(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートに共有結合している標的指向リガンドを含む以下によって表される構造を有する化合物を含む、両親媒性膜活性ポリアミン用可逆的修飾剤：
0005941926.tif 000070
（式中、
Ｘは−ＮＨ−であり、
Ｙは−ＮＨ−であり、
Ｒ１は−ＣＨ３であり、
Ｒ２は−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２であり、
Ｒ４は非荷電であって、かつ標的指向リガンドもしくはリンカーを有する標的指向リガンドからなり、
Ｒ５は２、４、または６位にある、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｚであり、ここでＺは
0005941926.tif 000071
であり、かつ、
Ｒ６は水素である）；
ここで、該標的指向リガンドは、ハプテン、ビタミン、および細胞表面受容体リガンドからなる群より選択される。
【請求項２】
標的指向リガンドがアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）リガンドである、請求項１記載の剤。
【請求項３】
ＡＳＧＰｒリガンドが、ラクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン、およびＮ−イソ−ブタノイル−ガラクトサミンからなるリストより選択される、請求項２記載の剤。
【請求項４】
Ｚが
0005941926.tif 000072
である、請求項１〜３のいずれか一項記載の剤。
【請求項５】
Ｒ−Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルボナート
（式中、
Ｒは立体安定化剤からなり、
Ａ１は疎水性アミノ酸であり、かつ
Ａ２は、アミド結合を介してＡ１に結合した親水性非荷電アミノ酸であり、ここで該親水性非荷電アミノ酸は中性ｐＨで非荷電である）
を含む、両親媒性膜活性ポリアミン用可逆的修飾剤であって、
ここで、該立体安定化剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、
該疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、およびトリプトファンからなる群より選択され、
該親水性非荷電アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、およびシトルリンからなる群より選択される、剤。
【請求項６】
アミドベンジルがｐ−アミドベンジル基である、請求項５記載の剤。
【請求項７】
カルボナートが活性化アミン反応性カルボナートである、請求項５または６に記載の剤。
【請求項８】
Ｒが中性である、請求項５〜７のいずれか一項記載の剤。
【請求項９】
以下によって表される構造を有する化合物を含む、両親媒性膜活性ポリアミン用可逆的修飾剤：
0005941926.tif 000073
（式中、
Ｒは立体安定化剤からなり、
Ｒ１は疎水性アミノ酸側鎖であり、
Ｒ２は親水性非荷電アミノ酸側鎖であり、ここで該親水性非荷電アミノ酸は中性ｐＨで非荷電であり、
Ｙは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、
Ｒ５は２、４、または６位にあって、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｚであり、ここでＺは
0005941926.tif 000074
であり、かつ
Ｒ６は、Ｒ５が占有している位置を除き、２、３、４、５、または６位のそれぞれで独立に水素、アルキル、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３、−（ＣＨ２）−（ＣＨ３）２、またはハロゲン化物であり、ここでｎおよびｍは独立に０〜４の整数である）
ここで、該立体安定化剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、
該疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、およびトリプトファンからなる群より選択され、
該親水性非荷電アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、およびシトルリンからなる群より選択される。
【請求項１０】
以下を含む、インビボでポリヌクレオチドを細胞に送達するための送達ポリマー：
Ｍ１ｙ−Ｐ−Ｍ２ｚ
式中、
Ｐは両親媒性膜活性ポリアミンであり、
Ｍ１はジペプチド−アミドベンジル−カルバマート連結を介してＰに連結された標的指向リガンドもしくはリンカーを有する標的指向リガンドからなり、
Ｍ２はジペプチド−アミドベンジル−カルバマート連結を介してＰに連結された立体安定化剤からなり、
ｙおよびｚはそれぞれゼロ以上の整数であり、
ｙ＋ｚは、マスキング剤の非存在下でのポリアミンＰ上のアミンの量により判定して、Ｐ上の一級アミンの５０％よりも大きい値を有し、かつ
ジペプチド−アミドベンジル−カルバマート連結が、以下：
Ｒ−Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルバマート−Ｐ
（式中、
ＲはＭ１の標的指向リガンドもしくはリンカーを有する標的指向リガンド、またはＭ２の立体安定化剤からなり、
Ａ１は疎水性アミノ酸であり、かつ
Ａ２は、アミド結合を介してＡ１に結合した親水性非荷電アミノ酸であり、ここで該親水性非荷電アミノ酸は中性ｐＨで非荷電であり、かつ
Ｐは両親媒性膜活性ポリマーである）によって表される構造を有し、
ここで、該標的指向リガンドは、ハプテン、ビタミン、および細胞表面受容体リガンドからなる群より選択され、
該立体安定化剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、
該疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、およびトリプトファンからなる群より選択され、
該親水性非荷電アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、およびシトルリンからなる群より選択される。
【請求項１１】
アミドベンジルがｐ−アミドベンジル基である、請求項１０記載の送達ポリマー。
【請求項１２】
Ｍ１およびＭ２が独立に非荷電であるかまたは電荷中性である、請求項１０または１１記載の送達ポリマー。
【請求項１３】
標的指向リガンドが細胞受容体リガンドである、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の送達ポリマー。
【請求項１４】
細胞受容体リガンドがＡＳＧＰｒリガンドである、請求項１３記載の送達ポリマー。
【請求項１５】
ＡＳＧＰｒリガンドが、ラクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイルガラクトサミン、およびＮ−イソ−ブタノイル−ガラクトサミンからなるリストより選択される、請求項１４記載の送達ポリマー。
【請求項１６】
Ｒ−Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルバマート−Ｐが、以下：
0005941926.tif 000075
（式中、
Ｙは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、
Ｒ１は疎水性アミノ酸Ａ１の側鎖であり、かつ
Ｒ２は親水性非荷電アミノ酸Ａ２の側鎖であり、ここで該親水性非荷電アミノ酸は中性ｐＨで非荷電である）によって表される構造を有する、請求項１０〜１５のいずれか一項記載の送達ポリマー。
【請求項１７】
両親媒性膜活性ポリアミンが、ランダム、ブロック、および交互合成ポリマーからなるリストより選択される、請求項１０〜１６のいずれか一項記載の送達ポリマー。
【請求項１８】
両親媒性膜活性ポリアミンがメリチンペプチドである、請求項１０〜１６のいずれか一項記載の送達ポリマー。
【請求項１９】
両親媒性膜活性ポリアミンがポリヌクレオチドにさらに共有結合している、請求項１０〜１８のいずれか一項記載の送達ポリマー。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを含む、請求項１９記載の送達ポリマー。
【請求項２１】
ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡからなる群より選択される、請求項２０記載の送達ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ポリヌクレオチドおよび他の実質的に細胞膜不透過性の化合物の生細胞への送達は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されている。アンチセンス、RNAi、および遺伝子療法において用いられる薬物は比較的大きい親水性ポリマーであり、高度に負に荷電していることが多い。これらの物理的特徴はいずれも、細胞膜を通過してのそれらの直接的拡散を重度に制限する。このため、ポリヌクレオチド送達の主な障壁は、細胞膜を通過しての細胞の細胞質または核へのポリヌクレオチドの送達である。
【０００２】
インビボで小さい核酸を送達するために用いられてきた1つの手段は、核酸を小さい標的化分子または脂質もしくはステロールのいずれかに結合することであった。これらの結合体でいくらかの送達および活性が観察されたが、これらの方法により必要とされる核酸用量はとてつもなく大きい。
【０００３】
インビトロでポリヌクレオチドの細胞への適度に効率的な送達を達成する多くの形質移入試薬も開発されている。しかし、これらの同じ形質移入試薬を用いてのポリヌクレオチドのインビボ送達は、インビボ毒性、有害な血清相互作用、および不良な標的化により複雑で無効となっている。インビトロで良好にはたらく形質移入試薬、カチオンポリマーおよび脂質は、典型的には大きいカチオン性静電粒子を形成し、細胞膜を不安定化する。インビトロ形質移入試薬の正電荷は電荷-電荷（静電）相互作用を介して核酸との結合を促進し、したがって核酸/形質移入試薬複合体を形成する。正電荷は媒体の細胞への非特異的結合、および膜融合、不安定化、または破壊のためにも有益である。膜の不安定化は実質的に細胞膜不透過性ポリヌクレオチドの細胞膜を通過しての送達を促進する。これらの特性はインビトロでの核酸移動を促進するが、これらはインビボで毒性および無効な標的化を引き起こす。カチオン電荷は血清成分との相互作用をもたらし、これはポリヌクレオチド-形質移入試薬相互作用の不安定化、不良なバイオアベイラビリティ、および不良な標的化を引き起こす。インビトロでは有効でありうる、形質移入試薬の膜活性は、インビボでは毒性につながることが多い。
【０００４】
インビボ送達のために、媒体（核酸および関連する送達物質）は小さい、直径100nm未満、好ましくは50nm未満であるべきである。さらにより小さい複合体、20nm未満または10nm未満がより有用であろう。100nmよりも大きい送達媒体はインビボで血管細胞以外の細胞にほとんど接近できない。静電相互作用により形成された複合体は、生理的塩濃度または血清成分に曝露されると凝集または分解する傾向にある。さらに、インビボ送達媒体上のカチオン電荷は有害な血清相互作用と、したがって不良なバイオアベイラビリティにつながる。面白いことに、高い負の電荷も、標的化に必須の相互作用、すなわち細胞受容体に対する標的化リガンドの結合を妨害することにより、標的化インビボ送達を阻害しうる。したがって、インビボでの分布および標的化のために、中性に近い媒体が望ましい。注意深く調節しなければ、膜破壊または不安定化活性はインビボで用いると毒性である。媒体毒性と核酸送達との釣り合いを取ることは、インビボよりもインビトロでより容易に達成される。
【０００５】
Rozemaらは、米国特許出願公開第20080152661号（特許文献1）において、二置換無水マレイン酸修飾を用いて、膜活性ポリアミンの膜破壊活性を可逆的に調節する手段を提供した。無水マレイン酸とアミンとの反応によって生成するマレアマート連結は、インビボ送達に適したpH範囲でpHに不安定である。このプロセスにより、膜活性ポリマーをインビボ送達または核酸のために用いることが可能となった。発明者らはここで、ジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を有する修飾膜活性ポリマーを提供する。ジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結は可逆的で、生理的に反応性である。二置換無水マレイン酸での修飾によるpHに不安定なマレアマート連結とは異なり、本明細書に記載のポリマー修飾剤連結は、インビボ循環においてより安定な、酵素的に切断可能な連結を生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第20080152661号
【発明の概要】
【０００７】
好ましい態様において、発明者らは、両親媒性膜活性ポリアミンを可逆的に修飾し、その膜活性を阻害するためのマスキング剤であって：本明細書においてジペプチドマスキング剤またはプロテアーゼ切断可能なマスキング剤と呼ぶ、ジペプチド-アミノベンジル-カルボナートに結合した立体安定化剤または標的指向リガンドを含むマスキング剤を記載する。ジペプチドマスキング剤は以下の一般式を有する：
R-A1A2-アミドベンジル-カルボナート
式中、Rは立体安定化剤または標的指向リガンドであり、A1はアミノ酸であり、かつA2はアミノ酸である。マスキング剤カルボナートとポリマーアミンとの反応によりカルバマート連結が生じる。マスキング剤はジペプチドがインビボで内因性プロテアーゼにより切断され、したがってポリアミンから立体安定化剤または標的指向リガンドを切断するまで安定である。ジペプチドの後（A2とアミドベンジルとの間）の酵素的切断後、アミドベンジル-カルバマートは自発的転移を起こし、その結果ポリマーアミンが再生する。好ましくは、Rは中性である。より好ましくは、Rは非荷電である。好ましい立体安定化剤はポリエチレングリコール（PEG）である。標的指向リガンドはジゴキシゲニンなどのハプテン、ビオチンなどのビタミン、抗体、モノクローナル抗体、および細胞表面受容体リガンドを含むリストから選択してもよい。標的指向リガンドはジペプチドに、PEGリンカーなどのリンカーを介して連結してもよい。好ましい細胞表面受容体リガンドはアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）リガンドである。好ましいASGPRリガンドはN-アセチルガラクトサミン（NAG）である。好ましいジペプチドは、親水性非荷電アミノ酸にアミド結合を介して連結されている疎水性アミノ酸からなる。好ましいアミドベンジル基はp-アミドベンジル基である。好ましいカルボナートは活性化アミン反応性カルボナートである。
【０００８】
好ましい態様において、本発明は、インビボでRNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドを細胞に送達するための組成物であって：ポリアミンが本明細書に記載のジペプチドマスキング剤での可逆的修飾によってマスクされている、マスクした両親媒性膜活性ポリアミン（送達ポリマー）およびRNAiポリヌクレオチドを含む組成物を特徴とする。送達ポリマーをRNAiポリヌクレオチドに共有結合することができる。送達ポリマーのRNAiポリヌクレオチドへの共有結合のための好ましい連結は生理的に不安定な連結である。一つの態様において、この連結はジペプチドマスキング剤連結に直交である。または、送達ポリマーはRNAiポリヌクレオチドに共有結合されておらず、RNAiポリヌクレオチドは標的指向分子に共有結合されている。
【０００９】
好ましい態様において、発明者らは：a）複数の標的指向リガンドまたは立体安定化剤にジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介して；およびb）1つまたは複数のポリヌクレオチドに1つまたは複数の可逆的連結を介して共有結合されている、両親媒性膜活性ポリアミンを含む組成物を記載する。一つの態様において、ジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結はポリヌクレオチド可逆的共有結合に直交である。ポリヌクレオチド-ポリマー結合体を薬学的に許容される担体または希釈剤中で哺乳動物に投与する。
【００１０】
好ましい態様において、発明者らは：a）複数の標的指向リガンドまたは立体安定化剤にジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介して共有結合されている、両親媒性膜活性ポリアミン；およびb）20個以上の炭素原子を有する疎水性基およびガラクトースクラスターからなるリストより選択される標的指向基に共有結合されている、RNAiポリヌクレオチドを含む組成物を記載する。本態様において、RNAiポリヌクレオチドは修飾した両親媒性膜活性ポリアミンに共有結合されていない。修飾したポリアミンおよびRNAiポリヌクレオチド標的指向基結合体を別々に合成し、別々の容器で供給してもよく、または1つの容器で供給してもよい。修飾したポリアミンおよびRNAiポリヌクレオチド-標的指向基結合体を一緒にまたは別々に、薬学的に許容される担体または希釈剤中で哺乳動物に投与する。
【００１１】
好ましいジペプチドマスキング剤は、プロテアーゼ（ペプチダーゼ）切断可能なジペプチド-p-アミドベンジルアミン反応性カルボナート誘導体を含む。本発明のプロテアーゼ切断可能なマスキング剤は、アミドベンジル活性化カルボナート部分に連結されたジペプチドを用いる。標的指向リガンドまたは立体安定化剤はジペプチドのアミノ末端に結合される。アミドベンジル活性化カルボナート部分はジペプチドのカルボキシ末端に結合される。本発明による使用に適したプロテアーゼ切断可能なリンカーは以下の構造を有する：
0005941926.tif 000002
式中、R4は標的指向リガンドまたは立体安定化剤を含み、R3はアミン反応性カルボナート部分を含み、かつR1およびR2はアミノ酸側鎖である。好ましい活性化カルボナートはパラ-ニトロフェノールである。しかし、当技術分野において公知の他のアミン反応性カルボナートもパラ-ニトロフェノールの代わりに容易に用いられる。活性化カルボナートとアミンとの反応により、標的指向リガンドまたは立体安定化剤が膜活性ポリアミンに、ペプチダーゼ切断可能なジペプチド-アミドベンジルカルバマート連結を介して連結される。アミノ酸とアミドベンジル基との間でのジペプチドの酵素切断により、R4がポリマーから除去されて脱離反応が誘発され、これはポリマーアミンの再生を引き起こす。
【００１２】
本発明のジペプチドマスキング剤は、両親媒性膜活性ポリアミンの可逆的修飾/阻害のために有用である。共有結合は、ジペプチドマスキング剤の活性化カルボナートとポリマーアミン、特に一級アミン基との反応によって生成される。したがって、本明細書において提供するのは、本明細書に記載のジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤および以下の両親媒性膜活性ポリアミンを含む結合体である：
0005941926.tif 000003
【００１３】
[本発明1001]
両親媒性膜活性ポリアミンを可逆的に修飾するための化合物であって、ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートに共有結合している立体安定化剤または標的指向リガンドを含む、化合物。
[本発明1002]
下記によって表される構造を有する、本発明1001の化合物：
0005941926.tif 000004
式中、
Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり、
Yは-NH-または-O-であり、
R1は-CH2-フェニル、-CH-(CH3)2、-CH2-CH-(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH3、
0005941926.tif 000005
であり、
R2は水素、-(CH2)3-NH-C(O)-NH2、-(CH2)4-N-(CH3)2、または-CH2-C(O)-NH2であり、
R4は非荷電であって、ポリエチレングリコールまたは標的指向リガンドを含み、
R5は2、4、または6位にあって、-CH2-O-C(O)-O-Zであり、ここでZは
-ハロゲン化物、
0005941926.tif 000006
であり、かつ、
R6は、R5が占有している位置を除き、2、3、4、5、または6位のそれぞれで独立に水素、アルキル、-(CH2)n-CH3（ここでn＝0〜4）、-(CH2)-(CH3)2、またはハロゲン化物である。
[本発明1003]
R4が立体安定化剤を含む、本発明1002の化合物。
[本発明1004]
立体安定化剤がポリエチレングリコール（PEG）である、本発明1003の化合物。
[本発明1005]
標的指向リガンドがアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）リガンドを含む、本発明1002の化合物。
[本発明1006]
ASGPrリガンドが、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソ-ブタノイル-ガラクトサミンからなるリストより選択される、本発明1005の化合物。
[本発明1007]
XおよびYが-NH-であり、かつZが
0005941926.tif 000007
である、本発明1001の化合物。
[本発明1008]
R1が-CH2-フェニルである、本発明1007の化合物。
[本発明1009]
R2が-(CH2)3-NH-C(O)-NH2である、本発明1007の化合物。
[本発明1010]
下記を含む、インビボでRNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドを細胞に送達するための送達ポリマー：
0005941926.tif 000008
式中、
Pは両親媒性膜活性ポリアミンであり、
M1はジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介してPに連結された標的指向リガンドであり、
M2はジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介してPに連結された立体安定化剤であり、
yおよびzはそれぞれゼロ以上の整数であり、かつ
y＋zは、マスキング剤の非存在下でのポリアミンP上のアミンの量により判定して、P上の一級アミンの50％よりも大きい値を有する。
[本発明1011]
立体安定化剤がPEGである、本発明1010の送達ポリマー。
[本発明1012]
標的指向リガンドがASGPrリガンドを含む、本発明1010の送達ポリマー。
[本発明1013]
ASGPrリガンドが、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソ-ブタノイル-ガラクトサミンからなるリストより選択される、本発明1012の送達ポリマー。
[本発明1014]
両親媒性膜活性ポリアミンが、ランダム、ブロック、または交互合成ポリマーからなるリストより選択される、本発明1010の送達ポリマー。
[本発明1015]
両親媒性膜活性ポリアミンがメリチンペプチドである、本発明1010の送達ポリマー。
[本発明1016]
ジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結が下記によって表される構造を有する、本発明1010の送達ポリマー：
0005941926.tif 000009
式中、
Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり
Yは-NH-または-O-であり
R1は-CH2-フェニル、-CH-(CH3)2、-CH2-CH-(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH3、
0005941926.tif 000010
であり；
R2は水素、-(CH2)3-NH-C(O)-NH2、-(CH2)4-N-(CH3)2、または-CH2-C(O)-NH2であり、
R4はM1の標的指向リガンドまたはM2の立体安定化剤を含み、かつ
ポリアミンは両親媒性膜活性ポリアミンである。
[本発明1017]
両親媒性膜活性ポリアミンがRNAiポリヌクレオチドにさらに共有結合している、本発明1016の送達ポリマー。
[本発明1018]
インビボでRNAiポリヌクレオチドを哺乳動物の細胞に送達する方法であって、RNAiポリヌクレオチドを哺乳動物に本発明1010の送達ポリマーと同時投与する段階を含む、方法。
[本発明1019]
RNAiポリヌクレオチドが送達ポリマーに共有結合している、本発明1018の方法。
[本発明1020]
細胞が肝実質細胞または肝臓癌細胞である、本発明1018の方法。
本発明の化合物は一般に、有機または医薬品化学分野の当業者には公知の方法を用いて得ることができる。本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、添付の図面と一緒に読めば、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、ジペプチドマスキング剤の構造を示す図であり、式中：R1およびR2はアミノ酸のR基であり、R4は立体安定化剤の標的指向リガンドであり、Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり、Yは-NH-または-O-でありR5は2、4、または6位にあって、-CH2-O-C(O)-O-Zであり、ここでZカルボナート、かつR6は、R5が占有している位置を除き、2、3、4、5、または6位のそれぞれで独立に水素、アルキル、またはハロゲン化物である。
【図２】図2は、ポリアミンに連結しているジペプチドマスキング剤の構造を示す図であり、式中：R1およびR2はアミノ酸のR基であり、R4は立体安定化剤の標的指向リガンドであり、Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり、かつYは-NH-または-O-である。
【図３】図3は、様々なジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。
【図４】図4は、ジペプチドマスキング剤または2つの異なる無水マレイン酸に基づくマスキング剤で修飾したポリマーの循環時間を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
記載するのは、両親媒性膜活性ポリアミンの可逆的修飾および阻害のために有用なマスキング剤ならびにジペプチドマスキング剤によるポリアミンの修飾によって生成した送達ポリマーである。ペプチダーゼ切断可能な連結は酵素非存在下での加水分解に安定で、電気的に中性であり、保存中およびインビボ循環中の長期DPC安定性を提供する。循環中の半減期が改善される（より長くなる）ことで、腫瘍組織などの組織におけるリガンド仲介性蓄積に対する機会のウィンドウの拡大が促進される。ポリマーの送達は、RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達のために特に有用である。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、遺伝子発現の治療的阻害（ノックダウン）のために有用である。
【００１６】
ジペプチドマスキング剤は以下の一般式を有する：
R-A1A2-アミドベンジル-カルボナート
式中、Rは立体安定化剤または標的指向リガンドであり、A1はアミノ酸であり、A2はアミノ酸であり、かつカルボナートは活性化アミン反応性カルボナートである。Rは好ましくは非荷電である。マスキング剤カルボナートとポリマーアミンとの反応によりカルバマート連結が生じる。マスキング剤はジペプチドがインビボで内因性プロテアーゼにより切断され、したがってポリアミンから立体安定化剤または標的指向リガンドを切断するまで安定である。ジペプチドの後（A2とアミドベンジルとの間）の酵素的切断後、アミドベンジル-カルバマートは自発的転移を起こし、その結果ポリマーアミンが再生する。好ましい立体安定化剤はポリエチレングリコール（PEG）である。肝送達のために好ましい標的指向リガンドはASGPrリガンドである。好ましいASGPrリガンドはN-アセチルガラクトサミン（NAG）である。好ましいアミドベンジル基はp-アミドベンジル基である。
【００１７】
A1A2（またはAA）で表される、ジペプチドマスキング剤のジペプチドは、アミド結合を介して連結されたアミノ酸の二量体である。αおよびβアミノ酸を含むアミノ酸は生物学および化学において周知で、アミン基、カルボン酸基および異なるアミノ酸の間で変動する側鎖を含む分子である。好ましいアミノ酸は、一般式H2NCHRCOOHを有するα-アミノ酸であり、ここでRは有機置換基である。好ましいαアミノ酸は非荷電の天然アミノ酸である。好ましいジペプチドにおいて、A1は疎水性アミノ酸であり、A2は非荷電親水性アミノ酸である。好ましい疎水性アミノ酸はフェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、またはトリプトファンである。好ましい非荷電親水性アミノ酸はアスパラギン、グルタミン、またはシトルリンである。より好ましくは疎水性アミノ酸はフェニルアラニンまたはバリンである。より好ましい非荷電親水性アミノ酸はシトルリンである。ジペプチドが好ましいが、A1とRとの間にさらなるアミノ酸を挿入することも可能である。アミノ酸A1を脱離することによりジペプチドの代わりに1つのアミノ酸を用いることも可能である。本発明において用いる任意の天然アミノ酸は、本明細書においてそれらの一般的略称で呼ぶ。荷電アミノ酸を用いることもできるが、マスキング剤は非荷電であることが好ましい。
【００１８】
好ましい態様において、両親媒性膜活性ポリアミンを本発明のジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤との反応により可逆的に修飾して、膜不活性送達ポリマーを得る。ジペプチドマスキング剤はポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し、循環時間を延長し、特異的相互作用を増強し、毒性を阻害し、またはポリマーの電荷を変えることができる。
【００１９】
本発明の可逆的にマスクしたポリマーは以下の構造を含む：
0005941926.tif 000011
式中：
Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり
Yは-NH-または-O-であり
R1は好ましくは
-(CH2)k-フェニル（kは1、2、3、4、5、6であり；k＝1ではフェニルアラニン）、
-CH-(CH3)2（バリン）、
-CH2-CH-(CH3)2（ロイシン）、
-CH(CH3)-CH2-CH3（イソロイシン）、
-CH3（アラニン）、
-(CH2)2-COOH（グルタミン酸）、
または
0005941926.tif 000012
であり；
R2は好ましくは
水素（グリシン）
-(CH2)3-NH-C(O)-NH2（シトルリン）、
-(CH2)4-N-(CH3)2（リジン(CH3)2）、
-(CH2)k-C(O)-NH2；（kは1、2、3、4、5、6である）、
-CH2-C(O)-NH2（アスパラギン）、
-(CH2)2-C(O)-NH2（グルタミン）、
-CH2-C(O)-NR1R2（アスパラギン酸アミド）、
-(CH2)2-C(O)-NR1R2（グルタミン酸アミド）、
-CH2-C(O)-OR1（アスパラギン酸エステル）、または
-(CH2)2-C(O)-OR1（グルタミン酸エステル）であり、
R1およびR2はアルキル基であり
R4はポリエチレングリコールまたは標的指向リガンドを含み；かつ
ポリアミンは両親媒性膜活性ポリアミンである。
【００２０】
上記の構造はポリマーに連結された1つのジペプチドマスキング剤を示しているが、本発明の実施において、ポリマーアミンの50％〜90％またはそれ以上がジペプチドマスキング剤によって修飾される。
【００２１】
好ましい態様において、本発明の可逆的にマスクしたポリマーは以下の構造を含む：
0005941926.tif 000013
式中、R1、R2、R4およびポリアミンは前述のとおりである。
【００２２】
本発明の可逆的にマスクしたポリマーは、本発明のジペプチドマスキング剤とポリマー上のアミンとの反応によって生成する。本発明のジペプチドマスキング剤は以下の構造を有する：
0005941926.tif 000014
式中：
X、Y、R1、R2、およびR4は前述のとおりであり
R5は2、4、または6位にあって、-CH2-O-C(O)-O-Zであり、ここでZは
-ハロゲン化物、
0005941926.tif 000015
R6は、R5が占有している位置を除き、2、3、4、5、または6位のそれぞれで独立に水素、アルキル、-(CH2)n-CH3（ここでn＝0〜4）、-(CH2)-(CH3)2、またはハロゲン化物である。
【００２３】
好ましい態様において、下記によって示すとおり、Xは-NH-であり、Yは-NH-であり、R4は非荷電であり、R5は4位にあり、かつR6は水素である：
0005941926.tif 000016
。
【００２４】
もう一つの態様において、R4は：
R-(O-CH2-CH2)s-O-Y1-であり、式中
Rは水素、メチル、またはエチルであり；かつsは1〜150の整数であり、かつY1は下記を含むリストから選択される：
-O-Y2-NH-C(O)-(CH2)2-C(O)-、ここでY2は
-(CH2)3-
-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-（pは1〜20の整数である）、および
-O-。
【００２５】
標的指向リガンドはハプテン、ビタミン、抗体、モノクローナル抗体、および細胞表面受容体リガンドを含むリストから選択してもよい。標的指向リガンドはジペプチドに、PEGリンカーなどのリンカーを介して連結してもよい。
【００２６】
本発明による使用に適した膜活性ポリマーの非限定例は、以前に米国特許出願公開第20080152661号、第20090023890号、第20080287630号、および第20110207799号に記載されている。適切な両親媒性膜活性ポリアミンは、メリチンペプチドなどの小ペプチドであってもよい。
【００２７】
ポリマーアミンを本明細書に記載の酵素切断可能なリンカーを用いて可逆的に修飾した。修飾基を切断してアミンが再生する場合、アミンは可逆的に修飾されている。以下に示すとおり、マスキング剤の活性化カルボナートとポリマーアミンとの反応により、標的指向リガンドまたは立体安定化剤がポリマーに、ペプチダーゼ切断可能なジペプチド-アミドベンジルカルバマート連結を介して連結される：
0005941926.tif 000017
R1は標的指向リガンド（保護基と共に、または保護基なしのいずれか）またはPEGを含み、
R2は両親媒性膜活性ポリアミンであり、
AAはジペプチド（保護基と共に、または保護基なしのいずれか）であり、かつ
Zはアミン反応性カルボナートである。
【００２８】
保護基をジペプチドマスキング剤の合成中に用いてもよい。存在する場合は、保護基を両親媒性膜活性ポリアミンの修飾前または修飾後に除去してもよい。
【００２９】
十分なパーセンテージのポリマーアミンのジペプチドマスキング剤による可逆的修飾は、膜活性ポリアミンの膜活性を阻害する。また、ポリマーアミンのジペプチドマスキング剤による修飾は、好ましくはアミンの電荷を中和する。ジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結はプロテアーゼ（またはペプチダーゼ）切断に感受性である。プロテアーゼ存在下で、アニリド結合が切断されて中間体を生じ、これはただちに1,6脱離反応を起こして遊離ポリマーを放出する：
0005941926.tif 000018
上記反応スキームにおいて、AAはジペプチドであり、R1は標的指向リガンドまたは立体安定化剤を含み、かつR2は両親媒性膜活性ポリアミンである。重要なことに、遊離ポリマーは脱修飾され、したがって膜活性を復旧する。
【００３０】
マスクした状態で、可逆的に修飾した膜活性ポリアミンは膜破壊活性を示さない。膜活性を阻害し、細胞標的指向機能を提供する、すなわち、可逆的にマスクした膜活性ポリマー（送達ポリマー）を生成するために、ポリアミン上のアミンの50％よりも多く、55％よりも多く、60％よりも多く、65％よりも多く、70％よりも多く、75％よりも多く、80％よりも多く、または90％よりも多くの、ジペプチドマスキング剤による可逆的修飾が必要とされうる。
【００３１】
本発明は、生体活性物質を細胞内に送達する方法も提供する。より具体的には、本発明は、インビボでRNAiポリヌクレオチド哺乳動物細胞を送達するのに有用な化合物、組成物、および方法を目的とする。
【００３２】
一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドを本発明の送達ポリマーに、生理的に不安定な共有結合を介して連結する。生理的に不安定な連結を用いることにより、ポリヌクレオチドをポリマーから切断して、細胞成分との機能的相互作用に参加するポリヌクレオチドを放出することができる。
【００３３】
本発明は、以下の一般構造の結合体送達系を含む：
0005941926.tif 000019
式中、NはRNAiポリヌクレオチドであり、L1は生理的に不安定な連結であり、Pは両親媒性膜活性ポリアミンであり、M1はジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介してPに連結された標的指向リガンドであり、かつM2はジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介してPに連結された立体安定化剤である。yおよびzはそれぞれ、いかなるマスキング剤も非存在下でのポリアミンP上のアミンの量により判定して、y＋zがP上の一級アミンの50％よりも大きい、60％よりも大きい、70％よりも大きい、80％よりも大きい、または90％よりも大きい値を有するとの条件で、ゼロ以上の整数である。その非修飾状態で、Pは膜活性ポリアミンである。送達ポリマーM1y-P-M2zは膜活性ではない。P一級アミンのM1および/またはM2の結合による可逆的修飾は、Pの膜活性を可逆的に阻害または不活化する。メリチンペプチドなどの、いくつかの小さい両親媒性膜活性ポリアミンは、3〜5つという少数の一級アミンを含むことに留意される。アミンのあるパーセンテージの修飾は、ポリマーの集団におけるアミンのあるパーセンテージの修飾を反映することになる。M1およびM2の切断後、ポリアミンのアミンが再生され、それによりPはその非修飾の膜活性状態に戻る。
【００３４】
もう一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドをインビボで本発明の送達ポリマーと同時投与する。したがって、本発明は、以下の一般構造の組成物を含む：
Ｍ１ｙ−Ｐ−Ｍ２ｚプラスＮ−Ｔ、
式中、NはRNAiポリヌクレオチドであり、Tは標的指向基であり、Pは両親媒性膜活性ポリアミンであり、M1はジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介してPに連結された標的指向リガンドであり、かつM2はジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介してPに連結された立体安定化剤である。yおよびzはそれぞれ、いかなるマスキング剤も非存在下でのポリアミンP上のアミンの量により判定して、y＋zがP上の一級アミンの50％よりも大きい、60％よりも大きい、70％よりも大きい、80％よりも大きい、または90％よりも大きい値を有するとの条件で、ゼロ以上の整数である。その非修飾状態で、Pは膜活性ポリアミンである。送達ポリマーM1y-P-M2zは膜活性ではない。P一級アミンのM1および/またはM2の結合による可逆的修飾は、Pの膜活性を可逆的に阻害または不活化する。メリチンペプチドなどの、いくつかの小さい両親媒性膜活性ポリアミンは、3〜5つという少数の一級アミンを含むことに留意される。したがって、アミンのあるパーセンテージの修飾は、ポリマーの集団におけるアミンのあるパーセンテージの修飾を反映することになる。M1およびM2の切断後、ポリアミンのアミンが再生され、それによりPはその非修飾の膜活性状態に戻る。Nは、当技術分野において標準の方法を用いてTに共有結合により連結し、RNAiポリヌクレオチド-標的指向基結合体を生成する。好ましい共有結合は生理的に不安定な結合である。N-T。送達ポリマーおよびN-Tは別々に合成または製造する。TもNもP、M1またはM2に直接または間接的に共有結合していない。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド結合体とマスクした、またはマスクしていないポリマーとの静電的または疎水性結合は、ポリヌクレオチドのインビボでの肝送達に必要ではない。マスクしたポリマーおよびポリヌクレオチド結合体は同じ容器または別々の容器で共有することができる。これらは投与前に混合してもよく、同時投与してもよく、または逐次投与してもよい。
【００３５】
肝実質細胞送達のために、RNAiポリヌクレオチドが送達ポリマーに共有結合を介して連結されているか、または送達ポリマーと同時投与するかのいずれにせよ、yはポリマーP上の一級アミンの50％よりも大きく、最大100％までの値を有する。したがって、zはゼロパーセント（0％）以上であるが、ポリマーP上の一級アミンの50％未満の値を有する。
【００３６】
肝腫瘍細胞への送達のために、zはより大きくポリマーP上の一級アミンの最大100％までの値を有していてもよい。好ましい態様において、腫瘍細胞への送達のために、zはポリアミンP上の一級アミンの50％よりも大きい、60％よりも大きい、70％よりも大きい、80％よりも大きい、または90％よりも大きい値を有し、yはゼロである。
【００３７】
膜活性ポリアミンは、原形質膜またはリソソーム/エンドサイトーシス膜を破壊することが可能である。この膜活性はポリヌクレオチドの細胞送達のために必須の特徴である。しかし、膜活性は、ポリマーをインビボで投与すると毒性を引き起こす。ポリアミンはインビボで多くのアニオン成分とも容易に相互作用し、望ましくない生体内分布を引き起こす。したがって、ポリアミンの膜活性の可逆的マスキングはインビボでの使用のために必須である。
【００３８】
マスキングは、記載したジペプチドマスキング剤を膜活性ポリアミンに可逆的に結合して、可逆的にマスクした膜活性ポリマー、すなわち送達ポリマーを生成することにより達成される。膜活性の阻害に加えて、マスキング剤は非特異的相互作用からポリマーを遮蔽し、血清相互作用を低減し、ポリアミンを中和して正電荷を低減し、ほぼ中性電荷のポリマーを生成し、循環時間を延長し、かつ/または細胞特異的相互作用、すなわち標的指向を提供する。
【００３９】
全般的に、マスキング剤がポリマーの膜活性を阻害することは、マスキング剤の必須の特徴である。マスキング剤は非特異的相互作用からポリマーを遮蔽しうる（血清相互作用を低減し、循環時間を延長する）。膜活性ポリアミンは非修飾（マスクしていない）状態で膜活性であり、修飾（マスクした）状態で膜活性ではない（不活化）。所望のレベルの不活化を達成するのに十分な数のマスキング剤をポリマーに連結する。マスキング剤の結合によるポリマーの所望のレベルの修飾は、適切なポリマー活性検定を用いて容易に判定される。例えば、ポリマーが所定の検定において膜活性を有するならば、その検定において膜活性の所望のレベルの阻害を達成するのに十分なレベルのマスキング剤がポリマーに連結されている。いかなるマスキング剤も非存在下でのポリマー上の一級アミンの量により判定して、マスキングはポリマーの集団上の一級アミン基の≧50％、≧60％、≧70％、≧80％または≧90％の修飾を必要とする。マスキング剤のポリマーへの結合がポリマーの正電荷を低減し、したがってより中性の送達ポリマーを生成することも、マスキング剤の好ましい特徴である。マスクしたポリマーが水溶性を保持していることが望ましい。
【００４０】
膜活性ポリアミンをマスキング剤に、過剰のマスキング剤存在下で結合することができる。過剰のマスキング剤を結合した送達ポリマーから除去した後に、送達ポリマーを投与してもよい。
【００４１】
本明細書において用いられる「立体安定化剤」は、立体安定化剤を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー（天然、合成、または非天然のいずれか）である。立体安定化剤は、それが結合しているポリマーが静電相互作用に参加することを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、複数の物質の非共有結合である。立体安定化剤は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化剤は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化剤はポリマーの凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化剤はポリエチレングリコール（PEG）またはPEG誘導体である。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約1〜500のエチレングリコールモノマー、または2〜25のエチレングリコールモノマーを有しうる。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約85〜20,000ダルトン（Da）、約85〜1000Daの分子量平均も有しうる。本明細書において用いられる立体安定化剤は水溶液中で、立体安定化剤を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。
【００４２】
「標的指向リガンド」は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体内分布特性を増強して、結合体の細胞または組織特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。明白にするために、本明細書において用いられる「標的指向リガンド」なる用語は、ジペプチドマスキング剤に結合している標的指向リガンドを示すために用い、「標的指向基」は、RNAiポリヌクレオチド-標的指向基結合体においてRNAiポリヌクレオチドに連結している標的指向リガンドである。標的指向リガンドは分子の標的細胞との結合を増強する。したがって、標的指向リガンドはそれらが結合している結合体の薬物動態または生体内分布特性を増強して、結合体の細胞分布および細胞取り込みを改善しうる。標的指向リガンドの細胞または細胞受容体への結合はエンドサイトーシスを開始しうる。標的指向リガンドは一価、二価、三価、四価、またはそれ以上の結合価を有しうる。標的指向リガンドは：細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、および細胞表面分子に親和性を有する抗体様物質を含む群より選択してもよい。好ましい標的指向リガンドは、細胞受容体リガンドを含む。薬物および遺伝子に細胞および特定の細胞受容体を標的とさせるために、様々なリガンドが用いられてきた。細胞受容体リガンドは：炭水化物、グリカン、糖質（ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、およびマンノース誘導体を含むが、それらに限定されるわけではない）、ビタミン、葉酸塩、ビオチン、アプタマー、およびペプチド（RGD含有ペプチド、インスリン、EGF、およびトランスフェリンを含むが、それらに限定されるわけではない）を含む群より選択してもよい。
【００４３】
肝実質細胞標的指向のために、好ましい標的指向リガンドはアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）に親和性を有する糖質である。ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝実質細胞表面上で発現されるASGPrへのそれらの結合を通じて、インビボで分子に肝実質細胞を標的とさせるために用いられてきた。本明細書において用いられる「ASGPr標的指向リガンド」は、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体を含む。ガラクトース標的指向リガンドのASGPrへの結合は、送達ポリマーの肝実質細胞への細胞特異的標的指向および送達ポリマーの肝実質細胞へのエンドサイトーシスを促進する。
【００４４】
ASGPr標的指向リガンドは、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン（NAG）、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択してもよい（Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686）。ASGPr標的指向部分はモノマー（例えば、1つのガラクトサミンを有する）またはマルチマー（例えば、複数のガラクトサミンを有する）の部分でありうる。
【００４５】
一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的指向リガンドマスキング剤のポリアミン上の一級アミンの≧50％、≧60％、≧70％、≧80％、または≧90％への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的指向リガンドマスキング剤およびPEGマスキング剤のポリマー上の一級アミンの≧50％、≧60％、≧70％、≧80％、または≧90％への結合により可逆的にマスクする。ASGPr標的指向リガンドマスキング剤およびPEGマスキング剤の両方の場合、PEGのASGPr標的指向リガンドに対する比は約0〜4：1、より好ましくは約0.5〜2：1である。
【００４６】
両親媒性（amphipathic）、または両親媒性（amphiphilic）ポリマーは当技術分野において周知で、認められており、親水性（極性、水溶性）および疎水性（非極性、親油性、水不溶性）基または部分の両方を有する。
【００４７】
「親水性基」は、質的な用語で、化学部分が水を好むことを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電または非荷電でありうる。荷電基は正に荷電（アニオン）もしくは負に荷電（カチオン）または両方（両性イオン）でありうる。親水性基の例には、以下の化学部分が含まれる：炭化水素、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄、およびヒドロキシル。
【００４８】
「疎水性基」は、質的な用語で、化学部分が水を避けることを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。親油性基は脂肪、油、脂質、および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力はほとんど、またはまったくない。複数の炭素原子を含む炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロール、およびコレステロール誘導体は疎水性基および化合物の例である。
【００４９】
疎水性基は、好ましくは、炭素および水素原子のみを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む、非極性置換または非極性ヘテロ原子は許容されうる。この用語は脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基を含み、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状であってもよい。疎水性基なる用語は、ステロール、ステロイド、コレステロール、ならびにステロイドおよびコレステロール誘導体も含む。
【００５０】
両親媒性ポリマーに関して、本明細書において用いられる部分とは、一つの共有結合が切断され、水素で置換されたときに誘導される分子と定義される。例えば、ブチルアミンにおいて、炭素と窒素との間の結合の切断、および水素による置換は、アンモニア（親水性）およびブタン（疎水性）を生じる。1,4-ジアミノブタンが窒素-炭素結合で切断され、水素で置換されると、得られる分子はここでもアンモニア（2×）およびブタンである。しかし、1,4-ジアミノブタンは、疎水性部分の生成が2つの結合の切断を必要とするため、両親媒性とは考えられない。
【００５１】
本明細書において用いられる表面活性ポリマーは、水の表面張力および/または他の相との界面張力を低下させ、したがって、液体/蒸気界面で積極的に吸着される。表面活性の性質は通常は、物質の分子が両親媒性（amphipathic）または両親媒性（amphiphilic）であるという事実による。
【００５２】
本明細書において用いられる「膜活性」ポリマーは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ポリマーである：非膜透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする、膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてポリマーの活性により機能的に規定することができる：赤血球溶解（溶血）、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ポリマーは、膜溶解性ポリマーとも呼ぶ。原形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性は、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成または非天然両親媒性ポリマーでありうる。
【００５３】
本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、HIV TATタンパク質由来のアルギニンを多く含むペプチド、アンテナペディアペプチド、VP22ペプチド、トランスポータン、アルギニンを多く含む人工ペプチド、小さいグアニジニウムを多く含む人工ポリマ−などの化合物によって表される、細胞透過性ペプチドまたはポリマーと呼ばれるポリマーのクラスとは異なる。細胞透過性化合物は、見かけ上エンドサイトーシスを必要とすることなく、また膜の完全性を妨害することなく、いくつかの分子を、脂質二重層の一方の側から脂質二重層の他の側へと膜を通過して輸送するようであるが、それらのメカニズムは不明である。
【００５４】
ポリヌクレオチドの細胞への送達は、膜に孔を形成する、またはエンドソームもしくはリソソーム小胞を破壊し、それにより小胞の内容物を細胞質中に放出させることを含む、原形質膜または内部の小胞膜（エンドソームまたはリソソームなど）を破壊または不安定化する、膜活性ポリマーによって仲介される。
【００５５】
本発明の両親媒性膜活性ポリアミンコポリマーは、2つまたはそれ以上のモノマー種の共重合の産物である。一つの態様において、本発明の両親媒性膜活性ヘテロポリマーは以下の一般構造を有する：
-(A)a-(B)b-
式中、Aは一級または二級アミン官能側基を含み、かつBは疎水性側基を含み、aおよびbは＞0の整数である。ポリマーはランダム、ブロック、または交互であってもよい。追加のモノマーの組み込みが許容される。
【００５６】
「エンドソーム溶解性ポリマー」は、溶解性酵素の存在などのエンドソーム特異的環境因子に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドなどの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、エンドソームにおいてそれらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。本発明の可逆的にマスクした膜活性ポリアミンは、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えられる。
【００５７】
「メリチン」は、天然のハチ毒中にみられる小さい両親媒性膜活性ペプチドである。メリチンは生体原料から単離することもでき、または合成品であってもよい。合成ポリマーは「人による」化学的プロセスによって調合または製造され、天然の生体プロセスによって生成されるものではない。本明細書において用いられるメリチンは、例えば、以下の種の毒液中で見いだすことができるメリチンファミリーの天然ハチ毒ペプチドを含む：セイヨウミツバチ（Apis mellifera）、トウヨウミツバチ（Apis cerana）、クロスズメバチの一種（Vespula maculifrons）、スズメバチの一種（Vespa magnifica）、スズメバチの一種（Vespa velutina nigrithorax）、アシナガバチの一種（Polistes sp. HQL-2001）、コミツバチ（Apis florae）、オオミツバチ（Apis dorsta）、トウヨウミツバチ（Apis cerana cerana）、アシナガバチ（Polistes hebraeus）。本明細書において用いられるメリチンは、天然メリチンペプチドと同一、または類似のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを含む。具体的には、メリチンアミノ酸配列は表1に示すものを含む。合成メリチンペプチドは、天然のL型アミノ酸または鏡像異性のD型アミノ酸（インベルソ（inverso））を含むことができる。しかし、メリチンペプチドは基本的に全L型または全D型アミノ酸のいずれかを含むべきであるが、アミノまたはカルボキシ末端のいずれかに付属した反対の立体中心のアミノ酸を有していてもよい。メリチンアミノ酸配列は逆にすることもできる（レベルソ（reverso））。レベルソメリチンはL型アミノ酸またはD型アミノ酸（レトロインベルソ）を有しうる。2つのメリチンペプチドを共有結合してメリチン二量体を生成することもできる。メリチンは、組織標的指向を増強する、またはインビボ循環を促進する、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合された、マスキング剤以外の修飾基を有しうる。
【００５８】
連結または「リンカー」は、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう一つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結はマスキング剤またはポリヌクレオチドをポリマーに接続することができる。不安定な連結は不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性および/または長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく；これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。
【００５９】
「不安定な結合」は、同じ分子内の他の共有結合を分解または切断しない条件下で選択的に分解または切断されうる、水素原子への共有結合以外の共有結合である。より具体的には、不安定な結合は、適切な条件下で同じ分子内の他の不安定でない共有結合よりも安定性が低い（熱力学的に）、またはより速やかに分解される（動力学的に）共有結合である。分子内の不安定な結合の切断は、2つの分子の生成を引き起こしうる。当業者にとって、結合の切断または不安定性は一般には結合切断の半減期（t1/2）（結合の半分が切断するのに要する時間）によって議論される。したがって、不安定な結合は、分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断されうる結合を含む。
【００６０】
本明細書において用いられる「生理的に不安定な結合」は、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件、または遭遇するものに類似の条件下で切断可能な不安定な結合である。生理的に不安定な連結基は、特定の生理的条件にある場合に化学変換（例えば、切断）を起こすように選択される。
【００６１】
本明細書において用いられる細胞生理的に不安定な結合は、哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な不安定な結合である。哺乳動物の細胞内条件には、哺乳動物の細胞において見られる、または遭遇するものに類似の、pH、温度、酸化または還元条件または物質、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解または加水分解酵素などの、哺乳動物の細胞において通常存在する酵素活性の存在も含まれる。細胞生理的に不安定な結合は、薬学的に許容される外因性物質の投与に反応して切断されてもよい。
【００６２】
RNAi干渉標的化基結合体：標的化基は、RNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的化部分はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。
【００６３】
一つの態様において、標的化基は疎水性基からなる。より具体的には、標的化基は、少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基からなる。ポリヌクレオチド標的化部分として用いる疎水性基は、本明細書において疎水性標的化部分と呼ぶ。適切な例示的疎水性基は、コレステロール、ジコレステロール、トコフェロール、ジトコフェロール、ジデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、イソプレノイド、およびコレアミドを含む群より選択されうる。6個以下の炭素原子を有する疎水性基はポリヌクレオチド標的化部分として有効ではないが、8から18個の炭素原子を有する疎水性基は疎水性基のサイズ増大（すなわち、炭素原子の数の増大）に伴い漸増するポリヌクレオチド送達を提供する。疎水性標的化基のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、送達ポリマーの同時投与なしでは、RNAiポリヌクレオチドの効率的な機能的インビボ送達を提供しない。siRNA-コレステロール結合体は、他の研究者らによりインビボでsiRNA（siRNA-コレステロール）を肝細胞に送達すると報告されているが、任意のさらなる送達媒体なしでは、高濃度のsiRNAが必要で、送達効果は悪い。本明細書に記載の送達ポリマーと組み合わせると、ポリヌクレオチドの送達は大幅に改善される。siRNA-コレステロールを本発明の送達ポリマーと一緒に提供することにより、siRNA-コレステロールの有効性は約100倍高まる。
【００６４】
ポリヌクレオチド標的化部分として有用な疎水性基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択してもよく、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロール、ステロイド、およびステロイド誘導体であってもよい。疎水性標的化基は好ましくは、炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持する置換またはヘテロ原子、例えばフッ素は許容されうる。疎水性標的化基は、当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、疎水性基はいずれの鎖に結合してもよい。
【００６５】
もう一つの態様において、標的化基はガラクトースクラスター（ガラクトースクラスター標的化部分）を含む。本明細書において用いられるガラクトースクラスターは、2から4つの末端ガラクトース誘導体を有する分子を含む。本明細書において用いられるガラクトース誘導体なる用語は、ガラクトースおよびASGPrに対してガラクトースと同等またはそれよりも大きい親和性を有するガラクトースの誘導体の両方を含む。末端ガラクトース誘導体を分子に、そのC-1炭素を通じて結合する。好ましいガラクトースクラスターは、それぞれアシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する3つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、3つの末端N-アセチルガラクトサミンを有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐ガラクトース、三価ガラクトースおよびガラクトーストリマーが含まれる。三分岐ガラクトース誘導体クラスターはASGPrに、二分岐または単鎖ガラクトース誘導体構造よりも大きい親和性で結合する（Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620；Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945）。nMの親和性を達成するには多価が必要とされる。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する1つのガラクトース誘導体の結合は、送達ポリマーと同時投与した場合に、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝実質細胞への機能的送達を可能にしない。
【００６６】
ガラクトースクラスターは、それぞれ中心の分枝点に連結している2〜4つの、好ましくは3つのガラクトース誘導体を含む。ガラクトース誘導体を中心分枝点に糖のC-1炭素を通じて結合する。ガラクトース誘導体を好ましくは分枝点にリンカーまたはスペーサーを介して連結する。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである（米国特許第5885968号；Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサーである。分枝点は、3つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合をさらに可能にする、任意の低分子である。例示的分枝点基はジリシンである。ジリシン分子は、それを通じて3つのガラクトース誘導体が結合する3つのアミン基、およびそれを通じてジリシンがRNAiポリヌクレオチドに結合しうるカルボキシル反応性基を含む。分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、リンカーまたはスペーサーを通じて起こりうる。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサー（3つのエチレン単位）である。ガラクトースクラスターは当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、ガラクトースクラスターはいずれの鎖に結合してもよい。好適なカラクトースクラスターは米国特許公開第20110207799号に記載されている。
【００６７】
「ポリヌクレオチド」、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボース-またはリボース-リン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボース-リン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、異なる型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNA（ペプチド核酸）、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5'末端、3'末端、または5'および3'両末端に末端キャップ部分を含んでいてもよい。キャップ部分は、逆方向デオキシ脱塩基部分、逆方向デオキシチミジン部分、チミジン部分、または3'グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。
【００６８】
「RNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチド」は、配列特異的様式で導入遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）転写物を分解またはその翻訳を阻害するための、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じてRNA干渉を誘導することができる分子である。2つの主なRNAiポリヌクレオチドは低分子（または短い）干渉RNA（siRNA）およびマイクロRNA（miRNA）である。RNAiポリヌクレオチドは、siRNA、マイクロRNA、二本鎖RNA（dsRNA）、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、およびRNA干渉を誘導しうるRNAをコードする発現カセットを含む群より選択されうる。siRNAは、典型的には15〜50塩基対、好ましくは21〜25塩基対を含み、細胞内で発現された標的遺伝子またはRNAにおけるコード配列と同じ（完全に相補的）またはほぼ同じ（部分的に相補的）ヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。siRNAはジヌクレオチド3'オーバーハングを有していてもよい。siRNAは2つのアニールしたポリヌクレオチドまたはヘアピン構造を形成する1つのポリヌクレオチドからなっていてもよい。本発明のsiRNA分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む。一つの態様において、結合体のsiRNAは2つのオリゴヌクレオチド断片から構築され、ここで1つの断片はsiRNA分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第二の断片はsiRNA分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、センス鎖はアンチセンス鎖に、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して接続される。マイクロRNA(miRNA）は、それらのmRNA標的の破壊または翻訳抑制を誘導する、約22ヌクレオチドの長さの小さい非コードRNA遺伝子産物である。miRNAと標的mRNAとの間の相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳が抑制される。相補性が高度である場合、標的mRNAは切断される。miRNAについて、複合体は、典型的にはmiRNAと部分的相同性しか共有しないmRNAの3'UTRに通常は位置する標的部位に結合する。「シード領域」-その標的と完全な塩基対を形成する、miRNAの5'末端における約7つの連続するヌクレオチドのひと続きの配列-は、miRNA特異性において重要な役割を果たす。RISC/miRNA複合体のmRNAへの結合は、タンパク質翻訳の抑制またはmRNAの切断および分解のいずれかを引き起こしうる。最近のデータは、シード領域でのみ完全な塩基対形成を示す代わりに、miRNAおよびその標的の全長にわたり完全な相同性がある場合に、mRNA切断が優先的に起こることを示している（Pillai et al. 2007）。
【００６９】
RNAiポリヌクレオチド発現カセットは細胞内で転写されて、siRNA、別々のセンスおよびアンチセンス鎖直鎖siRNA、またはmiRNAとして機能しうる小さいヘアピンRNAを産生することができる。RNAポリメラーゼIII転写DNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、およびtRNAプロモーターを含むリストから選択されるプロモーターを含む。RNAポリメラーゼIIプロモーターには、U1、U2、U4、およびU5プロモーター、snRNAプロモーター、マイクロRNAプロモーター、ならびにmRNAプロモーターが含まれる。
【００７０】
公知のmiRNA配列のリストは、特にWellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、およびEuropean Molecule Biology Laboratoryなどの研究組織によって維持されるデータベース中に見いだすことができる。公知の有効なsiRNA配列および同族の結合部位も関連する文献中に詳細に示されている。RNAi分子は当技術分野において公知の技術によって容易に設計され、産生される。加えて、有効かつ特異的配列モチーフを見いだす機会を高めるコンピューターツールがある（Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004）。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドは化学的に修飾することができる。そのような化学的修飾の非限定例には、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基残基組み込みが含まれる。これらの化学的修飾は、様々なポリヌクレオチド作成物において用いる場合、細胞内でポリヌクレオチド活性を保存するが、同時にこれらの化合物の血清安定性を高めることが示されている。化学的に修飾したsiRNAは、ヒトにおけるインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限にすることもできる。
【００７２】
一つの態様において、本発明の化学的に修飾したRNAiポリヌクレオチドは、2つの鎖を有する二重鎖を含み、その一方または両方は化学的に修飾されていてもよく、ここで各鎖は約19から約29ヌクレオチドである。一つの態様において、本発明のRNAiポリヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むが、細胞または再構成したインビトロ系内部でRNAiを仲介する能力を維持している。RNAiポリヌクレオチドを修飾することができ、ここで化学修飾は1つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。本発明のRNAiポリヌクレオチドは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数のパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含みうる。したがって、本発明のRNAiポリヌクレオチドは一般にはヌクレオチドの位置の約5から約100％（例えば、ヌクレオチドの位置の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）の修飾ヌクレオチドを含みうる。所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。RNAiポリヌクレオチドが一本鎖である場合、修飾パーセントは一本鎖RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。同様に、RNAiポリヌクレオチドが二本鎖である場合、修飾パーセントはセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンスおよびアンチセンス両方の鎖中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。加えて、所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの総数にも依存しうる。例えば、ここでRNAiポリヌクレオチド中に存在するすべてのピリミジンヌクレオチドおよび/またはすべてのプリンヌクレオチドが修飾される。
【００７３】
RNAiポリペプチドは遺伝子によってコードされるRNAの発現を調節する。複数の遺伝子が互いにある程度の配列相同性を共有しうるため、RNAiポリヌクレオチドは十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的とするよう設計することができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、異なる遺伝子標的の間で共有される、または特定の遺伝子標的に特有である、配列に対する相補性を有する配列を含むことができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、いくつかの遺伝子間の相同性を有するRNA配列の保存領域を標的とし、それにより遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライスバリアント、突然変異体遺伝子など）を標的とするよう設計することができる。もう一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドは、1つの遺伝子の特定のRNA配列に特有な配列を標的とするよう設計することができる。
【００７４】
「相補性」なる用語は、ポリヌクレオチドが伝統的なワトソン-クリックまたは他の非伝統的な型のいずれかによりもう一つのポリヌクレオチド配列と水素結合を形成する能力を意味する。本発明のポリヌクレオチド分子に関して、ポリヌクレオチド分子のその標的（エフェクター結合部位）または相補的配列との結合自由エネルギーは、ポリヌクレオチドの関連する機能、例えば、酵素的mRNA切断または翻訳阻害を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの判定は当技術分野において周知である（Frier et al. 1986, Turner et al. 1987）。相補性パーセントは、第二のポリヌクレオチド配列と水素結合（例えば、ワトソン-クリック塩基対形成）を形成しうる、第一のポリヌクレオチド分子の、近接鎖における塩基のパーセンテージ（例えば、10のうちの5、6、7、8、9、10は50％、60％、70％、80％、90％、および100％の相補性である）を示す。完全に相補性とは、ポリヌクレオチド配列の近接鎖中の塩基すべてが第二のポリヌクレオチド配列における同じ数の近接塩基と水素結合することを意味する。
【００７５】
遺伝子発現を阻害する、ダウンレギュレートする、またはノックダウンするとは、遺伝子から転写されたRNAのレベル、またはRNAから翻訳されたポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルにより評価しての遺伝子の発現が、本発明の阻止ポリヌクレオチド結合体非存在下で観察されるものよりも低減されることを意味する。本発明の組成物により送達されるポリヌクレオチドによる、遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーション、またはノックダウンは、好ましくは対照不活性核酸、混乱した配列もしくは不活化ミスマッチを含む核酸存在下、またはマスクしたポリマーへのポリヌクレオチドの結合非存在下で観察されるレベルよりも低い。
【００７６】
DNアーゼIIなどのエンドソーム/リソソーム局在ヌクレアーゼによる分解に対するsiRNA安定化は、標的ノックダウンを強力に改善することが見いだされた。そのような安定化は、細胞性RNAi機構がある原形質内に放出されるsiRNAの量に直接影響をおよぼしうる。原形質内で利用可能なsiRNA部分だけがRNAi効果を誘発することになる。
【００７７】
薬物動態特性が不良であるのに加えて、siRNAは、保護送達媒体なしで循環中にそのまま投与すると、生体環境におけるヌクレアーゼに感受性である。したがって、多くのsiRNAは、組織および血流中の細胞外で、または細胞内取り込み後（エンドソーム）のいずれかで速やかに分解される。ヌクレアーゼ切断は、2'-デオキシ、2'-O-メチル（2'-OMe）または2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'-F）ヌクレオチドなどの2'-OH基を欠くヌクレオチドによって、および、例えば、最初のヌクレオチド間連結におけるコレステロール、アミノアルキルリンカーまたはホスホチオアートのようなポリヌクレオチド5'-末端非ヌクレオチド部分によって阻害することができる。好ましくは、RNAiポリヌクレオチドは鎖内にいかなる2'-OHヌクレオチドも持たず、5'-末端の2'-OMeヌクレオチドで始まり、二番目のヌクレオチドにホスホロチオアート（PTO）連結によって連結される。
【００７８】
siRNAは、以下の設計を用いると有意に安定化することができ、ここでオリゴヌクレオチドは修飾パターン：5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖および修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖で提供され、式中
wは独立に5'-リン酸または5'-チオリン酸またはHであり、
Z1は独立に2'-修飾ヌクレオシドであり、
Z2は独立に2'-デオキシヌクレオシドまたは2'-フルオロ-修飾ヌクレオシドであり、
Z3は独立に2'-修飾ヌクレオシドであり、
naは8〜23であり、かつnsは8〜25である。
【００７９】
一つの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは修飾パターン：5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖および修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖で提供され、式中Z1は2'-フルオロ-修飾ヌクレオシドまたは2-デオキシ-ヌクレオシドであり、かつ残りの置換基すべて、ならびに変数naおよびnsは前述の意味を有する。
【００８０】
一つの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは修飾パターン：5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖および修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖で提供され、式中Z3は2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-フルオロ-修飾ヌクレオシドまたは2-デオキシ-ヌクレオシドであり、かつ残りの置換基すべて、ならびに変数naおよびnsは前述の意味を有する。
【００８１】
一つの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは修飾パターン：5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖および修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖で提供され、式中Z1は2'-フルオロ-修飾ヌクレオシドまたは2-デオキシ-ヌクレオシドであり、Z3は2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-フルオロ-修飾ヌクレオシドまたは2-デオキシ-ヌクレオシドであり、かつ残りの置換基すべて、ならびに変数naおよびnsは前述の意味を有する。
【００８２】
新規修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドの核酸配列におけるヌクレオシドは、5'-3'ホスホジエステルまたは5'-3'ホスホロチオアートのいずれかによって連結されうる。
【００８３】
本明細書において用いられる「アンチセンス」鎖は、標的mRNAに相補的であり、siRNAがいったん巻き戻されるとmRNAに結合することになる、siRNA鎖である。新規修飾パターンを含む該siRNAのセンス鎖は、アンチセンス鎖に相補的である。
【００８４】
原則として、RNAiポリヌクレオチドと、それが共有結合している標的指向部分または送達ポリマーとの間のヌクレアーゼ切断部位は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかで少なくとも1つの2'-OHヌクレオチドを含む3'-または5'-オーバーハングによって導入することができる。最終活性siRNA種は、細胞内ヌクレアーゼ処理によって生成される。また、塩基対領域内の2'-OHヌクレオチドによって与えられた規定の切断部位の使用も可能である。これは、反対の鎖に相補的な少なくとも1つの2'-OHヌクレオチドを用いて、または少なくとも1つのミスマッチ2'-OHヌクレオチドもしくは少なくとも1つの2'-OHヌクレオチドを含むヘアピン/バルジのいずれかの導入によって行うことができる。
【００８５】
ポリヌクレオチドの送達ポリマーへの連結
一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドを送達ポリマーに、生理的に不安定な結合またはリンカーを介して連結する。生理的に不安定なリンカーは、一定の生理的条件下にある場合に化学的変換（例えば、切断）を起こすように選択する（例えば、細胞原形質の還元環境で切断されるジスルフィド結合）。生理的に不安定な連結の切断による、ポリヌクレオチドのポリマーからの放出は、ポリヌクレオチドの適切な細胞成分との活性のための相互作用を促進する。
【００８６】
ポリヌクレオチド-ポリマー結合体は、ポリヌクレオチドのポリマーへの共有結合によって生成する。ポリマーは、それが反応性基Aを含むように重合または修飾する。ポリヌクレオチドも、それが反応性基Bを含むように重合または修飾する。反応性基AおよびBは、当技術分野において公知の方法を用いて、それらを可逆的な共有結合を介して連結しうるように選択する。
【００８７】
ポリヌクレオチドのポリマーへの結合は、過剰のポリマー存在下で実施することができる。ポリヌクレオチドおよびポリマーは結合中に反対の電荷のものでありうるため、過剰のポリマーの存在は結合体の凝集を低減または排除することができる。または、ポリカチオンなどの過剰の担体ポリマーを用いることもできる。過剰のポリマーを結合したポリマーから除去した後に、動物または細胞培養物に結合体を投与することができる。または、過剰のポリマーを動物または細胞培養物に結合体と同時投与することもできる。
【００８８】
インビボ投与
薬理学および毒性学において、投与経路は薬物、液体、毒、または他の物質を体に接触させる道である。一般に、哺乳動物を治療するための薬物および核酸の投与法は当技術分野において周知で、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の適切な経路を介して、最も好ましくは非経口により、その経路に適切に合わせて作られた製剤で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注射により、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与することができる。したがって、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。
【００８９】
投与の非経口経路には、シリンジおよび針またはカテーテルを用いる、血管内（静脈内、動脈内）、筋肉内、実質内、皮内、真皮下、皮下、腫瘍内、腹腔内、クモ膜下、硬膜下、硬膜外、およびリンパ内注射が含まれる。本明細書における血管内とは、体内の組織または臓器に接続される、血管と呼ばれる管状構造内を意味する。管状構造の腔内で、体液は体の部分に流動し、または体の部分から流動する。体液の例には、血液、脳脊髄液（CSF）、リンパ液、または胆汁が含まれる。血管の例には、動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、洞様血管、静脈、リンパ管、胆管、および唾液腺または他の外分泌腺の管が含まれる。血管内経路には、動脈または静脈などの血管を通じての送達が含まれる。血液循環系は薬剤の全身拡散を提供する。
【００９０】
記載した組成物を、薬学的に許容される担体溶液中で注射する。薬学的に許容されるとは、薬理学的/毒性学的観点から哺乳動物に対して許容される特性および/または物質を意味する。薬学的に許容されるなる語句は、生理的に耐容でき、典型的には哺乳動物に投与した場合にアレルギー性または他の有害もしくは毒性反応を生じない、分子実体、組成物、および特性を意味する。好ましくは、本明細書において用いられる薬学的に許容されるなる用語は、動物、特にヒトにおいて用いるために、連邦もしくは州政府の規制機関により承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。
【００９１】
これらの担体は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでいてもよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順、ならびに様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含の両方によって確実にしうる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが望ましいこともある。加えて、注射剤形の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質の包含によって行いうる。
【００９２】
一つの態様において、RNAiポリヌクレオチド-標的化基結合体を、本発明の送達ポリマーと同時投与する。同時投与とは、RNAiポリヌクレオチド結合体および送達ポリマーを哺乳動物に、両方が哺乳動物中に同時に存在するように投与することを意味する。RNAiポリヌクレオチド-標的化基結合体および送達ポリマーを一斉に投与してもよく、またはこれらを逐次投与してもよい。一斉投与のために、これらを投与前に混合してもよい。逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド-標的化部分結合体または送達ポリマーのいずれかをまず投与してもよい。
【００９３】
治療効果
RNAiポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的である変化を生じるために送達してもよい。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、研究試薬のため、ならびに様々な治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス適用のために有用である。発明者らは、肝実質細胞における内因性遺伝子発現の阻害をもたらすRNAiポリヌクレオチド送達を開示してきた。ポリヌクレオチドの送達後に測定したレポーター（マーカー）遺伝子発現のレベルは、他のポリヌクレオチド送達後の遺伝子発現が同様のレベルであるとの合理的な予想を示している。当業者により有益と考えられる治療のレベルは疾患ごとに異なる。例えば、血友病AおよびBはそれぞれX連鎖第VIIIおよび第IX凝固因子の欠失によって引き起こされる。これらの臨床経過は第VIIIまたは第IX因子の通常の血清レベルのパーセンテージによって大きく影響される：＜2％、重度；2〜5％、中等度；および5〜30％軽度。したがって、重度患者における循環因子の通常レベルの1％から2％への上昇は有益であると考えることができる。6％よりも高いレベルは自然出血を防止するが、手術または傷害に続発するものは防止しない。同様に、遺伝子の阻害は治療的利益を提供するために100％である必要はない。遺伝子療法の当業者であれば、マーカー遺伝子の結果の十分なレベルに基づき、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカー遺伝子が発現されて第VIII因子の通常レベルの2体積％に匹敵するレベルでタンパク質を生じる場合、第VIII因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現されるであろうと合理的に予期することができる。したがって、レポーターまたはマーカー遺伝子は一般に細胞内タンパク質の発現の有用な代表例として役立つ。
【００９４】
肝臓は、その代謝（例えば、様々な高コレステロール血症におけるリポタンパク質代謝）および循環タンパク質の分泌（例えば、血友病における凝固因子）における中心的役割を考慮すると、遺伝子療法の最も重要な標的組織の1つである。加えて、慢性肝炎および肝硬変などの後天的障害は一般的で、ポリヌクレオチドに基づく肝臓療法によって治療できる可能性もある。肝臓に影響をおよぼす、または肝臓によって影響を受けるいくつかの疾患または状態は、肝臓における遺伝子発現のノックダウン（阻害）を通じて治療できる可能性がある。そのような肝疾患および状態は、肝臓癌（肝実質細胞癌、HCCを含む）、ウイルス感染症（肝炎を含む）、代謝障害（高脂血症および糖尿病を含む）、線維症、および急性肝傷害を含むリストから選択されうる。
【００９５】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性となることなく、特定の患者、組成物、および投与の様式に対する所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変動しうる。選択する用量レベルは、用いる本発明の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、用いている特定の化合物の排出速度、治療の期間、用いる特定の組成物との組み合わせで用いる他の薬物、化合物および/または材料、治療中の患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の因子を含む、様々な薬物動態因子に依存することになる。
【００９６】
投与しようとする送達ポリマー、RNAiポリヌクレオチド-標的指向基結合体または送達ポリマー-RNAiポリヌクレオチド結合体の量（用量）は、経験的に決定することができる。発明者らは、動物体重1kgあたり0.1〜10mgのsiRNAおよび動物体重1kgあたり1.5〜60mgの送達ポリマーを用いて、遺伝子発現の有効なノックダウンを示した。マウスにおける好ましい量は0.25〜2.5mg/kgのsiRNA-結合体および10〜40 mg/kgの送達ポリマーである。より好ましくは、約1.5〜20mg/kgの送達ポリマーを投与する。RNAiポリヌクレオチド-結合体は典型的には高用量で毒性でないため、その量は容易に増やされる。
【００９７】
本明細書において用いられるインビボとは、生物内部で起こるものを意味し、より具体的には、部分的または死滅したものに対して、生きている組織全体、哺乳動物などの生きている多細胞生物（動物）の中または上で行われるプロセスを意味する。
【００９８】
本明細書において用いられる「薬学的組成物」は、本発明の結合体、薬学的担体または希釈剤、および製剤に必要な任意の他の媒質または物質を含む。
【００９９】
本明細書において用いられる「薬学的担体」は、生理的に適合性の、任意の、およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。
【実施例】
【０１００】
実施例1. プロテアーゼ（ペプチダーゼ）切断可能なマスキング剤の合成
NaHCO3水溶液中のアミノ酸のカップリングおよびシリル基脱保護を除き、すべての反応を新鮮無水溶媒を用いて無水条件で実施した。カラム精製は、明記した溶離剤を用いてシリカゲル上で行った。質量スペクトル（MS）はエレクトロスプレーイオン化を用いて得た。
【０１０１】
NAGおよびPEGの活性p-ニトロフェニル-p-アシルアミドベンジルカルボナート誘導体（NAG-L-AA-PABC-PNPおよびPEG-AA-PABC-PNP）の調製において、発明者らはそれぞれPEGまたはNAG含有誘導体のNHSエステルを用いて、ジペプチド-p-アシルアミノベンジルアルコール前駆体のアミノ末端をアシル化した。以下の段階において、ベンジルのヒドロキシル基をp-ニトロフェニルカルボナートに変換し、続いてアミノ酸およびNAG部分から保護基を除去した。いくつかの適用において、パラニトロフェノール（PNP）-カルボナートを特定のポリマーの修飾に用いた場合、ポリマー修飾の前の保護基。
0005941926.tif 000020
RはASGPrリガンド（保護または未保護）またはPEGを含み、かつ
A1およびA2はアミノ酸（保護または未保護のいずれか）である。
【０１０２】
合成はH-A1A2-PABA（表1）誘導体の調製から開始する。これらの付加物は、Dubowchikら（2002）によって記載された合成スキームをいくらかの改変と共に用いて得た。Fmoc-保護アミノ酸、Fmoc-A1-OHを、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）およびN-ヒドロキシククシンイミド（NHS）を用いての反応において、N-ヒドロキシククシンイミドエステル、Fmoc-A1-NHSに変換することにより活性化した。これらの反応性NHSエステルを保護アミノ酸A2と、アミノ基を反応性に保つために加えたNaHCO3水溶液存在下でカップリングさせた。1eおよび1f（表1）の調製では、NHSエステルの代わりに市販のペンタフルオロフェニルエステル（OPfp）をカップリングのために用いた。
【０１０３】
Fmocジペプチド1a〜hの合成
a）AAのNHSエステルをそれぞれのアミノ酸からNHSおよびDCCを用いて調製し、それ以上精製せずに用いた。
0005941926.tif 000021
条件：（i）N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、N-N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、0〜20℃。
【０１０４】
Fmoc-Ala-NHSのために、DCC（286mg、1.38mmol）をDCM（13mL）中のFmoc- Ala-OH（412mg、1.32mmol）およびNHS（160mg、1.38mmol）の氷冷溶液に加え、30分間撹拌し、次いで20℃で16時間撹拌した。固体のジシクロヘキシル尿素（DCU）をろ去し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１０５】
Fmoc-Asn(DMCP)-NHSのために、DCC（148mg、0.72mmol）をDCM（13mL）中のFmoc-Asn(DMCP)-OH（298mg、0.68mmol）およびNHS（83mg、0.72mmol）のの氷冷溶液に加え、30分間撹拌し、次いで20℃で16時間撹拌した。固体のDCUをろ去し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１０６】
Fmoc-Gly-NHSのために、Fmoc-Gly-OH（891mg、3mmol）およびNHS（380mg、3.3mmol）をTHF（10mL）中0℃で5分間撹拌し、THF（5mL）中のDCC溶液（650mg、3.15mmol）で処理した。30分で冷却浴を取り除き、反応混合物を20℃で10時間撹拌した。固体のDCUをろ去し、THFで洗浄し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。生成物を秤量し、DMEに溶解して、0.2mM溶液を作成した。
【０１０７】
Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHSのために、DCC（217mg、1.05mmol）をTHF（5mL）中のFmoc-Glu(O-2PhiPr)-OH（487mg、1mmol）およびNHS（127mg、1.1mmol）の氷冷溶液に加え、15分間撹拌し、次いで20℃で10時間撹拌した。後処理をFmoc-Gly-NHSについて記載したとおりに行った。
【０１０８】
Fmoc-Phe-NHSのために、DCC（1.181g、5.72mmol）をDCM（50mL）中のFmoc-Phe-OH（2.11g、5.45mmol）およびNHS（664mg、5.77mmol）の氷冷溶液に加え、30分間撹拌し、次いで20℃で10時間撹拌した。固体のDCUをろ去し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１０９】
Fmoc-Val-NHSのために、DCC（227mg、1.1mmol）をDCM（13mL）中のFmoc-Val-OH（339mg、1mmol）およびNHS（127mg、1.1mmol）の氷冷溶液に加え、30分間撹拌し、次いで20℃で16時間撹拌した。固体のDCUをろ去し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１１０】
b）アミノ酸、H-Asn(DMCP)-OHおよびH-Lys(MMT)-OHを、入手可能なFmoc保護誘導体から調製した。
0005941926.tif 000022
条件：（i）ジメチルホルムアミド（DMF）中のトリエチルアミン（Et3N）。
【０１１１】
H-Asn(DMCP)-OH
Fmoc-Asn(DMCP)-OH（576mg、1.32mmol）をDMF（9mL）中、Et3N（3.7mL、26.4mmol）と共に15時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより、40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。残渣をエーテル（30mL）で3回粉砕し、減圧下で乾燥した。収量271mg（96％）。MS: 643.6 [3M+1]+; 451.3 [2M+Na]+; 429.5 [2M+1]+; 236.7 [M+Na]+; 215.3 [M+l]+; 132.8 [M-DMCP+1]+。
【０１１２】
H-Lys(MMT)-OH。Fmoc-Lys(MMT)-OH（4.902g、7.65mmol）をDMF（100mL）中、Et3N（32mL、30当量、229.4mmol）と共に10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより、40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。残渣をエーテルで2回粉砕し、減圧下で乾燥した。収量3.1g（97％）。MS（ネガティブモード）: 455, 453.3 [M+Cl]-; 417.8 [M-1]-。
【０１１３】
c）Fmoc-A1A2-OHの合成
0005941926.tif 000023
A1＝Gly、Glu(2PhiPr)、Asn(DMCP)、Phe、Ala、Val。
A2＝Gly、Lys(MMT)、Cit、Asn(DMCP)、Lys(CH3)2。
条件：（i）H-A2-OH、NaHCO3、ジメトキシエタン（DME）、テトラヒドロフラン（THF）およびH2Oの混合物。（ii）H-A2-OH、NaHCO3、DME/THF/H2O。（iii）H-Cit-OH、NaHCO3、H2O中のTHF。
【０１１４】
Fmoc-GlyGly-OH 1aのために、グリシン（75mg、1mmol）およびNaHCO3（100mg、1.2mmol）をH2O（10mL）およびジメトキシエタン（DME)（5mL）に溶解した。DME中のFmoc-Gly-NHS溶液（5ml、1mmol）を加えた。THF（2.5mL）を加え、混合物を超音波処理して均質にし、20時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をEtOAcおよびH2O中5％KHCO3溶液で処理した。生成物をEtOAcで4回抽出し、pH＝3の食塩水で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、濃縮し、減圧下で乾燥した。収量321mg（90％）。MS: 775.0 [2M+2Na]+; 377.4 [M+Na]+; 355.1 [M+1]+。
【０１１５】
Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-OH 1bのために、グリシン（75mg、1mmol）およびNaHCO3（84mg、1mmol）をH2O（2mL）、THF（4mL）およびDME（5mL）の混合物に溶解した。DME中のFmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHS溶液（5mL、1mmol）を加え、10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、20mLの0.1M MES緩衝液（pH＝5）を加え、続いてEtOAc（25mL）を加えた。反応混合物を氷上で撹拌し、KHSO4の5％溶液でpH＝5まで酸性化した。生成物をEtOAcで4回抽出し、pH＝5の食塩水で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、濃縮し、減圧下で乾燥した。収量528mg（96％）。MS: 567 [M+Na]+; 562 [M+NH4]+; 545.0 [M+1]+; 427.1 [M-2PhiPr]+。
【０１１６】
Fmoc-Asn(DMCP)Gly-OH 1cをFmoc-Asn(DMCP)-NHSおよびH-Gly-OHから1bについて前述したとおりに調製した。収率96％。MS: 987.4 [2M+1]+; 516.3 [M+Na]+; 494.4 [M+1]+; 412.2 [M-DMCP+1]+。
【０１１７】
Fmoc-PheLys(MMT)-OH 1dをFmoc-Phe-NHSおよびH-Lys(MMT)-OHから1bについて前述したとおりに調製した。収率94％。MS: 788.5 [M+1]+、273.1 [M-MMT+1]+。
【０１１８】
Fmoc-PheCit-OH 1eのために：
i）DME（40mL）中のFmoc-Phe-NHS（4.96g、10.26mmol）をH2O（40mL）およびTHF（20mL）の混合物中のL-シトルリン（1.80g、10.26mmol）およびNaHCO3（0.86g、10.26mmol）を含む溶液に加えた。反応混合物を15時間撹拌した。活性化からの残存DCCをろ過し、有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。残渣にH2O（100mL）およびiPrOH（10mL）を加えた。懸濁液を5％KHSO4でpH=3まで酸性化し、生成物をEtOAc：iPrOH＝9：1溶液（3×、500mL）で抽出し、食塩水：iPrOH＝9：1の混合物（2×、50mL）で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、ろ過して濃縮し、オイルポンプで乾燥した。エーテルで粉砕して、純粋な生成物1eを得た。収量3.84g（68％）。MS: 545.6 [M+Na]+; 528.5 [M-H2O]+; 306.3 [M-Fmoc+H2O]+。
【０１１９】
ii）THF（5mL）中のFmoc-Phe-OPfp（553mg、1mmol）の溶液をH2O（2.6mL）中のH-Cit-OH（184mg、1.05mmol）およびNaHCO3（88.2mg、1.05mmol）の溶液に加えた。THF（2mL）を加えて溶液を均質にし、10時間撹拌した。THFをロータリーエバポレーターで除去し、残渣をH2O（10mL）およびiPrOH（1mL）で希釈し、3％HClでpH＝1まで酸性化した。生成物をEtOAc：iPrOH＝9：1溶液で5回抽出し、食塩水：iPrOH＝9：1の混合物で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、減圧下で濃縮した。エーテルで粉砕して、313mgの純粋な生成物1eを得た（57％）。
【０１２０】
Fmoc-AlaCit-OH 1fをFmoc-Ala-NHSおよびH-Cit-OHから1e-（a）について前述したとおりに調製した。収率77％。MS: 959.8 [2M+Na]+; 938.1 [2M+1]+; 491.4 [M+Na]+; 469.9 [M+1]+。
【０１２１】
粗製Fmoc-ValCit-OH 1gをFmoc-Val-NHSおよびH-Cit-OHから1bについて前述したとおりに調製した。最終精製をエーテルでの粉砕によって行った。全収率76％。MS: 1060.3 [2M+3Na]+; 1015.7 [2M+Na]+; 519.7 [M+Na]+; 497.9 [M+1]+。
【０１２２】
Fmoc-Ala-Asn(DMCP)-OH 1hをFmoc-Ala-NHSおよびH-Asn(DMCP)-OHから1bについて前述したとおりに調製した。収率95％。MS: 530.2 [M+Na]+; 508.2 [M+1]+; 426.0 [M-DMCP+1]+。
【０１２３】
p-アミノベンジルアルコールとのカップリング、Fmoc-AA-PABAおよびFmoc-A-PABA 2a〜mの調製
生成物1a〜hをp-アミノベンジルアルコール（PABA）と2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン（EEDQ）存在下でカップリングし、2a〜hを生成した。PABAに1つのアミノ酸だけが結合している4つの代表的化合物3j〜lも調製した。
0005941926.tif 000024
条件：（i）PABA、EEDQ、THF
【０１２４】
Fmoc-GlyGly-PABA 2aのために、DCM（17mL）およびMeOH（6mL）中の1a（318mg、0.9mmol）およびPABA（220mg、1.8mmol）の溶液をEEDQ（444mg、1.8mmol）と共に10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をEt2Oで粉砕し、生成物をろ過して、減圧下で乾燥した。収量348mg（84％）。
【０１２５】
Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-PABA 2bのために、DCM（10mL）中の1b（524mg、0.96mmol）およびPABA（142mg、1.55mmol）の溶液をEEDQ（357mg、1.44mmol）と共に10時間撹拌した。後処理を2aについて前述したとおりに行った。収量462mg（74％）。
【０１２６】
Fmoc-Asn(DMCP)Gly-PABA 2cを2aについて前述したとおりに調製した。収率64％。MS: 621.5 [M+22]+; 599.3 [M+1]+。
【０１２７】
Fmoc-PheLys(MMT)-PABA 2dを2bについて前述したとおりに調製した。収率70％。
【０１２８】
Fmoc-PheCit-PABA 2eのために、DCM（150mL）およびMeOH（50mL）中の1e（5.98g、10.97mmol）およびPABA（2.70g、21.95mmol）の溶液をEEDQ（5.43g、21.95mmol）で処理し、15時間撹拌した。後処理を2aについて前述したとおりに行った。収量6.14g（86％）。MS: 650.7 [M+1]+; 527.3 [M-PABA+1]+。
【０１２９】
Fmoc-AlaCit-PABA 2fのために、DCM（45mL）およびMeOH（15mL）中の1f（2.89g、6.17mmol）およびPABA（1.52g、12.34mmol）の溶液をEEDQ（3.05g、12.34mmol）で処理し、15時間撹拌した。後処理を2aについて前述したとおりに行った。収量4.56g（74％）。MS（ES、ネガティブモード）: 307.4 [M-263.6-1]-; 349.9 [M-Fmoc-1]-; 610, 608.4 [M+HCl-1]-。
【０１３０】
Fmoc-ValCit-PABA 2gを2bについて前述したとおりに調製した。（98％）。
【０１３１】
Fmoc-AlaAsn(DMCP)-PABA 2hを2aについて前述したとおりに調製した。収率59％。MS: 613.2 [M+1]+; 531.4 [M-DMCP+1]+; 408.2 [M-205+1]+。
【０１３２】
Fmoc-Lys(CH3)2-PABA 2iのために、Fmoc-Lys(CH3)2-OH HCl塩（433mg、1mmol）およびPABA（246mg、2mmol）をDCM（10mL）およびMeOH（1.5mL）に溶解し、5℃に冷却し、EEDQ（495mg、2mmol）を加えた。冷却浴を取り除き、混合物を室温で10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をEt2Oで粉砕し、粗生成物をろ過した。これをDCM（2mL）およびMeOH（1mL）の混合物に再度溶解し、Et2O（40mL）中に滴下することにより再度沈澱させた。生成物をろ過し、減圧下で乾燥した。収量448mg（83％）。
【０１３３】
Fmoc-Leu-PABA 2jのために、DCM（10mL）中のFmoc-Leu-OH（353mg、1mmol）、EEDQ（495mg、2mmol）およびPABA（222mg、1.8mmol）の溶液を10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をEt2O（40mL）に溶解し、ドライアイス上で2時間冷却し、固体を遠心沈降により分離した。得られた粗製材料をカラムにより、CHCl3中のMeOH（1〜2％）の溶離剤勾配で精製した。収量444mg（97％）。MS: 459.4 [M+1]+。
【０１３４】
Fmoc-Asn(DMCP)-PABA 2kを2jについて記載したとおりに調製した。DCMの除去後、カラム精製の代わりの後処理において、残渣をEt2Oで粉砕し、0℃まで冷却し、粗生成物をろ過した。この処理をもう一度繰り返し、続いて減圧下で乾燥した。収率77％。MS: 542.5 [M+1]+。
【０１３５】
Fmoc-Cit-PABA 2lのために、DCM（10mL）およびMeOH（4mL）中のFmoc-Cit-OH（345.7mg、0.87mmol）およびPABA（214mg、1.74mmol）の溶液をEEDQ（430mg、1.74mmol）で処理し、15時間撹拌した。固体生成物をエーテルで3回粉砕し、生成物をろ過して乾燥した。収量288mg（67％）。MS: 502.3 [M+1]+; 485.5 [M-H2O+1]+; 263 [M-Fmoc-H2O+1]+; 179.0 [M-306+1]+; 120.2 [M-365.3+1]+。
【０１３６】
生成物2mを異なるスキームを用いて調製した： H-Lys(CH3)2-PABA誘導体3のFmoc-Phe-NHSとのカップリング。
0005941926.tif 000025
条件：（i）DMF中、トリエチルアミン（Et3N）、10時間。（ii）Fmoc-Phe-NHS、ジソプロピルエチルアミン（DIEA）、DMF。
【０１３７】
Fmoc-PheLys(CH3)-PABA 2mのために、Fmoc-Lys(CH3)2-PABA（2i）（448mg、0.83mmol）をDMF（11mL）中、Et3N（3.5mL）と共に10時間撹拌することにより、Fmoc脱保護した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去して、粗生成物3iを得た。この生成物をDMF（7mL）に溶解し、Fmoc-Phe-NHS（482mg、0.996mmol）と、続いてDIEA（0.42mL、2.2mmol）を加え、混合物を10時間撹拌した。溶媒およびDIEAをロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去して粗製2mを得、これをそれ以上精製せずに用いた。MS: 549.4 [M+l]+。
【０１３８】
H-AA-PABA 3a〜h、mおよびH-A-PABA 3j〜lの調製
0005941926.tif 000026
条件：（i）DMF中、Et3N、10時間。
【０１３９】
Fmoc誘導体2a〜h、j〜lを3iについて前述したとおりにDMF中、Et3Nで処理し、続いて濃縮し、減圧下で乾燥した。粗生成物をDMFに溶解して0.1M溶液を作成し、それ以上精製せずに用いた。
【０１４０】
（表１）H-AA-PABA（1〜3）の中間体
0005941926.tif 000027
【０１４１】
プロテアーゼ切断可能なNAGマスキング試薬の調製
NAG(R1,R2,R3)-L-AA-PABC-PNP（表2、3）の調製
0005941926.tif 000028
R1、R2およびR3が保護基であり、Lがガラクトサミン部分（NAG）とジペプチド（AA）との間の連結である、NAG(R1,R2,R3)-L-AA-PABC-PNPの調製を、NAG-L-CO2H酸6、10a、b、13および17の調製から開始し、これらをNHSエステルに変換した後、H-AA-PABA 2をアシル化するために用いた。塩基感受性ポリマーのために設計したカルボナート21a〜fにおいて、保護基をポリマー修飾の間に除去しなければならなかった。このために、10a、b、13および17の調製において、GAL部分のAc-保護基を不安定なトリエチルシリル（TES）およびtert-ブチルジメチルシリル（TBDMS）基で置き換えた。これらの基は、塩基感受性PNP-カルボナート部分を損なうことなく、H2O中70％トリフルオロ酢酸（TFA）溶液を0℃で用いて除去することができる。
【０１４２】
a）R1＝R2＝R3＝OAcであるNAG-L1-CO2H 6の調製において、Z-保護NAG-4酢酸エステル4［3〜5］をZ-脱保護（H2、Pd/C（10％）、MeOH、CHCl3（20％）してNAG-アミン5を得、これを次いで無水コハク酸でアシル化した（無水コハク酸、Et3N、DCM、1時間）。
0005941926.tif 000029
条件：（i）H2、Pd/C（10％）、MeOH、CHCl3、(20％）、（ii）無水コハク酸、Et3N、CDM、1時間。
【０１４３】
NAG-アミン5：5の調製のために、MeOH（144mL）およびCHCl3（36mL）中のNAG 4（6.74g、11.85mmol）の溶液を10％Pd/C（674mg）存在下、1気圧で10時間水素添加した。触媒をセライトを通してろ去し、生成物を濃縮し、減圧下で乾燥した。収量5.04g（98％）。
【０１４４】
NAG-L1-OH 6：6の調製のために、DCM（30mL）中の無水コハク酸（966mg、9.65mmol）をDCM（50mL）中のNAG-アミン5（4g、9.15mmol）に加え、続いてEt3N（1.964mL、14mmol）を加えた。1時間後、反応混合物を濃縮し、減圧下で乾燥した。生成物をカラムにより、CHCl3中のMeOH（5〜7％）の溶離剤勾配で精製した。収量3.1g（63％）。MS: 535.3 [M+1]+; 330.3 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１４５】
b）容易に除去可能なシリルエーテル保護基を有するNAG誘導体を、水性メタノール中のトリエチルアミンの混合物中で4をO-脱アセチル化し、続いて塩化トリアルキルシリルで処理することにより調製した。
【０１４６】
i）NAG-L1-OH 10a、b。10a：R1＝OTESおよびOTBDMS、R2＝OH、R3＝OTES；10b：R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH
NAG 8a、bの調製
0005941926.tif 000030
条件：（i）Et3N、MeOH、H2O（5：7：6）10時間。（ii）DMF中TBDMSCl（1当量）、イミダゾール、1時間の後、TESCl（3当量）、10時間。（iii）DMF中TBDMSCl（3当量）、イミダゾール、10時間。
【０１４７】
NAG誘導体7
10a、bの調製
0005941926.tif 000031
条件：（i）H2、Pd/C（10％）、THF。（ii）無水コハク酸、Et3N、DCM、1時間。
7の調製のために、NAG 4（2g、3.52mmol）をMeOH（10mL）、H2O（32mL）、およびEt3N（25mL）の溶液中で10時間撹拌することによりO-脱アセチル化した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃で除去し、残渣を反応混合物からトルエンの蒸発を2回行って乾燥した。生成物7を次の段階で直接用いた。MS: 544.3 [M+Et3N+1]+; 443.7 [M+1]+; 204 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１４８】
8aの調製のために、DMF（15mL）中の生成物7（1.76mmol）をイミダゾール（718mg、10.54mmol）およびTBDMSCl（265mg、1.76mmol）で処理し、2時間撹拌し、反応混合物を0℃まで冷却した。TESCl（531mg、3.52mmol）を加え、10時間撹拌し、濃縮し、減圧下で乾燥した。残渣をEtOAc（110mL）およびH2O（30mL）の混合物に溶解した。有機層を分離し、5℃まで冷却し、クエン酸（5％）、H2O、NaHCO3で洗浄し、乾燥（Na2SO4）した。粗生成物を、CHCl3中MeOH 2％の溶離剤でカラムを通過させ、TBDMSおよびTESジSi-保護NAG誘導体8aの混合物を得た。収量575mg（49％）。MS: 672.0 [M+1]+; 432.5 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１４９】
8bの調製のために、DMF（15mL）中の7（1.76mmol）の溶液をイミダゾール（718mg、10.56mmol）およびTBDMSCl（1.061g、7mmol）と共に10時間撹拌した。反応混合物を8aの調製について前述したとおりに処理した。カラム精製後の収量767mg（65％）。M: 672.0 [M+1]+; 432.7 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１５０】
生成物10aを、以下の10bについて記載する手順に従って、TBDMSおよびTESジSi-保護NAG誘導体の混合物として調製した。
【０１５１】
10bの調製のために、化合物8b（920mg、1.37mmol）をTHF（20mL）中、Pc/C 10％（150mg）存在下、1気圧で10時間水素添加した。触媒をセライトを通してろ去し、生成物9bを濃縮し、減圧下で乾燥した。
【０１５２】
NAG-アミン9bをそれ以上精製せずDCM（12mL）に溶解し、DCM（7mL）中の無水コハク酸溶液（140mg、1.40mmol）と、続いてEt3N（0.236mL、1.676mmol）を加え、2時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、生成物をカラムにより、CHCl3中の1％AcOH、10％MeOHの溶離剤で精製した。収量614mg（72％）。
【０１５３】
ii）NAG-L2-OH 13。R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH。より長いPEGスペーサーを有するNAG誘導体。より長いPEGスペーサーを有する類縁体のために、前駆体5をまずアセチル脱保護して11を得た（Et3N、MeOH、H2O（5：7：6）10時間）。次いで、11をビス-dPEG5半ベンジル半NHSエステル（Quanta productカタログ番号10237）でアシル化してベンジルエステル12を得た（NHS-PEG5-CO2Bn、Et3N、DCM）。12を続いてTBDMSClでビス-シリル化し（DMF中TBDMSCl（3当量）、イミダゾール、10時間）、水素添加により脱ベンジル化し（H2、Pd/C（10％）、THF）、酸13を得た。
【０１５４】
NAG-誘導体12の調製
0005941926.tif 000032
条件：（i）Et3N、MeOH、H2O（5：7：6）10時間。（ii）NHS-PEG5-CO2Bn、Et3N、DCM。
【０１５５】
NAG-L2-OH 13の調製
0005941926.tif 000033
条件：DMF中TBDMSCl（3当量）、イミダゾール、10時間。（vi）H2、Pd/C（10％）、THF。
【０１５６】
NAG-PFG8-SAベンジルエステル12。NAG-アミン11の調製のために、NAG-アミン5（0.381mmol）を前駆体7について記載したとおりに（8a、bのための手順）O-脱アセチル化した。生成物11をロータリーエバポレーターでトルエンを2回蒸発させることにより乾燥し、DMF（25mL）に溶解した。反応混合物にビス-dPEG5半ベンジル半NHSエステル（200mg、0.381mmol）と、続いてDIEA（0.079mL、0.457mmol）を加え、8時間撹拌し、ロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で濃縮した。粗生成物12をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: 719.4 [M+1]+; 516.4 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１５７】
NAG-L2-OBnの調製のために、乾燥生成物12をDMF（5mL）に溶解し、TBDMSCl（230mg、1.524mmol）と、続いてイミダゾール（156mg、2.29mmol）で処理した。反応混合物を10時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去し、残渣をEtOAc（85mL）に溶解し、HCl（1％）、H2Oで洗浄した。水相を合わせ、EtOAcで逆抽出した。合わせた有機溶液を乾燥（Na2SO4）し、濃縮し、カラムにより、CHCl3中のMeOH（3〜6％）の溶離剤勾配で精製した。ベンジルエステルの収量291mg（80％）。MS: 965.3 [M+NH4]+;948.0 [M+1]+; 516.4 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１５８】
NAG-L2-OH 13の調製のために、エステルNAG-L2-OBnを9bについて記載したとおりに（10bのための手順）水素添加した。収率98％、MS: 858.0 [M+1]+; 426.1 [脱グリコシル化生成物]+。生成物をそれ以上精製せずに用いた。
【０１５９】
iii）NAG-L3-OH 17。R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH。より長いPEGスペーサーを有するNAG誘導体。
17を、ペンタ酢酸エステル14［3〜5］をPEG4モノ-tBuエステルでグリコシル化して（TMSOTf、DCE/HO-PEG4-CO2tBu、SnCl4、DCM）15を得ることにより調製した。15を加水分解して（HCO2H、10時間）酸16を得、次いでこれをO-脱アセチル化し（Et3N、MeOH、H2O（5：7：6）10時間）、TBDMSClで処理して（DMF中TBDMSCl（3当量）、イミダゾール、10時間）ビス-シリル化NAG-酸17を得た。
【０１６０】
エステルNAG(OAc)3-L3-O-tBu 15の調製
0005941926.tif 000034
条件：（i）トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（TMSOTf）、ジクロロエタン（DCE）（ii）12-ヒドロキシ-4,7,10-トリオキサドデカン酸t-ブチル（HO-PEG4-CO2tBu）、SnCl4、ジクロロメタン（DCM）。
【０１６１】
0005941926.tif 000035
条件：（i）HCO2H、10時間。（ii）Et3N、MeOH、H2O（5：7：6）10時間。（iii）DMF中TBDMSCl（3当量）、イミダゾール、10時間。
【０１６２】
エステルNAG(OAc)3-L3-O-tBu 15のために、ガラクトサミンのペンタアセチル誘導体14（10g、25.64mmol）をトルエンから2回蒸発させて乾燥した。得られた白色ガラスをDCE（223mL）中のTMSTf（5.18mL、28.6mmol）で処理し、60℃で16時間撹拌した。反応混合物を0℃に冷却し、TEA（2.6mL）で反応停止し、CHCl3（300mL）で希釈し、NaHCO3溶液および食塩水で2回洗浄した。分離した有機溶液をMgSO4で処理し、濃縮し、減圧下で乾燥した。粗製オキサゾリン誘導体をそれ以上精製せずに用いた。収量8.14g（96％）。MS: 368.1 [M+K]+; 352.2 [M+Na]+; 330.2 [M+1]+。
【０１６３】
DCM（270mL）中のオキサゾリン誘導体（5.28g、16mmol）、12-ヒドロキシ-4,7,10-トリオキサドデカン酸t-ブチル（5.12g、18.4mmol）およびCaSO4（20g）の混合物を撹拌しながら、これにSnCl4（0.84mL、0.84mmol）を滴加した。溶液を16時間撹拌し、ろ過し、CHCl3（250mL）で希釈し、NaHCO3溶液および食塩水で2回洗浄した。生成物をMgSO4で乾燥して、濃縮した。粗生成物をカラムにより、酢酸エチル中のMeOH（0〜7％）の溶離剤勾配で精製した。収量4.83g（50％）。MS: 630.8 [M+Na]+; 625.5 [M+NH4]+; 608.4 [M+1]+; 552.6 [M-t-Bu+1]+; 330.2 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１６４】
NAG(OAc)3-L3-OH 16のために、tert-ブチルエステル15（1.99g、3.27mmol）をニートのギ酸（54mL）中で16時間撹拌し、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、続いてトルエンを3回蒸発させた。生成物を減圧オイルポンプで2時間乾燥し、それ以上精製せずに用いた。収量1.77g（98％）。MS: 330.2 [脱グリコシル化生成物]+; 590.4 [M+K]+; 574.6 [M+Na]+; 569.6 [M+NH4]+; 552.6 [M+1]+。
【０１６５】
NAG(R1,R2,R3)-L3-OH 17（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH）のために、生成物16をO-脱アセチル化し、8bの調製におけるとおりにTBDMSClで処理し、カラムにより、CHCl3中の3％MeOH、0.5％AcOHの溶離剤で精製した。収率18％。MS: 1228.7 [M+1]+、796.7 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１６６】
5つの得られた酸6、10a、b、13、17をすべて、NHSおよびDCCによる反応においてNHSエステル18a〜eに変換した（NHS、DCC、DCM、10時間）。
0005941926.tif 000036
条件：（i）NHS、DCC、DXCM、10時間。
【０１６７】
NAG-L-NHS 18a〜eの調製のために、以下の18cについて記載した手順を用いた。生成物18cのために、DCM（15mL）中の10b（614mg、0.964mmol）およびNHS（122mg、1.061mmol）の氷冷溶液をDCC（219mg、1.061mmol）で処理し、氷上で30分間と20℃で8時間撹拌した。反応混合物を0℃に冷却し、DCUをろ去し、残渣を濃縮し、減圧下で乾燥した。粗生成物をDMFに溶解して0.05M溶液を作成し、それ以上精製せずに用いた。
【０１６８】
生成物18b〜eを18aについて記載したとおりに調製した。
【０１６９】
c）20a〜lの生成、3a〜hをヒドロキシル保護NAG誘導体18a〜eのNHSエステルでアシル化し（DIEA、DMF、5〜10時間）、19a〜lを得た。次いで、生成物19a〜lを5当量のビス(p-ニトロフェニル)カルボナート（(PNP)2CO）で処理し（(PNP)2CO、ジオキサンまたはDCM、40〜50℃、15〜24時間）、O-アセチル保護PNPカルボナート誘導体20a〜lを得た。生成物20a〜eをペプチドの修飾のために直接用いた。アセチル基およびアミノ酸から保護基2PhiPr、DMCP、MMTは、修飾後、DPCのTFAおよびEt3Nによる連続処理中に除去した。
0005941926.tif 000037
条件：（i）DIEA、DMF、5〜10時間。（ii）（PNP)2CO、ジオキサンまたはDCM、25〜60℃、16〜48時間。
【０１７０】
NAG(R1R2R3)-L-AA-PABA 19a〜l
生成物19a（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA＝GlyGly）のために、DMF中のNAG-NHSエステル18a溶液（0.05M）（0.282mmol）をDMF中の3aの0.1M溶液（0.282mmol）およびDIEA（59μL、0.338mmol）で処理した。3時間で、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去し、Et2Oで粉砕し、カラムにより、溶離剤：EtOAc：CHCl3：MeOH＝8：7：5〜8：7：6の勾配で精製した。収量114mg（53％）。MS: 754.4 [M+1]+。
【０１７１】
生成物19b（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA＝Glu(2PhiPr)Gly）を19aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤EtOAc：CHCl3：MeOH＝8：7：3で精製した。収率64％。MS: 944.5 [M+1]+。
【０１７２】
生成物19c（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA＝Asn(DMCP)Gly）のために、DMF（2.15mL）中の3c（0.43mmol）およびDIEA（83μL、0.476mmol）の溶液に、DMF（2.15mL）中の18a（0.43mmol）の溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。粗生成物をEt2Oで粉砕し、カラムにより、溶離剤CHCl3：アセトン：MeOH（5：5：1）で精製した。収量242mg（62％）。MS: 915.3 [M+Na]+; 910.6 [M+NH4]+; 893.6 [M+1]+。
【０１７３】
生成物19d（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA＝PheLys(MMT)）を19aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、CHCl3中のMeOH（5〜6％）の溶離剤勾配で精製した。収率56％。MS: 1187.9 [M+1]+。
【０１７４】
生成物19e（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA＝PheCit）のために、DMF（3mL）中の3e（0.57mmol）およびDIEA（119μL、0.684mmol）の溶液にDMF（3mL）中の18a（0.57mmol）の溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。粗生成物をCHCl3：MeOH（5mL）からEt2O（45mL）中に沈澱させ、それ以上精製せずに用いた。収量392mg（73％）。MS: 966.8 [M+Na]+; 944.7 [M+1]+; 926.8 [M-H2O]+; 821.5 [M-PABA+1]+; 615.6 [M-NAcGal+1]+; 492.3 [M-PABA-NAcGal+1]+。
【０１７５】
生成物19f（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L1、AA＝AlaCit）を19eについて記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに用いた。収率50％。MS: 993.2 [M+Na]+; 971.0 [M+1]+; 539.6 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１７６】
生成物19g（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L1、AA＝ValCit）を19fについて記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに次の段階で用いた。収率67％：998.9 [M+1]+。
【０１７７】
生成物19h（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L1、AA＝Glu(2PhiPr)Gly）を19aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、DCM中のNH4OH 3％およびMeOH 7.5％溶液の溶離剤で精製した。収率15％。MS: 1047.2 [M+1]+、615.7、432.6 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１７８】
生成物19i（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L1、AA＝PheCit）を19eの調製について記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに用いた。収率50％。MS: 1068.7 [M+Na]+; 1047.3 [M+1]+; 615.4 [脱グリコシル化生成物]+; 432.5 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１７９】
生成物19j（R1＝OTBDMSおよびOTES、R2＝OH、R3＝OTES、L＝L1、AA＝PheCit）を、C-3およびC-6 O-TBDMSおよびO-TES保護NAG誘導体の混合物としての3eおよび18bから、19eの調製について記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに次の段階で用いた。収率76％。MS: 1047.4 [M+1]+、615.8 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１８０】
生成物19k R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L2、AA＝PheCitを19eについて記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに次の段階で用いた。収率67％：1268.2 [M+1]+; 835.9 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１８１】
生成物19l R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L3、AA＝PheCitを19eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、CHCl3中の5％ MeOH溶液の溶離剤で精製した。収率60％。MS: 1064.0 [M+1]+; 632.7 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１８２】
NAG-AA-PABC-PNP 20a〜l
生成物20a（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA＝GlyGly）のために、ジオキサン（5mL）中の19a（100mg、0.132mmol）、(PNP)2CO（202mg、0.663mmol）およびDIEA（0.07mL、0.396mmol）の懸濁液を暗所、40℃で8時間撹拌した。さらに(PNP)2CO（121mg、0.397mmol）およびDIEA（0.04mL、0.226mmol）を加え、撹拌を40℃でさらに8時間続けた。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤：CHCl3：EtOAc：MeOH＝7：8：3で精製した。収量84mg（69％）。
【０１８３】
生成物20b（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA＝Glu(2PhiPr)Gly）のために、DCM（10mL）中の19b（160mg、0.169mmol）、(PNP)2CO（258mg、0.847mmol）およびDIEA（0.09mL、0.507mmol）の溶液を暗所で10時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、生成物をカラムにより、溶離剤：CHCl3中5〜6％MeOH溶液で精製した。収量174mg（92％）。
【０１８４】
生成物20c（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA＝Asn(DMCP)Gly）のために、DCM（5mL）中の19c（127mg、0.142mmol）、(PNP)2CO（216mg、0.710mmol）およびDIEA（74μL、0.426mmol）の溶液を暗所で16時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、生成物をカラムにより、溶離剤：CHCl3：EtOAc：MeOH（7：2.2：0.8）で精製した。収量110.6mg（74％）。MS: 1080.9 [M+Na]+; 1058.7 [M+1]+。
【０１８５】
生成物20d（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA-PheLys(MMT)）を20bについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤：CHCl3：EtOAc：MeOH＝9：7：1で精製した。収量76mg（47％）。
【０１８６】
生成物20e（R1＝R2＝R3＝OAc、L＝L1、AA＝PheCit）のために、ジオキサン（17mL）中の19e（164mg、0.173mmol）、(PNP)2CO（528mg、1.73mmol）およびDIEA（182μL、1.04mmol）の溶液を暗所、60℃で16時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去した。残留するDIEAを、DMFをロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で2回連続して蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH（8：1.5：0.5）と、続いてCHCl3：MeOH（7：1）で精製した。収量85mg（44％）。MS: 1132.0 [M+Na]+; 1110.1 [M+1]+; 780.8 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１８７】
生成物20f（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L1、AA＝AlaCit）を20eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤：CHCl3：EtOAc：MeOH＝9：10：1で精製した。収量153mg（36％）。
【０１８８】
生成物20g（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L1、AA＝ValCit）を20eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH＝16：3：1で精製した。収率44％。MS: 1164.5 [M+1]+。
【０１８９】
生成物20h（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L1、AA＝Glu(2PhiPr)Gly）を20bについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH＝8：7：1で精製した。収率77％。
【０１９０】
生成物20i（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L1、AA＝PheCit）のために、ジオキサン（7mL）中の19i（316mg、0.297mmol）、(PNP)2CO（913mg、2.97mmol）およびDIEA（310μL、1.78mmol）の溶液を暗所、65℃で40時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去した。残留するDIEAを、DMFをロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で2回連続して蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH（8：1.5：0.5）と、続いてCHCl3：MeOH（92：08）で精製した。収量297mg（81％）。MS: 1246.7 [M+NH4]+; 1228.7 [M+1]+; 797.6 [脱グリコシル化生成物]+; 432.7 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１９１】
生成物20j（R1＝OTBDMSおよびOTES、R2＝OH、R3＝OTES、L＝L1、AA＝PheCit）、C-3およびC-6 O-TBDMSおよびO-TES保護NAG誘導体の混合物としての生成物20jを20eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH＝16：3：1と、続いてCHCl3中10％MeOHで精製した。収率50％。MS: 1212.0 [M+1]+、480.0 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１９２】
生成物20k（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L2、AA＝PheCit）を20eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、CHCl3中のMeOH（8〜10％）の溶離剤勾配で精製した。収率85％。生成物を次の段階で直接用いた。
【０１９３】
生成物20l（R1＝R3＝OTBDMS、R2＝OH、L＝L3、AA＝PheCit）のために、ジオキサン（8mL）中の19l（316mg、297mmol）、(PNP)2CO（912mg、3mmol）およびDIEA（0.31mL、1.78mmol）の溶液を暗所、60℃のAr雰囲気下で48時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤：CHCl3：EtOAc：MeOH＝16：3：1で精製した。収量297mg（81％）。
【０１９４】
NAG-L-AA-PABC-PNP 21a〜f（R1＝R2＝R3＝OH）、20f〜lの脱保護
21a〜fの生成。塩基感受性ポリアクリラートの修飾のために、NAGおよびジペプチドAA上の保護基を除去した後、20f〜lをTFA：H2O＝3：1の混合物で処理することによりポリマーに結合し（TFA/H2O＝3：1、5℃、2〜3時間）、NAG-ジペプチドマスキング試薬21a〜fを提供した。
0005941926.tif 000038
条件：TFA/H2O＝3：1、5℃、2〜3時間
【０１９５】
生成物21a（AA＝AlaCit、L＝L1）のために、化合物20f（150mg、0.132mmol）を氷冷TFA：H2O＝3：1溶液（2mL）中で4時間撹拌し、撹拌中のEt2O（20mL）中に滴加した。沈澱を分離し、トルエンをロータリーエバポレーター/30℃で蒸発させて乾燥し、次いで減圧下で乾燥した。収量112mg（94％）。MS: 907.2 [M+1]+; 704.4 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１９６】
生成物21b（AA＝ValCit、L＝L1）のために、化合物20g（305mg、0.26mmol）を氷冷TFA：H2O＝3：1溶液（5mL）中で1時間撹拌し、撹拌中のEt2O（45mL）中に滴加した。固体生成物を分離し、トルエンをロータリーエバポレーター/30℃で蒸発させて乾燥し、次いで減圧下で乾燥した。収量193mg（79％）。MS: 935.8[M+1]+、732.7 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１９７】
生成物21c（AA＝GluGly、L＝L1）を21bについて記載したとおりに調製した。収量55mg（98％）。MS: 865.5 [M+1]+、662.3 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１９８】
生成物21d（AA＝PheCit、L＝L1）を21bについて記載したとおりに調製した。MS: 983.7 [M+1]+、780.9 [脱グリコシル化生成物]+。
【０１９９】
生成物21e（AA＝PheCit、L＝L2）のために、化合物20kを21bについて記載した条件下、氷冷TFA：H2O＝3：1溶液（5mL）中で1.5時間撹拌した。19kからの収率25％。MS: 1203.9 [M+1]+、1001.0 [脱グリコシル化生成物]+。
【０２００】
生成物21f（AA＝PheCit、L＝L3）を20lから、21bについて記載した条件下、3時間の脱保護を用いて調製した。収率75％。MS: 1203.9 [M+1]+、1001.0 [脱グリコシル化生成物]+。
【０２０１】
（表２）中間体NAG-L-AA-PABA（19）およびNAG-L-AA_PABC（20）
0005941926.tif 000039
【０２０２】
（表３）DPC調製のために用いた最終NAG-L-A1A2-PABC（20、21）
0005941926.tif 000040
【０２０３】
プロテアーゼ切断可能なPEGマスキング試薬の調製
任意のH-AA-PABA 3b、e、g、h、j、k〜mのアミノ基をPEG-酸のNHSエステルでアシル化し（DIEA、DMF、5〜10時間）、22a〜kを得た。次いで、生成物22a〜kのヒドロキシル基をp-ニトロフェニルカルボナートに変換し（(PNP)2CO、ジオキサンまたはTHF、40〜60℃、10時間）、23a〜kを得た。23a、d、gのために、AsnおよびGluから保護基を水性TFA処理によって除去し（TFA/H2O＝3：1、5℃、2〜3時間）、所望の生成物24a〜cを得た。（23a、d、gを24a、d、gに変換することにより一貫性を保持することができるか？）また、NAG版とPEG版との間の各文字についてアミノ酸の間に一貫性はあるか？
【０２０４】
PEGn-AA-PABA 22a〜kの調製
0005941926.tif 000041
条件：（i）DIEA、DMF、5〜10時間。
【０２０５】
生成物22a（n＝11、AA＝GluGly）。DMF中の3bの0.1M溶液（3.5mL、0.35mmol）をPEG11-NHSエステル（240mg、0.35mmol）およびDIEA（0.061mL、0.35mmol）と共に10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤：CHCl3：MeOH：AcOH＝38：2：1で精製した。収量274mg（78％）MS: 1015.6 [M+NH4]+、998.7 [M+1]+。
【０２０６】
生成物22b（n＝11、AA＝PheCit）。DMF（3mL）中の3e（0.88mmol）およびDIEA（167μL、0.96mmol）の溶液に、DMF（3mL）中のPEG11-NHSエステル（0.80mmol）の溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。粗生成物をCHCl3：MeOH（5mL）からEt2O（45mL）中に沈澱させ、カラムにより、CHCl3中のMeOH（10〜16％）の溶離剤勾配で精製した。収量420mg（53％）。MS: 1015.9 [M+H2O]+; 998.8 [M+1]+;981.1 [M-H2O]+。
【０２０７】
生成物22c（n＝11、AA＝ValCit）。生成物22fを、22aについて記載したとおりに、粗製3g（300mg、0.5mmolの2gから得た）、PEG11-NHSエステル（298mg、0.435mmol）およびDIEA（0.09mL、0.522mmol）から調製した。ロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプで濃縮した後、生成物をMeOH：DCM＝1：1混合物（6mL）に懸濁し、超音波処理し、ろ過し、Et2O（50mL）中に沈澱させた。固体を分離し、この手順を再度繰り返した。残留する溶媒を減圧下で除去した。収量283mg（60％）。MS: 951.5 [M+1]+。
【０２０８】
生成物22d（n＝11、AA＝AlaAsn(DMCP)）。DMF（3mL）中の3h（0.56mmol）およびDIEA（116μL、0.67mmol）の溶液に、DMF（3mL）中のPEG11-NHSエステル（0.56mmol）の溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。残渣をCHCl3：MeOH＝1：1混合物（5mL）に溶解し、冷却した（0℃）Et2O（45mL）中に沈澱させた。固体をカラムにより、DCM中のMeOH（3〜14％）の溶離剤勾配で精製した。収量261mg（49％）。MS: 983.7 [M+Na]+; 979.1 [M+NH4]+; 961.8 [M+1]+; 943.9 [M-H2O+1]+。
【０２０９】
生成物22e（n＝11、AA＝PheLys(Me2)）。生成物22eを22aについて記載したとおりに調製した。精製をHPLCカラムNucleodur C-18、250×4.6、溶離剤ACN-H2O（0.1％TFA）、勾配15〜30％を用いて行った。MS: 998.1 [M+1]+。単離した生成物をDowex 1×8樹脂により、溶離剤H2Oで脱塩した。収率40％。
【０２１０】
生成物22f（n＝11、AA＝Leu）。生成物22fを22aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤：CHCl3：EtOAc：MeOH：AcOH＝9：7：2：0.04で精製した。収率48％。MS: 824.9 [M+NH4]+。
【０２１１】
生成物22g（n＝11、AA＝Asn(DMCP）。粗製3k（419mg、0.77mmolの2kから得た）、Peg11NHSエステル（200mg、0.292mmol）およびDIEA（0.06mL、0.35mmol）をDCM（5mL）中で10時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH：AcOH＝4.5：3.5：1：0.02で精製した。収量254mg（37％）。MS: 891.1 [M+1]+。
【０２１２】
生成物22h（n＝11 AA＝Cit）。DMF（2.5mL）中の3l（0.50mmol）およびDIEA（104μL、0.60mmol）の溶液に、DMF（2.5mL）中のPEG11-NHSエステル（0.50mmol）の溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。残渣をCHCl3：MeOH＝1：1混合物（5mL）に溶解し、Et2O（45mL）中に沈澱させた。沈澱をさらに2回繰り返し、生成物をそれ以上精製せずに用いた。収量340mg（80％）。MS: 869.4 [M+NH4]+; 851.9 [M+1］+。
【０２１３】
生成物22i（n＝23、AA＝PheCit）。DMF（3mL）中の3e（0.72mmol）およびDIEA（130μL、0.74mmol）の溶液に、DMF（3mL）中のPEG23-NHSエステル（0.60mmol）の溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。残渣をCHCl3：MeOH＝1：1混合物（5mL）に溶解し、Et2O（45mL）中に沈澱させた。固体をカラムにより、CHCl3中のMeOH（7〜12％）の溶離剤勾配で精製した。収量487mg（53％）。MS: 1555.2 [M+Na]+; 1544.7 [M+NH4]+;1527.7 [M+1]+。
【０２１４】
生成物22j（平均MW 1000のPEG。AA＝PheCit）。mPEG-1000-アルコール（Fluka）（0.173g、0.173mmol）、N,N-ジスクシンイミジルカルボナート（62mg、0.242mmol）、およびTEA（0.101mL、0.726mmol）の混合物をMeCN（1mL）中で16時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、粗製残渣をCHCl3（10mL）に溶解した。有機層をH2O（1mL、pH＝5）と、次いで食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮して、PEG-1000-NHSカルボナートを得た。この生成物をDMF（1mL）中の3e（0.121mmol）およびDIEA（30μL、0.173mmol）と共に16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。残渣をCHCl3：MeOH＝1：1混合物（5mL）に溶解し、Et2O（45mL）中に沈澱させた。沈澱をさらに2回繰り返し、生成物をそれ以上精製せずに用いた。収量134mg（79％）。
【０２１５】
生成物22k（n＝23、AA＝ValCit）。DMF（4mL）中の3g（1.0mmol）およびDIEA（183μL、1.04mmol）の溶液に、DMF（4mL）中のPEG23-NHSエステル（0.87mmol）の溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で除去した。残渣をCHCl3：MeOH＝1：1混合物（5mL）に溶解し、Et2O（45mL）中に沈澱させた。沈澱をさらに2回繰り返し、生成物をそれ以上精製せずに用いた。収量1.0g（77％）。MS: 1496.1 [M+NH4]+; 1479.3 [M+1]+。
【０２１６】
PEG-AA-PABC-PNP 23a〜k
0005941926.tif 000042
条件：（i）（PNP)2CO、ジオキサンまたはTHF、40〜60℃、10時間。
【０２１７】
生成物23a（n＝11、AA＝Glu(2PhiPr)Gly）のために、DCM（15mL）中の生成物22a（274mg、0.274mmol）を暗所で(PNP)2CO（418mg、1.372mmol）およびDIEA（0.143mL、0.823mmol）と共に15時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、生成物をカラムにより、CHCl3中の4％MeOH、0.2％AcOHの溶離剤で精製した。収量260mg（81％）。MS: 1180.7 [M+NH4]+。
【０２１８】
生成物23b（n＝11、AA＝PheCit）のために、ジオキサン（4mL）中の22b（419mg、0.42 mmol)、(PNP)2CO（766mg、2.52mmol）およびDIEA（263μL、1.52mmol）の溶液を暗所、50℃で15時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去した。残留DIEAを、DMFをロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で連続2回蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH（4.5：5：0.5）と、続いてCHCl3：MeOH（9：1）で精製した。収量390mg（80％）。MS: 1181.2 [M+NH4]+、1164.2 [M+1]+。
【０２１９】
生成物23c（n＝11、AA＝ValCit）のために、1,4-ジオキサン（22mL）中の22c（273mg、0.287mmol）、(PNP)2CO（874mg、2.88mmol）およびDIEA（0.3mL、1.72mmol）の溶液を暗所、50℃で24時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH＝16：3：1と、続いてCHCl3中12〜15％のMeOHで精製した。収量163mg（51％）。MS: 1116.0 [M+1]+。
【０２２０】
生成物23d（n＝11、AA＝AlaAsn(DMCP)）を、23bの調製において記載したとおりに調製した。生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH（9：2：1）で精製した。収率77％。MS: 1144.0 [M+NH4]+; 1127.3 [M+1]+。
【０２２１】
生成物23e（n＝11、AA＝PheLys(Me)2）を、23aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤：CHCl3中の10％MeOH、0.2％AcOHで精製した。収率63％。MS: 1163.1 [M+1]+。
【０２２２】
生成物23f（n＝11、AA＝Leu）を、5当量の(PNP)2COおよび3当量のDIEAだけを用い、熱を24時間適用して、23cについて記載したとおりに調製した。生成物をカラムにより、CHCl3中MeOH（7〜12％）の溶離剤勾配で精製した。収率75％。MS: 972 [M+1]+。
【０２２３】
生成物23g（n＝11、AA＝Asn(DMCP)）を、23fについて記載したとおりに調製し、粗生成物をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: 1073.4 [M+18]+。
【０２２４】
生成物23h（n＝11、AA＝Cit）のために、DCM（4mL）中の22h（340mg、0.40mmol）、(PNP)2CO（608mg、2.00mmol）およびDIEA（208μL、1.20mmol）の溶液を暗所、30℃で15時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去した。残留DIEAを、DMFをロータリーエバポレーターにより40℃/オイルポンプ減圧下で連続2回蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH（7：2.5：0.5）と、続いてCHCl3中のMeOH（8〜14％）の勾配で精製した。収量390mg（80％）。MS: 1034.3 [M+NH4]+; 1016.9 [M+1］+。
【０２２５】
生成物23i（n＝23、AA＝PheCit）を、23bの調製において記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH（4.5：5：0.5）と、続いてCHCl3中のMeOH（6〜12％）の勾配で精製した。収率86％。MS: 1711.4 [M+NH4]+; 1694.4 [M+1]+。
【０２２６】
生成物23j（PEG 1000K AA＝PheCit）を、23bの調製において記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH（4.5：5：0.5）と、続いてCHCl3中のMeOH（6〜12％）の勾配で精製した。収率72％。
【０２２７】
生成物23k（n＝23、AA＝ValCit）を、23bの調製において記載したとおりに調製し、生成物をHPLCで精製した。カラム：Luna（Phenomenex）5u、C-8、100 A。移動相：ACN-H2O（F3CO2H 0.01％）、ACN勾配30〜37％、31分。収量：530mg（48％）。MS: 1666.4 [M+Na]+; 1644.2 [M+1]+。
【０２２８】
PEG-AA-PABC-PNP 24a〜c、AA脱保護
0005941926.tif 000043
条件：（i）TFA/H2O＝3：1、5℃、2〜3時間。
【０２２９】
生成物24a（n＝11、AA＝GluGly）。生成物23a（250mg、0.215mmol）をCHCl3の3％TFA溶液（16mL）中で35分間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、減圧下で乾燥した。収量224mg（100％）（MS: 1062.6 [M+NH4]+; 1045.9 [M+1]+。
【０２３０】
生成物24b（n＝11、AA＝AlaAsn-PABC-PNP）。化合物23dをTFA：DCM（3：1）の混合物中で1.5時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより20℃で除去した。生成物をカラムにより、CHCl3中のMeOH（6〜12％）の溶離剤勾配で精製した。収率30％。MS: 1066.7 [M+Na]+、1062.0 [M+NH4]+; 1045.2 [M+1]+。
【０２３１】
生成物24c（n＝11、AA＝Asn）。23g（160mg、0.143mmol）を含む反応フラスコを0℃まで冷却し、TFA：H2O（9：1）の冷混合物（12.5mL）を加えた。混合物を1.5時間撹拌し、冷H2O（50mL）で希釈した。撹拌を20℃で20分間続けた。沈澱をろ過し、H2Oで洗浄した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40℃で除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3：EtOAc：MeOH：AcOH＝4.5：3.5：1.2：0.02で精製した。収量43mg（30％）。MS: 974.0 [M+1]+。
【０２３２】
（表４）DPC調製のために用いた最終PEG-L-A1A2-PABC
0005941926.tif 000044
【０２３３】
実施例2. プロテアーゼ切断可能なマスキング剤のアミン含有ポリマーへの連結−p-アシルアミドベンジルカルバマート連結の生成
A. メリチンのプロテアーゼ切断可能なマスキング剤による修飾。1×mgのメリチンペプチドおよび10×mgのHEPES塩基を1〜10mg/mLペプチドで、2〜6×mgのNAG含有プロテアーゼ切断可能基質のアミン反応性p-ニトロフェニルカルボナートまたはN-ヒドロキシスクシンイミドカルボナート誘導体の添加によりマスクした。次いで、動物への注入前に、溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした。
【０２３４】
B. ポリアミンのプロテアーゼ切断可能なマスキング剤による修飾。p-アシルアミドベンジルアルコール誘導体の活性化（アミン反応性）カルボナートをpH＞8のH2O中で両親媒性膜活性ポリアミンのアミノ基と反応させて、p-アシルアミドベンジルカルバマートを得る。
0005941926.tif 000045
R1はASGPrリガンド（保護または未保護のいずれか）またはPEGを含み、
R2は両親媒性膜活性ポリアミンであり、
AAはジペプチド（保護または未保護のいずれか）であり、かつ
Zはアミン反応性カルボナートである。
【０２３５】
×mgのポリマーに等張グルコース中の12×mgのHEPES遊離塩基を加えた。緩衝化ポリマー溶液にDMF中の2×から16×mgの200mg/mlジペプチドマスキング剤を加えた。いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのジペプチドマスキング剤で修飾し、続いてsiRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を6×から8×mgのジペプチドマスキング剤でさらに修飾した。
【０２３６】
実施例3. siRNA
siRNAは以下の配列を有していた。
第VII因子siRNA
0005941926.tif 000046
第VII因子siRNA（霊長類）
0005941926.tif 000047
ApoB siRNA：
0005941926.tif 000048
Aha1 siRNA：
0005941926.tif 000049
Luc siRNA
0005941926.tif 000050
Eg5-KSP
0005941926.tif 000051
EGFP
0005941926.tif 000052
小文字＝2'-O-CH3置換
s＝ホスホロチオエート連結
ヌクレオチドの後のf＝2'-F置換
ヌクレオチドの前のd＝2'-デオキシ
【０２３７】
RNA合成を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare、Freiburg、Germany）および固体支持体としての多孔性ガラス（CPG）を用い、固相上で通常のホスホラミダイト化学により実施した。
【０２３８】
実施例4. インビボでのRNAiポリヌクレオチドの投与、および肝実質細胞への送達
DPCを前述のとおりに調製した。6〜8週齡のマウス（C57BL/6またはICR系統、それぞれ約18〜20g）をHarlan Sprague Dawley（Indianapolis IN）から入手した。マウスを注入前に少なくとも2日間ケージに収容した。給餌はHarlan Teklad Rodent Diet（Harlan、Madison WI）で適宜行った。DPCを本明細書に記載のとおりに合成した。結合体溶液（0.4mL）を尾静脈への点滴により注入した。組成物は生理的条件で可溶性かつ非凝集性であった。溶液を尾静脈への点滴により注入した。他の血管への注入、例えば、眼窩後注入も等しく有効であると予想される。Wistar Hanラット、175〜200gをCharles River（Wilmington、MA）から入手した。ラットを注入前に少なくとも1週間ケージに収容した。ラットの注入量は典型的には1mlであった。特に記載がないかぎり、注入の48時間後に血清試料を採取し、および/または肝試料を採取した。
【０２３９】
血清ApoBレベルの定量
マウスを4時間（ラットの場合は16時間）絶食させた後に顎下採血により血清を採取した。ラットの場合、血液を頚静脈から採取した。血清ApoBタンパク質レベルを、標準のサンドイッチELISA法によって定量した。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体（Biodesign International）をそれぞれ捕捉および検出抗体として用いた。その後、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（Sigma）を適用してApoB/抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチルベンジジン（TMB、Sigma）発色の吸光度をTecan Safire2（Austria、Europe）マイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。
【０２４０】
血漿第VII因子（F7）活性の測定
動物からの血漿試料を、標準の手順に従い、血液（9倍量）（マウスの場合は顎下採血により、またはラットの場合は頸静脈から）を0.109mol/Lクエン酸ナトリウム抗凝固剤（1倍量）を含む微小遠沈管に採取することにより調製した。血漿中のF7活性を、BIOPHEN VIIキット（Hyphen BioMed/Aniara、Mason、OH）を製造者の推奨に従って用い、色素産生法により測定した。発色の吸光度をTecan Safire2マイクロプレート読み取り器により405nmで測定した。
【０２４１】
実施例5. ジペプチド切断可能マスキング剤で可逆的に修飾した両親媒性膜活性ポリアクリラートポリアミンを用いての、インビボでのsiRNAの肝細胞への送達
100mMのpH7.5 HEPES緩衝液中のポリアクリラートAnt-41658-111を活性化ジスルフィド試薬のスクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ(2-ピリジル-ジチオ)トルエン（SMPT）（Pierce）で0.5重量％修飾し、続くsiRNAの結合のためのチオール反応性基を提供した。次いで、チオール反応性ポリマーを60mg/mL HEPES塩基中で5mg/mLに希釈した。この溶液に10mg/mLの様々な記載の酵素切断可能なマスキング試薬を加えた。この量はポリマーアミン1に対しマスキング剤2のモル比であった。ポリマー修飾反応のために、ポリマーアミンのマスキング試薬に対する好ましいモル比は1：1から1：5である。より好ましい比は1：2から1：4である。より好ましい比は1：2である。1時間後、酢酸エステル保護チオール内因性齧歯類第VII因子siRNA（ポリマーに対し0.1から0.2重量当量）をポリマー溶液に加えた。終夜インキュベートした後、無水マレイン酸のN-アセチルガラクトサミン誘導体（NAG-CDM；表5）を加えることにより、結合体をさらに修飾した。NAG-CDMを25mg/mLまで加え、30分から4時間インキュベートした。
【０２４２】
NAG-CDMポリマー修飾のために、NAG-CDMを氷酢酸の0.1％水溶液から凍結乾燥した。乾燥したNAG-CDMにポリマーの溶液を加えた。無水物を完全に溶解した後、動物に投与する前に溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。d NAG-CDMのポリマーとの反応により下記を得た：
0005941926.tif 000053
式中、Rはポリマーであり、R1はASGPrリガンド（例えば、N-アセチルガラクトサミン）を含む。表5に示すとおり、第VII因子発現はジペプチド剤でマスクしたDPCで処置した動物では49〜85％低減した。
【０２４３】
（表５）PEG-AA-p-ニトロフェニル-カルバマート＋NAG-CDM-DPCで処置したマウスにおけるインビボでの第VII因子のノックダウン
0005941926.tif 000054
a動物体重1kgあたりのポリマーまたはsiRNAのmg
b未処置対照に対して
【０２４４】
実施例6. NAG/PEG-AA-p-ニトロフェニル-カルバマートポリ(アクリラート)DPCを用いてのsiRNAのインビボ送達
A）PEGプラスNAG修飾
100mMのpH7.5 HEPES緩衝液中のポリアクリラートAnt-41658-111をPierceからの活性化ジスルフィド試薬のスクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ(2-ピリジルジチオ)トルエン（SMPT）で0.5重量％修飾した。チオール反応性ポリマーを60mg/mL HEPES塩基中で5mg/mLに希釈した。この溶液に10mg/mLの様々なPEG-AA-p-ニトロフェニル-カルボナートマスキング試薬を加えた。1時間後、酢酸エステル保護チオール第VII因子siRNAをポリマー溶液に、ポリマーのsiRNAに対する比＝5〜10：1の範囲で加えた。終夜インキュベートした後、NAG-AA-p-ニトロフェニル-カルボナートマスキング試薬を40mg/mLまで加えた。少なくとも30分であるが、4時間を超えない時間インキュベートした後、DPCを20gのICRマウスの尾静脈に注入した。注入の48時間後、血清の試料を採取し、fVIIのレベルを測定した。
【０２４５】
B）NAG単独での修飾
100mMのpH7.5 HEPES緩衝液中のポリアクリラートANT-41658 111をPierceからの活性化ジスルフィド試薬のスクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ(2-ピリジルジチオ)トルエン（SMPT）で0.5重量％修飾した。チオール反応性ポリマーを60mg/mL HEPES塩基中で5mg/mLに希釈した。酢酸エステル保護チオールsiRNA第VII因子をポリマー溶液に、ポリマーのsiRNAに対する比＝5〜10：1の範囲で加えた。終夜インキュベートした後、NAG-AA-p-ニトロフェニル-カルボナートマスキング試薬を50mg/mLまで加えた。少なくとも30分であるが、4時間を超えない時間インキュベートした後、ポリマー結合siRNAを20gのICRマウスの尾静脈に注入した。注入の48時間後、血清の試料を採取し、fVIIのレベルを測定した。
【０２４６】
（表６）PEG/NAG-AA-p-ニトロフェニル-カルバマートDPCで処置したマウスにおけるインビボでの第VII因子のノックダウン
0005941926.tif 000055
a動物体重1kgあたりのポリマーまたはsiRNAのmg
b未処置対照に対して
c重量当量
【０２４７】
実施例7. NAG/PEG-AA-p-ニトロフェニル-カルバマートポリ(ビニルエーテル)DPCを用いてのsiRNAのインビボ送達
両親媒性膜活性ポリ(ビニルエーテル)ポリアミンDW1360を10×重量当量のジペプチド切断可能マスキング剤で、ポリマー修飾中にマスキング剤が保護基を保持している以外はポリアクリラートAnt-41658-111について記載したとおりに修飾した。ポリマー修飾後、アミノ酸保護基をTFAにより除去し、NAG酢酸エステル保護基を30体積％トリエチルアミン、50％メタノールおよび20％水の溶液存在下でのインキュベーションにより除去した。酢酸エステル脱保護溶液をロータリーエバポレーションにより除去した。マスクしたポリマーをマウスにコレステロール-ApoB siRNA結合体と同時注入した。
【０２４８】
（表７）NAG-AA-p-ニトロフェニル-カルバマートポリ(ビニルエーテル)およびコレステロール-ApoB siRNA結合体を同時注入したマウスにおけるインビボでのApoBのノックダウン
0005941926.tif 000056
a動物体重1kgあたりのポリマーまたはsiRNAのmg
b未処置対照に対して
【０２４９】
実施例8. マウスにおけるインビボでのメリチン送達ペプチドによるApoB siRNA送達後の内因性ApoBレベルのノックダウン、酵素的に切断可能なマスキング剤
メリチンを前述のとおり示した量の酵素的に切断可能なマスキング剤で可逆的に修飾した。次いで、200〜300μgのマスクしたメリチンを50〜100μgのApoB siRNA-コレステロール結合体と同時注入した。ApoBレベルへの影響を前述のとおりに判定した。ペプチダーゼ切断可能なジペプチド-アミドベンジルカルバマートで修飾したメリチンは有効なsiRNA送達ペプチドであった。D型メリチンペチドの酵素的に切断可能なマスキング剤と組み合わせての使用が好ましい。ペプチドマスキングはより安定であったため、同じレベルの標的遺伝子ノックダウンにはより多くのペプチドが必要とされるが、治療指数は変化または改善のいずれもしなかった（CDM-NAGによる同じペプチドのマスキングに比べて）。
【０２５０】
（表８）第VII因子-siRNAコレステロール結合体および示した酵素的に切断可能なマスキング剤で可逆的に阻害したGIL-メリチン（D型）（Seq ID 25）によって処置したマウスにおける正常な肝細胞中の第VII因子活性の阻害
0005941926.tif 000057
aマスキング反応において用いたメリチンアミンあたりのマスキング剤の量。
【０２５１】
実施例9. プロテアーゼ切断可能なDPCによる腫瘍標的指向
A）標的遺伝子ノックダウン測定
以下に示すすべての試験について、Aha1遺伝子転写物に特異的なsiRNA、標的遺伝子。高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）に対するsiRNAをオフターゲット対照として用いた。Aha1 siRNAはヒトおよびマウス遺伝子の両方において100％相同であるAha1の配列モティーフに相補的であった。したがって、Aha1 siRNAのヒト異種移植片における宿主の細胞または腫瘍細胞のいずれかへの送達はmRNA切断および分解を引き起こす。マウスおよびヒトAha1遺伝子で異なる配列モティーフを用いて、細胞型の混合集団を含む組織試料中のヒトAha1およびマウスAha1 mRNAレベルの両方の定量的測定を可能にするPCRプライマーを設計した。siRNA送達後24、48または72時間の時点で、いくらかの健常マウス肝組織が付着した腫瘍を採取し、全RNA単離のためにTri-Reagent（Invitrogen）中で処理した。次いで、ヒトおよびマウスAha1 mRNAレベルの両方をqPCR検定により、内部参照遺伝子としてヒトCyc-Aおよびマウスβ-アクチンを用いて測定した。模擬注入した動物、またはオフターゲット対照GFP siRNAを注入したマウスからの動物におけるAha1 mRNAレベルを100％と考えた。結果は対照に対するAha1 mRNAレベルのパーセントで表し、以下の表に示す。
【０２５２】
B）正所性肝細胞癌（HCC）腫瘍モデルマウス
HegG2、Hep3B、またはHuH7細胞肝細胞癌に2つの発現ベクター、pMIR85ヒト胎盤分泌アルカリ性ホスファターゼ（SEAP）ベクターおよびpMIR3ネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子ベクターを同時形質移入して、安定にSEAPを発現する細胞株を生じた。細胞を、10％FBSおよび300ug/ml G418を補足したDMEM中で培養し、回収し、計数し、マトリゲル（BD Biosciences）（50体積％）と混合した。無胸腺ヌードマウスまたはScidベージュマウスを約3％イソフルランで麻酔し、胸骨臥位で置いた。剣状突起のすぐ下で小さい1〜2cmの正中線腹部切開を行った。湿った綿棒を用いて、肝左葉をゆっくり体外に出した。肝左葉をゆっくり退縮させ、シリンジ針を左葉の真ん中に挿入した。シリンジ針の斜端を肝臓被膜のすぐ下約0.5cmに挿入した。細胞100,000個を含む細胞/マトリゲル混合物10μlをシリンジポンプを用いて肝臓に注入した。針を肝臓内にしばらく（15〜20秒間）挿入したままにして、確実に注入を完了した。SEAP-HepG2細胞を無胸腺ヌードマウスに注入した。SEAP-Hep3BおよびSEAP-HuH7細胞をScidベージュマウスに注入した。次いで、シリンジを肝臓からの針から除去し、綿棒を細胞の漏出または出血を防ぐために注入部位上に置いた。マトリゲル/細胞混合物は目に見える塊を形成し、針の除去後も消失しなかった。次いで、肝葉をゆっくり腹部に戻し、腹壁を縫合した。腫瘍植え込み後、1週間に1回血清を採取し、SEAP検定にかけて腫瘍成長をモニターした。ほとんどの試験で、腫瘍測定値がSEAP値に基づき約4〜8mmと推定される、移植の4〜5週間後に腫瘍マウスを用いた。
【０２５３】
C）結腸直腸転移腫瘍モデル
HT29細胞を10％FBSを補足したMcCoy's 5a培地中で培養し、回収し、計数し、マトリゲル（BD Biosciences）（50体積％）と混合した。無胸腺ヌードマウスを約3％イソフルランで麻酔し、胸骨臥位で置いた。剣状突起のすぐ下で小さい1〜2cmの正中線腹部切開を行った。湿った綿棒を用いて、肝左葉をゆっくり体外に出した。肝左葉をゆっくり退縮させ、シリンジ針を左葉の真ん中に挿入した。シリンジ針の斜端を肝臓被膜のすぐ下約0.5cmに挿入した。細胞約40,000個を含む細胞/マトリゲル混合物5μlをシリンジポンプを用いて肝臓に注入した。針を肝臓内にしばらく（15〜20秒間）挿入したままにして、確実に注入を完了した。次いで、シリンジを肝臓から除去し、綿棒を細胞の漏出または出血を防ぐために注入部位上に置いた。マトリゲル/細胞混合物は目に見える塊を形成し、針の除去後も消失しなかった。次いで、肝葉をゆっくり腹部に戻し、腹壁を縫合した。移植の4〜5週間後に腫瘍マウスを用いた。
【０２５４】
実施例10. HepG2-SEAP正所性肝細胞癌（HCC）モデルにおけるPEG24-Val-Cit DPC投与後のインビボでの標的遺伝子発現のノックダウン
前述のとおり、（2011062805）Ant-129-1ポリマーDPCを18×重量過剰のPEG24-Phe-Citマスキング剤（またはPEG24-Val-Citマスキング剤）または7×PEG550-CDMのいずれかで修飾（マスク）した。前述のとおり、Aha1-siRNA（RD-09070）またはGFP-siRNA（RD-05814；オフターゲット対照）をポリマーに結合した（4：1の重量比）。DPCを送達前にゲルろ過で精製せず、標的指向リガンドを加えなかった。動物ごとに等張グルコース200μl中のDPC結合体320μg（ポリマー重量）を尾静脈注入により投与した（群ごとにn＝3）。24時間後、等張グルコース200μl中のDPC結合体320μg（ポリマー重量）の二回目の注入を動物に投与した。二回目の注入の48時間後、血清試料を採取して、肝酵素（ALTおよびAST）および血中尿素窒素（BUN）レベルを測定することにより毒性を評価し、続いて組織を採取し、qPCR分析を行った。
【０２５５】
Aha1 siRNAを送達するためにPEG24-Val-Cit-Ant-129-1-siRNA DPCを用いることで、ヒト腫瘍細胞におけるAha1遺伝子の46％ノックダウンを引き起こした（表9）。ヒトAha1ノックダウンレベルとは対照的に、マウスAha1はPEG24-Val-Cit-Ant-129-1-siRNA DPC投与に反応して70％のノックダウンを示した（表1）。二置換無水マレイン酸マスキング剤（PEG550-CDM）で作成した類似のDPCに比べて、内因性肝実質細胞Aha1ノックダウンは低減した。ALT、ASTおよびBUNレベルにより示されるとおり、PEG24-Val-Cit DPCはよく耐容され、毒性を示さなかった（表）。
【０２５６】
（表９）無水マレイン酸修飾またはペプチド切断可能修飾Aha1 siRNA DPCによるHepG2肝腫瘍モデルにおけるAha1ノックダウン
0005941926.tif 000058
【０２５７】
（表１０）無水マレイン酸修飾またはペプチド切断可能修飾Aha1 siRNA DPC投与後の血液化学毒性マーカー
0005941926.tif 000059
【０２５８】
実施例11. 二重特異性抗体（bsAb)-標的指向DPC（2011090701）による標的遺伝子発現のノックダウン
前述のとおり、Ant-129-1ポリマーを5×Dig-PheCit（Dig-FCit）マスキング剤で修飾した。次いで、siRNAを結合体に結合した。最後に、Dig-FCit-Ant-129-1-siRNA結合体を8×（重量）PEG12-FCitでさらに修飾した。Aha1-siRNA（RD-09070）またはGFP siRNA（RD-05814）を4：1のポリマー：siRNA重量比で結合した。PEG12-FCit DPCをSephadex G50スピンカラムで精製して、未結合の試薬を除去した。
【０２５９】
ヘパラン硫酸プロテオグリカングリピカン-3（GPC3）、すなわちHepG2-SEAP細胞で高度に発現されることが公知の細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびジゴキシゲニン（Dig）に特異的な、細胞標的指向二重特異性抗体（bsAb）を作成した。対照として、タンパク質CD33（骨髄由来造血幹細胞のマーカー）およびDigに特異的な二重特異性抗体を作成した。CD33はHepG2-SEAP細胞によって発現されない。BsAbを修飾DPCと、推定1：1のモル比を提供するために1.25：1の重量比で複合体形成した。送達前に複合体をPBS中、少なくとも30分間形成した。
【０２６０】
DPCをHepG2-SEAP腫瘍担持マウスに、bsAb標的指向剤と共に、またはbsAb標的指向剤なしのいずれかで投与した。各動物（群ごとにn＝3）にDPC 250μg（ポリマー重量）の1回用量を投与した。DPCは200μlの滅菌PBS中でマウスの尾静脈に注入した。血清および組織試料を48時間後に採取し、前述のとおりに分析した。表11に示すとおり、bsAb標的指向DPCの1回用量（250μgポリマー、62.5μg siRNA）は21〜32％の標的遺伝子ノックダウンを引き起こした。
【０２６１】
（表１１）二重特異性抗体を用いてのペプチド切断可能マスキング剤修飾Aha1 siRNA DPCによるHepG2肝腫瘍モデルにおけるAha1ノックダウン
0005941926.tif 000060
【０２６２】
実施例12. 二重特異性抗体（bsAb)-標的指向DPCによる標的遺伝子発現のノックダウン
DPCを、a）PEG12-FCitの代わりにPEG24-FCitを用い、かつb）Dig-PEG12-NHSを用いてDigをポリマーに結合したこと以外は、前述のとおりに調製した。PEG24-FCit DPCはPEG12-FCit DPCよりも凝集が少なく、その大きさがより小さく、より均質であった。連結が不安定でないことに加えて、Dig-PEG12-NHSはより長いPEGも含んでいた。DPCはbsAbとの複合体であり、動物に前述のとおりに注入した。血清および組織採取を注入の24時間後または48時間後のいずれかに行った。表12に示すとおり、DPCの1回用量（250μgポリマー重量）は、注入の24時間後に46〜56％のヒトAha1ノックダウンを引き起こした。
【０２６３】
（表１２）PEG長が長いペプチド切断可能マスキング剤を用いて修飾したAha1 siRNA DPCによるHepG2肝腫瘍モデルにおけるAha1ノックダウン
0005941926.tif 000061
【０２６４】
実施例13. bsAb標的指向DPCによるヒト結腸直腸腺癌転移肝腫瘍組織へのDPCの標的指向
Ant-129-1ポリマーを5×モル過剰のDig-PEG12-NHSおよび8×重量過剰のPEG24-FCitで修飾した。Aha1 siRNAまたはGFP siRNAを修飾ポリマーに4：1のポリマー：siRNA重量比で結合した。DPCをSephadex G50スピンカラムで精製して、未結合の試薬を除去した。注入前に、Dig-DPCを滅菌PBS中、等モル量のIGF1R-Dig bsAbもしくはCD33-Dig bsAbと、またはbsAbなしで、少なくとも30分間複合体形成した。HT29腫瘍細胞（ヒト結腸直腸腺癌；ATCC番号HTB-38）を含む動物にDPCを注入した。HT29細胞はインスリン様成長因子-1受容体タンパク質（IGF1R）を過剰発現し、IGF1R-Dig二重特異性抗体に結合し、これを内部に取り入れることができる。動物（n＝3）にDPC（320μgポリマー重量）を投与した。24時間後に注入を繰り返した。血清および組織試料を2回目の投与の48時間後に採取した。腫瘍細胞におけるヒトAha1のノックダウンは26〜38％であった（表13）。CDM-DPCに比べて、FCit-DPCは低いオフターゲット肝Aha1ノックダウンを示した（78〜83％に対して24〜36％）。FCit-DPCはCDM-DPCに比べて肝蓄積の低減も示した。
【０２６５】
（表１３）ジペプチド切断可能Aha1 siRNA DPCによるHT29結腸直腸腺癌転移肝腫瘍におけるAha1ノックダウン
0005941926.tif 000062
【０２６６】
実施例14. 肝腫瘍における内因性Aha1のインビボでのノックダウン
400μgのLau41648-106を8×（重量）PEG12-ValCitまたは16×PEG24-PheCitで修飾した。100μgのAha1 siRNAまたは100μgのEg5対照siRNAを、前述のとおり、修飾ポリマーに結合した。Hep3B-SEAP腫瘍細胞を含む動物にDPCを注入した。血清および組織試料を注入の48時間後に採取した。腫瘍細胞におけるヒトAha1ノックダウンは26〜38％であった。
【０２６７】
（表１４）ジペプチド切断可能Aha1 siRNA DPCによるHep3B-SEAP肝腫瘍におけるAha1ノックダウン
0005941926.tif 000063
【０２６８】
実施例15. マスクしたポリマーのインビボでの循環および組織標的指向
Lau24ABポリアクリラート（100μg）を50mM HEPES pH8.0緩衝液中、125I-ボールトン-ハンター（BH）試薬（50μCi）により、室温で1時間処理した。標識ポリマーを2mlの水中Sephadex QEAスピンカラムで精製した。標識ポリマーの溶液を4℃で保存した。200gのラット1匹あたり約1mgの0.2μCiを有するポリマーを注入するために、非標識ポリマーに125I標識ポリマーを補足した。標識および非標識ポリマーの混合物（約3.5匹の動物に対して計算）をPEG24-FCitまたはPEG-CDMで前述のとおりに修飾した（2mg/mlポリアクリラート、14mg/ml PEG-CDM試薬、14mg/ml NAG-PEG-CDM試薬、16mg/ml PEG24-FCit試薬）。インキュベーション時間1時間。次いで、反応混合物を等張グルコースで希釈して、1mlの量の動物ごとの注入用量を得た。3匹/群に注入した。所与の時間に動物から採血した（0.1〜0.2ml）。試料中のポリマーの量をガンマ計数器で計数することにより求めた。図4に示すとおり、プロテアーゼ切断可能なマスキング剤で修飾したポリマーはpHに不安定な無水マレイン酸マスキング剤でマスクしたポリマーよりも排出が遅かった。循環時間の延長は非肝組織への標的指向のために有益である。
【０２６９】
実施例16. 両親媒性膜活性ポリマーの合成
A）ポリ(ビニルアクリラート)
i）N-Boc-エチルエトキシアクリラートおよびメタクリル酸プロピルのRAFT共重合：
0005941926.tif 000064
0005941926.tif 000065
式中：Aはboc保護エチル-エトキシアミノアクリラートであり
Bはメタクリル酸プロピルであり
CはRAFT剤CPCPA（4-シアノ-4-(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸）であり
かつnおよびmは整数である。
合成後のboc保護基の除去によりアミンモノマーを生じる。
【０２７０】
他の膜活性ポリマーのために、Aはbe保護（beprotected）エチル、プロピル、またはブチルアミノアクリラートでありうる。Bは疎水性がより高い（炭素原子10〜24個、C18を示す）アクリラート、疎水性がより低い（炭素原子1〜6個、C4を示す）アクリラート、または疎水性がより低いアクリラートとより高いアクリラートとの組み合わせでありうる。
【０２７１】
アミンアクリラート/C3メタクリラートからなるコポリマーを以下のとおりに合成した。モノマーおよびRAFT剤を秤量し、酢酸ブチル中に示した比率で加えた。AIBN（アゾビス-イソブチロニトリル）を加え、窒素を反応混合物に室温で1時間通気した。次いで、反応混合物を80℃の油浴中に15時間置いた。次いで、ポリマーをヘキサンで沈澱させ、DCM/ヘキサン溶媒系を用いてさらに分別沈澱させた（下記参照）。次いで、ポリマーを減圧下で乾燥した。ポリマーを酢酸中2M HCl 7mlにより室温で30分間脱保護した。30分後、水15mlを反応混合物に加え、混合物を3.5kDa MWCO透析チューブに移した。ポリマーをNaClに対して終夜透析し、次いでdH2Oに対してもう1日透析した。次いで、水を凍結乾燥により除去し、ポリマーをdH2Oに溶解した。
【０２７２】
（Ant 41658-111）のためのモノマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)（AIBN、ラジカル開始剤）、4-シアノ-4-(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸（CPCPA、RAFT剤）および酢酸ブチルはSigma Aldrichから購入した。メタクリル酸プロピルモノマー（Alfa Aesar）はろ過して阻害剤を除去した。
【０２７３】
撹拌子を入れた2Lの丸底フラスコ中、2-(2-アミノエトキシ)エタノール（21.1g、202.9mmol、Sigma Aldrich）を350mLのジクロロメタンに溶解した。別の1Lのフラスコ中、BOC無水物（36.6g、169.1mmol）を660mLのジクロロメタンに溶解した。2Lの丸底フラスコに滴加漏斗を取り付け、BOC無水物溶液をフラスコに6時間かけて加えた。反応混合物を終夜撹拌した。2Lの分液漏斗中、生成物を10％クエン酸、10％K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各300mlで洗浄した。生成物のBOC保護2-(2-アミノエトキシ)エタノールをNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて蒸発させた。
【０２７４】
撹拌子を入れ、アルゴンを流した、500mlの丸底フラスコ中、BOC保護2-(2-アミノエトキシ)エタノール（27.836g、135.8mmol）と、続いて240mLの無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン（35.5ml、203.7mmol）を加え、系をドライアイス/アセトン浴中に置いた。塩化アクリロイル（12.1ml、149.4mmol）を10mlのジクロロメタンで希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温に戻し、終夜撹拌した。生成物をdH2O、10％クエン酸、10％K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各100mLで洗浄した。生成物のBOC-アミノエチルエトキシアクリラート（BAEEA）をNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションで蒸発させた。生成物を、直径7.5cmカラムを用い、29cmのシリカによるカラムクロマトグラフィで精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30％酢酸エチルであった。Rf：0.30。分画を集め、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて蒸発させた。BAEEAを収率74％で得た。BAEEAをフリーザーに保存した。
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【０２７５】
ポリマーAnt-41658-111：酢酸ブチル中のAIBN（1.00mg/mL）およびRAFT剤（4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸（CPCPA）、10.0mg/mL）の溶液を調製した。モノマーのモル供給比は75 BAEEA：25メタクリル酸プロピル（CAS:2210-28-8）ならびに0.108 CPCPA RAFT剤および0.016 AIBN触媒（合計0.00562mol）であった。
【０２７６】
BAEEA（1.09g、4.21mmol）（A）、メタクリル酸プロピル（0.180g、1.41mmol）（B）、CPCPA溶液（0.170ml、0.00609mmol）（C）、AIBN溶液（0.150ml、0.000915mmol）、および酢酸ブチル（5.68ml）を、撹拌子を入れた20mlのガラスバイアルに加えた。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジ針と出口としての第二の短いシリンジ針を用いて、溶液に窒素を1時間通気した。シリンジ針を除去し、系を油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで戻し、50mlの遠沈管に移した後、ヘキサン(35ml）を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上澄み層を注意深くデカントし、下層（固体またはゲル様）をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM（7mL）に再度溶解し、ヘキサン(35mL）中で沈澱させ、もう一度遠心分離した。上清をデカントし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。MALSで得た分子量：73,000（PDI 1.7）；H1NMRで得たポリマー組成：アミン:アルキル＝69：31。
【０２７７】
分別沈澱
乾燥し、沈澱した生成物をDCMに溶解した（100mg/mL）。ヘキサンを、曇り点に達する直後まで加えた（約20ml）。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層（約60％のポリマーである濃稠な液体）を抽出し、ヘキサン中に完全に沈澱させた。残りの上部の溶液も、ヘキサンをさらに加えることにより完全に沈澱させた。両方の分画を遠心分離し、その後、ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。分画1：Mw 87,000（PDI 1.5）；分画2：Mw 52,000（PDI 1.5〜1.6）。
【０２７８】
MALS分析
約10mgのポリマーを0.5mLの89.8％ジクロロメタン、10％テトラヒドロフラン、0.2％トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性（PDI）を、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角光分散検出器により、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用いて測定した。粗製ポリマー：MW：73,000（PDI 1.7）、分画1：MW 87,000（PDI：1.5）、分画2：MW 52,000（PDI 1.5〜1.6）
【０２７９】
精製したBOC保護ポリマーを酢酸中2M HCl（7ml）と0.5時間反応させてBOC保護基を除去し、アミンを生じた。15mLのdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500 MWカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いでDI H2Oに20mg/mlの濃度で溶解した。ポリマー溶液を2〜8℃で保存した。
【０２８０】
ii）ポリマーLau24Bを、モノマー供給比が72.5 BAEEA：27.5メタクリル酸プロピルである以外は、前述のとおりに調製した。
【０２８１】
iii）Ant-129-1を、以下のモノマーを用いる以外は、基本的に前述のとおりに作成した：
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【０２８２】
（表１５）Ant-129-1ポリマー合成反応物
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【０２８３】
N-Boc-アミノ-プロピル-アクリラート（BAPA）のために、撹拌子を入れ、アルゴンを流した、500mlの丸底フラスコ中、3-(BOC-アミノ)1-プロパノール（TCI）（135.8mmol）と、続いて240mLの無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン（203.7mmol）を加え、系をドライアイス/アセトン浴中に置いた。塩化アクリロイル（149.4mmol）を10mlのジクロロメタンで希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温に戻し、終夜撹拌した。生成物をdH2O、10％クエン酸、10％K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各100mLで洗浄した。生成物のBOC-アミノプロピルアクリラート（BAPA）をNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションで蒸発させた。生成物を、直径7.5cmカラムを用い、29cmのシリカによるカラムクロマトグラフィで精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30％酢酸エチルであった。Rf：0.30。分画を集め、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて蒸発させた。BAPAを収率74％で得た。BAPAをフリーザーに保存した。
【０２８４】
iv）N-Boc-エチルエトキシアクリラートおよびメタクリル酸プロピルのランダム共重合。アミンアクリラート/Cnメタクリラートからなるコポリマーを以下のとおりに合成した。モノマーを秤量し、ジオキサン中に示した比率で加えた。AIBN（アゾビス-イソブチロニトリル）を加え、窒素を反応混合物に室温で1時間通気した。次いで、反応混合物を60℃の油浴中に3時間置いた。次いで、ポリマーを減圧下で乾燥した。ポリマーをGPCで精製した。その後、ポリマーを酢酸中2M HCl 7mlにより室温で30分間脱保護した。30分後、水15mlを反応混合物に加え、混合物を3.5kDa MWCO透析チューブに移した。ポリマーをNaClに対して終夜透析し、次いでdH2Oに対してもう1日透析した。次いで、水を凍結乾燥により除去し、ポリマーをdH2Oに溶解した。
【０２８５】
ポリマーLau41648-106
モノマーのモル供給比は80 BAEEA：20メタクリル酸プロピル（CAS:2210-28-8）およびモノマーの合計モルに基づき3％のAIBN触媒であった。BAEEA（6.53g、25.2mmol）（A）、メタクリル酸プロピル（0.808g、6.3mmol）（B）、AIBN（0.155g、0.945mmol）、およびジオキサン（34.5ml）を、撹拌子を入れた50mlのガラスチューブに加えた。化合物AおよびBは実施例16Aiで前述したとおりに調製した。反応は三つ組で計画した。各溶液に長いピペットを用いて窒素を1時間通気した。ピペットを除去し、各チューブに注意深く栓をした。次いで、各溶液を油浴を用いて60℃で3時間加熱した。各溶液を室温まで戻し、丸底中で混合した。粗製ポリマーを減圧下で乾燥した。MALSで得た分子量：55,000（PDI 2.1）；H1NMRで得たポリマー組成：アミン:アルキル＝74：26。
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【０２８６】
GPC分別
乾燥した粗製ポリマーを75％ジクロロメタン、25％テトラヒドロフラン、および0.2％トリエチルアミン中、50mg/mlで溶解した。次いで、ポリマーをJordi Gel DVB 104Å−500mm/22mmカラムで、流速5ml/分および注入10mlを用いて分別した。前半の分画を15〜17分で回収し、後半の分画を17〜19分で回収した。分画15〜17：Mw 138,000（PDI 1.1）；分画17〜19：Mw 64,000（PDI 1.2）。
【０２８７】
MALS分析
約10mgのポリマーを0.5mLの89.8％ジクロロメタン、10％テトラヒドロフラン、0.2％トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性（PDI）を、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角光分散検出器により、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用いて測定した。粗製ポリマー：MW：55,000（PDI 2.1）、分画15〜17：MW 138,000（PDI：1.1）、分画17〜19：MW 64,000（PDI 1.2）
【０２８８】
精製したBOC保護ポリマーを酢酸中2M HCl（7ml）と0.5時間反応させてBOC保護基を除去し、アミンを生じた。15mLのdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500 MWカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いででDI H2Oに20mg/mlの濃度で溶解した。ポリマー溶液を2〜8℃で保存した。
【０２８９】
v）水溶性、両親媒性、膜活性ポリ(ビニルエーテル)ポリアミンターポリマーの合成
X mol％アミン保護ビニルエーテル（例えば、2-ビニルオキシエチルフタルイミド）を、乾燥器で乾燥した丸底フラスコの無水ジクロロメタン中に窒素雰囲気下で加える。この溶液に、Y mol％の低級疎水性基（例えば、プロピル、ブチル）ビニルエーテルおよび任意にZ mol％の高級疎水性基（例えば、ドデシル、オクタデシル）ビニルエーテルを加える（図1）。溶液を-50から-78℃の浴に入れ、2-ビニルオキシエチルフタルイミドを沈澱させる。この溶液に10mol％BF3・(OCH2CH3)2を加え、反応を-50から-78℃で2〜3時間進行させる。メタノール中の水酸化アンモニウム溶液を加えて重合を停止する。ポリマーを減圧下で乾燥し、次いで1,4-ジオキサン/メタノール（2/1）に加える。フタルイミドに対して20mol当量のヒドラジンを加えて、アミンから保護基を除去する。溶液を3時間還流し、次いで減圧下で乾燥する。得られた固体を0.5mol/LのHClに溶解し、15分間還流して、ポリマーの塩酸塩を生成し、蒸留水で希釈し、さらに1時間還流する。次いで、溶液をNaOHで中和し、室温（RT）まで冷却し、分子セルロースチューブに移し、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥する。ポリマーをサイズ排除または他のクロマトグラフィを用いてさらに精製することができる。ポリマーの分子量を、分析用サイズ排除クロマトグラフィおよび多角光分散によるサイズ排除クロマトグラフィ（SEC-MALS）を含む、標準の手順に従ってのカラムを用いて推定する。
【０２９０】
ポリマーDW1360
アミン/ブチル/オクタデシルポリ(ビニルエーテル)ターポリマーを、2-ビニルオキシエチルフタルイミド（5g、23.02mmol）、ブチルビニルエーテル（0.665g、6.58mmol）、およびオクタデシルビニルエーテル（0.488g、1.64mmol）モノマーから合成した。2-ビニルオキシエチルフタルイミドを、磁気撹拌子を含む200mLの乾燥器で乾燥した丸底フラスコの無水ジクロロメタン36mL中に窒素雰囲気下で加えた。この溶液に、ブチルビニルエーテルおよびn-オクタデシルビニルエーテルを加えた。モノマーを室温（RT）で完全に溶解して、澄明な均質溶液を得た。次いで、澄明溶液を含む反応容器を、ドライアイスをACS等級の変性アルコールおよびエチレングリコールの1：1溶液に加えることにより生成した-50℃の浴に入れ、フタルイミドモノマーの目に見える沈澱を生成させた。約1.5分間冷却した後、BF3・(OCH2CH3)2（0.058g、0.411mmol）を加えて、重合反応を開始した。フタルイミドモノマーは重合開始後に溶解した。反応を-50℃で3時間進行させた。メタノール中の1％水酸化アンモニウム5mLを加えて重合を停止した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。
【０２９１】
次いで、ポリマーを30mLの1,4-ジオキサン/メタノール（2/1）に溶解した。この溶液にヒドラジン（0.147g、46mmol）を加え、混合物を3時間加熱還流した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去し、次いで、得られた固体を20mLの0.5mol/L HClに加えて15分間還流し、20mLの蒸留水で希釈し、さらに1時間還流した。次いで、この溶液をNaOHで中和し、室温まで冷却し、分子量3,500のセルロースチューブに移し、蒸留水に対して24時間（2×20L）透析し、凍結乾燥した。
【０２９２】
B）メリチン
すべてのメリチンペプチドを、当技術分野において標準のペプチド合成技術を用いて作成した。適切なメリチンペプチドは全L型アミノ酸、全D型アミノ酸（インベルソ）でありうる。LまたはD型とは独立に、メリチンペプチド配列を反転することができる（レトロ）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４】
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【配列表】
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