(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒｒｅ３７遺伝子が過剰発現している藍藻。
【請求項２】
藍藻がポリヒドロキシアルカン酸生産能を有する、請求項１記載の藍藻。
【請求項３】
藍藻がポリヒドロキシブタン酸生産能を有する、請求項２記載の藍藻。
【請求項４】
ｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の藍藻。
【請求項５】
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、請求項１〜４のいずれか１項記載の藍藻。
【請求項６】
さらにｓｉｇＥ遺伝子が過剰発現している、請求項１〜５のいずれか１項記載の藍藻。
【請求項７】
ポリヒドロキシアルカン酸の生産方法であって、ポリヒドロキシアルカン酸生産能を有し、ｒｒｅ３７遺伝子が過剰発現している藍藻を培養すること、及びポリヒドロキシアルカン酸を採取することを含む、前記方法。
【請求項８】
藍藻がｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
藍藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
ポリヒドロキシアルカン酸がポリヒドロキシブタン酸である、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
藍藻が、さらにｓｉｇＥ遺伝子を過剰発現している、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
培養を窒素欠乏条件で行う、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
藍藻においてポリヒドロキシアルカン酸生産能を増強する方法であって、藍藻においてｒｒｅ３７遺伝子を過剰発現させることを含む、前記方法。
【請求項１４】
藍藻がｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
藍藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
ポリヒドロキシアルカン酸がポリヒドロキシブタン酸である、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
コハク酸の生産方法であって、請求項１〜６のいずれか１項記載の藍藻を培養し、コハク酸を採取することを含む、前記方法。
【請求項１８】
培養を窒素欠乏条件で行う、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
水素の生産方法であって、請求項１〜６のいずれか１項記載の藍藻を、嫌気条件下で培養することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、窒素応答性レスポンスレギュレーター遺伝子を過剰発現させた藍藻、及びこれを用いてポリヒドロキシアルカン酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）は、微生物が生産するバイオポリマーの一種であり、微生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待される材料である。ＰＨＢは、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の一種でアセチルＣｏＡから三段階の反応で合成されるポリエステルである。ＰＨＡを微生物により生産させる方法は、これまでに種々開示されている。例えば、特許文献１でＰＨＢの製造方法について開示されている。しかしながら、これらの何れの方法の場合も資化性炭素源として有機炭素源を必要とするという欠点があった。【０００３】
そこで、有機炭素源の還元物質を必要とすることなく微生物から効率的にＰＨＡを生産させる方法が種々模索された。これまでに藍藻ＰＨＡに関する研究報告は数多くなされているが、局所的な酵素活性の増大は、ＰＨＡ量の増加につながらないことが明らかとなっている（非特許文献１）。ＰＨＡ量をより増加させるためには、炭素代謝を大きく改変し、ＰＨＡへの代謝フローを促進させる必要があるが、個々の代謝酵素改変では代謝全体の改変にはつながらないことも明らかとなっている。また、Ａｎａｂａｅｎａ属の藍藻において窒素応答性レスポンスレギュレーター遺伝子が糖異化を制御することが報告されているが、当該藍藻はＰＨＡ産生能がなく、ＰＨＡの生産に利用することは報告されていない（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１−２２２７８８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｒｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３０，２００２，９７−１０４
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ２８６，４４，２０１１，３８１０９−３８１１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、光合成微生物である藍藻を用いて、光エネルギーと二酸化炭素を利用して、藍藻細胞内に蓄積するバイオプラスチックであるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を効率的に生産する系を構築し、ＰＨＡの生産量を増加させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、藍藻において、窒素応答性レスポンスレギュレーターであるｒｒｅ３７遺伝子を過剰発現させることにより、炭素の貯蔵源であるグリコーゲンを減少させ、解糖系の酵素を増加させ、炭素骨格をより多く供給し、ＰＨＡ合成酵素を増やすことによって、培養液あたり及び細胞乾燥重量あたりのＰＨＡ量を増加させることに成功した。【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。【０００９】
（１）ｒｒｅ３７遺伝子が過剰発現している藍藻。【００１０】
（２）ポリヒドロキシアルカン酸生産能を有する、（１）記載の藍藻。【００１１】
（３）ポリヒドロキシブタン酸生産能を有する、（２）記載の藍藻。【００１２】
（４）ｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の藍藻。【００１３】
（５）Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、（１）〜（４）のいずれかに記載の藍藻。【００１４】
（６）さらにｓｉｇＥ遺伝子が過剰発現している、（１）〜（５）のいずれかに記載の藍藻。【００１５】
（７）ポリヒドロキシアルカン酸の生産方法であって、ポリヒドロキシアルカン酸生産能を有し、ｒｒｅ３７遺伝子が過剰発現している藍藻を培養すること、及びポリヒドロキシアルカン酸を採取することを含む、前記方法。【００１６】
（８）藍藻がｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、（７）記載の方法。【００１７】
（９）藍藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、（７）又は（８）記載の方法。【００１８】
（１０）ポリヒドロキシアルカン酸がポリヒドロキシブタン酸である、（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。【００１９】
（１１）藍藻が、さらにｓｉｇＥ遺伝子を過剰発現している藍藻である、（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。【００２０】
（１２）培養を窒素欠乏条件で行う、（７）〜（１１）のいずれかに記載の方法。【００２１】
（１３）藍藻においてポリヒドロキシアルカン酸生産能を増強する方法であって、藍藻においてｒｒｅ３７遺伝子を過剰発現させることを含む、前記方法。【００２２】
（１４）藍藻がｐｈａＡＢ遺伝子とｐｈａＥＣ遺伝子を有する、（１３）記載の方法。【００２３】
（１５）藍藻がＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属に属する、（１３）又は（１４）記載の方法。【００２４】
（１６）ポリヒドロキシアルカン酸がポリヒドロキシブタン酸である、（１３）〜（１５）のいずれかに記載の方法。【００２５】
（１７）コハク酸の生産方法であって、（１）〜（６）のいずれかに記載の藍藻を培養し、コハク酸を採取することを含む、前記方法。【００２６】
（１８）培養を窒素欠乏条件で行う、（１７）記載の方法。【００２７】
（１９）水素の生産方法であって、（１）〜（６）のいずれかに記載の藍藻を、嫌気条件下で培養することを含む、前記方法。【００２８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-52208号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、光合成微生物である藍藻を用いて、光エネルギーと二酸化炭素を利用して、藍藻細胞内に蓄積するバイオプラスチックであるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を効率的に生産することが可能になる。また、コハク酸や水素の生産も効率的に実施することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｒｒｅ３７過剰発現株構築用のプラスミドの模式図を示す。
【図２】野生株（ＧＴ）とＲｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）におけるｒｒｅ３７ｍＲＮＡ量を示す。
【図３】野生株（ＧＴ）とＲｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）におけるＲｒｅ３７タンパク質量を示す。
【図４】Ｒｒｅ３７/ＳｉｇＥ二重過剰発現株構築用のプラスミドの模式図を示す。
【図５】Ｒｒｅ３７過剰発現株、Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）及び野生株（ＧＴ）について、細胞を窒素欠乏状態にし、細胞バイオマスを測定した結果を示す。
【図６】Ｒｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）、Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）及び野生株（ＧＴ）について、培養液１００ｍｌあたりのＰＨＢ量を測定した結果を示す。
【図７】Ｒｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）、Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）及び野生株（ＧＴ）について、ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）の細胞内蓄積量を測定した結果を示す。
【図８】Ｒｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）、Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）及び野生株（ＧＴ）について、クエン酸及びコハク酸の細胞内蓄積量を測定した結果を示す。
【図９】Ｒｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）及び野生株（ＧＴ）について、水素生産量を測定した結果を示す。
【図１０】Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）及び野生株（ＧＴ）について、培養液１Ｌあたりのコハク酸量を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、藍藻においてｒｒｅ３７遺伝子を過剰発現させることを特徴とする。藍藻は、シアノバクテリア（藍色細菌）とも呼ばれる真正細菌の1群であり、光合成によって酸素を生み出すという特徴を有する。単細胞で浮遊するもの、少数細胞の集団を作るもの、糸状に細胞が並んだ構造を持つものなどがあり、特に制限されないが、単細胞のものが好ましい。
【００３２】
ポリヒドロキシアルカン酸の生産量を増大させる観点からは、ポリヒドロキシアルカン酸、好ましくはポリヒドロキシブタン酸の生産能を有する藍藻を用いることが好ましい。したがって、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、例えばｐｈａＡＢ遺伝子及びｐｈａＥＣ遺伝子を有する藍藻を用いることが好ましい。ポリヒドロキシアルカン酸の生産能を有する藍藻には、遺伝子改変や突然変異誘導等によりポリヒドロキシアルカン酸の生産能が付与された藍藻も包含される。したがって、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、例えばｐｈａＡＢ遺伝子及びｐｈａＥＣ遺伝子を有する藍藻には、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が導入された藍藻も包含される。
【００３３】
藍藻の具体例としては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、Ｍｙｃｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｙｃｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属藍藻、例えばＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｒｔｏｐｈｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ属藍藻、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属藍藻、例えばＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ属藍藻、例えばＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ属藍藻、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻などが挙げられる。
【００３４】
このうち、少なくともＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｍｙｃｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えばＭｙｃｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属藍藻、例えばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属藍藻、例えばＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｒｔｏｐｈｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属藍藻、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ  ｍｕｓｃｏｒｕｍについては、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の存在が明らかとなっている。
【００３５】
ｒｒｅ３７遺伝子は、レスポンスレギュレーターの１種である、窒素応答性レスポンスレギュレーターＲｒｅ３７をコードする遺伝子である。細菌やカビなどの微生物、さらに高等植物は、「二成分情報伝達系」と呼ぶセンサーシステムを備えており、この二成分情報伝達系は、微生物が光、熱、酸素、ストレス、栄養、金属イオンなど、めまぐるしく変化するさまざまな外部環境を鋭敏に感知し、その変化に適応して生存していくために、欠かせないシステムである。二成分情報伝達系は、「ヒスチジンキナーゼ」と「レスポンスレギュレーター」と呼ぶ２種類のタンパク質からできている。ヒスチジンキナーゼは、環境変化を感じ取るセンサードメイン、リン酸化反応を行う触媒ドメインや、二量化ドメインという３種のパーツで構成されている。このヒスチジンキナーゼは、センサードメイン部で環境変化を感じ取ると、触媒ドメインが生体エネルギーの基となるＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を使って、二量化ドメインにあるヒスチジンにリン酸基を結合させる（リン酸化）。レスポンスレギュレーターは、さらにそのリン酸基をヒスチジンキナーゼから受取り、環境変化に適応できるようなタンパク質の発現や活性の調節を行っている。すなわち、二成分情報伝達系は、環境変化をリン酸化という生体シグナルに変換する役割を担っている。
【００３６】
窒素応答性レスポンスレギュレーターＲｒｅ３７は、窒素欠乏時に発現が増加するレスポンスレギュレーターである。藍藻由来ｒｒｅ３７遺伝子の具体例として、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３由来のｒｒｅ３７遺伝子の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。ｒｒｅ３７遺伝子には、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子も包含される。配列番号１の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、配列番号１と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性又は同一性を有する塩基配列からなり、窒素応答性レスポンスレギュレーターの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、本発明においてｒｒｅ３７遺伝子には、そのホモログやオルソログも包含される。
【００３７】
窒素応答性レスポンスレギュレーターＲｒｅ３７には、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質も包含される。配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質としては、配列番号２と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列からなり、窒素応答性レスポンスレギュレーターの活性を有するタンパク質が挙げられる。また、配列番号２のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、窒素応答性レスポンスレギュレーターの活性を有するタンパク質も、窒素応答性レスポンスレギュレーターＲｒｅ３７に包含される。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、通常２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
【００３８】
ｒｒｅ３７遺伝子をはじめ、目的遺伝子の塩基配列は公共のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ）より検索可能であり、例えば上記藍藻に由来するｒｒｅ３７遺伝子のうち、配列が未知の藍藻に由来するｒｒｅ３７遺伝子は、配列が既知の藍藻に由来するｒｒｅ３７遺伝子の情報を利用し、クローニングにより取得することができる。所望の遺伝子をクローニングにより取得する方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば、遺伝子配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換（遺伝子導入）に適した量のＤＮＡを得ることができる。遺伝子のクローニングに用いるゲノムライブラリの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている。
【００３９】
藍藻において、ｒｒｅ３７遺伝子に加えて、ｓｉｇＥ遺伝子を過剰発現させることにより、すなわちｒｒｅ３７遺伝子とｓｉｇＥ遺伝子とを二重過剰発現させることにより、ポリヒドロキシアルカン酸生産能をさらに増強することができる。
【００４０】
ｓｉｇＥ遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子であるＳｉｇＥをコードする遺伝子である。ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子は遺伝子のプロモーター領域に結合し、転写を開始させるために必要なタンパク質である。シグマ因子は生存に必須な主要型シグマ因子（グループ１）、主要型シグマ因子と類似したプロモーター認識特異性を有するが生存に必須でないシグマ因子（グループ２）、主要型シグマ因子とプロモーター認識特異性の異なるその他のシグマ因子（グループ３）に分別されるが、ＳｉｇＥは、グループ２シグマ因子に該当する。
【００４１】
藍藻由来ｓｉｇＥ遺伝子の具体例として、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３由来のｓｉｇＥ遺伝子の塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。上記ｓｉｇＥ遺伝子には、配列番号３の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子も包含される。配列番号３の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、配列番号３と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性又は同一性を有する塩基配列からなり、ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、本発明においてｓｉｇＥ遺伝子には、そのホモログやオルソログも包含される。
【００４２】
藍藻由来ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子ＳｉｇＥには、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質も包含される。配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質としては、配列番号４と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子の活性を有するタンパク質が挙げられる。また、配列番号４のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子の活性を有するタンパク質も、ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子ＳｉｇＥに包含される。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、通常２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
【００４３】
藍藻においてｒｒｅ３７遺伝子やｓｉｇＥ遺伝子を過剰発現させる方法としては、例えばｒｒｅ３７遺伝子やｓｉｇＥ遺伝子が過剰発現するような変異を加える方法が挙げられ、当技術分野で公知の方法で実施することができ、特に制限されない。ｒｒｅ３７遺伝子を過剰発現させる方法の具体例としては、ｒｒｅ３７遺伝子を導入する方法、ｒｒｅ３７遺伝子のプロモーターを当該遺伝子を過剰発現させるようなプロモーターと交換する方法、突然変異誘導による方法などが挙げられる。以下、ｒｒｅ３７遺伝子について具体的に説明するが、ｓｉｇＥ遺伝子についても同様である。
【００４４】
遺伝子導入は、ｒｒｅ３７遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターをｒｒｅ３７遺伝子が発現し得るように宿主である藍藻中に導入することにより、又は相同組換えによってゲノム上の任意の位置にｒｒｅ３７遺伝子又はその一部を挿入することにより実施できる。「一部」とは、宿主中に導入された場合にｒｒｅ３７遺伝子がコードするタンパク質を発現することができるｒｒｅ３７遺伝子の一部分を指す。導入するｒｒｅ３７遺伝子は、宿主である藍藻とは別の属や種に由来するものでもよいが、宿主である藍藻と同一の属や種に由来する遺伝子が好ましい。プロモーターの交換は、例えば、相同組換えによってゲノム上のｒｒｅ３７遺伝子プロモーターを目的のプロモーターと交換することにより実施できる。突然変異誘導による方法は、親株を紫外線照射、又は変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で処理した後、ポリヒドロキシアルカン酸を高生産する株を選抜することにより実施できる。
【００４５】
遺伝子導入のために遺伝子を連結するベクターとしては、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、ファージ及びコスミド等が挙げられる。染色体遺伝子との相同組換えによる遺伝子導入では、プラスミドを用いることなく、ＰＣＲ等によって、遺伝子配列の両末端相同組換え部位の遺伝子配列とｒｒｅ３７遺伝子配列を含む線状の遺伝子配列を合成したものを用いることができる。本線状遺伝子は配列の両末端に宿主ゲノム上の遺伝子と相同配列を有し、本相同配列を介して宿主染色体中へ導入される。
【００４６】
上記ベクターにおいては、挿入したｒｒｅ３７遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当なプロモーターを連結することができる。使用するプロモーターは、二酸化炭素を炭素源とする培養において窒素欠乏条件でｒｒｅ３７を発現させるプロモーターであれば制限されず、宿主に応じて当業者が適宜選択すればよい。光合成系ＩＩ反応中心タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、例えばｐｓｂＡＩＩのプロモーター、色素タンパク質フィコシアニンをコードする遺伝子ｃｐｃＡのプロモーター、炭素同化酵素ルビスコサブユニットをコードする遺伝子ｒｂｃＬのプロモーターなどが挙げられる。また、構成的プロモーターを用いてもよい。構成的プロモーターは、宿主細胞内外の刺激と関係なく一定のレベルで構造遺伝子を発現させるプロモーターをいう。構成的プロモーターの例としては、人工合成プロモーターｔｒｃ、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
ベクターには、プロモーター及び目的の遺伝子に加えて、所望により選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。また、導入する遺伝子配列は、選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーの例としては、カナマイシン、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシンなどの薬剤耐性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
【００４８】
遺伝子を連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。好ましくは市販のライゲーションキット、例えばＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）やＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。また、これらのベクターを、必要であればボイル法、アルカリＳＤＳ法、磁性ビーズ法及びそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらにエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
【００４９】
遺伝子の導入は、藍藻とベクター又はＤＮＡ断片とを接触させることにより実施できるが（自然形質転換）、接合法、エレクトロポレーション法等を用いてもよい。
【００５０】
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、このＤＮＡ断片を細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と選択マーカー遺伝子を連結したＤＮＡ断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えを利用して導入することもできる。
【００５１】
上記で得られたｒｒｅ３７遺伝子が過剰発現している藍藻（例えば、形質転換藍藻及び藍藻変異体）を、好ましくは窒素欠乏条件で培養することにより、ポリヒドロキシアルカン酸を生産することができる。藍藻が光エネルギーと二酸化炭素を利用して光合成を行う場合には、二酸化炭素を炭素源として培養することができる。
【００５２】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、ある種の微生物がその体内に蓄積することが知られているポリエステルであり、以下の化学式：
【化１】
0005946080.tif 000002
[式中、Ｒは同一でも異なっていてもよく、炭素数１〜１４の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、ｎは２以上の整数であり、好ましくは１００以上の整数であり、好ましくは１０００００以下の整数である]で表すことができる。
【００５３】
ＰＨＡは自然環境中で分解されることから生分解性プラスチックや生体適合性材料への応用が期待されている。ＰＨＡの具体例として、例えば、以下の化学式で表されるものが挙げられる。
【化２】
0005946080.tif 000003
【００５４】
ＰＨＡのうち、ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ及びＰ（３ＨＢ）とも表される）は、微生物が生産するバイオポリマーとして知られ、微生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待される材料である。ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）は、アセチルＣｏＡから三段階の反応で合成されるポリエステルである。
【００５５】
ポリヒドロキシブタン酸生産能を有する藍藻としては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属藍藻、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属藍藻、例えばＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｒｔｏｐｈｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属藍藻、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＭＡ１９、Ｎｏｓｔｏｃ属藍藻、例えばＮｏｓｔｏｃ  ｍｕｓｃｏｒｕｍなどが挙げられる。
【００５６】
本発明の藍藻の培養方法は、特に制限されないが、好ましくは二酸化炭素を炭素源として、窒素欠乏条件で培養する。培養に用いる培地は、当業者であれば適宜好適なものを選択できるが、例えば、ＢＧ−１１培地、ＭＤＭ培地、ＡＯ培地、ＡＴＣＣ培地、ＣＲＢＩＰ培地、ＳＰ培地などを利用できる。
【００５７】
例えば、本発明の藍藻は、上記ＢＧ−１１培地のような培地で、連続明好気条件で培養を行う。一般に培養温度は２０〜６０℃、好ましくは２５〜５５℃であり、培養液のｐＨは６〜１２、好ましくは７〜１０である。また光強度は２０〜１５０マイクロモルフォトン（１平方メートル、１秒あたり）が好ましく、時間は４〜１６８時間、好ましくは８〜４８時間である。明暗条件で培養することも可能である。
【００５８】
菌体内のＰＨＡ蓄積率を上げるためには、窒素欠乏条件、例えば分離した藍藻菌体を窒素源を制限した培養液、例えば、ＢＧ−１１培地から硝酸ナトリウムを除いた培地にて培養を行うことが好ましい。このようにして藍藻菌体にＰＨＡを生成蓄積させ、このＰＨＡを培養物から採取する。
【００５９】
「培養物」は、例えば、培養した藍藻を含む培養液の他に、培養液の上清、培養細胞若しくは培養菌体、又は、培養細胞若しくは培養菌体の破砕物等を包含する。ＰＨＡが、例えば、菌体内又は細胞内に生産される場合、培養後、菌体又は細胞を破砕することにより単離できる。また、ＰＨＡが、例えば、菌体外又は細胞外に生産される場合、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により培養液から菌体又は細胞を除去することで単離できる。その後、当技術分野で通常用いられる方法を、単独で、又は、適宜組み合わせることによって、培養物からＰＨＡを精製することもできる。精製方法としては、特に制限されず、例えば、ＰＨＡが可溶である有機溶剤にＰＨＡを溶解させて抽出する方法や、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化等させて取り除くことによりＰＨＡを得る方法などが挙げられる。抽出溶媒としては、メタノールなどのアルコール、ヘキサン、クロロホルムなどが挙げられる。例えば、ＰＨＡを培養物から採取する方法として、Ｇ．Ｂｒａｕｎｅｇｇらの方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，２９−３７（１９７８））や、Ｍ．  Ｋａｔｏらの方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−３７０（１９９６））を使用することができる。
【００６０】
本発明により得られる藍藻の乾燥重量あたりのＰＨＡの量は、Ｒｒｅ３７過剰発現株では野生株の１．４〜２．０倍であり、Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株では野生株の１．７〜２．７倍である。したがって、本発明によりＰＨＡ、特にＰＨＢを効率的に生産することが可能になる。
【００６１】
本発明の藍藻を培養することにより、コハク酸を効率的に生産することも可能である。培養及びコハク酸の採取は、上記と同様の方法により実施できる。また、本発明の藍藻を、上記ＢＧ−１１培地のような培地で、明好気条件で培養した後、光を遮断し、例えば窒素ガスでの空気の置換により酸素が実質的に存在しない条件（暗嫌気条件）にすることで、細胞外にコハク酸を放出させ、このコハク酸を培養物から採取することができる。コハク酸が細胞外に放出されることから、その精製を低コストで実施できる。酸素が実質的に存在しない条件とは、酸素濃度が、例えば１％以下、好ましくは０．５％以下、より好ましくは０．２％以下の条件をいう。
【００６２】
また、本発明のｒｒｅ３７遺伝子を過剰発現している藍藻を培養することにより、水素を効率的に生産することも可能である。藍藻は、光合成色素としてクロロフィルａ、フィコビリン、カロテノイドを有し、光合成細菌とは異なって、光合成系ＩおよびIIをもち、水を酸化して酸素を発生する緑色植物型光合成を行う。水素ガスの生成は、光合成によって生じた還元力（およびＡＴＰ）が、二酸化炭素の還元に用いられず、Ｈ+の還元に用いられた場合、または、一旦二酸化炭素の還元によって生成したデンプン等の細胞内貯蔵還元物質の分解によって生じた還元力（およびＡＴＰ）がＨ+の還元に用いられた場合に行われる。通常、藍藻での水素生産において、還元力の供給は、一旦固定された炭素化合物の分解に依存していることが多く、光エネルギーの水素への転換効率の大幅な改善は困難であった。
【００６３】
本発明の藍藻は、嫌気条件及び光照射下で培養することによって水素を効率的に発生させることができる。培養は、例えばＢＧ−１１培地を用い、５０〜８０μｍｏｌフォトン／ｍ２ｓの光照射下、２５〜３５℃で培養を行い、窒素ガスを吹き込んだ後、密閉条件でさらに培養することにより実施できる（明嫌気条件）。本発明の藍藻は、電子供与体と反応させることによってもまた水素を生産させることができる。電子供与体には、メチルビオローゲン、フェレドキシン等が例示される。本発明の藍藻と電子供与体の反応は、本発明の藍藻を濃縮した菌体培養液に対して電子供与体を終濃度１〜１０ｍＭ添加し、ジチオナイトなどを添加することによって嫌気状態にし、２５〜３５℃で反応させる。また、本発明の藍藻は、明嫌気条件下で培養後のものを使用することが水素発生量が増大する上で好ましい。発生した水素の採取は、当技術分野で公知の方法、例えば水上置換法によって実施できる。嫌気条件は、酸素が実質的に存在しない条件であり、例えば、窒素ガスでの空気の置換により達成される。酸素が実質的に存在しない条件とは、酸素濃度が、例えば１％以下、好ましくは０．５％以下、より好ましくは０．２％以下の条件をいう。
【００６４】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）Ｒｒｅ３７過剰発現株の構築
単細胞性シアノバクテリア（単細胞性藍藻）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３（以下Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）細胞を用いて、窒素応答性レスポンスレギュレーターＲｒｅ３７を過剰発現する株を構築した。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３は、パスツール研究所（フランス）から入手可能である（http://www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/en/research/collections/crbip/general-informations-concerning-the-collections/iv-the-open-collections/iv-iii-pasteur-culture-collection-of-cyanobacteria）。ｒｒｅ３７遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に光合成系ＩＩ反応中心タンパク質をコードするｐｓｂＡＩＩのプロモーターを付加し、ゲノム上の影響の少ない領域へ導入した（図１）。具体的には、Ｒｒｅ３７過剰発現株を、以下のとおり作製した。【００６６】
ｒｒｅ３７（ｓｌｌ１３３０）ＯＲＦ領域をＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓのゲノムＤＮＡを鋳型に、ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡）を用いてＰＣＲで増幅した。得られた断片の末端をＮｄｅＩとＨｐａＩ（タカラバイオ）で切断し、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ過剰発現用のベクターｐＴＫＰ２０３１ＶのＮｄｅＩ−ＨｐａＩ領域に導入した。ライゲーションには、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いた。完成したプラスミド（ｐＴＫＰ２０３１Ｖ−ｒｒｅ３７）の配列は、シークエンシングで確認した。【００６７】
形質転換は以下の通りに実施した。Ａ７３０＝２〜３の濃度のＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓの野生株（ＧＴ株）の培養液２００μｌに、ｐＴＫＰ２０３１Ｖ−ｒｒｅ３７を約１００ｎｇ加え、ＢＧ−１１培地プレート上の混合セルロースメンブレン（メルクミリポア）に塗布した。シアノバクテリア用インキュベータ内で１日培養した後、メンブレンを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んだＢＧ−１１培地プレートに移し、約３週間培養した。得られたコロニーを、同濃度のカナマイシンを含んだＢＧ−１１培地プレートで３回植継ぎ、Ｒｒｅ３７過剰発現株を確立した。ＢＧ−１１培地組成は以下のとおりである。
【表１】
0005946080.tif 000004
【００６８】
以下、ＢＧ−１１液体培地では、１７．６５ｍＭ  ＮａＮＯ３を除き、５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを窒素源とした。アンモニア源を使い切らせるか、窒素源を除いた培地にフィルターで回収した細胞を再懸濁することにより、窒素欠乏条件とした。【００６９】
得られた過剰発現株（ＲＯＸ３７０）と親株（ＧＴ）について、Ｒｒｅ３７のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲにより（図２）、及びタンパク質量をウエスタンブロットにより測定した（図３）。Ｒｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）では、親株に比べて、Ｒｒｅ３７のｍＲＮＡ量及びタンパク質量が大幅に増加していた。【００７０】
また、Ｒｒｅ３７過剰発現株では、窒素充足時又は窒素欠乏時に、すべてのＰＨＡ合成酵素（ＰｈａＡ、Ｂ、Ｃ及びＥ）が野生株に比べて増加することがわかった。さらに、ＰＨＡ合成酵素に加えて、グリコーゲン分解酵素や解糖系の酵素の発現がｍＲＮＡレベルで増加することがわかった。【００７１】
（実施例２）Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株の構築
単細胞性シアノバクテリア、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６８０３（以下Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）細胞を用いて、Ｒｒｅ３７とＳｉｇＥの二重過剰発現株を以下のとおり作製した。【００７２】
ｐＴＫＰ２０３１Ｖのカナマイシン耐性カセット領域を、ＸｈｏＩとＡａｔＩＩ（タカラバイオ）で除去した。ゲンタマイシン耐性カセット領域を、ｐＶＺ３２２ベクターを鋳型に、ＫＯＤポリメラーゼと特異的プライマー[５’−ＡＡＡＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＴＴＴＴＡ−３’（配列番号５）及び５’−ＡＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＣＴＧＴＴＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＣＴＴ−３’（配列番号６）]を用いて増幅した。得られた断片をＸｈｏＩとＡａｔＩＩで切断し、ｐＴＫＰ２０３１ＶのＸｈｏＩ−ＡａｔＩＩ領域に導入した。完成したプラスミドをｐＴＧＰ２０３１と名付けた。【００７３】
ＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓグリコーゲンシンターゼｇｌｇＡ（ｓｌｌ０９４５）の翻訳開始点＋１〜＋１１８０塩基の領域を、ＫＯＤポリメラーゼと特異的プライマー[５’−ＴＴＣＣＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣ−３’（配列番号７）及び５’−ＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＡＧＧＡＴＣＧＴＡＧＡＡ−３’（配列番号８）]を用いて増幅した。得られた断片をＳｐｈＩとＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵＣ１１９ベクター（タカラバイオ）のＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ領域に導入した。得られたプラスミドをＡｐａＩで切断し、この場所に、ゲンタマイシン耐性カセット、ｐｓｂＡＩＩプロモータ、ＮｄｅＩ−ＨｐａＩクローニングサイトを含む領域を、ｐＴＧＰ２０３１を鋳型にＫＯＤポリメラーゼと特異的プライマー[５’−ＴＴＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号９）及び５’−ＡＴＣＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＴＴＡＡＣ−３’（配列番号１０）]によって増幅した断片を導入した。得られたプラスミドをｐＴＧＰ０９４５と名付けた。【００７４】
ｓｉｇＥのＯＲＦ領域を、ＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓゲノムＤＮＡを鋳型に、ＫＯＤポリメラーゼと特異的プライマーを用いて増幅した[５’−ＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＡＴＡＴＧＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号１１）及び５’−ＡＡＡＧＧＧＧＴＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＣＣＴＴＴＧＡＧ−３’（配列番号１２）]。得られた断片をＮｄｅＩとＨｐａＩで切断した後、ｐＴＧＰ０９４５のＮｄｅＩ−ＨｐａＩ領域に導入した。完成したｐＴＧＰ０９４５−ｓｉｇＥプラスミド（図４）を、形質転換によってＲｒｅ３７過剰発現株に導入した。形質転換は、上記と同様だが、カナマイシンの替わりに、３μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含んだプレートを用いた。【００７５】
（実施例３）細胞バイオマスの測定
実施例１で作製したＲｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）、実施例２で作製したＲｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）及び野生株（ＧＴ）について、細胞を窒素欠乏状態にし、細胞バイオマスを調べた。窒素源のない培地に異なる濃度の塩化アンモニウムを窒素源として加え、これを使い切らせることにより窒素欠乏状態にした。本実施例では、３段階の初期塩化アンモニウム濃度（２、３、５ｍＭ）で９日間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を、−８０℃で３日間凍結乾燥し、その重量を細胞バイオマスとした。【００７６】
塩化アンモニウム濃度が増加するにつれ、細胞バイオマスが増加したが、Ｒｒｅ３７過剰発現株の細胞バイオマスは、全ての条件で野生株と同等だった。Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株では、細胞の乾燥重量が増加し、野生株に比べ、約２０％増加することが分かった（図５）。【００７７】
（実施例４）ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）生産量の測定
実施例１で作製したＲｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）、実施例２で作製したＲｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）及び野生株（ＧＴ）について、ポリヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）の細胞内蓄積量を測定した。ＰＨＢ定量には、２段階の初期塩化アンモニウム濃度（３、５ｍＭ）を使用した以外は実施例３と同様に培養した細胞を用いた。まず細胞を凍結乾燥し、得られた細胞をクロロホルムに懸濁し、４日間７０℃のインキュベートと約５分間の超音波破砕を行った。この破砕液をヘキサン、クロロホルム、メタノール等を用いて抽出・精製し、得られたサンプルの重量をＰＨＢ量とした。【００７８】
培養液１００ｍｌあたりのＰＨＢ量は、野生株では２つの培養条件で０．６〜０．７ｍｇであったのに対し、Ｒｒｅ３７過剰発現株では０．９〜１．２ｍｇであることが明らかになった。Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株では、培養液あたりのＰＨＢ量は、野生株の１．８〜２．８倍に増加していた（図６）。乾燥重量あたりのＰＨＢ量は、Ｒｒｅ３７過剰発現株では野生株の１．４〜２．０倍に増加し、Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株では野生株の１．７〜２．７倍に増加していた（図７）。【００７９】
（実施例５）クエン酸及びコハク酸の生産量の測定
実施例１で作製したＲｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）、実施例２で作製したＲｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）及び野生株（ＧＴ）について、クエン酸及びコハク酸の細胞内蓄積量を測定した。【００８０】
ＢＧ−１１液体培地５０ｍｌで３〜４日間培養し、７０ｍｌのＢＧ−１１０（窒素源の入っていない培地）＋５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌに、Ａ７３０＝０．２となるように、遠心して回収した前培養の細胞を加えた。９日間培養した後、培養した細胞を回収した。【００８１】
回収した細胞を次のとおり前処理した。細胞を６０％メタノール（４８０μｌ）＋５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３水溶液（内標）１２０μｌに懸濁し、シェーカーで振りながら抽出した（低温室のシェーカーで、強さ３０、１５分）。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分）し、上清５００μｌを５ｋＤａカットオフフィルターでろ過した（１５０００ｒｐｍ、４℃、約９０分）。全量をドライアップし（６５℃、３時間）、移動相（３ｍＭ  ＨＣｌＯ４溶液）４００μｌに溶解した。【００８２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ＬＣ−２０００  Ｐｌｕｓ（日本分光）により、Ａ４４０の吸収により、クエン酸及びコハク酸を定量した。標準物質の保持時間と比較して、物質を同定し、内標のＮａ２ＣＯ３で補正した。高速液体クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである。【００８３】
移動相：３ｍＭ過塩素酸水溶液
反応液：０．２ｍＭ  ＢＴＢ、１５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＳｐａｋ  ＫＣ−８１１ｘ２
結果を図８に示す。Ｒｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）、特にＲｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）において、野生株と比較してコハク酸生産量の顕著な増大が見られた。【００８４】
（実施例６）水素生産量の測定
実施例１で作製したＲｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）及び野生株（ＧＴ）を培養した場合の水素生産量を測定した。培養は、すべて３０℃、白色光５０〜８０μｍｏｌフォトン／ｍ２ｓで実施した。【００８５】
Ｒｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）及び野生株を、ＢＧ−１１液体培地５０ｍｌで３〜４日間培養し、７０ｍｌ  ＢＧ−１１０（窒素源の入っていない培地）＋１ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌに、Ａ７３０＝０．２となるように、遠心して回収した前培養の細胞を加えた。３日間培養し、培養した細胞を回収し、新しい１０ｍｌのＢＧ−１１０培地にＡ７３０＝１．０となるように細胞を再懸濁した。ガラスのガスクロバイアル瓶に入れ、ブチルゴムで密栓した。テルモシリンジを２本差し、片方からＮ２ガスを吹き込み、１時間経過後、Ｎ２ガスを止め、シリンジを抜いた。密閉したまま１日間振盪培養し、ＧＣ−ＴＣＤ（ＧＣ−２０１４  Ｐｌｕｓ  ＡＴ、島津）で、バイアル内のＨ２濃度を測定した。【００８６】
結果を図９に示す。Ｒｒｅ３７過剰発現株（ＲＯＸ３７０）において、野生株と比較して水素生産量の増大が見られた。【００８７】
（実施例７）コハク酸の生産量の測定
実施例２で作製したＲｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）及び野生株（ＧＴ）について、嫌気・暗条件での培養液中のコハク酸量を測定した。【００８８】
まず、各藍藻株を、７０ｍｌのＢＧ-１１培地で好気・明条件、３０℃で培養した。好気培養では、１％ＣＯ２を混合した空気を培養液中に導入した。３日間の培養の後、濁度がＡ７３０＝２０となるように、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）溶液１０ｍｌに細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にブチルゴムで蓋をした後、２本の注射針をゴム栓に刺し、一方から窒素ガスを１時間導入した。その後、注射針を抜くことで、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、３０℃で３日間振盪した。培養液を遠心分離にかけることで細胞を分離し、０．４５μｍフィルターで濾過をしながら上清を新しいチューブに移して、凍結乾燥によって内容物を固化させた。これを過塩素酸に懸濁し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、分析した。定量は、ブロモチモールブルーを用いたポストラベル法によって行った。【００８９】
結果を図１０に示す。Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥ二重過剰発現株（Ｒｒｅ３７／ＳｉｇＥｏｘ）において、野生株と比較してコハク酸生産量の増大が見られた。【００９０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参照により本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
0005946080.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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