(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプテリジウム（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ）種の細胞培養物から培地中でトリプトリドを生産する方法であって、
（ｉ）  バイオマス成長条件下にて栄養培地におけるカルスから誘導されるトリプテリジウム種の脱分化細胞のバイオマスの生産期、
（ｉｉ）  オーキシンを実質的に含まない除去培地において段階（ｉ）で得られた細胞培養物のホルモン除去期、
（ｉｉｉ）  除去培地で段階（ｉｉ）の細胞に、
ａ）  サイトカイニンおよびジベレリンから選択される植物細胞の少なくとも１種類の細胞分化因子、
ｂ）  ５−クロロサリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸、およびジャスモン酸メチルからなる群から選択される少なくとも１種類のストレッシング剤、および
ｃ）  ファルネソール、ゲラニオール、酢酸ナトリウム、ピルビン酸およびメバロン酸からなる群から選択される少なくとも１種類のテルペン合成経路の前駆体、
を含んでなる誘発カクテルの添加による誘発期、ならびに
（ｉｖ）  段階（ｉｉｉ）の終了時における培地からのトリプトリド冨化抽出物の調製
段階を含んでなる、方法。
【請求項２】
植物細胞の細胞分化因子が、サイトカイニンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ストレッシング剤が、５−クロロサリチル酸、アセチルサリチル酸またはサリチル酸、およびジャスモン酸メチルからなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
除去培地が、オーキシンを含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
除去培地が、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）またはナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ホルモン除去段階（ｉｉ）が、５〜１５日間継続する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ホルモン除去段階（ｉｉ）が、７日間継続する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
誘発期（ｉｉｉ）が、１５〜３５日間継続する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
誘発期（ｉｉｉ）が、２０〜２５日間継続する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
バイオマス産生期（ｉ）が２７〜２８℃にて１０〜３０日間撹拌しながら進行する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のトリプトリド産生の方法。
【請求項１１】
誘発カクテルが、ベンジルアミノプリン、５−クロロサリチル酸、アセチルサリチル酸またはサリチル酸、ジャスモン酸メチル、ファルネソールおよびゲラニオールを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のトリプトリド産生の方法。
【請求項１２】
段階（ｉｉｉ）の後の培養物上清のトリプトリド濃度が培地１Ｌ当たり５０ｍｇを上回る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のトリプトリド産生の方法。
【請求項１３】
段階（ｉｖ）が液／液抽出である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のトリプトリド産生の方法。
【請求項１４】
トリプテリジウム種の細胞培養のための誘発カクテルの使用であって、誘発カクテルが
ａ）  サイトカイニンおよびジベレリンから選択される植物細胞の少なくとも１種類の細胞分化因子、
ｂ）  ５−クロロサリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸、およびジャスモン酸メチルからなる群から選択される少なくとも１種類のストレッシング剤、および
ｃ）  ファルネソール、ゲラニオール、酢酸ナトリウム、ピルビン酸およびメバロン酸からなる少なくとも１種類のテルペン合成経路の前駆体
を含んでなる、使用。
【請求項１５】
誘発カクテルが、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）０．７〜３ｍｇ／ｌ、５−クロロサリチル酸（５−クロロＳＡ）３〜５ｍｇ／ｌ、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）３３〜４５ｍｇ／ｌ、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）２２．４〜２４ｍｇ／ｌ、ゲラニオール２０〜３０ｍｇ／ｌおよびファルネソール（Ｆ−ＯＨ）１９〜３０ｍｇ／ｌを含んでなり、ｍｇ／ｌは、培地１Ｌ当たりのｍｇを表す、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
活性成分としてのトリプトリドまたはトリプトリド冨化抽出物と、１種類以上の皮膚美容上および／または皮膚科学上許容可能な賦形剤とを含んでなる、掻痒症の治療に使用するための皮膚美容または皮膚科学組成物。
【請求項１７】
トリプトリド冨化抽出物が、トリプテリジウム種の脱分化細胞のイン・ビトロ培養物の培地から抽出することによって得られる、請求項１６に記載の皮膚美容または皮膚科学用組成物の製造方法。
【請求項１８】
トリプトリド冨化抽出物が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られる、請求項１７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、トリプテリジウム属（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ）の一種、例えばトリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の細胞懸濁培養物からトリプトリドを製造する方法に関する。
【０００２】
ジテルペントリエポキシドであるトリプトリドは、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）から精製される化合物である。この植物は、自己免疫疾患や炎症性疾患、特に関節リウマチの治療のための伝統的漢方薬において４世紀以上にわたって使用されてきている。最近では、トリプトリドの強力な抗癌活性も発見されている。抗増殖およびアポトーシス促進活性が、イン・ビトロおよびイン・ビボにおいて様々な種類の癌細胞で示された。臨床試験が、関節リウマチおよび進行期癌、例えば白血病の治療を研究するために開始された。最近の公表文献（Brinker AM et al., Phytochemistry 68 (2007) 732-766）には、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）由来のトリプトリドおよびその誘導体の薬理特性が要約されている。
【０００３】
【化１】
0005951491.tif 000002
【０００４】
トリプトリドは、植物の樹皮および気部に極少量含まれるが、根にはそれ以上の量（平均濃度＝１０ｐｐｍ）で天然に存在するジテルペンのファミリーに属する二次代謝物である。
【０００５】
トリプトリドの化学合成は、ざっと２０段階を含んでなる工程の実行が必要であるため、極めて困難である。
【０００６】
現在は、トリプトリドは、Ｐｈａｒｍａｇｅｎｅｓｉｓ社によって提供されている。トリプトリドは、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の根の抽出および２段階のクロマトグラフィーによる精製によって製造される。この方法は、長くて複雑である。
【０００７】
根からの抽出／精製収率は、例えば０．０００５％である。
【０００８】
この植物が十分に成長した後に収穫するまでには１０〜１５年かかり、成長した植物からトリプトリドを生産することは、この植物の破壊をもたらす。従って、環境に優しく維持可能な開発に関しては、目的の化合物の工業生産に好適な収率を可能にするトリプトリド生産の代替法を提供する必要がある。
【０００９】
Kutney JP at al.は、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の葉細胞懸濁培養物の調製方法、および前記培養物からトリプトリドおよびその誘導体を分離する方法を開示している（Can J Chem 58 (1981): 2677-2683）。しかしながら、生産収率は伝統的方法の収率より低いくらいである。
【００１０】
２００９年２月４日に公表された特許出願ＣＮ１０１３５８１８０Ａ号明細書には、幹細胞懸濁培養物の製造方法が記載されている。これらの細胞は、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の根から生じたものである。前記のトリプトリド生産は、１日当たり０．０２７ｍｇ／ｌに達した。この特許の著者らは、とりわけ細胞増殖培地を含んでなる方法、すなわちトリプトリド産生培地および総アルカロイド産生培地からなる方法を記載している。しかしながら、前記出願明細書では、本発明において記載されているように、テルペン生合成前駆体の非生物的誘発剤またはホルモン除去段階（ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）は用いられていない。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の気部の幹細胞からトリプトリドを工業生産に好適な高収率で製造する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、この特に有利な収率を達成することができるようにした培地も提供する。
【００１３】
実際に、本発明者らは、驚くべきことに、１日当たり培養物１Ｌ（リットル）当たり３ｍｇのトリプトリド収率を観測した。この収率は、特許出願ＣＮ１０１３５８１８０Ａ号明細書に記載されている最良の総収率より１１０倍高く、上清での最良の収率より７３倍高く、乾燥バイオマスの重量百分率に比較してトリプトリドの重量百分率で表した最良の収率より１２７倍高い。
【００１４】
驚くべきことには、本発明者らは、前記方法によって得られたトリプトリド冨化抽出物は、純粋なトリプトリドと同等な方法でＴＮＦαによる転写因子ＮＦκＢの活性化を阻害することも示した。
【００１５】
本発明者らは、本発明の方法によって得られたトリプトリド冨化抽出物が、純粋なトリプトリドより効果的にリポ多糖類によって誘導されるＮＯ２−の生成を阻害することも示した。
【００１６】
本発明者らは、本発明の方法によって得られたトリプトリド冨化抽出物が、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ−２）のトリプシンによる特異刺激によって誘導される細胞内カルシウムの流入を阻害することを示した。
【００１７】
これら３種類の試験により、本発明の方法によって得られたトリプトリド冨化抽出物の抗炎症活性が確認される。
【００１８】
この活性は、アトピー性皮膚炎および乾癬のモデルにおいてＰＣＲアレイを用いて確認されている。
【００１９】
従って、本発明は、トリプテリジウム属（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ）の一種、例えば、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）、トリプテリジウム・レゲリィ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｒｅｇｅｌｉｉ）またはトリプテリジウム・ヒポグラウクム（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｈｙｐｏｇｌａｕｃｕｍ）、またはセラストラセアエ（Ｃｅｌａｓｔｒａｃｅａｅ）科の植物の気部の細胞懸濁培養物からトリプトリドを製造する方法に関する。本発明の一態様では、トリプトリドの製造方法は、気部、例えば幹、葉柄、葉および／または花部の細胞懸濁培養物から行われる。
【００２０】
本発明は、
（ｉ）  例えば、バイオマス成長条件下にて増殖するための１または数種類の栄養培地における、例えばカルスから誘導されるトリプテリジウム（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ）種の脱分化細胞のバイオマスの生産期、
（ｉｉ）  オーキシンを実質的に含まない除去培地において段階（ｉ）で得られた細胞培養物のホルモン除去期、
（ｉｉｉ）  除去培地で段階（ｉｉ）の細胞に誘発カクテル（ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）の添加による誘発期、
（ｉｖ）  段階（ｉｉｉ）の終了時における培地からのトリプトリド冨化抽出物の調製
の段階を含んでなる、トリプテリジウム（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ）種の細胞培養物から培地中でトリプトリドを生産する方法に関する。
【００２１】
誘発期は、段階（ｉｉ）で生成された分離バイオマスを含む除去培地に誘発カクテルを添加した後培養することに基づいており、トリプトリド産生は前記培地で起こる。従って、本発明の文脈における誘発期は、トリプトリド産生期に相当する。
【００２２】
本発明によれば、本発明の方法で用いられる誘発カクテルは、
ａ）  植物細胞の少なくとも１種類の細胞分化因子、例えば、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、アブシシン酸、カイネチン、チジアズロン、６−γ−γ−ジメチルアリルアミノプリン、ゼアチンまたはイソペンテニルアデニンなどから選択されるサイトカイニン、またはジベレリン、
ｂ）  少なくとも１種類のストレッシング剤（ｓｔｒｅｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えば非生物的誘発剤、および
ｃ）  少なくとも１種類のテルペン合成経路、例えばトリプトリド合成経路の前駆体、例えばゲラニオール、ファルネソールおよびそれらのピロリン酸形態、酢酸ナトリウム、ピルビン酸またはメバロン酸
を含んでなる。
【００２３】
優先的には、本発明の方法の段階（ｉ）は、
（α）  細胞脱分化インデューサーを含んでなる寒天培地で培養することによってトリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の気部由来の組織の外植片からカルスを誘導し、
（β）  段階（ｉ）で得られたカルス細胞を増殖培地に懸濁して、懸濁細胞を増殖させる
段階によって先行する。
【００２４】
「気部」とは、地面より上にある植物の部分、例えば葉、幹、葉柄および／または花部を指す。
【００２５】
本発明によれば、前記の方法は、種子および根のような植物の任意の他の部分に応用することもできる。
【００２６】
本発明の方法の段階（α）は、組織外植片、例えばトリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の気部の外植片、例えば大きさがおよそ１ｃｍ２の葉から、脱分化インデューサーを含んでなる寒天培地で培養してカルスを生成することからなる。
【００２７】
本発明の一態様によれば、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の（複数の）気部は、葉、幹、葉柄および／または花部を包含する。
【００２８】
「カルス」とは、幹細胞とも呼ばれる脱分化細胞のクラスターを指す。
【００２９】
脱分化培地は、例えば、
例えば、６０００ｍｇ／ｌまでの濃度で、ＮＨ４ＮＯ３、ＫＮＯ３、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４などから選択した少なくとも１種類の多量栄養素、
例えば、前記培地に培地の２００ｍｇ／ｌまでの総微量栄養素濃度で、ＫＩ、Ｈ３ＢＯ３、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏなどの少なくとも１種類の微量栄養素、
例えば、３ｇ／ｌまでの培地中の濃度で、ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン−ＨＣｌまたはチアミン−ＨＣｌなどの少なくとも１種類のビタミン、
例えば、培地の３ｇ／ｌまでの濃度で、少なくとも１種類のアミノ酸、例えばグリシン、
例えば、培地の２０〜７０ｇ／ｌ、例えば３０ｇ／ｌの濃度で、スクロースなどの少なくとも１種類の炭素源、
例えば、培地の０．００１〜１０ｍｇ／ｌ、例えば培地の０．１〜３ｍｇ／ｌの濃度で、少なくとも１種類のホルモン、好ましくは植物ホルモンまたは成長因子、好ましくは植物成長因子または成長調節因子、好ましくは植物成長調節因子、例えば、カイネチン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）またはナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
を含んでなる培地である。
【００３０】
脱分化培地の組成およびその使用は、実施例に示す。
【００３１】
前記培地のｐＨを、例えばｐＨ６±０．５に調整し、それを１２１℃にて少なくとも２０分間オートクレーブ処理を行うか、または０．２μｍで濾過する。
【００３２】
インキュベーションは、暗所で例えば約２５〜３０℃、例えば２７℃または２８℃の温度で行うことができる。
【００３３】
脱分化培地は、例えば固体培地、例えば寒天を８〜１２ｇ／ｌ、例えば８ｇ／ｌ添加することによってゲル化した固体培地である。
【００３４】
本発明の方法の段階（β）は、第一段階で得られたカルス由来の脱分化細胞を液体培地に懸濁し、懸濁液の細胞を増殖させることからなる。培養は、例えば約２７℃の温度で１０〜３０日間、例えば１５〜２０日間行う。培養は、暗所で撹拌しながら行う。
【００３５】
この段階（β）の培地は、例えば細胞増殖培地、例えばｐＨ６に調整し、１２１℃で少なくとも２０分間オートクレーブ処理するか、または０．２μｍで滅菌濾過によって滅菌した細胞増殖培地である。
【００３６】
細胞増殖培地は、
例えば、６０００ｍｇ／ｌまでの濃度で、ＮＨ４ＮＯ３、ＫＮＯ３、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４などから選択した少なくとも１種類の多量栄養素、
例えば、培地の２００ｍｇ／ｌまでの前記培地中の総微量栄養素濃度で、ＫＩ、Ｈ３ＢＯ３、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏなどの少なくとも１種類の微量栄養素、
例えば、培地の３ｇ／ｌまでの濃度で、ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン−ＨＣｌ、チアミン−ＨＣｌなどの少なくとも１種類のビタミン、
例えば、３ｇ／ｌまでの培地中の濃度で、少なくとも１種類のアミノ酸、例えばグリシン、
例えば、３０ｇ／ｌの濃度で、スクロースなどの少なくとも１種類の炭素源、
例えば、培地の０．００１〜１０ｍｇ／ｌ、例えば０．１〜３ｍｇ／ｌの濃度で、少なくとも１種類のホルモン、好ましくは植物ホルモンまたは成長因子、好ましくは植物成長因子または成長調節因子、好ましくは植物成長調節因子、例えばカイネチン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
を含んでなる培地である。
【００３７】
増殖培地の例およびその使用は、実施例において提供する。
【００３８】
増殖培地は、例えば、例２の培地である。
【００３９】
本発明の代替態様によれば、脱分化（α）および／または増殖（β）の両段階は、増殖培地または脱分化培地で行うことができる。
【００４０】
本発明の方法の段階（ｉ）は、好適な栄養培地、例えば前記の増殖培地で、脱分化細胞、例えば段階（β）で得られた懸濁液の細胞からのバイオマスの産生からなる。これは、１０〜３０日間継続する。これは、好ましくは２７〜２８℃で行う。
【００４１】
この段階中に、細胞は、定期的に、例えば７〜１０日毎に移植または増殖させる。移植は、細胞培養物の一部を新たな培地で希釈することにある。例えば、培養物の１／５を、初期の培養物の容積に相当する容積の新たな培地に懸濁させる。これにより、細胞系を液体培地で保持することができる。
【００４２】
同様に、バイオマスの量を、全培養物を用いて新たな栄養培地に、最終培養容積の約１／５の接種物を接種することによって増加させることができる。
【００４３】
本発明の方法の段階（ｉｉ）は、例えば、５〜１５日間、例えば約７日間のホルモン除去段階からなる。
【００４４】
ホルモン除去の目的は、成長ホルモン２，４−Ｄおよび／またはＮＡＡのようなオーキシンを除去することである。この段階により、細胞の代謝的同期、すなわち、テルペン生合成経路の抑制解除を得ることができる。
【００４５】
ホルモン除去培地は、オーキシンを含まない、例えば２，４−ＤおよびＮＡＡを含まない培地であるか、またはオーキシンを実質的に含まない培地、例えば２，４−ＤおよびＮＡＡがそれぞれ培地の０．０１ｍｇ／ｌを下回る濃度で含まれている培地である。
【００４６】
除去培地は、下記の組成、
例えば、７０００ｍｇ／ｌまでの濃度で、ＮＨ４ＮＯ３、ＫＮＯ３、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４またはピルビン酸ナトリウムなどから選択した少なくとも１種類の多量栄養素、
例えば、培地の２００ｍｇ／ｌまでの前記培地中の総微量栄養素濃度で、ＫＩ、Ｈ３ＢＯ３、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏなどの少なくとも１種類の微量栄養素、
例えば、培地の６０ｍｇ／ｌまでの濃度で、ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン−ＨＣｌ、チアミン−ＨＣｌまたはグリシンなどの少なくとも１種類のビタミン、
例えば、２０〜７０ｇ／ｌ、例えば３０ｇ／ｌの濃度で、スクロースなどの少なくとも１種類の炭素源、
例えば、培地の０．００１〜１０ｍｇ／ｌ、例えば１〜３ｍｇ／ｌの濃度で、少なくとも１種類のホルモン、好ましくは植物ホルモンまたは成長因子、好ましくは植物成長因子または成長調節因子、好ましくは植物成長調節因子、例えばカイネチンまたはインドール−酪酸（ＩＢＡ）
を有する。
【００４７】
本発明の除去培地は、例えば、組成が例３に示されている除去培地である。培地のｐＨは、例えばｐＨ６±０．５に調整され、好適な手段によって滅菌される。
【００４８】
本発明の方法の段階（ｉｉｉ）の誘発期により、除去された細胞培養物からトリプトリド産生を誘発することができる。誘発期は、トリプトリド産生期でもある。それは、１５〜３５日間、例えば２０〜２５日間継続する。
【００４９】
本発明者らは、細胞分裂とトリプトリド産生は同時には起こらないことを実際に観察した。驚くべきことには、それらは両立しないことさえある。この問題を解決するために、本発明者らは、ホルモン除去段階および誘発剤のカクテルを開発し、細胞分裂を停止し、細胞ストレスを誘導することにより、トリプトリド産生を引き起こす生化学的防御経路を活性化し、テルペン生合成経路の前駆体を提供した。
【００５０】
本発明によれば、前記カクテルはオーキシンを含まず、例えば、前記カクテルは２，４−Ｄを含まないか、またはＮＡＡを含まないか、または２つの生成物のいずれをも含まない。
【００５１】
本発明の一態様によれば、前記カクテルは、
１）  少なくとも１種類の植物細胞の細胞分化因子、例えばサイトカイニンまたはジベレリン、例えばベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、
２）  化学的または「無生物」起源などの少なくとも１種類のストレッシング剤（ｓｔｒｅｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）または「誘発剤」、例えば５−クロロサリチル酸（５−クロロＳＡ）、サリチル酸、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）および／またはジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）、
３）  テルペン合成の少なくとも１種類の前駆体、例えば、ファルネソール、ゲラニオール、酢酸ナトリウム、ピルビン酸またはメバロン酸
を含んでなる。
【００５２】
本発明に関して、サイトカイニンは、例えば、アブシシン酸、ベンジルアミノプリン、ゼアチン、カイネチン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、６−γ−γ−ジメチルアリルアミノプリンまたはジベレリンである。
【００５３】
ＢＡＰは、例えば、培地の０．０１〜５ｍｇ／ｌ、例えば０．５〜５ｍｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００５４】
５−クロロサリチル酸（５−クロロＳＡ）は、例えば、培地の０．１〜１５ｍｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００５５】
サリチル酸は、例えば、培地の０．１〜１００ｍｇ、例えば２０〜６０ｍｇ／ｌ、例えば培地の４５ｍｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００５６】
ファルネソールは、培地の１〜１００ｍｇ／ｌ、例えば１５〜３０ｍｇ／ｌ、例えば培地の３０ｍｇ／ｌの濃度で含まれる。
【００５７】
ゲラニオールは、培地の１〜１００ｍｇ／ｌ、例えば２０〜３０ｍｇ／ｌの濃度で含まれる。
【００５８】
ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）は、１〜１００ｍｇ／ｌの濃度で含まれる。
【００５９】
前記の誘発剤カクテルは、細胞を細胞分化、例えば根に再配向する；細胞ストレスを生じることによって化学的防御反応生成物、例えばトリプトリドおよび／またはその誘導体の産生に関与する遺伝子を活性化する；植物細胞にテルペン合成前駆体を供給する、という３種類の作用を有する。
【００６０】
誘発カクテルの組成は、例えば：０．５〜５ｍｇ／ｌ、例えば０．５〜３ｍｇ／ｌ、例えば０．７〜３ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）；２〜６ｍｇ／ｌ、例えば３〜５ｍｇ／ｌ、例えば３ｍｇ／ｌまたは５ｍｇ／ｌの５−クロロサリチル酸（５−クロロＳＡ）；２０〜６０ｍｇ／ｌ、例えば３０〜５０ｍｇ／ｌ、例えば３３ｍｇ／ｌまたは４５ｍｇ／ｌのアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）および／またはサリチル酸；２２．４ｍｇ／ｌのジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）；１９〜４０ｍｇ／ｌのファルネソール（Ｆ−ＯＨ）；および２０〜３０ｍｇ／ｌのゲラニオールであり、ここで、ｍｇ／ｌでの量は、培地１Ｌ当たりのｍｇに相当する。これらは、保存溶液における様々な生成物の濃度ではない。
【００６１】
誘発カクテルは、例えば、ジメチルスルホキシド中で調製した濃縮保存溶液を用いて培地に導入される。
【００６２】
誘発期（ｉｉｉ）は、３〜３０日間、例えば１０〜３０日間、例えば２１〜２４日間行われる。
【００６３】
好ましくは、誘発期（ｉｉｉ）は、暗所で行われる。好ましくは、誘発期は、約２７℃で行われる。好ましくは、誘発期は、撹拌しながら行われる。
【００６４】
第一の実験室規模の態様によれば、懸濁液中の細胞は、容積が約２５０ｍｌの容器、例えば三角フラスコまたは培養ボトル中で培養される。
【００６５】
第二の実験室規模の態様によれば、懸濁液中の細胞は、撹拌しながら純酸素が冨化されている空気が供給されるバイオリアクター中で培養される。培養装置は、例えば２つの相互連結したバイオリアクターを含んでなる。これは、バイナリー培養装置である。一方のバイオリアクターは、タンクまたはバッグバイオリアクターであることができる。バイナリー装置の第一のバイオリアクターは、増殖バイオリアクターである。第二のものは、産生バイオリアクターである。バイオマスは、第一のリアクターと第二のリアクターとの間で移動させることができる。従って、増殖期が行われる第一のリアクターは、第二のバイオリアクターに産生期のためのバイオマスを供給する。それぞれ移動しても、第一の増殖バイオリアクターは細胞懸濁液の一部を保持して、新鮮な増殖培地を用いて増殖段階を再開させる。これは、種培養技術である。第一のバイオリアクターは、小型のバイオリアクターによって前播種し、工業規模での生産に必要な前培養物を供給することができる。
【００６６】
同時に、第一のバイオリアクターからバイオマスを受け取る第二の産生バイオリアクターは、ホルモン除去のための栄養培地または直接第二の代謝物のための産生培地が、場合により補足される。次いで、誘発カクテルが、産生バイオリアクターに導入される。
【００６７】
これらの２種類のタンク培養物は、下記の方法で温度、酸素分圧（ｐＯ２）および二酸化炭素分圧（ｐＣＯ２）が調節される。バイオリアクター温度は、バイオリアクター壁内の閉鎖系を循環している温度制御された水によって保持される。
【００６８】
酸素プローブは、飽和空気で較正され、活性化されたコンピューター化ｐＯ２レギュレーターにリアルタイムでのデータを提供して、曝気装置に滅菌した純酸素を注入することによってｐＯ２を８０％に保持するようにする。このバイオリアクターは、流出ガス（ヘッドスペース）におけるＣＯ２のインライン測定の装置も備えており、コンピューター化ｐＣＯ２レギュレーターにリアルタイムでのデータを提供してｐＣＯ２を６％に保持するようにする。後者は、滅菌大気を酸素と混合して曝気システムに注入することによって達成される。バイオリアクターは、細胞懸濁液を撹拌しかつそれが沈殿物を形成するのを防止するのに十分な一定速度で回転する撹拌ブレード装置も備えている。
【００６９】
本発明の方法は、
培養物生産性が、１日１Ｌ当たり２．７５ｍｇを上回り、
段階（ｉｉｉ）の後の培養物上清のトリプトリド濃度が、５０ｍｇ／ｌを上回り、かつ
乾燥バイオマスの百分率（ｗ／ｗ）でのトリプトリド濃度が、約０．３８５％である
ので、特に有利である。
【００７０】
比較では、文書ＣＮ１０１３５８１８０Ａ号明細書には、１日１Ｌ当たりのトリプトリド０．０４１ｍｇの容積生産性（２０日間の培養では０．８２ｍｇ／ｌ）が記載されている。本発明の方法は、ＣＮ１０１３５８１８０号明細書の方法が数日間で生産するものを約６．５時間で生産する。
【００７１】
本発明の方法の段階（ｉｖ）は、トリプトリドが産生される培地からトリプトリドを抽出することにある。
【００７２】
トリプトリドは、当業者に周知の方法によって、例えば液／液抽出によって培地から抽出することができる。
【００７３】
前記抽出は、純粋なトリプトリドまたはトリプトリド冨化抽出物をもたらす。
【００７４】
本発明の特定態様によれば、段階（ｉｖ）は酢酸イソプロピルによる液／液抽出である。
【００７５】
本発明のもう一つの目的は、前記のような脱分化培地である。
【００７６】
本発明のもう一つの目的は、バイオマスを産生するための増殖培地である。
【００７７】
本発明のもう一つの目的は、ホルモン除去培地である。
【００７８】
本発明のもう一つの目的は、前記の誘発カクテルである。
【００７９】
本発明のもう一つの目的は、トリプテリジウム（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ）種の細胞培養のための前記の誘発カクテルの使用である。
【００８０】
本発明のもう一つの目的は、トリプテリジウム属（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ）の一種、詳細にはトリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の脱分化細胞のイン・ビトロ培養物の培地から抽出によって得ることができるトリプトリド冨化抽出物に関する。優先的には、前記トリプトリド冨化抽出物は、本発明によるトリプテリジウム（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ）種の細胞培養物から培地でトリプトリドを産生する方法によって得ることができる。
【００８１】
本発明のもう一つの目的は、活性成分としてのトリプトリドまたはトリプトリド冨化抽出物と、１種類以上の皮膚美容上および／または皮膚科学上許容可能な賦形剤とを含んでなる皮膚美容または皮膚科学組成物に関する。
【００８２】
皮膚美容上および／または皮膚科学上許容可能な賦形剤は、クリーム、ローション、ゲル、ポマード、エマルション、マイクロエマルション、スプレーなどの形態で局所塗布用の組成物を得るための当業者に知られている任意の賦形剤であることができる。
【００８３】
本発明の皮膚美容用または皮膚科学用組成物は、詳細には、乳化剤、増粘剤、ゲル化剤、水定着剤（ｗａｔｅｒ  ｆｉｘｅｒｓ）、展着剤、安定剤、着色料、香料および防腐剤のような添加剤および処方助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｉｄｓ）を含むことができる。
【００８４】
本発明のもう一つの目的は、活性成分としてのトリプトリドまたはトリプトリド冨化抽出物と、１種類以上の皮膚美容上および／または皮膚科学上許容可能な賦形剤とを含んでなり、皮膚の炎症性疾患、優先的には掻痒症、湿疹、アトピー性皮膚炎および乾癬の治療に用いられる皮膚美容用または皮膚科学用組成物に関する。
【００８５】
本発明のもう一つの目的は、活性成分としてのトリプトリドまたはトリプトリド冨化抽出物と、１種類以上の皮膚美容上および／または皮膚科学上許容可能な賦形剤とを含んでなり、皮膚の炎症性疾患、優先的には掻痒症、湿疹、アトピー性皮膚炎および乾癬の治療を目的とする薬剤を製造するための皮膚科学用組成物の使用に関する。
【００８６】
本発明のもう一つの目的は、薬剤として使用するためのトリプトリド冨化抽出物に関する。
【００８７】
本発明のもう一つの目的は、皮膚の炎症性疾患、優先的には掻痒症、湿疹、アトピー性皮膚炎および乾癬の治療に用いられるトリプトリドまたはトリプトリド冨化抽出物に関する。
【００８８】
本発明のもう一つの目的は、皮膚の炎症性疾患、優先的には掻痒症、湿疹、アトピー性皮膚炎および乾癬の治療を目的とする薬剤を製造するためのトリプトリドまたはトリプトリド冨化抽出物の使用に関する。
【００８９】
本発明のもう一つの目的は、トリプトリドまたはトリプトリド冨化抽出物の皮膚美容上の使用に関する。
【００９０】
下記の図および実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】バイオリアクター培養（バイナリー装置）の例。発酵槽Ａでのバイオマスの増殖、培地の産生発酵槽Ｂへの移動、数週間後、除去、誘発およびバイオマス採取。
【図２】発酵槽Ｂにおける誘発によるトリプトリド（ＰＧ４９０）産生の動態の例。
【図３】空気／純酸素混合制御装置（Ｏ２ＭＩＸ）、溶存酸素分圧（ｐＯ２）測定装置（ＤＯＯＰＴ２０＋ＤＯＯＰＴ−ＰＲＯＢＥ）および１０および２０Ｌの細胞バッグ（２０ＥＨＴキット）を組込むための加熱プレート（温度を２７℃に調節）を備えたディスポーザブルＷＡＶＥ２０／５０ＥＨＴロッカーバイオリアクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【図４】ＷＡＶＥディスポーザブルバイオリアクターでのトリプトリド産生培養の動態。物理化学的パラメーターのフォローアップ：ｐＨ、溶存酸素分圧（ｐＯ２）、スクロース消費、乾燥バイオマス（ＤＷ）の発生、および培養物上清におけるトリプトリド濃度。
【図５】抽出物中のトリプトリド濃度を決定するためのＨＰＬＣ分析。
【図６】ＰＣＣ抽出物によるＮＦκＢ阻害の試験。
【図７】ＬＰＳ１μｇ／ｍｌで刺激したＲＡＷ２６４．７細胞によるＮＯ２−産生に対するＰＣＣ抽出物（ＩＢＯ．１８．１３４）の効果。
【図８】ＰＡＲ−２阻害に対するＰＣＣ抽出物の効果。
【図９】アトピー性皮膚炎モデルに対する化合物の効果。
【図１０】乾癬モデルに対する化合物の効果。
【図１１】細胞毒性試験（ＡＴＰｌｉｔｅおよびＬＤＨアッセイ）。
【実施例】
【００９２】
例１：細胞脱分化プロトコル
カルスは、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の葉の外植片から得られる。
【００９３】
外植片を、７０％エタノールに続いて２．５％活性塩素を含むジ亜塩素酸ナトリウムで殺菌した後、滅菌した脱塩水で洗浄する。場合によっては、外植片を滅菌した脱塩水で洗浄する前に７％過酸化水素で洗浄する。
【００９４】
葉を、例えばそれぞれの辺が約８〜１０ｍｍの正方形のような細片に切断する。葉の外植片を寒天培地上に置き、脱分化誘導（ＭＳＯ培地）および再接種する。
【００９５】
脱分化培地の組成は、下記の通りである。
【００９６】
多量栄養素：  １６５０ｍｇ／ｌ  ＮＨ４ＮＯ３、１９００ｍｇ／ｌ  ＫＮＯ３、４４０ｍｇ／ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３７０ｍｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１７０ｍｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、
【００９７】
微量栄養素：  ０．８３ｍｇ／ｌ  ＫＩ、６．２ｍｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、２２．３ｍｇ／ｌ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、６．６１ｍｇ／ｌまたは８．６ｍｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２５ｍｇ／ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２７．８ｍｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３７．３ｍｇ／ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、
【００９８】
ビタミン：  １００ｍｇ／ｌ  ミオイノシトール、０．５ｍｇ／ｌ  ニコチン酸、０．５ｍｇ／ｌ  ピリドキシン−ＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｌ  チアミン−ＨＣｌ、２ｇ／ｌ  グリシン、
【００９９】
炭素源：  ３０ｇ／ｌスクロース、
【０１００】
ホルモン：  ０．１ｍｇ／ｌ  カイネチン、０．５ｍｇ／ｌ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、１ｍｇ／ｌ  ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）。
【０１０１】
脱分化培地は、８〜１２ｇ／ｌの濃度で寒天を加えてゲル化し、そのｐＨを６±０．５に調整した後、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理を行う。外植片を含むペトリ皿を、２７〜２８℃にて暗所でインキュベーションする。
【０１０２】
得られたカルスを葉の外植片から分離し、新たな脱分化寒天上に置く。カルスを、同じ寒天培地で毎月再接種する。
【０１０３】
例２：増殖および培養培地の処方
数ヶ月間再接種を行い、脆いカルスを得た後、細胞懸濁液の増殖のために最適化した液体培地に移す。
【０１０４】
細胞懸濁液は、増殖培地を含む２００ｍｌ三角フラスコに脆いカルス約４０ｇを入れ、２７〜２８℃にて暗所で１００ｒｐｍに設定した撹拌ミキサー上で１週間インキュベーションすることによって調製する。細胞上清をピペットで集め、残渣のカルスクラスターを残す。得られた細胞懸濁液を１５日間培養した後、１５日毎に新たな培地で１／５倍に希釈することによって増殖させる。増殖培地ＴＷ２Ｈ６上で培養した細胞懸濁液ＮＳ系を生じた。
【０１０５】
増殖培地は、例えば下記の組成を有する。
【０１０６】
多量栄養素：  １６５０ｍｇ／ｌ  ＮＨ４ＮＯ３、２５００ｍｇ／ｌ  ＫＮＯ３、４４０ｍｇ／ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３７０ｍｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１３０ｍｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、
【０１０７】
微量栄養素：  ０．４１ｍｇ／ｌ  ＫＩ、６．２ｍｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、２２．３ｍｇ／ｌ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、７．５ｍｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２５ｍｇ／ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１９．８５ｍｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２６．６４ｍｇ／ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、
【０１０８】
ビタミン：  ５０ｍｇ／ｌ  ミオイノシトール、０．２５ｍｇ／ｌ  ニコチン酸、０．２５ｍｇ／ｌ  ピリドキシン−ＨＣｌ、０．２５ｍｇ／ｌ  チアミン−ＨＣｌ、
【０１０９】
ホルモン：  ０．０８３ｍｇ／ｌ  カイネチン、０．５７５ｍｇ／ｌ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、０．３５０ｍｇ／ｌ  ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、
【０１１０】
炭素源：  ３０ｇ／ｌスクロース。
【０１１１】
培地のｐＨを６±０．５に調整した後、好適な滅菌処理、例えば１２１℃にて少なくとも２０分間のオートクレーブ処理、または０．２μｍでの滅菌濾過を行う。
【０１１２】
三角フラスコを２０〜４０％の容量まで満たし、細胞懸濁液移動（ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）当たりの接種物は容積の２０〜２５％、すなわち、新鮮なバイオマス１Ｌ当たり約５０〜１００ｇである。培養は、このようにして１１０〜１２０ｒｐｍ（回転／分）で軌道撹拌しながら２７〜２８℃にて暗所で１５日間進行する。この段階では、バイオマスは、新鮮なバイオマス約３２０〜３５０ｇ／ｌまでの濃度で存在する。
【０１１３】
増殖は、脱分化培地で起こることもある。
【０１１４】
例３：三角フラスコでのトリプトリド産生
三角フラスコでの産生は、
１．  増殖培地での１５日間の細胞培養、
２．  ７日間のホルモン除去、
３．  約２０日間の誘発によるトリプトリド産生
の３つの期に分けられる。
【０１１５】
前記のように、三角フラスコにおける１５日間のバイオマスの増殖培養が終了したならば、それを沈降させて上清、例えば懸濁液の総容積の１／３を部分的に抜き取り、これを同容積のホルモン除去培地、例えば下記のホルモン除去培地で置換することができる。この除去培地の目的は、増殖培地に含まれるトリプトリド産生阻害剤である成長ホルモン２，４−Ｄの残渣を除去することである。ホルモン除去培地の組成は、下記の通りである。
【０１１６】
多量栄養素：  ２ｇ／ｌ  ＮＨ４ＮＯ３、３ｇ／ｌ  ＫＮＯ３、４４０ｍｇ／ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３７０ｍｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４３ｍｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ  ピルビン酸ナトリウム、
【０１１７】
微量栄養素：  ０．４１ｍｇ／ｌ  ＫＩ、６．２ｍｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、２２．３ｍｇ／ｌ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、７．５ｍｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２５ｍｇ／ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１９．８５ｍｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２６．６４ｍｇ／ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、
【０１１８】
ビタミン：  ５０ｍｇ／ｌ  ミオイノシトール、０．２５ｍｇ／ｌ  ニコチン酸、０．２５ｍｇ／ｌ  ピリドキシン−ＨＣｌ、０．２５ｍｇ／ｌ  チアミン−ＨＣｌ、１ｇ／ｌ  グリシン、
【０１１９】
ホルモン：  １．１ｍｇ／ｌ  カイネチン、２ｍｇ／ｌ  インドール酪酸（ＩＢＡ）、
【０１２０】
炭素源：  ３０ｇ／ｌスクロース。
【０１２１】
ｐＨを６±０．５に調整した後、１２１℃にて２０分間オートクレーブ処理を行う。
【０１２２】
除去は、１１０〜１２０ｒｐｍで軌道撹拌しながら２７〜２８℃にて暗所で７日間この方法で行う。
【０１２３】
除去段階を行ったならば、バイオマスを、ブッフナー濾過装置を用いて乾燥し、新鮮なバイオマス約１００〜２００ｇ／ｌの濃度で新たなホルモン除去培地に接種する。
【０１２４】
誘発カクテルは、例えばジメチルスルホキシドで調製した保存溶液を用いて培地に導入される。カクテル誘発剤の組成は、下記の通りである：  １．２５ｍｇ／ｌ  アブシシン酸（ＡＢＡ）、０．７ｍｇ／ｌまたは３ｍｇ／ｌ  ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、３ｍｇ／ｌまたは５ｍｇ／ｌ  ５−クロロサリチル酸（５−クロロＳＡ）、３３ｍｇ／ｌまたは４５ｍｇ／ｌ  アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）、２２．４ｍｇ／ｌ  ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）、１９ｍｇ／ｌまたは３０ｍｇ／ｌ  ファルネソール（Ｆ−ＯＨ）、および２３ｍｇ／ｌ  ゲラニオール。
【０１２５】
トリプトリド産生は、１２０ｒｐｍで軌道撹拌しながら２７〜２８℃にて暗所で１０〜２１日間この方法で行う。培養が停止したならば、培地を濾過して、トリプトリドの大部分を含んでいる透明な暗色上清を回収する。
【０１２６】
培養物上清のトリプトリド濃度は、培地の５０〜７０ｍｇ／ｌ、例えば４５〜６５ｍｇ／ｌである。
【０１２７】
例４：撹拌タンク式バイオリアクターでのトリプトリド産生
バイオリアクターにおけるトリプトリド産生は、
１．  増殖培地での１５日間の細胞培養、
２．  ７日間のホルモン除去、
３．  誘発による２１日間のトリプトリド産生
の３期に分けられる。
【０１２８】
増殖培地での細胞培養および増殖：
前記のように、三角フラスコでのバイオマスの１５日間の増殖培養が終了したならば、これを接種物として用いて１０Ｌバイオリアクター（リアクターＡ）にて培養する。図１のバイナリー装置を参照。
【０１２９】
２Ｌの接種物を、増殖バイオリアクター（Ａ）に投入する。このバイオリアクターは、２７．５℃で増殖培地８Ｌを含んでいる。
【０１３０】
酸素プローブを、飽和空気中で較正し、活性化されたコンピューター化ｐＯ２レギュレーターにリアルタイムでのデータを提供して、ｐＯ２を５０〜８０％に保持するようにする。このバイオリアクターは、流出ガス（ヘッドスペース）におけるＣＯ２のインライン測定の装置も備えており、コンピューター化ｐＣＯ２レギュレーターにリアルタイムでのデータを提供してｐＣＯ２を６〜８％に保持するようにする。バイオリアクターは、７５ｒｐｍで回転して細胞がリアクターの底に沈降しないようにする撹拌ブレード装置も備えている。
【０１３１】
培養をこれらの物理化学的条件下に１５日間保持して、細胞密度を新鮮なバイオマス１Ｌ当たり３２０ｇのオーダーとなるようにする。
【０１３２】
次いで、このバイオリアクターを、産生バイオリアクター（Ｂ）と呼ばれるもう一つのバイオリアクターに無菌的に連結する。１７００ｇの新鮮なバイオマスの当量（約５．３Ｌ容積）を、ＡからＢに移す。
【０１３３】
増殖バイオリアクターＡには、懸濁液の２Ｌの残余が保持されており、これに増殖培地を８Ｌの容積で投入して、細胞増殖を再開する。
【０１３４】
除去培地での除去および産生：
同時に、産生バイオリアクターＢに除去培地を、容積が１０Ｌおよび細胞密度が１７０ｇ／ｌとなるように補足する。産生バイオリアクターの培養物を４〜６日間この状態に保持して、バイオマスを増殖培地に含まれる微量の成長ホルモン、すなわち２，４−Ｄのようなオーキシンから完全に分離する。次いで、誘発カクテルを産生バイオリアクターＢに導入する。トリプトリド産生を、この状態で１５〜２１日間行う。図２に、タンクＢにおける誘発後（ｔ＝０）のトリプトリド産生の動態追跡の一例を示す。培養が終了したならば、培養物上清を、前濾過段階（１５〜２０μｍ）に続いて０．２μｍでの濾過によって回収する。透明な溶液が得られる。得られたトリプトリド濃度は、細胞外培地では２０〜３５ｍｇ／ｌである。
【０１３５】
このタイプのバイナリー培養は、一層大きな発酵槽（容積が１００Ｌを上回る）にスケールアップすることができる。
【０１３６】
例５：ＷＡＶＥディスポーザブルバッグ式バイオリアクターでのトリプトリド産生
極めて単純かつ廉価な装置を有利に用いるもう一つの方法により、前記の装置、すなわち伝統的なステンレススチール製発酵槽の場合におけるような大規模なメンテナンスおよびクリーニングを必要としないディスポーザブルリアクターに匹敵する収率を得ることができる。撹拌リアクターは、一般に懸濁哺乳類細胞の培養に用いられる。図解例には、例えば、１０Ｌまたは２０Ｌの容積のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから発売されているＷＡＶＥリアクターについて記載されているが、この方法は一層大きな容積および他の製造業者製の装置に適合させかつ応用することができる。
【０１３７】
伝統的なガラス製の実験室用バイオリアクターまたはステンレススチール製の工業用リアクターのための上記したバイナリー装置は、２個のＷＡＶＥバッグと同じ方法で応用される。図３の図解例を参照。
【０１３８】
増殖：
支持体上に置かれたＷＡＶＥバイオリアクターＡ（１０Ｌ）に、インライン滅菌濾過によって栄養培地を満たし、空気で膨張させる。次いで、それを、撹拌インキュベーター中で、１５日間撹拌した三角フラスコ中で調製した前培養物を増殖培地に接種する。
【０１３９】
バイオリアクターは、下記の条件に準じてインキュベーションする：
ロッキング角度：６〜８°、
ロッキング速度：１６〜２０ｒｐｍ、
曝気速度：５０％純酸素冨化空気０．１〜０．１５Ｌ／分、
Ｔ＝２７℃、
期間＝１４日間。
【０１４０】
誘発および産生：
バッグＡからの培養物約５００ｍｌの容積を、トレイ上にバッグＡと並べて置かれているバッグＢ（１０Ｌ）に移す。バッグＡの残り（約２Ｌ）を、２Ｘ除去培地２Ｌで希釈する。撹拌を、Ｔ＝２７℃で継続する。誘発期の培養物を、一定のパラメーターを測定することによって観察する（図４参照）。最高トリプトリド濃度は、１９日間のインキュベーション後には、培養上清１Ｌ当たり５５ｍｇである。トリプトリド産生速度は、培養１日当たり、無細胞上清１Ｌ当たり約２．８７ｍｇである。トリプトリド産生動態は、ほとんど総ての利用可能なスクロースが消費された直後に低下し始める。培養が終了したならば、培養物上清を回収した後、前濾過段階（１５〜２０μｍ）および０．２μｍでの第二の濾過段階を行う。透明な着色した（黄色または藤紫〜桃色）溶液が得られる。
【０１４１】
例６：ＷＡＶＥバイオリアクターでのトリプトリド産生
インキュベーション温度：総ての期（フラスコおよびバイオリアクターでの細胞増殖および誘発）について＋２７℃。
【０１４２】
前培養：
前培養物を、約１５日間培養したもの１００ｍｌを接種した増殖培地ＴＷ２Ｈ６  ４００ｍｌを含む撹拌１Ｌフラスコで調製する。
【０１４３】
【表１】
0005951491.tif 000003
【０１４４】
ＷＡＶＥバイオリアクターでの培養：
接種物５００ｍｌを、滅菌連結を介してディスポーザブルバイオリアクターセットアップに移し、滅菌した栄養培地を満たす。それを、下記の条件に準じてロッカー上でインキュベーションする：
ロッキング角度：６〜８°、
ロッキング速度：１６〜１８ｒｐｍ、
曝気速度：５０％純酸素冨化空気０．１〜０．１５Ｌ／分、
培養期間＝１４日間。
【０１４５】
【表２】
0005951491.tif 000004
【０１４６】
ＷＡＶＥバイオリアクターでの誘発：
この培養物の２Ｌの容積を、２Ｘ濃縮誘発カクテルを含む除去培地２Ｌで希釈することによって誘発させ、インキュベーションを下記の条件下で継続する：
ロッキング角度：６〜７°、
ロッキング速度：１７〜２１ｒｐｍ、
曝気速度：５０％純酸素冨化空気０．１〜０．１５Ｌ／分。
【０１４７】
結果：
誘発による細胞増殖および代謝物産生は、ディスポーザブルバイオリアクター、例えばＷＡＶＥバッグで行った。
【０１４８】
誘発期における培養の進行を、図４に示す。
【０１４９】
誘発期中に、一定のパラメーターを観察する：
【０１５０】
懸濁液における乾燥質量（ＤＷ）：１０日間で、５〜１３ｇ／ｌまで増加し、１０日間停滞した後、おそらく細胞溶解の開始により１０日間で１０ｇ／ｌまで若干減少する。
【０１５１】
ｐＨは、２０日間かなり安定であり（約５．５）、次いで培養の最後の１０日間にわたって７まで漸増する。このｐＨの上昇は、細胞溶解および細胞質内容物の放出による可能性がある。
【０１５２】
酸素分圧（ｐＯ２；培地の酸素飽和率）は、測定時に培地に溶解した酸素の量、従って培地が含むことができる総量（飽和）と細胞によって消費される酸素の量との結果を反映している。
【０１５３】
総スクロース濃度は、最初の１５日間は１日当たり２．７ｇ／ｌの割合で減少する。
【０１５４】
トリプトリド濃度は、１９日間で約５５〜５６ｍｇ／ｌまで増加した後、培養終了までほぼ安定のままである。
【０１５５】
例７：トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）培養上清の液／液抽出によるトリプトリド冨化抽出物ＩＢＯ．１８．１３４の産生
例６で得られたトリプトリドを含む培養上清約３０Ｌを、酢酸イソプロピル１容で抽出する（連続２回）。有機相を濃縮し、ロータリーエバポレーターで乾燥する。ベージュ〜黄色の乾燥物質６５０ｍｇが得られる。ＨＰＬＣアッセイを用いて、抽出物中のトリプトリド濃度を測定する：回収粉末０．６５ｇに含まれるトリプトリド１９５ｍｇ、または乾燥抽出物１ｇ当たりトリプトリド０．３ｇ（図５参照）。
【０１５６】
例８（比較例）：根からのトリプトリド冨化抽出物ＩＢＯ．１８．１３０の産生
トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の根の樹皮を剥いで、乾燥し、粉砕する。次いで、それらを９０％エタノールで抽出する。濃縮後、抽出物に１，２−ジクロロエタンで液／液抽出を行う。塩素化相（ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｐｈａｓｅ）を塩基性溶液（ＮａＯＨ）で洗浄し、濃縮して、シリカ上に吸着させる。このシリカ上の粗製抽出物を、−２０℃で保管する。
【０１５７】
シリカに吸着させたトリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の根を、メタノールで下記の通りに抽出する：メタノール１Ｌ中のシリカ上の粗製抽出物２００ｇ（単回抽出）を、室温にて１時間磁気撹拌下に放置する。次いで、メタノール相を、ロータリーエバポレーターで乾燥させる。茶〜橙色の乾燥物質２５ｇが得られる。ＨＰＬＣアッセイを用いて、抽出物のトリプトリド濃度を測定する：トリプトリド９０ｍｇは、回収粉末２５ｇに含まれているか、または乾燥抽出物１ｇ当たりトリプトリド０．００３６ｇ（図５参照）。
【０１５８】
下記の例９〜１２では、下記のものを比較する：
【０１５９】
１）  （同一トリプトリド（ＴＲＰ）濃度での）純粋なトリプトリドに比較した例７の植物細胞培養（ＰＣＣ）抽出物：
ＮＦκＢ転写の阻害（炎症誘発性および炎症性応答の阻害）、
亜硝酸塩（ＮＯ２）産生の阻害、
ＰＡＲ−２阻害。
【０１６０】
２）  （同一ＴＲＰ濃度での）薬理活性に関する例８の根（Ｒ）抽出物および例７の植物細胞培養（ＰＣＣ）抽出物：
炎症性遺伝子の阻害（アトピー性皮膚炎モデル）、
炎症性遺伝子の阻害（乾癬モデル）。
【０１６１】
３）  ２種類の抽出物ＲおよびＰＣＣのイン・ビトロでの細胞毒性も、比較した。  
【０１６２】
例９：ＰＣＣ抽出物によるＮＦκＢ阻害の試験
転写因子ＮＦκＢは、炎症性応答調節に関与する多数の遺伝子の発現を制御する。ある種の炎症誘発性刺激、例えば腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）は、ＮＦκＢ活性化すなわちその核転座を生じる。従って、ＮＦκＢは、サイトカイン、ケモカイン、接着分子、成長因子およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）および一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）のような誘導酵素をコードする炎症誘発性遺伝子の転写を誘導する。ＮＦκＢは、炎症性応答の開始および増幅に重要な役割を果たす。皮膚のある種の慢性炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎または乾癬は、ケラチン生成細胞によって発現される炎症メディエーターのディレギュレーションを特徴とする。同等量のトリプトリド（ＴＲＰ）を有する植物細胞培養抽出物（ＩＢＯ．１８．１３４）に対する純粋なトリプトリド（ＴＲＰ）の抗炎症活性を評価する。
【０１６３】
結果：
図６は、ＨａＣａＴケラチン生成細胞におけるＴＮＦα刺激に続くＮＦκＢ活性化に対する様々な抽出物の阻害を表す。ポジティブコントロールとして、ＮＦκＢ活性化を３６％だけ阻害するデキサメタゾン（２μΜ）を用いた。純粋なトリプトリドは、８ｎＭ〜８３ｎＭまで用量依存的に阻害する。
【０１６４】
８ｎＭ、２８ｎＭおよび８３ｎＭの同一トリプトリド濃度では、ＰＣＣおよびＴＲＰによるＮＦκＢ阻害は同等である。  
【０１６５】
例１０：ＬＰＳ  １μｇ／ｍｌで刺激したＲＡＷ２６４．７細胞によるＮＯ２−産生に対するＰＣＣ抽出物（ＩＢＯ．１８．１３４）の効果
この研究の目的は、ＰＣＣ抽出物（ＩＢ−１３４）と純粋なトリプトリドの抗炎症活性を比較することであった。
【０１６６】
この目的のために、選択した試験は、リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激したＲＡＷ２６４．７細胞によるＮＯ２−産生であった。
【０１６７】
簡単に説明すれば、ＲＡＷ２６４．７細胞（マウスマクロファージ）を、１．４・１０５細胞／ｃｍ２で播種した。２４時間後、細胞を様々な濃度の試験を行う生成物と共にインキュベーションした後、ＬＰＳ  １μｇ／ｍｌで２４時間刺激した。ＮＯ２−濃度を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を用いて培養物上清で評価した。
【０１６８】
結果（図７）は、上記した様々な条件下で得られたＮＯ２−産生を例示している。ＬＰＳコントロールに関して計算した百分率阻害は、それぞれのヒトスグラムに表れる。最後に、ＩＣ５０を、これらの値から計算した（太青色）。
【０１６９】
得られたデータは、同一ＴＲＰ濃度で試験した条件下では、ＰＣＣ抽出物（ＩＢＯ．１８．１３４）およびＴＲＰは、ＬＰＳによって誘導される亜硝酸塩産生を阻害し、ＰＣＣによる阻害の方が若干高いことを示している。
【０１７０】
ＩＣ５０値は、ＰＣＣがＴＲＰより大きいことを示している。ＰＣＣ抽出物は、ＮＯ２−阻害に関して純粋なトリプトリドより活性であることが示されている（図７参照）。  
【０１７１】
例１１：ＰＡＲ−２阻害に対するＰＣＣ抽出物の効果
プロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）は、炎症性応答を含む様々な疾患の生理病理学と関連している。
【０１７２】
ＰＡＲ−２は、Ｇ−タンパク質にカップリングした７−膜貫通ドメイン受容体のスーパーファミリーに属するが、単一の活性化経路を有する。
【０１７３】
実際に、ＰＡＲ２は、トリプシン、トリプターゼ、および因子ＸａおよびＶＩＩａのようなセリンプロテアーゼによって活性化される。これらのプロテアーゼによる受容体の細胞外部分の開裂は、受容体に「結合した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」リガンドとして作用する新たなアミノ末端ドメイン（ＳＬＩＧＫＶ）を露出し、細胞外ループ２でそれ自身に結合し、自動活性化を受ける。
【０１７４】
ＰＡＲ−２は、皮膚の様々な種類の細胞タイプ、すなわち、ケラチン生成細胞、汗腺の筋上皮細胞、毛嚢、真皮の樹状細胞様細胞、および基底膜および真皮の内皮細胞によって発現する。メラノサイトはこの受容体を発現させないが、ＰＡＲ−２は、メラニンのメラノサイトからケラチン生成細胞への移動を促進することによって色素沈着に重要な役割を果たす。
【０１７５】
表皮によって生じるセリンプロテアーゼは、皮膚における白血球補充を誘導する走化性効果を有する。それらは、ホメオスタシス、有糸分裂誘発および表皮分化の調節にも関与しており、またそれらは皮膚のバリヤー機能を調節する。更に、セリンプロテアーゼは、炎症、宿主防御、発癌、線維症および神経刺激に関係した皮膚疾患の生理病理学に寄与する。
【０１７６】
セリンプロテアーゼの生理学的および生理病理学的皮膚特性は、部分的にはＰＡＲに関係している。実際に、ＰＡＲ−２は、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬および乾癬のような皮膚の炎症性疾患の表皮、真皮および脈管で過剰発現する。ＰＡＲ−２は、アトピー性皮膚炎に罹っている患者の掻痒症の発生にも役割を果たしている。
【０１７７】
トリプシン型のプロテアーゼによるＰＡＲ−２の活性化は、ケラチン生成細胞（ＨａＣａＴ）からＩＬ８の産生を誘導する。更に最近では、白血球に化学誘引性であるケモカインであるＩＬ８により、尋常性乾癬の患者の表皮へ好中球が浸潤できるようになる。
【０１７８】
細胞内ＰＡＲ−２シグナル伝達は、細胞内カルシウムの流動化によってある程度まで補強される。
【０１７９】
従って、トリプシンによるＰＡＲ−２の特異的刺激に続いて誘導される細胞内カルシウムの流入を測定することによって、細胞系（ＨａＣａＴ）からのヒトケラチン生成細胞に対するＰＣＣ抽出物（ＩＢＯ．１８．１３４）およびトリプトリドの抗ＰＡＲ−２活性を評価することが提案される。
【０１８０】
イン・ビトロでの細胞スケールでは、トリプシンによるＰＡＲ−２の刺激により、細胞内カルシウムが流動化し、これは蛍光プローブを用いて検出することができる。
【０１８１】
同一のトリプトリド濃度では、ＰＡＲ−２阻害は試験した両生成物を和らげるが、阻害は、試験した濃度のＰＣＣによって更に顕著になる（図８参照）。  
【０１８２】
例１２：アトピー性皮膚炎モデルおよび乾癬モデルでの評価
根抽出物から得たトリプトリド（ＩＢＯ．１８．１３０）の抗炎症および鎮静活性を、ＰＣＣ抽出物（ＩＢＯ．１８．１３４）の活性と比較する。
【０１８３】
この評価は、正常なヒト表皮のケラチン生成細胞におけるアトピー性皮膚炎表現型および乾癬表現型の誘導に関して検討した。更に詳細には、これらの化合物の効果を、ケラチン生成細胞の炎症におけるそれらの重要性、更に正確にはアトピー性皮膚炎または乾癬におけるそれらの関与について選択された３２遺伝子（ｍＲＮＡ）の２つのパネルの発現についてＰＣＲアレイ（ＲＮＡチップ）によって分析した。
【０１８４】
これらの化合物の効果は、
ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｔｈ１サイトカイン（ＴＮＦα）とＴｈ２サイトカイン（ＩＬ４＋ＩＬ１３）との組み合わせ物による刺激後にアトピー性皮膚炎の表現型を示すケラチン生成細胞、および
サイトカイン（ＩＬ１７＋ＯＳＭ＋ＴＮＦα）の組み合わせ物による刺激後に乾癬表現型を示すケラチン生成細胞
で検討した。
【０１８５】
材料および方法
１．  抽出物
抽出物をＤＭＳＯに可溶化して、純粋なトリプトリドの濃度で表した２００ｍｇ／ｍｌ保存溶液を調製した。この濃度は、根抽出物の溶解度によって賦課されたものであり、特に注意を要するものである（緩やかに撹拌しながら室温で分離）。
【０１８６】
これらの化合物を直ちに薬理試験のために可溶化し、純粋なトリプトリド濃度当量２．５ｎｇ／ｍｌの両抽出物について試験を行った。
【０１８７】
２．  細胞の種類
用いた細胞は、正常なヒト表皮のケラチン生成細胞（ＮＨＥＫ）であり、標準的培養条件下で増幅させる。
【０１８８】
３．  薬理学
３．１  方法
ＮＨＥＫ細胞を、ケラチン生成細胞−ＳＦＭ培地に播種して、培養する。培地を、試験を行う抽出物を含むまたは含まない（コントロール）培地に換える。炎症インデューサー混合物を１時間プレインキュベーションした後、アトピー性皮膚炎の場合には、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＩＬ４、ＩＬ１３およびＴＮＦを含む混合物を加え、乾癬の場合には、ＩＬ１７、オンコスタチンＭおよびＴＮＦを含む混合物を加える。
【０１８９】
インデューサーまたは化合物を含まないコントロールも平行して調製し、誘導したモデルを検証することができる（ＮＨＥＫ対ＮＨＥＫ＋インデューサー）。
【０１９０】
総ての条件は、２回ずつ行った。
【０１９１】
インデューサー±純粋なトリプトリド当量２．５ｎｇ／ｍｌ抽出物の混合物と２４時間インキュベーションした後、ＲＮＡを細胞から抽出する。
【０１９２】
３．２  ＲＴ−ｑＰＣＲによる示唆的発現の分析
総ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの合成の後、３２個の特異的アトピー性皮膚炎遺伝子および３２個の特異的乾癬遺伝子を定量的ＰＣＲによって分析する。
【０１９３】
定量化遺伝子
アトピー性皮膚炎の表現型および乾癬の表現型に特徴的な定量化遺伝子を、それぞれ表１および２に示す。
【０１９４】
結果
１．  アトピー性皮膚炎表現型を示すケラチン生成細胞に対する化合物の効果  
１．１  実験の検証
ポリ（Ｉ：Ｃ）とＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ）との組み合わせ物によるケラチン生成細胞の処理は、この病理に関与する様々な特徴的遺伝子の発現を誘導することによってアトピー性皮膚炎表現型を明確に誘導した。
【０１９５】
実際に、先天性免疫マーカーＳ１００Ａ７、サイトカイン（ＴＳＬＰ、ＩＬ１Ａ、ＩＦＮ１ａ）および検討したケモカインの大部分（ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２７およびＩＬ８）の発現には、増加が観察された。
【０１９６】
これらの効果は、転写調節マーカーＲＡＲＲＥＳ３およびＢＣＬ３の増加を伴った。  同時に、ケラチン生成細胞の分化に関与したマーカー（ＫＲＴ１０、ＦＬＧ、ＩＶＬおよびＬＡＳＳ６）の阻害が観察される。
【０１９７】
１．２  アトピー性皮膚炎モデルに対する化合物の効果
２種類の化合物を、２．５ｎｇ／ｍｌ（純粋なトリプトリド当量）の濃度で試験した。
【０１９８】
根抽出物（ＩＢＯ．１８．１３０）
根抽出物は、炎症誘発性混合物の効果を逆にすることによって、このモデルに対して適度の抗炎症効果を有する。実際に、先天性免疫マーカーＳ１００Ａ７、ケモカイン（ＣＣＬ３、ＣＣＬ５およびＩＬ８）および酸化的ストレスマーカー（ＨＭＯＸ１）の発現は抑制されるのに対して、ケラチン生成細胞分化に関与するマーカーＫＲＴ１０の発現は、刺激された（表１）。
【０１９９】
植物細胞培養物抽出物（ＩＢＯ．１８．１３４）
植物細胞培養（ＰＣＣ）抽出物は、先天性免疫マーカーＳ１００Ａ７およびＲＮＡＳＥ７、サイトカインＴＳＬＰおよびＩＬ１Ａ、ケモカイン（ＣＣＬ３、ＣＣＬ５およびＩＬ８）、および酸化的ストレスマーカー（ＨＭＯＸ１）の発現を抑制することによって根抽出物より一層顕著な抗炎症効果を有する（図９）。
【０２００】
【表３】
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【０２０１】
２．  乾癬表現型を示すケラチン生成細胞に対する化合物の効果
２．１  実験の検証
サイトカイン混合物（オンコスタチンＭ＋ＩＬ１７＋ＴＮＦ）によるケラチン生成細胞の処理は、この病理に関与する様々な特徴的遺伝子の発現を誘導することによって乾癬表現型を明確に誘導した。
【０２０２】
サイトカイン混合物は、抗菌ペプチドをコードするまたは先天性免疫（ＣＡＭＰ、ＤＥＦＢ１０３Ａ、ＤＥＦＢ４、ＰＩ３、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ７Ａ、ＳＰＬＩおよびＴＬＲ２）、走化性（ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１０およびＩＬ８）、炎症（ＩＬ１Ｂ）、細胞外マトリックス分解（ＭＭＰ１およびＭＭＰ３）、および酸化性ストレスに対する細胞防御（ＨＭＯＸ１）に関与する遺伝子の発現増加を誘導する。同時に、分化（ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０およびＦＬＧ）および細胞粘着（ＤＳＧ１およびＣＡＬＭＬ５）に関与するマーカーの阻害が観察される。
【０２０３】
２．２  乾癬モデルに対する化合物の効果
両化合物を、２．５ｎｇ／ｍｌ（純粋なトリプトリド濃度当量）の濃度で試験した。
【０２０４】
根抽出物（ＩＢＯ．１８．１３０）
根抽出物は、このモデルに対して抗炎症効果を有する。実際に、サイトカインカクテルによって誘導される１０個の遺伝子は、この抽出物によって抑制される。ある種の遺伝子に対する用量依存性効果も観察することができる（図１０）。
【０２０５】
植物細胞培養物抽出物（ＩＢＯ．１８．１３４）
植物細胞培養（ＰＣＣ）抽出物は、このモデルに対して抗炎症効果も有する。実際に、サイトカインカクテルによって誘導される１３個の遺伝子は、抽出物によって２より大きなファクターだけ抑制される。乾癬モデルに対する抗炎症効果は、根抽出物よりも植物培養抽出物で一層顕著である（図１０）。
【０２０６】
【表４】
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【０２０７】
２つのモデルに対する結論
この試験の実験条件下で、抽出物ＩＢＯ．１８．１３０（根抽出物）およびＩＢＯ．１８．１３４（植物培養抽出物）は、ケラチン生成細胞で誘導したアトピー性皮膚炎および乾癬のイン・ビトロモデルで抗炎症効果を有した。この効果は、純粋なトリプトリド当量での根抽出物と比較して植物培養抽出物で一層顕著である。
【０２０８】
細胞毒性試験  
同一ＴＲＰ濃度で３種類の化合物ＴＲＰ（ＭＰ０００１１２８）、根抽出物（ＩＢＯ．１８．１３０）およびＰＣＣ抽出物（ＩＢＯ．１８．１３４）の細胞毒性比較。
【０２０９】
ＮＨＥＫ細胞を、黒色の９６ウェルマイクロプレートに播種し、３７℃にて５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションする。
【０２１０】
９６ウェルマイクロプレートを、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
【０２１１】
ＡＴＰライト(ＡＴＰｌｉｔｅ)アッセイ
ライシス緩衝液５０μｌを黒色マイクロプレートに加え、撹拌した後、基質５０μｌを加え、ルミネッセンスをＴｏｐＣｏｕｎｔカウンターで読み取る。
【０２１２】
ＬＤＨアッセイ
上清１００μｌを黒色マイクロプレートから採取し、透明なマイクロプレートに入れる。ＬＤＨアッセイ溶液１００μｌを加えた後、プレートを遮光して室温にて３０分間インキュベーションする。ＬＤＨアッセイの比色反応を、１ＮＨＣｌ  ５０μｌで停止する。細胞溶解を、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー上で４８５ｎｍの吸光度を読み取ることによって分析する。
【０２１３】
ＮＨＥＫ細胞を、様々な化合物の増加濃度と合わせる。
【０２１４】
ＬＤＨおよびＡＴＰライトアッセイによって得られた結果は、ＩＢＯ．１８．１３４（植物培養抽出物）およびＭＰ０００１１１２８（純粋なトリプトリド）と比較してＩＢＯ．１８．１３０（根抽出物）では一層大きな細胞毒性を明確に示している（図１１参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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