(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）
【化１】
0005951613.tif 000043
0005951613.tif 000044
の化合物であって、式中、
Ａは、リポーター部分であり、Ａはアミノルシフェリンであり、
Ｒ1は、式（Ｉ）の化合物の場合、アミノ封鎖基であり、
Ｒ1は、式（ＩＩ）の化合物の場合、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
Ｒ3は、アシルであり、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、前記化合物は、対アニオンをさらに含む、化合物。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ｒ1は、アセチルおよびスクシニルからなる群から選択されるアミノ封鎖基であり、式（ＩＩ）において、Ｒ1は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）およびｔｅｒｔブチルオキシ（Ｂｏｃ）からなる群から選択されるアミノ保護基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎは、２、３、４、または５である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4bである、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ4aおよびＲ4bは、それぞれメチルである、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cである、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cである、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ3は、アシルである、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ3は、アセチル又はトリフルオロアセチルである、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物は、
【化２】
0005951613.tif 000045
0005951613.tif 000046
【化３】
0005951613.tif 000047
【化４】
0005951613.tif 000048
から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
ヒストンデアセチラーゼ酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物を、ヒストンデアセチラーゼ酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、前記ヒストンデアセチラーゼ酵素を前記式（Ｉ）の化合物と反応させて生成物を形成し、前記エンドペプチダーゼを前記生成物と反応させて化合物Ａ−ＮＨ2を放出させるのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記エンドペプチダーゼは、前記式（Ｉ）の化合物と反応しない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生成物は、以下の式（ＩＩ）
【化５】
0005951613.tif 000049
を有する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の式（ＩＩ）の化合物を、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素と、前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素を前記式（ＩＩ）の化合物と反応させて生成物を形成するのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼを添加して、前記エンドペプチダーゼが前記式（ＩＩ）の化合物と反応し、化合物Ａ−ＮＨ2を放出するようにすることと、  ｃ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記エンドペプチダーゼは、前記生成物と反応しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生成物は以下の式（ＩＩＩ）
【化６】
0005951613.tif 000050
を有する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ．請求項１〜１０のいずれか１項に記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
を含む、組成物。
【請求項１８】
ａ．請求項１〜１０のいずれか１項に記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
を含む、キット。
【請求項１９】
標的酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）少なくとも１つの封鎖アルギニンまたはリジン残基を含む化合物を、標的酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと反応させて、前記反応が化合物Ａ−ＮＨ2の形成をもたらすことと、
ｂ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法であって、
Ａはアミノルシフェリンであり、
前記化合物が、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物からなる、前記方法：
【化７】
0005951613.tif 000051
式中、
Ａは、リポーター部分であり、Ａはアミノルシフェリンであり、
Ｒ1は、式（Ｉ）の化合物の場合、アミノ封鎖基であり、
Ｒ1は、式（ＩＩ）の化合物の場合、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
Ｒ3は、アシルであり、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、前記化合物は、対アニオンをさらに含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年９月１０日に出願された米国仮出願第６１／３８１，６７５号に対して優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
多くのアッセイ技術において、最適なアッセイを達成するためには複数の酵素を使用することが必要である。そのようなアッセイの目標は、基質上の１つの酵素（標的酵素）の活性を排他的に測定することである。しかし、標的酵素が目的とする反応を触媒すると、容易に定量可能であるか、少量で測定することができるか、または酵素の活性とともに直線的に増加もしくは減少するシグナルを生成するために、追加の酵素または複数の酵素が使用され得る。
【０００３】
理想的なアッセイは、全ての基質および酵素を単一の反応混合物に混合することを可能にするだろう。しかしながら、望ましくない副反応を防止し、アッセイが標的酵素の活性を排他的に監視できるようにするために、追加の酵素は、目的とする基質とのみ、かつ目的とする基質上の所定の位置でのみ反応しなければならない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ヒストンデアセチラーゼおよびヒストンアセチルトランスフェラーゼ等の酵素の活性をアッセイするための化合物および方法を提供する。一部の実施形態では、アッセイは、単一のステップで、即ち同種アッセイで実施され得る。
【０００５】
したがって、一態様において、本発明は、式（Ｉ）
【化１】
0005951613.tif 000002
の化合物を特徴とし、式中、
Ａは、リポーター部分であり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
Ｒ3は、アシルおよびスルホニルから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、化合物は、対アニオンをさらに含む。
【０００６】
別の態様において、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ酵素の活性を検出する方法を特徴とし、
ａ）式（Ｉ）の化合物と、ヒストンデアセチラーゼ酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼとを、ヒストンデアセチラーゼ酵素が式（Ｉ）の化合物と反応して生成物を形成し、エンドペプチダーゼが生成物と反応して化合物Ａ−ＮＨ2を放出するのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、式（ＩＩ）
【化２】
0005951613.tif 000003
の化合物を特徴とし、式中、
Ａは、リポーター部分であり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、化合物は、対アニオンをさらに含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性を検出する方法を特徴とし、
ａ）式（ＩＩ）の化合物と、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素とを、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素が式（ＩＩ）の化合物と反応して生成物を形成するのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼを添加して、エンドペプチダーゼが式（ＩＩ）の化合物と反応し、化合物Ａ−ＮＨ2を放出するようにすることと、
ｃ）化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、
ａ．式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
ｃ．任意に検出試薬と、を含む組成物を特徴とする。
【００１０】
別の態様において、本発明は、
ａ．式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
ｃ．任意に検出試薬と、を含むキットを特徴とする。
【００１１】
別の態様において、本発明は、標的酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）少なくとも１つの封鎖アルギニンまたはリジン残基を含む化合物を標的酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと反応させて、反応が化合物Ａ−ＮＨ2の形成をもたらすことと、
ｂ）化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む方法を特徴とする。
【００１２】
本発明の他の態様および実施形態は、以下の説明および添付の図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の方法を使用して実行された酵素アッセイの図である。
【図２】本発明の代表的な方法を使用した、阻害剤であるニコチンアミドを使用した酵素ＳＩＲＴ１（Ｂｉｏｍｏｌ）の阻害アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ヒストンデアセチラーゼおよびヒストンアセチルトランスフェラーゼ等の酵素の活性をアッセイするための化合物および方法を提供する。一部の実施形態では、アッセイは、単一のステップで、即ち同種アッセイで実施され得る。本明細書に記載される化合物は、ペプチド系であり、ペプチド鎖に少なくとも１つの封鎖リジンまたはアルギニン残基を有する。これらの化合物のペプチド鎖は、リポーター部分に直接結合される、潜在的に修飾されたリジン残基により終結される。この末端リジンは、ヒストンデアセチラーゼ酵素またはヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素等の測定される酵素の活性部位である。本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される化合物をヒストンデアセチラーゼまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼ等の酵素、およびトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃ等の塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと反応させて、後に検出され得るリポーター部分を放出させることを伴う。
【００１５】
定義
本明細書で使用される「アシル」という用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）Ｒの基を指し、式中、Ｒは、アシル基の置換基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはヘプチル基等の、Ｃ1-7、Ｃ1-6、Ｃ1-5、もしくはＣ1-4分枝状または非分枝状アルキル基（アルキルアシルまたはアルカノイル基とも称される）、Ｃ3-20、Ｃ3-10、もしくはＣ3-6ヘテロシクリル基（ヘテロシクリルアシル基とも称される）、またはＣ6-30、Ｃ5-20もしくはＣ6-14アリール基（アリールアシル基とも称される）である。アシル基の例としては、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ3（アセチル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2ＣＨ3（プロピオニル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ3）3（ブチリル）、および−Ｃ（＝Ｏ）Ｐｈ（ベンゾイル）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒは、例えば１つ以上のハロ基、オキソ基、またはヒドロキシ基でさらに置換され得る。例えば、Ｒは、トリフルオロメチル等のハロアルキルであってもよい。
【００１６】
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、例えば、１〜３０個の炭素原子、多くの場合、１〜１２個、１〜１０個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、または１〜４個の炭素原子を有する分枝状、非分枝状、または環状炭化水素を指す。例としては、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル）、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等が挙げられるが、これらに限定されない。アルキルは、非置換または置換であり得る。アルキルはまた、任意に、部分的または完全に不飽和であり得る。
【００１７】
本明細書で使用される「アリール」という用語は、１個の水素原子を親芳香族環系の単一炭素原子から除去することから生じる芳香族炭化水素基を指す。ラジカルは、親環系の飽和または不飽和炭素原子にあってもよい。アリール基は、６〜３０個の炭素原子、例えば６〜２０個の炭素原子または６〜１４個の炭素原子を有することができる。例えば、アリール基は、Ｃ6、Ｃ10、Ｃ12、Ｃ13、またはＣ14のアリール基であってもよい。アリール基は、単環（例えばフェニル）または複数の圧縮（縮合）環を有することができ、少なくとも１つの環は、芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、またはアントリル）である。典型的なアリール基としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等に由来するラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。アリールは、アルキル基について上述されたように、非置換であるか、または任意に置換されていてもよい。
【００１８】
本明細書で使用される「ハロ」または「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を指す。
【００１９】
本明細書で使用される「スルホン」または「スルホニル」という用語は、式−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒの基を指し、式中、Ｒは、スルホンの置換基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、またはヘプチル基等のＣ1-12、Ｃ1-10、Ｃ1-8、Ｃ1-7、Ｃ1-6、Ｃ1-5、もしくはＣ1-4アルキル基、Ｃ3-20、Ｃ3-10、もしくはＣ3-6ヘテロシクリル基、またはＣ6−30、Ｃ5-20、もしくはＣ6-14アリール基である。スルホン基の例としては、−Ｓ（＝Ｏ）2ＣＨ3（メタンスルホニル、メシル）、−Ｓ（＝Ｏ）2ＣＦ3（トリフリル）、−Ｓ（＝Ｏ）2ＣＨ2ＣＨ3、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｃ4Ｆ9（ノナフリル）、−Ｓ（＝Ｏ）2ＣＨ2ＣＦ3（トレシル）、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｐｈ（フェニルスルホニル）、４−メチルフェニルスルホニル（トシル）、４−ブロモフェニルスルホニル（ブロシル）、および４−ニトロフェニルスルホニル（ノシル）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書で使用される「対アニオン」という用語は、正荷電されたアミノ酸側鎖の電荷を平衡するために存在する形式負電荷を有する原子または基を指す。対アニオンは、ハロゲン化物（例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、Ｎ3-、ＰＯ43-、ＨＰＯ42-、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ42-、ＨＳＯ4-、ＮＯ3-、ＣｌＯ4-、ＣＯ32-、ＨＣＯ3-、ＣｒＯ42-、Ｃｒ2Ｏ72-、ＣＮ-、ＯＨ-、Ｃ2Ｏ42-、ＭｎＯ4-、ＢＦ4-、ＰＦ6-、ＨＣＯＯ-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＣＦ3ＣＯＯ-等を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用される「天然のアミノ酸」という用語は、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｉｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、およびメチオニン（Ｍｅｔ）をはじめ、タンパク質に存在する一般的で天然に生じるＬ−アミノ酸のうちのいずれか１つを指す。
【００２２】
本明細書で使用される「非天然アミノ酸」という用語は、上述の天然のアミノ酸ではない全てのアミノ酸を指す。そのようなアミノ酸は、上述の２０の天然に生じるアミノ酸のいずれかのＤ−アイソマーを含む。非天然アミノ酸は、ホモセリン、オルニチン、ノルロイシン、およびチロキシンも含む。さらなる非天然アミノ酸は、当業者に周知である。非天然アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−アイソマーであってもよい。非天然アミノ酸はまた、αアミノ酸またはβアミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸はまた、リン酸化セリン、スレオニンもしくはチロシン、アシル化リジン、またはアルキル化リジンもしくはアルギニン等の、翻訳後に修飾されたアミノ酸であってもよい。翻訳後に修飾されたアミノ酸の多くの形態が公知である。
【００２３】
本明細書で使用される「保護されたアミノ酸」という用語は、保護された官能基を追加で含有する上述のアミノ酸側鎖を指す。保護基は、当該技術分野において周知であり、合成手順中の望ましくない反応に対してアミノ、ヒドロキシ、チオ、またはカルボキシ等の官能基を保護することが意図される。保護基は、合成後に化学反応によって除去され得る。保護されたアミノ酸側鎖の例としては、セリンに由来するベンジルオキシメチル、チロシンに由来する（４−メトキシフェニル）メチル、およびグルタメートに由来するｔｅｒｔ−ブチルプロパノエートが挙げられる。
【００２４】
より一般的には、本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸、非天然アミノ酸、および保護されたアミノ酸を包含する。
【００２５】
本明細書で使用される「アミノ酸側鎖」という用語は、アミノ酸のα炭素に結合される基を指す。それは、アミノ酸の特徴部分であり、ＮＨ2ＣＨＣ（Ｏ）ＯＨ部分を除去することにより対応するアミノ酸から得られる。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖はメチルであり、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖はフェニルメチルである。アミノ酸側鎖は、天然のアミノ酸側鎖または非天然のアミノ酸側鎖であってもよい。一部の実施形態では、アミノ酸側鎖は、保護されたアミノ酸側鎖であってもよい。
【００２６】
本明細書で使用される「アミノ保護基」とは、その保護基が結合する窒素原子上で化学反応が生じるのを防止する部分を指す。アミノ保護基はまた、化学反応によって除去可能でなければならない。そのような基は、当該技術分野において周知であり、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に記載されているものを含み、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。適切なアミノ保護基は、カルボベンジルオキシ（−ＮＨＣＯ−ＯＣＨ2Ｃ6Ｈ5または−ＮＨ−Ｃｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ3）3または−ＮＨ−Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（−ＮＨ−Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル（−ＮＨ−Ｔｒｏｃ）、およびアリルオキシカルボニル（−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ）を含むが、これらに限定されない。（上記のそれぞれにおいて、−ＮＨ−は、保護されるアミノ基からの窒素を表す。）
【００２７】
本明細書に使用される「アミノ封鎖基」とは、その封鎖基が結合される窒素原子上で化学反応が生じるのを防止する部分を指す。アミノ保護基とは対照的に、アミノ封鎖基は、化学反応によって除去されることが意図されない。そのような基は、例えばアセチル（−ＮＨＣＯ−ＣＨ3）およびスクシニル（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯ-）等のアシル基を含む。（上記のそれぞれにおいて、−ＮＨ−は、封鎖されるアミノ基からの窒素を表す。）
【００２８】
本明細書で使用される「アミノルシフェリン」という用語は、（４Ｓ）−２−（６−アミノ−１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸、またはこの分子の置換された類似体を指す。
【００２９】
本明細書に記載されるあらゆる数値は、下方値から上方値の全ての値を含む、即ち列挙される最低値と最高値との間の全ての可能な数値の組み合わせが本願において明確に示されていると考えるべきであることを具体的に理解する。例えば、濃度範囲または有益作用範囲が１％〜５０％と記載される場合、２％〜４０％、１０％〜３０％、または１％〜３％等の値が本明細書において明確に列挙されていると意図される。これらは、何が具体的に意図されるかの単なる例である。
【００３０】
また、本明細書で使用される表現および用語は、説明の目的のためであり、制限するものと見なされるべきではないことを理解しなければならない。本明細書における「備える」、「含む」、「有する」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびそれらの等価物ならびに追加項目を包含することが意図される。
【００３１】
ヒストンデアセチラーゼおよびヒストンアセチルトランスフェラーゼ
ヒストンは、真核細胞核に存在するタンパク質であり、ＤＮＡのヌクレオソームと呼ばれる構造単位へのパッケージングおよび順序付けを伴う。これらは、ＤＮＡが巻きつくスプールとして作用するクロマチンの主タンパク質成分である。ヒストン尾部は、リジンおよびアルギニンのアミノ酸上のアミン基のプロトン化により、通常、正に荷電される。これらの正の電荷は、ヒストン尾部がＤＮＡ骨格上の負に荷電されたリン酸基と相互作用し、それに結合するのを補助する。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）によってもたらされるリジン残基のε−アミノ基のアセチル化は、アミノ基をアミドに変換し、正の電荷を排除し、それによってＤＮＡに対する親和性を低下させる。親和性の減少は、クロマチンの伸長を可能にし、ＤＮＡの遺伝的転写が生じるのを可能にする。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ヒストン上のリジン残基からアセチル基を除去し、ヒストン尾部の正の電荷を増加させ、ヒストンとＤＮＡ骨格との間の結合を助長する。ＤＮＡ結合の増加は、ＤＮＡ構造を圧縮し、転写を防止する。したがって、ヒストンアセチル化および脱アセチル化は、遺伝子発現の制御において重要な役割を果たす（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，１９５−２１１（２００７））。ＨＡＴおよびＨＤＡＣがヒストンの修飾に果たす役割に加えて、これらが他にも多数のタンパク質をアセチル化および脱アセチル化することも分かっている｛Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５，８３４−８４０（２００９））。アセチル化は、細胞生化学におけるその重要性に関してリン酸化と対抗すると言われている（ＥＭＢＯ，１９，１１７６−１１７９（２０００））。
【００３２】
ＨＤＡＣは、それらの機能、ＤＮＡ配列の類似性、および酵母ヒストンデアセチラーゼに対する相同性に基づき４つの群に分類される（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９，３−１６（２００２））：
ＨＤＡＣ１、−２、−３、および−８を含むクラスＩは、酵母ＲＰＤ３遺伝子に関連する。
ＨＤＡＣ４、−５、−６、−７、−９、および−１０を含むクラスＩＩは、酵母Ｈｄａｌ遺伝子に関連する。
サーチュインとしても知られるクラスＩＩＩは、Ｓｉｒ２遺伝子に関連し、ＳＩＲＴ１−７を含む。
ＨＤＡＣ１１を含むクラスＩＶは、クラスＩとＩＩの両方の特徴を有する。
【００３３】
クラスＩおよびＩＩは、亜鉛含有触媒ドメインに結合することによってトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）により活性が阻害される「古典的な」ＨＤＡＣと見なされる。クラスＩＩＩは、ＴＳＡの影響を受けないＮＡＤ+依存性タンパク質のファミリーである。クラスＩＶは、クラスＩおよびＩＩのものに対するＤＮＡ配列の類似性に基づくハイブリッドカテゴリーである。
【００３４】
ＨＤＡＣは、多様なヒト疾患に対して潜在的に有用な治療標的として認識されている（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５，７６９−７８４（２００６）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２９，１１４５１−１１４６０（２００９））。ＨＤＡＣ阻害剤は、一部のものが細胞増殖を阻害し、腫瘍細胞の分化および／またはアポトーシスを誘発することが分かっているため、癌治療のために開発されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，２７７，８−２１（２００９））。ＨＤＡＣは、糖尿病および他の代謝疾患ならびに加齢性の疾患においても役割を果たす場合がある（Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，２１，１７４５−１７５５（２００７））。
【００３５】
よって、異なるクラス間の生物学的関係の継続的な特徴付けを補助するためだけでなく、新しいＨＤＡＣ阻害剤の開発を補助するための研究ツールとしても、ＨＤＡＣ活性についてのアッセイが極めて望ましい（Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，３３２−３３７（２００５））。同様に、ＨＡＴ活性についてのアッセイも望ましい（Ｍｅｔｈｏｄｓ２６，２４５−２５３（２００２））。
アッセイ
【００３６】
ＨＤＡＣ活性についての代表的なアッセイをスキーム１に図示する。基質化合物Ａにおいて、Ｘは、任意のアミノ酸であり、ｎは、１〜約２０の整数であり、Ｒは、水素、アミノ保護基、またはアミノ封鎖基である。ＨＤＡＣ酵素の活性は、化合物Ａからアセチル基を除去し、化合物Ｂを生成する。
スキーム１
【化３】
0005951613.tif 000004
【００３７】
シグナルを生成するために、ペプチドとリポーター部分との間のアミド結合は、後に検出され得る化合物Ｃを生成するために切断されなければならない。化合物Ｂを化合物Ｃに変換するために、トリプシン等の塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼがアッセイ系に添加される。未修飾のリジンに対するエンドペプチダーゼの特異性は、それが化合物Ａを切断するのを防止し、結果として、アッセイにおいて生成されたシグナルの全てがＨＤＡＣ活性に依存する。
【００３８】
リポーター部分は、それがまだペプチドに結合しているときにシグナルを生成しないように選択され得る。例えば、フルオロフォアは、ペプチドに結合されるとき急冷され得るが、放出されるときに検出可能であってもよい。適切なリポーター部分の別の例は、アミノルシフェリンであり、これは、ペプチドに結合されるとき、ルシフェラーゼの基質ではないが、ルシフェラーゼと反応して、放出されるときに発光を生成する。化合物Ｃの蛍光または発光は、後に標的酵素の活性を判定するために使用される、存在する化合物Ｃの量を判定するために定量化され得る。上述のアッセイは、完全に単一ステップ、即ち同種アッセイで行うことができるため、ＨＤＡＣ活性は、即時に検出され得る。
【００３９】
上述のアッセイを最適化するために、化合物Ａに追加のアミノ酸（Ｘ）nが組み込まれ得る。このアミノ酸配列の最適化が、ＨＤＡＣによる基質のより良好な認識を可能にし、アッセイの全体的な性能を改善する可能性がある。アミノ酸の慎重な選択も、異なるＨＤＡＣアイソザイム間の選択性を可能にすることがある。１つのＨＤＡＣアイソザイムの活性を他のものに対して選択的に検出するアッセイは、非常に有用な研究ツールであろう。しかしながら、スキーム１に図示されるアッセイ設計は、特に、アッセイが単一ステップで実施される場合に、認識配列（Ｘ）nにおけるリジンまたはアルギニン残基の使用を排除する。アルギニンまたはリジンが含まれる場合、それは、トリプシン等の塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼによって認識され得る。よって、エンドペプチダーゼが初期の反応混合物に含まれる場合、化合物Ａは、ＨＤＡＣ酵素との反応前に切断され得る。
【００４０】
この認識配列にリジンまたはアルギニン残基を含むことが、そのような認識および選択性に重要な場合もある。そのため、本発明の化合物および方法は、塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼによる認識を防止する一方で、認識配列（Ｘ）nにおけるアミノ酸としてのリジンおよびアルギニンの使用を可能にするように設計された。本化合物および方法は、エンドペプチダーゼによる認識を封鎖するように修飾されたリジンまたはアルギニン残基を使用しながらも、標的酵素による認識をなお可能とするものである。したがって、基質は、標的酵素に作用されるまで切断されず、リポーター部分からのいずれのシグナルもＨＤＡＣ等の標的酵素の活性によるものであることを確実にする。このことが、アッセイが単一ステップで容易に実施されることを可能にする。
【００４１】
リジンおよびアルギニン残基がトリプシン等の塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼによって認識されるのを防止する封鎖基は、アルキル基およびアリール基を含む。アルキル化またはアリール化されたリジンおよびアルギニン残基は合成してもよく、また商業的な供給源から購入してもよい。
【００４２】
基質の認識配列に修飾されたリジン残基を使用する特定の代表的なアッセイをスキーム２に図示する。この例において、ジメチル化リジン残基が認識配列に存在する。メチル基の存在は、トリプシン等のエンドペプチダーゼによる認識を封鎖し、それによってジメチル化されたリジン残基とアセチル化されたリジン残基との間の切断を防止する。基質Ｄは、ＨＤＡＣ酵素によって脱アセチル化され、生成物Ｅを生成する。トリプシンは、脱アセチル化されたリジン残基を認識し、隣接するアミド結合を切断して、アミノルシフェリンＦを放出する。その後、ルシフェラーゼは、Ｆと反応して、発光シグナルを生成する。化合物Ｄまたは化合物Ｅのいずれも、ルシフェラーゼによって認識されない。
スキーム２
【化４】
0005951613.tif 000005
【００４３】
上述のアッセイは、例えば、最初に基質ＤをＨＤＡＣとインキュベートし、その後、後続のステップまたは複数のステップでトリプシンおよびルシフェラーゼを添加して、発光シグナルを生成することにより、複数のステップで実施され得るが、本アッセイは、単一のステップで実施され得る。基質Ｄ、ＨＤＡＣ、トリプシン、ルシフェラーゼ、および必要なあらゆる補因子は、共役するほぼ同時の反応をもたらすことができる単一の反応混合物へと混合され得る。単一ステップでアッセイを実施する能力は、迅速なデータの取得をもたらし、ＮＡＤ依存性デアセチラーゼ活性に比例し得るシグナルを伴う。単一ステップ反応を図示する概略図を図１に図示する。
【００４４】
ＨＡＴ活性についての代表的なアッセイをスキーム３に図示する。変動要因はスキーム１で上記に定義される通りである。この場合、ＨＡＴの活性は、化合物Ｇのリジン残基のアセチル化をもたらし、エンドペプチダーゼと反応しない化合物Ｈを形成する。基質Ｇは、エンドペプチダーゼによって認識され、リポーター化合物Ｉを生成する。したがって、この場合、ＨＡＴ活性は、リポーターからのシグナルの定量的減少により監視される。このアッセイにおいて、化合物Ｇは、最初にＨＡＴ（ステップ１）とプレインキュベートされ、初期反応後に得られる混合物にエンドペプチダーゼが添加される（ステップ２）。これは、ＨＡＴおよびエンドペプチダーゼが化合物Ｇにおいて競合せず、かつリポーターからの全てのシグナル出力がＨＡＴによってＨに変換されないＧの量のみを正確に反映することを確実にする。
スキーム３
【化５】
0005951613.tif 000006
【００４５】
認識配列Ｘnにおける封鎖リジンおよびアルギニン残基の使用は、化合物Ｇがリポーター部分に抱合されるＣ末端リジン以外の位置でエンドペプチダーゼによって切断されるのを防止する一方で、目的とするＨＡＴによる認識の最適化を可能にする。認識におけるエンドペプチダーゼ切断部位の除去に対する潜在的な利点は、共役酵素反応の簡略化された速度論、必要とされるエンドペプチダーゼの量の減少、およびリポーターからペプチドを切断するために必要とされる時間の短縮を含む。
【００４６】
ペプチド基質
一態様において、本発明は、本明細書に記載されるアッセイ等の同種アッセイに使用され得る新規化合物を特徴とする。本化合物は、塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼによる認識を防止する、少なくとも１つの封鎖（例えば、メチル化、ジメチル化、またはアリール化）されたリジンまたはアルギニン残基を特徴とする。
【００４７】
一部の実施形態では、化合物は、保護（例えばアシル化またはスルホニル化）され、リポーター部分に抱合され得るＣ末端リジン残基を特徴とする。そのような化合物は、標的酵素、例えばＨＤＡＣの活性を検出するために、アッセイに使用され得る。例えば、アセチル化リジン残基は、リジン残基を脱アセチル化して、その天然の遊離アミノ基を有するリジンを含む生成物をもたらすＨＤＡＣ酵素によって認識される。生成物は、エンドペプチダーゼによって認識され、かつ切断され得、後に検出され得るリポーター部分を放出する。ＨＤＡＣ酵素の活性は、検出されたリポーター部分の量に基づき計算され得る。
【００４８】
本発明の代表的なペプチド基質は、式（Ｉ）
【化６】
0005951613.tif 000007
の化合物を含み、式中、
Ａは、リポーター部分であり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
Ｒ3は、アシルおよびスルホニルから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、化合物は、対アニオンをさらに含む。
【００４９】
一部の実施形態では、Ａは、アミノルシフェリン、クマリン、ローダミン、セレンテラジン、レゾルフィン、およびクレシルバイオレットから選択される。
【００５０】
一部の実施形態では、Ｒ1は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔブチルオキシ（Ｂｏｃ）、アセチル、およびスクシニルからなる群から選択されるアミノ保護基またはアミノ封鎖基である。
【００５１】
一部の実施形態では、ｎは、２、３、４、または５である。
【００５２】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4bである。一部の実施形態では、Ｒ4aは水素であり、Ｒ4bはメチルである。一部の実施形態では、Ｒ4aおよびＲ4bは、それぞれメチルである。
【００５３】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cである。一部の実施形態では、Ｒ4a、Ｒ4b、およびＲ4cは、それぞれメチルである。
【００５４】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cである。一部の実施形態では、Ｒ5aおよびＲ5bは水素であり、Ｒ5cはメチルである。
【００５５】
一部の実施形態では、Ｒ3は、アシル（例えば、アセチルまたはトリフルオロアセチル）である。
【００５６】
本発明の代表的な化合物は、以下を含む。
【化７】
0005951613.tif 000008
0005951613.tif 000009
【００５７】
式（Ｉ）の化合物がいったんＨＤＡＣ酵素と反応すると、生成物は、式（ＩＩ）
【化８】
0005951613.tif 000010
の化合物であってもよく、式中、
Ａは、リポーター部分であり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、化合物は、対アニオンをさらに含む。
【００５８】
一部の実施形態では、化合物は、リポーターに結合された非置換のＣ末端リジン残基を特徴とする。そのような化合物は、例えばＨＡＴ酵素の活性を検出するために使用され得る。Ｃ末端リジン残基は、ＨＡＴ酵素によってアセチル化される。エンドペプチダーゼは、アセチル化された化合物を認識または切断しないが、未反応化合物を切断して、後に検出され得るリポーター部分を放出する。ＨＡＴ酵素の活性は、未反応の化合物および反応した化合物の量を比較した後に計算され得る。
【００５９】
したがって、本発明の代表的なペプチド基質は、（ＩＩ）
【化９】
0005951613.tif 000011
の化合物を含み、式中、
Ａは、リポーター部分であり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、化合物は、対アニオンをさらに含む。
【００６０】
一部の実施形態では、Ａは、アミノルシフェリン、クマリン、ローダミン、セレンテラジン、レゾルフィン、およびクレシルバイオレットから選択される。
【００６１】
一部の実施形態では、Ｒ1は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔブチルオキシ（Ｂｏｃ）、アセチル、およびスクシニルからなる群から選択されるアミノ保護基またはアミノ封鎖基である。
【００６２】
一部の実施形態では、ｎは、２、３、４、または５である。
【００６３】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4bである。一部の実施形態では、Ｒ4aは水素であり、Ｒ4bはメチルである。一部の実施形態では、Ｒ4aおよびＲ4bは、それぞれメチルである。
【００６４】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cである。一部の実施形態では、Ｒ4a、Ｒ4b、およびＲ4cは、それぞれメチルである。
【００６５】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cである。一部の実施形態では、Ｒ5aおよびＲ5bは水素であり、Ｒ5cはメチルである。
【００６６】
本発明の代表的な化合物は、以下を含む。
【化１０】
0005951613.tif 000012
0005951613.tif 000013
【００６７】
本明細書に記載されるペプチド基質は、当技術分野において公知のペプチド合成におけるいずれかの技法を使用して合成または製造され得る。例えば、ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）によって最初に説明された固体相合成法を使用して調製され得る。他のペプチド合成法は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２ｄ  Ｅｄ．，（１９７６）、Ｓｔｕａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１，（１９８４）、および当業者に容易に利用可能である他の参考文献に見出すことができる。ペプチドは、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｖｏｌ．ＩＩ，３ｄ  Ｅｄ．，Ｎｅｕｒａｔｈ  ｅｔ．ａｌ，Ｅｄｓ．，ｐ．１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）に記載される溶液法によっても合成され得る。さまざまなペプチド合成に使用するための適切な保護基は、上述の本文ならびにＧｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されている。
【００６８】
ペプチド基質は、カルボキシ末端で、リポーター部分に抱合される。抱合は、例えば、カップリング試薬を使用して、遊離カルボキシ末端をアミン含有リポーター基で抱合することにより達成され得る。そのような試薬としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等のカルボジイミド、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびｌ−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）等のトリアゾール、ならびにＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＨＣＴＵ、ＴＢＴＵおよびＰｙＢＯＰ等のウロニウムおよびホスホニウム塩が挙げられる。一部の実施形態では、リポーター部分またはリポーター部分の前駆体は、後にペプチド基質の残部に抱合され得るアミノ酸に結合され得る。
【００６９】
リポーター部分
本明細書に記載される化合物および方法は、適切な条件下で、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生成するリポーター部分を特徴とするペプチド系基質を使用する。代表的なリポーター部分としては、フルオロフォア、発光分子、放射標識物質、およびルシフェラーゼ等の酵素の基質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、リポーター部分は、例えば、リポーター部分が酵素の基質であるとき、間接的に検出可能なシグナルを生成してもよい。次いで、酵素の基質との反応は、蛍光または発光等の検出可能なシグナルを生成する。
【００７０】
一部の実施形態では、リポーター部分は、ルシフェラーゼとの反応時に発光シグナルを生成してもよいアミノルシフェリンであってもよい。ルシフェラーゼは、アミノルシフェリン抱合ペプチド基質と反応しない。アッセイは、アミノルシフェリンがペプチド基質から放出されたときにのみ発光シグナルを生成する。生成された発光シグナルは照度計を使用して検出され得る。
【００７１】
他の実施形態では、リポーター部分は、蛍光分子、例えば、クマリン、ローダミン、セレンテラジン、レゾルフィン、またはクレシルバイオレットであってもよい。リポーター部分の蛍光は、ペプチド基質に抱合されるとき、急冷され得、そのような場合、アッセイは、蛍光分子がペプチド基質から放出されたときにのみシグナルを生成する。代替的に、蛍光リポーター部分は、ペプチド基質に抱合されるとき、異なる放射波長を有してもよく、ペプチド基質からのその放出時の放射の変化が検出され得る。蛍光は、蛍光光度計を使用して検出され得る。
【００７２】
他の実施形態では、リポーター部分は、吸収特性がペプチド基質からのその放出時に変化する色素であってもよい。そのような変化は、分光光度計を使用して検出され得る。
【００７３】
一部の実施形態では、リポーター部分がローダミンまたはクレシルバイオレットであるとき等、リポーター部分はさらに官能化され得る。例えば、リポーター部分が２つのアミノ基を有するローダミンまたはクレシルバイオレットであるとき、１つのアミノ基は、ペプチド鎖に結合する部位であってもよく、一方、他方のアミノ基は、封鎖基（例えばアセチル等のアシル基）で官能化され得る。代替的に、両方のアミノ基がペプチド鎖に結合され得る。
【００７４】
エンドペプチダーゼ
本明細書に記載される方法で使用されるエンドペプチダーゼは、塩基性アミノ酸を認識するものを含む。これらは、例えば、リジンおよびアルギニン残基のカルボキシル側で基質を切断するセリンプロテアーゼであるトリプシンを含む。別の代表的なエンドペプチダーゼは、リジン残基のカルボキシル側で切断するセリンプロテアーゼであるＬｙｓ−Ｃである。これらの酵素は、例えば、リジンまたはアルギニン残基が保護基または封鎖基で修飾されるとき、修飾されたリジンおよびアルギニン残基のカルボキシル側で切断しない。
【００７５】
組成物
一部の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物等の本明細書に記載される化合物、トリプシンまたはＬｙｓ−Ｃ等の塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼ、および任意に検出試薬を含む組成物も提供する。組成物は、緩衝液、ＮＡＤ+等の酵素補因子、および／またはＨＤＡＣもしくはＨＡＴ等の標的酵素も含んでもよい。好ましい実施形態では、組成物は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、トリプシンまたはＬｙｓ−Ｃ等の塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼ、およびルシフェリン検出試薬を含む。
【００７６】
キット
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載するもの等の酵素活性をアッセイするための方法に使用するためのキットも提供する。キットは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物等の本明細書に記載される化合物、トリプシンまたはＬｙｓ−Ｃ等の塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼ、および任意に検出試薬を含んでもよい。キットは、緩衝液、ＮＡＤ+等の酵素補因子、ＨＤＡＣもしくはＨＡＴ酵素（例えばＨＤＡＣを含むＨｅＬａ細胞からの核抽出物）の供給源等の対照基質、酵素阻害剤（例えばニコチンアミド）、または酵素活性化剤をさらに含んでもよい。キットは、本明細書に記載される方法を実行するための説明書も含んでもよい。好ましい実施形態では、キットは、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、トリプシンまたはＬｙｓ−Ｃ等の塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼ、およびルシフェリン検出試薬を含む。
【実施例】
【００７７】
実施例１．Ｈ−Ｌyｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾール、トリフルオロ酢酸塩の合成
【化１１】
0005951613.tif 000014
乾燥ＴＨＦ（４１０ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｌｙｓ−（Ａｃ）−ＯＨ（２０．５ｇ、７１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、Ｎ2雰囲気下で、Ｎ−メチルモルホリン（７．８ｍＬ、７１ｍｍｏｌ）を添加した。反応槽を２０分間４℃に冷却し、その時にイソブチルクロロホルメート（９．３ｍＬ、７１ｍｍｏｌ）を滴下により添加した。約６０分間、氷浴で反応物を攪拌し、その時に６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾール（１０ｇ、５７ｍＭ）を添加した。氷浴で約３０分間、反応物を攪拌し、取り出し、反応混合物を一晩かけて室温に戻した。次いで、ブフナー漏斗を通して反応物を濾過し、濾過物を固体泡状物に濃縮した。この固体泡状物をジクロロメタン（１Ｌ）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（飽和水溶液、３００ｍＬ）で２Ｘ洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、固体泡状物を得た。次いで、この固体泡状物を、ヘプタン／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（８０分にわたり４０％ＥｔＯＡｃから１００％ＥｔＯＡｃの段階濃度）の勾配で、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、泡状固体として２４．７ｇのＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールを得た。
【００７８】
泡状固体に、Ｎ2の雰囲気下で、予め冷却した（−２０℃）チオアニソール（４８ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（２７０ｍＬ）の混合物を添加した。逆相ＨＰＬＣにより経過を監視した。開始材料が消費された時点で、高真空下で反応物を高粘度シロップに濃縮した。次いで、これを、ジクロロメタン（ＤＣＭ）／メタノール（ＭｅＯＨ）（４５分にわたり５％ＭｅＯＨから３０％ＭｅＯＨの段階濃度）の勾配で、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、２２．４ｇ（８５％）の標記化合物を得た：1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１０．９７（ｓ，１Ｈ）、８．７１（ｓ，１Ｈ）、８．２９（ｓ，３Ｈ）、８．２４（ｄ，１Ｈ）、７．７９−７．７６（ｍ，１Ｈ）、３．９８（ｓ，１Ｈ）、２．９９（ｑ，２Ｈ）、１．８２（ｑ，２Ｈ）、１．７２（ｓ，３Ｈ）、１．４０−１．３３（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ予測値３４６（Ｃ16Ｈ19Ｎ5Ｏ2Ｓ，Ｍ＋１）、実測値３４６。
【００７９】
実施例２．Ｈ−Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−アミノシアノベンゾチアゾール、トリフルオロ酢酸塩の合成
【化１２】
0005951613.tif 000015
この材料は、Ｈ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾール（実施例１）を合成するために使用された手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−ＯＨから合成された：1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１１．００（ｓ，１Ｈ）、９．３９（ｔ，１Ｈ）、８．７０（ｄ，１Ｈ）、８．３２（ｓ，３Ｈ）、８．２４（ｄ，１Ｈ）、７．７８（ｄｄ，１Ｈ）、４．００（ｔ，１Ｈ）、３．１６（ｑ，２Ｈ）、１．８４（ｑ，２Ｈ）、１．５５−１．４６（ｍ，２Ｈ）、１．４１−１．３３（ｍ，２Ｈ）；19Ｆ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ−７３．６，−７４．４。
【００８０】
実施例３．Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬyｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（１）の合成
【化１３】
0005951613.tif 000016
ステップ１．Ｃｂｚ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨの合成
Ａａｐｐｔｅｃモデル＃９０ペプチド合成機の５００ｍＬの反応槽に２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂（１２．５ｇ）を入れた。樹脂をＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）で膨潤させた。別の容器中で、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−（Ｍｅ2）−ＯＨ  ＨＣｌ（５ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１００ｍＬ）に溶解した。この溶液を樹脂に添加し、続いてジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（８ｍＬ）を添加し、機械的に４時間攪拌した。この時点で、樹脂をＤＭＦおよびＮＭＰで順次洗浄し、次いで、各キャッピングステップ間にＤＣＭですすぎながら、ＭｅＯＨで３Ｘキャッピングした。次いで、完全真空下で樹脂を一晩乾燥させ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−（Ｍｅ2）２−Ｃｌ  Ｔｒｔ樹脂を得た。
【００８１】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−（Ｍｅ2）２−Ｃｌ  Ｔｒｔ樹脂を合成機上に設置し、ＤＭＦ中の２５％のピペリジン（塩基対樹脂は１０：１）からなる２回の洗浄を使用して、Ｆｍｏｃを除去した。次いで、ＮＭＰ（１００ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（５．９ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾチアゾール（ＨＯＢｔ、３．１ｇ、２３ｍｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ν，Ν，Ν’，Ν’，−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロ−リン酸（ＨＢＴＵ、７．６ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（６．９ｍＬ、３９．６ｍｍｏｌ）の溶液をこの樹脂に添加し、１２０分間、機械的に混合させた。一級アミンについてのＫａｉｓｅｒ試験は、陰性であった。次いで、試薬溶液を樹脂から分離した。このプロトコルを繰り返し、Ｆｍｏｃを除去し、Ｃｂｚ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを樹脂に結合させた。
【００８２】
次いで、樹脂をＭｅＯＨ、続いてＤＣＭで洗浄し、この手順を３回繰り返した後、最後にＭｅＯＨで洗浄した。次いで、樹脂をＤＣＭ／酢酸／トリフルオロエタノール（ｌ００ｍＬ、８／１／１）の溶液で処理し、３時間、磁気的に攪拌した。樹脂を濾取りし、ＤＣＭですすぎ、得られた溶液を濃縮して、油状物を得た。ヘプタンを添加し、溶液を３回濃縮した。これにより、泡状固体（１１．９７ｇ、８７％）としてＣｂｚ−Ｇｌｕ（Ｔｒｔ）ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨを得、これは、さらに精製することなく使用された。
【００８３】
ステップ２．Ｃｂｚ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールの合成
Ｎ2雰囲気下で、乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のＣｂｚ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（７．４ｇ、９．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、Ｈ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾール（４．３７ｇ、９．５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ、１．３ｇ、９．５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１．６ｍＬ、９．５ｍｍｏｌ）を添加した。最後に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＡＣ、１．８ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で３０分間攪拌させた。逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ、４μｍ  ８０Å、２５０×４．６ｍｍ、方法：１５分にわたり３０％ＡＣＮから５５％ＡＣＮ、１ｍＬ／分、水性緩衝液は０．１％のＴＦＡｖ／ｖを含有する）により反応が完了したことを判定した時点で、それを濃縮した。得られた固体泡状物をＤＣＭ（２５０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（飽和水溶液、２５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（２０分にわたり段階濃度で０％ＭｅＯＨから１５％ＭｅＯＨ）を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーによりこの材料を精製し、Ｃｂｚ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾール（５．２６ｇ、５１％）を泡状固体として得た。
【００８４】
ステップ３．Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールの合成
ＴＦＡ／ＤＣＭ（４０ｍＬ、１／１）中のＣｂｚ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾール（５．２６）およびトリイソプロピルシラン（４ｍＬ）の溶液を、−２０度のＮ2雰囲気下で１時間攪拌した。逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ、４μｍ  ８０Å、２５０×４．６ｍｍ。方法：１５分にわたり２０％ＡＣＮから５５％ＡＣＮ、１ｍＬ／分、水性緩衝液は０．１％ＴＦＡｖ／ｖを含有する）により、開始材料が新しい種に変換されたことが確認された後、反応混合物を濃縮した。次いで、得られた粘稠なスラッジをジエチルエーテル（２００ｍＬ）で覆い、５分間攪拌し、遠心分離を介して固体を回収し、完全真空下で乾燥させ、粗Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾール（４．４ｇ）を得た。
【００８５】
ステップ４．Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリンの合成
粗Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールを、ＴＨＦ（１００ｍＬ）および緩やかなＮ2流で約５分間ガス抜きされたＨ2Ｏ（５０ｍＬ）中に溶解した。この溶液に、同様にガス抜きしたＨ2Ｏ（２０ｍＬ）中のＤ−システイン（０．９０ｇ、５．１ｍｍｏｌ）およびＮａ2ＣＯ3（０．５４ｇ、５．１ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、反応物を３０分間攪拌した。逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ、４μｍ  ８０Å、２５０×４．６ｍｍ。方法：１５分にわたり２０％ＡＣＮから５５％ＡＣＮ、１ｍＬ／分、水性緩衝液は０．１％ＴＦＡｖ／ｖを含有する）により、開始材料が新しい種に変換されたことが確認された後、反応物を固体に濃縮した。２０ｍＭのＮＨ4ＯＡｃ中のアセトニトリル（ＡＣＮ）の勾配（６０分にわたり１５％ＡＣＮから５０％ＡＣＮ）を使用した分取ＨＰＬＣにより、逆相シリカゲルを使用して、粗固体を精製し、白色固体として標記化合物（２．７５ｇ、５６％）を得た：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ８．４６（ｄｄ，１Ｈ）、７．９５（ｄｄ，１Ｈ）、７．６３−７．５９（ｍ，１Ｈ）、７．３５−７．２９（ｍ，５Ｈ）、５．２１（ｄｔ，２Ｈ）、５．０６（ｓ，２Ｈ）、４．４７−４．３８（ｍ，３Ｈ）、３．７３（ｄ，３Ｈ）、３．１４−３．０１（ｍ，４Ｈ）、２．７９（ｓ，３Ｈ）、２．７５（ｔ，２Ｈ）、２．３５（ｔ，２Ｈ）、２．２３−１．７１（ｍ，１８Ｈ）、１．５４−１．４６（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ予測値９６６（Ｃ45Ｈ60Ｎ10Ｏ10Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値９６６。
【００８６】
実施例４．追加化合物の合成
Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−アミノルシフェリン（２）
【化１４】
0005951613.tif 000017
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用した手順に従い、Ｃｂｚ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された：1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１０．６４（ｄ，１Ｈ）、９．４７（ｓ，１Ｈ）、８．６４（ｓ，１Ｈ）、８．４９（ｄ，１Ｈ）、８．０７−７．９８（ｍ，２Ｈ）、７．７７（ｄｄ，１Ｈ）、７．５１（ｄ，１Ｈ）、７．３４−７．２９（ｍ，５Ｈ）、６．７８（ｓ，１Ｈ）、５．１８（ｔ，１Ｈ）、４．９８（ｓ，２Ｈ）、４．３４−４．２２（ｍ，４Ｈ）、３．７５（ｑ，１Ｈ）、３．６７−３．５８（ｍ，３Ｈ）、３．１５（ｑ，２Ｈ）、２．４３−２．３８（ｍ，２Ｈ）、２．２８（ｄ，６Ｈ）、２．２１（ｔ，２Ｈ）、２．１２（ｔ，２Ｈ）、２．０５−１．９４（ｍ，２Ｈ）、１．８７−１．６３（ｍ，８Ｈ）、１．５１−１．２８（ｍ，１０Ｈ）。
【００８７】
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｅ）ＨｉｓＬｙｓ（Ａｃ）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（３）
【化１５】
0005951613.tif 000018
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨは、固体支持体上でＣｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨを使用して合成された：1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6およびＤ2Ｏ）δ８．４０（ｄ，１Ｈ）、７．９９（ｔ，１Ｈ）、７．８４（ｄ，４Ｈ）、７．６６（ｄ，２Ｈ）、７．４０（ｄ，２Ｈ）、７．３６−７．２６（ｍ，２Ｈ）、５．０３（ｔ，１Ｈ）、４．３５−４．２６（ｍ，２Ｈ）、４．２２−４．１９（ｍ，２Ｈ）、４．０３−３．９７（ｍ，１Ｈ）、３．５６−３．５３（ｍ，２Ｈ）、３．０４−２．８７（ｍ，８Ｈ）、２．６８−２．６３（ｍ，３Ｈ）、１．８３（ｓ，３Ｈ）、１．７４（ｓ，３Ｈ）、１．６７−１．４８（ｍ，６Ｈ）、１．３６−１．１４（ｍ，６Ｈ）。
【００８８】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａＬｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（４）
【化１６】
0005951613.tif 000019
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａ−ＯＨは、固体支持体上でＣｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用して合成された：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ７．９２（ｄｄ，１Ｈ）、７．８５（ｄｄ，１Ｈ）、７．７９−７．７１（ｍ，２Ｈ）、７．６７−７．５７（ｍ，３Ｈ）、７．４０−７．２０（ｍ，４Ｈ）、５．２０（ｔｄ，１Ｈ）、４．４５−４．１０（ｍ，５Ｈ）、４．００−３．６７（ｍ，７Ｈ）、３．１４（ｄｔ，２Ｈ）、３．０７−２．９５（ｍ，３Ｈ）、２．８１（ｓ，３Ｈ）、２．８０（ｄ，２Ｈ）、１．９５（ｓ，６Ｈ）、１．８９（ｄ，３Ｈ）、１．８７−１．６２（ｍ，４Ｈ）、１．４８−１．３４（ｍ，６Ｈ）；ＭＳ予測値１０１４（Ｃ49Ｈ60Ｎ10Ｏ10Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値１０１４。
【００８９】
Ｃｂｚ−ＧｌｙＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（５）
【化１７】
0005951613.tif 000020
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順のステップ１、２、および４に従い、Ｃｂｚ−ＧｌｙＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。ステップ１において、Ｃｂｚ−ＧｌｙＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨは、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、固体支持体上でＣｂｚ−Ｇｌｙ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨを使用して合成された：ＭＳ予測値７９８（Ｃ37Ｈ48Ｎ8Ｏ8Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値７９８。
【００９０】
Ｃｂｚ−ＬｅｕＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（６）
【化１８】
0005951613.tif 000021
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順のステップ１、２、および４に従い、Ｃｂｚ−ＬｅｕＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。ステップ１において、Ｃｂｚ−ＬｅｕＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨは、固体支持体上でＣｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨを使用して合成された：ＭＳ予測値８５４（Ｃ41Ｈ56Ｎ8Ｏ8Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値８５４。
【００９１】
Ｃｂｚ−ＰｈｅＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（７）
【化１９】
0005951613.tif 000022
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順のステップ１、２、および４に従い、Ｃｂｚ−ＰｈｅＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。ステップ１において、Ｃｂｚ−ＰｈｅＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨは、固体支持体上でＣｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨを使用して合成された：ＭＳ予測値８８８（Ｃ44Ｈ54Ｎ8Ｏ8Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値８８８。
【００９２】
Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）Ｌｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（８）
【化２０】
0005951613.tif 000023
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順のステップ１、２、および４に従い、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。ステップ１において、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨは、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、固体支持体上でＣｂｚ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨを使用して合成された：ＭＳ予測値９２６（Ｃ44Ｈ60Ｎ8Ｏ10Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値９２６。
【００９３】
Ｃｂｚ−ＨｉｓＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（９）
【化２１】
0005951613.tif 000024
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順のステップ１、２、および４に従い、Ｃｂｚ−ＨｉｓＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。ステップ１において、Ｃｂｚ−ＨｉｓＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨは、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、固体支持体上でＣｂｚ−Ｈｉｓ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨを使用して合成された：ＭＳ予測値８７８（Ｃ41Ｈ52Ｎ10Ｏ8Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値８７８。
【００９４】
Ｃｂｚ−ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（１０）
【化２２】
0005951613.tif 000025
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順のステップ１、２、および４に従い、Ｃｂｚ−ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。ステップ１において、Ｃｂｚ−ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨは、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、固体支持体上でＣｂｚ−Ｐｒｏ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨを使用して合成された：ＭＳ予測値８３８（Ｃ40Ｈ52Ｎ8Ｏ8Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値８３８。
【００９５】
Ｃｂｚ−ＧｌｕＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（１１）
【化２３】
0005951613.tif 000026
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順のステップ３に従い、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）Ｌｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリンから合成された：ＭＳ予測値８７０（Ｃ40Η52Ｎ8Ｏ10Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値８７０。
【００９６】
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａＬｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（１２）
【化２４】
0005951613.tif 000027
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａ−ＯＨは、固体支持体上でＣｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用して合成された：ＭＳ予測値８９２（Ｃ39Ｈ59Ｎ10Ｏ10Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値８９２。
【００９７】
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａＬｙｓ（ＴＦＡ）−アミノルシフェリン（１３）
【化２５】
0005951613.tif 000028
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用した手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された：ＭＳ予測値９４５（Ｃ39Ｈ56Ｆ3Ｎ10Ｏ10Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値９４５。
【００９８】
Ｃｂｚ−ＳｅｒＬｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｕＴｙｒＰｈｅＳｅｒＬｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（１４）
【化２６】
0005951613.tif 000029
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｃｂｚ−ＳｅｒＬｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｕＴｙｒＰｈｅＳｅｒ−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。Ｃｂｚ−ＳｅｒＬｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｕＴｙｒＰｈｅＳｅｒ−ＯＨは、固体支持体上でＣｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い合成された：ＭＳ予測値１３５４（Ｃ64Ｈ81Ｎ12Ｏ17Ｓ2，Ｍ＋１）、実測値１３５４。
【００９９】
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＬｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａＬｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（１５）
【化２７】
0005951613.tif 000030
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＬｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールから合成された。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＬｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａ−ＯＨは、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）を合成するために使用された手順に従い、固体支持体上で合成された：ＭＳ予測値６３８（Ｃ57Ｈ93Ｎ15Ｏ14Ｓ2，（Ｍ＋２）／２）、実測値６３８。
【０１００】
Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ−アミノルシフェリン（１６）
【化２８】
0005951613.tif 000031
この化合物は、Ｃｂｚ−ＧｌｎＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）Ｌｙｓ（Ａｃ）−アミノルシフェリン（実施例３）を合成するために使用された手順を使用して、Ｃｂｚ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールをカップリングすることにより合成された。Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−アミノシアノベンゾチアゾールは、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨ（実施例１）の手順を使用してＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびアミノシアノベンゾチアゾールをカップリングし、続いてＣｂｚ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＰｒｏＬｙｓ（Ｍｅ2）−ＯＨ（実施例３）の合成において記載されるＦｍｏｃを脱保護することにより合成された：1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１１．０９（ｓ，１Ｈ）、９．００（ｓ，１Ｈ）、８．７１（ｓ，１Ｈ）、８．３３（ｓ，１Ｈ）、８．２０（ｓ，１Ｈ）、８．０７−８．０１（ｍ，１Ｈ）、７．８９（ｔ，２Ｈ）、７．５８（ｄ，１Ｈ）、７．３８−７．２８（ｍ，５Ｈ）、６．７９（ｓ，２Ｈ）、５．２１−５．１１（ｍ，１Ｈ）、４．９８（ｓ，２Ｈ）、４．３８−４．２０（ｍ，３Ｈ）、３．８５−３．７６（ｍ，１Ｈ）、３．６７−３．５６（ｍ，２Ｈ）、２．８４−２．７０（ｍ，１Ｈ）、２．１７−２．０７（ｍ，４Ｈ）、２．０５−１．９０（ｍ，１４Ｈ）、１．８４（ｓ，６Ｈ）、１．６９−１．５０（ｍ，７Ｈ）、１．４３−１．２０（ｍ，４Ｈ）。
【０１０１】
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａＬｙｓ−アミノルシフェリン（１７）
【化２９】
0005951613.tif 000032
この化合物は、化合物１２に類似する様式で合成される。
【０１０２】
Ｃｂｚ−ＳｅｒＬｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｕＴｙｒＰｈｅＳｅｒＬｙｓ−アミノルシフェリン（１８）
【化３０】
0005951613.tif 000033
この化合物は、化合物１４に類似する様式で合成される。
【０１０３】
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＬｅｕＧｌｙＬｙｓ（Ｍｅ2）ＧｌｙＧｌｙＡｌａＬｙｓ−アミノルシフェリン（１９）
【化３１】
0005951613.tif 000034
この化合物は、化合物１５に類似する様式で合成される。
【０１０４】
実施例５．ＳＩＲＴ１阻害剤の有効性の判定
ニコチンアミドを連続的にＳＩＲＴ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に２倍希釈し、５０μＬを白色の９６ウェルプレートに添加した。５０μＬのＳＩＲＴ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液を、「非阻害」および「酵素なし」対照となるウェルに添加した。ＳＩＲＴ１酵素（Ｂｉｏｍｏｌ）をＳＩＲＴ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液に希釈し、全てのウェルに等容量（５０μＬ）で添加した。次いで、試料の均質性を確実にするために、プレートを５００〜７００ｒｐｍの旋回振とう器上に設置し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、全てのウェルに１００μＬの化合物１（実施例６のように可溶化される）を添加した。反応を酵素の定常状態に到達させるように振とうさせながら、プレートを室温で１５〜３０分間インキュベートし、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＰｏｌａｒＳｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ照度計上で発光を検出した。図２は、ＧｒａｐｈＰａｄのＰｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアにより判定されたニコチンアミドのＩＣ50値を示す。
【０１０５】
実施例６．Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼを使用したヒストンデアセチラーゼ活性のアッセイ
１０ｍＭの溶液を作製するために、最初に１／２容量（５１８μＬ）のＤＭＳＯ、続いて１／２容量（５１８μＬ）の水を添加することにより、１０ｍｇの化合物１を可溶化した。ルシフェリン検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；凍結乾燥されたルシフェリンケーキを９．８ｍＬの緩衝液で再水和することにより調製された）と２００μＬの１０ｍＭ化合物１（最終濃度２００μΜ）を混合することにより、部分デアセチラーゼ試薬を調製した。化合物１と同時精製された可能性があるいくらかの残留アミノルシフェリンを消散させるために、試薬を３７℃の水浴で１時間インキュベートした。ＨｅＬａ核抽出物を含有する１００μＬの緩衝液中に、Ｌｙｓ−Ｃ（５００ｎｇ／ｍＬ）を連続的に２倍希釈し（１：３０００に希釈）、９６ウェルプレートに添加した。部分デアセチラーゼ試薬を室温に平衡化し、１００μＬをプレートのウェルに添加した。旋回振とう器上でプレートを短時間混合し、ＢＭＧ  ＰｏｌａｒＳｔａｒ照度計を使用して発光を検出した。
【０１０６】
本明細書に引用される全ての特許、刊行物、および参考文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。本開示と組み込まれた特許、刊行物、および参照文献との間に矛盾がある場合、本開示が優先するものとする。
本発明の態様として、例えば以下のものがある。
〔１〕式（Ｉ）
0005951613.tif 000035
の化合物であって、式中、
Ａは、リポーター部分であり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
Ｒ3は、アシルおよびスルホニルから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、前記化合物は、対アニオンをさらに含む、化合物。
〔２〕Ａは、アミノルシフェリン、クマリン、ローダミン、セレンテラジン、レゾルフィン、およびクレシルバイオレットから選択される、前記〔１〕に記載の化合物。
〔３〕Ａは、封鎖基またはペプチド鎖でさらに官能化されるローダミンまたはクレシルバイオレットである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の化合物。
〔４〕Ｒ1は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔブチルオキシ（Ｂｏｃ）、アセチル、およびスクシニルからなる群から選択されるアミノ保護基またはアミノ封鎖基である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の化合物。
〔５〕ｎは、２、３、４、または５である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の化合物。
〔６〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4bである、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の化合物。
〔７〕Ｒ4aは水素であり、Ｒ4bはメチルである、前記〔６〕に記載の化合物。
〔８〕Ｒ4aおよびＲ4bは、それぞれメチルである、前記〔６〕に記載の化合物。
〔９〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cである、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の化合物。
〔１０〕Ｒ4a、Ｒ4b、およびＲ4cは、それぞれメチルである、前記〔９〕に記載の化合物。
〔１１〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cである、前記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の化合物。
〔１２〕Ｒ5aおよびＲ5bは水素であり、Ｒ5cはメチルである、前記〔１２〕に記載の化合物。
〔１３〕Ｒ3は、アシルである、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の化合物。
〔１４〕Ｒ3は、アセチルおよびトリフルオロアセチルから選択される、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の化合物。
〔１５〕前記化合物は、
0005951613.tif 000036
0005951613.tif 000037
から選択される、前記〔１〕に記載の化合物。
〔１６〕ヒストンデアセチラーゼ酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の化合物を、ヒストンデアセチラーゼ酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、前記ヒストンデアセチラーゼ酵素を前記式（Ｉ）の化合物と反応させて生成物を形成し、前記エンドペプチダーゼを前記生成物と反応させて化合物Ａ−ＮＨ2を放出させるのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
〔１７〕前記化合物Ａ−ＮＨ2の前記検出を前記ヒストンデアセチラーゼ酵素の活性と相関させることをさらに含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記ヒストンデアセチラーゼ酵素の活性は、定量化される、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記エンドペプチダーゼは、前記式（Ｉ）の化合物と反応しない、前記〔１６〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕前記生成物は、以下の式（ＩＩ）
0005951613.tif 000038
を有する、前記〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕ｎの値および各Ｒ2部分の特定は、前記ヒストンデアセチラーゼ酵素に対する特異性を付与するように選択される、前記〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕塩基性アミノ酸を認識する前記エンドペプチダーゼは、トリプシンである、前記〔１６〕〜〔２１〕のいずれかに記載の方法。
〔２３〕式（ＩＩ）
0005951613.tif 000039
の化合物であって、式中、
Ａは、リポーター部分であり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、前記化合物は、対アニオンをさらに含む、化合物。
〔２４〕Ａは、アミノルシフェリン、クマリン、ローダミン、セレンテラジン、レゾルフィン、およびクレシルバイオレットから選択される、前記〔２３〕に記載の化合物。
〔２５〕Ａは、封鎖基またはペプチド鎖でさらに官能化されるローダミンまたはクレシルバイオレットである、前記〔２３〕〜〔２４〕のいずれかに記載の化合物。
〔２６〕Ｒ1は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔブチルオキシ（Ｂｏｃ）、アセチル、およびスクシニルからなる群から選択されるアミノ保護基またはアミノ封鎖基である、前記〔２３〕〜〔２５〕のいずれかに記載の化合物。
〔２７〕ｎは、２、３、４、または５である、前記〔２３〕〜〔２６〕のいずれかに記載の化合物。
〔２８〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4bである、前記〔２３〕〜〔２７〕のいずれかに記載の化合物。
〔２９〕Ｒ4aは水素であり、Ｒ4bはメチルである、前記〔２８〕に記載の化合物。
〔３０〕Ｒ4aおよびＲ4bは、それぞれメチルである、前記〔２８〕に記載の化合物。
〔３１〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cである、前記〔２３〕〜〔３０〕のいずれかに記載の化合物。
〔３２〕Ｒ4a、Ｒ4b、およびＲ4cは、それぞれメチルである、前記〔３１〕に記載の化合物。
〔３３〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cである、前記〔２３〕〜〔３２〕のいずれかに記載の化合物。
〔３４〕Ｒ5aおよびＲ5bは水素であり、Ｒ5cはメチルである、前記〔３３〕に記載の化合物。
〔３５〕前記化合物は、
0005951613.tif 000040
0005951613.tif 000041
から選択される、前記〔２３〕に記載の化合物。
〔３６〕ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）前記〔２３〕〜〔３５〕のいずれか１項に記載の化合物を、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素と、前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素を前記式（ＩＩ）の化合物と反応させて生成物を形成するのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼを添加して、前記エンドペプチダーゼが前記式（ＩＩ）の化合物と反応し、化合物Ａ−ＮＨ2を放出するようにすることと、  ｃ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
〔３７〕前記化合物Ａ−ＮＨ2の前記検出を前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性と相関させることをさらに含む、前記〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性は、定量化される、前記〔３７〕に記載の方法。
〔３９〕前記エンドペプチダーゼは、前記生成物と反応しない、前記〔３６〕〜〔３８〕のいずれかに記載の方法。
〔４０〕前記生成物は以下の式（ＩＩＩ）
0005951613.tif 000042
を有する、前記〔３６〕〜〔３９〕のいずれかに記載の方法。
〔４１〕ｎの値および各Ｒ2部分の特定は、前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素に対する特異性を付与するように選択される、前記〔３６〕〜〔３９〕のいずれかに記載の方法。
〔４２〕塩基性アミノ酸を認識する前記エンドペプチダーゼは、トリプシンである、前記〔３６〕〜〔４１〕のいずれかに記載の方法。
〔４３〕ａ．式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
ｃ．任意に検出試薬と、を含む、組成物。
〔４４〕緩衝液、酵素補因子、および標的酵素からなる群から選択される１つ以上をさらに含む、前記〔４３〕に記載の組成物。
〔４５〕前記標的酵素は、ヒストンデアセチラーゼまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼである、前記〔４４〕に記載の組成物。
〔４６〕前記検出試薬は、ルシフェリン検出試薬を含む、前記〔４３〕に記載の組成物。
〔４７〕ａ．式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
ｃ．任意に検出試薬と、を含む、キット。
〔４８〕緩衝液、酵素補因子、標的酵素、対照基質、および酵素阻害剤または活性化剤からなる群から選択される１つ以上をさらに含む、前記〔４７〕に記載のキット。
〔４９〕前記標的酵素は、ヒストンデアセチラーゼまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼである、前記〔４８〕に記載のキット。
〔５０〕前記検出試薬は、ルシフェリン検出試薬を含む、前記〔４７〕に記載のキット。
〔５１〕標的酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）少なくとも１つの封鎖アルギニンまたはリジン残基を含む化合物を、標的酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと反応させて、前記反応が化合物Ａ−ＮＨ2の形成をもたらすことと、
ｂ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
〔５２〕少なくとも１つの封鎖アルギニンまたはリジン残基を含む前記化合物は、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の化合物である、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕少なくとも１つの封鎖アルギニンまたはリジン残基を含む前記化合物は、前記〔２３〕〜〔３５〕のいずれか１項に記載の化合物である、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５４〕前記標的酵素は、ヒストンデアセチラーゼまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素である、前記〔５１〕〜〔５３〕のいずれかに記載の方法。
【図２】
0005951613.tif 000052
【図１】
0005951613.tif 000053