(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温至適プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有
するタンパク質溶液（Ｄ）であって、（Ａ）の酵素反応至適温度が０℃〜５０℃であるタ
ンパク質溶液であって、
低温至適プロテアーゼ（Ａ）が、カンナーゼであって、
下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）が、配列番号２，１０又は２２のアミノ酸配列を有するタンパク質プロテアーゼ活性阻害剤であるタンパク質溶液。
ただし、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）  は、（Ｅ）として サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドを用いて、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが、１ｎＭ〜１００ｎＭである 。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質溶液（Ｄ）及び界面活性剤（Ｏ）を含む洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質溶液及びこれを含む洗剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く存在が知られている。その応用分野としては、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工など）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤などがあり、多くの分野で盛んに利用されている。
【０００３】
洗浄剤に添加するプロテアーゼとして、洗浄時の温度で高活性を発揮する低温至適プロテアーゼが近年開発されている。しかしながら、低温至適プロテアーゼは、プロテアーゼの中でも特に耐熱性が低く、一般的なプロテアーゼ（至適温度が５０を超え８０℃以下）と比較して溶液中での自己分解がより起こりやすく、酵素活性が低下しやすいという問題がある。
【０００４】
一方、プロテアーゼの活性を阻害するプロテアーゼ活性阻害剤の研究が行われている。例えば、非特許文献１には、ボロニックアシッドがセリンプロテアーゼやズブチリシンを阻害する旨の記載がある。
しかしながら、上記のプロテアーゼ活性阻害剤は、一般的なプロテアーゼに対しては一定の効果があるものの、低温至適プロテアーゼの酵素活性を長期間安定に維持できるほど十分でない。また、低温至適プロテアーゼの耐熱性の向上については効果がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５１，１９８３，ｐ５−３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、低温至適プロテアーゼの酵素活性の低下を抑制し、さらに耐熱性を向上させ、低温至適プロテアーゼの酵素活性を長期間安定に維持できるタンパク質溶液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明のタンパク質溶液は、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｄ）であって、（Ａ）の酵素反応至適温度が０℃〜５０℃であるタンパク質溶液である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｅ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のタンパク質溶液は、低温至適プロテアーゼの酵素活性の低下を抑制し、さらに耐熱性を向上できるので、低温至適プロテアーゼの酵素活性を長期間安定に維持できる。
また、本発明の洗剤組成物は、洗浄性の持続性が高い。
なお、本発明において、「洗浄性の持続性が高い」とは、一定期間保管した後に測定した洗浄性と、保管する直前に測定した洗浄性との差が小さく、一定の洗浄性を示すことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】カンナーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍを求めるために作成したＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットであり、縦軸をそれぞれの基質濃度［Ｓ］の酵素反応初速度ｖによる逆数（［Ｓ］／ｖ）、横軸を基質（Ｄ）の濃度［Ｓ］としてプロットしたグラフである。
【図２】カンナーゼの活性の最適ｐＨを求めるために、縦軸をｐＨ４．５〜９．５における傾き係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、カンナーゼの活性のｐＨ依存性を表したグラフである。
【図３】カンナーゼの活性の至適温度を求めるために、縦軸を２０〜７０℃における傾き係数ｋ、横軸を温度としてプロットし、カンナーゼの活性の温度依存性を表したグラフである。
【図４】製造例１で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のカンナーゼに対する阻害定数を求めるために作成したＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットであり、横軸に１／αを、縦軸に［（Ｂ１）のモル濃度］／（１−α）をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のタンパク質溶液は、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｄ）であって、（Ａ）の酵素反応至適温度が０〜５０℃であるタンパク質溶液である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｅ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。
【００１１】
本発明において低温至適プロテアーゼ（Ａ）は、酵素反応至適温度が０〜５０℃であるプロテアーゼである。
（Ａ）としては、酵素反応至適温度が０〜５０℃である公知のプロテアーゼが含まれ、例えば、アスパラギン酸プロテアーゼに分類されるもの｛活性部位に２個のアスパラギン酸を有するプロテアーゼ｝、システインプロテアーゼに分類されるもの｛活性部位に求核攻撃を行うシステインを有するプロテアーゼ｝、金属プロテアーゼに分類されるもの｛活性部位に金属イオンを有するプロテアーゼ｝並びにセリンプロテアーゼに分類されるもの｛触媒残基として、求核攻撃を行うセリン残基を有するプロテアーゼであり、具体的には、カンナーゼ（ノボザイムズ社）、スブチリシンＳ３９及びスブチリシンＳ４１等｝等が挙げられる。
（Ａ）としては、洗剤用途に広く使用されている観点から、セリンプロテアーゼに分類されるものが好ましい。
【００１２】
上記の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の酵素反応至適温度は、具体的には、後述する至適温度測定法によって求められる。
また、上記以外のプロテアーゼについて、低温至適プロテアーゼであるかどうかは、一般的なプロテアーゼ活性測定法（例えば、アゾカゼインを用いた活性測定法）によってプロテアーゼの酵素反応の至適温度を求めた際、至適温度が０〜５０℃であるかどうかで判断し、至適温度が０〜５０℃のものを低温至適プロテアーゼとする。
低温至適プロテアーゼは、至適温度が０〜５０℃であるプロテアーゼであるが、この至適温度は使用時（洗浄等）の温度で高活性を発揮する観点から、５〜４５℃が好ましく、さらに好ましくは１０〜４０℃である。
【００１３】
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）は、基質（Ｅ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤である。（Ｂ）は、（Ａ）と一定のモル比で可逆的に結合し、（Ａ）の活性を阻害するものである。
【００１４】
上記ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリドは、フェニルアラニンのアミノ基にオキシカルボキシベンジル基が結合し、カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、ＭＰ−バイオメディカル社（製品名：Ｎ−ｃｂｚ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）から入手可能である。
上記ベンゾイルアルギニンニトロアニリドは、アルギニンのアミノ基にカルボキシベンジル基が結合し、アルギニンのカルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、和光純薬工業（株）（製品名：Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩 ）から入手可能である。
上記フリルアクリロイルグリシルロイシンアミドは、グリシルロイシンアミドのアミノ基にフリルアクリル酸がペプチド結合したものであり、シグマ社（製品名：Ｎ‐（３‐［２‐Ｆｕｒｙｌ］ａｃｒｙｌｏｙｌ）‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ ａｍｉｄｅ）から入手可能である。
上記サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドは、アラニルアラニルプロリルフェニルアラニンの末端アミノ基に無水コハク酸が結合し、末端カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ社（製品名：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）から入手可能である。
【００１５】
上記基質（Ｅ）のうち、Ｋｉを求める際にどの基質を用いるかは、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）が活性を阻害する（Ａ）の分類により適宜選択される。上記アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−１）であればベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、システインプロテアーゼ（Ａ−２）であればベンゾイルアルギニンニトロアニリド、金属プロテアーゼ（Ａ−３）であればフリルアクリロイルグリシルロイシンアミド、セリンプロテアーゼ（Ａ−４）であればサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドを使用する。
上記に（Ａ）として例示されていないプロテアーゼについては、参考文献１（Ｒａｗｌｉｎｇｓ， Ｎ．Ｄ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ， Ａ．Ｊ． （１９９３） Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ ２９０， ｐ２０５−２１８）に、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかが記載されている。
また、上記にも、参考文献１にも記載されていないプロテアーゼが、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかは、参考文献２（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  ＆  Ｂａｒｒｅｔｔ（１９９８）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に示される方法を用いることで分類できる。
【００１６】
本発明において低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度は、（Ａ）に対する基質（Ｅ）のミカエリス定数Ｋｍの３分の１〜２倍である。ミカエリス定数Ｋｍは酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。具体的には、下記のミカエリス定数Ｋｍ測定法によって求めたものである。
＜ミカエリス定数Ｋｍ測定法＞
一定量の基質（Ｅ）、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｉ）の温度は、０〜５０℃の範囲内で、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（Ｉ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｉ）のｐＨは、ｐＨ３〜１２の範囲内であればいい。後述する最適ｐＨがわかっている場合は、最適ｐＨであることが好ましい。
酵素反応溶液（Ｉ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（Ｉ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択されるが、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（Ｉ）中の基質（Ｅ）の濃度（モル濃度）は、経時的な吸光度変化を観測できる最小の基質濃度から最大の基質濃度の間で３点以上選べばよい。測定に使用する（Ａ）と類似のプロテアーゼのミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、類似プロテアーゼのＫｍの１／５０〜１０倍の間で３点以上選べばよい。
酵素反応溶液（Ｉ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｉ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。基質（Ｅ）及び低温至適プロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）から酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）  （１）
さらに、基質（Ｅ）の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｉ）を用いて、同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
ミカエリス定数Ｋｍは、算出した酵素反応初速度ｖを用いて、下記ミカエリスメンテン式（数式（２））から派生するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットによって求められる。
ｖ＝Ｖｍａｘ［Ｓ］／（Ｋｍ＋［Ｓ］）  （２）
上記数式（２）中、ｖは酵素反応初速度（Ｍ／ｓ）、Ｖｍａｘは最大速度（Ｍ／ｓ）、［Ｓ］は酵素反応溶液中での基質濃度（Ｍ）である。
Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットは、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質（Ｅ）の濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］の酵素反応初速度ｖによる逆数（［Ｓ］／ｖ）をプロットしたものであり、プロットの近似直線とｘ軸との交点が−Ｋｍである。
【００１７】
低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適ｐＨは、様々なｐＨで酵素反応溶液の吸光度を測定することによって決定できる。具体的には、下記の最適ｐＨ測定法によって求めたｐＨである。
＜最適ｐＨ測定法＞
一定量の基質（Ｅ）、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含むｐＨを３〜１２に調製した酵素反応溶液（ＩＩ）を作成する。それぞれの溶液（ＩＩ）のｐＨ間隔は１程度とする（例えば、ｐＨ３．０、４．０及び５．０等）。
酵素反応溶液（ＩＩ）の温度は、０〜５０℃の範囲内で、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（ＩＩ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（ＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩ）中のｐＨ調整剤（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩ）中の基質（Ｅ）の濃度（モル濃度）は、上記低温至適プロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｅ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩ）において、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｅ）及び低温至適プロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き（係数ｋ）を求める。さらに、それぞれのｐＨ（３〜１２）の酵素反応溶液（ＩＩ）を用いて測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、係数ｋが極大値となるｐＨが最適ｐＨである。
ｐＨを調整する際に、バッファーの種類を変更する場合は、バッファーによってプロテアーゼ活性が異なるため、適宜これを補正する必要がある。補正する方法としては、バッファーの種類を変える境目のｐＨにおいて、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正する方法が挙げられる。
【００１８】
低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度は、０〜５０℃の範囲で酵素反応溶液の吸光度を測定することによって求められる。具体的には、下記の至適温度測定法によって求めた温度である。
＜至適温度測定法＞
一定量の基質（Ｅ）、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む最適ｐＨに調整した酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）の温度は、０℃、５℃、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃及び８０℃でそれぞれ作成する。０℃で測定する際は、塩化ナトリウムを１Ｍとなるように溶解して作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の基質（Ｅ）の濃度（モル濃度）は、後述する低温至適プロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｅ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｅ）及び低温至適プロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋ）を求める。０〜５０℃の各温度で作成した酵素反応溶液（ＩＩＩ）において測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットする。係数ｋが極大値となる温度がプロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度である。
【００１９】
＜阻害定数Ｋｉの測定方法＞
至適温度、最適ｐＨに調製した、一定量の低温至適プロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む低温至適プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成する。また、（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を数種類作成する。作成した（ｉ）は、数十分〜数時間静置する。静置後のそれぞれの（ｉ）に、基質（Ｅ）を添加して酵素反応溶液（ＩＶ）を作成する。
（ｉ）及び（ＩＶ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。（ｉ）及び（ＩＶ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭであり、最適ｐＨに調整できればいい。
（ｉ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、前述のＫｍを求めた際の（Ａ）の濃度付近であり、且つ、後に（ｉ）に添加する基質（Ｄ）のモル濃度の１０００分の１〜１０分の１の濃度である。（ＩＶ）中の（Ａ）のモル濃度は、（ＩＶ）中の基質（Ｅ）のモル濃度の１０００分の１〜１０分の１の濃度である。
（ｉ）及び（ＩＶ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度（モル濃度）は、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）の１０分の１〜１０００倍で４種類以上と（Ｂ）を含まないものを作成する。
酵素反応溶液（ＩＶ）中の基質（Ｅ）のモル濃度は、最適基質濃度（上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１〜２倍）である。
（ｉ）の静置時間は、（Ａ）と（Ｂ）が十分に結合し、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間であり、あらかじめ実験して求めておく。
低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間は、後述する吸光度を利用した活性測定法により求めることができる。具体的には、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成してから、一定時間おきに、後述する吸光度を利用した活性測定法により、直線の傾き（係数ｋ）を求める。係数ｋが一定になるまでの時間が（Ａ）の活性が一定になるまでの時間である。
プロテアーゼ活性の至適温度及び最適ｐＨの条件下、酵素反応溶液（ＩＶ）を作成後、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化すれば良い。単位時間あたりの吸光度変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εから上記数式（１）を用いて酵素反応初速度ｖを算出する。また、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を用いて作成した酵素反応溶液（ＩＶ）についても同様に測定し、酵素反応初速度ｖｉを算出する。（Ｂ）を含まない時の酵素反応初速度をｖｏとし、各（Ｂ）濃度での相対活性α（ｘ＝ｖｉ／ｖｏ）を算出する。
横軸に１／αを、縦軸に［（Ｂ）のモル濃度］／（１−α）をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成する。このプロットに近似直線を描いたときの傾きＫｉ（ａｐｐ）、測定時の基質濃度［Ｓ］及びミカエリス定数Ｋｍを式Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）に当てはめてＫｉを算出する。
【００２０】
上記Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットは、具体的には、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１２７，１９７２，ｐ２１−３３３に記載されている方法を用いる。
【００２１】
本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の阻害定数Ｋｉは、１ｐＭ〜１０μＭであり、適度な低温至適プロテアーゼ濃度範囲で低温至適プロテアーゼ活性を抑制及び回復並びに低温至適プロテアーゼの耐熱性を向上できるとの観点から、１ｎＭ〜１μＭが好ましい。
【００２２】
上記阻害定数Ｋｉが１ｐＭ未満では、低温至適プロテアーゼ（Ａ）とプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の結合が強いため、（Ａ）の活性を回復させるには大量に希釈しなければならない。例えば、Ｋｉが０．１ｐＭの（Ｂ）を、（Ａ）と等モル量用いて（Ａ）の活性を２０％以下にした場合、タンパク質溶液中の（Ａ）が約１．０×１０-10重量％の濃度になるように大希釈しなければ（Ａ）の活性を５０％以上に回復することができない。しかしながら、（Ａ）の濃度が１．０×１０-10重量％以下では、低温至適プロテアーゼを衣料用洗浄剤等として使用する場合、添加することによる有用な効果が得られない。
一方、（Ｂ）の阻害定数Ｋｉが１０μＭより大きくなると、（Ａ）の活性を抑制するのに、大量の（Ｂ）が必要となる。また、（Ｂ）を大量に添加すると、大量に希釈しなければ（Ａ）の活性を回復させることができない。
【００２３】
本発明において、（Ｂ）としては、上記の条件を満たす公知のプロテアーゼ活性阻害剤が含まれる。（Ｂ）としては、タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）及び非タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）が含まれる。
【００２４】
タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）は、天然物から抽出された又は宿主細胞に遺伝子を組み込むことで発現されたタンパク質であり、低温至適プロテアーゼの活性を阻害する性質をもつタンパク質である。（Ｂ１）として、例えば、ポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）及びタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−２）等が挙げられる。
【００２５】
ポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）としては、配列番号１のアミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸配列を置換した配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−１）、（Ｂ１−１−１）のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−２）、配列番号２６〜２８のアミノ酸配列を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−３）及びその他のタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−４）が含まれる。
【００２６】
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−１）は、 配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸を変更前のアミノ酸とは別のアミノ酸と置換した配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であって、下記（１）〜（８）のうち少なくとも１つの条件を満たすタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤である。
（１）（Ｙ）の１２位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ１）である
（２）（Ｙ）の３８位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ２）である
（３）（Ｙ）の４８位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ３）である
（４）（Ｙ）の５０位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ４）である
（５）（Ｙ）の５１位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ５）である
（６）（Ｙ）の５２位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ６）である
（７）（Ｙ）の５３位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ７）である
（８）（Ｙ）の７０位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ８）である
（Ｘ１）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＧｌｕ以外のアミノ酸
（Ｘ２）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＶａｌ以外のアミノ酸
（Ｘ３）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＭｅｔ以外のアミノ酸
（Ｘ４）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＴｙｒ以外のアミノ酸
（Ｘ５）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸
（Ｘ６）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＩｌｅ以外のアミノ酸
（Ｘ７）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｓｐ以外のアミノ酸
（Ｘ８）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸
（Ｘ０）：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ
【００２７】
上記（１）の条件において、（Ｘ１）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＧｌｕ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｓｐ、Ａｌａ、Ａｓｎ及びＧｌｎであり、特に好ましくはＡｌａ及びＡｓｐである。
上記（２）の条件において、（Ｘ２）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＶａｌ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｒｐが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｌｅｕ及びＩｌｅであり、特に好ましくはＡｌａ及びＩｌｅである。
上記（３）の条件において、（Ｘ３）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＭｅｔ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ及びＶａｌであり、特に好ましくはＡｌａ及びＧｌｙである。
上記（４）の条件において、（Ｘ４）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＴｙｒ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｐｈｅ及びＬｅｕであり、特に好ましくはＡｌａ、Ｐｈｅ及びＬｅｕである。
上記（５）の条件において、（Ｘ５）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｌｙｓ，Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ及びＨｉｓである。
上記（６）の条件において、（Ｘ６）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＩｌｅ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ及びＧｌｎである。
上記（７）の条件において、（Ｘ７）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＡｓｐ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＧｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ及びＧｌｎである。
上記（８）の条件において、（Ｘ８）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｌｙｓ，Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ及びＬｅｕであり、特に好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ及びＬｙｓである。
【００２８】
（Ｂ１−１−１）は、配列番号１のアミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸を変更前のアミノ酸とは別のアミノ酸と置換した配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであるが、配列（Ｙ）中におけるアミノ酸の置換数は、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜５個が好ましく、さらに好ましくは１〜３個である。
【００２９】
（Ｂ１−１−１）は、配列（Ｙ）を少なくとも１つ有すればよく、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から１〜４個が好ましい。
【００３０】
本発明において、（Ｂ１−１−１）は配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであり、配列（Ｙ）のみからなるものでもよく、配列（Ｙ）のＣ末端及び／又はＮ末端に配列（Ｚ）を１個又は複数個有しているものでもよく、これらが繰り返された配列でもよい。
配列（Ｚ）は、アミノ酸１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。
配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個である。
（Ｂ１−１−１）が配列（Ｚ）を有する場合、配列（Ｚ）の個数は、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１００個が好ましい。
【００３１】
また、（Ｂ１−１−１）を構成するアミノ酸配列中の配列（Ｙ）以外のアミノ酸の数は、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個である。
【００３２】
（Ｂ１−１−１）は配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであり、具体的には、配列番号２〜２５のタンパク質性プロテアーゼインヒビターが挙げられる。
（Ｂ１−１−１）として、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、配列番号２〜２５が好ましい。また、プロテアーゼの持続性の観点から、４、１２、１８、１９、２２、２３、２４及び２５が好ましい。
【００３３】
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−２）は、上記（Ｂ１−１−１）のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であって、下記（９）〜（１６）のうち少なくとも１つの条件を満たすタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−２）であるタンパク質性プロテアー活性阻害剤である。
（９）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の１２位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ１）である
（１０）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の３８位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ２）である
（１１）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の４８位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ３）である
（１２）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の５０位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ４）である
（１３）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の５１位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ５）である
（１４）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の５２位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ６）である
（１５）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の５３位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ７）である
（１６）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の７０位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ８）である
【００３４】
本発明において、（Ｂ１−１−２）のアミノ酸配列は、（Ｂ１−１−１）のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、９５％以上の相同性を有することが好ましく、さらに好ましくは９７％以上の相同性を有することである。
アミノ酸配列の相同性は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供する相同性解析プログラム「ＢＬＡＳＴ」の、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いて解析する（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。
【００３５】
配列番号２６〜２８のアミノ酸配列を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−３）としては、配列番号２６〜２８のアミノ酸配列を有するものであればよく、具体的には、配列番号２６〜２８のアミノ酸配列であるものが含まれる。
【００３６】
その他のタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−４）としては、Ｅｇｌｉｎ  Ｃ及びＷｈｅａｔ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等が挙げられる。
【００３７】
タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−２）には、ポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）以外の上記の条件を満たす公知のタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤が含まれ、具体的には、Ｆｕｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｆ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＨｕｍａｎ  ＬＥＫＴＩ等が挙げられる。
【００３８】
非タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）としては、上記（Ｂ１）以外の分子量５０〜１０００の化合物であり、低温至適プロテアーゼ（Ａ）と可逆的な結合を形成し、低温至適プロテアーゼの活性を阻害するものである。（Ｂ２）として、具体的には、２，４−ジクロロフェニルボロン酸等が挙げられる。
【００３９】
上記（Ｂ）のうち、入手しやすさ、低温至適プロテアーゼ活性の抑制及び耐熱性向上の観点から、タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）が好ましく、さらに好ましくはポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）であり、特に好ましくはＥｇｌｉｎ  Ｃ及びＷｈｅａｔ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒである。
また、上記（Ｂ）のうち、低温至適プロテアーゼ活性の抑制、耐熱性向上及び他のタンパク質の安定性の観点から、ポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）が好ましく、さらに好ましくはプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−１）及びプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−２）である。
【００４０】
本発明において、溶剤（Ｃ）としては、水、有機溶剤及びこれらの混合物が挙げられる。
【００４１】
水としては、特に限定されるものではなく、例えば、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、後述するｐＨ調整剤（Ｍ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
【００４２】
有機溶剤としては、アルコール（炭素数１〜１８のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等）、ケトン（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル（テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールモノアルキルエーテル、プロピレングリコールモノアルキルエーテル、環状エーテル等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）、脂肪族または脂環式炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ミネラルスピリット、シクロヘキサン等）及びふっ素含有化合物（テトラフルオロエチレン等）等が挙げられる。これらの有機溶剤のうち、タンパク質の安定性の観点からアルコールが好ましい。
【００４３】
溶剤（Ｃ）としては、低温至適プロテアーゼの安定性の観点からアルコール及び水が好ましく、さらに好ましくは水であり、特に好ましくはｐＨ調整剤（Ｍ）を含むバッファー水溶液である。
【００４４】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）は、上記低温至適プロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するものである。
タンパク質溶液（Ｄ）中の（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質分解効果を発揮する観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として０．０００００１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００１〜４０重量％であり、特に好ましくは０．０００１〜３０重量％である。
タンパク質溶液（Ｄ）中の（Ｂ）の含有量（重量％）は、低温至適プロテアーゼの活性阻害効果の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．０００００１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００１〜５０重量％であり、特に好ましくは０．０００１〜５０重量％である。
タンパク質溶液（Ｄ）中の（Ｃ）の含有量（重量％）は、低温至適プロテアーゼの安定性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．０００００００１〜９９．９９９９９８重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜９９．９９９９８重量％であり、特に好ましくは２０〜９９．９９９８％である。
【００４５】
タンパク質溶液（Ｄ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）と低温至適プロテアーゼ（Ａ）のモル比（（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数）は、低温至適プロテアーゼの効果的な阻害の観点から１〜１０００００が好ましく、さらに好ましくは１〜１０００であり、特に好ましくは１〜５００である。
【００４６】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）には、上記の低温至適プロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）以外に、無機塩（Ｇ）、糖（Ｈ）、アミノ酸（Ｉ）、低分子有機化合物（Ｊ）、脂肪酸（Ｋ）、油脂（Ｌ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）、（Ａ）と（Ｂ）以外のタンパク質（Ｎ）及び界面活性剤（Ｏ）を含有することができる。
【００４７】
無機塩（Ｇ）として、塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ギ酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等が挙げられる。
【００４８】
糖（Ｈ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００４９】
アミノ酸（Ｉ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン及びそれらの塩等が挙げられる。
【００５０】
脂肪酸（Ｋ）として、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸等が挙げられる。
【００５１】
油脂（Ｌ）としては、上記脂肪酸（Ｋ）のモノ、ジ、トリグリセリドが挙げられる。
【００５２】
ｐＨ調整剤（Ｍ）としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、例えば、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー及びクエン酸等が挙げられる。
【００５３】
（Ａ）と（Ｂ）以外のタンパク質（Ｎ）としては、特に限定するものではないが、低温至適プロテアーゼ以外の酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられ、具体的には、血清アルブミン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン及びシルクペプチド等が挙げられる。
【００５４】
界面活性剤（Ｏ）としては、後述する界面活性剤（Ｏ）が含まれ、好ましいものも同様である。
【００５５】
低分子有機化合物（Ｊ）としては、上記以外の分子量１０００以下の低分子有機化合物が含まれ、具体的には、酢酸ベンジル、メチルサリチル酸、ベンジルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、けい皮酸、カフェ酸、カテキン類、アスコルビン酸及びカロテノイド等が挙げられる。
【００５６】
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる無機塩（Ｇ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜１０％が好ましく、さらに好ましくは０〜５％、特に好ましくは０〜３％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる糖（Ｈ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれるアミノ酸（Ｉ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる低分子有機化合物（Ｊ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる脂肪酸（Ｋ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる油脂（Ｌ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれるｐＨ調整剤（Ｍ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる低温至適プロテアーゼ以外のタンパク質（Ｎ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる界面活性剤（Ｏ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜２５％、特に好ましくは０〜１０％である。
【００５７】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）溶剤（Ｃ）にｐＨ調整剤（Ｍ）及びプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を添加し、２０℃〜４０℃で均一になるまで撹拌する。
（２）低温至適プロテアーゼ（Ａ）を添加し、２０℃〜４０℃℃で均一になるまで撹拌する（低温至適プロテアーゼ（Ａ）とプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）との結合速度の観点から、３０分以上であることが好ましい）。
（３）最後に（Ｇ）〜（Ｏ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌し、タンパク質溶液（Ｄ）を製造する。
【００５８】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）のｐＨは、タンパク質の安定性の観点から、ｐＨ３〜１０が好ましく、さらに好ましくはｐＨ５〜９である。
（Ｄ）のｐＨは、ｐＨ調整剤（Ｍ）によって適宜調整できる。
【００５９】
本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）は、吸光度を利用した活性測定法によるプロテアーゼ活性Ｘｉが、プロテアーゼ活性の残存によるプロテアーゼ自身及び／又は他のタンパク質の分解を防止するとの観点から、タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜１０％であり、特に好ましくは０．０００１〜３％である。
【００６０】
タンパク質溶液（Ｓ）は、タンパク質溶液（Ｄ）において、（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液である。例えば、（Ｄ）中の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の含有量（重量％）が（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、（Ａ）が２重量％、（Ｂ）が１８重量％、（Ｃ）が８０重量％である場合、（Ｓ）中の（Ａ）は２重量％、（Ｃ）は９８重量％である。
【００６１】
本発明において、吸光度を利用した活性測定法とは、基質（Ｄ）を用いて、一定温度、一定ｐＨ、上述の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度の条件下で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する方法である。
基質（Ｅ）として、どの基質を用いるかは、上記Ｋｉを求める際に使用する基質と同様、タンパク質溶液（Ｄ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の分類により適宜選択される。
吸光度を利用した活性測定法として、具体的には、下記の測定によって求められる。
【００６２】
＜吸光度を利用した活性測定法＞
○プロテアーゼ活性Ｘｉ
一定量のタンパク質溶液（Ｄ）及び一定量の基質（Ｅ）を添加して酵素反応溶液（Ｖ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｖ）の温度は、０〜５０℃の範囲内で、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、測定の間一定に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）中の基質（Ｅ）のモル濃度は、最適基質濃度で上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１〜２倍であり、且つ、（Ｖ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）のモル濃度の５〜１０００００倍の濃度であればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｖ）を作成したときの温度と同温度である。酵素反応溶液（Ｖ）を作成直後の吸光度Ａλ0及び酵素反応溶液（Ｖ）を作成からｈ時間後の吸光度Ａλhを測定し、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を求める。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋX）を求める。
【００６３】
タンパク質溶液（Ｄ）に変えてタンパク質溶液（Ｓ）を使用する以外は同様にして吸光度を測定し、直線の傾き（係数ｋS）を求める。
【００６４】
上記タンパク質溶液（Ｄ）及び（Ｓ）は、作成してから３０分以上６時間以内のものを使用する。
【００６５】
（Ｄ）のプロテアーゼ活性Ｘｉは、タンパク質溶液（Ｄ）及びタンパク質溶液（Ｓ）を用いた上記の直線の傾き係数ｋX及びｋSから、下記数式（３）によって求められる。
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋX／ｋS｝×１００  （３）
【００６６】
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）の使用方法は、従来の
【００６７】
本発明の洗剤組成物は、上記タンパク質溶液（Ｄ）及び界面活性剤（Ｏ）を含有する洗剤組成物である。
【００６８】
本発明において、界面活性剤（Ｏ）は、ノニオン性界面活性剤（Ｏ−１）、アニオン性界面活性剤（Ｏ−２）、カチオン性界面活性剤（Ｏ−３）及び両性界面活性剤（Ｏ−４）が挙げられる。
【００６９】
ノニオン性界面活性剤（Ｏ−１）としては、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）アルキレンオキサイド（炭素数２〜８）付加物（重合度＝１〜１００）［オレイルアルコールエチレンオキサイド１１モル付加物等］、（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）グリコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［モノステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝２０）及びジステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝３０）等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸エチレングリコール及びモノラウリン酸ソルビタン等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル（ポリ）アルキレンオキサイド付加物（アルキレン基の炭素数２〜８，重合度＝１〜１００）［ソルビタンモノラウレートエチレンオキサイド（重合度＝１０）付加物及びメチルグルコースジオレエートエチレンオキサイド（重合度＝５０）付加物等］、脂肪酸Ｎ−ヒドロキシアルキルアミド［１：１型ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド及び１：１型ラウリン酸ジエタノールアミド等］、アルキル（炭素数１〜２２）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）フェニルエーテル、アルキル（炭素数８〜２４）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）−アミノアルキル（炭素数８〜２４）−エーテル及びアルキル（炭素数８〜２４）ジアルキル（炭素数１〜６）アミンオキシド［ラウリルジメチルアミンオキシド等］等が挙げられる。
【００７０】
アニオン性界面活性剤（Ｏ−２）としては、炭素数８〜２４のアルキルエーテルカルボン酸又はその塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンエーテルカルボン酸又はその塩［（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルスルホコハク酸２ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩［ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸ナトリウム及びラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸−トリエタノールアミン塩等］、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド硫酸スルホン酸ナトリウム、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩［ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキルリン酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンリン酸エステル塩［ラウリルリン酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム等］、脂肪酸塩［ラウリン酸ナトリウム及びラウリン酸トリエタノールアミン等］、アシル化アミノ酸塩［ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシントリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム及びラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム等］が挙げられる。
【００７１】
カチオン性界面活性剤（Ｏ−３）としては、第４級アンモニウム塩型［塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム及びエチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム等］及びアミン塩型［ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド乳酸塩、ジラウリルアミン塩酸塩及びオレイルアミン乳酸塩等］等が挙げられる。
【００７２】
両性界面活性剤（Ｏ−４）としては、ベタイン型両性界面活性剤［ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルヒドロキシスルホベタイン及びラウロイルアミドエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルベタインヒドロキシプロピルリン酸ナトリウム等］、アミノ酸型両性界面活性剤［β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等］が挙げられる。
【００７３】
界面活性剤（Ｏ）としては、１種又は２種以上を使用することができる。２種以上の界面活性剤を使用する場合、その組み合わせとしては、ノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤と両性界面活性剤の組み合わせ等が挙げられる。
【００７４】
界面活性剤（Ｏ）として、洗浄性の観点から、ノニオン性界面活性剤単独での使用、及びノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤との組み合わせでの使用が好ましい。
ノニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）エチレンオキサイド付加物（重合度＝１〜１００）が好ましく、さらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１８）エチレンオキサイド付加物（重合度４〜２０）、次にさらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１５）エチレンオキサイド付加物（重合度＝８〜１２）、特に好ましくはオレイルアルコールエチレンオキサイド１１モル付加物である。
アニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩、脂肪酸塩、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩が好ましく、さらに好ましくは、炭素数１２〜１６のアルキルフェニルスルホン酸塩及び炭素数８〜１６の脂肪酸塩、次にさらに好ましくは、ドデシルベンゼンスルホン酸モノエタノールアミン塩及びラウリン酸ナトリウムである。
【００７５】
洗剤組成物中のタンパク質溶液（Ｄ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、（Ｄ）及び（Ｏ）の合計重量に基づいて、０.１〜９９重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜８０重量％、特に好ましくは１〜７０重量％である。
洗剤組成物中の界面活性剤（Ｏ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、（Ｄ）及び（Ｏ）の合計重量に基づいて、１〜９９.９重量％が好ましく、さらに好ましくは２０〜９９．５重量％、特に好ましくは３０〜９９重量％である。
【００７６】
洗剤組成物中のタンパク質溶液（Ｄ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０.１〜９９重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜６０重量％、特に好ましくは１〜４５重量％である。
洗剤組成物中の界面活性剤（Ｏ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、１〜９８.９９９９９８重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜８９.９９９８重量％、特に好ましくは３０〜７８．９９８重量％である。
洗剤組成物中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０．０００００１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜４重量％、特に好ましくは０．００１〜３重量％である。
洗剤組成物中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の含有量（重量％）は、洗浄性の持続性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０．０００００１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜４０重量％、特に好ましくは０．００１〜３０重量％である。
洗剤組成物中の溶剤（Ｃ）の含有量（重量％）は、低温至適プロテアーゼ（Ａ）及びプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の安定性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、１〜９０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜８０重量％、特に好ましくは２０〜７０重量％である。
【００７７】
洗剤組成物のｐＨは、洗浄性の観点から、ｐＨ５．０〜９．０が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．５である。
【００７８】
本発明の洗剤組成物は、タンパク質溶液（Ｄ）及び界面活性剤（Ｏ）以外に、ビルダー（Ｐ）、キレート剤（Ｑ）、色素（Ｒ）、香料（Ｓ）、蛍光増白剤（Ｔ）、消泡剤（Ｕ）及び低温至適プロテアーゼ（Ａ）以外の酵素（Ｗ）等を含有することができる。
【００７９】
ビルダー（Ｐ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されているビルダーが使用でき、例えば、ポリカルボン酸塩（アクリル酸塩ホモポリマー及びマレイン酸塩ホモポリマー等）、多価カルボン酸塩（クエン酸及びリンゴ酸等）、及びアルカリビルダー（苛性ソーダ、ソーダ灰、アンモニア、トリエタノールアミン、トリポリリン酸ソーダ及びケイ酸ソーダ等）等が挙げられる。
【００８０】
キレート剤（Ｑ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されているキレート剤が使用でき、例えば、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸及びジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸及びカルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩並びにアミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）又はこれらのアルカリ金属若しくは低級アミン塩等が挙げられる。
【００８１】
洗剤組成物中のビルダー（Ｐ）及びキレート剤（Ｑ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜５重量％である。
【００８２】
色素（Ｒ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている色素が使用でき、例えば、ブロモフェノールブルー等が挙げられる。
【００８３】
香料（Ｓ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている香料が使用でき、例えば、フェニルエチルアルコール等が挙げられる。
【００８４】
蛍光増白剤（Ｔ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている蛍光増白剤が使用でき、例えば、ビフェニルスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００８５】
消泡剤（Ｕ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている消泡剤が使用でき、例えば、シリコーン系消泡剤、ポリオキシアルキレン系消泡剤及び鉱物油系消泡剤等が挙げられる。
【００８６】
洗剤組成物中の色素（Ｒ）、香料（Ｓ）、蛍光増白剤（Ｔ）及び消泡剤（Ｕ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５重量％である。
【００８７】
低温至適プロテアーゼ（Ａ）以外の酵素（Ｗ）には、セルラーゼ（Ｗ−１）、アミラーゼ（Ｗ−２）、リパーゼ（Ｗ−３）及びオキシドレダクターゼ（Ｗ−４）が含まれる。
【００８８】
セルラーゼ（Ｗ−１）としては、動物、植物又は微生物起源のものが含まれ、入手しやすさの観点から、微生物起源のものが好ましい。セルラーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。
セルラーゼとして、具体的には、ノボザイムス社のＣｅｌｌｕｚｙｍｅTM、ＣａｒｅｚｙｍｅTM等が挙げられる。
【００８９】
アミラーゼ（Ｗ−２）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。アミラーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書に詳細に記載されているＢ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊株から得られるα−アミラーゼ等が挙げられる。
市販のアミラーゼとしては、ノボザイムス社の  ＤｕｒａｍｙｌTM、ＴｅｒｍａｍｙｌTM、ＦｕｎｇａｍｙｌTM及びＢＡＮTM並びにＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社のＲａｐｉｄａｓｅTM及びＭａｘａｍｙｌ  ＰTM等が挙げられる。
【００９０】
リパーゼ（Ｗ−３）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。リパーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。リパーゼの例としては、フミコーラ・ランギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（欧州特許第２５８  ０６８号明細書及び欧州特許第３０５  ２１６号明細書）、リゾムーコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ（欧州特許第２３８  ０２３号明細書）、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ及びＢ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ）リパーゼ（欧州特許第２１４７６１号明細書）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（欧州特許第２１８２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（欧州特許第３３１３７６号明細書）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｂ．サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓ  他（１９９３），  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ１１３１，２５３−２６０）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（特公昭６４−７４４９９２号公報）並びにＢ．ピュミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（国際公開第９１／１６４２２号）等が挙げられる。
【００９１】
市販のリパーゼとしては、ジェネンコア社の  Ｍ１  ＬｉｐａｓｅTM、Ｌｕｍａ  ｆａｓｔTM及びＬｉｐｏｍａｘTM、ノボザイムス社のＬｉｐｏｌａｓｅTM及びＬｉｐｏｌａｓｅ  ＵｌｔｒａTM並びに天野エンザイム社のＬｉｐａｓｅ  Ｐ“Ａｍａｎｏ”TM等が挙げられる。
【００９２】
オキシドレダクターゼ（Ｗ−４）としては、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼ（例えばラッカーゼ）が含まれる。
ペルオキシダーゼとしては、植物、細菌又は真菌起源のものが含まれる。ペルオキシダーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。ペルオキシダーゼとしては、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）（例えばＣ．シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）又はＣ．マクロリザス（Ｃ．ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）の菌株由来のもの）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｂ．ピュミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）の菌株由来のもの）及び国際公開第９１／０５８５８号に記載されたペルオキシダーゼが好ましく、特に好ましくは国際公開第９１／０５８５８号に記載されたペルオキシダーゼである。
ラッカーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。ラッカーゼとしては、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）（例えばＴ．ビロサ（Ｔ．ｖｉｌｌｏｓａ）又はＴ．ベルシコロール（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）の菌株由来のもの］、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）［例えばＣ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）の菌株由来のもの］及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）［例えばＭ．サーモフィラ（Ｍ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌａ）の菌株由来のもの］等が挙げられる。
【００９３】
洗剤組成物中の（Ａ）以外の酵素（Ｗ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜８重量％、特に好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００９４】
本発明の洗剤組成物は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）界面活性剤（Ｏ）に、タンパク質溶液（Ｄ）を所定量添加し、２５℃均一になるまで撹拌する。
（２）その他成分を所定量添加し、２５℃で均一になるまで攪拌する。
【００９５】
本発明の洗剤組成物の使用方法は、従来の洗剤組成物の使用方法と同じでよく、特に限定されるものではない。衣料用洗剤としての使用方法の１例を下記に示す。
（１）洗濯物が入った洗濯機に水道水を張り、洗剤組成物を２５℃で添加し、軽く撹拌して溶解させる。
（２）洗濯機で洗濯物を洗浄する。
（３）洗濯機から液を抜き、水道水で１〜２回すすぐ。
（４）適宜脱水をかける。
【実施例】
【００９６】
以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９７】
＜製造例１＞
配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号１のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１）を作成した。このプラスミドと１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換するための変異導入用プライマー配列番号２９、３０を用い、以下の条件でプラスミド（Ｐ１）に変異導入を行った。即ち、プラスミド（Ｐ１）を０．５μＬ（１０ｎｇ）、１０μＭの変異導入用プライマー各０．７５μＬ（７．５ｐｇ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液２．５μＬ（タカラバイオ製）、２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）混液２μＬ（タカラバイオ製）、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ０．２５μＬ（タカラバイオ製）及び脱イオン水１７μＬを混合した後、ＴａＫａＲａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（タカラバイオ製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９８℃１０秒間、５０℃１０秒間、６８℃６．５分間を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）で精製後（５０μＬ）、６μＬの１０倍濃度のＤｐｎＩ用緩衝液及び３μＬの制限酵素ＤｐｎＩ（タカラバイオ製）を加え、３７℃で１時間、テンプレートを分解した。得られた制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを大腸菌ＤＨ５αへの形質転換に供した。即ち、制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのＥ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）に添加し、氷上で３０分間保存した後、４２℃で９０秒間過熱した。ここＳＯＣ培地（ＴＯＹＯＢＯ製）９００μＬを添加し、３７℃で１時間静置培養した。培養液のうち１００μＬをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。現れたコロニーをＬＢ培地１ｍＬで１２時間培養したのち、Ｑｕａｎｔｕｍｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に供し、配列番号２のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２）を精製した（１００μＬ）。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス解析サービス（マクロジェンジャパン社）に解析を依頼し、変異が導入されたことを確認した。
得られたプラスミド（Ｐ２）を大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に同様の方法で形質転換した。得られたプロテアーゼ活性阻害剤発現株をＬＢ培養液（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）１ｍＬに植菌して３０℃で１２時間培養を行い、終夜培養液を作成し、０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い７種類の前培養液を作成した。７種類の前培養液をそれぞれ５０ｍＬの培養液｛水５０ｍＬ中のそれぞれの成分の含有量は、酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン｝に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を行った。培養開始後１Ｍ  ＩＰＴＧ溶液を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０％  グリセリン、５０ｇ／Ｌ  ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ  消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン）の滴下を開始した。培養開始後、４８時間目に培養液（Ｋ−１）を回収した。
得られた培養液（Ｋ−１）をＨｉｓ-ｔａｇ精製用担体（ＧＥヘルスケア社製  Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）で分離し、配列番号１の１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換した配列番号２のアミノ酸配列のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）溶液（Ｌ−１）を得た。（Ｌ−１）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌであった。
【００９８】
＜製造例２＞
製造例１において、「１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換するための変異導入用プライマー（配列番号２９、３０）」に変えて、「５０位のチロシンをロイシンに置換するための変異導入用プライマー（配列番号３１、３２）」を用いる以外は同様にして、配列番号１の５０位のチロシンをロイシンに置換した配列番号１０のアミノ酸配列のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）溶液（Ｌ−２）を得た。（Ｌ−２）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌであった。
【００９９】
＜製造例３＞
製造例１において、「１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換するための変異導入用プライマー（配列番号２９、３０）」に変えて、「配列番号１の３８位のバリンをアラニンに置換する変異導入用プライマー（配列番号３１、３２）を用いて、３８位のバリンがアラニンに置換したプラスミド（Ｐ３）を得た。
また、製造例１において、「１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換するための変異導入用プライマー（配列番号２９、３０）」に変えて５１位のアルギニンと５２位のイソロイシンとをそれぞれアラニンに置換するための変異導入用プライマー（配列番号３３、３４）」を用い、プラスミドＰ１に変えてプラスミドＰ３を用いる以外は同様にして、配列番号１の３８位のバリンをアラニンに置換し、５１位のアルギニンと５２位のイソロイシンとをそれぞれアラニンに置換した配列番号２２のアミノ酸配列のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）溶液（Ｌ−３）を得た。（Ｌ−３）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌであった。
【０１００】
＜カンナーゼのプロテアーゼ活性の最適ｐＨの測定＞
カンナーゼ（ノボザイムズ社）１０ｍｇを１Ｌのバッファー１［５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］に溶解させ、カンナーゼ液（Ａ１）（０．３７μＭ）とした。
（Ａ１）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で５分静置し、温調した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（１）（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅをバッファー１溶解して５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）の濃度にしたもの）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩ−１）とした。（ＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
同様に、バッファー１に変えてバッファー２［５０ｍＭ  酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ５．５、２５℃）水溶液］、バッファー３［５０ｍＭ  酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー４［５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー５［５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液］、バッファー７［５０ｍＭ  ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］及びバッファー８［５０ｍＭ  ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９．５、２５℃）水溶液］をそれぞれ用いてカンナーゼ溶液（Ａ２）〜（Ａ８）及び基質溶液（２）〜（８）を作成した。
（Ａ１）に変えて（Ａ２）〜（Ａ８）を、基質溶液（１）に変えて基質溶液（２）〜（８）用いる以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−８）を作成し、（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−８）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−８）について、それぞれ（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−８）を作成した直後の吸光度をＡλ0、２分後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし（図２）、係数ｋが極大値となるｐＨを求めたところ、最適ｐＨはｐＨ７．５であった。
なお、バッファーの種類を変える境目のｐＨ（ｐＨ６.５及び８.５）において、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正した。ｐＨ６.５（バッファー３及び４）では、バッファー４を使用して求めた値をｐＨ６.５での結果とし、バッファー２を用いて求めた係数ｋにはバッファー３と４の比（バッファー４での係数ｋ／バッファー３での係数ｋ）をかけて補正した。同様に、ｐＨ８.５（バッファー１及び７）ではバッファー１での値をｐＨ８.５の結果とし、バッファー８を用いて求めた係数ｋにはバッファー１と７の比（バッファー１での係数ｋ／バッファー７での係数ｋ）をかけて補正した。カンナーゼの活性の最適ｐＨは８．５であった。
【０１０１】
＜カンナーゼのプロテアーゼ活性の至適温度の測定＞
カンナーゼ（ノボザイムズ社）１０ｍｇを１Ｌのバッファー１［５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］に溶解させたカンナーゼ溶液（Ａ１）（０．３７μＭ）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２０℃に保ち、セルを試料室内で５分静置した。
次に、セルに、２０℃に温調した基質溶液（１）（０．１１９ｍＭ、ｐＨ８.５）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）とした。（ＩＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
分光光度計の試料室をそれぞれ０℃、５℃、１０、２０、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃又は８０℃に設定して温調し、基質溶液（７）も試料室と同じ温度で温調してからセルに添加する以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−６）を作成した。（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−６）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）について、それぞれ（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）を作成した直後の吸光度をＡλ0、２分後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットし（図３）、係数ｋが極大値となる温度を求めたところ、至適温度は４０℃であった。
【０１０２】
＜カンナーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定＞
カンナーゼ（ノボザイムズ社）１０ｍｇを１Ｌのバッファー１［５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］に溶解させたカンナーゼ溶液（Ａ１）（０．３７μＭ）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２０℃に保ち、セルを試料室内で５分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（１）（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅをバッファー７溶解して５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）の濃度にしたもの）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｉ−１）とした。（Ｉ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
基質溶液（７）において、Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅのバッファー１中のモル濃度を０．０２４ｍＭ（基質溶液（８）、１ｍｇ／ｍＬ）、０．２３７ｍＭ（基質溶液（９）、１０ｍｇ／ｍＬ）、０．４７４ｍＭ（基質溶液（１０）、２０ｍｇ／ｍＬ）および１．１９ｍｍＭ（基質溶液（１１）、５０ｍｇ／ｍＬ）とした溶液を作成した。基質溶液（５）に変えて基質溶液（８）〜（１１）を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成した。（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）を作成直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
算出した酵素反応初速度ｖを用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］の酵素反応初速度ｖによる逆数［Ｓ］／ｖをプロットし、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成した（図１）。プロットの近似直線とｘ軸との交点（−Ｋｍ）から、ミカエリス定数Ｋｍは０．０４ｍＭであった。
【０１０３】
＜プロテアーゼ活性阻害剤のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）溶液（Ｌ−１）（１ｇ／Ｌ）１ｍＬを４９ｍＬのバッファー１（ｐＨ８．５）で希釈し、プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）（２．７μＭ）とした。（Ｂ１−１）をバッファー１で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（Ｂ１−２）〜（Ｂ１−５）とした。
バッファー１を１５３０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、カンナーゼ溶液（Ａ１）を４０μＬ及び（Ｂ１−１）を４０μＬ添加し、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ−１）を作成した。
分光光度計の試料室を４０℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（１２）｛Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅをバッファー７に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ（０．２３７ｍＭ）の濃度にしたもの｝を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＶ−１）を作成した。（ＩＶ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｂ１−１）に変えて（Ｂ１−２）〜（Ｂ１−５）をそれぞれ用いる以外は同様にして、カンナーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）混合溶液（ｉ−２）〜（ｉ−６）を作成し、基質溶液（１２）を用いて酵素反応溶液（ＩＶ−２）〜（ＩＶ−６）を作成し、同様に吸光度を記録した。
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−６）を作成直後の吸光度をＡλ0、ｈ時間後の吸光度をＡλhとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−５）の酵素反応初速度ｖｉ、（ＩＶ−６）の酵素反応初速度をｖｏとし、各（Ｂ１）濃度での相対活性α（ｘ＝ｖｉ／ｖｏ）を算出した。
横軸に１／αを、縦軸に［（Ｂ１）のモル濃度］／（１−α）をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成した（図４）。このプロットの近似直線の傾きＫｉ（ａｐｐ）（図４から３．０６）、測定時の基質濃度［Ｓ］及びミカエリス定数Ｋｍを式Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）に当てはめてＫｉを算出したところ、Ｋｉは１．４ｎＭであった。
【０１０４】
上記において、「製造例１で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）溶液（Ｌ−１）（１ｇ／Ｌ）１ｍＬ」に変えて「製造例２及び製造例３で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）及び（Ｂ３）の溶液（Ｌ−２）及び（Ｌ−３）（１ｇ／Ｌ）をそれぞれ１ｍＬ」用いる以外は同様にして（Ｂ２−１）〜（Ｂ２−５）及び（Ｂ３−１）〜（Ｂ３−５）を作成し、阻害定数Ｋｉを測定した。（Ｂ２）のＫｉは３０ｎＭ、（Ｂ３）のＫｉは９０ｎＭであった。
【０１０５】
＜カルボキシフェニルボロン酸のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
４−カルボキシフェニルボロン酸（東京化成工業株式会社）５０ｍｇを５０ｍＬのバッファー１（ｐＨ８．５）に溶解させ、フェニルボロン酸溶液（Ｂ’１）（８．２ｍＭ）とした。（Ｂ’１）をバッファー１で１／１０、１／４、１／２および３／４のモル濃度に希釈したものを（Ｂ’２）〜（Ｂ’５）とした。
上記「プロテアーゼ活性阻害剤のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定」において、（Ｂ１−１）〜（Ｂ１−５）に変えて（Ｂ’１）〜（Ｂ’５）を使用して、フェニルボロン酸のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、１９μＭであった。
【０１０６】
＜実施例１＞
バッファー１が１５３０μＬに、前述のカンナーゼ溶液（Ａ１）４０μＬ及び２０ｍｇ／Ｌのプロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｄ１）を作成した。
【０１０７】
＜実施例２＞
実施例１において、「プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）」に変えて、「プロテアーゼ阻害剤溶液（Ｂ２−１）」を用いる以外は同様にしてタンパク質溶液（Ｄ２）を作成した。
【０１０８】
＜実施例３＞
実施例１において、「プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）」に変えて、「プロテアーゼ阻害剤溶液（Ｂ３−１）」を用いる以外は同様にしてタンパク質溶液（Ｄ３）を作成した。
【０１０９】
＜比較例１＞
バッファー１が１５３０μＬに、前述のカンナーゼ溶液（Ａ１）４０μＬおよび前述の４−カルボキシフェニルボロン酸溶液（Ｂ’１）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｄ’１）を作成した。
【０１１０】
＜比較例２＞
バッファー１が１５３０μＬに、前述のカンナーゼ溶液（７）８０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｄ’２）を作成した。
【０１１１】
＜配合直後のプロテアーゼ活性＞
タンパク質溶液（Ｄ１）〜（Ｄ３）及び（Ｄ’１）〜（Ｄ’２）について、配合直後のタンパク質溶液をそれぞれ１６μＬと、バッファー１を１５８４μＬとを、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ１）〜（Ｙ５）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ１）〜（Ｙ５）のプロテアーゼ活性を測定した。結果を表１に示す。
【０１１２】
＜３０℃３ヶ月保存したときのプロテアーゼ活性＞
「配合直後のプロテアーゼ活性」において、「配合直後のタンパク質溶液」を用いる代わりに、「３０℃で３ヶ月保管したタンパク質溶液」を用いる以外は同様にして、プロテアーゼ活性を算出した。
【０１１３】
＜プロテアーゼ活性の長期持続性＞
配合直後のプロテアーゼ活性と３０℃で３ヶ月保管後のプロテアーゼ活性との比を、プロテアーゼ活性の長期持続性として、以下の式にて算出した。
プロテアーゼ活性の長期持続性（％）＝（３０℃で３ヶ月保管後のプロテアーゼ活性）／（調製直後のプロテアーゼ活性）×１００
【０１１４】
＜３０℃又は４０℃でそれぞれ１週間保存したときのプロテアーゼ活性＞
「配合直後のプロテアーゼ活性」において、「配合直後のタンパク質溶液」を用いる代わりに、「３０℃又は４０℃でそれぞれ１週間保管したタンパク質溶液」を用いる以外は同様にして、プロテアーゼ活性を算出した。
【０１１５】
＜プロテアーゼの耐熱性＞
３０℃で１週間保管後のプロテアーゼ活性と４０℃で１週間保管後のプロテアーゼ活性との比を、プロテアーゼの耐熱性として、以下の式にて算出した。
プロテアーゼの耐熱性（％）＝（４０℃で１週間保管後のプロテアーゼ活性）／（３０℃で１週間保管後のプロテアーゼ活性）×１００
【０１１６】
＜吸光度を利用した活性測定法＞
タンパク質溶液（Ｙ１）〜（Ｙ４）をそれぞれ１５７０μＬを分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、分光光度計の試料室を４０℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（２７）（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅをバッファー１に溶解して０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０１２ｍＭ）の濃度にしたもの）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｖ−１）を作成した。（Ｖ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｖ−１）を作成した直後の吸光度をＡλ0、ｈ秒後の吸光度をＡλhとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλh−Ａλ0）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋXを求た。
ブランクとして、バッファー７が１５７０μＬに、カンナーゼ溶液（Ａ７）４０μＬを配合したタンパク質溶液（Ｄ０）を１６μＬと、バッファー１を１５８４μＬとを分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ０）を作成した。同様にプロテアーゼ活性を測定し、直線の傾き係数ｋSを求た。
係数ｋX及び係数ｋSを用いて、下記数式（３）からタンパク質溶液（Ｙ１）及び（Ｙ２）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋX／ｋS｝×１００  （３）
【０１１７】
【表１】
0005952000.tif 000002
【０１１８】
表１の評価結果から、比較例１及び２のタンパク質溶液と比較して、実施例１〜３の本発明のタンパク質溶液は、プロテアーゼ活性の持続性が高く、長期的にプロテアーゼ活性を保つことができることがわかる。また、３０℃で１週間保管した後のプロテアーゼ活性と４０℃で１週間保管した後のプロテアーゼ活性とが共に高く、プロテアーゼの耐熱性も向上できることが分かる。さらに、カンナーゼの活性の至適温度は４０℃であり、通常、４０℃で保管すると自己分解しやすいが、３０℃で１週間保管した後のプロテアーゼ活性と４０℃で１週間保管した後のプロテアーゼ活性の比較から、４０℃で保管しても活性の低下が小さく、自己分解も効率よく抑制できることが分かる。
【０１１９】
＜実施例４〜６＞
表２の割合で４０℃で配合し、本発明の洗剤組成物を得た。
【０１２０】
＜比較例３〜５＞
表２の割合で４０℃で配合し、比較用の洗剤組成物を得た。
【０１２１】
【表２】
0005952000.tif 000003
なお、表２中、各成分の割合は、重量部で示した。
【０１２２】
実施例４〜６及び比較例３〜５で作製した洗剤組成物を用いて下記の洗浄性試験をおこなった。
＜洗浄性試験＞
＜配合直後の洗浄除去率＞
実施例４〜６及び比較例３〜５で得た洗剤組成物について、洗剤組成物の作成後直ちに洗剤組成物０．８ｇを水９９９．２ｇに溶解させ溶液を得た。この溶液に、湿式人工汚染布（４ｃｍ×４ｃｍ）５枚を投入し、ターゴトメーター（大栄化学製）を用いて以下の条件にて洗浄及びすすぎをした後、布を取り出し、ギヤーオーブン（ＴＡＢＡＩ製、ＧＰＳ−２２２）を用いて７０℃で６０分間乾燥し、試験布を得た。ついで、多光源分光測色計（スガ試験機製）を使用して、この試験布の５４０ｎｍの反射率を、試験布１枚ごとに表裏２個所ずつ計４個所（試験布５枚で合計２０個所）測定し、この平均値を求め、以下の式にて洗浄除去率（％）を算出した。結果を表２に記載した。
（洗浄条件）
時間：１０分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（すすぎ条件）
時間：１分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（洗浄除去率）
洗浄除去率（％）＝｛（ＲW−ＲS）／（ＲI−ＲS）｝×１００
なお、ＲIは清浄布の反射率、ＲWは洗浄布の反射率、ＲSは汚染布の反射率を示す。
また、使用した湿式人工汚染布は、表３の汚垢組成を有する財団法人洗濯科学協会製の湿式人工汚染布（５４０ｎｍにおける反射率が４０±５％）である。
【０１２３】
【表３】
0005952000.tif 000004
【０１２４】
＜３０℃３ヶ月保管後の洗浄除去率＞
実施例４〜６及び比較例３〜５で得た洗剤組成物について、「配合直後の洗浄除去率」において、「洗剤組成物の作成後直ち」に変えて、「洗剤組成物の作成後３０℃で３ヶ月保管した後」の洗剤組成物を用いる以外は同様に洗浄性試験をおこない、洗浄除去率を算出した。結果を表２に記載した。
【０１２５】
＜３０℃および４０℃１週間保管後の洗浄除去率＞
実施例４〜６及び比較例３〜５で得た洗剤組成物について、「配合直後の洗浄除去率」において、「洗剤組成物の作成後直ち」に変えて、「洗剤組成物の作成後３０℃又は４０℃で１週間保管した後」の洗剤組成物を用いる以外は同様に洗浄性試験をおこない、洗浄除去率を算出した。結果を表２に記載した。
【０１２６】
＜洗浄性の持続性＞
配合直後の洗浄除去率と３０℃および４０℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率との比を洗浄性の持続性として、以下の式にて算出した。
洗浄性の持続性（％）＝（３０℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率−比較例４の洗浄除去率）／（配合直後の洗浄除去率−比較例４の洗浄除去率）×１００
【０１２７】
＜洗浄性の耐熱性＞
３０℃又は４０℃で１週間保管後の洗浄除去率の比を洗浄性の耐熱性として、以下の式にて算出した。
洗浄性の耐熱性（％）＝（４０℃で１週間保管後の洗浄除去率−比較例４の洗浄除去率）／（３０℃で１週間保管後の洗浄除去率−比較例４の洗浄除去率）×１００
【０１２８】
表２に示すとおり、比較例３及び４の洗剤組成物は、配合直後の洗浄除去率は高いものの、３０℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率は、カンナーゼを含んでいない比較例５の洗剤組成物と同程度まで低下しており、洗浄性の持続性が５〜１１％と低かった。一方、本発明の洗剤組成物は、３０℃で３ヶ月保管後も、カンナーゼを含んでいない比較例５の洗剤組成物よりも洗浄除去率が１０％以上高く、また、洗浄性の持続性が５３〜７９％と非常に高かった。したがって、本発明の洗剤組成物は、洗浄性の持続性が高いことが分かる。さらに、３０℃で１週間保管した後の洗浄性と４０℃で１週間保管した後の洗浄性とが共に高く、洗浄性の耐熱性が６１〜６８％であり、洗剤組成物の耐熱性も向上できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明のタンパク質溶液は、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工など）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤として広範囲に使用できる。
【図１】
0005952000.tif 000005
【図２】
0005952000.tif 000006
【図３】
0005952000.tif 000007
【図４】
0005952000.tif 000008
【配列表】
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