(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄イオンと、遊離基による損害の減少のための薬物とするアミフォスチンと、薬物キャリアとするポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グルタミン酸）を含むことを特徴とする遊離基による損害の減少のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬組成物に関し、特に遊離基による損害を減少するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＲ−２７２１と呼ばれるアミフォスチンは抗酸化活性を示し、リン酸基をＷＲ−１０６５に付加する化合物である。現在、多くの国の医監督機関は放射線療法に起因する損害を治療するか、プラチナ関連の化学療法薬によって誘発される副作用を治療するための放射線防護薬とするアミフォスチンの使用を承認している。アミフォスチンは自発的に生体内で加水分解されるか、ＷＲ−１０６５とそのリン酸基間の結合をアルカリホスファターゼによって破壊することを通して代謝される。活発な薬物（ＷＲ−１０６５）は、それから放出され、細胞を損害から保護し、遊離基を捕捉することにより細胞毒性を減らす。しかし、患者に対する研究には、アミフォスチンの分布半減期が１分未満、また除去半減期が８分であることを示している。アミフォスチンは静脈注射の６分後に、わずか１０％が残る。除去されないアミフォスチンは活性な遊離チオール代謝物（ＷＲ−１０６５）に急速に変換され、機能し始める。従って、臨床的にアミフォスチンはそれぞれ、通常放射線療法と化学療法の３と１５分前に静脈注射を通して投与される。この結果、アミフォスチンの臨床応用の重要な課題はその短い半減期である。
【０００３】
多くの研究と文献はアミフォスチンが徐放性又は非経口投与の薬として処方されることができることを示唆した。そのような処方されるアミフォスチンの経口投与はその半減期を延長し、その有効性を増大することが報告されているが、原子力発電所の爆発または偶発的暴露によって引き起こされる放射線の毒性の予防などの様々な臨床的合併症の治療に良好な結果を示さなかった。その理由は放射線敏感性組織と器官でアミフォスチンの放出と選択的な分布を制御するための効果的方法が開示されていない。
【０００４】
これに加えて、他の抗酸化剤はそれらの効力を維持することか、簡単に生体内で代謝することが難しいので、遊離基からの長期の保護を提供できないことがある。そして、それらの抗酸化剤は放射線の毒性又は化学療法に起因する損害から保護することを簡単に適用できないかもしれない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記の先行技術にある欠点に鑑みてなされたものであり、産業上の要求を満たすため、台湾特許第１０１１２８９３９号に記載される発明者らの先行技術に開示されているように金属イオン含有組成物を利用し、アミフォスチン又は他の抗酸化剤を金属イオン含有ミセルにカプセル化し、放射線の毒性又は化学療法に起因する損害を減らす医薬組成物を提供する。この医薬組成物は薬物の半減期を延長し、薬物活性を保護し、生体内での薬物の分布を変化させることができる。また、本発明の前記医薬組成物は薬物の放出特性を遅らせ、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での薬物の分布を変更することができ、その結果、放射線及び化学療法に起因する損害を減少させる。医薬組成物は親油性及び粒子サイズを含む様々な要求に応じて組織と器官の保護をもたらす標的器官における分布を保証するために設計されることができる。
【０００６】
例えば、アミフォスチン、ＷＲ−１０６５、または他の抗酸化剤などの医薬組成物から放出される活性成分は放射線療法又は化学療法中に遊離基により誘発される正常組織の損害を減らし、その結果、遊離基により誘発される毒性を減らすことができる。
【０００７】
本発明の目的は、遊離基による損害を低減するための医薬組成物を提供する。この組成物は少なくとも１種の金属又はそのイオンと、少なくとも１つの薬物又はキャリアで保護され、変性される酸化防止剤と薬物キャリアを含む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的を実現するため、本発明は、前記金属はミセルのコアとし、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｉｎ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｇｄ、Ａｌ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｗ、Ｓｃ及びＴｉからなる群から選ばれる１種の金属またはその任意の組み合わせ又はその誘導体であることを開示している。
【０００９】
また、前記薬物キャリアはポリ（エチレングリコール）（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））、ポリ（アスパラギン酸）（ｐｏｌｙ（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（グルタミン酸）（ｐｏｌｙ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、ポリ（アクリル酸）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリ（メタアクリル酸）、ヒアルロン酸、コラーゲン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ））、アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ）、セルロース、ポリヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、ポリ乳酸、ポリ（ブチレンスクシネート）（ｐｏｌｙ（ｂｕｔｙｌｅｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ））、ポリ（カプロラクトン）、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、シクロデキストリン、ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グルタミン酸）（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｂ−ｐｏｌｙ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ））及びリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）からなる群から選ばれる１つまたはその組み合わせである。
【００１０】
本発明の医薬組成物は金属と結合していてもよい、または結合していなくてもよい。前記薬物はアミフォスチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）、ＷＲ−１０６５、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、メラトニン（ｍｅｌａｔｏｎｉｎ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、トコトリエノール（ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ）（ビタミンＥ）、Ｌ−カルニチン（Ｌ−ｃａｒｎｉｔｉｎｅ）、カロチン（ｃａｒｏｔｅｎｅ）、ユビキノール（ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ）、リポ酸（ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）、カテコールアミン（ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ）、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）、レスベラトロル（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、ピセイド（ｐｉｃｅｉｄ）、アセチルシステイン（ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、テンポ（ＴＥＭＰＯ）、アサロン（ａｓａｒｏｎｅ）、アミノグアニジン（ａｍｉｎｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、トコフェロールモノグルコシド（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ  ｍｏｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、グリシルリジン酸（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ  ａｃｉｄ）、エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）、オリエンチン（ｏｒｉｅｎｔｉｎ）、ビセニン（ｖｉｃｅｎｉｎ）、ＭＰＧ（２−メルカプトプロピオニルグリシン）（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ  ｇｌｙｃｉｎｅ）、メスナ（２−メルカプトエタンスルホン酸）（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群から選ばれる１つの誘導体またはその組み合わせである。
【００１１】
別の態様において、前記医薬組成物は、酸化された生体分子を還元する還元剤として利用され、遊離基による連続の伝送又は攻撃を阻止することにより生体分子が持つ本来の機能を回復することができる。従って、放射線、紫外線、化学療法、電磁効果等によって生成される遊離基のレベルを低下させる可能性があり、その結果、遊離基による損害を低減し、毒性を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の特徴、実施と効果について、図面と共に好ましい実施例により、更に詳細に説明する。
【図１】本発明の実施例１における金属をコアとして含有医薬組成物を概略的に示す図である。
【図２】コメットアッセイを概略的に示す図であり、ＣＯＮは負の対照を表示し、ＵＶは薬物が存在せずに、紫外線照射を正の対照として表示する（ＡＰＩ  ４０Ｘ（２  ｈｏｕｒｓ），  ＡＰＩ  ４０Ｘ（３０  ｍｉｎｓ），  ＦｅＰ  ４０Ｘ（２  ｈｏｕｒｓ），  ＦｅＰＡ  ２０Ｘ（２  ｈｏｕｒｓ）  ａｎｄ  ＦｅＰＡ  ２０Ｘ（３０  ｍｉｎｓ））。
【図３】コメットアッセイ（尾のＤＮＡの比率）の量化を概略的に示す図であり、ＣＯＮは負の対照を表示し、ＵＶは薬物が存在せずに、紫外線照射を正の対照として表示し（ＡＰＩ  ４０Ｘ（２  ｈｏｕｒｓ），  ＡＰＩ  ４０Ｘ（３０  ｍｉｎｓ），  ＦｅＰ  ４０Ｘ（２  ｈｏｕｒｓ），  ＦｅＰＡ  ２０Ｘ（２  ｈｏｕｒｓ）  ａｎｄ  ＦｅＰＡ  ２０Ｘ（３０  ｍｉｎｓ））、＊＊＊Ｐ＜０．００１はＵＶ組と明らかに異なり、＃Ｐ＜０．０５はＡＰＩ  ４０Ｘ  ２ｈ組と明らかに異なり、▲▲▲Ｐ＜０．００１はＦｅＰＡ  ２０Ｘ  ２ｈ組と明らかに異なる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、実施例を利用し、本発明を詳しく説明する。それらの実施例は限定ではなく、実証するために提供される。
【００１４】
実施例１．金属をコア（金属核）として含有医薬組成物の放出制御薬物キャリアの調製
【００１５】
図１は本発明の実施例１における金属をコアとして含有医薬組成物を概略的に示す図である。金属または金属イオン１２０は中心に位置し、抗酸化剤又は他の同じような薬物１１０によって囲まれ、また外側の層は薬物キャリア１００からなる。
【００１６】
活性成分
【００１７】
アミフォスチンは抗酸化剤とし、リン酸基をＷＲ−１０６５に付加するＷＲ−１０６５の誘導体であり、抗酸化力を持っている。現在、アミフォスチンは放射線の毒性とシスプラチナ関連の化学療法薬によって誘発される副作用とを防止することが多くの国の医監督機関の承認を得る。
【００１８】
医薬組成物の薬物キャリア
【００１９】
γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸（１５ｇ）及びトリホスゲン（７．５ｇ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、溶液が透明になるまで、窒素雰囲気下、５５℃で、攪拌した。溶液を濃縮した後、４００ｍＬのヘキサンを沈殿のために使用した。
【００２０】
ｎ−ヘキサンを除去した後、３００ｍＬのｎ−ヘキサン／酢酸エチル（１／１）を使用することにより再結晶、ろ過した後、モノマーとしてＮ−カルボキシ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸無水物（ＢＬＧ−ＮＣＡ）を得る。
【００２１】
１５ｇのＢＬＧ−ＮＣＡと２．１ｇのα−アミノ−ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＮＨ２）を４３ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、７２時間４０℃で攪拌した。２１５ｍＬのジエチルエーテルを用いて粗生成物を沈殿させた後、続いてジエチルエーテルを除去し、３１５ｍＬのエタノール及び２１０ｍＬの１ＮのＮａＯＨを添加し、混合物を２４時間２５℃で攪拌した。ｐＨ値を氷浴（アイスバス）中に３５％のＨＣｌを添加することによって７．０に調整し、次いでＭＷＣＯ３５００膜を使用して透析によって精製した。凍結乾燥後、ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＧＡ）を得る。
【００２２】
本発明は２０６．４４ｍｇのアミフォスチンと、８２５．５０ｍｇのＰＥＧ−ｂ−ＰＧＡと、２０６．４４ｍｇの塩化鉄（ＩＩ）（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）を含む材料を提供する。次いで、得られた材料を４１．２８８ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅ  −ｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）に添加し、２５℃でｐＨが７．０を有し、２００ｒｐｍでシェーカー上で激しく攪拌した。
【００２３】
ＦｅＰＡの調製はＰＥＧ−ｂ−ＰＧＡ：ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ：アミフォスチン＝４：１：１（ｗ：ｗ：ｗ、重量比率）に基づいて、アミフォスチンの好ましい濃度は５ｍｇ／ｍＬである。従って、アミフォスチンを含む材料は鉄イオン（Ｆｅ２＋）及びＰＥＧ−ｂ−ＰＧＡを配位結合によって自己組織化することにより形成する。
【００２４】
実施例１（ＦｅＰＡの調製）
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【００２５】
金属核を持つ医薬組成物のイン・ビトロ（生体外、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での抗酸化試験
【００２６】
細胞のＵＶ照射はこの実験で正常細胞に対する放射線の影響をシミュレートするために使用し、その結果をコメットアッセイにより評価した。コメットアッセイはＤＮＡ損傷を検査するために、高速で高感度かつ簡便な方法であり、放射線によるＤＮＡ損傷を研究し、ＤＮＡ架橋を調査し、薬物の遺伝毒性を評価し、細胞アポトーシスを同定するために、広く使用される。
【００２７】
合計で、７つの組はこの実験に含めた。
【００２８】
ＡＰＩ組：１ｍｇ／ｍＬのアミフォスチンを受けた。
【００２９】
ＦｅＰＡ組：１ｍｇ／ｍＬのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏと４ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ｂ−ＰＧＡと１ｍｇ／ｍＬのアミフォスチンを受けた。
【００３０】
ＦｅＰ：１ｍｇ／ｍＬのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏと４ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ｂ−ＰＧＡを受けた。
【００３１】
各実験組の動物は１ｍＬの治療薬物を受け、次のように対応する治療方法が示されている。
【００３２】
表１
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ＣＯＮ：負の対照組
ＵＶ：正の対照組、ＵＶ照射があり、治療薬物がない
４０ｘ：ＰＢＳで４０倍に希釈
２０ｘ：ＰＢＳで２０倍に希釈
【００３３】
テスト前に、マウス胚肝細胞（ＢＮＬＣＬ．２）は３５ｍｍの培養皿の上へ、３＊１０５細胞／ｍＬの密度で接種して少なくとも２０時間培養した。上澄みを除去した後、血清及び種々の濃度の化合物を含む新鮮な培養液を、実験計画に従って、異なる時間に対照組及び試験組に添加した。培養皿をＰＢＳで洗浄し、ＵＶＢ（１００Ｊ・ｍ−２のＵＶＢ線量）を照射した。次に、２ｍＬの新鮮な培養液を添加し、薬物の効果を得るために処理した細胞をインキュベーターで４時間培養した。処理した細胞をスクレーパーで回収し、計数し、５分間１２００  ｒｐｍで遠心分離した。ＰＢＳで１回洗浄した後（遊離のＣａ２＋、Ｍｇ２＋）、細胞数はＰＢＳを添加することにより１＊１０５細胞／ｍＬに調整した。
【００３４】
ＬＭアガロースを含むボトルはそのキャップを緩め、５分間、９５℃の水に置かれ、少なくとも２０分間、３７℃の水浴へ移された。細胞（１＊１０５／ｍＬ）及び溶けたＬＭアガロースを３７℃で、それぞれ、７μＬ及び７０μＬの容量で合わせ、６０μＬの混合物をすぐにＣｏｍｅｔＳｌｉｄｅ（登録商標）上に広げ、氷の上に平らに１０分間設置すると同時に、光から保護した。培養の最後に、スライドを予め冷却した溶解緩衝液中に浸漬し、３０分間、４℃で保存した。過剰の緩衝液を軽くタッピングすることによって除去し、次いで、室温で新たに調製したアルカリ性巻き出し溶液に６０分間置かれると同時に、光から保護した。その後、９５０ｍＬの予め冷却したアルカリ性電気泳動溶液は電気泳動タンク内に添加され、続いて、タンク内のスライドは配置され、スライドトレイオーバーレイ（Ｓｌｉｄｅ  Ｔｒａｙ  Ｏｖｅｒｌａｙ）で覆われた。電気泳動条件は３０分間、２１Ｖである。電気泳動の終了時に、溶液を穏やかに除去し、スライドを５分間、２回脱イオン水に浸漬し、次いで、さらに５分間７０％のエタノールに浸漬した。細胞の単一平面の容易な観察を可能にするために、スライド・サンプルをフードで空気乾燥した。サンプルはこの工程で乾燥剤とともに室温で保存するか、次の工程に直接進むことができる。一部の１００μＬの希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを乾燥ゲルに添加し、５分間、４℃で保存した。過剰のＳＹＢＲ溶液を穏やかにタッピングし、光から保護し、室温で風乾することによってスライドから除去した。落射蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの最大励起及び発光波長はそれぞれ４９４ｎｍ及び５２１ｎｍである）を用いて得られた画像（２００Ｘ）を分析した。蛍光フィルタは効率的な照明に応じて調整された。
【００３５】
結果が図２及び３に示す。正の対照組（ＵＶ）と比較して、ＦｅＰＡ２０ｘ、ＡＰＩ４０ｘ、ＦｅＰ４０ｘのコメット（％ＴＤＮＡ）の尾部に損傷を受けたＤＮＡの平均割合はＵＶ照射前の３０分間又は２時間に、ＦｅＰＡ２０ｘ、ＡＰＩ４０ｘ、ＦｅＰ４０ｘを投与した時に著しく減少した。しかし、イン・ビトロ実験は薬物キャリアとＡＰＩとの間の差別を示すのに十分な感度が高くなかった。このように、ＦｅＰＡの投与は細胞を紫外線照射に起因する損害から確かに保護し、そして、処理した細胞は紫外線照射なしで通常の細胞とほとんど形態学的に同一だった。
【００３６】
放射線毒性及び化学療法に誘発された副作用後の改善を示す他の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での結果
【００３７】
有効性結果
【００３８】
動物実験において、体重２０〜３０ｇ、３０日齢のＮＭＲＩマウスは急性放射線防護用に試験された。放射線対照組には、マウスを１０分間、１、４、８Ｇｙの線量で照射し、標準治療組には、ＦＤＡによって承認されたアミフォスチン（６．２５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に注射し、３０分後に、マウスを１０分間、８Ｇｙの線量で照射した。３０分の期間の設計はアミフォスチンの短い半減期に基づく。Ａ−０１はＰＥＧ−ｂ−ＰＧＡ：ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ：アミフォスチン＝４：１：１（ｗ：ｗ：ｗ、重量比率）を有するＦｅＰＡを表示する。Ａ−０１試験組で、マウスを、３７．５ｍｇ／ｋｇのＡ−０１（標準治療組と同じ量のアミフォスチンを含有する）を静脈内に投与し、１２０分後注射し、８Ｇｙの線量の放射線を１０分間与えた。ＷＢＣ数と生存数は治療の３０日後に分析した。
【００３９】
表２に示すように、Ａ−０１組中のＷＢＣ数は放射線対照組より３又は４倍であった。それは薬物Ａ−０１が少なくとも２時間、損傷から造血系を保護することができ、放射線により誘発される感染を著しく減少させることができることを示唆する。さらに、Ａ−０１は６．２５ｍｇ／ｋｇのアミフォスチンを含み、言い換えると、約３０ｍｇのアミフォスチン（前記医薬組成物１８０ｇに相当）は体重６０ｋｇの人の放射線防護を提供するのに有効であることを示唆した。逆に、ＦＤＡによって承認され、頭頸部腫瘍に対する放射線治療で使用されるアミフォスチンは放射線療法への３分前に投与されなければならなく、唾液腺の保護を提供するだけ、アミフォスチンの投与量は２００ｍｇ／ｍ２を必要にするため、体重６０ｋｇの人間にとっては３２０ｍｇのアミフォスチンを必要にする。こうして、薬物Ａ−０１は選択的蓄積及び遅い放出によって放射線毒性に対し、より良い保護を提供することができる。
【００４０】
表２
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（“−”は放射線量は造血系に重大な損傷を生じさせるのに十分ではないことを示し、薬物を投与しない。）
（“−  −”は急性毒性試験においてマウスに有害作用を観察されない、その結果が正常範囲内で、ＷＢＣ数が示されなかったことを示している。）
【００４１】
結論として、本発明は金属イオンに基づくミセル技術を提供し、アミフォスチン又は他の抗酸化剤をカプセル化し、放射線毒性又は化学療法に起因する損害を減らす。前記本発明の実施形態に多くの変更及び修正は明らかに、生体内でアミフォスチンの放出と選択的分布をよりよく制御することを実現でき、薬物の効果を高めることができる。従って、科学と有用な技術の進歩を促進するために、本発明の開示及び請求項の要旨は特許を取るために提出される。
【符号の説明】
【００４２】
１００  薬物キャリア
１１０  薬物又は他の抗酸化剤
１２０  金属又は金属イオン
【図１】
0005920955.tif 000005
【図３】
0005920955.tif 000006
【図２】
0005920955.tif 000007