(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
定常領域がヒトＩｇＧである、
Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドの両方に結合し、
他のＮ−アセチル及びＮ−グリコシルガングリオシドに結合しない、
モノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号２の軽鎖可変領域と、
以下のＣＤＲ：
【化１】
0005933044.tif 000015
を含有する重鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＣＤＲ−Ｈ２の配列及び／又はＣＤＲ−Ｈ３の配列が、
３位のＡｓｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによって置換されているＣＤＲ−Ｈ２
５位のＡｌａがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒによって置換されているＣＤＲ−Ｈ２
６位のＡｒｇ−７位のＡｒｇがＡｌａ−Ｌｙｓ、Ｈｉｓ−Ａｒｇ、又はＴｈｒ−Ａｒｇによって置換されているＣＤＲ−Ｈ３
８位のＧｌｙがＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＳｅｒによって置換されているＣＤＲ−Ｈ３
１０位のＴｙｒがＰｈｅによって置換されているＣＤＲ−Ｈ３
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号２の軽鎖可変領域と、
以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＩＤＰＡＴＡＹＴＥＳＮＱＫＦＫＤ，配列番号：１７
ＣＤＲ−Ｈ３：ＥＳＰＲＬＲＲＧＩＹＹＹＡＭＤＹ，配列番号：３４及び
以下の配列：
【化２】
0005933044.tif 000016
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ１を含有する重鎖可変領域を含む
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号２の軽鎖可変領域と、
以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＲＦＲＳＹＱＩＨ，配列番号：３
ＣＤＲ−Ｈ３：ＥＳＰＲＬＲＲＧＩＹＹＹＡＭＤＹ，配列番号：３４及び
以下の配列：
【化３】
0005933044.tif 000017
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ２を含有する重鎖可変領域を含む
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号２の軽鎖可変領域と、
以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＲＦＲＳＹＱＩＨ，配列番号：３
ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＩＤＰＡＴＡＹＴＥＳＮＱＫＦＫＤ，配列番号：１７及び
以下の配列：
【化４】
0005933044.tif 000018
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ３を含有する重鎖可変領域を含む
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号２の軽鎖可変領域と、
以下の配列：
【化５】
0005933044.tif 000019
からなる群から選択されるＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３の配列の任意の組合せを含有する重鎖可変領域を含む
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれか一項に記載の抗体由来の、
Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドの両方に結合し、
他のＮ−アセチル及びＮ−グリコシルガングリオシドに結合しない、抗体断片であって；
配列番号２の軽鎖可変領域と、
以下の配列：
【化６】
0005933044.tif 000020
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ１配列、以下の配列：
【化７】
0005933044.tif 000021
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ２配列、以下の配列：
【化８】
0005933044.tif 000022
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ３配列を含むこと
を特徴とする、抗体断片。
【請求項９】
配列番号２の軽鎖可変領域と、
以下の配列：
【化９】
0005933044.tif 000023
からなる群から選択されるＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３の配列の任意の組合せを含むことを特徴とする、請求項８に記載の断片。
【請求項１０】
Ｎ−アセチルＧＭ３及び／又はＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドを発現する悪性腫瘍を治療するための医薬組成物であって、
安定な薬学的ビヒクルと；
請求項１から７までのいずれかに記載の抗体のいずれか、又は
これらの抗体のいずれかに由来する、Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドの両方に結合し、他のＮ−アセチル及びＮ−グリコシルガングリオシドに結合しない、抗体断片とを；
含むことを特徴とする、上記医薬組成物。
【請求項１１】
Ｎ−アセチルＧＭ３及び／又はＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドを発現する悪性腫瘍の治療医薬の製造における、請求項１から７までのいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１２】
Ｎ−アセチルＧＭ３及び／又はＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドを発現する疾患を診断するための試薬のキットであって、
請求項１から７までのいずれかに記載の抗体のいずれか、又は
これらの抗体のいずれかに由来する、Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドの両方に結合し、他のＮ−アセチル及びＮ−グリコシルガングリオシドに結合しない、抗体断片を
含むことを特徴とする、上記試薬のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に、ヒトの健康に関する。本発明は、遺伝子操作によって修飾されたモノクローナル抗体を提供し、腫瘍の療法及び／又は診断のためのこれらの抗体及びその断片の使用を記載する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍関連抗原としてのＮ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシド
ガングリオシドは、脊椎動物の原形質膜中に見つかるシアル酸含有スフィンゴ糖脂質である。これらの分子は、様々な機能、例えば、細胞接着、信号伝達、組織の発達及び分化などに関与し、腫瘍進行にも関与する（Ｈａｋｏｍｏｒｉ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９９：２２５〜３２、２００２）。
【０００３】
いくつかのガングリオシドは、ある特定のタイプのがんにおいて発現され、又は発現が増大しているので、腫瘍関連抗原として特徴付けられている。Ｎ−グリコリルＧＭ３（ＮｅｕＧｃ−ＧＭ３）及びＮ−アセチルＧＭ３（ＮｅｕＡｃ−ＧＭ３、又は単にＧＭ３）は、腫瘍関連抗原である。
【０００４】
本発明は、Ｎ−グリコリルＧＭ３及びＮ−アセチルＧＭ３の両方に高親和性で結合するモノクローナル抗体に関する。
【０００５】
ＮｅｕＧｃ−ＧＭ３は、正常なヒト組織中で発現されないが（Ｖａｒｋｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８３：６１５〜２２、２００１）、いくつかのタイプの腫瘍中で見つかる（Ｍａｒｑｕｉｎａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５６：５１６５〜７１、１９９６；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２：８１７〜２３、２００３）。
【０００６】
Ｎ−アセチルＧＭ３は、正常なヒト組織中で一般的であるが（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｌｏｎｄｏｎ、５３３〜５４０頁、１９８０におけるＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ；Ｐｒｏｋａｚｏｖａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）、７４：２３５〜４９、２００９）、これは、様々なタイプのがんにおいて過剰発現されるので、腫瘍関連抗原として定義されている（Ｈｅｒｓｅｙら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、４１：３３６〜４３、１９８８；Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３５３：２５１〜８、２００７；Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１６：６４１〜５０、２００６）。がん免疫療法の標的としてどの抗原に優先順位をつけるべきかを明確化することを目的とした、米国国立がん研究所によって調整された最近の試験では、ＧＭ３は、この試験で選択された７５抗原の中で４８番目の位置を占めた（Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１５：５３２３〜３７、２００９）。
【０００７】
Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドは、非常に類似した構造を有する。これらは、３つの単糖単位（シアル酸、ガラクトース、及びグルコース）、並びにセラミド末端を含む。２種のガングリオシドは、Ｎ−アセチルシアル酸（ＮｅｕＡｃ）の窒素官能基中に存在するメチル基の酵素的水酸化のみのために互いに異なり、Ｎ−アセチルシアル酸は、このように変換されてＮ−グリコリルシアル酸（ＮｅｕＧｃ）になる。言い換えれば、ＮｅｕＡｃ−ＧＭ３及びＮｅｕＧｃ−ＧＭ３は、単にこれらのシアル酸単位中で水酸基が水素原子と置換しているために互いに異なる。しかし、この小さな構造上の差異は、顕著に異なる免疫系による認識をもたらす（Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎ、Ｃｌｉｎ  Ｒｅｖ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９：７３〜７８、２０００；Ｖａｒｋｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８３：６１５〜２２、２００１）。
【０００８】
Ｎ−アセチルＧＭ３を認識するモノクローナル抗体
ＧＭ３（Ｎ−アセチル）を認識するマウス又はヒト起源のいくつかのモノクローナル抗体：Ｍ２５９０  ｍＡｂ（マウスＩｇＭ）（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６０：１３３２８〜３３、１９８５）；ＦＣＭ１  ｍＡｂ（ヒトＩｇＭ）（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、ＰＮＡＳ、８４：２４１６〜２０、１９８７）；ＤＨ２  ｍＡｂ（マウスＩｇＧ）（Ｄｏｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４８、５６８０〜５、１９８８）；ＧＭＲ６  ｍＡｂ（マウスＩｇＭ）（Ｋｏｔａｎｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１１１７：９７〜１０３、１９９２）；Ｌ６１２  ｍＡｂ（ヒトＩｇＭ）（Ｈｏｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５３：５２４４〜２０、１９９３）；ｍＡｂ「１７」、及びＡＨ１８（ヒトＩｇＭ）（Ｂｒａｎｄｔら、米国特許第５６１０２８０号（１９９７年））；ＧＭＡ１  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ）（Ｍｕｋｅｒｊｅｅら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１７：１３３〜４２、１９９８）が文献に記載されている。これらの８つの抗体から、ｍＡｂ  ＤＨ２及びＬ６１２は、ＧＭ３に特異的であることが示された一方、他の６つの抗体は、他のガングリオシドに向けて拡張された反応性を示す。これらの抗体のいずれも、Ｎ−グリコリルＧＭ３も他のＮ−グリコリル化ガングリオシドも認識することが示されていない。
【０００９】
より最近の報告では、３種の抗ＧＭ３抗体（ＧＭ３Ａ６、ＧＭ３Ａ８、及びＧＭ３Ａ１５と呼ばれる）が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片のファージディスプレイライブラリーから得られた。このライブラリーは、がん患者の群の抗体遺伝子レパートリーから構築された（Ｌｅｅら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１２４：１２４３９〜４６、２００２）。これらの断片の解離定数（ＫＤ）は、ＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅによって求められた場合、１０−５〜１０−７Ｍの桁であった。
【００１０】
一般に、抗ガングリオシドモノクローナル抗体の親和性は、低／中程度の範囲内であることが判明している。これらの抗体のいくつかのＦａｂ断片についてＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅによって測定された解離定数は、１０−６〜１０−７Ｍの桁内であり（Ｃａｔｉｍｅｌら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、８：９２７〜３８；Ｂｏｆｆｅｙら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：９２〜１０３、２００５；Ｔｏｗｎｓｏｎら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１７：２９４〜３０３、２００７）、ほんのわずかな例外、例えば、１０−８Ｍの桁内のＫＤを示す抗ＧＤ２及び抗ＧＤ１ｂ断片を伴う（Ｂｏｆｆｅｙら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：９２〜１０３、２００５；Ｈｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ：１８３；５７４８〜５５、２００９）。
【００１１】
特にＮ−アセチルＧＭ３について、その低免疫原性は、高親和性ＩｇＧ抗体を得ることに対して深刻な障害を代表する（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２９：１７９〜８４、１９８９；Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎ、Ｃｌｉｎ  Ｒｅｖ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９：７３〜８、２０００）。
【００１２】
抗Ｎ−アセチルＧＭ３抗体を用いた前臨床結果及び臨床結果
インビトロ及びインビボ抗腫瘍活性の証拠がｍＡｂｓ  ＤＨ２及びＬ６１２について公開されている。ｍＡｂ  ＤＨ２は、インビトロで抗体依存性細胞毒性を誘導し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＢｌ６黒色腫細胞の増殖を阻害した（Ｄｏｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４８、５６８０〜５、１９８８）。ｍＡｂ  Ｌ６１２は、Ｎ−アセチルＧＭ３を発現するがん細胞を用いたインビトロ実験で補体依存性細胞傷害を生じさせた（Ｎｉｓｈｉｎａｋａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、４８：７３〜５、１９９８）。六量体ＩｇＭフォーマットを示す、この抗体の操作されたバージョンは、補体依存性細胞死を生じさせる能力の増大、及びマウスにおけるより大きい抗腫瘍効果を示した（Ａｚｕｍａら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１３：２７４５〜５０、２００７）。
【００１３】
ｍＡｂ  Ｌ６１２は、転移性黒色腫を有する９人の患者を伴った第Ｉ相試験において診療所で使用された（Ｉｒｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、５３：１１０〜７、２００４）。現在のところ、これが、報告された抗Ｎ−アセチルＧＭ３抗体の唯一の臨床試験である。何人かの患者は、処置に対して臨床反応を示した。さらに、正常組織中でＮ−アセチルＧＭ３が遍在するにもかかわらず、この抗体は、有毒な効果を生じなかった。
【００１４】
Ｎ−アセチルＧＭ３ガングリオシドも、診療所、即ち、黒色腫患者におけるＧＭ３／ＶＳＳＰワクチンの第Ｉ相試験において能動免疫療法の標的である（Ｇｕｔｈｍａｎｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２７：２４２〜５１、２００４）。以前に、サルにおいて１２か月の間に実施された実験で、このワクチンは、有毒な効果を生じることなく、ＩｇＭ及びＩｇＧアイソタイプの両方の強い抗ＧＭ３抗体応答を生じさせた（Ｂａｄａら、Ｅｘｐ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．、２１：２６３〜７、２００２）。臨床試験では、患者において生じた抗Ｎ−アセチルＧＭ３抗体は、ＩｇＭアイソタイプのものであった。念頭に置く有毒な効果は、まったく観察されなかった。
【００１５】
Ｎ−グリコリルＧＭ３を認識するモノクローナル抗体
Ｎ−グリコリルＧＭ３を認識するが、そのＮ−アセチル化バリアントを認識しない２種のモノクローナル抗体：ｍＡｂ  Ｐ３（マウスＩｇＭ）（Ｖａｚｑｕｅｚら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１４：５５１〜５６、１９９５）及びｍＡｂ  １４Ｆ７（マウスＩｇＧ）（Ｃａｒｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９：２４１〜４７、２０００）が、文献に記載されている。Ｐ３抗体は、他のＮ−グリコリル化ガングリオシドも認識し（Ｍｏｒｅｎｏら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、８、６９５〜７０８、１９９８）、一方、１４Ｆ７抗体は、Ｎ−グリコリルＧＭ３に対して特異的である。
【００１６】
本発明の主題である抗体の概念設計及び遺伝子操作は、１４Ｆ７抗体の可変ドメインのアミノ酸配列及び結晶構造に基づく（Ｋｒｅｎｇｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：５５９７〜６０３、２００４）。
【００１７】
１４Ｆ７モノクローナル抗体
受託コードＥＣＡＣＣ９８１０１９０１の下に寄託されたハイブリドーマによって生成されたモノクローナル抗体１４Ｆ７は、欧州特許出願第０９７２７８２号に記載されている。この抗体のヒト化バリアント及び断片は、特許出願ＷＯ２００４／０９４４７７に記載されている。
【００１８】
ｍＡｂ  １４Ｆ７は、高特異性（Ｃａｒｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９：２４１〜４７、２０００）及び高親和性でＮ−グリコリルＧＭ３を認識し、そのＦｖ断片について測定した場合、１０−８Ｍの桁の解離定数を示す（Ｒｏｊａｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９３：７１〜８３、２００４）ＩｇＧ免疫グロブリンである。免疫組織化学的試験により、１４Ｆ７は、いくつかのタイプの腫瘍、例えば、乳管癌及び黒色腫（Ｃａｒｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９：２４１〜４７、２０００）、胃、大腸、及び膵臓の腺癌（Ｂｌａｎｃｏら、ＩＳＲＮ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、文書番号６４５６４１、２０１１）、泌尿生殖器系の腫瘍（Ｂｌａｎｃｏら、ＩＳＲＮ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、文書番号９５３８０３、２０１１）、並びに神経外胚葉性腫瘍（Ｓｃｕｒｓｏｎｉら、Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖｅｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、文書番号２４５１８１、２０１１）などを認識することが示された。
【００１９】
１４Ｆ７のＮ−グリコリルＧＭ３結合部位は、ｍＡｂ  １４Ｆ７の重鎖（ＶＨ）ドメインを、マウス及びヒト起源の両方の多種多様の軽鎖可変ドメインと合わせるｓｃＦｖ断片のファージディスプレイライブラリーを構築することによって実証されたように、そのＶＨの可変ドメイン内に位置している（Ｒｏｊａｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９３：７１〜８３、２００４）。ライブラリー断片の３分の１超は、Ｎ−グリコリルＧＭ３を認識することができ、それは、ｍＡｂ  １４Ｆ７のＶＨドメインが、元の抗体特異性を維持しながら様々な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と対形成することができることをさらに実証する。
【００２０】
インビトロ及びインビボ試験では、ｍＡｂ  １４Ｆ７は、補体非依存性細胞死を生じさせ、マウスにおける骨髄腫の増殖を阻害することができた（Ｃａｒｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２１：４６３〜８、２００２）。乳がん患者で実施された前向き第Ｉ／ＩＩ相臨床試験では、テクネチウム標識１４Ｆ７抗体が腫瘍中に蓄積した（Ｏｌｉｖａら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ、９６：１１５〜２１、２００６）。
【００２１】
より最近の試験では、１４Ｆ７は、細胞膜内に病変部を生じさせる新規の機構によって、腫瘍細胞を殺すが、正常細胞を殺さないことが示された（Ｒｏｑｕｅ−Ｎａｖａｒｒｏら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、７：２０３３〜４１、２００８）。ｍＡｂ  １４Ｆ７の高親和性は、親和性が増大したｍＡｂ  Ｐ３の突然変異体を使用する最近の実験で示されたように、この種類の死を生じさせるための重要な要因を構成する（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｒｒｅｒｏら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４８：１０５９〜６７、２０１１）。ｍＡｂ  Ｐ３も、そのキメラバージョンＰ３Ｑも、Ｎ−グリコリルＧＭ３を発現する腫瘍細胞内で補体依存性細胞死を誘導することができず、一方、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｒｒｅｒｏ及び共同研究者によって得られた突然変異体（Ｐ３Ｑ  Ｅ９９Ｒと呼ばれる）は、Ｎ−グリコリルＧＭ３に対する親和性の増大（ｍＡｂ  Ｐ３Ｑと１４Ｆ７の親和性の間）を示し、このタイプの細胞死を生じさせることができた。ｍＡｂ  １４Ｆ７は、より高い親和性を有し、Ｐ３  Ｅ９９Ｒ突然変異体によって生じるものと比較して、補体非依存性細胞死のより強い効果を示したことに留意されるべきである。
【００２２】
Ｎ−グリコリルＧＭ３を標的にする診療所における療法
現在のところ、Ｎ−グリコリルＧＭ３に対する抗体が抗腫瘍効果を有し得ることを示す最も強い証拠は、このガングリオシドを標的にする２種の分子ワクチンの第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験に由来する。これらの生成物の１つは、ＮＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰワクチンであり、これは、その製剤中にＮ−グリコリルＧＭ３分子を含有する。第２の生成物は、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｕｍａｂ）又は１Ｅ１０と呼ばれる抗イディオタイプ抗体である（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖｅｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、文書番号８１４３９７、２０１０）。両ワクチンは、がん患者において高い抗Ｎ−グリコリルＧＭ３抗体価を誘導し、抗腫瘍効果を明確に実証した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖｅｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、文書番号８１４３９７、２０１０；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８６：３７３５〜４４、２０１１）。
【００２３】
抗体断片のファージディスプレイライブラリー
本発明の主題である二重特異性抗体は、この目的のために特に設計されたｓｃＦｖ断片のファージディスプレイライブラリーから得られた。
【００２４】
抗体断片のファージディスプレイは、様々なアミノ酸配列を有する多数の断片（最大数十億）を含有するライブラリーの構築、並びに特異性及び親和性の観点から所望の性質を有する断片のその後の選択を可能にするハイスループット技術である（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１７８：１〜３７、２００２）。
【００２５】
二重特異性を有する抗体
がんは、遺伝子異質性を特徴とする疾患であり、これは、単一の治療剤を使用して治療することを非常に困難にする。この理由で、様々ながん関連抗原を標的にするコンビナトリアル療法は、より高い成功確率を有し得る。この方向における可能な手法は、異なる特異性を有する抗体を合わせることである。しかし、この種類の療法は、抗体のそれぞれを開発及び生成する高い費用に起因して非常に高価である。
【００２６】
遺伝子操作を使用して、２種以上の分子を認識する能力を有する抗体又は抗体断片を得るための様々な方法を創製することが可能である。最も一般的な方法は、それぞれが異なる特異性を有する１種を超える抗体結合領域を合わせて単一の分子構築物にすることにある（Ｈｕｄｓｏｎ及びＳｏｕｒｉａｕ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９：１２９〜３４、２００３；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、１：２１１〜２２、２００９）。
【００２７】
最近、二重特異性を示す抗体の新しい概念設計が記載された。この新しい手法では、モノクローナル抗体の結合部位が、元の抗原の認識を保持しながら、第２の抗原の認識のために操作される。この新しい設計は、ファージディスプレイ技術を使用することによって、抗体ハーセプチンに適用された。結果として、元の抗原（ＨＥＲ２分子）への高親和性結合を保持するだけでなく、高親和性を伴って血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）も認識する突然変異体が得られた（Ｂｏｓｔｒｏｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２３：１６１０〜１４、２００９）。二重特異性を有する抗体（「ツーインワン」抗体）のこの新しい概念設計は、いくつかの利点を有する。これらの１つは、非常に重要な利点であり、二重特異性抗体がモノクローナル抗体として容易に生成され得ることである。
【発明の概要】
【００２８】
本発明は、Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドに対する二重特異性及び高親和性を有する組換えモノクローナル抗体に関する。本発明は、その範囲内に、これらの抗体に由来する任意の断片も含む。
【００２９】
好適な実施形態では、本発明は、Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドに対する二重特異性及び高親和性を有する抗体であって、前記抗体の重鎖可変領域が、以下のＣＤＲ：
【化１】
0005933044.tif 000002
を含有することを特徴とする、上記抗体に関する。
【００３０】
別の好適な実施形態では、本発明は、重鎖可変領域の配列が、配列番号１：
【化２】
0005933044.tif 000003
であることを特徴とする、抗体に関する。
【００３１】
別の特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変領域が、配列番号１：
【化３】
0005933044.tif 000004
を有し、軽鎖可変領域が配列番号２：
【化４】
0005933044.tif 000005
【００３２】
別の態様では、本発明は、重鎖可変領域の配列が、配列番号１：
【化５】
0005933044.tif 000006
であり、一方、軽鎖可変領域の配列が、抗体の軽鎖可変領域の任意の配列であることを特徴とするモノクローナル抗体に関する。
【００３３】
別の態様では、軽鎖可変領域は、ヒト抗体の任意の軽鎖可変領域である。
【００３４】
別の特定の態様では、軽鎖可変領域は、ヒト化抗体の任意の軽鎖可変領域である。
【００３５】
好適な実施形態では、本発明は、重鎖結合ドメインが、以下の配列：
【化６】
0005933044.tif 000007
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ１配列を含むことを特徴とする抗体に関する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２の配列が、以下の配列：
【化７】
0005933044.tif 000008
からなる群から選択されることを特徴とする。
【００３７】
追加の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ−Ｈ３の配列が、以下の配列：
【化８】
0005933044.tif 000009
からなる群から選択されることを特徴とする。
【００３８】
別の実施形態では、本発明の抗体は、上記に列挙したＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３の配列の任意の組合せを含む。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２の配列及び／又はＣＤＲ−Ｈ３の配列が、
Ａｓｐ５２がＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒによって置換されているＣＤＲ−Ｈ２
Ａｌａ５３がＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒによって置換されているＣＤＲ−Ｈ２
Ａｒｇ１００−Ａｒｇ１００ＡがＡｌａ−Ｌｙｓ、Ｈｉｓ−Ａｒｇ、又はＴｈｒ−Ａｒｇによって置換されているＣＤＲ−Ｈ３
Ｇｌｙ１００ＢがＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＳｅｒによって置換されているＣＤＲ−Ｈ３
Ｔｙｒ１００ＤがＰｈｅによって置換されているＣＤＲ−Ｈ３
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、抗体に由来する任意の軽鎖をさらに含むことを特徴とする。
【００４０】
別の特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトカッパ軽鎖定常領域を含む。
【００４１】
別の態様では、本発明は、本記載の抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ）２、及びｓｃＦｖ断片に関する。
【００４２】
本発明の断片は、
以下の配列：
【化９】
0005933044.tif 000010
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ１配列、以下の配列：
【化１０】
0005933044.tif 000011
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ２配列、以下の配列：
【化１１】
0005933044.tif 000012
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ３配列を特徴とする。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の断片は、上記に列挙したＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３の配列の任意の組合せを含む。
【００４４】
これらの抗体及びその断片は、本記載で公表される診断目的及び治療目的に有用である。したがって、別の態様では、本発明は、ガングリオシド抗原Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３に関する疾患を診断又は治療するための、本記載の抗体及び／又はこれらの抗体の断片を含む組成物に関する。
【００４５】
好ましくは、本発明は、Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドに対する二重特異性及び高親和性を伴った、１種若しくはいくつかの抗体、又はこれらの抗体に由来する断片を含有する、医薬組成物を含めた組成物を含む。さらに好ましくは、本発明は、本発明の少なくとも１種の抗体及び／又は断片、並びに薬学的に許容されるビヒクル及び／又は補助剤を含有する医薬組成物を含む。さらにより好ましくは、本発明は、配列番号１を有する重鎖可変領域、及び配列番号２を有する軽鎖可変領域を含有する抗体を含む。
【００４６】
一態様では、本発明は、Ｎ−アセチルＧＭ３又はＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシド抗原の少なくとも１種を発現する腫瘍を有する対象のための、本発明の抗体及びこれらの抗体に由来する断片を含む治療の方法にも関する。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００４７】
追加の態様では、本発明は、腫瘍診断に有用である試薬のキットであって、本発明の抗体及び／又はこれらの抗体に由来する断片の少なくとも１種を含む、上記試薬のキットに関する。好適な実施形態では、この試薬のキットの使用は、それだけに限らないが、患者に由来する組織試料又は流体、例えば、腫瘍組織試料、血液試料などの中の例えば、Ｎ−アセチルＧＭ３及び／又はＮ−グリコリルＧＭ３の存在に基づく診断を含む。
【００４８】
本発明の抗体を得るための方法
ｍＡｂ  １４Ｆ７に基づくｓｃＦｖ断片のファージディスプレイライブラリーの設計及び構成
本発明の抗体及び抗体断片は、この目的を考慮に入れて特に設計された、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片のファージディスプレイライブラリーから得られた。このライブラリー設計の新規性及び原理は、そもそも、抗原結合に関与する高い確率を有する領域に制限された、ｓｃＦｖアミノ酸配列中でランダム化される位置の慎重な選択に存在する。
【００４９】
本記載では、Ｋａｂａｔ番号付けスキームが、ＶＨ抗体ドメインのアミノ酸配列を番号付けるのに使用される。本発明の主題である抗体及び断片について、この番号付けスキームは、５２位（５２Ａ）、８２位（８２Ａ、８２Ｂ、８２Ｃ）、及び１００位（１００Ａ〜１００Ｈ）の後に挿入文字を導入する。
【００５０】
以前の研究（Ｒｏｊａｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９３：７１〜８３、２００４）で得られた、３Ｆｍと呼ばれるｓｃＦｖ断片の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、ｓｃＦｖライブラリーを構築するのに使用される唯一のＶＬドメインとして選ばれた。３Ｆｍ  ｓｃＦｖ断片は、１４Ｆ７  ｍＡｂのＶＨドメインを含有し、一方、そのＶＬドメインは、マウス軽鎖のライブラリーから抽出されたので、１４Ｆ７  ｍＡｂの元のＶＬドメインに関係しない。それにもかかわらず、これらの軽鎖の間の顕著な差異にもかかわらず、３Ｆｍ断片は、ｍＡｂ  １４Ｆ７によって示されるＮ−グリコリルＧＭ３に対する特異性及び高親和性を維持した。重要なことに、３Ｆｍ断片は、細菌内で発現され得る。
【００５１】
軽鎖が抗原認識に重要でないことを示す、Ｒｏｊａｓら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９３：７１〜８３、２００４）及びＫｒｅｎｇｅｌら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：５５９７〜６０３、２００４）によって得られた実験データを考慮して、ＶＬドメインの配列をライブラリー中で不変に保持した。
【００５２】
ｍＡｂ  １４Ｆ７のＶＨ配列を、ｓｃＦｖライブラリーのＶＨドメインを設計するための塩基配列として採用した。すべてがＶＨ超可変ループ中に位置している、突然変異されるべき位置の群の選択は、１４Ｆ７  Ｆａｂ断片の結晶構造の分析（Ｋｒｅｎｇｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：５５９７〜６０３、２００４）、及びＶＨドメインのみがＮｅｕＧｃ−ＧＭ３結合に極めて重要であることを示すデータに基づいた。突然変異されるべき位置の選択は、２つの主な基準、即ち、１）突然変異は、側鎖が溶媒に曝露されるアミノ酸について好ましくは行われるべきであること、及び２）突然変異されるべき位置は、ＶＨ中の５２位から１２オングストロームの半径以内の領域に囲まれていたことに基づいた。この最後の判定基準は、Ｋｒｅｎｇｅｌらによって報告された突然変異誘発実験（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：５５９７〜６０３、２００４）に基づいたものであり、これは、アミノ酸Ａｓｐ５２が、１４Ｆ７  ｍＡｂのその抗原との相互作用に関与していることを示す。
【００５３】
合計で、ＶＨ結合部位中の２０の位置が、ＶＨドメインの遺伝子合成のプロセスを調整することによって、ソフトランダム化（Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７：１７７５４〜６４、１９９８）にかけられた。このソフトランダム化手順を使用して、ｍＡｂ  １４Ｆ７の元のＶＨ配列からの限られた程度の相違を各個々の分子中で同時に保持しながら、選択された可変位置のそれぞれに２０の天然アミノ酸のいずれかを導入することが可能であった。
【００５４】
以下の位置をランダム化にかけた：Ｓｅｒ２８、Ｐｈｅ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｒｐ３３、Ｉｌｅ３４、Ｔｙｒ５０、Ｉｌｅ５１、Ａｓｐ５２、Ａｌａ５３、Ｔｈｒ５４、Ｔｙｒ５６、Ｇｌｕ５８、Ａｒｇ９８、Ｌｅｕ９９、Ａｒｇ１００、Ａｒｇ１００Ａ、Ｇｌｙ１００Ｂ、Ｉｌｅ１００Ｃ、及びＴｙｒ１００Ｄ。
【００５５】
突然変異に付された位置の３つ、Ｐｈｅ２９、Ｉｌｅ３４、及びＩｌｅ５１は、タンパク質中に埋め込まれた自己の側鎖を有し、且つＣＤＲ  Ｈ１及びＨ２のコンホメーションを保持するのに重要である疎水性アミノ酸に対応した。特にこれらの３つのアミノ酸、及びＣＤＲ  Ｈ３中のＬｅｕ９９について、特に設計されたコドン、即ちそれぞれ、ＴＴＴ、ＡＴＴ、ＡＴＴ、及びＴＴＧが使用された。この場合、下線を引いたヌクレオチドは、そのヌクレオチド（８５％）の、他の３つのヌクレオチド（１５％）の等モル混合物との混合物を表す。これらの部分的に縮重したコドンは、疎水性アミノ酸をコードし、対応する位置への元のアミノ酸の挿入に有利である。この設計の背後にある目的は、制限された相違を生成することであり、この相違は、結合親和性に対するいくつかの調節効果を場合により有しながら、ＣＤＲコンホメーションに対する効果がわずかであるはずである。
【００５６】
Ｋｒｅｎｇｅｌ及び共同研究者（Ｋｒｅｎｇｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：５５９７〜６０３、２００４）が、アミノ酸Ａｓｐ５２が１４Ｆ７のＮｅｕＧｃ−ＧＭ３への結合に重要であることを実証したことを考慮して、大部分は小サイズ及び中サイズの側鎖を有する６つの異なるアミノ酸をコードし、その中で元のアスパラギン酸が優位を占める、この位置についてのコドンの特定の混合物を設計した（Ｇ−８０％／Ａ−２０％）Ａ（Ｃ−５０％／Ｔ−５０％）。残りの１５のランダム化された位置については、所与の位置をコードするトリプレットの各塩基を、元のヌクレオチドの８５％、及び他の３つのヌクレオチドの等モル混合物の１５％を含有する混合物を使用して合成した。
【００５７】
設計したＶＨ遺伝子のコレクションを合成し、３Ｆｍ  ｓｃＦｖ断片をコードする遺伝子を含有するｐＨＡＢファージミドベクター中にクローン化した（Ｒｏｊａｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９３：７１〜８３、２００４）。ｓｃＦｖ断片を提示するファージをＭ１３  Ｋ０７補助バクテリオファージ（ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）を使用してライブラリーからレスキューし、Ｍａｒｋｓ及び共同研究者（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２２２：５８１〜９７、１９９１）によって記載された手順を使用して、引き続いて精製した。
【００５８】
Ｎ−グリコリルＧＭ３の高親和性認識を同時に保持しながら、Ｎ−アセチル  ＧＭ３  ガングリオシドを高親和性で認識する能力を有する突然変異体ｓｃＦｖ断片を獲得したことは、間違いなく意外な結果であった。実際に、これらの突然変異体に新しい性質を付与したｍＡｂ  １４Ｆ７のＶＨドメイン中のアミノ酸変化は、データの利用可能な部分から予測可能ではなかった。２種のガングリオシドに対する二重特異性及び高親和性を有するこのような抗体断片を得ることは、ファージディスプレイライブラリーの合理的な設計のために可能であった。この設計は、ガングリオシド抗原の結合に関連した抗体結合部位の領域内にライブラリーの配列相違を集中することを目的にして、構造的知識に基づいて、仕立てたソフトランダム化手順を、突然変異されるべき位置の慎重な選択と組み合わせたものである。
【００５９】
二重特異性を有するｓｃＦｖ断片の選択
Ｎ−グリコリルＧＭ３を用いたテスト単一選択ラウンドにより、ライブラリーは、この抗原を認識することができる多数の断片を含有することが実証されたので、本発明の主題であるＮ−グリコリルＧＭ３及びＮ−アセチルＧＭ３ガングリオシドに対する二重特異性を有する抗体断片は、標的分子としてＮ−アセチルＧＭ３のみを使用して、３回のファージ選択及び増幅ラウンド後の構築されたライブラリーから得られた。
【００６０】
選択ラウンドは、Ｒｏｊａｓ及び共同研究者によって記載された手順（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９３：７１〜８３、２００４）に類似の手順に従って実施した。（Ｍａｒｋｓら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２２２：５８１〜９７、１９９１）に記載されたように、指数関数的に増殖するＴＧ１細胞を使用して、５０ｍｌのスケールで選択されたファージをレスキューした。精製されたファージを、次の選択ラウンドの出発材料として使用した。３ラウンド後に、個々に選択されたファージクローンを、９６ウェルプレート中でレスキューした（Ｍａｒｋｓら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２２２：５８１〜９７、１９９１）。
【００６１】
選択されたファージがＮ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３を認識する能力は、（Ｒｏｊａｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９３：７１〜８３、２００４）に記載された手順に類似の手順に従って、ＥＬＩＳＡによって評価した。両ガングリオシドへの高い結合能力を示す抗体断片のヌクレオチド配列は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（韓国）によって求められた。
【００６２】
二重特異性を有する抗体の結合部位の特徴付け
ＮｅｕＡｃ−ＧＭ３及びＮｅｕＧｃ−ＧＭ３に対する二重特性を有する断片に加えて、ライブラリーに由来する他の抗体断片も配列決定された。これには、Ｎ−グリコリルＧＭ３のみを認識した断片、及びＥＬＩＳＡ実験で２種のガングリオシドのいずれも認識することができなかった断片が含まれる。
【００６３】
さらに、アミノ酸位置の選択された群の結合に対する影響を、二重特異性を有する断片の１つから出発して、各個々の位置の網羅的なランダム化を実施することによって試験した。
【００６４】
これらの試験により、結合部位中のどのアミノ酸がＮ−グリコリルＧＭ３及びＮ−アセチルＧＭ３の二重認識にとって最も重要であるかを判定することが可能になった。表１は、ライブラリーから抽出された二重特異性を有するｓｃＦｖ断片に属するＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列の群を示す。表２は、ＶＨドメイン中のどの配列位置が二重特異性に関連しているか、及びどの位置が異なる程度のアミノ酸可変性を許容するかを示す。
【００６５】
ＣＤＲ  Ｈ１中のわずか２つ又は３つの突然変異が、Ｎ−グリコリルＧＭ３に加えてＮ−アセチルＧＭ３にも結合する能力を断片に付与するのに十分であった。特に、置換Ｓｅｒ２８→Ａｒｇ、Ｔｈｒ３０→Ａｒｇ、及びＴｒｐ３３→Ｇｌｎが、両ガングリオシドに対して高親和性を伴う突然変異体（ＲＲＱ）を生じた。
【００６６】
Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドに対する二重特異性を有する組換え免疫グロブリンの構築
本発明は、Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドに対して二重特異性を有する、ヒト若しくはマウス起源のものであっても、又は任意の他の種に由来するものであっても、任意のアイソタイプの免疫グロブリン、及びこれらの免疫グロブリンの断片の任意のタイプを含む。任意の所望のアイソタイプの免疫グロブリンを、両ガングリオシドに結合する能力を有するｓｃＦｖ断片のＶＨドメインのアミノ酸配列、及びヒト若しくはマウス起源の、又は任意の他の種に由来するＶＬ配列から構築することができる。この目的は、確立された分子生物学技法を使用して、組換えタンパク質、特に、モノクローナル抗体の効率的な発現について記載されたベクターのいずれかを使用して実現され得る。
【００６７】
一実施形態では、哺乳動物細胞中の免疫グロブリンの発現に一般に使用されるベクターｐＡＨ４６０４及びｐＡＧ４６２２（Ｃｏｌｏｍａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、５２：８９〜１０４、１９９２）を使用して、ＩｇＧ１アイソタイプ免疫グロブリンを構築することが可能である。
【００６８】
二重特異性を有する免疫グロブリンを構築するのに使用されるＶＨ配列は、本発明で構築されるファージディスプレイライブラリーから直接抽出することができ、又は二重特異性を実現するのに重要である位置を配列中で維持して、ある程度の可変性を可能にするＣＤＲ位置中に任意の他の適切なアミノ酸を導入して、表１に示した実験データに基づいて設計することができる。使用されるＶＬ配列は、（Ｒｏｊａｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９３：７１〜８３、２００４）に実証されているように、フレームワーク及び超可変領域の両方において大きい程度の可変性を許容する。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、キメラ免疫グロブリン、即ち、ヒト定常領域及びマウス可変領域を有する免疫グロブリン、並びにヒト化可変領域を有する免疫グロブリンも提供する。
【００７０】
医薬組成物
一実施形態では、本発明は、１種若しくは複数の本発明の抗体、又はこれらの断片を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、これらの医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含む。
【００７１】
本発明で使用する場合、表現「薬学的に許容される担体又は補助剤」は、薬剤投与に適合した溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。追加の活性化合物も組成物中に組み込むことが出できる。「薬学的に許容される担体又は補助剤」は、抗体又は断片とともに対象に投与することができ、且つ治療量の抗体を送達するのに十分な用量で投与されるとき、これらの薬理活性を破壊せず、無毒性である担体又は補助剤も指す。
【００７２】
医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。非経口投与の例としては、とりわけ、例えば、非経口、皮内、静脈内、及び皮下がある。非経口、皮内、又は皮下投与に使用される溶液又は懸濁液として、以下の成分、即ち、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒など、抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール（ａｌｃｏｈｏｌ  ｂｅｎｚｙｌ）、又はメチルパラベンなど、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなど、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、緩衝液、例えば、アセタート、シトラート、又はホスファートなど、及び張性を調整するための作用物質、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースなどを挙げることができる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基を用いて調整することができる。非経口配合物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、又は多人数用バイアル中に封入することができる。
【００７３】
投与の容易さ及び投与量の均一性のために、単位剤形（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒｍ）で非経口組成物を製剤化することが有利である。単位剤形は、本明細書において、ビヒクルを必要とする医薬品に関連して、各単位が所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性化化合物を含有する、処置される対象の単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。
【００７４】
医薬組成物は、投与のための指示書と一緒に、容器、パック、又はディスペンサー中に含めることができる。
【００７５】
治療方法
本発明の抗体は、Ｎ−グリコリルＧＭ３若しくはＮ−アセチルＧＭ３、又は両ガングリオシドを発現する腫瘍の治療に使用することができる。
【００７６】
本発明の抗体の適当な治療用量は、１用量当たり約１ｍｇ〜約１ｇ、好ましくは１用量当たり約５０ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲内である。本発明の抗体は、非経口、皮下、肺内、鼻腔内、及び頭蓋内経路、並びに局所治療に望まれる場合、病巣内経路を含めた、任意の適当な方法によって投与される。
【００７７】
治療方法は、当業者に公知の、モノクローナル抗体又は誘導断片を用いた受動療法（ｐａｓｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）に適した用量スキームに従って患者に医薬組成物を投与することを含む。治療方法の例は、本発明の範囲を限定せず、例えば、６週間の間、本発明の抗体の２００ｍｇの用量の毎週投与、及び例えば、疾患進行又は制限毒性（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）まで２週間又は３週間毎のその後の維持治療を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Ａ）様々な抗体濃度を使用するＥＬＩＳＡ実験におけるｍＡｂ  ７Ｃ１によるガングリオシドＮ−グリコリルＧＭ３及びＮ−アセチルＧＭ３の認識を示す図である。Ｂ）ＥＬＩＳＡ実験における抗体１４Ｆ７ｈＴ（ヒトＩｇＧ１アイソタイプを有するｍＡｂ  １４Ｆ７のヒト化バージョン）、７Ｃ１、及びＴ１ｈ（陰性対照として使用した、ヒトＩｇＧ１アイソタイプを有するヒト化抗体）によるＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドの認識を示す図である。Ｃ）Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドのＴＬＣプレート上の免疫染色を示す図である（４つのプレートのそれぞれの上の、それぞれレーン１及び２）。左から右に：オルシノールを用いた化学染色、並びにそれぞれ、抗体１４Ｆ７ｈＴ、７Ｃ１、及びＴ１ｈを用いた免疫染色。７Ｃ１抗体のみがＮ−アセチルＧＭ３との反応性を示した。Ｄ）ＥＬＩＳＡ実験における抗体１４Ｆ７ｈＴ及び７Ｃ１による様々なガングリオシドのパネルの認識を示す図である。
【図２】フローサイトメトリー実験におけるＮ−アセチルＧＭ３又はＮ−グリコリルＧＭ３を発現する腫瘍細胞系のｍＡｂ  ７Ｃ１による認識を示す図である。Ａ）ＧＭ３ガングリオシドのＮ−アセチルバリアントのみを発現する形質転換された腫瘍細胞系Ｌ１２１０−ＳＨの染色を示す図である。Ｂ）Ｎ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドを主に発現する野生型腫瘍細胞系Ｌ１２１０の染色を示す図である。
【図３】抗体１４Ｆ７ｈＴと比較した、Ｎ−アセチルＧＭ３又はＮ−グリコリルＧＭ３を発現する腫瘍細胞に対する７Ｃ１抗体の細胞傷害効果を示す図である。Ａ）野生型細胞系Ｌ１２１０に対する細胞傷害効果を示す図である。Ｂ）形質転換細胞系Ｌ１２１０−ＳＨに対する細胞傷害効果を示す図である。Ｃ）実験からの結果を要約する表である。
【図４】Ａ）フローサイトメトリー実験におけるヒト化７Ｃ１抗体によるＢａｌｂ／ｃマウス脾細胞の認識を示す図である。Ｂ）抗体７Ｃ１で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスに由来する精製Ｂリンパ球を使用する細胞生存能アッセイの図である。両実験では、Ｂリンパ球を抗Ｂ２２０ポリクローナル抗体で染色した。キメラ抗体Ｃ５Ｑを陰性対照として使用した。
【実施例】
【００７９】
（例１）
Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドに対する二重特異性を有する組換えＩｇＧ１免疫グロブリン（７Ｃ１抗体）の構築
Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドに対する二重特異性を有するｓｃＦｖ断片に由来するＶＨドメインのアミノ酸配列を出発点として採用してＶＨ遺伝子を設計した。この遺伝子を哺乳動物細胞内の発現について最適化した。ｍＡｂ  １４Ｆ７の元のＶＬドメインをコードする遺伝子を、類似の方法で設計した。２種の遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔ（ドイツ）によって合成した。
【００８０】
選択されたＶＨドメインは、元の１４Ｆ７  ＶＨ配列に関して、アミノ酸レベルでわずか３つの突然変異を示す。これらの突然変異は、Ｓｅｒ２８→Ａｒｇ、Ｔｈｒ３０→Ａｒｇ、及びＴｒｐ３３→Ｇｌｎである。
【００８１】
ＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を、公知の分子生物学手順に従ってそれぞれ、ベクターｐＡＨ４６０４及びｐＡＧ４６２２中にクローン化した（Ｃｏｌｏｍａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、５２：８９〜１０４、１９９２）。これらのベクターを、哺乳動物細胞内の免疫グロブリンの発現に使用する。ｐＡＨ４６０４ベクターは、ＩｇＧ１アイソタイプのヒト重鎖定常領域を含有し、一方、ｐＡＧ４６２２ベクターは、ヒトカッパ鎖の定常ドメインを含有する。抗体を産生しないＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞を、組換え免疫グロブリンを発現させるのに使用した。この目的のために、重鎖及び軽鎖について得られた遺伝子構築物を細胞に順次トランスフェクトした。これらの細胞によって産生される免疫グロブリンを、プロテインＡカラムを使用して精製した。
【００８２】
得られた組換え抗体を７Ｃ１と呼んだ。
【００８３】
ｍＡｂ  ７Ｃ１がＮ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドを認識する能力を、（Ｒｏｊａｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９３：７１〜８３、２００４）に記載された手順に類似の手順に従って、様々な抗体濃度を使用してＥＬＩＳＡによって評価した。ｍＡｂ  ７Ｃ１は、２種のガングリオシドへの抗体結合を定量化する２つの光学密度（ＯＤ）曲線が互いに非常に類似することを示す図１Ａに示したように、実質的に同じ親和性で両ガングリオシドに結合することができた。さらに、ｍＡｂ  ７Ｃ１とＮ−グリコリルＧＭ３との間（及び転移によって、またｍＡｂ  ７Ｃ１とＮ−アセチルＧＭ３との間）の結合の親和性は、図１Ｂに示したように、Ｎ−グリコリルＧＭ３へのｍＡｂ  １４Ｆ７の結合について観察された親和性と非常に類似している。
【００８４】
これらの実験は、元の１４Ｆ７抗体の結合特性を保持する、１４Ｆ７ｈＴと呼ばれる、ヒトＩｇＧ１アイソタイプを有するｍＡｂ  １４Ｆ７のヒト化バージョンを使用して実施した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｒｒｅｒｏら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、２１６：１２３９〜４７、２０１１）。やはりヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体Ｔ１ｈ（抗ＣＤ６）を陰性対照として使用した。
【００８５】
さらに、ｍＡｂ  ７Ｃ１が両ガングリオシドに結合する能力を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって証明した。図１Ｃに示したように、ｍＡｂ  ７Ｃ１は、Ｎ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３の精製試料によって得られたバンドを染色することができた。
【００８６】
図１Ｄに示したように、ｍＡｂ  ７Ｃ１の特異性は真に二重であり、多重ではなく、抗体は、Ｎ−アセチル及びＮ−グリコリルタイプの両方のガングリオシドを含んだ多様なパネルからの分子のいずれも認識しなかったことを示す。
【００８７】
（例２）
Ｎ−アセチルＧＭ３又はＮ−グリコリルＧＭ３を発現する腫瘍細胞系のｍＡｂ  ７Ｃ１による認識
ｍＡｂ  ７Ｃ１がＮ−グリコリルＧＭ３又はＮ−アセチルＧＭ３を発現する腫瘍細胞を認識する能力を、Ｌ１２１０マウスリンパ球性白血病細胞系（アメリカンタイプカルチャーコレクションからのもの）の２種のバリアントを使用して、フローサイトメトリーによって実証した。野生型細胞（Ｌ１２１０）は、Ｎ−グリコリルＧＭ３を発現し、一方、Ｌ１２１０−ＳＨと呼ばれる遺伝的に形質転換されたバージョンは、Ｎ−アセチルＧＭ３を発現する（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｒｒｅｒｏら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４８：１０５９〜６７、２０１１）。
【００８８】
Ｌ１２１０の高Ｎ−グリコリルＧＭ３発現レベルは、ｍＡｂ  １４Ｆ７によるこれらの細胞の顕著な認識によって証明される。さらに、これらの細胞の糖脂質含量の分析は、８５：１５のＮｅｕＧｃ−ＧＭ３／ＮｅｕＡｃ−ＧＭ３比を生じた（Ｒｏｑｕｅ−Ｎａｖａｒｒｏら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、７：２０３３〜４１、２００８）。
【００８９】
Ｎ−グリコリルバリアントの代わりにＮ−アセチルＧＭ３を発現するＬ１２１０−ＳＨ細胞系は、シアル酸のＮ−アセチルタイプを変換してＮ−グリコリルタイプにするＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼの発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡのレンチウイルストランスダクションによって得た（Ｓｈａｗ及びＳｃｈａｕｅｒ、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ、３６９：４７７〜８６、１９８８）。この形質転換細胞系は、野生型系と比較してＮ−グリコリルＧＭ３発現の劇的な減少を示す（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｒｒｅｒｏら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４８：１０５９〜６７、２０１１）。
【００９０】
フローサイトメトリー実験は、ＦＡＣＳｃａｎ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して実施した。１０４個の細胞を各アッセイにおいて収集した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を細胞の蛍光染色に使用した。Ｔ１ｈ抗体を陰性対照として使用した。
【００９１】
図２Ａに示したように、ｍＡｂ  ７Ｃ１は、Ｌ１２１０−ＳＨ細胞（Ｎ−アセチルＧＭ３を発現する）を、これらの細胞を認識しないｍＡｂ  １４Ｆ７ｈＴと対照的に染色することができた。さらに、ｍＡｂ  ７Ｃ１は、Ｎ−グリコリルＧＭ３の高い発現を有する野生型Ｌ１２１０細胞も染色した。野生型細胞は、ｍＡｂ  １４Ｆ７ｈＴによっても染色され、この場合、陽性対照として使用した（図２Ｂ）。ｍＡｂ  ７Ｃ１による野生型Ｌ１２１０細胞の染色は、ｍＡｂ  １４Ｆ７ｈＴによって生じる染色より強かったことに留意されるべきであり、それは、ｍＡｂ  ７Ｃ１が、野生型細胞内で発現されるＮ−アセチルＧＭ３分子にも結合することができるという事実によって説明することができる。
【００９２】
（例３）
Ｎ−アセチルＧＭ３又はＮ−グリコリルＧＭ３を発現する腫瘍細胞に対するｍＡｂ  ７Ｃ１の細胞傷害効果
ｍＡｂ  ７Ｃ１が、補体非依存性機構によってＮ−アセチルＧＭ３又はＮ−グリコリルＧＭ３を発現する腫瘍細胞を殺す能力を、Ｌ１２１０及びＬ１２１０−ＳＨ細胞系を使用する実験で実証した。
【００９３】
これらの実験では、細胞を、１００万細胞／ミリリットルの濃度で、１％のウシ胎児血清を含む培地中に最初に懸濁させ、次いで１００マイクログラム／ミリリットルの抗体とともに、５％のＣＯ２雰囲気中で、３７℃で３時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、１０マイクログラム／ミリリットルのヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ中に懸濁させ、次いでフローサイトメトリーによって分析した。死細胞は、前方向散乱（ｆｒｏｎｔａｌ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）及び横方向散乱、並びにＰＩ内在化を測定することによって同定した。生細胞の特性範囲外の散乱レベルを有し、ＰＩで染色された細胞を死としてカウントした。
【００９４】
野生型Ｌ１２１０細胞内のみで細胞死を生じたｍＡｂ  １４Ｆ７ｈＴと異なって、二重特異性を有する抗体７Ｃ１は、野生型Ｌ１２１０細胞系（図３Ａ）、及びＮ−アセチルＧＭ３を発現する形質転換Ｌ１２１０−ＳＨ細胞（図３Ｂ）の両方において顕著な細胞死効果を生じた。野生型Ｌ１２１０細胞に対して７Ｃ１抗体によって生じる細胞傷害性効果（９５％）は、ｍＡｂ  １４Ｆ７ｈＴによって生じるもの（５４％）より強かったことに留意されるべきであり、それは、ｍＡｂ  ７Ｃ１がＮ−アセチルＧＭ３及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドの混合された過剰発現を有する細胞に対してより強い細胞傷害効果を生じさせることができることを実証する。図３Ｃは、これらの実験の結果を要約するものである。
【００９５】
（例４）
細胞死を生じさせることのないｍＡｂ  ７Ｃ１による正常細胞の認識
しかし、腫瘍細胞内で強い細胞傷害効果を生じさせる二重特異性７Ｃ１抗体は、Ｂａｌｂ／ｃマウス脾細胞を使用する実験で実証したように、Ｎ−グリコリルＧＭ３又はＮ−アセチルＧＭ３を発現する正常細胞内で細胞死を生じさせなかった。
【００９６】
フローサイトメトリー実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウスリンパ球を、抗Ｂ２２０ポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ、１：２００の希釈液）及びｍＡｂ  ７Ｃ１（１０マイクログラム／ミリリットルの濃度の）で二重染色した。細胞生存能アッセイを、ｍＡｂ  ７Ｃ１とともにインキュベートされたＢａｌｂ／ｃ脾臓Ｂリンパ球を使用して実施した。磁気パール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で精製した１００万個のＢリンパ球を、１％のＢＳＡを補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中に溶解させた５０マイクログラムの抗体とともに、５％のＣＯ２雰囲気中で、３７℃で３時間インキュベートした。抗体誘導性細胞死をＰＩ取り込みによって求めた。ヒト化抗体Ｃ５Ｑを、細胞認識実験及び細胞生存能アッセイの両方において、陰性対照として使用した。
【００９７】
図４Ａに示したように、ｍＡｂ  ７Ｃ１は、Ｂａｌｂ／ｃ  Ｂリンパ球、及び他の脾細胞を強く染色した。しかし、ｍＡｂ  ７Ｃ１によるこれらの細胞の強い認識にもかかわらず、精製Ｂリンパ球を用いた細胞生存能アッセイは、図４Ｂに示したように、ｍＡｂ  ７Ｃ１が、正常Ｂリンパ球に対して細胞傷害性効果をまったく有さないことを実証した。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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