(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＴＧＦ抗体又は抗ヒトＣＴＧＦ抗体フラグメント。
【請求項２】
一本鎖可変領域フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である、請求項１に記載の抗ヒトＣＴＧＦ抗体フラグメント。
【請求項３】
他のペプチド又はタンパク質と融合した、又は、修飾剤と結合した、請求項１〜２のいずれか1項に記載の抗ヒトＣＴＧＦ抗体又は抗ヒトＣＴＧＦ抗体フラグメント。
【請求項４】
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＣＴＧＦ抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド及び請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項６】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、宿主細胞。
（ａ）請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又は抗体フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又は抗体フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、宿主細胞。
（ａ）請求項４に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）請求項４に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＴＧＦ抗体又は抗ヒトＣＴＧＦ抗体フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＴＧＦ抗体又は抗ヒトＣＴＧＦ抗体フラグメントを生産する方法。
【請求項９】
請求項７に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＴＧＦ抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＣＴＧＦ抗体を生産する方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＴＧＦ抗体又は抗ヒトＣＴＧＦ抗体フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ヒトＣＴＧＦ抗体に関する。詳細には、本発明の新規抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、従来の抗ヒトＣＴＧＦ抗体と比較して結合活性及び／又は中和活性において優れた抗ヒトＣＴＧＦ抗体である。
【背景技術】
【０００２】
ＣＴＧＦ（結合組織成長因子）はＣＣＮファミリーに属する分子量約３６〜３８ｋＤａのシステイン残基に富んだ分泌タンパク質であり（非特許文献１）、従来、線維化において最も重要な増殖因子であると考えられていたＴＧＦ−βにより誘導されることが知られている（非特許文献２）。したがって、ＴＧＦ−βがＣＴＧＦを誘導し、誘導されたＣＴＧＦが、臓器や組織の線維化を促進すると推察され、ＣＴＧＦは、線維化、細胞の増殖、細胞外基質の代謝、血管形成、動脈硬化等に重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献３）。【０００３】
ＣＴＧＦには多くのドメインが存在し、他の因子と相互作用することが知られている。その中でも、フォン・ヴィレブランドＣドメインを介して、ＣＴＧＦは、ＴＧＦ−β又はＢＭＰ４と直接結合し、ＴＧＦ−βシグナリングの促進又はＢＭＰシグナリングの阻害を引き起こすことが示されている（非特許文献４）。【０００４】
ＣＴＧＦは、種々の腎疾患（例えば、慢性腎臓病、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、ＩｇＡ腎症、巣状分節性糸球体硬化症、ＡＮＣＡ関連腎炎、急速進行性糸球体腎炎、慢性移植腎症、ネフローゼ症候群、ループス腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎）において発現亢進し（非特許文献５）、線維化に深く関与していることが報告されている（非特許文献６）。【０００５】
また、ＣＴＧＦは、各種線維症（強皮症、間質性肺疾患、特発性肺線維症などの肺線維症、慢性Ｂ型またはＣ型肝炎から生じる線維症、放射線誘導性線維症、創傷治癒から生じる線維症、並びに心臓の肥大及び線維症）や、血管増殖性疾患、糖尿病性網膜症、癌などに関わっていることが報告され、新たな治療ターゲットとなると考えられている（非特許文献７、８）。【０００６】
従って、ＣＴＧＦに特異的に結合し、ＣＴＧＦによる種々の作用を阻害する活性を有するモノクローナル抗体を開発することができれば、ＣＴＧＦが病態形成に関与する各種疾患の診断、予防又は治療に有用であることが期待される。【０００７】
現在までに研究が進められてきたヒトＣＴＧＦに対して機能阻害作用を示す抗体としては、ヒトモノクローナル抗体であるＭ８４及びＭ３２０（特許文献１）、ＣＬＮ１（特許文献２）や、マウスモノクローナル抗体であるＣＴＧＦ−ｍ２−１（特許文献３）などが報告されている。その中でも、ＣＬＮ１が、最も詳細に検討がなされており、間質性肺線維症モデルや片側尿管結紮による腎間質線維化モデルにおいて、その効果が明らかにされている。ＣＬＮ１は、現在ＦＧ−３０１９として臨床試験（フェーズＩＩ）段階にある。【０００８】
しかし、従来の抗体はＣＴＧＦに対する結合活性が十分とはいえず、治療有効性の観点からＣＴＧＦに対する中和活性が十分に強いとはいえない。【０００９】
一般に、抗体医薬の有効投与量を規定する主な要因としては、抗体が有する抗原に対する結合活性や中和活性や、体内に存在する抗原の量が挙げられるが、結合活性や中和活性を向上させることは投与量の低減に繋がり、結果として患者の経済的な負担や医療コストの低減にも繋がる極めて有益な改良であるといえる。【００１０】
こうしたことから、従来の抗体よりも結合活性や中和活性が強い抗ヒトＣＴＧＦ抗体を取得することが、ＣＴＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療に利用するためには必要不可欠である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開2000-232884
【特許文献２】WO2004/108764
【特許文献３】WO2007/066823
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】D.M. Bradham et al, J. Cell Biol. 114:1285-1294 (1991)
【非特許文献２】A. Igarashi et al, Mol. Biol. Cell 4:637-645 (1993)
【非特許文献３】Blom IE et al, Matrix Biol. 21(6):473-82(2002)
【非特許文献４】Abreu, et al. Nat. Cell. Biol. 4, 599-604(2002)
【非特許文献５】Ito Y et al.: Kidney Int. 53(4) 853-61,(1998)
【非特許文献６】Phanish MK et al, Nephron Exp Nephrol. 114(3) e83-92,(2010)
【非特許文献７】Shi-Wen X et al, Cytokine Growth Factor Rev. 19(2):133-44.(2008)
【非特許文献８】Jun JI et al, Nat Rev Drug Discov. 10(12):945-63(2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、従来の抗ヒトＣＴＧＦ抗体と比較して結合活性及び／又は中和活性において優れた抗ヒトＣＴＧＦ抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、医学上又は産業上有用な物質・方法として以下の発明を含むものである。
［１］配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＴＧＦ抗体。
［２］前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域である、［１］の抗ヒトＣＴＧＦ抗体。
［３］前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、［１］の抗ヒトＣＴＧＦ抗体。
［４］前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、［１］の抗ヒトＣＴＧＦ抗体。
［５］配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［１］の抗ヒトＣＴＧＦ抗体。
［６］［１］〜［５］のいずれかの抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［７］［１］〜［５］のいずれかの抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［８］［６］及び／又は［７］のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［９］［８］の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１０］以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、［９］の宿主細胞。
（ａ）［１］〜［５］のいずれかの抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）［１］〜［５］のいずれかの抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
［１１］［９］又は［１０］の宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＴＧＦ抗体を発現させる工程を包含する、［１］〜［５］のいずれかの抗ヒトＣＴＧＦ抗体を生産する方法。
［１２］［１］〜［５］のいずれかの抗体を含む、ヒトＣＴＧＦが病態形成に関連する疾患の治療薬。
［１３］前記疾患が腎疾患である、［１２］の治療薬。
［１４］前記腎疾患が慢性腎臓病又は糖尿病性腎症である、［１３］の治療薬。
［１５］［１］〜［５］のいずれかの抗体を投与する工程を包含する、ヒトＣＴＧＦが病態形成に関連する疾患を予防又は処置するための方法。
［１６］前記疾患が腎疾患である、［１５］の方法。
［１７］前記腎疾患が慢性腎臓病又は糖尿病性腎症である、［１６］の方法。
［１８］ヒトＣＴＧＦが病態形成に関連する疾患の予防又は処置に使用するための、［１］〜［５］のいずれかの抗体。
［１９］前記疾患が腎疾患である、［１８］の抗体。
［２０］前記腎疾患が慢性腎臓病又は糖尿病性腎症である、［１９］の抗体。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって、従来の抗ヒトＣＴＧＦ抗体と比較して結合活性及び／又は中和活性において優れた抗ヒトＣＴＧＦ抗体が提供される。本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、ヒトＣＴＧＦの機能阻害により、強力な抗線維化作用を有するものであり、ヒトＣＴＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療に有用である。そして、このような本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、投与量の低減、投与間隔の拡大、投与方法の改善（例えば、皮下注射剤）等の臨床適用における優れた改善をもたらし、治療有効性及び患者コンプライアンスの改善に大きく寄与するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明について詳述する。
本発明者らは、抗ヒトＣＴＧＦ抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、従来の抗ヒトＣＴＧＦ抗体と比較して結合活性が改善し、中和活性において優れた抗ヒトＣＴＧＦ抗体を作製することに成功した。
【００１７】
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖および２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）および非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００１８】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶH）および軽鎖可変領域（ＶL）とよばれている。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＣH１、ＣH２、ＣH３あるいはＣLと表される）。
【００１９】
抗体の抗原決定部位はＶHおよびＶLによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
【００２０】
本発明者らが作製に成功した本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、以下の特徴を有する抗ヒトＣＴＧＦ抗体である。
配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＴＧＦ抗体。
【００２１】
具体的には、本発明者らは、ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いて抗体を作製し、各種生物学的活性試験及び物性試験を用いた抗体のスクリーニングによって、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体を同定することに成功した。ベロシミューン技術では、内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が対応するヒト可変領域で置換されたトランスジェニックマウスを目的の抗原（例えば、ヒトＣＴＧＦ）で免疫した後、抗体を発現するマウスのリンパ系細胞を取得し、マウスミエローマ細胞と細胞融合することによってハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマ細胞を、目的の抗原に特異的に結合する抗体を産生するか否かについてスクリーニングする。ここで産生される抗体は、ヒト抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（キメラ抗体とも称する）である。次いで、目的の抗原に特異的に結合する抗体が同定された場合、そのハイブリドーマ細胞から抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを所望のクラスのヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡに連結する。このようにして得られた重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を細胞内（例えば、ＣＨＯ細胞）で発現させて、抗体分子を産生する。当該方法により作製された抗体の重鎖及び軽鎖は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に由来する「完全ヒト型」抗体の重鎖及び軽鎖である。
【００２２】
本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、本願明細書に開示される、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。好ましくは、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をヒト抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域にそれぞれ連結して、完全ヒト型抗体として作製することができる。具体的には、本発明の抗体の重鎖可変領域アミノ酸（配列番号１０）をコードする塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子断片、及び本発明の抗体の軽鎖可変領域アミノ酸（配列番号４）をコードする塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子断片を作製する。そして、この可変領域遺伝子をヒト抗体の適当なクラスの定常領域遺伝子と連結させて完全ヒト型抗体遺伝子を作製する。次いで、この抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２３】
本発明の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸をコードする遺伝子断片は、例えば、該重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００２４】
次いで、上記の可変領域遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子とを連結させて完全ヒト型抗体遺伝子を作製する。使用されるヒト抗体の定常領域は、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてγ１、γ２、γ３またはγ４、軽鎖としてλまたはκ鎖の定常領域）も選択可能であり得るが、好ましくは重鎖定常領域としてはヒトＩｇγ１が、また、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇκを用いることができる。
【００２５】
この完全ヒト型抗体遺伝子の作製につづく、抗体遺伝子の発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、抗体の精製等については、当該分野で公知の種々の方法を使用して行うことができる。
【００２６】
上記のようにして得られた抗体遺伝子と連結される発現ベクターとしては、例えば、ＧＳベクターｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）が挙げられるが、抗体遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されない。また、ＡＧ−γ１やＡＧ−κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有するものを利用することもできる。
【００２７】
上記の発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等により、培養細胞中に導入される。
【００２８】
発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。
【００２９】
上記培養後、培養上清中に蓄積された抗体は、各種カラムクロマトグラフィー、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムを用いた各種クロマトグラフィーにより精製することができる。
【００３０】
本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、ヒトＣＴＧＦに結合する抗体である。得られた抗ヒトＣＴＧＦ抗体のヒトＣＴＧＦに対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡや表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析等の方法がある。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトＣＴＧＦ（配列番号１４）をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対して抗ヒトＣＴＧＦ抗体を添加して反応させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させ、洗浄した後、発色基質（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＴＭＢ発色試薬）を加えて吸光度を測定する。また、ＳＰＲ解析を用いて、ヒトＣＴＧＦに対する結合活性をより詳細に測定することができる。ＳＰＲ解析を行う場合、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いることによって、抗ヒトＣＴＧＦ抗体とヒトＣＴＧＦとの結合速度定数（ｋａ）と解離速度定数（ｋｄ）を測定し、２つの定数の比から解離定数（ＫＤ）を算出することができる。本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体には、他の動物由来のＣＴＧＦ（例えば、マウスＣＴＧＦ）にも結合する抗体も含まれ、これらのタンパク質に対する結合活性を測定してもよい。
【００３１】
また、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、ヒトＣＴＧＦに対する中和活性を有している。本明細書中で使用される場合、抗体の「中和活性」とは、ＣＴＧＦへの結合によりＣＴＧＦを介してもたらされる任意の生物活性を阻害する活性を意味し、ＣＴＧＦの１つ又は複数の生物活性を指標に評価することができる。このような中和活性としては、例えば、腎由来線維芽細胞におけるコラーゲン合成阻害（線維化抑制）作用が挙げられ、後記実施例に記載されるような方法を用いることによって評価することができる。
【００３２】
本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体の効果をより詳細に評価するために、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの薬効試験を用いることもできる。例えば、後記実施例に記載されるような、マウス慢性腎臓病モデルやラット腎炎モデルを用いる腎機能評価によって、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの薬効を評価することができる。
【００３３】
その他、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体の各種安定性（例えば、熱安定性、長期保存安定性、高濃度安定性）を評価する方法としては、例えば、示差走査熱量測定や、保存中の凝集体形成の測定を利用する方法が挙げられる。
【００３４】
好ましくは、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、当該分野で公知の方法を用いて、配列番号１０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び配列番号４に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを合成し、これらを適当なクラスのヒト抗体定常領域遺伝子、好ましくは重鎖についてはヒトＩｇγ１定常領域遺伝子、軽鎖についてはヒトＩｇκ定常領域遺伝子と連結して完全ヒト型抗体遺伝子を構築し、当該分野で公知の種々の方法を用いて、該完全ヒト型抗体遺伝子を発現ベクターへ導入し、該発現ベクターを培養細胞に導入して該培養細胞を培養し、得られる培養物から抗体を精製することによって、容易に取得することができる。好ましくは、配列番号１０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号９に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号４に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号３に示される塩基配列を含む。
【００３５】
配列番号１０に示される重鎖可変領域とヒトＩｇγ１定常領域とを含む、本発明の好ましい抗ヒトＣＴＧＦ抗体重鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖である。配列番号４に示される軽鎖可変領域とヒトＩｇκ定常領域とを含む、本発明の好ましい抗ヒトＣＴＧＦ抗体軽鎖は、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖である。好ましくは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＣＴＧＦ抗体重鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号１１に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＣＴＧＦ抗体軽鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号７に示される塩基配列を含む。配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体としては、後記実施例に記載される完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１が挙げられる。
【００３６】
本発明は、配列番号１０の３１〜３５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０の５０〜６６番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１０の９９〜１０８番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４の２４〜３５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４の５１〜５７番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号４の９０〜９８番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＴＧＦ抗体をも包含する。このような抗ヒトＣＴＧＦ抗体もまた、前述のような手順に従って当業者に容易に作製され得る。
【００３７】
本発明は、本発明の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域とを含み、活性を保持した、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2等の抗ヒトＣＴＧＦ抗体フラグメントをも包含する。また当業者であれば、本発明に基づいて、当該抗ヒトＣＴＧＦ抗体または抗体フラグメントと他のペプチドやタンパク質との融合抗体を作製することや、修飾剤を結合させた修飾抗体を作製することも可能である。融合に用いられる他のペプチドやタンパク質は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種ｔａｇペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチドまたはタンパク質等が挙げられる。修飾に用いられる修飾剤は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。
【００３８】
このようにして得られた本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、慢性腎臓病、糖尿病性腎症等の腎疾患、血管増殖性疾患、心筋症、肝臓の線維増殖疾患、肺線維症、皮膚線維化疾患、糖尿病性網膜症、癌等のＣＴＧＦが病態形成に関連する疾患の予防、治療に用いることができる。
【００３９】
本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、好ましくは、腎疾患治療剤、より好ましくは、慢性腎臓病又は糖尿病性腎症の治療剤として用いることができる。これら治療剤等の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
【００４０】
上記製剤化に当たっての本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
【００４１】
本発明はまた、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチド及びそれを含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び本発明の抗ＣＴＧＦ抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド、並びにそれらのいずれか又は両方を含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明の抗体あるいはその重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。好ましくは、本発明の発現ベクターは、前述の本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むか、あるいは本発明の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドの両方を含む。
【００４２】
本発明の発現ベクターは、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体あるいはその重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明の抗体あるいはその重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
【００４３】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明の抗体あるいはその重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明はまた、本発明の抗体あるいはその重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子が導入された形質転換体を提供する。このような形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製できる。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換は自体公知の方法により行われ得る。
【００４５】
好ましくは、本発明の形質転換体は、本発明の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明の抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞であるか、又は、本発明の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと本発明の抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。より好ましくは、本発明の形質転換体は、前述の本発明の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞であるか、又は、前述の本発明の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと本発明の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
【００４６】
本発明はまた、本発明の抗体あるいはその重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子を宿主細胞に発現させること、即ち、このような形質転換体を用いることを含む、本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体の生産方法を提供する。好ましくは、該方法で使用される宿主細胞は、前述の本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞であり、該発現ベクターは、本発明の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明の抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを、別々にか又は同時に含んでもよい。
【００４７】
本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体の生産において、形質転換体は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
【００４８】
形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨおよび培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００４９】
本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。単離、精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００５０】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００５１】
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。【００５２】
（実施例１：各種由来ＣＴＧＦタンパク質の取得）
本発明者らは、抗ＣＴＧＦ抗体を作製するための抗原としてヒトＣＴＧＦタンパク質を取得した。ヒトＣＴＧＦの全長遺伝子（配列番号１３）を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込み、作製したベクターを、遺伝子導入試薬であるＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ遺伝子導入した。この細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた無血清培養系で培養後、ヒトＣＴＧＦタンパク質を含む培養上清を取得した。取得した培養上清からＨｉＴｒａｐヘパリンカラム及びＣＭカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いてタンパク質を精製し、以下の実験に使用した。マウス、ラット及びサルＣＴＧＦタンパク質に関しても同様の方法を用いて取得した。【００５３】
（実施例２：ベロシミューンマウスへの免疫）
ヒトＣＴＧＦに対する抗体を、ベロシミューンマウスに免疫することによって取得した。本発明者らは、得られる抗体の多様性を高めるために、複数の免疫方法、投与経路、アジュバント、免疫期間等を検討した。免疫原としては、精製したヒトＣＴＧＦを使用し、アジュバントと混和した後に免疫を行った。投与経路としては、足蹠投与と腹腔内投与を検討した。アジュバントとしては、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ社）、及び不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ社）を検討した。さらに添加する免疫賦活剤としては、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとＡｌｕｍｉｎｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｇｅｌ（ＢＲＥＮＮＴＡＧ社）を検討した。免疫期間としては，３週間〜１４週間まで検討した。数回免疫した後、マウス尾静脈より採血を行い、力価をモニターすることで、ヒトＣＴＧＦに結合する抗体を産生するベロシミューンマウスの選択を行った。【００５４】
力価測定は以下の標準的なＥＬＩＳＡ方法を用いて測定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４プレート（Ｎｕｎｃ社）にヒトＣＴＧＦのリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（１μｇ／ｍＬ）を２０μＬ添加し、４℃にて一晩インキュベートして固相化した。翌日、プレートを洗浄液（ＴＢＳＴ：０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリスバッファー）１００μＬで１回洗浄後、ブロッキング剤（１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ）１００μＬを添加し室温にて１時間静置した。ＴＢＳＴ洗浄液１００μＬで１回洗浄後、採血した血漿の希釈系列を作製して添加した。室温にて１時間インキュベート後、ＴＢＳＴ洗浄液１００μＬにて３回洗浄し、０．１％  ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ洗浄液で５０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＲＰ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｚｙｍｅｄ社）を２０μＬ添加した。室温にて１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴ洗浄液１００μＬで３回洗浄した。ＴＭＢ発色試薬（住友ベークライト社）を４０μＬ加えて室温で１０分静置した後、停止液（２ｍｏｌ／Ｌ  硫酸）４０μＬを加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００５５】
（実施例３：抗ヒトＣＴＧＦ抗体産生ハイブリドーマの作製）
抗体価の上昇を確認して選択したマウスに最終免疫（抗原の静脈内投与または腹腔内投与）を行った。定法に従い、免疫したマウスの脾臓やリンパ節等を摘出しリンパ球を収集し、これをマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマを限界希釈し、単一クローンにしたうえで、上清からプロテインＡ又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて抗体を精製した。【００５６】
（実施例４：ＥＬＩＳＡアッセイ）
本発明者らは、ＥＬＩＳＡ方法を用いて、抗体のＣＴＧＦへの結合特異性を評価した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４プレート（Ｎｕｎｃ社）にヒトＣＴＧＦのＰＢＳ溶液（１μｇ／ｍＬ）を２０μＬ添加し、４℃にて一晩インキュベートして固相化した。翌日、プレートを洗浄液（ＴＰＢＳ：０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）１００μＬで１回洗浄後、ブロッキング剤（１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ）１００μＬを添加し室温にて１時間静置した。ＴＢＳＴ洗浄液１００μＬで１回洗浄後、精製抗体サンプルを、適宜希釈系列を作製して添加した。室温にて１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴ洗浄液１００μＬにて３回洗浄し、０．１％  ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ洗浄液で５０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＲＰ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｚｙｍｅｄ社）を２０μＬ添加した。室温にて１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴ洗浄液１００μＬで３回洗浄した。ＴＭＢ発色試薬（住友ベークライト社）を４０μＬ加えて室温で１０分静置した後、停止液（２ｍｏｌ／Ｌ  硫酸）４０μＬを加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。各抗体についてデュプリケートで試験を行い、ＥＣ５０を曲線当てはめにより分析した。【００５７】
この結果、３７−４５と命名した抗体が、高い結合活性（ＥＣ５０：１．６ｎｇ／ｍｌ）を有することが確認された。【００５８】
（実施例５：抗体の配列決定）
同定された抗体３７−４５について、本発明者らはハイブリドーマから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングした。ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ増幅キット（ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｃＤＮＡを作製した。次いで、ＰＣＲを用いて、重鎖及び軽鎖の可変領域を伸長及び増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ３．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等のＰＣＲ産物サブクローニング用ベクターへ組み換えた後、シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、遺伝子配列を決定した。【００５９】
決定された３７−４５の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に、３７−４５の軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４それぞれ示す。【００６０】
（実施例６：完全ヒト型抗体の作製）
前述の抗体は、可変領域がヒト由来であり、定常領域がマウス由来の抗体である。そこで、本発明者らは、マウス由来の定常領域をヒト由来の定常領域に置換して、完全ヒト型抗体（完全ヒト型３７−４５）を作製した。具体的には、抗体の重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列を、そして３’側にヒトＩｇγ１の定常領域遺伝子（Ｍａｎ  Ｓｕｎｇ  Ｃｏら,（１９９２）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１４８（４）：１１４９−１１５４）をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）ｐＥＥ６．４に挿入した。挿入時に、遺伝子中の制限酵素ＢｂｖＣＩ認識サイトを、抗体のアミノ酸配列に影響を及ぼさないＤＮＡ配列に変換した。また、抗体の軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（Ｍａｎ  Ｓｕｎｇ  Ｃｏら,前出）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入した。【００６１】
作製した完全ヒト型３７−４５の重鎖の塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。【００６２】
（実施例７：可変領域の糖鎖修飾部位の変異体作製）
前述の完全ヒト型３７−４５の重鎖可変領域アミノ酸には、Ｎ−Ｘ−（Ｔ／Ｓ）のＮ型糖鎖修飾モチーフ配列が含まれている。具体的には、配列番号２で示す重鎖可変領域における、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく５８番目のＡｓｎが糖鎖修飾部位に該当する。糖鎖修飾部位が存在すると細胞培養の間に抗体への糖鎖の付加が起こるが、糖鎖の付加は培養条件や発現させる宿主に依存することが知られている。すなわち、樹立した同一の抗体産生細胞であっても、培養条件（培地、細胞密度など）によって糖鎖付加の程度が変わる可能性があり、均一な品質の抗体医薬品を取得することが困難となる可能性がある。そこで、本発明者らは、完全ヒト型３７−４５の重鎖可変領域において変異を導入した完全ヒト型抗体（完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１）を作製した。【００６３】
作製した完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。作製した完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１の重鎖の塩基配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２にそれぞれ示す。完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１の軽鎖は、完全ヒト型３７−４５の軽鎖と同じである。【００６４】
完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく重鎖可変領域の３１〜３５番目、５０〜６５番目、及び９５〜１０２番目の領域であり、それぞれ、配列番号１０の３１〜３５番目、５０〜６６番目、及び９９〜１０８番目のアミノ酸配列からなる。完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく軽鎖可変領域の２４〜３４番目、５０〜５６番目、及び８９〜９７番目の領域であり、それぞれ、配列番号４の２４〜３５番目、５１〜５７番目、及び９０〜９８番目のアミノ酸配列からなる。【００６５】
（実施例８：完全ヒト型抗体の発現及び精製）
前述の各抗体（完全ヒト型３７−４５及び完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１）の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮＧＥＮＥ社）またはＬｉｇａｔｉｏｎ−ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。このベクターは、完全長の重鎖および軽鎖とグルタミン合成酵素（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）をコードしており、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞にトランスフェクションすることにより抗体を発現させた。培養上清をプロテインＡ又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）で精製し、各完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。【００６６】
（実施例９：完全ヒト型抗体のＥＬＩＳＡアッセイ）
本発明者らは、ＥＬＩＳＡ方法を用いて、前記実施例で作製した完全ヒト型３７−４５と完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１のヒト、マウス、ラット、およびサルＣＴＧＦへの結合特異性を評価した。ここでは、実施例４に記載の方法と同様の方法を用いたが、二次抗体として０．１％  ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ洗浄液で５０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＨＲＰ−ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＤＡＫＯ社）を用いた。各抗体についてデュプリケートで試験を行い、ＥＣ５０を曲線当てはめにより分析した。【００６７】
その結果、いずれの完全ヒト型抗体も、ヒト、マウス、ラット、およびサルＣＴＧＦに対して同程度の結合能を有することが分かった。
表１：完全ヒト型抗体の各種ＣＴＧＦに対する結合活性
【表１】
0006040943.tif 000002
【００６８】
（実施例１０：ＳＰＲ解析による結合活性評価）
本発明者らは、完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１の抗原特異的結合活性をさらに詳細に測定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析を行った。本実施例では、比較抗体として、抗ヒトＣＴＧＦ抗体ＣＬＮ１（特許文献２）を用いた。【００６９】
ＳＰＲ解析においては、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて解析を行った。Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５の表面にＨｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ＫｉｔとＡｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて、抗ＣＴＧＦ抗体を固相化した。実施例１で取得したヒトＣＴＧＦをＨＢＳ−ＥＰ溶液(ＧＥヘルスケアジャパン社)で段階希釈し、流速５０μｌ／分にて１００μｌを流路に添加した。この測定系により、ヒトＣＴＧＦタンパク質と抗ＣＴＧＦ抗体との結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、データ解析ソフトウェア（ＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を用いて計算した。
表２：ＳＰＲ解析による完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１のヒトＣＴＧＦに対する結合活性
【表２】
0006040943.tif 000003
【００７０】
この結果、完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１は、抗体ＣＬＮ１の活性と比較して、約１２倍高いヒトＣＴＧＦに対する結合活性を有することが確認された。【００７１】
（実施例１１：ラット腎由来細胞におけるコラーゲン合成の阻害作用）
本発明者らは、完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１の抗原特異的中和活性を測定するために、ラット線維芽細胞ＮＲＫ−４９ＦにおけるＴＧＦβ誘導性のコラーゲン合成に対する阻害効果を検討した。本実施例では、比較抗体としてＣＬＮ１を使用した。【００７２】
ＮＲＫ−４９Ｆ細胞（ＡＴＣＣより入手）は、ＴＧＦβ添加によりＣＴＧＦを産生する。ＮＲＫ−４９Ｆ細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地で２４ウェルプレートに（５ｘ１０4細胞）蒔き、２４時間後、０．０１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ（５００μＬ）に置換した。さらに、２４時間後、培地にＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；１ｎｇ／ｍｌ）を加えた。ＴＧＦβ添加１時間前に、抗ヒトＣＴＧＦ抗体（完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１又はＣＬＮ１）（１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの３群）を添加した。７２時間後に、上清を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ａｎｔｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ社）を用いて、常法に従いウエスタンブロット解析を行った。その結果、完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１が、濃度依存的に、ＣＬＮ１と比較して強いコラーゲン合成抑制能を有することが確認された。【００７３】
（実施例１２：マウス残存腎臓モデルによる腎機能評価試験）
糸球体硬化や尿細管変性は、慢性腎臓病を引き起こす様々な腎障害に共通に現れる所見である。この慢性腎臓病は、進行性腎障害を呈するマウス残存腎臓モデルで検討することができる。このモデルでは２／３片側腎摘出と反対側腎全摘出（５／６腎摘）により残存腎に負荷が掛かり、顕著なタンパク尿や腎機能低下が誘導され、病理組織学的には糸球体硬化や尿細管変性を示し軽度な間質線維化を示す（例えば、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、６４、３５０−３５５、２００３年、参照）。【００７４】
５／６腎摘出はＺｈａｎｇらの方法（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、５６、５４９−５５８、１９９９年）を参考に行なった。９週齢の雄性マウスＩＣＲ（日本エスエルシー、静岡県浜松市）にペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔し、左腎の頭側１／３と尾側１／３を切除した。最初の手術から１週間後、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔し、右側の腎臓を完全に摘出し５／６腎摘を完成させた。【００７５】
５／６腎摘出から１週間後に採尿と採血を行ない、尿中タンパク排泄率と腎機能パラメーター（血中クレアチニン濃度およびクレアチニンクリアランス）を測定した。タンパク濃度測定はＢｒａｄｆｏｒｄ法で行なった（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。クレアチニン濃度はＣＲＥ−ＥＮカイノス（カイノス社）を用いて測定した。尿中タンパク排泄率は、尿中タンパク濃度（ｍｇ／ｍｌ）を尿中クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄＬ）で補正して算出した。これら尿中タンパク排泄率、血中クレアチニン濃度、及びクレアチニンクリアランスを指標にし、溶媒処置群（ｐＨ７．４リン酸緩衝液を投与）または抗体投与群に群分けした（１群１５例）。抗体投与の用量は０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇの３群を設定して試験を開始した。リン酸緩衝液又は完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１は週１回で背部に皮下注射した（合計で６回投与）。試験開始時、試験開始から４週目及び６週目に、尿試料及び血液試料を採取し、尿中タンパク排泄率、血中クレアチニン濃度、及びクレアチニンクリアランスを測定した。【００７６】
尿中タンパク排泄率について、試験開始の時点で、溶媒処置群では、正常群と比較して尿中タンパク排泄率は増加した（正常群５．１±０．４；溶媒処置群９．７±０．７（Ｐ＜０．０１））。試験開始から４週目、６週目においても、溶媒処置群では正常群と比較して尿中タンパク排泄率は増加した。これに対し、抗体投与群（１ｍｇ／ｋｇ群及び２ｍｇ／ｋｇ群）では、統計学的有意差はなかったが、溶媒処置群と比較して、投与量依存的に尿中タンパク排泄率が減少した。【００７７】
血中クレアチニン濃度について、試験開始の時点で、溶媒処置群では、正常群と比較して血中クレアチニン濃度が上昇した（正常群０．３６±０．０１３ｍｇ／ｄＬ；溶媒処置群０．５３±０．０１６ｍｇ／ｄＬ（Ｐ＜０．０１））。その後、４週目、６週目においても、溶媒処置群では、正常群と比較して、血中クレアチニン濃度が上昇した（４週間目：正常群０．４２±０．０２５ｍｇ／ｄＬ；溶媒処置群０．６６±０．０３７ｍｇ／ｄＬ（Ｐ＜０．０１）、６週間目：正常群０．３１±０．０１６ｍｇ／ｄＬ；溶媒処置群０．８１±０．１２６ｍｇ／ｄＬ（Ｐ＜０．０５））。抗体処置群については、０．５ｍｇ／ｋｇ群では、有意差はないが、溶媒処置群と比較して、４週間目及び６週間目で血中クレアチニン濃度が低下した。また、１ｍｇ／ｋｇ群及び２ｍｇ／ｋｇ群では、溶媒処置群と比較して、血中クレアチニン濃度の上昇が有意に抑制された（４週間目：１ｍｇ／ｋｇ群０．５１±０．０２２ｍｇ／ｄＬ（Ｐ＜０．０５）；２ｍｇ／ｋｇ群０．５１±０．０１５ｍｇ／ｄＬ（Ｐ＜０．０５）、６週間目：１ｍｇ／ｋｇ群０．５５±０．０４３ｍｇ／ｄＬ（Ｐ＜０．０５）；２ｍｇ／ｋｇ群０．４９±０．０２４ｍｇ／ｄＬ（Ｐ＜０．０１））。【００７８】
クレアチニンクリアランス（尿中クレアチニン濃度×２４時間の尿量／血中クレアチニン濃度）について、試験開始の時点で、溶媒処置群では、正常群と比較してクレアチニンクリアランスの減少が認められた（正常群１．８±０．１８；溶媒処置群１．３±０．０８（Ｐ＜０．０１））。その後、４週間目、６週間目においても、溶媒処置群では、正常群に比較してクレアチニンクリアランスが低下した（４週間目：正常群２．１±０．１６；溶媒処置群１．６±０．１６、６週間目：正常群２．８±０．２９；溶媒処置群１．４±０．１７（Ｐ＜０．００１））。抗体処置群については、０．５ｍｇ／ｋｇ群では、溶媒処置群と比較して、クレアチニンクリアランスの低下抑制は認められなかった。これに対して、１ｍｇ／ｋｇ群では、４週間目及び６週間目で溶媒処置群と比較してクレアチニンクリアランスの低下が有意に抑制された（４週間目：溶媒処置群１．６±０．１６；１ｍｇ／ｋｇ群２．１±０．１１（Ｐ＜０．０５）、６週間目：溶媒処置群１．４±０．１７；１ｍｇ／ｋｇ群２．０±０．１８（Ｐ＜０．０５））。また、２ｍｇ／ｋｇ群では、６週間目で溶媒処置群と比較してクレアチニンクリアランスの低下が有意に抑制された（６週間目：溶媒処置群１．４±０．１７；２ｍｇ／ｋｇ群１．９±０．１４（Ｐ＜０．０５））。【００７９】
これらの結果から、完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１は、慢性腎臓病モデルにおいて腎機能低下を抑制することが確認された。【００８０】
（実施例１３：ラット腎炎モデルによる薬理評価試験）
ラット抗Ｔｈｙ１．１モデルは、腎糸球体のメサンギウム細胞の表面にあるＴｈｙ抗原に対する抗体を注入することにより発症させる、確立されたメサンギウム増殖性糸球体腎炎モデルである（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ及びＷｉｌｓｏｎ、１９８７  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．３２：５１４−２５、Ｍｏｒｉｔａら，１９９８  Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ３１：５５９−７３参照）。本モデルでは、メサンギウム細胞の融解の後、メサンギウム細胞の増殖と細胞外マトリックスが増加し、尿タンパク質が上昇する（例えば、Ｆｌｏｅｇｅら，１９９１  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４０：４７７−８８、Ｉｔｏら，２００１  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１２：４７２−８４参照）。抗Ｔｈｙ１．１モデルはヒトにおけるＩｇＡ腎症やヘノッホ−シェーンライン紫斑病と類似しており、本モデルを用いてタンパク尿を指標として病態の進展を予測することができる（例えば、Ｋａｓｕｇａら，２００１  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．６０：１７４５−５５、Ｌｉｕら，２００７  Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０５：ｅ６５−７４参照）。【００８１】
抗Ｔｈｙ１．１抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｔ  ＣＤ９０（Ｔｈｙ  １．１）ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｓｃｉｔｅｓ；ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社）を生理的食塩水で０．１ｇ／ｍＬに調製し、ラットに静脈内投与（体重１００ｇあたり２００オＬ）することにより腎炎を発症させた。抗Ｔｈｙ１．１抗体投与４時間後に完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１（０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇ）又は溶媒（ＰＢＳ）を静脈内投与した。病態誘発より３から４日後に２４時間の採尿を行ない尿中タンパク質の２４時間での排泄量（ＵＰ）および尿中タンパク排泄率（ＵＰ／ｕＣｒ：尿中タンパク濃度（ｍｇ／ｍｌ）を尿中クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄＬ）で補正）を測定した。その結果を表３（ＵＰ）及び表４（ＵＰ／ｕＣｒ）に示す。
【表３】
0006040943.tif 000004
【表４】
0006040943.tif 000005
【００８２】
その結果、完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１は用量依存的にタンパク尿を抑制し、２ｍｇ／ｋｇ群での溶媒投与群に対する阻害率は、ＵＰを指標にした場合は２７．２％、ＵＰ／ｕＣｒでは４６．０％であった。【００８３】
次に、ＣＬＮ１との作用強度の違いを確認する目的で、同モデル評価を行なった。評価手順は上記と同じである。評価は上記で有効であった用量を参考に、完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１の２ｍｇ／ｋｇを陽性対照として、ＣＬＮ１の２ｍｇ／ｋｇと１０倍用量の２０ｍｇ／ｋｇを使用した。また、異種抗体処置による非特異的な免疫反応の関与を調べる目的で、ヒト型ＩｇＧ１抗体（抗ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）抗体：ＫＬＨをベロシミューンマウスに免疫し、抗体を取得。その後、完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１と同様に完全ヒト型ＩｇＧ１として作製）の２ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇをコントロールとしておいた。その結果を表５（ＵＰ）及び表６（ＵＰ／ｕＣｒ）に示す。
【表５】
0006040943.tif 000006
【表６】
0006040943.tif 000007
【００８４】
その結果、病態は前回とほぼ同様の発症度であった。そして完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１の２ｍｇ／ｋｇは前回評価とほぼ同じ抑制率を示し、溶媒投与群を対照にした場合の阻害率は、ＵＰを指標にした場合２ｍｇ／ｋｇで２９．１％、ＵＰ／ｕＣｒでは３９．２％であった。【００８５】
一方でＣＬＮ１は完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１と比べてタンパク尿抑制作用は弱いものであった（２ｍｇ／ｋｇで、ＵＰ及びＵＰ／ｕＣｒを指標にした場合の溶媒投与群に対する阻害率は、それぞれ１２．６％及び２１．５％；２０ｍｇ／ｋｇで、ＵＰ及びＵＰ／ｕＣｒを指標にした場合の溶媒投与群に対する阻害率は、それぞれ３．５％及び９．５％）。また、ヒト型ＩｇＧ１抗体はタンパク尿に対してほとんど影響しなかった。【００８６】
このことから、完全ヒト型３７−４５−ＭＨ１は、ＣＬＮ１と比較して、強いタンパク尿抑制作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の抗ヒトＣＴＧＦ抗体は、慢性腎臓病や糖尿病性腎症などの腎臓疾患をはじめ、ヒトＣＴＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療に有用である。
【配列表】
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