(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
接触ゾーン内で、高温で１種または複数の窒素含有化合物がヒドリンダンチンと接触する、該１種または複数の窒素含有化合物を分析するための方法であって、
加熱ゾーン内で、第１の高温でニンヒドリンを１種または複数の還元剤に接触させることによって、ヒドリンダンチン含有混合物を生成するステップであって、該第１の高温は、１００℃から１６０℃である、ステップと、
該ヒドリンダンチン含有混合物を該接触ゾーンに導入し、第２の高温で該ヒドリンダンチン含有混合物を該窒素含有化合物に接触させるステップであって、該第２の高温は、１００℃から１６０℃である、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記１種または複数の窒素含有化合物がアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記加熱ゾーンおよび／または前記接触ゾーンがコイルまたはカラムの形態で構成される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記加熱ゾーンおよび接触ゾーンが別々のチャンバー内に収納されている、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記接触ゾーンが前記加熱ゾーンの下流に位置する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記加熱ゾーンおよび前記接触ゾーンが同一の温度で作動する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記加熱ゾーンおよび／または前記接触ゾーン内の温度が１１５℃〜１４５℃である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記加熱ゾーンおよび／または前記接触ゾーン内の温度が１２０℃〜１３５℃である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ニンヒドリンおよび前記還元剤が、前記加熱ゾーン内で１０〜１８０秒の期間の間加熱される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ニンヒドリンおよび前記還元剤が、前記加熱ゾーン内で１５〜１２０秒の期間の間加熱される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ニンヒドリンおよび前記還元剤が、前記加熱ゾーン内で２０〜８０秒の期間の間加熱される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ニンヒドリンおよび前記還元剤が、前記加熱ゾーン内で３０〜６０秒の期間の間加熱される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒドリンダンチン含有混合物が、前記接触ゾーン内で１０〜１００秒の滞留時間を有する、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒドリンダンチン含有混合物が、前記接触ゾーン内で２０〜８０秒の滞留時間を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒドリンダンチン含有混合物が、前記接触ゾーン内で３０〜６０秒の滞留時間を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ニンヒドリンからヒドリンダンチンの還元において、前記還元剤の活性に従いヒドリンダンチン生成の速度が制御される、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ヒドリンダンチン生成の速度が、前記還元剤の濃度、前記加熱ゾーンおよび／または接触ゾーン内の反応時間ならびに該加熱ゾーンおよび／または接触ゾーン内の温度のうちの１つまたは複数を変化させることによって制御される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ニンヒドリンがニンヒドリン試薬の形態の前記還元剤と接触し、該ニンヒドリン試薬が、
ニンヒドリンと、
水性緩衝液と、
第１の温度でニンヒドリンの還元において不活性であり、第２の温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンへ還元する活性があり、該第２の温度が該第１の温度より高い、温度依存性還元剤と
を含み、
該ニンヒドリン試薬が前記加熱ゾーン内で少なくとも該第２の温度に加熱される、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ニンヒドリン試薬が、ヒドリンダンチンを実質的に含まない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の温度が少なくとも１００℃である、請求項１８または１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
還元が不活性である第１の温度が０℃〜３０℃である、請求項１８から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
還元が不活性である第１の温度が５℃〜２５℃である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
還元が不活性である第１の温度が１０℃〜２０℃である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記温度依存性還元剤が、３カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記温度依存性還元剤が、６カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記温度依存性還元剤が、１２カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記温度依存性還元剤が、２４カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の糖を含む、請求項１８から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の単糖を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記温度依存性還元剤が、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ガラクトース、リボース、キシロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アラビノース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、タロースおよびＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、またはこれらの混合物を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の二糖を含む、請求項２８または２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記温度依存性還元剤が、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、スクロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノース、キシロビオースまたはこれらの混合物を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のより長鎖の多糖を含む、請求項１８から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記温度依存性還元剤が、スタキオース、デキストリン、マルトデキストリン、またはこれらの混合物を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のカルボン酸および／またはその塩を含む、請求項１８から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記温度依存性還元剤が、カルボン酸のＩ族またはＩＩ族の金属塩を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記温度依存性還元剤が１種または複数の単官能性カルボン酸またはその塩を含む、請求項３５または３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記カルボン酸がギ酸またはその塩である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記温度依存性還元剤が、少なくとも１種の追加の還元基を含む１種または複数のカルボン酸を含む、請求項３５から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記温度依存性還元剤が、クエン酸または酒石酸を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のアルデヒド基および／またはケトン基を有する１種または複数の化合物を含む、請求項１８から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記温度依存性還元剤がアセトンを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の無機化合物を含む、請求項１８から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記温度依存性還元剤が、低い酸化状態の硫黄の無機化合物および／または低い酸化状態のリン酸素酸を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記温度依存性還元剤が、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩および／もしくは次亜リン酸塩またはこれらの混合物を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のヒドロキシル基を有するアルコールを含む、請求項１８から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記温度依存性還元剤が、メタノール、エタノール、プロパノール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、マンニトールおよびソルビトールまたはこれらの混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記温度依存性還元剤が、メトキシエタノール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、カルビトール、ジメチルスルホキシドもしくはスルホランまたはこれらの混合物を含む、請求項１８から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記温度依存性還元剤の濃度が０．０１％〜７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、請求項１８から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記温度依存性還元剤の濃度が０．０１％〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が０．５〜３％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、請求項１８から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が１〜２．５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が約２％ｗ／ｖである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記緩衝液が水性緩衝液である、請求項１８から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記緩衝液が、弱酸およびその共役塩基／塩のうちの１種を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記緩衝液が有機酸を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記緩衝液が、エタン酸またはプロパン酸を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記緩衝液が３〜７の間の値にｐＨを維持する、請求項１８から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記緩衝液が、４〜６の間の値にｐＨを維持する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記緩衝液が４．５〜５．５の間の値にｐＨを維持する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記緩衝液が約５．２の値にｐＨを維持する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
１種または複数の有機溶媒をさらに含む、請求項１８から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、スルホラン、カルビトール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、メチルセロソルブおよびメタノールまたはこれらの混合物を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
有機溶媒の濃度が１０％〜７５％ｖ／ｖである、請求項６２または６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
有機溶媒の濃度が２５％〜６５％ｖ／ｖである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
有機溶媒の濃度が３５％〜５５％ｖ／ｖである、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばアミノ酸などの窒素含有化合物を分析するための新規の方法に関する。本発明はまたこの方法において使用するための試薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、タンパク質形成の元となる成分であり、ひいては多くの生物学的過程において主要な役割を果たしている。ある場合には、個体内にある特定のアミノ酸が存在することまたは存在しないことによって、個体の健康に著しく影響を及ぼす可能性がある。例えば、遺伝性の代謝障害であるフェニルケトン尿症（ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｅａ）に罹患した個体は、フェニルアラニンを代謝することができず、このフェニルアラニンの蓄積は個体の脳の発達に深刻な影響を及ぼす。したがって、遊離アミノ酸を検出するため、またはタンパク質のアミノ酸組成を決定するための方法は疾患の適切な診断および管理のために極めて重要である。同様に、このような方法は、市販の薬物、食品および食材の分析、ならびにタンパク質および酵素の研究および開発のために重要である。より一般的には、窒素含有化合物の検出および同定は、農業科学、生化学、臨床学、環境学、食品科学、法医学、組織化学、微生物学、医学、栄養学、植物科学およびタンパク質科学を含めた広範囲な研究分野の全域にわたり用途を見出している。
【０００３】
現在では、遊離アミノ酸または加水分解により放出されたアミノ酸はアミノ酸自動分析計を使用して通常検出している。１９５０年代には、最初の自動化されたアミノ酸分析法は、Ｍｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎ（Ｓｐａｃｋｍａｎ  ＤＨ、Ｓｔｅｉｎ  ＷＨ、およびＭｏｏｒｅ  Ｓ．  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、１９５８年、３０巻：１１９０〜１２０６頁）により開発された。この多段階法は、イオン交換液体クロマトグラフィーでアミノ酸を分離することを含む。ニンヒドリン試薬を試薬リザーバーからポンプで送り込み、イオン交換カラムからの溶離液と混合し、スチールまたはプラスチック反応コイルに通し、反応のために必要とされる温度まで加熱する。
【０００４】
ニンヒドリンは、すべてのアミノ酸および関連するアミン化合物と反応して、濃い色の反応生成物を形成する。特にルーエマンパープルが第一級アミンおよび第一級アミノ酸により形成され、５７０ｎｍの波長の光の吸光度により測定することができる。他の有色の反応生成物、黄色の反応生成物が、第二級アミンおよびいくつかの第二級アミノ酸により形成される。これらの反応生成物は、４４０ｎｍの波長の光のその吸光度により測定することができる。有色の反応生成物は、アミノ酸濃度により強度が異なる。
【０００５】
色素化合物により吸収された光が適切な波長、特に５７０ｎｍおよび４４０ｎｍにおいて検出される光度計にアミノ酸反応生成物を通す。異なるアミノ酸の存在はクロマトグラフィーにより決定することができる。各アミノ酸の識別情報は、その移動の特徴、したがってクロマトグラム上のその位置に基づき確立される。アミノ酸の濃度は、特定された波長での吸光度として光度計において検出される有色生成物の強度により決定する。したがって、本方法を使用して、どのアミノ酸が試験試料中に存在するか、ならびにそれぞれの相対濃度を定性的および定量的に決定することができる。  
【０００６】
ニンヒドリンとアミノ酸またはアミンとの間の発色反応は、室温では極めて遅い。高温ではかなり速いが、それでも、１３０℃以上の温度でさえ何分もかかる。良好なクロマトグラフィー性能を維持するために、発色反応は、およそ１分間以下の時間枠内で行なう必要がある。これを達成するためには、ニンヒドリン試薬が有効となるように、および許容される反応速度が得られるように、ニンヒドリンの還元型形態であるヒドリンダンチンが必要なことが判明した。高温で有色の生成物の形成をスピードアップするヒドリンダンチンの能力を説明するためのいくつかの理由またはメカニズムが示唆されてきた。１つの示唆は、ヒドリンダンチンが反応中間体のうちの１種に対して安定剤として作用することである。よってヒドリンダンチンは、触媒ではなく促進剤とみなされる。
【０００７】
残念なことに、ニンヒドリン試薬中に存在するヒドリンダンチンは、取り扱いが極めて困難な化合物である。ヒドリンダンチンは空気の存在下では特に不安定であり、酸素はヒドリンダンチンを急速に酸化してニンヒドリンにする。試薬内のヒドリンダンチンを著しく消耗させるために比較的少量の空気しか必要とせず、したがって測光分析における色生成の感度を実質的に減少させる。ヒドリンダンチンの酸化を減少させることを目指して、普通窒素である不活性雰囲気を、ニンヒドリン試薬の調製において、および使用中の両方に使用することができる。理解され得るように、不活性雰囲気に対する必要条件により、その使用前および／または使用中、迅速なアミノ酸分析に不可欠なヒドリンダンチンを許容できない速度で劣化させないことを確実にするためには、複雑な装置および取扱い手順が結果として必要となる。
【０００８】
加えて、ヒドリンダンチンは水性媒体には全く不溶性である。したがって、相当量の有機溶媒がこの貯蔵および使用のために必要とされる。
【０００９】
実際には、現存する装置および技法を使用して、標準的アミノ酸分析器上でのヒドリンダンチンを含むニンヒドリン試薬の混合または使用中に空気を完全に排除するのは不可能である。その結果、試薬中のヒドリンダンチン濃度は、クロマトグラフィー分析の時間枠内で発色反応が起こらなくなるまで、必然的に確実に低減する。実際に、ヒドリンダンチンを含む典型的なニンヒドリン試薬は、長くても１カ月、おそらく２週間位の短い貯蔵寿命しか持たない。
【００１０】
Ｍｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎがヒドリンダンチンを必要とするニンヒドリンベースの分析を発見してからこの６０年間でわずかな変化しか起こらなかった。むしろ、この方法は依然として現在最も一般的に使用されている技法である。しかし、ヒドリンダンチンに使用に関連する上記問題を考慮して、劣化の速度を最小限に抑えるため、この方法に対するわずかな修正がなされてきた。Ｍｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎによる元の方法は、還元剤として塩化第１スズを利用した。しかし、適度に速い反応に対して十分なヒドリンダンチンを生成するのに必要とされる塩化第１スズの量は、水酸化スズ化合物の最終的な沈殿を引き起こし、ひいてはこれが流管をふさぎ、遮断した。したがって、塩化第１スズの使用はすぐに破棄され、シアン化物、チタン塩、ボロハイドライドおよびアスコルビン酸などの他の還元剤が調査された。シアン化物は、毒性の問題のために商業的に使用することができず、必要な安定性を欠いていた。
【００１１】
水素化ホウ素ナトリウムおよびアスコルビン酸還元剤についてさらに本格的な研究が行われた。例えば、ＵＳ３，７７８，２３０およびＵＳ４，２７４，８３３は、還元剤としてそれぞれアスコルビン酸および水素化ホウ素ナトリウムまたは塩化第１スズを含むニンヒドリン試薬を開示している。しかし、これらの試薬は、ヒドリンダンチンの酸化のリスクを最小限に抑えるために、周囲温度で、不活性な容器内で最初に調製しなければならない。ＵＳ３，７７８，２３０および還元剤としてのアスコルビン酸の使用について特に言及すると、深刻な欠点は、結果の精度に悪影響を及ぼす有色の副生成物の生成である。
【００１２】
代替の技法、すなわちアミノ酸分析に対して異なる装置を使用するいくつかの技法も提案されてきた。例えば、ＵＳ４，３５９，３２３は、アミンのための液体クロマトグラフ分析システムに関する。このシステムは、クロマトグラフィーカラム、反応カラムおよび再利用のための移動相を再循環させるループからなる。このシステムの主要なおよび最も重大な特色は、アミノ酸試料を分離するために使用される液体移動相が、溶離液と、アミンと反応して測光法で検出可能な化合物を生じる物質との組合せで構成されていることである。したがって、この方法は、全部の作業のためにたった１つのポンプしか必要としない。こうすれば、ヒドリンダンチンの周囲空気への曝露は減少するはずである。しかし、反応成分が分離カラム内のアミノ酸試料に干渉する重大なリスクがこの発明に依然として存在する。
【００１３】
Ｍｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎの方法とは異なり、Ｈｉｔａｃｈｉは、加熱した反応チャンバーの前に、水素化ホウ素ナトリウムおよびニンヒドリンをラインで一緒に混合していると理解されている。したがって、Ｈｉｔａｃｈｉ試薬は、混合した試薬の標準である１カ月ではなく、最大１２カ月の間まで使用することができることが主張されている。しかし、水素化ホウ素ナトリウムは依然として完全に安定ではなく、微量の金属がその劣化を促進できることが公知である。その結果、１年が終わるまでにかなりの量の水素化ホウ素ナトリウムが喪失される可能性があった。ヒドリンダンチンはラインで生成されるが、追加のポンプシステムまたはラインが水素化ホウ素ナトリウムを分析装置に挿入するために必要となる。これは、システムの複雑さおよび費用を増加させ、Ｈｉｔａｃｈｉ試薬は、これらに追加のポンプ供給システムおよび供給ラインを取り付けない限り、他の製造業者の機器上で使用不可能となる。
【００１４】
ニンヒドリン試薬を調製するための代替の技法がＵＳ３，６３２，４９６において開示されている。試薬生成器は、一方の端に試薬受け入れ用の入口を含み、他方の端に活性化した試薬の放出用の出口を含むチャネルが通っている、細長い筺体から形成される。チャネルは、ニンヒドリンを還元して活性化した試薬を形成するための、触媒として活性のある金属材料の表面により画定されている。このように、ニンヒドリンは、その安定した状態で、１つのベシクル内に貯蔵し、活性化させることができる。しかし、この発明は、活性化したニンヒドリン試薬を調製するために、過度に複雑なメカニズムおよびデバイスを提供する。上で論じたように、製造業者は、別々に貯蔵されたニンヒドリンおよびヒドリンダンチンを、アミノ酸分析器での使用の直前に一緒に混合するずっと単純な方法を使用することに逆戻りしている。さらに、ＵＳ３，６３２，４９６の試薬反応器は、ペーパークロマトグラフィーの分野の用途における使用のために、試薬噴霧器に組み込まれることになる。したがって、ヒドリンダンチンを周囲空気に曝露することなく、使用のために、活性化した試薬を試薬反応器からアミノ酸分析器装置へ移動させることは、不可能ではないとしても、困難である可能性がある。
ＧＢ１３４９９４１は、特定のアリールアルキルアルデヒドを、ニンヒドリンと組み合わせて利用することによって、高い蛍光を示す複合体が得られる第一級アミノ基の蛍光分析アッセイのための初期の方法に関する。
さらに最近では、工業用の循環水中の従属栄養性細菌を検出するための方法がＣＮ  １０２６１８６２１Ａにおいて記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第３，７７８，２３０号明細書
【特許文献２】米国特許第４，２７４，８３３号明細書
【特許文献３】米国特許第４，３５９，３２３号明細書
【特許文献４】米国特許第３，６３２，４９６号明細書
【特許文献５】英国特許第１３４９９４１号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｍｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎ（Ｓｐａｃｋｍａｎ  ＤＨ、Ｓｔｅｉｎ  ＷＨ、およびＭｏｏｒｅ  Ｓ．  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、１９５８年、３０巻：１１９０〜１２０６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
代替のニンヒドリン試薬、特に、代替の還元剤を発見するためにかなりの研究がなされてきた一方で、アミノ酸などを分析する有効で、単純および安価な方式を提供する改善された方法に対する必要性が依然として存在する。広範囲なニンヒドリン試薬を用いた代替法が使用のために利用可能である場合特に有利となる。
【００１８】
したがって、最初の態様において、本発明は、接触ゾーン内で１種または複数の窒素含有化合物が高温でヒドリンダンチンと接触する、該１種または複数の窒素含有化合物を分析するための方法であって、
加熱ゾーン内で、第１の高温でニンヒドリンを１種または複数の還元剤と接触させることによって、ヒドリンダンチン含有混合物を生成するステップと、
ヒドリンダンチン含有混合物を接触ゾーンに導入し、第２の高温でヒドリンダンチン含有混合物を窒素含有化合物と接触させるステップと
をさらに含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の方法は、窒素含有化合物を可視化するため、より具体的にはアミノ酸およびアミンを定量的および定性的に分析するために使用することができる。本方法は、市販のアミノ酸分析器において使用されている十分に確立されたアミノ酸およびニンヒドリン反応に基づく。上で論じたように、市販のシステムは通常、イオン交換液体クロマトグラフィーにより試験試料をそのアミノ酸構成成分に分離する。次いで、溶出したアミノ酸を、ヒドリンダンチンを含むニンヒドリン試薬と混合し、反応コイル内で加熱することによって、有色の反応生成物を形成し、これに、公知の方式で測光を施す。
【００２０】
ニンヒドリンは当技術分野で公知であり、市販されている。本発明の方法において使用されるニンヒドリン試薬は、ニンヒドリンの還元のため、およびアミノ酸分析において当技術分野で公知の還元剤を含んでもよい。しかしより好ましくは、ニンヒドリン試薬は、本明細書で「温度依存性還元剤」と呼ばれる１種または複数の化合物を含む。本方法およびこれらの適性を評価するための試験における使用に適した温度依存性還元剤のさらに詳細な説明が以下の本発明の第２の態様において提供されている。以下の記載は、１種または複数の温度依存性還元剤を含むニンヒドリン試薬について言及している。しかし、本発明の方法はまた、当技術分野で公知であり得るような、他の還元剤を含むニンヒドリン試薬に適用することもできることを理解されたい。
【００２１】
上で論じたように、本発明の方法において、ニンヒドリンは第１の高温で１種または複数の還元剤と接触させて、ヒドリンダンチン含有混合物を生成してから、分析対象の窒素含有化合物との反応のために第２の高温で接触ゾーンへ導入する。アミノ酸および関連するアミンの決定のためにＭｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎのクロマトグラフィー法が開発されてから今まで、すべての機器開発には、接触ゾーンまたは反応コイル内の１つの加熱段階しか含まれない。ニンヒドリンおよび１種または複数の温度依存性還元剤をこのように予熱することは、還元剤の反応性を改善し、ひいては分析法の全体的な作業および効率を改善させることが判明した。おそらくさらに重要なことに、加熱時間の増加は、アミノ酸分析器機器のクロマトグラフィー性能に影響を及ぼさないことが判明した。実際に、ニンヒドリンおよび１種または複数の温度依存性還元剤を予熱することは、それに続くアミノ酸分析の感度を実質的に増加させることが判明した。またさらに、予熱段階を適用することによって、以下にさらに詳細に考察されているように、ニンヒドリンからヒドリンダンチンへの還元において温度依存性還元剤として使用することが可能な化合物の数および化合物の種類が増加することが判明した。
【００２２】
本発明の方法は、試薬が接触ゾーンに提供される前に、１種または複数の温度依存性還元剤を第１の高温に予熱するための予熱コイルまたはカラムなどの、加熱ゾーンを使用する。予熱コイルまたはカラムなどの加熱ゾーンを使用して、温度依存性還元剤およびニンヒドリンを予熱することによって、窒素含有化合物の不在下で、および接触ゾーン内で分析対象の窒素含有化合物と接触させる前にヒドリンダンチンを形成する。
加熱ゾーンおよび接触ゾーンは、単一のチャンバーもしくはベッセル内にあってもよいし、または別々のベッセル内に収納されていてもよい。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
接触ゾーン内で、高温で１種または複数の窒素含有化合物がヒドリンダンチンと接触する、該１種または複数の窒素含有化合物を分析するための方法であって、
加熱ゾーン内で、第１の高温でニンヒドリンを１種または複数の還元剤に接触させることによって、ヒドリンダンチン含有混合物を生成するステップと、
該ヒドリンダンチン含有混合物を該接触ゾーンに導入し、第２の高温で該ヒドリンダンチン含有混合物を該窒素含有化合物に接触させるステップと
を含む方法。
（項目２）
前記１種または複数の窒素含有化合物がアミノ酸である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記加熱ゾーンおよび／または前記接触ゾーンがコイルまたはカラムの形態で構成される、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記加熱ゾーンおよび接触ゾーンが別々のチャンバー内に収納されている、任意の先行する項目に記載の方法。
（項目５）
前記接触ゾーンが前記加熱ゾーンの下流に位置する、任意の先行する項目に記載の方法。
（項目６）
前記加熱ゾーンおよび前記接触ゾーンが同一の温度で作動する、任意の先行する項目に記載の方法。
（項目７）
前記加熱ゾーンおよび／または前記接触ゾーン内の温度が１００℃〜１６０℃である、任意の先行する項目に記載の方法。
（項目８）
前記加熱ゾーンおよび／または前記接触ゾーン内の温度が１１５℃〜１４５℃である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記加熱ゾーンおよび／または前記接触ゾーン内の温度が１２０℃〜１３５℃である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ニンヒドリンおよび前記還元剤が、前記加熱ゾーン内で１０〜１８０秒の期間の間加熱される、任意の先行する項目に記載の方法。
（項目１１）
前記ニンヒドリンおよび前記還元剤が、前記加熱ゾーン内で１５〜１２０秒の期間の間加熱される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ニンヒドリンおよび前記還元剤が、前記加熱ゾーン内で２０〜８０秒の期間の間加熱される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ニンヒドリンおよび前記還元剤が、前記加熱ゾーン内で３０〜６０秒の期間の間加熱される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ヒドリンダンチン含有混合物が、前記接触ゾーン内で１０〜１００秒の滞留時間を有する、任意の先行する項目に記載の方法。
（項目１５）
前記ヒドリンダンチン含有混合物が、前記接触ゾーン内で２０〜８０秒の滞留時間を有する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ヒドリンダンチン含有混合物が、前記接触ゾーン内で３０〜６０秒の滞留時間を有する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ニンヒドリンからヒドリンダンチンの還元において、前記還元剤の活性に従いヒドリンダンチン生成の速度が制御される、任意の先行する項目に記載の方法。
（項目１８）
ヒドリンダンチン生成の速度が、前記還元剤の濃度、前記加熱ゾーンおよび／または接触ゾーン内の反応時間ならびに該加熱ゾーンおよび／または接触ゾーン内の温度のうちの１つまたは複数を変化させることによって制御される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
ニンヒドリンがニンヒドリン試薬の形態の前記還元剤と接触し、該ニンヒドリン試薬が、
ニンヒドリンと、
水性緩衝液と、
第１の温度でニンヒドリンの還元において不活性であり、第２の温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンへ還元する活性があり、該第２の温度が該第１の温度より高い、温度依存性還元剤と
を含み、
該ニンヒドリン試薬が前記加熱ゾーン内で少なくとも該第２の温度に加熱される、任意の先行する項目に記載の方法。
（項目２０）
前記ニンヒドリン試薬が、ヒドリンダンチンを実質的に含まない、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記第２の温度が少なくとも１００℃である、項目１９または２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記温度依存性還元剤が、実施例１のプロトコル１の前記第２の温度での還元活性の基準を満たす化合物である、項目１９から２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記温度依存性還元剤がプロトコル１に従い前記第２の温度での還元活性の基準を満たす、最小吸光度０．３が観察されている化合物である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記第１の温度が０℃〜３０℃である、項目１９から２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記第１の温度が５℃〜２５℃である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の温度が１０℃〜２０℃である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記温度依存性還元剤が、実施例２のプロトコル２に従い、前記第１の温度において還元活性の基準を満たす化合物である、項目１９から２６のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
前記温度依存性還元剤が、３カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記温度依存性還元剤が、６カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記温度依存性還元剤が、１２カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記温度依存性還元剤が、２４カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の糖を含む、項目１９から３１のいずれかに記載の方法。
（項目３３）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の単糖を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記温度依存性還元剤が、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ガラクトース、リボース、キシロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アラビノース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、タロースおよびＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、またはこれらの混合物を含む、項目３３に記載の方法試薬。
（項目３５）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の二糖を含む、項目３２または３３のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記温度依存性還元剤が、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、スクロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノース、キシロビオースまたはこれらの混合物を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のより長鎖の多糖を含む、項目１９から３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記温度依存性還元剤が、スタキオース、デキストリン、マルトデキストリン、またはこれらの混合物を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のカルボン酸および／またはその塩を含む、項目１９から３８のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
前記温度依存性還元剤が、カルボン酸のＩ族またはＩＩ族の金属塩を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記温度依存性還元剤が１種または複数の単官能性カルボン酸またはその塩を含む、項目３９または４０のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
前記カルボン酸がギ酸またはその塩である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記温度依存性還元剤が、少なくとも１種の追加の還元基を含む１種または複数のカルボン酸を含む、項目３９から４２のいずれかに記載の方法。
（項目４４）
前記温度依存性還元剤が、クエン酸または酒石酸を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のアルデヒド基および／またはケトン基を有する１種または複数の化合物を含む、項目１９から４４のいずれかに記載の方法。
（項目４６）
前記温度依存性還元剤がアセトンを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の無機化合物を含む、項目１９から４６のいずれかに記載の方法。
（項目４８）
前記温度依存性還元剤が、低い酸化状態の硫黄の無機化合物および／または低い酸化状態のリン酸素酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記温度依存性還元剤が、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩および／もしくは次亜リン酸塩またはこれらの混合物を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のヒドロキシル基を有するアルコールを含む、項目１９から４８のいずれかに記載の方法。
（項目５１）
前記温度依存性還元剤が、メタノール、エタノール、プロパノール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、マンニトールおよびソルビトールまたはこれらの混合物を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記温度依存性還元剤が、メトキシエタノール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、カルビトール、ジメチルスルホキシドもしくはスルホランまたはこれらの混合物を含む、項目１９から５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記温度依存性還元剤の濃度が０．０１％〜７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、項目１９から５２のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
前記温度依存性還元剤の濃度が０．０１％〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が０．５〜３％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、項目１９から５４２のいずれかに記載の方法。
（項目５６）
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が１〜２．５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が約２％ｗ／ｖである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記緩衝液が水性緩衝液である、項目１９から５７のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
前記緩衝液が、弱酸およびその共役塩基／塩のうちの１種を含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記緩衝液が有機酸を含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記緩衝液が、酢酸、エタン酸またはプロパン酸を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記緩衝液が３〜７の間の値にｐＨを維持する、項目１９から６１のいずれかに記載の方法。
（項目６３）
前記緩衝液が、４〜６の間の値にｐＨを維持する、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記緩衝液が４．５〜５．５の間の値にｐＨを維持する、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記緩衝液が約５．２の値にｐＨを維持する、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
１種または複数の有機溶媒をさらに含む、項目１９から６５のいずれかに記載の方法。
（項目６７）
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、スルホラン、カルビトール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、メチルセロソルブおよびメタノールまたはこれらの混合物を含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
有機溶媒の濃度が１０％〜７５％ｖ／ｖである、項目６６または６７のいずれかに記載の方法。
（項目６９）
有機溶媒の濃度が２５％〜６５％ｖ／ｖである、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
有機溶媒の濃度が３５％〜５５％ｖ／ｖである、項目６９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明の方法を実行するためのシステムの一実施形態を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
一実施形態では、加熱ゾーンおよび接触ゾーンは同一の加熱チャンバー内に含有され、加熱ゾーンは接触ゾーンの上流に位置する。この配置において、加熱ゾーンおよび接触ゾーンは同一の温度または異なる温度に曝露されていてもよい。さらに、加熱ゾーンおよび接触ゾーンは、同一または異なる時間の間、ニンヒドリン試薬および／または窒素含有化合物を加熱するよう作動してもよい。本実施形態では、単一の温度で作動する単一の加熱チャンバーを有することで、加熱ゾーンおよび接触ゾーンを同一の温度とすることがさらに好都合である。
【００２５】
代わりに、加熱ゾーンは、接触ゾーンのものとは別のチャンバーまたはベッセル内に含有され、接触ゾーンの上流に位置する。本実施形態では、加熱ゾーンおよび接触ゾーンは、同一または異なる温度で作動してもよい。さらに、加熱ゾーンおよび接触ゾーンは、同一または異なる時間の間、ニンヒドリン試薬および／または窒素含有化合物を加熱するよう作動してもよい。各ゾーンにおける温度および反応時間を独立して変化させ、制御することができるよう接触ゾーンおよび加熱ゾーンを配置することによって、使用中にヒドリンダンチンの形成を制御するという点からさらなる汎用性が得られる。これは、還元剤の濃度が固定され、したがってヒドリンダンチンが形成される速度が制御できない公知の方法とは対照的である。
【００２６】
ニンヒドリン試薬を予熱するための予熱器を使用するというこの配置は、試薬成分は一般的により高い温度でさらに可溶性であるので、有機溶媒を含まない試薬を開発するためには特に有利である。加えて、比較的低い還元活性を有する化合物、例えば、本発明の温度依存性還元剤に追加の加熱を施すことによって、ニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元する十分な活性をこれらに付与することができる。したがって、本発明のこの態様の方法により、ニンヒドリンのための還元剤としてより広い範囲の成分の使用が得られる。
【００２７】
接触ゾーンは、第２の温度で、活性化したニンヒドリン試薬、すなわち、ヒドリンダンチンを含有する試薬を、窒素含有化合物、例えば、１種または複数のアミノ酸に接触させるために使用される。ニンヒドリンの還元によるヒドリンダンチンの生成は、接触ゾーン、すなわち、装置の色形成反応コイル内で継続する。しかし、温度依存性還元剤の濃度、接触ゾーン内の温度および反応時間を制御することによって、ヒドリンダンチンの濃度を制御可能な速度で増加させることが可能となる。さらに重大なことに、上述のように、接触ゾーン内の温度は、必要とされる濃度でヒドリンダンチンを形成する必要性によって制約されず、これは加熱ゾーン内で達成されている。このように、接触ゾーン内の条件は窒素含有化合物の分析、特にアミノ酸との色形成反応に対して最適化することができる。
【００２８】
接触ゾーンは、ヒドリンダンチンを含有する活性化したニンヒドリン試薬の、分析対象の窒素含有化合物への接触を可能にする任意の適切な構成であってよい。好ましくは、接触ゾーンは、本発明の加熱ゾーンと同様の方式、すなわち、コイルまたはカラムの形態で構成される。
【００２９】
ニンヒドリンおよび本発明の本態様の方法の１種または複数の温度依存性還元剤は、加熱ゾーンに別々に送達することができる。例えば、ニンヒドリンおよび１種または複数の還元剤は、別々の容器またはリザーバーからそれぞれのポンプにより引き出され、共通のラインまたは混合ゾーンに送達されて、そこでそれらは合わせられて混合物を形成する。次いで、この混合物は加熱ゾーンに送達される。代わりに、ニンヒドリンおよび１種または複数の還元剤は、別々の容器またはリザーバーからそれぞれのポンプにより引き出され、加熱ゾーンに直接送達され、そこでこれらの混合および加熱の両方が行われる。
【００３０】
しかし、ニンヒドリンおよび１種または複数の温度依存性還元剤は混合物として一緒に加熱ゾーンに送達されるのがより好ましい。なぜなら、アミノ酸分析装置上でのこれらの使用前に混合物の成分を調製することはさらに好都合であるためである。さらに、本発明の温度依存性還元剤を使用することによって、混合物の成分は極めて安定し、混合物は実際に使用される前に調製され、空気の存在下で長い貯蔵寿命を有することができる。
【００３１】
上で論じたように、市販のニンヒドリン試薬は、ニンヒドリンの溶液を、ヒドリンダンチンと合わせることによって調製される。加えて、ニンヒドリン試薬は通常１種または複数の緩衝液および有機溶媒を含む。したがって、好ましい実施形態では、ニンヒドリンを含むヒドリンダンチンを含まないニンヒドリン試薬、１種または複数の温度依存性還元剤、１種または複数の緩衝液および１種または複数の有機溶媒が、加熱ゾーン内で第１の温度で接触する。
【００３２】
ニンヒドリン試薬の成分、すなわち、ニンヒドリン、温度依存性還元剤および１種もしくは複数の緩衝液ならびに／または溶媒は、上に記載されている多くの方式、すなわち、別々にまたは１種または複数の成分を合わせて、加熱ゾーン内に提供されてもよい。しかし、ニンヒドリン試薬の成分は混合物として一緒に加熱ゾーンに送達されるのがより好ましい。なぜなら、分析におけるこれらの使用前に、該成分の混合物を調製することはさらに好都合であるためである。
【００３３】
上で論じたように、有利なことには、本発明の方法は、公知の方法およびニンヒドリン試薬での場合のように、別々の有機溶媒の存在を必ずしも必要としない。しかし、多くの有機溶媒は、本発明の方法に従い使用した場合、温度依存性還元剤として作用することが可能なことが判明した。したがって、本発明の方法において使用されるニンヒドリン試薬の代替の実施形態は、温度依存性還元剤として１種または複数の有機溶媒を含む。本実施形態では、有機溶媒は唯一の温度還元剤（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）であってよい。代わりに、ニンヒドリン試薬は１種または複数の追加の温度依存性還元剤を含み得る。本実施形態では、ニンヒドリン、有機溶媒、任意選択の１種または複数の温度依存性還元剤および必要な緩衝液（複数可）を、上述された方式のいずれか１つで導入することができる。
【００３４】
本発明の方法における使用のためのニンヒドリン試薬の一部を形成するのに適切な緩衝液および溶媒の種類に関するさらに詳細な情報が以下に提供されている。
【００３５】
ニンヒドリンおよび温度依存性還元剤が反応してヒドリンダンチンを生成する温度は、それぞれの第１および第２の温度での加熱および接触ゾーン内の滞留時間により異なる。加えて、コイルの滞留時間は、クロマトグラフィーに対して選ばれた流量により異なり、それは、窒素含有試料、特に分析対象のアミノ酸試料の種類に応じて異なり得る。さらに、試薬の正確な組成、例えば、温度依存性還元剤の濃度および還元強度ならびに存在する有機溶媒の量は、加熱および接触ゾーン内の温度環境を決定する。
【００３６】
上記を考慮して、ニンヒドリンおよび温度依存性還元剤は、加熱ゾーン内で、１００℃〜１６０℃、より好ましくは１１５℃〜１４５℃、さらにより好ましくは１２０℃〜１３５℃の範囲の第１の温度で接触させることができる。
【００３７】
さらに、ニンヒドリンおよび温度依存性還元剤は、加熱ゾーン内で、任意の適切な時間、特に必要とされる濃度のヒドリンダンチンを生成するのに十分な期間、接触させることができる。加熱ゾーン内の滞留時間は、温度依存性還元剤の濃度、還元剤の活性、適用される第１の温度および必要とされるヒドリンダンチンの濃度などの要因に依存する。特に、加熱ゾーン内の滞留時間は、１０〜１８０秒、好ましくは１５〜１２０秒、より好ましくは２０〜８０秒、さらにより好ましくは３０〜６０秒まで異なってもよい。
【００３８】
上で論じたように、ニンヒドリン試薬の成分は、加熱ゾーン内で、第１の温度で接触させることによって、活性化したヒドリンダンチン含有混合物を生成する。次いで、ヒドリンダンチン含有混合物を加熱ゾーンから接触ゾーンへ送達する。接触ゾーンは、試薬が分析対象の窒素含有化合物と接触し、色形成反応がニンヒドリン試薬と、１種または複数のアミノ酸などの窒素含有化合物との間で起きる箇所である。
【００３９】
ニンヒドリン試薬が接触ゾーンに導入される前のヒドリンダンチンの生成は、接触ゾーン内のより速い色生成反応をもたらし、ひいてはより短い滞留時間の利用を可能にし、実質的に感度を増加させる。さらに、ニンヒドリン試薬が色形成接触ゾーンへ導入される前にヒドリンダンチンが生成することは、有機溶媒を含有しないニンヒドリン試薬についてより高い感度が可能となることを意味する。
【００４０】
上述のように、加熱ゾーンを出るヒドリンダンチン含有混合物を接触ゾーン内で窒素含有化合物と接触させる。１種または複数のアミノ酸などの窒素含有化合物は、手順において任意の好都合な時点でシステムに導入することができるが、ただしこれは加熱ゾーンの下流にあるものとする。例えば、アミノ酸は、イオン交換カラムから、加熱ゾーンの下流で、接触ゾーンの上流にある場所に引き出され、ヒドリンダンチン含有混合物と混合されてもよい。次いでこの混合物は接触ゾーンに誘導される。代替の配置では、アミノ酸は、イオン交換カラムから直接接触ゾーンに引き出され、この中で活性化したヒドリンダンチン含有混合物と混合されてもよい。
【００４１】
加熱ゾーンを出たヒドリンダンチン含有混合物は、接触ゾーン内で、上で論じたような第２の温度で、窒素含有化合物と接触する。同様に、接触ゾーン内の第２の温度は、特に接触ゾーン内での色形成反応を最適化するために、本発明の方法で使用される温度依存性還元剤の濃度および活性、接触ゾーン内の滞留時間、ならびに窒素含有化合物の性質などの要因に従い異なってもよい。好ましくは、第２の温度は１００℃〜１６０℃、さらにより好ましくは１１５℃〜１４５℃、さらにより好ましくは１２０℃〜１３５℃の範囲内である。
【００４２】
接触ゾーン内の成分の滞留または滞留時間は、同様に、接触ゾーンの温度を含む上述の要因に従い異なってもよい。好ましくは、接触ゾーン内の滞留時間は、１０〜１００秒、より好ましくは２０〜８０秒、さらにより好ましくは３０〜６０秒の範囲である。
【００４３】
２つの加熱段階の滞留時間および温度を独立して制御する能力は、ヒドリンダンチン生成の改善された制御および色形成反応におけるその使用を提供する。特に、ずっと高い濃度のヒドリンダンチンを作ることができ、これによって、接触ゾーン内での成分の沈殿の危険が有意に減少し、またはなくなり、より速い色形成をもたらす。
【００４４】
上で論じたように、任意の温度依存性還元剤を本発明の方法に使用することができる。しかし、本発明の第２の態様によるニンヒドリン試薬が使用することがより好ましい。上述されている通り、加熱ゾーン内でのニンヒドリンの還元にいわゆる温度依存性還元剤を使用することは特に有利である。
【００４５】
したがって、第２の態様において本発明は、窒素含有化合物、特にアミノ酸などを分析するための方法における使用のためのニンヒドリン試薬であって、
ニンヒドリンと、
水性緩衝液と、
より低い温度でのニンヒドリンの還元に不活性であり、このより低い温度よりも高い温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元する活性のある温度依存性還元剤と
を含むニンヒドリン試薬を提供する。
【００４６】
本発明は、加熱ゾーン内で、ニンヒドリンが還元剤と接触してニンヒドリン試薬の形態となる、上述のニンヒドリン試薬を使用して窒素含有化合物を分析する方法であって、ニンヒドリン試薬が、
ニンヒドリンと
水性緩衝液と、
第１の温度でニンヒドリンの還元において不活性であり、第２の温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンへ還元する活性があり、この第２の温度が該第１の温度より高い、温度依存性還元剤と
を含み
ニンヒドリン試薬が加熱ゾーン内で少なくとも該第２の温度に加熱される方法をさらに提供する。
【００４７】
化合物は、第１の、より低い温度でニンヒドリンの還元において不活性であり、第２の、より高い温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元する活性がある場合、温度依存性還元剤とみなされる。この点において、「不活性」という用語は、より低い温度でのニンヒドリンの還元に関して使用される場合、最大活性以下の活性を有する化合物を指す。同様に、「活性のある」という用語は、より高い温度でのニンヒドリンの還元に関して使用される場合、以下にさらに詳細に考察されているように、最小活性以上の活性を有する化合物を指す。
【００４８】
ニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤の形成において使用するための化合物は、公知の還元剤の速度と同等の速度でニンヒドリンを還元することが可能な還元活性を有し得る。しかし、ニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤は、あまり活性がなく、商業的に利用されている還元剤の速度より遅い速度でニンヒドリンを還元することが好ましい。これは、還元反応の制御がさらに容易であるという利点を有する。
【００４９】
本発明において温度依存性還元剤としての使用に対して適切であるためには、所与の化合物は、ニンヒドリンの還元において活性があり、より高い温度で最小活性を示さなければならない。ある特定の化合物がより高い温度でニンヒドリンの還元において十分な活性を有するかどうか評価するために、プロトコル１が考案された。その詳細は実施例１において提供されている。プロトコル１の必要条件を満たす化合物は、より高いまたは閾値温度でのニンヒドリンからヒドリンダンチンへの還元において少なくとも最小活性を有するとみなされる。
【００５０】
プロトコル１の方法に従い、閾値温度（すなわち上述のより高い温度）において、化合物が最小程度の活性を有する、すなわち、特定された期間で、所与の量のニンヒドリンを還元することができる場合、化合物はニンヒドリンの還元において十分に活性があるとみなされる。このプロトコルにおいて、閾値温度は１００℃である。
【００５１】
プロトコル１に従い、ニンヒドリンおよびアミノ酸溶液、すなわちグリシンを、１００℃の閾値温度で選択された化合物の溶液と混合する。３５分後、（もしある場合）生成されたルーエマンパープルの強度を、標準的な分光光度計を使用して、特定された波長５７０ｎｍで溶液の吸収を測定することによって計算する。着色の強度が強いことは、選択された化合物が閾値温度において高度の活性を有することを示している。より好ましくは、選択された化合物が本発明のニンヒドリン試薬の一部を形成するために必要とされる最小程度の活性を有するかどうか評価するという目的のためには、０．２の最小吸光度が必要とされる。第２の温度でのニンヒドリンの還元における化合物の最小活性は、上述の試験において少なくとも０．２の吸光度が得られる活性である。約０．２未満の吸光度は、化合物が、本発明のニンヒドリン試薬に使用するためのニンヒドリンの還元において、より高い温度で十分に活性がないことを示す。より好ましくは、候補化合物により達成されるべき最小吸光度は少なくとも０．３である。
【００５２】
上記に加えて、本発明のニンヒドリン試薬において温度依存性還元剤を形成するのに使用する化合物は、第１の、より低い温度でのニンヒドリンの還元において不活性でなければならない。
【００５３】
化合物が不活性である必要があるより低い温度は、上述の閾値温度より低い。通常、このより低い温度とは、分析器内での使用前に、または一般的に窒素含有化合物を可視化するという目的のため、試薬が通常貯蔵され、および／または輸送される温度または温度の範囲である。現存するニンヒドリン試薬は通常室温以下で貯蔵される。したがって、より低い温度は好ましくは室温である。室温は通常外因により異なるので、第１の温度は好ましくは３０℃まで、さらにより好ましくは２５℃まで、さらにより好ましくは２０℃以下である。第１の温度は好ましくは０℃を超え、さらにより好ましくは５℃を超え、さらにより好ましくは１０℃を超える。一実施形態では、第１の温度は５℃〜２５℃である。さらにより好ましくは第１の温度は１０℃〜２０℃である。
【００５４】
より低い温度で不活性であると同定された化合物は、通常前記のより低い温度ではいかなる有意な還元作用も有さないとみなされるが、上述のより高い、閾値温度では十分に強い還元剤となり、ニンヒドリンと反応してヒドリンダンチンを形成する化合物を含む。加えて、より低い温度において不活性であると同定された温度依存性還元剤は、より低い温度では弱い還元活性（すなわち、上で定義された最大活性より低い活性）しか有さないことが公知であるが、より高い、閾値温度では十分に強い還元剤となり、ニンヒドリンと反応してヒドリンダンチンを形成する化合物を含む。
【００５５】
化合物がより低い温度で十分に不活性であるかどうか決定するために、プロトコル２が考案された。その詳細は実施例２において提供されている。プロトコル２は、実施例１に提供されるプロトコル１の前または後に実施することができる。より好ましくは、プロトコル１の後に実施されるプロトコル２を使用して、選択された化合物が、閾値またはより高い温度においてニンヒドリンの還元のために必要とされる最小程度の活性を有することを確証する。
【００５６】
プロトコル２の方法に従い、選択された化合物を含むニンヒドリン試薬を調製し、空気の存在下、より低い温度で貯蔵する。設定された時間間隔で、試料をニンヒドリン試薬から採取し、グリシンのアミノ酸溶液と混合し、上述のより高い、閾値温度に加熱する。実施例１において提供されたプロトコル１に関する継続性という目的のため、より高い温度は、上で論じたように好ましくは１００℃とする。（もしある場合）生成されたルーエマンパープルの強度は、標準的分光光度計を使用して溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定することによって計算する。連続する試料にわたり強度を測定すること、特に着色の強度における任意の低減の速度を決定することは、選択された化合物の長期安定性が本発明のニンヒドリン試薬に使用される化合物に対して適切であるかどうかを示す。
【００５７】
プロトコル２に従い、修正された吸光度が１カ月後に５０％未満に低下した場合、選択された化合物はより低い温度で十分に安定しておらず、したがって本発明のニンヒドリン試薬における温度依存性還元剤としての使用に対して適切ではないとみなされる。すなわち、本発明のニンヒドリン試薬における温度依存性還元剤の形成における使用に対して適切な化合物は、１カ月後にこれらの初期活性の少なくとも５０％の活性を有する。より好ましくは、選択された化合物は、修正された吸光度が３カ月後に５０％以上である場合、さらにより好ましくは修正された吸光度が６カ月後に５０％以上である場合、本発明のニンヒドリン試薬における使用に対して適切であるとみなされる。特に好ましい化合物とは、バッチ安定性試験において修正された吸光度が１２カ月後に少なくとも５０％、さらにより好ましくは、修正された吸光度が２４カ月後に初期の吸光度の少なくとも５０％であるような化合物である。
【００５８】
上記に設定した特性を有し、実施例１のプロトコル１の必要条件を満たすことができ、実施例２のプロトコル２の必要条件を満たすまたは超える化合物が、ニンヒドリン試薬における使用に対して最も有利であることが判明した。上述のように、実施例１と２の両方に提供された方法を使用して、一連の化合物は、第１の、より低い温度で十分に安定しており、その一方で本発明のニンヒドリン試薬における使用に対して第２の、より高い温度で必要とされる最小程度の活性も有することが判明した。これらの化合物は、より高い温度におけるこれらの活性の程度により異なり得るが、これらはすべて、本発明のニンヒドリン試薬における使用に対して必要とされる最小程度の活性を有する。
【００５９】
示されている通り、実施例１のプロトコル１および実施例２のプロトコル２を使用して、本発明のニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤としての使用に対するこれらの適性について、一連の化合物をスクリーニングした。ニンヒドリン試薬は単一の温度依存性還元剤を含んでもよい。代わりに、試薬は、２種以上の温度依存性還元剤の組合せを含んでもよい。
【００６０】
本発明のニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤としての使用に対して適切な化合物は、当技術分野で公知であり、市販されている。
【００６１】
一実施形態では、温度依存性還元剤は１種または複数の糖を含む。多くの糖は、軽度の還元特性を有し、時には還元糖と呼ばれる。還元糖は、その開環形態でアルデヒド基またはケトン基を生成する、その環状形態でヘミアセタール基またはヘミケタール基を含有するものとして定義することができる。すべての単糖および多くの二糖は還元糖である。
【００６２】
好ましい単糖として、グルコースおよびフルクトースが挙げられ、これらは、これらの環状形態において、ヘミアセタール基およびヘミケタール基をそれぞれ有する。グルコースおよびフルクトースは、上述のプロトコル１およびプロトコル２に供された場合、両方とも、より高い、閾値温度で十分な還元活性を有するが、その一方で空気の存在下、より低い温度で安定したままであることが判明した。
【００６３】
フルクトースは、室温で約３年の貯蔵寿命を有することが判明した。グルコースは、より高い温度でのニンヒドリンの還元においてあまり反応性はないが、室温で４年より長い貯蔵寿命を有し、フルクトースよりもさらに安定していることが判明した。したがって、より長い貯蔵寿命が必要とされる場合、本発明のニンヒドリン試薬は好ましくはグルコースを含む。
【００６４】
温度依存性還元剤としての使用に対して適切な他の単糖として、アルドース化合物、例えば、グリセルアルデヒド、ガラクトース、リボース、キシロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アラビノース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、タロースおよびＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、ならびにケトース化合物、例えば、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、ソルボース、タガトースおよびセドヘプツロース（Ｓｅｄｏｈｅｐｔａｌｏｓｅ）が挙げられる。
【００６５】
一般的に、二糖および多糖は、標準的なアミノ酸分析器で使用した場合、適切な温度依存性還元剤を形成するのに必要とされる特性を有さない。しかし、本発明の第１の態様の方法に従い使用した場合、非還元二糖であるスクロースは、試験プロトコルに従い評価した場合に、ニンヒドリンからヒドリンダンチンへの還元において十分な活性があることが判明した。スクロースと同様に大部分の他の非還元糖もまた、現在ニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元する十分な活性がある。一般的にこれらの極めて弱い温度依存性還元剤は、実施例１に記載されているプロトコル１をパスするためにより高い濃度を必要とする。
【００６６】
これらの環状形態でヘミアセタール基またはヘミケタール基を含むかなりの数の二糖および多糖が存在する。これらの種類の糖は、プロトコル１およびプロトコル２で定義されているような温度依存性還元剤として作用することが特に可能であると判明した。二糖であるラクトースおよびマルトースは、このような２つの例である。
【００６７】
本発明の方法において温度依存性還元剤として作用することが可能な他の二糖の非網羅的リストには、トレハロース（Ｔｒｉｈａｌｏｓｅ）、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノースおよびキシロビオースが挙げられる。
【００６８】
より長鎖の多糖は還元糖であることができる。テトラサッカロースである、スタキオースは一例である。より長鎖の多糖、例えば、デンプンは、還元単位が少なすぎて適切ではないが、部分的に加水分解されたデンプン、例えば、デキストリンおよびマルトデキストリンは有意な還元作用を有する。しかし、これらの長鎖の多糖では、より高い粘性の溶液および起こり得る沈殿問題が生じ得る。
【００６９】
代替の実施形態では、温度依存性還元剤は１種または複数のカルボン酸および／またはこれらの塩を含み得る。一般的に、単一のカルボン酸基だけで、他の官能基を含まない単純な単官能性カルボン酸は、プロトコル１およびプロトコル２に従い温度依存性還元剤として作用することが不可能であることが判明した。このような単官能性カルボン酸として、酢酸、プロピオン酸、および安息香酸が挙げられる。しかし、ギ酸およびその塩は、上述のプロトコル１およびプロトコル２に従い温度依存性還元剤として作用することが可能であることが判明した。
【００７０】
カルボン酸の適切な塩として、金属塩、例えば、周期表のＩ族またはＩＩ族の金属の塩が挙げられる。適切な塩の例として、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩が挙げられる。
【００７１】
ギ酸のナトリウム塩であるギ酸ナトリウムは、プロトコル２およびプロトコル１にそれぞれに従い、第１の、より低い温度でニンヒドリンの還元において十分に不活性であり、第２の、より高い温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元する活性があることが判明した。特に、ギ酸ナトリウムは、グルコースとフルクトースとの間の還元活性を有することが判明した。さらに、貯蔵寿命は、４年を超える貯蔵寿命を有するグルコースの貯蔵寿命と同様であった。
【００７２】
本発明による温度依存性還元剤としての使用に対して適切な他のカルボン酸および／またはこれらの塩は、少なくとも１種の追加の還元基、例えば、ヒドロキシル基、ケトン基またはアルデヒド基のうちの１種または複数を含むものである。例えば、ヒドロキシカルボン酸であるクエン酸は、本発明の条件下、温度依存性還元剤として作用することが判明した。他のヒドロキシカルボン酸、例えば、酒石酸は同じように作用することが判明した。
【００７３】
好ましいカルボン酸は、１〜２４個の炭素原子、より好ましくは１〜１８個の炭素原子、さらにより好ましくは１〜１２個を有し、Ｃ１〜Ｃ６アルデヒドおよびケトンがとりわけ好ましい。化合物は、直鎖、分枝または環状であってよい。
【００７４】
ヒドロキシル基（単純なアルデヒドおよびケトン自体を含む）が存在するか、または存在しないアルデヒド基およびケトン基を含む他の化合物は、プロトコル１およびプロトコル２の必要条件を満たすことが判明している。この種類の好ましい化合物は、１〜２４個の炭素原子、より好ましくは１〜１８個の炭素原子、さらにより好ましくは１〜１２個を有し、Ｃ１〜Ｃ６アルデヒドおよびケトンがとりわけ好ましい。化合物は直鎖、分枝または環状であってよい。適切なアルデヒドおよびケトンの例としてアセトンが挙げられる。
【００７５】
同様に、１種または複数のヒドロキシル基を含有するアルコールは、本発明の温度依存性還元剤を形成するのに適切であることが判明した。好ましいアルコールは、１〜１２個の炭素原子、より好ましくは１〜８個、さらにより好ましくは１〜６個の炭素原子を有し、Ｃ１〜Ｃ４アルコールがとりわけ好ましい。アルコールは直鎖または分枝であってよい。使用に対して適切な一価アルコールとして、メタノール、エタノールおよびプロパノールが挙げられる。適切な多価アルコールとして、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、マンニトールおよびソルビトールが挙げられる。エチレングリコールは、本発明に従い使用した場合、ニンヒドリンの還元において比較的低い程度の活性を有することが判明し、したがって比較的高濃度で存在する必要がある。しかし、エチレングリコールは空気の存在下で極めて安定しており、４年より長い貯蔵寿命を有することが判明した。
【００７６】
さらに、エチレングリコールは有機溶媒としておよび、還元剤としての両方で機能し得ることが利点である。いくつかの上記化合物はヒドリンダンチンの溶解性を維持し、貯蔵中または分析中のいずれかにおいて沈殿を防止するという目的のためだけにニンヒドリン試薬中で有機溶媒としてすでに使用されていることに注目されたい。これは本発明の新規性を強調するもので、２段階の加熱システムにより、溶解性と高温でのヒドリンダンチン生成の両方のためにこれらの有機溶媒を使用することが現在可能となり得る。
【００７７】
ヒドロキシル基およびエーテル基を含有する他の有機溶媒は、本発明の温度依存性還元剤を形成するのに適切である。好ましい化合物は、１〜１２個の炭素原子、より好ましくは１〜８個、さらにより好ましくは１〜６個の炭素原子を有し、Ｃ１〜Ｃ４化合物がとりわけ好ましい。適切な化合物の例は、メトキシエタノール、プロピレングリコールモノメチルエーテルおよびカルビトールである。またさらに、低い酸化状態の硫黄を含有する有機溶媒、例えば、ジメチルスルホキシドおよびスルホランをニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤として使用することができる。
【００７８】
本発明の方法において使用される温度依存性還元剤はまた１種または複数の無機化合物を含んでもよいが、ただし、これらもまたプロトコル１およびプロトコル２の必要条件を満たすものとする。特に、低い酸化状態の硫黄を含む無機化合物、例えば、亜硫酸塩およびチオ硫酸塩、ならびに／または低い酸化状態のリン酸素酸を含む無機化合物、例えば、亜リン酸塩および次亜リン酸塩が特に適切となり得る。例えば、リチウム、ナトリウムおよびカリウムの塩などの、その亜リン酸塩を含む亜リン酸は、フルクトースおよびギ酸ナトリウムの間の活性を有し、プロトコル１およびプロトコル２の両方をパスすることが判明した。
【００７９】
本発明のニンヒドリン試薬における使用のための温度依存性還元剤は一般的に当技術分野で公知であり、市販されているかまたは公知の合成経路と類似の方式で調製することができるかのいずれかである。
【００８０】
上記に同定されていない他の化合物または他のクラスの化合物は、本発明のニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤としての使用に対して適切な成分となり得るが、これは、プロトコル１とプロトコル２の両方の必要条件を満たすという条件下であることを理解されたい。一般的に、プロトコル１およびプロトコル２の必要条件を満たすことに加えて、温度依存性還元剤は、水に容易に可溶性または混和性であるべきであり、試薬の他の成分および／または分析方法において使用されたまたは生成された成分と合わせた場合に、沈殿を引き起こすべきではない。温度依存性還元剤が実質的に無毒性であることもまた有利である。
【００８１】
上記を考慮して、ニンヒドリン試薬は、任意の適切な濃度で温度依存性還元剤を含むことができる。これは、利用する温度依存性還元剤により、特により高い温度における活性の程度などの要因により異なる。温度依存性還元剤の濃度は０．０１％〜７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖの範囲内であってよい。より好ましくは、温度依存性還元剤の濃度は０．０１％〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである。２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖより高い濃度では、試薬の成分が溶液から沈殿するまたは溶液から他の成分の沈殿を引き起こす可能性がさらに高くなり、したがって２０％未満の濃度が好ましいことが判明した。
【００８２】
有利なことには、本発明の方法において使用される加熱ゾーンは、温度依存性還元剤として広範囲な化合物の使用を可能にする。これらの化合物はこれらの組成および還元活性の点からかなり有意に異なり得る。驚くことに、極めて弱い還元活性を有する化合物は、本発明の方法において温度依存性還元剤として使用するのに特に適していることが判明した。
【００８３】
一般的に、最も活性のある温度依存性還元剤、例えば、還元糖、ギ酸および亜リン酸は、０．０１〜５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖの濃度を必要とする。中間の活性化合物、例えば、非還元糖およびクエン酸は、５〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖの濃度を必要とする。最後に、最も弱い化合物、例えば、有機溶媒メタノールおよびエチレングリコールは、２０〜７５％ｖ／ｖの濃度を必要とする。全ての場合において、調査中の化合物の高すぎる濃度は、溶液からの成分の沈殿を引き起こし得ることに注意されたい。代わりにまたは加えて、これは不正確な測定につながるいくつかの他の有害作用を引き起こすこともある。
【００８４】
分析法における使用のためのニンヒドリン試薬を調製する場合、温度依存性還元剤の開始濃度は、この濃度が少なくとも０．２の実際の吸光度、より好ましくは０．２〜０．７の吸光度の提供に関与するので、実施例１により提供されるプロトコル１で同定された濃度と同様であることが好ましい。より好ましくは、毎回温度依存性還元剤のパーセンテージ濃度を増加させて、実施例１に従いプロトコル１を数回繰り返した結果、溶液からの沈殿を起こさず、またはニンヒドリン試薬の他の成分に悪影響を及ぼすことのない、０．６〜０．７の間の最も高い吸光度を提供する濃度を開始濃度として使用する。
【００８５】
本発明のニンヒドリン試薬は、ニンヒドリンおよび水性緩衝液をさらに含む。ニンヒドリンおよび適切な水性緩衝液は両方とも市販されており、現存するニンヒドリン試薬における使用が公知である。
【００８６】
本発明のニンヒドリン試薬は、ニンヒドリンを任意の適切な量で含んでもよい。好ましくは、試薬中のニンヒドリンの濃度は０．５〜３％ｗ／ｖである。より好ましくは、ニンヒドリンの濃度は１〜２．５％ｗ／ｖである。さらにより好ましくは、および実施例１によるプロトコル１毎に、試薬中のニンヒドリンの濃度は約２％ｗ／ｖである。
【００８７】
任意の適切な水性緩衝液をニンヒドリン試薬において使用することができる。適切な緩衝液は当技術分野で公知である。酸性緩衝液が好ましい。より好ましくは、弱酸性緩衝液は、ｐＨを３〜７、より好ましくは４〜６、さらにより好ましくは４．５〜５．５の間の値に維持するようにすることが好ましい。ある特定の適切なｐＨは５．２と５．３の間である。
【００８８】
緩衝液は、任意の弱酸およびその共役塩基／塩のうちの１種から調製されてもよい。酸は、有機酸または無機酸であってよい。有機酸が好ましく、その例として、酢酸、エタン酸およびプロパン酸が挙げられる。１つの好ましい組合せは酢酸とその塩の１種である。酸性塩は、任意の適切な塩であってよい。塩は、任意の金属カチオンから形成することもできる。しかし、塩は、アルカリ金属、特にリチウム、ナトリウムまたはカリウムのうちのいずれか１種から形成されるのが好ましい。
【００８９】
上述のように、ヒドリンダンチンは完全な水性媒体に不溶性である。これを考慮すると、ヒドリンダンチンを含む市販のニンヒドリン試薬は、相当量の有機溶媒の存在なしには製造または使用することができない。しかし、本発明の第１の態様の方法で使用した場合、本発明の第２の態様のニンヒドリン試薬は、有機溶媒または有機溶媒の混合物を含む必要がないことが本発明の利点である。これは、温度依存性還元剤は水溶液中で可溶性であるという事実、および予熱器が使用されるという事実による。予熱器の使用は、高い感度を依然として維持し、よって沈殿の可能性は極めて低い一方で、より低いレベルのヒドリンダンチンの生成を可能にする。その結果、製造費用は減少し、試薬は環境に対する悪影響が少なく、廃棄処理手順は単純化される。
【００９０】
ニンヒドリン試薬中の有機溶媒の存在は試薬の効力に影響を及ぼす可能性がある。しかし、有機溶媒を含まない本発明のいくつかの実施形態の試薬の感度は、有機溶媒または有機溶媒の混合物を含む市販の試薬よりも約１０％しか低くないことが判明した。加えて、有機溶媒の不在下で、予熱器を用いれば、沈殿リスクはずっと低くなる。
【００９１】
上記にもかかわらず、本発明の試薬は、有機溶媒を含まずに製剤化された場合、アミノ酸分析のために使用された場合に少なくとも許容される結果が得られる。加えて、プロトコル１およびプロトコル２による温度依存性還元剤の濃度の最適化によって、沈殿のリスクはさらに最小限に抑えられる。
【００９２】
代替のおよび好ましい実施形態では、本発明のニンヒドリン試薬は、有機溶媒または有機溶媒の混合物をさらに含む。市販の試薬に通常使用されている有機溶媒として、単独または混合物のいずれかでの、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、スルホラン、ヒドロキシエーテル、例えば、カルビトール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、およびメチルセロソルブ、ならびに単純アルコール、例えば、メタノールが挙げられる。有機溶媒の添加は、本発明のニンヒドリン試薬の感度を増加させる。これは、以下においてさらに詳細に考察されているように、クロマトグラフィーシステム上で好ましいニンヒドリン試薬を使用する場合に考慮に入れるべきである。
【００９３】
使用される有機溶媒の総濃度は、有機溶媒の性質により異なる。特に、使用される有機溶媒の総濃度は１０％ｖ／ｖから７５％ｖ／ｖまで異なる。より好ましくは、使用される有機溶媒の総濃度は、２５％ｖ／ｖから６５％ｖ／ｖまで異なる。さらにより好ましくは、使用される有機溶媒の総濃度は、３５％ｖ／ｖから５５％ｖ／ｖまで異なる。上記の市販の有機溶媒のいずれも使用することができるが、以下に示すクロマトグラフィー実施例に従い、本発明の方法は、好ましくは４０％ｖ／ｖから５５％ｖ／ｖまでのエチレングリコールを利用する。
【００９４】
ニンヒドリン試薬に１種または複数の有機溶媒を含めることは当技術分野で公知である。ニンヒドリン試薬において以前に使用され、溶媒としての使用が公知である化合物は、本発明の第１の態様の方法に従い使用した場合、温度依存性還元剤として活性があることがここで判明した。例えば、ニンヒドリンのための溶媒として公知であり、商業的に使用されているエチレングリコールは、本発明の方法で使用した場合、温度依存性還元剤として活性があることが現在判明している。
【００９５】
したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明の第１の態様の方法でニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元するための、本明細書中で以前に定義されたような温度依存性還元剤の使用を提供する。特に、温度依存性還元剤は、上述の有機溶媒のうちの１種または複数を含む。
【００９６】
上述のように、一連の温度依存性還元剤が、プロトコル１およびプロトコル２を使用して、第１の温度で不活性であり、第２の閾値温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元する活性のあるものとして同定された。プロトコル１、プロトコル２および本発明の実施形態が、ここで、以下の実施例において記載される。
【実施例】
【００９７】
（実施例１）
プロトコル１
本発明のプロトコル１は以下のステップで構成される；
１）以下の溶液を調製する：
ｉ）２％ニンヒドリンｗ／ｖおよび選ばれた開始濃度（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の化合物Ｘを含有する、ｐＨ５．２と５．３の間の、１Ｍの酢酸リチウム、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウム／酢酸の水性緩衝液。０．０１％ｗ／ｖまたはｖ／ｖから開始して、ステージごとに濃度を徐々に増加させることが好ましい。高濃度の水溶性の固体または液体、特に約５０％およびそれ超のものは、調製後または分析システムで使用する場合、溶解性の問題または他の有害作用により評価するのが困難なこともある。
ｉｉ）純水中、１．０ｍＭ濃度のグリシンの標準液。以前に考察されたように、グリシンは標準的な基準アミノ酸として選ばれている。
２）長さがおよそ１５ｃｍ、外部直径が１．５ｃｍあるガラス試験管に、上記溶液ｉ）２．０ｍｌ、標準グリシン溶液ｉｉ）０．２０ｍｌ、純水２．８ｍｌを添加する。
３）試験管を１００℃の液体加熱槽に配置し、３５分間静かに放置する。試験管を取り出し、室温まで急速に冷却する。
４）冷却した溶液を１ｃｍキュベットに移し、標準的な分光光度計または比色計を使用して、純水に対して５７０ｎｍで吸光度を測定する。
５）活性について化合物を評価するのと同時に、試薬中にアミノ酸またはアミン不純物が存在する場合に備えて、ブランク試料も実施するべきである。手順は、グリシン標準物質を除外し、純水の量を３．０ｍｌに増加させること以外は上記の２）における手順と同一である。次いで吸光度を上記４）の通りに５７０ｎｍで測定する。
６）評価中の化合物により生成された実際の吸光度（これより以下、修正された吸光度と呼ぶ）は、グリシンの標準吸光度からブランク試料の吸光度を差し引くことによって得られる。
【００９８】
化合物Ｘの活性の程度は不明なので、上記プロトコルの方法は、毎回化合物Ｘの濃度を徐々に増加させて、数回繰り返すことが好ましい。化合物Ｘの濃度は、修正された吸光度が０．６〜０．７の間に入るまで増加させるものとする。グリシンを対照として使用した場合、可能な限りの修正された最大吸光度は０．７５〜０．８０の間であり、よって、０．６〜０．７の修正された吸光度が達成された場合、化合物の濃度をそれ以上増加させても、必ずしもこのプロトコル評価において利点は得られない。
【００９９】
修正された吸光度が決して０．２を超えない場合、これは、化合物Ｘが本発明のニンヒドリン試薬における使用のために必要とされる活性の程度を有していないことを示す。
【０１００】
修正された吸光度は０．２未満に入るが、化合物Ｘの濃度の増加が溶液からの沈殿を引き起こす場合、またはいくつかの他の有害作用を引き起こす場合、これは、化合物Ｘが本発明のニンヒドリン試薬における使用のために必要とされる特性を有していないことを示す。
（実施例２）
プロトコル２
【０１０１】
化合物Ｘが、高温で、上記実施例１で設定されたプロトコル１の必要条件を満たすのに十分な活性があることを前提として、以下のプロトコルを使用して、室温でおよび空気の存在下で、化合物Ｘを含むニンヒドリン試薬の長期安定性を評価することができる。
【０１０２】
ニンヒドリン試薬は、実施例１のプロトコル１と同様の方式で調製し、空気の存在下、室温で貯蔵する。設定された時間の間隔で、ニンヒドリン試薬から試料を採取し、アミノ酸溶液と混合し、設定された時間の間１００℃に加熱する。（もしある場合）生成されたルーエマンパープルの量を吸光度値として測定する。連続する試料における着色（吸光度）の強度が低減する率は、化合物Ｘの長期安定性が、本発明のニンヒドリン試薬の一部を形成するのに適当であるかどうかを示している。
【０１０３】
他のアミノ酸およびアミン化合物の相対的感度はどの試薬が使用されたとしても同様であるため、プロトコル１の通り、グリシンを標準アミノ酸として使用する。
【０１０４】
本発明のプロトコル２は、以下のステップで構成される；
１）第１日目に以下の溶液を調製する：
ｉ）グリシンの１．０ｍＭの水中標準溶液。
ｉｉ）２％ｗ／ｖニンヒドリンおよび選ばれた濃度（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の化合物Ｘを含有する、ｐＨ５．２〜５．３の間の、１Ｍの酢酸リチウム、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウム／酢酸水性緩衝液を含むニンヒドリン試薬。化合物Ｘの濃度は、０．２〜０．７の間の修正された吸光度が達成される濃度としてプロトコル１において同定された濃度と同様であるのが好ましい。しかし、吸光度がこれら２つの数字の間に入っている限り、この試験は経時的に色の相対的な低減を測定するので、Ｘの実際の開始濃度は重要ではない。安定性試験を全期間持続させるためには、少なくとも２５０ｍｌの試薬が調製されるべきである。
２）第１日目に、標準の試験管に、ニンヒドリン試薬（ｉｉ）２．０ｍｌ、グリシン標準物質（ｉ）０．２０ｍｌおよび純水２．８ｍｌを逐次的に添加する。混合し、１００℃の液体加熱槽内に試験管を配置し、３５分間静かに放置する。試験管を取り出し、室温まで急速に冷却する。１ｃｍの経路長を有するフローセルを使用して、純水に対して５７０ｎｍで、分光光度計内で試験管溶液の吸光度を測定する。
３）第１日目に、試薬（ｉｉ）２．０ｍｌおよび純水３．０ｍｌを含むブランク試験管試料を調製する。これは、試薬を構成するために使用される成分中に存在し得る任意のアミノ酸またはアミンタイプの不純物を考慮に入れたものである。混合し、ブランク試験管を１００℃の加熱槽内に配置し、静かに３５分間放置する。試験管を取り出し、室温まで急速に冷却する。１ｃｍの経路長を有するフローセルを使用して、純水に対して５７０ｎｍで、分光光度計内で試験管溶液の吸光度を測定する。
４）第１日目に、化合物Ｘにより生成された、修正された吸光度を計算する。これは、実施例１のプロトコル１に記載されているように、グリシン試料吸光度からブランク試料の吸光度を差し引くことによって得られる。
５）第１日目に、ステップ１〜４が完了した後、暗所で、２０℃で、栓をしたビンの中で試薬を貯蔵し、空気に曝露する。これは、ビンの中に試薬とほぼ同一の体積の大きな空隙を残すことで達成される。
６）２〜４週間ごとに、試薬の試料を取り出し、ステップ２および３を繰り返す。毎回、ステップ４の通りに５７０ｎｍでの修正された吸光度を計算し、これを、第１日目に測定したものと比較する。
【０１０５】
（実施例３）
選択されたクロマトグラフィー実施例
上で論じたように、本発明の第２の態様に関して、プロトコル１および２を使用して、広範囲な温度依存性還元剤が、第１の温度でニンヒドリンからヒドリンダンチンへの還元において十分に不活性であり、第２の閾値温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元する際に十分な活性があると同定された。さらに、この広い範囲の温度依存性還元剤は、これらの還元活性の点からかなり有意に異なり、これらのすべては、本発明の第１の態様の方法による使用に特に適している。
【０１０６】
標準的アミノ酸分析器（商業的に生産されたものまたは市販の機器と同一の配置に基づくもののいずれか）上で標準アミノ酸としてグリシンを使用して、種々の温度依存性還元剤を含むいくつかのニンヒドリン試薬の相対的な感度が評価されてきた。加熱システムは本発明の第１の態様において上で論じたように２段階加熱の配置を含むように改変されている。これらのクロマトグラフィー実施例においてグリシンを分析するために使用された２段階加熱システムは、図１を考慮して以下にさらに詳細に記載されている。
【０１０７】
ヒドリンダンチンを含む市販のニンヒドリン試薬の溶解性を維持するために使用されるいくつかの有機溶媒は、本発明の方法に従い使用した場合、適切な温度依存性還元剤であることが判明した。同定された有機溶媒は、適切な温度依存性還元剤とみなされた他の化合物の大部分と比較して還元活性は比較的弱いが、必要とされる最小程度の還元活性を有することが判明した。したがって、本発明の方法による使用中により高い濃度および反応温度が必要となることが予想された。代わりに、反応条件を最適化するために、温度依存性の還元特性を有する有機溶媒と、低濃度の、より強い温度依存性の還元特性を有する化合物の組合せを利用することもできる。
【０１０８】
有機溶媒（複数可）を含有しないニンヒドリン試薬は、本発明の方法に従い使用した場合ちょうど効果的に働くことがさらに判明した。序文において考察されたように、このようなニンヒドリン試薬は、２段階加熱システムを含む本発明の方法に従い使用した場合、有機溶媒を含む試薬の感度に近い感度を提供することができる。
【０１０９】
以下のクロマトグラフィー実施例は、以下のいずれかのニンヒドリン試薬の感度を示す：有機溶媒の存在下で本発明による温度依存性還元剤を含むもの；有機溶媒の不在下で本発明による温度依存性還元剤を含むもの、または有機溶媒以外の活性化合物を含まないもの。さらに、加熱ゾーンにおける滞留時間を変化させて、相対的感度に対する効果を示す。異なる実施例に対する相対的感度は、保持時間として正確に比較することができ、半値幅はすべての実施例に対して一定である。
【０１１０】
プロトコル１を満たす化合物Ｘの濃度は、厳密には分析機器上で最適の性能が得られる濃度ではない可能性があることも指摘すべきである。プロトコル１は、自動化アミノ酸分析器などの機器での使用に対して適切である化合物Ｘの活性の定量的尺度を提供するにすぎない。化合物Ｘの混合物もまた、化合物Ｘのうちの１つが有機溶媒である以下の実施例に示されているように使用することができる。したがって、試験プロトコルにより提供される濃度（単数または複数）は、分析システム上で必要とされる感度を最適化するためのガイドとして使用されるものにすぎず、したがって反応時間および温度と共に異なってもよい。これらの実施例における溶媒の実際の寄与は、その濃度、予熱時間および予熱温度ならびに色形成段階に依存する。わかりやすく述べると、予熱および色形成段階の温度は以下の実施例において同一である。しかし、反応の温度および滞留時間を個々に変化させることは、２段階加熱システムの範囲および汎用性を有意に増加させることを理解されたい。
機器の条件：
【０１１１】
本発明の方法を実行するためのシステムの一実施形態が図１において示されている。
【０１１２】
図１を参照すると、本発明の方法を実行するためのアミノ酸分析器が示されており、これは２として全般的に示されている。このアミノ酸分析器２には、アミノ酸試料をその構成成分の成分に分離するための手段が示されていない。しかし、上で論じたように、アミノ酸を分離するための様々な公知の技法を利用することができる。アミノ酸分析器２は、加熱ゾーン４と接触ゾーン６を含み、それぞれが１種または複数の加熱した反応コイル７からなる。加熱ゾーン４および接触ゾーン６は本発明の好ましい実施形態に従い配置され、この中で加熱ゾーン４は接触ゾーン６のものとは別のチャンバーまたはベッセル内に含有され、接触ゾーン６の上流に位置する。代替の配置では、加熱ゾーン４および接触ゾーン６は、単一のチャンバーまたはベッセル内にあってもよく、加熱ゾーン４はチャンバーまたはベッセルの上流領域を含み、接触ゾーン６はチャンバーまたはベッセルの下流の領域を含む。
【０１１３】
アミノ酸分析器２は第１の供給ライン８をさらに含む。第１の供給ライン８は加熱ゾーン４の上流にあり、本発明のニンヒドリン試薬成分をアミノ酸分析器２に送達するために使用される。本実施形態では、ニンヒドリン試薬成分は混合物として一緒に加熱ゾーン４に送達される。加熱ゾーン４は、所定の期間の間、本発明のニンヒドリン試薬を高温に加熱し、これが試薬の加熱ゾーン４内の滞留時間である。次いで、ヒドリンダンチンを含むニンヒドリン試薬である活性化したニンヒドリン試薬は接触ゾーン６に送達される。
【０１１４】
アミノ酸分析器２は第２の供給ライン１０をさらに含む。第２の供給ライン１０は、クロマトグラフィーカラムからアミノ酸分析器２へ窒素含有化合物（実施例３の場合、これはグリシンである）を送達する。第２の供給ライン１０は、加熱ゾーン４の下流にあり、接触ゾーン６の上流にある、１２として示された箇所に、窒素含有化合物を送達する。１４として示された代替の実施形態では、第２のインプット１０は、窒素含有化合物を直接接触ゾーン６に送達する。
【０１１５】
接触ゾーン６は、既定の期間の間、活性化したニンヒドリン試薬および窒素含有化合物を高温に加熱する。反応生成物は、光度計１６に送達され、そこで、窒素含有化合物の濃度および特徴が検出される。
【０１１６】
上に記載のように、加熱ゾーンは、ニンヒドリン試薬が分離カラム流出液と混合され、接触ゾーンに入る前に、ニンヒドリン試薬のみを予熱する。したがって、ヒドリンダンチンは混合が生じる前に生成される。以下に提示された結果が示すように、接触ゾーン内の反応時間は、クロマトグラフィー性能に対して効果がない。
【０１１７】
機器の条件
クロマトグラフィーモード−均一濃度
カラム流量−０．４５ｍｌ／分
ニンヒドリン試薬の流量−０．３０ｍｌ／分
予熱チャンバーの温度−使用される化合物の活性に応じて１２５〜１３５℃の間で可変
加熱した色形成反応チャンバーの温度−すべての実施例に対して予熱チャンバーと同じ
予熱器の反応時間−３０または６０秒
色形成ヒーターの反応時間−６０秒
注入量−２０μｌ
注入したグリシンの量−２ナノモル
保持時間−５．０分
０．２６分の半値幅
感度スケール−１ｍＡＵは吸光度０．００１と同等
試薬の条件
【０１１８】
ｐＨ５．２に調整した、２％ｗ／ｖニンヒドリンを含有する１Ｍの酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（リチウムまたはカリウムベースの緩衝液もまた使用可能）。温度依存性還元剤（単数または複数）の濃度については、具体的実施例を参照されたい。
３０秒の予熱時間および６０秒の加熱した発色反応時間を用いた実施例
【０１１９】
実施例１および２に示されているように、エチレングリコールは、３０秒予熱した場合、温度依存性還元剤として機能しない。したがって、これらの実施例において、エチレングリコールは有機溶媒としてのみ作用する。
（実施例１）
【０１２０】
温度依存性還元剤として１％ｗ／ｖギ酸ナトリウムと４０％エチレングリコールとを含むニンヒドリン試薬の感度を本発明の方法に従い評価した。
【０１２１】
ニンヒドリン試薬を加熱ゾーン内で３０秒間予熱し、接触ゾーン内で６０秒間溶離液と反応させた。加熱ゾーンと接触ゾーンの両方の反応温度を１２８℃に設定した。
【０１２２】
上記の条件を使用して、ピーク高さ１５３ｍＡＵを観察した。
（実施例２）
【０１２３】
温度依存性還元剤として２％ｗ／ｖグルコースと４０％エチレングリコールとを含むニンヒドリン試薬の感度を本発明の方法に従い評価した。
【０１２４】
ニンヒドリン試薬を加熱ゾーン内で３０秒間予熱し、接触ゾーン内で６０秒間溶離液と反応させた。加熱ゾーンと接触ゾーンの両方の反応温度を１３０℃に設定した。
【０１２５】
上記条件を使用して、ピーク高さ１５０ｍＡＵを観察した。
（実施例３）
【０１２６】
温度依存性還元剤として２％ｗ／ｖグルコースを含み、有機溶媒を含まないニンヒドリン試薬の感度を本発明の方法に従い評価した。
【０１２７】
ニンヒドリン試薬を加熱ゾーン内で３０秒間予熱し、接触ゾーン内で６０秒間溶離液と反応させた。加熱ゾーンと接触ゾーンの両方の反応温度を１３０℃に設定した。
【０１２８】
上記条件を使用して、ピーク高さ１４０ｍＡＵを観察した。
６０秒の予熱時間および６０秒の加熱発色反応時間を用いた実施例
【０１２９】
実施例４および６に示されているように、エチレングリコールは、６０秒間予熱した場合、温度依存性還元剤として作用することが可能である。これらの実施例では、エチレングリコールは有機溶媒としても機能する。
（実施例４）
【０１３０】
温度依存性還元剤として１％ｗ／ｖグルコースと４０％エチレングリコールとを含むニンヒドリン試薬の感度を本発明の方法に従い評価した。
【０１３１】
ニンヒドリン試薬を加熱ゾーン内で６０秒間予熱し、接触ゾーン内で６０秒間溶離液と反応させた。加熱ゾーンと接触ゾーンの両方の反応温度を１３２℃に設定した。
【０１３２】
上記条件を使用して、ピーク高さ１４０ｍＡＵを観察した。
（実施例５）
【０１３３】
温度依存性還元剤として０．２％ｗ／ｖグルコースを含み、有機溶媒を含まないニンヒドリン試薬の感度を本発明の方法に従い評価した。
【０１３４】
ニンヒドリン試薬を加熱ゾーン内で６０秒間予熱し、接触ゾーン内で６０秒間溶離液と反応させた。加熱ゾーンと接触ゾーンの両方の反応温度を１３４℃に設定した。
【０１３５】
上記条件を使用して、ピーク高さ１２９ｍＡＵを観察した。
（実施例６）
【０１３６】
５０％のエチレングリコールを含み、他の温度依存性還元剤を含まないニンヒドリン試薬の感度を本発明の方法に従い評価した。
【０１３７】
ニンヒドリン試薬を加熱ゾーン内で６０秒間予熱し、接触ゾーン内で６０秒間溶離液と反応させた。加熱ゾーンと接触ゾーンの両方の反応温度を１３４℃に設定した。
【０１３８】
上記条件を使用して、ピーク高さ１３３ｍＡＵを観察した。
要約
【０１３９】
上記のクロマトグラフィー実施例は、本発明の方法が、使用することができる温度依存性還元剤の数の点から、追加の汎用性および範囲を提供することを示している。加えて、ある場合には、より低い濃度の温度依存性還元剤および／またはより低い反応温度を用いて、より高い感度が達成できる。３０秒の予熱コイルを考慮した場合、同様の条件下で、１段階加熱システムと比較すると、感度の増加は直ちに明らかであり、グルコースおよびエチレングリコール試薬が５５％増加し、エチレングリコール無しのグルコースが７７％増加する。
【０１４０】
６０秒の予熱器を使用した場合、有機溶媒である、エチレングリコールは４０％ｖ／ｖ以上のレベルで一層活性が高くなり、ここで温度依存性還元剤および有機溶媒の両方として作用することができる。したがって、エチレングリコールと組み合わせて、より低い濃度のより活性のある成分、例えば、グルコースを使用することができ、５０％エチレングリコールからはそのままで良好な感度が得られる。別の注目すべき結果は、有機溶媒を含まないより低い濃度のグルコースから１３４℃において良好な感度が得られる実施例５である。
【図１】
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