(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４〜配列番号２３、配列番号３８及び配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
支持担体の細胞培養表面に、請求項１に記載のポリペプチドを付与して、ポリペプチド被覆培養表面を得ること、及び
前記ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養すること、
を含む、多能性幹細胞の培養方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導型多能性幹細胞、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚からなる群より選択される少なくとも一種である請求項２に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞である請求項２又は請求項３に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞を、異種動物由来成分及び血清由来成分の非存在下で培養する請求項２〜請求項４のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドの前記細胞培養表面への付与量が、１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である請求項２〜請求項５のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項７】
細胞培養表面を有する支持担体と、前記支持担体の細胞培養表面上に配置された請求項１に記載のポリペプチドと、を有する培養器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
損傷した組織の機能回復等を目的として種々の再生医療が開発されている。なかでも組織そのものの再生などを最終的な目的とする霊長類、特にヒトの全能性又は多能性幹細胞に関する技術が多く報告されている。特に、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、胚性幹細胞とは異なり体細胞から誘導されるため、倫理面の問題が少ないという利点を有する。
これらの霊長類の全能性又は多能性幹細胞（これらの両者を総称して、本発明では単に「多能性幹細胞」と称する。）を培養する場合には、未分化状態で長期間にわたって維持することが要求される。未分化状態の多能性幹細胞を長期間培養するためには、一般に、マウス繊維芽細胞等のフィーダー細胞が用いられる。【０００３】
しかしながら、前記マウス繊維芽細胞のような異種動物由来のフィーダー細胞を使用することで、異種動物由来の抗原性物質などの異物が培養液中に混入する可能性が指摘されており、全能性又は多能性幹細胞を、医療用途、もしくはそれに準ずる用途に使用する場合には、これらの細胞をフィーダー細胞非存在下にて培養することが求められている。【０００４】
このような事情に鑑み、フィーダー細胞の機能を代替する細胞接着性素材の開発が行われている。例えばNature Biotechnology, 2001, Vol19, pp.971-974では、フィーダー細胞の代替物としてマウス肉腫抽出成分であるマトリゲルを使用し、未分化状態を維持したヒト胚性幹細胞を首尾よく培養したことが開示されている。【０００５】
特開２００１−１７１８３号公報には、フィーダー細胞を含まず、且つ増殖する霊長類始原細胞を含む細胞性組成物が開示されており、好ましい態様として、細胞外マトリクスを更に含む細胞性組成物が開示されている。また特開２０１０−２９１８６号公報には、所定濃度の細胞外マトリックスタンパク質と水性溶媒を含むコーティング溶液で、プラズマ重合された細胞培養表面を更にコーティングした細胞培養基質が開示されており、この細胞培養基質によれば、胚性幹細胞の分化を回避するのに役立つ良好な接着性を有すると記載されている。さらに、特表２０１２−５０２６６４公報には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合するペプチドが開示されている。【０００６】
Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8218及びNature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610には、胚性幹細胞の長期培養に寄与しうるビトロネクチン部分配列からなる組換えペプチド、もしくは合成ペプチド、具体的には、天然ビトロネクチンの１番目〜５２番目のアミノ酸配列（Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8218参照）、及びＲＧＤ配列を含む第４１番目〜第５２番目のアミノ酸配列（Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610）がそれぞれ開示されている。これらのペプチドは非生体試料であるが故に抗原性物質等の混入可能性を回避でき、かつ工業的に生産できる点で優れていると、知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、多能性幹細胞を再生医療等の医療用途、もしくはそれに準ずる用途に使用することを考慮すると、マウス等に由来する繊維芽細胞等の異種のフィーダー細胞及びマウス由来のマトリゲルをはじめとする異種動物由来成分の使用をできる限り排除すべきである。また、同種動物由来の細胞又は成分であっても、抗原性物質の混入などの可能性を完全に排除できるものではない。さらに、同種及び異種のいずれであっても生体に由来する材料は、抽出量がごく微量であること、又は、ドナーによって性能がばらつくことがあることなど、工業的観点からも好ましくない。近年、医療用途への応用を目指して、異種動物由来成分又は抗原性物質が混入しない化学的に同定された条件下での幹細胞の培養検討が盛んに行われている。しかしながら、実用に足る細胞培養性能を示すフィーダー細胞を代替できる材料は見出されていない。【０００８】
例えば、生体に由来する材料そのものの使用を回避する手段として、Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8218及びNature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610には、ヒトビトロネクチンの部分配列からなる組換えペプチド、もしくは合成ペプチドを使用して胚性幹細胞の長期培養を実施した例が開示されている。
しかしながら、このようなペプチドは培養器に対する吸着性が一様に低いため、培養器にて対して化学的に結合させる工程を必要とする。例えば、Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610では、培養器の細胞培養表面にアクリレートを導入して、ペプチドを共有結合させることが開示されているが、この方法ではペプチドを結合させる培養表面を自由に選択することが出来ず、汎用性、簡便性に劣る上、上記ペプチドだけでは、胚性肝細胞（ＥＳＣ）及び誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ）を培養するための細胞培養性能として充分とは言えない。さらに、特表２０１２−５０２６６４公報には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合するペプチドが開示されており、グリコサミノグリカンに結合する部位を利用してＥＳＣ及びｉＰＳの長期培養および維持に使用することが記載されている。しかしながら、ＧＡＧに対する結合部位だけでは、ＥＳＣ及びｉＰＳを培養するための細胞培養性能として充分とは言えない。【０００９】
従って、本発明の目的は、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にすると共に、化学結合による培養器への固定処理を必要とせず、工業的に生産可能なポリペプチドと、このポリペプチドを用いた多能性幹細胞の培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にすると共に、培養器への吸着性に優れ、化学結合による培養器への固定処理を必要としない組換えタンパク質を開発するべく鋭意研究を重ね、所定のヒトビトロネクチンＮ末端部分配列を含み培養器への吸着能を有するアミノ酸残基からなる所定のポリペプチドが、異種動物由来成分を含まない培養液中にて多能性幹細胞を長期にわたって未分化状態を維持しながら増殖させることが可能であり、かつ化学的な結合を介さずとも培養器に吸着することを見出した。さらに驚くべきことに当該配列よりなるポリペプチドは、ヒトビトロネクチン全長配列よりなる組換えビトロネクチンと比較して有意に増殖性に優れることを見出し、本発明に至った。【００１１】
本開示には、下記の実施形態が含まれる。本開示は、課題を解決するためのより具体的な手段として、下記［１５］及び下記［１５］を直接又は間接に引用する下記［１６］〜［２１］を提供する。
［１］  （１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域と、（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、及び（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列のいずれか一方を含む第２の領域と、を含み、前記第１の領域が前記第２の領域のＮ末端側に位置し、４０個〜２５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
［２］  前記第１の領域が、ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列の双方を含む［１］に記載のポリペプチド。
［３］  前記第１の領域が、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目〜５５番目のアミノ酸配列からなる［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
［４］  ＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５である［１］〜［３］のいずれかに記載のポリペプチド。
［５］  下記（３−ｉ）及び（３−ii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチド：（３−ｉ）  配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、及び（３−ii）  前記（３−ｉ）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［６］  下記（３ａ−ｉ）及び（３ａ−ii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチド：（３ａ−ｉ）  配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、１３２番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、及び（３ａ−ii）  前記（３ａ−ｉ）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［７］  下記（３ｂ−ｉ）及び（３ｂ−ii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチド：（３ｂ−ｉ）  配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、及び（３ｂ−ii）  前記（３ｂ−ｉ）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［８］  下記（４−ｉ）及び（４−ii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第４の領域を更に含む［１］〜［７］のいずれかに記載のポリペプチド：（４−ｉ）  配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、及び（４−ii）  前記（４−ｉ）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［９］  （１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２５番目〜４７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第４の領域、を含み、前記第１の領域が前記第２の領域のＮ末端側に位置し、１２８個〜２５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
［１０］  （１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目〜５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第４の領域、を含み、前記第１の領域が前記第２の領域のＮ末端側に位置し、１６０個〜２５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
［１１］  ＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５である［９］又は［１０］記載のポリペプチド。
［１２］  前記ポリペプチドが第３の領域を含み、前記第３の領域が、配列番号３で示されるアミノ酸配列のシステイン残基に対応する位置に、システイン残基以外のアミノ酸残基を有する［５］〜［１１］のいずれかに記載のポリペプチド。
［１３］  前記ポリペプチドが第３の領域を含み、前記第３の領域が、配列番号３で示されるアミノ酸配列のシステイン残基に対応する位置にセリン残基、アラニン残基又はグリシン残基を有する［５］〜［１１］のいずれかに記載のポリペプチド。
［１４］  配列番号１で示されるアミノ酸配列における２つのシステイン残基が両者間で架橋している［１］〜［１３］のいずれかに記載のポリペプチド。
［１５］  配列番号４〜配列番号２３、配列番号３８及び配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［１６］  支持担体の細胞培養表面に、［１］〜［１５］のいずれかに記載のポリペプチドを付与して、ポリペプチド被覆培養表面を得ること、及び、前記ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養すること、を含む、多能性幹細胞の培養方法。
［１７］  前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導型多能性幹細胞、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚細胞からなる群より選択される少なくとも一種である［１６］記載の多能性幹細胞の培養方法。
［１８］  前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞である［１６］又は［１７］記載の多能性幹細胞の培養方法。
［１９］  前記多能性幹細胞を、異種動物由来成分及び血清由来成分の非存在下で培養する［１６］〜［１８］のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養方法。
［２０］  前記ポリペプチドの前記細胞培養表面への付与量が１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である［１６］〜［１９］のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養方法。
［２１］  細胞培養表面を有する支持担体と、前記支持担体の細胞培養表面上に配置された［１］〜［１５］のいずれかに記載のポリペプチドと、を有する培養器。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にすると共に、化学結合による培養器への固定処理を必要とせず、工業的に生産可能なポリペプチド及び該ポリペプチドを用いた多能性幹細胞の培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施例における各ポリペプチドの培養プレート表面の吸着試験の結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例における各ポリペプチドを用いたｉＰＳ細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。
【図４】本発明の実施例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＮＡＮＯＧ染色像（右欄）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のポリペプチドは、（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含み、培養器への吸着能を有する４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は、（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列の少なくとも一方を含む第１の領域と、（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列を含む第２の領域と、を含み、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである。以下、本明細書では、これらのポリペプチドを「培養用ポリペプチド」と称する場合がある。ただし、本ポリペプチドは、培養用以外の目的に用いてもよい。
【００１５】
本発明にかかる前記培養用ポリペプチドでは、所定のアミノ酸配列を含む第１の領域が、優れた細胞接着性を有することから、細胞、特に多能性幹細胞を良好に増殖させることができることが本発明において見いだされた。このようなアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドは、多能性幹細胞を、未分化状態の維持しながら長期にわたって増殖させることができる。
また、所定の配列を含む第２の領域が、培養器の表面に対する吸着性に寄与することが本発明において見いだされた。このようなアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドは、培養器への良好な接着性を示し、前記第１の領域と共にポリペプチドに含まれることによって、培養期間中に培養器の細胞培養表面から剥がれることなく、多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながら長期にわたって増殖させることができる。また、本発明のポリペプチドは、培養中の未分化状態の多能性幹細胞を、培養器の表面からの剥がれを抑制しつつ増殖させることができ、培養操作における取扱い性を向上させることができる。
この結果、本発明によれば、多能性幹細胞の未分化状態での増殖を促進すると共に、化学結合による培養器への固定処理を必要とせず、工業的に生産可能なポリペプチドを得ることができる。
【００１６】
また、本発明にかかるポリペプチドは、天然ヒトビトロネクチンと比べて抗原性物質、感染症源の混入リスクを排除すると同時に、天然ビトロネクチンと同等の性能、即ち多能性幹細胞に対する接着性、細胞増殖性、未分化維持性を保持することができる。
【００１７】
一方、本発明にかかるポリペプチドの存在下（好ましくは、更に異種動物由来成分等の非存在下）で培養した多能性幹細胞は、試料等に由来する抗原性物質等の異物の混入可能性を、ほとんど完全に、または大幅に排除することが可能であり、当該培養方法にて培養した多能性幹細胞は医療用途、もしくはそれに準じた用途への使用に対し、充分に安全性を担保することができる。
また本発明のポリペプチドを用いた培養方法によれば、多能性幹細胞をより低コスト、かつ簡便な操作にて培養することができ、医療用途のみならず研究分野での需要に対しても広く貢献することができる。
【００１８】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１９】
本明細書において、「同種」とは、ヒトを意味し、「異種」とは、ヒト以外の動物を意味する。
本明細書では、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当該技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基を「Gly」）で表記する場合がある。
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸（又はイミノ酸）残基の個数を基準とする。
【００２０】
本明細書において、アミノ酸配列の特定のアミノ酸残基について使用される「対応するアミノ酸残基」等の表現は、対比する２つ以上のアミノ酸配列を、当該技術分野で周知のやり方で、挿入、欠失、及び置換を考慮に入れたうえで、同一となるアミノ酸残基が最も多くなるように整列（アライメント）させたときに、基準となるアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の位置に一致する、他方のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を示すことを意味する。
本明細書におけるアミノ酸配列に関する「同一性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、4ｔｈＥｄ  −  Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照）を用いて計算される値を指すことができる。例えば、配列番号２に対して同一性５０％以上とは、ＢＬＡＳＴにおけるＭａｘ．Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓの値が５０以上であることを示す。
【００２１】
本発明において、ビトロネクチンとは、ヒトビトロネクチンを意味し、具体的には、下記配列番号３で示される全長４９５アミノ酸残基で構成されたポリペプチドである。なお、天然のビトロネクチンは、配列の一部に糖鎖を有する糖タンパク質であることも確認されている。
【００２２】
配列番号３：
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSAGTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
【００２３】
＜ポリペプチド＞
本発明にかかるポリペプチド（培養用ポリペプチド）は、（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含み、培養器への吸着能を有する４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は、以下の第１の領域と第２の領域とを含み、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである：
（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列（以下、単にＲＧＤ配列と称する）からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域と、
（２）（２−ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２−ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（３−iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列を含む第２の領域。
【００２４】
前記第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列からなる群より選択された少なくとも一方を含む。
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ビトロネクチンのアミノ酸配列における２５番目〜３１番目の７アミノ酸残基に相当する。また、ＲＧＤ配列は、ビトロネクチンのアミノ酸配列における４５番目〜４７番目の３アミノ酸残基に相当する細胞接着性モチーフである。これらのアミノ酸配列はいずれも、天然ビトロネクチンの比較的Ｎ末端側に位置する配列であり、未分化多能性幹細胞との接着性を発揮し、その結果、未分化状態に維持された多能性幹細胞を増殖可能にしていると推測される。このため、これらのアミノ酸配列のいずれも含まないポリペプチドでは、細胞接着性に劣り、本発明の効果を得ることができない。ただし、本発明は、この理論に拘束されない。
なお、配列番号１で示されるアミノ酸配列における２つのシステイン残基は、これら両者間で架橋していてもよい。これにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列において高次構造が形成されて、多能性幹細胞との接着性が向上する傾向がある。
【００２５】
ここで、「多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能である」とは、多能性幹細胞が培養期間において分化能を維持していることを意味する。多能性幹細胞が未分化状態であるか否かは、既知の評価方法で行うことができる。例えば、分子マーカーの発現（ＳＳＥＡ−４、及び／又はＯｃｔ−４等のフローサイトメトリーによる発現測定、Ｏｃｔ−４及び／又はＮＡＮＯＧ等の免疫染色など）、インビトロ実験における多能性分化の確認、および免疫不全マウス等への移植によるテラトーマ形成の確認などの当業者既知の方法によりなされる。増殖しているか否かは、常法により、各種顕微鏡を用いた目視による観察若しくは、ＡＬＰ活性等の反応試験、フローサイトメトリーなどを利用した手法、又はその他の手段により行えばよい。また、本発明における多能性幹細胞が分化能を維持培養期間としては、培養条件及び多能性幹細胞の細胞状態によって異なるが、例えば、１ヶ月の培養期間とすることができる。
【００２６】
前記培養用ポリペプチドにおける第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列からなる群より選択されるいずれか一方を有していればよく、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、前記培養用ポリペプチドにおける第１の領域は、これらの配列の双方を含むことが好ましい。
【００２７】
前記第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列以外のアミノ酸配列を有していてもよい。このような他のアミノ酸配列としては、例えば、第１の領域の細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、（１ａ）配列番号３で示されるヒトビトロネクチンのアミノ酸配列の１番目〜２４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（１ｂ）４８番目〜５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は（１ｃ）３２番目〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列等、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。なお、（１ａ）〜（１ｃ）のアミノ酸配列はそれぞれ、第１の領域の細胞接着性及び細胞増殖性を損なわない範囲で、１個〜３０個のアミノ酸残基を置換、欠失又は削除した配列を有するものであってもよく、（１ａ）〜（１ｃ）のアミノ酸配列それぞれの配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
前記第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列に加えて、（１ａ）〜（１ｃ）のアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つを含むことができ、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列の双方を含み、且つ、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目〜５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又はこれに近似した若しくはその一部のアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００２８】
前記第１の領域のアミノ酸残基数は、細胞接着性及び増殖性の観点から、３〜６０アミノ酸残基数とすることができ、１０〜５５アミノ酸残基数であることが好ましい。
【００２９】
前記第２の領域は、配列番号２で示される３２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、培養用ポリペプチドの精製容易性の観点から好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然ビトロネクチンのＣ末端側に位置するヘモペキシン様ドメインIIの一部に含まれ、配列番号３で示されるアミノ酸配列の第３４２番目〜第３７３番目のアミノ酸残基で構成されたヘパリン結合ドメインに相当する。以下、配列番号２で示されるアミノ酸配列をヘパリン結合ドメインと称する場合がある。
【００３０】
前記培養用ポリペプチドは、前記ヘパリン結合ドメインを有することにより、培養器への吸着能を有すると推測される。この結果、未分化多能性幹細胞を、未分化状態を維持して長期にわたり培養することができるが、本発明はこの理論に拘束されない。
また、前記培養用ポリペプチドは、前記ヘパリン結合ドメインを含むことにより、前記培養用ポリペプチドの親水性を担保し、ポリペプチドの疎水凝集を抑制する傾向がある。この結果、前記培養用ポリペプチドが精製しやすくなり、製造効率を高めることができる。
【００３１】
ここで、「培養器への吸着能を有する」とは、前記アミノ酸配列が、対象となる培養器の細胞培養表面（以下、単に「培養表面」ということがある）に対して化学的な反応をすることなく物理的に吸着することを意味する。培養器の培養表面に対して吸着能を有するか否かについては、例えば、プラズマ処理したポリスチレン製培養器に２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２となるように当該ポリペプチドを含有する溶液を添加して３７℃で２時間放置した後、リン酸緩衝液にて２回洗浄したときに、培養皿表面に残存する当該ポリペプチドが１０ｐｍｏｌ/ｃｍ２以上存在するか否かにより評価することができる。
ここで培養皿表面に残存するポリペプチドの量は、ポリペプチドを認識する抗体との結合量を定量するＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法又は、吸着したポリペプチドを加水分解し、生じたアミノ酸をＨＰＬＣなどによって定量することにより測定できる。
【００３２】
また前記ヘパリン結合ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有すると共に、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能、且つ培養器への吸着能を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００３３】
また更に前記ヘパリン結合ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、１個〜３０個、好ましくは１個〜１５個、好ましくは１個〜６個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培養器への吸着能を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００３４】
前記培養用ポリペプチドは、前記第１の領域と、前記第２の領域とを有していればよく、その相対位置には特に制限はない。前記培養用ポリペプチドでは、第１の領域が、前記第２の領域のＮ末端側に位置していることが好ましい。
【００３５】
前記培養用ポリペプチドは、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなる。４０アミノ酸残基未満では、細胞接着性若しくは細胞増殖性又は培養器への吸着能が充分とはいえない．一方、４５０アミノ酸残基を超えると、細胞接着性又は細胞増殖性及び培養器への吸着能が適切に発揮されない場合があり、さらに、タンパク質同士の会合、架橋又は凝集の形成が起こりやすくなる。前記培養用ポリペプチドは、凝集の形成等を起こりにくくするという観点から、８０個以上であることが好ましく、９０個以上であることがより好ましく、１００個以上であることが更に好ましく、一方、４００個以下であることが好ましく、２５０個以下であることがより好ましく、１７０個以下であることが更に好ましく、１５０以下であることが更により好ましい。これらの上限値又は下限値はいずれを組み合わせてもよく、例えば、４０個〜４００個のアミノ酸残基からなることが好ましく、８０個〜２５０個のアミノ酸残基からなることがより好ましく、８０個〜１５０個のアミノ酸残基からなることが更に好ましく、１００個〜１５０個のアミノ酸残基からなることが更により好ましい。
【００３６】
前記培養用ポリペプチドは、−２．０〜−０．９５のＧＲＡＶＹ値を有することが、疎水凝集を防ぐ観点から好ましい。ＧＲＡＶＹ値（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132） は、ポリペプチドの疎水度の総平均を表す。ＧＲＡＶＹの値が大きいほど、疎水度が高いことを意味する。ＧＲＡＶＹ値が−０．９５以下であれば、疎水凝集の発生を容易に抑制できる傾向がある。一方、−２．０以上であれば、培養器表面への吸着及び未分化細胞の増殖をしやすくなり、ＧＲＡＶＹ値が大きくなるにつれて吸着性及び細胞増殖性が向上する傾向がある。ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値としては、凝集形成の抑制と吸着性又は細胞増殖性を両立する点で、−１．７０〜−０．９７５がより好ましく、−１．６０〜−１．１０が更に好ましい。アミノ酸残基数が少ないほど凝集する傾向があるため、アミノ酸残基数が８０〜１７０個のポリペプチドである場合に、凝集形成の抑制と吸着性又は細胞増殖性を両立する点で、ＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であることが好ましく、−１．６０〜−１．１０であることが更に好ましい。
【００３７】
ＧＲＡＶＹ値を調整するには、配列中の、例えば疎水性アミノ酸（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＭｅｔ）の割合の増減、又はアミノ酸残基数の増減等により調整することができる。
【００３８】
前記培養用ポリペプチドは、前記第１の領域及び前記第２の領域以外の他のアミノ酸配列を有することが好ましい。細胞接着性及び培養器への吸着能を適切に発揮する観点から、前記培養用ポリペプチドは、配列番号３で示されるポリペプチド、即ち、ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列の部分配列を含むことが好ましい。これにより、前記培養用ポリペプチドは、ヒトビトロネクチンに近い性質、例えば、多能性幹細胞に対する優れた接着性及び増殖性を獲得することができる。
【００３９】
前記培養用ポリペプチドに含まれうるヒトビトロネクチンの部分アミノ酸配列としては、前記培養用ポリペプチドの細胞接着性及び細胞増殖性、又は培養器への吸着能、又は凝集形成抑制の観点から、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つを含むことが好ましい：
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第３の領域、及び、
（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第４の領域。
【００４０】
前記第３の領域としては、ポリペプチドの作製時、疎水凝集を抑制する傾向があるという観点から、（３ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、１３２番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を選択することができ、又は、（３ｂ）２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を選択することができ、（３ｃ）２７４番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を選択することができ、又は、（３ｄ）２９４番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができる。（３ａ）〜（３ｄ）のアミノ酸配列では、アミノ酸残基数を減らすことによって疎水凝集を軽減できる傾向がある。中でも、（３ｄ）のアミノ酸配列を選択することが、疎水凝集をより確実に抑制できる傾向があるため好ましい。
【００４１】
前記第４の領域としては、培養皿への吸着性の観点から、３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができ、３７４番目〜４０９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができ、３７４番目〜３７９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができる。
中でも、培養皿への吸着性に加えて、ポリペプチド作製時に疎水凝集を抑制しやすいという点で、３７４番目〜３７９番目が好ましく、選択するアミノ酸数を減らすことによって疎水凝集が軽減される傾向がある。
【００４２】
前記第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列とは、所定範囲のアミノ酸残基のうち、連続する３アミノ酸残基以上で構成されたアミノ酸配列を意味する。これらの部分アミノ酸配列のアミノ酸残基数は、上述した前記培養用ポリペプチドの総アミノ酸残基数を超えない範囲で選択すればよい。
【００４３】
なお、前記第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列は、それぞれのアミノ酸配列又はその部分配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列であってもよい。これらのアミノ酸配列は、前記培養用ポリペプチドの細胞接着性及び培養器への吸着性を損なわない範囲で選択可能である。
【００４４】
また前記第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列は、それぞれのアミノ酸配列又はその部分配列に対して、１個〜３０個、好ましくは１個〜１５個、より好ましくは１個〜５個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。これらのアミノ酸残基が欠失等されたアミノ酸配列は、前記培養用ポリペプチドの細胞接着性及び培養器への吸着性を損なわない範囲で選択可能である。
【００４５】
前記培養用ポリペプチドは、前記第３の領域を含むことにより、前記培養用ポリペプチドは、培養皿との吸着性を高める利点を有する傾向がある。前記第４の領域を含むことにより、前記培養用ポリペプチドは、培養皿との吸着性をさらに高める利点を有する傾向がある。前記培養用ポリペプチドは、第３及び第４の領域のいずれか一方を有していればよい。
また、前記培養用ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値は、調整容易性の観点から、第３及び第４の領域を構成するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数の増減、アミノ酸残基の置換、欠失、付加等により調整されることが好ましく、特に、第３の領域を構成するアミノ酸配列の長さを調整することがより好ましい。
【００４６】
前記培養用ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜１３１番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよく、５６番目〜２６８番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよく、２６９番目〜２７３番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよく、あるいは、５０番目〜２９３番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよい。これらのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、前記培養用ポリペプチドの多能性細胞培養への性能に寄与しないものであると推測され、培養皿との吸着の観点で適した配列が選択される。
【００４７】
前記第３の領域が、配列番号３で示される配列のシステイン残基に対応するアミノ酸残基を含む場合、当該システイン残基の位置に、システイン残基以外のアミノ酸残基を有していてもよい。これにより、システイン残基による分子内又は分子間架橋の形成を防ぐことができ、好ましい。システイン残基を置換する他のアミノ酸残基としては、特に制限はなく、セリン残基、アラニン残基、グリシン残基等を挙げることができる。なかでも、システインと類似の構造を有する点で、セリン残基、アラニン残基が好ましい。
【００４８】
また前記培養用ポリペプチドは、細胞接着性及び培養器への吸着性が損なわれない範囲で、上記以外の他の付加的な任意のアミノ酸残基を有していてもよい。このような他の任意のアミノ酸残基からなる配列としては、例えば、前記培養用ポリペプチドを組換え技術によって容易に作製するために付加される付加配列を挙げることができる。このような付加配列としては、Ｎ末端側のメチオニン残基、Ｎ末端側のＧＰＬＧ配列、タグ配列（例えばＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等）、各領域間に付加可能なリンカー配列（例えば、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＧＳ等）などを挙げることができる。
【００４９】
前記培養用ポリペプチドは、当業者に既知のアミノ酸合成技術又は遺伝子組み換え技術によって製造することができる。
遺伝子組み換え技術により本発明の培養用ポリペプチドを得る場合、具体的にはまず、対象となるアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、目的とするポリペプチドが産生されるので、培養物から目的とするポリペプチドを常法により回収することにより、本発明にかかるポリペプチドを得ることができる。
【００５０】
前記培養用ポリペプチドとしては、細胞増殖性及び未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２５番目〜４７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域、を含む８０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ａ）であることが好ましい。
【００５１】
また、前記培養用ポリペプチドとしては、細胞増殖性及び未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目〜５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列とＲＧＤ配列を含む）からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域（ヘパリン結合ドメイン）と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つ：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域と、を含む１００個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ｂ）であることが好ましい。
【００５２】
また、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であるポリペプチドであることが好ましい。
また、上記ポリペプチド（Ａ）は、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個であることが好ましい。
更に、上記ポリペプチド（Ａ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であり、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
また更に、上記ポリペプチド（Ａ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であり、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
また、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個であることが好ましい。
更に、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であり、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
また更に、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であり、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
また更に、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であり、アミノ酸残基数が１００個〜１７０個のポリペプチドであることが好ましい。
前記培養用ポリペプチドの一例を以下に挙げるが、本発明はこれらに限定されない。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
＜多能性幹細胞の培養方法＞
本発明の多能性幹細胞の培養方法は、支持担体の細胞培養表面に前記培養用ポリペプチドを付与して、培養用ポリペプチド被覆培養表面を得ること（以下、培養表面調製工程という）、及び、前記培養用ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養すること（以下、培養工程という）、を含む。
本発明の培養方法は、多能性幹細胞を未分化状態で保持することができる第１のドメインと培養器への良好に吸着することができる第２のドメインとを有する前記培養用ポリペプチドを培養表面に吸着させて、その上に多能性幹細胞を播種して培養するので、多能性幹細胞を、細胞培養表面からの剥がれによる離脱を抑制しつつ、未分化状態を維持して培養することができる。
【００５５】
本発明にかかる培養用ポリペプチド上で培養することにより未分化状態を保持して増殖可能な多能性幹細胞は、霊長類動物の多能性幹細胞であり、具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、及び体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞及び初期胚細胞等が包含され、これらの細胞を１種、又は必要に応じて２種以上を混合して用いてもよい。ｉＰＳ細胞には、Nature, 2007, July 19; Vol.448, pp.313-317；Cell, 2006, August 25; Vol.126(4), pp.663-676に記載されている細胞、又はこれに類する細胞が包含される。
なかでも、本発明において好ましく適用される多能性幹細胞の例には、ｉＰＳ細胞を挙げることができる。
なお、霊長類動物としては、ヒト、サル、ゴリラなどが挙げられ、前記培養用ポリペプチドと同属となるヒトであることが特に好ましい。本発明に適用される成分又は物質が、霊長類動物に由来する成分又は物質であれば、同種動物由来の成分又は物質として本発明に好ましく適用可能である。
【００５６】
培養に用いられる培養液としては、培養対象となる細胞の種類に応じて適宜選択することができる。使用可能な培養液としては、公知のもののいずれであってもよく、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、１９９、ＭＣＤＢ１５３、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、Ｂａｓａｌ培地などを挙げることができる。また、これらの培養液には、一般に添加可能な各種の成分、例えば、グルコース、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）またはヒト血清、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％（v/v）とすることができる。
【００５７】
前記培養方法では、前記多能性幹細胞を、異種動物由来成分の非存在下で培養することが好ましい。これにより、異種動物由来の異物混入の可能性を高い精度で排除することができる。異種細胞由来成分の非存在下での培養としては、異種動物由来成分を含有しない培養液を使用する培養、異種動物由来のフィーダー細胞等を使用しない培養などが挙げられる。
更に、前記培養方法では、前記多能性幹細胞を異種動物由来成分及び血清成分の非存在下で培養することが好ましい。これにより、よりいっそう、異種動物由来成分の混入を排除することができる。
【００５８】
前記異種動物由来成分を含有しない培養液としては、非必須アミノ酸、グルタミン酸、β―メルカプトエタノール、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β、インスリン、トランスフェリンなどの培地成分の少なくとも１種を含有する低浸透圧培地からなる混合培地を使用することができる。具体的にはＴｅＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などの培地を使用することができるが、これに限定されない。
【００５９】
なお、細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％（v/v）ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
【００６０】
前記多能性幹細胞の培養および継代方法には、多能性幹細胞を維持するために用いられている通常の培地を使用することができる。具体的には、例えば、ｍＴｅＳＲ、ＴｅＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が挙げられる。培地への多能性幹細胞の播種は常法により行う。なお、一連の継代において用いる培地は必ずしも同一でなくてもよく、多能性幹細胞を未分化状態に維持することができるかぎり、異なる培地であってもよい。
【００６１】
前記培養表面調製工程では、前記培養用ポリペプチド被覆培養表面は、支持担体の培養表面に対して前記培養用ポリペプチドを所定量含有するコーティング溶液を付与することを含む。これにより、前記培養用ポリペプチドにより培養表面を被覆することができる。前記コーティング溶液における前記培養用ポリペプチドの含有量は、コーティング対象となる培養表面の種類又は大きさによって異なるが、培養表面に対する吸着能の観点から、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２とすることが好ましく、１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２とすることがより好ましい。前記コーティング溶液を調製するために用いられる水性媒体としては特に制限はなく、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、超純水等を挙げることができる。
コーティングは、前記コーティング溶液を付与した後、所定時間、例えば３０分〜２４時間程度保持すればよく、これにより特別な処理を要せずに、培養表面に前記培養用ポリペプチドを被覆することができる。
【００６２】
培養工程は、前記培養用ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養することを含む。
多能性幹細胞の播種密度及び培養については、特に制限はなく、一般に行われる条件をそのまま適用すればよい。例えば、１×１０３個／ｃｍ２〜１×１０５個／ｃｍ２程度の播種密度として、上述した培養及び継代条件にて培養すればよい。また１０μｍ〜１００μｍの細胞塊を１個／ｃｍ２〜５個／ｃｍ２程度の播種密度として上述した培養及び継代条件にて培養してもよい。
【００６３】
これにより、前記培養用ポリペプチド上で多能性幹細胞を取り扱いよく、また未分化状態を維持して良好に増殖させることができる。
【００６４】
＜培養器＞
本発明において培養器とは、細胞培養に用いられる表面を有する支持担体を指す。このような支持担体としては、当業界で細胞培養用支持担体として周知のものをそのまま用いることができる。支持担体の例には、プラスチック（例えば、ポリスチレン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂）、ガラス、微孔質のフィルター（例えば、セルロース、ナイロン、ガラス繊維、ポリエステルそしてポリカーボネート）、バッチ式又は連続式で細胞培養において、あるいは遺伝子工学（例えばバイオリアクター等）において用いられるバイオリアクター用材料（中空繊維チューブ又はマイクロキャリアビーズを含めてもよい。）及び、ポリエチレンテレフタレート、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、セラミック及びその関連ポリマー材料等を含めてもよい。
また、前記支持担体は、プラズマ重合薄膜により培養表面が被覆された支持担体であってもよい。
【００６５】
前記培養器の形態としては特に制限はなく、前記多能性幹細胞の培養に適用可能な如何なる形態であってもよい。このような形態の容器の例としては、マルチウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、９６ウェル）、培養皿（例えば、ペトリディッシュ等）、チューブ、培養フラスコ、ローラーボトル、振盪培養フラスコ等を挙げることができる。
【００６６】
本発明にかかる培養器は、細胞培養表面を有する支持体と、前記支持体の細胞培養表面上に配置された培養用ポリペプチドを有するものである。
本培養器は、前述した本発明にかかる培養用ポリペプチドを備えた培養表面を有しているので、培養表面に対して前記培養用ポリペプチドが良好に吸着しており、前記培養用ポリペプチド上に多能性幹細胞を播種した場合には、取扱い性よく、未分化状態を維持させた状態で多能性幹細胞を増殖させることができる。
ここで、培養器における培養表面とは、細胞を播種し成育する際に、細胞が付着し得る表面を意味する。
【００６７】
本発明にかかる培養器は、細胞培養表面を有する支持担体を備えたものを準備すること（以下、「準備工程」）、前記細胞培養表面に、前記培養用ポリペプチドを付与して、吸着処理を行うこと（以下、「吸着処理工程」）を含む製造方法により製造することができる。これにより、簡便に本発明にかかる培養器を得ることができる。
【００６８】
準備工程では、前記培養表面を有する支持担体を備えた培養器が準備される。前記支持担体が、プラズマ重合薄膜を培養表面に有する場合には、プラズマ重合薄膜を支持担体上に形成する工程を含めてもよい。プラズマ重合薄膜を形成する方法については、常法をそのまま適用すればよい。
【００６９】
吸着処理工程では、本発明にかかる培養用ポリペプチドを前記培養表面に付与して保持することを含む。吸着処理工程では、培養用ポリペプチドを所定量で含有する吸着液を調製し、培養表面に付与し、所定時間保持することにより、前記培養用ポリペプチドを培養表面に吸着させればよい。
吸着処理工程については、前記培養方法において前記培養用ポリペプチド被覆培養表面調製工程で説明した事項をそのまま適用することができる。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。【００７１】
［実施例１］
＜ポリペプチドの調製＞
ＰＣＲを利用した常法にて、表２及び表３に示すアミノ酸配列を有するＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１７の各ポリペプチドをコードする遺伝子配列を増幅した。なお、ＲＣＰ−１１は天然ヒトビトロネクチンの配列に相当する。なお、各ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号３）における位置を、表２及び表３中、「ＮＯＴＥ」欄に示す。ただし、各ポリペプチドのアミノ酸配列には、表中に記載された対応する範囲の天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列に対して付加、削除、又は置換されたアミノ酸配列が含まれる場合がある。なお、ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０及びＲＣＰ−１７は、上述した配列番号４〜１３及び配列番号３８で示されるアミノ酸配列のそれぞれに対して、１位にメチオニンを有する以外は、同一のアミノ酸配列を有する。【００７２】
ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０及びＲＣＰ−１７については、あらかじめＮｃｏＩ（タカラバイオ社）にて切断処理したｐＥＴ−２８ｂ（＋）に、ＩｎＦｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて目的遺伝子を挿入し、各発現用ベクターを構築した。ＲＣＰ−１１〜ＲＣＰ−１６については、あらかじめＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）にて切断処理したｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア社）に、上記と同様の手法にて目的遺伝子を挿入し、各発現用ベクターを構築した。発現用ベクターの配列は、シークエンス解析により確認した。【００７３】
【表２】
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0005986627.tif 000004
0005986627.tif 000005
【００７４】
【表３】
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【００７５】
作製したＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０及びＲＣＰ−１７の発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に常法によりトランスフォーメーションし、カナマイシン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃、１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬工業）を添加して、３７℃、５時間振とう培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。【００７６】
菌体を遠心処理にて回収し、菌体を洗浄用バッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）にて再懸濁した。ソニケーションにて菌体を破砕した後、１５０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃で遠心し、不溶性画分を回収した。０．５質量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む洗浄用バッファで洗浄した後、低濃度尿素バッファ（Ｌｏｗ  Ｕｒｅａ  Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ７．６）にて再懸濁し、ソニケーション処理を行った。遠心処理にて不溶性各分を回収した後、高濃度尿素バッファ（Ｈｉｇｈ  Ｕｒｅａ  Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を添加し、ソニケーション処理にて不溶性各分を可溶化した。【００７７】
上記の方法により得られた目的ペプチドを含む溶液を、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥヘルスケア社）及びＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ  ５ｍｌ（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。前記高濃度尿素バッファを結合用バッファとして、高塩濃度調整バッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を溶出用バッファとして段階的溶出を行い、目的のポリペプチドを精製した。【００７８】
上記で作製されたＲＣＰ−１１〜ＲＣＰ−１６の発現ベクターを、ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に常法によりトランスフォーメーションし、アンピシリン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃、１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１００μＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して、２０℃、２４時間振とう培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。【００７９】
菌体を回収し、Ｂ−ＰＥＲ（登録商標）  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて再懸濁したのち、ソニケーションにて菌体を破砕した。１５０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃で遠心して不溶性画分を除去し、上清をＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００、及びＧＳＴｒａｐＨＰ  ５ｍｌ×２（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。溶出画分をＨｉｐｒｅｐ  ２６／１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＧＥヘルスケア社）を用いて脱塩し、更に、ＧＳＴ融合タンパク質切断用プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）を、溶液量の１／２０００で添加して４℃で２４時間インキュベートし、ＧＳＴタグを切断した。再度ＧＳＴｒａｐＨＰ  ５ｍｌ×２にて精製し、切断したＧＳＴタグをカラムに吸着させ除去した。カラム通過画分をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（３．５Ｋ ＭＷＣＯ．：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、以下、同じ）を用いて透析し、ＰＢＳに置換した。【００８０】
上記のようにして得られたＲＣＰ−１のポリペプチドを、レディーゲル（１２．５％，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で泳動し、ＧｅｌＣｏｄｅＴＭ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で染色した。その結果、アミノ酸配列から予想される分子量２８．３ｋＤａに相当する箇所に単一のバンドが確認できた。その他のポリペプチドに対しても同様の結果が得られた。【００８１】
ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０及びＲＣＰ−１７について、精製後の各ポリペプチド溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（３．５Ｋ ＭＷＣＯ．）を用いて透析した。透析外液は、透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を基本とし、段階透析にて尿素を除去した。最終透析産物はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｒｅｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。透析後の凝集の有無を表４に示す。【００８２】
またＧＲＡＶＹ値は、アミノ酸ごとに決められている疎水性の指標を総和し、アミノ酸数で割った値として計算した（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132参照）。ＧＲＡＶＹ値は各ポリペプチドに含まれるアミノ酸の疎水度から計算されるポリペプチドの親疎水性の指標であり、値が大きいほど疎水的、小さいほど親水的であることを示す。結果を表４に示す。
また凝集有無については、以下のＧ、Ａ及びＢで評価した。結果を表４に併せて示す。
Ｇ：凝集物形成が見られない。
Ａ：粒径１００ｎｍ程度の粒子形成が認められる。
Ｂ：粒径１ｍｍ以上の可視凝集の形成が認められる。【００８３】
【表４】
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【００８４】
表４に示されるように、ＲＣＰ−２〜ＲＣＰ−５、ＲＣＰ−７〜ＲＣＰ−８、及びＲＣＰ−１７は、アミノ酸残基数が８０個〜１７０個のポリペプチドであり、凝集が生じやすいが、ＧＲＡＶＹ値が−１．７０〜−０．９７５であるため、凝集形成が抑制されていることがわかる。【００８５】
［実施例２］
＜培養皿への吸着性評価＞
上記の方法により得られた各ポリペプチドを、所定のバッファにて、０〜２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の所定の最終濃度でウェルへ添加できるように希釈し、プラズマ処理済ポリスチレン製９６ウェルプレート（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ―Ｔｒｅａｔｅｄ、Ｆａｌｃｏｎ社）に６４μＬずつ添加した。３７℃、２時間インキュベートして各ポリペプチドをプレートに吸着させた後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１６の各ポリペプチド被覆表面を得た。【００８６】
上記のようにして得られた各ポリペプチド被覆表面のうち、ＲＣＰ−１およびＲＣＰ−１１〜１６を被覆した表面に対し、ホウ酸バッファと１ＮのＮａＯＨをそれぞれ６４μＬ付与し、８０℃、湿度１００％で２４時間インキュベートした。空冷後、各ウェルにホウ酸バッファを７５μＬ添加し、さらにＯＰＡ（ｏ−フタルアルデヒド：和光純薬）／メタノール溶液（１６０ｍｇ／ｍｌ）と、ＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン：和光純薬）／ホウ酸バッファ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を１：１００（質量比）に混合した反応液を５０μＬ添加した。４０℃で３０分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ マルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて蛍光強度を測定した（励起３５５ｎｍ／蛍光４８６ｎｍ）。別途各ポリペプチド溶液より検量線を作成し、吸着量を算出した。結果を図１に示す。図１において黒菱形はＲＣＰ−１、黒四角はＲＣＰ−１１、黒三角はＲＣＰ−１２、黒丸はＲＣＰ−１３、白菱形はＲＣＰ−１４、白四角はＲＣＰ−１５、白三角はＲＣＰ−１６をそれぞれ示す。【００８７】
図１に示されるように、試験に使用したポリペプチドのうち、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２［配列番号３における３４２番目〜３７３番目］）を含むＲＣＰ−１、１５、１６のポリペプチドを用いた場合に、ヒトビトロネクチンの配列を有するＲＣＰ−１１と同等の良好なプレートへの吸着性を有することがわかる。一方でＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮを含まないＲＣＰ−１３、１４の吸着量は該配列を含むポリペプチドに対して約１／４と低く、培養皿への吸着材として不適当であることがわかる。【００８８】
［実施例３］
＜細胞接着性評価１＞
上記ポリペプチドへのヒトｉＰＳ細胞（「Ｔｉｃ」：細胞番号Ｎｏ．ＪＣＲＢ１３３１：独立行政法人  医薬基盤研究所［５６７−００８５  大阪府茨木市彩都あさぎ７丁目６番８号］より分譲）の細胞接着性評価は、以下のとおりに行った。
ヒトｉＰＳ細胞を維持するためのフィーダー細胞として、ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）（初代マウス胚性線維芽細胞：ハイグロマイシン耐性、マイトマイシンＣ処理済み, Ｃ５７／ＢＬ６由来、継代３代目）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％ (v/v) ウシ胎児血清培地を使用して２４時間培養し、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）上に接着させた。ヒトｉＰＳ細胞用培地は、表５の組成のものに、ＦＧＦ−２（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したものを使用した。【００８９】
【表５】
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【００９０】
ｉＰＳ細胞は、上記培地を用いて、３７℃、５％（v/v、以下同じ）ＣＯ２インキュベーター内で維持培養した。培地はｉＰＳ細胞の播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。継代操作は ディスパーゼII（ｎｅｕｔｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＧｒａｄｅII、Ｒｏｃｈｅ社）で細胞を剥離し、ピペッティング操作にて細胞を適切なサイズに分離することで実施した。【００９１】
上述の様にして培養したヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて３７℃、５分間処理し、シングルセルに分離した。３００ｒｐｍ，２ｍｉｎ遠心して細胞を回収し、終濃度１０μＭ  Ｙ−２７３６２（（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｉａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤、和光純薬工業）を含むＴｅＳＲ２（異種動物由来成分、血清成分不含培地、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁した。【００９２】
ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０及びＲＣＰ−１７と、ＲＣＰ−１１、ＲＣＰ−１５及びＲＣＰ−１６と、比較対照として、ヒトビトロネクチン（ヒト血漿より抽出、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、リコンビナントラミニン（ｒＬａｍｉｎｉｎ−５：オリエンタル酵母社、及び、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１：Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）とを、それぞれ表６に示す添加濃度となるように、試料１〜１７を調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、３７℃、２時間保持して吸着させた。得られたペプチド処理９６ウェルプレートの各ウェルに対し、ｉＰＳ細胞を、３００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度となるように播種した。２４時間培養した後、非接着細胞をＰＢＳ洗浄にて取り除き、接着細胞のみを４％パラホルムアルデヒド（和光純薬）にて固定した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標） ＡＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にてＡＬＰ活性を算出し、検量線からＡＬＰ活性を有する未分化ｉＰＳ細胞数を算出した。結果を表６に示す。表６中、細胞接着率については、天然ビトロネクチンを用いた試料１５による細胞接着率を１００とした相対値とした。ｎ＝３。【００９３】
【表６】
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【００９４】
表６に示されるように、配列番号３に記載された配列の１番目〜５５番目を有するＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０、ＰＣＲ−１７及びＲＣＰ−１１と天然ヒトビトロネクチンは、ｉＰＳ細胞の細胞接着率が良好であった。特に、配列番号３に記載された配列の第５６番目から第２６８番目のアミノ酸の一部もしくは全てを含まないＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０、ＰＣＲ−１７は、天然ヒトビトロネクチン及び、天然ヒトビトロネクチンと同一アミノ酸配列を有するＲＣＰ−１１よりも細胞接着率が良好であった。これより、配列番号３に記載された配列の１番目〜５５番目に細胞接着に重要な配列が存在することがわかる。【００９５】
［実施例４］
＜細胞接着性評価２＞
表７に示すポリペプチドをＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。天然ビトロネクチンを１３０ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度で吸着させた表面を作製した後、１００μＭの上記合成ペプチドを添加した細胞懸濁液を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種した。播種２４ｈ後の接着細胞数を、＜細胞接着性評価１＞と同様の手法にて算出した。結果を表７に示す。表７中、細胞接着率については、合成ペプチドを含まない培養液での細胞接着率を１００とした相対値とした。ｎ＝３。【００９６】
【表７】
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【００９７】
表７に示されるように、ＣＳＹＹＱＳＣ又はＲＧＤを含むＰｅｐｔｉｄｅ−４、５及び６を添加することで天然ビトロネクチンへの細胞の接着が有意に阻害されたのに対し、ＣＳＹＹＱＳＣおよびＲＧＤを含まないＰｅｐｔｉｄｅ−１、２、３およびＰｅｐｔｉｄｅ−５、６のＲＧＤ配列をＲＧＥに置換したＰｅｐｔｉｄｅ−７、８を添加した場合は接着阻害が無いことがわかる。従って、ポリペプチドがＣＳＹＹＱＳＣ及びＲＧＤの少なくとも一方を含むことにより、細胞接着能が発揮されることがわかる。【００９８】
［実施例５］
＜増殖評価＞
上記＜細胞接着性評価１＞と同様に回収したｉＰＳ細胞を、ＲＣＰ−１、１１及び天然ヒトビトロネクチンを吸着させた９６ウェルプレートに対し、２５０ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で８日間培養した。各経時後の接着細胞数を、上記＜細胞接着性評価１＞と同様の方法で計測し、増殖曲線を得た。増殖曲線を図２に示す。なお図２において黒菱形はＲＣＰ−１を用いた例、黒四角はＲＣＰ−１１を用いた例を示す。
同様にＲＣＰ−１〜１０及びＲＣＰ−１７と、比較対照として、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１をそれぞれ表８に示す添加濃度となるように、試料１〜１２を調製し、上記＜細胞接着性評価１＞と同様にして各ポリペプチドを吸着させた９６ウェルプレートに対して５０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。３日後の細胞数を上記＜細胞接着性評価１＞と同様の方法で計測した。結果を表８に示す。【００９９】
【表８】
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【０１００】
図２より、ＲＣＰ−１は、天然ビトロネクチンのアミノ酸配列を有するＲＣＰ−１１よりも高い細胞増殖性を示し、ＲＣＰ−１１は、培養８日目でＲＣＰ−１を用いた場合よりも約１／３程度の細胞数であった。得られた細胞数の増減から倍加時間を算出したところ、ＲＣＰ−１を用いた場合には４６．４±２．１時間、ＲＣＰ−１１を用いた場合には６７．７±２．１時間であった。
また表８より、ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０及びＲＣＰ−１７はいずれも、ビトロネクチンと同じ細胞外マトリクスであるラミニンよりも細胞増殖率が高いことがわかる。このような高い細胞増殖率は、配列番号３における２７４番目のシステイン残基をセリン残基に置換しても同様に得られることがわかる。【０１０１】
図２及び表８の結果から、驚くべきことに、細胞増殖と培養皿への吸着に有効な配列からなり、天然ヒトビトロネクチンの第５６番目から第２６８番目のアミノ酸の一部もしくは全てに相当する配列を含まないＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０及びＲＣＰ−１７は、ヒトビトロネクチンと同等の配列を有するＲＣＰ−１１、及び比較例であるＬａｍｉｎｉｎ−５１１よりも高い増殖能を有していることがわかる。
さらに、表８より、ＣＳＹＹＱＳＣの配列及びＲＧＤ配列と、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮの配列の双方を含むＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０及びＲＣＰ−１７はいずれも高い細胞増殖性を示すことがわかった。【０１０２】
［実施例６］
＜細胞接着性評価３＞
ＲＣＰ−１を、１２５ｐｍｏｌ/ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度にＰＢＳで調整して使用した以外は、前記＜細胞接着性評価１＞と同様にして細胞接着性を評価した。結果を表９に示す。表９中、細胞接着率については、天然ビトロネクチンを１３０ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度で吸着させた培養器に対する細胞接着率を１００とした場合の相対値とした。ｎ＝３。【０１０３】
【表９】
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【０１０４】
表９に示されるように、ＲＣＰ−１に対するｉＰＳ細胞の接着性は、１２５ｐｍｏｌ/ｃｍ２以上添加することで天然ビトロネクチンと同等の細胞接着率を示した。【０１０５】
［実施例７］
＜未分化維持評価＞
上記＜細胞接着性評価１＞と同様に回収したｉＰＳ細胞を、ＴｅＳＲ２中に懸濁した。上記＜細胞接着性評価１＞で用いた試料１、試料２、試料５、試料６及び試料７をそれぞれ、上記＜細胞接着性評価１＞と同様にして吸着させた６ウェルプレート（Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｔｒｅａｔｅｄ，  Ｆａｌｃｏｎ社）にｉＰＳ細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培地は播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。６日毎に前述と同様の方法にて継代を行った。それぞれの試料上で培養したｉＰＳ細胞の形態を図３に示す。【０１０６】
また本条件で１ヶ月間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳにて膜透過性を亢進させた。Ｉｍａｇｅ  ＩＴ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にてブロッキング処理を行った後、抗ヒトＮＡＮＯＧ抗体（ＡＦ１９９７，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびＤＡＰＩ（同仁化学社）を添加して標識し、蛍光顕微鏡にて撮像した。これらの蛍光顕微鏡像を図４に示す。【０１０７】
図３及び図４のそれぞれにおいて、（Ａ）はＲＣＰ−１上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｂ）はＲＣＰ−１１上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｃ）は天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｄ）はｒＬａｍｉｎｉｎ−５上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｅ）はｒＬａｍｉｎｉｎ−５１１上で培養したｉＰＳ細胞を、それぞれ示す。スケールバー：１００μｍ。図３において左欄はコロニー全体像、右欄は拡大像であり、図４において左欄はＤＡＰＩ染色像、右欄は抗ＮＡＮＯＧ抗体による染色像を示す。図３及び図４中のスケールバー：２００μｍ。【０１０８】
図３に示されるように、細胞増殖と培養皿への吸着に有効な配列を含むＲＣＰ−１、１１と天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞は均質なコロニー、かつ高い核占有率を有する未分化細胞に特徴的な形態を示していた。また図４に示されるように、細胞増殖ドメイン及び吸着ドメインを有するＲＣＰ−１、１１と天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞は、ＮＡＮＯＧをコロニー全体に強く発現しており、未分化状態が良好に維持されていることがわかった。【０１０９】
上記実施例１〜７の評価結果から、ＣＳＹＹＱＳＣ及びＲＧＤ配列のいずれか一方とＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮの配列を含む４０〜４５０アミノ酸残基からなるポリペプチドは、培養器への吸着性に優れていた。また、このようなポリペプチドは、ｉＰＳ細胞との共培養条件下では、ｉＰＳ細胞の細胞接着性、及び未分化状態の維持において、天然ビトロネクチンおよびヒトビトロネクチンと同等の配列を有するＲＣＰ−１１と同等であり、かつｉＰＳ細胞の増殖性においてはＲＣＰ−１１よりも優れる結果であった。ＲＣＰ−１〜ＲＣＰ−１０及びＲＣＰ−１７はいずれもｉＰＳ細胞の細胞接着性及び未分化状態の維持の点で良好であることがわかる。このような各能力の全てにおいて良好の結果は、その他のポリペプチド又は比較例であるリコンビナントラミニンでは得られなかった。【０１１０】
従って、本発明によれば、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にすると共に、細胞培養表面への吸着性に優れたポリペプチドと、該ポリペプチドを用いた多能性幹細胞の培養方法及び培養器を提供することができる。【０１１１】
２０１２年５月１日に出願された日本国特許出願第２０１２−１０４８１６号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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