(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）少なくとも次の３つのＣＤＲ、すなわち、ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号５５の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５６の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号５７の配列を含んでなる）を含んでなる重鎖；および／またはｉｉ）少なくとも次の３つのＣＤＲ、すなわち、ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５８の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号５９の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号６０の配列を含んでなる）を含んでなる軽鎖を含んでなる、ｃ−Ｍｅｔタンパク質と特異的に結合することができる単離された抗体、またはその機能的フラグメントであって、かつ
ａ）
ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号７の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、
ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と
を含んでなる抗体、またはその機能的フラグメント；および
ｂ）
ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号２９の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と
ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号３２の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と
を含んでなる抗体、またはその機能的フラグメント
からなる群から選択される、抗体、またはその機能的フラグメント。
【請求項２】
ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる、抗体またはその機能的フラグメント；および
ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと配列番号４１のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる、抗体またはその機能的フラグメント
からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項３】
ネズミ抗体としての、請求項１または２に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項４】
リガンドＨＧＦの、ｃ−Ｍｅｔタンパク質への結合を遮断しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項５】
２００８年３月１２日にＩ−３９４９番としてCNCM, Institut Pasteur, Paris, Franceに寄託されたハイブリドーマおよび２０１０年１月１４日にＩ−４２７３番としてCNCM, Institut Pasteur, Paris, Franceに寄託されたハイブリドーマから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を分泌することができるネズミハイブリドーマ。
【請求項６】
次の核酸：
ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｂ）配列番号１５〜２６または４２〜５２の配列からなる群から選択される配列を含んでなるＤＮＡ配列を含んでなる核酸；
ｃ）配列番号２７、２８、５３または５４の配列を含んでなるＤＮＡ配列を含んでなる核酸；
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に定義される核酸の対応するＲＮＡ核酸；または
ｅ）ａ）、ｂ）およびｃ）に定義される核酸の相補的核酸。
【請求項７】
ｃＭｅｔの発現に関連する腫瘍形成性障害をin vitroにおいて診断するのを補助するため、またはｃＭｅｔの発現に関連する腫瘍形成性障害の発症の予後をin vitroにおいて判定するのを補助するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的フラグメントの使用。
【請求項８】
被験体からのｃＭｅｔ発現腫瘍の存在および／または場所をin vitroにおいて検出する方法であって、（ａ）被験体からのサンプルを請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的フラグメントと接触させる工程、および（ｂ）該抗体とサンプルとの結合を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項９】
被験体からのｃＭｅｔ発現腫瘍におけるｃＭｅｔの発現レベルをin vitroで検出する方法であって、（ａ’）被験体からのサンプルと請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的フラグメントを接触させる工程、および（ｂ’）該サンプルにおいてｃＭｅｔと結合する抗体のレベルを定量する工程を含んでなる、方法。
【請求項１０】
ｃ−Ｍｅｔ発現レベルが、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｃＭｅｔ発現腫瘍をin vitroにおいて診断するのを補助する、または被験体におけるｃＭｅｔ発現腫瘍の発症に関して予後をin vitroにおいて判定するのを補助する方法であって、（ｉ）請求項９に従ってｃＭｅｔの発現レベルを判定する工程、および（ｉｉ）工程（ｉ）の発現レベルを、正常組織のｃＭｅｔの参照発現レベルと比較する工程を含んでなる、方法。
【請求項１２】
被験体の腫瘍のｃ−Ｍｅｔ状態をin vitroで判定する方法であって、（１）請求項９に従ってｃ−Ｍｅｔの発現レベルを判定する工程、（２）該腫瘍のｃ−Ｍｅｔ発現レベルのスコアを付ける工程、および（３）該スコアを対照サンプルから得られたものと比較する工程を含んでなる、方法。
【請求項１３】
前記スコア付けが、染色強度および陽性細胞のパーセンテージである２つのパラメーターに基づく適当なスケールの使用を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記適当なスケールが、０〜３＋のスケールであり、腫瘍細胞に膜反応性がない場合は０、および１０％を超える腫瘍細胞に強い完全な反応性が見られる場合は３＋のスコアが付けられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記適当なスケールが、０〜３＋のスケールであり、腫瘍細胞に膜反応性がない場合は０；１０％を超える腫瘍細胞にわずかな認知可能な膜反応性が見られる場合には１＋；１０％を超える腫瘍細胞に弱い〜中程度の完全な膜反応性が見られる場合には２＋；および１０％を超える腫瘍細胞に強い完全な反応性が見られる場合には３＋のスコアが付けられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍が、スコア２＋または３＋のｃ−Ｍｅｔ（＋）である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍形成性障害が、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはそのフラグメントによる処置に感受性があるかどうかを判定する方法であって、（ａ）請求項１６に従って被験体の腫瘍のｃ−Ｍｅｔ状態をin vitroにおいて判定する工程、および（ｂ）その状態がｃ−Ｍｅｔ（＋）であれば、その腫瘍形成性障害は抗ｃＭｅｔ抗体またはそのフラグメントによる処置に感受性があると判定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその機能的フラグメントを少なくとも含んでなる、キット。
【請求項１９】
該抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とｃ−Ｍｅｔの間の結合程度を検出するのに有用な試薬をさらに含んでなる、被験体においてｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍の存在および／または場所をin vitroで検出するための請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
該抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とｃ−Ｍｅｔの間の結合レベルを定量するのに有用な試薬をさらに含んでなる、ｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍におけるｃ−Ｍｅｔの発現レベルをin vitroで判定するための請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
ｉ）該抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とｃ−Ｍｅｔの間の結合程度を検出するのに有用な試薬と、
ｉｉ）ｃ−Ｍｅｔ発現レベルのスコア付けに有用な陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル
をさらに含んでなる、腫瘍のｃ−Ｍｅｔ状態をin vitroで判定するための請求項１８または１９に記載のキット。
【請求項２２】
ネズミ抗体に特異的なポリクローナル抗体をさらに含んでなる、腫瘍のｃ−Ｍｅｔ状態をin vitroで判定するための請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、患者における増殖性疾患の予後および／または診断の分野に関する。より詳しくは、本発明は、ヒトｃＭｅｔ受容体と特異的に結合することができる新規な抗体、ならびにこの抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。本発明は同様に、ｃＭｅｔの発現に関連する病的過増殖性腫瘍形成性障害を検出および診断するための該抗体の使用、および対応する方法を含んでなる。特定の実施形態では、障害は、正常またはｃＭｅｔの過剰発現と関係する他の任意の病態に比べて高いｃＭｅｔポリペプチド発現に関連する腫瘍形成性障害である。本発明は最後に、ある種の癌の予後または診断のための、少なくともこのような抗体を含んでなる生成物および／または組成物またはキットを含んでなる。
【０００２】
トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、イマチニブおよびゲフィチニブ阻害剤などの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）標的薬は、選択された癌の処置のためにこのタンパク質種を標的化することの重要性を示している。
【０００３】
ｃＭｅｔはＲＴＫサブファミリーの基本型メンバーであり、これにはまたＲＯＮおよびＳＥＡも含まれる。ｃＭｅｔ  ＲＴＫファミリーは他のＲＴＫファミリーとは構造的に異なり、分散因子（ＳＦ）としても知られる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対する、唯一知られている高親和性受容体である[D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251: 802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]。ｃＭｅｔおよびＨＧＦは種々の組織で広く発現し、それらの発現は通常それぞれ上皮起源および間葉起源の細胞に限定されている[M. F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]。それらは双方とも正常な哺乳類の発生に必要であり、細胞の遊走、形態形成分化および三次元管構造の組織化、ならびに成長および脈管形成に特に重要であることが示されている[F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]。ｃＭｅｔおよびＨＧＦの制御された調節が哺乳類の発生、組織の維持および修復に重要であることが示されている[Nagayama T, Nagayama M, Kohara S, Kamiguchi H, Shibuya M, Katoh Y, Itoh J, Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2): 155-66; Tahara Y, Ido A, Yamamoto S, Miyata Y, Uto H, Hori T, Hayashi K, Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1): 146-51]とともに、それらの調節不全が癌の進行に関連づけられている。
【０００４】
ｃＭｅｔの不適切な活性化により引き起こされる異常なシグナル伝達はヒトの癌に最も頻繁に見られる変化の１つであり、腫瘍形成および転移に重要な役割を果たしている[Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289-300]。
【０００５】
不適切なｃＭｅｔの活性化は、ｃＭｅｔの過剰発現を含むリガンド依存的および非依存的機構、および／またはパラ分泌または自己分泌の活性化、または機能的突然変異における増分により起こり得る[J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226:1-26]。しかしながら、ＡＴＰおよびチロシン含有ペプチド基質に対するキナーゼの結合親和性および結合速度を調節するには、リガンドの存在下または不在下でのｃＭｅｔ受容体のオリゴマー化が必要である[Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17, 43:10570-8]。活性化されたｃＭｅｔは、細胞質ドメインに位置するそのマルチドッキング部位(multidocking site)にシグナル伝達エフェクターを動員し、その結果、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＳｒｃおよびＳｔａｔ３を含むいくつかの重要なシグナル伝達経路が活性化される[Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]。これらの経路は腫瘍細胞の増殖、浸潤および脈管形成に、また、アポトーシスの回避に不可欠である[Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H, Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3): 122-30; Fan S, Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q, Cao Y, Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Apr 27, 19(18):2212-23]。さらに、他のＲＴＫに比べてｃＭｅｔシグナル伝達のユニークな一面は、その報告されている、焦点接着複合体(focal adhesion complexes)およびα６β４インテグリン[Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54]、ＣＤ４４ｖ６[Van der Voort R, Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M, Prevo R, Smit L, David G, Hartmann G, Gherardi E, Pals ST, J Biol Chem. 1999, 274(10):6499-506]、プレキシンＢ１またはセマフォリン[Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D, Tamagnone L, Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P, Valdembri D, Corso S, Serini G, Tamagnone L, Comoglio PM, Bussolino F, Giordano S, Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004, 23:5131-7]などの非キナーゼ結合相手との相互作用であり、これらがこの受容体による細胞機能の調節の複雑性にさらに加わる。最後に、最近のデータは、ｃＭｅｔが腫瘍のゲフィチニブまたはエルロチニブ耐性に関与している可能性があることを示し、ＥＧＦＲとｃＭｅｔの双方を標的とする化合物の組合せが極めて重要となり得ることを示唆している[Engelman JA at al., Science, 2007, 316:1039-43]。
【０００６】
ここ数年で、癌細胞系統においてｃＭｅｔのシグナル伝達を減弱するために多くの異なる戦略が開発されてきた。これらの戦略は、ｉ）ｃＭｅｔまたはＨＧＦ／ＳＦに対する抗体の中和[Cao B, Su Y, Oskarsson M, Zhao P, Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(13):7443-8; Martens T, Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R, Merchant M, Schwall R, Westphal M, Lamszus K, Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52]またはｃＭｅｔへのリガンドの結合を防ぐためのＨＧＦ／ＳＦアンタゴニストＮＫ４の使用[Kuba K, Matsumoto K, Date K, Shimura H, Tanaka M, Nakamura T, Cancer Res., 2000, 60:6737-43]、ｉｉ）キナーゼ活性を遮断するｃＭｅｔに対する小ＡＴＰ結合部位阻害剤[Christensen JG, Schreck R, Burrows J, Kuruganti P, Chan E, Le P, Chen J, Wang X, Ruslim L, Blake R, Lipson KE, Ramphal J, Do S, Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55]、ｉｉｉ）マルチドッキング部位への接近を妨げる、操作されたＳＨ２ドメインポリペプチドおよび受容体またはリガンドの発現を低下させるＲＮＡｉまたはリボザイムを含む。これらのアプローチのほとんどは、腫瘍阻害をもたらすｃＭｅｔの選択的阻害を示し、ｃＭｅｔが癌における治療的介入に重要となり得ることを示す。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、腫瘍形成性障害、特に、ｃＭｅｔの発現を特徴とするもの、または異常なｃＭｅｔ発現によって媒介されるものを検出および／またはモニタリングするための診断または予後バイオマーカーとして使用することができる少なくとも１つの試薬を提供することを目的とする。
【０００８】
診断または予後ツールとして使用することができる価値ある抗体を開発する試みはこれまでに報告されていない。本明細書には、この基準を満たす新規な抗体が記載される。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および実施例から明らかになる。
【００１０】
第一の態様において、本発明の対象は、ｃＭｅｔ受容体（ｃＭｅｔ）、好ましくは、ヒトｃＭｅｔと高い親和性で結合し、よって、ｃＭｅｔ発現によって媒介される病的過増殖性腫瘍形成性障害を診断する方法において有用である、単離された抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体である。
【００１１】
「機能的フラグメントおよび／または誘導体」とは、本明細書の以降で詳細に定義する。
【００１２】
ここで、本発明は天然型の抗体に関連するものではなく、すなわち、それらはそれらの天然環境になく、天然源から精製により単離または取得することができた、あるいはまた遺伝子組換えによって、もしくは化学合成によって取得することができたものであり、従って、さらに記載されているように、非天然アミノ酸を含み得るものと理解されるべきである。
【００１３】
より詳しくは、本発明の別の態様によれば、ｃＭｅｔと特異的に結合することができる単離された抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つに向けられ、該抗体は、配列番号１〜１２もしくは２９〜３９のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲ、またはその配列が最適なアライメントの後に配列１〜１２もしくは２９〜３９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲから選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなることを特徴とする。
【００１４】
抗体の「機能的フラグメント」とは、特に、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは、単鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディー、または半減期が延長されているフラグメントなどの抗体フラグメントを意味する。このような機能的フラグメントは、本明細書の以降で詳細に記載する。
【００１５】
抗体の「誘導化合物」または「誘導体」とは、特に、ペプチドスキャフォールドからなる結合タンパク質と、その被認識能を維持するために元の抗体の少なくとも１つのＣＤＲから構成される結合タンパク質を意味する。このような誘導化合物は当業者によく知られており、本明細書の以降でより詳しく記載する。
【００１６】
より好ましくは、本発明は、遺伝子組換または化学合成によって得られた、本発明による抗体、それらの誘導化合物またはそれらの機能的フラグメントを含んでなる。
【００１７】
好ましい実施形態によれば、本発明による抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
【００１８】
「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均質な抗体集団から得られる抗体を意味するものと理解される。より詳しくは、集団の個々の抗体は、最小の割合で見られる自然に起こるわずかな潜在的突然変異以外は同じである。言い換えれば、モノクローナル抗体は、単一細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核生物宿主細胞、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核生物宿主細胞など）の増殖から得られ、一般に、１つの単一のクラスおよびサブクラスの重鎖と単一のタイプの軽鎖を特徴とする均質な抗体からなる。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原に向けられる。さらに、一般に種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに向けられる。
【００１９】
ここで、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、それらはそれらの天然環境から採取されたものではなく、天然源から精製により単離または取得することができた、あるいは遺伝子組換えまたは化学合成によって取得することができたものであり、従って、以下に記載されるように、非天然アミノ酸を含み得るものと理解される。
【００２０】
本発明の第一および好ましい実施形態では、抗体のＣＤＲはＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義される。
【００２１】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体、鎖型または種が何であれ、可変ドメインを比較するために定義された[Lefranc M. -P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。このＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は常に同じ位置であり、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番の標準境界決定を提供する。ギャップは非占有位置に相当するので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧の中に示され、ドットで区切られる、例えば［８．８．１３］）は極めて重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼ばれる２Ｄグラフで、また、ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造で用いられる。
【００２２】
３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲがある。本明細書においてＣＤＲとは、場合によって、抗体と、その抗体が認識する抗原またはエピトープとの親和性によって結合を担うアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つ、またはいくつか、さらには全部を示すために用いられる。
【００２３】
より詳しくは、第一の態様によれば、本発明は、ｉ）ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義される、次のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも１つを含んでなる重鎖（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号５５の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５６の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号５７の配列を含んでなる）；および／またはｉｉ）ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義される、次のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つを含んでなる軽鎖（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５８の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号５９の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号６０の配列を含んでなる）を含んでなる、ｃ−Ｍｅｔタンパク質と特異的に結合することができる単離された抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体に関する。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明は、ｉ）少なくとも次の３つのＣＤＲ、すなわち、ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号５５の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５６の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号５７の配列を含んでなる）を含んでなる重鎖；および／またはｉｉ）少なくとも次の３つのＣＤＲ、すなわち、ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５８の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号５９の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号６０の配列を含んでなる）を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする、ｃ−Ｍｅｔタンパク質と特異的に結合することができる単離された抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体に関する。
【００２５】
明瞭にするために、本発明の配列番号５５〜６０のコンセンサス配列を下表１にまとめる。
【表１】
0005951486.tif 000002
ここで、
Ｘ１：ＳまたはＴ    Ｘ２：ＩまたはＦ    Ｘ３：Ａまたは−    Ｘ４：ＦまたはＷ
Ｘ５：ＹまたはＰ    Ｘ６：ＤまたはＳ    Ｘ７：−またはＮ    Ｘ８：ＴまたはＲ
Ｘ９：ＮまたはＴ    Ｘ１０：ＴまたはＡ    Ｘ１１：ＤまたはＲ    Ｘ１２：ＲまたはＶ
Ｘ１３：ＴまたはＧ    Ｘ１４：ＦまたはＹ    Ｘ１５：ＡまたはＬ    Ｘ１６：−またはＭ
Ｘ１７：−またはＤ    Ｘ１８：Ｑまたは−    Ｘ１９：ＲまたはＳ    Ｘ２０：ＩまたはＳ
Ｘ２１：ＹまたはＶ    Ｘ２２：ＮまたはＳ    Ｘ２３：ＹまたはＤ    Ｘ２４：ＡまたはＴ
Ｘ２５：ＳまたはＷ    Ｘ２６：ＷまたはＮ    Ｘ２７：ＬまたはＰ
「−」は、「不在」を意味する（この位置でのアミノ酸残基の欠失）
【００２６】
特定の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号７の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号２の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号８の配列を含んでなる）を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００２７】
特定の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号４の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号５の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号６の配列を含んでなる）を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００２８】
特定の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号２９の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号３０の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３１の配列を含んでなる）を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００２９】
特定の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号３２の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号３３の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３４の配列を含んでなる）を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００３０】
言い換えれば、本発明は、また、
ａ）ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号７の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖、および
ｂ）ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号２９の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖
からなる群から選択される重鎖を含んでなることを特徴とする抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体ということもできる。
【００３１】
本発明は、また、
ａ）ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖、および
ｂ）ＩＭＧＴナンバリング体系に従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号３２の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖
からなる群から選択される軽鎖を含んでなることを特徴とする抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体ということもできる。
【００３２】
もう１つの実施形態では、相補性決定領域またはＣＤＲとは、Kabat ら (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991,および後続版)によって定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲがある。本明細書において「ＣＤＲ」とは、場合によって、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の結合親和性を担うアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１以上、またはさらには全部を示すために用いられる。
【００３３】
別の特定の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、Ｋａｂａｔによって定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号９の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号１０の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３の配列を含んでなる）を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００３４】
別の特定の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、Ｋａｂａｔによって定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１１の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号１２の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号６の配列を含んでなる）を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００３５】
別の特定の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、Ｋａｂａｔナンバリング体系によって定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号３５の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号３６の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３７の配列を含んでなる）を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００３６】
別の特定の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、Ｋａｂａｔナンバリング体系によって定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号３８の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号３９の配列を含んでなり、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３４の配列を含んでなる）を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００３７】
本発明による抗体のＣＤＲを定義する別法は、ＩＭＧＴとＫａｂａｔに従って各ＣＤＲの共通残基を決定することからなることができる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、配列番号１、２もしくは３の配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも１つ、または最適なアライメントの後に配列番号１、２もしくは３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つの配列を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００３８】
より詳しくは、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、配列番号４、５もしくは６の配列の３つのＣＤＲのうち少なくとも１つ、または最適なアライメントの後に配列番号４、５もしくは６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つの配列を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００３９】
好ましい様式では、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、７、９、２９もしくは３５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１、７、９、２９もしくは３５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、１０、３０もしくは３６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２、１０、３０もしくは３６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり、かつ、
ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３、８、３１もしくは３７の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３、８、３１もしくは３７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる）
を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
【００４０】
さらにより好ましくは、本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、次の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号４、１１、３２もしくは３８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４、１１、３２もしくは３８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号５、１２、３３もしくは３９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５、１２、３３もしくは３９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり、かつ、
ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号６もしくは３４の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６もしくは３４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる）
を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
【００４１】
さらに別の実施形態では、本発明は、
ａ）
ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号７の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、
ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と
を含んでなる抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体；および
ｂ）
ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号２９の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と
ＩＭＧＴに従って定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号３２の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と
を含んでなる抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体
からなる群から選択されることを特徴とする抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体として記載することができる。
【００４２】
本明細書において、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」および「抗体化合物またはそれらの配列と結合したタンパク質」という用語は互換的である。
ここで、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、それらはそれらの天然環境から採取されたものではなく、天然源から精製により単離または取得することができた、あるいは遺伝子組換えまたは化学合成によって取得することができたものであり、従って、以下に記載されるように、非天然アミノ酸を含み得るものと理解される。
【００４３】
さらに明瞭にするために、以下の記載では、より詳しくは、表３ａおよび４ａでは、２２４Ｄ１０と呼ばれる抗体のＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリング、ｋａｂａｔナンバリングおよび共通ナンバリングによって定義されると理解されるべきである。
【００４４】
共通ナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリング体系とＫａｂａｔナンバリング体系によって定義されるＣＤＲに共通である、各ＣＤＲの残基部分を再編成する。
【００４５】
ＩＭＧＴナンバリング体系は、定義されるようなＩＭＧＴ体系に従ってＣＤＲを定義し、ｋａｂａｔナンバリング体系は、上記に定義されるｋａｂａｔ体系に従ってＣＤＲを定義する。
【００４６】
より詳しくは、ＣＤＲ−Ｈ１は、共通ナンバリング体系では配列番号１(TSAYF)、ＩＭＧＴナンバリング体系では配列番号７(GYSITSAYF)、そしてｋａｂａｔナンバリング体系では配列番号９(TSAYFWS)からなる。
【００４７】
ＣＤＲ−Ｈ２は、共通ナンバリング体系およびＩＭＧＴナンバリング体系では配列番号２(INYDGTN)、そしてｋａｂａｔナンバリング体系では配列番号１０(FINYDGTNNYNPSLKN)からなる。
ＣＤＲ−Ｈ３は、共通ナンバリング体系およびｋａｂａｔナンバリング体系では配列番号３(DRTFAY)からなるが、ＩＭＧＴナンバリング体系では配列番号８(TRDRTFAY)からなる。
軽鎖について、ＣＤＲ−Ｌ１は、共通ナンバリング体系およびＩＭＧＴナンバリング体系では配列番号４(QRIYNY)、そしてｋａｂａｔナンバリング体系では配列番号１１(RASQRIYNYLH)からなる。
ＣＤＲ−Ｌ２については、共通ナンバリング体系およびＩＭＧＴナンバリング体系では配列番号５(YAS)、そしてｋａｂａｔナンバリング体系では配列番号１２(YASQSIS)からなる。
最後に、ＣＤＲ−Ｌ３は、３つのナンバリング体系のそれぞれで配列番号６(QQSNSWPLT)からなる。
【００４８】
当業者ならば、抗体２２１Ｃ９についても同じことを容易に行うことができる。
これとともに、さらに明瞭にするために、以下の記載では、より詳しくは、表３ｂおよび４ｂでは、２２１Ｃ９と呼ばれる抗体のＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングおよびｋａｂａｔナンバリングによって定義されると理解されるべきである。
【００４９】
本発明の意味において、２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」は、最適なアライメントの後に得られる、比較する２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは単に統計的なものであり、２つの配列間の違いはそれらの全長にわたってランダムに分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、それらを最適にアラインした後にこれらの配列を比較することにより慣行するが、この比較はセグメントによるか、または「アライメントウィンドウ」を用いて行うことができる。比較のための配列の最適アライメントは、手作業の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、これらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐ比較ソフトウエア）の手段によって行うことができる。
【００５０】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、最適な方法でアラインしたこれら２つの配列を比較することにより決定され、比較される核酸またはアミノ酸配列は、これらの２配列間の最適なアライメントのために、参照配列に対して付加または欠失を含み得る。同一性パーセンテージは、２配列間でアミノ酸またはヌクレオチド残基が同一である位置の数を求め、この同一の位置の数をアライメントウィンドウの位置の総数で割り、得られた結果に１００を掛け、これらの２配列間の同一性パーセンテージを得ることにより算出される。
【００５１】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで入手できるＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250)を、デフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、「エクステンションギャップペナルティー」：２；選択されるマトリックスは、例えば、このプログラムにより提案されているマトリックス「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」である）とともに使用することができ、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムにより直接算出される。
【００５２】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列の好ましい例としては、参照配列、ある種の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長が挙げられる。１以上の連続的または非連続的アミノ酸の置換の場合、被置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換えられる置換が好ましい。ここで「等価なアミノ酸」とは、対応する抗体の生物活性を改変せずに構造アミノ酸の１つで置換され得る任意のアミノ酸を示すものとし、これらの具体例は以下に定義される。
【００５３】
等価なアミノ酸は、それらに代わるアミノ酸との構造的相同性か、または実施可能な種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果のいずれかによって決定することができる。
【００５４】
限定されない例として、下表２に対応する改変抗体の生物活性の著しい改変を生じさせることなく実施可能な置換の可能性をまとめる。もちろん、同じ条件で逆の置換も可能である。
【表２】
0005951486.tif 000003
【００５５】
当業者には、当技術分野の現状において、これら６つのＣＤＲ間の最大変動（長さおよび組成）は、３つの重鎖ＣＤＲに、より詳しくは、この重鎖のＣＤＲ−Ｈ３に見られることが知られている。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明は、ネズミ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【００５７】
本発明の別の実施形態は、ＣＤＲの「共通」定義に基づいて、次の３つのＣＤＲ：
配列番号１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる重鎖と、次の３つのＣＤＲ：
配列番号４の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；および
配列番号６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖とを含んでなる抗体２２４Ｄ１０、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つを開示する。
【００５８】
本発明のさらに別の実施形態は、ＩＭＧＴナンバリング体系に基づいて、次の３つのＣＤＲ：
配列番号７の配列、または最適なアライメントの後に配列番号７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる軽鎖と、次の３つのＣＤＲ：
配列番号４の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；および
配列番号６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖とを含んでなる抗体２２４Ｄ１０、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つを開示する。
【００５９】
本発明のさらに別の実施形態は、Ｋａｂａｔナンバリング体系に基づいて、次の３つのＣＤＲ：
配列番号９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号１０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、次の３つのＣＤＲ：
配列番号１１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号１２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；および
配列番号６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖とを含んでなる抗体２２４Ｄ１０、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つを開示する。
【００６０】
本発明による抗体２２４Ｄ１０、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、「共通」ナンバリング体系に従って、
配列番号１の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、
配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と
を含んでなることを特徴とする。
【００６１】
別の実施形態では、本発明による抗体２２４Ｄ１０、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従って、
配列番号７の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、
配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と
を含んでなることを特徴とする。
【００６２】
別の実施形態では、本発明による抗体２２４Ｄ１０、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、Ｋａｂａｔナンバリング体系に従って、
配列番号９の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０の配列のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、
配列番号１１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と
を含んでなることを特徴とする。
【００６３】
さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体２２４Ｄ１０、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号１３のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号１３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列を含んでなること；および／または配列番号１４のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号１４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン配列を含んでなることを特徴とする。
【００６４】
より詳しくは、本発明の抗体、その誘導化合物またはその機能的フラグメントは、
ａ）最適なアライメントの後に配列番号１３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列可変ドメイン、および／または最適なアライメントの後に配列番号１４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン配列を含んでなり；かつ
ｂ）該抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体が、
ｃ−Ｍｅｔタンパク質と特異的に結合することができ、好ましくは、
リガンドＨＧＦの、ｃ−Ｍｅｔタンパク質への結合を遮断しない
ことを特徴とする。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、次の３つのＣＤＲ：
配列番号２９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号３０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号３１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる重鎖と、次の３つのＣＤＲ：
配列番号３２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号３３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；およ
配列番号３４の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖とを含んでなる抗体２２１Ｃ９、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つを開示する。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態は、次の３つのＣＤＲ：
配列番号３５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号３６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；および
配列番号３７の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる軽鎖と、次の３つのＣＤＲ：
配列番号３８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号３９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＤＲ−Ｌ２；および
配列番号３４の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖とを含んでなる抗体２２１Ｃ９、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つを開示する。
【００６７】
言い換えれば、本発明による単離された抗体２２１Ｃ９、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従って、
配列番号２９の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０の配列のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３１の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と
配列番号３２の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３４の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と
を含んでなることを特徴とする。
【００６８】
別の実施形態では、本発明による単離された抗体２２１Ｃ９、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の１つは、Ｋａｂａｔナンバリング体系に従って、
配列番号３５の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３６の配列のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３７の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、
配列番号３８の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３４の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖と
を含んでなることを特徴とする。
【００６９】
さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体２２１Ｃ９、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号４０のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号４０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列を含んでなることを特徴とし、かつ／または配列番号４１のアミノ酸配列、または最適なアライメントの後に配列番号４１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン配列を含んでなることを特徴とする。
【００７０】
より詳しくは、本発明の抗体、その誘導化合物またはその機能的フラグメントは、
ａ）最適なアライメントの後に配列番号４０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列、および／または最適なアライメントの後に配列番号４１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン配列を含んでなり、かつ、
ｂ）該抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体が、
ｃ−Ｍｅｔタンパク質と特異的に結合することができ、好ましくは、
リガンドＨＧＦの、ｃ−Ｍｅｔタンパク質への結合を遮断しない
ことを特徴とする。
【００７１】
言い換えれば、本発明はまた、
ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体、および
ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと、配列番号４１のアミノ酸配列を含んでなる配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体
からなる群から選択されることを特徴とする抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体として記載することができる。
【００７２】
上記に見られるように、本発明はまた、本発明に記載される抗体に由来する化合物に関する。
【００７３】
より詳しくは、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、該誘導化合物が、最初の抗体のパラトープ認識特性の全部または一部を保存するために少なくとも１つのＣＤＲがグラフトされたペプチドスキャフォールド(scaffold)を含んでなる結合タンパク質からなることを特徴とする。
【００７４】
本発明に記載される６つのＣＤＲ配列のうち１以上の配列を、種々の免疫グロブリンタンパク質スキャフォールド上に提供することができる。この場合、このタンパク質配列は、グラフトされたＣＤＲの折りたたみに好適なペプチド主鎖の再生産を可能とし、これにより、それらのパラトープ抗原認識特性を保持できるようになる。
【００７５】
一般に、当業者であれば、元の抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲをグラフトするためのタンパク質スキャフォールドのタイプをどのように決定するかが分かる。より詳しくは、選択されるこのようなスキャフォールドが次のような基準の最大数を満たすべきであることが知られている(Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13, 167-187)。
・良好な系統発生的保存
・周知の三次元構造（例えば、結晶学またはＮＭＲ分光法または当業者に公知の他の任意の技術による）
・小型
・翻訳後修飾がほとんど無いか、全く無いこと
・生産、発現および精製が容易であること
【００７６】
このようなタンパク質スキャフォールドの起源は、限定されるものではないが、フィブロネクチン、好ましくは、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１０、リポカリン、アンチカリン(Skerra A., J. Biotechnol, 2001, 74(4):257-75)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のタンパク質ＡのドメインＢに由来するタンパク質Ｚ、チオレドキシンＡまたは「アンキリンリピート」(Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705)、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などのリピートモチーフを有するタンパク質から選択される構造であり得る。
【００７７】
例えば、サソリ、昆虫、植物または軟体動物などの毒素のような毒素および神経ＮＯシンターゼ（ＰＩＮ）のタンパク質阻害剤に由来するスキャフォールドに由来するも挙げておくべきであろう。
【００７８】
このようなハイブリッド構築の例として、限定されるものではないが、抗ＣＤ４抗体、すなわち、１３Ｂ８．２のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）の、ＰＩＮのループの１つへの挿入が挙げられ、このようにして得られた新たな結合タンパク質は、元の抗体と同じ結合特性を保存している(Bes et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343(1), 334-344)。また、抗リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）の、ネオカルジノスタチンのループの１つへのグラフトも、単に例として挙げられる(Nicaise et al., Protein Science, 2004, 13(7):1882-1891)。
【００７９】
最後に、上述のように、このようなタンパク質スキャフォールドは元の抗体に由来する１〜６のＣＤＲを含んでなることができる。好ましくは、限定されるものではないが、当業者ならば重鎖から少なくとも１つのＣＤＲを選択することができる（重鎖は主として抗体の特異性を担うことが知られている）。１以上の適切なＣＤＲの選択は当業者には自明であり、そして、当業者ならば好適な既知の技術を選択することができる(Bes et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74)。
【００８０】
よって、本発明は、ペプチドスキャフォールドが、ａ）系統発生的によく保存されており、ｂ）堅牢な構造であり、ｃ）周知の３Ｄ分子構成を有し、ｄ）小型であり、かつ／またはｅ）安定性を変化させることなく、欠失および／または挿入によって改変可能な領域を含んでなるタンパク質の中から選択されることを特徴とする、抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメンに関する。
【００８１】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、該ペプチドスキャフォールドが、ｉ）フィブロネクチン、有利にはフィブロネクチン３型ドメイン１０、リポカリン、アンチカリン、黄色ブドウ球菌のタンパク質ＡのドメインＢに由来するタンパク質Ｚ、チオレドキシンＡまたは「アンキリンリピート」(Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705) 、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などのリピートモチーフを有するタンパク質に由来するスキャフォールド、またはｉｉｉ）神経ＮＯシンターゼ（ＰＩＮ）のタンパク質阻害剤の中から選択されることを特徴とする。
【００８２】
本発明の別の態様は、上記の抗体の機能的フラグメントに関する。
より詳しくは、本発明は、該機能的フラグメントがＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントおよびダイアボディー、ペグ化フラグメントなどの半減期が延長されているいずれかのフラグメントの中から選択されることを特徴とする抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを対象とする。
【００８３】
本発明による抗体のこのような機能的フラグメントは、例えば、特に、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは、単鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディー、またはポリエチレングリコール（ペグ化）（ペグ化フラグメントは、Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧおよびＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）などのポリアルキレングリコールの付加などの化学修飾により、またはリポソーム、ミクロスフェアもしくはＰＬＧＡへの組み込みによりその半減期が延長されているいずれかのフラグメントからなり、該フラグメントは、特に、それが由来している抗体の活性を部分的にでも、一般的な様式で発揮し得るという点で、本発明の特徴的なＣＤＲを少なくとも１つ有する。
【００８４】
好ましくは、該機能的フラグメントは、それらが由来している抗体の可変重鎖または軽鎖の部分的配列を含んでなるか、またはそれを含み、該部分的配列は、それが由来している抗体と同じ結合特異性と、十分な親和性、好ましくは、それが由来している抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましくは少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するに十分なものである。
【００８５】
このような機能的フラグメントは、それが由来している抗体の配列の少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは、６、７、８、１０、１５、２５、５０または１００個の連続するアミノ酸を含む。
【００８６】
好ましくは、これらの機能的フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型またはダイアボディーのフラグメントであり、一般に、それが由来している抗体と同じ結合特異性を有する。本発明によれば、本発明のフラグメントは、上記の抗体から、ペプシンまたはパパインを含む酵素消化および／または化学的還元によるジスルフィド橋の切断によるなどの方法によって得ることができる。これらの抗体フラグメントはまた、これもまた当業者に公知の遺伝子組換え技術によって、あるいは例えば、Applied Biosystems社などによって販売されているものなどの自動ペプチド合成装置の手段によるペプチド合成によって得ることもできる。
【００８７】
より明瞭となるように、下表３ａに本発明の抗体２２４Ｄ１０に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる。
表３ａ（ここで、Ｍｕはネズミを表す）
【表３】
0005951486.tif 000004
【００８８】
より明瞭とするために、下表３ｂに本発明の抗体２２１Ｃ９に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる。
表３ｂ（ここで、Ｍｕはネズミを表す）
【表４】
0005951486.tif 000005
【００８９】
別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌することができるネズミハイブリドーマ、特に、２００８年３月１２日にＩ−３９４９番としてCNCM, Institut Pasteur, Paris, Franceに寄託されたネズミ起源のハイブリドーマに関する。該ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４系統細胞の融合によって得られた。
【００９０】
該抗体が２００８年３月１２日にＩ−３９４９番としてＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌されることを特徴とする、本明細書で２２４Ｄ１０と呼ばれるモノクローナル抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、明らかに本発明の一部をなす。
【００９１】
別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌することができるネズミハイブリドーマ、特に、２０１０年１月１４日にＩ−４２７３番としてCNCM, Institut Pasteur, Paris, Franceに寄託されたネズミ起源のハイブリドーマに関する。該ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ系統細胞の融合によって得られた。
【００９２】
該抗体が２０１０年１月１５日にＩ−４２７３番としてＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌されることを特徴とする、本明細書で２２１Ｃ９と呼ばれるモノクローナル抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、明らかに本発明の一部をなす。
【００９３】
本発明の新規な態様は、次の核酸：
ａ）本発明による抗体またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントをコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｂ）配列番号１５〜２６および４２〜５２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１５〜２６および４２〜５２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含んでなるＤＮＡ配列を含んでなる核酸；
ｃ）配列番号２７、２８、５３および／または５４の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２７、２８、５３および／または５４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなるＤＮＡ配列を含んでなる核酸；
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に定義される核酸の対応するＲＮＡ核酸；
ｅ）ａ）、ｂ）およびｃ）に定義される核酸の相補的核酸；および
ｆ）高ストリンジェント条件下で、配列番号１５〜２８および４２〜５４の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１５〜２８および４２〜５４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列、またはその相補的配列のＣＤＲの少なくとも１つとハイブリダイズすることができる少なくとも１８のヌクレオチドの核酸
から選択されることを特徴とする、単離された核酸に関する。
【００９４】
下表４ａに本発明の抗体２２４Ｄ１０に関する種々のヌクレオチド配列をまとめる。
表４ａ
【表５】
0005951486.tif 000006
【００９５】
下表４ｂに本発明の抗体２２１Ｃ９に関する種々のヌクレオチド配列をまとめる。
表４ｂ
【表６】
0005951486.tif 000007
【００９６】
「核酸」、「核酸配列(nucleic sequence)」、「核酸配列(nucleic acid sequence)」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、本明細書において互換的に用いられ、改変または非改変型の、核酸のフラグメントまたは領域を定義し、非天然ヌクレオチドを含有する、または含有しない、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはこれらのＤＮＡの転写産物のいずれかである、ヌクレオチドの正確な配列を意味する。
【００９７】
ここでまた、本発明はそれらの天然の染色体環境、すなわち自然状態のヌクレオチド配列に関するものではないと理解される。本発明の配列は単離および／または精製されたものであり、すなわち、それらは、少なくとも部分的に改変されたそれらの環境から、例えばコピーによって直接的または間接的にサンプリングされたものである。ここでまた、例えば宿主細胞の手段による遺伝子組換えによって得られた、または化学合成によって得られた単離された核酸を記載しておくべきであろう。
【００９８】
「最適なアライメントの後に好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性パーセンテージを示す核酸配列」とは、参照核酸配列に対して、特に、欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または置換、特に規則的なものなどの特定の改変を示す核酸配列を意味する。好ましくは、これらは参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列（これは遺伝コードの縮重に関連する）、または好ましくは高ストリンジェント条件下、特に以下に定義される条件下で、参照配列と特異的にハイブリダイズし得る遺伝コードまたは相補的配列である。
【００９９】
高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度に関する条件が、２つの相補的ＤＮＡフラグメント間でハイブリダイゼーションを維持させるように選択されることを意味する。単に例であるが、上記のポリヌクレオチドフラグメントを定義するためのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェント条件は以下のものが有利である。
【０１００】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブ長に応じた温度（すなわち、プローブ＞１００ヌクレオチド長の場合は４２℃）で２０時間の本ハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０℃、２０分の洗浄２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０℃、２０分の洗浄１回、という二段階で行う。最後の洗浄は、プローブ＞１００ヌクレオチド長の場合は６０℃で３０分間、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で行う。定義されたサイズのポリヌクレオチドに関する上記の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、当業者ならば、Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001)に記載の手順に従って、より長いまたは短いオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
【０１０１】
本発明はまた、本発明に記載される核酸を含んでなるベクターに関する。
【０１０２】
本発明は、特に、このようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを対象とする。
【０１０３】
本発明のベクターは好ましくは、所定の宿主細胞でのヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とする要素を含む。従って、ベクターはプロモーター、翻訳開始シグナルおよび終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含むこととなる。ベクターは宿主細胞で安定に維持される必要があり、所望により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを有することができる。これらの種々の要素は、当業者により、用いる宿主細胞に従って選択および至適化される。この趣意で、これらのヌクレオチド配列は選択された宿主内の自己複製ベクターに挿入することができ、または選択された宿主の組込型ベクターであり得る。
【０１０４】
このようなベクターは当業者により一般に用いられる方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学的方法などの標準的な方法によって好適な宿主に導入することができる。
【０１０５】
これらのベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは、本発明のヌクレオチド配列のクローニングまたは発現のために宿主細胞を形質転換するのに用いられる。
【０１０６】
本発明はまた、本発明に記載されるベクターにより形質転換された、または本発明に記載されるベクターを含んでなる宿主細胞を含んでなる。
【０１０７】
宿主細胞は原核生物系または真核生物系、例えば、細菌細胞、あるいはまた酵母細胞もしくは動物細胞、特に、哺乳類細胞から選択することができる。また、昆虫細胞または植物細胞を用いることもできる。
【０１０８】
本発明はまた、本発明に従って形質転換された細胞を含む、ヒト以外の動物に関する。
本発明の別の態様は、本発明による抗体またはその機能的フラグメントの１つの生産方法であって、
ａ）本発明による宿主細胞を培地中、好適な培養条件で培養する工程；および
ｂ）このようにして生産された該抗体またはその機能的フラグメントの１つを培養培地または該培養細胞から回収する工程
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【０１０９】
本発明に従って形質転換された細胞は、本発明による組換えポリペプチドの製造方法で用いられる。本発明によるベクターおよび／またはベクターによって形質転換された細胞を用いることを特徴とする、本発明によるポリペプチドの組換え型での製造方法も本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターによって形質転換された細胞は、該ポリペプチドの発現および該組換えペプチドの回収を可能とする条件下で培養される。
【０１１０】
既に述べたように、宿主細胞は原核生物系または真核生物系から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系で分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を同定することができる。従って、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌を意図した組換えタンパク質の生産のために有利に使用することができる。実際、目的のこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞の内部よりもむしろ細胞培養の上清中に存在するという事実により容易となる。
【０１１１】
また、本発明によるポリペプチドは化学合成によって製造することもできる。このような製造方法もまた本発明の課題である。当業者ならば、固相技術[特にSteward et al, 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.参照]、または部分的固相技術、または溶液中でのフラグメントの縮合もしくは慣例の合成によるなどの、化学合成法を知っている。化学合成によって得られ、対応する非天然アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた本発明に含まれる。本発明の方法によって得ることができる抗体またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントもまた本発明に含まれる。
【０１１２】
本発明の抗体のバイオマーカーとしての使用もまた開示される。これらの方法は、限定されるものではないが、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、膠芽腫、結腸、癌、胃癌、腎臓癌またはｃＭｅｔの発現に関連する他の任意の癌によって例示される、ｃＭｅｔの発現に関連する種々の過増殖性腫瘍形成性障害(hyperproliferative oncogenic disorder)を検出または診断するために使用され得る。当業者によって認識されるように、特定の障害に関連する抗体発現のレベルは、既存の症状の性質および／または重篤度によって異なる。
【０１１３】
本発明の抗体の、当業者に公知の慣行法（例えば、局所、非経口、筋肉内など）での投与は、サンプル中の異形成細胞を検出する、また、医師がｃＭｅｔの発現に関連するか、またはｃＭｅｔの発現により媒介される過増殖性障害の処置を受けている患者の治療計画をモニタリングできる極めて有用な方法を提供する。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明は、標識され、かつ、in vivoでｃＭｅｔと結合する上記モノクローナル抗体またはそのフラグメントと薬学上許容される担体とを含んでなる、ｃＭｅｔの発現に関連する腫瘍形成性障害のin vivo画像法のための医薬組成物に関する。
【０１１５】
本発明の抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体は、ｃＭｅｔの発現に関連する種々の病態の検出、診断および病期分類を含む種々の医療目的または研究目的に使用が見出せる。
【０１１６】
病期決定は潜在的予後の価値を持ち、最適な療法を計画するための基準を提供する。Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)。一般に、例えば乳癌の病理学的病期分類は、より精度の高い予後が得られるので、臨床学的病期分類よりも好ましい。しかしながら、臨床学的病期分類は、病理学的評価用の組織を得るために侵襲的手法に依存しないことから、病理学的病期分類と同等の精度があったとすれば望ましい。
【０１１７】
本発明の抗体は、好適な標識または他の適当な検出可能な生体分子または化学物質と併用すると、in vitroおよびin vivo診断および予後適用に特に有用である。
【０１１８】
イムノアッセイに使用するための標識は当業者に一般に公知であり、酵素、放射性同位元素、ならびに蛍光、発光および発色物質（金コロイドまたはラテックスビーズなどの有色粒子を含む）が挙げられる。好適なイムノアッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。以下に示されるものなど、種々の標識およびその標識を本発明の抗体とコンジュゲートする方法が当業者に周知である。
【０１１９】
本明細書において「ｃＭｅｔの発現に関連する腫瘍形成性障害」とは、障害に罹患している被験体における高レベルまたは異常に低いレベルのｃＭｅｔの存在（異常）が、その障害の病因を担っているかもしくはその障害の増悪に寄与する因子であることが示されているか、あるいはそうであることが疑われる疾患および他の障害を含むものとする。あるいは、このような障害は、例えば、細胞表面のｃＭｅｔレベルの増加またはその障害に罹患している被験体の罹患細胞または組織におけるチロシン自己リン酸化ｃＭｅｔの増加を証拠とすることができる。ｃＭｅｔレベルの増加は、例えば本発明の抗体２２４Ｄ１０を用いて検出することができる。さらに、それは比較的自律的増殖を示す細胞を意味し、そのため、それらは細胞増殖の制御の著しい欠損を特徴とする異常な増殖表現型を呈する。あるいは、これらの細胞は正常なレベルのｃＭｅｔを発現しながら異常な増殖を示す場合もある。
【０１２０】
特定の実施形態では、ｃＭｅｔに関して「発現の増加」とは、対照に比べて統計的に有意な発現増加（ＲＮＡ発現またはタンパク質発現によって測定される）を示すタンパク質または遺伝子発現レベルを意味する。
より詳しくは、ｃＭｅｔの発現に関連する腫瘍形成性障害をin vitroにおいて診断するため、またはｃＭｅｔの発現に関連する腫瘍形成性障害、例えば、ｃＭｅｔの発現に関連する癌の発症の予後をin vivoにおいて決定するための、記載されているような本発明による抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の使用が意図される。
【０１２１】
本発明に従ってもう１つの広義の態様は、被験体において、病的な過増殖性腫瘍形成性障害またはｃＭｅｔの発現に関連する病態に対する感受性を診断する方法であって、サンプル中のｃＭｅｔ保持細胞の有無を決定すること、および該ｃＭｅｔ保持細胞の有無に基づいて病態または病態に対する感受性を診断することを含んでなる方法に関する。本発明の抗体の診断上の使用は、原発腫瘍、癌転移を含んでなる。抗体は、検出可能、かつ／または定量可能なシグナルを得るために免疫複合体または標識抗体の形態で存在することができる。
【０１２２】
より詳しくは、本発明による好ましい１つの課題は、被験体においてｃＭｅｔ発現腫瘍の存在および／または場所をin vitroにおいて検出するプロセスであり、該プロセスは、被験体からのサンプルを本発明による抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、および（ｂ）該抗体とサンプルとの結合を検出する工程を含んでなる。この課題の別の態様は、臨床試験中の、より詳しくは、ｃ−Ｍｅｔ受容体のダウンレギュレーションおよびまたは分解が供試化合物の作用機序の成分の１つである場合の、ｃ−Ｍｅｔ標的療法に対する応答としてのｃ−Ｍｅｔ発現の追跡である。
【０１２３】
当業者には自明であるように、本発明の抗体の結合の検出は種々のアッセイによって明らかにすることができる。これらのアッセイを実施するいずれの手段も本発明に適合可能であるが、例として、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣを挙げることができる。
【０１２４】
本明細書において「サンプル」とは、新生細胞を含む、または含むことが疑われる結腸、胃、直腸、乳房、卵巣、前立腺、腎臓、肺、血液、脳またはその他の器官または組織由来の細胞などの新生細胞を含む、または含む可能性のある、任意の体液、細胞、組織、器官またはそれらの一部を意味するものとする。この用語は、個体に存在するサンプルならびに個体から取得された、もしくは個体に由来するサンプルを含む。例えば、サンプルは、生検によって得られた標本の組織学的切片、または組織培養下に置かれた、もしくは組織培養に適合された細胞であり得る。サンプルはさらに、細胞下画分もしくは抽出物、または未精製もしくは実質的に純粋な核酸分子またはタンパク質調製物であってもよい。
【０１２５】
臨床サンプルは、被験体から取得され、例えば、ｃＭｅｔ発現レベルを測定または検出する診断試験またはモニタリング試験などの、本発明の手法において有用な多様なサンプル種を包含するものとする。この定義には、外科的摘出によって取得された固形組織サンプル、病理標本、保管サンプルまたは生検標本、組織培養またはそれに由来する細胞およびそれらの後代、ならびにこれらの供給源のいずれかから調製された切片または塗抹標本が包含される。限定されない例として、乳房組織、リンパ節、結腸、膵臓、前立腺などから取得されたサンプルがある。この定義にはまた、生体起源の液体サンプルも包含され、その中に懸濁されている細胞もしくは細胞断片、または液体培地とその溶質のいずれかを表し得る。
【０１２６】
本発明による別の態様は、被験体からのｃＭｅｔ発現腫瘍におけるｃＭｅｔの発現レベルをin vitroで検出する方法に関し、該方法は、（ａ’）被験体からのサンプルと本発明による抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を接触させる工程、および（ｂ’）該サンプルにおいてｃＭｅｔと結合する抗体のレベルを定量する工程を含んでなる。
【０１２７】
当業者に自明であるように、ｃＭｅｔと結合する抗体のレベルは、種々のアッセイによるなど、いくつかの方法で定量することができる。これらのアッセイを実施するいずれの手段も本発明に適合可能であるが、好ましい方法は、ＥＬＩＳＡ技術に従う免疫酵素法、免疫蛍光、免疫組織化学または放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）技術または等価の方法を活用する。
【０１２８】
好ましくは、生体サンプルはヒト起源の血清、全血、細胞、組織サンプルまたは生検などの体液により形成される。サンプルとしては、例えば、ｃＭｅｔの発現に関連する病的な過増殖性腫瘍形成性障害の存在を好都合にアッセイすることができる生検組織が挙げられる。
【０１２９】
試験サンプル中に存在するｃＭｅｔの量の測定がなされれば、それらの結果を、サンプルと同様の方法で、発現に関連する過増殖性腫瘍形成性障害を持たない、または呈さない個体から得られた対照サンプルの結果と比較することができる。試験サンプルにおけるｃＭｅｔレベルが有意に高ければ、それが由来している被験体が該障害を有しているか、または発症する高い見込みがあると結論付けることができる。
【０１３０】
本発明は、より詳しくは、ｃＭｅｔ発現腫瘍をin vitroにおいて診断するか、または被験体におけるｃＭｅｔ発現腫瘍の発症(developing)に関して予後をin vitroにおいて判定する方法に関し、該方法は、（ｉ）上記のようにｃＭｅｔの発現レベルを判定する工程、および（ｉｉ）工程（ｉ）の発現レベルを、正常組織またはｃＭｅｔを発現しない組織のｃＭｅｔの参照発現レベルと比較する工程を含んでなる。
【０１３１】
本適用に用いられる疾患を「診断する」とは、例えば、ｃＭｅｔの発現に関連するか、またはｃＭｅｔの発現によって媒介される病的な過増殖性腫瘍形成性障害の存在を診断または検出すること、その疾病の進行をモニタリングすること、およびｃＭｅｔの発現に関連する障害の指標となる細胞またはサンプルを同定または検出することを含むものとする。
【０１３２】
本適用に用いられる「予後」とは、疾患から回復する見込み、または疾患のあり得る発症もしくは転機の予測を意味する。例えば、被験体由来のサンプルの、本発明の抗体による染色が陽性であれば、その被験体の「予後」は、サンプルのｃＭｅｔ染色が陰性であった場合よりも良好である。以降に詳細に示すように、サンプルに適当な尺度でｃＭｅｔ発現レベルのスコアを付けることができる。
【０１３３】
しかしながら、本発明の別の態様はまた、それらの作用機序の１つとしてのｃ−Ｍｅｔの分解を誘導する治療用化合物に対するｃ−Ｍｅｔ発現のモニタリングに関する。この場合、細胞膜上でのｃ−Ｍｅｔ発現の追跡は、臨床試験および「個別化」療法の際の処置の有効性を評価する重要なツールとなり得る。
【０１３４】
ｃＭｅｔの発現レベルは有利には、「参照レベル」または「参照発現レベル」とも呼ばれる対照細胞またはサンプルでのレベルに対して比較または測定する。「参照レベル」、「参照発現レベル」、「対照レベル」および「対照」は本明細書では互換的に用いられる。広く言えば、「対照レベル」とは、一般に無病または癌を持たない比較可能な対照細胞で測定された独立した基準レベルを意味する。それは同じ個体からのもの、あるいは正常な、または罹患サンプルもしくは試験サンプルが得られた、その疾患が存在しない別の個体からのものである。本発明の範囲内で「参照レベル」とは、患者の癌細胞含有サンプル中のｃＭｅｔ発現の試験レベルを評価するために用いるｃＭｅｔ発現の「対照レベル」を意味する。例えば、患者の生体サンプル中のｃＭｅｔレベルが参照ｃＭｅｔレベルよりも高い場合、それらの細胞はｃＭｅｔの高レベルの発現または過剰発現を示すとみなされる。この参照レベルは複数の方法によって決定することができる。従って、発現レベルはｃＭｅｔ保持細胞、あるいはまたｃＭｅｔを発現する細胞の数に依存しないｃＭｅｔの発現レベルを定義し得る。よって、各患者の参照レベルは、ｃＭｅｔの参照比で置き換えることができ、この参照比は、本明細書に記載の参照レベルを決定するための方法のいずれによって決定してもよい。
【０１３５】
例えば、対照はある所定の値であってもよく、この値は種々の形態をとり得る。それは中央値または平均値などの単一のカットオフ値であってもよい。「参照レベル」はどの患者にも個々に等しく適用可能な単一の数値であってもよいし、あるいは参照レベル患者の特定の部分集団によって異なってもよい。よって、例えば、同じ癌に対しても高齢者は若い人とは異なる参照レベルを持つ場合があり、同じ癌に対しても女性は男性と異なる参照レベルを持つ場合がある。あるいは、「参照レベル」は、被験新生細胞の組織と同じ組織からの非腫瘍形成性癌細胞におけるｃＭｅｔの発現レベルを測定することによって決定することもできる。同様に、「参照レベル」は、同じ患者内の非腫瘍細胞におけるｃＭｅｔレベルに対する患者の新生細胞におけるｃＭｅｔのある特定の比であってもよい。「参照レベル」はまた、腫瘍細胞をシミュレートするために操作可能であるか、または参照レベルを正確に決定する発現レベルが得られる他のいずれかの様式で操作可能なin vitro培養細胞のｃＭｅｔレベルであってもよい。他方、「参照レベル」は、高いｃＭｅｔレベルを有さない群と高いｃＭｅｔレベルを有する群などの比較群に基づいて設定することもできる。比較群の別の例は、特定の疾患、症状または徴候を有する群とその疾患を有さない群である。所定の値は、例えば、被験集団が、低リスク群、中リスク群および高リスク群などの群に、または最低の４分位(quandrant)または５分位が最低リスクまたは最高量のｃＭｅｔを有する個体であり、最高の４分位または５分位が最高リスクまたは最低量のｃＭｅｔを有する個体となるように４分位もしくは５分位に、等分割（または不等分割）されるように配分することができる。
【０１３６】
参照レベルはまた、同じ癌を有する患者集団におけるｃＭｅｔのレベルの比較によって決定することができる。これは例えば、患者の全コホートを、第一の軸がｃＭｅｔレベルを表し、第二の軸が、腫瘍細胞があるレベルのｃＭｅｔを発現するそのコホートの患者数を表すグラフに表すヒストグラム解析によって行うことができる。２以上の別の患者群は、同じまたは同等のｃＭｅｔレベルを有するコホートのサブセット集団の特定によって決定することができる。そして、参照レベルの決定は、これらの別集団を最もよく識別するレベルに基づいて行うことができる。参照レベルはまた、２以上のマーカーのレベルを表してもよく、その１つがｃＭｅｔである。２以上のマーカーは例えば、各マーカーのレベルの値の比によって表すことができる。
【０１３７】
同様に、見掛け上健康な集団も、ｃＭｅｔの発現に関連する症状を有することが分かっている集団が持つものとは異なる「正常範囲」を持っている。従って、選択される所定の値は、ある個体が属すカテゴリーを考慮に入れることができる。適当な範囲およびカテゴリーは、当業者ならば、慣例の実験法だけを用いて選択することができる。「上昇」、「増加」とは、選択された対照に対して高いことを意味する。一般に、対照は、適当な年齢層の見掛け上健康な正常個体に基づく。
【０１３８】
また、本発明による対照は、所定の値の他、試験材料と並行して試験された材料のサンプルであってもよいと理解される。例としては、同じ被験体から同時に得られた組織または細胞、例えば、単一の生検の一部または被験体からの単一細胞サンプルの一部が挙げられる。
【０１３９】
ｃＭｅｔにより媒介される疾患を有する患者の臨床診断またはモニタリングでは、ｃＭｅｔ発現細胞の検出または正常な被験体または非癌組織からの対応する生体サンプルにおけるレベルと比較した場合のｃＭｅｔレベルの増加は、一般に、ｃＭｅｔにより媒介される障害を有する、または呈することが疑われる患者の指標となる。
【０１４０】
上記に従えば、本発明は、癌に対する感受性を予測する方法であって、組織サンプルにおいてｃＭｅｔの発現レベルを検出することを含み、その存在が癌に対する感受性を示し、このｃＭｅｔ発現の程度が感受性の程度に相関する方法を提供する。よって、特定の実施形態では、例えば、前立腺組織、骨肉腫組織、肺組織、膵臓組織、結腸組織、乳房組織、膠芽種組織、卵巣組織または細胞がｃＭｅｔを発現する疑いのある他のいずれかの組織におけるｃＭｅｔの発現が検討され、サンプルにおけるｃＭｅｔの存在は、癌感受性または組織特異的腫瘍の出現もしくは存在の指標となる。
【０１４１】
腫瘍の侵襲性を評価する方法もまた提供される。一実施形態において、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察する方法は、腫瘍のサンプルにおいて細胞により発現されるｃＭｅｔのレベルを決定すること、このようにして決定されたレベルを、同じ個体から異なる時点で採取した同等の組織サンプルにおいて発現されたｃＭｅｔのレベルと比較することを含み、腫瘍サンプルにおける経時的なｃＭｅｔ発現の程度は、癌の進行に関する情報を与える。
【０１４２】
さらに別の実施形態では、本適用は、被験体に対して適当な治療プロトコールを決定する方法を提供する。特に、本発明の抗体は、特に被験体がｃＭｅｔとの結合に関して本発明の抗体と競合しないｃＭｅｔ抗体で処置される状況において、個体において悪性腫瘍の改善の経過をモニタリングするの極めて有用となる。本発明によるｃＭｅｔの有無またはレベルの変化は、被験体がｃＭｅｔに関連する再発性または進行性または持続的癌を有する可能性があることを示唆し得る。よって、ｃＭｅｔを発現する細胞の数の増加または種々の組織もしくは細胞に存在するｃＭｅｔの濃度の変化を測定することにより、ｃＭｅｔに関連する悪性腫瘍の改善を目的とした特定の治療計画が有効であるかどうかを決定することができる。
【０１４３】
本発明のもう１つの課題は、ｃＭｅｔの発現に関連する腫瘍形成性障害を画像化（イメージング）するin vivoにおける方法である。例えば、このような方法は腫瘍形成性障害の徴候を呈する患者に使用することができる。患者が例えばｃＭｅｔの高い発現レベルを持っていれば、その患者は癌性障害に罹患している可能性がある。同様に、この方法は、ｃＭｅｔにより媒介される癌を有すると事前に診断されている患者において進行および／または処置に対する応答をモニタリングするのに有用であり得る。上記の目的によれば、本発明は、好ましくは標識された、特に放射性標識された本発明による抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含んでなるin vivo造影試薬、および医療画像におけるその使用を提供する。よって、本発明に一般法は、画像上有効な量の、標識された上記のモノクローナル抗体などの造影試薬と薬学上有効な担体を患者に投与すること、次いで、それがサンプル中に存在するｃＭｅｔと結合した後にその試薬を検出することによって機能する。特定の実施形態では、本方法は、ターゲティング部分と活性部分を含んでなる、画像上有効な量の造影剤を投与することによって機能する。造影剤は、ヒトなどの哺乳類における診断使用に有効な量で投与し、その後、この造影剤の局在および蓄積を検出する。造影剤の局在および蓄積は、放射性核種(radionucleide)画像法、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影法、陽電子放射型断層撮影法、コンピューター体軸断層撮影法、Ｘ線または磁気共鳴画像法、蛍光検出および化学発光検出によって検出することができる。
【０１４４】
標的抗腫瘍療法の開発に関して、免疫組織学的技術による診断は、in situにおいて、受容体発現レベルに関する情報を与え、従って、処置に必要とされる受容体の発現レベルに従って、処置に感受性のある患者を選択することができる。
【０１４５】
モノクローナル抗体を用いた免疫療法では、受容体標的発現レベルに依存する処置に対する応答はトラスツズマブによる処置と同様であり、現在、乳癌におけるＨｅｒ２過剰発現の決定は、ヒト化抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体トラスツズマブの登場で、臨床上大きな重要性を持つ。トラスツズマブはＨｅｒ２を過剰発現する癌腫細胞を特異的に標的とすることによって働くので、Ｈｅｒ２の過剰発現を証明することは、トラスツズマブによる処置の必要条件である。Ｈｅｒ２の正確な試験は、コストがかかり、潜在的に有毒なトラスツズマブ処置が非過剰発現腫瘍を有する患者には施されないようにすること、およびトラスツズマブから利益を受け得る総ての患者が適当な処置を受けられるようにすることをねらいとする。
【０１４６】
Ｈｅｒ２を過剰発現したという患者選択におけるトラスツズマブによる教示は、モノクローナル抗体による療法を用いた場合に受容体の発現レベルを決定し、同時に、治療用モノクローナル抗体よりも、患者選択のために使用可能なモノクローナル抗体を開発するという利益を示した。
【０１４７】
結果として、本発明は、被験体の腫瘍のｃＭｅｔ状態をin vitroで判定する方法に関し、該方法は、（１）上記のようにｃＭｅｔの発現レベルを判定する工程、（２）該腫瘍のｃＭｅｔ発現レベルのスコアを付ける工程、および（３）該スコアを対照サンプルから得られたものと比較する工程を含んでなる。
【０１４８】
本発明の意味の範囲内で「ｃＭｅｔ状態」は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比色定量in situハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、遺伝子チップまたは当業者に公知の他の方法などの任意の方法によって測定されるｃＭｅｔ遺伝子の発現レベルの決定に基づいた、ｃＭｅｔ陽性［ｃＭｅｔ（＋）］種またはｃＭｅｔ陰性［ｃＭｅｔ（−）］種としての腫瘍の分類に関する。
好ましい実施形態では、診断用の抗体は、組織サンプルがホルマリン固定され、パラフィン包埋された際に標的化された受容体と結合できなければならない。
【０１４９】
より詳しくは、ｃＭｅｔ発現レベルは免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される。
一例として、サンプルはｃＭｅｔ発現レベルに関して、抗体染色レベルが０〜３＋のスケールでスコアを付けることができ、この場合、０は陰性であり、１＋〜３＋は強度が増す４つの判定量段階での陽性染色を表す。各陽性スコアはスコア０（陰性）と比べて再発および致死的疾患のリスクの有意な軽減と関連づけられるので、スコア１＋〜３＋は陽性と記録されるが、これらの陽性スコア間の強度の増加はさらなるリスク軽減をもたらし得る。ｃＭｅｔの予後値を評価するためには、従来の任意のハザード分析法が使用可能である。代表的な分析法としては、打ち切り例の存在下で、生存または時間事象データをモデル化するためのセミパラメトリック法であるコックス回帰分析(Hosmer and Lemeshow, 1999; Cox, 1972)が挙げられる。生命表またはカプラン−マイヤーなどの他の生存分析とは対照的に、コックスではモデルに予測因子変数（共変量）を含める。従来の方法、例えば、コックスを用いれば、原発腫瘍におけるｃＭｅｔ発現状態と、疾患の再発（無病生存時間または転移までの時間）、またはその疾患から死亡するまでの時間（全生存時間）のいずれかの発生までの時間との相関に関する仮説を検証することができる。コックス回帰分析はまた、コックス比例ハザード分析としても知られる。この方法は、患者の生存時間に対する腫瘍マーカーの予後値を検定するために標準的なものである。多変量様式で用いる場合、いくつかの共変量の効果が並行して検定されるので、独立した予後値を有する個々の共変量、すなわち、最も有用なマーカーが特定できる。腫瘍の陽性または陰性「ｃＭｅｔ状態」［ｃＭｅｔ（＋）またはｃＭｅｔ（−）とも記載される］はそれぞれスコア０またはスコア１＋〜３＋を表す。
【０１５０】
例えば乳癌などの癌の診断またはモニタリングの際に、サンプルに「スコアを付ける」ことができる。その最も簡単な形では、スコア付けは、免疫組織化学によるサンプルの視覚的検査によって判断された陰性または陽性分類であり得る。より定量的なスコア付けは、染色強度とサンプリングされた染色（「陽性」）細胞の割合という２つのパラメーターを判断することを含む。これらの２つのパラメーターに基づき、陽性染色のレベルの増大を表す数字を割り当てることができる。Allred et al. (Allred, Harvey et al. 1998)は、これを達成する１つの方法を記載しており、その方法は、両パラメーターに０（陰性）〜３＋のスケールでスコアを付けること、および全スコアに対して個々のパラメーターのスコアをまとめることを含んだ。これにより、０、２、３、４、５、６、７または８の、とり得るスコアを含むスケールが得られる（Allredのスケールではスコア１はとり得ないことを注記しておく）。いくらか簡単なスコア法では、核染色の強度と染色された核を呈する細胞の割合を合わせた０〜３＋のスケールに組み込む。どちらのスコア法を、細胞核における活性化Ｓｔａｔ５の染色の強度および割合のスコア付けに適用してもよい。本明細書で用いる腫瘍の陽性または陰性「ｃＭｅｔ状態」とは、簡略化されたスケールでそれぞれスコア０または１＋〜３＋に相当するｃＭｅｔの発現レベルを表す。
【０１５１】
一般に、本発明による試験またはアッセイの結果は、種々の形式のいずれかで表すことができる。これらの結果は定性的様式で表すことができる。例えば、試験レポートは、特定のポリペプチドが検出されたかどうかだけで示してもよく、おそらくこれには検出限界が付記される。結果は半定量的様式で表すこともできる。例えば、種々の範囲を定義することができ、それらの範囲を、ある程度の量的情報を提供するスコア（例えば、１＋〜３＋）を割り当てればよい。このようなスコアは、例えば、ｃＭｅｔが検出される細胞の数、シグナルの強度（ｃＭｅｔまたはｃＭｅｔ保持細胞の発現レベルを示し得る）などの種々の因子を表し得る。結果は、例えば、ポリペプチド（ｃＭｅｔ）が検出される細胞のパーセンテージ、タンパク質濃度などとして、定量的様式で表すこともできる。当業者には認識されるように、試験によって得られる出力のタイプは、その試験の技術的限界およびそのポリペプチドの検出に関連する生物学的有意性によって異なる。例えば、ある種のポリペプチドの場合、純粋に質的な出力（例えば、そのポリペプチドがある特定の検出レベルで検出されるかどうか）が有意な情報を提供する。他の場合では、より量的な出力（例えば、被験サンプル中のポリペプチドの発現レベルと正常レベルの比）が必要である。
【０１５２】
より好ましい実施形態では、ｃＭｅｔ発現レベルのスコア付けは、反応生成物の強度および陽性細胞のパーセンテージの評価に基づき、０〜３＋の階級とする。より明瞭とするために、以下の表５にこれらのパラメーターをまとめる。浸潤性腫瘍の完全な周辺の膜反応性のみを考慮し、これはしばしば「亀甲金網(chicken wire)」の外観に似ている。現行の指針の下では、ｃＭｅｔ  ＩＨＣに関してボーダーラインとしてスコア付けされたサンプル（スコア２＋以上）はｃＭｅｔ（＋）とみなされ、さらなる評価を必要とする。限定されるものではないが、対照が期待通りではなく、人為性がほとんどのサンプルに伴い、サンプルが正常な乳（内部対照）に強い膜陽性を有し、過剰な抗原賦活を示唆する場合には、そのＩＨＣ分析は棄却され、繰り返しを行うか、またはＦＩＳＨもしくは他の任意の方法による確認が行われる。
【０１５３】
表５
【表７】
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【０１５４】
本発明によるプロセスのより好ましい実施形態では、該スコア付けは、染色強度と陽性細胞のパーセンテージである２つのパラメーターに基づく適当なスケールの使用を含んでなる。
好ましい実施形態では、本発明によるプロセスは、スケール０〜３＋の適当なスケールを表し、腫瘍細胞の膜反応性が無い場合は０、１０％を超える腫瘍細胞に強い完全な反応性が見られる場合には３＋のスコアが付けられる。
【０１５５】
より詳しくは、上記のように、適当なスケールは０〜３のスケールであり、腫瘍細胞の膜反応性が無い場合は０；１０％を超える腫瘍細胞にわずかな認知可能な膜反応性が見られる場合には１＋；１０％を超える腫瘍細胞に弱い〜中程度の完全な膜反応性が見られる場合には２＋；および１０％を超える腫瘍細胞に強い完全な反応性が見られる場合には３＋のスコアが付けられる。
【０１５６】
本発明の特定の態様では、腫瘍はスコア２＋のｃＭｅｔ（＋）である。
本発明の特定の態様では、腫瘍はスコア３＋のｃＭｅｔ（＋）である。
本発明のもう１つの特定の態様では、腫瘍はスコア２＋または３＋のｃＭｅｔ（＋）である。
【０１５７】
本発明によれば、また、腫瘍形成性障害が抗ｃＭｅｔ抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体による処置に感受性があるかどうかを判定する方法も記載され、該方法は、（ａ）上記のように被験体の腫瘍のｃＭｅｔ状態をin vitroにおいて判定する工程、および（ｂ）その状態がｃＭｅｔ（＋）であれば、その腫瘍形成性障害は抗ｃＭｅｔ抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体による処置に感受性があると判定する工程を含んでなる。
【０１５８】
本発明のもう１つの態様では、このような診断または予後プロセスに有用なキットが意図され、該キットは本発明の抗体を含んでなる。
【０１５９】
便宜上、所定量の試薬とその診断アッセイの実施に関する説明書を組み合わせたパッケージ、例えば、キットも本発明の範囲内にある。キットは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおける、ｃＭｅｔのin vitro検出および定量のための抗体を含む。本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおける、ｃＭｅｔのin vitro検出および定量のためのキットに提供することができる。抗体が酵素で標識される場合、キットはその酵素が必要とする基質および補因子（例えば、検出可能な発色団または蛍光団を提供する基質前駆体）を含む。さらに、安定剤、バッファー（例えば、ブロッキングバッファーまたは溶解バッファー）などのような他の添加物を含んでもよい。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１以上の容器（このような容器は本発明の個々の要素を保持する）を収容するために仕切られた収納容器を含んでもよい。例えば、１つの容器は、不溶性または部分的可溶性の担体に結合された第一の抗体を含んでもよい。第二の容器は、可溶性の、検出可能なように標識された第二の抗体を凍結乾燥形態または溶液として含んでもよい。この収納容器はまた、検出可能なように標識された第三の抗体を凍結乾燥形態または溶液として保持する第三の容器を含んでもよい。この性質のキットは、本発明のサンドイッチアッセイで使用可能である。標識または添付文書には、組成物の説明ならびに意図されるin vitroまたは診断使用に関する説明を示すことができる。
【０１６０】
様々な試薬の相対量は、アッセイの感受性を実質的に至適化する試薬の溶液濃度とするように広く変更可能である。特に、これらの試薬は、溶解した際に適当な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常凍結乾燥された乾燥粉末として提供してもよい。
【０１６１】
本発明のさらなる態様では、本明細書に詳細に示されるモノクローナル抗体またはその結合フラグメントが検出可能な部分で標識されて提供され、従って、それらも例えばキットにおいて、上述の抗原を有する細胞を診断または同定するためにパッケージングされ、用いられる。このような標識の限定されない例としては、フルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光団；発色団、放射性核種または酵素が挙げられる。このような標識された抗体または結合フラグメントは、例えば、抗原の組織学的局在、ＥＬＩＳＡ、細胞選別、ならびにｃＭｅｔ、およびこの抗原を保持する細胞を検出または定量するための他の免疫学的技術のために使用可能である。
【０１６２】
また、アポトーシスアッセイの陽性対照として、また、細胞からのｃＭｅｔの精製または免疫沈降のために有用なキットも提供される。ｃＭｅｔの単離および精製の場合、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合された本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットなどにおける、ｃＭｅｔのin vitro検出および定量のための抗体を含むキットが提供可能である。製品としては、キットは容器と、容器上の、または容器に添付されたラベルまたは添付文書を含む。この容器は、本発明の少なくとも１つの抗ｃＭｅｔ抗体またはその結合フラグメントを含んでなる組成物を保持する。例えば、希釈剤およびバッファー、対照抗体を含むさらなる容器が含まれてもよい。ラベルまたは添付文書には、組成物の説明ならびに意図されるin vitroまたは診断使用に関する説明を示すことができる。
【０１６３】
より詳しくは、本発明は、当業者に公知の任意の方法によって腫瘍のｃＭｅｔ状態を判定するためのキットに関する。好ましい実施形態では、例に記載されているように、本発明はＩＨＣによって腫瘍のｃＭｅｔ状態を判定するためのキットに関する。
【０１６４】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも、上記のような抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体（該抗体は好ましくは標識される）を含んでなるキットからなる。
例えば、上述の標識の使用など、当業者により、任意の標識法を使用することができると理解される。
【０１６５】
好ましい実施形態では、被験体においてｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍の存在および／または場所をin vitro検出するのに有用な本発明によるキットは、該抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とｃ−Ｍｅｔの間の結合程度を検出するのに有用な試薬をさらに含んでなる。
【０１６６】
別の好ましい実施形態では、ｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍におけるｃ−Ｍｅｔの発現レベルのin vitro決定に有用な本発明のキットは、該標識抗体とｃ−Ｍｅｔの間の結合レベルを定量するのに有用な試薬をさらに含んでなる。
【０１６７】
さらに別の実施形態では、腫瘍のｃ−Ｍｅｔ状態のin vitro判定に有用な本発明によるキットは、
ｉ）該標識抗体とｃ−Ｍｅｔの間の結合程度を検出するのに有用な試薬と、
ｉｉ）ｃ−Ｍｅｔ発現レベルのスコア付けに有用な陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル
をさらに含んでなる。
【０１６８】
腫瘍のｃ−Ｍｅｔ状態のin vitro判定のための該キットは、ネズミ抗体に特異的なポリクローナル抗体をさらに含むことができ、好ましくは、該ネズミ抗体に特異的なポリクローナル抗体は標識される。
【０１６９】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面による一連の記載において明らかとなる。図面の凡例を以下に示す。
【実施例】
【０１７０】
実施例１：診断目的で使用することができる、ｃＭｅｔに対する抗体の作製および選択
−免疫誘導工程
抗ｃＭｅｔ抗体を作製するため、８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、その原形質膜上にｃＭｅｔを発現するＣＨＯトランスフェクト細胞系統で皮下に３〜５回（２０×１０６細胞／用量／マウス）免疫するか、または初回免疫誘導用の完全フロインドアジュバントと追加免疫誘導用の不完全フロインドアジュバントを混合した、ｃＭｅｔ細胞外ドメイン融合タンパク質（１０〜１５μｇ／用量／マウス）（R&D Systems、カタログ番号３５８ＭＴ）またはこの組換えタンパク質のフラグメントで２〜３回免疫した。マウスにＣＨＯ−ｃＭｅＴ細胞と組換えタンパク質の双方を施す混合プロトコールも実施した。細胞融合の３日前に、マウスに組換えタンパク質またはフラグメントでｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．に追加免疫を行った。次いで、マウスの脾臓を摘出し、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と融合し、ＨＡＴ選択を行った。一般に、とりわけ、ネズミ起源の、モノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製については、特に、手引書"Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術またはKohler and Milsteinによって記載されたハイブリドーマ調製技術(Nature, 256:495-497,1975)を参照することができる。
−２２４Ｄ１０についてのスクリーニング工程
【０１７１】
得られたハイブリドーマを、最初に、ＥＬＩＳＡによりｃＭｅｔ組換えタンパク質に対してスクリーニングした。要するに、組換えヒトｃＭｅｔ−Ｆｃタンパク質(R&D systems)をＩｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ９６ウェルプレートへ４℃で一晩コーティングし、０．５％ゼラチン溶液での１時間のブロッキング工程後に、用量範囲のｍ２２４Ｇ１０抗体を３７℃でさらに１時間加えた。次いで、プレートを洗浄し、ヤギ抗マウス(Jackson)特異的ＩｇＧ  ＨＲＰを３７℃で１時間加えた。ＴＭＢ基質溶液を使用して反応の発色を行った。次いで、生産された抗体が腫瘍細胞上の天然受容体も認識し得ることを確認するために、ＦＡＣＳ分析により、中〜高レベルのｃＭｅｔを発現する、Ａ４５９細胞系統およびＮＣＩ−Ｈ４４１細胞系統に対して、第２のスクリーニングを行った。そのために、２×１０５細胞を、濃度範囲の非結合の２２４Ｄ１０  Ｍａｂまたは９Ｇ４（ＩｇＧ１アイソタイプ対照Ｍａｂ）のいずれかとともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、細胞を二次抗体であるヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８（希釈溶液１／５００）とともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳでさらに３回洗浄した後、ＦＡＣＳ(Facscalibur, Becton-Dickinson)により細胞を分析した。少なくとも５０００個の細胞を評価し、蛍光強度の平均値を計算した。
【０１７２】
これらの２つの試験における陽性反応体を増幅し、クローニングし、ハイブリドーマセットを回収し、精製し、放射性標識ＨＧＦとの競合不在についてスクリーニングした。実際に、診断用抗体は、通常、患者の選択に必要であり、治療用抗体を用いて治療する患者の標的受容体の挙動に従うバイオマーカーとしても必要である。この後者の点に関して、考慮する主要な基準は、診断用抗体は、治療用抗体によって認識されるエピトープとは異なるエピトープと結合しなければならないということである。増殖因子受容体に対する治療用中和抗体の目標の１つは、リガンド結合を阻害することである。その点に関して、診断用抗体の選択中、リガンド結合を妨げないものを選択してもよい。その特性を検証するために、放射性標識ＨＧＦとの抗体の競合アッセイを計画した。要するに、プロテインＡ  ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ  ９６ウェルマイクロプレート(Perkin Elmer)を、ＰＢＳ中０．５％ゼラチン溶液でブロッキングした（室温で２時間）後、組換えｃＭｅｔ−Ｆｃタンパク質(R&D)により４℃で一晩コーティングした。空いて残っているプロテインＡ部位を、無関連のｈＩｇＧにより室温で２時間さらに飽和させた。各工程後にはプレートをＰＢＳで洗浄した。競合アッセイでは、固定化されたｃＭｅｔに対する２００ｐＭの［１２５Ｉ］−ＨＧＦ（比活性約２，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の結合を、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中０．１ｐＭ〜１μＭの範囲の、種々の濃度の、試験する抗ｃＭｅｔモノクローナル抗体またはＨＧＦ(R&D Systems)の存在下で測定した。ＨＧＦを置き換える能力で知られている抗体（２２４Ｇ１１、１１Ｅ１および５Ｄ５）を実験の陽性対照として含めた。５Ｄ５  Ｍａｂは、Genentechにより作製されている、ＡＴＣＣでハイブリドーマとして入手可能な抗体である。９Ｇ４として記載されているネズミＩｇＧ１を、アイソタイプ対照として使用した。次いで、プレートを室温で６時間インキュベートし、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンターで計数した。非特異的結合は、１μＭのＨＧＦの存在下で測定した。
【０１７３】
最後に、ｃＭｅｔを発現する腫瘍異種移植片のパラフィン包埋切片での最後のｃＭｅｔ認識試験のために、上記の３つの基準を満たしたＭａｂ［ｉ）ＥＬＩＳＡ試験においてｃＭｅｔを認識すること、ｉｉ）天然ｃＭｅｔへ結合することおよびｉｉｉ）放射性標識リガンドと競合しないこと］を選択した。その評価のために、Ｕ８７−ＭＧ異種移植片の腫瘍切片を脱パラフィン処理し、再水和し、熱処理によるエピトープの賦活化のために、９８℃で予熱した沸騰浴のＴａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ  １Ｘ（Ｄａｋｏ  Ｓ１６９９）に９８℃で３０分間、その後、Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｂｕｆｆｅｒにさらに３０分間入れた。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水−０．０５％ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ）（Ｄａｋｏ  Ｓ３００６）で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｄａｋｏ  Ｋ４００７）を５分間使用して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ブロッキング試薬（ＵｌｔｒａＶ  ｂｌｏｃｋ−ＴＡ−１２５ＵＢ−ＬａｂＶｉｓｉｏｎ）とともに５分間インキュベートした後、ｃＭｅｔマウスモノクローナルを試験抗体（５μｇ／ｍｌ）に加えた。マウスＩｇＧ１／κ（５μｇ／ｍｌ、Ｘ０９３１、Ｄａｋｏ）を陰性対照として使用した。次いで、切片を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｌｉｎｋ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（ＬＳＡＢ＋、Ｄａｋｏ  Ｋ０６７９）とともに室温で１５分間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、切片を、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（ＬＳＡＢ＋、Ｄａｋｏ  Ｋ０６７９）とともにさらに１５分間インキュベートした。褐色の反応産物の発色のためにジアミノベンジジンを使用した。
【０１７４】
一連の融合の後、ネズミ２２４Ｄ１０（ｍ２２４Ｄ１０）抗体がｃＭｅｔ陽性腫瘍診断の候補と確認された。図１に例示されるように、ｍ２２４Ｄ１０は、ＥＬＩＳＡアッセイ（図１Ａ）でも、ｃＭｅｔを発現することが分かっているＡ５４９細胞系統およびＮＣＩ−Ｈ４４１細胞系統の表面でも（図１Ｂ）ｃＭｅｔを認識することができる。
【０１７５】
次いで、ｍ２２４Ｄ１０を放射性標識ＨＧＦ置換試験により検証した。図２では、全特異的［１２５Ｉ］−ＨＧＦ結合の割合を、片対数グラフにリガンド濃度の関数としてプロットし、放射性リガンドの結合を５０％阻害するのに要する種々の阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を、得られたＳ字形競合曲線のグラフを用いて求めた。予想通り、非放射性標識ＨＧＦは、固定化されたｃＭｅｔに対する［１２５Ｉ］−ＨＧＦの結合に完全に置き換わることができたが、一方、対照抗体９Ｇ４はＨＧＦ遮断活性を示さなかった。陽性対照として使用した、抗ｃＭｅｔ  Ｍａｂ  ２２４Ｇ１１、１１Ｅ１および５Ｄ５は、固定化されたｃＭｅｔに対する［１２５Ｉ］−ＨＧＦの結合を阻害することができ、ＩＣ５０値はそれぞれ、３．６ｎＭ、４２ｎＭおよび４．４ｎＭであった。Ｍａｂ
【０１７６】
ｍ２２４Ｄ１０は、［１２５Ｉ］−ＨＧＦに置き換わることができず、免疫組織化学（ＩＨＣ）研究用に選択した。
図３Ｂに示される結果により、ｍ２２４Ｇ１０が、ｃＭｅｔ標的療法に対して特に感受性が高いことが分かっているＵ８７−ＭＧ異種移植腫瘍上のｃＭｅｔを認識し得ることが立証された。予想通り、ＩｇＧ１アイソタイプ対照では染色が観察されなかった（図３Ａ）。これらの結果に基づき、２２４Ｄ１０  Ｍａｂを利用して腫瘍上のｃＭｅｔにスコアをつけることができるかどうかを判断するために、実験を計画した。
−２２１Ｃ９についてのスクリーニング工程
【０１７７】
得られたハイブリドーマを、最初に、ＥＬＩＳＡにより二量体または単量体のｃＭｅｔ組換えタンパク質に対してスクリーニングした。要するに、組換えヒトｃＭｅｔ（二量体または単量体の）タンパク質をＩｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ９６ウェルプレートへ４℃で一晩コーティングし、０．５％ゼラチン溶液での１時間のブロッキング工程後に、単一ハイブリドーマ上清を３７℃でさらに１時間加えた。次いで、プレートを洗浄し、ヤギ抗マウス(Jackson)特異的ＩｇＧ  ＨＲＰを３７℃で１時間加えた。ＴＭＢ基質溶液を使用して反応の発色を行った。次いで、生産された抗体が腫瘍細胞上の天然受容体も認識し得ることを確認するために、ＦＡＣＳ分析により、中〜高レベルのｃＭｅｔを発現するＡ５４９細胞系統に対して、第２のスクリーニングを行った。そのために、２×１０５細胞を、１０μｇ／ｍｌのｍ２２１Ｃ９またはｍ１０Ｄ９（ＩｇＧ１アイソタイプ対照Ｍａｂ）とともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、細胞を二次抗体であるヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８（希釈溶液１／５００）とともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳでさらに３回洗浄した後、ＦＡＣＳ(Facscalibur, Becton-Dickinson)により細胞を分析した。少なくとも５０００個の細胞を評価し、蛍光強度の平均値を計算した。
【０１７８】
これらの２つの試験での陽性ハイブリドーマを増幅し、クローニングし、アイソタイプを決定し、増殖させた。次いで、新たなハイブリドーマ上清(new hybrido supernatants)を集め、それらのＩｇＧ含量を決定した。５種のヒト腫瘍性細胞系統（Ａ５４９、ＢＸＰＣ３、ＭＣＦ７、Ｕ８７ＭＧおよびＨｅｐＧ２）のパネルで相補的サイトメトリー分析を行った。これらの細胞系統は総て、ＡＴＣＣより提供を受けた。得られたデータは、図４に示し、ＭＦＩ値は下に表６において示している。
【０１７９】
表６
【表８】
0005951486.tif 000009
【０１８０】
精製２２１Ｃ９抗体を用いて相補的実験を行った。単量体ｃＭｅｔタンパク質および二量体ｃＭｅｔタンパク質の双方において一次抗体滴定を行った。
滴定曲線は図５に示している。どちらのｃＭｅｔ受容体形態に対しても同様の親和性が観察された。これらのＥＬＩＳＡを行うために、ヒト二量体ｃＭｅｔタンパク質（R&D sytems、カタログ番号３５８ＭＴ）を、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一晩コーティングする。プレート（Costar  ＃３６９０）を０．５％ゼラチン溶液により３７℃で２時間飽和させた後、ハイブリドーマ上清を３７℃で１時間インキュベートする。一度、ＰＢＳで洗い流し、抗マウスＨＲＰ−抗体（Jackson ImmunoResearch、カタログ番号１１５−０３５−１６４）をＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ中、０．１％ゼラチン／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）での１／５０００希釈溶液で各ウェルに加え、これらのプレートを３７℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳで３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ基質(Uptima)を加えることによりペルオキシダーゼ(peroxydase)の活性を明らかにする。この反応を室温で５分間生じさせる。５０μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を加えることにより反応を停止させ、プレートリーダーにより４５０ｎｍで読み取る。単量体ｃＭｅｔに対しても同様のプロトコールを実施し、その場合には、タンパク質を５μｇ／ｍｌでコーティングした。
【０１８１】
最後に、２２１Ｃ９  Ｍａｂは上記の２つの基準、（ｉ）ＥＬＩＳＡ試験においてｃＭｅｔを認識すること、（ｉｉ）ヒト腫瘍性細胞系統の表面において発現される天然ｃＭｅｔへ結合することを満たした。
【０１８２】
実施例２：ｍ２２４Ｄ１０  Ｍａｂおよびｍ２２１Ｃ９  Ｍａｂを用いたｃＭｅｔ発現についての組織の評価
上記のプロトコールを用いて、可変レベルのｃＭｅｔを発現しているパラフィン包埋ヒト腫瘍組織セットを、ｍ２２４Ｄ１０  Ｍａｂおよびｍ２２１Ｃ９  Ｍａｂそれぞれで染色した。
ｍ２２４Ｄ１０  Ｍａｂについては図６に、ｍ２２１Ｃ９  Ｍａｂについては図７に示される結果により、２つの腫瘍タイプでは、ｍ２２４Ｄ１０およびｍ２２１Ｃ９の双方とも、可変レベルのｃＭｅｔを有するヒト腫瘍を識別することができることが立証された。これらの抗体を使用して、腫瘍を以下のように評価することができる：
【０１８３】
０または陰性：膜染色が観察されなかった陰性腫瘍または観察された膜染色細胞が１０％未満であった陰性腫瘍、
１＋：１０％を超える腫瘍細胞でわずかに観察される染色、
２＋：１０％を超える腫瘍細胞で観察される中程度の完全な膜染色、
３＋：１０％を超える腫瘍細胞で強い完全な染色。
【０１８４】
実施例３：２２４Ｄ１０競合実験
すでに上に述べたように、診断用Ｍａｂは、標的受容体のダウンレギュレーションを誘導する治療用抗体に対する「応答マーカー」としても使用することができる。その点に関して、処置した患者において、血液または生検材料の採取を行い、ｃＭｅｔ状態について解析することができる。そのために、使用する診断用抗体は、治療用抗体によってターゲッティングされるエピトープとは異なるエピトープを認識しなければならない。治療用抗体は通常、ＨＧＦに置き換わることができるため、リガンド置換について競合しない診断用抗体の選択は、総ての治療用Ｍａｂに対する応答マーカーとして有用であり得る。
この実施例では、２２４Ｄ１０を応答マーカーとして使用し得ることを立証するために、２２４Ｄ１０と多くの治療用Ｍａｂとの競合実験を実施した。
【０１８５】
治療用抗ｃＭｅｔ  Ｍａｂ  １１Ｅ１、２２７Ｈ１、２２４Ｇ１１および５Ｄ５  Ｍａｂ（ＡＴＣＣでハイブリドーマとして入手可能な、ネズミ型(the murin form)ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ  ５Ｄ５である）をｂｉａｃｏｒｅ実験により研究した。要するに、ＣＭ５センサーチップを、フローセル１および２上で、アミンカップリングキットを使用して供給業者の使用説明書に従って抗ポリヒスチジンＭａｂを共有結合することによって活性化する。ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰバッファーである。実験は、２５℃、流速３０μｌ／分で実施する。ＨＧＦ−Ｒ／Ｆｃキメラタンパク質は、ランニングバッファー中１０μｇ／ｍｌの濃度で使用し、フローセル２に１分間注入した。一般に、およそ１９０ＲＵのｃＭｅｔ−Ｆｃが捕捉された。フローセル１は、Ｍａｂの非特異的結合の評価のための参照として用いた。一次Ｍａｂ（２０μｇ／ｍｌ）を両フローセルに２分間注入する。次いで、二次抗体（２０μｇ／ｍｌ）を両フローセルに注入した。特異なＦｃ２−Ｆｃ１共鳴信号が記録される。各サイクルの終了時に、グリシンｐＨ１．５再生バッファーを両フローセルに３０分間注入してｃＭｅｔタンパク質およびＭａｂタンパク質を廃棄することによりセンサーチップを再生した。
【０１８６】
第１の実験は、一次抗体として１１Ｅ１を、二次抗体として２２４Ｄ１０を用いて実施される（図８参照）。この実験では、１１Ｅ１および２２４Ｄ１０がｃＭｅｔ−Ｆｃ分子の表面で２つの遠位エピトープ領域に結合することが示される。第２の実験は、一次抗体として２２４Ｇ１１を、二次抗体として２２４Ｄ１０を用いて実施される（図９参照）。この実験では、２２４Ｇ１１および２２４Ｄ１０もまた２つの遠位領域に結合することが示される。第３の実験は、一次抗体として５Ｄ５を、二次抗体として２２４Ｄ１０を用いて実施される（図１０参照）。この場合もまた、この実験で、５Ｄ５および２２４Ｄ１０が２つの遠位領域に結合することが示される。結論として、２２４Ｄ１０は、１１Ｅ１、２２４Ｇ１１および５Ｄ５の結合部位のｃＭｅｔ分子の遠位領域に結合する。同様のＢｉａｃｏｒｅプロトコールを用いて得られた予備データで、Pfizerの１３．３．２抗ｃＭｅｔ抗体が１１Ｅ１と同じエピトープマッピング群に属すことが示されたため（図ｌｌ）、２２４Ｄ１０と１３．３．２は、この組合せで検証されたことがなかったとしても、同じｃＭｅｔ分子上に同時に結合することができると我々は推測することができる。
【０１８７】
２２４Ｇ１１と同じエピトープ群に属す２２７Ｈ１についても同様に（図１１）、２２７Ｈ１抗体と２２４Ｄ１０抗体はｃＭｅｔに同時に結合することができると見込まれる。最後に、５Ｄ５と同じエピトープマッピング群に属す２２３Ｃ４（図１１）は、２２４Ｄ１０と同時にｃＭｅｔに結合することができると見込まれる。
【０１８８】
実施例４：２２１Ｃ９抗体の存在下で実施されるＨＧＦ競合実験
診断用Ｍａｂをさらに特性評価するために、ＨＧＦ競合アッセイを実施した。
試験するＭａｂの存在下または不在下でｃＭｅｔタンパク質を含んでなる第１の反応混合物を、独立した飽和（ＰＢＳ  １Ｘ中０．５％ゼラチン）プレートで調製する。ネズミ抗体（参照および研究するＭａｂ）の連続１：２希釈（１２カラムで４０μｇ／ｍｌから出発）を行う。次いで、０．８μｇ／ｍｌのｒｈ  ｃＭｅｔ−Ｆｃタンパク質を加える（RDSystems、参照３５８−ＭＴ／ＣＦ）。但し、陰性対照系統はＥＬＩＳＡ希釈液（ＰＢＳ  １Ｘ中、０．１％ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）しか含まない。ホモジナイゼーション後、競合サンプルを、ＰＢＳ中０．３μｇ／ｍｌ  ｒｈＨＧＦ溶液（RDSystems、参照２９４−ＨＧＮ／ＣＦ）が入ったＨＧＦコーティングプレート上に添加する。インキュベーションと数回の洗浄の後に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Jackson、参照１０９−０３５−０９８）を使用して、結合しているｃＭｅｔタンパク質を検出する。一度、結合させたら、ＴＭＢ基質をプレートに加える。Ｈ２ＳＯ４酸性溶液を加えることにより反応を停止させ、得られた光学濃度を、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取る。
【０１８９】
この実験は、ｃＭｅｔ−Ｆｃ組換えタンパク質の存在下または不在下で２２１Ｃ９を用いて実施される（図１２参照）。この実験では、２２１Ｃ９がその固定化リガンド受容体上でのｃＭｅｔ結合に関して競合し得ることが示される。しかしながら、２０μｇ／ｍｌの２２１Ｃ９の存在下ではｃＭｅｔの部分的な結合しか観察されない。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１Ａ】ｍ２２４Ｄ１０  ＭａｂによるｃＭｅｔの認識、ＥＬＩＳＡ（図Ａ）およびＦＡＣＳ（図Ｂ）。
【図１Ｂ】ｍ２２４Ｄ１０  ＭａｂによるｃＭｅｔの認識、ＥＬＩＳＡ（図Ａ）およびＦＡＣＳ（図Ｂ）。
【図２】［１２５Ｉ］−ＨＧＦ結合阻害実験。全特異的［１２５Ｉ］−ＨＧＦ結合（単位：％）を、片対数グラフにリガンド濃度の関数としてプロットした。特異的結合値は、三連で実施した実験の平均である。
【図３Ａ】アイソタイプ対照（図３Ａ）およびｍ２２４Ｄ１０  Ｍａｂ（図３Ｂ）で染色したＵ８７−ＭＧ異種移植腫瘍のパラフィン包埋切片のＩＨＣ分析。
【図３Ｂ】アイソタイプ対照（図３Ａ）およびｍ２２４Ｄ１０  Ｍａｂ（図３Ｂ）で染色したＵ８７−ＭＧ異種移植腫瘍のパラフィン包埋切片のＩＨＣ分析。
【図４】ｍ２２１Ｃ９  ＭａｂによるｃＭｅｔの認識、ＦＡＣＳ。
【図５Ａ】固定化された二量体（Ａ）および単量体（Ｂ）のｃＭｅｔタンパク質に対する２２１Ｃ９  Ｍａｂの滴定曲線。
【図５Ｂ】固定化された二量体（Ａ）および単量体（Ｂ）のｃＭｅｔタンパク質に対する２２１Ｃ９  Ｍａｂの滴定曲線。
【図６】種々のレベルのｃＭｅｔを発現する乳房（Ａ）および胃（Ｂ）腫瘍組織のパラフィン包埋切片の、ｍ２２４Ｄ１０でのＩＨＣ染色。
【図７】種々のレベルのｃＭｅｔを発現する乳房（Ａ）および胃（Ｂ）腫瘍組織のパラフィン包埋切片の、ｍ２２１Ｃ９でのＩＨＣ染色。
【図８】抗ｔａｇ−Ｈｉｓ抗体により活性化されたＣＭ５センサーチップのフローセル２上に捕捉されたｃＭｅｔ−Ｆｃの２０１．７  ＲＵにおけるＭａｂ  １１Ｅ１および２２４Ｄ１０の連続的注入のセンサーグラム。
【図９】抗ｔａｇ−Ｈｉｓ抗体により活性化されたＣＭ５センサーチップのフローセル２上に捕捉されたｃＭｅｔ−Ｆｃの２０３．４  ＲＵにおけるＭａｂ  ２２４Ｇ１１および２２４Ｄ１０の連続的注入のセンサーグラム。
【図１０】抗ｔａｇ−Ｈｉｓ抗体により活性化されたＣＭ５センサーチップのフローセル２上に捕捉されたｃＭｅｔ−Ｆｃの２０３．６  ＲＵにおけるＭａｂ  ５Ｄ５および２２４Ｄ１０の連続的注入のセンサーグラム。
【図１１】７種の抗ｃＭｅｔ抗体のエピトープマッピングスキーム。矢印は、この研究のために実施した３つの実験を示している。灰色の四角は、２２４Ｄ１０と用いて試験していない抗体を示している。
【図１２】ｍ２２１Ｃ９  ＭａｂとのＨＧＦ競合アッセイ。
【図１Ａ】
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【図２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【配列表】
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