(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（ＣＨＯＰ−２）の１−３０９位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１においてＬ１３２に相当する位置での置換を含む光誘起イオンチャネルであって、該置換がチャネルの極性を増加するものであり、ＨＥＫ２９３細胞でのＦｕｒａ−２−イメージングによって測定される、カルシウム伝導度が、ＷＴ  ＣＨＯＰ−２と比較して少なくとも２倍増加される、光誘起イオンチャネル。
【請求項２】
Ｌ１３２の置換を除いて、配列番号１（ＣＨＯＰ−２）の１−３０９位置に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の光誘起イオンチャネルであって、該置換がチャネルの極性を増加するものである、光誘起イオンチャネル。
【請求項３】
Ｌ１３２の置換を除いて、配列番号１（ＣＨＯＰ−２）の１−３０９位置に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の光誘起イオンチャネルであって、該置換がチャネルの極性を増加するものである、光誘起イオンチャネル。
【請求項４】
置換が、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｓ、Ｌ１３２Ｅ、Ｌ１３２ＤおよびＬ１３２Ｔから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネル。
【請求項５】
置換が、Ｌ１３２Ｃである、請求項４に記載の光誘起イオンチャネル。
【請求項６】
ａ）光感受性が、海馬ニューロンにおいてＷＴ  ＣＨＯＰ−２と比較して５倍より多く増加する；かつ／または
ｂ）ＨＥＫ２９３細胞でのＦｕｒａ−２−イメージングによって測定される、カルシウム伝導度が、ＷＴ  ＣＨＯＰ−２と比較して少なくとも３倍増加される；かつ／または
ｃ）海馬ニューロンにおいて全細胞電気生理学的記録により測定した刺激頻度が、ＷＴ  ＣＨＯＰ−２と比較して、少なくとも１．５倍の増加を示す、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネル。
【請求項７】
さらに、少なくとも１個の以下のアミノ酸残基：配列番号１の位置２５３に対応する位置のアスパラギン酸；配列番号１の位置２５７に対応する位置のリジン；配列番号１の位置２６０に対応する位置のトリプトファン；配列番号１の位置１２３に対応する位置のグルタミン酸；配列番号１の位置１３４に対応する位置のヒスチジンまたはアルギニン；配列番号１の位置１２８に対応する位置のトレオニン、セリン、またはアラニン；および／または配列番号１の位置１５６に対応する位置のアラニン、を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネル。
【請求項８】
共通モチーフ、Ｌ（Ｉ）ＤｘｘｘＫｘｘＷ（Ｆ，Ｙ）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネル。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネル、およびレチナールまたはレチナール誘導体を含む、チャネルロドプシン。
【請求項１０】
レチナール誘導体が３，４−デヒドロレチナール、１３−エチルレチナール、９−ｄｍ−レチナール、３−ヒドロキシレチナール、４−ヒドロキシレチナール、ナフチルレチナール；３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，４，６，８，１０ペンタエナール；３，７ジメチル−デカ−２，４，６，８−テトラエナール；３，７−ジメチル−オクタ−２，４，６−トリエナール；および６−７回転阻止レチナール、８−９回転阻止レチナール、および１０−１１回転阻止レチナールからなる群から選択される、請求項９に記載のチャネルロドプシン。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列を含む、核酸構成体。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列または請求項１１に記載の核酸構成体を含む発現ベクター。
【請求項１３】
遺伝子治療に好適である、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
ウイルス媒介性の遺伝子導入に好適である、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項９に記載のチャネルロドプシン、請求項１１に記載の核酸構成体または請求項１２に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１６】
哺乳動物細胞または昆虫細胞、または酵母細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベまたはピチア・パストリスからの酵母細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
哺乳動物細胞が、
（ａ）光受容細胞、網膜桿状体細胞、網膜錐体細胞、網膜神経節細胞、双極ニューロン、神経節細胞、偽単極ニューロン、多極ニューロン、ピラミッド状ニューロン、プルキンエ細胞、または、顆粒細胞；または
（ｂ）メラノーマ細胞、ＣＯＳ細胞；ＢＨＫ細胞；ＨＥＫ２９３細胞；ＣＨＯ細胞；骨髄腫細胞；またはＭＤＣＫ細胞、
である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１９】
薬剤としての使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネル、または請求項９に記載のチャネルロドプシン、または請求項１１に記載の核酸構成体、または請求項１２に記載の発現ベクター、または請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
遺伝子治療における使用のための、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
失明または視力減少の治療における使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネル、または請求項９に記載のチャネルロドプシン、または請求項１１に記載の核酸構成体、または請求項１２に記載の発現ベクター、または請求項１８に記載の細胞。
【請求項２２】
がん細胞の切除における使用のための、配列番号１の位置１２８に相当する位置にスレオニン、セリンまたはアラニンを有し、かつ／または配列番号１の位置１５６に相当する位置にアラニンを有する、請求項７に記載の光誘起イオンチャネル。
【請求項２３】
がん細胞が黒色腫のがん細胞である、請求項２２に記載の光誘起イオンチャネル。
【請求項２４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の光誘起イオンチャネル、または請求項９に記載のチャネルロドプシン、または請求項１５に記載の細胞の、高スループットのスクリーニングにおける使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改良された特性を有する変異チャネルロドプシン、それをコードする核酸構成体、核酸構成体を担持する発現ベクター、該核酸構成体または発現ベクターを含む細胞、およびそれらのそれぞれの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
光駆動性の（ｌｉｇｈｔ−ｇａｔｅｄ）、内向き整流性の（ｉｎｗａｒｄｌｙ  ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ）陽イオンチャネル、チャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｖｉｖｏの両方で、ニューロンの、標的とされた光活性化のための好ましいツールとなっている１−４。野生型（ＷＴ）ＣｈＲ２は光誘起された脱分極（ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のために用いられるが、潜在的な将来の臨床応用のための、増加した光感受性をもつＣｈＲ２変異体の検索が現在進行している（ＷＯ０３／０８４９９４および５−７）。より高い効力は、低い光透過率、例えば脳組織、にも関わらず、適用された光源から離れた細胞層の脱分極を可能にするであろう。光感受性の増加もまた、完全なＷＴ  ＣｈＲ２活性化（４８０ｎｍでの、１０１８−１０１９  ｐｈ  ｓ−１ｃｍ−２）に必要である高い青色光強度に起因して、連続照射下での潜在的な細胞損傷の問題を解決するであろう。より高い光感受性がある変異体も、視力回復に関係する調査に重要である８、９。タンパク質レベルでは、光感受性そのものがＣｈＲ２発色団レチナールの本質に起因してわずかに改善できるように、より高い光効力は、開口状態の存続期間を増加させること、および／またはチャネルの単位コンダクタンスを上昇させることによってのみ達成できる。以前の研究は、ヘリックス３および４におけるそれぞれＣ１２８およびＤ１５６の位置での変異が、３０分以上までの開口存続期間をもつ著しく遅いチャネル動態をもたらし、５００倍またはさらに高い光感受性を得ることを示した５、６。これらのＣ１２８およびＤ１５６変異体は、赤色光により様々な開口時間でスイッチを切ることができる。優れた光感受性にもかかわらず、それらの遅い閉口動態は、それらの適用を阻害する要因として残っている。
【０００３】
従って、より高い光感受性と、より速い応答動態を示す、光誘起（ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）陽イオンチャネルの必要性がいまだある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞内膜表面の電位はＣａ＋＋によって強く影響されることが知られているので、亜膜性の（ｓｕｂｍｅｍｂｒａｎｅｏｕｓ）細胞内Ｃａ＋＋レベルの修飾は膜の脱分極およびニューロンにおける電位依存性Ｎａ＋チャネルの活性化をもたらすであろう。したがって、発明者は、ニューロンの光感受性がＣａ＋＋流入で内膜表面の電位を上げることによって間接的に増加できると仮定した。驚くべきことに、発明者は強化されたＣａ＋＋透過性をもつ、以下でＣａｔＣｈ（すなわち、カルシウム転位チャネルロドプシン）として表される、ＣｈＲ２変異体を見出した。ＣａｔＣｈは、ＷＴ  ＣｈＲ２と比べて、海馬ニューロンにおいて発現するとき、４倍高いＣａ＋＋透過性、７０倍高い光感受性、およびより速い応答動態を有する。強化された光感受性およびより早い動態は、内膜表面電位を上昇させ、Ｃａ＋＋活性化大コンダクタンスカリウム（ＢＫ）チャネルを活性化させる、比較的高い光駆動性のＣａ＋＋流入に起因することが示される。［Ｃａ＋＋］ｉの増加は、内側面の電位を上げ、電位依存性Ｎａ＋チャネルの活性化を容易にし、かつ間接的に光感受性を増加させる。光刺激に続く再分極はＣａ＋＋依存ＢＫ−チャネル活性化により著しく加速される。ＣａｔＣｈはニューロンの刺激光感受性を増加させるように光駆動性チャネルを設計できる新しい原則を例示する。活性化のために低い光強度を必要とする一方で、正確で速い活動電位の引き金となることなどの特性は臨床応用における光駆動性チャネルの使用のための道を開く。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、第一の態様において、本発明は配列番号１（ＣＨＯＰ−２）の１−３０９位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１においてＬ１３２に相当する位置での変異を含む、光誘起イオンチャネルに関する。
【０００６】
類似の第二の態様において、本発明はまた、第一の態様による光誘起イオンチャネル、およびレチナールまたはレチナール誘導体を含む、チャネルロドプシンに関する。さらに、第三の態様において、本発明は第一の態様による光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列を含む、核酸構成体を提供する。さらに他の態様において、本発明は第一の態様による光誘起イオンチャネルをコードする核酸または第三の態様による核酸構成体を含む、発現ベクターを提供する。
【０００７】
さらに、第二の態様によるチャネルロドプシン、第三の態様による核酸構成体、または第四の態様による発現ベクターを含む細胞が提供される。
【０００８】
また、本発明は、第一の態様による光誘起イオンチャネル、第二の態様によるチャネルロドプシン、本発明による核酸構成体または発現ベクター、本発明による細胞の、薬剤としての使用に関する。特に、遺伝子療法における本発明による発現ベクターの使用が熟慮される。
【０００９】
より具体的に、失明または視力減少の治療における本発明による光誘起イオンチャネル、チャネルロドプシン、核酸構成体、発現ベクターまたは細胞の使用が熟慮される。
【００１０】
さらに他の態様において、本発明はさらに配列番号１の位置１２８に相当する位置にスレオニン、セリンまたはアラニンを有し、かつ／または配列番号１の位置１５６に相当する位置にアラニンを有する、第一の態様による光誘起イオンチャネルのがん細胞の切除における使用を提供する。
【００１１】
最終的な態様において、本発明は第一の態様による光誘起イオンチャネル、または第二の態様によるチャネルロドプシンまたは本発明による細胞の、高スループットのスクリーニングにおける使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】センサリーロドプシン２構造（ＰＤＢコード１Ｈ２Ｓ）に基づく、ＣｈＲ２の相同性モデル。システインスキャニングのための目標領域（Ｒ１１５からＴ１３９）は膜貫通ヘリックス３（ＴＭ３）に位置し、赤で強調される。挿絵は、変異Ｌ１３２Ｃ、ＴＭ３およびＴＭ４を結合する、水素結合したＣ１２８およびＤ１５６を点線で、および、陽子供与体（Ｈ１３４）および陽子受容体（Ｅ１２３）それぞれのためのホモログ残基の推定される位置を示す。発色団は、シッフ塩基によって共有結合された全トランスのレチナール（ＡＴＲ）およびＫ２５７により形成される。ロイシンのメチル基の除去で形成された空洞は球として表され、システイン残基の変異したスルフヒドリル基（黄色い球）に重ね合わされた。図は、ＶＭＤ３０で作成された。
【００１３】
【図２】ＨＥＫ２９３細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞におけるＣａｔＣｈの生物物理学的特徴。（ａ）左、平均±標準偏差（ｎ＝６）で示される、−６０ｍＶにて、ＣａｔＣｈ（黒）およびＷＴ  ＣｈＲ２（赤）を発現するＨＥＫ２９３細胞において測定された、５００ｍｓ青色光パルスに反応した定常電流振幅の概要。右、定常電流に正規化された光電流のオフ動態（ｏｆｆ−ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の比較。（ｂ）左、１秒間の青色４７３ｎｍ光パルスに反応した実際の光電流。出力（ｔｒａｃｅ）は、ＷＴ（赤）と比較して、ＣａｔＣｈ（黒）の、定常電流−ピーク電流比における増加を説明するためにピーク光電流振幅に正規化される。右、ピーク電流に正規化された光電流のオン動態の比較。（ｃ）８０ｍＭ細胞外Ｃａ＋＋（ｐＨ９）中で、−１２０ｍＶにてアフリカツメガエル卵母細胞を発現するＣａｔＣｈおよびＷＴ  ＣｈＲ２の４７３ｎｍ光反応（連続した下側の出力）。残留チャネルロドプシンＣａ＋＋電流は残る一方で、内因性の（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）Ｃａ＋＋感受性塩素チャネルの重畳電流を無効にする、１ｍＭの最終的細胞質濃度へのＣａ＋＋キレート剤ＢＡＰＴＡの注射（破線の上側の出力）。電流は、ＷＴ  ＣｈＲ２ピーク電流に正規化され、他の６つの実験の典型である。ＷＴ  ＣｈＲ２と比較して増加したＣａ＋＋透過性を示す、ＣａｔＣｈのＢＡＰＴＡ注射の前後のより大きい光電流振幅差がわかる。（ｄ）−８０ｍＶ（ｎ＝６、方法を参照）でのＨＥＫ２９３細胞中のＣａｔＣｈのイオン流出の特性。（ｅ）１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（−●−、ＷＴ  ＣｈＲ２および重ねられたＣａｔＣｈ）と比較された９０ｍＭ  ＣａＣｌ２中のＷＴ  ＣｈＲ２（−■−）およびＣａｔＣｈ（−▲−）の電流電圧曲線。電流は−１００ｍＶにてＷＴ  ＣｈＲ２電流に正規化された。ＣａＣｌ２中のＣａｔＣｈの逆転電位は陽電位に移行し、増加するＣａ＋＋透過性（平均±標準偏差、ｎ＝５）を示す。（ｆ）ＣａｔＣｈ中の細胞内Ｃａ＋＋（対照非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞、▲）の４倍に増加した上昇を示す、９０ｍＭ細胞外Ｃａ＋＋（ｎ＝１０）の存在中での１０秒間の４６０ｎｍ光（青い棒）にＷＴ  ＣｈＲ２（●）およびＣａｔＣｈ（■）を発現するＨＥＫ２９３細胞中のＣａ＋＋流入のＦｕｒａ−２測定。
【００１４】
【図３】海馬培養ニューロンにおけるＣａｔＣｈ発現。（ａ）ＣＡＧプロモーター下でＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−２Ａ−ＥＧＦＰを発現する培養された海馬ニューロンの共焦点画像。縮尺目盛り２０μｍ。（ｂ）４７３ｎｍ青色光（Ｊ４７３ｎｍ、１×１０１９光子ｓ−１ｃｍ−２）の６００ｍｓパルスのによって誘起されたＣａｔＣｈ（黒）およびＷＴ（赤）の典型的な光電流の比較。（ｃ）定常状態電流振幅（−６０ｍＶ、ｎ＝６）の概要。
【００１５】
【図４】高速および高感度の神経の光刺激。（ａ−ｄ）２秒間の光パルスに反応したＣａｔＣｈ発現海馬ニューロンからの、代表的な全細胞電流固定の記録。（ａ）ＷＴに必要である４７３ｎｍの光強度は、脱分極性遮断（Ｊ４７３ｎｍ、２．５×１０１７光子ｓ−１ｃｍ−２）を引き起こす。（ｂ）光強度の減少は、発火を回復する（Ｊ４７３ｎｍ、２．５×１０１６光子ｓ−１ｃｍ−２）。（ｃ）スパイク発火のための代表的な光同調曲線（ｌｉｇｈｔ−ｔｕｎｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）（Ｊｍａｘ、９．７×１０１６光子ｓ−１ｃｍ−２、平均±標準偏差、２回実行）。（ｄ）中程度の緑色の５３２ｎｍ照射もまた、活動電位のトレーン（ｔｒａｉｎ）を誘起する（Ｊ５３２ｎｍ、２．５×１０１７光子ｓ−１ｃｍ−２）。（ｅ）２ｍＭ細胞外Ｃａ＋＋中の（■）、およびコントロールとしての、ＷＴ  ＣｈＲ２と類似の値まで待ち時間を増加させる３ｍＭ細胞外Ｍｇ＋＋中の（■）、５Ｈｚでの、１ｍｓ、４７３ｎｍの２５の光パルスからなる、光パルスのトレーンを通した、光パルスからスパイクまでのピーク待ち時間（Ｊ４７３ｎｍ、３×１０１８個の光子ｓ−１ｃｍ−２、平均±標準偏差［ジッター］）。（ｆ）５０Ｈｚの率で、１ｍｓ、４７３ｎｍのパルスに反応した（Ｊ４７３ｎｍ、２．８×１０１９光子ｓ−１ｃｍ−２）および（ｇ）１０ｎｓ、４７３ｎｍの１０Ｈｚでの光パルスに反応した（Ｊ４７３ｎｍ、１．１×１０２５光子ｓ−１ｃｍ−２）、スパイク発火。（ｈ）  １ｍＭ  ＴＥＡによるＢＫチャネルの阻害に起因する、不完全な膜の再分極（両矢印）。パルストレーンの３番目のスパイク（黒）、ＴＥＡ適用後の最初のスパイク（赤）、および３番目のスパイク（青）の重ね合わせ（Ｊ４７３ｎｍ、１．８×１０１８光子ｓ−１ｃｍ−２）。（ｉ）細胞外溶液中のＣａ＋＋のＭｇ＋＋による置換は、スパイク再分極を遅らせ、持続性の脱分極（５Ｈｚ、左）および、高周波（２０Ｈｚ、右）での複数のスパイクの形成を引き起こす（Ｊ４７３ｎｍ、８．３×１０１８光子ｓ−１ｃｍ−２）。
【００１６】
【図５】ＣａｔＣｈの分光学的特性評価。光励起の後に、ＣａｔＣｈ変異体（黒い出力波形）は、動態において、および光中間体（ｐｈｏｔｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）の存在において、ＷＴ（赤い出力波形）に匹敵する光サイクル（ｐｈｏｔｏｃｙｃｌｅ）に入る。図は、脱プロトン化シッフ塩基、Ｐ３９０（３８１ｎｍ、天板）、開口状態において優位なＰ５２０（５４１ｎｍ、２番目のパネル）のための、および基底状態（４４０ｎｍ、３番目のパネル）の固有波長での、４５０ｎｍの励起後のスペクトル変化について表す。最初の赤に移行した中間体、おそらくＰ５００は、解像されず、オフセットとしてのみ検出される。シッフ塩基は、マイクロ秒単位の時間尺度（τ＝５０μｓ）で、５４１ｎｍでの上昇を伴う、３８１ｎｍでの小さな振幅に起因してほとんど観察できない事象で、脱プロトン化する。Ｐ５２０中間体の上昇は、それが減衰し（ｔ＝９ｍｓ）、その結果２番目に持続する種（Ｐ４８０）が存在する（ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）前に、次の工程（ｔ＝１．５ｍｓ）で起こる。基底状態（Ｄ４７０）は次の工程（ｔ＝１０秒間）で戻る。光サイクルの変遷はＷＴで観測されたものに類似する。電流測定における開口および閉口の動態に関して、変異は機能的な状態の肉眼的変化を全くもたらさない。開口状態は主にＰ５２０中間体により決定される。主な違いは、ＷＴより低いＰ５２０と比べて、Ｐ３９０振幅の程度において見つけられる。したがって、Ｌ１３２Ｃ変異は、発色団部位での明反応に影響しない。光サイクルの分光動態データが５０ｍＭ  Ｃａ＋＋の存在で変更されなかったことに注意。
【００１７】
【図６】ＣａｔＣｈの動作スペクトルはアフリカツメガエル卵母細胞において２電極電圧固定法で決定された。電流振幅は、（実施例に示すように）Ｃａ＋＋の不存在下、異なる波長（λ）で測定され、陽子流で正規化された（ｎ＝６）。基底状態（−）と動作スペクトル（■）の比較。
【００１８】
【図７】Ｃａ＋＋によって誘起された表面電位変化。膜を横断する電圧降下は、適用された電位差（Ψ’）により、表面電位（Φ０）で変更されることが知られている。一般にΦ０は、対イオンでのスクリーニングで変更できる、陰性表面電荷密度に依存する。したがって、電位依存性ナトリウムチャネル（および他の電位感受性チャネル）の活性は、膜の外部または内部の側面のどちらかでの表面電荷の変化によって影響される１８。我々の場合、ＣａｔＣｈを通して伝達されたＣａ＋＋はニューロンの内膜表面の陰性表面電荷を中和する。これにより、膜電位への脱分極作用が誘起され、より低い光強度での活動電位の誘起につながる。このメカニズムの概要図面はａ−ｃに表される（Ｈｉｌｌｅ  ２００１の後に）。（ａ）暗闇では、ＣａｔＣｈチャネルは閉じられ、膜上の電位差、ＥＭ（適用された外部電位）は静止膜電位（ここに、−６０ｍＶに設定される）と同等である。簡単にするため、Φ０はΦ０’に設定された。ｂ）ＣａｔＣｈの光活性化の際に、普通の膜の脱分極Ｎａ＋流入が起こる。しかしながら、ニューロンに入る追加Ｃａ＋＋は内膜表面の表面電位（Φ０’’）を増加させる。より高いＣａ＋＋流入は、より陽性のΦ０’’（両矢印で示される）およびより小さい膜を横断する電圧低下となる。これは電位依存性ナトリウムチャネルの活性化を容易にする。（ｃ）細胞外Ｃａ＋＋を、ＣａｔＣｈに浸透せず、サイトゾルに既に〜４ｍＭで存在するＭｇ＋＋に置換することによって、小さな脱分極効果だけが起こる。これは、Ｃａ＋＋と比較して、わずかに細胞外表面電位（Φ０’）を下げる、より弱いＭｇ＋＋の細胞外膜側面への結合に起因する。表面電位の脱分極効果が、膜を横断する電圧降下による傾きの減少とともに増加することに注意。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
好ましい実施形態の詳細な説明
第一の態様において、本発明は配列番号１（ＣＨＯＰ−２）の１−３０９位置に示されるアミノ酸配列、より好ましくは配列番号１の１−３１５位置に示されるアミノ酸配列、さらには配列番号１の１−７３７位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１においてＬ１３２に相当する位置での変異を含む、光誘起イオンチャネルに関する。
【００２０】
野生型ＣＨＯＰ２は以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶ  ＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰ  ＶＶＶＮＧＳＶＬＶＰ  ＥＤＱＣＹＣＡＧＷＩ  ＥＳＲＧＴＮＧＡＱＴ  ＡＳＮＶＬＱＷＬＡＡ  ＧＦＳＩＬＬＬＭＦＹ  ＡＹＱＴＷＫＳＴＣＧ  ＷＥＥＩＹＶＣＡＩＥ  ＭＶＫＶＩＬＥＦＦＦ  ＥＦＫＮＰＳＭＬＹＬ  ＡＴＧＨＲＶＱＷＬＲ  ＹＡＥＷＬＬＴＣＰＶ  ＩＬＩＨＬＳＮＬＴＧ  ＬＳＮＤＹＳＲＲＴＭ  ＧＬＬＶＳＤＩＧＴＩ  ＶＷＧＡＴＳＡＭＡＴ  ＧＹＶＫＶＩＦＦＣＬ  ＧＬＣＹＧＡＮＴＦＦ  ＨＡＡＫＡＹＩＥＧＹ  ＨＴＶＰＫＧＲＣＲＱ  ＶＶＴＧＭＡＷＬＦＦ  ＶＳＷＧＭＦＰＩＬＦ  ＩＬＧＰＥＧＦＧＶＬ  ＳＶＹＧＳＴＶＧＨＴ  ＩＩＤＬＭＳＫＮＣＷ  ＧＬＬＧＨＹＬＲＶＬ  ＩＨＥＨＩＬＩＨＧＤ  ＩＲＫＴＴＫＬＮＩＧ  ＧＴＥＩＥＶＥＴＬＶ  ＥＤＥＡＥＡＧＡＶＮ  ＫＧＴＧＫＹＡＳＲＥ  ＳＦＬＶＭＲＤＫＭＫ  ＥＫＧＩＤＶＲＡＳＬ  ＤＮＳＫＥＶＥＱＥＱ  ＡＡＲＡＡＭＭＭＭＮ  ＧＮＧＭＧＭＧＭＧＭ  ＮＧＭＮＧＭＧＧＭＮ  ＧＭＡＧＧＡＫＰＧＬ  ＥＬＴＰＱＬＱＰＧＲ  ＶＩＬＡＶＰＤＩＳＭ  ＶＤＦＦＲＥＱＦＡＱ  ＬＳＶＴＹＥＬＶＰＡ  ＬＧＡＤＮＴＬＡＬＶ  ＴＱＡＱＮＬＧＧＶＤ  ＦＶＬＩＨＰＥＦＬＲ  ＤＲＳＳＴＳＩＬＳＲ  ＬＲＧＡＧＱＲＶＡＡ  ＦＧＷＡＱＬＧＰＭＲ  ＤＬＩＥＳＡＮＬＤＧ  ＷＬＥＧＰＳＦＧＱＧ  ＩＬＰＡＨＩＶＡＬＶ  ＡＫＭＱＱＭＲＫＭＱ  ＱＭＱＱＩＧＭＭＴＧ  ＧＭＮＧＭＧＧＧＭＧ  ＧＧＭＮＧＭＧＧＧＮ  ＧＭＮＮＭＧＮＧＭＧ  ＧＧＭＧＮＧＭＧＧＮ  ＧＭＮＧＭＧＧＧＮＧ  ＭＮＮＭＧＧＮＧＭＡ  ＧＮＧＭＧＧＧＭＧＧ  ＮＧＭＧＧＳＭＮＧＭ  ＳＳＧＶＶＡＮＶＴＰ  ＳＡＡＧＧＭＧＧＭＭ  ＮＧＧＭＡＡＰＱＳＰ  ＧＭＮＧＧＲＬＧＴＮ  ＰＬＦＮＡＡＰＳＰＬ  ＳＳＱＬＧＡＥＡＧＭ  ＧＳＭＧＧＭＧＧＭＳ  ＧＭＧＧＭＧＧＭＧＧ  ＭＧＧＡＧＡＡＴＴＱ  ＡＡＧＧＮＡＥＡＥＭ  ＬＱＮＬＭＮＥＩＮＲ  ＬＫＲＥＬＧＥ  （配列番号：１）
【００２１】
本発明の光誘起イオンチャネルは少なくとも５個の膜貫通ヘリックスをもつ、光感受性ポリエンと結合できる膜タンパク質である。６または７個の膜貫通ヘリックスをもつ膜貫通タンパク質が好ましい。しかしながら、７個以上、例えば８、９または１０のヘリックスをもつ膜貫通タンパク質もまた、本発明に含まれる。その上、本発明は膜貫通部分に加えて、Ｃ−末端配列が、膜に包まれた内腔の内側、例えば細胞の細胞質またはリポソームの内側、まで拡張でき、または膜外表面上にも配置できるところの、Ｃ−および／またはＮ−末端配列を含む膜貫通タンパク質も含む。同様のことが、任意に存在する、同様に内腔内部および膜の外表面上にも配置できるＮ−末端配列にも適用される。Ｃ−および／またはＮ−末端配列の長さは原則としてどんな制限も受けないが、しかしながら、膜に埋め込まれていない１から１０００アミノ酸、好ましくは１から５００、特に好ましくは５から５０のアミノ酸をもつ、Ｃ−末端配列をもつ光誘起イオンチャネルが好ましい。Ｃ−末端配列の長さから独立して、膜に埋め込まれないＮ−端末に位置する配列は、好ましくは１から５００のアミノ酸、特に好ましくは５から５０のアミノ酸を含む。膜貫通ヘリックスの概念は当業者によく知られている。これらは一般にαらせん状の、原則として２０から２５のアミノ酸を含む、立体構造である。しかしながら、天然の膜、例えば細胞または原形質膜、または合成膜の場合がある、膜の性質によって、膜貫通領域も、より短いか、または、より長い場合がある。例えば、人工膜の膜貫通領域は３０アミノ酸まで含むことができるが、他方で数個のみのアミノ酸、例えば１２から１６個を含むこともできる。
【００２２】
好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは、配列番号１の１−３０９位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
他の好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは、配列番号１の１−３１５位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
一般に、アミノ酸配列と、配置された配列との間の配列同一性が少なくともｘ％であれば、アミノ酸配列は上記の配列番号１または他のアミノ酸配列と「少なくともｘ％の同一性」を有する。そのような配置は、例えば公衆に利用可能な、ＮＣＢＩホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで提供される「ＢＬＡＳＴ」プログラムのような、コンピュータ相同性プログラムを、ここで提供される初期の設定で用いることにより実施できる。一組の核酸配列の配列同一性割合を計算するさらなる方法は当業者に既知である。
【００２５】
そのような、配列番号１の１−３０９または１−３１５位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む光誘起イオンチャネルの例は、コナミドリムシ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（ｇｉ：１５８１１３７９）からのＣＨＯＰ１、ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）からのＣＨＯＰ２（ｇｉ：１６７６５０７４８）およびＣＨＯＰ１（ｇｉ：１６７６５０７４４）、またはＣＨＯＰ２またはＣＨＯＰ１の他のいかなるオルソログまたは対立遺伝子多型である。
【００２６】
さらにより好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは、Ｌ１３２の変異を除いて、配列番号１（ＣＨＯＰ−２）の１−３０９位置に示されるアミノ酸配列を含む、好ましくはからなる。
【００２７】
他のさらにより好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは、Ｌ１３２の変異を除いて、配列番号１（ＣＨＯＰ−２）の１−３１５位置に示されるアミノ酸配列を含む、好ましくはからなる。
【００２８】
配列番号１のＬ１３２位置、またはＬ１３２に対応する位置での変異は、置換、追加および／または欠失であり得る。しかしながら、好ましくは変異は置換、より好ましくはＬ１３２Ｃ、Ｌ１３２Ｓ、Ｌ１３２Ｅ、Ｌ１３２ＤおよびＬ１３２Ｔから選択され、最も好ましくは置換はＬ１３２Ｃである。実験データがＬ１３２Ｃに関するものしかないとしても、置換Ｌ１３２Ｓ、Ｌ１３２Ｅ、Ｌ１３２ＤおよびＬ１３２Ｔは、全ての置換がチャネルの極性を増加させるので、効用の特性を示すであろうことが予期される。
【００２９】
加えて、光誘起イオンチャネルはさらに（準）保存的置換を含む。保存的置換は、それらの側鎖および化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、無極性脂肪族側鎖、無極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小さい側鎖、大きい側鎖、等である。典型的な準保存的および保存的置換は以下の通りである。
【００３０】
【表１】
0005933556.tif 000002
【００３１】
さらに、当業者は立体的に要求された位置のグリシンを置換すべきでないこと、およびアルファ−ヘリックスまたはベータ−シート構造を有するタンパク質の一部にプロリンを挿入すべきでないことを理解するであろう。
【００３２】
他の好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは共通モチーフ（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｍｏｔｉｆ）、Ｌ（Ｉ）ＤｘｘｘＫｘｘＷ（Ｆ，Ｙ）を含む。この共通配列はレチナール結合アミノ酸リジンを囲むモチーフである。
【００３３】
高い時間精度を維持する一方で、自然に起こる光強度でＣａｔＣｈを活性化させる可能性は、特に遺伝子治療での視力回復への努力のための、また他の生物医学的応用のための、優れた候補となる。その減少した光要求のために、ＣａｔＣｈスパイクは４７４ｎｍのスペクトル最大から離れた、例えば、緑色光（５３２ｎｍ、図４ｄ参照）による励起によっても発生できる。作用スペクトル外側の隣接域での作業は、その減少した光要求のために可能となり、組織透過を容易にする。
【００３４】
従って、好ましい本発明の変異光誘起イオンチャネルの光感受性は、海馬ニューロンにおいてＷＴ  ＣＨＯＰ−２と比較して５倍より多く、好ましくは１０倍より多く、より好ましくは２０倍より多く、例えば３０倍より多く、さらにより好ましくは４０倍より多く、例えば５０倍より多く、もっとも好ましくは６０倍より多く、または７０倍より多く増加する。さらに、本発明の変異光誘起イオンチャネルは、海馬ニューロンにおいて全細胞電気生理学的記録（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）により測定したＷＴ  ＣＨＯＰ−２と比較して、少なくとも１．５倍、より好ましくは２倍、またはさらにより好ましくは２．５倍増加した刺激頻度を示す。実施例に示されているように、ＷＴ−Ｃｈｏｐ２は、２０Ｈｚでのシグナル伝達はすでに不正確であるところの、約１０Ｈｚから約２０Ｈｚまでの海馬ニューロンにおける刺激頻度を示す。さらに、当業者は、内因性のスパイク頻度もまた細胞の型に依存することを認めるであろう。例えば、聴細胞は、５００Ｈｚまでの内因性スパイク頻度を有する。さらに、実験はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、すなわち周囲温度で行われた。しかしながら、当業者は、動態もまた温度依存であるため、刺激頻度が哺乳動物などの温血動物でさらに高くなると予想するであろう。したがって、細胞型と温度に依存して、本発明の変異光誘起イオンチャネルが、全細胞電気生理学的記録により測定したＷＴ  ＣＨＯＰ−２と比較して、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、またはより好ましくは少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、例えば少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、さらにより好ましくは少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍、最も好ましくは少なくとも１２５倍、例えば少なくとも１５０倍、または少なくとも１７５倍、およびさらに最も好ましくは少なくとも２００倍増加した刺激頻度を示し得ることが予想される。海馬ニューロンからの海馬培養神経細胞および電気生理学的記録は以下の実施例に例示される。
【００３５】
簡潔に、海馬は出生後Ｐ１  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から取り出され、パパイン（２０Ｕｍｌ−１）で３７℃にて２０分間処理される。海馬は１０％の牛胎児血清が補われたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、高グルコース）で洗浄され、少量のこの溶液中で粉砕される。〜７万５０００個の細胞が、２４ウェルプレート中のポリ−Ｄ−リジン／ラミニンでコートされたカバーガラス上に播種（ｐｌａｔｅ）される。３時間後に、プレート培地（ｐｌａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）は、培地（２％  Ｂ−２７補足剤、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ）に置き換えられた。変異体ＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−ＹＦＰおよびＣｈＲ２（ＷＴ）−ＹＦＰは、播種の５〜１０日後にリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトされる。あるいは、２〜５×１０９ＧＣ／ｍｌのウイルス（ＡＡＶ２／７−ＣＡＧ−ＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨ）が播種の４〜９日後に各々のウェルに加えられ得る。アデノ随伴ウイルスベクター構成体の代表的な構造は、以下の実施例で詳細に説明される。発現は、形質導入後５日間で目に見えるようになる。いかなる実験においても、全トランスレチナールは培地または記録培地（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）に全く添加されない。
【００３６】
海馬培養神経細胞の全細胞記録のために、５〜１０Ωの抵抗をもつパッチピペットが、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＡＴＰおよび０．３ｍＭ  Ｎａ３ＧＴＰで満たされ、ｐＨ７．２に滴定される。タイロード溶液は細胞外溶液として用いられる（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコースおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に滴定）。名目上はＣａ＋＋無しの細胞外溶液は、０ｍＭ  Ｃａ＋＋および３ｍＭ  Ｍｇ＋＋を有することを除いて、この同じ溶液を含む。記録は、興奮性シナプス伝達遮断剤、１，２，３，４−テトラヒドロ−６−ニトロ−２，３−ジオキソ−ベンゾ［ｆ］キノキサリン−７−スルホンアミド（ＮＢＱＸ，１０μＭ，Ｓｉｇｍａ）およびＤ（−）−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（ＡＰ−５，５０μＭ，Ｓｉｇｍａ）の存在下で行われた。電圧固定記録のため、１μＭのテトロドトキシンが細胞外溶液に添加される。ＢＫチャネル活性を阻害するため、１ｍＭ  ＴＥＡが加えられる。記録は、蛍光ランプを備える倒立Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５顕微鏡上で行われる。成功したタンパク質の発現はＥＧＦＰまたはＹＦＰによってもたらされる蛍光によって立証される。ニューロンのアクセス抵抗は、１５〜４０ＭΩであり、実験全体にわたって、安定性のために監視される。電気生理学的信号は、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用することで増幅され、１０ｋＨｚでフィルターにかけられ、Ａｘｏｎ  Ｄｉｇｉｄａｔａ１６００（５０Ｈｚ）でデジタル化され、かつｐＣｌａｍｐ９ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて入手および分析される。光電流は、ダイオード励起固体レーザー（Ｐｕｓｃｈ  Ｏｐｔｏ  Ｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ；λ１＝４７３ｎｍ，Ｐ１＝１００ｍＷ，λ２＝５３２ｎｍ，Ｐ２＝５０ｍＷ）からの様々な波長の光パルスまたはエキシマー励起色素レーザー（Ｃｏｕｍａｒｉｎ  ２，λ＝４５０ｎｍ）からの１０ｎｓ閃光により誘起される。特定の光強度は、細胞から〜５００μｍの距離にて、４００μｍ直径の石英光ファイバー（ＳＴＥ−Ｆ１００／４００−Ｙ−ＶＩＳ／ＮＩＲ；  Ｌａｓｅｒ  ２０００，Ｗｅｓｓｌｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の末端での強度である。ＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−ＹＦＰおよびＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−２Ａ−ＥＧＦＰを発現するニューロンから測定された電流は同じである。
【００３７】
加えて、他の好ましい実施形態において、本発明の変異光誘起イオンチャネルの、ＨＥＫ２９３細胞でのＦｕｒａ−２−イメージングによって測定される、カルシウム伝導度は、ＷＴ  ＣＨＯＰ−２と比較して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍増加される。カルシウム伝導度Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（５ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）室温にて３０分から１時間ロードされる。ローディングの後に、細胞はＣａ＋＋なしの１４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、７ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で回収される。黄色蛍光タンパク質は、そのＹＦＰ−蛍光からの各々の細胞発現レベルを見積もるため、４６０／４０ｎｍのフィルター（Ｖｉｓｉｔｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する光に５００ｍｓ曝すことにより励起される。１５分間の暗闇の後、光駆動チャネルが青色光（４６０／４０ｎｍ）で１０秒間刺激される。Ｆｕｒａ−２は、３４０ｎｍ（３４０／２０）および３８０ｎｍ（３８０／２０）、およびＣＣＤカメラ（全てのフィルターはＶｉｓｉｔｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｕｃｈｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で検出される放射光（５４０／８０ｎｍ）で励起される。
【００３８】
上記に示すように、変異光誘起イオンチャネルは、追加でさらなる変異、好ましくは置換を含み得る。一の好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルはさらに、少なくとも１個の以下のアミノ酸残基：配列番号１の位置２５３に対応する位置のアスパラギン酸；配列番号１の位置２５７に対応する位置のリジン；配列番号１の位置２６０に対応する位置のトリプトファン；配列番号１の位置１２３に対応する位置のグルタミン酸；配列番号１の位置１３４に対応する位置のヒスチジンまたはアルギニン、好ましくはアルギニン；配列番号１の位置１２８に対応する位置のトレオニン、セリン、またはアラニン；および／または配列番号の位置１５６に対応する位置のアラニン、を含み得る。従って、変異光誘起イオンチャネルは、配列番号１に対応する、示された位置におけるアミノ酸残基の以下の組み合わせの１個：
【００３９】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３；Ｃｙｓ１３２＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｌａ１５６；
【００４０】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｔｒｐ２６０；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｇｌｕ１２３；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ａｌａ１５６；
【００４１】
Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｇｌｕ１２３；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ａｌａ１５６；
【００４２】
Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ａｌａ１５６；
【００４３】
Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｌａ１５６；
【００４４】
Ｃｙｓ１３２＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００４５】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００４６】
Ｃｙｓ１３２＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００４７】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｇｌｕ１２３；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ａｌａ１５６；
【００４８】
Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ１５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ１５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ１５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ１５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ１５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ１５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ１５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ａｌａ１５６；
【００４９】
Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｌａ１５６；
【００５０】
Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００５１】
Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００５２】
Ｃｙｓ１３２＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００５３】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００５４】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ａｌａ１５６；
【００５５】
Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｌａ１５６；
【００５６】
Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００５７】
Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００５８】
Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００５９】
Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００６０】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｌａ１５６；
【００６１】
Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００６２】
Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００６３】
Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００６４】
Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００６５】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００６６】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１５６；
【００６７】
Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００６８】
Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００６９】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ｈｉｓ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６；
【００７０】
Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｔｈｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ｓｅｒ１２８＋Ａｌａ１５６；Ｃｙｓ１３２＋Ａｓｐ２５３＋Ｌｙｓ２５７＋Ｔｒｐ２６０＋Ｇｌｕ１２３＋Ａｒｇ１３４＋Ａｌａ１２８＋Ａｌａ１５６、を含み得る。
【００７１】
しかしながら、上記のリストにおいてＣｙｓ１３２はまた、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１３２、Ａｓｐ１３２またはＴｈｒ１３２のいずれかに置換され得る。
【００７２】
一般に、光誘起イオンチャネルの機能に必要なレチナール、またはレチナール誘導体は、細胞により生産され、該イオンチャネルでトランスフェクトされる。その配座によって、レチナールは、全トランスレチナール、１１−シスレチナール、１３−シスレチナール、または９−シスレチナールであり得る。しかしながら、本発明の変異光誘起イオンチャネルが小胞、リポソーム、または他の人工の細胞膜に組み込まれ得ることもまた、予期される。従って、第二の態様において、本発明は第一の態様の光誘起イオンチャネル、およびレチナールまたはレチナール誘導体を含む、チャネルロドプシンを提供する。好ましくは、レチナール誘導体は３，４−デヒドロレチナール、１３−エチルレチナール、９−ｄｍ−レチナール、３−ヒドロキシレチナール、４−ヒドロキシレチナール、ナフチルレチナール；３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，４，６，８，１０ペンタエナール；３，７ジメチル−デカ−２，４，６，８−テトラエナール；３，７−ジメチル−オクタ−２，４，６−トリエナール；および６−７回転阻止（ｒｏｔａｔｉｏｎ−ｂｌｏｃｋｅｄ）レチナール、８−９回転阻止レチナール、および１０−１１回転阻止レチナールからなる群から選択される。加えて、第一の態様の好ましい実施形態は、第二の態様の好ましい実施形態に対応する。
【００７３】
第三の態様において、本発明はまた、第一の態様の光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列を含む、核酸構成体に関する。
【００７４】
最適の発現を確実にするために、コーディングＤＮＡもまた、例えば、適切な調節配列および／または標的配列の付加、および／または、コーディングＤＮＡ配列の、選択された宿主の好ましいコドン使用頻度との照合により、変更できる。標的配列は、シナプス、ポストシナプス部位、軸索小丘、または小胞体などの、細胞内の特定の部位または区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に光誘起イオンチャネルを標的化する、Ｃ−末端伸張をコードし得る。核酸は、本発明のタンパク質の配列の発現を提供するために更なる要素、例えば、プロモーター、転写開始および停止信号、翻訳開始および停止信号、およびポリアデニル化信号、に結合され得る。プロモーターは誘導型または構成的、一般的または細胞特異的プロモーターであり得る。細胞特異的プロモーターの例は両極細胞に特有のｍＧｌｕ６−プロモーターである。プロモーター、ベクター、および他の要素の選択当業者のレベルでの設計事項である。そのような多くの要素が、文献に記載され、商業的供給者を通して入手可能である。
【００７５】
従って、第四の態様において、本発明は第一の態様の光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列または第三の態様の核酸構成体を含む、発現ベクターを提供する。好ましい実施形態において、ベクターは遺伝子治療に好適であり、特に、ウイルス媒介性の遺伝子導入に好適である。「ウイルス媒介性の遺伝子導入に好適」なる用語は、本明細書では、該ベクターがウイルスにパックされ、その結果、対象の部位または細胞に送達できることを意味する。遺伝子治療に好適なウイルスの例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびヘルペスウイルスである。これらのウイルスは、それらが認識し、感染させることができる細胞に遺伝子をどれくらいよく転移させるか、そして、それらが細胞のＤＮＡを永久にまたは一時的に改変するかどうかの点で異なる。しかしながら、遺伝子治療は裸のＤＮＡ、リポプレックスおよびポリプレックス、およびデンドリマーの適用などの非ウイルス性の方法もまた包含する。
【００７６】
上記の通り、得られる核酸配列は細胞、例えば担体としてのウイルスの使用により、または例えば、（リポフェクタミン、フージーンなどの）化学トランスフェクタント、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈殿およびＤＮＡの直接拡散を含むトランスフェクションにより細胞に導入され得る。細胞をトランスフェクトする方法は実施例に詳述され、それぞれの受容細胞に適合され得る。ＤＮＡでのトランスフェクションは、染色体外の形態で存在する、トランスフェクトされたＤＮＡがゲノム、または不安定な（一時的な）細胞または細胞株に組み込まれると、安定な細胞または細胞株をもたらす。その上、安定な細胞株は、エピソーム複製プラスミドを使用することにより、安定した細胞株を入手でき、それは、染色体外プラスミドの遺伝的形質が細胞ゲノムに組み込まれる制御要素により制御されることを意味する。一般に、適切なベクターまたはプラスミドの選択は、対象となる宿主細胞による。
【００７７】
従って、第五の態様において、本発明は第二の態様のチャネルロドプシン、第三の態様の核酸構成体または第四の態様の発現ベクターを含む細胞に関する。
【００７８】
以下で説明されるように、本発明の変異光誘起イオンチャネルの一つの適用は、人間または動物などの盲目の対象の治療である。生まれつきの視細胞がもはや機能しない、多くの疾患があるが、すべての神経接合部は、作動し続けることができる。今日、網膜上に人工セラミック光電セルの薄いフィルムを移植する試みが様々な研究センターで行われている。これらの光電セルは、二次的に網膜のいまだ無傷の細胞を脱分極し、その結果、神経インパルス（人工眼）の引き金となることを意図する。これらの神経節細胞、アマクリン細胞または両極細胞における本発明の光制御イオンチャネルの意図的な発現は、非常により的確な解決策であり、より大きい三次元的な視覚解像度を可能にするであろう。
【００７９】
変異光誘起イオンチャネルの、天然において対応するチャネルが発現しない細胞の膜への組込みは単純に、例えば、組み換えＤＮＡ技術の既知の手順を用いて、このイオンチャネルをコードするＤＮＡがまず適切な発現ベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはウイルスに組み込まれ、標的細胞はその後これにより形質転換され、タンパク質がこの宿主で発現されるということを達成できる。次に、細胞は適当な方法、例えばレチナールで、タンパク質およびレチナール間のシッフ塩基結合を可能にするために処理される。
【００８０】
好ましい実施形態において、これはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ  Ｐｏｍｂｅ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの種種の酵母において、細菌ロドプシン、および／またはウシロドプシンなどのロドプシンで既に成功裏に実施されているように、起こる。
【００８１】
また、発現は哺乳動物細胞系または昆虫細胞系でも生じ得る。それゆえ、好ましい実施形態において、細胞は哺乳動物細胞または昆虫細胞である。発現は、好ましくはメラノーマ細胞（例えば、ＢＬＭ細胞株）、ＣＯＳ細胞（「アフリカミドリザル腎臓ＣＶ１」細胞感染により生成される）またはＨＥＫ細胞（「ヒト胎児腎臓細胞」例えばＨＥＫ２９３細胞）、またはＢＨＫ細胞（「ベビーハムスター腎細胞」）における一時的発現としてのエピソーマルベクターで、またはＣＨＯ細胞（「チャイニーズハムスター卵巣細胞」）、骨髄腫細胞またはＭＤＣＫ細胞（「Ｍａｄｉｎｅ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞」）またはバキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞における、（ゲノムへの組込による）安定な発現形態においてのいずれかで生じる。従って、より好ましい実施形態において、哺乳動物細胞はＣＯＳ細胞；ＢＨＫ細胞；ＨＥＫ２９３細胞；ＣＨＯ細胞；またはＭＤＣＫ細胞である。
【００８２】
視力回復の文脈における、最も好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は光受容細胞；網膜桿状体細胞；網膜錐体細胞；網膜神経節細胞；双極ニューロン；神経節細胞；偽単極ニューロン；多極ニューロン；ピラミッド状ニューロン；プルキンエ細胞；または、顆粒細胞である。
【００８３】
ニューロンは、他の細胞との接続に特化された、電気的および、化学的シグナル伝達がシナプスを通して起こるところの、化学的シグナル伝達により情報を処理および伝達する電気的興奮細胞である。感覚器官の細胞に作用する、接触、音、光および多数の他の刺激に反応する感覚ニューロン、脳および脊椎から信号を受信し、筋収縮を引き起こし、腺に作用する運動ニューロン、脳または脊椎の同じ領域内の他のニューロンにニューロンを接続する介在ニューロンなどの、多数の特化された型のニューロンが存在する。一般に、ニューロンは体細胞、樹状突起、および軸索を有する。樹状突起は、細胞体から生じ、しばしば何百ミクロンも広がっていて、複数回分岐している、フィラメントである。軸索は、軸索小丘と呼ばれる部位の細胞体から生じる特別な細胞フィラメントである。ニューロンの細胞体は頻繁に複数の樹状突起をもたらすが、軸索がその終点までに数百回分岐し得るけれども、決して１つ以上の軸索をもたらさない。主要なシナプスにて、シグナルは１個のニューロンの軸索から他の樹状突起に送られる。しかしながら、これらの法則には多数の例外：樹状突起を欠くニューロン、軸索を全く有さないニューロン、軸索を別の軸索へ、または樹状突起を別の樹状突起に接続するシナプスなど、がある。さらにほとんどのニューロンは、解剖学的に単極または偽単極（樹状突起および軸索は同じ過程から現れる）、双極（体細胞の反対端の軸索および単独の樹状突起）、多極（２個以上の樹状突起を有し、さらに（ｉ）錐体細胞、プルキンエ細胞および前角細胞などの、長突起の軸索突起（ｌｏｎｇ−ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ  ａｘｏｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）をもつゴルジＩニューロン、および（ｉｉ）軸索突起が局所的に突出するゴルジＩＩニューロン、例えば顆粒細胞、としてさらに分類し得る）として特徴付けられる。
【００８４】
光受容細胞は、光伝達能を有する網膜で見つけられた特化されたニューロンである。２種の古典的な光受容体は、それぞれが視覚系により使用される情報に寄与する、桿体視細胞および錐体視細胞である。網膜神経節細胞は、目の網膜の内表面の近くに位置する一種のニューロンである。これらの細胞は、視蓋前域（中脳）、視床下部の視交差上核、および外側膝状体（視床）に突出させる、樹状突起および長い軸索を有する。わずかな比率は、視覚にほとんど貢献しないか全く貢献しないが、それ自体は感光性である。それらの軸索は、網膜視床下部路を形成し、日周期および瞳孔対光反射、瞳孔のリサイズに貢献する。それらは光受容体から、２個の介在ニューロン型：両極細胞およびアマクリン細胞、を経て視覚情報を受け取る。アマクリン細胞は網膜における介在ニューロンであり、網膜神経節細胞への入力の７０％に関与する。網膜神経節への他の３０％の入力に関与する両極細胞はアマクリン細胞によって調節される。網膜の一部として、両極細胞は光受容体（桿体細胞と錐体細胞）と神経節細胞の間に存在する。それらは、光受容体から神経節細胞まで信号を伝えるために直接または間接的に働く。
【００８５】
細胞は単離され（および遺伝学的に改変され）、維持され、適切な温度およびガス混合（典型的には、３７℃、５％ＣＯ２）で、任意に、当業者に既知および実施例における特定の細胞株または細胞型のために例示された、細胞培養器内で、培養され得る。培養条件は各々の細胞型により変化し得、特定の細胞型のための条件の変化は異なった表現型をもたらすことができる。温度とガス混合は別として、細胞培養系における最も一般的な変化の要素は増殖培地である。増殖培地のためのレシピは、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子、および特に他の栄養成分の存在において変化できる。増殖培地は、商業的に利用可能であるか、またはアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な組成に従って、調製できる。補足培地に使用される増殖因子はしばしば子牛血清などの動物血液由来である。追加で、抗生物質が増殖培地に加えられ得る。一般的な操作の中で、培養細胞上で実施されるものは、培地変更および細胞通過である。
【００８６】
ＣａｔＣｈ適用のための追加の電位場がある。Ｃａ＋＋は重要な細胞内調節因子であるため、ＣａｔＣｈは、細胞の、状態と活動を調節する、微調整されたＣａ＋＋の恒常性への光の介入を可能にする。基礎研究では、ＣａｔＣｈは、閉じ込められたＣａ＋＋２６に代わる手段としてＣａ＋＋依存開口分泌（例えば、シナプスの伝達物質放出）を光学的に制御する、カルシウム活性化キナーゼおよびホスファターゼを経て下流の細胞内プロセスを光学的に活性化する、またはゴルジ装置または小胞体などの細胞内区画にＣａｔＣｈを標的とすることによってアポトーシスを引き起こすために使用され得る。
【００８７】
したがって、本発明の更なる態様は、第一の態様の光誘起イオンチャネルまたは第二の態様のチャネルロドプシン、または第三の態様の核酸構成体または本発明の細胞の薬物としての使用である。特に、本発明の発現ベクターは遺伝子治療で使用され得る。より具体的には、第一の態様の光誘起イオンチャネル、第二の態様のチャネルロドプシン、第三の態様の核酸構成体、または本発明の細胞は、盲目または減少した視力の治療で使用され得る。しかしながら、３００Ｈｚまでのその早いスパイク開始の動作のため、聴力回復または難聴の治療における光誘起イオンチャネルの使用もまた熟慮される。
【００８８】
さらに、第一の態様の変異光誘起イオンチャネルは、恒久的な光誘起カルシウム流入を引き起こし、順に細胞死を引き起こす、追加の置換（ＳＦＯの、または遅い変異体と呼ばれる、表１参照）を含み得る。従って、癌細胞の除去における、配列番号１の位置１２８に相当する位置にスレオニン、セリンまたはアラニンを、および／または配列番号１の位置１５６に相当する位置にアラニンを追加的に有する本発明の光誘起イオンチャネルの使用が熟慮される。例えば、本発明の発現ベクターは癌細胞への癌細胞表面マーカーを経てウイルス媒介性の遺伝子導入で標的化できるであろう。さらに、具体的にはレトロウイルスが好ましくは癌細胞などの急速に分裂する細胞に組み込まれることに注意すべきである。結果として、本発明の光誘起イオンチャネルは、支配的に発現され、癌細胞の細胞膜に組み込まれる。光による刺激の際に、これらのイオンチャネルは、結果として癌細胞の死に通じる、恒久的なカルシウム流入を開いて、引き起こすであろう。そのような使用は、黒色腫の癌細胞のように光に自然に露出される癌細胞の除去に特に有利である。したがって、好ましい実施形態において、癌は黒色腫の癌である。
【００８９】
最終的な態様において、本発明は第一の態様の光誘起イオンチャネル、または第二の態様のチャネルロドプシン、または本発明の細胞の、高スループットのスクリーニングでの使用に関する。高スループットのスクリーニング（ＨＴＳ）は、特に創薬に使用され、かつ生物学および化学の分野に関連している科学実験のための方法である。ＨＴＳは、研究者が、しばしば現代のロボット工学、データ処理、制御ソフトウェア、液体の処理方法装置、および高感度検出器の組み合わせを通して、何百万もの生化学、遺伝子、または、薬理学の試験を短時間に行うことを許容する。この工程により、特定の生体分子経路を調節する活性剤；特に本発明の光誘起イオンチャネル、Ｃａ＋＋誘導カリウムチャネルまたはＢＫチャネルなどのイオンチャネルを改変する物質、を急速に同定し得る。例えば、宿主細胞の中でＣａ＋＋誘導カリウムチャネルおよび光誘起イオンチャネルを共発現し得る。光による刺激の際に、光誘起チャネルは開かれ、細胞内Ｃａ＋＋濃度が増加し、その結果、カリウムチャンネルを活性化するであろう。それ故、ＲＨ４２１（Ｎ（４−スルフォブチル）−４−（４（４（ジペンチルアミノ）フェニル）ブタジエニル）ピリジニウム、内塩）などの電位感受性色素によって監視され得る、膜電位における変化を受けるであろう。その結果、そのようなＨＴＳは以下の段階を含み得る；（ｉ）Ｃａ＋＋誘導（カリウム）チャネルおよび本発明の光誘起イオンチャネルを発現する細胞に、Ｃａ＋＋誘導チャネルに対する候補剤を接触させる、（ｉｉ）光誘起チャンネルを誘起するために光刺激を適用する；（ｉｉｉ）膜電位（混合シグナル）の変更の決定、および（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で決定したシグナルと、段階（ｉｉ）に供された本発明の光誘起イオンチャネルのみを発現する細胞で決定されたシグナル（単一シグナル）の比較。膜電位の変化の減少は、Ｃａ＋＋誘導（カリウム）チャンネルの有望なモジュレータを暗示するであろう。そのようなアプローチが、Ｃａ＋＋誘導チャネルのみを発現する細胞で実施された直接測定と比較して遙かに改良された、約５：１のシグナル・ノイズ比を得ることが示されるであろう。改良されたシグナル・ノイズ比のため、特に光誘起イオンチャネルを使用することによって、前述の方法は特にＨＴＳに適当であり得る。
【００９０】
本質において、ＨＴＳは、比較的短い時間で、特定の標的に対する多数の物質の効果について多量の実験データを集めるためのアプローチを使用する。スクリーニングは、この文脈においては、ただ一つの目標（通常、科学的仮説を試験する）のために、すべてのデータが続いて適用され得る、より大きい実験である。ＨＴＳに関して、本発明の細胞は、マルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレートのような組織プレートに播種され得る。その後、プレート中の細胞は標的イオンチャネルと相互作用するために十分な時間、試験物質と接触される。試験物質は、プレートにわたって、ウェルからウェルで異なり得る。培養時間が過ぎた後に、測定は、プレートのすべてのウェルにわたって、手動または機械によって行われ、任意に試験物質で接触されていない細胞の測定値と比較される。研究者が、自動化されたルーチンでまだ実行されていなかった効果を探して、パッチ・クランプを使用するとき、手動測定が必要であり得る。そうでなければ、特化された自動分析装置はウェル上で多数の実験（特定の頻度または高スループットパッチ・クランプ測定の光の分析など）を実行できる。この場合、装置は単一のウェルから得られた値へ各数をマッピングして、各々の実験の結果を、例えば数値の格子として、出力する。この最初のアッセイの結果によって、研究者は、同じスクリーニングの中で新しいアッセイプレートへ活性（すなわち、細胞内環状ヌクレオチドレベルを変更する）として特定されたものと同様の物質を使用することによって、追跡アッセイを実行でき、次に詳しいデータを集めるために実験を再実行して、化学剤の構造を最適化して、細胞への剤の効果を改良できる。自動化はＨＴＳの有用性において重要な要素である。特化されたロボットは、最終分析を経た創作から、しばしば単一のアッセイプレートの寿命を超える過程の多くの原因となる。ＨＴＳロボットは通常、多くのプレートを同時に調製、分析でき、さらにデータ収集の過程を促進する。本発明のＨＴＳに好適な装置の例は、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲＴＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＶＩＰＲ，Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ（登録商標）  Ｒａｔｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ（登録商標）（ＡＴＴＯ）を含む。
【００９１】
以下で、本発明は本発明の範囲を限定する意図でない図と実施例によって説明される。
【実施例】
【００９２】
ＣａｔＣｈの構築および生物物理学的特徴
以前のアプローチと対照的に、発明者の目的は、その変異が陽イオン透過性を改変するＷＴ  ＣｈＲ２内の残基、を特定することであった。発明者は、３番目の膜貫通ドメインに、このドメイン内のいくつかの変異している残基が光サイクルを改変し、チャネルを駆動する（ｇａｔｉｎｇ）ものとして、着目した（図１）５−７、１２。Ａｒｇ１１５からＴｈｒ１３９までの各々の残基は、個別にシステインに置き換えられ、アフリカツメガエル卵母細胞中で機能的な変化をスクリーニングされた。
【００９３】
分光法
ＣａｔＣｈは以前説明される５、１３ように、ピチア・パストリス内で発現され、精製された。閃光光分解（Ｆｌａｓｈ−ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ）研究が実施され、吸収変化が、エキシマー励起染料レーザー（ｅｘｃｉｍｅｒ  ｐｕｍｐｅｄ  ｄｙｅ  ｌａｓｅｒ）（４５０ｎｍ、２−３ｍＪ）１３からの１０ｎｓのレーザー閃光の励起後に測定された。
【００９４】
Ｌ１３２Ｃ（ＣａｔＣｈ）変異は電流出力の振幅および波形に優位な改変を示す。
【００９５】
ＨＥＫ２９３細胞培養および分子生物学
Ｃ末端切断型のＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−ＹＦＰ（ベクター：ｐｃＤＮＡ３（−）−ｃｈｏｐ２−３０９（Ｌ１３２Ｃ）−ＥＹＦＰ）は、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされ、常にＧ４１８選択下（０．６ｍｇ／ｍｌ；ＰＡＡ  Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃｏｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で保持された。野生型ＷＴ  ＣｈＲ２のために、Ｃ末端切断型のＣｈＲ２−ＹＦＰベクター：ｐｃＤＮＡ４ＴＯ−ｃｈｏｐ２−３０９−ＥＹＦＰ）がＨＥＫ２９３−Ｔｒｅｘ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に安定してトランスフェクトされ、以前に記載されたように１３、培養され、誘導された。定常関係（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎ）のピークは、測定の２４時間前にヒトコドン最適化ｐｃＤＮＡ３．１（−）−ＣｈＲ２−ＹＦＰ構成体（ＷＴ、Ｈ１３４ＲまたはＬ１３２Ｃ）で一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、ＱＩＡＧＥＮ）から決定された。
【００９６】
ＨＥＫ２９３細胞における電気生理学的記録
２−４ＭΩの抵抗をもつパッチピペットは、水平なＤＭＺユニバーサルプーラー（シリアルＮｏ．５３１８９０４１２０Ｂ、Ｚｅｉｔｚ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｇｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で薄肉のホウケイ酸ガラス（ＧＢ１５０−８Ｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｈｏｆｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から作成された。光電流は全細胞パッチ・クランプ法で記録され、４００μｍの光ファイバーに焦点を合わせられたダイオード励起固体レーザー（Ｐｕｓｃｈ  Ｏｐｔｏ  Ｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｂａｄｅｎ  Ｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；λ＝４７３ｎｍ）からの光パルスで活性化された。光パルスは速いコンピュータ制御シャッター（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ  ＬＳ６ＺＭ２，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）によって適用された。与えられたすべての光強度が、光導体の端で測定される。異なる陽イオンでの透過率の見積りを得るために、我々は、光電流−電圧関係を測定し、逆転電位を測定した。細胞内液は、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、７ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝９）を含み、細胞外液は１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝９）を含んだ。陽イオン透過率のために、外部の１４０ｍＭ  ＮａＣｌは、１４０ｍＭ  ＫＣｌ、９０ｍＭ  ＣａＣｌ２または９０ｍＭ  ＭｇＣｌ２でそれぞれ交換された。プロトン透過性は、ｐＨが９から７．４（または６）に減少したときに、電流−電圧関係の逆転電位のシフトによって測定された。透過率比は、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｈ＋およびＣａ＋＋のための条件を含む、ゴールドマン−ホジキン−カッツ（ＧＨＫ）の式により計算された。
【００９７】
ＨＥＫ２９３細胞において、トランスフェクションの２４時間後に、ＣａｔＣｈの青色光励起定常電流は、ＷＴ  ＣｈＲ２と比較して〜２．５倍高い振幅を有した（ＣａｔＣｈ：２５．０±８．８ｐＡ／ｐＦ；  ＷＴ：１０．１±４．１ｐＡ／ｐＦ；平均±標準偏差、ｎ＝６、−６０ｍＶ（図２ａ））。また、定常状態−ピーク電流比もまた、ＷＴの０．３７±０．１８から、ＣａｔＣｈの０．７１±０．１６まで増加した（図２ｂ）。反復性の青色光刺激の間、ＣａｔＣｈピーク電流は消失した。回復が黄色光で早期に誘導されなかったときに、それは暗闇の中で数分以内に回復した。対照的に、同じ条件下でのＷＴ  ＣｈＲ２ピーク電流の完全な回復は２０秒かかった１３。ＣａｔＣｈの活性化および非活性化時定数（τｏｎ＝５９０±３μｓ，τｏｆｆ＝１５±２ｍｓ，ｎ＝９，ｐＨ７．４，−６０ｍＶ，平均±標準偏差）は、ＷＴ  ＣｈＲ２と比べてわずかに長かった（τｏｎ＝２１４±２μｓ，・τｏｆｆ＝１０±１ｍｓ，ｎ＝９，ｐＨ７．４，−６０ｍＶ；平均±標準偏差；図．２ａ，ｂ，図．５下段，表１）。
【００９８】
次に、発明者は、チャネル特性の記載された効果を光サイクルにおけるスペクトル変化と比較した。精製ＣａｔＣｈの閃光光分解実験は、ＷＴ  ＣｈＲ２スペクトル１３からのわずかな逸脱だけを明らかにした（図５を参照）。１．脱プロトン化シッフ塩基を示す、初期Ｐ３９０中間体はわずかに検出可能である。２．チャネルの開口状態を示す、Ｐ５２０中間体は、電気生理学的に測定されたτｏｆｆ値に相当する９ｍｓのわずかに延長された生存時間を示す。同様の開口生存期間値は、変化していない単位コンダクタンスにて倍増した活性を示す２、１４、変異体Ｈ１３４Ｒで得られた。したがって、ＣａｔＣｈの場合でも、開口状態の減速された動態は、単位コンダクタンスが変化していないところの、ＨＥＫ２９３細胞で測定された２．５倍の増加する定常電流に関与できた。これは、以前に説明されるように１４、定常雑音解析（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｎｏｉｓｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、ＣａｔＣｈの単独チャネルコンダクタンスを測定することによって、確認された。
【００９９】
雑音解析
実験が、以前に記載された１４とおりにＨＥＫ２９３細胞上で実施され、室温（２３℃）で実施された。ピペット液は１ｍＭ  グアニジン−ＨＣｌ、１９９ｍＭ  ＮＭＧ−Ｃｌ（Ｎ−メチルグルカミン）、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含み、浴溶液は２００ｍＭ  グアニジン−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含んだ。青色光刺激への電流応答は、飽和光条件（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下および再度の、−６０ｍＶでの電流応答が最大電流の半分であるところの光条件（Ｉ０．５；２ｋＨｚ  ｌｏｗ−ｐａｓｓ  Ｂｅｓｓｅｌ  ｆｉｌｔｅｒ；サンプリングレート：１００ｋＨｚ；細胞直径：１５μｍ）下での電圧ステッププロトコル（ｖｏｌｔａｇｅ  ｓｔｅｐ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）の適用下で記録された。−６０ｍＶの保持電位での持続的な照射（２分）の間の定常Ｉ０．５の記録は、単独チャネルコンダクタンスを見積もるのに使用された（２ｋＨｚ  ｌｏｗ−ｐａｓｓ  Ｂｅｓｓｅｌ  ｆｉｌｔｅｒ；サンプリングレート２０ｋＨｚ）。照射無し（コントロール、３個の記録）および有り（光刺激開始の３０秒後、２個の記録）の交互の記録は、集められ、フーリエ変換され、単独チャネルコンダクタンスがローレンツ関数での近似から見積もられた（詳細は１４参照）。より低い光強度は、光駆動性チャネルの開口と閉鎖の最大限度の変動を得るために選ばれた。
【０１００】
ＷＴ  ＣｈＲ２およびＨ１３４Ｒ雑音解析実験に沿って、グアニジンは導電イオンとして使用された。チャネルの力学的特性は透過性陽イオンと独立であることに注意１４。異なるパワースペクトルの評価は、１５０ｆＳと推定された室温でのＷＴ  ＣｈＲ２単独チャネルコンダクタンス１４と同様の、室温（２３℃）で２００ｍＭグアニジンのための１４０±５ｆＳ（ｎ＝６、−６０ｍＶ）の単独チャネルコンダクタンスγをもたらした。雑音解析によって測定されたＣａｔＣｈの開口確率は、Ｈ１３４Ｒ（ｐ０〜０．６）との比較において変わりがなかった。それ故、増加した開口チャネルの存続期間は２．５の要素による光電流観測された増加を容易に占めることができるが、ＣａｔＣｈコピーのわずかに高められた発現は除くことができない。
【０１０１】
アフリカツメガエル卵母細胞調製および分子生物学
細胞外に露出したシステイン残基のないＣ末端切断型のＣｈＲ２変異体（残基１−３１５）（Ｃ３４ＡおよびＣ３６Ａ変異を含む）は、ベクターｐＴＬＮ２７にサブクローニングされた。単一のシステイン変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって導入されて、配列決定により確認された。ｍＲＮＡは、ＳＰ６  ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅキット（Ａｍｂｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）を使用して調製された。３０ｎｇのＷＴ  ＣｈＲ２／ＣａｔＣｈ  ｍＲＮＡを含む、５０ｎｌ  ｃＲＮＡが各々のアフリカツメガエル卵母細胞に注入された。部分的な卵巣摘出後のコラゲナーゼ処理で卵母細胞を得た。ｃＲＮＡ注入後に、卵母細胞は、全トランスレチナール（１μＭ、エタノール中の１ｍＭストックより）中で培養され、１ｍｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを含むＯＲＩバッファー（９０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｍＭ  Ｍｏｐｓ、ｐＨ７．４）中で、１８℃にて２〜４日間保持された。
【０１０２】
アフリカツメガエル卵母細胞上の２電極電圧固定法
光電流は、７５−Ｗキセノンアーク灯および４５０±２５ｎｍの帯域フィルターで活性化され、その光は〜１０１８光子ｓ−１ｃｍ−２の出力の１ｍｍ光導体と結合された。作用スペクトルは、各波長あたり〜１．４×１０１７光子ｓ−１ｃｍ−２のファイバー出力を達成するために、中性密度フィルターと組み合わせて狭帯域幅フィルター（３９８−６４５  ｎｍ；  ±  １０  ｎｍ  ；  Ｋ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｂａｌｚｅｒ）を使用することで記録された。作用スペクトルの生成のため、ＣａＣＣ電流を抑制するためにＯＲＩ溶液中のＣａ＋＋をＢａ＋＋に置き換えた。各波長における電流振幅は、等しい光子露出を表すために正規化された。分光法で決定された規定スペクトル（ｇｒｏｕｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）は、その後平均データポイントに合わせられた。カルシウム依存性塩素チャネル（ＣａＣＣ）の活性化を抑制するために、速いＣａ２＋キレート剤１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）の２０ｍＭ溶液の５０ｎｌが、各卵母細胞に注入された（卵母細胞において、〜１ｍＭの最終濃度）。
【０１０３】
アフリカツメガエル卵母細胞において波長が変化しているＣａｔＣｈの励起は、４７４ｎｍの最大の励起波長でのＷＴ  ＣｈＲ２スペクトルとほとんど同じ、ほとんど同じ動作スペクトルであることが明らかになった（図６）。細胞外Ｃａ＋＋および負の保持電位の存在下で、ＣａｔＣｈ電流は、カルシウム依存性塩素チャネル（ＣａＣＣ）のものと類似の重畳外向電流（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ  ｏｕｔｗａｒｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ）１５、１６に起因する照射の間、劇的な振幅の増加を示した（図２ｃ）。ＷＴ  ＣｈＲ２を発現する卵母細胞においてもまた、ＣａＣＣ電流が観察されたが、それらはＣａｔＣｈによって誘導されたものより著しく小さかった（図２ｃ）。ＷＴ  ＣｈＲ２、およびＣａｔＣｈ、の両方について、８０ｍＭの細胞外Ｃａ＋＋にて、速いＣａ＋＋キレート剤ＢＡＰＴＡ、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸の細胞への注入は、残余のＣａ＋＋電流が残る一方１で、ＣａＣＣ電流をなくした（図２ｃ）。ＣａｔＣｈのためのＢＡＰＴＡ注射の前後での光電流のより大きい違いは、捕獲活性化（ｃａｔｃｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に続く増加するＣａ＋＋流動の仮説をサポートする。
【０１０４】
増加した、ＣａｔＣｈのカルシウム透過率
ＣａｔＣｈイオン透過率の見積りを得るために、異なる陽イオンのための光電流電圧関係および逆転電位が、ＨＥＫ２９３細胞において測定された。これらの実験は、ナトリウム、カリウム、およびマグネシウムのための透過率がＷＴ  ＣｈＲ２１に匹敵していることを明らかにした（図２ｄ）。ＷＴ  ＣｈＲ２（ｐＨ／ｐＮａ＝２．５＊１０６）と比較して、ＣａｔＣｈ（ｐＨ／ｐＮａ＝４＊１０６）のプロトン透過性はわずかに増加した。Ｃａ＋＋透過率（ｐＣａ／ｐＮａ）は、細胞外液の１４０ｍＭ  Ｎａ＋を９０ｍＭ  Ｃａ＋＋に置き換えたときの逆転電位シフトにより測定された。ＣａｔＣｈの相対的なＣａ＋＋−透過率が、−３０．７±２．７ｍＶ（ＷＴ  ＣｈＲ２、平均±標準偏差、ｎ＝５）から−２１．６±３．８ｍＶ（ＣａｔＣｈ、平均±標準偏差、ｎ＝５；図２ｅ）への逆転電位（二イオン電位（ｂｉ−ｉｏｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ））のシフトからもわかるように、ＷＴ  ＣｈＲ２における０．１５から０．２４まで増加した。ＣａｔＣｈの増加するＣａ＋＋透過率をさらに定量化するために、我々は、ＣａｔＣｈを発現しているＨＥＫ２９３細胞のＦｕｒａ−２カルシウムイメージングを実施し、３４０／３８０の測定比率をＷＴ  ＣｈＲ２発現細胞で測定された比率と比較した。
【０１０５】
ＨＥＫ２９３細胞でのＦｕｒａ２イメージング
Ｆｕｒａ−２ＡＭ（５ｍＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は室温で３０分から１時間ロードされた。ローディングの後に、細胞はＣａ＋＋なしの１４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、７ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で回収された。黄色蛍光タンパク質はそのＹＦＰ−蛍光から各細胞の発現レベルを見積もるために、４６０／４０ｎｍのフィルター（Ｖｉｓｉｔｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる光に５００ｍｓ露出することにより励起された。溶液はその後、９０ｍＭ  ＣａＣｌ２、７ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳから成る細胞外Ｃａ＋＋溶液に置き換えられた。暗闇において１５分後、光駆動性チャネルは１０秒間、青色光（４６０／４０ｎｍ）で刺激された。Ｆｕｒａ−２は、３４０ｎｍ（３４０／２０）および３８０ｎｍ（３８０／２０）、およびＣＣＤカメラ（全てのフィルターはＶｉｓｉｔｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で検出された放射光（５４０／８０ｎｍ）で、励起された。
【０１０６】
カルシウム取込みの要素としての異なったタンパク質の発現レベルを除去するために、測定された３４０／３８０比が、各個別の細胞のＹＦＰ−蛍光値で正規化された。図２ｆは、飽和９０ｍＭ  Ｃａ＋＋溶液における１０秒間の青色光（４７０ｎｍ）の光刺激の際に、ＣａｔＣｈ発現細胞のＣａ＋＋増加が、ＷＴ発現細胞より約４倍大きいことを示す。
【０１０７】
海馬ニューロンへの適用
ニューロンへの適用のためのＣａｔＣｈの適合性を試験するため、構成体は培養された海馬錐体細胞の中で発現された。
【０１０８】
海馬ニューロン培養物
海馬は出生後Ｐ１  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から取り出され、パパイン（２０Ｕｍｌ−１）で３７℃にて２０分間処理された。海馬は１０％の牛胎児血清が補われたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、高グルコース）で洗浄され、少量のこの溶液中で粉砕された。〜７万５０００個の細胞が、２４ウェルプレート中のポリ−Ｄ−リジン／ラミニンでコートされたカバーガラス上に播種（ｐｌａｔｅ）された。３時間後に、プレート培地（ｐｌａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）は、培養培地（２％  Ｂ−２７補足剤、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ）に置き換えられた。ＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−ＹＦＰおよびＣｈＲ２（ＷＴ）−ＹＦＰは、播種の５〜１０日後にリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトされた。あるいは、２〜５×１０９ＧＣ／ｍｌのウイルス（ＡＡＶ２／７−ＣＡＧ−ＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨ）が播種の４〜９日後に各々のウェルに加えられた。発現は、形質導入後５日間で目に見えるようになった。培養物の生存期間（〜５週間）について、神経毒症状は全く見られなかった。ここで記載されるいかなる実験においても、全トランスレチナールは培地または記録培地（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）に全く添加されなかった。
【０１０９】
アデノ随伴ウイルスベクター構成体
サイトメガロウィルス初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーターは、ＰＣＲ増幅され、ｐＡＡＶ２−ＣＡＧ−ＥＧＦＰを入手するために、ｐＡＡＶ２−Ｒｈｏ−ＥＧＦＰ（Ａｌｂｅｒｔｏ  Ａｕｒｉｃｃｈｉｏからの親切な贈り物２８）に挿入された。ｐＡＡＶ２−ＣＡＧ−ＥＧＦＰウイルス発現プラスミドはさらに、ウッドチャック転写後調節要素（ＷＰＲＥ）および牛成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列を含んだ。ＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−２Ａ−ＥＧＦＰ（Ｖｏｌｋｅｒ  Ｂｕｓｓｋａｍｐｏからの親切な贈り物−２Ａ自己切断型ペプチド／ＣＨＹＳＥＬ２９）はアダプターＰＣＲによって構築され、Ｃｌｏｎｔｅｃｈのｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｋｉｔを使用して、ＥＧＦＰの置換により、ｐＡＡＶ２−ＣＡＧ−ＥＧＦＰにサブクローニングされた。ウイルスベクター（ｐＡＡＶ２−ＣＡＧ−ＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨ）はパッケージ化され（血清型７）、親和性はペンシルバニア大学のＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｇｒａｍで２．２６×１０１１ゲノムコピー／ｍｌの最終的な感染性ウイルス測定濃度で精製した。
【０１１０】
海馬ニューロンからの電気生理学的記録
海馬培養神経細胞の全細胞記録のために、５〜１０Ωの抵抗をもつパッチピペットが、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＡＴＰおよび０．３ｍＭ  Ｎａ３ＧＴＰで満たされ、ｐＨ７．２に滴定された。タイロード溶液は細胞外溶液として用いられた（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコースおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に滴定）。名目上はＣａ＋＋無しの細胞外溶液は、０ｍＭ  Ｃａ＋＋および３ｍＭ  Ｍｇ＋＋を有することを除いて、この同じ溶液を含んだ。記録は、興奮性シナプス伝達遮断剤、１，２，３，４−テトラヒドロ−６−ニトロ−２，３−ジオキソ−ベンゾ［ｆ］キノキサリン−７−スルホンアミド（ＮＢＱＸ，１０μＭ，Ｓｉｇｍａ）およびＤ（−）−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（ＡＰ−５，５０μＭ，Ｓｉｇｍａ）の存在下で行われた。電圧固定記録のため、１μＭのテトロドトキシンが細胞外溶液に添加された。ＢＫチャネル活性を阻害するため、１ｍＭ  ＴＥＡが加えられた。記録は、蛍光ランプを備える倒立Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５顕微鏡上で行われた。成功したタンパク質の発現はＥＧＦＰまたはＹＦＰによってもたらされる蛍光によって立証された。ニューロンのアクセス抵抗は、１５〜４０ＭΩであり、実験全体にわたって、安定性のために監視された。電気生理学的信号は、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用することで増幅され、１０ｋＨｚでフィルターにかけられ、Ａｘｏｎ  Ｄｉｇｉｄａｔａ１６００（５０Ｈｚ）でデジタル化され、かつｐＣｌａｍｐ９ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて入手および分析された。光電流は、ダイオード励起固体レーザー（Ｐｕｓｃｈ  Ｏｐｔｏ  Ｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ；λ１＝４７３ｎｍ，Ｐ１＝１００ｍＷ，λ２＝５３２ｎｍ，Ｐ２＝５０ｍＷ）からの様々な波長の光パルスまたはエキシマー励起色素レーザー（Ｃｏｕｍａｒｉｎ  ２，λ＝４５０ｎｍ）からの１０ｎｓ閃光により誘起された。特定の光強度は、図の注釈および文書に示され、細胞から〜５００μｍの距離にて、４００μｍ直径の石英光ファイバー（ＳＴＥ−Ｆ１００／４００−Ｙ−ＶＩＳ／ＮＩＲ；  Ｌａｓｅｒ  ２０００，Ｗｅｓｓｌｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の末端での強度である。ＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−ＹＦＰおよびＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）−２Ａ−ＥＧＦＰを発現するニューロンから測定された電流は同じである。
【０１１１】
共焦点イメージング
イメージングについて、海馬ニューロンがあるカバーガラスは、２％スクロースを含むＰＢＳバッファー中の４％パラホルムアルデヒド中で１０分間、４℃にて固定された。細胞は続いて、ウサギα−ＧＦＰＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１１２２）中で１．５時間培養され、その後Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８ロバ−α−ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０６）中で４５分間培養された。取り付けられたカバーガラスの免疫蛍光はＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ  ４０×／０．７５）上で撮影された。
【０１１２】
ＣａｔＣｈ変異体が数週間で、神経毒症状の兆候なしに海馬培養で確実に発現され（図３ａ）、ＨＥＫ２９３細胞のように、全細胞の記録において高い定常状態−ピーク比および４７３ｎｍの青色光への反応において、ＷＴの１６４±３９ｐＡ（−６０ｍＶ、ｎ＝６、平均±標準偏差）と比較して、６４４±３１ｐＡ（−６０ｍＶ、ｎ＝６、平均±標準偏差）の約４倍増加した電流振幅を示した（図３ｂ）。電流固定モードにおいて、典型的にＷＴを活性化するために用いられる人工的な高い光強度（１０１８〜１０１９光子ｓ−１ｃｍ−２）は、ＣａｔＣｈ発現錐体細胞を脱分極性遮断に追い込んだ（図４ａ）。信頼できるスパイクトレーンを誘導するために、光強度は２ログ単位（５＊１０１６〜２＊１０１７光子ｓ−１ｃｍ−２）によって錐体光受容体駆動明所視の本来の範囲内の光強度に減少させた（図４ｂ）１７。図４ｃは錐体細胞の光強度に依存する発火率のための代表的な同調曲線を示す。平均した最大発火率は、８．２×１０１６±２．５×１０１６光子ｓ−１ｃｍ−２（平均±標準偏差、ｎ＝５）の状態である。ＣａｔＣｈ発現ニューロンのより高い光効率は、図４ｄにおいて緑色光（５３２ｎｍ）で例示されるように、最大感度から離れた波長での活性化を容易にする。これは、より深く貫通する緑色光での、より効果的な組織動員の点で利益を与え得る。我々は増加したＣａ＋＋透過率に、ＣａｔＣｈ発現ニューロンの劇的に高められた光感受性を割当て、その結果、細胞質膜表面上の表面電位を一時的に増加させる１０、１１、１８、１９（表面電位のＣａ＋＋効果の説明について、図７を参照）。光励起の間、ＣａｔＣｈは局所的な細胞内表面Ｃａ＋＋濃度を一時的に増やすことにより、膜結合した速いＣａ＋＋供給源として機能し、その結果、負の表面電荷を中和する（図７）。このことは、内側面電位のより正の値へのシフトを引き起こし、その結果膜を脱分極することが知られている（図７）１１、１８。その帰結は、電圧駆動性Ｎａ＋チャネルが、より負の膜電位で活性化することである１８。短い光パルスまたは定常光を消した後に、Ｃａ＋＋が細胞質内で急速（マイクロ秒）に平衡化し、急速な回復および即座の活動電位の消失につながる。それ故、ＣａｔＣｈに関して、ＷＴ  ＣｈＲ２と比べて、より少ない光電流およびそれに続くより少ない光がスパイク開始に必要である。ＣａｔＣｈにおける光パルスからスパイクまでの待ち時間は、同様の光強度（２．８×１０１８光子ｓ−１ｃｍ−２）時に、ＷＴ  ＣｈＲ２（〜１０ｍｓ）の待ち時間３よりもより小さいジッターで、より速かった（〜５−６ｍｓ；図４ｅ）。発明者はＣａｔＣｈの、高頻度の光刺激で単一の活動電位を誘導するその性能についてさらに試験した。１ｍｓ長の青色の４７３ｎｍの光パルス（２．８×１０１９光子ｓ−１ｃｍ−２）のトレーンは、１００％信頼できるスパイクトレーンを５０Ｈｚの周波数まで動作させた（ｎ＝８；図４ｆ−ほとんどの錐体細胞は直流注入があっても５０Ｈｚを超えたウェルに続かない）。ＷＴは他方では、確実にスパイクを誘導するために少なくとも２ｍｓ光パルスを必要とし、これは２０Ｈｚの周波数までしか行われない１２。我々は、ＣａｔＣｈの短い活性化時間をさらに推し進め、各々のＣａｔＣｈタンパク質で単一の反転だけを誘導するのに十分な短いパルス長である、１０Ｈｚの周波数までの１０ｎｓの青色光パルス（１．１×１０２５光子ｓ−１ｃｍ−２）まで、単一の活動電位を誘起した（図４ｂ）。しかしながら、速い刺激頻度もまた、各スパイクの後に細胞の速い再分極を必要とする。ＷＴと比較して減速されたＣａｔＣｈのτｏｆｆにもかかわらず、各活動電位のミリセカンド後以内に元来の静止電位に細胞を強力に再分極するための十分なＣａ＋＋活性化大コンダクタンスカリウムチャネル（ＢＫチャネル）２０を活性化させるために、ＣａｔＣｈ活性化の間に〜４倍増加したＣａ＋＋流入（Ｆｕｒａ−２測定、図２ｆを参照）が現れる。速い再分極がＢＫチャネルを介してもたらされたことを立証するため、我々は１００μＭのカリウムチャネル阻害薬テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）を細胞外液へ加え、不完全な膜の再分極およびＷＴ  ＣｈＲ２のパルス刺激プロトコルで典型的に見られるプラトー電位の生成を観測した３（図４ｈ）。
【０１１３】
まとめると、ＷＴ−発現細胞と比べて、ＣａｔＣｈ発現ニューロンは、より速いスパイク開始、より速い再分極、および増加した光感受性を示す（比較について、表１参照）。外部のＣａ＋＋が不在で、３ｍＭ  Ｍｇ＋＋が存在する、表面電位にそれほど著しくない効果を有し１１、１８（図７）、ＷＴ  ＣｈＲ２またはＣａｔＣｈを通して行われない対照実験は、上記の解釈を支持する：１）光パルスからスパイクへの待ち時間はＷＴ  ＣｈＲ２値で増加した（図４ｅ）、２）Ｃａ＋＋の存在下で観察される速いスパイク再分極の代わりに、ＷＴ  ＣｈＲ２実験で見られるようなものと同様の長引いている人為的な脱分極が観察された（図４ｉ、左）、３）Ｃａ＋＋不在において、同等の光強度は、その他の点で等しい実験条件下で〜１０ｍＶ減少した脱分極をもたらした、４）ＣａｔＣｈの持続的な開口時間から期待される多重スパイクは、Ｃａ＋＋不在において再発する（図４ｉ、右）。
【０１１４】
したがって、発明者は、高いＣａ＋＋透過性をもつチャネルロドプシン、ＣａｔＣｈは増加する光感受性および速い動態を組み合わせ、その結果、ＷＴ  ＣｈＲ２および発表された遅いおよび速い変異体より優れることを示した（異なるＣｈＲ２変異体の特性の比較について、表１参照）。
【０１１５】
考察
一見したところでは、ＣａｔＣｈ、ＷＴ  ＣｈＲ２のＬ１３２Ｃ変異体、ＷＴ  ＣｈＲ２と比較してむしろ平凡な結果を示している：１）開口状態の存続期間の２倍の増加、２）光サイクル動態における、Ｐ５２０中間体の減速された減衰、３）変化しない単独のチャネルコンダクタンス、および４）わずかに赤にシフトした吸収極大（４ｎｍ）。２．５倍に増加した光電流は、発現レベルの増加と全く関連のないパラメータで容易に説明できる。しかしながら、もう一度見てみると、アフリカツメガエル卵母細胞を発現するＣａｔＣｈから得られた電圧固定法データのさらなる精査は、逆転電位の測定およびＨＥＫ２９３細胞上のカルシウムイメージング実験でその後確認された、上昇したＣａ＋＋透過性を与えた。図１におけるモデルから判断すると、Ｃａ＋＋透過性の増加は、光駆動プロトンポンプ細菌ロドプシンのＬ９４Ａ変異体について示されるように（図１と比較）２１、より柔軟な構造の構成およびその結果としての空洞の形成により容易にされ得る。この空洞は、Ｃ１２８から１らせん回転分だけ離れた、保存された膜貫通ヘリックス３（ＴＭ３）の一部として疎水性パッチ中に位置するであろう。Ｃ１２８（ＴＭ３）およびＤ１５６（ＴＭ４）の間の相互作用の操作は、ＣｈＲ２の反応サイクルを劇的に減速し５、６、その効果は細菌ロドプシン変異体Ｌ９３Ａ２２、２３、すなわちＬ９４の隣接残基でも観察された。ＣｈＲ２では、ＴＭ３およびＴＭ４の相互作用は、イオン孔への明反応のトランスデューサーとしての構造要素２４を指す、開閉（ｇａｔｉｎｇ）および選択性の両方に影響するように見える。より小さい、より親水性のシステインの挿入は螺旋状のセグメントの柔軟性を高め、Ｃａ＋＋のアクセスを容易にし得る。
【０１１６】
海馬錐体細胞に送達されたとき、ＣａｔＣｈはＷＴ  ＣｈＲ２と比較して、〜７０倍増加した光感受性を示した。通常、そのような増加した光効力は、強く持続された開口チャネル存続期間を伴う２、６、１３。ＣａｔＣｈではそれが当てはまらない。観察された光感受性はこれまでの他のチャネルロドプシンから観察されたものと著しく異なる。以下で説明されるように、神経細胞の興奮性への副次的効果はＣａｔＣｈを通したＣａ＋＋流入によって誘導される。ＷＴと比較してより遅い閉鎖動態を有するにもかかわらず、ＣａｔＣｈは高頻度の光刺激の間、増加したスパイク信頼性および正確性を示し、追加のスパイクを抑えて、２０Ｈｚを超える刺激頻度にてＷＴ発現細胞で典型的に観察される人為的なプラトー電位３、７、１２を排除する。室温で照射された１ｍｓの光パルスは、ＣａｔＣｈ発現錐体細胞で最大５０Ｈｚ（それらの自然なスパイクの自然の限界；  図４ｆ）までの信頼できるスパイクトレーンを誘導した。皮質パルブアルブミン介在ニューロンなどの細胞をより速くスパイクする高頻度のＣａｔＣｈ介在スパイク誘導は、試験されるべきものとして残る１２。チャネルロドプシン動態が〜２．３のＱ１０で温度依存である１４ので、発明者は光感受性をゆるめることなしの３７℃でのｉｎ  ｖｉｖｏ実験について、３．２倍加速したＣａｔＣｈを予想するであろう。これはＣａｔＣｈ介在スパイク刺激を少なくとも３００Ｈｚまで許容するであろう。より速い動態および高い時間精度と組み合わせられた増加した光感受性は、我々に各々のＣａｔＣｈ分子でシングルターンオーバーを活性化し、続いて単一のスパイクとなる。１０ｎｓのように短い光パルスでＣａｔＣｈを活性化することを許容した。興奮細胞における観察は、照射の間、増加したニューロンへのＣａ＋＋流入により最も良く説明される。透過性の増大による駆動力へのＣａ＋＋の寄与を無視できることに注意。しかしながら、我々は、ＣａｔＣｈを、ＣａｔＣｈチャネルが開いている限り、細胞膜の細胞質側表面にＣａ＋＋を一時的に送達する、光駆動性膜結合Ｃａ＋＋源（「膜結合収容Ｃａ＋＋（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ  ｃａｇｅｄ  Ｃａ＋＋）」）であるとみなすことができる。これは内膜表面上で負の帯電を一時型に中和し、その結果、膜の脱分極と同等である１１、膜電位の増加が起こる（図７）。予想されるように、細胞外Ｃａ＋＋を非透過性Ｍｇ＋＋に置き換えたとき、観察されたＣａ＋＋の活動電位への効果が消失され、ＷＴ  ＣｈＲ２の表現型が回復した。このことは、観察されたＣａ＋＋の効果が、細胞外Ｃａ＋＋の流入によるものであり、小胞体のような細胞小器官における電位発現を通した［Ｃａ＋＋］ｉの上昇によって引き起こされるものではないことを証明する。表面電位を経る速い初期の脱分極は、光パルスからピークへの待ち時間を、ＷＴ  ＣｈＲ２発現細胞３の〜１０ｍｓから、ＣａｔＣｈ発現細胞の〜５ｍｓまで半減させる。ＷＴ  ＣｈＲ２と比較して、ピーク定常電流比はＣａｔＣｈで非常に低下する（表１参照）。したがって、ＣａｔＣｈの持続している照射の間、細胞の脱分極レベルはほとんど静止したままで残る。持続的な照射の間の連続したＣａ＋＋流入は、カルシウム活性化非選択的陽イオンチャネルを活性化し得、それはさらに、定常的な脱分極レベルの維持を支持する。他方では、成功した高頻度のパルス刺激のための必須条件は、各々の活動電位に続く細胞の速い再分極である。ＷＴと比較してわずかに増加したＣａｔＣｈの開口状態の存続期間は、その最大限度の刺激頻度を制限するはずである。しかしながら、増加したＣａ＋＋透過性は、カルシウム活性化大コンダクタンスカリウムチャネル（ＢＫチャネル）の強力な活性化により、この制限を打ち消す。これは各々の活動電位の後、数ミリ秒以内でニューロンの静止膜電位を回復する。この理論は、パルス刺激プロトコルの長さの間、ニューロンの持続性の脱分極をもたらす、開口チャネル阻害薬ＴＥＡでのＢＫチャネルの阻害により確認された。
【０１１７】
既に利用可能な光遺伝学的方法（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｏｏｌ）との比較において、ＣａｔＣｈは遅い変異体１３またはＳＦＯ６と類似する、増加した光感受性を、しかしその増加したＣａ＋＋透過性による、より加速された応答動態および神経細胞の興奮性の結果と共に有する。これは、高い光感受性は速い動態のコストで確定される必要があり、速いチャネルロドプシン７、１２に関して逆もまた同様であるところの、利用可能なＣｈＲ２変異体より優れたＣａｔＣｈを作る（概観に関して、表１を参照）。
【０１１８】
光遺伝学的アプリケーションに関して、我々は、特異反応が究極的にはニューロンとＣａｔＣｈ発現レベルの本質的な生物物理的性質によって制御されるように、刺激の長さや強度などのそれぞれの実験的な準備における最適の光パルスパラメータを有効にするのが重要であることを注意する。
【０１１９】
【表２】
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【０１２０】
参考文献のリスト
ＷＯ  ０３／０８４９９４
１．  Ｎａｇｅｌ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２，  ａ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｌｉｇｈｔ−ｇａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈａｎｎｅｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，  １３９４０−１３９４５  （２００３）．
２．  Ｎａｇｅｌ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｇｈｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ｉｎ  ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｒａｐｉｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １５，  ２２７９−２２８４  （２００５）．
３．  Ｂｏｙｄｅｎ，  Ｅ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｆ．，  Ｂａｍｂｅｒｇ，  Ｅ．，  Ｎａｇｅｌ，  Ｇ．  ＆  Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ，  Ｋ．  Ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ−ｔｉｍｅｓｃａｌｅ，  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ８，  １２６３−１２６８  （２００５）．
４．  Ｚｈａｎｇ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｆａｓｔ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４６，  ６３３−６３９  （２００７）．
５．  Ｂａｍａｎｎ，  Ｃ．，  Ｇｕｅｔａ，  Ｒ．，  Ｋｌｅｉｎｌｏｇｅｌ，  Ｓ．，  Ｎａｇｅｌ，  Ｇ．  ＆  Ｂａｍｂｅｒｇ，  Ｅ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｔｏｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｈｅｌｉｃａｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４９，  ２６７−２７８  （２０１０）．
６．  Ｂｅｒｎｄｔ，  Ａ．，  Ｙｉｚｈａｒ，  Ｏ．，  Ｇｕｎａｙｄｉｎ，  Ｌ．，  Ｈｅｇｅｍａｎｎ，  Ｐ．  ＆  Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ，  Ｋ．  Ｂｉ−ｓｔａｂｌｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １２，  ２２９−２３４  （２００９）．
７．  Ｌｉｎ，  Ｊ．，  Ｌｉｎ，  Ｍ．，  Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，  Ｐ．  ＆  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９６，  １８０３−１８１４  （２００９）．
８．  Ｌａｇａｌｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｇｈｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ＯＮ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１，  ６６７−６７５  （２００８）．
９．  Ｂｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−ｔｙｐｅ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ５０，  ２３−３３  （２００６）．
１０．  Ｆｒａｎｋｅｎｈａｕｓｅｒ，  Ｂ．  ＆  Ｈｏｄｇｋｉｎ，  Ａ．  Ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｑｕｉｄ  ａｘｏｎｓ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  （Ｌｏｎｄ）  １３７，  ２１８−２４４  （１９５７）．
１１．  Ｈｉｌｌｅ，  Ｂ．  ６４９−６６２  （Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  ＵＳＡ，  ２００１）．
１２．  Ｇｕｎａｙｄｉｎ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １３，  ３８７−３９２  （２０１０）．
１３．  Ｂａｍａｎｎ，  Ｃ．，  Ｋｉｒｓｃｈ，  Ｔ．，  Ｎａｇｅｌ，  Ｇ．  ＆  Ｂａｍｂｅｒｇ，  Ｅ．  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｔｏｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７５，  ６８６−６９４  （２００８）．
１４．  Ｆｅｌｄｂａｕｅｒ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ｉｓ  ａ  ｌｅａｋｙ  ｐｒｏｔｏｎ  ｐｕｍｐ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （２００９）．
１５．  Ｃａｌｄｗｅｌｌ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＧｌｕＲ７．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８３，  ２４３００２４３０７  （２００８）．
１６．  Ｗｅｂｅｒ，  Ｗ．−Ｍ．  Ｉｏｎ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ：  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４２１，  ２１３−２３３  （１９９９）．
１７．  Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ２  ｉｎ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３０，  ８７４５−８７５８  （２０１０）．
１８．  Ｈｉｌｌｅ，  Ｂ．，  Ｗｏｏｄｈｕｌｌ，  Ｂ．  ＆  Ｓｈａｐｉｒｏ，  Ｂ．  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒｇｅ  ｎｅａｒ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  ｎｅｒｖｅ：  ｄｉｖａｌｅｎｔ  ｉｏｎｓ，  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｐＨ．  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ２７０，  ３０１−３１８  （１９７５）．
１９．  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｒ．  ＆  Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，  Ａ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒｇｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｔｈｉｎ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｂｙ  ｍｏｎａｚｏｍｙｃｉｎ．  Ｊ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６０，  ２８５−３０６  （１９７２）．
２０．  Ｆａｂｅｒ，  Ｅ．  ＆  Ｓａｈ，  Ｐ．  Ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｅｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌｓ：  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ９，  １８１−１９４  （２００３）．
２１．  Ｊｏｈ，  Ｎ．，  Ｏｂｅｒａｉ，  Ａ．，  Ｙａｎｇ，  Ｄ．，  Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇｅ，  Ｊ．  ＆  Ｂｏｗｉｅ，  Ｊ．  Ｓｉｍｉｌａｒ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐａｃｋｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３１，  １０８４６−１０８４７  （２００９）．
２２．  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，  Ｓ．，  Ｆａｒｕｑｉ，  Ａ．，  Ｏｅｓｔｅｒｈｅｌｔ，  Ｄ．  ＆  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｒ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｅｕ−９３→Ａｌａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｍｕｔａｎｔ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４  １７６７−１７７２  （１９９７）．
２３．  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，  Ｓ．，  Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，  Ｄ．，  Ｒａｔｈ，  Ｐ．，  Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ，  Ｋ．  ＆  Ｋｈｏｒａｎａ，  Ｈ．  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ−９３  ｂｙ  ａｌａｎｉｎｅ  ｏｒ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｓｌｏｗｓ  ｄｏｗｎ  ｔｈｅ  ｄｅｃａｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ  ａｎｄ  Ｏ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈｏｔｏｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｏｎ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  １３−ｃｉｓ−ｒｅｔｉｎａｌ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎａｌ  ｒｅｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，  ６８７３−６８７７  （１９９１）．
２４．  Ｎａｃｋ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ＤＣ  ｇａｔｅ  ｉｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２：  ｃｒｕｃｉａｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃ１２８  ａｎｄ  Ｄ１５６．  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９，  １９４−１９８  （２０１０）．
２５．  Ｂｕｓｓｋａｍｐ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ．  ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，  ４１３−４１７  （２０１０）．
２６．  Ｅｌｌｉｓ−Ｄａｖｉｅｓ，  Ｇ．  Ｃ．  Ｒ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｃａｇｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ．  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １０８，  １６０３−１６１３  （２００８）．
２７．  Ｌｏｒｅｎｚ，  Ｃ．，  Ｐｕｓｃｈ，  Ｍ．  ＆  Ｊｅｎｔｓｃｈ，  Ｔ．  Ｈｅｔｅｒｏｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ＣｌＣ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２，  １３３６２−１３３６６  （１９９６）．
２８．  Ａｌｌｏｃｃａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１，  １１３７２−１１３８０  （２００７）．
２９．  ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅ  ｕｎｕｍ  ｐｌｕｒｉｂｕｓ：  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４，  ６８−７５  （２００６）．
３０．  Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，  Ｗ．，  Ｄａｌｋｅ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｅｎ，  Ｋ．  ＶＭＤ  −  Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ．  Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  １４，  ３３−３８  （１９９６）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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