(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の検出を補助するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって：
表１に列挙されたバイオマーカーのうちＮを含むバイオマーカーのパネルを提供する工程、ここで前記バイオマーカーの少なくとも１つは炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）およびchordin-like 1（ＣＨＲＤＬ１）から選択される；および
個体由来の生物学的サンプルにおいて、前記パネル中のＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカーレベルを検出する工程を含み、前記個体が、前記バイオマーカーレベルに基づいて、ＮＳＣＬＣを持つまたは持たないと分類され、そしてＮは少なくとも２である
前記方法。
【請求項２】
個体における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の検出を補助するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって：
表１に列挙されたバイオマーカーのうちＮを含むバイオマーカーのパネルを提供する工程、ここで前記バイオマーカーの少なくとも１つは炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）およびchordin-like 1（ＣＨＲＤＬ１）から選択される；および
個体由来の生物学的サンプルにおいて、前記パネル中のＮのバイオマーカーに各々対応するバイオマーカーレベルを検出する工程を含み、前記個体が、前記バイオマーカーレベルに基づいて、ＮＳＣＬＣを持つまたは持たないと分類され、ここで、Ｎはバイオマーカーパネルが０．８またはそれより大きいＡＵＣ値を有するように選択される整数である、前記方法。
【請求項３】
個体における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の検出を補助するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって：
表１に列挙されたバイオマーカーのうちＮを含むバイオマーカーのパネルを提供する工程、ここで前記バイオマーカーの少なくとも１つは炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）およびchordin-like 1（ＣＨＲＤＬ１）から選択される；および
個体由来の生物学的サンプルにおいて、前記パネル中のＮのバイオマーカーに各々対応するバイオマーカーレベルを検出する工程を含み、前記個体が、前記バイオマーカーレベルに基づいて、ＮＳＣＬＣを持つまたは持たないと分類され、ここで、Ｎはバイオマーカーパネルが０．８５またはそれより大きいＡＵＣ値を有するように選択される整数である、前記方法。
【請求項４】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に関して、無症候性高リスク個体のスクリーニングを補助するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって：
表１に列挙されたバイオマーカーのうちＮを含むバイオマーカーのパネルを提供する工程、ここで前記バイオマーカーの少なくとも１つは炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）およびchordin-like 1（ＣＨＲＤＬ１）から選択される；および
個体由来の生物学的サンプルにおいて、前記パネル中のＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカーレベルを検出する工程を含み、前記個体が、前記バイオマーカーレベルに基づいて、ＮＳＣＬＣを持つまたは持たないと分類されるか、あるいは、ＮＳＣＬＣを有する個体の尤度を決定し、ここで、バイオマーカーパネルは０．８またはそれより大きいＡＵＣ値を有し、そしてＮが少なくとも２である前記方法。
【請求項５】
バイオマーカーレベルを検出する工程がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実行する工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが、前記バイオマーカーの各々に対応する少なくとも１つの捕捉試薬を含み、そしてアプタマー、抗体、および核酸プローブからなる群より、前記の少なくとも１つの捕捉試薬を選択する工程をさらに含む、請求項５の方法。
【請求項７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが、イムノアッセイ、アプタマーに基づくアッセイ、組織学的または細胞学的アッセイ、およびｍＲＮＡ発現レベルアッセイからなる群より選択される、請求項５の方法。
【請求項８】
各バイオマーカーレベルが、あらかじめ決定された値またはあらかじめ決定された値の範囲に基づいて評価される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
生物学的サンプルが肺組織であり、そしてバイオマーカーレベルが前記肺組織の組織学的または細胞学的分析より得られる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプルが、全血、血漿、および血清からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の尤度を示すためのコンピュータで実施される方法であって：
表１に列挙されたバイオマーカーのうちＮを含むバイオマーカーのパネルを提供し、ここで前記バイオマーカーの少なくとも１つは炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）およびchordin-like 1（ＣＨＲＤＬ１）から選択され；
コンピュータ上で、個体に関するバイオマーカー情報を回収し、ここでバイオマーカー情報は、表１より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含み；
前記バイオマーカー値の各々の分類をコンピュータで実行し；そして
複数の分類に基づいて、前記個体が癌を有する尤度を示す工程を含み、そしてＮが少なくとも２である
前記方法。
【請求項１２】
個体が癌を有する尤度を示す工程が、コンピュータディスプレイ上に尤度をディスプレイする工程を含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
Ｎが少なくとも３である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
Ｎが少なくとも４である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
Ｎが少なくとも５である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｎが少なくとも６である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
Ｎが少なくとも７である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
個体がヒトである、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
個体が喫煙者である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
個体が肺小結節を有する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の尤度を示すためのコンピュータプログラムであって：
計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体を含み、プログラムコードが：
個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが表１より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカーレベルを含み、ここで、前記バイオマーカーの少なくとも１つが炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）およびchordin-like 1（ＣＨＲＤＬ１）から選択され、且つ前記バイオマーカーが生物学的サンプル中で検出された、前記コード；および
前記バイオマーカー値の関数として、個体の癌状態を示す、分類法を実行するコード
を含み；そしてＮが少なくとも２である、前記コンピュータプログラム。
【請求項２２】
前記分類法が確率密度関数を用いる、請求項２１のコンピュータプログラム。
【請求項２３】
前記分類法が２またはそれより多いクラスを用いる、請求項２２のコンピュータプログラム。
【請求項２４】
前記バイオマーカーレベルおよび前記個体に対応するさらなる生物医学情報の少なくとも１つの項目に基づいて、前記個体がＮＳＣＬＣを持つまたは持たないと分類するか、あるいはＮＳＣＬＣを有する個体の尤度を決定する、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
さらなる生物医学情報の前記の少なくとも１つの項目が：
（ａ）前記個体の物理的記述因子に対応する情報、
（ｂ）前記個体における肺異常の放射線学的説明に対応する情報、
（ｃ）前記個体における肺小結節の存在または非存在に対応する情報、
（ｄ）前記個体における肺小結節の物理的記述因子に対応する情報、
（ｅ）前記個体の身長および／または体重における変化に対応する情報、
（ｆ）前記個体の民族性に対応する情報、
（ｇ）前記個体の性別に対応する情報、
（ｈ）前記個体の喫煙歴に対応する情報、
（ｉ）前記個体の環境タバコ曝露に対応する情報、
（ｊ）前記個体におけるアルコール使用歴に対応する情報、
（ｋ）前記個体の職歴に対応する情報、
（ｌ）前記個体における肺癌または他の癌の家族歴に対応する情報、
（ｍ）前記個体または前記個体の家族構成員における肺癌または癌のより高いリスクと相関する、少なくとも１つの遺伝子マーカーの前記個体における存在または非存在に対応する情報、
（ｎ）前記個体の臨床症状に対応する情報、
（ｏ）他の実験室試験に対応する情報、
（ｐ）前記個体の遺伝子発現値に対応する情報、および
（ｑ）既知の発癌因子に対する前記個体の曝露に対応する情報
からなる群より独立に選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
表１に列挙されたバイオマーカータンパク質に特異的な捕捉試薬を含む、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の診断用キットであって、個体におけるＮＳＣＬＣを以下の工程を含む方法によって診断するためのキット：
表１に列挙されたバイオマーカータンパク質のうちＮを含むバイオマーカーのパネルを提供し、ここで前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つは炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）およびchordin-like 1（ＣＨＲＤＬ１）から選択され；および
個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１から選択されるＮのバイオマーカータンパク質の１つに各々対応するバイオマーカーレベルを測定し、Ｎのバイオマーカータンパク質のレベルが、個体が肺癌を持つまたは持たない尤度についての指標を提供し、そしてＮは少なくとも２である。
【請求項２７】
表１に列挙されたバイオマーカータンパク質に特異的な捕捉試薬を含むスクリーニング用キットであって、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に関する無症候性高リスク個体を以下の工程を含む方法によってスクリーニングするためのキット：
表１に列挙されたバイオマーカータンパク質のうちＮを含むバイオマーカーのパネルを提供し、ここで前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つは炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）およびchordin-like 1（ＣＨＲＤＬ１）から選択され；および
個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１から選択されるＮのバイオマーカータンパク質の１つに各々対応するバイオマーカーレベルを測定し、Ｎのバイオマーカータンパク質のレベルが、個体がＮＳＣＬＣを持つまたは持たない尤度についての指標を提供し、そしてＮは少なくとも２である。
【請求項２８】
Ｎが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である、請求項２６または２７のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本出願は、一般的に、バイオマーカーの検出および個体における癌の診断に、そしてより具体的には、個体において、癌、より詳細には肺癌を診断するための１またはそれより多いバイオマーカー、方法、デバイス、試薬、系、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]以下の説明は、本出願に関連する情報の要約を提供し、そして提供する情報または本明細書に言及する刊行物がいずれも、本出願に対する先行技術であるという承認ではない。
【０００３】
[0003]いかなる他のタイプの癌よりも多くの人々が肺癌で死亡する。これは、男性および女性の両方に関して当てはまる。肺癌は、乳癌、前立腺癌、および結腸癌を合わせたより多い死亡の主因である。２０１０年、米国において、肺癌は、概算１５７，３００の死亡例またはすべての癌の死亡の２８％の主因であった。２０１０年には、１１６，７５０人の男性および１０５，７７０人の女性が肺癌と診断され、そして８６，２２０人の男性および７１，０８０人の女性が肺癌で死亡するであろうと概算される（Ｊｅｍａｌ，  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２０１０；６０：２７７）。米国の男性の間で、肺癌は、白人、黒人、アジア／太平洋諸島系、アメリカン・インディアン／アラスカ先住民、およびヒスパニックの男性の間で、二番目に多い癌である。米国の女性の間で、肺癌は、白人、黒人、およびアメリカン・インディアン／アラスカ先住民女性の間では二番目に多い癌であり、そしてアジア／太平洋諸島系およびヒスパニック女性の間では三番目に多い癌である。禁煙しない人に関しては、肺癌による死亡の確率は１５％であり、そして５０〜５９歳で禁煙した人に関してもなお約５％を超えたままである。米国のみで、肺癌の年間医療費は９５０億円である。
【０００４】
[0004]喫煙によって引き起こされる肺癌の９１パーセントが非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であり、これは、すべての肺癌のほぼ８５％に相当する。すべての肺癌の残りの１５％は小細胞肺癌であるが、混合細胞肺癌が存在する。小細胞肺癌はまれであり、そして迅速に致死性であるため、初期検出の好機は少ない。
【０００５】
[0005]ＮＳＣＬＣには３つの主なタイプがある：扁平細胞癌、大細胞癌、および腺癌である。腺癌は、肺癌の最も一般的な型であり（３０％〜６５％）、そして喫煙者および非喫煙者の両方に最も頻繁に見られる肺癌である。扁平細胞癌は、すべての肺癌の２５〜３０％を占め、そして一般的に、近位気管支に見られる。初期ＮＳＣＬＣは、局在化している傾向があり、そして早期に検出されれば、しばしば、手術によって治療可能であり、好ましい転帰および生存改善を伴う。他の治療オプションには、放射線治療、薬剤療法、およびこれらの方法の組み合わせが含まれる。
【０００６】
[0006]ＮＳＣＬＣは、腫瘍サイズ、およびリンパ節を含む他の組織における存在によって段階分けされる。潜在的段階では、癌細胞が、痰サンプルまたは洗浄液サンプルで見出される可能性があり、そして肺において腫瘍は検出不能である。０期では、肺の最も内側の裏打ちが癌細胞を示し、そして腫瘍は裏打ちを通過して増殖はしていない。ＩＡ期では、癌は局所的に侵襲性であると見なされ、そして肺組織内に深く増殖しているが、腫瘍は直径３ｃｍ未満である。この段階で、腫瘍は主気管支またはリンパ節には見られない。ＩＢ期では、腫瘍は直径３ｃｍより大きいか、あるいは気管支または胸膜内に増殖しているかいずれかであるが、リンパ節内には増殖していない。ＩＩＡ期では、腫瘍は直径７ｃｍ未満であり、そしてリンパ節内に増殖している可能性もある。ＩＩＢ期では、腫瘍はリンパ節に見られており、そして直径５ｃｍより大きいか、または気管支もしくは胸膜内に増殖しているか；あるいは癌はリンパ節にはないが、胸壁、横隔膜、胸膜、気管支、もしくは心臓を取り巻く組織に見られるか、または肺の同じ葉に別個の腫瘍小結節が存在する。ＩＩＩＡ期において、癌細胞は、肺および気管支近傍のリンパ節に、そして肺の間であるが、腫瘍が位置する胸の側のリンパ節に見られる。ＩＩＩＢ期では、癌細胞が、胸の腫瘍がある側と反対側に、または首に存在する。肺近傍の他の臓器もまた、癌細胞を有する可能性があり、そして多数の腫瘍が肺の１つの葉に見られうる。ＩＶ期では、腫瘍は、同じ肺の１つより多い葉に、または両方の肺に見られ、そして癌細胞は、体の他の部分で見られる。
【０００７】
[0007]肺癌を診断する現在の方法には、癌性細胞に関する痰の試験、胸部ｘ線、光ファイバー評価および気道の生検、ならびに低線量らせんコンピューター断層撮影（ＣＴ）が含まれる。痰細胞学は非常に低い感度を有する。胸部ｘ線もまた、比較的感度が低く、可視であるためには病変が１ｃｍより大きいサイズである必要がある。気管支鏡検査では、気管支鏡がアクセス可能な気道内部で、腫瘍が可視である必要がある。最も広く認識される診断法は低線量胸部ＣＴであるが、Ｘ線と同様、ＣＴの使用はイオン化放射線を伴い、これはそれ自体、癌を引き起こしうる。ＣＴはまた、重大な制限も有する：スキャンを解釈するには、高レベルの技術的技能を必要とし、そして観察される異常の多くは、実際には肺癌ではなく、そして追跡調査ＣＴ所見にはかなりの医療費を要する。最も一般的なありがちな所見は、良性肺小結節である。
【０００８】
[0008]肺小結節は、肺内に位置する比較的丸い病変、または異常組織領域であり、そしてサイズは多様でありうる。肺小結節は、良性または癌性である可能性があるが、大部分は良性である。小結節が４ｍｍ未満である場合、有病率はわずか１．５％であり、４〜８ｍｍである場合、有病率はおよそ６％であり、そして２０ｍｍを超える場合、発生率はおよそ２０％である。小さいおよび中程度のサイズの小結節に関して、患者は、３ヶ月から１年以内に反復スキャンを受けるよう助言される。多くの大きな小結節に関しては、患者は生検（侵襲性であり、そして合併症を導きうる）を受けるが、これらの大部分は良性である。
【０００９】
[0009]したがって、行われる外科的処置の数を減少させ、そして外科的合併症のリスクを最小限にするため、ＣＴを置換するかまたは補完することが可能な診断法が必要である。さらに、肺小結節が存在しないか未知である場合であっても、早期に肺癌を検出して患者転帰を改善する方法が必要である。５年生存率がわずか１３％である後期に診断される肺癌症例が８４％であるのに比較して、５年生存率が４６％である局在性早期癌として診断される肺癌症例は、わずか１６％である。このことは、診断のため症状に頼るのは有用でないことを立証しており、これは、症状の多くが、他の肺疾患と共通しており、そしてしばしば肺癌のより後期にしか存在しないためである。これらの症状には、持続性の咳、血痰、胸部痛、および再発性気管支炎または肺炎が含まれる。
【００１０】
[0010]癌の早期診断法が存在する場合、医学界によって、一般的に利点が認められている。広く利用されるスクリーニングプロトコルを有する癌は、最高の５年生存率を有し、例えば肺癌が１６％であるのに比較して、乳癌（８８％）および結腸癌（６５％）である。しかし、スクリーニングを通じて、Ｉ期で癌が診断されれば、最大８８％の肺癌患者が１０年またはそれより長く生存する。これは、信頼性を持って早期ＮＳＣＬＣを検出可能な診断法が明らかに必要であることを示す。
【００１１】
[0011]特定の疾患状態に関するバイオマーカー選択は、まず、特定の医学的適用に関する対照集団に比較した、疾患集団における、測定可能で、そして統計的に有意な相違を有するマーカーの同定を伴う。バイオマーカーには、疾患発展または進行と平行し、そして病変に反応して肺組織からまたは遠位組織から血流内に容易に拡散する、分泌分子または脱落分子が含まれうる。これらにはまた、腫瘍に反応して細胞によって作製されるタンパク質もまた含まれうる。同定されるバイオマーカーまたはバイオマーカーセットは、一般的に、選択された元来意図される使用に関して、信頼性がある指標であることが、臨床的に検証されるかまたは示される。バイオマーカーには、小分子、代謝産物、ペプチド、タンパク質、および核酸が含まれうる。バイオマーカーの同定に影響を及ぼす重要な論点のいくつかには、入手可能なデータの過剰適合またはデータ中のバイアスが含まれる。
【００１２】
[0012]バイオマーカーを同定し、そして疾患を診断する試みの中で、多様な方法が利用されてきている。タンパク質に基づくマーカーに関して、これらには、二次元電気泳動、質量分析、およびイムノアッセイ法が含まれる。核酸マーカーに関して、これらには、ｍＲＮＡ発現プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイル、ＦＩＳＨ、遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）、および大規模遺伝子発現アレイが含まれる。
【００１３】
[0013]二次元電気泳動の有用性は、低い検出感度；タンパク質可溶性、電荷、および疎水性に関する問題；ゲル再現性；ならびに多数のタンパク質に相当する単一のスポットがある可能性によって、限定される。質量分析に関しては、使用する形式に応じて、サンプルプロセシングおよび分離、低存在量タンパク質に対する感度、シグナル対ノイズ比の考慮、および検出されたタンパク質を直ちには同定不能であることに関する限界がある。イムノアッセイアプローチを利用してバイオマーカーを発見する際の限界は、抗体に基づく多重化アッセイでは、多数の分析物を測定することが不可能であることが中心である。単に、高品質抗体アレイをプリントし、そしてサンドイッチを伴わずにこれらの抗体に結合した分析物を測定することも可能である。（これは、ハイブリダイゼーションによって、生物または細胞におけるすべてのＤＮＡまたはＲＮＡ配列を測定する、核酸配列の全ゲノムの使用の正式な同等物であろう。ハイブリダイゼーション実験は、ハイブリダイゼーションが同一性に関してストリンジェントな試験でありうるために働く。非常に優れた抗体であったとしても、血液またはさらに細胞抽出物の背景において、結合パートナーを選択する際には十分にストリンジェントではなく、これは、これらのマトリックス中のタンパク質集合体が、非常に異なる存在量を有するためである。）したがって、イムノアッセイに基づくアプローチを用いてバイオマーカーを発見するには、異なるアプローチを使用しなければならない。多くの分析物を同時に測定して、どの分析物が実際にバイオマーカーであるかを決定するための十分なストリンジェンシーを得るには、多重化ＥＬＩＳＡアッセイ（すなわちサンドイッチ）を用いる必要があるであろう。サンドイッチイムノアッセイは、高含量では比例せず、そしてしたがって、ストリンジェントなサンドイッチイムノアッセイを用いたバイオマーカー発見は、標準的なアレイ形式を用いては不可能である。最後に、抗体試薬は、実質的なロット可変性および試薬不安定性を被る。タンパク質バイオマーカー発見のための本プラットフォームは、この問題を克服する。
【００１４】
[0014]これらの方法の多くは、分析前のサンプル分画のいくつかのタイプに頼るかまたはこうしたタイプを必要とする。したがって、一連のよく定義されたサンプル集団において、統計的に適切なバイオマーカーを同定／発見するように設計された、十分に強力な研究を実行するために必要なサンプル調製は、非常に困難で、コストが掛かり、そして時間を消費する。分画中、多様なサンプルに広範囲の可変性が導入されうる。例えば、潜在的なマーカーは、プロセスに対して不安定である可能性もあり、マーカーの濃度が変化する可能性もあり、不適切な凝集または脱凝集が起こる可能性もあり、そして不都合なサンプル混入が起こり、そしてしたがって、初期疾患において予期されるわずかな変化を不明瞭にする可能性もある。
【００１５】
[0015]これらの技術を用いたバイオマーカー発見法および検出法は、診断性バイオマーカーの同定に深刻な限界を有することが、広く認められている。これらの限界には、低存在量バイオマーカーを検出不能であること、プロテオームの全ダイナミック・レンジを一貫して含むことが不可能であること、サンプルプロセシングおよび分画に再現性がないこと、そして方法の全体の再現性がなく、そしてロバストネスが欠如していることが含まれる。さらに、これらの研究は、データにバイアスを導入しており、そしてターゲット疾患集団内で、バイオマーカーを同定し、そして検証するのに必要な分布およびランダム化に関して、適切な対照を含めて、サンプル集団の複雑さに適切に取り組んできていない。
【００１６】
[0016]新規のそして有効なバイオマーカーの発見に向けられる努力が数十年に渡って続けられてきているが、努力は大部分が失敗に終わっている。多様な疾患に関するバイオマーカーは、典型的には、大学研究室で同定されてきており、通常、何らかの疾患プロセスに関する基礎研究を行っている際の、偶然の発見を通じたものである。発見に基づき、そして少量の臨床データとともに、新規バイオマーカーの同定を示唆する論文が公開された。しかし、これらの提唱されるバイオマーカーの大部分は、真のまたは有用なバイオマーカーとは確認されてきておらず、これは主に、試験した少数の臨床サンプルが、有効なバイオマーカーが実際に見出されているという統計的証明を弱くしか提供しないためである。すなわち、統計の基礎要素に関して、初期同定は厳密ではなかった。１９９４年〜２００３年の各々において、科学文献の検索は、バイオマーカーに対して向けられる数千の参考文献が公開されたことを示す。しかし、同じ時間枠中に、ＦＤＡは、診断使用のために、１年に最大で３つの新規タンパク質バイオマーカーしか認可せず、そして数年間、新規タンパク質バイオマーカーをまったく認可しなかった。
【００１７】
[0017]バイオマーカー発見努力が失敗してきた歴史に基づき、疾患に関するバイオマーカーがまれであり、そして発見が困難であるという一般的な理解をさらに促進する、数学的理論が提唱されてきている。２Ｄゲルまたは質量分析に基づくバイオマーカー研究は、これらの知見を支持する。これらのアプローチを通じて、ごくわずかの有用なバイオマーカーしか同定されてこなかった。しかし、通常、２Ｄゲルおよび質量分析が、およそ１ｎＭ濃度およびそれより高い濃度で血中に存在するタンパク質を測定し、そしてこのタンパク質集合体が、疾患とともに変化する可能性は非常に低い可能性があることは見落とされている。本バイオマーカー発見プラットフォーム以外に、はるかにより低い濃度で、タンパク質発現レベルを正確に測定可能な、プロテオミクスバイオマーカー発見プラットフォームは存在しない。
【００１８】
[0018]複雑なヒト生物学に関する生化学的経路に関して、多くが知られている。多くの生化学経路は、病変内で局所作用する分泌タンパク質を集積する結果となるかまたはこうした分泌タンパク質によって開始され、例えば増殖因子が分泌されて、病変における他の細胞の複製を刺激し、そして他の因子が分泌されて、免疫系を回避するなどと続く。多くのこれらの分泌タンパク質がパラクリン様式で働く一方、いくつかは体の遠位で作用する。生化学経路の基本的な理解がある当業者は、多くの病変特異的タンパク質が、２Ｄゲルおよび質量分析の検出限界未満の（さらにはるかに低い）濃度で、血中に存在するはずであることを理解するであろう。この比較的豊富な数の疾患バイオマーカーの同定に先行する必要があるのは、２Ｄゲルまたは質量分析によって検出可能なものより低い濃度で、タンパク質を分析可能であるプロテオミクスプラットフォームである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ，  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２０１０；６０：２７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
[0019]したがって、（ａ）肺癌に関する高リスク喫煙者をスクリーニングし、（ｂ）悪性肺小結節から良性肺小結節を区別し；（ｃ）肺癌バイオマーカーを検出し；そして（ｄ）肺癌を診断することを可能にする、バイオマーカー、方法、デバイス、試薬、系、およびキットに関する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
概要
[0020]本出願には、癌およびより具体的にはＮＳＣＬＣの検出および診断のためのバイオマーカー、方法、試薬、デバイス、系、およびキットが含まれる。本出願のバイオマーカーは、実施例１に詳細に記載する多重化アプタマーに基づくアッセイを用いて同定された。本明細書に記載するアプタマーに基づくバイオマーカー同定法を用いることによって、本出願は、ＮＳＣＬＣの検出および診断に有用な驚くべき多数のＮＳＣＬＣバイオマーカー、ならびにより一般的に、癌の検出および診断に有用な多数の癌バイオマーカーを記載する。これらのバイオマーカーを同定する際、数百の個々のサンプルから１０００を超えるタンパク質を測定し、このうちいくつかは低フェントモル範囲の濃度であった。これは、２Ｄゲルおよび／または質量分析で行われるバイオマーカー発見実験よりも、約４桁低い。
【００２２】
[0021]記載するＮＳＣＬＣバイオマーカーの特定のものは、ＮＳＣＬＣを検出し、そして診断するために単独で有用であるが、本明細書に記載するのは、バイオマーカー・パネルとして有用なＮＳＣＬＣバイオマーカーの多数のサブセットをグループ化するための方法である。ひとたび個々のバイオマーカーまたはバイオマーカーサブセットが同定されたら、個体におけるＮＳＣＬＣの検出または診断は、生物学的サンプルにおいて、選択された単数または複数のバイオマーカーのレベルの相違を測定可能な任意のプラットフォームまたは形式を用いて達成可能である。
【００２３】
[0022]しかし、１０００を超える別個の潜在的バイオマーカー値を、ＮＳＣＬＣを持つまたは持たないとあらかじめ診断されている多数の個体から個々にスクリーニングする、本明細書記載のアプタマーに基づくバイオマーカー同定法を用いることによってのみ、本明細書に開示するＮＳＣＬＣバイオマーカーを同定することが可能であった。この発見アプローチは、馴化培地または溶解細胞からのバイオマーカーの発見とは著しく対照的であり、これは、該アプローチが、ヒト病理への変換を要しない、より患者に関連した系を問題にしているためである。
【００２４】
[0023]したがって、本出願の１つの側面において、ＮＳＣＬＣを診断するか、あるいはＣＴスキャンまたは他の画像化法で同定された未確定の肺小結節を持つ個体に見られるものなどの良性状態からのＮＳＣＬＣの示差診断、ＮＳＣＬＣに関する高リスク喫煙者のスクリーニング、およびＮＳＣＬＣでの個体の診断を可能にする、単独のまたは多様な組み合わせのいずれかで使用するための１またはそれより多いバイオマーカーを提供する。例示的な態様には、表１に提供するバイオマーカーが含まれ、これらは上述のように、一般的に実施例１に記載するような、そしてより具体的に実施例２および５に記載するような、アプタマーに基づく多重化アッセイを用いて同定された。表１に提供するマーカーは、高リスク集団においてＮＳＣＬＣを診断する際に、そして未確定の肺小結節を持つ個体において、ＮＳＣＬＣから良性肺疾患を区別するために、有用である。
【００２５】
[0024]記載するＮＳＣＬＣバイオマーカーの特定のものは、ＮＳＣＬＣを検出し、そして診断するために単独で有用であるが、本明細書にやはり記載するのは、２またはそれより多いバイオマーカーのパネルとして各々有用なＮＳＣＬＣバイオマーカーの多数のサブセットをグループ化するための方法である。したがって、本出願の多様な態様は、Ｎのバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここで、Ｎは少なくとも２つのバイオマーカーである。他の態様において、Ｎは２〜５９のバイオマーカーからの任意の数であるように選択される。
【００２６】
[0025]さらに他の態様において、Ｎは、２〜５、２〜１０、２〜１５、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜３５、２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、または２〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、３〜２５、３〜３０、３〜３５、３〜４０、３〜４５、３〜５０、３〜５５、または３〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、４〜５、４〜１０、４〜１５、４〜２０、４〜２５、４〜３０、４〜３５、４〜４０、４〜４５、４〜５０、４〜５５、または４〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、または５〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、６〜１０、６〜１５、６〜２０、６〜２５、６〜３０、６〜３５、６〜４０、６〜４５、６〜５０、６〜５５、または６〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、７〜１０、７〜１５、７〜２０、７〜２５、７〜３０、７〜３５、７〜４０、７〜４５、７〜５０、７〜５５、または７〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、８〜１０、８〜１５、８〜２０、８〜２５、８〜３０、８〜３５、８〜４０、８〜４５、８〜５０、８〜５５、または８〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、９〜１０、９〜１５、９〜２０、９〜２５、９〜３０、９〜３５、９〜４０、９〜４５、９〜５０、９〜５５、または９〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、または１０〜５９からの任意の数であるように選択される。Ｎは、類似の、しかしより高い桁の範囲を含むように選択可能であることが認識されるであろう。
【００２７】
[0026]別の側面において、個体においてＮＳＣＬＣを診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に提供するバイオマーカー群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する少なくとも１つのバイオマーカー値を検出する工程を含み、個体が、少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて、ＮＳＣＬＣを有すると分類される、前記方法を提供する。
【００２８】
[0027]別の側面において、個体においてＮＳＣＬＣを診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を決定する、前記方法を提供する。
【００２９】
[0028]別の側面において、個体においてＮＳＣＬＣを診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有すると分類され、そしてＮ＝２〜１０である、前記方法を提供する。
【００３０】
[0029]別の側面において、個体においてＮＳＣＬＣを診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を決定し、そしてＮ＝２〜１０である、前記方法を提供する。
【００３１】
[0030]別の側面において、個体がＮＳＣＬＣを持たないと診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に示すバイオマーカー群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する少なくとも１つのバイオマーカー値を検出する工程を含み、個体が、少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて、ＮＳＣＬＣを持たないと分類される、前記方法を提供する。
【００３２】
[0031]別の側面において、個体がＮＳＣＬＣを持たないと診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを持たないと分類され、そしてＮ＝２〜１０である、前記方法を提供する。
【００３３】
[0032]別の側面において、ＮＳＣＬＣを診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に示すバイオマーカー群より選択されるＮのバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値の分類が個体がＮＳＣＬＣを有することを示し、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００３４】
[0033]別の側面において、ＮＳＣＬＣを診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表２〜１１に示すパネル群より選択されるバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値の分類が個体がＮＳＣＬＣを有することを示す、前記方法を提供する。
【００３５】
[0034]別の側面において、ＮＳＣＬＣの非存在を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、バイオマーカーが表１に示すバイオマーカー群より選択されるＮのバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値の分類が個体においてＮＳＣＬＣが存在しないことを示し、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００３６】
[0035]別の側面において、ＮＳＣＬＣの非存在を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、バイオマーカーが表１に示すバイオマーカー群より選択されるＮのバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値の分類が個体においてＮＳＣＬＣが存在しないことを示し、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００３７】
[0036]別の側面において、ＮＳＣＬＣの非存在を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表２〜１１に提供するパネル群より選択されるバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値の分類が個体においてＮＳＣＬＣが存在しないことを示す、前記方法を提供する。
【００３８】
[0037]別の側面において、個体においてＮＳＣＬＣを診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、あらかじめ決定された閾値から派生する分類スコアに基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有すると分類され、そしてＮ＝２〜１０である、前記方法を提供する。
【００３９】
[0038]別の側面において、個体においてＮＳＣＬＣの非存在を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、あらかじめ決定された閾値から派生する分類スコアに基づいて、個体がＮＳＣＬＣを持たないと分類され、そしてＮ＝２〜１０である、前記方法を提供する。
【００４０】
[0039]別の側面において、ＮＳＣＬＣの尤度を示すためのコンピュータで実施される方法（computer-implemented method, コンピュータ実装法）を提供する。該方法は：コンピュータ上で、個体に関するバイオマーカー情報を回収し、ここでバイオマーカー情報は、表１に示すバイオマーカー群より選択される、Ｎが上に定義する通りである少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含み；バイオマーカー値の各々の分類をコンピュータで実行し；そして複数の分類に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を示す工程を含む。
【００４１】
[0040]別の側面において、個体がＮＳＣＬＣを持つまたは持たないのいずれかと分類するためのコンピュータ実装法を提供する。該方法は：コンピュータ上で、個体に関するバイオマーカー情報を回収し、ここでバイオマーカー情報は、表１に提供するバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含み；バイオマーカー値の各々の分類をコンピュータで実行し；そして複数の分類に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有するかどうかを示す工程を含む。
【００４２】
[0041]別の側面において、ＮＳＣＬＣの尤度を示すためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが表１に示すバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中の、Ｎが上に定義する通りである少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含む、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を示す、分類法を実行するコードを含む。
【００４３】
[0042]別の側面において、個体のＮＳＣＬＣ状態を示すためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが表１に提供するバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中の少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含む、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体のＮＳＣＬＣ状態を示す、分類法を実行するコードを含む。
【００４４】
[0043]別の側面において、ＮＳＣＬＣの尤度を示すためのコンピュータ実装法を提供する。該方法は、コンピュータ上で、個体に関するバイオマーカー情報を回収し、ここでバイオマーカー情報は、表１に示すバイオマーカー群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含み；バイオマーカー値の分類をコンピュータで実行し；そして分類に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を示す工程を含む。
【００４５】
[0044]別の側面において、個体がＮＳＣＬＣを持つまたは持たないと分類するためのコンピュータ実装法を提供する。該方法は、コンピュータから、個体に関するバイオマーカー情報を回収し、ここでバイオマーカー情報は、表１に提供するバイオマーカー群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含み；バイオマーカー値の分類をコンピュータで実行し；そして分類に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有するかどうかを示す工程を含む。
【００４６】
[0045]さらに別の側面において、ＮＳＣＬＣの尤度を示すためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが、表１に示すバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を示す、分類法を実行するコードを含む。
【００４７】
[0046]さらに別の側面において、個体のＮＳＣＬＣ状態を示すためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが、表１に提供するバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体のＮＳＣＬＣ状態を示す、分類法を実行するコードを含む。
【００４８】
[0047]記載するバイオマーカーの特定のものはまた、一般的な癌を検出し、そして診断するために、単独でも有用であるが、本明細書に記載するのは、一般的な癌を検出し、そして診断するために、バイオマーカーのパネルとして有用である、バイオマーカーの多数のサブセットをグループ化するための方法である。ひとたび個々のバイオマーカーまたはバイオマーカーサブセットが同定されたら、個体における癌の検出または診断は、生物学的サンプルにおいて、選択された単数または複数のバイオマーカーのレベルの相違を測定可能な任意のアッセイプラットフォームまたは形式を用いて達成可能である。
【００４９】
[0048]しかし、１０００を超える別個の潜在的バイオマーカー値を、癌を持つまたは持たないとあらかじめ診断されている多数の個体から個々にスクリーニングする、本明細書記載のアプタマーに基づくバイオマーカー同定法を用いることによってのみ、本明細書に開示する癌バイオマーカーを同定することが可能であった。この発見アプローチは、馴化培地または溶解細胞からのバイオマーカーの発見とは著しく対照的であり、これは、該アプローチが、ヒト病理への変換を要しない、より患者に関連した系を問題にしているためである。
【００５０】
[0049]したがって、本出願の１つの側面において、癌を診断する、単独のまたは多様な組み合わせのいずれかで使用するための１またはそれより多いバイオマーカーを提供する。例示的な態様には、表１９に提供するバイオマーカーが含まれ、これらは、一般的に実施例１に記載するような、そしてより具体的に実施例６に記載するような、多重化アプタマーに基づくアッセイを用いて同定された。表１９に提供するマーカーは、癌を持たない個体から癌を持つ個体を区別するために、有用である。
【００５１】
[0050]記載する癌バイオマーカーの特定のものは、癌を検出し、そして診断するために単独で有用であるが、本明細書にやはり記載するのは、３またはそれより多いバイオマーカーのパネルとして各々有用な癌バイオマーカーの多数のサブセットをグループ化するための方法である。したがって、本出願の多様な態様は、Ｎのバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここで、Ｎは少なくとも３つのバイオマーカーである。他の態様において、Ｎは３〜２３のバイオマーカーからの任意の数であるように選択される。
【００５２】
[0051]さらに他の態様において、Ｎは、２〜５、２〜１０、２〜１５、２〜２０、または２〜２３からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、または３〜２３からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、４〜５、４〜１０、４〜１５、４〜２０、または４〜２３からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、５〜１０、５〜１５、５〜２０、または５〜２３からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、６〜１０、６〜１５、６〜２０、または６〜２３からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、７〜１０、７〜１５、７〜２０、または７〜２３からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、８〜１０、８〜１５、８〜２０、または８〜２３からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、９〜１０、９〜１５、９〜２０、または９〜２３からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、１０〜１５、１０〜２０、または１０〜２３からの任意の数であるように選択される。Ｎは、類似の、しかしより高い桁の範囲を含むように選択可能であることが認識されるであろう。
【００５３】
[0052]別の側面において、個体において癌を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１９に提供するバイオマーカー群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する少なくとも１つのバイオマーカー値を検出する工程を含み、個体が、少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて、癌を有すると分類される、前記方法を提供する。
【００５４】
[0053]別の側面において、個体において癌を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１９に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値に基づいて、個体が癌を有する尤度を決定する、前記方法を提供する。
【００５５】
[0054]別の側面において、個体において癌を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１９に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値に基づいて、個体が癌を有すると分類され、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００５６】
[0055]別の側面において、個体において癌を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１９に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値に基づいて、個体が癌を有する尤度を決定し、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００５７】
[0056]別の側面において、個体が癌を持たないと診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１９に示すバイオマーカー群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する少なくとも１つのバイオマーカー値を検出する工程を含み、個体が、少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて、癌を持たないと分類される、前記方法を提供する。
【００５８】
[0057]別の側面において、個体が癌を持たないと診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１９に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値に基づいて、個体が癌を持たないと分類され、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００５９】
[0058]別の側面において、癌を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１９に示すバイオマーカー群より選択されるＮのバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値の分類が個体が癌を有することを示し、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００６０】
[0059]別の側面において、癌を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表２０〜２９に示すパネル群より選択されるバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値の分類が個体が癌を有することを示す、前記方法を提供する。
【００６１】
[0060]別の側面において、癌の非存在を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、バイオマーカーが表１９に示すバイオマーカー群より選択されるＮのバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値の分類が個体において癌が存在しないことを示し、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００６２】
[0061]別の側面において、癌の非存在を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表２０〜２９に提供するパネル群より選択されるバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに各々対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、バイオマーカー値の分類が個体において癌が存在しないことを示す、前記方法を提供する。
【００６３】
[0062]別の側面において、個体において癌を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１９に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、あらかじめ決定された閾値から派生する分類スコアに基づいて、個体が癌を有すると分類され、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００６４】
[0063]別の側面において、個体において癌の非存在を診断するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１９に示すバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに対応するバイオマーカー値を検出する工程を含み、あらかじめ決定された閾値から派生する分類スコアに基づいて、個体が癌を持たないと分類され、そしてＮ＝３〜１０である、前記方法を提供する。
【００６５】
[0064]別の側面において、癌の尤度を示すためのコンピュータ実装法を提供する。該方法は：コンピュータ上で、個体に関するバイオマーカー情報を回収し、ここでバイオマーカー情報は、表１９に示すバイオマーカー群より選択される、Ｎが上に定義する通りである少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含み；バイオマーカー値の各々の分類をコンピュータで実行し；そして複数の分類に基づいて、個体が癌を有する尤度を示す工程を含む。
【００６６】
[0065]別の側面において、個体が癌を持つまたは持たないのいずれかと分類するためのコンピュータ実装法を提供する。該方法は：コンピュータ上で、個体に関するバイオマーカー情報を回収し、ここでバイオマーカー情報は、表１９に提供するバイオマーカー群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含み；バイオマーカー値の各々の分類をコンピュータで実行し；そして複数の分類に基づいて、個体が癌を有するかどうかを示す工程を含む。
【００６７】
[0066]別の側面において、癌の尤度を示すためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが表１９に示すバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中の、Ｎが上に定義する通りである少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含む、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体が癌を有する尤度を示す、分類法を実行するコードを含む。
【００６８】
[0067]別の側面において、個体の癌状態を示すためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが表１９に提供するバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中の少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含む、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体の癌状態を示す、分類法を実行するコードを含む。
【００６９】
[0068]別の側面において、癌の尤度を示すためのコンピュータ実装法を提供する。該方法は、コンピュータ上で、個体に関するバイオマーカー情報を回収し、ここでバイオマーカー情報は、表１９に示すバイオマーカー群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含み；バイオマーカー値の分類をコンピュータで実行し；そして分類に基づいて、個体が癌を有する尤度を示す工程を含む。
【００７０】
[0069]別の側面において、個体が癌を持つまたは持たないと分類するためのコンピュータ実装法を提供する。該方法は、コンピュータから個体に関するバイオマーカー情報を回収し、ここでバイオマーカー情報は、表１９に提供するバイオマーカー群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含み；バイオマーカー値の分類をコンピュータで実行し；そして分類に基づいて、個体が癌を有するかどうかを示す工程を含む。
【００７１】
[0070]さらに別の側面において、癌の尤度を示すためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが、表１９に示すバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体が癌を有する尤度を示す、分類法を実行するコードを含む。
【００７２】
[0071]さらに別の側面において、個体の癌状態を示すためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが、表１９に提供するバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体の癌状態を示す、分類法を実行するコードを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】[0072]図１Ａは、生物学的サンプルにおいて、ＮＳＣＬＣを検出するための例示的な方法に関するフローチャートである。[0073]図１Ｂは、単純ベイズ分類法を用いて、生物学的サンプルにおいて、ＮＳＣＬＣを検出するための例示的な方法に関するフローチャートである。
【図２】[0074]図２は、ＮＳＣＬＣを検出する試験のため、単純ベイズ分類器を用いた、単一のバイオマーカー、ＭＭＰ７に関するＲＯＣ曲線を示す。
【図３】[0075]図３は、ＮＳＣＬＣを検出する試験のため、単純ベイズ分類器を用いた、２〜１０のバイオマーカー由来のバイオマーカー・パネルに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図４】[0076]図４は、ＮＳＣＬＣパネルに関する単純ベイズ分類を用いた、バイオマーカーの数を１から１０に増加させるにつれた、分類スコア（ＡＵＣ）の増加を例示する。
【図５】[0077]図５は、単純ベイズ分類器を訓練するために用いた正常ｃｄｆに適合する曲線（断続線）とともに、喫煙者および良性肺小結節対照を合わせたもの（実線）ならびにＮＳＣＬＣ疾患群（点線）に関する対数変換ＲＦＵにおける集積分布関数（ｃｄｆ）としてのＭＭＰ７の測定されたバイオマーカー分布を示す。
【図６】[0078]図６は、本明細書記載の多様なコンピュータ実装法で使用するための例示的コンピュータ系を例示する。
【図７】[0079]図７は、１つの態様にしたがった、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を示す方法に関するフローチャートである。
【図８】[0080]図８は、１つの態様にしたがった、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を示す方法に関するフローチャートである。
【図９】[0081]図９は、生物学的サンプルにおける、１またはそれより多いＮＳＣＬＣバイオマーカーを検出するために使用可能な、例示的なアプタマーアッセイを例示する。
【図１０】[0082]図１０は、潜在的なバイオマーカーの集合セットから、ＮＳＣＬＣ、ならびに喫煙者および良性肺小結節対照群の間を区別する分類器を構築する際に、バイオマーカーが用いられる頻度のヒストグラムを示す。
【図１１】[0083]図１１Ａは、表１に示すバイオマーカー（黒）およびランダムマーカーセット（灰色）を用いた、すべてのありうる単一タンパク質単純ベイズ分類器スコア（ＡＵＣ）を要約するヒストグラム対を示す。[0084]図１１Ｂは、表１に示すバイオマーカー（黒）およびランダムマーカーセット（灰色）を用いた、すべてのありうる２タンパク質タンパク質単純ベイズ分類器スコア（ＡＵＣ）を要約するヒストグラム対を示す。[0085]図１１Ｃは、表１に示すバイオマーカー（黒）およびランダムマーカーセット（灰色）を用いた、すべてのありうる３タンパク質単純ベイズ分類器スコア（ＡＵＣ）を要約するヒストグラム対を示す。
【図１２】[0086]図１２は、分類器生成中、全パネルから選択される２〜１０のマーカーを用いた単純ベイズ分類器に関するＡＵＣ、ならびに最適な５、１０、および１５マーカーを落とすことによって得られるスコアを示す。
【図１３】[0087]図１３Ａは、２〜５つのマーカーのパネルに関する表１４中のデータからモデル化されるＲＯＣ曲線セットを示す。[0088]図１３Ｂは、図１２Ａにおけるような２から５つのマーカーのパネルに関する訓練データから計算されるＲＯＣ曲線セットを示す。
【図１４】[0089]図１４は、実施例５に記載する臨床的バイオマーカーパネルから計算されるＲＯＣ曲線を示す。
【図１５】[0090]図１５Ａおよび１５Ｂは、実施例６に記載する欲張り（ｇｒｅｅｄｙ）選択法によって選択される１０の癌バイオマーカー（表１９）、および１０の「非マーカー」バイオマーカーの１，０００のランダムにサンプリングされたセットの間の性能の比較を示す。表１９の１０の癌バイオマーカーに関する平均ＡＵＣを垂直の点線として示す。図１５Ａにおいて、実施例６に記載する欲張り法によって選択されなかった１０の「非マーカー」のセットをランダムに選択した。図１５Ｂにおいて、１５Ａと同じ方法を用いた；が、サンプリングは、実施例６に記載する欲張り法によって選択されなかった、表１由来の残りの４９のＮＳＣＬＣバイオマーカーに制限された。
【図１６】[0091]図１６は、表３１に示す３つの単純ベイズ分類器に関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。各研究に関して、曲線下面積（ＡＵＣ）もまた、レジェンドの隣に示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
[0092]ここで、本発明の代表的な態様に対して、詳細に言及する。本発明は、列挙する態様と組み合わせて記載されるが、本発明はこれらの態様に限定されるとは意図されないことが理解されるであろう。対照的に、本発明は、請求項によって定義されるような本発明の範囲内に含まれうる、すべての代替物、修飾、および同等物を含むよう意図される。
【００７５】
[0093]当業者は、本発明の実施において使用可能であり、そして実施の範囲内にある、本明細書記載のものと類似のまたは同等な多くの方法および材料を認識するであろう。本発明は、いかなる点でも、記載する方法および材料に限定されない。
【００７６】
[0094]別に定義しない限り、本明細書で用いる技術的および科学的用語は、本発明が属する技術範囲の一般の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書記載のものと類似のまたは同等な任意の方法、デバイス、および材料を、本発明の実施または試験において使用可能であるが、好ましい方法、デバイス、および材料を、ここで記載する。
【００７７】
[0095]本出願に引用するすべての刊行物、公開特許文書、および特許出願は、本出願が関連する技術分野（単数または複数）の技術のレベルの指標である。本明細書に引用するすべての刊行物、公開特許文書、および特許出願は、各個々の刊行物、公開特許文書、または特許出願が、具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いに、本明細書に援用される。
【００７８】
[0096]本出願で使用する際、付随する請求項を含めて、文脈が別に明らかに示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数の言及が含まれ、そして「少なくとも１つ」および「１またはそれより多く」と交換可能に用いられる。したがって、「アプタマー（ａｎ  ａｐｔａｍｅｒ）」への言及には、アプタマーの混合物が含まれ、「プローブ（ａ  ｐｒｏｂｅ）」への言及には、プローブの混合物が含まれるなどである。
【００７９】
[0097]本明細書において、用語「約」は、数値が関連する項目の基本的な機能が不変であるような、数値の重要でない修飾または変動を示す。
【００８０】
[0098]本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、およびそれらの任意の変形は、非包括的包含を含むと意図され、したがって、要素または要素のリストを含むか、該要素が含まれるか、または該要素を含有する、問題のプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物には、これらの要素のみが含まれるのでなく、問題のこうしたプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物に明確に列挙されていないかまたは本質的でない、他の要素もまた、含まれてもよい。
【００８１】
[0099]本出願には、ＮＳＣＬＣおよびより一般的に癌の検出および診断のためのバイオマーカー、方法、デバイス、試薬、系、およびキットが含まれる。
【００８２】
[0100]１つの側面において、単独で、または多様な組み合わせのいずれかで、ＮＳＣＬＣを診断し、ＣＴスキャンまたは他の画像化法で同定された未確定の肺小結節を持つ個体で見られる非悪性状態から、ＮＳＣＬＣの示差的診断を可能にし、ＮＳＣＬＣに関して高リスクの喫煙者をスクリーニングし、そしてＮＳＣＬＣを有する個体を診断し、ＮＳＣＬＣ再発を監視し、または他の臨床的徴候に取り組む、１またはそれより多いバイオマーカーを提供する。以下に詳細に記載するように、例示的な態様には、表１に提供するバイオマーカーであって、一般的に実施例１に、そしてより具体的には実施例２に記載される多重化アプタマーに基づくアッセイを用いて同定される、前記マーカーが含まれる。
【００８３】
[0101]表１は、ＮＳＣＬＣ症例由来の数百の個体血液サンプル、ならびに高リスク喫煙者および良性肺小結節由来の数百の同等の個体対照血液サンプルを分析することから得た知見を示す。喫煙者および良性肺小結節対照群は、無症候性個体および症候性個体を含めて、ＮＳＣＬＣ診断試験が最も利益をもたらしうる集団にマッチするよう設計された。これらの症例および対照を、多数の臨床施設から得て、こうした試験を適用可能な現実世界の条件の範囲を模倣した。潜在的なバイオマーカーを、疾患および対照血をプールするのではなく、個々のサンプルにおいて測定した；これによって、疾患（この場合、ＮＳＣＬＣ）の存在および非存在に関連する表現型における個体および群変動をよりよく理解することが可能になった。１０００を超えるタンパク質測定を各サンプルに対して行い、そして疾患および対照集団各々由来の数百のサンプルを個々に測定するため、表１は、非常に多数のデータセットの分析から生じた。本明細書のセクション「バイオマーカーの分類および疾患スコアの計算」中に記載する方法を用いて、測定を分析した。表１は、喫煙者および良性肺小結節から得られる「対照」サンプルから、ＮＳＣＬＣの個体から得られるサンプルを区別する際に有用であることが見出される、５９のバイオマーカーを列挙する。
【００８４】
[0102]記載するＮＳＣＬＣバイオマーカーの特定のものは、ＮＳＣＬＣを検出し、そして診断するために単独で有用であるが、本明細書に記載するのはまた、ＮＳＣＬＣバイオマーカーの多数のサブセットをグループ化する方法であって、各グループ化またはサブセット選択が、３またはそれより多いバイオマーカーのパネルとして有用であり、本明細書において交換可能に「バイオマーカー・パネル」およびパネルと称されるものである、前記方法である。したがって、本出願の多様な態様は、Ｎのバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここでＮは少なくとも２つのバイオマーカーである。他の態様において、Ｎは、２〜５９のバイオマーカーより選択される。
【００８５】
[0103]さらに他の態様において、Ｎは、２〜５、２〜１０、２〜１５、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜３５、２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、または２〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、３〜２５、３〜３０、３〜３５、３〜４０、３〜４５、３〜５０、３〜５５、または３〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、４〜５、４〜１０、４〜１５、４〜２０、４〜２５、４〜３０、４〜３５、４〜４０、４〜４５、４〜５０、４〜５５、または４〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、または５〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、６〜１０、６〜１５、６〜２０、６〜２５、６〜３０、６〜３５、６〜４０、６〜４５、６〜５０、６〜５５、または６〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、７〜１０、７〜１５、７〜２０、７〜２５、７〜３０、７〜３５、７〜４０、７〜４５、７〜５０、７〜５５、または７〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、８〜１０、８〜１５、８〜２０、８〜２５、８〜３０、８〜３５、８〜４０、８〜４５、８〜５０、８〜５５、または８〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、９〜１０、９〜１５、９〜２０、９〜２５、９〜３０、９〜３５、９〜４０、９〜４５、９〜５０、９〜５５、または９〜５９からの任意の数であるように選択される。他の態様において、Ｎは、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、または１０〜５９からの任意の数であるように選択される。Ｎは、類似の、しかしより高い桁の範囲を含むように選択可能であることが認識されるであろう。
【００８６】
[0104]１つの態様において、バイオマーカー・サブセットまたはパネルに有用なバイオマーカーの数は、バイオマーカー値の特定の組み合わせに関する感度および特異性値に基づく。用語「感度」および「特異性」は、本明細書において、個体の生物学的サンプル中で検出される１またはそれより多いバイオマーカー値に基づいて、ＮＳＣＬＣを持つまたはＮＳＣＬＣを持たないとして、個体を正しく分類する能力に関して用いられる。「感度」は、ＮＳＣＬＣを持つ個体を正しく分類することに関するバイオマーカー（単数または複数）の性能を示す。「特異性」は、ＮＳＣＬＣを持たない個体を正しく分類することに関するバイオマーカー（単数または複数）の性能を示す。例えば、対照サンプルおよびＮＳＣＬＣサンプルのセットを試験するために用いられるマーカーのパネルに関して、８５％の特異性および９０％の感度は、パネルによって、対照サンプルの８５％が対照サンプルとして正しく分類され、そしてパネルによって、ＮＳＣＬＣサンプルの９０％がＮＳＣＬＣサンプルとして正しく分類されたことを示す。望ましいまたは好ましい最小値は、実施例３に記載するように決定可能である。代表的なパネルを表４〜１１に示し、これは３〜１０のバイオマーカーの１００の異なるパネルのシリーズを示し、各パネルに関して、特異性および感度の示すレベルを有する。これらのパネル各々における各マーカーの出現総数を表１２に示す。
【００８７】
[0105]１つの側面において、ＮＳＣＬＣは、個体由来の生物学的サンプルに対するアッセイを実行して、そしてバイオマーカー、ＭＭＰ７、ＣＬＩＣ１またはＳＴＸ１Ａおよび表１中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮのさらなるバイオマーカーの少なくとも１つに各々対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出されるかまたは診断され、ここで、Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、または９に等しい。さらなる側面において、ＮＳＣＬＣは、個体由来の生物学的サンプルに対するアッセイを実行して、そしてバイオマーカー、ＭＭＰ７、ＣＬＩＣ１またはＳＴＸ１Ａおよび表１中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮのさらなるバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出されるかまたは診断され、ここで、Ｎは、１、２、３、４、５、６、または７に等しい。さらなる側面において、ＮＳＣＬＣは、個体由来の生物学的サンプルに対するアッセイを実行して、そしてバイオマーカー、ＭＭＰ７および表１中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮのさらなるバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出されるかまたは診断され、ここで、Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、または９に等しい。さらなる側面において、ＮＳＣＬＣは、個体由来の生物学的サンプルに対するアッセイを実行して、そしてバイオマーカー、ＣＬＩＣ１および表１中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮのさらなるバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出されるかまたは診断され、ここで、Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、または９に等しい。さらなる側面において、ＮＳＣＬＣは、個体由来の生物学的サンプルに対するアッセイを実行して、そしてバイオマーカー、ＳＴＸ１Ａおよび表１中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮのさらなるバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出されるかまたは診断され、ここで、Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、または９に等しい。
【００８８】
[0106]本明細書に同定されるＮＳＣＬＣバイオマーカーは、ＮＳＣＬＣを有効に検出するかまたは診断するために使用可能な、バイオマーカーのサブセットまたはパネルの比較的多数の選択に相当する。こうしたバイオマーカーの望ましい数の選択は、選択されるバイオマーカーの特定の組み合わせに応じる。ＮＳＣＬＣを検出するかまたは診断するためのバイオマーカーのパネルにはまた、表１に見られないバイオマーカーも含まれる可能性もあり、そして表１に見られないさらなるバイオマーカーを含めると、表１より選択される特定のサブセットまたはパネル中のバイオマーカーの数を減少させることも可能であることを覚えておくことが重要である。サブセットまたはパネルに用いられる表１由来のバイオマーカーの数はまた、さらなる生物医学情報を、バイオマーカー値と組み合わせて用いて、所定のアッセイに関する許容されうる感度および特異性を確立すると、減少させることも可能である。
【００８９】
[0107]バイオマーカーのサブセットまたはパネル中で用いられるバイオマーカーの数に影響を及ぼしうる別の要因は、ＮＳＣＬＣに関して診断中の個体由来の生物学的サンプルを得るために用いられる方法である。注意深く管理されたサンプル調達環境において、望ましい感度および特異性値を満たすために必要なバイオマーカーの数は、サンプル収集、取り扱いおよび保存において、より大きい変動が存在しうる状況におけるよりも低いであろう。表１に示すバイオマーカーのリストを発展させる際、多数のサンプル収集施設を利用して、分類器訓練のためのデータを収集した。これは、サンプル収集、取り扱いおよび保存における変動により感受性でないよりロバストなバイオマーカーを提供するが、また非常に類似の条件下で訓練データがすべて得られた場合よりもサブセットまたはパネル中のバイオマーカーの数をより大きくすることもまた必要としうる。
【００９０】
[0108]本出願の１つの側面は、一般的に、図１Ａおよび１Ｂを参照して表現可能である。関心対照の単数または複数の個体から生物学的サンプルが得られる。次いで、生物学的サンプルをアッセイして、関心対照の１またはそれより多い（Ｎの）バイオマーカーの存在を検出して、そして前記のＮのバイオマーカー各々に関するバイオマーカー値を決定する（図１Ｂにおいて、マーカーＲＦＵと称される）。ひとたび、バイオマーカーが検出され、そしてバイオマーカー値が割り当てられたら、本明細書に詳細に記載するように、各マーカーをスコア付けするかまたは分類する。次いで、マーカースコアを合わせて、総診断スコアを提供し、これは、サンプルを得た個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を示す。
【００９１】
[0109]本明細書において、「肺（ｌｕｎｇ）」は、交換可能に「肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）」を指しうる。
【００９２】
[0110]本明細書において、「喫煙者」は、タバコの煙の吸入歴を有する個体を指す。
【００９３】
[0111]「生物学的サンプル」、「サンプル」、および「試験サンプル」は、本明細書において、交換可能に用いられ、個体から得られたかまたは別の方式で派生した、任意の材料、生物学的液体、組織、または細胞を指す。これには、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、血漿、および血清が含まれる）、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、息、尿、精液、唾液、腹腔洗浄液、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、細胞液、腹水、胸水、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支ブラッシング、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、および脳脊髄液が含まれる。これにはまた、前述のものすべての実験的に分離された分画も含まれる。例えば、血液サンプルを、血清、血漿に、あるいは特定の血球タイプ、例えば赤血球または白血球（白血球細胞）を含有する分画に分画してもよい。望ましい場合、サンプルは、個体由来のサンプルの組み合わせ、例えば組織および液体サンプルの組み合わせであってもよい。用語「生物学的サンプル」にはまた、ホモジナイズした固形材料、例えば糞便サンプル、組織サンプル、または組織生検由来のものも含まれる。用語「生物学的サンプル」にはまた、組織培養または細胞培養由来の材料も含まれる。生物学的サンプルを得るための任意の適切な方法を使用してもよく；例示的な方法には、例えば、静脈切開術、スワブ（例えば頬側スワブ）、および細針吸引生検法が含まれる。細針吸引しやすい例示的な組織には、リンパ節、肺、肺洗浄液、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄液）、胸膜、甲状腺、乳房、膵臓および肝臓が含まれる。サンプルはまた、例えば顕微解剖（例えば、レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）またはレーザー顕微解剖（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、スメア（例えばＰＡＰスメア）、または管洗浄によって収集可能である。個体から得られるかまたは派生する「生物学的サンプル」には、個体から得られた後、任意の適切な方式でプロセシングされている任意のサンプルが含まれる。
【００９４】
[00112]さらに、多くの個体から生物学的サンプルを得て、そしてこれらをプールするか、または各個体の生物学的サンプルのアリコットをプールすることによって、生物学的サンプルを得てもよいことを理解しなければならない。プールされたサンプルは、単一個体由来のサンプルと同様に処理可能であり、そしてプールされたサンプルにおいて、癌の存在が確立されたら、各個々の生物学的サンプルを再試験して、どの個体（単数または複数）がＮＳＣＬＣを有するかを決定してもよい。
【００９５】
[0113]本明細書の目的のため、句「個体由来の生物学的サンプルに起因するデータ」は、個体の生物学的サンプルから得られるか、またはこうしたサンプルを用いて生成された何らかの型のデータを意味するよう意図される。データは、生成された後、例えば１つの測定系の単位から、別の測定系の単位に変換することによって、ある程度まで、再フォーマットされるか、改訂されるか、または数学的に改変されていることも可能であるが；データは、生物学的サンプルから得られているかまたは該サンプルを用いて生成されたと理解される。
【００９６】
[0114]「ターゲット」、「ターゲット分子」、および「分析物」は、本明細書において交換可能に用いられ、生物学的サンプル中に存在可能な、関心対照の任意の分子を指す。「関心対照の分子」には、特定の分子の任意の重大でない変動、例えばタンパク質の場合、分子の同一性を実質的に改変しない、例えば、アミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは任意の他の操作または修飾、例えば標識構成要素でのコンジュゲート化の重大でない変動が含まれる。「ターゲット分子」、「ターゲット」、または「分析物」は、分子または多分子構造の１つのタイプまたは種のコピーセットである。「ターゲット分子」、「ターゲット」、および「分析物」は、１より多いこうした分子セットを指す。例示的なターゲット分子には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、自己抗体、抗体模倣体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織、および前述の任意のものの任意の断片または部分が含まれる。
【００９７】
[0115]本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、そして非アミノ酸によって中断されていてもよい。該用語はまた、天然にまたは介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含み；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは任意の他の操作または修飾、例えば標識構成要素でのコンジュゲート化で修飾されている。定義内にやはり含まれるのは、例えば、アミノ酸の１またはそれより多い類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）、ならびに当該技術分野に知られる他の修飾を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは、単一の鎖または会合する鎖であってもよい。定義内にやはり含まれるのは、プレタンパク質および損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）成熟タンパク質；成熟タンパク質から得られるペプチドまたはポリペプチド；タンパク質の断片；スプライス変異体；タンパク質の組換え型；アミノ酸修飾、欠失、または置換を含むタンパク質変異体；ならびに翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等である。
【００９８】
[0116]本明細書において、「マーカー」および「バイオマーカー」は、交換可能に用いられ、個体における正常または異常なプロセス、あるいは個体における疾患または他の状態を示すか、あるいはこれらの徴候である、ターゲット分子を指す。より具体的には、「マーカー」または「バイオマーカー」は、正常または異常であってもよく、そして異常である場合、慢性または急性であってもよい、特定の生理学的状態またはプロセスの存在と関連する、解剖学的、生理学的、生化学的、または分子パラメータである。バイオマーカーは、実験室アッセイおよび医学的画像化法を含む、多様な方法によって、検出可能であり、そして測定可能である。バイオマーカーがタンパク質である場合、生物学的サンプルにおける対応するタンパク質バイオマーカーの量または存在または非存在の代理尺度として対応する遺伝子の発現、あるいはバイオマーカーの発現を制御するバイオマーカーまたはタンパク質をコードする遺伝子のメチル化状態を用いることも可能である。
【００９９】
[0117]本明細書において、「バイオマーカー値」、「値」、「バイオマーカーレベル」、および「レベル」は、交換可能に用いられ、生物学的サンプル中のバイオマーカーを検出するための任意の分析法を用いて行われ、そして生物学的サンプル中のバイオマーカーの、該バイオマーカーに関する、または該バイオマーカーに対応する、存在、非存在、絶対量または濃度、相対量または濃度、力価、レベル、発現レベル、測定されたレベルの比等を示す、測定値を指す。「値」または「レベル」の正確な性質は、バイオマーカーを検出するために使用される特定の分析法の特定の設計および構成要素に応じる。
【０１００】
[0118]バイオマーカーが、個体における異常なプロセスまたは疾患または他の状態を示すか、またはその徴候である場合、バイオマーカーは、一般的に、個体における正常なプロセスまたは疾患もしくは他の状態の非存在を示すかまたはこれらの徴候であるバイオマーカーの発現レベルまたは値に比較した際、過剰発現されているかまたは過少発現されているかいずれかであると記載される。「上方制御」、「上方制御された」、「過剰発現」、「過剰発現された」、およびその任意の変形は、交換可能に用いられ、健康なまたは正常な個体由来の類似の生物学的サンプル中で典型的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル（あるいは値またはレベルの範囲）より大きい、生物学的サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルを指す。該用語はまた、特定の疾患の異なる段階で検出可能なバイオマーカーの値またはレベル（あるいは値またはレベルの範囲）より大きい、生物学的サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルも指してもよい。
【０１０１】
[0119]「下方制御」、「下方制御された」、「過少発現」、「過少発現された」、およびその任意の変形は、交換可能に用いられ、健康なまたは正常な個体由来の類似の生物学的サンプル中で典型的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル（あるいは値またはレベルの範囲）より小さい、生物学的サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルを指す。該用語はまた、特定の疾患の異なる段階で検出可能なバイオマーカーの値またはレベル（あるいは値またはレベルの範囲）より小さい、生物学的サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルも指してもよい。
【０１０２】
[0120]さらに、過剰発現されたかまたは過少発現されたかいずれかであるバイオマーカーはまた、個体における正常なプロセスまたは疾患もしくは他の状態の非存在を示すかまたはその徴候であるバイオマーカーの「正常」発現レベルまたは値と比較した際、「示差的に発現された」か、または「示差的レベル」または「示差的値」を有すると称されることも可能である。したがって、バイオマーカーの「示差的発現」はまた、バイオマーカーの「正常」発現レベルからの変動と称されることも可能である。
【０１０３】
[0121]用語「示差的遺伝子発現」および「示差的発現」は交換可能に用いられ、その発現が、正常または対照被験体における発現に比較して、特定の疾患を患う被験体において、より高いレベルまたはより低いレベルに活性化されている遺伝子（またはその対応するタンパク質発現産物）を指す。該用語にはまた、その発現が、同じ疾患の異なる病期で、より高いレベルまたはより低いレベルに活性化されている遺伝子（またはその対応するタンパク質発現産物）も含まれる。示差的に発現される遺伝子が、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化されるかまたは阻害されるかいずれであってもよく、あるいは異なるポリペプチド産物を生じる選択的スプライシングに供されていてもよいこともまた理解される。こうした相違は、ｍＲＮＡレベル、表面発現、ポリペプチドの分泌または他の分配を含む、多様な変化によって証明されていてもよい。示差的遺伝子発現には、２またはそれより多い遺伝子またはその遺伝子産物間の発現の比較；あるいは２またはそれより多い遺伝子またはその遺伝子産物間の発現の比の比較；あるいはさらに、正常被験体および疾患を患う被験体の間で；または同じ疾患の多様な病期の間で異なる、同じ遺伝子の２つの異なってプロセシングされた産物の比較が含まれてもよい。示差的発現には、例えば、正常および疾患細胞間の、あるいは異なる疾患事象または病期を経た細胞間の、遺伝子またはその発現産物の一時的または細胞発現パターンの、定量的および定性的両方の相違が含まれる。
【０１０４】
[0122]本明細書において、「個体」は、試験被験体または患者を指す。個体は、哺乳動物または非哺乳動物であってもよい。多様な態様において、個体は哺乳動物である。哺乳動物個体は、ヒトまたは非ヒトであってもよい。多様な態様において、個体はヒトである。健康なまたは正常な個体は、関心対照の疾患または状態（例えば肺疾患、肺関連疾患、または他の肺状態を含む）が、慣用的な診断法では検出不能である、個体である。
【０１０５】
[0123]「診断する」、「診断すること」、「診断」、およびその変形は、個体に属する１またはそれより多い徴候、症状、データ、または他の情報に基づいて、個体の健康状態または状態の検出、決定、または認識を指す。個体の健康状態は、健康／正常と診断される（すなわち疾患または状態の非存在の診断）か、または病気／異常である（すなわち、疾患または状態の存在の診断、またはその特性の評価）と診断されることも可能である。用語「診断する」、「診断すること」、「診断」等は、特定の疾患または状態に関して、疾患の最初の検出；疾患の性質決定または分類；疾患の進行、寛解、または再発の検出；ならびに個体への治療または療法投与後の疾患反応の検出を含む。ＮＳＣＬＣの診断には、癌を持たない個体から癌を持つ個体を区別する工程が含まれる。ＮＳＣＬＣから、喫煙者および良性肺小結節を区別する工程がさらに含まれる。
【０１０６】
[0124]「予後診断する」、「予後診断すること」、「予後」、およびその変形は、疾患または状態を有する個体における、疾患または状態の将来の経過の予測（例えば患者生存を予測する）を指し、そしてこうした用語は、個体に対する治療または療法投与後の疾患反応の評価を含む。
【０１０７】
[0125]「評価する」、「評価すること」、「評価」、およびその変形は、「診断する」および「予後診断する」の両方を含み、そしてまた、疾患を持たない個体における疾患または状態の将来の経過に関する決定または予測、ならびに見かけ上、疾患が治癒している個体において、疾患または状態が再発するであろう尤度に関する決定または予測も含む。用語「評価する」はまた、療法に対する個体の反応を評価し、例えば個体が療法剤に好ましく反応する可能性が高いか、または療法剤に反応する可能性が低いか（あるいは、例えば毒性または他の望ましくない副作用を経験するか）を予測し、個体に投与する療法剤を選択し、あるいは個体に投与されている療法に対する個体の反応を監視するかまたは予測することも含む。したがって、ＮＳＣＬＣを「評価すること」には、例えば以下：個体におけるＮＳＣＬＣの将来の経過を予後診断するか；見かけ上、ＮＳＣＬＣが治癒している個体において、ＮＳＣＬＣの再発を予測するか；あるいはＮＳＣＬＣ治療に対する個体の反応を決定するかまたは予測するか、または個体の生物学的サンプルから得られるバイオマーカー値の決定に基づいて、個体に投与するＮＳＣＬＣ治療を選択することのいずれかが含まれてもよい。
【０１０８】
[0126]以下の例のいずれかをＮＳＣＬＣを「診断している」かまたは「評価している」かいずれかと称することも可能である：まず、ＮＳＣＬＣの存在または非存在を検出する；ＮＳＣＬＣの特定の病期、タイプまたはサブタイプ、あるいは他の分類または特性を決定する；疑わしい肺小結節または塊が良性または悪性ＮＳＣＬＣであるかどうかを決定する；あるいはＮＳＣＬＣ進行（例えば腫瘍増殖または転移伝播を監視する）、寛解、または再発を検出する／監視する。
【０１０９】
[0127]本明細書において、「さらなる生物医学的情報」は、本明細書に記載するバイオマーカーのいずれかを用いる以外の、癌リスク、またはより具体的にはＮＳＣＬＣリスクと関連する、個体の１またはそれより多い評価を指す。「さらなる生物医学的情報」には、以下のいずれかが含まれる：個体の物理的記述因子、ＣＴ画像化によって観察される肺小結節の物理的記述因子、個体の身長および／または体重、個体の性別、個体の民族性、喫煙歴、職歴、既知の発癌性物質（例えばアスベスト、ラドンガス、化学薬品、火事の煙、および不動のまたは可動性の供給源からの放出物、例えば産業／工場または自動車／船舶／飛行機放出物を含みうる空気汚染いずれかに対する曝露）、受動喫煙への曝露、ＮＳＣＬＣ（または他の癌）の家族歴、肺小結節の存在、小結節のサイズ、小結節の位置、小結節の形態（例えばＣＴ画像化、磨りガラス陰影（ＧＧＯ）、固形、非固形を通じて観察されるようなもの）、小結節の境界特性（例えば平滑、分葉化、尖ってそして平滑、針骨状、浸潤）等。喫煙歴は、通常、「パック年」の単位で定量化され、これは、１日あたり喫煙するパックの平均数に、ヒトが喫煙してきた年数を乗じた数を指す。例えば、１日あたり平均１パックのタバコを３５年間、喫煙してきたヒトは、喫煙歴３５パック年を有すると称される。当該技術分野に知られるルーチンの技術を用いて、個体から、例えばルーチンの患者アンケートまたは健康歴アンケート等の使用によって個体自身から、または医師からなどで、さらなる生物医学的情報を得てもよい。あるいは、ＣＴ画像化（例えば低線量ＣＴ画像化）およびＸ線を含む、ルーチンの画像化技術から、さらなる生物医学的情報を得てもよい。任意のさらなる生物医学的情報の評価と組み合わせて、バイオマーカーレベルを試験すると、バイオマーカー試験のみまたはさらなる生物医学的情報の特定の任意の項目のみ（例えばＣＴ画像化のみ）を評価するのに比較して、例えば、感度、特異性、および／またはＮＳＣＬＣを検出するためのＡＵＣ（または他のＮＳＣＬＣ関連使用）が改善されうる。
【０１１０】
[0128]用語「曲線下面積」または「ＡＵＣ」は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下の面積を指し、これらはどちらも当該技術分野に周知である。ＡＵＣ測定値は、全データ範囲に渡る、分類器の正確性を比較するために有用である。より大きいＡＵＣを有する分類器は、関心対照の２つの群（例えばＮＳＣＬＣサンプルおよび正常または対照サンプル）の間で、未知のものを正しく分類する、より高い能力を有する。ＲＯＣ曲線は、２つの集団（例えばＮＳＣＬＣを有する症例およびＮＳＣＬＣを持たない対照）の間を区別する際、特定の特徴（例えば本明細書記載の任意のバイオマーカーおよび／またはさらなる生物医学情報の任意の項目）の性能をプロットするために有用である。典型的には、全集団（例えば症例および対照）に渡る特徴データを、単一の特徴の値に基づいて、昇順でソートする。次いで、その特徴に関する各値に関して、データに関する真の陽性率および偽陽性率を計算する。その特徴に関する値を超える症例の数を数え、そして次いで、症例総数で割ることによって、真の陽性率を決定する。その特徴に関する値を超える対照の数を数え、そして次いで、対照総数で割ることによって、偽陽性率を決定する。この定義は、対照に比較して、症例において、特徴が上昇しているシナリオを指すが、この定義はまた、対照に比較して、症例において、特徴がより低いシナリオにも当てはまる（こうしたシナリオの場合、その特徴に関する値より低いサンプルを数えるであろう）。単一の特徴に関して、ならびに他の単一の出力に関してＲＯＣ曲線を生成してもよく、例えば２またはそれより多い特徴の組み合わせを数学的に組み合わせて（例えば付加する、減じる、乗じる等）、単一の合計値を提供し、そしてこの単一の合計値をＲＯＣ曲線中にプロットしてもよい。さらに、組み合わせが単一の出力値を導く、多数の特徴の任意の組み合わせを、ＲＯＣ曲線中にプロットしてもよい。これらの特徴の組み合わせは、試験を含んでもよい。ＲＯＣ曲線は、試験の偽陽性率（１−特異性）に対する、試験の真の陽性率（感度）のプロットである。
【０１１１】
[0129]本明細書において、バイオマーカー値に関して「検出すること」または「決定すること」には、バイオマーカー値に対応するシグナルを観察し、そして記録するのに必要な装置、ならびにそのシグナルを生成するのに必要な材料（単数または複数）の両方の使用が含まれる。多様な態様において、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面音波、質量分析、赤外分光、ラマン分光、原子間力顕微鏡、走査トンネル顕微鏡、電気化学検出法、核磁気共鳴、量子ドット等の任意の適切な方法を用いて、バイオマーカー値を検出する。
【０１１２】
[0130]「固体支持体」は、本明細書において、分子が直接または間接的に、共有または非共有結合いずれかを通じて付着可能な表面を有する、任意の支持体を指す。「固体支持体」は、多様な物理的形式を有してもよく、これには、例えば、膜；チップ（例えばタンパク質チップ）；スライド（例えばガラススライドまたはカバーガラス）；カラム；空洞、固形、半固形、孔または空洞含有粒子、例えばビーズなど；ゲル；光ファイバー材料を含むファイバー；マトリックス；およびサンプルレセプタクルが含まれてもよい。例示的なサンプルレセプタクルには、サンプルウェル、チューブ、キャピラリー、バイアル、およびサンプルを保持することが可能な任意の他の容器、溝または刻み目が含まれる。サンプルレセプタクルは、マルチサンプルプラットフォーム、例えばマイクロタイタープレート、スライド、微量流体デバイス等の上に含有されてもよい。支持体は天然または合成材料、有機または無機材料で構成されてもよい。捕捉試薬が付着する固体支持体の組成は、一般的に、付着法（例えば共有付着）に応じる。他の例示的なレセプタクルには、微液滴および微量流体制御またはバルク油／水性エマルジョンが含まれ、その中でアッセイおよび関連操作を実行可能である。適切な固体支持体には、例えば、プラスチック、樹脂、多糖、シリカまたはシリカに基づく材料、官能化ガラス、変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、膜、ナイロン、天然繊維（例えば絹、羊毛および綿）、ポリマー等が含まれる。固体支持体を構成する材料には、捕捉試薬の付着に用いられる、反応性基、例えばカルボキシ、アミノ、またはヒドロキシル基が含まれてもよい。ポリマー性固体支持体には、例えばポリスチレン、ポリエチレングリコールテレフタレート、酢酸ポリビニル、塩化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、およびポリメチルペンテンが含まれてもよい。使用可能な適切な固体支持体粒子には、例えばコード化粒子、例えばＬｕｍｉｎｅｘ型コード化粒子、磁気粒子、およびガラス粒子が含まれる。
【０１１３】
バイオマーカーの例示的使用
[0131]多様な例示的態様において、個体の循環中、例えば血清または血漿中に存在する１またはそれより多いバイオマーカーに対応する１またはそれより多いバイオマーカー値を、本明細書記載の任意の分析法を含む任意の数の分析法によって検出することによって、個体において、ＮＳＣＬＣを診断するための方法を提供する。これらのバイオマーカーは、例えば、ＮＳＣＬＣを持たない個体に比較した際、ＮＳＣＬＣを持つ個体において示差的に発現される。個体におけるバイオマーカーの示差的発現の検出を用いて、例えば、ＮＳＣＬＣの初期診断を可能にし、良性および悪性肺小結節（例えばコンピュータ断層（ＣＴ）スキャン上で観察される小結節）の間を区別し、ＮＳＣＬＣ再発を監視することも可能であるし、または他の臨床的徴候のために用いることも可能である。
【０１１４】
[0132]本明細書記載の任意のバイオマーカーを、ＮＳＣＬＣに関する多様な臨床的適応において用いてもよく、以下のいずれも含まれる：ＮＳＣＬＣの検出（例えば高リスク個体または集団において）；例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の間の、および／または腺癌および扁平細胞癌の間の区別（またはそうでなければ組織病理学の促進）による、ＮＳＣＬＣの性質決定（例えばＮＳＣＬＣタイプ、サブタイプ、または病期の決定）；肺小結節が良性小結節または悪性肺腫瘍であるかの決定；ＮＳＣＬＣ予後の決定；ＮＳＣＬＣ進行または寛解の監視；ＮＳＣＬＣ再発に関する監視；転移の監視；治療選択；療法剤または他の治療に対する反応の監視；コンピュータ断層（ＣＴ）スクリーニングに関する個体の階層化（例えばＮＳＣＬＣのリスクがより高く、そしてしたがってスパイラルＣＴスクリーニングから利益を得る可能性が最も高く、したがってＣＴの陽性予測値を増加させる個体の同定）；さらなる生物医学的情報、例えば喫煙歴等、または小結節サイズ、形態等とのバイオマーカー試験の組み合わせ（ＣＴ試験またはバイオマーカー試験のみに比較して、アッセイに、診断性能増加を提供するようなもの）；肺小結節の悪性または良性としての診断の容易化；ＣＴ上で肺小結節が観察された際の臨床的決定の容易化（例えば、小結節が低リスクであると判断される場合、例えばバイオマーカーに基づく試験が陰性である場合、小結節のサイズのカテゴリー化を伴いまたは伴わずに、ＣＴスキャンの反復を命じるか、あるいは小結節が中程度から高リスクと判断される場合、例えばバイオマーカーに基づく試験が陽性である場合、小結節のサイズのカテゴリー化を伴いまたは伴わずに、生検を考慮する）；および臨床追跡調査に関する決定の容易化（例えば、ＣＴ上で非石灰化小結節が観察された後、反復ＣＴスキャン、細針生検、小結節切除または開胸術を実行するかどうか）。バイオマーカー試験は、高リスク個体のＣＴまたは胸部Ｘ線スクリーニング単独よりも、陽性予測値（ＰＰＶ）を改善させうる。ＣＴスクリーニングとの組み合わせにおいて有用であるのに加え、本明細書記載のバイオマーカーはまた、ＮＳＣＬＣに関して用いられる任意の他の画像化様式、例えば胸部Ｘ線、気管支鏡または蛍光気管支鏡、ＭＲＩまたはＰＥＴスキャンと組み合わせても使用可能である。さらに、記載されるバイオマーカーはまた、ＮＳＣＬＣ徴候が、画像化様式または他の臨床的関連物によって検出されるより前に、あるいは症状が現れるより前に、これらの特定の使用を可能にするのにも有用でありうる。これにはさらに、ＣＴスキャンで同定された不確定の肺小結節を持つ個体の区別、ＮＳＣＬＣに関する高リスク喫煙者のスクリーニング、およびＮＳＣＬＣを持つ個体の診断が含まれる。
【０１１５】
[0133]本明細書記載の任意のバイオマーカーを用いて、ＮＳＣＬＣを診断することが可能な方式の例として、ＮＳＣＬＣを持たないことが知られる個体において、記載されるバイオマーカーの１またはそれより多くの示差的発現は、個体がＮＳＣＬＣを有することを示す可能性があり、それによって、治療が最も有効である疾患の初期に、おそらく、他の手段によってＮＳＣＬＣが検出される前に、または症状が現れる前に、ＮＳＣＬＣの検出を可能にする。ＮＳＣＬＣの経過中のバイオマーカーの１つまたはそれより多くの過剰発現は、ＮＳＣＬＣ進行の指標である可能性もあり、例えば、ＮＳＣＬＣ腫瘍が増殖しており、そして／または転移しており（そしてしたがって劣った予後を示し）、一方、バイオマーカーの１つまたはそれより多くが示差的に発現される度合いが減少していれば（すなわち続くバイオマーカー試験において、個体における発現レベルが「正常」発現レベルに向かって移動するかまたは近づきつつある）、ＮＳＣＬＣ寛解の指標である可能性もあり、例えばＮＳＣＬＣ腫瘍は退縮している（そしてしたがって優れたまたはよりよい予後を示す）。同様に、ＮＳＣＬＣ治療の経過中、バイオマーカーの１つまたはそれより多くが示差的に発現される度合いが増加していれば（すなわち続くバイオマーカー試験において、個体における発現レベルが「正常」発現レベルから離れて移動している）、ＮＳＣＬＣが進行していることを示す可能性もあり、そしてしたがって、治療が無効であることを示す可能性もある一方、ＮＳＣＬＣ治療の経過中、バイオマーカーの１つまたはそれより多くの示差的発現が減少していれば、ＮＳＣＬＣ寛解を示す可能性もあり、そしてしたがって、治療が成功裡に働いていることを示す可能性もある。さらに、個体が見かけ上、ＮＳＣＬＣから治癒した後のバイオマーカーの１つまたはそれより多くの示差的発現の増加または減少は、ＮＳＣＬＣ再発の指標である可能性もある。こうした状況では、例えば、個体は、ＮＳＣＬＣの再発が後になるまで検出されなかった場合よりもより早い段階で、療法（または、個体が療法を維持している場合は、投薬量および／または頻度を増加させるように修飾された療法措置）を再開することも可能である。さらに、個体におけるバイオマーカーの１またはそれより多くの示差的発現レベルは、特定の療法剤に対する個体の反応を予測する可能性もある。ＮＳＣＬＣ再発または進行を監視する際、バイオマーカー発現レベルの変化は、例えばＮＳＣＬＣ活性を決定するか、または治療の変化に関する必要性を決定するために、画像化を反復する（例えばＣＴスキャンを反復する）必要性を示す可能性もある。
【０１１６】
[0134]本明細書記載の任意のバイオマーカーの検出は、ＮＳＣＬＣ治療の後に、または該治療と組み合わせて、例えば治療の成功を評価するか、あるいは治療後のＮＳＣＬＣ寛解、再発、および／または進行（転移を含む）を監視するのに特に有用である可能性もある。ＮＳＣＬＣ治療には、例えば、個体への療法剤の投与、手術の性能（例えば、ＮＳＣＬＣ腫瘍の少なくとも一部の外科的切除、またはＮＳＣＬＣおよび周囲組織の除去）、放射線療法の投与、または当該技術分野で用いられる任意の他のタイプのＮＳＣＬＣ治療、およびこれらの治療の任意の組み合わせが含まれうる。肺癌治療には、例えば、個体への療法剤の投与、手術の性能（例えば肺腫瘍の少なくとも一部の外科的切除）、放射線療法の投与、または当該技術分野に用いられるＮＳＣＬＣ治療の任意の他のタイプ、およびこれらの治療の任意の組み合わせが含まれうる。例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、遺伝子発現を阻害する合成二本鎖ＲＮＡ分子であり、そしてターゲット化肺癌療法剤として作用しうる。例えば、バイオマーカーのいずれかを、治療後、少なくとも１回検出してもよいし、または治療後、多数回（例えば定期的間隔で）検出してもよいし、または治療の前および後の両方で検出してもよい。長期に渡る個体のバイオマーカーいずれかの示差的発現レベルは、ＮＳＣＬＣ進行、寛解、または再発の指標である可能性もあり、その例には、以下の任意のものが含まれる：治療前のバイオマーカーの発現レベルと比較した、治療後のバイオマーカーの発現レベルの増加または減少；治療後のより早期の時点でのバイオマーカーの発現レベルと比較した、治療後のより後期の時点でのバイオマーカーの発現レベルの増加または減少；ならびにバイオマーカーの正常レベルと比較した、治療後の単一の時点でのバイオマーカーの示差的発現レベル。
【０１１７】
[0135]特定の例として、本明細書記載の任意のバイオマーカーのバイオマーカーレベルを、術前および術後（例えば手術の２〜１６週間後）血清または血漿サンプルにおいて、決定してもよい。術前サンプルと比較した、術後サンプルにおけるバイオマーカー発現レベル（単数または複数）の増加は、ＮＳＣＬＣの進行（例えば手術失敗）を示す可能性があり、一方、術前サンプルと比較した、術後サンプルにおけるバイオマーカー発現レベル（単数または複数）の減少は、ＮＳＣＬＣの退行（例えば手術が肺腫瘍を成功裡に除去した）を示す可能性がある。他の型の治療の前および後に、例えば放射線療法あるいは療法剤または癌ワクチンの投与の前および後に、バイオマーカーレベルの同様の分析を行ってもよい。
【０１１８】
[0136]単独型診断試験としてのバイオマーカーレベルの試験に加えて、バイオマーカーレベルはまた、疾患の感受性リスク増加の指標であるＳＮＰまたは他の遺伝的欠損または変動の決定と組み合わせて行ってもよい（例えばＡｍｏｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４０，  ６１６−６２２（２００９）を参照されたい）。
【０１１９】
[0137]単独診断試験としてのバイオマーカーレベルの試験に加えて、また、バイオマーカーレベルを、放射線スクリーニング、例えばＣＴスクリーニングと組み合わせて行ってもよい。例えば、バイオマーカーは、例えばＮＳＣＬＣのリスクがある大きな無症候性集団（例えば喫煙者）のスクリーニングのため、ＣＴスクリーニングを実行するための医学的および経済学的正当化を容易にしうる。例えばバイオマーカーレベルの「プレＣＴ」試験を用いて、ＣＴスクリーニングに関して、例えばバイオマーカーレベルに基づいて、ＮＳＣＬＣに関して最高のリスクにあり、そしてＣＴスクリーニングに関して優先させるべきである個体を同定するため、高リスク個体を階層化することも可能である。ＣＴ試験を実行する場合、１またはそれより多いバイオマーカーのバイオマーカーレベル（例えば血清または血漿サンプルのアプタマーアッセイによって決定されるようなもの）を測定し、そしてさらなる生物医学的情報（例えばＣＴ試験によって決定される腫瘍パラメータ）と組み合わせて、診断スコアを評価して、ＣＴまたはバイオマーカー試験のみの場合よりも、陽性予測値（ＰＰＶ）を増進させることも可能である。バイオマーカーレベルを決定するための「ポストＣＴ」アプタマーパネルを用いて、ＣＴ（または他の画像化様式）によって観察される肺小結節が悪性または良性である尤度を決定することも可能である。
【０１２０】
[0138]本明細書記載の任意のバイオマーカーの検出は、ポストＣＴ試験に有用でありうる。例えば、バイオマーカー試験は、ＣＴのみよりも、偽陽性試験のかなりの数を除去するかまたは減少させることも可能である。さらに、バイオマーカー試験は、患者の治療を促進しうる。例えば、肺小結節サイズが５ｍｍ未満である場合、バイオマーカー試験の結果は、患者が「じっと成り行きを見守る（ｗａｔｃｈ  ａｎｄ  ｗａｉｔ）」状態から生検へと、より早期に進行することを可能にし；肺小結節が５〜９ｍｍである場合、バイオマーカー試験は、偽陽性スキャンに対する生検または開胸術の使用を排除することも可能であり；そして肺小結節が１０ｍｍより大きい場合、バイオマーカー試験は、良性小結節を持つこれら患者の下位集団に関して手術を排除することも可能である。バイオマーカー試験に基づいて、ある程度の患者において、生検の必要性を排除することは、小結節生検に関連するかなりの死亡率があり、そして小結節の位置次第で、小結節組織を得ることが困難であるため、有益であろう。同様に、ある患者、例えば小結節が実際に良性である患者において、手術の必要性を排除することは、手術に関連する不必要なリスクおよびコストを回避するであろう。
【０１２１】
[0139]高リスク個体において、放射線スクリーニングと組み合わせてバイオマーカーレベルを試験することに加えて（例えば画像化スキャン上で観察される肺小結節または塊のサイズまたは他の特性と組み合わせて、バイオマーカーレベルを評価すること）、バイオマーカーに関する情報を、他のタイプのデータ、特にＮＳＣＬＣに関する個体のリスクを示すデータ（例えば患者臨床歴、職業上の曝露歴、症状、癌の家族歴、個体が喫煙者かどうかなどのリスク要因、および／または他のバイオマーカーの状態等）と組み合わせて評価してもよい。これらの多様なデータを自動化法、例えばコンピュータまたは他の装置／デバイスで具体化可能なコンピュータプログラム／ソフトウェアによって評価してもよい。
【０１２２】
[0140]記載する任意のバイオマーカーはまた、画像化試験においても使用可能である。例えば、画像化剤を、記載する任意のバイオマーカーとカップリングして、これを用いて、とりわけ、ＮＳＣＬＣ診断を補助し、進行／寛解または転移を監視し、疾患再発を監視し、または療法に対する反応を監視してもよい。
【０１２３】
バイオマーカーおよびバイオマーカー値の検出および決定
[0141]多様な既知の任意の分析法を用いて、本明細書記載のバイオマーカーに関するバイオマーカー値を検出することも可能である。１つの態様において、捕捉試薬を用いて、バイオマーカー値を検出する。本明細書において、「捕捉剤」または「捕捉試薬」は、バイオマーカーに特異的に結合可能な分子を指す。多様な態様において、捕捉試薬を溶液中のバイオマーカーに曝露してもよいし、または捕捉試薬を固体支持体に固定する一方、バイオマーカーに曝露してもよい。他の態様において、捕捉試薬は、固体支持体上の第二の特徴と反応性である特徴を含有する。これらの態様において、捕捉試薬を溶液中のバイオマーカーに曝露し、そして次いで、捕捉試薬上の特徴を固体支持体上の第二の特徴と組み合わせて用いて、固体支持体上にバイオマーカーを固定してもよい。捕捉試薬は、行おうとする分析のタイプに基づいて選択される。捕捉試薬には、限定されるわけではないが、アプタマー、抗体、抗原、アドネクチン、アンキリン、他の抗体模倣体および他のタンパク質骨格、自己抗体、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片、核酸、レクチン、リガンド結合性受容体、アフィボディ、ナノボディ、インプリンティングされたポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、および合成受容体、ならびにこれらの修飾物および断片が含まれる。
【０１２４】
[0142]いくつかの態様において、バイオマーカー／捕捉試薬複合体を用いて、バイオマーカー値を検出する。
【０１２５】
[0143]他の態様において、バイオマーカー値は、バイオマーカー／捕捉試薬複合体に由来し、そして間接的に、例えばバイオマーカー／捕捉試薬相互作用に続く反応の結果として検出されるが、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の形成に依存する。
【０１２６】
[0144]いくつかの態様において、生物学的サンプル中のバイオマーカーから、バイオマーカー値を直接検出する。
【０１２７】
[0145]１つの態様において、生物学的サンプル中の２またはそれより多いバイオマーカーの同時検出を可能にする多重化形式を用いて、バイオマーカーを検出する。多重化形式の１つの態様において、直接または間接的に、共有または非共有的に、固体支持体の別個の位置に、捕捉試薬を固定する。別の態様において、多重化形式は、別個の固体支持体を用い、ここで、各固体支持体は、その固体支持体、例えば量子ドットと会合するユニークな捕捉試薬を有する。別の態様において、生物学的サンプル中の検出しようとする多数のバイオマーカーの各々１つの検出のため、個々のデバイスを用いる。生物学的サンプル中の各バイオマーカーが、同時にプロセシングされることを可能にするように、個々のデバイスを構成することが可能である。例えば、プレート中の各ウェルが、生物学的サンプル中の検出しようとする多数のバイオマーカーの１つをユニークに分析するように用いられるように、マイクロタイタープレートを使用可能である。
【０１２８】
[0146]１つまたはそれより多い前述の態様において、蛍光タグを用いて、バイオマーカー／捕捉複合体の構成要素を標識して、バイオマーカー値の検出を可能にすることも可能である。多様な態様において、既知の技術を用いて、蛍光標識を、本明細書記載の任意のバイオマーカーに特異的な捕捉試薬にコンジュゲート化して、そして次いで、蛍光標識を用いて、対応するバイオマーカーを検出してもよい。適切な蛍光標識には、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ−３、Ｑドット６０５、リサミン、フィコエリトリン、テキサスレッド、および他のこうした化合物が含まれる。
【０１２９】
[0147]１つの態様において、蛍光標識は蛍光色素分子である。いくつかの態様において、蛍光色素分子には、少なくとも１つの置換インドリウム環系が含まれ、ここで、インドリウム環の３炭素上の置換基は、化学的反応基またはコンジュゲート化物質を含有する。いくつかの態様において、色素分子には、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ７００が含まれる。他の態様において、色素分子には、色素分子の第一のタイプおよび第二のタイプ、例えば２つの異なるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ分子が含まれる。他の態様において、色素分子には、色素分子の第一のタイプおよび第二のタイプが含まれ、そして２つの色素分子は異なる発光スペクトルを有する。
【０１３０】
[0148]広範囲のアッセイ形式と適合する多様な計測手段を用いて、蛍光を測定してもよい。例えば、分光蛍光光度計は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、プリントアレイ、キュベット等を分析するように設計されてきている。例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｌａｋｏｗｉｃｚ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＋  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，  Ｉｎｃ．，  ２００４を参照されたい。Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ＆  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ＆  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｅ．  ＳｔａｎｌｅｙおよびＬａｒｒｙ  Ｊ．  Ｋｒｉｃｋａ監修，  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００２を参照されたい。
【０１３１】
[0149]前述の態様の１またはそれより多くにおいて、場合によって化学発光タグを用いて、バイオマーカー／捕捉複合体の構成要素を標識して、バイオマーカー値の検出を可能にしてもよい。適切な化学発光物質には、塩化オキサリル、ローダミン６Ｇ、Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３２＋、ＴＭＡＥ（テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン）のいずれかが含まれる。ピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）、ルシゲニン、ペルオキシオキサレート、シュウ酸アリール、アクリジニウムエステル、ジオセタン、およびその他のいずれかが含まれる。
【０１３２】
[0150]さらに他の態様において、検出法には、バイオマーカー値に対応する、検出可能シグナルを生成する、酵素／基質の組み合わせが含まれる。一般的に、酵素は、分光光度測定、蛍光、および化学発光を含む、多様な技術を用いて、測定可能な発色原基質の化学的改変を触媒する。適切な酵素には、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ユリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が含まれる。
【０１３３】
[0151]さらに他の態様において、検出法は、測定可能シグナルを生じる、蛍光、化学発光、放射性核種または酵素／基質の組み合わせの組み合わせであってもよい。多様式シグナル伝達は、バイオマーカーアッセイ形式で、ユニークでそして好適な特性を有しうる。
【０１３４】
[0152]より具体的には、以下に詳述するような、単一化アプタマーアッセイ、多重化アプタマーアッセイ、単一化または多重化イムノアッセイ、ｍＲＮＡ発現プロファイリング、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、質量分析、組織学的／細胞学的方法等を含む、既知の分析法を用いて、本明細書記載のバイオマーカーに関するバイオマーカー値を検出してもよい。
【０１３５】
アプタマーに基づくアッセイを用いたバイオマーカー値の決定
[0153]生物学的サンプルおよび他のサンプルにおける生理学的に重要な分子の検出および定量化に向けられたアッセイは、科学的研究および医療分野で重要なツールである。こうしたアッセイの１つのクラスは、固体支持体上に固定された１またはそれより多いアプタマーを含む、マイクロアレイの使用を伴う。アプタマーは、各々、非常に特異的な方式で、そして非常に高いアフィニティで、ターゲット分子に結合可能である。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、表題「核酸リガンド」を参照されたい；また、例えば、各々「核酸リガンド診断バイオチップ」と題される米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、および米国特許第６，５０３，７１５号を参照されたい。ひとたび、マイクロアレイをサンプルと接触させると、アプタマーが、サンプル中に存在するそれぞれのターゲット分子に結合し、そしてそれによって、バイオマーカーに対応するバイオマーカー値の決定が可能になる。
【０１３６】
[0154]本明細書において、「アプタマー」は、ターゲット分子に対する特異的結合アフィニティを有する核酸を指す。アフィニティ相互作用は、程度の問題であることが認識される；しかし、この文脈では、アプタマーのそのターゲットに対する「特異的結合アフィニティ」は、アプタマーが、試験サンプル中の他の構成要素に結合するよりも、はるかに高い度合いのアフィニティで、そのターゲット一般に結合することを意味する。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つのタイプまたは種のコピーセットである。アプタマーには、任意の適切な数のヌクレオチドが含まれ、任意の数の化学的修飾ヌクレオチドが含まれる。「（複数の）アプタマー」は、こうした分子セットの１より多くを指す。異なるアプタマーは、同じまたは異なる数のヌクレオチドのいずれを有してもよい。アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたは化学的修飾核酸であってもよく、そして一本鎖、二本鎖であってもよく、または二本鎖領域を含有してもよく、そしてより高次の構造を含んでもよい。アプタマーはまた光アプタマーであってもよく、この場合、光反応性または化学的反応性官能基がアプタマーに含まれて、対応するターゲットに共有結合されることを可能にする。本明細書に開示する任意のアプタマー法には、同じターゲット分子に特異的に結合する２またはそれより多いアプタマーの使用が含まれうる。さらに以下に記載するように、アプタマーにはタグが含まれてもよい。アプタマーにタグが含まれる場合、すべてのコピーのアプタマーが同じタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーが各々タグを含む場合、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれを有してもよい。
【０１３７】
[0155]ＳＥＬＥＸプロセスを含む任意の既知の方法を用いて、アプタマーを同定してもよい。ひとたび同定されたら、化学合成法および酵素合成法を含む任意の既知の方法にしたがって、アプタマーを調製するかまたは合成してもよい。
【０１３８】
[0156]本明細書において、「ＳＯＭＡｍｅｒ」または緩慢解離速度修飾アプタマー（Ｓｌｏｗ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｐｔａｍｅｒ）は、改善された解離速度特性を有するアプタマーを指す。ＳＯＭＡｍｅｒは、米国公報第２００９／０００４６６７号、表題「改善された解離速度を持つアプタマーを生成するための方法」に記載される改善されたＳＥＬＥＸ法を用いて生成可能である。
【０１３９】
[0157]用語「ＳＥＬＥＸ」および「ＳＥＬＥＸプロセス」は、本明細書において交換可能に用いられ、一般的に、（１）望ましい方式で、ターゲット分子と相互作用する、例えばタンパク質に高アフィニティで結合する、アプタマーの選択と、（２）これらの選択された核酸の増幅の組み合わせを指す。ＳＥＬＥＸプロセスを用いて、特定のターゲットまたはバイオマーカーに対して高いアフィニティを持つアプタマーを同定することも可能である。
【０１４０】
[0158]ＳＥＬＥＸには、一般的に、核酸の候補混合物を調製し、候補混合物を所望のターゲット分子に結合させて、アフィニティ複合体を形成し、アフィニティ複合体を未結合候補核酸から分離し、アフィニティ複合体から核酸を分離し、そして単離し、核酸を精製し、そして特異的アプタマー配列を同定する工程が含まれる。プロセスには、選択されたアプタマーのアフィニティをさらに洗練させるため、多数の周期が含まれてもよい。プロセスには、プロセスの１またはそれより多い時点で、増幅工程が含まれてもよい。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、表題「核酸リガンド」を参照されたい。ＳＥＬＥＸプロセスを用いて、ターゲットに共有結合するアプタマー、ならびにターゲットに非共有結合するアプタマーを生成することも可能である。例えば、米国特許第５，７０５，３３７号、表題「指数関数的濃縮による核酸リガンドの体系的進化：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ」を参照されたい。
【０１４１】
[0159]ＳＥＬＥＸプロセスを用いて、例えば改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性または改善された送達特性などの改善された特性をアプタマーに与える、修飾ヌクレオチドを含有する高アフィニティアプタマーを同定することも可能である。こうした修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基位での化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸプロセスが同定する修飾ヌクレオチド含有アプタマーは、米国特許第５，６６０，９８５号、表題「修飾ヌクレオチドを含有する高アフィニティ核酸リガンド」に記載され、これは、ピリミジンの５’および２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許第５，５８０，７３７号、上記は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１またはそれより多いヌクレオチドを含有する非常に特異的なアプタマーを記載する。また、拡張された物理的および化学的特性を有する核酸ライブラリ、ならびにＳＥＬＥＸおよびｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸにおけるその使用を記載する、米国特許出願公報２００９／００９８５４９、表題「ＳＥＬＥＸおよびＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」も参照されたい。
【０１４２】
[0160]ＳＥＬＥＸを用いて、望ましい解離速度特性を有するアプタマーを同定することも可能である。ターゲット分子に結合可能なアプタマーを生成するための改善されたＳＥＬＥＸ法を記載する米国特許出願公報２００９／０００４６６７、表題「改善された解離速度を持つアプタマーを生成するための方法」を参照されたい。それぞれのターゲット分子からより緩慢な解離速度を有するアプタマーおよび光アプタマーを産生するための方法が記載される。該方法は、候補混合物をターゲット分子と接触させ、核酸−ターゲット複合体の形成が起こるのを可能にし、そして迅速な解離速度を持つ核酸−ターゲット複合体が解離し、そして再形成されない一方、緩慢な解離速度を持つ複合体が損なわれないまま残るような、緩慢解離速度濃縮プロセスを実行する工程が含まれる。さらに、該方法には、改善された解離速度性能を持つアプタマーを生成するための、候補核酸混合物産生における修飾ヌクレオチドの使用が含まれる。
【０１４３】
[0161]このアッセイの変形は、ターゲット分子に、アプタマーが共有結合するかまたは「光架橋される」ことを可能にする、光反応性官能基を含むアプタマーを使用する。例えば、米国特許第６，５４４，７７６号、表題「核酸リガンド診断バイオチップ」を参照されたい。これらの光反応性アプタマーはまた、光アプタマーとも称される。例えば、各々「指数関数的濃縮による核酸リガンドの体系的進化：核酸リガンドおよび溶液ＳＥＬＥＸの光選択」と題される、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、および米国特許第６，２９１，１８４号を参照されたい；また、例えば米国特許第６，４５８，５３９号、表題「核酸リガンドの光選択」も参照されたい。マイクロアレイをサンプルと接触させ、そして光アプタマーがターゲット分子に結合する機会を有した後、光アプタマーを光活性化し、そして固体支持体を洗浄して、いかなる非特異的結合分子も除去するよう、固体支持体を洗浄する。厳しい洗浄条件を用いてもよく、これは光アプタマーに結合したターゲット分子は、光アプタマー上の光活性化官能基（単数または複数）によって生成される共有結合により、一般的に、除去されないためである。この方式で、アッセイは、試験サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値の検出を可能にする。
【０１４４】
[0162]これらのアッセイ形式の両方において、アプタマーをサンプルと接触させる前に、固体支持体上に固定する。しかし、特定の状況下では、サンプルとの接触前のアプタマーの固定は、最適なアッセイを提供しない可能性もある。例えば、アプタマーの前固定は、固体支持体表面でのターゲット分子とアプタマーの非効率的な混合を生じ、おそらく長い反応時間を導き、そしてしたがって、ターゲット分子へのアプタマーの効率的な結合を可能にするには、インキュベーション期間を延長させる可能性がある。さらに、光アプタマーをアッセイ中で使用する際、そして固体支持体として利用する材料に応じて、固体支持体は、光アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合の形成を達成するために用いられる光を散乱させるかまたは吸収する傾向がありうる。さらに、使用する方法において、そのアプタマーに結合したターゲット分子の検出は、不正確になりやすく、これは、固体支持体表面もまた、用いる任意のラベリング剤に曝露され、そして影響を受ける可能性があるためである。最後に、固体支持体上のアプタマーの固定は、一般的に、アプタマーをサンプルに曝露する前のアプタマー調製工程（すなわち固定）を含み、そしてこの調製工程は、アプタマーの活性または官能性に影響を及ぼしうる。
【０１４５】
[0163]アプタマーが溶液中のターゲットを捕捉することを可能にし、そして次いで、検出前にアプタマー−ターゲット混合物の特定の構成要素を除去するように設計された分離工程を使用する、アプタマーアッセイもまた、記載されてきている（米国特許出願公報２００９／００４２２０６、表題「試験サンプルの多重化分析」を参照されたい）。記載するアプタマーアッセイ法は、核酸（すなわちアプタマー）を検出し、そして定量化することによって、試験サンプル中の非核酸ターゲット（例えばタンパク質ターゲット）の検出および定量化を可能にする。記載する方法は、非核酸ターゲットを検出し、そして定量化するために核酸代理（すなわちアプタマー）を生成し、したがって、増幅を含む非常に多様な核酸技術を、タンパク質ターゲットを含む、より広い範囲の所望のターゲットに適用することを可能にする。
【０１４６】
[0164]アプタマーを構築して、アプタマーバイオマーカー複合体（または光アプタマーバイオマーカー共有複合体）からアッセイ構成要素を分離するのを促進し、そして検出および／または定量化のため、アプタマーの単離を可能にする。１つの態様において、これらの構築物には、アプタマー配列内に切断可能または放出可能要素が含まれることも可能である。他の態様において、さらなる官能性、例えば標識または検出可能構成要素、スペーサー構成要素、あるいは特異的結合タグまたは固定化要素をアプタマーに導入してもよい。例えば、アプタマーには、切断可能部分、標識、標識を分離するスペーサー構成要素、および切断可能部分を通じて、アプタマーに連結されたタグが含まれてもよい。１つの態様において、切断可能要素は光切断可能リンカーである。光切断可能リンカーをビオチン部分およびスペーサーセクションに付着させてもよく、該リンカーはアミン誘導体化のため、ＮＨＳ基を含んでもよく、そして該リンカーを用いて、ビオチン基をアプタマーに導入し、それによって、アッセイ法において、後で、アプタマーの放出を可能にしてもよい。
【０１４７】
[0165]溶液中のすべてのアッセイ構成要素とともに行われる均質アッセイは、シグナルの検出前に、サンプルおよび試薬の分離を必要としない。これらの方法は迅速であり、そして使用が容易である。これらの方法は、分子捕捉または特異的ターゲットと反応する結合試薬に基づいてシグナルを生成する。ＮＳＣＬＣに関しては、分子捕捉試薬はアプタマーまたは抗体等であり、そして特異的ターゲットは表１のＮＳＣＬＣバイオマーカーであろう。
【０１４８】
[0166]１つの態様において、シグナル生成のための方法は、特異的バイオマーカーターゲットとフルオロフォア標識捕捉試薬の相互作用による、異方性シグナル変化を利用する。標識捕捉がターゲットと反応した際、分子量増加のため、複合体に付着したフルオロフォアの回転運動が引き起こされ、異方性値のはるかにより緩慢な変化となる。異方性変化を監視することによって、結合事象を用いて、溶液中のバイオマーカーを定量的に測定することも可能である。他の方法には、蛍光偏光アッセイ、分子ビーコン法、時間分解蛍光消光、化学発光、蛍光共鳴エネルギー移動等が含まれる。
【０１４９】
[0167]生物学的サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するために使用可能な、例示的な溶液に基づくアプタマーアッセイには、以下が含まれる：（ａ）生物学的サンプルを、第一のタグを含み、そしてバイオマーカーに対して特異的アフィニティを有するアプタマーと接触させることによって、混合物を調製し、ここで、バイオマーカーがサンプル中に存在する場合、アプタマーアフィニティ複合体が形成され；（ｂ）混合物を、第一の捕捉要素を含む第一の固体支持体に曝露し、そして第一のタグが第一の捕捉要素と会合するのを可能にし；（ｃ）第一の固体支持体と会合しない混合物のいかなる構成要素も除去し；（ｄ）アプタマーアフィニティ複合体のバイオマーカー構成要素に第二のタグを付着させ；（ｅ）第一の固体支持体からアプタマーアフィニティ複合体を放出させ；（ｆ）第二の捕捉要素を含む第二の固体支持体に、放出されたアプタマーアフィニティ複合体を曝露し、そして第二のタグが第二の捕捉要素と会合することを可能にし；（ｇ）複合体化していないアプタマーを、アプタマーアフィニティ複合体から分配することによって、混合物からいかなる非複合体化アプタマーも除去し；（ｈ）固体支持体からアプタマーを溶出させ；そして（ｉ）アプタマーアフィニティ複合体のアプタマー構成要素を検出することによって、バイオマーカーを検出する工程。
【０１５０】
[0168]当該技術分野に知られる任意の手段を用いて、アプタマーアフィニティ複合体のアプタマー構成要素を検出することによって、バイオマーカー値を検出してもよい。多くの異なる検出法、例えばハイブリダイゼーションアッセイ、質量分析、またはＱＰＣＲを用いて、アフィニティ複合体のアプタマー構成要素を検出することも可能である。いくつかの態様において、核酸配列決定法を用いて、アプタマーアフィニティ複合体のアプタマー構成要素を検出して、そしてそれによってバイオマーカー値を検出することも可能である。簡潔には、試験サンプルを任意の種類の核酸配列決定法に供して、試験サンプル中に存在する１またはそれより多いアプタマーの単数または複数の配列を同定し、そして定量化することも可能である。いくつかの態様において、配列には、全アプタマー分子または分子をユニークに同定するために使用可能な分子の任意の部分が含まれる。他の態様において、同定する配列決定は、アプタマーに付加された特定の配列であり；こうした配列は、しばしば「タグ」、「バーコード」、または「ジップコード」と称される。いくつかの態様において、配列決定法には、アプタマー配列を増幅するか、または任意の位に化学修飾を含有するＲＮＡおよびＤＮＡを含む、核酸の任意の種類を、配列決定に適した核酸の任意の他の種類に変換する、酵素工程が含まれる。
【０１５１】
[0169]いくつかの態様において、配列決定法には、１またはそれより多いクローニング工程が含まれる。他の態様において、配列決定法には、クローニングを伴わない直接配列決定法が含まれる。
【０１５２】
[0170]いくつかの態様において、配列決定法には、試験サンプル中の１またはそれより多いアプタマーをターゲットとする特異的プライマーを用いた有向性アプローチが含まれる。他の態様において、配列決定法には、試験サンプル中のすべてのアプタマーをターゲットとするショットガンアプローチが含まれる。
【０１５３】
[0171]いくつかの態様において、配列決定法には、配列決定のためにターゲティングされる分子を増幅する酵素工程が含まれる。他の態様において、配列決定法は、単一分子を直接配列決定する。生物学的サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するために使用可能な、例示的な核酸配列決定に基づく方法は、以下を含む：（ａ）酵素工程を用いて、化学的に修飾されたヌクレオチドを含有するアプタマー混合物を、非修飾核酸に変換し；（ｂ）例えば４５４配列決定系（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定系（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＡＢＩ  ＳＯＬｉＤ配列決定系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ単一分子配列決定装置（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓリアルタイム単一分子配列決定系（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ  Ｇ配列決定系（Ｄｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）などの配列決定プラットフォームを用いて、生じた非修飾核酸をショットガン配列決定し；そして（ｃ）特定の配列および配列カウントによって、混合物中に存在するアプタマーを同定し、そして定量化する工程。
【０１５４】
イムノアッセイを用いたバイオマーカー値の決定
[0172]イムノアッセイ法は、対応するターゲットまたは分析物に対する抗体の反応に基づき、そして特異的アッセイ形式に応じて、サンプル中の分析物を検出可能である。免疫反応性に基づいて、アッセイ法の特異性および感度を改善するため、モノクローナル抗体は、その特異的エピトープ認識のために、しばしば用いられる。ポリクローナル抗体もまた、モノクローナル抗体と比較した際、ターゲットに対するアフィニティが増加しているため、多様なイムノアッセイにおいて成功裡に用いられてきている。イムノアッセイは、広範囲の生物学的サンプルマトリックスで使用するために設計されてきている。イムノアッセイ形式は、定性的、半定量的、および定量的結果を提供するために設計されてきている。
【０１５５】
[0173]定量的結果は、検出しようとする特定の分析物の既知の濃度で生成された標準曲線の使用を通じて生成される。未知のサンプルからの反応またはシグナルを標準曲線上にプロットし、そして未知のサンプル中のターゲットに相当する量または値を確立する。
【０１５６】
[0174]多数のイムノアッセイ形式が設計されてきている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物の検出に関して定量的であることも可能である。この方法は、分析物または抗体のいずれかへの標識の付着に頼り、そして標識構成要素には、直接または間接的にのいずれかで酵素が含まれる。他の方法は、例えば放射性同位体（Ｉ１２５）または蛍光などの標識に頼る。さらなる技術には、例えば、凝集、比濁分析、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、血清学、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ等が含まれる（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｂｒｉａｎ  Ｌａｗ監修，  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｌｔｄ．発行，  ２００５年版）。
【０１５７】
[0175]例示的なアッセイ形式には、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）イムノアッセイが含まれる。バイオマーカーを検出するための方法の例には、バイオマーカー免疫沈降後、サイズおよびペプチドレベルの区別を可能にする定量的方法、例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィ等が含まれる。
【０１５８】
[0176]検出可能標識またはシグナル生成物質を検出し、そして／または定量化する方法は、標識の性質に応じる。適切な酵素（検出可能標識が酵素である場合；上記を参照されたい）によって触媒される反応の産物は、限定なしに、蛍光性、発光性、または放射性であってもよく、あるいはこれらは可視光または紫外光を吸収してもよい。こうした検出可能標識を検出するのに適した検出装置の例には、限定なしに、Ｘ線フィルム、放射性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーター、および濃度計が含まれる。
【０１５９】
[0177]検出のための任意の方法を、任意の適切な調製、プロセシング、および反応分析を可能にする任意の形式で実行してもよい。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば９６ウェルまたは３８４ウェル）中であってもよいし、あるいは任意の適切なアレイまたはマイクロアレイを用いてもよい。多様な剤のストック溶液を手動でまたはロボット制御で作製してもよく、そしてすべての続くピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、サンプル読み取り、データ収集および分析を、商業的に入手可能な分析ソフトウェア、ロボット工学、および検出可能標識を検出することが可能な検出装置を用いて、ロボット制御で行ってもよい。
【０１６０】
遺伝子発現プロファイリングを用いたバイオマーカー値の決定
[0178]生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡの測定を、生物学的サンプル中の対応するタンパク質レベルの検出の代理として、用いてもよい。したがって、本明細書記載の任意のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルもまた、適切なＲＮＡを検出することによっても検出可能である。
【０１６１】
[0179]ｍＲＮＡ発現レベルを逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ後、ｑＰＣＲ）によって測定する。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成する。ｃＤＮＡをｑＰＣＲアッセイにおいて用いて、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて、蛍光を生じることも可能である。標準曲線に比較することによって、ｑＰＣＲは、細胞あたりのｍＲＮＡのコピー数などの絶対測定値を生じうる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、およびキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲはすべて、サンプル中のｍＲＮＡの発現レベルを測定するために用いられてきている。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．  Ｓｈｉｍｋｅｔｓ監修，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００４を参照されたい。
【０１６２】
[0180]ｍｉＲＮＡ分子は、非コーディングであるが、遺伝子発現を制御可能な小分子ＲＮＡである。また、対応するｍｉＲＮＡに関して、ｍＲＮＡ発現レベルの測定に適した任意の方法を用いてもよい。近年、多くの研究室が、疾患に関するバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡの使用を調べてきている。多くの疾患は、広範な転写制御を伴い、そしてｍｉＲＮＡがバイオマーカーとしての役割を見出すことは驚くべきことではない。ｍｉＲＮＡバイオマーカーの値はかなりでありうるにも関わらず、ｍｉＲＮＡ濃度および疾患の間の関連は、しばしば、タンパク質レベルおよび疾患の間の関連より、さらに明らかではない。もちろん、疾患中に示差的に発現される任意のＲＮＡでのように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断製品の開発が直面する問題には、ｍｉＲＮＡが疾患細胞中で存続し、そして分析のために容易に抽出されるか、あるいはｍｉＲＮＡが血液または他のマトリックス内に放出され、測定されるのに十分に長い期間、存続しなければならない必要性が含まれる。タンパク質バイオマーカーは、類似の必要性を有するが、多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、疾患中、パラクリン方式で、病変部位で意図的に分泌され、そして機能する。多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、タンパク質が合成される細胞の外で機能するよう設計されている。
【０１６３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ分子画像化技術を用いたバイオマーカーの検出
[0181]任意の記載するバイオマーカー（表１を参照されたい）はまた、分子画像化試験で使用可能である。例えば、画像化剤を任意の記載するバイオマーカーにカップリングして、これを用いて、とりわけ、ＮＳＣＬＣ診断を補助し、疾患進行／寛解または転移を監視し、疾患再発に関して監視し、または療法に対する反応を監視してもよい。
【０１６４】
[0182]ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化技術は、個体の体の特定の疾患状態を決定するための、非侵襲性の方法を提供する。例えば、体の部分全体、またはさらに体全体を、三次元画像で見ることも可能であり、それによって、体の形態および構造に関する価値ある情報を提供する。こうした技術を、本明細書記載のバイオマーカーの検出と組み合わせて、個体の癌状態、特にＮＳＣＬＣ状態に関する情報を提供してもよい。
【０１６５】
[0183]ｉｎ  ｖｉｖｏ分子画像化技術の使用は、技術における多様な進歩のため拡大している。これらの進歩には、体内で強いシグナルを提供可能な、新規造影剤または標識、例えば放射標識および／または蛍光標識の開発；ならびに有用な情報を提供するのに十分な感度および正確性で、体の外からこれらのシグナルを検出し、そして分析することが可能な、強力な新規画像化技術の開発が含まれる。造影剤は、適切な画像化系において視覚化可能であり、それによって、造影剤が位置する体の単数または複数の部分の画像を提供することも可能である。造影剤は、捕捉剤、例えばアプタマーまたは抗体、および／またはペプチドまたはタンパク質、またはオリゴヌクレオチド（例えば遺伝子発現の検出のため）、あるいはこれらの任意のものと１またはそれより多い巨大分子および／または他の特定の型を含有する複合体とともに、結合するかまたはこれらと会合することも可能である。
【０１６６】
[0184]造影剤はまた、画像化に有用な放射性原子も特徴としうる。適切な放射性原子には、シンチグラフィ研究のためのテクネチウム−９９ｍ、またはヨウ素−１２３が含まれる。他の容易に検出可能な部分には、例えば、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄が含まれる。こうした標識は当該技術分野に周知であり、そして一般の当業者によって容易に選択可能である。
【０１６７】
[0185]標準的な画像化技術には、限定されるわけではないが、磁気共鳴画像化、コンピュータ断層撮影スキャニング、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）等が含まれる。診断ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化のため、利用可能な検出装置のタイプは、所定の造影剤、例えば所定の放射性核種およびターゲティングに用いられる特定のバイオマーカー（タンパク質、ｍＲＮＡ等）を選択する際の重要な要因である。選択される放射線核種は、典型的には、所定のタイプの装置によって検出可能な崩壊のタイプを有する。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断のための放射線核種を選択する際、半減期は、ターゲット組織による最大取り込みの時点で検出を可能にするために十分に長くなければならないが、宿主の有害な放射線照射が最小限になるために十分に短くなければならない。
【０１６８】
[0186]例示的な画像化技術には、限定されるわけではないが、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴが含まれ、これらは、放射性核種が合成的にまたは局所的に個体に投与される画像化技術である。放射性トレーサーの続く取り込みを長期間測定し、そしてこれを用いて、ターゲティングされる組織およびバイオマーカーに関する情報を得る。使用する特定の同位体が高エネルギー（ガンマ線）を放出し、そしてこれらを検出するために用いる装置が高感度であり、そして洗練されているため、放射能の二次元分布は、体の外部から推論可能である。
【０１６９】
[0187]ＰＥＴにおいて一般的に用いられるポジトロン放出核種には、例えば、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、およびフッ素−１８が含まれる。電子捕捉および／またはガンマ放出によって崩壊する同位体がＳＰＥＣＴにおいて用いられ、そしてこうした同位体には、例えば、ヨウ素−１２３およびテクネチウム−９９ｍが含まれる。テクネチウム−９９ｍでアミノ酸を標識するための例示的な方法は、キレート性前駆体の存在下での、過テクネチウム酸イオンの還元であり、不安定なテクネチウム−９９ｍ−前駆体複合体が形成されて、これは続いて、二官能性修飾走化性ペプチドの金属結合基と反応して、テクネチウム−９９ｍ−走化性ペプチドコンジュゲートを形成する。
【０１７０】
[0188]こうしたｉｎ  ｖｉｖｏ画像化診断法には、抗体を頻繁に用いる。ｉｎ  ｖｉｖｏ診断のための抗体の調製および使用が当該技術分野に周知である。個体の疾患状態を診断するかまたは評価する目的のため、用いる特定のバイオマーカーにしたがって検出可能な、表１のバイオマーカーのいずれかに特異的に結合する標識抗体を、特定のタイプの癌（例えばＮＳＣＬＣ）を有すると推測される個体内に注入してもよい。用いる標識は、先に記載するように、用いようとする画像化様式にしたがって選択されるであろう。標識の局在は、癌の伝播の決定を可能にする。臓器または組織内の標識の量はまた、その臓器または組織中の癌の存在または非存在の決定も可能にする。
【０１７１】
[0189]同様に、アプタマーをこうしたｉｎ  ｖｉｖｏ画像化診断法に用いてもよい。例えば、個体のＮＳＣＬＣ状態を診断するかまたは評価する目的のため、特定のバイオマーカーにしたがって検出可能な、表１に記載する特定のバイオマーカーを同定するために用いた（そしてしたがって、その特定のバイオマーカーに特異的に結合する）アプタマーを、適切に標識し、そしてＮＳＣＬＣを有すると推測される個体内に注入してもよい。用いられる標識は、先に記載するように、用いようとする画像化様式にしたがって選択されるであろう。標識の局在は、癌の伝播の決定を可能にする。臓器または組織内の標識の量はまた、その臓器または組織中の癌の存在または非存在の決定も可能にする。アプタマーに導かれる画像化剤は、他の画像化剤に比較した際、組織浸透、組織分布、動力学、排除、強度、および選択性に関する、ユニークでそして好適な特性を有することも可能である。
【０１７２】
[0190]こうした技術はまた、場合によって、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドでの画像化を通じて遺伝子発現を検出するため、標識オリゴヌクレオチドでも実行可能である。これらの方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのため、標識としての例えば蛍光分子または放射性核種とともに用いられる。遺伝子発現の検出のための他の方法には、例えば、レポーター遺伝子の活性の検出が含まれる。
【０１７３】
[0191]画像化技術の別の一般的なタイプは、光学画像化であり、ここで、被験体の外側にある光学デバイスによって被験体内の蛍光シグナルを検出する。これらのシグナルは、実際の蛍光および／または生物発光によってもよい。光学検出デバイスの感度の改善は、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイに関する光学画像化の有用性を増加してきている。
【０１７４】
[0192]ｉｎ  ｖｉｖｏ分子バイオマーカー画像化の使用は、臨床試験を含めて増加しており、例えば、新規癌療法のための試験において、臨床効率をより迅速に測定し、そして／または、長期治療が倫理的に疑わしいと見なされうる、多発性硬化症のような疾患のためのプラセボでの長期治療を回避する。
【０１７５】
[0193]他の技術の概説に関しては、Ｎ．  Ｂｌｏｗ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６，  ４６５−４６９，  ２００９を参照されたい。
【０１７６】
組織学／細胞学的方法を用いたバイオマーカー値の決定
[0194]ＮＳＣＬＣの評価のため、多様な組織サンプルを、組織学的または細胞学的方法で使用してもよい。サンプル選択は、原発性腫瘍の位置および転移の部位に応じる。例えば、気管支内および経気管支生検、細針吸引物、カッティングニードル、およびコア生検を組織学のために用いてもよい。気管支洗浄およびブラッシング、胸膜吸引、胸水、および痰を、細胞学のために用いてもよい。細胞学的分析は、なお、ＮＳＣＬＣの診断において用いられるが、組織学的方法は、癌の検出により高い感度を提供することが知られる。個体において上方制御されていることが示された（表１）、本明細書に同定する任意のバイオマーカーを用いて、疾患の徴候として組織学的標本を染色してもよい。
【０１７７】
[0195]１つの態様において、対応するバイオマーカー（単数または複数）に特異的な１またはそれより多い捕捉試薬は、肺組織細胞サンプルの細胞学的評価に用いられ、そしてこれには、１またはそれより多い以下が含まれてもよい：細胞サンプルを収集し、細胞サンプルを固定し、脱水し、清浄化し、細胞サンプルを顕微鏡スライド上に固定し、細胞サンプルを透過処理し、分析物回収のために処理し、染色し、脱染色し、洗浄し、ブロッキングし、そして緩衝溶液中で１またはそれより多い捕捉試薬と反応させる。別の態様において、細胞サンプルは細胞ブロックから産生される。
【０１７８】
[0196]別の態様において、対応するバイオマーカー（単数または複数）に特異的な１またはそれより多い試薬（単数または複数）を、肺組織サンプルの組織学的評価において用い、そしてこれには、１またはそれより多い以下が含まれてもよい：組織標本を収集し、組織サンプルを固定し、脱水し、清浄化し、細胞サンプルを顕微鏡スライド上に固定し、組織サンプルを透過処理し、分析物回収のために処理し、染色し、脱染色し、洗浄し、ブロッキングし、再水和し、そして緩衝溶液中で捕捉試薬（単数または複数）と反応させる。別の態様において、固定および脱水を、凍結で置換する。
【０１７９】
[0197]別の態様において、対応するバイオマーカー（単数または複数）に特異的な１またはそれより多いアプタマー（単数または複数）を、組織学的または細胞学的サンプルと反応させ、そしてこれを、核酸増幅法において、核酸ターゲットとして利用することも可能である。適切な核酸増幅法には、例えば、ＰＣＲ、ｑ−ベータレプリカーゼ、ローリングサークル増幅、鎖置換法、ヘリカーゼ依存性増幅、ループ仲介等温増幅、リガーゼ連鎖反応、ならびに制限および環状化補助ローリングサークル増幅が含まれる。
【０１８０】
[0198]１つの態様において、組織学的または細胞学的評価で使用するための対応するバイオマーカーに特異的な１またはそれより多い捕捉試薬（単数または複数）を、緩衝溶液中で混合し、これには、以下：ブロッキング材料、競合剤、界面活性剤、安定化剤、キャリアー核酸、ポリアニオン材料等のいずれかが含まれてもよい。
【０１８１】
[0199]「細胞学プロトコル」には、一般的に、サンプル収集、サンプル固定、サンプル固定化、および染色が含まれる。「細胞調製」には、サンプル収集後のいくつかのプロセシング工程が含まれてもよく、調製細胞の染色のための１またはそれより多い緩慢解離速度アプタマーの使用が含まれる。
【０１８２】
[0200]サンプル収集には、非処理輸送容器中にサンプルを直接入れるか、何らかのタイプの媒体を含有する輸送容器中にサンプルを入れるか、あるいはいかなる処理または固定も伴わずに、スライド上にサンプルを直接置く（固定）工程が含まれてもよい。
【０１８３】
[0201]ポリリジン、ゼラチン、またはシランで処理したガラススライドに、収集した標本の部分を適用することによって、サンプル固定を改善してもよい。薄い、そして均一の細胞層をスライドに渡ってスメアすることによって、スライドを調製してもよい。機械的歪みおよび乾燥アーチファクトを最小限にするように、全般に注意を払う。液体標本を細胞ブロック法においてプロセシングしてもよい。あるいは、液体標本を、固定溶液と１：１で、室温で約１０分間混合してもよい。
【０１８４】
[0202]残渣浸出液、痰、尿沈降物、胃腸液、肺液、細胞擦過、または細針吸引物から、細胞ブロックを調製してもよい。遠心分離または膜ろ過によって、細胞を濃縮するかまたはパッキングする。細胞ブロック調製のためのいくつかの方法が開発されてきている。代表的な方法には、固定沈降、細菌寒天、または膜ろ過法が含まれる。固定沈降法において、細胞沈降を、ブアン、ピクリン酸、または緩衝ホルマリンのような固定剤と混合し、そして次いで、混合物を遠心分離して、固定細胞をペレットにする。上清を除去し、細胞ペレットを可能な限り完全に乾燥させる。ペレットを収集し、そしてレンズペーパーにくるみ、そして次いで、組織カセット中に入れる。組織カセットを、さらなる固定剤を含むジャーに入れ、そして組織サンプルとしてプロセシングする。寒天法は非常に類似であるが、ペレットを除去し、そしてペーパータオル上で乾燥させ、そして次いで半分に切る。切った側を、ガラススライド上の融解した寒天滴中に乗せ、そして次いでペレットを寒天で覆い、寒天中に泡がないことを確認する。寒天を硬化させ、そして次いで、いかなる過剰な寒天も取り払う。これを組織カセット中に入れ、そして組織プロセスを完了する。あるいは、ペレットを直接２％液体寒天中に６５℃で懸濁して、そしてサンプルを遠心分離する。寒天細胞ペレットを４℃で１時間固化させる。固形寒天を遠心分離管から除去し、そして半分にスライスしてもよい。寒天をろ紙にくるみ、そして次いで、組織カセットに入れる。この時点以降のプロセシングは上述の通りである。これらの任意の方法において、遠心分離を膜ろ過で置換してもよい。これらのプロセスはいずれも、「細胞ブロックサンプル」を生成するために使用可能である。
【０１８５】
[0203]Ｌｏｗｉｃｒｙｌ樹脂、ＬＲホワイト、ＬＲゴールド、Ｕｎｉｃｒｙｌ、およびＭｏｎｏＳｔｅｐを含む特殊化樹脂を用いて、細胞ブロックを調製してもよい。これらの樹脂は、低い粘性を有し、そして低温で、そして紫外（ＵＶ）光で、重合可能である。包埋プロセスは、脱水中にサンプルを次第に冷却し、サンプルを樹脂に移し、そして適切なＵＶ波長を用い最終低温でブロックを重合させることに頼る。
【０１８６】
[0204]細胞ブロック切片を、細胞形態学的検査のため、ヘマトキシリン−エオジンで染色し、一方、さらなる切片を特異的マーカーの検査のために用いてもよい。
【０１８７】
[0205]プロセスが細胞学的または組織学的であれ、サンプル分解を防止するため、さらなるプロセシング前に、サンプルを固定してもよい。このプロセスは「固定」と称され、そして交換可能に使用可能な材料および方法を広範に記載する。サンプル固定プロトコルおよび試薬は、検出しようとするターゲットおよび分析しようとする特定の細胞／組織タイプに経験的に基づいて、最適に選択される。サンプル固定は、エタノール、ポリエチレングリコール、メタノール、ホルマリン、またはイソプロパノールなどの試薬に頼る。サンプルは、収集およびスライドへの固定の後、可能な限り速やかに固定しなければならない。しかし、選択される固定液は、多様な分子ターゲット内に構造変化を導入し、それによって、続く検出がより困難になる。固定および固定化プロセスおよびその順序は、細胞の外見を修飾する可能性もあり、そしてこれらの変化は細胞技術者によって予測されそして認識されなければならない。固定液は、特定の細胞タイプの縮みを引き起こし、そして細胞質を顆粒状または網状に見えるようにした。多くの固定剤は、細胞構成要素を架橋することによって機能する。これは、特定のエピトープに損傷を与えるかまたはエピトープを修飾し、新規エピトープを生成し、分子会合を引き起こし、そして膜浸透性を減少させる可能性もある。ホルマリン固定は、最も一般的な細胞学的／組織学的アプローチの１つである。ホルマリンは、隣のタンパク質との間のまたはタンパク質内でのメチル架橋を形成する。固定のため、沈降または凝集もまた用い、そしてエタノールは、このタイプの固定に頻繁に用いられる。架橋および沈降の組み合わせもまた、固定に用いてもよい。強い固定プロセスは、形態学的情報を保持する際に最適であり、一方、より弱い固定プロセスは、分子ターゲットを保持するために最適である。
【０１８８】
[0206]代表的な固定液は５０％無水エタノール、２ｍＭポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１．８５％ホルムアルデヒドである。この配合に対する変動には、エタノール（５０％〜９５％）、メタノール（２０％〜５０％）、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）のみが含まれる。別の一般的固定液は、２％  ＰＥＧ１５００、５０％エタノール、および３％メタノールである。スライドを固定液中に、室温で約１０〜１５分間入れ、そして次いで取り出して、そして乾燥させた。ひとたびスライドを固定したら、これらをＰＢＳのような緩衝溶液でリンスしてもよい。
【０１８９】
[0207]広範囲の色素を用いて、細胞、細胞内、および組織特徴または形態学的構造を、示差的に強調し、そして対比または「染色」してもよい。ヘマトイリン（ｈｅｍａｔｏｙｌｉｎ）を用いて、核を青または黒色に染色する。オレンジＧ−６およびエオジンアズールはどちらも、細胞の細胞質を染色する。オレンジＧは、ケラチンおよびグリコーゲンを含有する細胞を黄色に染色する。エオジンＹを用いて、核、繊毛、赤血球、および表在性上皮扁平細胞を染色する。空気乾燥スライドに関しては、ラマノフスキー染色を用い、そしてこれは、多型性を増進し、そして細胞質内物質から細胞外を区別するのに有用である。
【０１９０】
[0208]染色プロセスには、染色剤に対する細胞の透過性を増加させる処理が含まれてもよい。界面活性剤での細胞の処理を用いて、透過性を増加させてもよい。細胞および組織透過性を増加させるため、固定サンプルを、さらに溶媒、サポニン、または非イオン性界面活性剤で処理してもよい。酵素消化もまた、組織サンプル中の特異的ターゲットのアクセス可能性を改善しうる。
【０１９１】
[0209]染色後、アルコール濃度を増加させながら、アルコールリンスの連続を用いて、サンプルを脱水する。最終洗浄は、スライドに適用されるカバースリップのものに近い反射率を有する、キシレンまたはキシレン代替物、例えばシトラス・テルペンで行われるものである。この最終工程は、クリアリングと称される。ひとたびサンプルを脱水し、そしてクリアリングしたら、マウンティング媒体を適用する。マウンティング媒体は、ガラスに近い反射率を有するように選択され、そしてスライド上のカバースリップに結合可能である。これは、細胞サンプルのさらなる乾燥、縮み、または退色も阻害するであろう。
【０１９２】
[0210]染色またはプロセシングを用いるにも関わらず、肺細胞学的標本の最終評価は、形態の視覚的調査およびマーカーの存在または非存在の決定を可能にするある種の顕微鏡によって行われる。例示的な顕微鏡法には、明視野、位相差、蛍光、および微分干渉コントラスト法が含まれる。
【０１９３】
[0211]検査後、サンプルに対する二次試験が必要である場合、カバースリップを取り除き、そしてスライドを脱染色してもよい。脱染色は、色素を添加せずに、元来のスライドを染色する際に用いた元来の溶媒系を用い、そして元来の染色法の逆の順序で進行する。脱染色はまた、細胞が無色になるまで、スライドを酸アルコールに浸すことによって完了可能である。ひとたび無色になったら、スライドを水槽中でよくリンスし、そして二次染色法を適用する。
【０１９４】
[0212]さらに、抗体あるいは核酸プローブまたはアプタマーなどの特異的分子試薬の使用を通じて、細胞形態学的分析と組み合わせて、特異的分子差別化が可能である。これによって、診断細胞学の正確性が改善される。顕微解剖を用いて、さらなる評価のため、特に、異常な染色体、遺伝子発現、または突然変異の遺伝子評価のため、細胞サブセットを単離してもよい。
【０１９５】
[0213]組織学的評価のための組織サンプルの調製は、固定、脱水、浸潤、包埋、および切片作製を伴う。組織学で用いられる固定試薬は、細胞学で用いられるものと非常に類似であるかまたは同一であり、そして個々のタンパク質などの分子のものを犠牲にして、形態学的特徴を保持する同じ問題を有する。組織サンプルを固定せず、そして脱水せずに、その代わり凍結し、そして次いで凍結中に切片作製すれば、時間を節約可能である。これは、より穏やかなプロセシング法であり、そしてより多くの個々のマーカーを保持可能である。しかし、凍結は、細胞内情報が、氷の結晶の導入によって失われるため、組織サンプルの長期保存には認められない。凍結組織サンプル中の氷はまた、切片作製プロセスにおいて、非常に薄い切片を産生するのを妨げ、そしてしたがって、ある程度の顕微鏡解像度および細胞内構造の画像化が失われる可能性もある。ホルマリン固定に加えて、四酸化オスミウムを用いて、固定し、そしてリン脂質（膜）を染色する。
【０１９６】
[0214]アルコール濃度を増加させて連続して洗浄することによって、組織の脱水を達成する。クリアリングは、アルコールと混和可能な材料および包埋材料を使用し、そして５０：５０アルコール：クリアリング剤で始まり、そして次いで１００％クリアリング剤（キシレンまたはキシレン置換物）となる、段階的なプロセスを伴う。浸潤は、組織を包埋剤の液体型（温かい蝋、ニトロセルロース溶液）と、最初は５０：５０包埋剤：クリアリング剤で、そして１００％包埋剤で、インキュベーションする工程を含む。包埋は、組織をモールドまたはカセットに入れ、そして融解した包埋剤、例えばワックス、寒天、またはゼラチンを充填することによって、完了する。包埋剤を固化させる。次いで、固化した組織サンプルを、染色および続く検査のため、薄い切片にスライスする。
【０１９７】
[0215]染色前に、組織切片を脱ワックスし、そして再水和する。キシレンを用いて、切片を脱ワックスし、キシレンの１またはそれより多い変化を用いてもよく、そして組織を、減少する濃度のアルコール中で連続洗浄することによって、再水和する。脱ワックス前に、約８０℃で約２０分間、組織切片をガラススライドに固定してもよい。
【０１９８】
[0216]レーザー捕捉顕微解剖によって、組織切片から、さらなる分析のため、細胞サブセットを単離することも可能である。
【０１９９】
[0217]細胞学におけるように、顕微鏡特徴の視覚化を増進するため、組織切片またはスライスを多様な染色剤で染色してもよい。商業的に入手可能な染色剤の多くのメニューを用いて、特定の特徴を増進するかまたは同定することも可能である。
【０２００】
[0218]細胞学的／組織学的サンプルと分子試薬の相互作用をさらに増加させるため、「分析物回収」のための多くの技術が開発されてきている。第一のこうした技術は、固定サンプルの高温加熱を用いる。この方法はまた、熱誘導性エピトープ回収、またはＨＩＥＲと称される。多様な加熱技術が用いられてきており、これには、スチーム加熱、マイクロ波、オートクレーブ、水槽、および加圧調理、または加熱のこれらの方法の組み合わせが含まれる。分析物回収溶液には、例えば、水、クエン酸、および正常生理食塩水が含まれる。分析物回収への重要な点は高温での時間であるが、より長い時間に渡る、より低い温度もまた成功裡に用いられてきている。分析物回収に関する別の重要な点は、加熱溶液のｐＨである。低ｐＨは、最適な免疫染色を提供することが見出されてきているが、バックグラウンドの上昇を生じ、これはしばしば、負の対照として、第二の組織選択の使用を必要とする。最も一貫した利益（バックグラウンドの増加を伴わない免疫染色の増加）は、一般的に、緩衝液組成物とは関係なく、高いｐＨ溶液で得られる。特異的ターゲットに関する分析物回収プロセスは、プロセス最適化のための変数として、熱、時間、ｐＨ、および緩衝組成物を用いて、ターゲットに関して経験的に最適化される。マイクロ波分析物回収法を用いて、抗体試薬で、異なるターゲットの連続染色を可能にする。しかし、染色工程間に抗体および酵素複合体を得るために必要な時間もまた、細胞膜分析物を分解させることが示されてきている。マイクロ波加熱法は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法もまた改善している。
【０２０１】
[0219]分析物回収プロセスを開始するため、切片をまず脱ワックスし、そして水和する。次いで、スライドを、プレートまたはジャーの中の１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０中に入れる。代表的な方法は、１１００Ｗマイクロ波を用い、そして１００％出力で２分間、スライドをマイクロ波処理し、その後、スライドが液体中に覆われたままであることを確認した後、２０％出力を用いて１８分間、スライドをマイクロ波処理する。次いで、スライドを覆いのない容器中で冷却し、そして次いで、再蒸留水でリンスする。ＨＩＥＲを、酵素消化と組み合わせて用いて、免疫化学試薬へのターゲットの反応性を改善する。
【０２０２】
[0220]１つのこうした酵素消化プロトコルは、プロテイナーゼＫを用いる。２０ｇ／ｍｌ濃度のプロテイナーゼＫを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０緩衝液中で調製する。プロセスはまず、各５分ずつのキシレンの２回交換で切片を脱ワックスする工程を含む。次いで、各３分間の１００％エタノールの２回交換、各１分間の９５％および８０％エタノール、そして次いで、再蒸留水中でのリンスで、サンプルを再水和する。切片をプロテイナーゼＫ作業溶液で覆い、そして加湿チャンバー中、３７℃で１０〜２０分間インキュベーションする（最適なインキュベーション時間は、組織タイプおよび固定の度合いに応じて多様でありうる）。切片を室温で１０分間冷却し、そして次いでＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０中、２ｘ２分でリンスする。望ましい場合、切片をブロッキングして、内因性化合物および酵素からの潜在的な干渉を排除してもよい。次いで、切片を、一次抗体希釈緩衝液中の適切な希釈の一次抗体と、室温で１時間または４℃で一晩インキュベーションする。次いで、切片をＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０中、２ｘ２分でリンスする。特異的適用が必要である場合、さらなるブロッキングを行ってもよく、その後、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０で、３ｘ２分でさらにリンスし、そして次いで最終的に免疫染色プロトコルを完了する。
【０２０３】
[0221]室温で１％ＳＤＳでの単純な処理もまた、免疫組織化学染色を改善することが示されてきている。分析物回収法は、スライドマウンティング切片、ならびに自由流動切片に適用されてきている。別の処理オプションは、クエン酸および０．１  Ｎｏｎｉｄｅｎｔ  Ｐ４０を含有するジャーにスライドを入れ、そして９５℃に加熱することである。次いで、スライドをＰＢＳのような緩衝溶液で洗浄する。
【０２０４】
[0222]組織の免疫学的染色のため、切片を血清または脱脂粉乳などのタンパク質溶液に浸すことによって、組織タンパク質と抗体の非特異的会合をブロックすることが有用でありうる。
【０２０５】
[0223]ブロッキング反応には、内因性ビオチンのレベルを減少させ；内因性電荷効果を排除し；内因性ヌクレアーゼを不活性化し；そして／またはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような内因性酵素を不活性化する必要が含まれうる。内因性ヌクレアーゼは、プロテイナーゼＫでの分解によって、熱処理によって、キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの使用によって、キャリアーＤＮＡまたはＲＮＡの導入によって、カオトロープ、例えば尿素、チオ尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸リチウム等、またはジエチルピロカーボネートでの処理によって、不活性化可能である。アルカリホスファターゼは、０．１Ｎ  ＨＣｌで、室温で５分間処理するか、または１ｍＭレバミゾールで処理することによって、不活性化可能である。ペルオキシダーゼ活性は、０．０３％過酸化水素で処理することによって、排除可能である。スライドまたは切片を、アビジン（ストレプトアビジン、ニュートラアビジンで置換可能である）中に室温で少なくとも１５分間浸すことによって、内因性ビオチンをブロッキングしてもよい。次いで、スライドまたは切片を、緩衝液中、少なくとも１０分間洗浄する。これを少なくとも３回反復してもよい。次いで、スライドまたは切片を、ビオチン溶液中に１０分間浸す。これを、各回、新鮮なビオチン溶液で、少なくとも３回反復してもよい。緩衝液洗浄法を反復する。ブロッキングプロトコルは、細胞または組織構造あるいは関心対照の単数または複数のターゲットのいずれかに損傷を与えるのを防止するため、ブロッキングプロトコルを最小限にすべきであるが、これらのプロトコルの１またはそれより多くを組み合わせて、１またはそれより多い緩慢解離速度アプタマーとの反応前に、スライドまたは切片を「ブロック」することも可能である。Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｓ，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇ．  Ｋｅｓｓｅｌ著，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９８を参照されたい。
【０２０６】
質量分析法を用いたバイオマーカー値の決定
[0224]多様な配置の質量分析計を用いて、バイオマーカー値を検出してもよい。いくつかのタイプの質量分析計が入手可能であるか、または多様な配置で産生可能である。一般的に、質量分析計は、以下の主要構成要素を有する：サンプル入り口、イオン供給源、質量分析装置、検出装置、真空系、および装置制御系、およびデータ系。サンプル入り口、イオン供給源、および質量分析装置の相違は、一般的に、装置のタイプおよびその能力を定義する。例えば、入り口は、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィ供給源であってもよいし、あるいは、マトリックス支援レーザー脱離において用いられるような直接プローブまたはステージであってもよい。一般的なイオン供給源は、例えば、ナノスプレーおよびマイクロスプレーを含むエレクトロスプレーまたはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析装置には、四重極マスフィルター、イオン捕捉質量分析装置および時間飛行質量分析装置が含まれる。さらなる質量分析法が当該技術分野に周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７０：６４７  Ｒ−７１６Ｒ（１９９８）；  Ｋｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，  ニューヨーク（２０００）を参照されたい）。
【０２０７】
[0225]タンパク質バイオマーカーおよびバイオマーカー値を、以下の方法のいずれによって、検出し、そして測定することも可能である：エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス補助レーザー脱離イオン化時間飛行質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増進レザー脱離／イオン化時間飛行質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上の脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、四極子時間飛行（Ｑ−ＴＯＦ）、ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれるタンデム時間飛行（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、大気圧化学イオン化質量分析法（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析法（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）Ｎ、四極子質量分析法、フーリエ変換質量分析法（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析法、およびイオン捕捉質量分析法。
【０２０８】
[0226]タンパク質バイオマーカーの質量分析特性決定およびバイオマーカー値の決定の前に、サンプル調製戦略を用いて、サンプルを標識し、そして濃縮する。標識法には、限定されるわけではないが、相対および絶対定量化のための等圧性タグ（ｉＴＲＡＱ）、および細胞培養中のアミノ酸での安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）が含まれる。質量分析前に、候補バイオマーカータンパク質に関して、サンプルを選択的に濃縮するために用いる捕捉試薬には、限定されるわけではないが、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替抗体骨格（例えばディアボディ等）、インプリンティングされたポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、および合成受容体、ならびにこれらの修飾および断片が含まれる。
【０２０９】
近接連結アッセイを用いた、バイオマーカー値の決定
[0227]近接連結アッセイを用いて、バイオマーカー値を決定してもよい。簡潔には、試験サンプルを、一対のアフィニティプローブと接触させ、ここでこのプローブは、一対の抗体または一対のアプタマーであってもよく、対の各メンバーはオリゴヌクレオチドで伸張される。対のアフィニティプローブに関するターゲットは、１つのタンパク質上の２つの別個の決定因子、または２つの異なるタンパク質各々の上の１つの決定因子であってもよく、これらはホモまたはヘテロ多量体複合体として存在してもよい。プローブがターゲット決定因子に結合すると、オリゴヌクレオチド伸張の未結合端が、ともにハイブリダイズするのに十分に近い近接性になる。オリゴヌクレオチド伸張のハイブリダイゼーションは、共通の連結因子オリゴヌクレオチドによって促進され、該オリゴヌクレオチドは、十分に近接して配置されると、オリゴヌクレオチド伸張を一緒に架橋するように働く。プローブのオリゴヌクレオチド伸張がひとたびハイブリダイズしたら、伸張の端は酵素ＤＮＡ連結によって一緒に連結される。
【０２１０】
[0228]各オリゴヌクレオチド伸張は、ＰＣＲ増幅のためのプライマー部位を含む。ひとたび、オリゴヌクレオチド伸張が一緒に連結されたら、オリゴヌクレオチドは、連続ＤＮＡ配列を形成し、これはＰＣＲ増幅を通じて、ターゲットタンパク質の同一性および量に関連する情報、ならびにターゲット決定因子が２つの異なるタンパク質上にある場合、タンパク質−タンパク質相互作用に関する情報を明らかにする。近接連結は、リアルタイムＰＣＲの使用を通じて、リアルタイムタンパク質濃度および相互作用情報に関する非常に高感度でそして特異的なアッセイを提供可能である。関心対照の決定因子に結合しないプローブは、対応するオリゴヌクレオチド伸長が近接せず、そして連結またはＰＣＲ増幅が進行不能であり、その結果、シグナルはまったく産生されない。
【０２１１】
[0229]前述のアッセイによって、ＮＳＣＬＣを診断するための方法において有用であるバイオマーカー値の検出を可能にし、ここで該方法は、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に提供するバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに各々対応する、少なくともＮのバイオマーカー値を検出する工程を含み、ここで、以下に詳細に記載するような、バイオマーカー値を用いた分類は、個体がＮＳＣＬＣを有するかどうかを示す。記載するＮＳＣＬＣバイオマーカーの特定のものが、単独で、ＮＳＣＬＣを検出し、そして診断するのに有用であるが、本明細書において、３またはそれより多いバイオマーカーのパネルとして、各々、有用である、ＮＳＣＬＣバイオマーカーの多数のサブセットのグループ化のための方法もまた、本明細書に記載する。したがって、本出願の多様な態様は、Ｎが少なくとも３つのバイオマーカーである、Ｎバイオマーカーを含む組み合わせを提供する。他の態様において、Ｎは、２〜５９バイオマーカーからの任意の数であるように選択される。Ｎは上述の範囲のいずれか由来の任意の数、ならびに類似であるが、より高い桁の範囲であるようにも選択可能であることが認識されるであろう。本明細書記載の方法のいずれかにしたがって、バイオマーカー値を検出し、そして個々に分類するか、または例えば多重化アッセイ形式におけるように、集合的にこれらを検出し、そして分類してもよい。
【０２１２】
[0230]別の側面において、ＮＳＣＬＣの非存在を検出するための方法であって、個体由来の生物学的サンプルにおいて、表１に提供するバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに各々対応する、少なくともＮのバイオマーカー値を検出する工程を含み、ここで、以下に詳細に記載するような、バイオマーカー値の分類は、個体におけるＮＳＣＬＣの非存在を示す。記載するＮＳＣＬＣバイオマーカーの特定のものが、単独で、ＮＳＣＬＣの非存在を検出し、そして診断するのに有用であるが、３またはそれより多いバイオマーカーのパネルとして、各々、有用である、ＮＳＣＬＣバイオマーカーの多数のサブセットのグループ化のための方法もまた、本明細書に記載する。したがって、本出願の多様な態様は、Ｎが少なくとも３つのバイオマーカーである、Ｎバイオマーカーを含む組み合わせを提供する。他の態様において、Ｎは、２〜５９バイオマーカーからの任意の数であるように選択される。Ｎは上述の範囲のいずれか由来の任意の数、ならびに類似であるが、より高い桁の範囲であるようにも選択可能であることが認識されるであろう。本明細書記載の方法のいずれかにしたがって、個々にバイオマーカー値を検出し、そして分類するか、または例えば多重化アッセイ形式におけるように、集合的にこれらを検出し、そして分類してもよい。
【０２１３】
バイオマーカーの分類および疾患スコアの計算
[0231]所定の診断試験に関するバイオマーカー「シグネチャー」は、マーカーのセットを含有し、各マーカーは、関心対照の集団において、異なるレベルを有する。この文脈において、異なるレベルは、２もしくはそれより多い群における個体に関するマーカーレベルの異なる平均、または２もしくはそれより多い群における異なる分散、あるいは両方の組み合わせを指すことも可能である。診断試験の最も単純な型に関しては、これらのマーカーを用いて、疾患または疾患でない、２つの群のいずれか一方に、個体由来の未知のサンプルを割り当てることも可能である。２またはそれより多い群の１つへのサンプルの割り当ては、分類として知られ、そしてこの割り当てを達成するために用いる方法は、分類器または分類法として知られる。分類法はまた、スコアリング法とも称されうる。バイオマーカー値セットから診断分類器を構築するために使用可能な、多くの分類法がある。一般的に、分類法は、区別しようとする２つ（または、多重分類状態に関しては、それより多く）の別個の群に、個体から得られたサンプルを用いてデータセットを収集する、教師付き学習技術を用いて、最も容易に行われる。各サンプルが属するクラス（群または集団）は、各サンプルに関してあらかじめ知られているため、分類法を訓練して、望ましい分類反応を生じることも可能である。教師なし学習技術を用いて、診断分類器を生じることもまた可能である。
【０２１４】
[0232]診断分類器を開発するための一般的なアプローチには、決定木；バギング、ブースティング、フォレストおよびランダムフォレスト；ルール推論に基づく学習；パルツェン窓；線形モデル；ロジスティック；神経ネットワーク法；教師なしクラスター形成；Ｋ−平均法；階層的昇順／降順；半教師付き学習；プロトタイプ法；最近傍；カーネル密度推定量；サポートベクターマシン；隠れマルコフモデル；ボルツマン学習が含まれ；そして分類器を単純に、または特定の目的関数が最小限になる方式で、組み合わせてもよい。概説に関しては、例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｒ．  Ｏ．  Ｄｕｄａら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  第２版，  ２００１を参照されたい；また、Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  −Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ，  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，  Ｔ．  Ｈａｓｔｉｅら監修，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，  ＬＬＣ，  第２版，  ２００９を参照されたい；これらは各々、その全体が本明細書に援用される。
【０２１５】
[0233]教師付き学習技術を用いて、分類器を産生するため、訓練データと呼ばれるサンプルセットを得る。診断試験の文脈において、訓練データには、未知のサンプルを後に割り当てようとする、別個の群（クラス）由来のサンプルが含まれる。例えば、対照集団における個体および特定の疾患集団における個体から収集したサンプルは、未知のサンプル（またはより具体的には、サンプルが得られた個体）を、疾患を有するかまたは疾患を持たないかいずれかとして分類可能な分類器を発展させる訓練データを構成しうる。訓練データ由来の分類器の発展は、分類器を訓練するとして知られる。分類器訓練に関する特定の詳細は、教師付き学習技術の性質に応じる。例示の目的のため、単純ベイズ分類器を訓練する例を以下に記載する（例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｒ．  Ｏ．  Ｄｕｄａら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  第２版，  ２００１を参照されたい；また、Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  −Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ，  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，  Ｔ．  Ｈａｓｔｉｅら監修，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，  ＬＬＣ，  第２版，  ２００９を参照されたい）。
【０２１６】
[0234]典型的には、訓練セット中のサンプルよりも、多くのより潜在的なバイオマーカー値があるため、過剰適合を回避するため、注意を払わなければならない。過剰適合は、統計モデルが、根底にある関連の代わりに、ランダムな誤差またはノイズを記載する際に生じる。過剰適合は、例えば、分類器を発展させる際に用いるマーカーの数を限定することによって、マーカー反応が互いに独立であると仮定することによって、使用する根底の統計モデルの複雑さを限定することによって、そして根底にある統計モデルがデータに一致することを確実にすることによって、多様な方式で回避可能である。
【０２１７】
[0235]バイオマーカーセットを用いた診断試験の発展の例示的な例には、単純ベイズ分類器、バイオマーカーの厳密に独立な処理を伴うベイズ理論に基づいた単純確率的分類器の適用が含まれる。各バイオマーカーは、各クラスにおける測定されたＲＦＵ値または対数ＲＦＵ（相対蛍光単位）値に関するクラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）によって記載される。１つのクラスにおけるマーカーセットのジョイントｐｄｆは、各バイオマーカーに関する個々のクラス依存性ｐｄｆの積であると仮定される。この文脈において、単純ベイズ分類器の訓練は、クラス依存性ｐｄｆを特徴付けるパラメータを割り当てることになる（「パラメータ化」）。クラス依存性ｐｄｆに関して、任意の根底にあるモデルを用いてもよいが、モデルは、一般的に、訓練セット中で得られるデータに一致していなければならない。
【０２１８】
[0236]特に、疾患クラス中のバイオマーカーｉに関する値ｘｉを測定するクラス依存性確率は、ｐ（ｘｉ｜ｄ）と記載され、そして値
【０２１９】
【化１】
0005986638.tif 000002
【０２２０】
を持つｎのマーカーを観察する全体の単純ベイズ確率は
【０２２１】
【化２】
0005986638.tif 000003
【０２２２】
式中、個々のｘｉｓは、ＲＦＵまたは対数ＲＦＵにおいて測定されたバイオマーカーレベルである、と書き表される。未知の値に関する分類割り当ては、同じ測定される値に関して、疾患不含（対照）にある確率
【０２２３】
【化３】
0005986638.tif 000004
【０２２４】
に比較して、測定される
【０２２５】
【化４】
0005986638.tif 000005
【０２２６】
を有する疾患である確率
【０２２７】
【化５】
0005986638.tif 000006
【０２２８】
を計算することによって容易になる。これらの確率の比を、ベイズ定理の適用によってクラス依存性ｐｄｆから計算し、すなわち、
【０２２９】
【化６】
0005986638.tif 000007
【０２３０】
式中、ｐ（ｄ）は、試験に適切な集団における疾患の有病率である。この比の両側の対数を取り、そして上記から単純ベイズクラス依存性確率を置換すると
【０２３１】
【化７】
0005986638.tif 000008
【０２３２】
が生じる。この型は、対数尤度比として知られ、そして疾患を有するものに対して、特定の疾患を持たない対数尤度を単純に記載し、そして主に、ｎの個々のバイオマーカーの個々の対数尤度比の合計で構成される。最も単純な型において、未知のサンプル（またはより具体的には、サンプルが得られた個体）を、上記比がゼロより多い場合は疾患を持たないと分類し、そして比がゼロ未満である場合は、疾患を有すると分類する。
【０２３３】
[0237]１つの例示的態様において、クラス依存性バイオマーカーｐｄｆ、ｐ（ｘｉ｜ｃ）およびｐ（ｘｉ｜ｄ）は、測定されるＲＦＵ値ｘｉにおいて、正常または対数正常分布であると仮定され、すなわち
【０２３４】
【化８】
0005986638.tif 000009
【０２３５】
であり、ｐ（ｘｉ｜ｄ）に関しては、μｄおよびσｄを伴う類似の表現である。モデルのパラメータ化は、各クラス依存性ｐｄｆに関して、訓練データから２つのパラメータ、平均μおよび分散σ２の概算を必要とする。これは、例えば最大尤度概算によって、最小二乗法によって、そして当業者に知られる任意の他の方法によってを含めて、多数の方式で達成可能である。μおよびσに関する正規分布を、上に定義する対数尤度比に置換すると、以下の表現が生じる：
[0238]
【０２３６】
【化９】
0005986638.tif 000010
【０２３７】
[0239]ひとたび、訓練データ由来の各クラス中の各ｐｄｆに関して、μおよびσ２のセットが定義され、そして集団における疾患有病率が特定されたら、ベイズ分類器を完全に決定し、そしてこれを用いて、測定値
【０２３８】
【化１０】
0005986638.tif 000011
【０２３９】
を持つ未知のサンプルを分類することも可能である。
【０２４０】
[0240]単純ベイズ分類器の性能は、分類器を構築し、そして訓練するために用いたバイオマーカーの数および品質に依存する。単一のバイオマーカーは、以下の実施例３に定義するようなＫＳ距離（コルモゴロフ−スミルノフ）にしたがって機能するであろう。分類器性能測定基準が、受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）として定義される場合、完璧な分類器は、スコア１を有し、そしてランダム分類器は、平均して０．５のスコアを有するであろう。ｎおよびｍのサイズを持つ２つのセットＡおよびＢの間のＫＳ距離の定義は、値、Ｄｎ，ｍ＝ｓｕｐｘ｜ＦＡ，ｎ（ｘ）−ＦＢ，ｍ（ｘ）｜であり、これは、２つの経験的集積分布関数（ｅｄｆ）の間の最大相違である。ｎの観察ＸｉのセットＡに関する経験的ｅｄｆは、
【０２４１】
【化１１】
0005986638.tif 000012
【０２４２】
と定義され、式中、
【０２４３】
【化１２】
0005986638.tif 000013
【０２４４】
は、Ｘｉ＜ｘである場合１に等しく、そしてその他の場合０に等しい、指標関数である。定義によって、この値は、０および１の間に結びつけられ、ここで、１のＫＳ距離は、経験分布が重複しないことを示す。
【０２４５】
[0241]すぐれたＫＳ距離（例えば＞０．３）を持つ、続くマーカーの付加は、一般的に、続いて付加されるマーカーが第一のマーカーとは独立である場合、分類性能を改善するであろう。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を分類器スコアとして用いると、単純に、欲張りアルゴリズムの変形とともに、多くの高スコアリング分類器が生じる。（欲張りアルゴリズムは、大域的最適解を発見することを望んで、各段階で局所的に最適である選択を行う、問題解決メタヒューリスティックにしたがうアルゴリズムいずれかである。）
[0242]本明細書で用いるアルゴリズムアプローチを実施例４に詳細に記載する。簡潔には、潜在的なバイオマーカーの表からすべての単一分析物分類器を生成し、そしてリストに付加する。次いで、保存された単一分析物分類器各々への第二の分析物のすべてのありうる付加を行い、最適スコアリング対のあらかじめ決定された数、例えば１０００を新規リスト上に取っておく。最適２マーカー分類器のこの新規リストを用いて、すべてのあり得る３つのマーカー分類器を探索し、再びこれらの最適の１０００を取っておく。スコアがプラトーに達するか、またはさらなるマーカーを付加した際に劣化し始めるまで、このプロセスを続ける。収束後に残る高スコアリング分類器を、意図される使用のため望ましい性能に関して評価してもよい。例えば、１つの診断適用において、高感度で、そして中程度の特異性を持つ分類器は、中程度の感度でそして高い特異性を持つものよりもより望ましい可能性もある。別の診断適用において、高い特異性および中程度の感度を持つ分類器がより望ましい可能性もある。性能の望ましいレベルは、一般的に、各々、特定の診断適用に関して許容可能である、偽陽性および偽陰性の数の間で行わなければならないトレードオフに基づいて選択される。こうしたトレードオフは、一般的に、偽陽性または偽陰性いずれかの誤差の医学的結果に応じる。
【０２４６】
[0243]多様な他の技術が当該技術分野に知られ、そしてこれを使用して、単純ベイズ分類器を用いたバイオマーカーのリストから、多くの潜在的な分類器を生成することも可能である。１つの態様において、遺伝的アルゴリズムと称されるものを用いて、上に定義するような適合スコアを用いて、異なるマーカーを合わせてもよい。遺伝的アルゴリズムは、潜在的分類器の非常に多様な集団を探索するのに特によく適している。別の態様において、いわゆる蟻コロニー最適化を用いて、分類器セットを生成してもよい。当該技術分野に知られる他の戦略もまた使用可能であり、これらには、例えば、他の進化的戦略ならびにシミュレーションアニーリングおよび他の確率的探索法が含まれる。メタヒューリスティック法、例えばハーモニーサーチもまた使用可能である。
【０２４７】
[0244]例示的な態様は、多様な組み合わせで、表１に列挙したＮＳＣＬＣバイオマーカーの任意の数を用いて、ＮＳＣＬＣを検出するための診断試験を生じる（これらのバイオマーカーをどのように同定するかの詳細な説明に関しては、実施例２を参照されたい）。１つの態様において、ＮＳＣＬＣを診断するための方法は、単純ベイズ分類法を、表１に列挙するＮＳＣＬＣバイオマーカーの任意の数と組み合わせて用いる。例示的な例（実施例３）において、単一のバイオマーカー、例えば０．５９のＫＳ距離でＮＳＣＬＣ中で示差的に発現されるＭＭＰ７を用いて、喫煙者および良性肺小結節の集団から、ＮＳＣＬＣを検出するための最も単純な試験を構築することも可能である。表１６由来のＭＭＰ７に関するパラメータμｃ、ｉ、σｃ、ｉ、μｄ、ｉ、およびσｄ、ｉならびに上記の対数尤度に関する等式を用いて、０．８０３のＡＵＣを伴う診断試験が得られうる。表１５を参照されたい。この試験に関するＲＯＣ曲線を図２に示す。
【０２４８】
[0245]例えば０．５３のＫＳ距離を持つバイオマーカーＣＬＩＣ１を付加すると、分類器性能が０．８８３のＡＵＣに有意に改善される。２つのバイオマーカーで構築された分類器に関するスコアが、ＫＳ距離の単純な合計ではないことに注目されたい；ＫＳ距離は、バイオマーカーを合わせた際、付加的ではなく、そして強いマーカーと同じレベルの性能を達成するには、はるかに多くの弱いマーカーを要する。例えば、第三のマーカー、ＳＴＸ１Ａを付加すると、分類器性能は０．９０１のＡＵＣにブーストされる。さらなるバイオマーカー、例えばＣＨＲＤＬ１、ＰＡ２Ｇ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＢＤＮＦ、ＧＨＲ、ＴＧＦＢＩ、およびＮＭＥ２を付加すると、表１５に要約し、そして図３の一連のＲＯＣ曲線として示す一連のＮＳＣＬＣ試験が生じる。分類器構築に用いた分析物の数の関数としての分類器スコアを図４に示す。この例示的な１０マーカー分類器のＡＵＣは０．９４８である。
【０２４９】
[0246]表１に列挙するマーカーを多くの方式で組み合わせて、ＮＳＣＬＣを診断するための分類器を産生することも可能である。いくつかの態様において、バイオマーカーパネルは、選択される特定の診断性能基準に応じて、異なる数の分析物で構成される。例えば、バイオマーカーの特定の組み合わせは、他の組み合わせよりもより感度が高い（またはより特異的な）試験を産生するであろう。
【０２５０】
[0247]表１由来のバイオマーカーの特定のセットを含むようにパネルを定義し、そして訓練データセットから分類器を構築したら、診断試験の定義を完了する。１つの態様において、未知のサンプルを分類するのに用いる方法を図１Ａに概略する。別の態様において、未知のサンプルを分類するのに用いる方法を図１Ｂに概略する。生物学的サンプルを適切に希釈し、そして次いで、１またはそれより多いアッセイにおいて実行して、分類に用いる適切な定量的バイオマーカーレベルを生じる。測定したバイオマーカーレベルを、分類法のための入力として用いて、該方法は、分類、およびクラス割り当ての確かさを反映する、サンプルに関する場合によるスコアを出力する。
【０２５１】
[0248]表１は、ＮＳＣＬＣを診断するのに有用な５９のバイオマーカーを同定する。これは、バイオマーカーを発見する努力の中で典型的に見出されるものに比較した際、予期されるよりも驚くほどより多数であり、そしてこれは、記載する研究のスケールに起因する可能性があり、これは、低フェントモル濃度範囲の濃度のいくつかの場合、数百の個々のサンプルで測定される、１０００を超えるタンパク質を含む。おそらく、多数のバイオマーカーが発見されるのは、腫瘍生物学および腫瘍の存在に対する体の反応の両方に関与する多様な生化学的経路を反映し；各経路およびプロセスは、多くのタンパク質を伴う。結果は、小さい群のタンパク質のどの単一のタンパク質もこうした複雑なプロセスに関してユニークに情報を持つのではなく；むしろ、多数のタンパク質が適切なプロセス、例えばアポトーシスまたは細胞外マトリックス修復に関与することを示す。
【０２５２】
[0249]記載する研究中に多くのバイオマーカーが同定されることを考慮すると、多様な診断法において使用可能な、多数の高性能分類器が得られる可能性があることが予期されるであろう。この知見を試験するため、表１中のバイオマーカーを用いて、数万の分類器を評価した。実施例４に記載するように、表１に提示するバイオマーカーの多くのサブセットを合わせて、有用な分類器を産生してもよい。例えば、ＮＳＣＬＣを検出するための１つ、２つ、および３つのバイオマーカーを含有する分類器に関して、説明を提供する。実施例４に記載するように、表１中のバイオマーカーを用いて構築したすべての分類器は、「非マーカー」を用いて構築した分類器よりも著しく優れた性能を示す。
【０２５３】
[0250]表１中のマーカーのいくつかをランダムに排除して、分類器を構築するものより少数のサブセットを生じることによって得られる分類器の性能もまた試験した。実施例４に記載するように、表１中のマーカーのランダムサブセットから構築される分類器は、表１中のマーカーの全リストを用いて構築される最適分類器と同様に働いた。
【０２５４】
[0251]１０マーカー集合体から「最適な」個々のマーカーを排除することによって得られる１０マーカー分類器の性能もまた試験した。実施例４に記載するように、表１中の「最適な」マーカーなしに構築した分類器もまた、よく働いた。表１に列挙するバイオマーカーの多くのサブセットは、表中に列挙されるマーカーの上位１５を除いた後であっても、最適に近く働いた。これは、任意の特定の分類器の性能特性は、バイオマーカーのいくつかの小さいコアグループによるのではなく、そして疾患プロセスは、多くの生化学的経路に影響を及ぼす可能性が高く、これが多くのタンパク質の発現レベルを改変するようであることを示す。
【０２５５】
[0252]実施例４の結果は、特定のありうる結論を示唆する：第一に、多数のバイオマーカーの同定は、同様に高い性能を提供する、非常に多数の分類器への集合を可能にする。第二に、根底にある疾患プロセスの複雑性に疑いなく行き渡るように、余剰性を反映する方式で、特定のバイオマーカーが、他のバイオマーカーで置換可能であるように、分類器を構築することも可能である。すなわち、表１に同定される任意の個々のバイオマーカーによって貢献される疾患に関する情報は、表１中の特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーの小さい群がいずれも、任意の分類器に含まれなければならないわけではないように、他のバイオマーカーによって貢献可能な情報と重複する。
【０２５６】
[0253]例示的な態様は、未知のサンプルを分類するために、表１６中のデータから構築される単純ベイズ分類器を用いる。方法を図１Ａおよび１Ｂに概略する。１つの態様において、生物学的サンプルを場合によって希釈して、そして多重化アプタマーアッセイを行う。アッセイ由来のデータを正規化して、そして実施例３に概略するように較正し、そして生じたバイオマーカーレベルをベイズ分類スキームへの入力値として用いる。測定したバイオマーカー各々に関して個々に対数尤度比を計算し、そして次いで、合計して最終分類スコアを生じ、これをまた、診断スコアと称する。生じた割り当て、ならびに全体の分類スコアを報告してもよい。場合によって、各バイオマーカーレベルに関して計算する個々の対数尤度リスク因子もまた報告してもよい。分類スコア計算の詳細を実施例３に提示する。
【０２５７】
キット
[0254]例えば本明細書に開示する方法を実行する際に使用するための、適切なキットを用いて、表１のバイオマーカーの任意の組み合わせ（ならびにさらなる生物医学情報）を検出することも可能である。さらに、任意のキットは、蛍光部分などの本明細書記載の１またはそれより多い検出可能標識を含有することも可能である。
【０２５８】
[0255]１つの態様において、キットには、（ａ）生物学的サンプル中の１またはそれより多いバイオマーカーを検出するための１またはそれより多い捕捉試薬（例えば少なくとも１つのアプタマーまたは抗体）であって、バイオマーカーが、表１中に示すバイオマーカーのいずれかを含む、前記捕捉試薬、および場合によって（ｂ）本明細書にさらに記載するように、ＮＳＣＬＣを持つまたは持たないとして生物学的サンプルを得た個体を分類するための、あるいは個体がＮＳＣＬＣを有する尤度を決定するための、１またはそれより多いソフトウェアまたはコンピュータプログラム製品が含まれる。
【０２５９】
[0256]対応する捕捉試薬およびシグナル生成物質との固体支持体の組み合わせは、本明細書において「検出デバイス」または「キット」と称される。キットにはまた、デバイスおよび試薬を用い、サンプルを取り扱い、そしてデータを分析するための使用説明書も含まれうる。さらに、キットをコンピュータ系またはソフトウェアとともに用いて、生物学的サンプルの分析の結果を分析し、そして報告することも可能である。
【０２６０】
[0257]キットはまた、生物学的サンプルをプロセシングするための、１またはそれより多い試薬（例えば可溶化緩衝液、界面活性剤、洗浄液、または緩衝液）も含有してもよい。本明細書記載の任意のキットにはまた、例えば緩衝液、ブロッキング剤、質量分析マトリックス物質、抗体捕捉剤、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、ソフトウェアおよび情報、例えばプロトコル、ガイダンスおよび参考データも含まれてもよい。
【０２６１】
[0258]１つの側面において、本発明は、ＮＳＣＬＣ状態の分析のためのキットを提供する。該キットには、表１より選択される１またはそれより多いバイオマーカーに関するＰＣＲプライマーが含まれる。キットにはさらに、使用のための使用説明書およびＮＳＣＬＣとバイオマーカーの相関が含まれてもよい。キットにはまた、表１より選択される１またはそれより多いバイオマーカーの相補体を含有するＤＮＡアレイ、試薬、および／またはサンプルＤＮＡを増幅するかまたは単離するための酵素も含まれてもよい。キットにはまた、リアルタイムＰＣＲのための試薬、例えばＴａｑＭａｎプローブおよび／またはプライマー、ならびに酵素が含まれてもよい。
【０２６２】
[0259]例えば、キットは、（ａ）試験サンプル中の１またはそれより多いバイオマーカーを定量化するための少なくとも捕捉試薬を含む試薬であって、前記バイオマーカーが表１に示すバイオマーカー、あるいは本明細書記載の任意の他のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルを含む、前記試薬、および場合によって、（ｂ）試験サンプル中で定量化された各バイオマーカーの量を、１またはそれより多いあらかじめ決定したカットオフに比較して、そして前記比較に基づいて、定量化された各バイオマーカーにスコアを割り当て、定量化された各バイオマーカーに関する割り当てられたスコアを合わせて総スコアを得て、総スコアをあらかじめ決定されたスコアと比較して、そして前記比較を用いて、個体がＮＳＣＬＣを有するかどうか決定する工程を実行するための１またはそれより多いアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを含んでもよい。あるいは、１またはそれより多いアルゴリズムまたはコンピュータプログラムよりも、上記工程を人によって手動で行うための１またはそれより多い使用説明書を提供してもよい。
【０２６３】
コンピュータ法およびソフトウェア
[0260]バイオマーカーまたはバイオマーカーパネルがひとたび選択されたら、個体を診断するための方法は、以下を含むことも可能である：１）生物学的サンプルを収集するかまたは別の方式で得る；２）生物学的サンプルにおいて、パネル中の単数または複数のバイオマーカーを検出し、そして測定する分析法を実行する；３）バイオマーカー値を収集するために用いる方法に必要な任意のデータ正規化または標準化を実行する；４）マーカースコアを計算する；５）マーカースコアを合わせて、総診断スコアを得る；および６）個々の診断スコアを報告する。このアプローチでは、診断スコアは、疾患の存在または非存在の指標であるプリセット閾値と比較して、すべてのマーカー計算の合計から決定した単一の数値であってもよい。または診断スコアは、各々、バイオマーカー値を示す、一連のバーであってもよく、そして反応パターンを、疾患の存在または非存在の決定のため、プリセットパターンに比較してもよい。
【０２６４】
[0261]コンピュータの使用を伴い、本明細書記載の方法の少なくともいくつかの態様を実行してもよい。コンピュータ系１００の例を図６に示す。図６に対する言及とともに、プロセッサ１０１、入力デバイス１０２、出力デバイス１０３、記憶デバイス１０４、コンピュータ読み取り可能記憶媒体読み取り装置１０５ａ、通信系１０６、プロセシング加速（例えばＤＳＰまたは特殊目的プロセッサ）１０７およびメモリ１０９を含む、バス１０８を通じて電気的にカップリングされた、ハードウェア装置で構成される系１００を示す。コンピュータ読み取り可能記憶媒体読み取り装置１０５ａはさらに、コンピュータ読み取り可能記憶媒体１０５ｂ、遠隔、局所、固定および／または取り外し可能記憶デバイスに加えて、コンピュータ読み取り可能情報を一時的におよび／またはより永続的に含有する記憶媒体、メモリ等に包括的に相当する組み合わせにさらにカップリングされ、これには記憶デバイス１０４、メモリ１０９および／または任意の他のこうしたアクセス可能系１００供給源もまた含まれてもよい。系１００はまた、操作系１９２および他のコード１９３、例えばプログラム、データ等を含む、ソフトウェア要素（作業メモリ１９１内に現在位置すると示される）も含む。
【０２６５】
[0262]図６に関して、系１００は、徹底的な柔軟性および設定可能性を有する。したがって、例えば、単一構築を利用して、現在望ましいプロトコル、プロトコル変形、拡張等にしたがって、さらに構成することも可能である。しかし、当業者には、態様が、より特異的な出願必要性にしたがって、十分に利用可能であることが明らかであろう。例えば、１またはそれより多い系の要素を、系１００構成要素内の下位要素（例えば通信システム１０６内）として実行してもよい。カスタム化ハードウェアもまた、利用可能であり、そして／または特定の要素をハードウェア、ソフトウェアまたは両方の中で実施してもよい。さらに、ネットワーク入力／出力デバイス（未提示）などの他の計算デバイスに対する連結が使用可能であるが、他の計算デバイスへの有線、無線、モデム、および／または他の単数または複数の連結もまた利用可能であることが理解されるものとする。
【０２６６】
[0263]１つの側面において、系は、ＮＳＣＬＣに特徴的なバイオマーカーの特徴を含有するデータベースを含んでもよい。バイオマーカーデータ（またはバイオマーカー情報）を、コンピュータ実装法の一部として使用するため、コンピュータへの入力値として利用してもよい。バイオマーカーデータには、本明細書に記載するようなデータが含まれうる。
【０２６７】
[0264]１つの側面において、系はさらに、１またはそれより多いプロセッサに入力データを提供するための１またはそれより多いデバイスを含む。
【０２６８】
[0265]系はさらに、ランキングしたデータ要素のデータセットを記憶するためのメモリを含む。
【０２６９】
[0266]別の側面において、入力データを提供するためのデバイスは、データ要素の特性を検出するための検出装置、例えば質量分析装置または遺伝子チップ読み取り装置を含む。
【０２７０】
[0267]系はさらに、データベース管理系を含むことも可能である。ユーザー要求またはクエリーを、クエリーをプロセシングして、訓練セットのデータベースから適切な情報を抽出するデータベース管理系によって理解される適切な言語にフォーマットしてもよい。
【０２７１】
[0268]系は、ネットワークサーバーおよび１またはそれより多いクライアントが連結するネットワークに連結可能でありうる。ネットワークは、当該技術分野に知られるような、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）であってもよい。好ましくは、サーバーには、ユーザーリクエストをプロセシングするためのデータベースデータにアクセスするため、コンピュータプログラム製品（例えばソフトウェア）を実行するのに必要なハードウェアが含まれる。
【０２７２】
[0269]系には、データベース管理系からの命令を実行するためのオペレーティングシステム（例えばＵＮＩＸ（登録商標）またはＬｉｎｕｘ（登録商標））が含まれてもよい。１つの側面において、オペレーティングシステムは、グローバル・コミュニケーション・ネットワーク、例えばインターネット上で操作可能であり、そしてこうしたネットワークに連結するために、グローバル・コミュニケーション・ネットワーク・サーバーを利用することも可能である。
【０２７３】
[0270]系には、当該技術分野に知られるグラフィカル・ユーザー・インターフェースにルーチンに見られるような、ボタン、プルダウンメニュー、スクロールバー、テキストを入力するためのフィールドなどのインターフェース要素を含むグラフィカル・ディスプレイ・インターフェースを含む１またはそれより多いデバイスが含まれてもよい。ユーザー・インターフェース上に入力されたリクエストを、フォーマットのための系におけるアプリケーションプログラムに伝達して、系のデータベースの１またはそれより多くにおいて、適切な情報を検索してもよい。ユーザーによって入力されるリクエストまたはクエリーを、任意の適切なデータベース言語で構築してもよい。
【０２７４】
[0271]オペレーティング・システムの一部としてのグラフィカル・ユーザー・インターフェース・コードによって、グラフィカル・ユーザー・インターフェースを生成して、そしてこれを用いてデータを入力し、そして／または入力されたデータをディスプレイしてもよい。プロセシングされたデータの結果をインターフェース中にディスプレイし、系とのコミュニケーションがあるプリンター上で印刷し、メモリデバイス中に保存し、そして／またはネットワーク上で伝達することも可能であるし、あるいはコンピュータ読み取り可能媒体の形で提供してもよい。
【０２７５】
[0272]系は、系にデータ要素に関するデータ（例えば発現値）を提供するための入力デバイスとコミュニケーションがあってもよい。１つの側面において、入力デバイスには、遺伝子発現プロファイリング系が含まれてもよく、これには、例えば質量分析装置、遺伝子チップまたはアレイ読み取り装置等が含まれる。
【０２７６】
[0273]多様な態様にしたがって、ＮＳＣＬＣバイオマーカー情報を分析するための方法および装置を、任意の適切な方式で、例えばコンピュータ系上で作動するコンピュータプログラムを用いて、実行可能である。プロセッサおよびランダムアクセスメモリを含む慣用的なコンピュータ系、例えば遠隔アクセス可能アプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピュータまたはワークステーションが使用可能である。さらなるコンピュータ系構成要素には、メモリデバイスまたは情報記憶系、例えば大量記憶系およびユーザーインターフェース、例えば慣用的モニター、キーボードおよびトラッキングデバイスが含まれてもよい。コンピュータ系は、サーバーおよび１またはそれより多いデータベースを含む、独立型の系またはネットワークの一部であってもよい。
【０２７７】
[0274]ＮＳＣＬＣバイオマーカー分析系は、データ分析、例えばデータ収集、プロセシング、分析、報告および／または診断を完了する機能および操作を提供可能である。例えば、１つの態様において、コンピュータ系は、ＮＳＣＬＣバイオマーカーに関連する情報を受け取り、保存し、検索し、分析し、そして報告することも可能なコンピュータプログラムを実行可能である。コンピュータプログラムは、多様な機能または操作を実行する多数のモジュール、例えば生データをプロセシングし、そして補足データを生成するためのプロセシングモジュール、ならびに生データおよび補足データを分析して、ＮＳＣＬＣ状態および／または診断を生成するための分析モジュールを含むことも可能である。ＮＳＣＬＣ状態の診断は、疾患に関連する個体の状態に関する、さらなる生物医学情報を含む任意の他の情報を生成するかまたは収集し、さらなる試験が望ましい可能性があるかどうかを同定し、あるいは別の方式で個体の健康状態を評価する工程を含んでもよい。
【０２７８】
[0275]ここで、図７を参照すると、開示する態様の原理にしたがってコンピュータを利用する方法の例を見ることが可能である。図７において、フローチャート３０００を示す。ブロック３００４において、個体に関して、バイオマーカー情報を回収することも可能である。バイオマーカー情報は、コンピュータデータベースから、例えば個々の生物学的サンプルの試験を行った後に、回収してもよい。バイオマーカー情報は、表１に提供するバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含んでもよく、ここでＮ＝２〜５９である。ブロック３００８において、コンピュータを利用して、バイオマーカー値各々を分類してもよい。そして、ブロック３０１２において、複数の分類に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度に関して決定を行ってもよい。表示は、人によって見られうるような、ディスプレイまたは他の表示デバイスへの出力であってもよい。したがって、表示は、例えば、コンピュータのディスプレイスクリーンまたは他の出力デバイス上にディスプレイされてもよい。
【０２７９】
[0276]ここで図８を参照すると、別の態様にしたがって、コンピュータを利用する代替法を、フローチャート３２００を通じて例示可能である。ブロック３２０４において、コンピュータを利用して、個体に関するバイオマーカー情報を回収してもよい。バイオマーカー情報は、表１に提供するバイオマーカー群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む。ブロック３２０８において、バイオマーカー値の分類をコンピュータで行ってもよい。そして、ブロック３２１２において、分類に基づいて、個体がＮＳＣＬＣを有する尤度に関して、表示を行ってもよい。表示は、人によって見られうるような、ディスプレイまたは他の表示デバイスへの出力であってもよい。したがって、例えば、コンピュータのディスプレイスクリーンまたは他の出力デバイス上にディスプレイされてもよい。
【０２８０】
[0277]コンピュータプログラム製品を含むように、本明細書記載のいくつかの態様を実行してもよい。コンピュータプログラム製品には、データベースを含むコンピュータ上でアプリケーションプログラムを実行させる媒体において具体化される、コンピュータ読み取り可能プログラムコードを有する、コンピュータ読み取り可能媒体が含まれてもよい。
【０２８１】
[0278]本明細書において、「コンピュータプログラム製品」は、任意の性質の物理的媒体（例えば書面、電子、磁気、光学またはその他）に含有され、そしてコンピュータまたは他の自動化データプロセシング系で使用可能な、自然言語またはプログラミング言語命令文の形の命令の系統的セットを指す。こうしたプログラミング言語命令文は、コンピュータまたはデータプロセシング系によって実行された際、コンピュータまたはデータプロセシング系が、特定の内容の命令文にしたがって働くようにする。コンピュータプログラム製品には、限定なしに：ソースコードおよびオブジェクトコード中のプログラムおよび／またはコンピュータ読み取り可能媒体中に埋め込まれた試験またはデータライブラリが含まれる。さらに、コンピュータ系またはデータプロセシング装置デバイスが、あらかじめ選択された方式で作用することを可能にするコンピュータプログラム製品を、限定されるわけではないが、オリジナルソースコード、アセンブリコード、オブジェクトコード、機械言語、前述およびあらゆる同等物の暗号化または圧縮型を含む、多くの型で提供してもよい。
【０２８２】
[0279]１つの側面において、コンピュータプログラム製品を、ＮＳＣＬＣの尤度を示すために提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが表１に提供するバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中の少なくともＮのバイオマーカーの１つに各々対応するバイオマーカー値を含み、ここで、Ｎ＝２〜５９である、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体のＮＳＣＬＣ状態を示す、分類法を実行するコードを含む。
【０２８３】
[0280]さらに別の側面において、コンピュータプログラム製品を、ＮＳＣＬＣの尤度を示すために提供する。コンピュータプログラム製品には、計算デバイスまたは系のプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、プログラムコードは：個体由来の生物学的サンプルに起因するデータを回収するコードであって、データが表１に提供するバイオマーカー群より選択される、生物学的サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む、前記コード；およびバイオマーカー値の関数として、個体のＮＳＣＬＣ状態を示す、分類法を実行するコードを含む。
【０２８４】
[0281]多様な態様を方法または装置として記載してきているが、態様が、コンピュータとカップリングしたコード、例えばコンピュータ上に常在するかまたはコンピュータによってアクセス可能なコードを通じて実行可能であることが理解されるべきである。例えば、ソフトウェアおよびデータベースを利用して、上に論じる方法の多くを実行することも可能である。したがって、ハードウェアによって達成される態様に加えて、具体化され、本明細書に開示する機能を使用可能にするコンピュータ読み取り可能プログラムコードを有するコンピュータ使用可能媒体で構成される製品の使用を通じて、達成可能であることもまた注目される。したがって、そのプログラムコード手段における態様もまた、本特許によって保護されると見なされることが望ましい。さらに、態様は、限定なしにＲＡＭ、ＲＯＭ、磁気媒体、光学媒体、または磁気光学媒体を含む、実質的に任意の種類のコンピュータ読み取り可能メモリ中に記憶されるコードとして具体化可能である。さらにより一般的に、態様は、ソフトウェア中で、またはハードウェア中で、またはその任意の組み合わせで実行可能であり、限定されるわけではないが、汎用プロセッサ、マイクロコード、ＰＬＡ、またはＡＳＩＣ上で動くソフトウェアが含まれる。
【０２８５】
[0282]搬送波中で具体化されるコンピュータシグナル、ならびに伝達媒体を通じて伝搬するシグナル（例えば電気的および光学的）として、態様を達成可能であることもまた想定される。したがって、上に論じる多様なタイプの情報を、構造、例えばデータ構造にフォーマットし、そして伝達媒体を通じて、電気シグナルとして伝達するか、またはコンピュータ読み取り可能媒体上で記憶させることも可能である。
【０２８６】
[0283]本明細書に列挙する多くの構造、材料、および行為が、機能を実行するための手段、または機能を実行するための工程として列挙されうることもまた注目される。したがって、こうした言語は、本明細書に援用されるものを含めて、本明細書内に開示されるすべてのこうした構造、材料、または行為、およびその同等物を含む権利を与えられることが認識されなければならない。
【０２８７】
[0284]バイオマーカー同定プロセス、本明細書に開示するバイオマーカーの利用、およびバイオマーカー値を決定するための多様な方法を、ＮＳＣＬＣに関して上に詳細に記載する。しかし、プロセスの適用、同定されるバイオマーカーの使用、およびバイオマーカー値を決定するための方法は、他の特定のタイプの癌、癌一般、任意の他の疾患または医学的状態、あるいは補助医学治療によって利益を受けうるまたは受けない可能性がある個体の同定に、完全に適用可能である。ＮＳＣＬＣに関連する特定の結果に言及する場合を除いて、文脈から明らかであるように、ＮＳＣＬＣに対する本明細書の言及は、他のタイプの癌、癌一般、あるいは任意の他の疾患または医学的状態を含むことが理解されうる。
【実施例】
【０２８８】
[0285]以下の実施例は、例示目的のみのために提供され、そして付随する請求項によって定義されるような適用の範囲を限定することを意図しない。当業者に周知であり、そしてルーチンである標準技術を用いて、本明細書記載のすべての実施例を実行した。以下の実施例に記載するルーチンの分子生物学技術は、標準的実験室マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１）に記載されるように実行可能である。
【０２８９】
実施例１．  サンプルの多重化アプタマー分析
[0286]本実施例は、表１に示すバイオマーカーセットの同定のため（図９を参照されたい）、そして表１９に示す癌バイオマーカーの同定のため、サンプルおよび対照を分析する多重化アプタマーアッセイを記載する。ＮＳＣＬＣ、中皮腫および腎細胞癌研究のため、多重化分析は、各々特異的ターゲットに対してユニークである、１，０３４アプタマーを利用した。
【０２９０】
[0287]本方法において、各溶液添加に関して、ピペットチップを交換した。
【０２９１】
[0288]また、別に示さない限り、大部分の溶液トランスファーおよび洗浄液添加は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦｘＰの９６ウェルヘッドを用いた。手動でピペッティングされる方法工程は、別に示さない限り、１２チャネルＰ２００  Ｐｉｐｅｔｔｅｍａｎ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  ＬＬＣ，  カリフォルニア州オークランド）を用いた。ＳＢ１７と称されるカスタム緩衝液は、社内で調製され、これは、ｐＨ７．５で、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ。ＳＢ１８と称されるカスタム緩衝液は、社内で調製され、これは、ｐＨ７．５で、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだ。別に示さない限り、すべての工程を室温で実行した。
【０２９２】
[0289]１．  アプタマーストック溶液の調製
[0290]５％、０．３１６％および０．０１％血清のためのカスタムストックアプタマー溶液を、１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中、２倍濃度で調製した。
【０２９３】
[0291]これらの溶液を使用まで−２０℃で保存する。アッセイ当日、各加熱工程の間に激しく混合しながら、各アプタマー混合物を３７℃で１０分間融解し、沸騰水槽中に１０分間入れ、そして２５℃に２０分間の冷却を可能にした。加熱−冷却後、５５μＬの各２ｘアプタマー混合物を９６ウェルＨｙｂａｉｄプレート内に手動でピペッティングし、そしてプレートをホイルで密封した。最終結果は、５％、０．３１６％または０．０１％アプタマー混合物を含む、３つの９６ウェルホイル密封Ｈｙｂａｉｄプレートであった。個々のアプタマー濃度は、２ｘ最終または１ｎＭであった。
【０２９４】
[0292]２．  アッセイサンプル調製物
[0293]−８０℃で保存された、１００％血清または血漿の凍結アリコットを、２５℃水槽に１０分間入れた。融解したサンプルを氷上に置き、穏やかに８秒間ボルテックスし（４にセット）、そして次いで氷上に置いた。
【０２９５】
[0294]５０μＬの８チャネルに渡るピペッターを用いて、８μＬのサンプルを、各ウェルが適切なサンプル希釈剤（血清に関しては１ｘＳＢ１７または血漿に関しては０．８ｘＳＢ１８に加えて、０．０６％Ｔｗｅｅｎ−２０、１１．１μＭ  Ｚ−ブロック＿２、０．４４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．２ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、１．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５５．６μＭ  ＥＤＴＡ）７２μＬを含有する、９６ウェルＨｙｂａｉｄプレートに４℃でトランスファーすることによって、１０％サンプル溶液（２ｘ最終）を調製した。このプレートを、ＢｉｏｍｅｋＦｘＰロボット上で次のサンプル希釈工程が始まるまで、氷上で保存した。
【０２９６】
[0295]サンプルおよびアプタマー平衡化を開始するため、１０％サンプルプレートを短時間遠心分離し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＦＸ上に置き、ここで、９６ウェルピペッターを用いて上下にピペッティングすることによって混合した。次いで、６μＬの１０％サンプルを、２ｍＭ  ＡＥＢＳＦを含む８９μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０内で希釈することによって、０．６３２％サンプルプレート（２ｘ最終）を調製した。次に、６μＬの生じた０．６３２％サンプルを１８４μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０内で希釈して、０．０２％サンプルプレート（２ｘ最終）を作製した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦｘＰ上で希釈を行った。各トランスファー後、上下にピペッティングすることによって、溶液を混合した。次いで、５５μＬのサンプルを、５５μＬの適切な２ｘアプタマー混合物に添加することによって、３つのサンプル希釈プレートをそれぞれのアプタマー溶液に移した。上下にピペッティングすることによって、サンプルおよびアプタマー溶液をロボット上で混合した。
【０２９７】
[0296]３．  サンプル平衡化結合
[0297]サンプル／アプタマープレートをホイルで密封し、そして捕捉１工程に進む前に、３７℃インキュベーター中に３．５時間入れた。
【０２９８】
[0298]４．  捕捉２ビーズプレートの調製
[0299]ＭｙＯｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）ストレプトアビジンＣ１ビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）の１１ｍＬのアリコットを、等体積の２０ｍＭ  ＮａＯＨ（各洗浄に関して５分間のインキュベーション）で２回、等体積の１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、そして１１ｍＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に再懸濁した。１２スパンのマルチチャネルピペッターを用いて、５０μＬのこの溶液を９６ウェルＨｙｂａｉｄプレートの各ウェルに手動でピペッティングした。次いで、プレートをホイルで覆い、そしてアッセイで使用するため、４℃で保存した。
【０２９９】
[0300]５．  捕捉１ビーズプレートの調製
[0301]３つの０．４５μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＶプレート（Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜、カタログ番号ＭＡＨＶＮ４５５０）を１００μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で少なくとも１０分間平衡化した。次いで、平衡化緩衝液を、プレートを通じてろ過し、そして１３３．３μＬの７．５％ストレプトアビジン−アガロースビーズスラリー（１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を各ウェルに添加した。ストレプトアビジン−アガロースビーズをフィルタープレート内にトランスファーしつつ、懸濁状態で維持するため、ビーズ溶液を、２００μＬ、１２チャネルピペッターで、ピペッティング事象の間に、少なくとも６回、手動で混合した。ビーズを３つのフィルタープレートに渡って分配した後、真空を適用して、ビーズ上清を除去した。最後に、ビーズをフィルタープレート中で、２００μＬ  １ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、そして次いで、２００μＬ  １ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に再懸濁した。フィルタープレートの底をブロットし、そしてプレートをアッセイで使用するために保存した。
【０３００】
[0302]６．  Ｃｙｔｏｍａｔの装填
[0303]Ｃｙｔｏｍａｔをすべてのチップ、プレート、トラフ中のすべての試薬（プレートへの添加直前に新鮮に調製したＮＨＳ−ビオチン試薬を除く）、３つの調製捕捉１フィルタープレート、および１つの調製ＭｙＯｎｅプレートに装填した。
【０３０１】
[0304]７．  捕捉１
[0305]３．５時間の平衡化時間後、サンプル／アプタマープレートをインキュベーターから取り除き、約１分間遠心分離し、カバーを取り外し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦｘＰ上に置いた。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦｘＰプログラムを開始した。別に示さない限り、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦｘＰロボットによって、捕捉１のすべての続く工程を実行した。プログラム内で、捕捉１フィルタープレートに真空を適用して、ビーズ上清を取り除いた。各１００マイクロリットルの５％、０．３１６％および０．０１％平衡化結合反応をそれぞれの捕捉１ろ過プレートに添加し、そしてデッキ上の軌道振盪装置を８００ｒｐｍで１０分間用いて、各プレートを混合した。
【０３０２】
[0306]未結合溶液を真空ろ過によって除去した。溶液を分配し、そして直ちに真空で抜き取ってプレートを通じて溶液をろ過することによって、捕捉１ビーズを、１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中の１９０μＬの１００μＭビオチンで、その後、５ｘ１９０μＬのＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で、洗浄した。
【０３０３】
[0307]８．  タグ化
[0308]無水ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ  ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンアリコットを３７℃で６分間融解し、そして次いで、タグ化緩衝液（ｐＨ７．２５のＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１：１００に希釈した。ロボットプロンプトに際して、希釈したＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン試薬をデッキ上のトラフに添加して、そしてロボットプログラムを手動で再開して、１００μＬのＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンを、各捕捉１フィルタープレートの各ウェルに分配した。この溶液を、軌道振盪装置上、８００ｒｐｍで５分間振盪しながら、捕捉１ビーズとのインキュベーションを可能にした。
【０３０４】
[0309]９．  動力学的曝露および光切断
[0310]真空ろ過によってタグ化反応を取り除き、そして１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中の１５０μＬの２０ｍＭグリシンを捕捉１プレートに添加することによって停止した。ＮＨＳ−タグ／グリシン溶液を真空ろ過を通じて取り除いた。次に、１５００μＬ  ２０ｍＭグリシン（１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を各プレートに添加し、そして軌道振盪装置上で１分間インキュベーションした後、真空ろ過によって取り除いた。
【０３０５】
[0311]続いて、１９０μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を３回添加し、その後、真空濾過し、そして次いで１９０μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を８００ｒｐｍで１分間振盪しながら添加し、その後、真空ろ過することによって、捕捉１プレートのウェルを３回洗浄した。最後の洗浄後、プレートを１ｍＬの深ウェルプレートの上に置き、そしてデッキから取り除いた。捕捉１プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、溶出前に、アガロースビーズから外部の体積をできる限り多く取り除いた。
【０３０６】
[0312]Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦｘＰ上にプレートを戻し、そして８５μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中の１０ｍＭ  ＤｘＳＯ４をフィルタープレートの各ウェルに添加した。
【０３０７】
[0313]フィルタープレートをデッキから取り除き、ＢｌａｃｋＲａｙ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州レディング）光源下、Ｖａｒｉｏｍａｇ  Ｔｈｅｒｍｏｓｈａｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）上に置き、そして８００ｒｐｍで振盪しながら５分間照射した。５分間インキュベーションした後、プレートを１８０°回転させ、そしてさらに５分間振盪しながら照射した。
【０３０８】
[0314]まず５％捕捉１フィルタープレートを１ｍＬの深ウェルプレートの上に置き、そして１０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって、光切断溶液を各捕捉１プレートから共通の深ウェルプレート内に連続して溶出させた。次いで、０．３１６％および０．０１％捕捉１プレートを同じ深ウェルプレート内に連続して遠心分離した。
【０３０９】
[0315]１０．  捕捉２ビーズ捕捉
[0316]捕捉１の合わせた溶出物を含有する１ｍＬ深ウェルブロックを、捕捉２のため、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦｘＰのデッキ上に置いた。
【０３１０】
[0317]ロボットは、すべての光切断溶出物を、１ｍＬ深ウェルプレートから、先に調製した捕捉２  ＭｙＯｎｅ磁気ビーズ（磁気分離を通じてＭｙＯｎｅ緩衝液を除去した後）を含有するＨｙｂａｉｄプレート上に移した。
【０３１１】
[0318]Ｖａｒｉｏｍａｇ  Ｔｈｅｒｍｏｓｈａｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）上、１３５０ｒｐｍで振盪しながら、２５℃で５分間、溶液をインキュベーションした。
【０３１２】
[0319]ロボットは、プレートをデッキ上の磁気分離装置ステーションにトランスファーした。プレートを磁石上で９０秒間インキュベーションした後、上清を除去し、そして廃棄した。
【０３１３】
[0320]１１．  ３７℃  ３０％グリセロール洗浄
[0321]捕捉２プレートをデッキ上のサーマル振盪装置に移し、そして７５μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を各ウェルにトランスファーした。プレートを１３５０ｒｐｍおよび３７℃で１分間混合して、ビーズを再懸濁して、そして温めた。捕捉２プレートの各ウェルに、７５μＬの６０％グリセロールを３７℃でトランスファーし、そしてプレートをさらに１分間、１３５０ｒｐｍおよび３７℃で混合し続けた。ロボットは、プレートを３７℃磁気分離装置にトランスファーし、ここで磁石上で２分間、プレートをインキュベーションし、そして次いで、ロボットを取り除き、そして上清を廃棄した。これらの洗浄をさらに２回反復した。
【０３１４】
[0322]捕捉２ビーズから３回目の３０％グリセロール洗浄を除去した後、１５０μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を各ウェルに添加し、そして３７℃でインキュベーションし、１３５０ｒｐｍで１分間振盪した後、３７℃の磁石上の磁気分離によって除去した。
【０３１５】
[0323]捕捉２ビーズを、最後に、１５０μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて１分間インキュベーションしながら１３５０ｒｐｍ、２５℃で振盪した後、磁気分離した。
【０３１６】
[0324]１２．  捕捉２ビーズ溶出および中和
[0325]１０５μＬの１００ｍＭ  ＣＡＰＳＯと１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を各ウェルに添加することによって、捕捉２ビーズからアプタマーを溶出した。この溶液とともに、１３００ｒｐｍで５分間振盪しながらビーズをインキュベーションした。
【０３１７】
[0326]次いで、捕捉２プレートを、磁気分離装置上に９０秒間置いた後、６３μＬの溶出物を、各ウェル中に７μＬの５００ｍＭ  ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する新規９６ウェルプレートにトランスファーした。トランスファー後、６０μＬを上下に５回ピペッティングすることによって、溶液をロボットで混合した。
【０３１８】
[0327]１３．  ハイブリダイゼーション
[0328]Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦｘＰは、２０μＬの中和捕捉２溶出物を、新鮮なＨｙｂａｉｄプレートにトランスファーし、そしてハイブリダイゼーション対照の１０ｘスパイクを含有する６μＬの１０ｘＡｇｉｌｅｎｔブロックを各ウェルに添加した。次に、３０μＬの２ｘＡｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーション緩衝液を、手動で、中和サンプルおよびブロッキング緩衝液を含有するプレートの各ウェルにピペッティングし、そして大規模な泡形成を回避するため、２５μＬを手動で上下にゆっくりと１５回ピペッティングすることによって、溶液を混合した。プレートを１０００ｒｐｍで１分間回転させた。
【０３１９】
[0329]いくつかのプライマー領域に加えて、アプタマーランダム領域に相補的なプローブを含有するように、カスタムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスライド（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）を設計した。アプタマーの大部分に関しては、相補配列の最適な長さを経験的に決定し、そしてこれは、４０〜５０ヌクレオチドの範囲であった。後者のアプタマーに関しては、４６量体の相補領域をデフォルトで選択した。総プローブ長６０ヌクレオチドに関して、ポリＴリンカーでスライド表面にプローブを連結した。
【０３２０】
[0330]ガスケットスライドをＡｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーションチャンバー内に入れ、そしてハイブリダイゼーションおよびブロッキング溶液を含有する４０μＬの各サンプルを、手動で、各ガスケット内にピペッティングした。泡形成を最小限にするよう意図された方式で、８チャネル可変スパンピペッターを用いた。次いで、カスタムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスライド（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）を番号バーコードが上を向くようにして、ゆっくりとガスケットスライド上に下ろした（詳細な説明に関しては、Ａｇｉｌｅｎｔマニュアルを参照されたい）。
【０３２１】
[0331]ハイブリダイゼーションチャンバーの上部を、スライド／裏打ちサンドイッチ上に置き、そして固定ブラケットを全アセンブリ上にスライドさせた。ねじをしっかり回すことによって、これらのアセンブリをきつく固定した。
【０３２２】
[0332]各スライド／裏打ちスライドサンドイッチを視覚的に検査して、溶液の泡がサンプル内を自由に移動可能であることを確認した。泡が自由に移動していない場合、ハイブリダイゼーションチャンバーアセンブリを穏やかにタッピングして、ガスケット近くに止まった泡を解放した。
【０３２３】
[0333]組み立てたハイブリダイゼーションチャンバーをＡｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーションオーブン中で、２０ｒｐｍで回転させながら６０℃で１９時間インキュベーションした。
【０３２４】
[0334]１４．  ハイブリダイゼーション後洗浄
[0335]およそ４００ｍＬのＡｇｉｌｅｎｔ洗浄緩衝液１を２つの別個の各ガラス染色プレートに入れた。染色プレートの１つを磁気攪拌プレートおよびスライドラック上に置き、そして攪拌バーを緩衝液内に入れた。
【０３２５】
[0336]攪拌バーを空のガラス染色プレート内に入れることによって、Ａｇｉｌｅｎｔ洗浄液２に関する染色プレートを調製した。
【０３２６】
[0337]第四のガラス染色プレートを最終アセトニトリル洗浄のために取り置いた。
【０３２７】
[0338]６つのハイブリダイゼーションチャンバー各々を分解した。１つずつ、スライド／裏打ちサンドイッチをハイブリダイゼーションチャンバーから取り外し、そして洗浄液１を含有する染色プレート内に浸した。マイクロアレイスライドを浸したまま、ピンセットを用いて、スライド／裏打ちサンドイッチをこじ開けた。スライドを、磁気攪拌プレート上の洗浄液１染色プレート中のスライドラックに迅速にトランスファーした。
【０３２８】
[0339]スライドラックを穏やかに５回上下させた。磁気攪拌装置を低いセッティングでオンにし、そしてスライドを５分間インキュベーションした。
【０３２９】
[0340]洗浄液１に関して残り１分となったら、インキュベーター中で３７℃にあらかじめ温めた洗浄緩衝液２を第二の調製された染色プレートに添加した。スライドラックを迅速に洗浄緩衝液２にトランスファーし、そしてラックの底にあるいかなる過剰な緩衝液も、染色プレートの上部で掻き取ることによって取り除いた。スライドラックを穏やかに５回上下させた。磁気攪拌装置を低いセッティングでオンにし、そしてスライドを５分間インキュベーションした。
【０３３０】
[0341]スライドラックをゆっくりと洗浄液２から引き出し、およそ１５秒間掛けてスライドを溶液から取り除いた。
【０３３１】
[0342]洗浄液２において残り１分となったら、アセトニトリル（ＡＣＮ）を第四の染色プレートに添加した。スライドラックをアセトニトリル染色プレートにトランスファーした。スライドラックを穏やかに５回上下させた。磁気攪拌装置を低いセッティングでオンにし、そしてスライドを５分間インキュベーションした。
【０３３２】
[0343]スライドラックをゆっくりとＡＣＮ染色プレートから引き出し、そして吸収タオル上に置いた。スライドの底の縁を迅速に乾燥させ、そしてスライドをきれいなスライドボックス内に入れた。
【０３３３】
[0344]１５．  マイクロアレイ画像化
[0345]マイクロアレイスライドをＡｇｉｌｅｎｔスキャナスライドホルダーに入れ、そして製造者の指示にしたがって、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナに装填した。
【０３３４】
[0346]スライドをＣｙ３−チャネル中、５μｍ解像度で１００％ＰＭＴ設定および０．０５で有効にしたＸＲＤオプションで画像化した。Ａｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェア、バージョン１０．５を用いて、生じたｔｉｆｆ画像をプロセシングした。
【０３３５】
実施例２．  バイオマーカー同定
[0347]ＣＴスキャンまたは他の画像化法で同定された不確定の肺小結節を持つ個体においてＮＳＣＬＣを診断し、ＮＳＣＬＣに関して高リスク喫煙者をスクリーニングし、そしてＮＳＣＬＣを持つ個体を診断するために、潜在的なＮＳＣＬＣバイオマーカーの同定を行った。本研究のための登録基準は、喫煙者、年齢１８歳またはそれより上、インフォームドコンセントを提供可能であるもの、ならびにＮＳＣＬＣまたは良性知見の血液サンプルおよび文書化診断である。症例に関しては、血液サンプルを治療または手術前に収集し、そして続いてＮＳＣＬＣと診断した。排除基準には、血液抜き取り５年以内の、癌（皮膚の扁平上皮癌を除く）の先の診断または治療が含まれた。血清サンプルを３つの異なる部位から収集し、そして表１７に記載するように、これには、４６のＮＳＣＬＣサンプルおよび２１８の対照群サンプルが含まれた。実施例１に記載するような多重化アプタマーアフィニティアッセイを用いて、これらの２６４サンプル各々において、１，０３４分析物に関するＲＦＵ値を測定し、そして報告した。
【０３３６】
[0348]１，０３４分析物各々に関して、クラス依存性累積分布関数（ｃｄｆ）を生成することによって、症例および対照集団各々を別個に比較した。２セットのサンプル由来の値の間のＫＳ距離（コルモゴロフ−スミルノフ統計値）は、１つのセット（セットＡ）由来の値の経験分布が、他のセット（セットＢ）由来の値の分布と異なる度合いのノンパラメトリック測定値である。閾値Ｔの任意の値に関して、セットＡ由来の値のある程度の割合はＴ未満であろうし、そしてセットＢ由来の値のある程度の割合はＴ未満であろう。ＫＳ距離は、任意の選択のＴに関して２つのセット由来の値の割合の間の最大（符号なし）相違を測定する。
【０３３７】
[0349]潜在的なバイオマーカーのこのセットを用いて、サンプルを対照群または疾患群のいずれかに割り当てる分類器を構築してもよい。実際、バイオマーカーのこれらのセットから多くのこうした分類器を産生し、そして任意のバイオマーカーが優れたスコアリング分類器中で用いられる頻度を決定した。上位のスコアリング分類器の中で最も頻繁に生じるバイオマーカーは、診断試験を生成するのに最も有用であった。本実施例において、ベイズ分類器を用いて、分類空間を探索したが、多くの他の教師付き学習技術をこの目的のために使用可能である。疾患有病率を０．５と仮定する、ベイズ表面での分類器の受信者動作特性曲線下面積（ＲＯＣのＡＵＣ）によって、任意の個々の分類器のスコアリング適合性を評価した。このスコアリング測定基準はゼロから１の間で多様であり、１が誤差を伴わない分類器である。バイオマーカー集団測定からベイズ分類器を構築する詳細を、実施例３に記載する。
【０３３８】
[0350]表１中の５９の分析物を用いて、総数９６４の１０分析物分類器は、対照群からＮＳＣＬＣを診断するため、０．９４のＡＵＣを持つことが見出された。分類器のこのセットから、総数１２のバイオマーカーが３０％またはそれより多い高スコアリング分類器中に存在することが見出された。表１３は、これらの潜在的なバイオマーカーのリストを提供し、そして図１０は、同定されたバイオマーカーに関する頻度プロットである。
【０３３９】
実施例３．  ＮＳＣＬＣに関する単純ベイズ分類
[0351]ＮＳＣＬＣおよび対照の間を区別するために有用であると同定されたバイオマーカーのリストから、１０バイオマーカーのパネルを選択し、そして単純ベイズ分類器を構築した。表１６および１８を参照されたい。クラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）、ｐ（ｘｉ｜ｃ）およびｐ（ｘｉ｜ｄ）、式中、ｘｉはバイオマーカーｉに関する測定されたＲＦＵ値の対数であり、そしてｃおよびｄは、対照および疾患集団を指す、は、平均μおよび分散σ２によって特徴付けられる対数正規分布関数としてモデル化された。１０バイオマーカーのｐｄｆに関するパラメータを表１６に列挙し、そして通常のｐｄｆに適合するモデルとともに生データの例を図５に示す。根底にある仮定は、図５に立証されるように、データに非常によく適合するようである。
【０３４０】
[0352]こうしたモデルに関する単純ベイズ分類を、検定に適した以下の等式によって提供し、式中、ｐ（ｄ）は、集団における疾患の有病率であり、
【０３４１】
【化１３】
0005986638.tif 000014
【０３４２】
そしてｎ＝１０である。合計の項は各々、個々のマーカーに関する対数尤度比であり、そして疾患を有するものに対して、関心対照の疾患（すなわちこの場合、ＮＳＣＬＣ）を含まないサンプル
【０３４３】
【化１４】
0005986638.tif 000015
【０３４４】
の総対数尤度比は、単純に、これらの個々の項の合計に、疾患の有病率を構成する項を加えたものである。単純にするため、本発明者らは、ｐ（ｄ）＝０．５と仮定し、したがって、
【０３４５】
【化１５】
0005986638.tif 000016
【０３４６】
である。
【０３４７】
[0353]６．９、８．７、７．９、９．８、８．４、１０．６、７．３、６．３、７．３、８．１の１０のバイオマーカー各々に関する対数（ＲＦＵ）における未知のサンプル測定を所与として、分類の計算を表１６に詳述する。対照クラスに対する疾患の対数尤度比を含む個々の構成要素を表にし、そして表１６中のパラメータおよび
【０３４８】
【化１６】
0005986638.tif 000017
【０３４９】
の値から計算してもよい。個々の対数尤度比の合計は−１１．５８４であり、または疾患を有するものに対して疾患を持たない尤度は１０７，３８６であり、ここで、尤度ｅ１１．５８４＝１０７，３８６である。最初の３つのバイオマーカー値は、疾患群とより一致する尤度を有する（対数尤度＞０）が、残りの７つのバイオマーカーは、すべて対照群を支持することが見出される。尤度をともに乗じると、上記に示すものと同じ結果が得られ；未知のサンプルが疾患を含まない尤度は１０７，３８６である。実際、このサンプルは訓練セット中の対照群由来であった。
【０３５０】
実施例４．  分類器のためのバイオマーカーパネルを選択するための欲張りアルゴリズム
[0354]本実施例は、本明細書記載の方法いずれかにおいて分類器として使用可能なパネルを形成する、表１からのバイオマーカーの選択を記載する。表１中のバイオマーカーのサブセットを選択して、優れた性能の分類器を構築した。本方法はまた、どの潜在的なマーカーが実施例２中のバイオマーカーとして含まれるかを決定した。
【０３５１】
[0355]本明細書で用いた分類器性能の測定値はＡＵＣであり；０．５の性能は、ランダム（コイントス）分類器に関するベースライン期待値であり、ランダムより劣った分類器は、０．０〜０．５の間にスコアされ、ランダム性能より優れた分類器は０．５〜１．０の間にスコアされるであろう。誤差がない完全な分類器は、１．０の感度および１．０の特異性を有するであろう。実施例４に記載する方法を、Ｆ値、感度および特異性の合計、または感度および特異性の積などの性能の他の一般的な測定値に適用することも可能である。特に、ある程度の感度を犠牲にして、より高い特異性を持って実行する分類器を選択するため、またはある程度の特異性を犠牲にして、より高い感度を持って実行する分類器を選択するため、感度および特異性を異なる加重で処理したいと希望する可能性もある。本明細書記載の方法は、「性能」の測定値を伴うのみであるため、単一の性能測定値を生じる任意の加重スキームが使用可能である。異なる適用は、真の陽性および真の陰性発見に関して異なる利点を有し、そしてまた、偽陰性発見とは異なる、偽陽性発見に関するコストを有するであろう。例えば、無症候性喫煙者およびＣＴで発見される良性小結節の示差診断をスクリーニングする工程は、一般的に、特異性および感度の間の同じ最適なトレードオフを持たないであろう。２つの試験の異なる要求は、一般的に、性能測定値に反映される、陽性および陰性の誤った分類に異なる加重を設定することを必要とするであろう。性能測定値を変化させると、一般的に、所定のデータセットに関して、表１から選択されるマーカーの正確なサブセットが変化するであろう。
【０３５２】
[0356]実施例３に記載する、対照サンプルからＮＳＣＬＣサンプルを区別するためのベイズアプローチに関して、分類器は、疾患および良性訓練サンプルにおけるバイオマーカーの分布によって完全にパラメータ化され、そしてバイオマーカーのリストは表１から選択された；すなわち、包含するよう選択されたマーカーのサブセットは、訓練データセットを所与として、１対１方式で分類器を決定した。
【０３５３】
[0357]本明細書で使用する欲張り法を用いて、表１由来のマーカーの最適なサブセットに関して検索した。少数のマーカーまたは比較的少数のマーカーを含む分類器に関して、ありうるマーカーサブセットすべてを列挙し、そして特定のマーカーセットで構築される分類器の性能に関して評価した（実施例４、パート２を参照されたい）。（このアプローチは、「最適サブセット選択」として統計分野に周知である；例えばＨａｓｔｉｅらを参照されたい）。しかし、本明細書記載の分類器に関して、多数のマーカーの組み合わせ数は非常に大きくなる可能性があり、そして１０マーカーのすべてのあり得るセットを評価することは実行可能でなく、これは、わずか３０の総分析物のリストから３０，０４５，０１５のありうる組み合わせが生成可能であるためである。すべてのマーカーサブセットを通じた検索は非現実的であるため、単一の最適サブセットを見出すことは可能ではない；しかし、このアプローチを用いることによって、多くの優れたサブセットが見出され、そして多くの場合で、これらのサブセットはいずれも、最適なものに相当する可能性がある。
【０３５４】
[0358]すべてのあり得るマーカーセットを評価する代わりに、「欲張り」順方向段階的アプローチにしたがってもよい（例えばＤａｂｎｅｙ  ＡＲ，  Ｓｔｏｒｅｙ  ＪＤ  （２００７）  Ｏｐｔｉｍａｌｉｔｙ  Ｄｒｉｖｅｎ  Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｄａｔａ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２（１０）：  ｅｌ００２．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００１００２を参照されたい）。この方法を用いると、分類器を最適な単一マーカー（個々のマーカーに関するＫＳ距離に基づく）で開始し、そして続いて、マーカーリストの、現在、分類器のマーカーセットのメンバーではない各メンバーを試すことによって、各段階で成長させる。存在する分類器と組み合わせて最適なスコアを生じる１つのマーカーを分類器に加える。性能のさらなる改善が達成されなくなるまで、これを反復する。不運なことに、このアプローチは、プロセスが停止する前に、個々のマーカーのいくつかがすべては選択されないマーカーの価値ある組み合わせを見逃す可能性もある。
【０３５５】
[0359]本明細書で用いる欲張り法は、進行性順方向段階的アプローチの精緻化であり、この中で、検索を広げるため、各段階で単一の候補分類器（マーカーサブセット）を単に維持するよりも、候補分類器のリストを維持した。リストには、すべての単一マーカーサブセットが植え付けられた（表中のすべてのマーカーをそのまま使用する）。現在リストにあるものから新たな分類器（マーカーサブセット）を得て、そしてリストに付加することによって、段階的にリストを拡張した。すでにその分類器の一部になっておらず、そしてサブセットへの付加に際して、存在するサブセットを重複させないであろう、表１由来の任意のマーカー（これらは「許容マーカー」と称される）を付加することによって、現在リスト上にある各マーカーサブセットを拡張した。リストからのすべての許容マーカーによって、すべての存在するマーカーサブセットを拡張した。明らかに、こうしたプロセスは、最終的にすべてのありうるサブセットを生じ、そしてリストはスペース不足になるであろう。したがって、生成される分類器すべてを、リストが何らかのあらかじめ決定されたサイズ未満の間のみ維持した（しばしば、すべての３つのマーカーサブセットを維持するのに十分であった）。リストがあらかじめ決定されたサイズ限界に到達したら、エリート主義（ｅｌｉｔｉｓｔ）となり；すなわち、特定のレベルの性能を示す分類器のみがリスト上に維持され、そして他のものは、リストの端から落ち、そして失われた。これは、分類器性能の順にソーティングされるリストを維持することによって達成され；少なくとも、現在リスト上にある最悪の分類器と同程度によい新規分類器が挿入され、現在の最低の成績不振者の排除を強いた。１つのさらなる実行詳細は、リストが完全に各世代段階で交換されるものであり；したがってリスト上のすべての分類器が、同じ数のマーカーを有し、そして各工程で、分類器あたりのマーカー数が１つずつ大きくなる。
【０３５６】
[0360]この方法は、異なる組み合わせのマーカーを用いて、候補分類器のリストを生じるため、最適な単一分類器によって、または最適分類器の少数群によって、作製されうる誤差を回避するため、分類器を組み合わせてもよいかどうか疑問が生じうる。こうした「アンサンブル」および「専門家委員会」法は、統計分野および機械学習分野で周知であり、そしてこれには例えば、「平均」、「投票」、「スタッキング」、「バギング」および「ブースティング」が含まれる（例えばＨａｓｔｉｅらを参照されたい）。単純分類器のこれらの組み合わせは、いくつかの異なる分類器を含め、そしてしたがって、バイオマーカー表由来のマーカーのより大きなセットからの情報を含めて、分類器間を有効に平均することによって、マーカーの任意の特定のセットにおけるノイズによる、分類における分散を減少させるための方法を提供する。このアプローチの有用性の例は、単一のマーカー中の異常値が、単一のサンプルの分類に不都合に影響を及ぼすことを防止可能であることである。より多数のシグナルを測定する必要性は、慣用的な「一度に１マーカー」抗体アッセイでは非現実的でありうるが、完全に多重化されたアプタマーアッセイに関しては、不都合な点ではない。これらなどの技術は、バイオマーカーのより包括的な表から利益を得て、そして疾患プロセスに関する情報の多数の供給源を使用して、よりロバストな分類を提供する。
【０３５７】
[0361]表１で選択するバイオマーカーは、「非マーカー」（すなわち、表１に含まれる基準を満たさなかったシグナルを有するタンパク質（実施例２に記載される通り））で構築された分類器よりもよりよく働く分類器を生じさせた。
【０３５８】
[0362]１、２、および３つのマーカーしか含有しない分類器に関しては、表１中のバイオマーカーを用いて得られる、すべてのありうる分類器を列挙し、そしてランダムに選択された非マーカーシグナルの類似の表から構築された分類器に比較した性能分布に関して調べた。
【０３５９】
[0363]図１１において、ＡＵＣを性能測定値として用いた；０．５の性能は、ランダム（コイントス）分類器のベースライン期待値である。分類器性能のヒストグラムを、５９の非マーカーシグナルの「非マーカー」表から構築された分類器の類似の徹底的な列挙からの性能のヒストグラムと比較した；対照および疾患集団の間の示差的シグナル伝達を示さない５９のシグナルを、アプタマーからランダムに選択した。
【０３６０】
[0364]図１１は、対照群およびＮＳＣＬＣの間を区別可能なバイオマーカーに関する表１４のバイオマーカーパラメータから構築された、すべてのありうる１、２、および３マーカー分類器の性能のヒストグラムを示し、そしてこれらの分類器を、５９の「非マーカー」アプタマーＲＦＵシグナルを用いて構築された、すべてのありうる１、２、および３マーカー分類器と比較する。図１１Ａは、単一マーカー分類器性能のヒストグラムを示し、図１１Ｂは、２マーカー分類器性能のヒストグラムを示し、そして図１１Ｃは、３マーカー分類器性能のヒストグラムを示す。
【０３６１】
[0365]図１１において、実線は、表１４における喫煙者および良性肺小結節およびＮＳＣＬＣに関する、バイオマーカーデータを用いた、すべての１、２、および３マーカー分類器の分類器性能のヒストグラムを示す。点線は、対照およびＮＳＣＬＣに関するデータを用いるが、ランダム非マーカーシグナルのセットを用いる、すべての１、２、および３マーカー分類器の分類器性能ヒストグラムである。
【０３６２】
[0366]表１に列挙するマーカーから構築される分類器は、別個のヒストグラムを形成し、１マーカー、２マーカーおよび３マーカー比較のすべてに関して、「非マーカー」由来のシグナルで構築された分類器とははっきり分離された。表１中のバイオマーカーから構築された分類器の性能およびＡＵＣスコアはまた、非マーカーから構築された分類器よりも、マーカー数とともに迅速に増加し、分類器あたりのマーカー数が増加するにつれて、マーカーおよび非マーカー分類器の間の分離は増加する。表１４中に列挙されるバイオマーカーを用いて構築されたすべての分類器は、「非マーカー」を用いて構築された分類器よりも著しく優れた性能を示す。
【０３６３】
[0367]分類器性能の分布は、表１中の分析物セットから得られうる、多くのありうる多数マーカー分類器があることを示す。いくつかのバイオマーカーは、単一分析物に関する分類器スコアの分布およびＡＵＣによって示されるように、そのままで、他のものよりも優れているが、こうしたバイオマーカーが高性能分類器を構築するのに必要であるかどうかを決定することが望ましかった。この決定を行うため、最適バイオマーカーのいくつかを除外することによって、分類器性能の振る舞いを調べた。図１２は、表１中のバイオマーカーの全リストで構築された分類器の性能と、上位にランキングされるマーカーを排除した表１由来のバイオマーカーサブセットで構築された分類器の性能を比較する。
【０３６４】
[0368]図１２は、最適マーカーを含まずに構築された分類器が優れた性能を示すことを立証し、分類器の性能が、いくつかの少数のマーカーのコア群によるものではなく、そして疾患と関連するプロセスの根底にある変化は、多くのタンパク質の活性に反映されることを暗示する。表１中のバイオマーカーの多くのサブセットは、表１由来の５９マーカーのうち上位１５を除いた後であっても、最適に近い性能を示した。表１から上位にランキングされる１５のマーカー（ＫＳ距離によってランキング）を落とした後、分類器性能は、表から選択されるマーカーの数とともに増加して、ほぼ０．９３のＡＵＣに到達し、これは、バイオマーカー全リストから選択される、０．９４８の最適分類器スコアの性能に近かった。
【０３６５】
[0369]最後に、図１３は、実施例３にしたがって、表１４中のパラメーターのリストから構築された典型的な分類器のＲＯＣ性能がどのようであるかを示す。ＭＭＰ７、ＣＬＩＣ１、ＳＴＸ１Ａ、ＣＨＲＤＬ１、およびＰＡ２Ｇ４で５つの分析物分類器を構築した。図１３Ａは、実施例３におけるように、これらのマーカーの独立性を仮定して、モデルの性能を示し、そして図１３Ｂは、表１４中のパラメータを定義するのに用いた研究データセットから生成される経験的なＲＯＣ曲線を示す。選択されるマーカーの所定の数に関する性能は、定性的に一致し、そしてＡＵＣによって立証されるように、定量的な一致は一般的にきわめて優れていたが、モデル計算は、分類器性能を過剰評価する傾向があることがわかる。これは、疾患プロセスに関する任意の特定のバイオマーカーによって寄与される情報が、表１に提供される他のバイオマーカーによって寄与される情報と重複しており、一方、モデル計算が完全な独立性を仮定しているという知見と一致する。図１３は、したがって、実施例３に記載される方法と組み合わされて、表１が、対照群からＮＳＣＬＣを区別するのに有用な非常に多くの分類器の構築および評価を可能にすることを立証する。
【０３６６】
実施例５．  臨床バイオマーカーパネル
[0370]ランダムフォレスト分類器を、臨床診断試験で使用するのに最も適している可能性がある、選択されたバイオマーカーパネルから構築した。単純ベイズ欲張り順方向アルゴリズムによって選択されたモデルとは異なり、ランダムフォレスト分類器は、バイオマーカー測定がランダムに分布すると仮定しない。したがって、このモデルは、単純ベイズ分類器では有効ではない表１由来のバイオマーカーを利用可能である。
【０３６７】
[0371]ランダムフォレスト分類器によって提供されるジニ重要性測定値を利用して、逆方向排除法を用いて、パネルを選択する。ジニ重要性は、訓練セットにおけるサンプルを正しく分類する際のバイオマーカーの有効性の測定値である。
【０３６８】
[0372]バイオマーカー重要性のこの測定値を用いて、分類器の性能に、より重要でないマーカーを排除することも可能である。逆方向排除法は、表１のすべての５９を含む、ランダムフォレスト分類器を構築することによって開始された。次いで、最も重要でないバイオマーカーを排除し、そして残りのバイオマーカーを用いて、新規モデルを構築した。この方法を、単一のバイオマーカーが残るまで続けた。
【０３６９】
[0373]選択された最終パネルは、モデルにおける最高ＡＵＣおよび最低数のマーカーの間の最適なバランスを提供した。これらの基準を満たす８バイオマーカーのパネルは、以下の分析物、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ７、ＫＬＫ３−ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＲＰ、Ｃ９、ＣＮＤＰ１、ＣＡ６、およびＥＧＦＲで構成された。このバイオマーカーパネルに関するＲＯＣ曲線のプロットを図１４に示す。このモデルの感度は０．７０であり、対応する特異性は０．８９である。
【０３７０】
実施例６．  癌の診断のためのバイオマーカー
[0374]癌の一般的な診断のための潜在的なバイオマーカーの同定を行った。症例および対照サンプルの両方を、３つの異なるタイプの癌（肺癌、中皮腫、および腎細胞癌）から評価した。施設にまたがり、包含基準は、サインされたインフォームドコンセントを伴い、少なくとも１８歳であることであった。症例および対照はどちらも、問題の癌以外の既知の悪性病変に関して排除された。
【０３７１】
[0375]肺癌。症例および対照サンプルを実施例２に記載するように得た。総数４６の症例および２１８の対照を本実施例で用いた。
【０３７２】
[0376]胸膜中皮腫。後に非悪性と診断された疑わしい放射線知見を含めた良性肺疾患からの、胸膜中皮腫の示差的診断に関する潜在的なマーカーを同定するため、症例および対照サンプルを、大学癌センターバイオレポジトリから得た。総数１２４の中皮腫症例および１３８のアスベスト曝露対照を本実施例に用いた。
【０３７３】
[0377]腎細胞癌。腎細胞癌（ＲＣＣ）および良性塊（ＢＥＮ）を持つ患者由来の大学癌センターバイオレポジトリから、症例および対照サンプルを得た。手術前サンプル（ＴＰ１）をすべての被験体に関して得た。一次分析は、臨床追跡調査を通じて文書化された「疾患の証拠」（ＥＶＤ）対「疾患の証拠なし」（ＮＥＤ）を有するＲＣＣ患者に関する転帰データ（ＳＥＥＲデータベースフィールドＣＡステータス１に記録されるようなもの）を比較した。総数３８のＥＶＤ症例および１０４のＮＥＤ対照を本実施例で用いた。
【０３７４】
[0378]３つの異なる癌研究の各々に関して考慮されたバイオマーカーセットを組み合わせることによって、癌バイオマーカーの最終リストを同定した。増加するサイズのバイオマーカーセットを用いたベイズ分類器は、欲張りアルゴリズム（本実施例のセクション６．２により詳細に記載するようなもの）を用い、成功裡に構築された。異なる部位およびタイプの癌の中で、癌一般を診断するのに有用なバイオマーカーのセット（またはパネル）を、セット（またはパネル）サイズの関数としてコンパイルし、そしてその性能に関して分析した。この分析は、表１９に示す２３の癌バイオマーカーのリストを生じ、この各々は、これらの連続マーカーセットの少なくとも１つに存在し、サイズは３〜１０マーカーの範囲であった。例示的な例として、本発明者らは、表３２に示す、１０の癌バイオマーカーで構成される特異的パネルの生成を記載する。
【０３７５】
６．１  癌のための単純ベイズ分類器
[0379]表１中のバイオマーカーリストから、本実施例のセクション６．２に概略するように、バイオマーカー選択のための欲張りアルゴリズムを用いて、１０の潜在的癌バイオマーカーのパネルを選択した。３の各々に関して、別個の単純ベイズ分類器を構築した。クラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）、ｐ（ｘｉ｜ｃ）およびｐ（ｘｉ｜ｄ）、式中、ｘｉはバイオマーカーｉに関する測定されたＲＦＵ値の対数であり、そしてｃおよびｄは、対照および疾患集団を指す、は、平均μおよび分散σ２によって特徴付けられる対数正規分布関数としてモデル化された。１０の潜在的なバイオマーカーで構成される３モデルのｐｄｆに関するパラメータを表３１に列挙する。
【０３７６】
[0380]こうしたモデルに関する単純ベイズ分類を、検定に適した以下の等式によって提供し、式中、ｐ（ｄ）は、集団における疾患の有病率であり、
[0381]
【０３７７】
【化１７】
0005986638.tif 000018
【０３７８】
そしてｎ＝１０である。合計の項は各々、個々のマーカーに関する対数尤度比であり、そして疾患を有するものに対して、関心対照の疾患（すなわちこの場合、３つの異なる癌タイプ由来の各々特定の疾患）を含まないサンプル
【０３７９】
【化１８】
0005986638.tif 000019
【０３８０】
の総対数尤度比は、単純に、これらの個々の項の合計に、疾患の有病率を構成する項を加えたものである。単純にするため、本発明者らは、ｐ（ｄ）＝０．５と仮定し、したがって、
【０３８１】
【化１９】
0005986638.tif 000020
【０３８２】
である。
【０３８３】
[0382]９．５、８．８、７．８、８．３、９．４、７．０、７．９、６．３、７．７、１０．６の１０のバイオマーカー各々に関する対数（ＲＦＵ）における未知のサンプル測定を所与として、分類の計算を表３２に詳述する。対照クラスに対する疾患の対数尤度比を含む個々の構成要素を表にし、そして表３１中のパラメータおよび
【０３８４】
【化２０】
0005986638.tif 000021
【０３８５】
の値から計算してもよい。個々の対数尤度比の合計は−３．３２６であり、または疾患を有するものに対して疾患を持たない尤度は２８であり、ここで、尤度ｅ３．３２６＝２８である。４つのバイオマーカー値のみは、疾患群とより一致する尤度を有する（対数尤度＞０）が、残りの６つのバイオマーカーは、すべて対照群を支持することが一貫して見出される。尤度をともに乗じると、上記に示すものと同じ結果が得られ；未知のサンプルが疾患を含まない尤度は２８である。実際、このサンプルは腎細胞癌訓練セット中の対照群由来であった。
【０３８６】
６．１  癌のための単純ベイズ分類器
[0383]表１中のバイオマーカーリストから、本実施例のセクション６．２に概略するように、バイオマーカー選択のための欲張りアルゴリズムを用いて、１０の潜在的癌バイオマーカーのパネルを選択した。３つの異なる癌タイプの各々に関して、別個の単純ベイズ分類器を構築した。クラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）、ｐ（ｘｉ｜ｃ）およびｐ（ｘｉ｜ｄ）、式中、ｘｉはバイオマーカーｉに関する測定されたＲＦＵ値の対数であり、そしてｃおよびｄは、対照および疾患集団を指す、は、平均μおよび分散σ２によって特徴付けられる対数正規分布関数としてモデル化された。１０の潜在的なバイオマーカーで構成される３モデルのｐｄｆに関するパラメータを表３１に列挙する。
【０３８７】
[0384]こうしたモデルに関する単純ベイズ分類を、検定に適した以下の等式によって提供し、式中、ｐ（ｄ）は、集団における疾患の有病率であり、
【０３８８】
【化２１】
0005986638.tif 000022
【０３８９】
そしてｎ＝１０である。合計の項は各々、個々のマーカーに関する対数尤度比であり、そして疾患を有するものに対して、関心対照の疾患（すなわちこの場合、３つの異なる癌タイプ由来の各々特定の疾患）を含まないサンプル
【０３９０】
【化２２】
0005986638.tif 000023
【０３９１】
の総対数尤度比は、単純に、これらの個々の項の合計に、疾患の有病率を構成する項を加えたものである。単純にするため、本発明者らは、ｐ（ｄ）＝０．５と仮定し、したがって、
【０３９２】
【化２３】
0005986638.tif 000024
【０３９３】
である。
【０３９４】
[0385]９．５、８．８、７．８、８．３、９．４、７．０、７．９、６．３、７．７、１０．６の１０のバイオマーカー各々に関する対数（ＲＦＵ）における未知のサンプル測定を所与として、分類の計算を表３２に詳述する。対照クラスに対する疾患の対数尤度比を含む個々の構成要素を表にし、そして表３１中のパラメータおよび
【０３９５】
【化２４】
0005986638.tif 000025
【０３９６】
の値から計算してもよい。個々の対数尤度比の合計は−３．３２６であり、または疾患を有するものに対して疾患を持たない尤度は２８であり、ここで、尤度ｅ３．３２６＝２８である。４つのバイオマーカー値のみは、疾患群とより一致する尤度を有する（対数尤度＞０）が、残りの６つのバイオマーカーは、すべて対照群を支持することが一貫して見出される。尤度をともに乗じると、上記に示すものと同じ結果が得られ；未知のサンプルが疾患を含まない尤度は２８である。実際、このサンプルはＮＳＣＬＣ訓練セット中の対照群由来であった。
【０３９７】
６．２  分類器のための癌バイオマーカーパネルを選択するための欲張りアルゴリズム
パート１
[0386]表１中のバイオマーカーのサブセットを選択して、どのマーカーが癌を検出する一般的な癌バイオマーカーとして使用可能か決定することが可能な潜在的な分類器を構築した。
【０３９８】
[0387]マーカーセットを所与とし、３つの癌研究の各々に関して別個のモデルを訓練し、したがって、多くの異なるタイプの癌を同時に分類可能であるバイオマーカーセットを選択するため、性能の広範囲の測定値が必要であった。本明細書で用いる分類器性能の測定値は、すべての単純ベイズ分類器に渡って、ＲＯＣ曲線下面積の平均であった。ＲＯＣ曲線は、単一の分類器の真の陽性率（感度）対偽陽性率（１−特異性）のプロットである。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、０〜１．０の範囲であり、１．０のＡＵＣは完全分類に対応し、そして０．５のＡＵＣはランダム（コイントス）分類器に対応する。性能の他の一般的な測定値、例えばＦ値、あるいは感度および特異性の合計または積などを適用することも可能である。特に、ある程度の感度を犠牲にして、より高い特異性を持って実行する分類器を選択するため、または特異性を犠牲にして、より高い感度を持って実行する分類器を選択するため、感度および特異性を異なる加重で処理したいと希望する可能性もある。本発明者らは、感度および特異性のすべての組み合わせを単一の測定値に含むため、ＡＵＣの使用を選択した。異なる適用は、真の陽性および真の陰性発見に関して異なる利点を有し、そして偽陰性発見とは異なる、偽陽性発見に関するコストを有するであろう。性能測定値を変化させると、所定のデータセットに関して、所定のデータセットに関して選択されるマーカーの正確なサブセットが変化する可能性もある。
【０３９９】
[0388]本実施例のセクション６．１に記載する、対照サンプルから癌サンプルを区別するためのベイズアプローチに関して、分類器は、３つの癌研究各々におけるバイオマーカーの分布によって完全にパラメータ化され、そしてバイオマーカーのリストは表１９から選択された。すなわち、包含するよう選択されたマーカーのサブセットは、訓練データセットを所与として、１対１方式で分類器を決定した。
【０４００】
[0389]本明細書で使用する欲張り法を用いて、表１由来のマーカーの最適なサブセットに関して検索した。少数のマーカーまたは比較的少数のマーカーを含む分類器に関して、ありうるマーカーサブセットすべてを列挙し、そして特定のマーカーセットで構築される分類器の性能に関して評価した（実施例４を参照されたい）。（このアプローチは、「最適サブセット選択」として統計分野に周知である；例えばＨａｓｔｉｅらを参照されたい）。しかし、本明細書記載の分類器に関して、多数のマーカーの組み合わせ数は非常に大きくなる可能性があり、そして１０マーカーのすべてのあり得るセットを評価することは実行可能でなく、これは、わずか３０の総分析物のリストから３０，０４５，０１５のありうる組み合わせが生成可能であるためである。すべてのマーカーサブセットを通じた検索は非現実的であるため、単一の最適サブセットを見出すことは可能ではない；しかし、このアプローチを用いることによって、多くの優れたサブセットが見出され、そして多くの場合で、これらのサブセットはいずれも、最適なものに相当する可能性がある。
【０４０１】
[0390]すべてのありうるマーカーセットを評価する代わりに、「欲張り」順方向段階的アプローチにしたがってもよい（例えばＤａｂｎｅｙ  ＡＲ，  Ｓｔｏｒｅｙ  ＪＤ  （２００７）  Ｏｐｔｉｍａｌｉｔｙ  Ｄｒｉｖｅｎ  Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｄａｔａ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２（１０）：  ｅｌ００２．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００１００２を参照されたい）。この方法を用いると、分類器を最適な単一マーカー（個々のマーカーに関するＫＳ距離に基づく）で開始し、そして続いて、マーカーリストの、現在、分類器のマーカーセットのメンバーではない各メンバーを試すことによって、各段階で成長させる。存在する分類器と組み合わせて最適なスコアを生じる１つのマーカーを分類器に加える。性能のさらなる改善が達成されなくなるまで、これを反復する。不運なことに、このアプローチは、プロセスが停止する前に、個々のマーカーのいくつかがすべては選択されないマーカーの価値ある組み合わせを見逃す可能性もある。
【０４０２】
[0391]本明細書で用いる欲張り法は、進行性順方向段階的アプローチの精緻化であり、この中で、検索を広げるため、各段階で単一の候補マーカーサブセットを単に維持するよりも、候補マーカーセットのリストを維持した。リストには、単一マーカーリストが植え付けられた。現在リストにあるものから新たなマーカーサブセットを得て、そしてリストに付加することによって、段階的にリストを拡張した。すでにその分類器の一部になっておらず、そしてサブセットへの付加に際して、存在するサブセットを重複させないであろう、表１由来の任意のマーカー（これらは「許容マーカー」と称される）を付加することによって、現在リスト上にある各マーカーサブセットを拡張した。各時点で、マーカーの新規セットを定義し、これらのマーカーを用いて、各癌研究の１つで構成される分類器セットを訓練し、そして全体の性能を、すべての３つの研究に渡る平均ＡＵＣを介して測定した。潜在的な過剰適合を回避するため、各癌研究モデルに関するＡＵＣを１０倍交差検定法を通じて計算した。リストからのすべての許容マーカーによって、すべての存在するマーカーサブセットを拡張した。明らかに、こうしたプロセスは、最終的にすべてのありうるサブセットを生じ、そしてリストはスペース不足になるであろう。したがって、生成されるマーカーセットすべてを、リストが何らかのあらかじめ決定されたサイズ未満の間のみ維持した。リストがあらかじめ決定されたサイズ限界に到達したら、エリート主義となり；すなわち、特定のレベルの性能を示す分類器セットのみがリスト上に維持され、そして他のものは、リストの端から落ち、そして失われた。これは、分類器セット性能の順にソーティングされるリストを維持することによって達成され；その分類器が、全体的に、少なくとも現在リスト上にある最悪の分類器セットと同程度によい新規マーカーセットが挿入され、現在の最低の成績不振分類器セットの排除を強いた。１つのさらなる実行詳細は、リストが完全に各世代段階で交換されるものであり；したがってリスト上のすべてのマーカーセットが、同じ数のマーカーを有し、そして各工程で、分類器あたりのマーカー数が１つずつ大きくなる。
【０４０３】
[0392]１つの態様において、非癌から一般的な癌を診断するための分類器を構築するのに有用なバイオマーカーのセット（またはパネル）は、分類スキームで使用するバイオマーカーの特定の組み合わせに関する平均ＡＵＣに基づく。本発明者らは、対照から、異なる癌サンプルを有効に分類可能な、表１９中のマーカーから得られるバイオマーカーの多くの組み合わせを同定した。代表的なパネルを表２２〜２９に示し、これは、３〜１０バイオマーカーの１００の異なるパネルシリーズを示し、これらは、各パネルに関して、示す平均交差検定（ＣＶ）ＡＵＣを有する。これらのパネル各々における各マーカー発生の総数を、各表の底部に示す。
【０４０４】
[0393]表１９で選択されるバイオマーカーは、「非マーカー」で構築される分類器よりも優れた性能を示す分類器を生じさせた。図１５において、本発明者らは、他のありうる分類器の性能に比較した、１０のバイオマーカー分類器の性能を示す。
【０４０５】
[0394]図１５Ａは、表１９中の１０のマーカーを除いて、すべての３つの研究に存在する２３の全セットから取った１０の「非マーカー」のランダムにサンプリングされたセットから構築された分類器に関する平均ＡＵＣの分布を示す。１０の潜在的な癌バイオマーカーの性能を、垂直の点線として示す。このプロットは、明らかに、１０の潜在的なバイオマーカーの性能が、他のマーカー組み合わせの分布をはるかに超えることを示す。
【０４０６】
[0395]図１５Ｂは、図１５Ａと類似の分布を示すが、ランダムにサンプリングされたセットは、１０の分析物分類器に関する欲張りバイオマーカー選択法によって選択されない、表１由来の４９バイオマーカーに限定された。このプロットは、欲張りアルゴリズムによって選択される１０のマーカーが、残りの４９のバイオマーカーで構築される分類器よりもはるかに優れて癌の他のタイプに一般化される、バイオマーカーサブセットに相当することを立証する。
【０４０７】
[0396]最後に、図１６は、３つの癌研究分類器各々に関する分類器ＲＯＣ曲線を示す。前述の態様および実施例は、例としてのみ意図される。特定の態様、実施例、あるいは特定の態様または実施例の要素は、いずれも、請求項のいずれかの決定的な、必要な、または本質的な要素または特徴とは見なされないものとする。さらに、本明細書記載の要素はいずれも、明らかに「本質的」または「決定的」と記載されない限り、付随する請求項の実施に必要とはされない。付随する請求項によって定義される本出願の範囲から逸脱することなく、開示する態様に多様な改変、修飾、置換、および他の変動を行ってもよい。図および実施例を含む明細書は、制限する方式ではなく、例示の方式で見なされるものとし、そしてすべてのこうした修飾および置換は、本出願の範囲内に含まれると意図される。したがって、本出願の範囲は、上に提供する実施例によるのではなく、付随する請求項およびその法的な同等物によって決定されなければならない。例えば、任意の方法またはプロセス請求項に列挙される工程を、実行可能な任意の順で遂行してもよく、そしてこうした工程は、態様、実施例、または請求項のいずれに提示される順にも限定されない。さらに、前述の方法いずれにおいても、表１または表１９の１またはそれより多いバイオマーカーを、個々のバイオマーカーとして、または任意のパネル由来のバイオマーカーとして、具体的に排除してもよい。
【０４０８】
表１：癌バイオマーカー
【０４０９】
【表１】
0005986638.tif 000026
【０４１０】
表２：  １バイオマーカーのパネル
【０４１１】
【表２】
0005986638.tif 000027
【０４１２】
表３：  ２バイオマーカーのパネル
【０４１３】
【表３−１】
0005986638.tif 000028
【０４１４】
【表３−２】
0005986638.tif 000029
【０４１５】
表４：  ３バイオマーカーのパネル
【０４１６】
【表４−１】
0005986638.tif 000030
【０４１７】
【表４−２】
0005986638.tif 000031
【０４１８】
表５：  ４バイオマーカーのパネル
【０４１９】
【表５−１】
0005986638.tif 000032
【０４２０】
【表５−２】
0005986638.tif 000033
【０４２１】
表６：  ５バイオマーカーのパネル
【０４２２】
【表６−１】
0005986638.tif 000034
【０４２３】
【表６−２】
0005986638.tif 000035
【０４２４】
表７：  ６バイオマーカーのパネル
【０４２５】
【表７−１】
0005986638.tif 000036
【０４２６】
【表７−２】
0005986638.tif 000037
【０４２７】
【表７−３】
0005986638.tif 000038
【０４２８】
表８：  ７バイオマーカーのパネル
【０４２９】
【表８−１】
0005986638.tif 000039
【０４３０】
【表８−２】
0005986638.tif 000040
【０４３１】
【表８−３】
0005986638.tif 000041
【０４３２】
【表８−４】
0005986638.tif 000042
【０４３３】
表９：  ８バイオマーカーのパネル
【０４３４】
【表９−１】
0005986638.tif 000043
【０４３５】
【表９−２】
0005986638.tif 000044
【０４３６】
【表９−３】
0005986638.tif 000045
【０４３７】
【表９−４】
0005986638.tif 000046
【０４３８】
表１０：  ９バイオマーカーのパネル
【０４３９】
【表１０−１】
0005986638.tif 000047
【０４４０】
【表１０−２】
0005986638.tif 000048
【０４４１】
【表１０−３】
0005986638.tif 000049
【０４４２】
【表１０−４】
0005986638.tif 000050
【０４４３】
表１１：  １０バイオマーカーのパネル
【０４４４】
【表１１−１】
0005986638.tif 000051
【０４４５】
【表１１−２】
0005986638.tif 000052
【０４４６】
【表１１−３】
0005986638.tif 000053
【０４４７】
【表１１−４】
0005986638.tif 000054
【０４４８】
表１２：  バイオマーカーパネル中のマーカーのカウント
【０４４９】
【表１２】
0005986638.tif 000055
【０４５０】
表１３：  １０マーカー分類器における分析物
【０４５１】
【表１３】
0005986638.tif 000056
【０４５２】
表１４：  単純ベイズ分類器に関する訓練セットから得られるパラメータ
【０４５３】
【表１４】
0005986638.tif 000057
【０４５４】
表１５：  バイオマーカーの例示的な組み合わせに関するＡＵＣ
【０４５５】
【表１５】
0005986638.tif 000058
【０４５６】
表１６：  単純ベイズ分類器に関する訓練セット由来の計算
【０４５７】
【表１６】
0005986638.tif 000059
【０４５８】
表１７：  訓練セットの臨床特性
【０４５９】
【表１７】
0005986638.tif 000060
【０４６０】
表１８：  １０バイオマーカー分類器タンパク質
【０４６１】
【表１８】
0005986638.tif 000061
【０４６２】
表１９：  一般的な癌のバイオマーカー
【０４６３】
【表１９】
0005986638.tif 000062
【０４６４】
表２０：  １バイオマーカーのパネル
【０４６５】
【表２０】
0005986638.tif 000063
【０４６６】
表２１：  ２バイオマーカーのパネル
【０４６７】
【表２１−１】
0005986638.tif 000064
【０４６８】
【表２１−２】
0005986638.tif 000065
【０４６９】
【表２１−３】
0005986638.tif 000066
【０４７０】
表２２：  ３バイオマーカーのパネル
【０４７１】
【表２２−１】
0005986638.tif 000067
【０４７２】
【表２２−２】
0005986638.tif 000068
【０４７３】
表２３：  ４バイオマーカーのパネル
【０４７４】
【表２３−１】
0005986638.tif 000069
【０４７５】
【表２３−２】
0005986638.tif 000070
【０４７６】
【表２３−３】
0005986638.tif 000071
【０４７７】
表２４：  ５バイオマーカーのパネル
【０４７８】
【表２４−１】
0005986638.tif 000072
【０４７９】
【表２４−２】
0005986638.tif 000073
【０４８０】
表２５：  ６バイオマーカーのパネル
【０４８１】
【表２５−１】
0005986638.tif 000074
【０４８２】
【表２５−２】
0005986638.tif 000075
【０４８３】
【表２５−３】
0005986638.tif 000076
【０４８４】
【表２５−４】
0005986638.tif 000077
【０４８５】
表２６：  ７バイオマーカーのパネル
【０４８６】
【表２６−１】
0005986638.tif 000078
【０４８７】
【表２６−２】
0005986638.tif 000079
【０４８８】
【表２６−３】
0005986638.tif 000080
【０４８９】
【表２６−４】
0005986638.tif 000081
【０４９０】
表２７：  ８バイオマーカーのパネル
【０４９１】
【表２７−１】
0005986638.tif 000082
【０４９２】
【表２７−２】
0005986638.tif 000083
【０４９３】
【表２７−３】
0005986638.tif 000084
【０４９４】
【表２７−４】
0005986638.tif 000085
【０４９５】
表２８：  ９バイオマーカーのパネル
【０４９６】
【表２８−１】
0005986638.tif 000086
【０４９７】
【表２８−２】
0005986638.tif 000087
【０４９８】
【表２８−３】
0005986638.tif 000088
【０４９９】
【表２８−４】
0005986638.tif 000089
【０５００】
表２９：  １０バイオマーカーのパネル
【０５０１】
【表２９−１】
0005986638.tif 000090
【０５０２】
【表２９−２】
0005986638.tif 000091
【０５０３】
【表２９−３】
0005986638.tif 000092
【０５０４】
【表２９−４】
0005986638.tif 000093
【０５０５】
表３０：  バイオマーカーパネル中のマーカーのカウント
【０５０６】
【表３０】
0005986638.tif 000094
【０５０７】
表３１：  単純ベイズ分類器に関する癌データセットセット由来のパラメータ
【０５０８】
【表３１】
0005986638.tif 000095
【０５０９】
表３２：  単純ベイズ分類器に関する訓練セット由来の計算
【０５１０】
【表３２】
0005986638.tif 000096
【図１】
0005986638.tif 000097
【図２】
0005986638.tif 000098
【図３】
0005986638.tif 000099
【図４】
0005986638.tif 000100
【図５】
0005986638.tif 000101
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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