(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２×１０−１０Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でヒトＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒに結合するモノクローナル抗体であって、
それぞれ配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ヒトＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；または
それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ヒトＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ヒトＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；または
配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ヒトＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；
である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のモノクローナル抗体の相補性決定領域をすべて含む抗体の断片であって、２×１０−１０Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でヒトＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒと結合できる、抗体の断片。
【請求項５】
標的結合因子としての請求項１から３のいずれかに記載のモノクローナル抗体あるいは請求項４に記載の抗体の断片と、薬物とを含む医薬組成物。
【請求項６】
標的結合因子としての請求項１から３のいずれかに記載のモノクローナル抗体あるいは請求項４に記載の抗体の断片を含む、薬物送達用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体および該抗体を利用した医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１４−１８５８６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。【０００３】
一般に、経口や静脈内注射によって薬物を全身投与すると、投薬対象物としての病巣部位だけでなく、正常組織にも薬物が供給される。この結果、薬物投与による副作用が認められ、治療方法の変更や中断が必要になる場合がある。これに対し、副作用の低減を目的として、投薬対象物に固有の受容体、リガンド、酵素等の分子マーカーに特異的に結合する能力を有した、分子標的薬と呼ばれる薬物が開発されている（例えば、特許文献１）。【０００４】
一方、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ（以下、「ＴＦ」と称する場合がある）は外因系凝固の開始因子であり、血管損傷等により産生が促進される。通常反応におけるＴＦ発現は、局所的、かつ、一過性である。しかしながら、膵臓癌、胃癌等の多くの固形癌においては、腫瘍組織内の癌細胞、血管内皮細胞および単球、マクロファージ等の細胞表面でＴＦが恒常的に発現亢進していることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許公開公報２０１２／００３９９８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的の一つは、ＴＦに対する新規抗体の提供にある。また、本発明の目的の別の一つは、該抗体を標的結合因子として利用した医薬組成物の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、細胞へのインターナリゼーション能を有する新規の抗ＴＦモノクローナル抗体を発見し、さらに、該抗体を標的結合因子として用いることにより表面にＴＦを発現する細胞へ薬物を高い選択性で送達し得ることに想到し、本発明を完成させるに至った。【０００８】
すなわち、本発明によれば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒに結合する、以下のモノクローナル抗体が提供される。
それぞれ配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ヒトＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；
それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ヒトＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体；または
それぞれ配列番号１９、２０および２１に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号２２、２３および２４に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗マウスＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒモノクローナル抗体。
本発明の別の局面によれば、上記モノクローナル抗体が結合するＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒのエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体が提供される。
本発明のさらに別の局面によれば、上記モノクローナル抗体の一部を含み、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒと結合できる、抗体の断片が提供される。
本発明のさらに別の局面によれば、標的結合因子としての上記モノクローナル抗体または抗体の断片と、薬物とを含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらに別の局面によれば、標的結合因子としての上記モノクローナル抗体または抗体の断片を含む、薬物送達用組成物が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のモノクローナル抗体は、ＴＦを発現する細胞を認識し、かつ、該細胞へのインターナリゼーション能を有し得る。よって、該抗体を標的結合因子として利用することにより、効率よく該細胞に薬物を送達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】インターナリゼーションアッセイの結果を示す顕微鏡写真である。
【図２】抗凝固作用評価の結果を示すグラフである。
【図３】殺細胞効果確認試験の結果を示すグラフである。
【図４】抗腫瘍効果確認試験における腫瘍体積の変動を示すグラフである。
【図５】抗腫瘍効果確認試験における体重の変動を示すグラフである。
【図６】インターナリゼーションアッセイの結果を示す顕微鏡写真である。
【図７】マウスＢ１６メラノーマ細胞およびそのＴＦ強制発現細胞におけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対するＴＦのｍＲＮＡ発現量の割合を示すグラフである。
【図８】ＦＡＣＳ解析で得られたヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［Ａ．モノクローナル抗体］
本発明によれば、ＴＦに結合するモノクローナル抗体が提供される。本発明のモノクローナル抗体は、代表的には、ＴＦに結合でき、かつ、ＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。ＴＦは、血液凝固の第ＩＩＩ因子であり、膜貫通型の糖タンパクとして細胞表面に発現している。本発明において、ＴＦは、好ましくはヒトＴＦ（ｈＴＦ）である。ｈＴＦの全長アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＿ＡＡＡ６１１５２（配列番号１）として既に知られている。本発明においてはまた、マウスＴＦ（ｍＴＦ）に対するモノクローナル抗体も提供される。抗ｍＴＦモノクローナル抗体を薬物の標的結合因子として利用することは、マウスを用いた試験や研究において有効であり得る。ｍＴＦの全長アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＿ＡＡＡ６３４００（配列番号２）として既に知られている。
【００１２】
本明細書において、インターナリゼーションとは、抗体が細胞表面の抗原と免疫複合体を形成後、細胞内に取り込まれる現象を意味する。抗ＴＦモノクローナル抗体がインターナリゼーション能を有するか否かは、例えば、標識物質を結合した抗体を表面にＴＦを発現する細胞と接触させ、該標識物質が細胞内に移行するか否かを確認する方法、細胞毒性を有する物質を結合した抗体を表面にＴＦを発現する細胞と接触させた際に、細胞死または細胞の増殖阻害が誘導されるか否かを確認する方法等によって判断することができる。より具体的には、実施例に記載のインターナリゼーショアッセイによって抗体のインターナリゼーション能の有無を確認することができる。
【００１３】
上記表面にＴＦを発現する細胞としては、任意の適切な細胞が用いられ得、例えば、腫瘍組織内の細胞が挙げられる。正常組織におけるＴＦの発現は、通常、局所的かつ一過性の発現であるのに対し、腫瘍組織内の癌細胞、血管内皮細胞、単球、マクロファージ等の細胞表面においては、ＴＦの発現が恒常的に亢進している。癌細胞の具体例としては、膵臓癌細胞、胃癌細胞等が挙げられる。
【００１４】
本明細書において、モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が産生する抗体である。モノクローナル抗体は、均一な一次構造を有し、同一のエピトープを認識する。本発明のモノクローナル抗体は、相同な重鎖２本と相同な軽鎖２本とがジスルフィド結合によって結合されたテトラマーからなる基本構造を有する。本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよく、好ましくはＩｇＧである。
【００１５】
本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体が認識するエピトープは、好ましくはＴＦの細胞外領域に存在する。
【００１６】
本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体のＴＦに対する解離定数（ＫＤ）は、例えば、５×１０−９Ｍ以下、さらには１×１０−９Ｍ以下、特には２×１０−１０Ｍ以下にまで達する。解離定数は、例えば、表面プラズモン共鳴法を用いて測定することができる。
【００１７】
本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体は、抗凝固作用を有していてもよく、有していなくてもよい。抗凝固作用の有無またはその程度はプロトロンビン時間（ＰＴ）によって判断することができる。抗凝固作用を有さないまたは抗凝固作用が低い抗ＴＦモノクローナル抗体によれば、血餅等で捕捉され難いことから、薬物の標的結合因子として利用した場合に標的部位への薬物の送達性が向上され得、その結果として、薬効が好適に発揮され得る。本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体の抗原抗体複合体を形成した状態における凝固延長時間比（ＰＢＳ相対比）は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下、さらに好ましくは１〜１．５である。抗原抗体複合体を形成した状態における凝固延長時間比は、実施例に記載の方法で決定され得る。
【００１８】
［Ａ−１．抗ｈＴＦモノクローナル抗体］
第１の実施形態において、本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む。その具体例としては、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ｈＴＦモノクローナル抗体が好ましく例示できる。
【００１９】
第２の実施形態において、本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する軽鎖可変領域と、を含む。その具体例としては、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ｈＴＦモノクローナル抗体が好ましく例示できる。
【００２０】
上記第１または第２の実施形態で例示した各モノクローナル抗体の改変体もまた、本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体に含まれ得る。当該改変体としては、例えば、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域が１個または数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を含むモノクローナル抗体が挙げられる。このような改変体もまた、好適にｈＴＦに結合でき、かつ、ｈＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有し得る。
【００２１】
上記モノクローナル抗体の改変体の具体例としては、配列番号９に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体が挙げられる。また、別の改変体の具体例としては、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体が挙げられる。これらの改変体は、好ましくは、ｈＴＦに結合でき、かつ、ｈＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。
【００２２】
上記モノクローナル抗体の改変体は、対応するモノクローナル抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の少なくとも１つのＣＤＲにおいて、１個または数個、例えば１、２または３個、好ましくは１個または２個、より好ましくは１個のアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を含んでいてもよい。改変体の各ＣＤＲは、対応するモノクローナル抗体の各ＣＤＲと好ましくは９０〜１００％の相同性を有し、より好ましくは９５〜１００％、さらに好ましくは９８〜１００％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。また、改変体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜３全体は、対応するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜３全体と好ましくは９０〜１００％の相同性を有し、より好ましくは９５〜１００％、さらに好ましくは９８〜１００％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。
【００２３】
第３の実施形態において、本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体は、上記第１または第２の実施形態で例示したモノクローナル抗体が結合するｈＴＦのエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体であり得る。該同じエピトープに結合する抗体は、競合ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法により得ることができる。競合ＥＬＩＳＡ法においては、例えば、被験抗体の非存在下における対照抗体（すなわち、第１または第２の実施形態で例示したモノクローナル抗体）の結合活性と比較して、被験抗体が、３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、対照抗体の結合性を低下させる場合、該被験抗体は対照抗体と実質的に同じエピトープに結合する抗体ということができる。該同じエピトープに結合する抗体は、好ましくはｈＴＦに結合でき、かつ、ｈＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。なお、当該実施形態において、該同じエピトープに結合する抗体は、上記第１または第２の実施形態で例示したモノクローナル抗体の改変体であってもよい。
【００２４】
上記で説明した本発明の抗ｈＴＦモノクローナル抗体は、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
【００２５】
ヒト型キメラ抗体とは、非ヒト哺乳動物由来の抗体の可変領域とヒト由来の抗体の定常領域とを連結した抗体である。よって、本発明のヒト型キメラ抗体は、上記第１、第２または第３の実施形態で例示したモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結することによって得られるキメラ抗体であり得る。
【００２６】
具体的には、本発明のヒト型キメラ抗体の例としては、重鎖ＣＤＲ１、２および３としてそれぞれ、配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖ＣＤＲ１、２および３としてそれぞれ、配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結したキメラ抗体が挙げられる。当該キメラ抗体の具体例としては、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結したキメラ抗体が挙げられる。
【００２７】
本発明のヒト型キメラ抗体の別の例としては、重鎖ＣＤＲ１、２および３としてそれぞれ、配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖ＣＤＲ１、２および３としてそれぞれ、配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結したキメラ抗体が挙げられる。当該キメラ抗体の具体例としては、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に連結したキメラ抗体が挙げられる。
【００２８】
ヒト型キメラ抗体の重鎖定常領域は、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属するものであればよく、好ましくはｈＩｇＧクラスに属する。同様に、ヒト型キメラ抗体の軽鎖定常領域は、ｈＩｇに属するものであればよく、κクラスまたはλクラスのいずれであってもよい。
【００２９】
ヒト化抗体とは、非ヒト哺乳動物由来の抗体のＣＤＲをヒト由来の抗体の可変領域の適切な位置に移植した抗体である。よって、本発明のヒト化抗体は、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜３として上記第１、第２または第３の実施形態で例示したモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜３を有し、その他の領域がヒト抗体に由来するヒト抗体であり得る。
【００３０】
本発明のヒト化抗体の具体例としては、重鎖のＣＤＲ１、２および３がそれぞれ、配列番号３、４および５に記載されるアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、２および３がそれぞれ、配列番号６、７および８に記載されるアミノ酸配列からなり、その他の領域がヒト抗体に由来するヒト化抗体、重鎖のＣＤＲ１、２および３がそれぞれ、配列番号１１、１２および１３に記載されるアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、２および３がそれぞれ、配列番号１４、１５および１６に記載されるアミノ酸配列からなり、その他の領域がヒト抗体に由来するヒト化抗体が挙げられる。
【００３１】
ヒト化抗体の重鎖は、ｈＩｇに属するものであればよく、好ましくはｈＩｇＧクラスに属する。同様に、ヒト化抗体の軽鎖は、ｈＩｇに属するものであればよく、κクラスまたはλクラスのいずれであってもよい。
【００３２】
［Ａ−２．抗ｍＴＦモノクローナル抗体］
１つの実施形態において、本発明の抗ｍＴＦモノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１９、２０および２１に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する重鎖可変領域と、それぞれ配列番号２２、２３および２４に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を有する軽鎖可変領域とを含む。その具体例としては、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗ｍＴＦモノクローナル抗体が好ましく例示できる。
【００３３】
上記で例示したモノクローナル抗体の改変体もまた、本発明の抗ｍＴＦモノクローナル抗体に含まれ得る。当該改変体としては、例えば、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域が１個または数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を含むモノクローナル抗体が挙げられる。このような改変体もまた、好適にｍＴＦに結合でき、かつ、ｍＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有し得る。
【００３４】
上記モノクローナル抗体の改変体の具体例としては、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むモノクローナル抗体が挙げられる。このような改変体は、好ましくは、ｍＴＦに結合でき、かつ、ｍＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。
【００３５】
上記モノクローナル抗体の改変体は、対応するモノクローナル抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の少なくとも１つのＣＤＲにおいて、１個または数個、例えば１、２または３個、好ましくは１個または２個、より好ましくは１個のアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を含んでいてもよい。改変体の各ＣＤＲは、対応するモノクローナル抗体の各ＣＤＲと好ましくは９０〜１００％の相同性を有し、より好ましくは９５〜１００％、さらに好ましくは９８〜１００％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。また、改変体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜３全体は、対応するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１〜３全体と好ましくは９０〜１００％の相同性を有し、より好ましくは９５〜１００％、さらに好ましくは９８〜１００％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。
【００３６】
別の実施形態において、本発明の抗ｍＴＦモノクローナル抗体は、上記で例示したモノクローナル抗体が結合するｍＴＦのエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体であり得る。該同じエピトープに結合する抗体は、好ましくはｍＴＦに結合でき、かつ、ｍＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。当該実施形態において、該同じエピトープに結合する抗体は、上記で例示したモノクローナル抗体の改変体であってもよい。なお、該同じエピトープに結合する抗体の取得方法は上述のとおりである。
【００３７】
[Ｂ．モノクローナル抗体の製造方法]
Ｂ−１．ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマから目的の抗体を産生するものを選択し、選択されたハイブリドーマに抗体を産生させることによって得られ得る。
【００３８】
Ｂ−１−１．抗原の調製
動物の免疫に用いる抗原としては、例えば、ＴＦ（全長ＴＦ）またはその部分ペプチドあるいはＴＦを表面に発現する細胞が用いられ得る。ｈＴＦは、例えば、特開平９−３０２０００号に記載の方法等に準じてヒト胎盤由来のｈＴＦを精製して得ることができる。また、例えば、遺伝子工学的方法または化学合成法によってＴＦまたはその部分ペプチドを得ることができる。部分ペプチドは、必要に応じて任意の適切なキャリアタンパク質と結合させて用いられ得る。なお、ｈＴＦのｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００１９９３．４（配列番号２７）において公知である。また、ｍＴＦのｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ５７８９６．１（配列番号２８）において公知である。
【００３９】
Ｂ−１−２．抗体産生細胞の調製
上記のようにして得られた抗原を任意の適切なアジュバントと混合して、マウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の非ヒト哺乳動物に投与して免疫する。免疫した動物の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価の高い動物に対して最終免疫を施す。最終免疫日から数日後に脾臓細胞、リンパ節細胞等の抗体産生細胞を採取する。免疫方法および抗体産生細胞の採取方法の詳細は、当業者に周知であるのでその詳細な説明は省略する。抗体価は、例えば、動物から採取した血液を用いて、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等によって測定することができる。
【００４０】
Ｂ−１−３．細胞融合
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウス、ラット等の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な任意の適切な細胞株を用いることができる。好ましくは、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地（ＨＡＴ培地））で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するミエローマ細胞が用いられる。細胞融合は、ＰＥＧ法、電気融合法等の任意の適切な方法を用いて行われ得る。次いで、細胞融合処理後の細胞を選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）に懸濁および希釈し、培養プレートの各ウェルにて培養を行う。
【００４１】
Ｂ−１−４．ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
上記細胞融合後の培養の結果、コロニーを形成した細胞をハイブリドーマとして選択する。次いで、選択したハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、得られた培養上清を採取して抗原に対する反応性を測定する。抗原に対する反応性は、ＥＩＡ、ＲＩＡ等によって測定することができる。該測定の結果、抗原に対して反応性を示すものを選択し、限界希釈法等によってモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離する。
【００４２】
Ｂ−１−５．ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマを任意の適切な培地で培養し、得られた培養上清から精製する方法、マウス、ラット等の非ヒト哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して腹水中で培養し、得られた腹水から精製する方法等によって調製され得る。抗体の精製は、例えば、硫安塩析法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、抗イムノグロブリンカラム、プロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィー法等を必要に応じて組み合わせて用いることによって行うことができる。
【００４３】
Ｂ−２．遺伝子工学的手法によるモノクローナル抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、上記ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用して、遺伝子工学的手法によって作製され得る。
【００４４】
Ｂ−２−１．可変領域をコードする遺伝子のクローニング
目的の抗体を産生するハイブリドーマから全ｍＲＮＡを抽出し、得られた全ｍＲＮＡから逆転写酵素を用い、抗体遺伝子に共通な配列をプライマーとして抗体可変領域をコードするｃＤＮＡを合成する。当該ｃＤＮＡの合成および増幅は、例えば、５’−ＲＡＣＥ法を用いて行うことができ、その際、ｃＤＮＡの両末端に任意の適切な制限酵素サイトを導入することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結して大腸菌等に導入することによって所望の組換えベクターを調製する。次いで、目的とする抗体遺伝子の塩基配列をデオキシ法等の公知の方法によって確認する。
【００４５】
Ｂ−２−２．宿主細胞への抗体遺伝子の導入
上記のようにしてクローニングした可変領域をコードするＤＮＡを所望の抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。あるいは、可変領域をコードするＤＮＡを所望の定常領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。このようにして得られた発現ベクターを任意の適切な宿主細胞に導入し、これにより、抗体を発現させることができる。このとき、重鎖または軽鎖を別々に発現ベクターに組み込み、これら２つの発現ベクターを同じ宿主細胞に同時に導入してもよいし、あるいは重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入してもよい。なお、可変領域をコードするＤＮＡは、Ｂ−２−１項で決定した塩基配列に基づいて人工遺伝子合成サービス等を利用して全合成を行うことによっても得られ得る。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等が挙げられる。
【００４６】
Ｂ−２−３．宿主細胞からのモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、上記発現ベクターを組み込まれた宿主細胞を任意の適切な培地で培養し、得られた培養上清から精製することによって得られ得る。抗体の精製方法は、上述のとおりである。
【００４７】
Ｂ−３．キメラ抗体の作製
ヒト型キメラ抗体は、例えば、上記と同様にして得たモノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、発現させることにより得られ得る（例えば、ＷＯ９５／１４０４１）。
【００４８】
Ｂ−４．ヒト化抗体の作製
ヒト化抗体は、いわゆるＣＤＲグラフティング技術を用いて、非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に連結するようにヒト抗体に移植することによって得られ得る。非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）の抗体のＣＤＲをヒトのフレームワーク領域に移植する方法は公知であり、例えば、オーバーラップエクステンションＰＣＲ法が挙げられる。
【００４９】
一般に、ＣＤＲグラフティングにおいては、非ヒト哺乳動物の抗体のフレームワーク領域と相同性の高いヒトフレームワーク領域を選択することが、ＣＤＲの機能の維持において有利である。よって、移植するＣＤＲに隣接するフレームワーク領域のアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトフレームワーク領域を利用することが好ましい。
【００５０】
［Ｃ．抗体断片］
本発明はまた、Ａ項に記載のモノクローナル抗体の一部を含み、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒと結合できる、抗体の断片を提供する。本発明の抗体の断片は、代表的には、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有する。当該抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ)、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ)、２量化体Ｖ領域断片(Ｄｉａｂｏｄｙ)、ＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。
【００５１】
Ｆａｂは、上記モノクローナル抗体をパパイン処理して得ることができる。また、上記モノクローナル抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを任意の適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることもできる。
【００５２】
Ｆ(ａｂ’)２は、上記モノクローナル抗体をペプシン処理して得ることができる。また、上記モノクローナル抗体のＦ(ａｂ’)２をコードするＤＮＡを任意の適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることもできる。
【００５３】
Ｆａｂ’は、Ｆ(ａｂ’)２のヒンジ間のＳ‐Ｓ結合を切断して得られる抗体断片である。Ｆａｂ’は、上記Ｆ(ａｂ’)２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’をコードするＤＮＡを任意の適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることもできる。
【００５４】
ｓｃＦｖは、重鎖と軽鎖の可変領域のみを適切なペプチドリンカーで連結したものである。ｓｃＦｖは、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡに基づいてｓｃＦｖ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることができる。
【００５５】
ｄｓＦｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをＳ‐Ｓ結合を介して結合したものである。各領域におけるシステイン残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。ｄｓＦｖは、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡに基づいてｄｓＦｖ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることができる。
【００５６】
Ｄｉａｂｏｄｙは、８アミノ酸残基以下の短いペプチドリンカーで連結されたｓｃＦｖの２量体であり、２価の抗原結合活性を有する。２価の抗原結合活性は、同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。Ｄｉａｂｏｄｙは、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡに基づいて８アミノ酸残基以下のペプチドリンカーで連結されたｓｃＦｖの発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることができる。
【００５７】
ＣＤＲを含むペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つを含む。ＣＤＲを含むペプチドは、複数のＣＤＲを直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させたものであってもよい。ＣＤＲを含むペプチドは、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域におけるＣＤＲをコードするＤＮＡを任意の適切な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主細胞へ導入し、発現させることによって得ることができる。また、Ｆｍｏｃ法、ｔＢｏｃ法等の化学合成法によって得ることもできる。
【００５８】
［Ｄ．医薬組成物］
本発明の医薬組成物は、標的結合因子としてのＡ項に記載のモノクローナル抗体またはＣ項に記載の抗体の断片と、薬物とを含む。上記モノクローナル抗体または該抗体の断片（以下、「モノクローナル抗体等」と称する場合がある）を標的結合因子として利用することにより、表面にＴＦを発現する細胞内に効率よく薬物を送達することができる。
【００５９】
第１の実施形態において、上記モノクローナル抗体等は薬物と結合された状態であり得る。また、当該実施形態においては、必要に応じて、モノクローナル抗体等に高分子化合物がさらに結合されていてもよい。
【００６０】
上記薬物としては、治療対象の疾患等に応じて任意の適切な薬物が選択される。例えば、核酸医薬、抗体医薬、遺伝子治療薬等のバイオ薬物およびサイトトキシン、細胞傷害性薬物等の細胞傷害分子が挙げられる。
【００６１】
核酸医薬としては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムサイトが挙げられる。
【００６２】
サイトキシンとしては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジハイドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、オーリスタチンまたはそれらの誘導体が挙げられる。
【００６３】
細胞傷害性薬物としては、例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン等の代謝拮抗物質、メクロレタミン、チオエパクロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）等のアルカリ化剤、ダウノルビシン、ドキソルビシン等のアントラサイクリン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アンスラマイシン（ＡＭＣ）等の抗生物質およびビンクリスチン、ビンブラスチン等の有糸分裂剤が挙げられる。
【００６４】
薬物または高分子化合物とモノクローナル抗体等との結合は、当該技術分野において公知の方法で行われ得る。例えば、各々が有する官能基または必要に応じて導入された官能基を反応させることによって行われ得る。当該官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基とカルボキシル基、カルボキシル基とヒドロキシル基、マレイミド基とチオール基、チオール基とチオール基、ヒドラジド基とケトン基、ヒドラジド基とアルデヒド基、アミノ基とアルデヒド基、チオール基とカルボキシル基、アミノ基とスクアリン酸誘導体、ジエニルアルデヒド基とアミノ基、ハロエステルとチオール基、アジドとアルキン等が挙げられる。また、例えば、薬物がタンパク質またはペプチドである場合には、遺伝子工学的手法によりモノクローナル抗体等との融合タンパク質であってもよい。さらにまた、薬物が電荷を有する場合には、イオン結合を介して結合していてもよい。
【００６５】
上記高分子化合物としては、任意の適切な高分子化合物が選択される。具体例としては、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。このような高分子化合物が結合されることにより、血中安定性が向上し得る。
【００６６】
高分子化合物の結合部位は、モノクローナル抗体等の抗原結合活性およびインターナリゼーション能を損なわない限りにおいて任意の適切な部位であり得る。
【００６７】
第２の実施形態において、上記モノクローナル抗体等はＤＤＳキャリア素材と結合された状態であり得る。当該ＤＤＳキャリア素材としては、薬物を内包したナノ粒子（例えば、平均粒子径が好ましくは１０ｎｍ〜４００ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ〜３００ｎｍ、さらに好ましくは３０ｎｍ〜１５０ｎｍの粒子）を形成し得るものが好ましく用いられ得る。このようなＤＤＳキャリア素材によれば、薬物を内包したナノ粒子が形成され得るので、生体内での該薬物の安定性が向上され得、また、徐放化が可能となる。さらに、モノクローナル抗体等による標的細胞内への確実な薬物送達が可能となる。
【００６８】
モノクローナル抗体等は、ＤＤＳキャリア素材の任意の適切な位置に結合される。標的結合性を好適に発揮させる観点から、好ましくは、モノクローナル抗体等は、ＤＤＳキャリア素材が形成するナノ粒子の外表面に露出するように結合される。モノクローナル抗体等とＤＤＳキャリア素材との結合は、例えば、それぞれが有する官能基または必要に応じて導入した官能基を反応させることによって行われ得る。官能基の好ましい組み合わせについては上記のとおりである。
【００６９】
上記ＤＤＳキャリア素材としては、例えば、親水性セグメントと疎水性セグメントとを有するブロックコポリマー等のポリマーミセル形成材料、リン脂質等のリポソーム形成材料、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸等の天然高分子、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等の合成高分子等のナノハイドロゲルカプセル形成材料、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびこれらの共重合体等のナノスフェア形成材料が挙げられる。なかでも、親水性セグメントと疎水性セグメントとを有するブロックコポリマーを用いることが好ましい。親水性セグメントと疎水性セグメントとを有するブロックコポリマーの親水性セグメントにモノクローナル抗体等を結合して標的結合性ブロックコポリマーとすることにより、薬物を標的細胞内へ高い確実性で送達可能なポリマーミセルが得られ得る。
【００７０】
上記薬物としては、第１の実施形態と同様の薬物が用いられ得る。第２の実施形態においては、薬物は、そのまま用いてもよく、親水性セグメントと疎水性セグメントとを有するブロックコポリマーの疎水性セグメントに結合されて、薬物結合ブロックコポリマーの形態で用いられてもよい。
【００７１】
［Ｅ．薬物送達用組成物］
本発明の薬物送達用組成物は、Ａ項に記載のモノクローナル抗体またはＣ項に記載の抗体の断片を含む。上記モノクローナル抗体または該抗体の断片はＴＦを発現する細胞への標的結合因子として利用され得、さらには、該細胞へのインターナリゼーション能を発揮し得る。よって、本発明の薬物送達用組成物を用いて薬物を投与することにより、表面にＴＦを発現する細胞内に効率よく薬物を送達することができる。
【００７２】
［Ｆ．本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体の用途］
本発明の抗ＴＦモノクローナル抗体は、代表的には、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒが関与する疾患（例えば、組織や細胞表面にてＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒの発現の亢進を伴う疾患）の治療に用いられる。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒが関与する疾患としては、例えば、癌、炎症、血栓症等が挙げられる。ＴＦは、種々の癌組織において発現が恒常的に亢進していることから、癌の種類に関わらずその治療に用いることができる。また、例えば、膵臓癌においては、ＴＦを高発現する患者の予後が悪いことが報告されており、このような患者を対象とする治療においても有効に利用され得る。
【００７３】
本発明の医薬組成物の投与ルートは、皮下、静脈、動脈、局所等の非経口投与が好ましく、静脈内注射が特に好ましい。投与量は、薬物の種類、用法、患者の年齢、性別、患者の健康状態等に応じて適切に決定され得る。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、「部」および「％」は、「重量部」および「重量％」を意味する。【００７５】
［実施例１  抗ｈＴＦモノクローナル抗体およびその断片］
［抗原の調製］
ｈＴＦ全長アミノ酸配列の３３位〜２５１位までのアミノ酸配列を含む組み換え蛋白質を大腸菌で発現させ、ニッケルカラムで精製して得られたレコンビナントｈＴＦ（配列番号２９）を抗原として用いた。【００７６】
［ラットへの免疫］
レコンビナントｈＴＦ５０μｇをフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と共に６週令のＷｉｓｔｅｒ雌ラット３匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その１４日後にレコンビナントｈＴＦ５０μｇをＳｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ）と共に投与し、追加免疫とした。以降、２１日毎に同様の追加免疫を５回行った。さらに１２６日後にＰＢＳで希釈したレコンビナントｈＴＦ１０μｇを腹腔投与し、レコンビナントｈＴＦ４０μｇを尾静脈投与することで最終免疫とした。【００７７】
［ハイブリドーマの調製］
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を５０％濃度のポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ）を用いて融合させ、ＨＡＴ培地で選択した。【００７８】
［抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング］
細胞融合８日後に抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたイムノアッセイは以下のとおりである。ＥＬＩＳＡ法を行うにあたり、９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルにレコンビナントｈＴＦを１μｇ／ｍＬ含む５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩もしくは室温で２時間固定した。これらのウェルを３００μＬの洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／２．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／１％  ＢＳＡ／１００  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５）を２００μＬで加えて４℃で一晩もしくは室温で１時間静置してブロッキングを行った。このようにして得たｈＴＦ固相化プレートの各ウェルに５０μＬのハイブリドーマ培養上清を添加して室温で１時間反応させた。各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄後、ブロッキングバッファーで５,０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）を５０μＬで加えて３０分反応させた。反応後、各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄し、３．７ｍＭ  o-フェニレンジアミン／２５ｍＭ  クエン酸／１３０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／０．００６％  Ｈ２Ｏ２（ｐＨ５．０）を１００μＬで添加し、呈色させた。１０〜１５分後に２規定硫酸を３０μＬ／ｗｅｌｌで添加して反応を停止し、吸光度（４９０ｎＭ）を吸光プレートリーダーで測定した。また免疫沈降ＥＬＩＳＡ法はレコンビナントｈＴＦとハイブリドーマ培養上清とを混合し、混合液中の未結合ｈＴＦの量をｈＴＦ定量サンドイッチＥＬＩＳＡで測定することで実施した。さらに、フローサイトメトリー法を定法に従って実施し、ｈＴＦ発現細胞に対するハイブリドーマ培養上清の反応性を測定した。【００７９】
上記測定の結果、ｈＴＦと強い親和性を示したハイブリドーマを選択し、これらのクローンについて限界希釈法を２回行うことでｈＴＦと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを樹立した。【００８０】
［抗体の調製］
樹立した各ハイブリドーマを牛由来ＩｇＧを除去した牛血清を５％量含むＲＰＭＩ１６４０培地等で大量培養し、培養上清を得た。もしくは、各ハイブリドーマをＩＣＲヌードマウスの腹腔内で大量培養し、腹水を採取した。得られた培養上清もしくは腹水をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇアフィニティカラムクロマトグラフィーに供してＩｇＧモノクローナル抗体を精製した。【００８１】
［インターナリゼーションアッセイ］
上記のようにして得られた各モノクローナル抗体を以下のインターナリゼーションアッセイに供した。
カルチャースライド４チャンバー（ＢＤ）にＴＦ高発現のヒト膵臓癌細胞ＢｘＰＣ３を５×１０４ｃｅｌｌｓ／チャンバーで播種し、ＲＰＭＩ  １６４０培地で３７℃、５％ＣＯ２環境下、１２時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後にＡｌｅｘａ６４７蛍光ラベルｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した３０μｇの抗体を１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地で希釈し各チャンバーに投与し、３時間培養した。当該３時間の培養においては、培養開始から２時間経過後に、終濃度７５ｎＭとなるようにＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ＲＥＤ−ＤＮＤ９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養液に加え、その後さらに１時間培養した。次いで、ＰＢＳで３回洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で核染色後、ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で封入した。次いで、蛍光顕微鏡(Ｋｅｙｅｎｃｅ)を用いて各細胞を観察した。観察の結果を図１に示す。【００８２】
図１（ａ）および（ｂ）に示すように、２つのモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９、Ｎｏ．１８５９）においては、細胞内に標識物質が移行していることから、これらのモノクローナル抗体がインターナリゼーション能を有することが確認された。一方、図１（ｃ）に示す抗体に関してはインターナリゼーション能が確認されなかった。なお、これらの抗体について、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、Ｎｏ．１８４９はＩｇＧ２ｂ、Ｎｏ．１８５９はＩｇＧ２ａであった。【００８３】
［可変領域をコードするＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびＣＤＲ配列の決定］
１．抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）
抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）を産生するハイブリドーマから常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次いで、得られた全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。【００８４】
合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にて、抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を得た。具体的には、下記のプライマー一覧の中から、重鎖可変領域クローニング用のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして、それぞれ、以下のプライマー１〜１９の混合プライマーおよびプライマー２０を用い、軽鎖可変領域クローニング用のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして、それぞれ、以下のプライマー２２〜３８の混合プライマーおよびプライマー３９を用いてＰＣＲを行った。
［プライマー一覧］
プライマー１（配列番号３０）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＲＭＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣ
プライマー２（配列番号３１）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＢＣＡＧＣＴＢＣＡＧＣＡＧＴＣ
プライマー３（配列番号３２）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＳＡＳＴＣ
プライマー４（配列番号３３）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＲＣＴＧＣＡＡＣＡＲＴＣ
プライマー５（配列番号３４）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＹＣＡＧＣＴＢＣＡＧＣＡＲＴＣ
プライマー６（配列番号３５）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＹＣＡＲＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣ
プライマー７（配列番号３６）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣ
プライマー８（配列番号３７）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＳＳＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣ
プライマー９（配列番号３８）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＷＧＹＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ
プライマー１０（配列番号３９）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＳＫＧＧＴＧＧＡＧＴＣ
プライマー１１（配列番号４０）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＭＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ
プライマー１２（配列番号４１）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＲＴＣ
プライマー１３（配列番号４２）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＲＣＴＴＧＴＴＧＡＧＴＣ
プライマー１４（配列番号４３）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＲＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣ
プライマー１５（配列番号４４）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＲＳＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣ
プライマー１６（配列番号４５）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＡＣＴＣＴＲＡＡＡＧＷＧＴＳＴＧ
プライマー１７（配列番号４６）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＶＣＡＧＣＡＲＣＣ
プライマー１８（配列番号４７）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣ
プライマー１９（配列番号４８）
ＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＧＴＣ
プライマー２０（配列番号４９）
ＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＧＧＡＧＣＡ
プライマー２１（配列番号５０）
ＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＲＴＣＡＴＴＴＡＣＣＭＧＧＡＧＡＧＴ
プライマー２２（配列番号５１）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ
プライマー２３（配列番号５２）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＷＣＣＣＡＧＴＣ
プライマー２４（配列番号５３）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＭＡＣＴＣＡＧＴＣ
プライマー２５（配列番号５４）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＹＴＲＡＣＡＣＡＧＴＣ
プライマー２６（配列番号５５）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＲＡＴＧＡＣＭＣＡＧＴＣ
プライマー２７（配列番号５６）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＭＡＧＡＴＲＡＭＣＣＡＧＴＣ
プライマー２８（配列番号５７）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＹＤＣＡＧＴＣ
プライマー２９（配列番号５８）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＹＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ
プライマー３０（配列番号５９）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＷＣＣＡＧＴＣ
プライマー３１（配列番号６０）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＷＧＣＴＳＡＣＣＣＡＡＴＣ
プライマー３２（配列番号６１）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＳＴＲＡＴＧＡＣＣＣＡＲＴＣ
プライマー３３（配列番号６２）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＲＴＴＫＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＲＡＣ
プライマー３４（配列番号６３）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＢＣＡＧＫＣ
プライマー３５（配列番号６４）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＹＣＡＧＧＡ
プライマー３６（配列番号６５）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＷＴ
プライマー３７（配列番号６６）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣ
プライマー３８（配列番号６７）
ＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣ
プライマー３９（配列番号６８）
ＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＣＴ
なお、上記塩基配列中、ＲはＧまたはＡ、ＹはＴまたはＣ、ＭはＡまたはＣ、ＫはＧまたはＴ、ＳはＧまたはＣ、ＷはＡまたはＴ、ＢはＧ、ＣまたはＴ、ＤはＡ、ＧまたはＴ、ＶはＡ、ＧまたはＣ、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを意味する。【００８５】
上記で得られた各ＰＣＲ産物を常法に従ってベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。【００８６】
上記のようにして決定した抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列はそれぞれ、配列番号６９および７０に記載のとおりである。また、該重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号９および１０に記載されるとおりである。また、これらのアミノ酸配列を既知の抗体のアミノ酸配列のデータベース（ＩＭＧＴのウェブサイト：ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｉｍｇｔ.ｏｒｇ／）と比較して相同性を調べることにより、ＣＤＲのアミノ酸配列を以下のとおり決定した。
【表１】
0005957637.tif 000002
【００８７】
２．抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８５９）
抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８５９）を産生するハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出したこと、および、重鎖可変領域クローニング用のアンチセンスプライマーとしてプライマー２１を用いたこと以外は、上記と同様にして抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８５９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を決定した。【００８８】
決定された抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８５９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列はそれぞれ配列番号７１および７２に記載のとおりである。また、該重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１７および１８に記載されるとおりである。また、これらの可変領域におけるＣＤＲのアミノ酸配列を以下のとおり決定した。
【表２】
0005957637.tif 000003
【００８９】
［表面プラズモン共鳴法による結合活性評価］
Ｂｉａｃｏｒｅ社のＣＭ５チップ表面に抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９、Ｎｏ．１８５９）を固相化した。各抗体を固相化したＣＭ５チップをＳＰＲ装置にセットし、その流路に精製ｈＴＦを含有した抗原含有ｂｕｆｆｅｒを流した。この測定系により各抗体とｈＴＦとの解離定数を求めた。なお、測定条件は以下のとおりである。
ＳＰＲ装置：Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００（ビアコア社）
抗原含有ｂｕｆｆｅｒ：ｈＴＦを最終濃度２５μｇ／ｍｌで含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．５，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  ３ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．００５％  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０），  ｐＨ７．４）。【００９０】
上記測定の結果、各抗体のｈＴＦに対する解離定数（ＫＤ）は、Ｎｏ．１８４９が９．１３９×１０−１１、Ｎｏ．１８５９が１．８９４×１０−１０であった。【００９１】
［抗凝固作用評価］
以下のようにして、抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９およびＮｏ．１８５９）のプロトロンビン時間を測定した。
リコンビナントｈＴＦ抗原３５０ｎｇに抗体３μｇを添加し、全量が５μｌになるまでＰＢＳを加えた。３７℃、６００ｒｐｍで振とうさせながら１５分抗原抗体反応をさせた。反応液に３．８％クエン酸ナトリウムで抗凝固処理をしたヒト血漿  ５０μｌ、２５ｍＭ  ＣａＣｌ２  １００μｌを添加すると同時に３７℃、６００ｒｐｍで振とうさせながら培養し、フィブリン塊が形成されるまでの時間（プロトロンビン時間）を計測した。反応液の代わりにＰＢＳを用いた対照におけるプロトロンビン時間を１としたときの各抗体の凝固延長時間比（プロトロンビン時間比）を表３および図２に示す。
【表３】
0005957637.tif 000004
【００９２】
表３および図２に示されるとおり、Ｎｏ．１８５９の凝固延長時間比は１．２２２であり、抗凝固作用が極めて小さいことがわかる。【００９３】
［実施例２  医薬組成物］
［モノクローナル抗体と薬物との結合］
以下のようにしてモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が結合された抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）（以下、「ｈＴＦ−ＭＭＡＥ」と称する）を得た。【００９４】
【化１】
0005957637.tif 000005
Ｈ−Ｃｉｔ−ＯＨ（１．１８ｇ，６．７４ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ３（５６６ｍｇ，６．７４ｍｍｏｌ）の水溶液（１８ｍＬ）にＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（２．８０ｇ，６．４２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１８ｍＬ）溶液を加え、さらにＴＨＦ（９ｍＬ）を加えて、終夜撹拌した。反応を１５％クエン酸水溶液（４０ｍＬ）により停止させ、水層をＡｃＯＥｔ／ｉ−ＰｒＯＨ（９／１）混合溶液（１００ｍＬ，２０ｍＬ  ×２）により抽出した。あわせた有機層を水（７０ｍＬ）で洗浄し、減圧濃縮した。残渣の固体をジエチルエーテルにより洗浄し、ジペプチド（３．１１ｇ，９７％）を白色固体として得た。【００９５】
【化２】
0005957637.tif 000006
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＯＨ（３．００ｇ，６．０４ｍｍｏｌ）とｐ−アミノベンジルアルコール（１．４９ｇ，１２．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（７０ｍＬ）とメタノール（３０ｍＬ）の溶液に１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（２．９９ｇ，１２．１ｍｍｏｌ）を加えた。１日後、さらにＥＥＤＱ（１．５０ｇ，６．０４ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。反応液を濃縮し、残渣をジエチルエーテルにより洗浄し、目的物（２．５１ｇ，６９％）を得た。【００９６】
【化３】
0005957637.tif 000007
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ（２．００ｇ，３．３２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）に溶かし、ビス−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（２．０２ｍｇ，６．６５ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．８７ｍＬ，４．９８ｍｍｏｌ）を加えた。終夜撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルとジエチルエーテルにより洗浄し、ｐ−ニトロフェニルカーボネート体（１．７３ｇ，６８％）を得た。【００９７】
【化４】
0005957637.tif 000008
ｐ−ニトロフェニルカーボネート体（１．２８ｇ，１．６７ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ（３７６ｍｇ，２．７８ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（３．４ｍＬ）とピリジン（０．８５ｍＬ）の溶液にＭＭＡＥ（１．００ｇ，１．３９ｍｍｏｌ）を加えた。２４時間後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０（溶媒ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１）により精製し、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（１．４４  ｇ，７７％）を得た。【００９８】
【化５】
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Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（１．４４ｇ，１．０７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）にＥｔ２ＮＨ（５ｍＬ）を加えた。終夜撹拌後、反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルとジエチルエーテルにて洗浄し、淡黄色固体（９６０ｍｇ，８０％）を得た。【００９９】
【化６】
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Ｈ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（９６０ｍｇ，０．８５５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）にＮ末端にマレイミド基を有するＭａｌ−ＰＥＧ１２−ＯＳｕ（８１４ｍｇ，０．９４ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．４５ｍｍｏｌ，２．５７ｍｍｏｌ）を加えた。終夜撹拌し、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１）と分子ふるいＨＰＬＣにより精製し、Ｍａｌ−ＰＥＧ１２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（以下、「マレイミドＭＭＡＥ化合物」と称する場合がある）を無色オイル（７６９ｍｇ，４８％）として得た。【０１００】
５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳと１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）とを用いてｐＨ６．４の緩衝液を調製し、得られた緩衝液を用いて抗体濃度が１．０ｍｇ／ｍｌになるよう抗体溶液を調製した。該抗体溶液にジチオトレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度１〜１０ｍＭになるように加えて、２６〜３７℃で３０〜４５分反応させた。次いで、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ:３０，０００）で反応液から反応試薬を除去した。吸収測定したところ抗体の回収率は８０〜９９％であった。また、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）によるＳＨ基の定量結果から、１抗体あたり３〜５個のＳＨ基が得られたことがわかった。【０１０１】
次に、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳと１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）とを用いてｐＨ６．４の緩衝液を調製し、得られた緩衝液を用いて上記反応液をタンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。該希釈液に上記マレイミドＭＭＡＥ化合物を１：４のモル比（抗体：マレイミドＭＭＡＥ化合物）で混合した後、室温１時間、その後４℃で一晩反応させた。【０１０２】
その後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ:３０，０００）で反応液から反応試薬を除去した後、溶媒をＰＢＳに置換した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａでタンパク質を回収したところ６０〜９０％の回収率であった。【０１０３】
上記のようにして、抗体１個あたり３〜５個のＭＭＡＥが付加されたｈＴＦ−ＭＭＡＥを得た。【０１０４】
［殺細胞効果確認試験］
９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにヒト膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ３）を３×１０３個ずつ加え、１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ培地で培養した。各ウェルに種々の薬物濃度となるようにｈＴＦ−ＭＭＡＥを添加し、添加後７２時間における細胞生存率を算出した。【０１０５】
なお、比較試験として、ｈＴＦ−ＭＭＡＥの代わりに、ヒト癌細胞に発現していないマウスＴＦに対するモノクローナル抗体（ｍＴＦ）に上記と同様にしてＭＭＡＥを結合したｍＴＦ−ＭＭＡＥを用いて同様の試験を行い、細胞生存率を算出した。ネガティブコントロール（薬物サンプルの添加なし）の細胞生存率を１００％とした場合における各細胞生存率の割合（％）を図３に示す。【０１０６】
図３に示されるとおり、ｈＴＦ−ＭＭＡＥは、ｍＴＦ−ＭＭＡＥに比べて顕著に優れた殺細胞効果を示した。このことから、薬物が抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）に結合されることによって、表面にｈＴＦを発現する細胞内への移行性が向上し、高い薬効を発揮し得ることがわかる。【０１０７】
［抗腫瘍効果確認試験］
４週齢ヌードマウス（ＢＡＬＢｃ  ｎｕ／ｎｕ、メス）の背部皮下に１×１０７個／１００μＬのヒト膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ３）を移植し、腫瘍体積（腫瘍径に基づいて算出）が約２００ｍｍ３となった時点から治療を開始した。治療開始当日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０、４および８に１回ずつ薬物を尾静脈投与した（計３回投与）。薬物としては、ｈＴＦ−ＭＭＡＥを用い、対照として生理食塩水を投与した（各群：Ｎ＝７）。薬物の投与量は、１回あたり１０ｍｇ／ｋｇ（抗体量：約２００μｇ／匹）であった。以後、Ｄａｙ３０まで腫瘍径および体重を週２回計測した。Ｄａｙ０における腫瘍体積および体重に対する腫瘍体積および体重の比をそれぞれ図４および５に示す。【０１０８】
図４に示されるとおり、ｈＴＦ−ＭＭＡＥは顕著に優れた抗腫瘍効果を示した。該結果はｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認された殺細胞効果に一致するものである。また、図５に示されるとおり、ｈＴＦ−ＭＭＡＥを投与した群において体重の減少は確認されなかった。【０１０９】
［実施例３  抗ｍＴＦモノクローナル抗体およびその断片］
［抗原の調製］
ｍＴＦ全長アミノ酸配列の３０位〜２５１位までのアミノ酸配列を含む組み換え蛋白質を大腸菌で発現させ、ニッケルカラムで精製して得られたレコンビナントｍＴＦ（配列番号７３）を抗原として用いた。【０１１０】
［ラットへの免疫］
レコンビナントｍＴＦ５０μｇをフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と共に６週令のＷｉｓｔｅｒ雌ラット３匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その１４日後にレコンビナントｍＴＦ５０μｇをＳｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ）と共に投与し、追加免疫とした。以降、２１日毎に同様の追加免疫を７回行った。さらに２０７日後にＰＢＳで希釈したレコンビナントｍＴＦ１０μｇを腹腔投与し、レコンビナントｍＴＦ４０μｇを尾静脈投与することで最終免疫とした。【０１１１】
［ハイブリドーマの調製］
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を５０％濃度のポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ）を用いて融合させ、ＨＡＴ培地で選択した。【０１１２】
［抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング］
細胞融合８日後に抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたイムノアッセイは以下のとおりである。ＥＬＩＳＡ法を行うにあたり、９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルにレコンビナントｍＴＦを１μｇ／ｍＬ含む５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩もしくは室温で２時間固定した。これらのウェルを３００μＬの洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／２．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／１％  ＢＳＡ／１００  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５）を２００μＬで加えて４℃で一晩もしくは室温で１時間静置してブロッキングを行った。このようにして得たｍＴＦ固相化プレートの各ウェルに５０μＬのハイブリドーマ培養上清を添加して室温で１時間反応させた。各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄後、ブロッキングバッファーで５,０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）を５０μＬで加えて３０分反応させた。反応後、各ウェルを３００μＬの洗浄液で３回洗浄し、３．７ｍＭ  o-フェニレンジアミン／２５ｍＭ  クエン酸／１３０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／０．００６％  Ｈ２Ｏ２（ｐＨ５．０）を１００μＬで添加し、呈色させた。１０〜１５分後に２規定硫酸を３０μＬ／ｗｅｌｌで添加して反応を停止し、吸光度（４９０ｎＭ）を吸光プレートリーダーで測定した。また免疫沈降ＥＬＩＳＡ法はレコンビナントｍＴＦとハイブリドーマ培養上清とを混合し、混合液中の未結合ｍＴＦの量をｍＴＦ定量サンドイッチＥＬＩＳＡで測定することで実施した。さらに、フローサイトメトリー法を定法に従って実施し、ｈＴＦ発現細胞に対するハイブリドーマ培養上清の反応性を測定した。【０１１３】
上記測定の結果、ｍＴＦと強い親和性を示したハイブリドーマを選択し、これらのクローンについて限界希釈法を２回行うことでｍＴＦと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを樹立した。【０１１４】
［抗体の調製］
樹立した各ハイブリドーマを牛由来ＩｇＧを除去した牛血清を５％量含むＲＰＭＩ１６４０培地等で大量培養し、培養上清を得た。もしくは、各ハイブリドーマをＩＣＲヌードマウスの腹腔内で大量培養し、腹水を採取した。得られた培養上清もしくは腹水をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇアフィニティカラムクロマトグラフィーに供してＩｇＧモノクローナル抗体を精製した。【０１１５】
［インターナリゼーションアッセイ］
上記のようにして得られた各モノクローナル抗体を以下のインターナリゼーションアッセイに供した。
カルチャースライド４チャンバー（ＢＤ）にマウスＢ１６メラノーマ細胞とそのＴＦ強制発現細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／チャンバーで播種し、ＲＰＭＩ  １６４０培地で３７℃、５％ＣＯ２環境下、１２時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後にＡｌｅｘａ６４７蛍光ラベルｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した３０μｇの抗体を１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地で希釈し各チャンバーに投与し、３時間培養した。当該３時間の培養においては、培養開始から２時間経過後に、終濃度７５ｎＭとなるようにＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ＲＥＤ−ＤＮＤ９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養液に加え、その後さらに１時間培養した。次いで、ＰＢＳで３回洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で核染色後、ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で封入した。次いで、蛍光顕微鏡(Ｋｅｙｅｎｃｅ)を用いて各細胞を観察した。観察の結果を図６に示す。【０１１６】
図６に示すように、モノクローナル抗体（Ｎｏ．１１５７）においては、細胞内に蛍光標識された抗体（赤色）が移行していることから、当該モノクローナル抗体がｍＴＦを発現する細胞へのインターナリゼーション能を有することが確認された。なお、図６において、蛍光標識された抗体（赤色）が内部に移行している細胞は、ＴＦ強制発現のマウスＢ１６メラノーマ細胞であり、内部に抗体が移行していない細胞は、通常のマウスＢ１６メラノーマ細胞と推測される（参考として、ＴＦ強制発現のマウスＢ１６メラノーマ細胞におけるＴＦ発現量の増強レベルを図７に示す。図７は、マウスＢ１６メラノーマ細胞およびそのＴＦ強制発現細胞におけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対するＴＦのｍＲＮＡ発現量の割合を示すグラフである）。【０１１７】
［可変領域をコードするＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびＣＤＲ配列の決定］
抗ｍＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１１５７）を産生するハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出したこと以外は、抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列の決定方法と同様にして、抗ｍＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１１５７）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列を決定した。【０１１８】
決定された抗ｍＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１１５７）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列はそれぞれ配列番号７４および７５に記載のとおりである。また、該重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２５および２６に記載されるとおりである。また、これらの可変領域におけるＣＤＲのアミノ酸配列を以下のとおり決定した。
【表４】
0005957637.tif 000011
【０１１９】
［実施例４  キメラ抗体の作製］
実施例１でクローニングした抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。重鎖の可変領域ＤＮＡ断片をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を発現するクローニングベクター（ｐＦＵＳＥｓｓ＿ＣＨＩｇ−ｈＧ１ｅ２（ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ））に挿入し、軽鎖の可変領域ＤＮＡ断片をヒトｋａｐｐａ軽鎖定常領域を発現するクローニングベクター（ｐＦＵＳＥ２ｓｓ＿ＣＬＩｇ＿ｈｋ（ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ））に挿入して、発現ベクターを得た。得られた発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションした。次いで、１０μｇ／ｍＬ  Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ  Ｓ（科研製薬）および３００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて薬剤選択を行い、両耐性細胞株を得た。【０１２０】
得られた細胞株をＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ（ｗａｋｏ）、１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０μｇ／ｍＬ  Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ  Ｓおよび３００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎを含む培地で維持培養した。次いで、９６ｗｅｌｌプレートを用いた限界希釈法により抗ｈＴＦヒト型キメラ抗体の定常発現細胞株（Ｎｏ．１８４９キメラクローン）をクローニングした。【０１２１】
クローニングした細胞株（Ｎｏ．１８４９キメラクローン）の培養上清をＥＬＩＳＡに供したところ、ｈＴＦとの反応性が確認できた。また、クローニングした細胞株の培養上清をフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）に供したところ、ヒト結腸腺癌細胞（ＤＬＤ−１）に対する反応性が確認できた。具体的には、図８に示されるとおり、培養上清は、ｈＴＦ発現細胞であるＤＬＤ−１に対して特異的な反応性を示した（図８中、（１）、（２）および（３）はそれぞれ、ラット抗ｈＴＦモノクローナル抗体（Ｎｏ．１８４９）、Ｎｏ．１８４９キメラクローンの培養上清およびラットのアイソタイプ・コントロールを用いた解析結果を示す）。【０１２２】
［キメラ抗体をコードするＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の決定］
Ｎｏ．１８４９キメラクローンからベクターを抽出し、常法に従って該ベクターにコードされている抗ｈＴＦヒト型キメラ抗体（Ｎｏ．１８４９）の重鎖および軽鎖の塩基配列ならびにアミノ酸配列を決定した。決定されたキメラ抗体の重鎖および軽鎖の塩基配列はそれぞれ配列番号７６および７７に記載のとおりである。また、決定されたキメラ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号７８および７９に記載のとおりである。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明のモノクローナル抗体またはその断片は、ＤＤＳの分野において好適に利用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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