(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーに於いて使用するカラムの出口流路に抵抗を設け、前記抵抗の作動によりカラム入口圧力を１０ＭＰａ〜１００ＭＰａに調整し、異性体化合物を成分ごとに溶質挙動を変化させることを特徴とする異性体化合物の処理方法。
【請求項２】
前記溶質挙動の変化は溶質の分離であることを特徴とする請求項１に記載の異性体化合物の処理方法。
【請求項３】
前記溶質挙動の変化は溶質出現順序の変化であることを特徴とする請求項１に記載の異性体化合物の処理方法。
【請求項４】
前記溶質挙動の変化は溶質の合体であることを特徴とする請求項１に記載の異性体化合物の処理方法。
【請求項５】
前記カラム入口圧力を１００ＭＰａ〜１０ＭＰａの間で連続的又は段階的に下げながら異性体化合物の溶質挙動を変化させることを特徴とする請求項１から４のうち何れか一項に記載の異性体化合物処理方法。
【請求項６】
溶離液の組成を変化させることで、前記カラム入口圧力を１００ＭＰａ〜１０ＭＰａの間で連続的又は段階的に変化させ異性体化合物の溶質挙動を変化させることを特徴とする請求項１から４のうち何れか一項に記載の異性体化合物の処理方法。
【請求項７】
カラム温度を変化させることで、前記カラム入口圧力を１００ＭＰａ〜１０ＭＰａの間で変化させ、異性体化合物の溶質挙動を変化させることを特徴とする請求項１から４のうち何れか一項に記載の異性体化合物の処理方法。
【請求項８】
前記カラムが分析カラムであることを特徴とする請求項１から７のうち何れか一項に記載の異性体化合物の分析方法。
【請求項９】
前記カラムが分取カラムであることを特徴とする請求項１から７のうち何れか一項に記載の異性体化合物の分取方法。
【請求項１０】
異性体化合物を処理する装置であって、カラム出口流路に於いて、カラム出口から検出器までの間、又は、検出器から排出の間、又はその両方に抵抗を接続し、カラム入口圧力を所定の圧力に調整自在としたことを特徴とする異性体化合物の処理装置。
【請求項１１】
前記抵抗は、抵抗管であることを特徴とする請求項１０に記載の異性体化合物の処理装置。
【請求項１２】
前記抵抗管はチューブ、モノリスカラム又は充填カラムのうちの一であることを特徴とする請求項１１に記載の異性体化合物の処理装置。
【請求項１３】
前記抵抗は、液体が流通する空間容量を変化できるレギュレータであることを特徴とする請求項１０に記載の異性体化合物の処理装置。
【請求項１４】
前記カラム出口流路側にバルブを設け、該バルブに複数の抵抗を接続し、接続する抵抗の選択により、所定のカラム入口圧力を得ることを特徴とする請求項１０から１３のうち何れか一項に記載の異性体化合物の処理装置。
【請求項１５】
請求項１０から１４のうち何れか一項に記載の異性体化合物の処理装置であって、前記カラムとして分析カラムを使用したことを特徴とする異性体化合物の分析装置。
【請求項１６】
請求項１０から１４のうち何れか一項に記載の異性体化合物の処理装置であって、前記カラムとして分取カラムを使用したことを特徴とする異性体化合物の分取装置。
【請求項１７】
１０ＭＰａ以上の耐圧のある粒子状担体又はモノリス担体に固定相を２μｍｏｌ／ｍ２以上の密度に塗布又は化学結合させた充填剤を用いたことを特徴とする異性体化合物分離カラム。
【請求項１８】
１０ＭＰａ以上の耐圧のある粒子状担体又はモノリス担体に固定相を２μｍｏｌ／ｍ２以上の密度に塗布又は化学結合させたことを特徴とする異性体化合物分離カラム用充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーにおける異性体化合物の処理、特にその分離及び分取に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは、化合物の官能基の種類や大きさの違いによる吸着力・電荷・疎水性の差を利用して、成分分離に広く使われている手法である。しかし、分子量と官能基の種類が同一、つまり分子式が同一ではあるが、その分子構造が異なる化合物、所謂異性体化合物間の分離においては、吸着力・電荷・疎水性の差が小さいため、これらの化学的な相互作用の大きな差が期待できない。その目的ではカラムの基本的な分離性能が非常に高い、２０万段以上の理論段数が得られるキャピラリーガスクロマトグラフィーが期待されるが、熱分解成分や高沸点化合物には適用できないので、分析の前に誘導体化するなどの手間のかかる手法が取られる。
【０００３】
一方、前処理の手間が比較的かからない液体クロマトグラフィーではどうかというと、有機溶媒と水の割合を変える単純な溶離液の変更だけでは異性体化合物間の分離はできないことが多い。そのため、異性体化合物の認識能が高いシクロデキストリンなどの高分子化合物を溶離液に添加したり、これらの化合物を固定相としたＬＣカラムを用いたりするなどの種々の工夫を行う必要が出てくる。
特殊な溶離液への変更はベースラインの安定に時間を要し、場合によっては装置の接液部にダメージを与えることも考えられる。
【０００４】
カラム温度を１５℃以下に下げ、低温分析する手法も提案されているが、高価な冷却用オーブンが必要で、さらに、冷却するには多くのエネルギーも必要となる。時期によっては結露による装置へのダメージも考えられ、使いづらさやカラムを均一な温度にするための安定時間などを考慮すると実用に困難を伴う。
【０００５】
液体クロマトグラフィーにおいて、保持及び分離が安定する、言い換えると、システム系すべての状態が平衡化するには、かなりの時間が必要となる。特に、異性体化合物分離においては特殊な溶離液を用いたり、分析温度を下げたりするのでより長い時間がかかってしまう。さらに、カラム変更においては、その付け替え時間、カラム内溶媒を溶離液に変化させるための中間溶媒の選択、その溶離液の平衡化ということで多大なる手間と時間がかかる。
【０００６】
それに対して、流量及び圧力の変更は、平衡化が速く、液体クロマトグラフィーにおいては有効な手段となり得る。流量の変更は、保持が全体的に早くあるいは遅くなるだけで、個々の成分間の分離は大きく変化しないが、圧力の変更は、分離に様々影響するとの知見が得られてきている。
【０００７】
Ｒｏｇｅｒｓ らは、シリカ固定相、水移動相系で、メチルオレンジとエチルオレンジの保持について、２００００ｐｓｉまでは保持減少、２００００ｐｓｉより高圧になると、保持増加を認めた報告を行っており、後にｉｏｎ−ｐａｉｒ  ＲＰＬＣにおいて２４１０ｂａｒに昇圧するとメチルオレンジの保持増加が３．２倍になったこと、その原因としてイオンペア系は複雑な平衡系であり、高圧によるイオン対生成の増加が保持の増加をもたらした可能性の考えられることが示唆されている（非特許文献１）。
【０００８】
Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎらは、アセトニトリル （ＡＣＮ）−水（４０：６０ｖ／ｖ）混合溶液の粘度（０．８９ｃＰ）が、２５℃、３５００ｂａｒで０．１６ｃＰ／ｋｂａｒ増加することを報告している（非特許文献２）。  
【０００９】
ＭｃＧｕｆｆｉｎらはＣ１０−Ｃ２０脂肪酸のメトキシクマリン誘導体が、カラム入口圧力３６−３６０ｂａｒの増加により９％から２４％保持増加したことを報告している（非特許文献３，４）。相互作用として分散力が、エントロピー的な効果と併せて考慮されていて、溶質、移動相、固定相すべてが圧縮されると考えられている。さらに、平面的芳香族（ＰＡＨ）については保持増加７%、非平面的芳香族については効果は小さいかむしろ減少を報告している。
【００１０】
Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎらは２，３‐ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅについてオクタデシル（ＯＤＳ）基結合シリカゲルカラムを用い１０００ｂａｒで１２％の保持増加を報告している（非特許文献５）。
【００１１】
田中らは、解離可能な溶質（酸、塩基）がそれらのｐＫａ（酸解離定数）付近のｐＨにおいて溶出されるとき、圧力が溶質や緩衝溶液物質のｐＫａを変化させ、高圧がイオン化を促進するという報告を行っている。この結果、イオン化制御逆相クロマトグラフィーにおいて、移動相のｐＨや溶質のイオン化率が圧力によって変化し、弱酸、弱塩基の保持が変化し、分離パターンの変化をもたらす。この場合、圧力が、より大きな体積変化をもたらす種に対する圧力効果が、保持の変化の方向（増加あるいは減少）を支配すると考察している（非特許文献６）。
【００１２】
Ｅｖａｎｓらはシクロデキストリン添加逆相クロマトグラフィー系、あるいはシクロデキストリン結合固定相系において、加圧によりシクロデキストリンへの取り込みが増加し、ｐ‐ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌの保持や、優先的に取り込まれる光学異性体化合物の保持が変化し、分離係数が変化（増加あるいは減少）する場合があることを報告している。このような環状構造ホスト物質による取り込み平衡系における圧力効果は、固定相における圧力効果より大きく、分離度はいずれの場合にも減少すると報告している（非特許文献７，８）。
【００１３】
ＭｃＣａｌｌｅｙらは、５０ＭＰａ程度の加圧（カラムと検出器の間に３０μｍ キャピラリーを接続）により、疎水性・中性物質について１２％程度、極性、高分子物質についてさらに大きな増加、イオン（酸、塩基）性物質について５０％以上の保持の増加が認められたと報告している。さらに、固定相による影響（Ｃ１８がＣ１より大きな効果）を報告している。高圧による保持の増加は、高圧下で溶質が脱溶媒和し、保持を促進することによりもたらされると結論している。又、タンパク質のような高分子について、はるかに大きな圧力効果（保持の増加）が報告されている。（非特許文献９，１０，１１，１２）
【００１４】
以上のように注目されるべき見解を含む種々の発表がされている。しかし、これらの分離カラムの加圧による保持の変化に関する報告の多くは、親水性化合物に関するものである。５０ＭＰａの圧力増加に対して疎水性化合物でも、５−２４％の保持の増加が認められているが、親水性化合物のように大きな保持の増加を報告しているものは見当たらない。
【００１５】
加圧効果に関するこれまでの報告を分類すると、次の４つのタイプに表される。
タイプ１：非極性・疎水性化合物（長鎖アルキル化合物，ＰＡＨ）の分散相互作用（ＭｃＧｕｆｆｉｎ，ＭｃＣａｌｌｅｙ）：疎水性（平面的）溶質に対する保持の小さな増加（分散力の増加＋立体排除）。
タイプ２：ｐＫａ付近のｐＨにおける弱酸，弱塩基のイオン化制御（Tanaka）：弱酸、弱塩基について、ｐＨ，ｐＫａの変化を通じた保持の変化（増加、減少）（溶媒和の増加（電縮）による高圧におけるイオン解離の促進）
タイプ３：ｐＫａから離れたｐＨにおいて、イオンや親水性溶質の脱溶媒和（ＭｃＣａｌｌｅｙ）：親水性溶質やイオンについて、保持の大きな増加（溶質の脱溶媒和に基づいているとも考えられている）。
タイプ４： 環状構造ホストによるＩｎｃｌｕｓｉｏｎ（取り込み）現象（錯体形成の増加)において、ホストの空間に取り込まれ得る親水性溶質について加圧による錯体生成の増加、光学異性体化合物間の分離係数のわずかな変化(増加あるいは減少)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】G.Prukop,L.B.Rogers,Sep.Sci.Technol.,13（1978）59.
【非特許文献２】J.W. Thompson, T.J. Kaiser, J.W. Jorgenson, J. Chromatogr. A 1134 (2006) 201.
【非特許文献３】V.L. McGuffin, S.-H. Chen, Anal. Chem. 69 (1997) 930.
【非特許文献４】V.L. McGuffin, C.E. Evans, J. Microcol. Sep. 3 (1993) 513.
【非特許文献５】J.S. Mellors, J.W. Jorgenson, Anal. Chem. 76 (2004) 5441.
【非特許文献６】N. Tanaka, T. Yoshimura, M. Araki, J. Chromatogr. 406 (1987) 247.
【非特許文献７】L.M. Ponton, S.M. Hoenigman, M. Cai, C.E. Evans, Anal. Chem. 72 (2000) 3581.
【非特許文献８】C.E. Evans, J.A. Davis, Anal. Chim. Acta 397 (1999) 163.
【非特許文献９】M. M. Fallas, U. D. Neue, M. R. Hadley, D. V. McCalley, Journal of Chromatography A, 1209 (2008) 195
【非特許文献１０】S.-H. Chen, C.-T. Ho, K.-Y. Hsiao, J.-M. Chen, J. Chromatogr. A 891 (2000) 207.
【非特許文献１１】M.A. Stadalius, H.S. Gold, L.R. Snyder, J. Chromatogr. 296 (1984) 31.
【非特許文献１２】X. Liu, P. Szabelski, K. Kaczmarski, D. Zhou, G. Guiochon, J. Chromatogr. A 988 (2003) 205.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
このような背景があり、異性体化合物の分離においては、安定の早い簡単な溶離液で、分離を達成することが求められている。尚、ここでカラムは分離カラムの意で用いられ、分析カラム、分取カラムである。
【００１８】
異性体化合物の分離を実現させるために、異性体各成分の分離を更に言えば異性体各成分ごとの溶質挙動（パターン）を変化させることが重要である。圧力による相互作用としては、タイプ１が普遍的に働き、加えて立体選択性が働くことにより、異性体化合物間の分離を変化させることが期待できる。
【００１９】
液体クロマトグラフィーにおいては、流量を大きくするとカラム内の抵抗により、カラム入口圧力を上げることは可能であるが、出口側では大気圧になってしまい、カラム中央では、入口圧力の１／２の増加にとどまる。固定相に対する圧力効果は、入口の一部しか働かない上、カラムの分離性能が下がることが多い。圧力の増加のために温度を下げる方法は、実用的な温度では粘度の増加が大きくないので、圧力を上げる効果が小さい。
【００２０】
一方、流速やカラム長さが変わると圧力が変化するが、カラム性能も同時に変化するので分離パターンの変化が、圧力の効果によるものか、他の要素によるものか不明確で安定した圧力の効果が得られない。一定の圧力効果を得るためには、カラム入口側の圧力効果と同じ効果をカラム出口でもたらす必要があり、出口側に入口と同じ背圧を加える必要がある。すなわち、カラム全体の平均的圧力が、通常の分析時の２倍以上になるように背圧を加えればその効果が最も明確に得られることになる。
【００２１】
例えば、良く用いられる５μｍ粒子が充填されたカラムの場合、１００％アセトニリルを溶離液として、線速度１ｍｍ／ｓｅｃで流した場合、分析圧力は、１ＭＰａ〜５ＭＰａになる。出口側でも同じ圧力効果が働くように背圧を加えると、入口圧力は２倍の２ＭＰａ〜１０ＭＰａとなる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記課題を達成するための手段としては下記の通りである。
その一として、液体クロマトグラフィーに於いて使用するカラムの出口流路に抵抗を設け、該抵抗の作動によりカラム入口圧力を１０ＭＰａ〜１００ＭＰａに調整し異性体化合物を成分ごとに溶質挙動を変えることを特徴とする異性体化合物の処理方法である。
【００２３】
その一として、溶質挙動の変化は溶質の分離であることを特徴とする異性体化合物の処理方法である。
【００２４】
その一として、溶質挙動の変化は溶質出現順序の変化であることを特徴とする異性体化合物の処理方法である。
【００２５】
その一として、溶質挙動の変化は溶質の合体であることを特徴とする異性体化合物の処理方法である。
【００２６】
その一として、前記カラム入口圧力を１００ＭＰａ〜１０ＭＰａの間で連続的又は段階的に下げながら異性体化合物の溶質挙動を変化させることを特徴とする異性体化合物処理方法である。
【００２７】
その一として、溶離液の組成を変化させることで、前記カラム入口圧力を１００ＭＰａ〜１０ＭＰａの間で連続的又は段階的に変化させ異性体化合物の溶質挙動を変化させることを特徴とする異性体化合物の処理方法である。
【００２８】
その一として、カラム温度を変化させることで、前記カラム入口圧力を１００ＭＰａ〜１０ＭＰａの間で変化させ、異性体化合物の溶質挙動を変化させることを特徴とする異性体化合物の処理方法である。
【００２９】
その一として、前記カラムが分析カラムであることを特徴とする異性体化合物の分析方法である。
【００３０】
その一として、前記カラムが分取カラムであることを特徴とする異性体化合物の分取方法である。
【００３１】
その一として、異性体化合物を処理する装置であって、カラム出口流路に於いて、カラム出口から検出器までの間または検出器から排出の間またはその両方に抵抗を接続し、カラム入口圧力を所定の圧力に調整自在としたことを特徴とする異性体化合物の処理装置である。
【００３２】
その一として、前記カラムに分析カラムを使用した異性体化合物分析装置である。
【００３３】
その一として、前記カラムに分取カラムを使用した異性体化合物分取装置である。
【００３４】
その一として、前記抵抗が抵抗管であることを特徴とする異性体化合物の処理装置である。
【００３５】
その一として、前記抵抗管はチューブ、モノリスカラム、充填カラムのうちの一であることを特徴とする異性体化合物の処理装置である。
【００３６】
その一として、前記抵抗が、液体が流通する空間容量を変化できるレギュレータであることを特徴とする異性体化合物の処理装置である。
【００３７】
その一として、上記の何れかに記載の異性体化合物の処理装置であって、前記カラムとして分析カラムを使用したことを特徴とする異性体化合物の分析装置である。
【００３８】
その一として、上記の何れかに記載の異性体化合物の処理装置であって、前記カラムとして分取カラムを使用したことを特徴とする異性体化合物の分取装置である。
【００３９】
その一として、前記カラム出口流路側にバルブを設け、該バルブに複数の抵抗を接続し、接続する抵抗の選択により、所定のカラム入口圧力を得ることを特徴とする異性体化合物の処理装置である。
【００４０】
その一として、１０ＭＰａ以上の耐圧のある粒子状担体又はモノリス担体に固定相を２μｍｏｌ／ｍ２以上の密度に塗布又は化学結合させた充填剤を用いた異性体化合物分離カラムである。
【００４１】
その一として、１０ＭＰａ以上の耐圧のある粒子状担体又はモノリス担体に固定相を２μｍｏｌ／ｍ２以上の密度に塗布又は化学結合させた異性体化合物分離カラム用充填剤である。
【発明の効果】
【００４２】
カラム出口から検出器までの間または検出器から排出の間またはその両方に、抵抗を接続し、分析圧力を１０ＭＰａ以上にすることで、異性体化合物溶出の変化、例えば分離、分離順序の変更、合体等の変化をさせることが可能となった。分析圧力の変更では、平衡時間は短く、従来のような溶離液や温度を変えた場合の３０分以上の平衡化待ち時間を無くすことができる。
【００４３】
又、圧力調整は、従来から市販されている種々の方法が使用でき、簡単に実現可能である。
【００４４】
又、単純な溶離液で、室温でも異性体化合物分離が可能となるので、従来多量の溶離液を用いて、温調が難しかった分取が簡単にできるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明一実施例概略説明図
【図２】本発明−実施例対象異性体化合物トコフェロール図
【図３】本発明一実施例概略説明図
【図４】本発明一実施例概略説明図
【図５】本発明一実施例ロータリーバルブ図
【図６】本発明一実施例バルブ切換図
【図７】本発明一実施例レギュレータ図
【図８】本発明一実施例クロマトグラム
【図９】本発明一実施例クロマトグラム
【図１０】本発明一実施例クロマトグラム
【図１１】本発明一実施例クロマトグラム
【図１２】本発明一実施例クロマトグラム
【図１３】本発明一実施例クロマトグラム
【図１４】本発明一実施例クロマトグラム
【図１５】本発明一実施例クロマトグラム
【図１６】本発明一実施例クロマトグラム
【図１７】本発明一実施例クロマトグラム
【図１８】本発明一実施例クロマトグラム
【図１９】本発明一実施例クロマトグラム
【図２０】本発明一実施例クロマトグラム
【図２１】本発明一実施例クロマトグラム
【発明を実施するための形態】
【００４６】
一般的に二酸化炭素の溶解において、その溶解度は、圧力に対して１０ＭＰａ程度までは、大きく上昇し、１０ＭＰａ以上では変化が少なく１５ＭＰａでほぼ一定となると言われている。
ＨＰＬＣにおける試料成分の固定相への溶解度もほぼ同等の傾向を示すと考えられ、保持の早い安定を考えると、圧力における溶解度の変化が小さくなる１０ＭＰａ以上が理想と考えられる。本願発明の実施例においても、１０ＭＰａ以上で効果が得られることが実証されている。
【００４７】
装置やカラムが許すならば、圧力が高い方が、カラム内の圧力勾配の影響が、システム全体に影響しないので、安定が早くなる。背圧を加えてシステム圧力を１００ＭＰａまで上げると、カラム部分の圧力影響は５％以下になり、カラムの種類やカラムサイズによる圧力変化影響もほとんど無くなる。従って、１０ＭＰａ以上ならば異性体化合物の処理が可能であり、上限圧力は装置耐圧に依存される。
現在市販されている最も耐圧の高いＨＰＬＣ装置は、耐圧１５０ＭＰａであり、そのカラム部分の圧力影響は３％以下となるため、より安定なデータが得られることが期待される事になる。しかし、実際には溶離液を送り出す送液ポンプのプランジャーや試料導入を行うインジェクターなどの接液部には樹脂性のシール材が使用されており、１５０ＭＰａでは磨耗が早く長時間の安定した送液ができない。従って、圧力調整の実用における上限は、１００ＭＰａと考えるのが適当である。
【００４８】
異性体化合物の分離を再現良く変化させるすなわち、化合物間の分離をコントロールするには、カラム入口圧力を１０ＭＰａ〜１００ＭＰａ内になるように、カラム出口側即ちカラム出口流路に抵抗を接続し、調整することが非常に有用である。
【００４９】
その場合、カラム出口側と検出器又は検出器セル間での抵抗増加でも異性体化合物分離は達成できるが、その部分でのデッドボリュームが生じるのでピーク形状が悪くなる懸念があり、検出器セルの後に抵抗を付けることが理想的である。
【００５０】
また検出器セルそのものを抵抗として使用することも可能で本発明の効果が期待できる１０ＭＰａ以上の耐圧セルならば何でも良いが、具体的には下記セルが使用できる。
検出器セルとしては一般的に石英やガラスが使用されることが多いが、そのままでは耐圧性が無いため、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（以後ＰＥＥＫと略す）などの検出に用いる光を透過する樹脂をコートした石英やガラス製セルなどが５０ＭＰａ程度の耐圧が得られるので適している。また内径１ｍｍ未満の溶融シリカキャピラリーセルを用いると１００ＭＰａ程度までの耐圧が得られ、そのままで本発明の異性体化合物分離を実現できる。
【００５１】
しかしながら、キャピラリーの場合では内径が１ｍｍ未満であるため、用いることのできる流速が１ｍＬ／ｍｉｎ程度に限定されてしまうという限界がある。より高流速を用いる分取を考えると、５０ＭＰａ以上の背圧に耐えるためにはステンレスなどの金属製セルが好ましい。検出器セルに高圧が掛かると、数μｍオーダーの表面の傷にも溶質が入り込み吸着原因になってしまう。物理的に研磨する方法は種々あるが、細かい検出器セルの機械的な内面加工には限界がある。そこで、テトラエトキシシラン、テトラメトキシシラン、シクロシロキサンなどのケイ酸化合物やポリシラザンなどの反応性試薬による化学処理によって、ガラス表面を形成させたセルを用いることが良い。
【００５２】
カラム出口流路側に抵抗を接続し、圧力制御する方法としては、１０ＭＰａ以上の圧力がカラム入口に掛かれば良く、特に規定するものではないが、具体的には下記のような方法が考えられる。
【００５３】
内径０．１５ｍｍ以下の中空抵抗管、好ましくは接液面がなめらかである溶融石英キャピラリーチューブを接続する方法が簡便で適している。
物理的な振動による破損を防ぐため、ＰＥＥＫなどの樹脂チューブで、接続部または抵抗管全体を保護する事が有効である。
さらに、より短い長さでより強い抵抗を得るためには、１００μｍ以下例えば５０μｍの貫通するスルーポアを持ち、かつ骨格が３次元的に繋がった一体型の所謂モノリス体をチューブ内に形成したモノリス抵抗管が好ましい。
【００５４】
それらは、比較的デッドボリュームが小さいので、カラムと検出器又は検出器セルの間に設けても、十分使用できる。これら単独でも十分使用できるが、さらに、抵抗を接続しても良い。
【００５５】
カラムと検出器又は検出器セル間で一定の抵抗を接続することで、すぐに圧力が１０ＭＰａ以上で安定し、異性体化合物分離が安定して行える。さらに後に変化可能な異なる抵抗を設けることで、圧力を加えて調整できる。
【００５６】
たとえば、カラムと検出器セル間にデッドボリュームの影響のないモノリス抵抗管を入れて、効果が得られる１０ＭＰａ以上の２０ＭＰａになるようにする。
そのようなセルの後に４０ＭＰａとなる下記のような抵抗を設けると、カラム入口圧力は、２０ＭＰａ〜６０ＭＰａまで調整できる。この場合には、セルには最大で４０ＭＰａしか掛らないので、市販されている耐圧４０ＭＰａセルを使用すればガラス化などの工夫は必要なく使用できる。
【００５７】
検出器又は検出器セルの後での抵抗としては、ＨＰＬＣ充填カラムを抵抗管の代わりに用いることも可能である。さらに、複数の抵抗管をバルブに取り付け、順次流路を切り替えることで、順次圧力を変えることもできる。また、従来から市販されている高耐圧の液体用ニードルバルブも使用できる。ニードルの絞りを変えることで自由に流路抵抗を変化させられるので、自動で圧力を簡単に変えることができる。
【００５８】
内径を順次細くした円錐状の抵抗管やモノリスフィルターを用いた抵抗調整など、背圧調整ができれば、従来技術が何でも使用できる。デッドボリュームの影響が考えられる場合には、低デッドボリュームの抵抗管とボリュームのある抵抗を組み合わせることが推奨される。
【００５９】
用いるカラムとしては、特に限定される訳ではないが、高密度構造固定相を持ったＬＣ充填タイプカラムやモノリスカラムが異性体化合物分離の変化が大きくなる。この溶出挙動変化としては、分離の拡大、促進、流出順序の変化、変更、合体が挙げられる。
【００６０】
オリゴ糖や多糖誘導体やタンパク質などの剛直な構造を固定相とした粒子充填タイプカラムやモノリスカラムなどが、加圧による異性体化合物分離により効果を発揮する。
【００６１】
具体的には、Ｃ１６以上の長鎖アルキル鎖を持つ化合物固定相や平面的な構造を持つ芳香環を持つ固定相などは、高密度構造になり異性体化合物分離の変化が大きくなる。
【００６２】
固定相や多孔質体によって異なるが、１〜２μｍｏｌ／ｍ２の固定相を導入すると1層に並んだ形での単分子層が形成される（モノメリック結合）。1μｍｏｌ以下だと疎となり固定相としては低密度となる。高密度と言われる固定相では、結合基が多層に重なり（ポリメリック）導入された状態になり、２μｍｏｌ／ｍ２以上の固定相の場合が多い。
【００６３】
担体として、シリカゲル、チタニア、ジルコニアなどの粒子状無機担体、それらに有機物を含む無機-有機のハイブリッド担体、スチレンジビルベンゼンポリマーなどの有機担体、無機モノリス体、無機−有機のハイブリッドモノリス、有機モノリスなどで、固定相を保持できる１０ＭＰａ以上の担体ならば、どれでも適用できる。
【実施例１】
【００６４】
カラム入口の圧力を１０ＭＰａ以上にする方法として、具体的に下記の方法を実施した。
図１は一般的なＬＣシステムとしてのＨＰＬＣシステムであり、ＨＰＬＣポンプ１、インジェクター２、カラム３、検出器４から構成される。移動相となる溶離液は、ＨＰＬＣポンプ１により送り出され、インジェクター２，カラム３，検出器４の順に流れ、廃液される。
【００６５】
図１の装置に於いては、カラム３の後に第１抵抗５、または検出器の後に第２抵抗６を設置した。ＨＰＬＣシステム全体の圧力は、配管インジェクター圧力とカラム圧力と抵抗５圧力と検出器配管圧力と抵抗６圧力の合計値となって表わされる。カラム入口圧力は、システム全体の圧力から配管インジェクター圧力を引いた圧力となる。実際には、もっとも高性能が得られる線速度２ｍｍ／ｓｅｃ以下の場合では、配管インジェクター圧力は、０．５ＭＰａ以下であり、システム圧力とカラム入口圧力は同じと考えてよい。
【００６６】
固定相となるＨＰＬＣ充填カラムとして、内径４．６ｍｍ長さ２５ｃｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）Ｃ３０（ＵＳＰコード  Ｌ６２  トリアコンチル基結合シリカゲル  ５μｍ  ジーエルサイエンス社製）を用いて、トコフェロール異性体の分離をおこなった。トコフェロールは図２の構造を持ち、特にβとγの異性体はメチル基（図中Ｍｅと略す）の結合位置が異なるだけで、分離は難しい。溶離液としては、ＨＰＬＣで広く使われもっとも単純な組成であるメタノール１００％を使用し、流速５００μＬ／ｍｉｎ（線速度０．５ｍｍ／ｓｅｃ）、カラム温度４０℃を分析条件とした。
【００６７】
抵抗５と６を接続していない分析では、カラム入口圧力は、３．１ＭＰａになり、異性体は分離していない（図８（１）  １：δ−トコフェロール、２：γ−トコフェロール、３：β−トコフェロール、４：α−トコフェロール  以下同じ）。
【００６８】
抵抗５に、内径０．０５ｍｍ溶融シリカキャピラリーチューブ４０ｃｍを設置し、抵抗６は接続無しとした結果、カラム入口圧力は、１３ＭＰａとなりピーク２，３に表される異性体の溶出が変化し分離が見られた（図８（２））。
【００６９】
さらに抵抗５を内径０．０３ｍｍ溶融シリカキャピラリーチューブ２５ｃｍに変える事で、カラム入口圧力は、４９ＭＰａとなり、異性体のγ−トコフェロールに対してβ−トコフェロールの溶出が、より遅くなり、結果として分離した（図８（３））。
【００７０】
どちらのシステムもその容量は、1μＬ以下で、そのデッドボリュームによる遅れ時間は、０．１秒以下でありピーク形状への悪化影響もなかった。つまり、カラムとセル間にカラム入口圧力が１０ＭＰａ以上になる抵抗を接続することで、単純な溶離液での異性体分離が行えることが確認された。
【００７１】
さらに、抵抗の種類、接続場所を種々変えて、その効果を確かめた。
抵抗５に、モノリスキャピラリーチューブＭｏｎｏＣａｐ（登録商標）内径０．２ｍｍ、長さ１．５ｃｍ（容量０．６μＬスルーポア２μｍ）を接続した結果、圧力４９ＭＰａになり、図８（３）と同じく異性体が分離した。
【００７２】
抵抗５に、内径０．０５ｍｍ溶融シリカキャピラリーチューブ長さ４０ｃｍを接続し、セルの後に抵抗６としてＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８ＨＰＬＣカラム（ＵＳＰコード  Ｌ１  オクタデシル基結合シリカゲル  ２μｍ  ジーエルサイエンス社製）内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍを取り付けた。カラム入口圧は、４９ＭＰａとなり、図８（３）と同じく異性体が分離した。
【００７３】
抵抗６に用いるカラムは、検出後であり分離に影響しないので、分離が悪くなった使い古したカラムでも良く経済的である。また、このシステムの場合、セルに掛かる圧力は、３０ＭＰａであり高耐圧の市販セルでも使用できるので、便利である。また、ＨＰＬＣカラムは、キャピラリーチューブより詰まりにくく、抵抗変動が生じにくいためより有用である。
【００７４】
抵抗５に内径０．０３ｍｍ溶融シリカキャピラリーチューブ長さ５ｃｍを接続し、抵抗６に、６方ロータリーバルブを５種類の抵抗を設けて接続した。ロータリーバルブを回すと段階的に抵抗を切換することができる。ロータリーバルブ７の出口ポート９には抵抗をつけず、出口ポート１０に内径０．０６５ｍｍ  ＰＥＥＫチューブ３０、長さ３ｍを取り付け、出口ポート１１に内径０．０５ｍｍ溶融シリカキャピラリーチューブ３１長さ１．２ｍを取り付け、出口ポート１２に内径０．０３ｍｍ溶融シリカキャピラリーチューブ３２長さ１５ｃｍを取り付け、出口ポート１３に内径０．２ｍｍモノリスキャピラリーチューブ３３ＭｏｎｏＣａｐ、長さ２ｃｍ（スルーポア：１μｍ）を取り付け、出口ポート１４に粒子径２μｍＨＰＬＣカラム内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍカラム３４を取り付けた。
【００７５】
ロータリーバルブ７を回してポート１０に設定した場合には、カラム入口圧力は、１３ＭＰａとなり、図８（２）と同じ分離が得られた。回してポート１１〜１４に設定した場合には、カラム入口圧力は４９ＭＰａとなり、図８（３）と同じ分離が得られた。どのポートに回しても、異性体の分離に適用できる事が確認された。さらに、ポート１０〜１４に回して、圧力変動はほとんどなく、取り付ける抵抗を変える事で、自由に圧力を変更できることも確認できた。
【００７６】
今回の検討で、抵抗管が詰まる事はなかったが、バルブシールによる汚れが出て来ることが考えられるので、詰まりにくいカラムやなるべく内径の太い抵抗が推奨される。
【００７７】
抵抗５には図３に示すように抵抗を接続せず、抵抗６に６方切換バルブ７を接続し、図６に示すように抵抗管１８、１９を組み入れた。バルブを切り換えることにより、段階的に抵抗を変えることができる。抵抗として、内径０．０５ｍｍ溶融シリカキャピラリーチューブ１８長さ４０ｃｍと内径０．０３ｍｍ溶融シリカキャピラリーチューブ長さ２５ｃｍを組み込み、切り換えたところ、それぞれ、カラム入口圧力が、１３ＭＰａ、４９ＭＰａとなり、それぞれ、図８（２）、図８（３）と同様の分離が得られた。切換バルブの容量は、１０μＬ以下と小さく、遅れ時間は、1秒程度であり、検出器セル前にも使用できる。
【００７８】
抵抗５には、抵抗を接続せず、抵抗６にレギュレータを接続した。レギュレータは、図７に示すような構造で圧縮ばね２３の荷重と出口側圧力による力の平衡を利用し、ピストンシール２２の働きによりピストン２１を移動させて液体が流通する空間容量を変化させるにより抵抗圧力を調整する事ができる。開放状態では、抵抗が掛からず、図８（１）と同じ分離状態であったが、圧力調整ねじ２４を回して調整することにより１３ＭＰａにすると、図８（２）のように分離が見られ、さらに絞って調整すると、図８（３）のように異性体が分離した。
【００７９】
圧力調整ねじ２４を自動で機械的に調整すれば、圧力を連続的に可変できる事になる。その場合、１０ＭＰａ以上の圧力にカラム入口圧がなれば、異性体分離効果が発揮されるので、実際には、１０ＭＰａ以上になり、かつデッドボリュームの少ない抵抗管を前段に接続し、その後に、レギュレータを接続する事が推奨される。また、圧力変動も少なくシステム安定が早くなる。
【００８０】
このように本発明においては、基本的には、１０ＭＰａ以上の圧力をカラム入口に掛けられれば、手段は多種のものが利用でき、その抵抗の数や接続位置は限定されない。
【実施例２】
【００８１】
実施例１と同じ試料であるトコフェロール異性体を用いて、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）Ｃ３０内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのＨＰＬＣ充填カラムを用いて、単純な溶離液であるメタノール１００％を用いて、従来から言われている温度効果と本発明である圧力効果の比較をおこなった。実施例１にあるように、図９（１）のように通常の条件では、βとγトコフェロール異性体は完全分離しない。しかし、カラム温度を下げる事により、図９（３）に示すように分離された。２０℃で異性体の分離は達成されている。
【００８２】
しかし、オーブン温度を２０℃に設定し、モニター温度が設定値になったのは約３０分後であった。そこで実際に分析を行ったが、ピーク保持時間は安定せず、３回目の分析から安定したデータが取れ始めた。オーブン温度が安定してから、約３０分後にやっと保持時間が安定したことになり、オーブン温度設定からだと、１時間程度の平衡化時間が必要になることがわかった。当然、冷却には膨大なエネルギーが使われる事になる。
【００８３】
同じカラム、同じ溶離液、同じ試料で本願発明の方法を実施した。
カラム温度は、３０℃一定とし、カラムの後に、内径０．０３ｍｍ、長さ２８ｃｍの溶融シリカキャピラリーチューブ（容量０．２μＬ）を抵抗として接続した。カラム入口圧力は５７．９ＭＰａとなり、２０分程度で安定し、最初の分析から図１０（１）のような安定したデータが得られた。さらに、その後に抵抗として、内径０．０３ｍｍ、長さ１０ｃｍの溶融シリカキャピラリーチューブを接続した。カラム入口圧力は７９ＭＰａとなった。抵抗管を繋ぐジョイント部分の容量を入れても全容量は１μＬ以下であり、図１０（２）のように完全分離したデータが得られた。
安定時間も、２０分以内であり、圧力を掛けることによる異性体分離は従来方法よりも簡便で早く安定する事が確認された。
【実施例３】
【００８４】
実施例１と同じ方法を、標準試料ではなく、実試料市販サプリメントのＨＰＬＣ分析に適用した。
市販トコトリエノールサプリメント1粒をカッターで割り中身を１０．５ｍｇ量り取り、ヘキサン／イソプロパノール＝１：１  １ｍLで溶解しＨＰＬＣ用試料とした。
Iｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）Ｃ３０  内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのＨＰＬＣ充填カラムを用いて、メタノール１００％を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度３０度、検出２９５ｎｍで分析して、従来法と本発明方法と比較してその効果を確かめた。
従来方法では  圧力３．１ＭＰａで、異性体である  ２）ガンマトコトリエノールと  ３）ベータトコトリエノールは分離していない。（図1１上）
本発明方法では破損防止のため、内径０．４ｍｍのピークチューブを保護チューブとして被せた内径０．１ｍｍ  長さ25ｃｍの溶融シリカキャピラリーを、抵抗管として、ＳＵＳ  １／１６  インチフェラルでカラムの後と検出器の間に接続し、その他は従来法と同条件で分析した。
カラム入口圧は、６３．３ＭＰａとなり図１１下のように１）デルタトコトリエノール、２）ガンマトコトリエノール、  ３）ベータトコトリエノール、４）アルファートコトリエノールという異性体４成分がすべて分離し、４成分がこのサプリメントに含まれていることがわかった。サプリメントからの抽出物という実試料分析にも、本発明による異性体分離が適用できることが確認された。
【実施例４】
【００８５】
実施例１と同じ条件で脂肪酸メチルエステルである１．γ‐Ｍｅｔｈｙｌ（ｚ，ｚ，ｚ）‐６，９，１２‐ｏｃｔａｄｅｃａｔｒｉｅｎｏａｔｅと２．α‐Ｍｅｔｈｙｌ（ｚ，ｚ，ｚ）‐９，１２，１５‐ｏｃｔａｄｅｃａｔｒｉｅｎｏａｔｅの異性体の分析を行った。
【００８６】
使用し易く、置換が早い１００％メタノール溶離液を用いて、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）Ｃ３０内径４．６ｍｍ長さ２５０ｍｍとＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−Ｐ内径３．０ｍｍ、長さ２００ｍｍの２種類のカラムで本願発明方法を実施した。カラムの出口流路に高耐圧セルを接続し、その後に抵抗としてレギュレータを接続し、背圧を可変しながら実験を行った。
【００８７】
Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）Ｃ３０、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍにおいて、まず、背圧は掛けずに、分析を行ったところ、圧力７．４ＭＰａでは、ほとんど分離できなかった（図１２（１））。レギュレータのつまみを回して、カラム入口圧力を５６．３ＭＰａに調整すると、２成分の溶出時間が変化し、分離が見られた。（図１２（２））完全分離ではないが、圧力が分離に効果的に作用していることが確認された（ピーク１：γ‐Ｍｅｔｈｙｌ（ｚ，ｚ，ｚ）‐６，９，１２‐ｏｃｔａｄｅｃａｔｒｉｅｎｏａｔｅ、ピーク２：α‐Ｍｅｔｈｙｌ（ｚ，ｚ，ｚ）‐９，１２，１５‐ｏｃｔａｄｅｃａｔｒｉｅｎｏａｔｅ）。
【００８８】
Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−Ｐ、内径３．０ｍｍ、長さ２００ｍｍにおいても、同様な事を行った。圧力を掛けない場合では、７．４ＭＰａでほとんど分離せず（図１２（１））、５７．３ＭＰａに調整すると、２成分の溶出時間が変化し、完全にベースライン分離となった（図１２（２））。
【００８９】
セルの前に内径０．０３ｍｍ、長さ２５ｃｍの溶融シリカキャピラリーチューブを接続しても同じ効果が得られた。カラムの種類によっては大小はあるが、異性体の分離を変化させることにおいて圧力が効果的に働くことが確認された。
【実施例５】
【００９０】
実施例１に示す本発明の方法及び装置を分取に適用した例を以下に示す。
Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−Ｐ（ＵＳＰコード  Ｌ1  オクタデシル基結合シリカゲル  ５μｍ  ジーエルサイエンス社製）内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍの分取カラムを用いて、単純な溶離液である７０％アセトニトリル水を流速１０ｍＬ／ｍｉｎで送液し、キシレン異性体１．ｏ−キシレン、２．ｍ−キシレン、３．ｐ−キシレンの分取を試みた。分離カラムの出口流路に内径０．１３mm、長さ２mのコイル状に巻いたＰＥＥＫチューブを抵抗として接続し、分取を行った。分離カラム入口圧力は６５ＭＰａであった。抵抗管の容量は、０．０３ｍＬとなるが、流速が早いため、実際のピーク遅れ時間としては０．２秒以下でまったく影響しない。
【００９１】
ＯＤＳ‐Ｐにおいて、溶離液にβ‐シクロデキシトリンの添加をすることなく、単純な７０％アセトニトリル水溶離液でキシレン異性体の分取が可能であった（図１３）。
１０分〜１１．５分を第１分画（４）、１１．６分〜１２．８分を第２分画（５）１２．８分〜１３分を第３分画（６）として、各分画部をガスクロマトグラフィーを用いて純度チェックを行ったところ、第１分画（４）で、純度１００％のｏ‐キシレンが９９％の回収で得られ、第３分画（６）で純度９８％ｐ‐キシレンが７０％回収率で得られ、第２分画（５）で、純度７０％ｍ‐キシレンが９０％の回収率で得られ、目的成分が分取できる事が分かった。
従来の手法では、β‐シクロデキストリンが溶離液に含まれるため、分取後さらに取り除くことが必要となったが、本発明では添加成分のない単純な溶離液で行えるので、そのまま溶媒のみ蒸発させる事で濃縮または乾固が簡単に行えるので精製にも非常に適していることが判明した。
【００９２】
自動でつまみ２４を回すレギュレータ２５を抵抗として用いて、５０ＭＰａから１０ＭＰａへ圧力を傾斜可変する圧力グラジエントを行い異性体を分取することも可能であった。流量が早いので、カラムと検出器セル間にレギュレータ２５を設けても、デッドボリュームの影響はなく、異性体を分取することが可能となった。図７にレギュレータの一例を示す。概略、ボディー２０にピストン２１をピストンシール２２を介して圧縮ばね２３により流路を遮蔽する構造である。
【実施例６】
【００９３】
実施例1に示す装置及び方法によりＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）Ｃ３０内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ及びＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ‐Ｐ内径３ｍｍ、長さ２００ｍｍの分析カラムを用いて、単純な溶離液である５０％アセトニトリル−水、２０℃の一定温度で１．α‐エストラジオールと２．β‐エストラジオール異性体の分離を試みた。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）Ｃ３０、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍは、流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎとした。抵抗を接続していない従来の分析では圧力４．２ＭＰａであり、異性体のピーク１，２は分離していた（図１４（１））。
【００９４】
抵抗として、内径０．０３ｍｍ、長さ２５ｃｍの溶融シリカキャピラリーチューブをカラム出口に接続し、カラム圧力を７１ＭＰａとして分析した結果、分離せずに１本のピークとして溶出した（図１４（２））。
【００９５】
Ｃ３０カラムでは、固定相となる官能基が高密度に存在するため、その固定相を加圧することで、より平面的なβ‐エストラジオールが、高密度な固定相の中に入り込みやすく、大きく溶出が遅れると考えられる。一方、α‐エストラジオールはβ一体に比べると分子の形が立体的であり、影響があまり顕著ではないため、結果的として７１ＭＰａでは分離しなくなっているが、異性体間の分離を変化させるために圧力が効果的であることは確認された。
【００９６】
Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ‐Ｐ内径３ｍｍ、長さ２００ｍｍの場合は、流速０．１３ｍＬ／ｍｉｎとした。抵抗を接続しない従来の分析では圧力３．４ＭＰａであり、２のβーエストラジオールが先に溶出している（図１５（１））。抵抗として、内径０．０３ｍｍ、長さ６６ｃｍの溶融シリカキャピラリーチューブをカラム出口に接続し、カラム圧力を７１ＭＰａとして分析した結果、逆にα―エストラジオールが先に溶出した（図１５（２））。
【００９７】
ＯＤＳ‐Ｐでも、より平面的なβ‐エストラジオールはより強く保持され、溶出時間が遅くなり、３．４ＭＰａ時と比べてピークの溶出が逆転している。これらのことにより、圧力調整することで、分離を大きく変えることが可能であり、従来、溶離液変更で行なっていた分離の調製が、抵抗を接続し圧力を変えるだけで簡単にできることがわかった。
【実施例７】
【００９８】
実施例１に示す装置及び方法により、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ‐Ｐ内径３ｍｍ、長さ２００ｍｍのカラムを用いて、イオン性の親水基を持った異性体化合物の分離に適用した。末端にカルボニル基を持った脂肪酸の異性体である、
１．Ｃｉｓ‐ｖａｃｃｅｎｉｃ  ａｃｉｄ（１１Ｚ‐Ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ）
２．Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ｃｉｓ‐６‐Ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ）
３．Ｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ（ｔｒａｎｓ‐９‐Ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ）
を試料とし、溶離液として、９７．５％メタノール，２．５％１０ｍＭリン酸（Ｈ２Ｏ）混合移動相を用い、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで効果を検証した。
【００９９】
抵抗を接続していない通常分析では、カラム入口圧は１０ＭＰａ以下である３．２ＭＰａとなり脂肪酸異性体分離していない（図１６（１））。それに内径０．０３ｍｍ、長さ１５ｃｍの溶融シリカキャピラリーチューブを抵抗としてカラム出口に接続すると、カラム入口圧は１０ＭＰａ以上の４０．２ＭＰａとなり、異性体が分離した（図１６（２））。
【０１００】
イオン性の異性体の分離に於いても本発明の方法は効果がある事が確認された。なお、当然のことながら、溶離液としてバッファーを含んだ場合でも効果が得られることも確認された。
【０１０１】
以上から、従来の分析状態に、カラム入口圧が１０ＭＰａ以上になるように、抵抗を加えるだけで、異性体の溶出挙動を変化させ、分離を変化させることができることがわかった。
【実施例８】
【０１０２】
実施例１に示す装置及び方法により、実施例２のトコフェロール異性体（１．σ‐ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ、２．γ‐ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ、３．β‐ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ、４．α‐ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）を試料とし、異なるタイプの固定相を持つ充填カラムで分離を実施した。
【０１０３】
球状シリカゲルにオクタデシル基を結合させた、所謂ＯＤＳカラムの中で、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ‐３（ＵＳＰコード  Ｌ１  オクタデシル基結合シリカゲル  炭素量１５％  ５μｍ  ジーエルサイエンス社製）内径３ｍｍ長さ１００ｍｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ‐ＥＰ（ＵＳＰコード  Ｌ１  オクタデシル基結合シリカゲル  エンベット型  炭素量９％  ５μｍ  ジーエルサイエンス社製）内径３ｍｍ長さ１００ｍｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ‐Ｐ（ＵＳＰコード  Ｌ1  オクタデシル基結合シリカゲル  炭素量２９％  ５μｍ  ジーエルサイエンス社製）内径３ｍｍ長さ２００ｍｍの３種類のカラムを用い、１００％メタノール溶離液で流速０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、抵抗として内径０．０３ｍｍ長さ６０ｃｍの溶融シリカキャピラリーチューブをカラム出口に接続し、圧力効果を検証した。
【０１０４】
ＯＤＳ‐３およびＯＤＳ‐ＥＰでは、圧力の増大により保持時間の増加はあるが、異性体間分離の変化は見られず、β体とγ体は分離しなかった（図１７、図１８）。
【０１０５】
それに対して、ＯＤＳ‐Ｐでは、異性体化合物の溶出が変化し分離してきている（図１９）。圧力効果の少ないＯＤＳ‐３、ＯＤＳ‐ＥＰはそれぞれ、オクタデシル基の結合基密度が、１．３μｍｏｌ／ｍ２、１．７μｍｏｌ／ｍ２であり、圧力効果の高いＯＤＳ‐Ｐでは、２．３μｍｏｌ／ｍ２である。ちなみに実施例２で使用したＣ３０では、化学結合基の結合基密度は２．５ｍｏｌ／ｍ２であり、異性体分離における圧力効果は、２ｍｏｌ／ｍ２以上の高密度の固定相に有効であることがわかる。
【０１０６】
Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ‐３  １．３μｍｏｌ／ｍ２、ＯＤＳ‐ＥＰ  １．７μｍｏｌ／ｍ２、にもタイプ１と同様の圧力効果が働き、保持の増大だけが起こっているが、異性体化合物間の分離にめざましい変化はおきていない。異性体化合物は、結合基が同じでその配置が異なるだけであり、タイプ１〜４の効果による分離はあまり期待できない。
【０１０７】
Ｃ３０、ＯＤＳ‐Ｐにおいては、結合配置が異なり、分子の立体構造が異なる異性体化合物間の溶出が変化している事から、タイプ１の効果に加えて、充填剤として多層に重なり（ポリメリック結合）高密度の固定相の立体選択性効果が働いている事が解った。さらに、圧力を加えると、立体選択効果が大きく表れ分離が飛躍的に変化するものと思われる。
【０１０８】
なお、これらの充填カラムは一般に市販されているため簡単に入手でき、特殊な固定相を選択する必要が無く、異性体分離に適用できる。
【０１０９】
しかしながら、市販充填カラムを使用しなくても下記のような合成を行えば同様の固定相を作成できることは言うまでもない。具体的合成方法は以下のようである。表面積４５０ｍ２／ｍ２、細孔径１０ｎｍ、粒子径５μｍのシリカゲルに５％のオクタデシルトリクロロシランをトルエンに溶かした溶液中で、１０時間以上還流反応を行い、市販のＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ‐ＥＰと同様のオクタデシル基の結合基密度が、２μｍｏｌ／ｍ２以上の固定相が得られた（結合基密度２．１μｍｏｌ／ｍ２）。
【０１１０】
また、同じゲルに１０％安息香酸トリアコンチル安息香酸トルエン溶液を塗布後、窒素中、１２０℃で減圧除去した結果、市販のＩｎｅｒｔｓｉｌ  Ｃ３０と同様の結合基密度２．２μｍｏｌ／ｍ２の固定相が得られた。
【０１１１】
これらの固定相でも圧力増加による異性体間における分離の変化効果が得られており、合成方法や用いる担体はどのような物でも良いが、結合基密度が２μｍｏｌ／ｍ２以上になると、異性体間の分離変化効果が高くなることが確かめられた。
【実施例９】
【０１１２】
これまでの実施例から、１０ＭＰａ以上の圧力がＨＰＬＣカラムに掛かる事が異性体分離に有効であり、具体的にはカラムの後に抵抗を取り付け、さらに変化させることで実現できることが確認された。
【０１１３】
一方、従来の溶離液割合を変化させるグラジエント分析においては、溶離液割合の変化とともにカラム圧力も変化する事が知られている。典型的な逆相分配カラムを用いたグラジエント分析では、有機溶媒量を増加させることにより早期の溶出を目的とするため、圧力は減少する変化が生じる。分析開始時の圧力が１０ＭＰａ以上であってもグラジエント分析が進むと有機溶媒濃度が増え、溶離液の粘性が下がり最終的な分析圧力は５ＭＰａに下がってしまう。これでは異性体間の分離には適用できない。
【０１１４】
そこで、カラムの後に抵抗管を付け１０ＭＰａ以上の状態にし、異性体間の分離に適用できるか検証を行った。
試料には、１）シス１１−オクタデシルメチルエステル、２）シス６−オクタデシルメチルエステル  を用い、実験条件は以下のように設定してＨＰＬＣ分析を行った。
ＨＰＬＣ分析カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ‐Ｐ  ３μｍ  内径３ｍｍ  長さ１００ｍｍ
溶離液Ａ：１０ｍＭ  リン酸水溶液
溶離液Ｂ：メタノール
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ 
グラジエント：Ａ／Ｂ  １６／８４  （初期）  →１５分リニアグラジエント→  １／９９  →３０分までホールド→その後初期状態へ
検出波長：ＵＶ２０５ｎｍ
カラム温度１９℃の場合、圧力は８．８ＭＰａ−５ＭＰａに下がり、図２１Ａのクロマトグラムが得られた。内径０．４ｍｍのピークチューブを保護チューブとして被せた内径０．１ｍｍ  長さ２５ｃｍの溶融シリカキャピラリーを、抵抗管として、ＳＵＳ  １／１６  インチフェラルでカラムの後と検出器の間に接続し、同じ条件で分析した結果が図２１Ｂのクロマトグラムである。圧力は、６２．４ＭＰａ−３９．５ＭＰａまで変化したが、それでも１０ＭＰａ以上であり、ピークも高くなりより異性体は分離した。この結果より、グラジント時の溶媒変化による圧力変化も本発明の効果がある事が確認された。
【０１１５】
抵抗管を変えなくても、グラジエントの溶離液変化だけで、６２．４ＭＰａ−３９．５ＭＰａまで変化でき、異性体分離状態も調整できた。本実施例では、水―メタノール系であるので、２倍弱の変化であるが、３０％エタノール（１０℃粘性４）−酢酸エチル（１０℃粘性０．５）であれば、８倍程度の圧力変化が可能になるので、一番低い時に１０ＭＰａ以上になるようにすれば、異性体分離には有効となる。
【０１１６】
また、ＨＰＬＣにおいて、温度を上げると固定相内での溶質成分の移動速度は速くなるので、溶出が早くなりピーク形状が良くなる事は知られている。
そこで、本発明状態でカラム温度を変化させて分析した。
【０１１７】
２０℃では、５６．２‐３５．８ＭＰａまで、２５℃では５０．４‐３２．０ＭＰａまで圧力は変化し、図２１C、Dのクロマトグラムが得られた。温度が上がるほど圧力は下がり、１と２の溶出は近づき異性体として分離能は悪くなる。しかし、それでもグラジエント終了時で１０ＭＰａ以上を保持しており、これらの異性体は分離されている事が確認された。例えば、３０％エタノールの場合、カラム温度で８０℃粘度０．６℃粘度７であり、温度変化をさせると１０倍近い圧力変化を起こす事ができる。
【０１１８】
この結果より、分析温度の調整は、１０ＭＰａ以上の圧力を保持できれば、異性体の分離を保持しながら、ピーク形状を変化させる事も可能である事が明らかとなった。
従って、グラジエントに伴う溶媒割合変化と、カラム温度変化によって１０倍弱の圧力変化が可能で、異性体分離を変化させる事ができ、さらに両方を組み合わせて変更する事で、１０ＭＰａ〜１００ＭＰａまでの圧力変化も可能になることが確認された。
【実施例１０】
【０１１９】
従来から圧力変化に応じて溶質の相比が変化し、保持時間が変化する現象は報告されているが、化合物の異性体間でその保持が変化し、異性体間の分離に効果があると言う報告はこれまで無かった。本発明に係るこの特性を確かめるために、実施例データをまとめて、どのような現象が起きているかを確認した。
【０１２０】
保持は、溶質（Ｓｏｌｕｔｅ）が固定相にどのくらい留まるかによって生じるので、圧力上昇に伴う保持比の変化から、固定相内に占める溶質容積変化量△Ｖが下記式より得られる。
△Ｖ＝−気体定数×Ｔ（Ｋ）×ln（本発明を行った時の保持比／従来分析の場合の保持比）／本発明の実施圧力
△Ｖ１を溶質１の溶質容積変化量、△Ｖ２を溶質２の溶質容積変化量とすると、溶質１、溶質２の異性体化合物間の変化量の比である△△Ｖ値は、相比の影響を受けない数値となる。
【０１２１】
２種類のＨＰＬＣ分析カラムについて分析した結果を下記の表にまとめた。溶質の構造の差に対応して、圧力を加える事で、固定相への取り込みが生じて、固定相内で体積変化が起き、異性体間の分離している事が判る。
【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
例えば、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ‐Ｐのカラムを用いる、異性体であるα-/γ-linolenic acid methyl esterの温度３０３Ｋ（２０℃）の場合（表中の1行目）を例にとると、従来分析でのα-linolenic acid methyl esterの保持比は１．００、本発明の圧力５０ＭＰａ掛けた場合の保持比は１．８２、となり、上記の計算式により、△V1は、−３０．２（−８．３１ｘ３０３ｘIn（１．８２／１．００）／５０）となる。
【０１２４】
その異性体である  γ-linolenic acid methyl esterの保持比は１．１２、本発明の圧力５０ＭＰａ掛けた場合の保持比は２．４５、となり、上記の計算式により△V２は、−３９．４となる。両異性体間のその差△△Vは、端数処理をして−９．３となる。
【０１２５】
同様の方法で計算を行うと、異性体化合物毎に△△Vが得られる。この差の絶対値が大きいほど、より本発明の効果が期待できる異性体成分であると考えられる。
Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）Ｃ３０カラムを使った場合でも、同様の方法で各化合物毎に△△Vが得られた。
【０１２６】
固定相の種類によって△△V値は異なり、今回の結果では、Ｃ３０とＯＤＳ‐Ｐについて同等の△△V値が得られる場合と、 △△V値（ＯＤＳ‐Ｐ） > △△V値（Ｃ３０）の場合があった。 表中２行目のm-/p-xylene  や表中６行目β-/α-estradiolでは、ほぼ同じ値が、β-/γ-tocopherolではほぼ同じ絶対値が得られている。
【０１２７】
溶出順が固定相によって異なるため＋―の違いがある場合もあるが、圧力変化に伴う固定相内での溶質の保持変化量はほぼ同じで、その異性体間での溶出変化効果はほぼ同じと考えられる。
【０１２８】
一方、表中１，３，４行目の化合物では、ＯＤＳ‐Ｐの△△V値の絶対値がＣ３０の △△V値の絶対値より大きくなる。
【０１２９】
表中２，６行目の化合物は、炭化水素鎖が主骨格となり剛的なサイトを持った溶質であり、表中１，３，４行目の化合物はエステル鎖を持っており柔軟なサイトの溶質と考えられる。
すなわち、Ｃ３０の識別部位は剛的であり、ＯＤＳ‐Ｐの認識部位は剛的なサイトと柔軟なサイトが存在するものと考えられる。
【０１３０】
以上のように、圧力効果の大きさを測る指標として△△Ｖ値の使用が示唆された。そして、この値を使用することで圧力効果により溶質の溶け込みに差が生じ、異性体間の分離が変化する事が明確になった。さらに、液相種によって異性体間の認識部位が異なり、化合物の構造も認識している事が推定できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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