(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性炎症を治療するための組成物であって、哺乳類の被験者における慢性炎症の少なくとも１つの症状を軽減するために有効な量の下記式：
0006046633.tif 000010
を有する化合物またはその塩と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを有する組成物。
【請求項２】
請求項１記載の組成物において、前記組成物は単位投薬形態である組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組成物において、前記組成物は錠剤またはカプセルである組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物において、前記化合物またはその塩は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５００ｍｇ／ｋｇの量で存在するものである組成物。
【請求項５】
関節リウマチの治療のための薬剤を製造するための、下記式：
0006046633.tif 000011
を有するＪＡＫ２キナーゼ阻害化合物またはその塩の使用。
【請求項６】
慢性全身性炎症の治療のための薬剤を製造するための、下記式：
0006046633.tif 000012
を有するＪＡＫ２キナーゼ阻害化合物またはその塩の使用。
【請求項７】
哺乳類の被験者における慢性炎症の少なくとも１つの症状を軽減するための薬剤を製造するための、下記式：
0006046633.tif 000013
を有するＪＡＫ２キナーゼ阻害化合物またはその塩の使用。
【請求項８】
炎症性疾患または疾病の治療のための薬剤を製造するための、下記式：
0006046633.tif 000014
を有するＪＡＫ２キナーゼ阻害化合物またはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）は、主に滑膜関節に影響を及ぼす慢性全身性炎症性疾患である。ＲＡは肺および胸膜にも広汎性炎症を生じるほか、皮下結節性病変も形成する。世界人口の約１〜２％がＲＡに罹患しており、疾患発症時には性差による偏向があり、３５〜５０歳では女性が男性よりもＲＡを発症する確率が３倍高い。
【０００２】
炎症が病状の主な要因となる場合は、これまで感染性疾患および自己免疫性疾患に限られてきたが、炎症が肥満、冠動脈疾患、および癌など複数の疾患状態に大きく関与していることがより明らかになっている。ＲＡの正確な原因はまだ分かっていないが、前記疾患の根底にあるメカニズムがより理解されてきたことで、炎症のメディエーターを標的とした多数の治療法の開発が促された。例えば、そのような治療法には生物製剤、とりわけ、疾患を引き起こすサイトカインを捕捉または中和する抗体を含む。
【０００３】
ＪＡＫキナーゼがサイトカイン受容体のシグナル伝達に関与し、シグナル伝達兼転写活性化因子（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＳＴＡＴ）タンパク質をリン酸化および活性化することについては、十分報告されている。これらのＪＡＫによりコントロールされたサイトカイン受容体経路のいくつかは、ＲＡ疾患発症機序の開始および進行と密接に関与している。慢性炎症性プロセスに関与するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、およびＧＭ−ＣＳＦ）は、病原因子に対して適切に機能した免疫反応にとっても重要である。ＪＡＫ２はＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５の下流での活性化に関係し、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、およびＩＬ−１２を含むＲＡの発症機序に関係する、いくつかの炎症性サイトカインの変換シグナルに関与している。ＲＡの発症機序に関係する他の分子には、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ｐ３８／ＭＡＰＫ、およびＢＣＲ  タンパク質チロシンキナーゼＳｙｋを含む。
【０００４】
承認されているＲＡの治療には、ＮＳＡＩＤｓ、メトトレキセートおよびレフルノミドなどの抗代謝物、様々なコルチコステロイドおよびグルココルチコイド、スルファサラジン、およびアバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））、およびリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））を含む様々な生物製剤を含む。最近のＦＤＡによるトシリズマブ（抗ＩＬ−６Ｒ）（Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））の承認は、さらに、サイトカインおよび関連受容体を標的とし、慢性炎症性疾患を治療することの力を証明している。
【０００５】
しかし、製造コストがかかる、数回の注入が必要である、およびアナフィラキシー反応の可能性があるなど、生物製剤には経口投与可能な小分子よりも、いくつか不利な点がある。小分子は、サイトカイン受容体シグナルの形質導入に関与する重要キナーゼの阻害により、サイトカイン経路を標的とすることで炎症を治療する、別の、おそらく補足的なアプローチを提供すると考えられる。経口での生物学的利用能は、小分子が魅力的な疾患治療方法であることのもう１つの理由である。
【０００６】
慢性炎症を治療によりコントロールすることは、ＲＡを含む多くの高頻度でみられる疾患状態の臨床管理において重要である。したがって、これらの消耗性疾患の安全かつ効果的な治療の開発は、まだ重要な医学的需要となっている。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許出願公開第２０１０／０３１１６９３号明細書
（特許文献２）  国際公開第２００９／１５５５６５号
（特許文献３）  国際公開第２０１０／１４１７９６号
（非特許文献）
（非特許文献１）  ＡＬＯＮＺＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６  ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ"，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８），Ｖｏｌ．１８７，ｐｐ  ４６１−４６８
（非特許文献２）  ＢＡＪＰＡＩ，"Ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂ，ａ  Ｓｙｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ"，ＩＤｒｕｇｓ（２００９），Ｖｏｌ．１２，ｐｐ  １７４−１８５
（非特許文献３）  ＢＩＮＧＨＡＭ，"Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ"，Ｂｕｌｌ．ＮＹＵ  Ｈｏｓｐ．ｆｏｒ  Ｊｏｉｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００８），Ｖｏｌ．６６，ｐｐ．２１０−２１５
（非特許文献４）  ＢＲＡＤＳＨＡＷ，Ｔｈｅ  Ｓｒｃ，Ｓｙｋ，ａｎｄ  Ｔｅｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅｓ：  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ，"Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ（２０１０），Ｖｏｌ．２２，ｐｐ  １１７５−１１８４
（非特許文献５）  ＢＲＡＮＤ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ"，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４），Ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．２９５−３１２
（非特許文献６）  ＣＡＬＥＲＯ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  Ｂｅｙｏｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ，"Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍｅｒ．（２０１０），Ｖｏｌ．３６，ｐｐ．３２５−３４３
（非特許文献７）  ＣＨＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１０），Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．３０１−３１６
（非特許文献８）  ＣＨＵＲＣＨ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｉｍｅｒ：  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １β  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  （２００８），Ｖｏｌ．４，ｐｐ．３４−４２
（非特許文献９）  ＣＯＨＥＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ"，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  （２０１０），Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．３３０−３３５
（非特許文献１０）  ＣＯＲＮＥＬＩＳＳＥＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  ＩＬ−１２／ＩＬ−２３  ａｘｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  （２００９），Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．４５２−４６２
（非特許文献１１）  ＤＯＵＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ＴＮＦ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｄｉａｃｅｒｅｉｎ：  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ"，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．（２００４），Ｖｏｌ．６，ｐｐ．Ｒ６５−Ｒ７２
（非特許文献１２）  ＥＧＧＥＲＴ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｂｕｆｆｅｒｓ，"Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９７９），Ｖｏｌ．５９，ｐｐ．２１５−２２４
（非特許文献１３）  ＥＬＬＩＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−ＫＢ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ａｉｒ  ｐｏｕｃｈ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，"Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．（２０００），Ｖｏｌ．５９，ｐｐ．３０３−３０７
（非特許文献１４）  ＦＡＢＩＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍａｐ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ"，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５），Ｖｏｌ．２３，ｐｐ．３２９−３３６
（非特許文献１５）  ＦＯＮＳＥＣＡ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｐｌａｙｅｒ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｊｏｉｎｔ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，"Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｒｅｖ．（２００９），Ｖｏｌ．８，ｐｐ．５３８−５４２
（非特許文献１６）  ＦＯＷＥＬＬ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＮＦＡＴｃ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  Ｔｈ２  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｌｔｋ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＣＤ４  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９），Ｖｏｌ．１１，ｐｐ  ３９９−４０９
（非特許文献１７）  ＦＲＩＤＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＡＫ１  ａｎｄ  ＪＡＫ２  ｉｓ  Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ  ｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＮＣＢ０２８０５０，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１０），Ｖｏｌ．１８４，ｐｐ．５２９８−５３０７
（非特許文献１８）  ＦＵＨＲＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＡＫ２  ａｎｄ  ＰＰ２Ａ，ＰＩ３Ｋ，ａｎｄ  Ｙｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１，"Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９６），Ｖｏｌ．２２４，ｐｐ．２８９−２９６
（非特許文献１９）  ＧＡＥＳＴＥＬ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ"，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００９），Ｖｏｌ．８，ｐｐ  ４８０−４９９
（非特許文献２０）  ＧＨＯＲＥＳＣＨＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｉｎａｓｅｓ：  ｔｏ  ｂｅ  ｏｒ  ｎｏｔ  ｔｏ  ｂｅ？，"Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （２００９），Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．３５６−３６０
（非特許文献２１）  ＧＯＬＤＢＡＣＨ−ＭＡＮＳＫＹ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｗ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．（２００３），Ｖｏｌ．５４，ｐｐ．１９７−２１６
（非特許文献２２）  ＨＡＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，"ＳＯＣＳ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ＪＡＫ２（Ｖ６１７Ｆ，Ｔ８７５Ｎ  ａｎｄ  Ｋ５３９Ｌ）ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，"Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００９），Ｖｏｌ．２８，ｐｐ．３０６９−３０８０
（非特許文献２３）  ＨＡＵＢＥＲＴ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｖａｖ１  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｏ  ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  ＰＫＣ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ，"Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ（２０１０），Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．９４４−９５４
（非特許文献２４）  ＨＥＸＮＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｅｓｔａｕｒｔｉｎｉｂ  （ＣＥＰ７０１）  ｉｓ  ａ  ＪＡＫ２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"Ｂｌｏｏｄ（２００８），Ｖｏｌ．１１１，ｐｐ．５６６３−５６７１
（非特許文献２５）  ＨＯＬＭＤＡＨＬ，"Ｐｒｉｍｅｒ：  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  −  ａ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｒｅｓｏｌｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ，"Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００７），Ｖｏｌ．３，ｐｐ．１０４−１１１
（非特許文献２６）  ＩＭＢＯＤＥＮ，"Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｅｃｈ．Ｄｉｓ．（２００９），Ｖｏｌ．４，ｐｐ．４１７−３４
（非特許文献２７）  ＩＳＯＭＡＫＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＯＣＳ  ｉｓ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００７），Ｖｏｌ．４６，ｐｐ  １５３８−１５４６
（非特許文献２８）  ＫＡＧＡＲＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ＩＬ−１β  ａｎｄ  ＴＮＦ−α  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｏｎｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＩＬ−６，ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），Ｖｏｌ．１６９，ｐｐ．１４５９−１４６６
（非特許文献２９）  ＫＡＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  ＩＬ−４  ａｎｄ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ：  ｔｈｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＩＬ−４  ａｎｄ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＩＡ，"Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０００），Ｖｏｌ．４９，ｐｐ．３１７−３２４
（非特許文献３０）  ＫＡＲＡＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００８），Ｖｏｌ．２６，ｐｐ．１２７−１３２
（非特許文献３１）  ＫＥＲＢＬＥＳＫＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，"Ｇｕｔ（２００９），Ｖｏｌ．５８，ｐｐ．１０３３−１０３９
（非特許文献３２）  ＫＩＳＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ＪＡＫ２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ａ  ｐａｔｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗ，"Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ（２０１０），Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４７１−４９５
（非特許文献３３）  ＫＵＮＤＵ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：  Ｇｅａｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎｅｙ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ，"Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．（２００８），Ｖｏｌ．６５９，ｐｐ．１５−３０
（非特許文献３４）  ＬＡＣＡＶＡ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｗｅｉｇｈｔ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｉｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００４），Ｖｏｌ．４，ｐｐ．３７１−３７９
（非特許文献３５）  ＬＯ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＧＦＲ  ａｎｄ  ＳＴＡＴ３  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉＮＯＳ／ＮＯ  ｐａｔｈｗａｙ，"Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ（２００５），Ｖｏｌ．７，ｐｐ．５７５−５８９
（非特許文献３６）  ＬＵ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｔｒａｃｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＳＴＡＴ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐａｗｓ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｃ  Ｍｉｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｂｅａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，"ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１０），ｐｐ．１−１１
（非特許文献３７）  ＭＣＣＵＬＬＯＣＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：  ｎｅｗ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００６），Ｖｏｌ．５，ｐｐ  ８６４−８７６
（非特許文献３８）  ＭＣＩＮＮＥＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７），Ｖｏｌ．７，ｐｐ．４２９−４４２
（非特許文献３９）  ＭＯＮＴＥＳＩＮＯＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ２Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ａ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ，"Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．&  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６），Ｖｏｌ．８，Ｒ５３
（非特許文献４０）  ＭＵＥＬＬＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ａｓｔｈｍａ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ＩＴＫ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３），Ｖｏｌ．１７０，ｐｐ  ５０５６−５０６３
（非特許文献４１）  ＮＡＴＨＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｏｎｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ"，Ｃｅｌｌ（２０１０），Ｖｏｌ．１４０，ｐｐ．８７１−８８２"Ｄｉｐｐｉｎｇ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｃｙｔｅ’ｓ  ＪＡＫ−ｐｏｔ"，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１０），Ｖｏｌ．９，ｐ．９４
（非特許文献４２）  ＯＬＤＦＩＥＬＤ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ−Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ｄｒｕｇｓ（２００９），Ｖｏｌ．６９，ｐｐ．６０９−６３２
（非特許文献４３）  ＯＬＳＥＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００４），Ｖｏｌ．３５０，ｐｐ．２１６７−７９
（非特許文献４４）  ＯＰＡＲ，"Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｔｔｒａｃｔ  ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ａｓ  ｏｒａｌ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｄｒｕｇｓ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１０），Ｖｏｌ．２０１０，ｐｐ．２５７−２５８
（非特許文献４５）  Ｏ’ＳＨＥＡ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，"Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００８），Ｖｏｌ．２８，ｐｐ．４７７−４８７
（非特許文献４６）  Ｏ’ＳＨＥＡ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｏｄａｌｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＪＡＫ／ＳＴＡＴ  Ｐａｔｈｗａｙ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００４），Ｖｏｌ．３，ｐｐ．５５５−５６４
（非特許文献４７）  ＰＲＯＣＡＣＣＩＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｅｐｔｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  Ａ  Ｋｅｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，"Ｃｕｒｒ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９），Ｖｏｌ．４，ｐｐ．２２−３０
（非特許文献４８）  ＲＡＭＯＳ−ＣＡＳＡＬＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＴＮＦ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，"Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃ．&  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００８），Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．８４７−８６１
（非特許文献４９）  ＲＯＭＡＮＯ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｉｒ  ｐｏｕｃｈ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｍｏｄｅｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，"Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（１９９７），Ｖｏｌ．６，ｐｐ．３２−３８
（非特許文献５０）  ＲＹＵ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｓ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＡＫ２  ｐ１２５ＦＡＫ，ａｎｄ  Ｐａｘｉｌｌｉｎ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００），Ｖｏｌ．１６５，ｐｐ．２１１６−２１２３
（非特許文献５１）  ＳＡＳＡＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｏｎｓｅｔ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ，"Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  &  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９９），Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１６３５−１６４３
（非特許文献５２）  ＳＡＹＥＳＫＩ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＪＡＫ２  ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｙｎ，"Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．（１９９９），Ｖｏｌ．２７４，ｐｐ．３３１３１−３３１４２
（非特許文献５３）  ＳＥＡＶＥＹ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎ  Ａｎｔｉ−Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２／Ｆｅｔａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｋｉｎａｓｅ−１  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  Ａｎｔｉ−Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ＋  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ１"，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００９），Ｖｏｌ．１８２，ｐｐ．５５３７−５５４６
（非特許文献５４）  ＳＥＦＴＯＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，"Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４），Ｖｏｌ．６，ｐｐ．３７２−３７９
（非特許文献５５）  ＳＨＩＧＥＭＡＴＳＵ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｖ  Ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｖａｖ）ｉｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，"Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．（１９９７），Ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．１４３３４−１４３４０
（非特許文献５６）  ＳＩＮＧＨ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈ１／Ｔｈ１７  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ／Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ，"Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．３４，ｐｐ  ２２８５−９０
（非特許文献５７）  ＳＴＵＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ  ２，ＣＥＰ−３３７７９，ａｂｌａｔｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  &  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１１），Ｖｏｌ．１３，Ｒ６８，ｐｐ  １−１５
（非特許文献５８）  ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ−ＴＥＺＵＫＡ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｅｃ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｌｉｎｋｓ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ＰＩ−３  ｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｂａｂｌｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＪＡＫ，"Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９７），Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．２２７３−２２８２
（非特許文献５９）  ＴＵＲＫＳＯＮ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔａｔ３  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｒｃ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎ  ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８），Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．２５４５−２５５２
（非特許文献６０）  ＵＣＨＩＹＡＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ，ａ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（２００８），Ｖｏｌ．３１，ｐｐ．１１５９−１１６３
（非特許文献６１）  ＶＥＲＤＥＮＩＵＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．（１９５８），Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．２２９−２３６
（非特許文献６２）  ＶＩＮＧＳＢＯ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｓｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＣＩＩ）  Ｂｒｅａｋｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＣＩＩ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｒｉｇｇｅｒｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，"Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３），Ｖｏｌ．３７，ｐｐ．３３７−３４２
（非特許文献６３）  ＷＡＬＫＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  ＪＡＫ−ＳＴＡＴ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００５），Ｖｏｌ．３２，ｐｐ．１６５０−１６５３
（非特許文献６４）  ＷＥＳＴ，"Ｅｒｒａｔｕｍ：  ＣＰ−６９０５５０，ａ  ＪＡＫ３  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇ（２００９），Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１００４−１００６
（非特許文献６５）  ＷＩＬＬＩＡＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｐｕｓ，"Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  （２００９），Ｖｏｌ．４８，ｐｐ．７１６−７２０
（非特許文献６６）  ＹＩＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＳＯＣＳ３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，"Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１０），Ｖｏｌ．１３６，ｐｐ．１６１７−１６２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願書類は、下記構造を有する１，２，４−トリアゾロ［１，５ａ］ピリジン誘導体（化合物Ａ）：
【化１】
0006046633.tif 000002
【０００８】
またはその塩、およびヤーヌスキナーゼ２（Ｊａｎｕｓ  Ｋｉｎａｓｅ  ２：ＪＡＫ２）が介在する疾患または疾病の治療におけるその使用に関する。特に、化合物ＡはＪＡＫ２の強力な経口活性小分子阻害薬であり、慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）などの慢性全身性疾患によって特徴付けられる疾病または疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ：化合物Ａの生化学的および細胞的特徴
【００１０】
図１Ａ：ＪＡＫ２および他の特定キナーゼに対する化合物Ａの酵素阻害活性を示している。
【００１１】
化合物Ａによる各組み換え酵素（ＪＡＫ２、ＪＡＫ３）のキナーゼ活性の阻害をプレートベースのＴＲＦ検出システムにおいて評価した。細胞系における化合物Ａの作用はｉｒｆ−ｂｌａ  ＴＦ−１細胞（ＪＡＫ２）およびＢａ／Ｆ３（ＪＡＫ３）細胞を用いて測定した。これらの細胞では、ＪＡＫ１およびＴＹＫ２の有無は検討しなかった。ＩＣ５０値は、少なくとも４回の独立した定量の平均±標準偏差として報告している。
【００１２】
図１Ｂ：ＳＴＡＴ５のリン酸化阻害により決定したＨＥＬ９２細胞における化合物Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示している。
【００１３】
ＨＥＬ９２細胞は、示したとおり、無血清培地で１時間化合物Ａの濃度を増加させて処理した。Ｔｒｉｔｏｎベースの溶解バッファーに抽出物を用意し、タンパク質濃度を測定し、等量をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ブロットした。特異的抗体を用いてＳＴＡＴ５およびｐＳＴＡＴ５を分析した。ブロットをスキャンし、各グループのシグナルを蛍光体／全体としてＧｅｌＰｒｏ（登録商標）を用いて決定した。Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを用い、ＩＣ５０値を計算した。
【００１４】
図１Ｃ：５５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａをマウスに経口投与してからＨＥＬ９２腫瘍抽出物を除去した（注入後２時間）、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学的（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ：ＰＤ）アッセイの結果を示している。ＳＴＡＴ５およびｐＳＴＡＴ５濃度をウエスタンブロットにより定量した。各レーンは個別のサンプルを表している。
【図２】図２Ａ〜２Ｂ：コラーゲン抗体関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＣＡＩＡ）の足炎症に対するＪＡＫ２抑制の結果を示している。
【００１５】
雌ＤＢＡ／１マウスに精製した抗コラーゲンＩＩ型抗体を静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ：ｉ．ｖ．）注射し、次に３日後、２５μｇのリポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）を腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ：ｉ．ｐ．）投与し、５日目までに関節炎を誘導した。１つの足につき関節炎の基準スコア１を満たしたマウスを研究に用いた。検討したすべての用量で化合物Ａを１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）経口投与し、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ：Ｄｅｘ）を週３回１．５ｍｇ／ｋｇで投与し、溶媒（ＰＥＧ４００＋１％  ＤＭＳＯ）を経口投与した。
【００１６】
図２Ａ−１：経時的に測定した足の平均サイズを示している（１つ１つの足を厚さで測定）。
【００１７】
図２Ａ−２：各足の総臨床スコアを示している。図のデータは、１群あたりＮ≧１０とした二元分散分析（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を示している。
【００１８】
図２Ｂ：１群あたりの被験マウス数Ｎ＝３とし、投与したマウスの血漿、足、および脾臓における化合物Ａ  ５５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの１日１回（ｓ．ｉ．ｄ．）ｐ．ｏ．投与の薬物動態学的（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ：ＰＫ）研究の結果を示している。図に示したデータは平均±標準誤差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅａｎ：ＳＥＭ）を示している。
【図３】図３Ａ〜３Ｅ：ＣＡＩＡモデルにおける治療の効果を示している。
【００１９】
雌ＤＢＡ／1マウスに精製した抗コラーゲンＩＩ型抗体をｉ．ｖ．注射し、次に３日後、２５μｇのＬＰＳをｉ．ｐ．投与し、５日目までに関節炎を誘導した。１つの足につき関節炎の基準スコア１を満たしたマウスを研究に用いた。検討したすべての用量で化合物Ａをｂ．ｉ．ｄ．、経口投与し、Ｄｅｘを週３回１．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与し、溶媒（ＰＥＧ４００＋１％  ＤＭＳＯ）を経口投与した。
【００２０】
図３Ａ：脾臓および足のホスホ−ＳＴＡＴ３濃度に対する治療の効果を経時的に示している。グラフ化したデータはＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズキットを用いて作成し、ＢＳＡアッセイで決定したとおり、濃度は総タンパク質３ｍｇあたり、１ｍｌあたりの単位濃度である。前記グラフ化したデータは平均±ＳＥＭを表しており、統計は二元分散分析を用いて行った。
【００２１】
図３Ｂ：関節炎（ＣＡＩＡ）の足におけるホスホ−ＳＴＡＴ３濃度に対する治療の効果を示している。
【００２２】
図３Ｃ−１〜３Ｃ−６：関節炎（ＣＡＩＡ）の足における様々なサイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、およびＧＭ−ＣＳＦ）に対する治療効果を示している。サイトカインは既知の手順により測定した［３２］。
【００２３】
図３Ｄ：すべての投与群の手根骨および足根骨のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｏｓｉｎ：Ｈ&Ｅ）染色パラフィンワックス包埋切片画像。代表的な組織画像を１０倍で示している。組織はサフラニン−Ｏでも染色し、基質の変性を評価した。各群５匹の代表的マウスを組織学的分析に送り、以下に説明するスコア化法に従って分類した。図のデータは平均±ＳＥＭで示し、すべての統計はＰｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアおよび二元分散分析を用いて行った。
【００２４】
図３Ｅ：ＣＡＩＡモデルにおける全身の体重に対する治療の効果を示している。
【図４】図４Ａ〜４Ｅ：コラーゲン誘導関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＣＩＡ）モデルにおけるＪＡＫ２阻害の結果を示している。
【００２５】
雌ＤＢＡ／１マウスのＣＦＡに精製したＩＩ型コラーゲンを皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ：ｉ．ｄ．）注射した後、２１日目にＩＦＡ皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ：ｓ．ｃ．）にＩＩ型コラーゲンを追加注射し、２８日目、ＬＰＳにｉ．ｐ．注射して関節炎（ＣＩＡ）を誘導した。それぞれの足でスコア「１」以上のマウスを関節炎とみなし、研究に使用した。投与は関節炎誘導後７〜１０日で開始した。検討したすべての用量で化合物Ａをｂ．ｉ．ｄ．、経口投与し、Ｄｅｘを週３回１．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与し、溶媒（ＰＥＧ４００＋１％  ＤＭＳＯ）をｂ．ｉ．ｄ．、経口投与した。
【００２６】
図４Ａ−１および４Ａ−２：各投与群の足の平均サイズ（１本１本の足を測定）およびそれぞれの臨床スコアに対する治療の効果を示している。
【００２７】
図４Ｂ：各投与群の関節炎の足におけるホスホ−ＳＴＡＴ３発現を示している。
【００２８】
図４Ｃ−１〜４Ｃ−４：各投与群の関節炎の足における様々な血清サイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、およびＴＮＦα）の濃度を示している。
【００２９】
図４Ｄ：ＩＩ型コラーゲンフラグメント（ＣＢ１１）、ＯＶＡ、または培地のみを負荷し、治療したマウスから、刺激された脾細胞のＩＦＮγ  Ｅｌｉｓｐｏｔ（登録商標）の結果を示している。この図に示したＥｌｉｓｐｏｔ画像は各投与群を代表したもので、棒グラフは各投与群のマウスを用いたデータを表している。スポットはＣ．Ｔ．Ｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｅｌｉｓｐｏｔスキャナおよびスポット計数ソフトウェアを用いて計数した。
【００３０】
図４Ｅ：すべての投与群の手根骨および足根骨のＨ&Ｅ染色パラフィンワックス包埋切片画像。代表的な画像を１０倍で示している。基質の変性を検出するため、組織もサフラニン−Ｏで染色し、この情報をスコア化に用いた。図のデータは平均±ＳＥＭで示し、統計はＰｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアおよび二元分散分析を用いて行った（＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．００１）。
【図５】図５Ａ〜５Ｃ：カラギナン誘導性炎症に対する治療効果を示している。
【００３１】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを誘導し、無菌の空気で空気嚢を誘起した（材料と方法を参照）。カラギナンを食塩水に１％で溶解し、直接空気嚢に注入した後、１時間後に化合物Ａまたはデキサメゾン（Ｄｅｘ）を投与した。空気嚢液１００μリットルを投与後２４時間で除去した。
【００３２】
図５Ａ：フローサイトメトリー分析およびＢＤ  ＴｒｕＣｏｕｎｔビーズにより、７−ＡＡＤを排除した総細胞数を示している。
【００３３】
図５Ｂ：Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）サイトカイン分析により決定した上清のＩＬ−６濃度を示している。
【００３４】
図５Ｃ：Ｄｒａｂｋｉｎアッセイにより評価したヘモグロビン数を示している。図に示したすべてのデータは平均±ＳＥＭを示しており、統計は二元分散分析により行った（＊ｐ<０．０５、１試験群あたりのマウス数Ｎ＝５）。
【図６】ＣＡＩＡモデルの関節炎症の組織病理学的スコア（表Ｉ）
【００３５】
Ｈ&Ｅおよびサフラニン−Ｏ染色パラフィンワックス包埋した手根骨および足根骨切片は、材料と方法で説明した基準を用いて、委員会が認定し、独立した病理学者がスコア化した。表にしたデータは、足根骨のみ、平均±標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：ＳＤ）を示している。統計は二元分散分析により行った（＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．００１、１試験群あたりのマウス数Ｎ＝５）。
【図７】ＣＩＡモデルの関節炎症の組織病理学的スコア（表ＩＩ）
【００３６】
Ｈ&Ｅおよびサフラニン−Ｏ染色パラフィンワックス包埋した手根骨および足根骨切片は、材料と方法で説明した基準を用いて、委員会が認定し、独立した病理学者がスコア化した。表にしたデータは、足根骨のみ、平均±ＳＤを示している。統計は二元分散分析により行った（＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．００１、１試験群あたりのマウス数Ｎ＝５）。
【図８】図８Ａ〜８Ｃ：ＣＡＩＡモデルにおける治療効果を示している。
【００３７】
雌ＤＢＡ／１マウスのＣＦＡに精製したＩＩ型コラーゲンをｉ．ｄ．注射した後、２１日目にＩＦＡにＩＩ型コラーゲンをｓ．ｃ．追加注射し、この後２８日目までに、ＬＰＳにｉ．ｐ．注射して関節炎（ＣＩＡ）を誘導した。それぞれの足でスコア「１」以上のマウスを関節炎とみなし、研究に使用し、投与は完全に関節炎となって数日経過後に開始した。検討したすべての用量で化合物Ａをｂ．ｉ．ｄ．経口投与し、Ｄｅｘを週３回１．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与し、溶媒（ＰＥＧ４００＋１％  ＤＭＳＯ）をｂ．ｉ．ｄ．経口投与した。
【００３８】
図に示したデータは平均±ＳＥＭを表している。
【００３９】
図８Ａ：投与後４時間での足のＩＬ−４濃度に対する治療効果を示している。
【００４０】
図８Ｂ：投与後４時間でのサイトカインＩＬ−１２濃度に対する治療効果を示している。
【００４１】
図８Ｃ：投与後４時間での足のＩＬ−６濃度に対する治療効果を示している。
【図９】図９Ａおよび９Ｂ：ＣＩＡモデルにおける体重および血清抗ＣＩＩ自己抗体濃度に対する治療効果を示している。
【００４２】
雌ＤＢＡ／１マウスのＣＦＡに精製したＩＩ型コラーゲンを皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ：ｉ．ｄ．）注射した後、２１日目にＩＦＡ皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ：ｓ．ｃ．）にＩＩ型コラーゲンを追加注射し、この後２８日目までに、ＬＰＳにｉ．ｐ．注射して関節炎（ＣＩＡ）を誘導した。それぞれの足でスコア「１」以上のマウスを関節炎とみなし、研究に使用し、投与は完全に関節炎となって数日経過後に開始した。検討した各用量で化合物Ａをｂ．ｉ．ｄ．経口投与し、Ｄｅｘを週３回１．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与し、溶媒（ＰＥＧ４００＋１％  ＤＭＳＯ）をｂ．ｉ．ｄ．経口投与した。
【００４３】
血清は１週間間隔で採取し、試験まで−８０℃で保存した。既知の手順［１８］に従い、材料と方法で示したとおり、抗ＩＩ型コラーゲン自己抗体ＥＬＩＳＡを行った。図に示したデータは平均±ＳＥＭを表しており、統計は二元分散分析により行った（１試験群あたりのマウス数Ｎ＝１０）。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下には、ＪＡＫ２の活性を阻害または調節することで、関節リウマチ（ＲＡ）などの慢性全身炎症性疾患および疾病を治療する方法のさらに制限されない詳細を提供する。以下には、前記ＪＡＫ２活性を阻害または調節する、化合物Ａなどの特定化合物、および関節リウマチなどの慢性全身性炎症により特徴付けられる疾患または疾病を治療するため、これらの化合物を用いる方法も提供する。本明細書で使用したセクションのタイトルは索引作業および検索の目的のみであり、いかなる方法でも制限するものとして解釈すべきではない。
【００４５】
１つの態様では、本出願書類が関節リウマチを治療する方法について説明およびこれを提供し、前記方法は、関節リウマチに罹患した個人または関節リウマチを発症しやすい個人を特定する工程と、前記個人に下記式：
【化２】
0006046633.tif 000003
【００４６】
を有するＪＡＫ２阻害薬またはその塩の治療有効量を投与する工程とを有する。
【００４７】
別の態様では、本出願書類が慢性全身性炎症を治療する方法について説明およびこれを提供し、前記方法は、慢性全身性炎症に罹患した患者を特定する工程、および前記患者に下記式：
【化３】
0006046633.tif 000004
【００４８】
を有するＪＡＫ２阻害薬またはその塩の治療有効量を投与する工程とを有する。
【００４９】
別の態様では、本出願書類が被験者の慢性炎症の少なくとも１つの症状を軽減する方法を説明およびこれを提供し、前記方法は、下記式：
【化４】
0006046633.tif 000005
【００５０】
を有するＪＡＫ２阻害薬またはその塩をＪＡＫ２キナーゼを阻害する効果がある量で投与する工程とを有する。
【００５１】
別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記ＪＡＫ２キナーゼ阻害薬は１日４回まで投与される。
【００５２】
別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記ＪＡＫ２キナーゼ阻害薬は１日につき約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５００ｍｇ／ｋｇの量で投与される。
【００５３】
別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記ＪＡＫ２阻害薬は少なくとも１つの追加治療薬と併用投与される。
【００５４】
別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記ＪＡＫ２阻害薬と少なくとも１つの追加治療薬は別に投与される。
【００５５】
別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記ＪＡＫ２阻害薬と少なくとも１つの追加治療薬は単一の固定用量として併用投与される。
【００５６】
別の態様では、本出願書類が慢性全身性炎症を治療する組成物について説明およびこれを提供し、下記式：
【化５】
0006046633.tif 000006
【００５７】
またその塩を、哺乳類の被験者の慢性炎症の症状を軽減するために有効な量で有し、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を有する化合物を有する。
【００５８】
別の態様では、本出願書類が慢性全身性炎症を治療する組成物について説明およびこれを提供し、治療有効量の下記式：
【化６】
0006046633.tif 000007
【００５９】
またその塩を、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、および選択的に、少なくとも１つの追加治療薬との混合剤で有する。
【００６０】
別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う組成物を説明およびこれを提供し、前記組成物は単位投薬形態であり、前記化合物は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５００ｍｇ／ｋｇの量で存在する。
【００６１】
別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う組成物を説明およびこれを提供し、前記組成物は単位投薬形態であり、錠剤またはカプセルの形態である。
【００６２】
別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う組成物を説明およびこれを提供し、前記組成物は経口投与される。
【００６３】
定義
本明細書で説明する化合物は、国際純正・応用化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＵＰＡＣ）または化学情報検索サービス機関（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ：ＣＡＳ）の命名法に従い命名することができる。それとは反対に明示されていない限り、「下記式を有する化合物」、「化合物Ａ」、および「化合物」は、化合物Ａと指定された化合物および化合物Ａのすべての塩を指し、これを含む。
【００６４】
本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、「治療する方法」および「治療方法」は特定の疾患「の治療に使用するための」という表現と置き換えて使用することができる。後者の表現は最近、化合物の医学的／治療的使用を主張するが、同時にスイス式の形態を廃止する適切な形態としてＥＰＯに認められた。
【００６５】
本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、「薬学的に許容される」は、例えば、薬学的に許容される賦形剤などの指定構成要素は、製剤または組成物中の他の成分と化学的および／または物理的に混合可能であり、および／またはその患者と生理学的に適合することを示している。
【００６６】
本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、「被験者」および「患者」はヒトを含む哺乳類を指す。ヒトの用語はヒトの小児、思春期青年、または成人を指し、これを含む。
【００６７】
本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、「治療する」、「治療している」、「治療された」、および「治療」は、予防、改善、緩和、および治療のための使用および結果、またはその組み合わせを指し、これを含む。「予防」または予防のための使用または結果は、絶対的または完全な予防（つまり、１００％の予防または保護のための使用または結果）を指さず、またはこれを必要としないことは理解されるものとする。本明細書で使用するとおり、予防または予防のための使用または結果は、化合物または組成物の投与が本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患の重症度を軽減または低下させ、本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患が生じる可能性を軽減または低下させ、または本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患の発症または再燃（再発）を遅らせ、または前述のすべての組み合わせとなる使用および結果を指す。
【００６８】
本明細書で用いるとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、「治療上の」および「治療有効量」は、（ａ）本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患を治療し、（ｂ）本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患の１若しくはそれ以上の症状を減弱、改善、または消失させ、（ｃ）本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患の発症または再燃（再発）を遅らせる化合物または組成物の量を指す。「治療上の」および「治療有効量」という用語は、前述の効果（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つを単独または他の効果（ａ）〜（ｃ）のいずれかと組み合わせて含むことは理解されることとする。
【００６９】
本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、「治療薬」は疾患、病状、または障害または共存症（つまり、別の疾患、病状、または障害と同時に存在する疾患、病状、または障害）の治療に有用な組成物に含まれる何らかの物質を指し、化合物Ａではない。
【００７０】
製剤
本明細書で説明する化合物の薬学的に許容される塩には、薬学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、およびアミノ酸付加塩を含む。酸付加塩の例には、例えば、塩化物（ＨＣｌ）、硫酸、およびリン酸塩などの無機酸付加塩、および、酢酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、および乳酸塩などの有機酸付加塩を含む。金属塩の例には、例えば、リチウム、ナトリウム、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、および例えば、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、および亜鉛塩などのアルカリ土類金属塩を含む。アンモニウム塩の例には、例えば、アンモニウムおよびテトラメチルアンモニウム塩などの塩を含む。有機アミン付加塩の例には、例えば、モルホリンおよびピペリジン塩を含む。アミノ酸付加塩の例には、例えば、グリシン、フェニルアラニン、グルタミン酸およびリジン塩などの塩を含む。
【００７１】
化合物Ａは、１若しくはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤と混合することで薬学的組成物（または単に「組成物」または「製剤」）に製剤化することができる。本明細書で用いるとおり、「賦形剤」の用語は、本明細書で定義するとおり、組成物中に存在する可能性がある、化合物Ａおよび他の治療薬以外のすべての成分を指し、これを含む。したがって、薬学的に許容される賦形剤は、例えば、界面活性剤、湿潤剤、香味料／味覚マスキング剤、溶媒、担体、希釈剤、防腐剤、充填剤、可溶化剤などを指し、これを含む。賦形剤の選択は、主に、例えば特定の投与様式、および望みの溶解性および安定性プロフィール、および前記投薬形態の性質などの因子に依存する。
【００７２】
化合物Ａを有する組成物は、例えば、特に溶液または懸濁液の形態の非経口、特に錠剤、カプセル、またはシロップ／液剤の形態の経口、粉末、点鼻薬、またはエアロゾルの形態の経鼻、または特にゲル、クリーム、ローション、または経皮貼布の形態の経皮など、いかなる投与様式の種類にも調整することができる。化合物Ａを有する組成物は、単位投与量で都合良く投与することができ、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９８０）に説明されているように、薬学分野でよく知られているいずれかの方法によって調整することができる。
【００７３】
錠剤は、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、およびメチルセルロースなどの賦形剤、でんぷん、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、および結晶セルロースなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの潤滑剤、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリビニル・ピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、およびメチルセルロースなどの結合剤、ショ糖脂肪酸エステルおよびソルビトール脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを用い、従来の方法で調整することができる。各錠剤には化合物Ａを約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ含むことが好ましい。
【００７４】
顆粒は、ラクトースおよびスクロースなどの賦形剤、でんぷんなどの崩壊剤、ゼラチンなどの結合剤などを用い、従来の方法で調整することができる。粉末は、ラクトースおよびマンニトールなどの賦形剤などを用い、従来の方法で調整することができる。カプセルは、ゼラチン、水、スクロース、アラビア・ゴム、ソルビトール、グリセリン、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどを用い、従来の方法で調整することができる。前記カプセルには、ビーズなどの固体粒子を含むか、または代わりに、液体またはゲルが充填されていてもよい。各カプセルには化合物Ａを約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ含むことが好ましい。
【００７５】
化合物Ａを有するシロップ製剤は、スクロース、水、エタノールなどの糖を用い、従来の方法で調整することができる。
【００７６】
化合物Ａを有する軟膏は、ワセリン、流動パラフィン、ラノリンおよびマクロゴールなどの軟膏基剤、ラウリル乳酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびアラビア・ゴムなどの乳化剤などを用い、従来の方法で調整することができる。
【００７７】
化合物Ａを有する注射用製剤は、水、生理食塩水、植物油（例えば、オリーブ油およびピーナッツ油）、オレイン酸エチル、およびプロピレン・グリコールなどの溶媒、安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、およびウレタンなどの可溶化剤、塩化ナトリウムおよびグルコースなどの等張化剤、フェノール、クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、およびクロロブタノールなどの防腐剤、アスコルビン酸およびピロ亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤などを用い、従来の方法で調整することができる。
【００７８】
非経口投与製剤には、ポリエチレン・グリコール、水素化ナフタレンなどのポリアルキレン・グリコールを含むことができる。特に、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体は、活性な化合物Ａの放出を制御するために有用な賦形剤となる可能性がある。他に、化合物Ａにとって有用となる可能性のある非経口送達システムには、エチレン酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入システム、およびリポソームを含む。他の非経口投与製剤には、口腔投与用グリココール酸、直腸投与用サリチル酸塩、または膣内投与用クエン酸も含む可能性がある。吸入投与製剤には、例えば、ラクトースなどの賦形剤を含むか、例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩、およびデオキシコール酸塩を含む水溶液、または点鼻薬の形態、または鼻腔内に適用されるゲルとして投与する油性溶液とすることができる。経皮貼布用製剤は、好ましくは親油性乳剤である。
【００７９】
化合物Ａまたはその薬学的に許容される塩は、単独投与、または医薬品中の、本明細書で定義した１若しくはそれ以上の追加治療薬と併用投与することができる。一般に慢性全身性炎症、または特に関節リウマチに伴う１若しくはそれ以上の中核症状および／または共存症を治療するため、追加の治療薬を使用することができる。１つの態様では、化合物Ａが固定用量として少なくとも１つの治療薬とともに製剤化（および投与）される。別の態様では、化合物Ａが前記治療薬とは別に製剤化（および投与）される。 
化合物Ａと併用して使用することのできる治療薬の例には、これに限定されるものではないが、例えば、非ステロイド性抗炎症薬／鎮痛薬（ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ／ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ：ＮＳＡＩＤｓ）、オーラノフィン（Ｒｉｄａｕｒａ（登録商標））、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ（登録商標））、金チオリンゴ酸ナトリウム（Ａｕｒｏｌａｔｅ（登録商標））、メトトレキセート、またはレフルノミドなどの抗リウマチ薬（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎｔｉ−ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ：ＤＭＡＲＤｓ）、ベタメタゾンまたはプレドニゾンなどのグルココルチコイド、スルファサラジン、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ／Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、セルトリズマブ（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））、またはトシリズマブ（ＲｏＡｃｔｅｍｒａ／Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））などの様々な生物反応修飾物質、トラマドールまたはアセトアミノフェンなどの様々な鎮痛薬、ＣＰ−６９０，５５０（ｔａｓｏｃｉｔｉｎｉｂ）、ＶＸ−５０９、ＶＸ−７０２、ＢＭＳ−５８２９４９、ＩＮＣＢ−１８４２４、ＩＮＣＢ−２８０５０、Ｒ−７８８（ホスタマチニブジナトリウム）、ＡＣ４３０、ＳＢ１５７８、ＡＧ４９０、ＴＧ１０１２０９、ＣＹＴ３８７、ＡＺ９６０、ＸＬ０１９、ＳＧＩ−１２５２、ＡＴ９２８３、ＣＥＰ−７０１（レスタウルチニブ）などの他の小分子阻害薬、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）およびＰＲ−９５７／ＯＮＹＸ０９１４などのプロテアソーム阻害薬、およびカーフィルゾミブを含む。
【００８０】
化合物Ａおよびその薬学的に許容される塩は、経口投与または、例えば軟膏または注射などの非経口投与とすることができる。特定医薬品中の化合物Ａの濃度は、本明細書に説明するとおり、または当業者の１人によって決定されるとおり、変化する可能性がある。特に、特定の投薬形態での化合物Ａの濃度は、総投与量、化合物Ａの化学的特徴（例えば、疎水性）、投与経路、患者の年齢、体重、および症状などに依存する。化合物Ａの好ましい投与量の範囲は、治療される疾患の種類および進行の程度、前記特定患者の全体的な健康状態、そこに含まれる特定の製剤（投薬形態）および賦形剤、また投与経路に依存する可能性がある。
【００８１】
化合物Ａの典型的な用量範囲は、約１μｇ／ｋｇ〜約３ｇ／ｋｇ体重／日である。１つの態様では、化合物Ａの好ましい用量範囲が約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。別の態様では、化合物Ａの好ましい用量範囲が約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、これは１日１〜４回投与される。まだ別の態様では、化合物Ａの好ましい用量範囲が約３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、これは１日１回または２回投与され、経口投与がより好ましい。さらに別の態様では、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを、例えば持続注入などにより、連続的に投与することが好ましい。
【００８２】
当業者は、本明細書に提供される説明および例に基づき、化合物Ａの投与範囲および投与法は治療分野で周知の方法に従って調節可能であることを理解するだろう。つまり、当業者の１人は、検出可能な治療上の利益を提供するために必要な、化合物Ａの特定用量および投与の時間的要件を容易に決定することができる。したがって、本出願書類では特定の用量および投与法について説明および／または例示しているが、これらの例は、決して、本明細書で説明される方法を実行する上で使用することのできる用量または投与法を制限するものではないことは理解されるものとする。
【００８３】
材料と方法
化合物Ａ
化合物Ａ、［８−（４−メタンスルホニル−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イル］−［３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−フェニル］−アミンは下記構造を有する。
【００８４】
【化７】
0006046633.tif 000008
【００８５】
本明細書で説明する実験について、化合物Ａは国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３７３６３号の実施例３５で報告されている方法と類似の方法で調整した。
【００８６】
本明細書で説明される実験および実施例は、化合物ＡがＲＡに特徴的な、特定の生物学的状況および症状を改善することができる、強力な経口活性ＪＡＫ２阻害薬であることを示している。より具体的には、本明細書で説明される実験および実施例は、化合物Ａを投与した結果、ＪＡＫ２阻害がＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、およびＩＦＮγを含む数種類の炎症性サイトカインを全身および疾患部位局所的に抑制し、また、十分忍容性のある方法で、慢性の病的関節破壊の特定症状を治療したことを示している。
【００８７】
化合物Ａは、単離したヒト酵素を用いたアッセイで強力なＪＡＫ２キナーゼの阻害薬として同定された（ＩＣ５０＝１．８±０．６ｎＭ、図１Ａ）。化合物ＡはＪＡＫファミリーの他のメンバーと対比して評価し、ＴＹＫ２に対する選択性は４０倍を超える様々な程度であるのに対し、ＪＡＫ１は８００倍を超えることが証明された（図１Ａ）。一連の４０２キナーゼに対する結合アッセイを用い、化合物Ａがカイノーム（ｋｉｎｏｍｅ）の他のメンバーを阻害する力も評価した［２５］。１μＭの試験濃度で、化合物Ａは高い選択性を示した。Ｋａｒａｍａｎらが定義した選択性スコアを用い、４０２キナーゼの９％が９０％超阻害され、１％のみが９９％超阻害された（Ｓ（９０）４０２＝０．０９およびＳ（９９）４０２＝０．０１）［２６］。（図１Ａ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系において、ＳＴＡＴ５のリン酸化を測定することにより、化合物ＡはＨＥＬ９２細胞のＪＡＫ２を阻害することが示された（図１Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物ＡのＪＡＫ２阻害力は、ＨＥＬ９２細胞を用いた薬力学的（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ：ＰＫ）アッセイにより証明した（図１Ｃ）。ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（登録商標）レポーターアッセイを利用した他の実験では、化合物Ａはｉｒｆ−ｂｌａ  ＴＦ−１細胞のＪＡＫ２も阻害することが示された。
【００８８】
別の実験では、化合物Ａが抗ｐＳＴＡＴ３活性も示した。研究からは、ＳＴＡＴ３がＥＧＦＲ受容体およびＳｒｃキナーゼシグナル伝達経路を介して活性化される可能性があることが示された［２７，２８］。しかし、上述のプロファイリングパネルでは、化合物Ａにはこれらのキナーゼいずれかに対する活性はなく、化合物ＡのｐＳＴＡＴ３に対する作用はＪＡＫ２の阻害を介していることが示唆される。総じて、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏデータは、化合物ＡがＪＡＫ２の強力で選択的な阻害薬であることと一致している。
【００８９】
ＪＡＫキナーゼを阻害することで治療上利益が得られる可能性があることは、当初は臓器移植の免疫抑制を意図した強力なＪＡＫ３阻害薬であったＣＰ−６９０，５５０を使用し、ＲＡで証明されたが、その後、抗ＪＡＫ１およびＪＡＫ２活性も有することが示された［２６］。より最近では、選択的ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害薬であるＩＮＣＢ０２８０５０が様々な齧歯類ＲＡモデルで効果があることが示され、さらに、この疾患ではＪＡＫキナーゼが中心的役割を果たしていることも示された［１４］。ＲＡに対してトシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））の使用が成功したことで、さらに、疾患の発症機序の中心にあるサイトカイン経路を標的とすることの機構的根拠が証明され、ＴＮＦα遮断生物製剤のいくつかには免疫抑制の副作用はない［１５］。
【００９０】
ＪＡＫ２を阻害することで、コラーゲン抗体関節炎が抑制され、局所サイトカイン反応が阻害される。
【００９１】
抗コラーゲンＩＩ型抗体をマウスにｉ．ｖ．にて送達し、最小スコアの要件を満たし、投与群に登録された時点で、化合物Ａの経口投与を開始した。化合物Ａは合計２週間、１日２回で１０、３０、または５５ｍｇ／ｋｇをｐ．ｏ．投与した。溶媒群に１％  ＤＭＳＯに溶解したＰＥＧ４００を投与し、標準的なグルココルチコイド参照治療薬としてデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ：Ｄｅｘ）を用いた。Ｄｅｘは生理食塩水に溶解し、全身の体重１ｋｇあたり１．５ｍｇで週３回（４８時間ごとに）単独ｉ．ｐ．投与した。この高用量のＤｅｘを選択したのは完全に治療された疾患の指標を定義するためであり、炎症モデルを用いていくつかの群で利用された範囲内である（０．３〜１．５ｍｇ／ｋｇ）［２９，３０，３１］。
【００９２】
１本１本の足は標準的な電気キャリパーを用いてスコア化および測定し、測定値を平均化して結果をグラフ化した。用量依存的反応は、投与により、経時的に足の厚さまたはサイズが減少したことから明らかであった（溶媒と比較し、５５ｍｇ／ｋｇの投与では１３日目に１．３倍減少）（図２Ａ−１）。これらの結果は、使用した最高用量、つまり５５ｍｇ／ｋｇで総臨床スコアのピークが低下したこととよく関連していた（溶媒と比較し、５５ｍｇ／ｋｇの投与では１３日目に２．４倍低下）（図２Ａ−２）。ＣＡＩＡ誘導後１３〜２０日目に、化合物Ａの５５ｍｇ／ｋｇ投与で観察された効果はＤｅｘで認められた結果と同等であった（図２Ａ−２）。
【００９３】
２０日目、投与後２および６時間での血漿、足、および脾臓中の化合物Ａ濃度を分析し、これらの組織では化合物Ａ濃度が用量依存的に増加することが証明された（図２Ｂ）。標的組織、つまり、足の化合物Ａ濃度は比較的低かったが、化合物Ａの濃度は５５ｍｇ／ｋｇ投与群では２つの時点で比較的一定であった。この結果は、化合物Ａが経時的に疾患（つまり、炎症）組織に保持されているため、投与後、これらの部位で慢性炎症および／またはＲＡの症状を治療する上で効果的であることを示している。図２Ｂに示したデータ（平均±ＳＥＭ、Ｎ＝３）を以下の表にまとめる。
【００９４】
【表１】
0006046633.tif 000009
【００９５】
投与したマウスの足における化合物Ａのリン酸化ＳＴＡＴｓおよびサイトカイン濃度に対する効果を検討するため、マルチプレックスビーズアレイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ）を用いた分析用に、滑液および細胞関節抽出物を罹患動物の足および足関節から得る方法が開発された［３２］。化合物Ａを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果に基づき（つまり、図１Ａ−Ｂ）、投与したマウスの足ではリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）、ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）、および可能性としてはＳＴＡＴ１（ｐＳＴＡＴ１）が減少すると想定された。マルチプレックスビーズキットを用い、リン酸化ＳＴＡＴｓの測定は、ウエスタンブロット法のみを用いる方法と同様で、これよりも定量的であると判断された。したがって、本明細書に説明するすべての実験でリン酸化ＳＴＡＴｓを測定する主な方法として、多重分析を利用した。
【００９６】
罹患動物の局所的な足ｐＳＴＡＴ５濃度は溶媒のみと同様であったが、罹患していない動物と比べ、最も高くアップレギュレートされたＳＴＡＴ分子としてｐＳＴＡＴ３が多数派を占めており、ＪＡＫ２を抑制すると総濃度が有意に低下し（図３Ａ）、検討したすべてのサンプルでｐＳＴＡＴ１はわずかに検出されただけであった。化合物Ａ  ５５ｍｇ／ｋｇ投与後２時間で足のホスホ−ＳＴＡＴ３レベルはほぼ消失し（図３Ａ、左図）、投与後６時間でゆっくりと回復し始めただけであった（図３Ａ、右図）。足のｐＳＴＡＴ３の総発現量は、疾患経過中、溶媒を投与した対照マウスと比較し、化合物Ａを投与した場合に減少した。抗体移入後３日でＬＰＳ  ２５μｇを用いてマウスを初回刺激する必要があったため、ｐＳＴＡＴ３濃度はＣＡＩＡマウスで上昇したが、これらの動物では足の炎症が持続し、経時的にｐＳＴＡＴ３活性があったことから、疾患が持続していたことは明らかであった（図３Ｂ）。化合物Ａのｂ．ｉ．ｄ．投与後２４時間以内に、ｐＳＴＡＴ３の低下は溶媒のみと比較し、Ｄｅｘで有意に大きくなった（図３Ｂ、６〜７日目、溶媒と比較し、３０ｍｇ／ｋｇでｐ<０．０１、５５ｍｇ／ｋｇでｐ<０．００１）。このｐＳＴＡＴ３の低下は、投与開始後４８時間でＤｅｘ投与により達成された（図３Ｂ、６〜８日目）。残りの実験期間中、化合物Ａはアッセイの下限までｐＳＴＡＴ３発現を低下させた（図３Ｂ）。
【００９７】
図２Ａ−１に示すとおり足腫脹と、図３Ａおよび３Ｂに示すとおりｐＳＴＡＴ３発現の抑制は、これらの化合物Ａ濃度（つまり、３０〜５５ｍｇ／ｋｇ）では、ＳＴＡＴ３によるいくつかのサイトカイン発現の抑制が後で観察されることを強く示している（図３Ｃ−１〜３Ｃ−６参照）。この仮説を確認するため、化合物Ａの用量３０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇを用いてＣＡＩＡモデル実験を繰り返し、足抽出物の炎症性サイトカイン数種類の発現レベルを分析した。化合物Ａの用量５５ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇは、いずれも、ＲＡの発症機序に関係があるとされるサイトカイン数種類の濃度を有意に低下させた［３３］。足抽出物で検討したすべてのサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、およびＩＬ−４で用量依存的減少が観察された（図３Ｃ−１〜３Ｃ−６（５５ｍｇのみ）および図８Ａ〜８Ｃを参照）。
【００９８】
検討したサイトカイン数種類について、サイトカイン発現はＤｅｘ投与群で観察された濃度未満に有意に低下し（図３Ｃ、＊溶媒と比較してｐ<０．０５）、５５ｍｇ／ｋｇの用量の化合物Ａは残りの試験期間、サイトカイン抑制を低下および持続させた（図３Ｃ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、＊＊溶媒と比較してｐ<０．０１）。このデータは、これらの実験では１．５ｍｇ／ｋｇと比較的高用量のＤｅｘを利用していたにもかかわらず、化合物Ａを投与することで重要な臨床パラメーターの数が効率的にＤｅｘで達成できる濃度未満に低下したことから、化合物Ａがこの標準的治療薬よりも強力で効果的であることが示唆される。
【００９９】
脱灰された前後肢の組織学的解析は、化合物Ａの投与により、進行性関節リウマチに伴う臨床的特徴のいくつかも軽減することを示していた。独立した病理学者によるスコア化と画像収集から、化合物Ａの投与は、溶媒を用いた対照と比較し、基質の浸食、軟骨骨溶解、骨増殖、滑膜増殖、パンヌス形成、および炎症の程度などいくつかのパラメーターを有意に抑制する可能性があると判断された（図６、表Ｉを参照）。ＪＡＫ２阻害薬の投与、つまり化合物Ａの投与に対する用量依存的反応により、組織病理学画像から明らかなとおり、骨分解、組織破壊、および骨関節炎が抑制された（図３Ｄ）。
【０１００】
化合物Ａ（すべての用量）を投与したすべてのＣＡＩＡ誘導動物について、全身の体重は溶媒投与動物と有意な差はなかった（図３Ｅ）。これまでの実験では、罹患していない動物が溶媒投与動物と比較して体重増加が同等であることが示されている。
【０１０１】
ＪＡＫ２を阻害すると慢性コラーゲン誘導関節炎の進行が遅くなり、疾患を進行させるＴｈ１細胞の生成が抑制される
化合物ＡをＲＡのより生理的な進行性疾患モデルで検討した（つまり、コラーゲン誘導関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＣＩＡ）モデル）。この実験では、自己ＩＩ型コラーゲンに対して事前に感作させ、自然ＲＡの表現型を示していた関節炎マウスに化合物Ａを投与した。実験室での研究からは、すでに文献で報告されているとおり、このＣＩＡモデルが関節炎様の炎症を示すことが証明された［１８］。初期のモデル最適化研究では、対照を投与した罹患していない動物にはない、確実なコラーゲン誘導関節炎の表現型を一貫して発生させた。ＣＩＡ関節炎動物を治療群に分け、３０、５５、および１００ｍｇ／ｋｇの用量で化合物Ａをｂ．ｉ．ｄ、ｐ．ｏ．投与し、溶媒または標準的な参照治療薬のＤｅｘ  １．５ｍｇ／ｋｇは上述のとおり投与した。化合物Ａを投与したマウスでは、平均的な足のサイズが明らかに減少するとともに（足の値は１匹ずつ回収した）、臨床スコアが用量依存的に減少していた（図４Ａ−１および４Ａ−２）。最も印象的な所見は、Ｄｅｘを投与したマウスと、化合物Ａ  １００ｍｇ／ｋｇを投与したマウスでは、足腫脹抑制がほぼ同じであることであった（図４Ａ−１）。さらに、前記１００ｍｇ／ｋｇ投与群では前記Ｄｅｘ投与群と比較し、腫脹がより急速に抑制されることが観察された（図４Ａ−１、４３日目）。１００ｍｇ／ｋｇ投与群ではより早く腫脹の減少が起こることは、化合物Ａの作用機序の差によって説明できる。
【０１０２】
図４Ｂに示すとおり、ｐＳＴＡＴ３は５５ｍｇ／ｋｇ（図４Ｂ、＊＊ｐ<０．０１）および１００ｍｇ／ｋｇ（図４Ｂ、＊＊＊ｐ<０．００１）で化合物Ａを投与したマウスで有意に減少した。化合物Ａの用量３種類すべてについて、データは、局所的な足ｐＳＴＡＴ３発現量の減少が、関節炎の疾患進行に関与するいくつかの血清および足サイトカイン（図４Ｃ−１〜４Ｃ−４参照、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ｐ<０．０５。図８Ａも参照、ＩＬ−４、＊＊＊ｐ<０．００１）および脾臓ＩＬ−１２（図８Ｂ、＊ｐ<０．０５）の減少と直接対応していたことを示している。上述のＣＡＩＡ実験では、化合物Ａによる足ＩＬ−６の減少（図８Ｃ、＊ｐ<０．０５）も観察された。しかし、溶媒群では見かけ上ＩＬ−６で誘導された炎症が急増を引き起こしていたため、このサイトカイン（ＩＬ−６）はモニターが困難であった。体重はいずれの投与群でも有意な変化はなかったが、化合物Ａを投与したマウスは、対照群よりも健康であるように見え、より大きな体重を保持していた（図９Ａ）。
【０１０３】
化合物Ａの用量反応は、病原性Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞の主な前駆体であり促進因子であるＩＬ−１２［３４，３５］を測定した場合に最も明らかに観察された（図４Ｃ−１）。この実験で投与したＤｅｘの用量（１．５ｍｇ／ｋｇ）は関節炎マウスの血清における内因性ＩＬ−１２の発現を抑制する上で効果的であったが、化合物Ａの３種類の用量はすべてＤｅｘで観察された濃度と比較し、ＩＬ−１２濃度を有意に低下させることができた（図４Ｃ−１）。ＩＬ−１２は（Ｔ−ｂｅｔ発現を介して）Ｔｈ１細胞を分化させるサイトカインであり、抗コラーゲンＩＩ型Ｔｈ１細胞はＣＩＡモデルの足炎症の主な促進因子の１つであるため、化合物Ａが循環血液中のＩＬ−１２を抑制することができれば、ＩＩ型コラーゲン特異的Ｔ細胞の総度数は投与によって減少するはずであると仮定された。足に局所的に認められるＴｈ１細胞は動物体内を循環して二次的なリンパ器官に入るため、ＩＦＮγ  Ｔ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、投与したＣＩＡマウスの脾細胞全体を、ｅｘ  ｖｉｖｏで精製ＩＩ型コラーゲンフラグメント（ＣＢ１１）を含む免疫優勢エピトープを用いて再刺激した。図４Ｄに示すとおり、Ｄｅｘまたは化合物Ａを５５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇで４週間ｂ．ｉ．ｄ、ｐ．ｏ．投与した場合、ＣＢ１１特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の度数が有意に減少した（図４Ｄ、＊ｐ<０．００１）。代表的なＥｌｉｓｐｏｔブロット画像は、化合物Ａの用量が高いほど、Ｔｈ１様細胞反応の度数が大きく減少することを示している（図４Ｄ）。しかし、化合物Ａ投与マウスで抗ＣＩＩ  ＩｇＧ血清力価の減少は観察されず（図９Ｂ）、問題の根元、つまり自己反応性Ｂ細胞についてはまだ取り組む必要があることを示唆している［３６］。抗ＣＩＩ抗体は関節炎ではないマウスには存在せず、抗ＣＩ抗体を検討したが、この実験または前記ＣＩＡモデルには認められなかった。化合物Ａを用いて疾患を治療すると、組織学的分析（図４Ｅ）および独立し、盲検化した病理学者のスコア（図７、表ＩＩ）から証明されるとおり、足の炎症および骨の劣化が少なくなる可能性がある。ＣＩＡモデルでは、足根骨は手根骨よりも炎症が大きくなる傾向があるが、前記ＣＡＩＡモデルでは反対の効果が認められる。化合物Ａの用量１００ｍｇ／ｋｇおよび５５ｍｇ／ｋｇはいずれも足根骨を保護したが、化合物Ａの用量１００ｍｇ／ｋｇではいずれの領域も最適な保護を提供した（図４Ｅ）。ＣＩＡモデルの炎症度のみが、化合物Ａの用量１００ｍｇ／ｋｇおよび５５ｍｇ／ｋｇのいずれにおいても有意となることが観察された（図７、溶媒による対照と比較し、＊＊１００ｍｇ／ｋｇではｐ<０．０１、および＊５５ｍｇ／ｋｇではｐ<０．０５）。
【０１０４】
空気嚢炎症モデルを用い、ＪＡＫ２阻害により細胞性免疫を阻害する
細胞レベルでの化合物ＡによるＪＡＫ２阻害の影響を検討するため、マウス空気嚢モデル（ａｉｒ  ｐｏｕｃｈ  ｍｏｄｅｌ：ＡＰＭ）を利用した。空気で膨らんだ皮下の空気嚢を滅菌条件で管理し、１０、３０、および５５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａと同時に、１％カラギナンを注入した。食塩水のみ（溶媒）またはデキサメタゾン１．５ｍｇ・ｋｇを対象として用いた。化合物ＡのＪＡＫ２阻害は、空気嚢の細胞内蓄積を有意に減少させた（図５Ａ、＊溶媒と比較しｐ<０．０５）。化合物Ａの投与に対してＪＡＫ２阻害も、Ｄｅｘよりも低くＩＬ−６の発現を阻害することが示された（図５Ｂ、＊溶媒と比較しｐ<０．０５）。さらに、間接的な血管新生アッセイであるＤｒａｂｋｉｎアッセイを用い、空気嚢の内容物の総ヘモグロビン含有量を測定したとおり、血管新生が影響を受けた（図５Ｃ、＊溶媒と比較しｐ<０．０５）。空気嚢モデル（ＡＰＭ）で化合物Ａを投与すると、１〜０．１ｍｇ／ｋｇで投与した場合、結果が同様となった。これらのデータは、化合物ＡによるＪＡＫ２阻害が直接細胞免疫機能に影響するため、ＲＡモデルの作用機序が白血球の流れおよびサイトカイン放出／反応のレベルで介在している必要があることを示している。
【０１０５】
動物、抗体、細胞培養試薬、化合物、細胞株
ＣＩＡおよびＣＡＩＡ研究に使用したマウスはＨａｒｌａｎ雌ＤＢＡ／１マウスであり、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの雌Ｂａｌｂ／ｃ  ｍｉｃｅをすべての空気嚢モデル（ａｉｒ  ｐｏｕｃｈ  ｍｏｄｅｌ：ＡＰＭ）研究に用いた。実験開始から６〜８週間でマウスの年齢をマッチさせた。すべての動物を２４時間の明暗サイクルで管理し、食餌と水は自由に摂取させた。すべての動物実験手順は、Ｃｅｐｈａｌｏｎ，  Ｉｎｃ．の研究機関の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）の承認を受け、その規制に従った。
【０１０６】
すべての脾臓サンプルをＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ、米国ミシガン州Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）を用いて分析した。ウエスタンブロットに使用した抗体は、抗リン酸化ＳＴＡＴ５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州Ｄａｎｖｅｒｓ）および抗総ＳＴＡＴ５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州Ｄａｎｖｅｒｓ）であった。すべてのＥｌｉｓｐｏｔ実験について、脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養が関与するすべての実験に完全培地（Ｒ１０）を用いた。完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）＋１％  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）、１％  Ｌ−Ｇｌｎ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）、１％非必須アミノ酸（Ｃｅｌｌｇｒｏ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）、および１０％  ＦＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から成った。小分子ＪＡＫ２阻害薬である化合物Ａは、別の文献で詳細が示されている手順に従い合成した［１６］。細胞株ＨＥＬ９２（ＡＴＣＣ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）を、化合物Ａを用いたｐＳＲＡＴ５阻害の初期薬力学的（ｐｈａｒｍａｃｐｄｙｎａｍｉｃ：ＰＤ）検査に用いた。
【０１０７】
ウエスタンブロット法
サンプルを１０分間７０℃で加熱し、ＮｕＰＡＧＥ  １０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、１．５ｍｍ、１５ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）に載せた。使用した分子量のマーカーはＢｉｏＲａｄ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ染色済み基準品（ＢｉｏＲａｄ、米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）であった。実行条件は、１５０ボルト、室温（ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＲＴ）で１時間とした。半乾燥させた移動装置（ＢｉｏＲａｄ、米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用い、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。一次抗体は、リン酸化ＳＴＡＴ３  ｐＹ７０５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州Ｄａｎｖｅｒｓ）では５％牛乳で１：１０００に希釈し、総ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州Ｄａｎｖｅｒｓ）では５％  ＢＳＡで１：１０００に希釈し、ＴＢＳ中５％牛乳＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて４℃で一晩インキュベートした。抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合二次抗体を１：２０００で使用した（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州Ｄａｎｖｅｒｓ）。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いて検出を行った。濃度測定はＧｅｌＰｒｏアナライザー３．１ソフトウェアを用いて行った。
【０１０８】
酵素アッセイ
他の文献で説明されている時間分解蛍光（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＴＲＦ）検出システムを利用し［１７］、バキュロウイルス発現ヒトＪＡＫキナーゼ（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、またはＴＹＫ２）のキナーゼ活性を測定した［１７］。各９６ウェルのＣｏｓｔａｒ高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国ニューヨーク州Ｃｏｒｎｉｎｇ）を１００μｌ／ウェルの１０μｇ／ｍｌニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）により、ＴＢＳ中、３７℃で２時間コーティングした後、１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ  １５ｍｅｒペプチド基質（ビオチニル−アミノ−ヘキサノイル−ＥＱＥＤＥＰＥＧＤＹＦＥＷＬＥ−アミド、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、米国ペンシルベニア州Ａｓｔｏｎ）により、３７℃で１時間コーティングした。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．２）、ＡＴＰ（各キナーゼのＫｍレベル）、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．１％  ＢＳＡ、および被験化合物（ＤＭＳＯに希釈、アッセイ中最終濃度２．５％  ＤＭＳＯ）から成るキナーゼアッセイ混合物（総量＝１００μｌ／ウェル）を前記アッセイプレートに加えた。使用したＡＴＰ濃度は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、およびＴＹＫ２で０．２μＭ  ＡＴＰ、ＪＡＫ３で０．１μＭ  ＡＴＰであった。酵素を加え、前記反応を２０分間ＲＴで進めた。リン酸化生成物の検出は、ＴＢＳ−Ｔ中０．２５％  ＢＳＡで１：５０００または１：１００００に希釈した１００μｌ／ウェルのＥｕ−Ｎ１標識ＰＹ１００抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）を加えて行った。サンプルはＲＴで１時間インキュベートした後、１００μｌの強化溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）を加えた。プレートを１０分間攪拌し、得られた溶液の蛍光性はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０２または２１０４マルチラベルプレートリーダーを用いて測定した。ＩＣ５０値は、ＸＬＦｉｔ（登録商標）４（ＩＤＢＳ，  Ｌｔｄ．、英国Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ）の４パラメーターロジスティックモデルにより決定した。
【０１０９】
コラーゲン抗体関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＣＡＩＡ）モデル
試験開始前に順化したマウスを無作為に割り付け、事前に採血し、ベースラインの炎症を測定した。０日の時点で、ＤＢＡ／１雌マウスに、食塩水に懸濁したＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）の様々なエピトープに対する関節炎発症モノクローナル抗体の１０ｍｇ／ｍｌカクテル１．５ｍｇを含む食塩水１００μｌをｉ．ｖ．注射した。３日目、マウスに５０μｇのＥ．  ｃｏｌｉ  ０１１１：Ｂ４  ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ原液）（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）１００μｌをｉ．ｐ．注射し、回復中はゲル状食を与えた。関節炎の足はＬＰＳ投与後２日間のモニタリングを開始し、関節炎のピークは通常ＬＰＳ投与後２〜３日に発生した。各四肢について臨床スコア「１」以上を示したマウスは関節炎とみなし、研究に用いた。関節炎の臨床スコアを表にしたものは、別の文献にみられる［１８］。簡潔に言えば、スコア「０」は紅斑および腫脹の根拠がないことを示し、スコア「１」は足根骨に限局した紅斑および軽度の腫脹を示し、スコア「２」は足関節から足中央部に広がる紅斑および軽度の腫脹を示し、スコア「３」は足関節から中足関節に広がる紅斑および中等度の腫脹を示し、スコア「４」は足関節、足、および指を含む紅斑および重度の腫脹を示す。溶媒は１日２回（ｂ．ｉ．ｄ）経口投与されるＰＥＧ４００＋１％  ＤＭＳＯから成った。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（Ｈａｎｎａ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ、米国デラウェア州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）を食塩水中１．５ｍｇ／ｋｇで週３回ｉ．ｐ．投与し、炎症のピーク時から実験終了まで継続した。実験中、サイトカインおよび抗体の血清サンプルを採取するため、マウスの頬を出血させた。すべてのサンプルはアッセイの準備ができるまで−８０℃に維持した。ＳＴＡＴおよびサイトカインの定量と組織学的解析を行うため、約４週間の時点でマウスの脾臓、血清、および関節炎の足を摘出した。早期に妥当性を確認するため、誘導後３〜４週間前後で試験を終了し、様々な時点で足を摘除し、経時的にサイトカイン濃度を測定した。
【０１１０】
コラーゲン誘導関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＣＩＡ）モデル
試験開始前に順化したマウスを無作為に割り付け、事前に採血し、ベースラインの炎症を測定した。０日目、ＣＦＡ、５ｍｇ／ｍｌ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）乳剤に懸濁した０．０５Ｍ酢酸（Ｃｈｒｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）中、等容積のウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）、２ｍｇ／ｍｌ原液によりＤＢＡ／１雌マウスに一次免疫を行い、尾のつけ根に１００μｇのＣＩＩを１００μｌで経皮（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｌｙ：ｉ．ｄ．）注射した。一次免疫後２１日目の時点で、フロイント不完全アジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ：ＩＦＡ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）に乳化したＣＩＩをマウスの横腹にｓ．ｃ．再負荷した。２８日目、各マウスにＥ．ｃｏｌｉ  ０１１１：Ｂ４  ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ原液）（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）を食塩水１００μｌ中１０μｇでｉ．ｐ．注射した（２５〜５０μｇのＬＰＳは１匹あたり１０μｇに減量し、エンドトキシンショックによる死亡率を低下させた）。３５日目前後にマウスは足に炎症および疾患の徴候を示し始めた。投与開始前にマウスを無作為に割り付け、グループに分け、スコア化し、耳にタグを付け、事前に採血してベースライン疾患を決定した。各四肢について臨床スコア「１」以上を示したマウスは関節炎とみなし、研究に登録した。関節炎の臨床スコアはＣＡＩＡモデルをスコア化するために使用したものと同じであった（ＣＡＩＡの方法を参照）。溶媒は１日２回（ｂ．ｉ．ｄ）経口投与されるＰＥＧ４００＋１％  ＤＭＳＯから成った。デキサメタゾン（Ｈａｎｎａ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ、米国デラウェア州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）を食塩水中１．５ｍｇ／ｋｇで週３回ｉ．ｐ．投与し、炎症のピーク時から実験終了まで継続した。実験中、サイトカインおよび抗体の血清サンプルを採取するため、マウスの頬を出血させた。すべてのサンプルはアッセイの準備ができるまで−８０℃に維持した。ＳＴＡＴおよびサイトカインの定量と組織学的解析を行うため、約６０日目の時点でマウスの脾臓、血清、および関節炎の足を摘出した。
【０１１１】
カラギナン誘導炎症の空気嚢マウスモデル
この迅速な炎症スクリーニングモデルの確立およびデザインに関する詳細は、他の文献に見ることができる［１９，２０］。簡潔に言えば、５日前の時点でＢａｌｂ／ｃマウスに滅菌した空気４ｍｌをｓ．ｃ．注射し、ベースラインの測定値を記録し、マウスを群に無作為に割り付けた。３日前までに空気嚢を維持する試験にマウスを登録したが、この時点で空気嚢を維持するため２ｍｌの滅菌した空気を注入する。０日目、直接マウスの空気嚢に食塩水に懸濁した１％カラギナン（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリー州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）を注射した。これにより、主に好中球およびマクロファージの急速な炎症性流入が誘導される。この被験化合物を食塩水中、総量１００μｌでｍｇ／ｋｇの濃度とし、前記カラギナン注射と同時に直接空気嚢に導入した（食塩水中カラギナン１％）。炎症反応が誘導され、続いてＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１β空気嚢サイトカインが急増し、これは８日目までに解消した。カラギナンおよびそれぞれの被験化合物投与後２４時間で１００μｌの空気嚢液を細胞性滲出物とともに摘出した。細胞性滲出物を遠心分離にかけ、上清はＬｕｍｉｎｅｘサイトカイン分析用に処理し、細胞ペレットの総肝細胞および死滅細胞を計数した。総細胞数の計数はＢＤ  ＴｒｕＣｏｕｎｔビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）を用いて実施し、細胞分析は生存判別色素として７−ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリー州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）を用いて行い、死滅細胞を除外した。Ｄｒａｂｋｉｎのアッセイ（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリー州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）アッセイを利用し、ヘモグロビン含有量を決定した。
【０１１２】
組織学−ＣＡＩＡおよびＣＩＡ関節炎モデル
各実験終了時に、組織学的解析のため、前足および後足（手根骨および足根骨を含む）を動物身体から摘除した。指先端の皮膚を剥離し、外科用ハサミを用いて中足部の皮膚を穿孔し、完全に脱灰させた。サンプルは、別の文献で説明されたとおり、ギ酸を用いた脱灰手順に従った［２１，２２］。７〜１０日脱灰した後、サンプルを蒸留水で２時間洗い、処理の準備ができるまで４℃で７０％エタノールに保存した。サンプルをパラフィン包埋し、切片とし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｏｓｉｎ：Ｈ&Ｅ）染色し、基質分解を検討するためサフラニン−Ｏでも染色した（画像は図示せず、病理学者がスコア化に使用した）。すべての組織学的研究はＷｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）で行った。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０カメラおよびＯｌｙｍｐｕｓ  ＬａｂＳｅｎｓソフトウェアを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡（２００９）により収集した。組織病理像により各群合計５匹のマウスを分析し、検討した各群について１０倍の代表的画像を示している。
【０１１３】
血清抗Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン自己抗体の測定
血清は１〜２週間ごとに収集し、使用まで−８０℃で保存した。解凍したサンプルを社内で作成したＩＩ型およびＩ型コラーゲンＥＬＩＳＡ法により分析した。簡潔に言えば、ＢＢＳ（０．０２５Ｍ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７−１０Ｈ２Ｏ、０．０１Ｍ  Ｈ３ＢＯ３、０．０７５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．４）バッファー中、４℃で一晩、９６ウェルプレートの各ウェルを５μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）またはＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）５０μｌでコーティングした。手順の前にプレートをＢＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗った。精製したマウス抗コラーゲンＩ型またはＩＩ型抗体を用いて標準曲線を作成し、１ウェルあたり５０μｌで血清を加え、室温（ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＲＴ）で１時間インキュベートした後、ＢＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０で洗った。洗浄後、１μｇ／ｍｌのウサギ抗マウスＨＲＰ−Ｆａｂフラグメント５０μｌを検出抗体として加え（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、米国ペンシルバニア州Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ）、ＲＴで４５分間インキュベートした。プレートはＢＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗い、次に１００μｌのテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＴＭＢ）基質を加え、１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止した。プレートを４５０ｎｍで読み取り、参照波長は５７０ｎｍとした。
【０１１４】
Ｅｌｉｓｐｏｔｓ
ＴおよびＢ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔ法については別の文献にみられ［２３，２４］、各方法について以下に簡潔に説明する。
【０１１５】
Ｔ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔｓ
ＣＩＡ実験については、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅニトロセルロースＩＰフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）を、滅菌ＰＢＳ中、１ウェルあたり６０μｌでそれぞれ７μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌの抗マウスＩＦＮγ（ＡＮ１８、ＭａｂＴｅｃｈ、米国オハイオ州Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ）または抗マウスＩＬ−４（１１Ｂ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）でコーティングし、ＲＴで３時間または４℃で一晩インキュベートした。コーティングしたウェルをＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で洗い、軽く叩いて半乾燥させてから、完全培地を用いて使用前に少なくとも１時間ブロッキングした。精製したマウスＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｒｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｈｒｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）、または第三者の対照トリオボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：ＯＶＡ）（Ｓｉｇｍａ米国ミズーリー州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）を用い、総抗原濃度１０μｇ／ｍｌで１ウェルあたり１００万個の処理脾細胞を負荷した。バックグラウンドの対照として培地のみを用い、第三者の対照としてＯＶＡ、ＩＦＮγおよびＩＬ−４の陽性対照としてＰＭＡ＋イオノマイシンが、それぞれＴｈ１およびＴｈ２細胞によって放出される。
【０１１６】
Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔｓ
Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔの成分はＭａｂＴｅｃｈから入手し、ニトロセルロースＩＰフィルタープレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手した。簡潔に言えば、ＣＩＡ実験では、Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔのウェルをエタノールで活性化した後、滅菌ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌの精製したウシＩＩ型またはＩ型コラーゲン（Ｃｈｒｏｎｄｒｅｘ、米国ワシントン州Ｒｅｄｍｏｎｄ）で洗い、コーティングし、第三者の対照としてＯＶＡを用い、バックグラウンドは培地のみとした。処理した脾細胞を各ウェルに加え、ＬＰＳ刺激は行わず、抗体分泌細胞タイプ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ：ＡＳＣｓ）の真のｅｘ  ｖｉｖｏ度数を回避した。ＩｇＧ産生ＡＳＣ全体について抗マウス総ＩｇＧを陽性対照として用い、結果を正規化するために使用した。各抗原を検出するための細胞度数は、検討する各モデルの最適化および検証過程ですでに同定されていた（データ図示せず）。ＣＩＡ実験では、ＣＩおよびＣＩＩでコーティングしたウェルについて、合計５００，０００個の細胞を各ウェルに加えた。Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔｓを一晩３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。各アッセイを展開するため、二次抗体（ＭａｂＴｅｃｈ、米国オハイオ州Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ）を各ウェルに加え、インキュベート、洗浄して、アルカリホスファターゼ・ストレプトアビジンを抱合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、米国ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）として用い、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国ペンシルバニア州Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ）を基質として用い、スポットが見えるようになるまで展開した。すべてのＥｌｉｓｐｏｔ分析はＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  Ｃ．Ｔ．Ｌ．スキャナおよびＢｉｏｓｐｏｔソフトウェア（２００９）を用いて行った。
【０１１７】
マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズアッセイによる血清サイトカインの測定
−８０℃で凍結した血漿を氷上解凍し、ボルテックスをかけた後、１０分間遠心分離して壊死組織片および凝集体を取り除いた。製造業者の指示に従い、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイには合計２５〜５０μｌの血清を用いた。マウスサイトカイン１０−ｐｌｅｘビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用い、１０種類のマウスサイトカインを測定した。簡潔に言えば、フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）を２００μｌの洗浄液（キットの構成要素）で事前に湿らせ、１ウェルあたり２５μｌのビーズを加えた。血清サンプルを希釈し、１ウェルあたり合計５０μｌの量を加えた（つまり、サンプル血清２５μｌ＋アッセイ希釈液２５μｌ）。ビーズが入ったプレートを、暗所でオービタルシェーカーに載せ、２時間ＲＴでインキュベートした。インキュベーション終了時にプレートをバッファーで２回洗い、前記キットに提供されているビオチン希釈液中、希釈倍率１：１０、１００μｌで二次ビオチン化抗体を加えた。プレートを暗所、ＲＴで１時間インキュベートし、バッファーで２回洗った。アッセイ希釈液に溶解したストレプトアビジンを１ウェルあたり１００μｌで加えた後、暗所、ＲＴで３０分間インキュベートした。プレートは１００μｌの洗浄液で３回洗い、暗所、ＲＴで２〜３分間攪拌した。データ取得および解析ソフトウェアを搭載したＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ  ２００ユニット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）で直ちにプレートを測定した。ビーズの洗浄はすべて、真空マニホールドユニット（Ｐａｌｌ、米国ニューヨーク州Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて行った。
【０１１８】
マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズアッセイによる足サイトカインおよびホスホ−ＳＴＡＴｓの測定
この方法のより詳細な説明は別の文献に見ることができる（Ｌｕら、２０１０、発表用に提出済み）。簡潔に言えば、前（手根骨を含む）および後（足根骨を含む）右足を採取し、ドライアイスで冷却したイソペンタン中に凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。足は２ｍｍ×２ｍｍの切片に切断し、ポリプロピレン製の丸底試験管に入れ、ドライアイスで保存した。プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）およびＨａｌｔプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）またはＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ、米国インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を組織抽出試薬Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｅｓｂａｄ）中に含む組織抽出バッファー７００μｌを各サンプルに加えた。サンプルはＰＴ  １０−３５  Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを用いて凍結後均質化した。均質化後、４℃、２０００×ｇで１０分間サンプルを遠心分離し、４℃、最大スピード１４，０００×ｇで１５分間、上清を再度遠心分離した。上清を慎重に取り除き、最上層の脂質／脂肪組織片を取らないようにした。タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いて測定し、３ｍｇ／ｍｌに調節した。上述のプロトコールでは、マウスサイトカイン１０−ｐｌｅｘビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）またはリン酸化ＳＴＡＴ１，  ３，  ５ａ／ｂ，  ３−ｐｌｅｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用い、この抽出物を最低２５μｌ使用した。
【０１１９】
化合物の定量化（ＰＫ、薬物動態）
足および脾臓サンプルの血漿およびタンパク質抽出物を定量分析に提出し、それぞれの化合物の濃度を決定した。血液サンプルをヘパリン添加した試験管に回収し、遠心分離（１６，０００×ｇ、５分）まで氷上に置き、結晶を分離した。上清を回収し、分析を待つ間、−２０℃で保存した。分析時に、２種類の用量の内部標準（アルプレノロール）を含む冷アセトニトリルを各サンプルに追加し、これをボルテックスにかけ、遠心分離した。上清を除き、オートサンプラーのバイアルに入れ、サンプルに存在する化合物の量を液体クロマトグラフ／質量分析（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）により分析した。サンプル中の化合物の濃度は、５〜２０，０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で連続的に希釈して作成したマウス血漿の標準曲線と比較して定量した。前記標準曲線の最小部を１０％以上超える濃度を含むサンプルは、アセトニトリルで１：１０に希釈した。血漿、足、および脾臓の検出限界は<１０ｎｇ／ｍｌであった。
【０１２０】
統計解析
すべてのＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイは線形回帰曲線を用いて分析し、データ取得後に分析物の濃度を決定した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック一元または二元分散分析を統計学的検定として用い、実験および検討した仮説によって図の説明文に示した。ｐ値が０．０５未満の場合に有意と考えた。使用した統計ソフトウェアはＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５．０１、２００７）であり、計算はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ（Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、２００３）により行った。
【０１２１】
本明細書に報告したのは、選択性が高く、経口投与可能なＪＡＫ２小分子阻害薬である化合物Ａの有効性プロフィールであり、２つのＲＡマウスモデルで評価した。ＪＡＫ２の薬力学的阻害により、足浮腫および臨床スコアの平均値が関節炎のＣＩＡおよびＣＡＩＡモデルの両方で低下した。足および血清サイトカインの減少は、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔで測定したとおり、脾臓のＣＩＩ特異的Ｔｈ１細胞度数の減少と関連していた。いずれのモデルでも、投与により疾患寛解の組織学的証拠が示され、足ｐＳＴＡＴ３濃度が低下した。この研究では、強力で選択性の高い経口投与可能なＪＡＫ２阻害薬をＲＡの治療に用いることの有用性を示している。
【０１２２】
ＣＩＡモデルはＴ細胞およびＢ細胞反応の両方に依存しており、ヒトＲＡと同様、ＩＬ−６の作用に依存していることから、化合物Ａはヒトの疾患に関与する重要な免疫サイトカインを調節できることが示される［１５，３７，３８］。ＣＩＡモデルとは異なり、ＣＡＩＡモデルではこのサイトカインが欠乏しているマウスもまだ関節炎を誘導することができるため、完全にＩＬ−６に依存しているわけではないことが示された［３９］。しかし、驚くべきことに、化合物Ａの強力な活性がＣＡＩＡモデルで観察され、この活性は標準的な治療薬であるＤｅｘを超えることもある。トシリズマブを使用することで、明白な免疫抑制を行わずにサイトカインを標的とすることが、疾患の進行にいかに直接影響しているかが示されている［８］。ＩＮＣＢ０２８０５０などの他の小分子も同様の表現型を示す、つまり、免疫抑制を行わずにＩＬ−６および疾患を抑制することも報告された［１４］。急性炎症性マウスモデル（つまり、ＩＮＣＢ０２８０５０では遅延型過敏症、化合物ＡではＡＰＭモデル）では化合物ＡとＩＮＣＢ０２８０５０がいずれも免疫細胞の流入およびサイトカインの放出を阻害する可能性があるため、化合物ＡはＩＮＣＢ０２８０５０と同様に作用する可能性がある。
【０１２３】
ＪＡＫ２は、ｇｐ１３０受容体ファミリー、ＩＬ−６ＲおよびＩＬ−１２Ｒβ、およびＩＦＮγＲ２など、自己免疫および炎症に重要な役割を果たすことと強く関連する受容体を含む、数種類の受容体によるシグナル伝達に介在している［４０］。さらに、ＪＡＫ２はＧＭ−ＣＳＦ受容体スーパーファミリーのいくつかの構成要素（例えば、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ）によるシグナル伝達に介在する。ＪＡＫ２は、エリスロポエチン受容体（Ｅｐｏ−Ｒ）、トロンボポエチン受容体（Ｔｐｏ−Ｒ）、成長ホルモン受容体（ＧＨ−Ｒ）、プロラクチン受容体（ＰＲＬ−Ｒ）およびレプチン受容体（ＬＲ）などの単鎖受容体もコントロールする。レプチンはＩＬ−２およびＩＬ−１５と構造が類似しており、免疫に関与していると考えられてきた［４１］。ＪＡＫ２はＬＲからのシグナル伝達に介在するため、ＪＡＫ２の阻害は、動脈硬化およびアテローム性動脈硬化など、明らかに心血管系が関連している炎症性疾患の標的として作用する可能性がある［４２］。 
様々な免疫関連シグナル伝達分子とＪＡＫ２との相互作用は、このキナーゼの阻害がいかに他の免疫細胞タイプ、またそのため他の自己免疫疾患の治療に影響することができるかを決定する。下流のＪＡＫ２はＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、およびＳＴＡＴ１と相互作用することができる［４３］。しかし、ＳＴＡＴ５ａ／ｂのみが直接ＪＡＫ２による活性化を受け、ＳＴＡＴ４はＴＹＫ２により、ＳＴＡＴ１はＪＡＫ１により活性化される可能性があり、ＳＴＡＴ３はＥＧＦＲ経路、ＪＡＫ１、およびＳｒｃキナーゼにより活性化される可能性がある［２７，２８］。さらに、Ｔｅｃ、Ｖａｖ１、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ１、およびＰＴＫ２を含むいくつかのキナーゼも直接ＪＡＫ２と相互作用する［４４−４８］。これらのキナーゼは、すべてある程度、免疫サブセット、特にＴおよびＢリンパ球の制御および活性化に関与している。ＪＡＫ２の阻害は、ただサイトカインシグナル伝達を直接阻害するよりもさらに意味があると考えられる。ＪＡＫ２阻害によりＴおよびＢ細胞の活性化は下流で阻害され、別の適応症でこのキナーゼの強力な阻害薬を使用できる可能性が広がる。
【０１２４】
例えば、リンパ球の活性化をコントロールするキナーゼにはチロシンキナーゼのＴｅｃファミリーを含み、Ｔ細胞のアダプター分子の島ＳＬＰ７６のＶａｖ１およびＢ細胞のＢＬＮＫなどの分子と相互作用するＩｔｋおよびＢｔｋキナーゼを含む［４９］。主に、Ｔｅｃキナーゼは適切なＴ細胞受容体のシグナル伝達および活性化に関与する。ＴｅｃキナーゼＩｔｋが欠損したマウスはＴｈ２エフェクター細胞に効率的に分化することができず、侵入してくる細胞外寄生虫、および一部のウイルス感染に対しても防御促進力が欠けている［５０］。Ｉｔｋ欠損マウスも、喘息マウスモデルでＴ細胞の肺浸潤の低下を示す［５１］。下流分子のＶａｖ１は、Ｔ細胞活性化に関与するＰＫＣおよびＥＲＫを介して、ＴＣＲおよびＣＤ２８シグナルをＣＲＥに伝達する［５２］。ＪＡＫ２の下流標的として考えられるＦｙｎおよびＹｅｓ１は、ＴおよびＢ細胞の活性化に重要な役割を果たし、いずれかを阻害するとリンパ球の活性化に必要な下流の閾値に影響する可能性がある［５３］。したがって、ＪＡＫ２活性の阻害により上述のキナーゼのいずれかを完全または部分的に阻害すると、数種類の自己免疫疾患の発症および進行に大きく影響する可能性がある。他の免疫疾患でこの強力な阻害薬を使用するためには、さらなる研究が必要である。
【０１２５】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達のサプレッサーである、ＳＯＣＳも、直接ＪＡＫ２と相互作用する（例えば、ＳＯＣＳ３）［４３，５４］。ＳＯＣＳタンパク質はＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路のネガティブフィードバックループとして働く［５５］。興味深いことに、ＳＯＣＳの発現はＲＡ患者では変化しており、ＳＯＣＳ１およびＳＯＣＳ３の濃度はＲＡ患者のＰＢＭＣでは上昇していることが示された［５６］。ＳＯＣＳ１は、ＲＡ患者の末梢血単球のＳＯＣＳ３発現に関与する末梢血Ｔ細胞でアップレギュレートされていた［５６］。ＳＯＣＳ１は、骨関節炎患者と比較し、ＲＡ患者の滑膜でアップレギュレートされることも示された。これは、ＳＯＣＳの作用を介したＪＡＫ２シグナル伝達の脱制御がＲＡの発症に寄与している可能性があり、患者の疾患の発症しやすさを予測することを示唆している。
【０１２６】
化合物Ａにより疾患を促進させるサイトカイン経路の阻害は、標準的な治療を用いて測定した結果に匹敵し、クローン病および潰瘍性大腸炎など、他のＩＬ−６依存性疾患にこの阻害薬を使用することを強く提案している。化合物Ａは、ＳＬＥ、ＩＢＤ、乾癬、および結腸、前立腺、および膵癌を含む様々な癌など、これらの同経路に依存する他の疾患にも有用と考えられる。これらの結果から、化合物Ａなどの選択的ＪＡＫ２阻害薬のさらなる前臨床評価が必要である。
【０１２７】
当業者は、本明細書に詳細を示した具体的実験が、本発明の様々な態様を説明するためだけのものであることは容易に理解するだろう。本出願書類の精神および範囲から離れずに、様々な変更を行うことができることは理解されるものとする。
【０１２８】
参考文献
本出願書類が関係する技術の状態をより十分説明するため、以下の科学論文は上記で言及されている。これらの参考文献の引用はすべて、以下に提供される。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ−１】
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【図３Ｃ−２】
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【図３Ｃ−３】
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【図３Ｃ−４】
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【図３Ｃ−５】
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【図３Ｃ−６】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｃ−３】
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【図４Ｃ−４】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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