(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）脂肪酸油混合物および銀塩水溶液を組み合わせて水相および有機相を形成するステップであって、前記水相中、前記銀塩水溶液が少なくとも１のω３脂肪酸と錯体を形成するステップ；
（ｂ）前記有機相から前記水相を分離するステップ；
（ｃ）置換液により前記水相を抽出し、または前記水相の温度を少なくとも３０℃に上昇させ、または置換液による抽出と温度の上昇とを組み合わせて、少なくとも１の抽出物を形成させるステップ；
（ｄ）前記水相を水と組み合わせ、または前記水相を超臨界ＣＯ2で抽出し、または前記水相を水と組み合わせることと超臨界ＣＯ2による前記水相の抽出とを組み合わせて、前記錯体を解離させるステップであって、前記銀塩を含む水層と、脂肪酸濃縮物を含む少なくとも１の溶液とが形成されるステップ；および
（ｅ）前記銀塩を含む前記水相から前記脂肪酸濃縮物を含む前記少なくとも１の溶液を分離するステップ；
を含む、脂肪酸油混合物から少なくとも１のω３脂肪酸を濃縮し、かつ脂肪酸油混合物の少なくとも１のω６脂肪酸濃度を低減し、前記脂肪酸濃縮物中のω６脂肪酸に対するω３脂肪酸の割合が４０を超える、方法。
【請求項２】
銀塩の濃度が水中１０重量％〜水中９０重量％の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記銀塩がＡｇＮＯ3およびＡｇＢＦ4から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１のω３脂肪酸が（全Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、（全Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１の前記脂肪酸濃縮物、前記少なくとも１の抽出物および前記少なくとも１の溶液中のＥＰＡ／ＤＨＡ重量比が０．１〜１０の範囲である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記脂肪酸濃縮物が少なくとも９０重量％のω３脂肪酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記脂肪酸油混合物に比べて、前記脂肪酸濃縮物中のω３脂肪酸のω６脂肪酸に対する比率を増加させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記脂肪酸濃縮物中のω６脂肪酸の総濃度が３重量％未満である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
脂肪酸油混合物の前記銀塩溶液に対する重量比が、０．４〜１．６の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）が、アルコールを前記水相に添加するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記置換液が有機溶媒を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記置換液により前記水相を抽出するステップが、少なくとも２回の連続抽出を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも３０℃の温度が、３０℃〜９０℃の範囲の温度である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記水相を水と組み合わせ、または前記水相を超臨界ＣＯ2で抽出し、または前記水相を水と組み合わせることと超臨界ＣＯ2による前記水相の抽出とを組み合わせて、前記錯体を解離させるステップを、少なくとも１回繰り返す、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂肪酸油混合物が動物油、植物油、微生物油、海藻油またはこれらの任意の組み合わせに由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂肪酸濃縮物が、前記脂肪酸油混合物に比べて減少した濃度の少なくとも１の環境汚染物質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂肪酸濃縮物が、前記脂肪酸油混合物に比べて減少した濃度のコレステロールを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１のω３脂肪酸がエチルエステル、遊離酸およびグリセリドから選択される形である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記脂肪酸濃縮物が、前記脂肪酸油混合物に比べて減少した濃度の、（全Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および（全Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）以外の少なくとも１のＣ20〜Ｃ22ω３脂肪酸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記脂肪酸濃縮物中の、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外のＣ20〜Ｃ22ω３脂肪酸の総濃度が３重量％未満である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｆ）少なくとも１の精製法によって前記脂肪酸濃縮物を精製するステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１の精製法が、短行路蒸留、分子蒸留、ヨードラクトン化による分離、超臨界流体抽出、酵素分画および分取クロマトグラフィーから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、少なくとも１回繰り返され、ここで、前記脂肪酸濃縮物、前記少なくとも１の抽出物および前記少なくとも１の溶液の少なくとも１が、その後のプロセスで前記脂肪酸油混合物を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも８０％の、（全Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、（全Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および（全Ｚ）−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）から選択される少なくとも１のω３脂肪酸を含む脂肪酸濃縮物を製造する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂肪酸濃縮物、前記少なくとも１の抽出物および前記少なくとも１の溶液の少なくとも１を、少なくとも１の分画法により処理する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１の分画法が、蒸留、抽出、ヨードラクトン化およびクロマトグラフィーから選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１の分画法が、少なくとも８０％の、Ｃ20〜Ｃ22ω３脂肪酸から選択される少なくとも１のω３脂肪酸を含む脂肪酸濃縮物を製造する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１のω３脂肪酸が、（全Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および（全Ｚ）−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）から選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記脂肪酸油混合物が、ダイオキシン、ＰＣＢ、ＤＤＴおよびＰＤＢＥから選択される少なくとも１の残留性有機汚染物質を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂肪酸油混合物中の前記少なくとも１の残留性有機汚染物質を、前記脂肪酸濃縮物中少なくとも９５％減少させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記脂肪酸油混合物がコレステロールを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記超臨界ＣＯ2が少なくとも１の極性修飾剤を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記脂肪酸油混合物および前記銀塩水溶液を、−２５℃〜９０℃の範囲の温度で組み合わせる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記脂肪酸油混合物および前記銀塩水溶液を組み合わせた後、前記水相を−２５℃〜９０℃の範囲の温度で前記有機相から分離する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１０年９月２４日出願の米国仮特許出願第６１／３８６０９６号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、一般に、銀塩水溶液、例えば、ＡｇＮＯ3水溶液を用いて、脂肪酸油混合物から多価不飽和脂肪酸、例えば、ω３脂肪酸を濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ω３脂肪酸は、医薬および／または栄養補助製品を含むいくつかの用途で有用である。例えば、ω３脂肪酸は、血漿脂質濃度、心血管および免疫機能、インスリン作用、ニューロン発達、ならびに視覚機能を調節することができる。ω３脂肪酸は、心血管疾患、例えば、高血圧および高トリグリセリド血症のリスクファクターならびに凝固第ＶＩＩ因子リン脂質複合体活性に対して、有用な効果を有し得る。ω３脂肪酸はまた、血清トリグリセリドを低下させ、血清ＨＤＬコレステロールを増加させ、収縮期および拡張期血圧ならびに／または脈拍数を低下させることができ、血液凝固第ＶＩＩ因子−リン脂質複合体の活性を低下させることができる。さらに、ω３脂肪酸は、一般的に、忍容性が良好であり、重度の副作用を起こすことがない。
【０００４】
一般に魚油とも呼ばれているマリンオイル（Ｍａｒｉｎｅ  ｏｉｌｓ）は、脂質代謝を調節することが分かっている、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含むω３脂肪酸の供給源である。植物性油、微生物油および海藻油（ａｌｇａｅ  ｏｉｌｓ）もω３脂肪酸の供給源である。ω３脂肪酸のいくつかの配合物が開発されている。例えば、ω３脂肪酸油混合物の一形態は、ＤＨＡおよびＥＰＡを含む魚油からの主なω３長鎖多価不飽和脂肪酸の濃縮物、例えば、商標Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）／Ｌｏｖａｚａ（商標）／Ｚｏｄｉｎ（登録商標）／Ｓｅａｃｏｒ（登録商標）で販売されているものである。例えば、米国特許第５５０２０７７号、第５６５６６６７号および第５６９８５９４号を参照されたい。特に、Ｌｏｖａｚａ（商標）の各１０００ｍｇカプセルは、少なくとも９０％のω３エチルエステル脂肪酸（８４％ＥＰＡ／ＤＨＡ）；およそ４６５ｍｇのＥＰＡエチルエステルおよびおよそ３７５ｍｇのＤＨＡエチルエステルを含む。
【０００５】
他のω３脂肪酸にも活性があるかもしれない。例えば、Ｋａｕｒ他（Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．（２０１１）第５０（１）巻、２８〜３４頁）は、特定の生物学的効果をｎ−３  ＤＰＡによるものとしている。ｎ−３  ＤＰＡがＥＰＡよりも１０倍高い内皮細胞遊走能力を有するという証拠が存在し、これは、創傷治癒プロセスで重要であり得る。さらに、報告によれば、ｎ−３  ＤＰＡは、血小板凝集の阻害においてＥＰＡおよびＤＨＡよりも効果的である。さらに、ｎ−３  ＤＰＡは、空間学習および長期増強の加齢性低下を弱めるのに役立ち得る。しかしながら、ｎ−３  ＤＰＡは、純粋な化合物の入手可能性が限られるために、広範囲な研究がなされていない。
【０００６】
ω３脂肪酸の供給源の多くは、ω６脂肪酸の供給源でもある。しかしながら、特定の生物学的過程では、ω３脂肪酸およびω６脂肪酸は逆の活性を示し得るので、低濃度のω６脂肪酸、すなわち、高いｎ−３／ｎ−６比が望ましい。欧州薬局方モノグラフ１２５０に従った市販の製品は、典型的には２４〜４０の範囲のｎ−３／ｎ−６比を有する。
【０００７】
ω３酸の濃縮物を調製する方法の概要は、Ｂｒｅｉｖｉｋ（Ｌｏｎｇ−Ｃｈａｉｎ  Ｏｍｅｇａ−３  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｏｉｌｓ、Ｔｈｅ  Ｏｉｌｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＰＪ  Ｂａｍｅｓ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｒｉｄｇｗａｔｅｒ  ＵＫ、１１１〜１４０頁、２００７）により示されている。マリンオイルの複雑な脂肪酸組成のために、１つの濃縮技術のみを使用してω３脂肪酸の高濃縮組成物を調製することは困難である。通常は、技術の組み合わせが使用され、最も一般的には、不飽和度による分離（例えば、酵素分離および／または尿素分画）と炭素鎖長による分離（例えば、分子／短行程蒸留および／または超臨界流体抽出）を組み合わせた技術が使用される。従来技術は、通常、出発油中の量に比べて低いω３脂肪酸収量の濃縮物を生じるという欠点を有する。これは、尿素分画および短行程蒸留のような低収率技術を組み合わせる場合に特に問題となり得る。
【０００８】
さらに、短行程蒸留および主に鎖長に基づいて脂肪酸エステルを分離する他の方法のような分離法は、典型的には同じ数の炭素原子を有するω３脂肪酸とω６脂肪酸、例えば、Ｃ２０：４ｎ−３とＣ２０：４ｎ−６、またはＣ２２：５ｎ−３とＣ２２：５ｎ−６は分離しない。脂肪酸誘導体が尿素と固体複合体を形成する傾向は、最初の二重結合から脂肪酸エステルのカルボニル基までの距離（Δ値として一般的に知られている）と共に増加するので、例えば、尿素分画は、同族体ω３脂肪酸よりもω６脂肪酸に関して高い濃縮係数をもたらし得る。ω６脂肪酸がΔ’のΔ値を有する場合、対応するω３脂肪酸は（Δ’＋３）のΔ値を有し、尿素との複合体形成度がより高い。この傾向は、大きい尿素相対量を利用するω３脂肪酸の高濃縮物で特に顕著である。
【０００９】
銀塩を使用して混合物から多価不飽和脂肪酸を単離する研究が行われている。例えば、Ｑｕｉｎｎ他（Ｐｅｒｒｙ他、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７１の１３３〜１６９頁）；Ｐｅｅｒ他（Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８６）第２１巻４６３〜４６９頁）；Ｓｕｚｕｋｉ他（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（１９９３）第３巻１９７〜２０４頁）；Ｔｅｒａｍｏｔｏ他（Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９９４）、第３３巻３４１〜３４５頁）；Ｔｅｒａｍｏｔｏ他（Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉ．、（１９９４）第９１巻、２０９〜２１３頁）；Ｋｕｂｏｔａ他（Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７）、第３２巻、１５２９〜１５４１頁）；Ｃｈｅｎ他（Ｊ．Ｊｉａｎｇｓｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（２０００）、第２１巻、１８〜２２頁）；Ｔａｏ他（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ．Ｍａｒｉｎｅ  Ｄｒｕｇｓ、（２００４）Ｎｏ．３、２８〜３０頁）；Ｈｕｏｎｇ（Ｊ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）、第４５巻、７５７〜７６２頁）；Ｌｉ他（Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）第４３巻、２０７２〜２０８９頁）；ＥＰ０４５４４３０Ｂ１；ＥＰ０５７６１９１Ａ２；Ｓｅｉｋｅ他（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（２００７）、第４０巻、１０７６〜１０８４頁）；およびＫａｍｉｏ他（Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、（２０１１）第５０（１１）巻、６９１５〜２４頁）を参照されたい。しかしながら、以前から知られている方法は、ω３脂肪酸を濃縮するための十分に選択的および／または効率的な方法を提供しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、脂肪酸油混合物からω３脂肪酸を濃縮するより効率的な方法が当技術分野で必要とされている。
【００１１】
前記一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも代表的および説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されている本発明を制限しないことを理解すべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、一般的に、（ａ）脂肪酸油混合物および銀塩（ＡｇＮＯ3またはＡｇＢＦ4など）水溶液を組み合わせて水相および有機相を形成するステップであって、水相中、銀塩水溶液が少なくとも１のω３脂肪酸と錯体とを形成するステップと、（ｂ）有機相から水相を分離するステップと、（ｃ）置換液により水相を抽出し、または水相の温度を少なくとも３０℃に上昇させ、または置換液による抽出と温度の上昇を組み合わせて、少なくとも１の抽出物を形成させるステップと、（ｄ）水相を水と組み合わせ、または水相を超臨界ＣＯ2で抽出し、または水相と水の組み合わせと超臨界ＣＯ2による水相の抽出とを組み合わせて、錯体を解離させるステップであって、水相は銀塩を含み、少なくとも１の溶液は脂肪酸濃縮物形を含むステップと、（ｅ）銀塩を含む水相から脂肪酸濃縮物を含む少なくとも１の溶液を分離するステップとを含む、脂肪酸油混合物から少なくとも１のω３脂肪酸を濃縮する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１に記載されているような、水相を７０℃に加熱することにより回収した脂肪酸濃縮物のガスクロマトグラムを示す図である。
【図２】実施例１に記載されているような、図１に示す濃縮物を除去した後に水相を水に希釈することにより得られた脂肪酸濃縮物のガスクロマトグラムを示す図である。
【図３】実施例２Ａの表４Ａに記載されているような、置換溶媒としてのヘキサンによる抽出により得られた分画のガスクロマトグラムを示す図である。
【図４】実施例３の表５に記載されているような濃縮物４のガスクロマトグラムを示す図である。
【図５】実施例２Ｂの表４Ｅに記載されているような、特定の選択された脂肪酸エステルのエチルエステルの相対濃度を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示の特定の態様を以下でさらに詳細に記載する。本出願で使用されるおよび本明細書で明らかにされる用語ならびに定義は、本開示内での意味を表すことを意図している。本明細書で言及されるおよび上に言及される特許ならびに科学文献は、これによって参照により組み込まれる。参照により組み込まれる用語および／または定義と矛盾する場合には、本明細書に提供される用語および定義が優先する。
【００１５】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の指示がない限り、複数対象を含む。
【００１６】
用語「およそ」および「約」は、言及した数または値とほぼ同じであることを意味する。本明細書で使用する場合、用語「およそ」および「約」は、一般に、指定の量、回数または値の±３０％を包含するものと理解すべきである。
【００１７】
用語「脂肪酸（複数可）」には、例えば、少なくとも１個のカルボン酸基を含む短鎖および長鎖の飽和および不飽和（例えば、一価不飽和および多価不飽和）炭化水素が含まれる。
【００１８】
用語「ω３脂肪酸（複数可）」には、天然および合成ω３脂肪酸、ならびにこれらの薬学的に許容されるエステル、遊離酸、トリグリセリド、誘導体、抱合体（例えば、各々がこれにより参照により組み込まれている、Ｚａｌｏｇａ他、米国特許出願公開第２００４／０２５４３５７号およびＨｏｒｒｏｂｉｎ他、米国特許第６２４５８１１号参照）、前駆体、塩および混合物が含まれる。ω３脂肪酸油の例としては、それだけに限らないが、ω３多価不飽和脂肪酸、例えば、α−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）、オクタデカテトラエン酸（すなわち、ステアリドン酸、ＳＴＡ、１８：４ｎ−３）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ、２０：３ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）、ヘニコサペンタエン酸（ＨＰＡ、２１：５ｎ−３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、イワシ酸、２２：５ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）；ω３脂肪酸とグリセリンのエステル、例えば、モノ−、ジ−およびトリグリセリド；ならびにω脂肪酸と第一級、第二級および／または第三級アルコールのエステル、例えば、脂肪酸メチルエステルおよび脂肪酸エチルエステルが挙げられる。
【００１９】
用語「ω６脂肪酸（複数可）」には、天然および合成ω６脂肪酸、ならびにその薬学的に許容されるエステル、遊離酸、トリグリセリド、誘導体、抱合体、前駆体、塩および混合物が含まれる。ω６脂肪酸油の例としては、それだけに限らないが、ω６多価不飽和長鎖脂肪酸、例えば、リノール酸（１８：２ｎ−６）、γ−リノール酸（１８：３ｎ−６）、エイコサジエン酸（２０：２ｎ−６）、ジホモ−γ−リノール酸（２０：３ｎ−６）、アラキドン酸（２０：４ｎ−６）、ドコサジエン酸（２２：２ｎ−６）、アドレン酸（２２：４ｎ−６）およびドコサペンタエン酸（すなわち、オズボンド酸、２２：５ｎ−６）；ならびにこれらのエステル、トリグリセリド、誘導体、抱合体、前駆体、塩および／または混合物が挙げられる。
【００２０】
本開示による多価不飽和脂肪酸（例えば、ω３脂肪酸および／またはω６脂肪酸）、これらのエステル、トリグリセリド、誘導体、抱合体、前駆体、塩および／または混合物は、濃縮および／または精製形で、ならびに／あるいは油、例えば、マリンオイル（例えば、魚油）、海藻油、微生物油および／または植物性油の成分として使用することができる。
【００２１】
脂肪酸油混合物
本開示による脂肪酸油混合物は、動物油（複数可）および／または非動物油（複数可）に由来し得る。本開示のいくつかの実施形態では、脂肪酸油混合物は、マリンオイル、単細胞油、海藻油、植物性油、微生物油およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１種の油に由来する。マリンオイルには、例えば、魚油、オキアミ油および魚に由来する脂質組成物が含まれる。植物性油には、例えば、アマニ油、キャノーラ油、からし油およびダイズ油が含まれる。単細胞／微生物油には、例えば、Ｍａｒｔｅｋ，Ｎｕｔｒｉｎｏｖａ，ａｎｄ  Ｎａｇａｓｅ＆Ｃｏ．の製品が含まれる。単細胞油は、通常、微生物細胞に由来しており、ヒト消費向けの油と定義される。例えば、ＷｙｎｎおよびＲａｔｌｅｄｇｅ、「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｉｌｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｔｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ｏｍｅｇａ−３  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ」、４３〜７６頁、Ｂｒｅｉｖｉｋ（編）、Ｌｏｎｇ−Ｃｈａｉｎ  Ｏｍｅｇａ−３  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｏｉｌｓ、Ｔｈｅ  Ｏｉｌｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｎｅｓ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ  ＵＫ、２００７を参照されたい。
【００２２】
別の油には、長鎖トリグリセリドとして一般的に知られているトリグリセリド植物油、例えば、ヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、オリーブ油、ラッカセイ油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油、水素化ダイズ油および水素化植物油；中鎖トリグリセリド、例えば、ヤシ油またはパーム核油に由来するもの、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドが含まれる。混合グリセリドのほかに、プロピレングリコールのエステル、例えば、プロピレングリコールのカプリル／カプリン酸の混合ジエステル、プロピレングリコールの飽和ヤシおよびパーム核油由来カプリル、リノール、コハクまたはカプリン脂肪酸のエステルなどの他の油が存在する。
【００２３】
脂肪酸油混合物の脂肪酸を、アルキルエステル、例えば、エチルエステルにエステル化することができる。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、モノ−、ジ−およびトリグリセリドから選択されるようなグリセリド形である。他の実施形態では、脂肪酸は遊離酸形である。
【００２４】
脂肪酸油混合物の不飽和脂肪酸は、シスおよび／またはトランス配置であり得る。全シス配置のω３脂肪酸の例としては、それだけに限らないが、（全Ｚ）−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸（ＡＬＡ）、（全Ｚ）−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（ＳＴＡ）、（全Ｚ）−１１，１４，１７−エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、（全Ｚ）−８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、（全Ｚ）−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、（全Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、（全Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および（全Ｚ）−６，９，１２，１５，１８−ヘニコサペンタエン酸（ＨＰＡ）が挙げられる。全シス配置のω６脂肪酸の例としては、それだけに限らないが、（全Ｚ）−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（オズボンド酸）、（全Ｚ）−９，１２−オクタデカジエン酸（リノール酸）、（全Ｚ）−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（ＡＡ）および（全Ｚ）−６，９，１２−オクタデカトリエン酸（ＧＬＡ）が挙げられる。シス配置の一価不飽和脂肪酸の例としては、それだけに限らないが、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）、（Ｚ）−９−オクタデセン酸（オレイン酸）、（Ｚ）−１１−オクタデセン酸（バクセン酸）、（Ｚ）−９−エイコセン酸（ガドレイン酸）、（Ｚ）−１１−エイコセン酸（ゴンド酸）、（Ｚ）−１１−エイコエセン酸（ｅｉｃｏｅｓｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、（Ｚ）−１１−ドコセン酸（セトレイン酸）、（Ｚ）−１３−ドコセン酸（エルカ酸）および（Ｒ−（Ｚ））−１２−ヒドロキシ−９−オクタデセン酸（リシノール酸）が挙げられる。
【００２５】
本開示による脂肪酸油混合物の例としては、それだけに限らないが、欧州薬局方Ｏｍｅｇａ−３  Ａｃｉｄ  Ｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒｓ  ６０、欧州薬局方Ｆｉｓｈ  Ｏｉｌ  Ｒｉｃｈ  ｉｎ  Ｏｍｅｇａ−３  Ａｃｉｄｓモノグラフ、ＵＳＰ  Ｆｉｓｈ  Ｏｉｌモノグラフ、欧州薬局方Ｏｍｅｇａ−３  Ａｃｉｄ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ、欧州薬局方Ｏｍｅｇａ−３−Ａｃｉｄ  Ｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒｓ  ９０およびＵＳＰ  Ｏｍｅｇａ−３−Ａｃｉｄ  Ｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒｓモノグラフに定義されている脂肪酸が挙げられる。
【００２６】
異なる脂肪酸を含む脂肪酸油混合物の市販の例としては、それだけに限らないが、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）ω３マリンオイル濃縮物、例えば、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）ＴＧ７０１０  ＳＲ、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）Ｅ７０１０  ＳＲ、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）ＴＧ６０１５、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）ＥＰＡ５００ＴＧ  ＳＲ、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）Ｅ４００２００  ＳＲ、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）Ｅ４０１０、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）ＤＨＡ７００ＴＧ  ＳＲ、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）ＤＨＡ７００Ｅ  ＳＲ、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）ＤＨＡ５００ＴＧ  ＳＲ、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）ＴＧ３３２２  ＳＲ、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）Ｅ３３２２  ＳＲ、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）ＴＧ３３２２、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）Ｅ３３２２、Ｉｎｃｒｏｍｅｇａ（商標）Ｔｒｉｏ  ＴＧ／ＥＥ（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＬＣ、Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）；ＥＰＡＸ６０００ＦＡ、ＥＰＡＸ５０００ＴＧ、ＥＰＡＸ４５１０ＴＧ、ＥＰＡＸ２０５０ＴＧ、ＥＰＡＸ５５００ＥＥ、ＥＰＡＸ５５００ＴＧ、ＥＰＡＸ５０００ＥＥ、ＥＰＡＸ５０００ＴＧ、ＥＰＡＸ６０００ＥＥ、ＥＰＡＸ６０００ＴＧ、ＥＰＡＸ６５００ＥＥ、ＥＰＡＸ６５００ＴＧ、ＥＰＡＸ１０５０ＴＧ、ＥＰＡＸ２０５０ＴＧ、ＥＰＡＸ６０１５ＴＧ／ＥＥ、ＥＰＡＸ４０２０ＴＧおよびＥＰＡＸ４０２０ＥＥ（ＥＰＡＸはＴｒｙｇｇ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＳの全額出資子会社である）；Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）／Ｌｏｖａｚａ（商標）／Ｚｏｄｉｎ（登録商標）／Ｓｅａｃｏｒ（登録商標）最終医薬製品、Ｋ８５ＥＥ、ＡＧＰ１０３、Ｋ３０ＥＥ、Ｋ５０ＥＥおよびＫ７０ＥＥ（Ｐｒｏｎｏｖａ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ  Ｎｏｒｇｅ  ＡＳ）；ＭＥＧ−３（登録商標）ＥＰＡ／ＤＨＡ魚油濃縮物（Ｏｃｅａｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｃａｎａｄａ）；ＤＨＡ  ＦＮＯ「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｏｉｌ」およびＤＨＡ  ＣＬ「Ｃｌｅａｒ  Ｌｉｑｕｉｄ」（Ｌｏｎｚａ）；Ｓｕｐｅｒｂａ（商標）Ｋｒｉｌｌ  Ｏｉｌ（Ａｋｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｉｎｅ）；Ｍａｒｔｅｋ製のＤＨＡを含むω３製品；Ｎｅｐｔｕｎｅオキアミ油（Ｎｅｐｔｕｎｅ）；Ｍｏｌｌｅｒｓ製のタラ肝油製品および抗還流魚油濃縮物（ＴＧ）；Ｌｙｓｉ  Ｏｍｅｇａ−３  Ｆｉｓｈ  ｏｉｌ；Ｓｅｖｅｎ  Ｓｅａｓ  Ｔｒｉｏｍｅｇａ（登録商標）Ｃｏｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｏｉｌ  Ｂｌｅｎｄ（Ｓｅｖｅｎ  Ｓｅａｓ）；Ｆｒｉ  Ｆｌｙｔ  Ｏｍｅｇａ−３（Ｖｅｓｔｅｒａｌｅｎｓ）；ならびにＥｐａｄｅｌ（Ｍｏｃｈｉｄａ）が挙げられる。これらの市販の実施形態は、種々のω３脂肪酸、組み合わせ、ならびに種々の供給源、例えば、海の、海藻、微生物（単細胞）および／または植物性供給源からω３脂肪酸（複数可）を得るためのエステル交換法または調製方法の結果としての他の成分を提供する。
【００２７】
本開示のいくつかの実施形態では、脂肪酸油混合物は、少なくとも１のω３脂肪酸、例えば、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡを含む。少なくとも１の実施形態では、脂肪酸油混合物はＥＰＡおよびＤＨＡを含む。脂肪酸油混合物は、少なくとも１の他の脂肪酸、例えば、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）をさらに含んでもよい。このようなＰＵＦＡの例としては、それだけに限らないが、他のω脂肪酸、例えば、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外のＣ20〜Ｃ22ω３脂肪酸、およびω６脂肪酸が挙げられる。
【００２８】
本開示のいくつかの実施形態では、本方法は、Ｃ２２：５ｎ−３（ｎ−３  ＤＰＡ）の濃縮物を製造する。
【００２９】
ω３脂肪酸（複数可）を濃縮する方法
本開示のいくつかの実施形態は、脂肪酸油混合物から少なくとも１のω３脂肪酸を濃縮する方法に関する。
【００３０】
一実施形態によると、本方法は、脂肪酸油混合物を銀塩水溶液、例えば、硝酸銀（ＡｇＮＯ3）溶液と組み合わせるステップを含む。本議論はＡｇＮＯ3に焦点を当てているが、当業者は、テトラフルオロホウ酸銀（ＡｇＢＦ4）などの他の適当な銀塩を使用することができることを認識するだろう。銀イオンは、脂肪酸油混合物中の多価不飽和脂肪酸、例えば、ω３脂肪酸、例えば、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡと錯体を形成することができる。こうして形成した銀錯体（複数可）は、水相中に残り得る一方で、脂肪酸油混合物中に存在する他の脂肪酸（例えば、飽和脂肪酸、短鎖脂肪酸、一価不飽和脂肪酸および／または他の不飽和脂肪酸、例えば、複合ＰＵＦＡより少ない二重結合を有する脂肪酸）は未溶解脂肪酸として有機相中に残り得る。
【００３１】
銀塩溶液、例えば、ＡｇＮＯ3溶液の濃度は、約１０重量％〜約９０重量％、例えば、約６０重量％〜約８０重量％に及び得る。いくつかの実施形態では、例えば、ＡｇＮＯ3水溶液の濃度は、約６０重量％、約７０重量％、約７５重量％または約８０重量％である。いくつかの実施形態では、脂肪酸油混合物のＡｇＮＯ3（固体）に対する重量比は、少なくとも０．４である。例えば、いくつかの実施形態では、脂肪酸油混合物のＡｇＮＯ3に対する重量比は約０．４〜約１．６の範囲である。脂肪酸油混合物およびＡｇＮＯ3溶液は、室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）で、または冷却により室温より低い温度、例えば、約−２５℃〜約２０℃で、または室温より高い温度、例えば、約２５℃〜約９０℃で組み合わせることができる。
【００３２】
脂肪酸油混合物と混合する前および／または後に、少なくとも１の有機溶媒、例えば、極性有機溶媒をＡｇＮＯ3溶液に添加することができる。適当な有機溶媒の例としては、それだけに限らないが、アルコール、例えば、エタノールおよびメタノールが挙げられる。極性有機溶媒の添加は、例えば、脂肪酸の脂肪酸油混合物からＡｇＮＯ3水溶液への溶解性を高めることができる。
【００３３】
脂肪酸油混合物およびＡｇＮＯ3溶液は、一般的に、数分から数時間程度、例えば、約１５分〜約２時間混合され、有機相および水相、例えば、油−水エマルジョンが得られる。当業者は、必要とされる混合時間が関係する体積および混合の効率に依存することを理解するだろう。例えば、マイクロリアクターにより調製されるスラグ流では、硝酸銀水溶液でＤＨＡエチルエステルおよびＥＰＡエチルエステルを抽出する場合、平衡に達するのに２０秒未満しか必要とされない（Ｓｅｉｋｅ他（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ、第４０巻、１０７６〜１０８４頁）。あまり効率的でない混合により一緒にされる大体積については、脂肪酸と銀イオン水溶液の伝達および錯化は、平衡に達するのに実質的により長い時間、例えば、２時間以上かかるだろう。
【００３４】
沈殿により、有機相および水相を当技術分野で既知の方法にしたがって分離することができる。相分離は、例えば、混合物を、遠心分離、膜技術または他の適当な手段により２つの実質的に透明な相を得るのに十分な時間放置することにより起こる。
【００３５】
有機相を除去した後、水相を置換液、例えば、有機溶媒で抽出して、少なくとも１の抽出物を形成させることができる。置換液は、例えば、特定の脂肪酸、例えば、ω６脂肪酸ならびに／あるいはＥＰＡおよびＤＨＡ以外のω３脂肪酸を優先的に除去することにより選択性の強化を提供することができる。理論に拘束されることなく、置換液は、脂肪酸の水相への相対溶解度に影響を及ぼすことにより、および／または銀錯体との相互作用を通して選択性を提供することができる。いくつかの例では、置換液は、銀イオンと錯体を形成しないように、または濃縮すべきω３脂肪酸よりも弱い銀イオンとの錯体を形成するように選択することができる。適当な置換液の例としては、それだけに限らないが、アルカン、アルケン、シクロアルカン、シクロアルケン、ジエン、アロメート（ａｒｏｍａｔｅ）およびハロゲン化溶媒が挙げられる。特定の例、例えば、ジクロロメタン、および１個もしくは複数の塩素原子を含む他の溶媒、および／または１もしくは複数の他のハロゲン化物、ヘキサン、ヘキセン、へプタン、ヘプテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、１，７−オクタジエン、１，５−シクロオクタジエン、ならびに１個もしくは複数の二重結合を含む他のアルケン、例えば、１個、２個もしくは３個の二重結合を含むアルケン、および酸素および窒素含有溶媒、例えば、ケトンおよびアミド／アミンに非限定的な言及をすることができる。水相は、２回以上、すなわち、少なくとも２回の連続抽出で抽出することができる。各抽出のための置換液の量は、水性銀イオン相に溶解している脂肪酸油混合物の量の約０．１〜約５重量倍に及び得る。
【００３６】
１種または複数の特定のω３脂肪酸を濃縮する際に所望の選択性にしたがって、異なる置換液および／または置換液の組み合わせを使用してもよい。
【００３７】
水相および有機相を、分離する前に加熱してもよい。このような場合、適当な温度を決定する際に有機相の沸点を考慮することができる。一般的に言えば、水相／有機相混合物を約３０℃〜約９０℃の範囲である温度に加熱することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、有機相を除去した後に水相を加熱して少なくとも１の抽出物を形成させる。例えば、水相を少なくとも３０℃、例えば、約３０℃〜約９０℃の範囲である温度に加熱することができる。このような場合、加熱により、水相からのω６脂肪酸および／または特定のω３脂肪酸、例えば、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外のＣ20〜Ｃ22ω３脂肪酸が濃縮した脂肪酸油混合物の遊離がもたらされ得る。加熱は、多価不飽和脂肪酸の酸化、異性化および／または分解を避けるために酸素の非存在下および十分に穏やかな条件で慎重に行うべきである。
【００３９】
さらに本方法によると、ＡｇＮＯ3錯体（複数可）を解離させて、それによって脂肪酸濃縮物、すなわち、少なくとも１のω３脂肪酸が濃縮した脂肪酸油混合物を遊離させるために、水相を水で希釈することができる。いくつかの実施形態では、水相を２回以上、すなわち、少なくとも２回の連続的希釈で希釈する。希釈に使用する水の量は、使用する固体硝酸銀（ＡｇＮＯ3（固体））の重量の約１〜約２０倍に及び得る。正確な量は、銀イオン濃度および脂肪酸油混合物の性質を含むいくつかの因子に依存する。その後、脂肪酸濃縮物を水相から分離して少なくとも１の溶液を形成することができる。いくつかの実施形態では、銀イオンをその後のプロセスに再利用するために回収することができる。例えば、銀イオンを再生（例えば、電気分解を介した再生を含む）、濾過、遠心分離および／または精製により再利用のために回収することができる。
【００４０】
さらに本方法によると、Ａｇ+錯体（複数可）を解離させて、それによって脂肪酸濃縮物の全部または一部分を遊離させるために、水相を超臨界圧力下二酸化炭素（ＣＯ2）で抽出することができる。二酸化炭素は、少なくとも１の極性修飾剤（ｐｏｌａｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、例えば、水またはアルコール、例えば、エタノールを含んでよい。二酸化炭素による抽出の利点には、錯体を破壊するための大量の水の必要性の排除が含まれ得る。ＣＯ2は、圧力を解除することによりエチルエステルから容易に除去される。ＣＯ2は無毒であり、活性Ａｇ+を不活性Ａｇ2Ｏの形成から保護するために必要とされる不活性雰囲気を提供することができる。
【００４１】
本開示による方法は、脂肪酸油混合物中の少なくとも１のω６脂肪酸の濃度を減少させながら、少なくとも１のω３脂肪酸を濃縮することができる。本方法は、例えば、脂肪酸油混合物に対して、脂肪酸濃縮物中のω３脂肪酸のω６脂肪酸に対する比率を増加させることができる。いくつかの実施形態では、脂肪酸濃縮物混合物中のω３脂肪酸のω６脂肪酸に対する比率（ｎ−３／ｎ−６）は、約４０より大きい、例えば、約８０より大きい、約１００より大きい、約１５０より大きい、または約２００より大きい。いくつかの実施形態では、脂肪酸濃縮物中のω６脂肪酸の総濃度は約３重量％未満、例えば、約２重量％未満または約１重量％未満であり得る。
【００４２】
現在開示している方法はまた、他のω３脂肪酸の濃度を減少させながら、１種または複数のω３脂肪酸を濃縮することができる。いくつかの実施形態では、例えば、本方法は、ＥＰＡおよびＤＮＡ以外のＣ20〜Ｃ22ω３脂肪酸の濃度を減少させながら、ＥＰＡおよびＤＮＡを濃縮する。いくつかの実施形態では、脂肪酸濃縮物中のＥＰＡおよびＤＮＡ以外のＣ20〜Ｃ22ω３脂肪酸の総濃度は、３重量％未満、例えば、２．５重量％未満、例えば、０．５重量％未満である。
【００４３】
現在開示している方法はさらに、他のω３脂肪酸よりも１のω３脂肪酸をいくぶん濃縮することにより、脂肪酸油混合物中のＥＰＡ／ＤＨＡ比を調節する。例えば、ＥＰＡ／ＤＨＡ比は、温度、置換液および／または水希釈比を変化させることにより、ならびに極性修飾剤、例えば、水もしくはアルコール、例えば、エタノールを含むまたは含まないＣＯ2により抽出することにより、調節することができる。いくつかの実施形態では、脂肪酸濃縮物、少なくとも１の抽出物および少なくとも１の溶液のうち、少なくとも１におけるＥＰＡ／ＤＨＡ重量比は、約０．１〜約１０の範囲である。
【００４４】
脂肪酸濃縮物、少なくとも１の抽出物および／または少なくとも１の溶液は、少なくとも１の精製法を使用することにより精製することができる。精製法は、例えば、残留銀化合物、残留置換液、短鎖脂肪酸（例えば、脂肪酸１６：４ｎ−１）、銀イオンとの錯化により濃縮された低分子量化合物、環境汚染物質、コレステロールおよび／またはビタミンを除去することができる。このような精製法には、それだけに限らないが、短行路蒸留、分子蒸留、超臨界流体抽出、酵素分離法、ヨードラクトン化分画および分取クロマトグラフィーが含まれる。
【００４５】
現在開示している方法を繰り返して、少なくとも１のω３脂肪酸をさらに濃縮するおよび／または１もしくは複数の他のω３脂肪酸を濃縮することができる。本方法を使用して少なくとも１のω６脂肪酸を濃縮することもできる。例えば、脂肪酸濃縮物、少なくとも１の抽出物および／または少なくとも１の溶液は、上記のように１または複数のその後のプロセスで脂肪酸油混合物を含み得る。本開示による１または複数の濃縮法から得られる脂肪酸濃縮物は、少なくとも８０％の少なくとも１のω３脂肪酸、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の少なくとも１のω３脂肪酸を含み得る。
【００４６】
現在開示している方法から得られる脂肪酸濃縮物、少なくとも１の抽出物および／または少なくとも１の溶液はまた、少なくとも１の従来の分画法、例えば、短行路蒸留、分子蒸留、ヨードラクトン化分画、酵素分画法、抽出および／またはクロマトグラフィーにより処理することができる。こうして得られる脂肪酸濃縮物は、少なくとも８０％の少なくとも１のω３脂肪酸、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはさらには少なくとも９８％の少なくとも１のω３脂肪酸を含み得る。一実施形態では、例えば、少なくとも１の分画法は、少なくとも９０％の（全Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、例えば、少なくとも９５％のＤＨＡまたは例えば、少なくとも９８％のＤＨＡを含む脂肪酸濃縮物を製造する。別の実施形態では、少なくとも１の分画法は、少なくとも８０％の（全Ｚ）−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、例えば、少なくとも９０％のＤＰＡ、例えば、少なくとも９５％のＤＰＡまたは例えば、少なくとも９８％のＤＰＡを含む脂肪酸濃縮物を製造する。当業者は、少なくとも１の従来の分画法により本開示にしたがって得られる濃縮物を処理することにより、例えば、欧州薬局方モノグラフ１２５０、Ｏｍｅｇａ−３−Ａｃｉｄ  Ｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒｓ  ９０モノグラフおよび／またはＵＳＰ  Ｏｍｅｇａ−３−Ａｃｉｄ  Ｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒｓモノグラフに従う組成物を製造することができることを認識するだろう。
【００４７】
現在開示している方法は、脂肪酸油混合物中の少なくとも１の環境汚染物質の濃度を減少させ、脂肪酸油濃縮物、少なくとも１の抽出物および／または少なくとも１の溶液が脂肪酸油混合物よりも低濃度の少なくとも１の環境汚染物質を含むようにすることができる。環境汚染物質には、それだけに限らないが、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）化合物、ポリクロロジベンゾジオキシン（ＰＣＤＤ）化合物、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）化合物、臭素化難燃剤、例えば、ポリ臭化ジフェニルエーテル（ＰＢＤＥ）、テトラブロモビスフェノールＡ（ＴＢＢＰ−Ａ）およびヘキサブロモシクロドデカン（ＨＢＣＤ）ならびに殺虫剤、例えば、ＤＤＴ（２，２−ビス−（ｐ−クロロフェニル）−１，１，１−トリクロロエタン）およびＤＤＴの代謝産物が含まれる。現在開示している方法はまた、脂肪酸油混合物中の総コレステロール（すなわち、遊離および／または結合コレステロール）の濃度を減少させ、脂肪酸濃縮物が脂肪酸油混合物よりも低濃度の総コレステロールを含むようにすることができる。本開示のいくつかの実施形態では、脂肪酸油混合物は、ＡｇＮＯ3水溶液と組み合わせる前に、少なくとも１の除去処理ステップ、例えば、蒸留で除去され、除去処理ステップは、脂肪酸油混合物中の少なくとも１の環境汚染物質および／または総コレステロールの量を減少させる。
【００４８】
以下の実施例は、本質的に限定することなく、本開示を説明することを意図したものである。当業者は、本明細書に提供する開示と調和した追加の実施形態を想起するだろうと理解される。以下の表に示す組成値は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）面積百分率に基づく。当業者は、ＧＣ面積百分率がＧＣ質量百分率とは異なる、例えばＧＣ面積百分率は対応するＧＣ質量百分率よりも高くなり得ることを理解するだろう。ＧＣ質量百分率を分析する手順は、欧州薬局方モノグラフ２．４．２９、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｏｉｌｓ  Ｒｉｃｈ  ｉｎ  Ｏｍｅｇａ−３−Ａｃｉｄｓに提供されている。
【実施例】
【００４９】
実施例１：  温度
相分離前
Ｋ５０ＥＥを７０重量％のＡｇＮＯ3溶液（Ｋ５０ＥＥ：ＡｇＮＯ3＝３：５）と約１．５時間混合し、所望の温度（表１参照、すなわち、８℃、２１℃、５０℃、６０℃または７０℃）とした。油／水混合物を約２時間放置して水相および有機相に分離し、有機相を除去した。水相を水に希釈し（水：ＡｇＮＯ3（固体）＝重量で約７．５：１）、有機物質、すなわち、脂肪酸濃縮物を遊離させた。濃縮物を回収し、その組成を表１に示すようにＧＣ分析（ＧＣ面積％）により決定した。結果は、より高温がｎ−６脂肪酸および／または特定のｎ−３脂肪酸（例えば、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外の長鎖（ＬＣ）脂肪酸）の相対濃度を減少させたことを示している。
【００５０】
【表１】
0005946833.tif 000002
【００５１】
相分離後
Ｋ３０ＥＥを室温で７０重量％のＡｇＮＯ3溶液（Ｋ３０ＥＥ：ＡｇＮＯ3＝１．２：１）と撹拌し、水相および有機相に分離させた。有機相を除去した。次いで、水相を７０℃に加熱し、この実施例と同じ手順を使用したが加熱はしないで調製した濃縮物（「自然放熱濃縮物（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ａｍｂｉｅｎｔ）と比較してｎ−６脂肪酸および特定のｎ−３脂肪酸が濃縮した脂肪酸濃縮物（「濃縮物−１」）を遊離させた。水相を水に希釈し（水：ＡｇＮＯ3（固体）＝重量で約７．５：１）、第１の濃縮物と比較して、ｎ−３／ｎ−６比が増加し、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外のｎ−３脂肪酸の濃度が低い第２の濃縮物（「濃縮物−２」）を得た。表２を参照されたい。
【００５２】
【表２】
0005946833.tif 000003
【００５３】
図１および図２は、それぞれ、濃縮物−１および濃縮物−２についてのガスクロマトグラフを示している。図１および図２の比較は、現在開示している方法が、脂肪酸化合物を選択的に除去して、出発混合物と比較して特定の脂肪酸の量が低い濃縮物（例えば、図２）を与えることを示している。
【００５４】
水相の高い塩濃度は、上記と同様の分離法を０℃よりずっと低い温度で行うことができるよう融点を下げる。おそらく、水相中の多価不飽和脂肪酸／脂肪酸誘導体の含量も融点のさらなる低下をもたらすだろう。本明細書に開示する方法により行うと、例えば、水相のいかなる凝固または部分的凝固も起こることなく、−２０℃で７０％硝酸銀水溶液を用いて実験が行われた。おそらく、温度をさらに低下させることができるだろう。当業者は、このような温度の低下が上に論じた温度調節法の技術的価値を増加させ得ることを理解するだろう。
【００５５】
低温はＥＰＡおよびＤＨＡエチルエステルの取り込みを促進することが当技術分野で認識されている（Ｓｅｉｋｅ他（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ、第４０巻、１０７６〜１０８４頁）。しかしながら、温度調節を利用して、表２により説明されるように脂肪酸を分離すること、例えば、ｎ３／ｎ６比を変えること、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外の脂肪酸（例えば、２２：５ｎ−３）を単離するための出発物質として適した中間体を作ること、ならびにより少量の他の長鎖ω３脂肪酸を含むＥＰＡおよびＤＨＡの濃縮物を作ることができることは当技術分野で認識されていない。
【００５６】
実施例２Ａ：  置換液による抽出
Ｋ３０ＥＥを周囲温度で７０重量％のＡｇＮＯ3溶液（Ｋ３０ＥＥ：ＡｇＮＯ3（固体）＝１．２：１）と撹拌した。混合物を沈殿させ、有機相を除去した。水相を１−ヘキセン（ヘキセン：ＡｇＮＯ3（固体）＝重量で約０．５４：１）で抽出し、次いで、水（水：ＡｇＮＯ3（固体）＝重量で約７．５：１）に希釈した。希釈により遊離した脂肪酸濃縮物を回収し、ＧＣにより分析した。表３を参照されたい。
【００５７】
【表３】
0005946833.tif 000004
【００５８】
表４Ａは、異なる置換液：有機溶媒ヘキサン、１−ヘキセンおよびシクロヘキセンの比較を示している。３種の溶媒全てについて以下の手順に従った。ＡｇＮＯ3およそ３０．２ｇを水１２．９ｇに溶解して７０重量％のＡｇＮＯ3溶液を調製した。溶液を７０℃でＫ３０ＥＥおよそ２４．１ｇと撹拌した。７０℃で相分離を起こさせ、有機相（約１７．１ｇ〜１７．７ｇ）を除去した。次いで、水相を４倍容の溶媒（それぞれ、４×１５．８ｍｌヘキサン、４×１６．１ｍｌヘキセン、４×１９．５ｍｌシクロヘキセン）で抽出した。４種の抽出物の組み合わせが、表４Ａに示す各溶媒についての「抽出物」を表す。残っている水相を水２２５ｍｌで希釈し、室温で暗所中、一晩放置した。水相から回収した脂肪酸濃縮物を分離し、これは表４Ａに示す各溶媒についての「濃縮物」を表す。組成をＧＣ面積％で報告する。
【００５９】
ヘキサンにより製造した抽出物のＧＣクロマトグラムを図３に示す。例えば、表４Ａに示すＧＣ面積から分かるように、ヘキサンにより製造した抽出物については、ＤＰＡｎ−３／ＤＨＡ比は約３．３：１であり、ＤＰＡｎ−３／ＤＰＡｎ−６比は約３．０：１である。ここで、いわゆる「ヨードラクトン化反応」（Ｂｒｅｉｖｉｋ  ２００７参照）を使用して多価不飽和脂肪酸を分離することができる。適当な量の試薬を添加することにより、ＤＨＡおよびＤＰＡｎ−６のより安定な五員環ヨード−γ−ラクトンが形成する一方で、ＤＰＡｎ−３は実質的に影響されないままであるだろう。ＤＨＡおよびＤＰＡｎ−６のヨードラクトンを未反応脂肪酸から除去することができる。図３と類似の脂肪酸組成物では、ヨードラクトン化反応を利用して２２個の炭素原子の鎖長を有する唯一の脂肪酸としてＤＰＡｎ−３（２２：５ｎ−３）を実質的に含む脂肪酸組成物を製造することができる。当業者は、このような生成物が純粋なＤＰＡｎ−３の製造に比類なく適していることを理解するだろう。
【００６０】
【表４】
0005946833.tif 000005
【００６１】
表４Ａが示すように、３種の濃縮物全てが９４％超のｎ−３脂肪酸を含んでいたが、異なるｎ−３およびｎ−６脂肪酸の相対濃度は有意に異なっていた。ヘキサンはｎ−６脂肪酸の相対的除去ならびに最終生成物中のＥＰＡまたはＤＨＡの実質的な損失がない（約１５％の損失）ＤＨＡ以外のｎ−３脂肪酸の除去において最も効率的な溶媒であった。ＤＰＡ（ｎ−３）：ＤＨＡ＝３．３：１という高い比は、ヘキサン抽出物がＤＰＡ（ｎ−３）の精製に適していることを示唆している。同様に、（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）：（他のＬＣ  ｎ−３）比についての１．７という低い値は、ヘキサン抽出物が他のＬＣω３脂肪酸の相対含量が高い濃縮物の製造に適していることを示している。ヘキセン抽出物は、およそ１：１のＤＰＡ（ｎ−３）：ＤＨＡ比を有し、ヘキサン抽出物よりも高い総濃度のｎ−３脂肪酸を含んでいた。ヘキセン抽出物はまた、このような濃縮物および個々の純粋な脂肪酸エステルを製造するための適当な原材料となり得る。シクロヘキセンは、他の溶媒よりもｎ−６脂肪酸が低く（ｎ−６脂肪酸は実質的に非存在であった）、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外のｎ−３脂肪酸が低い濃縮物を与えたが、最終生成物におけるＥＰＡおよびＤＨＡの収率も低かった（約６８％の損失）。濃縮物中のＥＰＡ＋ＤＨＡの和は約９１．０％であったが、他のＣ20〜Ｃ22  ｎ−３脂肪酸（「他のＬＣ  ｎ−３」）の和はわずか２．７％であった。
【００６２】
表３および表４Ａの結果は、温度を変化させること、ならびに異なる相対量の出発脂肪酸混合物および溶媒を使用することが、得られる濃縮物の組成に影響を及ぼすことを示している。例えば、表３に示す結果は、表４Ａのものと同じ体積のＫ３０ＥＥおよび１−ヘキセンを使用したが、わずか２／３体積の７０重量％のＡｇＮＯ3溶液を用いて得られた。使用する温度も異なっていた（室温対７０℃）。
【００６３】
１，７−オクタジエンでも研究を行った；しかしながら、この溶媒はかなりの発熱反応をもたらした。発熱反応は、シクロオクタジエンおよび他のジエン／ポリエンの銀イオンに対する高い親和性を示し、この高い親和性は、十分な安全対策を適用するなら、これらの化合物を置換液として有用にすることができるだろう。実施例２Ｂの表４Ｂも参照されたい。
【００６４】
実施例２Ｂ：  置換液の使用に関する追加の実施例
表４Ｂに列挙する有機溶媒でいくつかの実験を行った。各実験について、以下のおおよその量の試薬およびエチルエステル出発物質を使用した：硝酸銀６０ｇ、水に溶解して７０％の濃度を得た（水２５．７ｇ）、およびＫ３０ＥＥエチルエステル（バッチ２１０１０７１）４８ｇ。正確な量、ならびに回収した抽出物の量を表４Ｃに示す。
【００６５】
室温で１．５時間、マグネチックスターラーにより撹拌した後、硝酸銀水溶液およびＫ３０ＥＥの各混合物を分液漏斗に移し、相分離が起こるまで暗所に放置した。上部有機層（「非溶解エステル」）を除去した。分析用の試料を一連の実験の第１の実験のために回収した。
【００６６】
一連の実験の第１の実験を除いては、水相を３部の溶媒で抽出した。各部はおよそ０．３６ｍｏｌの溶媒を含んでいた。エチルエステル約２０ｇが非溶解エステルの除去後に水相中に残っていたと推定される。エチルエステルの平均分子量が３３０ｇ／ｍｏｌであると仮定すると、エチルエステル２０ｇは０．０６ｍｏｌに相当する。これは、水相に元々溶解しているエチルエステルと比較して推定６倍モル過剰の溶媒で各抽出が行われたことを意味する。表４Ｂを参照されたい。
【００６７】
抽出が完了した後、水６００ｍｌを水相に添加し、激しく撹拌した後、混合物を暗所で一晩放置して新たな相分離を完了した。
【００６８】
溶媒を含む全抽出物を、ロータリーエバポレーターを使用して真空下で蒸発させた。抽出物を秤量した後、試料を分析のためにとった。
【００６９】
選択された脂肪酸エチルエステルからの分析結果を表４Ｃに示す。
【００７０】
【表５】
0005946833.tif 000006
【００７１】
【表６】
0005946833.tif 000007
【００７２】
【表７】
0005946833.tif 000008
【００７３】
【表８】
0005946833.tif 000009
【００７４】
表４Ｄから分かるように、種々の溶媒は、異なる方法で置換液として作用した。以下の議論は、種々の脂肪酸エチルエステル（またはエチルエステルの組み合わせ）の濃縮物のための原材料の製造のためにこれらの溶媒を使用するために存在する多くの異なる可能性のいくつかにのみ焦点を当てている。当業者は、これらの結果が、いくつかのさらなる脂肪酸エチルエステルまたは脂肪酸エチルエステルの組み合わせのための原材料を作る可能性を示したことを理解するだろう。
【００７５】
ヘキサンはＤＨＡに比べてＤＰＡ（２２：５ｎ−３）に富む分画の製造を可能にする有用な特性を有することが分かり、したがって、ＤＨＡの濃縮物の製造に（および作表した値から２０：４ｎ−３が濃縮した濃縮物の製造にも）有用であると思われたが、ジクロロメタン（ＣＨ2Ｃｌ2）は、例えば、少量の他のｎ−３脂肪酸ならびに少量のｎ−６脂肪酸を含むＥＰＡおよびＤＨＡの濃縮物の製造によく適合し得る。さらに、他の置換液と比べて、ＣＨ2Ｃｌ2はまた、高不飽和脂肪酸１６：４ｎ−１の相対量を減少させる効果を有していた。したがって、ＣＨ2Ｃｌ2または同様の効果を有する置換液は、鎖長により作用する補足の分離技術により１６：４ｎ−１を減少させる必要性を排除し得るので、ＥＰＡおよびＤＨＡの高濃縮物の製造に有用となり得る。分子蒸留／短行路蒸留は、一般的に使用されている鎖長による分離技術である。しかしながら、この技術の分離力はあまり大きくないので、分子蒸留／短行路蒸留による脂肪酸１６：４ｎ−１の除去は、所望の脂肪酸のいくらかの損失ももたらし得る。したがって、値は、他の置換液に比べて１６：４ｎ−１の含量を減少させるＣＨ2Ｃｌ2のような置換液を使用している。
【００７６】
表４Ｃは、ジクロロメタンを置換液として使用した場合に、比較的大量のエチルエステルが第１の分画（分画Ａ）に出たことを示している。表４Ｅは、置換剤としてジクロロメタンを使用したさらなる実験の結果を示している。ＣＨ2Ｃｌ2２３．１ｍｌによる第１の抽出をそれぞれＣＨ2Ｃｌ2８ｍｌによる３回の抽出に置換したことを除いて、手順は表４Ｂおよび表４Ｃに示すものと同一とした。
【００７７】
濃縮物の最終量（６．３４ｇ）は、ＣＨ2Ｃｌ2を使用した第１の実施例で得られたものに近かった。ＥＰＡおよびＤＨＡの濃度ならびに他の脂肪酸の濃度も第１の実施例で得られたものと非常に近かった（表４Ｄ参照）。抽出物Ａの組成は、ＥＰＡおよびＤＨＡの量が少ないこと、ならびに他の長鎖ω３脂肪酸および長鎖ω６脂肪酸の相対量が多いことを示した。したがって、例えば、少量のジクロロメタンを利用して、ＥＰＡおよびＤＨＡの含量を改善し、他の長鎖ｎ−３脂肪酸および長鎖ｎ−６脂肪酸の含量を減少させることができることが分かった。ＣＨ2Ｃｌ2の量を変化させることにより、抽出物としてまたは濃縮物として異なる組成物が得られるだろう。この実施例の情報から、出発物質の量および濃度に対して特定の比のＣＨ2Ｃｌ2を利用することにより、特定の脂肪酸含量を有する組成物を仕立てることができる。表４Ｅおよび表４Ｄから分かるように、ＣＨ2Ｃｌ2によるさらなる抽出は、他の長鎖ｎ−３脂肪酸および長鎖ｎ−６脂肪酸を大部分除去して、水希釈後に９０％超のＥＰＡおよびＤＨＡのエチルエステル（ＧＣ面積％）を含む濃縮物をもたらした。そのため、中間体抽出物は、このような長鎖ｎ−３およびｎ−６脂肪酸の濃縮した分画を製造するための有用な出発物質を表した。また、中間体生成物は、ＥＰＡが濃縮しており、このことは中間体生成物を、例えば、Ｅｐａｄｅｌ製品のような高濃度のＥＰＡを含む製品を製造するための中間体として有用にした。
【００７８】
図５は、表４Ｅと同じデータを表しており、柱は同じ選択された脂肪エステルのエチルエステルの相対濃度を表している。図および表から、特定の成分の最大抽出がいつ得られるかに基づき、Ｋ３０ＥＥおよび抽出物Ａの相対濃度の比ならびに抽出物Ｅおよび最終濃縮物の相対濃度の比と比較して、置換液としてのＣＨ2Ｃｌ2による脂肪酸エチルエステルの除去の容易さについての「つつき順位」を推測することができる。
【００７９】
この「つつき順位」は、
１８：３ｎ−３＞２０：４ｎ−６＞２２：５ｎ−６＞２０：４ｎ−３＞１８：４ｎ−３＞２２：５ｎ−３＞２１：５ｎ−３＞１６：４ｎ−１＞ＥＰＡ＞ＤＨＡ
であるように思われる。１９：５脂肪酸はあまりに少量で存在するので、この「つつき順位」の中の位置を見出すことが不可能であった。
【００８０】
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）による分析は、置換液としてＣＨ2Ｃｌ2を使用すると、エチル化油中の典型的な微量成分である部分グリセリドが濃縮物中に濃縮されることを示した。他の溶媒を使用すると、濃縮物中の部分グリセリドの濃度は、出発Ｋ３０ＥＥに比べて有意な程度に影響を受けているようには見えなかった。これは、表４Ｆに示す分析結果で説明される。
【００８１】
【表９】
0005946833.tif 000010
【００８２】
表４Ｄおよび表４ＥのＧＣ面積結果は、欧州薬局方モノグラフ２．４．２９およびＵＳＰモノグラフＯｍｅｇａ−３  ａｃｉｄ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓにより記載されているようにエチルエステル試料の直接注入により得た。試料中の部分グリセリドが出発Ｋ３０ＥＥの組成に似ている場合、当業者は、分析への部分グリセリドの包含がＥＰＡおよびＤＨＡの測定含量の減少につながることを理解するだろう。この理由は、部分グリセリドはＧＣクロマトグラムで観察されないためであり、この理由のために、エチルエステルピークの相対面積％は、全成分がクロマトグラムで観察される場合よりも高いだろう。当業者は、部分グリセリドを分析に含める方法が、試料をメチル化し、それによって、エチルエステルおよび部分グリセリドの両者をメチルエステルに変換することであることを理解するだろう。したがって、置換液としてＣＨ2Ｃｌ2を使用して得られる濃縮物のためにこのような手順を行うと、ＥＰＡおよびＤＨＡの含量は、表４Ｄおよび表４Ｅに示す結果と比べて減少するだろうと思われる。
【００８３】
しかしながら、置換液としてＣＨ2Ｃｌ2を使用して得られる濃縮物をメチル化した場合、得られたメチルエステルは、ＥＰＡおよびＤＨＡの含量が減少していなかった。それどころか、ＥＰＡの濃度はいくぶん影響されなかったように見えたが、ＤＨＡの濃度は増加したように見えた（表４Ｇ）。同時に、１６：４ｎ−１の相対濃度は増加せず、むしろわずかに減少したように見えた。したがって、例えば、ＣＨ2Ｃｌ2のような置換液を使用すると、最終濃縮物中の部分グリセリドの濃度は増加し、これらの部分グリセリドは、例えば、出発Ｋ３０ＥＥに比べて、ＥＰＡおよびＤＨＡの濃度が強く増加したように思われる。したがって、分子蒸留および尿素分画のような伝統的な濃縮手順において部分グリセリド分画と共に損失した有用な脂肪酸は、本明細書に開示する方法により保持および濃縮される。
【００８４】
【表１０】
0005946833.tif 000011
【００８５】
この実施例から、例えば、ＣＨ2Ｃｌ2は、炭素および水素のみを含む炭化水素に比べて置換液としての効果が改善していた。当業者は、他のハロゲン化溶媒ならびに酸素または窒素のような他の極性官能基を含む溶媒によっても同様の効果の改善が得られることを理解するだろう。
【００８６】
実施例２Ｃ：  出発物質としてトリグリセリドを使用したＥＰＡおよびＤＨＡの濃縮
タラ肝油（Ｍｏｌｌｅｒ’ｓ  Ｔｒａｎ）６０．３ｇを、７０℃でＨ2Ｏ２３ｇおよびＡｇＮＯ3５９ｇの混合物に添加した。混合物を１時間撹拌し、次いで、相分離が起こるまで放置した。下部水相を上部油相から分離し、水４００ｇを添加して、Ａｇ+錯体を解離させ、ＥＰＡおよびＤＨＡが濃縮したトリグリセリドを遊離させた。出発物質および得られた油の脂肪酸プロファイルを表４Ｈに示す。ＥＰＡおよびＤＨＡは、２倍超の増加を示した。この実施例は、トリグリセリドでも錯化が起こることを示している。ＥＰＡおよびＤＨＡの濃縮を達成するためには、脂肪酸の分布は、トリグリセリド中で完全にランダムにすることはできない。トリグリセリドのいくらかは主鎖に結合した飽和または不飽和脂肪酸を主に有さなければならない。トリグリセリド中の脂肪酸の分布は、種に応じて変化し得る。
【００８７】
【表１１】
0005946833.tif 000012
【００８８】
実施例２Ｄ：  超臨界ＣＯ2による抽出
５０℃で、４５％／１９％／３６％（重量基準）のＡｇＮＯ3／Ｈ2Ｏ／ＥＥ比を使用すると、エチルエステルの６８％が有機層に残っていた。水層を抽出のためにＳＦＥ（超臨界流体抽出）カラムに移した。Ｓｕｚｕｋｉ（Ｓｕｚｕｋｉ他（１９９３）、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ３、１９７〜２０４頁）の発見に反して、錯体からのエチルエステルの全てを抽出することができたわけではなかった。エチルエステルの約７０％を抽出した後、残っている混合物はゲル状固体に変わった。抽出の温度および圧力を利用してＥＰＡ／ＤＨＡ比を変化させることができる。２８０バールで６０℃から７０℃まで抽出温度を上昇させると、抽出したエチルエステル中のＥＰＡ／ＤＨＡは５３／１５から５５／２３に変化した。全てのエチルエステルを抽出するために、抽出中に水を添加することが必要であった。エチルエステルの完全な抽出を可能にするには０．５％Ｈ2ＯをＣＯ2流に添加することで十分であった。以下の実施例６の結果は、エタノールの添加もこの点で有用となり得ることを示唆している。
【００８９】
実施例３：  水への希釈
水による水相の部分希釈により、ｎ−６脂肪酸および／または特定のω３脂肪酸（例えば、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外の長鎖ｎ−３脂肪酸）が濃縮した有機分画が遊離することが分かった。
【００９０】
Ｋ８５ＥＥを６０重量％のＡｇＮＯ3溶液（Ｋ８５ＥＥ：ＡｇＮＯ3＝重量で約７：１０）と撹拌した。水相を有機相から分離し、水で徐々に希釈した。水（水：ＡｇＮＯ3（固体）＝重量で約１．２：１）による１回の希釈後に「濃縮物−１」を得た。水相のさらなる希釈（水：ＡｇＮＯ3（固体）＝重量で約２．８：１）により第２の脂肪酸濃縮物を得た（分析せず）。さらなる希釈（水：ＡｇＮＯ3（固体）＝重量で約２０：１）により「濃縮物−４」を得た。表５は、Ｋ８５ＥＥ出発混合物、分離した有機相（「未溶解エステル」）、濃縮物−１および濃縮物−４の組成（ＧＣ面積％）を比較している。Ｋ８５ＥＥ出発混合物の重量と比較した収率をかっこ内に示す。濃縮物−４のガスクロマトグラムは図４にある。
【００９１】
【表１２】
0005946833.tif 000013
【００９２】
表５の結果は、有機相がＫ８５ＥＥ出発混合物に比べてｎ−６脂肪エステルが濃縮していたことを示している。同様の結果がＤＨＡ以外のｎ−３脂肪酸について観察された。濃縮物４は、７０％ＤＨＡ（ＧＣ面積％）および非常にわずかなＤＰＡを含んでおり、このようなおよび類似の分画を純粋なＤＨＡを製造するための中間体として適したものにしている。
【００９３】
実施例４：  ＡｇＮＯ3濃度
Ｋ８５ＥＥを、Ｋ８５ＥＥ：ＡｇＮＯ3＝２：１（２０．０ｇ対１０．１ｇ）で６０重量％または７０重量％のＡｇＮＯ3溶液と撹拌した。油／水混合物を分離させ、有機相を除去した。水相を水１００ｍｌで希釈し、希釈により遊離した脂肪酸濃縮物（「濃縮物−１」）を回収した。追加の水５０ｍｌを水相に添加して第２の濃縮物（「濃縮物２」）を得た。Ｋ８５ＥＥ出発混合物、分離した有機相（「未溶解エステル」）ならびに濃縮物１および２の組成を、表６および表７に示すようにＧＣ分析（ＧＣ面積％）により決定した。Ｋ８５ＥＥ出発混合物の重量と比較した収率をかっこ内に示す。
【００９４】
【表１３】
0005946833.tif 000014
【００９５】
【表１４】
0005946833.tif 000015
【００９６】
比較的低濃度の銀イオンを含む水溶液により脂肪酸濃縮物を得ることも可能であり得る。しかしながら、２種の混合物：より多量のＥＰＡおよびＤＨＡ（すなわち、より少量のω６脂肪酸および／または特定のω３脂肪酸、例えば、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外の長鎖ω３脂肪酸）を含む脂肪酸濃縮物、ならびにより多量のω６脂肪酸および／または特定のω３脂肪酸、例えば、ＥＰＡおよびＤＨＡ以外の長鎖ω３脂肪酸（すなわち、より少量のＥＰＡおよびＤＨＡ）を含む別の濃縮物（例えば、分離した有機相）を得るためには、水による希釈が好ましいだろう。このことを以下のように表８で説明する。Ｋ３０ＥＥを、Ｋ３０ＥＥ：ＡｇＮＯ3＝０．８でＡｇＮＯ3溶液（６０重量％、７０重量％または８０重量％）と混合し、２つの得られた相を分離した。水相を水に希釈した。表８の各ＡｇＮＯ3濃度について、（１）の記号のついた列は、分離した有機相の組成を示す一方で、列（２）は約７０℃の温度で水相を水に希釈することにより回収した脂肪酸濃縮物の組成を示す。表８に示すように、６０％ＡｇＮＯ3溶液は、より高いｎ−３／ｎ−６比およびより高いＤＨＡ濃度をもたらした。
【００９７】
【表１５】
0005946833.tif 000016
【００９８】
実施例５：  脂肪酸混合物：ＡｇＮＯ3比
ＡｇＮＯ3（固体）に対する出発脂肪酸混合物の量を変化させることの影響を、Ｋ３０ＥＥ：ＡｇＮＯ3比を０．４から１．６まで変化させることにより試験した。全ての実験でＡｇＮＯ3の７０重量％水溶液を使用した。組み合わせたＫ３０ＥＥ−ＡｇＮＯ3を７０℃で１．５時間撹拌した後、同じ温度で相分離を起こさせた。各実験で、約１時間後に２つの視覚的に明らかな相が得られた。有機相を除去した後、水溶液を水（水：ＡｇＮＯ3（固体）＝重量で約７．５：１）で希釈した。得られた濃縮物を表９に示す。組成をＧＣ分析（ＧＣ面積％）により決定した。表９の結果は、ＡｇＮＯ3当たりのＫ３０ＥＥの量を増加させることにより、より高いｎ−３／ｎ−６比ならびにより高い（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）／Σ（他のＬＣ  ｎ−３）比が得られることを示している。
【００９９】
【表１６】
0005946833.tif 000017
【０１００】
実施例６：  アルコールの添加
Ｋ３０ＥＥを、表１０に示すように増加した相対量のエタノールを含む７０重量％のＡｇＮＯ3溶液と撹拌した。上記のように最初の有機相を除去した後、残っている水相を水（水：ＡｇＮＯ3（固体）＝重量で７．５：１）で希釈した。組成を表１０に示すようにＧＣ分析（ＧＣ面積％）により決定した。
【０１０１】
【表１７】
0005946833.tif 000018
【０１０２】
表１０の結果は、エタノールの添加が、種々の多価不飽和脂肪酸に異なって影響を及ぼすことを示している。エタノールの相対量を増加させると、大量の一価不飽和脂肪酸（例えば、１８：１ｎ−９）が水相に入るようになり得る。エタノールの添加はまた、ｎ−３脂肪酸に比べてｎ−６脂肪酸の濃度の増加をもたらすように見える。「他のＬＣ  ｎ−３酸」の含量も、ＥＰＡ＋ＤＨＡの和に比べて増加するように見える。これらの効果は、「他のＬＣ  ｎ−３酸」の含量が高いおよび／またはｎ−６脂肪酸の含量が高い濃縮物を製造するのに有用となり得る。
【０１０３】
実施例７：  汚染物質の除去
いくつかの残留性有機汚染物質（ＰＯＰ）をＫ３０ＥＥに添加し、得られたエチルエステルを現在開示している方法にしたがって濃縮した。得られた油（すなわち、脂肪酸濃縮物）のＰＯＰおよびコレステロールを測定した。コレステロールは、欧州薬局方モノグラフ２．４．３２、Ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ｏｉｌｓ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｏｍｅｇａ−３  ａｃｉｄｓにしたがって分析した。ＰＯＰの濃度は低く、脂肪酸濃縮物中の総コレステロール（遊離およびエステル型コレステロール）の濃度は０．０６ｍｇ／ｇであった。Ｋ３０ＥＥ出発物質中および得られた濃縮物中のＰＯＰの濃度を表１１に示す。銀イオンはπ結合系と相互作用することが知られているので（表４Ｃ参照）、芳香環系を含む残留性有機汚染物質の濃度は本方法中増加すると予想され得る。ベンゾ（ａ）ピレンは、７４％の減少を示した。これは、銀イオンとの弱い錯化傾向、およびベンゾ（ａ）ピレンが完全には水相に移らず、主に有機相に残ることを示している。ハロゲン化溶媒は、銀イオン／多価不飽和脂肪酸錯体と相互作用する高い能力を示したことに留意すると（表４Ｃ参照）、少量のハロゲン化芳香族が水相に移り、濃縮物中に見出されることは驚くべきことである。出発物質に添加されたハロゲン化芳香族の９６％以上が本方法で除去される。
【０１０４】
【表１８】
0005946833.tif 000019
【０１０５】
実施例以外においてまたは特に指示しない限りは、本明細書および特許請求の範囲に使用する全ての成分の量を表す数字、反応条件、分析測定値などは、全ての例で用語「約」により修飾されるものと理解すべきである。したがって、特に指示しない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に示す数値パラメータは、本開示により得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低でも、また特許請求の範囲への均等論の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、有効数字の数および通常の丸めアプローチに照らして解釈すべきである。
【０１０６】
本開示の広範な範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるが、特に指示しない限り、特定の実施例に示す数値は、可能な限り正確に報告している。しかしながら、いかなる数値も、本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必ず生じる特定の誤差を含む。
【図１】
0005946833.tif 000020
【図２】
0005946833.tif 000021
【図３】
0005946833.tif 000022
【図４】
0005946833.tif 000023
【図５】
0005946833.tif 000024