(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラ抗体であり、キメラ抗体が重鎖を欠失するマウス免疫グロブリンκ軽鎖を含み、マウス免疫グロブリンκ軽鎖の定常ドメイン（Ｃκ）が対応するヒトＣκドメイン又はその断片で置換されており、キメラ抗体がＨＳＰ９０に特異的に結合して腫瘍細胞の成長及び／又は浸襲性を減少させることができる、単離されたキメラ抗体。
【請求項２】
配列番号４で表される配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるキメラ抗体であり、キメラ抗体がマウス免疫グロブリンκ軽鎖を含み、マウス免疫グロブリンκ軽鎖の定常ドメイン（Ｃκ）が対応するヒトＣκドメイン又はその断片で置換されており、キメラ抗体が配列番号５、配列番号６及び配列番号７で表される配列からなる相補性決定領域を含み、キメラ抗体がＨＳＰ９０に特異的に結合して腫瘍細胞の成長及び／又は浸襲性を減少させることができる、単離されたキメラ抗体。
【請求項３】
アミノ酸配列が、配列番号４で表される配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２に記載のキメラ抗体。
【請求項４】
キメラ抗体が、ヒト化抗体であるか又は原核細胞若しくは真核細胞の培養物から単離される、請求項１〜３の何れか一項に記載のキメラ抗体。
【請求項５】
キメラ抗体が、二量体、多量体又はヒト免疫グロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）との融合体からなる、請求項１〜４の何れか一項に記載のキメラ抗体。
【請求項６】
キメラ抗体が、通常のマウス抗体と比較して、ヒト対象において免疫応答を誘導する能力が減少している、請求項１〜５の何れか一項に記載のキメラ抗体。
【請求項７】
キメラ抗体及びその断片の腫瘍細胞の成長及び／又は浸襲性を減少させる能力が、癌細胞コロニー形成アッセイ、創傷治癒アッセイ、アクチン再編成の検出、葉状仮足の進展の検出、又は浸襲性の別の形態学的マーカーの検出の何れかによって行われる、請求項１〜６の何れかに記載のキメラ抗体。
【請求項８】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか一項に記載のキメラ抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
細胞内で発現するように配置された、請求項９又は１０に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含んでなる細胞であり、細胞が原核細胞又は真核細胞である、細胞。
【請求項１３】
キメラ抗体の発現に適切な条件下で請求項１２に記載の細胞を培養すること、及び培養細胞からキメラ抗体を単離することを含んでなる、請求項１〜７の何れか一項に記載のキメラ抗体を製造する方法。
【請求項１４】
請求項１〜７の何れか一項に記載の単離されたヒト化キメラ抗体を含んでなる、腫瘍細胞の成長及び／又は浸襲性を減少させるための医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜７の何れか一項に記載の単離されたヒト化キメラ抗体を含んでなる、腫瘍形成を有する対象を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜７の何れか一項に記載の単離されたヒト化キメラ抗体を含んでなる、腫瘍形成を有する対象における腫瘍進行又は転移を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項１７】
腫瘍細胞が癌細胞であり、癌が乳癌、メラノーマ、膠芽腫、結腸癌、非小細胞肺癌、リンパ腫、およびＨＳＰ９０が過剰発現されるその他の癌からなる群より選択される、請求項１４〜１６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
キメラ抗体が機能的部分、放射性機能的部分又は化学療法剤と共有結合している、請求項１４〜１７の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
キメラ抗体が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルフォンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルヴィン−カロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルマスティン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、ストラムスチンリン酸塩、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン及びビンフルニンからなる群より選択される、１つ又はそれ以上の化学療法剤の治療有効量と組み合わせて使用される、請求項１４〜１８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
化学療法剤がパクリタキセルである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
治療有効量の請求項１〜７の何れか一項に記載のキメラ抗体及び薬学的に許容される担体を含んでなる、腫瘍形成の治療のための医薬組成物。
【請求項２２】
治療有効量の請求項８に記載の単離されたポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含んでなる、腫瘍形成の治療のための医薬組成物。
【請求項２３】
治療有効量の請求項１〜７の何れか一項に記載のキメラ抗体又は請求項８に記載の単離されたポリペプチド、及びキットを使用するための説明書を含んでなる、腫瘍形成の治療のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年９月２７日に出願された米国仮出願番号第６１／３８６，７６４号の優先権を主張するものであり、その内容すべてが参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）４Ｃ５は、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）のαアイソフォームおよび（より少ない程度で）βアイソフォームの両方を特異的に認識するマウス抗体である。ＨＳＰ９０のクライアントタンパク質のほとんどが、悪性表現型の獲得における重要な分子であると考えられるので、ＨＳＰ９０は、最近、癌治療の非常に魅力的な薬物標的になっている。また、この分子シャペロンが癌細胞表面に存在することを実証する新たなデータは、癌細胞の浸潤および転移に関与する細胞外シャペロニングの広範な現象を示唆している。
【０００３】
ｍＡｂ４Ｃ５は、アクチン細胞骨格の再編成および運動性構造（例えば、葉状仮足）の形成に影響を与えることによって、神経系の発達中に、インビトロで細胞移動過程を阻害することが最初に示された。ｍＡｂ４Ｃ５は、ＨＳＰ９０の表面プールに選択的に結合して、メラノーマ細胞の浸潤および転移を有意に減少させる。さらに、ｍＡｂ４Ｃ５は、ＭＤＡＭＢ４５３乳癌細胞において、ＨＳＰ９０と成長因子受容体ＨＥＲ−２との間の細胞外相互作用を阻害し、下流シグナル伝達の障害、ならびに癌細胞の運動性および浸潤の減少をもたらすことが示された。最後に、ｍＡｂ４Ｃ５は、分泌されたＨＳＰ９０とＭＭＰ２前駆体およびＭＭＰ９前駆体との間の機能的相互作用（これは、ＥＣＭ分解ならびに癌細胞の浸潤および溢出に不可欠なこれらの酵素の活性化に必要である）を阻害することが示された。
【０００４】
これらの総合データにより、ｍＡｂ４Ｃ５が、この分子シャペロンの広範囲にわたる重要な細胞内の役割に影響を与えずに、ＨＳＰ９０の細胞外プールを特異的に阻害する能力は、ヒト悪性腫瘍の治療において臨床的利点を有し得ることが示唆された。しかしながら、マウスｍＡｂは、理想的な治療剤とならない。マウスｍＡｂをヒト臨床試験において使用することの明らかな問題は、ヒトの抗マウス抗体反応が発生する可能性である。マウス抗体が、ヒトの抗マウス抗体免疫応答（ＨＡＭＡ）によって認識されて、患者の免疫系が治療濃度域を狭めたので、マウスに由来するｍＡｂをヒト治療において使用する最初の試みは妨げられた。これらの障害は、キメラ抗体またはヒト化抗体の開発につながった組換えＤＮＡ技術の出現によって克服された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以下に記載されるように、本発明は、腫瘍形成(neoplasia)の治療のための治療組成物および治療方法を提供する。特定の実施態様では、本発明は、腫瘍形成の治療において使用するためのキメラヒト／マウス抗体を提供する。このような抗体は、組成において大部分がヒトによるものであるので、それらは、通常のマウス抗体と比較して、ヒト対象において免疫応答を誘導する能力が減少している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、重鎖が欠けた、マウスカッパＬ鎖を含む単離されたキメラ抗体を提供し、ここで、マウス免疫グロブリンκ軽鎖定常ドメイン（Ｃκ）が対応するヒトＣκドメインまたはその断片で置換されており、抗体はＨＳＰ９０に特異的に結合して、腫瘍細胞の成長及び／又は浸襲性を減少させることができる。一実施態様では、マウスカッパＬ鎖は、配列番号２と少なくとも７５％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。別の実施態様では、マウスカッパＬ鎖は、配列番号２を含む。別の実施態様では、マウスカッパＬ鎖は、１つまたはそれ以上のマウス相補性決定領域を含む。別の実施態様では、マウス相補性決定領域は、配列番号５、６または７と少なくとも７５％の同一性を有する。別の実施態様では、マウス軽鎖は、配列番号５、６および／または７である１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。別の実施態様では、マウス軽鎖は、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列番号５、６および７を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号４と少なくとも７５％、８５％、９５％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、配列番号４を含むか、または本質的に配列番号４からなる単離されたキメラ抗体を特徴とする。一実施態様では、抗体は、ヒト化抗体である。別の実施態様では、抗体は、原核細胞または真核細胞の培養物から単離される。
【０００８】
上記態様の様々な実施態様では、キメラ抗体は、通常のマウス抗体と比較して、ヒト対象において免疫応答を誘導する能力が減少している。
【０００９】
上記態様のさらに他の実施態様では、抗体またはその断片が成長および浸襲性を減少させる能力は、癌細胞コロニー形成アッセイおよび創傷治癒アッセイをそれぞれ使用して、アクチン再編成、葉状仮足の進展、または浸襲性の別の形態学的マーカーを検出することによってアッセイされる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、配列番号４の配列を含む単離されたポリペプチドを特徴とする。
【００１１】
別の態様では、本発明は、いずれかの前記態様のキメラ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。
【００１２】
別の態様では、本発明は、前記態様のキメラ抗体または前記態様の単離されたポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド特徴とする。一実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号３の配列を有する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、細胞における発現のために配置されたいずれかの前記態様のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを特徴とする。
【００１４】
別の態様では、本発明は、その発現ベクターを含む細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）を特徴とする。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明のキメラ抗体を製造するための方法であって、キメラ抗体の発現に適している条件下で本発明の発現ベクターを含む細胞を培養すること、および培養細胞からキメラ抗体を単離することを含む、方法を特徴とする。
【００１６】
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞の成長および／または浸襲性を減少させる方法であって、いずれかの前記態様のあるいは本明細書において説明されるキメラ抗体に腫瘍細胞を接触させ、それにより、腫瘍細胞の成長および／または浸襲性を減少させることを含む、方法を特徴とする。
【００１７】
別の態様では、本発明は、腫瘍形成を有する対象を治療する方法であって、いずれかの前記態様のあるいは本明細書において説明されるキメラ抗体の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象を治療することを含む、方法を特徴とする。
【００１８】
別の態様では、本発明は、腫瘍形成を有する対象における腫瘍の進行もしくは転移を治療または予防する方法を特徴とし、この方法はいずれかの前記態様のあるいは本明細書に説明されているキメラ抗体の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象における腫瘍の進行もしくは転移を治療または予防することを含む。一実施態様では、腫瘍細胞は、癌細胞であるか、または腫瘍中に存在する。別の実施態様では、癌は、乳癌、メラノーマ、膠芽腫、結腸癌、非小細胞肺癌またはリンパ腫である。別の実施態様では、キメラ抗体は、全身投与または局所投与される。別の実施態様では、キメラ抗体は、機能的部分と共有結合している。別の実施態様では、機能的部分は、放射性であるか、または化学療法剤である。別の実施態様では、方法は、１つまたはそれ以上の化学療法剤の治療有効量を対象に投与することをさらに含む。上記態様の様々な実施態様では、１つ又はそれ以上の化学療法剤は、以下のいずれかの１つ又はそれ以上から選択される：酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルフォンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルヴィン−カロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルマスティン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、ストラムスチンリン酸塩、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシンおよびビンフルニン。
【００１９】
上記態様の様々な実施態様では、キメラ抗体は、通常のマウス抗体と比較して、ヒト対象において免疫応答を誘導する能力が減少している。
【００２０】
別の態様では、本発明は、いずれかの前記態様のあるいは本明細書に説明されているキメラ抗体の治療有効量を含む、腫瘍形成の治療のための医薬組成物を特徴とする。
【００２１】
別の態様では、本発明は、配列番号４を含む単離されたポリペプチドの治療有効量を含む、腫瘍形成の治療のための医薬組成物を特徴とする。
【００２２】
別の態様では、本発明は、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択される１つまたはそれ以上の相補性決定領域を含む単離されたポリペプチドの治療有効量を含む、腫瘍形成の治療のための医薬組成物を特徴とする。
【００２３】
別の態様では、本発明は、腫瘍形成の治療のためのキットを特徴とし、キットはいずれかの前記態様のあるいは本明細書に説明されているキメラ抗体又は配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される配列を含む単離されたポリペプチドの治療有効量；ならびにいずれかの前記態様の方法においてキットを使用するための説明書を含む。
すなわち、本発明は、以下の（１）から（３７）に関する。
（１）  マウス免疫グロブリンκ軽鎖定常ドメイン（Ｃκ）が対応するヒトＣκドメイン又はその断片で置換されており、抗体がＨＳＰ９０に特異的に結合しそして腫瘍細胞の成長及び／又は浸襲性を減少させることができる、重鎖を欠失しているマウスカッパＬ鎖を含んでなる単離されたキメラ抗体。
（２）  マウスカッパＬ鎖が、配列番号２に記載の配列と少なくとも８５％の同一性を有する、前記（１）に記載のキメラ抗体。
（３）  マウスカッパＬ鎖が、配列番号２に記載の配列を含む、前記（１）に記載のキメラ抗体。
（４）  マウスカッパＬ鎖が、１つ又はそれ以上のマウス相補性決定領域を含む、前記（１）に記載のキメラ抗体。
（５）  マウス相補性決定領域が、配列番号５、６又は７に記載の配列と少なくとも７５％の同一性を有する、前記（４）に記載のキメラ抗体。
（６）  マウス軽鎖が、配列番号５、６又は７に記載の配列からなる群より選択される１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、前記（５）に記載のキメラ抗体。
（７）  マウス軽鎖が、配列番号５、６及び７に記載の配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、前記（５）に記載のキメラ抗体。
（８）  抗体が、配列番号４に記載の配列と少なくとも７５％、８５％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する、前記（１）に記載のキメラ抗体。
（９）  配列番号４に記載の配列を含むか、又は本質的に配列番号４に記載の配列からなる、単離されたキメラ抗体。
（１０）  抗体がヒト化抗体である、前記（１）〜（９）の何れかに記載のキメラ抗体。
（１１）  抗体が原核細胞又は真核細胞の培養物から単離される、前記（１）〜（９）の何れかに記載のキメラ抗体。
（１２）  キメラ抗体が、通常のマウス抗体と比較して、ヒト対象において免疫応答を誘導する能力が減少している、前記（１）〜（１１）の何れかに記載のキメラ抗体。
（１３）  成長及び浸襲性を減少させる抗体又はその断片の能力が、癌細胞コロニー形成アッセイ及び創傷治癒アッセイをそれぞれ使用して、アクチン再編成を検出することによって、葉状仮足の進展を検出することによって、又は浸襲性の別の形態学的マーカーを検出することによってアッセイされる、前記（１）〜（１１）の何れかに記載のキメラ抗体。
（１４）  配列番号４に記載の配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
（１５）  前記（１）〜（１３）の何れかに記載のキメラ抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
（１６）  前記（１）〜（１３）の何れかに記載のキメラ抗体又は前記（１４）に記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
（１７）  ポリヌクレオチドが配列番号３に記載の配列を有する、前記（１５）に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１８）  細胞内で発現するように配置された、前記（１５）〜（１７）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
（１９）  前記（１８）に記載の発現ベクターを含んでなる、細胞。
（２０）  細胞が、原核又は真核細胞である、前記（１９）に記載の細胞。
（２１）  方法が、キメラ抗体の発現に適切な条件下で前記（１８）に記載の細胞を培養すること、及び培養細胞からキメラ抗体を単離することを含んでなる、前記（１）に記載のキメラ抗体を製造する方法。
（２２）  方法が、腫瘍細胞を前記（１）〜（１３）の何れかに記載のキメラ抗体と接触させ、それにより、腫瘍細胞の成長及び／又は浸襲性を減少させることを含んでなる、腫瘍細胞の成長及び／又は浸襲性を減少する方法。
（２３）  方法が、治療有効量の前記（１）〜（１１）の何れかに記載のキメラ抗体を対象に投与し、それにより、対象を治療することを含んでなる、腫瘍形成を有する対象を治療する方法。
（２４）  方法が、治療有効量の前記（１）〜（１１）の何れかに記載のキメラ抗体を対象に投与し、それにより、対象における腫瘍進行又は転移を治療又は予防することを含んでなる、腫瘍形成を有する対象における腫瘍進行又は転移を治療又は予防する方法。
（２５）  腫瘍細胞が癌細胞であるか、又は腫瘍中に存在する、前記（２４）に記載の方法。
（２６）  癌が、乳癌、メラノーマ、膠芽腫、結腸癌、非小細胞肺癌及びリンパ腫からなる群より選択される、前記（２４）又は（２５）に記載の方法。
（２７）  キメラ抗体が全身又は局所投与される、前記（２４）又は（２５）に記載の方法。
（２８）  キメラ抗体が機能的部分と共有結合している、前記（２７）に記載の方法。
（２９）  機能的部分が放射性である、前記（２８）に記載の方法。
（３０）  機能的部分が化学療法剤である、前記（２８）に記載の方法。
（３１）  治療有効量の１つ又はそれ以上の化学療法剤を対象に投与することをさらに含んでなる、前記（２４）又は（２５）に記載の方法。
（３２）  １つ又はそれ以上の化学療法剤が、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、アウリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルフォンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルヴィン−カロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルマスティン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、ストラムスチンリン酸塩、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン及びビンフルニンからなる群より選択される、前記（２３）又は（２４）に記載の方法。
（３３）  キメラ抗体が、通常のマウス抗体と比較して、ヒト対象において免疫応答を誘導する能力が減少している、前記（２３）又は（２４）に記載の方法。
（３４）  治療有効量の前記（１）〜（１１）の何れかに記載のキメラ抗体を含んでなる、腫瘍形成の治療のための医薬組成物。
（３５）  配列番号４に記載の配列を含む単離されたポリペプチドの治療有効量を含んでなる、腫瘍形成の治療のための医薬組成物。
（３６）  配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の配列からなる群より選択される１つ又はそれ以上の相補性決定領域を含む単離されたポリペプチドの治療有効量を含んでなる、腫瘍形成の治療のための医薬組成物。
（３７）  キットが前記（１）〜（１１）の何れかに記載のキメラ抗体又は配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の配列からなる群より選択される配列を含む単離されたポリペプチドの治療有効量；及び前記（２２）〜（３３）の何れかに記載の方法でキットを使用するための説明書を含んでなる、腫瘍形成の治療のためのキット。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、ｍＡｂ４Ｃ５が、重鎖を欠いているカッパＬ鎖二量体であることを示す。図１Ａは、還元および非還元条件下で実施し、マウスカッパ鎖、マウスＦａｂおよびＦｃγに特異的な抗体でプローブしたｍＡｂ４Ｃ５のウエスタンブロットである。ハイブリドーマ培養物から単離した精製ｍＡｂ４Ｃ５を、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付し、その後、抗マウスカッパ鎖、抗マウスＦａｂおよび抗Ｆｃγ抗体を用いて免疫ブロッティングした。還元電気泳動を行い、その後、抗Ｆａｂ抗体を用いてウエスタンブロットすると、１本の２５ｋＤａの免疫反応性バンドが観察され、これは、抗マウスカッパ鎖抗体を用いるウエスタンブロットによって示されたカッパＬ鎖に対応するバンドと同じである。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後、抗カッパ抗体および抗Ｆａｂ抗体の両方を用いてウエスタンブロットすると、ｍＡｂ４Ｃ５は、１５０ｋＤａ（通常のＩｇＧ１分子）ではなく、約５０ｋＤａに移動することが示された。還元および非還元の両条件下で電気泳動し、その後、抗Ｆｃγ抗体を用いてウエスタンブロットした後に、ｍＡｂ４Ｃ５の免疫反応性は検出されなかった。図１Ｂは、重鎖プローブとハイブリダイズさせた４Ｃ５ハイブリドーマＲＮＡのノーザンブロットである。重鎖放射性標識プローブを用いて４Ｃ５ハイブリドーマに由来するＲＮＡをノーザンブロット分析した後に、放射活性は検出されなかった。２Ｄ１０およびＮＳＯに由来するＲＮＡを、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとした。
【図２】図２は、ｍＡｂ４Ｃ５のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、マウス−ヒトキメラ４Ｃ５および組換えマウス４Ｃ５が両方とも、親のｍＡｂ４Ｃ５と類似の電気泳動運動性を示すことを示す。図３Ａは、還元条件下における精製した抗体のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。精製した抗体を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付し、その後、クマシーブリリアントブルーＲで染色すると、すべての場合において、Ｌ鎖に対応する約２５ｋＤａのバンドが現れた。図３Ｂは、非還元条件下における精製した抗体のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。非還元条件下において、抗体はＬ鎖二量体として移動することが示されている。ｒｅｃ４Ｃ５：組換え４Ｃ５、ｃｈ４Ｃ５：キメラ４Ｃ５。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５がＨＳＰ９０を特異的に認識することを示す。図４Ａは、市販のポリクローナル抗ＨＳＰ９０α抗体、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５でプローブしたＭＤＡＭＢ４５３溶解物のウエスタンブロットである。すべての場合において、ＨＳＰ９０に対応する１本の９０ｋＤａの免疫反応性バンドが観察された。図４Ｂは、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５でプローブしたＭＤＡＭＢ４５３溶解物の抗ＨＳＰ９０免疫沈降物の免疫ブロットである。ＭＤＡＭＢ４５３細胞溶解物を抗ＨＳＰ９０で免疫沈降し、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５で免疫ブロットした。すべての場合において、１本の免疫反応性バンドが観察された。図４Ｃは、抗ＨＳＰ９０αでプローブしたＭＤＡＭＢ４５３溶解物のｍＡｂ４Ｃ５免疫沈降物、組換え４Ｃ５免疫沈降物およびキメラ４Ｃ５免疫沈降物の免疫ブロットである。ｍＡｂ４Ｃ５、ｒｅｃ４Ｃ５およびｃｈ４Ｃ５を使用して、ＭＤＡＭＢ４５３細胞溶解物で逆免疫沈降実験を実施し、その後、抗ＨＳＰ９０αでウエスタンブロットした。すべての場合において、１本の免疫反応性バンドが観察され、これは、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５が両方とも、ｍＡｂ４Ｃ５の特異性を保持しており、ＨＳＰ９０を認識することを示している。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄは、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５が、細胞表面に結合し、ＭＤＡＭＢ４５３細胞によって内在化されないことを示す。図５Ａは、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５を使用して、ＭＤＡＭＢ４５３細胞を免疫蛍光染色した顕微鏡写真である。断続的な免疫標識は、ＨＳＰ９０の表面プールを示す。ｍＡｂ４Ｃ５および抗ＨＳＰ９０αを使用して、同様の結果が得られた。細胞内タンパク質βチューブリンに対する抗体を使用して、陰性コントロールを実施した（示さず）。スケールバー：２０μｍ。図５Ｂは、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５の細胞内ＨＳＰ９０への結合の顕微鏡写真である。マウス抗体と同様に、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５も、細胞透過化した後に、ＨＳＰ９０の細胞内プールを認識する。４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による透過化を用いる固定条件下で、ＭＤＡＭＢ４５３細胞の細胞内ＨＳＰ９０の免疫蛍光検出を実施した。スケールバー：２０ｐｍ。図５Ｃは、抗体内在化の検出の顕微鏡写真である。細胞を、様々な時間間隔で、抗体と共に３７℃で培養し、固定して、透過処理した。蛍光標識抗体を使用して、抗体の結合を可視化した。培養の２４時間後においてさえ、ｍＡｂ４Ｃ５抗体、組換え４Ｃ５抗体およびキメラ４Ｃ５抗体の内在化は、観察されなかった。対照的に、抗ＨＳＰ９０α抗体は、培養の８時間後に細胞内で検出された。スケールバー：２０μｍ。図５Ｄは、ＥｒｂＢ２、Ａｋｔ、ｃＲａｆ、およびＨＳＰ９０に対する抗体でプローブした、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５またはキメラ４Ｃ５で処理したＭＤＡＭＢ４５３細胞に由来する細胞溶解物のウエスタンブロットである。アクチンを、ローディングコントロールとした。３つの４Ｃ５抗体による処理は、コントロールと比較して、試験した細胞内キナーゼのレベルに影響を与えなかった。
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、および６Ｇは、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５が両方とも、ｍＡｂ４Ｃ５の機能阻害特性を保持しており、ＭＤＡＭＢ４５３乳癌細胞およびＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の浸潤を阻害することを示す。図６Ａは、インビトロ創傷治癒アッセイの結果の顕微鏡写真のパネルである。写真は、ゼロ時間（左のパネル）、およびスクラッチ形成後４８時間（右のパネル）に得られた位相差画像を表し、コントロール培養物、または抗ＨＳＰ９０α、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５もしくはキメラ４Ｃ５を含む培養物のいずれかにおけるＭＤＡＭＢ４５３細胞の移動を示している。スケールバー：２００μｍ。図６Ｂは、創傷治癒アッセイの結果のグラフ表示である。２００μｇ／ｍｌの抗ＨＳＰ９０αおよびｍＡｂ４Ｃ５の培養培地への添加は、１００％の創縫合をもたらすとみなしたコントロール培養物と比較して、創縫合の４８．５７％および５５．３％の阻害をそれぞれもたらした。２００μｇ／ｍｌの組換え４Ｃ５またはキメラ４Ｃ５の培養培地への添加は、創縫合の４６．５１％および５１．１９％の阻害をそれぞれもたらした。バーは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。１回の実験において、各条件を３回試験した。統計的な有意差をスチューデントＴ検定によって試験した。抗ＨＳＰ９０α、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５の存在は、創縫合に対して統計的に有意な効果があった（それぞれｐ＜０，０１、ｐ＜０，０１、ｐ＜０，０１およびｐ＜０，０１）。図６Ｃは、ゼロ時間（左のパネル）、およびスクラッチ形成後２４時間（右のパネル）に得られた位相差画像の顕微鏡写真であり、２００μｇ／ｍｌのキメラ４Ｃ５の存在下の創傷治癒アッセイにおけるＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の浸潤を示している。スケールバー：２００μｍ。図６Ｄは、創縫合に対する漸増濃度のキメラ４Ｃ５の効果のグラフ表示である。５０μｇ／ｍｌのキメラ４Ｃ５の存在は１６％の浸潤阻害をもたらしたが、１００μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌのキメラ４Ｃ５の添加は、１００％の創縫合をもたらすとみなしたコントロール培養物と比較して、２７，９％および５２，３％の移動阻害をそれぞれもたらした。図６Ｅは、トリパンブルー色素を使用して可視化した死細胞の顕微鏡写真である。各場合における細胞死率を観察するために、コントロール、ｍＡｂ４Ｃ５、抗ＨＳＰ９０αおよびキメラ４Ｃ５で処理した細胞を、トリパンブルーと共に培養した。スケールバー、３０μｍ。図６Ｆは、コントロールおよびキメラ４Ｃ５で処理した細胞を固定し、透過化し蛍光標識ファロイジンで染色した後の顕微鏡写真である。スケールバー４０μｍ。図６Ｇは、ファロイジン染色（Ｆアクチン）を示すより高倍率のものである。キメラ４Ｃ５は、葉状仮足の広がりを有効に阻害する。スケールバー：１６μｍ。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、コロニー形成アッセイにおいて、キメラ４Ｃ５が、ＭＤＡＭＢ２３１ヒト乳癌細胞によって形成された個々の各コロニーの細胞数を有意に減少させたことを示す。図７Ａは、コロニー形成アッセイの結果の顕微鏡写真であり、コントロールまたはキメラ４Ｃ５のいずれかで処理した培養物におけるＭＤＡＭＢ２３１細胞のギムザ染色コロニーを示している。図７Ｂは、各コロニーの細胞数に対するキメラ４Ｃ５の効果のグラフ表示である。コントロール培養物と比較して、４７．３％の減少が観察されている（ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
「ｍＡｂ４Ｃ５」とは、配列番号２と少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％またはさらに９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は抗腫瘍活性を有し、そして／またはＨＳＰ９０特異的結合活性を有するその断片を意味する。ｍＡｂ４Ｃ５は、ヒト熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）のαアイソフォームおよび（より少ない程度で）βアイソフォームの両方を特異的に認識するマウス抗体である。
【００２６】
配列番号２の配列は、以下に提供される：
ＥＬＶＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＮＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＲＬＴＦＧＡＧＴＲＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＩＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ。
【００２７】
「キメラ４Ｃ５タンパク質」とは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％またはさらに９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は抗腫瘍活性を有し、そして／またはＨＳＰ９０特異的結合活性を有するその断片を意味する。マウスｍＡｂ４Ｃ５のＣκを対応するヒトＣκドメインで置換することによって、ヒト−マウスキメラ４Ｃ５抗体を構築した。
【００２８】
配列番号４の配列は、以下に提供される：
ＥＬＶＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＮＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＲＬＴＦＧＡＧＴＲＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
【００２９】
「キメラ４Ｃ５ポリヌクレオチド」は、キメラ４Ｃ５ポリペプチドをコードする何れかの核酸分子を意味する。
【００３０】
「４Ｃ５  ＣＤＲ１」とは、配列番号５と少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％またはさらに９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味し、４Ｃ５  ＣＤＲ１を含む抗体は、ＨＳＰ９０特異的結合活性を有する。配列番号の配列は、以下に提供される：
ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ。
【００３１】
「４Ｃ５  ＣＤＲ２」とは、配列番号６と少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％またはさらに９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味し、４Ｃ５  ＣＤＲ２を含む抗体は、ＨＳＰ９０特異的結合活性を有する。配列番号６の配列は、以下に提供される：
ＲＡＮＲＬＶＤ。
【００３２】
「４Ｃ５  ＣＤＲ３」とは、配列番号７と少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％またはさらに９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味し、４Ｃ５  ＣＤＲ３を含む抗体は、ＨＳＰ９０特異的結合活性を有する。配列番号７の配列は、以下に提供される：
ＬＱＹＤＥＦＰＲＬＴ。
【００３３】
「ＨＳＰ９０特異的結合活性」とは、本発明の抗体がＨＳＰ９０ポリペプチドに特異的に結合することを意味する。
【００３４】
「改善する」とは、疾患の発症もしくは進行を減少、抑制、軽減、緩和、阻止または安定化することを意味する。
【００３５】
「類縁体」とは、同一ではないが、類似の機能的特徴または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類縁体は、天然に存在するポリペプチドと比較して類縁体の機能を増強させる特定の生化学的修飾を有しながら、対応する天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持している。このような生化学的修飾は、例えば、リガンド結合を変化させずに、類縁体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を増加させることができる。類縁体は、非天然アミノ酸を含むことができる。
【００３６】
本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法に帰する意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができる；「本質的にからなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に、米国特許法に帰する意味を有し、この用語は非制限的であり、記載されているものの基本的または新規な特徴が、記載されているもの以外の存在によって変化しないが、先行技術の実施態様を除外する限りにおいて、記載されているもの以外の存在も許容する。
【００３７】
「キメラ抗体」とは、少なくとも２つの別個のポリペプチド断片（マウス抗体に由来する第１のポリペプチド断片、およびヒト抗体に由来する第２のポリペプチド断片）を含む抗体を意味する。第１および第２のポリペプチド断片のそれぞれは、核酸構築物によってコードされて、構築物が発現すると、ヒト抗体断片に連結されたマウス抗体断片を含む機能的キメラ抗体が生成されるように機能的に連結される。一実施態様では、マウス抗体断片は、それぞれがＨＳＰ９０に特異的に結合する１つ又はそれ以上の相補性決定領域を含む。
【００３８】
「細胞毒性部分」という用語は、アブリン、リシン、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素またはそれらの改変毒素を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
「疾患」とは、細胞、組織もしくは器官の正常な機能を損傷するか、もしくは妨げる何れかの病態または障害を意味する。一実施態様では、疾患は、癌または腫瘍形成である。
【００４０】
「有効量」とは、未治療の患者と比較して疾患の症状を改善するのに必要な量を意味する。疾患の治療的処置のための本発明の実施に使用される活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重および一般的な健康に応じて変化する。最終的には、主治医または獣医が、適切な量および投薬計画を決定する。このような量は、「有効な」量と称される。
【００４１】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。ある実施態様では、この一部分は、参照核酸分子または参照ポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含む。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる。
【００４２】
「機能部分」とは、標的化剤が何れかの特定の目的を果たす能力を改変、増大あるいは変化させるか、もしくは標的化剤が新たな目的を果たすことを可能にする活性または特性を有する何れかの化合物、薬剤、分子などを意味する。このような目的は、腫瘍形成に関連する疾患もしくは病態の診断情報および／もしくは予後情報ならびに／または治療を提供することを含むが、これらに限定されない。
【００４３】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されているアミノ酸配列のいずれか１つ）もしくは参照核酸配列（例えば、本明細書に記載されている核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸において、比較に使用される配列と少なくとも６０％、より好ましくは８０％または８５％、より好ましくは、９０％、９５％またはさらに９９％同一である。
【００４４】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、遺伝子に隣接している遺伝子が存在していない核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ；自己複製プラスミドまたはウイルスに組み込まれた組換えＤＮＡ；または、原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ；または、他の配列から独立した別の分子（例えば、ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ分解によって生成されたｃＤＮＡまたはゲノム断片もしくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。加えて、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子、およびさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
【００４５】
「単離されたポリペプチド」とは、それに天然に付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に結合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を少なくとも６０重量％含んでいない場合に、単離されたことになる。ある特定の実施態様では、調製物は、少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、およびさらに少なくとも９９重量％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出によって、このようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；またはタンパク質を化学的に合成することによって得られる。純度は、何れかの適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００４６】
「マーカー」とは、疾患もしくは障害に関連する発現レベルまたは活性が変化している何れかのタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
【００４７】
「腫瘍形成(neoplasia)」とは、細胞または組織の病的な増殖、およびそれに続く他の組織もしくは器官への移動または浸潤によって特徴付けられる疾患を意味する。腫瘍の成長は、典型的には、制御されず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発しないか、または正常細胞の増殖の停止を引き起こす条件下で起こる。腫瘍形成は、限定されないが、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、神経膠、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮および膣からなる群より選択される器官もしくはそれらの組織もしくは細胞型を含む、様々な細胞型、組織または器官を冒し得る。腫瘍形成は、肉腫、癌腫または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などの癌を含む。一実施態様では、腫瘍形成は、乳癌またはメラノーマである。
【００４８】
周囲組織に浸潤するか、または血流もしくはリンパ管に侵入する腫瘍細胞は、原発腫瘍から離れて二次腫瘍または転移を形成する。転移した腫瘍は、治療するのがより困難であり、予後不良であることが多い。腫瘍形成の重症度（すなわち、腫瘍サイズおよび浸襲性）に応じて、病期の番号は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶと指定される。病期Ｉの腫瘍形成は、最も進行していないものであり、予後が最も良好である。病期ＩＩの腫瘍形成は、典型的には、より大きな腫瘍を含み、予後不良にいくらか関連している。病期ＩＩＩおよびＩＶの腫瘍形成は、それらの出現部位以外に広がっており、予後が最も不良である。
【００４９】
本明細書において使用される「薬剤を得る」のような「得る」は、薬剤を合成、購入あるいは入手することを含む。
【００５０】
本明細書において使用される「組換え」は、ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを発現する細胞を使用して製造されたポリペプチドの参照を含む。細胞は、適切な単離された核酸配列の導入によって遺伝的に改変されているので、組換えポリペプチドを産生する。この用語は、異種核酸を導入することによって、もしくは天然の核酸をその細胞にとって天然ではない形態に改変することによって修飾された細胞もしくは核酸もしくはベクター、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することへの参照も含む。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然の（非組換え）形態においては見出されない遺伝子を発現するか、天然の形態において見出される遺伝子の変異体を発現するか、または、そうでなければ異常に発現されるか過少に発現されるかもしくは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００５１】
「減少させる」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の変化を意味する。
【００５２】
「参照」とは、標準またはコントロールの状態を意味する。
【００５３】
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される定義された配列である。参照配列は特定の配列；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列のサブセットまたは全体であってよい。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、そしてある特定の実施態様では約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、または約１００アミノ酸である。核酸に関しては、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、およびさらに約１００ヌクレオチド、または約３００ヌクレオチド、またはその付近もしくはその間のいずれかの整数である。
【００５４】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705 のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、ＢＬＡＳＴプログラム、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＧＡＰプログラム、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、相同性の程度を、様々な置換、欠失および／または他の修飾に対して割り当てることによって同一配列または類似配列を一致させる。同類置換は、典型的には、以下の群の中での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；および、フェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的な方法において、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ−３からｅ−１００の間における確率スコアにより、近い関係にある配列が示される。
【００５５】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする何れかの核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示す。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする何れかの核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示す。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェントな条件下、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書において記載されている遺伝子）またはその一部分の間を対合して、二本鎖分子を形成させることを意味する（例えば、Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399;Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507を参照のこと）。
【００５６】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸塩基の間の、ワトソン−クリックフーグスティーンであってよい水素結合、または逆フーグスティーン水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対合する相補的核酸塩基である。
【００５７】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭのＮａＣｌおよび７５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、好ましくは約５００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、より好ましくは約２５０ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低い。低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションは、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の非存在下で得ることができ、一方で、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。様々なさらなるパラメーター、例えば、ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、および、キャリアＤＮＡを含むこと、または、キャリアＤＮＡを除くことなどが、当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーが、これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって達成される。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは、３０℃で、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳにおいて行われる。より好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは、３７℃で、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）において行われる。最も好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは、４２℃で、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡにおいて行われる。これらの条件に対する有用な変更は、当業者にとって容易に明らかであろう。
【００５８】
ほとんどの適用に関して、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程も、ストリンジェンシーが異なる。洗浄のストリンジェントな条件は、塩濃度によって、および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによって、または、温度を上げることによって増大させることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭのＮａＣｌおよび３ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低く、最も好ましくは約１５ｍＭのＮａＣｌおよび１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムよりも低い。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含む。好ましい実施態様では、洗浄工程は、２５℃で、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳにおいて行われる。より好ましい実施態様では、洗浄工程は、４２℃で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳにおいて行われる。より好ましい実施態様では、洗浄工程は、６８℃で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳにおいて行われる。これらの条件に対するさらなる変更は、当業者にとって容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis(Science 196:180,1977);Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975);Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001);Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York);およびSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yorkに記載されている。
【００５９】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されているアミノ酸配列のいずれか１つ）もしくは参照核酸配列（例えば、本明細書に記載されている核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。ある特定の実施態様では、このような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸において、比較に使用される配列（すなわち、参照配列）と少なくとも６０％、８０％または８５％、９０％、９５％またはさらに９９％同一である。
【００６０】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識して、それに結合するが、サンプル（例えば、本発明のポリペプチドを天然に含む生物サンプル）中の他の分子を実質的に認識せず、それに実質的に結合しない化合物または抗体を意味する。
【００６１】
「対象」とは、限定されないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコ）を含む哺乳動物を意味する。
【００６２】
本明細書において使用される「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、すべての腫瘍細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌細胞および癌細胞および前癌組織および癌組織を指す。
【００６３】
本明細書において提供される範囲は、範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０からなる群からの何れかの数、数の組み合わせ、または部分的な範囲を含むと理解される。
【００６４】
本明細書において使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、障害および／もしくはそれに関連する症状を軽減または改善することを指す。障害または病態を治療することは、除外はされないが、障害、病態またはそれらに関連する症状が完全に除去されることを必要としないと理解される。
【００６５】
特に明記されるか又は文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される「または」という用語は、包括的であると理解される。特に明記されるか又は文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、単数形または複数形であると理解される。
【００６６】
特に明記されるか又は文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容値の範囲内（例えば、平均の２標準偏差内）と理解される。約は、表示値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％内と理解できる。文脈から明らかでない限り、本明細書において提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾される。
【００６７】
本明細書における可変基のあらゆる定義における化学基の一覧の記載は、その可変基の定義を、何れかの単一基または一覧に挙げられる基の組み合わせとして含む。本明細書における可変基又は態様に関する実施態様の記載は、その実施態様を、何れかの単一の実施態様又は何れかの他の実施態様もしくはその一部分との組み合わせとして含む。
【００６８】
本明細書において提供されるあらゆる組成物または方法は、本明細書において提供される他の組成物および方法のいずれかの１つ又はそれ以上と組み合わせることができる。
【００６９】
本発明は、抗腫瘍特性を有するポリペプチドを提供する。本明細書に記載されているポリペプチドは、抗体軽鎖に対応するマウス−ヒトキメラを含み、これは抗体重鎖を欠いているが、ＨＳＰ９０αタンパク質に結合する能力を保持している。
【００７０】
本発明は、少なくとも部分的には、モノクローナル抗体４Ｃ５が、重鎖を完全に欠いており、機能的カッパ軽鎖二量体からなるという発見、および元の抗体の特異性および機能特性を保持している組換えキメラマウス−ヒト抗体軽鎖の製造に基づいている。特に、キメラ抗体は、インビトロで、表面ＨＳＰ９０の機能を阻害して、乳癌細胞およびメラノーマ癌細胞の浸潤を減少させ、転移性沈着物およびトリプルネガティブ乳癌細胞のＳＣＩＤマウスの肺への転移を減少させ、ＳＣＩＤマウスにおいて同所的（orthotopically）に成長するＭＤＡＭＢ２３１トリプルネガティブ乳癌細胞の原発腫瘍の成長を遅らせた。これらの結果は、このキメラ抗体が、有害な免疫原性効果を減少させて、抗癌剤として有用であることを示している。
【００７１】
したがって、本発明は、マウス−ヒトキメラ抗体を含む治療組成物、および腫瘍細胞（例えば、乳癌細胞およびメラノーマ細胞）の浸襲性を予防、減少または除去するために、あるいは腫瘍形成またはその症状を治療するためにこのような抗体を使用する方法を提供する。
【００７２】
抗体
抗ＨＳＰ９０ポリペプチドに選択的に結合する抗体（例えば、キメラ４Ｃ５）は、本発明の方法において有用である。このような抗体は、腫瘍細胞の成長および浸襲性を減少または除去するのに特に有用である。特に、このような抗体は、腫瘍の発生および転移能を減少または除去するために使用できる。本明細書において以下に記載されているように、腫瘍細胞のコロニー形成能および浸襲性を分析することによってアッセイすると、ＨＳＰ９０ポリペプチドへの結合は、腫瘍細胞におけるＨＳＰ９０の生物活性を減少させる。いくつかの実施態様では、コロニー形成能は、コロニー形成アッセイを使用して、インビトロで腫瘍細胞コロニーの成長を分析することによって試験する。ある特定の実施態様では、浸襲性は、培養物における腫瘍細胞の創傷への移動を検出することによって、アクチン再編成を検出することによって、または葉状仮足の進展を検出することによって、インビトロでアッセイする。他の実施態様では、浸襲性は、インビボで動物モデルにおける腫瘍細胞の転移を検出することによってアッセイする。
【００７３】
抗体を製造する方法は、免疫学の科学における当業者に周知である。本明細書において使用される「抗体」という用語は、無傷の抗体分子だけでなく、免疫原結合能を保持する抗体分子の断片も意味する。このような断片も当該技術分野で周知であり、インビトロおよびインビボの両方で通常使用されている。したがって、本明細書において使用される「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片であるＦ（ａｂ’）２およびＦａｂも意味する。無傷抗体のＦｃ断片を欠いているＦ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ断片は、より迅速に循環から除去され、無傷抗体の非特異的な組織結合がより少なくてもよい（Wahl et al.,J.Nucl.Med.24:316 325(1983)。ある特定の実施態様では、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、融合ポリペプチド、および特殊な抗体を含む。他の実施態様では、本発明は、抗体の一部分が第１の抗体（例えば、マウス抗体）から得られるものであり、他の部分が異なる第２の抗体（例えば、ヒト抗体）から得られるハイブリッド抗体を提供する。このような抗体は、「キメラ」抗体と称されることが多い。このようなハイブリッドは、ヒト化抗体を使用しても形成できる。
【００７４】
一般に、無傷抗体は、「Ｆｃ」および「Ｆａｂ」領域を含むと言われている。Ｆｃ領域は、補体活性化に関与し、抗原結合に関与しない。Ｆｃ’領域が酵素的に切断された抗体、またはＦｃ’領域なしで製造された抗体（これは、「Ｆ（ａｂ）２」断片と命名される）は、無傷抗体の抗原結合部位の両方を保持している。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された抗体、またはＦｃ領域なしで製造された抗体（これは、「Ｆａｂ」断片と命名される）は、無傷抗体の抗原結合部位の一方を保持している。Ｆａｂ断片は、共有結合している抗体軽鎖と抗体重鎖の一部（これは、「Ｆｄ」と示される）からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主な決定因子である（１個のＦｄ断片は、抗体特異性を変化させずに、最大１０個の異なる軽鎖に結合できる）。単離されたＦｄ断片は、免疫原性エピトープに特異的に結合する能力を保持している。
【００７５】
抗体は、ＨＳＰ９０またはその免疫原性断片を免疫原として利用して、当業者に公知の方法のいずれかにより製造できる。抗体を得る方法の１つは、適切な宿主動物を免疫原で免疫化し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の製造のための標準的な手順に従うことである。免疫原は、細胞表面上への免疫原提示を促進する。適切な宿主の免疫化は、多数の方法で実施できる。ＨＳＰ９０ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列を、宿主の免疫細胞によって取り込まれる送達媒体によって宿主に提供することができる。そして、細胞は、細胞表面上に受容体を発現して、宿主内で免疫原性応答を起こす。あるいは、ＨＳＰ９０ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列をインビトロで細胞中に発現させた後に、ポリペプチドを単離し、抗体を産生する適切な宿主にポリペプチドを投与できる。
【００７６】
あるいは、ＨＳＰ９０ポリペプチドに対する抗体は、所望により、抗体ファージディスプレイライブラリーから得ることができる。バクテリオファージは、細菌に感染して、細菌内で増殖することができ、ヒト抗体遺伝子と組み合わせると、ヒト抗体タンパク質を提示するように改変できる。ファージディスプレイ法は、ファージがその表面にヒト抗体タンパク質を「ディスプレイ（提示）」するように作製される過程である。ヒト抗体遺伝子ライブラリーに由来する遺伝子は、ファージの集団に挿入される。それぞれのファージは、異なる抗体の遺伝子を保有し、それにより、異なる抗体をその表面に提示する。
【００７７】
次いで、当該技術分野において公知の何れかの方法により作製された抗体は、宿主から精製できる。抗体の精製方法は、塩析沈殿法（例えば、硫酸アンモニウムによる）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換カラムまたは陰イオン交換カラムで、中性ｐＨで実行し、イオン強度を増加させる勾配工程により溶出する）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ゲルろ過ＨＰＬＣを含む）、ならびにプロテインＡ、プロテインＧ、ヒドロキシアパタイト、および抗免疫グロブリンなどの親和性樹脂でのクロマトグラフィーを含むことができる。
【００７８】
抗体は、その抗体を発現するように改変されたハイブリドーマ細胞から好都合に産生できる。ハイブリドーマを作製する方法は、当該技術分野において周知である。ハイブリドーマ細胞は、適切な培地で培養でき、使用済みの培地は、抗体源として使用できる。そして、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを、その抗体を産生するハイブリドーマから得ることができ、次いで、これらのＤＮＡ配列から、その抗体を合成的にまたは組換え的に製造できる。大量の抗体を製造するためには、一般に、腹水を得ることがより好都合である。腹水を生じさせる方法は、一般に、ハイブリドーマ細胞を免疫学的にナイーブな組織適合性または免疫耐性の哺乳動物、特にマウスに注入することを含む。適切な組成物（例えば、プリスタン）を予め投与することにより、哺乳動物を、腹水の産生のために準備できる。
【００７９】
本発明の方法により製造される抗体は、当該技術分野において公知の方法により「ヒト化」できる。「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部が、その初期形態から、それをよりヒト免疫グロブリン様にするように改変された抗体である。抗体をヒト化する技術は、非ヒト動物（例えば、マウス）の抗体を作製する場合に特に有用である。マウス抗体をヒト化するための方法の例は、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、米国特許第５，５３０，１０１号明細書、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第５，８５９，２０５号明細書に提供されている。一実施態様では、重鎖Ｃ領域および軽鎖Ｃ領域は、ヒト配列で置換されている。別の変形では、ＣＤＲ領域は、目的の抗原の認識のためのアミノ酸配列を含み、さらに可変フレームワーク領域もヒト配列に変換されている。哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域は、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、非特異的抗体または異種特異的抗体の対応する領域で置換され得ることが十分に確立されている。機能的抗体を製造するために、この技術は、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合しているヒト化抗体の開発ならびに使用に有用である。第３の変形では、可変領域は、ヒト可変領域およびマウス可変領域のコンセンサス配列を設計し、コンセンサス配列間で異なるＣＤＲの外側の残基を変換することによってヒト化される。
【００８０】
一実施態様では、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（配列番号５、配列番号６および配列番号７）を含むアミノ酸をコードする核酸配列を、ヒトフレームワーク領域の配列（ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３）をコードする核酸配列に機能的に連結することによって作製される。
【００８１】
他の実施態様では、本発明は、「特殊な抗体」を提供する。特殊な抗体は、限定されないが、ナノボディ、線形抗体（Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062,1995）、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体および多価を有する抗体（例えば、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディおよびペンタボディ）を含む。ナノボディは、軽鎖の非存在下で完全に機能的であるように進化した天然に存在する重鎖抗体の最小断片である。ナノボディは、一本鎖Ｆｖ断片のわずか半分のサイズであるが、通常の抗体の親和性および特異性を有している。ナノボディが、通常の抗体にアクセス不可能な治療標的に結合できるのは、過度の安定性およびヒト抗体フレームワークとの高度な相同性と組み合わせた固有の構造の結果である。多価を有する組換え抗体の断片は、癌細胞に対する高い結合活性および固有の標的特異性を提供する。サイズが約６０から１００ｋＤａの低分子は、より迅速な血液クリアランスおよび迅速な組織吸収を提供するので、これらの多量体ｓｃＦｖ（例えば、ダイアボディ、テトラボディ）は、親抗体を凌ぐ改善をもたらす。Power et al.,(Generation of recombinant multimeric antibody fragments for tumor diagnosis and therapy.Methods Mol Biol,207,335-50,2003)；および Wu et al.(Anti-carcinoembryonic antigen(CEA)diabody for rapid tumor targeting and imaging.Tumor Targeting,4,47-58,1999)を参照のこと。
【００８２】
非従来型の抗体を作製するための様々な技術は、記載されている。ロイシンジッパーを使用して製造される二重特異性抗体は、Kostelny et al.(J.Immunol.148(5):1547-1553,1992)に記載されている。ダイアボディの技術は、Hollinger et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993)に記載されている。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することにより二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略は、Gruber et al.(J.Immunol.152:5368,1994)に記載されている。三重特異性抗体は、Tutt et al.(J.Immunol.147:60,1991)に記載されている。Huston,et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)に記載されているように、一本鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、共有結合したＶＨ::ＶＬへテロ二量体を含み、これは、直接的に連結されたか、またはペプチドをコードするリンカーによって間接的に連結されたＶＨおよびＶＬをコードする配列を含む核酸から発現させることができる。米国特許第５，０９１，５１３号明細書、米国特許第５，１３２，４０５号明細書および米国特許第４，９５６，７７８号明細書；ならびに米国特許出願公開第２００５０１９６７５４号明細書および米国特許出願公開第２００５０１９６７５４号明細書も参照のこと。
【００８３】
本発明の抗体は、乳癌およびメラノーマまたは他の腫瘍（これに限定されないが、膠芽腫、リンパ腫、結腸癌、非小細胞肺癌などを含む）を含む腫瘍形成の治療に特に有用である。したがって、本発明は、本明細書に記載されているキメラ抗体を含む医薬組成物の治療有効量を対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む、腫瘍性疾患および／もしくは障害またはそれらの症状を治療する方法を提供する。したがって、一実施態様は、腫瘍性疾患もしくは障害またはそれらの症状に罹患しているか、または罹患しやすい対象を治療する方法である。この方法は、疾患もしくは障害が治療されるような条件下で、疾患もしくは障害またはそれらの症状を治療するのに十分な治療量の（ある量の）本明細書における化合物を哺乳動物に投与する工程を含む。
【００８４】
本明細書における方法は、本明細書に記載されている化合物または本明細書に記載されている組成物の治療有効量を対象（このような治療を必要とすると同定された対象を含む）に投与して、このような効果を生み出すことを含む。このような治療を必要とする対象の同定は、対象または医療専門家の判断に委ねられ、主観的（例えば、私見）または客観的（例えば、試験または診断方法によって測定可能）であってよい。
【００８５】
本発明の治療方法（予防的治療を含む）は、一般に、治療有効量の本明細書に説明されているキメラ抗体を、哺乳動物（特に、ヒト）を含むそれを必要とする対象（例えば、動物、ヒト）に投与することを含む。このような治療は、腫瘍性疾患に関連する転移に罹患しているか、転移を有するか、転移に罹患しやすいか、または転移に罹患するリスクがある対象（特に、ヒト）に適切に施される。「リスクがある」対象の決定は、診断試験または対象もしくは医療提供者の意見（例えば、遺伝子試験、酵素マーカーまたはタンパク質マーカー、マーカー（本明細書に定義されるような）、家族暦など）による何れかの客観的判断または主観的判断によってなされてよい。
【００８６】
一実施態様では、本発明は、治療経過をモニタリングする方法を提供する。この方法は、腫瘍形成に関連する障害またはその症状に罹患しているか、または罹患しやすい対象において、診断マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）（例えば、本明細書の化合物、タンパク質、またはそれらの指標などによって調節される本明細書に説明されている何れかの標的）のレベルを決定するか、または診断測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）を確認する工程を含み、ここで対象は、疾患またはその症状を治療するのに十分な治療量の本明細書の化合物を投与されている。この方法において確認されたマーカーレベルを、健常コントロールまたは他の患者における既知のマーカーレベルと比較して、対象の疾患状態を確立することができる。ある特定の実施態様では、対象における第２のマーカーレベルは、第１のレベルの確認よりも後の時点で確認され、２つのレベルは、疾患の経過または治療効果をモニタリングするために比較される。ある特定の実施態様では、対象における治療前のマーカーレベルは、本発明による治療を開始する前に確認される。次いで、この治療前のマーカーレベルは、治療開始後の対象におけるマーカーレベルと比較され、治療効果を確認することができる。
【００８７】
組換えポリペプチドの発現
本発明は、腫瘍形成の治療に有用な本発明の抗体（キメラ抗体）を提供する。特に、本発明は、組換え技術によって発現され得るヒト−マウスキメラ４Ｃ５抗体を提供する。典型的には、組換えポリペプチドは、適切な媒体中で、ポリペプチドをコードする核酸分子もしくはその断片の全部または一部で、適切な宿主細胞を形質転換することによって製造することができる。
【００８８】
分子生物学の分野の当業者は、多種の発現系のいずれもが、組換えタンパク質を提供するのに使用できることを理解するであろう。使用される正確な宿主細胞は、本発明には重要ではない。本発明のポリペプチドは、原核生物宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））中に、または真核生物宿主（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）、または哺乳動物の細胞（例えば、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨｅＬａまたはＣＯＳ細胞））中で産生することができる。このような細胞は、広範囲の供給源（例えば、American Type Culture Collection,Rockland,Md.;例えば、Ausubel et al.,Current Protocol in Molecular Biology,New York:John Wiley and Sons,1997も参照のこと）から入手可能である。形質転換またはトランスフェクションの方法および発現媒体の選択は、選択された宿主系に依存する。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えば、Ausubel et al（上記）に記載されている；発現ビヒクルは、例えば、Cloning Vectors:A Laboratory Manual(P.H.Pouwels et al.,1985,Supp.1987)において提供されているものから選択できる。
【００８９】
本発明のポリペプチドを製造するために、様々な発現系が存在する。このようなポリペプチドを製造するのに有用な発現ベクターは、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルスに由来するベクター、例えば、細菌のプラスミドに由来するベクター、バクテリオファージに由来するベクター、トランスポゾンに由来するベクター、酵母エピソームに由来するベクター、挿入因子に由来するベクター、酵母染色体因子に由来するベクター、バキュロウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター、ならびにそれらの組み合わせに由来するベクターを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
ポリペプチド製造のための特定の細菌発現系の１つは、大腸菌ｐＥＴ発現系（例えば、ｐＥＴ−２８）（Novagen,Inc.,Madison,Wis）である。この発現系によれば、ポリペプチドをコードするＤＮＡを、発現可能なように設計された方向で、ｐＥＴベクターに挿入する。このようなポリペプチドをコードする遺伝子は、Ｔ７調節シグナルの制御下にあるので、ポリペプチドの発現は、宿主細胞中でＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導することによって達成される。これは、典型的には、ＩＰＴＧ誘導に応答してＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主株を使用して達成される。産生されると、組換えポリペプチドは、次いで、当該技術分野において公知の標準的な方法（例えば、本明細書において記載される方法）にしたがって単離される。
【００９１】
ポリペプチド製造のための別の細菌発現系は、ｐＧＥＸ発現系（Pharmacia）である。この系は、遺伝子または遺伝子断片を融合タンパク質として高レベルで発現するように設計されていて、機能的遺伝子産物の迅速な精製および回収を実現するＧＳＴ遺伝子融合系を使用する。目的のタンパク質は、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）に由来するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質のカルボキシル末端に融合しており、グルタチオンセファロース４Ｂを使用してアフィニティークロマトグラフィーによって、細菌溶解物から容易に精製される。融合タンパク質は、グルタチオンで溶出することによる穏やかな条件下で回収することができる。融合タンパク質からのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼドメインの切断は、部位特異的プロテアーゼの認識部位がこのドメインの上流に存在することによって促進される。例えば、ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドで発現されるタンパク質は、トロンビンで切断できる；ｐＧＥＸ−３Ｘで発現されるものは、ファクターＸａで切断できる。
【００９２】
あるいは、本発明の組換えポリペプチドは、メチロトローフ酵母であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現される。ピキアは、唯一の炭素源としてメタノールを代謝できる。メタノール代謝の第一段階は、酵素であるアルコールオキシダーゼによって、メタノールをホルムアルデヒドに酸化することである。ＡＯＸ１遺伝子によってコードされるこの酵素の発現は、メタノールによって誘導される。ＡＯＸ１プロモーターは、ポリペプチドの発現、または目的の遺伝子の構成的発現のためのＧＡＰプロモーターを誘導するのに使用できる。
【００９３】
本発明の組換えポリペプチドが発現されると、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、それを単離する。一例では、本発明のポリペプチドに対して産生された抗体（例えば、本明細書に記載のように製造される）をカラムに結合させて、組換えポリペプチドを単離するのに使用できる。アフィニティークロマトグラフィー前のポリペプチド含有細胞の溶解および分画は、標準的な方法によって実施できる（例えば、Ausubel et al（上記）を参照のこと）。あるいは、ポリペプチドは、ニッケルカラムに結合するヘキサヒスチジンタグなどの配列タグを使用して単離される。
【００９４】
単離されると、遺伝子組換えタンパク質は、所望により、例えば高速液体クロマトグラフィーによって、さらに精製することができる（例えば、Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology,eds.,Work and Burdon,Elsevier,1980を参照のこと）。本発明のポリペプチド、特に短いペプチド断片は、化学合成によっても製造できる（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,1984 The Pierce Chemical Co.,Rockford,III.に記載されている方法によって）。ポリペプチドの発現および精製のこれらの一般的な技術は、有用なペプチド断片または類縁体（本明細書に記載されている）を製造および単離するのにも使用できる。
【００９５】
抗体およびその類縁体
さらに、本発明は、腫瘍細胞の成長、増殖もしくは生存を減少させる能力を高めるか、または阻害しない様式で改変されている、抗体またはその断片（例えば、ヒト／マウスキメラ抗体）を提供する。一実施態様では、本発明は、変化を起こすことによって、キメラ抗体のアミノ酸配列またはキメラ抗体をコードする核酸配列を最適化する方法を提供する。このような変化は、いくつかの突然変異、欠失、挿入または翻訳後修飾を含むことができる。一実施態様では、アミノ酸配列は、プロテアーゼ耐性を高めるように改変される。したがって、本発明は、何れかの天然に存在する本発明のポリペプチドの類縁体をさらに含む。類縁体は、アミノ酸配列の違いにより、または翻訳後修飾により、またはその両方により天然に存在する本発明のポリペプチドと異なってもよい。本発明の類縁体は、一般に、天然に存在する本発明のアミノ酸配列の全部または一部と少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％またはさらに９９％の同一性を示す。配列比較の長さは、少なくとも１０、１３、１５のアミノ酸残基、少なくとも２５のアミノ酸残基、および３５を超えるアミノ酸残基である。この場合も同様に、同一性の程度を決定する例示的な方法において、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ−３からｅ−１００の間における確率スコアにより、近い関係にある配列が示される。改変は、インビボおよびインビトロにおけるポリペプチドの化学的誘導体化（例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化またはグリコシル化）を含む；このような改変は、ポリペプチドの合成もしくは処理、またはその後に続く単離された修飾酵素による処理の期間中に生じさせることができる。類縁体は、一次配列の変化によっても、天然に存在する本発明のポリペプチドと異なっていてもよい。これらは、天然型および誘導型（例えば、放射線照射もしくは硫酸エタンメチルへの曝露によるランダム突然変異誘発、またはSambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.),CSH Press,1989 もしくは Ausubel et al（前掲）に記載されている部位特異的突然変異誘発に起因する）の両方の遺伝子変異体を含む。Ｌ−アミノ酸以外の残基（例えば、Ｄ−アミノ酸）または天然に存在しないアミノ酸もしくは合成アミノ酸（例えば、βアミノ酸またはγアミノ酸））を含む環化されたペプチド、分子および類縁体も含まれる。
【００９６】
全長ポリペプチドに加えて、本発明は、本発明のポリペプチドのいずれか１つの断片も含む。本明細書において使用される「断片」という用語は、長さが少なくとも５、１０、１３または１５のアミノ酸を意味する。他の実施態様では、断片は、少なくとも２０の連続するアミノ酸、少なくとも３０の連続するアミノ酸、または少なくとも５０の連続するアミノ酸、他の実施態様では少なくとも６０から８０またはそれ以上の連続するアミノ酸である。本発明の断片は、当業者に公知の方法によって作製することができるか、または通常のタンパク質処理（例えば、生物学的活性に必要とされないアミノ酸の新生ポリペプチドからの除去、または代替的ｍＲＮＡスプライシング事象もしくは代替的タンパク質処理事象によるアミノ酸の除去）に起因していてもよい。
【００９７】
抗体の機能活性（例えば、抗腫瘍活性、抗原結合活性）を模倣するように設計された化学構造を有する抗体類縁体は、本発明の方法にしたがって投与できる。類縁体設計の方法は当該技術分野において周知であり、類縁体の合成は、得られる類縁体が配列番号２のまたは配列番号２を含むキメラ抗体の抗腫瘍活性を示すように化学構造を改変させることによるような方法にしたがって実施できる。ある特定の実施態様では、抗体類縁体は、インビボでの分解に対して比較的耐性であり、投与によって長期の治療効果をもたらす。機能活性を測定するためのアッセイは、下記の実施例に記載されるているものを含むが、これらに限定されない。
【００９８】
治療薬
本発明は、腫瘍形成の治療に有用であるキメラ抗体を提供する。特定の一実施態様では、本発明のキメラ抗体は、腫瘍の成長、および腫瘍細胞が周囲組織に浸潤するかもしくは転移する傾向を予防または減少させるのに有用である。治療用途の場合、本願明細書に開示されている抗体は、例えば、生理食塩水などの医薬的に許容される緩衝液中に製剤化され、全身投与することができる。ある特定の実施態様では、投与経路は、例えば、継続的、持続的なレベルの薬物を患者に提供する皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、または皮内注射を含む。ヒト患者または他の動物の治療は、生理学的に許容される担体中の、本願明細書において同定される治療薬の治療有効量を使用して実施される。適切な担体およびその製剤は、例えば、E.W.MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences に記載されている。投与される治療剤の量は、投与方法、患者の年齢および体重、ならびに腫瘍形成の臨床症状に応じて変化する。一般に、量は、腫瘍形成に関連する他の疾患の治療において使用される他の薬剤に使用される量の範囲内であるが、場合によっては、化合物の特異性の増大によって、必要とされる量はより少なくなる。
【００９９】
治療方法
本発明の抗体（例えば、本明細書に記載されているマウス抗体およびヒト−マウスキメラ抗体）は、腫瘍性疾患を予防または改善するのに有用である。治療方法の１つでは、本明細書において同定または記載されている薬剤は、疾患に冒された可能性がある組織もしくは疾患に実際に冒された組織の部位に投与されるか、または全身投与される。投与される薬剤の投与量は、個々の患者のサイズおよび健康を含む多数の要因に依存する。何れかの特定の対象に関して、具体的な投薬計画は、個々の必要性、および組成物の投与を実施または監督する者の専門的な判断にしたがって、時間の経過と共に調整されるべきである。
【０１００】
医薬組成物の製剤化
腫瘍形成の治療のための化合物の投与は、他の成分と組み合わせて、腫瘍形成を改善、減少または安定化するのに有効な治療薬の濃度をもたらす何れかの適切な方法によって実施できる。この化合物は、何れかの適切な担体物質に何れかの適切な量で含められてもよく、一般に、組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。この組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内）投与経路に適切な剤形で提供できる。有利な投与方法は、静脈内注入である。医薬組成物は、従来の製薬実務（例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams & Wilkins,2000 およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New Yorkを参照のこと）にしたがって製剤化できる。
【０１０１】
本発明の医薬組成物は、投与時に実質的にすぐに、または投与後の何れかの所定時もしくは所定期間に抗体を放出するように製剤化できる。後者のタイプの組成物は、一般に、（ｉ）長時間にわたり体内に薬物の実質的に一定の濃度をもたらす製剤；（ｉｉ）所定時間遅らせた後に、長時間にわたり体内に薬物の実質的に一定の濃度をもたらす製剤；（ｉｉｉ）活性物質の血漿レベルにおける変動（鋸歯状の動態パターン）に関連する望ましくない副作用を最小限にしつつ、体内において比較的一定した有効レベルを維持することによって、作用を所定期間持続する製剤；（ｉｖ）例えば、放出制御組成物を胸腺に隣接または接触させて空間配置させることによって、作用を局在化させる製剤；（ｖ）例えば、１週間または２週間に１回、用量を投与するような好都合な投与を可能にする製剤；および（ｖｉ）担体または化学的誘導体を使用して、治療剤を特定の細胞型（例えば、腫瘍細胞）に送達することによる腫瘍形成の製剤を含む放出制御製剤として公知である。いくつかの適用について、放出制御製剤は、血漿レベルを治療レベルに維持するための、日中の頻繁な投与の必要性をなくす。
【０１０２】
その放出速度が問題となっている化合物の代謝速度を上回るような制御された放出を得るために、多数の戦略のいずれかを追求することができる。一例では、放出制御は、例えば、様々な種類の放出制御組成物および放出制御コーティングを含む様々な製剤パラメータおよび製剤成分の適切な選択によって得られる。したがって、治療薬は、投与により制御された方法で治療薬を放出する医薬組成物の中に、適切な賦形剤と共に製剤化される。例は、単一の又は複数ユニットの錠剤又はカプセル組成物、油剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームを含む。
【０１０３】
非経口組成物
医薬組成物は、剤形中に、製剤中に又は従来の非毒性の薬学的に許容される担体およびアジュバントを含む適切な送達装置もしくは移植片を介して、（皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内などに）注射、注入または移植によって非経口投与できる。このような組成物の製剤化および調製は、医薬製剤の分野の当業者に周知である。製剤化は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy（上記）に見出すことができる。
【０１０４】
非経口用途の組成物は、単位剤形（例えば、単回用量のアンプル）、または複数回用量を含むバイアルで提供でき、適切な防腐剤を添加できる（以下を参照のこと）。この組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、輸液用器具もしくは移植のための送達装置の形態であってよく、または使用前に水もしくは別の適切な媒体で再構成される乾燥粉末として提供できる。腫瘍形成を減少または改善する活性薬剤とは別に、組成物は、適切な非経口的に許容される担体および／または賦形剤を含んでよい。活性治療剤は、放出制御のために、ミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込める。さらに、組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、等張性調整剤、および／または分散剤を含んでよい。
【０１０５】
上記のように、本発明の医薬組成物は、滅菌注射用の適切な形態にできる。このような組成物を調製するために、適切な治療成分を、非経口的に許容される液状の媒体に溶解または懸濁する。許容される媒体及び溶媒の中で、使用できるものは、水、適切な量の塩化水素酸、水酸化ナトリウムまたは適切な緩衝液を添加することで適切なｐＨに調整された水、１，３−ブタンジオール、リンガー溶液、ならびに生理食塩液およびデキストロース溶液である。水性製剤は、１つ又はそれ以上の防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）も含むことができる。これらの化合物の１つが水にやや溶けにくいか、またはわずかにしか溶けない場合、溶解促進剤または可溶化剤を添加できるか、または溶媒が、１０〜６０重量％のプロピレングリコールなどを含むことができる。
【０１０６】
非経口放出制御組成物
非経口放出制御組成物は、水性懸濁液、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁性ミクロスフェア、油剤、油懸濁液、または乳剤の形態でよい。あるいは、抗体は、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、移植片、または輸液用器具に組み込むことができる。
【０１０７】
ミクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルの調製において使用するための材料は、例えば、ポリグラクチン、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ［Ｎ−２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）］、およびポリ（乳酸）などの生分解性／生体内分解性のポリマーである。非経口放出制御製剤を調製する際に使用される生体適合性担体は、炭水化物（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミン）、リポタンパク質、または抗体である。移植片において使用するための材料は、非生分解性（例えば、ポリジメチルシロキサン）、または生分解性（例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、もしくはポリ（オルトエステル）、またはそれらの組み合わせ）であってよい。
【０１０８】
経口用固形剤形
経口用途製剤は、無毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に有効成分を含む錠剤を含む。このような製剤は、当業者に公知である。賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶性セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）；顆粒化剤および崩壊剤（例えば、微結晶性セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、またはアルギン酸）；結合剤（例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α‐デンプン、微結晶性セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール）；ならびに平滑剤、流動促進剤、および付着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、またはタルク）であってよい。他の薬学的に許容される賦形剤は、着色剤、着香料、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などであってよい。
【０１０９】
錠剤は、コーティングされていなくてもよいし、または随意に胃腸管における崩壊および吸収を遅らせ、それにより、長期間にわたる持続作用を提供するために公知の技術によってコーティングされていてもよい。コーティングは、所定のパターンで（例えば、放出制御製剤を達成するために）活性薬物を放出するように適合させることができるか、または胃を通過するまで活性薬物を放出しないように適合させることができる（腸溶コーティング）。コーティングは、糖コーティング、フィルムコーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレート共重合体、ポリエチレングリコール、および／またはポリビニルピロリドン系）、または腸溶コーティング（例えば、メタクリル酸共重合体、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ポリビニル酢酸フタル酸、セラック、および／またはエチルセルロース系）であってよい。さらに、例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの遅延材料を使用できる。
【０１１０】
固形錠剤組成物は、組成物を望ましくない化学変化（例えば、キメラ抗体の放出前の化学分解）から保護するように適合されたコーティングを含むことができる。コーティングは、Encyclopedia of Pharmaceutical Technology（前記）に記載されているものと同様の様式で固形剤形に適用できる。
【０１１１】
経口用途製剤はまた、咀しゃく錠として、または有効成分を不活性固形希釈剤（例えば、ジャガイモデンプン、ラクトース、微結晶性セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリン）と混合しているハードゼラチンカプセル剤として、または有効成分を水もしくは油媒体（例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、もしくはオリーブ油）と混合しているソフトゼラチンカプセル剤として提供できる。粉剤および顆粒剤は、例えば、混合器、流動床装置、または噴霧乾燥機器を使用して従来の様式で、錠剤およびカプセル剤下で上記成分を用いて調製できる。
【０１１２】
放出制御経口剤形
経口用途放出制御組成物は、例えば、活性物質の溶解および／または拡散を制御することによってキメラ抗体治療薬を放出するように構成できる。溶解又は拡散制御放出は、化合物の錠剤、カプセル剤、ペレット、もしくは顆粒製剤を適切にコーティングすることによって、または化合物を適切なマトリックスに組み込むことによって達成できる。放出制御コーティングは、上記コーティング物質、及び／又は例えば、セラック、蜜蝋、グリコワックス、ひまし油ワックス（ｃａｓｔｏｒ  ｗａｘ）、カルナバワックス、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセロール、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、酢酸絡酸セルロース、塩化ポリビニル、酢酸ポリビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および／またはポリエチレングリコールの１つ又はそれ以上を含むことができる。放出制御マトリックス製剤では、マトリックス材料はまた、例えば、水和メチルセルロース、カルナバワックスおよびステアリルアルコール、カルボポール９３４、シリコーン、トリステアリン酸グリセリル、メチルアクリレート−メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、および／またはハロゲン化フルオロカーボンを含むことができる。
【０１１３】
１つ又はそれ以上の治療化合物を含む放出制御組成物は、浮遊性錠剤または浮遊性カプセル剤の形態（すなわち、経口投与されると、胃内容物の頂部に特定期間浮遊する錠剤またはカプセル剤）であってよい。化合物の浮遊性錠剤製剤は、化合物と、賦形剤および２０〜７５重量％の親水コロイド（例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）との混合物を顆粒状にすることによって調製することができる。次いで、得られた顆粒は、錠剤に圧縮することができる。胃液と接触すると、錠剤は、実質的に水を通さないゲルバリアをその表面の周辺に形成する。このゲルバリアは、１未満の密度を維持するのに関与し、それにより、錠剤は、胃液内で浮遊状態を維持できる。
【０１１４】
併用療法
随意に、本発明のキメラ抗体治療薬は、何れかの他の化学療法薬と併用して投与できる；このような方法は、当業者に公知であり、E.W.MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences に記載されている。
【０１１５】
キット
本発明は、腫瘍形成の治療または予防のためのキットを提供する。一実施態様では、キットは、治療有効量のキメラ抗体を含む治療又は予防用組成物を単位剤形で含む。いくつかの実施態様では、キットは、治療又は予防用細胞組成物を含む滅菌容器を含む；このような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、管、袋、パウチ、ブリスターパック、または当該技術分野において公知の他の適切な容器形態であってよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または薬物を保持するのに適切な他の材料から作ることができる。
【０１１６】
所望により、本発明のキメラ抗体は、癌（例えば、メラノーマ、乳癌）を有するか、またはそれを発症するリスクがある対象にキメラ抗体を投与するための説明書と共に提供される。説明書は、一般に、腫瘍形成の治療または予防のための組成物の使用に関する情報を含む。他の実施態様では、説明書は、以下の少なくとも１つを含む：治療剤の説明；虚血もしくはその症状の治療または予防のための投薬スケジュールおよび投与法；使用上の注意；警告；適応症；禁忌症；過量摂取情報；副作用；動物薬効薬理；臨床研究データ（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ）；および／または参考文献。説明書は、容器（存在する場合は）上に直接印刷するか、またはラベルとして容器に添付するか、または別個のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダーとして容器内もしくは容器と共に提供することができる。
【０１１７】
別段の指示がない限り、本発明の実施には、当業者の十分に範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術が使用される。このような技術は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」，second edition(Sambrook,1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(Gait,1984)；「Animal Cell Culture」(Freshney,1987)；「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」（Weir,1996）；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」（Miller and Calos,1987）；「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubel,1987）；「PCR:The Polymerase Chain Reaction」，（Mullis,1994）；「Current Protocols in Immunology」（Coligan,1991）などの文献に十分説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に適用可能であるため、本発明を作成および実施する際に考慮できる。特定の実施態様に特に有用な技術は、以下のセクションにおいて考察される。
【０１１８】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法をどのように実施し使用するかについての完全な開示ならびに説明を当業者に提供するために提示するものであり、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０１１９】
実施例１：ｍＡｂ４Ｃ５は、重鎖を欠いている。
還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ハイブリドーマ培養物から単離したｍＡｂ４Ｃ５の電気泳動運動性を研究した。この分析により、このマウスモノクローナル抗体は、通常のＩｇＧ分子ではないことが明らかになった。精製したｍＡｂ４Ｃ５を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、その後、抗マウスＦａｂ抗体を用いて免疫ブロッティングすると、通常のＩｇＧ抗体の抗体軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖にそれぞれ対応する典型的な２５ｋＤａおよび５０ｋＤａのバンドが観察されなかった。代わりに、約２５ｋＤａの１本のバンドが見られた（図１Ａ）。興味深いことに、抗カッパＬ鎖抗体を用いて免疫ブロッティングした後に、同じ２５ｋＤａの１本のバンドが得られた（図１Ａ）。したがって、非還元電気泳動し、その後、上記両抗体を用いて免疫ブロッティングした後に、ｍＡｂ４Ｃ５は、１５０ｋＤａではなく約５０ｋＤａに移動したので、通常のＩｇＧ１分子よりも極めて小さいことが示された（図１Ａ）。最後に、還元および非還元の両条件下でｍＡｂ４Ｃ５を電気泳動し、その後、抗Ｆｃγ抗体を使用してウエスタンブロット分析すると、免疫反応性は検出されなかった（図１Ａ）。総合すると、これらのデータにより、ｍＡｂ４Ｃ５は、そのＨ鎖の一部を欠いているか、またはＨ鎖を完全に欠いていることが示された。
【０１２０】
これらの可能性をさらに精査するために、ＩｇＧ１ Ｈ鎖ｃＤＮＡのノーザンブロット分析並びにＰＣＲ増幅を実施した。ｍＡｂ４Ｃ５ハイブリドーマおよびＮＳＯ骨髄腫細胞（陰性コントロール）に由来するＲＮＡをＨ鎖プローブとハイブリダイズすると、陽性コントロールとは対照的に、放射活性は検出されなかった（図１Ｂ）。これらの結果により、ｍＡｂ４Ｃ５は、Ｈ鎖遺伝子を完全に欠いている可能性があることが示された。Ｈ鎖ＰＣＲ増幅実験によって、このことをさらに確認した。ｍＡｂ４Ｃ５のＨ鎖ｃＤＮＡの増幅のために、それぞれ遺伝子の５’及び３’に対する８マウスユニバーサルプライマー及びポリＡ＋プライマーのパネルを、数回の別々のＰＣＲ反応で試験した。試験したすべての条件において、特異的なＨ鎖ＰＣＲ産物の増幅は観察されなかった。これらの総合データは、ｍＡｂ４Ｃ５がＨ鎖を欠いていることを実証している。
【０１２１】
実施例２：ヒト−マウスキメラ抗体を構築した
４Ｃ５を発現するハイブリドーマから、ｍＡｂ４Ｃ５をコードするｃＤＮＡを単離した。ユニバーサルマウスＬ鎖プライマーを使用して、第１螺旋ｃＤＮＡの鋳型から、ｍＡｂ４Ｃ５カッパ鎖遺伝子の最初の増幅を実施した。次いで、全長ｍＡｂ４Ｃ５のＬ鎖に対応する約６５０ｂｐのＰＣＲ産物を、ｐＣｏｍｂ３ＨＳＳベクターのＳａｃＩおよびＸｂａＩ制限部位にサブクローニングした。クローニングしたｍＡｂ４Ｃ５のＬ鎖の配列分析により、それはカッパ鎖サブグループＩに属することが明らかになった（図２）。
【０１２２】
マウスｍＡｂ４Ｃ５のＣκを対応するヒトＣκドメインで置換することによって、ヒト−マウスキメラ４Ｃ５抗体を構築した。いくつかの組換えクローンの配列分析により、キメラマウス−ヒト４Ｃ５の構築が成功したことを確認した。組換え４Ｃ５抗体およびキメラ４Ｃ５抗体の両方を細菌上清中で可溶型に発現させ、精製した。還元および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製した抗体の電気泳動運動性を試験し、元のｍＡｂ４Ｃ５抗体の対応する運動性と類似していることを見出した（図３）。
【０１２３】
実施例３：キメラ４Ｃ５は、ＨＳＰ９０を特異的に認識した。
組換えＬ鎖の特異性を調査するために、市販のポリクローナル抗ＨＳＰ９０α抗体（Chemiconから入手した）、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５を使用して、ＭＤＡＭＢ４５３乳癌細胞溶解物において、ウエスタンブロット分析を実施した。すべての場合において、１本の同じ免疫反応性バンドが観察され（図４Ａ）、これにより、マウス組換えＬ鎖およびキメラヒト−マウスＬ鎖は、父性ｍＡｂ４Ｃ５の特異性を保持していることが確認された。ポリクローナル抗ＨＳＰ９０αを使用して、プレクリアしたＭＤＡＭＢ４５３細胞溶解物において免疫沈降実験を実施し、その後、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５を用いて免疫ブロッティングすることによって、このことをさらに確認した。すべての場合において、１本の免疫反応性バンドが観察されたが、これは、キメラ軽鎖がＨＳＰ９０を特異的に認識したことを示している（図４Ｂ）。ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５を使用して免疫沈降を実施し、その後、ポリクローナル抗ＨＳＰ９０α抗体を用いてウエスタンブロッティングすると、同じ結果が得られた（図４Ｃ）。すべての実験において、無関連のマウスＩｇＧを陰性コントロールとして使用した。
【０１２４】
実施例４：ヒト／マウスキメラ軽鎖抗体は、細胞表面に結合し、ＭＤＡＭＢ４５３細胞により内在化されなかった
過去の研究により、ｍＡｂ４Ｃ５は表面ＨＳＰ９０に特異的に結合することが示されている。キメラ４Ｃ５抗体もこの特徴を保持しているかを調査するために、固定していないＭＤＡＭＢ４５３培養物を組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５のＬ鎖と培養し、２時間培養した後に、細胞を丁寧に洗浄し、固定して、蛍光標識二次抗体で標識した。したがって、一次抗体は、細胞外表面にのみアクセスした。典型的な断続的な免疫染色が観察され、ＨＳＰ９０の細胞表面局在が確認された（図５Ａ）。市販の抗ＨＳＰ９０α、および当然ながらｍＡｂ４Ｃ５を使用して、同様の結果が得られた（図５Ａ）。ＭＤＡＭＢ４５３細胞の固定化及び透過化後の免疫蛍光によって実証されたように、ｍＡｂ４Ｃ５と同様に、キメラ４Ｃ５および組換え４Ｃ５も細胞内ＨＳＰ９０を認識したことは、注目に値する（図５Ｂ）。最後に、様々な時間間隔において、生きているＭＤＡＭＢ４５３への両Ｌ鎖抗体の結合をモニタリングした。抗体と共に３７℃で培養した後に、細胞を固定し、透過処理して、蛍光標識二次抗体で染色した。ｍＡｂ４Ｃ５と同様に、および抗ＨＳＰ９０αとは対照的に、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５は内在化されず、細胞表面上に依然として結合していたことが示された（図５Ｃ）。
【０１２５】
実施例５：キメラ軽鎖は、細胞内ＨＳＰ９０の機能に影響を与えなかった
特定のＨＳＰ９０細胞内クライアントタンパク質のレベルをモニタリングすることによって、キメラＬ鎖抗体の細胞不透過性の重要性を調査した。これまでに、１００個を超える細胞内ＨＳＰ９０クライアントタンパク質が同定されている。これらのタンパク質の安定性は、細胞内ＨＳＰ９０の機能に依存するので、細胞透過性のＨＳＰ９０阻害剤は、これらのタンパク質の分解を誘導する。データにより、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５はすべて、細胞不透過性である可能性が示されているので、３個のよく特徴付けられた細胞内ＨＳＰ９０クライアントタンパク質（Ａｋｔ、ｃＲａｆ、およびＥｒｂＢ２）の安定性にそれらが影響を与える能力を試験した。ＭＤＡＭＢ４５３乳癌細胞を、表示濃度のｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５またはキメラ４Ｃ５のいずれかと培養し、その後、ウエスタンブロッティングによってＡｋｔ、ｃＲａｆ、およびＥｒｂＢ２のレベルをモニタリングした。図５Ｄに示されるように、試験した抗体は、いずれのＨＳＰ９０クライアントタンパク質の定常状態レベルにも影響を与えなかった。
【０１２６】
実施例６：創傷治癒アッセイにおいて、キメラ軽鎖抗体は、ＭＤＡＭＢ４５３癌細胞およびＢ１６Ｆ１０癌細胞の浸潤を阻害した
過去の研究により、創傷治癒アッセイにおいて、ｍＡｂ４Ｃ５は、ＭＤＡＭＢ４５３乳癌細胞およびＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の浸潤を阻害することが示されている。キメラ抗体が親のｍＡｂ４Ｃ５と同じ機能特性を示すかを確認するために、ＭＤＡＭＢ４５３癌細胞およびＢ１６Ｆ１０癌細胞を使用して、インビトロ創傷治癒アッセイを実施した。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、培養培地中のキメラ４Ｃ５の存在は、コントロール培養物と比較して、４８時間後の移動ギャップ内におけるＭＤＡＭＢ４５３癌細胞の浸潤率を有意に減少させた。ＭＤＡＭＢ４５３の浸潤の阻害率は、抗ＨＳＰ９０αならびに親のｍＡｂ４Ｃ５および組換え４Ｃ５を培養培地に含めた場合に得られた阻害率と類似していた（図６Ａおよび図６Ｂ）。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞および漸増濃度のキメラ４Ｃ５を使用する創傷治癒アッセイにおいて、同様の結果が得られた（図６Ｃおよび図６Ｄ）。興味深いことに、メラノーマ細胞の浸潤阻害は用量依存的であり、これは、抗体の特異性を示している（図６Ｄ）。培養培地単独、または無関連のＩｇＧ１抗体２００μｇ／ｍｌを含む培養培地中で、コントロール培養物を成長させた。使用した２種類のコントロールの間で、統計的な有意差は観察されなかったことに注目するのが重要である。図示したコントロール値は、２種類のコントロールの平均値である。
【０１２７】
トリパンブルー染色によって判定すると、ＭＤＡＭＢ４５３細胞の浸潤率に対する抗ＨＳＰ９０α抗体の阻害効果は、少なくとも大部分は、細胞死の増加によるものであったことに注目すべきである（図６Ｅ）。対照的に、培養物をｍＡｂ４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５で処理した場合、細胞死率は、コントロール培養物で観察された細胞死率と類似していた（図６Ｅ）。この結果は、ポリクローナル抗ＨＳＰ９０α抗体とは対照的に、キメラ４Ｃ５は内在化されないため、細胞生存にとって重要なＨＳＰ９０の細胞内プールに影響を与えないことをさらに裏付けている。
【０１２８】
最後に、アクチン再編成の動力学に関して、蛍光標識ファロイジンを使用して、上記培養物を検査した。培養物をキメラＬ鎖に曝露すると、コントロール培養物と比較して、細胞拡散はほとんど観察されず、非運動性細胞を示す形態が見られた。さらに、これらの培養物をより高倍率で可視化すると、コントロール培養物におけるＭＤＡＭＢ４５３の葉状仮足と比較して、葉状仮足はほとんど進展も、広がってもいなかった（図６Ｆおよび図６Ｇ）。これらの結果は、アクチン再編成および葉状仮足の進展に対するｍＡｂ４Ｃ５の効果に関する過去に公開されたデータと一致している。
【０１２９】
実施例７：コロニー形成アッセイにおいて、キメラ軽鎖抗体は、ＭＤＡＭＢ２３１ヒト乳癌細胞によって形成された個々の各コロニーの細胞数を有意に減少させた。
ＭＤＡＭＢ２３１ヒト乳癌細胞のコロニー形成能に影響を与えるキメラ４Ｃ５の能力を精査するために、コロニー形成アッセイを実施した。培養物をキメラＬ鎖に曝露すると、コントロール培養物と比較して、個々の各コロニーの細胞数の有意な減少が観察された。この結果は、キメラ抗体が、ヒト乳癌のコロニーの成長に対する細胞増殖抑制効果を有することを示している。
【０１３０】
本明細書において報告した実験には、ｍＡｂ４Ｃ５という名の抗ＨＳＰ９０マウスモノクローナル抗体のクローニングおよび配列決定が記載されている。より重要なことに、ｍＡｂ４Ｃ５は、通常のＩｇＧ分子ではないが、代わりに、Ｈ鎖を完全に欠いており、κ軽鎖二量体からなることが見出された。ｍＡｂ４Ｃ５が通常とは異なりそれぞれ約２６ｋＤａおよび５０ｋＤａに移動したことを実証している、変性および非変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、このことが最初に裏付けられた。加えて、ｍＡｂ４Ｃ５を産生するハイブリドーマ細胞株から単離した全ＲＮＡを、ＩｇＧ１ Ｈ鎖ｃＤＮＡ放射性標識プローブを使用するノーザンブロットハイブリダイズに付すと、放射活性を検出できなかった。上記結果と一致して、ユニバーサルマウスＨ鎖プライマーを使用して、Ｈ鎖ｃＤＮＡを増幅できなかった。最後に、細菌中に発現させた組換えκ軽鎖は、父性抗体のすべての特性（抗原結合および癌細胞の浸潤のインビトロ阻害を含む）を保持していることが示されたので、ｍＡｂ４Ｃ５の並外れた性質は、何ら疑いの余地がないことが確認された。
【０１３１】
このモノクローナル抗体は、元来１５日齢ラット胚の脳膜画分でマウスを免疫することによって製造され（Thomaidou D,Patsavoudi E.Identification of a novel neuron-specific surface antigen in the developing nervous system,by monoclonal antibody 4C5.Neuroscience.1993;53:813-27）、表面ＨＳＰ９０を特異的に認識し、細胞移動過程中の表面ＨＳＰ９０の機能を阻害することが示された（Sidera K,Samiotaki M,Yfanti E,Panayotou G,Patsavoudi E.Involvement of cell surface HSP90 in cell migration reveals a novel role in the developing nervous system.J Biol Chem.2004;279:45379-88）。加えて、ｍＡｂ４Ｃ５は、癌細胞の浸潤率および転移率を有意に減少させることが示された。より具体的には、この抗体が、メラノーマ細胞の浸潤および転移（Stellas D,Karameris A,Patsavoudi E.Monoclonal antibody 4C5 immunostains human melanomas and inhibits melanoma cell invasion and metastasis.Clin Cancer Res.2007;13:1831-8）ならびに表面ＨＳＰ９０とＨＥＲ−２の細胞外ドメインとの相互作用を阻害し、下流シグナル伝達の障害、およびそれに続いて、インビトロ乳癌細胞浸潤率の減少をもたらすことが実証された（Sidera K,Gaitanou M,Stellas D,Matsas R,Patsavoudi E.A critical role for HSP90 in cancer cell invasion involves interaction with the extracellular domain of HER-2.J Biol Chem.2008;283:2031-41）。
【０１３２】
マウス抗体は、その免疫原性により、ヒトにおけるインビボ治療の使用が制限されていることは周知である。この問題は、キメラマウス−ヒト抗体および完全ヒト抗体を製造するための遺伝子工学的方法を使用して克服されている。ヒト化処理中に抗体の親和性が減少することが多いという事実と併せ、ｍＡｂ４Ｃ５の特殊な性質を考慮して、父性親抗体と同様に表面ＨＳＰ９０に結合し、癌細胞の浸潤を阻害する機能的マウス−ヒトキメラ型にマウスｍＡｂを再構成した。父性マウス抗体のＣ領域を対応するヒトＣ領域で置換することによって改変したキメラ抗体は、父性マウス抗体の特異性および親和性を保持していることが示された。
【０１３３】
抗体分子は、その完全な活性のために、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方を必要とするというのが、一般的に認められている概念である（Sastry L,Alting-Mees M,Huse WD,Short JM,Sorge JA,Hay BN,et al.Cloning of the immunological repertoire in Escherichia coli for generation of monoclonal catalytic antibodies:construction of a heavy chain variable region-specific cDNA library.Proc Natl Acad Sci U S A.1989;86:5728-32）。また、Ｈ鎖は、結合の自由エネルギーへの主な寄与因子であると考えられているが、抗原結合へのＬ鎖の寄与は限定的であると考えられている（Novotny J,Bruccoleri RE,Saul FA.On the attribution of binding energy in antigen-antibody complexes McPC 603,D1.3,and HyHEL-5.Biochemistry.1989;28:4735-49;Ward ES,Gussow D,Griffiths AD,Jones PT,Winter G.Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli.Nature.1989;341:544-6）。後者は、Ｌ鎖を完全に欠いていて、Ｈ鎖ダイマーからなる完全に機能的な抗体のクラスをラクダが有するという事実によってさらに裏付けられている（Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,et al.Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature.1993;363:446-8;Muyldermans S,Cambillau C,Wyns L.Recognition of antigens by single-domain antibody fragments:the superfluous luxury of paired domains.Trends Biochem Sci.2001;26:230-5）。これらの知見との関連において、Ｈ鎖が単独で、特異的な方法で様々な抗原と相互作用する（無傷抗体よりも低い親和性ではあるが）ことが示され、これが、Ｈ鎖に由来する単一ドメイン抗体の使用につながった（Winter G,Milstein C.Man-made antibodies.Nature.1991;349:293-9）。
【０１３４】
これまでに、Ｌ鎖による抗原結合が散発的に実証されている。遊離免疫グロブリン軽鎖の最初の報告は、いわゆるベンスジョーンズタンパク質に関するものであった。これらは、ヒト患者の尿から採取された多発性骨髄腫細胞によって発現されたＬ鎖二量体として報告された（Bradwell AR,Carr-Smith HD,Mead GP,Harvey TC,Drayson MT.Serum test for assessment of patients with Bence Jones myeloma.Lancet.2003;361:489-91）。さらに、大量のＬ鎖が、Ｌ鎖を分泌する腫瘍を有する患者の細胞外液及び組織中に蓄積している（Stevens FJ,Solomon A,Schiffer M.Bence Jones proteins:a powerful tool for the fundamental study of protein chemistry and pathophysiology.Biochemistry.1991;30:6803-5）。１９９３年に、Mei Sun et al.,(Sun M,Li L,Gao QS,Paul S.Antigen recognition by an antibody light chain.J Biol Chem.1994;269:734-8）は、血管活性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）に対するモノクローナル抗体から精製したＬ鎖が、ＶＩＰに対して配列特異的かつ高親和性の結合を示したことを報告した。それに応じて、Nishimura E et al.,(Nishimura E,Mochizuki K,Kato M,Hashizume S,Haruta H,Shirahata S,et al.Recombinant light chain of human monoclonal antibody HB4C5 as a potentially useful lung cancer-targeting vehicle.Hum Antibodies.1999;9:111-24）は、無傷抗体と比較して、抗原に対して有意に高い結合活性を示すλ軽鎖の組換え製造を報告した。さらに、著者らは、この組換え軽鎖が、肺癌の放射免疫イメージングおよび放射免疫療法などの臨床用途に有用な媒体候補として機能することができるという証拠を示した。マウスハイブリドーマによって産生された抗体Ｌ鎖二量体が、ヒトメラノーマ組織に反応したことも報告された（Masat L,Wabl M,Johnson JP.A simpler sort of antibody.Proc Natl Acad Sci U S A.1994;91:893-6）。１９９８年に、Pereira B et al.,(Pereira B,Benedict CR,Le A,Shapiro SS,Thiagarajan P.Cardiolipin binding a light chain from lupus-prone mice.Biochemistry.1998;37:1430-7）は、単一のＬ鎖可変配列が、無傷抗体の親和性と類似の親和性で、カルジオリピン結合に必要なすべての決定基を含むことを示した。より最近では、Dubnovitsky AP et al.,(Dubnovitsky AP,Kravchuk ZI,Chumanevich AA,Cozzi A,Arosio P,Martsev SP.Expression,refolding,and ferritin-binding activity of the isolated VL-domain of monoclonal antibody F11.Biochemistry(Mosc).2000;65:1011-8）は、フェリチンに対するモノクローナル抗体の組換えＶＬドメインがその抗原結合機能を保持していたこと、およびＶＬドメインの抗原結合定数が全長親抗体の抗原結合定数と同程度であることを報告した。
【０１３５】
本明細書において報告した結果は、機能阻害活性を有するＬ鎖二量体の最初の実験的な証拠を示している。より具体的には、本検討は、Ｌ鎖二量体からなる組換え４Ｃ５およびキメラ４Ｃ５の両方が、乳癌細胞を使用して免疫ブロッティング及び免疫蛍光実験で試験されたように、高い特異的活性を有することを明らかにしている。さらにそして、父性抗体と同様に、それらは、インビトロ創傷治癒アッセイによって判定されたように、機能阻害特性を示す。これらの結果は、Ｌ鎖抗体の臨床的適用における包括的アプローチのための新たな理解を提供する。ヒト治療を目的とする場合、組換えＬ鎖抗体は、通常の抗体およびＶＨ抗体を超える多数の利点（すなわち、とりわけ、一定の質で容易かつ再現可能な製造、より高い溶解度および凝集耐性、循環からのより迅速なクリアランス）を有する。特に、ｍＡｂ４Ｃ５の場合、２つのさらなる特性が、そのキメラ化を治療用途に価値あるものにする。第１に、細胞内のＨＳＰ９０の機能を妨げずに、細胞表面上に局在するＨＳＰ９０プールを機能的かつ特異的に阻害するその能力；および第２に、その組成が大部分はヒトのものであるので、臨床状況におけるその免疫原性が最小であること。したがって、キメラＡｂ４Ｃ５の開発は、ヒト悪性腫瘍の治療のための新規なＨＳＰ９０阻害剤の開発における重要な一歩を示す。
【０１３６】
以下の方法および材料を使用して、上記結果を得た。
【０１３７】
ＲＮＡおよびＤＮＡの操作
製造業者の説明書（Stratageneから入手したＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ）にしたがってシリカをベースとしたファイバーマトリックス上での吸収を使用して、１０７個のハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離した。ノーザンブロット分析のために、アガロースゲル上での電気泳動によって２５μｇのＲＮＡを分離し、正電荷のナイロン膜（Bioradから入手したＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ）に転写し、標識した１．２ｋｂ重鎖ＩｇＧ１α ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ＶＨおよびＶＬ抗体断片の増幅のために、製造業者の説明書（Rocheから入手した１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ）にしたがって、ポリＴオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して逆転写によって、特定の第１螺旋ｃＤＮＡを合成した。続いて、表１に示される特定のマウス免疫グロブリンプライマーを使用して、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した。
【０１３８】
【表１】
0005946459.tif 000002
【０１３９】
増幅したＬ鎖ｃＤＮＡ断片を、ｐＣｏｍｂ３ＨＳＳファージミド（generous gift of Drs.C.F.Barbas and D.R.Burton,The Scripps Research Institute,La Jolla,CA）のＳａｃＩ／ＸｂａＩ制限部位に挿入し、Institute of Molecular Biology and Biotechnology(IMBB)の配列決定設備で、両方向に配列を決定した。National Center for Biotechnology Information のＩｇＢＬＡＳＴサーバー（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を使用して、再構成されたＶＬ配列の生殖細胞系対応物を分析し、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを使用して、配列をアライメントした。
【０１４０】
マウス−ヒトキメラＡｂ４Ｃ５の構築
ｍＡｂ４Ｃ５ ＶＬのｃＤＮＡをヒトＣκ遺伝子断片と融合することによって、マウス−ヒトキメラ抗体を構築した。つまり、ｍＡｂ４Ｃ５のκ軽鎖をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫプラスミドにサブクローニングし、次いで、マウスＣκ領域を含むＢｓｇＩ／ＸｂａＩ断片を、ヒトＣκを含むＢｓｇＩ／ＸｂａＩ制限断片で置換した。最後に、ｍＡｂ４Ｃ５のキメラｋＬ鎖遺伝子をｐＣｏｍｂ３ＨＳＳのＳａｃＩ／ＸｂａＩ部位に挿入した。すべてのＤＮＡ操作は、（Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.1989）にしたがって実施した。
【０１４１】
マウスＬ鎖およびキメラＬ鎖の発現ならびに精製
以前に記載されているように（Barbas,C.F.3rd and Burton,D.R.,Monoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries,1994）、個々の細菌コロニーから、可溶性組換え抗体軽鎖を生産し、（Charlton,K.A.,Expression and Isolation of Recombinant Antibody Fragments in E.coli.,Methods Mol.Biol.2004;248:245-54）にしたがって、細菌ペリプラスム画分を抽出し、製造会社の説明書にしたがってＦＰＬＣ ＡＫＴＡ ｓｙｓｔｅｍ（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）でプロテインＬカラム（PIERCE,USA）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１４２】
還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
抗体を含むＦＰＬＣ画分を共にプールし、透析膜（Milliporeから入手したＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を通して遠心分離によって濃縮した。以前に記載されているＬａｅｍｍｌｉの不連続系（Laemmli,U.K.,Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.,Nature.1970;227:680-5）を使用して、還元および非還元条件下で、マウス抗体、組換え抗体およびキメラ抗体の電気泳動運動性を試験した。クマシーＲ染色によって、または特定の二次ＨＲＰ−共役抗カッパ鎖抗体を使用してウエスタンブロットによって、抗体を可視化した。
【０１４３】
細胞溶解物の調製、免疫沈降およびウエスタンブロット分析
以前に記載されているように（Thomaidou,D.and Patsavoudi,E.,Identification of a Novel Neuron-specific Surface Antigen in the Developing Nervous System,by Monoclonal Antibody 4C5.,Neuroscience.1993;53:813-27）、ＭＤＡＭＢ４５３癌細胞溶解物を得て、定量化して、等量の全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロースに転写した。この膜を、脱脂粉乳（５％）を用いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝食塩水（「ＴＢＳ」）中、室温で４０分間ブロットして、非特異的な結合部位をブロッキングし、次いで、特定の一次抗体と共に、４℃で一晩培養した。この膜を、ＴＢＳに溶解させた０．３％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）で洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗カッパ鎖二次抗体と共に、室温で２時間培養した。ＴＢＳで洗浄した後に、製造業者によって記載されているように、ＤＡＢおよび／または化学発光試薬（Amershamから入手したＥＣＬ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ）、ならびにＸ線フィルム（Kodakから入手したＸＯＭＡＴ−ＡＲ  ｆｉｌｍ）への曝露を用いて、結合した抗体複合体を検出した。
【０１４４】
以前に記載されているように（Sidera,K.et al.,A Critical role for HSP-90 in Cancer Cell Invasion Involves Interaction with the Extracellular Domain of HER-2.,J.Biol.Chem.,2008;283:2031-41）、免疫沈降を実施した。つまり、等量のプレクリアしたＭＤＡＭＢ４５３癌細胞溶解物を、抗体と共に４℃で一晩培養した。次いで、免疫複合体を、プロテインＧセファロースと共に室温で２時間培養して、溶解緩衝液で３回洗浄した。ゲル電気泳動した後にウエスタンブロットによって、結合したタンパク質を分析した。すべての免疫沈降実験に関して、陰性コントロールは無関連のＩｇＧを使用して実施した。
【０１４５】
細胞培養および免疫蛍光
１０％ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）を補充したＲＰＭＩ中で、ＭＤＡＭＢ４５３乳癌細胞株を保持した。免疫蛍光研究のために、細胞を、４８ウェルプレート中、細胞５ｘ１０４個／ウェルの密度で、ポリＬリシンをコーティングしたカバースリップ上にプレートして、１０％ＦＢＳを補完したＲＰＭＩ培地中で培養した。以前に記載されているように（Thomaidou,D.and Patsavoudi,E.,Identification of a Novel Neuron-specific Surface Antigen in the Developing Nervous System,by Monoclonal Antibody 4C5.,Neuroscience.1993;53:813-27）、２４時間後に細胞を固定し、間接免疫蛍光のために処理した。以前に報告されているように（Sidera,K.et al.,Involvement of Cell Surface HSP90 in Cell Migration Reveals a Novel Role in the Developing Nervous System.,J.Biol.Chem.,2004;279:45379-88）、間接免疫蛍光によって、生きているＭＤＡＭＢ４５３細胞を標識した。Ａｌｅｘａ５４６標識ファロイジン（Molecular Probes,Eugene,OR）を、Ｆアクチンを可視化するのに使用した。すべての実験に関して、コントロールは、一次抗体を省略することによって、及び／又は無関連の神経タンパク質ＢＭ８８に対するＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を使用して実施した。Ｌｅｉｃａ ＴＳＣ共焦点顕微鏡を使用して共焦点顕微鏡法によって、免疫蛍光を分析した。
【０１４６】
抗体内在化アッセイ
ＭＤＡＭＢ４５３細胞を、等濃度の抗体を含む培養液中で、２、８および２４時間培養した。次いで、細胞をＲＰＭＩ中で洗浄して、固定した。あらゆる内在化された抗体の検出のために、細胞を、ＰＢＳに溶解した０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過化し、続いて、Ａｌｅｘａ４８８共役二次抗体（Molecular Probes,Eugene,OR）と培養した。すべての実験に関して、コントロールは上記のように実施した。
【０１４７】
創傷治癒アッセイ
以前に記載されているように（Sidera,K.et al.,A Critical role for HSP-90 in Cancer Cell Invasion Involves Interaction with the Extracellular Domain of HER-2.,J.Biol.Chem.,2008;283:2031-41）、アッセイを実施した。つまり、ＭＤＡＭＢ４５３およびＢ１６Ｆ１０を、４８ウェルプレート中、それぞれ細胞１ｘ１０５個／ウェルおよび細胞２．５ｘ１０５個／ウェルの密度で、ポリＬリシンをコーティングしたカバースリップ上にプレートした。２４時間後に培地を無血清ＲＰＭＩに交換し、その１６時間後に、細胞単層を滅菌イエローギルソンピペットチップで穏やかにスクラッチし、それにより、約１ｍｍ幅の無細胞領域を形成することによって、無細胞領域を作成した。スクラッチした後すぐに、培地を、抗ＨＳＰ９０α抗体、ｍＡｂ４Ｃ５、組換え４Ｃ５またはキメラ４Ｃ５を含む新鮮培地に交換した。アッセイ期間中は、すべての薬剤を培養物中に保持した。
【０１４８】
コントロール培養物を、培養培地単独（ＲＰＭＩ）、または無関連のタンパク質ＢＭ８８に対するＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（濃縮した無血清ハイブリドーマ上清）を含む培養培地中で成長させた。コンピュータに接続したＬＥＩＣＡ ＤＭ３００ビデオカメラを備えるＬｅｉｃａ ＤＭ ＩＬ倒立顕微鏡を使用して、所定の時間間隔で、ギャップ内における癌細胞の移動を顕微鏡でモニタリングした。Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ分析ソフトウェアを使用してデジタル画像を取得および分析することによって、移動距離を評価し、コントロール培養物中の細胞によって覆われた距離のパーセントとして表した。スチューデントＴ検定を使用することによって、統計的分析を実施した。
【０１４９】
トリパンブルー染色
創傷治癒アッセイの終了時点に、ＭＤＡＭＢ４５３細胞を、ＰＢＳに溶解した０．４％トリパンブルーと５分間培養した。過剰な染色を除去し、細胞をＬｅｉｃａ顕微鏡で可視化した。
【０１５０】
コロニー形成アッセイ
以前に記載されているように（Franken N et al.,Clonogenic assay of cells インヒ゛トロ Nature Protocols 2006;1;2315-2319）、コロニー形成アッセイを実施した。すなわち、ＭＤＡＭＢ２３１単個細胞懸濁液を、細胞５００個／ウェルの密度で６ウェルプレート上に播種し、培養培地単独、または２００μｇ／ｍｌのキメラ４Ｃ５を含む培養培地中で培養した。３日毎に培地を交換し、ギムザ染色前に２週間コロニーを成長させた。
【０１５１】
他の実施態様
前記説明から、本明細書に記載されている本発明を変更および修正して、様々な用途および状況に適合させることができるのは明らかである。このような実施態様も、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１５２】
本明細書における可変基のすべての定義における要素の一覧の記載は、すべての単一要素または一覧に挙げられている要素の組み合わせ（または、サブコンビネーション）としてのその可変基の定義を含む。本明細書における実施態様の記載は、すべての単一の実施態様又はすべての他の実施態様若しくはその一部との組み合わせとしてのその実施態様を含む。
【０１５３】
参照による組み込み
本明細書において引用されるすべての特許、公開された特許出願および他の参考文献の内容はすべて、それらの全体が参照により本明細書に明確に組み込まれている。
【０１５４】
均等物
当業者であれば、本明細書において記載されている具体的な手順の多数の均等物を認識する、又は日常の実験のみを用いて確認できる。このような均等物は、本発明の範囲内であるとみなされ、以下の特許請求の範囲に包含される。
【０１５５】
配列表
配列表、配列番号１、ｍＡｂ ４Ｃ５をコードするヌクレオチド配列に対応する：
GAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAACAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCTCGGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAGGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTATCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
配列表、配列番号２、ｍＡｂ ４Ｃ５のアミノ酸配列に対応する：
ELVMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTINSLEYEDMGIYYCLQYDEFPRLTFGAGTRLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列表、配列番号３、キメラ４Ｃ５のヌクレオチド配列に対応する：
GAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAACAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCTCGGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAGGCTGGAGCTGAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGGACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
配列表、配列番号４、キメラ４Ｃ５およびｃｈ４Ｃ５Δｃｙｓ（ただし後者は下線を引いた３’末端のＣ末端システインを欠く）のアミノ酸配列に対応する：
ELVMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTINSLEYEDMGIYYCLQYDEFPRLTFGAGTRLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列表、配列番号５、４Ｃ５のＣＤＲ１のアミノ酸配列に対応する：
KASQDINSYLS
配列表、配列番号６、４Ｃ５のＣＤＲ２のアミノ酸配列に対応する：
RANRLVD
配列表、配列番号７、４Ｃ５のＣＤＲ３のアミノ酸配列に対応する：
LQYDEFPRLT
【図２】
0005946459.tif 000003
【図１】
0005946459.tif 000004
【図３】
0005946459.tif 000005
【図４】
0005946459.tif 000006
【図５】
0005946459.tif 000007
【図６】
0005946459.tif 000008
【図７】
0005946459.tif 000009
【配列表】
0005946459000001.app