(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-アミラーゼ活性を備えるポリペプチド変異体であって、親α-アミラーゼとしてのAmyE (SEQ ID NO: 1)に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性または親α-アミラーゼとしてのAmyE切断変異体(SEQ ID NO: 2)に対し少なくとも92%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、下記群から選択される1つの位置が修飾されており、親ポリペプチドよりも高いマルトース及びマルトヘプタオース基質からグルコースへの転換能力を示す、ポリペプチド変異体：153K, 153N, 及び153F。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチド変異体を含む洗剤組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチド変異体を含む澱粉転換用組成物。
【請求項４】
さらにグルコアミラーゼ活性を有する別のポリペプチドを含有する、請求項３に記載の澱粉転換用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は2008年6月6日に出願した米国仮出願61/059,513及び61/059,618に基づく優先権を主張するとともに、これらの出願を参照として本願に組み込む。
【０００２】
本願はバシラス・スブチリス(AmyE)由来のアルファ-アミラーゼ、及びその変異体、及びこの変異体をコードする核酸、及びこの核酸を備える宿主細胞に関する。また、AmyEまたはその変異体を、澱粉の液化および／または糖化等に使用する方法に関する。この方法により、エタノールの製造または高フラクトースコーンシロップの製造において有用な糖を生産することができる。本願のアミラーゼは、低pHにおいてカルシウムおよび／またはグルコアミラーゼの非存在下で使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
穀粒、穀物、及び例えばコーンスターチ等の植物性澱粉は、シロップやバイオ燃料等の工業製品の製造において広く用いられている。例えば、高フラクトースコーンシロップ(HFCS)は、高フラクトース含有量の砂糖に匹敵する甘みを有するコーンシロップの加工された形態であり、HFCSはソフトドリンク用や他の加工食品用の砂糖代替物として有用である。現在のHFCSの市場規模は非常に大きい。バイオ燃料用のエタノールの生産は急速に拡大している。
【０００４】
シロップ及びバイオ燃料は、澱粉を原料として、澱粉からグルコースへの分解を触媒する酵素プロセスにより製造される。この酵素プロセスでは、以下の酵素触媒反応が順次生じる。
【０００５】
(1) 液化：アルファ(α)-アミラーゼ(EC 3.2.1.1)は、先ず30-40% w/wの乾燥固体成分(ds)を含む澱粉懸濁液のマルトデキストランへの分解を触媒する。α-アミラーゼは内部α-1,4-D-グルコシド結合のランダムな切断を触媒するエンドヒドロラーゼである。通常の液化は、例えば90-100℃の高温で行われるため、この工程では例えばバシラス属由来のα-アミラーゼ等の熱安定性α-アミラーゼが好ましい。現在この工程で用いられている、例えばB. リケニホルミス(licheniformis), B. アミロリケファシエンス(amyloliquefaciens),及びB. ステアロサーモフィリス(stearothermophilus) (AmyS)由来のα-アミラーゼは、多量のグルコースを産出することができない。得られた液化物はむしろ低デキストロース等量(DE)であり、高重合度(DPn)のマルトースと糖を含有する。
【０００６】
(2) 糖化：グルコアミラーゼおよび／またはマルトース生産型α-アミラーゼは、液化後に生じたマルトデキストランの非還元末端の加水分解を触媒して、D-グルコース、マルトース、及びイソマルトースを生じさせる。糖化により、グルコースリッチまたは高マルトースのシロップが得られる。前者の場合、グルコアミラーゼは通常、例えば60℃、pH 4.3のような、高温で酸性の条件下において糖化を触媒する。通常、このプロセスで用いられるグルコアミラーゼは、例えばOPTIDEXTM L400に用いられているアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、またはフミコーラ・グリセア(Humicula grisea) グルコアミラーゼ等のように、菌類から得られる。プルラナーゼ等の脱分岐酵素は、糖化を助成する。
【０００７】
また、マルトース生産型α-アミラーゼは高マルトースシロップを生成する糖化反応を触媒する。通常マルトース生産型α-アミラーゼはグルコアミラーゼよりも最適pHが高く、最適温度は低い。また、通常マルトース生産型α-アミラーゼはCa2+を必要とする。現在この用途に用いられているマルトース生産型α-アミラーゼは、B. スブチリスα-アミラーゼ、植物性アミラーゼ、及びアスペルギルス・オリザエ(oryzae)由来のα-アミラーゼ、CLARASETM Lの活性成分等である。種々の製品の製造に用いられる糖化反応の例を、下記に示す。
【化１】
0005933619.tif 000002
【０００８】
(3) 下流プロセス：このプロセスの分岐点は、上記の反応系路の左側に示したグルコースリッチシロップを生産した後にある。最終製品がバイオ燃料である場合、酵母によりグルコースリッチシロップを発酵させてエタノールに得ることができる。一方、最終製品がフラクトースリッチシロップである場合、グルコースイソメラーゼがグルコースリッチシロップからフラクトースへの転換を触媒する。
【０００９】
グルコースリッチシロップの製造における律速段階は糖化工程である。通常、糖化工程は48-72時間行われる。この間に多数のグルコアミラーゼが活性を失う。さらに、α-アミラーゼとグルコアミラーゼの両者とも糖化を触媒するが、上記のように、これらの酵素の最適pH及び最適温度は異なる。これらの酵素を順次使用する場合、この2つの酵素の反応条件が異なるためpH及び温度の調整が必要になる結果、プロセスの遅延が生じ、不溶性アミロース凝集体が生成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のように、澱粉から工業製品を製造するための改良されたプロセス求められている。特に糖化工程における効率の改良が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願は、バシラス・スブチリス(AmyE)由来のα-アミラーゼ及び関連するポリペプチドの組成物、及び方法に関する。AmyEα-アミラーゼはpH5.0以下、あるいはpH4〜4.5において高い比活性度を示すことを特徴とする。さらに、AmyEの熱安定性はCa2+に影響されないため、澱粉液化または糖化工程においてCa2+を外来栄養として添加する必要がない。AmyEポリペプチドの有するこれらの特徴により、液化工程と糖化工程の間に反応混合物のpHを調整することなく、液化と糖化を同一の反応混合物(あるいは同じ反応器)において行うことが可能になる。特に、AmyEとグルコアミラーゼを用いる場合、反応条件を調整する必要がないため、液化工程と糖化工程の間の工程および時間の遅れと、不溶性アミロースの凝集の発生を回避することができる。従って、グルコアミラーゼに適したpH及びCa2+濃度においてAmyEとグルコアミラーゼとを順次または同時に用いて、澱粉の液化および／または糖化を行なうことが可能になる。AmyEはグルコアミラーゼ活性も有するため、糖化工程において、グルコアミラーゼ活性を有する別のポリペプチドを添加する必要がなくなるか、あるいは添加量を低減することができる。
【００１２】
一態様では、澱粉転化プロセスにおける液化及び糖化方法が提供され、この方法では、澱粉基質をAmyEポリペプチドと接触させて、澱粉基質を液化及び糖化してグルコースを製造するための反応混合物を調製する工程が含まれ、液化及び糖化を、pH調製を行うことなく同一の反応混合物中で行う。
【００１３】
いくつかの実施形態では、糖化工程(すなわち糖化)を、グルコアミラーゼ活性を有する別のポリペプチドを添加せずに行なう。いくつかの実施形態では、液化工程(すなわち液化)を、グルコアミラーゼポリペプチドの活性に適したpHにおいて行う。いくつかの実施形態では、pHは5.0以下である。いくつかの実施形態では、pHは4.5以下である。いくつかの実施形態では、pHは4.0以下である。いくつかの実施形態では、反応混合物に外来栄養としてのカルシウムを添加しない。いくつかの実施形態では、反応混合物中のカルシウム濃度は約8ppm未満である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、澱粉基質をAmyEポリペプチドに接触させる前に、グルコアミラーゼ活性を有する別のポリペプチドを反応混合物に添加する。いくつかの実施形態では、澱粉基質をAmyEポリペプチドに接触させた後に、グルコアミラーゼ活性を有する別のポリペプチドを反応混合物に添加する。いくつかの実施形態では、澱粉基質をAmyEポリペプチドに接触させるときに、グルコアミラーゼ活性を有する別のポリペプチドを反応混合物に添加する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、液化及び糖化により生成したグルコースを発酵させて、アルコール等のバイオ燃料を製造することが含まれる。いくつかの実施形態では、アルコールはエタノールである。いくつかの実施形態では、アルコールはブタノールである。いくつかの実施形態では、SSFの場合のように、糖化の少なくとも一部と発酵が同一反応混合物中で同時に行われる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、クローズドシステムのバッチ式発酵プロセスが用いられ、反応混合物の組成(pHを含む)を発酵開始時に選択し、発酵中は変更しない。別の実施形態では、「流加発酵」システムが用いられ、発酵の進行に伴い澱粉基質を段階的に添加する。また別の実施形態では、連続発酵システムが用いられ、バイオリアクターに所定量の発酵培地を連続的に供給するとともに、等量の反応済みの反応混合物を取り出してさらに加工する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、糖化された澱粉溶液を、HFCS等のフラクトース-澱粉ベースシロップ(HFSS)に転換する。HFSSへの転換は、pH約6.0から約8.0、例えばpH7.5において触媒され、製品にはフラクトースが約40-45%含まれる。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、液化及び糖化により生成したグルコースにグルコースイソメラーゼを接触させて、フラクトース(例えばHFCSの形態)を製造する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、反応混合物に外来栄養としてのカルシウムを添加しない。いくつかの実施形態では、反応混合物中のカルシウム濃度は約8ppm未満である。いくつかの実施形態では、この方法にはさらに、液化及び糖化により生成したグルコースにグルコースイソメラーゼを接触させて、反応混合物中のカルシウムの量を減らすことなくフラクトース(例えばHFCSの形態)を製造する工程が含まれる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、反応混合物中の乾燥固体成分(ds)1トン当たりに約0.03〜1 kgの量のAmyEポリペプチドを添加する。いくつかの実施形態では、反応混合物は約20〜35%のds (w/w)を含む澱粉のスラリーである。糖化反応は、約60℃から約90℃、例えば70℃から85℃の温度、あるいは澱粉ゲル化温度(すなわち約75℃)より10, 12, 14, 16, 18, または20℃低い温度と、約4.0から約6.0、例えば約4.2から約4.8のpHにおいて行われる。いくつかの実施形態では、糖化反応の生成物はグルコース-リッチなシロップである。グルコース濃度は少なくとも約95% w/w dsに達する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、AmyEポリペプチドは天然のAmyEポリペプチドであり、例えば、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 3に示すアミノ酸配列を有するAmyEポリペプチドであり、あるいは、例えばBLAST配列アライメント法で測定したときSEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列に対し少なくとも約85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%の配列同一性を示すアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、この発明の方法で用いるAmyEポリペプチドは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列に対し少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、この発明の方法で用いるAmyEポリペプチドは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列に対し少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、この発明の方法で用いるAmyEポリペプチドは、C-末端澱粉結合ドメインに欠失を有する。いくつかの実施形態では、C-末端に欠失を有するAmyEポリペプチドは、SEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を有するか、またはSEQ ID NO: 2に対し配列同一性を少なくとも約85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、AmyEポリペプチドは、残基D425(SEQ ID NO: 1参照)から切断される。
【００２１】
別の態様では、有益な性質を有するAmyE変異体が提供される。AmyE変異体は、野生型AmyEポリペプチドとの比較において改変された性質を有し、例えば澱粉、マルトヘプタオース、および／またはマルトトリオース基質に対する比活性度、基質特異性、熱安定性、最適温度、最適pH、pHおよび／または温度範囲、耐酸化性、澱粉組成物の粘度を下げる効果等の性質が改変されている。いくつかの実施形態では、AmyE変異体の改変された性質は、特定のコーン粉、マルトトリオース、マルトヘプタオース基質に対する特定のpH(例えば4または5.8)における比活性度、特定の温度(例えば60℃)における熱安定性、または特定のpH(例えばpH 8または10)における洗浄性能に関する。改変された性質は性能指数(PI)によって表すことができる。ここでPIは、AmyE変異体を野生型AmyEと比較した比率である。いくつかの実施形態では、PIは約0.5より大きく、別の実施形態ではPIは約1か、または1より大きい。
【００２２】
一態様ではポリペプチド変異体はα-アミラーゼ活性と、酵素活性を向上させる少なくとも1の改変された性質とを有し、ポリペプチド変異体は、AmyE (SEQ ID NO: 1)から選択される親α-アミラーゼポリペプチド、または切断変異体であるAmyE (SEQ ID NO: 2)に対し、アミノ酸配列同一性を少なくとも60%有し、以下に示す群から選択される1以上の位置に修飾を有する：
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び425。
これにより、修飾によって、酵素活性を向上させる少なくとも1の性質の性能指数(PI)が1より大きいポリペプチド変異体が生じる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体には次の群から選択される1以上の位置に修飾を有する：
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 140, 141, 142, 143, 144, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 179, 180, 181, 184, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び 425。
これにより、修飾によって、タンパク質発現に関する性能指数(PI)が0.5より大きく、酵素活性を向上させる少なくとも1の性質の性能指数(PI)が1.1より大きいポリペプチド変異体が生じる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、1以上の位置は次の群から選択される：
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び 425。
これらの位置は、全長親ポリペプチド、または切断親ポリペプチドの性能発現に関し不完全拘束である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、修飾は、次の群から選択される1以上の位置における、親ポリペプチド中の1以上のアミノ酸残基の別のアミノ酸残基への置換である：
1A, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 10A, 10I, 10L, 10M, 10N, 10P, 10Q, 10S, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 11S, 11V, 11W, 11Y, 12I, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13I, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 16I, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 17I, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 20S, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 21I, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 22I, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 25I, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26I, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30I, 30K, 30L, 30M, 30N, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33I, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 34I, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 36I, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 39I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 40A, 40D, 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 45I, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 46I, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 48I, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 49I, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 53I, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 54I, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 55I, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 57I, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 60A, 60C, 60D, 60E, 60G, 60I, 60K, 60L, 60M, 60N, 60Q, 60R, 60T, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 62I, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 64I, 64L, 64M, 64N, 64S, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 65I, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 65S, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 66I, 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66W, 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 67I, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 67S, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 68I, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 68Y, 69A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 70A, 70E, 70H, 70N, 70S, 71S, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72L, 72P, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 73I, 73K, 73L, 73M, 73P, 73S, 73T, 73V, 73W, 74A, 74E, 74F, 74M, 74S, 74T, 74Y, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 76I, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76S, 76V, 76Y, 77A, 77C, 77D, 77G, 77H, 77I, 77K, 77L, 77R, 77S, 77T, 77V, 77W, 77Y, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 79Q, 79S, 79T, 80A, 80L, 80M, 80W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 81I, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, 83F, 83I, 83L, 83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 84I, 84K, 84M, 84N, 84Q, 84S, 84T, 84V, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85L, 85M, 85N, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C, 88D, 88F, 88G, 88H, 88I, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 89I, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90C, 90D, 90E, 90F, 90G, 90H, 90I, 90K, 90L, 90M, 90N, 90Q, 90R, 90S, 90T, 90V, 90W, 91A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L, 91M, 91N, 91P, 91Q, 91R, 91S, 91T, 91W, 91Y, 92L, 92N, 92T, 92V, 93A, 93C, 93D, 93E, 93F, 93G, 93I, 93L, 93M, 93N, 93P, 93Q, 93R, 93S, 93T, 93V, 93W, 93Y, 94A, 94C, 94I, 94M, 94T, 95A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 96I, 96L, 96M, 96P, 96T, 97A, 97E, 97M, 97W, 98C, 98G, 98I, 98L, 98M, 98T, 98V, 99A, 99C, 99E, 99F, 99G, 99I, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T, 100A, 100C, 100F, 100M, 100N, 100P, 100T, 100V, 100Y, 101A, 102A, 102G, 102Q, 102S, 102W, 102Y, 103A, 103C, 103I, 103M, 103N, 103S, 103V, 104A, 104C, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T, 105V, 105W, 105Y, 106A, 106C, 106E, 106F, 106H, 106I, 106K, 106L, 106M, 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 107I, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 108I, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 109I, 109K, 109L, 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T, 109V, 109W, 109Y, 110L, 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 111I, 111K, 111L, 111M, 111N, 111P, 111Q, 111R, 111T, 111V, 111W, 111Y, 112A, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G, 112H, 112I, 112K, 112L, 112M, 112P, 112Q, 112R, 112S, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 113I, 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 113Q, 113S, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 115I, 115L, 115M, 115N, 115Q, 115R, 115S, 115T, 115V, 115W, 115Y, 116A, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 116I, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 117F, 117L, 117N, 117Q, 117V, 117W, 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E, 118F, 118G, 118H, 118I, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119R, 119S, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 121S, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 124I, 124K, 124M, 124Q, 124R, 124S, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 125I, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 125Q, 125R, 125S, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127M, 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 129I, 129K, 129L, 129M, 129R, 129S, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 130I, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131M, 131N, 131Q, 131R, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 132I, 132L, 132M, 132N, 132Q, 132S, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 134I, 134L, 134M, 134N, 134R, 134S, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N, 135Q, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 141Q, 141S, 141T, 141V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 143Q, 143R, 143S, 143W, 144G, 144S, 144T, 144V, 144W, 145W, 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 147I, 147L, 147N, 147P, 147Y, 148A, 148C, 148F, 148H, 148K, 148M, 148R, 148Y, 149S, 150A, 150H, 150N, 150S, 151A, 151C, 151D, 151E, 151F, 151G, 151H, 151I, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151R, 151S, 151T, 151V, 151Y, 152A, 152C, 152D, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153A, 153C, 153D, 153E, 153F, 153G, 153H, 153I, 153K, 153L, 153M, 153N, 153P, 153R, 153S, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 154C, 154I, 154N, 154P, 154Q, 154S, 154T, 154Y, 155A, 155C, 155E, 155F, 155G, 155H, 155I, 155L, 155M, 155T, 155V, 155W, 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, 156I, 156K, 156L, 156N, 156Q, 156R, 156T, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C, 157F, 157H, 157I, 157M, 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 158I, 158M, 158Q, 158S, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 159I, 159L, 159M, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 160S, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 161G, 161H, 161K, 161L, 161M, 161N, 161S, 162A, 162C, 162E, 162F, 162I, 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 163I, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 164I, 164L, 164M, 164N, 164Q, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 165I, 165L, 165M, 165Q, 165S, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 166I, 166K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 166T
, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168I, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 171I, 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 173I, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 174Q, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175W, 175Y, 176E, 176F, 176I, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 177G, 177M, 177Q, 177S, 178C, 178G, 178M, 178S, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 179I, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 184I, 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 187T, 187V, 187W, 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 188I, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 192I, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 192S, 192T, 192V, 193A, 193I, 193L, 193M, 194I, 195A, 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 195I, 195K, 195L, 195M, 195N, 195Q, 195R, 195S, 195T, 195V, 195W, 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 196I, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196W, 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 197S, 197T, 197V, 198A, 198C, 198G, 198H, 198I, 198L, 198M, 198N, 198R, 198S, 198V, 199A, 199C, 199D, 199E, 199F, 199G, 199H, 199I, 199L, 199M, 199P, 199R, 199S, 199T, 199V, 199Y, 200A, 200C, 200D, 200E, 200F, 200G, 200H, 200I, 200K, 200L, 200M, 200N, 200P, 200Q, 200R, 200S, 200V, 200W, 200Y, 201A, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201I, 201K, 201L, 201M, 201N, 201P, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202F, 202G, 202I, 202K, 202L, 202M, 202N, 202P, 202Q, 202R, 202S, 202T, 202V, 202Y, 203A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203N, 203P, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 204A, 204C, 204E, 204I, 204L, 204M, 204T, 204V, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205D, 205E, 205F, 205G, 205H, 205I, 205K, 205L, 205M, 205N, 205R, 205S, 205T, 205V, 205W, 205Y, 206F, 207A, 207C, 207M, 208K, 208N, 208R, 209C, 209F, 209L, 209M, 209T, 209V, 210F, 210I, 210V, 210W, 211A, 211C, 211D, 211E, 211G, 211H, 211M, 211P, 211S, 211T, 211W, 211Y, 212A, 212C, 212E, 212G, 212H, 212N, 212P, 212Q, 212S, 212T, 212Y, 213A, 213C, 213D, 213E, 213F, 213G, 213H, 213I, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 214I, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 215A, 215C, 215H, 215T, 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 217I, 217K, 217M, 217N, 217P, 217Q, 217R, 217S, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 218I, 218K, 218L, 218M, 218N, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219K, 219L, 219M, 219N, 219Q, 219R, 219S, 219T, 219V, 219W, 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 221I, 221L, 221M, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221V, 221Y, 222A, 222C, 222D, 222F, 222G, 222I, 222K, 222M, 222P, 222R, 222S, 222T, 222V, 223A, 223C, 223E, 223F, 223H, 223I, 223L, 223M, 223N, 223Q, 223V, 223W, 224I, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225E, 225F, 225H, 225I, 225K, 225L, 225M, 225N, 225P, 225Q, 225S, 225T, 225V, 225W, 225Y, 226A, 226C, 226F, 226I, 226L, 226M, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 227S, 228C, 228D, 228M, 228N, 228P, 228S, 228T, 228V, 229C, 229D, 229E, 229F, 229G, 229H, 229M, 229N, 229Q, 229R, 229T, 229V, 229Y, 230A, 230D, 230E, 230F, 230G, 230H, 230I, 230K, 230M, 230P, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231A, 231C, 231H, 231L, 231M, 231Q, 231W, 232A, 232C, 232M, 232N, 232Q, 232S, 232Y, 233A, 233C, 233D, 233E, 233F, 233G, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233P, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235C, 235F, 235L, 235M, 235T, 236A, 236C, 236D, 236E, 236G, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236Q, 236S, 236T, 237A, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 237I, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239A, 239E, 239F, 239I, 239M, 239T, 240A, 240C, 240D, 240E, 240F, 240G, 240H, 240I, 240L, 240M, 240N, 240Q, 240R, 240S, 240T, 240V, 240W, 240Y, 241A, 241C, 241D, 241E, 241F, 241G, 241H, 241I, 241K, 241L, 241M, 241P, 241Q, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242E, 242F, 242I, 242K, 242L, 242M, 242Q, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243A, 243C, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244A, 244F, 244I, 244M, 244T, 244V, 244W, 244Y, 245A, 245C, 245D, 245F, 245H, 245I, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246A, 246C, 246D, 246E, 246F, 246G, 246H, 246I, 246K, 246L, 246P, 246Q, 246R, 246S, 246T, 246W, 246Y, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247P, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248A, 248C, 248E, 248F, 248G, 248H, 248I, 248K, 248L, 248M, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249E, 249F, 249H, 249L, 249M, 249P, 249S, 249V, 249Y, 250A, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250I, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251I, 251K, 251L, 251M, 251N, 251P, 251Q, 251R, 251V, 251Y, 252C, 252D, 252E, 252F, 252G, 252H, 252I, 252K, 252L, 252M, 252Q, 252R, 252S, 252T, 252V, 252W, 253C, 253E, 253F, 253G, 253H, 253I, 253K, 253L, 253M, 253P, 253R, 253S, 253T, 253V, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255A, 255C, 255E, 255F, 255G, 255I, 255K, 255L, 255N, 255P, 255Q, 255R, 255S, 255T, 255V, 255W, 255Y, 256A, 256C, 256I, 256M, 256N, 256T, 257A, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 257I, 257K, 257L, 257M, 257N, 257P, 257Q, 257R, 257T, 257V, 257W, 258C, 258D, 258E, 258F, 258G, 258H, 258I, 258K, 258L, 258M, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258T, 258V, 258Y, 259A, 259E, 259G, 259H, 259I, 259K, 259L, 259M, 259P, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 259Y, 260A, 260C, 260D, 260E, 260F, 260G, 260H, 260I, 260L, 260M, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260T, 260V, 260W, 260Y, 261A, 261C, 261I, 261M, 261N, 261Q, 261S, 261T, 261V, 262A, 262C, 262I, 262M, 262T, 263A, 263C, 263L, 263M, 263N, 263P, 263S, 263V, 264D, 264E, 264G, 264H, 264I, 264L, 264N, 264Y, 265A, 265C, 265F, 265M, 265T, 265Y, 267A, 267C, 267D, 267F, 267G, 267H, 267M, 267N, 267Q, 267T, 267V, 268M, 268Q, 268R, 268V, 268Y, 270C, 270F, 270G, 270I, 270L, 270M, 270N, 270R, 270S, 270V, 270Y, 271F, 272G, 272I, 272L, 272M, 272N, 272S, 272T, 272V, 273D, 273G, 273I, 273K, 273L, 273P, 273Q, 273R, 273S, 273T, 273V, 273W, 273Y, 274A, 274C, 274F, 274G, 274H, 274I, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275A, 275C, 275E, 275F, 275G, 275H, 275I, 275K, 275L, 275M, 275N, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 275W, 275Y, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 277A, 277C, 277D, 277F, 277G, 277H, 277I, 277K, 277L, 277M, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277W, 277Y, 278A, 278C, 278T, 279D, 279E, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279R, 279S, 279V, 279W, 279Y, 280A, 280D, 280E, 280F, 280G, 280H, 280K, 280L, 280M, 280N, 280Q, 280R, 280S, 280T, 280Y, 281C, 281F, 281L, 282A, 282C, 282D, 282E, 282F, 282G, 282H, 282I, 282K, 282L, 282M, 282N, 282P, 282Q, 282R, 282T, 282V, 282W, 282Y, 283A, 283C, 283F, 283G, 283H, 283I, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 283Y, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 284L, 284M, 284N, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285A, 285C, 285E, 285H, 285I, 285L, 285M, 285N, 285Q, 285S, 285T, 285V, 285Y, 286A, 286C, 286L, 286M, 286N, 286Q, 286T, 286V, 287A, 287C, 287D, 287E, 287F, 287G, 287H, 287I, 287K, 287L, 287M, 287N, 287P, 287Q, 287S, 287T, 287V, 287W, 287Y, 288A, 288C, 288I, 288M, 288T, 288V, 289A, 289S, 290F, 290H, 290M, 290Y, 291C, 291F, 291G, 291I, 291L, 291M, 291N, 291S, 291T, 291V, 292A, 292C, 292I, 292L, 292M, 292S, 292T, 292W, 293C, 293D, 293E, 293F, 293G, 293N, 293Q, 293S, 293V, 294C, 294G, 294M, 294N, 294S, 294T, 294V, 295A, 295C, 295G, 295T, 296A, 296C, 296F, 296G, 296H, 296K, 296M, 297A, 297C, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 300I, 300K, 300L, 300M, 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 301I, 301K, 301L, 301M, 301Q, 301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 302S, 302T, 303L, 303M, 303W, 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 305I, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 307Q, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309C, 309D, 309E, 309F, 309H, 309I, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 310I, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F, 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 311Q, 311R, 311S, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 313I, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 313Q, 313R, 313S, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 315I, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, 315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 316I, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 317I, 317K, 317L, 317N, 317Q, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320W, 320
Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 326Q, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 331I, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 332I, 332K, 332L, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 333I, 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 336I, 336K, 336L, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 337Q, 337R, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 338I, 338L, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 339I, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 340I, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341I, 341L, 341M, 341V, 341W, 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 342L, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343P, 343Q, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, 344H, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 345W, 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A, 347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 348I, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 349I, 349K, 349L, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N, 350S, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351S, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 352I, 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352W, 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T, 355C, 355D, 355E, 355F, 355G, 355I, 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 356I, 356K, 356L, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 357I, 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358W, 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 359I, 359K, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 362I, 362L, 362M, 362Q, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 365I, 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 365S, 365T, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 366L, 366M, 366S, 366T, 366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 367I, 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 368I, 368K, 368L, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 368T, 368V, 368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 371I, 371L, 371M, 371N, 371Q, 371S, 371T, 371W, 371Y, 372A, 372C, 372G, 372I, 372L, 372M, 372N, 372Q, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373G, 373I, 373M, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 374I, 374L, 374M, 374N, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 376I, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377I, 377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 380I, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A, 381G, 381I, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383W, 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 384I, 384K, 384L, 384P, 384Q, 384S, 384T, 384V, 384W, 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 385I, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 386I, 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 387I, 387L, 387N, 387Q, 387S, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 388I, 388L, 388M, 388N, 388P, 388Q, 388R, 388S, 388T, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 389I, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389W, 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 390I, 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 391I, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392M, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 394S, 394T, 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 395I, 395K, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T, 397A, 397C, 397D, 397E, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397M, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F, 398G, 398I, 398L, 398M, 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398T, 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399H, 399I, 399K, 399L, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400N, 400P, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403E, 403G, 403H, 403I, 403M, 403N, 403Q, 403S, 403T, 403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 404I, 404L, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 405I, 405K, 405Q, 405S, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y, 407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 408I, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 409I, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 410I, 410K, 410Q, 410S, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 411I, 411L, 411M, 411N, 411Q, 411R, 411S, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 412I, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 412S, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 413I, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 415I, 415K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415W, 416F, 416I, 416L, 416P, 416Q, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 419I, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 421I, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 422I, 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 423I, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 424I, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425M, 425S, 425T, 425V, 425W, 及び 425Y。
【００２６】
いくつかの実施形態では、修飾は、次の群から選択される1以上の位置における、親ポリペプチド中の1以上のアミノ酸残基の別のアミノ酸残基への置換である：
1A, 1D, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2W, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4D, 4E, 4F, 4G, 4I, 4K, 4L, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5K, 5L, 5V, 5W, 6D, 6H, 6K, 6L, 6P, 6Q, 6S, 6V, 6W, 7A, 7D, 7E, 7H, 7N, 7Q, 7R, 7S, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y,9A, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9V, 9W, 9Y, 10I, 10L, 10M, 10P, 10S, 10V, 11A, 11F, 11M, 11V, 12I, 12M, 13A, 13D, 13Q, 14G, 14S, 14T, 14V, 15F, 16M, 16Q, 18G, 18N, 18R, 19H, 19W, 20A, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20M, 20R, 20S, 20V, 20W, 20Y, 21E, 21I, 21M, 21Q, 21S, 21V, 22I, 22T, 22V, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24F, 24G, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25E, 25F, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26I, 26L, 27A, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28V, 28W, 28Y, 29F, 29L, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30L, 30M, 30N, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31Y, 32G, 32S, 33A, 33D, 33E, 33H, 33Q, 33S, 34W, 35A, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 36F, 36H, 36I, 36L, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37V, 39A, 39P, 39S, 39V, 42V, 43A, 43S, 43T, 43V, 44A, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44N, 44R, 44S, 44T, 44Y, 45F, 45H, 45I, 45L, 45M, 45S, 45T, 46A, 46D, 46F, 46H, 46L, 46M, 46N, 46R, 47A, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48E, 48F, 48H, 48N, 48P, 48W, 49A, 49F, 49G, 49H, 49K, 49L, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50E, 50F, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53E, 53F, 53H, 53I, 53L, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 54A, 54C, 54F, 54G, 54H, 54L, 54N, 54P, 54R, 54T, 54W, 54Y, 55A, 55F, 55H, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57E, 57H, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57Y, 58F, 59A, 59C, 59F, 59H, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59W, 60L, 60N, 63H, 63N, 64A, 64S, 65A, 65I, 65R, 66D, 66E, 66G, 66M, 66N, 66Q, 66R, 67A, 67F, 67G, 67I, 67L, 67N, 67Q, 67T, 67W, 68D, 68F, 68H, 68I, 68L, 68N, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 69M, 69V, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73F, 73M, 73W, 74M, 74T, 76A, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76Y, 77A, 77D, 77K, 77L, 77R, 77Y, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78P, 78R, 78S, 78T, 78W, 78Y, 79A, 79M, 79Q, 79S, 80M, 81E, 81G, 81H, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81Y, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82Y, 83A, 83F, 83L, 84A, 84N, 84S, 84T, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87G, 88A, 88D, 88F, 88G, 88H, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88W, 88Y, 89D, 89F, 89G, 89H, 89I, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90D, 90E, 90F, 90H, 90I, 90K, 90M, 90N, 90R, 90S, 90T, 90V, 90W, 91D, 91E, 91H, 91K, 91N, 91Q, 91R, 91S, 92L, 92V, 93A, 93D, 93G, 93M, 93N, 93R, 93S, 93Y, 94I, 95F, 95M, 96I, 98C, 99I, 100C, 100F, 100M, 100V, 103A, 103C, 103V, 104A, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105M, 105W, 105Y, 106E, 106H, 106N, 106Q, 106S, 106T, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 107I, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 108I, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109D, 109H, 109I, 109K, 109L, 109N, 109R, 109S, 109V, 109W, 109Y, 110V, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 111K, 111L, 111M, 111N, 111Q, 111R, 111T, 112A, 112D, 112E, 112H, 112K, 112L, 112R, 112S, 112T, 112W, 112Y, 113A, 114L, 115A, 115H, 115I, 115L, 115R, 115V, 115Y, 116A, 116F, 116G, 116H, 116I, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 118D, 118F, 118G, 118H, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119E, 119F, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119S, 119T, 119Y, 121S, 124A, 124K, 124Q, 124R, 124S, 124T, 125A, 125D, 125F, 125I, 125K, 125Q, 125R, 125V, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 128A, 128C, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 129C, 129D, 129E, 130A, 130F, 130L, 130T, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131N, 131Q, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132I, 132N, 132S, 132W, 134E, 134F, 134L, 134M, 134R, 134Y, 135E, 136L, 140A, 141F, 141H, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143C, 143D, 143K, 143L, 143N, 143Q, 143S, 144T, 147F, 147L, 150H, 151C, 151D, 151E, 151G, 151H, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151S, 151T, 152A, 152C, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153E, 153F, 153H, 153K, 153L, 153N, 153R, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 155M, 156A, 156F, 156G, 156K, 156L, 156Q, 156R, 156V, 156Y, 157F, 157H, 158A, 158I, 158M, 158T, 158V, 159H, 159I, 159L, 159M, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160Q, 160S, 160T, 160V, 162I, 162M, 163A, 163E, 163F, 163G, 163H, 163I, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163Y, 164G, 164H, 164L, 164N, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165I, 165L, 165M, 165T, 165V, 166C, 166I, 166M, 166V, 167A, 167C, 167E, 167F, 167G, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 170C, 171E, 171H, 171I, 171M, 171N, 171Q, 171R, 172A, 175Y, 179A, 179C, 179G, 179H, 179S, 179W, 180M, 181V, 184D, 186E, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187M, 187Q, 187S, 187V, 187W, 188A, 188D, 188F, 188G, 188I, 188K, 188L, 188M, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190H, 190K, 190Q, 190R, 190S, 192G, 192K, 192L, 192P, 192S, 192V, 195D, 195F, 195G, 195H, 195K, 195M, 195R, 195V, 195W, 196A, 196C, 196E, 196F, 196H, 196I, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196Y, 197L, 197V, 198A, 198C, 198I, 198L, 198V, 199C, 199D, 199E, 199F, 199H, 199R, 199S, 199T, 199Y, 200I, 200N, 200S, 200V, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202V, 203A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 204I, 204M, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205I, 205L, 205M, 205N, 205V, 207A, 209L, 209V, 211H, 211S, 211T, 212G, 212N, 213A, 213E, 213F, 213G, 213I, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 214C, 214D, 214F, 214G, 214I, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 217I, 217Q, 217T, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 218I, 218K, 218L, 218M, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219N, 219Q, 219S, 219T, 219V, 219Y, 221C, 221E, 221G, 221Q, 221S, 221V, 222F, 222T, 223H, 223L, 223M, 223W, 224I, 225E, 225F, 225N, 225P, 225Q, 225T, 225Y, 226I, 226L, 229D, 229E, 229N, 229T, 230A, 230D, 230E, 230F, 230H, 230I, 230K, 230M, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231H, 231W, 232S, 233A, 233D, 233E, 233F, 233G, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234F, 234G, 234H, 234I, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235L, 235M, 236A, 236G, 236I, 236L, 236M, 236N, 236Q, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 237I, 237K, 237L, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238E, 238G, 238N, 238R, 238S, 238W, 239I, 239M, 240A, 240E, 240F, 240G, 240L, 240Q, 240R, 240T, 240V, 240Y, 241F, 241G, 241H, 241I, 241K, 241L, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242F, 242I, 242K, 242L, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244I, 244M, 244V, 245C, 245F, 245H, 245I, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246C, 246D, 246E, 246G, 246I, 246L, 246Q, 246W, 246Y, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248F, 248G, 248K, 248L, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249F, 249L, 249M, 249V, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250I, 250K, 250L, 250M, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251K, 251L, 251M, 251P, 251Q, 251V, 251Y, 252F, 252L, 252W, 253F, 253I, 253K, 253L, 253M, 253R, 253T, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254I, 254L, 254N, 254T, 254V, 254Y, 255A, 255E, 255I, 255K, 255P, 255R, 255S, 255V, 256A, 256C, 256I, 257E, 257I, 257L, 257P, 258C, 258D, 258E, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258V, 259A, 259G, 259H, 259K, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 260A, 260C, 260D, 260F, 260H, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260Y, 261M, 262I, 263C, 263L, 263M, 263S, 263V, 264E, 264H, 264I, 264L, 264Y, 267A, 267C, 267N, 267T, 268M, 268Q, 270F, 270G, 270N, 270S, 270V, 271F, 272G, 272L, 272S, 272V, 273G, 273I, 273L, 273T, 273Y, 274F, 274G, 274H, 274I, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275F, 275G, 275H, 275K, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276Y, 277A, 277D, 277F, 277G, 277H, 277I, 277K, 277L, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277Y, 279H, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279Y, 280F, 280Y, 281C, 281L, 282A, 282D, 282I, 282K, 282L, 282M, 282N, 282Q, 282T, 282W, 282Y, 283C, 283G, 283H, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 284L, 284N, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285E, 285M, 286C, 286L, 286M, 286V, 287A, 287C, 287E, 287H, 287I, 287K, 287L, 287M, 287Q, 287S, 287T, 287V, 288C, 288I, 288M, 288V, 289A, 290Y, 291C, 291G, 291L, 291S, 291T, 292A, 292C, 292I, 292L, 292T, 293C, 293V, 294C, 294G, 294S, 294T, 295A, 295G, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299G, 299I, 299N, 299V, 300H, 300M, 300R, 300V, 301I, 301K, 301L, 301M, 301T, 302T, 303M, 304L, 304Y, 305T, 305V, 307C, 307N, 308C, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 30
8W, 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 320I, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 331I, 331L, 331Q, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 336I, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336W, 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 338I, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 343S, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 348F, 348H, 348I, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 349I, 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353W, 353Y, 355C, 355F, 355I, 355L, 355M, 355V, 355Y, 356D, 356F, 356G, 356I, 356K, 356L, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357H, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359W, 360F, 360P, 360T, 361C, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 362A, 362C, 362I, 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 365I, 365K, 365L, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 367S, 367T, 367W, 367Y, 368G, 368I, 368K, 368L, 368R, 368T, 368V, 368W, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369S, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 371I, 371L, 371M, 371N, 371S, 371T, 371Y, 372A, 372C, 372I, 372L, 372N, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373I, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 374I, 374M, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375Y, 376G, 376I, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 381I, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 382I, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 384I, 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387I, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 388L, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 389I, 389M, 389Q, 389V, 390F, 390I, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 399I, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 403I, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 409I, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 413I, 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 415I, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 419I, 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 421S, 421T, 422F, 422I, 422S, 422W, 423D, 423I, 423Q, 423R, 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425V, 及び 425Y。
【００２７】
いくつかの実施形態では、置換により位置153のアミノ酸残基がN, KまたはFに変更され、得られたポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも高いマルトース及びマルトヘプタオース基質からグルコースへの転換能力を示す。いくつかの実施形態では、置換により位置153のアミノ酸残基がKに変更され、得られたポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも高いDP7基質からグルコースへの転換能力を示す。
【００２８】
いくつかの実施形態では、置換はL142F, L142G, L142Q, L142S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L, 及びS254Iから成る群から選択され、置換により得られるポリペプチド変異体が、SEQ ID NO: 1の親ポリペプチドより高い澱粉液化能力を示す。いくつかの実施形態では、置換はW60L, W60M, W60N, I100F, I100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V, 及びT279Aから成る群から選択され、置換により得られるポリペプチド変異体は、SEQ ID NO: 2の親ポリペプチドより高い澱粉液化能力を示す。
【００２９】
いくつかの実施形態では、置換は052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, 及び416Vから成る群から選択され、この突然変異誘発により、タンパク質と活性の双方のPI値が>0.5になる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドの75, 97, 101, 102, 120, 123, 133, 137, 182, 266, 及び306から成る群から選択される1の位置のアミノ酸残基が修飾されていない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、75及び123から成る群から選択される1の位置のアミノ酸残基が修飾されておらず、ここで、位置75及び123は、切断親ポリペプチドの性能発現のために完全に拘束された位置である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266,及び306から成る群から選択される1の位置のアミノ酸残基が修飾されておらず、ここで、位置75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266,及び306は全長親ポリペプチドの性能発現のために完全に拘束された位置である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1または2のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性を少なくとも80%有する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1または2のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性を少なくとも90%有する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性を少なくとも90%有する。
いくつかの実施形態では、酵素性能を向上させる性質は、向上した熱安定性、向上した比活性度、及び向上したタンパク質発現から成る群から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、酵素性能を向上させる性質は、向上した熱安定性、向上した比活性度、及び向上したタンパク質発現から成る群から選択される。
【００３３】
また澱粉加工用組成物が提供され、この組成物はAmyEポリペプチド（変異体を含む）と、任意成分のグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-アミラーゼ、菌類α-アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼ、及びこれらの組合シェーカら成る。いくつかの実施形態では、この組成物にはグルコアミラーゼ活性を有する追加のポリペプチドが含まれる。
【００３４】
また、本願により溶液またはゲル中にAmyEポリペプチド（変異体を含む）を含有するベーキング用組成物が提供される。ベーキング方法には、ベーキングされる物質にベーキング用組成物を添加する工程と、この物質をベーキングする工程とが含まれる。
【００３５】
別の態様では洗浄用組成物が提供され、この組成物はAmyEポリペプチド（変異体を含む）の水溶液から成り、任意成分として、別の酵素、洗剤、および／または漂白剤が含まれる。洗浄液は、衣類の洗濯、食器洗浄、または他の表面の洗浄に用いることができる。洗浄用組成物に関する方法では、食器、洗濯物、または他の表面と洗浄用組成物とを、これらの物品を洗浄するために必要な時間接触させる。
【００３６】
別の態様では、織物のデサイジング用組成物が提供され、この組成物はAmyEポリペプチド（変異体を含む）の水溶液から成り、任意成分として別の酵素が含まれる。デサイジング用組成物に関する方法では、織物とデサイジング用組成物とを、織物をデサイジングするために必要な時間だけ接触させる。
【００３７】
別の態様では、AmyE変異体をコードする核酸と、このポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、AmyE変異体を発現する宿主細胞とが提供される。また別の態様では、本願に開示するいずれかのAmyE変異体をコードする核酸と相補的な核酸が提供される。さらに、本願に開示するいずれかのAmyE変異体をコードする核酸とハイブリッド化可能な、または相補的な核酸が提供される。また別の態様では、本願に開示するいずれかのAmyE変異体をコードする合成核酸に関連する組成物及び方法が提供され、任意に、コドンが特定の宿主有機対中の発現に最適化された方法が提供される。
【００３８】
本願の組成物及び方法の様々な態様について、下記の詳細な説明と添付した図面に基づいて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】SEQ ID NO: 1 (以下「全長AmyE」と呼ぶ)のアミノ酸配列を有するAmyEと、SEQ ID NO: 3 (以下「Amy31A」と呼ぶ) のアミノ酸配列を有するAmyEの配列アライメントを表す図である。アミノ酸配列の相違部を太字で示す。残基番号は、酵素の成熟形の最初のアミノ酸から順に付与した。
【図２】AmyE-tr (SEQ ID NO: 2)をコードするポリヌクレオチド(「SAMY 425aa」で示す)を含有するプラスミドpME630-7の図である。このプラスミドは、B. リケニホルミスα-アミラーゼ由来のシグナル配列(「pre LAT」で示す)をコードするSAMY遺伝子を備えたポリヌクレオチドを含有する。
【図３】レマゾール・ブリリアントブルー(RBB)で標識した不溶性コーンスターチ基質に対するAmyE (SEQ ID NO: 1;「全長AmyE」)、AmyE-tr (SEQ ID NO: 2; 「切断AmyE」)、及びAmy31A (SEQ ID NO: 3)の相対的比活性度を表す図である。pH 4.5, 5.0,または 5.6において、基質の加水分解を50℃で30分間触媒した。酵素活性は、放出されたRBB標識の595 nmにおける吸光度から求めた。
【図４】図４Aは、pH 4.5または5.8で、0.7 mgのAmyE-tr (SEQ ID NO: 2)の存在下における、15 g ds澱粉基質の粘度(μNm)の経時変化(分)を表す。図４Bは、pH 4.5または5.8で、2.2 mgのAmyE (SEQ ID NO: 1) の存在下における、基質の粘度の経時変化を表す。図４Cは、pH 4.5または5.8で、1.4 mgの Amy31A (SEQ ID NO: 3) の存在下における、基質の粘度の経時変化を表す。図４Dは、pH 4.5または5.8で、4.1 mgのAmy31Aの存在下における、基質の粘度の経時変化を表す。
【図５】図５Aは、2mM Ca2+の存在下または非存在下における、AmyE (SEQ ID NO: 1;「全長AmyE」) 及び AmyE-tr (SEQ ID NO: 2;「切断AmyE」)についての過剰熱容量の示差走査熱量測定(DSC)による分析結果を表す。図５Bは、2 mM Ca2+の存在下または非存在下における、Amy31A (SEQ ID NO: 3)のDSC分析結果を表す。図５Cは、2 mM Ca2+の存在下または非存在下における、ゲオバシラス・ステアロサーモフィリス(Geobacillus stearothermophilus)α-アミラーゼ(AmyS) のDSC分析結果を表す。
【図６】AmyE-tr (SEQ ID NO: 2)によるマルトース基質からのグルコース産出を、AmyEQ153位変異体、及び切断AmyS (SEQ ID NO: 4)と比較して表す図である。
【図７】AmyE-tr (SEQ ID NO: 2)によるマルトヘプタオース基質からのグルコース産出を、AmyEQ153位変異体、及び切断AmyS (SEQ ID NO: 4)と比較して表す図である。
【図８】マルトヘプタオース(DP7)を用いてAmyE-trのインキュベーションを0時間（紙面上側）、及び72時間(紙面下側）行ったとき、HPLCで検出された分解生成物を表す図である。
【図９】DP7基質を用いてAmySのインキュベーションを（紙面上から）0時間、2時間、4時間、及び24時間行ったとき、HPLCで検出された分解生成物を表す図である。
【図１０】AmyE-tr Q153K変異体とマルトヘプタオース(DP7)とを用いてインキュベートしたときの生成物を表す図である。上から0時間、1時間、2時間、3時間、及び24時間経過後のHPLC測定データを表す。
【図１１】pH 4.3及び5.8の従来法発酵における、切断AmyE及びSPEZYMETM Xtraアミラーゼによるエタノール発酵を表す図である。
【図１２】pH 4.3及びpH 5.8における、全長 (FL) 及び切断(tr) AmyEによる不溶性粒状澱粉（加熱処理無し）のエタノールへの加水分解を、AkAA単独またはStargenTM 002と比較して示す図である。
【図１３】pH4.5及び5.6における、全長B. スブチリスAmyE、切断AmyE、及びAmy 31Aによるグルコース産出をAmySと比較して示す図である。
【図１４】全長AmyEを原料澱粉（コーンフラワー）を用いてインキュベートした結果を表し、0, 30, 90分経過後に産出されたオリゴ糖をHPLCにより分析した結果を示す図である。
【図１５】AmyEポリペプチドを用いた澱粉加水分解アッセイにより得られたピーク粘度及び最終粘度の値を示す図である。
【図１６】AmyEポリペプチドを用いたパンの劣化アッセイの結果を示す図である。
【００４０】
＜配列の説明＞
本願では以下の配列が参照される。
SEQ ID NO: 1: 全長バシラス・スブチリスAmyEのアミノ酸配列。天然シグナル配列は表示していない。
【化２】
0005933619.tif 000003
SEQ ID NO: 2: 切断バシラス・スブチリスAmyE (AmyE-tr)のアミノ酸配列。天然シグナル配列は表示していない。
【化３】
0005933619.tif 000004
SEQ ID NO: 3: バシラス・スブチリスα-アミラーゼ変異体Amy31Aのアミノ酸配列 (UniProtKB/TrEMBL 受託番号 O82953)。天然シグナル配列を太字で表示した。
【化４】
0005933619.tif 000005
SEQ ID NO: 4: 切断ゲオバシラス・ステアロサーモフィリスα-アミラーゼタンパク質の配列 (SPEZYMETM Xtra アミラーゼ)。シグナル配列を太字で表示した。
【化５】
0005933619.tif 000006
SEQ ID NO: 5: SEQ ID NO: 1のAmyEをコードするヌクレオチド配列。
【化６】
0005933619.tif 000007
SEQ ID NO: 6: AmyE-tr (SEQ ID NO: 2)をコードするヌクレオチド配列。
【化７】
0005933619.tif 000008
SEQ ID NO: 7: B.スブチリスAmy31A (SEQ ID NO: 3) をコードするヌクレオチド配列。
【化８】
0005933619.tif 000009
SEQ ID NO: 8: ゲオバシラス・ステアロサーモフィリスAmyS (SEQ ID NO: 4)をコードするヌクレオチド配列。
【化９】
0005933619.tif 000010
SEQ ID NO: 9: SEQ ID NO: 1のAmyEの天然シグナル配列。
【化１０】
0005933619.tif 000011
SEQ ID NO: 10: プライマーPSTAMYE-F 5'。
【化１１】
0005933619.tif 000012
SEQ ID NO: 11: プライマーAMYENOPST-R 5'。
【化１２】
0005933619.tif 000013
SEQ ID NO: 12: プライマーAMYENOPST-F 5'。
【化１３】
0005933619.tif 000014
SEQ ID NO: 13: プライマーHPAIAMYE-R 5'。
【化１４】
0005933619.tif 000015
SEQ ID NO: 14: プライマーHPAIAMYE466-R 5'。
【化１５】
0005933619.tif 000016
SEQ ID NO: 15: プライマーAMYE SEQ-F1 5'。
【化１６】
0005933619.tif 000017
SEQ ID NO: 16: プライマーAMYE SEQ-F2 5'。
【化１７】
0005933619.tif 000018
SEQ ID NO: 17: ブティアウクセラ(Buttiauxiella)・フィターゼのBP-17変異体。
【化１８】
0005933619.tif 000019
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本願の組成物及び方法は、他のα-アミラーゼと比較して優れた効果を有するバシラス・スブチリス(AmyE)由来のアルファ-アミラーゼ、及びその変異体（一括してAmyEポリペプチドと呼ぶ）に関する。AmyEポリペプチドは、例えば酸性pHにおいて澱粉基質に対し高い比活性度を示すことにより、AmyEポリペプチドを糖化にも適した条件下の澱粉液化に用いることが可能になる。これにより、液化工程と糖化工程の間における澱粉スラリーのpH調整が不要になる。AmyEポリペプチドはグルコアミラーゼ活性も有するため、糖化を行うための追加のグルコアミラーゼの添加が不要になるか、または添加量が低減される。さらに、AmyEポリペプチドを熱安定性にするためのカルシウムが少量で済むか、または不要になるため、次工程の異性化の前に添加したカルシウムを除去する必要が無くなる結果、高フルクトースコーンシロップの製造に必要な工程の内の少なくとも1工程を省くことができる。
【００４２】
以下、本願の組成物及び方法の様々な特徴について説明する。
【００４３】
＜1．定義及び略号＞
特に断りのない限り、本明細書にて用いるすべての技術及び科学用語及び略号、は当業者が通常理解している意味と同様の意味を有する。より明確にするために、次の用語及び略号の定義を以下に示す。
【００４４】
＜1.1. 定義＞
「澱粉」とは、アミロースとアミロペクチンから成り、化学式(C6H10O5)X (Xは任意の数)で表わされる植物性の複合多糖炭水化物を含有する物質を意味する。
特に、澱粉とは植物中に存在する天然の炭化水素を意味し、植物の非限定的例示として穀物、草、塊茎、根茎が挙げられ、より詳しくは、小麦、大麦、コーン、ライ麦、米、ソルガム、フスマ、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカが挙げられる。
【００４５】
「オリゴ糖」とは、3-20の単糖類からなる炭水化物分子を意味する。
【００４６】
「アミラーゼ」とは、澱粉の分解を触媒することができる酵素を意味する。一般に、アルファ-アミラーゼ(EC 3.2.1.1; (α-D-(1→4)-グルカン・グルカノヒドロラーゼ)は、澱粉中のα-D-(l→4) O-グリコサイド結合をランダムに切断するエンド型酵素と定義される。これに対し、β-アミラーゼ(EC3.2.1.2; α-D-(l→4)-グルカンマルトヒドロラーゼ)や、マルトゲン性α-アミラーゼ(EC 3.2.1.133)のような、いくつかの生成物特異的アミラーゼ等のエクソ型澱粉分解酵素は、基質の非還元末端から澱粉分子を切断する。β-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ(EC 3.2.1.20; α-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ)、グルコアミラーゼ(EC 3.2.1.3; α-D-(l→4)-グルカン・グルコヒドロラーゼ)、及び生成物特異的アミラーゼは、澱粉から特定の鎖長のマルトオリゴ糖を産出することができる。本願では、アミラーゼにはグルコアミラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、及び例えばB. リケニホルミス及びB. スブチリス等のバスラス属の野生型α-アミラーゼ等の全てのアミラーゼが含まれ、α-アミラーゼにはこれらの酵素の前述のサブセットが含まれる。
【００４７】
「α-アミラーゼ変異体」及びこれに類似する用語は、そのα-アミラーゼの変異体／突然変異体を意味し、そのα-アミラーゼの親（野生型：参照）アミノ酸配列に対するアミノ酸の置換、挿入および／または欠失が含まれる。「変異体」は「突然変異体」と同義で用いる。α-アミラーゼ変異体には、親シグナル配列に対する、シグナル配列の突然変異体が含まれる。さらに、α-アミラーゼ変異体は非相同アルファ-アミラーゼシグナル配列、例えばB.リケニホルミス(LAT)由来のシグナル配列を含む融合タンパク質の形態であってもよい。
【００４８】
「親核酸／ポリヌクレオチド」、「野生型核酸／ポリヌクレオチド」または「参照核酸／ポリヌクレオチド」とは、親ポリペプチドをコードする核酸配列であって、親ポリペプチドと相補的な核酸を意味する。
【００４９】
「核酸／ポリヌクレオチド変異体」とは、ポリペプチド変異体をコードする核酸配列、またはこれと相補的な核酸、または親ポリヌクレオチド配列に関し少なくとも1の塩基置換、挿入、欠失を有するポリヌクレオチド配列、またはこれと相補的な核酸を意味する。このように特定される核酸には、参照配列に対し特定の程度の相同性を有する核酸、または例えばストリンジェントな条件[例えば50℃及び0.2X SSC (1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 Mクエン酸三ナトリウム, pH 7.0)]、または高度にストリンジェントな条件[例えば65℃及び0.1X SSC (1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 Mクエン酸三ナトリウム, pH 7.0)]において参照配列にハイブリダイズ可能な核酸が含まれる。核酸変異体は、例えばメチロトローフ酵母(例えばピチア(Pichia)属、ハンセルナ(Hansenula)属等)、または糸状菌(例えばトリコデルマ属(例えば T. リーゼイ) 等)、または他の発現宿主(例えばバシラス属, ストレプトミセス属等)の、特定の宿主有機体でのコドン使用を考慮して最適化されていてもよい。
【００５０】
「シグナル配列」とは、タンパク質のN-末端に共有結合したアミノ酸配列を意味し、例えば成熟タンパク質の細胞外への分泌等、タンパク質の輸送を促進する。「シグナル配列」を、「リーダー配列」または「プロ配列」と呼ぶことがある。
【００５１】
本願で言うアミラーゼの「未成熟」または「全長(FL)」形態には、シグナルペプチドが含まれる。未成熟形態には、他の翻訳後修飾が含まれる。
【００５２】
本願で言う細胞外タンパク質(例えばアミラーゼ)の「成熟」形には、シグナル配列が含まれていない。シグナル配列は分泌プロセスにおいて切断されていてもよい。あるいは、ポリペプチドが例えば細胞内タンパク質として成熟形で発現されてもよいし、成熟形で合成されてもよい。
【００５３】
AmyEの「切断」形(すなわち「AmyE-tr」)とは、C-末端澱粉結合ドメインの全部または一部が欠失したAmyEポリペプチドを意味する。例えばSEQ ID NO: 2に示すAmyE-trの場合、SEQ ID NO: 1に示すAmyEのD425残基において切断されている。このAmyE-trの解像度2.5Åの結晶構造は、Protein Databank 信託番号 1BAGから入手可能であり、Fujimoto et al., “Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from B. subtilis complexed with maltopentaose,” J. Mol. Biol. 277: 393-407 (1998)に開示されている。C-末端澱粉結合ドメインの全部または一部が除去される限り、AmyE-trは他の位置、例えばSEQ ID NO: 1に示すAmyEのY423, P424, D426またはI427で切断されていてもよい。
【００５４】
細胞、核酸、タンパク質またはベクターについて「組み換え体」というときは、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが非相同核酸またはタンパク質の導入により修飾されたこと、または天然核酸またはタンパク質の改変により修飾されたこと、またはその細胞がそのように修飾された細胞に由来することを意味する。従って、組み換え体細胞は例えば天然（非組み換え体）細胞には見られない遺伝子を発現するか、天然遺伝子を過剰に発現するか、十分発現しないか、または全く発現しない。
【００５５】
「回収された」、「単離された」または「分離された」とは、天然において化合物、タンパク質、細胞、核酸、またはアミノ酸に付随する少なくとも1の成分から除去された化合物、タンパク質、細胞核酸、またはアミノ酸を意味する。
【００５６】
「精製された」というときは、その物質（例えば単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチド）が相対的に純粋な状態にあることを意味し、例えば純度が少なくとも約90%、約95%、約98%、または少なくとも約99%であることを意味する。
【００５７】
「熱に安定な」及び「熱安定性」とは、ある酵素が高温に曝された後で酵素活性を維持しうる能力を意味する。酵素の熱安定性、例えば、アルファ‐アミラーゼの熱安定性は、その半減期によって評価することができる。半減期(t1/2)は分、時間、日の単位で表され、所定の条件下においたとき、酵素活性の半分が消失する時間である。半減期は、酵素を高温に曝した後（すなわちチャレンジさせた後）の残留アルファ‐アミラーゼ活性を測定することにより求めることができる。
【００５８】
「pH範囲」とは酵素が触媒活性を示すpH値の範囲を意味する。
【００５９】
「pH安定性」、「pH安定」とは、様々なpH値において所定の時間(例えば15分、30分、1時間等)、酵素が活性を保持し得る能力を意味する。
【００６０】
本明細書では「アミノ酸配列」と、「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」とは同義で用いる。アミノ酸配が活性を示す場合、「酵素」を意味する。本願では、従来の1文字又は3文字アミノ酸残基コードを用いる。
【００６１】
「核酸」には、DNA、RNA、ヘテロ二本鎖、及びポリペプチドをコード可能な合成分子が含まれる。核酸は、一本鎖、又は二本鎖であり、または化学的に修飾されている。「核酸」は「ポリヌクレオチド」と同義で用いられる。遺伝子コードは退縮しているため、特定のアミノ酸のコードに1以上のコドンが用いられる。この発明の組成物と方法には、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる。特に断りのない限り、核酸は左から右に向かって5'から3'方向に記載し、アミノ酸配列は左から右に向かってアミノ基からカルボキシル基方向に記載に記載する。
【００６２】
「相同」とは、参照アミノ酸またはヌクレオチド配列、または別の共通する特定の構造または機能的特徴に対し、ある程度の同一性を有するアミノ酸、またはヌクレオチド配列を意味する。相同配列には、公知の配列アライメント手段(例えばClustal, BLAST等)を用いたとき、参照配列に対する同一性が少なくとも75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, あるいは99%のアミノ酸配列が含まれる。特に断りの無い限り、相同体には参照アミノ酸配列と同じ活性部位残基が含まれている。
【００６３】
本願で言う「ハイブリッド化」とは、ブロットハイブリッド化法及びPCR法において、1の核酸のストランドが塩基対合により相補ストランドに結合するプロセスを意味する。
【００６４】
本願で核酸中の「縮重配列」と言うときは、遺伝子コードの縮重により複数のヌクレオチド配列が同じコドンをコードすることを意味する。縮重配列は、例えばコドン選択の結果、コードされたポリペプチドの特定の宿主有機体中での発現が最適化されるように選択される。
【００６５】
「合成」分子とは、有機体により作られた分子ではなく、人工的化学合成または酵素的合成により作られた分子を意味する。
【００６６】
細胞について「形質転換された」、「安定に形質転換された」及び「遺伝子組み換えの」と言うときは、細胞がその細胞のゲノムに組み込まれるか、または細胞が多世代にわたり保存されるエピソームプラスミドとして伝えられる1の非天然（例えば非相同）核酸配列を有することを意味する。
【００６７】
細胞中への核酸配列の挿入に関して「導入された」というときは、公知の「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味する。
【００６８】
「宿主株」、または「宿主細胞」とは、発現ベクター、ファージ、ウイルス、または対象とするポリペプチド(例えばα−アミラーゼ変異体)をコードするポリヌクレオチド等のDNA構築体が導入された有機体を意味する。宿主株の例は細菌の細胞である。「宿主細胞」という用語には、例えばバスラス属等の細胞由来のプロトプラストが含まれる。
【００６９】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質について「非相同」というときは、天然の宿主細胞では生じないポリヌクレオチドまたはタンパク質を意味する。
【００７０】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質について「内因性」というときは、天然宿主細胞内で生じるポリヌクレオチドまたはタンパク質を意味する。
【００７１】
「発現」とは、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産出されるプロセスを意味する。このプロセスには、転写と翻訳の両者が含まれる。
【００７２】
「選択マーカ」または「選択性マーカ」とは、宿主中で発現することができる遺伝子であって、その遺伝子有する宿主細胞の選択を容易する遺伝子を意味する。選択可能マーカの非限定的例示として、宿主細胞に抗生物質（例えばハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはネオマイシン）に対する耐性を付与する遺伝子、および／または、宿主細胞に栄養的選択性を付与する等、代謝選択性を付与する遺伝子が挙げられる。
【００７３】
「培養」とは微生物細胞の集団を、液体または固体の培地において、適切な条件下で成長させることを意味する。培養には、粒状澱粉を含有する澱粉基質を発酵させ（通常は容器または反応器中で）、生物変換により最終製品にすることが含まれる。
【００７４】
「発酵」とは、微生物を用いて有機物質を酵素分解し、より単純な有機化合物を生成させることを意味する。一般に発酵は嫌気的条件下で生じるが、厳密な嫌気的条件に限定されず、酸素存在下でも発酵は生じる。
【００７５】
「遺伝子」は、ポリペプチドの産出に関与するDNAセグメントを意味し、コード領域と、コード領域の前後に位置する領域や、各コードセグメント（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）を備える。
【００７６】
「ベクター」は一以上の細胞種へ核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチド配列を意味する。ベクターにはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等が含まれる。
【００７７】
「発現ベクター」とは、対象とするポリペプチドをコードするDNA配列を備え、適切な宿主においてDNAの発現を実行する適切な制御配列に作動可能に結合されたDNA構築体を意味する。制御配列には転写を実行するプロモータ、転写を制御する任意のオペレータ配列、mRNA上の適切なリボゾーム結合部位をコードする配列、エンハンサー、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列が含まれていてもよい。
【００７８】
「プロモータ」とは、遺伝子の転写を開始する際のRNAポリメラーゼの結合に関与する調節配列を意味する。プロモータは、誘導プロモータまたは構成的プロモータである。プロモータの例として、バシラス・リケニホルミス α-アミラーゼ(AmyL)プロモータが挙げられる。
【００７９】
「作動可能に結合」とは、特定の各構成部が、意図した態様で機能することができるような関係(例えば並置であるが、これに限定されない）にあることを意味する。例えば、調節配列はコード配列に対し、コード配列の発現が調節配列の制御下に置かれるようにして作動可能に結合している。
【００８０】
「転写制御下」とは、ポリヌクレオチド配列、通常はDNA配列の転写が、転写開始に関与するか、又は転写を促進する構成要素に、その配列が作動的可能に結合することにより依存していることを意味する。
【００８１】
「翻訳制御下」とは、ポリヌクレオチド配列、通常はDNA配列のポリペプチドへの翻訳が、翻訳開始に関与するか、又は翻訳を促進する構成要素に、その配列が作動的可能に結合することにより依存していることを意味する。
【００８２】
「生物学的に活性」とは、特定の生物学的活性、例えば酵素活性を有する配列を意味する。本願のアミラーゼの場合、活性はα-アミラーゼ活性である。
【００８３】
「水の硬度」とは、水に含有されるミネラル（例えばカルシウムやマンガン）の量を意味する。
【００８４】
「糊化」とは、加熱処理 (cooking)により澱粉分子を可溶化させて粘性懸濁液にすることを意味する。
【００８５】
「液化（Liquefaction）」又は「液化する（liquefy）」は、澱粉をより低分子量（すなわち短鎖）のデキストリンに転換するプロセスを意味し、通常低分子量のデキストリンは出発物質の澱粉より溶解性が高く、低粘度である。この発明のプロセスではAmyE又はその変異体の添加と同時、又は添加後に、デンプンの糊化が生じる。追加の液化酵素を添加することもできる。
【００８６】
「第一液化」とは、スラリーの温度が糊化温度に達するか、又は近づいたときの液化段階を意味する。温度上昇に引き続き、スラリーは熱交換器又はジェットを通され、約90〜150℃、例えば100〜110℃(華氏200〜300度、例えば華氏220〜235度)の温度となる。熱交換器又はジェットで処理した後、スラリーを3〜10分間その温度に保つ。スラリーを90〜150℃に保つ段階を第一液化と呼ぶ。
【００８７】
「第二液化」とは、第一液化（90〜150℃(華氏200〜300度)に加熱）の次の液化段階を意味し、このときスラリーは室温まで冷却される。この冷却段階は、30分から180分、例えば90分から120分行われる。
【００８８】
「第二液化の時間」とは、第二液化の開始からDEを測定するまでの時間を意味する。
【００８９】
「糖化」とは、液化により生じたマルトデキストランを、酵素によりグルコースに転換することを意味する。
【００９０】
「重合度(DP)」とは、あるサッカライド中の無水グルコピラノースユニットの数(n)を意味する。DP1の例は、グルコース及びフラクトース等のモノサッカライドである。DP2の例は、マルトース及びサッカロース等のジサッカライドである。DP>3は重合度が3以上のポリマーを表わす。
【００９１】
澱粉転化に関して「最終製品」または「所望の最終製品」というときは、澱粉基質から酵素により転換された特定の炭素源由来分子を意味する。
【００９２】
「乾燥固体成分(ds)」とは、スラリー中の全固体成分の乾燥重量％を意味する。
【００９３】
「スラリー」とは、不溶性固体成分を含有する水性混合物を意味する。
【００９４】
「残留澱粉」とは、澱粉含有基質を酵素により発酵または加水分解させた後の組成物中に残留している（溶解または非溶解）澱粉を意味する。
【００９５】
「リサイクル工程」とは、残留澱粉と、澱粉から成る基質を発酵させるための酵素および／または微生物とを含むマッシュ成分をリサイクルすることを意味する。
【００９６】
「マッシュ」とは、アルコール等の発酵製品の製造に用いる、発酵可能な炭素源（炭水化物）と水との混合物を意味する。いくつかの実施形態では、「ビール」と「マッシュ」を同義で用いることがある。
【００９７】
「スティレッジ」とは、非発酵固体成分と水との混合物を意味し、例えば発酵後のマッシュからアルコールを除いた残渣である。
【００９８】
「蒸留乾燥粒(DDG)」及び「可溶分入り蒸留乾燥粒(DDGS)」とは、穀物発酵後の有用な副産物を意味する。
【００９９】
「エタノール生産微生物」とは、糖またはオリゴ-サッカライドをエタノールに転換する能力を有する微生物を意味する。エタノール生産微生物は、単独または協働して糖をエタノールに転換する１以上の酵素を発現する能力を有することにより、エタノール生産性となる。
【０１００】
「エタノール生産体」または「エタノール生産体微生物」とは、ヘキソースまたはペントースからエタノールを産出できる有機体または細胞を意味する。一般に、エタノール生産細胞にはアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼが含まれる。エタノール生産体微生物の一例として、酵母等の菌性微生物が挙げられる。好ましい酵母の例として、サッカロミセス(Sacchromyces)株、特にS. セレビシアエ(cerevisiae)が挙げられる。
【０１０１】
アミラーゼ酵素及びその基質について「接触」と言うときは、酵素を基質に近接させ、酵素による基質の最終製品への転換を可能にすることを意味する。接触という用語には混合が含まれる。
【０１０２】
「由来する」とは、文脈によっては「起源する」、「に基づく」、「から得られた」、「から得られる」または「から単離された」を意味する。
【０１０３】
「酵素による転換」とは、酵素の作用により(例えばアミラーゼ)基質(例えば澱粉)を修飾することを意味する。
【０１０４】
「ディスインテグレーション」とは、バイオフィルム中の各微生物細胞を互いに連結し結合しているバイオフィルムマトリックス中の多糖類を加水分解することを意味し、これにより微生物細胞がバイオフィルムから放出されて除去される。
【０１０５】
「試験見本(swatch)」とは汚れを付着させた布地等の材料片であり、組成物の洗浄効果を評価するための汚れが付着されている。
【０１０６】
「比活性度」とは、特定の条件下において単位時間当たりに、酵素の調合液により製品に転換される基質のモル数を意味する。比活性度の単位は(U)/タンパク質のmg数で表される。
【０１０７】
「生物学的に活性」とは、予め選択した生物学的機能を発揮する分子を意味する。
【０１０８】
「収量」とは、あるプロセスで製造された最終製品の量を意味し、例えば濃度、容積、量、または出発物質のパーセントで表される。
【０１０９】
「ATCC」とは、Manassas, Va. 20108 (ATCC)にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)を意味する。
【０１１０】
精製用の「沈降剤」とは、AmyEまたはその変異体等のポリペプチドを溶液から沈殿させることができる物質を意味する。沈降剤の形状は、例えば結晶状、無定形、または両者の組合せである。
【０１１１】
「NRRL」とは、Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL（以前はUSDA Northern Regional Research Laboratoryとして知られていた）を意味する。
【０１１２】
「試験見本(swatch)」とは汚れが付着されるか、または汚れを付着させた布地等の材料である。この材料は、例えば、木綿、ポリエステル又は天然及び合成繊維の混合物である。または、この材料は紙、例えば、ろ紙またはニトロセルロース、又は例えばセラミック、金属又はガラスのような堅い材料である。汚れの例として、血液、牛乳、インク、草、茶、ワイン、ホウレン草、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、粘土、色素、オイル、又はこれらの化合物の混合物が挙げられる。
【０１１３】
「小型試験見本」とは、例えば一孔パンチにより切り抜かれた、または特別注文の96孔パンチ（この多孔パンチのパターンは標準的96ウエルのマイクロタイタープレートに適合している）で切り抜かれた試験見本であり、または別の方法で切り取った試験見本の一部である。この試験見本は織物、紙、金属又は他の適した材料でもよい。小型の試験見本を24-,48-、又は96-ウエルのマイクロタイタープレートのウエルへ入れる前、または後に汚れを付着させる。
【０１１４】
「食物」という用語には、消費者向けの食品製造者に利益をもたらす穀物粉等の食物用原料、及び加工調理済み食品の両方が含まれる。食物原料には、酸性化又は乳化させるために食物または食材に添加する配合剤も含まれる。食物原料は、使用方法及び／又は使用態様及び／又は添加方法により、溶液又は固体の形態とすることが出来る。
【０１１５】
「穀物粉」という用語には、製粉されたか又は挽かれた穀物、又は、挽かれたか又はすり潰されたサゴ又は塊茎製品を意味する。いくつかの実施態様では、製粉又はすり潰された穀物又は植物性物質の他に、穀物粉に膨張剤等の成分が含まれていてもよい。穀物という用語には、小麦、オート麦、ライ麦、及び大麦等が含まれる。塊茎製品いう用語には、タピオカ粉、キャッサバ粉、及びカスタードパウダーが含まれる。「穀物粉」という用語にはまた、挽かれたコーン粉、コーンミール、米粉、全粒小麦、セルフライジング・フラワー、タピオカ粉、キャッサバ粉、挽かれた米、栄養強化穀物粉、及びカスタードパウダーが含まれる。
【０１１６】
「ストック」とは、圧搾又は破砕された穀物及び植物成分を意味する。例えば、ビールの製造に使用される大麦は、発酵用のマッシュの調製に適した稠度を得るために粗挽又は圧搾された粉体である。本願で言う「ストック」には、圧搾又は粗挽された状態の、前述のタイプのいずれかの植物及び穀物が含まれる。
【０１１７】
「性能指数(PI)」とは、特定の性能特性についての、ポリペプチド変異体性能の親ポリペプチドの性能に対する比率を意味する。本願では「上昇突然変異」とはPI > 1の突然変異体を意味する。「中立突然変異」とはPI > 0.5の突然変異体を意味する。「非有害突然変異」とはPI > 0.05の突然変異体を意味する。「有害突然変異」とはPI ≦ 0.05の突然変異体を意味する。
【０１１８】
「添加（または追加）グルコアミラーゼ（またはグルコアミラーゼポリペプチド）」または「グルコアミラーゼ活性を有する追加のポリペプチド」とは、AmyEとは別のグルコアミラーゼ酵素を意味する。
【０１１９】
特に断りの無い限り、原文の"a", "an,"及び"the"等の単数形には、複数形も含まれる。従って、例えば「１つの酵素」には複数の酵素が含まれ、「この調合液」には１つ以上の調合液及び当業者が等価と認識する細胞等も含まれる。
【０１２０】
数値範囲には、その範囲を規定する数値も含まれる。見出しは説明のためのものであり、限定を意図していない。全ての引用文献を、本願に参照として組み込む。
＜1.2 略号＞
特に断りの無い限り、下記の略号を用いる。
AE：アルコールエトキシレート
AEO：アルコールエトキシレート
AEOS：アルコールエトキシサルフェート
AES：アルコールエトキシサルフェート
AGU：グルコアミラーゼ活性単位
AkAA：アスペルギルス・カワチイ(Aspergillus kawachii)αアミラーゼ
AmyE：バシラス・スブチリスαアミラーゼ
AmyS：ゲオバシラス・ステアロサーモフィリスαアミラーゼ
AS：アルコール硫酸塩
BAA：バクテリア性α―アミラーゼ
cDNA：相補的ＤＮＡ
CMC：カルボキシメチルセルロース
DE：デキストロース当量
DI：蒸留された、脱イオン化した 
DNA：デオキシリボ核酸
DP3：サブユニット3個の重合度
DPn：サブユニットｎ個の重合度
DSまたはds：乾燥固体成分
DTMPA：ジエチルトリアミノペンタ酢
EC：酵素分類のための酵素コミッション(enzyme commission for enzyme classification)
EDTA：エチレンジアミン四酢酸
EDTMPA：エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸 
EO：酸化エチレン
F&HC：織物及び家庭用品ケア用品
GAU：グルコアミラーゼ単位
HFCS：高フルクトースコーンシロップ
HFSS：高フルクトース澱粉ベースシロップ
IPTG：イソプロピルβ-D-チオガラクトシド
LA：ルリア寒天 
LB：ルリアブロス
LU：リパーゼ単位
L1T：1位のロイシン(L)残基がスレオニン(T)残基で置換されていることを表し、ここで、公知の1文字略号で指定される。
MW：分子量
NCBI：全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)
nm：ナノメートル
NOBS：ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸
NTA：ニトリロ三酢酸
OD：光学密度
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応
PEG：ポリエチレングリコール
pI：等電点
ppm：100万分の一
PVA：ポリ（ビニルアルコール）
PVP：ポリ（ビニルピロリドン）
RAU：参照アミラーゼ単位
RNA：リボ核酸
SAS：二次アルカンスルホン酸塩
1X SSC：0.15 M NaCl, 0.015 M クエン酸ナトリウ
SSF：同時糖化発酵
SSU：溶解性澱粉単位、1分間に放出される1 mgのグルコースの還元力に等しい
TAED：テトラアセチルエチレンジアミン
TNBS：トリニトロベンゼンスルホン酸
TrGA ：トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)グルコアミラーゼ
w/v：重量/容積
w/w：重量/重量
wt：野生型
μL：マイクロリットル
μNm：マイクロニュートン×メートル
【０１２１】
＜2.AmyEポリペプチド＞
＜2.1 親AmyEポリペプチド＞ 
AmyEα−アミラーゼとは、SEQ ID NO: 1で例示されるB. スブチリス由来の天然α-アミラーゼ(EC 3.2.1.1; 1,4-α-D-グルカン・グルカノヒドロラーゼ)を意味する。関連するポリペプチドは天然AmyEとは異なるアミノ酸配列を有し、例えばマッチングパラメータが初期設定されたBLAST配列アライメントアルゴリズムで測定したとき、SEQ ID NO: 1に対し配列同一性を少なくとも約85%, 少なくとも約90%, 少なくとも約91%, 少なくとも約92%, 少なくとも約93%, 少なくとも約94%, 少なくとも約95%, 少なくとも約96%, 少なくとも約97%,少なくとも約98%, または少なくとも約99%有する。
【０１２２】
AmyEポリペプチドの別の例は、SEQ ID NO: 3 (Amy31A)の配列を有するAmy31Aである。Amy31AはOhdan et al., “Characteristics of two forms of alpha-amylases and structural implication,” Appl. Environ. Microbiol. 65(10): 4652-58 (1999) and UniProtKB/TrEMBL Accession No. O82953 (SEQ ID NO: 3) に開示されている。Amy31Aは、BLASTアルゴリズムで評価したとき、SEQ ID NO: 1のAmyEに対し約86%の配列同一性を有する。別のAmyEポリペプチドの非限定的例示としてNCBI信託番号ABW75769, ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841, 及びBAA31528に記載されたアミノ酸配列を有するAmyEが挙げられ、これらは本願に参照として組み込まれる。 
【０１２３】
SEQ ID NO: 1に示す代表的AmyEアミノ酸配列は天然のシグナル配列の無い成熟形である。成熟形のAmyEを「全長AmyE」と呼ぶこともある。一般にAmyEの成熟形は酵素として興味深いが、宿主細胞からの分泌に影響する(シグナル配列の有る)未成熟形を発現することが望ましい。このAmyEの天然シグナル配列は、SEQ ID NO: 9に示す、長さが41アミノ酸残基である。SEQ ID NO: 3のN-末端の45アミノ酸残基はAmy31Aのシグナル配列である。図1にAmyE (SEQ ID NO: 1)とAmy31A (シグナル配列無し)との配列アライメントを示す。
【０１２４】
SEQ ID NO: 2 (AmyE-tr)のアミノ酸配列を有する切断AmyEポリペプチドに例示されるように、AmyEポリペプチドはC-末端澱粉結合ドメインの欠失を有していてもよい。このポリペプチドは(SEQ ID NO: 1を参照として）D425残基から切断される。解像度2.5ÅのAmyE-trの結晶構造は、Protein Databank 信託番号1BAGから入手可能であり、Fujimoto et al., “Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from B. subtilis complexed with maltopentaose,” J. Mol. Biol. 277: 393-407 (1998)に開示されている。C-末端澱粉結合ドメインの全部または一部が除去される限り、AmyE-trは他の位置、例えばSEQ ID NO: 1に示すAmyEのY423, P424, D426またはI427で切断されていてもよい。Amy31A及びその他のAmyEポリペプチドについて同様の切断を行うこともできる。
【０１２５】
＜2.2. AmyE変異体＞
AmyE変異体は、SEQ ID NO: 1の天然AmyEまたはSEQ ID NO: 2 (切断ポリペプチド)と比較して、少なくとも1のアミノ酸修飾を有する。従って、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2を、AmyE変異体が派生される「親ポリペプチド」、「親酵素」、または「親配列」と言うことができる。修飾されていないアミノ酸配列(すなわち、残りの隣接アミノ酸配列)は、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3、またはNCBI 信託番号ABW75769, ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841, 及びBAA31528のいずれかのアミノ酸配列と同一である。あるいは、残りのアミノ酸配列はこれらの配列に対し、例えばアライメントパラメータが初期設定されたタンパク質配列のBLASTアルゴリズムで評価したとき、特定の配列同一性を有する。例えば、 残りのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2のAmyEに対し、配列同一性を少なくとも約85%, 少なくとも約90%, 少なくとも約91%, 少なくとも約92%, 少なくとも約93%, 少なくとも約94%, 少なくとも約95%, 少なくとも約96%, 少なくとも約97%, 少なくとも約98%, または少なくとも約99% 有する。 
【０１２６】
AmyE変異体は、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列と比較して1のアミノ酸修飾を有するか、あるいは例えば2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20またはそれ以上のアミノ酸修飾を有していてもよい。修飾には、置換、挿入、欠失またはこれらの組み合わせが含まれる。修飾は、生物学的機能には不要なアミノ酸残基において行われてもよい。修飾するアミノ酸残基の選択は、AmyE配列間の配列相同性に基づいて行われる。通常、AmyE配列中で十分保存されているアミノ酸は、生物学的活性に必要である可能性が高い。これに対しAmyE配列間で相違するアミノ酸残基位置は、生物学的活性には必要とされない可能性が高い。例えばAmyEとAmy31Aとをアライメントさせたときに異なるアミノ酸残基(図１に太字で示す）は、AmyE変異体において生物学的活性を損なうことなく修飾することができる可能性が高い。
【０１２７】
好ましいAmyE変異体は、天然AmyEと比較して1,4-α-D-グルカン・ヒドロラーゼ活性を少なくとも有る程度有するとともに、天然AmyEと比較して少なくとも1の改変された性質を有する。改変された性質は、澱粉、マルトヘプトース、および／またはマルトトリオース基質に対する基質特異性、熱安定性、最適温度、最適pH、pH及び温度範囲、酸化安定性、澱粉組成物の粘度を低下させる能力等である。AmyE変異体の改変された性質は、特定のpH(例えば4または5.8)における特定のコーン粉、マルトトリオース、マルトヘプトース基質に対する比活性度、特定の温度(例えば60℃)における熱安定性または特定のpH(例えばpH8または10)における洗浄性能でもよい。改変された性質は性能指数(PI)で評価することができる。ここでPIはAmyE変異体の野生型AmyEに対する性能の比率である。いくつかの実施形態ではPIは約0.5より大きく、別の実施形態ではPIは約1または1より大きい。
【０１２８】
置換により得られたAmyE変異体に有用な性質を付与する特定の残基には、次の1以上が含まれる：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424,及び425。
これらの位置のいずれかを修飾することにより、タンパク質の発現に関し性能指数(PI)が0.5より大きく、酵素の性能を向上させる少なくとも1の性質に関するPIが1より大きいポリペプチド変異体が得られる。 
【０１２９】
置換により得られたAmyE変異体に有用な性質を付与する特定の残基の下位群には、次の1以上が含まれる：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 140, 141, 142, 143, 144, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 179, 180, 181, 184, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び425。
これらの位置のいずれかを修飾することにより、タンパク質の発現に関し性能指数(PI)が0.5より大きく、酵素の性能を向上させる少なくとも1の性質に関するPIが1.1より大きいポリペプチド変異体が得られる。 
【０１３０】
次の群から1以上の位置を選択することもできる：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び425。
これらの位置は、全長または切断親ポリペプチドのいずれかにおいて、性能発現のために不完全に拘束されている。
【０１３１】
いくつかの位置は、切断AmyE親ポリペプチドにおいて、性能発現のために不完全に拘束されている(すなわち、1, 2, 3, 4, 5, 8, 18, 20, 23, 24, 25, 27, 28, 30, 35, 44, 45, 47, 49, 50, 51, 52, 54, 56, 59, 68, 73, 76, 78, 85, 88, 89, 90, 91, 106, 107, 108, 109, 112, 115, 116, 118, 119, 124, 125, 126, 127, 131, 132, 134, 142, 143, 152, 153, 156, 160, 163, 166, 167, 184, 185, 187, 188, 190, 192, 195, 199, 200, 201, 202, 203, 212, 213, 214, 218, 219, 221, 222, 223, 233, 234, 238, 240, 241, 243, 245, 247, 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 257, 259, 260, 274, 275, 276, 277, 282, 283, 284, 287, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 318, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 331, 333, 344, 346, 347, 349, 357, 358, 359, 367, 368, 369, 378, 380, 382, 385, 386, 388, 390, 393, 395, 400, 401, 402,及び 406)。
また、いくつかの位置は、切断AmyE親ポリペプチドにおいて、性能発現のために不完全に拘束されている(すなわち、 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 48, 52, 53, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 74, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 110, 111, 113, 114, 117, 121, 122, 126, 128, 129, 130, 131, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 164, 165, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 189, 191, 193, 194, 196, 197, 198, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 215, 216, 217, 220, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 242, 244, 246, 249, 256, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 278, 279, 280, 281, 285, 286, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 312, 315, 316, 322, 326, 329, 330, 332, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 348, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 387, 389, 391, 392, 394, 396, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425)。
【０１３２】
修飾は、親ポリペプチド中の1以上のアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による置換であってもよく、以下が例示される：
1A, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 10A, 10I, 10L, 10M, 10N, 10P, 10Q, 10S, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 11S, 11V, 11W, 11Y, 12I, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13I, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 16I, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 17I, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 20S, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 21I, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 22I, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 25I, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26I, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30I, 30K, 30L, 30M, 30N, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33I, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 34I, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 36I, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 39I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 40A, 40D, 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 45I, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 46I, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 48I, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 49I, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 53I, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 54I, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 55I, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 57I, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 60A, 60C, 60D, 60E, 60G, 60I, 60K, 60L, 60M, 60N, 60Q, 60R, 60T, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 62I, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 64I, 64L, 64M, 64N, 64S, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 65I, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 65S, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 66I, 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66W, 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 67I, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 67S, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 68I, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 68Y, 69A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 70A, 70E, 70H, 70N, 70S, 71S, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72L, 72P, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 73I, 73K, 73L, 73M, 73P, 73S, 73T, 73V, 73W, 74A, 74E, 74F, 74M, 74S, 74T, 74Y, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 76I, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76S, 76V, 76Y, 77A, 77C, 77D, 77G, 77H, 77I, 77K, 77L, 77R, 77S, 77T, 77V, 77W, 77Y, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 79Q, 79S, 79T, 80A, 80L, 80M, 80W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 81I, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, 83F, 83I, 83L, 83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 84I, 84K, 84M, 84N, 84Q, 84S, 84T, 84V, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85L, 85M, 85N, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C, 88D, 88F, 88G, 88H, 88I, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 89I, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90C, 90D, 90E, 90F, 90G, 90H, 90I, 90K, 90L, 90M, 90N, 90Q, 90R, 90S, 90T, 90V, 90W, 91A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L, 91M, 91N, 91P, 91Q, 91R, 91S, 91T, 91W, 91Y, 92L, 92N, 92T, 92V, 93A, 93C, 93D, 93E, 93F, 93G, 93I, 93L, 93M, 93N, 93P, 93Q, 93R, 93S, 93T, 93V, 93W, 93Y, 94A, 94C, 94I, 94M, 94T, 95A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 96I, 96L, 96M, 96P, 96T, 97A, 97E, 97M, 97W, 98C, 98G, 98I, 98L, 98M, 98T, 98V, 99A, 99C, 99E, 99F, 99G, 99I, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T, 100A, 100C, 100F, 100M, 100N, 100P, 100T, 100V, 100Y, 101A, 102A, 102G, 102Q, 102S, 102W, 102Y, 103A, 103C, 103I, 103M, 103N, 103S, 103V, 104A, 104C, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T, 105V, 105W, 105Y, 106A, 106C, 106E, 106F, 106H, 106I, 106K, 106L, 106M, 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 107I, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 108I, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 109I, 109K, 109L, 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T, 109V, 109W, 109Y, 110L, 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 111I, 111K, 111L, 111M, 111N, 111P, 111Q, 111R, 111T, 111V, 111W, 111Y, 112A, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G, 112H, 112I, 112K, 112L, 112M, 112P, 112Q, 112R, 112S, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 113I, 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 113Q, 113S, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 115I, 115L, 115M, 115N, 115Q, 115R, 115S, 115T, 115V, 115W, 115Y, 116A, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 116I, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 117F, 117L, 117N, 117Q, 117V, 117W, 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E, 118F, 118G, 118H, 118I, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119R, 119S, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 121S, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 124I, 124K, 124M, 124Q, 124R, 124S, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 125I, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 125Q, 125R, 125S, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127M, 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 129I, 129K, 129L, 129M, 129R, 129S, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 130I, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131M, 131N, 131Q, 131R, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 132I, 132L, 132M, 132N, 132Q, 132S, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 134I, 134L, 134M, 134N, 134R, 134S, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N, 135Q, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 141Q, 141S, 141T, 141V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 143Q, 143R, 143S, 143W, 144G, 144S, 144T, 144V, 144W, 145W, 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 147I, 147L, 147N, 147P, 147Y, 148A, 148C, 148F, 148H, 148K, 148M, 148R, 148Y, 149S, 150A, 150H, 150N, 150S, 151A, 151C, 151D, 151E, 151F, 151G, 151H, 151I, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151R, 151S, 151T, 151V, 151Y, 152A, 152C, 152D, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153A, 153C, 153D, 153E, 153F, 153G, 153H, 153I, 153K, 153L, 153M, 153N, 153P, 153R, 153S, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 154C, 154I, 154N, 154P, 154Q, 154S, 154T, 154Y, 155A, 155C, 155E, 155F, 155G, 155H, 155I, 155L, 155M, 155T, 155V, 155W, 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, 156I, 156K, 156L, 156N, 156Q, 156R, 156T, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C, 157F, 157H, 157I, 157M, 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 158I, 158M, 158Q, 158S, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 159I, 159L, 159M, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 160S, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 161G, 161H, 161K, 161L, 161M, 161N, 161S, 162A, 162C, 162E, 162F, 162I, 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 163I, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 164I, 164L, 164M, 164N, 164Q, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 165I, 165L, 165M, 165Q, 165S, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 166I, 166K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 166T
, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168I, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 171I, 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 173I, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 174Q, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175W, 175Y, 176E, 176F, 176I, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 177G, 177M, 177Q, 177S, 178C, 178G, 178M, 178S, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 179I, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 184I, 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 187T, 187V, 187W, 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 188I, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 192I, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 192S, 192T, 192V, 193A, 193I, 193L, 193M, 194I, 195A, 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 195I, 195K, 195L, 195M, 195N, 195Q, 195R, 195S, 195T, 195V, 195W, 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 196I, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196W, 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 197S, 197T, 197V, 198A, 198C, 198G, 198H, 198I, 198L, 198M, 198N, 198R, 198S, 198V, 199A, 199C, 199D, 199E, 199F, 199G, 199H, 199I, 199L, 199M, 199P, 199R, 199S, 199T, 199V, 199Y, 200A, 200C, 200D, 200E, 200F, 200G, 200H, 200I, 200K, 200L, 200M, 200N, 200P, 200Q, 200R, 200S, 200V, 200W, 200Y, 201A, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201I, 201K, 201L, 201M, 201N, 201P, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202F, 202G, 202I, 202K, 202L, 202M, 202N, 202P, 202Q, 202R, 202S, 202T, 202V, 202Y, 203A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203N, 203P, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 204A, 204C, 204E, 204I, 204L, 204M, 204T, 204V, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205D, 205E, 205F, 205G, 205H, 205I, 205K, 205L, 205M, 205N, 205R, 205S, 205T, 205V, 205W, 205Y, 206F, 207A, 207C, 207M, 208K, 208N, 208R, 209C, 209F, 209L, 209M, 209T, 209V, 210F, 210I, 210V, 210W, 211A, 211C, 211D, 211E, 211G, 211H, 211M, 211P, 211S, 211T, 211W, 211Y, 212A, 212C, 212E, 212G, 212H, 212N, 212P, 212Q, 212S, 212T, 212Y, 213A, 213C, 213D, 213E, 213F, 213G, 213H, 213I, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 214I, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 215A, 215C, 215H, 215T, 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 217I, 217K, 217M, 217N, 217P, 217Q, 217R, 217S, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 218I, 218K, 218L, 218M, 218N, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219K, 219L, 219M, 219N, 219Q, 219R, 219S, 219T, 219V, 219W, 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 221I, 221L, 221M, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221V, 221Y, 222A, 222C, 222D, 222F, 222G, 222I, 222K, 222M, 222P, 222R, 222S, 222T, 222V, 223A, 223C, 223E, 223F, 223H, 223I, 223L, 223M, 223N, 223Q, 223V, 223W, 224I, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225E, 225F, 225H, 225I, 225K, 225L, 225M, 225N, 225P, 225Q, 225S, 225T, 225V, 225W, 225Y, 226A, 226C, 226F, 226I, 226L, 226M, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 227S, 228C, 228D, 228M, 228N, 228P, 228S, 228T, 228V, 229C, 229D, 229E, 229F, 229G, 229H, 229M, 229N, 229Q, 229R, 229T, 229V, 229Y, 230A, 230D, 230E, 230F, 230G, 230H, 230I, 230K, 230M, 230P, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231A, 231C, 231H, 231L, 231M, 231Q, 231W, 232A, 232C, 232M, 232N, 232Q, 232S, 232Y, 233A, 233C, 233D, 233E, 233F, 233G, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233P, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235C, 235F, 235L, 235M, 235T, 236A, 236C, 236D, 236E, 236G, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236Q, 236S, 236T, 237A, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 237I, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239A, 239E, 239F, 239I, 239M, 239T, 240A, 240C, 240D, 240E, 240F, 240G, 240H, 240I, 240L, 240M, 240N, 240Q, 240R, 240S, 240T, 240V, 240W, 240Y, 241A, 241C, 241D, 241E, 241F, 241G, 241H, 241I, 241K, 241L, 241M, 241P, 241Q, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242E, 242F, 242I, 242K, 242L, 242M, 242Q, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243A, 243C, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244A, 244F, 244I, 244M, 244T, 244V, 244W, 244Y, 245A, 245C, 245D, 245F, 245H, 245I, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246A, 246C, 246D, 246E, 246F, 246G, 246H, 246I, 246K, 246L, 246P, 246Q, 246R, 246S, 246T, 246W, 246Y, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247P, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248A, 248C, 248E, 248F, 248G, 248H, 248I, 248K, 248L, 248M, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249E, 249F, 249H, 249L, 249M, 249P, 249S, 249V, 249Y, 250A, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250I, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251I, 251K, 251L, 251M, 251N, 251P, 251Q, 251R, 251V, 251Y, 252C, 252D, 252E, 252F, 252G, 252H, 252I, 252K, 252L, 252M, 252Q, 252R, 252S, 252T, 252V, 252W, 253C, 253E, 253F, 253G, 253H, 253I, 253K, 253L, 253M, 253P, 253R, 253S, 253T, 253V, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255A, 255C, 255E, 255F, 255G, 255I, 255K, 255L, 255N, 255P, 255Q, 255R, 255S, 255T, 255V, 255W, 255Y, 256A, 256C, 256I, 256M, 256N, 256T, 257A, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 257I, 257K, 257L, 257M, 257N, 257P, 257Q, 257R, 257T, 257V, 257W, 258C, 258D, 258E, 258F, 258G, 258H, 258I, 258K, 258L, 258M, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258T, 258V, 258Y, 259A, 259E, 259G, 259H, 259I, 259K, 259L, 259M, 259P, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 259Y, 260A, 260C, 260D, 260E, 260F, 260G, 260H, 260I, 260L, 260M, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260T, 260V, 260W, 260Y, 261A, 261C, 261I, 261M, 261N, 261Q, 261S, 261T, 261V, 262A, 262C, 262I, 262M, 262T, 263A, 263C, 263L, 263M, 263N, 263P, 263S, 263V, 264D, 264E, 264G, 264H, 264I, 264L, 264N, 264Y, 265A, 265C, 265F, 265M, 265T, 265Y, 267A, 267C, 267D, 267F, 267G, 267H, 267M, 267N, 267Q, 267T, 267V, 268M, 268Q, 268R, 268V, 268Y, 270C, 270F, 270G, 270I, 270L, 270M, 270N, 270R, 270S, 270V, 270Y, 271F, 272G, 272I, 272L, 272M, 272N, 272S, 272T, 272V, 273D, 273G, 273I, 273K, 273L, 273P, 273Q, 273R, 273S, 273T, 273V, 273W, 273Y, 274A, 274C, 274F, 274G, 274H, 274I, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275A, 275C, 275E, 275F, 275G, 275H, 275I, 275K, 275L, 275M, 275N, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 275W, 275Y, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 277A, 277C, 277D, 277F, 277G, 277H, 277I, 277K, 277L, 277M, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277W, 277Y, 278A, 278C, 278T, 279D, 279E, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279R, 279S, 279V, 279W, 279Y, 280A, 280D, 280E, 280F, 280G, 280H, 280K, 280L, 280M, 280N, 280Q, 280R, 280S, 280T, 280Y, 281C, 281F, 281L, 282A, 282C, 282D, 282E, 282F, 282G, 282H, 282I, 282K, 282L, 282M, 282N, 282P, 282Q, 282R, 282T, 282V, 282W, 282Y, 283A, 283C, 283F, 283G, 283H, 283I, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 283Y, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 284L, 284M, 284N, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285A, 285C, 285E, 285H, 285I, 285L, 285M, 285N, 285Q, 285S, 285T, 285V, 285Y, 286A, 286C, 286L, 286M, 286N, 286Q, 286T, 286V, 287A, 287C, 287D, 287E, 287F, 287G, 287H, 287I, 287K, 287L, 287M, 287N, 287P, 287Q, 287S, 287T, 287V, 287W, 287Y, 288A, 288C, 288I, 288M, 288T, 288V, 289A, 289S, 290F, 290H, 290M, 290Y, 291C, 291F, 291G, 291I, 291L, 291M, 291N, 291S, 291T, 291V, 292A, 292C, 292I, 292L, 292M, 292S, 292T, 292W, 293C, 293D, 293E, 293F, 293G, 293N, 293Q, 293S, 293V, 294C, 294G, 294M, 294N, 294S, 294T, 294V, 295A, 295C, 295G, 295T, 296A, 296C, 296F, 296G, 296H, 296K, 296M, 297A, 297C, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 300I, 300K, 300L, 300M, 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 301I, 301K, 301L, 301M, 301Q, 301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 302S, 302T, 303L, 303M, 303W, 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 305I, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 307Q, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309C, 309D, 309E, 309F, 309H, 309I, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 310I, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F, 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 311Q, 311R, 311S, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 313I, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 313Q, 313R, 313S, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 315I, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, 315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 316I, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 317I, 317K, 317L, 317N, 317Q, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320W, 320
Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 326Q, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 331I, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 332I, 332K, 332L, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 333I, 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 336I, 336K, 336L, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 337Q, 337R, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 338I, 338L, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 339I, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 340I, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341I, 341L, 341M, 341V, 341W, 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 342L, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343P, 343Q, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, 344H, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 345W, 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A, 347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 348I, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 349I, 349K, 349L, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N, 350S, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351S, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 352I, 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352W, 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T, 355C, 355D, 355E, 355F, 355G, 355I, 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 356I, 356K, 356L, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 357I, 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358W, 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 359I, 359K, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 362I, 362L, 362M, 362Q, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 365I, 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 365S, 365T, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 366L, 366M, 366S, 366T, 366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 367I, 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 368I, 368K, 368L, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 368T, 368V, 368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 371I, 371L, 371M, 371N, 371Q, 371S, 371T, 371W, 371Y, 372A, 372C, 372G, 372I, 372L, 372M, 372N, 372Q, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373G, 373I, 373M, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 374I, 374L, 374M, 374N, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 376I, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377I, 377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 380I, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A, 381G, 381I, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383W, 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 384I, 384K, 384L, 384P, 384Q, 384S, 384T, 384V, 384W, 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 385I, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 386I, 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 387I, 387L, 387N, 387Q, 387S, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 388I, 388L, 388M, 388N, 388P, 388Q, 388R, 388S, 388T, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 389I, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389W, 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 390I, 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 391I, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392M, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 394S, 394T, 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 395I, 395K, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T, 397A, 397C, 397D, 397E, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397M, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F, 398G, 398I, 398L, 398M, 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398T, 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399H, 399I, 399K, 399L, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400N, 400P, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403E, 403G, 403H, 403I, 403M, 403N, 403Q, 403S, 403T, 403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 404I, 404L, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 405I, 405K, 405Q, 405S, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y, 407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 408I, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 409I, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 410I, 410K, 410Q, 410S, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 411I, 411L, 411M, 411N, 411Q, 411R, 411S, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 412I, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 412S, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 413I, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 415I, 415K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415W, 416F, 416I, 416L, 416P, 416Q, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 419I, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 421I, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 422I, 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 423I, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 424I, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425M, 425S, 425T, 425V, 425W, and 425Y.
【０１３３】
修飾は、親ポリペプチド中の1以上のアミノ酸残基を、別のアミノ酸残基に置換するものであってもよく、以下が例示される：
1A, 1D, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2W, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4D, 4E, 4F, 4G, 4I, 4K, 4L, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5K, 5L, 5V, 5W, 6D, 6H, 6K, 6L, 6P, 6Q, 6S, 6V, 6W, 7A, 7D, 7E, 7H, 7N, 7Q, 7R, 7S, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y,9A, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9V, 9W, 9Y, 10I, 10L, 10M, 10P, 10S, 10V, 11A, 11F, 11M, 11V, 12I, 12M, 13A, 13D, 13Q, 14G, 14S, 14T, 14V, 15F, 16M, 16Q, 18G, 18N, 18R, 19H, 19W, 20A, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20M, 20R, 20S, 20V, 20W, 20Y, 21E, 21I, 21M, 21Q, 21S, 21V, 22I, 22T, 22V, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24F, 24G, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25E, 25F, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26I, 26L, 27A, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28V, 28W, 28Y, 29F, 29L, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30L, 30M, 30N, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31Y, 32G, 32S, 33A, 33D, 33E, 33H, 33Q, 33S, 34W, 35A, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 36F, 36H, 36I, 36L, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37V, 39A, 39P, 39S, 39V, 42V, 43A, 43S, 43T, 43V, 44A, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44N, 44R, 44S, 44T, 44Y, 45F, 45H, 45I, 45L, 45M, 45S, 45T, 46A, 46D, 46F, 46H, 46L, 46M, 46N, 46R, 47A, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48E, 48F, 48H, 48N, 48P, 48W, 49A, 49F, 49G, 49H, 49K, 49L, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50E, 50F, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53E, 53F, 53H, 53I, 53L, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 54A, 54C, 54F, 54G, 54H, 54L, 54N, 54P, 54R, 54T, 54W, 54Y, 55A, 55F, 55H, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57E, 57H, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57Y, 58F, 59A, 59C, 59F, 59H, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59W, 60L, 60N, 63H, 63N, 64A, 64S, 65A, 65I, 65R, 66D, 66E, 66G, 66M, 66N, 66Q, 66R, 67A, 67F, 67G, 67I, 67L, 67N, 67Q, 67T, 67W, 68D, 68F, 68H, 68I, 68L, 68N, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 69M, 69V, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73F, 73M, 73W, 74M, 74T, 76A, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76Y, 77A, 77D, 77K, 77L, 77R, 77Y, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78P, 78R, 78S, 78T, 78W, 78Y, 79A, 79M, 79Q, 79S, 80M, 81E, 81G, 81H, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81Y, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82Y, 83A, 83F, 83L, 84A, 84N, 84S, 84T, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87G, 88A, 88D, 88F, 88G, 88H, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88W, 88Y, 89D, 89F, 89G, 89H, 89I, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90D, 90E, 90F, 90H, 90I, 90K, 90M, 90N, 90R, 90S, 90T, 90V, 90W, 91D, 91E, 91H, 91K, 91N, 91Q, 91R, 91S, 92L, 92V, 93A, 93D, 93G, 93M, 93N, 93R, 93S, 93Y, 94I, 95F, 95M, 96I, 98C, 99I, 100C, 100F, 100M, 100V, 103A, 103C, 103V, 104A, 104S, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105M, 105W, 105Y, 106E, 106H, 106N, 106Q, 106S, 106T, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 107I, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 107S, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 108I, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109D, 109H, 109I, 109K, 109L, 109N, 109R, 109S, 109V, 109W, 109Y, 110V, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 111K, 111L, 111M, 111N, 111Q, 111R, 111T, 112A, 112D, 112E, 112H, 112K, 112L, 112R, 112S, 112T, 112W, 112Y, 113A, 114L, 115A, 115H, 115I, 115L, 115R, 115V, 115Y, 116A, 116F, 116G, 116H, 116I, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 118D, 118F, 118G, 118H, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119E, 119F, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119S, 119T, 119Y, 121S, 124A, 124K, 124Q, 124R, 124S, 124T, 125A, 125D, 125F, 125I, 125K, 125Q, 125R, 125V, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 128A, 128C, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 129C, 129D, 129E, 130A, 130F, 130L, 130T, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131N, 131Q, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132I, 132N, 132S, 132W, 134E, 134F, 134L, 134M, 134R, 134Y, 135E, 136L, 140A, 141F, 141H, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143C, 143D, 143K, 143L, 143N, 143Q, 143S, 144T, 147F, 147L, 150H, 151C, 151D, 151E, 151G, 151H, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151S, 151T, 152A, 152C, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 152S, 152V, 152W, 152Y, 153E, 153F, 153H, 153K, 153L, 153N, 153R, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 155M, 156A, 156F, 156G, 156K, 156L, 156Q, 156R, 156V, 156Y, 157F, 157H, 158A, 158I, 158M, 158T, 158V, 159H, 159I, 159L, 159M, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160Q, 160S, 160T, 160V, 162I, 162M, 163A, 163E, 163F, 163G, 163H, 163I, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 163T, 163V, 163W, 163Y, 164G, 164H, 164L, 164N, 164S, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165I, 165L, 165M, 165T, 165V, 166C, 166I, 166M, 166V, 167A, 167C, 167E, 167F, 167G, 167I, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 167S, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 170C, 171E, 171H, 171I, 171M, 171N, 171Q, 171R, 172A, 175Y, 179A, 179C, 179G, 179H, 179S, 179W, 180M, 181V, 184D, 186E, 187E, 187F, 187H, 187I, 187K, 187M, 187Q, 187S, 187V, 187W, 188A, 188D, 188F, 188G, 188I, 188K, 188L, 188M, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190H, 190K, 190Q, 190R, 190S, 192G, 192K, 192L, 192P, 192S, 192V, 195D, 195F, 195G, 195H, 195K, 195M, 195R, 195V, 195W, 196A, 196C, 196E, 196F, 196H, 196I, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196Y, 197L, 197V, 198A, 198C, 198I, 198L, 198V, 199C, 199D, 199E, 199F, 199H, 199R, 199S, 199T, 199Y, 200I, 200N, 200S, 200V, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202V, 203A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 204I, 204M, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205I, 205L, 205M, 205N, 205V, 207A, 209L, 209V, 211H, 211S, 211T, 212G, 212N, 213A, 213E, 213F, 213G, 213I, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 214C, 214D, 214F, 214G, 214I, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 214S, 214T, 214V, 214W, 214Y, 217I, 217Q, 217T, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 218I, 218K, 218L, 218M, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219N, 219Q, 219S, 219T, 219V, 219Y, 221C, 221E, 221G, 221Q, 221S, 221V, 222F, 222T, 223H, 223L, 223M, 223W, 224I, 225E, 225F, 225N, 225P, 225Q, 225T, 225Y, 226I, 226L, 229D, 229E, 229N, 229T, 230A, 230D, 230E, 230F, 230H, 230I, 230K, 230M, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231H, 231W, 232S, 233A, 233D, 233E, 233F, 233G, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234F, 234G, 234H, 234I, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235L, 235M, 236A, 236G, 236I, 236L, 236M, 236N, 236Q, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 237I, 237K, 237L, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238E, 238G, 238N, 238R, 238S, 238W, 239I, 239M, 240A, 240E, 240F, 240G, 240L, 240Q, 240R, 240T, 240V, 240Y, 241F, 241G, 241H, 241I, 241K, 241L, 241R, 241S, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242F, 242I, 242K, 242L, 242S, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 243S, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244I, 244M, 244V, 245C, 245F, 245H, 245I, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246C, 246D, 246E, 246G, 246I, 246L, 246Q, 246W, 246Y, 247F, 247G, 247H, 247I, 247L, 247M, 247N, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248F, 248G, 248K, 248L, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249F, 249L, 249M, 249V, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250I, 250K, 250L, 250M, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251K, 251L, 251M, 251P, 251Q, 251V, 251Y, 252F, 252L, 252W, 253F, 253I, 253K, 253L, 253M, 253R, 253T, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254I, 254L, 254N, 254T, 254V, 254Y, 255A, 255E, 255I, 255K, 255P, 255R, 255S, 255V, 256A, 256C, 256I, 257E, 257I, 257L, 257P, 258C, 258D, 258E, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258V, 259A, 259G, 259H, 259K, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 260A, 260C, 260D, 260F, 260H, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260Y, 261M, 262I, 263C, 263L, 263M, 263S, 263V, 264E, 264H, 264I, 264L, 264Y, 267A, 267C, 267N, 267T, 268M, 268Q, 270F, 270G, 270N, 270S, 270V, 271F, 272G, 272L, 272S, 272V, 273G, 273I, 273L, 273T, 273Y, 274F, 274G, 274H, 274I, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 274S, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275F, 275G, 275H, 275K, 275P, 275Q, 275R, 275S, 275T, 275V, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 276S, 276T, 276Y, 277A, 277D, 277F, 277G, 277H, 277I, 277K, 277L, 277N, 277P, 277Q, 277R, 277S, 277T, 277V, 277Y, 279H, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279Y, 280F, 280Y, 281C, 281L, 282A, 282D, 282I, 282K, 282L, 282M, 282N, 282Q, 282T, 282W, 282Y, 283C, 283G, 283H, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 284L, 284N, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285E, 285M, 286C, 286L, 286M, 286V, 287A, 287C, 287E, 287H, 287I, 287K, 287L, 287M, 287Q, 287S, 287T, 287V, 288C, 288I, 288M, 288V, 289A, 290Y, 291C, 291G, 291L, 291S, 291T, 292A, 292C, 292I, 292L, 292T, 293C, 293V, 294C, 294G, 294S, 294T, 295A, 295G, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299G, 299I, 299N, 299V, 300H, 300M, 300R, 300V, 301I, 301K, 301L, 301M, 301T, 302T, 303M, 304L, 304Y, 305T, 305V, 307C, 307N, 308C, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 30
8W, 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 320I, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 331I, 331L, 331Q, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 336I, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336W, 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 338I, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 343S, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 348F, 348H, 348I, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 349I, 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 353I, 353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353W, 353Y, 355C, 355F, 355I, 355L, 355M, 355V, 355Y, 356D, 356F, 356G, 356I, 356K, 356L, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357H, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357S, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 358I, 358K, 358L, 358M, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359W, 360F, 360P, 360T, 361C, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 362A, 362C, 362I, 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364G, 364I, 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 365I, 365K, 365L, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 367S, 367T, 367W, 367Y, 368G, 368I, 368K, 368L, 368R, 368T, 368V, 368W, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369S, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 371I, 371L, 371M, 371N, 371S, 371T, 371Y, 372A, 372C, 372I, 372L, 372N, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373I, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 374I, 374M, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375Y, 376G, 376I, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 381I, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 382I, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 384I, 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387I, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 388L, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 389I, 389M, 389Q, 389V, 390F, 390I, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 399I, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 403I, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 409I, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 413I, 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 415I, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 419I, 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 421S, 421T, 422F, 422I, 422S, 422W, 423D, 423I, 423Q, 423R, 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425V, and 425Y.
【０１３４】
置換を次の群から選択することもできる：
052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, 及び 416V。
これらの突然変異体は、タンパク質発現及び活性のPI値が>0.5である。
【０１３５】
親AmyEポリペプチドの153位のアミノ酸残基をN, K またはFに変更する置換により、マルトース及びマルトヘプタオース基質をグルコースへ転換する能力が向上する。親AmyEポリペプチドの153位のアミノ酸残基を Kに変更する置換により、DP7基質をグルコースへ転換する能力が向上する。
【０１３６】
L142F, L142G, L142Q, L142S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L, 及びS254I置換により、澱粉液化能力が全長AmyEポリペプチドよりも高くなる。W60L, W60M, W60N, I100F, I100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V, 及びT279A置換により、澱粉液化能力が切断AmyEポリペプチドよりも高くなる。
【０１３７】
以下の1以上の位置を置換することにより、タンパク質発現及び活性の双方のPI値が>0.5となり、さらにAmyEポリペプチドの様々な性質に影響を及ぼすことが期待される：
052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, 及び416V。 
【０１３８】
AmyEポリペプチドの多数の残基位置を突然変異誘発することができるが、位置75, 97, 101, 102, 120, 123, 133, 137, 182, 266, 及び306は、通常これらの位置の突然変異誘発により性能が低下するという意味において、拘束されている。特に、位置75及び123は切断親ポリペプチドの性能発現のために完全に拘束されており、位置75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266,及び 306は全長親ポリペプチドのの性能発現のために完全に拘束されている。
【０１３９】
大きな群及び小さな群について多数の突然変異を列挙したが、各突然変異は分離独立しており、いずれか1以上の指定した突然変異が、さらなる小さな群に含まれるか、または除外される。従って、本願の組成物及び方法には、本願に開示する1以上の変異体、またはその組合せが含まれる。
【０１４０】
＜3. AmyEポリペプチドの産出＞
適切なプロモータ、オペレータ、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び、任意にリプレッサー遺伝子、または種々のアクティベータ遺伝子をコードする制御配列を有する発現ベクターを用いて、AmyEポリペプチドをコードするDNA配列を酵素の形態で発現させることができる
【０１４１】
AmyEまたはその変異体をコードする核酸を備えるベクターも提供される。このベクターを含む宿主細胞も提供される。宿主細胞はAmyE変異体をコードするポリヌクレオチドを発現することができる。宿主細胞は、例えばB.スブチリス等のバシラス属である。
【０１４２】
＜3.1 ポリヌクレオチド及びベクター＞
この発明の組成物及び方法の一態様には、AmyEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドだけでなく、このポリヌクレオチドに基づくAmyEポリペプチドの発現に有用なベクターや宿主細胞が含まれる。AmyEポリペプチドをコードする核酸の非限定的例示として、SEQ ID NO: 1のAmyE及びAmyE-tr (SEQ ID NO: 2)のそれぞれをコードするSEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 6のポリヌクレオチド、及びこれらの変異体が挙げられる。別の代表的ポリヌクレオチドとして、Amy31A (SEQ ID NO: 3)をコードするSEQ ID NO: 7のポリヌクレオチドが挙げられる。NCBI 信託番号ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841, 及びBAA31528に開示されたAmyEも公知のデータベースに開示されたポリヌクレオチドによコードされ、これらの配列を本願に参照として組み込む。核酸は、DNA, mRNA, またはcDNA等である。核酸にはさらに上記の核酸のいずれかに対応する縮重配列も含まれる。縮重配列は、特定の宿主有機体に適したコドンを用いた発現に適合するように設計されている。
【０１４３】
AmyEポリペプチド（変異体を含む）をコードするDNA配列を備える組換え変異体ベクターは、DNA組換え法での使用に適したベクターであればよく、ベクターを導入する宿主細胞に応じてベクターを選択する。すなわち、ベクターは自己複製ベクター、すなわち染色体外に存在するベクターであって、その複製は染色体複製から独立しており、例えばプラスミド、バクテリオファージ、または染色体外エレメント、ミニクロモソーム、または合成染色体である。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノムに導入され、そのベクターが組み込まれた染色体とともに複製されるベクターであってもよい。またベクターが組み込まれた遺伝子も、抗生物質選択、または必須調節遺伝子等の他の選択圧、または必須代謝経路遺伝子の相補性によって機能する増幅機構により増幅されて、染色体中の遺伝子の多数のコピーが作られる。
【０１４４】
通常、発現ベクターにはクローニングベクターの構成要素、例えば、選択した宿主生物中のベクターを自律的に複製させる構成要素や、細胞選択のための一以上の表現型の検出可能なマーカーを発現させる構成要素が含まれている。通常、この発現ベクターにはプロモータ、オペレーター、リボソーム、結合部位、翻訳開始シグナル及び任意に、リプレッサー遺伝子又は1以上の活性化物質遺伝子が含まれている。一態様では、使用する全てのシグナル配列は、酵素の容易な回収や精製のため、物質を細胞培養培地へ向かわせる。Amyまたはその変異体、プロモータ、ターミネータ及び他の構成要素のそれぞれをコードするDNA構造体をリゲートし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために用いられる手順は、本技術分野の技術者にとって公知である（Sambrookら、MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, 第2版、Cold Spring Harbor, 1989 及び第3版、2001）。
【０１４５】
ベクター中では、DNA配列が適切なプロモータ配列に作動可能に連結していなければならない。プロモータは選択した宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であればよく、宿主細胞と相同または非相同のタンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモータでもよい。特に細菌の宿主においてAmyEまたはその変異体をコードするDNA配列の転写の指令に適したプロモータは、例えばB. スブチリス(subtilis), B.リケニホルミス(licheniformis), B. ステアテルモフィラス(stearothermophilus), またはB. アミロリケファシエンス(amyloliquefaciens)等の様々なバシラス属由来のα-アミラーゼプロモータ、E. coliのlac オペロンのプロモータ、ストレプトマイセス・ケリカラー (Streptmyces coelicolor) アガラーゼ遺伝子dagA又はcelA プロモータ、及びバチルス・スブチリス xylA 及びxylB遺伝子のプロモータ等である。菌類の宿主での転写において有用なプロモータの例は、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテナーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)中性α-アミラーゼ、A・ニガー(A.niger）酸安定α-アミラーゼ、A・ニガー(A.niger）グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、A.オリザエ(A.oryzae)アルカリプロテアーゼ、A.オリゼ(A.oryzae)トリオースホスフェートイソメラーゼ、またはA.ニジュランス(A.nidulans)アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。AmyEまたはその変異体をコードする遺伝子を大腸菌等のバクテリア種中で発現させるとき、適当なプロモータを選択することができ、例えば、T7プロモータとファージラムダプロモータ等のバクテリオファージプロモータから選択することができる。酵母種中で発現させるときに適したプロモータの非限定的例示として、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のGal1及びGal 10プロモータ、及びピキア・
パストリス(Pichia pastoris)のAOX1又はAOX2プロモータが挙げられる。
【０１４６】
発現ベクターには適切な転写ターミネータが含まれていてもよく、真核細胞では、ポリα-アミラーゼ変異体をコードするDNA配列に作動可能に結合したポリアデニル化配列が含まれていてもよい。ターミネーション配列とポリアデニル化配列は、プロモータと同一の源に由来するものでもよい。さらに、ベクターに、この宿主細胞でベクターを複製させることのできるDNA配列が含まれていてもよい。このような配列の例として、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pICatH及びｐIJ702の複製の開始点になる配列が挙げられる。
【０１４７】
また、ベクターには、例えば、B・スブチリス(B. subtilis)またはB・リケニホルミス(B.licheniformis)由来のdal遺伝子のように、その遺伝子の産出物が宿主細胞の欠陥を補う遺伝子、または、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与える遺伝子のように抗生物質への耐性を与える遺伝子等の、選択マーカが含まれていてもよい。さらに、ベクターにamdS,argB,niaD及びxxsC等のハイグロマイシン耐性を生じるマーカのようなアスペルギルス選択マーカが含まれていてもよく、また選択を本技術分野で公知のコトランスフォーメーション(co-transformation)により行うこともできる。例えばWO91/17243が参照される。
【０１４８】
＜3.2 AmyEポリペプチドの発現と宿主有機体＞
AmyEポリペプチドを宿主細胞中で発現させたとき、培地中に分泌されることが好ましい。このため、AmyEポリペプチドには、発現された酵素を倍地中に分泌させることができるシグナル配列が含まれている。シグナル配列はAmyEと同じ遺伝子でコードされる。例えばSEQ ID NO: 1に示すAmyEは、シグナル配列、及び付随するN-末端アミノ酸を有する配列であるMFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE (SEQ ID NO: 9)によって自然に発現される。あるいは、シグナル配列は、別のAmyEまたは別のタンパク質に由来するB. スブチリス属のシグナル配列でもよい。さらに、B. リケニホルミス等の別の種に由来するシグナル配列でもよい。シグナル配列は、例えば特定の宿主細胞中でAmyEまたはその変異体の最適な発現が得られるように選択することができる。成熟AmyEは、N-末端に付随するシグナル配列ではない配列のタンパク質分解切断の結果得られる。例えば、B. リケニホルミス由来の31-アミノ酸残基シグナル配列(LATリーダー配列)をAmyE配列の骨格に融合させることができる。例えば、AmyEをコードする核酸を、図2に示す発現ベクター中のB. リケニホルミスシグナル配列に作動可能に結合させる。
【０１４９】
DNA構築体または発現ベクターのいずれかを含有する単離細胞を、AmyEまたはその変異体の組換え体産出用の宿主細胞として有効に用いることができる。この細胞にAmyEまたはその変異体をコードするDNA構築体を宿主の染色体に組み込むことによって、この細胞をAmyEまたはその変異体をコードするDNA構築体で形質転換することができる。DNA配列は細胞中でより安定化するので、このような組み込みは有利であると考えられる。DNA構築体の宿主の染色体への組み込みは、例えば相同または非相同組換え等の公知の方法で行なうことができる。あるいは、宿主細胞を、様々な種類の宿主細胞に関して上記で説明したように、発現ベクターにより形質転換することができる。
【０１５０】
好ましいバクテリア性宿主有機体はグラム陽性バクテリアであり、例えばバチラス・スブチリス、バチラス・リケニホルミス、バチラス・レンタス(Bacillus lentus)、バチラス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチラス・ステアロテルモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バチラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バチラス・アミロリケファシンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチラス・コーギュランス(coagulans)、バチラス・ロータス(lautus)、バチラス・メガテリウム(megaterium)、及びバチラス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)等のバチラス属；スプレプトマイセス・ムリヌス(Streptomyces murinus)等のスプレプトマイセス属、ラクトコーカス・ラクティス(Lactococcus lactis)等のラクトコーカス属を含む乳酸バクテリア；ラクトバシルス・リューテリ(Lactobacillus reuteri)を含むラクトバシルス属；リューコノストック(Leuconostoc)属；ペジオコックス(Pediococcus)属；及びスプレプトコックス(Streptococcus)属等である。また別の有用な宿主細胞は、例えばA 7-7等のバシラス属である。あるいは、大腸菌を含むエンター・オバクテリアシー(Enter obacteriaceae)、またはシュードモナス(seudomonadaceae)に属するグラム陰性バクテリアの株を宿主有機体として用いることもできる。
【０１５１】
好ましい酵母宿主有機体は、バイオテクノロジー的に関連する酵母から選択され、非限定的例示として、ピチア(Pichia)属、ハンセルナ(Hansenula)属、またはクリベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウィニア(Yarrowinia)属、サッカロミセス・セレヴィシエ( cerevisiae)を含むサッカロミセス(Saccharomyces)属、あるいは、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ(Pombe)を含むシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属が挙げられる。メチオトローフ酵母のピチア・パストリス株を宿主有機体として用いることができる。あるいは、宿主有機体はハンセヌラ属であってもよい。好ましい繊維状菌類の宿主有機体として、例えばアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・チュビゲンシス(tubigensis)、アスペルギルス・アワモリ(awamori)、アスペルギルス・ニジュランス(nidulans)等のアスペルギルス属が挙げられる。または、フザリウム・オキシスポルム(oxysporum)等のフザリウム属の株や、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)等のリゾムコール属の株を宿主有機体に用いることができる。このほか、サーモミセス(Thermomyces)属、ムコール(Mucor) 属の株を宿主有機体に用いることもできる。菌類細胞は、原形質体を形成し、原形質体を形質転換し、次に公知の方法で細胞壁を再生することによって、形質転換することができる。アスペルギルス宿主細胞の形質転換に適した方法は、例えば欧州特許番号EP 238023に開示されている。
【０１５２】
この発明の組成物と方法により、AmyE変異体を産出する方法が提供される。この方法では、変異体を産出できる条件下で上記の宿主細胞を培養し、変異体を細胞および／または培地から回収する。宿主細胞を培養する培地は、宿主細胞の培養に適し、AmyE変異体を発現させることができる公知の培地である。好ましい培地と培地用材料は市販されている。あるいは、例えばAmerican Type Culture Collection(ATCC)のカタログに記載された処方に従って調製することができる。培地の非限定的例示として、3000リットルの撹拌発酵槽を用いた流加培養法が挙げられる。この場合、成長培地には、トウモロコシ浸漬固体と大豆粉が有機化合物源として含まれ、さらに、ナトリウム源、カリウム源、リン源、マグネシウム源、イオウ源としての無機塩と、その他の微量成分が含まれる。一般に、当初の培地にはグルコース等の炭水化物源が含まれている。培養液が調製され、培養が始まると、公知のように、培養を継続するため炭水化物を培養槽に添加する。培養槽からサンプルを定期的に採取し、例えば比色分析によって酵素力価を測定する。分析により酵素産出速度の増加が停止したと認められたとき、発酵プロセスを終了する。
【０１５３】
宿主細胞から分泌されたAmyEポリペプチドは、培地から公知の方法により回収することができる。この方法には、細胞を濾過または遠心分離によって培地から分離し、硫酸アンモニウム等の塩で培地中の蛋白性物質を沈殿させ、次にイオン交換や、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフ工程を行なうことが含まれる。
【０１５４】
宿主細胞は、AmyEポリペプチドの発現に適した条件で培養される。蛋白の発現は、蛋白が連続して産出され、または誘導され、発現が開始される刺激が与えられるようにして構成される。誘導性発現の場合、蛋白の産出を行なうとき、例えばデキサメタゾン、IPTG、またはセファロース等の誘導物質を培地に添加することにより、発現を開始することができる。ポリペプチドは、例えばTnTTM (Promega社)ウサギ網状赤血球系のようなインビトロ(in vitro)無細胞系で、組換えにより産出することもできる。
【０１５５】
AmyEポリペプチドを発現する宿主は、宿主に適した培地中で好気的条件下において培養することができる。宿主と所望のα-アミラーゼ変異体の培養に要求される条件にもよるが、例えば約30℃から約75℃の温度の宿主に適した温度で、振蕩、または撹拌及び通気を行いながら培養する。培養は約12時間から約100時間またはそれ以上（あるいはこの中間の時間）、または例えば24時間から72時間行なわれる。宿主と所望のAmyE変異体の培養に要求される条件にもよるが、培養液のpHは一般に約5.5から約8.0である。
【０１５６】
発現された酵素の澱粉分解活性は、例えば、基質にジャガイモ澱粉を用いて評価することができる。この方法は、修飾されたジャガイモ澱粉を酵素で分解させ、この澱粉/酵素のサンプル溶液をヨウ素溶液と混合することを基本とする。溶液は、最初は暗青色を呈するが、澱粉が分解されるに従い青色が弱まり、次第に赤褐色に変化する。この色を標準着色ガラス板と比較する。
【０１５７】
AmyEポリペプチドは、AmyEの成熟形のN-および／またはC-末端に、例えばシグナル配列またはHis-tag等の、発現、検出、および／または精製を促進する配列を備える融合タンパク質として発現される。このような配列には、宿主有機体中でのAmyEの分泌及び発現を促進するシグナル配列が含まれる。付随するアミノ酸残基はAmyEのN-末端から切断され、次にYang et al., “Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillus subtilis,” Nucleic Acids Res. 11: 237-49 (1983)に記載されているように、シグナル配列が切断される。
【０１５８】
＜4.AmyEポリペプチドの精製＞
公知の方法を用いて、精製されたAmyEポリペプチドを調製することができる。培地で宿主有機体を培養した後、成長(または発酵)ブロスが得られ、このブロスから微生物細胞、種々の懸濁固形分、及び発酵用原料の残渣を公知の分離方法で除去することにより、アミラーゼ含有液が得られる。一般に、濾過、遠心分離、精密濾過、回転ドラム式真空濾過の後、限外濾過、抽出またはクロマトグラフィー等が用いられる。
【０１５９】
通常、回収を容易にするため、AmyEまたはその変異体を含有する液を濃縮することが好ましい。濃縮されていない液を用いると、精製されたα-アミラーゼ変異体を含有する沈殿物を回収するためのインキュベーション時間が長くなる。α-アミラーゼ変異体を含有する液を、公知の濃縮方法によって所望の酵素濃度になるまで濃縮する。酵素を含有する液の濃縮は、上記の方法によって行なうことができる。例えば、限外濾過により濃縮することができる。一実施態様ではロータリー真空蒸発及び/又は限外濾過を用いることができる。または、限外濾過を用いることができる。
【０１６０】
沈殿操作は、例えば金属ハロゲン化物沈降剤を用いて行なうことができる。金属ハロゲン化物沈降剤には、アルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物、またはこれらの金属ハロゲン化物の2種類以上の混合物が含まれる。金属ハロゲン化物は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、 またはこれらの金属ハロゲン化物の2種類以上の混合物から選択される。好ましい金属ハロゲン化物は、塩化ナトリウム、及び塩化カリウムであり、特に塩化ナトリウムは保存料としても使用できるので好ましい。当業者であれば、酵素変異体を沈降させるために必要な金属ハロゲン化物の量と最適値、及び最大回収量を得るためのインキュベーション時間、pH、温度、AmyEまたはその変異体濃度等の条件設定を、通常の予備試験により容易に選択することができる。
【０１６１】
一般に、少なくとも約5% w/v (重量/容積)から約25% w/v、通常は少なくとも8% w/vの金属ハロゲン化物を酵素変異体濃縮液に添加する。一般に、約25% w/vを超えない量、通常は約20% w/vを超えない量の金属ハロゲン化物を酵素変異体濃縮液に添加する。金属ハロゲン化物の最適濃度は、特定のAmyEまたはその変異体の性質と、AmyEまたはその変異体の溶液中の濃度に特に依存する。
【０１６２】
酵素の沈殿を生じさせる別の方法は、酵素変異体濃縮液に添加可能な有機化合物を使用することである。有機化合物沈降剤には、4-ヒドロキシ安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、4-ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、及びこれらの有機化合物の2種類以上の混合物が含まれる。有機化合物沈降剤の添加は、金属ハロゲン化物沈降剤の添加前、添加と同時または添加後に行なうことができ、有機化合物沈降剤と金属ハロゲン化物沈降剤の両者を添加する場合、同時または順次添加することができる。より詳しくは、例えばDanisco A/Sの米国特許第5,281,526号を参照することができる。
【０１６３】
一般に有機化合物沈降剤は、4-ヒドロキシ安息香酸のナトリウム塩、またはカリウム塩等の4-ヒドロキシ安息香酸アルカリ金属塩、炭素数が1から12の直鎖または分岐アルキル基を有する4-ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル、及びこれらの有機化合物の2種類以上の混合物から成る群から選択される。有機化合物沈降剤は、炭素数が1から10の直鎖または分岐アルキル基を有する4-ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル、及びこれらの有機化合物の2種類以上の混合物であってもよい。好ましい有機化合物として、炭素数が1から6の直鎖アルキル基を有する4-ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル、及びこれらの有機化合物の2種類以上の混合物が挙げられる。4-ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、4-ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、4-ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、4-ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル、及びこれらの有機化合物の２種類以上の混合物を用いることもできる。別の有機化合物の比限定的例示として、4-ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（メチルPARABEN）、及び4-ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（プロピルPARABEN）が挙げられ、これらはアミラーゼの保存剤でもある。有機化合物沈降剤の添加により、沈殿条件におけるpH、温度、α-アミラーゼ変異体濃度、沈降剤濃度、 及びインキュベーション時間のフレキシビリティが高くなる。一般に、少なくとも0.01% w/vの有機化合物沈降剤が酵素変異体濃縮液に添加され、通常は少なくとも0.02% w/v添加される。一般に、0.3% w/vを超えない量の有機化合物沈降剤が酵素変異体濃縮液に添加され、通常は0.2% w/vを超えない量が添加される。
【０１６４】
精製される酵素変異体の性質に応じて、必要であれば、例えば有機化合物沈降剤と、金属ハロゲン化物沈降剤とを含有する酵素変異体濃縮液のpHを調整する。一般に、pHをアミラーゼの等電点近くに調整する。一般に、pHを等電点(PI)から約2.5 pH単位低い値から、等電点(PI)より約2.5 pH単位高い値の範囲に調整する。変異体のpIが野生型のpIとは異なる場合、pHを調整することができる。
【０１６５】
精製された酵素沈殿物を得るために必要なインキュベーション時間は、精製しようとする酵素の性質、酵素の濃度、使用する沈降剤の種類と濃度に依存する。酵素を沈殿させるために必要な時間は、一般に約1から約30時間で、通常25時間を超えない。有機化合物沈降剤の存在下では、インキュベーション時間は約10時間未満まで低減され、多くの場合約6時間まで低減される。
【０１６６】
インキュベーション中の温度は、一般に約4℃から約50℃である。通常、この方法は約10℃から約45℃、または約20℃から約40℃の温度範囲において行なわれる。沈殿を生じさせるための最適温度は、溶液濃度、及び酵素、または使用する沈降剤により異なる。
【０１６７】
精製された酵素変異体の総回収量、及び回収プロセスの効率は、酵素、添加された金属ハロゲン化物及び有機化合から成る溶液を撹拌することにより改善される。撹拌工程は、金属ハロゲン化物及び有機化合を添加している間、及びその後のインキュベーションの間の双方において行なうことができる。好ましい撹拌方法には、機械的撹拌または振蕩、強力な通気、その他同様の方法が含まれる。
【０１６８】
精製された酵素は、濾過、遠心分離、精密濾過、回転ドラム式真空濾過、限外濾過、加圧濾過、クロスメンブラン精密濾過、クロスフロー膜精密濾過等の公知の分離方法で回収される。クロスメンブラン精密濾過を用いることができる。精製された酵素変異体沈殿物を水洗することにより、さらに精製することができる。例えば、精製された酵素変異体沈殿物を、金属ハロゲン化物沈降剤を含む水で洗浄することができ、例えば金属ハロゲン化物沈降剤と有機化合物沈降剤を含む水で洗浄することができる。
【０１６９】
培養中、培養液中に発現された酵素が細胞外に蓄積する。発現された酵素を分離精製するために、培養液から遠心分離または濾過により細胞を除き、得られた細胞を含まない液を用いて酵素の精製を行なう。ひとつの実施形態では、飽和度約70%の硫酸アンモニウムを用いて細胞を含まない培養液の塩析を行なう。この70%飽和-沈殿物を緩衝液に溶解させ、Sephadex G-100カラム等のカラムに通し、流出させて酵素変異体活性分画を回収する。さらに精製するために、イオン交換クロマトグラフィー等の公知の方法を用いることもできる。
【０１７０】
精製された酵素は、その酵素が利用されているあらゆる用途に用いることができる。例えば、酵素を洗濯用洗剤や汚れ落としに用いることができ、食品分野では澱粉加工や澱粉分解に用いることができ、また消化剤として医薬品組成物用いることができる。酵素は、液状(溶液、スラリー)または固形状(顆粒、粉末)の最終製品にされる。
【０１７１】
また、産出された酵素を回収し、培養液に凝集剤を添加し、細胞と細胞の残骸を濾過または遠心分離で除去し、それ以上は精製しないこともできる。
【０１７２】
上記の方法で産生し精製したAmyEポリペプチドは、種々の有用な産業的用途に用いることができる。この変異体は織物と家庭用品のケア(F&HC)に関連する用途に適した性質を有する。例えば、変異体を洗浄、食器洗い及び硬質表面の洗浄剤組成物の成分として用いることができる。AmyEポリペプチドはまた、デンプンからの甘味料とエタノールの生産及び/又は織物のデサイジングにも有用である。AmyEポリペプチドは特に、例えばWO2005/111203と米国の公開された出願第2006/0014265(Danisco A/S)に記載されているように、デンプンの液化及び/又は糖化方法等のデンプン転換プロセスにおいて有用である。以下、α-アミラーゼ変異体の種々の用途について説明する。
【０１７３】
＜5. AmyEポリペプチド組成物とその使用＞
＜5.1 澱粉加工用組成物とその使用＞
＜概要＞
AmyEポリペプチドは、甘味料の生産、燃料又は飲料用（すなわち、飲用アルコール）アルコールの生産、飲料の生産、甘蔗糖の生産、又は、例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、ケトン、アミノ酸、抗生物質、酵素、ビタミン、及びホルモン等の所望の有機化合物の生産において重要な、澱粉の液化及び／又は糖化に用いることが出来る。澱粉の転化では通常、糊化または顆粒状澱粉のスラリーを加水分解して溶解性澱粉加水分解物にする。澱粉の転換は通常、3つの連続した酵素工程から成る。すなわち、液化工程、糖化工程、及びグルコースから所望の製品を製造する追加工程である。追加工程では、所望の製品に応じて異性化、発酵等を行う。澱粉をフラクトースシロップに転換するプロセスでは、追加工程は異性化である。
【０１７４】
＜5.1.2. 澱粉組成物＞
原料の澱粉は、塊茎、根茎、茎、マメ科植物、穀類、または全粒分から得られる。より詳しくは、粒状澱粉はコーン、穂軸、小麦、大麦、ライ麦、マイロ、サゴ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウ豆、豆類、バナナ、またはイモ類から得られる。特にワックス状及び非ワックス状のコーン及び大麦が好ましい。澱粉は高度に精製されていてもよく、例えば純度が少なくとも90%, 少なくとも95%, 少なくとも97%, または少なくとも99.5%である。あるいは、澱粉は胚芽残留物及び繊維等の非澱粉成分を含む製粉された全粒分から成る粗製澱粉であってもよい。全粒分等の原料は製粉により粉砕して更に加工することができる。 
【０１７５】
湿式製粉と乾式製粉の、2種類の製粉プロセスを用いることができる。乾式製粉の場合、全穀粒を製粉して使用する。乾式製粉された穀粒には、デンプン以外に相当量の非澱粉質炭水化物化合物が含まれている。このような不均一な原料をジェットクッキング(jet cooking)により加工したとき、デンプンの一部だけが糊化することが多い。湿式製粉の場合は、胚芽と粗びき粉(澱粉粒と蛋白)の分離が良好であり、通常シロップの生産に用いられる。このプロセスは、限外濾過系で実施することができる。限外濾過では、酵素、原料澱粉、及び水が存在する循環流の下で膜非透過物が膜に保持され、水溶性の澱粉加水分解物が膜を透過する。またこのプロセスは、限外濾過膜を有する連続膜型反応器で実施することもできる。この場合、酵素、原料澱粉、及び水が存在する循環流の下で膜非透過物が膜に保持され、水溶性の澱粉加水分解物が膜を透過する。またこのプロセスは、精密濾過膜を有する連続膜型反応器で実施することができる。この場合、酵素、原料澱粉、及び水が存在する循環流の下で、膜非透過物が膜に保持され、水溶性の澱粉加水分解物が膜を透過物する。
【０１７６】
上記のいずれかの態様で使用されるデンプンスラリーには、約20%から約55%の乾燥固体顆粒デンプン、約25%から約40%の乾燥固体顆粒デンプン、または約30%から約35%の固体顆粒デンプンが含まれている。この酵素変異体は、可溶デンプンを、顆粒デンプンのデンプン加水分解物に少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%変換する。
【０１７７】
＜5.1.3. 液化及び糖化＞
液化工程では、α-アミラーゼによって、澱粉スラリー中の長鎖の澱粉分子が短鎖分岐または直鎖分子(マルトデキストリン)に分解される。SPEZYMETM Xtra (Genencor社)やLIQUOZYMETM (Novozymes社)等の、多数のα-アミラーゼが市販されている。
【０１７８】
通常、液化工程では約105-110℃で5から10分間処理した後、95℃で1-2時間処理する。液化工程でのpH は約5.0から約6.2の間であり、通常5.5より高い。これらの条件下でα-アミラーゼの安定性を高めるため、通常1 mMのカルシウムが添加される (フリーカルシウムイオン40 ppm)。これらの処理により液化澱粉組成物のデキストリン含有量が増加し、デキストロース当量(DE)が約10-15になる。
【０１７９】
液化工程の後、別の糖化工程においてグルコアミラーゼ(例えばAMGTM)を添加することにより、デキストリンをデキストロースに転換する。イソメラーゼやプルラナーゼ(例えば PROMOZYMETM)等の脱分岐酵素を添加することもできる。糖化工程の準備として、温度を95℃以上に保ちながら、スラリーのpHを約4.5未満に下げ、液化α-アミラーゼを変性させる。温度を約60℃に下げ、デキストリンからのグルコース生産に影響を及ぼすため、グルコアミラーゼと脱分岐酵素を添加する。糖化プロセスは一般に約24から約72時間行われる。
【０１８０】
＜5.1.4. 糖化により生産されたグルコースの追加加工＞
糖化工程の後、固定化グルコースイソメラーゼ(例えばSWEETZYMETM)デキストロースシロップを高フルクトースシロップに転換することができる。一態様では、本願のプロセスで得られる水溶性の澱粉加水分解物は、高フルクトースコーンシロップ(HFCS)等の、高フルクトース澱粉ベースシロップ(HFSS)に転換される。この転換反応は、グルコースイソメラーゼ、特に固体担体に固定化したグルコースイソメラーゼを用いて行なうことができる。イソメラーゼには、SweetzymeTM, IT (Novozymes AJS社); G-zymeTM IMGI, 及び G-zymeTM G993, KetomaxTM, G-zymeTM G993, G- zymeTM G993 liquid, 及び GenSweetTM IGI等の市販品を用いることができる。Ca2+は公知のα-アミラーゼの安定性を向上させるが、グルコースイソメラーゼの活性を低下させる。このため、通常は異性化の前に例えばイオン交換によりCa2+を除去し、Ca2+濃度を3-5ppm未満にする。このプロセスは時間がかかり、高価である。
【０１８１】
あるいは、糖化により生産されたグルコースを発酵させて、例えばエタノール、ブタノール、本願に開示するその他の製品、及び公知の製品等の発酵製品を製造することができる。発酵により澱粉を含む物質からエタノールを生産する典型的なプロセスには、(i)澱粉を含有する物質をAmyEポリペプチドまたはその変異体により液化する工程と、(ii)得られた液化マッシュを糖化する工程と、(iii)工程(ii)で得られた物質を発酵有機体の存在下で発酵させる工程とが含まれる。任意に、このプロセスにはエタノールを回収する工程が含まれる。発酵中、エタノールの濃度は少なくとも約7%, 少なくとも約8%, 少なくとも約9%, 少なくとも約10%, 少なくとも約11%, 少なくとも約12%, 少なくとも約13%, 少なくとも約14%, 少なくとも15%, または少なくとも16%に達する。 
【０１８２】
糖化工程及び発酵工程は、同時糖化発酵(SSF)プロセスにより行うことができる。 発酵を粒状澱粉スラリーの加水分解と同時に行なう場合、その温度は30℃から35℃、特に31℃から34℃である。このプロセスを、限外濾過系で実施することができ、酵素、原料澱粉、酵母、酵母の栄養源及び水が存在する循環流の下で、膜非透過物は膜に保持され、エタノールを含む液体が膜を透過する。またこのプロセスを、限外濾過膜を有する連続膜型反応器で実施することができ、酵素、原料澱粉、酵母、酵母の栄養源及び水が存在する循環流の下で、膜非透過物は膜に保持され、エタノールを含む液体が膜を透過する。
【０１８３】
糖化工程により生産されたグルコースをエタノール、ブタノール、クエン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、またはエリソルビンナトリウム等の発酵製品の製造に用いることができる。
【０１８４】
＜5.1.5. AmyEα-アミラーゼの利点＞
AmyEポリペプチドを澱粉の加水分解に使用したとき、他のα-アミラーゼには無いいくつかの利点が得られ、これにより澱粉加水分解法を合理化することができる。第1に、AmyEポリペプチドを用いれば、グルコアミラーゼに適した反応条件下で、デキストリンをデキストロースに転換することができる。これにより、反応混合物(例えばスラリー)をα-アミラーゼに適したpH及び温度に合わせる必要が無くなり、例えばpHおよび／または温度を下げて、反応条件をグルコアミラーゼに適合するように調整すればよい。このように、AmyEポリペプチドを澱粉の加水分解に使用することにより、液化と糖化を同一のスラリー条件下で行うことが可能になり、澱粉加水分解の工程の1つを省略することができる。
【０１８５】
いくつかの態様では、液化と糖化の双方を、pH約4-7,例えば約4-5, 約4-6, 約5-6, 約5-7, 及び約6-7の単一のpHにおいて行うことができる。単一のpHというときは、液化及び糖化工程において生じる反応混合物のわずかなpH変化は無視されるが、反応混合物のpH を変化させるために酸または塩基を故意に添加することは含まれない。いくつかの態様では、液化と糖化の双方を、従来の液化工程よりも低いpHで行うことができ、例えばpH約5.0未満、約4.8未満、約4.6,未満、約4.4未満、約4.2未満、またはpH約4.0で行うことができる。AmyEを液化に用いることにより、液化に用いる澱粉組成物中の希薄スティレッジの量を、例えば>50%, または >60%に増やすことができる。いくつかの態様では、液化と糖化の双方を約20-105℃、例えば60-85℃の温度で行うことができ、あるいは、澱粉の糊化温度(すなわち約75℃)より約10, 12, 14, 16, 18, または20℃低い温度で行うことができる。重要な点は、pH調整による中断をはさまずに、液化と糖化を一体で行えることである。あるいは、液化と糖化の間にpH調整を行う方がよい場合でも、従来法と比べて少量の酸または塩基を用いて行うことができるので、反応混合物中に生じる塩が少なくなる。 
【０１８６】
さらに、AmyEポリペプチドは、マルトース、マルトトリオース、及びマルトヘプタオース等の複合糖の分解を触媒して、グルコースにする。このような酵素活性は、従来はα-アミラーゼではなくグルコアミラーゼのものとされてきた。このAmyEポリペプチドの活性により、澱粉からグルコースの加水分解を、別のグルコアミラーゼの非存在下、または従来のα-アミラーゼを用いたとき必要とされる量より少量のグルコアミラーゼの存在下で行うことができる。このように、澱粉の加水分解にAmyEポリペプチドを用いれば、液化と糖化を、α-アミラーゼとグルコアミラーゼの両者の機能を有する単一の酵素を用いて同時に行うことができ、別の酵素を用いる必要性が低減される。
【０１８７】
また、AmyEポリペプチドの安定性を維持するために必要なCa2+は少量または無添加であるため、液化反応にCa2+を添加する必要性が低減されるか、全く必要なくなる。Ca2+を添加する工程を回避できることに加え、その後スラリーをCa2+に対し敏感なグルコースイソメラーゼ等の酵素に接触させる前に、スラリーからCa2+を除去(例えばイオン交換)する必要が無くなる。Ca2+の除去を回避できることにより、時間とコストを節約でき、高フルクトースシロップの生産効率を高めることができる。
【０１８８】
最後に、AmyEポリペプチドは、従来のα-アミラーゼの酵素活性では取り扱いが困難な糊化されていない澱粉に対しても高い活性を示す。これにより、転化効率を高めるために湿式製粉による澱粉が好ましいとされてきた液化及び糖化において、ジェットクッキングした乾式製粉による澱粉を用いることが可能になる。
【０１８９】
AmyEは、発酵、異性化、またはSSF等の他の後工程に繋がる液化/糖化プロセスでの使用に適している。
【０１９０】
＜5.1.6. AmyEとグルコアミラーゼ、及び他の酵素との組み合わせ＞
AmyEポリペプチドは、(例えば澱粉加工における唯一の澱粉分解酵素として)単独で用いることもできるし、他のα-またはβ-アミラーゼ、あるいは別の酵素と組み合わせて様々な活性を有する「カクテル」とすることもできる。例えば、澱粉を 菌類α-アミラーゼ(EC 3.2.1.1), バクテリア性α-アミラーゼ、例えばバシラスαアミラーゼまたは非バシラスαアミラーゼ、またはβ-アミラーゼ(EC 3.2.1.2)から成る群から選択される1以上の酵素と接触させることができる。AmyEポリペプチドを、イソメラーゼ(EC 3.2.1.68)またはプルラナーゼ(EC 3.2.1.41)等の、その他の澱粉分解酵素と組み合わせることもできる。イソアミラーゼはアミロペクチン及びβ-リミットデキストリン中のα-1,6-D-グルコシド分岐結合を加水分解し、イソアミラーゼはプルランを分解できない点、及びイソアミラーゼはα-リミットデキストリンに対する作用が限定的である点で、プルラナーゼとは異なる。
【０１９１】
β-アミラーゼはエクソ活性型マルトース生成型アミラーゼであり、1,4-α-グルコシド結合のアミロース、アミロペクチン、及び関連するグルコースポリマーへの加水分解の触媒となり、マルトースを放出する。β-アミラーゼは、種々の植物及び微生物から分離されている(Fogarty et al., PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, pp. 112-115, 1979)。これらのβ-アミラーゼは、最適温度範囲が40℃から65℃で、最適pH範囲が約4.5から約7.0であることで特徴付けられる。本願で用いられるβ-アミラーゼの非限定的例示として、大麦由来のβ-アミラーゼのSpezymeTM BBA 1500, SpezymeTM DBA, OptimaltTM ME, OptimaltTM BBA (Danisco A/S社)；及びNovozymTM WBA (Novozymes AJS社)が挙げられる。
【０１９２】
本願のAmyEポリペプチドはグルコアミラーゼ活性を有し、あるいは、別のグルコアミラーゼの非存在下で使用することができる。または、従来の澱粉加水分解法と比べてグルコアミラーゼの使用量を削減することができる。好ましくは、グルコアミラーゼは0.5グルコアミラーゼ活性単位 (AGU)/g DS (すなわち乾燥固形成分1グラム当りのグルコアミラーゼ活性単位)を超えない(すなわち未満)の量で使用することができ、0.4 AGU/g DS未満、0.3 AGU/g DS未満、0.2 AGU/g DS未満、または0.1 AGU/g DS未満で使用することができる。一般に、グルコアミラーゼは0.02-2.0 AGU/g DSまたは0.1-1.0 AGU/g DSの範囲で使用することができるが、これらの範囲はAmyEと組み合わせたときに必要な量よりも多い量のグルコアミラーゼを使用することが意図されている。AmyEポリペプチドはグルコアミラーゼと同じpH及び温度で活性を示すため、AmyEポリペプチドは、グルコアミラーゼを添加する前または後に添加することができ、あるいは、例えばAmyEとグルコアミラーゼの両者を含むカクテルを用いて、同時に添加することができる。すなわち、α-アミラーゼとグルコアミラーゼを添加する順序及び方法はもはや重要ではなく、これにより澱粉加水分解プロセスのフレキシビリティが向上する。
【０１９３】
グルコアミラーゼ (EC 3.2.1.3)は、微生物または植物に由来する。様々な菌類またはバクテリア由来のグルコアミラーゼが知られている。バクテリア由来のグルコアミラーゼの例は、アスペルギルス・グルコアミラーゼ、特にアスペルギルス・ニガー(niger) GlまたはG2グルコアミラーゼ(Boel et al. (1984), EMBO J. 3:1097-1102)、または例えばWO 92/00381及びWO 00/04136に開示されたこれらの変異体、あるいは、アスペルギルス・アワモリ(awamori) グルコアミラーゼ(WO 84/02921)、アスペルギルス・オリザエ(oryzae) (Agric. Biol. Chem. (1991) 55(4): 941-949)、またはこれらの変異体または断片である。他のアスペルギルスグルコアミラーゼ変異体には、熱安定性が強化された次に示す変異体が含まれる：G137A及びG139A (Chen et al. (1996) Prot. Eng. 9:499-505); D257E及びD293E/Q (Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8:575-582); N182 (Chen et al. (1994) Biochem. J. 301:275-281); ジスルフィド結合, A246C (Fierobe et al. (1996) Biochemistry, 35:8698-8704); 及びA435及びS436位置へのPro残基の導入 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10:1199-1204)。他のグルコアミラーゼには、トリコデルマ・リーセイ(reesie)グルコアミラーゼ (例えば WO 2006/060062のSEQ ID NO: 3; TrGA), タラロマイセス・グルコアミラーゼ、特に T. エマーソニー(emersonii) (WO 99/28448), T.レイセタナス(leycettanus) (U.S. Patent No. RE 32,153), T. デュポンチ(duponti), またはT. サーモフィラス(thermophilus) (U.S. Patent No. 4,587,215)由来のグルコアミラーゼが含まれる。バクテリア性グルコアミラーゼには、クロストリジウム(Clostridium)属由来のグルコアミラーゼ、特にクロストリジウム・サーモアミロリティカム(thermoamylolyticum) (EP 135138)、及びクロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム(thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)が含まれる。他の好ましいグルコアミラーゼの例にはアスペルギルス・オリザエ由来のグルコアミラーゼが含まれ、例えばWO 00/04136のSEQ ID NO: 2に示されたアミノ酸配列に対し相同性を50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,または90%有するグルコアミラーゼである。また、市販のAMG 200L; AMG 300 L; SANTMSUPER and AMGTM E (Novozymes社); OPTIDEXTM 300 (Genencor Division, Danisco US Inc.社); AMIGASETM 及び AMIGASETM PLUS (DSM社); G-ZYMETM G900 (Enzyme Bio-Systems社); G-ZYMETM G990 ZR (低プロテアーゼ含有量のアスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ)等のグルコアミラーゼも好ましい。
【０１９４】
フィターゼは穀物及び油糧種子中に含まれるフィチン酸(フィテート）を分解することができる酵素である。フィテート及びその分解中間体は、α-アミラーゼを不安定化させるか、阻害すると考えられており、α-アミラーゼの効率を低下させる。α-アミラーゼと組み合わせて使用可能なフィターゼは、培養及び液化工程の所定の所定の条件下でフィチン酸を加水分解できるものである。いくつかの実施形態では、フィターゼはイノシトールヘキサホスフェート(フィチン酸)から少なくとも1の無機リン酸塩を放出させることができる。フィターゼは、フィテート分子中で加水分解の起点となるホスフェートエステル基の特異的位置に対する選択性により(例えば3-フィターゼ(EC 3.1.3.8) または6-フィターゼ(EC 3.1.3.26)のように)分類される。フィターゼの典型的な例はミオ-イオシトール-ヘキサキホスフェート-3-ホスホヒドロラーゼである。 
【０１９５】
フィターゼは菌類及びバクテリア等の微生物から得られる。これらの微生物の例として、例えばアスペルギル(例えばA.ニガー, A. テレウス(terreus), A.フィカム(ficum) 及びA.フミガタス(fumigatus)), ミセリオフトラ(Myceliophthora) (M.サーモフィラ(thermophila)), タラロマイセス(T. サーモフィラス(thermophilus)) 、トリコデルマ 属(T. リーセイ)、及びサーモミセス(WO 99/49740)が挙げられる。また、フィターゼをペニシリウム属、例えばP. ホーデイ(hordei) (ATCC No. 22053), P. ピセウム(piceum)(ATCC No. 10519), またはP.ブレビ-コンパクタム(brevi-compactum)(ATCC No. 48944)から得ることもできる。例えばUSP 6,475,762が参照される。さらに、フィターゼをバシラス(例えばB. スブチリス), シュードモナス属(Pseudomonas), ペニオフォラ属(Peniophora), E. coli, シトロバクター(Citrobacter), エンターバクター(Enterbacter) 及びブティアウクセラ(Buttiauxella) (WO2006/043178参照)から得ることもできる。
【０１９６】
NATUPHOSTM (BASF社), RONOZYMETM P (Novozymes A/S社), PHZYMETM (Danisco A/S社, Diversa) and FINASETM (AB Enzymes社)等の市販のフィターゼも入手可能である。微生物のフィターゼの活性とフィターゼ単位を求める方法は、Engelen et al. (1994) J. AOAC Int. 77:760 - 764に記載されている。フィターゼは、野生型フィターゼ、変異体、あるいはその断片であってもよい。
【０１９７】
典型的なフィターゼはブティアウクセラ属（Buttiauxiella）のバクテリアに由来する。ブティアウクセラ属には、ブティアウクセラ・アグレスティス（B. agrestis）、 ブティアウクセラ・ブレネラエ（B. brennerae）、ブティアウクセラ・フェラギターゼ（B. ferragutiase）、ブティアウクセラ・ガビニアエ（B. gaviniae）、ブティアウクセラ・イザルディイ（B. izardii）、ブティアウクセラ・ノアキアエ（B. noackiae）、及びブティアウクセラ・ワ−ムボールディアエ（B. warmboldiae）が含まれる。ブティアウクセラ属はDSMZ、German National Resource Center for Biological Material (Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, DE) から入手できる。受託番号NCIMB 41248で寄託されたブティアウクセラ属株P1-29は、フィターゼを得るための有用な菌株の例である。フィターゼはBP-野生型、及びWO 06/043178に開示されたBP-野生型の変異体(例えばBP-11)、あるいは2007年3月6日出願の米国特許公開番号 US20080220498に開示された変異体(例えばTable 1及びSEQ ID NO: 3参照)等である。
【０１９８】
フィターゼは、以下に示すSEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を有するブティアウクセラ・フィターゼのBP-17変異体であってもよく、あるいは、SEQ ID NO: 17に示すアミノ酸配列に対し配列同一性を少なくとも75%, 少なくとも80%, 少なくとも85%, 少なくとも88%, 少なくとも90%, 少なくとも91%, 少なくとも92%, 少なくとも93%, 少なくとも94%, 少なくとも95%, 少なくとも96%, 少なくとも97%, 少なくとも98% または少なくとも99%有するフィターゼであってもよい。
【０１９９】
培養液および／または液化プロセスで使用されるフィターゼの量(添加量)は、0.001から50 FTU/g ds (例えば約0.01から25 FTU/g ds, 約0.01から15 FTU/g ds, 約0.01から10 FTU/g ds, 約0.05から15 FTU/g ds,及び約0.05から5.0 FTU/g) の範囲である。
【０２００】
AmyEポリペプチドと組み合わせて用いることができるその他の酵素として、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ/ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、ラッカーゼ、またはこれらの組み合わせが挙げられる。WO 98/22613に開示されたタイプのカルボヒドレート結合ドメインを用いることもできる。
【０２０１】
＜5.2 洗浄及び食器洗い用組成物と使用方法＞
AmyEポリペプチドを、食器洗浄用、または他の硬質表面洗浄用の洗剤組成物に調合することができる。洗剤組成物は、ゲル状、粉末状又は液体状にすることができる。この組成物には、AmyEポリペプチドが唯一の澱粉分解酵素として含まれている。あるいは、洗剤組成物に、他の追加の澱粉分解酵素、他の洗浄酵素、及び洗浄剤組成物に一般的に用いられている他の成分が含まれていてもよい。衣類用洗剤組成物には、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、および／またはラッカーゼ、またはこれらの組み合わせの内の1以上の追加の酵素が含有されている。
【０２０２】
通常、食器洗浄用組成物には、アニオン性、非イオン性、カチオン性、両性、またはこれらの混合物の界面活性剤が1以上含まれている。洗剤には、低または非発泡性のエトキシル化プロポキシル化直鎖アルコール等の非イオン性界面活性剤が、0%から約90重量%含まれている。
【０２０３】
液体洗剤組成物にはプロピレングリコールが含有されている。AmyEポリペプチドは、例えば塩化カルシウムを10%含有する25%容量/容量のプロピレングリコール溶液中で撹拌することにより、プロピレングリコール中に溶解される。
【０２０４】
食器洗い洗剤組成物には、無機及び/又は有機タイプの洗剤ビルダー塩が含まれていてもよい。洗剤ビルダーはリン含有タイプ及び非リン含有タイプに分類される。洗剤組成物には通常約1%から約90%の洗剤ビルダーが含有されている。リン含有無機アルカリ洗剤ビルダーの例は、水溶性の塩、特にピロリン酸、オルトリン酸及びポリリン酸のアルカリ金属塩である。リン含有有機アルカリ洗剤ビルダーの例は、水溶性のリン酸塩である。非リン含有無機ビルダーの例には水溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸塩、ケイ酸塩、及び種々の水不溶性結晶又は非晶質のアルミノシリケートが含まれ、これらのうち、ゼオライトが最も知られた代表的な物質である。
【０２０５】
好ましい有機ビルダーの例には、アルカリ金属、アンモニア及び置換されたアンモニア、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホネート、カルボキシメチルコハク酸塩、アンモニウムポリアセテート、カルボキシレート、ポリカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、ポリアセチルカルボキシレート、及びポリヒドロキシスルホネートが含まれる。他の好ましい有機ビルダーには、ビルダーとしての性質を有することが知られている高分子量ポリマー及びコポリマーが含まれ、その例として、適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸、ポリアクリル酸／ポリマレイン酸コポリマー、及びこれらの塩が挙げられる。
【０２０６】
洗浄剤組成物に塩素/臭素タイプ、または酸素タイプの漂白剤が含まれていてもよい。無機塩素/臭素タイプの漂白剤の例は、リチウム、ナトリウムまたはカルシウム次亜塩素酸塩、及び次亜臭素酸塩、及び塩素化されたリン酸３ナトリウムである。有機塩素/臭素タイプの漂白剤の例は、トリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸と、ジクロロイソシアヌル酸のような複素環とのN-ブロモ-及びN-クロロイミド、あるいはカリウムやナトリウムのような水溶性のカチオンとの塩である。ヒダントイン化合物も好ましい。
【０２０７】
洗浄剤組成物に、例えば無機過酸の形態の酸素漂白剤が含まれていてもよく、任意に漂白剤前駆体とともに、又はペルオキシ酸化合物として含まれていてもよい。ペルオキシ漂白化合物の典型的な例は、アルカリ金属過ホウ酸塩の4水和物及び1水和物、アルカリ金属の過炭酸塩、過ケイ酸塩及び過リン酸塩である。好ましい活性化剤物質はテトラアセチルエチレンジアミン(TAED)とグリセロールトリアセテート等である。例えばWO2005/056783に開示されているように、過ホウ酸塩又は過炭酸塩、トリ酢酸グリセロール及びペルヒドロラーゼのような、酵素漂白活性系が含まれてもよい。
【０２０８】
洗浄剤組成物は、公知の酵素用の安定化剤、例えばプロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体（例．芳香族ホウ酸エステル）により安定化されてもよい。洗浄剤組成物に他の公知の洗剤成分、例えば、解膠剤物質、充填剤、発泡抑制剤、腐食防止剤、汚れ懸濁剤、金属イオン遮蔽剤、汚れ再沈着防止剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤及び香料が含まれていてもよい。
【０２０９】
最後に、AmyEポリペプチドを従来の食器洗い洗剤で用いることもできる。例えば、以下に示す特許に開示されている洗剤のいずれかにおいて、以下に示す特許または公開公報に開示されたα-アミラーゼの代わりに、又は追加して、AmyEポリペプチドを使用することができる：CA2006687、GB2200132、GB2234980、GB2228945、DE3741617、DE3727911、DE4212166、DE4137470、DE3833047、DE4205071、WO93/25651、WO93/18129、WO93/04153、WO92/06157、WO92/08777、WO93/21299、WO93/17089、WO93/03129、EP481547、EP530870、EP533239、EP554943、EP429124、EP346137、EP561452、EP318204、EP318279、EP271155、EP271156、EP346136、EP518719、EP518720、EP518721、EP516553、EP561446、EP516554、EP516555、EP530635、EP414197及び米国特許第5,112,518;5,141,664及び5,240,632号。
【０２１０】
AmyEポリペプチドを含有する洗剤組成物は、手洗いまたは食器洗浄機用として処方されていてもよい。
【０２１１】
＜5.3 衣類洗剤用組成物とその使用＞
AmyEポリペプチドを、非粉塵性顆粒、安定な液体、又は保護された酵素等の形態で、洗剤組成物の一成分として用いることができる。非粉塵性顆粒は例えば米国特許第4,106,991号と4,661,452号に開示された方法で製造することができ、任意に、公知の方法により被覆することもできる。ワックス状の被覆原料の例は、例えば、平均分子量が1,000から20,000の（ポリエチレングリコール、PEG）；エチレンオキシドユニット数が16から50のエトキシル化ノニルフェノール；アルコールの炭素数が12から20で、エチレンオキシドユニット数が15から80のエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；脂肪酸のモノ-及びジ-及びトリグリセリド等の、ポリ(エチレンオキシド)製品である。流動床法に適した皮膜形成物質の例は、例えばGB Patent No. 1,483,591に開示されている。
【０２１２】
液体酵素調製物は、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール等のポリオール、あるいは乳酸またはホウ酸を添加する公知の方法によって安定化することができる。その他の酵素安定化剤は公知である。保護された酵素は、例えばUS 5,879,920 (Danisco A/S社) またはEP 238216開示された方法によって調製することができる。ポリオールはタンパク質の溶解性を改善することが知られており、またタンパク質の安定化剤として知られている。例えばKaushik et al., J. Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003) 及びその引用文献；及びM. Conti et al., J. Chromatography 757: 237-245 (1997) を参照することができる。
【０２１３】
洗剤組成物は、例えばゲル、粉末、顆粒、ペースト又は液体等の、いずれかの形態にすることができる。液体洗剤は水溶液であり、通常は約70%までの水と0%から約30%の有機溶媒とが含まれ、あるいは約30%の水を含む小型ゲルタイプでもよい。
【０２１４】
通常、衣類洗剤用組成物には１以上の、アニオン性、非イオン性(半極性を含む)、カチオン性、又は双性イオン性、またはこれらの混合物の界面活性剤が含まれている。通常、界面活性剤は0.1%から60%重量%含有されている。通常、この洗剤には0%から約40%または約50%のアニオン性界面活性剤を含有されており、アニオン性界面活性剤の例として、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；α-オレフィンスルホン酸；アルキル硫酸塩（脂肪酸アルコール硫酸塩）（AS）；アルコールエトキシスルサルフェート(AEOS又はAES)；2級アルカンスルホン酸塩(SAS)；α-スルホ脂肪酸メチルエステル；アルキル-又はアルケニルコハク酸；又は石鹸が挙げられる。また、この組成物には、WO92/06154に記載されているように、例えばアルコールエトキシレート(AEO又はAE)、カルボキル化されたアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、またはポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、またはグルコースアミン(グルカミド)のN-アシル-N-アルキル誘導体等の、非イオン性界面活性剤が0%から約40%含まれていてもよい。
【０２１５】
さらに、この洗剤組成物に１以上の他の酵素が含まれていてもよく、例えば、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、ラッカーゼ、および／または他の澱粉分解酵素(例えば別のα-アミラーゼ)、またはこれらの組み合わせが含まれていてもよい。衣類用洗剤に2,6-β-D-fructan hydrolaseを添加して、家庭用品および／または工業用衣類/洗濯物に含まれバイオフィルムの除去/洗浄に用いることもできる。
【０２１６】
衣類洗剤に、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、、ホスホン酸塩、クエン酸、ニトリロ３酢酸(NTA)、エチレンジアミン４酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン５酢酸(DTMPA)、アルキル-又はアルケニルコハク酸、可溶ケイ酸塩または層状ケイ酸塩（例．ヘキストのSKS-6）等の洗剤ビルダー又は複合化剤が、約1%から約65%含まれていてもよい。この洗剤は、アンビルト(unbuilt)、すなわち実質的に洗剤ビルダーが含まれていなくてもよい。酵素の安定性に適合する組成であれば、どのような組成においても酵素を使用できる。カプセル化、顆粒化、又はヒドロゲル中での金属イオン遮蔽化等の公知の方法により、酵素を有害な成分から保護することができる。デンプン結合ドメインを有するか又は有さない酵素、特にα-アミラーゼの用途は衣類洗剤及び食器洗浄剤に限られず、表面洗浄剤や、デンプンまたはバイオマスからの及びエタノール生産に使用することもできる。
【０２１７】
洗剤に１以上のポリマーが含まれていてもよい。例として、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ（ビニルアルコール）(PVA)、ポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマーとメタクリ酸ラウリル/アクリル酸コポリマー等のポリカルボキシレートが挙げられる。
【０２１８】
衣類洗剤に、過ホウ酸塩又は過炭酸塩のようなH2O2源と、任意成分のTAEDまたはノナノイロキシベンゼンスルホン酸塩(NOBS)等の過酸形成漂白活性化剤とが含まれる漂白剤が含まれていてもよい。あるいは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含む漂白剤でもよい。また漂白剤は、WO2005/056783に開示されたペルヒドロラーゼが過酸化物を活性化する酵素系漂白剤であってもよい。
【０２１９】
AmyEポリペプチドを含有する衣類洗剤組成物は、公知の安定化剤、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのようなポリオール；糖または糖アルコール；乳酸；ホウ酸または芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体を用いて安定化することができる。この衣類洗剤組成物は、例えばWO92/19709とWO92/19708に開示された方法で調合することができる。
【０２２０】
衣類洗剤に、例えば布地柔軟剤、粘土、発泡剤、発泡抑制剤、腐食防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ再沈着防止剤、染料、殺菌剤、増白剤又は香料等の、公知の洗剤成分が含まれていてもよい。pH（使用時の濃度の水溶液で測定）は通常、中性またはアルカリ性であり、例えば、pHは約7.0から約11.0であるが、AmyEポリペプチドは、澱粉加水分解の場合と同様、低pHでも機能する。
【０２２１】
衣類洗剤組成物中に1以上のAmyEポリペプチドが、従来の衣類洗剤組成物で用いられている濃度、例えば洗浄液1リットル当りのAmyEポリペプチドが（純粋の酵素タンパク質として）0.00001-1.0 mgとなる濃度で含まれていてもよい。衣類洗剤の組成の例として、以下が挙げられる。
【０２２２】
(１)嵩密度が少なくとも600g/Lの顆粒として調合される洗剤組成物であって、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩約7%から約12%（酸として）；アルコールエトキシサルフェート(例．C12-18アルコール、1,2エチレンオキサイド(EO))またはアルキルサルフェート(例C16-18)約1%から約4%；アルコールエトキシレート(例．C14-C15アルコール、7EO)約5%から約9%、炭酸ナトリウム(Na2CO3として)約14%から約20%；可溶性ケイ酸塩（例，NaAlSiO4）約2%から約6%；ゼオライト(例．NaAlSiO4)約15%から約22%；硫酸ナトリウム（例．Na2SO4）0%から約6%；クエン酸ナトリウム/クエン酸(例．C6H5Na3O7/C6H8O7)約0%から約15%；過ホウ酸ナトリウム(例．NaBO3H2O)約11%から約18%；TAED約2%から約6%；カルボキシメチルセルロース(CMC)0%から約2%；ポリマー(例．マレイン酸/アクリル酸コポリマー，PVP，PEG)0-3%；0.0001-0.1%タンパク質の酵素（純酵素として）、及び少量の成分（例．発泡抑制剤、香料、光学的増白剤、光脱色剤）0-5%を含有する洗剤組成物。
【０２２３】
(2) 嵩密度が少なくとも600g/Lの顆粒として調合される洗剤組成物であって、約6%から約11%の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として）；約1%から約3%のアルコールエトキシ硫酸(例．C12-18アルコール、1,2エチレンオキサイド(EO))または硫酸アルキル(例C16-18)；約5%から約9%のアルコールエトキシレート(例．C14-C15アルコール、7EO)、約15%から約2１%の炭酸ナトリウム(Na2CO3として)；約1%から約4%の可溶性ケイ酸塩；約24%から約34%のゼオライト(例．NaAlSiO4)；約4%から約10%の硫酸ナトリウム（例．Na2SO4）；0%から約15%のクエン酸ナトリウム/クエン酸(例．C6H5Na3O7/C6H8O7)；約11%から約18%の過ホウ酸ナトリウム(例．NaBO3H2O)；約2%から約6%のTAED；0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(CMC)；1-6%のポリマー(例．マレイン酸/アクリル酸コポリマー，PVP，PEG)；0.0001-0.1%の酵素（純酵素として）及び0-5%の少量の成分（例．発泡抑制剤、香料）を含有する洗剤組成物。
【０２２４】
(3) 嵩密度が少なくとも600g/Lの顆粒として調合される洗剤組成物であって、約5%から約9%の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として）；約7%から約14%のアルコールエトキシレート(例．C12-C15アルコール、7EO)、約1から約3%の脂肪酸（例．C16-22脂肪酸）として石鹸；約10%から約17%の炭酸ナトリウム(Na2CO3として)；約3%から約9%の可溶性ケイ酸塩；約23%から約33%のゼオライト(例．NaAlSiO4)；0%から約4%の硫酸ナトリウム（例．Na2SO4）；約8%から約16%の過ホウ酸ナトリウム(例．NaBO3H2O)；約2%から約8%のTAED；0%から約1%のホスホン酸塩(例．EDTMPA)；0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(CMC)；0-3%のポリマー(例．マレイン酸/アクリル酸コポリマー，PVP，PEG)；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）及び0-5%の少量の成分（例．発泡抑制剤、香料、光学的増白剤）を含有する洗剤組成物。
【０２２５】
(4) 嵩密度が少なくとも600g/Lの顆粒として調合される洗剤組成物であって、約8%から約12%の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として）；約10%から約25%のアルコールエトキシレート(例．C12-C15アルコール、7EO)；約14%から約22%の炭酸ナトリウム(Na2CO3として)；約1%から約5%の可溶性ケイ酸塩；約25%から約35%のゼオライト(例．NaAlSiO4)；0%から約10%の硫酸ナトリウム（例．Na2SO4）；0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(CMC)；1-3%のポリマー(例．マレイン酸/アクリル酸コポリマー，PVP，PEG)；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）及び0-5%の少量の成分（例．発泡抑制剤、香料）を含有する洗剤組成物。
【０２２６】
(5)約15%から約21%の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として）；約12%から約18%のアルコールエトキシレート(例．C12-C15アルコール、7EOまたはC12-15アルコール、5EO)、約3から約13%の脂肪酸（例．オレイン酸）として石鹸；0%から約13%のアルケニルコハク酸(C12-14)、約8%から約18%のアミノエタノール；約2%から約8%のクエン酸；0%から約3%のホスホン酸塩；0%から約3%のポリマー（例．PVP、PEG）；0%から約2%のホウ酸塩（例．B4O7）；0%から約3%のエタノール；約8%から約14%のプロピレングリコール；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）及び0-5%の少量の成分（例．分散剤、発泡抑制剤、香料、光学的増白剤）を含有する、水性液体洗剤組成物。
【０２２７】
(6)約15%から約21%（酸として）の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；3-9%のアルコールエトキシレート(例．C12-15アルコール、7EOまたはC12-15アルコール、5EO)；約3%から約10%の脂肪酸（例．オレイン酸）として石鹸；約14%から約22%のゼオライト（NaAlSiO4）；約9%から約18%のクエン酸カリウム；0%から約2%のホウ酸塩(例．B4O7)、0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(CMC)；0から約3%のポリマー(例．PEG、PVP)；0%から約3%のアンカーリングポリマー(anchoring polymer)(例．メタクリル酸ラウリル/アクリル酸コポリマー；モル比25:1、MW 3800）；0%から約5%のグリセロール；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）；及び0-5%の少量の成分（例．分散剤、発泡抑制剤、香料、光学的増白剤）を含む、水性液体洗剤組成物。
【０２２８】
(7)嵩密度が少なくとも600g/Lの顆粒として調合された洗剤組成物であって、約5%から約10%の脂肪酸アルコール硫酸塩；約3%から約9%のエトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド；0-3%の脂肪酸としての石鹸；約5％から約10%の炭酸ナトリウム(例．Na2CO3)；約1%から約4%の可溶性ケイ酸塩；約20%から約40%のゼオライト（例．NaAlSiO4）；約2%から約8%の硫酸ナトリウム（Na2SO4）；約12%から約18%の過ホウ酸ナトリウム(例．NaBO3H2O)；約2%から約7%のTAED；約1%から約5%のポリマー（例．マレイン酸/アクリル酸コポリマー、PEG）；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）；0-5%の少量の成分（例．光学的増白剤、発泡抑制剤、香料）を含有する洗剤組成物。
【０２２９】
(8)約8%から約14%の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として）；約5%から約11%のエトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド；0%から約3%の脂肪酸として石鹸；約4%から約10%の炭酸ナトリウム（例．Na2CO3）；約1%から約4%の可溶性ケイ酸塩；約30%から約50%のゼオライト（例．NaAlSiO4）；約3%から約11%の硫酸ナトリウム（例．Na2SO4）；約5%から約12%のクエン酸ナトリウム（例．C6H5Na3O7）；約1%から約5%のポリマー（例．PVP、マレイン酸/アクリル酸コポリマー、PEG）；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）；及び0-5%の少量の成分（例．発泡抑制剤、香料）を含有する、顆粒として調合された洗剤組成物。
【０２３０】
(9) 約6%から約12%の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として）；約1%から約4%の非イオン性界面活性剤；約2%から約6%の脂肪酸としての石鹸；約14%から約22%の炭酸ナトリウム(Na2CO3として)；約18%から約32%のゼオライト(例．NaAlSiO4)；5%から約20%の硫酸ナトリウム（例．Na2SO4）；約3%から約8%のクエン酸ナトリウム(例．C6H5Na3O7)；約4%から約9%の過ホウ酸ナトリウム(例．NaBO3H2O)；約1%から約5%の漂白活性化剤（例．NOBS又はTAED）；0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(CMC)；約1%から約5%のポリマー(ポリカルボキシレート又はPEG)；0.0001-0.1%タンパク質の酵素（純酵素として）及び0-5%の少量の成分（例．光学的増白剤、香料）を含有する、顆粒として調合される洗剤組成物。
【０２３１】
(10) 約15%から約23%の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として）；約8%から約15%のアルコールエトキシ硫酸(例．C12-C15アルコール、2-3EO)；約3%から約9%のアルコールエトキシレート(例．C12-15アルコール、7EO、またはC12-15アルコール,5EO)；約0から約3%の脂肪酸（例．ラウリン酸）としての石鹸；約1%から約5%のアミノエタノール；約5%から約10%のクエン酸ナトリウム；約2%から約6%のヒドロトロープ(例．トルエンスルホン酸ナトリウム)；0%から約2%のホウ酸塩（例．B4O7）；0%から約1%のカルボキシメチルセルロース；約1%から約3%のエタノール；約2%から約5%のプロピレングリコール；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）及び0-5%の少量の成分（例．ポリマー、分散剤、香料、光学的増白剤）を含有する、水性液体洗剤組成物。
【０２３２】
(11)約20%から約32%の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として）；6%-12%のアルコールエトキシレート(例．C12-C15アルコール、7EOまたはC12-15アルコール、5EO)；約2%から約6%のアミノエタノール；約8%から約14%のクエン酸；約1%から約3%のホウ酸塩（例．B4O7）；0%から約3%のポリマー（例．マレイン酸/アクリル酸コポリマー、アンカーリングポリマー、例えばメタクリル酸ラウリル/アクリル酸コポリマー）；約3%から約8%のグリセロール；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）及び0-5%の少量の成分（例．ヒドロトロープ、分散剤、香料、光学的増白剤）を含有する、水性液体洗剤組成物。
【０２３３】
(12) 嵩密度が少なくとも600g/Lの顆粒として調合される洗剤組成物であって、約25%から約40%のアニオン性界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、α-オレフィンスルホン酸塩、α-スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸塩、石鹸）；約1%から約10%の非イオン性界面活性剤（例．アルコールエトキシレート）；約8%から約25%の炭酸ナトリウム(例．Na2CO3)；約5%から約15%の可溶性ケイ酸塩；0から約5%の硫酸ナトリウム（例．Na2SO4）；約15%から約28%のゼオライト(NaAlSiO4)；0から約20%の過ホウ酸ナトリウム（例．NaBO3 4H2O）；約0%から約5%の漂白活性化剤(TAEDまたはNOBS)；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）；0-3%の少量の成分（例．香料、光学的増白剤）を含有する洗剤組成物。
【０２３４】
(13)上記1)-12)に記載した洗剤組成物であって、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩の全部又は一部が（C12-C18）アルキル硫酸塩で置き換えられた洗剤組成物。
【０２３５】
(14)嵩密度が少なくとも600g/Lの顆粒として調合された洗剤組成物であって、約9%から約15%の（C12-C18）アルキル硫酸塩；約3%から約6%のアルコールエトキシレート；約1%から約5%のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド；約10%から約20%のゼオライト(例．NaAlSiO4)；約10%から約20%の層化ジシリケート（例．ヘキストのSK56）、約3%から12%の炭酸ナトリウム（例．Na2CO3）；0％から約6%の可溶性ケイ酸塩；約４％から約8%のクエン酸ナトリウム；約13%から約22%の過炭酸ナトリウム；約3%から約8%のTAED；0%から約5%のポリマー（例．ポリカーボネートとPVP）；0.0001-0.1％の酵素（純酵素タンパク質として）；及び0-5%の少量の成分（例．光学的増白剤、光学的漂白剤、香料、泡抑制剤）を含有する洗剤組成物。
【０２３６】
(15)嵩密度が少なくとも600g/Lの顆粒として調合された洗剤組成物であって、約4%から約8%の(C12-C18)アルキル硫酸塩；約11%から約15%のアルコールエトキシレート；約1%から約4%の石鹸；約35%から約45%のゼオライトMAP又はゼオライトA；約2%から約8%の炭酸ナトリウム（例．Na2CO3）；0%から約4%の可溶性ケイ酸塩；約13%から約22%の過炭酸ナトリウム；1-8%のTAED；0%から約3%のカルボキシメチルセルロース(CMC)；0%から約3%のポリマー（例．ポリカーボキシレートとPVP）；0.0001-0.1%の酵素（純酵素タンパク質として）；及び0-3%の少量の成分（例．光学的増白剤、ホスホン酸塩、香料）を含有する洗剤組成物。
【０２３７】
(16)上記1)-15)に記載した洗剤調合剤であって、追加成分又は上記の漂白剤の代替として、安定化された過酸、又はカプセル充填された過酸を含有する、洗剤調合剤。
【０２３８】
(17)上記、1)、3)、7)、9)及び12)に記載した洗剤組成物であって、過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられた洗剤組成物。
【０２３９】
(18)上記1),3),7),9),12)及び15)に記載した洗剤組成物であって、さらにマンガン触媒を含む洗剤組成物。
【０２４０】
(19) 非水性液状洗剤組成物として調合された洗剤組成物であって、例えば直鎖アルコキシル化１級アルコール等の液状非イオン性界面活性剤、ビルダー（例．リン酸塩）、酵素、及びアルカリを含有する非水性液状洗剤組成物。また、この洗剤にはアニオン性界面活性剤及び/又は漂白剤が含まれる。
【０２４１】
AmyEポリペプチドを含有する洗剤組成物は、汚れた布地の前処理に適した洗剤添加剤組成物、およびリンスが添加された布地柔軟剤等の手洗い用又は機械洗い用洗濯洗剤として調合することができ、あるいは一般家庭用品の硬質表面のクリーニングに使用する洗剤組成物として調合することもできる。
【０２４２】
この洗剤組成物には、2,6-β-D-フルクタンヒドロラーゼ、１以上の別のα-アミラーゼ酵素、及び、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び/又はペルオキシダーゼ、及び/又はそれらの混合物等の他の洗浄用酵素を１以上含むことができる。一般に、選択した酵素の性質は、選択した洗剤に適合していなければならず（例．最適pH、他の酵素成分又は非酵素成分との適合性）、酵素は有効量で含まれていなければならない。
【０２４３】
洗剤用添加剤、すなわち別々の添加剤、または混合された添加剤を、顆粒状、液状、スラリー状等の形態で調合することができる。好ましい顆粒洗剤添加物調合物として非粉塵性顆粒が挙げられる。
【０２４４】
AmyEポリペプチドは、洗浄液1リットル当りの酵素タンパク質濃度が約0.01から約100 mgとなるように、特に洗浄液1リットル当りの酵素タンパク質濃度が約0.05から約5.0 mgとなるように、特に好ましくは洗浄液1リットル当りの酵素タンパク質濃度が約0.1から約1.0 mgとなるようにして、洗剤組成物に添加することができる。
【０２４５】
＜５．４ AmyEポリペプチドと組み合わせて用いる酵素＞
上記のように、AmyEポリペプチド含有洗浄組成物には、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、および／またはペルオキシダーゼ、2,6-β-D-フルクタンヒドロラーゼ、追加のα-アミラーゼ酵素、および／またはこれらの組合せ等の、1以上の追加の酵素が含まれていてもよい。一般に、選択した酵素の性質は、選択した洗剤に適合しなければならず（例．最適pH、他の酵素成分又は非酵素成分との適合性）、酵素は有効量で含まれていなければならない。酵素の例を下記に示す。これらの酵素の大部分は、洗浄用組成物以外の組成物中のAmyEポリペプチドと組み合わせて用いることができる。
【０２４６】
プロテアーゼ：好ましいプロテアーゼは、動物、植物又は微生物由来のプロテアーゼである。また、化学的に修飾されるか、又はタンパク質工学的に操作された変異体も好ましい。このプロテアーゼは、例えばアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼ等の、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼでもよい。アルカリプロテアーゼの例はスブチリシン、特にバチルス属由来の種、例えば、スブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309（例えばU.S. Patent No. 6,287,841参照）、スブチリシン147、及びスブチリシン168（例えばWO 89/06279参照）等である。トリプシン様のプロテアーゼの例はトリプシン（例．ブタ又はウシ起源）、またはフザリウム(Fusarium)プロテアーゼ（例えば、WO 89/06270とWO 94/25583参照）である。有用なプロテアーゼの非限定的例示としてWO92/19729及びWO98/20115に開示された変異体が挙げられる。好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、ALCALASETM, SAVINASETM, PRIMASETM, DURALASETM, ESPERASETM, 及びKANNASETM (Novo Nordisk A/S社); MAXATASETM, MAXACALTM, MAXAPEMTM, PROPERASETM, PURAFECTTM, PURAFECT OXPTM, FN2TM, 及びFN3TM (Danisco A/S社)等である。
【０２４７】
リパーゼ：好ましいリパーゼは、細菌又は菌類由来のリパーゼである。化学的に修飾された、又はタンパク質工学的に操作された突然変異体も含まれる。有用なリパーゼの例として、フミコラ属(Humicola)（サーモマイセス属（Thermomyces)の同義語）のリパーゼ、例えばH.ラヌギノザ(H. lanuginosa)（T.ラヌギノスス）（例えばEP258068とEP305216参照）とH. インソレンス(H.insolens)（例えばWO96/13580参照）由来；シュードモナス属(Pseudomonas)のリパーゼ（例えば、P.アルカリゲネス(P. alcaligenes )又はP.シュードアルカリゲネス(P.pseudoalcaligenes)由来、；例えばEP218272参照）、P.セパシア(P.cepacia)（例えばEP331376参照）、P.スツトゼリ(P.stutzeri)（例えばGB1,372,034参照）、P.フルオレセンス(P.fluorescens)、シュードモナスの種の株 SD 705（例えば、WO95/06720とWO96/27002を参照）、P.ウィスコンシネンシス(P.wisconsinensis)（例えばWO96/12012参照）由来；バチラス属(Bacillus )のリパーゼ（例えば、B．スブチリス(B.subtilis)由来：例えばDartois et al. Biochemica Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)参照）,B．ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)（例えばJP 64/744992参照）、又はB. プミルス(B.pumilus)（例えばWO91/16422参照）由来のリパーゼが挙げられる。調合物で使用するため使用可能な他のリパーゼ変異体の例として、WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, and EP 260105に記載されたリパーゼ変異体が挙げられる。市販のリパーゼ酵素として、LIPOLASETM及びLIPOLASETM Ultra (Novo Nordisk A/S社)が挙げられる。
【０２４８】
ポリエステラーゼ：好ましいポリエステラーゼの非限定的例示としてWO 01/34899 (Danisco A/S社) 及びWO 01/14629 (Danisco A/S社)に記載されたポリエステラーゼが挙げられ、本明細書に記載した他の酵素と組み合わせることもできる。
【０２４９】
アミラーゼ：組成物に他のα-アミラーゼ、例えば非変異体α-アミラーゼを添加することができる。これらは市販のアミラーゼでもよく、非限定的例示としてDURAMYLTM, TERMAMYLTM, FUNGAMYLTM 及びBANTM (Novo Nordisk A/S社), RAPIDASETM, 及びPURASTARTM (Danisco A/S社)が挙げられる。
【０２５０】
セルラーゼ：セルラーゼを組成物に添加することができる。好ましいセルラーゼは、細菌又は菌類由来のセルラーゼである。化学的に修飾されるか、又はタンパク質工学的に操作された変異体も含まれる。好ましいセルラーゼの例として、バシラス属、シュードモナス属、フミコラ属、フザリウム属、シエラヴィア属(Thielavia)、アクレモニウム属(Acremonium)など由来のセルラーゼ、例えば、U.S. Patent No. 4,435,307; 5,648,263; 5,691,178; 5,776,757; 及びWO 89/09259に開示された、フミコラ・インソレンス、マイセリオフソラ・テルモフィラ (Myceliophthora thermophila) とフザリウム・オキシスポルム (Fusarium oxysporum) から産生される菌類セルラーゼが挙げられる。使用可能なセルラーゼの例は、織物の色の保護効果を有するセルラーゼである。このようなセルラーゼの例として、EP 0495257; EP 531 372; WO 99/25846 (Danisco A/S社), WO 96/34108 (Danisco A/S社), WO 96/11262; WO 96/29397; 及びWO 98/08940に開示されたセルラーゼが挙げられる。他の例は、WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531 315; U.S. Patent No. 5,457,046; 5,686,593; 及び5,763,254に開示されたセルラーゼ変異体である。市販のセルラーゼとして、CELLUZYMETM 及びCAREZYMETM (Novo Nordisk A/S社); CLAZINASETM及び PURADAX TM HA (Danisco A/S社); 及びKAC-500(B)TM (Kao Corporation)が挙げられる。
【０２５１】
ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ：この発明の組成物での使用に適したペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類に由来するものである。化学的に修飾されるか、又はタンパク質工学的に操作された変異体も含まれる。有用なペルオキシダーゼの例には、WO93/24618、WO95/10602、及びWO98/15257に開示されたコプリナス属(Coprinus)由来のペルオキシダーゼが含まれ、例えば、C.シネレウス(C.cinereus)由来のペルオキシダーゼと、その変異体が含まれる。市販のペルオキシダーゼとして、例えばGUARDZYMETM (Novo Nordisk A/S社)が挙げられる。
【０２５２】
＜５．５ AmyE ポリペプチドの洗浄性能の評価方法＞
AmyE ポリペプチドの洗浄性能の評価方法の例を、下記と実施例に示す。AmyE ポリペプチドを含有する組成物の洗浄効率を試験する標準的な方法のひとつは試験見本テストである。種々の材料に既知の「強度」の汚れを付着させた試験見本が市販されている(EMPA, St. Gallen, Switzerland; wfk--Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; またはCenter for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands参照)、及び/又は技術者が作ることができる(Morris and Prato, Textile Research Journal 52(4): 280-286 (1982))。試験見本は、例えば、血液/牛乳/インク（BMI）、ホウレン草、草又はチョコレート/牛乳/すすから作られた汚れが付着された、木綿を含有する布地から成る。BMI汚れは、例えば0.0003%から0.3%の過酸化水素で木綿に固定することができる。別の組み合わせは、0.001%から1%のグルタルアルデヒドで固定された草またはホウレン草、0.001%から1%のグルタルアルデヒドで固定されたゼラチンとクーマシー(Coomassie)の汚れ、又は0.001%から1%グルタルアルデヒドで固定されたチョコレート、牛乳及びスス等である。
【０２５３】
試験見本をAmyEポリペプチド及び/又は洗剤調合物とともにインキュベートしている間に撹拌することもできる。洗浄性能データは、特に96ウエルのプレートでは、ウエル中の試験見本の向き（水平対垂直）により変わる。これはインキュベートしている間の混合が不十分であることを示す。インキュベート中に十分な撹拌を確保するための方法は多数あるが、ミクロタイタープレートを2枚のアルミニウムの板の間に挟むプレートホルダーを作成することができる。これは、例えばウエル上に付着性のプレートシーラーを置き、市販の適切なクランプで96-ウエルプレートを2枚のアルミニウムのプレートで挟むことにより、簡単に行うできる。次に、これを市販のインキュベータシェーカに取り付ける。シェーカを約400rpmに設定すれば非常に効率的な混合が得られ、一方ホルダーにより漏れやクロスコンタミネーションが効果的に防止される。
【０２５４】
トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を用いて洗浄液中のアミノ基の濃度を定量することができる。これは試験見本から除去されたタンパク質の量の測定に役に立つ（例えば、Cayot and Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184-200 (1997)参照）。しかし、洗剤又は酵素のサンプルが、異常に小さいペプチド断片を生成するときは（例えば、サンプル中のペプチダーゼの存在により）、大きなTNBSシグナルとなる、すなわち「ノイズ」が大きくなる。
【０２５５】
血液/牛乳/インクの洗浄性能を測定する別の手段では、遊離されたインクを含む洗浄液の吸光度を測定して定量する。吸光度は、350nmと800nmの間、例えば410nm又は620nmのいずれかの波長で測定することができる。また、草、ホウレン草、ゼラチン、クーマシー汚れを含む汚れの洗浄性能を評価するために、洗浄液を分析することができる。これらの汚れの測定に適した波長は、ホウレン草または草の場合670nm、ゼラチンまたはクーマシー汚れの場合620nmである。例えば、洗浄液の一部（典型的には、例えば96ウエルマイクロプレートからの100-150μL）を採取して、キュベット又はマルチウエルマイクロプレートに入れる。次に、これを分光光度計に入れ、適切な波長で吸光度を測定する。このシステムはまた、例えば、布、プラスチック又は陶器等の適した基材に付着させた血液/牛乳/インク汚れを使用して、食器洗いに適した酵素及び/又は洗剤剤組成物を決定するために用いることもできる。
【０２５６】
一態様では、BMI汚れは、BMI/木綿試験見本を0.3%過酸化水素を用いて25℃で30分間処理することにより、またはBMI/木綿試験見本を0.03%過酸化水素を用いて60℃で30分間処理することにより木綿へ固定することができる。約0.25インチの小さな試験見本をBMI/木綿試験見本から切り取り、96ウエルマイクロタイタープレートのウエルに入れる。洗剤組成物と、例えばタンパク質変異体等の酵素との既知の混合物を各ウエルに加える。マイクロタイタープレートを付着性プレートシーラーで覆った後、このミマイクロタイタープレートをアルミニウムの板で挟み、約250rpmで約10分から60分間オービタルシェーカ(orbital shaker)で撹拌する。撹拌が終了した時、上澄み液を新しいマイクロタイタープレートのウエルに移し、インクの吸光度を620nmで測定する。ホウレン草/木綿試験見本又は草/木綿試験見本を0.01%グルタルアルデヒドを用いて25℃で30分間処理して木綿に固定したホウレン草汚れ又は草汚れについても同様にして試験することができる。チョコレート、牛乳、及び/またはススの汚れについても同様にして試験することができる。
【０２５７】
＜５．６ 布デサイジング用組成物とその使用＞
本願はまた、１以上のAmyEポリペプチドを用いた織物の処理用組成物、及び織物の処理方法（例えば布のデサイジング）に関する。AmyEポリペプチドは、公知のあらゆる織物処理方法において用いることができる(例えばU.S. Patent No. 6,077,316参照)。例えば、溶液中でAmyEポリペプチドを織物と接触させることにより、織物の手触りと外観を改良することができる。織物を加圧下の溶液中で処理することもできる。
【０２５８】
AmyEポリペプチドは布を織っているとき、または織った後に用いられ、またはデサイジング中に用いられ、または、１以上の別の織物加工工程において用いられる。布を織っているとき、糸には大きな機械的応力が加えられる。自動織機で織る前に、縦糸の引張強度を増加させて切断を防ぐため、縦糸にサイジング用澱粉または澱粉誘導体を塗布する。AmyEポリペプチドは、サイジング用澱粉または澱粉誘導体を除去するために用いられる。布を織った後、織物をデサイジング工程に送る。この後、１以上の別の織物加工工程を行うこともできる。デサイジングは、布からサイズ剤を除去する工程である。織り工程の後、織物をさらに加工する前に、織物を均一で洗濯に耐え得るようにするため、サイズ剤を除去しておく必要がある。このとき、AmyEポリペプチドの作用によりサイズ剤を酵素的加水分解することから成る織物のデサイジング方法においてAmyEポリペプチドが用いられる。
【０２５９】
AmyEポリペプチドは単独、または他のデサイジング剤、および／または織物をデサイジングするための酵素と組み合わせて、木綿を含む織物等の織物のデサイジングに用いられる。AmyEポリペプチドは、ストーンウォッシュ状外観のインジゴで染色されたデニム織物及び衣料を製造するための組成物及び方法にも用いられる。衣服を製造する場合、織物は切断され縫製されて衣服または衣料にされ、その後仕上げが行われる。特に、デニムジーンズの製造の場合、異なる酵素による仕上げ方法が開発されている。通常、デニム衣料の仕上げは酵素によるデサイジング工程から始まり、このとき衣料の織物の柔軟性を増加させるとともに、木綿を次の酵素仕上げ工程に適応し易くするために澱粉分解酵素により処理する。AmyEポリペプチドは、デニム衣料の仕上げ方法（例えば「バイオストーンプロセス」）、酵素デサイジング、織物への柔軟性付与、および／または、仕上げ工程において用いることができる。
【０２６０】
＜５．７ ベーキング及び食品配合用の組成物と方法＞
AmyEポリペプチドを、ベーキング及び食品配合用の組成物と方法において用いることができる。産業用及び家庭用のベーキング及び食品生産用の穀粉の場合、穀粉中でα-アミラーゼ活性の適正な水準を維持することが重要である。活性水準が高すぎると粘りがあり、及び/又は生焼けであり、市販できない製品となる。しかし穀粉のα-アミラーゼ活性が不足していると、酵母に適切な機能を発揮させるのための糖が不足し、乾燥したもろいパンとなる。従って、穀粉中の内在的なα-アミラーゼ活性のレベルを増加させるために、AmyEポリペプチドを単独、または別のα-アミラーゼと組み合わせて、穀粉に添加することができる。本願に開示するように、AmyEポリペプチドの最適温度は30-90℃、50-80℃、55℃-75℃、または60-70℃の範囲であるため、ベーキング及び食品生産での使用に適している。異なるAmyEポリペプチドの最適温度は、pH5.5の可溶性デンプン1%溶液、または本願に開示する方法、あるいは公知の方法を用いて測定することができる。
【０２６１】
穀物と他の植物のベーキングにおける使用に加えて、大麦、オートムギ、小麦等の穀物、及びコーン、ホップ及びコメ等の植物性成分は、産業用及び家庭用の双方の醸造において使用されている。醸造に使用される原料には麦芽を添加しなくてもよく、または添加して、すなわち部分的に発芽させて、α-アミラーゼ等の酵素のレベルを増加させてもよい。醸造を順調に行うには、発酵に必要な糖の適正水準を確保するために、適正レベルのα-アミラーゼ酵素活性が必要である。AmyEポリペプチドを単独、または別のα-アミラーゼと組み合わせて麦芽汁またはマッシュに添加することにより澱粉転化を改善することができる。本願に開示するように、AmyEポリペプチドはグルコアミラーゼ活性を示すため、追加のグルコアミラーゼを添加しなくても、または他のα-アミラーゼを使用する場合と比較して少量のグルコアミラーゼを添加することにより、澱粉を含有する穀粉からグルコースを産出させることができる。
【０２６２】
さらに、AmyEポリペプチドは劣化、つまりベーキング製品が固くなり粉々になることを防ぎ、又は遅らせるために、単独又は他のアミラーゼと組み合わせて添加することができる。劣化防止用AmyEポリペプチドの量は通常、穀粉1kg当たりの酵素タンパク質量が0.01-10mgの範囲、例えば1-10mg/kgである。AmyEポリペプチドと組み合わせて使用できる追加の劣化防止用アミラーゼは、エンド-アミラーゼ、例えば、バシラス属由来のバクテリア性エンド-アミラーゼである。追加のアミラーゼはマルトース産生性α-アミラーゼ(EC3.2.1.133)であり、例えばバチルス属由来である。NOVAMYLTMは、B.ステアロテルモフィラス株、NCIB 11837由来の好ましいマルトース産生性α-アミラーゼであり、Christophersen et al. (1997) Starch, 50:39-45.に開示されている。劣化防止エンド-アミラーゼの他の例は、例えばB.リケニホルミス又はB.アミロリケファシエンス等のバチルス属由来のバクテリア性α-アミラーゼ、及び、例えば大豆のような植物源由来、またはバシラス属のような微生物源由来のβ-アミラーゼ等の、エキソ-アミラーゼである。
【０２６３】
AmyEポリペプチドを含むベーキング組成物に、さらにホスホリパーゼが含まれていてもよい。このホスホリパーゼは、リソ-リン脂質を形成してリン脂質から脂肪酸を除く、A1又はA2活性を備えていてもよい。ホスホリパーゼはリパーゼ活性、すなわちトリグリセリドに対する活性を備えていても、備えていなくてもよい。ホスホリパーゼの最適温度は通常30-90℃、例えば30-70℃である。添加されるホスホリパーゼは動物由来でもよく、例えば、膵臓由来、例えば、ウシ又はブタ膵臓由来、ヘビ毒又はハチ毒由来でもよい。あるいは、ホスホリパーゼは微生物起源でもよく、例えば、糸状菌、酵母又は細菌由来でもよく、例えば、アスペルギルス属、A・ニガー；ディクチオステリウム属(Dictyostelium)、D・ディスコイデウム(D.discoideum)；ムコル属(Mucor)、M・ジャバニクス(M.javanicus)、M・ムセド(M.mucedo)、M・スブチリシムス(M.subtilissimus)；ニューロスポラ属(Neurospora)、N・クラッサ(N.crassa)；リゾムコル属(Rhizomucor)、R・プシラス(R.pusillus)；リゾプス属(Rhizopus)、R・アルヒズス(R.arrhizus)、R・ジャポニクス(R.japonicus)、R・ストロニフェル(R.stolonifer)；シレロティニア属(Sclerotinia)、S.リベルチアナ(S. libertiana)；トリコフィトン属(Trichophyton)、T.ルブルム(T.rubrum)；ヘツェリニア属(Whetzelinia)、W.シレオチオルム(W.sclerotiorum)；バチルス属(Bacillus)、B.メガテリウム(B.megaterium)、B.スブチリス(B.subtilis)；シトロバクター属(Citobacter)、C. フロインディ（C.freundii）；エンテロバクター属(Enterobacter)、E. エロゲネス(E.aerogenes)、E.クロアセ属(E.cloacae)；エドバルドシエラ属(Edwardsiella)、E.タルダ(E. tarda)；エトビニア属(Etwinia)、E.ヘルビコラ(E.herbicola)；エシェリキア属(Escherichia)、大腸菌（E.coli）；クレブシエラ属(Klebsiella)、肺炎桿菌(K.pneumoniae)：プロテウス属(Proteus)、P.ブルガリス(P.vulgaris)；プロビデンシア属(Providencia)、P.スツアルティ(P.stuartii)；サルモネラ属(Salmonella)、S・ティフィムリウム(S.typhimurium)；セラチア属(Serratia)、S・リケファシエンス(S.liquefasciens)、S.マルセッセンス(S.marcescens)；シゲラ属(Shigella)、S.フレクスネリ(S.flexneri)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、S. ビオレセオルベル(S.violeceoruber)、エルシニア属(Yersinia)、Y.エンテロコリチカ(Y.enterocolitica)、フサリウム(Fusarium)、F．オキシスポラム(F.oxysporum)、例えばDSM 2672株由来でもよい。
【０２６４】
ホスホリパーゼはベーキング後の最初の期間、特に最初の24時間の間にパンの柔らかさを向上させ得る量で添加される。ホスホリパーゼの量は穀粉１kg当た0.01-10mg酵素タンパク質の範囲、例えば0.1-5mg/kgである。つまり、ホスホリパーゼ活性は一般的に穀粉１kg当たり20-1000リパーゼ単位(LU)の範囲であり、ここでリパーゼ単位は、エマルジョン剤としてアラビアゴムを用い、基質としてトリブチルスズを用いたとき、30分、pH7.0において１分当たりにブタン酸１μmolを遊離させるために必要な酵素の量と定義される。
【０２６５】
通常、パン生地組成物には小麦のあら引き粉又は小麦粉、及び/又はトウモロコシ粉、トウモロコシ澱粉、ライ麦あら引き粉、ライ麦粉、オート麦粉、オート麦あら引き粉、大豆粉、モロコシ粉、馬鈴薯あら引き粉、馬鈴薯粉又は馬鈴薯デンプンのような他の種類のあら引き粉、穀粉又はデンプンが含まれている。パン生地は新鮮、冷凍又は半製品化した生地でもよい。パン生地は、発酵された生地又は発酵される生地のいずれでもよい。生地は種々の方法で発酵され、例えば重炭酸ナトリウム等の化学的発酵剤を加えることにより、又はパン種、つまり、発酵している生地を加えることにより発酵させることができる。パン生地は適切な培養酵母、例えば市販の1S. セレビシエ株等の、培養サッカロマイセス・セレビシエ(Sacchromyces cerevisiae)（パン酵母）を添加することにより発酵させることもできる。
【０２６６】
パン生地に他の公知のパン生地成分、例えば、粉乳、グルテンと大豆等のタンパク質；卵（例．全卵、卵の黄身または卵の白身）；アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカーボンアミド(ADA)又は過硫酸アンモニウム等の酸化剤；L-システインのようなアミノ酸；糖；又は塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウム又は硫酸カルシウム等の塩が含まれていてもよい。生地はさらに、例えば顆粒化された脂肪又はショートニング等のトリグリセリド類のような脂肪、および／または、モノ-又はジグリセリド、モノ-又はジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエトリレン又はリゾレシチン等の乳化剤が含まれていてもよい。乳化剤を加えずにパン生地を作ることもできる。
【０２６７】
任意に、追加の酵素を固化防止アミラーゼ及びホスホリパーゼとともに使用することができる。追加の酵素は第二(すなわち追加)のアミラーゼであり、例えば、アミログルコシダーゼ、β-アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである。又は追加の酵素はペプチダーゼ、特にエキソペプチダーゼであり、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、特に、キシラナーゼ等のペントサナーゼ、プロテアーゼ、例えばWO95/00636に開示されたタンパク質ジスルフィド異性化酵素等のタンパク質ジスルフィド異性化酵素、グルカノトランスフェラーゼ、ブランチング酵素(1,4-α-グルカンブランチング酵素)、4-α-グルカノトランスフェラーゼ（デキストリングルコシルトランスフェラーゼ）又は、例えばペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、L-アミノ酸オキシダーゼ又は炭水化物オキシダーゼ等の、オキシドリダクターゼである。追加の酵素は、哺乳類、植物、及び特に微生物（細菌、酵母、菌類）起源等、どのような起源ものでもよく、公知の方法で得ることができる。
【０２６８】
キシラナーゼは通常微生物由来であり、例えばアスペルギルス属、特にA.アキュレアタス(A.aculeatus)、A.ニガー(A.niger)（WO91/19782参照）、A.アワモリ(A.awamori)（例．WO91/18977）またはA.チュビゲンシス(A.tubigenesis)（例．WO92/01793）等のバクテリアまたは菌類由来；例えば、T・レセイ(T.reesei)、またはフミコラ属の株由来、例えば、H.インソレンス(H.insolens)(例．WO 92/17573)等のトリコデルマ属(Trichoderma)の株由来である。Pentopan（登録商標） Novozym384（登録商標） PENTOPANTM とNOVOZYM 384TM はトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)から産生される市販のキシラナーゼ調合液である。アミノグルコシダーゼはA.ニガー・アミノグルコシダーゼ(AMGTM)でもよい。他の有用なアミラーゼ製品として、GRINDAMYLTM A 1000又はA 5000A 5000（Grindested Products社製、Denmark)、及びAMYLASETM HまたはAMYLASETM P (Gist-Brocades社製、The Netherlands)が挙げられる。グルコースオキシダーゼは菌類のグルコースオキシダーゼでもよく、特にアスペルギルス・ニガーグルコースオキシダーゼ（例えば、GLUZYMETM）でもよい。プロテアーゼの例はNeutraseTMである。リパーゼの例として、サーモマイセス属(Thermomyces)（フミコーラ属）、リゾムコル属(Rhizomucor)、カンジダ属(Candida)、アスペルギルス属(Aspergillus)、リゾプス属(Rhizopus)またはシュードモナス属(Pseudomonas)の株から産生されるリパーゼが挙げられ、特にサーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）（フミコーラ・ラヌギノザ(lanuginosa)）,リゾムコル・ミヘイ(Rhizomucor miehei)、カンジダ・アンタークチカ(Candida antarctica)、アスペルギルス・ニガー、リゾプス・デレマル(Rhizopus delemar)又はリゾプス・アルヒズス(Rhizopus arrhizus)又はシュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)由来のリパーゼが挙げられる。リパーゼは、例えばWO88/02775に開示されたカンジダ・アンタークチカ由来のリパーゼA（Lipase A）またはリパーゼB(Lipase B)でもよく、または、リパーゼは例えばEP238,023に開示されたリゾムコル・ミヘイ由来でもよく、または例えばEP305,216に開示されたフミコラ・ラヌギノザ、または例えばEP214,761及びWO89/01032に開示されたシュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)由来でもよい。
【０２６９】
AmyEポリペプチド含有調合物は、顆粒または塊状の粉末の形状であってもよい。この調合物では、95%重量を超える量の粒子が25から500μmの範囲に分布する狭い粒子サイズ分布を有していることができる。顆粒及び塊状粉末は、公知の方法で調製することができ、例えば、流動床顆粒化装置中の担体にAmyEポリペプチドをスプレーして調製することができる。この担体は適切な粒径の粒子核から作ることができる。この担体は可溶性又は不溶性であり、例えば塩（例えばNaClまたは硫酸ナトリウム）、糖（例えばショ糖または乳糖）、糖アルコール（例えばソルビトール）、デンプン、コメ、トウモロコシの粒または大豆でもよい。
【０２７０】
AmyEポリペプチドを含有する粒子を食品グレードの脂質を用いてカプセル化することもできる。食品グレードの脂質は、水に不溶性で、炭化水素やジエチルエーテルのような非極性の有機溶媒に可溶性の天然の有機化合物であればよい。適切な食品グレードの脂質の非限定的例示として、飽和又は不飽和の脂肪または油状のトリグリセリドが挙げられる。飽和トリグリセリドを構成する脂肪酸及びその組み合わせの非限定的例示として、酪酸（乳脂肪由来）、パルミチン酸（動物及び植物脂肪由来）、及び/又はステアリン酸（動物及び植物脂肪由来）が挙げられる。不飽和トリグリセリドを構成脂肪酸及びその組み合わせの非限定的例示として、パルミトレイック酸（動物及び植物脂肪由来）、オレイン酸（動物及び植物脂肪由来）、リノール酸（植物油由来）、及び/又はリノレン酸（アマニ油由来）が挙げられる。他の適切な食品グレードの脂質の非限定的例示として、上記のトリグリセリド由来のモノグリセリドとジグリセリド、リン脂質と糖脂質が挙げられる。
【０２７１】
食品グレードの脂質、特に液状の脂質を、粉末状のAmyEポリペプチド粒子の表面の大部分、例えばAmyEポリペプチド粒子の表面の100％が脂質により覆われる（包まれる）ようにして接触させる。AmyEポリペプチドの粒子を被覆する利点は2つある。まず、ベーキングプロセス中に、食品グレードの脂質が熱的に不安定な酵素を熱変性から保護する。この結果、AmyEポリペプチドが、プルービング及びベーキング工程中は安定化及び保護される一方、ベーキングされた最終製品中では保護皮膜から放出されて、ポリグルカン中のグルコシド結合を加水分解する。また、添加された搬送媒体により、ベーキングされた最終製品中に継続的に活性な酵素が放出される。すなわち、ベーキングプロセスの後、活性なAmyEポリペプチドがパンの劣化を妨げる速度、すなわち劣化を低減させる速度で保護皮膜から継続的に放出される。
【０２７２】
一般に、AmyEポリペプチド粒子に適用される脂質の量は、脂質の性質、α-アミラーゼ粒子に脂質を適用する方法、処理されるパン生地混合物の組成、及びパン生地混合操作の激しさに応じて、α-アミラーゼの総重量の数パーセントから数倍にまで変わりうる。
【０２７３】
脂質で被覆された酵素は、ベーキングした製品の寿命を延ばすために有効な量で、ベーキングした製品の製造に使用される原料中に添加される。パン製造業者は、所望の固化防止効果を得るために必要な、上記のようにして調製された被覆されたα-アミラーゼの量を算出することができる。被覆されたα-アミラーゼの必要量は、被覆された酵素の濃度、及び穀粉に対するα-アミラーゼの比率に基づいて算出される。広い範囲の濃度において効果が確認されたが、上述のように、固化防止作用の測定可能な改善効果はα-アミラーゼの濃度には直線的に対応せず、ある最小の濃度以上では、α-アミラーゼ濃度を大きく増加させても改善効果は殆ど増加しない。特定の製パン所の製造で実際に使用されるα-アミラーゼ濃度は、パン製造業者が不注意で少なく秤り取ることに対する保険として、最低限必要な量より多くてもよい。酵素濃度の下限値は、パン製造業者が達成したいと考える最低限の固化防止効果に基づいて決定される。
【０２７４】
ベーキングされた製品を製造する方法は：a)脂質で被膜されたAmyEポリペプチド粒子を調製し、実質的に100パーセントのα-アミラーゼ粒子が被膜される工程と；b)穀粉を含有するパン生地を混合する工程と；c)混合が終了する前にパン生地に脂質で被膜されたα-アミラーゼを加え、α-アミラーゼから脂質の被膜が除去される前に混合を終了する工程と；d)パン生地を発酵させる工程と；e)パン生地を焼いてベーキングされた製品を製造する工程とから成り、ここでα-アミラーゼは、混合、発酵及びベーキング段階で不活性であり、ベーキングされた製品中で活性である。被覆されたAmyEポリペプチドは混合サイクル中、例えば混合サイクルの終了近くでパン生地へ添加してパン生地の全体に十分分散させることができる。しかし、混合工程は、保護膜がα-アミラーゼ粒子から取り除かれる前に終了させる。
【０２７５】
脂質で被膜されたAmyEポリペプチド含有粒子に、バクテリア性α-アミラーゼ(BAA)を添加することもできる。BAAはその過剰な熱安定性のためにパンをゴム状の塊にし、十分にベーキングされたパンの塊の中で活性を保持する。しかし、脂質で被膜された粒子にBAAを添加すると、非常に低いBAA添加量でも追加の固化防止効果が得られる。
【０２７６】
本願の組成物及び方法は、種々変更及び改変して実施することができる。引用した文献は全て本願に参照として組み込まれる。
【０２７７】
＜実施例＞
下記の記載及び実施例では次の略語を用いる。wt%（重量パーセント）、℃（摂氏）、H2O（水）、 dH2O（脱イオン水）、dIH2O（脱イオン水、Milli-Qろ過）、g又はgm（グラム）、μg（マイクログラム）、mg（ミリグラム）、kg（キログラム）、μL及びμl（マイクロリットル）、ml及びmL（ミリリットル）、mm（ミリメートル）、μm（マイクロメートル）、M（モル）、mM（ミリモル）、μM（マイクロモル）、U（単位）、MW（分子量）、sec（秒）、min（分）、hr（時間）、DO（溶存酸素）、W/V（体積当たりの重量）、W/W（重量当たりの重量）、V/V（体積当たりの体積）、IKA (IKA Works Inc社 2635 North Chase Parkway SE, Wilmington, NC)、Genencor (Danisco US Inc社 Genencor Division, Palo Alto, CA)、Ncm (ニュートン・センチメートル)、 ETOH (エタノール)、eq (等量)、N (規定)、dsまたはDS (乾燥固体成分)、SAPU (分光分析による酸プロテアーゼ単位、ここでSAPUの1単位は、試験条件下でカゼイン基質から1分間に1マイクロモルのチロシンを遊離させるプロテアーゼ酵素活性である)、及び GAU(グルコアミラーゼ単位、pH4.2及び60℃の溶解性澱粉基質から還元糖をグルコース換算で1時間当り1g産出させる酵素の量と定義される）。
【０２７８】
＜実施例１＞
＜プラスミドの構築とタンパク質の発現＞
プラスミドの構築とタンパク質の発現には、以下の方法を用いた。
【０２７９】
＜1.1 プラスミドの構築＞
SEQ ID NO: 1のAmyE、またはC末端切断AmyE変異体をコードする核酸を、U.S. Patent No. 5,024,943に開示されたB.スブチリスpHPLT発現ベクター中にクローン化した。図2にAmyE-trをコードする核酸を含むベクターを示す。
【０２８０】
pHPLT ベクターには、B.リケニホルミスLATプロモータ(“Plat”)と、LATシグナルペプチド(“preLAT”)をコードする配列と、これに続くクローン化用のPstI及びHpaI制限酵素認識部位が含まれていた。“ori-pUB”はpUB110からの複製の複製起点である。“reppUB”はpUB110由来の複製のレプリカーゼ遺伝子である。“neo”はpUB110由来のネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子である。“bleo”はブレオマイシン耐性マーカである。“Tlat”はB.リケニホルミスアミラーゼ由来の転写ターミネータである。プラスミドpUB110の詳細はMcKenzie et al., Plasmid 15(2): 93-103 (1986)に開示されている。
【０２８１】
AmyE及びAmyE-trを発現させるためのプラスミド構築体を、Yang et al, “Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillus subtilis,” Nucl. Acids Res. 11(2): 237-49 (1983) に記載されたAmyE-コード配列を用いて構築した。プラスミドpME629.5には、SEQ ID NO: 1の全長AmyEをコードする核酸が含まれている。この遺伝子は、Yangらが開示した配列との比較において、澱粉結合ドメインをコードする配列中に3つの塩基の欠失を有する。
【０２８２】
図2に示すプラスミドpME630.7には、切断AmyE配列(すなわちAmyE-tr)が含まれていた。AmyE-trは、SEQ ID NO: 1のD425において切断されている。AmyE-trは、Fujimoto et al., “Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from Bacillus subtilis complexed with maltopentaose,” J. Mol. Biol. 277: 393-(1998) に開示されている、澱粉結合ドメインが欠落したAmyE変異体の結晶構造に基づいてデザインした。RCSB Protein Data Bank信託番号1BAGの“Alpha-Amylase From Bacillus Subtilis Complexed With Maltopentaose”も参照することができる。
【０２８３】
発現プラスミドを構築するため、AmyEポリペプチドをHERCULASETM (Stratagene, La Jolla, CA, USA)を用いてPCR増幅し、Qiagen QIAQUIKTM PCR精製キット(Qiagen, Valencia, CA, USA)に含まれるカラムを用いて精製し50μLのMILLI-QTM 精製水中に再懸濁させた。50μLの精製したDNAをHpaI (Roche)とPstI (Roche)とを順次用いて消化し、得られたDNA断片を30μLのMILLI-QTM精製水中に再懸濁させた。10-20 ng/μLの DNAを、PstI及びHpaIクローン化部位を用いてプラスミドpHPLT中にクローン化した。結紮混合物をコンピテントB.スブチリス細胞(遺伝子型: ΔaprE, ΔnprE, degUHy32 oppA, ΔspoIIE3501, amyE::xylRPxylAcomK-phleo)中に直接形質転換した。これらのB.スブチリス細胞は、キシロース誘導プロモータの制御下におかれたコンピテンシー遺伝子(comK)を備えていた。キシロースを添加して、DNA結合及び取り込みに対するコンピテンシーを誘導した。親プラスミド中のamyE遺伝子は2つのPstI部位を備えているため、クローン化する前にこれらの部位をPCR融合反応により除去した。PCR融合反応は、2種のPCR反応の後に行った。HpaI and PstI sitesを用いたpHPLT構造体の構築には、下記のプライマーを用いた。
【化１９】
0005933619.tif 000020
【化２０】
0005933619.tif 000021
【化２１】
0005933619.tif 000022
【化２２】
0005933619.tif 000023
【化２３】
0005933619.tif 000024
【化２４】
0005933619.tif 000025
【化２５】
0005933619.tif 000026
【０２８４】
プラスミドpME629.5及びpME630.7は、翻訳後切除される31残基のシグナル配列を有するAmyEを発現する。その次の10個のN-末端アミノ酸を、Yangら(1983)の提案に従い、別に処理した。pME629.5は「全長」AmyEをコードし、pME630.7は「切断」AmyEをコードする。 
【０２８５】
＜1.2 タンパク質の発現＞
全長AmyEをコードする構造体、及び切断ポリペプチドをコードする構造体を有するバクテリア性形質転換体を、10 μg/mLのネオマイシンと1%の不溶性澱粉を含むルリア寒天(LA)上で選択し、37℃で一夜培養した。コロニーの周りに透明部(またはハロー）が認められた形質転換を選択し、更に分析した。各形質転換体のそれぞれの前培養物を、10 μg/mLのネオマイシンを含むLB中で8時間成長させた。10 μg/mLのネオマイシン及び5 mMのCaCl2を添加した培養液(下記参照)30 mLを入れた250 mLフラスコ中に、各前培養物30 μLを添加した。用いた培養液はMOP緩衝液をベースとし、主要な窒素源としての尿素と、主要な炭素源としてのグルコースとを含み、健全な細胞を成長させるためにソイトンを1%添加した栄養分強化半合成培地であった。振蕩フラスコを37℃において250 rpmで撹拌しながら、60-65時間インキュベートした。培養物は、コニカルチューブを用い、5,000 rpmで20分間遠心分離して集菌した。全長AmyEタンパク質と切断AmyEタンパク質の両者とも高濃度で発現されたため、培養物の上清を精製せずにその後の分析に用いた。
【０２８６】
＜実施例2＞
＜共通のアッセイ方法＞
下記の実施例では、以下説明するアッセイを用いた。下記に示す方法と異なる点は、各実施例において表示する。これらの実験では、反応完了後に、生成した産品の吸光度を分光光度計により測定した。
【０２８７】
＜2.1 アミラーゼ活性のアッセイ＞
アミラーゼ活性は分光光度計を用いて測定した。基質には、Remazol Brilliant Blue R (“RBB-コーンスターチ,” Sigma S7776)標識に共有結合させた不溶性コーンスターチを用いた。pH 4.5, 5.0または5.6の50 mM酢酸ナトリウム溶液中にRBB-コーンスターチを含む2% (wt ds)スラリー75μLを、100 μg/mLの酵素溶液10 μLに添加して十分撹拌した。この混合物を50℃で30分間インキュベートした。次に、サンプルを氷上に置き、卓上遠心分離機を用いて4,100 rpmで20分間遠心分離することにより基質を除去した。生成物の量は、澱粉から放出された青色色素の量を測定することにより求めた。色素の光学密度(OD)は、595 nmで3回測定した。 
【０２８８】
＜2.2 粘度測定方法＞
粘度計を用いて、アミラーゼの存在下のコーンスターチ基質の粘度をpH 4.5及び5.8で測定した。30% dsのコーンスターチ基質のスラリーを新たに調製し、硫酸によりpHを4.5または5.8まで下げた。各反応のつど、スラリー50g(15 g ds)を秤り取り70℃で10分間暖めた。α-アミラーゼを添加した後、直ちに温度を70℃から85℃に上げ、反応液を75 rpmで撹拌した。スラリーと酵素の混合物のスラリーの温度が85℃に達した後、粘度を30分間測定した。
【０２８９】
＜2.3 示差走査熱量測定(DSC)による熱安定性測定＞
2mM塩化カルシウムの存在下または非存在下におけるAmyEまたはその変異体の過剰熱容量を、超高感度高速示差走査熱量計(VP-Capillary DSC; MicroCal, Inc., Northampton, MA, USA)を用いて測定した。0.5 mg/mLのAmyEまたはその変異体溶液500μLを30-120℃の温度範囲で走査した。コントロールには、切断ゲオバシラス・ステアロサーモフィリスのα-アミラーゼ(AmyS)を用いた。34アミノ酸残基のシグナル配列を有するAmySのアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 4に示す。同じサンプルについて再走査して、可逆性をチェックした。使用した緩衝液は、pH 5.5の10 mM酢酸ナトリウムであった。凝集に起因するアーチファクトを最小限にするため、走査速度は200℃/hrとした。DSC曲線の熱中点(thermal midpoint (Tm))を、熱安定性の指標として用いた。全てのTm測定の標準誤差は1%未満であった。
【０２９０】
＜2.4 96-ウエルマイクロタイタープレート中でのブラッドフォードアッセイ＞
上清サンプル中のタンパク質濃度をBradford QUICKSTARTTM 染色試薬 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いて測定した。サンプルは、37℃の加湿空気下において280rpmで振蕩しながら3日間マイクロタイタープレート (MTP)を用いて培養した培養物のブロスを濾過して調製した。別のMTPのウエル中で、培養物の濾液10μLにBradford QUICKSTARTTM染色試薬200μLを添加した。十分撹拌した後、室温で少なくとも10分間MTPをインキュベートした。気泡を除去し、595 nmのOD (光学密度)を測定した。各サンプルの測定からバックグラウンド(植菌していないウエル)の値を差し引いてタンパク質濃度を求めた。
【０２９１】
＜2.5 HPLC測定によるグルコース生成＞
＜マルトース及びマルトヘプタオースの加水分解＞
各実験例に示してあるように、pH 4.5または5.6の50 mM酢酸ナトリウム溶液中、またはpH 5.6の50 mMマレイン酸溶液中に、マルトースまたはマルトヘプタオースが0.5%含まれる溶液を調製した。まず全酵素溶液を希釈して、1 mg/mLとした。適切な濃度の基質溶液を用いて、最終酵素濃度が1 ppmになるようにして酵素を希釈することにより反応溶液を調製し、次にサンプル200 μLを採取して滅菌したスクリューキャップ付チューブに入れ、37℃のインキュベータに取り付けた。所与の各時間において、10 mM水酸化ナトリウム溶液を用いて10倍に希釈することにより、反応を停止させた。 
【０２９２】
＜不溶性澱粉の加水分解＞ 
不溶性粒状澱粉の加水分解を測定するために、pH 5.6のマレイン酸緩衝液により、精製したAmy Eまたはその変異体(24.5g/L)を最終濃度が20.4 ppmになるように希釈した。このタンパク質溶液を、コーン粉5%を含むpH 5.6のマレイン酸緩衝液に添加して最終濃度を1 ppmとし、この混合液をシェーカにより32℃でインキュベートした。サンプルを定期的に採取して50 mM水酸化ナトリウム溶液で10倍に希釈することにより反応を停止させた。
【０２９３】
＜HPLC測定方法＞
グルコースの生成及びその他の基質分解物を、Dionex PA-1カラムと電気化学的検出器を備えるAgilent 1100 LCシステムを用いて、HPLCにより分析した。サンプル10 μLを注入し、NaOHと酢酸ナトリウムのグラディエントを25℃において1.0 mL/分で流通させた。単糖類の分布を、予め測定しておいた標準サンプルにより求めた。溶出液のデータを45分以上採取した。産出されたグルコースの定量値(g/Lで表示)は、認証されたグルコース標準サンプル(Sigma, MO, USA)を用いて、糖類のピーク面積を実際の各糖の濃度に換算することにより求めた。
【０２９４】
＜2.6. マルトース及びマルトヘプタオース基質を用いたグルコース生成＞
マルトースまたはマルトヘプタオースのグルコースへの分解を、HPLCにより測定した。pH 4.5または5.6の50 mM酢酸ナトリウム溶液中に、マルトースまたはマルトヘプタオースが0.5%含まれる溶液を調製した。各酵素サンプルの精製ストック溶液を希釈して、1 mg/mLとした。1 mg/mLの酵素のサンプルをさらにマルトース溶液で希釈して、最終酵素濃度を1 ppmにした。次にサンプル200 μLを採取して滅菌したスクリューキャップ付チューブに入れ、37℃のインキュベータに取り付けた。2, 5, 及び8日経過後に、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応を停止させた。実施例2.5に記載した方法を用いて、グルコースとマルトース分解物の生成を、認証標準サンプルに対するHPLCにより分析した。
【０２９５】
＜2.7 トリプレックス(Triplex)アッセイ＞
標準的な全還元糖、グルコース、及びヨウ素のアッセイを個別に行い、アミロペクチン消化生成物の特性を分析した。2.2% (w/w)のコーンアミロペクチン基質の溶液を、pH 5.8の55 mM酢酸ナトリウム緩衝液を用い、混合物を撹拌しながら30分間撹拌した後、室温まで冷却して調製した。基質溶液100μlを96ウエル培地結合ポリスチレン製マイクロタイタープレートに入れ、さらに希釈したAmyE変異体の培養液の上清10 μlを添加した。マイクロタイタープレートをシール(Nunc, cat. # 236366) した後、直ちにiEMS振蕩インキュベータに移し、50℃において1150 rpmで10分間インキュベートした。アミラーゼの反応は、20 μl の0.5 N NaOHを添加して撹拌することにより停止させた。 
【０２９６】
全還元糖の量は、フルスカート(full skirt)PCRプレート(Axygen PCR-96-FS-C)中で、20μlの5% w/v 4-ヒドロキシベンズヒドラジド(Sigma H9882, 0.5 N HCl溶液)と80μlの0.5 N NaOH、さらに20 μlのアミラーゼ反応液を混合して測定した。このプレートをシール(Microseal B粘着性シーラー, BioRad MSB-1001) し、95℃で2分間インキュベートした後、直ちにPCR用熱サイクルヒーティングブロックを用いて25℃まで冷却した。反応液のサンプル80 μlをポリスチレン製96ウエルマイクロタイタープレートに移し、440 nmの光学密度をSpectramaxプレートリーダーにより測定した。
【０２９７】
アミラーゼ反応液中の全グルコースの量を、マイクロタイタープレート中で反応液のサンプル20 μlと、0.005% v/vのTween 80を含むpH 6.8の50 mMリン酸カリウム緩衝液中に2,2′-アジノ-ビス(3-エチルベンゼンチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩 (Sigma, A1888)が5.8 mg/ml含まれた溶液50 μlとを混合し、次に、同じ緩衝液中にホースラディッシュタイプVI (Sigma, P8375)由来のペルオキシダーゼ0.33 U/mlと、3.33 U/mlのOxyGo (グルコースオキシダーゼ, Genencor)を含む溶液を添加して分析した。マイクロタイタープレートを直ちにSpectramaxプレートリーダーに取付け、5秒間撹拌した後、405 nmの光学密度を9秒間隔で60-180秒間測定した。
【０２９８】
アミラーゼ反応液のヨウ素分析は、ポリスチレン製マイクロタイタープレート中で、アミラーゼ反応1:4希釈液(水で希釈)と、ルゴール試薬(ヨウ素5gとヨウ化カリウム10gを水100 mlに溶解させた溶液)を水で1:20に希釈した溶液80μlを混合することにより行った。580 nmの光学密度をSpectramaxプレートリーダーにより測定した。マイクロソフト社のエクセルを用いてSoftmax Proソフトウエア(プレートリーダー)から得られたデータを加工した。
【０２９９】
ヨウ素分析の結果は全OD580で表示した。鎖長/残留アミロースは全ODの関数となるので、アミラーゼ活性は全ODに反比例する。全還元糖は全OD440で表示した。全還元糖はODに比例するので、アミラーゼ活性はODに正比例する。全グルコースは、グルコースアッセイにおける動力学定数で表示した。全グルコースは動力学定数に正比例する。ODと動力学定数による表示は、グルコースから作成した検量線を用いて既知量に変換する代わりに用いた。比率は生データを用いて表示したため、無単位である。この3種のデータを、全還元糖に対するグルコースの比でヨウ素を割った比として、グラフ上で組み合わせた。
【０３００】
＜2.8 高速粘度計アッセイによる粘度低下速度の測定＞
市販の分子ロータCCVJ (9-(2-カルボキシ-2-シアノビニル) ジュロリジン)を用いて高速粘度計アッセイを開発した。分子ロータは、量子収量(放出されたフォトンの数を吸収されたフォトンの数で割った値)がミクロ環境の自由体積、ひいては粘度に依存する蛍光性物質である。このような分子は、分子内回転により励起状態から緩和する。分子内回転はミクロ分子環境の粘度に比例して抑制され、残余のエネルギーは放射緩和(蛍光発光)により消失する。
【０３０１】
酵素活性による粘度低下速度を測定するために、次のようにして分子ロータCCVJをコーンアミロペクチンの緩衝懸濁液中に添加した。 凍結乾燥されたCCVJ (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO)5 mgを入れたバイアルにジメチルスルホキシド186μlを添加して、100 mMのCCVJのストック溶液を調製した。CCVJストック溶液を室温で暗所に貯蔵し、使用前に沈殿の有無をチェックした。2,850mLの蒸留水に、コーン由来のアミロペクチン(MP Biomedicals LLC, Solon, OH) 90gを添加した。この溶液を撹拌しながら沸騰させた。この条件下で、アミロペクチンは徐々に糊化し溶解した。得られた均一で粘稠な糊化アミロペクチンの懸濁液を熱源から離し、連続的に撹拌しながら室温に戻した後、pH 5.8の1 M 酢酸ナトリウム緩衝液150 mL (予め1モルの酢酸ナトリウムに1 M酢酸を滴下して調製しておいた)を添加し、次に150 μlのTween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO)を添加した。Tween-80が完全に溶解したとき、100 mM CCVJストック溶液150 μlを添加して溶解させてアミロペクチン/CCVJ試薬の調製を完了し、使用に供した。この試薬を透明ガラス容器に入れ、3日間撹拌を続けて粘度スクリーニングを完了した。 
【０３０２】
これらのアッセイでは、全ての液体の取り扱いは、96-ウエルマイクロタイタープレートの全96ウエルに同時に滴下可能なマルチチャンネルヘッドを備えたBiomek FXPロボットにより行った。アミロペクチン/CCVJ試薬60μlを、未処理の黒色ポリスチレン製96-ウエルマイクロタイタープレート(Corning Incorporated, Corning, NY)の各ウエルに添加した。酵素のサンプル30μlを各ウエルに滴下し、直ちにマイクロタイタープレートをSpectramax M2e蛍光測定装置 (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)により測定した。この蛍光測定装置の設定は次の通りであった：トップ-リード(top-read)蛍光モード；励起波長435ナノメータ(nm)；蛍光発光波長495 nm；遮断波長455 nm；測定間隔24秒の動力学測定モード；最初の測定の前に15秒間撹拌、各測定の間に3秒間撹拌；全測定時間192秒間で20秒の遅延時間(各動力学速度算出から最初の9つの測定データを除外)。
【０３０３】
このアッセイでは、粘度低下速度は、蛍光強度の低下速度により測定した。蛍光強度低下の動力学的速度は、Spectramax測定装置に付属するソフトウエアであるSoftmax Proにより、「Vmax (ミリ単位/分)」として自動的に算出した。 
【０３０４】
＜2.9 液化後の粘度測定の高速粘度アッセイ＞
酵素活性による液化後の粘度低下を測定するために、次のようにしてコーン粉の緩衝化スラリー中に分子ロータCCVJを添加した。凍結乾燥されたCCVJ (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO)5 mgを入れたバイアルにジメチルスルホキシド186μlを添加して、100 mMのCCVJのストック溶液を調製した。CCVJストック溶液を室温で暗所に貯蔵し、使用前に沈殿の有無をチェックした。有機栽培コーン粉(Azure Farm, Dufur, OR)を600-マイクロメータの篩に通し、95℃で16時間ベーキングした後、室温に戻した。
蒸留水1520g、pH 5.6の1M酢酸ナトリウム緩衝液80 mL (予め1モルの酢酸ナトリウムに1 M酢酸を滴下して調製しておいた)、80 μlのTween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO)、80μlの100 mM CCVJストック溶液、及び篩にかけた有機栽培コーン粉400gを混合して、1バッチが2-kgの、pH5.8でコーン粉20% (重量/重量)のスラリーを調製した。このスラリーを、磁性撹拌子を用いて30分間激しく撹拌した後、pHが5.8であることを確認した。スラリーを継続して激しく撹拌してコーン粉を均一に分散させながら、先端を細くして内径を約2.3ミリメートルにすることにより200-μlに調整したマルチチャンネルピペットを用いて、スラリー90μlをポリスチレン製黒色未処理96-ウエルマイクロタイタープレート(Corning Incorporated, Corning, NY)の各ウエルに入れた。マルチチャンネルピペットの先端の内径はノギス(Mitutoyo Corporation, Kure, Hiroshima, Japan)で測定した。
マイクロタイタープレートの各ウエルのコーン粉のスラリー上に、酵素のサンプル10 μlを滴下した。その後、マイクロタイタープレートを粘着性シーラー(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)でシールし、80℃の高温オーブンで予熱した金属板の間に緊密に挟み込んだ。このプレートを1時間インキュベートした後、室温に戻して、室温で一夜放置した。翌日、プレートのシーラーを取り除き、次のように設定したSpectramax M2e蛍光測定装置(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)で測定した：トップ-リード(top-read)蛍光モード；励起波長435ナノメータ(nm)；蛍光発光波長495 nm；遮断波長455 nm。このアッセイでは、蛍光強度の低下は糊化したコーン粉の密度の低下に比例し、従って酵素活性による液化の進行に相当する。
【０３０５】
＜実施例3＞
＜比活性度と最適pH＞
全長AmyE (SEQ ID NO: 1), AmyE-tr (SEQ ID NO: 2)、及びその変異体の比活性度と最適pHを実施例2.1に記載した方法により測定した。比活性度は、50℃、pH 4.5, 5.0, 及び5.6において30分間にRBB-コーン澱粉基質から放出される染料の量を分光分析で測定して求めた。図3は、AmyE-tr及びAmy31Aは、pH 5または5.6との比較において、pH4.5のとき最も高い比活性度を示す。AmyEはpH5.6よりもpH5のときより高い比活性度を示す。
【０３０６】
＜実施例4＞
＜コーンスターチ基質の粘度低下＞
AmyE, AmyE-tr、及びその変異体のコーンスターチ基質の粘度を低下させる能力を、実施例2.2に記載した方法を用いて測定した。各酵素について、pH 4.5及び5.8において粘度の経時変化を測定した。図4A及び4Bはそれぞれ、AmyE-tr及びAmyEはpH 4.5及び5.8の双方において基質の粘度を低下させることを示している。図4C及び4Dはそれぞれ、Amy31AはpH 4.5及び5.8において性能が優れていることを示している。
【０３０７】
＜実施例5＞
＜熱安定性＞
AmyE, AmyE-tr,及びその変異体の熱安定性を、実施例2.3に記載した示差走査熱量測定法(DSC)を用いてCa2+の存在下または非存在下で測定し、Ca2+が酵素の熱安定性に影響するか否かを検討した。DSCにより、アンフォールディング過程は不可逆であることが明らかになった。図5Aは、2 mM Ca2+の存在下または非存在下でのAmyE及びAmyE-trのDSC法で測定したアンフォールディング曲線を表す。図5Bは、全長Amy31A変異体のDSC法で測定したアンフォールディング曲線を表す。カルシウムの熱融点に対する影響は全く見られないことから、AmyE, AmyE-tr, 及びAmy31AのいずれもCa2+と結合しないか、またはmMオーダーのCa2+濃度では安定化されないことが示唆される。図5Cに示すように、G. ステアロサーモフィリスα-アミラーゼ(AmyS)では対照的な結果が得られた。Table 1に試験した各酵素の融点を示す。AmyE, AmyE-tr, またはAmy31Aの熱安定性はCa2+を添加しても殆ど変化しなかったが、AmySの熱安定性はCa2+の添加により顕著に増加した。
【表１】
0005933619.tif 000027
【０３０８】
＜実施例6＞
＜マルトース及びマルトヘプタオースのグルコースへの転換＞
実施例2.3に記載したグルコース生成アッセイを用いて、AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) 及びAmyE-trの6種のQ153位 (C, F, I, K, N, 及びV)AmyE変異体について、pH 5.6におけるマルトース基質及びマルトヘプタオース基質をグルコースへ転換する能力を分析した。生成したグルコースは1, 2, 及び3日経過後に測定した。AmyE-tr 及びAmyE変異体の濃度は1 ppmであった。比較として、同一添加処方の切断AmyS (SEQ ID NO: 4)を用いた。 
【０３０９】
図６にマルトース基質からのグルコース生成結果を示す。AmySによるグルコース生成は僅かであったが、AmyE-tr及びQ153位変異体は顕著な量のグルコースを生成した。これらの条件下では、Q153N変異体が最も多量のグルコースを生成した。これらの結果から、AmyE及びAmyE変異体は、マルトースからグルコースを効率的に生成することが確認された。 
【０３１０】
図7にマルトヘプタオース基質からのグルコース生成結果を示す。マルトースを基質に用いた場合と同様、AmySによるマルトヘプタオースからグルコースへの転換効率は低かった。これに対し、AmyE-tr及びQ153位変異体はマルトヘプタオースをグルコースへ効率的に転換し、Q153K及びF変異体は3日目まで最も高い効率を示した。この実施例は、AmyE及びAmyE変異体は複合オリゴ糖からグルコースを効率的に生産することを示している。
【０３１１】
＜実施例7＞
＜マルトヘプタオースのグルコースへの転換＞
AmyE-tr (SEQ ID NO: 2), AmyS, 及び AmyE変異体 Q153Kのマルトヘプタオース(DP7)のグルコース(DP1)への転換能力を分析した。反応液中の生成物の分析は、実施例2.2に示したHPLC法により行った。図8〜10に代表的溶出曲線を示す。 
【０３１２】
図8は、72時間インキュベートしたときAmyE-trはDP7を主にDP1に転換し、残余成分はマルトース(DP2)であることを示している。これに対し図9は、AmySはDP7を低分子量のオリゴ糖に転換し、DP5, DP4, DP3, DP2 及びDP1オリゴ糖の混合物を生成することを示している。図10はAmyE変異体Q153Kの存在下でのDP7から低分子量オリゴ糖への転換の経時変化を表している。1時間の内に、顕著な量のDP1, DP2, 及びDP3が検出された。3時間が経過するまで、Q153K変異体はDP7を主にDP1に転換した。これらの結果は、AmyE及びその変異体は、DP7基質からグルコース(DP1)を効率的に生成可能なことを示している。
【０３１３】
＜実施例8＞
＜位置変異体の創出と発現＞
この実施例は、位置変異体のライブラリの創出と発現に関する。
【０３１４】
＜8.1. 位置変異体ライブラリの創出＞
プラスミドpME630.7 (図2, 実施例1)を用いて、AmyE-trの異なる150アミノ酸残基における位置変異体ライブラリを創出した。Table 1に位置変異体ライブラリの創出に用いた各残基を示す。残基の位置の番号付与は、SEQ ID NO: 2における位置に基づいて行った。各位置について示したアミノ酸は、SEQ ID NO: 2 に示すAmyEに見られる残基(すなわち、野生型の残基)である。
【表２】
0005933619.tif 000028
【０３１５】
Table 1に示した150残基のそれぞれについての位置変異体ライブラリには、約16個のアミノ酸置換変異体が含まれていた。このライブラリは、上記の150の位置におけるAmyE変異体配列をコードする発現プラスミドを含む、形質転換されたB.スブチリス細胞から成る。各変異体のタンパク質活性を評価する前に、DNAシーケンシング分析によりその配列を確認した。各クローンを下記のようにして培養し、得られた様々なAmyE変異体の性質を分析した。
【０３１６】
＜8.2. タンパク質の発現＞
置換AmyE変異体を含むB. スブチリス形質転換体を、ネオマイシン10μg/mlを含有するLB (ルリアブロス)を入れた96ウエルプレート中で8時間培養し、この予備培養液30μl を、25 ppmのクロラムフェニコール及び5 mMのCaCl2を添加した培養培地(下記参照)30 mLを入れた250 mLのフラスコに入れた。このフラスコを、250 rpmの一定速度で撹拌しながら、37℃で60-65時間インキュベートした。コニカルチューブを用いて5,000 rpmで20分間遠心分離することにより、培養物を集菌した。培養液の上清を分析に供した。使用した培養培地は、MOP緩衝液をベースとし、主な窒素源が尿素、主な炭素源がグルコースで、健全な細胞を培養するためのソイトン1%が添加された栄誉強化半合成培地であった。
【０３１７】
＜実施例9＞
＜比活性度及び熱安定性を測定するための澱粉加水分解アッセイ＞
澱粉加水分解アッセイにより、AmyE位置変異体の比活性度及び熱安定性を測定した。また、クリーニング試験見本アッセイにより、AmyE変異体の汚れ除去性能を測定した。AmyE変異体のpH安定性は、マルトヘプタオース基質上でのアミラーゼ活性を測定することにより評価した。各AmyE変異体の熱安定性は、熱ストレス前後におけるマルトトリオース基質上でのアミラーゼ活性を測定することにより評価した。
【０３１８】
＜9.1. 比活性度及び熱安定性の測定＞
澱粉加水分解アッセイにより、AmyE及びAmyE変異体の比活性度及び熱安定性を測定した。実際のクリーニング及び穀物加工の条件に近い条件を用いた。活性は、コーン粉の酵素的分解により生じた還元末端の量と定義される。還元末端は、下記に示すPAHBAH (p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド)アッセイにより測定した。安定性は、80℃において維持された活性と定義される。
【０３１９】
使用機器：PCRプレートアダプター付Inheco Variomag Teleshake 95加熱式シェーカ(Hamilton Company, Reno NV); Thermo Electron Multidrop自動ディスペンサー(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA); iEMSインキュベータ(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA); V&P Scientific撹拌式ディスクディスペンサー(model VP722B); Axygen PCR-96-FS-CフルスカートPCRプレート(Axygen Scientific, Inc., Union City, CA); Tetrad サーモサイクラー(MJ Research, Waltham, MA), BiomekTM FX リキッドハンドラー(Beckman Coulter, Fullerton, CA)。
【０３２０】
＜澱粉加水分解＞
Azure Farms 有機コーン粉(Norco, CA, USA)を篩にかけ、<600ミクロンの粉を採取し、80℃で4時間ベーキングし、室温で一晩放置し温度を下げた。調製した乾燥コーン粉を、VP722Bユニットをパウダーフリップディスペンサーとして用いてAxygen PCRプレートに移した。各ウエルに入れたコーン粉の量は、約5mgであった。pH 5.6(最終懸濁液のpHは~5.8)の50 mM酢酸ナトリウム溶液100 μLを各ウエルに入れて撹拌した。AmyE及びAmyE変異体の培養液上清を、希釈緩衝液(水+ 0.005% Tween-80)により約20 μg/mLに希釈した。希釈した上清10 μLを8分間反応用プレート及び30分間反応用プレートに移し、サンプルを上下に一回ピペッティングして撹拌した。軽油50 μLを各ウエルに入れた。次に、プレートを、80℃に予熱したInheco装置に移した。インキュベート開始から所定時間が経過した後、各ウエルに10 μLの4N NaOHを添加して澱粉加水分解反応を停止させた。澱粉加水分解反応の生成物をPAHBAHアッセイにより分析した。
【０３２１】
＜PAHBAHアッセイ＞
80 μLの0.5N NaOHを空のPCRプレート(PAHBAH反応プレート)の全てのウエルに入れ、次に、20 μLのPAHBAH試薬 (5% w/v p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド (Sigma # H9882, St. Luois, MO, USA), 0.5N HCl中に溶解)を入れた。溶液を上下にピペッティングして撹拌した。PAHBAH反応プレートの各ウエルに澱粉加水分解反応上清10 μLを添加した。プレートをシールし、95℃で2分加熱後20℃に冷却するようプログラムしたサーモサイクラーに入れた。PAHBAH反応混合液のサンプル80μLを新しいプレートに移し、分光光度計で405 nmの吸光度を測定した。
【０３２２】
＜9.2. 汚れ除去性能の評価＞
CS-28米澱粉汚染小試験見本を用いて、AmyE及びAmyE変異体の汚れ除去性能を評価した。CFT Vlaardingen (Netherlands)社製の、直径1/4インチの円形小試験見本を用いた。96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに2つの小試験見本を入れた。
【０３２３】
濾過した培養ブロスのサンプルを、10 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, 0.005% Tween-80の混合液で性能試験における最終濃度の20倍の濃度に希釈することにより、適切な濃度で試験した。酵素の最終濃度は約0.025-0.10 ppmであった。アミラーゼの性能は、pH 8及びpH 10で測定した。
【０３２４】
小試験見本を入れたマイクロタイタープレートの各ウエルに、(A)25mM HEPES (Sigma, H7523), 2mM CaCl2, 0.005% Tween-80を含むpH 8.0の緩衝液、または(B) 25mM CAPS (Sigma, C2632), 2mM CaCl2, 0.005% ween-80を含むpH 10.0の緩衝液のいずれかを190 μl添加した。各ウエルに希釈したアミラーゼのサンプル10μlを添加して、総容積を200μl/ウエルにした。マイクロタイタープレートをプレートシールで覆ってiEMSインキュベータに入れ、1,150 rpmで撹拌しながら40℃で60分間インキュベートした。適切な条件下でインキュベートした後、各ウエルから溶液100 lを採取し、新しいマイクロタイタープレートに入れ、分光光度計により488nmの吸光度を測定した。この試験には、ウエル中に2つの小試験見本と洗剤を含むがアミラーゼを含まない「ブランクコントロール」も含まれていた。
【０３２５】
＜CS-28米澱粉加水分解性能の計算＞
得られた吸光度の値を、ブランクコントロールの値で補正した。得られた吸光度「ΔOD488」を、アミラーゼ活性の指標とした。各AmyE及びAmyE変異体について、変異体の活性値を野生型酵素の活性値で割ることにより、性能指数を求めた。すなわち性能指数は、同じタンパク質濃度における変異体の性能(実際の値)と標準AmyE参照酵素の性能(理論値)との比較を表す。また、理論値は標準AmyE酵素のラングミュア式のパラメータから計算した。
【０３２６】
野生型酵素に対して性能の異なる変異体を、性能指数(PI)により分類した。PIが1より大きい(PI > 1)場合は、標準、すなわち野生型より優れた変異体であり、PIが1(PI = 1)の場合は変異体の性能は標準と同じである。PIが1未満の場合、野生型より劣る変異体である。
【０３２７】
＜9.3 pH安定性の評価＞
マルトヘプタオースを基質に用いたアミラーゼ活性アッセイにより、AmyE及びAmyE変異体のpH安定性を評価した。アルファ-アミラーゼ活性を、酵素共役比色動力学アッセイを用いてpH 5.8及びpH 4におけるグルコースの生成を計測することにより測定した。酵素反応は、平底のポリスチレン製96-ウエルマイクロタイタープレートを用いて室温で行った。pH 5.8で行ったアッセイでは、AmyEまたはAmyE変異体の5x希釈培養液上清を含む0.005% (w/v) Tween-20水溶液5μlを、酢酸ナトリウム, CaCl2, Tween-20, ホースラディッシュ・ペルオキダーゼ(Sigma-Aldrich, cat. # 8375)及びグルコースオキシダーゼ(OXYGOTM; Genencor Division, Danisco US Inc.)を含むpH 5.8の緩衝液と混合した。最終容積50μl中には各成分がそれぞれ50 mM, 2.6 mM, 0.005% (w/v), 20 U/ml及び50 U/ml含まれていた。50 mM 酢酸ナトリウム, 5.4 mg/ml 2,2′-アジオ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩(Sigma-Aldrich, cat. # A1888) 及び10 mMマルトヘプタオース(Sigma-Aldrich, cat. # M7753)を含むpH 5.8の緩衝液を添加して反応を開始させ、5秒間撹拌した。反応液の405 nmの発色を、SpectraMAX 250 分光光度計(Molecular Devices, Union City, CA)を用いて９秒間隔で240秒間計測した。酵素活性は、計測中の120-240秒の間の発色速度として測定した。pH4.0のアッセイでは、pH 4.0の緩衝液と、20μlの希釈したAmyEまたはAmyE変異体のサンプルと、及び、ペルオキシダーゼ/グルコースオキシダーゼ30μlとを、各成分の濃度を適切な値にして用いた点を除き、上記の方法を繰り返した。
【０３２８】
＜9.4 熱安定性の評価＞
AmyE及びAmyE変異体の熱安定性の測定は、pH 5.8におけるマルトトリオース基質に対するアミラーゼ活性を、酵素共役比色動力学アッセイを用いてグルコースの生成を計測することにより行った。ここで用いたアッセイ方法では、マルトトリオース基質を用いて上記の手順で行った。AmyEまたはAmyE変異体の希釈培養液上清のサンプル20μlを使用し、発色は反応の60-180秒の間計測した。また、希釈培養液のサンプル80μlを新しいプレートに移し、プレートシーラーで覆い、iEMS装置 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)により650rpmでシェーキングしながら60℃で30分間インキュベートした。プレートを氷上で4分間冷却し、20 μlのサンプルについて、上記のようにしてマルトトリオース基質に対する活性を測定した。前記の分析のように、各AmyEまたはAmyE変異体について変異体の活性値を野生型酵素の活性値で割ることにより性能指数を算出した。性能指数により、同一タンパク質濃度における変異体の性能(実際の値)と標準AmyE参照酵素(理論値)とを比較した。
【０３２９】
＜実施例10＞
＜AmyE位置変異体の相対性能＞
実施例9に示した方法により、AmyE-trの相対性能または相対活性を、実施例6に示した方法で生成させたAmyE変異体と比較した。それぞれに6種以上のメンバーが含まれる全142種類の位置変異体を評価した。
【０３３０】
＜定義＞
次の定義が適用される。
性能指数 (PI): 変異体の親タンパク質に対する性能の比
上昇突然変異: PI > 1
中性突然変異: PI > 0.5
非有害突然変異: PI > 0.05
有害突然変異: PI ≦ 0.05
完全拘束位置: タンパク質及び活性の中立突然変異無し
不完全拘束位置: 試験した1の性質について少なくとも1の中立突然変異有り 
非拘束位置: 少なくとも1の性質について≧ 20% の中立突然変異有り
【０３３１】
Table 2にAmyE-tr及びAmyE変異体の部位について評価したスクリーニング結果を示す。Table 2の第1列に、評価したアミノ酸の位置を示す。第2列に、その位置にある野生型酵素のアミノ酸を示す。第3列に、この実施例で検討した、その位置における変異体の数を示す。それ以降の列は、変異体の数と、各評価において同定された中立突然変異のパーセント(%)を表している。評価した性質は次の通りである：第4及び5列(corn flour ddG)、コーン粉基質での比活性度；第6及び7列 (DP3 ddG)、pH 5.8におけるマルトトリオース加水分解；第8及び9列(DP7 pH 4 ddG)、pH 4におけるマルトヘプタオース加水分解；第10及び11列(DP7 pH 5.8 ddG)、pH 5.8におけるマルトヘプタオース加水分解；第12及び13列(DP3 HS ddG)、マルトトリオース加水分解アッセイによる熱安定性 ( 60℃において30分)；第14及び15列(Clean pH 8 ddG)、pH 8における米澱粉汚染小試験見本アッセイ；第16及び17列 (Clean pH 10 ddG)、pH 10における米澱粉汚染小試験見本アッセイ。評価した切断AmyE中の150の部位には、2箇所の完全に拘束された位置、すなわち75及び123が含まれていた。評価した全長AmyEの295の部位には、10箇所の完全に拘束された位置、すなわち75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266, 及び306が含まれていた。
【表３】
0005933619.tif 000029
0005933619.tif 000030
0005933619.tif 000031
0005933619.tif 000032
0005933619.tif 000033
【０３３２】
＜実施例11＞
＜AmyEによるエタノール生成＞
この実施例では、従来のエタノール発酵アッセイを用いて、llinois River EnerIgy (IRE) 液化物(31% DS)の従来のエタノール発酵における切断AmyEの性能を試験する実験を行った。尿素を400 ppm含む31% DS Illinois River Energy (IRE)液化物の調合液を複数調製し、5N H2SO4を用いて1つの調合液のpH を4.3に調整し、別の調合液のpHを5.8に調整した。1つのフラスコ(125 ml エルレンマイヤー)について基質100gを用いた。記載した量の酵素を添加した。発酵物に0.2 mlの10% (w/v) Red Star Ethanol Red 酵母(DI水で約45分間予備水和させた)を植菌した。フラスコを撹拌棒により320 rpmで撹拌しながら32℃でインキュベートし、48時間発酵させた。生成したエタノールの量をHPLCで測定した。pH 4.3及びpH 5.8において、切断AmyE(SEQ ID NO: 2)の性能をSPEZYMETM Xtraアミラーゼ(SEQ ID NO: 4)と比較した。切断AmyE及びSPEZYMETM Xtraアミラーゼの添加量は0.2 mg/gDSであった。
【０３３３】
図11に示すように、pH 5.8において切断AmyEから生成されたエタノールは12.0% (v/v)であった。pH 4.3では、切断AmyEから生成されたエタノールは7.3% (v/v)であった。SPEZYMETM Xtraアミラーゼから生成されたエタノールは、pH 4.3のときは2.7% (v/v)で、pH 5.8のときは3.9% (v/v)であった。
【０３３４】
＜実施例12＞
＜AmyEと他のα-アミラーゼとの、エタノール生成の比較＞
この実施例では、pH 4.3及びpH 5.8において、実施例11に記載した全粒コーン粉のエタノール発酵アッセイを用いて、全長AmyE(SEQ ID NO: 1)及び切断AmyE(SEQ ID NO: 2)が不溶性粒状デンプン(非加熱)を加水分解してエタノールを生成する能力を比較する実験を行った。 
【０３３５】
このアッセイを用いて、全長及び切断AmyEのエタノール生成能力を、A. カワチイ(kawachii）アルファアミラーゼ(AkAA, GC626)を1.5 SSU/g添加した場合(酵素活性-SSU溶解性澱粉単位の1単位は、pH 4.5で50℃の溶解性ポテト澱粉基質(4%ds)を加水分解して1分間に1mgのグルコースを放出させる還元力に等しい)、及び STARGENTM 002(トリコデルマ・リーゼイ中に発現されたアスペルギルス・カワチイアルファアミラーゼ、及びトリコデルマ・リーゼイ由来のグルコアミラーゼであり、相乗的に粒状澱粉基質をグルコースに加水分解する)を0.5GAU/g添加した場合と比較した。ここで、グルコアミラーゼ単位(GAU)はpH4.2及び60℃の溶解性澱粉基質 (4% ds)から還元糖をグルコースに換算して1時間当り1μM産出させる酵素の量と定義される。SSU及びGAUはU.S. Pat. No. 7,037,704に詳しく記載されている。全長AmyE及び切断AmyEの添加量はいずれも0.2 mg/gDSであった。 
【０３３６】
図12に、これらの酵素の性能をpH4.3及び5.8で比較したときの結果を最終エタノール生成量で表示して示す。pH5.8で試験したとき、全長及び切断AmyEはいずれもSTARGENTM 002と同等の性能を示し、pH 4.3では、全長AmyEはSTARGENTM 002より優れたエタノール生成量を示すことが認められた。切断AmyEはpH 5.8において、同一pHにおけるSTARGENTM 002と同等の性能を示した。これに対し、A.カワチイアルファアミラーゼは、pH4.3及び5.8のいずれにおいても劣っていた。
【０３３７】
＜実施例13＞
＜バシラス・スブチリスアルファアミラーゼによるグルコース生成＞
この実施例では、実施例2に示したグルコース生成アッセイを用いて、pH4.5及び5.6におけるバシラス・スブチリスのマルトースをグルコースに転換する能力を測定する実験を行った。反応液を2, 5,及び8日経過後に分析した。
【０３３８】
図13に示すように、全長B.スブチリスAmyE (SEQ ID NO: 1)、切断AmyE (SEQ ID NO: 2)、及びα-アミラーゼAmyE31A変異体 (SEQ ID NO: 3)はいずれも効果的にマルトースをグルコースに転換したが、同一条件下では切断ゲオバシラス・ステアロサーモフィリスα-アミラーゼ、AmyS(SEQ ID NO: 4)は少量のグルコースしか生成しなかった。
【０３３９】
＜実施例14＞
＜生澱粉に対するAmyEの作用＞
この実施例では、全長AmyE (SEQ ID NO: 1)が不溶性澱粉(非加熱)を加水分解する能力を測定する実験を行った。不溶性澱粉から生成したサッカライドの検出に用いたHPLC測定方法は次の通りである。
【０３４０】
精製したAmyE(24.5 g/L)を、pH 5.6のマレイン酸緩衝液を用いて最終濃度が20.4 ppmになるように希釈した。このタンパク質を、コーン粉を5%含むpH 5.6のマレイン酸緩衝液中に、最終濃度が1ppmになるように添加した。この混合物を、シェーカを用いて32℃でインキュベートした。定期的にサンプルを抜き出し、50mM NaOHで希釈して反応を停止させた。次に、サンプル10μLを、電気化学的検出器を備えたHPLC システム(Agilent 1000)に注入した。NaOH及び酢酸ナトリウムのグラディエントとPA1カラムを用い、25℃で測定した。予め測定しておいた標準サンプルに基づいて分布を測定した。 
【０３４１】
測定結果：1 ppmの全長AmyE酵素と生澱粉とをインキュベートすることにより、時間の経過に従って様々なオリゴ糖(DP2,3,4,5,6,7)と、グルコース(DP1)が放出された。HPLCにより、これらの分解生成物の発生量を消化時間毎に定量した。図14に、0,30,及び90分経過後のサンプルのデータを示す。切断AmyE酵素についても、同様の結果が得られた(データは示していない）。
【０３４２】
＜実施例15＞
＜全長AmyEの位置変異体ライブラリ＞
全長AmyE(SEQ ID NO: 1)の295の部位について、Geneart (Geneart GmbH, Josef-Engert-strasse 11, D-93053 Regensburg, Germany)によって位置変異体ライブラリが構築された。Table 3に位置変異体ライブラリの構築に使用した残基の一覧を示す。各残基の位置番号は、SEQ ID NO: 1の位置に基づいて付与した。
【表４】
0005933619.tif 000034
0005933619.tif 000035
0005933619.tif 000036
【０３４３】
全長AmyE及びAmyE-trの両者について、位置27, 30, 45, 52, 75, 88, 89, 126, 131, 167, 184, 223, 238, 241, 260, 307, 312, 344, 380及び402の20種の位置変異体ライブラリを構築した。実施例8に記載した方法により、全長AmyE置換ライブラリを含有するB. スブチリス形質転換体を培養した。培養液の上清を分析に用いた。
【０３４４】
＜実施例16＞
＜AmyE変異体の性能＞
実施例8及び9に記載した方法により、全長AmyE及び切断AmyEの性能及び活性を、構築した全長AmyE及び切断AmyEの変異体と比較した。Table 4に全長AmyE変異体の部位評価スクリーニング結果を示し、Table 5に切断AmyEの部位評価スクリーニング結果を示す。第1列に野生型酵素のアミノ酸を示す。第2列に、この実施例で評価した位置における変異体を示す。これ以降の列には、評価した性質毎の各変異体の性能指数の値を示す。評価した性質は次の通りである：ブラッドフォードアッセイによるタンパク質の同定(発現)、粘度低下速度(ピーク粘度)、液化後の粘度低下(最終粘度)、重合度(ヨウ素）、生成還元末端(還元末端)、全グルコース量(グルコース)、pH 5.8におけるマルトヘプタオースの加水分解(DP7 pH 5.8)、pH 5.8におけるマルトヘプタオースの加水分解(DP7 pH 5.8、加熱)による熱安定性(60℃において30分)、pH 4でのマルトヘプタオース加水分解(DP7 pH 4)、pH 5.8でのマルトトリオース加水分解(DP3 HS)を用いた熱安定性(60℃において30分)、コーン粉基質に対する30分間の比活性度(コーン粉30分)、pH8での米澱粉汚染小試験見本アッセイ(Cleaning pH 8)、及びpH10での米澱粉汚染小試験見本アッセイ(Cleaning pH10)。性能指数(Pi)は、変異体性能の親タンパク質の性能に対する比と定義される。
【表５】
0005933619.tif 000037
0005933619.tif 000038
0005933619.tif 000039
0005933619.tif 000040
0005933619.tif 000041
0005933619.tif 000042
0005933619.tif 000043
0005933619.tif 000044
0005933619.tif 000045
0005933619.tif 000046
0005933619.tif 000047
0005933619.tif 000048
0005933619.tif 000049
0005933619.tif 000050
0005933619.tif 000051
0005933619.tif 000052
0005933619.tif 000053
0005933619.tif 000054
0005933619.tif 000055
0005933619.tif 000056
0005933619.tif 000057
0005933619.tif 000058
0005933619.tif 000059
0005933619.tif 000060
0005933619.tif 000061
0005933619.tif 000062
0005933619.tif 000063
0005933619.tif 000064
0005933619.tif 000065
0005933619.tif 000066
0005933619.tif 000067
0005933619.tif 000068
0005933619.tif 000069
0005933619.tif 000070
0005933619.tif 000071
0005933619.tif 000072
0005933619.tif 000073
0005933619.tif 000074
0005933619.tif 000075
0005933619.tif 000076
0005933619.tif 000077
0005933619.tif 000078
0005933619.tif 000079
0005933619.tif 000080
0005933619.tif 000081
0005933619.tif 000082
0005933619.tif 000083
0005933619.tif 000084
0005933619.tif 000085
0005933619.tif 000086
0005933619.tif 000087
0005933619.tif 000088
0005933619.tif 000089
0005933619.tif 000090
0005933619.tif 000091
0005933619.tif 000092
0005933619.tif 000093
0005933619.tif 000094
0005933619.tif 000095
0005933619.tif 000096
0005933619.tif 000097
0005933619.tif 000098
0005933619.tif 000099
0005933619.tif 000100
0005933619.tif 000101
0005933619.tif 000102
0005933619.tif 000103
0005933619.tif 000104
0005933619.tif 000105
0005933619.tif 000106
0005933619.tif 000107
0005933619.tif 000108
0005933619.tif 000109
0005933619.tif 000110
0005933619.tif 000111
0005933619.tif 000112
0005933619.tif 000113
0005933619.tif 000114
0005933619.tif 000115
0005933619.tif 000116
0005933619.tif 000117
0005933619.tif 000118
0005933619.tif 000119
0005933619.tif 000120
0005933619.tif 000121
0005933619.tif 000122
0005933619.tif 000123
0005933619.tif 000124
0005933619.tif 000125
0005933619.tif 000126
0005933619.tif 000127
0005933619.tif 000128
0005933619.tif 000129
0005933619.tif 000130
0005933619.tif 000131
0005933619.tif 000132
0005933619.tif 000133
0005933619.tif 000134
0005933619.tif 000135
0005933619.tif 000136
0005933619.tif 000137
0005933619.tif 000138
0005933619.tif 000139
0005933619.tif 000140
0005933619.tif 000141
0005933619.tif 000142
0005933619.tif 000143
0005933619.tif 000144
0005933619.tif 000145
0005933619.tif 000146
0005933619.tif 000147
0005933619.tif 000148
0005933619.tif 000149
0005933619.tif 000150
0005933619.tif 000151
0005933619.tif 000152
0005933619.tif 000153
0005933619.tif 000154
0005933619.tif 000155
0005933619.tif 000156
0005933619.tif 000157
0005933619.tif 000158
0005933619.tif 000159
0005933619.tif 000160
0005933619.tif 000161
0005933619.tif 000162
0005933619.tif 000163
0005933619.tif 000164
0005933619.tif 000165
0005933619.tif 000166
0005933619.tif 000167
0005933619.tif 000168
0005933619.tif 000169
0005933619.tif 000170
0005933619.tif 000171
0005933619.tif 000172
0005933619.tif 000173
0005933619.tif 000174
0005933619.tif 000175
0005933619.tif 000176
0005933619.tif 000177
0005933619.tif 000178
0005933619.tif 000179
0005933619.tif 000180
【表６】
0005933619.tif 000181
0005933619.tif 000182
0005933619.tif 000183
0005933619.tif 000184
0005933619.tif 000185
0005933619.tif 000186
0005933619.tif 000187
0005933619.tif 000188
0005933619.tif 000189
0005933619.tif 000190
0005933619.tif 000191
0005933619.tif 000192
0005933619.tif 000193
0005933619.tif 000194
0005933619.tif 000195
0005933619.tif 000196
0005933619.tif 000197
0005933619.tif 000198
0005933619.tif 000199
0005933619.tif 000200
0005933619.tif 000201
0005933619.tif 000202
0005933619.tif 000203
0005933619.tif 000204
0005933619.tif 000205
0005933619.tif 000206
0005933619.tif 000207
0005933619.tif 000208
0005933619.tif 000209
0005933619.tif 000210
0005933619.tif 000211
0005933619.tif 000212
0005933619.tif 000213
0005933619.tif 000214
0005933619.tif 000215
0005933619.tif 000216
0005933619.tif 000217
0005933619.tif 000218
0005933619.tif 000219
0005933619.tif 000220
0005933619.tif 000221
0005933619.tif 000222
0005933619.tif 000223
0005933619.tif 000224
0005933619.tif 000225
0005933619.tif 000226
0005933619.tif 000227
0005933619.tif 000228
0005933619.tif 000229
0005933619.tif 000230
0005933619.tif 000231
0005933619.tif 000232
0005933619.tif 000233
0005933619.tif 000234
0005933619.tif 000235
0005933619.tif 000236
0005933619.tif 000237
0005933619.tif 000238
0005933619.tif 000239
0005933619.tif 000240
0005933619.tif 000241
0005933619.tif 000242
0005933619.tif 000243
0005933619.tif 000244
0005933619.tif 000245
0005933619.tif 000246
0005933619.tif 000247
0005933619.tif 000248
0005933619.tif 000249
0005933619.tif 000250
0005933619.tif 000251
0005933619.tif 000252
0005933619.tif 000253
0005933619.tif 000254
0005933619.tif 000255
0005933619.tif 000256
【０３４５】
Table 2, 4, 及び5に記載したAmyE変異体の性質の相対的性能データに基づき、全長AmyE及び切断AmyE位置を以下のように分類した：
完全拘束位置: 試験した性質の中立突然変異無し
不完全拘束位置: 試験した1の性質について少なくとも1の中立突然変異有り 
非拘束位置: 少なくとも1の性質について≧ 20% の中立突然変異有り
【０３４６】
Table 6に、切断AmyE変異体中の不完全拘束位置、及び各位置に対応する位置にある野生型アミノ酸残基種と、各性質についての%中立突然変異を示す。一覧表に示した全ての位置は、試験した性質に関して望ましい態様で性能が改変されるようにして突然変異誘発されている。Table 7に全長AmyE変異体の不完全拘束位置、及び各位置に対応する位置にある野生型アミノ酸残基種と、各性質についての%中立突然変異を示す。前記と同様、一覧表に示した全ての位置は、試験した性質に関して望ましい態様で性能が改変されるようにして突然変異誘発されている。
【表７】
0005933619.tif 000257
0005933619.tif 000258
0005933619.tif 000259
0005933619.tif 000260
0005933619.tif 000261
【表８】
0005933619.tif 000262
0005933619.tif 000263
0005933619.tif 000264
0005933619.tif 000265
0005933619.tif 000266
0005933619.tif 000267
0005933619.tif 000268
0005933619.tif 000269
0005933619.tif 000270
【０３４７】
以上の説明から明らかなように、いずれかの性質を損なうことなく1以上の性質を変更するために、AmyEポリペプチドの特定の位置に突然変異誘発することができる。これらの突然変異誘発は、表面特性についてのコンビナブル・ミューテーション(combinable mutation)と総称されている。このような位置は一般に操作しやすいので、単一突然変異体、及び組み合わせ突然変異体創生するための良い候補である。一方、これらの位置に突然変異誘発すると、得られたAmyE変異体に異なる性質が付与されていることから、これらの位置は酵素の構造および／または機能にとって重要であることが示される。AmyE以外のα-アミラーゼ等の親アミラーゼにおいて対応する位置に、同様にして突然変異誘発することができる。別の親アミラーゼにおいて対応する位置に異なるアミノ酸残基がある場合、このアミラーゼを野生型AmyEポリペプチド中に有るアミノ酸残基を導入して突然変異誘発することができる。このような位置は次の通りである：052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, and 416V。これらの突然変異誘発における全ての突然変異体は、タンパク質と活性の双方についてPI値が>0.5であることから、これらの位置はタンパク質の発現または性能を損なうことなく突然変異誘発されることが示される。
【０３４８】
＜実施例１７＞
＜粘度計中での液化＞
α-アミラーゼの作用によるコーン粉の粘度低下を、HAAKE Viscotester 550装置を用いて測定した。硫酸を用いてpHを5.8に調整した。スラリー(乾燥固形成分15 g)50gを秤量し、撹拌しながら10分間予備インキュベートして温度を70℃まで上げた。α-アミラーゼを添加し、75 rpmで撹拌しながら温度を直ちに70℃から85℃まで上げた。スラリーと酵素の混合物の温度が85℃に達した後、温度を一定に保ちながら粘度を30分間測定した。粘度は継続的に測定した。粘度の単位はμNmで表示する。
【０３４９】
野生型AmyE(全長または切断)、及びこれらのいくつかの変異体約0.25から1.5 mgをコーン粉スラリー50 gに添加して、粘度を測定した。 
【０３５０】
図15に、スラリー粘度の典型的な経時変化を示す。図15は全長AmyEと、全長AmyE変異体I100F及びW60Mとの比較を示す図である。これ以外については、スラリーのピーク粘度及び最終粘度のみを表に示した。Tables 8及び9に、野生型、全長AmyE、及び全長AmyEに基づくL142F, L142G, L142Q, L142S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L, 及びS254I変異体の測定結果を示す。Table 10に野生型、切断AmyE、及び切断AmyEに基づくW60L, W60M, W60N, I100F, I100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V, 及びT279A変異体の粘度測定結果を示す。
【表９】
0005933619.tif 000271
【表１０】
0005933619.tif 000272
【表１１】
0005933619.tif 000273
【０３５１】
粘度計アッセイでの性能の改善は、様々な基準、すなわち、ピーク粘度の低下、最終粘度の低下、または同一のピークまたは最終粘度にするために要求される参照(コントロール)酵素の添加量よりも、要求される酵素添加量が少ないことによって識別することができる。Table 8-10中に太字で示した文字は、各変異体とそれぞれの野生型コントロールとの比較において、性能の改善を識別する際の基準である。
【０３５２】
＜実施例18＞
＜示差走査熱量測定による全長AmyE、AmyE-tr、及びAmyE変異体の熱安定性＞
超高感度走査型高速微少熱量計VP-Cap DSC (MicroCal, Inc., Northampton, MA, USA)を用いて、過剰熱容量曲線を測定した。DSC測定の標準的方法と、この測定法の原理は公知である(Freire, E. (1995) Differential Scanning Calorimetry Methods. Mol. Biol. 41:191-218)。0.5 mg/mlのAmyE-trまたは切断AmyE変異体500μLを30-120℃の温度範囲で走査した。同一のサンプルを再走査して、可逆性をチェックした。使用した緩衝液は、pH 4.0またはpH 5.8の10mM酢酸ナトリウムであった。凝集に起因するアーチファクトを最小限にするために、走査速度を200℃/hrとした。DSC曲線の熱中点(Tm)を、熱安定性の指標として用いた。Table 11に、pH 4.0 及びpH 5.8で測定した切断野生型AmyE、及び切断AmyE変異体のTm値を示す。 
【表１２】
0005933619.tif 000274
【０３５３】
＜実施例19＞
＜パンの劣化＞
以下の実施例は、AmyEポリペプチドを使用してパンの劣化を低減させる方法に関する。
【０３５４】
＜A. ベーキング試験用のレシピ＞
標準的な精白パン生地及びUSトースト用パン生地のレシピにより、ベーキング試験を行った。General Mills社の"Gold Medal"小麦粉1400g、水800g、菜種油40g、 7,5 g GRINDSTEDTM SSL P55 Veg、10 gの乳化剤DIMODANTM PH200、及び圧搾酵母60 gを用いて、パン生地を調製した。このパン生地をHobartスパイラルミキサーにより低速で1分間混合し、次にスピード目盛2で3分間混合した。次に、このパン生地を25℃、85% RHで3時間発酵させた。
【０３５５】
その後、パン生地に“Gold Medal” 小麦粉600 g 、圧搾酵素18 g、プロピオン酸カルシウム5g、砂糖160g、プロピオン酸カルシウム5g、水、アスコルビン酸(最終濃度60ppm )及びADA (アゾジカルボン酸アミド；最終濃度40 ppm)432 gを添加した。得られたパン生地をDiosnaミキサーにより低速で1分間混合し、次に高速で2分間混合した。次に、パン生地に食塩30gを添加した。
【０３５６】
パン生地を室温で5分間静置した後、パン生地550 gを秤量し、1:4, 2:4, 3:15, 4:12 及び両面幅8に設定したGlimekシーターにより成形し、ベーキング型に入れた。パン生地を43℃、95% RHで65分間プルーフィングした後、MIWEオーブンを用いて200℃で26分間ベーキングした。
【０３５７】
＜B. 硬さ、弾力性、粘り評価方法＞
Stable Micro Systems社, (UK)のTexture Analyserを用いたTexture Profile Analysisにより、スライスしたパンの硬さ、弾力性、及び粘りを評価した。硬さ及び弾力性は、Stable Micro System社, (UK)の装置に予め設定されていた標準法に従って計算した。使用したプローブは、50mmの球状のアルミニウム製のものであった。
【０３５８】
パンを厚さ12.5mmでスライスした。スライスしたパンから直径45mmの円形試験片を複数打ち抜き、個別に測定した。
【０３５９】
以下の設定で評価を行った：プレテストスピード: 2 mm/s、テストスピード:2 mm/s、ポストテストスピード: 10 mm/s、ラプチャーテストディスタンス: 1%、ディスタンス:40%、力：0.098 N、時間：5.00秒、カウント：5、ロードセル：5kg、トリガータイプ： Auto - 0.01 N。
【０３６０】
圧縮方法は、AACC 74-09標準法で用いられる方法を修正したものである。試験ではサンプルを2回圧縮した。
【０３６１】
＜C. 硬さの評価方法＞
硬さは、最初に圧縮しているときの40％圧縮時において評価した。この値は、最初の厚みを40％まで圧縮するために必要な力である。この値が小さい程、柔らかいパンである。硬さは、例えばhPaのように圧力で表される。
【０３６２】
＜D. AmyE変異体ポリペプチドで処理された食品のハンドリング特性の改善＞
AmyEtrを0.4 mg/kg添加したパンをベーキングした後、異なる経過時間後に上記の方法に従って硬さを測定した。パンの硬さを測定した。コントロールとして、酵素無添加のパンの硬さも測定した。
【０３６３】
図16に、ベーキング試験結果を示す。この図は、AmyE trで処理したパンの硬さと、酵素無添加のパンの硬さを比較した図である。AmyE trを用いてベーキングしたパンの1日目から14日目までの硬さの増加が低下していることから、この酵素は劣化防止効果を有し、パンがより新鮮に保たれることが分かる。
【図１】
0005933619.tif 000275
【図２】
0005933619.tif 000276
【図３】
0005933619.tif 000277
【図４Ａ】
0005933619.tif 000278
【図４Ｂ】
0005933619.tif 000279
【図４Ｃ】
0005933619.tif 000280
【図４Ｄ】
0005933619.tif 000281
【図５Ａ】
0005933619.tif 000282
【図５Ｂ】
0005933619.tif 000283
【図５Ｃ】
0005933619.tif 000284
【図６】
0005933619.tif 000285
【図７】
0005933619.tif 000286
【図８】
0005933619.tif 000287
【図９】
0005933619.tif 000288
【図１０】
0005933619.tif 000289
【図１１】
0005933619.tif 000290
【図１２】
0005933619.tif 000291
【図１３】
0005933619.tif 000292
【図１４】
0005933619.tif 000293
【図１５】
0005933619.tif 000294
【図１６】
0005933619.tif 000295
【配列表】
0005933619000001.app