(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失しており、
前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入された非ヒト動物であり、
前記非ヒト動物がマウスであり、前記マウスの遺伝的背景が、Ｃ３Ｈ、Ｃ３Ｈコンジェニック系統、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種、及びＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種に由来する交雑型近交系からなる群から選ばれ、多動性の行動障害の症状を示すことを特徴とする多動性障害モデル動物。
【請求項２】
前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の対立遺伝子の両方が破壊されてなる請求項１に記載の多動性障害モデル動物。
【請求項３】
更に、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している非ヒト動物である請求項１又は２に記載の多動性障害モデル動物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の多動性障害モデル動物に被験物質を投与することを特徴とする、多動性障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記被験物質が投与されたときと投与されていないときとを比較して、前記被験物質が投与されたときの前記非ヒト哺乳動物における多動性障害の発症、促進、予防、抑制又は治癒を指標にして、前記被験物質を多動性障害の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択する請求項４に記載の多動性障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失しており、
前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されたマウスであり、
前記マウスの遺伝的背景が、Ｃ３Ｈ、Ｃ３Ｈコンジェニック系統、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種、及びＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈ の雑種に由来する交雑型近交系からなる群から選ばれ、多動性の行動障害の症状を示す前記マウスを、多動性モデル動物として使用する方法。
【請求項７】
前記マウスにおいて、前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の対立遺伝子の両方が破壊されている請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マウスにおいて、更に、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している請求項６又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）等の行動障害モデルとなるモデル動物およびこのモデル動物を利用する行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）は、児童にもっとも多く見られる精神神経疾患であり、児童の約５％が発症すると言われている。ＡＤＨＤの主な症状は注意欠陥、衝動性そして多動性であり、それらの症状が共存した状態で現れることもある。
また、ＡＤＨＤと診断された児童の３０〜５０％は、成人になっても症状が持続することが知られ、成人期のＡＤＨＤは成人期ＡＤＨＤ（Ａｄｕｌｔ ＡＤＨＤ）と呼ばれている。Ａｄｕｌｔ ＡＤＨＤの症状としては、注意欠陥の他に気分障害、不安感亢進などの合併症が報告されており、これらの症状が社会生活を困難にすることがある。
ＡＤＨＤ患者に使用される薬としてアトモキセチンやメチルフェニデートが知られているが、特に後者は依存性などの副作用が懸念されており、ＡＤＨＤの症状の改善に有効な治療法や、更なる薬の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Gizer, I.R., Ficks, C. & Waldman, I.D. 2009. Candidate gene studies of ADHD: a meta-analytic review. Hum Genet. 126, 51-90.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＡＤＨＤの原因は不明だが、遺伝的要因があることが知られている（非特許文献１）。したがって、遺伝的要因に沿ったＡＤＨＤの発症機構の解明や、有効な薬物の探索を行う必要がある。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ＡＤＨＤ等の行動障害モデルとなるモデル動物の提供、及びこのモデル動物を利用する行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がトランスジェニックベクターの挿入により破壊されたＳｐｏｃｋ３のノックアウトマウスが、多動性の症状を示すことを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００６】
（１）Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失しており、
前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入された非ヒト動物であり、
前記非ヒト動物がマウスであり、前記マウスの遺伝的背景が、Ｃ３Ｈ、Ｃ３Ｈコンジェニック系統、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種、及びＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種に由来する交雑型近交系からなる群から選ばれ、多動性の行動障害の症状を示すことを特徴とする多動性障害モデル動物。
（２）前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の対立遺伝子の両方が破壊されてなる前記（１）に記載の多動性障害モデル動物。
（３）更に、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している非ヒト動物である前記（１）又は（２）に記載の多動性障害モデル動物。
（４）前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の多動性障害モデル動物に被験物質を投与することを特徴とする、多動性障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
（５）前記被験物質が投与されたときと投与されていないときとを比較して、前記被験物質が投与されたときの前記非ヒト哺乳動物における多動性障害の発症、促進、予防、抑制又は治癒を指標にして、前記被験物質を多動性障害の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択する前記（４）に記載の多動性障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
（６）Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失しており、
前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されたマウスであり、
前記マウスの遺伝的背景が、Ｃ３Ｈ、Ｃ３Ｈコンジェニック系統、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種、及びＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈの雑種に由来する交雑型近交系からなる群から選ばれ、多動性の行動障害の症状を示す前記マウスを、多動性モデル動物として使用する方法。
（７）前記マウスにおいて、前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の対立遺伝子の両方が破壊されている前記（６）に記載の方法。
（８）前記マウスにおいて、更に、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している前記（６）又は（７）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＡＤＨＤ等の行動障害モデルとなるモデル動物を提供することができる。またこのモデル動物を利用する行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例における、マウスゲノム上のトランスジーンの挿入部分と、それに伴う欠失部分を模式的に示す図である。
【図２】実施例において、本発明に係る行動障害モデルマウスに対する観察時間内でのジャンピングの頻度の計測結果を示すグラフである。
【図３】実施例において、本発明に係る行動障害モデルマウスに対する観察時間内でのジャンピングの頻度の計測結果を示すグラフである。
【図４】実施例において、野生型マウスに対する観察時間内でのジャンピングの頻度の計測結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
≪モデル動物≫
本発明の行動障害モデル動物は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している非ヒト哺乳動物である。
【００１０】
ＳＰＯＣＫ３の属するＳｐｏｃｋ／Ｔｅｓｔｉｃａｎファミリー蛋白質は、コンドロイチン硫酸やヘパラン硫酸などのグリコサミノグリカンを有するプロテオグリカンであり、神経系組織において細胞外マトリックス分子として存在している。
マウスゲノム上では、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の他に、Ｓｐｏｃｋ１及びＳｐｏｃｋ２遺伝子が存在している。Ｓｐｏｃｋ１、Ｓｐｏｃｋ２及びＳｐｏｃｋ３は、マルチドメインから構成される蛋白質であり、プロテアーゼの阻害因子として細胞外基質の統合や再構築の制御に関与することが示唆されている。マウス（Mus musculus）のＳＰＯＣＫ３タンパク質のアミノ酸配列が開示されている（Gene ID: 72902、 RefSeq accession number: XP_006509579, XP_006509580, NP_076178, NP_001239549, XP_006509581, NP_001239550）。マウスのＳｐｏｃｋ３遺伝子の塩基配列が開示されている（NM_023689, XM_006509518, XM_006509516, XM_006509517, NM_001252620, NM_001252621）。なお、本明細書において、Gene IDとは、Geneデータベース（URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）の登録番号を表わす。
【００１１】
Ｓｐｏｃｋ３遺伝子としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列、或いは、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【００１２】
ここで、欠失、置換、又は付加されていてもよいアミノ酸の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個が特に好ましく、１〜２個が最も好ましい。
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（参照URL：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）により求めることができる。
【００１３】
本発明のモデル動物となる任意の非ヒト哺乳動物が有するＳｐｏｃｋ３遺伝子が公知である場合は、その情報に基づき本発明のモデル動物となる非ヒト哺乳動物のＳｐｏｃｋ３の配列を選択することができる。例えばラットのＳｐｏｃｋ３遺伝子ホモログの配列は公知である（RefSeq accession number: XM_008771117.1, NM_001107310.1, XP_008769339.1, NP_001100780.1）。本発明のモデル動物となる任意の非ヒト哺乳動物が有するＳｐｏｃｋ３遺伝子が公知ない場合であっても、当業者であれば、対象の非ヒト哺乳動物のＳｐｏｃｋ３の配列を選択することができる。
【００１４】
ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が喪失しているとは、ＳＰＯＣＫ３タンパク質が本来有する機能が完全に失われている状態のことをいう。ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制されているとは、ＳＰＯＣＫ３タンパク質が本来有する機能が部分的に失われている状態のことをいう。ＳＰＯＣＫ３タンパク質が本来有する機能が部分的に失われている場合には、ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能の抑制の程度は、モデル動物と、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物とを比較して、モデル動物に行動障害と認められる状態（コントロールとの差異）が表れる程度であればよい。
【００１５】
行動障害と認められる状態の指標としては、注意欠陥、衝動性、多動性が挙げられ、なかでも多動性を行動障害と認められる状態の指標とすることが好ましい。モデル動物となる動物が多動性を有するかについては、例えば、同一条件下で動物を飼育して行動を観察して調べることができる。多動性の指標としては、例えば、モデル動物となる動物が一定期間内にジャンピングした（飛び跳ねた）回数、一定期間内にジャンピングを継続した平均時間、若しくは一定期間内にジャンピングに費やした合計時間、又は、一定期間内に飼育ケージ内を移動した回数、一定期間内に飼育ケージ内の移動を継続した平均時間、若しくは一定期間内に飼育ケージ内の移動に費やした合計時間、或いはそれらの組み合わせが挙げられ、一定期間内にジャンピングに費やした合計時間が好ましい。また、多動性は概日リズムに連動しており、夜間に著しく、昼間は減衰する傾向があるため、夜間における行動観察の結果に基づいて多動性を評価することが好ましい。ただし、多動性を強く誘導あるいは強く促進する物質をスクリーニングする場合には、多動性の低下した昼間における行動観察の結果に基づいて多動性を評価してもよい。飼育ケージを叩くなど、外界刺激に代表される誘発因子を与るなど、任意の条件を付加して行動評価を行ってもよい。
【００１６】
ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能の抑制又は喪失は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失することによっても生じ得る。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現能が喪失しているとは、モデル動物となる動物において、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子産物が喪失していることをいう。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現能が抑制しているとは、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子産物の量が抑制されていることをいう。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子産物の量が抑制されている場合には、抑制の程度は、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、上記に示すようなジャンピング等の行動異常が表れる程度であればよい。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現の抑制は、Ｓｐｏｃｋ３伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列をモデル動物に導入し、遺伝子ノックダウンにより生じさせることができる。
【００１７】
本発明のモデル動物は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されてなることが好ましい。
導入される変異は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させる、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能を抑制若しくは喪失させるものであればよい。
【００１８】
上記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子とは、ＳＰＯＣＫ３タンパク質をコードする領域であるエクソンのほか、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させる、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能を抑制若しくは喪失させることができる場合にはイントロンも含まれる。
Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域とは、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現を調節する領域であって、例えば、プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、応答配列である。
【００１９】
ＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能の喪失は、例えばＳｐｏｃｋ３遺伝子に変異を導入し、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現能の抑制又は喪失は、例えば、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異を導入するすることにより生じさせることができる。
Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異を導入する方法は、公知の遺伝子工学的手法である遺伝子改変により行うことができる。変異は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の一部が欠失している場合、欠失は１つ以上のエクソンの欠失であることが好ましい。これらの変異を導入することは、例えば、変異原性物質（Mutagen）による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、Cre-loxP系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。
【００２０】
本発明に係るモデル動物は、行動障害の現れやすさの観点から、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されて、対立遺伝子の両方が破壊されたホモ接合体であることが好ましい。
本発明に係るモデル動物は、より軽微な行動障害を扱えるとの利点からは、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子又はＳｐｏｃｋ３遺伝子の発現調節領域に変異が導入されて、対立遺伝子の片方が破壊されたヘテロ接合体であることが好ましい。
【００２１】
変異により、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現を抑制若しくは喪失したか、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能を抑制若しくは喪失したかどうかは、例えば、本発明に係るモデル動物を、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子における全部の欠失をホモで有するモデル生物と、及び野生型などのコントロールとなる動物と、表現型やＳｐｏｃｋ３の発現量を比較することを、ひとつの指標とすることができる。
【００２２】
後述する実施例において示すように、多動性の症状を示すＳｐｏｃｋ３のノックアウトマウスでは、トランスジェニックベクターの挿入により、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子に加えて更にＡｎｘａ１０遺伝子も破壊されていた。
【００２３】
したがって、本発明の行動障害モデル動物は、Ｓｐｏｃｋ３遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＳＰＯＣＫ３タンパク質の機能が抑制若しくは喪失し、更に、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失している非ヒト哺乳動物であることが好ましい。ただし、Ａｎｘａ１０遺伝子は胃粘膜に発現するため、多動性発症に関与する可能性は低いものと考えられる。
【００２４】
Ａｎｘａ１０はアネキシンファミリーのタンパク質をコードしており、アネキシンファミリーのタンパク質はカルシウムおよびリン脂質に結合することが知られており、細胞増殖の制御や、細胞内のシグナル伝達に関与することが分かっている。また、近年では腫瘍細胞との関係が明らかにされており、胃がん、肝細胞癌、膀胱癌ではAnxa10は発現が顕著に減少し（参考文献：Munksgaard, P.P., Mansilla, F., Brems Eskildsen, A.S., Fristrup, N., Birkenkamp-Demtroder, K., Ulhoi, B.P., Borre, M., Agerbaek, M., Hermann, G.G., Orntoft, T.F. & Dyrskjot, L. 2011. Low ANXA10 expression is associated with disease aggressiveness in bladder cancer. Br J Cancer. 105, 1379-1387. Kim, J.K., Kim, P.J., Jung, K.H., Noh, J.H., Eun, J.W., Bae, H.J., Xie, H.J., Shan, J.M., Ping, W.Y., Park, W.S., Lee, J.Y. & Nam, S.W. 2010. Decreased expression of annexin A10 in gastric cancer and its overexpression in tumor cell growth suppression. Oncol Rep. 24, 607-612.
）、逆に、鋸歯状腺腫（結腸直腸腺腫のサブタイプ）や上部消化器官に関連する腺腫では腫瘍細胞のバイオマーカーになり得ることが報告されている（参考文献：Sajanti, S.A., Vayrynen, J.P., Sirnio, P., Klintrup, K., Makela, J., Tuomisto, A. & Makinen, M.J. 2014. Annexin A10 is a marker for the serrated pathway of colorectal carcinoma. Virchows Arch. Tsai, J.H., Lin, Y.L., Cheng, Y.C., Chen, C.C., Lin, L.I., Tseng, L.H., Cheng, M.L., Liau, J.Y. & Jeng, Y.M. 2014. Aberrant expression of annexin A10 is closely related to gastric phenotype in serrated pathway to colorectal carcinoma. Mod Pathol.）。しかし、Ａｎｘａ１０遺伝子の機能についての詳細は解明されていない。
【００２５】
マウス（Mus musculus）のＡＮＸＡ１０タンパク質のアミノ酸配列が開示されている（Gene ID: 26359、RefSeq accession number： NP_001129561.1, NP_036052.2）。マウスのＡｎｘａ１０遺伝子の塩基配列が開示されている（RefSeq accession number：NM_011922.3, NM_001136089.2）。
【００２６】
Ａｎｘａ１０遺伝子としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列、或いは、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【００２７】
ここで、欠失、置換、又は付加されていてもよいアミノ酸の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個が特に好ましく、１〜２個が最も好ましい。
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（参照URL：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）により求めることができる。
【００２８】
本発明のモデル動物となる任意の非ヒト哺乳動物が有するＡｎｘａ１０遺伝子が公知である場合は、その情報に基づき本発明のモデル動物となる非ヒト哺乳動物のＡｎｘａ１０の配列を選択することができる。例えばラットのＡｎｘａ１０遺伝子ホモログの配列は公知である（RefSeq accession number： XR_596427.1, XM_008771200.1, NM_001109110.1, NP_001102580.1）。本発明のモデル動物となる任意の非ヒト哺乳動物が有するＡｎｘａ１０遺伝子が公知ない場合であっても、当業者であれば、対象の非ヒト哺乳動物のＡｎｘａ１０の配列を選択することができる。
【００２９】
ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が喪失しているとは、ＡＮＸＡ１０タンパク質が本来有する機能が完全に失われている状態のことをいう。ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制されているとは、ＡＮＸＡ１０タンパク質が本来有する機能が部分的に失われている状態のことをいう。ＡＮＸＡ１０タンパク質が本来有する機能が部分的に失われている場合には、ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能の抑制の程度は、モデル動物と、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物とを比較して、モデル動物に行動障害と認められる状態（コントロールとの差異）が表れる程度であればよい。
【００３０】
行動障害と認められる状態の指標としては、注意欠陥、衝動性、多動性が挙げられ、なかでも多動性を行動障害と認められる状態の指標とすることが好ましい。多動性の確認は、上述のＳＰＯＣＫ３タンパク質について説明したものと同様の方法で行うことができる。
【００３１】
ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能の抑制又は喪失は、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失することによっても生じ得る。Ａｎｘａ１０遺伝子の発現能が喪失しているとは、モデル動物となる動物において、Ａｎｘａ１０遺伝子産物が喪失していることをいう。Ａｎｘａ１０遺伝子の発現能が抑制しているとは、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、Ａｎｘａ１０遺伝子産物の量が抑制されていることをいう。Ａｎｘａ１０遺伝子産物の量が抑制されている場合には、抑制の程度は、モデル動物となる動物の野生型の動物等のコントロールとなる動物と比較して、上記に示すようなジャンピング等の行動異常が表れる程度であればよい。Ａｎｘａ１０遺伝子の発現の抑制は、Ａｎｘａ１０伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列をモデル動物に導入し、遺伝子ノックダウンにより生じさせることができる。
【００３２】
Ａｎｘａ１０遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能が抑制若しくは喪失は、Ａｎｘａ１０遺伝子又はＡｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域に変異が導入されたことによるものであることが好ましい。
【００３３】
上記Ａｎｘａ１０遺伝子とは、ＡＮＸＡ１０タンパク質をコードする領域であるエクソンのほか、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させる、又は前記Ａｎｘａ１０遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能を抑制若しくは喪失させることができる場合にはイントロンも含まれる。
Ａｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域とは、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現を調節する領域であって、例えば、プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、応答配列である。
【００３４】
ＡＮＸＡ１０タンパク質の機能の喪失は、例えばＡｎｘａ１０遺伝子に変異を導入し、Ａｎｘａ１０遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。Ａｎｘａ１０遺伝子の発現能の抑制又は喪失は、例えば、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域に変異を導入するすることにより生じさせることができる。
Ａｎｘａ１０遺伝子又はＡｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域に変異を導入する方法は、公知の遺伝子工学的手法である遺伝子改変により行うことができる。変異は、Ａｎｘａ１０遺伝子又はＡｎｘａ１０遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。これらの変異を導入することは、例えば、変異原性物質（Mutagen）による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、Cre-loxP系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。
【００３５】
変異により、Ａｎｘａ１０遺伝子の発現を抑制若しくは喪失したか、又は前記Ｓｐｏｃｋ３遺伝子がコードするＡＮＸＡ１０タンパク質の機能を抑制若しくは喪失したかどうかは、例えば、本発明に係るモデル動物を、Ａｎｘａ１０遺伝子における全部の欠失をホモで有するモデル生物と、及び野生型などのコントロールとなる動物と、表現型やＡｎｘａ１０の発現量を比較することを、ひとつの指標とすることができる。
【００３６】
非ヒト哺乳動物としては、特に制限されないが、げっ歯類に分類される動物であることが好ましい。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコが挙げられる。
非ヒト哺乳動物がマウスである場合、多動性の観点から、後述する実施例に示すように、本発明のモデル動物となる動物はＣ３Ｈ系統のマウス又はＣ３Ｈ系統から作出されたマウスであることが特に好ましい。Ｃ３Ｈ系統の他にも、Ｃ３Ｈ系統の親系統であるＢＡＬＢ/ｃ系統とＤＢＡ系統、そしてＣ３Ｈ系統と同じ親系統から作出されたＣＢＡ系統、さらにオープンフィールド内で高頻度に動き回る行動傾向を示す１２９Ｔ１/ＳｖＪ系統、ＦＶＢ/ＮＪ系統のマウス、又はこれらの系統から作出されたマウスでも多動性行動を示しやすい傾向が予測されるので（参考文献、Crawley, J.N. (2007) What’s wrong withmy mouse? : behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. Chapter 4. Motor Functions. p63-84. John Wiley, Hoboken, N.J.）、これらの系統のマウスも、Ｃ３Ｈ系統のマウスと同様に、本発明のモデル動物となる好ましい動物として例示できる。
上記Ｃ３Ｈ系統、ＢＡＬＢ/ｃ系統、ＤＢＡ系統、ＣＢＡ系統、１２９Ｔ１/ＳｖＪ系統、又はＦＶＢ/ＮＪ系統のマウスから作出されたマウスとしては、上記系統のマウスと別の系統マウスとの雑種マウス、戻し交配等により変異アリルが導入された上記系統のマウスがレシピエントのコンジェニック系統マウス、上記系統のマウスと他の系統を交配させて得られた雑種兄妹同士のハイブリッドレコンビナント近交系マウスを好ましいものとして例示できる。
なかでも、Ｃ３Ｈ系統マウスと別の系統マウスとの雑種マウス、変異アリルをＣ３Ｈ系統に戻し交配により導入したＣ３Ｈコンジェニック系統マウス、Ｃ３Ｈ系統と他の系統を交配させて得られた雑種兄妹どうしのハイブリッドレコンビナント近交系マウス、又はＣ３Ｈ系統と上記の系統を交配させて得られた雑種兄妹どうしのハイブリッドレコンビナント近交系マウスであることがより好ましい。他の系統としては、発生工学的手法を用いてモデル動物を作出する制約上、適切な系統を適宜選択すればよいが、例えば、後述する実施例に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６系統が挙げられ、Ｃ３Ｈ系統マウスとＣ５７ＢＬ／６系統のマウスとの雑種マウス、及び上記系統のマウスとＣ５７ＢＬ／６系統のマウスを交配させて得られた雑種兄妹同士のハイブリッドレコンビナント近交系マウスであることが更に好ましい。
上記コンジェニック系統のマウスとしては、変異アリル導入のための戻し交配を１〜３０世代以上行ったものが好ましく、８〜３０世代繰り返したものがより好ましい。また、上記雑種兄妹どうしのハイブリッドレコンビナント近交系のマウスとしては、兄妹交配を６世代以上くり返したのものが好ましく、８〜３０世代繰り返したものがより好ましい。
【００３７】
本発明に係るモデル動物は、少なくとも多動性の行動障害の症状を示す。そのため多動性を特徴的な症状とする病気のメカニズムの解明や、その治療等に有用な物質の探索、治療方法などの開発に用いることができる。多動性はＡＤＨＤに特徴的な症状であるため、ＡＤＨＤのメカニズムの解明や、その治療等に有用な物質の探索、治療方法などの開発に用いることができる。
【００３８】
≪スクリーニング方法≫
本発明の行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法は、本発明の行動障害モデル動物に被験物質を投与するものである。前記行動障害としては注意欠陥、衝動性、多動性が挙げられ、多動性が好ましい。前記行動障害はＡＤＨＤであることが好ましい。
【００３９】
発明者らは、後述する実施例において示すようにＳｐｏｃｋ３遺伝子及びＡｎｘａ１０遺伝子のノックアウトマウスが、少なくとも多動性の行動障害の症状を示すことを見出した。したがって、本発明のモデル動物は、多動性の行動障害に対する薬物効果などの個体レベルでのスクリーニングに使用することができる。
【００４０】
本発明の行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法は、例えば、本発明のモデル動物に被験物質を接触させ、前記被験物質が投与されたときと投与されていないときとを比較して、前記被験物質が投与されたときの前記非ヒト哺乳動物における行動障害の発症、促進、予防、抑制又は治癒を指標にして、前記被験物質を行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択することを行ってもよい。
【００４１】
被験物質としては、特に制限はなく、例えば、ペプチド、タンパク質、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液等が挙げられる。
【００４２】
多動性は、例えば、同一条件下でモデル動物を飼育して、一定期間内にジャンピングに費やした合計時間を計測することで、評価することができる。飼育条件及びデータ取得方法は、後述する実施例と同様のものとすることができる。
飼育ケージを叩くなど、外界刺激に代表される誘発因子を与えるなど、任意の条件を付加して行動評価を行ってもよい。
【００４３】
評価対象がマウスである場合、評価対象のマウスは、例えば、本発明に係るモデル動物のマウス（モデルマウス）の系統の野生型マウスであって被験物質を接触させていない野生型マウス、被験物質を接触させた野生型マウス、被験物質を接触させていないモデルマウス、被験物質を接触させたモデルマウスとすることができる。これら評価対象のマウスについて多動性を測定し、多動性の程度を比較する。
【００４４】
例えば、被験物質を接触させていないモデルマウスと被験物質を接触させたモデルマウスの多動性の程度を比較して、被験物質を接触させたモデルマウスの多動性が被験物質を接触させていないモデルマウスの多動性よりも抑制されていることが認められた場合、当該被験物質を多動性の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択することができる。
【００４５】
また例えば、被験物質を接触させていないモデルマウスと被験物質を接触させたモデルマウスの多動性の程度を比較して、被験物質を接触させたモデルマウスの多動性が被験物質を接触させていないモデルマウスの多動性よりも促進されていることが認められた場合、当該被験物質を多動性の行動異常を促進させる物質の候補物質として選択することができる。
【００４６】
本発明の行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法により選択された物質は、行動障害の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として利用できる。
【実施例】
【００４７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
＜Ｓｐｏｃｋ３遺伝子欠損マウスの作出＞
以下の文献（Yamamoto, A., Uchiyama, K., Nara, T., Nishimura, N., Hayasaka, M., Hanaoka, K. and Yamamoto, T. (2014). Structural abnormalities of corpus callosum and cortical axonal tracts accompanied by decreased anxiety-like behavior and lowered sociability in Spock3-mutant mice. Dev Neurosci. 及びUchiyama, K., Watanabe, D., Hayasaka, M. and Hanaoka, K. (2014). A novel imprinted transgene located near a repetitive element that exhibits allelic imbalance in DNA methylation during early development. Dev Growth Differ.）に記載の方法により、Ｃ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈのハイブリッドの受精卵にトランスジーンを導入し、複数のトランスジェニックマウスを得た。この中からトランスジーンを発現するものを選抜したところ1個体だけであった。この個体をＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈのハイブリッドと交配し、これにより得られたトランスジーンヘテロ接合型兄妹どうしを交配して、トランスジーンホモ接合型の個体を得た。さらに、ホモ接合型個体どうしを少なくとも１０世代以上兄妹交配してC57BL/6 × C3H のハイブリッドレコンビナント系統を作出した。このハイブリッドレコンビナント系統のゲノムにおいて、トランスジーンが組み込まれた領域の塩基配列を明らかにしたところ、８番染色体上で隣接しているＳｐｏｃｋ３遺伝子及びＡｎｘａ１０遺伝子が、トランスジーンの組み込みにより同時にノックアウトされた二重ノックアウトホモ接合体であることが判明した。したがって、上記ホモ接合型のマウス及び上記ヘテロ接合型のマウスの遺伝的背景はＣ５７ＢＬ/６ × Ｃ３Ｈ のハイブリッドに由来する交雑型近交系の遺伝的背景である。
【００４９】
図１は、マウスゲノム上のトランスジーンの導入部分と、それに伴う欠失部分を模式的に示す図である。図１に示すように、トランスジーンの導入により、Ａｎｘａ１０のＥｘｏｎ１と制御領域、Ｓｐｏｃｋ３のＥｘｏｎ１〜４及び制御領域が欠失していた。ＳＰＯＣＫ３のアミノ酸配列を配列番号１に示し、Ｓｐｏｃｋ３のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。マウスのＳｐｏｃｋ３にはNM_001252620.1とNM_001252621.1で登録されている２種のアイソフォームがあることが知られており、上記に示す配列番号１は、NM_001252620.1の配列である。ＡＮＸＡ１０のアミノ酸配列を配列番号３に示し、Ａｎｘａ１０のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号４に示す。なお、転写調節領域を含むＳｐｏｃｋ１及びＳｐｏｃｋ２のローカスには、変異は導入されていなかった。
【００５０】
（試験例１）
得られたホモ接合型マウスについて、以下の条件にて行動実験を行った。
・週齢：６週齢
・飼育条件（離乳後〜６週齢）：室温２３度、湿度５０％、明期８：００〜２０：００（上記時間以外は暗期）
・観察条件：夜間（暗期）、室温２３度、湿度５０％、同一のケージに５〜８個体を共存させてビデオ撮影を行った。
・多動性評価方法：３分間の観察中にジャンピングをしていた時間の割合。ここでジャンピングとは、マウスが後肢だけで直立した状態から、後肢を使って床敷を蹴って上方に向かって跳び上がる行動とした。
【００５１】
（試験例２）
得られたヘテロ接合型マウスについて、以下の条件にて行動実験を行った。
・週齢：５週齢
・飼育条件（離乳後〜５週齢）：上記ホモ接合型マウスでの行動実験と同様
・観察条件：上記ホモ接合型マウスでの行動実験と同様
・多動性評価方法：１５分間の観察中にジャンピングをしていた時間の割合。ここでジャンピングとは、マウスが後肢だけで直立した状態から、後肢を使って床敷を蹴って上方に向かって跳び上がる行動とした。
【００５２】
（試験例３）
得られたホモ接合型マウス（上記試験例１とは別個体のマウス）について、週齢を７週齢とした以外は、上記試験例１と同様にして、行動実験を行った。
【００５３】
（試験例４）
得られたヘテロ接合型マウス（上記試験例２とは別個体のマウス）について、週齢を９週齢とした以外は、上記試験例２と同様にして、行動実験を行った。
【００５４】
（比較試験例１）
野生型マウスとして、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスについて行動実験を行った。週齢を１２週齢とした以外は、上記試験例２と同様にして行動実験を行った。
【００５５】
（比較試験例２）
野生型マウスとして、１２９Ｔ１／ＳｖＪ系統のマウスについて行動実験を行った。週齢を１３週齢とした以外は、上記試験例２と同様にして行動実験を行った。
【００５６】
結果を図２〜図４に示す。
図２（ａ）は、試験例１のホモ接合型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。図３（ａ）は、試験例３のホモ接合型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。
ホモ接合型マウスの半数以上が著しい多動性を示すことが単純な目視だけで確認できた。ホモ接合型マウスのうち、多動性を示さない個体においても落ち着きのない性急な様子が観察され、これらの個体では、軽度の誘発因子を与えるだけで多動性を引き起こすことが可能であると推測される。
【００５７】
図２（ｂ）は、試験例２のヘテロ接合型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。図３（ｂ）は、試験例４のヘテロ接合型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。
試験例２のヘテロ接合型マウスにおいて、７個体のうち２個体がジャンピングを行ったことが確認できた。試験例４のヘテロ接合型マウスにおいても、６個体のうち３個体がジャンピングを行ったことが確認できた。ジャンピングは通常野生型では観察されない行動であることから、ヘテロ接合型マウスでも、僅かながら多動性を示すことが確認できた。ただし、それは上記のホモ接合型マウスであるＳｐｏｃｋ３ノックアウトマウスで見られたように、連続してジャンピングするものではなかった。
【００５８】
図４（ａ）は、比較試験例１の野生型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。図４（ｂ）は、比較試験例２の野生型マウスのジャンピング時間の割合を示すグラフである。
図４（ａ）及び図４（ｂ）のグラフに示すように、野生型マウスではジャンピングが観察されなかった。
【００５９】
現在行われているマウス行動実験は、目視による単純な観察だけでは気づくことのできない行動異常を検出できる点で優れたものである。しかしながら、その優れた感度を得るためには、被験マウスを、試験者をも含めた実験環境に馴らすために時間と用意周到な手間のかかる準備が必要である(Crawley, 2007)。したがって様々な構造を持つ化合物群の神経薬理的な効果を大規模スクリーニングするなどの評価実験に組み込むには不向きな解析方法である。
【００６０】
対して、本発明に係る行動障害モデル動物を被験マウスに使用することで、目視だけで薬理効果を評価できる行動実験が可能となった。上記のトランスジェニックマウス系統では、繁殖維持が簡単な上に、ホモ個体の半数以上が著しい多動性を示すことが単純な目視だけで確認できる。
したがって、本発明に係るスクリーニング方法は、一つの化合物につき少数の個体に投与するだけで多動性行動に影響を与えるかどうかを評価可能な、大変に優れた方法である。
【００６１】
また、上記試験例２及び試験例４のヘテロ変異マウスは、野生型と比較して明らかな多動性を示すことが判明した。当該ヘテロ変異マウスは、ホモ変異マウスの個体に比べて脳組織がより野生型に近い状態であると考えられる。ヘテロ変異マウスを使用する本発明に係るスクリーニング方法は、そのような脳に対しても多動性行動に影響を与える物質を検索可能な、非常に有用な方法である。
【００６２】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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