(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合し、該ＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該リガンドがＴＥＣＫであり、該抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）により産生されたｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と競合するものであり、ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは、細胞表面上に発現している配列番号：２からなるポリペプチドに結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
該哺乳類ＧＰＲ−９−６がヒトＧＰＲ−９−６である、請求項１記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
ａ）マウスハイブリドーマ３Ｃ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６５３）により産生されるｍＡｂ  ３Ｃ３、
ｂ）マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）により産生されるｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１、
ｃ）マウスハイブリドーマ１１．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６９）により産生されるｍＡｂ  １１．３．１、
ｄ）マウスハイブリドーマ１６．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６８）により産生されるｍＡｂ  １６．３．１、または
ｅ）  ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）の抗原結合性フラグメント、
をコードする核酸であって、該抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントである、核酸。
【請求項４】
請求項３記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
ａ）生物学的試料と、哺乳類ＧＰＲ−９−６または該レセプターの一部に結合し、該レセプターへのＴＥＣＫの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントとを、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部への該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程；および
ｂ）該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合を検出する工程；
を含む、生物学的試料中の哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部の検出方法であって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、該レセプターまたは該レセプターの一部の存在を示し、該抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）により産生されたｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と競合するものであり、ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは、細胞表面上に発現している配列番号：２からなるポリペプチドに結合する、方法。
【請求項６】
生物学的試料がヒト起源のものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ヒトＴＥＣＫに結合し、レセプターへの該ＴＥＣＫの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該レセプターがＧＰＲ−９−６であり、該抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマ１１．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６９）により産生されたｍＡｂ  １１．３．１またはマウスハイブリドーマ１６．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６８）により産生されたｍＡｂ  １６．３．１と競合するものであり、該抗体は、哺乳類ＧＰＲ−９−６を発現する細胞のＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害し、ヒトＴＥＣＫは、配列番号：９または配列番号：１１からなる配列を有する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
該ｍＡｂ  １１．３．１および該ｍＡｂ  １６．３．１が、配列番号：１１からなるポリペプチドに結合する、請求項７記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
抗体の発現に適した条件下で単離された細胞を維持する工程を含む、抗体を産生する方法であって、該単離された細胞は、
ａ）マウスハイブリドーマ３Ｃ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６５３）により産生されるｍＡｂ  ３Ｃ３、
ｂ）マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）により産生されるｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１、
ｃ）マウスハイブリドーマ１１．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６９）により産生されるｍＡｂ  １１．３．１、
ｄ）マウスハイブリドーマ１６．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６８）により産生されるｍＡｂ  １６．３．１、または
ｅ）  ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）の抗原結合性フラグメント
を産生し、該抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントであり、該単離された細胞が、ハイブリドーマおよび組換え細胞からなる群より選択され、該ハイブリドーマが、マウスハイブリドーマ３Ｃ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６５３）、マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）、マウスハイブリドーマ１１．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６９）またはマウスハイブリドーマ１６．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６８）を他の細胞と融合することによって得られる、方法。
【請求項１０】
該抗体の回収および精製をさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
炎症性疾患を有する被験体を治療するための医薬の製造における請求項１〜２または７〜８いずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントの使用。
【請求項１２】
被験体における白血球のＧＰＲ−９−６媒介性ホーミングを阻害するための医薬の製造における請求項１〜２または７〜８いずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントの使用。
【請求項１３】
該炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項１１記載の使用。
【請求項１４】
該炎症性腸疾患がクローン病または結腸炎である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
該被験体がヒトである、請求項１１〜１４いずれか記載の使用。
【請求項１６】
該抗体または抗原結合性フラグメントが、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または前記いずれかの抗原結合性フラグメントである、請求項１１〜１５いずれか記載の使用。
【請求項１７】
被験体における粘膜組織への白血球のＧＰＲ−９−６媒介性ホーミングを阻害するための医薬の製造における、請求項７または８記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用。
【請求項１８】
ＧＰＲ−９−６を発現する細胞と該ＧＰＲ−９−６に結合するインヒビターとを接触させ、それにより該ＧＰＲ−９−６の機能を阻害する工程を含む、ＧＰＲ−９−６機能のインビトロ阻害方法であって、該インヒビターが、請求項１または２記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントである、インビトロ阻害方法。
【請求項１９】
該インヒビターがＧＰＲ−９−６の機能を阻害しうる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該機能が、ＴＥＣＫ結合、ＴＥＣＫ誘導性化学走性およびＴＥＣＫ誘導性Ｃａ２＋フラックスからなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ａ）哺乳類ＧＰＲ−９−６または該レセプターの一部に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性フラグメント、ここで該抗体またはその抗原結合性フラグメントが該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、該リガンドがＴＥＣＫである；および
ｂ）該抗体またはその抗原結合性フラグメントと該哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部との複合体の存在を検出するのに適切な１またはそれ以上の補助試薬
を含んでなる、生物学的試料中の哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部の存在の検出に使用するための試験キットであって、該抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）により産生されたｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と競合するものであり、ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは、細胞表面上に発現している配列番号：２からなるポリペプチドに結合する、試験キット。
【請求項２２】
該哺乳類ＧＰＲ−９−６がヒトＧＰＲ−９−６である、請求項２１記載の試験キット。
【請求項２３】
ａ）哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性フラグメント、ここで該抗体またはその抗原結合性フラグメントがレセプターへのＴＥＣＫの結合を阻害し、該レセプターがＧＰＲ−９−６である；および
ｂ）該抗体またはその抗原結合性フラグメントと該哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部との複合体の存在を検出するのに適切な１またはそれ以上の補助試薬
を含んでなる、生物学的試料中の哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部の存在の検出に使用するための試験キットであって、該抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントであり、該抗体または該抗原結合性フラグメントは配列番号：１１からなるポリペプチドに結合し、該抗体または該抗原結合性フラグメントは、マウスハイブリドーマ１１．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６９）により産生されたｍＡｂ  １１．３．１またはマウスハイブリドーマ１６．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６８）により産生されたｍＡｂ  １６．３．１と競合するものであり、該抗体は、哺乳類ＧＰＲ−９−６を発現する細胞のＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害する、試験キット。
【請求項２４】
癌を有する被験体を治療するための医薬の製造における請求項１〜２または７〜８いずれか１項記載の抗体または抗原結合性フラグメントの使用。
【請求項２５】
癌を有する被験体を治療するための医薬の製造におけるＧＰＲ−９−６に結合する抗体の使用であって、該抗体が、該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、かつ補体を活性化し得、該リガンドがＴＥＣＫであり、該抗体が細胞表面上に発現している配列番号：２からなるポリペプチドに結合し、該抗体は、マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）により産生されたｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と競合するものである、使用。
【請求項２６】
癌を有する被験体を治療するための医薬の製造における免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質の使用であって、該免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質が、ＧＰＲ−９−６に結合し、該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、かつさらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合している抗体の少なくとも抗原結合性部分を含み、該リガンドがＴＥＣＫであり、該抗体が細胞表面上に発現している配列番号：２からなるポリペプチドに結合し、該抗体は、マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）により産生されたｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と競合するものであり、該抗原結合性部分が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントである、使用。
【請求項２７】
該さらなる治療薬剤が細胞傷害剤である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
ＧＰＲ−９−６に結合し、該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、かつさらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合している抗体の少なくとも抗原結合性部分を含む、免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質であって、該リガンドがＴＥＣＫであり、該抗体が細胞表面上に発現している配列番号：２からなるポリペプチドに結合し、該抗体は、マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）により産生されたｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と競合するものであり、該抗原結合性部分が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントである、免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質。
【請求項２９】
ＧＰＲ−９−６に結合し、該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、かつさらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合している抗体の少なくとも抗原結合性部分を含む、抗原結合性融合タンパク質であって、該リガンドがＴＥＣＫであり、該抗体の抗原結合性部分および該さらなる治療薬剤が連続するポリペプチドの一部であり、該抗体が細胞表面上に発現している配列番号：２からなるポリペプチドに結合し、該抗体は、マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７０）により産生されたｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と競合するものであり、該抗原結合性部分が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはＦｖフラグメントである、抗原結合性融合タンパク質。
【請求項３０】
ａ）生物学的試料と、哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部に結合し、レセプターへのＴＥＣＫの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントとを、哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部への該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程、ここで、該レセプターがＧＰＲ−９−６である；および
ｂ）該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合を検出する工程；
を含む、生物学的試料中の哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部の検出方法であって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、該ＴＥＣＫまたは該ＴＥＣＫの一部の存在を示し、ＴＥＣＫレベルの上昇は、炎症性の疾患または状態を示し、該抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦｖフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマ１１．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６９）により産生されたｍＡｂ １１．３．１またはマウスハイブリドーマ１６．３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４６８）により産生されたｍＡｂ １６．３．１と競合するものであり、該抗体は、哺乳類ＧＰＲ−９−６を発現する細胞のＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害し、哺乳類ＴＥＣＫは、配列番号：９または配列番号：１１からなる配列を有する、検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
ケモカインは、広範な生物学的機能を媒介する約４０の６〜１４ｋＤの（非グリコシル化）ヘパリン結合性タンパク質の大きく、発達しつつあるファミリーである〔非特許文献１〕。ケモカインは、２つのジスルフィド結合を形成する４つのシステイン残基の位置に基づいてファミリーに分けられうる〔非特許文献２、３、４〕。また、ケモカインレセプターは、それらが結合するケモカインのタイプに基づいてファミリーに分けられうるが、レセプターサブファミリーを区別する明かな構造差異は同定されていない〔非特許文献５〕。さらに、十分に特徴づけられたケモカインレセプターと配列相同性を共有する多数のいわゆる「オーファン（ｏｒｐｈａｎ）」ケモカインレセプター（例えば、ＧＰＲ−９−６）が存在する。しかし、オーファンレセプターの生物学的機能および特異的なアゴニストは不明なままである。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、白血球接着および管外遊出において重要な役割を演じる。例えば、種々のインビトロアッセイにおいて、ケモカインは、白血球の化学走性または経内皮遊走を誘導し得〔非特許文献１〕、一方、ケモカインのインビボ注入〔非特許文献６〕または過剰発現〔非特許文献７〕は、ケモカイン注入または発現の部位で白血球蓄積を生じうる。ケモカインのアンタゴニストは、白血球輸送を妨げ得〔非特許文献８〕、急性および慢性の炎症のいくつかのモデルにおいて有益な効果を有し得る〔非特許文献９、１０〕。さらに、ケモカインは、脈管形成〔非特許文献１１〕、造血〔非特許文献１〕ならびにＴリンパ球活性化〔非特許文献１２、１３〕を調節することが報告された。さらに、数種のケモカインレセプターは、ＣＤ４とともに、ＭトロピックおよびＴトロピックＨＩＶ−１の侵入に対する補助レセプター(co-receptor)として働く〔非特許文献１４、１５〕。
【０００３】
ＣＤ４リンパ球のいくつかのサブセットは、異なる生理的部位に輸送をもたらすことが知られている種々の接着分子の発現に基づいて規定されうる〔非特許文献１６〕。例えば、ＣＬＡ+ve記憶ＣＤ４リンパ球は、皮膚に移動し〔非特許文献１７〕、一方、ＣＬＡ-veα４β７+ve記憶ＣＤ４リンパ球は粘膜部位に移動する〔非特許文献１８〕。内皮への白血球接着は、回転、活性化および静止を含む、いくつかのオーバーラップする工程に関与すると考えられる。回転する白血球は、白血球の活性化およびインテグリン媒介接着のアップレギュレーションを生じる接着部位で発現される薬剤に曝される。かかるインテグリン媒介相互作用の結果として、白血球は内皮で静止する〔非特許文献８、１９〕。白血球活性化およびインテグリン分子のアップレギュレーションは、ケモカインレセプターに関与すると考えられている百日咳毒素感受性機構を介して生じる〔非特許文献８、２０〕。
【０００４】
記憶ＣＤ４+リンパ球は、所定のケモカインレセプターの発現に基づいてグループ化されうる。例えば、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５〔非特許文献２１、２２、２３〕は、記憶ＣＤ４リンパ球のサブセット上に全て発現され、所定のケモカインは、未処置（ｎａｉｖｅ）のＴ細胞上で選択的に作用する〔非特許文献２４〕。さらに、かかるレセプターに対するリガンドである数種のケモカインは、炎症部位で〔非特許文献２５〕およびある場合にはチャレンジ部位で(challenged site)を排出するリンパ節で〔非特許文献２６〕発現されることが示された。インビトロ由来ＴH１／ＴH２リンパ球株は、ケモカインレセプターを差次的に発現することが示された。具体的には、ＴH１リンパ球は、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ５を選択的に発現することが示されたが、一方、ＴH２リンパ球は、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８およびＣＣＲ３を選択的に発現する〔非特許文献２７、２８、２９、３０、３１〕。興味深いことに、ある場合には、これらのそれぞれのケモカインレセプターに対するケモカイン、例えば、ＣＣＲ４に対するＭＤＣおよびＣＸＣＲ３に対するＩＰ−１０は、ＴH１／ＴH２環境に関連したサイトカインにより誘導される〔非特許文献３０、３２〕。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔａｕｂ，Ｄ．Ｄ．およびＯｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．，Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１：２２９−２４６（１９９４）
【非特許文献２】Ｋｅｌｎｅｒ，Ｇ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１２３９５−１３９９（１９９４）
【非特許文献３】Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３８５：６４０−６４４（１９９７）
【非特許文献４】Ｐｉｎ，Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３８５：６１１−６１７（１９９７）
【非特許文献５】Ｍａｃｋａｙ，Ｃ．Ｒ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：７９９−８０２（１９９６）
【非特許文献６】Ｔａｕｂ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１９３１−１９４１（１９９６）
【非特許文献７】Ｆｕｅｎｔｅｓ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：５７６９−５７７６（１９９５）
【非特許文献８】Ｂａｒｇａｔｚｅ，Ｒ．Ｆ．およびＢｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：３６７−３７２（１９９３）
【非特許文献９】Ｓｅｋｉｄｏ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３６５：６５４−６５７（１９９３）
【非特許文献１０】Ｋａｒｐｕｓ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：５００３−５０１０（１９９５）
【非特許文献１１】Ｇｕｐｔａ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７７９９−７８０３（１９９５）
【非特許文献１２】Ｚｈｏｕ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４３３３−４３４１（１９９３）
【非特許文献１３】Ｔａｕｂ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：２０９５−２１０３（１９９６）
【非特許文献１４】Ｃｈｏｅ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ，８５：１１３５−１１４８（１９９６）
【非特許文献１５】Ｆｅｎｇ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：８７２−８７７（１９９６）
【非特許文献１６】Ｍａｃｋａｙ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：４２３−４２７（１９９３）
【非特許文献１７】Ｂｅｒｇ，Ｅ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１７４（６）：１４６１−１４６６（１９９１）
【非特許文献１８】Ｈａｍｍａｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３２８２−３２９２（１９９４）
【非特許文献１９】Ｂａｒｇａｔｚｅ，Ｒ．Ｆ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：９９−１０８（１９９５）
【非特許文献２０】Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：３８１−３８３（１９９８）
【非特許文献２１】Ｑｉｎ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：６４０−６４７（１９９６）
【非特許文献２２】Ｑｉｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０１：７４６−７５４（１９９８）
【非特許文献２３】Ｌｉａｏ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：１８６−１９４（１９９９）
【非特許文献２４】Ａｄｅｍａ，Ｇ．Ｊ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ，３８７：７１３−７１７（１９９７）
【非特許文献２５】Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９８：２３３２−２３４５（１９９６）
【非特許文献２６】Ｔｅｄｌａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：５６６３−５６７２（１９９８）
【非特許文献２７】Ｂｏｎｅｃｃｈｉ，Ｒ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：１２９−１３４（１９９８）
【非特許文献２８】Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：８７５−８８３（１９９８）
【非特許文献２９】Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：２００５−２００７（１９９７）
【非特許文献３０】Ａｎｄｒｅｗ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：５０２７−５０３８（１９９８）
【非特許文献３１】Ｚｉｎｇｏｎｉ，Ａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：５４７−５５５（１９９８）
【非特許文献３２】Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：６７２−６７６（１９８５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、哺乳類ＧＰＲ−９−６（ＧＰＲ−９−６はまた、ＣＣケモカインレセプター９（ＣＣＲ９）とも呼ばれる）またはそのレセプターの一部に結合する抗体（免疫グロブリン）またはその機能的フラグメント（例えば、抗原結合性フラグメント）に関する。一つの態様では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒトＧＰＲ−９−６に結合する。他の態様では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、哺乳類ＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合を阻害しうる。好ましい態様では、抗体または抗体結合性フラグメントは、ヒトＧＰＲ−９−６に結合し、レセプターへのＴＥＣＫの結合を阻害しうる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ｍＡｂ  ３Ｃ３、ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１または前述のいずれかの抗原結合性フラグメントにより認識されるエピトープと同一であるかまたは類似するエピトープに結合する。例えば、ヒトＧＰＲ−９−６への本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの結合は、配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチドにより阻害されうる。他の態様では、ヒトＧＰＲ−９−６への本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの結合は、ｍＡｂ  ３Ｃ３により阻害されうる。好ましい態様では、抗体は、ｍＡｂ  ３Ｃ３またはその抗原結合性フラグメントである。より好ましい態様では、抗体は、ｍＡｂ  ＧＰＲ−９−６またはその抗原結合性フラグメントである。
【０００８】
本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを産生する単離された細胞に関し、これには哺乳類９−６に結合するものおよびレセプターへのリガンドの結合を阻害するものが含まれる。特定の態様では、単離された細胞は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ−１２６５３の下で寄託されたマウスハイブリドーマ３Ｃ３（マウスハイブリドーマＬＳ１２９−３Ｃ３−Ｅ３−１とも呼ばれる）である。他の特定の態様において、単離された細胞は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１４７０の下で寄託されたマウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１（マウスハイブリドーマＬＳ２７２  ＧＰＲ９６  １−５とも呼ばれる）である。
【０００９】
本発明はまた、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する薬剤（すなわち、分子または化合物）を検出または同定する方法に関する。一つの態様では、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合し、ＧＰＲ−９−６へのリガンド（例えば、ＴＥＣＫ）の結合を阻害（低減または妨害）しうる薬剤が競合結合アッセイにおいて同定される。他の態様では、治療に使用するための薬剤は、直接結合アッセイにおいて同定される。従って、本発明は、ＧＰＲ−９−６機能を調節する薬剤、例えば、リガンドまたはレセプター機能のインヒビター（例えば、アンタゴニスト）またはプロモーター（例えば、アゴニスト）を含む哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する他の物質を同定する方法を含む。哺乳類ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種の適切な供給源は、本発明の方法に従ってＧＰＲ−９−６結合薬剤を同定するために使用されうる。一つの態様では、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種を発現する細胞（例えば、細胞株、組換え細胞）が使用される。他の態様では、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種を発現する細胞の膜調製物が使用される。
【００１０】
また、本発明は、哺乳類ＴＥＣＫまたはケモカインの一部に結合する抗体（免疫グロブリン）またはその機能的フラグメント（例えば、抗原結合性フラグメント）に関する。一つの態様では、抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒトＴＥＣＫに結合する。他の態様では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、レセプターへの哺乳類ＴＥＣＫの結合を阻害しうる。好ましい態様では、抗体または抗体結合性フラグメントは、ヒトＴＥＣＫに結合し、ＧＰＲ−９−６へのＴＥＣＫの結合を阻害しうる。
【００１１】
他の態様では、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ｍＡｂ  １１．３．１、ｍＡｂ  １６．３．１または前述のいずれかの抗原結合性フラグメントにより認識されるエピトープと同一または類似のエピトープに結合する。他の態様では、ヒトＧＰＲ−９−６への本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの結合は、ｍＡｂ  １１．３．１および／またはｍＡｂ  １６．３．１により阻害されうる。特定の態様では、抗体は、ｍＡｂ  １１．３．１またはその抗原結合性フラグメントである。他の特定の態様では、抗体は、ｍＡｂ  １６．３．１またはその抗原結合性フラグメントである。
【００１２】
また、本発明は、哺乳類ＴＥＣＫに結合し、レセプターへのＴＥＣＫの結合を阻害するものを含む、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを産生する単離された細胞に関する。特定の態様では、単離された細胞は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１４６９の下で寄託されたマウスハイブリドーマ１１．３．１（マウスハイブリドーマＬＳ２５０  １１．３．１とも呼ばれる）である。他の特定の態様では、単離された細胞は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１４６８の下で寄託されたマウスハイブリドーマ１６．３．１（マウスハイブリドーマＬＳ２５０  １６．３．１とも呼ばれる）である。
【００１３】
本発明はまた、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する薬剤（すなわち、分子または化合物）を検出または同定する方法に関する。一つの態様では、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合し、ＧＰＲ−９−６へのリガンド（例えば、ＴＥＣＫ）の結合を阻害（低減または妨害）しうる薬剤は、競合結合アッセイで同定される。他の態様では、治療に使用するための薬剤は、直接結合アッセイにおいて同定される。
【００１４】
本発明はまた、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合し、ＧＰＲ−９−６機能を調節（阻害または促進）するか、または哺乳類ＴＥＣＫに結合し、ＧＰＲ−９−６機能を調節しうる薬剤をかかる治療を必要とする被験体に投与する治療方法に関する。一つの態様では、治療方法は、炎症性疾患を有する被験体を治療する方法である。好ましい態様では、被験体は、炎症性腸疾患等の粘膜組織に関連した炎症性疾患を有する。特定の態様では、炎症性腸疾患は、クローン病または結腸炎である。他の態様では、治療方法は、白血球のＧＰＲ−９−６媒介性ホーミングの阻害方法である。他の態様では、この方法は、ＧＰＲ−９−６機能の調節方法である。
【００１５】
本発明は、さらに生物学的試料中の哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部を検出または定量する方法に関する。この方法は、生物学的試料と本発明の抗ＧＰＲ−９−６抗体または抗原結合性フラグメントとを結合に適した条件下で接触させる工程、およびＧＰＲ−９−６と抗体または抗原結合性フラグメントとで形成された複合体を検出する工程を含む。一つの態様では、生物学的試料は、ヒト細胞または該細胞の画分（例えば、膜調製物）を含む。
【００１６】
また、本発明は、生物学的試料中の哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部を同定または定量するための試験キットに関する。一つの態様では、キットは、本発明の抗体および適切な補助試薬を含有する。
【００１７】
本発明は、さらに生物学的試料中の哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部を検出または定量する方法に関する。この方法は、生物学的試料と本発明の抗ＴＥＣＫ抗体または抗原結合性フラグメントとを結合に適した条件下で接触させ、ＴＥＣＫと抗体または抗原結合性フラグメントとで形成される複合体を検出する工程を含む。また、本発明は、生物学的試料中の哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部を同定または定量するための試験キットに関する。一つの態様では、キットは、本発明の抗体および適切な補助試薬を含む。
【００１８】
本発明はまた、癌を有する被験体を治療する方法に関する。一つの態様では、この方法は、癌を有する被験体にＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストを投与する工程を含む。他の態様では、ＧＰＲ−９−６に結合する抗体、抗原結合性融合タンパク質または免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が投与される。また、本発明は、他の治療剤に直接または間接的に結合したＧＰＲ−９−６に結合する抗体の抗原結合部分を少なくとも含有する免疫複合体および抗原結合性融合タンパク質に関する。
【００１９】
本発明は、治療（予防を含む）または診断に使用するための本明細書に記載される抗体、抗原結合性フラグメントまたは薬剤（例えば、免疫複合体、抗原結合性融合タンパク質）、および本明細書に記載される特定の疾患または状態（例えば、粘膜組織に関連する炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患（例えば、クローン病））、癌（例えば、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病））の治療用薬物の製造のためのかかる抗体、抗原結合性フラグメントまたは薬剤の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、他の白血球ケモカインレセプターとのＧＰＲ−９−６の関係を示す樹状図である。クラスターのアラインメント分析プログラム（ＤＮＡｓｔａｒ）を用いて、白血球ケモカインレセプターのタンパク質配列を整列させ、ＧＰＲ−９−６と数種のケモカインレセプターとの間の系統学的距離を決定するために使用した。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、ＧＰＲ−９−６トランスフェクタントへのｍＡｂ  ３Ｃ３の特異的結合を示す。図２Ａにおいて、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントを、ｍＡｂ  ３Ｃ３（点刻の輪郭）、抗−ＣＣＲ６抗体（・・・・・・・）またはマウスＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂ（----）（ｎ＝２）で染色した。図２Ｂにおいて、ＣＣＲ６／Ｌ１．２トランスフェクタントをｍＡｂ  ３Ｃ３（・・・・・・・）、抗ＣＣＲ６抗体（点刻の輪郭）またはマウスＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂ（----）（ｎ＝２）で染色した。
【図３Ａ−Ｆ】図３は、ＧＰＲ−９−６がＢリンパ球およびＣＤ４およびＣＤ８リンパ球のサブセット上で発現されることを説明する一連の蛍光プロットである。ｍＡｂ  ３Ｃ３を、単核細胞上で、抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ（図３Ａ）、抗ＣＤ８  ＦＩＴＣ（図３Ｂ）、抗ＣＤ１９  ＦＩＴＣ（図３Ｃ）、抗ＣＤ５６チクローム（Ｃｙｃｈｒｏｍｅ）（図３Ｄ）および抗ＣＣＲ３  ＦＩＴＣ（図３Ｅ）とともに２色研究において使用した。胸腺細胞について（図３Ｆ）、２色研究をｍＡｂ  ３Ｃ３および抗ＴｃＲチクロームを用いて行った。単球（図３Ｇ）、好酸球（図３Ｈ）および好中球（図３Ｉ）上でのＧＰＲ−９−６発現を、これらの細胞の単離された集団およびｍＡｂ  ３Ｃ３（−）およびＩｇＧ２ｂ対照（----）を用いて１色研究において評価した（注：ｍＡｂ  ３Ｃ３（−）およびＩｇＧ２ｂ（----）はオーバーラップを生じ、重ね書きしている（非点刻のピーク））。抗ＣＣＲ２、抗ＣＣＲ３および抗ＣＸＣＲ２抗体を、単球、好酸球および好中球、それぞれの陽性対照として用いた（点刻の輪郭）（ｎ＝３）。
【図３Ｇ−Ｉ】図３は、ＧＰＲ−９−６がＢリンパ球およびＣＤ４およびＣＤ８リンパ球のサブセット上で発現されることを説明する一連の蛍光プロットである。ｍＡｂ  ３Ｃ３を、単核細胞上で、抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ（図３Ａ）、抗ＣＤ８  ＦＩＴＣ（図３Ｂ）、抗ＣＤ１９  ＦＩＴＣ（図３Ｃ）、抗ＣＤ５６チクローム（Ｃｙｃｈｒｏｍｅ）（図３Ｄ）および抗ＣＣＲ３  ＦＩＴＣ（図３Ｅ）とともに２色研究において使用した。胸腺細胞について（図３Ｆ）、２色研究をｍＡｂ  ３Ｃ３および抗ＴｃＲチクロームを用いて行った。単球（図３Ｇ）、好酸球（図３Ｈ）および好中球（図３Ｉ）上でのＧＰＲ−９−６発現を、これらの細胞の単離された集団およびｍＡｂ  ３Ｃ３（−）およびＩｇＧ２ｂ対照（----）を用いて１色研究において評価した（注：ｍＡｂ  ３Ｃ３（−）およびＩｇＧ２ｂ（----）はオーバーラップを生じ、重ね書きしている（非点刻のピーク））。抗ＣＣＲ２、抗ＣＣＲ３および抗ＣＸＣＲ２抗体を、単球、好酸球および好中球、それぞれの陽性対照として用いた（点刻の輪郭）（ｎ＝３）。
【図４】図４Ａ〜４Ｈは、ＧＰＲ−９−６が、未成熟樹状細胞（ＩＭＤＣ）、成熟樹状細胞（ＭＤＣ）またはＴH１／ＴH２リンパ球において発現されないことを説明するプロットである。成熟（−）および未成熟樹状細胞（点刻の輪郭）を抗ＣＣＲ５（図４Ａ）、抗ＣＤ８３（図４Ｂ）、抗ＣＤ８６（図４Ｃ）または抗ＧＰＲ−９−６（図４Ｄ）で染色した。また、ＩＭＤＣにおけるＩｇＧ２ｂ対照（・・・・）を用いた染色を示す。図４Ｅは、抗ＣＸＣＲ４（点刻の輪郭）、抗ＧＰＲ−９−６（−）およびＩｇＧ２ｂ（・・・・）で臍ＣＤ４リンパ球の染色を示す。図４Ｆ〜４Ｈは、示されるような抗ＣＸＣＲ３（図４Ｆ）、抗α４β７（Ａｃｔ１）（図４Ｇ）または抗ＧＰＲ−９−６（ｍＡｂ  ３Ｃ３）（図４Ｈ）でのＴH１（点刻の輪郭）およびＴH２（−）リンパ球の染色を示し、（・・・・）はＴH１リンパ球におけるＩｇＧ２ｂ対照での染色を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、Ｔリンパ球活性化を超過した時間（ｏｖｅｒ  ｔｉｍｅ）のおよびＴリンパ球活性化のときのリンパ球上のＧＰＲ−９−６の調節を示すグラフである。単核細胞を、１４日を超過した設定時間にある個体から単離し、ｍＡｂ  ３Ｃ３および抗ＣＤ４  ＦＩＴＣまたは抗ＣＤ１９  ＦＩＴＣを用いて２色実験で染色し、ＢおよびＣＤ４リンパ球におけるＧＰＲ−９−６発現を調べた（図５Ａ）。図５Ｂ〜５Ｃでは、単核細胞を、抗ＴｃＲ  ｍＡｂ  ＯＫＴ３を結合させたプレートで４日間、活性化させ、続いて５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２で拡大した。Ｔリンパ球活性化におけるＧＰＲ−９−６発現を測定するためにｍＡｂ  ３Ｃ３（図５Ｂ）を用いて、またはＴ細胞活性化におけるＣＣＲ−３およびＣＣＲ−５の発現を測定するために抗ＣＣＲ６  ｍＡｂおよび抗ＣＣＲ５  ｍＡｂ（図５Ｃ）を用いて細胞のアリコートを過剰時間染色した。
【図６】図６は、ＧＰＲ−９−６がα４β７highＣＬＡ-veＣＤ４+記憶リンパ球上で発現されることを示す一連の蛍光プロットである。単核細胞を、抗ＣＤ−４チクロームを用いて３色実験で染色し、ＣＤ４リンパ球に固定した（ｇａｔｅ  ｏｎ）。また、細胞を抗ＧＰＲ−９−６  ｍＡｂ  ３Ｃ３で、続いてＦ（ａｂ’）2抗マウスＩｇＧフィコエリトリンで染色し、抗αＥ（ＨＭＬ１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）（図６Ａ）、抗β７（Ｆｉｂ５０４、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（図６Ｂ）、抗ＣＤ４９ｄ（ＨＰ２／１、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（図６Ｃ）、抗ＣＬＡ（ＨＥＣＡ  ４５２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（図６Ｄ）、抗ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＬＨ１、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（図６Ｅ）および抗ＣＤ６２Ｌ（ＣＤ５６）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（図６Ｆ）で規定したサブセット上でのＧＰＲ−９−６発現を調査した（ｎ＝５）。
【図７】図７は、他のケモカインレセプターに関連したＣＤ４リンパ球上のＧＰＲ−９−６の発現を示す一連の蛍光プロットである。単核細胞を、抗ＣＤチクロームを用いて３色実験において染色し、ＣＤ４リンパ球に固定した（ｇａｔｅ  ｏｎ）。また、細胞を抗ＧＰＲ−９−６  ｍＡｂ  ３Ｃ３で、続いてフィコエリトリンに結合したＦ（ａｂ’）2抗マウスＩｇＧで染色し、抗ＣＣＲ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（図７Ａ）、抗ＣＣＲ５（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（図７Ｂ）、抗ＣＣＲ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（図７Ｃ）、抗ＣＸＣＲ３（１Ｃ６、Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）（図７Ｄ）、抗ＣＸＣＲ４（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（図７Ｅ）および抗ＣＸＣＲ５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（図７Ｆ）で規定したサブセットにおけるＧＰＲ−９−６発現を調査した。これらは全てフィコエリトリンに結合させた（ｎ＝２）。
【図８Ａ−Ｄ】図８Ａ〜８Ｆは、ＧＰＲ−９−６がＴＥＣＫに対するケモカインレセプターであることを示すグラフおよび一連のヒストグラムである。ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントを、１０〜１０００ｎＭのＴＥＣＫに対する化学走性応答について試験した（図８Ａ）。図８Ｂは、抗ＧＰＲ−９−６（ｍＡｂ  ３Ｃ３）がＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントの１５０ｎＭ  ＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害したが、抗ＣＣＲ３は阻害しないことを示す。図８Ｃは、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントの百日咳毒素（ＰＴＸ）前処理がＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントの１５０ｎＭ  ＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害したことを示す。図８Ｄおよび図８Ｅは、それぞれＴＥＣＫに化学走性を示す（ｃｈｅｍｏｔａｘ）ＭＯＬＴ−４細胞の能力およびＳＫＷ３細胞が化学走性を示し得ないことを示す。図８Ｆは、１５０ｎＭ  ＴＥＣＫに応答して走化するＭＯＬＴ−１３細胞の能力、およびこの遊走をブロックするｍＡｂ  ３Ｃ３の能力を、ＣＸＣＲ４を介してこれらの細胞の化学走性を誘導することが知られているケモカインとしてＳＤＦ１αを１００ｎｇ／ｍｌで用いて示す（ｎ＝２）。
【図８Ｅ−Ｆ】図８Ａ〜８Ｆは、ＧＰＲ−９−６がＴＥＣＫに対するケモカインレセプターであることを示すグラフおよび一連のヒストグラムである。ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントを、１０〜１０００ｎＭのＴＥＣＫに対する化学走性応答について試験した（図８Ａ）。図８Ｂは、抗ＧＰＲ−９−６（ｍＡｂ  ３Ｃ３）がＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントの１５０ｎＭ  ＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害したが、抗ＣＣＲ３は阻害しないことを示す。図８Ｃは、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントの百日咳毒素（ＰＴＸ）前処理がＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントの１５０ｎＭ  ＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害したことを示す。図８Ｄおよび図８Ｅは、それぞれＴＥＣＫに化学走性を示す（ｃｈｅｍｏｔａｘ）ＭＯＬＴ−４細胞の能力およびＳＫＷ３細胞が化学走性を示し得ないことを示す。図８Ｆは、１５０ｎＭ  ＴＥＣＫに応答して走化するＭＯＬＴ−１３細胞の能力、およびこの遊走をブロックするｍＡｂ  ３Ｃ３の能力を、ＣＸＣＲ４を介してこれらの細胞の化学走性を誘導することが知られているケモカインとしてＳＤＦ１αを１００ｎｇ／ｍｌで用いて示す（ｎ＝２）。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、ＧＰＲ−９−６を発現する細胞株がＴＥＣＫに応答してＣａ2+フラックスを受けることを示す。ＧＰＲ−９−６を発現する細胞株ＭＯＬＴ−４に、Ｃａ2+感受性染料Ｆｕｒａ−２を負荷し、次いで１５０ｎＭ  ＴＥＣＫ  （図９Ａ）、１００ｎＭ  ＳＤＦ１α（図９Ｂ）または１００ｎＭ  ＭＤＣ（図９Ｃ）ケモカインに応答してＣａ2+を動員するそれらの能力について試験した（ｎ＝２）。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０は、ＣＤ４リンパ球および胸腺細胞のサブセットがＴＥＣＫに走化することを示す一連のヒストグラムである。ＣＤ４+リンパ球（図１０Ｆ）、ＣＤ８+リンパ球（図１０Ｂ）、ＣＤ５６+ＮＫ細胞（図１０Ｄ）およびＣＤ１４+単球（図１０Ａ）を、適切なＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓを用いて単核細胞から単離した。好中球（図１０Ｅ）を、デキストラン沈殿、続いてＦｉｃｏｌｌにより単離し、抗ＣＤ１６  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓを用いた枯渇により好中球から好酸球（図１０Ｃ）を分離した。ＥＶＣ３０４単層がアッセイの前に挿入物よりも成長した好酸球および好中球を除いて、非被覆の３μｍ  Ｃｏｓｔｅｒプレートを用いてこれらの白血球サブセットで化学走性を評価した。各々の場合で、１ｎＭから２２０ｎＭの用量応答様式でＴＥＣＫを試験した。白血球サブセットにおいて作用することが知られているケモカインを陽性対照として使用した（ｎ＝２）。
【図１０Ｃ−Ｆ】図１０は、ＣＤ４リンパ球および胸腺細胞のサブセットがＴＥＣＫに走化することを示す一連のヒストグラムである。ＣＤ４+リンパ球（図１０Ｆ）、ＣＤ８+リンパ球（図１０Ｂ）、ＣＤ５６+ＮＫ細胞（図１０Ｄ）およびＣＤ１４+単球（図１０Ａ）を、適切なＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓを用いて単核細胞から単離した。好中球（図１０Ｅ）を、デキストラン沈殿、続いてＦｉｃｏｌｌにより単離し、抗ＣＤ１６  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓを用いた枯渇により好中球から好酸球（図１０Ｃ）を分離した。ＥＶＣ３０４単層がアッセイの前に挿入物よりも成長した好酸球および好中球を除いて、非被覆の３μｍ  Ｃｏｓｔｅｒプレートを用いてこれらの白血球サブセットで化学走性を評価した。各々の場合で、１ｎＭから２２０ｎＭの用量応答様式でＴＥＣＫを試験した。白血球サブセットにおいて作用することが知られているケモカインを陽性対照として使用した（ｎ＝２）。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、胸腺細胞およびＣＤ４リンパ球のＴＥＣＫ誘導性化学走性がＧＰＲ−９−６により媒介されることを示す一連のヒストグラムである。ＣＤ４リンパ球および胸腺細胞を、化学走性アッセイにおいて使用する前に５０μｇ／ｍｌの抗ＧＰＲ−９−６  ｍＡｂ  ３Ｃ３で前処理した。胸腺細胞を、１５０ｎＭ  ＴＥＣＫおよび１００ｎＭ  ＳＤＦ１αを用いてアッセイし（図１１Ａ）、ＣＤ４リンパ球を１５０ｎＭ  ＴＥＣＫを用いてアッセイし（図１１Ｂ）、ならびにＣＤ４リンパ球を１００ｎＭ  ＴＡＲＣを用いてアッセイした（図１１Ｃ）。全てのアッセイにおいて、ＴＥＣＫ誘導性化学走性を、抗ＧＰＲ−９−６（ｍＡｂ  ３Ｃ３）により阻害した。さらに、無関係なｍＡｂ抗ＣＣＲ６  ｍＡｂ  ２Ａ９（図１１Ａ）および抗ＣＣＲ４  ｍＡｂ  ２Ｂ１０（図１１Ｂ）を、ＴＥＣＫまたはＴＡＲＣへのＣＤ４または胸腺細胞化学走性におけるそれらの影響について調査した。さらに、ＣＤ４リンパ球化学走性について、ＴＡＲＣ誘導性ＣＤ４リンパ球化学走性におけるｍＡｂ  ３Ｃ３の効果を、さらなる陰性対照として試験した（図１１Ｃ）（ｎ＝２）。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＴＥＣＫおよびＧＰＲ−９−６の組織分布を示す。多組織ノーザンブロット分析フィルター（２μｇ  ＲＮＡ／レーン）（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）および種々の細胞株（２０μｇ／レーン）に由来するＲＮＡを用いて調製したノーザンブロットを、32Ｐ  ＴＥＣＫ  ＤＮＡプローブ（図１２Ａ）または標識したＧＰＲ−９−６（図１２Ｂ）でプローブし、それらの組織分布を測定した。図１２Ｃでは、大腸、小腸、脳、リンパ節、脾臓、胸腺、およびゲノムＤＮＡに由来するｃＤＮＡ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を、ＧＰＲ−９−６の配列から設計したプライマーを用いてＰＣＲ（３０サイクル）において増幅した。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、α４β７highＣＤ４およびＣＤ８リンパ球のみがＴＥＣＫに遊走することを示すヒストグラムである。４色識別において、ＣＤ４５ＲＡの中間体／陰性発現ならびにＣＤ２７およびＣＤ８の発現により規定される記憶ＣＤ８リンパ球を、Ａｃｔ１−フィコエリトリンを用いて、α４β７陰性、中間体および高集団に分類した。ＣＤ４リンパ球について、ＣＤ４５ＲＡの欠失およびＣＤ４の発現により規定される記憶ＣＤ４リンパ球を、抗α４β７抗体Ａｃｔ１−フィコエリトリン(phyorythrin)および抗ＣＬＡ抗体ＨＥＣＡ  ４５２−ＦＩＴＣを用いるＣＬＡおよびα４β７発現に基づいてα４β７-veＣＬＡ-ve、α４β７-veＣＬＡ+ve、およびα４β７+veＣＬＡ-ve分集団に分類した。次いで、記憶ＣＤ４（図１３Ａ）およびＣＤ８（図１３Ｂ）リンパ球のこれらの分集団を、１μＭ  ＴＥＣＫに走化するそれらの能力について調査した（ｎ＝２）。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｂは、５８位で始まるオープンリーディングフレームを有する、Ｇｅｎｂａｎｋにアクセッション番号Ｕ４５９８２の下で寄託したヒト（ホモサピエンス）ＧＰＲ−９−６をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｂは、５８位で始まるオープンリーディングフレームを有する、Ｇｅｎｂａｎｋにアクセッション番号Ｕ４５９８２の下で寄託したヒト（ホモサピエンス）ＧＰＲ−９−６をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。
【図１５】図１５は、図１４Ａ〜１４Ａに示されるＤＮＡ配列（配列番号：１）によりコードされるヒトＧＰＲ−９−６タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＧＰＲ−９−６が小腸（粘膜固有層（ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ）リンパ球（ＩＰＬ、図１６Ｂ）、上皮内リンパ球（ＩＥＬ、図１６Ｃ）から単離されたリンパ球上に発現され、末梢血リンパ球の小サブセット（図１６Ａ）だけがレセプターを発現することを示す蛍光ヒストグラムである。ＧＰＲ−９−６発現を、これらの細胞の単離された集団およびｍＡｂ  ３Ｃ３（点刻のピーク）またはＩｇＧ２ｂ対照（非点刻のピーク）を用いた１色研究において評価した。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＴＥＣＫがＩＥＬ（図１７Ａ）およびＬＰＬ（図１７Ｂ）に対する化学誘因物質であることを説明するヒストグラムである。このヒストグラムはまた、ＴＥＣＫ誘導性化学走性がｍＡｂ  ３Ｃ３により阻害されたことを示し、ＧＰＲ−９−６がＩＥＬおよびＬＰＬ上に発現されるＴＥＣＫに対する主要な生理的レセプターであることを示す。非被覆５μｍＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートを用いて、これらのリンパ球サブセットを用いるＴＥＣＫ誘導性化学走性を評価した。リンパ球を、ＴＥＣＫに曝露する前に４℃で１０分間、ｍＡｂ  ３Ｃ３（抗ＣＣＲ９）、対照ＩｇＧ２ｂ（ＩｇＧ２ｂ）または培地単独（−）とともにインキュベートした。
【図１８】図１８は、ｍＡｂ  ３Ｃ（−三角−）またはｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１（−四角−）によるＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントのＴＥＣＫ誘導性（約１５０ｎＭ）化学走性の用量依存性阻害を示すグラフである。ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントを、ＴＥＣＫへの曝露の前に氷上で１０分間、種々の濃度の抗ＧＰＲ−９−６抗体（ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１またはｍＡＢ  ３Ｃ３）とともにインキュベートした。
【図１９】図１９は、ＴＥＣＫに結合するｍＡｂｓによるＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントのＴＥＣＫ誘導性化学走性の阻害を示すヒストグラムである。ＴＥＣＫを、対照ＩｇＧ１  ｍＡｂ（２０ｍｇ／ｍｌ）を含む培養培地に希釈するか（最終濃度約１５０んＭ）、またはＴＥＣＫに結合するｍＡｂを産生するハイブリドーマの条件培養培地に希釈した。ＴＥＣＫ溶液を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレートの底に配置し、室温で１０分間、インキュベートした。次いで、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントを、培養培地に懸濁し、挿入物中に配置し、プレートのウェル中に配置した。マウスハイブリドーマ１１．２、１１．３．１、１６．２および１６．３．１（それぞれ、ｍＡｂ  １１．２、ｍＡｂ  １１．３．１、ｍＡｂ  １６．２およびｍＡｂ  １６．３．１）により産生されたモノクローナル抗体は、ＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害した。ＴＥＣＫにも結合する、マウスハイブリドーマ２０．２により産生された抗体、および非特異的ＩｇＧは、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントのＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害しなかった。バックグラウンド化学走性（−）を、ＴＥＣＫを添加しなかったアッセイにおいて評価した。
【図２０】図２０は、ヒト（ホモサピエンス）ＴＥＣＫをコードするヌクレオチド配列（配列番号：８）を示す。この配列は、１位で始まるオープンリーディングフレームを有し、３１１位のｙは、ピリミジン（システイン（ｃ）、チミン（ｔ））であり得る。アクセッション番号Ｕ８６３５８の下でＧｅｎｂａｎｋに寄託されたヒトＴＥＣＫをコードするヌクレオチド配列は、３１１位にチミンを有し、１位で始まるオープンリーディングフレームを有する。
【図２１】図２１は、図２０に示したヌクレオチド配列（配列番号：８）によりコードされるヒトＴＥＣＫタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。１０４位のＸは、メチオニン残基（Ｍｅｔ，Ｍ）またはトレオニン残基（Ｔｈｒ，Ｔ）であり得る。アクセッション番号Ｕ８６３５８でＧｅｎｂａｎｋに寄託されたヌクレオチド配列は、１０４位にメチオニン残基を有するＴＥＣＫをコードする。
【図２２】図２２は、アミノ酸残基１０９（アラニン１０９）が欠失したヒト（ホモサピエンス）ＴＥＣＫの変種をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１０）を示す。この配列は、１位で始まるオープンリーディングフレームを有し、３１１位のｙは、ピリミジン（システイン（ｃ）、チミン（ｔ））であり得る。
【図２３】図２３は、図２２に示されるヌクレオチド配列（配列番号：１０）によりコードされるヒトＴＥＣＫタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。１０４位のＸは、メチオニン残基（Ｍｅｔ、Ｍ）またはトレオニン残基（Ｔｈｒ，Ｔ）であり得る。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｃは、アンチセンスＴＥＣＫプローブ（図２４Ａおよび２４Ｂ）またはセンスＴＥＣＫプローブ（陰性対照、図２４Ｃ）にハイブリダイズしたマウス小腸の切片の写真である。ＴＥＣＫ発現は、絨毛およびリーベルキューンの陰窩上の上皮に局在化した。ＴＥＣＫ発現は絨毛の底部で最も高く、絨毛の上部でより低いレベルのＴＥＣＫハイブリダイゼーションが検出された（図２４Ａおよび２４Ｂ）。ＴＥＣＫの発現は、小腸に付着したパイラー斑では検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本明細書で使用した略語を挙げる：ＥＣＶ３０４、ヒト臍静脈内皮細胞株（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１９９８）；ＡＤＥＣ、アデノイド発現ケモカイン；ＩＰ１０、ＩＦＮ−ガンマ誘導性１０ｋＤａタンパク質；ＩＭＤＣ、未熟樹状細胞；Ｉ−ＴＡＣ、インターフェロン誘導性Ｔ細胞アルファ化学誘引物質；ＭＣＰ−１、単球化学誘引物質タンパク質；ＳＤＦ、ストロマ細胞由来因子；ＭＤＣ、成熟樹状細胞ケモカイン；ＭＩＧ、インターフェロン−ガンマによって誘導されたモノカイン；ＲＡＮＴＥＳ、regulated on activation normal T cell expressed ；ＭＩＰ３、マクロファージ炎症性タンパク質３；ＭＩＰ４、マクロファージ炎症性タンパク質４；ＴＥＣＫ、胸腺発現ケモカイン；ＳＬＣ、二次リンパ様組織ケモカイン；ＤＣ、樹状細胞。
【００２２】
ケモカインとそのレセプターは、指向性白血球遊走の方向の調節で重要な部分を構成する。ケモカインは、炎症部位で産生され、対応するレセプターを有する種々の白血球を誘引する。炎症部位で発現したケモカインのスペクトルは、一定の炎症性細胞を差異を持って誘引しうる一方で、白血球でのケモカインレセプター発現の選択性および変化は、さらなる調節を与え、特定の炎症性刺激に応答して適当な細胞漸増を確実にする。同定されかつ特徴づけられたケモカインレセプターの数が増加し続けるにつれて、ＴH１およびＴH２、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）および記憶、活性化および休止したＴ細胞等の白血球の機能的なサブセットを同定し、マークし、またはその他の方法で特徴付けしうる数個のレセプターを細胞が選択的に発現することがますます明瞭になる。数個の特徴付けられたおよび／またはオーファンケモカインレセプターは個体細胞上で同時発現しうるために、疾患の開始および進行でまたはさらに言えば通常の免疫機能で特異的なレセプターの役割を確認することは困難であった。
【００２３】
本明細書に記載のように、オーファンケモカインレセプターＧＰＲ−９−６の研究を行なった。研究の過程で、ヒトＧＰＲ−９−６に結合する抗体（ｍＡｂ  ３Ｃ３）が作製され、種々の型の白血球のレセプターの発現および機能を解析するのに使用した。レセプターが、粘膜部位（例えば、気道、尿生殖路、消化管および関連する組織（膵臓、胆嚢）にホーミングする胸腺細胞およびα４β７hiＣＤ４+記憶リンパ球で主に発現されることを見出した。本明細書に記載されるように、ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）は、結合して、胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）として既知のＣＣケモカインによって活性化される機能的ＣＣケモカインレセプターである。
【００２４】
本発明は、ケモカインレセプターＧＰＲ−９−６および該レセプターに結合する薬剤（例えば、リガンド、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト）に関する。１つの局面において、本発明は、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはＧＰＲ−９−６の一部に結合する抗体に関する。
【００２５】
抗体および抗体産生細胞
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、用語「抗体」はポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を包含することを意図する。用語ポリクローナルおよびモノクローナルは、抗体調製の等質性の程度をいい、特定の産生方法に限定されることを意図しない。本明細書で使用される用語「抗体」はまた、ヒト、キメラ、ヒト化、霊長類化、ベニア化 (veneered) または単鎖抗体のフラグメントを含む抗体の機能的フラグメントをも包含する。機能的フラグメントは、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する抗原結合性フラグメントを含む。例えば、限定されないがＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2フラグメントを含む哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部に結合しうる抗体フラグメントは、本発明により包含される。かかるフラグメントは、酵素開裂または組換え技術により産生されうる。例えば、パパインまたはペプシン開裂は、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2フラグメントを作製しうる。必要な基質特質性を有する他のプロテアーゼもまた、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2フラグメントを作製するのに使用しうる。１つまたはそれ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて、種々の切断型で、抗体はまた産生されうる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ1ドメインおよび重鎖のヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計されうる。
【００２６】
単鎖抗体、およびキメラ、ヒト化または霊長類化（ＣＤＲ移植）またはベニア化抗体、ならびに異なる種に由来する部分を含有するキメラ、ＣＤＲ移植またはベニア化単鎖抗体等もまた、本発明および用語「抗体」により包含される。これらの抗体の種々の部分は、通常の技術によりお互いに化学的に連結され得、または遺伝子工学技術を用いて連続的なタンパク質として調製され得る。例えば、キメラまたはヒト化鎖をコードする核酸は、発現して連続的なタンパク質を産生しうる。例えば、Cabillyら、米国特許第4,816,567号明細書;Cabillyら、欧州特許第0,125,023 B1号明細書;Bossら、米国特許第4,816,397 号明細書;Boss ら、欧州特許第0,120,694 B1号明細書;Neuberger,M.S. ら、WO 86/01533;Neuberger,M.S.ら、欧州特許第0,194,276 B1号明細書;Winter 、米国特許第5,225,539 号明細書;Winter 、欧州特許第0,239,400 B1号明細書;Queenら、欧州特許第0 451 216 B1号明細書; およびPadlan,E.A. ら、EP 0 519 596 A1 を参照のこと。また、霊長類化抗体に関しては、Newman,R. ら、BioTechnology,10:1455-1460(1992)、および単鎖抗体に関しては、Ladnerら、米国特許第4,946,778 号明細書およびBird,R.E. ら、Science,242:423-426(1988))を参照のこと。
【００２７】
ヒト化抗体は、標準の方法もしくは他の適切な技術を用いる合成または組換えＤＮＡ技術を用いて産生しうる。ヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）配列はまた、あらかじめヒト化した可変領域由来のＤＮＡテンプレート等のヒトまたはヒト化鎖をコードするＤＮＡ配列を変更するためのＰＣＲ変異誘発法を使用して構築されうる（例えば、Kamman,M. ら、Nucl.Acids Res. 、17:5404(1989));Sato,K.ら、Cancer Research,53:851-856(1993);Daugherty,B.L. ら、Nucleic Acids Res.、19(9):2471-2476(1991);ならびにLewis,A.P.およびJ.S.Crowe 、Gene、101:297-302(1991) を参照のこと）。これらのまたは他の適切な方法を用いて、変種もまた容易に産生しうる。１つの態様において、クローン化した可変領域が変異され得、所望の特異性を有する変種をコードする配列が選択されうる（例えば、ファージライブラリー由来；例えば、Krebber ら、米国特許第5,514,548 号明細書;Hoogenboom ら、WO 93/06213 、1993年４月１日発行）。
【００２８】
哺乳類（例えば、ヒト）ＧＰＲ−９−６に特異的な抗体は、単離されたおよび／または組換えヒトＧＰＲ−９−６またはその部分（合成ペプチド等の合成分子を含む）等の適切な免疫原に対して生じうる。抗体はまた、適切な宿主（例えば、マウス）を胸腺細胞等のＧＰＲ−９−６を発現する細胞で免疫化することにより生じうる。さらに、トランスフェクトされた細胞等の組換え哺乳類ＧＰＲ−９−６を発現する細胞が、免疫原としてまたはレセプターに結合する抗体に対するスクリーンに使用しうる（例えば、Chuntharapaiら、J.Immunol.、152:1783-1789(1994);Chuntharapaiら、米国特許第5,440,021 号明細書を参照のこと）。
【００２９】
免疫性抗原の調製、およびポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生は、いずれの適切な技術を使用しても行ないうる。種々の方法が記載されている（例えば、Kohlerら、Nature,256：495-497(1975) およびEur.J.Immunol.6:511-519(1976);Milsteinら、Nature,266:550-552(1977);Koprowskiら、米国特許第4,172,124 号明細書;Harlow,E.およびD.Lane、1988、Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor,NY);Current Protocols In Molecular Biology,Vol.2(Supplement 27,Summer '94)、Ausubel,F.M.ら編、(John Wiley & Sons:New York,NY) 、Chapter 11、(1991)を参照のこと）。一般的に、ハイブリドーマは、適切な不死細胞株（例えば、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３またはヘテロ骨髄腫(heteromyloma)等の骨髄腫細胞株）を、抗体産生細胞と融合することによって産生される。抗体産生細胞は、目的の抗原と免疫化したヒトまたは他の適切な動物の末梢血液、または好ましくは脾臓もしくはリンパ節から得られうる。融合した細胞（ハイブリドーマ）は、選択培地条件を使用して単離して、限界希釈によりクローン化しうる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により選択されうる。必要な特異性を有する抗体（例えば、ヒト抗体または抗原結合性フラグメント）を産生するまたは単離する他の適切な方法が使用されうる。かかる方法は、例えば、ライブラリー（ファージディスプレイライブラリー）由来の組換え抗体を選択する方法、またはヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫化による方法を含む。ヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えば、異種マウス(Xenomouse) （Abgenics,Freemont,CA）は、適切な方法を使用して産生しうる（例えば、Jakobovitsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551-2555(1993);Jakobovitsら、Nature、362:255-258(1993);Lonberg ら、米国特許第5,545,806 号明細書; Suraniら、米国特許第5,545,807 号明細書;Lonbergら、WO97/13852）。
【００３０】
１つの態様において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、哺乳類ＧＰＲ−９−６、好ましくは天然に存在するまたは内因性ヒトＧＰＲ−９−６に対する結合特異性を有する。他の態様において、抗体はＩｇＧまたはＩｇＧの抗原結合性フラグメントである。他の態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合してレセプターの１つまたはそれ以上の機能を阻害（低減または妨害）しうる。好ましい態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、レセプターへのリガンド（すなわち、１つまたはそれ以上のリガンド）の結合、および／またはリガンド結合に応答してＧＰＲ−９−６によって媒介される１つまたはそれ以上の機能を阻害しうる。
【００３１】
特定の態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、哺乳類（例えば、ヒト）ＧＰＲ−９−６への哺乳類（例えば、ヒト）ＴＥＣＫの結合および／またはＴＥＣＫ結合に応答してＧＰＲ−９−６によって媒介される１つまたはそれ以上の機能を阻害しうる。特に好ましい態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、ＴＥＣＫのＧＰＲ−９−６への結合を阻害し、それによってＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害しうる。
【００３２】
本明細書に示されるように、ＴＥＣＫはＧＰＲ−９−６に対するリガンドであり、ＧＰＲ−９−６を発現する細胞にＴＥＣＫ誘導性Ｃａ2+フラックスをもたらすレセプターを活性化する（図９Ａ）。組換え細胞を含む哺乳類ＧＰＲ−９−６発現細胞は、ＴＥＣＫ誘導性化学走性もまた受けうる（図８Ａ〜８Ｄ、８Ｆ、１０、１１Ａ〜１１Ｂおよび１３Ａ〜１３Ｂ）。リガンド結合（例えば、ＴＥＣＫ）に応答してＧＰＲ−９−６によって媒介されうる他の機能は、例えば、シグナル伝達〔例えば、ＧＰＲ−９−６関連Ｇタンパク質によるＧＤＰ／ＧＴＰ交換、サイトゾルの遊離カルシウム濃度〔Ｃａ2+〕iの一過性増加）ならびにＧＰＲ−９−６媒介過程および細胞応答（例えば、増殖、遊走、化学走性、分泌、脱顆粒、炎症伝達物質放出（リューコトリエン（例えば、リューコトリエンＣ4）等の生物活性脂質等）、呼吸バースト〕を含む。
【００３３】
他の態様において、抗体またはその抗原結合性フラグメントの哺乳類（例えば、ヒト）ＧＰＲ−９−６への結合は、配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチドにより阻害されうる。
【００３４】
本明細書に記載されるように、ヒトＧＰＲ−９−６に結合する「ｍＡｂ  ３Ｃ３」と称する抗体が産生されている。ｍＡｂ  ３Ｃ３は、マウスハイブリドーマＬＳ１２９−３Ｃ３−Ｅ３−１とも呼ばれているマウスハイブリドーマ３Ｃ３により産生され得、１９９９年３月４日にアクセッション番号ＨＢ−１２６５３として、LeukoSite,Inc.,215 First Street,Cambridge,MA 02142,U.S.A. を代表としてAmerican Type Culture Collection,10801 University Boulevard Manassas,Virginia 20110,U.S.A.に寄託された。他の態様において、本発明の抗ＧＰＲ−９−６抗体はｍＡｂ  ３Ｃ３またはその抗原結合性フラグメントである。他の態様において、抗体またはその抗原結合性フラグメントの哺乳類（例えば、ヒト）ＧＰＲ−９−６への結合は、ｍＡｂ  ３Ｃ３によって阻害されうる。かかる阻害は、同一または類似のエピトープに対する競合、立体障害の結果またはレセプターに抗体が結合すると誘導されるＧＰＲ−９−６のコンホメーションにおける変化によるものでありうる。さらに他の態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ｍＡｂ  ３Ｃ３と同一または類似のエピトープ特異性を有する。ｍＡｂ  ３Ｃ３のものと同一または類似であるエピトープ特異性を有する抗体は、種々の適切な方法によって同定されうる。例えば、ｍＡｂ  ３Ｃ３と同一または類似のエピトープ特異性を有する抗体は、哺乳類ＧＰＲ−９−６への結合に対してｍＡｂ  ３Ｃ３と競合する能力に基づいて同定されうる。他の例としては、ｍＡｂ  ３Ｃ３の結合および哺乳類ＧＰＲ−９−６と同一または類似のエピトープ特異性を有する抗体の結合は、シングルペプチド（例えば、天然ペプチド、合成ペプチド）により阻害されうる。ペプチドは、９〜約５０アミノ酸を含有しうる。好ましくは、ペプチドは、９〜約２６アミノ酸を含有する。さらに他の例において、ｍＡｂ  ３Ｃ３と同一または類似のエピトープ特異性を有する抗体は、キメラレセプターを用いて同定されうる（例えば、Ruckerら、Cell、87:437-446(1996)）。
【００３５】
本明細書に記載されるように、ヒトＧＰＲ−９−６に結合する「ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１」と称する抗体が産生されている。ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１は、マウスハイブリドーマＬＳ２７２  ＧＰＲ９６  １−５とも呼ばれているマウスハイブリドーマＧＰＲ−９６−１により産生され得、２０００年３月９日にアクセッション番号ＰＴＡ−１４７０の下で、LeukoSite,Inc., 215 First Street, Cambridge, MA 02142, U.S.A.を代表としてAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110, U.S.A.に寄託された。他の態様において、本発明の抗ＧＰＲ−９−６抗体は、ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１またはその抗原結合性フラグメントである。他の態様において、抗体または抗原結合性フラグメントの哺乳類（例えば、ヒト）ＧＰＲ−９−６への結合は、ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１によって阻害されうる。かかる阻害は、同一または類似のエピトープに対する競合、立体障害の結果または抗体がレセプターに結合すると誘導されるＧＰＲ−９−６のコンホメーションの変化によるものでありうる。さらに他の態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と同一または類似のエピトープ特異性を有する。ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１のものと同一または類似のエピトープ特異性を有する抗体は、本明細書に記載されたもののような種々の適切な方法によって同定されうる。
【００３６】
本発明はまた、哺乳類ＧＰＲ−９−６と少なくとも１つの他の抗原とに結合する二重特異性抗体、またはその機能的フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2）に関する。特定の態様において、二重特異性抗体、またはその機能的フラグメントは、ｍＡｂ  ３Ｃ３またはｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と少なくとも１つの他の抗体とに同一または類似のエピトープ特異性を有する〔例えば、米国特許第5,141,736 号明細書(Iwasaら）、米国特許第4,444,878 号明細書、5,292,668 号明細書、5,523,210 号明細書（全てPaulusら）および米国特許第5,496,549 号明細書（Yamazakiら）〕。
【００３７】
好ましい態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは哺乳類ＧＰＲ−９−６に特異的に結合する。本明細書で使用されるように、抗体−抗原相互作用をいう時の「特異的な抗体」または「特異的」という用語は、抗体が１つの抗原のみに結合できることを示すというよりむしろ、抗体が哺乳類ＧＰＲ−９−６に選択的に結合しうることを示すのに使用される。例えば、抗体は、低親和性で１つまたは数個の抗原に結合し、かつ高親和性でヒトＧＰＲ−９−６に結合しうる。適切な濃度で使用されるとき（例えば、治療または診断適用）、抗体が選択的にヒトＧＰＲ−９−６に結合しうるために、かかる抗体はヒトＧＰＲ−９−６に特異的であるとみなされる。哺乳類ＧＰＲ−９−６に選択性を与えるのに必要な抗体の濃度（例えば、低親和性結合を低減するまたは除去する濃度）は、適切な方法、例えば滴定によって容易に測定しうる。
【００３８】
他の局面において、本発明は、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを産生する単離された細胞に関する。好ましい態様において、本発明の単離された抗体産生細胞は、ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、リンパ芽球様細胞または組換え細胞等の不死細胞である。本発明の抗体産生細胞は、抗体産生のための他の使用を有する。例えば、本発明の細胞は、他の細胞（適切に薬物標識されたヒト骨髄腫、マウス骨髄腫、ヒト−マウスヘテロ骨髄腫(heteromyeloma)またはヒトリンパ芽球様細胞等）と融合して、例えば、追加のハイブリドーマを産生し得、したがって抗体をコードする遺伝子の導入を提供しうる。さらに、細胞は抗ＧＰＲ−９−６免疫グロブリン鎖をコードする核酸源として使用され得、それは単離および発現されうる〔例えば、いずれもの適切な技術を使用して他の細胞へ導入すると（例えば、Cabillyら、米国特許第4,816,567号明細書;Winter、米国特許第5,225,539号明細書）を参照のこと〕。例えば、再配列した抗ＧＰＲ−９−６軽鎖および／または重鎖をコードする配列を含有するクローンが単離されうる（例えば、ＰＣＲにより）か、またはｃＤＮＡライブラリーが細胞株から単離されたｍＲＮＡから調製され得、かつ抗ＧＰＲ−９−６免疫グロブリン鎖をコードするｃＤＮＡクローンが単離されうる。したがって、抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸またはその部分が得られ、種々の宿主細胞またはインビトロ翻訳系での特異的免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその変種（例えば、ヒト化免疫グロブリン）の産生に使用されうる。組換え抗体産生細胞を産生するために、核酸が１つまたはそれ以上の発現制御エレメントに作動可能に結合されるように（例えば、ベクターで、または宿主細胞ゲノムに組み込んで）、例えば、ｃＤＮＡ、またはヒト化免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン鎖等の変種をコードするその誘導体を含む核酸を、適切な原核生物または真核生物ベクター（例えば、発現ベクター）に入れ、適当な方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）により適切な宿主細胞に導入されうる。
【００３９】
本発明の抗体は、いずれもの適切な方法、例えば、哺乳類ＧＰＲ−９−６で免疫化された動物（例えば、マウス、ヒト、トランスジェニックマウス）から血清を採取することにより産生されうる。他の例において、適切な抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、リンパ芽球様細胞、組換え細胞）が、インビトロまたはインビボのどちらかで、発現に適切な条件下（例えば、誘導物質、適当な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補給剤を補充した適切な培地の存在下）で維持され得、それにより抗体または抗原結合性フラグメントが産生される。所望の場合、抗体または抗原結合性フラグメントは、回収および／または単離され（例えば、宿主細胞、培養培地から）そして所望の程度に精製されうる。抗体の回収および精製は、遠心分離、濾過、カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾過、疎水性相互作用、アフィニティ）、調製用の未変性電気泳動、沈降および限外濾過等の適切な方法を使用して達しうる。産生方法は、トランスジェニック動物の宿主細胞での発現を包含することが認識される（例えば、WO 92/03918、GenPharm International、1992年3月19日発行）。
【００４０】
本明細書に記載されるように、本発明の抗体およびその機能的フラグメントは、哺乳類ＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合を阻害（低減または妨害）しうるおよび／またはＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合に関連した１つまたはそれ以上の機能を阻害しうる。以下に説明するように、ＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合および／またはレセプターへのリガンドの結合に関連した機能の阻害を評価するために種々の方法が使用されうる。
【００４１】
抗ＴＥＣＫ抗体
他の局面において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、哺乳類ＴＥＣＫ、好ましくは天然に存在するまたは内因性ヒトＴＥＣＫに対する結合特異性を有する。１つの態様において、抗体は、ＩｇＧまたはＩｇＧの抗原結合性フラグメントである。他の態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、哺乳類ＴＥＣＫに結合して、レセプター（例えば、ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９））へのＴＥＣＫの結合、および／またはＴＥＣＫ結合に応答してレセプターにより媒介される１つまたはそれ以上の機能を阻害（低減または妨害）しうる。
【００４２】
特定の態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、哺乳類（例えば、ヒト）ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）への哺乳類（例えば、ヒト）ＴＥＣＫの結合および／またはＴＥＣＫ結合に応答してＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）により媒介される１つまたはそれ以上の機能を阻害しうる。特に好ましい態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）へのＴＥＣＫの結合を阻害し、それによりＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害しうる。
【００４３】
本明細書に記載されるように、ヒトＴＥＣＫに結合する「ｍＡｂ  １１．３．１」と称する抗体が産生されている。ｍＡｂ  １１．３．１は、マウスハイブリドーマＬＳ２５０  １１．３．１とも呼ばれているマウスハイブリドーマ１１．３．１により産生され得、２０００年３月９日にアクセッション番号ＰＴＡ−１４６９の下で、LeukoSite,Inc., 215 First Street, Cambridge, MA 02142,U.S.A.を代表としてAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110,U.S.A.に寄託された。他の態様において、本発明の抗ＴＥＣＫ抗体は、ｍＡｂ  １１．３．１またはその抗原結合性フラグメントである。他の態様において、哺乳類（例えば、ヒト）ＴＥＣＫへの抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合は、ｍＡｂ  １１．３．１によって阻害されうる。かかる阻害は、同一または類似のエピトープに対する競合、立体障害の結果またはレセプターへの抗体結合で誘導されるＴＥＣＫのコンホメーションにおける変化のためでありうる。さらに他の態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ｍＡｂ  １１．３．１と同一または類似のエピトープ特異性を有する。ｍＡｂ  １１．３．１のものと同一または類似であるエピトープ特異性を有する抗体は、種々の適切な方法によって同定されうる。例えば、ｍＡｂ  １１．３．１と同一または類似のエピトープ特異性を有する抗体は、哺乳類ＴＥＣＫへの結合に対してｍＡｂ  １１．３．１と競合する能力に基づいて同定されうる。他の例では、ｍＡｂ  １１．３．１の結合および哺乳類ＴＥＣＫに対して同一または類似のエピトープ特異性を有する抗体の結合は、シングルペプチド（例えば、天然ペプチド、合成ペプチド）により阻害されうる。ペプチドは、９〜約５０アミノ酸を含有しうる。好ましくは、ペプチドは、９〜約２６アミノ酸を含有する。さらに他の例において、ｍＡｂ  １１．３．１と同一または類似のエピトープ特異性を有する抗体は、キメラレセプターを用いて同定されうる（例えば、Ruckerら、Cell 87:437-446(1996)）。
【００４４】
本明細書に記載されるように、ヒトＴＥＣＫに結合する「ｍＡｂ  １６．３．１」と称する抗体が産生されている。ｍＡｂ  １６．３．１は、マウスハイブリドーマＬＳ２５０  １６．３．１とも呼ばれているマウスハイブリドーマ１６．３．１により産生され得、２０００年３月９日にアクセッション番号ＰＴＡ−１４６８の下で、LeukoSite,Inc., 215 First Street, Cambridge, MA 02142, U.S.A.を代表としてAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110,U.S.A.に寄託された。他の態様において、本発明の抗ＴＥＣＫ抗体は、ｍＡｂ  １６．３．１またはその抗原結合性フラグメントである。他の態様において、哺乳類（例えば、ヒト）ＴＥＣＫへの抗体または抗原結合性フラグメントの結合は、ｍＡｂ  １６．３．１によって阻害されうる。かかる阻害は、同一または類似のエピトープに対する競合、立体障害の結果または抗体結合で誘導されるＴＥＣＫのコンホメーションにおける変化のためでありうる。さらに他の態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ｍＡｂ  １６．３．１と同一または類似のエピトープ特異性を有する。ｍＡｂ  １６．３．１のものと同一または類似であるエピトープ特異性を有する抗体は、本明細書に記載される方法等の種々の適切な方法によって同定されうる。
【００４５】
本発明はまた、二重特異性抗体、またはその機能的フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）2〕に関し、それは、哺乳類ＴＥＣＫおよび少なくとも１つの他の抗原に結合する。特定の態様において、二重特異性抗体、またはその機能的フラグメントは、ｍＡｂ  １１．３．１またはｍＡｂ  １６．３．１と少なくとも１つの他の抗体と同一または類似のエピトープ特異性を有する〔例えば、米国特許第5,141,736号明細書(Iwasaら）、米国特許第4,444,878号明細書、5,292,668号明細書、5,523,210号明細書（全てPaulusら）および米国特許第5,496,549号明細書（Yamazakiら）〕。好ましくは、抗体または抗原結合性フラグメントは、哺乳類ＴＥＣＫに特異的に結合する。
【００４６】
別の局面において、本発明は、哺乳類ＴＥＣＫに結合する抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを産生する単離された細胞に関する。好ましい態様において、本発明の単離された抗体産生細胞は、ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、リンパ芽球様細胞または組換え細胞等の不死細胞である。
【００４７】
本発明の抗ＴＥＣＫ抗体は、任意の適切な方法、例えば、哺乳類ＴＥＣＫで免疫化された動物（例えば、マウス、ヒト、トランスジェニックマウス）由来の血清を採取することにより産生されうる。他の例において、適切な抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、リンパ芽球様細胞、組換え細胞）が、インビトロまたはインビボのどちらかで、発現に適切な条件下（例えば、誘導物質、適当な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補給剤を補充した適切な培地の存在下）で維持され得、それにより抗体または抗原結合性フラグメントが産生される。所望の場合、抗体または抗原結合性フラグメントは、回収および／または単離され（例えば、宿主細胞、培養培地から）そして所望の程度に精製されうる。抗体の回収および精製は、遠心分離、濾過、カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾過、疎水性相互作用、アフィニティー）、調製用の未変性電気泳動、沈降および限外濾過等の適切な方法を使用して達しうる。産生方法が、トランスジェニック動物の宿主細胞での発現を包含することが認識される（例えば、WO 92/03918、GenPharm International、1992年3月19日発行）。
【００４８】
本明細書に記載されるように、本発明の抗体およびその機能的フラグメントは、レセプターへの哺乳類ＴＥＣＫの結合を阻害（低減または妨害）しうるおよび／またはレセプターへのＴＥＣＫの結合に関連した１つまたはそれ以上の機能を阻害しうる。以下に説明するように、レセプターへのＴＥＣＫの結合および／またはレセプターへのリガンドの結合に関連した機能の阻害を評価するために種々の方法が使用されうる。
【００４９】
本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、種々の適切な結合を介して直接または間接的に他の診断用または治療用薬剤〔例えば、薬物（例えば、細胞傷害性薬剤）、治療用タンパク質（例えば、サイトカイン、増殖因子）、放射性核種〕に結合しうる。したがって、本発明は、抗原結合性融合タンパク質または免疫複合体を提供する。例えば、追加の診断用または治療用薬剤がタンパク質またはペプチドである場合、抗体または抗原結合性フラグメントと追加の薬剤とは、連続的なポリペプチド（すなわち、融合タンパク質）の部分でありうる。かかる融合タンパク質において、抗体または抗原結合性フラグメントと追加の薬剤とは、ポリペプチド上にいずれの適切な立体配置でも配置されうる。抗体または抗原結合性フラグメントと追加の薬剤とは、（すなわち、１つまたはそれ以上の）ペプチドリンカーを介して間接的に結合されうるか、またはお互いにペプチド結合を介して直接結合されうる。例えば、治療用タンパク質またはペプチド（例えば、サイトカインまたはケモカイン）のアミノ酸配列は、Ｆｖのアミノ末端またはカルボキシル末端に融合されうる。治療用タンパク質またはペプチドの配列はまたスペーサーとしても利用でき、Ｆｖの可変領域（重鎖可変領域、軽鎖可変領域）に結合するスペーサーに挿入されうる。
【００５０】
抗体または抗原結合性フラグメントと追加の薬剤とが連続的なポリペプチド（例えば、免疫複合体）の部分でない場合、それらは抗体または抗原結合性フラグメント上の官能基（もしくはその活性化誘導体）の追加の薬剤上の第２の官能基（もしくはその活性化誘導体）との反応により形成される化学結合（例えば、共有結合）により直接結合されうる。例えば、２つのチオールは反応してジスルフィド結合を形成し得、アミンはカルボン酸またはハロゲン化アシルと反応してアミドを形成しうる。使用されうる種々の他の適切な反応は、当該技術分野において公知である（例えば、Hermanson,G.T.、Bioconjugate Techniques,Academic Press:San Diego,CA(1996)を参照のこと）。抗体または抗原結合性フラグメントと追加の薬剤とは、適切なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して間接的に結合されうる。一般的に、リンカーは、反応して抗体との結合および追加の薬剤との結合を形成しうる２つの反応性基を含む。２つの異なる反応性基を含むリンカー（例えば、ヘテロ二官能性リンカー）は、追加の薬剤に抗体または抗原結合性フラグメントを選択的に結合させるために使用されうる。タンパク質、核酸、ペプチド、ビタミン、糖、脂質、小さい有機分子および他の適切な薬剤の間で複合体を形成するのに適切な多くのリンカーが、公知である（例えば、米国特許第5,856,571号明細書、5,880,270号明細書;Hermanson,G.T.、Bioconjugate Techniques,Academic Press:San Diego,CA(1996)を参照のこと）。
【００５１】
好ましくは、抗原結合性融合タンパク質および免疫複合体（例えば、抗体、細胞傷害性薬剤）の構成部分の独立した活性は、別個の分子の存在としての構成部分の活性と有意に異ならない。例えば、抗体または抗原結合性フラグメントがＧＰＲ−９−６に結合する場合、約１０００倍以内、好ましくは１００倍以内、より好ましくは１０倍以内の親和性または遊離の抗体または抗原結合性フラグメントの親和性と実質的に同一の親和性で、免疫複合体はＧＰＲ−９−６に結合しうる。
【００５２】
１つの態様において、免疫複合体は、リンカーを介して哺乳類ＧＰＲ−９−６（例えば、ヒトＧＰＲ−９−６）またはその抗原結合性フラグメントに結合する抗体に結合される適切な細胞傷害性薬剤を含有する。リンカーは、抗体および／または細胞傷害性薬剤の特異的部位との結合を形成しうる。例えば、リンカーは、抗体または抗原結合性フラグメントのシステイニル残基の側鎖、リジン残基の側鎖またはアスパルチルもしくはグルタミル残基の側鎖に結合しうる。抗体にコンジュゲートしうる適切な細胞傷害性薬剤は、例えば、化学療法用薬剤（例えば、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シクロヘキサミン（cyclohexamine））およびリシン、ゲロニン（gelonin）等の毒素が挙げられる。
【００５３】
他の態様において、本発明は、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’2、Ｆｖ）と細胞傷害性細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化および／または誘引しうるタンパク質またはペプチドとを含有する抗原結合性融合タンパク質を提供する。インターロイキン１２およびケモカイン６Ｃｋｉｎｅ（ＳＬＣ、Ｅｘｏｄｕｓ２、ＴＣＡとも呼ばれる）およびＣｋｂｅｔａ−１１（Ｍ３ｂｅｔａ、ＥＬＣとも呼ばれる）等の細胞傷害性細胞を活性化および／または誘引しうる多数のタンパク質およびペプチドが、当該技術分野において公知である（例えば、Kim C.H.ら、Cell.Immunomol. 、193:226-235(1999) ；Pham-Nguyen K.B.ら、Int.J.Cancer、81:813-819(1999)を参照のこと）。融合タンパク質を調製するためのいくつかの適切な方法が当該技術分野において公知であり、例えば、融合タンパク質は、米国特許第5,767,260号明細書、5,824,782号明細書および5,889,157号明細書に記載された方法または他の適切な方法を用いて調製されうる。米国特許第5,767,260号明細書、5,824,782号明細書および5,889,157号明細書の全教示は、参照により本明細書に取り込まれる。
【００５４】
結合アッセイ
本発明はまた、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種に結合しうる薬剤（すなわち、分子または化合物）を検出または同定するための方法に関する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「哺乳類ＧＰＲ−９−６」は、天然に存在するまたは内因性の哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質、および哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質に対応する天然に存在するまたは内因性のものと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質〔例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、合成有機化学の方法を用いて産生される）〕のことをいう。したがって、本明細書で定義される時、該用語は、哺乳類ＧＰＲ−９−６の成熟レセプタータンパク質、多型または対立遺伝子変種および他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたは他の細胞過程により産生される）、および前述のものの修飾または非修飾型（例えば、脂質化、グリコシル化、非グリコシル化）を含む。天然に存在するまたは内因性の哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質は、哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）に天然に存在する成熟ＧＰＲ−９−６、多型または対立遺伝子変種および他のアイソフォーム等の野生型タンパク質を含む。かかるタンパク質は、例えば、哺乳類ＧＰＲ−９−６を天然に産生する供給源から回収または単離されうる。哺乳類ＧＰＲ−９−６の多型、対立遺伝子、スプライスおよび他の天然に存在する変種は、特定の器官、組織または細胞で発現され得、改変された特性〔例えば、リガンド（例えば、ＴＥＣＫ）に対する変化した親和性〕および特殊な生物学的機能（例えば、Ｔ細胞発達、Ｔ細胞漸増）を有しうる。天然に存在するまたは内因性の哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質、および哺乳類ＧＰＲ−９−６に対応する天然に存在するまたは内因性のものと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳類の名前で呼ばれる。例えば、対応する哺乳類がヒトである場合、タンパク質は、ヒトＧＰＲ−９−６タンパク質（例えば、適切な宿主細胞で産生される組換えヒトＧＰＲ−９−６タンパク質）と称される。
【００５６】
哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質の「機能的変種」は、適切な方法〔例えば、変異誘発（例えば、化学的変異誘発、放射線変異誘発）、組換えＤＮＡ技術〕を用いて産生されうる機能的フラグメント、機能的変異タンパク質、および／または機能的融合タンパク質を含む。「機能的変種」は、結合活性、シグナル伝達活性および／または細胞応答を刺激する能力等の本明細書に記載されるような哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質に特徴的な少なくとも１つの機能を有するタンパク質またはポリペプチドである。好ましい機能的変種は、リガンド（すなわち、ＴＥＣＫ等の１つまたはそれ以上のリガンド）に結合しうる。
【００５７】
一般的に、哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質のフラグメントまたは部分は、成熟哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質に関するアミノ酸（すなわち、１つまたはそれ以上のアミノ酸）の欠失（すなわち、１つまたはそれ以上の欠失）を有するもの（Ｎ末端、Ｃ末端または内部欠失等）を含む。成熟哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質に関して連続アミノ酸のみが欠失しているかまたは非連続アミノ酸が欠失しているフラグメントまたは部分がまた構想される。
【００５８】
変異哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質は、１つまたはそれ以上の連続または非連続のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換により異なる哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質の天然または人工の変種（例えば、レセプターキメラ）を含む。かかる変異は、タンパク質の１つまたはそれ以上の部位、例えば、保存領域または非保存領域（他のケモカインレセプターまたはＧタンパク質結合レセプターと比較して）、細胞外領域、細胞質領域または膜貫通領域で生じうる。
【００５９】
融合タンパク質は、天然で見出されるような哺乳類ＧＰＲ−９−６では存在しない第２部分に共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して結合される第１部分としての哺乳類ＧＰＲ−９−６（例えば、ヒトＧＰＲ−９−６）またはその変種を含有するポリペプチドを包含する。したがって、第２部分は、アミノ酸、オリゴペプチドまたはポリペプチドでありうる。第２部分は、適切な位置、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端または内部で第１部分に結合されうる。１つの態様において、融合タンパク質は、第１部分として親和性リガンド（例えば、酵素、抗原、エピトープタグ（tag）、結合ドメイン）と、リンカー配列およびヒトＧＰＲ−９−６またはその部分を含有する第２部分とを含有する。追加の（例えば、第３または第４）部分が、適宜存在しうる。
【００６０】
１つの態様において、哺乳類ＧＰＲ−９−６の機能的変種（例えば、リガンド結合性変種）は、前記哺乳類ＧＰＲ−９−６と少なくとも約８０％アミノ酸配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％アミノ酸配列類似性、より好ましくは前記哺乳類ＧＰＲ−９−６と少なくとも約９５％アミノ酸配列類似性を共有する。他の態様において、機能的融合タンパク質は、哺乳類ＧＰＲ−９−６と少なくとも約８５％配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％配列類似性、より好ましくは哺乳類ＧＰＲ−９−６（例えば、ヒトＧＰＲ９−６（例えば、配列番号：２））と少なくとも約９５％配列類似性を共有する第１部分を含有する。他の態様において、機能的哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質または哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質の機能的変種は、天然に存在するヒトＧＰＲ−９−６（例えば、配列番号：２）と少なくとも約８０％アミノ酸配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％アミノ酸配列類似性、より好ましくは少なくとも約９５％アミノ酸配列類似性を共有する。ＰＡＭ２５０残基重量表、ギャップペナルティ（gap penalty）１０、ギャップ長ペナルティ１０およびデフォルト（default）パラメーター（ペアワイズ(pairwise)配列パラメーター：クツプル(ktuple)＝１、ギャップペナルティー＝３、ウインドウ＝４および対角セーブ(diagonals saved)＝５）でＣｌｕｓｔａｌ法を使用するＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ（DNASTAR,Inc.,Madison,WI ）等の適切な配列のアラインメントアルゴリズムを使用して、アミノ酸配列類似性は決定されうる。他の態様において、機能的変種は、天然に存在する核酸配列とは異なる核酸配列によりコードされるが、遺伝コードの縮重のために、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその部分をコードする。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「哺乳類ＴＥＣＫ」は、天然に存在するまたは内因性の哺乳類ＴＥＣＫタンパク質、および哺乳類ＴＥＣＫタンパク質に対応する天然に存在するまたは内因性のものと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質〔例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、合成有機化学の方法を用いて産生される）〕のことをいう。したがって、本明細書で定義される時、該用語は、哺乳類ＴＥＣＫの成熟レセプタータンパク質、多型または対立遺伝子変種、および他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたは他の細胞過程により産生される）、および前述のものの修飾または非修飾型（例えば、脂質化、グリコシル化、非グリコシル化）を含む。天然に存在するまたは内因性の哺乳類ＴＥＣＫタンパク質は、哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）に天然に存在する成熟ＴＥＣＫ、多型または対立遺伝子変種および他のアイソフォーム等の野生型タンパク質を含む。かかるタンパク質は、例えば、哺乳類ＴＥＣＫを天然に産生する供給源から回収または単離されうる。
【００６２】
哺乳類ＴＥＣＫの多型、対立遺伝子、スプライスおよび他の天然に存在する変種は、特定の器官、組織または細胞で発現され得、変化した特性〔例えば、レセプター（例えば、ＧＰＲ−９−６）に対する変化した親和性〕および特殊な生物学的機能（例えば、Ｔ細胞発達、Ｔ細胞漸増）を有しうる。例えば、本明細書に記載されるように、ヒトＴＥＣＫの選択的スプライス型は、１１０位のアミノ酸（Ａｌａ  １１０）が欠失しており、胸腺よりも小腸でより多く見られる。
【００６３】
天然に存在するまたは内因性の哺乳類ＴＥＣＫタンパク質、および哺乳類ＴＥＣＫに対応する天然に存在するまたは内因性のものと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳類の名前で呼ばれる。例えば、対応する哺乳類がヒトである場合、タンパク質はヒトＴＥＣＫタンパク質（例えば、適切な宿主細胞で産生された組換えヒトＴＥＣＫタンパク質）と称される。
【００６４】
哺乳類ＴＥＣＫタンパク質の「機能的変種」は、適切な方法〔例えば、変異誘発（例えば、化学的変異誘発、放射線変異誘発）、組換えＤＮＡ技術〕を用いて産生されうる機能的フラグメント、機能的変異タンパク質、および／または機能的融合タンパク質を含む。「機能的変種」は、結合活性、シグナル伝達活性および／または細胞応答を刺激する能力等の本明細書に記載されるような哺乳類ＴＥＣＫタンパク質に特徴的な少なくとも１つの機能を有するタンパク質またはポリペプチドである。好ましい機能的変種は、レセプター〔例えば、ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）〕に結合しうる。
【００６５】
一般的に、哺乳類ＴＥＣＫタンパク質のフラグメントまたは部分は、成熟哺乳類ＴＥＣＫタンパク質に関するアミノ酸（すなわち、１つまたはそれ以上のアミノ酸）の欠失（すなわち、１つまたはそれ以上の欠失）を有するもの（Ｎ末端、Ｃ末端または内部欠失等）を含む。成熟哺乳類ＴＥＣＫタンパク質に関して連続アミノ酸のみが欠失しているかまたは非連続アミノ酸が欠失しているフラグメントまたは部分がまた構想される。
【００６６】
成熟哺乳類ＴＥＣＫタンパク質は、１つまたはそれ以上の連続または非連続のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換により異なる哺乳類ＴＥＣＫタンパク質の天然または人工の変種を含む。かかる変異は、タンパク質の１つまたはそれ以上の部位、例えば、保存領域または非保存領域（他のケモカインと比較して）で生じうる。
【００６７】
融合タンパク質は、天然で見出されるような哺乳類ＴＥＣＫでは存在しない第２部分に共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して結合された第１部分としての哺乳類ＴＥＣＫ（例えば、ヒトＴＥＣＫ）またはその変種を含有するポリペプチドを包含する。したがって、第２部分は、アミノ酸、オリゴペプチドまたはポリペプチドでありうる。第２部分は、適切な位置、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端または内部で第１部分に結合されうる。１つの態様において、融合タンパク質は、第１部分として親和性リガンド（例えば、酵素、抗原、エピトープタグ、結合ドメイン）と、リンカー配列およびヒトＴＥＣＫまたはその部分を含有する第２部分とを含有する。追加の（例えば、第３または第４）部分が適切に存在しうる。
【００６８】
１つの態様において、哺乳類ＴＥＣＫの機能的変種（例えばリガンド結合性変種）は、前記哺乳類ＴＥＣＫと少なくとも約８０％アミノ酸配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％アミノ酸配列類似性、より好ましくは前記哺乳類ＴＥＣＫ（例えば、配列番号：９、配列番号：１１）と少なくとも約９５％アミノ酸配列類似性を共有する。他の態様において、機能的融合タンパク質は、哺乳類ＴＥＣＫと少なくとも約８５％配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％配列類似性、より好ましくは哺乳類ＴＥＣＫ〔例えば、ヒトＴＥＣＫ（例えば、配列番号：９、配列番号：１１）〕と少なくとも約９５％配列類似性を共有する第１部分を含有する。他の態様において、機能的哺乳類ＴＥＣＫタンパク質または哺乳類ＴＥＣＫタンパク質の機能的変種は、天然に存在するヒトＴＥＣＫ（例えば、配列番号：９、配列番号：１１）と少なくとも約８０％アミノ酸配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％アミノ酸配列類似性、より好ましくは少なくとも約９５％アミノ酸配列類似性を共有する。アミノ酸配列類似性は、ＰＡＭ２５０残基重量表、ギャップペナルティ１０、ギャップ長ペナルティ１０およびデフォルトパラメーター（ペアワイズ配列パラメーター：クツプル＝１、ギャップペナルティー＝３、ウインドウ＝４および対角セーブ＝５）でＣｌｕｓｔａｌ法を使用する、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ（DNASTAR,Inc.,Madison,WI ）等の適切な配列のアラインメントアルゴリズムを使用して決定されうる。他の態様において、機能的変種は、天然に存在する核酸配列とは異なる核酸配列によりコードされるが、遺伝コードの縮重のために、哺乳類ＴＥＣＫまたはその部分をコードする。
【００６９】
本発明はまた、哺乳類ＧＰＲ−９−６および哺乳類ＴＥＣＫの天然に存在する変種（例えば、スプライス変種、対立遺伝子変種）および該変種をコードする核酸（例えば、配列番号：１０、配列番号：１１）に関する。
【００７０】
哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を含有する組成物は、レセプターに結合しうる薬剤を検出および／または同定するためまたはＴＥＣＫに結合しうる薬剤を検出および／または同定するために結合アッセイで使用されうる。結合アッセイでの使用に適する組成物は、例えば、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を天然に発現する細胞〔例えば、胸腺細胞、ＧＰＲ−９−６+ＣＬＡ-veα４β７hiＣＤ４+記憶リンパ球、細胞株（例えば、ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８２）、ＭＯＬＴ−１３（M.Brenner 、Brigham およびWomans Hospital,Boston,MA）上皮内リンパ球（ＩＥＬ）、固有層リンパ球（ＬＰＬ）〕および哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種をコードする外因性核酸を含有する組換え細胞が挙げられる。結合アッセイでの使用に適する組成物はまた、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を含有する膜調製物を含む。かかる膜調製物は、天然（例えば、原形質膜）または合成膜を含みうる。好ましくは、膜調製物は、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を発現する細胞の膜画分である。
【００７１】
１つの態様において、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する薬剤を検出または同定する方法は、参照薬剤（例えば、リガンド（例えば、ＴＥＣＫ）、抗体）の結合を阻害する試験薬剤の能力が評価される競合結合アッセイである。例えば、参照薬剤は、本明細書に記載のような適切な標識で標識され得、アッセイで存在するＧＰＲ−９−６を飽和するために必要な標識参照薬剤の量が測定されうる。飽和量の標識参照薬剤および種々の量の試験薬剤は、測定される結合および複合体形成に適切な条件下で、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を含有する組成物と接触されうる。
【００７２】
参照薬剤とＧＰＲ−９−６またはその機能的変種との複合体の形成は、適切な方法を用いて直接または間接的に検出または測定しうる。例えば、薬剤は適切な標識で標識され得、複合体の形成が標識の検出により測定されうる。複合体の特異性は、非標識薬剤または標識のみ等の適切な対照を使用して測定されうる。薬剤と哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種との複合体の検出での使用に適する標識は、例えば、放射性同位体、エピトープ、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジン）、スピン標識、酵素、蛍光群または化学発光群を含む。標識の使用が望ましくない場合、複合体の形成は、表面プラズモン共鳴等の他の適切な方法を使用して検出されうる。
【００７３】
参照薬剤と哺乳類ＧＰＲ−９−６との複合体の形成を阻害する試験薬剤の能力は、標識参照薬剤の特異的結合の５０％阻害に必要な試験薬剤の濃度（ＩＣ50値）として報告されうる。特異的な結合は、好ましくは、全結合（例えば、複合体での全標識）マイナス非特異的結合として定義される。非特異的結合は、好ましくは、過剰の非標識参照薬剤の存在下で形成された複合体でなお検出される標識の量として定義される。該方法での使用に適する参照薬剤は、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種に特異的に結合する分子および化合物、例えば、ＧＰＲ−９−６のリガンド（例えば、ＴＥＣＫ）または抗体を含む。好ましい態様において、参照薬剤は、ｍＡｂ  ３Ｃ３またはｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１である。特に好ましい態様において、参照薬剤は、哺乳類（例えば、ヒト）ＴＥＣＫである。
【００７４】
本発明はまた、哺乳類ＴＥＣＫに結合する薬剤を検出または同定する方法に関する。１つの態様において、哺乳類ＴＥＣＫに結合する薬剤を検出または同定する方法は、ＴＥＣＫ性結合参照薬剤（例えば、レセプター（例えば、ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）、抗体）に対するＴＥＣＫまたはその機能的変種の結合を阻害する試験薬剤の能力が評価される競合結合アッセイである。例えば、ＴＥＣＫ（例えば、ヒトＴＥＣＫ）は、本明細書に記載のような適切な標識で標識され得、アッセイで存在するＧＰＲ−９−６を飽和するために必要な標識ＴＥＣＫの量が測定されうる。飽和量の標識ＴＥＣＫおよび種々の量の試験薬剤は、測定される結合および複合体形成に適切な条件下で、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を含有する組成物と接触されうる。ＴＥＣＫとＧＰＲ−９−６またはその機能的変種との複合体の形成は、適切な方法を用いて直接または間接的に検出または測定しうる。例えば、ＴＥＣＫは適切な標識で標識され得、複合体の形成が標識の検出により測定されうる。複合体の特異性は、非標識ＴＥＣＫまたは標識のみ等の適切な対照を使用して測定されうる。ＴＥＣＫと哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種との複合体の検出での使用に適する標識は、例えば、放射性同位体、エピトープ、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジン）、スピン標識、酵素、蛍光群または化学発光群を含む。標識の使用が望ましくない場合、複合体の形成は、表面プラズモン共鳴等の他の適切な方法を使用して検出されうる。
【００７５】
ＴＥＣＫと参照試薬（例えば、哺乳類ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９））との複合体の形成を阻害する試験薬剤の能力は、前記のように、標識参照薬剤の特異的結合の５０％阻害に必要な試験薬剤の濃度（ＩＣ50値）として報告されうる。
【００７６】
本発明はまた、本明細書に記載のように、治療に使用されうる薬剤（すなわち、分子または化合物）を同定または単離する方法に関する。１つの態様において、薬剤は、前記のような競合結合アッセイで同定または単離される。他の態様において、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を発現する細胞は、レセプターの発現に適切な条件下で維持されうる。細胞は、結合に適切な条件下（例えば、適切な結合緩衝液中）で薬剤（例えば、リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト）と接触させ、薬剤と哺乳類ＧＰＲ−９−６との複合体の形成が、適切な技術を使用して検出または測定される。例えば、薬剤は本明細書に記載のように標識され得、薬剤−ＧＰＲ−９−６複合体に存在する標識の量が測定されうる。複合体形成の程度は、適切な対照〔例えば、薬剤の非存在下に測定されるバックグラウンドと比較して、２次薬剤（すなわち、標準、イソタイプ対照）の結合と比較して、ＧＰＲ−９−６を発現しない細胞への薬剤の結合と比較して〕に対して測定されうる。
【００７７】
したがって、本発明は、炎症性疾患を有する被験体を治療するのに使用される薬剤を同定または単離する方法に関する。特定の態様において、該方法は、クローン病または大腸炎等の粘膜組織に関連した炎症性疾患を有する被験体を治療するのに使用される薬剤を同定または単離する方法である。他の態様において、該方法は、被験体の白血球のＧＰＲ−９−６媒介性ホーミングを阻害するのに使用される薬剤を同定または単離する方法である。他の態様において、該方法は、被験体におけるＧＰＲ−９−６機能を調節するのに使用される薬剤を同定または単離する方法である。
【００７８】
本発明はまた、癌腫〔例えば、急性または慢性白血病（例えば、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、急性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、慢性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、慢性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキン病、Ｔ細胞リンパ腫）、癌腫（例えば、胸（例えば、腺管癌、小葉癌）、卵巣、精巣、前立腺、偏平上皮細胞、基底細胞）、黒色腫、骨髄腫、腺腫〕を有する被験体を治療するのに使用される薬剤を同定または単離する方法に関する。特定の態様において、該方法は、白血病〔例えば、急性リンパ芽球性白血病（例えば、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、急性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病）、慢性リンパ芽球性白血病、例えば、慢性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、慢性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病）〕を有する被験体を治療するのに使用される薬剤を同定または単離する方法である。
【００７９】
薬剤は、本明細書に記載の方法に従って、個々にスクリーンされうるか、または１つまたはそれ以上の薬剤が同時に試験されうる。化合物の混合物が試験される場合、記載された過程により選択された化合物は（適当に）分離され得、適切な方法（例えば、配列決定、クロマトグラフィー）により同定されうる。試験試料における１つまたはそれ以上の化合物（例えば、リガンド、インヒビター、プロモーター）の存在はまた、これらの方法に従って測定されうる。
【００８０】
哺乳類ＧＰＲ−９−６または哺乳類ＴＥＣＫに結合し、かつ本明細書に記載された治療方法で有用な薬剤は、例えば、本明細書に記載のアッセイでライブラリーもしくは国立癌研究所の化学物質貯蔵所（Chemical Repository)等の分子の所蔵品をスクリーニングすることにより、または他の適切な方法を使用することにより、同定されうる。コンビナトリアル（combinatorial）化学合成または他の方法により製造された化合物（例えば、有機化合物、組換えまたは合成ペプチド、「ペプトイド」、核酸）の大きなコンビナトリアルライブラリーが、試験されうる〔例えば、Zuckerman,R.N.ら、J.Med.Chem.,37:2678-2685(1994)およびそれに引用された参考文献を参照のこと；また、標識化合物に関してOhlmeyer,M.H.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922-10926(1993)およびDeWitt,S.H. ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909-6913(1993)を参照のこと；Rutter,W.J.ら、米国特許第5,010,175号明細書;Huebner,V.D.ら、米国特許第5,182,366 号明細書; およびGeysen,H.M.、米国特許第4,833,092号明細書〕。本方法によるコンビナトリアルライブラリーから選択された化合物が独特の標識を有する場合、クロマトグラフィー法による個々の化合物の同定が達成されうる。１つの態様において、本発明の方法に従って試験される薬剤の集団は、ケモカインまたはその変異体もしくはアナログを含有しない。
【００８１】
機能的アッセイ
哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種に結合する薬剤は、かかる薬剤が本明細書に記載のようなＧＰＲ−９−６の１つまたはそれ以上の機能を調節（阻害（低減または妨害）または促進）しうるかどうか測定するために、１つまたはそれ以上の適切なアッセイでさらに研究されうる。例えば、薬剤は、細胞外酸性化アッセイ、カルシウムフラックスアッセイ、リガンド結合アッセイ、化学走性アッセイまたは脱顆粒もしくは炎症伝達物質放出をモニターするアッセイで試験されうる（例えば、Hesselgesserら、J.Biol.Chem.273(25):15687-15692(1998)およびWO 98/02151を参照のこと）。
【００８２】
例えば、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する薬剤は、適切な細胞を使用する白血球化学走性アッセイで試験されうる。適切な細胞は、例えば、哺乳類ＧＰＲ−９−６を発現し、かつＧＰＲ−９−６リガンド誘導（例えば、ＴＥＣＫ誘導）性化学走性を受ける細胞株、組換え細胞または単離された細胞を含む。１つの例において、ＧＰＲ−９−６発現組換えＬ１．２細胞（Ｌ１．２細胞に関してCampbellら、J Cell Biol,134:255-266(1996) を参照のこと）は、内皮貫通（transendothelial）遊走アッセイの改良法で使用されうる（Carr,M.W. ら、T.A.、Proc.Natl Acad Sci、USA 、(91):3652(1994)）。このアッセイで使用される内皮細胞は、好ましくは、内皮細胞株、ＥＣＶ  ３０４であり、それは、American Type Culture Collection（Manassas,VA）から得られうる。内皮細胞は、３．０μｍの孔サイズを有する６．５ｍｍ直径のトランスウェル培養インサート（Transwell culture insert）（Costar Corp.、Cambridge,MA）で培養されうる。ＥＣＶ  ３０４細胞に対する培養培地は、Ｍ１９９＋１０％  ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、および抗生物質からなりうる。アッセイ培地は、０．５％ＢＳＡを含む等量部のＲＰＭＩ  １６４０とＭ１９９とからなりうる。アッセイの２時間前に、２×１０5ＥＣＶ  ３０４細胞が２４ウェルトランスウェル化学走性プレートの各インサート上にプレートされ、３７℃でインキュベートされうる。ＴＥＣＫ等の化学走性因子（Peprotech 、Rocky Hill、NJ）（アッセイ培地で希釈）は、最終容量６００μＬで２４ウェル組織培養プレートに添加されうる。内皮で覆われたトランスウェルが各ウェルに挿入され得、研究されている白血球型の１０6細胞が、アッセイ培地の最終容量１００μＬで上のチャンバーに添加される。プレートは、次いで５％ＣＯ2／９５％空気で、１〜２時間３７℃でインキュベートされうる。インキュベートの間に下のチャンバーに遊走する細胞は、例えばフローサイトメトリーを使用してカウントされうる。フローサイトメトリーにより細胞をカウントするために、下のチャンバーから５００μＬの細胞懸濁液をチューブに入れ、関連するカウントが、設定した時間間隔、例えば３０秒で得られうる。このカウント法は高い再現性があり、白血球のゲーティング（gating）、および解析由来の残骸または他の細胞型の排除を可能にする。代わりに、細胞は顕微鏡でカウントされうる。化学走性を阻害または促進しうる薬剤を評価するためのアッセイは、１％までＤＭＳＯ共溶媒を含むアッセイ培地で、細胞添加の前に上と下の両方のチャンバーに薬剤溶液が添加されうることを除いて、上記対照実験と同一の方法で行なわれうる。化学走性を阻害または促進する薬剤の能力は、薬剤を含むウェルで下のチャンバーに遊走する細胞の数を、対照ウェルで下のチャンバーに遊走する細胞の数と比較することにより測定されうる。対照ウェルは、薬剤を含まないが、等量のＤＭＳＯを含みうる。
【００８３】
哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する薬剤はまた、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を発現する適切な細胞を使用して、活性レセプターによって誘導される細胞応答をモニターすることにより評価されうる。例えば、エキソサイトーシス（例えば、エステラーゼ（例えば、セリンエステラーゼ）、パーフォリン、および／またはグランザイム）等の１つまたはそれ以上の酵素または他の顆粒成分の放出をもたらす細胞の脱顆粒、炎症伝達物質放出（ロイコトリエン（例えば、ロイコトリエンＣ4）等の生物活性脂質の放出）、および呼吸バーストは、当該技術分野で公知の方法または他の適切な方法によりモニターされうる〔例えば、顆粒誘導性セリンエステラーゼの放出のアッセイに関してTaub,D.D.ら、J.Immunol.、155:3877-3888(1995)；酵素およびグランザイム放出のアッセイに関してLoetscherら、J.Immunol.、156:322-327(1996)；呼吸バーストに関してRot,A.ら、J.Exp.Med.、176:1489-1495(1992)；Bischoff,S.C.ら、Eur.J.Immunol.、23:761-767(1993)およびBaggliolini,M.およびC.A.Dahinden、Immunology Today、15:127-133(1994)を参照のこと〕。
【００８４】
１つの態様において、ＧＰＲ−９−６の機能を阻害または促進しうる薬剤が、脱顆粒またはこの機能の可能な細胞によるエキソサイトーシス時の酵素の放出をモニターすることにより同定される。哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を発現する細胞は、適切な条件下で適切な培地で維持され得、脱顆粒が誘導されうる。細胞を試験する薬剤と接触させ、酵素放出が評価されうる。培地への酵素の放出は、免疫学的アッセイ、または酵素活性に対する生化学的アッセイ等の適切なアッセイを使用して検出または測定されうる。
【００８５】
アッセイの構成部分（例えば、基質、補因子、抗体）を培地に導入する（例えば、細胞と薬剤とを合わせる前に、同時にまたは後に）ことにより、培地は直接アッセイされうる。アッセイは、アッセイ前に細胞から分離されたまたはさらに処理された（例えば、分画化）培地でもまた行なわれうる。例えば、簡便なアッセイが、セリンエステラーゼ等の酵素に対して利用可能である（顆粒由来のセリンエステアーゼの放出に関して、例えば、Taub,D.D.ら、J.Immunol.、155:3877-3888(1995)を参照のこと）。
【００８６】
他の態様において、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を発現する細胞をＧＰＲ−９−６（例えば、ＴＥＣＫ）のリガンドと合わせ、その前に、その後にまたは同時に、試験される薬剤を添加し、そしてＣａ2+フラックスが評価される。リガンド誘導性Ｃａ2+フラックスの阻害は、薬剤が哺乳類ＧＰＲ−９−６機能のインヒビターまたアンタゴニストであることを示す。
【００８７】
細胞接着は、当該技術分野で公知の方法または他の適切な方法によりモニターされうる。リンパ球のケモカインレセプターの関与(engagement)は、インテグリン活性化、脈管構造または脈管周囲の空間で発現される接着分子への接着の誘発を生じうる。１つの態様において、ＧＰＲ−９−６機能のリガンド、インヒビターおよび／またはプロモーターが、接着可能な細胞による細胞接着をモニターすることにより同定される。例えば、試験される薬剤は、（ａ）哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその機能的変種を発現する細胞（好ましくは、レセプターとトランスフェクトされると接着能力を得る非接着細胞）、（ｂ）適切な接着分子を含有する構成物（例えば、フィブロネクチン等の接着分子でコートされた培養ウェル等の基材）、および（ｃ）リガンドまたはプロモーター（例えば、アゴニスト）と合わされ、リガンド誘導性接着またはプロモーター誘導性接着に簡便な条件下で維持されうる。蛍光染料での細胞の標識は、接着細胞を検出する適切な手段を提供する。非接着細胞は除去され得（例えば、洗浄によって）、接着細胞の数が測定されうる。リガンドまたはプロモーター誘導性接着を阻害するまたは増強する薬剤の効果は、それぞれインヒビター活性またはプロモーター活性を示しうる。アッセイで活性な薬剤は、結合、シグナルおよび／または細胞応答のインヒビターおよびプロモーターを含む。他の態様において、試験される薬剤は、リガンド誘導性接着またはプロモーター誘導性接着に適切な条件下で、哺乳類ＧＰＲ−９−６を発現する細胞および適切な接着分子を含有する組成物と合わせられ得、接着がモニターされる。適切な対照と比較して増加した接着は、リガンドおよび／またはプロモーターの存在を示す。
【００８８】
哺乳類ＴＥＣＫまたはその機能的変種に結合する薬剤は、該薬剤がＴＥＣＫ結合時のレセプター（例えば、ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９））により媒介される１つまたはそれ以上の機能を調節（阻害（低減または妨害）または促進）しうるかどうかを測定するために、１つまたはそれ以上の適切なアッセイでさらに研究されうる。ＴＥＣＫ結合性薬剤がケモカインの機能を調節しうるかどうかを評価するための適切なアッセイは、ＴＥＣＫレセプター〔例えば、ヒトＧＰＲ−９−６（ヒトＣＣＲ９）〕およびＴＥＣＫ（例えば、ヒトＴＥＣＫ）を発現する細胞が使用される本明細書に記載されるもの等のアッセイを含む。
【００８９】
哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質（ＣＣＲ９）に結合する薬剤、哺乳類ＴＥＣＫタンパク質に結合する薬剤および／またはＧＰＲ−９−６タンパク質機能またはＴＥＣＫタンパク質機能の調節剤（インヒビター、プロモーター）を検出または同定するために、前記結合アッセイおよび機能的アッセイは、単独で、またはお互いにもしくは他の適切な方法と組み合わせて、使用されうる。本発明のインビトロ法は、多数のサンプルが処理される（例えば、９６ウェル形態）高スループットスクリーニングに適合されうる。高スループットスクリーニングに適切なレベルで哺乳類ＧＰＲ−９−６（例えば、ヒトＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９））またはその機能的変種を発現する細胞が使用され得、したがってＧＰＲ−９−６に結合する薬剤、ＴＥＣＫに結合する薬剤、およびＧＰＲ−９−６またはＴＥＣＫ機能の調節剤の同定および／または単離に特に価値がある。ＧＰＲ−９−６の発現は、種々の方法でモニターされうる。例えば、発現は、レセプターまたはその一部に結合する本発明の抗体を用いてモニターされうる。また、商業的に入手可能な抗体は、レセプタータンパク質またはポリペプチド（例えば、ＦＬＡＧ標識レセプター）を含有する抗原標識またはエピトープ標識融合タンパク質の発現を検出するために使用され得、所望のレベルでＧＰＲ−９−６を発現する細胞が選択されうる（例えば、フローサイトメトリーにより）。
【００９０】
炎症のモデル
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントならびに本明細書に記載される方法により同定される薬剤の有効性を治療剤と同様にインビボで評価するために使用されうる炎症のインビボモデルが入手可能である。例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモットまたは霊長類（例えば、アカゲザルマカク（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ））等の適切な動物に哺乳類ＧＰＲ−９−６と反応性であるケモカインおよび抗体またはその抗原結合性フラグメントの皮内注入による白血球浸潤が、モニターされうる（例えば、Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：５９−６５（１９９２）；Ｚａｃｈａｒｉａｅ、Ｃ．Ｏ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：２１７７−２１８２（１９９０）；Ｊｏｓｅ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：８８１−８８７（１９９４））。一つの態様では、皮膚バイオプシーが、白血球（例えば、ＧＰｒ−９−６+Ｔ細胞）の浸潤について組織学的に評価される。他の態様では、化学走性および管外遊走が可能である標識された細胞（例えば、例として111Ｉｎで標識した哺乳類ＧＰＲ−９−６を発現する安定に形質移入した細胞）が動物に投与される。例えば、哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合する評価対象の抗体または薬剤は、ＧＰＲ−９−６リガンドまたはアゴニスト（例えば、ＴＥＣＫ）が試験動物に投与される前、それと同時または後のいずれかに投与されうる。抗体または薬剤の非存在下での炎症の程度と比較した、抗体または薬剤の存在下での炎症の程度の減少は、阻害の指標である。
【００９１】
本明細書中に記載するように、ＧＰＲ−９−６は、粘膜の部位（例えば、ＣＬＡ-veα４β７highＣＤ４+リンパ球）にホーミング（ｈｏｍｅ）する記憶リンパ球上に選択的に発現される。従って、粘膜（例えば、気道、泌尿生殖器、消化管および関連する器官または組織（例えば、膵臓、肝臓、胆嚢））の炎症疾患の動物モデルが、ＧＰＲ−９−６調節因子の治療有効性を評価するために使用されうる。例えば、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントならびに本明細書に記載される方法により同定される薬剤が、炎症腸疾患のコットントップタマリン（ｃｏｔｔｏｎ−ｔｏｐ  ｔａｍａｒｉｎ）モデルにおいて研究されうる（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３７２−３８０  （１９９３））。ＣＤ４５ＲＢHi／ＳＣＩＤモデルは、クローン病および潰瘍性結腸炎の両方に類似性を有するマウスモデルを提供する（Ｐｏｗｒｉｅ，Ｆ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：５５３−５６２（１９９４））。このモデルにおける治療有効性は、例えば、薬剤の投与（例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）および経口（ｐ．ｏ．））後の大腸への111Ｉｎ標識細胞の補充の阻害および大腸の粘膜固有層におけるＣＤ４+Ｔリンパ球の数における減少等のパラメータを用いることにより評価されうる。ヒト炎症腸疾患と類似した腸病巣を発生するノックアウトマウスもまた記載されており（Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．およびＥｈｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｏ．、Ｃｅｌｌ、７５：２０３−２０５（１９９３））、ＮＯＤマウスはインスリン依存性糖尿病の動物モデルを提供する。
【００９２】
本明細書に記載されるように、ＧＰＲ−９−６はまた、ガン細胞上に発現される。従って、癌の動物モデルは、インビボでのＧＰＲ−９−６調節因子の抗癌活性を評価するために使用されうる。例えば、白血病（例えば、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病）の治療用の治療剤としての、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントならびに本明細書に記載される方法により同定される抗体の有効性は、ウサギ（Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｒ．Ｍ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７４：６９６−７１０（１９９６））またはＳＣＩＤもしくはＮＯＤマウス（Ｓｔｅｌｌｅ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ，９０：２０１５−２０１９（１９９７））において評価されうる。
【００９３】
診断適用
本発明の抗体は、ＧＰＲ−９−６が細胞の表面上で検出されうる手順における適用を有する。該レセプターは、これが発現される白血球細胞型のマーカーを提供する。例えば、本明細書に記載の抗体（例えば、ｍＡｂ  ３Ｃ３、ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１）などの、哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質またはペプチドに対する抗体は、哺乳類ＧＰＲ−９−６を発現する細胞を検出および／または定量するために使用することができる。一態様では、抗体を用いて（例えば、ＧＰＲ−９−６+ＣＬＡ-veα４β７+veＣＤ４+記憶Ｔ細胞などの粘膜にホーミング（ｈｏｍｅ）する白血球を単離するために）細胞混合物の中からＧＰＲ−９−６を発現する細胞を選別することができる。細胞を計測および／または選別するために適した方法を本目的（例えば、フローサイトメトリー、蛍光標示式細胞分取）に使用することができる。細胞の計測数を、白血球細胞型（例えば、粘膜にホーミングする白血球、ＩＥＬ、ＬＰＬ）の増加または減少が観察される疾患または症状の診断に使用することができる。
【００９４】
さらに、抗体を用いて、ＧＰＲ−９−６の発現を検出または測定することができる。例えば、本発明の抗体を用いて生物学的試料（例えば、血液、血清、白血球（例えば、活性化Ｔリンパ球）、気管支肺胞洗浄液、唾液、腸液、生検試料などの個体由来の細胞、組織または体液）中の哺乳類ＧＰＲ−９−６を検出または測定することができる。例えば、試料（例えば、組織および／または体液）を個体から得ることができ、適当なアッセイを用いてＧＰＲ−９−６タンパク質の存在または量を評価することができる。適当なアッセイには、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット（例えば、ウエスタンブロット）および免疫組織学を含む、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ解析）および固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的方法および免疫化学的方法が含まれる。一般的に、試料と本発明の抗体とを抗体−ＧＰＲ−９−６複合体の形成に適する条件下で合わせ、抗体−レセプター複合体の形成を（直接または間接的に）評価する。
【００９５】
個体から得た試料（例えば、組織サンプル）中におけるＧＰＲ−９−６反応性レベルの増加の存在は、炎症、および／または、炎症性腸疾患、同種移植拒絶、遅延型過敏症反応またはウイルスもしくは細菌感染などの感染などの、炎症性の疾患または症状に関連する白血球（例えば、活性化Ｔ細胞）の浸潤および／または蓄積を示しうる。また、循環（例えば、循環しているリンパ球の表面上）におけるＧＰＲ−９−６反応性レベルの低下の存在は、炎症部位での白血球の浸潤および／または蓄積を示しうる。哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質または変種の発現レベルはまた、哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質の発現の増加または低下を、特定の疾患または症状と相関させるため、および哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質の発現の増加または低下（例えば、正常個体における発現レベルなどの適当な対照に対する増加または減少）が生じる疾患または症状の診断において使用することができる。同様に、被験体由来の試料におけるＧＰＲ−９−６免疫反応性を評価することにより治療の経過をモニターすることができる。例えば、本発明の抗体を用いて、抗炎症剤または免疫抑制剤で治療中の被験体由来の試料（例えば、血液、組織）中におけるＧＰＲ−９−６発現細胞の数をモニターすることができる。
【００９６】
ＴＥＣＫに結合する抗体を用いてＴＥＣＫの発現を検出または測定することができる。例えば、本発明の抗体を用いて生物学的試料（例えば、血液、血清、白血球（例えば、活性化Ｔリンパ球）、気管支肺胞洗浄液、唾液、腸液などの個体由来の細胞または体液）中の哺乳類ＴＥＣＫを検出または測定することができる。例えば、試料（例えば、血清）を個体から得ることができ、適当なアッセイを用いてＴＥＣＫタンパク質の存在または量を評価することができる。適当なアッセイには、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット（例えば、ウエスタンブロット）および免疫組織学を含む、フローサイトメトリー（例えば、細胞内染色を含むＦＡＣＳ解析）および固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的方法および免疫化学的方法が含まれる。（分泌されたタンパク質を検出するための細胞の細胞内染色に関しては、例えば、Kallas, E.G.ら、J. Infect. Dis., 179:1124-1131 (1999)を参照のこと。）一般的に、試料と本発明の抗体とを抗体−ＴＥＣＫ複合体の形成に適する条件下で合わせ、抗体−ＴＥＣＫ複合体の形成を（直接または間接的に）評価する。
【００９７】
個体から得た試料（例えば、体液サンプル）中におけるＴＥＣＫ反応性レベルの増加の存在は、炎症、および／または、炎症性腸疾患、同種移植拒絶、遅延型過敏症反応またはウイルスもしくは細菌感染などの感染などの、炎症性の疾患または症状に関連する白血球（例えば、活性化Ｔ細胞）の浸潤および／または蓄積を示しうる。ＴＥＣＫタンパク質または変種の発現レベルはまた、哺乳類ＴＥＣＫタンパク質の発現の増加または低下を、特定の疾患または症状と相関させるため、および哺乳類ＴＥＣＫタンパク質の発現の増加または低下（例えば、正常個体における発現レベルなどの適当な対照に対する増加または減少）が生じる疾患または症状の診断において使用することができる。同様に、被験体由来の試料におけるＴＥＣＫ免疫反応性を評価することにより治療の経過をモニターすることができる。例えば、本発明の抗体を用いて、抗炎症剤または免疫抑制剤で治療中の被験体由来の試料（例えば、血液）中におけるＴＥＣＫの量をモニターすることができる。
【００９８】
生物学的試料における哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質または哺乳類ＴＥＣＫタンパク質の存在の検出に使用するためのキットもまた調製することができる。かかるキットは、標的タンパク質（すなわち、哺乳類ＧＰＲ−９−６レセプターまたは該レセプターの一部、哺乳類ＴＥＣＫタンパク質またはその一部）に結合する抗体またはその機能的フラグメント、ならびに抗体またはフラグメントと標的との複合体の存在を検出するのに適した１種またはそれ以上の補助試薬を含みうる。本発明の抗体組成物は、単独または他のエピトープに特異的なさらなる抗体との組み合わせのいずれかで、凍結乾燥した形態で提供されうる。抗体は、標識されていても標識されていなくてもよく、キット内に添加剤（例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸塩および炭酸塩などのバッファー、安定剤、賦形剤、殺生物剤および／または不活性タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン）とともに含まれうる。例えば、該抗体は、添加剤との凍結乾燥混合物として提供することができ、ユーザーが合わせるために添加剤を別個に提供することもできる。一般に、これらの添加剤物質は、活性な抗体の量に対して約５重量％未満で存在し、通常、抗体濃度に対して総量が少なくとも約０．００１重量％で存在する。標的タンパク質（例えば、二次抗ＧＰＲ−９−６抗体または二次抗ＴＥＣＫ抗体）に結合することができる二次抗体を用いる場合、かかる抗体を、例えば独立したバイラルまたは容器などのキット内に提供することができる。二次抗体は、存在する場合は、典型的には標識されており、上述の抗体配合物と同様にして配合される。キットの構成要素（例えば、抗ＧＰＲ−９−６抗体またはその抗原結合性フラグメント、補助試薬）は、適当な収容手段（例えば、ビン、箱、袋(envelope)、チューブ）内に独立して、または一緒にパッケージされうる。キットが複数の個々にパッケージされた構成要素を含む場合、個々のパッケージは、１つの大きな収容手段（例えば、ビン、箱、袋、チューブ）内に収容されうる。
【００９９】
同様に、本発明はまた、細胞による哺乳類ＧＰＲ−９−６レセプターまたは該レセプターの一部の発現を検出および／または定量する方法に関し、ここでは、細胞またはその画分（例えば、膜画分）を含有する組成物を、哺乳類ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）または該レセプターの一部に結合する抗体またはその機能的フラグメント（例えば、ｍＡｂ  ３Ｃ３、ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１）と、抗体またはそのフラグメントとの結合に適切な条件下で接触させ、結合をモニターする。抗体と哺乳類ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）またはその一部との複合体の形成を示すものである抗体の検出は、該レセプターの存在を示す。抗体の細胞への結合は、任意の適当な方法を用いて測定することができる。該方法を用いて（例えば、血液、唾液などの体液などの試料または他の適当な試料中の）被験体由来の細胞上でのＧＰＲ−９−６の発現を検出することができる。細胞（例えば、白血球）の表面上でのＧＰＲ−９−６の発現レベルもまた、例えば、フローサイトメトリーにより測定することができ、発現のレベル（例えば、染色強度）を疾患の罹患率、進行またはリスクと相関させることができる。
【０１００】
治療方法
哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質に特徴的な少なくとも１の機能の阻害または促進により、本発明による哺乳類ＧＰＲ−９−６機能の調節は、レセプター媒介性機能の阻害または促進の有効かつ選択的な方法を提供する。いったんリンパ球がある部位で漸増すると、単球などの他の白血球細胞型は、二次シグナルにより漸増されうる。したがって、リガンド、インヒビターおよび／またはプロモーターを含む、本明細書に記載のようにして同定されるものなどの、ＧＰＲ−９−６機能を調節しうる薬剤を用いて白血球機能（例えば、漸増および／または蓄積を含む白血球浸潤）を調節することができる。
【０１０１】
一局面において、本発明は、哺乳類ＧＰＲ−９−６機能を阻害または促進する薬剤の有効量をかかる治療を必要とする被験体に投与する工程を含む、被験体における炎症性応答を調節（阻害または促進）する方法を提供する。一態様では、哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質（例えば、ヒトＧＰＲ−９−６）の１またはそれ以上の機能を阻害する薬剤の有効量は、炎症を阻害（すなわち、低減または抑制）するために被験体に投与される。被験体における炎症性応答を調節するための好ましい薬剤は、リガンド（例えば、ＴＥＣＫ）のＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）への結合を阻害（すなわち、低減または抑制）する薬剤である。例えば、ｍＡｂ  ３Ｃ３、ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１、ｍＡｂ  １１．３．１およびｍＡｂ  １６．３．１を含む本発明の抗体を該方法において使用することができる。その結果、白血球遊出、化学走性、（例えば、酵素の）エキソサイトーシスまたは炎症媒介因子の放出などの１またはそれ以上の炎症過程が阻害される。例えば、炎症部位（例えば、炎症した粘膜（例えば、大腸、小腸））の白血球浸潤は、本発明の方法により阻害することができる。別の態様では、哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質（例えば、ヒトＧＰＲ−９−６）の１またはそれ以上の機能を阻害する薬剤の有効量は、ＧＰＲ−９−６媒介性の白血球のホーミングを阻害（すなわち、低減または抑制）するために被験体に投与される。特定の態様では、ヒトＧＰＲ−９−６（ヒトＣＣＲ９）に結合する薬剤の有効量および／またはヒトＴＥＣＫに結合する薬剤の有効量が、かかる治療を必要とする被験体に投与される。
【０１０２】
したがって、本発明は、ＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、炎症性疾患を有する被験体を治療する方法に関する。特定の態様では、被験体は、クローン病または大腸炎などの炎症性腸疾患を有する。治療には、治療的処置または予防的処置が含まれる。該方法によれば、治療は、完全にまたはある程度、疾患を予防または疾患の重篤度を低減しうる。
【０１０３】
本発明はまた、ＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、被験体においてＧＰＲ−９−６媒介性の白血球のホーミングを阻害する方法に関し、例えば、白血球の粘膜部位へのホーミングが阻害されうる。循環している白血球の臓器または組織（例えば、腸）への移動および／または臓器または組織内での白血球の局所漸増（例えば、ＩＥＬ、ＬＰＬ）が、該方法により阻害されうる。
【０１０４】
哺乳類ＧＰＲ−９−６タンパク質（例えば、ヒトＧＰＲ−９−６）の１またはそれ以上の機能を促進する薬剤（例えば、レセプターアゴニスト）は、所望の部位での細胞の漸増を誘導（誘発または増強）するため、または白血球遊出、化学走性、（例えば、酵素の）エキソサイトーシスまたは炎症媒介因子の放出などの炎症性応答を誘導するために投与することができ、炎症過程の有益な刺激となる。例えば、Ｔ細胞は、ウイルス、細菌またはカビの感染を撲滅するために漸増されうる。したがって、本発明は、ＧＰＲ−９−６機能のプロモーター（例えば、アゴニスト）の有効量を投与する工程を含む、被験体におけるＧＰＲ−９−６媒介性の白血球のホーミングを促進する方法に関する。
【０１０５】
別の局面において、本発明は、癌（例えば、急性または慢性白血病（例えば、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、急性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、慢性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、慢性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキン病、Ｔ細胞リンパ腫）、癌腫（例えば、胸部（例えば、腺管癌、小葉癌）、卵巣、精巣、前立腺、偏平上皮細胞、基底細胞）、黒色腫、骨髄腫、腺腫）を有する被験体を治療する方法である。治療には、治療的処置または予防的処置が含まれる。該方法によれば、治療は、完全にまたはある程度、疾患を予防または疾患の重篤度を低減しうる。例えば、該方法は、腫瘍の形成、腫瘍の増殖および／または転移（例えば、腸または胸腺の白血球細胞の浸潤）を阻害するのに使用することができる。
【０１０６】
一態様では、癌を有する被験体を治療する方法は、ＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストの有効量（すなわち、１種またはそれ以上）を、かかる治療を必要とする被験体に投与する工程を含む。別の態様では、癌を有する被験体を治療する方法は、ＧＰＲ−９−６に結合する抗体の有効量を、かかる治療を必要とする被験体に投与する工程を含む。ＧＰＲ−９−６に結合する抗体は、ＧＰＲ−９−６アンタゴニスト（例えば、リガンド（例えば、ＴＥＣＫ）のＧＰＲ−９−６への結合を阻害し、それによりＧＰＲ−９−６媒介性のシグナル伝達を阻害する）でありえ、および／または直接もしくは間接的に細胞死を誘導しうる。例えば、ＧＰＲ−９−６に結合するＩｇＧまたはＩｇＭは、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病を有する被験体に投与されうる。白血病細胞により発現されたＧＰＲ−９−６に結合すると、ＩｇＧまたはＩｇＭは、補体を活性化して細胞の溶解を誘導しうる。直接または間接的に細胞傷害性剤（抗体結合性融合タンパク質、免疫複合体）に結合する抗体はまた、ＧＰＲ−９−６を発現する細胞を選択的に枯渇させるために投与されうる。
【０１０７】
好ましい態様では、本発明は、ＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストおよび／またはＧＰＲ−９−６に結合する抗体の有効量（すなわち、１種またはそれ以上）を、かかる治療を必要とする被験体に投与する工程を含む、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（例えば、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、急性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病）、慢性リンパ芽球性白血病、例えば、慢性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、慢性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病））を有する被験体を治療する方法である。
【０１０８】
「被験体」という用語は、限定されないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシ亜科、ヒツジ様、ウマ科、イヌ科、ネコ科、齧歯類もしくはネズミ科の種を含む哺乳類などの動物を含むことを本明細書において定義する。炎症および／または感染に関連する疾患および症状は、本明細書に記載の方法を用いて治療しうる。好ましい態様では、該疾患または症状は、リンパ球、特に粘膜組織にホーミングするリンパ球の作用が、治療目的（予防目的を含む）のために阻害または促進されるものである。特に好ましい態様では、炎症性の疾患または症状は、Ｔ細胞媒介性の疾患または症状である。
【０１０９】
本発明の方法により治療されうる粘膜組織に関連する炎症性疾患の例には、乳房炎（乳腺）、膣炎、胆嚢炎、胆管炎または胆管周囲炎（胆管および肝臓の周辺組織）、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、喘息および（例えば、消化管内の）対宿主性移植片病が含まれる。クローン病に見られるように、炎症は、しばしば粘膜表面からさらに広がり、したがって、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（例えば、特発性肺線維症もしくは慢性関節リウマチに関連するＩＬＤまたは他の自己免疫症状）、過敏性肺炎、膠原病、サルコイドーシス、および他の特発性症状などの間質性線維症に至る肺の慢性炎症性疾患は、治療しやすくなりうる。膵炎およびインスリン依存性糖尿病は、本発明の方法を用いて治療しうる他の疾患である。
【０１１０】
特に好ましい態様では、このようにして治療しうる疾患に、潰瘍性大腸炎、クローン病、回腸炎、セリアック病、非熱帯性スプルー、腸炎、セロネガティブ関節症に関連する腸症、微視的(microscopic)大腸炎もしくはコラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎、または直腸結腸切除術および回腸吻合術（ileoanal anastomosis）後に生じる回腸嚢炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＬ）が含まれる。
【０１１１】
ＧＰＲ−９−６機能のインヒビターで治療しうるヒトまたは他の種の慢性疾患を含むさらなる疾患または症状には、限定されないが、
・全身アナフィラキシーまたは過敏症反応、（例えば、ペニシリン、セファロスポリンなどに対する）薬物アレルギー、虫刺されによるアレルギー；乾癬、および皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、じんま疹などの炎症性皮膚病；脈管炎（例えば、壊死性、皮膚性および過敏性脈管炎）；脊椎性関節症(spondyloarthropathy)；強皮症；喘息、アレルギー性鼻炎などの呼吸器系アレルギー性疾患を含む炎症性またはアレルギー性の疾患および症状；
・関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年発症糖尿病、糸球体腎炎およびその他の腎炎、自己免疫甲状腺炎、ベーチェット病などの自己免疫疾患；
・同種移植片拒絶または対宿主性移植片病を含む（例えば、移植術における）移植片拒絶；
・限定されないが、アテローム性動脈硬化、再狭窄、筋炎（多発性筋炎、皮膚筋炎を含む）を含む、阻害されうる望ましくない炎症性応答が治療されうる他の疾患または症状；
・癌、特に、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（例えば、菌状息肉腫）などの皮膚または臓器の白血球浸潤を伴うもの；
が含まれる。
【０１１２】
ＧＰＲ−９−６機能のプロモーター（例えば、アゴニスト）で治療しうるヒトまたは他の種の疾患または症状には、限定されないが、
・新生物形成性疾患、網膜症（例えば、糖尿病網膜症）および黄斑変性を含む、血管新生または新生脈管形成がある役割を果たす疾患；
・細菌感染およびらい病ならびに特にウイルス感染などの感染性疾患；
・ＡＩＤＳなどの免疫不全症候群を有する個体、放射線治療、化学療法または免疫抑制を起こす他の治療を受けている個体などにおける免疫抑制；レセプター機能の認識不全または他の原因による免疫抑制
が含まれる。
【０１１３】
投与形態
該方法によれば、１種またはそれ以上の薬剤を適切な経路により、単独で、または別の薬物と組み合わせて被験体に投与することができる。薬剤（例えば、リガンド結合を阻害する分子、抗ＧＰＲ−９−６抗体またはその抗原結合性フラグメント、抗ＴＥＣＫ抗体またはその抗原結合性フラグメント）の有効量が投与される。有効量は、ＧＰＲ−９−６レセプター機能の阻害または促進に充分であり、それにより、ＧＰＲ−９−６媒介過程（例えば、炎症性応答）がそれぞれ阻害または促進される量などの、投与条件下で所望の治療効果または予防効果を達成するのに充分な量である。薬剤は、単回投与または反復投与で行われ得る。用量は、当該技術分野で公知の方法により決定され得、例えば、選ばれる具体的な薬剤、被験体の年齢、薬物に対する過敏性および耐性および全身の健康状態（overall well-being)に依存する。抗体の適切な用量は、１回の治療につき、約０．０１ｍｇ／体重ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇである。例えば、経口、治療食、局所、経皮、直腸、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、鞘内、皮内での注射）および吸入（例えば、気管支内、鼻腔内または経口の吸入、点鼻）の投与経路を含むさまざまな投与経路を、薬剤および治療する疾患または症状に応じて用いることができる。投与は、指示通り、局所または全身に行いうる。好ましい投与形態は、選択した具体的な薬剤（例えば、ＧＰＲ−９−６アンタゴニスト、抗ＴＥＣＫ抗体）および治療している具体的な症状（例えば、疾患）に応じて変わりうるが、経口または非経口投与が一般的に好ましい。
【０１１４】
該薬剤は、中性化合物として、または塩として投与することができる。アミンまたは他の塩基性基を含有する化合物の塩は、例えば、該化合物を塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などの適当な有機酸または無機酸と反応させることにより得ることができる。第四級アンモニウム基を有する化合物もまた、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、過塩素酸塩などの対陰イオンを含む。カルボン酸または他の酸性官能基を含有する化合物の塩は、適切な塩基、例えば、水酸化物塩基と反応させることにより調製することができる。酸性官能基の塩は、ナトリウム、カリウムなどの対陽イオンを含む。
【０１１５】
薬剤（例えば、ＴＥＣＫのＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）への結合を阻害する薬剤）は、医薬組成物または生理学的組成物の一部として個体に投与されうる。例えば、薬剤は、ＧＰＲ−９−６機能のインヒビターまたはプロモーターと薬学的に許容され得る担体とを含有するＧＰＲ−９−６機能の調節のための医薬組成物の一部として個体に投与されうる。配合は、選択した投与経路（例えば、溶液、乳液、カプセル）に応じて変わる。適切な医薬用担体または生理学的担体は、ＧＰＲ−９−６機能のプロモーター（アゴニスト）またはインヒビター（アンタゴニスト）と相互作用しない不活性な成分を含み得る。Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PAに記載されているものなどの標準的な製薬配合技術を用いることができる。非経口投与に適する医薬用担体には、例えば、滅菌水、生理食塩水、静菌性生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含む生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、乳酸加リンゲル液などが含まれる。組成物をカプセル化する方法（硬質ゼラチンまたはシクロデキストランの被覆内など）は、当該技術分野において公知である（Baker ら、"Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986）。吸入のためには、薬剤を可溶化し、投与のための適切なディスペンサー（例えば、アトマイザー、噴霧器または圧力式エーロゾルディスペンサー）内に充填することができる。
【０１１６】
さらに、薬剤がタンパク質またはペプチドである場合、該薬剤は、組換えタンパク質のインビボ発現により投与されうる。インビボ発現は、適切な方法に従って体細胞発現により行われる（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号明細書参照のこと）。この態様では、該タンパク質をコードする核酸を、レトロウイルス、アデノウイルスまたは送達のための他の適切なベクター（好ましくは、複製能欠損感染性ベクター）に組み込むことができ、または送達のために該タンパク質を発現する能力を有するトランスフェクトされた宿主細胞または形質転換された宿主細胞に導入することができる。後者の態様では、該タンパク質を治療有効量で発現させるのに効果的な量で細胞を（単独で、または隔離(barrier)デバイスにて）移植、注入またはその他の方法で導入することができる。
【０１１７】
本発明を以下の実施例により説明するが、何ら限定することを意図しない。
【実施例】
【０１１８】
実施例１
細胞集団の精製
ヒト末梢血を１０％（ｖ／ｖ）０．１Ｍ  ＥＤＴＡ中に採取し、1-Step Polymorphs グラジエント（１．１１３±０．０１ｇ／ｍｌ、Accurate Chemical Co., Westbury, NY）上に重層し、４００×ｇで３０分間室温で遠心分離した。好中球層および単核細胞層を回収し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Life Technologies, Grand Island, NY）中に再懸濁し、約７５０×ｇで１５分間遠心分離した。赤血球は、ペレットをＥ−Ｌｙｓｅ（５ｍｌ／１０7細胞）（Cardinal Associates, Santa Fe, NM）に５分間氷上で再懸濁することにより好中球画分中に溶解した。両方の細胞画分を氷冷ＤＰＢＳで２回洗浄した。単核細胞を、タンパク質でコーティングしたプラスティックに２〜３時間接着させた後、非接着性細胞を静かにプレートから洗い流した。さらに１２時間後、非接着性樹状細胞をプレートから洗い流し、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２でコーティングした磁気ビーズ（Dynabeads; Dynal, Oslo, Norway）（細胞あたり５ビーズ）でＢリンパ球およびＴリンパ球を枯渇させた。５０ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ、R and D Systems, Minneapolis, MN）および４０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４（R and D Systems）ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco BRL, Grand Island, NY）１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、HyClone, Logan, UT）に加えて添加物：ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム１０ｍＭ、ＭＥＭ非必須アミノ酸０．１ｍＭおよび２−メルカプトエタノール５．５×１０-5Ｍ（すべてGibco BRL, Grand Island, NY製）中で残った細胞を７日間培養し（Sallusto, F.および Lanzabecchia, A.,J. Exp. Med., 179:1109-1118(1994)）、未熟樹状細胞（ＩＭＤＣ）を生じさせ、場合によっては、さらに２４時間１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ中で培養したものを用いて該樹状細胞を成熟させた。関連するMiltenyi Beads（Millenyi Biotek, Bergisch Gladbach, Germany）により、１０7単核細胞につき２０μｌのビーズを用い、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ中、５×１０7細胞／ｍｌで３０分間４℃で、ＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ１４+、ＣＤ５６+およびＣＤ１９+集団を単核細胞から精製した。次いで、それらをスピンダウンし、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に５×１０7細胞／ｍｌで再懸濁し、磁場内のＶＳカラム（Miltenyi Biotech, Auburn, CA 95603）に通して非標識細胞を除去した。磁場外で２０ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ／５ｍＭ  ＥＤＴＡをＶＳカラムに通すことにより、細胞を取り出した。
【０１１９】
抗体および試薬
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＬＡ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＸＣＲ５、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する標識抗体をPharmingen (San Diego, CA)から入手して免疫蛍光試験に使用し、一方、抗αＥおよび抗ＣＤ８３はBeckman Coulter (Fullerton, CA)から入手した。ＯＫＴ３、抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂはAmerican Type Culture Collection （ＡＴＣＣ，Manassas, VA）から入手し、抗ヒトＣＤ２８  ｍＡｂはBecton Dickinson （Mountain View, CA）から入手した。抗ケモカインレセプターｍＡｂのいくつかはLeukoSite, Inc.（Cambridge, MA）で作製し、クローン名を抗ＣＣＲ３（７Ｂ１１）、抗ＣＣＲ４（２Ｂ１０）、抗ＣＣＲ６（１１Ａ９）および抗ＣＸＣＲ３（１Ｃ６）と命名する。ＦＡＣＳ解析で使用した数種類の抗ケモカインレセプターｍＡｂは市販の供給源から入手した。免疫蛍光試験に使用した抗ＣＣＲ２、抗ＣＣＲ６および抗ＣＸＣＲ５  ｍＡｂはR and D Systems（Minneapolis, MN）から入手したが、抗ＣＣＲ５および抗ＣＸＣＲ４はPharmingen （San Diego, CA ）から入手した。組換えヒトケモカインは、Peprotech （Rocky Hill, NJ）および R&D Systems（Minneapolis, MN）から入手し、場合によっては、記載のように（Clark-Lewis, I. ら、Biochemistry, 30:3128-3135(1991)）、最適化し、かつ完全自動ペプチド合成装置（４３０Ａ型；Applied Biosystems, Foster City, CA ）に適合させた固相法を用いて合成した。ヒト内皮細胞株ＥＣＶ３０４をＡＴＣＣから購入した。すべてのサイトカインは、R&D Systems （Minneapolis, MN）から入手した。
【０１２０】
抗ＧＰＲ−９−６  ｍＡｂの作製
配列ＭＡＤＤＹＧＳＥＳＴＳＳＭＥＤＹＶＮＦＮＦＴＤＦＹＣ（配列番号：３）を有する、ＧＰＲ−９−６のＮＨ2末端からなるペプチドを作製した。１日目に、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ、Sigma, St. Louis, MO）中で調製したＧＰＲ−９−６ペプチド／ＫＬＨコンジュゲート１０μｇで、２０日目に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、Sigma, St. Louis, MO）中で調製したＧＰＲ−９−６ペプチド／ＫＬＨコンジュゲート１０μｇで、そして４０日目に、ＰＢＳ中で調製したＧＰＲ−９−６ペプチド／ＫＬＨコンジュゲート１０μｇでＢＡＬＢ／Ｃマウスをｉ．ｐ．免疫した。６０日目、ＰＢＳ中ＧＰＲ−９−６ペプチド／ＫＬＨ１０μｇでマウスを追加免疫し、４日後、脾臓を取り出し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と融合させた（Coligan ら、 Current Protocols in Immunology 2.5.1 (1992)）。ＧＰＲ−９−６ペプチドでコーティングしたプレートを用い、融合細胞をＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。抗ＧＰＲ−９−６ｍＡｂを産生するハイブリドーマをＧＰＲ−９−６トランスフェクタントとの反応性について調べ、さらなる特性評価のためにサブクローニングした。ハイブリドーマＬＳ１２９−３Ｃ３−Ｅ３−１とも称するマウスハイブリドーマ３Ｃ３は、ＦＣＳ（１０％）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｌ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（１０ｍＭ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）および２−メルカプトエタノール（５．５×１０-5Ｍ）を加えたＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養することができる。
【０１２１】
慢性的に活性化したＴH１およびＴH２リンパ球の調製
先に記載したように（Murphy, E.ら、J. Exp. Med.,183:901-913(1997)）、６穴Ｆａｌｃｏｎプレートを１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８および２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３で一晩コーティングした後、ＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４＋リンパ球（Poietic Systems, German Town, MD）を１０5〜１０6細胞／ｍｌで、１０％ＦＣＳおよびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）を加えたＤＭＥＭ中で培養した。ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ）をＴH１に対して使用し、ＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）をＴH２に対して使用した。４〜５日後、活性化したＴH１およびＴH２リンパ球をＤＭＥＭ中で１回洗浄し、１０％ＦＣＳおよびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）を加えたＤＭＥＭ中で４〜７日間培養した。この後、活性化したＴH１およびＴH２リンパ球を、アポトーシスを阻害するための抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加した以外は上述のようにして抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３およびサイトカインで５日間再度刺激した。４〜５日後、ＴH１およびＴH２リンパ球を洗浄し、次いで、ＩＬ−２とともに再度４日間培養した。活性化したＴH１およびＴH２リンパ球をこのようにして最高３回維持した。
【０１２２】
ＥＣＶ３０４遊出および化学走性アッセイ
３μｍ孔径Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ組織培養インサート（ｉｎｓｅｒｔ）を、コーティングせずに、または２％ゼラチンで２時間コーティングして用いた。次いで、５％ＦＣＳを加えた０．４５ｍｌのＤＭＥＭをチャンバの下側ウェルに入れ、２×１０5ＥＶＣ３０４細胞を、０．２ｍｌのＤＭＥＭ５％ＦＣＳ中の各ゼラチンコーティングインサートに加えた。２日後、ウェルおよびインサートを、０．５％ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０(Gibco BRL, Grand Island, NY)で２回洗浄し、次いで、ケモカインを下側ウェルに加えた。研究対象の細胞をＲＰＭＩ中で１回洗浄し、ＴH１／ＴH２リンパ球、細胞株およびトランスフェクタントは４×１０6細胞／ｍｌで、または休止ＣＤ４リンパ球は１０7細胞／ｍｌで、ＲＰＭＩ０．５％ＨＳＡおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中に再懸濁した。細胞懸濁液の２００μｌアリコート（投入量は、それぞれ８×１０5細胞および２×１０6細胞）を各インサートに加えた。２〜４時間後、インサートを取り出し、ゲートを目的の細胞を獲得するために設定したBecton Dickinson FACScanで３０秒間、ＥＣＶ３０４単層を通って下側ウェルに移動した細胞の数を計測した。この技術を用いると、１００％移動は、ＴH１／ＴH２細胞では２５０００細胞、休止ＣＤ４リンパ球では７５０００細胞であると考えられ、ここで、この数は、１分間にわたってＦＡＣＳｃａｎで計測した下側ウェル内の細胞を表す。移動する細胞の表現型を研究するため、２４ｍｍ径インサートを使用し、６ウェルプレートでＣＤ４リンパ球を用いて同一の実験を行った。化学走性アッセイは、フィブロネクチンでコーティングしたインサート（１０μｇ／ｍｌ）を用いたこと以外はＥＣＶ３０４移動アッセイと同一であった。すべての場合において、データポイントは、２つ組の(duplicate)ウェルの結果であり、平均値を示し、エラーバーはサンプルの標準偏差を示す。
【０１２３】
Ｃａ2+動員（Ｃａ2+フラックス）アッセイ
ＤＰＢＳ中１０7細胞／ｍｌをＦｕｒａ２色素（Molecular Probes, Eugene, OR）により２ｍＭで３０分間標識し、ＤＰＢＳ中で３回洗浄し、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび５．５ｍＭグルコースを含有するＤＰＢＳ中に１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。次いで、１０％ＮＰ−４０および１０ｍＭ  ＥＤＴＡを用い、細胞を蛍光光度計（日立、Ｆ２０００型蛍光分光光度計、励起３４０ｎｍ、発光５１０ｎｍ）で解析して最大および最低Ｃａ2+動員を確立した。
【０１２４】
組換えＤＮＡ法
ＱＩＡＧＥＮチップを用い、製造業者(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA)が推奨するとおりにプラスミドＤＮＡを単離した。ＤＮＡのライゲーション、制限エンドヌクレアーゼ消化およびゲル電気泳動を前述のようにして行った（Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, NY)(1989) ）。アガロースゲル抽出によるＤＮＡ精製を、QIAEXII Gel Extraction Kitを用い、製造業者(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA )が推奨するとおりに行った。プラスミドＤＮＡを化学的形質転換（GIBCO, Inc.）により大腸菌に導入した。酵素をNew England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)、GIBCO Bethesda Research Laboratories, Inc. (Gaitherburg, MD)または Boehringer Mannheim, Inc.（ドイツ）から購入した。ＲＮＡは、標準的なイソチオシアン酸グアニジン法（Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, NY)(1989)）または推奨されるようなＲＮｅａｓｙキット（QIAGEN Inc., Chatsworth, CA）のいずれかを用い、凍結された組織または細胞から単離した。ＤＮＡシークエンシングは、FS DyeDeoxy Terminatorサイクルシークエンシングキットおよび３７７型ＤＮＡシークエンサー（Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA）を用い、Ｓｅｑｕｉ−Ｎｅｔ（Colorado State University ）により行った。配列は、ＳｅｑＭａｎ（DNASTAR, Inc., Madison WI）を用いて解析した。
【０１２５】
ＰＣＲ
ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたヌクレオチド配列（Ｕ４５９８２）（配列番号：１）（これは参照により本明細書に取り込まれる）に基づいて、ＧＰＲ−９−６の完全コード領域を増幅するためのＰＣＲにおける使用のためのプライマーを設計した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位をプライマー対ＢＡＺ２０１
【０１２６】
【化１】
0005933204.tif 000002
【０１２７】
およびＢＡＺ２０２
【０１２８】
【化２】
0005933204.tif 000003
【０１２９】
に、指向的クローニング（directional cloning）のために組み込んだ（太字：コード配列、イタリック：酵素部位）。１００μｌ容中に、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９．５、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｐｍｏｌプライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰおよび５単位のＰｆｕＩポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）とともにＰｆｕＰＣＲサイクルの鋳型として５μｇの全ヒトゲノムＤＮＡ（Clontech, Palo Alto, CA）を用いた。サイクルパラメータは、ＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CN）中で、初期融解９５℃、２分、次いで３５サイクル：９５℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、２分１５秒の後、最終伸長７２℃、７分とした。
【０１３０】
公表されたヌクレオチド配列（寄託番号Ｕ８６３５８）（これは参照により本明細書に取り込まれる）に基づいて、ＴＥＣＫの完全コード領域を増幅するためのプライマーを設計した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位をプライマー対ＢＡＺ２０３
【０１３１】
【化３】
0005933204.tif 000004
【０１３２】
およびＢＡＺ２０４
【０１３３】
【化４】
0005933204.tif 000005
【０１３４】
に、指向的クローニングのために組み込んだ（太字：コード配列、イタリック：酵素部位）。５μｇのヒト胸腺ＲＮＡを、２０μｌ容でオリゴｄＴを用いて逆転写した。ｃＤＮＡを、５０μｌ容中２００μＭ  ｄＮＴＰ、１００ｐｍｏｌプライマー、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１０単位のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Roche Molecular Systmems, Branchburg, NJ ）と混合した。サイクルパラメータは、初期融解９５℃、２分、次いで３５サイクル：９５℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、１分の後、最終伸長７２℃、７分とした。ヒト胸腺は、Children's Hospital （Boston, MA）から入手した。
【０１３５】
プライマーＢＡＺ２０３（配列番号：６）およびＢＡＺ２０４（配列番号：７）を用いたＴＥＣＫの半定量ＰＣＲ増幅、ならびにプライマーＢＡＺ２０１（配列番号：４）およびＢＡＺ２０２（配列番号：５）を用いたＧＰＲ−９−６の半定量ＰＣＲ増幅を、胸腺、小腸、結腸、脳、リンパ節および脾臓由来ｃＤＮＡ（５００ｎｇ）鋳型ならびに５００ｎｇのゲノムＤＮＡ（ClonTech, Palo Alto, CA）を等量で用いて行った。３０サイクルで行った以外は、上述のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＰＣＲサイクルと同じ条件およびＰＣＲプロフィルを用いた。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）プライマー（ClonTech, Palo Alto, CA 、カタログ番号５８４０−１）を用いて鋳型の等価性を示した。
【０１３６】
アガロースゲル電気泳動後、ＵＶ光源を用い、エチジウムブロミドの存在下でＰＣＲ産物を可視化した。推定した大きさ（ＴＥＣＫは約４５０ｂｐ、ＧＰＲ−９−６は約１ｋｂ）のＤＮＡフラグメントを単離し、配列解析およびさらなる操作のためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Stratagene, Inc., La Jolla, CA）およびｐｃＤＮＡ３（Stratagene, Inc.）のそれぞれにクローニングした。
【０１３７】
発現ベクターの構築およびＧＰＲ−９−６発現安定細胞株の作製
ＧＰＲ−９−６のコード領域をＰＣＲにより増幅し、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, San Diego, CA）のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位に指向的にクローニングした。次いで、トランスフェクタントをマウス前Ｂリンパ腫細胞株Ｌ１．２内で作製し、１０％ウシ胎仔血清（HyClone, Logan, UT）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０単位／ｍｌ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、０．５５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL）を加えたＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。ｐｃＤＮＡ３中の線状化ＧＰＲ−９−６を２０μｇ用い、次のようにして該細胞株をトランスフェクトした。Ｌ１．２細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、同０．８ｍｌ中に再懸濁した。プラスミドＤＮＡを該細胞と混合し、１０分間、室温でインキュベートし、０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。ついでシングルパルスを２５０Ｖ、９６０μＦで負荷した。エレクトロポレーションの後、１０分間、室温でインキュベートした。トランスフェクションの４８時間後、Ｇ４１８（Geneticin, Gibco BRL）を加えて終濃度を０．８ｍｇ／ｍｌとし、薬剤選別下で２〜３週間、細胞をバルク培養（bulk culture）で成長させた。次いで、トランスフェクタントを、ＧＰＲ−９−６ペプチドに対する反応性を有するｍＡｂで染色し（下記参照）、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA）で解析してＧＰＲ−９−６の表面発現を確認し、限界希釈によりクローニングした。実験の前に、トランスフェクトした細胞を５ｍＭ  ｎ−酪酸で２４時間処理した（Palmero, D.P. ら、J. Biotech.,19:35-47(1991)）。
【０１３８】
ノーザンブロット解析
ノーザンブロットは、ClonTech社から購入するか、または以下のようにして調製した。全ＲＮＡを、１．２％ホルムアルデヒドアガロースゲル上での電気泳動により分離し、上述（Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, NY)(1989)）のようなキャピラリー法によりナイロン膜（Hybond-N+; Amersham Corp., Arlington Heights, IL）に移し、Stratalinker（Stratagene, Inc.）を用いて架橋した。放射標識したプローブとのハイブリダイゼーションは、ExpressHyb Solution（Clonetech ）により製造業者の指示したプロトコルを用いて行った。オートラジオグラフィー暴露の長さは、対応する図の説明に記載している。完全長のゲル精製したＴＥＣＫおよびＧＰＲ−９−６のＤＮＡフラグメントをハイブリダイゼーションに用いた。
【０１３９】
結果
ＧＰＲ−９−６に対するｍＡｂ、ｍＡｂ  ３Ｃ３はＧＰＲ−９−６トランスフェクタントと選択的に反応する
他の公知の白血球ケモカインレセプターとの密接な系統発生的関連性により（図１）、本発明者らは、寄託されたＧｅｎＢａｎｋ配列から設計したプライマーを用いてＰＣＲによりＧＰＲ−９−６をクローニングした。ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントを調製し、ＫＬＨに結合したＧＰＲ−９−６のＮＨ2末端の最初の２６個のアミノ酸（配列番号：３）でマウスを免疫した融合細胞内でＧＰＲ−９−６に対するｍＡｂで染色した。ｍＡｂ  ３Ｃ３と命名したｍＡｂは、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントと反応したが、親Ｌ１．２細胞とは反応しなかった。ｍＡｂ  ３Ｃ３は、ＩｇＧ2bアイソタイプを有することがわかった。交差反応性試験では、ｍＡｂ  ３Ｃ３は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７またはＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ４トランスフェクタントと交差反応しなかった。ＣＣＲ６は、ＧＰＲ−９−６とより密接に関連するケモカインレセプターの１つであることから、そのデータを本明細書に示す（図２Ａ〜２Ｂ）。また、ＧＰＲ−９−６のＮＨ2末端ペプチド（配列番号：３）は、ｍＡｂ  ３Ｃ３のＧＰＲ−９−６トランスフェクタントへの結合を完全にブロックすることがわかり（データ示さず）、さらにこのｍＡｂの特異性を検証した。
【０１４０】
ＧＰＲ−９−６は、末梢血中のＢリンパ球のすべて、ＣＤ４リンパ球のサブセットおよびＣＤ８リンパ球の微少量(minor)サブセット、ならびに胸腺細胞上で発現される
最初の末梢血の二色試験において、ＧＰＲ−９−６は、ＣＤ４リンパ球の少量サブセット（２〜４％）上、ならびにＣＤ８リンパ球の極少量サブセット上で発現されることがわかったが（図３Ａ〜３Ｂ）、Ｂリンパ球は低く不均一なレベルのＧＰＲ−９−６を発現した。単球、好塩基球、好酸球、好中球およびＮＫ細胞は、使用した条件下でＧＰＲ−９−６を発現しなかった（図３Ｃ〜３Ｉ）。ＴｃＲhighＧＰＲ−９−６-ve胸腺細胞の少量サブセットは明白であったが、ＧＰＲ−９−６は、全てのレベルのＴｃＲを発現する胸腺細胞の大量サブセットで発現された。三色実験では、ＧＰＲ−９−６は、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４+veＣＤ８+ve胸腺細胞の大部分、および未成熟ＣＤ４-veＣＤ８-ve胸腺細胞の約５０％に見られた（データ示さず）。ＧＰＲ−９−６の発現は、未成熟樹状細胞でも成熟樹状細胞でも認められなかった（図４Ｄ）。しかしながら、予期したとおり、未成熟樹状細胞は、ＬＰＳ活性化によりダウンレギュレートされるＣＣＲ５を発現したが、ＣＤ８３およびＣＤ８６はアップレギュレートされた（図４Ａ〜４Ｃ）。大きな数の一群の(a large panel of)細胞株の検査では、ＧＰＲ−９−６がいくつかのＴ細胞株上に見られた（表１）。臍帯ＣＤ４＋リンパ球はＧＰＲ−９−６を発現せず（図４Ｅ）、ＴH１またはＴH２リンパ球を作製するためのＩＬ−１２およびＩＬ−４の存在下でのこれらの細胞の慢性活性化は、ＧＰＲ−９−６の発現を誘導しなかった（図４Ｈ）。しかしながら、予期した通り、ＣＸＣＲ３は明らかにＴH１リンパ球においてアップレギュレートされたが（図４Ｆ）、粘膜部位へのリンパ球輸送(trafficking)に利用されるインテグリン、α４β７は、ＴH１およびＴH２の両方のリンパ球においてアップレギュレートされた（図４Ｇ）。
【０１４１】
ＧＰＲ−９−６のＣＤ４リンパ球およびＢリンパ球上での発現を経時的に測定すると、比較的一定であることがわかった（図５Ａ）。しかしながら、抗ＣＤ３  ｍＡｂでのＴリンパ球の活性化により、２日間にわたってＧＰＲ−９−６の一過性ダウンレギュレーションが起こり、ＩＬ−２中での１０日間の培養後に発現が回復した（図５Ｂ）。ケモカインレセプターＣＣＲ６およびＣＣＲ５は、Ｔリンパ球で活性化すると発現において同様の変化を示した（図５Ｃ）。
【０１４２】
ＧＰＲ−９−６を発現するＣＤ４リンパ球サブセットは、主に記憶表現型であり、高レベルの粘膜リンパ様ホーミングレセプターα４β７を発現するが、皮膚ホーミングレセプターＣＬＡは発現しない
ＧＰＲ−９−６を発現するＣＤ４リンパ球の少量サブセットを、三色染色によってより詳細に調べた（図６Ａ〜６Ｆ）。ＧＰＲ−９−６を発現するＣＤ４リンパ球は主に記憶表現型であり、最も高レベルのＧＰＲ−９−６を発現する細胞はすべて記憶表現型であった。興味深いことに、皮膚に輸送される記憶ＣＬＡ+veＣＤ４リンパ球は、ＧＰＲ−９−６を発現しなかった。対照的に、粘膜部位に輸送される記憶α４β７highＣＤ４リンパ球のサブセットは、明らかにＧＰＲ−９−６を発現した。αＥβ７の発現により定義される記憶ＣＤ４リンパ球のサブセットもまた、ＧＰＲ−９−６陽性サブセットとＧＰＲ−９−６陰性サブセットに明確に細分された。ＧＰＲ−９−６highＣＤ４リンパ球は、末梢リンパ節への輸送に関与するホーミングレセプターであるＣＤ６２Ｌを発現しなかったが、ＧＰＲ−９−６dullＣＤ６２Ｌ+veリンパ球の少量サブセットは明白であった。
【０１４３】
また、ＧＰＲ−９−６+veＣＤ４リンパ球を、ＣＤ４リンパ球上に発現することが知られている他のケモカインレセプターとの同時発現について調べた（図７Ａ〜７Ｆ）。ＧＰＲ−９−６は、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ５の陽性サブセット上および陰性サブセット上の両方で明白にみられたが、ＣＣＲ２およびＧＰＲ−９−６のＣＤ４リンパ球発現は互いに排他的であった。
【０１４４】
ＧＰＲ−９−６ケモカインレセプターはＴＥＣＫに特異的に結合する
試験したすべての公表されたケモカインのうち、ＴＥＣＫのみがＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントの化学走性を誘導する能力を有することがわかった（図８Ａ）。ＭＣＰ−１−４、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、エオタキシン(eotaxin)−１、エオタキシン−２、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ−３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、ＭＩＰ４、ＳＬＣ、ＨＣＣ１、フラクタルカイン(fractalkine)、リンフォタクチン(lymphotactin)、ＭＩＧ、ＩＰ−１０、ＩＴＡＣ、ＡＤＥＣ、ＩＬ−８、ｇｒｏ−α、ｇｒｏ−β、ｇｒｏ−γ、ロイコタクチン(leukotactin)、ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、ＭＩＰ３およびＭＩＰ４はすべて、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントの化学走性を誘導しえないとわかった。Ｌ１．２／ＧＰＲ−９−６トランスフェクタントのＴＥＣＫ誘導性化学走性は、ｍＡｂ  ３Ｃ３によって阻害されたが、抗ＣＣＲ３  ｍＡｂ  ７Ｂ１１には阻害されなかった（図８Ｂ）。ＴＥＣＫは、試験したその他のトランスフェクタント（ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７およびＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、データ示さず）のいずれにも作用しなかった。興味深いことに、ＴＥＣＫはまた、ＧＰＲ−９−６を発現するＴ細胞株ＭＯＬＴ−４（図８Ｄ）およびＭＯＬＴ−１３（図８Ｆ）に作用することがわかった（表１）。ＴＥＣＫは、ＧＰＲ−９−６を発現しないＳＫＷ３（図８Ｅ）などの他の細胞株に関しては化学走性ではなかった。Ｔ細胞株ＭＯＬＴ−４を用いると、ＴＥＣＫ誘導性化学走性は、百日咳毒素により阻害されることが示された（図８Ｃ）。さらに、抗ＧＰＲ−９−６ｍＡｂ  ３Ｃ３は、ＭＯＬＴ−１３細胞のＴＥＣＫへの化学走性をブロックしたが、該細胞のＳＤＦ１α誘導性化学走性に対する影響はなかった（図８Ｆ）。カルシウム動員実験では、ＴＥＣＫはまた、ＭＯＬＴ−４などのＧＰＲ−９−６+ve細胞株におけるＣａ2+フラックスを誘導することがわかったが（図９Ａ〜９Ｃ）、該細胞が関連レセプターを発現しないＭＤＣなどのケモカインは効果がなかった。
【０１４５】
【表１】
0005933204.tif 000006
【０１４６】
また、ＴＥＣＫに対して化学走性を示す(chemotax)か否かを調べるため、白血球サブセットを試験した（図１０Ａ〜１０Ｆ）。マウスにおいて観察されるように、好中球、単球、好酸球、ＣＤ８およびＮＫ細胞はＴＥＣＫに対する化学走性を示さなかったが、他のケモカインに対しては化学走性を示した。しかしながら、ＴＥＣＫは、ＣＤ４リンパ球の微少量サブセットに対して化学走性を示した。マウスＴＥＣＫは胸腺細胞化学走性を誘導することから、ともに胸腺細胞化学走性を媒介する（データ示さず）ＴＥＣＫおよびＳＤＦ１αに対するヒト胸腺細胞の化学走性を調べた。抗ＧＰＲ−９−６ｍＡｂ  ３Ｃ３は、胸腺細胞およびＣＤ４リンパ球のＴＥＣＫに対する化学走性をブロックした。抗ＧＰＲ−９−６ｍＡｂ  ３Ｃ３は、ＣＤ４リンパ球のＴＡＲＣ誘導性化学走性に対して効果はなく、これは、効果が特異的であることを示す（図１１Ａ〜１１Ｃ）。これらの結果は、ＧＰＲ−９−６がＴＥＣＫの主な生理的レセプターであることを示す。
【０１４７】
ＴＥＣＫ転写物およびＧＰＲ−９−６転写物の組織分布
ＧＰＲ−９−６の粘膜ホーミングリンパ球上での発現により、リンパ様組織および粘膜組織におけるＴＥＣＫ転写物およびＧＰＲ−９−６転写物の分布を調べた（図１２Ａ〜１２Ｂ）。ＴＥＣＫは胸腺および小腸で選択的に発現されたが（図１２Ａ）、ＧＰＲ−９−６は、胸腺は高レベルで発現され、脾臓および末梢血白血球での発現は弱かった（図１２Ｂ）。ＧＰＲ−９−６転写物は、小腸におけるノーザンブロット解析では検出されなかったが、ＧＰＲ−９−６メッセージは、より感度の高いＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて小腸、胸腺、リンパ節および脾臓で検出された（図１２Ｃ）。ＴＥＣＫおよびＧＰＲ−９−６の両方のメッセージは、脳でも結腸でも検出されなかった。他のノーザンブロットでは、ＴＥＣＫおよびＧＰＲ−９−６は、ＴH１、ＴH２、Ｔｒ１（Grouxら、Nature 389:737-742(1997)）リンパ球、ＬＡＫ細胞、単球、ＣＤ３４由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、星状細胞、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および肺静脈内皮細胞（ＰＵＶＥＣ）では検出されなかった（データ示さず）。最終的に、ＧＰＲ−９−６転写物は、ｍＡｂ  ３Ｃ３で染色し、該ｍＡｂの特異性をさらに検証することにより、先にＧＰＲ−９−６+であることが示された細胞株にのみ存在することが示された（図１２Ｂ）。
【０１４８】
α４β７highＣＤ４およびＣＤ８リンパ球のみがＴＥＣＫへと遊走する
ＧＰＲ−９−６が主に記憶α４β７highＣＤ４リンパ球で発現されることから、α４β７を発現しないか、中レベルまたは高レベルのα４β７を発現するＣＤ４５ＲＡ-ve記憶ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球を単離した。α４β７high記憶ＣＤ８リンパ球およびα４β７+veＣＬＡ-ve記憶ＣＤ４リンパ球のみがＴＥＣＫに対して化学走性を示した（図１３Ａ〜１３Ｂ）。
【０１４９】
考察
数種の異なる接着分子が、末梢リンパ節などの別の生理的位置（Gallitin, W.M.ら、Nature, 304:30-34(1983)）、Peyers Patches (Hamman, A.ら、J. Immunol., 152:3282-3292(1994); Andrew, D.P.ら、Eur. J. Immunol., 26:897-905(1996))および炎症部位（Frenette, P.S.ら、Cell, 84:563-574(1996); Tietz, W.Y. ら、J. Immunol., 161(2):963-970(1998); Picker, L.J.ら、J. Immunol., 145:3247-3255(1990)）へのリンパ球サブセットの輸送に関与している。これらのリンパ球サブセットで発現される特異的ケモカインレセプターは、白血球の活性化、停止（arrest）および経内皮（transendothelial）移動を媒介する領域で発現されるケモカインと相互作用しうると考えられる。したがって、ある種の接着分子の発現により規定されるＣＤ４サブセットはまた、これらの部位へのリンパ球の輸送に重要な公知のオーファンケモカインレセプターまたはまだ発見されていないケモカインレセプターを発現しうる。本明細書に記載した研究は、粘膜部位への記憶ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球サブセットの選択的輸送に関与しうる、かかるケモカインレセプターの一種に関連する。
【０１５０】
ＧＰＲ−９−６は、もともと、ＣＣＲ６およびＣＣＲ７を含む他の公知のケモカインレセプターとの強い系統発生学的関連性により、興味をひく可能性のあるオーファンケモカインレセプターとして選択された。ノーザンブロット解析では、ＧＰＲ−９−６は胸腺に見られ、これは、Ｔ細胞の発達におけるなんらかの役割を示す。脾臓および血液での弱い発現は、記憶Ｔリンパ細胞およびＢリンパ細胞でのＧＰＲ−９−６の発現を反映しうる。ＧＰＲ−９−６が胸腺細胞の大部分によって発現され、かつこれらのＧＰＲ−９−６+ve胸腺細胞があらゆるレベルのＴｃＲを発現することから、ＧＰＲ−９−６は、見かけ上、Ｔ細胞発達のすべての段階で発現される。胸腺から出ると、ＧＰＲ−９−６はダウンレギュレートされるはずであり、末梢のようにＣＤ４リンパ球の少量サブセットおよびＣＤ８リンパ球のより少量のサブセットのみがＧＰＲ−９−６を発現する。三色実験では、ＧＰＲ−９−６は主に記憶ＣＤ４リンパ球に見られる。より興味深いことには、ＣＬＡ+ve記憶ＣＤ４リンパ球（Picker, L.J.ら、J. Immunol., 145:3247-3255(1990)）はＧＰＲ−９−６を発現しないが、記憶α４β７highＣＤ４リンパ球のサブセット（Andrew, D.P.ら、Eur. J. Immunol., 26:897-905(1996)）はこのケモカインレセプターを発現する。これは、粘膜部位へのリンパ球の輸送におけるＧＰＲ−９−６の役割またはそこに存在するときはそのエフェクター作用を反映しうる。ＧＰＲ−９−６は粘膜輸送ＣＤ４リンパ球上で明白に発現されたが、ＧＰＲ−９−６転写物はノーザンブロット解析では小腸で検出されなかった。これは、細胞の大部分が活性に分裂するＧＰＲ−９−６+ve胸腺細胞である場合、胸腺と比べて小腸組織でのＧＰＲ−９−６+veＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋リンパ球の数が少ないことを反映しうる。しかしながら、より感度の高いＲＴ−ＰＣＲ技術を用いると、ＧＰＲ−９−６転写物は小腸において検出されたが脳では検出されなかった。興味深いことに、ＧＰＲ−９−６転写物およびＴＥＣＫ転写物は小腸で発現されるが、結腸ではノーザン解析およびＲＴ−ＰＣＲ解析のいずれにおいてもＧＰＲ−９−６転写物もＴＥＣＫ転写物も検出されなかった。
【０１５１】
粘膜環境に存在する因子は、Ｔリンパ球でのＧＰＲ−９−６の発現およびＴＥＣＫ発現を誘導しうる。ＴH１／ＴH２環境に存在するサイトカインは、ＴH２上のＣＣＲ４およびＴH１リンパ球上のＣＸＣＲ３などのある種のケモカインレセプターの発現、ならびにこれらのレセプターに結合するケモカインの産生を誘導する（Bonecchi, R.G.ら、J. Exp. Med., 187:129-134(1998); Sallusto, F.D. ら、J. Exp. Med., 187:875-883(1998); Sallusto, F., Science, 277:2005-2007(1997); Andrew, D.P.ら、(1998); Zingoni, A.ら、J. Immunol., 161:547-555(1998)）。しかしながら、これらの条件は、Ｔリンパ球でのＧＰＲ−９−６発現をアップレギュレートしなかった。また、以前にＴリンパ球にαＥを誘導することが示された（Kilshaw, P.J.およびMurant, S.J., Eur. J. Immunol., 21:2591-2597(1991)）サイトカインＩＬ−１−１８またはＴＧＦ−βを用い、活性化された臍帯ＣＤ４リンパ球でＧＰＲ−９−６の発現を誘導する試みでは、ＧＰＲ−９−６の発現をアップレギュレートするサイトカインを同定することができなかった。したがって、ＧＰＲ−９−６発現がＣＤ４上で制御される機構は不明である。ＴｃＲ架橋により活性化すると、ケモカインレセプターＣＸＣＲ４の発現のように（Bermejo, M.ら、J. Immunol. 28:3192-3204(1998)）、ＧＰＲ−９−６の発現はダウンレギュレートされる。ＴｃＲ架橋は抗原提示を擬態するため、本発明者らは、リンパ節に入り、ＡＰＣの抗原性ペプチド＋ＭＨＣ−ＩＩ発現に遭遇すると、Ｔリンパ球はＧＰＲ−９−６などのケモカインレセプターをダウンレギュレートすると結論づける。これにより、Ｔリンパ球はリンパ節内に保持され、そこでＴリンパ球は、Ｔ：Ｂ認識相互作用によりＢ細胞クラススイッチなどの他の免疫機能を媒介しうる。
【０１５２】
試験したすべてのケモカインのうち、ＴＥＣＫ（Vicari, A.P.ら、Immunity, 7(2):291-301(1997)）のみがＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントの化学誘引物質として作用し、１５０ｎＭで至適化学走性をもたらすことがわかった。これは、他の白血球ケモカインが活性である１ｎＭ〜１μＭの範囲に含まれる。しかしながら、本発明者らはペプチド合成により作成したＴＥＣＫを用いていることから、ＣＫＢ８の場合のように（Macphee, C.H. ら、J. Immunol., 161:6273-6279(1998)）、細胞外の因子によるインビボでのＴＥＣＫの翻訳後修飾またはさらなる切断によって、より活性なフラグメントが生じないとは確信できない。ＴＥＣＫは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ９およびＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ５  Ｌ１．２トランスフェクタントの化学誘引物質として作用しなかった。しかしながら、ＣＣＲ３／Ｌ１．２トランスフェクタントでのＴＥＣＫのある程度の弱い活性（エオタキシン−１で観察された化学走性活性の約２０％）が検出された。この活性は、ＴＥＣＫが好酸球の化学誘引物質として作用しないにもかかわらず、抗ＣＣＲ３ｍＡｂによりブロックされた。したがって、ＴＥＣＫは、おそらくＣＣＲ３レセプターの生理的ケモカインではない。この結果は、これまでの研究においてＭＩＰ−１αが、ＣＣＲ４／Ｌ１．２トランスフェクタントでなく（Imai, T.M.ら、J. Biol. Chem.,272:15036-15042(1997)）ＣＣＲ４／ＨＥＫ２９３トランスフェクタントの化学誘引物質として作用することが示されている（Power, C.A.ら、J. Biol. Chem., 270:19495-19500(1995) ）ことから、先例がないことではない。さらなる実験では、ＧＰＲ−９−６を発現するＴ細胞株のみがＴＥＣＫに対して化学走性を示すことがわかったが、原始細胞の中では、ＴＥＣＫはＣＤ４リンパ球の少量サブセットに対してのみ化学走性を示した。化学走性が抗ＧＰＲ−９−６ｍＡｂ  ３Ｃ３によりブロックされることから、おそらく、これらの細胞は、ＧＰＲ−９−６を発現するＣＤ４リンパ球細胞の少量サブセットを表す。さらに、α４β７+ve記憶ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球だけがＴＥＣＫに化学走性を示し、これはＧＰＲ−９−６を発現すると予想されるサブセットである。ＴＥＣＫは、最初は、その発現が胸腺および小腸に限られている（Vicari, A.P.ら、Immunity, 7(2):291-301(1997)）、胸腺樹状細胞により産生されるケモカインとして記載した。本発明者らのノーザンブロットデータは、この観察を確認し、ＴＥＣＫのレセプター、ＧＰＲ−９−６はまた、これらの部位で発現されることを示す。小腸および胸腺におけるケモカインレセプターＧＰＲ−９−６およびそのリガンドＴＥＣＫの両方の発現は、Ｔ細胞発達および粘膜免疫学におけるＧＰＲ−９−６およびＴＥＣＫの役割が予期される。
【０１５３】
要約すると、オーファンケモカインレセプターＧＰＲ−９−６は、大部分の胸腺細胞上および粘膜部位へ輸送される記憶ＣＤ４リンパ球のサブセット上で発現されることが示された。胸腺および小腸でのＴＥＣＫおよびＧＰＲ−９−６の選択的発現は、Ｔ細胞発達および粘膜免疫応答の両方におけるＧＰＲ−９−６の二重（dual）の役割を意味する。
【０１５４】
実施例２  機能的ＧＰＲ−９−６は急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病細胞株で発現される
本明細書に記載のように、ＧＰＲ−９−６発現は、ｍＡｂ  ３Ｃ３を用いてＭＯＬＴ−４およびＭＯＬＴ−１３細胞上で検出された（表１）。ＭＯＬＴ細胞株は、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病（ＡＴＬ）と診断された患者由来のヒトＴ細胞株である。ＣＥＭ、ＰＥＥＲ、ＨＵＴ７８、ＰＭ１、ＳＫＷ３およびＪＵＲＫＡＴを含む他のＴ細胞白血病細胞株はＧＰＲ−９−６を発現しなかった。さらなる研究では、Ｔ細胞株がＴＥＣＫ誘導性化学走性を示す能力をインビトロ化学走性アッセイで評価した。ＡＬＴ細胞、ＭＯＬＴ−４およびＭＯＬＴ−１３は、ＴＥＣＫ誘導性化学走性を示したが、他のＴ細胞株（ＣＥＭ、ＰＥＥＲ）では示さなかった。
【０１５５】
実施例３  上皮内リンパ球（ＩＥＬ）およびリンパ球固有層（lamina propria lymphocyte）（ＬＰＬ）はＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）を発現し、ＴＥＣＫ誘導性化学走性を示す
リンパ球単離
ヒト腸の上皮および固有層由来のリンパ球を上述（Zabal, B.A. ら、J. Exp. Med.,190:1241-1256(1999)）のようにして単離した。簡単には、腸の小片を切り開き、平らにして氷冷ＨＢＳＳで洗浄した。はさみで粘膜から漿膜を分離し、廃棄した。粘膜を細片に切り刻み、冷０．１５％（ｗ／ｖ）ＨＢＳＳ中ジチオトレイトール(dithiolthreitol)（ＤＴＴ／ＨＢＳＳ）とともに３０分間インキュベートした。次いで、冷ＨＢＳＳで粘膜を洗浄し、粘液を除去した。次いで、粘膜細片を冷１ｍＭ  ＨＢＳＳ中ＥＤＴＡ中、攪拌下で９０分間インキュベートし、上皮および上皮内リンパ球（ＩＥＬ）を取り出した。上皮細胞が該細片から脱落しなくなるまで、攪拌下、１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＨＢＳＳ中でのインキュベーションを数回繰り返した。残った粘膜細片を５０メッシュの漉し器（Sigma. St. Louis, MO）に通して破砕し、固有層リンパ球（ＬＰＬ）を単離した。
【０１５６】
ＦＡＣＳ解析
単離したリンパ球をＦＡＣＳバッファー中に≦１×１０6ｍｌの濃度で再懸濁した。非特異的抗体結合をウマＩｇＧ（Sigma. St. Louis, MO）を用いてブロックした。非結合抗ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）抗体（ｍＡｂ  ３Ｃ３）を、ビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Vector Laboratories, Burlingame, CA）およびストレプトアビジンＰｅｒＣＰ（Phamingen, San Diego, CA）を用いて検出した。
【０１５７】
腸のリンパ球の化学走性
孔径５μｍのポリカーボネート膜を備えた２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（Corning Costar, Cambridge, MA）を用い、化学走性アッセイを行った。簡単には、０．５％ＢＳＡを有するＲＰＭＩ１６４０中に希釈した６００μｌのＴＥＣＫをＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの底部チャンバに入れ、１００μｌの細胞（ＩＥＬは１×１０6、ＬＰＬは５×１０5）を各インサートに入れた。抗体阻害実験のために、インサートをウェルに加える前に、ＩＥＬまたはＬＰＬを４０μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ３Ｃ３、対照マウスＩｇＧ２ｂ（クローン４９．２、PharMingen, San Diego, CA）とともに、または培地のみで１０分間４℃でインキュベートした。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ2中で３時間インキュベートした。アッセイ中に下側チャンバに移動した細胞の数をＦＡＣＳ解析により測定し、４０秒間隔の間で小リンパ球の光散乱プロフィル特性により検出器を通過した数を計測した。１００％細胞遊走に相当する数は、投入細胞懸濁液をＦＡＣＳにより４０秒間計測したときに記録された数の６分の１に等しかった。
【０１５８】
結果
ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）発現は、フローサイトメトリーにより末梢血白血球の少量サブセットのみで検出された。対照的に、実質的にすべてのＩＥＬおよびＬＰＬが高レベルのＧＰＲ−９−６を発現した（図１６Ａ〜１６Ｃ）。さらに、インビトロ化学走性アッセイにより、ＩＥＬおよびＬＰＬの両方がＴＥＣＫ誘導性化学走性を示し、これは抗ＧＰＲ−９−６抗体（ｍＡｂ  ３Ｃ３）により阻害されうるが、アイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ２ｂ）によっては阻害されえないことが明らかになった（図１７Ａおよび１７Ｂ）。したがって、ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）は、ＩＥＬおよびＬＰＬにより発現されるＴＥＣＫの主な生理的レセプターである。データは、腸の上皮内での白血球の局所輸送がＴＥＣＫとＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）との相互作用に媒介されることを示す。
【０１５９】
実施例４  さらなる抗ＧＰＲ−９−６ｍＡｂ
Ｃ５７／Ｂｌａｃｋマウスを、安定にＧＰＲ−９−６を発現するトランスフェクトＬ１．２細胞（ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２）１０００万個で免疫した（実施例１参照）。免疫する前に、トランスフェクトＬ１．２細胞をＰＢＳ（Sigma ）中のマイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ）で処理した。３週間後、マイトマイシンＣで処理したＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントでマウスを再度免疫した。その後、マウスをＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタント１０００万個で３週間ごとに免疫した。マウスは、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントで最低４回免疫した。ハイブリドーマ形成のため、最後の免疫から３〜４日後の免疫化マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞に融合した。ＧＰＲ−９−６（ＣＣＲ９）に特異的に結合する（すなわちＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントを染色するが、他のケモカインレセプターを発現するＬ１．２細胞トランスフェクタントは染色しない）抗体を産生するハイブリドーマをＦＡＣＳ解析により同定した。
【０１６０】
ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１を産生するマウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１を単離し、インビトロ化学走性アッセイにおいてＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２のＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害するｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１の能力を評価した。この抗体阻害アッセイのため、ＴＥＣＫに暴露する前に、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントを種々の濃度のｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１またはｍＡｂ  ３Ｃ３とともに１０分間氷上でインキュベートした。化学走性アッセイは、ＥＣＶ３０４細胞を使用しなかった以外は実質的に上述のようにして行った。図１８にグラフで示した結果により、該アッセイ条件下では、ＴＥＣＫ誘導性化学走性の阻害において、ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１はｍＡｂ  ３Ｃ３よりも効率的であることが明らかになった。
【０１６１】
ハイブリドーマＬＳ２７２  ＧＰＲ９６  １−５とも称するマウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１は、ＦＣＳ（１０％）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（１０ｍＭ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）および２−メルカプトエタノール（５．５×１０-5Ｍ）を加えたＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気中で培養することができる。
【０１６２】
実施例５  抗ＴＥＣＫ  ｍＡｂ
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、まず完全フロイントアジュバント（Sigma, F 5881）中１０μｇのヒトＴＥＣＫ（Peprotech, Rocky Hill, NJ 330-45）で腹腔内免疫した。３週間後、マウスを、不完全フロイントアジュバント（Sigma, F 5506）中１０μｇのヒトＴＥＣＫ（Peprotech, Rocky Hill, NJ 330-45）で腹腔内免疫した。その後、ＰＢＳ中１０μｇのＴＥＣＫで３週間ごとにマウスを腹腔内免疫した。各マウスは最低４回免疫した。ハイブリドーマ形成のため、最後の免疫から３〜４日後の免疫化マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞に融合した。ＴＥＣＫに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを、２μｇ／ｍｌのＴＥＣＫでコーティングしたプレート用いてＥＬＩＳＡにより同定した。次いで、インビトロアッセイにおいて、抗ＴＥＣＫ抗体をＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントのＴＥＣＫ誘導性（１５０ｎＭ）化学走性を阻害する能力について試験した。
【０１６３】
マウスハイブリドーマ１１．２、１１．３．１、１６．２および１６．３．１（ハイブリドーマ１１．３．１および１６．３．１はそれぞれハイブリドーマ１１．２および１６．２のサブクローン）を単離し、インビトロ化学走性アッセイにおいて、これらが産生するｍＡｂの、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２細胞のＴＥＣＫ誘導性化学走性阻害能を評価した。ＴＥＣＫを、対照ＩｇＧ１  ｍＡｂ（２０ｍｇ／ｍｌ）を含む培養培地中で希釈（終濃度約１５０ｎＭ）するか、またはＴＥＣＫに結合するｍＡｂを産生するハイブリドーマの条件培養培地中で１：４に希釈した。ＴＥＣＫ溶液をＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの底部に入れ、室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＧＰＲ−９−６／Ｌ１．２トランスフェクタントを培養培地中に懸濁し、インサート内に入れ、これをプレートのウェル内に入れた。トランスフェクタントを２〜３時間移動させた後、下側ウェル内に蓄積した細胞をＦＡＣＳＣＡＮで計測した。
【０１６４】
図１９にグラフで示したアッセイの結果により、ｍＡｂ  １１．２、１１．３．１、１６．２および１６．３．１のそれぞれは、ＴＥＣＫ誘導性化学走性を阻害したが、同様にＴＥＣＫに結合するｍＡｂ  ２０．２および非特異的ＩｇＧは阻害しなかった。
【０１６５】
ハイブリドーマＬＳ２５０  １１．３．１とも称するマウスハイブリドーマ１１．３．１およびハイブリドーマＬＳ２５０  １６．３．１とも称するマウスハイブリドーマ１６．３．１は、ＦＣＳ（１０％）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（１０ｍＭ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）および２−メルカプトエタノール（５．５×１０-5Ｍ）を加えたＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気中で培養することができる。
【０１６６】
実施例６  天然ＴＥＣＫ変種
Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用い、胸腺および炎症小腸または非炎症小腸のヒト試料からＲＮＡを調製した。該ＲＮＡを逆転写し、ＢＡＺ２０３（配列番号：６）およびＢＡＺ２０４（配列番号：７）を用い、記載（実施例１参照）のようにしてＰＣＲによりＴＥＣＫのコード領域を増幅した。ＰＣＲ産物を酵素ＢａｍＨ１およびＸｂａｌで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳにライゲートした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｍ１３およびＴ３）内の配列にアニーリングするプライマーを用いて挿入物のシークエンシングを行った。シークエンシングデータにより、異なる形態のＴＥＣＫがこれらの組織で発現されることが明らかになった。トレオニン（Ｔ）またはメチオニン（Ｍ）のいずれかを有するアミノ酸１０４の多型が見られた（配列番号：９）。アミノ酸１０９（アラニン）の欠損をもたらす塩基３２６〜３２８のフレームシフト欠失を有するスプライス変種も見られた。
【０１６７】
これに関してさらに、別個のＲＮＡ試料からＰＣＲにより作製した挿入物の配列を調べると、フレームシフト変異により生じる２つの形態のＴＥＣＫの差次的（differential）発現が明らかになり、アラニン欠損型は、胸腺よりも小腸においてより多かった。
【０１６８】
実施例７
ＴＥＣＫは小腸の表皮細胞により高度に発現される
インサイチューハイブリダイゼーション
合成オリゴヌクレオチド５プライムプライマー（t aag gat ccg caa ggt gcc ttt gaa gac tgc t；配列番号：１２）およびオリゴヌクレオチド３プライムプライマー（caa gaa ttc tta att gtt ctt tct ggg cat；配列番号：１３）を用いて、胸腺からＲＴ−ＰＣＲにより調製されたマウスｃＤＮＡのプールからＴＥＣＫプローブをまず増幅し、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１によりサブクローニングした。２回目のＰＣＲ増幅工程を、ＲＮＡポリメラーゼ部位を導入するために、合成オリゴヌクレオチドプライマーｍ＿ＴＥＣＫ  Ｔ３（aat taa ccc tca cta aag gga act gtg gct ttt tgc ctg c；配列番号：１４）およびｍ＿ＴＥＣＫ  Ｔ７（taa tac gac tca cta tag ggt gtt ggt ctt tct ggg cat c；配列番号：１５）を用いて行った。ＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ／Ｇｅｎｉｕｓ  ４  Ｋｉｔ(Roche Molecular Biochemicals)を用い、センスおよびアンチセンスジゴキシゲニン標識プローブを合成した。
【０１６９】
５ミクロンのマウス小腸凍結切片を切り取り、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ）上で解凍し、室温で１〜２時間風乾し、同日にハイブリダイゼーションに使用した。最初のキシレン工程を省略し、プロテイナーゼＫ（０．１μｇ／ｍｌ）で５分間室温で消化することを含めた以外は記載（“Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual" 2 nd edition Copyright 1996 Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica の Breitschopfら、Detection of mRNA on paraffin embedded material of the central nervous system with DIG-labeled RNA probes.）のようにして該切片を前処理した。２００ｎｇ／ｍｌジゴキシゲニン標識プローブ、５０％ホルムアミド（Gibco BRL）５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液（Sigma）、０．５ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ（Gibco BRL）および２５μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ（Sigma）を含むハイブリダイゼーションバッファー中で該切片を１６〜１８時間６０℃でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を０．２×ＳＳＣ中で１時間６０℃で、次いで０．２×ＳＳＣ中で５分間室温で洗浄した。ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ／Ｇｅｎｉｕｓ  ３(Roche Molecular Biochemicals)を用い、抗体（１：１００）とのインキュベーションを４℃で一晩行い、１０％７０〜１００ｋＤポリビニルアルコール（Sigma）をアルカリホスファターゼ反応バッファーに加えた以外は記載のようにしてジゴキシゲニン標識プローブを検出した。
【０１７０】
結果
インサイチューハイブリダーゼーションを用いてマウス腸におけるＴＥＣＫ発現の細胞性部位を直接評価した。ＴＥＣＫ発現は、小腸の絨毛およびリーベルキューン陰窩の上皮に局在した。絨毛での発現は、基底部で最大であり、より低レベルのＴＥＣＫハイブリダイゼーションが絨毛の上部に向かって検出された。ＴＥＣＫの発現は小腸に接着したパイアー斑（ＰＰ）では検出されなかった（図２４Ａ〜２４Ｃ）。
【０１７１】
データは、ＴＥＣＫが小腸の上皮細胞でより高レベルで選択的に発現されることを示す。この発現パターンは、循環している「小腸ホーミング」リンパ球の漸増ならびにＩＥＬおよびＬＰＬの局所漸増の調節におけるＴＥＣＫの高度に選択的な役割をさらに支持する。
【０１７２】
本発明をその好ましい態様に関して具体的に示し記載したが、当業者は、添付の請求の範囲により規定される本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく本明細書において形態および詳細の種々の変更を行いうることを理解されたい。
【０１７３】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
〔１〕  哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合し、該ＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合を阻害する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔２〕  該哺乳類ＧＰＲ−９−６がヒトＧＰＲ−９−６である、前記〔１〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔３〕  該リガンドがＴＥＣＫである、前記〔１〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔４〕  ＧＰＲ−９−６への該抗体または該抗原結合性フラグメントの結合が、配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチドにより阻害されうる、前記〔１〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔５〕  ＧＰＲ−９−６への該抗体または該抗原結合性フラグメントの結合がｍＡｂ  ３Ｃ３により阻害されうる、前記〔１〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔６〕  該抗体または抗原結合性フラグメントが、ｍＡｂ  ３Ｃ３と同一または同様のエピトープに結合する、前記〔５〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔７〕  ＧＰＲ−９−６への該抗体または該抗原結合性フラグメントの結合がｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１により阻害されうる、前記〔１〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔８〕  該抗体または抗原結合性フラグメントが、ｍＡｂ  ＧＰＲ−９−６と同一または同様のエピトープに結合する、前記〔７〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔９〕  マウスハイブリドーマ３Ｃ３により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔１０〕  哺乳類ＧＰＲ−９−６に結合し、該ＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントを産生する単離された細胞。
〔１１〕  該哺乳類ＧＰＲ−９−６がヒトＧＰＲ−９−６である、前記〔１０〕記載の単離された細胞。
〔１２〕  該リガンドがＴＥＣＫである、前記〔１１〕記載の単離された細胞。
〔１３〕  該単離された細胞が、該抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする１またはそれ以上の外来核酸分子を含有する不死化Ｂ細胞、ハイブリドーマおよび組換え細胞からなる群より選択されてなる、前記〔１２〕記載の単離された細胞。
〔１４〕  マウスハイブリドーマ３Ｃ３。
〔１５〕  ａ）生物学的試料と、哺乳類ＧＰＲ−９−６または該レセプターの一部に結合し、レセプターへのリガンドの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントとを哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部への該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程；および
ｂ）該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合を検出する工程；
を含み、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、該レセプターまたは該レセプターの一部の存在を示す、生物学的試料中の哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部の検出方法。
〔１６〕  生物学的試料がヒト起源である、前記〔１５〕記載の方法。
〔１７〕  抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
ａ）ｍＡｂ  ３Ｃ３；
ｂ）哺乳類ＧＰＲ−９−６への結合に関してｍＡｂ  ３Ｃ３と競合しうる抗体；
ｃ）哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部に結合する（ａ）または（ｂ）の抗原結合性フラグメント；および
ｄ）前述の組み合わせ、
からなる群から選択される、前記〔１６〕記載の方法。
〔１８〕  抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
ａ）ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１；
ｂ）哺乳類ＧＰＲ−９−６への結合に関してｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と競合しうる抗体；
ｃ）哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部に結合する（ａ）または（ｂ）の抗原フラグメント；および
ｄ）前述の組み合わせ、
からなる群より選択される、前記〔１６〕記載の方法。
〔１９〕  ａ）参照薬剤、
ｂ）試験薬剤、および
ｃ）機能的な哺乳類ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種を含有する組成物を、該ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種への該参照薬剤の結合に適した条件下で組み合わせる工程；ならびに
該参照薬剤と該ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種との複合体の形成を検出または測定する工程を含み、適切な対照と比較した該複合体の形成の減少が、該試験薬剤が該ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種に結合することを示す、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種に結合する薬剤を検出および同定する方法。
〔２０〕  該参照薬剤が、放射性同位体、エピトープ、アフィニティ標識、酵素、蛍光群および化学発光群からなる群より選択される標識で標識化される、前記〔１９〕記載の方法。
〔２１〕  該参照薬剤がＴＥＣＫである、前記〔１９〕記載の方法。
〔２２〕  該参照薬剤が該ＧＰＲ−９−６に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔１９〕記載の方法。
〔２３〕  機能的な哺乳類ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種を含有する該組成物が哺乳類ＧＰＲ−９−６を発現する細胞である、前記〔１９〕記載の方法。
〔２４〕  該細胞が組換え細胞である、前記〔２３〕記載の方法。
〔２５〕  該細胞が細胞株である、前記〔２３〕記載の方法。
〔２６〕  該細胞がＭＯＬＴ−４およびＭＯＬＴ−１３からなる群より選択される、前記〔２５〕記載の方法。
〔２７〕  機能的な哺乳類ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種を含有する該組成物が、哺乳類ＧＰＲ−９−６またはそのリガンド結合性変種を発現する細胞の膜調製物である、前記〔１９〕記載の方法。
〔２８〕  ａ）試験対象の薬剤、該ＧＰＲ−９−６のリガンドまたはプロモーターおよび該ＧＰＲ−９−６を発現する細胞を、リガンド誘導性応答またはプロモーター誘導性応答を検出するのに適した条件下で組み合わせる工程；および
ｂ）該応答を阻害する試験化合物の能力を測定する工程、
を含み、該薬剤によるリガンド誘導性応答またはプロモーター誘導性応答の阻害が、該薬剤がインヒビターであることの指標である、哺乳類ＧＰＲ−９−６レセプターのインヒビターを検出または同定する方法。
〔２９〕  該細胞がヒトＧＰＲ−９−６を発現する組換え細胞である、前記〔２８〕記載の方法。
〔３０〕  該リガンドまたはプロモーターがＴＥＣＫである、前記〔２９〕記載の方法。
〔３１〕  該応答が化学走性またはＣａ2+フラックスである、前記〔２８〕記載の方法。
〔３２〕  被験体に哺乳類ＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、炎症性疾患を有する被験体の治療方法。
〔３３〕  該炎症性疾患がクローン病または結腸炎である、前記〔３２〕記載の方法。
〔３４〕  該アンタゴニストが哺乳類ＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合を阻害する、前記〔３２〕記載の方法。
〔３５〕  該リガンドがＴＥＣＫである、前記〔３４〕記載の方法。
〔３６〕  該アンタゴニストが哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその抗原結合性フラグメントに結合する抗体である、前記〔３４〕記載の方法。
〔３７〕  被験体にＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、被験体における白血球のＧＰＲ−９−６媒介性ホーミングの阻害方法。
〔３８〕  該アンタゴニストが、ＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合を阻害する、前記〔３７〕記載の方法。
〔３９〕  該リガンドがＴＥＣＫである、前記〔３８〕記載の方法。
〔４０〕  該アンタゴニストが、ＧＰＲ−９−６に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔３９〕記載の方法。
〔４１〕  被験体にＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、被験体における粘膜組織への白血球のＧＰＲ−９−６媒介性ホーミングの阻害方法。
〔４２〕  該被験体にＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、炎症性腸疾患を有する患者の治療方法。
〔４３〕  該アンタゴニストがＧＰＲ−９−６へのリガンドの結合を阻害する、前記〔４２〕記載の方法。
〔４４〕  該リガンドがＴＥＣＫである、前記〔４３〕記載の方法。
〔４５〕  該アンタゴニストがＧＰＲ−９−６に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔４４〕記載の方法。
〔４６〕  ＧＰＲ−９−６を発現する細胞とそれに結合する薬剤とを接触させ、それにより該ＧＰＲ−９−６の機能を調節する工程を含む、ＧＰＲ−９−６機能の調節方法。
〔４７〕  該薬剤がＧＰＲ−９−６の機能を阻害しうる、前記〔４６〕記載の方法。
〔４８〕  該薬剤が抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔４７〕記載の方法。
〔４９〕  該機能が、リガンド結合、リガンド誘導性化学走性およびリガンド誘導性Ｃａ2+フラックスからなる群より選択される、前記〔４８〕記載の方法。
〔５０〕  該リガンドがＴＥＣＫである、前記〔４９〕記載の方法。
〔５１〕  ａ）哺乳類ＧＰＲ−９−６または該レセプターの一部に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性フラグメント、ここで該抗体またはその抗原結合性フラグメントがレセプターへのリガンドの結合を阻害する；および、
ｂ）該抗体またはその抗原結合性フラグメントと該哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部との複合体の存在を検出するのに適切な１またはそれ以上の補助試薬、
を含有してなる、生物学的試料中の哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部の存在の検出に使用するための試験キット。
〔５２〕  抗体が、
ａ）ｍＡｂ  ３Ｃ３；
ｂ）哺乳類ＧＰＲ−９−６への結合に関してｍＡｂ  ３Ｃ３と競合しうる抗体；
ｃ）哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部に結合する（ａ）または（ｂ）の抗原結合性フラグメント；および
ｄ）前述の組み合わせ、
からなる群より選択されてなる、前記〔５１〕記載の試験キット。
〔５３〕  抗体が、
ａ）ｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１；
ｂ）哺乳類ＧＰＲ−９−６への結合に関してｍＡｂ  ＧＰＲ９６−１と競合しうる抗体；
ｃ）哺乳類ＧＰＲ−９−６またはその一部に結合する（ａ）または（ｂ）の抗原結合性フラグメント；および
ｄ）前述の組み合わせ
からなる群より選択されてなる、前記〔５１〕記載の試験キット。
〔５４〕  哺乳類ＴＥＣＫに結合し、レセプターへの該ＴＥＣＫの結合を阻害する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔５５〕  該哺乳類ＴＥＣＫがヒトＴＥＣＫである、前記〔５４〕記載の抗体またはその抗原フラグメント。
〔５６〕  該レセプターがＧＰＲ−９−６である、前記〔５４〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔５７〕  ＴＥＣＫへの該抗体または該抗原結合性フラグメントの結合が、ｍＡｂ  １１．３．１および／またはｍＡｂ  １６．３．１により阻害されうる、前記〔５４〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔５８〕  該抗体または抗原結合性フラグメントが、ｍＡｂ  １１．３．１と同一または同様のエピトープに結合する、前記〔５７〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔５９〕  該抗体または抗原結合性フラグメントが、ｍＡｂ  １６．３．１と同一または類似のエピトープに結合する、前記〔５７〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔６０〕  マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔６１〕  マウスハイブリドーマＧＰＲ９６−１。
〔６２〕  マウスハイブリドーマ１１．３．１により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔６３〕  マウスハイブリドーマ１１．３．１。
〔６４〕  マウスハイブリドーマ１６．３．１により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔６５〕  マウスハイブリドーマ１６．３．１。
〔６６〕  哺乳類ＴＥＣＫに結合し、レセプターへの該ＴＥＣＫの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントを産生する単離された細胞。
〔６７〕  該哺乳類ＴＥＣＫがヒトＴＥＣＫである、前記〔６６〕記載の単離された細胞。
〔６８〕  レセプターがＧＰＲ−９−６である、前記〔６６〕記載の単離された細胞。
〔６９〕  ａ）生物学的試料と、哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部に結合し、レセプターへのＴＥＣＫの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントとを、哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部への該抗体またはその抗原フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程；および
ｂ）該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合を検出する工程；
を含み、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、該レセプターまたは該レセプターの一部の存在を示す、生物学的試料中の哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部の検出方法。
〔７０〕  ａ）哺乳類ＴＥＣＫまたは該レセプターの一部に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性フラグメント、ここで該抗体またはその抗原結合性フラグメントがレセプターへのＴＥＣＫの結合を阻害する；および
ｂ）該抗体またはその抗原結合性フラグメントと該哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部との複合体の存在を検出するのに適切な１またはそれ以上の補助試薬、
を含有してなる、生物学的試料中の哺乳類ＴＥＣＫまたはその一部の存在の検出に使用するための試験キット。
〔７１〕  ＧＰＲ−９−６機能のアンタゴニストの有効量を被験体に投与する工程を含む、癌を有する被験体の治療方法。
〔７２〕  該アンタゴニストが、ＧＰＲ−９−６に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔６２〕記載の方法。
〔７３〕  ＧＰＲ−９−６に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの有効量を被験体に投与する工程を含み、該抗体またはフラグメントが補体を活性化しうる、癌を有する被験体の治療方法。
〔７４〕  免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質の有効量を被験体に投与する工程を含み、該免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質が、さらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合したＧＰＲ−９−６に結合する抗体の少なくとも抗原結合部分を含有する、癌を有する被験体の治療方法。
〔７５〕  該さらなる治療薬剤が細胞傷害剤である、前記〔７４〕記載の方法。
〔７６〕  さらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合したＧＰＲ−９−６に結合する抗体の抗原結合部分を少なくとも含有する免疫複合体。
〔７７〕  さらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合したＧＰＲ−９−６に結合する抗体の抗原結合部分を少なくとも含有し、該抗体の抗原結合部分および該さらなる治療薬剤が連続するポリペプチドの一部である、抗原結合性融合タンパク質。
【図１】
0005933204.tif 000007
【図２】
0005933204.tif 000008
【図３Ａ−Ｆ】
0005933204.tif 000009
【図３Ｇ−Ｉ】
0005933204.tif 000010
【図４】
0005933204.tif 000011
【図５】
0005933204.tif 000012
【図６】
0005933204.tif 000013
【図７】
0005933204.tif 000014
【図８Ａ−Ｄ】
0005933204.tif 000015
【図８Ｅ−Ｆ】
0005933204.tif 000016
【図９】
0005933204.tif 000017
【図１０Ａ−Ｂ】
0005933204.tif 000018
【図１０Ｃ−Ｆ】
0005933204.tif 000019
【図１１】
0005933204.tif 000020
【図１２】
0005933204.tif 000021
【図１３】
0005933204.tif 000022
【図１４Ａ】
0005933204.tif 000023
【図１４Ｂ】
0005933204.tif 000024
【図１５】
0005933204.tif 000025
【図１６】
0005933204.tif 000026
【図１７】
0005933204.tif 000027
【図１８】
0005933204.tif 000028
【図１９】
0005933204.tif 000029
【図２０】
0005933204.tif 000030
【図２１】
0005933204.tif 000031
【図２２】
0005933204.tif 000032
【図２３】
0005933204.tif 000033
【図２４】
0005933204.tif 000034
【配列表】
0005933204000001.app