(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２を指向するか、またはケモカイン受容体ＣＸＣＲ２に結合する、少なくとも２つの免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、ＣＸＣＲ２上の第１エピトープを認識する第１抗原結合ドメインと、ＣＸＣＲ２上の第２エピトープを認識する第２抗原結合ドメインとを含み、
ポリペプチドは下記構造：
ｉ）ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−−リンカー−−ＨＬＥ
［式中、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が第１抗原結合ドメインを含むのであれば、ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８は第２抗原結合ドメインを含み；
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が第２抗原結合ドメインを含むのであれば、ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８は第１抗原結合ドメインを含み；
ＨＬＥは増加したインビボ半減期を与える結合ユニットである］。
を有し、
ａ）単一可変ドメインの該第２免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含み、かつ単一可変ドメインの該第１免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号２３７に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８６に示すアミノ酸配列を含む；
ｂ）単一可変ドメインの該第２免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含み、かつ単一可変ドメインの該第１免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む；
ｃ）単一可変ドメインの該第２免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含み、かつ単一可変ドメインの該第１免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４３に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号２３５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８３に示すアミノ酸配列を含む；
ｄ）単一可変ドメインの該第２免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１７１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１９１に示すアミノ酸配列を含み、かつ単一可変ドメインの該第１免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号２３７に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８６に示すアミノ酸配列を含む；
ｅ）単一可変ドメインの該第２免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１７１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１９１に示すアミノ酸配列を含み、かつ単一可変ドメインの該第１免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む；または
ｆ）単一可変ドメインの該第２免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１７１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１９１に示すアミノ酸配列を含み、かつ単一可変ドメインの該第１免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４３に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号２３５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８３に示すアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
第１抗原結合ドメインが、配列番号２１６に示すアミノ酸配列であり、第２抗原結合ドメインが、配列番号２１７に示すアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２２１、２２２、２２５、２２６、または２２７に示すアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
部分的にまたは完全にヒト化された、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
該第１抗原結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸Ｆ１１、Ｆ１４およびＷ１５を含むエピトープに結合する、請求項１〜４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
該エピトープが線状である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
該第２抗原結合ドメインがヒトＣＸＣＲ２の外部ループ内のエピトープ（配列番号１のアミノ酸残基１０６〜１２０、１８４〜２０８および２７４〜２９４）に結合する、請求項１〜６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
該エピトープが配列番号１のアミノ酸残基１０６〜１２０内にある、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
該エピトープがコンフォメーショナルである、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
該第２抗原結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸残基Ｗ１１２、Ｇ１１５、Ｉ２８２およびＴ２８５を含むＣＸＣＲ２のエピトープに結合する、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＨＬＥが配列番号２２８に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２２５に示すアミノ酸配列からなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸分子または請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドと医薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１７】
医薬品として使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）およびＣＯＰＤの増悪の処置に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
嚢胞性線維症、喘息、重症喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成の処置に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管新生ならびに黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む新しい血管の発達を特徴とする疾患、多発性硬化症、乾癬、加齢性黄斑変性疾患、眼ベーチェット病、ぶどう膜炎、特発性ＰＡＨ、家族性ＰＡＨおよび随伴性ＰＡＨを含む肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、非小細胞癌、大腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞癌、虚血  再灌流傷害、鎌形血球症における溶血性輸血誘発性血流閉塞発作、虚血／再灌流傷害、急性脳卒中／心筋梗塞、閉鎖性頭部外傷、外傷後炎症またはインスリン抵抗性糖尿病の処置に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または（ＣＯＰＤ）の増悪を処置するための医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか一つのポリペプチドの有効量を含む、嚢胞性線維症、喘息、重症喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成からなる群より選択される状態を処置するための医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を含む、アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管新生ならびに黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む新しい血管の発達を特徴とする疾患、多発性硬化症、乾癬、加齢性黄斑変性疾患、眼ベーチェット病、ぶどう膜炎、特発性ＰＡＨ、家族性ＰＡＨおよび随伴性ＰＡＨを含む肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、非小細胞癌、大腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞癌、虚血灌流傷害、鎌形血球症における溶血性輸血誘発性血流閉塞発作、虚血／再灌流傷害、急性脳卒中／心筋梗塞、閉鎖性頭部外傷、外傷後炎症およびインスリン抵抗性糖尿病からなる群より選択される状態を処置するための医薬組成物。
【請求項２４】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）またはＣＯＰＤの増悪を処置するための医薬品の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２５】
喘息、重症喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成を処置するための医薬品の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２６】
アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管新生ならびに黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む新しい血管の発達を特徴とする疾患、多発性硬化症、乾癬、加齢性黄斑変性疾患、眼ベーチェット病、ぶどう膜炎、特発性ＰＡＨ、家族性ＰＡＨおよび随伴性ＰＡＨを含む肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、非小細胞癌、大腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞癌、虚血再灌流傷害、鎌形血球症における溶血性輸血誘発性血流閉塞発作、虚血／再灌流傷害、急性脳卒中／心筋梗塞、閉鎖性頭部外傷、外傷後炎症またはインスリン抵抗性糖尿病を処置するための医薬品の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケモカイン受容体CXCR2を指向し、ケモカイン受容体CXCR2に特異的に結合するポリペプチドに関し、特にCXCR2からのシグナル伝達を調整する能力を有するポリペプチドに関する。また本発明は、本発明のポリペプチドを発現する能力を有する核酸、ベクターおよび宿主細胞、前記ポリペプチドを含む医薬組成物、ならびに慢性閉塞性肺疾患（COPD）およびCXCR2の異常機能が関与する他の疾患を処置するための該ポリペプチドおよび組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、気流制限を特徴とする一連の障害を記述するために使用される用語であり、この気流制限は、ほとんどの場合、進行性であり、かつ有害粒子に対する肺の異常な炎症応答と関連し、気道機能の低下をもたらす肺実質の破壊を伴う（Barnes PJら, 2003「Chronic obstructive pulmonary disease: molecular and cellular mechanisms」Eur. Respir J, 22, 672-688；Barnes PJら, 2004「Mediators of chronic obstructive pulmonary disease」Pharmacol. Rev. 56, 515-548）。遺伝因子および環境因子はCOPDの発生の一因であるが、喫煙は最も重要な単独原因であり、再発性肺感染が進行性の肺機能減退につながる。禁煙が疾患の進行を低減するのは、それを早期に適用した場合に限られ、著しい症状が起こった後では、ほとんど効果がない。COPDには、喘息、心血管疾患、うつ病および筋消耗など、いくつかの合併性状態が関連する（Mannino DMおよびBuist S, 2007「Global burden of COPD: risk factors, prevalence and future trends」Lancet, 370, 765-773）。
【０００３】
ケモカインは走化性因子のなかでも数が多く、それゆえに、COPD肺における慢性炎症およびその急性憎悪時のさらなる増幅のとりまとめに、重要な役割を果たしている。ケモカインIL-8（CXCL8）、GROα（CXCL1）およびENA-78（CXCL5）の生物学的活性は、白血球および体中の至るところにある他の多くの細胞タイプ上に存在する2つの細胞表面受容体群CXCR1およびCXCR2によって媒介される。白血球の遊走は、主として、IL-8、GROα、β、γ、ENA78、およびGCP-2を含むいくつかのリガンドに結合するCXCR2によって媒介される。対照的に、CXCR1はIL-8によって選択的に活性化され、IL-8ほどではないが、GCP-2によっても活性化される。インビボでのヒト好中球走化性が、一方の受容体によって媒介されるのか、それとも両方の受容体によって媒介されるのかは、まだ不明である。
【０００４】
CXCR2は、CXCR1とアミノ酸レベルで78％のホモロジーを共有し、どちらの受容体も、好中球上に異なる分布パターンで存在する。CD8+ T細胞、NK、単球、肥満細胞、上皮、内皮、平滑筋および中枢神経系の多数の細胞タイプを含むさまざまな細胞および組織におけるCXCR2の発現は、この受容体が、構成的条件下でも、多くの急性および慢性疾患の病態生理においても、幅広い機能的役割を有しうることを示唆している。CXCR2活性化は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質のGiファミリーと共役している受容体を刺激し、それが次に、細胞内イノシトールリン酸の放出、細胞内Ca2+の増加を刺激すると共に、ERK1/2依存的機序によって、ケモカイン勾配に対する有方向的細胞遊走に関連する細胞内タンパク質のリン酸化を刺激する。ひとたび活性化されると、CXCR2はリン酸化され、アレスチン/ダイナミン依存的機序によって迅速に内部に取り込まれて、受容体脱感作をもたらす。この過程は、他の大半のGPCRで観察されるものと似ているが、アゴニストが誘導するCXCR2のインターナリゼーションの速度と程度は、CXCR1で見られるものよりも大きい（Richardson RM, Pridgen BC, Haribabu B, Ali H, Synderman R. 1998「Differential cross-regualtion of the human chemokine receptors CXCR1 and CXCR2. Evidence for time-dependent signal generation」J Biol. Chem, 273, 23830-23836）。
【０００５】
IL-8は古くからCOPDにおける好中球性炎症のメディエーターであると目されてきた（Keatings VMら, 1996「Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma」Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153, 530-534；Yamamoto Cら, 1997「Airway inflammation in COPD assessed by sputum levels of interleukin-8」Chest, 112, 505-510）。COPD患者からの気管支気道、小気道および肺実質の生検材料では、T細胞の浸潤と好中球数の増加が、特に気道内腔に認められる（Hogg JCら, 2004「The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease」N. Eng. J. Med. 350, 2645-2653）。COPD患者の肺では好中球が増加しており、これは疾患の重症度と相関する（Keatings VMら, 1996「Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma」Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153, 530-534）。加えて、COPD患者の喀痰ではTNFαのレベルも上昇しており、これは、気道上皮細胞からのIL-8を誘導する（Keatings）。COPD患者の誘発喀痰および気管支肺胞洗浄（BAL）液では、正常喫煙者および非喫煙者と比較して、GROα濃度が著しく上昇している（Traves SLら 2002「Increased levels of the chemokines GROα and MCP-1 in sputum samples from patients with COPD」Thorax, 57, 50-595；Pesci A.ら, 1998「Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with COPD」Eur Respir J. 12, 380-386）。GROαは、TNFα刺激に応答して肺胞マクロファージおよび気道上皮細胞によって分泌され、CXCR2を選択的に活性化し、好中球および単球にとって走化性である。COPD患者では、GROαに対する単球走化性応答の増加が認められるが、これは、これらの細胞におけるCXCR2のターンオーバーまたは再利用の増加と関係しているのかもしれない（Traves SLら, 2004「Specific CXC but not CC chemokines cause elevated monocyte migration in COPD: a role for CXCR2」J Leukoc. Biol. 76, 441-450）。ウイルス性および細菌性の肺感染は、COPD患者では、しばしば、気道における好中球数の増加を特徴とする重症な増悪をもたらす（Wedzicha JA, Seemungal TA., 2007, COPD exacerbations: defining their cause and prevention」Lancet 370 (9589): 786-96）。COPD急性重症増悪患者の気管支生検材料では、ENA-78、IL-8およびCXCR2 mRNA発現の量が有意に増加しており（Qiu Yら, 2003「Biopsy neutrophilia, neutrophil chemokine and receptor gene expression in severe exacerbations of chronic obstrutive pulmonary disease」Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 168, 968-975）、喀痰では好中球数が増加している（Bathoorn E, Liesker JJw, Postma DSら「Change in inflammation in out-patient COPD patients from stable phase to a subsequent exacerbation」(2009) Int J COPD, 4(1):101-9）ことから、COPDとこの疾患の重症増悪の両方におけるこの受容体の潜在的役割が示唆される。気管支生検標本では、組織好中球の存在と相関するCXCR2 mRNAの発現が増加している（Qiu 2003）。ENA-78は主として上皮細胞に由来し、COPDの増悪中は、上皮細胞におけるENA-78発現に、著しい増加が認められる（Qiu 2003）。COPD気道ではIL-8、GROαおよびENA-78の濃度が増加しており、これら3つのリガンドは全て、CXCR2を介してシグナルを伝達するので、この共通の受容体を選択的アンタゴニストでブロックすることは、この疾患における効果的な抗炎症戦略になるであろう。
【０００６】
COPDはゆっくりと進行性に進展し、疾患進行は、伝統的には、努力呼気量（FEV1）の肺活量測定などといった肺機能検査によって見積もられる。＜50％予想FEV1の患者は重症と分類される。重症COPD患者の35％近くが12年以内にこの疾患で死亡するのに対して、軽症〜中等症患者の場合は5％に過ぎないので、肺機能は死亡率と密接に関連する。COPDは、世界で4番目の死亡原因であり（世界保健機関（WHO）、World Health Report, ジュネーブ, 2000、URL：http://www.who.int/whr/2000/en/whr00_annex_en.pdfから入手可能）、今後数十年にわたって、その有病率および死亡率のさらなる増加を予想することができる（Lopez AD, Shibuya K, Rao Cら, 2006「Chronic obstructive pulmonary disease: current burden and future projections」Eur Respir J, 27(2), 397-412）。増悪は、体調不良の下方スパイラルにおける重要な因子であり、COPD入院の大部分の主要原因になっている（BTS（British Thoracic Society）, 2006「Burden of Lung Disease Report」第2版, http://www.brit-thoracic.org.uk/Portals/0/Library/BTS%20Publications/burdeon of_lung_disease2007.pdf）。平均年率は、症状面から見た（symptom-defined）増悪については2.3、健康管理面から見た（healthcare-defined）増悪については2.8であった（O'Reilly JF, Williams AE, Holt Kら, 2006, Prim Care Respir J. 15(6):346-53）。予防の改善に加えて、早期診断と患者の増悪に関する管理の改善は、これらの入院がすでに手一杯の資源に課す負担を低減するのに役立つであろう。利用できるCOPDの処置は主に対症療法的であり、この疾患に関連する肺機能の減退または進行性の気道破壊を停止する治療法はない。この疾患の症状および増悪の処置には、短時間作用型および長時間作用型β-アドレナリン作動性気管支拡張薬、吸入抗コリン作用薬（ムスカリンアンタゴニスト）および吸入コルチコステロイドなどといった処置が、現在使用されている。現行のコルチコステロイド療法の大きな制約は、患者がコルチコステロイドに対する抵抗性を示してこれらの薬物の抗炎症作用を不活化するため、コルチコステロイドが効果を失ってしまうことである。COPDの進行を防止する新規薬物に対して、未だ満たされていない大きな医療ニーズが依然として存在することは、明白である。ケモカイン受容体アンタゴニストはCOPD治療に対する魅力的なアプローチである。というのも、COPDにおける炎症性細胞輸送は複数のケモカインによって編成されているので、LMWアンタゴニストによるケモカイン受容体のブロックは、この疾患における効果的な抗炎症戦略になるかもしれないからである。COPDにおける極めて重要な特徴は正常な喫煙者にみられる炎症応答の増幅であるから、治療の目標は、炎症細胞浸潤を完全に抑制することではなく、それを、COPDを有さない正常喫煙者にみられるレベルまで低下させることである。抗CXCR2は、特異的に作用することにより、ステロイドに付随する全般的免疫抑制を回避するであろう−CXCR1活性の保全は、COPDおよびCFにおける宿主防御にとって重要なベースライン好中球活性化を可能にするであろう。大半のCOPD薬は、現在、全身性副作用を低下させるために吸入によって投与されているが、ケモカインアンタゴニストは循環している炎症細胞において発現する受容体に作用するので、全身性投与が最適であるだろう。これは、COPDにおいて冒される小気道および肺実質に到達するための効率のよい方法になるであ��う。
【０００７】
ケモカイン受容体は、サイトカインおよびインターロイキン受容体とは異なり、高度に「ドラッガブル」（druggable）な7TM-GPCRのスーパーファミリーに属している。にも関わらず、強力なアンタゴニストを見いだそうという初期の試みは、低分子ペプチドまたは生体アミンリガンドを有するGPCRでの経験に基づいて予測されていたものを上回る困難に直面した。ケモカイン受容体アンタゴニストに的を絞った低分子創薬計画での努力により、ケモカイン受容体の特質と、アンタゴニストとして作用するために低分子に要求される構造的要素とが、次第に理解され始めた。興味深いことに、CCケモカイン受容体アンタゴニストの構造的多様性は、同定された本質的に異なる化学系統の数によって表されるとおり、CXCケモカイン受容体アンタゴニストの場合よりもかなり高く、このことは、アンタゴニストを発見することの相対的な難しさが、これら2つの受容体クラスの間で、異なりうることを示唆している。
【０００８】
ケモカイン受容体は全般に、アンタゴナイズするのが困難なターゲットであることが判明しており、強力で選択的なCXCR2アンタゴニストを同定するために、多大な努力がなされてきた。初めての低分子量CXCR2アンタゴニストが1998年に記載されて以来、多くの非競合的アロステリックCXCR2アンタゴニストが開発され、そのうちのいくつかは、現在、臨床治験まで進んでいる。それでもなお、より良く、より強力な、CXCR2機能のアンタゴニストが、明らかに必要とされている。
【０００９】
免疫グロブリンクラスの分子は、この10年ほどの間に、その臨床的有用性が著しく拡大した。ターゲットに対するそれらの特異性と、組換え技法を使ってそれらを工学的に操作できることとが、高度に指向的な疾患処置を開発する可能性を、著しく高めている。従来の四本鎖抗体、FabおよびF(ab)2フラグメント、単一ドメイン抗体（D(ab)）、単鎖Fvおよびナノボディ（Nanobody）を含む多くのタイプの免疫グロブリン分子および修飾免疫グロブリン分子は、適切な工学的操作を加えるために利用することが、潜在的に可能である。これらを、CXCR2の少なくとも2つのエピトープを指向するように構築されたポリペプチドに関する本発明との関連において、以下にさらに詳しく議論する。
【００１０】
それゆえに、慢性閉塞性肺障害またはCOPDおよびケモカイン受容体CXCR2の異常機能と関連する他の疾患を防止または処置する新しい手段を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
COPDおよびCXCR2の異常機能と関連する他の疾患を処置または防止する手段であって、免疫療法であるものを提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１２】
CXCR2シグナル伝達のアンタゴニストである免疫グロブリンCDRを含むポリペプチドを提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【発明の概要】
【００１３】
発明の概要
本発明は、ケモカイン受容体CXCR2を指向するか、またはケモカイン受容体CXCR2に結合する、少なくとも2つの免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、CXCR2上の第1エピトープを認識する第1抗原結合ドメインと、CXCR2上の第2エピトープを認識する第2抗原結合ドメインとを含むポリペプチドに関する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号7に示すアミノ酸の配列からなる線状ペプチドに結合する能力を有する第1抗原結合ドメインと、該線状ペプチドに結合する能力を有さないかまたは該線状ペプチドに低いアフィニティで結合する第2抗原結合ドメインとを含む。配列番号7はヒトCXCR2の最初の19個のN末端アミノ酸である。本発明の好ましいポリペプチドは二パラトープ性（biparatopic）である。本明細書において使用する用語「二パラトープ性」は、ポリペプチドが、同じタンパク質ターゲット上の2つの異なるエピトープを認識する2つの抗原結合ドメインを含むことを意味する。ただし、多パラトープ性（multiparatopic）であるポリペプチド、すなわち、同じターゲットタンパク質上の3つ、4つまたはそれ以上のエピトープを認識する抗原結合ドメインを含有するポリペプチドも、本発明の範囲に包含され、二パラトープ性または多パラトープ性であり、かつ多価でもあるポリペプチド、すなわち、1つ以上の他のターゲットタンパク質を認識する抗原結合ドメインをも有するポリペプチドも同様である。
【００１４】
本発明の好ましいポリペプチドでは、第1抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列と第2抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列とが、リンカー領域によって接合される。本明細書においてさらに詳しく議論するとおり、リンカーは免疫グロブリン由来であっても、そうでなくてもよいが、好ましくはペプチドである。
【００１５】
特に好ましい本発明のポリペプチドでは、該第1抗原結合ドメインが第1免疫グロブリン単一可変ドメイン内に含まれ、該第2抗原結合ドメインが第2免疫グロブリン単一可変ドメイン内に含まれる。該第1および第2免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも一方は、VLドメインもしくはそのフラグメントであるか、またはVHドメインもしくはそのフラグメントであることができる。第1および第2抗原結合ドメインのそれぞれが、VLドメインもしくはそのフラグメント内に含まれるポリペプチド、または第1および第2抗原結合ドメインのそれぞれが、VHドメインもしくはそのフラグメント内に含まれるポリペプチドは、本発明に包含される。本発明のポリペプチドは、VLアミノ酸配列とVHアミノ酸配列またはそれらのフラグメントの両方を、単一分子内に含みうる。
【００１６】
さらなる好ましい実施形態では、第1および第2抗原結合ドメインが、ドメイン抗体（dAb）である第1および第2免疫グロブリン単一可変ドメイン内に含まれる。最も好ましい実施形態では、該第1および第2抗原結合ドメインの少なくとも一方、好ましくは両方が、ラクダ科動物から得ることができる重鎖抗体の単一重鎖からのVHHドメインである免疫グロブリン単一可変ドメイン内に含まれるか、またはそのフラグメントであるか、または少なくとも1つのヒト化置換がフレームワーク領域中に組み込まれているそのヒト化型である。
【００１７】
ラクダ科動物から得ることができるタイプの重鎖のみの抗体からのVHHアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを、ここでは、代替的に、「VHHドメイン」もしくはそのフラグメントというか、または「ナノボディ」（Nanobody）という場合がある。Nanobody（登録商標）、Nanobodies（登録商標）およびNanoclone（登録商標）は、Ablynx N.V.の登録商標であることに留意しなければならない。
【００１８】
本発明のポリペプチドにおいて、各抗原結合ドメインは、本明細書において定義する少なくとも1つのCDR、好ましくは2つまたは3つのCDRを含む。本発明の好ましいポリペプチドでは、免疫グロブリン単一可変ドメインの好ましい構造は、VHHドメインまたはナノボディの構造であり、次の構造を有するものである：
FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR
［式中、CDRおよびFRは、本明細書においてさらに定義するとおりである］。
【００１９】
本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディは、次に挙げる構造の一つを有する：
i）FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
ii）FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--リンカー--HLE
iii）FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--HLE--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4が第1抗原結合ドメイン（線状配列番号7結合剤）を含むのであれば、FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8は、第2抗原ドメイン（線状配列番号7非結合剤）を含み、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4が第2抗原ドメイン（線状配列番号7非結合剤）を含むのであれば、FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8は第1抗原結合ドメイン（線状配列番号7結合剤）を含み、HLEは増加したインビボ半減期を与える結合ユニットである］。
【００２０】
上記好ましい二パラトープ性ナノボディのフラグメントまたは変異体は、CDRおよびFRがラクダ化動物由来のものである実施形態、またはFRの1つ以上が少なくとも1つのヒト化置換を有し、好ましくは完全にヒト化されている実施形態を含めて、本発明に包含される。
【００２１】
特に好ましい本発明の二パラトープ性ナノボディは、本明細書において163D2/127D1、163E3/127D1、163E3/54B12、163D2/54B12、2B2/163E3、2B2/163D2、97A9/2B2および97A9/54B12と呼ばれるもの（そのアミノ酸配列は表13に示す）、特に、FRが本明細書に定義する最適化アミノ酸置換を含んでいる、例えばコンポーネントナノボディについて表32に示すような、その変異体である。
【００２２】
さらなる特に好ましい本発明の二パラトープ性ナノボディは、表33に示すものである。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、CXCR2シグナル伝達の調整物質であり、CXCR2活性をブロックし、低下させ、または阻害する。これらは、ヒトCXCR2への天然リガンド（例えばGro-α）の結合を、20nM未満のIC50で阻害しうる。好ましくは、本発明のポリペプチド、特に本発明の二パラトープ性ナノボディは、上で説明した163D2/127D1、163E3/127D1、163E3/54B12、163D2/54B12、2B2/163E3、2B2/163D2、97A9/2B2および97A9/54B12の1つ以上によるCXCR2への結合を交差ブロックする能力を有する。
【００２４】
また、二もしくは多パラトープ性または多価ナノボディの構築に使用される一価ポリペプチドビルディングブロックも、ここに記載する発明に包含される。好ましい一価ナノボディは、表9、表34に示すアミノ酸配列、またはフレームワーク領域の少なくとも1つが表9または表34に示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を伴う、ありとあらゆるポリペプチドである。好ましい一価ナノボディは、表9に示すものであるが、フレームワーク領域に少なくとも1つの配列最適化置換を伴うもの、例えば表32または表34に示すナノボディなどである。137B7と呼ばれる一価ナノボディおよびその配列最適化型は特に好ましい。
【００２５】
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸F11、F14およびW15を含むエピトープ（CXCR2）に結合する。本発明の好ましい二パラトープ性ポリペプチド、例えば二パラトープ性ナノボディでは、第2抗原結合ドメインが、ヒトCXCR2の外部ループ（配列番号1のアミノ酸残基106〜120、184〜208および274〜294）内のエピトープに結合する。本発明の一実施形態では、該エピトープがコンフォメーショナルである。本発明のある実施形態では、該エピトープが、配列番号1のアミノ酸残基W112、G115、I282およびT285を含む。
【００２６】
本発明は、任意の本発明ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにそのフラグメントをコードする核酸、例えば二パラトープ性ナノボディ内に含まれる個々のナノボディをコードする核酸なども包含する。本発明の核酸を含むベクター、および該ベクターを含み、本発明のポリペプチドを発現する能力を有する宿主細胞も、本発明に包含される。
【００２７】
もう一つの態様において、本発明は、医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わされた本発明のポリペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明のポリペプチドはCXCR2の活性をブロックし、阻害し、または低下させることができるので、これらは、CXCR2からの異常なシグナル伝達が役割を果たす疾患の処置に有用である。そのような疾患としては、アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管新生、多発性硬化症、乾癬、加齢性黄斑変性疾患、眼ベーチェット病、ぶどう膜炎、非小細胞癌、大腸がん、膵がん、食道がん、黒色腫、肝細胞癌または虚血灌流傷害などを挙げることができる。そのような疾患には、嚢胞性線維症、重症喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成（bronchopulmonary dysplasis）などといった気道の状態も含めることができる。
【００２８】
特に好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、白血球（特に好中球）の肺実質への遊走とそれに続くその破壊とを特徴とし、その遊走がCXCR2シグナリングを介して媒介される、慢性閉塞性肺障害（COPD）またはCOPDの増悪を処置するのに使用するためのものである。CXCR2活性をブロックし、阻害し、または低下させる本発明ポリペプチドの能力は、それらを、この疾患の防止または処置において使用するための優れた候補にしている。
【００２９】
ヒトの処置については、本発明のポリペプチドが、ヒトCXCR2を指向し、またはヒトCXCR2に特異的に結合することが、好ましい。ただし、該ポリペプチドが霊長類CXCR2、特にカニクイザルCXCR2と交差反応することができるのであれば、適当な毒性試験を該サルで実施するためには、それが好ましい。獣医学的使用が考えられる場合には、本発明のポリペプチドが、他の種に由来するCXCR2ホモログを指向するか、他の種に由来するCXCR2ホモログに特異的に結合してもよい。
【００３０】
本発明の他の態様は、本明細書におけるさらなる議論から明白になるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
本明細書、実施例および特許請求の範囲においては、
a）別段の表示または定義がある場合を除き、使用される用語は全て、当技術分野におけるその通常の意味を有し、それらは当業者には明白であるだろう。例えば次に挙げるような標準的参考書を参照されたい。Sambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第2版）第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；F. Ausubelら編「Current protocols in protocols」Green Publishing and Wiley Interscience、ニューヨーク（1987）；Lewin「Genes II」John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク（1985）；Oldら「Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering」第2版、University of California Press、カリフォルニア州バークレー（1981）；Roittら「Immunology」（第6版）Mosby/Elsevier、エディンバラ（2001）；Roittら「Roitt' s Essential Immunology」第10版、Blackwell Publishing、英国（2001）；およびJanewayら「Immunobiology」（第6版）Garland Science Publishing/Churchill Livingstone、ニューヨーク（2005）。
【００３３】
b）別段の表示がある場合を除き、「免疫グロブリン」または「免疫グロブリン配列」という用語は−それが、本明細書において、重鎖抗体を指すために使用されているか、従来の4本鎖抗体を指すために使用されているかとはかかわりなく−フルサイズの抗体、その個々の鎖、ならびにその全てのパーツ、ドメインまたはフラグメント（限定するわけではないが、それぞれVHHドメインまたはVH/VLドメインなどの、抗原結合ドメインまたは抗原結合フラグメントを含む）をどちらも包含する一般用語として使用される。加えて、本明細書において（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「VHH配列」または「タンパク質配列」のような用語において）使用する「配列」という用語は、文脈上、もっと限定的な解釈が必要な場合を除き、一般的には、関連するアミノ酸配列と、それをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列とを、どちらも包含すると理解すべきである。
【００３４】
c）別段の表示がある場合を除き、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、限定するわけではないが、抗原結合ドメインまたは抗原結合フラグメント（例えば、それぞれ、VHHドメインまたはVHもしくはVLドメイン）を包含する一般用語として使用される。抗原結合分子または抗原結合タンパク質という用語は可換的に使用され、ナノボディという用語も包含する。免疫グロブリン単一可変ドメインはさらに、軽鎖可変ドメイン配列（例えばVL配列）または重鎖可変ドメイン配列（例えばVH配列）であり；より具体的に述べると、それらは、従来の四本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であることができる。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、もしくはドメイン抗体としての使用に適した免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、もしくは単一ドメイン抗体としての使用に適した免疫グロブリン配列、「dAb」、もしくはdAbとしての使用に適した免疫グロブリン配列、またはナノボディ（VHH配列を含むが、これに限るわけではない）であることができる。本発明は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダ科動物免疫グロブリン配列を含む、異なる起源の免疫グロブリン配列を包含する。免疫グロブリン単一可変ドメインには、完全ヒト免疫グロブリン配列、ヒト化免疫グロブリン配列、他の方法で配列が最適化された免疫グロブリン配列、またはキメラ免疫グロブリン配列が包含される。免疫グロブリン単一可変ドメインおよび免疫グロブリン単一可変ドメインの構造は、4つのフレームワーク領域または「FR」（これらは、当技術分野および本明細書において、「フレームワーク領域1」または「FR1」；「フレームワーク領域2」または「FR2」；「フレームワーク領域3」または「FR3」；および「フレームワーク領域4」または「FR4」と、それぞれ呼ばれている）から構成され、これらのフレームワーク領域の間に3つの相補性決定領域または「CDR」（これらは、当技術分野において、「相補性決定領域1」または「CDR1」；「相補性決定領域2」または「CDR2」；および「相補性決定領域3」または「CDR3」と、それぞれ呼ばれている）が介在しているとみなすことができる（ただし、これに限定されるわけではない）。
【００３５】
d）別段の表示がある場合を除き、具体的に詳述されていない方法、ステップ、技法および操作は全て、当業者には明白であるだろうとおり、自体公知の方法で行うことができ、自体公知の方法で行われた。例えばここでも、本明細書において言及する標準的参考書と一般的背景技術およびそこに言及されているさらなる参考文献、ならびに例えば次に挙げるような総説を参照されたい：Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56；Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57；Irvingら, J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45；Schmitzら, Placenta, 2000, 21 Suppl. A、S106-12、Gonzalesら, Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43（これらには、タンパク質工学の技法、例えば親和性成熟ならびに免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性および他の望ましい性質を改善するための他の技法が記述されている）。
【００３６】
e）アミノ酸残基は、標準的な三文字または一文字アミノ酸コードに従って示す。
【００３７】
f）2つ以上のヌクレオチド配列の比較を目的とする場合、第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージは、[第2ヌクレオチド配列中の対応する位置にあるヌクレオチドと同一な第1ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を［第1ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数］で割り、［100％］を掛けることによって（この場合、第2ヌクレオチド配列における−第1ヌクレオチド配列と比較した−ヌクレオチドの欠失、挿入、置換または付加はそれぞれ、単一ヌクレオチド（位置）における相違とみなされる）、または適切なコンピュータアルゴリズムもしくは技法を使って、計算または決定することができる。2つ以上のヌクレオチド配列の
配列同一性の程度は、NCBI Blast v2.0などの既知の配列アラインメント用コンピュータアルゴリズムを標準的設定で使用することによって、計算することができる。配列同一性の程度を決定するための技法、コンピュータアルゴリズムおよび設定は、例えばWO 04/037999、EP 0 967 284、EP 1 085 089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185およびGB 2 357 768-Aなどに、他にもいくつか記載されている。通常、上に概説した計算方法に従って2つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定するという目的には、ヌクレオチド数が最も多いヌクレオチド配列を「第1」ヌクレオチド配列とし、他方のヌクレオチド配列が「第2」ヌクレオチド配列とされるであろう。
【００３８】
g）2つ以上のアミノ酸配列の比較を目的とする場合、第1アミノ酸配列と第2アミノ酸配列の間の「配列同一性」（本明細書では「アミノ酸同一性」ともいう）のパーセンテージは、[第2アミノ酸配列中の対応する位置にあるアミノ酸残基と同一な第1アミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第1アミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［100％］を掛けることによって（この場合、第2アミノ酸配列における−第1アミノ酸配列と比較した−アミノ酸残基の欠失、挿入、置換または付加はそれぞれ、単一アミノ酸残基（位置）における相違、すなわち本明細書に定義する「アミノ酸相違」とみなされる）、または適切なコンピュータアルゴリズムもしくは技法を使って、計算または決定することができる。上に概説した計算方法に従って2つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定するという目的には、アミノ酸数が最も多いアミノ酸配列を「第1」アミノ酸配列とし、他方のアミノ酸配列が「第2」アミノ酸配列とされるであろう。
【００３９】
また、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際に、当業者は、下記v）において述べるように、「保存的」アミノ酸置換を考慮することもできる。
【００４０】
本明細書に記載するポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換は、種が異なる相同タンパク質間のアミノ酸変異の頻度の解析（Schulzら「Principles of Protein Structure」Springer-Verlag（1978）が開発したもの）、構造形成能の解析（Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974およびAdv. Enzymol., 47: 45-149, 1978が開発したもの）、およびタンパク質中の疎水性パターンの解析（Eisenbergら, Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984；Kyte & Doolittle, J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981、およびGoldmanら, Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986が開発したもの）に基づくこともできる（これらの文献は全て、引用により、そのまま本明細書に組み込まれる）。ナノボディの一次構造および二次構造については、ラマ由来のVHHドメインの結晶構造が、例えばDesmyterら, Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996)；Spinelliら, Natural Structural Biology (1996)；3, 752-757；およびDecanniereら, Structure, Vol.7, 4, 361 (1999)に記載されている。
【００４１】
h）2つのアミノ酸配列を比較する場合、「アミノ酸相違」という用語は、第2配列と比較した第1配列のある位置における単一アミノ酸残基の挿入、欠失または置換を指し、2つのアミノ酸配列は、1つ、2つまたはそれ以上のそのようなアミノ酸相違を含有することができると理解される。
【００４２】
i）あるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、それぞれ、別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「を含む」、または別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「から本質的になる」という場合、これは、後者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、それぞれ、最初に述べたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中に組み込まれたことを意味しうるが、これは一般に、最初に述べた配列が実際にどのようにして生成または取得されたか（これは、例えば本明細書に記載する任意の適切な方法によることができる）とは無関係に、最初に述べたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、その配列内に、それぞれ、後者の配列と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するヌクレオチドまたはアミノ酸残基のストレッチを含むことを意味することの方が普通である。限定するわけではないが、一例として、本発明の二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディが、CDR配列を含むという場合、これは、該CDR配列が本発明の二パラトープ性ナノボディ中に組み込まれたことを意味しうるが、これは一般に、該二パラトープ性ナノボディがどのようにして生成または取得されたかとは無関係に、本発明の二パラトープ性ナノボディが、その配列内に、該CDR配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸残基のストレッチを含有することを意味することの方が普通である。後者のアミノ酸配列が特別な生物学的または構造的機能を有する場合、それは、好ましくは、最初に述べたアミノ酸配列中でも、本質的に同じ、類似のまたは等価な生物学的または構造的機能を有する（言い換えると、最初に述べたアミノ酸配列は、好ましくは、後者の配列が本質的に同じ、類似のまたは等価な生物学的または構造的機能を果たす能力を有するものである）ことにも留意すべきである。例えば、本発明の二パラトープ性ナノボディが、CDR配列またはフレームワーク配列を、それぞれ含むという場合、そのCDR配列およびフレームワークは、好ましくは、該二パラトープ性ナノボディにおいて、それぞれCDR配列またはフレームワーク配列として機能する能力を有する。また、あるヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むという場合、最初に述べたヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現産物（例えばポリペプチド）へと発現した時に、後者のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列が、該発現産物の一部を形成する（言い換えると、後者のヌクレオチド配列が、最初に述べた、より大きなヌクレオチド配列と同じ読み枠にある）ものである。
【００４３】
j）核酸配列またはアミノ酸配列は、例えばそれを取得した自然の生物学的供給源および/または反応媒質もしくは培養培地と比較して、それが、該供給源または媒質（培地）において通常それに付随する少なくとも1つの他の構成要素、例えば他の核酸、他のタンパク質/ポリペプチド、他の生物学的構成要素もしくは高分子または少なくとも一つの夾雑物、不純物もしくは微量構成要素から分離された場合に、「本質的に単離された（形態にある）」とみなされる。特に、核酸配列またはアミノ酸配列は、それが、少なくとも2倍、特に少なくとも10倍、より具体的には少なくとも100倍、そして1000倍またはそれ以上まで精製された場合に、「本質的に単離された」とみなされる。「本質的に単離された形態にある」核酸配列またはアミノ酸配列は、好ましくは、適切な技法、例えばポリアルキルアミドゲル電気泳動などの適切なクロマトグラフィー技法を使って決定した場合に、本質的に均一である。
【００４４】
k）本明細書において使用する「抗原結合ドメイン」という用語は、少なくとも1つのCDRを含み、ターゲット抗原性決定基またはターゲットエピトープを認識するようなコンフォメーションをとっている、免疫グロブリン中のアミノ酸の配列を指す。
【００４５】
l）「抗原性決定基」および「エピトープ」という用語は、本明細書においては可換的にも使用することができ、線状コンフォメーションであるか、非線状コンフォメーションであるかを問わず、抗原結合ドメインによって認識されるターゲットCXCR2内のアミノ酸配列を指す。
【００４６】
m）特異的抗原性決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質（または少なくともその一部、フラグメントまたはエピトープ）に、（特異的に）結合することができ、それらに対するアフィニティを有し、かつ/またはそれらに対する特異性を有する、例えば本明細書に記載する二パラトープ性ナノボディまたはそのフラグメントなどといった本発明のポリペプチドは、該抗原性決定基、エピトープ、抗原もしくはタンパク質「に対する」（against）、または抗原性決定基、エピトープ、抗原もしくはタンパク質「を指向する」（directed against）という。
【００４７】
n）「特異性」という用語は、本発明のポリペプチドの特定抗原結合ドメインが結合することのできる、異なるタイプの抗原または抗原性決定基の数を指す。任意の特定抗原/エピトープに対する抗原結合タンパク質の特異性は、WO 08/020079（引用により本明細書に組み込まれる）の53〜56頁に記載されているように、アフィニティおよび/またはアビディティに基づいて決定することができ、この文献には、ポリペプチドと当該抗原またはエピトープの間の結合を測定するための好ましい技法も、いくつか記載されている。典型的には、各抗原結合タンパク質（本発明のポリペプチドなど）において、各抗原結合ドメインは、それぞれ独立して、それらの抗原/エピトープに、10-5〜10-12モル/リットル以下、好ましくは10-7〜10-12モル/リットル以下、より好ましくは10-8〜10-12モル/リットルの解離定数（KD）で（すなわち105〜1012リットル/モル以上、好ましくは107〜1012リットル/モル以上、より好ましくは108〜1012リットル/モルの会合定数（KA）で）、結合しうる。104モル/リットルより大きい任意のKD値（または104M-1より低い任意のKA値）は、一般に、非特異的結合を示すとみなされる。好ましくは、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、所望の抗原に、500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満のアフィニティで結合するであろう。CXCR2への本発明のポリペプチドの特異的結合は、自体公知の任意の適切な方法、例えばスキャッチャード分析および/または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素イムノアッセイ（EIA）およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびに自体公知のその変法；ならびに本明細書において言及する他の技法で決定することができる。当業者には明らかであるだろうとおり、またWO 08/020079の53〜56頁に記載されているとおり、解離定数は、真の解離定数または見掛けの解離定数であることができる。解離定数を決定するための方法は当業者には明らかであるだろうし、これには、例えばWO 08/020079の53〜56頁で述べられている技法が含まれる。
【００４８】
o）本発明のポリペプチド、特に本発明の二パラトープ性ナノボディの半減期は、一般に、本発明のポリペプチドの血清中濃度が、例えばそのポリペプチドの分解および/またはそのポリペプチドの天然の機序によるクリアランスまたは隔離などによって、インビボで50％低下するのに要する時間と定義することができる。本発明のポリペプチドのインビボ半減期は、自体公知の任意の方法で、例えば薬物動態分析によって、決定することができる。適切な技法は当業者には明らかであるだろうし、例えば一般に、WO 08/020079の57頁のパラグラフo）に記載されているとおりであることができる。また、WO 08/020079の57頁のそのパラグラフで言及されているように、半減期は、t1/2-α、t1/2-βおよび曲線下面積（AUC）などのパラメータを使って表現することができる。例えば、下記の実験項と、Kenneth, Aら「Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists」およびPetersら「Pharamacokinetic analysis: A Practical Approach」（1996）などの標準的参考書を参照されたい。また、M GibaldiおよびD Perron「Pharmacokinetics」Marcel Dekker刊、第2改訂版（1982）も参照されたい。「半減期の増加」または「増加した半減期」という用語は、t1/2-βの増加を指し、t1/2-αおよび/またはAUCまたはその両者の増加を伴う場合も、伴わない場合もある。
【００４９】
p）本発明に関して、適切なインビトロアッセイ、細胞アッセイまたはインビボアッセイを使って測定されるCXCR2の活性を「ブロックし、低下させまたは阻害する」とは、CXCR2の関連するまたは意図する生物学的活性の活性を、本発明のポリペプチドが存在しない点以外は同じ条件下での同じアッセイにおけるCXCR2の活性と比較して、少なくとも1％、好ましくは少なくとも5％、例えば少なくとも10％または少なくとも25％、例えば少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または90％以上、ブロックし、低下させ、または阻害することを意味しうる。
【００５０】
当業者には明らかであるだろうとおり、阻害には、本発明のポリペプチドが存在しない点以外は同じ条件と比較して、CXCR2の、そのリガンドまたは結合パートナーの1つ以上に対するアフィニティ、アビディティ、特異性および/または選択性の減少をもたらすこと、および/またはCXCR2が存在する培地または環境における1つ以上の条件（例えばpH、イオン強度、補因子の存在など）に対するCXCR2の感受性の減少をもたらすことも伴いうる。当業者には明らかであるだろうとおり、これもまた、関与するターゲットまたは抗原に応じて、任意の適切な方法で、かつ/または任意の適切な自体公知のアッセイを使って、決定することができる。
【００５１】
q）本明細書にいう「調整」は、CXCR2のアロステリック調整、および/またはCXCR2の、そのリガンドの一つへの結合を低下させもしくは阻害することを、および/またはCXCR2への結合に関して天然リガンドと競合することを意味しうる。調整は、例えば、CXCR2のフォールディングまたはコンフォメーションに関して、またはそのコンフォメーションを（例えばリガンドの結合時に）変化させるその能力、他の（サブ）ユニットと会合する能力、もしくは解離する能力に関して、変化をもたらすことも伴いうる。調整は、例えば、他の化合物を輸送するCXCR2の能力または他の化合物（例えばイオン）のチャネルとして機能する能力に変化をもたらすことも伴いうる。
【００５２】
本発明のポリペプチド、特に本発明の二パラトープ性ナノボディによる、CXCR2活性の調整、特に阻害または低下は、可逆的であることも、不可逆的であることもありうるが、医薬的および薬理学的目的には、通常は、可逆的であるだろう。
【００５３】
r）本発明のポリペプチドは、それが第2のターゲットまたはポリペプチドに結合する際のアフィニティの少なくとも10倍、例えば少なくとも100倍、好ましくは少なくとも1000倍、最大10,000倍以上であるアフィニティ（上述のとおりであって、KD値、KA値、Koff速度および/またはKon速度として適切に表現されたもの）でCXCR2に結合する場合に、第2のターゲットまたは抗原と比較して、CXCR2「に対して特異的」であるという。例えば本発明のポリペプチドは、それが別のターゲットまたはポリペプチドもしくはそのエピトープに結合する際のKDの10分の1以下、例えば100分の1以下、好ましくは1000分の1以下、例えば10,000分の1以下、さらにはそれより低いKD値で、CXCR2に結合しうる。
【００５４】
s）「交差ブロックする」（cross-block）、「交差ブロックされた」（cross-blocked）および「交差ブロッキング」（cross-blocking）という用語は、本明細書においては可換的に使用され、ある免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの、所与のターゲットに対する本発明の他の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの結合を妨害する能力を意味する。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドが、別のターゲットの結合を妨害することができる程度、そしてそれゆえに、それが本発明に従って交差ブロックするということができる程度は、競合結合アッセイを使って決定することができる。特に適切な定量的交差ブロッキングアッセイの一つでは、FACSまたはELISAに基づくアプローチを使って、本発明の標識（例えばHisタグ付き、放射標識または蛍光標識）免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドと、当該他の結合剤との間の、ターゲットへのそれらの結合に関する競合を測定する。実験項では、ある結合分子が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドを交差ブロックするかどうか、または交差ブロックする能力を有するかどうかを決定するための適切なFACSおよびELISA置換アッセイ（displacement-based assay）を概説する。このアッセイが、本明細書に記載する免疫グロブリン単一可変ドメインまたは他の結合剤のどれにでも使用できることは理解されるであろう。したがって一般に、本発明の交差ブロッキングアミノ酸配列または他の結合剤は、上記交差ブロッキングアッセイにおいて、アッセイ中に、本発明の第2のアミノ酸配列または他の結合剤の存在下で、記録される本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの置換（displacement）が、試験対象である潜在的交差ブロッキング剤（例えば他の抗体フラグメント、VHH、dAbまたは類似のVH/VL変異体）による最大理論置換の50％〜100％であるような形で、ターゲットに結合するであろうものである。
【００５５】
t）本発明のポリペプチドは、2つの異なる抗原または抗原性決定基（例えば、2つの異なる哺乳動物種、例えばヒトとカニクイザルとに由来する、血清アルブミンまたはCXCR2）に関して、それが、これら異なる抗原または抗原性決定基の両方に対して特異的（上に定義したもの）であるならば、「交差反応性」であるという。
【００５６】
u）本明細書に定義する保存的アミノ酸変化とは、あるアミノ酸残基が類似する化学構造の別のアミノ酸残基で置き換えられているアミノ酸置換であって、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的性質にはほとんど影響を有さないか、本質的に影響を有さないアミノ置換を指す。そのような保存的アミノ酸置換は当技術分野では、例えばWO 04/037999、GB-A-3 357 768、WO 98/49185、WO 00/46383およびWO 01/09300などから、よく知られており；そのような置換の（好ましい）タイプおよび/または組合せは、WO 04/037999およびWO 98/49185ならびにそこで言及されているさらなる文献からの該当する教示に基づいて選択することができる。
【００５７】
そのような保存的置換は、好ましくは、次に挙げるグループ（a）〜（e）内のアミノ酸の一つが同じグループ内の別のアミノ酸残基で置換されている置換である：（a）Ala、Ser、Thr、ProおよびGlyを含む、小さい脂肪族非極性または低極性残基；（b）Asp、Asn、GluおよびGlnを含む、極性陰性荷電残基およびそれらの（非荷電）アミド；（c）His、ArgおよびLysを含む、極性陽性荷電残基；（d）Met、Leu、He、ValおよびCysを含む、大きい脂肪族非極性残基；および（e）Phe、TyrおよびTrpを含む、芳香族残基。
【００５８】
特に好ましい保存的置換は次のとおりである：AlaのGlyまたはSerへの置換；ArgのLysへの置換；AsnのGlnまたはHisへの置換；AspのGluへの置換；CysのSerへの置換；GlnのAsnへの置換；GluのAspへの置換；GlyのAlaまたはProへの置換；HisのAsnまたはGlnへの置換；IleのLeuまたはValへの置換；LeuのIleまたはValへの置換；LysのArg、GlnまたはGluへの置換；MetのLeu、TyrまたはIleへの置換；PheのMet、LeuまたはTyrへの置換；SerのThrへの置換；ThrのSerへの置換；TrpのTyrへの置換；TyrのTrpへの置換；および/またはPheのVal、IleまたはLeuへの置換。
【００５９】
v）本明細書にいうCDRは、本発明のポリペプチドの相補性決定領域である。CDRは、単独で、または他の1つ以上のCDRとの組合せで、本発明のポリペプチドが認識する抗原またはエピトープとの相補性を確立するアミノ酸のストレッチである。CDRは、一定のナンバリング規約（numbering convention）によって、アミノ酸配列中に同定される。請求項および本明細書の具体的説明については、Kabatナンバリングを使用する。
【００６０】
w）本明細書にいうFRは、フレームワーク領域（FWと呼ぶ場合もある）である。フレームワーク領域は、1つ以上のCDRに隣接するアミノ酸のストレッチであり、それらを、抗原認識またはエピトープ認識にとって正しい三次元コンフォメーションで支えている。FRは、ターゲット抗原またはターゲットエピトープに特異的ではないが、それらが内在している免疫グロブリン分子の種起源またはタイプに特異的である。本明細書で詳しく議論するとおり、本発明のポリペプチドにおいて、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、免疫グロブリンの供給源（例えばラクダ科動物）によって適用されるフレームワーク配列とは異なるように工学的に操作する余地がある。
【００６１】
x）本明細書にいうCXCR2は、少なくとも白血球の表面に存在するサイトカイン受容体であって、天然に存在するそのリガンドが、Gro-α、β、γ、IL-8、ENA-78またはGCP-2でありうるものを指す。CXCR2は、一般に、本明細書においては、起源の種とは無関係に、CXCR2機能を示す任意のタンパク質を指す。ただし、本明細書にいうヒトCXCR2は、配列番号1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質またはその任意のアレル変異体もしくはオルソログを指し、カニクイザルCXCR2は、配列番号3に示すアミノ酸配列を含むタンパク質またはその任意のアレル変異体もしくはオルソログを指す。
【００６２】
y）本明細書にいう「配列最適化」は、自然の配列中には存在しないであろう特定の性質または構造的特徴を確保する目的で、アミノ酸配列中の置換、挿入または欠失を促進することを指す。そのような置換、挿入または欠失は、例えば、化学的安定性のために、製造可能性を改善するために、ピログルタミン酸形成または酸化もしくは異性化を避けるために、行うことができる。本発明の二パラトープ性ポリペプチド、特に二パラトープ性ナノボディに使用することができる、そのような性質の最適化を達成するための方法は、引用により本明細書に組み込まれるWO 2009/095235に記載されている。配列最適化技法は、本発明の二パラトープ性ポリペプチドを本明細書に記載する方法でヒト化するためにも行うことができる。したがって、本明細書において配列最適化、配列最適化する、または配列最適化されたという場合、これは常に、ヒト化置換または挿入への具体的言及、および部分的または完全にヒト化された二パラトープ性ポリペプチド、好ましくは二パラトープ性ナノボディへの具体的言及を包含する。
【００６３】
発明の詳細な説明
上述のように、本発明は、その第1の態様において、ケモカイン受容体CXCR2を指向するか、またはケモカイン受容体CXCR2に結合する、少なくとも2つの免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、CXCR2上の第1エピトープを認識する第1抗原結合ドメインと、CXCR2上の第2エピトープを認識する第2抗原結合ドメインとを含むポリペプチドを提供する。
【００６４】
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号7に示すアミノ酸の配列からなる線状ペプチドに結合する能力を有する第1抗原結合ドメインと、該線状ペプチドに結合する能力を有さないかまたは該線状ペプチドに低いアフィニティで結合する第2抗原結合ドメインとを含む。配列番号7はヒトCXCR2の最初の19個のN末端アミノ酸である。
【００６５】
ある実施形態において、第1抗原結合ドメインは、CXCR2のアミノ酸1〜19を含むまたはCXCR2のアミノ酸1〜19内にある第1エピトープを認識し、該第2抗原結合ドメインは、アミノ酸1〜19外にあるCXCR2上の第2のエピトープを認識する。
【００６６】
第1および第2抗原結合ドメインは、免疫グロブリンクラスの分子に特有な1つ以上のアミノ酸配列中に含まれうる。例えば、これらのペプチドまたはポリペプチドは、それぞれ、リンカーによって接合された従来の四本鎖抗体を含みうる。特に本発明のポリペプチドは、該第1および第2抗原結合ドメインが、それぞれ第1および第2抗体（それぞれ、2本の重鎖と2本の軽鎖とを含むもの）に含まれ、該第1および第2抗体がリンカーで接合されているものであることができる。あるいは、該第1および第2抗原結合ドメインが、2本の重鎖および2本の軽鎖を含む単一抗体内に含まれていてもよい。
【００６７】
本発明の代替的一実施形態において、第1および第2抗原結合ドメインは、重鎖抗体であるアミノ配列内に含まれ、特に本発明のポリペプチドは、該第1抗原結合ドメインが第1重鎖抗体内に含まれ、かつ該第2抗原結合ドメインが第2重鎖抗体内に含まれていて、該第1および第2重鎖抗体がリンカーによって接合されているものであることができる。そのような重鎖抗体はラクダ科から得ることができ、それらは本質的に、それぞれが定常領域と可変領域とを有する2本の重鎖だけを含む。該第1および第2結合ドメインが2本の重鎖を含む単一重鎖抗体内に含まれているポリペプチドも、本発明では考えられる。
【００６８】
もう一つの代替的実施形態において、第1および第2結合ドメインを含むペプチドまたはポリペプチドは単鎖Fv（scFv）であることができる。これらはVLドメインとVHドメインの線状融合物を含む。したがって本発明のポリペプチドは、該第1および第2抗原結合ドメインがそれぞれ第1および第2抗体単鎖Fv（scFv）フラグメント内に含まれ、該第1および第2scFvフラグメントがリンカーによって接合されているものであることができる。
【００６９】
さらにもう一つの代替的実施形態では、第1および第2抗原結合ドメインが、従来の四本鎖抗体の1つ以上のFabまたはF(ab)2フラグメントに含まれていてもよい。Fabフラグメントは、従来の抗体の1本の重鎖および1本の軽鎖のそれぞれからの、1つの定常ドメインと1つの可変ドメインとを含む。F(ab)2フラグメントは、従来の抗体のヒンジ領域の一部によって接合された2つのFabフラグメントを含む。特に、本発明のポリペプチドは、該第1および第2抗原結合ドメインがそれぞれ第1および第2抗体FabまたはF(ab)2フラグメント内に含まれ、該第1および第2FabまたはF(ab)2フラグメントがリンカーによって接合されているものであることができる。そのような実施形態では、該第1抗原結合ドメインが抗体Fabフラグメント内に含まれ、かつ該第2抗原結合ドメインがF(ab)2フラグメント内に含まれていてもよく、その逆でもよい。
【００７０】
本発明の好ましい一実施形態では、第1抗原結合ドメインが第1免疫グロブリン単一可変ドメイン内に含まれ、かつ該第2抗原結合ドメインが第2免疫グロブリン単一可変ドメイン内に含まれる。
【００７１】
本発明のこの実施形態のある特定例は、第1および第2抗原結合ドメインがd(ab)と呼ばれるドメイン抗体に含まれているものである。d(ab)は、従来の抗体からの単一VLまたはVHドメインを含む。したがって本発明のポリペプチドは、該第1および第2抗原結合ドメインが第1および第2ドメイン抗体（dAb）内に含まれ、該第1および第2dAbがリンカーによって接合されているものであることができる。該第1および第2dAbは、抗体VLフラグメントまたは抗体VHフラグメントであることができる。そのような実施形態では、該第1抗原結合ドメインがVLフラグメントに含まれ、かつ該第2抗原結合ドメインがVHフラグメントに含まれるか、またはその逆であることができる。
【００７２】
（単一）ドメイン抗体の一般的説明については、EP 0 368 684も参照されたい。「dAb」という用語については、例えばWardら（Nature 1989 Oct 12；341 (6242): 544-6）、Holtら, Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490；ならびに例えばWO 06/030220、WO 06/003388およびDomantis Ltd.の他の特許出願公開を参照されたい。また、それらが哺乳動物由来でないという理由で本発明においてはそれほど好ましくはないものの、単一ドメイン抗体または単一可変ドメインが、サメの一定の種に由来しうること（例えばいわゆる「IgNARドメイン」、例えばWO 05/18629参照）にも留意すべきである。
【００７３】
上述の重鎖抗体の単鎖の可変領域はVHHドメインとして知られており、ナノボディとして知られている抗体フラグメントを含む。ナノボディはVHHドメイン全体またはそのフラグメントを含みうる。重鎖抗体およびその可変ドメインの一般的説明については、WO08/020079の59頁に挙げられている従来技術、および国際出願WO06/040153の41〜43頁に挙げられている参考文献一覧を参照されたい。VHHドメインは、ユニークな構造的特徴と機能的性質をいくつか有し、それらが、単離されたVHHドメイン（ならびに、それに基づくナノボディであって、天然に存在するVHHドメインと同じ構造的および機能的特徴を有するもの）およびそれを含有するポリペプチドを、機能的な抗原結合ドメインまたはポリペプチドとして、著しく有利にしている。特に、VHHドメイン（これは、軽鎖可変ドメインが存在しなくても、または軽鎖可変ドメインとの相互作用が何もなくても、抗原に機能的に結合するように、自然が「設計」したものである）およびナノボディは、単一の比較的小さな機能的抗原結合構造単位、ドメインまたはタンパク質として機能することができる。本明細書において使用するナノボディという用語は、天然に存在するVHHドメインおよびそのフラグメントだけでなく、本明細書に詳述するその変異体および誘導体も包含する。
【００７４】
本発明の最も好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ポリペプチドが、該第1抗原結合ドメインが第1ナノボディ内に含まれ、かつ該第2抗原結合ドメインが第2ナノボディ内に含まれていて、該第1および第2ナノボディがリンカーによって接合されているものである。
【００７５】
VHHドメインの構造は
FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR
と表すことができ、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、次に挙げる構造の一つを有しうる：
i）FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
ii）FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--リンカー--HLE
iii）FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--HLE--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4が第1抗原結合ドメイン（線状配列番号7結合剤）を含むのであれば、FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8は、第2抗原ドメイン（線状配列番号7非結合剤）を含み、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4が第2抗原ドメイン（線状配列番号7非結合剤）を含むのであれば、FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8は第1抗原結合ドメイン（線状配列番号7結合剤）を含み、HLEは増加したインビボ半減期を与える結合ユニットである］。
【００７６】
したがって、本明細書にいう「本発明の二パラトープ性ナノボディ」は、リンカーによって接合された2つの単一ナノボディを含むポリペプチドを指す。
【００７７】
しかし、本発明の二パラトープ性ナノボディは、各ナノボディ中にCDRを1つだけ含んでいてもよい。その場合、好ましいCDRは、CDR3および/またはCDR6である。しかし、本発明の二パラトープ性ナノボディは、N末端ナノボディにCDR1もしくはCDR2もしくはCDR3、またはCDR1およびCDR2、もしくはCDR1およびCDR、もしくはCDR2およびCDR3、またはCDR1およびCDR2およびCDR3を含み、C末端ナノボディには次に挙げる組合せのいずれか一つを含みうる：CDR4もしくはCDR5もしくはCDR6、またはCDR4およびCDR5もしくはCDR4およびCDR6もしくはCDR5およびCDR6、またはCDR4およびCDR5およびCDR6。上記のように、本発明の二パラトープ性ナノボディは、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5およびCDR6の全てを含んでいて、各CDRにFRが隣接していてもよい。
【００７８】
FRは、ラクダ科供給源と合致するアミノ酸配列を有しうる。しかし、好ましい実施形態では、FRの1つ以上が、少なくとも1つの配列最適化ミノ酸置換を有し、好ましくは、FRの1つ以上、より好ましくは全てが、部分的または完全にヒト化されている。配列最適化のための置換については、以下に、さらに詳しく議論する。
【００７９】
第1および第2抗原結合ドメインが、ナノボディではなく、上で述べた従来の抗体のドメインまたはフラグメント、例えばヒト抗体、ドメインまたはフラグメント中の、第1および第2免疫グロブリン単一可変ドメインに含まれている本発明の実施形態では、その中のCDRを少なくとも1つのラクダ化置換で修飾すること、また場合によっては、完全にラクダ化されたCDRを生成させることが可能であるということも、本明細書では言及しておく。
【００８０】
本明細書においてさらに説明するとおり、単一のナノボディ中のアミノ酸残基の総数は、110〜120の範囲にあることができ、好ましくは112〜115であり、最も好ましくは113である。しかし、ナノボディのパーツ、フラグメント、類似体または誘導体（本明細書においてさらに説明するもの）は、そのパーツ、フラグメント、類似体または誘導体が本明細書に概説するさらなる要件を満たし、好ましくは本明細書に記載する目的に同様に適している限り、その長さおよび/またはサイズに関して、特に制限されないことに留意すべきである。
【００８１】
本明細書においてさらに説明するとおり、ナノボディのアミノ酸残基は、RiechmannおよびMuyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23；240 (1-2):185-195の論文においてラクダ科動物からのVHHドメインに応用されているように（例えばこの刊行物の図2を参照されたい）、Kabatら（「Sequence of proteins of immunological interest」US Public Health Services、NIH、メリーランド州ベセスダ、刊行物番号91）に記載されているVHドメインについての一般的ナンバリングに従ってナンバリングされ、したがってナノボディのFR1は1〜30番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのCDR1は31〜35番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのFR2は36〜49番目のアミノ酸を含むことができ、ナノボディのCDR2は50〜65番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのFR3は66〜94番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのCDR3は95〜102番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのFR4は103〜113番目のアミノ酸残基を含むことができる。本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディでは、N末端ナノボディが上に挙げた位置にFRおよびCDRを有することができ、C末端ナノボディでは、ナノボディのFR5が1〜30番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのCDR4が31〜35番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのFR6が36〜49番目のアミノ酸を含むことができ、ナノボディのCDR5が50〜65番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのFR7が66〜94番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのCDR6が95〜102番目のアミノ酸残基を含むことができ、ナノボディのFR8が103〜113番目のアミノ酸残基を含むことができる。
【００８２】
しかし抗体（特にナノボディ）中のCDRおよびFRを、Kabatに代わるナンバリングシステムで同定しうることも、理解されるであろう。これらには、Chothia、IMGTおよびAHoシステムなどがある。これらの代替的ナンバリングシステムによる、表9、13、19、32、33および34において同定するアミノ酸配列のいずれか一つのCDRまたはFRの位置の同定は、配列の解析によって達成することができる。この目的には、次に挙げるウェブサイトが関連しうる：http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/（Chothia）；http://imgt.cines.fr（IMGT）およびhttp://www.bio.uzh.ch/antibody/index.html（AHo）。具体的には、本明細書に記載する本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディでは、CDR1、2、3、4、5または6が、Kabatに代わるこれらのナンバリングシステムの一つによって定義されうるが、それでもなお、本発明の範囲内にあるだろう。
【００８３】
本発明のナノボディのいくつかについて、Chotia CDRを表35に示す。
【００８４】
ナノボディは、いわゆる「VH3クラス」（すなわちDP-47、DP-51またはDP-29などのVH3クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列相同性を有するナノボディ）であることができ、これらのナノボディは、本発明の二パラトープ性ナノボディの構築にとって好ましい。ただし、CXCR2を指向するナノボディはどのタイプでも、例えばいわゆる「VH4クラス」に属するナノボディ（すなわち、DP-78などのVH4クラスのヒト生殖細胞系配列に対して高度な配列同一性を有するナノボディ）、例えばWO 07/118670に記載されているものなども、本発明の二パラトープ性ナノボディの構築に使用できることに留意すべきである。
【００８５】
本発明に従って第1および第2抗原結合ドメインを含む1つ以上のペプチドまたはポリペプチドを接合するリンカー分子は、免疫グロブリン由来のものであってもよいし、そうでなくてもよい。本発明のポリペプチドが二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディである場合は、リンカーが、抗原結合ドメインを含む1つの免疫グロブリン単一可変ドメインのC末端を、抗原結合ドメインを含むもう一つの免疫グロブリン単一可変ドメインのN末端に接合する。
【００８６】
第1抗原結合ドメインと第2抗原結合ドメインとを一つに連結するために、特に2つのナノボディを一つに連結するために、本発明の二パラトープ性ポリペプチドにおいて使用するのに適したスペーサーまたはリンカーは、当業者には明白であるだろうし、これは、一般的には、アミノ酸配列を連結するために当技術分野で使用される任意のリンカーまたはスペーサーであることができる。好ましくは、該リンカーまたはスペーサーは、医薬としての使用を意図したタンパク質またはポリペプチドの構築における使用に適している。
【００８７】
例えばリンカーは、適切なアミノ酸配列、特にアミノ酸残基数が1〜50、好ましくは1〜30、例えば1〜10個のアミノ酸配列であることができる。そのようなアミノ酸配列の好ましい例としては、gly-serリンカー、例えばWO 99/42077に記載されている(gly4ser)3または(gly3ser2)3などの(glyxsery)zタイプ、本明細書において言及するAblynxの出願に記載されているGS30、GS15、GS9およびGS7リンカー（例えばWO 06/040153およびWO 06/122825参照）、ならびにヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域または類似する配列（例えばWO 94/04678に記載されているもの）などが挙げられる。
【００８８】
考えうるリンカーには、他にも、ポリアラニン（AAAなど）、ならびにリンカーGS30（WO 06/122825の配列番号85）およびGS9（WO 06/122825の配列番号84）などがある。
【００８９】
本発明において好ましいリンカーは、3〜50アミノ酸長のペプチドリンカー、例えばアミノ酸長が3〜9、10〜15、16〜20、21〜25、26〜35、36〜40、41〜45または46〜50のリンカーである。本発明の一実施形態では、ペプチドリンカーが35アミノ酸長である。リンカーは2種類のアミノ酸だけからなることができる。上述のように、これらはグリシンとセリンであることができる。あるいは、それらはプロリンとセリンであってもよい。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態、特に本発明の二パラトープ性ナノボディでは、ペプチドリンカーが、アミノ酸配列：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号220）
からなる。
【００９１】
他の適切なリンカーは、一般に、有機化合物またはポリマー、特に医薬用のタンパク質における使用に適したものを含む。例えば、ポリ(エチレングリコール)部分を使って、抗体ドメインを連結することができる。例えばWO 04/081026を参照されたい。
【００９２】
したがって、もう一つの態様において、本発明は、ケモカイン受容体CXCR2を指向するか、またはケモカイン受容体CXCR2に結合する、少なくとも2つのポリペプチドを含む分子であって、第1ポリペプチドが第1免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、第2ポリペプチドが第2免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、該第1および第2抗原結合ドメインがCXCR2上の第1および第2エピトープを認識し、該少なくとも2つのポリペプチドが非ペプチドリンカーによって接合されている分子に関する。
【００９３】
好ましくは、本発明の上記態様において、第1抗原結合ドメインは、配列番号7に示すアミノ酸の配列からなる線状ペプチドに結合する能力を有し、該第2抗原結合ドメインは、該線状ペプチドに結合する能力を有さないかまたは該線状ペプチドに低いアフィニティで結合する。好ましくは、第1エピトープは、CXCR2のアミノ酸1〜19を含むか、その内部にあり、第2エピトープはCXCR2のアミノ酸1〜19外にある。
【００９４】
好ましくは、本発明のこの態様では、第1および第2抗原結合ドメインが免疫グロブリン単一可変ドメインに含まれ、ここで、該第1および第2免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくはナノボディ、特に本明細書に具体的に記載するナノボディのいずれかである。
【００９５】
ここに記載する本発明の全ての態様において、リンカーの基本的性質は、それが、第1抗原結合ドメインと第2抗原結合ドメインとがCXCR2上のそれぞれのエピトープに結合することを可能にするような長さおよびコンフォメーションを有することである。
【００９６】
使用されるリンカーは、（例えば本発明の二パラトープ性ナノボディの誘導体に関して本明細書に記載するように）、本発明のポリペプチドに1つ以上の他の好ましい性質または機能性を付与し、かつ/または誘導体を形成するためのおよび/または官能基を取り付けるための1つ以上の部位を与えることもできる。例えば、1つ以上の荷電アミノ酸残基を含有するリンカー（国際出願WO 08/020079の48頁の表A-2参照）は改善された親水性を与えることができ、一方、小さなエピトープまたはタグを形成または含有するリンカーは、検出、同定および/または精製という目的に使用することができる。ここでも、本明細書における開示に基づいて、当業者は、具体的な本発明ポリペプチドにおける使用に最適なリンカーを、場合によってはいくつかの限られた日常的実験後に、決定することができるであろう。
【００９７】
最後に、本発明のポリペプチドに2つ以上のリンカーを使用する場合、これらのリンカーは同じであっても異なってもよい。ここでも、本明細書における開示に基づいて、当業者は具体的な本発明ポリペプチドにおける使用に最適なリンカーを、場合によってはいくつかの限られた日常的実験後に、決定することができるであろう。
【００９８】
通常、発現および生産を容易にするために、本発明のポリペプチドは線状ポリペプチドであるだろう。しかし本発明は、その最も広義においては、それに限定されない。例えば本発明のポリペプチドが3つ以上のナノボディを含む場合、3つ以上の「アーム」を有するリンカーを使ってそれらを連結することができ、この場合は、「星形」コンストラクトが得られるように、各「アーム」がナノボディに連結される。また、通常はそれほど好ましくはないものの、環状のコンストラクトを使用することもできる。
【００９９】
特に、2つ以上のナノボディと上述の1つ以上のリンカーとは、任意の配置で調製することができる。例えば、CXCR2を指向するまたはCXCR2に結合する2つの免疫グロブリン結合ドメインと、ヒト血清アルブミン（HSA）を指向するまたはHSAに結合する1つ以上の免疫グロブリン結合ドメインとを含む、二パラトープ性二重特異性ナノボディを構想することができ、該HSA結合ドメインは、CXCR2結合ナノボディに任意の位置で（例えば2つのCXCR2結合ナノボディの間に、上で述べたリンカーによって）連結されたナノボディで構成させることができる。
【０１００】
本発明者らは本発明に従って二パラトープ性ポリペプチドを調製した。多価および二パラトープ性抗CXCR2ナノボディのアミノ酸配列を、本明細書の実施例中の表13に示す。これらのうち、特に好ましい本発明のポリペプチドは、表13において、163D2-127D1、163E3-127D1、163E3-54B12、163D2-54B12、2B2-163E3、2B2-163D2、97A9-2B2、97A9-54B12、127D1-163D2、127D1-163E3、2B2-97A9、54B12-163D2、54B12-163E3、163D2-2B2および163E3,-2B2、ならびに127D1-97A9、54B12-97A9および97A9-127D1と呼ばれる二パラトープ性ナノボディ、およびそれらの配列最適化変異体である。これらの二パラトープ性ナノボディは全て、配列番号7に示すアミノ酸の配列（CXCR2のアミノ酸1〜19）からなる線状ペプチドに結合する能力を有する第1抗原結合ドメインを含む第1ナノボディと、該線状ペプチドに結合する能力を有さないかまたは該線状ペプチドに低いアフィニティで結合する第2抗原結合ドメインを含む第2ナノボディとを含む（表8参照）。特に好ましいのは、本発明によれば、163D2-127D1、163E3-127D1、163E3-54B12、163D2-54B12、2B2-163E3、2B2-163D2、97A9-2B2および97A9-54B12である。
【０１０１】
1）163D2-127D1（配列番号58）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第2ナノボディが、配列番号145、165および185からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号145、165もしくは185のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1ナノボディが、配列番号141、161および181からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号141、161もしくは181のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１０２】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第2ナノボディでは、CDR1が配列番号145に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号165に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号185に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1ナノボディでは、CDR4が配列番号141に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号161に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号181に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号145、165、185、141、161または181に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０１０３】
本アミノ酸配列と配列番号145、165、185、141、161または181のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１０４】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号83に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号104に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号124に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号79に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号100に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号120に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号83、104、124、131、79、100、または120のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０１０６】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１０７】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号58に示すアミノ酸配列、または配列番号58のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０８】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号58に示すアミノ酸配列、または配列番号58と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性もしくはKabutナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を、20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１０９】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号58に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは163D2ナノボディに関して表28に適切であると同定したものおよび127D1ナノボディに関して表26に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、163D2ナノボディが、配列番号218に示すアミノ酸配列、または配列番号218と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、127D1ナノボディが、配列番号216に示すアミノ酸配列、または配列番号216と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１１０】
2）163E3-127D1（配列番号59）
本発明のこの実施形態は、第2ナノボディが、配列番号146、166および186からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号146、166もしくは186のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1ナノボディが、配列番号141、161および181からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号141、161もしくは181のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１１１】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第2ナノボディでは、CDR1が配列番号146に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号166に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号186に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1ナノボディでは、CDR4が配列番号141に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号161に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号181に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号146、166、186、141、161または181に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０１１２】
本アミノ酸配列と、配列番号146、166、186、141、161または181に示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１１３】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号84に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号105に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号125に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号79に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号100に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号120に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号84、105、125、131、79、100または120のいずれかに示すアミノ酸配列と、少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有しうる。
【０１１５】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１１６】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号59に示すアミノ酸配列、または配列番号59のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、または少なくとも85％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
本発明のこの態様の一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号59に示すアミノ酸配列、または配列番号59と少なくとも80％の同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１１８】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号59に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは163E3ナノボディに関して表24に適切であると同定したものおよび127D1ナノボディに関して表26に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、163E3ナノボディが、配列番号217に示すアミノ酸配列、または配列番号217と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、127D1ナノボディが、配列番号216に示すアミノ酸配列、または配列番号216と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１１９】
3）163E3/54B12（配列番号62）
本発明のこの実施形態は、該第2ナノボディが、配列番号146、166および186からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号146、166もしくは186のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1ナノボディが、配列番号151、171および191からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号151、171もしくは191のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１２０】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第2ナノボディでは、CDR1が配列番号146に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号166に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号186に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1ナノボディでは、CDR4が配列番号151に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号171に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号191に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6が、配列番号146、166、186、151、171または191に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも85％または少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０１２１】
本アミノ酸配列と、配列番号146、166、186、151、171、191に示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１２２】
本発明のこの態様によれば、FR1は配列番号84に示すアミノ酸配列を含み、FR2は配列番号105に示すアミノ酸配列を含み、FR3は配列番号125に示すアミノ酸配列を含み、FR4は配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5は配列番号89に示すアミノ酸配列を含み、FR6は配列番号110に示すアミノ酸配列を含み、FR7は配列番号130に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8は配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号84、105、125、131、89、110または130のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有する。
【０１２４】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１２５】
好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号62に示すアミノ酸配列、または配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％、もしくは少なくとも95％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
好ましい一実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが配列番号62に示すアミノ酸配列、または配列番号62に対して少なくとも80％のアミノ酸同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１２７】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号62に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは163E3ナノボディに関して表24に適切であると同定したものおよび51B12ナノボディに関して表30に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、163E3ナノボディが、配列番号217に示すアミノ酸配列、または配列番号217と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、54B12ナノボディが、配列番号219に示すアミノ酸配列、または配列番号219と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号212〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１２８】
4）163D2/54B12（配列番号63）
本発明のこの実施形態は、該第2ナノボディが、配列番号145、165および185からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号145、165もしくは185のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1ナノボディが、配列番号151、171および191からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号151、171もしくは191のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１２９】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号145に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号165に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号185に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号151に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号171に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号191に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6が、配列番号145、165、185、151、171、または191に示すアミノ酸配列のいずれか一つの少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、または少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する］
を含む。
【０１３０】
本アミノ酸配列と、配列番号145、165、185、151、171または191に示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１３１】
本発明のこの態様によれば、FR1が配列番号83に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号104に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号124に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号89に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号110に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号130に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号83、104、124、131、89、110、または130のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０１３３】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１３４】
好ましい一実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、配列番号63に示すアミノ酸配列、または配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３５】
好ましい一実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、配列番号63に示すアミノ酸配列、または配列番号63に対して少なくとも80％のアミノ酸同一性もしくはKabatナンバリングによるフレームワーク領域に対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を、2.0E-09M未満のIC50で阻害することができる。
【０１３６】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号63に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは163D2ナノボディに関して表28に適切であると同定したものおよび54B12ナノボディに関して表30に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、163D2ナノボディが、配列番号218に示すアミノ酸配列、または配列番号218と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、54B12ナノボディが、配列番号219に示すアミノ酸配列、または配列番号219と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１３７】
5）2B2/163E3（配列番号64）
本発明のこの実施形態は、該第1ナノボディが、配列番号147、167および187からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号147、167もしくは187のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2ナノボディが、配列番号146、166および186からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号146、166もしくは186のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１３８】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号147に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号167に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号187に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号146に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号166に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号186に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6が、配列番号147、167、187、164、146または186に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する］
を含む。
【０１３９】
本アミノ酸配列と、配列番号147、167、187、146、166または186に示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１４０】
本発明のこの態様によれば、FR1が配列番号85に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号106に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号126に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号84に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号105に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号125に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号85、106、126、131、84、105、または125のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有する。
【０１４２】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１４３】
好ましい一実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、配列番号64に示すアミノ酸配列、または配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４４】
本発明の二パラトープ性ナノボディの好ましい一実施形態は、配列番号64に示すアミノ酸配列、または配列番号64と少なくとも80％のアミノ酸同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を、20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１４５】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号64に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは2B2ナノボディに関して表20に適切であると同定したものおよび163E2ナノボディに関して表24に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、2B2ナノボディが、配列番号213もしくは214に示すアミノ酸配列または配列番号213もしくは214のどちらか一方と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、163E3ナノボディが、配列番号217に示すアミノ酸配列または配列番号217と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１４６】
6）2B2/163D2（配列番号65）
本発明のこの実施形態は、該第1ナノボディが、配列番号147、167および187からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号147、167もしくは187のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2ナノボディが、配列番号145、165および185からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号145、165もしくは185のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１４７】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号147に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号167に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号187に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号145に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号165に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号185に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6が、配列番号147、167、187、145、165または185に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する］
を含む。
【０１４８】
本アミノ酸配列と、配列番号147、167、187、145、165または185に示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１４９】
本発明のこの態様によれば、FR1が配列番号85に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号106に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号126に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号83に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号104に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号124に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１５０】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号85、106、126、131、83、104、または124のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有する。
【０１５１】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１５２】
本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディは、配列番号65に示すアミノ酸配列または配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５３】
本発明の二パラトープ性ナノボディの好ましい一実施形態は、配列番号65に示すアミノ酸配列または配列番号65と少なくとも80％のアミノ酸同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を、20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１５４】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号65に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは2B2ナノボディに関して表20に適切であると同定したものおよび163D2ナノボディに関して表28に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、2B2ナノボディが、配列番号213または214に示すアミノ酸配列または配列番号213もしくは214と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、163D2ナノボディが、配列番号218に示すアミノ酸配列または配列番号218と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１５５】
7）97A9/2B2（配列番号47）
本発明のこの実施形態は、該第2ナノボディが、配列番号143、163および183からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号143、163もしくは183のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1ナノボディが、配列番号147、167および187からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号147、167もしくは187のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１５６】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第2ナノボディでは、CDR1が配列番号143に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号163に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号183に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1ナノボディでは、CDR4が配列番号147に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号167に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号187に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6が、配列番号143、163、183、147、167、または187に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する］
を含む。
【０１５７】
本アミノ酸配列と、配列番号143、163、183、147、167または187に示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１５８】
本発明のこの態様によれば、FR1が配列番号81に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号102に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号122に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号133に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号85に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号106に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号126に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１５９】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号81、102、122、133、85、106、126または131のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有する。
【０１６０】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１６１】
好ましい二パラトープ性ナノボディは、配列番号47に示すアミノ酸配列、または配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６２】
特に好ましい一実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、配列番号47に示すアミノ酸配列、または配列番号47と少なくとも80％のアミノ酸同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１６３】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号47に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは97A9ナノボディに関して表22に適切であると同定したものおよび2B2ナノボディに関して表20に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、97A9ナノボディが、配列番号215に示すアミノ酸配列または配列番号215と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、2B2ナノボディが、配列番号213もしくは214に示すアミノ酸配列または配列番号213もしくは配列番号214のどちらか一方と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１６４】
8）97A9/54B12（配列番号61）
本発明のこの実施形態は、該第2ナノボディが、配列番号143、163および183からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号143、163もしくは183のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1ナノボディが、配列番号151、171および191からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号151、171もしくは191のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１６５】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第2ナノボディでは、CDR1が配列番号143に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号163に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号183に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1ナノボディでは、CDR4が配列番号151に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号171に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号191に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6が、配列番号143、163、183、151、171または191に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する］
を含む。
【０１６６】
本アミノ酸配列と、配列番号143、163、183、151、271または191に示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１６７】
本発明のこの態様によれば、FR1が配列番号81に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号102に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号122に示すアミノ酸配列を含み、FR4がアミノ酸配列133を含み、FR5が配列番号89に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号110に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号130に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号81、102、122、133、89、110、130または131のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有する。
【０１６９】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１７０】
好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号61に示すアミノ酸配列または配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１７１】
特に好ましい一実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、配列番号61に示すアミノ酸配列、または配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも80％の同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を、20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１７２】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号61に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは97A9ナノボディに関して表22に適切であると同定したものおよび54B12ナノボディに関して表30に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、97A9ナノボディが、配列番号215に示すアミノ酸配列または配列番号215と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、54B12ナノボディが、配列番号219に示すアミノ酸配列、または配列番号219と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１７３】
9）127D1/163D2（配列番号53）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第1ナノボディが、配列番号141、161および181からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号141、161もしくは181のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2ナノボディが、配列番号145、165および185からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号145、165もしくは185のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１７４】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号141に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号161に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号181に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号145に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号165に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号185に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号141、161、181、145、165または185に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０１７５】
本アミノ酸配列と、配列番号145、165、185、141、161または181のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１７６】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号79に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号100に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号120に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号83に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号104に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号124に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１７７】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号79、100、120、131、83、104、または124のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０１７８】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１７９】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号53に示すアミノ酸配列、または配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８０】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号53に示すアミノ酸配列または配列番号53もしくはそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１８１】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号54に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは127D1ナノボディに関して表26に適切であると同定したものおよび163D2ナノボディに関して表28に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、127D1ナノボディが、配列番号216に示すアミノ酸配列または配列番号216と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、163D2ナノボディが、配列番号218に示すアミノ酸配列または配列番号218と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１８２】
10）127D1/163E3（配列番号54）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第1ナノボディが、配列番号141、161および181からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号141、161もしくは181のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2ナノボディが、配列番号146、166および186からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号146、166もしくは186のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１８３】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-R4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号141に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号161に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号181に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号146に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号166に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号186に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号146、166、186、141、161または181に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０１８４】
本アミノ酸配列と、配列番号146、166、186、141、161または181のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１８５】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号79に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号100に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号120に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号84に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号105に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号125に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０１８６】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号79、100、120、131、84、105、または125のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０１８７】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１８８】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号54に示すアミノ酸配列または配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８９】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号54に示すアミノ酸配列、または配列番号54と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１９０】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号54に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは127D1ナノボディに関して表26に適切であると同定したものおよび163E3ナノボディに関して表24に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、127D1ナノボディが、配列番号216に示すアミノ酸配列または配列番号216と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、163E3ナノボディが、配列番号217に示すアミノ酸配列、または配列番号217と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１９１】
11）127D1/97A9（配列番号37および39）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第1ナノボディが、配列番号141、161および181からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号141、161もしくは181のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2ナノボディが、配列番号143、163および183からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号143、163もしくは183のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０１９２】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号141に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号161に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号181に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号143に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号163に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号183に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号141、161、181、143、163または183に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０１９３】
本アミノ酸配列と、配列番号141、161、181、143、163または183のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０１９４】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号79に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号100に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号120に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号81に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号102に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号122に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号133に示すアミノ酸配列を含む。
【０１９５】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号79、100、120、131、81、102、122、または133のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０１９６】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０１９７】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号37に示すアミノ酸配列を含む第1抗原結合ドメインと、配列番号39に示すアミノ酸配列第2抗原結合ドメインとを含むか、配列番号37および39に示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９８】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号37および39に示すアミノ酸配列、または配列番号37および39もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ポリペプチドは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０１９９】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号37および39に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは127D1ナノボディに関して表26に適切であると同定したものおよび97A9ナノボディに関して表22に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、127D1ナノボディが、配列番号216に示すアミノ酸配列、または配列番号216と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、97A9ナノボディが、配列番号215に示すアミノ酸配列または配列番号215と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２００】
12）2B2/97A9（配列番号46）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第1ナノボディが、配列番号147、167および187からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号147、167もしくは187のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2ナノボディが、配列番号143、163および183からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号143、163もしくは183のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０２０１】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号147に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号167に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号187に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号143に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号163に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号183に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号147、167、187、143、163または183に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０２０２】
本アミノ酸配列と、配列番号147、167、187、143、163または183のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０２０３】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号85に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号106に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号126に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号81に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号102に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号122に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号133に示すアミノ酸配列を含む。
【０２０４】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号85、106、126、131、81、102、122または133のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０２０５】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０２０６】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号46に示すアミノ酸配列、または配列番号46のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２０７】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号46に示すアミノ酸配列、または配列番号46と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域に対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２０８】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号46に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは2B2ナノボディに関して表20に適切であると同定したものおよび97A9ナノボディに関して表22に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、2B2ナノボディが、配列番号213もしくは214に示すアミノ酸配列または配列番号213もしくは214のどちらか一方と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、97A9ナノボディが配列番号215に示すアミノ酸配列または配列番号215と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２０９】
13）54B12/163D2（配列番号69）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第1ナノボディが、配列番号151、171および191からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号151、171もしくは191のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2ナノボディが、配列番号145、165および185からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号145、165もしくは185のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０２１０】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号151に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号171に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号191に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号145に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号165に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号185に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号151、171、191、145、165または185に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０２１１】
本アミノ酸配列と、配列番号151、171、191、145、165または185のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０２１２】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号89に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号110に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号130に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号83に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号104に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号124に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０２１３】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8は、配列番号89、110、130、131、83、104、または124のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０２１４】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０２１５】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号69に示すアミノ酸配列または配列番号69のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２１６】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号69に示すアミノ酸配列、または配列番号69と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２１７】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号69に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは54B12ナノボディに関して表30に適切であると同定したものおよび163D2ナノボディに関して表28に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、54B12ナノボディが、配列番号219に示すアミノ酸配列、または配列番号219と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、163D2ナノボディが、配列番号218に示すアミノ酸配列、または配列番号218と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２１８】
14）54B12/163E3（配列番号68）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第1ナノボディが、配列番号151、171および191からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号151、171もしくは191のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2ナノボディが、配列番号146、166および186からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号146、166もしくは186のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０２１９】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号151に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号171に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号191に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号146に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号166に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号186に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号151、171、191、146、166または186に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０２２０】
本アミノ酸配列と、配列番号151、171、191、146、166または186のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０２２１】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号89に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号110に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号130に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号84に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号105に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号125に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０２２２】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8は、配列番号89、110、130、131、84, 105、または125のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０２２３】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０２２４】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号68に示すアミノ酸配列、または配列番号68のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２２５】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号68に示すアミノ酸配列、または配列番号68と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２２６】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号68に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは54B12ナノボディに関して表30に適切であると同定したものおよび163E3ナノボディに関して表24に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、54B12ナノボディが、配列番号219に示すアミノ酸配列、または配列番号219と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、163E3ナノボディが、配列番号217に示すアミノ酸配列、または配列番号217と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２２７】
15）54B12/97A9（配列番号90および39）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第1ナノボディが、配列番号141、161および181からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号141、161もしくは181のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2ナノボディが、配列番号143、163および183からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号143、163もしくは183のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０２２８】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第1ナノボディでは、CDR1が配列番号141に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号161に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号181に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2ナノボディでは、CDR4が配列番号143に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号163に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号183に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号141、161、181、143、163または183に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０２２９】
本アミノ酸配列と、配列番号141、161、181、143、163または183のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０２３０】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号89に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号110に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号130に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号81に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号102に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号122に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０２３１】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号89、110、130、131、81、102、または122のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０２３２】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０２３３】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号90および39に示すアミノ酸配列、または配列番号90および39のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２３４】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号90および39に示すアミノ酸配列、または配列番号90および39と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２３５】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号90および39に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは54B12ナノボディに関して表30に適切であると同定したものおよび97A9ナノボディに関して表22に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、54B12ナノボディが、配列番号90および39に示すアミノ酸配列、または配列番号90および/または39と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、97A9ナノボディが、配列番号215に示すアミノ酸配列、または配列番号215と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２３６】
16）97A9/127D1（配列番号39および37）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第2ナノボディが、配列番号143、163および183からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号143、163もしくは183のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1ナノボディが、配列番号141、161および181からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号141、161もしくは181のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０２３７】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第2ナノボディでは、CDR1が配列番号143に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号163に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号183に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1ナノボディでは、CDR4が配列番号141に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号161に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号181に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号143、163、183、141、161または181に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０２３８】
本アミノ酸配列と、配列番号143、163、183、141、161または181のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０２３９】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号81に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号102に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号122に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号133に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号79に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号100に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号120に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０２４０】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号81、102、122、133、79、100、120または131のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０２４１】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０２４２】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号39および37に示すアミノ酸配列または配列番号39および/または37のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２４３】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号39および37に示すアミノ酸配列または配列番号39および/または37と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２４４】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号39および37に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは97A9ナノボディに関して表22に適切であると同定したものおよび97A9ナノボディに関して表26に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、97A9ナノボディが、配列番号39および37に示すアミノ酸配列、または配列番号39および37と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、127D1ナノボディが、配列番号216に示すアミノ酸配列、または配列番号216と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２４５】
17）163D2/2B2（配列番号67）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第2ナノボディが、配列番号145、165および185からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号145、165もしくは185のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1ナノボディが、配列番号147、167および187からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号147、167もしくは187のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０２４６】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第2ナノボディでは、CDR1が配列番号145に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号165に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号185に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1ナノボディでは、CDR4が配列番号147に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号167に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号187に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号145、165、185、147、167または187に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０２４７】
本アミノ酸配列と、配列番号145、165、185、147、167または187のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０２４８】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号83に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号104に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号124に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号85に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号106に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号126に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０２４９】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号83、104、124、131、85、106、または126のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０２５０】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０２５１】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号67に示すアミノ酸配列、または配列番号67のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２５２】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号67に示すアミノ酸配列、または配列番号67と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２５３】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号67に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは163D2ナノボディに関して表28に適切であると同定したものおよび2B2ナノボディに関して表20に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、163D2ナノボディが、配列番号218に示すアミノ酸配列、または配列番号218と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、2B2ナノボディが、配列番号213または214に示すアミノ酸配列、または配列番号213もしくは214のどちらか一方と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２５４】
18）163E3/2B2（配列番号66）
本発明のこの実施形態は、上に定義した該第2ナノボディが、配列番号146、166および186からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号146、166もしくは186のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1ナノボディが、配列番号147、167および187からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号147、167もしくは187のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのCDRを含む、二パラトープ性ナノボディに関する。
【０２５５】
好ましくは、本二パラトープ性ナノボディは、構造：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、該第2ナノボディでは、CDR1が配列番号146に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号166に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号186に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1ナノボディでは、CDR4が配列番号147に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号167に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号187に示すアミノ酸配列を含むか、またはCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5もしくはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号146、166、186、147、167または187に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも85％もしくは少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有する］
を含む。
【０２５６】
本アミノ酸配列と、配列番号146、166、186、147、167または187のいずれかに示すアミノ酸配列との相違は、保存的アミノ酸変化だけでありうる。本アミノ酸配列と上記配列番号のいずれかのアミノ酸配列との相違は、1個、2個または3個のアミノ酸だけでありうる。
【０２５７】
本発明のこの態様の好ましい一実施形態では、FR1が配列番号84に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号105に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号125に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号85に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号106に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号126に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む。
【０２５８】
あるいは、FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号84、105、125、131、85、106、または126のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有しうる。
【０２５９】
例えば本発明のこの態様において、FR1および/またはFR4は、配列番号70〜89のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR2および/またはFR5は、配列番号91〜110のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、FR3および/またはFR6は、配列番号111〜130のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができ、かつFR4および/またはFR8は、配列番号131〜133のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を含むことができる。
【０２６０】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号66に示すアミノ酸配列、または配列番号66のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２６１】
本発明のこの態様のもう一つの実施形態では、二パラトープ性ナノボディが、配列番号66に示すアミノ酸配列、または配列番号66と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性もしくはKabatナンバリングによるそのフレームワーク領域と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、この二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２６２】
本発明のこの態様のもう一つの好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ナノボディが、実質的に配列番号66に示すCDR配列を含むが、フレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化置換を含むように、好ましくは163E3ナノボディに関して表24に適切であると同定したものおよび2B2ナノボディに関して表20に適切であると同定したものの1つ以上を含むように、修飾されているものを含む。好ましくは、163E3ナノボディが、配列番号217に示すアミノ酸配列、または配列番号217と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、2B2ナノボディが、配列番号213または214に示すアミノ酸配列、または配列番号213もしくは214のどちらか一方と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。例えば、これらのナノボディのフレームワーク領域は、表32の配列番号213〜219のいずれか一つに示す、Kabatナンバリングによるフレームワーク領域FR1、FR2、FR3またはFR4の配列を有しうる。好ましくは、そのような配列最適化二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害することができる。
【０２６３】
上で既に述べたように、本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディは、163D2/127D1、163E3/127D1、163E3/54B12、163D2/54B12、2B2/163E3、2B2/163D2、97A9/2B2、97A9/54B12、127D1/163D2、127D1/163E3、127D1/97A9、2B2/97A9、54B12/163D2、54B12/163E3、54B12/97A9、97A9/127D1、163D2/2B2または163E3/2B2と呼ばれる具体的実施形態およびその変異体を含めて、そのフレームワーク領域内に少なくとも1つの配列最適化アミノ酸置換を有するのであれば望ましく、該フレームワーク領域は、例えば部分的にまたは完全にヒト化されていてもよい。配列最適化の程度は、それが、少なくともフレームワーク領域に関して、配列番号58、59、62、63、64、65、47、61、53、54、46、69、68、67または66と80〜90％の配列同一性を有する二パラトープ性ナノボディをもたらすものであれば、望ましい。
【０２６４】
本発明の実施形態は、さらに、第1抗原結合ドメインが、配列番号213、214、216および219、またはこれらの一つに対して、少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択され、かつ第2抗原結合ドメインが、配列番号215、217および218、またはこれらの一つに対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される、ポリペプチドを含む。
【０２６５】
（0079-0076）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドが、単一可変ドメインの該第2免疫グロブリン中に、配列番号141に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号236に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号181に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含み、さらに、単一可変ドメインの該第1免疫グロブリン中に、配列番号146に示すアミノ酸配列を含むCDR4と、配列番号237に示すアミノ酸配列を含むCDR5と、配列番号186に示すアミノ酸配列を含むCDR6とを含む。さらなる実施形態では、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号141、236、181、146、237または186のいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号141、236、181、146、237または186に示すものとの相違が保存的アミノ酸変化だけであるアミノ酸配列を含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号216または配列番号216に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第1抗原結合ドメインと、配列番号217または配列番号217に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第2抗原結合ドメインとを含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが配列番号221を含む。
【０２６６】
（0079-0086）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドが、単一可変ドメインの該第2免疫グロブリン中に、配列番号141に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号236に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号181に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含み、さらに、単一可変ドメインの該第1免疫グロブリン中に、配列番号145に示すアミノ酸配列を含むCDR4と、配列番号165に示すアミノ酸配列を含むCDR5と、配列番号185に示すアミノ酸配列を含むCDR6とを含む。さらなる実施形態では、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号141、236、181、145、165または185に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号141、236、181、145、165または185に示すものとの相違が保存的アミノ酸変化だけであるアミノ酸配列を含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号216または配列番号216に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第1抗原結合ドメインと、配列番号218または配列番号218に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第2抗原結合ドメインとを含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが配列番号222を含む。
【０２６７】
（0079-0061）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドが、単一可変ドメインの該第2免疫グロブリン中に、配列番号141に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号236に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号181に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含み、さらに、単一可変ドメインの該第1免疫グロブリン中に、配列番号143に示すアミノ酸配列を含むCDR4と、配列番号235に示すアミノ酸配列を含むCDR5と、配列番号183に示すアミノ酸配列を含むCDR6とを含む。さらなる実施形態では、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号141、236、181、143、235または183に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号141、236、181、143、235または183に示すものとの相違が保存的アミノ酸変化だけであるアミノ酸配列を含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号220を有するリンカーによって分離された、配列番号216または配列番号216に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第1抗原結合ドメインと、配列番号215または配列番号215に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第2抗原結合ドメインとを含む。
【０２６８】
（0104-0076）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドが、単一可変ドメインの該第2免疫グロブリン中に、配列番号151に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号171に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号191に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含み、さらに、単一可変ドメインの該第1免疫グロブリン中に、配列番号146に示すアミノ酸配列を含むCDR4と、配列番号237に示すアミノ酸配列を含むCDR5と、配列番号186に示すアミノ酸配列を含むCDR6とを含む。さらなる実施形態では、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号151、171、191、146、237または186に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号151、171、191、146、237または186に示すものとの相違が保存的アミノ酸変化だけであるアミノ酸配列を含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号219または配列番号219に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第1抗原結合ドメインと、配列番号217または配列番号217に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第2抗原結合ドメインとを含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが配列番号223を含む。
【０２６９】
（0104-0086）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドが、単一可変ドメインの該第2免疫グロブリン中に、配列番号151に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号171に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号191に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含み、さらに、単一可変ドメインの該第1免疫グロブリン中に、配列番号145に示すアミノ酸配列を含むCDR4と、配列番号165に示すアミノ酸配列を含むCDR5と、配列番号185に示すアミノ酸配列を含むCDR6とを含む。さらなる実施形態では、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号151、171、191、145、165または185に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号151、171、191、145、165または185に示すものとの相違が保存的アミノ酸変化だけであるアミノ酸配列を含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号219または配列番号219に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第1抗原結合ドメインと、配列番号218または配列番号218に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第2抗原結合ドメインとを含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが配列番号224を含む。
【０２７０】
（0104-0061）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドが、単一可変ドメインの該第2免疫グロブリン中に、配列番号151に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号171に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号191に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含み、さらに、単一可変ドメインの該第1免疫グロブリン中に、配列番号143に示すアミノ酸配列を含むCDR4と、配列番号235に示すアミノ酸配列を含むCDR5と、配列番号183に示すアミノ酸配列を含むCDR6とを含む。さらなる実施形態では、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号151、171、191、143、235または183に示すアミノ酸配列の少なくとも1つと、少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号151、171、191、143、235または183に示すものとの相違が保存的アミノ酸変化だけであるアミノ酸配列を含む。
さらなる一実施形態では、ポリペプチドが、配列番号220を有するリンカーによって分離された、配列番号219または配列番号219に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第1抗原結合ドメインと、配列番号215または配列番号215に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドから選択される第2抗原結合ドメインとを含む。
【０２７１】
本発明の好ましい実施形態の上述の議論に関して、これは特に、二パラトープ性ナノボディに関するものであるが、本開示が、CXCR2を指向するまたはCXCR2に結合する二パラトープ性ポリペプチドであって、第1および第2結合ドメインが従来の四本鎖抗体、重鎖抗体、単鎖Fv、FabまたはFab(2)に含まれていて、しかも上述の好ましい実施形態の機能的または構造的特徴の1つ以上を有するポリペプチドにも関係することは、理解されるであろう。
【０２７２】
第1および第2抗原結合ドメインが、上述の実施形態のそれぞれの1つ以上の機能的または構造的特徴を有する、VLドメイン、VHドメイン、(dAb)およびVHHドメインなどの免疫グロブリン単一可変ドメインおよびそのフラグメント内に含まれている実施形態も、明示的に開示されている。
【０２７３】
もう一つの態様において、本発明は、CXCR2結合に関して一価であり、かつ本発明の二パラトープ性ポリペプチドのビルディングブロックであって、その生産プロセスにおける中間体とみなすことができるポリペプチド、特にVHHドメインまたはナノボディなどの免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。好ましい一価免疫グロブリン単一可変ドメインは、表9に示す配列番号25〜43および90を有するポリペプチド、または配列番号25〜43および90のいずれか一つに対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。
【０２７４】
好ましい一価ポリペプチドは、137B7と呼ばれ、配列番号36に示すアミノ酸配列を有するもの、または配列番号36と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％もしくは少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。好ましい一実施形態では、配列番号36のフレームワーク領域が、1つ以上の配列最適化アミノ酸置換を有する。その他、127D1、2B2、54B12、97A9、163D2および163E3と呼ばれるもの（フレームワーク領域において配列最適化されているものを含む）も、好ましい一価ポリペプチドである。
【０２７５】
例えば、127D1は、表26で考慮されているような1つ以上の配列最適化アミノ酸置換がなされている配列番号37のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドが、配列番号216に示すアミノ酸配列を含む。
【０２７６】
2B2は、表20で考慮されているような1つ以上の配列最適化置換がなされている配列番号43のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドが、配列番号213または214に示すアミノ酸配列を含む。
【０２７７】
54B12は、表30で考慮されているような1つ以上の配列最適化置換がなされている配列番号90のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドが、配列番号219に示すアミノ酸配列を含む。
【０２７８】
97A9は、表22で考慮されているような1つ以上の配列最適化置換がなされている配列番号39のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドが、配列番号215に示すアミノ酸配列を含む。
【０２７９】
163D2は、表28で考慮されているような配列最適化置換の1つ以上がなされている配列番号41のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドが、配列番号218に示すアミノ酸配列を含む。
【０２８０】
163E3は、表24で考慮されているような1つ以上の配列最適化置換がなされている配列番号42に示すアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドが、配列番号217に示すアミノ酸配列を含む。
【０２８１】
配列番号58、59、62、63、64、65、47または61のいずれか一つに示すアミノ酸配列を有するポリペプチドによるCXCR2への結合を交差ブロックする能力を有する一価ポリペプチド、特にナノボディなどの免疫グロブリン単一可変ドメインも、本発明のこの態様に包含される。
【０２８２】
上述の好ましい一価ナノボディはどれでも、また特に137B7は、本明細書に挙げる応用例に、例えばCOPDの処置に使用することができる。
【０２８３】
本発明の二パラトープ性ポリペプチド、特に上述の好ましい二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインは、そのラクダ化およびヒト化型を全て含めて、CXCR2の調整物質であり、特にCXC2シグナル伝達を阻害する。
【０２８４】
好ましくは、本発明の二パラトープ性ポリペプチド中の、特に二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン中の、CDR配列およびFR配列は、
・CXCR2に、10-5〜10-12モル/リットル以下、好ましくは10-7〜10-12モル/リットル以下、より好ましくは10-8〜10-12モル/リットルの解離定数（KD）で（すなわち105〜1012リットル/モル以上、好ましくは107〜1012リットル/モル以上、より好ましくは108〜1012リットル/モルの会合定数（KA）で）結合するもの
および/または、
・CXCR2に、102M-1s-1〜約107M-1s-1、好ましくは103M-1s-1〜107M-1s-1、より好ましくは104M-1s-1〜107 M-1s-1、例えば105M-1s-1〜107M-1s-1のkon速度で結合するもの
および／または
・CXCR2に、1s-1（t1/2＝0.69秒）〜10-6s-1（t1/2が複数日であるほぼ不可逆的な複合体を与える）、好ましくは10-2s-1〜10-6s-1、より好ましくは10-3s-1〜10-6s-1、例えば10-4s-1〜10-6s-1のkoff速度で結合するもの。
【０２８５】
好ましくは、本発明のポリペプチドおよび二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン中に存在するCDR配列およびFR配列は、CXCR2に、500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満のアフィニティで結合するものである。
【０２８６】
特に、本明細書の実施例で示すように、本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディは、ヒトCXCR2へのGro-αの結合を、20nM未満のIC50で阻害することができる。本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディは、CXCR2を保持するRBL細胞からのアゴニスト誘発性（Gro-α）Ca放出も、100nM未満のIC50で阻害しうる。本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディは、CXCR2-CHO膜におけるアゴニスト誘発性（Gro-α）[35S]GTPγS蓄積も、50nM未満のIC50で阻害しうる。また、本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディは、Gro-αへのばく露時のヒト白血球の形状変化を＜1nm未満のIC50で、またカニクイザル白血球の形状変化を＜2nm未満のIC50で、阻害しうる。
【０２８７】
本発明の最も好ましい態様によれば、本発明の二パラトープ性（bioparatopic）ポリペプチド、例えば二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば本明細書に記載するナノボディは、配列番号1のアミノ酸配列を有するCXCR2ポリペプチドへの、配列番号58、59、62、63、64、65、47または61に示すポリペプチドのいずれかまたは全てによる結合を、交差ブロックするであろう。交差ブロッキングは当業者に周知のどの方法で測定してもよい。
【０２８８】
医薬的使用には、本発明のポリペプチドが、好ましくは、ヒトCXCR2（例えば配列番号1に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド）を指向し；一方、獣医学的目的には、本発明のポリペプチドが、好ましくは、処置される種に由来するCXCR2を指向するか、少なくとも、処置される種に由来するCXCR2と交差反応する。
【０２８９】
さらにまた、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、場合によっては、CXCR2に結合するための少なくとも2つの抗原結合ドメインに加えて、他のエピトープ、抗原、タンパク質またはターゲットに結合するための1つ以上のさらなる結合部位またはドメインを含有する。
【０２９０】
本発明のポリペプチドおよびそれを含む組成物の効力（efficacy）は、当該ポリペプチドが、COPDまたは異常なCXCR2シグナル伝達が関与する他の任意の疾患の処置に有用でありうることを示すのに適した、任意の適切な自体公知のインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイおよび/または動物モデル、またはそれらの任意の組合せを使って試験することができる。適切なアッセイおよび動物モデルは当業者には明白であるだろう。
【０２９１】
また、本発明によれば、ヒトCXCR2を指向するポリペプチドは、1つ以上の他の温血動物種に由来するCXCR2と交差反応性を示しても示さなくてもよい。しかし好ましくは、ヒトCXCR2を指向する本発明のポリペプチドは、毒性試験のために、1つ以上の他の霊長類種（例えば限定するわけではないが、マカク属（Macaca）のサル（例えば特にカニクイザル（Macaca fascicularis）および/またはアカゲザル（Macaca mulatta））およびヒヒ（Papio ursinus））に由来するCXCR2との交差反応性を示すであろう。好ましい交差反応性は、カニクイザル由来のCXCR2との交差反応性である。疾患の動物モデルにおいて（特にCXCR2と関連する疾患および障害の動物モデルにおいて）使用されることが多い1つ以上の動物種（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタまたはイヌ）との交差反応性は望ましいであろう。この点において、そのような交差反応性が存在する場合、それには、医薬開発の観点から利点あるだろうということは、当業者には明白であるだろう。というのも、ヒトCXCR2に対するアミノ酸配列およびポリペプチドを、そのような疾患モデルで試験することが可能になるからである。
【０２９２】
より一般的には、複数の哺乳動物種に由来するCXCR2と交差反応する本発明のポリペプチドが、獣医学的応用における使用には、通常、有利であるだろう。というのも、それにより、複数の種にわたって、同じポリペプチドを使用することが可能になるだろうからである。
【０２９３】
好ましくは、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、CXCR1またはCXCR4とは交差反応しない。
【０２９４】
本発明の二パラトープ性ポリペプチドでは、少なくとも1つの抗原結合部位が、相互作用部位、すなわちCXCR2が別の分子、例えばその1または複数の天然リガンドと相互作用する部位を指向しうる。
【０２９５】
本発明の二パラトープ性ポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインは、第2抗原結合ドメインが配列番号7の線状ペプチドに結合せず、本明細書に配列番号8、9、10、11または12として示すペプチドを含むエピトープまたはそのペプチド内にあるエピトープを認識するものでありうる。加えて、第1抗原結合ドメインは、配列番号7のペプチドを含むエピトープまたは配列番号7のペプチド内にあるエピトープを認識しうる。
【０２９６】
カニクイザルCXCR2と交差反応する本発明の実施形態では、第1抗原結合ドメインが、配列番号4のペプチドを含むエピトープまたは配列番号4のペプチド内にあるエピトープも認識する。そのような一実施形態では、第2抗原結合ドメインが、配列番号5または6のペプチドを含むエピトープまたは配列番号5もしくは6のペプチド内にあるエピトープを認識しうる。
【０２９７】
CXCR2の天然に存在するまたは合成の類似体、変異体、ミュータント、アレル、パーツおよびフラグメントに広く結合するタイプ、または少なくとも、CXCR2（例えば配列番号1の野生型CXCR2）において本発明のポリペプチドが結合する抗原性決定基またはエピトープと基本的に同じである1つ以上の抗原性決定基またはエピトープを含有するCXCR2の類似体、変異体、ミュータント、アレル、パーツおよびフラグメントに広く結合するタイプの二パラトープ性ポリペプチド、特に二パラトープ性ナノボディも、本発明の範囲内で提供される。そのような場合、本発明のポリペプチドは、上記類似体、変異体、ミュータント、アレル、パーツおよびフラグメントに、本発明のポリペプチドが（野生型）CXCR2に結合する際の上述のアフィニティおよび/または特異性で結合しうる。また、当業者には明らかであるだろうとおり、二パラトープ性であるポリペプチドは、対応する単一抗原結合ドメインポリペプチドよりも高いアビディティでCXCR2に結合する。
【０２９８】
本明細書で論じるさまざまな治療的背景において本発明の二パラトープ性ポリペプチド（特に二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン）のパーツ、フラグメント、類似体、ミュータント、変異体、アレルおよび/または誘導体を使用することも、それらが完全なポリペプチドと等価な関連機能ドメインを含む場合は常に、本発明の範囲に含まれる。そのようなパーツ、フラグメント、類似体、ミュータント、変異体、アレルまたは誘導体は、本発明の二パラトープ性ポリペプチドについて上述した機能的特徴のすべてを有しうる。
【０２９９】
もう一つの態様において、本発明は、場合によっては1つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニットをさらに含む、二パラトープ性ポリペプチド、場合によっては、二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。そのようなさらなる基、残基、部分、結合ユニットまたはアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドにさらなる機能性を与えても与えなくてもよく、その性質を修飾しても修飾しなくてもよい。
【０３００】
例えば、そのようなさらなる基、残基、部分または結合ユニットは、本発明が（融合）タンパク質または（融合）ポリペプチドになるように、1つ以上の追加アミノ酸配列であることができる。好ましい、ただし非限定的な一態様では、該1つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニットが免疫グロブリン配列である。さらに好ましくは、該1つ以上の他の基、残基、部分または結合ユニットが、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、「dAb」、dAbとしての使用に適したアミノ酸配列、またはナノボディからなる群より選ばれる。
【０３０１】
あるいは、そのような基、残基、部分または結合ユニットは、例えば、単独では生物学的および/または薬理学的に活性であっても活性でなくてもよい化学的な基、残基、部分であることもできる。例えば、本明細書においてさらに説明する本発明のポリペプチドの「誘導体」が得られるように、そのような基を1つ以上の本発明のポリペプチドに連結することができる。
【０３０２】
そのようなコンストラクトでは、1つ以上の本発明のポリペプチドと、1つ以上の基、残基、部分または結合ユニットを、互いに直接的に、かつ/または1つ以上の適切なリンカーもしくはスペーサーを介して連結することができる。例えば1つ以上の基、残基、部分または結合ユニットがアミノ酸配列である場合、結果として生じるコンストラクトが融合（タンパク質）または融合（ポリペプチド）になるように、リンカーもアミノ酸配列であることができる。
【０３０３】
上記の、そして本明細書における、さらなる説明から明白であるだろうが、これは、本発明の二パラトープ性ポリペプチドを、さらなる本発明のポリペプチドを形成させるための「ビルディングブロック」として、すなわち、多パラトープ性であり、場合によっては多価または多重特異性、二/多価および二/多重特異性である本明細書に記載のコンストラクトを形成させるために、それらを他の基、残基、部分または結合ユニットと適切に組み合わせることによって、使用できることを意味している。
【０３０４】
本発明のこの態様のポリペプチドは、一般に、1つ以上の本発明のポリペプチドを、1つ以上のさらなる基、残基、部分または結合ユニットに、場合によっては1つ以上の適切なリンカーを介して適切に連結する少なくとも1つのステップを含む方法によって調製することができる。
【０３０５】
本発明の具体的一態様では、本発明の二パラトープ性ポリペプチドが、対応する無修飾の本発明ポリペプチドと比較して増加した半減期を有するように修飾される。本明細書におけるさらなる開示に基づいて、当業者には、いくつかの好ましいポリペプチドが明確になるであろう。それらは、例えば、その半減期が増加するように（例えばPEG化、PAS化またはHES化によって）化学修飾された本発明のアミノ酸配列またはポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、血清タンパク質（血清アルブミンなど）への結合のために、少なくとも1つの追加結合部位を含んでもよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの半減期を増加させる少なくとも1つの部分（特に少なくとも1つのアミノ酸配列）に連結された少なくとも1つのアミノ酸配列を含んでもよい。そのような半減期延長部分または半減期延長アミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例としては、1つ以上の血清タンパク質またはそのフラグメント（例えば（ヒト）血清アルブミンまたはその適切なフラグメント）に適切に連結するポリペプチド、または血清タンパク質に結合することができる1つ以上の結合ユニット（例えば、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、IgGなどの血清免疫グロブリン、またはトランスフェリンなどといった血清タンパク質に結合することができるドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、「dAb」、dAbとしての使用に適したアミノ酸配列、またはナノボディ）；Fc部分（例えばヒトFc）またはその適切な一部もしくはフラグメントに連結されているポリペプチドが挙げられる。血清タンパク質に結合することができる1つ以上の小さなタンパク質またはペプチド（例えば、限定するわけではないが、WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489、および2006年12月5日に出願されたAblynx N.V.の米国仮特許出願（発明の名称「Ppeptides capable of binding to serum proteins」）（PCT/EP2007/063348も参照されたい）に記載のタンパク質およびペプチド）に連結されている本発明のポリペプチドも、本発明に包含される。
【０３０６】
医薬タンパク質の半減期を増加させかつ/または免疫原性を低下させるための技法であって最も広く使用されているものの一つは、薬理学的に許容される適切なポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)（PEG）またはその誘導体（例えばメトキシポリ(エチレングリコール)またはmPEG）の取り付けを含む。一般に、任意の適切な形態のPEG化、例えば当技術分野において抗体および抗体フラグメント（（単一）ドメイン抗体およびScFvを含むが、これらに限るわけではない）に使用されるPEG化などを、使用することができる。例えばChapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002)；VeroneseおよびHarris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003)、HarrisおよびChess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003)ならびにWO 04/060965を参照されたい。タンパク質をPEG化するためのさまざまな試薬も、例えばNektar Therapeutics（米国）などから市販されている。
【０３０７】
好ましくは、部位特異的PEG化が、特にシステイン残基を介して使用される（例えばYangら, Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)を参照されたい）。例えばこの目的には、本発明の二パラトープ性ナノボディ中に天然に存在するシステイン残基に、PEGを取り付けることができる。いずれも当業者には自体公知のタンパク質工学の技法を使って、PEGを取り付けるための1つ以上のシステイン残基が適切に導入されるように本発明の二パラトープ性ポリペプチドを修飾するか、またはPEGを取り付けるための1つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を二パラトープ性ポリペプチドのNおよび/またはC末端に融合することができる。
【０３０８】
好ましくは、本発明の二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドには、5000を超える、例えば10,000を超えかつ200,000未満の、例えば100,000未満の、例えば20,000〜80,000の範囲の分子量を有するPEGが使用される。
【０３０９】
PEG化は、免疫グロブリン可変ドメインの一方もしくは両方および/または任意のペプチドリンカー領域に適用することができる。適切なPEG化技法はEP 1639011に記載されている。
【０３１０】
PEGの代わりに、HES化と呼ばれている技法によって半減期を引き延ばすこともでき、この技法では、本発明のポリペプチドにヒドロキシエチルデンプン（HES）誘導体が取り付けられる。使用されるヒドロキシエチルデンプンは、ワキシー（waxy）トウモロコシデンプン由来のアミロペクチンであって、分子量を調節するために酸加水分解によって修飾されており、かつグルコース残基がヒドロキシエチル化されているものである。さらなる詳細は、Pavisic R.ら, Int J Pharm (2010) March 15, 387 (1-2):110-9から得ることができる。
【０３１１】
一般に、増加した半減期を有する本発明のポリペプチドは、好ましくは、対応する本発明のポリペプチドそのものの半減期より、少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも10倍または20倍以上大きい半減期を有する。例えば、増加した半減期を有する本発明のポリペプチドは、対応する本発明のポリペプチドそのものと比較して、1時間以上、好ましくは2時間以上、より好ましくは6時間以上、例えば12時間以上、さらには24、48または72時間以上増加した半減期を有しうる。
【０３１２】
本発明の好ましい一態様では、そのような本発明のポリペプチドは、対応する本発明のポリペプチドそのものと比較して、1時間以上、好ましくは2時間以上、より好ましくは6時間以上、例えば12時間以上、さらには24、48または72時間以上増加した血清中半減期を有する。
【０３１３】
本発明のもう一つの好ましい態様では、本発明のポリペプチドが、ヒトにおいて、少なくとも約12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも48時間、さらに好ましくは少なくとも72時間またはそれ以上の血清中半減期を示す。例えば、本発明のポリペプチドは、少なくとも5日（例えば約5〜10日）、好ましくは少なくとも9日（例えば約9〜14日）、より好ましくは少なくとも約10日（例えば約10〜15日）、または少なくとも約11日（例えば約11〜16日）、より好ましくは少なくとも約12日（例えば約12〜18日またはそれ以上）または14日以上（例えば約14〜19日）の半減期を有しうる。
【０３１４】
本発明はさらに、本明細書で述べるポリペプチド、核酸、宿主細胞および組成物を調製または作製するための方法に関する。
【０３１５】
一般に、これらの方法は、
a）ポリペプチドのセット、コレクションまたはライブラリーを用意するステップ；および
b）該ポリペプチドのセット、コレクションまたはライブラリーを、CXCR2に結合することができかつ/またはCXCR2に対するアフィニティを有するアミノ酸配列についてスクリーニングするステップ；および
c）CXCR2に結合することができかつ/またはCXCR2に対するアフィニティを有するアミノ酸配列を単離するステップ
を含みうる。
【０３１６】
ポリペプチドのセット、コレクションまたはライブラリーは、免疫グロブリン配列（本明細書に記載するもの）のセット、コレクションまたはライブラリー、例えば免疫グロブリン配列のナイーブセット、コレクションまたはライブラリー；免疫グロブリン配列の合成または半合成セット、コレクションまたはライブラリー；および/または親和性成熟に付された免疫グロブリン配列のセット、コレクションまたはライブラリーであることができる。
【０３１７】
また、そのような方法において、ポリペプチドのセット、コレクションまたはライブラリーは、重鎖可変ドメイン（例えばVHドメインまたはVHHドメイン）または軽鎖可変ドメインのセット、コレクションまたはライブラリーであることもできる。例えば、ポリペプチドのセット、コレクションまたはライブラリーは、ドメイン抗体または単一ドメイン抗体のセット、コレクションまたはライブラリーであるか、ドメイン抗体または単一ドメイン抗体として機能する能力を有するアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーであることができる。
【０３１８】
この方法の好ましい一態様では、ポリペプチドのセット、コレクションまたはライブラリーが、例えば、CXCR2またはそれに基づくもしくはそれに由来する適切な抗原性決定基、例えばその抗原性のパーツ、フラグメント、領域、ドメイン、ループまたは他のエピトープで適切に免疫処置された、哺乳動物、例えばラマに由来する、免疫グロブリン配列の免疫セット、コレクションまたはライブラリーであることができる。
【０３１９】
上記の方法では、例えばスクリーニングを容易にするなどの目的で、ペプチドまたはポリペプチドのセット、コレクションまたはライブラリーを、ファージ、ファージミド、リボソームまたは適切な微生物（例えば酵母）上にディスプレイすることができる。アミノ酸配列（のセット、コレクションまたはライブラリー）をディスプレイしスクリーニングするための適切な方法、技法および宿主細胞は、例えば本明細書におけるさらなる開示に基づいて、当業者には明白であるだろう。HoogenboomによるNature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)の総説も参照されたい。
【０３２０】
もう一つの態様において、本発明の二パラトープ性ポリペプチドの構築に使用するためのポリペプチドを作製するための方法は、少なくとも、
a）ポリペプチドを発現する細胞のコレクションまたはサンプルを用意するステップ；
b）該細胞のコレクションまたはサンプルを、CXCR2に結合することができかつ/またはCXCR2に対するアフィニティを有するポリペプチドを発現する細胞についてスクリーニングするステップ；および
c）（i）該ポリペプチドを単離するか、または（ii）該細胞から該ポリペプチドをコードする核酸配列を単離した後、該ポリペプチドを発現させるステップ
を含む。
【０３２１】
例えば、所望のポリペプチドが免疫グロブリン配列である場合、細胞のコレクションまたはサンプルは、例えばB細胞のコレクションまたはサンプルであることができる。また、この方法では、細胞の試料が、CXCR2またはそれに基づくもしくはそれに由来する適切な抗原性決定基、例えばその抗原性のパーツ、フラグメント、領域、ドメイン、ループまたは他のエピトープで適切に免疫処置された哺乳動物、例えばラマに由来しうる。ある特定の一態様では、該抗原性決定基が細胞外のパーツ、領域、ドメイン、ループまたは他の細胞外エピトープでありうる。
【０３２２】
本明細書において同定する本発明の好ましい二パラトープ性ナノボディの調製では、ラマを、ヒトCXCR2を発現する哺乳動物細胞、カニクイザルCXCR2を発現する哺乳動物細胞、完全長ヒトCXCR2をコードするDNA、Δ1-17ヒトCXCR2をコードするDNA、カニクイザルCXCR2をコードするDNA、および表5に示すペプチドで免疫処置した。
【０３２３】
上述のスクリーニング方法は、当業者には明らかであるだろうとおり、任意の適切な方法で行うことができる。例えばEP 0 542 810、WO 05/19824、WO 04/051268およびWO 04/106377を参照されたい。ステップb）のスクリーニングは、好ましくは、FACSなどのフローサイトメトリー技法を使って行われる。これについては、例えばLiebyら, Blood, Vol. 97, No. 12, 3820 (2001)を参照されたい。
【０３２４】
もう一つの態様において、本発明のポリペプチドの構築に使用するためのCXCR2を指向するポリペプチドを作製するための方法は、少なくとも、
a）ポリペプチドをコードする核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを用意すること；
b）該核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを、CXCR2に結合することができ、かつ/またはCXCR2に対するアフィニティーを有するアミノ酸配列をコードする核酸配列についてスクリーニングするステップ；
c）該核酸配列を単離し、次に該ポリペプチドを発現させるステップ
を含みうる。
【０３２５】
そのような方法では、ポリペプチドをコードする核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーが、例えば免疫グロブリン配列のナイーブセット、コレクションまたはライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリー；免疫グロブリン配列の合成または半合成セット、コレクションまたはライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリー；および/または親和性成熟に付された免疫グロブリン配列のセット、コレクションまたはライブラリーをコードする核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーでありうる。
【０３２６】
また、そのような方法では、核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーが、重鎖可変ドメイン（例えばVHドメインまたはVHHドメイン）または軽鎖可変ドメインのセット、コレクションまたはライブラリーをコードしうる。例えば、核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーは、ドメイン抗体または単一ドメイン抗体のセット、コレクションまたはライブラリー、またはドメイン抗体もしくは単一ドメイン抗体として機能する能力を有するアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーをコードしうる。
【０３２７】
この方法の好ましい一態様では、核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーが、例えばCXCR2またはそれに基づくもしくはそれに由来する適切な抗原性決定基、例えばその抗原性のパーツ、フラグメント、領域、ドメイン、ループまたは他のエピトープで適切に免疫処置された哺乳動物に由来する核酸配列の免疫セット、コレクションまたはライブラリーでありうる。特定の一態様では、該抗原性決定基は、細胞外のパーツ、領域、ドメイン、ループまたは他の細胞外エピトープでありうる。
【０３２８】
本発明のポリペプチドの作製では、上で説明したようにラマを抗原で免疫処置した。
【０３２９】
上記の方法では、例えばスクリーニングを容易にするなどの目的で、ヌクレオチド配列のセット、コレクションまたはライブラリーを、ファージ、ファージミド、リボソームまたは適切な微生物（例えば酵母）上にディスプレイすることができる。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、コレクションまたはライブラリー）をディスプレイしスクリーニングするための適切な方法、技法および宿主細胞は、例えば本明細書におけるさらなる開示に基づいて、当業者には明白であるだろう。HoogenboomによるNature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)の総説も参照されたい。
【０３３０】
もう一つの態様において、本発明の二パラトープ性ポリペプチドに使用することができるCXCR2を指向するポリペプチドを作製するための方法は、少なくとも
a）ポリペプチドをコードする核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを用意するステップ；
b）該核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを、CXCR2に結合することができかつ/またはCXCR2に対するアフィニティーを有するアミノ酸配列であって、本発明の二パラトープ性ナノボディ、例えば配列番号58、59、62、63、64、65、47または61によってコードされるものによって交差ブロックされるか、それらを交差ブロックするものについて、スクリーニングするステップ；および
c）該核酸配列を単離し、次に該ポリペプチドを発現させるステップ
を含みうる。
【０３３１】
本発明は、上記の方法によって、あるいは上記の方法の一つを含むと共に、少なくとも、該免疫グロブリン配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定するステップと、および該アミノ酸配列を自体公知の方法で（例えば適切な宿主細胞または宿主細胞における発現によって、または化学合成によって）発現させまたは合成し、そこから二パラトープ性ポリペプチドを構築するステップとを含む方法によって得られる、二パラトープ性ポリペプチドにも関する。
【０３３２】
上記の方法は、当業者には明らかであるだろうし、以下にも詳述するとおり、任意の適切な方法で行うことができる。例えばEP 0 542 810、WO 05/19824、WO 04/051268およびWO 04/106377を参照されたい。例えば、ステップb）のスクリーニングは、好ましくは、FACSなどのフローサイトメトリー技法を使って行われる。これについては、例えばLiebyら, Blood, Vol. 97, No. 12, 3820 (2001)を参照されたい。特にAblynx N.V.による国際出願WO 06/079372に記載のいわゆる「Nanoclone（商標）」技法を参照されたい。
【０３３３】
CXCR2を指向するVHH配列またはナノボディ配列を得るためのもう一つの技法では、重鎖抗体を発現する能力を有するトランスジェニック哺乳動物を適切に（すなわちCXCR2を指向する免疫応答および/または重鎖抗体が生じるように）免疫処置し、該トランスジェニック哺乳動物から、該VHH配列またはナノボディ配列（をコードする核酸配列）を含有する適切な生物学的サンプル（例えば血液サンプル、血清サンプル、またはB細胞のサンプル）を取得し、次に、該サンプルから出発し、任意の適切な自体公知の技法（例えば本明細書に記載する方法のいずれか、またはハイブリドーマ技法）を使って、CXCR2を指向するVHH配列を作製する。例えば、この目的には、重鎖抗体発現マウスや、WO 02/085945、WO 04/049794およびWO 06/008548およびJanssensら, Proc. Natl. Acad. Sci .USA. 2006 Oct 10;103(41):15130-5に記載されているさらなる方法および技法を、使用することができる。例えば、そのような重鎖抗体発現マウスは、任意の適切な（単一）可変ドメイン、例えば天然源由来の（単一）可変ドメイン（例えばヒト（単一）可変ドメイン、ラクダ科動物（単一）可変ドメインまたはサメ（単一）可変ドメイン）ならびに例えば合成または半合成（単一）可変ドメインを有する重鎖抗体を発現することができる。
【０３３４】
天然に存在するVH配列または好ましくはVHH配列から出発して、本発明において使用するためのナノボディおよび/またはそれをコードする核酸を得るための他の適切な方法および技法は、当業者には明白であるだろうが、これには、例えば本明細書において言及するWO 08/00279Aの64頁で言及されている技法が含まれうる。
【０３３５】
VHHドメインまたはナノボディは、それらのFR内にある1つ以上の「ホールマーク（Hallmark）残基」を特徴としうる。ホールマーク残基とは、FRをラクダ科動物、例えばラマ由来のものと特徴づける残基である。したがってホールマーク残基は、置換、好ましくはヒト化置換の望ましいターゲットである。
【０３３６】
Kabatナンバリングによれば、ホールマーク残基は、ナノボディ中の11、37、44、45、47、83、84、103、104または108番目に位置しうる。そのようなフレームワーク配列と代替ホールマーク残基（の適切な組合せ）の非限定的な例は、WO 2008/020079の65〜98頁に記載されており、これらのページはそのまま本明細書に組み込まれる。他のヒト化または部分ヒト化配列も考えられ、それらも本発明に包含される。
【０３３７】
上で既に述べたように、本発明において使用するためのナノボディは、天然に存在するヒトVHドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にDP-47の対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の少なくとも1つに少なくとも「1つのアミノ酸相違」（本明細書において定義するもの）を有しうる。より具体的には、本発明の非限定的な一態様によれば、ナノボディは、天然に存在するヒトVHドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にDP-47の対応するフレームワーク領域と比較して、ホールマーク残基（108番目、103番目および/または45番目にあるものを含む）の少なくとも1つに少なくとも「1つのアミノ酸相違」（本明細書において定義するもの）を有しうる。通常、ナノボディは、そのような天然に存在するVHドメインとのアミノ酸相違を、FR2および/またはFR4の少なくとも1つに、特にFR2および/またはFR4中のホールマーク残基（ここでも、108番目、103番目および/または45番目にあるものを含む）の少なくとも1つに、少なくとも1つは有するであろう。
【０３３８】
また、本発明のヒト化ナノボディは、本明細書において定義するとおりでありうるが、それは、天然に存在するVHHドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の少なくとも1つに、少なくとも「1つのアミノ酸相違」（本明細書において定義するもの）を有するものとする。より具体的には、本発明の非限定的一態様によれば、ヒト化されたまたは他の形で配列最適化されたナノボディは、本明細書に定義するとおりでありうるが、それは、天然に存在するVHHドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、ホールマーク残基（108番目、103番目および/または45番目にあるものを含む）の少なくとも1つに、少なくとも「1つのアミノ酸相違」（本明細書において定義するもの）を有するものとする。通常、ヒト化または他の形で配列最適化されたナノボディは、FR2および/またはFR4の少なくとも1つに、特にFR2および/またはFR4中のホールマーク残基（ここでも、108番目、103番目および/または45番目にあるものを含む）の少なくとも1つに、天然に存在するVHHドメインとのそのようなアミノ酸相違を、少なくとも1つは有するであろう。
【０３３９】
本明細書における開示から明白であるだろうとおり、本明細書において定義する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの天然または合成類似体、ミュータント、変異体、アレル、ホモログおよびオルソログ（本明細書ではこれらをまとめて「類似体」という）、特に配列番号58、59、62、63、64、65、47、61、53、54、46、69、68、67または66の二パラトープ性ナノボディの類似体を使用することも、本発明の範囲に包含される。
【０３４０】
一般に、そのような類似体では、本明細書において定義する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して、1つ以上のアミノ酸残基が置き換えられ、削除されかつ/または付加されている。そのような置換、挿入または欠失は、フレームワーク領域の1つ以上および/またはCDRの1つ以上において行うことができる。そのような置換、挿入または欠失をフレームワーク領域の1つ以上において行う場合、それらは、ホールマーク残基の1つ以上および/またはフレームワーク残基中の他の位置の1つ以上において行いうるが、ホールマーク残基における置換、挿入または欠失は、一般的には、あまり好ましくない（上述のようにそれらが適切なヒト化置換である場合を除く）。
【０３４１】
非限定的な例として、置換は例えば保存的置換（本明細書において説明するもの）であることができ、かつ/またはアミノ酸残基を、別のVHHドメイン中の同じ位置に天然に存在する別のアミノ酸残基で置き換えることができる（そのような置換の非限定的ないくつかの例についてはWO 2008/020079を参照されたい）が、本発明は一般的にはこれらに限るわけではない。したがって、例えば本発明の二パラトープ性ナノボディに使用するためのナノボディなどの性質を改善するか、所望の性質からまたは本発明の望ましい性質のバランスもしくは組合せを、少なくとも大きくは（すなわちナノボディまたは二パラトープ性ナノボディがもはやその意図した用途に適さなくなるほどには）損ねない任意の1つ以上の置換、欠失もしくは挿入、またはそれらの組合せは、本発明の範囲に包含される。当業者は、一般に、適切な置換、欠失もしくは挿入、またはそれらの適切な組合せを、本明細書における開示に基づいて、また場合によっては限られた日常的実験（これは、例えば、限られた数の考えうる置換を導入し、そうして得られたナノボディの性質に及ぼすそれらの影響を決定することを伴いうる）後に、決定し、選択することができるであろう。
【０３４２】
例えば、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドを発現させるために使用する宿主細胞に依存して、そのような欠失および/または置換は、当業者の能力で可能であるだろうとおり、翻訳後修飾のための1つ以上の部位（例えば1つ以上のグリコシル化部位）が除去されるように設計することができる。あるいは、例えば部位特異的PEG化（本明細書で説明するもの）を可能にするために官能基（これも本明細書において説明するもの）を取り付けるための1つ以上の部位が導入されるように、置換または挿入を設計することもできる。
【０３４３】
一般に本明細書では、天然配列には存在しない特定の性質または構造的特徴を確保するために、アミノ酸配列中の置換、挿入または欠失を促進することを、「配列最適化」という。これについては、本明細書の定義の項の項目（y）が関係するであろう。
【０３４４】
類似体は、好ましくは、本発明の二パラトープ性ナノボディについて本明細書において定義したとおりのアフィニティ（本明細書においてさらに説明するように、KD値（真または見掛けの値）、KA値（真または見掛けの値）、kon速度および/またはkoff速度として、あるいはIC50値として適切に測定されかつ/または表現されたもの）で、CXCR2に結合することができるものである。
【０３４５】
類似体は、好ましくは、本明細書に記載する二パラトープ性ナノボディの好ましい性質を保持しているものでもある。
【０３４６】
また、好ましい一態様によれば、類似体は、配列番号58、59、62、63、64、65、47、61、53、54、46、69、68、67または66の二パラトープ性ナノボディの1つに対して、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％もしくは99％またはそれ以上の配列同一性を有し；かつ/または、好ましくは多くても20個、好ましくは多くても10個、さらに好ましくは多くても5個、例えば4、3、2またはただ1個のアミノ酸相違（本明細書において定義するもの）を有する。
【０３４７】
また、類似体のフレームワーク配列およびCDRは、好ましくは、本明細書において定義する好ましい態様に従うものである。より一般的には、本明細書で述べるように、類似体は、（a）108番目のQ；および/または（b）45番目の荷電アミノ酸またはシステイン残基と好ましくは44番目のE、より好ましくは44番目のEと45番目のR；および/または（c）103番目のP、RまたはSを有するであろう。
【０３４８】
本発明の二パラトープ性VHHドメインまたはナノボディの類似体の好ましいクラスの一つは、ヒト化（すなわち天然に存在するナノボディの配列と比較して）されたものである。上述のように、そのようなヒト化では、一般に、天然に存在するVHHの配列中の1つ以上のアミノ酸残基が、ヒトVHドメイン、例えばヒトVH3ドメイン中の同じ位置に存在するアミノ酸残基で置き換えられる。本明細書の表20、22、24、26、28および30に具体的に開示したもの以外の考えうるヒト化置換の例は、本明細書において既に開示したように、ナノボディの配列と天然に存在するヒトVHドメインの配列との比較から、およびWO 2008/020079の開示から、当業者には明白であるだろう。
【０３４９】
一般に、ヒト化の結果として、免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に本発明のナノボディは、本明細書に記載する本発明のナノボディの好ましい性質を依然として保ったまま、より「ヒト様」になりうる。結果として、そのようなヒト化ナノボディは、対応する天然に存在するVHHドメインと比較して、低下した免疫原性などといった利点を、いくつか有しうる。ここでも、本明細書における開示に基づいて、また場合によっては、限られた日常的実験後に、当業者は、ヒト化置換によってもたらされる好ましい性質と天然に存在するVHHドメインの好ましい性質との間で、望ましいまたは適切なバランスが最適化または達成されるような、ヒト化置換またはヒト化置換の適切な組合せを行うことができるであろう。
【０３５０】
本発明の二パラトープ性ナノボディに組み込むためのナノボディは、任意のフレームワーク残基において、例えば1つ以上のホールマーク残基（本明細書において定義するもの）もしくは1つ以上の他のフレームワーク残基（すなわち非ホールマーク残基）またはそれらの任意の適切な組合せにおいて、適切にヒト化することができる。「P,R,S-103グループ」または「KEREグループ」のナノボディの場合、好ましいヒト化置換の一つは、Q108→L108である。「GLEWクラス」のナノボディも、他のホールマーク残基の少なくとも1つがラクダ科動物（ラクダ化）置換（本明細書において定義するもの）を含むのであれば、Q108→L108置換によってヒト化することができる。例えば、上述のように、ヒト化ナノボディの特に好ましいクラスは、44〜47番目にGLEWまたはGLEW様配列；103番目にP、RまたはS（特にR）、および108番目にLを有する。
【０３５１】
ヒト化類似体および他の類似体、ならびにそれをコードする核酸配列は、自体公知の任意の方法で、例えばWO 08/020079の103頁および104頁に言及されている技法の1つ以上を使って、提供することができる。
【０３５２】
そこで述べられているように、ヒトVH配列（すなわちアミノ酸配列または対応するヌクレオチド配列）から出発して、例えばDP-47、DP-51またはDP-29などのヒトVH3配列から出発して、本発明のナノボディの配列が得られるように、かつ/またはそうして得られた配列にナノボディの好ましい性質が付与されるように、1つ以上のラクダ化置換を導入することによって（すなわち、該ヒトVHドメインのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸残基を、VHHドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基に変えることによって）、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン（それらの類似体を含む）を設計しかつ/または調製できることも、当業者には明白であるだろう。ここでも、これは、一般に、先のパラグラフで言及したさまざまな方法および技法を使用し、出発点としてヒトVHドメインのアミノ酸配列および/またはヌクレオチド配列を使って行うことができる。
【０３５３】
いくつかの好ましい、ただし非限定的なラクダ化置換は、WO 2008/020079から導き出すことができる。ホールマーク残基の1つ以上におけるラクダ化置換が、一般に、他のアミノ酸位置の1つ以上における置換より大きな影響を、望ましい性質に対して有するであろうことは明白であるだろうが、それらはどちらも、またはそれらのどの適切な組合せも、本発明に包含される。例えば、望ましい性質の少なくとも一部を付与する1つ以上のラクダ化置換を導入し、次に、該性質をさらに改善しかつ/またはさらなる好ましい性質を付与するさらなるラクダ化置換を導入することができる。ここでも、当業者は、一般に、適切なラクダ化置換またはラクダ化置換の適切な組合せを、本明細書における開示に基づいて、また場合によっては限られた日常的実験（これは、例えば、限られた数の考えうるラクダ化置換を導入し、免疫グロブリン単一可変ドメインの好ましい性質が得られるかどうかまたは（元のVHドメインと比較して）改善されるかどうかを決定することを伴いうる）後に、決定し、選択することができるであろう。しかし一般的には、そのようなラクダ化置換は、好ましくは、得られたアミノ酸配列が少なくとも（a）108番目のQ；および/または（b）45番目の荷電アミノ酸またはシステイン残基と好ましくは44番目のE、より好ましくは44番目のEと45番目のR；および/または（c）103番目のP、RまたはSを含み、場合によっては1つ以上のさらなるラクダ化置換を含むものである。より好ましくは、ラクダ化置換は、本発明において使用するための免疫グロブリン単一可変ドメインおよび/またはその類似体（本明細書において定義するもの）、例えばヒト化類似体および/または好ましくは先のパラグラフにおいて定義した類似体をもたらすものである。
【０３５４】
ナノボディなどの免疫グロブリン単一可変ドメインは、自然界では稀であるがそれでもなおVHドメインフォールドと構造的に適合する置換の組込みによって、VHドメインから導き出すこともできる。例えば、限定するわけではないが、これらの置換は、次の1つ以上を含みうる：35番目のGly、37番目のSer、ValまたはThr、39番目のSer、Thr、Arg、Lys、His、AspまたはGlu、45番目のGluまたはHis、47番目のTrp、Leu、Val、Ala、Thr、またはGlu、50番目のSまたはR（Barthelemyら, J Biol Chem. 2008 Feb 8;283(6):3639-54. Epub 2007 Nov 28）。
【０３５５】
本発明は本発明の二パラトープ性ポリペプチドの誘導体も含む。そのような誘導体は、一般に、本発明の二パラトープ性ポリペプチドのおよび/または本発明の二パラトープ性ポリペプチドを形成するアミノ酸残基の1つ以上の修飾によって、特に化学的および/または生物学的（例えば酵素的）修飾によって、得ることができる。
【０３５６】
そのような修飾の例、ならびにそのような方法で（すなわちタンパク質バックボーン上で、好ましくは側鎖上で）修飾することができるポリペプチド内のアミノ酸残基、そのような修飾を導入するために使用することができる方法および技法、そのような修飾の潜在的用途および利点の例は、当業者には明らかであるだろう。
【０３５７】
例えば、そのような修飾は、本発明の二パラトープ性ポリペプチド中または本発明の二パラトープ性ポリペプチド上への1つ以上の官能基、残基または部分の（例えば共有結合的連結による、または他の適切な方法での）の導入、特に1つ以上の所望の性質または機能性を本発明の二パラトープ性ポリペプチドに付与する1つ以上の官能基、残基または部分の導入を伴いうる。そのような官能基の例は、当業者には明白であるだろう。
【０３５８】
例えば、そのような修飾は、本発明のポリペプチドの半減期、溶解度および/または吸収を増加させ、本発明のポリペプチドの免疫原性および/または毒性を低下させ、本発明のポリペプチドの望ましくないいくつかの副作用を排除または減弱し、かつ/または本発明の二パラトープ性ナノボディおよび/またはポリペプチドの他の有利な性質を付与しかつ/または望ましくない性質を低下させる1つ以上の官能基の（例えば共有結合的連結による、または他の適切な方法での）導入、または前記のうちの2つ以上の任意の組合せを含みうる。そのような官能基およびそれらを導入するための技法の例は、当業者には明白であるだろうし、これには、一般に、当技術分野において知られている全ての官能基、ならびに医薬タンパク質を修飾するための、特に抗体または抗体フラグメント（ScFvおよび単一ドメイン抗体を含む）を修飾するための、自体公知の官能基および技法が含まれうる。これについては、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」（第16版、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン（1980））を参照されたい。当業者にはやはり明らかであるだろうが、そのような官能基は、例えば、本発明の二パラトープ性ポリペプチドに直接（例えば共有結合によって）連結するか、場合によっては適切なリンカーまたはスペーサーを介して連結することができる。
【０３５９】
もう一つの、通常はそれほど好ましくない修飾は、N結合型またはO結合型グリコシル化を、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドを発現させるために使用する宿主細胞に依存して、通常は翻訳時および/または翻訳後修飾の一部として含む。
【０３６０】
さらにもう一つの修飾は、標識ポリペプチドまたは標識ナノボディの使用目的に応じて、1つ以上の検出可能なラベルまたは他のシグナル生成基もしくはシグナル生成部分の導入を含みうる。適切なラベルと、それらを取り付け、使用し、検出するための技法は、当業者には明らかであるだろうし、限定するわけではないが、これには、例えば蛍光ラベル、リン光ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル、放射性同位体、金属、金属キレート化合物、金属カチオン、発色団および酵素、例えばWO 08/020079の109頁に挙げられているものが含まれる。他の適切なラベルは当業者には明らかであるだろうし、これには、例えばNMRまたはESR分光法を使って検出することができる部分が含まれる。
【０３６１】
そのような本発明の標識二パラトープ性ナノボディおよびポリペプチドは、具体的なラベルの選択に依存して、例えばインビトロ、インビボまたはインサイチューアッセイ（ELISA、RIA、EIAおよび他の「サンドイッチアッセイ」などといった自体公知のイムノアッセイを含む）ならびにインビボ診断およびイメージング目的に使用することができる。
【０３６２】
当業者には明らかであるだろうとおり、もう一つの修飾は、例えば上述の金属または金属カチオンの一つをキレートするためのキレート基の導入を伴いうる。適切なキレート基には、例えば限定するわけではないが、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などがある。
【０３６３】
さらにもう一つの修飾は、ビオチン-（ストレプト）アビジン結合ペアなどの特異的結合ペアの一方のパーツである官能基の導入を含みうる。そのような官能基は、本発明の二パラトープ性ポリペプチドまたはナノボディを、結合ペアの他方のパーツに結合している別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学的化合物に、結合対の形成によって連結するために使用することができる。例えば、本発明の二パラトープ性ナノボディをビオチンにコンジュゲートし、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされたもう一つのタンパク質、ポリペプチド、化合物または単体に連結させることができる。例えば、そのようなコンジュゲート二パラトープ性ナノボディは、例えば検出可能シグナル生成剤がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされている診断系において、レポーターとして使用することができる。そのような結合ペアは、例えば本発明の二パラトープ性ナノボディを担体（医薬目的に適した単体を含む）に結合するためにも使用することができる。非限定的な一例は、CaoおよびSuresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000)に記載されているリポソーム製剤である。そのような結合ペアは、本発明のナノボディに治療活性剤を連結するために使用することもできる。
【０３６４】
いくつかの応用では、特に、本発明の二パラトープ性ポリペプチドまたは免疫グロブリン単一可変ドメインが指向するCXCR2ターゲットを発現する細胞を（例えばがんの処置において）殺そうとする応用、またはそのような細胞の成長および/または増殖を低下させまたは遅くしようとする応用では、本発明の二パラトープ性ポリペプチドを、毒素または毒性残基もしくは毒性部分に連結することもできる。例えば細胞毒性化合物を得るために本発明の二パラトープ性ポリペプチドに連結することができる毒性部分、毒性化合物または毒性残基の例は、当業者には明らかであるだろうし、例えば上述の従来技術および/または本発明のさらなる説明に見いだすことができる。その一例は、WO 03/055527に記載のいわゆるADEPT（商標）技術である。
【０３６５】
他の潜在的な化学修飾および酵素修飾は当業者には明らかであるだろう。そのような修飾は、研究目的で（例えば機能活性関係を調べるために）導入することもできる。例えばLundbladおよびBradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997)を参照されたい。
【０３６６】
好ましくは、誘導体は、本発明の二パラトープ性ナノボディについて本明細書において定義したとおりのアフィニティ（本明細書においてさらに説明するように、KD値（真または見掛けの値）、KA値（真または見掛けの値）、kon速度および/またはkoff速度として、あるいはIC50値として適切に測定されかつ/または表現されたもの）で、CXCR2に結合するものである。
【０３６７】
上述のように、本発明は、少なくとも1つの本発明の二パラトープ性ポリペプチドから実質的になるまたは少なくとも1つの本発明の二パラトープ性ポリペプチドを含むタンパク質またはポリペプチドにも関する。「から実質的になる」（essentially consist of）とは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が、本発明の二パラトープ性ポリペプチドのアミノ酸配列と全く同じであるか、限られた数のアミノ酸残基、例えば1〜20個のアミノ酸残基、例えば1〜10個のアミノ酸残基、好ましくは1〜6個のアミノ酸残基、例えば1、2、3、4、5または6個のアミノ酸残基が、二パラトープ性ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方に付加されているそのような本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に対応することを意味する。
【０３６８】
該アミノ酸残基は、ポリペプチドの（生物学的）性質を変化し、改変し、または他の影響を及ぼしても及ぼさなくてもよく、それにさらなる機能性を付加しても付加しなくてもよい。例えば、そのようなアミノ酸残基は：
・例えば異種宿主細胞または宿主生物における発現の結果として、N末端Met残基を含むことができる；
・合成後に宿主細胞からの二パラトープ性ポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列またはリーダー配列を形成しうる。適切な分泌リーダーペプチドは、当業者には明らかであるだろうし、本明細書においてさらに説明するとおりでありうる。通常、そのようなリーダー配列は、二パラトープ性ポリペプチドのN末端に連結されるであろう；
・二パラトープ性ポリペプチドが特定の器官、組織、細胞、または細胞のパーツもしくはコンパートメントを指向し、かつ/またはそれらを貫通しもしくはそれらに進入することを可能にする、および/または二パラトープ性ポリペプチドが、細胞膜、上皮細胞の層などの細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、または血液脳関門などといった生物学的障壁を貫通し、または横切ることを可能にする、配列またはシグナルを形成しうる。そのようなアミノ酸配列の例は、当業者には明らかであるだろうし、これには、WO 08/020079の112頁のパラグラフc）で言及されているものが含まれる；
・「タグ」、例えば、二パラトープ性ナノボディの精製（例えば当該配列または残基を指向するアフィニティ技法を用いた精製）を可能にするまたは容易にするアミノ酸配列または残基を形成しうる。その後、該配列または残基を（例えば化学的または酵素的切断によって）除去することで、二パラトープ性ポリペプチド配列を得ることができる（この目的には、場合により、タグを切断可能なリンカー配列を介して二パラトープ性ポリペプチド配列に連結してもよいし、タグが切断可能なモチーフを含んでいてもよい）。そのような残基の好ましい、ただし非限定的な例をいくつか挙げると、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基およびmycタグ（例えばWO 06/12282の配列番号31参照）である；
・官能化された、かつ/または官能基を取り付けるための部位として役立ちうる、1つ以上のアミノ酸残基でありうる。適切なアミノ酸残基および官能基は、当業者には明らかであるだろうし、限定するわけではないが、これには、本発明の二パラトープ性ポリペプチドまたはナノボディの誘導体について本明細書で言及したアミノ酸残基および官能基が含まれる。
【０３６９】
もう一つの態様によれば、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、そのアミノ末端、そのカルボキシ末端、またはそのアミノ末端とカルボキシ末端の両方で、少なくとも1つのさらなるペプチドまたはポリペプチドに融合されている本発明の二パラトープ性ナノボディ（すなわち、該本発明の二パラトープ性ナノボディと1つ以上のさらなるペプチドまたはポリペプチドとを含む融合タンパク質が得られるように融合されているもの）を含む。そのような融合物を、本明細書では「ナノボディ融合物」ともいう。
【０３７０】
好ましくは、さらなるペプチドまたはポリペプチドは、1つ以上の望ましい性質または機能性を本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドに付与するものである。
【０３７１】
例えば、さらなるペプチドまたはポリペプチドは、さらなる結合部位を提供してもよく、その結合部位は、所望する任意のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原性決定基またはエピトープ（例えば限定するわけではないが、本発明の二パラトープ性ポリペプチドが指向するものと同じタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原性決定基もしくはエピトープ、または異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原性決定基またはエピトープ）を指向しうる。
【０３７２】
そのようなペプチドまたはポリペプチドの例は、当業者には明らかであるだろうし、これには、一般に、従来の抗体およびそのフラグメント（限定するわけではないが、ScFvおよび単一ドメイン抗体を含む）に基づくペプチド融合物に使用される全てのアミノ酸配列を含めることができる。例えばHolligerおよびHudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005)による総説を参照されたい。
【０３７３】
例えば、そのようなペプチドまたはポリペプチドは、本発明のポリペプチドそのものと比較して、半減期、溶解度、または吸収を増加させ、免疫原性または毒性を低下させ、望ましくない副作用を排除または減弱し、かつ/または本発明のポリペプチドに他の有利な性質を付与し、かつ/または本発明のポリペプチドの望ましくない性質を低下させるアミノ酸配列であることができる。そのようなペプチドおよびポリペプチドの非限定的な例をいくつか挙げると、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（例えばWO 00/27435参照）またはハプテン分子（例えば循環抗体によって認識されるハプテン、例えばWO 98/22141参照）である。
【０３７４】
特に、血清アルブミンまたはそのフラグメントへの免疫グロブリンのフラグメント（例えばVHドメイン）の連結は、半減期を増加させるために使用できることが、当技術分野では記載されている。WO 00/27435およびWO 01/077137を参照されたい。本発明によれば、本発明の二パラトープ性ポリペプチド、好ましくは二パラトープ性ナノボディは、好ましくは、血清アルブミン（またはその適切なフラグメント）に直接連結されるか、または適切なリンカーを介して、特に、本発明のポリペプチドを遺伝子融合物（タンパク質）として発現させることができるように適切なペプチドリンカーを介して連結される。具体的一態様によれば、少なくとも血清アルブミンのドメインIIIまたはその一部を含む血清アルブミンのフラグメントに、本発明の二パラトープ性ナノボディを連結することができる。Ablynx N.V.のWO 07/112940を参照されたい。
【０３７５】
あるいは、既に本明細書において議論したように、さらなるペプチドまたはポリペプチドは、増加した血清中半減期がもたらすように、血清タンパク質（例えばヒト血清アルブミンまたはIgGなどの他の血清タンパク質）を指向するさらなる結合部位または結合ユニットを与えてもよい。そのようなアミノ酸配列には、例えば以下に述べるナノボディ、ならびにWO 91/01743、WO 01/45746およびWO 02/076489に記載の小さなペプチドおよび結合タンパク質、WO 03/002609およびWO 04/003019に記載のdAbが含まれる。Harmsenら, Vaccine, 23 (41)；4926-42, 2005、ならびにEP 0 368 684、ならびにAblynx N.V.によるWO 08/028977、WO 08/043821、WO 08/043822、ならびに2006年12月5日に出願されたAblynx N.V.の米国仮特許出願（発明の名称「Peptides capable of binding to serum protein」）（PCT/EP2007/063348も参照されたい）も参照されたい。
【０３７６】
そのようなペプチドまたはポリペプチドは、特に、血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）および/またはIgG（特にヒトIgG）を指向することができる。例えば、そのようなアミノ酸配列は、（ヒト）血清アルブミンを指向するアミノ酸配列およびFcRnへの血清アルブミンの結合には関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合することができるアミノ酸配列（例えばWO 06/0122787参照）および/または血清アルブミンのドメインIIIの一部を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合する能力を有するアミノ酸配列（ここでも例えばWO 06/0122787を参照されたい）；増加した半減期を有するまたは与えることができるアミノ酸配列（例えばAblynx N.V.によるWO 08/028977参照）；少なくとも1つの哺乳動物種に由来する血清アルブミン、特に少なくとも1つの霊長類種（例えば限定するわけではないが、マカク（Macaca）属のサル（例えば特にカイニクイザル（Macaca fascicularis）および/またはアカゲザル（Macaca mulatta））およびヒヒ（Papio ursinus）に由来する血清アルブミンと交差反応する、ヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列（ここでもWO 08/028977を参照されたい）；pH非依存的に血清アルブミンに結合することができるアミノ酸配列（例えばAblynx N.V.によるWO 08/043821（発明の名称「Amino Acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof」）参照）および/または条件付き結合剤（conditional binder）であるアミノ酸配列（例えばAblynx N.V.によるWO 08/043822（発明の名称「Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner」）参照）でありうる。
【０３７７】
もう一つの態様によれば、1つ以上のさらなるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列は、従来の四本鎖抗体（特にヒト抗体）および/または重鎖抗体の1つ以上のパーツ、フラグメントまたはドメインを含みうる。例えば、通常はそれほど好ましくないものの、本発明の二パラトープ性ナノボディは、従来の（好ましくはヒト）VHもしくはVLドメインに、またはVHもしくはVLドメインの天然もしくは合成類似体に、ここでも場合によってはリンカー配列を介して連結することができる（限定するわけではないが、他の（単一）ドメイン抗体、例えばWardらが記載したdAbを含む）。
【０３７８】
二パラトープ性ポリペプチドまたはナノボディは、1つ以上の（好ましくはヒト）CH1、CH2および/またはCH3ドメインにも、場合によってはリンカー配列を介して連結することができる。例えば、適切なCH1ドメインに連結された二パラトープ性ナノボディを、例えば適切な軽鎖と一緒に使用することで、従来のFabフラグメントまたはF(ab')2フラグメントと類似しているが、従来型VHドメインの1つまたは（F(ab')2フラグメントの場合には）1つもしくは両方が本発明の二パラトープ性ナノボディで置き換えられている、抗体フラグメント/構造を作製することができるだろう。また、2つの二パラトープ性ポリペプチドをCH3ドメインに（場合によってはリンカーを介して）連結することで、インビボで増加した半減期を有するコンストラクトを得ることもできるだろう。
【０３７９】
本発明のポリペプチドの具体的一態様によれば、1つ以上の本発明の二パラトープ性ポリペプチドまたはナノボディを、1つ以上の定常ドメイン（例えばFc部分の一部として使用することができる、またはFc部分を形成させるために使用することができる、2個または3個の定常ドメイン）に、Fc部分に、および/または本発明のポリペプチドに1つ以上のエフェクター機能を付与しかつ/または1つ以上のFc受容体に結合する能力を付与することができる1つ以上の抗体パーツ、フラグメントもしくはドメインに、（場合によっては適切なリンカーまたはヒンジ領域を介して）連結することができる。例えば、この目的のためには、限定するわけではないが、1つ以上のさらなるペプチドまたはポリペプチドは、例えば重鎖抗体（本明細書において説明するもの）に由来する、より好ましくは従来のヒト四本鎖抗体に由来する、抗体のCH2および/またはCH3ドメインを、1つ以上含むことができ；かつ/または、例えばIgGに由来する（例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4に由来する）、IgEに由来する、または他のヒトIg、例えばIgA、IgDまたはIgMに由来する、Fc領域（の一部）を形成することができる。例えば、WO 94/04678には、ラクダ科動物VHHドメイン、またはそのヒト化誘導体（すなわちナノボディ）を含む重鎖抗体であって、それぞれがナノボディとヒトCH2およびCH3ドメインとを含む（ただしCH1ドメインは含まない）2本の重鎖からなる免疫グロブリンが得られるように、ラクダ科動物のCH2および/またはCH3ドメインがヒトCH2およびCH3ドメインで置き換えられていて、その免疫グロブリンは、CH2およびCH3ドメインによって提供されるエフェクター機能を有し、軽鎖が存在しなくても機能することができるものが記載されている。エフェクター機能を与えるために本発明のナノボディに適切に連結することができる他のアミノ酸配列は、当業者には明らかであるだろうし、これは、所望するエフェクター機能に基づいて選択することができる。例えばWO 04/058820、WO 99/42077、WO 02/056910およびWO 05/017148、ならびにHolligerおよびHudsonによる総説（前掲）を参照されたい。Fc部分へのポリペプチド、例えば本発明のナノボディのカップリングは、対応する本発明のポリペプチドと比較して増加した半減期ももたらしうる。いくつかの応用には、生物学的に有意なエフェクター機能を何ら伴わずに増加した半減期を付与するFc部分および/または定常ドメイン（すなわちCH2および/またはCH3ドメイン）の使用も適切である場合があり、さらにはそれが好ましい場合さえある。1つ以上の二パラトープ性ポリペプチド、例えばナノボディと、インビボで増加した半減期を有する1つ以上の定常ドメインとを含む他の適切なコンストラクトは、当業者には明らかであるだろうし、これは、例えば、CH3ドメインに（場合によってはリンカー配列を介して）連結された2つのナノボディを含みうる。一般に、増加した半減期を有する融合タンパク質または誘導体はいずれも、好ましくは、腎吸収のカットオフ値である50kDaを上回る分子量を有するであろう。
【０３８０】
もう一つの具体的な、ただし非限定的な態様では、本発明のポリペプチドを形成させるために、1つ以上の本発明のアミノ酸配列を、二量体へと自己会合する傾向が（従来の四本鎖抗体に天然に存在する定常ドメインと比較して）低下している（または本質的にない）天然、合成または半合成定常ドメイン（またはその類似体、変異体、ミュータント、パーツまたはそのフラグメント）に、（場合によっては適切なリンカーまたはヒンジ領域を介して）連結することができる。そのような単量体型（すなわち自己会合性でない）Fc鎖変異体、またはそのフラグメントは、当業者には明らかであるだろう。例えば、Helmら, J Biol Chem 1996 271 7494には、本発明のポリペプチド鎖に使用することができる単量体型Fc□鎖変異体が記載されている。
【０３８１】
また、そのような単量体型Fc鎖変異体は、好ましくは、（それが由来するFc部分に依存して）補体または関連するFc受容体に結合する能力を依然として有するもの、かつ/またはそれらが由来するFc部分のエフェクター機能の一部または全部を依然として（またはレベルは低下しているが意図した用途には依然として適するレベルで）有するものである。あるいは、そのような本発明のポリペプチド鎖では、単量体型Fc鎖を、ポリペプチド鎖に増加した半減期を付与するために使用することができ、その場合、単量体型Fc鎖は、エフェクター機能を有さないか、実質的に有さなくてもよい。
【０３８２】
さらなるペプチドまたはポリペプチドは、（例えば、本発明のポリペプチドを発現させるために使用する宿主細胞に依存して、本発明のポリペプチドのプレ-、プロ-またはプレプロ型が得られるように）合成後に本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドの宿主細胞からの分泌を指示するシグナル配列またはリーダー配列を形成してもよい。
【０３８３】
さらなるペプチドまたはポリペプチドは、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドが、特定の器官、組織、細胞、または細胞のパーツもしくはコンパートメントを指向し、かつ/またはそれらを貫通しもしくはそれらに進入することを可能にする、および/または本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドが、細胞膜、上皮細胞の層などの細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、または血液脳関門などといった生物学的障壁を貫通し、または横切ることを可能にする、配列またはシグナルを形成してもよい。そのようなアミノ酸の適切な例は当業者には明らかであるだろうし、限定するわけではないが、これには、例えばWO 08/020079の118頁で言及されているものが含まれる。いくつかの応用では、特に、本発明の二パラトープ性ポリペプチドが指向するターゲットを発現する細胞を（例えばがんの処置において）殺そうとする応用、またはそのような細胞の成長および/または増殖を低下させまたは遅くしようとする応用では、本発明の二パラトープ性ポリペプチドを、（細胞）毒性タンパク質またはポリペプチドに連結することもできる。例えば本発明の毒性ポリペプチドなどを得るために本発明のナノボディに連結することができるそのような毒性タンパク質および毒性ポリペプチドの例は、当業者には明らかであるだろうし、例えば上述の従来技術および/または本明細書におけるさらなる説明に見いだすことができる。その一例は、WO 03/055527に記載のいわゆるADEPT（商標）技術である。
【０３８４】
ある随意の、ただし非限定的な態様によれば、該1つ以上のさらなるペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも3つ、例えば4つ、5つまたはそれ以上のナノボディを含む本発明のポリペプチドが得られるように、少なくとも1つのさらなるナノボディを含み、該ナノボディは、場合によっては、1つ以上のリンカー配列（本明細書において定義するもの）を介して連結されうる。
【０３８５】
最後に、本発明の二パラトープ性ポリペプチドが2つ以上のナノボディと1つ以上のさらなるペプチドまたはポリペプチド（本明細書において言及するもの）とを含有し得ることも、本発明の範囲内である。
【０３８６】
2つ以上のVHHドメインを含有する多価および多重特異性ポリペプチドとそれらの調製については、Conrathら, J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001；Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302；ならびに例えばWO 96/34103およびWO 99/23221を参照されたい。本発明の具体的な多重特異性および/または多価ポリペプチドの他の例は、本明細書において言及するAblynx N.V.の出願にいくつか見いだすことができる。
【０３８７】
本発明の多重特異性ポリペプチドの好ましい例の一つは、少なくとも1つの本発明の二パラトープ性ナノボディと、増加した半減期をもたらす少なくとも1つのナノボディとを含む。そのようなナノボディは、例えば血清タンパク質、特にヒト血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、チロキシン結合タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、フィブリノゲン、IgG、IgEまたはIgMなどの免疫グロブリンを指向するか、WO 04/003019に列挙されている血清タンパク質の一つを指向するナノボディであることができる。これらのうち、血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）またはIgG（特にヒトIgG、例えばMuyldermansnによる総説（前掲）に記載されているナノボディVH-1を参照されたい）に結合することができるナノボディは、特に好ましい（ただし、例えばマウスまたは霊長類における実験には、それぞれマウス血清アルブミン（MSA）または該霊長類に由来する血清アルブミンに対するまたはそれらと交差反応するナノボディを使用することができる。ただし、医薬的使用には、ヒト血清アルブミンまたはヒトIgGに対するナノボディが、通常は好ましいであろう）。増加した半減期をもたらし、本発明のポリペプチドにおいて使用することができるナノボディには、WO 04/041865、WO 06/122787、およびAblynx N.V.によるさらなる特許出願に記載されている血清アルブミンを指向するナノボディ、例えば上述のものが含まれる。
【０３８８】
例えば、本発明において使用するための、増加した半減期をもたらす好ましいナノボディには、FcRnへの血清アルブミンの結合には関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合することができるナノボディ（例えばWO 06/0122787参照）；血清アルブミンのドメインIIIの一部を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合する能力を有するナノボディ（ここでも例えばWO 06/0122787を参照されたい）；増加した半減期を有するまたは与えることができるナノボディ（例えばAblynx N.V.によるWO 08/028977参照）；少なくとも1つの哺乳動物種に由来する血清アルブミン、特に少なくとも1つの霊長類種（例えば限定するわけではないが、マカク（Macaca）属のサル（例えば特にカイニクイザル（Macaca fascicularis）および/またはアカゲザル（Macaca mulatta））およびヒヒ（Papio ursinus））に由来する血清アルブミンと交差反応する、ヒト血清アルブミンに対するナノボディ（ここでもAblynx N.V.のWO 08/028977を参照されたい）；pH非依存的に血清アルブミンに結合することができるナノボディ（例えば本明細書において言及したAblynx N.V.によるWO2008/043821参照）および/または条件付き結合剤であるナノボディ（例えばAblynx N.V.によるWO 08/043822参照）などがある。
【０３８９】
増加した半減期をもたらし、本発明のポリペプチドに使用することができる、特に好ましいナノボディには、WO 06/122787に開示されているナノボディALB-1〜ALB-10（表IIおよび表III参照）があり、このうち、ALB-8（WO 06/122787の配列番号62）はとりわけ好ましい。
【０３９０】
本発明の具体的一態様によれば、本発明のポリペプチドは、2つ以上のナノボディの他に、ヒト血清アルブミンに対するナノボディを少なくとも1つは含有する。
【０３９１】
本発明の二パラトープ性ポリペプチドに付加しまたは取り付けまたは融合することができるさらなる追加ペプチドまたはポリペプチドとして、プロリン、アラニンおよびセリンで構成されるポリマー（PAS配列）が挙げられる。PAS配列は200〜600残基で構成され、血漿中半減期の延長をもたらす流体力学的体積（hydrodynamic volume）の劇的な増加につながりうる。本発明の二パラトープ性ポリペプチドの血清中半減期は、Schellenbrgerら, (2009), Nature Biotechnology 27, No 12, p1186-1190に記載されているように、XTENと呼ばれる864アミノ酸ポリペプチドへの融合によって引き延ばすこともできる。
【０３９２】
一般に、1つ以上の本発明の二パラトープ性ナノボディを含有する、増加した半減期を有する本発明のポリペプチド、および本発明の二パラトープ性ナノボディの誘導体、または増加した半減期を有する前記ポリペプチドの誘導体はいずれも、好ましくは、対応する本発明のナノボディそのものの半減期より、少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも10倍または20倍以上長い半減期を有する。例えば、増加した半減期を有するそのような誘導体またはポリペプチドは、対応する本発明のナノボディそのものと比較して、1時間以上、好ましくは2時間以上、より好ましくは6時間以上、例えば12時間以上、さらには24、48または72時間以上増加した半減期を有しうる。
【０３９３】
本発明の好ましい、ただし非限定的な一態様では、そのような誘導体またはポリペプチドは、ヒトにおいて、少なくとも約12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも48時間、さらに好ましくは少なくとも72時間またはそれ以上の血清中半減期を示しうる。例えば、そのような誘導体またはポリペプチドは、少なくとも5日（例えば約5〜10日）、好ましくは少なくとも9日（例えば約9〜14日）、より好ましくは少なくとも約10日（例えば約10〜15日）、または少なくとも約11日（例えば約11〜16日）、より好ましくは少なくとも約12日（例えば約12〜18日またはそれ以上）または14日以上（例えば約14〜19日）の半減期を有しうる。
【０３９４】
本発明の多重特異性ポリペプチドのもう一つの好ましい、ただし非限定的な例は、少なくとも1つの本発明の二パラトープ性ナノボディと、本発明のポリペプチドを、特定の器官、組織、細胞、または細胞のパーツもしくはコンパートメントに向かわせ、かつ/または本発明のポリペプチドがそれらを貫通しもしくはそれらに進入することを可能にする、および/またはナノボディが、細胞膜、上皮細胞の層などの細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、または血液脳関門などといった生物学的障壁を貫通し、または横切ることを可能にする、少なくとも1つのナノボディとを含む。そのようなナノボディの例には、所望の器官、組織または細胞の特異的細胞表面タンパク質、マーカーまたはエピトープ（例えば腫瘍細胞に付随する細胞表面マーカー）を指向するナノボディ、およびWO 02/057445およびWO 06/040153に記載の単一ドメイン脳ターゲティング抗体フラグメントなどがあり、なかでもFC44（WO 06/040153の配列番号189）およびFC5（WO 06/040154の配列番号190）は好ましい例である。
【０３９５】
本発明のポリペプチドでは、2つ以上のナノボディと1つ以上のポリペプチドとが、（例えばWO 99/23221で述べられているように）互いに直接連結されていてもよく、かつ/または1つ以上の適切なスペーサーもしくはリンカーまたはその任意の組合せを介して、互いに連結されていてもよい。
【０３９６】
本発明の一態様によれば、本発明のポリペプチドは、本明細書において定義する本質的に単離された形態にある。
【０３９７】
本発明のアミノ酸配列、二パラトープ性ナノボディ、ポリペプチドおよび核酸は、本明細書におけるさらなる説明から当業者には明らかであるだろうとおり、自体公知の方法で調製することができる。例えば、本発明の二パラトープ性ナノボディおよびポリペプチドは、抗体を調製するための、特に抗体フラグメント（限定するわけではないが（単一）ドメイン抗体およびScFvフラグメントなど）を調製するための、自体公知の方法で、調製することができる。アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチドおよび核酸を調製するための好ましい、ただし非限定的な方法には、例えば本明細書に記載する方法および技法が含まれる。
【０３９８】
当業者には明らかであるだろうとおり、本発明の二パラトープ性ナノボディおよび/またはポリペプチドを調製するためのとりわけ有用な方法の一つは、一般に、
i）適切な宿主細胞もしくは宿主生物（本明細書においては「本発明の宿主」ともいう）または他の適切な発現系において、該本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」ともいう）を発現させるステップ；
および場合によってはそれに続いて、
ii）そうして得られた該本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドを単離および/または精製するステップ
を含む。
【０３９９】
特に、そのような方法は、
i）本発明の宿主を、該本発明の宿主が少なくとも1つの本発明の二パラトープ性ナノボディおよび/またはポリペプチドを発現しかつ/または生産するような条件下で、培養しかつ/または維持するステップ、
場合によって、それに続いて
ii）そうして得られた本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドを単離および/または精製するステップ
を含みうる。
【０４００】
もう一つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチド（またはその適切なフラグメント）をコードする核酸分子に関する。そのような核酸は、本明細書では「本発明の核酸」ともいい、例えば、本明細書においてさらに説明するとおり、遺伝子コンストラクトの形態をとりうる。
【０４０１】
好ましい実施形態において、本発明は、表9および表32の個々の具体的ナノボディに関する配列番号25〜43、90および配列番号213〜219に示すアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。あるいは、本発明の核酸分子は、配列番号44〜69の多価および二パラトープ性ナノボディコンストラクトをコードする核酸分子を含む。さらに、本発明の核酸分子は、表18において同定するナノボディに関する配列番号192〜211の核酸配列を有する分子を含む。
【０４０２】
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAの形態をとることができ、好ましくは二本鎖DNAの形態にある。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムDNA、cDNAまたは合成DNA（例えば意図する宿主細胞または宿主生物における発現に特に適合させたコドン頻度を有するDNA）であることができる。
【０４０３】
本発明の一態様によれば、本発明の核酸は、本明細書において定義する本質的に単離された形態にある。
【０４０４】
本発明の核酸は、ベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはYACなどの形態にあり、それらの中に存在し、かつ/またはそれらの一部であることもでき、これらはまた、本質的に単離された形態にありうる。
【０４０５】
本発明の核酸は、ここに提供する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づいて、自体公知の方法で調製または取得することができ、かつ/または適切な天然源から単離することができる。類似体を得るには、該類似体をコードする本発明の核酸が得られるように、天然に存在するVHHドメインをコードするヌクレオチド配列を、例えば部位特異的変異誘発に付すことができる。また、当業者には明らかであるだろうとおり、本発明の核酸を調製するには、いくつかのヌクレオチド配列、例えば本発明のポリペプチドをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列と、例えば1つ以上のリンカーをコードする核酸とを、適切な方法で一つに連結することもできる。
【０４０６】
本発明の核酸を作製するための技法は、当業者には明らかであるだろうし、例えば限定するわけではないが、自動DNA合成；部位特異的変異誘発；2つ以上の天然および/または合成配列（または2つ以上のそのパーツ）の組合せ、切断型発現産物の発現をもたらす変異の導入；1つ以上の制限部位の導入（例えば、適切な制限酵素を使って容易に消化および/またはライゲートすることができるカセットおよび/または領域を作出するため）、および/または1つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用し、例えば天然に存在する形態のCXCR2の配列をテンプレートとして用いる、PCR反応を利用した変異の導入を挙げることができる。これらの技法および他の技法は当業者には明らかであるだろうし、例えばここでも、上で言及したSambrookらやAusubelらなどの標準的参考書、ならびに下記の実施例を参照されたい。
【０４０７】
本発明の核酸は、遺伝子コンストラクトの形態もとり、遺伝子コンストラクト中に存在し、かつ/または遺伝子コンストラクトの一部であることもできる。そのような遺伝子コンストラクトは、一般的には、少なくとも1つの本発明の核酸を含み、これは、場合によっては、1つ以上の自体公知の遺伝子コンストラクトの要素、例えば1つ以上の適切な調節要素（例えば適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）および本明細書において言及する遺伝子コンストラクトのさらなる要素に連結されている。少なくとも1つの本発明の核酸を含むそのような遺伝子コンストラクトを、本明細書では「本発明の遺伝子コンストラクト」ともいう。
【０４０８】
本発明の遺伝子コンストラクトはDNAまたはRNAであることができ、好ましくは二本鎖DNAである。本発明の遺伝子コンストラクトは、意図した宿主細胞または宿主生物の形質転換に適した形態、意図した宿主細胞のゲノムDNAへの組込みに適した形態、または意図した宿主生物における非依存的複製、維持および/または遺伝に適した形態もとりうる。例えば、本発明の遺伝子コンストラクトは、ベクターの形態、例えばプラスミド、コスミド、YAC、ウイルスベクターまたはトランスポゾンなどの形態をとりうる。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわちインビトロおよび/またはインビボで（例えば適切な宿主細胞、宿主生物および/または発現系で）発現をもたらすことができるベクターであることができる。
【０４０９】
好ましい、ただし非限定的な一態様では、本発明の遺伝子コンストラクトが
i）少なくとも1つの本発明の核酸であって、
ii）1つ以上の調節要素、例えばプロモーターおよび場合により適切なターミネーターに作動可能に接続されているものと、
場合によっては
iii）1つ以上の自体公知の遺伝子コンストラクトのさらなる要素と
を含み、ここで、用語「作動可能に接続されている」および「作動可能に連結されている」という用語は、WO 08/020079の131〜134頁に記載されている意味を有し、「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」および「さらなる要素」は、WO 08/020079の131〜134頁に記述されているとおりであり、遺伝子コンストラクトはさらに、WO 08/020079の131〜134頁に記述されているとおりでありうる。
【０４１０】
本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドを発現および/または生産するために、本発明の核酸および/または本発明の遺伝子コンストラクトを使って、宿主細胞または宿主生物を形質転換することができる。適切な宿主または宿主細胞は当業者には明らかであるだろうし、これは、例えば、任意の適切な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株または任意の適切な真菌、原核もしくは真核生物、例えばWO 08/020079の134頁および135頁に記載されているもの；ならびに当業者には明らかであるだろう、抗体および抗体フラグメント（（単一）ドメイン抗体およびScFvフラグメントを含むが、これらに限るわけではない）を発現および生産するための、他の全ての自体公知の宿主または宿主細胞であることができる。上述した一般的背景技術ならびに例えばWO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenkenら, (1998), 前掲；RiechmannおよびMuyldermans, (1999), 前掲；van der Linden, (2000), 前掲；Thomassenら, (2002), 前掲；Joostenら, (2003), 前掲；Joostenら, (2005), 前掲；および本明細書において言及するさらなる参考文献も参照されたい。
【０４１１】
本発明の二パラトープ性ナノボディおよびポリペプチドは、WO 08/020079の135頁および136頁ならびにWO 08/020079において言及されているさらなる文献にさらに記載されているように、例えば予防的および/または治療的目的のために（例えば遺伝子治療として）、多細胞生物の1つ以上の細胞、組織または器官に導入し、そこで発現させることもできる。
【０４１２】
細胞におけるナノボディの発現については、例えばWO 94/02610、WO 95/22618およびUS-A-7004940；WO 03/014960；Cattaneo, A.およびBiocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag；ならびにKontermann, Methods 34, (2004), 163-170に記載されているように、それらを、いわゆる「イントラボディ」（intrabody）として発現させることもできる。
【０４１３】
本発明の二パラトープ性ナノボディおよびポリペプチドは、例えば、トランスジェニック哺乳動物の乳汁、例えばウサギ、ウシ、ヤギまたはヒツジの乳汁（導入遺伝子を哺乳動物に導入するための一般技法については例えばUS-A-6,741,957、US-A-6,304,489およびUS-A-6,849,992を参照されたい）、植物または植物の一部、例えば限定するわけではないが葉、花、果実、種子、根または塊茎（turber）（例えばタバコ、トウモロコシ、ダイズまたはアルファルファ）、または例えばカイコBombix moriの蛹などにおいて生産させることができる。
【０４１４】
さらにまた、本発明の二パラトープ性ナノボディおよびポリペプチドを、無細胞発現系で発現させ、かつ/または生産することもでき、そのような系の適切な例は、当業者には明らかであるだろう。好ましい、ただし非限定的な例には、小麦胚芽系、ウサギ網状赤血球溶解物、または大腸菌Zubay系における発現などがある。
【０４１５】
上述のように、二パラトープ性ポリペプチドおよびナノボディの使用の利点の一つは、それに基づくポリペプチドを、適切な細菌系における発現によって調製できることであり、適切な細菌発現系、ベクター、宿主細胞、調節要素などは、例えば上述の参考文献などから、当業者には明白であるだろう。ただし、本発明はその最も広い意味において、細菌系における発現に限定されないことを留意すべきである。
【０４１６】
好ましくは、本発明では、医薬的用途に適した形態にある本発明のポリペプチドを与える細菌発現系などの（インビボまたはインビトロ）発現系が使用され、そのような発現系は、ここでも、当業者には明白であるだろう。同様に当業者には明白であるだろうとおり、医薬的使用に適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成のための技法を使って調製することができる。
【０４１７】
工業規模で生産する場合、二パラトープ性ナノボディまたはナノボディ含有タンパク質治療薬の（工業）生産にとって好ましい異種宿主としては、大規模発現/生産/発酵に適した、特に大規模医薬（すなわちGMPグレード）発現/生産/発酵に適した、大腸菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシア（S. cerevisiae）の株が挙げられる。そのような株の適切な例は当業者には明らかであるだろう。また、そのような株および生産/発現系は、Biovitrum（スウェーデン・ウプサラ）などの会社から入手することもできる。
【０４１８】
あるいは、大規模発現/生産/発酵、特に大規模医薬発現/生産/発酵には、哺乳動物細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を使用することもできる。ここでも、そのような発現/生産系は、上述の会社のいくつかから、同様に入手することができる。
【０４１９】
具体的発現系の選択は、ひとつには、一定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化に関する要件に依存するであろう。グリコシル化が望まれるまたは必要なナノボディ含有組換えタンパク質の生産には、発現したタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物発現宿主の使用が必要になるであろう。この点に関して、得られるグリコシル化パターン（すなわち、取り付けられる残基の種類、数および位置）が、発現に使用される細胞または細胞株に依存することは、当業者には明白であるだろう。好ましくは、ヒト細胞またはヒト細胞株を使用するか（すなわち、本質的にヒトグリコシル化パターンを有するタンパク質につながる）、またはヒトグリコシル化と本質的および/または機能的に同じグリコシル化パターンを与えるか少なくともヒトグリコシル化を模倣することができる他の哺乳動物細胞株を使用する。一般に、大腸菌などの原核宿主は、タンパク質をグリコシル化する能力を有さず、酵母などの下等真核生物の使用は、通常、ヒトグリコシル化とは異なるグリコシル化パターンをもたらす。それでもなお、得ようとする所望の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドに応じて、本発明においては、上述の宿主細胞および発現系の全てを使用することができると理解すべきである。
【０４２０】
したがって、本発明の一態様によれば、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドはグリコシル化されている。本発明のもう一つの非限定的態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディまたはポリペプチドは、非グリコシル化体である。
【０４２１】
本発明の好ましい、ただし非限定的な一態様によれば、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドは、細菌細胞、特に大規模医薬生産に適した細菌細胞、例えば上述した株の細胞において生産される。
【０４２２】
本発明のもう一つの好ましい、ただし非限定的な態様によれば、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドは、酵母細胞、特に大規模医薬生産に適した酵母細胞、例えば上述した種の細胞において生産される。
【０４２３】
本発明のさらにもう一つの好ましい、ただし非限定的な態様によれば、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞またはヒト細胞株の細胞、より具体的には大規模医薬生産に適したヒト細胞またはヒト細胞株の細胞、例えば上述の細胞株において生産される。
【０４２４】
WO 08/020079の138頁および139頁にさらに詳しく述べられているように、宿主細胞における発現を使って本発明の二パラトープ性ナノボディおよびポリペプチドを生産する場合、それらは、細胞内で（例えばサイトゾル、ペリプラズム、または封入体において）生産させた後、次に宿主細胞から単離し、場合によってはさらに精製することもできるし、細胞外に（例えば宿主細胞を培養する培地中に）生産させた後、培養培地から単離し、場合によってはさらに精製することもできる。したがって、本発明の非限定的一態様によれば、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドは、細胞内で生産され、かつ宿主細胞から、特に細菌細胞から、または細菌細胞中の封入体から単離された、アミノ酸配列、ナノボディまたはポリペプチドである。本発明のもう一つの非限定的態様によれば、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドは、細胞外に生産され、かつ宿主細胞を培養する培地から単離されたナノボディまたはポリペプチドである。
【０４２５】
これらの宿主細胞と共に使用するための、好ましい、ただし非限定的なプロモーターとしては、WO 08/020079の139頁および140頁で言及されているものが挙げられる。
【０４２６】
これらの宿主細胞と共に使用するための、好ましい、ただし非限定的な分泌配列としては、WO 08/020079の140頁で言及されているものが挙げられる。
【０４２７】
本発明の宿主または宿主細胞を形質転換するための適切な技法は、当業者には明らかであるだろうし、それは、意図した宿主細胞/宿主生物および使用する遺伝子コンストラクトに依存しうる。ここでも、上述の参考書および特許出願を参照されたい。
【０４２８】
形質転換後は、本発明のヌクレオチド配列/遺伝子コンストラクトでうまく形質転換されている宿主細胞または宿主生物を検出し選択するためのステップを行うことができる。これは、例えば本発明の遺伝子コンストラクト中に存在する選択可能マーカーに基づく選択ステップであるか、例えば特異的抗体を使った本発明のポリペプチドの検出を伴うステップでありうる。
【０４２９】
形質転換された宿主細胞（安定細胞株の形態をとりうる）または宿主生物（安定ミュータント系統または安定ミュータント株の形態をとりうる）は、本発明のさらなる態様を形成する。
【０４３０】
好ましくは、これらの宿主細胞または宿主生物は、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドを（宿主生物の場合は、その少なくとも1つの細胞、パーツ、組織または器官において）発現するもの、または（少なくとも）（例えば適切な条件下で）発現する能力を有するものである。本発明は、例えば細胞分裂によってまたは有性生殖もしくは無性生殖によって得ることができる、本発明の宿主細胞または宿主生物のさらなる世代、後代および/または子孫も包含する。
【０４３１】
本発明のアミノ酸配列を生産する/その発現を得るには、一般に、形質転換された宿主細胞または形質転換された宿主生物を、（所望する）本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドが発現/生産されるような条件下で、保持、維持および/または培養することができる。適切な条件は当業者には明らかであるだろうし、通常は、使用する宿主細胞/宿主生物、ならびに本発明の（関連）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節要素に依存するであろう。ここでも、本発明の遺伝子コンストラクトに関するパラグラフで上に述べた参考書および特許出願を参照されたい。
【０４３２】
一般に、適切な条件には、適切な培地の使用、適切な食物源および/または適切な栄養の存在、適切な温度の使用、そして場合によっては適切な誘導因子または化合物の存在（例えば本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）が含まれ、これらは全て、当業者によって選択されうる。また、そのような条件下で、本発明のポリペプチドは、構成的に、一過性に、または適切に誘導した場合にのみ、発現しうる。
【０４３３】
使用する宿主細胞/宿主生物によっては、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドが（まず最初に）未成熟型（上述したもの）で生成し、次にそれが翻訳後修飾に付される場合があることも、当業者には明白であるだろう。また、本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドは、ここでもやはり使用する宿主細胞/宿主生物に依存して、グリコシル化されうる。
【０４３４】
本発明の二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドは、次に、宿主細胞/宿主生物から、および/または該宿主細胞または宿主生物を培養した培地から、自体公知のタンパク質単離および/または精製技法、例えば（分取用）クロマトグラフィーおよび/または電気泳動技法、分別沈殿技法、アフィニティ技法（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディまたはポリペプチドと融合された特異的切断可能アミノ酸配列を使用するもの）および/または分取用免疫技法（すなわち単離しようとするアミノ酸配列に対する抗体を使用するもの）などを使って、単離することができる。
【０４３５】
一般に、医薬的使用には、本発明のポリペプチドを、少なくとも1つの本発明のポリペプチドと、少なくとも1つの医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤および/または佐剤と、場合によっては1つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび/または化合物とを含む医薬調製物または医薬組成物として製剤化することができる。非限定的な例として、そのような製剤は、経口投与、非経口投与（例えば静脈内、筋肉内もしくは皮下注射または静脈内注入によるもの）、局所投与（topical administration）、吸入による投与（例えばネブライザー、定量吸入器（MDI）または乾燥粉末吸入器（DPI）または鼻腔経路によるもの）、皮膚貼付剤による投与、インプラントによる投与、坐剤による投与、舌下経路による投与などに適した形態をとりうる。そのような適切な投与形態（これは、投与の方法に依存して固形、半固形、または液状であることができる）ならびにその製造に使用するための方法および担体は、当業者には明らかであるだろうし、本明細書においてもさらに説明する。
【０４３６】
したがって、さらなる一態様において、本発明は、少なくとも1つの本発明の二パラトープ性ポリペプチド、好ましくは少なくとも1つの二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン、より好ましくは少なくとも1つの本発明の二パラトープ性ナノボディと、少なくとも1つの適切な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち医薬的使用に適したもの）と、場合によっては1つ以上のさらなる活性物質とを含有する医薬組成物に関する。
【０４３７】
一般に、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、自体公知の任意の適切な方法で製剤化し、投与することができる。これについては、例えば上に挙げた一般的背景技術（特にWO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867およびWO 08/020079）ならびに標準的参考書、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」第18版、Mack Publishing Company、米国（1990）、「Remington, the Science and Practice of Pharmacy」第21版、Lippincott Williams and Wilkins（2005）；または「Handbook of Therapeutic Antibodies」(S. Dubel編）, Wiley, ワインハイム, 2007（例えば252〜255頁参照）を参照されたい。
【０４３８】
例えば、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、通常の抗体および抗体フラグメント（ScFvおよびダイアボディを含む）ならびに他の医薬活性タンパク質のための自体公知の任意の方法で、製剤化し、投与することができる。そのような製剤およびそれを製造するための方法は当業者には明らかであるだろうし、これには例えば、非経口投与（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管腔内、動脈内または髄腔内投与）または局所投与（すなわち経皮または皮内投与）に適した調製物などが含まれる。
【０４３９】
非経口投与用の調製物は、例えば、注入または注射に適する滅菌された溶液、懸濁液、分散液または乳液であることができる。そのような調製物のための適切な担体または希釈剤には、例えば限定するわけではないが、WO 08/020079の143頁に挙げられているものなどが含まれる。通常は、水性の溶液または懸濁液が好ましいであろう。
【０４４０】
二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインおよびナノボディを含む本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、遺伝子治療の送達方法を使って投与することができる。例えば引用によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第5,399,346号を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使うことで、本発明の二パラトープ性ポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトされた初代細胞を、特定の器官、組織、移植片、腫瘍、または細胞を標的とするために、組織特異的プロモーターでさらにトランスフェクトすることができ、細胞内での限局的発現のためのシグナルおよび安定化配列で、さらにトランスフェクトすることができる。
【０４４１】
したがって本発明の二パラトープ性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびナノボディは、例えば経口的に、医薬上許容される媒体、例えば不活性希釈剤または同化可能な可食担体と組み合わせて、全身投与することができる。それらは、ハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか、患者の規定食の食品に直接的に組み込むことができる。治療的経口投与には、本発明の二パラトープ性ポリペプチドを1つ以上の賦形剤と組合せ、摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハース（wafers）などの形態で使用することができる。そのような組成物および調製物は、少なくとも0.1％の本発明の二パラトープ性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはナノボディを含有すべきである。組成物および調製物におけるそれらのパーセンテージはもちろんさまざまであることができ、好都合には、所与の単位剤形の重量の約2〜約60％でありうる。そのような治療的に有用な組成物中の本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、有効な投薬量レベルが得られるものである。
【０４４２】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤および甘味剤または矯味矯臭剤、例えばWO 08/020079の143〜144頁に挙げられているものなども含有しうる。単位剤形がカプセル剤である場合、それは、上述のタイプの材料に加えて、液状担体、例えば植物油またはポリエチレングリコールも含有しうる。さまざまな他の材料が、コーティングとして、または固形単位剤形の物理的形態を他の形で修飾するために、存在しうる。例えば錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラックまたは糖などでコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、本発明の二パラトープ性ナノボディおよびポリペプチド、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素および矯味矯臭剤、例えばチェリーまたはオレンジフレーバーを含有することができる。もちろん、どの単位剤形の製造に使用されるどの材料も、医薬上許容され、使用する量において実質的に無毒性であるべきである。また、本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドを徐放性調製物および徐放性デバイスに組み入れることもできる。
【０４４３】
経口投与用の調製物および製剤には、本発明のコンストラクトが胃の環境に耐えて、腸へと通過することが可能になるように、腸溶コーティングを施すこともできる。より一般的には、経口投与用の調製物および製剤は、消化管の任意の所望する部分に送達するために適切に製剤化することができる。また、消化管への送達のために、適切な坐剤を使用してもよい。
【０４４４】
本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、WO 08/020079の144頁および145頁でさらに詳しく述べられているように、注入または注射によって静脈内または腹腔内に投与することもできる。
【０４４５】
局所投与の場合は、本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドを、純粋な形態で適用することができる（すなわち、それらが液体である場合）。しかし一般的には、WO 08/020079の145頁でさらに詳しく述べられているように、それらを、固形物または液状物であることができる皮膚科学的に許容される担体と組み合わされた組成物または製剤として、皮膚に投与することが望ましいであろう。
【０４４６】
一般に、ローション剤などの液状組成物における本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドの濃度は、約0.1〜25wt％、好ましくは約0.5〜10wt％であるだろう。ゲル剤または粉末剤などの半固形または固形組成物における濃度は、約0.1〜5wt％、好ましくは約0.5〜2.5wt％であるだろう。
【０４４７】
処置に使用するのに必要な本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドの量は、選択したその特定二パラトープ性ナノボディまたはポリペプチドによって変動するだけでなく、投与経路、処置される状態の性質、患者の年齢および状態によっても変動し、最終的には、担当医師または臨床医の判断によるであろう。また、本発明の二パラトープ性ナノボディおよびポリペプチドの投薬量は、標的とする細胞、腫瘍、組織、移植片または器官によっても変動する。
【０４４８】
望ましい用量は、単回用量中に存在するか、または適当な間隔で投与される分割用量として、例えば1日あたり2、3、4分割またはそれ以上の部分用量として存在すると、好都合でありうる。部分用量そのものを、例えば吸入器からの複数回の吸入、または眼への複数滴の適用など、少し間隔をあけたいくつかの離散した投与などへと、さらに分割してもよい。
【０４４９】
投与レジメンには長期連日処置を含めることができる。「長期」とは、少なくとも2週間、好ましくは数週間、数ヶ月、または数年の継続期間を意味する。当業者は、本明細書における教示があれば、この投薬量範囲における必要な変更を、日常的な実験だけを使って決定することができる。「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Martin, E.W.、第4版, Mack Publishing Co., ペンシルバニア州イーストン）を参照されたい。合併症が見られる場合、個々の医師は投薬量を調節することもできる。
【０４５０】
本発明は、そのもう一つの態様において、有効量の本発明のポリペプチドまたは医薬組成物、好ましくは本発明の二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはナノボディまたはそれを含有する組成物を投与することによって、CXCR2シグナル伝達の異常機能と関連する疾患または状態を処置する方法に関する。本明細書において論じるとおり、CXCR2シグナル伝達は、肺実質の破壊を引き起こす慢性閉塞性肺疾患（COPD）を患っている患者において、肺における炎症性応答を媒介する。COPDを患っている患者の肺において数の上昇が認められる白血球の遊走は、その細胞の表面にあって、IL-8、Gro-α、β、γ、EMA 78およびGCP-2を含むいくつかのリガンドに結合するCXCR2によって媒介される。肺における増加した好中球数は、疾患の重症度と相関する。さらに、Gro-α濃度は、COPD患者の誘発喀痰および気管支洗浄（BAL）液では、著しく上昇している。したがってCXCR2アンタゴニズムは、この疾患の痛ましい症状を防止し、処置し、または緩和すると予想される。
【０４５１】
したがって本発明は、二パラトープ性ポリペプチド、例えば本発明の二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインまたはナノボディ、特にその医薬組成物を投与することを含む、COPDまたはCOPDの増悪を防止または処置する方法に関する。本発明は、COPDおよびCOPDの増悪を処置するための該二パラトープ性ポリペプチド（二パラトープ性ナノボディおよびそれらを含有する組成物を含む）の使用にも関係する。
【０４５２】
本発明の二パラトープ性ポリペプチド、特に二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインまたはナノボディおよびその組成物が、CXCR2シグナル伝達の異常機能が関与する他の疾患、例えば嚢胞性線維症、重症喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成などといった、気道の他の状態の処置にも有用であることは、当業者には明白であるだろう。
【０４５３】
本発明の二パラトープ性ポリペプチド、例えば二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインまたはナノボディおよびその医薬組成物で防止または処置することができるさらなる疾患および状態は、アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管新生、および新しい血管の発達を特徴とする疾患（黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む）、多発性硬化症、乾癬、加齢性黄斑変性疾患、眼ベーチェット病、ぶどう膜炎、肺動脈高血圧（PAH）（特発性PAH、家族性PAHおよび随伴性PAHを含む）、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、非小細胞癌、大腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞癌または虚血再灌流傷害である。
【０４５４】
本発明の二パラトープ性ポリペプチド、例えば二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインまたはナノボディおよびその医薬組成物で防止または処置することができるさらなる疾患および状態は、鎌形血球症における溶血性輸血誘発性血流閉塞発作、虚血/再灌流傷害、急性脳卒中/心筋梗塞、閉鎖性頭部外傷、外傷後炎症およびインスリン抵抗性糖尿病である。
【０４５５】
上記の方法では、本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび/またはポリペプチドおよび/またはそれを含む組成物を、使用する具体的医薬製剤または組成物に応じて、任意の適切な方法で投与することができる。したがって本発明の二パラトープ性ナノボディおよび/またはポリペプチドおよび/またはそれを含む組成物は、ここでも、使用される具体的医薬製剤または組成物に応じて、経口投与、腹腔内投与（例えば静脈内、皮下、筋肉内、または消化管を回避する他の任意の投与経路によるもの）、鼻腔内投与、経皮投与、局所投与するか、坐剤によって投与するか、吸入によって投与することができる。一般にCOPDの場合、吸入は好ましい経路ではない。臨床家は、適切な投与経路およびそのような投与に使用すべき適切な医薬製剤または組成物を、個々の患者の必要に応じて選択することができるだろう。
【０４５６】
本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび/またはポリペプチドおよび/またはそれを含む組成物は、防止または処置されるべき疾患または障害を防止および/または処置するのに適した処置レジメンに従って投与される。臨床家は、一般に、防止または処置されるべき疾患または障害、処置されるべき疾患の重症度および/またはその症状の重症度、使用しようとする具体的な本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド、使用しようとする具体的投与経路および医薬製剤または医薬組成物、患者の年齢、性別、体重、食餌、全身の状態などといった因子、ならびにこれに類する臨床家には周知の因子に応じて、適切な処置レジメンを決定することができるであろう。
【０４５７】
一般に、本明細書において言及する疾患および障害、特にCOPDの防止および/または処置に関して、投与すべき量は、使用しようとする具体的な本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの力価（potency）、使用しようとする具体的投与経路および医薬製剤または医薬組成物に依存するであろう。一般的には、1日あたり体重1kgあたり1グラム〜0.01マイクログラム、好ましくは1日あたり体重1kgあたり0.1グラム〜0.1マイクログラム、例えば1日あたり体重1kgあたり約1、10、100または1000マイクログラムの量で、連続的に（例えば注入によって）、1日1回投与として、または1日に複数回の分割投与として、投与されるであろう。臨床家は、本明細書において言及する因子に応じて、適切な1日量を決定することができるであろう。特別な例では、臨床家が、例えば上で言及した因子および自身の専門家としての判断に基づいて、これらの量からの逸脱を選択しうることも明らかであるだろう。
【０４５８】
本発明の二パラトープ性ナノボディ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、1つ以上のさらなる医薬活性化合物または医薬活性成分と組み合わせて、すなわち併用処置レジメンとして、使用することができ、それらは相乗効果をもたらしてもよいし、もたらさなくてもよい。ここでも、臨床家は、そのようなさらなる化合物または成分ならびに適切な併用処置レジメンを、上で言及した因子および自身の専門家としての判断に基づいて、選択することができるであろう。
【０４５９】
例えば、本発明の二パラトープ性ポリペプチド、例えば二パラトープ性ナノボディを、従来のCOPD処置、例えば短時間作用型または長時間作用型のβアドレナリン作動性気管支拡張薬、吸入抗コリン作用薬（ムスカリン性アンタゴニスト）および吸入コルチコステロイドと組み合わせることが可能であるだろう。
【０４６０】
本発明に従って使用される処置レジメンの有効性は、臨床家には明らかであるだろうとおり、関与する疾患または障害に関する自体公知の任意の方法で、決定しおよび/または追跡することができる。所望の治療効果が達成され、望ましくない副作用を回避、制限または軽減し、かつ/または所望の治療効果を達成することと望ましくない副作用を回避、制限または軽減することとの間に適当なバランスが達成されるように、臨床家は、適宜かつ個別に、特定の処置レジメンを変更し修正を加えることもできるであろう。
【０４６１】
一般に、所望の治療効果が達成されるまでは、かつ/または所望の治療効果が維持されるべき間は、処置レジメンが施行されるであろう。ここでも、臨床家はこれを決定することができる。
【０４６２】
処置される対象は、任意の温血動物であることができるが、特に哺乳動物、より具体的にはヒトである。当業者には明らかであるだろうとおり、処置される対象は、特に、本明細書において言及する疾患および障害を患っている人、またはそのリスクがある人であるだろう。
【０４６３】
以下に、下記の限定でない好ましい態様、実施例および図面を用いて、本発明をさらに詳しく説明する。
【０４６４】
本明細書において言及する刊行物は全て引用により本明細書に組み込まれる。
【０４６５】
寄託情報
表32に示す配列最適化ナノボディのポリペプチドをコードするインサートを含む6つのプラスミドDNAが、2010年6月15日、Novartis Pharma AG（スイス）により、DSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zallkulturem GmbH（ドイツ国D-38124ブラウンシュワイク、インホーフェンシュトラッセ7B）に寄託された。これらの寄託は、1997年4月28日の特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って行われ、下記の受託番号を有する。
【表１−１】
0005933573.tif 000002
【０４６６】
1．ヒトおよびシノ（cyno）CXCR2クローニング
［表1］
【表１−２】
0005933573.tif 000003
【０４６７】
pcDNA3.1(+)（Invitrogen、V790-20）は、さまざまな哺乳動物細胞株における高レベルな構成的発現用に設計されている。これは、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナル、哺乳動物細胞用のネオマイシン選択マーカー、および大腸菌における選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含有している。
pVAX1（Invitrogen、V260-20）は、DNAワクチン用に設計されたプラスミドベクターである。これは、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナルおよび大腸菌における選択のためのカナマイシン耐性遺伝子を含有している。
【０４６８】
［表2］（コンストラクト）
【表２】
0005933573.tif 000004
【０４６９】
2．ヒトCXCR2およびカニクイザルCXCR2を発現するCHO、CaKi、RBLおよびHEK293T細胞株の樹立
［表3］（細胞株）
【表３】
0005933573.tif 000005
【０４７０】
CHO-K1Δ1-17ヒトCXCR2（N末端3xHAタグ）
Amaxaエレクトロポレーションシステム（溶液T（solution T）中、プログラムU23）を使って、CHO-K1細胞にプラスミドpcDNA3.1_3xHA-Δ1-17-hCXCR2をトランスフェクトした。トランスフェクト細胞のプールを、トランスフェクション後2日目から、選択圧（1000αg/mL G418）下に保った。8日後に、FMAT Blue標識ヒトGRO-αを使ってヒトCXCR2陽性集団を同定した。ヒトGro-α（Biosource、PHC1063）のFMAT Blue標識は、FMAT Blue Monofunctional Reactive Dye Kitを製造者の説明に従って使用することによって行った（Applied Biosystems、4328408）。FACSaria（BD Biosciences）を使って単一細胞を96ウェル細胞培養プレート中に選別した。成長するクローンを、FACSarray（BD Biosciences）デバイスで、FMAT Blue標識ヒトGRO-αを使って、Δ1-17ヒトCXCR2発現について試験した。発現量が最も大きいCHO-K1クローンを選択した（MCF値9000）。
【０４７１】
HEK293TカニクイザルCXCR2
FuGene HD Transfection Reagent（Roche）を使って、HEK293T細胞にプラスミドpcDNA3.1_cCXCR2をトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、FACSarray（BD Biosciences）デバイスで、50nM FMAT Blue標識GRO-αを使って、細胞をcCXCR2発現について試験した。以後は、発現量の多い細胞（12000前後のMCF値）を使用した。
【０４７２】
RBL-2H3カニクイザルCXCR2
1×非必須アミノ酸、0.15％重炭酸ナトリウム、1mMピルビン酸ナトリウムおよび15％ウシ胎児血清（Invitrogen）を補足したMEMイーグル培地（Invitrogen）中、37℃/5％CO2で成長させ、通常どおりに継代したウサギ好塩基球性白血病細胞（RBL-2H3）を、エレクトロポレーション（Amaxa Biosystems）によるヌクレオフェクションに、製造者のプロトコールに従って付した。トランスフェクト細胞を37℃/5％CO2でインキュベートし、トランスフェクションの24時間後に、ジェネティシンを最終濃度が1mg/mLになるように加えることによって、抗生物質選択を開始した。トランスフェクト細胞を選択培地中で3〜5日間、成長させ、継代してから、96ウェルプレートへの段階希釈による単一細胞選別に付した。約2週間後に、活発に成長するコロニーを拡大培養してから、シノCXCR2転写産物発現について分析した。次に、分析のために、陽性クローンをさらに拡大培養した。
【０４７３】
CHO-Trex(HA)3-huCXCR2および(HA)3huCCR9-CXCR2ハイブリッド
チャイニーズハムスター卵巣T-Rex（T-Rex（商標）-CHO、Invitrogen、#R718-07）を、10％テトラサイクリン非含有ウシ胎児血清（FBS）（Biosera）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10μg/mLのブラストサイジンを補足した2mM L-グルタミンを含有するハムF12培地中の単層培養物として、37℃で維持した。このテトラサイクリン調節発現（Tetracycline-Regulated Expression）（T-Rex（商標））細胞株はテトラサイクリンリプレッサー（TetR）を安定に発現する。次に、ヌクレオフェクション法（Cell line Nucleofector Kit T、Amaxa Biosystem、プログラムU-23）を使って、両CXCR2コンストラクトを発現する安定細胞株を作出した。トランスフェクト細胞を37℃/5％CO2でインキュベートし、トランスフェクションの48時間後に、300μg/mLのゼオシン（Zeocin）で処理した。細胞をゼオシンの存在下で2週間培養することで、陽性形質転換体の選択を可能にした後、Mo-Flo FACSソーターを使って、単一細胞選別を行った。2週間後に、活発に成長するコロニーを、ゼオシン濃度が300μg/mLである通常培地に維持しながら、拡大培養した。
【０４７４】
3．ヒトGro-a、カニクイザルGro-a、ヒトIL-8、ヒトENA-78
［表4］（NVTS-IL-8、ENA-78、カニクイザルGro-a）
【表４】
0005933573.tif 000006
【０４７５】
ペプチド
ヒトおよびカニクイザルCXCR2のさまざまなN末端および細胞外ループ（EL）ストレッチを表すペプチドを、Bachemに注文した（表5）。「環状」と表示し多ペプチドでは、最初のアミノ酸と最後のアミノ酸がシステイン残基で置き換えられていて、野生型配列の天然に存在する内部システインが、ロイシン残基で置き換えられている。これらのペプチドは、両端のシステイン残基を介して環化した。
表5
【表５】
0005933573.tif 000007
【０４７６】
5．免疫処置
3頭のラマを、ヒトCXCR2を発現する哺乳動物細胞で、7〜9回免疫処置し、1頭のラマを、カニクイザルCXCR2を発現する哺乳動物細胞で、6回免疫処置した。このレジメンの後、（不）完全フロイントアジュバントに混合したペプチド-キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）コンジュゲートカクテル（ペプチドがヒトCXCR2とカニクイザルCXCR2の両方の細胞外ループ番号2および3に相当するもの）を、4回投与した（表5参照）。8頭の別のラマを、pVAX1から発現されるヒト完全長CXCR2またはΔ1-17CXCR2をコードするDNAで、4〜5回免疫処置した後、ヒト完全長CXCR2を発現する哺乳動物細胞を1回投与した。さらに3頭のラマを、pVAX1から発現されるカニクイザルCXCR2をコードするDNAで、4回免疫処置した後、カニクイザルCXCR2を発現する哺乳動物細胞を1回投与した。免疫血液サンプルおよびリンパ節サンプルを、各抗原の投与の4日後および8日後に採取した。
【０４７７】
6．ライブラリー構築
cDNAサンプルを、免疫血液サンプルおよびリンパ節サンプルの全RNA調製物から作製した。ナノボディをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはカニクイザルCXCR2で免疫処置した全てのラマのcDNAサンプルから、プライマーABL051、ABL052およびABL003を使った1段階RT-PCRで増幅した。プライマー配列を表6に示す。サンプル中のIgG2およびIgG3 cDNAから増幅された700bpアンプリコンをゲルから単離し、次に、それらを、SfiI制限酵素部位を含有するABL050プライマーとABL003プライマーとをを用いるネステッドPCR反応におけるテンプレートとして使用した。次に、PCR産物をSfiIおよびBstEII（VHH遺伝子のFR4中に天然に存在するもの）で消化し、ファージミドベクターpAX50の対応する制限部位にライゲートすることで、大腸菌TG-1へのエレクトロポレーション後に、ライブラリーを得た。pAX50は、LacZプロモーター、大腸菌ファージpIIIタンパク質コード配列、アンピシリンまたはカルベニシリン用の耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびgen3リーダー配列を含有するpUC119由来の発現ベクターである。このベクターは、ナノボディ（Nanobody（登録商標））コード配列と同じ読み枠で、C末端c-mycタグおよび(His)6タグをコードしていた。このファージミドベクターは、個々のナノボディをgeneIII産物との融合タンパク質として発現するファージ粒子の生産を可能にする。
【０４７８】
［表6］（プライマー配列）
【表６】
0005933573.tif 000008
【０４７９】
7．選択
バクテリオファージの表面に発現する上記pAX50ナノボディライブラリーを、CXCR2エピトープを提示するペプチド、膜抽出物および全細胞を使って選択した。
【０４８０】
ペプチドを使った選択では、ニュートラアビジン被覆（Pierce、31000）Maxisorpマイクロタイタープレート（Nunc、430341）上に捕捉された0〜1000nMのビオチン化ペプチド（表5参照）上で、ファージライブラリーをインキュベートした。あるいは、ファージライブラリーを10nMビオチン化ペプチドと共に溶解状態でインキュベートした後、ストレプトアビジン被覆Dynabeads（Invitrogen、112-06D）上に、ペプチド-ファージ複合体を補足した。ブロッキングは、1％カゼインを補足したPBSを使って行った。ライブラリーから調製されたファージを加え、（0.1％カゼインおよび0.1％ツイーン20を補足したPBS中で）1時間インキュベートした。結合していないファージを（0.05％ツイーン20を補足したPBSで）洗い流し、トリプシン（PBS中、1mg/ml）を15分間添加することによって、結合しているファージを溶出させた。2ラウンド目の選択は、基本的に上述のように行った。
【０４８１】
膜抽出物を使った選択は、イムノチューブ（immunotube）（Nunc、444474）を、ヒトCXCR2を発現する細胞から調製された50μg/mL（総タンパク質）膜抽出物（Perkin Elmer、ES-145-M400UAおよび6110524400UA）でコーティングすることによって行った。陰性対照として、ヒトFPR1を発現するCHO細胞から調製された膜抽出物（Perkin Elmer、6110527400UA）を並行してコーティングした。ブロッキングは、4％Marvel脱脂粉乳を補足したPBSを使って行った。ファージを（1％Marvelを補足したPBS中で）2時間インキュベートした。結合していないファージをPBSで洗い流し、トリプシン（PBS中、1mg/ml）を15分間添加することによって、結合しているファージを溶出させた。2ラウンド目の選択は、基本的に上述のように行った。場合によっては、対照膜抽出物でコーティングした一連のチューブまたはウェル上でファージを前もって吸収させることにより、無関係な細胞バックグラウンドエピトープに結合するファージを特異的に枯渇させた。次に、コーティングしたヒトCXCR2膜抽出物でのインキュベーションを、溶解状態にある対照膜抽出物の存在下で行った。他の実験では、ペプチドでの1ラウンドまたは2ラウンドの選択を行った後、膜抽出物での選択を1ラウンド行うか、またはその逆を行った。
【０４８２】
もう一組の実験では、ヒトまたはカニクイザルCXCR2を発現する100万〜500万個の哺乳動物細胞を、10％FBSおよび1％Marvel脱脂粉乳を補足したPBS中、ファージライブラリーと共にインキュベートした。形質転換していない細胞株を陰性対照として使用した。結合していないファージをPBSで洗い流し、トリプシン（PBS中、1mg/ml）を15分間添加することによって、結合しているファージを溶出させた。2ラウンド目の選択は、基本的に上述のように、ただし1ラウンド目とは異なる細胞株バックグラウンドで行った。
【０４８３】
他の実験では、溶解状態にある1μMのペプチド（表5参照）の存在下で、ファージを、CXCR2を発現する膜抽出物または哺乳動物細胞と共にインキュベートすることで、これらのペプチドによって表される領域に結合するナノボディを発現するファージを枯渇させた。
【０４８４】
8．ペリプラズム抽出物の調製
溶出したファージを指数的に成長しているTG-1細胞に感染させてから、それをカルベニシリン含有LB寒天プレートにプレーティングした。カルベニシリン耐性クローンを、インサートの存在について分析し、陽性クローンの配列を検証した。目的のクローンを、カルベニシリンを補足したTB培地中で成長させ、IPTGの添加によって発現を誘導した。発現を37℃で4時間継続させた後、細胞を遠沈した。大腸菌発現培養物からの終夜凍結細胞ペレットを、PBS（元の培養体積の10分の1）に溶解し、穏やかな振とう条件下、4℃で1時間インキュベートした。次に細胞をもう一度遠沈し、ペリプラズム間隙に分泌されたタンパク質を含有する上清を保存した。
【０４８５】
9．スクリーニング
ペリプラズム抽出物（上で説明したもの）を、ヒトCXCR2への結合におけるGro-αとの競合について、FACSで分析した。2×105個の細胞を、FACS緩衝液（PBS＋10％ウシ胎児血清（Sigma、F7524））中のペリプラズム抽出物の1/2希釈液と共に、4℃で30分間インキュベートした。次に、等体積のFMAT Blue標識ヒトGro-α（FACS緩衝液中、6nM）を加え、インキュベーションを暗所、4℃で、さらに30分間続けた。次に細胞をFACS緩衝液中で3回洗浄し、最後にFACS緩衝液に再懸濁した。死細胞をヨウ化プロピジウム（Sigma、P4170）で染色した。次にサンプルをFACSarray（BD Biosciences）で分析した。表7に、ペリプラズム抽出物がヒトCXCR2でのGro-αとの競合を示したナノボディを列挙する。
【０４８６】
［表7］（ヒトCXCR2でのGro-α競合（ペリプラズム抽出物））
【表７】
0005933573.tif 000009
【０４８７】
もう一つの設定では、ペリプラズム抽出物を、ヒト1〜19ペプチドへの結合について、ELISAで分析した。MaxiSorbプレート（Nunc、430341）をニュートラアビジンで2時間コーティングした後、1時間のブロッキング（PBS、1％カゼイン）を行った。次に、100nMビオチン化ヒト1〜19ペプチドを、これらのプレートに、1時間加えた後（PBS、0.1％カゼイン、0.05％ツイーン20）、ペリプラズム抽出物の10倍希釈液と共に1時間インキュベートした。結合していないペリプラズム抽出物を洗い流し（0.05％ツイーン20を補足したPBS）、結合しているナノボディを、マウス抗myc（Roche、11667149001）と、それに続くウサギ抗マウスHRPコンジュゲート（Dakocytomation、P0260）とを使って検出した。表8に、無関係な対照ナノボディに対する抗CXCR2ナノボディの結合シグナルの比を要約する。
【０４８８】
［表8］（ペリプラズム抽出物のヒトCXCR2 1〜19ペプチドへの結合）
【表８】
0005933573.tif 000010
【０４８９】
10．配列
［表9］（一価抗CXCR2ナノボディの配列）
【表９−１】
0005933573.tif 000011
【表９−２】
0005933573.tif 000012
【０４９０】
リードキャラクタリゼーション一価ナノボディ
11．一価ナノボディの構築
Fwd-EVQL-MfeIプライマーおよびRev-TVSS-BstEIIプライマー（表1）を使った機能的ファージミドクローンでのPCRによって得られるナノボディ含有DNAフラグメントを、MfeIおよびBstEIIで消化し、pAX100ベクターにライゲートし、大腸菌TG-1コンピテント細胞に形質転換した。pAX100は、LacZプロモーター、カナマイシン用の耐性遺伝子、マルチクローニング部位およびOmpAリーダー配列を含有するpUC119由来の発現ベクターである。このベクターは、ナノボディコード配列と同じ読み枠で、C末端c-mycタグおよびHis6タグをコードしていた。カナマイシン耐性クローンをインサートの存在について分析し、陽性クローンの配列を検証した。
【０４９１】
12．小スケール発現
目的のナノボディをコードする発現ベクターを含有するTG-1細胞を、TB培地＋100μg/mlカナマイシンが入っているバッフル付き振とうフラスコ中で成長させ、1mM IPTGの添加によって発現を誘導した。発現を37℃で4時間継続させた。細胞を収集した後、ペリプラズム抽出物を調製し、His6タグ付きナノボディを、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（HisTrap FF Crude、GE Healthcare）によって精製した後、PBS中で脱塩（HiPrep 26/10、GE Healthcare）またはゲル濾過クロマトグラフィー（Superdex 75 HR16/10、GE Healthcare）を行った。
【０４９２】
13．リガンド競合アッセイ
精製一価抗CXCR2ナノボディを、ヒトおよびカニクイザルCXCR2でのFACSリガンド競合アッセイにおいて、3nM FMAT-Blue標識Gro-αに対してタイトレーションした（表10）。ヒトCXCR2では、ブロッキング能がnM表示で二桁台〜nM未満の範囲にあるが、カニクイザルCXCR2では、nM表示で一桁台〜二桁台の範囲にある。
【０４９３】
［表10］（一価抗CXCR2ナノボディのリガンド競合能）
【表１０】
0005933573.tif 000013
NA：測定可能な活性はなかった。
【０４９４】
14．組換え細胞株を使った機能アッセイ
（1）細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出の測定（FLIPR）
ヒトまたはカニクイザルCXCR2受容体のどちらか一方を発現するRBL細胞を96ウェルプレートに播種し、37℃で終夜インキュベートした。実験当日、細胞にFluo-4色素を、37℃で30分間、負荷した後、精製一価抗CXCR2ナノボディと共に30分間インキュベートした。最後に、蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR）を使って、GRO-αの添加を行ってから、細胞内カルシウムの放出に対応する蛍光シグナルを検出した。選択性アッセイはヒトCXCR1を発現するL2071細胞を使って行った。アッセイプロトコールは、CXCR2について説明したものと同じとしたが、アゴニストとしてIL-8を使用した。平均IC50値の要約を表11に示す。また、試験したナノボディはいずれも、試験した濃度（最大濃度1μM）では、CXCR1受容体における細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出の阻害を示さなかった。
【０４９５】
（2）アゴニスト刺激による[35S]GTPγS蓄積の測定
精製一価抗CXCR2ナノボディを、GRO-α、GDP、SPAビーズおよびヒトCXCR2受容体を発現するCHO細胞から調製したCHO-CXC2膜と共に、96ウェルプレート中で60分間インキュベートした。次に、[35S]GTPγSを添加し、さらに60分間インキュベートした。最後にプレートを遠心分離してから、Topcountで読み取った。平均IC50値の要約を表11に示す。
【０４９６】
［表11］（組換え細胞株を使った機能アッセイにおける精製一価抗CXCR2ナノボディ（Nanobodies（登録商標））のIC50値）
【表１１】
0005933573.tif 000014
*試験した濃度ではプラトーが得られなかったので曲線を100％阻害に固定。NA−測定可能な活性はなかった。ND−未検
【０４９７】
15．初代好中球を使った機能アッセイ
（1）ヒト好中球全血形状変化アッセイ（hWBSC）
ドナーは全身性投薬を受けていない健康な正常ボランティアであった（Novartis Horshamドナーパネル）。52mM EDTA（滅菌）で抗凝固処理された全血を、EDTA 1mLに対して血液9mLの比で収集した。血液は室温で収集し、使用前に37℃に予温した。ケモカインで刺激する前に、80μLの全血を、CXCR2ナノボディと共に、室温で10分間、プレインキュベートし（1つの用量応答試験あたり10点（0.03〜1.144×10-7μM））、10μLのrhGROα（2nM、ほぼEC70濃度）を、ゼロ化合物（これには10μLの形状変化アッセイ緩衝液を加えた）を除く全てのウェルに加えた。サンプルを穏やかに振とうし、37℃でさらに5分間インキュベートした。次に、チューブを氷上に置き、250μLの氷冷最適化CellFix（商標）溶液を加え、チューブを穏やかに振とうし、さらに5分間インキュベートしてから、1.4mLの1×塩化アンモニウム溶解溶液を全てのチューブに加え、氷上にさらに20分間放置した。赤血球溶解後に、サンプルをFACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson）で分析した。前方散乱/側方散乱（FSC/SSC）ゲーティングと、それに続く、最初のプロットからのゲーティングされた顆粒球を用いるFSC/FL-2プロットとによって、細胞集団を同定した。好中球はFL-2プロットで好酸球と識別された。後者の方が高い自己蛍光を有するからである。1サンプルあたり5000イベントをカウントした。
【０４９８】
（2）ヒト好中球走化性アッセイ
ドナーは全身性投薬を受けていない健康な正常ボランティアであった（Novartis Horshamドナーパネル）。52mM EDTA（滅菌）で抗凝固処理された全血を、EDTA 1mLに対して血液9mLの比で収集した。標準的プロトコールを使って白血球を単離した。すなわち、4％デキストランを20mL抗凝固処理血に加え、穏やかに混合した後、赤血球を沈殿させるために、氷上で30分間インキュベートした。次に、末梢血単核球（PMN）を含有する上清を、Ficoll-Paque（登録商標）密度勾配に重層し、300×g、18℃で25分間遠心分離した。PMNリッチ画分を500μLの1×PBSに再懸濁し、低浸透圧ショックを使って赤血球溶解を行った。20mLの氷冷滅菌エンドトキシンフリー蒸留水をペレットに加え、30〜40秒間溶解させてから、20mLの2×PBSを加えた。サンプルを穏やかに混合し、300×g、18℃で、10分間遠心分離することで、顆粒球を得た。顆粒球ペレットを500μLの1×PBSに再懸濁し、50mLの×1 PBSで2回洗浄した。顆粒球ペレットをRPMI 1640（pH7.4）＋2.5％ FBSに再懸濁し、カウントし、最終濃度が2e6/mLになるように希釈した。3μm PETメンブレンを有するBecton Dickinson製のトランスウェルプレートを使って、遊走を測定した。簡単に述べると、6nMのGROα（EC80〜EC100）をプレートのボトムウェルに加えてから（1000μL/ウェル）、マルチウェルインサートを所定の位置に下げ、次に、さまざまな濃度のナノボディ（一価については0.13〜1000nM、または二パラトープ性については0.6pM〜30nM）と共に室温で30分間プレインキュベートしておいたPMNを、インサートに加えた（500μL/ウェル）。次に、プレートを37℃で90分間インキュベートし、FACSCaliburフローサイトメーターを使って、ボトムチャンバに遊走した細胞をカウントした。フローサイトメーターは、1サンプルあたり20秒の設定時間でFSC/FL-2プロット上のR2ゲート内のイベントの数をカウントするように設定した。
【０４９９】
（3）カニクイザル好中球全血形状変化アッセイ（CynoWBSC）
前腕または脚のどちらかから採取した静脈血を、クエン酸ナトリウム1mLに対して血液9mLの比率の3.8％クエン酸ナトリウム（滅菌）で、抗凝固処理した。血液は室温で収集し、使用前に37℃に予温した。ケモカインで刺激する前に、80μLの全血を、CXCR2ナノボディと共に、室温で10分間、プレインキュベートし（1つの用量応答試験あたり10点（0.03〜1.144×10-7μM））、10μLのrhGROα（30nM、ほぼEC70-90濃度）を、ゼロ化合物（これには10μLの形状変化アッセイ緩衝液を加えた）を除く全てのウェルに加えた。サンプルを穏やかに振とうし、37℃でさらに5分間インキュベートした。次に、チューブを氷上に置き、250μLの氷冷最適化CellFix（商標）溶液を加え、チューブを穏やかに振とうし、さらに5分間インキュベートしてから、2mLの溶解緩衝液（Sigma Aldrich、#R7757）を全てのチューブに加え、氷上にさらに40〜60分間放置した。赤血球溶解後に、サンプルをFACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson）で分析した。前方散乱/側方散乱（FSC/SSC）ゲーティングと、それに続く、最初のプロットからのゲーティングされた顆粒球を用いるFSC/FL-2プロットとによって、細胞集団を同定した。好中球はFL-2プロットで好酸球と識別された。後者の方が高い自己蛍光を有するからである。1サンプルあたり5000イベントをカウントした。
【０５００】
［表12］（初代好中球およびrhGROαを使った機能アッセイにおける精製一価抗CXCR2ナノボディのIC50値）
【表１２】
0005933573.tif 000015
【０５０１】
多価ナノボディ
16．二価ナノボディの構築
二価ナノボディの構築には2つのアプローチを使用した。
一価ビルディングブロックをコードするプラスミドDNA上でPCR増幅を行った。N末端ビルディングブロックは、Fwd-EVQL-MfeIと、GlySerリンカーの一部をコードするリバースプライマーとを使って増幅し、一方、C末端ビルディングブロックは、GlySerリンカーの残りの部分をコードするフォワードプライマーと、Rev-TVSS-BstEIIとを使って増幅した（表6）。N末端フラグメントをMfeIおよびBamHIで消化し、C末端フラグメントをBamHIおよびBstIIで消化し、次にこれらをpAX100ベクターに同時にライゲートし、大腸菌TG-1コンピテント細胞に形質転換した。
【０５０２】
あるいは、一価ビルディングブロックをコードするプラスミドDNA上で異なるPCR増幅を行った。N末端ビルディングブロックは、Fwd-EVQL-MfeIとRev-TVSS-BspEIとを使って増幅し、一方、C末端ビルディングブロックは、Fwd-EVQL-BamHIとRev-TVSS-BstEIIとを使って増幅した（表6）。N末端フラグメントをMfeIおよびBamHIで消化し、C末端フラグメントをBspEIおよびBstIIで消化した。GlySerリンカーのコード情報を含有するpAX100誘導体に、N末端フラグメントをライゲート（MfeI-BspEI）し、大腸菌TG-1コンピテント細胞に形質転換した。この形質転換混合物からプラスミドDNAを調製し、BspEIおよびBstEIIで消化した後、C末端フラグメントをpAX100ベクターにライゲートし、大腸菌TG-1コンピテント細胞に形質転換した。
【０５０３】
カナマイシン耐性クローンをインサートの存在について分析し、陽性クローンの配列を検証した。
【０５０４】
17．多価抗CXCR2ナノボディの配列
表13
【表１３−１】
0005933573.tif 000016
【表１３−２】
0005933573.tif 000017
【表１３−３】
0005933573.tif 000018
【０５０５】
18．リガンド競合アッセイ
多価抗CXCR2ナノボディを、ヒトおよびカニクイザルCXCR2でのFACSリガンド競合アッセイにおいて、3nM FMAT-Blue標識Gro-αに対してタイトレーションした（表14）。ヒトCXCR2では、ブロッキング能がnM表示で二桁台〜nM未満の範囲にあるが、カニクイザルCXCR2では、nM表示で一桁台〜二桁台の範囲にある。
【０５０６】
［表14］（多価抗CXCR2ナノボディのリガンド競合分析）
【表１４】
0005933573.tif 000019
ND：未検
【０５０７】
19．組換え細胞株を使った機能アッセイ
（1）細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出の測定（FLIPR）
ヒトまたはカニクイザルCXCR2受容体のどちらか一方を発現するRBL細胞を96ウェルプレートに播種し、37℃で終夜インキュベートした。実験当日、細胞にFluo-4色素を、37℃で30分間、負荷した後、精製多価抗CXCR2ナノボディと共に30分間インキュベートした。最後に、蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR）を使って、GRO-αの添加を行ってから、細胞内カルシウムの放出に対応する蛍光シグナルを検出した。選択性アッセイは、ヒトCXCR1を発現するL2071細胞（アゴニストとしてIL-8）およびヒトCXCR4を内在性に発現するCEM細胞（アゴニストとしてSDF-1）を使って行ったが、アッセイプロトコールは、CXCR2について説明したものと同じとした。平均IC50値の要約を表15に示す。また、試験したナノボディはいずれも、試験した濃度（最大濃度1μM）では、CXCR1においても、CXCR4においても、細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出の阻害を示さなかった。
【０５０８】
（2）アゴニスト刺激による[35S]GTPγS蓄積の測定
精製多価抗CXCR2ナノボディを、アゴニスト（GRO-α、IL-8またはENA-78）、GDP、SPAビーズおよびヒトCXCR2受容体を発現するCHO細胞から調製したCHO-CXC2膜と共に、96ウェルプレート中で60分間インキュベートした。次に、[35S]GTPγSを添加し、さらに60分間インキュベートした。最後にプレートを遠心分離してから、Topcountで読み取った。平均IC50値の要約を表15に示す。
【０５０９】
［表15］（組換え細胞株を使って細胞内カルシウムの放出を測定する機能アッセイにおける精製多価抗CXCR2ナノボディのIC50値）
【表１５】
0005933573.tif 000020
*試験した濃度ではプラトーが得られなかったので曲線を100％阻害に固定。ND−未検
【０５１０】
［表16］（ヒトCHO-CXCR2細胞膜での[35S]GTPγSの蓄積を測定する機能アッセイにおける精製多価抗CXCR2ナノボディのIC50値）
【表１６】
0005933573.tif 000021
ND−未検
【０５１１】
（3）抗CXCR2ナノボディの作用機序を決定するためのSchild解析
IL-8およびGRO-α刺激による[35S]GTPγS蓄積アッセイを使ってSchild解析を行った。このアッセイフォーマットでは、[35S]GTPγSの添加に先だってアゴニストとナノボディとを平衡させるので、結果として、機序の誤った解釈につながりうる半平衡の人為産物は回避されるはずである。これを行うために、一連のナノボディ濃度の存在下でアゴニスト濃度応答曲線を決定した。2つの一価ナノボディ54B12および163E3ならびに結果として得られる多価ナノボディに関するデータを例として挙げる。このデータはGRO-αに関する濃度応答曲線を示しているが、IL-8を使用した場合にも同様のデータが観察された。
【０５１２】
一価ナノボディ54B12および163E3はどちらもアロステリック作用機序を示すが、アゴニストの阻害に対する効果は異なっている。54B12および他の1〜19結合剤のアロステリック機序は、アゴニスト濃度応答曲線の右側への平行移動が低いナノボディ濃度で起こり、ナノボディの濃度を増加させてもそれ以上右方向に移動しないことよって例証される。最大アゴニスト応答の減少を伴わないこの効果の飽和性は、アゴニストのアフィニティに対するアロステリック効果を示している。対照的に、163E3および他の非1〜19結合剤のアロステリック機序は、アゴニスト応答曲線の右側への平行移動と、高いナノボディ濃度における最大アゴニスト応答の低下との組合せによって例証される。この効果は飽和を起こしうるが、それは、使用した濃度では観察されなかった。しかし重要な知見は、最大アゴニスト応答の低下であり、これは、アゴニストの効力に対するアロステリック効果を示している。最後に、多価ナノボディ54B12-163E3は、両方のアロステリック機序を併せもち、その結果、はるかに低いナノボディ濃度における右側への平行移動と最大アゴニスト応答の著しい減少とによって例証される効果をアゴニスト濃度応答曲線にもたらす。
【０５１３】
アロステリック調整物質の現在の定義は、それがアゴニスト（オルソステリックリガンド）結合部位とは明確に異なる部位に結合すること、およびオルソステリックリガンドとアロステリック調整物質の両方が同時に受容体に結合することである。本発明者らは、今のところ、これを確認するためのデータを持っていないし、理論に束縛されることも望まないが、ナノボディ結合部位はアゴニスト結合部位と明確に異なるのではなく、結合部位はオーバーラップしていると考えている。アゴニストとナノボディの両方が受容体に同時に結合していることを示すデータもないが、Schild解析データは、これらのナノボディがCXCR2のアロステリック調整物質であることを示唆するものであるだろう。
【０５１４】
20．機能アッセイ−NSC
セクション15で説明したものと同じ方法。
【０５１５】
［表17］（初代ヒトまたはカニクイザル好中球を使った機能アッセイにおける精製二パラトープ性抗CXCR2ナノボディのIC50値（対rhGROα、平均±SD））
【表１７】
0005933573.tif 000022
【０５１６】
表18
【表１８−１】
0005933573.tif 000023
【表１８−２】
0005933573.tif 000024
【表１８−３】
0005933573.tif 000025
【表１８−４】
0005933573.tif 000026
【表１８−５】
0005933573.tif 000027
【０５１７】
リードパネル-CDR＋FR CXCR2 Kabat
表19
【表１９−１】
0005933573.tif 000028
【表１９−２】
0005933573.tif 000029
【０５１８】
21．配列最適化−CXCR2アンタゴニストポリペプチド
熱シフトアッセイ（TSA）：10μlの緩衝液（100mMリン酸、100mMホウ酸、100mMクエン酸、115mM NaCl、3.5〜9の範囲の異なるpHで緩衝化したもの）中で、5μlの精製一価ナノボディ（80mg/ml）を、5μlの蛍光プローブSypro Orange（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド、カタログ番号S6551）（最終濃度10×）と混合した。次に、LightCycler 480II機器（Roche、スイス・バーゼル）において、サンプルを37℃から90℃まで4.4℃/秒で加熱した後、2.2℃/秒で37℃まで冷却した。熱誘発アンフォールディングが起こると、タンパク質の疎水性パッチが露出し、そこにSypro Orangeが結合して、蛍光強度の増加をもたらす。蛍光強度曲線の一次導関数の変曲点は、融解温度（Tm）の尺度として役立つ。（Ericssonら, 2006, Annals of Biochemistry, 357: 289-298）。
【０５１９】
示差走査熱量測定（DSC）：実験は、Auto-Cap VP-DSC（MicroCal−GE Healthcare）で、製造者の説明に従って行った。ナノボディ（0.25mg/mL）の融解温度決定は、30℃から95℃までの温度範囲にわたって、1℃/分の加熱速度で行った。最終的なサーモグラムは、適正なベースライン差引後に得た。ソフトウェアによる（Origin 7.0）ピーク検出により、対応する融解温度が得られた。
【０５２０】
強制酸化：ナノボディサンプル（1mg/mL）を、暗所、室温で4時間、H2O2なしの対照サンプルと並行して、PBS中の10mM H2O2に供した後、Zeba脱塩スピンカラム（0.5mL）（Thermo Scientific）を使って、PBSに緩衝液交換した。次に、ストレス負荷サンプルと対照サンプルとを、シリーズ1200機器（Agilent Technologies）でZorbax 300SB-C3カラム（Agilent Technologies）によるRPCを使って、70℃で分析した。酸化ストレスの結果として生じるプレピークの％ピーク面積を、主タンパク質ピークと比較して決定することにより、ナノボディの酸化を定量した。
【０５２１】
2B2配列最適化
親2B2のタンパク質配列を、ヒトVH3-23（DP-47）およびJH5生殖細胞系とアラインメントした（後掲の表20）。ヒト生殖細胞系配列との比較で、アミノ酸相違を文字によって表し、同一アミノ酸を点によって表す。下線を付したアミノ酸相違をヒト対応物への変換のために選択し、他はそのままにしておいた。
【０５２２】
精製一価材料を2B2、CXCR20059およびCXCR20063から製造し、次にそれを、ヒトCXCR2とカニクイザルCXCR2の両方に対し、FACSリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出（FLIPR）アッセイにおいて特徴づけた。また、変異体の融解温度を、熱シフトアッセイ（TSA）において、または示差走査熱量測定（DSC）を使って、決定した（表21）。CXCR20059およびCXCR20063におけるM93L変異は、強制酸化に対する親2B2の感受性を消滅させる。
【０５２３】
［表21］（一価の2B2および配列最適化変異体の機能的特徴づけ）
【表２０】
0005933573.tif 000030
【０５２４】
97A9配列最適化
親97A9のタンパク質配列を、ヒトVH3-23（DP-47）およびJH5生殖細胞系とアラインメントした（後掲の表22）。ヒト生殖細胞系配列との比較で、アミノ酸相違を文字によって表し、同一アミノ酸を点によって表す。下線を付したアミノ酸相違をヒト対応物への変換のために選択し、他はそのままにしておいた。
【０５２５】
精製一価材料を97A9およびCXCR20061から製造し、次にそれを、ヒトCXCR2とカニクイザルCXCR2の両方に対し、FACSリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出（FLIPR）アッセイにおいて特徴づけた。また、変異体の融解温度を、熱シフトアッセイ（TSA）において決定した（表23）。
【０５２６】
［表23］（一価の979A9および配列最適化変異体の機能的特徴づけ）
【表２１】
0005933573.tif 000031
【０５２７】
163E3配列最適化
親163E3のタンパク質配列をヒトVH3-23（DP-47）およびJH5生殖細胞系とアラインメントした（後掲の表24）。ヒト生殖細胞系配列との比較で、アミノ酸相違を文字によって表し、同一アミノ酸を点によって表す。下線を付したアミノ酸相違をヒト対応物への変換のために選択し、他はそのままにしておいた。
【０５２８】
精製一価材料を163E3およびCXCR20076から製造し、次にそれを、ヒトCXCR2とカニクイザルCXCR2の両方に対し、FACSリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出（FLIPR）アッセイにおいて特徴づけた。また、変異体の融解温度を、熱シフトアッセイ（TSA）において決定した（表25）。
【０５２９】
［表25］（一価の163E3および配列最適化変異体の機能的特徴づけ）
【表２２】
0005933573.tif 000032
【０５３０】
127D1配列最適化
親127D1のタンパク質配列を、ヒトVH3-23（DP-47）およびJH5生殖細胞系とアラインメントした（後掲の表26）。ヒト生殖細胞系配列との比較で、アミノ酸相違を文字によって表し、同一アミノ酸を点によって表す。下線を付したアミノ酸相違をヒト対応物への変換のために選択し、他はそのままにしておいた。
【０５３１】
精製一価材料を127D1およびCXCR20079から製造し、次にそれを、ヒトCXCR2とカニクイザルCXCR2の両方に対し、FACSリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出（FLIPR）アッセイにおいて特徴づけた。また、変異体の融解温度を、熱シフトアッセイ（TSA）において決定した（表27）。CXCR20079中のM57R変異は、強制酸化に対する親127D1の感受性を消失させる。
【０５３２】
［表27］（一価の127D1および配列最適化変異体の機能的特徴づけ）
【表２３】
0005933573.tif 000033
【０５３３】
163D2配列最適化
親163D2のタンパク質配列を、ヒトVH3-23（DP-47）およびJH5生殖細胞系とアラインメントした（後掲の表28）。ヒト生殖細胞系配列との比較で、アミノ酸相違を文字によって表し、同一アミノ酸を点によって表す。下線を付したアミノ酸相違をヒト対応物への変換のために選択し、他はそのままにしておいた。
【０５３４】
精製一価材料を163D2およびCXCR20086から製造し、次にそれを、ヒトCXCR2とカニクイザルCXCR2の両方に対し、FACSリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出（FLIPR）アッセイにおいて特徴づけた。また、変異体の融解温度を、熱シフトアッセイ（TSA）において決定した（表29）。
【０５３５】
［表29］（一価の163D2および配列最適化変異体の機能的特徴づけ）
【表２４】
0005933573.tif 000034
【０５３６】
54B12配列最適化
親54B12のタンパク質配列を、ヒトVH3-23（DP-47）およびJH5生殖細胞系とアラインメントした（後掲の表30）。ヒト生殖細胞系配列との比較で、アミノ酸相違を文字によって表し、同一アミノ酸を点によって表す。下線を付したアミノ酸相違をヒト対応物への変換のために選択し、他はそのままにしておいた。
【０５３７】
精製一価材料を、54B12、CXCR20103およびCXCR2104から製造し、次にそれを、ヒトCXCR2とカニクイザルCXCR2の両方に対し、FACSリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムのアゴニスト誘発性放出（FLIPR）アッセイにおいて特徴づけた。また、変異体の融解温度を、熱シフトアッセイ（TSA）において決定した（表31）。
【０５３８】
［表31］（一価の54B12および配列最適化変異体の機能的特徴づけ）
【表２５】
0005933573.tif 000035
【０５３９】
［表20］（2B2と配列最適化変異体とのアラインメント）
【表２６】
0005933573.tif 000036
［表22］（97A9と配列最適化変異体とのアラインメント）
【表２７】
0005933573.tif 000037
［表24］（163E3と配列最適化変異体とのアラインメント）
【表２８】
0005933573.tif 000038
［表26］（127D1と配列最適化変異体とのアラインメント）
【表２９】
0005933573.tif 000039
［表28］（163D2と配列最適化変異体とのアラインメント）
【表３０】
0005933573.tif 000040
［表30］（54B12と配列最適化変異体とのアラインメント）
【表３１】
0005933573.tif 000041
［表32］（配列最適化変異体のアミノ酸配列）
【表３２】
0005933573.tif 000042
［表33］（配列最適化二パラトープ性のアミノ酸配列（Alb8のHLEを含む））
【表３３】
0005933573.tif 000043
［表34］（配列最適化変異体および親のアミノ酸配列（CDR（Kabat）およびフレームワーク領域のアノテーションを含む））
【表３４】
0005933573.tif 000044
［表35］（配列最適化変異体のChothia CDRアノテーション）
【表３５】
0005933573.tif 000045
【０５４０】
22．エピトープマッピング
ナノボディのエピトープマッピングは、Integral Molecular Inc.（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア、スイート900、マーケットストリート3711、www.integralmolecular.com）により、彼らのショットガン変異誘発技術（Shotgun Mutagenesis Technology）を使って行われた。
【０５４１】
ショットガン変異誘発技術の要約
ショットガン変異誘発では、変異型ターゲットタンパク質の大きなライブラリーの真核細胞内での発現および解析を可能にする独自の高スループット細胞発現技術を使用する。機能の変化をアッセイするために、タンパク質中のあらゆる残基を、通常は複数の他のアミノ酸に、個別に変異させる。タンパク質を標準的哺乳動物細胞株内で発現させるので、真核細胞の翻訳または翻訳後プロセシングを必要とする困難なタンパク質であってもマッピングすることができる。
エピトープマッピングのための命名は次のとおりである。
RDHBC792＝CXCR20079
RDHBC793＝CXCR20061
RDHBC792＝CXCR20076
抗CXCR2抗体RD-HBC792（CXCR20079）、RD-HBC793（CXCR220061）およびRD-HBC794（CXCR20076）のエピトープは、ショットガン変異誘発法を使って、次のように単一アミノ酸解像度でマッピングされた。
親コンストラクト：タグなしの親遺伝子を高発現ベクターにクローニングし、配列決定し、免疫検出法によって発現を検証した。
ナノボディ最適化：394ウェルマイクロプレートで一連のナノボディ希釈液をアッセイすることによって、ショットガン変異誘発フォーマットにおけるナノボディの検出を最適化した。変異ライブラリーをスクリーニングするために、各ナノボディの至適濃度を選択した。変異ライブラリーを揃え、各アミノ酸位置を変異させて保存的および非保存的に変化させた（各残基のAla置換体への変異を含む）。ライブラリーを表面発現について試験し、三つ一組にして、免疫検出法により、ナノボディ結合についてスクリーニングした。ナノボディ結合の喪失に関してライブラリーの分析を行い、重要残基（critical residue）を同定し、マッピングした。
【０５４２】
一過性に発現した野生型親コンストラクトの親コンストラクト発現免疫検出は、免疫ルミネセンス法（immunoluminescence）および免疫蛍光法により、384ウェルフォーマットで行った。正確さと高い実験再現性を確保するために、どの実験でも、細胞トランスフェクションおよび免疫染色に伴う液体ハンドリングステップは、液体ハンドリングロボットを使って行った。
【０５４３】
［表36］（親プラスミドを試験するために使用した実験パラメータ）
【表３６】
0005933573.tif 000046
【０５４４】
ポリクローナル血清を使った全受容体細胞表面発現の検出。総発現量の定量にはポリクローナル血清（全ての変異体と反応できるもの）を使用するので、変異ライブラリー中の各クローンを検出することができる。
［表37］（ポリクローナル免疫検出のために使用した実験パラメータ）
【表３７】
0005933573.tif 000047
【０５４５】
結論：野生型親コンストラクトでは、対照MAbとポリクローナル血清を使ってロバストな表面発現と総発現量が検出されるので、この野生型親コンストラクトは、ショットガン変異誘発法に使用することができる。免疫ルミネセンスアッセイは、高いシグナル：バックグラウンドと低い変動性とを示し、マッピング研究に使用されるであろう。
【０５４６】
マッピングナノボディを使って免疫検出を最適化した。免疫検出は、野生型受容体プラスミドまたはベクターのみのプラスミドを一過性にトランスフェクトした細胞を使って、384ウェルフォーマットで行った。以後のマッピング研究用に選択した濃度は、高いシグナル：バックグラウンドと低い変動性とを有する近最大（near-maximal）シグナルに基づいた。
【０５４７】
変異ライブラリーをスクリーニングするための最終アッセイ条件
［表38］（ショットガン変異誘発384ウェルフォーマットにおいて最適化されたアッセイ検出のために使用した実験パラメータ）
【表３８】
0005933573.tif 000048
【０５４８】
ここに規定した最適化アッセイ条件を使って、384ウェルフォーマットでCXCR2変異ライブラリーをマッピングした。ライブラリー中の各クローンを、一過性トランスフェクションによって細胞中で発現させ、トランスフェクションの約18時間後にナノボディ反応性についてアッセイした。CXCR2ナノボディRD-HBC792、RD-HBC793およびRD-HBC794はFc領域を欠くが、mycタグを含有しているので、中間マウス抗myc抗体（9E10）を使用した後に、抗マウスHRP抗体による検出を行う多段階検出戦略を使用した。
【０５４９】
結論：3つのCXCR2ナノボディの免疫検出およびエピトープマッピングのための最終条件を決定した。最適化された条件は、ショットガン変異誘発フォーマットにおいて高いシグナル：バックグラウンドと低い変動性をもたらしたので、信頼度の高いエピトープマッピングに使用することができた。エピトープマッピングでは、ここで決定されたものと同じアッセイ条件を応用したが、受容体変異体の変異ライブラリーを使用した。
【０５５０】
ナノボディエピトープの重要残基の同定
［表39］（重要残基の同定）
【表３９】
0005933573.tif 000049
【０５５１】
クローンのナノボディ反応性を、ポリクローナル反応性（表面発現）と比較することによって、MAbの重要残基を同定した。抗体エピトープに関与する残基を、ナノボディ結合については陰性であるがポリクローナル結合については陽性であり、Ala残基置換（すなわち残基の側鎖の除去）を含み、細胞外ループ中に位置するものとして同定した。MAb結合およびポリクローナル抗体結合に関する平均反応性および標準偏差を示す。各MAbについて重要残基に灰色の陰を付けてある。RD HBC792に関するデータをRD HBC793とも比較した。というのも、RD HBC792の結合プロファイルは市販のポリクローナル血清（これはヒトCXCR2のN末端細胞外ドメインから誘導されたもので、おそらくF11、F14、およびW15変異に対する血清の反応性が低いことの説明になっている）していることがわかったからである。
【０５５２】
エピトープ情報のさらなる分析
ショットガン変異誘発マッピングによって同定された重要アミノ酸は、3つのCXCR2 MAbの結合部位を規定している。MAb RD HBC792はCXCR2のN末端領域にマッピングされ、重要残基が近接していることは、エピトープの性質が線状であることを示唆している。MAb RD HBC793およびRD HBC794は、主としてCXCR2のECL1およびECL3によって形成されるコンフォメーション的に複雑なエピトープに結合するようである。ケモカイン受容体において細胞外ループを所定の位置に保持している2つのジスルフィド橋を形成することが知られている細胞外Cys残基の変異は、MAb793および794の結合も失わせるので、エピトープ相互作用に直接関与するとは考えていない。793と794のエピトープは、かなりオーバーラップしているが、これら2つの間のわずかな相違も明白である。
【０５５３】
実施形態
1．ケモカイン受容体CXCR2を指向するか、またはケモカイン受容体CXCR2に結合する、少なくとも2つの免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、CXCR2上の第1エピトープを認識する第1抗原結合ドメインと、CXCR2上の第2エピトープを認識する第2抗原結合ドメインとを含むポリペプチド。
【０５５４】
2．該第1抗原結合ドメインが、配列番号7に示すアミノ酸の配列からなる線状ペプチドに結合する能力を有し、該第2抗原結合ドメインが、該線状ペプチドに結合する能力を有さないか、または該線状ペプチドに低いアフィニティで結合する、実施形態1のポリペプチド。
【０５５５】
3．該第1抗原結合ドメインが第1免疫グロブリン単一可変ドメイン内に含まれ、該第2抗原結合ドメインが抗体の第2免疫グロブリン単一可変ドメイン内に含まれている、実施形態1または実施形態2のポリペプチド。
【０５５６】
4．該第1および第2抗原結合ドメインの少なくとも一方が、抗体VLドメインまたはそのフラグメント内に含まれている、実施形態3のポリペプチド。
【０５５７】
5．該第1および第2抗原結合ドメインの少なくとも一方が、抗体VHドメインまたはそのフラグメント内に含まれている、実施形態3のポリペプチド。
【０５５８】
6．該第1抗原結合ドメインが、VLドメインまたはそのフラグメントに含まれ、該第2抗原結合ドメインが、VHドメインまたはそのフラグメントに含まれている、実施形態4または5のポリペプチド。
【０５５９】
7．該第1抗原結合ドメインが、VHドメインまたはそのフラグメントに含まれ、該第2抗体結合ドメインがVLドメインまたはそのフラグメントに含まれている、実施形態4または5のポリペプチド。
【０５６０】
8．該第1および第2抗原結合ドメインが第1および第2ドメイン抗体（dAb）内に含まれている、実施形態3〜7のいずれか一つのポリペプチド。
【０５６１】
9．該第1および第2抗原結合ドメインの少なくとも一方が、ラクダ科動物から得ることができる重鎖抗体の単一重鎖からのVHHドメインもしくはそのフラグメント内に含まれているか、またはその配列最適化（ヒト化を含む）変異体である、実施形態3または実施形態5のポリペプチド。
【０５６２】
10．該抗原結合ドメインのそれぞれがラクダ科動物に由来する重鎖抗体の単一重鎖からのVHHドメインまたはそのフラグメント内に含まれているか、またはその配列最適化（ヒト化を含む）変異体である、実施形態9のポリペプチド。
【０５６３】
11．各VHH配列またはそのフラグメントが、1つ、2つまたは3つのCDRを含む、実施形態9または10のポリペプチド。
【０５６４】
12．各VHH配列が構造：FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FRを有する、実施形態9〜11のいずれか一つのポリペプチド。
【０５６５】
13．該少なくとも2つの抗原結合ドメインがリンカーによって接合されている、上記実施形態のいずれか一つのポリペプチド。
【０５６６】
14．構造：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--リンカー--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
［式中、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4が第1抗原結合ドメインを含むのであれば、FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8は第2抗原ドメインを含み、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4が第2抗原ドメインを含むのであれば、FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8は第1抗原結合ドメインを含む］
を有する、実施形態3〜13のいずれか一つのポリペプチド。
【０５６７】
15．該第1および第2抗原結合ドメインのそれぞれが重鎖抗体内に含まれている、実施形態1または2のポリペプチド。
【０５６８】
16．該第1抗原結合ドメインが第1重鎖抗体の単一鎖内に含まれ、かつ該第2抗原結合ドメインが第2重鎖抗体の単一鎖内に含まれていて、該第1および第2単一重鎖抗体がリンカーによって接合されている、実施形態1または2のポリペプチド。
【０５６９】
17．該第1および第2抗原結合ドメインのそれぞれが、2本の重鎖と2本の軽鎖とからなる抗体内に含まれている、実施形態1または2のポリペプチド。
【０５７０】
18．該第1および第2抗原結合ドメインが、それぞれ2本の重鎖と2本の軽鎖とを含む第1および第2抗体に、それぞれ含まれ、該第1および第2抗体がリンカーによって接合されている、実施形態1または2のポリペプチド。
【０５７１】
19．該第1および第2抗原結合ドメインが、それぞれ、第1および第2抗体FabまたはF(ab)2フラグメント内に含まれ、該第1および第2FabまたはF(ab)2フラグメントがリンカーによって接合されている、実施形態1または2のポリペプチド。
【０５７２】
20．該第1抗原結合ドメインが抗体Fabフラグメント内に含まれ、かつ該第2抗原結合ドメインがF(ab)2フラグメント内に含まれているか、またはその逆である、実施形態19のポリペプチド。
【０５７３】
21．該第1および第2抗原結合ドメインが、それぞれ、第1および第2抗体単鎖Fv（scFv）またはそのフラグメント内に含まれ、該第1および第2scFvがリンカーによって接合されている、実施形態1または2のポリペプチド。
【０５７４】
22．リンカーが、抗原結合ドメインを含む1つの免疫グロブリンのC末端を、抗原結合ドメインを含む第2免疫グロブリンのN末端に接合している、実施形態13、14、16、18、19、20、または21のいずれか一つのポリペプチド。
【０５７５】
23．リンカーが、免疫グロブリン由来でないアミノ酸配列を含むペプチドである、実施形態13、14、16、または18〜22のいずれか一つのポリペプチド。
【０５７６】
24．ペプチドリンカーが3〜50アミノ酸長である、実施形態23のポリペプチド。
【０５７７】
25．リンカー中のアミノ酸の数が、3〜9、10〜15、16〜20、21〜25、26〜35、36〜40、41〜45または46〜50から選択される、実施形態24のポリペプチド。
【０５７８】
26．リンカーが35アミノ酸長である、実施形態24のポリペプチド。
【０５７９】
27．リンカーがもっぱら2つの異なるアミノ酸だけから構成される、実施形態24のポリペプチド。
【０５８０】
28．リンカーがアミノ酸グリシンおよびセリンから構成される、実施形態27のポリペプチド。
【０５８１】
29．リンカーがアミノ酸プロリンおよびセリンならびに場合によってはアラニンから構成される、実施形態27のポリペプチド。
【０５８２】
30．リンカーがもっぱらアラニンだけで構成される、実施形態23〜26のいずれか一つのポリペプチド。
【０５８３】
31．ペプチドリンカーが配列番号220に示すアミノ酸配列からなる、実施形態26のポリペプチド。
【０５８４】
32．ラクダ科動物単一重鎖抗体に由来するまたはラクダ科動物単一重鎖抗体に特有のCDRアミノ酸配列を含む、上記実施形態のいずれか一つのポリペプチド。
【０５８５】
33．フレームワーク領域のアミノ酸配列がラクダ科動物単一重鎖抗体に由来するまたはラクダ科動物単一重鎖抗体に特有である、実施形態9〜14のいずれか一つのポリペプチド。
【０５８６】
34．フレームワーク領域のアミノ酸配列が、その配列最適化（ヒト化を含む）変異体である、実施形態9〜14のいずれか一つのポリペプチド。
【０５８７】
35．CXCR2に特異的に結合する、上記実施形態のいずれか一つのポリペプチド。
【０５８８】
36．ヒトCXCR2を指向する、またはヒトCXCR2に結合する、任意の上記実施形態のポリペプチド。
【０５８９】
37．血清タンパク質を指向するまたは血清タンパク質に特異的に結合する少なくとも1つのさらなる抗原結合ドメインを含む、任意の上記実施形態のポリペプチド。
【０５９０】
38．血清タンパク質がヒト血清アルブミンである、任意の上記実施形態のポリペプチド。
【０５９１】
39．ケモカイン受容体CXCR2を指向するか、またはケモカイン受容体CXCR2に結合する、少なくとも2つのポリペプチドを含む分子であって、第1ポリペプチドが第1免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、かつ第2ポリペプチドが第2免疫グロブリン抗原結合ドメインを含んでいて、該第1および第2抗原結合ドメインがCXCR2上の第1および第2エピトープを認識し、該少なくとも2つのポリペプチドが非ペプチドリンカーで接合されている分子。
【０５９２】
40．該第1抗原結合ドメインが配列番号7に示すアミノ酸の配列からなる線状ペプチドに結合する能力を有し、該第2抗原結合ドメインが該線状ペプチドに結合する能力を有さないか該線状ペプチドに低いアフィニティで結合する、実施形態38に記載の分子。
【０５９３】
41．実施形態3〜22および32〜38のいずれか一つに記載の特徴を有する、実施形態39または40に記載の分子。
【０５９４】
42．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号145、165および185からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号145、165もしくは185のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含み、単一可変ドメインの該第1免疫グロブリンが、配列番号141、161および181からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号141、161もしくは181のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む、実施形態3〜14または実施形態22〜39のいずれか一つのポリペプチド。（163D2/127D1）。
【０５９５】
43．実施形態14に記載の構造を含む実施形態42のポリペプチドであって、単一可変ドメインの該第2免疫グロブリンにおいて、CDR1が配列番号145に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号165に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号185に示すアミノ酸配列を含み、かつ単一可変ドメインの該該第1免疫グロブリンにおいて、CDR4が配列番号141に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号161に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号181に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０５９６】
44．CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号145、165、185、141、161または181に示すアミノ酸配列のいずれか一つと、少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、実施形態43のポリペプチド。
【０５９７】
45．配列番号145、165、185、141、161または181に示すものとのアミノ酸配列の相違が、保存的アミノ酸変化だけである、実施形態43または44のポリペプチド。
【０５９８】
46．単一可変ドメインの各単量体中のフレームワーク領域が、Kabatナンバリングで11、37、44、46、47、83、84、103、104および108番目のアミノ酸に、1つ以上のホールマーク残基を含む、実施形態43〜45のいずれか一つのポリペプチド。
【０５９９】
47．FR1が配列番号83に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号104に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号124に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号79に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号100に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号120に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む、実施形態43〜46のいずれか一つのポリペプチド。
【０６００】
48．FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号83、104、124、131、79、100、または120のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有するように修飾されている、実施形態47のポリペプチド。
【０６０１】
49．配列番号58に示すアミノ酸配列、または配列番号58のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態41〜48のいずれかのポリペプチド。
【０６０２】
50．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号218に示すアミノ酸配列、または配列番号218に対して少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号216に示すアミノ酸配列、または配列番号216に対して少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態42〜46のいずれか一つのポリペプチド。
【０６０３】
51．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号146、166および186からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号146、166もしく188のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号141、161および181からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号141、161または181のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態3〜14または実施形態22〜39のいずれか一つのポリペプチド。（163E3/127D1）。
【０６０４】
52．実施形態14に記載の構造を含む実施形態51のポリペプチドであって、単一可変ドメインの該第2免疫グロブリンにおいて、CDR1が配列番号146に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号166に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号186に示すアミノ酸配列を含み、かつ単一可変ドメインの該第1免疫グロブリンにおいて、CDR4が配列番号141に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号161に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号181に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０６０５】
53．CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号176、166、186、141、161または181に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、実施形態52のポリペプチド。
【０６０６】
54．配列番号146、166、186、141、161または181に示すものとのアミノ酸配列の相違が保存的アミノ酸変化だけである、実施形態52または53のポリペプチド。
【０６０７】
55．単一可変ドメインの各単量体におけるフレームワーク領域が、アミノ酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104および108に、1つ以上のホールマーク残基を含む、実施形態52〜54のいずれか一つのポリペプチド。
【０６０８】
56．FR1が配列番号84に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号105に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号125に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号79に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号100に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号120に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む、実施形態52〜55のいずれか一つのポリペプチド。
【０６０９】
57．FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号84、105、125、131、79、100、または120のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有するように修飾されている、実施形態56のポリペプチド。
【０６１０】
58．配列番号59に示すアミノ酸配列または配列番号59のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態51〜57のいずれかのポリペプチド。
【０６１１】
59．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号217に示すアミノ酸配列または配列番号217と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号216に示すアミノ酸配列または配列番号216と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態51〜58のいずれか一つのポリペプチド。
【０６１２】
60．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号146、166および186からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号146、166または186のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号151、171および191からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号151、171または191のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態3〜14または実施形態22〜39のいずれか一つのポリペプチド。（163E3/54B12）。
【０６１３】
61．実施形態14に記載の構造を含む実施形態60のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR1が配列番号146に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号166に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号186に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR4が配列番号151に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号171に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号191に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０６１４】
62．CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号146、166、186、151、171または191に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、実施形態61のポリペプチド。
【０６１５】
63．配列番号146、166、186、151、171または191に示すものとのアミノ酸配列の相違が保存的アミノ酸変化だけである、実施形態61または62のポリペプチド。
【０６１６】
64．単一可変ドメインの各単量体中のフレームワーク領域が、Kabatナンバリングでアミノ酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104および108に、1つ以上のホールマーク残基を含む、実施形態61〜63のいずれか一つのポリペプチド。
【０６１７】
65．FR1が配列番号84に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号105に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号125に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号89に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号110に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号130に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む、実施形態61〜64のいずれか一つのポリペプチド。
【０６１８】
66．FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号84、105、125、131、89、110、または130のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有する、実施形態65のポリペプチド。
【０６１９】
67．配列番号62に示すアミノ酸配列または配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態60〜66のいずれかのポリペプチド。
【０６２０】
68．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号217に示すアミノ酸配列または配列番号217と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号219に示すアミノ酸配列または配列番号219と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態60〜64のいずれか一つのポリペプチド。
【０６２１】
69．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号145、165および185からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号145、165もしくは185のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号151、171および191からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号151、171もしくは191のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態3〜14または実施形態22〜39のいずれか一つのポリペプチド。（163D2/54B12）。
【０６２２】
70．実施形態14に記載の構造を含む実施形態69のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR1が配列番号145に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号165に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号185に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR4が配列番号151に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号171に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号191に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０６２３】
71．CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号145、165、185、151、171、または191に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、実施形態70のポリペプチド。
【０６２４】
72．配列番号145、165、185、151、171または191に示すものとのアミノ酸配列の相違が保存的アミノ酸変化だけである、実施形態70または71のポリペプチド。
【０６２５】
73．単一可変ドメインの各単量体中のフレームワーク領域が、Kabatナンバリングでアミノ酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104および108に、1つ以上のホールマーク残基を含む、実施形態70〜72のいずれか一つのポリペプチド。
【０６２６】
74．FR1が配列番号83に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号104に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号124に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号89に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号110に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号130に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む、実施形態70〜73のいずれか一つのポリペプチド。
【０６２７】
75．FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号83、104、124、131、89、110または130のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有するように修飾されている、実施形態74のポリペプチド。
【０６２８】
76．配列番号63に示すアミノ酸配列または配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態69〜75のいずれかのポリペプチド。
【０６２９】
77．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号218に示すアミノ酸配列または配列番号218と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号219に示すアミノ酸配列または配列番号219と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態69〜73のいずれか一つのポリペプチド。
【０６３０】
78．該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号147、167および187からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号147、167もしくは187のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号146、166および186からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号146、166もしくは186のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態3〜14または実施形態22〜39のいずれか一つのポリペプチド。（2B2/163E3）。
【０６３１】
79．実施形態14に記載の構造を含む実施形態78のポリペプチドであって、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR1が配列番号147に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号167に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号187に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR4が配列番号146に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号166に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号186に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０６３２】
80．CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号147、167、187、146、166または186に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、実施形態79のポリペプチド。
【０６３３】
81．配列番号147、167、187、146、166または186に示すものとのアミノ酸配列の相違が、保存的アミノ酸変化だけである、実施形態79または80のポリペプチド。
【０６３４】
82．単一可変ドメインの各単量体中のフレームワーク領域が、Kabatナンバリングでアミノ酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104および108に、1つ以上のホールマーク残基を含む、実施形態79〜81のいずれか一つのポリペプチド。
【０６３５】
83．FR1が配列番号85に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号106に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号126に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号84に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号105に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号125に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む、実施形態79〜82のいずれか一つのポリペプチド。
【０６３６】
84．FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号85、106、126、131、84、105または125のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有するように修飾されている、実施形態83のポリペプチド。
【０６３７】
85．配列番号64に示すアミノ酸配列または配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態78〜84のいずれかのポリペプチド。
【０６３８】
86．該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号213もしくは214に示すアミノ酸配列または配列番号213もしくは214と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号217に示すアミノ酸配列または配列番号217と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態78〜82のいずれか一つのポリペプチド。
【０６３９】
87．該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号147、167および187からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号147、167もしくは187のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第2免疫グロブリン可変ドメインが、配列番号145、165および185からなる群より選択される少なくとも1つのCDRまたは配列番号145、165もしくは185のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態3〜14または実施形態22〜39のいずれか一つのポリペプチド。（2B2/163D2）。
【０６４０】
88．実施形態14に記載の構造を含む実施形態87のポリペプチドであって、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR1が配列番号147に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号167に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号187に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第2免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR4が配列番号145に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号165に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号185に示すアミノ酸配列を含むプリペプチド。
【０６４１】
89．CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号147、167、187、145、165または185に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、実施形態88のポリペプチド。
【０６４２】
90．配列番号147、167、187、145、165または185のものとのアミノ酸配列の相違が保存的アミノ酸変化だけである、実施形態88または89のポリペプチド。
【０６４３】
91．単一可変ドメインの各単量体中のフレームワーク領域が、Kabatナンバリングでアミノ酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104および108に、1つ以上のホールマーク残基を含む、実施形態88〜90のいずれか一つのポリペプチド。
【０６４４】
92．FR1が配列番号85に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号106に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号126に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号131に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号83に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号104に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号124に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む、実施形態88〜91のいずれか一つのポリペプチド。
【０６４５】
93．FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号85、106、126、131、83、104または124のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有するように修飾されている、実施形態94のポリペプチド。
【０６４６】
94．配列番号65に示すアミノ酸配列、または配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態87〜93のいずれかのポリペプチド。
【０６４７】
95．該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号213もしくは214に示すアミノ酸配列または配列番号213もしくは214と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号218に示すアミノ酸配列または配列番号218と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態87〜91のいずれか一つのポリペプチド。
【０６４８】
96．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号143、163および183からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号143、163もしくは183のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号147、167および187からなる群より選択される少なくとも1つのCDR、または配列番号147、167もしくは187のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態3〜14または実施形態22〜39のいずれか一つのポリペプチド（97A9/2B2）。
【０６４９】
97．実施形態14に記載の構造を含む実施形態96のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR1が配列番号143に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号163に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号183に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR4が配列番号147に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号167に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号187に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０６５０】
98．CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号143、163、183、147、167または187に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、実施形態97のポリペプチド。
【０６５１】
99．配列番号143、163、183、147、167または187に示すものとのアミノ酸配列の相違が保存的アミノ酸変化だけである、実施形態97または98のポリペプチド。
【０６５２】
100．単一可変ドメインの各単量体中のフレームワーク領域が、Kabatナンバリングでアミノ酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104および108に、1つ以上のホールマーク残基を含む、実施形態97〜99のいずれか一つのポリペプチド。
【０６５３】
101．FR1が配列番号81に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号102に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号122に示すアミノ酸配列を含み、FR4が配列番号133に示すアミノ酸配列を含み、FR5が配列番号85に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号106に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号126に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む、実施形態97〜100のいずれか一つのポリペプチド。
【０６５４】
102．FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号81、102、122、133、85、106、126または131のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有するように修飾されている、実施形態101のポリペプチド。
【０６５５】
103．配列番号47に示すアミノ酸配列、または配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態96〜102のいずれかのポリペプチド。
【０６５６】
104．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号215に示すアミノ酸の配列または配列番号215と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号213および214に示すアミノ酸の配列または配列番号213もしくは214と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸の配列を含む、実施形態96〜100のいずれか一つに記載のポリペプチド。
【０６５７】
105．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号143、163および183からなる群より選択されるアミノ酸配列または配列番号143、163もしくは183のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号151、171および191からなる群より選択される少なくとも1つのCDR、または配列番号151、171もしくは191のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態3〜14または実施形態22〜39のいずれか一つのポリペプチド。（97A9/54B12）。
【０６５８】
106．実施形態14に記載の構造を含む実施形態105のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR1が配列番号143に示すアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号163に示すアミノ酸配列を含み、CDR3が配列番号183に示すアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて、CDR4が配列番号151に示すアミノ酸配列を含み、CDR5が配列番号171に示すアミノ酸配列を含み、CDR6が配列番号191に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０６５９】
107．CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5またはCDR6のアミノ酸配列が、配列番号143、163、183、151、171または191に示すアミノ酸配列のいずれか一つと少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する、実施形態106のポリペプチド。
【０６６０】
108．配列番号143、163、183、151、171または191に示すものとのアミノ酸配列の相違が保存的アミノ酸変化だけである、実施形態106または107のポリペプチド。
【０６６１】
109．単一可変ドメインの各単量体中のフレームワーク領域が、Kabatナンバリングでアミノ酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104および108に、1つ以上のホールマーク残基を含む、実施形態106〜108のいずれか一つのポリペプチド。
【０６６２】
110．FR1が配列番号81に示すアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号102に示すアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号122に示すアミノ酸配列を含み、FR4がアミノ酸配列133を含み、FR5が配列番号89に示すアミノ酸配列を含み、FR6が配列番号110に示すアミノ酸配列を含み、FR7が配列番号130に示すアミノ酸配列を含み、かつ/またはFR8が配列番号131に示すアミノ酸配列を含む、実施形態106〜109のいずれか一つのポリペプチド。
【０６６３】
111．FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7およびFR8が、配列番号81、102、122、133、89、110、130または131のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を持つアミノ酸配列を有するように修飾されている、実施形態110のポリペプチド。
【０６６４】
112．配列番号61に示すアミノ酸配列または配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、実施形態105〜111のいずれかのポリペプチド。
【０６６５】
113．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号215に示すアミノ酸の配列または配列番号215と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸の配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号219に示すアミノ酸の配列または配列番号219と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態105〜109のいずれか一つに記載のポリペプチド。
【０６６６】
114．配列最適化されたフレームワーク領域（部分的または完全にヒト化されたフレームワーク領域を含む）を含む、実施形態1〜38または42〜113のいずれか一つのポリペプチド。
【０６６７】
115．非ヒト霊長類CXCR2と交差反応する、実施形態1〜38または42〜114のいずれか一つのポリペプチド。
【０６６８】
116．霊長類がカニクイザルである、実施形態115のポリペプチド。
【０６６９】
117．非霊長類種からのCXCR2とは交差反応しない、実施形態1〜38または42〜116のいずれか一つのポリペプチド。
【０６７０】
118．CXCケモカインファミリーの他の受容体とは交差反応しない、実施形態1〜38または42〜117のいずれか一つのポリペプチド。
【０６７１】
119．該第2抗原結合ドメインが、配列番号8、9、10、11および12に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCXCR2エピトープまたは前記アミノ酸配列内にあるCXCR2エピトープを認識する、実施形態1〜38および114〜118のいずれか一つのポリペプチド。
【０６７２】
120．該第1抗原結合ドメインが、配列番号7に示すアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記アミノ酸配列内にあるエピトープを認識する、実施形態119のポリペプチド。
【０６７３】
121．該第1抗原結合ドメインが、配列番号4に示すアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記アミノ酸配列内にあるエピトープを認識する、実施形態119または120のポリペプチド。
【０６７４】
122．該第2抗原結合ドメインが、配列番号5または6に示すアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記アミノ酸配列内にあるエピトープを認識する、実施形態119〜121のいずれかのポリペプチド。
【０６７５】
123．10-5〜10-12モル/リットル以下、好ましくは10-7〜10-12モル/リットル以下、より好ましくは10-8〜10-12モル/リットルの解離定数（KD）でヒトCXCR2に特異的に結合することができる、実施形態1〜38または実施形態42〜122のいずれか一つのポリペプチド。
【０６７６】
124．102M-1s-1〜約107M-1s-1、好ましくは103M-1s-1〜107M-1s-1、より好ましくは104M-1s-1〜107M-1s-1、例えば105M-1s-1〜107M-1s-1の会合速度で（kon速度）でヒトCXCR2に特異的に結合することができる、実施形態1〜38または実施形態42〜123のいずれか一つのポリペプチド。
【０６７７】
125．1s-1〜10-6s-1、好ましくは10-2s-1〜10-6s-1、より好ましくは10-3s-1〜10-6s-1、例えば10-4s-1〜10-6s-1の解離速度（koff速度）でヒトCXCR2に特異的に結合することができる、実施形態1〜38または実施形態42〜124のいずれか一つのポリペプチド。
【０６７８】
126．500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満のアフィニティでヒトCXCR2に特異的に結合することができる、実施形態1〜38または実施形態42〜125のいずれか一つのポリペプチド。
【０６７９】
127．ヒトCXCR2へのGro-αの結合を20nM未満のIC50で阻害する能力を有する、実施形態1〜38または実施形態42〜126のいずれか一つのポリペプチド。
【０６８０】
128．ヒトCXCR2を発現するRBL細胞からのGro-α誘導性カルシウム放出を100nM未満のIC50で阻害する能力を有する、実施形態1〜38または42〜127のいずれか一つのポリペプチド。
【０６８１】
129．ヒトCHO-CXCR2膜における[35S]GTPγSのGro-α誘導性蓄積を50nM未満のIC50で阻害する能力を有する、実施形態1〜38または42〜128のいずれか一つのポリペプチド。
【０６８２】
130．実質的に単離された形態にある、実施形態1〜38または42〜129のいずれか一つのポリペプチド。
【０６８３】
131．多パラトープ性コンストラクトである、実施形態1〜38および42〜130のいずれか一つのポリペプチド。
【０６８４】
132．対応する無修飾のアミノ酸配列と比較して増加したインビボ半減期を有するように修飾されている、実施形態1〜38または42〜131のいずれか一つのポリペプチド。
【０６８５】
133．該増加した半減期が、血清タンパク質またはそのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合ユニット、Fc部分、および血清タンパク質に結合することができる小さなタンパク質またはペプチドからなる群より選ばれる1つ以上の結合ユニットによってもたらされる、実施形態132のポリペプチド。
【０６８６】
134．ポリペプチドに増加した半減期を与える該1つ以上の他の結合ユニットが、ヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントからなる群より選ばれる、実施形態133のポリペプチド。
【０６８７】
135．ポリペプチドに増加した半減期を与える該1つ以上の他の結合ユニットが、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）または血清免疫グロブリン（IgGなど）に結合することができる結合ユニットからなる群より選ばれる、133のポリペプチド。
【０６８８】
136．該増加した半減期が、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）もしくは血清免疫グロブリン（IgGなど）に結合することができる、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、「dAb」、dAbとしての使用に適したアミノ酸配列、またはナノボディからなる群より選ばれる1つ以上の他の結合ユニットによってもたらされる、実施形態132のポリペプチド。
【０６８９】
137．血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）または血清免疫グロブリン（IgGなど）に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインである、実施形態134のポリペプチド。
【０６９０】
138．対応する無修飾ポリペプチドの半減期より少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも10倍または20倍以上長い血清中半減期を有する、実施形態132〜137のいずれかのポリペプチド。
【０６９１】
139．対応する無修飾ポリペプチドと比較して、1時間以上、好ましくは2時間以上、より好ましくは6時間以上、例えば12時間以上、さらには24、48または72時間以上増加した血清中半減期を有する、実施形態132〜138のいずれかのポリペプチド。
【０６９２】
140．ヒトにおいて少なくとも約12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも48時間、さらに好ましくは少なくとも72時間またはそれ以上；例えば少なくとも5日（例えば約5〜10日）、好ましくは少なくとも9日（例えば約9〜14日）、より好ましくは少なくとも約10日（例えば約10〜15日）、または少なくとも約11日（例えば約11〜16日）、より好ましくは少なくとも約12日（例えば約12〜18日またはそれ以上）、または14日以上（例えば約14〜19日）の血清中半減期を有する、実施形態132〜139のいずれかのポリペプチド。
【０６９３】
141．PEG化されている、実施形態1〜38または42〜140のいずれかのポリペプチド。
【０６９４】
142．PAS化されている、実施形態1〜38または42〜140のいずれか一つのポリペプチド。
【０６９５】
143．HES化されている、実施形態1〜38または42〜140のいずれか一つのポリペプチド。
【０６９６】
144．該さらなる抗原結合ドメインが血清タンパク質に、500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500nM未満のアフィニティで結合する、実施形態36もしくは37または実施形態42〜143のいずれか一つのポリペプチド。
【０６９７】
145．実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチドをコードする核酸分子。
【０６９８】
146．配列番号25〜43、90および213〜219に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸分子。
【０６９９】
147．配列番号192〜211に示す核酸配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態146の核酸分子。
【０７００】
148．配列番号44〜69に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
【０７０１】
149．実施形態145〜148のいずれか一つに記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【０７０２】
150．実施形態145〜148のいずれか一つの核酸配列から実施形態1〜38または42〜149のいずれか一つのポリペプチドを発現する能力を有する宿主細胞。
【０７０３】
151．実施形態150の宿主細胞を培養することによって得ることができる一価、二価、多価、二パラトープ性または多パラトープ性ナノボディ。
【０７０４】
152．実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチドと医薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【０７０５】
153．医薬品として使用するための、実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチド。
【０７０６】
154．慢性閉塞性肺疾患（COPD）およびCOPDの増悪の処置に使用するための、実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチド。
【０７０７】
155．嚢胞性線維症、喘息、重症喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成の処置に使用するための、実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチド。
【０７０８】
156．アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管新生および新しい血管の発達を特徴とする疾患（黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む）、多発性硬化症、乾癬、加齢性黄斑変性疾患、眼ベーチェット病、ぶどう膜炎、肺動脈高血圧（PAH）（特発性PAH、家族性PAHおよび随伴性PAHを含む）、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、非小細胞癌、大腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞癌または虚血再灌流傷害の処置に使用するための、実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチド。
【０７０９】
157．実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチドの有効量を対象に投与することを含む、慢性閉塞性肺疾患（COPD）または（COPD）の増悪を処置する方法。
【０７１０】
158．実施形態1〜37または41〜143のいずれか一つのポリペプチドの有効量を対象に投与することを含む、嚢胞性線維症、喘息、重症喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成からなる群より選択される状態を処置する方法。
【０７１１】
159．アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管新生および新しい血管の発達を特徴とする疾患（黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む）、多発性硬化症、乾癬、加齢性黄斑変性疾患、眼ベーチェット病、ぶどう膜炎、肺動脈高血圧（PAH）（特発性PAH、家族性PAHおよび随伴性PAHを含む）、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、非小細胞癌、大腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞癌および虚血灌流傷害からなる群より選択される状態を、実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つによるポリペプチドの有効量を対象に投与することによって処置する方法。
【０７１２】
160．慢性閉塞性肺疾患（COPD）またはCOPDの増悪を処置するための医薬品の製造における、実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチドの使用。
【０７１３】
161．喘息、重症喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成を処置するための医薬品の製造における、実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチドの使用。
【０７１４】
162．アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管新生および新しい血管の発達を特徴とする疾患（黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む）、多発性硬化症、乾癬、加齢性黄斑変性疾患、眼ベーチェット病、ぶどう膜炎、肺動脈高血圧（PAH）（特発性PAH、家族性PAHおよび随伴性PAHを含む）、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、非小細胞癌、大腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞癌または虚血再灌流傷害を処置するための医薬品の製造における、実施形態1〜38または42〜144のいずれか一つのポリペプチドの使用。
【０７１５】
163．実施形態49、58、67、76、85、94、103または112のいずれか一つのポリペプチドによるCXCR2への結合を交差ブロックする能力を有する、実施形態1〜38のいずれか一つのポリペプチド。
【０７１６】
164．該第1および第2抗原結合ドメインが、実施形態1〜22、32〜38または42〜144のいずれか一つにおける該ドメインについて示した特徴のいずれかを含む、実施形態39〜41のいずれか一つの分子。
【０７１７】
165．実施形態106〜135の特徴のいずれかを示す、実施形態164の分子。
【０７１８】
166．実施形態49、58、67、76、85、94、103または112のいずれか一つのポリペプチドによるCXCR2への結合を交差ブロックする能力を有する、CXCR2を指向するまたはCXCR2に結合する少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド。
【０７１９】
167．実施形態14に記載の構造を含む実施形態3〜14および22〜39のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23727がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23726がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含むプリペプチド。
【０７２０】
168．該第2免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23727がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域と、該第1免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23726がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域とをさらに含む、実施形態167のポリペプチド。
【０７２１】
169．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインに、配列番号220に示すアミノ配列を有するペプチドリンカーによって接合されている、実施形態168のポリペプチド。
【０７２２】
170．実施例14に記載の構造を含む実施形態3〜14および22〜39のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23725がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23726がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０７２３】
171．該第2免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23725がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域と、該第1免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23726がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域とをさらに含む、実施形態170のポリペプチド。
【０７２４】
172．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインに、配列番号220に示すアミノ配列を有するペプチドリンカーによって接合されている、実施形態171のポリペプチド。
【０７２５】
173．実施形態14に記載の構造を含む実施形態3〜14および22〜39のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23725がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23728がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０７２６】
174．該第2免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23725がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域と、該第1免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23728がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域とをさらに含む、実施形態173のポリペプチド。
【０７２７】
175．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインに、配列番号220に示すアミノ配列を有するペプチドリンカーによって接合されている、実施形態174のポリペプチド。
【０７２８】
176．実施形態14に記載の構造を含む実施形態3〜14および22〜39のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23727がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23728がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０７２９】
177．該第2免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23727がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域と、該第1免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23728がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域とをさらに含む、実施形態176のポリペプチド。
【０７３０】
178．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインに、配列番号220に示すアミノ配列を有するペプチドリンカーによって接合されている、実施形態177のポリペプチド。
【０７３１】
179．実施形態14に記載の構造を含む実施形態3〜14および22〜39のポリペプチドであって、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23723がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含み、かつ該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23725がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０７３２】
180．該第1免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23723がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域と、該第2免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23725がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域とをさらに含む、実施形態179のポリペプチド。
【０７３３】
181．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインに、配列番号220に示すアミノ配列を有するペプチドリンカーによって接合されている、実施形態180のポリペプチド。
【０７３４】
182．実施形態14に記載の構造を含む実施形態3〜14および22〜39のポリペプチドであって、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23723がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含み、かつ該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23727がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０７３５】
183．該第1免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23723がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域と、該第2免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23727がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域とをさらに含む、実施形態182のポリペプチド。
【０７３６】
184．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインに、配列番号220に示すアミノ配列を有するペプチドリンカーによって接合されている、実施形態183のポリペプチド。
【０７３７】
185．実施形態14に記載の構造を含む実施形態3〜14および22〜39のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23724がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23723がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０７３８】
186．該第2免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23724がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域と、該第1免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23723がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域とをさらに含む、実施形態185のポリペプチド。
【０７３９】
187．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインに、配列番号220に示すアミノ配列を有するペプチドリンカーによって接合されている、実施形態186のポリペプチド。
【０７４０】
188．実施形態14に記載の構造を含む実施形態3〜14および22〜39のポリペプチドであって、該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23724がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含み、かつ該第1免疫グロブリン単一可変ドメインが、寄託されたプラスミドDSM23728がコードするKabatナンバリングによるCDRアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【０７４１】
189．該第2免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23724がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域と、該第1免疫グロブリン単一可変ドメイン中に、寄託されたプラスミドDSM23728がコードするKabatナンバリングによるアミノ酸配列を有するFR領域とをさらに含む、実施形態188のポリペプチド。
【０７４２】
190．該第2免疫グロブリン単一可変ドメインが、該第1免疫グロブリン単一可変ドメインに、配列番号220に示すアミノ配列を有するペプチドリンカーによって接合されている、実施形態189のポリペプチド。
【配列表】
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