(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖類リン酸又は単糖類リン酸のリン酸基に、アミノアルコール又はポリエチレングリコールが結合された単糖類リン酸誘導体が、無機系粒子の表面に付着されて表面が親水性に改質された親水性ナノ粒子であって、前記表面改質された親水性ナノ粒子のサイズは１ｎｍ〜２００ｎｍであり、数平均流体力学的径と無機系粒子のコアサイズとの差は６ｎｍ以下であり、前記無機系粒子は、金属、金属カルコゲン化物、金属酸化物、磁性合金、及びこれらの多成分混成構造体からなる群から選択される何れか１又は２以上である、請求項１に記載のナノ粒子である、表面改質された親水性ナノ粒子。
【請求項２】
前記単糖類リン酸は、グルコース‐６‐リン酸、フラクトース‐６‐リン酸、及びマンノース‐６‐リン酸からなる群から選択される１又は２以上を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記アミノアルコールは、エタノールアミン、ヘプタミノール、イソエタリン、ノルエピネフリン、プロパノールアミン及びスフィンゴシンからなる群から選択される１又は２以上である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールは、一方又は両方の末端にアミン基を有し、数平均分子量が３００〜５０,０００である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記金属は、Pd、Pt、Au、Cu及びAgからなる群から選択される１又は２以上であり、
前記金属カルコゲン化物は、MxEyであって、
(前記Mは、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zr、Mo、Ru、Rh、Ag、W、Re、Ta、Hf又はZnであり、
E=O、S又はSeであり、
xは１〜３であり、
yは１〜５である。)
前記金属酸化物は、酸化チタン、酸化バナジウム、酸化クロム、酸化マンガン、酸化鉄、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化銅、酸化ジルコニウム、酸化モリブデン、酸化ルテニウム、酸化ロジウム、酸化銀、酸化タングステン、酸化レニウム、酸化タンタル、酸化ハフニウム及び酸化亜鉛からなる群から選択される１又は２以上であり、
前記磁性合金は、CoCu、CoPt、FePt、CoSm、NiFe及びNiFeCoからなる群から選択される１又は２以上である、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記多成分混成構造体は、コア‐シェル又はヘテロ接合構造体である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記金属酸化物は酸化鉄である、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記酸化鉄は、FeO、Fe3O4(マグネタイト(magnetite))、α‐Fe2O3、β‐Fe2O3、γ‐Fe2O3(マグヘマイト(maghemite))、ε‐Fe2O3、Fe(OH)2、Fe(OH)3、α‐FeOOH、β‐FeOOH、γ‐FeOOH、δ‐FeOOH、Fe5HO8・４H2O、５Fe2O3・９H2O、FeOOH・４H2O、Fe8O8(OH)6(SO)・nH2O、Fe3+16O16(OH・SO4)12-13・１０-１２H2O、及びFe3O4(マグネタイト(magnetite))とγ‐Fe2O3(マグヘマイト(maghemite))との混合物からなる群から選択される１又は２以上である、請求項７記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記酸化鉄は、Fe3O4(マグネタイト(magnetite))、γ‐Fe2O3(マグヘマイト(maghemite))及びこれらの混合物からなる群から選択される１つ又は２つ以上である、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
請求項１に記載のナノ粒子が水に分散されているコロイド溶液。
【請求項１１】
請求項１０に記載のコロイド溶液を含む造影剤。
【請求項１２】
前記造影剤は、磁気共鳴画像Ｔ１造影剤又は磁気共鳴画像Ｔ２造影剤である、請求項１１に記載の造影剤。
【請求項１３】
前記磁気共鳴画像Ｔ１造影剤は、血管造影用である、請求項１２に記載の造影剤。
【請求項１４】
前記磁気共鳴画像Ｔ２造影剤は、リンパ節造影用である、請求項１２に記載の造影剤。
【請求項１５】
単糖類リン酸又は単糖類リン酸のリン酸基に、アミノアルコール又はポリエチレングリコールが結合された単糖類リン酸誘導体が水に分散された溶液；極性有機溶媒；及び金属、金属カルコゲン化物、金属酸化物、磁性合金、及びこれらの多成分混成構造体からなる群から選択される１又は２以上の表面に親油性配位子が付着されたナノ粒子；を接触させて、親油性のナノ粒子の表面を親水性に改質させ、表面改質された親水性ナノ粒子のサイズは１ｎｍ〜２００ｎｍであり、数平均流体力学的径と無機系粒子のコアサイズとの差は６ｎｍ以下である、表面改質された親水性ナノ粒子の製造方法。
【請求項１６】
前記金属酸化物は、Fe3O4(マグネタイト(magnetite))、γ‐Fe2O3(マグヘマイト(maghemite))、及びこれらの混合物からなる群から選択される１又は２以上である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単糖類‐リン酸又はその誘導体が表面に付着された親水性ナノ粒子を含む組成物、そのコロイド溶液及びその用途に関する。より詳細には、単糖類‐リン酸又はその誘導体で表面改質された無機系ナノ粒子を含む組成物、それを水に分散させたコロイド溶液、及びそれを含む磁気共鳴画像造影剤（Magnetic Resonance Imaging contrast agent）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は、生体画像技術、医療、遺伝子伝達、薬物送達、疾病の診断及び治療などの多様な分野で応用されている。特に、最近、ナノ粒子は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）造影剤、細胞レベルの治療、温熱療法、薬物送達、核酸分離などを含む多様な生物医学分野で幅広く使用されているため、その重要性が増大している。
【０００３】
ナノ粒子を生物医学分野に応用するために最も重要なことは、第一に、高い品質のナノ粒子を確保するとともに、ナノ粒子が体内で安定して維持されるように水分散安定性を持たせることである。ここで、高い品質のナノ粒子とは、i）粒子サイズの均一性、ii）粒子サイズの調節の容易性、iii）粒子の優れた結晶性などを有するナノ粒子を意味する。
【０００４】
このような高い品質のナノ粒子を人体及び生物科学技術に適用することで生体外（in vitro）及び生体内（in vivo）の両方において満足できる結果を得るためには、応用分野の特性に適したナノ粒子を選択しなければならず、何よりも、優れた分散性を有する生体適合性の物質でナノ粒子を処理する技術を備えなければならない。
【０００５】
現在市販されている大部分のナノ粒子は、水系でｐＨを調節してナノ粒子を沈殿させる共沈により合成されるか、または気相で合成することで得られる。しかし、上述の方法により生成されたナノ粒子は、合成されたナノ粒子の表面に安定化剤がないため凝集が激しく発生するだけでなく、ナノ粒子のサイズを制御してナノ粒子を均一なサイズに製造することが困難である。
【０００６】
したがって、最近、有機溶媒内で無機系前駆体を界面活性剤とともに高温で熱分解することで、親油性界面活性剤が表面に付着されたナノ粒子を合成する方法が開発された。この方法は、ナノ粒子のサイズ及び形状の調節に有利であり、合成されたナノ粒子は、そのサイズが非常に均一で、且つ結晶性に優れて、凝集がないという利点を有する。しかし、合成されたナノ粒子は、疏水性を有する界面活性剤が表面に付着されているため、水に分散されず、生体内で用いることが困難であるという欠点がある。したがって、このように製造された無機系ナノ粒子を生体内で用いるためには、親水性に表面改質する必要がある。疏水性ナノ粒子を親水性に表面改質する方法として、大きく３つの方法がある。
【０００７】
第一は、配位子交換（ligand exchange）方法であって、ナノ粒子の表面に結合できる官能基を有する過量の配位子を導入して、界面活性剤が取り外された位置に配位子を付着させる方法である。
【０００８】
第二は、カプセル化（encapsulation）方法であって、両親媒性配位子をナノ粒子に導入して、両親媒性配位子の疏水性部分がナノ粒子の界面活性剤部分に向けるとともに、親水性部分が外側に出ることにより親水化される方法である。しかし、この方法は、それぞれの粒子を両親媒性物質で囲まなければならないため、実験条件が複雑であって、大量生産が困難であるという欠点がある。
【０００９】
第三は、ミセル（micelle）を用いる方法であって、疏水性ナノ粒子が分散された溶媒中にミセルを形成して、ナノ粒子がミセルに導入されるようにする方法である。この方法は、1個のミセルに数個のナノ粒子が導入されるため、小さい流体力学的径の親水性ナノ粒子を製造することが困難である。また、生体内におけるイオンの濃度及び血流の速度が増加・減少することでミセルが破壊され得るという欠点がある。
【００１０】
したがって、近年、配位子交換方法を用いてナノ粒子を親水化するための多くの研究が行われている。しかし、界面活性剤が結合されているナノ粒子の表面に配位子を結合させることができる官能基を適切に選択することが重要である。通常、帯電性官能基がナノ粒子の表面によく結合されるが、その例としては、主に、アミン系、リン酸系（phosphates）、硫酸系（sulfates）、カルボン酸塩（carboxylate）などが挙げられる。
【００１１】
通常、親水化されたナノ粒子は、親水化物質の特性に応じて水での分散安定性が決定される。単分子の場合、分子の電荷による斥力によってナノ粒子が凝集されず、水分散性が維持される。しかし、ｐＨが変わるとナノ粒子が凝集されるため、生体内における分散安定性が劣る。したがって、分子量が相対的に大きい配位子で表面改質し、ファンデルワールスカを用いたナノ粒子の親水化方法が研究されている。しかし、分子量が大きい配位子で親水化されたナノ粒子は、流体力学的径が大きくなる欠点があり、分子量が大きくなるほど、効果的な配位子交換反応が困難となるという欠点がある。
【００１２】
また、生体適合性の配位子の製造は、その製造工程が非常に複雑であって、大量生産が困難であるという欠点がある。
【００１３】
最近、ホスフィンオキシド（phosphine oxide）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された高分子を用いてナノ粒子を水に分散させる方法が、非特許文献１に発表された。また、メトキシポリエチレングリコールを塩化ホスホリル（ＰＯＣｌ3）と反応させてＰＯ‐ＰＥＧ配位子を合成し、それを有機溶媒中に分散されているナノ粒子と配位子交換反応させて、水に分散させる方法が公開された。この方法は、比較的簡単な製造方法を採用しているが、配位子を製造する際に、塩化ホスホリル（ＰＯＣｌ3）がすぐに酸素と接して酸化されるため、アルゴンや窒素などの不活性雰囲気で合成しなければならないなどの工程上の困難性がある。さらに、配位子を製造する際に、１個〜３個のポリエチレングリコールがホスホリル基に結合されるため、再現性のある配位子を製造することが困難であるという欠点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】ケミカル  コミュニケーション（Chem．Comm．），ヒョン  ビン  ナ（Hyon   Bin Na）, イン  ス  リー（In Su Lee）, ヘオンジン  セオ（Heonjin Seo）, ヨン    イル  パク（Yong Il Park）, ジュン  ヒー  リー（Jung Hee Lee）, サン−ウー  キム（  Sang-Wook Kim*）， タエワン  ヒョン（Taeghwan Hyeon*） 「水分散性金属酸化物ナノ  結晶のための多目的なPEG誘導体化ホスフィンオキシド配位子」（"Versatile PEG-derivat  ized Phosphine Oxide Ligands for Water-Dispersible Metal Oxide Nanocrystals,"），   ケミカル  コミュニケーション（Chem．Comm．）, 2007年, 5167
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、上記の従来技術の問題点を解消するために鋭意検討した結果、ナノ粒子を水系に分散させるために、ナノ粒子の表面を親水性に改質させることができる分散安定化剤を見出し、この分散安定化剤が付着された親水性ナノ粒子を含む組成物を生物医学分野などに効率的に利用できることが分かった。
【００１６】
本発明の目的は、単糖類リン酸、又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された親水性ナノ粒子を含む組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、単糖類リン酸を、ポリエチレングリコール系高分子又はアミン基が付いているアルコールと結合させることで形成される単糖類リン酸誘導体を提供するとともに、この誘導体が表面に付着された親水性ナノ粒子を含む組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、前記単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された親水性ナノ粒子を含む組成物を水に分散させたコロイド溶液、及びそのコロイド溶液を含む造影剤を提供するとともに、その造影剤を生体内に注入してイメージングする方法を提供することにある。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が水に分散された溶液に、極性有機溶媒中の親油性ナノ粒子を接触させることで、親油性ナノ粒子の表面を親水性ナノ粒子で改質させる工程を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記の目的を達成するために、本発明によれば、無機系ナノ粒子が生体適合的で、且つ優れた水分散性を有するように、単糖類リン酸又はその誘導体を用いて分散安定化されるように表面改質されたナノ粒子を含む組成物、それを含むコロイド溶液、及び前記コロイド溶液を含む造影剤が提供される。
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
本発明における単糖類リン酸は、下記化学式１で表される構造を有する。
【００２３】
［化学式１］
【００２４】
【化１】
0005951769.tif 000002
【００２５】
前記化学式１において、リン酸基には１個の単糖類が結合されており、本発明で用いられる単糖類は、炭素数２〜９の単糖類を含む。その具体的な例としては、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、エリトルロース、エリトロース、トレオース、リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フコース、フクロース、ラムノース、セドヘプツロース、ノイラミン酸などが挙げられるが、これに限定されない。
【００２６】
本発明によれば、単糖類リン酸は、好ましくは、グルコース６‐リン酸（Glucose  ６‐phosphate）、フルクトース６‐リン酸（Fructose  ６‐phosphate）、又はマンノース６‐リン酸（Mannose  ６‐phosphate）である。
【００２７】
本発明によれば、単糖類リン酸誘導体は、下記化学式２で表される構造を有する。
【００２８】
［化学式２］
【００２９】
【化２】
0005951769.tif 000003
【００３０】
前記化学式２中、
Ｘ1は単糖類であり、
Ｘ2は、ＯＨ、アミノアルコール又はポリエチレングリコールであり、
Ｘ3はＯＨである。
【００３１】
アミノアルコールは、好ましくは、エタノールアミン、ヘプタミノール、イソエタリン、ノルエピネフリン、プロパノールアミン、及びスフィンゴシンから選択される１つ又は２つ以上である。
【００３２】
ポリエチレングリコールは、好ましくは、一方又は両方の末端にアミン基を有しており、分子量が３００〜５，０００である。
【００３３】
本発明によれば、ナノ粒子は、金属、金属カルコゲン化物、金属酸化物、磁性物質、磁性合金、半導体物質、又は多成分混成構造体からなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
【００３４】
本発明によれば、金属は、Ｐｄ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｃｕ、及びＡｇからなる群から選択され、金属カルコゲン化物は、ＭXＥY（Ｍ＝Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｒ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ｗ、Ｒｅ、Ｔａ、Ｈｆ、及びＺｎ；Ｅ＝Ｏ、Ｓ又はＳｅ；０＜ｘ≦３；０＜ｙ≦５）から選択され、金属酸化物は、酸化チタン、酸化バナジウム、酸化クロム、酸化マンガン、酸化鉄、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化銅、酸化ジルコニウム、酸化モリブデン、酸化ルテニウム、酸化ロジウム、酸化銀、酸化タングステン、酸化レニウム、酸化タンタル、酸化ハフニウム、及び酸化亜鉛から選択されることができる。より好ましくは、酸化鉄は、ＦｅＯ、Ｆｅ3Ｏ4（マグネタイト（magnetite））、α‐Ｆｅ2Ｏ3、β‐Ｆｅ2Ｏ3、γ‐Ｆｅ2Ｏ3（マグヘマイト（maghemite））、ε‐Ｆｅ2Ｏ3、Ｆｅ（ＯＨ）2、Ｆｅ（ＯＨ）3、α‐ＦｅＯＯＨ、β‐ＦｅＯＯＨ、γ‐ＦｅＯＯＨ、δ‐ＦｅＯＯＨ、Ｆｅ5ＨＯ8・４Ｈ2Ｏ、５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ、ＦｅＯＯＨ・４Ｈ2Ｏ、Ｆｅ8Ｏ8（ＯＨ）6（ＳＯ）・ｎＨ2Ｏ、Ｆｅ3+16Ｏ16（ＯＨ・ＳＯ4）12-13・１０−１２Ｈ2Ｏ、及びＦｅ3Ｏ4（マグネタイト（magnetite））とγ‐Ｆｅ2Ｏ3（マグヘマイト（maghemite））との混合物から選択されることができる。好ましくは、磁性物質は、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｇｄ、ＭＭ´2Ｏ4、ＭXＯY（Ｍ又はＭ´＝Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｄ、Ｃｒ；０＜ｘ≦３；０＜ｙ≦５）からなる群から選択され、磁性合金は、ＣｏＣｕ、ＣｏＰｔ、ＦｅＰｔ、ＣｏＳｍ、ＮｉＦｅ、及びＮｉＦｅＣｏからなる群から選択される。半導体物質は、２族及び６族からそれぞれ選択された元素を含む半導体、３族及び５族からそれぞれ選択された元素を含む半導体、４族元素を含む半導体、４族及び６族からそれぞれ選択された元素を含む半導体、及び５族及び６族からそれぞれ選択された元素を含む半導体からなる群から選択される。多成分混成構造体は、金属、金属カルコゲン化物、磁性物質、磁性合金、及び半導体物質からなる群から選択される２種以上の成分を含み、さらにコア‐シェル構造又はヘテロ接合構造を有するものを含むことができる。
【００３５】
前記表面改質された親水性ナノ粒子のサイズは１ｎｍ〜２００ｎｍであることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明は、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が付着された親水性ナノ粒子を含む組成物が水に分散されたコロイド溶液、そのコロイド溶液を含む造影剤、及びその造影剤を生体内に注入してイメージングする方法を提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された酸化鉄ナノ粒子を含む組成物を提供する。単糖類リン酸は、好ましくは、グルコース６‐リン酸、フルクトース６‐リン酸、又はマンノース６‐リン酸から選択される。単糖類リン酸誘導体は、単糖類リン酸のリン酸基に、アミノアルコール又はポリエチレングリコール、より好ましくは、一方又は両方の末端にアミン基を有し、且つ分子量が３００〜５０，０００であるポリエチレングリコールが結合されていることが好ましい。酸化鉄は、多様な酸化鉄が用いられることができ、その中でも、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γ‐Ｆｅ2Ｏ3）、又はそれらが混合された酸化鉄が好ましい。本発明は、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された酸化鉄ナノ粒子を含む組成物が水に分散されたコロイド溶液を提供する。また、例えば、塩化ナトリウム溶液、デキストロース注射液などの溶剤、ｐＨを調節するための緩衝剤、血圧に合わせて浸透圧を調節するための等張化剤、グルコースなどの無痛化剤などの各種注射可能な添加剤を前記コロイド溶液に添加することで、生体内に注射できる造影剤を製造し、この造影剤を生体内に注入してイメージングする方法を提供する。
【００３８】
また、本発明は、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された親水性酸化鉄を含む組成物が水に分散されたコロイドであって、i）前記酸化鉄は、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γ‐Ｆｅ2Ｏ3）、又はこれらが混合された酸化鉄であり、ii）親水性組成物の数平均流体力学的径（Hydrodynamic Diameter）と酸化鉄コア粒子の直径（Core diameter）との差が６ｎｍ以下であることを特徴とするコロイドを提供するとともに、このコロイドを含む磁気共鳴画像（ＭＲＩ）造影剤を提供する。
【００３９】
また、本発明は、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された親水性酸化鉄を含む組成物が水に分散されたコロイドであって、i）前記単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体は、グルコース６‐リン酸（Glucose  ６‐phosphate）又はグルコース６‐リン酸にエタノールアミン又はポリエチレングリコールが付着されたものであり、ii）酸化鉄コアのサイズは２ｎｍ〜８ｎｍであり、iii）親水性組成物の数平均流体力学的径（Dynamic Light Scatteringで測定）は２ｎｍ〜１５ｎｍであることを特徴とするコロイドを提供するとともに、このコロイドを含むＭＲＩ  Ｔ１造影剤を提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、単糖類リン酸誘導体が表面に付着された親水性酸化鉄を含む組成物が水に分散されたコロイドであって、i）前記単糖類リン酸誘導体は、グルコース６‐リン酸にエタノールアミン又はポリエチレングリコールが付着されたものであり、ii）酸化鉄コアのサイズは７ｎｍ〜２５ｎｍであり、iii）親水性組成物の数平均流体力学的径（Dynamic Light Scatteringで測定）は７ｎｍ〜５０ｎｍであることを特徴とするコロイドを提供するとともに、このコロイドを含むＭＲＩ  Ｔ２造影剤を提供する。
【００４１】
さらに、本発明は、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が水に分散された溶液を、極性有機溶媒及び親油性ナノ粒子溶液に接触させることで、ナノ粒子の表面を親水性に改質させる工程を提供する。ここで、親油性ナノ粒子の中心粒子は、金属、金属カルコゲン化物、金属酸化物、磁性物質、磁性合金、半導体物質、又は多成分混成構造体であり、好ましくは酸化鉄である。極性有機溶媒は、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、ｎ‐プロパノール、メタノール、エタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、アセトン、酢酸であることが好ましい。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体で無機系ナノ粒子の表面を親水性に改質することで、生体適合的で、且つ優れた水分散性を有するナノ粒子組成物及びそのコロイドを容易に製造することができる。このように製造されたナノ粒子組成物は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）造影剤、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）用造影剤などの生体画像分野、量子ドット発光素子などのナノ‐電子融合技術分野、温熱療法などの生物医学分野などの多様な分野で効率的に用いられることができる。また、従来の分散安定化剤により分散されたナノ粒子組成物に比べ、優れた分散安定性及び相対的に小さい流体力学的径を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ｎ‐ヘキサン溶媒に分散されたサイズ３ｎｍの表面に、オレイン酸が付着された酸化鉄ナノ粒子を示す透過型電子顕微鏡（Transmission Electron microscopy、ＴＥＭ）写真である。
【図２】実施例１の方法により水に分散されたサイズ３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図３】実施例１、２、３の方法により水に分散された酸化鉄ナノ粒子の流体力学的径を分析したもので、１は、３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子をグルコース６‐リン酸で親水化して得られたナノ粒子であって、その流体力学的径が３．８ｎｍであり、２は、７ｎｍの酸化鉄ナノ粒子をマンノース６‐リン酸で親水化して得られたナノ粒子であって、その流体力学的径が８．７ｎｍであり、３は、１０ｎｍの酸化鉄ナノ粒子をフルクトース６‐リン酸で親水化して得られたナノ粒子であって、その流体力学的径が１１．３ｎｍであることを示す分析結果である。
【図４】実施例７‐１におけるラットの体内（in vivo）血管造影画像である。
【図５】実施例７‐１におけるラットの体内（in vivo）血管造影画像の信号強度（signal intensity）を信号対雑音比（signal to noise ratio）で示したものである。
【図６】実施例８‐１におけるラットの体内（in vivo）血管造影画像である。
【図７】実施例８‐１におけるラットの体内（in vivo）血管造影画像の信号強度を信号対雑音比で示し、特に、右心房、下大静脈、大動脈などの信号強度を示したものである。
【図８】実施例８‐２におけるラットの体内（in vivo）血管造影画像である。
【図９】実施例８‐２におけるラットの体内（in vivo）血管造影画像の信号強度を信号対雑音比で示し、特に、右心房、下大静脈、大動脈などの信号強度を示したものである。
【図１０】実施例８‐３におけるマウスの体内（in vivo）  ＭＲＩリンパ節（lymph  node）造影画像で、注入前（ＰＲＥ）及び注入１日後（１Day）の画像であって、上端の画像はマウスの上腕リンパ節（brachial  lymph  node）を示し、下端の画像はマウスの鼠径リンパ節（inguinal  lymph  node）を示す。
【図１１】実施例８‐３におけるマウスの体内（in vivo）リンパ節画像の信号強度を信号対雑音比で示し、特に、上腕及び鼠径リンパ節の信号強度の変化を示したものである。
【図１２】実施例９におけるマウスの体内（in vivo）  ＭＲＩリンパ節造影画像で、注入前（ＰＲＥ）及び注入１日後（１Day）の画像であって、上端の画像はマウスの上腕リンパ節を示し、下端の画像はマウスの鼠径リンパ節を示す。
【図１３】実施例９におけるマウスの体内（in vivo）リンパ節画像の信号強度を信号対雑音比で示し、特に、上腕及び鼠径リンパ節の信号強度の変化を示したものである。
【図１４】実施例１１のＭＴＴアッセイの結果であって、Ａはグルコース６‐リン酸で安定化された１０ｎｍの酸化鉄ナノ粒子、Ｂはグルコース６‐リン酸‐ＰＥＧ誘導体で安定化された１０ｎｍの酸化鉄ナノ粒子、Ｃはグルコース６‐リン酸‐アミノアルコールで安定化された３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
上述の目的、特徴及び長所は、添付図面を参照して後述する詳細な説明によりさらに明らかになる。これにより、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想を容易に実施できるのであろう。また、本発明を説明するにあたって用いられる技術用語及び科学用語において、他に定義されない限り、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が通常的に理解する意味を有し、本発明に係わる公知技術についての説明が本発明の要旨を不明瞭にする可能性があると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【００４５】
本発明は、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体がナノ粒子の表面に付着された組成物を提供する。
【００４６】
本発明における単糖類リン酸は、グルコース６‐リン酸、フルクトース６‐リン酸、又はマンノース６‐リン酸の形態のものであり、水に分散されていてもよい。また、単糖類リン酸誘導体は、グルコース６‐リン酸、フルクトース６‐リン酸、又はマンノース６‐リン酸の単糖類リン酸のリン酸基に、水系媒質に対して親和性を有するポリエチレングリコール系生体適合性高分子が結合された単糖類‐リン酸‐ポリエチレングリコール、及び／又はアミン基が付いているアルコールが結合された単糖類‐リン酸‐アミノアルコールであることができる。
【００４７】
単糖類リン酸の構造は下記化学式１のとおりである。
【００４８】
［化学式１］
【００４９】
【化１】
0005951769.tif 000004
【００５０】
前記化学式１において、リン酸基には１個の単糖類が結合されており、本発明による単糖類は炭素数２〜９の単糖類を含む。その具体的な例としては、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、エリトルロース、エリトロース、トレオース、リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース、プリコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フコース、フクロース、ラムノース、セドヘプツロース、ノイラミン酸などが挙げられるが、これに限定されない。
【００５１】
また、単糖類の位置に多糖類が結合されることができ、多糖類は、二糖類、三糖類、四糖類、オリゴ糖、及び多糖類を含む。その具体的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース、ラフィノース、メレチトース、マルトトリオース、アカルボース、澱粉、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、クルカン、グリコーゲン、アミロース、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、マルトデキストリン、トルクタン、マンナン、ガラクタンなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００５２】
単糖類リン酸誘導体の構造は、下記化学式２のとおりである。
【００５３】
［化学式２］
【００５４】
【化２】
0005951769.tif 000005
【００５５】
前記化学式２中、Ｘ1は単糖類であり、好ましくは、グルコース、フルクトース、マンノースである。
【００５６】
Ｘ2は、ＯＨ、アミノアルコール、又はポリエチレングリコールである。
【００５７】
アミノアルコールの例としては、エタノールアミン、ヘプタミノール、イソエタリン、ノルエピネフリン、プロパノールアミン、スフィンゴシンが挙げられる。
【００５８】
ポリエチレングリコールは、（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ、（ＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＯ）nＯＨ、又は（ＯＣＨ2ＣＯ）nＯＨであり、ｎは１〜１２００の整数である。好ましくは、ポリエチレングリコールは、一方又は両方の末端にアミン基を有しており、分子量が３００〜５０，０００である。前記単糖類リン酸に誘導体を結合させる方法としては、２つの分子が共有結合できる反応であれば使用可能である。
【００５９】
アミノアルコールの結合は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１‐ethyl‐３‐［３‐dimethylaminopropyl］carbodiimide hydrochloride）及びＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ、N‐hydroxysuccinimide）を用いて、リン酸基とアミノアルコールのアミン基とをホスホルアミデート（phosphoramidate）結合形成させることでなされる。ポリエチレングリコールの結合は、ＥＤＣ及びＮＨＳを用いてエチレンジアミン（Ｃ2Ｈ8Ｎ2）をリン酸基と共有結合させて単糖類リン酸エチレンジアミンを製造した後、ＥＤＣ及びＮＨＳを用いて、一方の末端にカルボキシル基を有するポリエチレングリコールと共有結合させるか、又は、ＥＤＣ及びＮＨＳを用いて、一方の末端にアミン基を有するＰＥＧと単糖類‐リン酸を共有結合させることでなされる。
【００６０】
Ｘ3はＯＨである。
【００６１】
単糖類‐リン酸のうちグルコース６‐リン酸は、解糖過程で生成される物質であって、生体内で豊富であるため、生体適合性を有する。また、他の単糖類リン酸及び単糖類リン酸誘導体も、優れた生体適合性を有すると期待される。
【００６２】
ナノ粒子は、金属、金属カルコゲン化物、金属酸化物、磁性物質、磁性合金、半導体物質、又は多成分混成構造体から選択されることができる。ナノ粒子は、その表面に親油性配位子が付着されていることができる。例えば、酸化鉄の場合、熱分解により合成されたナノ粒子の表面に、オレイン酸に起因する有機物、合成溶媒に起因する有機物、または沈殿剤に起因する有機物などが付着されていることができる。ナノ粒子の表面に付着されている有機物は、本発明による方法によって殆ど除去されるため、親水性を有するナノ粒子組成物となる。ナノ粒子の直径は１ｎｍ〜２００ｎｍであり、好ましくは１ｎｍ〜５０ｎｍである。
【００６３】
金属ナノ粒子は、Ｐｄ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｃｕ、及びＡｇからなる群から選択され、金属カルコゲン化物は、ＭXＥY（Ｍ＝Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｒ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ａｇ、Ｗ、Ｒｅ、Ｔａ、Ｈｆ、及びＺｎ；Ｅ＝Ｏ、Ｓ又はＳｅであり；０＜ｘ≦３；０＜ｙ≦５）からなる群から選択され、金属酸化物は、酸化チタン、酸化バナジウム、酸化クロム、酸化マンガン、酸化鉄、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化銅、酸化ジルコニウム、酸化モリブデン、酸化ルテニウム、酸化ロジウム、酸化銀、酸化タングステン、酸化レニウム、酸化タンタル、酸化ハフニウム、及び酸化亜鉛からなる群から選択されることができる。金属酸化物のうち、酸化鉄の具体的な例としては、ＦｅＯ、Ｆｅ3Ｏ4（マグネタイト（magnetite））、α‐Ｆｅ2Ｏ3、β‐Ｆｅ2Ｏ3、γ‐Ｆｅ2Ｏ3（マグヘマイト（maghemite））、ε‐Ｆｅ2Ｏ3、Ｆｅ（ＯＨ）2、Ｆｅ（ＯＨ）3、α‐ＦｅＯＯＨ、β‐ＦｅＯＯＨ、γ‐ＦｅＯＯＨ、δ‐ＦｅＯＯＨ、Ｆｅ5ＨＯ8・４Ｈ2Ｏ、５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ、ＦｅＯＯＨ・４Ｈ2Ｏ、Ｆｅ8Ｏ8（ＯＨ）6（ＳＯ）・ｎＨ2Ｏ、Ｆｅ3+16Ｏ16（ＯＨ・ＳＯ4）12-13・１０−１２Ｈ2Ｏ、又はＦｅ3Ｏ4（マグネタイト（magnetite））とγ‐Ｆｅ2Ｏ3（マグヘマイト（maghemite））との混合物から選択されることができる。磁性物質は、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｇｄ、ＭＭ´2Ｏ4、ＭXＯY（Ｍ又はＭ´＝Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｄ、Ｃｒ；０＜ｘ≦３；０＜ｙ≦５）からなる群から選択され、磁性合金は、ＣｏＣｕ、ＣｏＰｔ、ＦｅＰｔ、ＣｏＳｍ、ＮｉＦｅ、及びＮｉＦｅＣｏからなる群から選択される。半導体物質は、２族及び６族からそれぞれ選択された元素を含む半導体、３族及び５族からそれぞれ選択された元素を含む半導体、４族元素を含む半導体、４族及び６族からそれぞれ選択された元素を含む半導体、及び５族及び６族からそれぞれ選択された元素を含む半導体からなる群から選択される。多成分混成構造体は、金属、金属カルコゲン化物、磁性物質、磁性合金、及び半導体物質からなる群から選択された２種以上の成分を含み、コア‐シェル構造又はヘテロ接合構造を有することができる。
【００６４】
単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着されたナノ粒子を含む組成物の製造方法は、ナノ粒子を、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が溶解された溶液及び溶媒と接触させることを含む。単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体は、水に溶解された水溶液として用いられることができる。ナノ粒子は親水性又は疎水性（即ち、親油性）であるため、水又は有機溶媒に分散されていることができる。単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体がナノ粒子及び溶媒と適切に接触されるように、水に対して親和性を有する溶媒、例えば、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、ｎ‐プロパノール、メタノール、エタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、アセトン、酢酸などの極性溶媒を使用することが好ましい。単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体によりナノ粒子の表面に付着された物質が交換（配位子交換）を起こすと考えられる。一部の単糖類又は単糖類誘導体は、ミセル形態でナノ粒子を囲んでいることができる。
【００６５】
本発明は、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された酸化鉄ナノ粒子を含む組成物が水に分散されたコロイド溶液を提供する。このコロイド溶液を生体内に注射するために、塩化ナトリウム溶液、デキストロース注射液などの溶剤、ｐＨを調節するための緩衝剤、血圧に合わせて浸透圧を調節するための等張化剤、グルコースなどの無痛化剤などの多様な注射可能な添加剤を添加して造影剤を製造し、この造影剤を生体内に注入してイメージングする方法を提供する。生体内注入方法としては、静脈注射、経口投与、吸入などがあり、静脈注射が最も好ましい。イメージング方法としては、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）、Ｘ−ｒａｙ、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴなどが挙げられ、このうちＭＲＩが最も好ましい。ＭＲＩによる造影としては、陰性造影（Ｔ２、darkening）、陽性造影（Ｔ１、Brightening）が可能である。使用する酸化鉄のサイズ及び親水化された組成物の数平均流体力学的径がそれぞれ５ｎｍ、１５ｎｍより小さい場合には、陽性造影を用いることが好ましく、使用する酸化鉄のサイズ及び親水化された組成物の数平均流体力学的径がそれぞれ５ｎｍ、１５ｎｍより大きい場合には、陰性造影を用いることが好ましい。親水化された酸化鉄表面の厚さを薄くすることができれば、酸化鉄コアのサイズより僅かに大きいサイズの親水化されたナノ粒子組成物が得られるため、流体力学的径を高精度に制御することができる長所がある。ナノ粒子の水における長期安定性を向上させるために、立体障害（steric hindrance）及び静電反発（electrostatic repulsion）を用いることができる。従来、親水性高分子を用いてナノ粒子の表面をコーティングしたり配位子を交換する方法が用いられてきたが、高分子は流体力学的径を過度に厚くする。小さい分子をナノ粒子の表面に付着させると、流体力学的径は減少できるが、水における長期安定性が悪くなり、生体適合性が制限される。したがって、粒子の流体力学的径を減少させるとともに、長期安定性を高めることができる方法が強く要求されている。
【００６６】
本発明は、また、コロイド、及びこのコロイドを含み、血中保持時間が長い磁気共鳴画像造影剤を提供する。前記コロイドは、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された親水性酸化鉄ナノ粒子を含む組成物が水に分散されて製造され、ここで、i）酸化鉄はマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γ‐Ｆｅ2Ｏ3）、又はこれらが混合された酸化鉄であり、ii）親水性組成物の数平均流体力学的径（Hydrodynamic Diameter）と酸化鉄コア粒子の直径（Core diameter）との差が６ｎｍ以下であることを特徴とする。親水性組成物の流体力学的径と酸化鉄コアの直径とのサイズ差が小さい場合、親水化されたナノ粒子組成物の血中保持時間（blood retention time、又はＢＨＬ：blood half life）はより長くなり得る。既存のＭＲＩ造影剤であるGd‐complex（マグネビスト―バイエル―シェリング社（Magnevist‐Bayer Schring Co.）、オムニスタン−ジーイー  ヘルスケア  社（Omniscan‐GE Healthcare Co.））は血中保持時間（BHL）が数分以下と非常に短く、酸化鉄系造影剤（フェリデクス−エーエムエージー社（Feridex‐AMAG Co.）、レゾビスト―ガイヤー―シェリング社（Resovist‐Gayer Schering Co.））は、マクロファージ（macrophage）により数十分内に肝臓に運ばれて分布される特徴を有する。よって、親水化後の酸化鉄ナノ粒子組成物の流体力学的径を減少させることで血中保持時間を長くするための新規な、且つ改善された親水化方法が強く要求されている。
【００６７】
さらに、本発明は、コロイド、及びこのコロイドを含むＭＲＩ  Ｔ１造影剤を提供する。前記コロイドは、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された親水性酸化鉄を含む組成物が水に分散されて製造され、ここで、（i）単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体は、グルコース６‐リン酸、又はグルコース６‐リン酸にエタノールアミン又はポリエチレングリコールが付着された誘導体であり、（ii）酸化鉄コアのサイズは２ｎｍ〜８ｎｍであり、（iii）親水性組成物の数平均流体力学的径（Dynamic Light Scatteringで測定）は２ｎｍ〜１５ｎｍであることを特徴とする。酸化鉄コアが小さいと、Ｔ２緩和度（r２）とＴ１緩和度（r１）の比率（r２／r１）が減少するため、陽性造影（Ｔ１）の実施が可能となる。実施例１０（生体内（in vitro）ＭＲＩ試験）で示されるように、グルコース６‐リン酸、又はグルコース６‐リン酸エタノールアミン又はグルコース６‐リン酸ポリエチレングリコールにより形成された、コア直径が小さい親水化された酸化鉄組成物は、比較的に高い「r１」及び低い「r２」を示し、これによって低いr２／r１を示す。このコロイドを含有する造影剤をラット（rat）の尾静脈を介して注射して、ＭＲＩ陽性造影を実施した結果、実施例７‐１、８‐１、８‐２で示されるように、鮮明で、且つ明るい画像（陽性造影）が得られた。１時間又は２時間までは、血管が明るく造影されたが、２４時間後には、全く明るく造影されなかった。このような結果から、造影剤は血管内に数時間留まるが、約１日後には血管から完全に除去されると思われる。よって、この造影剤を用いて血管造影を実施できることが分かる。
【００６８】
本発明は、また、コロイド及びこのコロイドを含むＭＲＩ  Ｔ２造影剤を提供する。前記コロイドは、単糖類リン酸誘導体が表面に付着された親水性酸化鉄を含む組成物が水に分散されて製造され、ここで、（i）単糖類リン酸誘導体は、グルコース６‐リン酸エタノールアミン又はグルコース６‐リン酸ポリエチレングリコールであり、（ii）酸化鉄コアのサイズは７ｎｍ〜２５ｎｍであり、（iii）親水性組成物の数平均流体力学的径（Dynamic Light Scatteringで測定）は７ｎｍ〜５０ｎｍであることを特徴とする。酸化鉄コアが大きいと、Ｔ２緩和率（r２）は急激に増加し、Ｔ１緩和率（r１）はほぼ同じである。したがって、r２／r１が非常に増加して、陰性造影（Ｔ２）効果が大きくなる。その結果、陰性造影（Ｔ２）が有利に実施され、陽性造影は実質的に不可能となる。実施例１０（生体内（in vitro）ＭＲＩ試験）で示されるように、グルコース６‐リン酸エタノールアミン又はグルコース６‐リン酸ポリエチレングリコールにより形成された、コア直径が大きい親水化された酸化鉄組成物は、比較的低い「r１」及び高い「r２」を示し、これによって高いr２／r１を示す。前記コロイドを含有する造影剤をラットの尾静脈を介して注射して、ＭＲＩ陰性造影を実施した結果、実施例８‐３、実施例９で示されるように、一日後にリンパ節で強い陰性造影（darkening）が得られた。このような結果から、この造影剤を用いてリンパ節などの生体組織を陰性造影（Ｔ２）でイメージングできることが分かる。
【００６９】
本発明により提供される、単糖類リン酸又は単糖類リン酸誘導体が表面に付着された親水性酸化鉄を含む組成物を含むコロイドは、生体内で毒性がほとんどない。実施例１１に示すように、細胞毒性試験結果、（A）グルコース６‐リン酸で安定化された１０ｎｍの酸化鉄ナノ粒子、（B）グルコース６‐リン酸‐ＰＥＧ誘導体で安定化された１０ｎｍの酸化鉄ナノ粒子、（C）グルコース６‐リン酸‐アミノアルコールで安定化された３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の全てのナノ粒子が、２００ｐｐｍの濃度まで細胞生存に影響を与えないと示され、生体適合性に非常に優れることが分かる。
【００７０】
以下、添付図面を参照して本発明による好ましい実施例を詳細に説明する。
【００７１】
［実施例１］グルコース６‐リン酸で親水化された酸化鉄ナノ粒子を含む組成物
オレイン酸が表面に付着された３ｎｍサイズの酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）１００ｍｇを８ｍｌのＴＨＦ（Tetrahydrofuran）に分散させて分散液を製造し、グルコース６‐リン酸ナトリウム塩２００ｍｇを蒸留水（ＤＩＷ（Distilled water））２ｍｌに溶解させて溶液を製造して、前記分散液と前記溶液とを混合した。その混合物を６０℃で４時間撹拌及び加熱した後、その反応生成物を静置及び冷却させた。上層のＴＨＦ層を除去して、親水性酸化鉄を含む組成物を得た。この組成物にＤＩＷを添加してコロイド溶液を製造した。このコロイド溶液を室温で６ヵ月間放置したが、濁度変化が見られず、優れた長期安定性を示した。
【００７２】
マルバーン  ゼータサイザー（Malvern Zetasizer） Nano ZSを用いてコロイド溶液中のナノ粒子組成物の流体力学的径を測定した。その流体力学的径は、コアサイズ（３ｎｍ）とほぼ類似した３．８ｎｍであった。６ヶ月後、流体力学的径は３．９ｎｍであった。
【００７３】
［実施例２］マンノース６‐リン酸で親水化された酸化鉄ナノ粒子を含む組成物の製造
実施例１と同様の方法で、７ｎｍの酸化鉄ナノ粒子をマンノース６‐リン酸ナトリウム塩を用いて水に分散させた。マルバーン  ゼータサイザー（Malvern Zetasizer） Nano ZSを用いて測定した流体力学的径が８．７ｎｍであり、コアサイズ（７ｎｍ）とほぼ類似したサイズを示した。
【００７４】
［実施例３］フルクトース６‐リン酸で親水化された酸化鉄ナノ粒子を含む組成物の製造
実施例１と同様の方法で、１０ｎｍの酸化鉄ナノ粒子をフルクトース６‐リン酸ナトリウム塩を用いて水に分散させた。マルバーン  ゼータサイザー（Malvern Zetasizer） Nano ZSを用いて測定した流体力学的径が１１．３ｎｍであり、コアサイズ（１０ｎｍ）とほぼ類似したサイズを示した。
【００７５】
［実施例４］グルコース６‐リン酸ポリエチレングリコールの合成
［実施例４‐１］リン酸‐ジエチルアミンの合成
グルコース６‐リン酸ナトリウム塩１ｇを１０ｍｌの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、２‐（N‐morpholino）ethanesulfonic acid）バッファ溶液に溶かした後、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１‐ethyl‐３‐［３‐dimethylaminopropyl］carbodiimide hydrochloride）０．６８ｇ及びＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ、N‐hydroxysuccinimide）０．４ｇを混合して３０分間維持させた。その後、ジエチルアミン０．２３ｍｌを添加して、グルコース６‐リン酸‐ジエチルアミンを結合させた。
【００７６】
［実施例４‐２］グルコース６‐リン酸‐ジエチルアミン‐ＰＥＧの合成
メトキシポリエチレングリコールカルボキシル（ｍＰＥＧ‐ＣＯＯＨ、５０００）１７．７５ｇを４０ｍｌのＭＥＳバッファ溶液に分散させた後、ＥＤＣ１．３６１ｇ及びＮＨＳ０．８１７gを添加して、３０分間撹拌した。その後、実施例４‐１で合成したグルコース６‐リン酸‐ジエチルアミンを添加して、１日間撹拌した。次いで、透析（dialysis）により未反応物質及び副産物を除去した後、水を除去した。
【００７７】
［実施例５］グルコース６‐リン酸エタノールアミンの合成
グルコース６‐リン酸ナトリウム塩１ｇを１０ｍｌのＭＥＳバッファ溶液に溶かした後、ＥＤＣ０．６８ｇ及びＮＨＳ０．４ｇを混合して３０分間維持させた。その後、エタノールアミン（２‐アミノエタノール）０．２２ｍｌを添加して、グルコース６‐リン酸アミノアルコールを製造した。
【００７８】
［実施例６］グルコース６‐リン酸エタノールアミンが表面に付着された酸化鉄ナノ粒子組成物の製造
実施例４及び実施例５で製造したグルコース６‐リン酸誘導体を用いて、実施例１と同様の方法でナノ粒子組成物を製造した。
【００７９】
［実施例７］単糖類リン酸で親水化された酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液の体内（in vivo）磁気共鳴画像の測定
実施例１、２、３で提示された方法により水に親水化された酸化鉄ナノ粒子を含む組成物及びそのコロイド溶液を製造し、マルバーン  ゼータサイザー（Malvern Zetasizer） Nano ZS装置を用いて流体力学的径を分析した。
【００８０】
単糖類リン酸で表面改質された酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液と、比較例１、２の方法により親水化された酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液の流体力学的径を下記表１に示した。単糖類リン酸で表面改質されて親水化された酸化鉄ナノ粒子の場合、コアサイズと数平均流体力学的径との差が、比較例１および２に比べずっと小さいことが分かる。
【００８１】
【表１】
0005951769.tif 000006
【００８２】
［実施例７‐１］グルコース６‐リン酸が付着された３ｎｍのコア酸化鉄ナノ粒子を含む組成物の磁気共鳴Ｔ１画像の分析
磁気共鳴画像診断装置（Trio  ３．０T、シーメンス（Simens））で手首コイル（wrist coil）を用いて、表１に示すように分散及び親水化された酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液の体内（in vivo）Ｔ１画像性能を評価した。
【００８３】
体内（in vivo）Ｔ１画像性能の評価は、ラットＦ‐３４４を用いて行った。ラットの体重は２００〜３００ｇであった。ラットを麻酔した後、磁気共鳴画像診断装置に水平に入れてその断面を観察した。ラットの磁気共鳴画像は、造影剤注入前、造影剤注入後、造影剤注入２時間後、造影剤注入２４時間後に測定して、造影剤注入前と注入後のラットの血管を観察比較した。表１に示した３ｎｍのコア酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液に、５％のグルコース溶液（株式会社チョンウェ（Joong-wea）製薬）を添加して造影剤を製造した。鉄の濃度をＩＣＰ‐ＡＥＳにより分析し、ラットの体重を考慮して投与量を計算して、注入される造影剤の総体積が１ｍｌとなるようにした。造影剤は、ラットの尾静脈を介して注入され、注入された量は５．２ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇ（ラット）であった。
【００８４】
体内（in vivo）Ｔ１緩和性能はSimens社から提供される３Ｄ  ＳＰＧＲ  シークエンス（sequence）（ＴＲ／ＴＥ：２５／５．１、フリップ角度（Flip angle）：２５゜）を用いて測定し、スキャン時間は１２分であり、画像厚さは１ｍｍ、格子数は２５６×１４６、ＦＯＶは６５×１１０ｍｍであった。
【００８５】
製造された造影剤のＴ１造影効果を定量的に評価するために、最も明らかに見える部分である大動脈、鎖骨下静脈、右心房、腋窩静脈の１つの断面を選定し、明るい部分をＲＯＩ（Region of Interest）として選択して、信号強度を分析した。得られた磁気共鳴画像の全体的な信号強度が測定するたびに変わるため、生理食塩水（Saline）をノイズとして用いて、相対的な信号強度（ＳＮＲ：Signal to Noise Ratio）を求めた。造影剤使用前後のＳＮＲを比較してＴ１信号増幅比（ΔＲ１）を計算し、これを図面にグラフで示した。次の数式１は、Ｔ１信号増幅比（ΔＲ１）を計算する方法である。
【００８６】
［数式１］
Ｔ１信号増幅比（ΔＲ１）＝１００×［１−（ＳＮＲt／ＳＮＲ0）］
ＳＮＲ0（造影剤投与前ＳＮＲ）＝ＲＯＩ0の信号強度／筋肉0（muscle0）の信号強度
ＳＮＲt（造影剤投与後ＳＮＲ）＝ＲＯＩtの信号強度／筋肉t（musclet）の信号強度
図４は３ｎｍサイズのコア酸化鉄ナノ粒子を親水化させた組成物を水に分散させたコロイドを含む造影剤をラットに注入した後に撮影したＭＲＩ  Ｔ１血管造影画像である。ラットの血管が白く強調された部分（陽性造影）が観察され、体内で２時間以上留まることを確認することができた。従来のガドリニウム造影剤の場合、体内（in vivo）保持時間が１分未満と非常に短いため、ＭＲＩスキャン時間を増やして撮影することが不可能であって、高解像度の画像を得ることができない。しかし、本発明により製造された酸化鉄造影剤の場合、体内（in vivo）保持時間が長いため、スキャン時間を増やして撮影することができて、高解像度の画像を得ることができる。したがって、体内の微小血管まで観察が可能であるということが分かる。
【００８７】
また、図５はＭＲ信号強度を示し、造影剤注入前に比べ最大４倍まで明るくなることを確認することができる。また、０．２ｍｍサイズの鎖骨下静脈まで確実な観察が可能であることが分かる。
【００８８】
［実施例８］グルコース６‐リン酸エタノールアミンで親水化された造影剤の体内（in vivo）磁気共鳴画像の測定
実施例７に提示された方法により、下記表のような物性を有するグルコース６‐リン酸エタノールアミンで親水化された酸化鉄ナノ粒子を製造した。
【００８９】
グルコース６‐リン酸エタノールアミンで表面改質された酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液の流体力学的径を下記表２に示した。
【００９０】
【表２】
0005951769.tif 000007
【００９１】
［実施例８‐１］グルコース６‐リン酸エタノールアミンで親水化された３ｎｍの酸化鉄を含む組成物のラット血管Ｔ１造影剤
グルコース６‐リン酸エタノールアミンで親水化されたコアサイズ３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子を用いて、実施例７‐１と同様の方法でＴ１血管造影を行い、その結果を図６に示した。
【００９２】
それを実施例７‐１の数式１によって処理した後、その結果を図７に示した。図面から、下大静脈、右心房、及び大動脈で信号が著しく増加することを確認することができる。
【００９３】
［実施例８‐２］グルコース６‐リン酸エタノールアミンで親水化された７ｎｍの酸化鉄のラット血管Ｔ１造影
グルコース６‐リン酸エタノールアミンで親水化されたコアサイズ７ｎｍの酸化鉄ナノ粒子を用いて、実施例８と同様の方法でＴ１血管造影を行い、その結果を図８に示した。
【００９４】
それを実施例７‐１の数式１によって処理した後、その結果を図９に示した。図面から、下大静脈、右心房、及び大動脈で信号が著しく増加することを確認することができる。
【００９５】
［実施例８‐３］グルコース６‐リン酸エタノールアミンで親水化された７ｎｍの酸化鉄を含む組成物のマウスリンパ節Ｔ２造影
グルコース６‐リン酸アミノアルコールで親水化されたコアサイズ７ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の磁気共鳴画像用造影剤としての使用可能性を評価するために、磁気共鳴画像診断装置（Trio  ３．０Ｔ、Simens）でループコイル（loop coil）を用いて体内（in vivo）Ｔ２緩和性能を評価した。
【００９６】
体内（in vivo）緩和性能の評価は、ヌードマウス（BALB／c nude mouse）を用いて行い、ヌードマウスの体重は約２０〜３０ｇであった。マウスを麻酔した後、磁気共鳴画像診断装置に水平に入れてその断面を観察した。ヌードマウスの磁気共鳴画像は、造影剤注入前、造影剤注入２４時間後に測定し、造影剤注入前と後のリンパ節を観察比較した。造影剤は０．５ｍｌの５％ＤＷに分散させ、鉄の濃度はＩＣＰ‐ＡＥＳにより分析した。また、造影剤は、マウスの体重を考慮して、１０．４ｍｇＦｅ／ｋｇの投与量でマウスの尾静脈を介して注入した。
【００９７】
体内（in vivo）Ｔ２緩和性能の測定は、シーメンス（Simens）社から提供されるT２Me３dパルスシーケンスを用いて行った。具体的なパラメーターは次のとおりである。
【００９８】
ＴＲ（繰り返し時間（repetition time））＝４０．０ｍｓｅｃ，
ＴＥ（エコー時間（echo time））＝２２．０ｍｓｅｃ，
ＦＯＶ＝４９ｍｍ×７０ｍｍ，
マトリックスサイズ（Matrix size）＝２５６×１８０，
スライス厚さ（slice thickness）＝０．６ｍｍ，
アクイジション数（number of acquisition）＝６
製造された造影剤のＴ２減衰効果を定量的に評価するために、最も明らかに見えるリンパ節である鼠径リンパ節及び上腕リンパ節の１つの断面を選定し、リンパ節の変色された部分をＲＯＩ（Region of Interest）として選択して、信号強度を分析した。得られた磁気共鳴画像の全体的な信号強度が測定するたびに変わるため、信号強度の絶対値（Ｓ：signal  intensity）で造影性能を評価するには無理がある。したがって、鼠径リンパ節は、右側後肢筋肉を対照群（Ｎ：noise）として用い、上腕リンパ節は、右側前肢筋肉を対照群（Ｎ：noise）として用いて、その相対的な信号強度（ＳＮＲ：Signal to Noise Ratio）を求めた。造影剤の使用前後のＳＮＲを比較してＴ２信号減衰比（ΔＲ２）を計算し、これを図１１にグラフで示した。次の数式２はＴ２信号減衰比（ΔＲ２）を計算する方法である。
【００９９】
［数式２］
Ｔ２信号減衰比（ΔＲ２）＝１００×［１−（ＳＮＲt／ＳＮＲ0）］
ＳＮＲ0（造影剤投与前ＳＮＲ）＝ＲＯＩ0の信号強度／筋肉0（muscle0）の信号強度
ＳＮＲt（造影剤投与後ＳＮＲ）＝ＲＯＩtの信号強度／筋肉t（musclet）の信号強度
図１０に、グルコース６‐リン酸エタノールアミン誘導体で改質された７ｎｍの酸化鉄のナノ粒子を用いて得た体内（in vivo）ＭＲＩリンパ節画像を示した。注入１日後、マウスの正常リンパ節に酸化鉄が取り込まれ（uptake）黒く変わることが確認された。図１１には数式２によって信号強度の減少を示したが、信号が著しく減少することが分かる。
【０１００】
［実施例９］グルコース６‐リン酸ポリエチレングリコールで親水化された１０ｎｍのコア酸化鉄を含む組成物の体内（in vivo）磁気共鳴画像の測定
実施例４、５の方法により得られた単糖類‐リン酸‐ポリエチレングリコールで１０ｎｍのコア酸化鉄ナノ粒子を親水化処理して、数平均流体力学的径が３０ｎｍのコロイドを製造した。実施例８‐３と同様の方法によりマウスリンパ節のＴ２造影性能評価を行って、造影剤注入前、後のリンパ節画像を得た。
【０１０１】
グルコース６‐リン酸ポリエチレングリコールで表面改質された酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液の流体力学的径を下記表３に示した。
【０１０２】
【表３】
0005951769.tif 000008
【０１０３】
図１２に、１０ｎｍの酸化鉄をグルコース６‐リン酸ポリエチレングリコールで改質させたナノ粒子を用いて得た体内（in vivo）ＭＲＩリンパ節画像を示した。注入１日後、マウスの正常リンパ節に酸化鉄が取り込まれて（uptake）黒く変わることが確認された。図１３には数式２によって信号強度の減少を示しており、信号の著しい減少が現れることが分かる。
【０１０４】
［実施例１０］単糖類リン酸及びその誘導体で表面改質された酸化鉄ナノ粒子組成物のＭＲ体外（in vitro）緩和特性
実施例１、２、３の方法により親水化された酸化鉄ナノ粒子組成物のＭＲ造影能力を測定するために、２ｎｍ、３ｎｍ、７ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍサイズの酸化鉄ナノ粒子のファントム撮影を、４．７  Ｔ  ＭＲ（Biospec４７／４０、ブルーカー  バイオスピン  エムアールアイ社（Bruker Biospin MRI GmbH）で勾配コイル（gradient coil）を用いて行って、緩和性能を評価した。酸化鉄ナノ粒子の濃度はＩＣＰ‐ＡＥＳにより測定し、Ｔ２緩和時間はＭＳＭＥ（Multi Slice-Multi Echo sequence）パルスシーケンスを用いて測定した。具体的なパラメーターは次のとおりである。
【０１０５】
Ｔ１撮影パラメーターは次のとおりである；
ＲＡＲＥ  シークエンス（sequence），
ＴＲ＝１００，２００，５００，１，０００，２，０００，４，０００，６，０００，８，０００  ｍｓ，
ＴＥ＝７．７５６  ｍｓ，
ＦＯＶ＝５ｃｍ，
マトリックスサイズ（Matrix size）＝１２８×１２８，
スライス厚さ（slice thickness）＝２ｍｍ。
【０１０６】
Ｔ２撮影パラメーターは次のとおりである。
【０１０７】
カーパーセルメイブームギル（CarrPurcellMeiboomGill（ＣＰＭＧ））シークエンス（sequence）、
ＴＲ＝１０ｍｓ，
ＴＥ＝７．５  ９６０．０  ｍｓ，
ＦＯＶ＝５ｃｍ，
マトリックスサイズ（Matrix size）＝１２８×１２８，
スライス厚さ（slice thickness）＝２ｍｍ。
【０１０８】
単糖類リン酸を用いた酸化鉄ナノ粒子のＭＲＩ体外（in vitro）結果を下記表４に示した。
【０１０９】
【表４】
0005951769.tif 000009
【０１１０】
表４に、単糖類リン酸及びその誘導体で表面改質された酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液のＭＲＩ緩和性能を示した。コアサイズの小さい酸化鉄ナノ粒子の場合、ｒ１値は大きいが、ｒ２値は小さいため、画期的なＴ１造影剤として用いられることができる。コアサイズの大きいナノ粒子の場合、ｒ２値が大きいため、Ｔ２造影剤として用いられることができる。したがって、単糖類リン酸及びその誘導体で置換された酸化鉄ナノ粒子は、Ｔ１及びＴ２造影剤として効果的に応用されることができることが確認された。
【０１１１】
［実施例１１］グルコース６‐リン酸及びその誘導体で表面改質された酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液の毒性試験
酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液の毒性を試験するために、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞でＭＴＴアッセイを実施した。グルコース６‐リン酸で親水化された１０ｎｍのコア酸化鉄ナノ粒子（A）、グルコース６‐リン酸‐ＰＥＧ誘導体で親水化された１０ｎｍのコア酸化鉄ナノ粒子（B）、グルコース６‐リン酸‐アミノアルコールで親水化された３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子（C）の３つを５％ＤＷ溶液に分散させた後、０．２μｍの滅菌注射器フィルタで溶液を通過させた。通過された溶液は、誘導結合プラズマ原子分光分析（ＩＣＰ‐ＡＥＳ：Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy）を用いて濃度を測定した。濃度を測定した後、酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液をそれぞれ２００μｌずつ分取し、培地（ＤＭＥＭ：ダルベコ修正イーグル培地（Dulbeco’s Modified Eagle's Medium）８９％、プルロニック（登録商標）（Pluronic（登録商標）） F‐１２７１０％、AA：抗真菌抗生物質（antibiotic‐antimycotic）１％）２００μｌと混合した。その後、１／２ずつ希釈して９個の試料を準備した。対照群としては、酸化鉄無しで、５％ＤＷ溶液を上記過程と同様に準備した。継代培養により増殖させたＨｅｐＧ２細胞に試料１００μｌをそれぞれ添加した後、３７℃で２４時間培養させた。次に、ＭＴＴ（３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２イル）‐２，５‐ジフェニル‐２H‐テトラゾリウム  ブロマイド（３‐（４，５‐dimethylthiazol‐２yl）‐２，５‐diphenyl‐２H‐tetrazolium bromide））試薬を２０μｌずつ添加した後、３７℃で４時間培養させた。培養中に生成されたホルマザン結晶を溶かすために、可溶性溶液を１００μｌずつ添加して、３７℃で２４時間さらに培養させた。培養後、マイクロプレートリーダ（モレキュラーデバイス（Molecular Devices）社、Spectra Max１９０）を用いて５５０ｎｍ及び６９０ｎｍでの光学密度値を測定し、その測定された光学密度値から、細胞生存率を求めた。細胞生存率は下記の数式３により計算した。
【０１１２】
［数式３］
細胞生存率（％）＝（ＯＤi,550−ＯＤi,690）／（ＯＤＳi,550−ＯＤＳi,690）×１００
ＯＤi,550：試料が注入されたウェルプレートＮｏ．ｉの５５０ｎｍでの光学密度値
ＯＤi,690：試料が注入されたウェルプレートＮｏ．ｉの６９０ｎｍでの光学密度値
ＯＤＳi,550：対照群ウェルプレートＮｏ．ｉの５５０ｎｍでの光学密度値
ＯＤＳi,690：対照群ウェルプレートＮｏ．ｉの６９０ｎｍでの光学密度値
図１４は細胞生存率実験の結果を示したグラフである。通常、細胞生存率実験において、許容誤差範囲は±２０％であるが、実験濃度区間で８０％以上の細胞生存率を示すことが確認できる。特に、２００μｇ／ｍＬの高濃度でも細胞に異常が生じないことから、酸化鉄ナノ粒子が生体適合性を有するとみなすことができる。
【０１１３】
［実施例１２］グルコース６‐リン酸で親水化されたナノ粒子のコロイド溶液の製造
有機溶媒で合成された有機界面活性剤で安定化されたナノ粒子を、グルコース６‐リン酸を用いて実施例１と同様の方法で親水化させることで、安定した分散性を有するコロイド溶液を製造し、その結果を表５に示した。
【０１１４】
【表５】
0005951769.tif 000010
【０１１５】
［実施例１３］多様な溶媒でグルコース６‐リン酸を用いたナノ粒子の親水化
実施例１で用いた溶媒ＴＨＦに代えて、水に対して親和性を有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びエタノールなどの様々な極性溶媒を用いた。グルコース６‐リン酸を用いて、１０ｎｍサイズの酸化鉄ナノ粒子を親水化することで、安定した分散性を有するコロイド溶液を製造した。表６に、親水化実験に使用された溶媒とＤＩＷとの比率、反応温度、反応時間、親水化後の流体力学的径を示した。
【０１１６】
［実施例１３‐１］ＤＭＳＯでグルコース６‐リン酸を用いた１０ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の親水化によるナノ粒子コロイド溶液の製造
オレイン酸で安定化された酸化鉄ナノ粒子１００ｍｇを８ｍｌのＤＭＳＯに分散させたものと、２００ｍｇのグルコース６‐リン酸ナトリウム塩を２ｍｌのＤＩＷに分散させたものとを混合し、この混合液を１２０℃で１２時間撹拌、反応させた後、冷却及び静置した。ＤＭＳＯを除去して、親水化組成物を得た。この組成物に蒸溜水を添加して、水で優れた分散安定性を有するグルコース６‐リン酸で表面が置換されたナノ粒子のコロイド溶液を製造した。
【０１１７】
［実施例１３‐２］エタノールでグルコース６‐リン酸を用いた１０ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の親水化
オレイン酸で安定化された酸化鉄ナノ粒子１００ｍｇを８ｍｌのエタノールに添加した後、２００ｍｇのグルコース６‐リン酸ナトリウム塩が２ｍｌのＤＩＷに分散された水溶液を混合して、その混合液を７０℃で１２時間撹拌、反応させた後、冷却及び静置した。エタノールを除去して、親水化されたナノ粒子組成物を得た。この組成物に蒸溜水を添加して、水で優れた分散安定性を有するグルコース６‐リン酸で表面が置換されたナノ粒子のコロイド溶液を製造した。
【０１１８】
【表６】
0005951769.tif 000011
【０１１９】
［実施例１４］グルコース６‐リン酸を用いた酸化鉄ナノ粒子コロイド溶液の製造
［実施例１４‐１］疏水性酸化鉄ナノ粒子を親水化するための改質
韓国特許出願第１０‐２０１１‐００１１２９４号の実施例１にしたがって、疏水性酸化鉄を親水化されるように改質した。オレイン酸が表面に付着された３ｎｍサイズの酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）５０ｍｇと、硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4、平均粒子サイズ１５０μｍ）とを、１：５００の重量比で混合し、それをｎ−ヘキサンで撹拌した後、ヘキサンを蒸発させた。酸化鉄ナノ粒子と硫酸ナトリウム粉末との混合物を５００で５時間空気条件で加熱することで、オレイン酸を除去した。塩を十分に除去するために、ナノ粒子及び塩粉末を蒸溜水で３回洗浄した。水に分散された酸化鉄ナノ粒子を観察して、生成物が親水化されたことを確認した。加熱後に凝集された粒子は観察されなかった。製造された酸化鉄ナノ粒子は水に分散されるが、表面に安定化剤がないため、時間が経つにつれて沈む特性を示す。
【０１２０】
マルバーン  ゼータサイザー（Malvern  Zetasizer） Nano ZSを用いてコロイド溶液中のナノ粒子組成物の流体力学的径を測定した結果、流体力学的径が３０ｎｍと確認された。これは、表面安定化物質がないため、水溶液で粒子が凝集されたためであると判断される。
【０１２１】
［実施例１４‐２］グルコース６‐リン酸を用いて改質された酸化鉄ナノ粒子の安定化
実施例１４‐１で製造された酸化鉄ナノ粒子水溶液（１０ｍｌ）にグルコース６‐リン酸ナトリウム塩１ｇを添加した後、６０で４時間ソニケーション（sonication）を維持した。反応終了後、グルコース６‐リン酸により安定化された酸化鉄ナノ粒子のコロイド溶液が製造されたことを確認した。このコロイドを室温で６ヶ月間放置したが、濁度が変わらなかったことから、長期安定性に非常に優れることが分かる。マルバーン  ゼータサイザー（Malvern  Zetasizer） Nano ZSを用いてコロイド溶液中のナノ粒子組成物の流体力学的径を測定した結果、流体力学的径が８．５ｎｍと確認された。このことから、実施例１４‐１で製造された分散安定剤のない酸化鉄ナノ粒子に比べ、流体力学的径が減少し、分散安定性が向上されたことが確認された。
【０１２２】
［比較例１］酸化鉄ナノ粒子の親水化カプセルの製造
オレイン酸で安定化された１０ｎｍの酸化鉄ナノ粒子４０ｍｇとＰＬＧＡ（ポリラクチック―コ―グリコリック酸（poly（lactic‐co‐glycolic  acid））４０ｍｇをエチルアセテート溶液に分散させた。それをプルロニック（登録商標）（Pluronic（登録商標））F１２７（ビーエーエスエフ社（BASF  Corporation）、二官能性ブロック共重合体（difunctional block copolymer））４ｍｌ溶液と混合した後、撹拌して、カプセル化した。カプセルの流体力学的径を分析した結果を表１に示した。
【０１２３】
［比較例２］ＰＯ‐ＰＥＧｓを用いた酸化鉄ナノ粒子の親水化
オレイン酸で安定化された３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子５０ｍｇとＰＯ‐ＰＥＧｓ（ＰＥＧ、ＭＷ：２０００）５ｇを１０ｍｌのエタノールに入れた後、７０℃で１２時間撹拌して、親水化酸化鉄ナノ粒子を製造した。ナノ粒子の流体力学的径を分析した結果を表１に示した。
【０１２４】
以上ように、特定事項、及び限定された実施例及び図面により本発明を説明したが、これは、本発明のより全体的な理解のために提供されたものに過ぎず、本発明が上記の実施例に限定されるものではなく、本発明が属する分野において通常の知識を有する者であれば、このような記載から多様な修正及び変形が可能である。
【０１２５】
したがって、本発明の思想は上述の実施例に限定されて決まってはならず、添付の特許請求の範囲だけでなく、この特許請求の範囲と均等又は等価的な変形のある全てのものが、本発明の思想の範疇に属するといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005951769.tif 000023
【図１３】
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【図１４】
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