(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起波長の励起光線に反応するラマン散乱プローブであって、
ナノメートル寸法の細長いカプセルと、
該細長いカプセルに結合された複数のラマン活性分子と、
該細長いカプセルの外側に固着され該カプセルと標的材料の連結を可能にする少なくとも１つの官能化化学基と、
を含み、
該ラマン活性分子は、該プローブが励起波長の励起光線で照らされると、移動した波長で集合的にラマン散乱反応を示し、そして、該ラマン活性分子は、該ラマン散乱反応が該移動した波長での該ラマン活性分子からの蛍光雑音より強いように、該細長いカプセルに沿って整列している、
ラマン散乱プローブ。
【請求項２】
カプセルが少なくとも１つのナノチューブを含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
ラマン活性分子が前記カプセル内に封入されている、請求項１および２のいずれかに記載のプローブ。
【請求項４】
ラマン活性分子が前記カプセルの外表面に固着されているか、または、前記官能化化学基に固着されている、請求項１および２のいずれかに記載のプローブ。
【請求項５】
少なくとも１つの官能化化学基が、標的材料に特異的に固着する特異的官能化化学基を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項６】
少なくとも１つの官能化化学基が、それぞれが標的材料を特徴づける異なる分子に特異的に固着する複数の特異的官能化化学基を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項７】
少なくとも１つの官能化化学基が、標的材料を特徴づける複数の異なる分子のいずれか１つに特異的に固着する多重特異性官能化化学基を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項８】
少なくとも１つの官能化化学基が、それぞれが標的材料を特徴づける複数の異なる分子のいずれか１つに特異的に固着する複数の多重特異性官能化化学基を含む、請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
少なくとも１つの官能化基が、カルボン酸もしくはアミン、ＤＮＡ基もしくはＲＮＡ基、またはハロゲン化フェニル基を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１０】
少なくとも１つの官能化化学基が、標的材料を含む液体媒体中のプローブの分散または溶解を容易にする分散化学的官能化基を含む、請求項１〜９のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１１】
少なくとも１つの官能化化学基が記標的材料に固着する複数の二次官能化化学基のいずれか１つと結合するように適合した一般的官能化基を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１２】
少なくとも１つの官能化化学基が、一般的官能化基に結合した二次官能化化学基の少なくとも１つをさらに含む、請求項１１に記載のプローブ。
【請求項１３】
一般的官能化基が、脂肪族疎水基、極性基、または帯電基を含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１４】
励起波長の励起光線に反応するラマン散乱プローブを作製する方法であって、
ナノメートル寸法の細長いカプセルを用意すること、
複数のラマン活性分子を該カプセルに結合すること、
ここで、該複数のラマン活性分子は、該プローブが励起波長の励起光線で照らされると、移動した波長で集合的にラマン散乱反応を示し、そして、該複数のラマン活性分子は、該ラマン散乱反応が該移動した波長での該ラマン活性分子からの蛍光雑音より強いように、該細長いカプセルに沿って整列される、
該細長いカプセルの外表面に該カプセルと標的材料の間の連結を提供する官能化化学基を固着すること、
を含む方法。
【請求項１５】
ラマン活性分子をカプセルに結合することが、該ラマン活性分子を該カプセルの内側に封入することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ラマン活性分子をカプセルに結合することが、該ラマン活性分子を官能化化学基に固着することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
試料のラマン調査を行う方法であって、
ラマン散乱プローブを該試料中の対象の標的材料に固着すること、
ここで、該ラマン散乱プローブは複数のラマン活性分子が結合したナノメートル寸法の細長いカプセルを含み、該ラマン活性分子は、該プローブが励起波長の励起光線で照らされると、移動した波長で集合的にラマン散乱反応を示し、そして、該複数のラマン活性分子は、該ラマン散乱反応が該移動した波長での該ラマン活性分子からの蛍光雑音より強いように、該細長いカプセルに沿って整列していて、
該プローブは、該細長いカプセルの外側に固着され該標的材料との結合を形成する少なくとも１つの官能化化学基を介して固着され、
該試料を、励起波長の励起光線で照らすこと、
移動した波長での該ラマン散乱反応の結果発生する光を検出すること、
を含む方法。
【請求項１８】
カプセルが、ラマン活性分子が封入された少なくとも１つのナノチューブを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ラマン調査がラマン分光測定を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ラマン調査がラマン撮像を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にナノスケール分光測定および撮像の分野に関し、さらに具体的にはラマン分光測定および撮像における分子標識用ナノスケールプローブの作製と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学的撮像のための現在の明暗差および標識を付ける方法は光吸収、光反射、および分子蛍光において広く用いられている。そのような光学的撮像技術は医療診断、市民安全、鉱山探査、その他用途に頻繁に用いられている。蛍光標識は、例えば自動ＤＮＡ配列解析の様な多様な用途に用いられる。
【０００３】
近年、大きな明暗差が分子に固有でかつ分子振動に基づいている光学的撮像技術の開発に関心が高まってきている。その課題は、感度を下げずに分子を一義的に検出することである。ラマン分光法は分子振動の識別および分析に利用できる最も強力な技術の１つであるが、他の分光技術に比べて感度が劣る。その結果、ラマン撮像やラマン分子プローブは商業的用途にはあまり用いられない。
【０００４】
ラマン感度
種々の撮像技術の感度は、光の散乱の観察に必要な断面積を考慮することによって比較することができる。ラマン分光の場合、分子の散乱光の強度Ｉ（光子／ｓ／ｃｍ２）は、分子あたりの散乱断面積σＲおよび入射光の強度Ｉｏに比例し、Ｉ＝σＲＩｏの関係に従う。ラマン分光では、σＲは１０−２９〜１０−３２ｃｍ２であり、同等の蛍光および光吸収の断面積はそれぞれ、およそ１０−１９〜１０−１８および１０−２９〜１０−３２ｃｍ２である（S. Nie and S. R. Emory, "Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering（表面強調ラマン散乱による単一分子および単一ナノ粒子のプローブ探査）", Science 275 1102-1106 （1997））。したがってラマン法と、光吸収法または蛍光法の相対効率にはほぼ１２桁を越える大きさの差がある。しかしラマン分光測定は高強度レーザーから利益を得て、低効率の散乱過程が相殺されてこの分析技術の利用が容易になる。それでもなお、低感度は依然としてラマン撮像の問題である。また、高強度励起レーザーを使用していることから試験中の試料が局部加熱によって変性する可能性がある。そのような場合、加熱を防止するために光放射プローブの強度を下げて点状に掃引してラマン撮像を行うが、画像取得に時間がかかり効率が悪くなる。感度がより高い蛍光法および光吸収／反射法がこれまで光学的撮像に選ばれてきた（V. Ntziachristos, Fluorescence molecular Imaging, Annual Review of Biomedical Engineering, Vol. 8: 1-33 （2006））。
【０００５】
光学プローブの化学分析への使用
吸光分析および蛍光分光による化学分析が可能であるが、吸光または蛍光放射の帯域は広いため精密度に欠ける。しかも、吸光の光学的明暗差は透過性が同様の材料では一般に弱く、多くの分子は蛍光性が無いかまたは弱蛍光性である。したがって、試料に光学色素を加えなければならないことが多い。さまざまな光学色素または蛍光剤が市販されており、造影剤すなわち分子プローブとして頻繁に使用されている。この方法は、光音響撮像の明暗差の向上にも一般的に用いられている（A. De La Zerda et al. "Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice（生体ネズミにおける光音響分子撮像剤としての炭素ナノチューブ）" Nat. Nanotechnol. Vol. 3, No. 9, 557-562 （2008））。しかし、これらの造影剤は吸収帯域または放射帯域が非常に広いため、このような造影剤を複数混合し、それぞれのきれいな波長特性を維持するのは難しい。
【０００６】
一方ラマン分光測定および赤外分光測定では非常に明確な分子の明暗差が可能である。その理由は、これらの方法が分子の振動遷移に関する情報（１００ｃｍ−１〜６０００ｃｍ−１）を提供し、かつ一連のスペクトル帯域が非常に狭小（一般に５ｃｍ−１未満）であるからである。分子あるいは固体はそれぞれに振動遷移の鮮やかなスペクトルがあり、それらのラマンスペクトルおよび赤外スペクトルによってこの情報が正確に得られる。振動スペクトルは分子のいわば「指紋」のようなものである。
【０００７】
このようにラマンおよび赤外吸収は化学分析にとって非常に強力な技術であるが、それぞれの弱点が他方の長所になっている。赤外吸収の感度（σＲは約１０−２１ｃｍ２）はラマン（σＲは約１０−２９ｃｍ２）に比べると良いが、その効率は劣る。光検出器の赤外領域の感度が悪いからである。一方ラマンは可視域（４００〜８００ｎｍ）で作動し、ＳｉＣＣＤ型の検出器は非常に高効率、高感度である（１回の検出に数個の光子しか要しない）。さらに、空間分解能は赤外では低く、ラマンでは優れる。その理由は分解能の限界は波長に依存し（レイリーの基準によれば分解能の限界は約λ／２）、この波長は赤外で比較的長く（λは約３０μｍ）ラマンで短い（λ＝４００〜６００ｎｍ）ためである。ラマンを用いる応用が理想的ということになるが、ラマン散乱には断面積の問題があり、散乱が弱すぎて光学的撮像または分子標識に役立たない。
【０００８】
増幅ラマンプローブ
ラマン散乱における分子検出の感度改善を試みる解決法が提案されてきた。
例えば、プローブ分子が金属粒子または粗い表面の近くにあると、ラマン信号の増幅が起こることが観察されている（S. Nie and S. R. Emory, "Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering（表面強調ラマン散乱による単一分子および単一ナノ粒子のプローブ探査）", Science 275 1102-1106 （1997））。この信号強調は、金属対象物の極めて近傍の電場の局所増幅に起因し、ラマン散乱断面積を大きく改善することができる。ラマン信号のこれらの増幅は一般に「表面強調ラマン分光」（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy、以下ＳＥＲＳ）または「表面強調共鳴ラマン分光」（Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy、以下ＳＥＲＲＳ）と呼ばれる。化学的または物理的に１つ以上の色素分子と結合された金属粒子または金属表面を用いて作られた多数のＳＥＲＳプローブまたはＳＥＲＲＳプローブがある。これらのプローブは共鳴分子に結合しており、これらのプローブで可能な信号強調は約１０１４に達する。しかしこれらのプローブの作製は難しく、多くは毒性があり（体外用途用）、高価で再現が難しい前処理または合成を必要とする。さらに、これらの効果をナノメートル寸法のプローブまたは標識に付与するのは困難である。
【０００９】
炭素ナノチューブのラマン散乱断面は、σＲがおよそ１０−２１ｃｍ２と並外れていることも観察されている（A. Jorio et al. "Structural (n, m) Determination of Isolated Single-Wall Carbon Nanotubes by Resonant Raman Scattering（共鳴ラマン散乱による独立単一壁炭素ナノチューブの構造（ｎ、ｍ）決定）", Phys. Rev. Lett., Vol. 86, No. 6, 1118-1121 (2001)、およびJ. E. Bohn et al. 25 "Estimating the Raman cross sections of single carbon nanotubes（単一炭素ナノチューブのラマン断面積の推定）", ACS Nano 4 (6), 3466-3470 (2010)）。この特性は、ナノ構造体の世界では準特異的で、積み重ねて大きな構造体に組み立てられた分子集合体の共鳴ラマン断面積に匹敵する。ナノチューブ内のラマン散乱現象の物理はかなりよく分かっている。その理由は、この散乱現象が共鳴過程と関係することおよび対象物がきれいに整列した多数の原子でできているためである（すなわち、ナノチューブは分子に比べて大きい）。したがってナノチューブはそれ自体非常に興味深いラマンプローブであるが、現実にはナノチューブは種々のナノチューブが入り交じって得られる傾向があり、同じ種類のナノチューブの試料を入手するのは難しい。プローブとして役立てるには、ナノチューブを対掌性または異なる同位体組成によって分類する必要がある（Z. Liu, S. Tabakman, S. Sherlock, X. Li, Z. Chen, K. Jiang, S. Fan, and H. Dai, Multiplexed Five-Color Molecular Imaging of Cancer Cells and Tumor Tissues with Carbon Nanotube Raman Tags in the Near- Infrared（近赤外域の炭素ナノチューブラマン標識による癌細胞と腫瘍組織の多重化５色分子撮像）, Nano Res 3: 222-233(2010)）。入手できるのは炭素の２つの同位体（Ｃ１２およびＣ１３）だけであり、ライブラリーの多様性の大きな制限となっている。ナノチューブの分離には複数の方法があるが、費用がかかり極少量の材料しか得られない。さらにナノチューブを化学的に官能化するとそのラマン信号は一般的には弱まる。
【００１０】
炭素ナノチューブを基にしたラマンプローブの開発は興味深いが、そのラマン信号をプローブの明確な識別に用いるのは依然難しい。
高ラマン活性分子
ラマン散乱の効率がたとえ悪くとも、ラマン活性のある分子は多数存在する。強い信号を得るためには、分析領域内に高濃度の分子が必要である。この制限にもかかわらず、ラマン分光測定によって特定環境下にある分子の特性を評価することができる。多くの分子色素に強いラマン活性があり、可視域スペクトル内で共鳴するため特性評価が可能になる。よく知られた例にはβカロテン、ピリジン、ローダミン６−Ｇのような共役分子がある。これら分子における散乱が共鳴ラマンに関与し、（分子ごとの）断面積は共鳴波長で最大１０−２４〜１０−２５ｃｍ２に達し得る（S. Shim, C. M. Stuart, and R. A. Mathies, Resonance Raman Cross-Sections and Vibronic Analysis of Rhodamine 6G from Broadband Stimulated Raman Spectroscopy（広帯域励起ラマン分光法によるローダミン６Ｇの共鳴ラマン断面積と振動解析）, ChemPhysChem9, 697-69 (2008)）。それでもなお、この断面積は分子標識すなわちタグ付け用途に必要な断面積に対し、まだ貧弱である。そのような場合、共鳴ラマンによって１個の分子を検出するのは不可能であり、許容範囲の信号を得るには分析領域に複数の分子が必要となる。さらに、これら分子の多くは高強度レーザーの影響下では不安定で、蛍光を発してラマン信号を減弱または隠してしまうことがある。
【発明の概要】
【００１１】
したがって光学的撮像または分子標識に適し、高感度で比較的簡単かつ低価格な作製方法で入手できる新しいプローブの必要性がある。
光学的撮像または分子標識に適し、ラマン散乱を用い、蛍光が少なく、強くはっきり区別できるラマン信号が可能になる新しいプローブの必要性がある。
【００１２】
光学的撮像または分子標識に適し、高濃度のプローブが不要で許容範囲の信号が得られる新しいプローブの必要性がある。
光学的撮像または分子標識に適し、ラマン散乱を基にし、単独で検出および識別ができる新しいプローブの必要性がある。
【００１３】
光学的撮像または分子標識に適し、ラマン散乱を基にし、複数の異なる色素の同時使用が可能で、それぞれが固有の波長特性を維持する新しいプローブの必要性がある。
本発明によればラマン散乱プローブが提供され、該ラマン散乱プローブはナノメートル寸法のカプセルを含み、該カプセルにはラマン活性分子が結合され、該ラマン活性分子は該プローブが励起光線で照らされるとラマン散乱反応を示す。該プローブは官能化化学基も含み、該官能化化学基は該カプセルの外側に固着され該カプセルと標的材料の連結を可能にする。
【００１４】
本発明の第１の態様では、該カプセルはナノチューブの形状を有するが、他のカプセル形状を用いてもよく、該プローブは１つに束ねられた複数のカプセル（例えば複数のナノチューブ）を用いてもよい。該ラマン活性分子は該カプセル内に封入されてもよく、または別の態様では、該カプセルの外表面に固着されても、または該カプセルに固着された該官能化化学基に固着されてもよい。複数のラマン活性分子を該カプセルに結合させることも可能であり、これらを共に該カプセル内に入れても、該カプセル外側に固着してもよい。これらのラマン活性分子集合は、該プローブが適切な励起光線で照らされるとそれぞれ異なるラマン散乱反応を起こすように、互いに異なってもよい。
【００１５】
多種の官能化化学基を該プローブと一緒に用いてもよい。一態様では、該官能化化学基は標的材料に直接結合する。該官能化化学基は１つ以上の標的材料に特異でもよい。該官能化化学基は、該標的材料を含む液体媒体中の該プローブの分散または溶解を容易にする分散性化学基でもよく、それによって該液体環境下に導入された複数のプローブがその中で分散したままになる。さらに別の態様では、該官能化化学基は一般的な化学的官能化を有してもよく、これが複数の二次化学基のいずれかに結合し、その各々が次に該標的材料に結合することができる。該プローブは異なる官能化化学基で同時に官能化されてもよい。これらの異なる種類の官能化は、複数の官能化化学基が同一のカプセルに固着されるように、同一のプローブと結合されてもよい。これによって同一のプローブを、同種または異種の複数の標的分子のような複数の標的材料に結合させることができ、または１つ以上の標的分子のほか該プローブの液体中の分散を促進する溶媒に結合させることができる。
【００１６】
本発明には、上記のようなラマン散乱プローブを作る方法も含まれる。該方法にはナノチューブのようなナノメートル寸法のカプセルの提供が含まれる。前もって準備されていなければ、ナノメートル寸法の未処理カプセルを洗浄しカプセルを開放する第１の工程を含んでもよい。次にラマン活性分子は該カプセルに結合され、該カプセルに封入またはその外側に固着される。該カプセル外側への固着は、該カプセルの外表面への直接固着、または該カプセル外表面に固着された官能化化学基への固着のいずれによってもよい。該カプセルの作製には所望の官能化化学基の該カプセル外表面への固着も含まれる。該固着された官能化化学基は、標的材料に直接または選択的に結合してもよく、または該標的材料が複数の二次化学基のいずれかに結合する一般的な官能化化学基であってそれぞれ別の所定の標的材料に直接結合する官能化化学基でもよい。該官能化工程はラマン活性分子の導入の前でも後でもよい。
【００１７】
本発明の別の側面では、本明細書に記載のプローブを用いて試料をラマン調査することができる。具体的には、ラマンプローブは上記の様に試料中の対象の標的材料に固着され、該ラマン散乱プローブは少なくとも１つのラマン活性分子と結合されたナノメートル寸法のカプセルを含む。該プローブは該標的材料に少なくとも１つの官能化化学基を介して固着され、該官能化化学基は該カプセルの外側に固着され該標的材料との結合を形成する。該方法には該試料を励起光線で照らすことがさらに含まれ、該励起光線はラマン散乱反応を該ラマン活性分子内で引き起こす波長を有し、該ラマン散乱反応に起因する光がふさわしい検出器を用いて検出される。該調査はラマン撮像の利用でも、またはラマン分光の利用でもよい。
【００１８】
本発明およびその利点は、本発明の種々の態様を説明する以下の詳細説明と実施例から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、本発明の一態様を説明するラマン散乱プローブの概略図である。図１Ｂは、本発明の一態様を説明するラマン散乱プローブの概略図である。図１Ｃは、本発明の一態様を説明するラマン散乱プローブの概略図である。
【図２】図２は、本発明の一態様を説明するラマン散乱プローブを作る種々の加工工程の概略図である。
【図３】図３Ａは、ナノチューブへの６Ｔの封入の概略図であって、カプセルが分子に比べて大きいことを概略的に示す。図３Ｂは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の単一壁炭素ナノチューブ（６Ｔ＠ＳＷＮＴ）に封入されたα−セキシチオフェン（６Ｔ）の吸収スペクトルの図である。
【図４】図４は、それぞれ、励起波長４８８ｎｍ、５１４ｎｍ、６３３ｎｍ、７８２ｎｍにおける６Ｔ＠ＳＷＮＴの粉体の全ラマンスペクトルの図である。
【図５】図５は、４８８ｎｍ、５１４ｎｍ、６３３ｎｍ、７８２ｎｍの励起波長を用いて単一壁炭素ナノチューブ（ＳＷＮＴ）のみのスペクトルと比較した６Ｔ＠ＳＷＮＴの粉体の全ラマンスペクトルであって、６Ｔ＠ＳＷＮＴのスペクトルを上側に、元のナノチューブのスペクトルを下側に示す。
【図６】図６は、原子間力顕微鏡測定（ＡＦＭ）で得られ、シリコン基板に堆積された６Ｔ＠ＳＷＮＴの像（図の左側）を示す図である。ＡＦＭ像からは、高さがほぼ３ナノメートルの６Ｔ＠ＳＷＮＴの束が明らかである。この図は結像した小集合のラマンスペクトル（図の右側）も左側に示す。この小集合は、同じ領域に局在化した２つまたは３つのプローブから成る。励起波長は６３３ｎｍである。
【図７】図７は、ＳＷＮＴへの封入に用いられるＤＰＰ複合体を合成する工程を説明する反応図である。
【図８Ａ】図８Ａは、ＳＷＮＴに封入されたＤＰＰ２分子（ＤＰＰ２＠ＳＷＮＴ）の６３３ｎｍで測定されたラマンスペクトルおよびナノチューブ開放工程を経ていない炭素ナノチューブ試料を用いた調製物のスペクトルの図を示す。このラマン対照試験によってプローブの作製手順の検証と分子の炭素ナノチューブ内への封入の確認ができる。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＤＰＰ２＠ＳＷＮＴプローブの作製工程中であり封入の直後かつ化学基Ｒによる官能化後のラマンスペクトルを示す。ラマンスペクトルは６３３ｎｍで測定される。
【図９】図９は、炭素ナノチューブ封入されたＤＰＰ３分子（ＤＰＰ３＠ＳＷＮＴ）およびＤＰＰ２＠ＳＷＮＴの６３３ｎｍにおけるラマンスペクトル、および炭素ナノチューブに封入されたＤＰＰ１（ＤＰＰ１＠ＳＷＮＴ）から成るプローブの５１４ｎｍにおけるラマンスペクトルを示す。
【図１０】図１０は、炭素ナノチューブに封入されたメチレンバイオレット分子（バイオレットＢ＠ＳＷＮＴ）の６３３ｎｍで測定されたラマンスペクトルを、粉体のメチレンバイオレットＢの４８８ｎｍで測定したラマンスペクトルと共に示す。
【図１１】図１１は、炭素ナノチューブに封入されたＤＴＤＣＩ分子（ＤＴＤＣＩ＠ＳＷＮＴ）の６３３ｎｍで測定されたラマンスペクトルを、粉体のＤＴＤＣＩの４８８ｎｍで測定されたラマンスペクトルと比較した図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ナノチューブへの外側固着によるトルイジンブルーの挿入反応の図である（「ＣＮＴ」は該炭素ナノチューブを示し、「ＤＭＦ（ａｎｈｙｄｒｅ）」は無水ＤＭＦを指す）。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、共有結合によって二重壁ナノチューブ（ＤＷＮＴ）の外表面に結合したトルイジンブループローブのスペクトルを示す。下のスペクトルは封入も化学的官能化もしていないＤＷＮＴのスペクトルである。
【図１３】図１３は、本発明の一態様による６Ｔ＠ＳＷＮＴプローブの調製の工程の概略図である。
【図１４】図１４Ａは、図１３のような油中で、異なる作製工程で得られた６Ｔおよびプローブのラマンスペクトルおよび吸収スペクトルを示すグラフである。図１４Ｂは、図１３のような油中で異なる作製工程で得られた６Ｔおよびプローブのラマンスペクトルおよび吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１５】図１５Ａは、金属製６Ｔ＠ＳＷＮＴプローブおよび半導体６Ｔ＠ＳＷＮＴプローブの、３つの異なるレーザーエネルギーにおけるラマンスペクトルを示すグラフである。図１５Ｂは、金属製６Ｔ＠ＳＷＮＴプローブおよび半導体６Ｔ＠ＳＷＮＴプローブの、３つの異なるレーザーエネルギーにおけるラマンスペクトルを示すグラフである。図１５Ｃは、半導体６Ｔ＠ＳＷＮＴプローブの２つのラマンピークの分極による強度の変化を示すグラフである。差し込み図は６Ｔ＠ＳＷＮＴの原子間力顕微鏡画像を分極角の記述とともに示す。
【図１６】図１６Ａは、酸化シリコン基板に格子状に堆積・パターン化された６Ｔ＠ＳＷＮＴプローブのＳＥＭおよびラマン強度分布を示す画像である。図１６Ｂは、酸化シリコン基板に格子状に堆積・パターン化された６Ｔ＠ＳＷＮＴプローブのＳＥＭおよびラマン強度分布を示す画像である。図１６Ｃは、図１６Ａおよび図１６Ｂを重ねた合成画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一側面によれば、ラマン散乱分光測定に使用するプローブが提供される。本発明のこの側面によるプローブにはそれぞれナノメートル寸法のカプセル、カプセルに挿入されたまたはその外表面に固着された少なくとも１つのラマン活性分子、およびカプセルの外側に固着された少なくとも１つの官能化化学基が含まれる。
【００２１】
「カプセル」の用語は本明細書で用いられるように、本発明によるプローブを形成する基本構造体をいう。カプセルは基本構造体であって、これにラマン活性分子が結合される。
【００２２】
また、この基本構造体すなわちカプセルはその外表面に沿って１つ以上の化学基によって官能化される。カプセルはナノメートル寸法で球状、円筒状、円錐状、または当業者には既知の他の形状を有する何らかの容器でよい。例えば、この容器は炭素ナノチューブ（単一壁、二重壁、または多重壁）、窒化ホウ素ナノチューブ、またはフラーレン（Ｃ６０、Ｃ７０他）でよい。
【００２３】
「ナノメートル寸法」という表現は先に定義したカプセルの少なくとも１つの方向に沿った大きさをいう。一部の態様では、この表現はカプセルを形成する球状、円筒状、円錐状、または他の中空形状を有する構造の直径をいう。この直径は一般におよそ０．３ｎｍ〜５ｎｍである。カプセルの長さは用途に応じて１ｎｍ〜１ｍｍまで変化してもよく、したがってナノメートル程度の寸法に限定されない。
【００２４】
「結合（bond）」、「結び付き」、「固着」、「連結」、または「結合（couple）」の用語は、カプセルと、ラマン活性分子または官能化化学基のいずれかの分子との化学的、静電気的、または物理的な連結をいう。
【００２５】
「ラマン活性分子」、「ラマン散乱に活性のある分子」、「色素分子」、および「色素」の用語は単独で用いられて活性分子を定義し、活性分子はプローブの形成に用いられるカプセルに封入されるか、またはカプセルの外側に固着される。ラマン活性分子はプローブがふさわしい波長の励起光線で照らされるとラマン散乱反応を示し、したがってラマン活性分子をラマン分光測定で検出および識別することができる。使用されるラマン装置で利用可能なレーザー励起波長の範囲で分子が光学共鳴すれば、強いラマン信号も可能である。したがって多種多様な活性分子が見込まれ、本発明の当業者は使用に適した分子を識別することができる。活性分子は以下の誘導体でよく、例えばオリゴチオフェン、カロテノイド（例えばβ−カロテン）、次の化学式を有するメチレンバイオレットＢ、
【００２６】
【化１】
0006030073.tif 000002
【００２７】
トルイジンブルー、「ファストブラックＫ塩（ＦＢＫ）」、および次の化学式を有するＤＴＤＣＩがある。
【００２８】
【化２】
0006030073.tif 000003
【００２９】
オリゴチオフェン誘導体は、例えば３，６−ジチオフェン−２−イル−２，５−ジヒドロ−ピロロ［３，４−Ｃ］ピロール−１，４−ジオンの誘導体（ＤＰＰ誘導体）でもよい。これに加えてπ型共役に基づく発色団またはオリゴマーのような可視スペクトル内の全てのラマン共鳴分子がある。一部の重要な例として、カルバゾール、ポリアニン、ポリフラン、ポリフルオレン、ポリピロール、パラフェニレン、またはポリヘテロ原子ビニルのような共役重合体のオリゴマーが含まれる。フラーレン、ペンタセン誘導体、アントラセン、ペリレン、ポルフィリン、ナフタレンの様な大きな多環芳香族分子、およびベンゾトリアゾール（例えば６−トリルトリアゾール）、ローダミン（例えばローダミン６Ｇ）、ピロリン（例えばピロリンＧおよびチオピロニン）のような共鳴ラマンに既知の系も有る。これらラマン活性分子の同位体誘導体の使用によって、異なるラマン特性を与える分子の選択が広がる。
【００３０】
本開示の目的に対し、「ラマン」の用語は一般にレーザー光源からの単色光の「非弾性散乱」の物理的現象をいう。光源からの光子と試料材料中の分子のような物質の相互作用によって、異なるエネルギーしたがって異なる波長を有する光子が生じる。このエネルギー差は分子の振動状態に対応し、分子の元の振動状態に応じて光子のエネルギー利得または損失となる。分子のエネルギー損失によって長波長への移動が生じ（「ストークス」移動と呼ぶ）、分子のエネルギー利得によって短波長への移動が生じる（「反ストークス」移動と呼ぶ）。所定分子からのラマン散乱によって、特定のエネルギーを有するストークスまたは反ストークス波長移動が起き、この波長移動を検出し、これを用いて試料材料に存在する分子を識別してもよい。「ラマン分光測定」とは特定部位で散乱した光のスペクトル分析を言い、一方「ラマン撮像」とは２次元または３次元領域内の複数点のラマン散乱によって生じる光子の検出を言う。後者を用いてその領域内のラマン活性材料の相対位置を示す画像を形成してもよい。「ラマン調査」の表現がラマン分光測定、ラマン撮像、または他の何らかの技術を言い、これらがラマン散乱によって分子または系の情報を得ることに関連することは当業者には容易に理解できる。
【００３１】
「官能化化学基」または「化学基」の表現はカプセルの外側に固着された基をいう。化学基は、カプセルの外表面に直接固着することも、またはラマン活性分子がカプセルの外側に固着されていればそれに固着することもできる。化学基は、液状媒体中のプローブの分散または溶解を容易にする基、またはプローブを媒体と親和性にしおよび／またはプローブを特定分子部位に選択的に付着させる基である。このため、種々多数の方法を種々の期待される用途に適合させることができる。例えば、カルボン酸またはアミンのような化学基のカプセルに正または負の電荷を与えることによって、反対の電荷を有する基質との選択的な関連性が可能になる。相補体と関連したＤＮＡあるいはＲＮＡ基の使用、または受容体のある蛋白質の使用は、医療診断または検査用の分子標識向けの応用を開発する他の良い例である。
【００３２】
「標的材料」の表現は何らかの分子、分子の群、細胞、溶媒、または同種のものであって、官能化化学基を固着してもよいものをいう。標的材料の特性によっては、官能化基が標的材料全体に固着してもまたはその一部に固着してもよいことが分かる。
【００３３】
本発明の説明用の態様によるプローブの説明
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは本発明の可能な態様によるプローブを示す。プローブ１０はカプセル１２によって具体化された基本構造を有する。このカプセルはプローブ内で重要な構造的役割を果たすが、プローブのラマンスペクトルを処理するときの分光測定の標準の役割も果たすことができる。
【００３４】
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃに示したカプセル１２は円筒形状を有する。例えば、円筒形のカプセルは炭素ナノチューブでもまたは窒化ホウ素ナノチューブでもよい（ＢＮナノチューブ）。カプセルはいくつかのナノチューブの小さな束または集合でもよい。カプセル１２は例えばフラーレン（Ｃ６０、Ｃ７０他）のような球形状、例えばナノホーンのような円錐形状、または当業者には既知の他の任意の形状を有してもよいことがわかる。ナノチューブの場合、カプセルは単一壁、二重壁、または多重壁のナノチューブでもよい。カプセル１２は寸法がナノメートルであり、より具体的には、カプセルの直径は一般的におよそ０．３ｎｍ〜５ｎｍである。ナノチューブカプセルの場合、その長さは一般におよそ０．５ｎｍ〜１ｍｍである。
【００３５】
プローブ１０は少なくとも１つのラマン活性分子１４も含む。図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃからわかるように、プローブは２つ以上のラマン活性分子１４を含むことができ、それらは互いに同じものでも異なってもどちらでもよい。
【００３６】
図１Ａに示すように、活性分子１４はカプセルの内側に挿入（封入）される。そのために、そのような活性分子は全てカプセルに適切に挿入され、非特異的ファンデルワールス（van der Waals）相互作用または静電気的相互作用によって内側に維持される寸法であることが求められる。代わりに、図１Ｂおよび１Ｃに示すように、活性分子をカプセル１２の外表面に化学的、静電気的、または物理的に固着することもできる。所定のカプセルに対し、その内側に活性分子を閉じ込めると同時に、その外表面に同種または異種の活性分子を固着することも可能であることが当業者には理解される。
【００３７】
「色素分子」または単に「色素」とも呼ばれる活性分子１４はラマン散乱に活性のある分子であり、すなわちラマン分光測定によって検出・識別することができる分子である。これは、使用されるラマン装置の励起レーザーの波長範囲のラマンでこれらの分子が光学共鳴すれば可能である。したがって多種の活性分子が見込まれ、当業者にはどの分子を使用するか特定できる。例えば、活性分子はオリゴチオフェン型の誘導体、例えばβ−カロテン、次の化学式を有するメチレンバイオレットＢのようなカロテノイドの誘導体でもよく、
【００３８】
【化３】
0006030073.tif 000004
【００３９】
トルイジンブルー、「ファストブラックＫ塩（ＦＢＫ）」、および次の化学式を有するＤＴＤＣＩでもよい。
【００４０】
【化４】
0006030073.tif 000005
【００４１】
オリゴチオフェン型誘導体は、例えば、ＤＰＰ（３，６−ジチオフェン−２−イル−２，５−ジヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピロール−１，４−ジオン）またはＤＰＰ誘導体である。ＤＰＰ誘導体は、例えば次の化学式を有するＤＰＰ（２）、
【００４２】
【化５】
0006030073.tif 000006
【００４３】
次の化学式を有するＤＰＰ（２）Ｂｒ２、
【００４４】
【化６】
0006030073.tif 000007
【００４５】
または次の化学式を有するＤＰＰ（３）である。
【００４６】
【化７】
0006030073.tif 000008
【００４７】
これにπ型共役に基づく発色団またはオリゴマーのようなラマン活性分子が追加される。例えば、カルバゾール、ポリアニン、ポリフラン、ポリフルオレン、ポリピロール、パラフェニレン、またはポリヘテロ原子ビニルのような共役重合体の注目すべきオリゴマーがある。また、フラーレン、ペンタセン、アントラセン、ペリレンポルフィリン、またはナフタレン他の誘導体のような大きな多環芳香族分子、およびベンゾトリアゾール（例えば６−トリルトリアゾール）、ローダミン（例えばローダミン６Ｇ）、ピロリン（例えばピロリンＧおよびチオピロニン）他のようなラマン共鳴で既知の系もある。これらのラマン活性分子の同位体誘導体を使用することによって、種々のラマン特性を与える分子の選択が広がる。
【００４８】
なお、プローブ１０は同一の活性分子を複数含むか、またはそれぞれ固有のラマン共鳴を有する異種の活性分子を複数含んでもよい。より複雑なこれらのプローブに対する関心事は、種々の波長を用いるプローブのラマン検出を可能にすることである。
【００４９】
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃに示すプローブ１０は、カプセル１２の外側に固着された化学基１６によって官能化されている。図１Ａおよび１Ｂでは、化学基１６はカプセルの外側に直接固着され、一方図１Ｃでは、化学基は外側カプセル表面に直接固着された活性分子に化学的に連結される。
【００５０】
化学基１６は複数の異なる種類でもよい。
それらの特性に応じ、基によって標的材料の特定分子部分にプローブが選択的に付着できるようにもなる。化学基は所定の標的材料に特異的でも、または複数の特異性すなわち複数の標的材料のいずれか１つに固着することができてもよい。当業者にはプローブの推奨の用途に応じて適切な化学基をどのように選ぶかが分かっている。目的とする用途によって多種の官能化法が存在する。例えば、正または負の電荷をカルボン酸またはアミンのような基が付いたカプセルに付け足すことによって、反対に帯電された基質との選択的関連が可能になる。
【００５１】
ＤＮＡまたはＲＮＡ基をその相補体と関連させるまたは受容体をもつ蛋白質と関連させる注目すべき用途は、医療診断、標識付け、走査用途向けの他の良い例である。本発明の一態様によれば、化学基はヨードフェニルまたはブロモフェニルのようなハロゲン化フェニル基でもよい。これらの基はそれ自身が容易に官能化されて他の化学基を形成できる。
【００５２】
別の実施例では、官能化化学基は、液体材料中のプローブの溶解拡散を容易にする分散性化学基でもよい。例えば、脂質膜媒体では脂肪族疎水基の添加が必要であり、水媒体では極性基または帯電基が必要である。
【００５３】
さらに別の実施例では、官能化化学基は、標的材料に固着可能な複数の二次化学基のいずれかと結合できる一般的な基でもよい。プローブはその後の特定の官能化のために一般的官能化基のみを備えてもよく、または予め一般的官能化基および二次官能化基を両方備えてもよい。
【００５４】
所定のプローブが、１つまたは複数の標的材料に対して分散的、一般的、特異的、または多特異的であるような多種多様の化学基を結合してもよいことは容易に理解することができる。
【００５５】
本発明の一部の態様によるラマン散乱プローブには以下のような多くの利点がある。
ｉ）カプセルがその中に封入された活性分子を保護することができる。例えば、炭素ナノチューブは正常状態では酸化せず、種々の化学処理および熱処理に非常に耐性がある。またこの保護によってラマン活性分子が熱的または化学的腐食の厳しい条件に耐え得る。
ｉｉ）カプセル内に隔離されることによって、プローブが分散している媒体と活性分子との強い相互作用が抑制される。代わりに活性分子がカプセル外側にあるときは、そのような相互作用がプローブの所望の用途に応じて促進される。
ｉｉｉ）カプセルの化学的官能化（共有結合性または非共有結合性）のせいで、プローブは非常に特異的な化学親和力を示す。すなわちプローブは多種の媒体と親和性があるため、分子標識のような特定用途に適合させることができる。
ｉｖ）プローブがナノメートル寸法であることおよび多くの官能化の可能性があることから、特異な用途を巧みに狙う多様性が生まれる。例えば、１つ以上の特定基質の認識部位として作用する化学基を含む可能性が生まれる。
ｖ）そのようなプローブの場合、複数の異なる機能をカプセルの表面に固着することができ、したがって同一のプローブを種々の用途に利用できるようになる。
ｖｉ）プローブの複数の態様では、ラマン信号に重畳する寄生的放射（分子の蛍光またはリン光）が少ないかまたは無い。したがってラマン光信号の対雑音比が改善される。
ｖｉｉ）それぞれのプローブが固有のラマン特性を有するため、それらのラマンスペクトルを比較して複数のプローブを互いに区別することができる。
ｖｉｉｉ）励起光線と共鳴する活性分子を選ぶ際に、プローブを１つの特定励起波長用に対して最適化できる。
ｉｘ）それぞれのプローブがラマン検出に適した並外れた感度を示し、強い信号を得ることができ、単独のプローブの識別が可能になる。したがってラマン撮像の場合、精密な位置のプローブの有無を５００ｎｍあるいはそれより細かい高空間分解能で識別することができる。
ｘ）一部のプローブは、カプセルに対して方向付けされた１つ以上の活性分子で構成してもよく、これが励起光の分極に対するラマン信号の異方性を与える。したがってこの異方性によって媒体中のプローブの方向の測定ができる。
ｘｉ）一部の態様ではプローブ蛍光の残りが（わずかに蛍光のある波長で）ラマン特性と結合し、プローブのさらに高感度かつ特異的な検出が可能になる。すなわちカプセル型プローブの蛍光およびラマンの組合せ使用が可能になる。
【００５６】
以下に示すように、本発明の態様によるラマン散乱プローブには、分光測定やラマン撮像における分子標識を含む広範囲の用途がある。一般的状況では、ラマン散乱プローブは上記のように、標的分子に直接結合する官能化化学基またはそれぞれ異なる標的分子に直接結合する多数の二次化学基のいずれかと結合する一般的化学的官能化のいずれかを用いて、特定の標的分子用に官能化されてもよい。試料材料に応用される場合、プローブは試料中の標的分子または対象の部位に固着される。次に試料は、ラマン活性分子内でラマン散乱反応を引き起こす波長を有する励起光線で照らされる。次にラマン散乱反応による光が検出され、標的分子の存在が示される。撮像装置を用いてラマン散乱反応の光を試料の表面全体の複数点で検出してもよい。そうすることによって標的分子の相対位置を示す画像を形成することが可能になる。
【００５７】
プローブをどのように使用できるかといういくつかの実施例には医学的用途が含まれる。この用途の場合、ふさわしい化学基で官能化されたプローブを用いて、例えば血液中の細胞または蛋白質の膜様受容体の有無を識別することができる。体外的（in vitro）に、プローブを適用して病原体または不健康な細胞を識別することができる。プローブが受容体に特異であれば、それらを生体に挿入し、医療診断の確定ための道具または存在する不健康細胞もしくは癌性細胞の所在を特定する道具としての機能を果たすこともできる。さらには、これらプローブを生物医学的ラマン撮像時の造影剤として用いることもできる。
【００５８】
他の特定用途、例えば市民安全および／または科学捜査の分野では、プローブを用いて、爆発物、薬物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、またはホルモンのような痕跡化合物を検出することができる。これらのラマンプローブを記録文書の識別に用いることもできる。特定のプローブを記録文書の材料に挿入しラマン分析によって記録文書を識別すると、記録文書の真偽の確たる証明を得る手段となる。
【００５９】
研究用の道具として本発明によるプローブは、代謝と生理化学、生化学と生物体のような複雑な過程を調べるための光学的追跡子になり得る。微小流体装置でプローブを使えば、ラマンによって装置の流路の１つの中にある物質または細胞の有無を測定することによって位置の確認ができるようになる。この位置確認は、物質または細胞の分類、抽出、または標識付けのようなさらなる作業に用いることができる。
【００６０】
本発明の態様による製作方法の説明
本発明の別の側面によれば、ラマン散乱プローブを作る方法も提供される。
図２に、上記ラマン散乱プローブを作る方法の種々の工程が示されている。本方法にはナノメートル寸法のカプセルを提供する第１の工程が含まれる。必要に応じ、本方法はナノメートル寸法の未処理のカプセルを洗浄し開放することを含んでもよい。説明のための態様によれば、この工程はカプセルを濃硝酸中の還流によって洗浄すること含んでもよい。硝酸中の処理によって、カプセルの洗浄および開放の両方を行うことができ、その後のカプセル内封入が可能になる。カプセルの洗浄および開放の後、真空ポンプを用いてカプセルを多孔質膜で濾過し、空気乾燥することが望ましい。そのようにして乾燥されたカプセルは、フィルターから取り除かれたら脱イオン水に浸されその後の熱水処理に備える。この処理時に、カプセルは−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、および＝Ｏのような酸化基で官能化される。熱水処理は一般に還流および一定攪拌の下でおよそ３時間行われる。この水相はその後の濾過によって取り除かれる。カプセルは次に溶媒を用いて洗浄され、真空中で乾燥される。炭素ナノチューブの洗浄および開放に関するこの詳細な手順の一例が以下に紹介される。カプセルを、液体または酸溶液中で超音波処理を用いた切断によって短くし、寸法または材料特性（例えば金属か半導体か）でクロマトグラフィーまたは密度勾配中の超遠心を用いて分類してもよい。
【００６１】
図２に示す第２の工程では、１つ以上のラマン活性分子がカプセルに結合される。一部の態様では、この結合は、カプセルへの挿入（カプセル内封入）またはカプセルの外表面への化学的結合のいずれで達成されてもよく、そうすることによってカプセル−活性分子複合体を形成する。活性分子をカプセル内へ封入することも、カプセルの外表面にも固着することもどちらも可能である。
【００６２】
カプセル内封入は気相または液相で行うことができる。一態様では、気相法は、好ましくは真空下でアンプルのような容器内で行われる。容器を清浄かつ開放されたカプセルで満たし、カプセルに封入される分子を供給する。カプセル内に封入される分子の昇華温度まで容器を単純加熱することによって封入を誘導する。封入の完了には一般的に数時間かかる。次に、封入されなかった分子を溶媒または遊離分子の昇華を用いて除去する。液相封入の方法には、封入される分子を飽和濃度まで溶解して内部に含む溶媒中に開放カプセルを拡散することが含まれる。その後、封入される分子の溶媒中の溶解度を低下させる。この溶解度低下は、温度の緩やかな低下または溶媒の緩やかな蒸発または溶媒を活性分子の溶解度にあまり望ましくない別の溶媒で緩やかに置換することで行われる。液相または気相でのカプセル内封入は自然発生的な熱力学過程である。
【００６３】
別の態様では、カプセルの外表面の活性分子の化学的会合は、分子のカプセルとの遊離基反応を用いた炭素−炭素結合反応によって行うことができる。この種の反応の詳細が以下に示されており、例えば炭素ナノチューブプローブの場合は、その外表面にトルイジンブルーの活性分子を固着している。
【００６４】
本発明によるプローブを作る第３の工程では、少なくとも１つの官能化化学基がカプセルの外表面に固着される。この官能化によって、プローブが液体媒体もしくは水性媒体または受容体と、または両方と相溶性になる。このため、官能化基Ｒがカプセルに直接固着されるかまたは、カプセル外側に固着された活性分子に固着される。官能化基による官能化は、一般に水媒体または溶媒中における遊離基試薬との共有結合により達成される。遊離基試薬の一例はフェニルジアゾニウム塩またはジアゾニウム塩の誘導体である。本発明はこれらの試薬に限定されず、カプセルに追加反応を与える他種の試薬をどのように選ぶかについては当業者には既知である。過剰な試薬はその後、例えば溶媒およびＰＴＦＥ膜による濾過によって除去される。複数基との後続の反応によって種々の官能化が可能になる。化学基の選択はプローブの目的である具体的な用途によって決まる。炭素ナノチューブで可能な一部の反応の詳細が以下に提示される。一般的情報も炭素ナノチューブへの化学的固着に関する近年の文献から入手できる。
【００６５】
カプセルに固着された化学基Ｒによる官能化は、「一般的」官能化または「標的に特異な」官能化のいずれでもよい。標的に特異な官能化には、カプセルに固着された化学基、および対象の標的分子すなわちプローブによって標識付けされる分子に直接固着された化学基の両方が含まれる。標的に特異な官能化によってプローブと標的の間の直接結合が可能になるが、プローブを各標識付け用途に合わせて個々に開発する必要がある。代わりに本発明の別の態様ではプローブを「一般的」官能化で形成し、これをその後変性して特定の標的に特異に変えてもよい。
【００６６】
他種の分子標識に関し、一般的官能化の概念は当業者には既知である。この場合、プローブによって提供される官能化は標的に特異なものではなく、むしろ標的に特異な別の化学基に容易に結合可能なものである。すなわち図１および２を再度参照すると、化学基Ｒは、一般的な場合、多種の潜在的二次化学基の容易な固着が可能になる化学構造を有し、その潜在的二次化学基が代わりに標的に特異的となる。つまり一般的官能化および追加の化学基は共にカプセルと標的分子とを連結する機能を果たすことになる。したがって、一般的官能化によるプローブを大量に作り、その後、具体的な用途向けに誂えることができる。
【００６７】
一般的官能化の一例では化合物ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する。この化合物の変種を用いてカプセルの外表面に固着してもよいし、この化合物が他の化学基に容易に結合する化学構造を有してもよい。すなわちＰＥＧに基づく官能化で作られたプローブを使用者が改良して標的に特異な所望の化学基に固着させ、それによってプローブを標的に特異にしてもよい。
【００６８】
最後に、プルロニックまたはＰＥＧのような界面活性剤または重合体化合物による非共有結合性官能化を実施して、プローブを水媒体中でより安定化することもできる。この場合、洗浄工程時にカプセルを僅かに酸化させると界面活性剤−カプセル複合体の安定化に役立つ。この工程にはプローブの溶液への界面活性剤（または重合体化合物）の添加、およびその後の超音波処理による混合物の活性化が含まれる。遠心分離の最終工程はプローブを溶液中に保持して最大の凝集体を抽出する働きをする。この手順は炭素ナノチューブを分散させるために用いられる。
【００６９】
本発明によるプローブを得るための方法の別の態様によれば、上記の第３の工程は第２の工程の前に実施される。実際には、カプセル−活性分子複合体の形成前に、カプセルを化学基Ｒによって官能化することができる。
【００７０】
上記方法を用いて非常に多種のラマンプローブを作ることができる。その数はほぼ無限であって、用途およびラマン装置で予測され利用可能な波長によって決まる。
カプセル内封入されたラマンプローブとその作製方法の実施例
以下の実施例では、本発明によるラマン散乱プローブは単一壁炭素ナノチューブを用いて作られた。各ナノチューブは直径が約１．４ｎｍ、長さが１００ｎｍ〜５μｍまたはそれ以上であった。ナノチューブの表面に固着された化学基はブロモフェニル基またはフェニルジアゾニウム基である。種々の活性分子が以下の詳細な説明のようにＳＷＮＴに封入された。別の種類のプローブも二重壁炭素ナノチューブ（ＤＷＮＴ）を用いて作られた。この場合、トルイジンブルーを活性分子として用い、共有結合によってナノチューブの外表面に結合させた。
【００７１】
発明者等は、色素で化学的に官能化された個々のＳＷＮＴプローブが顕著なラマン散乱特性を示すことを確認した。色素の位置すなわち炭素ナノチューブの外側か内側かによって、一般的合成手順は以下の３工程で用いられる。ｉ）ナノチューブの開放および洗浄、ｉｉ）色素のカプセル内封入、およびｉｉｉ）外側層での共有結合性反応。カプセル内封入の工程に関する詳細は使用される色素に固有であるが、工程ｉ）およびｉｉｉ）は全てのプローブに対して同じである。
【００７２】
ｉ）ナノチューブの開放および洗浄の手順
全てのナノチューブ試料が前もって濃硝酸中で還流によって洗浄された。この手順によりナノチューブの洗浄、−ＣＯＯＨ基による官能化、およびナノチューブの端部の開放ができ、カプセル内封入が可能になる。この手順は以下のように用いられる。質量１００ｍｇの未処理ＳＷＮＴを３００ｍｌの６７％硝酸（フィッシャー社（Fisher））に入れる。混合物を加熱して一定攪拌下で４時間還流する。次に真空ポンプを用いてナノチューブを１．２２μｍＰＴＦＥ膜で濾過する。その結果できた薄膜は一般に「バッキーペーパー（ｂｕｃｋｙｐａｐｅｒ）」と呼ばれ、これを空気乾燥する。次にこれを膜から取り外し３００ｍｌの脱イオン水（１８．２ＭΩ−ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に入れて、水熱処理する。酸処理と同様、この処理は還流と一定攪拌下で３時間継続する。水相を１．２２μｍＰＴＦＥ膜で濾過して除去する。最後に「バッキーペーパー」を溶媒で洗浄し、真空下で膜から容易に除去できるまで乾燥する。一般に、炭素ナノチューブの最終質量は４０ｍｇ〜６０ｍｇである。
【００７３】
ｉｉｉ）化学基Ｒが付いた炭素ナノチューブの外表面の共有結合性官能化の手順
官能化の反応は、低濃度のフェニルジアゾニウムを有する水媒体中で行われる。まず、ｐＨが約１０で０．７９ｍＭのテトラフルオロホウ酸４−ブロモフェニルジアゾニウム（９６％、シグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich））の酸素除去溶液を作る。ｐＨの調整は水酸化ナトリウムを加えて実施する。次にカプセル内挿入されたＳＷＮＴを溶液に浸漬し、１０分間攪拌下で室温に置き、最後に脱酸素水およびジエチルエーテルで洗浄する。
【００７４】
これら官能化の複数の変種（すなわち異なる化学基Ｒを用いる）が可能で、カプセルプローブをある用途または別の用途に適合させることができる。例えば、ジアゾニウム塩による官能化の工程（前工程）で残った基Ｒの共有結合性反応を用いて、トルイジンブルー、ラマン活性分子をカプセル外側に固着することができる。発明者等が実証した別の実施例は、負に帯電された化学基を同じ基Ｒへ固着することによって、ナノチューブを選択的に表面へ組み付けることができる。官能化の変形は実際には無限で、見込まれる用途によって決まる。
【００７５】
実施例１：オリゴチオフェン＠ＳＷＮＴ型のプローブ
ａ）α−セキシチオフェン＠ＳＷＮＴプローブ
炭素ナノチューブ内のα−セキシチオフェン（６Ｔ）の組立体は従来から知られている（M. A. Loi, J. Gao, F. Cordella, P. Blondeau, E. Menna, B Bartova, C. Hebert, S. Lazar, G. A. Botton, M. Milko, et C. Ambrosch-Draxl, Adv. Mater. 22, 1-5 (2010)）。図３Ａにはナノチューブへの６Ｔの封入が説明されており、分子に比べて寸法が大きいカプセルの概略が示されている。
【００７６】
６Ｔ＠ＳＷＮＴ複合体の粉体、それらを含む溶液、およびシリコン基板に堆積された個々の６Ｔ＠ＳＷＮＴ複合体の試料の吸収およびラマン散乱の測定が、発明者等によって行われた。６Ｔ＠ＳＷＮＴ堆積物を溶媒溶液中に分散させるため、試料を濃ＨＮＯ３の中で化学酸化によって官能化した。この工程によって、ＣＯＯＨ官能基をナノチューブの外側に固着することができる。図３Ｂに示した官能化された６Ｔ＠ＳＷＮＴ粉末の吸収スペクトルは、主吸収帯域が５１０ｎｍ付近にあり、複数の他の吸収帯域が６００ｎｍ〜１２００ｎｍにある。５１０ｎｍの帯域は６Ｔの色素分子と関係し、他の帯域（９００〜１２００ｎｍおよび６００〜８００ｎｍ）は炭素ナノチューブの光吸収と関係する。これらの信号のラマンスペクトルが種々の励起波長で測定された（７８２、６３３、５１４、および４８８ｎｍ、図３Ｂに示す）。試料粉末の各励起波長における単独のラマンスペクトルが図４に提示されている。図５には、図４の約１５００ｃｍ−１の領域のスペクトルが示されており、これらは未処理炭素ナノチューブで得られたスペクトルと比較されている。この図では、６Ｔ＠ＳＷＮＴ複合体のスペクトルを参照番号５０で示し、未処理炭素ナノチューブのスペクトルを参照番号５２で示す。ラマンスペクトルの１４５７ｃｍ−１付近の帯域がカプセル内封入されたα−セキシチオフェンの最も顕著な特徴である。色素が無いナノチューブのスペクトルと比較することによって、ナノチューブと関係した他のあまり強くない帯域が識別される。励起波長が色素と共鳴状態に近いまたは共鳴状態にある場合、すなわち６３３ｎｍ、５１４ｎｍ、または４８８ｎｍのいずれかでは、色素からの信号はナノチューブの信号よりさらに強くなる。しかし７８２ｎｍでは、６Ｔに起因する信号はナノチューブの信号に比べてそれほど強くない。これらの測定値は、６Ｔ＠ＳＷＮＴによるラマン散乱過程の共鳴特性を説明している。図４および５は、励起エネルギーの波長がα−セキシチオフェンの吸収エネルギーの波長に近い場合だけα−セキシチオフェンのラマン信号がより強いことから、共鳴過程があることを示している。
【００７７】
６Ｔ＠ＳＷＮＴ複合体のラマン測定によって、分子から出る強いラマン信号を観察することができ、共鳴がラマン散乱の最大化に必須であると断定することができる。しかし粉末の測定では、分子のラマン散乱が強いか否かは断定できない。それでもこの第１の実験で発明者等には、ここで存在するスペクトルの領域よりも広い範囲にも蛍光信号は存在しないことがわかった。蛍光雑音が無いため、この特徴によってスペクトル測定の実行が容易になる。ラマン信号の強度を決定するため、発明者等は単独の６Ｔ＠ＳＷＮＴについて追加実験を行った。図６に示された結果は、共鳴エネルギー状態にある分子のラマン信号はナノチューブのラマン信号よりも強いことを実証している。この実験は、酸化シリコンの表面に配置された長さが約１ミクロンのα−セキシチオフェン＠ナノチューブの小さな束で行われた。プローブのＡＦＭ画像を図６の左側に示す。このプローブの位置における局所ラマン測定を図６の右側に示す。色素と関連した帯域およびその６３３ｎｍでの強度をスペクトルに明確に見ることができる。この強度はナノチューブの強度よりも強い。この測定によって、α−セキシチオフェン分子のラマン信号は一般にナノチューブのラマン信号より強いか、またはそれと同等であると結論付けしてもよい。ナノチューブの断面積はσＲ約１０−２２ｃｍ２であるため、この測定から、光束内の分子の断面積が重要であることが実証される。この測定によって発明者等は、この種類の複合体が並外れた特性を示すこと、およびそのことが強いラマン信号を得るためには非常に興味深いという結論を出すことができる。
【００７８】
α−セキシチオフェン＠ＳＷＮＴプローブのラマン散乱断面積
図６の分子のラマン散乱の断面積を推定する第１の方法は、ナノチューブのラマン散乱を内部標準として用いることである。ナノチューブの散乱断面積は３×１０−２３〜３×１０−２２ｃｍ２／ｓｒの範囲にあると考えられる。分子から出る信号はナノチューブに関連した信号よりも約３倍強く、光束内の分子の集合体の断面積は１０−２２〜１０−２１ｃｍ２／ｓｒの範囲にあると推定することができる。光束に曝され直径が５００ｎｍのナノチューブ内の分子数はナノチューブあたりおよそ４５５である。分子で完全に満たされた１つのナノチューブと等価物があると仮定すると、分子あたりの断面積は２×１０−２５〜２×１０−２４ｃｍ２／ｓｒである。概算ではあるがこの推定値には合理性がある。理由は、この束には現実には３〜５本のナノチューブが含まれるが、これらのナノチューブには一部しか分子が充填されていないからである。分子あたり１０−２４ｃｍ２の断面積がα−セキシチオフェンのような色素のラマンの共鳴過程では一般的であることが知られている。この複合体の分子の一般的な面積は１．４ｎｍ×４．４７ｎｍ／４＝１．５７×１０−６μｍ２（すなわち１．５７×１０−１４ｃｍ２）であり、ラマン信号を得るためにはナノチューブあたりの分子あたり１０１１〜１０１０の光子が必要である。
【００７９】
分子あたりの断面積のこの推定値を、測定に用いられるレーザー出力の測定値によって検証することができる。初期の実験から、波長が５１４ｎｍで出力が１４．５ｍＷのレーザー光の場合の１００倍対物レンズの出力は、１００％時に約２μＷ、５０％時に約１μＷである。６３３ｎｍ（１３ｍＷ）のレーザーの場合の１００倍対物レンズの出力は、１００％時に約２ｍＷ、５０％時に約１ｍＷであった。１００倍対物レンズの開口数は０．９（角度６５°または１．１３ｓｒ）、光束（ｓｐｏｔ）の寸法は約５００ｎｍである。図６の場合の出力は、直径５００ｎｍの光束で２ｍＷ（またはエネルギー密度が約１０６Ｗ／ｃｍ２）、スペクトルの露出時間は３０秒である。したがってこのエネルギー密度は７×１０１７光子μｍ−２の密度に相当する（すなわち２×１０１６光子／ｓ／μｍ２で３０秒）。光束内のナノチューブの断面は長さが０．５μｍで幅が１．４ｎｍしかないため、スペクトル測定の光子の総数は約６×１０１４しかない。分子数は約４５５であることから分子あたり１０１２の光子密度となる。この値は先の推定値に近い。差異があるとすれば、検出器の効率の制限および伝達光学系による光子の損失に起因する可能性がある。
【００８０】
ｂ）ＤＰＰ＠ＳＷＮＴプローブ
他の共鳴エネルギーで活性のあるプローブを検討するため、カプセル内封入されたオリゴチオフェンを基にした別のプローブが作られた。発明者等は、可視スペクトルのいろいろな位置で共鳴エネルギーを調整可能な以下に示すようなＤＰＰ複合体プローブを作った。ＤＰＰ（ＤＰＰ１、ＤＰＰ２、およびＤＰＰ３）は、赤色（６３３ｎｍ近傍）〜青色（５１４ｎｍ）の波長範囲で興味深い共鳴をするポリチオフェン誘導体である。これらの分子は合成の自由度が高い。図７に示した反応線図は、ＳＷＮＴへの封入に用いられたＤＰＰ複合体の合成工程を説明している。線図で、ＤＰＰ２は化合物（６）、ＤＰＰ３は化合物（７）である。
【００８１】
これらのＤＰＰ＠ＳＷＮＴプローブの作製には、先に説明した炭素ナノチューブの最初の洗浄と開放が含まれる。封入のため、洗浄・開放後の２ｍｇのＳＷＮＴを３０分間超音波処理して２０ｍｌのＤＭＦ中に分散させる。その後、１０ｍｇのＤＰＰ色素を加え、この溶液をさらに５分間超音波処理する。溶液を窒素雰囲気中で加熱して一晩還流する。１０回の洗浄後に濾過して試料を回収する。洗浄にはＴＨＦを用い、洗浄と洗浄の間に低強度の超音波処理を３分間行ってチューブを分散させ、濾過に続きＤＭＦでさらに１０回同様に洗浄を行う。これらの複合体の基Ｒによる官能化は上記の手順に従って進行する。
【００８２】
ＤＰＰ３＠ＳＷＮＴプローブ、ＤＰＰ２＠ＳＷＮＴプローブ、およびＤＰＰ１＠ＳＷＮＴプローブの作製は工程に従って行われる。各工程で、ラマンスペクトルが測定された。図８Ａおよび８Ｂには、ＤＰＰ２＠ＳＷＮＴプローブの合成工程の途中で測定されたラマンスペクトルの例が示されている。図８Ａには、ＳＷＮＴの開放工程の有無による６３３ｎｍのスペクトルが示されている。図の中で、参照番号７０は開放されたＳＷＮＴによるＤＰＰ２スペクトルを、参照番号７２は開放されていないＳＷＮＴによるスペクトルを示し、ＤＰＰ信号は含まれずＳＷＮＴラマンピークだけが含まれている。
【００８３】
開放および洗浄の工程がＤＰＰ分子の強い信号を得るために必須であるということをこれらのスペクトルは明確に示している。化学基Ｒによる官能化の最終工程（ここでＲ＝ブロモフェニル）は、図８Ｂに示す様に、ラマンスペクトルがこの工程の前のスペクトルとほぼ同一であることを実証している。この図で、化学基Ｒが無いＤＰＰ２＠ＳＷＮＴスペクトルを参照番号８０で示し、基ＲのあるＤＰＰ２＠ＳＷＮＴスペクトルは参照番号８２で示す。
【００８４】
この実験から、ＳＷＮＴの外表面の共有結合性反応によってラマンスペクトルがほとんどまたは全く変化しないことが示される。図９には、３つのプローブＤＰＰ３＠ＳＷＮＴ、ＤＰＰ２＠ＳＷＮＴ、およびＤＰＰ１＠ＳＷＮＴの、励起波長がそれぞれ６３３ｎｍ、６３３ｎｍ、および５１４ｎｍにおけるラマンスペクトルが示されている。官能化はラマン反応に影響しないが、それにも関わらず、プローブ間で溶媒中の分散または溶解を比較すると官能化が明確に示される。未官能化プローブはＤＭＦのような液体に溶解せず、不溶性沈殿物を形成する。化学基Ｒで官能化されたプローブは溶媒中に容易に分散し、凝集のない安定した懸濁液を形成する。さらに、光子放出Ｘの（ＸＰＳによる）分光測定によって、化学基Ｒの固着が成功していることが確認できる。
【００８５】
実施例２：市販分子によるカプセル内封入されたラマン散乱プローブ
市販されている分子を用いて複数のカプセルプローブを作ることができる。ラマン活性分子の選択は、所定の用途に必要なラマン共鳴エネルギーとスペクトル特性を基に行われる。多種多様な分子を入手することができ、発明者等はメチレンバイオレットＢおよびジエチルチオジカルボシアニンヨウ化物（ＤＴＤＣＩ）のような分子を用いて作業を行ってきた。
【００８６】
ａ）メチレンバイオレットＢ＠ＳＷＮＴプローブ
メチレンバイオレットＢで作られたカプセルプローブはラマン散乱に良好に反応することが示されている。メチレンバイオレットＢは次の構造を有する。
【００８７】
【化８】
0006030073.tif 000009
【００８８】
作製の過程は説明した一般的な工程に従う。封入の工程では、多量のＳＷＮＴおよびメチレンバイオレットＢをヘプタン中に分散させ、懸濁液を約２分間超音波処理する。次に懸濁液を一晩攪拌して還流し、その後、ＤＭＦで連続洗浄して精製する。この工程は、濾過物の色がごく薄いかまたは最終洗浄の前後に記録したラマンスペクトルが等価であれば終了する。
【００８９】
メチレンバイオレットＢ＠ＳＷＮＴプローブの合成の後に得られた６３３ｎｍでのラマンスペクトルの一例が図１０に参照番号１００で示されている。プローブのラマン特性はメチレンバイオレットＢ粉末のラマン特性とも比較されており、そのスペクトルも図１０に参照番号１０２で示されている。スペクトルの差は特に１５００ｃｍ−１前後の領域で歴然である。この差は分子のＳＷＮＴプローブへの封入に由来する。
【００９０】
ｂ）ＤＴＤＣＩ＠ＳＷＮＴプローブ
ジエチルチオジカルボシアニンヨウ化物（ＤＴＤＣＩ）によるプローブの作製もうまく機能した。これらのプローブも上記の一般的な手順に従って作られた。下に説明したＤＴＤＣＩの構造は共役直鎖分子の構造であり、分極率が良く、したがって可視域のラマン拡散での応答性が良い。
【００９１】
【化９】
0006030073.tif 000010
【００９２】
カプセル内封入工程では、ＳＷＮＴを多量のＤＴＤＣＩと共に水中に分散させ、その後超音波処理を約１５分間行う。次に溶液を攪拌しながら２０時間還流する。ＤＭＦを用いた洗浄を複数回行い、これを封入されない色素が完全に抽出されるまで行う（すなわち、濾過物が無色になるまで行う）。
【００９３】
合成後に得られたＤＴＤＣＩ＠ＳＷＮＴプローブの６３３ｎｍでのラマンスペクトルが図１１に参照番号１１０で示されている。プローブのラマンスペクトルはＤＴＤＣＩ粉末のラマンスペクトルとも比較されており、これも図１１に参照番号１１２で示されている。２つのスペクトルの違いは顕著である。これらの差はＳＷＮＴへの分子のカプセル内封入に由来する。
【００９４】
実施例３：トルイジンブルー−ＤＷＮＴプローブ（色素外側固着）
図１Ｂに示したようなカプセルプローブの一例が、トルイジンブルーをラマン活性分子として用いることによって得られた。このプローブでは、ラマン活性色素は共有結合性反応によってナノチューブの外側に、より具体的にはカプセルの外表面に、化学的に固着された。
【００９５】
作製方法には、上記の一般的方法の変形が用いられる。このプローブにはカプセル内封入の工程は不要であるためこの工程は省き、この過程は色素のカプセルへの化学的固着に直接進む。トルイジンブルー−ＤＷＮＴプローブでは、二重壁ナノチューブ（ＤＷＮＴ）とトルイジンブルーを１対４の比率で丸底フラスコに入れる。フラスコを窒素で浄化し、１３０℃まで加熱する。次にこの混合物に比率３０の亜硝酸イソアミルを加え、十分に攪拌しながら２４時間反応させる。トルイジンブルー−ＤＷＮＴを含む残留物を水で２回洗浄した後、遊離色素が完全に除去されるまでＤＭＦで複数回洗浄する（遊離トルイジンブルーはＤＭＦに非常に溶けやすい）。洗浄はＤＭＦ中の反応の残留物の１０分間の超音波処理で行う。次に生成物を濾過して回収し、ＴＨＦで乾燥させる。
【００９６】
同じ結果が得られるこの反応の変形では、固相ではなく液相での反応が用いられる。液相の場合の手順は同じであるが、亜硝酸イソアミルの量が比率で（３０ではなく）４５であり、無水ＤＭＦを２００の比率で媒体に加える点が異なる。ナノチューブへの外側固着によるトルイジンブルーの挿入反応の図が図１２Ａに示されている（「ＣＮＴ」は炭素ナノチューブ、「ＤＭＦ（ａｎｈｙｄｒｅ）」は無水ＤＭＦを示す）。
【００９７】
固相合成後に得られたトルイジンブルー−ＤＷＮＴプローブの６３３ｎｍでのスペクトルが図１２Ｂに参照番号１２０で示されている。プローブのラマンスペクトルが二重壁ナノチューブ（ＤＷＮＴ）のラマンスペクトルと比較されており、これを図１２Ｂに参照番号１２２で示す。トルイジンブルー−ＤＷＮＴのスペクトルでは５００および１４００ｃｍ−１付近の追加的な帯域が顕著である。これらの帯域はＤＷＮＴに化学的に固着されたトルイジンブルー分子のラマン信号に由来する。
【００９８】
α−セキシチオフェンプローブの詳細検討
発明者等が実施した別の実験では、フェニル基−官能化されたＳＷＮＴに封入されたα−セキシチオフェン（６Ｔ）で構成されたラマンプローブ（６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴ）が作られた。ラマンによる詳細な検討が作製手順の各工程でその場（in situ）で行われた。この手順の一般的な工程が図式的に図１３に説明されている。第１の工程では、ナノチューブ１３０を酸と超音波で処理し、液相で６Ｔ分子を封入した。得られた６Ｔ＠ＳＷＮＴ１３２を、次にジアゾニウム塩を用いてヨードフェニル基またはブロモフェニル基のいずれかを共有結合によって付加して官能化した。この手順により、図に示すようにフェニル基グラフトによる６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴ生成物１３４が得られる。図１３の１３６で示したのはナノチューブ内に整列され６Ｔのさらに詳細な説明である。図に示した矢印は分子のラマン分極率方向を示す。
【００９９】
６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴプローブの作製には、試薬等級の溶媒のみを用いた。テトラフルオロホウ酸４−ブロモベンゼンジアゾニウム塩（９６％、アルドリッチ社）、４−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（９９％、アルドリッチ社）、亜硝酸イソペンチル（９６％、アルドリッチ社）、およびα−セキシチオフェン（アルドリッチ社）をそのまま用いた。４−ヨードアニリン（９８％、アルドリッチ社）は使用前にヘキサンから再結晶化させた。ＳＷＮＴはレーザーアブレーションで作製した。
【０１００】
ＳＷＮＴにα−セキシチオフェンを封入する場合（６Ｔ＠ＳＷＮＴ）、まずＳＷＮＴを濃硝酸湿式化学酸化によって精製し、ＳＷＮＴをピラニア溶液（３：１の濃Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２）に３時間曝して切断する。ＳＷＮＴをＰＴＦＥフィルター（細孔径１．２μｍ）で濾過し、十分に水洗した。次に、５５ｍｇのナノチューブ残留物をＤＭＦ中に分散させ、濾過し、ＴＨＦ中に分散させ、濾過し、トルエンで洗浄した。その後１２ｍｇの６Ｔを１０ｍＬのトルエンに加え、５分間超音波で処理した。濾過して得られたバッキーペーパーを６Ｔ溶液に加え、２分間超音波に掛け、１１５℃で４８時間還流した。カプセル内封入されたＳＷＮＴをＰＴＦＥフィルター（０．４５μｍ）で濾過し、１５ｍＬのＤＭＦ中に分散させた。ナノチューブの分散および濾過を５回繰り返して遊離６Ｔ分子を除去した。得られた６Ｔ＠ＳＷＮＴのバッキーペーパーをその後ラマン分光測定して特性を解析した。
【０１０１】
６Ｔ＠ＳＷＮＴのヨードフェニル基官能化（６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴ）を１ｍｇの６Ｔ＠ＳＷＮＴと７５ｍｇのヨードアニリンで実施し、これを窒素中で浄化し、その後２０μＬの亜硝酸イソペンチルを加えた。反応を８０℃で３時間加熱し、混合物を２５ｍＬのＤＭＦで希釈し濾過した。濾過物の薄層クロマトグラフィー測定でヨードアニリンが含まれなくなるまで、６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴをＤＭＦ中で洗浄した。
【０１０２】
アミノプロピルトリエトキシシラン基質（ＡＰＴＥＳ）を、ＳｉＯ２／Ｓｉパターンを付けた基板上に形成した。この基板の作製は１００ｎｍの酸化物（ＳｉＯ２／Ｓｉ）を有するシリコン基板から始めた。標準的なフォトリソグラフィーを用いて電極パターンを作り、その後チタン（０．５ｎｍ）およびパラジウム（２５ｎｍ）の電子ビーム蒸着を行なった。このパターンを用いて基板上の個々のナノチューブを識別し、各変更後にラマンにより同一構造の位置を特定することができた。基板洗浄手順は、アセトンおよびイソプロパノール（ＩＰＡ）中で各５分の連続した超音波で構成された。次に基板をガラス製乾燥機内に置き、少なくとも１０分間真空乾燥した。次に、１ミリリッターのＡＰＴＥＳを入れた小さな結晶化皿の上に浮かせたガラススライド上に基板を置いた。乾燥機を真空ポンプで１分間吸引し、槽をさらに３０秒間密閉した。最後にＡＰＴＥＳ層を標準的な炉内で約１００℃の空気中で２０分間熱処理した。
【０１０３】
次に、ＡＰＴＥＳパターンが付けられた基板上にＳＷＮＴを堆積させた。精製されたＳＷＮＴをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に分散し、必要に応じて希釈した。ＤＭＦ懸濁液から７０００ｒｐｍの速度の回転によってＡＰＴＥＳ基板上にスピンコートし、約１ナノチューブ／３μｍ２のＳＷＮＴを得た。
【０１０４】
６Ｔ＠ＳＷＮＴを得る封入を行うため、基板上のＳＷＮＴをＤＭＦ、ＴＨＦ、およびトルエンに浸漬して水分を除去した。次に丸底フラスコ内で１２ｍｇの６Ｔを５ｍＬのトルエンと混合し、超音波に５分間掛けた。ＳＷＮＴで覆われた基板を、凝縮器を備えたフラスコ内に慎重に置き、溶液を１１５℃で２４〜４８時間還流した。残った６Ｔを、まず新しいトルエン中の超音波およびＤＭＦ中の超音波によって表面から除去した。次に試料をＩＰＡで洗浄し、窒素で乾燥し、その後原子間力顕微鏡法（ＡＭＦ）およびラマン分光測定で特性を評価した。
【０１０５】
６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴを得る６Ｔ＠ＳＷＮＴの官能化を、２０ｍＬの脱気ｍｉｌｌｉＱ水（ｐＨは約１０）を用いて調製した２ｍＭのテトラフルオロホウ酸４−ブロモベンゼンジアゾニウム塩で開始した。次に６Ｔ＠ＳＷＮＴを塩類水溶液に１０分間入れ、水およびＩＰＡ中で洗浄し、窒素流で乾燥した。
【０１０６】
格子模様の６Ｔ＠ＳＷＮＴの層を作るため（その結果が以下に図１６と関連付けて説明される）、ＡＰＴＥＳを上記ＳｉＯ２基板上に堆積した。次に、１ｍｇ／ｍＬ濃度の６Ｔ＠ＳＷＮＴのＤＭＦ懸濁液を、超音波を１０分間かけて調製した。ＡＰＴＥＳ基板を６Ｔ＠ＳＷＮＴ分散液中に室温で３０分間浸漬し、次にＤＭＦで洗浄し、その後高温のＤＭＦに２分浸漬した。ナノチューブで覆われた基板をＩＰＡで洗浄し、窒素で吹き飛ばして乾燥した。次に、シップリー（Ｓｈｉｐｌｅｙ）Ｓ１８０５フォトレジストの層をナノチューブで覆われた基板にスピンコートで被覆し、フォトリソグラフィーを用いて格子模様を作った。未保護領域を酸素反応性イオンエッチングで除去し（３０秒、１２５ｍＴｏｒｒ、８０ｍＷ／ｃｍ２）、基板を除去剤に入れて６Ｔ＠ＳＷＮＴの格子模様を浮かび上がらせた。次にこの模様の特性をＳＥＭ画像およびラマン分光測定を用いて評価した。
【０１０７】
６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴプローブの測定
図１４Ａ〜１６に示した実験結果は、酸化シリコン基板に堆積された個々のＳＷＮＴ、酸化シリコン基板上に堆積し光リソグラフィーで格子模様に形成された６Ｔ＠ＳＷＮＴの単層未満の層（sub-monolayer）、または無機油中に分散させた多量の６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴで得たものである。これらのスペクトルは、手順の各工程で吸収およびラマン分光測定を用いて記録した。プローブの構造もＡＦＭおよびＳＥＭを用いて調べた。
【０１０８】
ＡＦＭ画像は、ナノスコープＩＶ（Nanoscope IV）制御装置およびクワッドレックス（ｑｕａｄｒｅｘ）拡張モジュールを備えたディメンジョン３１００（Dimension 3100）走査プローブ顕微鏡を用いて生成した。高さ画像は、間欠接触モードを用い、公称バネ定数４２Ｎｍ−１、共鳴周波数約３２０Ｈｚ、先端曲率半径＜１０ｎｍのシリコンプローブを用いて取得した。
【０１０９】
使用したラマン分光計は特注装置であり、３つの異なる励起レーザー輝線（２．５４、２．４５、１．９４ｅＶ）、１００倍対物レンズ、および窒素冷却された電荷結合素子カメラ（JY Symphony）が装備されている。試料台には圧電式３軸変位台が備えられている。試料へのレーザー出力は約９５μＷ・μｍ−２であった。スペクトル領域プローブはＳＷＮＴのＤおよびＧ領域で１２００〜１７００ｃｍ−１で、精度は±１ｃｍ−１であった。ラマン分布図作成はＸおよびＹ軸に沿って１μｍ刻みで行った。出力が３００μＷ・μｍ−２のレーザーで、各点を５秒間積分した。
【０１１０】
ＳＷＮＴ、６Ｔ＠ＳＷＮＴ、および無機油中に多量に分散させた６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴの吸収スペクトルを図１４Ｂに示す。図示のように、６Ｔの吸収が強く、３５０〜７００ｎｍ領域に構成されている。６Ｔ＠ＳＷＮＴは、共鳴吸収ピークに大きなずれがない６ＴとＳＷＮＴの吸収特性を合わせた吸収スペクトルを有する。６Ｔ＠ｆ−ＳＷＮＴは６Ｔ＠ＳＷＮＴと同様のスペクトルを示すが、フェニル基のＳＷＮＴ側壁へのグラフトのせいでＳＷＮＴの吸収の方が弱い点が異なる。
【０１１１】
図１４Ａに示したラマンスペクトルでは、分離した単独のＳＷＮＴを前もって酸化シリコン基板上に置き、ＡＦＭおよびラマンで識別した。その見かけの高さはＡＦＭでは１．２ｎｍで、これは単独のナノチューブの直径に相当する。手順の各工程で、図１４Ａのラマンスペクトルを同じ位置および同じ分極条件を用いて取得した。封入前は（上部スペクトル）、約１５９０ｃｍ−１のラマンＧモードの形状によって半導体ＳＷＮＴの存在が裏付けられる。単一ＲＢＭモード（図示せず）の存在は単独のＳＷＮＴから出る信号と一致している。封入後は（中央スペクトル）、６Ｔ分子のラマンピーク特性が６Ｔ＠ＳＷＮＴのスペクトルに強く明確に出現した。６Ｔの１４５０ｃｍ−１で最も強いピークは、分子の主軸に沿って伝播するＣ＝Ｃ伸張モードの主成分のせいである。このラマンモードの存在によって、６Ｔ分子の存在が一義的に明らかになる。６Ｔ＠ＳＷＮＴの周辺領域を調べても信号は無く、この分子信号は６Ｔ＠ＳＷＮＴの構造のみからで、表面に吸収された他の６Ｔ分子からではないことを暗示している。ブロモフェニル基官能化工程の後に単独の６Ｔ＠ＳＷＮＴで取得したラマンスペクトルを、図１４Ａの下のスペクトルに示す。６Ｔピークの強度は保持されているが、ＳＷＮＴの約１５９０ｃｍ−１におけるＧモードは強度が低下している。ＳＷＮＴの約１３３０ｃｍ−１におけるＤ−モードと呼ばれる不良モードの出現は、分子（６Ｔおよびグラフト）とＳＷＮＴに相互作用があることを示す。スペクトル内のＳＷＮＴモードの変化および６Ｔ信号に変化が無いことは、ＳＷＮＴがブロモフェニル付加物で官能化されていることおよび６Ｔがナノチューブ内にあることの証明である。
【０１１２】
別の一連の実験では、酸化シリコン基板に堆積された６Ｔ＠ＳＷＮＴの２つの個々の位置を、まず微小ラマン分光法およびＡＦＭ撮像を用いて特定した（図１５Ａ〜１５Ｂ）。各ＳＷＮＴカプセルと関係したラマンスペクトルは励起エネルギーによる独特な共鳴を示し、１つは金属（図１５Ａ）、他方は半導体（図１５Ｂ）を示す。発明者等のレーザーアブレーションＳＷＮＴ試料では、金属ＳＷＮＴだけが１．９４ｅＶでラマン共鳴し（図１５Ａ）、半導体ＳＷＮＴは２．３３ｅＶおよび２．５４ｅＶだけで共鳴している（図１５Ｂ）ことから、そのような識別ができる。２．３３および２．５４ｅＶ励起では、単独の金属６Ｔ＠ＳＷＮＴには１４６０ｃｍ−１に強い６Ｔピークが有り、ＳＷＮＴカプセルの信号にはほとんど無い。すなわちＳＷＮＴは共鳴せず、６Ｔは明確に共鳴しており、これは図１４Ｂの吸収スペクトルと一致する。１．９４ｅＶ励起ではその逆が観察される。すなわち６Ｔ信号は弱く、ＳＷＮＴは強い。したがってＳＷＮＴおよび６Ｔのラマン信号には相互関係が無く、吸収スペクトル内の共鳴パターンに従っているだけである。さらに、ＳＷＮＴ共鳴の存在は６Ｔラマン信号の強調に大きく寄与しないということが明確に分かる。単独の半導体６Ｔ＠ＳＷＮＴ（図１５Ｂ）の場合、６ＴおよびＳＷＮＴの両方とも２．５４および２．３３ｅＶにはラマンピークがあるが１．９４ｅＶ励起には信号が無いことを示している。この一致はそれぞれの共鳴のスペクトルの重なりから起こる。金属６Ｔ＠ＳＷＮＴも半導体６Ｔ＠ＳＷＮＴも、６Ｔ信号の強度は分子の吸収特性のみに従う。したがって、ＳＷＮＴカプセルが金属か半導体か、官能化されたか否かは６Ｔ信号に影響しない。最後に、このスペクトルはラマンプローブからの蛍光信号が僅かまたは無いことを示している。したがってこの構造は、色素分子の通常の蛍光による背景雑音を積極的に抑制する。これらの特性はラマン撮像および標識用途に理想的である。
【０１１３】
分極実験を単独の半導体６Ｔ＠ＳＷＮＴで行った。図１５Ｃ中の分極のグラフは、２．３３ｅＶのレーザー分極に対する６Ｔのラマン信号（１４５０ｃｍ−１）および単独のＳＷＮＴ（１５９０ｃｍ−１）は直接の相互関係があることを示す。分極角θは管軸と光の分極ベクトルの角度によって定義される（図１５Ｃにはめ込み）。分極のｃｏｓ２θ依存は、６Ｔ分子に双極子活性があること、およびこれらが管に沿って綺麗に整列していることを実証している。ラマンプローブのこの特性は分子の封入の１つの利点を示す。分極の結果およびＳＷＮＴカプセルの共有結合性官能化の効果の両方によって、ＳＷＮＴが６Ｔ分子を保護・整列させることが明確に実証される。この最終結果は、強く分極されたラマンプローブが強い異方性信号を与えることを示している。
【０１１４】
ラマンプローブ特有の構造的特性は、ＳＷＮＴに封入された分子のラマン散乱に観察される大きな強調係数という原点に現れる。図６の６Ｔ＠ＳＷＮＴの束で先に実施されたように、単独のＳＷＮＴのラマン断面の解析から、ラマンプローブの断面積は１４６０ｃｍ−１で約１０−２１ｃｍ２／ｓｒであることが分かり、これは６Ｔの固有信号の波数である。最大４５５の分子が存在すると仮定すると、分子あたりの断面積は約１０−２４ｃｍ２／ｓｒである。この値は共鳴状態の同様のラマン色素の断面積に一致する。ラマンプローブが色素分子の共鳴ラマン効果の利点を引き出す最良条件を提供することがわかる。分子あたりの面積が（１．４ｎｍ×４．４７ｎｍ）／４＝１．５７×１０−１４ｃｍ２であることを考慮すると、そのような断面積から、プローブのラマン信号の検出には光子数がおよそ１０１１〜１０１０であれば十分であることが示唆される。これは、現在入手できる代表的なレーザー出力を考えると極めて合理的である（６３３ｎｍ波長に対し、４５μＷ／ｃｍ２で約１０１４光子Ｓ−１ｃｍ−２）。したがってプローブのこのラマン断面積はラマン撮像に良く適している。図１６Ａ〜１６Ｃの画像がこれを実証する。６Ｔ＠ＳＷＮＴの層をＳｉＯ２／Ｓｉ基板上にパターン化し、ＳＥＭ（図１６Ａ）およびラマン（図１６Ｂ）分布図作成を用いて画像化した。両画像は図１６Ｃに示した様にきれいに重なる。このラマン画像を得るには、３００μＷ／ｃｍ２のレーザー出力で画素あたり５秒しかかからない。すなわちこの実証から、ラマンプローブのラマン撮像および分子標識での潜在的用途の実施例が提供される。
［１］ラマン散乱プローブであって、
ナノメートル寸法のカプセルと、
該カプセルに結合され、該プローブが励起光線で照らされるとラマン散乱反応を示す少なくとも１つのラマン活性分子と、
該カプセルの外側に固着され該カプセルと標的材料の連結を可能にする少なくとも１つの官能化化学基と、を含む、ラマン散乱プローブ。
［２］カプセルが少なくとも１つのナノチューブを含む、［１］に記載のプローブ。
［３］ラマン活性分子が前記カプセル内に封入されている、［１］および［２］のいずれかに記載のプローブ。
［４］ラマン活性分子が前記カプセルの外表面に固着されている、［１］および［２］のいずれかに記載のプローブ。
［５］ラマン活性分子が前記官能化化学基に固着される、［１］および［２］のいずれかに記載のプローブ。
［６］少なくとも１つの官能化化学基が、標的材料に特異的に固着する特異的官能化化学基を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載のプローブ。
［７］少なくとも１つの官能化化学基が、それぞれが異なる標的材料に特異的に固着する複数の特異的官能化化学基を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載のプローブ。
［８］少なくとも１つの官能化化学基が、複数の異なる標的材料のいずれか１つに特異的に固着する多重特異性官能化化学基を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載のプローブ。
［９］少なくとも１つの官能化化学基が、それぞれが複数の異なる標的材料のいずれか１つに特異的に固着する複数の多重特異性官能化化学基を含む、［８］に記載のプローブ。
［１０］少なくとも１つの官能化基が、カルボン酸もしくはアミン、ＤＮＡ基もしくはＲＮＡ基、またはハロゲン化フェニル基を含む、［１］〜［９］のいずれかに記載のプローブ。
［１１］少なくとも１つの官能化化学基が、標的材料を含む液体媒体中のプローブの分散または溶解を容易にする分散化学的官能化基を含む、［１］〜［１０］のいずれかに記載のプローブ。
［１２］少なくとも１つの官能化化学基が記標的材料に固着する複数の二次官能化化学基のいずれか１つと結合するように適合した一般的官能化基を含む、［１］〜［１１］のいずれかに記載のプローブ。
［１３］少なくとも１つの官能化化学基が、一般的官能化基に結合した二次官能化化学基の少なくとも１つをさらに含む、［１２］に記載のプローブ。
［１４］一般的官能化基が、脂肪族疎水基、極性基、または帯電基を含む、［１１］〜［１３］のいずれかに記載のプローブ。
［１５］ラマン散乱プローブを作製する方法であって、
ナノメートル寸法のカプセルを用意すること、
該プローブが励起光線で照らされるとラマン散乱反応を示すラマン活性分子を該カプセルに結合すること、
該カプセルの外表面に該カプセルと標的材料の間の連結を提供する官能化化学基を固着すること、を含む方法。
［１６］ナノメートル寸法のカプセルを提供することが、少なくとも１つのナノチューブを提供することを含む、［１５］に記載の方法。
［１７］ナノメートル寸法のカプセルを提供することが、該カプセルを未処理の形態で提供すること、および、該カプセルを洗浄することおよび開放することを含む、［１５］および［１７］のいずれかに記載の方法。
［１８］ラマン活性分子をカプセルに結合することが、該ラマン活性分子を該カプセルの内側に封入することを含む、［１５］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］ラマン活性分子をカプセルに結合することが、該ラマン活性分子を官能化化学基に固着することを含む、［１５］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［２０］官能化化学基をカプセルの外表面に固着することが、標的材料に直接結合する官能化化学基を固着することを含む、［１５］〜［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］官能化化学基をカプセルの外表面に固着することが、標的材料に固着する複数の二次官能化化学基のいずれか１つに結合するように適合した一般的官能化基を固着することを含む、［１５］〜［１９］のいずれかに記載の方法。
［２２］官能化化学基を固着することが、少なくとも１つの二次化学基を一般的官能化基に結合することをさらに含む、［２１］に記載の方法。
［２３］試料のラマン調査を行う方法であって、
ラマン散乱プローブを該試料中の対象の標的材料に固着すること、ここで、該ラマン散乱プローブは少なくとも１つのラマン活性分子が結合したナノメートル寸法のカプセルを含み、該プローブは、該カプセルの外側に固着され該標的材料との結合を形成する少なくとも１つの官能化化学基を介して固着され、
該試料を、該ラマン活性分子内のラマン散乱反応を引き起こす波長を有する励起光線で照らすこと、
該ラマン散乱反応の結果発生する光を検出すること、を含む方法。
［２４］カプセルが、ラマン活性分子が封入された少なくとも１つのナノチューブを含む、［２３］に記載の方法。
［２５］官能化化学基が標的材料に直接結合する、［２３］および［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］官能化化学基が、それぞれが標的材料に直接結合する複数の二次化学基のいずれかと結合する一般的化学的官能化基を含む、［２３］および［２４］のいずれかに記載の方法。
［２７］官能化化学基が、一般的官能化基に結合した少なくとも１つの二次化学基をさらに含む、［２６］に記載の方法。 
［２８］ラマン調査がラマン分光測定を含む、［２３］〜［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］ラマン調査がラマン撮像を含む、［２３］〜［２７］のいずれかに記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図６】
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【図１６】
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