(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物又はその分画物を含む肥満の予防又は治療用薬学組成物であって、当該複合抽出物がＣ１〜Ｃ４アルコール又はそのアルコールと水との混合溶媒を用いた抽出物である薬学組成物。
【請求項２】
前記複合抽出物は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジが１：０．２〜１：０．２〜１（ｗ／ｗ／ｗ）の割合で混合した試料の抽出物である請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項３】
サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウを、１０：４〜６：１０：４〜６（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）の割合で混合した試料の複合抽出物又はその分画物を含む肥満の予防又は治療用薬学組成物であって、当該複合抽出物がＣ１〜Ｃ４アルコール又はそのアルコールと水との混合溶媒を用いた抽出物である薬学組成物。
【請求項４】
前記複合抽出物は、２５％エタノール（ＥｔＯＨ）を用いて抽出したものである請求項１又は３に記載の薬学組成物
【請求項５】
前記分画物は、前記複合抽出物に溶媒分画法、限外濾過分画法、クロマトグラフィー分画法及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法を適用して分画した分画物である請求項１又は３に記載の薬学組成物。
【請求項６】
サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物又はその分画物を含む肥満の予防又は改善用食品組成物であって、当該複合抽出物がＣ１〜Ｃ４アルコール又はそのアルコールと水との混合溶媒を用いた抽出物である食品組成物。
【請求項７】
前記複合抽出物は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジが、１：０．２〜１：０．２〜１（ｗ／ｗ／ｗ）の割合で混合した試料の抽出物である請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウを、１０：４〜６：１０：４〜６（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）の割合で混合した試料の複合抽出物又はその分画物を含む肥満の予防又は改善用食品組成物であって、当該複合抽出物がＣ１〜Ｃ４アルコール又はそのアルコールと水との混合溶媒を用いた抽出物である食品組成物。
【請求項９】
前記複合抽出物は、２５％エタノール（ＥｔＯＨ）を用いて抽出したものである請求項６又は８に記載の食品組成物。
【請求項１０】
前記分画物は、前記複合抽出物に溶媒分画法、限外濾過分画法、クロマトグラフィー分画法及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法を適用して分画した分画物である請求項６又は８に記載の食品組成物。
【請求項１１】
サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含む試料をＣ１〜Ｃ４のアルコール又はそのアルコールと水との混合溶媒で抽出して抽出物を取得する段階を含む、請求項１又は６記載の組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記試料は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを１：０．２〜１：０．２〜１（ｗ／ｗ／ｗ）の割合で含むものである請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウを１０：４〜６：１０：４〜６（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）の割合で含む試料をＣ１〜Ｃ４のアルコール又はそのアルコールと水との混合溶媒で抽出して抽出物を取得する段階を含む、請求項３又は８記載の組成物の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から５のいずれか一項の薬学組成物を、ヒトを除いた個体に投与する段階を含む、肥満の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物を含む、肥満の予防又は治療用組成物に関するものである。より具体的に、本発明は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物、又はサンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの複合抽出物を含む、肥満の予防又は治療用薬学組成物、食品組成物及び前記複合抽出物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満とは、一般に体内に脂肪組織が過剰な状態であることを意味し、食物から摂取したエネルギーが身体活動などにより消費したエネルギーと均衡をなすことができず、余分なエネルギーが体脂肪として蓄積される現象である。長期間にわたるエネルギーの不均衡により体脂肪が異常に多くなると、糖尿病、高脂血症、心臓病、脳卒中、動脈硬化症、脂肪肝などの各種代謝性疾患や生活習慣病が誘発されるが、これは西欧のみならず韓国においても深刻な社会問題として台頭している。
【０００３】
肥満は、遺伝的要因、西洋化した食生活による環境的要因、ストレスによる心理的要因、エネルギー代謝の異常などの様々な原因により発生する。また、その種類は、原因によって食べ過ぎや運動不足による単純性肥満と、内分泌性、視床下部性、遺伝性、代謝性などによる症候性肥満とに分けられる。
【０００４】
肥満度評価には、体重を測定する方法、皮膚のシワの厚さを測定する方法があるが、一般に肥満度指数２５以上を肥満と定義する。身体の肥満指数（体質量指数, body mass index, BMI）は、体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の２乗で割った値であり、西洋人は３０以上であるが、人種差を考慮して韓国では２５以上を肥満と評価している。
【０００５】
全世界的に肥満治療剤の開発のために多角的な研究が進められている。肥満治療用薬物は、大きく脂肪吸収抑制、脂肪分解及び熱発生促進、食欲及び満腹感の調節、タンパク質代謝阻害、そして食物の摂取に関する情緒調節機序に分けられる。代表的な肥満治療剤としては、オルリスタット（orlistat）を原料として脂肪吸収を抑制するゼニカルＴＭ（XenicalTM）と、シブトラミン（sibutramine）を主原料とし、交感神経系を刺激して食欲を抑制するリダクティルＴＭ（ReductilTM）とがある。しかし、ゼニカルＴＭにおいては、脂肪便、腹痛、嘔吐、かゆみ、肝臓損傷などの副作用が報告されており、リダクティルＴＭにおいては、頭痛、食欲不振、不眠症、便泌などの副作用だけでなく、深刻な心血管系副作用を引き起こすことから、近年、使用基準が強化されるなどの論難が起きている。 
【０００６】
このような肥満治療剤による薬物療法以外にも、肥満を予防、治療するための方法として、食物の摂取を制限する食餌療法、エネルギー消費を増加させる運動療法があり、精神療法、行動療法、外科療法なども行われている。
【０００７】
好ましい肥満の治療方法としては、運動によるエネルギー消費の促進と副作用が少ない肥満治療用薬剤を併用することが、最も安全かつ効果的な方法として提示されている。しかし、肥満治療用薬剤においては、前述したゼニカルＴＭとリダクティルＴＭの例のように深刻な副作用が報告されており、安全性に対する明確な信頼が裏付けられていない現状である。従って、人体において抗肥満に優れた効能を示すと共に安全性が保証される物質の開発が求められている。
【０００８】
こうした背景の下、本発明者らは、人体に副作用を引き起こすことなく肥満治療効果に優れた物質を見出すべく鋭意努力した結果、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物が、細胞に毒性を示さない範囲で肥満に対する予防及び治療効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物又はその分画物を、それを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む、肥満の予防又は治療方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの複合抽出物又はその分画物を、それを必要とする個体に有効量で投与する段階を含む、肥満の予防又は治療方法を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含む試料を水、Ｃ１〜Ｃ４のアルコール又はそれらの混合溶媒で抽出して抽出物を取得する段階を含む、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物の製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウを含む試料を水、Ｃ１〜Ｃ４のアルコール又はそれらの混合溶媒で抽出して抽出物を取得する段階を含む、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの複合抽出物の製造方法を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物又はその分画物を含む組成物を提供することを目的とする。
【００１４】
さらに、本発明は、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの複合抽出物又はその分画物を含む組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明の一態様は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの複合抽出物又はそれらの分画物を含む肥満の予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【００１６】
本発明における「サンパクソウ（Saururus chinensis Baill.）」とは、漢方薬の薬材として用いられてきた、コショウ目ドクダミ科の多年生草本を意味する。前記サンパクソウは、味が苦くて、辛く、花と根が白色であり、花が咲く頃に上部の葉２〜３枚が白色に変わり、実が９〜１０月頃につぼみに１つずつ丸く実ることが知られている。
【００１７】
本発明における前記サンパクソウは、肥満の予防又は治療用薬学組成物の有効成分として用いられてもよく、この際、用いられる部位は、葉、茎、根又は植物全部位になり得る。
【００１８】
本発明における「キョウオウ（Curcumae Longae Rhizoma）」とは、漢方薬の薬材として用いられてきた、ショウガ目ショウガ科の多年生草本を意味する。前記キョウオウは、味が辛くて、苦く、根茎の表面は薄黄色、中は朱色であり、樟脳のような香りがし、花穂は葉より先に付き、４〜６月に葉腋から黄色の花が咲くことが知られている。
【００１９】
本発明における前記キョウオウは、肥満の予防又は治療用薬学組成物の有効成分として用いられてもよく、この際、用いられる部位は茎又は根の部分になり得る。
【００２０】
本発明における「オンジ（Polygalae Radix）」とは、漢方薬の薬材として用いられてきた、マメ目ヒメハギ科の多年生草本を意味する。前記オンジは、味が辛く、苦く、根が太く、長く、筋があり、上部にあるやや曲がった毛を除いて毛がほとんどなく、７〜８月に赤紫色の花が咲き、実はいくつかの房に分かれて多くの種子が入ったさく果であることが知られている。
【００２１】
本発明における前記オンジは、肥満の予防又は治療用薬学組成物の有効成分として用いられてもよく、この際、用いられる部位は根の部分になり得る。
【００２２】
本発明における「セキショウ（Acori Gramineri Rhizoma）」とは、漢方薬の薬材として用いられてきた、サトイモ目サトイモ科の多年生草本を意味する。前記セキショウは、根茎が横に伸び、節からヒゲ根を出し、地中では節間が長いが、地上に出るものは、節間が短く、全体的に緑色を呈し、１つの花におしべとめしべの両方が備わっている両性花であり、６〜７月に黄色の花が咲き、実はいくつかの房に分かれて多くの種子が入っていることが知られている。
【００２３】
本発明における前記セキショウは、肥満の予防又は治療用薬学組成物の有効成分として用いられてもよく、用いられる部位は茎及び根の部位になり得る。
【００２４】
本発明における「複合抽出物」とは、前記サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含む試料を抽出して得られた複合抽出物、又は前記サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウを含む試料を抽出して得られた複合抽出物を意味する。植物は、抽出部位によって各抽出物又はその分画物の活性の有無、活性の程度、及びそれに含まれる具体的な成分が相異することがある。本発明者らは、サンパクソウの植物全体、キョウオウの茎と根の部位及びオンジの根の部位の複合抽出物、又はサンパクソウの植物全体、キョウオウの茎と根の部位、オンジの根の部位及びセキショウの茎と根の部位の複合抽出物が、肥満を予防又は治療する効果を示すことを最初に解明した。
【００２５】
本発明における前記複合抽出物は、肥満の予防又は治療用薬学組成物の有効成分として用いられてもよく、前記複合抽出物を得るための試料に含まれるサンパクソウ、キョウオウ及びオンジの含量は、肥満の予防又は治療効果を示す組成物の製造に用いられるものであれば特にそれらに限定されるものではないが、前記試料に含まれるサンパクソウ、キョウオウ及びオンジの混合比が１：０．２〜１：０．２〜１（ｗ／ｗ／ｗ）であることが好ましく、前記混合比が１：０．４〜１：０．４〜１（ｗ／ｗ／ｗ）であることがより好ましく、前記混合比が１：０．６：１（ｗ／ｗ／ｗ）であることが最も好ましい。
【００２６】
また、前述したサンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウを含む試料から複合抽出物を取得する場合、前記試料に含まれるサンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの含量は、肥満の予防又は治療効果を示す組成物の製造に用いられるものであれば、特にそれらに限定されるものではないが、前記試料に含まれるサンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの混合比が１：０．２〜１：０．２〜１：０．２〜１（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）であることが好ましく、前記混合比が１：０．４〜１：０．４〜１：０．４〜１（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）であることがより好ましく、前記混合比が１：０．６：１：０．４（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）であることが最も好ましい。また、前述したサンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウは、商業的に市販されているものを購入して用いてもよく、自然から採取又は裁培したものを用いてもよい。
【００２７】
前記抽出方法としては、これらに限定されるものではないが、熱湯抽出、熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出、又は超音波抽出などの方法を用いることが好ましい。
【００２８】
前記抽出物は、抽出溶媒で抽出するか、抽出溶媒で抽出して製造した抽出物に分画溶媒を加えて分画することにより製造することができる。前記抽出溶媒は、これらに限定されるものではないが、水、有機溶媒、又はそれらの混合溶媒などを用いることができ、前記有機溶媒は、炭素数１〜４のアルコール、エチルアセテート又はアセトンなどの極性溶媒、ヘキサン又はジクロロメタンの非極性溶媒、又はそれらの混合溶媒を用いることができる。また、水、炭素数１〜４のアルコール又はそれらの混合溶媒を用いることが好ましく、エタノールを用いることがより好ましい。本発明の一実施例においては、前記溶媒として２５％エタノール（ＥｔＯＨ）を用いた抽出物を製造した。
【００２９】
前記抽出物は、それぞれ薬学組成物の総重量に対して０．００１〜１００重量％、より好ましくは０．１〜８０重量％の量で含まれ得る。
【００３０】
本発明における「複合抽出物の分画物」とは、前記各複合抽出物から特定成分又は特定群を分離する分画方法で得られた結果物を意味する。
【００３１】
本発明における前記分画物は、複合抽出物に対して様々な分画方法を適用することにより得ることができるが、前記分画方法としては、特にこれらに限定されるものではないが、様々な溶媒を処理して行う溶媒分画法、一定の分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を通過させて行う限外濾過分画法、様々なクロマトグラフィー（サイズ、電荷、疎水性又は親和性による分離のために製作された）を行うクロマトグラフィー分画法などが挙げられる。特に、前記溶媒分画法に用いられる溶媒は、特にこれらに限定されるものではないが、極性溶媒又は非極性溶媒を用いることができ、非極性溶媒を用いることが好ましい。前記溶媒分画法は、非極性レベルの高い溶媒から低い溶媒を用いて前記複合抽出物を順に分画する方法として用いることができるが、例えばヘキサン又はエチルアセテートを用いて前記複合抽出物を順に分画する方法を用いることができる。
【００３２】
前記分画物は、それぞれ薬学組成物の総重量に対して０．００１〜１００重量％、より好ましくは０．１〜８０重量％で含まれ得る。
【００３３】
本発明における「薬学的組成物」とは、疾病の予防又は治療を目的に製造されたものを意味し、それぞれ通常の方法で様々な形態に剤形化して用いることができる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤などの経口剤形に剤形化することができ、外用剤、坐剤及び滅菌注射用液の形態に剤形化することができる。
【００３４】
本発明における「肥満」とは、体重の増加により健康上不適切な状態を招くものであり、エネルギー摂取がエネルギー消費より多くて、消費されずに残った過剰エネルギーが様々な脂質の形態で体脂肪として蓄積されたり、血液中に脂質の含量が高くなった状態を意味する。前記肥満が発生すると、糖尿病、高脂血症、心臓病、脳卒中、動脈硬化症、脂肪肝などの各種代謝性疾患や生活習慣病が誘発され得る。
【００３５】
本発明で提供する組成物は、脂肪生成を抑制することにより肥満を治療できるだけでなく、肥満から派生する肥満関連疾患、例えば糖尿病、高脂血症、心臓病、脳卒中、動脈硬化症、脂肪肝などの各種代謝性疾患を改善、予防又は治療することができる。
【００３６】
本発明における「予防」とは、本発明の組成物を投与することにより、前記肥満又は肥満関連疾患の発生を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。
【００３７】
本発明における「治療」とは、本発明の組成物を投与することにより、前記肥満又は肥満関連疾患の症状を好転させたり、好適に変更させるあらゆる行為を意味する。
【００３８】
本発明の一実施例によれば、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウを含む試料又は前記各成分を個別に含む試料の熱水抽出物（複合抽出物又は個別抽出物）、温水抽出物（複合抽出物又は個別抽出物）又はエタノール抽出物（複合抽出物又は個別抽出物）をそれぞれ取得し（表１）、前記各抽出物を様々な濃度で３Ｔ３−Ｌ１細胞に処理して（表２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗肥満効果を検証した結果、熱水抽出物（図１ａ〜図１ｃ）、温水抽出物（図２ａ〜図２ｃ）、又はエタノール抽出物（図３ａ〜図３ｃ）の中で、複合抽出物とオンジ抽出物は、脂肪含量減少効果と細胞数減少効果を示し、サンパクソウ抽出物、キョウオウ抽出物及びセキショウ抽出物は脂肪含量減少効果と細胞数減少効果を全く示さないことが確認された。また、前記熱水抽出物、温水抽出物及びエタノール抽出物のうち、エタノール抽出物が脂肪含量減少効果及び安全性に最も優れることが確認された。さらに、前記各抽出物を様々な含量で高脂肪食餌を与えたマウスに投与し（表３）、前記各抽出物のｉｎ ｖｉｖｏ抗肥満効果を検証した結果、オンジ抽出物と複合抽出物（エタノール抽出物）を投与したマウスで最も優れた体重減少効果が示され、そのうちオンジ抽出物は深刻な毒性を示すのに対して、複合抽出物（エタノール抽出物）は毒性が低いことが確認され（図４）；脂肪重量を測定した結果、脂肪増加抑制効果に最も大きな影響を及ぼす成分はオンジであり、その次がキョウオウであり、セキショウは脂肪増加抑制効果に寄与するところが最も少ないと分析され（図６）、肝臓組織（図７）及び腎臓組織（図８）において、オンジ抽出物に比べて複合抽出物（エタノール抽出物）が高い安全性を示すことが確認された。
【００３９】
本発明の他の実施例によれば、前記複合抽出物に含まれる成分のうち脂肪増加抑制効果に寄与するところが最も少ないと分析されたセキショウを除く残りのサンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物の肥満抑制効果を確認するために、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを必ず含み、セキショウとクローバーを選択的に含む試料を対象に各エタノール抽出物を取得した（表４）。前期取得した各エタノール抽出物を様々な用量でマウスに投与して各実験動物を得て（表５）、前述したように得られた実験動物を対象に体重（図９）、食餌摂取量（図１０）、脂肪重量（図１１ａ〜図１１ｄ）、グレリンレベル（図１２ａ〜図１２ｃ）、レプチンレベル（図１３）及び血中成分レベル（図１４ａ〜図１４ｋ）を評価した。その結果、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物だけでなく、それにセキショウを含む複合抽出物もまた対照群に比べ、向上した抗肥満効果を示すことが確認された。
【００４０】
従って、本発明の抗肥満用組成物に含まれる複合抽出物は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを必ず含むか、それに加えて、セキショウをさらに含む試料から得られることが分かった。
【００４１】
前記本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体をさらに含むことができる。薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であり得る。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、１つの化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）又はラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当され、通常用いられる通常の希釈剤である水、液体パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などのような植物性油、オレイン酸エチルなどのような注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
【００４２】
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができる。
【００４３】
前記目的を達成するために、本発明の他の実施形態は、前記複合抽出物又はその分画物を有効成分として含む肥満予防又は治療用薬学組成物を、肥満が発生する可能性があるか、又は発生した個体に投与する段階を含む、肥満を予防又は治療する方法を提供する。この際、前記複合抽出物に含まれる各有効成分は前述したものと同一である。
【００４４】
本発明における「個体」とは、肥満が発生したか、発生する可能性のあるヒトを含むあらゆる動物を意味する。
【００４５】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で個体に本発明の薬学組成物を導入する行為を意味する。
【００４６】
本発明における前記薬学組成物の投与は、目的組織に到達できるものであれば、いかなる一般的な経路を介しても行うことができる。本発明の薬学組成物は、目的に応じて経口投与、口腔投与、直腸投与、局所投与、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、経鼻(nasal)投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、鼻内(intranasal)投与、肺内投与、直腸内投与、眼球投与などの方法で投与することができるが、これらに限定されるものではない。また、前記薬学組成物は、活性物質が標的細胞へ移動できる任意の装置により投与することができる。
【００４７】
本発明の一実施例による薬学組成物は前記複合抽出物を含む。前記組成物に含まれる複合抽出物の含量は、特にこれに限定されるものではないが、薬学組成物の総重量に対して０．１〜５０重量％で含むことができる。
【００４８】
前記本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与することができるが、本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素及びその他医学分野で公知の要素により決定される。本発明の薬学組成物は、個別治療剤で投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次又は同時に投与することができる。そして、単一又は多重投与することができる。前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大限の効果が得られる量を投与することが重要である。
【００４９】
本発明の肥満予防又は治療用薬学組成物の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分として用いられる物質の種類などを考慮して当業者が決定することができる。一実施例として、本発明の薬学組成物は、成人１人当たり約１μｇ／ｋｇ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは２０〜３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量で投与することができる。前記薬学組成物の投与頻度は、特にこれらに限定されるものではないが、１日１回投与してもよく、又は用量を数回に分けて投与してもよい。
【００５０】
前記目的を達成するために、本発明のさらに他の実施形態は、前記複合抽出物又はその分画物を含む肥満予防又は改善用食品組成物を提供する。
【００５１】
前記複合抽出物に含まれるサンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウは、長期間にわたって漢方薬の薬材として用いられており、その安全性が立証されているので、常食することもでき、肥満の予防又は改善を図ることのできる食品の形態として製造され摂取することができる。この際、前記食品に含まれる前記複合抽出物又はその分画物の含量は、特にこれらに限定されるものではないが、食品組成物の総重量に対して０．０１〜１００重量％、より好ましくは１〜８０重量％で含まれ得る。食品が飲料の場合は、１００ｍｌを基準に１〜３０ｇ、好ましくは３〜２０ｇの割合で含まれ得る。また、前記組成物は、食品組成物に常用されて香り、味、視覚などを向上させることのできる追加成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（niacin）、ビオチン（biotin）、葉酸（folate）、パントテン酸（panthotenic acid）などを含んでもよい。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）などのミネラルを含むことができる。また、リシン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。また、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（サラシ粉と高度サラシ粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）など）、甘味料（ズルチン、チクロ、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ−酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、被膜剤、ガムベース、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（food additives）を添加することができる。前記添加物は、食品の種類によって選別されて適切な量で用いられる。
【００５２】
一方、前記複合抽出物又はその分画物を含む食品組成物を用いて肥満予防又は改善用機能性食品を製造することができる。
【００５３】
具体的な例として、前記食品組成物を用いて肥満を予防又は改善できる加工食品を製造することができる。このような加工食品には、例えば、菓子、飲料、酒類、発酵食品、缶詰、牛乳加工食品、肉類加工食品、麺類などが含まれる。菓子には、ビスケット、パイ、ケーキ、パン、キャンディ、ゼリー、ガム、シリアル（シリアルフレークなどの食事代用品類を含む）などが含まれる。飲料には、飲用水、炭酸飲料、機能性イオン飲料、ジュース（例えば、リンゴ、ナシ、ブドウ、アロエ、ミカン、ピーチ、ニンジン、トマトジュースなど）、シッケ(食醢)などが含まれる。酒類には、日本酒、ウイスキー、焼酎、ビール、洋酒、果実酒などが含まれる。発酵食品には、醤油、味噌、コチュジャンなどが含まれる。缶詰には、水産物缶詰（例えば、マグロ、サバ、サンマ、サザエ缶詰など）、畜産物缶詰（牛肉、豚肉、鶏肉、七面鳥缶詰など）、農産物缶詰（トウモロコシ、モモ、パイナップル缶詰など）が含まれる。牛乳加工食品には、チーズ、バター、ヨーグルトなどが含まれる。肉類加工食品には、トンカツ、ビーフカツ、チキンカツ、ソーセージ、酢豚、ナゲット類、ノビアニなどが含まれる。麺類には、密封包装生麺などが含まれる。これら以外にも、前記組成物はレトルト食品、スープ類などに用いることができる。
【００５４】
本発明における「機能性食品（functional food）」とは、特定保健用食品（food for special health use, FoSHU）と同義であり、栄養供給以外にも生体調節機能が効率的に表れるように加工された医学、医療的効果の高い食品を意味し、前記食品は骨疾患の予防又は改善に有用な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸剤などの様々な形態に製造することができる。
【００５５】
前記目的を達成するために、本発明のさらに他の実施形態は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含む試料を水、Ｃ１〜Ｃ４のアルコール又はそれらの混合溶媒で抽出して抽出物を取得する段階を含む前記複合抽出物の製造方法を提供する。
【００５６】
前記複合抽出物の製造方法において、熱水抽出法、温水抽出法、エタノール抽出法、超音波抽出法、濾過法、還流抽出法など、当業界の通常の抽出方法を用いることができ、抽出物を得た後に前記抽出物を濾過、濃縮又は凍結乾燥する段階をさらに含むことができる。
【００５７】
前記目的を達成するために、本発明のさらに他の実施形態は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含む試料を水、Ｃ１〜Ｃ４のアルコール又はそれらの混合溶媒で抽出して抽出物を取得する段階を含む、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物の製造方法を提供する。この際、前記複合抽出物に含まれる各有効成分は前述したものと同一である。
【００５８】
前記試料は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを１：０．２〜１：０．２〜１（ｗ／ｗ／ｗ）の割合で含むものであってもよい。
【００５９】
前記目的を達成するために、本発明のさらに他の実施形態は、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウを含む試料を水、Ｃ１〜Ｃ４のアルコール又はそれらの混合溶媒で抽出して抽出物を取得する段階を含む、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの複合抽出物の製造方法を提供する。この際、前記複合抽出物に含まれる各有効成分は前述したものと同一である。
【００６０】
前記試料は、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウを１：０．２〜１：０．２〜１：０．２〜１（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）の割合で含むものであってもよい。
【００６１】
前記目的を達成するために、本発明のさらに他の実施形態は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジの複合抽出物又はその分画物を含む組成物を提供する。この際、前記複合抽出物に含まれる各有効成分は、前述したものと同一である。
【００６２】
前記組成物は、肥満の治療用途のものであってもよい。
【００６３】
前記複合抽出物は、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジが１：０．２〜１：０．２〜１（ｗ／ｗ／ｗ）の割合で混合した試料の抽出物であってもよい。
【００６４】
前記複合抽出物は、２５％エタノール（ＥｔＯＨ）を用いて取得ものであってもよい。
【００６５】
前記目的を達成するために、本発明のさらに他の実施形態は、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの複合抽出物又はその分画物を含む組成物を提供する。この際、前記複合抽出物に含まれる各有効成分は前述したものと同一である。
【００６６】
前記組成物は、肥満の治療用途のものであってもよい。
【００６７】
前記複合抽出物は、サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウが１：０．２〜１：０．２〜１：０．２〜１（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）の割合で混合した試料の抽出物であってもよい。
【００６８】
前記複合抽出物は、２５％エタノール（ＥｔＯＨ）を用いて得たものであってもよい。
【発明の効果】
【００６９】
本発明の複合抽出物を含む組成物は、細胞毒性の副作用がなく、脂肪生成を阻害することができるので、肥満又は肥満関連疾患の予防、改善又は治療に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１ａ】オイルレッドＯ染色により、３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞内の中性脂肪蓄積に対するＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）熱水抽出物の抑制効果を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１からの分化を誘導する際にＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂとその組成生薬熱水抽出物で処理して８日後にオイルレッドＯ染色を行った。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＊印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した中性脂肪蓄積の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１ｂ】オイルレッドＯ染色により、３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞内の中性脂肪蓄積に対するＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）熱水抽出物の抑制効果を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１からの分化を誘導する際にＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂとその組成生薬熱水抽出物で処理して８日後にオイルレッドＯ染色を行った。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＊印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した中性脂肪蓄積の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１ｃ】オイルレッドＯ染色により、３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞内の中性脂肪蓄積に対するＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）熱水抽出物の抑制効果を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１からの分化を誘導する際にＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂとその組成生薬熱水抽出物で処理して８日後にオイルレッドＯ染色を行った。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＊印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した中性脂肪蓄積の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１ｄ】３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率に及ぼすＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）熱水抽出物の影響を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率をＷＳＴ法で測定して示したものである。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１ｅ】３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率に及ぼすＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）熱水抽出物の影響を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率をＷＳＴ法で測定して示したものである。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１ｆ】３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率に及ぼすＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）熱水抽出物の影響を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率をＷＳＴ法で測定して示したものである。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図２ａ】オイルレッドＯ染色により、３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞内の中性脂肪蓄積に対するＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）ＤＷ抽出物（蒸留水抽出物）の抑制効果を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１からの分化を誘導する際にＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂとその組成生薬熱水抽出物で処理して８日後にオイルレッドＯ染色を行った。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＊印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した中性脂肪蓄積の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図２ｂ】オイルレッドＯ染色により、３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞内の中性脂肪蓄積に対するＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）ＤＷ抽出物（蒸留水抽出物）の抑制効果を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１からの分化を誘導する際にＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂとその組成生薬熱水抽出物で処理して８日後にオイルレッドＯ染色を行った。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＊印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した中性脂肪蓄積の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図２ｃ】オイルレッドＯ染色により、３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞内の中性脂肪蓄積に対するＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）ＤＷ抽出物（蒸留水抽出物）の抑制効果を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１からの分化を誘導する際にＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂとその組成生薬熱水抽出物で処理して８日後にオイルレッドＯ染色を行った。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＊印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した中性脂肪蓄積の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図２ｄ】３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率に及ぼすＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）ＤＷ抽出物（蒸留水抽出物）の影響を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率をＷＳＴ法で測定して示したものである。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図２ｅ】３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率に及ぼすＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）ＤＷ抽出物（蒸留水抽出物）の影響を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率をＷＳＴ法で測定して示したものである。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図２ｆ】３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率に及ぼすＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）ＤＷ抽出物（蒸留水抽出物）の影響を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率をＷＳＴ法で測定して示したものである。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。＄＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。
【図３ａ】オイルレッドＯ染色により、３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞内の中性脂肪蓄積に対するＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１） ２５％ＥｔＯＨ抽出物の抑制効果を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１からの分化を誘導する際にＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂとその組成生薬熱水抽出物で処理して８日後にオイルレッドＯ染色を行った。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＊印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した中性脂肪蓄積の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図３ｂ】オイルレッドＯ染色により、３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞内の中性脂肪蓄積に対するＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２） ２５％ＥｔＯＨ抽出物の抑制効果を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１からの分化を誘導する際にＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂとその組成生薬熱水抽出物で処理して８日後にオイルレッドＯ染色を行った。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＊印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した中性脂肪蓄積の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図３ｃ】オイルレッドＯ染色により、３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞内の中性脂肪蓄積に対するＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３） ２５％ＥｔＯＨ抽出物の抑制効果を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１からの分化を誘導する際にＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂとその組成生薬熱水抽出物で処理して８日後にオイルレッドＯ染色を行った。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＊印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した中性脂肪蓄積の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図３ｄ】３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率に及ぼすＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１） ２５％ＥｔＯＨ抽出物の影響を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率をＷＳＴ法で測定して示したものである。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂの濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。＄＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。
【図３ｅ】３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率に及ぼすＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２） ２５％ＥｔＯＨ抽出物の影響を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率をＷＳＴ法で測定して示したものである。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂの濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。＊印はオンジ２５％ＥｔＯＨ抽出物の細胞生存率と比較したＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２） ＥｔＯＨ抽出物の細胞生存率の向上に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図３ｆ】３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率に及ぼすＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３） ２５％ＥｔＯＨ抽出物の影響を示す図である。３Ｔ３−Ｌ１から分化した細胞の生存率をＷＳＴ法で測定して示したものである。グラフにおける処理濃度はＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）の濃度を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）を組成するサンパクソウ、キョウオウ、オンジ、セキショウは組成含量に従って処理した。＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。＄＄印は対照群（０μｇ／ｍＬ）と比較した細胞生存率の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。＊印はオンジ２５％ＥｔＯＨ抽出物の細胞生存率と比較したＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３） ＥｔＯＨ抽出物の細胞生存率の向上に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図４】ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ ２５％ＥｔＯＨ抽出物の肥満動物モデルにおける体重減少効果を示す図である。１０％高脂肪食餌のみ与えた正常（normal）対照群、６０％高脂肪食餌のみ与えたネガティブ（negative）対照群、ゼニカル（Xenical, ６２．５ｍｇ／ｋｇ）＋６０％高脂肪食餌を与えたポジティブ（positive）対照群を用いた。抽出物処理群の１Ｘは成人男性が１日に服用する煎剤を基準にした抽出物投与量であり、４Ｘはその投与量の４倍の量で投与したものである。ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ−４Ｘ群は著しい体重減量を示す。
【図５】ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ ２５％ＥｔＯＨ抽出物を与えたマウスの食餌摂取量を示す図である。＊印は６０％ＨＦＤマウスの食餌摂取量と比較したＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３） ＥｔＯＨ抽出物を与えたマウスの食餌摂取量の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図６】ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ ２５％ＥｔＯＨ抽出物の脂肪蓄積抑制効果を示す図である。１０％高脂肪食餌のみ与えた正常（normal）対照群、６０％高脂肪食餌のみ与えたネガティブ（HFD, negative）対照群、ゼニカル（Xenical, ６２．５ｍｇ／ｋｇ）＋６０％高脂肪食餌を与えたポジティブ（positive）対照群を用いた。マウスの脂肪組織は腹部及び皮下脂肪の重量を測定した。＊＊印は６０％ＨＦＤマウスの腹部脂肪の重量と比較したＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３） ＥｔＯＨ抽出物を与えたマウスの腹部脂肪の重量の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図７】ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ ２５％ＥｔＯＨ抽出物の肝臓に及ぼす影響を示す図である。肝臓組織はホルマリンで固定してＨ＆Ｅ組織染色及び病理学的所見を依頼した。Ａは肝臓組織における微小水疱性脂肪腫の増加を示すものであり、ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ処理群において微小水疱性脂肪腫の増加が抑制されたことを示している。Ｂは肝臓における慢性炎症の増加を示すものである。ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂの処理群において他の生薬抽出物処理群より、特にオンジ抽出物処理群より有意（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）に減少することを示している。＄＄印は正常対照群（Normal control）と比較した微小水疱性脂肪腫の増加に対する有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。＄印は正常対照群（Normal control）と比較した微小水疱性脂肪腫の増加に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。＊＊印はオンジ抽出物−４Ｘ処理群と比較したＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ処理群における慢性炎症の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。＊印はオンジ抽出物−４Ｘ処理群と比較したＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ処理群における慢性炎症の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。＃＃印はネガティブ対照群（Negative control）と比較した慢性炎症の増加に対する有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。＃印はネガティブ対照群（Negative control）と比較した慢性炎症の増加に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図８】ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ ２５％ＥｔＯＨ抽出物の腎臓に及ぼす影響を示す図である。腎臓組織はホルマリンで固定してＨ＆Ｅ組織染色及び病理学的所見を依頼した。腎臓における慢性炎症の増加を示すものである。ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂの処理群において他の生薬抽出物処理群より、特にオンジ抽出物処理群より有意（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）に減少することを示した。＊＊印はオンジ抽出物−４Ｘ処理群と比較したＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ処理群における慢性炎症の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。＊印はオンジ抽出物−４Ｘ処理群と比較したＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ処理群における慢性炎症の減少に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。＃＃＃印はネガティブ対照群（Negative control）と比較した慢性炎症の増加に対する有意性（Ｐ＜０．００１）を示す。＃＃印はネガティブ対照群（Negative control）と比較した慢性炎症の増加に対する有意性（Ｐ＜０．０１）を示す。＃印はネガティブ対照群（Negative control）と比較した慢性炎症の増加に対する有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図９】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの体重を比較した結果を示すグラフである。
【図１０】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの食餌摂取量を比較した結果を示すグラフである。
【図１１ａ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの腹部生殖器脂肪の重量を比較した結果を示すグラフである。
【図１１ｂ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの腸間膜脂肪の重量を比較した結果を示すグラフである。
【図１１ｃ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの皮下脂肪の重量を比較した結果を示すグラフである。
【図１１ｄ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの総脂肪の重量を比較した結果を示すグラフである。
【図１２ａ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの活性型グレリンのレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１２ｂ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの活性化したデスアシルグレリンレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１２ｃ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの活性型グレリン比率レベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１３】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血漿中のレプチンレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ａ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中中性脂肪レベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｂ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中総コレステロールレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｃ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中ＬＤＬコレステロールレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｄ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中ＨＤＬコレステロールレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｅ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血糖レベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｆ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中クレアチニンレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｇ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中尿素レベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｈ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中ＬＤＨレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｉ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中ＡＬＰレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｊ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中ＧＰＴレベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１４ｋ】サンパクソウ、キョウオウ及びオンジを含み、セキショウ又はクローバーを選択的に含む抽出物の処理用量による動物モデルの血中ＧＯＴレベルを比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７２】
サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの個別抽出物及び複合抽出物の製造
サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの各粉砕物を下記表１の割合で混合して３０ｇの混合物を取得し、前記混合物を熱水抽出、温水抽出及びエタノール抽出方法に各々適用してそれぞれの該当抽出物を得た。前期取得した各抽出物を濾過して液状成分を得て、得られた液状成分を凍結乾燥して粉末状の抽出物（熱水抽出物、温水抽出物及びエタノール抽出物）を得た。前記粉末状の抽出物を蒸留水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて、以後の実験で試料として用いた。この際、前記熱水抽出は前記混合物に生水１リットルを加えて１００ｍＬになるまで加熱して行い、前記温水抽出は前記混合物に蒸留水３００ｍＬを加えて３８℃に保持しながら２４時間抽出して行い、前記エタノール抽出は前記混合物に２５％エタノール３００ｍＬを加えて３８℃に保持しながら２４時間抽出して行った。
【００７３】
また、前記サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの各粉砕物３０ｇを前述した方法と同様の方法に適用して各成分の個別抽出物（熱水抽出物、温水抽出物及びエタノール抽出物）を製造した。
【００７４】
【表１】
0006047545.tif 000002
【実施例２】
【００７５】
サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの個別抽出物及び複合抽出物のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗肥満効果
米国ＡＴＣＣ社から入手した３Ｔ３−Ｌ１細胞を１０％ウシ血清（Bovine Serum, BS, Gibco）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンが含まれるＤＭＥＭ（Dulbcco's Modified Eagle's Medium, Lonza）培地に接種し、３７℃及び５％ＣＯ２の条件で培養し、次いで３〜４日間隔で継代培養して脂肪前駆細胞を得た。
【００７６】
前述したように得られた脂肪前駆細胞を回収し、１×１０４細胞数／ｍＬの濃度で滴定し、次いでこれを９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルの量で分注し、３７℃及び５％ＣＯ２の条件で飽和するまで４日間培養した。次に、前記培養された細胞に、実施例１で製造した各個別抽出物又は複合抽出物が含まれる脂肪細胞分化誘導培地（ＤＭＥＭ、０．２５μＭデキサメタソン、０．５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、１０μｇ／ｍＬインシュリン及びＦＢＳ(Fetal Bovine Serum)）を加えて２日間さらに培養した。この際、脂肪細胞分化誘導培地に含まれる前記個別抽出物又は複合抽出物の濃度は、下記表２の通りである。
【００７７】
【表２】
0006047545.tif 000003
【００７８】
次に、培地を除去し、１０μｇ／ｍＬのインシュリンのみ含むＤＭＥＭ培地を加えた後２日間培養し、その後は２日間隔でＦＢＳのみを含むＤＭＥＭ培地を交換しながら８日間培養した。
【００７９】
培養終了後に細胞を回収してＰＢＳで洗浄し、次いで１０％ホルマリンで固定した。固定された細胞にオイルレッドＯ（Oil Red O）を加えて染色し、７０％イソプロピルアルコールを加えて洗浄した。洗浄した細胞を乾燥し、１００％イソプロピルアルコールを加えて細胞を染色したオイルレッドＯを溶解させた。４９０ｎｍで吸光度を測定し、測定された吸光度値を用いて細胞内に蓄積された脂肪の含量を算出した。この際、脂肪の含量は対照群の平均吸光度値に対する百分率で表した。
【００８０】
一方、ＷＳＴ（Water-soluble tetrazolium, the sodium salt of 4-[3-(4iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate）測定法を用いて前述したように分化した細胞の生存率を測定し、各複合抽出物及び個別抽出物の細胞毒性を評価した。大概、前記培養が終了した細胞にＷＳＴ溶液（１０μＬ／１００μＬ）を処理して１時間さらに培養し、次いで培養液に放出されたホルマザンの量を吸光度（５２０ｎｍ）で算出することにより、生存する細胞レベルを測定し、これを対照群の値に対する割合として表した。
【００８１】
まず、熱水抽出物の脂肪蓄積抑制効果を分析した結果、図１ａ〜図１ｃに示すように、各複合抽出物（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３））は５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度で処理すると濃度依存的に脂肪含量が減少し、各個別抽出物のうちオンジ抽出物のみが複合抽出物と同程度に脂肪含量減少効果を示しただけで、サンパクソウ、キョウオウ及びセキショウ抽出物は処理濃度に関係なく特に脂肪含量減少効果を示さないことが確認された。また、各複合抽出物（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３））を５０μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合の脂肪減少率は、それぞれ１０、１３及び１７％であり、１００μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合の脂肪減少率は、それぞれ２５、２８及び２６％であることが確認された。
【００８２】
また、熱水抽出物の細胞毒性を分析した結果、図１ｄ〜図１ｆに示すように、各複合抽出物（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３））は５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度で処理すると濃度依存的に細胞数が減少し、各個別抽出物のうちオンジ抽出物で処理した場合は細胞数が大幅に減少したが、サンパクソウ、キョウオウ及びセキショウ抽出物で処理した場合は処理濃度に関係なく細胞数が減少しないことが確認された。
【００８３】
次に、温水抽出物の脂肪蓄積抑制効果を分析した結果、図２ａ〜図２ｃに示すように、各複合抽出物（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３））は５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度で処理すると濃度依存的に脂肪含量が減少し、各個別抽出物のうちオンジ抽出物のみが複合抽出物と同程度に脂肪含量減少効果を示しただけで、サンパクソウ、キョウオウ及びセキショウ抽出物は、処理濃度に関係なく特に脂肪含量減少効果を示さないことが確認された。
【００８４】
また、温水抽出物の細胞毒性を分析した結果、図２ｄ〜図２ｆに示すように、各複合抽出物（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３））は、５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度で処理すると濃度依存的に細胞数が減少し、各個別抽出物のうちオンジ抽出物で処理した場合は細胞数が大幅に減少したが、サンパクソウ、キョウオウ及びセキショウ抽出物で処理した場合は、処理濃度に関係なく細胞数が減少しないことが確認された。
【００８５】
最後に、エタノール抽出物の脂肪蓄積抑制効果を分析した結果、図３ａ〜図３ｃに示すように、各複合抽出物（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３））は１０、５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度で処理すると濃度依存的に脂肪含量が減少し、各個別抽出物のうちオンジ抽出物のみが複合抽出物と同程度に脂肪含量減少効果を示しただけで、サンパクソウ、キョウオウ及びセキショウ抽出物は、処理濃度に関係なく特に脂肪含量減少効果を示さないことが確認された。
【００８６】
また、温水抽出物の細胞毒性を分析した結果、図３ｄ〜図３ｆに示すように、各複合抽出物（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２），ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３））は１００μｇ／ｍＬの濃度で処理すると細胞数が減少し、各個別抽出物のうちオンジ抽出物を５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合は細胞数が大幅に減少したが、サンパクソウ、キョウオウ及びセキショウ抽出物で処理した場合は、処理濃度に関係なく細胞数が減少しないことが確認された。
【００８７】
前述した各複合抽出物（熱水抽出物、温水抽出物及びエタノール抽出物）の結果を総合すると、脂肪蓄積抑制効果と細胞安全性の面でエタノール抽出物が最も優れていることが分かった。
【実施例３】
【００８８】
サンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの個別抽出物及び複合抽出物のｉｎ ｖｉｖｏ抗肥満効果
実施例２の結果から、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて脂肪蓄積抑制効果と細胞安全性の面でサンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウのエタノール抽出物が優れた効果を示すことが確認されたので、前記エタノール抽出物がｉｎ ｖｉｖｏ条件でも有効か否かを確認した。このために、前記エタノール抽出方法で取得した個別抽出物と複合抽出物をマウスに摂食させながら飼育し、飼育したマウスの体重、食餌摂取量及び脂肪重量を測定し、肝臓組織と腎臓組織を比較分析した。
【００８９】
実施例３−１：各条件別に飼育したマウスの取得
５週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを１７０匹購入して１週間順応させ、その後６０％高脂肪食餌（high fat diet, HFD）を５週間摂食させて飼育し、次いで飼育したマウスを１０匹ずつ１７の群に分け、互いに異なる試験物質を含むそれぞれ異なる条件の飼料を摂食させてさらに６週間飼育した（表３）。この際、ポジティブ対照群は公知の肥満治療剤であるゼニカルを投与した群とし、複合抽出物は正常食餌群（１Ｘ）と過剰食餌群（４Ｘ）に分けて投与した。また、飼育室温度は２２±１℃に保持し、湿度は５０±５％に保持し、明暗は１２時間間隔で調節し、１０％高脂肪食餌と６０％高脂肪食餌は、中央実験動物社から購入して与えた。
【００９０】
【表３】
0006047545.tif 000004
【００９１】
実施例３−２：体重評価
実施例３−１で飼育した１７種の実験群マウスの体重を測定し、比較分析した（図４）。図４に示すように、正常対照群と最も近いレベルで体重が減少した実験群は実験群９（オンジ−４Ｘ群）であることが確認され、その次に体重が減少した実験群は実験群１５（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）−４Ｘ群）及び１７（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）−４Ｘ群）であることが確認された。それ以外の実験群のマウスもまたネガティブ対照群より低いレベルを示し、概して体重減少効果を示すことが分かった。
【００９２】
しかし、実験群９（オンジ−４Ｘ群）においては６週間で１０匹のうち４匹が死亡し、１匹は健康状態が非常に悪化したことから、毒性による被害が深刻であることが確認された。それに対して、実験群１５（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）−４Ｘ群）及び１７（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）−４Ｘ群）は毒性による被害は現れなかった。
【００９３】
実施例３−３：食餌摂取量評価
実施例３−１で飼育した１７種の実験群マウスの食餌摂取量を測定し、比較分析した（図５）。図５に示すように、各実験群毎に食餌摂取量に多少差があったが、実験群９（オンジ−４Ｘ群）を除いては有意な差は示さなかった。
【００９４】
実施例３−４：脂肪重量評価
実施例３−１で飼育した１７種の実験群マウスを５時間絶食させ、マウスが摂取した飼料を全て消化するように誘導し、前記各マウスを頸椎脱臼法で犠牲にし、次いで各マウスから腹部脂肪及び皮下脂肪を摘出した。前述したように摘出した腹部脂肪と皮下脂肪を生理食塩水で洗浄し、濾過紙を通して水分を除去し、次いでそれら脂肪の総重量を測定し、比較分析した（図６）。図６に示すように、実験群９（オンジ−４Ｘ群）及び実験群１５（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）−４Ｘ群）はネガティブ対照群に比べて有意に脂肪重量が減少したことが確認された。また、同レベルの複合抽出物を投与した実験群１２（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）−１Ｘ群）、実験群１４（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）−１Ｘ群）及び実験群１６（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）−１Ｘ群）を比較すると、実験群１４、１６及び１２の順に脂肪重量が増加し、実験群１３（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（１）−４Ｘ群）、実験群１５（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（２）−４Ｘ群）及び実験群１７（ＫＩＯＭ−２０１２Ｏｂ（３）−４Ｘ群）を比較すると、実験群１５、１７及び１３の順に脂肪重量が増加することが確認された。よって、前述した各複合抽出物に含まれるサンパクソウ、キョウオウ、オンジ及びセキショウの含量を鑑みると、前記複合抽出物の脂肪増加抑制効果に最も大きな影響を及ぼす成分はオンジであり、その次がキョウオウであり、セキショウは脂肪増加抑制効果に寄与するところが最も少ないと分析された。
【００９５】
実施例３−５：肝臓組織の病理学的分析
実施例３−４で犠牲にしたマウスから肝臓組織を摘出し、それをホルマリンで固定して病理学的分析を行い、肝臓組織に含まれる微小水疱性脂肪腫レベル及び慢性炎症レベルを比較分析した（図７）。図７のＡに示すように、肝臓組織に含まれる微小水疱性脂肪腫は、ネガティブ対照群に比べて、オンジ抽出物（実験群８及び９）と複合抽出物（実験群１２〜１７）を投与した場合にいずれも低い値であり、肝臓組織に含まれる微小水疱性脂肪腫レベルが有意に減少することが確認された。
【００９６】
また、図７のＢに示すように、肝臓組織の慢性炎症レベルは、全ての実験群でネガティブ対照群より高いレベルであり、その中でも、オンジ抽出物（実験群８及び９）を投与したマウスでは最も高いレベルである。それに対して、複合抽出物（実験群１２〜１７）を投与したマウスではオンジ抽出物を投与したマウスより低いレベルを示した。
【００９７】
実施例３−６：腎臓組織の病理学的分析
実施例３−４で犠牲にしたマウスから腎臓組織を摘出し、それをホルマリンで固定した後、病理学的分析を行い、腎臓組織に含まれる慢性炎症レベルを比較分析した（図８）。図８に示すように、腎臓組織の慢性炎症レベルは、全ての実験群でネガティブ対照群はもとより正常対照群より高いレベであり、その中でも、オンジ抽出物（実験群９）を投与したマウスが比較的高いレベルである。それに対して、複合抽出物（実験群１２〜１７）を投与したマウスではオンジ抽出物を投与したマウスと同等又は低いレベルを示した。
【００９８】
実施例３−２〜３−６の結果を総合すると、ｉｎ ｖｉｖｏでオンジ抽出物と複合抽出物が肥満抑制効果を示し、肥満抑制効果に優れるものの動物に対して深刻な毒性を示すオンジ抽出物に比べて、複合抽出物は比較的優れた肥満抑制効果と共に向上した安全性を示すことが分かった。
【実施例４】
【００９９】
サンパクソウ、キョウオウ及びオンジ由来の複合抽出物の肥満抑制効果
実施例３−４の結果から、前記複合抽出物に含まれる成分のうち脂肪増加抑制効果に寄与するところが最も少ないと分析されたので、セキショウを除いてサンパクソウ、キョウオウ及びオンジのみからなる試料から抽出された複合抽出物が肥満抑制効果を示すか否かを確認した。
【０１００】
実施例４−１：天然抽出物の取得
粉砕したサンパクソウ、キョウオウ及びオンジを必ず含み、セキショウ及びクローバーは選択的に含む混合物を取得し（表４）、前記混合物に２５％エタノール３００ｍＬを加え、３８℃に保持しながら２４時間抽出することによりそれぞれの複合抽出物を得た。前述したように得られた各抽出物を濾過して液状成分を得て、得られた液状成分を凍結乾燥して粉末状の抽出物を得た。前記粉末状の抽出物を蒸留水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて後の実験で試料として用いた。
【０１０１】
また、比較群として用いる緑茶抽出物も同様の方法で得た。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
実施例４−２：各条件別に飼育したマウスの取得
５週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを１２６匹購入して１週間順応させ、その後マウスを９匹ずつ１４の群に分け、６０％高脂肪食餌（ＨＦＤ）と異なる試験物質を含むそれぞれ異なる条件の飼料を摂食させて８週間飼育した（表５）。この際、飼育室温度は２２±１℃に保持し、湿度は５０±５％に保持し、明暗は１２時間間隔で調節し、賦形剤としては生理食塩水を用いた。
【０１０４】
【表５】
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【０１０５】
実施例４−３：体重評価
実施例４−２で飼育した１４種の実験群マウスの体重を測定し、比較分析した（図９）。図９に示すように、全ての実験群（実験群２７〜３４）の体重がネガティブ対照群の体重より低いレベルであり、正常対照群と最も近いレベルで体重が減少する実験群は実験群３４（ＫＳＬ）であり、次いで実験群２８（Ｋ ３００）、実験群３０（ＫＳ ３００）、実験群３３（ＫＣＬ）、実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群２７（Ｋ １５０）、実験群３１（ＫＣ １５０）、実験群３２（ＫＣ ３００）の順であることが確認された。
【０１０６】
前記結果から、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジからなる試料から抽出された複合抽出物も体重抑制効果を示すことが分かった。
【０１０７】
実施例４−４：食餌摂取量評価
実施例４−２で飼育した１４種の実験群マウスの食餌摂取量を測定し、比較分析した（図１０）。図１０に示すように、各実験群毎に食餌摂取量に多少差があったが有意な差はなかった。
【０１０８】
実施例４−５：脂肪重量評価
実施例４−２で飼育した１４種の実験群マウスを５時間絶食させ、マウスが摂取した飼料を全て消化するように誘導し、前記各マウスを頸椎脱臼法で犠牲にし、次いで各マウスから腹部生殖器脂肪、腸間膜脂肪及び皮下脂肪を摘出した。前述したように摘出した腹部生殖器脂肪、腸間膜脂肪及び皮下脂肪を生理食塩水で洗浄し、濾過紙を通して水分を除去し、次いでそれら脂肪の各重量及び総重量を測定し、比較分析した（図１１ａ〜１１ｄ）。
【０１０９】
図１１ａに示すように、腹部生殖器脂肪においては、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群より低いレベルであり、正常対照群と最も近いレベルで脂肪重量が減少する実験群は実験群２８（Ｋ ３００）であり、次いで実験群３４（ＫＳＬ）、実験群３０（ＫＳ ３００）、実験群３３（ＫＣＬ）、実験群２７（Ｋ １５０）、実験群３２（ＫＣ ３００）、実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群３１（ＫＣ １５０）の順であることが確認された。
【０１１０】
図１１ｂに示すように、腸間膜脂肪においては、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群より低いレベルであり、正常対照群と最も近いレベルで脂肪重量が減少する実験群は実験群３０（ＫＳ ３００）であり、次いで実験群３４（ＫＳＬ）、実験群２８（Ｋ ３００）、実験群３３（ＫＣＬ）、実験群３２（ＫＣ ３００）、実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群２７（Ｋ １５０）、実験群３１（ＫＣ １５０）の順であることが確認された。
【０１１１】
図１１ｃに示すように、皮下脂肪においては、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群より低いレベルであり、正常対照群と最も近いレベルで脂肪重量が減少する実験群は実験群２８（Ｋ ３００）であり、次いで実験群３４（ＫＳＬ）、実験群３０（ＫＳ ３００）、実験群３３（ＫＣＬ）、実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群２７（Ｋ １５０）、実験群３２（ＫＣ ３００）、実験群３１（ＫＣ １５０）の順であることが確認された。
【０１１２】
図１１ｄに示すように、総脂肪においては、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群より低いレベルであり、正常対照群と最も近いレベルで脂肪重量が減少する実験群は実験群２８（Ｋ ３００）であり、次いで実験群３４（ＫＳＬ）、実験群３０（ＫＳ ３００）、実験群３３（ＫＣＬ）、実験群２７（Ｋ １５０）、実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群３２（ＫＣ ３００）、実験群３１（ＫＣ １５０）の順であることが確認された。
【０１１３】
図１１ａ〜１１ｄの結果を総合すると、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジからなる試料から抽出された複合抽出物が脂肪蓄積抑制効果を示すことが分かった。
【０１１４】
実施例４−６：グレリン（ghrelin）レベル評価
胃から分泌され、空腹ホルモン（hunger hormone）として知られるグレリンレベルを、実施例４−２で飼育した１４種の実験群マウスを対象に、活性型グレリン（activated ghrelin）、デスアシルグレリン（desacyl-ghrelin）及びグレリンの比率（ghrelin ratio）に細分化して評価した。
【０１１５】
まず、血漿に存在する活性型グレリンレベルは、グレリン測定キット（Active Ghrelin ELISA kit, SCETI, Japan）を用いて測定した。大概、各実験群のマウスから得た血液をＥＤＴＡとアプロチニン（aprotinin）の入ったチューブに入れて混合し、次いで遠心分離して血漿を得た。前記血漿に血漿体積の１０％に相当する１ｍｏｌ／ＬのＨＣＬを加えて試料を準備した。前記試料を前記グレリン測定キットに加えて反応させ、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、測定された吸光度の値から活性型グレリンレベルを算出した（図１２ａ）。
【０１１６】
図１２ａに示すように、活性型グレリンにおいては、ネガティブ対照群の値より高いレベルの実験群は実験群３２（ＫＣ ３００）であり、ネガティブ対照群の値と同程度の値の実験群は実験群２７（Ｋ １５０）及び実験群３４（ＫＳＬ）であり、ネガティブ対照群の値より低いレベルの実験群は実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群２８（Ｋ ３００）、実験群３３（ＫＣＬ）、実験群３０（ＫＳ ３００）及び実験群３１（ＫＣ １５０）であり、最も低いレベルの実験群は実験群２９（ＫＳ １５０）であることが確認された。
【０１１７】
次に、血漿に存在するデスアシルグレリンレベルは、前記グレリン測定キット（Active Ghrelin ELISA kit, SCETI, Japan）を代替してデスアシルグレリン測定キット（desacyl-Ghrelin ELISA kit, SCETI, Japan）を用いることを除いては、前述した方法と同様の方法で測定した（図１２ｂ）。
【０１１８】
図１２ｂに示すように、デスアシルグレリンにおいては、ネガティブ対照群の値より低いレベルの実験群は実験群３２（ＫＣ ３００）であり、ネガティブ対照群の値と同程度の値の実験群は実験群２９（ＫＳ １５０）及び実験群３４（ＫＳＬ）であり、ネガティブ対照群の値より高いレベルの実験群は実験群２７（Ｋ １５０）、実験群２８（Ｋ ３００）、実験群３３（ＫＣＬ）、実験群３０（ＫＳ ３００）及び実験群３１（ＫＣ １５０）であり、最も高いレベルの実験群は実験群３３（ＫＣＬ）であることが確認された。
【０１１９】
最後に、グレリンの比率は、前記測定されたデスアシルグレリンレベルに対する活性型グレリンレベルの百分率で算出した（図１２ｃ）。
【０１２０】
図１２ｃに示すように、グレリンの比率においては、ネガティブ対照群の値より高いレベルの実験群は実験群３２（ＫＣ ３００）であり、ネガティブ対照群の値と同程度の値の実験群は実験群２７（Ｋ １５０）であり、ネガティブ対照群の値より低いレベルの実験群は実験群３４（ＫＳＬ）、実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群２８（Ｋ ３００）、実験群３３（ＫＣＬ）、実験群３０（ＫＳ ３００）及び実験群３１（ＫＣ １５０）であり、最も低いレベルの実験群は実験群３３（ＫＣＬ）であることが確認された。
【０１２１】
図１２ａ〜１２ｃの結果を総合すると、サンパクソウ、キョウオウ及びオンジからなる試料から抽出された複合抽出物はネガティブ対照群と同程度又はそれより低いレベルの活性型グレリン、デスアシルグレリン及びグレリンの比率を示すため、前記複合抽出物の肥満抑制効果は食欲の抑制により現れるわけではないことが分かった。
【０１２２】
実施例４−７：レプチン（leptin）レベル評価
実施例４−２で飼育した１４種の実験群マウスを対象に血漿中のレプチンレベルを評価した。
【０１２３】
具体的には、血漿に存在するレプチンは、レプチン測定キット（Mouse and Rat Leptin ELISA kit, mediagnost, Germany）を用いて測定した。大概、各実験群のマウスから得た血液をＥＤＴＡとアプロチニンの入ったチューブに入れて混合し、次いで遠心分離して血漿を得た。前記血漿に前記キットに含まれた希釈緩衝液を加えて希釈し、次いで前記希釈液を前記レプチン測定キットに加えて反応させ、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、測定された吸光度の値からレプチンレベルを算出した（図１３）。
【０１２４】
図１３に示すように、血漿中のレプチンレベルは、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群より低いレベルであり、正常対照群と最も近いレベルで血漿中のレプチンレベルが減少する実験群は実験群２８（Ｋ ３００）であり、次いで実験群３３（ＫＣＬ）、実験群３４（ＫＳＬ）、実験群３０（ＫＳ ３００）、実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群２７（Ｋ １５０）、実験群３２（ＫＣ ３００）、実験群３１（ＫＣ １５０）の順であることが確認された。
【０１２５】
通常、肥満を誘導した実験動物においては、レプチンの抵抗性が増加することにより血中レプチンレベルが増加することが知られている。本発明が提供するサンパクソウ、キョウオウ及びオンジからなる試料から抽出された複合抽出物を投与した実験群２８（Ｋ ３００）が最も低いレプチンレベルであることが確認され、これはレプチンの抵抗性が最も低いレベルであることを意味するので、前記複合抽出物は肥満の発生を効果的に抑制する効果を示すことが分かった。
【０１２６】
実施例４−８：血中成分レベルの評価
実施例４−２で飼育した１４種の実験群マウスを対象に、公知の方法に従い血中中性脂肪、総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、血糖、クレアチニン、尿素、ＬＤＨ、ＡＬＰ、ＧＰＴ、ＧＯＴなどの血中成分のレベルを評価した（図１４ａ〜１４ｋ）。
【０１２７】
図１４ａに示すように、血中中性脂肪（triglyceride）においては、実験群３４（ＫＳＬ）のみネガティブ対照群の値より低いレベルであり、それ以外の実験群はネガティブ対照群の値と同程度又は高いレベルであり、最も高いレベルの実験群は実験群３２（ＫＣ ３００）であることが確認された。
【０１２８】
図１４ｂに示すように、血中総コレステロール（total cholesterol）においては、ネガティブ対照群の値より低いレベルの実験群は実験群２７（Ｋ １５０）及び実験群３４（ＫＳＬ）であり、ネガティブ対照群の値と同程度の値の実験群は実験群２８（Ｋ ３００）及び実験群３０（ＫＳ ３００）であり、ネガティブ対照群の値より高いレベルの実験群は実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群３３（ＫＣＬ）、実験群３２（ＫＣ ３００）及び実験群３１（ＫＣ １５０）であり、最も高いレベルの実験群は実験群３３（ＫＣＬ）であることが確認された。
【０１２９】
図１４ｃに示すように、血中ＬＤＬコレステロールにおいては、ネガティブ対照群の値より高いレベルの実験群は実験群３１（ＫＣ １５０）、実験群３２（ＫＣ ３００）及び実験群３３（ＫＣＬ）であり、ネガティブ対照群の値と同程度の値の実験群は実験群２９（ＫＳ １５０）及び実験群３０（ＫＳ ３００）であり、ネガティブ対照群の値より低いレベルの実験群は実験群２７（Ｋ １５０）、実験群２８（Ｋ ３００）及び実験群３４（ＫＳＬ）であり、最も低いレベルの実験群は実験群３４（ＫＳＬ）であることが確認された。
【０１３０】
図１４ｄに示すように、血中ＨＤＬコレステロールにおいては、実験群２８（Ｋ ３００）のみネガティブ対照群の値より低いレベルであり、それ以外の実験群はネガティブ対照群の値と同程度又は高いレベルであり、最も高いレベルの実験群は実験群３１（ＫＣ １５０）であることが確認された。
【０１３１】
図１４ｅに示すように、血糖（glucose）においては、ネガティブ対照群の値より低いレベルの実験群は実験群２８（Ｋ ３００）及び実験群２９（ＫＳ １５０）であり、ネガティブ対照群の値と同程度の値の実験群は実験群３４（ＫＳＬ）であり、ネガティブ対照群の値より高いレベルの実験群は実験群２７（Ｋ １５０）、実験群３１（ＫＣ １５０）、実験群３２（ＫＣ ３００）、実験群３３（ＫＣＬ）及び実験群３０（ＫＳ ３００）であり、最も高いレベルの実験群は実験群３２（ＫＣ ３００）であることが確認された。
【０１３２】
図１４ｆに示すように、血中クレアチニン（creatinine）においては、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群と同程度又は高いレベルであるが、ネガティブ対照群と同程度のレベルの実験群は実験群２９（ＫＳ １５０）及び実験群３１（ＫＣ １５０）であり、それ以外の実験群は全てネガティブ対照群の値より高いレベルであり、最も高いレベルの実験群は実験群３４（ＫＳＬ）であることが確認された。
【０１３３】
図１４ｇに示すように、血中尿素（urea）においては、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群の値より高いレベルであるが、最も高いレベルに尿素レベルが増加した実験群は実験群３３（ＫＣＬ）であり、次いで実験群３０（ＫＳ ３００）、実験群３４（ＫＳＬ）、実験群２７（Ｋ １５０）、実験群３１（ＫＣ １５０）、実験群２８（Ｋ ３００）、実験群２９（ＫＳ １５０）、実験群３２（ＫＣ ３００）の順であることが確認された。
【０１３４】
図１４ｈに示すように、血中ＬＤＨ（lactate dehydrogenase）においては、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群と同程度又は高いレベルであるが、ネガティブ対照群と同程度のレベルの実験群は実験群３０（ＫＳ ３００）及び実験群３４（ＫＳＬ）であり、それ以外の実験群は全てネガティブ対照群の値より高いレベルであり、最も高いレベルの実験群は実験群３２（ＫＣ ３００）であることが確認された。
【０１３５】
図１４ｉに示すように、血中ＡＬＰ（alkaline phosphatase）においては、実験群２９（ＫＳ １５０）のみネガティブ対照群の値より高いレベルであり、それ以外の実験群はネガティブ対照群の値と同程度又は低いレベルであり、最も低いレベルの実験群は実験群３１（ＫＣ １５０）であることが確認された。
【０１３６】
図１４ｊに示すように、血中ＧＰＴ（glutamic-pyruvic transaminase）においては、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群と同程度又は高いレベルであるが、ネガティブ対照群と同程度のレベルの実験群は実験群２７（Ｋ １５０）、実験群２８（Ｋ ３００）及び実験群３０（ＫＳ ３００）であり、それ以外の実験群は全てネガティブ対照群の値より高いレベルであり、最も高いレベルの実験群は実験群３１（ＫＣ １５０）であることが確認された。
【０１３７】
図１４ｋに示すように、血中ＧＯＴ（glutamic-oxaloacetic transaminase）においては、全ての実験群（実験群２７〜３４）でネガティブ対照群と同程度又は高いレベルであるが、ネガティブ対照群と同程度のレベルの実験群は実験群２９（ＫＳ １５０）及び実験群３４（ＫＳＬ）であり、それ以外の実験群は全てネガティブ対照群の値よりも高いレベルであり、最も高いレベルの実験群は実験群３１（ＫＣ １５０）であることが確認された。
【０１３８】
図１４ｉ〜１４ｋに示すように、本発明が提供するサンパクソウ、キョウオウ及びオンジからなる試料から抽出された複合抽出物を投与した実験群の血中ＡＬＰ、ＧＰＴ及びＧＯＴレベルは概して対照群と比較して有意な差を示さなかったため、前記複合抽出物は肝毒性を示さないものと分析される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１４ｅ】
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【図１４ｆ】
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【図１４ｇ】
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【図１４ｈ】
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【図１４ｉ】
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【図１４ｊ】
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【図１４ｋ】
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