(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を決定するための、循環腫瘍細胞、ならびに、HER-2、bcl-2およびki67を検出し、かつ、ＣＴＣ−内分泌療法指数を算出する方法であって、前記方法が、
ａ）乳がんを有する対象から得た試料中で、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルを検出すること；
ｂ）エストロゲン受容体、HER-2、bcl-2およびki67の発現が陽性であるＣＴＣの数を決定すること；
ｃ）前記ＣＴＣのレベル、ならびに、エストロゲン受容体、HER-2、bcl-2およびki67の発現が陽性であるＣＴＣの数にポイントを割り当てることによって、前記エストロゲン受容体、HER-2、bcl-2およびki67の発現が陽性であるＣＴＣの数と、ＣＴＣの総数とに基づいて、ＣＴＣ−内分泌療法指数（CTC-ETI）を算出することであって、前記CTC-ETIは、以下のｉ）〜ｖｉ）によって算出されること；
ｉ）前記ＣＴＣの数が７．５ｍＬあたり０〜４である場合に０ポイントを割り当て、前記ＣＴＣの数が７．５ｍＬあたり５〜１０である場合に１ポイントを割り当て、前記ＣＴＣの数が７．５ｍＬあたり１０よりも多い場合に２ポイントを割り当てること；
ｉｉ）前記エストロゲン受容体が陽性であるＣＴＣの数が１０％よりも多い場合に０ポイントを割り当て、前記エストロゲン受容体が陽性であるＣＴＣの数が１〜１０％である場合に２ポイントを割り当て、前記エストロゲン受容体が陽性であるＣＴＣの数が０である場合に６ポイントを割り当てること；
ｉｉｉ）前記HER-2が陽性であるＣＴＣの数が０％である場合に０ポイントを割り当て、前記HER-2が陽性であるＣＴＣの数が１〜１０％である場合に１ポイントを割り当て、前記HER-2が陽性であるＣＴＣの数が１０％よりも多い場合に２ポイントを割り当てること；
ｉｖ）前記bcl-2が陽性であるＣＴＣの数が１０％よりも多い場合に０ポイントを割り当て、前記bcl-2が陽性であるＣＴＣの数が１〜１０％である場合に１ポイントを割り当て、前記bcl-2が陽性であるＣＴＣの数が０％である場合に２ポイントを割り当てること；
ｖ）前記ki67が陽性であるＣＴＣの数が０％である場合に０ポイントを割り当て、前記ki67が陽性であるＣＴＣの数が１〜１０％である場合に１ポイントを割り当て、前記ki67が陽性であるＣＴＣの数が１０％よりも多い場合に２ポイントを割り当てること；および
ｖｉ）前記ポイントを加算して前記CTC-ETIを得ること；並びに
ｄ）前記CTC-ETIが所定の値よりも低い場合に、前記対象への抗エストロゲン治療を選択し、かつ、前記CTC-ETIが所定の値以上である場合に、前記対象への化学療法を選択すること；
を含む方法。
【請求項２】
前記抗エストロゲン治療が、タモキシフェンの投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗エストロゲン治療が、レトロゾール、アナストロゾール、またはエキセメスタンの投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記エストロゲン受容体、前記HER-2、前記bcl-2および前記ki67が、マルチプレックスＰＣＲ法を使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記エストロゲン受容体、前記HER-2、前記bcl-2および前記ki67が、免疫磁気アッセイを使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記乳がんが、転移性である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記乳がんが、エストロゲン受容体陽性である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年７月７日に出願された仮出願第６１／３６２，０２１号、および２０１１年３月３１日に出願された同６１／４６９，８９０号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、限定されないが、がんマーカーを含む、がんの診断、研究および治療のための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、がん治療に対する対象の応答を予測するための組成物および方法に関する。
【０００３】
〔背景技術〕
乳がんは、米国の女性における二番目に最も一般的な種類のがんであり、女性におけるがんによる死亡の二番目の主因である。１９８０年代には、乳がんの新たな症例の数が急増したが、現在はその数は安定しているようである。乳がんによる死亡率の低下は、おそらくは、より多くの女性がマンモグラムを受けているという事実に起因する。早期に発見されれば、乳がん治療が成功する可能性は、大いに改善する。
【０００４】
外科手術、放射線療法、化学療法、およびホルモン療法によって非常に治療可能である乳がんは、初期において発見されれば、ほとんどの場合治癒可能である。マンモグラフィーは、乳がんの早期発見のための最も重要な検診様式である。乳がんは、多様なサブタイプに分類されるが、これらのうちの少数のみが、予後または治療法の選択に影響を与える。最初の乳がんの疑いに続く患者の管理は、一般に、診断の確定、病期の評価、および治療法の選択を含む。診断は、吸引細胞診、触知不可能な病巣のための定位または超音波技術を用いた針生検、または切開もしくは切除生検により、確定することが出来る。腫瘍組織が外科的に除去される時には、その一部をＥＲおよびＰＲレベルの判定のために処理する。
【０００５】
予後および治療法の選択は、患者の年齢、病期、腫瘍壊死の存在を含む原発性腫瘍の病理学的特徴、腫瘍組織におけるエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）レベル、ＨＥＲ２過剰発現の状況および増殖能力の程度、ならびに閉経の状況および総体的な健康により、影響される。体重過多の患者の予後がより良くないこともある（Bastarrachea et al., Annals of Internal Medicine,120: 18 (1994)）。予後は人種によっても変化し得、黒人、および程度はより少ないがヒスパニックは、白人よりも、より予後が良くない（Elledge et al., Journal of the National Cancer Institute 86: 705 (1994); Edwards et al., Journal of Clinical Oncology 16: 2693 (1998)）。
【０００６】
乳がんの３つの主要な治療法は、外科手術、放射線、および薬剤療法である。すべての患者に適合する治療法はなく、多くの場合、２つ以上が必要とされる。選択は、患者の年齢および閉経の状況、がんの種類（例えば、腺管がんか小葉がんか、など）、その病期、腫瘍がホルモン受容性かどうか、およびその侵襲性レベルを含む、多くの要因によって決定される。
【０００７】
乳がん治療は、局所的または全身的として定義される。外科手術および放射線は、腫瘍、乳房、リンパ節、または他の特定の領域を直接治療するため、局所的治療とみなされる。薬剤治療は、その効果が広範なため、全身的治療と呼ばれる。薬剤療法には、伝統的な化学療法薬剤、ホルモン遮断治療（例えば、アロマターゼ阻害薬、選択的エストロゲン受容体調節薬、およびエストロゲン受容体減少薬）、およびモノクローナル抗体治療（例えば、ＨＥＲ２に対する）が含まれる。これらは単独で、または、ほとんどの場合、異なる組み合わせにおいて使用することが出来る。
【０００８】
さらなる治療法、特に患者の腫瘍に合わせて調整された治療法が求められている。
【０００９】
〔発明の概要〕
本発明は、限定されないが、がんマーカーを含む、がんの診断、研究および治療のための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、がん治療に対する対象の応答を予測するための組成物および方法に関する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、対象（例えば、転移性の乳がんと診断された対象）の生存の予後または治療（例えば、抗エストロゲン治療）に対する応答の判定に使用される。このような方法は、研究および臨床的用途の両方において使用される。
【００１１】
例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、治療方針を決定するための方法を提供し、前記方法は、転移性乳がんと診断された対象から得た試料中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルを検出すること；および前記試料中のＣＴＣのレベルに基づいて治療方針を決定することを含む。いくつかの実施形態において、治療方針は、抗エストロゲン療法（例えば、タモキシフェン、またはレトロゾール、アナストロゾール、もしくはエキセメスタンなどのアロマターゼ阻害薬）を含む。他の実施形態において、治療方針は化学療法を含む。いくつかの実施形態において、方法はＣＴＣ（例えば、エストロゲン受容体、ＨＥＲ−２、ｂｃｌ−２、アポトーシスマーカー、ＩＧＦＲ１、ビメンチン、またはｋｉ６７）に関連する１つまたは複数の腫瘍マーカーを特徴づけるステップをさらに含む。いくつかの実施形態においては、アポトーシスマーカーを、モノクローナル抗体Ｍ３０を使用して検出する。いくつかの実施形態において、転移性乳がんはエストロゲン受容体陽性である。いくつかの実施形態においては、腫瘍マーカーのうちの１つまたは複数を、マルチプレックス技術（例えば、マルチプレックスＰＣＲ）または免疫磁気アッセイを使用して検出する。いくつかの実施形態において、アッセイは自動化されている。いくつかの実施形態において、方法はＣＴＣ−内分泌療法指数（Endocrine Therapy Index）（ＣＴＣ−ＥＴＩ）を決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＴＣ−ＥＴＩは、ＣＴＣのレベルおよび腫瘍マーカーにポイントを割り当てることにより算出される。いくつかの実施形態において、低いＣＴＣ−ＥＴＩは、患者が内分泌（例えば、抗エストロゲン）療法に応答する可能性があることを示す。いくつかの実施形態において、高いＣＴＣ−ＥＴＩスコアは、患者が内分泌療法に応答する可能性があまりなく、化学療法によってより良好に治療されることを示す。
【００１２】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、がん細胞株における、エストロゲン受容体の発現を示す図である。
【００１３】
図２は、がん細胞株における、ａ）Ｂｃｌ−２、ｂ）Ｋｉ−６７、およびｃ）ＨＥＲ−２の発現を示す図である。
【００１４】
図３は、がん細胞株についてのＣＴＣ−ＥＴＩスコアの算出法を示す図である。
【００１５】
図４は、３人の患者についてのＣＴＣ−ＥＴＩスコアの算出法を示す図である。
【００１６】
図５は、乳がんにおける、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアの例示的な臨床試験および臨床結果を示す模式図である。
【００１７】
図６は、乳がんにおける、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアの例示的な臨床試験および臨床結果を示す模式図である。
【００１８】
図７は、乳がんにおける、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアの例示的な臨床試験および臨床結果を示す模式図である。
【００１９】
図８は、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアをモニターした８人の患者の臨床試験の結果を示す図である。
【００２０】
〔定義〕
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および表現を以下に定義する。
【００２１】
本明細書において、「発見／検出する」、「発見／検出すること」、または「発見／検出」という用語は、発見もしくは識別の一般的行為、または組成物の特定の観察のどちらかを表し得る。
【００２２】
本明細書において、「核酸分子」という用語は、分子を含むあらゆる核酸を指し、限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。該用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡのあらゆる既知の塩基類似体を含む配列を包含し、限定されないが以下を含む：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン（mannosylqueosine）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン（queosine）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン（queosine）、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００２３】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆物質、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長のコード配列によって、または完全長もしくは断片の所望の活性または機能的特性（例えば、酵素的活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性など）が保持されている限り、コード配列のいずれの部分によっても、コードされ得る。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域、ならびに、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、５’末端および３’末端の両方においてコード領域に隣接し、どちらの末端上でも約１ｋｂ以上の範囲にわたって位置する配列をも包含する。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって中断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子の区分であり；イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または一次転写物から除去または「切り出される（spliced out）」；従ってイントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物中に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳時に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定する機能を果たす。
【００２４】
本明細書において、「異種遺伝子」という用語は、その天然の環境にはない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子には、別の種に導入された１つの種由来の遺伝子が含まれる。異種遺伝子にはまた、何らかの方法で改変された生物（例えば、変異した、複数のコピー中に追加された、非天然の制御配列に結合した、など）に生来属している遺伝子も含まれる。異種遺伝子の配列は、典型的に、染色体中の遺伝子配列と天然に関連して存在しないか、または天然には存在しない染色体の一部（例えば、その遺伝子が通常発現しない遺伝子座で発現している遺伝子）と関連しているＤＮＡ配列に連結しているという点で、異種遺伝子は内在性遺伝子と区別される。
【００２５】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い長さの一本鎖ポリヌクレオチド鎖を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的に２００未満の残基長（例えば、１５〜１００）であるが、本明細書においてこの用語は、より長いポリヌクレオチド鎖をも包含することが意図される。オリゴヌクレオチドは、しばしば、それらの長さによって表される。例えば２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４マー」とよばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズにより、または他のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、２次および３次構造を形成することが出来る。そのような構造には、限定されないが二重構造、ヘアピン構造、十字型構造、屈曲構造、および三重構造が含まれる。
【００２６】
本明細書において、「相補的な」または「相補性」という用語は、塩基対合則により関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）に関連して使用される。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に対して相補的である。相補性は、核酸塩基の一部のみが塩基対合則により一致する、「部分的な」ものであってもよい。または、核酸間の「完全な」または「全体的な」相補性もあり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に、有意な影響を与える。これは、核酸間の結合に依存する増幅反応および検出方法において、特に重要である。
【００２７】
「相同性」という用語は、相補性の程度を示す。部分的な相同性、または完全な相同性（すなわち、同一性）があり得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な核酸分子が標的核酸にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する核酸分子であり、「実質的に相同」である。完全に相補的な配列の標的配列に対するハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシーの条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して、試験することができる。実質的に相同の配列またはプローブは、低ストリンジェンシーの条件下で、完全に相同の核酸分子の標的に対する結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）に競合し、結合を阻害する。これは、低ストリンジェンシーの条件が、非特異的結合を可能にするということではない；低ストリンジェンシーの条件は、２つの配列の互いに対する結合が特異的（すなわち、選択的）な相互座用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、実質的に非相補的な（例えば、約３０％未満の同一性）第２の標的を使用することにより試験し得る；非特異的結合が存在しない場合、プローブは第２の非相補的な標的にハイブリダイズしない。
【００２８】
二本鎖の核酸配列、例えばｃＤＮＡまたはゲノムクローンに関して使用される場合、「実質的に相同な」という用語は、上述の低ストリンジェンシーの条件下で、二本鎖核酸配列のどちらかまたは両方の鎖にハイブリダイズすることが出来るあらゆるプローブを指す。
【００２９】
遺伝子は、一次ＲＮＡ転写物の差別的スプライシングにより生成される複数のＲＮＡ種を産生し得る。同一の遺伝子のスプライスバリアントであるｃＤＮＡは、配列同一性または完全な相同性（両方のｃＤＮＡ上での、同一のエクソンまたは同一のエクソンの一部の存在を表す）の領域、および完全な非同一性（例えば、ｃＤＮＡ１上ではエクソン「Ａ」の存在を表し、ｃＤＮＡ２は代わりにエクソン「Ｂ」を含む）の領域を含む。２つのｃＤＮＡは配列同一性の領域を含むため、それらは両方とも、両方のｃＤＮＡに存在する配列を含む完全な遺伝子または遺伝子の部分に由来するプローブにハイブリダイズする；従って２つのスプライスバリアントは、そのようなプローブに対して、および互いに対して、実質的に相同である。
【００３０】
一本鎖核酸配列に関して使用される場合、「実質的に相同な」という用語は、上述の低ストリンジェンシーの条件下で、一本鎖核酸配列とハイブリダイズする（すなわち、その相補体である）ことが出来るあらゆるプローブを指す。
【００３１】
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対形成に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因に影響される。構造内に、相補的な核酸の対を含む単一分子は、「自己ハイブリダイズされている」といわれる。
【００３２】
本明細書において、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、および例えば有機溶媒などの他の化合物の存在の条件に関して使用される。「低ストリンジェンシーの条件」下において、目的の核酸配列は、その正確な相補体、単一塩基の不一致を有する配列、密接に関連した配列のみを有する配列（例えば、９０％以上の相同性を有する配列）、および部分的な相同性（例えば、５０〜９０％相同性を有する配列）とハイブリダイズする。「中ストリンジェンシーの条件」下において、目的の核酸配列は、その正確な相補体、単一塩基の不一致を有する配列、および密接に関連した配列（例えば、９０％以上の相同性を有する配列）とのみハイブリダイズする。「高ストリンジェンシーの条件」下において、目的の核酸配列は、その正確な相補体、および（温度などの条件に応じて）単一塩基の不一致を有する配列とのみハイブリダイズする。言い換えれば、高ストリンジェンシーの条件下において、温度を上昇させることにより、単一塩基の不一致を有する配列に対するハイブリダイゼーションを除外することが出来る。
【００３３】
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合、「高ストリンジェンシーの条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブが使用される場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％  ＳＤＳ、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、ならびに１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから成る溶液中、４２℃での結合またはハイブリダイゼーションに続く、０．１Ｘ  ＳＳＰＥ、１．０％  ＳＤＳを含む溶液中、４２℃での洗浄と同等の条件を含む。
【００３４】
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合、「中ストリンジェンシーの条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブが使用される場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％  ＳＤＳ、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、ならびに１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから成る溶液中、４２℃での結合またはハイブリダイゼーションに続く、１．０Ｘ  ＳＳＰＥ、１．０％  ＳＤＳを含む溶液中、４２℃での洗浄と同等の条件を含む。
【００３５】
「低ストリンジェンシーの条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブが使用される場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％  ＳＤＳ、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬［５０Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬は、５００ｍｌあたり：５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ  ４００、ファーマシア社（Pharamcia））、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；シグマ社（Sigma）を含む］、ならびに１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから成る溶液中、４２℃での結合またはハイブリダイゼーションの後、５Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳを含む溶液中、４２℃での洗浄、と同等の条件を含む。
【００３６】
低ストリンジェンシーの条件を構成するために、多数の同等の条件を使用し得ることは、当技術分野で周知である；プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）、ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物、溶液中に存在するかまたは固定化されているなど）、ならびに塩および他の構成成分の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）などの要因が考慮され、ハイブリダイゼーション溶液を変化させて、上述の条件と異なるが、同等である、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を作り出してもよい。さらに、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ステップの温度を上昇させる、ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを使用する、など）は、当技術分野で周知である（「ストリンジェンシー」の定義については上述の定義を参照のこと）。
【００３７】
本明細書において、「増幅オリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸またはその相補体とハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドを指す。増幅オリゴヌクレオチドの一例は、鋳型核酸とハイブリダイズし、増幅プロセスにおいてポリメラーゼにより延長された３’−ＯＨ末端を含む、「プライマー」である。増幅オリゴヌクレオチドの別の例は、ポリメラーゼにより延長されていないが（例えば、ブロックされた３’末端を有するため）、増幅に関連するかまたは増幅を促進するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴヌクレオチドは、所望により、修飾されたヌクレオチドもしくは類似体、または増幅反応に関連するが標的核酸と相補的ではないかもしくは標的核酸に含まれる、追加のヌクレオチドを含んでもよい。増幅オリゴヌクレオチドは、配列標的または鋳型配列と相補的ではない配列を含んでもよい。例えば、プライマーの５’側領域は、標的核酸と非相補的なプロモーター配列（「プロモーター−プライマー」と呼ばれる）を含んでもよい。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴヌクレオチドは、５’側プロモーター配列を含むように修飾され、それによりプロモーター−プライマーとして機能し得るということを理解するであろう。同様に、プロモーター−プライマーは、プロモーター配列の除去、またはプロモーター配列なしの合成により修飾され、それでもなおプライマーとして機能し得る。３’末端をブロックされた増幅オリゴヌクレオチドはプロモーター配列を提供し、重合のための鋳型（「プロモーター−プロバイダー」と呼ばれる）として機能してもよい。
【００３８】
本明細書において、「プライマー」という用語は、精製された制限消化物中で天然に発生するかまたは合成により生成されたかに関わらず、核酸鎖と相補的なプライマー延長生成物の合成が誘導される条件下に置かれた場合（例えば、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘発物質の存在下、好適な温度およびｐＨにおいて）、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅において最大の効率を得るために、一本鎖が好ましいが、代替として二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、延長生成物を作製するために使用する前に、まずプライマーを処理して鎖を分離する。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、誘発物質の存在下で延長生成物の合成を刺激するのに十分長くなくてはならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの原料、および方法の使用を含む、多くの要因に依存する。
【００３９】
本明細書において、「プローブ」という用語は、精製された制限消化物中で天然に発生するか、または合成、組換え、もしくはＰＣＲ増幅により生成されたかに関わらず、別の目的のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズすることが出来る、オリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、識別、および単離において有用である。本発明に使用されるすべてのプローブは、限定されないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素ベースの組織化学分析）、蛍光、放射性、および発光システムを含むいかなる検出システムにおいても検出可能であるように、いずれかの「リポーター分子」によって標識することが考慮される。本発明が、いずれの特定の検出方法または標識に限定されることも、意図されてはいない。
【００４０】
「単離された」という用語は、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」などのように、核酸に関して使用される場合、その天然の原料においてそれが通常関連している少なくとも１つの構成成分または混入物から、識別され分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、そのように、それが天然に存在しているものとは異なる形態および環境に存在する。対照的に、単離されていない核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸は、それらが天然に存在する状態で存在する。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、宿主細胞染色体上に、付近の遺伝子に近接して存在する；ＲＮＡ配列、例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとともに、混合物として細胞中に存在する。しかしながら、所与のタンパク質をコードする単離された核酸には、例として、通常は所与のタンパク質を発現する細胞中の核酸であって、該核酸が天然細胞のものとは異なる染色体上の位置にある、そうでなければ天然に存在するものとは異なる核酸配列が隣接しているような核酸、が含まれる。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形態で存在してもよい。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドが、タンパク質を発現させるために使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、少なくともセンス鎖またはコード鎖を含む（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であってもよい）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。
【００４１】
本明細書において、「精製された」または「精製する」という用語は、試料から構成成分（例えば、混入物）を除去することを指す。例えば、抗体は、混入した非免疫グロブリンタンパク質を除去することにより、精製される；抗体はまた、標的分子に結合しない免疫グロブリンを除去することによっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去は、試料中の標的反応性の免疫グロブリンの割合（％）の増加をもたらす。別の例においては、組換え型ポリペプチドを細菌宿主細胞中で発現させ、宿主細胞タンパク質を除去することによりポリペプチドを精製する；それによって、組換え型ポリペプチドの割合（％）は、試料中で増加する。
【００４２】
本明細書において、「試料」という用語は、その最も広い意味において使用される。１つの意味において、該用語はいかなる原料由来の検体または培養物、ならびに生物試料および環境試料をも含むことが意図される。生物試料は、動物由来（ヒトを含む）であってもよく、液体、固体、組織、および気体を包含する。生物試料は、血漿、血清などの血液製剤を含む。環境試料は、環境物質、例えば表面物質、土壌、水、結晶、および工業試料を含む。しかしながらこのような例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものとは解釈されない。
【００４３】
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、限定されるものではないが、がんマーカーを含む、がんの診断、研究、および治療のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、がん治療に対する対象の反応を予測するための組成物および方法に関する。
【００４４】
西欧諸国における乳がんの死亡率は過去３０年間で減少したが、その理由の１つは、アジュバント全身療法の適用が普及したためである。しかしながら、米国では、２００８年に４０，０００人が転移性乳がんで死亡したと推定される。転移性乳がんを有する患者は、ときには治癒したと見られることもあるが、大部分は、最終的には自身の疾病で死亡する運命にある。それでも、いくつかの治療法がこのような状況の患者に導入され、その結果、生存期間が中程度に延長し、寛解が実質的に改善されている。
【００４５】
したがって、大部分の転移性乳がん患者に対する治療の目標は、反応の可能性が最も高く、かつ毒性の最も低い治療法を選択し、それにより、がんの症候と治療の副作用とのバランスを取ることである。実際、現在では、こうした患者を治療するための多様な方策および薬剤が利用可能になっている。こうした方策・薬剤には、化学療法（現在、転移性乳がんの治療用として１０種類を超える薬剤が承認済み）のほか、抗ＨＥＲ２療法（トラスツズマブ、ラパチニブ）などがある。また、ＦＤＡに承認されていないが、抗血管新生療法も非常に有望と見られる。しかしながら、転移性乳がん患者の主力の治療法の１つは、抗エストロゲン療法である。
【００４６】
乳がんは、様々な抗エストロゲン方法で治療でき、これらの方法は基本的に、相加的方法と切除的方法に分類できる。最もよく使われている相加的治療法は、選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）であるタモキシフェンの使用であるが、フルオキシメステロンなどのアンドロゲン治療、および酢酸メゲストロールなどのプロゲステロン作用薬も効果がある。切除療法は、過去においては主として外科的であったが、最近では、閉経前女性には、ゴセレリン、ロイプロリドなどの黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニストおよびアンタゴニスト、閉経後女性には、前駆物質であるジヒドロエピアンドロステンジオン（ＤＨＥＡ）およびテストステロンからエストラジオールおよびエストロンへのアロマターゼ誘導性変換を阻害する薬剤を用いた切除療法が行われている。米国では、３種類のアロマターゼ阻害（ＡＩ）剤：レトロゾール、アナストロゾール、およびエキセメスタンを利用できる。
【００４７】
転移性乳がん患者の適切な治療法の選択は、２つの要因、すなわち予後と予測に基づいて行われる。この点で、抗エストロゲン療法は、最古の「標的」療法とみなすことができる。その後の試験により、ＥＲ陰性の乳がん患者では、タモキシフェンが不活性であることが実証された。しかしながら、抗エストロゲン治療が有効であるのは、転移性、初期状況のいずれも、ＥＲ陽性の（すなわちＥＲが「豊富」な）腫瘍を有する女性のわずか３０〜５０％である。ＥＲ陽性であるが内分泌療法に抵抗性の転移性乳がん患者に関しては、毒性は低いが効力のない内分泌療法を数ヶ月間試して化学療法を遅らせるより、毒性プロファイルの上昇にもかかわらず直ちに化学療法を施した方が役立つと考えられている。
【００４８】
転移性乳がん患者に対してひとたび対症療法レジメンが選択されると、その療法を停止して新しい療法を開始する理由は、次の２つのうちどちらかとなる。１）選択した治療法の毒性があまりに高く、たとえ作用していても寛解を誘発できる見込みがない、または２）その治療法は作用しておらず、腫瘍が進行している。このような現象、特に後者の現象を確定するために現在使われている方法には、問診、理学的検査、血清検査、およびＸ線検査評価が含まれる。問診と理学的検査は、主観性の問題があり、また、患者の５０％超は、内部器官（骨、肝臓、肺など）の転移性病変のみを有するという事実があることから、信頼性がないものとして広く認識されている。非特異的血清検査、例えば、骨由来の酵素（アルカリホスファターゼ）、肝臓由来の酵素（アルカリホスファターゼ、血清グルタミン酸シュウ酸トランスフェラーゼ（Ｓｅｒｕｍ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｏｘａｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）など）は、進行を確定するに足る十分な感受性および特異性の両方に欠ける。このような患者のモニタリングにおいては、腫瘍関連の少なくとも３種類の腫瘍マーカーが使われている。これらには、ＭＵＣ−１タンパク質（ＣＡ１５−３、ＣＡ２７．２９）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、およびＨＥＲ２細胞外ドメインのアッセイが含まれる。米国臨床腫瘍学会の腫瘍マーカーガイドライン委員会は、転移性乳がんを有する特定の患者のモニタリングにおいて、少なくともＣＡ１５−３とＣＥＡを使用することを勧告した。しかしながら、３つのいずれの場合も、治療の反応または失敗の初期判定では、「腫瘍マーカースパイク」という現象による混乱が生じる。腫瘍マーカースパイクとは、最終的に治療に反応したと感じられる患者の２５％にも上る数において、腫瘍マーカー値がベースライン以下に低下するまでの２〜３週間から数ヶ月の間、マーカー値が実際に上昇する現象である。したがって、治療法を新規に開始してから最初の１〜２ヶ月間の進行を確定するには、循環腫瘍マーカーの結果は、今のところ基本的に無価値である。
【００４９】
Ｘ線画像法は、転移性乳がん患者の臨床経過を判断する手段として最も高く評価されている。単純Ｘ線写真、コンピューター断層撮影、および磁気共鳴画像法について、反応、安定性、および進行を明確化するための厳格な基準が策定されている。しかし、Ｘ線画像法にはいくつか欠点がある。治療の最初の１または２サイクルの間は、大部分の患者にとって、これらのすべての診断法は進行に対する感度が低く、特に後者の２診断法は不便であり、費用を要し、患者の不快感を伴う。こうしたことから、これらの検査は通常、新しい治療法の開始から数ヶ月して、患者の経過を観察する時点になるまで行われない。おそらくより重要なことは、転移性乳がん患者のうち、「測定可能な」疾患を有するのは、わずか５０％程度であり、転移性乳がん患者はむしろ、骨および／または胸膜の「測定不能の」病変や、皮膚および肺における小さすぎて正確に定量化できない「粟粒」病変を有することである。「骨のみ」の疾患を有する患者をモニタリングしようとする努力は、特にフラストレーションを起こしがちである。これらの患者をモニターする画像診断法として、ピロリン酸テクネチウムを用いた骨シンチグラフィーが最も広く使われているが、この診断法は、進行検出に対しては比較的感度が低く、かつ、いわゆる「シンチグラフィックフレア」（ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ  ｆｌａｒｅ）がある点で限界がある。シンチグラフィックフレアにおいては、治療、特に内分泌療法に反応している患者は、既知の病変部に放射性トレーサーの取り込みの増加が見られ、さらに、骨芽細胞治癒活性の増加に応じて、新規の取り込み部位の出現が見られる場合もある。
【００５０】
臨床、血清、および／またはＸ線による手段により、急速な進行が容易に確定される特定の患者が存在する。しかし、新規に開始した治療法が数ヶ月間に渡って奏功する見込みであるか、あるいは無益なレジメンであるかを判断する上で、転移性乳がんを有する多くの患者は臨床上の難題を呈する。無益なレジメンである場合、そのような患者は、現在の治療と比べてたとえ毒性が高くても潜在的に効果の高い、化学療法などの治療の方がより適切に治療できることになる。
【００５１】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＥＲ陽性であり、抗エストロゲン療法に反応する可能性の低い転移性乳がん患者を特定する方法を提供する。このような患者においては、直ちに、または抗エストロゲン療法を短期間試行した後に、従来の化学療法を開始することができる。いくつかの実施形態では、本発明の本方法は、現在の治療の効果をより早期にモニタリングすることを可能にする。そのような状況においては、現在の治療に反応していない対象の別の治療法を選択することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分析を利用した方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＴＣのレベルを定量化することにより抗エストロゲン療法の効果を確定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣレベルを使用して、予後を判定し治療方針を導く。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＣＴＣレベルを、がんを有していない対象のＣＴＣレベル、またはがんと診断されていない対象群の母集団平均のＣＴＣレベルと比較する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣを、転移性乳がんと診断された対象群（抗エストロゲン療法に反応した対象群および反応しなかった対象群を含む）の母集団平均と比較する。他の実施形態では、転移性乳がんまたは非転移性乳がんと診断された対象のＣＴＣのレベルを経時的にモニタリングする。
【００５４】
他の実施形態では、抗エストロゲン療法が奏功する女性と、ホルモン抵抗性と見られる女性とを区別し、それにより予後または治療方針を決定する目的で、ＣＴＣに関連する１つ以上の腫瘍マーカーを特徴付けする。いくつかの実施形態では、これらの腫瘍マーカーにはＥＲ、ＨＥＲ２、ｂｃｌ−２、アポトーシス（モノクローナルＭ３０で染色）、ＩＧＲＦＲ１、ビメンチン、およびＫｉ６７が含まれるが、これらに限定されない。当業者に対して公知の、さらなる腫瘍マーカーを利用してもよい。本発明は、既知、未知（例えば未発見の）両方の腫瘍マーカーを企図している。好ましい腫瘍マーカーは、ＣＴＣ表面に存在し、抗エストロゲン療法に対する反応を（単独または組み合わせにより）示すマーカーである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＣＴＣ表面の腫瘍マーカーの状態と、同一患者から収集した原発組織内および／または転移性組織内の同一腫瘍マーカーの状態とを相関させる。
【００５６】
Ｉ．循環腫瘍細胞
ヒトの血行路に初めて腫瘍細胞が認められたのは、死後のものではあるが、１５０年以上前のことである。近年の技術進歩により、免疫磁気的方法を用いて全血から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分離するための、高度に自動化され標準化されたシステムの開発が可能になった。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）システム（イミュニコン社、ペンシルベニア州ハンチンドンバレー）を利用してＣＴＣを定量化する（Allard et al., Clin Cancer Res 2004;10(20):6897-904; Cristofanilli et al., N Engl J Med 2004;351(8):781-91）（これらの各文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＥＬＬ  ＳＥＡＲＣＨシステムは、抗サイトケラチン抗体を用いた免疫蛍光染色により元は上皮性であることが測定時に特徴付けられ、ＤＡＰＩを用いた染色により細胞性であると判定された「事象」を特定する。抗ＣＤ４５モノクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色により、混入した白血球を特定し、結果をデジタル形式で画像表示する。
【００５７】
本発明は、ＣＥＬＬ  ＳＥＡＲＣＨシステムの使用に限定されない。ＣＴＣを単離および／または定量化する任意の方法を利用してよい。
【００５８】
ＩＩ．腫瘍マーカー
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＴＣに関連する腫瘍マーカーを特定する方法を提供する。代表的な腫瘍マーカーについて、以下でより詳細に説明する。
【００５９】
エストロゲン受容体（ＥＲ）。数あるマーカーの中でも、エストロゲン療法からの独立性を示す特定のマーカーには、ＥＲ、ＨＥＲ２、ｂｃｌ−２、およびアポトーシス測定値の相対レベルが含まれる。いくつかの試験により、ＥＲ発現および内分泌療法の利点の間の関連性は二分法的ではなく、ＥＲタンパク質の定量的レベルに関連することが示唆されている。したがって、ＥＲの様々なアッセイに対して、様々なカットオフ値を使用して「陽性」と「陰性」の二分類が行われている。いくつかの実施形態では、ＣＴＣで測定できるＥＲの相対レベルを用いて、内分泌療法に反応する可能性の判定に役立てる。
【００６０】
ＨＥＲ２。ＥＲ陽性の乳がんにおいて、ＨＥＲ２の過剰発現および／または増幅がエストロゲン治療に対する感受性を低下させることを、種々の前臨床試験および臨床試験が示している。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、本発明を実行する上で、機序の理解は必要とされない。とはいえ、ＥＲ陽性かつＨＥＲ２陽性の乳がんを有する患者は、抗エストロゲン治療の利点を得る可能性が比較的低いことが予期されている。
【００６１】
ＢＣＬ−２。ＢＣＬ−２は、細胞がプログラム細胞死経路に進入するのを防止する抗アポトーシス性タンパク質である。ＢＣＬ−２は、一般に乳がんに発現し、予後悪化と関連性がある。ＢＣＬ−２は、ＥＲ陰性の乳がんよりもＥＲ陽性の乳がんで多く発現する。前臨床試験およびいくつかの臨床試験では、ＢＣＬ−２の発現は、抗エストロゲン療法に対する相対的耐性に関連すると見られることを示している。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、本発明を実行する上で、機序の理解は必要とされない。とはいえ、ＥＲ陽性かつＢＣＬ−２陽性の乳がんは、内分泌療法に抵抗性である可能性が比較的高いことが予期されている。
【００６２】
アポトーシス。抗エストロゲン療法の一作用機序は、アポトーシスによるプログラム細胞死が介在する。したがって、アポトーシスを連続的にモニタリングすることにより、乳がん細胞死のエビデンスが得られる。化学療法、ホルモン療法の両方の術前試験では、アポトーシスの早期誘導がその後の臨床反応と関連していることが実証されている。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、本発明を実行する上で、機序の理解は必要とされない。とはいえ、アポトーシスの連続的評価が、抗エストロゲン療法の効果を示すことが予期されている。
【００６３】
ＫＩ−６７。Ｋｉ６７は、細胞の代謝回転を表す増殖抗原である。原発組織におけるＫｉ６７の免疫組織化学染色は、早期乳がんの予後と関連している。ネオアジュバント試験では、Ｋｉ６７レベルの低下が、抗エストロゲン療法（タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤の両方を含む）の明らかな利点と関連していた。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、本発明を実行する上で、機序の理解は必要とされない。とはいえ、内分泌治療前および内分泌治療時のＣＴＣに関連するＫｉ６７の連続的評価が、利点の可能性を示すものと予期されている。
【００６４】
いくつかの実施形態では、上に挙げたマーカーの１つ以上が多重形式またはパネル形式で検出される。例えば、いくつかの実施形態では、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ（商標）（ジェノミックヘルス社、カリフォルニア州）などの多パラメータｒｔ−ＰＣＲベースのアッセイを利用する。ＥＲ、ＢＣＬ−２、ＨＥＲ２、およびＫｉ６７の発現の相対値がアルゴリズムを駆動し、このアルゴリズムを使ってＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘの「再発スコア（ＲＳ）」が導き出される。高度に妥当性確認された相関試験では、リンパ節転移陰性、リンパ節転移陽性の両方の患者のうち、高ＥＲ、低ＨＥＲ２、低ＢＣＬ−２、および低Ｋｉ６７を示す再発スコアの低い患者は、タモキシフェン単独で治療した場合に何らかの予後を有するのに対し、低ＥＲ、高ＨＥＲ２、高ＢＣＬ−２、および高Ｋｉ６７を示す再発スコアの高い患者は、タモキシフェン単独で治療した場合は予後が非常に悪化するが、化学療法の利点を得る可能性が非常に高いことが実証されている（Paik et al., N Engl J Med 2004;351:2817-26; Paik et al., J Clin Oncol 2006;24:3726-34）。
【００６５】
ＩＩＩ．検出方法
ＣＴＣに関連するマーカーの代表的な検出方法を以下に述べる。ただし、腫瘍マーカー核酸またはタンパク質を検出する任意の適切な方法を利用してよい。
【００６６】
Ａ．ＤＮＡおよびＲＮＡの検出
いくつかの実施形態では、当業者に対して公知の種々の核酸手法を使用して、腫瘍マーカーをｍＲＮＡとして検出する。このような核酸技術には、核酸シークエンシング（配列決定）、核酸ハイブリダイゼーション、および核酸増幅が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
１．シークエンシング（配列決定）
核酸シークエンシング手法の例示的で非限定的な例として、チェーンターミネーター（サンガー）シークエンシングおよびダイターミネーターシークエンシングが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、ＲＮＡは細胞内で比較的不安定であり、ヌクレアーゼ攻撃を受けやすいことを経験から得ているため、通常は、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写してからシークエンシングすることを認識するであろう。
【００６８】
チェーンターミネーターシークエンシングでは、修飾ヌクレオチド基質を用いて、ＤＮＡ合成反応を配列特異的に停止させる。鋳型ＤＮＡ上の特定の部位で、伸長を開始する。このとき、その部位の鋳型に対して相補的な、放射性標識または他の標識がされた短いオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。オリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、ＤＮＡポリメラーゼ、標準の４つのデオキシヌクレオチド塩基、および低濃度の一本鎖停止ヌクレオチド（最もよく使われるのはジデオキシヌクレオチド）を使って行う。この反応を、４つの個別のチューブにおいて、塩基の各々をジデオキシヌクレオチドとして使用して順に繰り返す。ＤＮＡポリメラーゼにより鎖停止ヌクレオチドが限定的に取り込まれる結果、該当する特定のジデオキシヌクレオチドが使われた位置でのみ停止した一連の関連ＤＮＡ断片が得られる。個々の反応チューブごとに、平板ポリアクリルアミドゲルまたは粘性ポリマー充填毛細管での電気泳動により、断片をサイズ別に分離する。ゲルの上から下の方向へ、標識プライマーの視覚化マークが生じた列を読み取ることにより、配列を決定する。
【００６９】
ダイターミネーターシークエンシングでは、代わりにターミネーターを標識する。ジデオキシヌクレオチドのチェーンターミネーターの各々を、異なる波長で蛍光発光する個別の蛍光色素で標識することにより、１回の反応で完全なシークエンシングを実施できる。
【００７０】
２．ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーション手法の例示的で非限定的な例として、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイ、およびサザンまたはノーザンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、組織の一部もしくは切片（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、または組織が十分に小さい場合は組織全体（ホールマウントＩＳＨ）において、特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の位置を特定するプローブとして、標識された相補的なＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を使用するハイブリダイゼーションの一種である。ＤＮＡ  ＩＳＨを使用すると、染色体の構造を特定できる。ＲＮＡ  ＩＳＨは、組織切片またはホールマウント内のｍＲＮＡおよび他の転写物を測定し位置を特定するのに使用する。通常は、試料の細胞および組織を処置して標的転写物を適所に固定し、プローブを接近しやすくする。温度を上げた状態で、プローブが標的配列とハイブリダイズし、次いで余分なプローブが洗い流される。放射性物質、蛍光、または抗原で標識されたプローブについて、それぞれ、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法、または免疫組織化学的検査を使用して、組織内のプローブの位置を特定し、プローブを定量化する。また、ＩＳＨでは、放射性標識または他の非放射性標識で標識された２つ以上のプローブを使用して、２つ以上の転写物を同時に検出することもできる。
【００７２】
２．１  ＦＩＳＨ
いくつかの実施形態では、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使って腫瘍マーカー配列を検出する。本発明のための好ましいＦＩＳＨアッセイは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を利用する。ＢＡＣは、ヒトゲノム配列決定プロジェクトにおいて広範に使用され（Nature 409: 953-958 (2001)を参照）、現在では、多くのソース（例えばＮＣＢＩ）を通じて検索可能な頒布者から、個々のＢＡＣを含むクローンを入手できる。ヒトゲノム由来の各ＢＡＣクローンには、明確に識別できる参照名が与えられている。この参照名を使って、対応するＧｅｎＢａｎｋ配列を検索し、頒布者にクローンのコピーを注文することができる。
【００７３】
ＦＩＳＨを実施するための具体的プロトコルは、当技術分野でよく知られており、本発明に容易に適応できる。方法に関する指針は、以下の文献を含む多くの文献から取得できる：In situ Hybridization: Medical Applications (eds. G. R. Coulton and J. de Belleroche), Kluwer Academic Publishers, Boston (1992); In situ Hybridization: In Neurobiology; Advances in Methodology (eds. J. H. Eberwine, K. L. Valentino, and J. D. Barchas), Oxford University Press Inc., England (1994); In situ Hybridization: A Practical Approach (ed. D. G. Wilkinson), Oxford University Press Inc., England (1992); Kuo, et al., Am. J. Hum. Genet. 49:112-119 (1991); Klinger, et al., Am. J. Hum. Genet. 51:55-65 (1992); およびWard, et al., Am. J. Hum. Genet. 52:854-865 (1993)。ＦＩＳＨアッセイを実施するためのプロトコルを示した市販のキットも存在する（例えば、メリーランド州ゲイサーズバーグのオンコール社から入手できる）。方法に関する指針を示している特許には、米国特許第５，２２５，３２６号、第５，５４５，５２４号、第６，１２１，４８９号、第６，５７３，０４３号が含まれる。これらの参考文献すべての全文は、参照により本明細書に組み込まれ、当技術分野における類似の参考文献および本明細書の「実施例」の部分で提供する情報と共に使用することにより、個々の研究室にとって簡便な手順を確立することができる。
【００７４】
２．２  マイクロアレイ
様々な種類の生物学的アッセイがマイクロアレイと呼ばれており、具体的には、ＤＮＡマイクロアレイ（例えばｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）；タンパク質マイクロアレイ；組織マイクロアレイ；トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ；化合物マイクロアレイ；および抗体マイクロアレイなどがあるが、これらに限定されない。ＤＮＡマイクロアレイは、一般に遺伝子チップ、ＤＮＡチップ、またはバイオチップと呼ばれ、数千の遺伝子の発現プロファイリングまたは発現レベルのモニタリングを同時に行う目的で、微視的なＤＮＡスポットの集団を固体表面（例えばガラス、プラスチック、またはシリコンチップ）に付着させアレイ状に配置したものである。付着したＤＮＡ断片はプローブと呼ばれ、単一のＤＮＡマイクロアレイに数千のプローブを使用できる。マイクロアレイを使用して、疾患細胞と正常細胞の遺伝子発現を比較することにより、疾患遺伝子を特定することができる。マイクロアレイは、様々な技術を使用して作製できる。こうした技術には、先端の細いピンによるガラススライドへのプリント；既製マスクを使用したフォトリソグラフィー；動的マイクロミラーデバイスを使用したフォトリソグラフィー；インクジェットプリンティング；または微小電極アレイ上の電気化学反応が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
サザンブロット法とノーザンブロット法は、それぞれ、特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を検出するために用いられる。試料から抽出したＤＮＡまたはＲＮＡを断片化し、マトリックスゲル上で電気泳動により分離し、メンブレンフィルターに移す。フィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡを、目的の配列と相補的な標識プローブとハイブリダイズさせる。フィルターに結合しハイブリダイズされたプローブを検出する。この手順の異型が逆ノーザンブロットであり、この場合、膜に付着する基質核酸が、単離されたＤＮＡ断片の集団であり、プローブは、組織から抽出され標識されたＲＮＡである。
【００７６】
３．増幅
ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡは、検出前または検出と同時に増幅することができる。核酸増幅手法の例示的で非限定的な例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、ある特定の増幅手法（例えば、ＰＣＲ）では、増幅の前にＲＮＡをＤＮＡに逆転写する必要がある（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）のに対し、他の増幅手法では、ＲＮＡを直接増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことを認識するであろう。
【００７７】
ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、および第４，９６５，１８８号。これらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる）は、一般にＰＣＲと呼ばれ、変性、プライマーペアの逆鎖へのアニーリング、およびプライマー伸長というサイクルを繰り返すことにより、標的核酸配列のコピー数を指数関数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれるバリエーションでは、逆転写酵素（ＲＴ）を使用してｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製してから、ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅してＤＮＡの複数のコピーを作製する。ＰＣＲの他の様々な置換については、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号；Mullis et al., Meth. Enzymol. 155:335 (1987)；およびMurakawa et al., DNA 7:287 (1988)（それぞれ、参照により全体が本明細書に組み入れられる）を参照。
【００７８】
一般にＴＭＡと呼ばれる転写介在増幅（米国特許第５，４８０，７８４号および第５，３９９，４９１号。これらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる）では、温度、イオン強度、およびｐＨが実質的に同一であり、標的配列の複数のＲＮＡコピーが自己触媒的に追加のコピーを生成する条件下で、自己触媒的に標的核酸配列の複数コピーを合成する。例えば、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，８２４，５１８号（これらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照。米国特許出願公開第２００６００４６２６５号（この全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているバリエーションでは、ＴＭＡは、任意で遮断部分、停止部分、および他の変更部分の使用を取り入れて、ＴＭＡプロセスの感度と精度を向上させる。
【００７９】
一般にＬＣＲと呼ばれるリガーゼ連鎖反応（Weiss, R., Science 254:1292 (1991)。この全体が参照により本明細書に組み入れられる）では、標的核酸の隣接領域とハイブリダイズする２セットの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーション、および連結という反復サイクルにおいて、ＤＮＡリガーゼによる共有結合を受け、検出可能な二本鎖連結オリゴヌクレオチド産物を生成する。
【００８０】
一般にＳＤＡと呼ばれる鎖置換増幅（Walker, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396 (1992)；米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号。これらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる）では、プライマー配列ペアを標的配列の逆鎖へアニーリングし、ｄＮＴＰαＳの存在下でのプライマーの伸長により、二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を生成し、エンドヌクレアーゼの介在により半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位にニックを入れ、ポリメラーゼの介在によりニックの３’末端からプライマーを伸長させることにより既存の鎖を置換し、次回のプライマーアニーリング、ニッキング、鎖置換のための鎖を生成するというサイクルを用いて、産物を幾何級数的に増幅させる。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、本質的に同じ方法で、ただしより高い温度で、好熱性のエンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用する（欧州特許第０  ６８４  ３１５号）。
【００８１】
他の増幅方法の例として、一般にＮＡＳＢＡと呼ばれる、核酸配列に基づく増幅（米国特許第５，１３０，２３８号。この全体が参照により本明細書に組み入れられる）；一般にＱβレプリカーゼと呼ばれ、ＲＮＡレプリカーゼを使用してプローブ分子自身を増幅させる方法（Lizardi et al., BioTechnol. 6:1197 (1988)。この全体が参照により本明細書に組み入れられる）；転写に基づく増幅方法（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)）；および自律的配列複製（Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874 (1990)。各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる）が挙げられる。公知の増幅方法のさらなる考察については、Persing, David H., "In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques" Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC (1993))を参照。
【００８２】
４．検出方法
増幅を受けない、または増幅された腫瘍マーカー核酸は、従来の任意の手段により検出できる。例えば、いくつかの実施形態では、検出可能に標識されたプローブとのハイブリダイゼーションおよびその結果生じるハイブリッドの測定により、腫瘍マーカー核酸を検出する。検出方法の例示的で非限定的な例を以下に記載する。
【００８３】
１つの例示的な検出方法であるハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）は、化学発光性オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、アクリジニウムエステル標識（ＡＥ）プローブ）を標的配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされていないプローブ上に存在する化学発光標識を選択的に加水分解し、残りのプローブから生じる化学発光を照度計で測定することを伴う。例えば、米国特許第５，２８３，１７４号およびNorman C. Nelson et al., Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, ch. 17, Larry J. Kricka ed., 2d ed. 1995（各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照。
【００８４】
別の例示的な検出方法では、増幅プロセスの定量的評価をリアルタイムで行うことができる。増幅プロセスの「リアルタイム」の評価は、増幅反応中、連続的または定期的に、反応混合物中の単位複製配列の量を測定し、その測定値を使用して、試料中に最初に存在していた標的配列の量を算出することを伴う。リアルタイム増幅に基づき、試料に最初に存在していた標的配列の量を決定する様々な方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第６，３０３，３０５号および６，５４１，２０５号で開示されている方法などがある（これらの各文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる）。試料中に最初に存在していた標的配列の量を決定するための別の方法として、リアルタイム増幅に基づかない方法が米国特許第５，７１０，０２９号（この全体が参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。
【００８５】
増幅産物は、様々な自己ハイブリダイズプローブを使用してリアルタイムに検出でき、そうしたプローブの大部分はステムループ構造を有する。このような自己ハイブリダイズプローブは、プローブが自己ハイブリダイズした状態か、それとも標的配列とのハイブリダイゼーションを通じて変化した状態であるかによって、異なる検出可能シグナルを発するように標識される。非限定的な例として、「分子トーチ」は、自己相補性の特定領域（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と呼ばれる）を含む自己ハイブリダイズプローブの一種である。この特定領域は連結領域（例えば、非ヌクレオチドリンカー）により連結され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする。好ましい実施形態では、分子トーチは、標的結合ドメイン中に１〜約２０塩基長さの一本鎖塩基領域を含み、鎖置換条件下において、増幅反応物に存在する標的配列とハイブリダイズしやすくなっている。鎖置換条件下では、標的配列が存在する場合以外は、分子トーチ中の２つの相補的領域（完全に相補的でも部分的に相補的でもよい）がハイブリダイズしていることが好ましく、標的配列が存在する場合、標的配列は、標的結合ドメインに存在する一本鎖領域に結合し、標的閉鎖領域の全部または一部を置換する。分子トーチの標的結合ドメインと標的閉鎖ドメインは、検出可能標識または相互作用する標識ペア（例えば、発光／消光剤）を含み、この標識は、分子トーチが自己ハイブリダイズしているときと、分子トーチが標的配列とハイブリダイズしているときとで異なるシグナルを発するように配置されているため、ハイブリダイズしていない分子トーチの存在下で、試験試料中のプローブ：標的の二重鎖を検出することができる。分子トーチおよび種々の相互作用標識ペアは、米国特許第６，５３４，２７４号で開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８６】
自己相補性を有する検出プローブの別の例として、「分子ビーコン」がある。分子ビーコンは、標的に相補的な配列を有する核酸分子のほか、増幅反応物中に存在する標的配列がないときはプローブを閉鎖立体構造に保持する親和性ペア（または核酸アーム）、およびプローブが閉鎖立体構造にあるときに相互作用する標識ペアを含む。標的配列および標的に相補的な配列がハイブリダイズすると、親和性ペアのメンバーが分離し、それによりプローブが開放立体構造に移行する。標識ペアは、例えば蛍光体と消光剤（例えばＤＡＢＣＹＬとＥＤＡＮＳ）であってよく、開放立体構造の移行は、この標識ペアの相互作用の低下により検出できる。分子ビーコンは米国特許第５，９２５，５１７号および６，１５０，０９７号で開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８７】
他の自己ハイブリダイズプローブは当業者によく知られている。非限定的な例として、例えば米国特許第５，９２８，８６２号（この全体が参照により本明細書に組み入れられている）に開示されているような相互作用標識を有するプローブ結合ペアは、本発明での使用に適応しうる。さらなる検出方式として、米国特許出願公開第２００５００４２６３８号（この全体が参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている「分子スイッチ」が挙げられる。インターカレート性色素および／または蛍光色素を含むプローブなどの他のプローブも、本発明における増幅産物の検出に有用である。例えば、米国特許第５，８１４，４４７号（この全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照。
【００８８】
Ｂ．タンパク質の検出
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍マーカータンパク質および／または腫瘍マーカータンパク質のレベルを検出する方法を提供する。当業者に対して公知の様々なタンパク質手法を用いてタンパク質を検出できる。これらの手法には、タンパク質シークエンシング（配列決定）およびイムノアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
１．シークエンシング（配列決定）
タンパク質シークエンシング手法の例示的で非限定的な例として、質量分析およびエドマン分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
質量分析は、原理上は、任意のサイズのタンパク質を配列決定できるが、計算的には、サイズが大きくなるほど困難になる。タンパク質をエンドプロテアーゼで消化させ、得られた溶液を高圧液体クロマトグラフィーカラムに通す。カラムの末端で、高い正電位をかけた細いノズルから、溶液を質量分析計に噴射する。小滴にかかった電荷により、単一のイオンのみが残るまでタンパク質が断片化される。次に、ペプチドを断片化し、断片の質量電荷比を測定する。質量スペクトルをコンピューターで解析し、また多くの場合、以前に配列決定されているタンパク質のデータベースと比較して、断片の配列を決定する。次いで、このプロセスを別の消化酵素で繰り返し、配列の重複部分を用いてタンパク質の配列を構成する。
【００９１】
エドマン分解反応では、配列決定するペプチドを固体表面（例えば、ポリブレンを塗布したガラス繊維）に吸収させる。エドマン試薬であるフェニルイソチオシアネート（ＰＴＣ）を、１２％トリメチルアミンの弱塩基性緩衝液と共に、吸収されたペプチドに加え、Ｎ末端アミノ酸のアミン基と反応させる。次に、無水酸を追加することにより、末端アミノ酸誘導体を選択的に分離できる。誘導体が異性化して置換フェニルチオヒダントインが生成されるので、これを洗い流してクロマトグラフィーで同定でき、このサイクルを繰り返すことができる。各段階の効率は約９８％であり、約５０のアミノ酸を高い信頼性で決定できる。
【００９２】
２．イムノアッセイ
イムノアッセイの例示的で非限定的な例として、免疫沈降；ウェスタンブロット；ＥＬＩＳＡ；免疫組織化学法；免疫細胞化学法；フローサイトメトリー；および免疫ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。当業者に対して公知の様々な手法を使用して検出可能に標識された（例えば、比色、蛍光、化学発光、放射性物質）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、イムノアッセイでの使用に適している。
【００９３】
免疫沈降は、抗原を、その抗原に特異的な抗体を用いて溶液から沈降させる手法である。このプロセスを用いて、細胞抽出物中に存在するタンパク質複合体に含まれると考えられるタンパク質を標的にすることにより、タンパク質複合体を同定することができる。最初に細菌から単離された、プロテインＡやプロテインＧなどの不溶性の抗体結合性タンパク質により、溶液から複合体を取り出す。また、抗体をセファロースビーズに結合させると、溶液から容易に単離することができる。洗浄後、質量分析、ウェスタンブロット法、その他の任意の数の方法を用いて沈降物を解析し、複合体の成分を同定できる。
【００９４】
ウェスタンブロットまたはイムノブロットは、組織ホモジネートまたは抽出物の所与の試料中のタンパク質を検出する方法である。この方法では、ゲル電気泳動を使用して、変性したタンパク質を質量別に分離する。次に、タンパク質をゲルからメンブレン（通常はポリビニルジフルオリドまたはニトロセルロース）に移し、目的のタンパク質に特異的な抗体を用いてタンパク質を探索する。その結果、研究者は、所与の試料中のタンパク質の量を調べ、いくつかのグループ間でレベルを比較することができる。
【００９５】
ＥＬＩＳＡは、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（酵素結合免疫吸着検定法）の略語であり、試料中の抗体または抗原の存在を検出する生化学手法である。この方法では、少なくとも２つの抗体を利用する。その一方は抗原に対して特異的であり、他方は酵素と結合している。第２の抗体が、発色基質または蛍光発生基質を通じてシグナルを出す。ＥＬＩＳＡのバリエーションとして、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴなどがある。ＥＬＩＳＡは、試料中の抗原の存在と抗体の存在のどちらの評価にも実施できるので、血清抗体濃度の測定と抗原の存在の検出の両方に利用できる、有用なツールである。
【００９６】
免疫組織化学法と免疫細胞化学法は、それぞれ、組織切片中または細胞中のタンパク質の位置を特定するプロセスを指し、組織中または細胞中の抗原がそれぞれの抗体と結合するという原理に基づく。抗体に発色タグまたは蛍光タグを付けることにより、可視化が可能になる。発色タグの代表例として、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光体タグの代表例として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やフィコエリトリン（ＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
フローサイトメトリーは、流体の流れの中に懸濁した微細粒子を計数、調査、および選別する手法である。この方法では、光学／電子検出装置内を流れる単一細胞の物理的および／または化学的特性の同時の多パラメータ解析が可能である。単一の周波数または色の光線（例えば、レーザー）を、流体力学的に集中した流体の流れに向ける。流れが光線を通過する点に、数台の検出器で狙いを定める。ここで、１台は光線と方向を揃え（前方散乱（ＦＳＣ））、数台は光線と垂直の方向に向ける（側方散乱（ＳＳＣ）および１台以上の蛍光検出器）。光線を通過する各懸濁粒子が何らかの方法で光を散乱して、粒子中の蛍光化学物質が励起され、光源より低い周波数で光を放射し得る。散乱光と蛍光の組み合わせを検出器で測定し、また、蛍光放射ピークごとに各検出器における輝度の変動を解析することにより、個別の各粒子の物理的および化学的構造に関する様々な事実を推定することができる。ＦＳＣは細胞容積と相関し、ＳＳＣは粒子の密度または内部の複雑さ（例えば、核の形状、細胞質顆粒の量とタイプ、膜の粗さなど）と相関する。
【００９８】
免疫ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ）では、核酸増幅手法を利用して、抗体に基づくイムノアッセイにおけるシグナル生成を増加させる。ＰＣＲにはタンパク質の同等物が存在しないため、つまり、ＰＣＲ中の核酸増幅と同じ方法でタンパク質を複製することはできないため、検出感度を上げる唯一の方法は、シグナルの増幅である。標的タンパク質は、オリゴヌクレオチドに直接的または間接的にコンジュゲートしている抗体に結合する。結合していない抗体は洗い流され、残りの結合した抗体のオリゴヌクレオチドが増幅される。増幅されたオリゴヌクレオチドを標準の核酸検出方法（リアルタイムの方法を含む）で検出することにより、タンパク質が検出される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、免疫磁気による検出を利用する。いくつかの実施形態では、検出は自動化される。代表的な免疫磁気検出方法として、ベリデックス（ニュージャージー州ラリタン）が市販している検出方法が挙げられるが、これに限定されない。
【０１００】
Ｃ．データ解析
いくつかの実施形態では、コンピューターベースの解析プログラムを使用して、検出アッセイで生成された生データ（例えば、腫瘍マーカー発現の有無もしくは量および／またはＣＴＣレベル）を臨床医向けの予測値データに変換する（例えば、がん治療法の選択）。臨床医は、任意の適切な手段を使用して予測データにアクセスできる。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、遺伝学や分子生物学の教育を受けない可能性のない臨床医でも生データの理解は不要であるという、さらなる利点を提供する。データは、その最も有用な形態で臨床医に直接提示される。次いで、臨床医は、対象の治療を最適化するために、この情報を直ちに利用することができる。
【０１０１】
本発明は、アッセイを実施している研究室、情報提供者、医療従事者、および対象との間で情報の受信、処理、および送信ができる任意の方法を企図している。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、対象から試料（例えば、生検試料または血液もしくは血清試料）を取得し、世界の任意の場所（例えば、対象が居住する国や情報が最終的に使われる国とは異なる国）に位置するプロファイリングサービス（例えば、医療施設の臨床検査室、ゲノムプロファイリング業者など）に提出して、生データを作成する。試料が組織または他の生体試料を含む場合は、対象が医療センターを訪れ、試料を採取させてプロファイリングセンターに送付させるか、または対象が試料（例えば、尿試料）を自身で採取して、直接プロファイリングセンターに送付することができる。試料が以前に測定された生体情報を含む場合は、対象からプロファイリングサービスに直接情報を送信してもよい（例えば、情報を含む情報カードをコンピューターでスキャンし、電子通信システムを使用してプロファイリングセンターのコンピューターに伝送してもよい）。プロファイリングサービスが試料を受領した後、試料が処理され、その対象に望まれる診断情報または予後情報に特化したプロファイルが作成される（すなわち発現データ）。
【０１０２】
次いで、治療担当医による解釈に適した形式でプロファイルデータが作成される。例えば、生のデータを提供するのでなく、対象の診断またはリスク評価（例えば、がん治療が奏功する見込み）を、特定の治療選択肢に関する推奨事項と共に提示する形式で作成できる。データは、任意の適切な方法で臨床医に表示することができる。例えば、いくつかの実施形態では、プロファイリングサービスは、臨床医向けに（例えば、治療の現場で）印刷できる報告書、または臨床医に対してコンピューターモニターに表示できる報告書を作成する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、最初に治療現場または地域の施設で情報を解析する。次に、生データを中央処理施設を送付してさらなる解析を行い、かつ／または、生データを臨床医もしくは患者にとって有用な情報に変換する。中央処理施設は、プライバシー（統一したセキュリティプロトコルの下で全データを中央施設に保存）、スピード、およびデータ解析の一様性という利点を提供する。次に、中央処理施設は、対象の治療後のデータの扱いを管理できる。例えば、中央施設は、電子通信システムを用いて臨床医、対象、または研究者にデータを提供することができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、対象は、電子通信システムを使用してデータに直接アクセスすることができる。対象は、結果に基づいて、さらなる介入またはカウンセリングを選択してもよい。いくつかの実施形態では、データは研究用途で使用される。例えば、データを使用して、特定の症状または病期の有用な指標としてのマーカーの採用または除外を、さらに最適化することができる。
【０１０５】
Ｄ．組成物およびキット
本発明の診断方法で使用する組成物には、プローブ、増幅オリゴヌクレオチド、および抗体が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい組成物は、ＣＴＣ試料中の腫瘍マーカーの発現レベルの存在を検出する。
【０１０６】
これらの組成物のいずれも、単独で、または本発明の他の組成物と組み合わせて、キットの形で提供することができる。例えば、腫瘍マーカーの増幅と検出のために、単一の標識プローブおよび１対の増幅オリゴヌクレオチドをキットとして提供できる。キットには、適切な対照および／または検出試薬をさらに含めてもよい。
【０１０７】
本発明のプローブおよび抗体組成物を、アレイまたはパネルアレイの形で提供することもできる。
【０１０８】
ＩＶ．治療方針の決定
いくつかの実施形態では、本発明は、治療方針を決定するためのシステム、キット、および方法を提供する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ＣＴＣ−内分泌療法指数（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｄｅｘ）（ＣＴＣ−ＥＴＩ）を決定する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣおよび腫瘍マーカーのレベルにポイントを割り当てることにより、ＣＴＣ−ＥＴＩを算出する（例えば、実施例１を参照）。いくつかの実施形態では、低いＣＴＣ−ＥＴＩは、内分泌（例えば抗エストロゲン）療法に反応する見込みがある対象を示す。いくつかの実施形態では、高いＣＴＣ−ＥＴＩスコアは、内分泌療法に反応する可能性が低く、化学療法の方が良好に治療される対象を示す。
【０１１０】
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を実証しさらに例証するために提供され、その範囲を限定するものとは解釈されない。
【０１１１】
〔実施例１〕
ＣＴＣ−内分泌療法指数（Endocrine Therapy Index）（ＣＴＣ−ＥＴＩ）の開発
ＣＴＣは、市販の、自動化された免疫磁気システム（例えば、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システム；ベリデックスエルエルシー（Veridex LLC））を使用して、再現性よく、および確実に、数えることが出来る。高レベルのＣＴＣは、転移性乳がん（ＭＢＣ）を有する患者における急速な進行を予測する（Cristofanilli, et al NEJM 2004）。内分泌療法（ＥＴ）の恩恵を受けるのは、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性ＭＢＣを有する患者の〜５０％のみである。内分泌性−難治性ＭＢＣは、化学療法によって、より良好に緩和される。本実施例は、ＥＴによる恩恵を受ける可能性が低く、化学療法によってより良好に治療される、ＥＲ陽性ＭＢＣを有する患者を特定する、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）を使用した多パラメータアッセイを説明する。
【０１１２】
方法。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムは、４つの蛍光チャネルを有する。これらのうち３つを使用して、ＣＴＣをＷＢＣ（ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン、抗ＣＤ４５）と識別する。４番目の「空の」チャネルは抗原特異的な蛍光標識された抗体を用いて、ＥＲ、Ｂｃｌ−２、ＨＥＲ２、およびＫｉ６７の発現を測定するために使用された。これらの４つのマーカーは、ＥＴに対する感受性（ＥＲ、Ｂｃｌ−２）または抵抗性（ＨＥＲ２、Ｋｉ−６７）との関連により正当に選択された。培養されたヒト乳がん細胞（ＭＣＦ−７：ＥＲ＋、ＢＣＬ−２＋、ＨＥＲ２−、Ｋｉ６７＋；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：ＥＲ−、Ｂｃｌ−２−、ＨＥＲ２−、Ｋｉ６７＋；ＢＴ−４７４：ＥＲ＋、Ｂｃｌ−２＋、ＨＥＲ２＋、Ｋｉ６７＋）を、正常な提供者から得た７．５ｍｌのヒト全血中に混入し、ＣＸＣ  ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）キットを使用して分離し、特徴付けした。
【０１１３】
表１は種々のマーカーとＥＴに対する応答の関連を示す。
【０１１４】
【表１】
0005951603.tif 000002
【０１１５】
表２は抗体および実験パラメータを示す。
【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
結果。各細胞株を、それぞれのマーカーに対して、適切な陰性対象で、適切に染色したが、単一の細胞株内であっても、染色は不均一であった（図１〜３）。
【０１１８】
これらのデータを使用して、細胞数と各マーカーの細胞陽性度の相対的な割合（％）および程度との組み合わせから成る個々のカテゴリーにスコアを割り当て、より低いスコア（低いＣＴＣまたはＣＴＣ無し、またはＥＲおよびＢｃｌ−２の高％および強度を伴うＣＴＣ；低いＨＥＲ２およびＫｉ−６７）においてＥＴに対する良好な応答が予測される、ＣＴＣ−ＥＴＩが開発された（表３および４）。
【０１１９】
【表３】
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【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
上述の方法を使用して、転移性乳がんを有する３人の患者についてのＣＴＣ−ＥＴＩを決定した。結果を図４に示す。
【０１２２】
さらなる試験において、２１人の患者を試験した。試験デザインおよび結果を図７〜８に示す。一人の患者が不適格であった。２０人の患者のうち５人が低ＣＴＣ数（＜５  ＣＴＣ／７．５ｍｌの全血）を有し、比較的良好な予後を有すると期待される。ＣＴＣ−ＥＴＩは１０人（５０％）の患者において決定された：２人の患者は低数値、３人は中数値、および５人は高数値のＣＴＣ−ＥＴＩを有した。技術的な問題により、残りの４人の患者において、正確なＣＴＣ−ＥＴＩが得られなかった。追記として、一人の患者におけるＣＴＣの中でバイオマーカーの発現は不均一であった。
【０１２３】
より低いＣＴＣ−ＥＴＩスコア（低いＣＴＣまたはＣＴＣ無し、または高いＣＴ  ＣＥＲおよびＢＣＬ−２ならびに低いＣＴＣＨＥＲ２およびＫｉ−６７を伴うＣＴＣ）が、ＥＴに対する良好な応答に関連していると考えられる。高ＣＴＣ−ＥＴＩが、ＥＴにおける抵抗性および迅速な進行を予測するかどうかを判断するために、ＭＢＣを有する患者において、ＣＴＣ−ＥＴＩを算出した。
【０１２４】
上述の明細書に記載される、全ての刊行物、特許、特許出願および受託番号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は特定の実施形態との関連において記載されているが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に、不当に限定されるべきではないことを理解するべきである。実際には、記載される本発明の組成物および方法の種々の改変および変更が、当業者には明らかであり、以下の請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、がん細胞株における、エストロゲン受容体の発現を示す図である。
【図２】図２は、がん細胞株における、ａ）Ｂｃｌ−２、ｂ）Ｋｉ−６７、およびｃ）ＨＥＲ−２の発現を示す図である。
【図３】図３は、がん細胞株についてのＣＴＣ−ＥＴＩスコアの算出法を示す図である。
【図４】図４は、３人の患者についてのＣＴＣ−ＥＴＩスコアの算出法を示す図である。
【図５】図５は、乳がんにおける、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアの例示的な臨床試験および臨床結果を示す模式図である。
【図６】図６は、乳がんにおける、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアの例示的な臨床試験および臨床結果を示す模式図である。
【図７】図７は、乳がんにおける、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアの例示的な臨床試験および臨床結果を示す模式図である。
【図８Ａ】図８Ａは、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアをモニターした８人の患者の臨床試験の結果を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアをモニターした８人の患者の臨床試験の結果を示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＣＴＣ−ＥＴＩスコアをモニターした８人の患者の臨床試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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