(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に存在する菌を非選択培地中で培養するステップ（ａ）と、
前記ステップ（ａ）で得られた培養液を希釈してから検査対象菌用の液体選択培地と混合し、前記検査対象菌を選択的に培養するステップ（ｂ）と、
前記ステップ（ｂ）で培養中の前記培養液の溶存酸素量を酸素電極法により測定するステップ（ｃ）と、
前記ステップ（ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記試料中での前記検査対象菌の有無を判定するステップ（ｄ）とを備え、
前記検査対象菌はサルモネラであり、
前記ステップ（ｂ）では、前記ステップ（ａ）で得られた前記培養液を１×１０3倍以上１×１０4倍以下に希釈して前記液体選択培地と混合することを特徴とする菌の検査方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記ステップ（ａ）で得られた前記培養液の希釈直後の菌濃度は、いずれの菌種についても１×１０6ｃｆｕ／ｍＬ以下となっていることを特徴とする菌の検査方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、
前記ステップ（ｂ）では、前記ステップ（ａ）で得られた前記培養液を希釈した後、希釈された前記培養液の一部と前記液体選択培地とを測定用のセル（10）内に注入し、
前記ステップ（ａ）で得られた前記培養液に前記検査対象菌が含まれる場合、前記セル（10）内に注入される希釈された前記培養液中には少なくとも１個の前記検査対象菌が含まれることを特徴とする菌の検査方法。
【請求項４】
請求項１〜３のうちいずれか１つにおいて、
少なくとも前記ステップ（ｃ）は測定部（20）と判定部（22）とを有する測定システム（18）により行われ、
前記ステップ（ｃ）での前記培養液の溶存酸素濃度の測定は前記測定部（20）により測定され、
前記ステップ（ｄ）では、前記判定部（22）が、前記測定部（20）から送られた測定結果に基づいて前記試料に前記検査対象菌が存在するか否かを判定することを特徴とする菌の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気的方法を用いた細菌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ属菌（サルモネラ）、腸炎ビブリオ菌、黄色ブドウ球菌、ボツリヌス菌、病原性大腸菌など種々の細菌が、食中毒の原因菌として知られている。我が国では食の安全を確保するため、販売又は提供される食品に対して、これらの原因菌の検査を義務付けており、基準を満たさない食品が市場に出回らないようにしている。食中毒の原因菌についての標準的な検査方法は、菌種ごとに定められており、公定法と呼ばれている。以下、図４を参照して、代表的な食中毒の原因菌である、サルモネラについての公定法を説明する。
【０００３】
公定法では、まず検体となる食品を少なくとも２５ｇ（液体の場合は２５ｍL）採量し、例えば当該食品に増菌培地を加えて１０倍量となるようにし、ホモジナイザーで混合、乳化することで、試料を調整する（ステップＳｔ１）。ここでは、増菌培地として２２５ｍＬの緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）を用いることができる。
【０００４】
次いで、前増菌培養を行う（ステップＳｔ２）。ここでは、調整された試料をそのまま３７℃、２２時間インキュベートする。
【０００５】
続いて、サルモネラの選択増菌培養を行う（ステップＳｔ２０１）。ここでは、前増菌培養で得られた試料を所定量採取し、サルモネラを選択的に増殖させることができる選択培地を用いて４２℃、２２時間の条件でサルモネラを選択的に増殖させる。
【０００６】
次に、サルモネラの選択分離培養を行う（ステップＳｔ２０２）。ここでは、選択増菌培養後の試料を白金耳等を用いて選択分離用の寒天培地上にプレーティングし、当該試料を３７℃、２４〜４８時間インキュベートする。
【０００７】
次いで、試料中にサルモネラが存在するか否かの判定を行う（ステップＳｔ２０３）。ここでは、寒天培地上のコロニーの色調等から試料中にサルモネラが存在するか否かを判定する。次いで、陽性であると判定された場合には、市販の確認培地や抗原抗体反応を用いた確定試験を行う（Ｓｔ７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−６４６４８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】厚生労働省監修「食品衛生検査指針〈微生物編２００４〉― 公定試験法・標準試験法詳解」、２００４年６月発行、p.181-p.186
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上述の検査方法では、結果が得られるまでに３〜４日間もの時間を要する。このため、検査結果が得られるまでに汚染された食品が消費されてしまったり、食中毒の原因菌の特定が遅れることにより対策を講じるのが遅れたりするおそれがある。また、検査を行う技術者が未熟な場合、寒天培地上での菌の分離ができないこと等により検査が正確に行えないおそれもある。
【００１１】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、迅速に結果が得られ且つ信頼性の高い細菌の検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の発明は、菌の検査方法であって、試料に存在する菌を非選択培地中で培養するステップ（ａ）と、前記ステップ（ａ）で得られた培養液を希釈してから検査対象菌用の液体選択培地と混合し、前記検査対象菌を選択的に培養するステップ（ｂ）と、前記ステップ（ｂ）で培養中の前記培養液の溶存酸素量を酸素電極法により測定するステップ（ｃ）と、前記ステップ（ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記試料中での前記検査対象菌の有無を判定するステップ（ｄ）とを備えていることを特徴とする。前記検査対象菌は、サルモネラである。
【００１３】
第１の発明では、酸素電極法を用いて選択増菌培養時に検査対象菌の増加による溶存酸素濃度の減少からその有無を判定しているので、公定法に比べて選択分離培養を行うことなく菌を検出できる。そのため、第１の発明によれば、公定法に比べて迅速に検査結果を得ることができる。さらに、非選択培地を用いた培養後、培養液を適切な倍率で希釈してから選択培養を行うことにより、高い検出感度を維持しつつ、夾雑菌による検査対象菌の誤検出を効果的に防ぐことができる。
【００１４】
第１の発明はまた、前記前記ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ）で得られた前記培養液を１×１０3倍以上１×１０4倍以下に希釈して前記液体選択培地と混合することを特徴とする。
【００１５】
第１の発明によれば、ステップ（ｂ）で培養液を１×１０３倍以上に希釈してから培養しているので、夾雑菌の存在によって検出結果が偽陽性となるのが防がれている。また、ステップ（ｂ）で培養液を１×１０4倍以下に希釈してから培養することで、試料中の検査対象菌の濃度が、極めて高い確率で測定セルに分注される程度に保証され、確実に菌の検出を行うことができる。
【００１６】
第２の発明は、第１の発明の前記ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ）で得られた前記培養液の希釈直後の菌濃度が、いずれの菌種についても１×１０6ｃｆｕ／ｍＬ以下となっていることを特徴とする。
【００１７】
第２の発明によれば、酸素電極法を用いる場合に培養液に含まれる夾雑菌の濃度を、偽陽性が生じない範囲内にすることができるので、検査の信頼性を向上させることができる。
【００１８】
第３の発明は、前記ステップ（ｂ）では、前記ステップ（ａ）で得られた前記培養液を希釈した後、希釈された前記培養液の一部と前記液体選択培地とを測定用のセル（10）内に注入し、前記ステップ（ａ）で得られた前記培養液に前記検査対象菌が含まれる場合、前記セル（10）内に注入される希釈された前記培養液中には少なくとも１個の前記検査対象菌が含まれることを特徴とする。
【００１９】
第４の発明は、第１〜第３の発明のうちいずれか１つにおいて、少なくとも前記ステップ（ｃ）が測定部（20）と判定部（22）とを有する測定システム（18）により行われ、前記ステップ（ｃ）での前記培養液の溶存酸素濃度の測定が前記測定部（20）により測定され、前記ステップ（ｄ）では、前記判定部（22）が、前記測定部（20）から送られた測定結果に基づいて前記試料に前記検査対象菌が存在するか否かを判定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明はよれば、酸素電極法を用いて検査対象菌の有無を判定しているので、公定法に比べて選択分離培養を行うことなく菌を検出できる。そのため、本発明によれば、公定法に比べて迅速に検査結果を得ることができる。さらに、非選択培地を用いた培養後、培養液を適切な倍率で希釈してから選択培養を行うことにより、高い検出感度を維持しつつ、夾雑菌による検査対象菌の誤検出を効果的に防ぐことができる。すなわち、本発明によれば、高精度に検査対象菌の検出を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（ａ）、（ｂ）は、酸素電極法を用いて液中の酸素濃度を測定する測定装置（測定システム）（18）の構成を概略的に示す図である。
【図２】酸素電極法を用いた菌の検査方法を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る菌の検査方法を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る菌の検査方法の手順と公定法の手順との比較を示す図である。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、サルモネラに汚染されていない食品サンプルより調整した前増菌培養後の培養液を１００倍希釈、１６７倍希釈、１０００倍希釈した場合における、培養液の溶存酸素量の測定結果をそれぞれ示す図である。
【図６】（ａ）、（ｂ）は、大腸菌と健常状態のサルモネラとを添加した場合、及び大腸菌と熱損傷状態のサルモネラとを添加した場合における、培養液の溶存酸素量の測定結果をそれぞれ示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
−検査方法についての検討−
本願発明者らは、迅速且つ信頼性の高い検査方法として、電気的方法を用いた方法に注目した。さらに、本願発明者らは、電気的方法の中でも、電極を用いて溶存酸素量を測定する酸素電極法（ＤＯＸ(登録商標）：dissolved oxygen electrode method）が食中毒の原因菌の検査に有用であると考えた。
【００２３】
図１（ａ）、（ｂ）は、酸素電極法を用いて液中の酸素濃度を測定する測定装置（測定システム）（18）の構成を概略的に示す図である。同図に示す測定装置（18）には、対極（12）、作用極（14）及び参照極（16）をそれぞれ有するセルが多数セットされる。測定装置（18）は、セル（10）の各電極（12、14、16）に接続され、液中の溶存酸素量を測定する測定部（20）と、測定部（20）から送られた測定結果を用いて試料中の検査対象菌の有無を判定する判定部（22）と、判定部（22）での判定結果のデータを保持する記憶部（24）とを備えている。なお、判定部（22）及び記憶部（24）は、測定装置（18）に接続されたコンピュータ内に設けられていてもよい。
【００２４】
セル（10）内の溶液に酸素が溶存する場合、作用極（14）の表面でＯ２＋ ４Ｈ＋＋ ４ｅ−  →  ２Ｈ２Ｏの反応が生じ、対極（12）と作用極（14）との間に溶存酸素量に対応する大きさの電流が流れる。このため、対極（12）と作用極（14）との間に流れる電流を測定することで、液中の溶存酸素量を知ることができる。
【００２５】
ここで、酸素呼吸する細菌が培養液中で増殖すると、培養液中の酸素濃度が低下する。このため、検査対象菌を選択的に増殖させる培養液を用いて培養を行い、当該培養液中での酸素濃度の変化を測定することによって、検査対象菌の有無を判定することができる。より具体的には、培養液の酸素濃度を測定しながら培養を続けた場合、対極（12）と作用極（14）との間に流れる電流量が急激に減少し、所定値を下回った場合に検査対象菌が試料中に存在すると判定でき、対極（12）と作用極（14）との間に流れる電流量が変化しない場合には試料中に検査対象菌が存在しないと判定できる。
【００２６】
サルモネラは、通性嫌気性菌であり、好気条件下で酸素呼吸を行うので、上記の方法により試料中のサルモネラを検出できるとも考えられた。
【００２７】
図２は、酸素電極法を用いた菌の検査方法を示す図である。この方法ではまず、検体となる食品２５ｇとリン酸緩衝液（ＰＢＳ）又は生理食塩水２２５ｍＬとをホモジナイザーを用いて混合する（ステップＳｔ１０１）。次いで、調整された試料のうち１ｍＬを採取し、測定装置（18）のセル（10）内でサルモネラ用の液体選択培地と混合し、３７℃、２０時間程度インキュベートする（ステップＳｔ１０２）。この培養は、測定装置（18）内で行うことが可能である。また、この選択培養を行いながら、酸素電極法により、培養液中のサルモネラの検出を行う（ステップＳｔ１０３）。
【００２８】
次いで、測定結果に基づいて、測定装置が検査対象菌の有無を判定する（ステップＳｔ１０４）。以上の手順でサルモネラの検出が行われる。
【００２９】
しかし、サルモネラは食品中に少量しか存在しない場合が多い。１ｇ中に１０個以下、つまり上記ステップＳｔ１０１で調整した試料中のサルモネラ濃度が例えば１ｃｆｕ／ｍＬ未満であるとすると、上記ステップＳｔ１０２で採取する１ｍＬの試料中にはサルモネラが入らない可能性がある。このように、上記の方法では、食品中に少量しか含まれない細菌を、２５ｇ中に１個のサルモネラがいることを検査できる公定法と同じように確実に検出するのは困難であった。また、食品においては、冷凍等によって菌が損傷している場合が多いが、損傷菌は健常菌に比べて増殖するのに時間がかかる上、選択培地上では増殖しない場合がある。このため、上記の方法ではサルモネラの検出が所定の時間にできず偽陰性が発生し、健常菌を検出する場合に比べて検出感度も低下する。
【００３０】
そこで、本願発明者らは、上記ステップＳｔ１０１に代えて、試料と液体の非選択培地とを混合し、前増菌培養を行うことを考えた。前増菌培養により、損傷菌の回復を図ることができ、サルモネラの菌濃度を大幅に高くすることができる。
【００３１】
この前増菌培養では、サルモネラ以外の細菌も増殖する。しかし、初期菌数が多い菌や増殖速度が速い菌がサルモネラよりも速く増殖したとしても、増殖曲線で知られているとおり、１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ〜１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ程度の濃度で静止期を迎え、以後は死滅期において菌濃度がゆるやかに低下する。これに対し、サルモネラは、生理食塩水又は緩衝液によって希釈されたセル内の検査液中に存在すれば、２２〜２４時間程度培養した場合、１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ以上に増殖する。このため、前増菌培養後にサルモネラを選択的に培養することで、食品中に含まれるサルモネラを確実に検出できるのではないかと思われた。
【００３２】
本願発明者らが前増菌培養後に選択培養を行い、培養液を酸素電極法により測定したところ、食品中にサルモネラが存在する場合には高い確率で陽性として判定できることが確かめられた。ところが、実験の結果、実際にはサルモネラが存在しない食品を検査した場合にも陽性になる例が見られた。この誤検出は、培養液に含まれる夾雑菌の菌数が多い場合、選択培地を用いて培養しても溶存酸素を減少させることができる濃度の夾雑菌が一気に死滅するわけでなく、夾雑菌が減る前に検出閾値まで溶存酸素濃度を減少させてしまうために生じるものと考えられた。
【００３３】
そこで、本願発明者らはさらなる検討を重ね、前増菌培養後の培養液を適切な倍率で一旦希釈し、希釈後の培養液にサルモネラの選択培地を加えて培養することで、誤検出が生じる割合を大きく低減できることに想到した。以下、本発明の実施形態として、この方法を説明する。なお、以下の実施形態は、本質的に好ましい例示であって、本発明、その適用物、あるいはその用途の範囲を制限することを意図するものではない。
【００３４】
《発明の実施形態》
図３は、本発明の実施形態に係る菌の検査方法を示す図である。同図に示すように、本実施形態に係る方法では、まず検体となる食品を少なくとも２５ｇ（液体の場合は２５ｍL）採量し、例えば当該食品に２２５ｍＬの増菌培地を加えて１０倍量となるようにし、ホモジナイザーで混合するか、リンスすることで、試料を調整する（ステップＳｔ１）。
【００３５】
本実施形態に係る方法では、検査対象となる食品の種類や形状、状態は特に限定されず、例えば牛、豚、鶏、馬肉及びこれらの加工品、冷凍食品、卵、魚肉、野菜、ジュース等を幅広く検査することができる。また、本ステップで用いられる増菌培地は、非選択培地であれば特に限定されないが、緩衝ペプトン水であれば安価であり、サルモネラ（検査対象菌）の損傷回復及び増殖を十分に図ることができるので、好ましい。なお、ＥＥＭブイヨン、ブレインハート インフュジョンブロス、トリプトソイ ブロス等を増菌培地として用いてもよい。
【００３６】
次いで、前増菌培養を行う（ステップＳｔ２）。ここでは、調整された試料をそのままインキュベートする。培養温度はサルモネラが生育可能な温度であればよく、培養時間は、サルモネラの菌濃度が１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ以上になる時間であればよい。ここでは、培養を迅速に行うために培養温度を３７℃とし、培養時間を２２時間とする。本ステップでは、試料となる食品に菌が含まれていた場合、培養液中の当該菌の濃度は、概ね１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ以上１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ以下の範囲で飽和する。
【００３７】
続いて、前増菌培養で得られた培養液を所定の倍率で希釈する（ステップＳｔ３）。本ステップでは、生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水等を用いて培養液を希釈する。この他に、リン酸緩衝希釈水、ペプトン加生理食塩水を培養液の希釈に用いてもよい。
【００３８】
ここで、培養液の希釈倍率の下限は菌の検出に用いる電気的方法の感度や、後の選択培養に用いる選択培地の選択性等の条件に応じて適宜設定すればよい。また、培養液の希釈倍率の上限は、培養液中にサルモネラが存在する場合、選択培養を行う際に採取する培養液中に当該サルモネラが確実に含まれるような値とする。
【００３９】
菌の選択培養及び検出に酸素電極法を利用するＤＯＸシステム（DOX-30F又はDOX-60F及びサルモネラ用選択培地；株式会社バイオ・シータ社製）を用いる場合、本ステップにおいて培養液を１×１０３倍以上１×１０４倍以下とすれば好ましい。
【００４０】
ＤＯＸシステムにおいては、本願発明者らの検討結果から、セル（10）に注入される培養液の夾雑菌濃度が１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ以下であれば誤検出を効果的に防ぐことができることが分かっている。そこで、培養液を１×１０３倍以上希釈することで、いずれの菌種の菌数も１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ以下にすることができ、誤検出を効果的に防ぐことが可能となる。
【００４１】
また、培養液の希釈倍率を１×１０４倍以下とすれば、培養液中のサルモネラ濃度のばらつきを考慮してもセル（10）内に注入される１ｍＬの培養液中に確実にサルモネラを入れることができるので、検出感度を向上させることができる。なお、前増菌培養後のサルモネラは健常状態となっているので、セル（10）内に１個でもサルモネラが入れば検出可能となっている。
【００４２】
次に、希釈された培養液をサルモネラ用の液体選択培地と混合し、混合された培養液を３５℃〜３７℃、１２時間〜２０時間程度インキュベートする（ステップＳｔ４）。上述のＤＯＸシステムを用いる場合、希釈された培養液１ｍＬと２倍濃度の液体選択培地１ｍＬとを図１（ａ）に示す電極付きセル（10）内で混合し、測定装置（18）内で培養を行う。一例として、培養温度は３７℃、培養時間は２０時間とする。ただし、培養に要する時間はセル（10）に添加されたサルモネラの菌数が多いほど短くすることができる。
【００４３】
なお、選択培地としては、サルモネラの栄養となる基質、選択剤等を含んでいるものが用いられ、ここではＤＯＸシステム用の専用培地を用いた。
【００４４】
また、上述の選択培養（ステップＳｔ４）を行っている間、測定部（20）が酸素電極法により培養液の溶存酸素濃度を経時的に測定する（ステップＳｔ５）。次いで、ステップＳｔ６で得られた測定結果に基づいて、試料中でのサルモネラの有無を判定部（22）が判定する（ステップＳｔ５）。判定部（22）では、培養液の溶存酸素量が急激に減少し、所定のしきい値（例えば３００ｎＡ）を下回った場合にサルモネラの陽性判定を行う。
【００４５】
また、測定結果は、データベースの一部として記憶部（24）に保存される。なお、ＤＯＸシステムでは、実際には判定部（22）及び記憶部（24）は測定装置（18）の外部に設けられている。
【００４６】
次いで、ステップＳｔ６でサルモネラ陽性と判定された場合には、確定試験を行って試料中にサルモネラが存在するのか否かを確定する（図４に示すステップＳｔ７）。
【００４７】
本願発明者らは、以上の方法を用いて種々の食品（鶏挽肉、ローストビーフ、冷凍フライドチキン、マヨネーズ、マグロ刺身、カットキャベツ、カットメロン、冷凍ピラフ等）に対するサルモネラ検査を行い、各試料の確定試験を含む公定法（図４参照）での検査結果と比較した。その結果、本実施形態に係る検査方法を用いた場合には、高い割合で公定法による結果と一致することが確かめられた。
【００４８】
図４は、本実施形態に係る検査方法と上述の公定法との手順を比較した図である。同図に示すように、本実施形態の検査方法は試料の調整（ステップＳｔ１）及び前増菌培養（ステップＳｔ２）までは公定法と同じであるが、公定法と比べて選択分離培養（ステップＳｔ２０２）を行う必要がない。一方で、本実施形態の検査方法では、公定法に比べて選択増菌培養（Ｓｔ４、Ｓｔ２０１）の前に培養液を希釈するステップが追加されているが、当該ステップに要する時間は選択分離培養に比べて非常に短い。従って、本実施形態の検査方法によれば、公定法よりも１〜２日程度短い期間で検査結果を得ることができる。
【００４９】
その結果、本実施形態に係る検査方法を用いれば、食品のサルモネラによる汚染を迅速に発見でき、食品の販売停止や廃棄などの食中毒対策を早期に取ることができるようになる。また、選択培養（ステップＳｔ４）、溶存酸素量の測定、及びサルモネラの有無の判定を全て測定システムにより行うことができるので、作業者の熟練度に依存することなく安定した検査結果を得ることができる。
【００５０】
さらに、本実施形態の検査方法では、選択培養の前に培養液を１×１０３倍以上に希釈しているので、夾雑菌の存在によって偽陽性となるのが防がれている。このため、本実施形態の検査方法では、図２に示す方法に比べて高精度の菌検出が可能となり、検査結果の信頼性が大幅に高くなっている。
【００５１】
また、選択培養の前に培養液を希釈する際の倍率を１×１０４倍以下としていることにより、食品中に存在するサルモネラを確実に検出することが可能となっている。なお、ステップＳｔ３における培養液の希釈倍率は上述のように１×１０３倍以上１×１０４倍以下であれば好ましい。中でも、液体選択培地に加える培養液のサルモネラ濃度が高い程、判定に必要な培養時間が短くなるので、培養液の希釈倍率は１×１０３倍であることがより好ましい。
【００５２】
なお、以上で説明した培養条件、培養液の希釈倍率その他の条件は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。また、本実施形態の検査方法の検査対象は、サルモネラに限られず、リステリア等であってもよい。特に、試料に含まれる菌数が少ない細菌、あるいは増殖速度が比較的遅い細菌に対して本実施形態の方法で検査を行えば、大きな効果を得ることができる。
【００５３】
また、本実施形態の検査方法では検査対象菌を酸素電極法により検出したが、他の電気的方法によって検出してもよい。
【実施例】
【００５４】
−確認試験１−
本実施形態に係る検査方法によって誤判定を防ぐことができることを確認するため、本願発明者らは、図３に示す手順に沿って生食用馬肉の検査を行った。ただし、試料の調整ステップ（ステップＳｔ１）においては、生食用馬肉２５ｇに１×１０３ｃｆｕレベルの大腸菌を添加したものを検体として用いた。前増菌培養（ステップＳｔ２）は３７℃で２２時間行い、培地としては市販のＢＰＷを２２５ｍＬ用いた。
【００５５】
培養液の希釈ステップ（ステップＳｔ３）では、生理食塩水を用いて培養液をそれぞれ（ａ）１００倍希釈、（ｂ）１６７倍希釈、（ｃ）１０００倍希釈し、それぞれの希釈培養液１ｍＬとサルモネラ用液体選択培地１ｍＬ（株式会社バイオ・シータ社製）とをセルに注入し、測定装置（DOX-60F；株式会社バイオ・シータ社製）にセットした。そして、３７℃で培養しながら、当該測定装置により培養液中の溶存酸素量を測定し、サルモネラの有無の判定を行った。ここで、セルの電極間に流れる電流値が安定する一定時間（例えば６０分）後、３００ｎＡを下回った場合に陽性と判定した。これと同時に、この前増菌培養液を用いて、公定法によっても検査を行い、サルモネラがいないことを確認した。
【００５６】
図５（ａ）〜（ｃ）は、前増菌培養後の培養液を１００倍希釈、１６７倍希釈、１０００倍希釈した場合における、培養液の溶存酸素量の測定結果をそれぞれ示す図である（例数ｎ＝３）。図５（ａ）、（ｂ）に示すように、培養液を１００倍希釈及び１６７倍希釈した場合には実際には存在しないサルモネラについて陽性判定、すなわち誤判定された。これに対し、図５（ｃ）に示すように、前増菌培養後の培養液を１０００倍希釈した場合には、測定装置に検出される電流値は時間が経過してもほぼ変わらず、サルモネラについて陰性判定、すなわち正常判定された。
【００５７】
以上の結果から、酸素電極法を用いてサルモネラを検出する場合、前増菌培養後の培養液を１０００倍希釈することで、実際にはサルモネラ陰性の試料を陽性と誤判定するのを防ぐことができることが確かめられた。
【００５８】
−確認試験２−
次に、夾雑菌の存在下で、本実施形態に係る検査方法によってサルモネラが検出できることを確認するため、本願発明者らは、図３に示す手順に沿って生食用馬肉の検査を行った。使用する試薬、培養液、測定装置、培養条件、判定基準等は確認試験１と同じとした。ただし、試料の調整ステップ（ステップＳｔ１）において、無菌状態にした生食用馬肉２５ｇにそれぞれ（ａ）１×１０３ｃｆｕレベルの大腸菌と１×１０１ｃｆｕレベルの健常状態のサルモネラとを添加した場合と、（ｂ）１×１０３ｃｆｕレベルの大腸菌と１×１０１ｃｆｕレベルの熱損傷状態のサルモネラとを添加した場合とについて試験を行った。
【００５９】
図６（ａ）、（ｂ）は、大腸菌と健常状態のサルモネラとを添加した場合、及び大腸菌と熱損傷状態のサルモネラとを添加した場合の培養液の溶存酸素量の測定結果をそれぞれ示す図である（例数ｎ＝３）。なお、両方の場合とも前増菌培養後の培養液を１０００倍希釈した。
【００６０】
図６（ａ）、（ｂ）に示す結果により、試料に夾雑菌とサルモネラが混在していても、前増菌培養後の培養液を１０００倍希釈することで、サルモネラの検出を正常に行えることが確認された。また、健常菌の検出に比べて熱損傷菌の検出には時間がかかるものの、いずれの状態のサルモネラが試料に存在する場合であっても、正常に検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上説明したように、本発明に係る菌の検査方法は、食品等の安全性の向上に有用である。
【符号の説明】
【００６２】
１０      セル
１２      対極
１４      作用極
１６      参照極
１８      測定装置
２０      測定部
２２      判定部
２４      記憶部
【図１】
0006040558.tif 000002
【図２】
0006040558.tif 000003
【図３】
0006040558.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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