(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫化有効量の不活化エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）を含むワクチン組成物であって、該ワクチンが、親油性アジュバントを含む非極性溶媒を含み、該エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）が、ホルマリンによって不活化されており、該不活化エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）が、前記ワクチンが一次ワクチンとして投与される場合、患者において保護免疫応答を誘発するが、最小限の体液性応答しか誘発しない、前記組成物。
【請求項２】
前記エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）が、イヌ細胞中において増殖している、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記イヌ細胞は、イヌ骨髄細胞である、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記イヌ細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５を有する、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記親油性アジュバントは、トレハロース６，６’−ジマイコレートを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記非極性溶媒はクロロホルム溶媒系である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記クロロホルム溶媒系は、約６５〜９５％（容量／容量）のクロロホルムを含む、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記クロロホルム溶媒系は、約５．０〜３０％（容量／容量）のメタノールをさらに含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記クロロホルム溶媒系は、容量／容量で、約９０％のクロロホルム：１０％のメタノール：１．０％の水をそれぞれ含む、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
（ａ）ホルマリンで不活化したエーリキア・カニス（Ehrlichia canis）に感染した細胞であって、該エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５を有する細胞中において増殖したものである細胞、および
（ｂ）９０：１０：１のクロロホルム：メタノール：水中に溶解したトレハロース６，６’−ジマイコレートを含むアジュバント
を含む、ワクチン組成物。
【請求項１１】
非ヒト患者にエーリキア・カニス（Ehrlichia canis）に対しワクチン接種する方法であって、前記非ヒト患者に請求項１に記載のワクチン組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
非ヒト患者にエーリキア・カニス（Ehrlichia canis）に対しワクチン接種する方法であって、該方法が、前記非ヒト患者に請求項１に記載のワクチン組成物の初回投与を行うこと、及び、該ワクチン組成物の初回投与の約２１日後に、該ワクチン組成物の第２回投与を行うことを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のワクチン組成物を産生する手順であって、
（ａ）イヌ細胞中においてエーリキア・カニス（Ehrlichia canis）を増殖させること、
（ｂ）該エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）をホルマリンで不活化すること、
（ｃ）該不活化エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）を濃縮すること、及び
（ｄ）該不活化エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）を親油性アジュバントを含む非極性溶媒と混合することを含む、手順。
【請求項１４】
前記イヌ細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５を有する、請求項１３に記載の手順。
【請求項１５】
前記親油性アジュバントは、トレハロース６，６’−ジマイコレートを含む、請求項１４に記載の手順。
【請求項１６】
非ヒト患者に、エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）に対してワクチン接種する方法であって、該非ヒト患者に請求項１０に記載のワクチン組成物を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許法第３５章１１９条（ｅ）の下に、米国仮特許出願第６１／３６０，９６９号（２０１０年７月２日出願）の優先権を主張し、その内容は本明細書によってその全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、細菌エーリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）によって起こるイヌ単球エーリキア症（ＣＭＥ）に対する免疫原性組成物およびワクチンならびに関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
イヌ単球エーリキア症（ＣＭＥ）は、細菌エーリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）（Ｅ．カニス）によって起こる、イヌにおける重度のリケッチア症である。Ｅ．カニスは、クリイロコイタマダニ（リピセファラス・サンギナス（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ））を介してイヌからイヌへと蔓延する。感染後２〜３週間の培養期間の後に、イヌは、疾患の急性期、無症候期および慢性期を通して進行し得る。急性期において、臨床徴候は、血小板減少、白血球減少、貧血、嗜眠および体重減少の軽度から重度に亘る。２ヶ月後に、ほとんどのイヌは、何ヶ月ももしくは何年も続く無症候期に入り、この間、低い血液値は持続し得るが、臨床徴候は最小限である。僅かな割合の感染したイヌは、熱帯イヌ汎血球減少症（ＴＣＰ）として知られる疾患の重症形態を発症し得る。持続的な骨髄抑制、出血、神経障害、抹消性浮腫および重度の体重減少が、ＴＣＰの特徴である。低血圧ショックを発症して、死に至る場合がある。Ｅ．カニスに対する免疫原性組成物の報告（例えば、Ｍａｈａｎら，Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ  Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．７２（２）：１１９−１２８（２００５）；米国特許出願公開第２００６／０１８８５２４号明細書を参照されたい）にもかかわらず、現在、Ｅ．カニス対する効果的なワクチンが示されていない。したがって、ＣＭＥおよび／またはＴＣＰに対して保護するワクチンが必要とされている。
【０００４】
本明細書中の任意の参考文献の引用は、本出願に対する「先行技術」として利用できる参考文献であることを認めるものと解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１８８５２４号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｈａｎら，Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ  Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．７２（２）：１１９−１２８（２００５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、エーリキア症の病因に対する保護的免疫応答を促進するワクチンおよび／または免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、ワクチン組成物および／または免疫原性組成物は、一次ワクチンとして患者に投与された場合に、患者において、存在する場合は最小限の体液性免疫応答しか誘発しない薬剤を含む。詳細な実施形態において、この免疫原性組成物は、一次ワクチンとして患者に投与された場合に、患者において、存在する場合は最小限の体液性免疫応答しか誘発しないが、なお保護的免疫応答を誘発する薬剤を含む。このような実施形態は、イヌ骨髄細胞株において増殖した不活化Ｅ．カニスを含むワクチンである。この型の詳細な実施形態において、このワクチンは、さらにアジュバントを含み得る。この型の特定の実施形態において、このアジュバントは、コードファクターである。より詳細な実施形態において、コードファクターアジュバントは、クロロホルム溶媒系中に溶解される。
【０００８】
１つの局面において、本発明は、患者への初回投与（例えば、一次ワクチンとして）の際に、抗原に対する有意な抗体の産生を誘発しない、Ｅ．カニス由来の抗原を含むワクチン組成物および／または免疫原性組成物を提供する。したがって、本発明の特定の実施形態は、免疫化有効量のＥ．カニス由来抗原を含む免疫原性組成物および／またはワクチン組成物を含み、ここで、この組成物の患者への初回投与／一次ワクチンは、最小限の体液性応答しか誘発しない。詳細な実施形態において、本発明は、初回投与／一次ワクチンの後で測定可能な体液性応答を誘発せず、患者における保護的免疫応答を誘発する、免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。特定の実施形態において、一次ワクチン接種／初回投与における本発明のワクチンおよび／または免疫原性組成物は、細胞性免疫応答を誘発し、最小限のおよび／または測定不能な（例えば、検出不能な）体液性応答しか誘発しない。
【０００９】
したがって、関連する局面において、本発明は、免疫化有効量のＥ．カニス由来抗原を含むワクチン組成物を提供する。この型の特定の実施形態において、このワクチンが一次ワクチンとして投与される場合、この抗原は、患者において保護免疫応答を誘発するが、最小限の体液性応答しか誘発しない。本発明のワクチンおよび／または免疫原性組成物は、本明細書中で開示されるように、細胞において増殖したおよび／または継代したＥ．カニスから産生された抗原を含み得る。特定の実施形態において、このＥ．カニスは、イヌ細胞株において増殖するかおよび／または継代する。より詳細な実施形態において、この細胞株は、イヌ骨髄細胞株であってもよい。より詳細な実施形態において、この細胞は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５を有するか、ならびに／またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５を有する細胞を特定する特徴を１つ以上、および／もしくは全て有するものである。詳細な実施形態において、Ｅ．カニス抗原は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４６を有する細胞関連Ｅ．カニスであるか、ならびに／またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４６を有する細胞関連Ｅ．カニスを特定する特徴を１つ以上、および／もしくは全て有するものである。
【００１０】
本発明はさらに、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４６を有する細胞関連Ｅ．カニスを提供する。本発明はまた、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４６を有する細胞関連Ｅ．カニスを特定する特徴を１つ以上、および／もしくは全て有する細胞関連Ｅ．カニスをも提供する。さらに、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５を有する細胞を提供する。本発明はさらに、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５を有する細胞を特定する特徴を１つ以上、および／もしくは全て有する細胞を提供する。
【００１１】
さらに、本発明のワクチンおよび／または免疫原性組成物のＥ．カニス抗原は、不活化されてもよい。特定の実施形態において、不活化Ｅ．カニス抗原は、ホルマリンによって不活化される。
【００１２】
別の局面において、本発明は、アジュバントを含むワクチンおよび／または免疫原性組成物を提供する。この型の特定の実施形態において、このアジュバントは、親油性アジュバントである。特定の実施形態において、この親油性アジュバントは、非極性溶媒中である。詳細な実施形態において、本発明の免疫原性組成物および／またはワクチンは、疎水性アジュバントと合わせられてワクチンおよび／または免疫原性組成物中に含まれる極性溶媒と混和できるようにされ得る抗原を含む。より詳細な実施形態において、このアジュバントは、トレハロース６，６’−ジマイコレートのようなコードファクターを含む。詳細な実施形態において、トレハロース６，６’−ジマイコレートは、非極性溶媒中である。より詳細な実施形態において、このアジュバントは、クロロホルム溶媒系中に溶解したトレハロース６，６’−ジマイコレートを含む。詳細な実施形態において、クロロホルム溶媒系は、約６５〜９５％（容量／容量）のクロロホルムを含む。より詳細な実施形態において、クロロホルム溶媒系は、約８０〜９５％（容量／容量）のクロロホルムを含む。詳細な実施形態において、クロロホルム溶媒系は、約５．０〜３０％（容量／容量）のメタノールを含む。より詳細な実施形態において、クロロホルム溶媒系は、約７．５〜１５％（容量／容量）のメタノールを含む。詳細な実施形態において、クロロホルム溶媒系は、約０．５〜５．０％（容量／容量）の水を含む。より詳細な実施形態において、クロロホルム溶媒系は、約０．７５〜２．５％（容量／容量）の水を含む。特定の実施形態において、クロロホルム溶媒系は、約９０％クロロホルム：１０％メタノール：１．０％水（容量対容量）の水を、それぞれ含む。詳細な実施形態において、このワクチンおよび／または免疫原性組成物は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５を有する寄託細胞において増殖したホルマリン不活化細胞関連Ｅ．カニスならびに９０：１０：１クロロホルム：メタノール：水中に溶解したトレハロース６，６’−ジマイコレートを含むアジュバントを、含む。アジュバントとして使用されるクロロホルム溶媒系に溶解されたトレハロース６，６’−ジマイコレートのようなコードファクターを含む組成物もまた、本発明の一部である。
【００１３】
さらに、本発明は、Ｅ．カニスの増殖に特に適した細胞および／または細胞株において増殖した細菌Ｅ．カニスを提供する。本発明はさらに、本発明のワクチンおよび／または免疫原性組成物のための抗原を産生するための手順を提供する。したがって、本発明は、Ｅ．カニス抗原を産生するための手順を提供する。詳細な実施形態において、Ｅ．カニスは、マクロファージにおいて増殖する。特定の実施形態において、Ｅ．カニス細菌は、マクロファージ様細胞株において増殖する。特定の実施形態において、Ｅ．カニスは、イヌ骨髄腫（ＤＢＭ）細胞において増殖し、細胞関連Ｅ．カニス抗原を産生する。詳細な実施形態において、Ｅ．カニス細菌は、ＤＢＭ細胞株において増殖する。詳細な実施形態において、このＤＢＭ細胞株は、ＤＢＭ（ＷＣＳ）ＭＣＳ＋１２、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５である。詳細な実施形態において、Ｅ．カニスは、細胞関連の、ＷＳ  ＭＳ＋３，１９５１７−００１、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ  １０５４６である。代替の実施形態において、Ｅ．カニスは、ＤＨ−８２細胞株において増殖する。
【００１４】
本発明のＥ．カニス抗原は、不活化Ｅ．カニスであってもよい。詳細な実施形態において、Ｅ．カニス抗原は、バクテリンである。特定の実施形態において、不活化Ｅ．カニス抗原は、細胞関連である。
【００１５】
本発明はまた、患者をＥ．カニスに対して免疫化する方法を提供する。このような方法は、患者に本発明のワクチン組成物および／または免疫原性組成物を投与することを含み得る。特定の実施形態は、本発明にしたがうワクチンおよび／または免疫原性組成物を、患者に皮内投与することを含む。別のこのような方法は、本発明にしたがうワクチンおよび／または免疫原性組成物を、患者に皮下投与することを含む。なお別のこのような方法は、本発明にしたがうワクチンおよび／または免疫原性組成物を、患者に経口投与することを含む。この型の詳細な実施形態において、動物患者は、イヌである。別の実施形態において、動物患者は、ネコ（例えば、飼い猫）である。詳細な実施形態において、ワクチン組成物および／または免疫原性組成物の第２回投薬は、ブースターとして提供される。特定の実施形態において、このブースターは、このワクチン組成物の初回投薬の２１日後に投与される。
【００１６】
本発明はさらに、本発明のワクチン組成物および／または免疫原性組成物を製造する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書中で記載されるＥ．カニス抗原を産生するための手順を提供する。ワクチン組成物および／または免疫原性組成物は、本発明の抗原を獣医学的に適した賦形剤と混合することによって調製される。この型の特定の実施形態において、抗原は、細胞関連Ｅ．カニスバクテリンである。詳細な実施形態において、獣医学的に適した賦形剤は、クロロホルム溶媒系中に溶解したコードファクターアジュバントである。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の局面は、図面、詳細な説明および実施例を参照することによってより理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】対照動物（三角）およびワクチン接種動物（四角）の、時間に亘るチャレンジ後平均白血球数の図示である。太線は、メルクマニュアルにしたがい正常とみなされる白血球数の最小レベルを表す。
【図２】対照動物（三角）およびワクチン接種動物（四角）の、時間に亘るチャレンジ後平均赤血球数の図示である。太線は、メルクマニュアルにしたがい正常とみなされる赤血球数の最小レベルを表す。
【図３】対照動物（三角）およびワクチン接種動物（四角）の、時間に亘るチャレンジ後平均ヘモグロビン値の図示である。太線は、メルクマニュアルにしたがい正常とみなされるヘモグロビン数の最小レベルを表す。
【図４】対照動物（三角）およびワクチン接種動物（四角）の、時間に亘るチャレンジ後平均ヘマトクリット値の図示である。太線は、メルクマニュアルにしたがい正常とみなされるヘマトクリット数の最小レベルを表す。
【図５】対照動物（三角）およびワクチン接種動物（四角）の、時間に亘るチャレンジ後平均血小板数の図示である。太線は、メルクマニュアルにしたがい正常とみなされる血小板数の最小レベルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、Ｅ．カニスの病原性種によるチャレンジ後の血小板減少、白血球減少、貧血および体重減少の発生率を下げることができる免疫原性組成物およびワクチンを提供する。本結果は、感染したイヌに関する以前の報告（このイヌは、抗生物質処置によって治癒しているがその後の疾患に罹りやすかった。例えば、Ｂｒｅｉｔｓｃｈｗｅｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４２（２）３６２−３６８（１９９８）を参照されたい）と矛盾している。これらの以前の報告は、生体への曝露後に、保護免疫が発生しないことを示唆する。これとは真逆に、本発明は、本発明の免疫原性組成物および／またはワクチン組成物を患者に投与することによって、患者においてイヌ単球エーリキア症（ＣＭＥ）および／または熱帯イヌ汎血球減少症（ＴＣＰ）を緩和および／または予防するための方法を提供する。したがって、１つの局面において、本発明は、Ｅ．カニスに対する有効なワクチンを提供する。
【００２０】
本明細書中で開示されるように、Ｅ．カニスチャレンジモデルの発生の間、イヌは、Ｅ．カニスに対する体液性抗体を迅速に発生させる。抗Ｅ．カニス抗体の出現に相関することは、血小板数の急激な減少すなわち血小板減少、および幾つかの他の臨床徴候の開始である。しかし、イヌにおいて強い体液性応答を誘発するワクチンは、疾患の臨床徴候からイヌを保護しない。実際、Ｅ．カニスに対する強い抗体応答を産生するワクチン接種したイヌは、チャレンジ後、ワクチン接種しなかった対照よりも悪い臨床結果を有し得る。いかなる特定の理論にも拘束されないが、本明細書中に開示される結果は、Ｅ．カニスに対する抗体を用いてオプソニン作用のプロセスを通して細胞の内部へのアクセスを得るＥ．カニスと矛盾しないと考えられる。
【００２１】
本発明はさらに、免疫原性組成物および／またはワクチン自体のために抗原を産生するための手順を提供する。詳細な実施形態において、このプロセスは、特定の細胞株においてＥ．カニスを増殖させて抗原を産生することを含む。幾つかの実施形態において、この抗原は、獣医学的に適した賦形剤と混合される。より詳細な実施形態において、本発明は、イヌ骨髄細胞株において増殖した不活化Ｅ．カニスを含む組成物を含む。本発明の免疫原性組成物および／またはワクチンは、さらにアジュバントを含み得る。
【００２２】
Ｅ．カニスがどの細胞に感染するかを識別するための選別メカニズムはあまり分かっていないが、感染に好適な細胞は、共通して、主要組織適合因子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ抗原レセプターを発現する。Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，９６：２３９−２４３（２００３）］は、Ｅ．カニスが、感染する細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩレセプターの発現を下方制御するためのメカニズム（免疫サーベイランスを避けるためのメカニズムであり得る）を持っていることを実証している。ダニの種由来の細胞株が哺乳動物ＭＨＣクラスＩＩレセプターを発現しないことが明らかである一方で、Ｓｉｎｇｕ  ｅｔ  ａｌ．［Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８（９），１４７５−１４８７（２００６）］は、Ｅ．カニスが、脊椎動物宿主に感染したかまたは無脊椎動物に感染したかに依存して表面タンパク質発現を変えることを実証している。したがって、別の局面において、本発明は、Ｅ．カニスの増殖を受け入れると同時に、ワクチン用途に最適化されたＥ．カニス抗原を産生する細胞および／または細胞株を提供する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「患者」は、Ｅ．カニスに感染し得る任意の種をいう。特定の実施形態において、患者は、非ヒト動物患者である。詳細な実施形態において、患者は、イヌまたはネコのいずれかである。特定の実施形態において、この動物患者は、イヌである。他の実施形態において、この動物患者は、ネコである。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「イヌ」は、他に示されない限り、全ての飼い犬、ハイイロオオカミ族（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｙ）またはイヌ族（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｙ）を含む。
【００２５】
「免疫化有効量」は、本明細書中で使用される場合、ワクチンを産生するために使用されるＥ．カニスの株に依存して変動し得、保護免疫応答を惹起するために充分な任意の量であり得る。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「保護免疫応答」は、患者における、感染の１種以上の徴候に対する保護をもたらす免疫応答であり得、「保護免疫応答」は、何らかの感染の徴候からの完全な保護を求めるものではない。むしろ、「保護免疫応答」は、チャレンジ後、感染を裏付ける症候が少なくとも軽減するために充分であるか、および／またはその症候をもたらす根底にある細胞性、生理学的もしくは生化学的な要因またはメカニズムが軽減するかおよび／または消失するために充分な、免疫応答であり得る。「軽減する」とは、この文脈で使用される場合、感染の生理学的状態だけではなく感染の分子状態も含めて、感染の状態に関する意味を持つ。本発明のワクチンは、保護免疫応答を提供することが企図される。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「最小限の体液性応答しか誘発しない」とは、患者（例えば、イヌ）への一次ワクチン接種におけるＥ．カニスを含むワクチン組成物の投与が、ワクチン組成物への一次曝露の２１日後に患者から得た試験血清中に、Ｅ．カニスに対する抗体が検出されない（この検出が、以下の手順で実施されるとき：１：４０希釈した試験血清を固定化Ｅ．カニスに曝露し、充分に洗浄して未結合の物質を除去し、患者の種に適した蛍光標識抗ＩｇＧ抗体を添加し、充分に洗浄して未結合の物質を除去し、Ｅ．カニスに特異的な抗体を介して固定化Ｅ．カニスに結合した蛍光標識抗ＩｇＧ抗体に起因する蛍光を視覚的に調べる）ことを意味する。詳細な実施形態において、患者にこのワクチンの事後単回ブースターワクチン接種を投与するとしてもなお、Ｅ．カニスに対する有意な体液性応答を誘発せず、上記の一次ワクチンについて実施した方法で検出した場合に、最終的に検出可能であったとしても、ブースターワクチン組成物への曝露後の動物患者から得た試験血清中のＥ．カニスに対する抗体を検出するために、試験血清を１：１６０以下に希釈することが必要である。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「安定的に感染した」細胞株とは、細胞培養の少なくとも１０代の継代後に感染し続けている細胞株をいう。
【００２９】
抗原
本発明のＥ．カニス抗原は、Ｅ．カニスの幾つもの供給源または株から単離され得る。このようなＥ．カニスの株の例としては、Ｅｂｏｎｙ、Ｂｒｏａｄｆｏｏｔ、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｉｓｒａｅｌ  ６１１、Ｋｏｇａｓｈｉｍａ  １、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ、Ｏｋｌａｈｏｍａ、Ｖｅｎｚｕｅｌａ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＣＳＵ）株ＪａｋｅならびにＮＣＳＵ単離物Ｄｅｍｏｎ，Ｄ  ＪおよびＦｕｚｚｙが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、この抗原は、Ｅ．カニスバクテリンであり得る。さらなる実施形態において、この抗原は、利用可能な任意の好適な方法によって不活化されているＥ．カニス細菌から単離され得るか、またはこれに由来し得る。このような方法の例としては、加熱、ホルムアルデヒド、ホルマリン、ｂｉ−エチレンアミン、放射線照射およびβ−プロピオラクトン処理が挙げられるが、これらに限定されない。詳細な実施形態において、Ｅ．カニス細菌は、ホルマリン処理によって不活化され得る。
【００３０】
詳細な実施形態において、Ｅ．カニス抗原は、患者に提示された場合、患者に外来物質として認識されない（すなわち、患者が、この１種以上の抗原に対して体液性応答を惹起しないか、または最小限の体液性応答しか惹起しない）１種以上の抗原を含み得る。幾つかの実施形態において、１種以上のＥ．カニス抗原は、この１種以上のＥ．カニス抗原に対する抗体の産生を誘発しないか、あるいは、最小限の抗体産生しか誘発しない。さらに、このようなＥ．カニス抗原は、１種以上のＥ．カニス抗原に対して保護免疫応答を誘発する。本発明は、この型のエーリキア症に対してイヌをワクチン接種するための免疫原性組成物を含み、この組成物は、イヌにおいて免疫応答をもたらす薬剤を含み、イヌにおいて体液性免疫応答を僅かに誘発するかまたは誘発しないが、イヌにおいて保護免疫応答を誘発する薬剤を、薬剤として用いる。詳細な実施形態において、この保護免疫応答は、細胞媒介型免疫応答の少なくとも一部に起因する。
【００３１】
細胞
本発明のＥ．カニス細菌は、適切な細胞および／または細胞株において増殖し得る。したがって、Ｅ．カニス由来の抗原は、細胞株において増殖したかまたは伝播したＥ．カニス細菌から産生され得る。このような細胞および細胞株の例としては、以下に示すような、初代細胞（例えば、マクロファージ）および／または細胞株／継代細胞株が挙げられる。
初代細胞株：
イヌ血液マクロファージ、例えば、［Ｎｙｉｎｄｏ，ｅｔ．ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３２：１６５１−１６５８（１９７１）］を参照されたい。
【００３２】
腹膜マクロファージ、例えば、［Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３８：１８１５−１８１９（１９７７）］を参照されたい。
継代細胞株：
ヒト／イヌハイブリッド細胞株、例えば、［Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４１：２３４−２４０（１９８０）］を参照されたい。
【００３３】
イヌマクロファージ細胞株（ＤＨ−８２）、例えば、［Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６３：５６４−５６７（１９９１）］を参照されたい。
【００３４】
マウス腹膜マクロファージ；マウス／イヌハイブリッド細胞株（ＭＤＨ−ＳＰ）、例えば、［Ｈｏｌｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｒｉｓｔｉｃ，Ａｂｓｔｒ  ５５，ｐ．８９，ｉｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ａｎｄ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＶｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ  ａｎｄ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｐｉｅｓｔａｎｙ  Ｓｐａ，Ｃｚｅｃｈ  ａｎｄ  Ｓｌｏｖａｋ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃｓ］を参照されたい。
【００３５】
マウスマクロファージ細胞株、例えば、［Ｋｅｙｓａｒｙ，ｅｔ．Ａｌ．，Ｊ  ＶＥｔ  Ｄｉａｇｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １３：５２１−５２３（２００１）］を参照されたい。
【００３６】
イヌ骨髄細胞株（ＤＢＭ細胞）、例えば、［Ｇａｕｎｔ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．３４（６）：１４２９−１４３２（１９９６）］を参照されたい。
【００３７】
ネコ胚性繊維芽細胞株（ＦＥＦ）例えば、［Ｂａｔｔｌｅｓ  ｅｔ．ａｌ．，国際公開第２００９／０３６１７７号パンフレット］を参照されたい。
【００３８】
ダニ細胞株（ＩＤＥ８およびＩＳＥ６）、例えば、［Ｍｕｎｄｅｒｌｏｈ，ｅｔ．ａｌ．米国特許第５，８６９，３３５号明細書］を参照されたい。
【００３９】
本発明の１つの局面において、細胞株は、マクロファージ様細胞株であり、イヌマクロファージによって発現される表面レセプターと類似の表面レセプターを発現する。関連の実施形態において、細胞株は、マクロファージ細胞株である。この型の詳細な実施形態において、使用される細胞株は、ＤＨ−８２細胞株であり、これは、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１０３８９を有する。
【００４０】
本発明は、単球様またはマクロファージ様の哺乳動物細胞株において増殖しているＥ．カニスを含む。特定の場合、これらの細胞株は、不死化されているので、ワクチンの製造のための連続的且つ信頼性のある増殖基質を提供する。不死化細胞は、新生物性先祖細胞から作製され得、例えば、Ｗｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるＤＨ−８２細胞株である［Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｂｉｏｌ  ２４：２２３−２２８，（１９８８）］。細胞は、ウイルス遺伝子の使用によって不死化され得る。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原が、不死化細胞を作製するための非常に信頼性のある方法であることが示されており、ＳＶ４０形質転換されたヒト細胞とハイブリダイズされたイヌ腹膜マクロファージ体細胞ハイブリッドが、Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によって、連続的様式でＥ．カニスを増殖させるために使用された［Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ  ４１（２）：２３４−４０，（１９８０）］。広範な薬剤が、細胞を不死化させるために使用され得、これらとしては、種々のウイルス、Ｘ線、有機溶媒、金属化合物および核酸が挙げられる。これらの方法は、広範囲に亘ってＲｈｉｍによって評価されている［Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｓｃｉ．９１９：１６−２５（２０００）］。本発明の特定の実施形態において、Ｅ．カニスは、このような細胞株において増殖し、次いで、不活化されて、Ｅ．カニスバクテリン抗原を形成する。
【００４１】
特定の実施形態において、細胞株は、イヌ骨髄（ＤＢＭ）細胞株である。詳細な実施形態において、ＤＢＭ細胞株は、Ｇａｕｎｔらによって記載されたものである［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３４（６）：１４２９−１４３２，（１９９６）］。詳細な実施形態において、ＤＢＭ細胞株は、寄託株ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４５である。特定の実施形態において、細胞株は、Ｅ．カニスに安定的に感染しているＤＢＭ細胞株である。この型の詳細な実施形態において、細胞関連Ｅ．カニスは、寄託されていて、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４６を有する。代替の実施形態において、細胞株は、昆虫細胞株である。この型の詳細な実施形態において、昆虫細胞株は、ダニ細胞株である。１つの特定の実施形態において、昆虫細胞は、ＩＤＥ８ダニ細胞株であり、クロアシマダニ（Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）から単離され、これは、ＡＴＣＣに寄託されていて、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１１９７３を有する。
【００４２】
Ｅ．カニスの伝搬
Ｅ．カニスに感染した培養細胞は、フラスコ内で増殖し、その後、免疫原性組成物および／またはワクチンを製造するために必要な、より大きな容量の材料を入れるための、より大きなフラスコに移され得る。あるいは、感染した培養細胞は、その後フラスコからローラーボトル、スピナーフラスコ、セルキューブ、バイオリアクターまたは免疫原性組成物および／またはワクチンを混ぜるために必要な好適な量の材料を製造するために培養細胞を大容量で増殖させ得る任意の装置に移され得る。感染した培養細胞は、好適な溶媒中で凍結させ、後の培養細胞の感染のために使用され得る。
【００４３】
細胞は、増殖フラスコもしくは装置に接着し得るかもしくは付着し得る（マイクロキャリアへの付着を含む）か、または、代わりに、浮遊液中に浮遊し得る。付着した細胞をはがすための方法としては、機械的細胞スクレイパーを用いてフラスコから手で掻き取ること、またはトリプシン溶液で処理してフラスコからはがした後に未使用のトリプシンをタンパク質溶液で中性化することが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、細胞は、遠心分離されて濃縮され、好適な凍結培地中に再懸濁され得る。凍結培地としては、１０〜９０％ウシ胎仔血清と１〜２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とを含む培地が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な凍結保存剤が、使用され得、これは、別の細胞株に対してより好適であり得、解凍および培養の再開の際に高レベルの生存率をもたらす。
【００４４】
感染培養を開始するために、非感染細胞が冷凍庫から取り出されて、好適な培地中で培養され得る。例えば、１×１０５のＤＢＭ細胞を含む１ｍＬバイアルを、迅速に解凍し、ＤＢＭ細胞の増殖のために好適な培地を含むＴ−７５組織培養フラスコ（表面積７５ｃｍ２）中に入れる。１つの詳細な実施形態において、この培地は、フィッシャー完全増殖培地である。例えば、ＤＢＭ細胞のための１リットルのフィッシャー完全増殖培地は、２００ｍＬのウマ血清を７７０ｍＬのフィッシャー培地に添加することによって作製される。この培地は、１０ｍＬの２ｍｇ／ｍＬヒドロコルチゾン溶液、１０ｍＬの２００ｍＭグルタミン溶液、および１０ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ溶液の添加によって完成する。
【００４５】
一旦、ＤＢＭ培養物が好適なコンフルーエンスレベル（１０〜９０％）に達すると、この培養物は、感染の準備が整っている。１バイアルの感染培養物は、冷蔵庫から取り出され、迅速に解凍されて、増殖培養物に入れられる。この培養物は、キャップされたフラスコまたはベントキャップフラスコ中で、ＣＯ２供給ありまたはなしで、３６プラスマイナス２℃で増殖する。この培養物は、当業者に周知の方法にしたがって、必要なだけ新鮮な培地中に細胞を継代することによって維持される。数週間後、この培養物を、抗Ｅ．カニス抗体を用いた間接蛍光顕微鏡検査法または他の好適な方法によって、感染のレベルについてチェックしてもよい。培養物は、９０％以上の感染のレベルの達し得る。より高い感染レベルであるほど、培養物の容量あたりより高い抗原物質の収量を生じるため、より望ましい。感染培養物は、培養物のより大きなフラスコ、ローラーボトルまたは他の好適な培養容器への移動によって、より大きな容量の培養物に移され得る。
【００４６】
Ｅ．カニスによる細胞培養物の感染は、幾つかの方法によって検出され得る。これらの方法としては、色素（例えば、ギムザ染色、Ｃａｍｃｏ  Ｄｉｆｑｕｉｃｋ染色またはアクリジンオレンジ染色）で染色した細胞の顕微鏡検査分析法が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Ｅ．カニスに特異的な抗体は、直接的にまたは間接的にのいずれかで、蛍光マーカーによって標識されて、特定の蛍光マーカーについての好適な波長において蛍光顕微鏡によって見られ得る。他の技術が、培養物の感染のレベルを決定するために使用され得、これらとしては、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）またはＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
未感染細胞は、培養物中で特定のレベルの感染を維持するために必要に応じて培養物に添加され得る。感染培養物の好適な容量が達成されると、この培養物は、種々の方法によって不活化され得、これらの方法としては、加熱または化学的方法が挙げられるが、これらに限定されない。不活化の前に、培養物は、いかなる量の不活化後培養物が混合物に添加されるかを決定する方法として、力価測定されて、培養物中の感染粒子の量を決定され得る。感染細胞の力価測定のための方法は、以下の実施例において提供される。特定の実施形態において、ホルマリンが、最終濃度０．０５％まで培養物に添加されて、培養物は、３６プラスマイナス２℃において３日間混合される。他のこのような使用され得る不活化剤としては、エチレンイミン（ＥＩ、ＢＥＩ）、βプロピオラクトンおよびフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。デオキシサイクリンなどの抗生物質またはＥ．カニスが感受性である任意の他の抗生物質もまた、培養物を不活化するために使用され得る。
【００４８】
培養物は、数多くの方法によって、試験されて、生存率を決定され得る。このような方法としては、細胞培養物における逆力価測定、非浸透性色素耐性についての膜完全性、ならびにイヌへの注射および感染の代表的な症候についてのモニタリングが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
一旦不活化されると、この培養物は、多くの方法によって濃縮され得る。例えば、生育不能Ｅ．カニスの濃縮は、遠心分離、限外濾過または蒸散によってなされ得る。１つの詳細な実施形態において、Ｅ．カニスに感染したＤＢＭ細胞は、不活化され、次いで全細胞のペレットに１４００×ｇで１５分間遠心分離される。上清は捨てられて、ペレットは、フィッシャー培地中に血清なしで再懸濁される。ゲンタマイシンまたは類似の保存剤が、不活化後に、夾雑物問題を避けるために添加されてもよい。この培養物は、血清なしでフィッシャー培地中に元の容量の１０分の１に再懸濁されることによって不活化培養物を濃縮し、扱いやすくされる。不活化濃縮物中で入手可能な抗原の量は、クロマトグラフィー、分光法または種々の型の特異的イムノアッセイを含む多くの方法によって決定され得る。大量の抗原は、希釈剤およびアジュバントと合わせられて、許容可能なワクチンを作製し得る。
【００５０】
免疫原性組成物およびワクチン
上で示されるように、本発明の抗原（例えば、Ｅ．カニスバクテリン）を含む免疫原性組成物および／またはワクチンは、さらに、１種以上の薬学的に許容され得るアジュバントを含み得るが、かならずしも必要であるわけではない。薬学的に許容され得るアジュバントの例は、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）およびＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１０ｔｈｅｄ．２００１）を参照されたい。詳細な実施形態において、アジュバントは、細胞媒介型免疫応答を刺激するが、体液性免疫応答を刺激しないものであり得る。
【００５１】
さらにアジュバントを含む本発明の免疫原性組成物および／またはワクチンは、一般的に水には溶けない１種以上の要素を含み得る。詳細な実施形態において、アジュバントは、非極性溶媒中に溶解した非極性溶質である。非極性溶媒の例としては、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホルムおよび酢酸エチルが挙げられるが、これらに限定されない。このような１つの実施形態において、この溶媒は、クロロホルム溶媒系である。クロロホルムは、不燃性であるため、ある場合において特に好ましいことがあり、獣医学生物学的製剤を製造するためにより好適である。本明細書中で例示されるアジュバントは、クロロホルム溶媒系中のトレハロース６，６’−ジマイコレートである。
【００５２】
非極性溶媒は、代表的に水に溶けず、したがって、比較的低い比誘電率を有するが良好な水溶性を有する極性溶媒の使用が、溶媒系において使用され得、水溶液中へのアジュバント混合物の可溶性を増大する。極性溶媒の例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、非極性アジュバントは、コードファクター（例えば、トレハロース６，６’−ジマイコレート）である。他の非極性アジュバントは、細胞媒介型免疫を刺激するために有用であり得、これらとしては、精製サポニンの疎水性画分、細菌リポペプチド（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）およびモノホスホリルリピドＡが挙げられるが、これらに限定されない。詳細な実施形態において、コードファクターは、クロロホルム溶媒系に溶解される。詳細な実施形態において、クロロホルム溶媒系は、約６５〜９５％（容量／容量）のクロロホルムを含む。
【００５３】
したがって、クロロホルム溶媒系の特定の実施形態としては、クロロホルムおよびメタノールを含む溶媒系が挙げられるが、これらに限定されない。非限定の例において、クロロホルム溶媒系は、約７０％〜９５％のクロロホルムおよび／または約５％〜約３０％のメタノール（容量／容量）を含み得る。この型の特定の実施形態において、クロロホルム溶媒系は、０．５％〜５．０％の水（容量／容量）をさらに含む。１つの非限定の例において、クロロホルム溶媒系は、９０容量部のクロロホルム、１０容量部のメタノールおよび１容量部の水を含み得る（すなわち、それぞれ、約９０％のクロロホルム：１０％のメタノール：１．０％の水（容量／容量））。詳細な実施形態において、アジュバントは、クロロホルム溶媒系中に溶解されたコードファクターおよび／または他のアジュバントを含み得る。このような実施形態において、アジュバントは、トレハロース６，６’−ジマイコレートであり、これは、クロロホルム溶媒系（９０ｍＬのクロロホルム：１０ｍＬのメタノール：１ｍＬの水）中に溶解される。
【００５４】
詳細な実施形態において、ワクチン組成物は、１種以上の薬学的に許容され得るかまたは獣医学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤を含み得る。ワクチン組成物処方において使用され得るキャリアまたは希釈剤の非限定の例としては、水、グルコース溶液、デキストロース／生理食塩水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、フィッシャー培地、ハンク溶液、リンガー溶液が挙げられる。このような処方物は、安定性、送達可能性または可溶性を高めるための薬学的に許容可能な補助物質（例えば、緩衝化剤、張度調製剤、湿潤剤、洗剤など）を含み得る。付加物はまた、さらなる活性成分（例えば、殺菌剤または安定剤）をも含み得る。例えば、この溶液は、チメロサール、ゲンタマイシン、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラートまたはトリエタノールアミンオレアートを含み得る。組成物は、従来的な、公知の殺菌技術によって殺菌され得る。
【００５５】
特定の実施形態において、ワクチン組成物は、他の活性構成要素（例えば、狂犬病ウイルス、ライム病（ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））、イヌジステンパーウイルス、イヌボルデテラ、イヌパルボウイルス、イヌアデノウイルス、イヌコロナウイルス、バベシア・カニス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ジアルジア；レプトスピラインターロガンス（Ｇｉａｒｄｉａ；ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（例えば、カニコーラ（ｃａｎｉｃｏｌａ）、イクテロヘモラジア（ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、ポモナ（ｐｏｍｏｎａ）、グリポティフォーサ（ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）またはブラチスラバ（ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）の血清型）など、あるいはこれらの任意の組み合わせの、抗病原性構成要素もしくは抗原性構成要素ならびに／または弱毒化単離物および／もしくは死滅化単離物）をさらに含み得ることが企図されるが、これらに限定されない。
【００５６】
幾つかの実施形態において、ワクチンおよび／または免疫原性組成物は、投与を容易にし、用量の単一性を確実にする投薬単位形態で処方され得る。本明細書中で、ワクチン組成物に適した投薬単位は、患者に対しての単位用量として適切な物理的に別個の単位をいい、各単位は、所望の免疫原性効果を生じるように計算された所定量のＥ．カニス抗原をアジュバント、キャリア、および／またはビヒクルと共に含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物および／またはワクチンは、凍結乾燥される。
【００５７】
特定の実施形態において、ワクチンおよび／または免疫原性組成物は、非経口（例えば、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内など）的に投与され得るか、または免疫原性組成物および／またはワクチンは、Ｅ．カニスのキャリアに対し曝露され得る時間によって決定されたスケジュールにしたがって、有効量で、経口投与もしくは鼻腔内投与され得る。この方法において、処置された患者は、天然に曝露される間に免疫をつくる時間を有し得る。例えば、代表的な処置スケジュールは、曝露の可能性の少なくとも４２日間前の皮下注射を含み得る。実施形態において、ワクチン組成物の１回を超える投与が、患者に提供され得る。非限定の例として、初回投与は、患者の曝露の可能性の約４２日前であり、第２回投与は、約２１日前である。しかし、免疫の開始は、より迅速な時間経過で起こり得る。
【００５８】
ワクチンの投与
本発明のワクチンは、液体、エマルジョン、乾燥粉末（凍結乾燥粉末を含む）および／またはミストとして、任意の経口経路を介することによる投与、静脈投与、腹腔内投与、皮内投与、スカリフィケーションによる投与、皮下投与、筋肉内投与、または粘膜経路による（例えば、エアロゾルとして経口にてもしくは鼻腔内に）接種、点眼投与、胚内投与によって、あるいは凍結乾燥粉末を移植されることによって、投与され得る。
【００５９】
ＡＴＣＣ寄託
以下の生物学的材料の培養物が、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の要件を満たす条件下で、以下の国際寄託によって、寄託されている。
管理委員会、
Ｌｏｕｉｓｉａｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ａｎｄ  ＬＳＵ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，１０４  Ｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｈａｌｌ、
Ｂａｔｏｎ  Ｒｏｕｇｅ，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ，７０８０３
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
微生物                ＡＴＣＣ受託番号      寄託日
イヌ骨髄細胞          ＰＴＡ−１０５４５    ２００９年１２月２２日
細胞関連Ｅ．カニス    ＰＴＡ−１０５４６    ２００９年１２月２２日
本発明は、本発明の例示として提供される以下の非限定の実施例を参照することによってよりよく理解され得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に理解するために提示される。しかし、これらは、決して本発明の広範な範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例
【実施例１】
【００６０】
【表１】
0005933538.tif 000002
【実施例２】
【００６１】
研究設計および結果：
【００６２】
【表２】
0005933538.tif 000003
収容および動物飼育：
順化／調教：動物を、既存プール（したがって、処置も調教もされていないことが必要である）から出した。動物を、研究開始前の少なくとも７日間順化した。全ての動物に、研究を通して普通良好飼育実施を受けさせ、ルーチン手順を全ての動物に亘って標準化した。
【００６３】
収容：イヌを、処置群とは関係なく、囲いの中にランダムに群で収容した（１つの囲いあたり４〜５匹）。
【００６４】
食餌：全ての動物に、水を自由に与えた。給餌は、その齢の動物の最小限の栄養的な必要条件に適合していて、標準的手順にしたがった。
【００６５】
【表３】
0005933538.tif 000004
ランダム化：イヌを、ブロック内でのランダム数の発生によってランク付けし、関連する群ＩＤによって仕分けた。ブロック内の最低ランダム数を、群１に割り当て、最高ランダム数を、群２に割り当てた。体重減少は、Ｅ．カニス感染に関連する臨床徴候の１つであるので、ランダム化の間、イヌを、体重によってもブロックした。
【００６６】
研究の盲検化：研究室サンプルの有人試験、毎日の動物観察の実施、臨床評価および剖検観察の実施は、研究が完了するまで、処置群割り当てを知らせなかった。
実験手順：
ワクチン接種前モニタリング／順化：
サンプル：血液サンプルを、研究０日目第１回ワクチン接種前に、抗体力価分析のために血清分離チューブに採取した。
【００６７】
身体検査：−３日目に試験施設において、全ての動物に、担当の獣医師によって身体検査を受けさせ、健康であり研究のために好適であることを見出した。
【００６８】
毎日の観察：順化期間の間、全ての動物を、動物世話スタッフによって毎日観察させた。
【００６９】
臨床観察：臨床徴候および直腸温度を、０日目および２１日目のワクチン接種前に記録した。
ワクチン接種：
生物由来物質の投与：各動物に、０日目および２１日目に、３ｍＬシリンジおよび２３ゲージ×１インチ針を用いて、１．０ｍＬ用量でワクチンを皮下投与した。全てのワクチンを、動物施設への輸送の間およびワクチン投与の間、湿った氷上で維持した。皮下ワクチン接種を、第１回用量について右肩甲骨上領域で、第２回用量について左肩甲骨上領域で、実施した。
【００７０】
ワクチン接種後の手順：
注射部位反応；注射部位観察を、各ワクチン接種後の７日間について記録した。
【００７１】
毎日の観察：ワクチン接種後の期間、全ての動物を、動物世話スタッフによって毎日観察させた。
【００７２】
血清学：研究２１日目、血液サンプルを、抗体力価分析のために血清分離チューブに採取した。
【００７３】
チャレンジ前手順：
臨床観察：臨床徴候および直腸温度を、研究３５日目、３９日目および４２日目（チャレンジ前）に見、基線値を確立した。
【００７４】
血液サンプル：血液サンプルを、研究４２日目（チャレンジ前）に、抗体力価分析のために血清分離チューブに採取した。研究３５日目、３９日目および４２日目（チャレンジ前）に、血液サンプルを、基線ＣＢＣのためにＥＤＴＡチューブ内に採取した。研究４２日目（チャレンジ前）に、血液を、ＰＣＲ分析のためにＰＡＸ  Ｇｅｎｅチューブ内に採取した。
【００７５】
体重を、研究４２日目（チャレンジ前）に、基線値のために記録した。
【００７６】
チャレンジ：
チャレンジ材料：２バイアルのＥ．カニスチャレンジ材料（イヌにおいて継代された低継代凍結培養物）を、液体窒素から取り出し、迅速に解凍して、フィッシャー培地中に１：１００（１ｍＬ＋９９ｍＬ）に希釈した。希釈したチャレンジ材料に蓋をし、ひっくり返して混合し、１ｍＬを力価測定のために取り出した。バイアルをアルミニウム蓋でシールし、標識し、そして、動物ユニットへの輸送のために、こぼれ防止二次容器中にて氷上に置いた。
【００７７】
チャレンジ投与：４２日目に、全てのイヌを、２．０ｍＬの希釈チャレンジ材料にて皮下チャレンジした。
【００７８】
チャレンジ確認／逆力価測定：希釈チャレンジ材料からのサンプルを採取し、２４ウェル組織培養プレートにてチャレンジ日に直ちに力価測定するために用いた。
【００７９】
チャレンジ後モニタリング：
体重：体重を、チャレンジ後毎週記録した。
【００８０】
毎日の観察：動物観察を、臨床観察および体温測定の実施される日を除いて、４９日目までチャレンジ後毎日記録した。
【００８１】
臨床観察：４９日目から研究の最後まで、臨床徴候（鬱、脱水、鼻血および鼻／眼性流出物）を毎日記録し、直腸温度を２週間に１度記録した。
【００８２】
注射部位反応：注射部位観察を、チャレンジ後７日間行った。
【００８３】
血液サンプル：
ＣＢＣのための血液：ＣＢＣプロフィールをモニタリングするために、血液サンプル（ＥＤＴＡ）を、チャレンジ後１週間に２回採取した。
【００８４】
ＰＧＲ試験のための血液：ＰＣＲ分析のために、ＰＡＸ  Ｇｅｎｅチューブ内に血液を毎週採取した。
【００８５】
血清のための血液：血清学のために、チャレンジ後２週間に１回、イヌに出血させた。
剖検／処分：全ての試験動物を、剖検の前にＢｅｕｔｈａｎａｓｉａの静脈内注射によって人道的に安楽死させた。
【００８６】
サンプル採取および操作：
ＣＢＣのためのＥＤＴＡ血液：頚静脈の静脈穿刺によって、三カリウム−ＥＤＴＡを含む真空チューブを用いて血液を採取した。血液を、氷パック上で容器に入れ、同日に血液プロフィール分析のために処理した。
【００８７】
抗体分析のためのＳＳＴ血液：頚静脈の静脈穿刺によって、真空チューブを用いて血液を採取した。血液を２５００ＲＰＭにて１０分間遠心分離し、血清を標識し、−１０℃以下で保存した。
【００８８】
ＰＣＲ試験のための血液：頚静脈の静脈穿刺によって、真空ＰＡＸ  Ｇｅｎｅチューブを用いて血液を採取し、ＰＣＲ分析を行った。
【００８９】
分析方法：
血小板数：血小板数を、当該分野で充分に確立された手順により決定した。
【００９０】
Ｅ．カニス力価測定：希釈チャレンジ材料の保持サンプルを、試験した。簡潔には、ＤＢＭ細胞を、２４ウェルプレート中に、１ｍＬあたり１．０×１０５個の細胞の濃度にて調製し、アッセイを行う前に３６プラスマイナス２℃で１日間インキュベートした。１日齢のＤＢＭ培養物から培地を吸引除去し、チャレンジ材料の１０倍の連続希釈物を、ウェルあたり１ｍＬ、２４ウェルプレートに４ウェルずつ反復して加えた。プレートを、７日間３６プラスマイナス２℃でインキュベートした。７日間後、プレートに、新鮮なフィッシャー増殖培地を、ウェルあたり１ｍＬ再び加え、７日間３６プラスマイナス２℃に戻した。インキュベーション１４日目に、プレートを、２０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、培地を吸引し、培養物を、１００％メタノール（ウェルあたり０．５ｍＬ）で１０分間固定した。一旦プレートが乾燥したら、ウェルあたり０．５ｍＬのマウス抗Ｅ．カニスモノクローナル抗体（０．０１Ｍ  ＰＢＳ中に１：１０００希釈）を加え、３０分間３６プラスマイナス２℃でインキュベートした。プレートを、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回および最後に水で洗浄した。次いで、ウェルあたり０．５ｍＬのＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（０．０１Ｍ  ＰＢＳ中に１：１００希釈）を加え、３０分間３６プラスマイナス２℃でインキュベートした。プレートを再び洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。力価測定を、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を用いて５０％エンドポイントにて計算した。
【００９１】
血清学：間接免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイを、イヌ血清中の抗Ｅ．カニス抗体の検出のために使用した。簡潔には、血清の初回１：２０希釈を、血清希釈緩衝液中で行った。１つのサンプルを、１：４０、１：８０、１：１６０および１：３２０に希釈し、次いで、固定Ｅ．カニス感染ＤＢＭ細胞を含む１２ウェルスライドに加え（希釈ごとに１０μＬ）、湿潤チャンバ内で３０分間３６プラスマイナス２℃でインキュベートした。スライドを、０．０１Ｍ  ＰＢＳで１０分間洗浄し、１０μＬのＦＩＴＣ標識したヤギ抗イヌＩｇＧ（０．０１Ｍ  ＰＢＳ中に１：１００希釈）を、スライド上の各ウェルに加えた。次いで、スライドを、３０分間３６プラスマイナス２℃にて湿潤チャンバ内に置き、０．０１Ｍ  ＰＢＳ中で１０分間洗浄し、蛍光顕微鏡で読み取った。蛍光が視認可能である場合、力価を、最高希釈によって決定した。
【００９２】
ＰＣＲ：ＰＣＲを、当該分野で充分に確立されている手順により、血液サンプルにおいて実施した。
【００９３】
不活化試験：ホルマリン不活化抗原を、完全不活化を確認するために試験した。簡潔には、ＤＢＭ細胞を、フラスコにつき１ｍＬおよび６０ｍＬあたり１．０×１０５個の細胞を播種する１日前に、１５０ｃｍ２フラスコ中に調製した。１．０ｍＬの各試験サンプル（陽性対照および陰性対照を含む）を、フラスコに播種し、８日間３６プラスマイナス２℃でインキュベートした。２つの盲検継代を行い、各継代に、１０ｍＬの以前の継代種菌を入れた。２回の盲検継代８日目に、各フラスコ材料を、特異的免疫蛍光によって染色した。培養物中の蛍光の欠如は、完全な不活化の指標である。
【００９４】
データ分析：
結果変数：ワクチン処方物の効力の決定のための一次変数は、対照群と比較したワクチン接種群における重度な血小板減少の予防に基づいた。体重減少百分率、剖検総点、血液値および臨床徴候を、予防の証拠を支持すると考えた。
【００９５】
臨床観察の点数付け：チャレンジ後１２週間に亘って、毎日各イヌの臨床徴候を記録し、点数付けした。
【００９６】
臨床評価ガイド：隔離室に入る際、動物の態度を評価するために歩いて通る。鬱についての得点は、この最初の歩きの間に多くの動物について決定され得る。次に臨床観察に進む。次いで、体温を測定し、次いで所要の血液サンプルを得る。
【００９７】
死：１００点（生命徴候なし、瀕死で安楽死させたイヌを含む）。
【００９８】
鬱：なし（正常な活動および行動）。あり：無気力、あなたが部屋にいる間、横たわっており、起き上がるのを嫌がる。
【００９９】
鼻流出物：正常（なし）；液性（中程度から重度）：下までまたは口の下までずっと（鼻の脇に沿ってまたは鼻溝を下へ）透明な液体、多くの場合水っぽい；粘液膿性（中程度から重度）：粘液膿性、下までまたは口の下までずっと（鼻の脇に沿ってまたは鼻溝を下へ）透明ではなく、多くの場合色のついた流出物。
【０１００】
眼性流出物：正常（なし）；液性（中程度から重度）：鼻の下半分まで落ちているか、または眼の縁が盛り上がっておりうっ血しているかもしくは眼の内側または外側の端で毛が浸水している、透明な液体、多くの場合水っぽい；粘液膿性（中程度から重度）：粘液膿性、鼻の下半分まで落ちているか、または眼の縁が盛り上がっておりうっ血しているかもしくは眼の内側または外側の端で毛が浸水している、透明ではなく、多くの場合色のついた流出物。
【０１０１】
鼻血：（鼻腔からの出血）−正常（なし）；あり：鼻腔からの出血。
【０１０２】
脱水：正常（なし）；あり：肩の間の皮膚のしわがくっつくか、または引っ込むまでに３秒以上かかる。
【０１０３】
【表４】
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体重減少百分率の計算：各イヌを、チャレンジ前に体重測定し、基線体重を決定した。チャレンジ後毎週、各イヌについての体重減少を、以下の式を用いて計算した：（（基線体重−現在体重）／基線体重）×１００＝％体重減少。
結果および考察：
同時発生疾患：１匹の対照のイヌは、研究中に処置しなければならなかった。このイヌは、左目に潰瘍を発症し、まぶたが腫れ上がって閉じていた。抗生物質は避けたため、研究に影響はなかった。状態は、特定の日に発見された。この時点で、目を等張生理食塩水で洗い流した。２日後に、このイヌに、アトロピンを局所的に皮下注射した。この状態が発見された５日後に、このイヌは獣医師によって診察され、完全に回復した。この状態は、外傷（別のイヌからの引っ掻き傷）によって生じたと考えられ、研究試験製品またはチャレンジの結果ではないと考えられる。
【０１０４】
ワクチン接種前試験：イヌを、ワクチン接種前に、Ｅ．カニスに対する抗体の存在についてスクリーニングした。全てのイヌは、Ｅ．カニス特異的免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイによって試験した際に、４０未満の力価を有することが見出された（表５を参照されたい；４２日目は、チャレンジの日である）。臨床観察および直腸温度もまた、ワクチン接種前に取った。全てのイヌは、臨床的に正常であることが見出された。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
ワクチン接種後試験：
ワクチン接種後、注射部位反応を有するイヌは観察されなかった。全てのイヌを、両ワクチン接種後のワクチンの有害効果について毎日観察した。ワクチン接種後、いかなる有害な臨床徴候も示したイヌはいなかった。
【０１０７】
血液サンプルを、血清学のために、ワクチン接種後２１日目、第２回ワクチン接種の直前に採取した。力価を、Ｅ．カニス感染ＤＢＭ細胞で被膜された１２ウェルスライド上で血清の倍加希釈を用いて測定した。希釈を、１：４０で始めた。ワクチン接種群には、ワクチンの１回投薬後にバックグラウンドの１：４０を超える力価を示すイヌはいなかった（表５を参照されたい）。
【０１０８】
４２日目に、チャレンジの直前における、Ｅ．カニス抗体ワクチン接種力価の分析は、以下の通りであった（表５もまた、参照されたい）：
力価＜４０：      ０匹のイヌ
力価＝８０：      ４匹のイヌ
力価＝１６０：    ３匹のイヌ
力価＞３２０：    １匹のイヌ
全ての未ワクチン接種対照イヌは、チャレンジ前に、血清学的陰性（＜１：４０）であった。
【０１０９】
チャレンジ：全てのイヌを、解凍したチャレンジ材料をフィッシャー培地で１：１００に希釈し、各イヌに２ｍＬのチャレンジを皮下投与することによって、研究４２日目にチャレンジした。チャレンジ材料を、イヌへの投与の時点で力価測定し、２ｍＬ用量あたり１０３．２ＴＣＩＤ５０の力価を見出した。
【０１１０】
チャレンジ後臨床評価：
チャレンジに関連する体重減少：体重を、チャレンジ後毎週記録した。結果を表６にまとめる。
【０１１１】
【表６】
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最高の百分率の体重減少は、対照イヌにおいてみられ、チャレンジ７週間後に平均で体重の１６．９７％の減少であった。これはまた、処置群（ワクチン接種イヌのみが体重の７．８５％の減少を経験した）との間で最も相違が大きい時点でもあった。体重減少を、統計学的に試験した。重度の体重減少を、イヌの体重の１５％以上と規定した。８７％（７／８）の対照イヌが、その体重の１５％以上の体重を失っていて、１２％（１／８）であるワクチン接種イヌと対照的であった。この相違は、非常に有意である（ｐ＝０．００４２）。
【０１１２】
死亡：対照群中８匹中２匹（２５％）のイヌを、臨床徴候の重症度ゆえに安楽死させた。ワクチン接種群には、試験中に死んだイヌはいなかった。安楽死は、臨床徴候（体重減少、血球値および電解質値）に基づく獣医師の判断であった。担当獣医師は、群識別に対し盲検を行った。相違は支持的であるが、研究におけるイヌの数の少なさゆえに、有意ではない（ｐ＝０．２１１８）。
【０１１３】
全血球数評価：血液サンプルを、白血球および赤血球（ＷＢＣおよびＲＢＣ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）ならびに血小板についての基線値を設定するために、研究３５日目、３９日目および４２日目にも採取した。全てのイヌは、チャレンジ前に、Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ，（１９９８）］にしたがって、これらの測定値について正常範囲であった。
【０１１４】
血液サンプルを、チャレンジ後、週２回採取した。ＣＢＣ結果は、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、ヘマトクリット（Ｈｃｔまたは血球容量）および血小板を含んだ。Ｅ．カニスは、血液値にこのような劇的な効果を有するので、点数付けシステム（「正常、異常または臨床的に有意（すなわち重度）」の発症率）を確立した。表７は、この研究において使用された値をまとめる。
【０１１５】
【表７】
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臨床的に有意な（すなわち重度）の値は、複数日に亘って正常範囲の下限の約７５％として計算した。この範囲内のイヌは、多くの場合、関連の血球の欠損に直接関連する臨床徴候を有することが観察された。異常値は、正常レベルの下限を下回る全ての値である。
【０１１６】
血小板：低血小板数は、リケッチア感染に関連する初期臨床徴候である。この研究について、これは一次変数であった。Ｅ．カニスは、感染イヌにおいて血小板数の非常に重度の低下をもたらすことにおいて特に秀でている。８匹の対照イヌ全て（１００％）および８匹中５匹のワクチン接種イヌ（６５％）が、血小板減少（血小板数が２００，０００／μＬ未満）を発症した。図５は、チャレンジ後の平均血小板数（対照対ワクチン接種）を示し、表８は、データのまとめを示す。２回以上の読み取りで血液１μＬあたり１５０，０００個の血小板に満たない血小板数を有するイヌを、重度のカテゴリーにいるとみなした。これらは、損傷の際に出血の高い危険がある。動物世話人は、サンプル採取後かなりの時間持続した静脈穿刺出血に関連する損傷により、これらのイヌを容易に同定できた。対照イヌについて、８匹のうち６匹（７５％）が、重度カテゴリーの血小板数を有した。ワクチン接種イヌの８匹中２匹（２５％）だけが、重度カテゴリーの数を有した。統計学的に、この相違は、有意ではなかった（ｐ＝０．０７６８）。しかし、少なくとも１匹の対照イヌにおける死亡において、このイヌが重度の血小板減少を示したことにより研究の初期に死亡したために、データが削除された。このイヌが死亡していなければ、この研究は、少なくとも８匹中７匹の対照が重度の血小板減少を示したと結論付けられたであろう。死亡は、血小板減少よりも重度の臨床徴候であるので、一次変数は、血小板減少または死亡であるとして、再分析した。死亡を数に入れると、対照とワクチン接種との間の相違は、有意になる（ｐ＝０．０２１３）。
【０１１７】
【表８】
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【０１１８】
赤血球：図２は、チャレンジ後の期間についての平均赤血球数を示す。図２は、試験期間のほとんどにおいて、対照イヌの平均は正常より低く、ここで、試験期間のほとんどにおいて、ワクチン接種の平均は正常範囲内に留まったことを示す。表９は、１００％の対照イヌがＭｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌの貧血の定義に合致し、６３％が重度のカテゴリーに進行したことという、チャレンジの重症度を示す。ワクチン接種したイヌに、貧血の重度カテゴリーに進行したイヌはいなかった。この相違は、非常に優位である（ｐ＝０．００８１）。
【０１１９】
【表９】
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【０１２０】
白血球：図１は、チャレンジ後の期間についての白血球数の結果をまとめる。図１は、白血球数の重度の減少が対照において観察されたことを示す。データは、表１０において最もよくまとめられていて、ここでは、軽度および重度の白血球減少の両方についての顕著な相違が、イヌにおいて観察される。対照群における３８％のイヌは、白血球減少の「重度」カテゴリーに進行し、ここで、ワクチン接種イヌに白血球減少の「重度」カテゴリーに進行したイヌはいなかった。この相違は、有意ではない（ｐ＝０．０８２２）。表１０および図１は、ワクチン接種イヌについての平均と対照イヌについての平均との間の相違を示す。対照の平均は、正常についての最小レベルを下回るが、ここで、ワクチン接種イヌの平均は下回らない。この傾向は、各研究群により多くの動物がいることにより、この相違は有意になり得ることを示唆する。
【０１２１】
【表１０】
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【０１２２】
ヘモグロビン値：図３は、チャレンジ後のヘモグロビン測定の結果をまとめる。他の血液パラメータと矛盾せず、図３は、チャレンジ期間後のほとんどについて対照の平均が最小値をはるかに下回ることを示す。ワクチン接種群平均は、正常を下回ることはなかった。表１１は、対照イヌの１００％が、低ヘモグロビン値を有し、ワクチン接種の５０％しかこのレベルにはならなかったことを示す。ヘモグロビンレベルの重度カテゴリーに進行したワクチン接種イヌはいなかった。しかし、対照の２５％のみが、重度カテゴリーに進行していて、この相違は、有意ではなかった（ｐ＝０．２１１８）。
【０１２３】
【表１１】
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【０１２４】
ヘマトクリット百分率：図４は、チャレンジ後のヘマトクリット値の結果をまとめる。貧血の他の測定値と同様、図４は、チャレンジ期間の後半について、対照平均が正常をかなり下回り、ここで、ワクチン接種イヌ平均は、正常値を決して下回らないことを示す。表１２は、試験製品によるイヌのワクチン接種が、半分のみ、貧血の発症率を低下させることを、ヘマトクリット数の測定により示す。６３％（５／８）の対照イヌが、ヘマトクリットについての重度カテゴリーに進行し、ここで、１／８のワクチン接種群のイヌ（１３％）のみが、重度値を有する。この相違は、有意に非常に近い（ｐ＝０．０５３４）。
【０１２５】
【表１２】
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【０１２６】
臨床徴候：各イヌを、重症感染の指標となる臨床徴候について毎日観察した。この結果を、表１３にまとめる。臨床徴候点数付けは、鬱、鼻漏出物、眼性漏出物、鼻血、脱水および死の徴候について、イヌを盲検で有人観察することによって行われる観察に基づいた。得点を、臨床徴候の重症度に関して各観察に割り当てた。対照群の総得点は、２５４であり、対してワクチン接種については２８であった。対照対ワクチン接種についての平均点は、それぞれ３２および４であった。保護を非常に示唆しているようであるが、群の間の相違は有意ではなかった（ｐ＝０．４３６４）。
【０１２７】
【表１３】
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【０１２８】
直腸温度：週に２回、直腸温度を測り、記録した。イヌは、直腸温度が３９．５℃を超えると熱があるとみなされた。これは、３８．９℃プラスマイナス０．５℃の温度範囲が正常であると列挙しているＭｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌとも合致している。Ｅ．カニスは、感染イヌにおいて体温の急激な上昇を起こすことが知られる。この研究からの観察は、これに合致していて、表１４にまとめられる。対照の８７．５％（７／８）は、熱の急上昇を有し、対して、ワクチン接種イヌは５０％（４／８）であった。熱の急上昇を、統計学的に相違について比較した。対照の２５％（２／８）は、２日間以上熱を有したが、ワクチンイヌの１２．５％（１／８）しか２日間以上熱を有さなかった。この相違は、有意ではなかった（ｐ＝０．６７０９）。
【０１２９】
【表１４】
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【０１３０】
チャレンジ注射部位反応：イヌを、チャレンジ部位の反応について観察した。ワクチン群であろうと対照群であろうと、１６匹のイヌのうちにチャレンジ投与部位において何らかの反応を示したイヌはいなかった。
【０１３１】
血液中のＥ．カニスのＰＣＲ検出の結果：血液サンプルを、ＰＣＲ分析のために採取し、チャレンジの直前にＥ．カニス感染を判定した。ＰＣＲ結果を、表１５に示す。予測通り、全てのイヌは、チャレンジ前にＥ．カニス感染について陰性のままであった。チャレンジ後毎週の、Ｅ．カニス感染についての血液のＰＣＲ分析についての結果は、表１５にある。１回以上の時点で、全ての対照イヌは、血液中で、Ｅ．カニスに対し陽性であった。ワクチン接種イヌの３匹において、ＰＣＲはＥ．カニスを全く検出しなかった。これらの結果は、血小板の結果と完全に合致する（チャレンジ後に血小板減少を発症しなかったイヌと同じイヌである）。陽性結果についての対照とワクチン接種との間の相違は、有意ではない（ｐ＝０．０８２２）。
【０１３２】
【表１５】
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【０１３３】
チャレンジ後の血清学：チャレンジ後の２週間ごとに、血清学を実施した。ワクチン接種イヌについての血清学結果は、チャレンジ後にＰＣＲによって陰性であり、血小板減少を含む臨床徴候を発症しなかったこの群のイヌは、実際にＥ．カニスに曝露されたか否かという質問に答える。過去の４２日目（チャレンジの日）のある時点で、これらの３匹全てのイヌは、力価における迅速な上昇を有し、チャレンジ材料に対する曝露を示す。血清学の平均のまとめを、表５に示す。抗体力価と保護との関係性は、この研究からは明らかではない。血清学は、病原性Ｅ．カニスへの曝露のよい指標であると考えられる。
【０１３４】
剖検の点：全てのイヌにおいて、安楽死の時点で剖検を行い、剖検を行う者は、盲検で行った。ほとんどのイヌについて、これは、チャレンジの８週間後であった。重症な臨床徴候ゆえにより早期に安楽死させなければならなかったイヌについては、剖検は死の時点で行った。イヌを解剖し、安楽死後直ちに点数付けした。脾腫は、Ｅ．カニス感染に明らかに関連し得る１つの観察であった。ワクチン接種状態は、脾腫の観察に影響を有するとみられる（表１６）。ワクチン接種イヌには、脾腫を有したイヌがいなかったが、これに対して、対照については３８％（３／８）であった。この相違は、有意ではない（０．０８２２）。８週間試験の最後よりも前に安楽死させなければならなかったイヌにおいて、担当獣医師は、腹水の蓄積が一貫してみられたことに気が付いた。低血清アルブミンレベルは、循環と組織との間の浸透圧不均衡をもたらすので、腹腔内における液の蓄積が生じ得る。残りの試験期間について、２週間に一度試験のために送られる血液サンプルにおいて、化学パネルを実施するよう指示した。アルブミンレベルについてのこれらの試験の結果は、表１７にまとめられる。対照の半分（４／８）は、腹腔内に液の有意な蓄積を有したことが、剖検において観察された。液蓄積を有する対照のうち、５０％は、２００ｍＬを超える液体が回収され、重度の評価を有した。ワクチン接種イヌのうち、何らの液蓄積を有したイヌはいなかった（表１６）。この相違は、有意ではなかった（ｐ＝０．２１１８）。血清アルブミンレベルと血小板数との興味深い相関性があった。血小板減少を発症した全てのイヌは、正常アルブミン値を下回った。ワクチン接種状態は、明らかに血清アルブミンレベルに影響しているとみられる（６／８対照（７５％）が血清中のアルブミン濃度についての最小値の７５％を下回り、ここで、ワクチン接種の３／８（２５％）しか、このレベルまで低下しない（表１７））。
【０１３５】
【表１６】
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【０１３６】
【表１７】
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【０１３７】
全ての結果のまとめ表：これらの複合的な結果の全ての重症度を試行し把握するために、まとめ表を作成した（表１８）。この表において、この試験において測定された各パラメータについて、臨床的に有意な（重度の）点のみを試験する。対照についての平均重症度点は１４．６であり、対して、ワクチン接種については３．５である。この劇的な相違は、全てのワクチン接種イヌ対対照イヌにおいて、試験製品の効力を強調する。
【０１３８】
結論：
チャレンジは、有効であり、計画したよりも強力であった（対照の１００％が、血小板減少を発症し、Ｅ．カニスの高い力価、重度の臨床徴候、体重減少を有し、２匹のイヌが安楽死させられなければならなかった）。
【０１３９】
死ゆえの削除を考慮に入れる場合、重度の血小板減少の発症率（一次変数）は、対照におけるよりもワクチン接種において低く、この相違は有意である（ｐ＝０．０２１３）。
【０１４０】
ワクチン接種は、死亡率に影響したとみられる（チャレンジ後、人道的理由により対照の２５％が安楽死させる必要があったが、ワクチン接種にはその必要がなかった）。
【０１４１】
重度の体重減少は、対照群のイヌにおいて経験され、数匹のイヌは、チャレンジ後８週間の間にほぼ２５％の体重減少となった。重度の体重減少の発症率は、ワクチン接種イヌにおいて対照イヌよりも低く、相違は非常に優位であった（ｐ＝０．００４２）。
【０１４２】
重度のレベルに達する他の血液パラメータについてのワクチン接種イヌと対照イヌとの間の相違は、あまり有意ではなく、幾つかは非常に近かった。これらは、ＷＢＣ（ｐ＝０．０８２２１）、ヘマトクリット（ｐ＝０．０５３４）、およびヘモグロビン（ｐ＝０．２１１８）を含んだ。
【０１４３】
血液中におけるＥ．カニスのＰＣＲ検出は、血小板減少の発症率について達成された結果と正確に合致した。
【０１４４】
ワクチン群における３匹のイヌは、感染の臨床徴候を何ら示さず、ＰＣＲによって血液中に検出可能なレベルのＥ．カニスも有さなかった。しかし、血清学は、これらの３匹のイヌが、チャレンジ後にＥ．カニスに対し既往反応を有するとみられたことを示した。このことは、これらのイヌが、病原性チャレンジ材料に曝露されたことを示す。
【０１４５】
血液中の重度のアルブミン欠損の結果としての腹部における液体蓄積は、対照群のイヌにおいてのみみられ、ワクチン接種イヌにはみられなかった。
【０１４６】
鬱、鼻漏出物、眼性漏出物、鼻血、脱水および死を含む臨床徴候は、ワクチン接種イヌと比較して対照イヌにおいて最も重度であったが、群の間で相違は有意に異なっていなかった（ｐ＝０．４３６４）。
【０１４７】
チャレンジ後の直腸温度の急激な上昇は、対照イヌにおいて、より共通していた。
【０１４８】
ワクチン接種またはチャレンジ注射のいずれも、イヌにおいて何ら観察可能な反応を発症しなかった。
【０１４９】
剖検の際、脾腫は、対照においてのみみられた。
【０１５０】
これらの結果は、本発明のワクチンの効力を支持する。
【０１５１】
【表１８】
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本発明は、本明細書中に開示される特定の構成、手順工程、材料に限定されず、このような構成、手順工程および材料自体が何らかの変動をし得ることが理解される。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみで使用され、限定することを企図せず、本発明は、添付の請求項およびその均等物によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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