(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシアルカノエートコポリマーの製造方法であって、以下の工程、
（ｉ）酸性溶液中でスクロース含有原料を前処理する工程、
（ｉｉ）前記前処理された原料を、ポリヒドロキシアルカノエート生成微生物細胞を含む生物反応器に供給する工程、
（ｉｉｉ）前記ポリヒドロキシアルカノエート生成微生物細胞を培養し、ヒドロキシアルカノエートコポリマーを含む細胞塊を形成する工程、
（ｉｖ）前記細胞塊から前記ヒドロキシアルカノエートコポリマーを回収する工程、
を含み、二つの異なる前処理された原料が前記生物反応器に供給され、第一の前処理された原料がグルコース及びフルクトースを含み、実質的に４−ケト吉草酸を含まず、第二の前処理された原料がグルコース及び４−ケト吉草酸を含み、実質的にフルクトースを含まない、方法。
【請求項２】
酸性媒体における前記前処理工程が、（ｉ−ａ）前記スクロース含有原料を酸性化して１．０〜４．０のｐＨ値にする工程、及び（ｉ−ｂ）前記酸性化されたスクロース含有原料を７０℃〜２５０℃の温度で加熱する工程、によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スクロース含有原料が、有機植物粗原料の処理から得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記前処理工程において、前記原料が、酸性物質を加えることにより酸性化される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記酸性物質が、塩酸、硫酸、リン酸、及びそれらの混合物から選択されるブレンステッド酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酸性物質が、０．１〜３．０ｍｍｏｌ Ｈ+／ｇのＨ+／固体比で原料に加えられる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記出発原料が、５質量％〜３０質量％の固体濃度が得られるように前もって希釈される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記前処理工程が、１５分〜１２時間の時間で実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記前処理された原料が、前記生物反応器への供給工程の前に、周囲温度まで冷却され、次に、前記生物反応器に直接導入される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞増殖、ポリマー生合成及びコポリマー組成を制御するために、前記前処理された原料が、前もって決められた供給手順に従って前記生物反応器に供給される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養工程が、発酵に適したｐＨ及び温度条件で実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養工程が２５℃〜４５℃の温度で実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養工程が、６．０〜７．５のｐＨ値で実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養工程の間にｐＨ値を調整するために、塩基性物質が前記生物反応器に供給される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクロース含有原料（feedstock）からの微生物コポリエステル、特に微生物ヒドロキシアルカノエートコポリマーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、細菌細胞において炭素及びエネルギー貯蔵として合成及び蓄積されるバイオポリエステルのファミリーである。バイオポリエステルは、従来のプラスチックのように溶融及び成形され得るが、環境中で完全に生物分解され得る。ＰＨＡバイオプラスチックは再生可能な原料から製造されるため、その化石エネルギー消費及び温室効果ガス放出は、石油ベースの対応物のそれらよりもはるかに少ない。
【０００３】
通常Ｐ３ＨＢ又はＰＨＢとして同定されるポリ−（３−ヒドロキシブチレート）は、微生物によって炭水化物から生成される、最も一般的なＰＨＡであり、以下の式、
0005986213.tif 000002
によって表される。他のＰＨＡの生成は、しばしば前駆物質又は構造的に関連する基質を必要とする。天然の微生物種において代謝を介して生成されるヒドロキシアルカノエートモノマーは、ＰＨＡ生合成における酵素の立体特異性のため、通常、Ｒ配置にある３−ヒドロキシアルカノエート（３ＨＡ）である。
【０００４】
高い立体規則性のため、バイオポリエステルは、いくつかのＰＨＡポリマーの光学活性、生物分解性、生体適合性、及び高結晶度のようないくつかの独特な性質を示す。例えば、Ｐ３ＨＢは、７０％までの高い結晶度を有し、結果として高い融点（１８０℃）、高い弾性率（３．５ＧＰａ）、高い引張強さ（４３ＭＰａ）を有するが、低い破断点伸びを有する、硬い物質となる。従って、Ｐ３ＨＢは、制限された応用を有している。
【０００５】
Ｐ３ＨＢの延性は、エチル基のような、大きな側鎖をポリエステル骨格に導入して、通常Ｐ３ＨＢ３ＨＶ又はＰＨＢＶとして同定され、以下の式、
0005986213.tif 000003
を有するコポリエステル、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバリレート）、を生成することによって向上され得る。ＰＨＢと比較して、ＰＨＢＶコポリエステル（ＨＢ：ＨＶ＝９０：１０）は、より低い結晶度（６０％）、より低い融点（１４０℃）、より低い弾性率（０．８ＧＰａ）、より低い引張強さ（２０ＭＰａ）を有するが、より高い破断点伸び（５０％）を有する。しかしながら、３ＨＶモノマーは、Ｐ３ＨＢの結晶格子に導入され得、これはエチル基の機能を減じるアイソジモーフィズム（isodimorphism）と呼ばれる現象である（例えば、P.J. Barham, P. Barker, S.J. Organによる論文FEMS Microbiol. Lett. 103: 289-298 (1992)参照）。
【０００６】
４−ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）のような長いモノマーをＰＨＡ骨格に導入することにより、結晶度もまた減少され得、従って物質の性質は変更され得る。例えば、以下の式、
0005986213.tif 000004
を有するコポリエステル、Ｐ３ＨＢ４ＨＢ（３ＨＢ：４ＨＢ＝８４：１６）は、４５％の結晶度、２６ＭＰａの引張強さ、及び４００％の破断点伸びを有する（Z. Zhu, P. Dakwa, P. Tapadia, R.W. Whitehouse, S.Q. Wangによる論文Macromolecules 36: 4891-4897. (2003)参照）。長いモノマーは、コ−ポリエステルの延性の向上において非常に効果的なようである。しかしながら、４ＨＢの高い含有量は、低い引張強さ及び遅い結晶化を招く。
【０００７】
通常Ｐ３ＨＢ３ＨＶ４ＨＶ又はＰＨＢＶＶとして同定され、以下の式、
0005986213.tif 000005
を有するターポリエステル（ter-polyester）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバリレート−コ−４−ヒドロキシバリレート）（３ＨＢ：３ＨＶ：４ＨＶ＝０．８：６９．２：３０）は、細菌シュードモナス・プチダＧＰｐ１Ｏ４（P.putida GPp1O4）を用いることにより、４−ケト吉草酸から合成された。前記ターポリエステルは、溶融体から非常にゆっくりと凝固し、このことはバイオプラスチックの熱加工及び成形加工に対する大きな挑戦を引き起こし得る（V. Gorenflo, G. Schmack, R. Vogel及びA. Steinbuchelによる論文Biomacromolecules, 2: 45-57 (2001)参照）。
【０００８】
微生物のＰＨＡ生合成において、３ＨＶ、４ＨＢ及び４ＨＶのモノマーは、単独の炭素源として又はグルコースのような一般の炭素源との補助基質として、プロピオン酸、１，４−ブタンジオール及び４−ケト吉草酸のような前駆物質又は構造的に関連する化学物質にしばしば由来する。しかしながら、前駆物質は、しばしばグルコースや炭水化物よりもはるかに高価であり、従ってＰＨＡバイオプラスチックの高い製造コストに大きく寄与する。ライストニア・ユートロファ（Raistonia eutropha）は代表的なＰＨＡプロデューサーであり、細胞量（cell mass）の７０〜８０質量％までＰＨＡポリマーを蓄積し得る。この非胞子形成性、グラム陰性の好気性細菌は、単純な炭素源及び無機塩上で成長する。グルコース及びプロピオン酸又は吉草酸の存在下において、ラルストニア・ユートロファ（R. eutropha）は、５〜２５モル％の３ＨＶ含有量を有するＰ３ＨＢ３ＨＶコポリマーを合成する。ＰＨＡ骨格への前記有機酸の比較的非効率的な導入のため、細胞に対する高い毒性をもたらす高い酸濃度が、培地においてしばしば維持される
【０００９】
米国特許第５３６４７７８号において、上記の問題に対する可能な解決策が開示され、ＨＢ及びＨＶモノマー単位を含むコポリマーを製造するための微生物学的プロセスは、本質的にＨＶ成分からなる基質において非成長制限条件下で培養されるときに有意な成長ができないＰＨＢ蓄積細菌を用いる。従って、培養の少なくとも一部は、成長制限条件下で、すなわち、成長のための必須条件が制限されるがコポリマーの蓄積は制限されない条件下で、実施される。そのような成長制限条件下で、細菌のＰＨＢホモポリマーを製造及び蓄積する傾向は回避され、ＨＶ含有コポリマーの製造及び蓄積が誘導されるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
出願人は、広範な応用に適切となるように、材料強度及び延性の組み合わせを有する生物分解性ポリエステルの製造の問題に取り組んできた。出願人は、上記で説明されるように、その微生物発酵による製造が、主に、３ＨＶ及び４ＨＶモノマーに関する有機前駆物質の高コスト、ポリエステル骨格へのＨＶモノマーの非効率的な導入、微生物細胞に対する有機前駆物質の毒性及び全体のプロセスの高い製造費用による、多くの欠点を示すヒドロキシアルカノエートコポリマー、特にＰＨＢＶＶターポリマーにその努力を集中してきた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願明細書及び特許請求の範囲内では、用語「コポリマー」（又は「コポリエステル」）は、少なくとも二つの異なるコモノマーからなるあらゆるポリマー（又はポリエステル）を含み、特に、コポリマー、すなわち二つの異なるモノマーから生成されるポリマー（例えばＰ３ＨＢ３ＨＶ及びＰ３ＨＢ４ＨＢ）、及びターポリマー、すなわち三つの異なるモノマーから生成されるポリマー（例えばＰ３ＨＢ３ＨＶ４ＨＶ）、の両方を含むことに留意すべきである。
【００１２】
出願人は、ヒドロキシアルカノエートコポリマーが、スクロース原料の微生物発酵によって効率的に製造され得、スクロース原料は酸性加水分解において前処理されてスクロースがグルコース及びフルクトースに変換し、グルコース及びフルクトースは次に４−ケト吉草酸に変換されて、ヒドロキシアルカノエートコポリマーの微生物合成のための単糖及び有機前駆物質の混合物を与えることを見出した。
【００１３】
従って、第一の特徴によると、本発明は、ヒドロキシアルカノエートコポリマーの製造方法であって、以下の工程、
（ｉ）酸性溶液中でスクロース含有原料を前処理する工程、
（ｉｉ）前記前処理された原料を、ポリヒドロキシアルカノエート生成微生物細胞を含む生物反応器に供給する工程、
（ｉｉｉ）前記ポリヒドロキシアルカノエート生成微生物細胞を培養し、ヒドロキシアルカノエートコポリマーを含む細胞塊を形成する工程、
（ｉｖ）前記細胞塊から前記ヒドロキシアルカノエートコポリマーを回収する工程、
を含む方法に関する。
【００１４】
酸性媒体における前処理工程は、好ましくは、（ｉ−ａ）前記スクロース含有原料を酸性化して１．０〜４．０、好ましくは２．０〜３．０のｐＨ値にする工程、及び（ｉ−ｂ）前記酸性化されたスクロース含有原料を７０℃〜２５０℃、好ましくは１００℃〜２００℃の温度で加熱する工程、によって実施される。
【００１５】
前処理工程は、スクロースをグルコース及びフルクトースに加水分解する主要な機能を有し、グルコース及びフルクトースは次に４−ケト吉草酸に変換されて、ヒドロキシアルカノエートコポリマー、及び特にＰＨＢＶＶターポリマーの微生物合成のための単糖及び有機前駆物質の混合物を与える。微生物細胞は、基質分子のみが輸送され、代謝され、ＰＨＡポリマーに合成される個々の「ミニプラント」のように機能するため、前処理工程から得られる基質の複雑且つ高価な精製工程は必要とされない。溶液は、微生物ＰＨＡ生合成のための供給溶液として直接使用され得る。細胞内で蓄積されるバイオポリエステルは、更なる精製のために水性媒体から容易に回収され得る。ヘキソースからの前駆物質のその場での生成は、それに続く微生物生合成の工程に関して高効率であり、吉草酸及び４−ケト吉草酸のような純粋な有機前駆物質の添加に関してはるかに低いコストを有するという結果となった。
【００１６】
ＰＨＡ発酵の前に、原料又は培地を殺菌し、炭素源及び栄養分についてＰＨＡ生成細胞と競合し、低いＰＨＡ収率及び除去すべき相当量の非ＰＨＡバイオマスをもたらす野生型種を除去するべきである。本発明によると、前処理工程は、それに続く微生物生合成について有利な効果を有する殺菌操作でもあり、従来のＰＨＡ発酵と比較して余分なエネルギーをほとんど消費しない。更に、前処理された糖溶液は、ヒドロキシアルカノエートコポリマーの製造に直接使用され、炭水化物及び有機前駆物質の精製のための更なる操作の費用を省く。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、処理された甜菜ジュースの試料内のグルコース、蟻酸、４−ケト吉草酸（４−ＫＶＡ）及び５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）の濃度の時間的経過を示す。
【図２】図２は、生物反応器に供給された様々な成分の累積堆積の時間的経過を示す。
【図３】図３は、細胞密度、ＰＨＡ含量並びにＰＨＡの３ＨＢ、３ＨＶ及び４ＨＶのモル％の時間的経過を示す。
【図４】図４は、ＰＨＢＶＶの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、第一の加水分解物溶液（溶液Ａ）、第二の加水分解物溶液（溶液Ｂ）及びＣ／Ｎ比の時間的経過を示す。
【図６】図６は、細胞密度、ＰＨＡ含量並びにＰＨＡの３ＨＢ、３ＨＶ及び４ＨＶのモル％の時間的経過を示す。
【図７】図７は、バイオポリマーの結晶度を１１８４ｃｍ−１の波数で測定し、冷却時間に対してプロットしたグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「スクロース含有原料」により、ＰＨＡ生成微生物細胞によって代謝され得、可能ならば他の炭水化物との混合物の形態でスクロースを含み、且つ、果汁、サトウキビ糖蜜、甜菜パルプ、甜菜糖蜜等のような有機植物粗原料（raw material）の処理から得ることができるあらゆる基質を意味する。原料は、スクロース及び可能な他の炭水化物の他に、追加の有機成長因子、Ｎ、Ｐ及び／又は他の無機塩を細胞増殖のための栄養分として含んでもよい。
【００１９】
前処理工程は、オートクレーブ内又は反応器内で好ましくは実施される。原料の酸性化は、酸性物質、好ましくは塩酸、硫酸、リン酸、又はそれらの混合物のようなブレンステッド酸を、上記で示されるような所望のｐＨ値を達成できるような量で添加することによって好ましくは達成される。植物粗原料の前の処理に由来する、通常スクロース含有原料中に存在する固体は、強い緩衝能を有し得る、すなわち、固体はＨ＋イオンと反応又は結合し、遊離のプロトンの濃度及び従って全体の酸性度を減少させ得ることが考慮されるべきである。従って、原料に加えられるべき酸性基質の量は、Ｈ＋／固体比として、すなわち、原料中に存在する固体の単位質量（ｇ）当たりの、所望のｐＨ値を達成するために原料に加えられるべきＨ＋イオンの量（ｍｍｏｌ）として表され得る。通常、上記の量は、０．１〜３．０ｍｍｏｌ Ｈ＋／ｇ、より好ましくは０．３〜１．５ｍｍｏｌ Ｈ＋／ｇの範囲である。
【００２０】
好ましい態様によると、高い固体濃度（５０質量％以上）では、熱加水分解工程の間に、フミンや炭化物（char）のような望ましくない副産物の生成が起こり得るため、出発原料は、５質量％〜３０質量％、より好ましくは１０質量％〜２０質量％の固体濃度が得られるように、前もって希釈される。更に、その濃度が高いレベルに達したときに細胞増殖及びＰＨＡ生成を阻害し得る蟻酸、酢酸、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）のような、いくつかの他の微量の（minor）副産物が、スクロース、グルコース及びフルクトースの熱加水分解から生成され得る。本発明に従って反応条件を制御することにより、それらの副産物の生成が、実質的に減少し、望ましくない細胞阻害効果を回避し得る。
【００２１】
前処理工程は、スクロースのグルコース及びフルクトースへの加水分解、及びそれに続くグルコース及びフルクトースの４−ケト吉草酸への変換を達成し、単糖及び有機前駆物質の混合物をもたらすのに十分な時間、好ましくは実施される。好ましくは、前処理工程は、１５分〜１２時間、より好ましくは３０分〜６時間の時間で実施される。
【００２２】
生物反応器に供給する前に、前処理された原料は好ましくは周囲温度（例えば２０℃〜３５℃）に冷却され、次に生物反応器（又は発酵槽）に直接導入される。好ましい態様によると、適切な供給手順に従って前処理された原料は徐々に加えられて微生物細胞に与えられ、このことは細胞増殖、ポリマー生合成及びコポリマー組成の制御に重要である。コポリマー組成は得られるＰＨＡコポリマーの性質を決定するのに非常に重要である。細胞挙動は時間と線形ではないことを考慮すると、前処理された原料の供給速度は、時間の経過と共に、一定でないことが好ましい。例えば、発酵の初めでの前処理された原料の最初の添加の後、細胞増殖させ、且つグルコース及び４−ケト吉草酸の濃度を比較的低い値（好ましくは、グルコースについては０〜２０ｇ／ｌ及び４−ケト吉草酸については０〜２ｇ／ｌ）内に保つため、一定の時間（例えば約８〜１５時間）更なる添加はなされない。その後、前処理された原料の添加は実質的に一定の速度で再開され得る。
【００２３】
コポリマー組成を制御するため、上記に記載されるようなスクロース含有原料の前処理により調製される、二つの異なる前処理された原料が、好ましくは生物反応器に供給され得、第一の前処理された原料はグルコース及びフルクトースを含み、実質的に４−ケト吉草酸を含まず、第二の前処理された原料はグルコース及び４−ケト吉草酸を含み、実質的にフルクトースを含まない。第一の前処理された原料は、最初に供給され、細胞増殖を促進し、一方でＣ／Ｎ比を１０以下（高窒素栄養分含量）に保つ（４−ケト吉草酸及び他の副産物は、細胞に対して糖よりもより抑制的であり、低い細胞密度をもたらし得る）。この段階の間、少量のＰＨＢ（一般に細胞量の１０質量％未満）が生成される。その後、第二の前処理された原料の供給が開始され、コポリエステルを生成する。この第二の段階の間も、第二の前処理された原料と共に第一の前処理された原料の供給を続けて、コポリマーのモノマー組成を制御し、及びその結果物質の性質を制御することが好ましい。上記で述べたように、非常に高い含量の３ＨＶ及び４ＨＶは、減少した強度及び結晶化速度のようないくつかの不利点をもたらし得る。
【００２４】
生物反応器は、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）株の細胞のような、ポリヒドロキシアルカノエート生成微生物細胞を含む。培養工程は、発酵に適したｐＨ及び温度条件で実施され得る。一般に、温度は２５℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜３５℃の範囲内に保たれ、ｐＨ値は６．０〜７．５、より好ましくは６．５〜７．０の値で好ましくは維持される。
【００２５】
前処理された原料が酸性溶液であることを考慮すると、培養工程の間にｐＨ値を調整するために、ｐＨ値を所望の範囲内に維持するために徐々に加えられる、アンモニア水溶液のような塩基性物質が、好ましくは生物反応器に供給される。添加されたアンモニアもまた、細胞増殖のための窒素栄養分を提供する。水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カリウムのような他のアルカリ性溶液をアンモニア溶液に代えて、培地中の窒素に対する炭素の比（Ｃ／Ｎ）を制御してもよい。
【００２６】
細胞塊からのヒドロキシアルカノエートコポリマーの回収は、例えば、米国特許第７５１４５２５号及び国際特許出願国際公開第２０１１／０４５６２５号パンフレットに記載されるような、公知の技術に従って実施されてもよい。
【００２７】
以下の実施例は、その範囲を制限することなく、本発明を更に説明するために提供される。
【実施例】
【００２８】
実施例１
６９質量％の総固体及び６５質量％のスクロースを含む濃縮甜菜ジュースを、０．５６ｍｍｏｌ Ｈ＋／ｇ固体に相当する量でＨＣｌ溶液（３０質量％）を用いて酸性化した。前処理された甜菜ジュースを、水を用いて更に希釈し、２０質量％の総固体濃度を得た。
【００２９】
上記の酸性化及び希釈された甜菜ジュースを、１７０℃で１０時間の合計時間、処理した。グルコース、蟻酸、４−ケト吉草酸（４−ＫＶＡ）及び５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）の濃度を、（ＨＰＬＣによって）処理されたジュースの試料を分析することによって、時間の経過と共にモニターした。結果を本願に添付される図１のグラフに報告する。それらの結果から、４−ＫＶＡの濃度は、前処理の後４時間は実質的に安定であり、一方で、細胞増殖及びＰＨＡ生成に有害であり得る副産物であるＨＭＦの濃度は、前処理の持続時間を増やすことによって１０ｇ／Ｌ未満に減少したことが分かる。
【００３０】
そうして得られる加水分解溶液を、ＰＨＡ生成のためのラルストニア・ユートロファ株の培養に用いた。溶液は、８１ｇ／Ｌのグルコース、３６ｇ／Ｌの４−ＫＶＡ、１６ｇ／Ｌの蟻酸、４ｇ／ＬのＨＭＦ及び２ｇ／Ｌの酢酸を含んだ。溶液を、中和及び解毒なしに、生物反応器の供給溶液として直接用いた。培養を、ペンチトップ（bench top）生物反応器において制御条件下（３０℃、空気飽和の１０％より多い溶存酸素、及びｐＨ６．４〜６．８）で実施した。培地のｐＨをアンモニア溶液（１５％）及び酸性加水分解溶液を用いて制御した。細胞増殖の基本栄養分用の１１００ｍＬの無機塩溶液で始め、加水分解物溶液を生物反応器へ導入した。
【００３１】
時間の経過と共に生物反応器に供給された様々な成分の累積体積を、本願に添付される図２に報告する。
【００３２】
図２の供給手順に対応して、細胞密度、ＰＨＡ含量並びにＰＨＡの３ＨＢ、３ＨＶ及び４ＨＶのモル％の時間的経過を図３に報告する。ＰＨＢＶＶ中の主なモノマーは３ＨＢ（７１〜７４モル％）、続いて３ＨＶ（２３〜２６モル％）であり、一方、４ＨＶは微量成分（２〜３モル％）である。一つの加水分解溶液を用いることにより、ＰＨＡ発酵においてＰＨＢＶＶの化学組成を一定のレベルで制御し得る。
【００３３】
図４において、そうして得られるＰＨＢＶＶの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを報告する。
【００３４】
実施例２
第一の加水分解物溶液（溶液Ａ）を、１２０℃、４時間のサトウキビ糖蜜溶液（２０質量％スクロース、ｐＨ２．６）の熱加水分解によって調製した。主な加水分解産物は、グルコース及びフルクトースであり、無視できる量の酢酸、ＨＭＦ及び４−ケト吉草酸を含んだ。第二の加水分解物溶液（溶液Ｂ）を、１７０℃、５時間の熱加水分解によって甜菜溶液から得た（実施例１、図１参照）。主な加水分解産物は、グルコース（９１ｇ／Ｌ）及び４−ケト吉草酸（３２ｇ／Ｌ）であった。少量の産物は、蟻酸（１４ｇ／Ｌ）、ＨＭＦ（６ｇ／Ｌ）、酢酸（１ｇ／Ｌ）を含んだ。溶液Ｂ中にフルクトースは検出されなかった。
【００３５】
最初の無機塩溶液（１１００ｍＬ）で始め、図５に示されるように溶液Ａ及びＢの供給手順を用いて、生物反応器をフェドバッチ（fed-batch）モードで運転した。図５には時間に伴う溶液Ａ及びＢの累積体積（ｍｌ）に加え、最初のスクロース炭素及び加えられたアンモニア−Ｎから見積もったＣ／Ｎ比が示される。
【００３６】
図５の供給手順に対応して、細胞密度、ＰＨＡ含量並びにＰＨＡの３ＨＢ、３ＨＶ及び４ＨＶのモル％の時間経過を図６に報告する。実施例１（図３）と比較して、全体の３ＨＢの含量は増加し（８８．４モル％）、一方で３ＨＶ（１１．０モル％）及び４ＨＶ（０．６モル％）の含量は減少した。実質的に４−ケト吉草酸を含まない溶液Ａをフェドバッチ培養の初め及び終わりに導入したため、このことは予測される。実際に、溶液Ａを唯一の炭素源として用いると、ホモポリエステルであるＰ３ＨＢがグルコース及びフルクトースから生成された（ここではデータは示されない）。
【００３７】
実施例３
実施例２に従って得られる純粋なＰ３ＨＢ及びＰ３ＨＢ３ＨＶ４ＨＶ（３ＨＢ：３ＨＶ：４ＨＶ＝８８．４：１１：０．６）を、凍結乾燥させた細胞塊から熱いクロロホルム中に抽出した。白い沈殿が形成されるまでメタノールを徐々に加えることにより（７５％メタノール及び２５％クロロホルム）、溶解したポリマーをクロロホルムから沈殿させた。ポリマーをろ過し、後の使用のため空気中及び更にオーブン中で乾燥した。
【００３８】
溶融体からの結晶化
精製されたＰ３ＨＢ及びＰ３ＨＢ３ＨＶ４ＨＶを、それぞれ１８０℃又は１６０℃で、周囲条件で約１０分間溶解し、その後、すぐに減衰全反射（ＡＴＲ）を備えるフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）のウィンドウに置いた。溶融ポリマーを冷却すると、ＩＲ吸収が継続的にモニターされ、バイオポリエステルの結晶化が測定された。バイオポリマーの結晶度を１１８４ｃｍ−１の波数で測定し、冷却時間に対してプロットした。結果を図７に報告する。Ｐ３ＨＢは、ＰＨＢＶＶよりも、高い結晶度及び速い結晶化速度を有した。
【００３９】
ＰＨＡ骨格中の１１モル％の３−ＨＶ及び０．６モル％の４−ＨＶの存在は、結晶度を下げるのみでなく、ＰＨＢＶＶの結晶化プロセスを遅らせる。溶融ＰＨＡの遅い凝固がバイオプラスチックの熱処理における問題を引き起こし得るため、その結果、ＰＨＢＶＶの化学組成の制御は、所望の熱的及び機械的性質を有するバイオプラスチックの製造に必須である。
【００４０】
引張試験
精製されたＰＨＡを熱いクロロホルム中に溶解することにより、ＰＨＢ及びＰＨＢＶＶのフィルムを調製した。室温に冷却した後、溶液を清潔なガラス表面上に流延して薄いフィルム（約０．３ｍｍ）にした。フィルムを空気中で５、１５及び２５日間熟成させた（age）。フィルムを３〜４ｍｍ２のおおよその断面積及び２５ｍｍの初期長を有する薄い細片（１０ｍｍ）に切断した。細片を引張試験装置内に置き、破損まで負荷をかけて破断させた。機械的性質を表１に報告する。
【００４１】
表１
0005986213.tif 000006
【００４２】
上記の試験は、Ｐ３ＨＢが高い弾性率及び低い破断点伸びを有する硬い物質であり、一方で、Ｐ３ＨＢ３ＨＶ４ＨＶは比較的低い弾性率を有するが、高い破断点伸びを有することを、明らかに示す。結果はまた、引張試験前にフィルムを２５日間熟成させて、完全な溶媒の蒸発及びＰＨＡ分子の結晶化をさせるべきであることを示す。文献中に報告されるＰＨＢ（５％）及びＰＨＢＶ（３ＨＢ：３ＨＶ＝９０：１０）（５０％）の破断点伸び（延性）と比較して、本発明に従って得られるＰＨＢＶＶ（３ＨＢ：３ＨＶ：４ＨＶ＝８８．４：１１．０：０．６）は、おそらくはＰＨＢＶの結晶化（crystalline）を妨げる少量の４ＨＶの存在のため、ＰＨＢＶよりも高い延性（１０５％）を示す。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕ヒドロキシアルカノエートコポリマーの製造方法であって、以下の工程、
（ｉ）酸性溶液中でスクロース含有原料を前処理する工程、
（ｉｉ）前記前処理された原料を、ポリヒドロキシアルカノエート生成微生物細胞を含む生物反応器に供給する工程、
（ｉｉｉ）前記ポリヒドロキシアルカノエート生成微生物細胞を培養し、ヒドロキシアルカノエートコポリマーを含む細胞塊を形成する工程、
（ｉｖ）前記細胞塊から前記ヒドロキシアルカノエートコポリマーを回収する工程、
を含む、方法。
〔２〕酸性媒体における前記前処理工程が、（ｉ−ａ）前記スクロース含有原料を酸性化して１．０〜４．０、好ましくは２．０〜３．０のｐＨ値にする工程、及び（ｉ−ｂ）前記酸性化されたスクロース含有原料を７０℃〜２５０℃、好ましくは１００℃〜２００℃の温度で加熱する工程、によって実施される、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記スクロース含有原料が、果汁、サトウキビ糖蜜、甜菜パルプ、甜菜糖蜜等のような有機植物粗原料の処理から得られる、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記前処理工程において、前記原料が、酸性物質、好ましくはブレンステッド酸を加えることにより酸性化される、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５〕前記ブレンステッド酸が、塩酸、硫酸、リン酸、及びそれらの混合物から選択される、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記酸性物質が、０．１〜３．０ｍｍｏｌ Ｈ+／ｇ、好ましくは０．３〜１．５ｍｍｏｌ Ｈ+／ｇのＨ+／固体比で原料に加えられる、前記〔４〕に記載の方法。
〔７〕前記出発原料が、５質量％〜３０質量％、好ましくは１０〜２０質量％の固体濃度が得られるように前もって希釈される、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕前記前処理工程が、１５分〜１２時間、好ましくは３０分〜６時間の時間で実施される、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕前記前処理された原料が、前記生物反応器への供給工程の前に、周囲温度まで冷却され、次に、前記生物反応器に直接導入される、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕細胞増殖、ポリマー生合成及びコポリマー組成を制御するために、前記前処理された原料が、前もって決められた供給手順に従って前記生物反応器に供給される、前記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕二つの異なる前処理された原料が前記生物反応器に供給され、第一の前処理された原料がグルコース及びフルクトースを含み、実質的に４−ケト吉草酸を含まず、第二の前処理された原料がグルコース及び４−ケト吉草酸を含み、実質的にフルクトースを含まない、前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１２〕前記培養工程が、発酵に適したｐＨ及び温度条件で実施される、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１３〕前記培養工程が２５℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜３５℃の温度で実施される、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕前記培養工程が、６．０〜７．５、好ましくは６．５〜７．０のｐＨ値で実施される、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１５〕前記培養工程の間にｐＨ値を調整するために、塩基性物質、好ましくはアンモニア水溶液が前記生物反応器に供給される、前記〔１４〕に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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