(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵調味料の製造方法において、
異化代謝産物抑制（catabolite repression）様現象を利用した方法により得られる枯草菌の芽胞形成能欠損株を、固形物当たり３０％以上のタンパク質を含有する食品であって、水分を含有しかつ流動性を有するペースト状、スラリー状又は液体の流動物に接種した後、振盪、通気もしくは撹拌又はそれらの組合せにより好気的に発酵させる発酵工程と、
該発酵後に発酵物を１００℃以下で殺菌する殺菌工程と、
を含むことを特徴とする発酵調味料の製造方法。
【請求項２】
食品が、細切処理、粉砕処理、抽出処理を単独又は組み合わせて処理した食品である、請求項１に記載の発酵調味料の製造方法。
【請求項３】
発酵前又は発酵工程と並行して、タンパク質を含む食品をプロテアーゼで処理する工程を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の発酵調味料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、枯草菌の芽胞形成能欠損株を用いた発酵調味料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
枯草菌（Bacillus subtilis）は、種々の発酵食品に利用されている。
主な枯草菌による発酵食品としては、日本の納豆や豆腐よう（沖縄地方）、中国及び台湾の臭豆腐や豆腐よう、韓国のチョングッチャン、ネパールのキネマ等がある。枯草菌による発酵食品は、低級脂肪酸やピラジン化合物に由来する特徴的な風味があり、栄養価が高く、様々な機能性成分を含有するが、枯草菌が芽胞形成能を有するため、発酵食品中に栄養細胞や芽胞が存在し、品質劣化や枯草菌による製造設備又は他製品への汚染等の問題がある。
【０００３】
枯草菌芽胞を死滅させるためには、例えば、１２０℃、２０分間以上の加圧加熱殺菌や１８０℃、３０分間以上の乾熱殺菌等の過酷な条件での殺菌処理が必要とされ、このような条件で殺菌した場合、殺菌後の発酵食品の風味や色が大きく損なわれる。そのため、枯草菌による発酵食品の食品産業における利用範囲は限定されており、特に調味料として利用されている例はない。
【０００４】
枯草菌による発酵食品の一つである納豆について、その保存性を高めるために、例えば、乾燥納豆を、１０５℃にて減圧湿熱殺菌又はガス湿熱殺菌により殺菌処理を行うことにより胞子が残存しない無菌納豆の製造方法（特許文献１）、が開示されているが、乾燥工程及び１００℃よりも高い温度での加熱工程が必要であることから、枯草菌による発酵食品本来の風味を維持することは困難である。また、従来の芽胞形成能を有する枯草菌を利用することから、殺菌前の納豆、少なくとも乾燥納豆には多くの芽胞が存在しているため、依然として製造設備における菌汚染の問題がある。
【０００５】
芽胞形成能欠損変異株については、例えば、納豆菌を紫外線等の変異誘起剤で処理して得た、胞子形成能が欠損あるいは低下したビタミンＫ高生産性納豆菌変異株を培養することを特徴とするビタミンＫの生産方法（特許文献２）が開示されている。この方法については、菌体培養に一般的に用いられる培地を利用して培養を行った場合、溶菌することが文献内に指摘されており、広く工業的に利用する上では適するものではない。また、当該芽胞形成能欠損変異株を培養して得られる培養物が１００℃以下の加熱殺菌によって殺菌できることに関する記述はない。さらに、一般的に紫外線、放射線又はニトロソグアニジン等の変異原を用いた処理によって得られる変異株は、変異箇所が不明であるのと同時に、複数の遺伝子が変異する可能性があり、菌が本来持つ性質を大きく変えてしまうという問題があるし、復帰変異により芽胞形成能が復元するという問題がある。
【０００６】
また、遺伝子組み換えにより特定の遺伝子を破壊し、胞子の発芽率が低下した又は胞子形成能が低下した納豆菌変異株、及び当該変異株を用いた除菌・殺菌が困難な胞子の少ない納豆（特許文献３及び４）が開示されている。しかしながら、これらの変異株は、容易に形質が変わるという問題や、発芽能や芽胞形成能が復元するという問題がある。また、遺伝子組み換え法については枯草菌の特定の複数の遺伝子を選択的に破壊する必要があるため、非効率的であるとともに技術的な課題がある。さらに、遺伝子組み換え微生物を利用すること、及び遺伝子破壊状態を維持するためにカナマイシン等の抗生物質による選択圧を必要とすること等から、食品産業における利用が大きく制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−６１１７号公報
【特許文献２】特開２０００−８３６５３号公報
【特許文献３】特開２０１０−１１５１３９号公報
【特許文献４】特開２０１１−１０６３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、枯草菌による発酵食品については、該発酵食品中に芽胞が存在せず、風味や栄養成分を損なわない程度の殺菌条件で殺菌された発酵食品、特に発酵調味料が求められているが、このような発酵調味料については、報告がない。
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明は、遺伝子組み換えや人為的突然変異により造成された枯草菌の芽胞形成能欠損変異株ではなく、自然突然変異による方法により得られる枯草菌の芽胞形成能欠損株を、タンパク質を含有する食品に接種して発酵させることを特徴とする発酵調味料の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、枯草菌に属する微生物による発酵に着目し鋭意研究した結果、遺伝子組み換えや人為的突然変異により造成された枯草菌の芽胞形成能欠損変異株ではなく、自然突然変異による方法により得られる枯草菌の芽胞形成能欠損株を、タンパク質を含有する食品に接種して発酵させることにより、芽胞が存在せず、風味や栄養成分を損なわない程度の殺菌条件で殺菌することができる発酵調味料を効率的に製造することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明には、下記の態様が含まれる。
項（１）
発酵調味料の製造方法において、自然突然変異による方法により得られる枯草菌の芽胞形成能欠損株を、タンパク質を含有する食品に接種した後、好気的に発酵させる発酵工程と、
該発酵後に発酵物を殺菌する殺菌工程と、
を含むことを特徴とする発酵調味料の製造方法。
項（２）
タンパク質を含む食品が、固形物当たり３０％以上のタンパク質を含む食品であることを特徴とする項（１）に記載の発酵調味料の製造方法。
項（３）
自然突然変異による方法が、異化代謝産物抑制（catabolite repression）様現象を利用した方法であることを特徴とする項（１）又は項（２）に記載の発酵調味料の製造方法。
項（４）
発酵前又は発酵工程と並行して、タンパク質を含む食品をプロテアーゼで処理する工程を含むことを特徴とする項（１）乃至項（３）に記載の発酵調味料の製造方法。
項（５）
殺菌工程が、１００℃以下で行われることを特徴とする項（１）乃至項（４）のいずれか１項に記載の発酵調味料の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、得られる発酵調味料中に芽胞が存在しないため、該発酵調味料の加工又は該発酵調味料を用いた加工において、製造設備及び製品の微生物面での衛生管理が容易となり、さらに、該発酵調味料の食品産業における利用範囲を拡大することができる。また、本発明によれば、該発酵調味料中に芽胞が存在しないため、緩和な条件による殺菌を行うことができ、風味良好な発酵調味料を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、自然突然変異による方法により得られる枯草菌の芽胞形成能欠損株を、タンパク質を含有する食品に接種して発酵させ、さらに、殺菌して得られる発酵調味料の製造方法を提供するものである。
【００１４】
本発明は、発酵調味料の製造方法において、自然突然変異による方法により得られる枯草菌の芽胞形成能欠損株を、タンパク質を含有する食品に接種した後、好気的に発酵させる発酵工程と、該発酵後に発酵物を殺菌する殺菌工程と、を含むことを特徴とする発酵調味料の製造方法である。
【００１５】
本発明において、自然突然変異による方法により得られる枯草菌の芽胞形成能欠損株を、タンパク質を含有する食品に接種する工程について、以下に詳述する。
【００１６】
本発明において親株として用いる枯草菌（Bacillus subtilis）は、好気性のグラム染色陽性桿菌であり、芽胞形成能を有する。
【００１７】
本発明において親株として用いる枯草菌（Bacillus subtilis）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構等から入手することができる。具体的には、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＮＢＲＣ３００９、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＮＢＲＣ３０１３、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＮＢＲＣ１３１６９等が挙げられる。
【００１８】
芽胞形成能欠損株を得る方法としては、遺伝子組み換え技術により芽胞形成関連遺伝子をノックアウトすることで芽胞形成能欠損株を造成する遺伝子組み換えによる方法、放射線や紫外線やニトロソ化合物やアルキル化剤等の各種変異原で処理して芽胞形成能欠損株を誘発する人為的突然変異による方法、培養中に芽胞形成能が自然に変化して欠損した株をスクリーニングする自然突然変異による方法等が挙げられるが、本発明においては、自然突然変異による方法により芽胞形成能欠損株を得る。本発明において得られる芽胞形成能欠損株は、自然突然変異による方法により得られることから、食品産業における利用が制限されるものではない。
【００１９】
本発明において用いる枯草菌の芽胞形成能欠損株を取得する方法は、培養中に芽胞形成能が変化して欠損した株をスクリーニングする自然突然変異による方法であれば限定されないが、具体的には、枯草菌を一定の培養条件下で繰り返し培養することにより、芽胞形成能欠損株を取得することが好ましい。例えば、４８℃〜５０℃の高温で培養を行う高温培養法や、野生株と欠損株のコロニーのメラニン色素の着色により識別するランダム法、異化代謝産物抑制（catabolite repression）様現象を利用した方法（Ｊ．Ｆ．Ｍｉｃｈｅｌ，Ｂ．Ｃａｍｉ，Ｐ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ：Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ，１１４，１１；２１（１９６８））が挙げられる。中でも、異化代謝産物抑制様現象を利用した方法がより好ましい。異化代謝産物抑制様現象を利用する方法により得られる芽胞形成能欠損株は、芽胞形成能とともにリゾチーム活性及び形質転換能が欠損しているため、溶菌による問題がなく継代することができ、芽胞形成能欠損という形質を維持することができる。
【００２０】
異化代謝産物抑制様現象を利用する方法は、例えば、硝酸塩を唯一の窒素源とする培地で枯草菌を繰り返し希釈して培養する方法や、クエン酸やヒスチジンを単一炭素源とする培地で植え継ぐ方法等が挙げられる。好ましくは、硝酸塩を唯一の窒素源とする培地で枯草菌を繰り返し希釈して培養する方法であり、具体的には、ＮａＮＯ３やＫＮＯ３等の硝酸塩を唯一の窒素源とする培地で対数増殖期末期に達した枯草菌細胞を繰り返し希釈して培養し、枯草菌の芽胞形成能欠損株を取得する方法である。硝酸塩を唯一の窒素源とする培地を用いる場合、該培地は、本発明における枯草菌の芽胞形成能欠損株を取得することができるものであればいずれでもよく、例えば、以下の［培地Ａ］が挙げられる。
【００２１】
［培地Ａの組成］
グルコース：１０ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３：３ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４：２．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．２ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ：３ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３：６８ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ：７ｍｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２：０．６ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：３ｍｇ／Ｌ、ＮｉＳＯ４・Ｈ２Ｏ：０．５ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ：２０μｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ：５０μｇ／Ｌ、Ｌ−アスコルビン酸：３２０ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸アミド：４４ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム：２４ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩：１７ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩：５ｍｇ／Ｌ、リボフラビン：４ｍｇ／Ｌ、葉酸：０．８ｍｇ／Ｌ、ビオチン：０．３ｍｇ／Ｌ、シアノコバラミン：８μｇ／Ｌ
【００２２】
本発明において、枯草菌の芽胞形成能欠損株を取得する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、硝酸塩を唯一の窒素源とする培地で枯草菌を繰り返し希釈して培養する方法であれば、具体的に以下の方法が挙げられる。
すなわち、硝酸塩を唯一の窒素源とする培地で枯草菌を、３０℃で５〜７日間、繰り返し希釈して培養することにより、芽胞形成能欠損株を集積させる。集積した培養液を適宜希釈して標準寒天培地で培養し、出現したコロニーをピックアップして、さらに適切な培地、例えば以下記載のＳｃｈａｅｆｆｅｒ培地等で、３７℃で７２時間、培養し、得られた培養液を、加熱処理（例えば８０℃、１０分間）した後、標準寒天培地で培養し、コロニーが出現しない菌株を芽胞形成能欠損株とする。
【００２３】
［Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ培地の組成］
ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．１２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２：１ｍＭ、ＭｎＣｌ２：１０μＭ、ＦｅＳＯ４：１μＭ、ｐＨ７．０
【００２４】
本発明において、原料のタンパク質を含む食品は、その食品中にタンパク質を含んでいればよいが、タンパク質を固形物当たり３０％以上含む食品が好ましい。このような食品は、例えば、豆類、乳類、畜肉類、魚介類、酵母、酒粕等が挙げられる。中でも、豆類にあっては、大豆、そらまめが好ましく、畜肉類にあっては、鶏肉、豚肉、牛肉が好ましく、魚介類にあっては、カツオ、サバ、イワシが好ましい。魚介類においては、それら魚介類から得られる節類（荒節、裸節、枯節等）であってもよい。また、原料のタンパク質を含む食品は、未加熱のものでも、加熱処理したものでもよい。
【００２５】
さらに、本発明においては、タンパク質を含む食品を細切処理、粉砕処理、抽出処理等を行って用いることもできる。これら処理方法は、公知の手段を単独又は組み合わせて行えばよい。
例えば、細切処理又は粉砕処理する方法では、切断、破砕、摩擦、空気圧、水圧等を利用して加工する各種の裁断機、粉砕機等が挙げられ、具体的には、カッター、スライサー、ダイサー、チョッパー、グラインダー、ミキサー、ミル等を用いることができる。細切処理又は粉砕処理したものの例としては、きな粉、呉、挽肉、魚粉等が挙げられる。
また、例えば、抽出処理する方法では、常温抽出、加熱抽出、加圧抽出、撹拌抽出、超音波抽出等が挙げられ、好ましくは、加熱抽出により抽出処理する。通常、抽出処理は、食品加工に用いることのできる水等による溶媒抽出であり、好ましくは、水、アルコール、水−アルコール混合溶液による抽出である。また、その抽出時間及び抽出温度は、被抽出物の物性やその抽出方法により適宜決定されるが、抽出温度については、通常２０〜１５０℃、抽出時間については、通常１分間〜２４時間である。
本発明において、タンパク質を含む食品の抽出物は、抽出後そのまま又は固液分離して得られた液部を用いることができるが、好ましくは抽出後固液分離して得られた液部を用いる。また、いずれにおいても、その濃縮物を用いることができる。抽出処理したものの例としては、豆乳、畜肉類エキス、魚介類エキス、酵母エキス等が挙げられる。
【００２６】
本発明において、原料のタンパク質を含む食品は、水分を含有し、かつ流動性を有するペースト状、スラリー状又は液状の流動物として用いられる。原料のタンパク質を含む食品を、ペースト状、スラリー状又は液体の流動物にする方法は、特に限定されず、食材の加工に一般的に用いられる方法で行われ、必要であれば、加水してペースト状、スラリー状又は液体にしてもよく、粉砕した原料を水中に分散させることで、ペースト状、スラリー状又は液体としてもよい。
【００２７】
本発明において、原料のタンパク質を含む食品は、発酵工程の前に、殺菌して用いることが好ましい。殺菌条件は、微生物を殺菌できる温度及び時間であればよく、通常、常圧下８０℃以上で５〜１２０分、加圧下１００〜１４０℃で０．１〜４０分間を例示することができる。また、酸性液中で殺菌を行うとより効果的に殺菌することができる。
【００２８】
本発明において、原料のタンパク質を含む食品は、好気的条件下で枯草菌の芽胞形成能欠損株により発酵される。すなわち、該食品に枯草菌の芽胞形成能欠損株を接種し、振盪、通気もしくは撹拌又はそれらの組合せにより発酵させる。発酵の温度及び時間は、発酵が適切に行われる条件であればよく、温度は、通常２０〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃であり、時間は、通常１時間〜４８時間、好ましくは１時間〜３６時間、より好ましくは、２〜２４時間である。
【００２９】
本発明において、得られる発酵調味料の風味をさらに向上させるために、発酵前又は発酵工程と並行して、タンパク質を含む食品をプロテアーゼで処理することが好ましい。プロテアーゼで処理することにより、発酵調味料中にグルタミン酸等のアミノ酸やペプチド等のタンパク質分解物が生じ、旨味やコク味が増し、風味が向上する。プロテアーゼの使用量は、酵素活性の力価に応じて決定することができ、特に限定はされないが、通常、タンパク質を含む食品の重量に対して０．０１〜５００Ｕ／ｇ程度である。
【００３０】
本発明において用いるプロテアーゼは、食品に用いることができるプロテアーゼであればいずれでもよく、動物由来、植物由来又は微生物由来のプロテアーゼを１種又は２種以上組み合わせて使用することができる。動物由来のプロテアーゼとしてはペプシンやトリプシン等、植物由来のプロテアーゼとしてはパパイン等、微生物由来のプロテアーゼとしては糸状菌由来や枯草菌由来等のプロテアーゼを挙げることができる。
【００３１】
本発明において用いる市販プロテアーゼとしては、例えば、ウマミザイムＧ（天野エンザイム株式会社製、Aspergillus属由来）、スミチーム（登録商標）ＦＰ（新日本化学工業株式会社製、Aspergillus属由来）、ヌクレイシン（登録商標）（エイチビィアイ株式会社製、Bacillus属由来）、精製パパインＦＬ−３（アサヒフードアンドヘルスケア株式会社製、パパイヤ由来）等が挙げられる。
【００３２】
本発明において、発酵工程により得られた発酵物は、殺菌処理される。
本発明においては、発酵調味料中に芽胞が存在しないため、緩和な条件による殺菌処理を行うことができ、殺菌処理後の発酵調味料の風味、色、テクスチャーが損なわれない、風味良好な発酵調味料を提供することができる。
本発明において、加熱殺菌による殺菌処理条件は、殺菌後の物性風味が許容されるものであればよく、適宜設定することができるが、加熱温度は、少なくとも１００℃以下であり、好ましくは、７０〜１００℃であり、加熱時間は、温度に応じて決定され、通常、１〜６０分である。
【００３３】
本発明の製造方法による発酵調味料中には芽胞が存在しないため、当該発酵調味料を加工する場合、製造設備及び製品の微生物については芽胞を死滅させる程の強力な殺菌処理が求められず、衛生管理が容易である。
また、本発明による殺菌後の発酵調味料は、殺菌が適切に行われれば、枯草菌による発酵食品としては菌数が顕著に少なく、食品産業において広く利用することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。なお、本発明において、培地に用いる各成分又は素材の配合％又は濃度はすべて、重量部ベースである。
【００３５】
［取得例１］（芽胞形成能欠損株の取得１）
自然突然変異による方法である異化代謝産物抑制（catabolic repression）様現象を利用した方法により、枯草菌の芽胞形成能欠損株を取得した。具体的には、以下の方法による。
枯草菌（Bacillus subtilis）ＮＢＲＣ３０１３株（以下「ＮＢＲＣ３０１３株」という）を、硝酸塩を唯一の窒素源とする培地Ａ（本願明細書段落番号００２１記載）を用いて、３回繰り返し希釈して振盪培養（３０℃、１２０時間）した後、培養液を適宜希釈して標準寒天培地に塗沫し、３０℃で２日間培養した。培養後に生じたコロニーから１６菌株ピックアップし、それぞれＳｃｈａｅｆｆｅｒ培地（本願明細書段落００２３記載）を用いて３７℃で７２時間振盪培養した。得られた培養液を８０℃で１０分間、加熱処理した後、標準寒天培地に塗沫し、３０℃で４８時間培養したところ、１６菌株のうち９菌株についてコロニーが出現した。そこで、１６菌株のうちコロニーが出現しなかった７菌株が芽胞形成能欠損株であると判断し、その７菌株のうちからさらに１菌株を任意に選択し、Ｂ．３０１３ΔＳｐｏＡ株とした。
【００３６】
［試験例１］（芽胞形成能欠損株の確認試験）
Ｂ．３０１３ΔＳｐｏＡ株が、枯草菌の芽胞形成能欠損株であることを確認するために、増殖温度及び耐熱性菌数の測定について試験を行った。
【００３７】
増殖温度についての試験は、ＮＢＲＣ３０１３株とＢ．３０１３ΔＳｐｏＡ株とを、それぞれ標準寒天培地を用いて、３０、３７、４０、４５、５０℃の各温度で２０時間培養して増殖度合いを試験した。その結果を表１に示す。
【００３８】
耐熱性菌数の測定についての試験は、ＮＢＲＣ３０１３株とＢ．３０１３ΔＳｐｏＡ株とを、それぞれＳｃｈａｅｆｆｅｒ培地（本願明細書段落番号００２３記載）を用いて、３７℃で７２時間振盪培養して得られた培養液を、８０℃で１０分間加熱処理した後、一般生菌数を常法により検査した。その結果を表２示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１について、ＮＢＲＣ３０１３株及びＢ．３０１３ＡΔＳｐｏ株とも、３７、４０、４５℃が増殖大で最適温度であり、同様な特性を示した。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
表２について、ＮＢＲＣ３０１３株は、８０℃、１０分間の加熱処理後においても１０６個／ｇ程度の生菌が検出され、芽胞を形成していることが確認された。一方、Ｂ．３０１３ΔＳｐｏＡ株は、８０℃、１０分間の加熱処理後において生菌が検出されなかったことから、芽胞を形成していない、すなわち芽胞形成能欠損株であることが確認された。
【００４３】
［実施例１］（殺菌処理済み大豆発酵調味料の作製）
きな粉２０４ｇを、水９９６ｇと共に２Ｌ容ジャーファメンターに入れて混合し、オートクレーブを用いて１２１℃で１５分間殺菌処理をした。殺菌処理後、４０℃まで冷却し、枯草菌の芽胞形成能欠損株であるＢ．３０１３ΔＳｐｏＡ株の前培養液（生菌数１０８個／ｇ程度）を６ｇ接種し、プロテアーゼ（ウマミザイムＧ）０．６ｇを添加して、４０℃で１５時間、通気撹拌発酵した。なお、前培養液については、Ｂ．３０１３ΔＳｐｏＡ株のコロニーを、水に酵母エキス２重量％とグルコース２重量％を配合した培地に接種して、４０℃で７時間、振盪培養することで得られた培養液を前培養液として使用した。
通気撹拌発酵して得られた発酵物（一般生菌数：６．７×１０７個／ｇ）を、８０℃で１０分間殺菌することにより、殺菌処理済み大豆発酵調味料（実施例１）１１００ｇ（Ｂｒｉｘ１３．６°）を得た。この殺菌処理済み大豆発酵調味料について、一般生菌数を常法により検査した。また、食品分析用テストコンビネーションであるＦ−キットＬ−グルタミン酸（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いてＬ−グルタミン酸含量を測定した。それぞれの結果を表３に示す。
また、得られた殺菌処理済み大豆発酵調味料を官能評価したところ、枯草菌発酵物特有の好ましい風味及び旨みを十分に有しており、調味料素材として良好な風味を有していた。
【００４４】
［比較例１］
発酵菌を芽胞形成能を有するＮＢＲＣ３０１３株とする以外は、実施例１と同様に通気撹拌発酵した。通気撹拌発酵して得られた発酵物（一般生菌数：４．８×１０８個／ｇ）を、８０℃で１０分間殺菌することにより、殺菌処理済み大豆発酵調味料（比較例１）１１００ｇ（Ｂｒｉｘ１３．５°）を得た。
この殺菌処理済み大豆発酵調味料について、実施例１と同様にして、生菌数及びＬ−グルタミン酸含量を測定した。それぞれの結果を表３に示す。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
表３について、本発明により得られた殺菌処理済み大豆発酵調味料（実施例１）は、親株であるＮＢＲＣ３０１３株を用いて発酵することにより得られた比較例１の殺菌処理済み大豆発酵調味料と同等のグルタミン酸を含有するとともに、一般生菌が検出されなかった。また、本発明により得られた殺菌処理済み大豆発酵調味料（実施例１）の官能評価結果は、８０℃、１０分間という緩和な殺菌条件であるため、加熱による影響がほとんどなく、風味良好であった。
一方、比較例１の殺菌処理済み大豆発酵調味料は、芽胞が存在しているため、一般生菌が３．０×１０６個／ｇ検出された。
【００４７】
［取得例２］（芽胞形成能欠損株の取得２）
親株として、枯草菌（Bacillus subtilis）ＮＢＲＣ１３１６９株を用いること以外は、取得例１と同様にして、枯草菌の芽胞形成能欠損株Ｂ．１３１６９ΔＳｐｏＢ株を得た。
【００４８】
［実施例２］（殺菌処理済み発酵ポークエキスの作製）
ポークエキス（Ｂｒｉｘ６０°）１０ｇを、水３９ｇ及びグルコース１ｇと共に２００ｍｌ容三角フラスコに入れて混合し、オートクレーブを用いて１２１℃で１５分間殺菌処理をした。殺菌処理後、３７℃まで冷却し、枯草菌の芽胞形成能欠損株であるＢ．１３１６９ΔＳｐｏＢ株の前培養液（生菌数１０８個／ｇ程度）を１ｇ接種し、プロテアーゼ（スミチームＦＰ）０．０５ｇを添加して、３７℃で２０時間、振盪発酵した。なお、前培養液については、Ｂ．１３１６９ΔＳｐｏＢ株のコロニーを、水に酵母エキス２重量％とグルコース２重量％を配合した培地に接種して、３７℃で７時間、振盪培養することで得られた培養液を前培養液として使用した。
振盪発酵して得られた発酵物（一般生菌数：１．２×１０８個／ｇ）を、７０℃で３０分間加熱殺菌することにより、殺菌処理済み発酵ポークエキス（実施例２）４０ｇ（Ｂｒｉｘ１３．８°）を得た。
この殺菌処理済み発酵ポークエキスについて、実施例１と同様にして、一般生菌数及びＬ−グルタミン酸含量を測定した。それぞれの結果を表４に示す。
また、得られた殺菌処理済み発酵ポークエキスを官能評価したところ、枯草菌発酵物特有の好ましい風味及び旨みを有しており、調味料素材として良好な風味を有していた。
【００４９】
［比較例２］
発酵菌を芽胞形成能を有するＮＢＲＣ１３１６９株とする以外は、実施例２と同様にして、振盪発酵した。振盪発酵して得られた発酵物（一般生菌数：５．６×１０８個／ｇ）を、７０℃で３０分間加熱殺菌することにより、殺菌処理済み発酵ポークエキス（比較例２）４０ｇ（Ｂｒｉｘ１３．８°）を得た。
この殺菌処理済み発酵ポークエキスについて、実施例１と同様にして、一般生菌数及びＬ−グルタミン酸含量を測定した。それぞれの結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
表４について、本発明により得られた殺菌処理済み発酵ポークエキス（実施例２）は、親株であるＮＢＲＣ１３１６９株を用いて発酵することにより得られた比較例２の殺菌処理済み発酵ポークエキスと同等のグルタミン酸を含有するとともに、一般生菌が検出されなかった。また、本発明により得られた殺菌処理済み発酵ポークエキス（実施例２）の官能評価結果は、７０℃、３０分間という緩和な殺菌処理条件であるため、加熱による影響がほとんどなく、風味良好であった。
一方、比較例２の殺菌処理済み発酵ポークエキスは、芽胞が存在しているため、一般生菌が２．２×１０６個／ｇ検出された。
【００５２】
［実施例３］（殺菌処理済み発酵チキンエキスの作製）
チキンエキス（Ｂｒｉｘ４０°）１０ｇを、水４０ｇ及びプロテアーゼ（スミチームＦＰ）０．１ｇと共に２００ｍｌ容三角フラスコに入れて混合し、５０℃で５時間酵素処理した後、オートクレーブを用いて１２１℃で１５分間殺菌処理をした。殺菌処理後、３７℃まで冷却し、枯草菌の芽胞形成能欠損株であるＢ．３０１３ΔＳｐｏＡ株の前培養液（生菌数１０８個／ｇ程度）を１ｇ接種して、３７℃で２０時間、振盪発酵した。なお、前培養液については、Ｂ．３０１３ΔＳｐｏＡ株のコロニーを、水に酵母エキス２重量％とグルコース２重量％を配合した培地に接種して、３７℃で７時間、振盪培養することで得られた培養液を前培養液として使用した。
振盪発酵して得られた発酵物（一般生菌数：６．０×１０７個／ｇ）を、７０℃で３０分間加熱殺菌することにより、殺菌処理済み発酵チキンエキス（実施例３）４５ｇ（Ｂｒｉｘ７．５°）を得た。
この殺菌処理済み発酵チキンエキスについて、実施例１と同様にして、一般生菌数及びＬ−グルタミン酸含量を測定した。それぞれの結果を表５に示す。
また、得られた殺菌処理済み発酵チキンエキスを官能評価したところ、枯草菌発酵物特有の好ましい風味及び旨みを有しており、調味料素材として良好な風味を有していた。
【００５３】
［比較例３］
発酵菌を芽胞形成能を有するＮＢＲＣ３０１３株とする以外は、実施例３と同様にして、振盪発酵した。振盪発酵して得られた発酵物（一般生菌数：３．８×１０８個／ｇ）を、７０℃で３０分間加熱殺菌することにより、殺菌処理済み発酵チキンエキス（比較例３）４５ｇ（Ｂｒｉｘ７．６°）を得た。
この殺菌処理済み発酵チキンエキスについて、実施例１と同様にして、一般生菌数及びＬ−グルタミン酸含量を測定した。それぞれの結果を表５に示す。
【００５４】
【表５】
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【００５５】
表５について、本発明により得られた殺菌処理済み発酵チキンエキス（実施例３）は、親株であるＮＢＲＣ３０１３株を用いて発酵することにより得られた比較例３の殺菌処理済み発酵チキンエキスと同等のグルタミン酸を含有するとともに、一般生菌が検出されなかった。また、本発明により得られた殺菌処理済み発酵チキンエキス（実施例３）の官能試験結果は、７０℃、３０分間という緩和な殺菌処理条件であるため、加熱による影響がほとんどなく、風味良好であった。
一方、比較例３の殺菌処理済み発酵チキンエキスは、芽胞が存在しているため、一般生菌が３．０×１０６個／ｇ検出された。