(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体は、
アミノ酸配列Thr Tyr Ser Met Asnを有するＶＨ  ＣＤＲ１、および
アミノ酸配列Ser Ile Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Glyを有するＶＨ  ＣＤＲ２、および
アミノ酸配列Asp Leu Val Thr Ser Met Val Ala Phe Asp Tyrを有するＶＨ  ＣＤＲ３、および
アミノ酸配列Ser Gly Asp Ala Leu Pro Gln Lys Tyr Val Pheを有するＶＬ  ＣＤＲ１、および
アミノ酸配列Glu Asp Ser Lys Arg Pro Serを有するＶＬ  ＣＤＲ２、および
アミノ酸配列Tyr Ser Thr Asp Arg Ser Gly Asn His Arg Valを有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
アイソタイプ対照抗体と比較して、異種移植モデルにおけるヒト癌細胞系の成長を阻害する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体は、１２２位のＡｓｐ、１２５位のＡｒｇ、または１１３位のＡｒｇの３つのアミノ酸残基のうちの少なくとも２つを含む、ヒトＢ７−Ｈ１の細胞外ドメイン上のエピトープに結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体は、競合アッセイによって決定して、ヒトＢ７−Ｈ１上の５４位にＩｌｅ、１１７位にＳｅｒ、および１２１位にＡｌａを含むエピトープへの結合を示さない、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体は、前記ヒトＢ７−Ｈ１上の前記１１３位のＡｒｇがＡｌａ、またはＴｙｒ、またはＬｅｕに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体は、前記ヒトＢ７−Ｈ１上の前記１２５位のＡｒｇがＡｌａ、またはＧｌｎ、またはＳｅｒに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体は、前記ヒトＢ７−Ｈ１上の１２３位のＡｒｇがＡｌａ、またはＰｈｅ、またはＴｈｒに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を保持する、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体は、ヒトＢ７−Ｈ１上の１９位のＰｈｅ、２０位のＴｈｒ、または１２２位のＡｓｐの３つのアミノ酸残基のうちの少なくとも２つに結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体は、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１上の５４位にＩｌｅ、１１５位にＭｅｔ、１１７位にＳｅｒ、および１２１位にＡｌａを含むエピトープへの結合を示さない、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体は、前記ヒトＢ７−Ｈ１上の前記１９位のＰｈｅがＡｌａ、またはＧｌｙ、またはＳｅｒに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体は、前記ヒトＢ７−Ｈ１上の前記２０位のＴｈｒがＡｌａ、またはＶａｌ、またはＡｓｐに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体は、前記ヒトＢ７−Ｈ１上の前記１２２位のＡｓｐがＡｓｎまたはＧｌｕに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体は、前記ヒトＢ７−Ｈ１上の１２３位のＡｒｇがＡｌａ、またはＰｈｅ、またはＴｈｒに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を保持する、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体は、Ｆｃ変異体をさらに含み、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されているＥＵ指標により番号付けして、２３４Ｆ、２３５Ｆ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１６に記載の抗体をコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子を含むベクターを形質移入された宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載の、前記抗体を発現する前記宿主細胞を培養することを含む方法により産生される抗体。
【請求項２０】
請求項１または２に記載の抗体を含む組成物。
【請求項２１】
請求項１または２に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
配列番号６２のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号６７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
配列番号６２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
【請求項２６】
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ７−Ｈ１タンパク質に対する標的結合剤およびそのような薬剤の使用に関する。一部の実施形態において、本発明は、Ｂ７−Ｈ１を対象とする完全ヒトモノクローナル抗体およびそれらの抗体の使用に関する。本発明の態様はまた、そのような標的結合剤または抗体を発現する細胞系にも関する。記載される標的結合剤は、Ｂ７−Ｈ１の活性および／または発現に関連する疾患の診断薬として、および当該疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
順応性免疫応答は、Ｔ細胞およびＢ細胞と呼ばれる２つの主要なリンパ細胞の活性化、選択、およびクローン増殖が関与する。抗原に遭遇した後、Ｔ細胞は増殖し、抗原特異的エフェクター細胞に分化し、一方、Ｂ細胞は増殖し、抗体分泌細胞に分化する。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間のいくつかのシグナル伝達事象を必要とする多段階プロセスである。Ｔ細胞活性化が生じるためには、２種類のシグナルが休止Ｔ細胞に送達されなければならない。第１の種類は、抗原特異的Ｔ細胞レセプター（ＴｃＲ）によって媒介され、免疫応答に特異性を付与する。第２の同時刺激の種類は、応答の程度を調節し、Ｔ細胞上の補助レセプターを通して送達される。
【０００３】
主な同時刺激シグナルは、そのリガンドであるＢ７−１またはＢ７−２の係合時に活性化ＣＤ２８レセプターを通して送達される。それに対して、同じＢ７−１またはＢ７−２リガンドによる阻害ＣＴＬＡ−４レセプターの係合は、Ｔ細胞応答の減衰をもたらす。よって、ＣＴＬＡ−４シグナルは、ＣＤ２８により媒介される同時刺激を拮抗する。高抗原濃度で、ＣＤ２８同時刺激は、ＣＴＬＡ−４阻害作用を無効にする。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４発現の時間的調節は、活性化シグナルと阻害シグナルとの間のバランスを維持し、効果的な免疫応答の発生を確実にし、一方で、自己免疫の発生を防ぐ。
【０００４】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の分子相同体ならびにそれらのＢ−７様リガンドが、近年、特定された。ＩＣＯＳは、ＣＤ２８様同時刺激レセプターである。ＰＤ−１（プログラム死１）は、阻害レセプターであり、ＣＴＬＡ−４の対応物である。本開示は、Ｂ７−Ｈ１により媒介される免疫応答の調節に関する。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１としても知られるＢ７−Ｈ１は、大きさが約５３ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である。ヒトにおいて、Ｂ７−Ｈ１は、活性化および反応不顕性／消耗Ｔ細胞を含むいくつかの免疫細胞型上、無感作および活性化Ｂ細胞上、ならびに骨髄樹状細胞（ＤＣ）、単球、およびマスト細胞上で発現する。それは膵島、肝臓のクッパー細胞、血管内皮、および選択された上皮、例えば、気道上皮および尿細管上皮を含む非免疫細胞上でも発現し、ここで、その発現は、炎症性症状の発現時に強化される。Ｂ７−Ｈ１発現は、増加レベルで、乳房、結腸、結腸直腸、肺、腎臓を含むがこれらに限定されない、いくつかの腫瘍上でも認められ、腎細胞腫、胃、膀胱、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、および膵癌、ならびにメラノーマを含む。
【０００６】
Ｂ７−Ｈ１は、Ｂ７ファミリーのタンパク質の成員であり、２つの細胞外Ｉｇドメインを含有し、１つのＮ末端Ｖ型ドメインの後にＣ型ドメインが続く。３０のアミノ酸の長さの細胞内ドメインは、明らかなシグナル伝達モチーフを含有しないが、タンパク質キナーゼＣリン酸化の潜在的部位を有する。マウス形態のＢ７−Ｈ１は、ヒト形態のＢ７−Ｈ１と６９％のアミノ酸同一性を有し、また保存構造も共有する。
【０００７】
Ｂ７−Ｈ１は、２つの代替リガンドに結合することが知られており、これらのうちの１つであるＰＤ−１は、当初、活性化誘発されたアポトーシスを受けるＴ細胞系で特定された、５０〜５５ｋＤａのＩ型膜貫通レセプターである。ＰＤ−１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、および単球、ならびに免疫系の他の細胞上で発現し、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）および関連するＢ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）の双方に結合する。２つ目は、Ｂ７ファミリーの成員であるＢ７−１であり、これは、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、および抗原提示細胞上で発現する。
【０００８】
ＰＤ−１は、その細胞外領域に単一のＩｇ  Ｖ様ドメインを含有する、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの成員である。ＰＤ−１細胞質ドメインは、２つのチロシンを含有し、最も膜に近位のチロシン（マウスＰＤ−１においてＶＡＹＥＥＬ）は、ＩＴＩＭ（免疫レセプターチロシン系阻害モチーフ）内に位置する。ＰＤ−１上におけるＩＴＩＭの存在は、この分子が細胞質ホスファターゼの動員により抗原レセプターシグナル伝達を減衰するように機能することを示す。ヒトとマウスのＰＤ−１タンパク質は、４つの可能性のあるＮグリコシル化部位の保存とＩｇ−Ｖドメインを画定する残基で、約６０％のアミノ酸同一性を共有する。細胞質領域のＩＴＩＭおよびカルボキシ末端チロシン（ヒトおよびマウスにおいてＴＥＹＡＴＩ）を包囲するＩＴＩＭ様モチーフは、ヒトとマウスのオルソログ間でも保存される。
【０００９】
ＰＤ−１／Ｂ７−Ｈ１軸を介するシグナル伝達は、Ｔ細胞応答を負に調節することにより、免疫系内で、重要で非冗長の機能を果たすと考えられている。この調節は、胸腺におけるＴ細胞発達、慢性炎症性応答の調節、ならびに抹消耐容性および免疫特権の双方の維持に関与する。これらの機能の重要性は、ＰＤ−１欠損マウスに例証され、これは、自己免疫表現型を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＤ−１欠損は、慢性進行性狼瘡様糸球体腎炎および関節炎をもたらす。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＤ−１欠損は、心組織特異的自己反応抗体の存在により重篤な心筋症をもたらす。Ｂ７−Ｈ１／Ｂ７−１を介するシグナル伝達の機能は、あまり明らかではないが、Ｔ細胞および抗原提示細胞の双方への負の調節シグナルの送達に関与するとも考えられている。
【００１０】
腫瘍細胞上でのＢ７−Ｈ１発現は、免疫系による検出および排除の回避において、腫瘍を助けると考えられている。Ｂ７−Ｈ１は、この点において、腫瘍浸潤Ｔリンパ細胞の消耗および反応不顕性を促進する、免疫抑制サイトカインの腫瘍微小環境への分泌を刺激する、抑制調節Ｔ細胞機能を刺激する、およびＢ７−Ｈ１発現腫瘍細胞を腫瘍細胞特異的細胞毒性Ｔ細胞による溶解から保護することを含む、いくつかの代替機構を介して機能する。
【００１１】
一般に、例えば、癌および慢性のウイルス感染等の免疫応答の抑制に関連する障害のための安全で効果的な治療方法を提供する必要性が存在する。これらの障害に関与する免疫応答の調節は、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−１経路を操作することにより達成することができる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ１の生物学的活性を阻害する標的結合剤に関する。本発明の一実施形態において、本発明は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによってＢ７−Ｈ１活性を阻害する標的結合剤に関する。本発明の別の実施形態において、本発明は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによってＢ７−Ｈ１のＰＤ−１への結合を阻害する標的結合剤に関する。本発明のまた別の実施形態において、本発明は、Ｂ７−Ｈ１誘発されたＴ細胞抑制を遮断し、それによって、抗腫瘍免疫を強化する標的結合剤に関する。本発明のまた別の実施形態において、本発明は、さらに、混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２分泌を含む活性のうちの１つ以上をさらに刺激することができる標的結合剤に関する。本発明の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ１の生物学的活性を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、標的結合剤の不在において生じるであろうよりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の生物学的活性を阻害する。
【００１３】
本発明の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによってＢ７−Ｈ１活性を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、標的結合剤の不在において生じるであろうよりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＢ７−Ｈ１活性を阻害する。
【００１４】
本発明の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによってＰＤ−１への結合を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、標的結合剤の不在において生じるであろうものと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＢ７−Ｈ１／ＰＤ−１レセプターリガンド結合を阻害する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、ＰＤ−１／ＦｃのＥＳ−２細胞上で発現するヒトＢ７−Ｈ１への結合を阻害することができる。一実施形態において、標的結合剤は、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、または０．０６ｎＭ未満のＩＣ５０で結合を阻害する。さらに、別の実施形態において、本発明の抗体は、約１ｎＭから約０．０６ｎＭに至るまで、または約０．５ｎＭから約０．０６ｎＭに至るまで、または約０．１ｎＭから約０．０６ｎＭに至るまで、または約１ｎＭから約０．１ｎＭに至るまで、または約１ｎＭから約０．５ｎＭに至るまでのＩＣ５０を有する。
【００１６】
本発明の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによってそのリガンドであるＢ７−１への結合を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、標的結合剤の不在において生じるであろうものと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のＢ７−Ｈ１／Ｂ７−１レセプターリガンド結合を阻害する。
【００１７】
本発明の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ１誘発された腫瘍増殖を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、標的結合剤の不在において生じるであろうよりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＢ７−Ｈ１誘発された腫瘍増殖を阻害する。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによってＢ７−Ｈ１誘発された腫瘍細胞の生存を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、標的結合剤の不在において生じるであろうよりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＢ７−Ｈ１誘発された腫瘍細胞の生存を阻害する。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによってＡ３７５またはＨＰＡＣ癌細胞系の腫瘍成長を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、アイソタイプ対照と比較して、３０日目で、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の癌細胞の成長を阻害する。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによって腫瘍反応性Ｔ細胞のＢ７−Ｈ１媒介抑制を阻害し、それによって抗腫瘍細胞溶解性Ｔ細胞活性を強化する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、標的結合剤の不在において生じるであろうよりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の腫瘍反応性Ｔ細胞活性のＢ７−Ｈ１媒介抑制を阻害する。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによって抗腫瘍免疫を強化する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、標的結合剤の不在において生じるであろうよりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の抗腫瘍免疫を強化する。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、それによって細胞増殖を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、標的結合剤の不在において生じるであろうよりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞増殖を阻害する。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ１発現腫瘍細胞に対する特異的細胞溶解（ＣＴＬ）活性を増加する標的結合剤に関する。一実施形態において、本発明の抗体は、１００ｎＭ、５０ｎＭ、もしくは１ｎＭ以下のＥＣ５０を有する。さらに、別の実施形態において、本発明の抗体は、約１００ｎＭから約１ｎＭに至るまで、または約５０ｎＭから約１ｎＭに至るまで、または約２０ｎＭから約１ｎＭに至るまで、または約１００ｎＭから約５０ｎＭに至るまで、または約１００ｎＭから約７０ｎＭに至るまでのＥＣ５０を有する。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、１００ｎＭ以下のＥＣ５０で、Ｔ細胞増殖のＢ７−Ｈ１媒介抑制を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、本発明の抗体は、１００ｎＭ以下、例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｎＭのＥＣ５０を有する。さらに、別の実施形態において、本発明の抗体は、約１００ｎＭから約１０ｎＭに至るまで、または約５０ｎＭから約１０ｎＭに至るまで、または約２０ｎＭから約１０ｎＭに至るまで、または約１００ｎＭから約５０ｎＭに至るまで、または約１００ｎＭから約７０ｎＭに至るまで、または約１００ｎＭから約８０ｎＭに至るまでのＥＣ５０を有する。
【００２５】
標的結合剤は、腫瘍細胞の付着、運動性、侵入、および細胞転移も阻害し、加えて、標的結合剤は、腫瘍成長の低下に有用である。これを達成することができる機構は、Ｂ７−Ｈ１活性の阻害を含むが、これに限定されない。
【００２６】
本発明の一実施形態において、標的結合剤は抗体である。本発明の一実施形態において、標的結合剤は、モノクローナル抗体である。本発明の一実施形態において、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体、またはその断片である。そのようなモノクローナル抗体は、本明細書において、抗Ｂ７−Ｈ１抗体または本発明の抗体と称される。
【００２７】
抗体、モノクローナル抗体、およびヒトモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４アイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ２を含む。本発明の一実施形態において、標的結合剤は、ＩｇＧ２アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。このアイソタイプは、他のアイソタイプと比較して、エフェクター機能を誘発する可能性が低く、これは、毒性の低下をもたらし得る。本発明の別の実施形態において、標的結合剤は、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプと比較して、抗体指向性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発する可能性が高く、これは、有効性の向上をもたらし得る。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ４と比較して、向上した安定性を有し、これは、生体利用能の向上／製造の簡易化／長い半減期をもたらし得る。一実施形態において、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体は、ｚ、ｚａ、またはｆのアロタイプである。本発明の一実施形態において、標的結合剤は、Ｂ７−Ｈ１への高結合親和性、生体外および生体内のＢ７−Ｈ１活性を阻害する能力、Ｂ７−Ｈ１媒介腫瘍細胞の生存を阻害する能力、および腫瘍反応性Ｔ細胞のＢ７−Ｈ１媒介抑制を阻害する能力うちの１つ以上から選択される、望ましい治療特性を有し、これは、ひいては腫瘍細胞増殖、運動性、侵入、転移、および腫瘍成長を低下させることができる。
【００２８】
一実施形態において、本発明は、非常に高い親和性（Ｋｄ）でＢ７−Ｈ１に特異的に結合する抗体を含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤は、５ナノモル（ｎＭ）未満の結合親和性（Ｋｄ）でＢ７−Ｈ１に結合する。他の実施形態において、標的結合剤は、４ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、または１ｎＭ未満のＫｄで結合する。さらに、一部の他の実施形態において、本発明の抗体は、約５ｎＭ〜約１ｎＭ、または約５ｎＭ〜約２ｎＭ、または約５ｎＭ〜約３ｎＭ、または約５ｎＭ〜約４ｎＭ、または約３ｎＭ〜約１ｎＭ、または約２ｎＭ〜約１ｎＭのＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤は、９５０ピコモル（ｐＭ）未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤は、９００ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。他の実施形態において、標的結合剤は、８００ｐＭ、７００ｐＭ、または６００ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤は、５００ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。他の実施形態において、標的結合剤は、４００ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。さらに他の実施形態において、標的結合剤は、３００ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。一部の他の実施形態において、標的結合剤は、２００ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。一部の他の実施形態において、標的結合剤は、１００ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。さらに、一部の他の実施形態において、本発明の抗体は、約９００ｐＭ〜約１００ｐＭ、または約９００ｐＭ〜約２００ｐＭ、または約９００ｐＭ〜約３００ｐＭ、または約９００ｐＭ〜約４００ｐＭ、または約９００ｐＭ〜約５００ｐＭ、または約９００ｐＭ〜約６００ｐＭ、または約９００ｐＭ〜約７００ｐＭ、または約２００ｐＭ〜約１００ｐＭ、または約３００ｐＭ〜約２００ｐＭ、または約４００ｐＭ〜約３００ｐＭのＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。一部の他の実施形態において、標的結合剤は、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５５ｐＭ、または５０ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。一部の他の実施形態において、標的結合剤は、６０ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。一部の他の実施形態において、標的結合剤は、５５ｐＭ未満のＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。さらに、一部の他の実施形態において、本発明の抗体は、約１００ｐＭ〜約５０ｐＭ、または約１００ｐＭ〜約７０ｐＭ、または約１００ｐＭ〜約８０ｐＭ、または約１００ｐＭ〜約９０ｐＭ、または約７０ｐＭ〜約５０ｐＭ、または約６０ｐＭ〜約５０ｐＭ、または約５５ｐＭ〜約５０ｐＭのＫｄでＢ７−Ｈ１に結合する。Ｋｄは、本明細書に記載される、または当業者に公知の方法を使用して評価することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。本発明の標的結合剤は、従来の技術において報告されている抗体と比較して、Ｂ７−Ｈ１への大幅に向上した結合親和性を有する。
【００２９】
本発明の標的結合剤または抗体の結合特性は、解離または会合速度（それぞれ、ｋｏｆｆおよびｋｏｎ）を参照することによっても測定することができる。
【００３０】
本発明の一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、少なくとも１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）kon→Ａｂ−Ａｇ）を有する。さらに、一部の他の実施形態において、本発明の抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、約５×１０４Ｍ−１ｓ−１〜約５×１０８Ｍ−１ｓ−１、または約５×１０５Ｍ−１ｓ−１〜約５×１０８Ｍ−１ｓ−１、または約５×１０６Ｍ−１ｓ−１〜約５×１０８Ｍ−１ｓ−１、または約５×１０７Ｍ−１ｓ−１〜約５×１０８Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度を有する。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、５×１０−１ｓ−１未満、１０−１ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、または１０−１０ｓ−１未満のｋｏｆｆ速度（（Ａｂ−Ａｇ）koff→抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ））を有する。さらに、一部の他の実施形態において、本発明の抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定して、約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−５ｓ−１、または約１×１０−４ｓ−１〜約５×１０−４ｓ−１のｋｏｆｆ速度を有する。
【００３２】
本発明の標的結合剤は、ヒトＢ７−Ｈ１に特異的に結合する。一部の実施例において、本発明の標的結合剤は、他の免疫共調節タンパク質、例えば、ヒトＰＤ−Ｌ２、ヒトＢ７−Ｈ２、ヒトＢ７−Ｈ３、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＴＬＡ−４、およびヒトＰＤ１に結合しない。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、他の種からの他のＢ７−Ｈ１タンパク質と交差反応性である。一実施形態において、本発明の標的結合剤は、カニクイザルＢ７−Ｈ１と交差反応性である。別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、マウスＢ７−Ｈ１、例えば、２．７Ａ４と交差反応性である。別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、カニクイザルＢ７−Ｈ１およびマウスＢ７−Ｈ１、例えば２．７Ａ４と交差反応性である。別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、カニクイザルＢ７−Ｈ１と交差反応性であるが、マウスＢ７−Ｈ１、例えば、２．９Ｄ１０および２．１４Ｈ９とは交差反応性ではない。
【００３４】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８に示される重鎖配列（ＶＨ）のうちのいずれか１つを含む配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、または２．１４Ｈ９ＯＰＴの重鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。軽鎖乱交雑は、当該分野において定着しており、よって、抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、もしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴ、または本明細書に開示される別の抗体の重鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む標的結合剤または抗体は、表９に示される軽鎖配列（ＶＬ）、または抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、もしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴ、あるいは本明細書に開示される他の抗体のうちのいずれか１つをさらに含み得る。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、または，２．１４Ｈ９ＯＰＴの重鎖配列のうちのいずれか１つを含み、抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、または２．１４Ｈ９ＯＰＴの対応する軽鎖配列をさらに含む配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３５】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、表９に示される軽鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、または２．１４Ｈ９ＯＰＴの軽鎖配列のうちのいずれか１つを含む配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３６】
別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．７Ａ４の重鎖配列のいずれかを含み、抗体２．７Ａ４の軽鎖配列をさらに含む配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．１４Ｈ９の重鎖配列のいずれかを含み、抗体２．１４Ｈ９の軽鎖配列をさらに含む配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．９Ｄ１０の重鎖配列のいずれかを含み、抗体２．９Ｄ１０の軽鎖配列をさらに含む配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．７Ａ４ＯＰＴの重鎖配列のいずれかを含み、抗体２．７Ａ４ＯＰＴの軽鎖配列をさらに含む配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴの重鎖配列のいずれかを含み、抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴの軽鎖配列をさらに含む配列を含む。
【００３７】
一部の実施形態において、標的結合剤は、表１に示されるモノクローナル抗体のうちのいずれか１つである。一部の実施形態において、標的結合剤は、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、または２．１４Ｈ９ＯＰＴから成る群より選択されるモノクローナル抗体である。一実施形態において、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、または２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちの１つ以上を含む。ある実施形態において、標的結合剤は、モノクローナル抗体２．７Ａ４である。ある他の実施形態において、標的結合剤は、モノクローナル抗体２．１４Ｈ９である。さらに他の実施形態において、標的結合剤は、モノクローナル抗体２．９Ｄ１０である。ある実施形態において、標的結合剤は、モノクローナル抗体２．７Ａ４ＯＰＴである。ある他の実施形態において、標的結合剤は、モノクローナル抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴである。さらなる実施形態において、標的結合剤は、前述のモノクローナル抗体のいずれかより導き出すことができる。
【００３８】
別の実施形態において、標的結合剤は、それぞれ、２００８年１１月１９日に番号４１５９８の下、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、および２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇ、２．１４Ｈ９＿Ｇ、および２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされる重鎖可変配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つを含む配列を含み得る。
【００３９】
別の実施形態において、標的結合剤は、それぞれ、２００８年１１月１９日に番号４１５９８の下、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、または２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下に寄託された、２．７Ａ４＿Ｇ、２．１４Ｈ９＿Ｇ、および２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つを含む配列を含み得る。
【００４０】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に受託番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされたＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、２００８年１１月１９日に受託番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされたＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。
【００４１】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に受託番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００４２】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に受託番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００４３】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に受託番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、２００８年１１月１９日に受託番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。
【００４４】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされたＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００４５】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされたＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされたＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。
【００４６】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００４７】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００４８】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。
【００４９】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされたＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００５０】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされたＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされたＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。
【００５１】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００５２】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【００５３】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。
【００５４】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の重鎖可変配列を含む。
【００５５】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の重鎖可変配列を含む。
【００５６】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の重鎖可変ドメイン配列を含む。
【００５７】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の軽鎖可変ドメインを含む。
【００５８】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の軽鎖可変ドメインを含む。
【００５９】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の軽鎖可変ドメインを含む。
【００６０】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の重鎖可変ドメイン配列と、２００８年１１月１９日に番号４１５９８の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．７Ａ４＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の軽鎖可変ドメイン配列とを含む。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の軽鎖可変ドメイン配列と、２００８年１１月１９日に番号４１５９７の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．１４Ｈ９＿Ｇと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の重鎖可変ドメイン配列とを含む。
【００６２】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の重鎖可変ドメイン配列と、２００８年１１月１９日に番号４１５９９の下、ＮＣＩＭＢに寄託された、２．９Ｄ１０＿ＮＧと指定されるプラスミド中のポリヌクレオチドによりコードされた抗体の軽鎖可変ドメイン配列とを含む。
【００６３】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８に示される配列のうちのいずれか１つより選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む配列を含み得る。一実施形態において、標的結合剤または抗体は、表９に示される配列のうちのいずれか１つより選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む配列を含み得る。一実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、または３．１８Ｇ１のＣＤＲのうちのいずれか１つより選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む配列を含み得る。一実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、または３．１８Ｇ１のＣＤＲのうちのいずれか１つより選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む配列を含み得る。
【００６４】
さらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、表９に示されるＣＤＲ２配列のうちの１つと、ＣＤＲ３配列のうちの１つとを含む配列を含む、標的結合剤または抗体である。さらなる実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８に示されるＣＤＲ３配列を含む配列をさらに含む。さらなる実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８および／または表９に示されるＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む配列をさらに含む。さらなる実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８および／または表９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む配列をさらに含む。
【００６５】
別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８に示される完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、または２．９Ｄ１０のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つを含む配列を含み得る。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、表９に示される完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、または２．９Ｄ１０のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つを含む配列を含み得る。一実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８に示される完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、または２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む配列を含み得る。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、表９に示される完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、または２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む配列を含み得る。
【００６６】
別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８に示される完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列と、表９に示される、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列とを含む配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８に示される完全ヒトモノクローナル抗体２．１４Ｈ９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列と、表９に示される、完全ヒトモノクローナル抗体２．１４Ｈ９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列とを含む配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、表８に示される完全ヒトモノクローナル抗体２．９Ｄ１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列と、表９に示される完全ヒトモノクローナル抗体２．９Ｄ１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列とを含む配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６７】
当業者は、ＣＤＲの決定を容易に達成することができることに留意する。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３を参照のこと。Ｋａｂａｔは、多数の種の抗体のアイソタイプからの免疫グロブリン鎖の多重配列アライメントを提供する。アライメントされた配列は、単一付番方式である、Ｋａｂａｔ付番方式に従い番号付けされる。Ｋａｂａｔ配列は、１９９１の公表から更新され、電子配列データベース（現在、Ｋａｂａｔデータベースウェブサイトから入手可能、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，２８（１），２１４−２１８も参照のこと）として入手可能である。いかなる免疫グロブリン配列も、Ｋａｂａｔ参照配列とのアライメントを実施することにより、Ｋａｂａｔに従い番号付けすることができる。したがって、Ｋａｂａｔ付番方式は、免疫グロブリン鎖を番号付けするための統一方式を提供する。
【００６８】
本発明のさらなる実施形態は、配列２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、もしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つの、または表８もしくは表９に示されるフレームワーク領域およびＣＤＲに及ぶ近接配列、特に、ＦＲ１からＦＲ４まで、またはＣＤＲ１からＣＤＲ３までを含む配列を含む標的結合剤または抗体である。本発明のさらなる実施形態は、配列２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、もしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つの、または表８および表９に示されるフレームワーク領域およびＣＤＲに及ぶ近接配列、特に、ＦＲ１からＦＲ４まで、またはＣＤＲ１からＣＤＲ３までを含む配列を含む標的結合剤または抗体である。一実施形態において、標的結合剤または抗体は、モノクローナル抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、もしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴの配列のうちのいずれか１つの、または表８もしくは表９に示されるフレームワーク領域およびＣＤＲに及ぶ近接配列、特に、ＦＲ１からＦＲ４まで、またはＣＤＲ１からＣＤＲ３までを含む配列を含む。本発明のさらなる実施形態は、モノクローナル抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、３．１５Ｇ８、２．２０Ａ８、３．１８Ｇ１、２．７Ａ４ＯＰＴ、もしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴの配列のうちのいずれか１つの、または表８および表９に示されるフレームワーク領域およびＣＤＲに及ぶ近接配列、特に、ＦＲ１からＦＲ４まで、またはＣＤＲ１からＣＤＲ３までを含む配列を含む標的結合剤または抗体である。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６９】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、表８もしくは９に示されるＣＤＲ３配列、または表８もしくは９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の配列のうちのいずれか１つ、または表８に示される軽鎖可変ドメイン配列のうちのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列、または表９に示される重鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む。
【００７０】
一実施形態は、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質を提供し、薬剤、もしくは抗体、またはその抗原結合タンパク質は、配列番号２、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３７、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５７、配列番号６２、配列番号６７、配列番号７２、または配列番号７７を含む配列を含む。
【００７１】
一実施形態は、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質を提供し、薬剤、もしくは抗体、またはその抗原結合タンパク質は、配列番号２の配列を含む重鎖配列を含む。一実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号７の配列を含む軽鎖配列をさらに含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７２】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００７３】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号１２の配列を含む重鎖配列を含む。一実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号１７の配列を含む軽鎖配列をさらに含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７４】
一実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００７５】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号２２の配列を含む重鎖配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号２７の配列を含む軽鎖配列をさらに含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７６】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号２７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００７７】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号３２の配列を含む重鎖配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号３７の配列を含む軽鎖配列をさらに含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７８】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号３７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００７９】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号４２の配列を含む重鎖配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号４７の配列を含む軽鎖配列をさらに含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００８０】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号４２のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号４７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００８１】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号５２の配列を含む重鎖配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号５７の配列を含む軽鎖配列をさらに含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００８２】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号５２のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号５７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００８３】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号６２の配列を含む重鎖配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号６７の配列を含む軽鎖配列をさらに含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００８４】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号６２のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号６７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００８５】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号７２の配列を含む重鎖配列を含む。別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号７７の配列を含む軽鎖配列をさらに含む。一部の実施形態において、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００８６】
別の実施形態において、標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの抗原結合タンパク質は、配列番号７２のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号７７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００８７】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、本明細書に開示されるＣＤＲの変異形もしくは誘導体、フレームワーク領域およびＣＤＲ（特に、ＦＲ１からＦＲ４まで、もしくはＣＤＲ１からＣＤＲ３まで）に及ぶ近接配列、本明細書に開示される軽鎖もしくは重鎖の配列、または本明細書に開示される抗体を含む。変異形は、表８もしくは表９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つに２０、１６、１０、９もの、もしくはそれ以下、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのアミノ酸の添加、置換、欠損、および／または挿入を有する配列、表８もしくは表９に示されるフレームワーク領域およびＣＤＲ（特に、ＦＲ１からＦＲ４まで、もしくはＣＤＲ１からＣＤＲ３まで）に及ぶ近接配列、本明細書に開示される軽鎖もしくは重鎖の配列を含む、または本明細書に開示されるモノクローナル抗体を含む、標的結合剤または抗体を含む。変異形は、表８もしくは表９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれか１つに１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸の添加、置換、欠損、および／または挿入を有する配列、表８もしくは表９に示されるフレームワーク領域およびＣＤＲ（特に、ＦＲ１からＦＲ４まで、もしくはＣＤＲ１からＣＤＲ３まで）に及ぶ近接配列、本明細書に開示される軽鎖もしくは重鎖配列を含む、または本明細書に開示されるモノクローナル抗体を含む、標的結合剤または抗体を含む。変異形は、表８もしくは表９に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちのいずれかと少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、もしくは約９９％のアミノ酸配列の同一性を有する配列、表８もしくは表９に示されるフレームワーク領域およびＣＤＲ（特に、ＦＲ１からＦＲ４まで、もしくはＣＤＲ１からＣＤＲ３まで）に及ぶ近接配列、本明細書に開示される軽鎖もしくは重鎖配列を含む、または本明細書に開示されるモノクローナル抗体を含む、標的結合剤または抗体を含む。２つのアミノ酸配列の同一性％は、ペアワイズタンパク質アライメントを含むがそれらに限定されない、当業者に公知のいずれかの方法によって決定することができる。一実施形態において、変異形は、天然に生じる、または組み換えＤＮＡ技術もしくは変異誘発技術を使用した未変性配列の生体外操作によって導入される、本明細書に開示されるＣＤＲ配列、または軽鎖もしくは重鎖の配列における変更を含む。天然に生じる変異形は、外来性抗原に対する抗体の生成中、対応する生殖系列ヌクレオチド配列に生体内で生成されるものを含む。
【００８８】
一実施形態において、変異形(変異体)は、
（ａ）配列番号３と同一のアミノ酸配列、または配列番号３に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４と同一のアミノ酸配列、または配列番号４に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５と同一のアミノ酸配列、または配列番号５に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号８のＶＬ  ＣＤＲ１と同一のアミノ酸配列、または配列番号８のＶＬ  ＣＤＲ１に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号９と同一のアミノ酸配列、または配列番号９に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号１０と同一のアミノ酸配列、または配列番号１０に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を有する配列を含む、標的結合剤または抗体を含む。
【００８９】
別の実施形態において、変異形は、
（ａ）配列番号２３と同一のアミノ酸配列、または配列番号２３に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４と同一のアミノ酸配列、または配列番号２４に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２５と同一のアミノ酸配列、または配列番号２５に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２８のＶＬ  ＣＤＲ１と同一のアミノ酸配列、または配列番号２８のＶＬ  ＣＤＲ１に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２９と同一のアミノ酸配列、または配列番号２９に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号３０と同一のアミノ酸配列、または配列番号３０に対して１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を有する配列を含む、標的結合剤または抗体を含む。
【００９０】
一実施形態において、誘導体は、異種抗体、つまり、２つ以上の抗体が一緒に連結される抗体であり得る。誘導体は、化学的に修飾された抗体を含む。例としては、水溶性ポリマー、Ｎ結合型もしくはＯ結合型炭水化物、糖類、リン酸塩、および／または他のそのような分子等の、１つ以上のポリマーの共有結合が挙げられる。誘導体は、結合される分子の型または位置のいずれかにおいて、天然に生じる、または開始抗体と異なる様式で修飾される。誘導体はさらに、抗体上に天然に存在する１つ以上の化学基の欠損を含む。
【００９１】
本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２を含む配列を含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２を含む配列を含み、配列番号２は、表１０の各列に示される生殖系列および非生殖系列の残基の独特な組み合わせのうちのいずれか１つを含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２を含む配列を含み、配列番号２は、表１０に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、または５つ全てを含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２を含む配列を含み、配列番号２は、表１０の各列に示される生殖系列および非生殖系列の残基の独特な組み合わせのうちのいずれか１つを含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２を含む配列を含み、配列番号２は、表１０に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ、または５つ全てを含む。
【００９２】
本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号７を含む配列を含み、配列番号７は、表１１の各列に示される生殖系列および非生殖系列の残基の独特な組み合わせのうちのいずれか１つと、表１１の各列に示される生殖系列および非生殖系列の残基の独特な組み合わせのうちのいずれか１つとを含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号７を含む配列を含み、配列番号７は、表１１に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ、または５つ全てを含む。
【００９３】
発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号１２を含む配列を含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号１２を含む配列を含み、配列番号１２は、表１２の各列に示される生殖系列および非生殖系列の残基の独特な組み合わせのうちのいずれか１つを含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号１２を含む配列を含み、配列番号１２は、表１２に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、または２つ全てを含む。
【００９４】
本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号１７を含む配列を含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号１７を含む配列を含み、配列番号１７は、表１３の各列に示される生殖系列および非生殖系列の残基の独特な組み合わせのうちのいずれか１つを含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号１７を含む配列を含み、配列番号１７は、表１３に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、または４つ全てを含む。
【００９５】
本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２７を含む配列を含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２７を含む配列を含み、配列番号２７は、表１４の各列に示される生殖系列および非生殖系列の残基の独特な組み合わせのうちのいずれか１つを含む。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２７を含む配列を含み、配列番号２７は、表１４に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、または３つ全てを含む。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１への結合において、本発明の標的結合剤または抗体と競合する、標的結合剤または抗体である。本発明の別の実施形態において、Ｂ７−Ｈ１への結合において、本発明の標的結合剤または抗体と競合する抗体がある。別の実施形態において標的結合剤または抗体は、Ｂ７−Ｈ１への結合において、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、もしくは２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴもしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つと競合する。「競合」とは、標的結合剤または抗体がＢ７−Ｈ１への結合において、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、もしくは２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴもしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つと競合する、すなわち、競合は一方向性であることを示す。
【００９７】
本発明の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１への結合において、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、もしくは２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴもしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つと交差競合する標的結合剤または抗体を含む。「交差競合」とは、標的結合剤または抗体がＢ７−Ｈ１への結合において、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、もしくは２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴもしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つと競合し、また逆の場合も同様である、すなわち、競合は二方向性であることを示す。
【００９８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の標的結合剤もしくは抗体と同じ、ヒトＢ７−Ｈ１の細胞外ドメイン上のエピトープ、または複数のエピトープに結合する標的結合剤または抗体である。本発明の実施形態は、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、もしくは２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴもしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つと同じ、ヒトＢ７−Ｈ１の細胞外ドメイン上のエピトープ、または複数のエピトープに結合する標的結合剤または抗体も含む。
【００９９】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、１２２位のＡｓｐおよび１２５位のＡｒｇから成る群より選択されるアミノ酸のうちの少なくとも１つ以上を含む、ヒトＢ７−Ｈ１上のエピトープに結合する。別の実施形態において、本発明の抗体は、１２２位のＡｓｐ、１２５位のＡｒｇ、および１１３位のＡｒｇの３つのアミノ酸残基のうちの少なくとも２つを含むヒトＢ７−Ｈ１上のエピトープに結合する。別の実施形態において、抗体は、ヒトＢ７−Ｈ１上のエピトープに結合し、抗体は、ヒトＢ７−Ｈ１上の５４位のＩｌｅ、１１７位のＳｅｒ、および１２１位のＡｌａへの結合を示さない。またさらなる実施形態において、本発明の抗体は、１１３位のＡｒｇがＡｌａ、またはＴｙｒ、またはＬｅｕに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う。またさらなる実施形態において、本発明の抗体は、１２５位のＡｒｇがＡｌａ、またはＧｌｎ、またはＳｅｒに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う。またさらなる実施形態において、本発明の抗体は、１２３位のＡｒｇがＡｌａ、またはＰｈｅ、またはＴｈｒに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を保持する。この例において、抗体は２．１４Ｈ９である。別の例において、抗体は２．１４Ｈ９ＯＰＴである。
【０１００】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、１２２位のＡｓｐおよび２０位のＴｈｒのアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む、ヒトＢ７−Ｈ１の細胞外ドメイン上のエピトープに結合する。一実施形態において、抗体は、ヒトＢ７−Ｈ１上の１９位のＰｈｅ、２０位のＴｈｒ、および１２２位のＡｓｐの３つのアミノ酸残基のうちの少なくとも２つに結合する。別の実施形態において、Ｂ７−Ｈ１ヒト上で、５４位のＩｌｅ、１１５位のＭｅｔ、１１７位のＳｅｒ、および１２１位のＡｌａの３つのアミノ酸残基うちの少なくとも１つへの結合を示さない。またさらなる実施形態において、本発明の抗体は、１９位のＰｈｅがＡｌａ、またはＧｌｙ、またはＳｅｒに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う。またさらなる実施形態において、本発明の抗体は、２０位のＴｈｒがＡｌａ、またはＶａｌ、またはＡｓｐに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う。またさらなる実施形態において、本発明の抗体は、１２２位のＡｓｐがＡｓｎ、またはＧｌｕに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を失う。またさらなる実施形態において、本発明の抗体は、１２３位のＡｒｇがＡｌａ、またはＰｈｅ、またはＴｈｒに変異される場合、野生型Ｂ７−Ｈ１への結合と比較して、競合アッセイによって決定される、ヒトＢ７−Ｈ１に結合するその能力を保持する。一例において、抗体は２．７Ａ４である。別の例において、抗体は２．７Ａ４ＯＰＴである。
【０１０１】
一実施形態において、標的結合剤は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、同じ、または異なるタンパク質上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野において公知である（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）、米国特許第４，４７４，８９３号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、第５，５７３，９２０号、第５，６０１，８１号、第９５，７３１，１６８号、第４，６７６，９８０号、および第４，６７６，９８０号、国際公開第９４／０４６９０号、国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、国際公開第９３／１７７１５号、国際公開第９２／０８８０２、および欧州特許ＥＰ第０３０８９号を参照）。
【０１０２】
本明細書に記載される本発明の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ１の機能に影響を及ぼすモノクローナル抗体に関する。他の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に対する高結合親和性、Ｂ７−Ｈ１シグナル伝達の阻害に対する高選択性、低毒性、ＰＤ−１レセプター活性を遮断する能力、免疫抑制を通してＢ７−Ｈ１誘発された腫瘍細胞の生存を阻害する能力、抗腫瘍免疫のＢ７−Ｈ１媒介抑制を阻害する能力を含む、治療上の観点から望ましい特性を伴って、Ｂ７−Ｈ１およびその調製物に特異的に結合する完全ヒト抗体に関し、これは、ひいては、新生物疾患を含む増殖もしくは侵入関連疾患、ならびに／または腫瘍細胞の生体外および生体内で成長する能力を阻害し得る。さらに他の実施形態は、本発明の抗体を含む有効量の組成物を、それを必要とする動物に投与することにより、動物においてＢ７−Ｈ１媒介Ｔ細胞阻害を抑制する方法に関する。さらに他の実施形態は、大幅なヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答をもたらさず、それによって反復投与を可能にする、Ｂ７−Ｈ１およびその調製物に特異的に結合する完全ヒト抗体に関する。
【０１０３】
本発明の一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体のいずれかをコードする核酸分子を提供する。一実施形態においては、本発明の抗体の軽鎖もしくは重鎖をコードする核酸分子である。一実施形態において、核酸分子は、本明細書に記載される抗体のいずれかの完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖もしくは重鎖をコードする。一実施形態において、核酸分子は、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つの軽鎖もしくは重鎖をコードする。別の実施形態において、核酸分子は、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つの軽鎖および重鎖をコードする。本発明は、本明細書に定義される緊縮または低緊縮のハイブリッド形成条件下で、本明細書に記載される標的結合剤または抗体のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成されるポリヌクレオチドも包含する。
【０１０４】
本発明の別の実施形態において、上述の核酸分子または複数の分子を含むベクターを提供し、ベクターは、上述の標的結合剤をコードする。本発明の一実施形態において、上述の核酸分子または複数の分子を含むベクターを提供し、ベクターは、上に定義する抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする。一実施形態において、ベクターは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする核酸分子を含む。一実施形態において、ベクターは、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つの軽鎖または重鎖をコードする核酸分子を含む。別の実施形態において、ベクターは、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴのうちのいずれか１つの軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含む。
【０１０５】
さらなる実施形態において、上述の核酸分子のいずれかで形質転換された宿主細胞を提供する。本発明の別の実施形態において、上述の核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は、２つ以上のベクターを含み得る。
【０１０６】
当該分野において公知の通り、抗体は、有利に、例えば、ポリクローナル、オリゴクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、および／または完全ヒト抗体であり得る。
【０１０７】
本発明の実施形態は、いずれの特定の抗体形態、または生成もしくは産生の方法にも限定されないことを理解する。本発明の一部の実施形態において、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体の結合断片である。例えば、標的結合剤は、完全長抗体（例えば、無処置ヒトＦｃ領域を有する）、または抗体結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはより詳細に以下に記載される他の周知の抗体断片）であり得る。加えて、抗体は、ｄＡｂ断片等の、Ｂ７−Ｈ１に結合するラクダもしくはヒトの単一ＶＨまたはＶＬドメイン等の単一ドメイン抗体であり得る。
【０１０８】
本明細書に記載される本発明の実施形態は、これらの抗体を産生するための細胞も提供する。細胞の例としては、ハイブリドーマ、またはＢ７−Ｈ１に対して抗体を産生するチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ細胞の変異形（例えば、ＤＧ４４）、およびＮＳ０細胞等の組み換えにより作製された細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞の変異形についてのさらなる情報は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｒｅｉｌｌｙ（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５，４５６−４６２に見出すことができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマ、または抗体をコードする遺伝子もしくは複数の遺伝子で形質転換または形質移入された組み換えにより操作された細胞から製造され得る。
【０１０９】
加えて、本発明の一実施形態は、核酸分子が標的結合剤または抗体を産生するように発現される条件下で宿主細胞を培養した後、標的結合剤または抗体を回収することにより、本発明の標的結合剤または抗体を産生する方法である。一実施形態は、核酸分子が抗体を産生するように発現される条件下で宿主細胞を培養した後、抗体を回収することにより、本発明の抗体を産生する方法である。さらに他の実施形態は、本発明の抗体をコードする核酸分子によってコードされる抗体を発現する宿主細胞を培養し、前記培養から前記抗体を単離する方法により産生される、本発明の抗体を含む。
【０１１０】
本発明の実施形態は、抗体産生のために宿主細胞中に形質移入された時に、抗体またはその断片の収率を増加するために最適化された核酸配列を含む、本発明の抗体または抗体の断片をコードするいかなる核酸分子をも含むことも理解するべきである。
【０１１１】
本明細書のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１を発現する細胞、Ｂ７−Ｈ１を含有する単離した細胞膜、精製したＢ７−Ｈ１、もしくはそれらの断片、および／または１つ以上のオルソロガス配列もしくはそれらの断片で哺乳類を免疫化することにより、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ１の生物学的活性を阻害する抗体を産生する方法を含む。
【０１１２】
本明細書のさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１を発現する細胞、Ｂ７−Ｈ１を含有する単離した細胞膜、精製したＢ７−Ｈ１、もしくはそれらの断片、および／または１つ以上のオルソロガス配列もしくはそれらの断片で哺乳類を免疫化することにより、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ１の生物学的活性を阻害する高親和性抗体を産生する方法を含む。
【０１１３】
他の実施形態は、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ１の生物学的活性を阻害する単離した抗体の生成および特定に基づく。Ｂ７−Ｈ１は、いくつかの腫瘍型上に発現する。Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合する抗体は、Ｂ７−Ｈ１媒介腫瘍細胞の生存を防止し、免疫抑制を通して抗腫瘍免疫応答のＢ７−Ｈ１媒介抑制を阻害することができ、これは、ひいては、腫瘍細胞の侵入、転移、腫瘍成長、および他の特性を減少させることができる。
【０１１４】
加えて、抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマ、または抗体をコードする遺伝子もしくは複数の遺伝子で形質転換または形質移入された組み換えにより操作された細胞から製造され得る。
【０１１５】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体を産生するハイブリドーマがある。一実施形態において、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖を産生するハイブリドーマがある。一実施形態において、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を産生し得る。別の実施形態において、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴの軽鎖および／または重鎖を産生する。代替的に、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴと同じエピトープまたは複数のエピトープに結合する抗体を産生し得る。代替的に、ハイブリドーマは、Ｂ７−Ｈ１への結合において、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴと競合する抗体を産生し得る。代替的に、ハイブリドーマは、Ｂ７−Ｈ１への結合において、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴと交差競合する抗体を産生し得る。
【０１１６】
他の実施形態において、本発明は、本発明の標的結合剤、もしくは抗体、またはそれらの結合断片、および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【０１１７】
本発明のまたさらなる実施形態は、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することにより、動物における増殖もしくは侵入関連疾患を治療する方法を含む。ある実施形態において、方法はさらに、増殖もしくは侵入関連疾患の治療を必要とする動物を選択することと、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することとを含む。ある実施形態において、動物はヒトである。ある実施形態において、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体である。ある実施形態において、標的結合剤は、本発明の抗体であり、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、もしくは２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴもしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴから成る群より選択され得る。
【０１１８】
本発明のまたさらなる実施形態は、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することにより、動物における細胞増殖または侵入関連疾患をＢ７−Ｈ１媒介構成要素で阻害する方法を含む。ある実施形態において、方法はさらに、Ｂ７−Ｈ１媒介構成要素で細胞増殖または侵入関連疾患の治療を必要とする動物を選択することと、治療有効量の本発明の標的結合剤を前記動物に投与することとを含む。ある実施形態において、動物はヒトである。ある実施形態において、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体である。ある実施形態において、標的結合剤は、本発明の抗体であり、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、もしくは２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴもしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴから成る群より選択され得る。
【０１１９】
本発明のまたさらなる実施形態は、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することにより、動物における腫瘍の細胞侵入、細胞転移、または腫瘍成長を阻害する方法を含む。ある実施形態において、方法はさらに、腫瘍の細胞侵入、細胞転移、または腫瘍成長の治療を必要とする動物を選択することと、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することとを含む。ある実施形態において、動物はヒトである。ある実施形態において、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体である。ある実施形態において、標的結合剤は、本発明の抗体であり、２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、もしくは２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴもしくは２．１４Ｈ９ＯＰＴから成る群より選択され得る。
【０１２０】
本発明のまたさらなる実施形態は、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することにより、新生物疾患を被る動物を治療する方法を含む。ある実施形態において、方法はさらに、新生物疾患の治療を必要とする動物を選択することと、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することとを含む。
【０１２１】
本発明のまたさらなる実施形態は、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することにより、非新生物疾患を被る動物を治療する方法を含む。ある実施形態において、方法はさらに、非新生物疾患の治療を必要とする動物を選択することと、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することとを含む。
【０１２２】
本発明のまたさらなる実施形態は、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することにより、慢性ウイルス感染を被る動物を治療する方法を含む。ある実施形態において、方法はさらに、慢性ウイルス感染の治療を必要とする動物を選択することと、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することとを含む。
【０１２３】
本発明のまたさらなる実施形態は、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することにより、悪性腫瘍を被る動物を治療する方法を含む。ある実施形態において、方法はさらに、悪性腫瘍の治療を必要とする動物を選択することと、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することとを含む。
【０１２４】
本発明のまたさらなる実施形態において、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することにより、Ｂ７−Ｈ１発現に関連する疾患または状態を被る動物を治療する方法を含む。ある実施形態において、方法はさらに、Ｂ７−Ｈ１発現に関連する疾患または状態の治療を必要とする動物を選択することと、治療有効量の本発明の標的結合剤を動物に投与することとを含む。
【０１２５】
悪性腫瘍は、メラノーマ、皮膚癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠腫、肝細胞（肝臓）癌、胆嚢癌、甲状腺腫、骨癌、胃性（胃）癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、外陰癌、子宮内膜癌、精巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、腎細胞癌、結腸癌、結腸直腸、膵癌、食道癌、脳／ＣＮＳ癌、頭頚部癌、神経細胞癌、中皮腫、肉腫、胆汁（胆管細胞癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、類表皮癌、肉腫、胸膜／腹膜の癌等の固形腫瘍、および急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病および多発性骨髄腫を含む白血病から成る群より選択され得る。
【０１２６】
治療可能な増殖または侵入関連疾患は、メラノーマ、皮膚癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、唾液腺、膠腫、肝細胞（肝臓）癌、胆嚢癌、甲状腺腫、骨癌、胃性（胃）癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、外陰癌、子宮内膜癌、精巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫甲状腺癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、食道癌、脳／ＣＮＳ癌、神経細胞癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆汁（胆管細胞癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、類表皮癌、肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病および多発性骨髄腫を含む、胸膜／腹膜および白血病の癌等の、新生物疾患を含む。治療可能な慢性ウイルス感染は、ヒトにおけるＨＩＶ、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）、および肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）、サルにおけるサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ならびにマウスにおけるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を含む。
【０１２７】
疾患関連細胞侵入および／または増殖は、あらゆる異常な、望ましくない、もしくは病的な細胞侵入および／または増殖、例えば、腫瘍関連細胞侵入および／または増殖であり得る。
【０１２８】
一実施形態において、新生物疾患は、乳房、結腸、結腸直腸、前立腺、胃、胃性、卵巣、食道、膵臓、胆嚢、非小細胞肺癌、甲状腺、子宮内膜、頭頚部、腎臓、腎細胞癌、膀胱、および膠腫の癌のうちのいずれか１つより選択される固形腫瘍である。
【０１２９】
一実施形態において、本発明は、Ｂ７−Ｈ１にのみ、またはそれに部分的に依存する腫瘍を有する患者のＢ７−Ｈ１の阻害の使用に適している。
【０１３０】
本発明のまたさらなる実施形態は、増殖または侵入関連疾患を被る動物の治療の医薬の調製に本発明の標的結合剤または抗体を使用することを含む。ある実施形態において、使用はさらに、増殖または侵入関連疾患の治療を必要とする動物を選択することを含む。
【０１３１】
本発明のまたさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１媒介構成要素を用いた、動物における増殖または侵入関連疾患の治療のための医薬の調製に本発明の標的結合剤または抗体を使用することを含む。ある実施形態において、使用はさらに、Ｂ７−Ｈ１媒介構成要素を用いて、増殖または侵入関連疾患の治療を必要とする動物を選択することを含む。
【０１３２】
本発明のまたさらなる実施形態は、動物における腫瘍細胞の侵入、細胞転移、または細胞成長の治療のための医薬の調製に本発明の標的結合剤または抗体を使用することを含む。ある実施形態において、使用はさらに、腫瘍細胞の侵入、細胞転移、または腫瘍の治療を必要とする動物を選択することを含む。
【０１３３】
本発明のまたさらなる実施形態は、新生物疾患を被る動物の治療のための医薬の調製に本発明の標的結合剤または抗体を使用することを含む。ある実施形態において、使用はさらに、新生物疾患の治療を必要とする動物を選択することを含む。
【０１３４】
本発明のまたさらなる実施形態は、原因が、例えば、肝細胞癌、胃癌、または子宮頸癌等の、感染病原体に関連する疾患を被る動物の治療のための医薬の調製に本発明の標的結合剤または抗体を使用することを含む。ある実施形態において、使用はさらに、新生物疾患の治療を必要とする動物を選択することを含む。
【０１３５】
本発明のまたさらなる実施形態は、非新生物疾患を被る動物の治療のための医薬の調製に本発明の標的結合剤または抗体を使用することを含む。ある実施形態において、使用はさらに、非新生物疾患の治療を必要とする動物を選択することを含む。
【０１３６】
本発明のまたさらなる実施形態は、慢性ウイルス感染を被る動物の治療のための医薬の調製に本発明の標的結合剤または抗体を使用することを含む。ある実施形態において、使用はさらに、非新生物疾患の治療を必要とする動物を選択することを含む。さらに他の実施形態において、使用はさらに、眼疾患、炎症性疾患、心血管疾患、および敗血症を含む。
【０１３７】
本発明のまたさらなる実施形態は、悪性腫瘍を被る動物の治療のための医薬の調製に本発明の標的結合剤または抗体を使用することを含む。ある実施形態において、使用はさらに、悪性腫瘍の治療を必要とする動物を選択することを含む。
【０１３８】
本発明のまたさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１発現に関連する疾患または状態を被る動物の治療のための医薬の調製に本発明の標的結合剤または抗体を使用することを含む。ある実施形態において、使用はさらに、Ｂ７−Ｈ１発現に関連する疾患または状態の治療を必要とする動物を選択することを含む。
【０１３９】
本発明のまたさらなる実施形態は、増殖または侵入関連疾患を被る動物の治療のための医薬として使用するための、本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【０１４０】
本発明のまたさらなる実施形態は、動物において、腫瘍細胞の侵入、細胞転移、または腫瘍成長を被る動物の治療のための医薬として使用するための、本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【０１４１】
本発明のまたさらなる実施形態は、Ｂ７−Ｈ１発現に関連する疾患または状態を被る動物の治療のための医薬として使用するための、本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【０１４２】
一実施形態において、
増殖または侵入関連疾患、
新生物疾患、
非新生物疾患、
悪性腫瘍、もしくは
慢性ウイルス感染、または
Ｂ７−Ｈ１発現に関連する疾患もしくは状態
の治療は、前述の疾患または状態のいずれかを管理する、改善する、防止することを含む。
【０１４３】
一実施形態において、新生物疾患の治療は、腫瘍成長の阻害、腫瘍成長の遅延、腫瘍の退縮、腫瘍の縮小、治療の中止時に腫瘍が再成長する時間の延長、腫瘍が再発する時間の延長、疾患の進行の緩徐化を含む。
【０１４４】
一実施形態において、Ｂ７−Ｈ１発現に関連する疾患または状態の治療は、Ｂ７−Ｈ１を発現する細胞の成長を阻害することを含む。
【０１４５】
一部の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体の投与後、血液から過剰循環抗体を除去するために、クリアリング剤が投与される。
【０１４６】
本発明の一部の実施形態において、治療される動物はヒトである。
【０１４７】
本発明の一部の実施形態において、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【０１４８】
本発明の一部の実施形態において、標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、および２．９Ｄ１０から成る群より選択される。
【０１４９】
本発明の実施形態は、本明細書に記載される標的結合剤および治療剤を含む共役体を含む。本発明の一部の実施形態において、治療剤は毒素である。他の実施形態において、治療剤はラジオアイソトープである。さらに他の実施形態において、治療剤は、医薬組成物である。
【０１５０】
別の態様において、患者の癌細胞を選択的に死滅させる方法を提供する。方法は、完全ヒト抗体共役体を患者に投与することを含む。完全ヒト抗体共役体は、Ｂ７−Ｈ１に結合することができる抗体および薬剤を含む。薬剤は、癌細胞を死滅させる毒素、ラジオアイソトープ、または別の物質のいずれかである。抗体共役体は、よって、選択的に癌細胞を死滅させる。
【０１５１】
一態様において、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合する共役された完全ヒト抗体を提供する。抗体に結合されるのは薬剤であり、抗体の細胞への結合は、薬剤の細胞への送達をもたらす。一実施形態において、上記の共役された完全ヒト抗体は、Ｂ７−Ｈ１の細胞外ドメインに結合する。別の実施形態において、抗体および共役された毒素は、Ｂ７−Ｈ１を発現する細胞によって内部に取り込まれる。別の実施形態において、薬剤は、細胞毒性剤である。別の実施形態において、薬剤は、例えば、サポリン、もしくはアウリスタチン、シュードモナス外毒素、ゲロニン、リシン、カリケアマイシン、またはマイタンシン系免疫共役体等である。また別の実施形態において、薬剤は、ラジオアイソトープである。
【０１５２】
本発明の標的結合剤または抗体は、単独で投与されるか、または追加の抗体もしくは化学療法剤、もしくは放射線療法、もしくは治療ワクチンと組み合わせて投与することができる。例えば、抗腫瘍免疫のＢ７−Ｈ１媒介抑制を遮断するＢ７−Ｈ１抗体のモノクローナル、オリゴクローナル、またはポリクローナル混合物が、腫瘍細胞増殖の阻害を示す薬物と組み合わせて投与され得る。
【０１５３】
本発明の別の態様によると、本発明の標的結合剤または抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【０１５４】
本発明の別の実施形態は、本明細書に開示される抗体が、患者もしくは患者の試料中のＢ７−Ｈ１の存在および／またはレベルを検出するために利用される疾患または状態を診断する方法を含む。一実施形態において、患者の試料は、血液、もしくは血液血清、もしくは尿である。さらなる実施形態において、抗Ｂ７−Ｈ１抗体を使用して、Ｂ７−Ｈ１の発現および／または過剰発現を識別することを含む、危険因子を特定する、疾患を診断する、および疾患を病期分類するための方法を提示する。一部の実施形態において、方法は、細胞上のＢ７−Ｈ１に選択的に結合する完全ヒト抗体共役体を患者に投与することを含む。抗体共役体は、Ｂ７−Ｈ１および標識に特異的に結合する抗体を含む。方法はさらに、患者における標識の存在を観察することを含む。比較的高い標識量は比較的高リスクの疾患を示し、比較的低い標識量は、比較的低リスクの疾患を示す。一実施形態において、標識は、緑色蛍光タンパク質である。
【０１５５】
本発明はさらに、本明細書に開示される抗体を患者からの生物学的試料と接触させることと、前記試料中の前記抗体とＢ７−Ｈ１の間の結合レベルを検出することとを含む、患者の試料中のＢ７−Ｈ１の存在および／またはレベルをアッセイするための方法を提供する。より具体的な実施形態において、生物学的試料は、血液、血漿、または血清である。
【０１５６】
本発明の別の実施形態は、血清または細胞を本明細書に開示される抗体を接触させ、その後Ｂ７−Ｈ１の存在を検出することにより、細胞中のＢ７−Ｈ１の発現に関連する状態を診断するための方法を含む。一実施形態において、状態は、新生物疾患を含むがこれに限定されない、増殖または侵入関連疾患であり得る。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明は、哺乳類組織、細胞、または体液中のＢ７−Ｈ１を検出するためのアッセイキットを含む。そのようなキットは、Ｂ７−Ｈ１関連疾患のスクリーニングに有用であろう。キットは、本発明の標的結合剤または抗体、および存在する場合、標的結合剤または抗体のＢ７−Ｈ１との反応を示す手段を含む。一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態において、Ｂ７−Ｈ１に結合する抗体は標識される。別の実施形態において、抗体は、非標識一次抗体であり、キットはさらに、一次抗体を検出するための手段を含む。一実施形態において、検出するための手段は、抗免疫グロブリンである標識された二次抗体を含む。抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種、および放射線不透過性物質から成る群より選択されるマーカーで標識することができる。
【０１５８】
一部の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、補体を固定し、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を強化するように修飾され得る。他の実施形態において、標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を強化するように修飾され得る。また他の実施形態において、標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を強化し、かつ補体を固定し、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を強化するように修飾され得る。
【０１５９】
一部の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、補体を固定し、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を低下させるように修飾され得る。他の実施形態において、標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を低下させるように修飾され得る。また他の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与するそれらの能力を低下させ、かつ補体を固定し、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）に関与するそれらの能力を低下させるように修飾され得る。
【０１６０】
ある実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体、および本発明の組成物の半減期は、少なくとも約４〜７日である。ある実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体、および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約２〜５日、３〜６日、４〜７日、５〜８日、６〜９日、７〜１０日、８〜１１日、８〜１２、９〜１３、１０〜１４、１１〜１５、１２〜１６、１３〜１７、１４〜１８、１５〜１９、または１６〜２０日である。他の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体、および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約１７〜２１日、１８〜２２日、１９〜２３日、２０〜２４日、２１〜２５日、２２〜２６日、２３〜２７日、２４〜２８日、２５〜２９日、または２６〜３０日である。またさらなる実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体、および本発明の組成物の半減期は、最大約５０日であり得る。ある実施形態において、本発明の抗体および組成物の半減期は、当該分野において公知の方法によって延長され得る。そのような延長は、同時に、抗体組成物の投与量および／または頻度を低下させることができる。向上した生体内半減期を有する抗体およびそれらを調製する方法は、米国特許第６，２７７，３７５号国際公開ＷＯ第９８／２３２８９号およびＷＯ第９７／３４６１号に開示されている。
【０１６１】
別の実施形態において、本発明は、容器を含む製造の物品を提供する。容器は、本明細書に開示される標的結合剤または抗体を含有する組成物と、組成物が、Ｂ７−Ｈ１の発現もしくは過剰発現を特徴とする疾患を含むがこれに限定されない、細胞付着、侵入、血管新生、および／または増殖関連疾患を治療するために使用され得ることを示す添付文書もしくはラベルとを含む。
【０１６２】
他の実施形態において、本発明は、Ｂ７−Ｈ１の発現に関与する疾患を治療し、本明細書に開示される標的結合剤または抗体、および治療を必要とする対象にモノクローナル抗体を投与するための説明書を含むキットを提供する。
【０１６３】
本発明は、変異形Ｆｃ領域を含むタンパク質の製剤を提供する。つまり、天然に生じないＦｃ領域、例えば、Ｆｃ領域は、１つ以上の天然に生じないアミノ酸残基を含む。アミノ酸欠損、付加、および／または修飾を含むＦｃ領域も、本発明の変異形Ｆｃ領域によって包含される。
【０１６４】
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎのＦｃ領域の結合親和性を増加させることにより増加させることができる。一実施形態において、Ｆｃ変異形タンパク質は、同程度の分子と比較して、強化された血清半減期を有する。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明はＦｃ変異形を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３９、３３０、および３３２から成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異形を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅから成る群より選択される、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含む。任意に、Ｆｃ領域はさらに、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２５２、２５４、および２５６から成る群より選択される１つ以上の位置で、さらなる天然に生じないアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異形を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅから成る群より選択される、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸と、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅから成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸とを含む。
【０１６６】
別の実施形態において、本発明はＦｃ変異形を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４、２３５、および３３１から成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異形を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、２３５Ｅ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含む。さらに具体的な実施形態において、本発明のＦｃ変異形は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、および３３１Ｓの天然に生じないアミノ酸残基を含む。別の具体的な実施形態において、本発明のＦｃ変異形は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓの天然に生じないアミノ酸残基を含む。別の具体的な実施形態において、本発明のＦｃ変異形は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４Ｆ、２３５Ｅ、および３３１Ｓの天然に生じないアミノ酸残基を含む。任意に、Ｆｃ領域はさらに、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２５２、２５４、および２５６から成る群より選択される、１つ以上の位置で、さらなる天然に生じないアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、本発明はＦｃ変異形を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、２３５Ｅ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸と、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸と、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅから成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸とを含む。本明細書に使用される、「ＯＰＴ」および「ＴＭ」の表示は、同義であり、抗体依存細胞媒介細胞毒性および補体依存細胞毒性を作動させるその能力を排除するために、ヒンジのＬ２３４ＦおよびＬ２３５ＥならびにＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインのＰ３３１Ｓの３つの変異体を導入するように操作された、本発明の抗体を説明するために使用される（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，Ｄ６４：７００−７０４）。
【０１６７】
別の実施形態において、本発明はＦｃ変異形タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３９、３３０、および３３２から成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ変異形タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅから成る群より選択される、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含む。任意に、Ｆｃ領域はさらに、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２５２、２５４、および２５６から成る群より選択される、１つ以上の位置で、さらなる天然に生じないアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ変異形タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３９Ｄ、３３０Ｌ、および３３２Ｅから成る群より選択される、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含み、１つ以上の位置で、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅから成る群より選択される。
【０１６８】
別の実施形態において、本発明は、Ｆｃ変異形タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４、２３５、および３３１から成る群より選択される１つ以上の位置で、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ変異形タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、２３５Ｅ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含む。任意に、Ｆｃ領域はさらに、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２５２、２５４、および２５６から成る群より選択される、１つ以上の位置で、さらなる天然に生じないアミノ酸を含む。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ変異形タンパク質製剤を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙ、２３５Ｅ、および３３１Ｓから成る群より選択される、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含み、１つ以上の位置で、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸は、Ｋａｂａｔに記述されるＥＵ指数により番号付けされる、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅから成る群より選択される。
【０１６９】
天然に生じないＦｃ領域を生成するための方法は、当該分野において公知である。例えば、アミノ酸置換および／または欠損は、部位指向性変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２（１９８５））、ＰＣＲ変異誘発（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．１７７−１８３（１９９０））、およびカセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ３４：３１５−３２３（１９８５））を含むがこれに限定されない、変異誘発により生成され得る。好ましくは、部位指向性変異誘発は、重複伸長ＰＣＲ法によって実施される（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．６１−７０（１９８９））。重複伸長ＰＣＲ（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｂｉｄ．）の技術は、あらゆる所望の変異を標的配列（開始ＤＮＡ）に導入するためにも使用され得る。例えば、重複伸長法の最初のＰＣＲは、外側プライマー（プライマー１）と、内部変異誘発プライマー（プライマー３）を用い、別に第２の外側プライマー（プライマー４）と、内部プライマー（プライマー２）を用いて標的配列を増幅し、２つのＰＣＲセグメント（セグメントＡおよびＢ）を得ることを含む。内部変異誘発プライマー（プライマー３）は、所望の変異を特定する標的配列に対するミスマッチを含有するように設計される。２回目のＰＣＲにおいて、最初のＰＣＲの産物（セグメントＡおよびＢ）は、２つの外側プライマー（プライマー１および４）を使用して、ＰＣＲにより増幅される。得られた完全長ＰＣＲセグメント（セグメントＣ）は、制限酵素で消化され、得られた制限断片は、適切なベクター中にクローン化される。変異誘発の第１ステップとして、開始ＤＮＡ（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、抗体、または単にＦｃ領域をコードする）は、操作可能に、変異誘発ベクター中にクローン化される。プライマーは、所望のアミノ酸置換を示すように設計される。変異形Ｆｃ領域の生成に有用な他の方法は、当該分野において公知である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、第５，８８５，５７３号、第５，６７７，４２５号、第６，１６５，７４５号、第６，２７７，３７５号、第５，８６９，０４６号、第６，１２１，０２２号、第５，６２４，８２１号、第５，６４８，２６０号、第６，５２８，６２４号、第６，１９４，５５１号、第６，７３７，０５６号、第６，８２１，５０５号、第６，２７７，３７５号、米国特許公開第２００４／０００２５８７号およびＰＣＴ公開ＷＯ第９４／２９３５１号、ＷＯ第９９／５８５７２号、ＷＯ第００／４２０７２号、ＷＯ第０２／０６０９１９号、ＷＯ第０４／０２９２０７号、ＷＯ第０４／０９９２４９号、ＷＯ第０４／０６３３５１を参照）。
【０１７０】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体のグリコシル化パターンは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を強化するように修飾される。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）ＪＢＣ．２７７：２６７３３、Ｓｈｉｎｋａｗａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＪＢＣ．２７８：３４６６  ａｎｄ  Ｏｋａｚａｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３６：１２３９を参照のこと。一部の実施形態において、Ｆｃ変異形タンパク質は、１つ以上の操作されたグリコフォーム、すなわち、Ｆｃ領域を含む分子に共有結合される炭水化物を含む。操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を強化する、または低下させることを含むがこれらに限定されない種々の目的に有用である。操作されたグリコフォームは、当業者に公知のいずれかの方法、例えば、操作された、もしくは変異形の発現株を使用することにより、１つ以上の酵素、例えば、ＤＩ  Ｎ−アセチルグリコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）との同時発現により、種々の生物、もしくは種々の生物からの細胞系のＦｃ領域を含む分子を発現させることにより、またはＦｃ領域を含む分子が発現した後に炭水化物を修飾することにより生成され得る。操作されたグリコフォームを生成するための方法は、当該分野において公知であり、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３）、米国特許第６，６０２，６８４号、米国出願第１０／２７７，３７０号、米国出願第１０／１１３，９２９号、ＰＣＴＷＯ第００／６１７３９Ａ１号、ＰＣＴＷＯ第０１／２９２２４６Ａ１号、ＰＣＴＷＯ第０２／３１１１４０Ａ１号、ＰＣＴＷＯ第０２／３０９５４Ａ１号、Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化工学技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されるものを含むが、これらに限定されない。例えば、ＷＯ第０００６１７３９号、第ＥＡ０１２２９１２５号、ＵＳ第２００３０１１５６１４号、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９を参照のこと。
【０１７１】
Ｆｃ領域のグリコシル化は、エフェクター機能を増加させる、または低下させるように修飾することができることも公知である（例えば、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７８：３４６６−３４７３）、米国特許第６，６０２，６８４号、米国出願第１０／２７７，３７０号、米国出願第１０／１１３，９２９号、ＰＣＴＷＯ第００／６１７３９Ａ１号、ＰＣＴＷＯ第０１／２９２２４６Ａ１号、ＰＣＴＷＯ第０２／３１１１４０Ａ１号、ＰＣＴＷＯ第０２／３０９５４Ａ１号、Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化工学技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照のこと）。したがって、一実施形態において、本発明の抗体のＦｃ領域は、変更されたアミノ酸残基のグリコシル化を含む。別の実施形態において、変更されたアミノ酸残基のグリコシル化は、エフェクター機能の低下をもたらす。別の実施形態において、変更されたアミノ酸残基のグリコシル化は、エフェクター機能の増加をもたらす。具体的な実施形態において、Ｆｃ領域は、低下したフコシル化を有する。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）される（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号を参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】ビーズアッセイにおける、本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体のＴ細胞増殖に対する効果を示す棒グラフである。
【図２】ＤＣＭＬＲアッセイにおける、本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体によるＴ細胞増殖の強化を示す棒グラフである。
【図３】ＤＣＭＬＲアッセイにおける、本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体によるＩＦＮ−γの放出を示す棒グラフである。
【図４】抗体活性に対するＩｇＧのクラス転換および生殖系列化の影響を評価するためのヒトＰＤ１／ヒトＢ７−Ｈ１リガンド阻害アッセイにおける、本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体による抗Ｂ７−Ｈ１  ＩＣ５０の９５％信頼区間を示すグラフである。
【図５】共調節抗原に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体交差反応性を評価するために実施されたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す線グラフである。
【図６】生体外Ｔｅｔ想起アッセイにおける、本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果を示す棒グラフである。
【図７】Ｔｅｔ想起アッセイを使用した、本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体のアゴニズム活性の検査結果を示す棒グラフである。
【図８】マウス異種移植モデルにおける、ＨＰＡＣ細胞に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果を示す線グラフである。
【図９】マウス異種移植モデルにおける、Ａ３７５細胞に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果を示す線グラフである。
【図１０】マウス異種移植モデルにおける、ＨＰＡＣ細胞に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果を示す線グラフである。
【図１１】マウス異種移植モデルにおける、ＨＰＡＣ細胞に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果を示す線グラフである。
【図１２】マウス異種移植モデルにおける、Ａ３７５細胞に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果を示す線グラフである。
【図１３】Ｔ細胞が存在する、および存在しないマウス異種移植モデルにおける、Ａ３７５細胞に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果を示す線グラフである。
【図１４】Ｔ細胞が存在する、および存在しないマウス異種移植モデルにおける、Ａ３７５細胞に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果を示す線グラフである。
【図１５】マウス異種移植モデルにおける、Ａ３７５細胞に対する本発明の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果を示す線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１７３】
定義
特に定義されない限り、本明細書に使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、特に文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞および組織の培養物、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴ−もしくはポリヌクレオチド化学およびハイブリッド形成に関連して利用される命名法、およびそれらの技術は、当該分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
【０１７４】
標準的な手法が、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に使用される。酵素反応および精製法は、製造者の仕様に従うか、または一般的に当該分野において達成されるように、もしくは本明細書に記載されるように実施される。前述の手法および手順は、一般に、当該分野において周知の慣用の方法に従い、本仕様全体を通して引用され、説明される種々の一般的な、およびより具体的な参考文献に記載されるように実施される。例えば、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１））を参照し、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬および薬学的化学に関連して利用される命名法、ならびに実験手順および手法は、当該分野において周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な手法が、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、および送達、ならびに患者の治療に使用される。
【０１７５】
本開示に従い利用される以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【０１７６】
拮抗薬または阻害剤は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、小分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組み換えタンパク質、抗体、もしくはその断片、または共役体、もしくはその融合タンパク質であり得る。ＲＮＡｉの概説については、Ｍｉｌｈａｖｅｔ  Ｏ、Ｇａｒｙ  ＤＳ、Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．２００３  Ｄｅｃ；５５（４）：６２９−４８．Ｒｅｖｉｅｗ）、およびアンチセンスについては、（Ｏｐａｌｉｎｓｋａ  ＪＢ，Ｇｅｗｉｒｔｚ  ＡＭ．（Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ．２００３  Ｏｃｔ  ２８；２００３（２０６）：ｐｅ４７．）を参照のこと。
【０１７７】
化合物は、約２０００ダルトン未満の分子量を有するあらゆる小分子量化合物を指す。
【０１７８】
「Ｂ７−Ｈ１」という用語は、ヒトＢ７−Ｈ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７相同体１、ＣＤ２７４抗原、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、ＰＤＣＤ１リガンド１、ＰＤＬ１、ＰＤ−Ｌ１、プログラム細胞死１リガンド１前駆体、またはプログラム死リガンド１を指す。
【０１７９】
抗体等の標的結合剤に言及する時、「中和」または「阻害」という用語は、前記抗体が標的抗原の活性を排除する、低下させる、または大幅に低下させる能力に関連する。しがたって、本発明の「中和」抗Ｂ７−Ｈ１抗体は、Ｂ７−Ｈ１の活性を排除する、または大幅に低下させることができる。Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合する抗体を中和する、拮抗する、または阻害することは、例えば、Ｂ７−Ｈ１のその同族リガンドへの結合を遮断することにより作用し得る。理想的には、Ｂ７−Ｈ１に対する中和抗体は、Ｔ細胞免疫のＢ７−Ｈ１媒介抑制を阻害する。Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合する中和、拮抗、阻害抗体は、例えば、Ｂ７−Ｈ１のＰＤ−１および／またはＢ７−１への結合を阻害することにより作用し得る。
【０１８０】
「Ｂ７−Ｈ１の生物学的活性を阻害する」は、本発明の標的結合剤もしくは抗体の不在下の生物学的活性と比較して、Ｂ７−Ｈ１活性を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％阻害することを包含する。
【０１８１】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、未変性タンパク質、断片、またはポリペプチド配列の類似体を指すための一般的用語として使用される。したがって、未変性タンパク質、断片、および類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明に従う好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトカッパ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにカッパもしくはラムダ軽鎖免疫グロブリン分子等の軽鎖免疫グロブリン分子を有する重鎖免疫グロブリン分子、およびそれらの逆を含む組み合わせで形成される抗体分子、ならびにそれらの断片および類似体を含む。本発明に従う好ましいポリペプチドは、単に、ヒト重鎖免疫グロブリン分子、またはその断片も含み得る。
【０１８２】
対象物に適用される、本明細書に使用される「天然に生じる」という用語は、対象物が自然界で発見され得るという事実を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、かつ実験室で、または他の方法で人間によって意図的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が、天然に生じるものである。
【０１８３】
本明細書に使用される「制御配列」という用語は、それらが連結されるコード配列の発現および処理をもたらすか、またはそれらに影響を及ぼすかのいずれかに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物により異なり、原核生物において、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物において、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、エンハンサー、イントロン、転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列、ならびに５’および‘３非翻訳領域を含み得る。「制御配列」という用語は、その存在が発現および処理に必須である全ての構成要素を最低限含むことを意図し、また、その存在が有利であるさらなる構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【０１８４】
本明細書に言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態であるリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの修飾形態のいずれか、あるいはＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖を意味する。本用語は、ＤＮＡの一本鎖または二本鎖の形態を含む。
【０１８５】
本明細書に言及される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に生じるヌクレオチド、ならびに天然に生じる、および天然に生じない連結によって一緒に連結される、修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、長さが２００以下の塩基を含むポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜６０の塩基であり、最もこのましくは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０の塩基である。オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異の構築物に使用するために二本鎖であってもよいが、オリゴヌクレオチドは、通常、例えば、プローブ用の単一鎖である。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスのいずれかのオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１８６】
本明細書に言及される「天然に生じるヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書に言及される「修飾されたヌクレオチド」という用語は、修飾された、または置換された糖類等を有するヌクレオチドを含む。本明細書に言及される「オリゴヌクレオチド連結」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート等の、オリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）、Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）、Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ６：５３９（１９９１）、Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））、Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，１５１，５１０号、Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ９０：５４３（１９９０）を参照し、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドは、所望する場合、検出のために標識を含むことができる。
【０１８７】
本明細書に言及される「選択的にハイブリッド形成する」という用語は、検出可能に、かつ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらの断片は、認識しうる量の検出可能な非特異的核酸への結合を最小にするハイブリッド形成および洗浄条件下で、核酸鎖と選択的にハイブリッド形成する。高緊縮条件は、当該分野において公知であり、本明細書に説明される選択的ハイブリッド形成条件を達成するように使用され得る。一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または抗体断片と関心の核酸配列との間の核酸配列の相同性は、少なくとも８０％であり、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％の相同性の増加が好ましい。
【０１８８】
緊縮なハイブリッド形成条件は、約４５℃の６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）（０．９ＭのＮａＣｌ／９０ｍＭのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）中でフィルタ結合ＤＮＡとハイブリッド形成した後、約５０〜６５℃の０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中で１回以上洗浄する、約４５℃の６Ｘ  ＳＳＣ中でフィルタ結合ＤＮＡとハイブリッド形成した後、約６０℃の０．１Ｘ  ＳＳＣ／０．２％のＳＤＳ中で１回以上洗浄する等の高緊縮条件、または当業者に公知のいかなる他の緊縮なハイブリッド形成条件をも含むが、これらに限定されない（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ  ａｔ  ｐａｇｅｓ６．３．１  ｔｏ  ６．３．６  ａｎｄ  ２．１０．３を参照）。
【０１８９】
２つのアミノ酸配列は、それらの配列間で部分的または完全な同一性がある場合に「相同」である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列が最大一致にアライメントされる時、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。（整合される２つの配列のうちのいずれかにおける）ギャップは、一致を最大にするときに許容され、５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。代替的かつ好ましくは、２つのタンパク質配列（または長さが少なくとも約３０のアミノ酸であるそれらに由来するポリペプチド配列）は、これらが、変異データマトリクスおよび６以上のギャップペナルティーのプログラムＡＬＩＧＮを使用して５を上回るアライメントスコア（標準偏差単位）を有する場合、この用語が本明細書に使用されるように、相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））および本巻のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２，ｐｐ．１−１０を参照のこと。２つの配列またはそれらの一部は、それらのアミノ酸が、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適にアライメントされた時、５０％同一を上回るかまたはそれに等しい場合、より好ましく相同である。２つのオルソルガス配列内に異なる相同の領域が存在し得ることに理解するべきである。例えば、マウスおよびヒトのオルソロガスの機能部位は、非機能領域より高程度の相同を有し得る。
【０１９０】
「〜に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全て、もしくは一部に相同である（すなわち、同一であり、厳密に進化的に関連しない）か、またはポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列に同一であることを意味するように本明細書で使用される。
【０１９１】
対照的に、「〜に相補的」という用語は、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全て、もしくは一部に相同であることを意味するように本明細書で使用される。図示のため、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【０１９２】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、比較窓に対して（すなわち、ヌクレオチドごと、または残基ごとに）同一であることを意味する。「配列同一性のパーセント」という用語は、２つの最適にアライメントされた配列を比較窓と比較し、同一核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、もしくはＩ）またはアミノ酸残基が双方の配列で生じ、一致した位置の数をもたらす位置の数を決定し、一致した位置の数を比較窓の位置の総数で割り（すなわち、窓の大きさ）、結果を１００で掛けて配列の同一性のパーセントを得ることにより計算される。本明細書に使用される「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示し、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８のヌクレオチド（６つのアミノ酸）位置の比較窓、しばしば、少なくとも２４〜４８のヌクレオチド（８〜１６のアミノ酸）位置の窓に対する参照配列と比較して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、配列同一性のパーセントは、比較窓に対して参照配列の合計が２０％以下となる欠損もしくは付加を含み得る配列と参照配列を比較することにより計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであり得る。本明細書に使用される、２０の従来のアミノ酸およびそれらの略号は従来の使用に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照し、参照により本明細書に組み込まれる。２０の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−、α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の特殊なアミノ酸も、本発明のポリペプチドの構成要素に適し得る。特殊なアミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジンε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似するアミノ酸、ならびにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書に使用されるポリペプチド表記法において、標準的な使用および慣用に従い、左方向は、アミノ末端方向であり、右方向は、カルボキシ末端方向である。同様に、特定されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端部は、５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と称される。未成熟のＲＮＡ転写物の５’から３’付加への方向は転写方向と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有し、かつＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流の配列」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有し、かつＲＮＡ転写体の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流の配列」と呼ばれる。ポリペプチドに適用される、「実質的な同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップウ��イトを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ等により最適にアライメントされる時、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一でない残りの位置は保存アミノ酸置換のみ異なる。保存アミノ酸置換は、類似する側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の基は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の基は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基側鎖を有するアミノ酸の基は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の基は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書に説明される、抗体もしくは免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における多少の変形は、本発明により包含されるように意図されるが、但し、アミノ酸配列における変形が、本明細書に記載される抗体もしくは免疫グロブリン分子に対して、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を維持するものとする。特に、保存アミノ酸置換が意図される。保存置換は、関連する側鎖を有するアミノ酸のファミリー内で行われるものである。一般にコードされるアミノ酸は、一般に、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）無電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンのファミリーに分類される。より好ましいファミリーは、セリンおよびスレオニンは脂肪族−ヒドロキシファミリーであり、アスパラギンおよびグルタミンは、アミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、脂肪族ファミリーであり、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンとの、アスパラギン酸のグルタミンとの、スレオニンのセリンとの単離された置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似置換は、特に、置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合機能もしくは特性に重大な作用を及ぼさないであろうと想定することは妥当である。アミノ酸の変更が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることにより、容易に決定することができる。アッセイは、本明細書に詳細に記載される。抗体もしくは免疫グロブリンの断片また��類似体は、当業者によって容易に調製され得る。好ましい断片または類似体のアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くで生じる。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の配列データを公共もしくは登録配列データベースと比較することにより特定することができる。好ましくは、コンピュータ化比較法を使用して、既知の構造および／または機能をもつ他のタンパク質中に生じる配列モチーフまたは予測されるタンパク質の高次構造ドメインを特定する。既知の三次元構造の中に折り畳まれるタンパク質配列を識別する方法は、公知である。Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：１６４（１９９１）。よって、前述の例は、当業者が、本明細書に記載される抗体により、構造的および機能的ドメインを画定するために使用され得る配位列モチーフおよび構造的高次構造を識別することができることを示す。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、それぞれ、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミドされる。これらの残基は、中和もしくは塩基性条件下で脱アミドされる。これらの残基の脱アミド形態は、本発明の範囲内である。
【０１９３】
一般に、タンパク質中のシステイン残基は、折り畳まれたタンパク質領域の一部である時、システイン−システインジスルフィド結合に関与するか、またはジスルフィド結合から立体的に保護されるかのいずれかである。タンパク質中のジスルフィド結合形成は複雑なプロセスであり、これは、環境の酸化還元電位および酵素を交換する特定化されたチオール−ジスルフィドにより決定される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０７，３０５−３２９，１９８４、Ｈｏｕｅｅ−Ｌｅｖｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３５３，３５−４４，２００２）。システイン残基がタンパク質構造中に対を有さず、かつ折り畳み構造により立体的に保護されない時、ジスルフィドシャフリングとして知られるプロセスの、溶液からの遊離システインとジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィドスクランブリングとして知られる別のプロセスにおいて、遊離システインは、天然に生じるジスルフィド結合（抗体構造中に存在するもの等）とも干渉し、低結合、低生物学的活性、および／または低安定性をもたらす。
【０１９４】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、（４）結合親和性を変更する、および（４）そのような類似体の他の物理化学的もしくは機能的特性を付与する、または修正するものである。類似体は、天然に生じるペプチド配列以外の種々の変異タンパク質の配列を含むことができる。例えば、単一もしくは複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存アミノ酸置換）は、天然に生じる配列（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの一部）で行われ得る。保存アミノ酸置換は、実質的に、親配列の構造的特徴を変更するべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるらせん体を切断する、または親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊する傾向にあるべきではない）。当該技術において認識されるポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｔ．Ｎａｔｕｒｅ３５４：１０５（１９９１）に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、そのような方法は、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠損を行うように使用され、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠損する抗体分子を生成し得る。
【０１９５】
「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗体に抗原結合特異性を付与する抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域を示すことが意図される。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、および以降の版により定義され得る。抗体は、通常、３つの重鎖ＣＤＲと、３つの軽鎖ＣＤＲとを含有する。ＣＤＲまたはＣＤＲｓという用語は、本明細書において、状況により、抗体のそれが認識する抗原もしくはエピトープへの親和性によって結合に関与する大部分のアミノ酸残基を含有する、これらの領域のうちの１つ、もしくはいくつか、またはこれらの領域の全てさえを示すために使用される。
【０１９６】
重鎖の第３ＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きな大きさの可変性を有する（より大きな多様性は、基本的に、それを生じる遺伝子の配置の機構による）。より長い既知の大きさは２６であるが、２つほどの短いアミノ酸であり得る。ＣＤＲの長さは、特定の基底にあるフレームワークにより収容され得る長さによっても変動し得る。機能的に、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定に部分的な役割を果たす（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，７１：４２９８−４３０２，１９７４、Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３，１９８６、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７，１９８７、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３，１９８９、Ｃａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：１９６５−１９６８，１９９０、Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８７：４８１４−４８１７，１９９０、Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：４８６３−４８６９，１９９０、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１７０９−１７１９，１９９１）。
【０１９７】
本明細書に言及される「ＣＤＲ一式」という用語は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。よって、ＨＣＤＲ一式は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指し、ＬＣＤＲ一式は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す。
【０１９８】
アミノ酸配列が本明細書に提示され、標的結合剤に利用され得るものを含む、本発明のＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変異形およびＢ７−Ｈ１の抗体は、配列変更または変異の方法、および所望の特徴を標的とする抗原のスクリーニングによって得ることができる。所望の特徴の例としては、抗原に特異的である既知の抗体と比較して抗原の増加した結合親和性、活性が既知である場合、抗原に特異的である既知の抗体と比較して抗原活性の増加した中和、特定のモル比での抗原に対する既知の抗体もしくはリガンドとの指定された競合能、リガンド−レセプター複合体を免疫沈降させる能力、特定のエピトープに結合する能力、直鎖状エピトープ、例えば、ペプチド結合スキャン、例えば、直鎖状および／または制限された高次構造においてスクリーニングされるペプチドを使用して識別されるペプチド配列、非連続残基により形成される高次構造エピトープ、Ｂ７−Ｈ１の新しい生物学的活性、もしくは下流分子を調節する能力、Ｂ７−Ｈ１に結合する、および／もしくは中和する能力、ならびに／またはあらゆる他の所望する特性が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤＲ、抗体のＶＨもしくはＶＬドメイン、および抗原結合部位のアミノ酸配列内で置換を行うために必要とされる技術は、当該分野において利用可能である。本明細書に開示される抗体分子の変異形は、本発明において産生され、使用され得る。構造／特性−活性関係に対する多変量データ分析技術（Ｗｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  −Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．：Ｂ．Ｋｏｗａｌｓｋｉ），Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｈｏｌｌａｎｄ，１９８４）を適用した計算化学の導出後、抗体の定量的な活性−特性関係が、分析回帰、パターン認識、および分類等の周知の数学的手法を使用して導かれ得る（Ｎｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｐｒｉｌ  １９９８）、Ｋａｎｄｅｌ，Ａｂｒａｈａｍ＆Ｂａｃｋｅｒ，Ｅｒｉｃ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  ＰＴＲ，（Ｍａｙ  １１，  １９９５）、Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ｗｏｊｔｅｋ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ２２（Ｐａｐｅｒ））．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０００）、Ｗｉｔｔｅｎ，Ｉａｎ  Ｈ．＆Ｆｒａｎｋ，Ｅｉｂｅ．Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｊａｖａ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ；（Ｏｃｔｏｂｅｒ１１，１９９９）、Ｄｅｎｉｓｏｎ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｔ．���Ｅｄｉｔｏｒ），Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｂａｎｉ  Ｋ．Ｍａｌｌｉｃｋ，Ａｄｒｉａｎ  Ｆ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ．Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；（Ｊｕｌｙ  ２００２）、Ｇｈｏｓｅ，Ａｒｕｐ  Ｋ．  ＆Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ，Ｖｅｌｌａｒｋａｄ  Ｎ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｏｏｌｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。一部の場合において、抗体の特性は、抗体配列、機能的および三次元構造の経験的および理論的モデル（例えば、可能性のある接触残基の分析、または計算された物理化学特性）から引き出され、これらの特性は、単独で、および組み合わせで考慮され得る。ＶＨドメインおよびＶＬドメインから成る抗体抗原結合部位は、通常、６つのループのポリペプチドにより形成され、３つが軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、そして３つが重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からである。既知の原子構造の抗体の分析は、抗体結合部位の配列と三次元構造との間に明確な関係を明らかにした。これらの関係は、ＶＨドメインの第３領域（ループ）を除き、結合部位のループが少数の主鎖高次構造のうちの１つである正準構造を有することを示唆する。特定のループに形成される正準構造は、ループおよびフレームワーク領域の双方の主要部位のある残基のその大きさおよび存在により決定されることが示されている。
【０１９９】
この配列と構造関係の研究は、既知の配列だが未知の三次検構造の抗体におけるこれらの残基の予測に使用することができ、これは、そのＣＤＲループの三次元構造を維持するのに重要であり、よって、結合特異性を維持する。これらの予測は、予測を導出最適化実験からの出力と比較することにより確認され得る。構造アプローチにおいて、ＷＡＭ等の、あらゆる自由に利用可能な、または市販のパッケージを使用して、抗体分子のモデルを作製することができる。次いで、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）またはＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗ等のタンパク質の視覚化および分析ソフトウェアパッケージが、ＣＤＲの各位置での可能な置換を評価するために使用され得る。次いで、この情報は、活性に対して最小もしくは有益な効果を有する、または他の所望する特性を付与する可能性がある置換を行うために使用され得る。
【０２００】
本明細書に使用される「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠損を有するポリペプチドを指すが、ここで、残りのアミノ酸配列は、例えば、完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に生じる配列の対応する位置と同一である。断片は、通常、少なくとも５、６、８、または１０のアミノ酸の長さ、好ましくは、少なくとも１４のアミノ酸の長さ、より好ましくは、少なくとも２０のアミノ酸の長さ、一般には、少なくとも５０のアミノ酸の長さ、さらにより好ましくは、少なくとも７０のアミノ酸の長さである。本明細書に使用される「類似体」という用語は、推定されるアミノ酸配列の一部と実質的な同一性を有する、少なくとも２５のアミノ酸のセグメントから成り、かつ（１）適切な結合条件下で、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合する、（２）適切なＢ７−Ｈ１とタンパク質の結合を遮断する能力、または（３）Ｂ７−Ｈ１活性を阻害する能力の特性のうちの少なくとも１つを有するポリペプチドを指す。通常、ポリペプチド類似体は、天然に生じる配列に関して、保存アミノ酸置換（または付加もしくは欠損）を含む。類似体は、通常、少なくとも２０のアミノ酸の長さ、好ましくは、少なくとも５０のアミノ酸の長さであり、多くの場合、完全長の天然に生じるポリペプチドと同じ長さであり得る。
【０２０１】
ペプチド類似体は、一般的に、テンプレートペプチドのものに類似する特性を有する非ペプチド薬物として、製薬業界で使用される。非ペプチド化合物のこれらの型は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）、Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）、およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）は、参照により本明細書に組み込まれる。そのような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子のモデル化の補助により開発される。治療上有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣物は、同等の治療上の、または予防的効果を産生するように使用され得る。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体等の、構造的にパラダイムペプチド（すなわち、生化学的特性もしくは薬理学的活性を有するポリペプチド）に類似するが、当該分野において周知の方法により、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−から成る群より選択される連結により任意に置換される１つ以上のペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じ型のＤ−アミノ酸との系統的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）は、より安定したペプチドを生成するために使用され得る。加えて、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列の変形を含む制限ペプチドは、当該分野において公知の方法により（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、参照により本明細書に組み込まれる）、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システインを付加することにより生成され得る。
【０２０２】
本明細書に使用される「抗体」および「複数の抗体」（免疫グロブリン）は、単独で、または既知の技術によって提供される他のアミノ酸配列と組み合わせて、可溶性または結合形態で標識され得る、オリゴクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ラクダ化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植された抗体、多重特異的抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、および複数の抗体、ならびにそれらの断片、変異形、もしくは誘導体であり得る。抗体は、いかなる種からでもあり得る。抗体は、抗原の抗原決定基の特色に相補的な内部表面形状および電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折り畳み構造から形成される、少なくとも１つの結合ドメインから成るポリペプチドまたはポリペプチドの群を含む。抗体は、通常、四量体形態を有し、２つの同一のポリペプチド鎖の対を含み、各対は、１つの「軽鎖」と１つの「重鎖」を有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。未変性抗体は、一般に、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から成る。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結され、一方、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖および軽鎖は、一定の間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）、そしてそのもう一方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づき、ラムダ鎖またはカッパ鎖のいずれかとして分類される。カッパ軽鎖の可変ドメインは、本明細書において、ＶＫとも表され得る。「可変領域」という用語は、重鎖または軽鎖の可変ドメインを説明するためにも使用され得る。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメインとの間の接触面を形成すると考えられている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。そのような抗体は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス等を含むが、これらに限定されないあらゆる哺乳類に由来し得る。
【０２０３】
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「複数の抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、本発明の抗体の結合断片を含み、例示的な断片には、単一鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単一鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性を示す抗体断片、ジスルフィド安定化された可変領域（ｄｓＦｖ）、二量体可変領域（ダイアボディ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内抗体、直鎖状抗体、単一鎖抗体分子、ならびに上のいずれかの抗体断片およびエピトープ結合断片から形成される多重抗体が挙げられる。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グロブリン分子の断片、すなわち、抗原結合断片を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれかの型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。
【０２０４】
酵素であるパパインによる抗体の消化は、「Ｆａｂ」断片としても知られる２つの同一の抗原結合断片、および抗原結合活性をもたないが、結晶化する能力をもつ「Ｆｃ」断片をもたらす。酵素であるペプシンによる抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原を架橋する能力をもつ。
【０２０５】
本明細書で使用される時、「Ｆｖ」は、抗原認識と抗原結合部位の双方を保持する抗体の最小断片を指す。この領域は、密接で非共有結合、または共有結合会合で、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体から成る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定するのが、この構造においてである。全体として、６つのＣＤＲが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）は、全結合部位より低い親和性であるが、抗原を認識し、結合する能力をもつ。
【０２０６】
本明細書で使用される時、「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常ドメインと、重鎖のＣＨ１ドメインとを含む抗体の断片を指す。
【０２０７】
本明細書で使用される時、「ｄＡｂ」は、ヒト抗体の最小機能結合単位である抗体の断片を指す。「ｄＡｂ」は、単一ドメイン抗体であり、抗体の重鎖の可変ドメイン（ＶＨドメイン）、または抗体の軽鎖の可変ドメイン（ＶＬドメイン）のいずれかを含む。各ｄＡｂは、６つの天然に生じるＣＤＲのうちの３つを含有する（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ３４１，５４４−５４６（１９８９）；Ｈｏｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，４８４−４９（２００３））。１１〜１５ｋＤａの範囲の分子量であり、それらは、断片抗原結合（Ｆａｂ）２より４倍小さく、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子の半分の大きさである。
【０２０８】
本明細書で使用される時、「ラクダ」は、軽鎖に欠く重鎖二量体から成るが、それにもかかわらず、広範な抗原結合レパートリーを有する抗体分子を指す（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ，Ａｔａｒｈｏｕｃｈ  Ｔ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｇ，Ｈａｍｅｒｓ  Ｃ，Ｓｏｎｇａ  ＥＢ，Ｂｅｎｄａｈｍａｎ  Ｎ，Ｈａｍｅｒｓ  Ｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８）。
【０２０９】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対にさせ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、より詳細に、例えば、ＥＰ第４０４，０９７号、ＷＯ第９３／１１１６１号、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されている。
【０２１０】
全抗体の断片が抗原と結合する機能を実施できることが示されている。結合断片の例としては、（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１，５４４−５４６）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインから成るＦａｂ断片、（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片、（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２１，４８４−４９０）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｉｖ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４１，５４４−５４６（１９８９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２１，４８４−４９０］、これは、ＶＨもしくはＶＬドメインから成る、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含むＦ（ａｂ’）２断片、二価断片、（ｖｉｉ）単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは２つのドメインを会合させて、抗原結合部位を形成するペプチドリンカーにより連結される（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３）、（ｖｉｉｉ）二重特異性単一鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構築された「ダイアボディ」、多価または多重特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．（１９９３）  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０  ６４４４−６４４８，）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋を組み込むことにより安定化させることができる（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６）。ＣＨ３ドメインに結合されるｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる（Ｈｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１）。結合断片の他の例は、Ｆａｂ’であり、これは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端でいくつかの残基が付加されることにより、Ｆａｂ断片とは異なり、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステイン、および定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨを含む。
【０２１１】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間の配列において広範に異なり、その特定の抗原における各特定の抗体の結合特異性に関与するという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分配されない。可変性は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの双方の相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるセグメントに集中する。より高度に保存された可変ドメインの部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。未変性重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、４つのＦＲ領域を含み、大部分は、３つのＣＤＲによって連結されるβシート構造を取り、これは、βシート構造に連結し、一部の場合においてはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照）。定常ドメインは、一般に、抗原結合に直接関与しないが、抗原結合親和性に影響を及ぼし、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはアポトーシスにおける抗体の関与等の、種々のエフェクター機能を示す場合がある。
【０２１２】
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される時、抗原へのその結合に関連する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））、および／または「超可変ループ」からのこれらの残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌｌ）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））を包含する。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、ＣＤＲに隣接するこれらの可変ドメイン残基である。ＦＲ残基は、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディ、ワクチボディ（ｖａｃｃｉｂｏｄｉｅｓ）、直鎖状抗体、および二重特異性抗体に存在する。
【０２１３】
本明細書に使用される、「標的結合剤」、「標的結合タンパク質」、「特異的結合タンパク質」、および同様の用語は、薬剤、例えば、標的部位に優先的に結合する抗体、またはその結合断片を指す。一実施形態において、標的結合剤は、１つの標的部位にのみ特異的である。他の実施形態において、標的結合剤は、２つ以上の標的部位に特異的である。一実施形態において、標的結合剤は、モノクローナル抗体であり、標的部位は、エピトープであり得る。標的結合剤は、抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ）を含むことができ、前記ドメインは、異種タンパク質足場、例えば、非抗体タンパク質足場に縮合される、またはその中に含有される。
【０２１４】
抗体の「結合断片」は、組み換えＤＮＡ技術により、または無処置抗体の酵素もしくは化学切断により産生される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および単一鎖抗体を含む。「二重特異性」または「二重機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。過剰な抗体が、対レセプターに結合されるレセプターの量を少なくとも約２０％、４０％、６０％、または８０％、より一般的には、約８５％超低下させる時（生体外競合結合アッセイにおいて測定される）、抗体は、実質的に、レセプターの対レセプターへの付着を阻害する。
【０２１５】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合することができる、いかなるタンパク質決定基をも含む。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸または糖側鎖等の化学的に活性な表面分子群から成り、必ずしもそうではないが、指定の三次面構造特徴、ならびに指定の電荷特徴を有し得る。抗体は、解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは１０ｎＭ以下の時、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０２１６】
「薬剤」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または生物学的材料から作製された抽出物を表すために使用される。
【０２１７】
Ｂ７−Ｈ１ポリペプチドに関する「活性（Ａｃｔｉｖｅ）」または「活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、未変性Ｂ７−Ｈ１ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するＢ７−Ｈ１ポリペプチドの一部を指す。本明細書で使用される時、「生物学的」とは、未変性Ｂ７−Ｈ１ポリペプチドの活性によって生じる生物学的機能を指す。好ましいＢ７−Ｈ１の生物学的活性は、例えば、Ｂ７−Ｈ１誘発細胞増殖、細胞付着、および侵入を含む。
【０２１８】
本明細書で使用される時、「哺乳類」とは、哺乳類と考えられるあらゆる動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【０２１９】
本明細書で使用される時、「動物」とは、哺乳類と考えられる動物を包含する。好ましくは、動物はヒトである。
【０２２０】
「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学対象を含む。
【０２２１】
「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を指す。
【０２２２】
本明細書で使用される時、「リポソーム」は、本発明のＢ７−Ｈ１ポリペプチドまたはそのようなＢ７−Ｈ１ポリペプチドに対する抗体を含み得る薬物の哺乳類への送達に有用であり得る小型小胞を指す。
【０２２３】
本明細書で使用される、「標識」または「標識された」は、検出可能部分のポリペプチドへの付加、例えば、放射標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識、またはビオチニル基を指す。ラジオアイソトープまたは放射性核種は、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉを含み、蛍光標識は、ローダミン、ランタニド系蛍光体、またはＦＩＴＣを含み、酵素標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシターゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを含み得る。
【０２２４】
さらなる標識は、例示であって、これらに限定されないが、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、α−Ｄ−ガラクトシターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびペルオキシダーゼ等の酵素；染料；さらなる蛍光標識もしくは蛍光因子は、フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ＧＦＰ（「緑色蛍光タンパク質」のＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレスカミン等を含む；ランタニドクリプテートおよびキレート、例えば、ユーロピウム等（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ａｎｄ  Ｃｉｓｂｉｏ  Ａｓｓａｙｓ）のフルオロフォア；イソルミノール、ルミノール、およびジオキセタン等の化学発光標識または化学発光物質；感作物質；補酵素；酵素；酵素基質、ラテックスまたは炭素粒子等の粒子；金属ゾル；結晶子；リポソーム；染料、触媒、または他の検出可能な基でさらに標識され得る細胞等；ビオチン、ジゴキシゲニン、または５−ブロモデオキシウリジン等の分子；例えば、シュードモナス外毒素（ＰＥ、またはその細胞毒性断片もしくは変異体）、ジフテリア毒素、またはその細胞毒性断片もしくは変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、もしくはＦ、リシンもしくはその細胞毒性断片、例えば、リシンＡ、アブリンもしくはその細胞毒性断片、サポリンもしくはその細胞毒性断片、ヤマゴボウ抗ウイルス毒素もしくはその細胞毒性断片、およびブリオジン１もしくはその細胞毒性断片から成る群より選択される毒素部分等の毒素部分により標識され得る。
【０２２５】
本明細書に使用される、「薬学的薬剤または薬物」という用語は、患者に適切に投与される時、所望の治療効果を誘発することができる化学化合物または組成物を指す。本明細書における他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））（参照により本明細書に組み込まれる）により例示される、当該分野における従来の使用法に従い使用される。
【０２２６】
本明細書に使用される、「実質的に純粋な」とは、対象種が主要な種（すなわち、モル基準で、組成物中の他のいずれの個々の種よりも豊富）であり、好ましくは、実質的に精製された画分は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％超、より好ましくは、約８５％、９０％、９５％、および９９％超を含む。最も好ましくは、対象種は、組成物が本質的に単一高分子種から成る、本質的な同種に精製される（不純物種は、従来の検出法によって組成物中に検出されない）。
【０２２７】
「抗体依存細胞媒介細胞毒性(抗体依存細胞媒介細胞傷害)」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｉｇ  Ｆｃレセプター（ＦｃＲｓ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、好中球、およびマクロファージ）を発現する非特異的細胞毒性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解をもたらす細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表９に要約されている。関心の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号、または第５，８２１，３３７号等に記載される生体外ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、抹消血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的に、または加えて、関心の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９８８）等に開示される動物モデルにおいて、生体内で評価され得る。
【０２２８】
「補体依存細胞毒性(補体依存細胞傷害)」および「ＣＤＣ」とは、抗体がそれらの細胞死滅機能を実行する機構を指す。補体の第１構成要素の構成物であるＣ１ｑのＩｇｓ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのＦｃドメインへの結合により開始され、これは、抗原と複合体を形成している（Ｈｕｇｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｂ．Ｇａｒｄｎｅｒ．１９７９．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：６９７）。Ｃ１ｑは、７０μｇ／ｍｌの濃度でヒトの血清に存在する、大きく、構造的に複雑な、約４１０ｋＤａの糖タンパク質である（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｎ．Ｒ．１９８５．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１５１）。Ｃ１ｒおよびＣ１ｓの２つのセリンプロテアーゼと共に、Ｃ１ｑは、補体の第１構成要素である複合体Ｃ１を形成する。Ｃ１ｑのＮ末端の球状頭部のうちの少なくとも２つが、Ｃ１活性化のため、よって、補体カスケードの開始のために、ＩｇｓのＦｃに結合されなければならない（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｎ．Ｒ．１９８５．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１５１）。
【０２２９】
本明細書に使用される、「抗体半減期」という用語は、それらの投与後の抗体分子の平均生存時間の測定基準である、抗体の薬物動態特性を意味する。抗体半減期は、例えば、血清もしくは血漿中、すなわち循環半減期、または他の組織で測定される、既知の免疫グロブリン量の５０％を患者の身体、またはその特定の区画から排除するのに必要な時間として表現される。半減期は、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンのクラスによって変動し得る。一般に、抗体半減期の増加は、投与された抗体の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増加をもたらす。
【０２３０】
「アイソタイプ」という用語は、抗体の重鎖もしくは軽鎖の定常領域の分類を指す。抗体の定常ドメインは、抗原への結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列により、所与のヒト抗体または免疫グロブリンは、免疫グロブリンの５つの主なクラスであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。これらのクラスのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１（ガンマ１）、ＩｇＧ２（ガンマ２）、ＩｇＧ３（ガンマ３）、およびＩｇＧ４（ガンマ４）、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分配される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスの構造および三次元構造は周知である。種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＭのみが、補体を活性化することが知られている。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４は、Ｆｃガンマレセプターに結合することが知られており、これは、ＡＤＣＣを含む種々のエフェクター機能を媒介する。ヒト軽鎖定常領域は、カッパおよびラムダの２つの主なクラスに分類され得る。
【０２３１】
所望する場合、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合する抗体のアイソタイプは、例えば、異なるアイソタイプの生物学的特性を利用するために転換することができる。例えば、一部の場合において、Ｂ７−Ｈ１に対する治療抗体として抗体を生成することに関して、抗体が補体を固定し、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）に関与することできることが望ましい場合がある。同様のことができるいくつかの抗体のアイソタイプがあり、それにはマウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態において、Ｂ７−Ｈ１に対する治療抗体として抗体を生成することに関して、抗体がエフェクター細胞上のＦｃレセプターに結合し、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与することができることが望ましい場合がある。同様のことができるいくつかの抗体のアイソタイプがあり、それにはマウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３が含まれるが、これらに限定されない。生成される抗体は、そのようなアイソタイプを最初に保有している必要はないが、むしろ、抗体は、生成される時にいずれかのアイソタイプを有することができ、抗体は、当該分野に周知の従来の技術を使用して、その後、アイソタイプ転換され得ることを理解する。そのような技術は、特に、直接組み換え技術（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号を参照）、細胞−細胞融合技術（例えば、米国特許第５，９１６，７７１号および第６，２０７，４１８号を参照）の使用を含む。
【０２３２】
例として、本明細書に説明される抗Ｂ７−Ｈ１抗体は、完全ヒト抗体である。抗体がＢ７−Ｈ１に対して所望の結合を保有する場合、常に同じ可変領域（抗体の特異性およびその親和性の一部を定義する）を有しながら、容易にアイソタイプ転換して、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１、またはヒトＩｇＧ３のアイソタイプを生成することができる。そうすることにより、そのような分子は、補体を固定し、ＣＤＣに関与することができる、かつ／またはエフェクター細胞上のＦｃレセプターに結合し、ＡＤＣＣに関与することができるだろう。
【０２３３】
「全血アッセイ」は、天然のエフェクターの供給源として未分画血液を使用する。血液は、多形核細胞（ＰＭＮ）および単核細胞（ＭＮＣ）等のＦｃＲ発現細胞エフェクターと共に、血漿に補体を含有する。よって、全血アッセイは、生体外のＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機構の双方の相乗作用の同時評価を可能にする。
【０２３４】
本明細書に使用される、「治療有効」量とは、対象にある改善もしくは利益を提供する量である。言い換えると、「治療有効」量は、少なくとも１つの臨床症状において、ある軽減、緩和、および／または減少を提供する量である。本発明の方法により治療され得る疾患に関連する臨床症状は、当業者に周知である。さらに、当業者は、ある利益が対象に提供される限り、治療効果は完全である、または治癒的である必要はないことを理解する。
【０２３５】
ヒトにおける例示的な癌は、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳およびＣＮＳ癌（例えば、膠腫腫瘍）、子宮頸癌、絨毛癌、結腸および直腸癌、結合組織癌、消化系の癌；子宮内膜癌、食道癌；眼癌；頭頚部の癌；胃癌；上皮内新生物；腎臓癌；咽頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；メラノーマ；骨髄腫，神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵癌、網膜芽細胞腫；黄紋筋肉腫；直腸癌、，腎癌、呼吸器系の癌；肉腫、皮膚；胃癌、精巣癌、甲状腺癌；子宮癌、泌尿器系の癌、ならびに他の細胞癌および肉腫を含む。
【０２３６】
ヒトにおける例示的な慢性感染は、ＨＩＶ、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）、および肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）を含む。
【０２３７】
本明細書に使用される、「および／または」という用語は、もう一方を含む、または含まない、２つの特定の特色または構成要素のそれぞれの指定された開示と見なされる。例えば、「Ａおよび／またはＢ」とは、それぞれが本明細書に個別に提示されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの特定の開示と見なされる。
【０２３８】
抗体の構造
基本的な抗体の構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一対から成り、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と、１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥのように抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合され、重鎖も、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的に、  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと（全ての目的において、参照によりその全体が組み込まれる）。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０２３９】
よって、無傷抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性もしくは二重特異性抗体を除き、２つの結合部位は同じである。
【０２４０】
鎖は全て、ＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域により接合される、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の双方は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４ドメインを含む。アミノ酸の各ドメインへの割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０２４１】
二重特異的または二機能性の抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対、および２つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む種々の方法により産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０），Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。二重特異性抗体は、単一結合部位（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖ）を有する断片の形態で存在しない。
【０２４２】
通常、ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対となり、抗体抗原結合部位を提供するが、ＶＨまたはＶＬドメインは、単独で抗原と結合するために使用され得る。ＶＨドメイン（表９を参照）は、ＶＬドメイン（表１３を参照）と対となり得、ＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体抗原結合部位が形成される。
【０２４３】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、マウスもしくはラット可変および／または定常領域を保有する抗体に関連する問題のいくつかを回避する。そのようなマウスもしくはラット由来のタンパク質の存在は、抗体の急速なクリアランスをもたらすか、または患者により抗体に対する免疫応答の生成をもたらす場合がある。マウスもしくはラット由来の抗体の利用を回避するために、ゲッ齒類、他の哺乳類、または動物が完全ヒト抗体を生産するように、機能性ヒト抗体遺伝子座をゲッ齒類、他の哺乳類、または動物の中に導入することにより、完全ヒト抗体を生成することができる。
【０２４４】
完全ヒト抗体を生成するための一方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座の最大１０００ｋｂであるがそれ未満の大きさの生殖系列構成断片を含有するように操作された、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株の使用を通してである。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照のこと。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ）より入手可能である。
【０２４５】
次いで、そのようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することができるが、マウス免疫グロブリン分子および抗体の産生に欠ける。同様のことを達成するために利用される技術は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号、および１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願ＷＯ第９８／２４８９３号、ならびに２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ第００／７６３１０号に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）も参照し、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４６】
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株の産生はさらに、１９９０年１月１２に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０日に出願された第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日出願された第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された第０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日に出願された第０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国公開第２００３／００９３８２０号、ならびに米国特許第６，１６２，９６３号、第６，１５０，５８４号、第６，１１４，５９８号、第６，０７５，１８１号、および第５，９３９，５９８号、ならびに日本国特許第３  ０６８  １８０  Ｂ２号、第３  ０６８  ５０６  Ｂ２号、および第３  ０６８  ５０７  Ｂ２号に記載され、記述されている。１９９６年６月１２日に付与公開された欧州特許第ＥＰ０  ４６３  １５１  Ｂ１号、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願ＷＯ第９４／０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願ＷＯ第９６／３４０９６号、１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ第９８／２４８９３号、２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ第００／７６３１０号も参照のこと。上に引用された特許、出願、および参考文献のそれぞれの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４７】
代替的なアプローチにおいて、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他社は、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチを利用した。ミニ遺伝子座アプローチにおいて、外来性Ｉｇ遺伝子座は、Ｉｇ遺伝子座からの小片（個別の遺伝子）を含むことを通して模倣される。よって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、および通常、第２の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物への挿入のために構築物中に形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号ならびにそれぞれＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、第５，６２５，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、および第６，２５５，４５８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓの米国特許第５，５９１，６６９号および第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓらの米国特許第５，６１２，２０５号、第５，７２１，３６７号、および第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉおよびＤｕｎｎらの米国特許第５，６４３，７６３号、ならびに１９９０年８月２９日に出願されたＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日に出願された第０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された第０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日に出願された第０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日に出願された第０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された第０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日に出願された第０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日に出願された第０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された第０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日に出願された第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日に出願された第０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日に出願された第０８／２０９，７４１号に記載されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。欧州特許第０  ５４６  ０７３  Ｂ１号国際特許出願ＷＯ第９２／０３９１８号、ＷＯ第９２／２２６４５号、ＷＯ第９２／２２６４７号、ＷＯ第９２／２２６７０号、ＷＯ第９３／１２２２７号、ＷＯ第９４／００５６９号、ＷＯ第９４／２５５８５号、ＷＯ第９６／１４４３６号、ＷＯ第９７／１３８５２号、およびＷＯ第９８／２４８８４号、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照し、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｔａｙｌｏｒら（１９９２）、Ｃｈｅｎら（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）、Ｃｈｏｉら（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒら（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎら（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６）をさらに参照し、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４８】
Ｋｉｒｉｎは、微小核体融合を通して、大きな染色体の小片、または染色体全体が導入されたマウスからのヒト抗体の生成も示した。欧州特許出願第７７３  ２８８号、および第８４３  ９６１号を参照し、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスをＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスと交雑した結果であるＫＭＴＭ−マウスが生成されている。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨ導入染色体と、Ｇｅｎｐｈａｒｍマウスのカッパ鎖導入遺伝子とを保有する（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，（２００２）４：９１−１０２）。
【０２４９】
ヒト抗体は生体外法によっても得ることができる。適切な例としては、ファージ提示（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（前のＰｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソーム提示（ＣＡＴ）、酵母提示等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５０】
抗体の調製
本明細書に記載される抗体は、以下に記載するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の利用を通して調製された。そのようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することができるが、マウス免疫グロブリン分子および抗体の産生に欠ける。同様のことを達成するために利用された技術は、本明細書の背景技術セクションに開示される特許、出願、および参考文献において開示される。しかしながら、特に、マウスおよびそれからの抗体の遺伝子導入産生の好ましい実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号、ならびに１９９８年６月１１日に出願された国際特許出願ＷＯ第９８／２４８９３号、および２０００年１２月２１日に出願されたＷＯ第００／７６３１０号に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）も参照し、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５１】
そのような技術の使用を通して、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が産生された。基本的に、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系のマウスが関心の抗原（例えば、Ｂ７−Ｈ１）で免疫化され、リンパ管細胞（Ｂ細胞等）が、過剰免疫化マウスから回収され、回収されたリンパ細胞は、不死ハイブリドーマ細胞系を調製するために骨髄型細胞系と融合される。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、選択して、関心の抗原に特異的である抗体を産生したハイブリドーマ細胞系を特定する。Ｂ７−Ｈ１に特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞系を産生するための方法を本明細書に提供する。さらに、そのような細胞系によって産生された抗体の特徴を本明細書に提供し、これは、そのような抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含む。
【０２５２】
代替的に、ハイブリドーマを生成するために骨髄細胞に融合させる代わりに、Ｂ細胞を直接アッセイすることができる。例えば、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を過剰免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスから単離し、増殖させ、抗体分泌形質細胞に分化させる。次いで、Ｂ７−Ｈ１免疫原に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより細胞上清からの抗体をスクリーニングする。上清も、Ｂ７−Ｈ１の断片に対する免疫活性についてスクリーニングし、さらに結合について、異なる抗体をＢ７−Ｈ１の機能的な関心のドメインに位置付けてもよい。抗体は、また、他の関連するヒトタンパク質、ならびにラット、マウス、およびカニクイザル等のＢ７−Ｈ１のオルソログであるヒト以外の霊長類に対してスクリーニングされ、最後に種の交差反応性を決定してもよい。関心の抗体を含有するウェルからのＢ細胞は、個別のもしくはプールされたウェルのいずれかよりハイブリドーマを作製するための融合、またはＥＢＶとの感染、もしくは既知の不死化遺伝子により形質移入した後、適切な培地で平板培養することを含む種々の方法により不死化され得る。代替的に、所望の特異性を有する抗体を分泌する単一の形質細胞は、その後、Ｂ７−Ｈ１特異的溶血性プラークアッセイを使用して単離される（例えば、Ｂａｂｃｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７８４３−４８（１９９６）を参照）。溶解を標的とする細胞は、好ましくは、Ｂ７−Ｈ１抗原でコーティングされたヒツジの赤血球（ＳＲＢＣ）である。
【０２５３】
関心の免疫グロブリンおよび補体を分泌する形質細胞を含有するＢ細胞培養物の存在において、プラークの形成は、関心の形質細胞を包囲するヒツジの赤血球の特異的Ｂ７−Ｈ１媒介溶解を示す。プラークの中心の単一抗原特異的形質細胞を単離することができ、抗原の特異性をコードする遺伝子情報を単一の形質細胞から単離する。逆転写、続いてＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡをクローン化することができる。その後、そのようなクローン化されたＤＮＡはさらに、適切な発現ベクター、好ましくは、ｐｃＤＮＡ等のベクターカセット、より好ましくは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを含有する、そのようなｐｃＤＮＡベクター中に挿入され得る。次いで、生成されたベクターは、宿主細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞中に形質移入され、転写の誘発、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なように修飾された従来の栄養培地中で培養され得る。
【０２５４】
理解されるように、本明細書に記載される抗体は、ハイブリドーマ細胞系以外の細胞系で発現し得る。特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳類の宿主細胞を形質転換するように使用され得る。形質転換は、ポリヌクレオチドをウイルス中（またはウイルスベクター中）にパッケージングすること、および宿主細胞をウイルス（またはベクター）で形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するためのいずれかの既知の方法により、または米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号（これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる）により例示される、当該分野に公知の形質移入手順により行われ得る。使用される形質転換手順は、形質転換される宿主による。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞中に導入するための方法は、当該分野において周知であり、デキストラン媒介形質移入、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介形質移入、原形質融合、電気穿孔、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、およびＤＮＡの核への直接微量注入を含む。
【０２５５】
発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は、当該分野において周知であり、ＮＣＩＭＢより入手可能な多くの不死化細胞系を含み、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞、サルの腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞（Ｈｅｋ２９３）、およびいくつかの他の細胞系を含むが、これらに限定されない。特定の好ましい細胞系は、どの細胞系が高発現レベルを有し、構成的Ｂ７−Ｈ１結合特性を有する抗体を産生するかを決定することを通して選択される。
【０２５６】
細胞−細胞融合技術において、いずれかの所望のアイソタイプを有する重鎖を保有する骨髄腫、ＣＨＯ細胞、または他の細胞系が調製され、軽鎖を保有する別の骨髄腫、ＣＨＯ細胞、または他の細胞系が調製される。そのような細胞は、その後、融合され、無傷抗体を発現する細胞系が単離され得る。
【０２５７】
したがって、上述の所望の「構造的」特質を満たす抗体候補が生成されると、それらは、一般に、アイソタイプ転換を通して、少なくともいくつかの所望の「機能的」特質を伴って提供され得る。
【０２５８】
細胞−細胞融合技術において、いずれかの所望のアイソタイプを有する重鎖を保有する骨髄腫、ＣＨＯ細胞、または他の細胞系が調製され、軽鎖を保有する別の骨髄腫、ＣＨＯ細胞、または他の細胞系が調製される。そのような細胞は、その後、融合され、無傷抗体を発現する細胞系が単離され得る。
【０２５９】
したがって、上述の所望の「構造的」特質を満たす抗体候補が生成されると、それらは、一般に、アイソタイプ転換を通して、少なくともいくつかの所望の「機能的」特質を伴って提供され得る。
【０２６０】
抗体配列
本発明の実施形態は、以下の表１に列挙される抗体を含む。この表は、それぞれ、各抗体の識別番号と、それとともに対応する重鎖および軽鎖の遺伝子およびポリペプチドの可変ドメインの配列番号を報告する。各抗体配列には、識別番号が与えられている。
【表１】
0006047646.tif 000002
【０２６１】
治療用の投与および製剤
本発明の実施形態は、障害の治療に有用である抗Ｂ７−Ｈ１抗体の減菌薬学的製剤を含む。そのような製剤は、Ｂ７−Ｈ１がその同族リガンドのうちの１つ以上に結合することを阻害し、それによって、例えば、血清または組織Ｂ７−Ｈ１が異常に上昇する病的状態を治療するであろう。本発明の抗体は、好ましくは、Ｂ７−Ｈ１活性を強力に阻害する、またはＢ７−Ｈ１がその同族リガンドのうちの１つ以上に結合することを阻害するための十分な親和性を保有し、好ましくは、ヒトにおける低頻度投与を可能にするのに十分な作用持続を有する。作用持続の延長は、皮下または筋肉内注射等の代替の非経口経路による、頻度が低く、より簡便な投与スケジュールを可能にする。
【０２６２】
減菌製剤は、抗体の凍結乾燥および再構成の前または後に、減菌濾過膜を通して濾過することにより作製され得る。抗体は、通常、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存される。治療抗体組成物は、一般に、減菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バックまたは皮下注射針によって穿痛可能なストッパー等の製剤の回収を可能にするアダプターを有するバイアルの中に入れられる。
【０２６３】
抗体投与経路は、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、くも膜下腔内、吸入、もしくは病巣内経路による注射または注入、腫瘍部位への直接注射、あるいは以下に説明する徐放系による、既知の方法に従う。抗体は、好ましくは、注入により、またはボーラス注射により連続的に投与される。
【０２６４】
治療的に利用される抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態による。したがって、治療者が投与量を滴定し、最適な治療効果を得るために、必要に応じ投与経路を修正することが好ましい。通常、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで抗体を投与する。この療法の進行は、従来のアッセイにより、または本明細書に記載されるアッセイにより容易に監視される。
【０２６５】
本明細書に記載される抗体は、薬学的に許容される担体と混合して調製され得る。この治療用組成物は、好ましくは、液体もしくは粉末エアロゾール（凍結乾燥された）として、静脈内、または鼻もしくは肺を通して投与され得る。組成物は、所望に応じて、非経口的に、または皮下にも投与され得る。全身的に投与される時、治療用組成物は、減菌の、発熱物質を含まず、ｐＨ、等張性、および安定性に十分に考慮した非経口的に許容される溶液であるべきである。これらの条件は、当業者に公知である。簡潔には、本明細書に記載される化合物の投与量製剤は、所望の純度を有する化合物を薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより、保管または投与用に調製される。そのような材料は、利用される投与量および濃度で、受給者に非毒性であり、ＴＲＩＳ  ＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、および他の有機酸塩等の緩衝剤、アスコルビン酸等の抗酸化剤、ポリアルギニン等の低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリジノン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン等のアミノ酸、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡ糖のキレート剤、マンニトールまたはソルビトール糖の糖アルコール、ナトリウム等の対イオン、および／またはＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、またはポリエチレングリコール等の非イオン界面活性剤を含む。
【０２６６】
注射用の減菌組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００３））に記載の従来の薬学的慣習に従い製剤化され得る。例えば、水等のビヒクル、またはゴマ油、落花生油、もしくは綿実油等の天然に生じる植物油、あるいはエチルオレイン酸塩等の合成脂肪ビヒクル中の活性化合物の溶解または懸濁が所望され得る。緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤等が、認容の薬学的慣習に従い組み込まれ得る。
【０２６７】
徐放調製物の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形物品、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，（１９８１）１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，（１９８２）１２：９８−１０５により説明されるポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、第ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，（１９８３）２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照）、ＬＵＰＲＯＮ  Ｄｅｐｏｔ（商標）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから成る注射可能な小球体）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（第ＥＰ１３３，９８８号）が挙げられる。
【０２６８】
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日以上にわたり分子を放出できるが、あるヒドロゲルは、短い時間の間タンパク質を放出する。封入されたタンパク質が長期間身体内に留まる時、それらは、３７℃で水分に曝された結果として変性するか、または凝集し、生物学的活性の欠損、および免疫原性の変更の可能性をもたらす。合理的な戦略が、関与する機構により、タンパク質の安定化について考案され得る。例えば、凝集機構が、ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、含水量を制御し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することにより達成され得る。
【０２６９】
徐放組成物は、懸濁剤中に結晶を維持することができる適切な製剤に懸濁された抗体の結晶を調製することも含む。これらの調製物は、皮下的に、または腹腔内に注射される時、徐放作用を生じさせることができる。他の組成物は、リポソーム的に封入された抗体も含む。そのような抗体を含有するリポソームは、それ自体が知られている方法により調製される：米国特許第ＤＥ３，２１８，１２１号、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８５）８２：３６８８−３６９２、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８０）７７：４０３０−４０３４、ＥＰ第５２，３２２号、ＥＰ第３６，６７６号、ＥＰ第８８，０４６号、ＥＰ第１４３，９４９号、１４２，６４１、日本国特許出願第８３−１１８００８、米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号、ならびにＥＰ第１０２，３２４号。
【０２７０】
所与の患者における抗体製剤の投与量は、担当の医師によって決定され、障害の重篤度および種類、体重、性別、食事、投与の時間および経路、他の薬物、ならびに他の関連する臨床因子を含む、薬物作用を修飾することが知られている種々の要因を考慮する。治療有効量は、生体外または生体内のいずれかの方法によって決定され得る。
【０２７１】
本明細書に記載される抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態による。したがって、治療者が投与量を滴定し、最適な治療効果を得るために、必要に応じ投与経路を修正することが好ましい。通常の日用量は、上述の要因に依存して、患者の体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１００００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。投与量は、上述の要因に依存して、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇであり得る。通常、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで治療用抗体を投与する。この療法の進行は、従来のアッセイにより、または本明細書に記載されるように容易に監視される。
【０２７２】
本発明の抗体の用量は、反復することができ、投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３ヶ月、または少なくとも６ヶ月隔てることができる。
【０２７３】
本明細書の組成物および方法に従う治療学的実体の投与は、製剤中に組み込まれて改善された転送、送達、耐性等を提供する適切な担体、賦形剤、および他の薬剤と共に投与されるであろうことが理解される。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、液体、小胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）等）を含有する脂質（陽イオンまたは陰イオン）、ＤＮＡ共役体、無水吸収ペースト、水中油系および油中水系エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含有する半固体混合物を含む。前述の混合物のいずれも、本発明に従う治療および療法に適切であり得るが、但し、製剤中の活性成分が製剤によって不活化されず、製剤が投与形態と物理的に適合性があり、許容できるものとする。Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８（２０００）、Ｗａｎｇ  Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ“Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）、および薬剤師に周知の製剤、賦形剤、および担体に関する追加情報についてのそれらの中の引用も参照のこと。
【０２７４】
他の治療薬の設計および生成
本発明に従い、またＢ７−Ｈ１に関して本明細書で産生され、特徴付けされる抗体の活性に基づき、抗体部分を超えた他の治療様式の設計が容易になり、当業者に開示される。そのような様式は、二重特異性抗体、免疫毒素、放射性標識化治療薬、および単一抗体Ｖドメイン等の進歩した抗体治療薬、Ｖ領域足場以外に基づく抗体様結合剤、単一ドメイン抗体、ペプチド治療薬の生成、新規足場におけるＢ７−Ｈ１結合ドメイン、遺伝子療法、特に細胞内抗体、アンチセンス治療薬、ならびに小分子を含むが、これらに限定されない。
【０２７５】
抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはシトクロームＢ等の非抗体タンパク質足場上のＣＤＲの配置によって（Ｈａａｎ＆Ｍａｇｇｏｓ（２００４）ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）：Ａ１−Ａ６、Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４：１１４１−１１５１、Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３−４６９）、またはタンパク質足場内のループのアミノ酸残基を無作為化する、または変異させて、所望の標的に結合特異性を付与することにより提供され得る。タンパク質中の新規結合部位を操作するための足場は、Ｎｙｇｒｅｎら（Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３−４６９）により詳細に考察されている。抗体模倣物のタンパク質足場は、ＷＯ第／００３４７８４号に開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、その発明者は、少なくとも１つの無作為化ループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体模倣物）を説明している。１つ以上のＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ一式を移植するための適切な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのいかなるドメイン成員によっても提供され得る。足場は、ヒトまたはヒト以外のタンパク質であり得る。非抗体タンパク質足場の利点は、少なくともいくつかの抗体分子より小さい、および／または製造が容易である足場分子に抗原結合部位を提供することができることである。小さい大きさの結合成員は、細胞に進入する、組織深部に浸透する、もしくは他の構造内の標的に達する、または標的抗原のタンパク質空洞内に結合する能力等の、有用な生理学的特性を付与することができる。非抗体タンパク質足場の抗原結合部位の使用は、Ｗｅｓｓ，２００４（Ｗｅｓｓ，Ｌ．Ｉｎ：ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，２００４）に考察されている。安定した骨格および１つ以上の可変ループを有するタンパク質が一般的であり、ループまたは複数のループのアミノ酸配列は、特異的かつ無作為に変異し、抗原を標的とする抗原結合部位を作製する。そのようなタンパク質は、黄色ブドウ球菌、トランスフェリン、アルブミン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）、リポカリン、ならびにガンマ結晶および他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）足場（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）からのタンパク質ＡのＩｇＧ結合ドメインを含む。他のアプローチの例としては、分子内ジスルフィド結合を有する小タンパク質であるサイクロチドに基づく合成「微小体」、微小タンパク質（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、Ａｍｕｎｉｘ）、およびアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）が挙げられる。
【０２７６】
抗体配列および／または抗原結合部位に加え、本発明に従う標的結合剤は、例えば、折り畳まれたドメイン等のペプチドもしくはポリペプチドを形成する、または抗原に結合する能力に加え、分子に別の機能特徴を付与する、他のアミノ酸を含むことができる。本発明の標的結合剤は、検出可能な標識を備えるか、または毒素、もしくは標的部分あるいは酵素に（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）共役され得る。例えば、標的結合剤は、触媒部位（例えば、酵素ドメインに）、ならびに抗原結合部位を含むことができ、抗原結合部位は、抗原に結合し、よって、抗原に対する触媒部位を標的とする。触媒部位は、例えば、切断により抗原の生物学的機能を阻害することができる。
【０２７７】
進歩した抗体治療薬の生成に関連して、補体固定が望ましい特質である場合、例えば、二重特異性抗体、免疫毒素、または放射性標識の使用を通した細胞死滅において、補体への依存を回避することが可能であり得る。
【０２７８】
例えば、（ｉ）一緒に共役される、１つがＢ７−Ｈ１に特異的であり、もう一方が第２の分子に特異的である２つの抗体、（ｉｉ）Ｂ７−Ｈ１に特異的な鎖１本と第２の分子に特異的な第２の鎖とを有する単一抗体、または（ｉｉｉ）Ｂ７−Ｈ１および他の分子に特異性を有する単一鎖抗体を含む二重特異性抗体を生成することができる。そのような二重特異性抗体は、周知の技術を使用して生成することができ、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）に関しては、例えば、Ｆａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ４：７２−８１（１９９４）およびＷｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ（上記参照）を参照に、（ｉｉｉ）に関しては、例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１−５２（１９９２）を参照のこと。それぞれの場合において、第２の特異性は、所望に応じて作製することができる。例えば、第２の特異性は、ＣＤ１６もしくはＣＤ６４（例えば、Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１８：１２７（１９９７））、またはＣＤ８９（例えば、Ｖａｌｅｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ９０：４４８５−４４９２（１９９７）を参照）を含むが、これらに限定されない重鎖活性化レセプターに対して行われる。
【０２７９】
抗体は、当該分野に周知の技術を利用して、免疫毒素として機能するように修飾することもできる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ１４：２５２（１９９３）を参照のこと。米国特許第５，１９４，５９４号も参照のこと。放射性標識化抗体の調製に関して、そのような修飾された抗体も、当該分野に周知の技術を利用して、容易に調製することができる。例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ６５５−６８６（２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ  （１９９６））のＪｕｎｇｈａｎｓらを参照のこと。米国特許第４，６８１，５８１号、第４，７３５，２１０号、第５，１０１，８２７号、第５，１０２，９９０（ＲＥ３５，５００）号、第５，６４８，４７１号、および第５，６９７，９０２号も参照のこと。各免疫毒素または放射性標識化分子は、所望の多量体酵素サブユニットオリゴマー形成ドメインを発現する細胞を死滅させる可能性が高いであろう。
【０２８０】
抗体が薬剤（例えば、ラジオアイソトープ、医薬組成物、または毒素）に連結される時、薬剤は、抗有糸分裂、アルキル化、代謝拮抗、血管新生抑制、アポトーシス、アルカロイド、ＣＯＸ−２、および抗生物質ならびにそれらの組み合わせの群より選択される薬学的特性を保有することが意図される。薬剤は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗薬、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、拮抗薬、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、およびそれらの類似体、ならびにそれらの組み合わせの群より選択することができる。毒素の例としては、さらにゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス内毒素、カリケアマイシンおよびエスペラミシン等の分子のエンジインファミリーの成員、ならびに誘導体、それらの組み合わせおよび修正形が挙げられる。化学毒素は、デュオカルマイシン（例えば、米国特許第５，７０３，０８０号および米国特許第４，９２３，９９０号を参照）、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シス−プラチナム、エトポシド、ブレオマイシン、および５−フルオロウラシルからも成る群より選択され得る。化学療法剤の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、サイトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照）、メルファラン、および他の関連するナイトロジェンマスタードも挙げられる。適切な毒素および化学療法剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  １９９５）、およびＧｏｏｄｍａｎ  Ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）に記載されている。他の適切な毒素および／または化学療法剤は、当業者に公知である。
【０２８１】
ラジオアイソトープの例としては、局在化および／または療法に使用され得るガンマ放出体、ポジトロン放出体、およびＸ線放出体、ならびに療法に使用され得るベータ放出体およびアルファ放出体が挙げられる。診断、予後、および病期分類に有用であるとして前述したラジオアイソトープは、治療薬にも有用である。
【０２８２】
抗癌剤または抗白血病剤の例としては、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、イダルビシン、ドキソルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、およびモルホリノ等のアントラサイクリン、ならびにそれらの置換誘導体、組み合わせおよび修飾形が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的薬剤の例としては、シス−プラチナム、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロミド、サリドマイド、およびブレオマイシン、ならびにそれらの誘導体、組み合わせ、および修飾形が挙げられる。好ましくは、抗癌剤または抗白血病剤は、ドキソルビシン、モルホリノドキソルビシン、またはモルホリノダウノルビシンである。
【０２８３】
本発明の抗体は、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、未修飾抗体を超える半減期（例えば、血清半減期）を有する抗体も包含する。一実施形態において、前記抗体の半減期は、約１５日を超える、約２０日を超える、約２５日を超える、約３０日を超える、約３５日を超える、約４０日を超える、約４５日を超える、約２ヶ月を超える、約３ヶ月を超える、約４ヶ月を超える、または約５カ月を超える。哺乳類、好ましくはヒトにおける本発明の抗体、またはその断片の半減期の増加は、哺乳類における前記抗体もしくは抗体断片の高血清力価をもたらし、よって、前記抗体もしくは抗体断片の投与頻度を低下させる、および／または投与される前記抗体もしくは抗体断片の濃度を低下させる。増加した生体内半減期を有する抗体またはその断片は、当業者に公知の技術によって生成することができる。例えば、増加した生体内半減期を有する抗体またはその断片は、ＦｃドメインとＦｃＲｎレセプターとの間の相互作用に関与すると特定されたアミノ酸残基を修飾する（例えば、置換する、欠損する、または付加する）ことによって生成することができる（例えば、国際公開ＷＯ第９７／３４６３１号およびＷＯ第０２／０６０９１９号を参照し、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。増加した生体内半減期を有する抗体またはその断片は、前記抗体または抗体断片に高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマー分子を結合することによって生成することができる。ＰＥＧは、ＰＥＧの前記抗体または抗体断片のＮもしくはＣ末端への部位特異的共役を通して、またはリジン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介するかのいずれかにより、多官能性リンカーを用いて、または用いずに前記抗体または抗体断片に結合することができる。生物学的活性の最小損失をもたらす直鎖状または分枝状ポリマー誘導化法が使用される。共役の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法により厳密に観察され、ＰＥＧ分子の抗体への適切な共役を確実にする。未反応ＰＥＧは、例えば、分子ふるい、またはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体−ＰＥＧ共役体から分離することができる。
【０２８４】
上記実施形態において、当業者に理解されるように、親和性値は重要であり得るが、他の因子も抗体の特定の機能に依存して、同様に重要であるか、またはより重要であり得る。例えば、免疫毒素（抗体に伴う毒素）において、抗体が標的に結合する作用は有用であり得るが、一部の実施形態において、毒素の細胞内での内在化が、所望の最終的な結果である。したがって、内在化の割合が高いことは、これらの状況において望ましい場合がある。よって、一実施形態において、内在化に高効率の抗体が意図される。内在化の高効率は、内在化された抗体の割合（％）として測定することができ、低値から１００％に及び得る。例えば、種々の実施形態において、０．１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９９、および９９〜１００％が高効率であり得る。当業者に理解されるように、望ましい効率は、異なる実施形態において、例えば、伴う薬剤、領域に投与され得る抗体の量、抗体−薬剤複合体の副作用、種類（例えば、癌の種類）、および治療される問題の重篤度によって異なり得る。
【０２８５】
他の実施形態において、本明細書に開示される抗体は、Ｂ７−Ｈ１の発現の変化に関連する障害または疾患についてスクリーニングするために、哺乳類組織または細胞におけるＢ７−Ｈ１発現を検出するためのアッセイキットを提供する。キットは、Ｂ７−Ｈ１に結合する抗体、および存在する場合、抗体の抗原との反応を示すための手段を含む。
【０２８６】
一部の実施形態において、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合する抗体を含有する組成物を含む容器、および組成物がＢ７−Ｈ１発現により媒介される障害を治療するために使用され得ることを示す添付文書またはラベルを含む製造物品を提供する。好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトが、Ｂ７−Ｈ１に特異的に結合する抗体を受ける。
【０２８７】
併用
本明細書に定義される抗腫瘍治療は、単独療法として適用されるか、または本発明の化合物に加え、従来の手術、骨髄および抹消血幹細胞移植、または放射線療法、もしくは化学療法を含むことができる。そのような化学療法は、以下の抗腫瘍剤のカテゴリーのうちの１つ以上を含み得る：
（ｉ）アルキル化剤（例えば、シス−プラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾロミド、およびニトロソウレア）、代謝拮抗薬（例えば、ゲムシタビンならびに５−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジン等の葉酸代謝拮抗薬、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシウレア）、抗腫瘍抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）、抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイド、ならびにポロキナーゼ阻害剤）、ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドのようなエピポドフィロトキシンおよびテニポシド、アムサクリン、トポテカンならびにカンプトテシン）等の、医療腫瘍学で使用される他の抗増殖／抗新生物薬物およびそれらの組み合わせ、
（ｉｉ）抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、およびイドキシフェン）、抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、および酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨ拮抗薬もしくはＬＨＲＨ作動薬（例えば、ゴセレリン、リュープロレイン、およびブセレリン）、プロゲストーゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、およびエキセメスタン）、ならびにフィナステリド等の５α−レダクターゼの阻害剤等の、細胞分裂阻害剤、
（ｉｉｉ）抗侵入剤（ａｎｔｉ−ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０；国際特許出願ＷＯ第０１／９４３４１）およびＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−いイルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ｄａｓａｔｉｎｉｂ，ＢＭＳ−３５４８２５；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００４，４７，６６５８−６６６１）のようなｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤）、およびマリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター機能の阻害剤、またはカテプシン活性の阻害剤、セリンプロテアーゼの阻害剤、例えば、マトリプターゼ、ヘプシン、ウロキナーゼ、およびインテグリンαｖβ６機能の阻害剤、
（ｉｖ）フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン、クロラムブシル、またはドキソルビシン、およびフルダラビン＋シクロホスファミド、ＣＶＰ：シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＡＣＶＢＰ：ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンデシン＋ブレオマイシン＋プレドニゾン、ＣＨＯＰ：シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＣＮＯＰ：シクロホスファミド＋ミトキサントロン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ｍ−ＢＡＣＯＤ：メトトレキサート＋ブレオマイシン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋デキサメタゾン＋ロイコボリン、ＭＡＣＯＰ−Ｂ：メトトレキサート＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン固定用量＋ブレオマイシン＋ロイコボリン、またはＰｒｏＭＡＣＥ  ＣｙｔａＢＯＭ：プレドニゾン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋エトポシド＋シタラビン＋ブレオマイシン＋ビンクリスチン＋メトトレキサート＋ロイコボリンの、それらの組み合わせ等の細胞毒性剤、
（ｖ）成長因子機能の阻害剤：例えば、そのような阻害剤は、成長因子抗体および成長因子レセプター抗体（例えば、Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌ．５４，ｐｐ１１−２９に開示される抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ，Ｃ２２５］、ならびにあらゆる成長因子および成長因子レセプター抗体）を含み、そのような阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮増殖因子ファミリーの阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）、および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）等のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブ等のｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、イマチニブ等の血小板由来成長因子ファミリーの阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼの阻害剤（例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤等のＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤、例えば、ソレフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６））、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼを通した細胞シグナル伝達の阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＩＧＦレセプター（インスリン様成長因子）キナーゼ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８、およびＡＸ３９４５９）、ならびにＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤等のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ならびにＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ等の生存シグナル伝達タンパク質、例えば、ＡＢＴ−７３７も含む、
（ｖｉ）血管内皮増殖因子の作用を阻害するもの［例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））］、および４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４；ＷＯ第０１／３２６５１号内の実施例２）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１；ＷＯ第００／４７２１２号内の実施例２４０）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７；ＷＯ第９８／３５９８５号）、および第ＳＵ１１２４８（スニチニブ；ＷＯ第０１／６０８１４号）等のＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ阻害剤、国際特許出願ＷＯ第９７／２２５９６号、ＷＯ第９７／３００３５号、ＷＯ第９７／３２８５６号、ＷＯ第９８／１３３５４号、ＷＯ第００／４７２１２号、およびＷＯ第０１／３２６５１号に開示されるもの等の化合物、抗ＫＤＲ抗体および抗ｆｌｔ１抗体等の抗血管内皮増殖因子レセプター抗体）、ならびに他の機構、またはコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）、もしくはＣＳＦ１レセプターにより機能する化合物（例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤、およびアンジオスタチン）］等の抗血管新生剤；ＡＺＤ２１７１のさらなる詳細は、Ｗｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６５（１０）：４３８９−４００に見出され得る。ＡＺＤ６４７４のさらなる詳細は、Ｒｙａｎ＆Ｗｅｄｇｅ（２００５）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．９２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ６−１３に見出され得る。双方の刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８８】
（ｖｉｉ）コンブレスタチンＡ４、および国際特許出願ＷＯ第９９／０２１６６号、ＷＯ第００／４０５２９号、ＷＯ第００／４１６６９号、ＷＯ第０１／９２２２４号、ＷＯ第０２／０４４３４号、およびＷＯ第０２／０８２１３号に開示される化合物等の、血管損傷剤、
（ｖｉｉｉ）アンチセンス療法、例えば、ＩＳＩＳ２５０３、抗ｒａｓアンチセンス、または抗ｂｃｌ２アンチセンスであるＧ３１３９（ゲナセンス）等の、上に列挙される標的を対象とするもの、
（ｉｘ）遺伝子療法アプローチ、例えば、異常ｐ５３もしくは異常ＢＲＣＡ１、またはＢＲＣＡ２等の異常遺伝子を置換するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、または細菌性ニトロレダクターゼ酵素を使用するもの等のＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および多剤耐性遺伝子療法等の化学療法もしくは放射線療法に対する患者の耐性を増加するアプローチを含む、
（ｘ）例えば、アレムツズマブ（ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（商標））を用いた治療、ＣＤ５２に向けられるモノクローナル抗体、またはＣＤ２２に向けられる抗体を用いた治療、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増加するための生体外および生体内アプローチ、インターロイキン２、インターロイキン４、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子等のサイトカインを用いた形質移入、ＣＴＬＡ−４機能を阻害するモノクローナル抗体を用いた治療等のＴ細胞の反応不顕性を低下させるアプローチ、サイトカイン形質移入された樹状細胞等の形質移入された免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカイン形質移入された腫瘍細胞系を使用するアプローチ、ならびに非特異的に活性化された、または生体内で関心の特定の抗原を標的としたＴ細胞を使用する養子Ｔ細胞移入である、抗イディオタイプ抗体を使用するアプローチを含む、免疫療法アプローチ、
（ｘｉ）例えば、ＨＩＶもしくはＨＢＶ等の特定のウイルス感染を対象としたワクチンを用いた治療、または特定の腫瘍抗原を対象としたワクチンを用いた治療を含む、ワクチン接種アプローチ、
（ｘｉｉ）Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ）等のプロテアソーム阻害剤等のタンパク質分解の阻害剤、
（ｘｉｉｉ）生物学的療法治療アプローチ、例えば、レセプターリガンドを捕捉する、リガンドがレセプターに結合するのを阻害する、またはレセプターのシグナル伝達を低下させる（例えば、レセプター分解の強化、または発現レベルの低下）かのいずれかである、ペプチドまたはタンパク質（抗体、もしくは可溶性外部レセプタードメイン構築物）を使用するもの。
【０２８９】
一実施形態において、本明細書に定義される抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加え、アルキル化剤（例えば、シス−プラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾロミド、およびニトロソウレア）、代謝拮抗薬（例えば、ゲムシタビンならびに５−フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジン等の葉酸代謝拮抗薬、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシウレア）、抗腫瘍抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）、抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイド、ならびにポロキナーゼ阻害剤）、ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドのようなエピポドフィロトキシンおよびテニポシド、アムサクリン、トポテカンならびにカンプトテシン）等の、医療腫瘍学で使用される他の抗増殖／抗新生物薬物およびそれらの組み合わせを用いた治療を含み得る。
【０２９０】
そのような共同治療は、個別の治療の構成要素の同時、遂次、または別個の投与によって達成することができる。そのような組み合わせ産物は、前述に記載される投与量範囲内の本発明の化合物、または薬学的に許容されるその塩、およびその承認された投与量範囲内の他の薬学的活性剤を利用する。
【実施例】
【０２９１】
実施された実験および達成された結果を含む以下の実施例は、単に例示目的のために提供され、本明細書の教示を制限するものと解釈されるものではない。
【０２９２】
実施例１：組み換えヒトＢ７−Ｈ１の発現
ヒトＢ７−Ｈ１  ｃＤＮＡ（Ｄｏｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１３６５−１３６９）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、Ｉｍａｇｅクローン７２６２２０８（ＡＴＣＣ）から増幅した後、ｐｃｒ３．１ＢｉｄベクターのＮｈｅ１およびＥｃｏＲ１部位の中にクローン化した。この構築物をＣＨＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号＃ＣＣＬ−６１）の中にリポフェクション導入（ｌｉｐｏｆｅｃｔｅｄ）し、細胞表面上の発現を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析により確認した。
【０２９３】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたヒトＢ７−Ｈ１の細胞外ドメイン（アミノ酸残基１−２３９）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（カタログ＃１５６−Ｂ７−１００）から購入した。
【０２９４】
実施例２：免疫化および滴定
免疫化
ヒトＢ７−Ｈ１に対するモノクローナル抗体を、順次、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ株：ＸＭＧ２（ＩｇＧ２カッパ／ラムダ）およびＸＭＧ４（ＩｇＧ４カッパ／ラムダ）Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）５〜１０μｇのＢ７−Ｈ１／Ｆｃキメラタンパク質もしくは実施例１に記載する組み換えヒトＢ７−Ｈ１を発現する１−２ｘ１０（６）ＣＨＯ細胞のいずれかで免疫化することにより開発した。
【０２９５】
免疫化は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号、ならびに１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願ＷＯ第９８／２４８９３号、および２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ第００／７６３１０号に開示される方法に従い実施され、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。免疫化プログラムを表２に要約する。
【０２９６】
採取するための動物の滴定による選択
免疫化されたマウスからの血清中の抗体の滴定量をＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定した。プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、カタログ＃３３６８）をヒトＢ７−Ｈ１／Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カタログ＃１５６−Ｂ７−１００）でコーティングした。Ｂ７−Ｈ１特異的抗体を西洋わさびペルオキシダーゼに共役されたマウス抗ヒトＩｇＧ抗体およびヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用いて検出した。通常、各免疫化コホート内で最も滴定量が高い５匹の動物が、リンパ球単離、およびハイブリドーマの生成ために選択された。
【表２】
0006047646.tif 000003
【０２９７】
実施例３：リンパ細胞の回収、Ｂ細胞の単離、融合、およびハイブリドーマの生成
免疫化マウスを頚部脱臼により屠殺し、所属リンパ腺を、各コホートから採取し、プールした。ＤＭＥＭ中で粉砕することによりリンパ球細胞を解離し、組織から細胞を開放し、細胞をＤＭＥＭに懸濁した。細胞を数え、１億のリンパ細胞当り０．９ｍｌのＤＭＥＭを細胞ペレットに添加し、細胞を穏やかに、しかし完全に再懸濁した。１億の細胞当り１００μｌのＣＤ９０＋磁気ビーズを使用して、１５分間４℃で、磁気ビーズを用いて細胞をインキュベートすることにより、細胞を標識した。最大１０８の陽性細胞（または最大２×１０９の総細胞）を含有する磁気的に標識された細胞懸濁液をＬＳ＋カラム上に装填し、カラムをＤＭＥＭで洗浄した。全流出物をＣＤ９０陰性画分（これらの細胞の大半は、Ｂ細胞であると予想された）として収集した。
【０２９８】
上記の洗浄した富化Ｂ細胞、およびＡＴＣＣ、カタログ＃ＣＲＬ１５８０（Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１９７９，１５４８−１５５０）から購入した非分泌型骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を１：１の割合で混合することにより融合を実施した。８００ｘｇで遠心分離することにより、細胞混合物を穏やかにペレット化した。上清を完全に除去した後、細胞をわずか２分間、２〜４ｍＬのＰｒｏｎａｓｅ溶液（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ＃５３７０２；ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ）で処理した。３〜５ｍｌのＦＢＳを添加し、酵素活性を停止させ、電気細胞融合溶液（ＥＣＦＳ，０．３Ｍのスクロース、Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｓ７９０３、０．１ｍＭの酢酸マグネシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｍ２５４５、０．１ｍＭの酢酸カルシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｃ４７０５）を使用して、懸濁液を４０ｍｌの総容量に調節した。遠心分離後、上清を除去し、細胞を４０ｍｌのＥＣＦＳに再懸濁した。この洗浄ステップを繰り返し、細胞を再びＥＣＦＳに再懸濁し、２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度とした。
【０２９９】
融合発生装置（モデルＥＣＭ２００１，Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、電気細胞融合を実施した。使用した融合チャンバの大きさは、２．０ｍｌであり、以下の装置設定を使用した。
【０３００】
・アライメント条件：電圧５０Ｖ、時間：５０秒
・膜切断：電圧：３０００Ｖ、時間：３０μ秒
・融合後保持時間：３秒
ＥＣＦ後、細胞懸濁液を減菌条件下で融合チャンバから慎重に取り出し、Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸、ウシインスリン）（全てＳｉｇｍａ）、およびＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で補充された、同容量のハイブリドーマ培養培地（ＤＭＥＭ，ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１５％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有する減菌管中に移した。細胞を３７℃で１５〜３０分間インキュベートした後、５分間、４００ｘｇ（１０００ｒｐｍ）で遠心分離した。細胞を小容量のハイブリドーマ選択培地（０．５ｘＨＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ａ９６６６）で補充されたハイブリドーマ培養培地）に穏やかに再懸濁し、総量が９６ウェルプレート当り５ｘ１０６Ｂ細胞の最終平板培養およびウェル当り２００μｌに基づき、容量をさらなるハイブリドーマ選択培地で適切に調節した。細胞を穏やかに混合し、９６ウェルプレート中にピペット注入し、成長させた。７日目および１０日目に、培地の半分を取り除き、ハイブリドーマ選択培地を細胞に再供給した。
【０３０１】
選択培地中で通常処理としてハイブリドーマを成長させた。ハイブリドーマから収集した完全上清を実施例４〜５に記載される種々のアッセイで検査した。注記しておくが、３の番号で始まる抗体、例えば３．１５Ｇ８はＩｇＧ４であり、２で始まる抗体、例えば２．９Ｄ１０はＩｇＧ２である。
【０３０２】
実施例４：細胞に結合したヒトおよびカニクイザルＢ７−Ｈ１への結合
ハイブリドーマ細胞から収集した上清を検査して、分泌された抗体が、完全長ヒトまたはカニクイザルのいずれかのＢ７−Ｈ１を一過的に発現する２９３Ｔ細胞に結合する能力を評価した。疑似形質移入された２９３Ｔ細胞系を陰性対照として使用した。２％のＦＢＳを含有するＰＢＳに希釈した細胞を、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、カタログ＃３７１２）に４０μｌ／ウェルで、２５００〜３０００の発現および１５０００〜１７５００の疑似形質移入された細胞の濃度で播種した。平板培養直後、１０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清を添加し、プレートを室温で１．５時間インキュベートした。次に、１０μｌ／ウェルのＣｙ５共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（７００ｎｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃１０９−１７５−０９８）を添加し、ＦＭＡＴ８２００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で蛍光シグナルを読み取る前に、プレートを室温で３時間インキュベートした。６つのハイブリドーマ上清の結果を表３に示す。
【表３】
0006047646.tif 000004
【０３０３】
実施例５：Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−１レセプターとリガンド結合の阻害
抗体を含有する上清の相対的な効力を決定するために、ヒトＰＤ−１／Ｆｃタンパク質のＣＨＯ細胞の表面上に発現するヒトＢ７−Ｈ１への結合を阻害するそれらの能力を評価した。２５０００細胞／ウェルを３８４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、カタログ＃３７１２）のウェル中で５０μｌの培地にて平板培養した。翌日、５０μｌ／ウェルの希釈した（１：５）ハイブリドーマ上清を添加し、プレートを４℃で１時間、振蘯器上でインキュベートした。ビオチン化ヒトＰＤ−１／Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃１０８６−ＰＤ）を添加して、１．２５μｇ／ｍｌの最終濃度にし、プレートを４℃で１時間、振蘯器上でインキュベートした。細胞を洗浄し、３．７％のホルムアルデヒドと３％のウシ血清アルブミンを含有する１００μｌのＰＢＳに、室温で２０分間固定した。細胞を洗浄し、０．６％のＨ２Ｏ２と３％のウシ血清アルブミンを含有する１００μｌのＰＢＳに、室温で１０分間固定した。細胞を洗浄し、１：４０００で希釈された５０μｌの西洋わさびペルオキシダーゼ共役されたストレプトアビジン中で、４℃で３０分間インキュベートした。シグナル検出前に細胞を洗浄した。（ＯＤｍａｘ−ＯＤｍｉｎ）の比率（％）としてデータを表示するが、ここで、ＯＤｍａｘは、ビオチン共役されたヒトＰＤ−１／Ｆｃタンパク質の存在下、無関係のハイブリドーマ上清を用いてインキュベートされた細胞より得た平均値であり、ＯＤｍｉｎは、ビオチン共役されたヒトＰＤ−１／Ｆｃタンパク質の不在下で無関係のハイブリドーマ上清を用いてインキュベートされた細胞より得た平均値である。０％の最大応答は、ハイブリドーマ上清によるＢ７−Ｈ１／ＰＤ−１結合の１００％阻害を示す（表４）。
【表４】
0006047646.tif 000005
【０３０４】
実施例６：精製された抗Ｂ７−Ｈ１抗体のヒトＢ７−Ｈ１、ヒトＢ７−ＤＣ、マウスＢ７−Ｈ１への結合
精製された抗体がヒトＢ７−Ｈ１、Ｂ７−ＤＣ、マウスＢ７Ｈ１、およびカニクイザルＢ７−Ｈ１に結合する能力をＦＡＣＳ分析によって決定した。簡潔には、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１１６６８）を使用して、ヒトＢ７−Ｈ１またはヒトＢ７−ＤＣのいずれかで、２９３Ｔ細胞を疑似形質移入するか、または一過的に形質移入するかのいずれかを行った。マウスＢ７−Ｈ１を発現するマウスＪ５５８細胞をＡＴＣＣ（カタログ＃ＴＩＢ−６）より得た。２％のＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝剤）を含有するＰＢＳに細胞を再懸濁し、５００００細胞／ウェルで、Ｖ字底プレート中に播種した。ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した抗Ｂ７−Ｈ１およびアイソタイプ対照抗体を５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、プレートを４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、ヤギ抗ヒトＦｃ  Ｃｙ５（５μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃１０９−１７５−０９８）および７−ＡＡＤ（５μｇ／ｍｌ）を添加し、プレートを４℃で１５分間インキュベートした後ＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置で読み取った。表５は、精製された抗体（５μｇ／ｍｌ）がヒトＢ７−Ｈ１を形質移入された２９３Ｔ細胞を結合する能力を示す。選択された抗体のいずれも、ヒトＢ７−Ｈ１を形質移入された２９３Ｔ細胞、またはマウスＢ７−Ｈ１を発現するＪ５５８細胞に結合しなかった。マウス抗ヒトＢ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＭＡＢ１２２４、ヤギ抗マウスＦｃ  Ｃｙ５で検出、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をＢ７−ＤＣ発現の陽性対照として使用した。ＰＥ共役されたラット抗マウスＢ７−Ｈ１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＭ１Ｈ５、ヤギ抗ラットＦｃ  Ｃｙ５で検出、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をマウスＢ７−Ｈ１発現の陽性対照として使用した。
【表５】
0006047646.tif 000006
【０３０５】
実施例７：精製されたヒト抗Ｂ７−Ｈ１抗体の刺激されたヒトおよびカニクイザルＴ細胞への結合
９６ウェルの高結合プレートをＰＢＳ（ＯＫＴ３クローン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ＃１６００３７）中に１μｇ／ｍｌで希釈した１００μｌ／ウェルの抗ＣＤ３抗体と、一晩、４℃でインキュベートした。Ｔ細胞富化キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１９０５１）を使用して、ヒトＴ細胞を凍結したロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）から単離した。抗ＣＤ３ｍＡｂコーティングされたプレートをＰＢＳで洗浄し、精製されたＴ細胞を３６００００細胞／ウェルで２００μｌのＩＣＭ培地に添加し、７２時間培養した。次いで、Ｔ細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、９６ウェルのＶ字底アッセイプレート（５０μｌ／ウェル）中、１μｇ／ｍｌの最終濃度で、希釈した精製された抗Ｂ７−Ｈ１抗体、または無関係のヒトＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体と混合した。４℃で２時間インキュベーションした後、Ｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２度洗浄した後、Ｃｙ５共役されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（５μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃１０９−１７５−０９８）および７−ＡＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）で染色した。細胞を４℃で３０分間インキュベートした後ＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置で読み取った。順方向および側面分散ならびに７−ＡＡＤの陰性染色に基づき、生リンパ球集団を分析のために選択した。
【０３０６】
カニクイザルＴ細胞の活性化のために、９６ウェル高結合プレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍｌで希釈された１００μｌ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体と、一晩、４℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＩＣＭ培地（クローンＳＰ−３４、ＢＤカタログ＃５５６６１０）中に１μｇ／ｍｌで希釈された抗ＣＤ３抗体を用いて、３７℃で２時間インキュベートした。カニクイザルのＰＢＭＣを抹消血液（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、カタログ＃ＣＹＮＷＢＣＰＴ）から単離した。抗ＣＤ３ｍＡｂコーティングされたプレートをＰＢＳで洗浄し、単離したＰＢＭＣを約２０００００細胞／ウェルで２００μｌのＩＣＭ培地中に添加し、７２時間培養した。次いで、細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、９６ウェルのＶ字底アッセイプレート（５０μｌ／ウェル）中、１μｇ／ｍｌの最終濃度で、希釈した精製された抗Ｂ７−Ｈ１抗体、または無関係のヒトＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体と混合した。４℃で２時間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２度洗浄した後、Ｃｙ５共役されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（５μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃１０９−１７５−０９８）、ＦＩＴＣ共役された抗ＣＤ３抗体（１：２５に希釈、Ｂｉｏｓｐｅｃｉａｌｔｙ）、および７−ＡＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）で染色した。細胞を４℃で１時間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置で読み取った。順方向および側面分散ならびにＣＤ３マーカーの陽性染色および７−ＡＡＤの陰性染色に基づき、サルＴリンパ球集団を分析のために選択した。表６は、精製された抗Ｂ７−Ｈ１抗体（１μｇ／ｍｌ）が、活性化されたヒトＴ細胞ならびに活性化されたカニクイザルＴ細胞に結合する能力を示す。
【表６】
0006047646.tif 000007
【０３０７】
実施例８：Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−１レセプターとリガンド結合の阻害
精製されたヒト抗Ｂ７−Ｈ１抗体が、ヒトＰＤ−１／Ｆｃタンパク質のＥＳ−２細胞（ＡＴＣＣ、カタログ＃ＣＲＬ−１９７８）の表面上で発現したヒトＢ７−Ｈ１への結合を阻害する能力を評価した。簡潔には、５００００細胞／ウェルを３８４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、カタログ＃３７１２）のウェル中で５０μｌのＰＢＳにて平板培養した。次に、５０μｌ／ウェルの希釈したモノクローナル抗体を２．５、０．５、０．１、０．０２、０．００４、０．００８、０．０００１６ｎＭの最終濃度で添加し、プレートを４℃で１時間インキュベートした。細胞を２度洗浄し、１００μｌ／ウェルのビオチン化ヒトＰＤ−１／Ｆｃタンパク質（１０μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃１０８６−ＰＤ）を添加し、プレートを４℃で１時間インキュベートした。細胞を一度洗浄し、１００μｌ／ウェルのＣｙ５共役されたストレプトアビジンを添加し、２％のＦＣＳを含有するＰＢＳで再度洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置で読み取る前に、プレートを４℃で１５分間インキュベートした。最小（０％）および最大（１００％）レベルのＢ７−Ｈ１／ＰＤ−１結合阻害を設定するために、いくつかのウェルをビオチン共役されたヒトＰＤ−１／Ｆｃを含む、または含まない無関係のヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４モノクローナル抗体とインキュベートした。抗体濃度に対する阻害の比率（％）を曲線適合ツール（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア）を使用して分析し、各抗体のＩＣ５０値を計算し、これを表７に示す。
【表７】
0006047646.tif 000008
【０３０８】
実施例９：ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖に対する抗Ｂ７−Ｈ１抗体の効果の決定
ビーズ上に抗ＣＤ３抗体と同時に提示されるＢ７−Ｈ１タンパク質が、ＣＤ３媒介細胞活性化を阻害することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０００，１９２（７）：１０２７−１０３４、Ｂｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３，１７０：７１１−７１８）。精製されたヒトモノクローナル抗Ｂ７−Ｈ１抗体の、Ｔ細胞活性化のＢ７−Ｈ１媒介抑制に干渉する能力を以下のように決定した。
【０３０９】
簡潔には、５ｘ１０（８）ビーズ／ｍｌの洗浄したトシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１４０．１３）を、３７℃で２４時間振蘯させながら、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）中の５０μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ＃５５５３２９）でコーティングした。４ｘ１０（８）のＣＤ３コーティングしたビーズ／ｍｌをさらに、１６０ｇ／ｍｌの組み換えヒトＩｇＧ１Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃１１０−ＨＧ−１００）、または８０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１Ｆｃタンパク質と混合した８０μｇ／ｍｌの組み換えヒトＢ７−Ｈ１／Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃１５６−Ｂ７−１００）（総濃度１６０μｇ／ｍｌ）と結合させ、３７℃で２４時間、振蘯させながらインキュベートした。次いで、ビーズを０．０５％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で、室温で１時間インキュベートし、０．１％のＢＳＡおよびＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２ｍＭのＥＤＴＡで４回洗浄し、最後に、５ｘ１０（７）ビーズ／ｍｌで１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。
【０３１０】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ１７−１４４０−０３）密度勾配遠心分離を使用して、抹消血単球を白血球除去パックから単離し、無血清ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ  ２２４００−０８９）に再懸濁し、製造者の指示に従いＤｙｎａｌ  ＣＤ４陰性単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１１３−３７Ｄ）を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。１０μｌのコーティングしたビーズを試料管中で１０μｌの希釈した抗Ｂ７−Ｈ１または対照ＩｇＧ２／４抗体と混合し、振蘯器で室温で３〜４時間インキュベートした。精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃３６０３）中、１０（５）細胞／８０μｌ／ウェルで平板培養し、ビーズ−抗体混合物を２０μｌ／ウェルで１００μｌ／ウェルの総容量に添加した。Ｂ７−Ｈ１阻害作用の不在下でのＴ細胞活性化は、抗ＣＤ３抗体およびヒトＩｇＧ１Ｆｃタンパク質でコーティングしたビーズを使用して決定された。細胞を５日間培養し、上清を採取し、製造者の指示に従いＢＤヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキットＩＩ（ＢＤカタログ番号５５０６１２）を使用して、ＩＦＮ−γ放出について分析した。１０μｌ／ウェルのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＡＬ１０２５）を添加して、細胞増殖を５日目に測定した。細胞を５時間インキュベートし、５４５ｎｍの励起波および６００ｎｍの発光波長で、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ分光光度計で蛍光を定量化した。ＯＤｍａｘの比率（％）としてデータを表示し、ここで、ＯＤｍａｘは、抗ＣＤ３／ＩｇＧ１Ｆｃビーズで活性化されたＴ細胞で得た平均値である。図１を参照のこと。
【０３１１】
実施例１０：樹状細胞−Ｔ−細胞混合リンパ球アッセイにおける抗Ｂ７−Ｈ１抗体のＣＤ４  Ｔ細胞の活性化に対する作用の決定
Ｂ７−Ｈ１を対象とする抗体によるＴ細胞活性化の強化は、樹状細胞−Ｔ細胞混合リンパ球（ＤＣＭＬＲ）アッセイにより決定された。以前に記載されたように樹状細胞を単球前駆体より生成した（Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｍａｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ７：Ｕｎｉｔ７．３２）。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ１７−１４４０−０３）密度勾配遠心分離を使用して、抹消血単球を白血球除去バックから単離し、無血清ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ  ２２４００−０８９）に再懸濁し、Ｔ１５０細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ４３０８２５）に付着させた。３７℃で１時間後、付着しなかった細胞を取り除き、細胞を５％のヒト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ３４００５１００）で補充したＲＰＭＩ中で培養した。サイトカインを２ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５００６８）および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５４６０５）の最終濃度で添加した。サイトカインを含む新しい培地を２〜３日おきに添加した。培養６日目に、細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５４６１８）で成熟させ、２４時間インキュベートした。成熟した樹状細胞を採取し、表現型化し、後に使用するために凍結した。
【０３１２】
製造者の指示に従い磁気単離キット（Ｄｙｎａｌ  １１３．１７）を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離し、以前に記載されたように、一次ＭＬＲ中で培養した（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ａｐｒ  １；１７０（７）：３６３７−４４）。１．５Ｅ５同種ＣＤ４＋応答Ｔ細胞を、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９５）中で、１：２．５のＴ細胞：樹状細胞比で樹状細胞と培養した。あらゆる増殖をリンパ細胞の汚染から防止するために、同時培養に添加する前に、樹状細胞調製物を１００μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４２８７）で処理した。２００μｌのＲＰＭＩ＋１０％のヒト血清の最終容量で、抗体を種々の濃度で添加した。［３Ｈ］チミジン（１μｃｉ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＮＥＴ０２７００１ＭＣ）での１６時間のパルスにより、５日目にチミジンの取り込みを測定した。放射活性標識の前に上清を採取し、製造者の指示に従いＬｕｍｉｎｅｘアッセイ（ＢｉｏＲａｄ  １７１−Ｂ１１９２１）により、ＩＦＮ−γ放出について分析した。反復実験による抗Ｂ７−Ｈ１抗体によるＴ細胞増殖の強化を図２に示す。対応するＩＦＮ−γ放出を図３に示す。
【０３１３】
実施例１１：Ｂ７−Ｈ１抗体の構造分析
抗体の重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列が、それらのＤＮＡ配列を決定するために配列決定された。抗Ｂ７−Ｈ１抗体の完全な配列情報は、各ガンマおよびカッパまたはラムダ鎖の組み合わせにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列と共に列挙される配列で提供される。可変重鎖配列は、ＶＨファミリーおよびＪ領域配列を決定するために分析された。次いで、配列は、一次アミノ酸配列を決定するために翻訳され、体細胞超変異を評価するために、生殖系列ＶＨおよびＪ領域配列と比較された。
【０３１４】
表８および９は、抗体重鎖領域をそれらの同族生殖系列重鎖領域と、抗体軽鎖領域をそれらの同族生殖系列軽鎖領域と比較した表である。アミノ酸の番号付けは、数的番号付けである。
【０３１５】
免疫グロブリン遺伝子は、免疫応答の成熟中、種々の修飾を受け、Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメント間の組み換え、アイソタイプ転換、および種々の領域での超変異を含む。組み換えおよび体細胞超変異は、抗体の多様性および親和性成熟の生成の基礎であるが、それらは、治療剤としてのそのような免疫グロブリンの商用製品の産生を困難にするか、または抗体の免疫原性リスクを増大する場合がある配列傾向も生成し得る。一般に、ＣＤＲ領域での変異は、親和性および機能の向上に寄与する可能性があり、一方、フレームワーク領域での変異は、免疫原性のリスクを増大し得る。このリスクは、フレームワーク変異を生殖系列に戻すことによって低減することができ、同時に、抗体の活性が悪影響を及ぼさないことを確実にする。いくつかの構造傾向は、多様化プロセスにより生成されるか、またはそれらは、重鎖および軽鎖の可変ドメインに寄与する生殖系列配列内に存在し得る。供給源に関わらず、不安定性、凝集、産物の不均一性、または免疫原性の増加をもたらす可能性のある構造的傾向を取り除くことが望ましい場合がある。望ましくない傾向の例としては、不対システイン（ジスルフィド結合スクランブリング、または種々のスルフヒドリル付加体形成をもたらし得る）、Ｎ連結グリコシル化部位（構造および活性の不均一性をもたらす）、ならびに脱アミド（例えば、ＮＧ、ＮＳ）、異性化（ＤＧ）、酸化（露出メチオニン）、および加水分解（ＤＰ）部位が挙げられる。
【０３１６】
免疫原性のリスクを低減し、リード抗体の薬学的特性を向上するために、生殖系列からの変異の数を減少させる、および／または構造的傾向を取り除くことが望ましい場合がある。
【０３１７】
よって、一実施形態において、特定の抗体が、アミノ酸レベルでその個々の生殖系列配列と異なる場合、抗体配列は、もとの生殖系列配列に変異され得る。そのような補正変異は、標準的な分子生物学的技術を使用して、１、２、３以上の位置で、または変異位置のいずれの組み合わせでｍｐ生じ得る。以下の表１０〜１４は、ｍＡｂ２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、および２．１４Ｈ９の生殖系列に戻るそのような変形の位置を図示する。各列は、太字で示される位置での生殖系列および非生殖系列残基の固有の組み合わせを表す。アミノ酸の位置は、数的番号付けにより表される。
【０３１８】
別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の不均一性に影響を及ぼす可能性がある配列のあらゆる構造的傾向を置換することを含む。そのような傾向は、グリコシル化部位、不対システイン、表面露出メチオニン等を含む。そのような不均一性のリスクを低減するために、そのような構造的傾向のうちの１つ以上を除去するための変更を行うことが提案される。
【０３１９】
一実施形態において、抗体生殖系列または抗体配列から１つ以上のコンセンサスＮ連結グリコシル化部位を除去することが望ましい場合がある。当業者は、そのようなグリコシル化部位を容易に特定することができるであろう。通常、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位配列は、中央のアミノ酸がプロリン（Ｐｒｏ）であることができない、Ａｓｎ−ａｎｙ  ＡＡ−ＳｅｒまたはＴｈｒの配列を有する。別の実施例において、不対システインは、単独で、または他の構造変化と併せて置換され得る。不対システインは、セリン等の同様の側鎖特性を有する適切なアミノ酸に変異することができる。
【０３２０】
本明細書で言及される場合、最適化された配列は、１つ以上の位置でもとのその生殖系列配列に変異されているか、構造的傾向等の１つ以上の他の傾向を除去するように修飾され得る配列である。最適化された配列は、１つ以上の位置でもともその生殖系列配列に変異した、また１つ以上の構造的傾向も除去するようにさらに修飾された配列も含むことができる。
【表８】
0006047646.tif 000009
【０３２１】
0006047646.tif 000010
【表９】
0006047646.tif 000011
【０３２２】
0006047646.tif 000012
【表１０】
0006047646.tif 000013
【０３２３】
本発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２を含む配列を含む。ある実施形態において、配列番号２は、表１０の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを含む。一部の実施形態において、配列番号２は、表１０に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いっずれか４つ、いずれか５つ、または５つ全てを含む。ある実施形態において、配列番号２は、表１０の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組み合わせのいずれか１つを含む。具体的な一実施例において、非生殖系列配列は、ＦがＹに変化する８０位で、およびＫがＲに変化する８７位で、もとの生殖系列に変異する。そのような配列の具体的な例は、表１５に示される２．７Ａ４ＶＨＯＰＴである。
【表１１】
0006047646.tif 000014
【０３２４】
0006047646.tif 000015
【０３２５】
発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号７を含む配列を含む。ある実施形態において、配列番号７は、表１１の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを含む。一部の実施形態において、配列番号７は、表１１に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ、または５つ全てを含む。ある実施形態において、配列番号７は、表１１の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組み合わせのいずれか１つを含む。特定の生殖系列配列に変異した２．７Ａ４可変軽鎖ドメインの具体的な例は、表１５に示される２．７Ａ４  ＶＬＯＰＴ（非生殖系列配列が、１７位でＡからＴに、１０４位でＲからＫに変異された場合、最適化される）を含む。
【表１２】
0006047646.tif 000016
【０３２６】
発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号１２を含む配列を含む。ある実施形態において、配列番号１２は、表１２の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを含む。一部の実施形態において、配列番号１２は、表１２に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、または２つ全てを含む。ある実施形態において、配列番号１２は、表１２の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組み合わせのいずれか１つを含む。
【表１３】
0006047646.tif 000017
【０３２７】
発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号１７を含む配列を含む。ある実施形態において、配列番号１７は、表１３の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを含む。一部の実施形態において、配列番号１７は、表７に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、または４つ全てを含む。ある実施形態において、配列番号１７は、表１３の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組み合わせのいずれか１つを含む。配列番号１７を変更するか、または非生殖系列化を配列番号１７に変更することによりさらに変更することができる。一実施例において、配列番号１７は、３７位でＦからＹに、５０位でＦからＹのように変更することができる。
【表１４】
0006047646.tif 000018
【０３２８】
発明の一部の実施形態において、標的結合剤または抗体は、配列番号２７を含む配列を含む。ある実施形態において、配列番号２７は、表１４の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の組み合わせのいずれか１つを含む。一部の実施形態において、配列番号２７は、表１４に示される生殖系列残基のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、または３つ全てを含む。ある実施形態において、配列番号２７は、表１４の各列により示される生殖系列および非生殖系列残基の固有の組み合わせのいずれか１つを含む。特定の生殖系列配列に変異した２．７Ａ４可変軽鎖ドメインの具体的な例は、表１５に示される２．１４Ｈ９ＯＰＴ（非生殖系列配列が、１０４位でＥからＫに変異される場合、最適化される）を含む。
【０３２９】
２．１４Ｈ９の重鎖は、配列番号２２のアミノ酸３１で、ＲからＳに変更され得る。
【表１５】
0006047646.tif 000019
【０３３０】
特定の生殖系列化の例
非生殖系列化（ＮＧ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．７Ａ４、２．１４Ｈ９、および２．９Ｄ１０のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列をＶＢＡＳＥデータベース（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，１９９７；ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）の既知のヒト生殖系列配列と整列させ、配列の類似性により最も近い生殖系列を特定した。抗Ｂ７−Ｈ１抗体の最も近い生殖系列の一致を表１６および１７に記載する。バーニヤ残基（Ｆｏｏｔｅ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ２０：２２４（２）：４８７−９９，１９９２）を考慮せず変更しないままにし、変更されるべき位置を表１８に記載する。
【表１６】
0006047646.tif 000020
【表１７】
0006047646.tif 000021
【０３３１】
抗体２．７Ａ４を考えると、ＶＨドメインのフレームワークに２つの変更あり、ＶＬドメインのフレームワークに２つの変更ある。これらの残基は、ＶＨドメインのＫａｂａｔ番号７９および８３（または数的番号付けの場合、残基８０および８７）、ならびにＶＬドメインのＫａｂａｔ番号１８および１０３（または数的番号付けの場合、残基１７および１０４）に位置し、ヒト生殖系列に戻された。表１８を参照のこと。抗体２．１４Ｈ９においては、ＶＨドメインのフレームワークに変更はなく、ＶＬドメインのフレームワークに１つ変更ある。この残基は、ＶＬドメインのＫａｂａｔ番号１０３（または数的番号付けの場合、残基１０４）に位置し、ヒト生殖系列に戻された。表１８を参照のこと。抗体２．９Ｄ１０においては、ＶＨドメインのフレームワークに変更はなく、ＶＬドメインに２つ変更があり、これは、Ｋａｂａｔ番号３６および４９（または数的番号付けの場合、３７および５０）に位置する。しかしながら、これらの２つの残基は、バーニヤ位に位置し、ＣＤＲループ構造を変更しないように変異されなかった。
【表１８】
0006047646.tif 000022
【０３３２】
これらのアミノ酸残基の生殖系列化は、適切な変異原性プライマーを用いた、標準的な部位指向性変異誘発技術を使用して実行された。生殖系列化配列は、抗体名の後に接頭辞「ＯＰＴ」、例えば、２．７Ａ４ＶＨＯＰＴ、２．７ＶＬＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＶＬＯＰＴが付く。その後、生殖系列化ＩｇＧは、ヒトＢ７−Ｈ１／ｈＰＤ１リガンド阻害アッセイにおいて再評価され、抗体生体外活性が低下しなかったことが確認された。
【０３３３】
生殖系列化対非生殖系列化抗Ｂ７−Ｈ１抗体の活性の例を図４に提供する。
【０３３４】
遺伝子合成とＩｇＧ１およびＩｇＧ１−ＴＭとしての再構成の例
ＶＨおよびＶＬドメインをそれぞれ全抗体の重鎖および軽鎖を発現するベクターにサブクローン化することにより、クローンをｓｃＦｖからＩｇＧ形式に変換した。ＶＨドメインをＩｇＧ１を発現するようにベクターｐＥＵ１５．１、またはＩｇＧ１−ＴＭ抗体を発現するようにベクターｐＥＵ１５．１−ＴＭ中にクローン化した。双方のベクターは、哺乳類細胞で全ＩｇＧ重鎖を発現するように、ヒト重鎖定常ドメインおよび調節エレメントを含有する。ベクターｐＥＵ１５．１−ＴＭは、修飾されたｐＥＵ１５．１ヒトＩｇＧ１ベクターである。それは、抗体依存細胞媒介細胞毒性および補体依存細胞毒性を作動させるその能力を排除するために、ヒンジのＬ２３４ＦおよびＬ２３５ＥならびにＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインのＰ３３１Ｓの３つの変異体を導入するように操作された（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，Ｄ６４：７００−７０４）。ベクターの操作は、適切な変異原性プライマーを用いた標準的な部位指向性変異誘発技術を使用して実施された。
【０３３５】
ＶＬドメインは、哺乳類細胞で全ＩｇＧ軽鎖を発現させるための調節エレメントと共に、ヒトラムダおよびカッパ軽鎖定常ドメインを発現させるために、それぞれ、ｐＥＵ４．４およびｐＥＵ３．４ベクター中にクローン化された。重鎖および軽鎖を発現するためのベクターは、本来、Ｖａｕｇｈａｎら  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４（３）：３０９−３１４，１９９６）に記載された。これらのベクターは、単純に、ＯｒｉＰエレメントを導入することにより操作された。
【０３３６】
ＩｇＧｓを得るために、重鎖および軽鎖のＩｇＧ発現ベクターをＥＢＮＡ−ＨＥＫ２９３哺乳類細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｒ６２０−０７）に形質移入した。ＩｇＧを発現させ、培地中に分泌させた。採取物をプールし、精製前に遠心沈降させた。試料のあらゆる内毒素汚染を回避するために、事前に消毒したＡＫＴＡ発現精製系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した、ＩｇＧをプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。培養上清を１ｍＬのＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１１−００３４−９３）に装填し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用して、結合ＩｇＧをカラムから溶出し、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を添加することにより中和した。Ｎａｐ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，１７−０８５４−０２）を使用して、溶出した材料をＰＢＳ中に緩衝交換し、タンパク質濃度および内毒素レベルを決定する前に濾過した。ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく消衰係数を使用して、ＩｇＧ濃度を分光光度的に決定した（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記参照）。１〜０．１のＥＵ／ｍＬおよび１０〜０．１ＥＵ／ｍＬのＬＡＬカートリッジ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＴ５２０）に適合させたＥｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、内毒素レベルを決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分解について精製したＩｇＧを分析した。
【０３３７】
ヒトＢ７−Ｈ１／ｈＰＤ１リガンド阻害アッセイで、ＩｇＧ１−ＴＭ形式の抗Ｂ７−Ｈ１抗体を評価し、同じだがＩｇＧ１形式の抗体と比較し、ＩｇＧアイソタイプ転換による抗体生体外活性が低下しなかったことを確認した（図４）。
【０３３８】
実施例１２：ヒトＢ７Ｈ１／ＦＣ結合ヒトＰＤ１／ＦＣ−ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ
記載されるアッセイは、洗浄ステップを必要としないＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ技術を使用した、同種ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイである。Ｃｏｓｔａｒ３６７６マイクロタイタープレートに、５μｌ／ウェルのＰＢＳ中に希釈した１ｎＭのビオチン化ＰＤ１／Ｆｃを添加した。この後、５μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ＋０．８ＭのＫＦ）中に希釈した４ｎＭのストレプトアビジンＸＬｅｎｔ（ＣｉｓＢｉｏ）を添加した。５μｌ／ウェルのＰＢＳに希釈した試料材料の滴定を適切なウェルに添加した。総結合を定義するために、ウェル当り５μｌのＰＢＳもしくは適切な試料緩衝液を添加した。非特異的結合を定義するために、過剰（６００ｎＭ）の非標識化Ｂ７Ｈ１／ＦｃもしくはＰＤ１／Ｆｃを使用した。アッセイ緩衝液中に１：１００に希釈した５μｌ／ウェルのクリプテート標識化Ｂ７Ｈ１／Ｆｃ（クリプテート標識−ＣｉｓＢｉｏ，Ｂ７Ｈ１／Ｆｃ−ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の添加が最終プロセスであった。ＨＴＲＦ（登録商標）適合プレート読み取り装置で読み取る前に、アッセイプレートを室温で３時間放置した。
【０３３９】
抗Ｂ７−Ｈ１抗体についてのヒトＰＤ１／ヒトＢ７−Ｈ１リガンド阻害アッセイにおけるＩＣ５０の測定の例を表１９に提供する。全ての抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体は、ＩｇＧ１−ＴＭ形式である。
【表１９】
0006047646.tif 000023
【０３４０】
実施例１３：ヒトＢ７Ｈ１／ＦＣ結合ヒトＢ７−１／ＦＣ−ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ
記載されるアッセイは、洗浄ステップを必要としないＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ技術を使用した、同種ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイであった。Ｃｏｓｔａｒ３６７６マイクロタイタープレートに、５μｌ／ウェルのＰＢＳ中に希釈した８ｎＭのビオチン化Ｂ７−１／Ｆｃを添加した。この後、５μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ＋０．８ＭのＫＦ）中に希釈した２０ｎＭのストレプトアビジンＸＬｅｎｔ（ＣｉｓＢｉｏ）を添加した。５μｌ／ウェルのＰＢＳに希釈した試料材料の滴定を適切なウェルに添加した。総結合を定義するために、ウェル当り５μｌのＰＢＳもしくは適切な試料緩衝液を添加した。非特異的結合を定義するために、過剰（２００ｎＭ）の非標識化Ｂ７Ｈ１／ＦｃもしくはＢ７−１／Ｆｃを使用した。アッセイ緩衝液中に１：１００に希釈した５μｌ／ウェルのクリプテート標識化Ｂ７Ｈ１／Ｆｃ（クリプテート標識−ＣｉｓＢｉｏ，Ｂ７Ｈ１／Ｆｃ−ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の添加が最終プロセスであった。一晩４℃でアッセイプレートを放置した後、室温に戻し、ＨＴＲＦ（登録商標）適合プレート読み取り装置で読み取った。
【０３４１】
抗Ｂ７−Ｈ１抗体についてのヒトＢ７−１／ヒトＢ７−Ｈ１リガンド阻害アッセイにおけるＩＣ５０の測定の例を表２０に提供する。全ての抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体は、ＩｇＧ１−ＴＭ形式である。
【表２０】
0006047646.tif 000024
【０３４２】
実施例１４：他の免疫共調節タンパク質との抗Ｂ７−Ｈ１抗体の交差反応性
他の免疫共調節性分子に対する抗Ｂ７−Ｈ１  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体の交差反応性を決定するために、ＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡは、４℃で一晩、ウェル当り２５０ｎｇのヒトＢ７−Ｈ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１５６−Ｂ７）、ヒトＰＤ−Ｌ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１２２４−ＰＬ）、ヒトＢ７−Ｈ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１６５−Ｂ７）、ヒトＢ７−Ｈ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０２７−Ｂ３）、ヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，３４２−ＣＤ）、ヒトＣＴＬＡ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，３２５−ＣＴ）、およびヒトＰＤ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０８６−ＰＤ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）でＭａｘｉＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）をコーティングした後、室温で１時間、３％の乾燥粉乳を含有するＰＢＳでプレートを遮断することから成った。マウスＢ７−Ｈ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０１９−Ｂ７）のＥＣＤをコーティングすることにより、マウス交差反応性も検証した。３％の乾燥粉乳を含有するＰＢＳに１００ｎＭの希釈されたビオチン化抗Ｂ７−Ｈ１  ＩｇＧ１−ＴＭを室温で２時間インキュベートし、結合させた。結合したビオチン化ＩｇＧｓを０．２μｇ／ｍＬでユーロピウムＮ１標識化ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，１２４４−３６０）で検出した。市販の抗体であるマウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＢ７−Ｈ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ１５６）、マウスＩｇＧ２ｂ抗ヒトＰＤ−Ｌ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ１２２４）、マウスＩｇＧ２ｂ抗ヒトＢ７−Ｈ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ１６５）、マウスＩｇＧ１抗ヒトＢ７−Ｈ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ１０２７）、マウスＩｇＧ１抗ヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ３４２）、マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＴＬＡ−４（Ａｂｃａｍ，ａｂ３３３２０）、マウスＩｇＧ２ｂ抗ヒトＰＤ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ１０８６）、およびラットＩｇＧ２ａ抗マウスＢ７−Ｈ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ１０１９）を使用して、ＮＵＮＣプレートにコーティングする抗原を示す対照実験を実施した。３％の乾燥粉乳を含有するＰＢＳ中５μｇ／ｍＬで一次抗体を２時間インキュベートした。３％の乾燥粉乳を含有するＰＢＳに１：５０００に希釈された二次抗体の抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ共役体（Ｓｉｇｍａ，Ａ２５５４）、または抗ラットＩｇＧペルオキシダーゼ共役体（Ｓｉｇｍａ，Ａ５７９５）を１時間室温でインキュベートし、続いてＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ，Ｔ０４４０）を添加することにより、検出を実施した。８つの抗原全てをＭａｘｉｓｏｒｐ  ＮＵＮＣプレート上で検出することができた。非特異的結合を５μｇ／ｍＬのＩｇＧ１アイソタイプ対照でコーティングしたウェルを使用して決定した。ヒトＢ７−Ｈ１に対するのと比較した、抗原への特異的結合の割合（％）で、交差反応性を計算した。
【０３４３】
８つの免疫共調節性抗原の集団に対する２．７Ａ４ＯＰＴ、２．９Ｄ１０、および２．１４Ｈ９ＯＰＴの３つの抗Ｂ７−Ｈ１  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体の交差反応性は、三つ組で決定された。１００ｎＭの抗体濃度で、３つ全ての抗Ｂ７−Ｈ１抗体は、我々が検査した７つのヒト免疫共調節性分子のいずれにも交差反応性を示さない（図５）。ＩｇＧ１−ＴＭ抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．７Ａ４ＯＰＴは、ヒトＢ７−Ｈ１に対する１００％結合と比較して、平均で５．３％のシグナルレベルのマウスＢ７−Ｈ１に測定可能な交差反応性を示す。試験した他の２つの抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．９Ｄ１０および２．１４Ｈ９ＯＰＴは、マウスＢ７−Ｈ１に対していかなる交差反応性をも示さない（図５）。
【０３４４】
実施例１５：ヒトおよびカニクイザルのＢ７−Ｈ１に対する抗Ｂ７−Ｈ１抗体の親和性
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、表面プラズモン共鳴により単量体ヒトおよびカニクイザルのＢ７−Ｈ１に対するＩｇＧ１−ＴＭ形式の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の結合親和性および動態パラメータを決定した。簡潔に、実験は、泳動緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）を使用して、２５℃で実施した。製造者の指示（ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＢＩＡｃｏｒｅ）に従い、プロテインＧを介してＣＭ５センサチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）の表面上にＩｇＧを親和捕捉し、これは、約５００応答単位（ＲＵ）の密度を達成するようにＣＭ５表面上にアミン結合された。組み換え単量体のヒトもしくはカニクイザルのＢ７−Ｈ１  ＦｌａｇＨｉｓ１０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を分析物として使用した。泳動緩衝液中のＢ７−Ｈ１  ＥＣＤの希釈物（２００−３．１２ｎＭ）を６０秒間、１００μｌ／分の一定流量で注入した。全ての測定値は、対照（活性−不活化）流れ細胞により得られたセンサーグラムを引くことによりベースライン補正され、またブランク（ゼロ分析物濃度）注入と二重参照された。Ｔ−１００  ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアパッケージを使用してデータを分析し、ローカルＲｍａｘおよび０に設定されたバルク屈折率を用いた、簡単な１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。少なくとも２つの独立した実験からデータを計算した。物質移動効果は、親和捕捉されたＩｇＧのレベルを２５０ＲＵ以下に保つことにより制限された。全ての検査された抗体より得られたセンサーグラムは、単一指数関数的１：１結合モデル上に容易に適合され、一貫して０．３以下のカイ二乗値で良好に適合し得る。
【０３４５】
単量体ヒトＢ７−Ｈ１に対する２．７Ａ４ＯＰＴおよび２．１４Ｈ９ＯＰＴの抗Ｂ７−Ｈ１抗体の親和性は、それぞれ、１ｎＭおよび１７５ｐＭである（表２１）。
【表２１】
0006047646.tif 000025
【０３４６】
単量体カニクイザルＢ７−Ｈ１の抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．７Ａ４ＯＰＴおよび２．１４Ｈ９ＯＰＴの親和性は、それぞれ、８３５ｐＭおよび３６７ｐＭである（表２２）。これらの２つの抗体は、親和性がヒトＢ７−Ｈ１のものと非常に近いため、カニクイザルＢ７−Ｈ１に強力に交差反応性である。
【表２２】
0006047646.tif 000026
【０３４７】
実施例１６：抗Ｂ７−Ｈ１抗体のエピトープマッピング
エピトープマッピングを、抗Ｂ７−Ｈ１抗体への結合に関与するヒトＢ７−Ｈ１残基を特定するために実施した。マウスＰＤ１と複合するヒトＢ７Ｈ１の細胞外ドメインの構造は、以前に文献（Ｌｉｎ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０５，ｐ３０１１−３０１６）に記載され、１４のＢ７−Ｈ１残基がＰＤ１への結合に関与していることが明らかにされている（表２３）。
【表２３】
0006047646.tif 000027
【０３４８】
抗Ｂ７−Ｈ１抗体は、ヒトＢ７−Ｈ１のヒトＰＤ１への結合について競合するため（実施例５、８および１２）、Ｂ７Ｈ１結合接触面とヒトおよびマウスＰＤ１との間の差が無視できるほどであると想定した場合（２つの種の間の細胞外ドメイン配列が６２％のアミノ酸同一性）、これらは、これらの１４の残基のうちのいくつかと相互作用するはずである。単一アミノ酸Ｂ７−Ｈ１変異体は、表２３に記載される１４の位置の全てにおいて生成される。変異体は、ファージＥＬＩＳＡによって抗Ｂ７−Ｈ１抗体への結合、およびＨＴＲＦ（商標）競合アッセイにおいて、抗Ｂ７−Ｈ１抗体のヒトＢ７−Ｈ１への結合を競合する能力について検査される。記載される全ての抗Ｂ７−Ｈ１抗体は、ＩｇＧ１−ＴＭ形式である。
【０３４９】
ファージ提示発現においてバクテリオファージ遺伝子ＩＩＩと融合するヒトＢ７−Ｈ１細胞外ドメイン遺伝子のクローン化
ヒトＢ７−Ｈ１タンパク質の細胞外ドメインをコードする遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＺＱ７、アミノ酸［１９−２３８］）を、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．により外部で合成し、Ｂ７Ｈ１＿ＦＯＲ（５’−ＡＡＴＡＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧ−３’）およびＢ７Ｈ１＿ＲＥＶ（５’−ＡＡＴＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＴＴＧＧＧＧＧＡＴＧＣ−３’）のプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅し、それぞれ、５’端および３’端のＳｆｉ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ制限部位に導入した。次いで、Ｓｆｉ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ制限部位を使用して、ＰＣＲ産物をｐＣＡＮＴＡＢ６ベクターに一方向にクローン化した（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４７，ｐ１５７−１７３）。大腸菌株ＴＧ１を連結により形質転換し、個別のコロニーを配列決定によりスクリーニングし、Ｂ７−Ｈ１＿ｐＣＡＮＴＡ６と命名されるＢ７−Ｈ１形質転換体を特定した。
【０３５０】
Ｂ７−Ｈ１変異体の生成および特定
Ｂ７−Ｈ１変異体は、完全無作為化ＮＮＳプライマー（表２４）およびＤＮＡテンプレートとしてのプラスミドＢ７−Ｈ１＿ｐＣＡＮＴＡ６を使用して、ＰＤ１接触面の１４の残基の全てで、飽和変異誘発によって生成された。変異誘発は、製造者の指示に従い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ多重部位特異的変異誘発キット（カタログ＃２００５１３）を用いて実施した。大腸菌株ＴＧ１を形質転換するために変異反応を使用し、個別のコロニーを配列決定によりスクリーニングし、Ｂ７−Ｈ１変異形を特定した。２８０（２０のアミノ酸×１４の位置）の可能性のある変異形のうちの合計２５２の変異形を特定し、３つの９６ウェル培養プレートに選別した。
【表２４】
0006047646.tif 000028
【０３５１】
抗Ｂ７−Ｈ１抗体への結合についてのＢ７−Ｈ１変異体のファージＥＬＩＳＡ
遺伝子ＩＩＩタンパク質と融合したＢ７−Ｈ１細胞外ドメインがファージ表面で提示され得ることを確認した後、Ｂ７−Ｈ１変異体の抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴ、２．７Ａ４ＯＰＴ、または参照抗体＃１への結合をファージＥＬＩＳＡにより評価した。慎重に採取されたＴＧ１培養物を成長させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで重感染させ、それらの表面でＢ７−Ｈ１変異体を示すファージ粒子を産生した。ファージ上清をＰＢＳ＋３％の脱脂乳で遮断し、一晩、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬの２．１４Ｈ９ＯＰＴ、２．７Ａ４ＯＰＴ、または参照抗体＃１で予めコーティングし、ＰＢＳ＋３％の脱脂乳で遮断されたＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｂプレートでインキュベートした。ビオチン化抗Ｍ１３二次抗体（Ｐｒｏｇｅｎ）を用いてインキュベートした後、ユーロピウム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と結合したストレプトアビジンを使用して、結合ファージを検出した。
【０３５２】
ＰＤ１接触面に位置する１４のヒトＢ７−Ｈ１残基のうち、４つは、試験した３つの抗Ｂ７−Ｈ１抗体のいずれの結合にも関与しない（Ａｓｐ２６、Ｔｙｒ５６、Ｇｌｕ６６、およびＬｙｓ１２４）。アラニンまたはグリシンによるそれらの置換は、著しく結合シグナルに影響を及ぼさない。ファージＥＬＩＳＡデータに基づき、他の１０の位置のそれぞれにおける２〜３の主な変更を代表する合計２８の変異体を選択し、結合プロファイルを確認したが、精製されたタンパク質を使用した。
【０３５３】
生化学競合アッセイ
ヒトＢ７−Ｈ１野生型および変異体の細胞外ドメインを細菌に発現させ、以前に記載されているように親和性クロマトグラフィーにより精製した（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９４，９３１−９３７）。
【０３５４】
ＨＴＲＦ（商標）競合アッセイは、抗Ｂ７−Ｈ１抗体のＨＩＳ  ＦＬＡＧタグを付けたＢ７−Ｈ１への結合を測定した。上述のように調製されたタグ付けされないＢ７−Ｈ１試料の滴定は、抗Ｂ７−Ｈ１抗体の結合においてＨＩＳ  ＦＬＡＧタグを付けたＢ７−Ｈ１と競合し、アッセイシグナルの低下をもたらす。抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴ、２．７Ａ４ＯＰＴ、および参照抗体＃１を、精製された野生型または変異体Ｂ７−Ｈ１の相対的結合を特徴付けるための競合アッセイを確立するために使用した。これは、どのＢ７−Ｈ１残基が抗体結合に必要とされるかを確認する。１０μｌのＢ７−Ｈ１試料を３８４ウェル低容量アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３６７３）に添加した。この後、製造者の指示（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，  ５３０５１）に従い、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９により共役された、５μＬの０．２９ｎＭの２．１４Ｈ９ＯＰＴまたは１．１５ｎＭの２．７Ａ４ＯＰＴ、または１．１５ｎＭの参照抗体＃１のいずれか、および５μＬの０．４３ｎＭの抗ＦＬＡＧクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，６１ＦＧ２ＫＬＢ）と１．２５ｎＭのＨＩＳ  ＦＬＡＧタグを付けたヒトＢ７−Ｈ１との混合溶液を添加した。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレート読み取り装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの発光波長で時間分解蛍光を読み取る前に、アッセイプレートを室温で４時間インキュベートした。
【０３５５】
さらなる３つのＢ７−Ｈ１残基（Ｉｌｅ５４、Ｓｅｒ１１７、およびＡｌａ１２１）は、それらの残基のＢ７−Ｈ１変異体のＩＣ５０が、野生型Ｂ７−Ｈ１に類似するか、またはそれと比較してわずかに修飾されているので、２．１４Ｈ９ＯＰＴおよび２．７Ａ４ＯＰＴへの結合に関与しない。野生型および他の全てのＢ７−Ｈ１変異体における３つの抗Ｂ７−Ｈ１抗体に対する競合データを表２５に要約する。
【表２５】
0006047646.tif 000029
【０３５６】
Ａｒｇ１１３およびＡｒｇ１２５は、２．１４Ｈ９ＯＰＴへの結合に強く関与する。Ａｌａまたは他のアミノ酸（１１３位のＴｙｒもしくはＬｅｕ、および１２５位のＧｌｎもしくはＳｅｒ）による置換は、その抗体への完全な結合損失をもたらす。これらのＢ７−Ｈ１変異体の２．７Ａ４ＯＰＴもしくは参照抗体＃１への結合プロファイルは、野生型Ｂ７−Ｈ１に類似する。これは、結合の損失が、例えば、ほどかれたタンパク質等の、Ｂ７−Ｈ１の一般構造の修飾によるものではなく、これらの残基の２．１４Ｈ９ＯＰＴ結合との直接関与によるものであることを示す。これらのデータは、２．１４Ｈ９ＯＰＴ結合エピトープが２．７Ａ４ＯＰＴおよび参照抗体＃１エピトープと異なることも示す。Ｍｅｔ１１５、Ａｓｐ１２２、およびＴｙｒ１２３も、２．１４Ｈ９ＯＰＴへの結合に関与するが、程度は低い。Ｍｅｔ１１５のＡｌａによる置換は、２．１４Ｈ９ＯＰＴまたは２．７Ａ４ＯＰＴへの結合に影響を及ぼさないが、Ａｓｎによる置換は、２．１４Ｈ９ＯＰＴへの完全な結合活性の損失をもたらすが、２．７Ａ４ＯＰＴへの完全な結合活性の損失はもたらさない。同様に、Ａｓｐ１２２のＡｓｎによる置換は、２．１４Ｈ９ＯＰＴへの結合に影響を及ぼすが、参照抗体＃１へは影響を及ぼさない。Ｔｙｒ１２３のＡｌａもしくはＴｈｒによる変異は、２．１４Ｈ９ＯＰＴへの結合プロファイルを大きき修飾するが、２．７Ａ４ＯＰＴへの結合プロファイルは修飾しない。興味深いことに、Ｐｈｅによる置換は、２．１４Ｈ９ＯＰＴへの結合を変更せず、チロシン１２３のヒドロキシル基が結合相互作用に関与しないことを示す。
【０３５７】
Ｐｈｅ１９、Ｔｈｒ２０、およびＡｓｐ１２２は、２．７Ａ４ＯＰＴへの結合に強く関与する。これらの位置での全てのＢ７−Ｈ１変異体は、その抗体に結合しないが、野生型Ｂ７−Ｈ１と同様に２．１４Ｈ９ＯＰＴまたは参照抗体＃１に結合するが、これらの２つの抗体をあまり効率的に結合しないＢ７Ｈ１＿Ｄ１２２Ｅ変異体を除く。これらの３つの残基は、２．７Ａ４ＯＰＴ  ｍＡｂ結合エピトープに特異的であり、２．１４Ｈ９ＯＰＴまたは参照抗体＃１エピトープにより共有されない。Ａｒｇ１１３は、２．７Ａ４ＯＰＴ  エピトープにも関与するが、程度は低い。Ａｌａによる置換は、その抗体への結合に影響を及ぼさないが、ＴｙｒまたはＬｅｕ変異は、完全な結合損失をもたらす。１１３位でのこれらの変異は、参照抗体＃１への結合に影響を及ぼさず、Ｂ７−Ｈ１変異体がそれでも適切な高次構造であることを示す。Ｔｙｒとしてのバルクアミノ酸による置換は、いくつかの立体障害を導く可能性がある。これらの結果は、Ａｒｇ１１３が２．７Ａ４ＯＰＴ抗体への接触に直接関与しないが、実際の結合エピトープに非常に近いことを示す。
【０３５８】
この実施例は、２．１４Ｈ９ＯＰＴ、２．７Ａ４ＯＰＴ、および参照抗体＃１の３つの抗Ｂ７−Ｈ１抗体が、ＰＤ１とのＢ７−Ｈ１接触面で別個の結合エピトープを有することを示す。さらに、これらの抗体は他のヒトＢ７−Ｈ１残基にも結合するが、それらのヒトＢ７−Ｈ１残基はＰＤ１接触面に位置しない可能性がある。
【０３５９】
実施例１７．想起抗原の準最適濃度への記憶Ｔ細胞の応答に対する抗Ｂ７−Ｈ１抗体の作用の決定
ＰＤ−１とのＢ７−Ｈ１相互作用が、抗原特異的Ｔ細胞応答を阻害することが示されている。抗Ｂ７−Ｈ１抗体のこの阻害に対する作用を評価するために、準最適抗原想起アッセイを実施した。
【０３６０】
製造者の指示に従い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−１４４０−０３）密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単球（ＰＢＭＣ）をヒト血液バフィーコートから単離した。単離細胞を１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ、．１５１４０）および４％のヒトＡＢ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，３４００５）で補充されたＲＰＭＩ１６４０  Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ培地（ＧＩＢＣＯ、．６１８７０）に再懸濁し、続いて、３７℃、５％のＣＯ２で、ウェル当り１ｘ１０５細胞密度の０．１μｇ／ｍＬの破傷風トキソイド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．５８２２３１）を含む、または含まない、９６ウェルの丸底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，．３７９９）中で培養した。３日間培養した後、ＩｇＧ１−ＴＭ形式またはアイソタイプ対照の抗Ｂ７−Ｈ１抗体を、示される濃度で添加し、さらに２日間、培養物を３７℃に戻し、この時点で、上清を採取し、ＤＥＬＦＩＡによりインターフェロン−γのレベルについて分析した。抗Ｂ７−Ｈ１抗体によるインターフェロン−γ放出の強化を図６に示す。
【０３６１】
抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴは、インターフェロン−γ放出を増加させることができる。このデータは、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４ＯＰＴ、および２．１４Ｈ９ＯＰＴが抗原特異的Ｔ細胞応答を強化する能力を確認する。
【０３６２】
実施例１８．想起抗原の最適濃度への記憶Ｔ細胞応答に対する抗Ｂ７−Ｈ１抗体の作用の決定
Ｂ７−Ｈ１は、可能性のある阻害シグナル伝達特性を有することが示されている。そのような阻害シグナル伝達を促進するかもしれない作動薬として機能する抗Ｂ７−Ｈ１抗体の可能性は、抗原想起応答を阻害するそれらの能力を検証することにより検査された。
【０３６３】
製造者の指示に従い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−１４４０−０３）密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単球（ＰＢＭＣ）をヒト血液バフィーコートから単離した。単離細胞を１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ、．１５１４０）および４％のヒトＡＢ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３４００５）で補充されたＲＰＭＩ１６４０  Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ培地（ＧＩＢＣＯ、．６１８７０）に再懸濁し、続いて、ＩｇＧ１−ＴＭ形式またはアイソタイプ対照の種々の濃度の抗Ｂ７−Ｈ１抗体の存在下、または不在下で、５μｇ／ｍＬの破傷風トキソイド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ．５８２２３１）と共に、３７℃、５％のＣＯ２で、９６ウェルの丸底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，．３７９９）中で培養した。Ｔ細胞共レセプターに対する抗体が、陽性対照として使用された。５日間の培養後、増殖性活性を評価するために、細胞を０．５μＣｉ／ウェルのトリチウム化チミジンで１６時間パルスした。
【０３６４】
図７に示されるように、陽性対照とは対照的に、阻害作用は、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、および２．１４Ｈ９抗Ｂ７−Ｈ１抗体で観察されなかった。これは、２．９Ｄ１０、２．７Ａ４、および２．１４Ｈ９抗体がいかなる作動活性もない純粋な拮抗薬であることを示唆する。
【０３６５】
実施例１９．抗Ｂ７−Ｈ１抗体の腫瘍成長阻害活性
易感染性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病／重症複合免疫不全）マウスを使用した異種移植マウスモデルで抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体の生体内活性を調査した。健康なドナーの抹消血単核細胞から単離し、アロ反応性エフェクターＴ細胞用に培養して富化したヒトＢ７−Ｈ１ならびにヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を発現するヒト癌細胞系をマウスの皮下（ＳＣ）に移植した。ヒト膵癌細胞系ＨＰＡＣまたはヒトメラノーマ細胞系Ａ３７５を接種されたマウスに抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体を腹腔内（ＩＰ）投与した。２０００ｍｍ３の腫瘍体積または肉眼的な腫瘍壊死までの腫瘍成長において、抗体の作用を観察した。
【０３６６】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞系を生成するために、２０ｍＬの全血当り１ｍＬのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｔ細胞富化産物を添加することにより、健康なドナーからのヒトＰＢＭＣをＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞用に富化した。この後、２０分間インキュベートし、続いて、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  ＤＭ−Ｌ密度培地を使用した密度勾配遠心分離によって単離した。遠心分離後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％のＦＢＳで補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。富化したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をｒｈＩＬ−２で補充された培地中で別々に７〜１０日間培養し、それぞれ、マイトマイシンＣ処理されたＡ３７５またはＨＰＡＣ細胞と混合した。Ｔ細胞を収集し、ｒｈＩＬ−２で補充された培地中で別々に７〜１０日間再度培養し、マイトマイシンＣ処理されたＡ３７５またはＨＰＡＣ細胞と混合した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を収集し、１：１の割合で混合した。
【０３６７】
Ａ３７５およびＨＰＡＣ癌細胞系ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞用に富化されたＰＢＭＣを皮下（ＳＣ）投与直前に、示されるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の割合で混合した。各癌細胞系の接種数は、経験的な腫瘍形成用量試験により予め決定され、一般的に、０．２ｍＬの総容量で２．５×１０６細胞が各動物に移植された。
【０３６８】
６匹の動物を各実験群に割り当てた。アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ１ＯＰＴ（本明細書において「ＩｇＧ１ＴＭ」とも称される）抗体、またはＩｇＧ１ＯＰＴ形式の抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９  ＩｇＧ２ａ、２．１４Ｈ９ＯＰＴ、２．７Ａ４ＯＰＴもしくは参照抗体＃１を動物に与えた。合計８つの独立した実験を実行し、各実験の試験設計を表２６〜３３に示す。記載される抗Ｂ７−Ｈ１抗体は、指定される場合を除きＩｇＧ１ＯＰＴ形式である。
【０３６９】
癌／エフェクターＴ細胞の移植後、第１用量（２００μＬ）の試験物をＩＰで１時間投与した；試験３、５、８、および／または１０日目に、最大４回のさらなる用量の試験物を動物に与えた。陽性対照として、いくつかの試験においてアロ反応性を強化するために、癌／エフェクターＴ細胞の移植後、ｒｈＩＬ−２をＩＰで１時間投与した；４日間連続して、さらに４回、日用量のｒｈＩＬ−２を動物に与えた。週に１また２回、腫瘍の形成を各動物において観察した。腫瘍をカリパスで測定した；以下の式を使用して腫瘍体積（Ｖ）を計算した。
【０３７０】
Ｖ（ｍｍ３）＝０．５（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２）
各群において、結果を算術平均として報告する。抗癌作用は、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）％として表され、以下の方法により計算された：
ＴＧＩ％＝［１−（治療群の平均腫瘍Ｖ）÷（対照群の平均腫瘍Ｖ）］×１００
試験１において、抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９  ＩｇＧ２ａおよび２．７Ａ４ＯＰＴは、アイソタイプ対照群と比較して、３０日目で、それぞれ、最大６１％および５０％まで、大幅にＨＰＡＣ（膵臓）癌細胞の成長を阻害した（図８および表２６）。
【表２６】
0006047646.tif 000030
【０３７１】
試験２において、抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴおよび２．７Ａ４ＯＰＴは、アイソタイプ対照群と比較して、３９日目で、それぞれ、最大７０％および６８％までＨＰＡＣ（膵臓）癌細胞の成長を阻害した（図９および表２７）。
【表２７】
0006047646.tif 000031
【０３７２】
試験３において、抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴは、アイソタイプ対照群と比較して、３０日目で、最大６０％まで、大幅にＨＰＡＣ（膵臓）癌細胞の成長を阻害した（図１０および表２８）。
【表２８】
0006047646.tif 000032
【０３７３】
試験４において、抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴは、アイソタイプ対照群と比較して、２２日目で、最大７４％まで、大幅にＨＰＡＣ（膵臓）癌細胞の成長を阻害した（図１１および表２９）。
【表２９】
0006047646.tif 000033
【０３７４】
試験５において、Ａ３７５（メラノーマ）異種移植モデルにおける抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９  ＩｇＧ２ａまたは２．７ＯＰＴのＩＰ投与も、アイソタイプ対照群と比較して、２９日目で、それぞれ、６４％および６１％ほど、大幅に腫瘍成長を阻害した（図１２および表３０）。
【表３０】
0006047646.tif 000034
【０３７５】
試験６において、抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴは、Ｔ細胞と組み合わせた時、アイソタイプ対照群と比較して、２５日目で、最大７７％まで、Ａ３７５（メラノーマ）癌細胞の成長を大幅に阻害した（図１３および表３１）。
【表３１】
0006047646.tif 000035
【０３７６】
試験７において、抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴは、Ｔ細胞と組み合わせた時、アイソタイプ対照群と比較して、２５日目で、最大８２％まで、Ａ３７５（メラノーマ）癌細胞の成長を大幅に阻害した（図１４および表３２）。
【表３２】
0006047646.tif 000036
【０３７７】
試験８において、抗Ｂ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９ＯＰＴは、Ｔ細胞と組み合わせた時、アイソタイプ対照群と比較して、２５日目で、最大９３％まで、Ａ３７５（メラノーマ）癌細胞の成長を大幅に阻害した（図１５および表３３）。
【表３３】
0006047646.tif 000037
【０３７８】
これらの結果は、抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体２．１４Ｈ９  ＩｇＧ２ａ、２．１４Ｈ９ＯＰＴ、および２．７Ａ４ＯＰＴがヒトの癌の異種移植マウスモデルにおいて強力な生体内抗癌活性を有することを示し、これらの抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体がＢ７−Ｈ１を発現する癌を被る患者の治療の薬剤単独療法としての活性を有し得るという証拠を提供する。
【０３７９】
参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書等を含む本明細書に引用される全ての参考文献、ならびにそこに引用される参考文献は、それらが既に引用されていない限り、ここで参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。２００９年１１月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／２６４，０６１号、その中の図、および配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３８０】
等価物
前述の明細書は、当業者が本発明を実践するのに十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、本発明のある好ましい実施形態を詳述し、発明者により企図される最適な方法を記載する。しかしながら、たとえ上述が詳細に本文で使用されているとしも、本発明は、多くの手法で実践することができ、本発明は、付属の請求項およびあらゆるその等価物により解釈されるべきであることを理解する。
【受託番号】
【０３８１】
NCIMB 41597
NCIMB 41598
NCIMB 41599
【図１】
0006047646.tif 000038
【図２】
0006047646.tif 000039
【図３】
0006047646.tif 000040
【図４】
0006047646.tif 000041
【図５】
0006047646.tif 000042
【図６】
0006047646.tif 000043
【図７】
0006047646.tif 000044
【図８】
0006047646.tif 000045
【図９】
0006047646.tif 000046
【図１０】
0006047646.tif 000047
【図１１】
0006047646.tif 000048
【図１２】
0006047646.tif 000049
【図１３】
0006047646.tif 000050
【図１４】
0006047646.tif 000051
【図１５】
0006047646.tif 000052
【配列表】
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