(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡ分子であって、（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチド分子、（ｂ）配列番号：６の完全長と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子、または（ｃ）（ａ）または（ｂ）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド分子を含む、組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記組換えＤＮＡ分子が事象ＭＯＮ８８３０２由来であり、事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子の代表的試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０９５５で寄託されている、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記組換えＤＮＡ分子が、アブラナ属植物、植物細胞、種子、後代植物、植物器官または遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物に由来する商品に含まれている、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記組換えＤＮＡ分子が、事象ＭＯＮ８８３０２からのＤＮＡ由来のテンプレート分子から生成されるアンプリコンである、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記組換えＤＮＡ分子が、事象ＭＯＮ８８３０２の存在に特徴的である、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
事象ＭＯＮ８８３０２の存在に特徴的なポリヌクレオチドプローブであって、前記ポリヌクレオチドプローブが配列番号：１または配列番号：２を含む核酸分子と結合するのに十分な長さであり、前記ポリヌクレオチドプローブがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１または配列番号：２を含むＤＮＡ分子とハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では配列番号：１または配列番号：２を含まないＤＮＡ分子とはハイブリダイズしないことを特徴とする、事象ＭＯＮ８８３０２の存在に特徴的なポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
ＤＮＡ試料中で事象ＭＯＮ８８３０２由来のＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料を請求項６に記載のポリヌクレオチドプローブと接触させるステップと、（ｂ）前記試料および前記ポリヌクレオチドプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に晒すステップと、（ｃ）前記ＤＮＡ分子への前記ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含み、前記ハイブリダイゼーションの検出が、前記ＤＮＡ試料中の事象ＭＯＮ８８３０２由来の前記ＤＮＡ分子の存在に特徴的である、方法。
【請求項８】
第１のＤＮＡ分子および第１のＤＮＡ分子とは異なる第２のＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子対であって、前記ＤＮＡ分子が、事象ＭＯＮ８８３０２由来のテンプレートとの増幅反応において一緒に用いられるときにＤＮＡプライマーとして機能して試料中の事象ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡに特徴的なアンプリコンを生成する、配列番号：６の中の十分な長さの連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補体を有するポリヌクレオチド分子を含み、当該第１のＤＮＡ分子は配列番号：６の導入遺伝子インサートＤＮＡ配列に存在し、当該第２のＤＮＡ分子は配列番号：６のアブラナ属ゲノムＤＮＡ配列に存在する、ＤＮＡ分子対。
【請求項９】
前記アンプリコンが配列番号：１および配列番号：２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のＤＮＡ分子対。
【請求項１０】
ＤＮＡ試料中で事象ＭＯＮ８８３０２由来のＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、（ａ）請求項８に記載のＤＮＡ分子対にＤＮＡ試料を接触させるステップと、（ｂ）配列番号：１または配列番号：２の中の連続する少なくとも４０ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド分子を含むアンプリコンを生成するのに十分な増幅反応を実行するステップと、（ｃ）前記アンプリコンを検出するステップとを含み、前記アンプリコンの検出が、前記ＤＮＡ試料中の事象ＭＯＮ８８３０２由来の前記ＤＮＡ分子の存在に特徴的である、方法。
【請求項１１】
事象ＭＯＮ８８３０２由来のＤＮＡの存在を検出するのに特異的なＤＮＡプライマーまたはポリヌクレオチドプローブとして機能する、配列番号：６の中の十分な長さの連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列およびその相補体を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を含むＤＮＡ検出キットであって、前記ＤＮＡの検出が、試料中の前記事象ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡの存在に特異的である、ＤＮＡ検出キット。
【請求項１２】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含む、植物、種子、細胞または植物器官。
【請求項１３】
前記植物、種子、細胞または植物器官がグリホサート系除草剤処理に耐性である、請求項１２に記載の植物、種子、細胞または植物器官。
【請求項１４】
前記植物、種子、細胞または植物器官のゲノムが、ＤＮＡ増幅方法で試験されるとき事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンを生成する、請求項１２に記載の植物、種子、細胞または植物器官。
【請求項１５】
前記植物器官が、花粉、胚珠、鞘、花、根組織、茎組織または葉組織からなる群より選択される、請求項１２に記載の植物器官。
【請求項１６】
事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物、種子、細胞または植物器官であって、事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子の代表的試料がＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１０９５５で寄託されている、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物、種子、細胞または植物器官。
【請求項１７】
前記植物、種子、細胞または植物器官がグリホサート系除草剤処理に耐性である、請求項１６に記載の植物、種子、細胞または植物器官。
【請求項１８】
前記植物または種子が、事象ＭＯＮ８８３０２由来の少なくとも１つの親を有するハイブリッドである、請求項１６に記載の植物または種子。
【請求項１９】
ＤＮＡ増幅方法で試験するときに事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンを生成することのできる種子、植物または器官であって、前記アンプリコンが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択される配列を有するＤＮＡ分子を含む、種子、植物または器官。
【請求項２０】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるＤＮＡ分子を含む、事象ＭＯＮ８８３０２由来の非生存植物材料。
【請求項２１】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含む微生物。
【請求項２２】
前記微生物が植物細胞である、請求項２１に記載の微生物。
【請求項２３】
事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物、種子、細胞または植物器官由来の商品であって、前記商品が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む、植物、種子、細胞または植物器官由来の商品。
【請求項２４】
前記商品が、無損傷の種子または加工種子、動物飼料、油、ミール、穀物粉、フレーク、ふすま、バイオマスおよび燃料製品からなる群より選択される、請求項２３に記載の商品。
【請求項２５】
事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物を含んだ圃場における雑草防除方法であって、事象ＭＯＮ８８３０２を含む前記植物を損傷させることなく前記圃場における雑草の生長を防除するのに有効な量のグリホサートを用いて前記圃場を処理するステップを含む、方法。
【請求項２６】
雑草の生長を防除するのに有効なグリホサートの前記量が、１エーカー当たり０．１２５ポンド〜６．４ポンドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
雑草の生長を防除するのに有効なグリホサートの前記量が、１エーカー当たり１．６ポンドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
圃場を処理する前記ステップが、事象ＭＯＮ８８３０２を含む前記植物の６葉期を超えて行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
グリホサート系除草剤の施用に耐えるアブラナ属植物を生成する方法であって、（ａ）事象ＭＯＮ８８３０２を含むグリホサート耐性アブラナ属植物を第２のアブラナ属植物と交雑させ、これにより種子を生成するステップと、（ｂ）前記種子を生育させて複数の後代植物を生成するステップと、（ｃ）事象ＭＯＮ８８３０２を含む後代植物を選択するステップとを含む、方法。
【請求項３０】
後代植物を選択する前記ステップが、前記後代植物をグリホサートで処理するステップと、グリホサート耐性のある後代植物を選択するステップとを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
後代植物を選択する前記ステップが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む後代植物を同定するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２のアブラナ属植物がグリホサート系除草剤耐性を有さない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
グリホサート系除草剤の施用に耐性のあるアブラナ属植物を生成する方法であって、（ａ）事象ＭＯＮ８８３０２を含むグリホサート耐性事象アブラナ属植物を自家受粉させて、これにより種子を生成するステップと、（ｂ）前記種子を生育させて複数の後代植物を生長させるステップと、（ｃ）事象ＭＯＮ８８３０２を含む後代植物を選択するステップとを含む、方法。
【請求項３４】
事象ＭＯＮ８８３０２植物または種子の接合状態を決定する方法であって、（ａ）事象ＭＯＮ８８３０２由来のゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において使用されるときに、事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的な第１のアンプリコンを生成する配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４を含むプライマーセットに、ＤＮＡを含む試料を接触させるステップと、（ｂ）核酸増幅反応を行って、これにより前記第１のアンプリコンを生成するステップと、（ｃ）前記第１のアンプリコンを検出するステップと、（ｄ）植物からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応に用いられるときに、事象ＭＯＮ８８３０２であると同定された導入遺伝子挿入のゲノム領域と相同的な天然のゲノムＤＮＡを含む第２のアンプリコンを生成する前記プライマーセットに、ＤＮＡを含む前記試料を接触させるステップと、（ｅ）核酸増幅反応を行って、これによって前記第２のアンプリコンを生成するステップと、（ｆ）前記第２のアンプリコンを検出するステップと、（ｇ）試料中で前記第１および第２のアンプリコンを比較するステップとを含み、両アンプリコンの存在が、前記試料が導入遺伝子挿入に関してヘテロ接合性であることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、全体が参照により組み込まれている、２０１０年６月４日出願の米国仮出願第６１／３５１，３１７号の利益を主張するものである。
【０００２】
（配列表の組み込み）
ファイル名「ＭＯＮＳ２９１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（２１キロバイト）（サイズはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）で２０１１年５月３１日に作成された配列表を電子的申請により本願と共に出願し、参照により組み込まれるものとする。
【０００３】
本発明は、生物工学分野および農業分野に関し、具体的には、遺伝子組換え作物に関する。
【背景技術】
【０００４】
アブラナ属作物は世界の多数の地域において重要である。生物工学の方法をアブラナ属作物に適用して、除草剤耐性などの形質が改善された作物を生成し得る。除草剤耐性は、かかる耐性を付与することが可能な導入遺伝子の発現によって遺伝子組換え植物において実現され得る。ある植物における導入遺伝子の発現は、因子の組合せ（例えば、導入遺伝子カセットに用いられる調節因子、導入遺伝子インサートの染色体の位置および組み込み部位近傍の内因性調節因子の近接）によって影響を受けることがある。例えば、同じように生成された事象間では導入遺伝子発現の全体的レベルまたは導入遺伝子発現の空間的および時間的パターンが広範囲に変動し得ることが認められている。このため、市販の農業目的に有用な１つの事象を最終的に同定するために、何百もの個々の植物の形質転換事象を生成および検証する必要があり得る。次いで、所望の導入遺伝子発現および分子的特徴を有していることが同定されると、かかる事象は植物育種方法を用いてその形質を他の遺伝的背景に遺伝子移入され得る。得られた後代はその遺伝子組換え事象を含み、ひいては元の形質転換体の形質の導入遺伝子発現特性を有するであろう。この後代は改善された形質を含み、特定の地域の生育条件に適切に適合された多数の異なる品種を生成するために使用し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、その代表的な種子サンプルが米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に受入番号ＰＴＡ−１０９５５で寄託された、事象ＭＯＮ８８３０２を含む遺伝子組換え植物および種子を提供する。事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物は、グリホサート系除草剤の施用に対して商業上許容可能な耐性を示す。本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２を含む後代植物、植物器官および細胞、事象ＭＯＮ８８３０２に関連する組換えＤＮＡ分子およびこれら分子の使用方法、事象ＭＯＮ８８３０２に由来するか事象ＭＯＮ８８３０２を含む商用産物、ならびに事象ＭＯＮ８８３０２の使用方法を提供する。
【０００６】
本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物、種子、細胞、後代植物、または植物器官、および事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物、細胞、植物器官または種子に由来する商用産物を提供する。ひいては、本発明は配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるヌクレオチド配列およびそのフラグメントを有するＤＮＡ分子を含む植物、種子、細胞、後代植物、植物器官または商用産物を提供する。本発明は、例えばＤＮＡ増幅方法において、本発明のＤＮＡ分子を含むアンプリコンを生成する組換えＤＮＡ分子を含む植物、種子、細胞、後代植物または植物器官を提供する。
【０００７】
本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２に関係するＤＮＡ分子を提供する。これらのＤＮＡ分子は、事象ＭＯＮ８８３０２の導入遺伝子インサートおよびフランキングゲノムＤＮＡ間の結合、および／または挿入ＤＮＡに隣接するゲノムＤＮＡの領域、および／または挿入部位に隣接する組込み遺伝子組換えＤＮＡの領域、および／または組込み遺伝子組換え発現カセットの領域、および／またはこれらの領域のいずれかの連続配列を表すかまたはそれらに由来するヌクレオチド配列を含み得る。また、本発明は、アブラナ事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なプライマーおよびプローブとして有用なＤＮＡ分子を提供する。これらの分子を含む植物、細胞、植物器官、商品、後代および種子を提供する。
【０００８】
本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２に由来したＤＮＡの存在を検出するのに有用な方法、組成物およびキットを提供する。本発明は、ＤＮＡを含む試料と、事象ＭＯＮ８８３０２からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応に用いたときに事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンを生成するプライマーセットとを接触させ、核酸増幅反応を行い、それによりアンプリコンを生成し、このアンプリコンを検出することによる事象ＭＯＮ８８３０２の検出方法を提供する。また、本発明は、ＤＮＡを含む試料と、事象ＭＯＮ８８３０２からのゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応に用いた場合に事象ＭＯＮ８８３０２に特異的なＤＮＡ分子にハイブリダイズするプローブとを接触させ、ハイブリダイゼーション反応を行い、次いで、ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションを検出することによる事象ＭＯＮ８８３０２の検出方法を提供する。また、事象ＭＯＮ８８３０２に由来したＤＮＡの存在を検出するのに有用な本発明の方法および組成物を含むキットを提供する。
【０００９】
本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物を植え付け（すなわち、事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子の播種）、次いで、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物を害することなく雑草を防除することのできる有効量のグリホサートを施用することによって圃場の雑草を防除する方法を提供する。
【００１０】
本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２を含むか、または配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択される配列を含むグリホサート耐性植物と第２の植物とを交配し、それによって種子を生成し、その種子を生育させて後代植物を生成し、その後代植物をグリホサートで処理し、事象ＭＯＮ８８３０２を含みかつグリホサート耐性のある後代植物を選択することによる、グリホサート除草剤の施用に耐性である植物および／または種子の生成方法を提供する。本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２を含むか、または配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択される配列を含むグリホサート耐性植物を自家受粉し、それによって種子を生成し、その種子を生育させて後代植物を生成し、その後代植物をグリホサートで処理し、事象ＭＯＮ８８３０２を含みかつグリホサート耐性のある後代植物を選択することによる、グリホサート除草剤の施用に耐性である植物および／または種子の生成方法を提供する。
【００１１】
本発明は、ＤＮＡを含む試料を、事象ＭＯＮ８８３０２からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において使用されるときに事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンを生成する第１のプライマーセットと接触させ、核酸増幅反応を行い、これによってアンプリコンを生成し、そのアンプリコンを検出し、植物からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において用いられるときに事象ＭＯＮ８８３０２と同定された導入遺伝子インサートのゲノム領域と相同性の天然（ｎａｔｉｖｅ）のゲノムＤＮＡを含む第２のアンプリコンを生成する第２のプライマーセットと試料を接触させ、核酸増幅反応を行い、これによって第２のアンプリコンを生成し、この第２のアンプリコンを検出し、試料中で第１と第２のアンプリコンを比較することによって、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物または種子の接合状態を決定する方法を提供し、ここにおいて、両方のアンプリコンが存在していることが、その試料、ひいてはその植物または種子が導入遺伝子インサートとヘテロ接合性であることを示す。
【００１２】
本発明の前記および他の態様は、以下の詳細な記載からより明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】事象ＭＯＮ８８３０２の概略図を示し、［Ａ］は５’結合領域の相対的位置に対応し、［Ｂ］は３’結合領域の相対的位置に対応し、［Ｃ］は５’フランキング領域の相対的位置および挿入された遺伝子組換えＤＮＡの５’末端の一部分に対応し、［Ｄ］は３’フランキング領域の相対的位置、および挿入された遺伝子組換えＤＮＡの３’末端の一部分に対応し、［Ｅ］は導入遺伝子発現カセットを表し、［Ｆ］はセイヨウアブラナのゲノムフランキング配列および導入遺伝子発現カセットの連続配列を表す。
【図２】４〜６葉期にグリホサートを施用した場合のＭＯＮ事象８８３０２と比較したＲＴ７３事象の穀物収率を示し、ＲＴ７３をＲＲ１で示す。
【図３】初花にてグリホサートを施用した場合のＭＯＮ事象８８３０２と比較したＲＴ７３事象の穀物収率を示し、ＲＴ７３をＲＲ１で示す。（配列の簡単な説明）
【００１４】
配列番号：１−セイヨウアブラナゲノムＤＮＡと組込み導入遺伝子発現カセットとの間の５’結合配列を表す６０ヌクレオチド配列。このヌクレオチド配列は配列番号：３の７６２〜８２１位（図１の［Ｃ］を参照）および配列番号：６の７６２〜８２１位に対応する。
【００１５】
配列番号：２−組込み発現カセットとセイヨウアブラナゲノムＤＮＡとの間の３’結合配列を表す６０ヌクレオチド配列。このヌクレオチド配列は、配列番号：４の３１３〜３７２位（図１の［Ｄ］を参照）および配列番号：６の５１８９〜５２４８位に対応する。
【００１６】
配列番号：３−挿入された遺伝子組換えＤＮＡの領域を含む事象ＭＯＮ８８３０２のＤＮＡに隣接する５’の配列。配列番号：３のヌクレオチド７６２〜８２１位は配列番号：１のヌクレオチド１〜６０位に対応し、配列番号：３のヌクレオチド７４２〜８４１位は配列番号：７のヌクレオチド１〜１００位に対応し、配列番号：３のヌクレオチド７９２〜９５６位は配列番号：５のヌクレオチド１〜１６５位に対応する。
【００１７】
配列番号：４−挿入された遺伝子組換えＤＮＡの領域を含む事象ＭＯＮ８８３０２のＤＮＡに隣接する３’の配列。配列番号：４のヌクレオチド３１３〜３７２位は配列番号：２のヌクレオチド１〜６０位に対応し、配列番号：４のヌクレオチド２９３〜３９２位は配列番号：８のヌクレオチド１〜１００位に対応し、配列番号：４のヌクレオチド１〜３４２位は配列番号：５のヌクレオチド４０８６〜４４２７位に対応する。
【００１８】
配列番号：５−グリホサート除草剤耐性を付与する組み込まれた遺伝子組換え発現カセットの配列。配列番号５は配列番号：６のヌクレオチド７９２〜５２１８位に対応する。
【００１９】
配列番号：６−挿入された事象ＭＯＮ８８３０２のＤＮＡに隣接する５’配列（配列番号：３）、組み込まれた発現カセットの配列（配列番号：５）および挿入された事象ＭＯＮ８８３０２のＤＮＡに隣接する３’配列（配列番号：４）のコンティグを表すヌクレオチド配列。
【００２０】
配列番号：７−セイヨウアブラナゲノムＤＮＡと組み込まれた遺伝子組換え発現カセットとの間の５’結合配列を表す１００−ヌクレオチド配列。このヌクレオチド配列は、配列番号：３の７４２〜８４１位（図１［Ｃ］を参照）および配列番号：６の７４２〜８４１位に対応する。
【００２１】
配列番号：８−組み込まれた発現カセットとセイヨウアブラナゲノムＤＮＡとの間の３’結合を表す１００−ヌクレオチド配列。このヌクレオチド配列は、配列番号：４の２９３〜３９２位（図１［Ｄ］を参照）および配列番号：６の５１６９〜５２６８位に対応する。
【００２２】
配列番号：９‐事象ＭＯＮ８８３０２の同定に用いるプライマーＳＱ２０９０１。プライマーＳＱ２０９０１は３’導入遺伝子インサートの境界近傍の領域に挿入された発現カセットと相補的である。プライマーＳＱ２０９０１とＳＱ２３７７０（配列番号：１０）の併用により生成されたアンプリコンは、事象ＭＯＮ８８３０２の存在に対して陽性結果である。
【００２３】
配列番号：１０−プライマーＳＱ２３７７０と呼ばれ、事象ＭＯＮ８８３０２に用いられるプライマーの配列。プライマーＳＱ２３７７０は挿入された発現カセットに隣接する３’領域および導入遺伝子ＤＮＡ挿入の境界に相補的である。プライマーＳＱ２０９０１（配列番号：９）とＳＱ２３７７０の併用により生成されたアンプリコンは、事象ＭＯＮ８８３０２の存在に対して陽性結果である。
【００２４】
配列番号：１１−プローブＰＢ１０１６４と呼ばれ事象ＭＯＮ８８３０２の同定に用いるプローブの配列。挿入された発現カセットに隣接する３’領域および導入遺伝子ＤＮＡ挿入の境界に相補的である。このプローブは６ＦＡＭ（商標）−標識合成オリゴヌクレオチドである。６ＦＡＭ（商標）−標識プローブＰＢ１０１６４と組み合わせてプライマーＳＱ２０９０１およびＳＱ２３７７０（配列番号：９〜１０）を用いた増幅反応における蛍光シグナルの放出は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイの事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的である。
【００２５】
配列番号：１２−プライマーＳＱ２１９４８と呼ばれＭＯＮ８８３０２事象接合状態の同定に用いるプライマーの配列。
【００２６】
配列番号：１３−プライマーＳＱ２４６３５と呼ばれセイヨウアブラナ野生型接合状態を同定するのに用いるプライマーの配列。
【００２７】
配列番号：１４−プライマーＳＱ２２１７６と呼ばれＭＯＮ８８３０２事象およびセイヨウアブラナ野生型接合状態を同定するのに用いるプライマーの配列。
【００２８】
配列番号：１５−ＭＯＮ８８３０２事象接合状態アッセイ用のプローブ（ＰＢ４２１３）の配列。
【００２９】
配列番号：１６−セイヨウアブラナ野生型接合状態アッセイ用のプローブ（ＰＢ１０７８７）の配列。
【００３０】
配列番号：１７−プライマーＳＱ２５６３と呼ばれＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで内部対照として用いるプライマーの配列。
【００３１】
配列番号：１８−プライマーＳＱ２５６４と呼ばれＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで内部対照として用いるプライマーの配列。
【００３２】
配列番号：１９−ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで内部対照として用いるＶＩＣ（商標）−標識合成オリゴヌクレオチドプローブ（ＰＢ０７５１）の配列。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供するものである。特記しない限りは、用語は、関連技術分野における当業者により従来の用法に従って理解されるべきである。
【００３４】
本明細書に用いた「含む」なる用語は、「限定されるものではないが、〜を含む」を意味する。
【００３５】
本発明は、遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２を提供する。本明細書で用いる「事象」なる用語は、植物のゲノムの染色体上の特定の場所に遺伝子組換えＤＮＡを挿入した結果として生成されるＤＮＡ分子をいう。事象ＭＯＮ８８３０２とは、配列番号：５として本明細書に記載した配列を有する遺伝子組換えＤＮＡがセイヨウアブラナ属のＡゲノムの結合基（ｌｉｎｋａｇｅ  ｇｒｏｕｐ）Ｎ４の特定の場所に挿入された結果生じるＤＮＡ分子をいう。本発明では事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物および種子も提供される。ＭＯＮ８８３０２を含む種子試料は寄託番号ＰＴＡ−１０９５５で米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されている。ＭＯＮ８８３０２を含む植物はグリホサート系除草剤の施用に対して商業上許容可能な耐性を示す。
【００３６】
その事象を含む植物とは、植物ゲノムの特定の位置に挿入された導入遺伝子を含む元の形質転換体ということができる。その事象を含む植物は、植物ゲノムの特定の位置に挿入された導入遺伝子を含む元の形質転換体の後代ともいえる。かかる後代は、自家受粉によるか、あるいは形質転換体またはその後代と別の植物との間の性的交配により生成し得る。かかる他の植物は、同一または異なる導入遺伝子を含む遺伝子組換え植物および／または非遺伝子組換え植物（例えば、異なる品種からのもの）であり得る。反復親への戻し交配を繰り返した後であっても、形質転換した親からの挿入されたＤＮＡおよびフランキングＤＮＡは、同一のゲノム位置での交配の後代に存在する。
【００３７】
遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２は、セイヨウアブラナ植物のＡゲノムの結合基Ｎ４に遺伝子組換えＤＮＡ（本明細書では配列番号：５として記載）を挿入することによって創製した。セイヨウアブラナは一般にナタネとして知られており、特定の品種をキャノーラと呼ぶこともある。本明細書で用いる用語「キャノーラ」または「キャノーラ植物」とはキャノーラ油（すなわち、２％未満のエルカ酸を含有する特定の品質指定を満たす油）を製造するのに使用できるアブラナ属植物を指し、種々のセイヨウアブラナ、ルタバガ、カブ、カラシナおよびハクサイが挙げられる。セイヨウアブラナはカブ（以前のハクサイ）およびブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）両方のゲノムの交雑および保持から生じる異質４倍体であるため、遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２を含むセイヨウアブラナ植物を育種方法と一緒に用いて、他のアブラナ属のメンバーにＭＯＮ８８３０２事象を導入し得るし、ひいてはグリホサート耐性形質を導入し得る。本発明の方法の実施に有用なアブラナ属のメンバーの例には、限定するものではないが、カラシナ、ルタバガ、ブラッシカ・オレラセア、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ、セイヨウアブラナ、カブおよびハクサイのほか、アブラナ属間で育種を可能にするアブラナ属に属する他のあらゆる植物を含む。
【００３８】
事象ＭＯＮ８８３０２を含むＤＮＡ分子とは、挿入された遺伝子組換えＤＮＡ（配列番号：５として記載）の少なくとも一部およびその挿入されたＤＮＡの直近のフランキングゲノムＤＮＡの少なくとも一部を含むＤＮＡ分子をいう。それ自体、事象ＭＯＮ８８３０２を含むＤＮＡ分子は、遺伝子組換えＤＮＡインサートの少なくとも一部およびその遺伝子組換えＤＮＡが挿入された植物のゲノムの特定の領域の少なくとも一部を表すヌクレオチド配列を有する。周囲の植物ゲノムに関連した事象ＭＯＮ８８３０２において挿入されたＤＮＡの配置は事象ＭＯＮ８８３０２に特異的かつ固有であり、したがって、かかるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的で固有である。そういったＤＮＡ分子の配列の例を本明細書では配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８として記載する。このＤＮＡ分子は、事象８８３０２を含み、植物の後代に伝え得る植物の染色体の不可欠な部分でもある。
【００３９】
事象ＭＯＮ８８３０２は、植物に施用されるグリホサート除草剤に対する耐性を付与する。「グリホサート」はＮ−ホスホノメチル−グリシンおよびその塩をいう。グリホサートは広範囲の植物種に対する活性を有する除草剤である。植物表面に施用された場合、グリホサートは植物の全身に移動する。グリホサートは芳香族アミノ酸の合成のための前駆体を提供するシキミ酸経路をそれが抑制するために植物毒素である。
【００４０】
本明細書に用いた「組換え体」なる用語は、通常天然に見出されず、かつそれ自体がヒト介在によって創製されたＤＮＡおよび／またはタンパク質および／または有機体の形態をいう。かかるヒト介在は、組換えＤＮＡ分子および／または組換え植物を生成し得る。本明細書に用いた「組換えＤＮＡ分子」は、天然には一緒に発生せず、ヒト介在の結果であるＤＮＡ分子の組合せを含むＤＮＡ分子、例えば、互いに異種の少なくとも２つのＤＮＡ分子の組合せを含むＤＮＡ分子および／または人工的に合成され、通常は天然に存在するポリヌクレオチド配列から逸脱するポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子および／または宿主細胞のゲノムＤＮＡおよび宿主細胞のゲノムの関連するフランキングＤＮＡに人工的に組み込まれた導入遺伝子を含むＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子の一例は、セイヨウアブラナゲノムへの導入遺伝子の挿入に起因して、本明細書に記載されたＤＮＡ分子であり、それは最終的には、その有機体中の組換えＲＮＡおよび／または蛋白分子の発現を生じさせ得る。本明細書に用いた「組換え植物」は、通常は天然に存在しない植物であり、ヒト介在の結果であり、導入遺伝子および／またはそのゲノムに組み込まれた異種のＤＮＡ分子を含む。かかるゲノムの改変の結果、遺伝子組換え植物は、関連する野生型植物とは明確に異なる。組換え植物の一例は、事象ＭＯＮ８８３０２を含むものとして本明細書に記載された植物である。
【００４１】
本明細書に用いた「導入遺伝子」なる用語は、宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれたポリヌクレオチド分子をいう。かかる導入遺伝子は、宿主細胞に異種であり得る。「遺伝子組換え植物」なる用語は、かかる導入遺伝子を含む植物をいう。
【００４２】
本明細書に用いた「異種」なる用語は、第２の分子と組み合わせて天然には通常見出されない第１の分子をいう。例えば、分子は、第１の種に由来し、第２の種のゲノムに挿入され得る。かくして、分子は、宿主に異種であり、宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれるであろう。
【００４３】
本明細書に用いた「キメラ」なる用語は、第２のＤＮＡ分子に第１のＤＮＡ分子を融合させることにより生成された単一のＤＮＡ分子をいい、ここに、第１のＤＮＡ分子も第２のＤＮＡ分子も、その配置、すなわち、他方に融合されたもので通常見出されないであろう。かくして、キメラＤＮＡ分子は通常天然に見出されない限りは新しいＤＮＡ分子である。
【００４４】
本発明は、ＤＮＡ分子およびそれらの対応するヌクレオチド配列を提供する。本明細書に用いた用語「ＤＮＡ配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」は、通常は５’（上流）末端から３’（下流）末端に存在するＤＮＡ分子のヌクレオチドの配列をいう。本明細書に用いた命名法は、米国連邦規則集第３７巻第１．８２２条によって必要とされ、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）、付属書２の表１および３の表に記載されたものである。本発明は、遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２に提供される２つのヌクレオチド配列鎖の１つの鎖のみを参照して開示される。したがって、含意および派生によって、当該技術分野において完全な相補体または逆方向の相補的配列といわれる相補的配列も本発明の範囲内にあり、したがって、特許請求された主題の範囲内にあることも意図される。
【００４５】
挿入された遺伝子組換えＤＮＡおよびその挿入された遺伝子組換えＤＮＡのいずれかの末端に隣接するセイヨウアブラナゲノムＤＮＡの実質的セグメントの完全なヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を本明細書では配列番号：６と記載する。このサブセクションは、配列番号：５として記載した挿入された遺伝子組換えＤＮＡである。挿入された遺伝子組換えＤＮＡの５’末端およびその挿入されたＤＮＡの５’末端の一部に隣接するゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を本明細書では配列番号：３として記載する。挿入された遺伝子組換えＤＮＡの３’末端またはその挿入されたＤＮＡの３’末端の一部に隣接するゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を本明細書では配列番号：４として記載する。遺伝子組換えＤＮＡがゲノムＤＮＡに繋がり、かつゲノムＤＮＡと結ばれた場所に亘る領域を本明細書では「結合」という。「結合配列」または「結合領域」とは、挿入された遺伝子組換えＤＮＡおよび隣接したフランキングゲノムＤＮＡに亘るＤＮＡ配列および／または対応するＤＮＡ分子をいう。事象ＭＯＮ８８３０２の結合配列の例を本明細書では配列番号：１、配列番号：２、配列番号：７および配列番号：８と記載する。アブラナ属植物または種子に由来するヌクレオチド分子中のこれら結合配列のうちの１つを同定することで、事象ＭＯＮ８８３０２から得られたものであり、事象ＭＯＮ８８３０２からのＤＮＡの試料中の存在に特徴的であることが確認される。配列番号：１は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの５’末端との間の結合に亘る６０ヌクレオチド配列である。配列番号：７は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの５’末端との間の結合に亘る１００ヌクレオチド配列である。配列番号：２は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの３’末端との間の結合に亘る６０ヌクレオチド配列である。配列番号：８は、ゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの３’末端との間の結合に亘る１００ヌクレオチド配列である。配列番号：１または配列番号：７を含む遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２に由来するＤＮＡのどのようなセグメントも本発明の範囲内にある。配列番号：２または配列番号：８を含む遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２に由来するＤＮＡのどのようなセグメントも本発明の範囲内にある。また、本パラグラフに記載の配列のいずれかに相補的な配列を含むどのようなポリヌクレオチドも本発明の範囲内にある。図１は、５’〜３’に配置された配列番号：６に対し、配列番号：１〜５および配列番号：７〜８の物理的な配置を示す。また、本発明は、配列番号：６の完全長に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ分子を含む核酸分子を提供する。
【００４６】
本発明は、試料中の事象ＭＯＮ８８３０２由来のＤＮＡの存在を確かめるためのプライマーまたはプローブのいずれかとして使用することができる例示的なＤＮＡ分子を提供する。そういったプライマーまたはプローブは、標的核酸配列に特異的であり、それ自体が本明細書に記載の本発明の方法による事象ＭＯＮ８８３０２核酸配列の同定に有用である。
【００４７】
「プライマー」とは、典型的には、熱増幅を含む特定のアニーリングまたはハイブリダイゼーション方法における使用のために設計される高度に精製され単離されたポリヌクレオチドである。プライマー対は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のごとき熱増幅におけるセイヨウアブラナゲノムＤＮＡの試料のごときテンプレートＤＮＡと共に用いて、かかる反応から生成したアンプリコンが、プライマーがテンプレートにハイブリダイズした場合に２つの部位間に位置したテンプレートＤＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列を有する場合にアンプリコンを生成し得る。本明細書に用いた「アンプリコン」は、増幅技術を用いて合成されたＤＮＡの一片または断片（すなわち、増幅反応の産物）である。本発明の１実施形態において、事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンは、セイヨウアブラナゲノム中で天然に見出されない配列を含む。本発明のアンプリコンは、配列番号：１または配列番号：２またはその相補体の中の少なくとも約４０の連続ヌクレオチドを含む。プライマーは、典型的には、相補的な標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成するように設計され、プライマーの存在は、テンプレートとして標的ＤＮＡ鎖を用いるプライマーの伸長（すなわち、延長するポリヌクレオチド分子へのさらなるヌクレオチドの重合）を始めるポリメラーゼによる認識ポイントである。本発明に用いたプライマー対は、典型的には、熱増幅反応または他の従来の核酸増幅方法において、プライマー対の個々のメンバーによって結合するための標的とされた位置間にポリヌクレオチドセグメントを直線的に増幅する目的で、２本鎖のヌクレオチドセグメントの反対の鎖に結合する２つのプライマーの使用をいうように意図される。プライマーとして有用な典型的なＤＮＡ分子は、配列番号：９〜１０として提供される。配列番号：９および配列番号：１０として提供されるプライマー対は、第１のＤＮＡ分子、および第１のＤＮＡ分子とは異なる第２のＤＮＡ分子として提供され得、両分子はそれぞれ、セイヨウアブラナ事象ＭＯＮ８８３０２に由来したテンプレートＤＮＡと熱増幅反応に一緒に用いて、遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２の３’部分に特異的かつ固有のアンプリコンが生成されるときにＤＮＡプライマーとして機能するように、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６あるいはその相補対のいずれかの中の十分な長さの連続したヌクレオチドである。この例示的なプライマー対を用いて事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的な３’結合領域を増幅し得る。また、本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的な５’結合領域を増幅するのに使用し得るプライマー対を提供する。かかるプライマーは、第１のＤＮＡ分子およびこの第１のＤＮＡ分子とは異なる第２のＤＮＡ分子を含み得る、その両方は、事象ＭＯＮ８８３０２に由来したテンプレートＤＮＡと熱増幅反応に一緒に用いて、遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２の５’部分に特異的かつ固有のアンプリコンが生成されるときにＤＮＡプライマーとして機能するように、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：６あるいはその相補対の中の十分な長さの連続したヌクレオチドである。
【００４８】
「プローブ」は、標的核酸の鎖に相補的である単離された核酸である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、ポリアミドおよび標的ＤＮＡ配列に特異的に結合する他のプローブ物質も含み、かかる結合の検出は、特定の試料中のその標的ＤＮＡ配列の存在を分析、識別、決定または確認するのに有用であることができる。プローブは、従来の検出可能な標識またはリポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素に結合し得る。本発明の１つの具体例において、事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なプローブは、セイヨウアブラナゲノムにおいて天然に見出されない配列を含む。プローブとして有用な典型的なＤＮＡ分子は配列番号：１１として提供される。
【００４９】
本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列同一性を有することができるが、標的配列に優先的にハイブリダイズする能力を保持する標的配列とは異なるプライマーおよびプローブも、従来方法によって設計され得る。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するために、使用した特定の溶媒および塩濃度下で安定な２本鎖構造を形成できるために、配列における十分に相補的であることだけを必要とする。いずれの通常の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いても、試料中の事象ＭＯＮ８８３０２からの遺伝子組換えＤＮＡの存在を同定できる。プローブおよびプライマーは、長さが一般的に少なくとも約１１以上のヌクレオチド、少なくとも約１８以上のヌクレオチド、少なくとも約２４以上のヌクレオチドまたは少なくとも約３０以上のヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする。通常のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）およびＨａｙｍｅｓらのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（１９８５年）により記載されている。本明細書に用いた２つの核酸分子は、その２つの分子が逆平行の２本鎖核酸構造を形成できるならば、相互に特異的にハイブリダイズできると言われる。核酸分子は、それらが完全な相補性を示すならば、もう一つの核酸分子の「相補体」であると言われる。本明細書に用いた分子は、一方の分子のすべてのヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的である場合に、「完全な相補性」を示すと言われる。２つの分子が、それらが少なくとも通常の「低ストリンジェンシー」条件下でそれらが相互にアニーリングされたままとするのを可能とするように十分な安定性で相互にハイブリダイズできるならば、「最小に相補的」であると言われる。同様に、分子は、それらが通常の「高ストリンジェンシー」条件下でそれらが相互にアニーリングされたままとするのを可能とするように十分な安定性で相互にハイブリダイズできるならば、「相補的」であると言われる。したがって、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が２本鎖構造を形成する分子の能力を完全に除外しない限りは、許容可能である。
【００５０】
本明細書に用いた「単離された」なる用語は、そのネイティブまたは天然状態においてそれに通常関連する他の分子から少なくとも部分的に分子を分離することをいう。１つの実施形態において、「単離された」なる用語は、そのネイティブまたは天然状態においてＤＮＡ分子に通常隣接する核酸から少なくとも部分的に分離されたＤＮＡ分子をいう。かくして、例えば、組換え技術の結果としての通常関連しない調節またはコード配列に融合したＤＮＡ分子は、本明細書において単離されたと考えられる。かかる分子は、宿主細胞の染色体に組み込まれたか、または他のＤＮＡ分子を含む核酸溶液中に存在する場合でさえ、単離されたと考えられる。
【００５１】
当業者によく知られた多数の方法を用いて、本発明に開示されるＤＮＡ分子またはその断片を単離および操作できる。例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術を用いて、特定の出発ＤＮＡ分子を増幅でき、および／または元来の分子の変異体を生成できる。また、ＤＮＡ分子またはその断片は、化学的手段によって直接的に断片を合成することによってのごとく、他の技術によって得ることができ、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーの使用により一般的に実行される。
【００５２】
したがって、本明細書に提供されるＤＮＡ分子および対応するヌクレオチド配列は、特に、事象ＭＯＮ８８３０２を同定する、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物品種または雑種を選択する、試料中の事象ＭＯＮ８８３０２に由来したＤＮＡの存在を検出する、および事象ＭＯＮ８８３０２または事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物および植物器官の存在および／または不存在につき試料をモニタリングするのに有用である。
【００５３】
本発明は、植物、後代、種子、植物細胞、植物器官（例えば、花粉、胚珠、鞘、花、根または茎組織、繊維および葉）および商品を提供する。これらの植物、後代、種子、植物細胞、植物器官および商品は、本発明の検出可能な量のポリヌクレオチド、すなわち、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：７または配列番号：８として供される配列の少なくとも１つを有するポリヌクレオチドを含む。また、本発明の植物、後代、種子、植物細胞および植物器官は、１以上のさらなる導入遺伝子を含み得る。かかる導入遺伝子は、限定されるものではないが、耐虫性の増加、水使用効率の増加、収率効率の増加、耐乾燥性の増加、種子品質の向上、病害耐性、栄養価の改善および／または除草剤耐性の増加を含めた望ましい形質を与えるタンパク質をコードするいずれかのヌクレオチド配列またはＲＮＡ分子であり得、ここに、その望ましい形質は、かかるさらなる導入遺伝子を欠く同等な植物に関して測定される
【００５４】
本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２を含む遺伝子組換え植物に由来した植物、後代、種子、植物細胞、ならびに花粉、胚珠、鞘、花、根または茎組織、および葉のごとき植物器官を提供する。事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子の代表的試料は、本発明を可能にする目的でブダペスト条約により寄託されている。その寄託を受けるために選択された貯蔵所は、郵便番号２０１１０、米国バージニア州マナッサス  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄの住所を有する米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）である。そのＡＴＣＣ貯蔵所は、事象ＭＯＮ８８３０２種子に受入番号ＰＴＡ−１０９５５を割り当てた。
【００５５】
本発明は、そのゲノム中に存在する配列番号：１、配列番号：２、配列番号：７または配列番号：８を有するＤＮＡ分子を含む微生物を提供する。かかる微生物の例は、遺伝子組換え植物細胞である。本発明の植物細胞のごとき微生物は、限定されるものではないが、以下を含めて多数の産業上の適用に有用である：（ｉ）科学研究または産業調査用の研究ツールとしての使用；（ｉｉ）引き続いての科学的調査または工業製品として用い得る内因性または組換え炭水化物、脂質、核酸もしくは蛋白質製品を生成する小分子のための培養での使用；および（ｉｉｉ）農業の研究または生成に次いで用い得る遺伝子組換え植物または植物組織培養物を生成する現代の植物組織培養技術での使用を含めて多数の産業適用に有用である。遺伝子組換え植物細胞のごとき微生物の生成および使用は、現代の微生物学技術およびヒト介在を利用して、人工のユニークな微生物を生成する。このプロセスにおいて、組換えＤＮＡを植物細胞のゲノムに挿入して、自然発生の植物細胞から分離および特有である遺伝子組換え植物細胞を創製する。次いで、この遺伝子組換え植物細胞は、現代の微生物学技術を用いて細菌および酵母細胞のように培養することができ、未分化の単細胞状態で存在し得る。新しい植物細胞の遺伝子組成および表現型は、細胞のゲノムへの異種ＤＮＡの組み込みによって創製された技術的効果である。本発明のもう一つの態様は、本発明の微生物の使用方法である。遺伝子組換え植物細胞のごとき本発明の微生物の使用方法は、（ｉ）細胞のゲノムへ組換えＤＮＡを組み込み、次いで、細胞を用いて、同じ異種ＤＮＡを所有するさらなる細胞を得ることによる遺伝子組換え細胞を生成する方法；（ｉｉ）現代の微生物学技術を用いて、組換えＤＮＡを含む細胞を培養する方法；（ｉｉｉ）培養細胞から内因性もしくは組換え炭水化物、脂質、核酸または蛋白質製品を生成し精製する方法；および（ｉｖ）遺伝子組換え植物または遺伝子組換え植物組織培養物を生成するための遺伝子組換え植物細胞での現代の植物組織培養技術を使用する方法を含む。
【００５６】
本明細書に用いた「後代」は、いずれの植物、種子、植物細胞および／または祖先植物に由来した事象ＤＮＡおよび／または配列番号：１、配列番号：２、配列番号：７または配列番号：８として提供される少なくとも１つの配列を有するポリヌクレオチドを含む再生可能な植物器官を含む。植物、後代および種子は、導入遺伝子にホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。後代は事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物により生成された種子、および／または事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物からの花粉で受精された植物によって生成された種子から生育し得る。
【００５７】
後代植物は、自家受粉（「自配」としても知られている）して、植物、すなわち、導入遺伝子にホモ接合性の植物の真の生育系を生成する。適切な後代の自家受粉は、双方の追加された外来性遺伝子にホモ接合性である植物を生成できる。
【００５８】
別法として、後代植物は、他家交配、例えば、もう一つの無関係な植物で生育させて、変種または雑種の種子または植物を生成し得る。他の無関係な植物は、遺伝子組換えまたは非遺伝子組換えであり得る。かくして、本発明の変種または雑種種子または植物は、ＭＯＮ８８３０２の特異的かつ固有のＤＮＡを欠く第１の親と、ＭＯＮ８８３０２を含む第２の親とを交配させることにより誘導する結果、ＭＯＮ８８３０２の特異的かつ固有のＤＮＡを含む雑種を生じ得る。各親は、その交配または生育が、本発明の植物または種子、すなわち、ＭＯＮ８８３０２および／または配列番号：１および配列番号：２の特異的かつ固有のＤＮＡを含有する少なくとも１つの対立遺伝子を有する種子において生じる限りは、雑種または生来／変種であることができる。かくして、２つの異なる遺伝子組換え植物を交配させて、２つの独立して分離するさらなる外来性遺伝子を含む雑種子孫を生成し得る。例えば、事象ＭＯＮ８８３０２を含むグリホサート耐性植物を他の遺伝子組換えイネ植物と交配させて、双方の遺伝子組換え親の特性を有する植物を生成できる。この１つの例は、１以上のさらなる形質を有するアブラナ属植物（カラシナまたはキャノーラなど）との事象ＭＯＮ８８３０２を含むグリホサート耐性アブラナ属植物の交配であり、その結果、グリホサートに耐性であり、１以上のさらなる形質を有する後代の植物または種子を生じるであろう。所望の遺伝子組換え形質を有するアブラナ属植物は当該技術では公知であり、限定するものではないが、除草剤耐性を有する形質を有するアブラナ属植物（例えば、事象ＲＴ２００、事象ＲＴ７３、事象ＭＳ１、事象ＲＦ１、事象ＲＦ２、Ｔｏｐａｓ  １９／２、ＭＳ８、ＲＦ３、Ｔ４５）、ハイブリッド育種系または繁殖（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）系（例えば、事象ＭＳ１、事象ＭＳ８、事象ＲＦ１、事象ＲＦ２、事象Ｒｆ３）、昆虫防除、増強された収率、病害耐性（例えば、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属耐性、根朽ち病耐性、根こぶ病耐性、立ち枯れ病耐性）、改変または増強された油組成（例えば、事象ｐＣＧＮ３８２８−２１２／８６−１８、事象ｐＣＧＮ３８２８−２１２／２３）、例えば公的に利用可能な米国農務省（ＵＳＤＡ）動植物衛生検査部（ＡＰＨＩＳ）のＰｅｔｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｓｔａｔｕｓのリストに記載されているものすべてが含まれる。所望の非遺伝子組換え形質を有するアブラナ属植物が当該技術では公知であり、限定するものではないが、除草剤耐性（例えば、イミダゾリン耐性の１４７１、イミダゾリン耐性のＣＬＢ−１、トリアジン耐性のＴＴＣ）、病原体性、昆虫防除、増強された収率、病害耐性（例えば、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属耐性、根朽ち病耐性、根こぶ病耐性、立ち枯れ病耐性）、改変または増強された油組成（例えば、低リノレン酸および／または高オレイン酸）、改変された化学的および／または栄養組成、改変されたタンパク質組成、冷温耐性、渇水耐性、改変された成熟期および／または開花期およびその他の改変または改良された農学的性質といった形質が含まれる。
【００５９】
また、親植物への戻し交配および非遺伝子組換え植物との他家交配は、栄養繁殖であると考えられる。異なる形質および作物に一般的に用いる他の育種方法の記載は、いくつかの引用文献の１つ、例えば、Ｆｅｈｒ，  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．  ｅｄ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，  ウィスコンシン州マディソン所在  （１９８７）に見出すことができる
【００６０】
本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物に由来する植物器官を提供する。本明細書に用いた「植物器官」とは、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物に由来した物質を含む植物のいずれかの器官をいう。植物器官は、限定されるものではないが、花粉、胚珠、鞘、花、根もしくは茎組織、繊維および葉を含む。植物器官は、生存、非生存、再生可能および／または再生不能であり得る。
【００６１】
本発明は、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物に由来する商品を提供する。本明細書に用いた「商品」とは、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物、種子、植物細胞または植物器官に由来した物質を含むいずれかの組成物または生成物をいう。商品は消費者に販売でき、生存または非生存であり得る。非生存商品は、限定されるものではないが、非生存種子および粒；加工された種子、種子部分および植物器官；脱水された植物組織、冷凍植物組織および加工された植物組織；陸生および／または水生動物消費用の動物飼料、ヒト消費用の油、食事、小麦粉、フレーク、糠、繊維および他のあらゆる食物のために加工された種子および植物器官；バイオマスおよび燃料生成物を含む。生存商品は、限定されるものではないが、種子および植物細胞を含む。事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物を用いて、アブラナから典型的に獲得されるいずれの商品も製造できる。事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物から由来するいずれのかかる商品も、事象ＭＯＮ８８３０２に対応する少なくとも検出可能な量の特有でユニークなＤＮＡを含むこともでき、具体的には、配列番号：１および配列番号：２の中の少なくとも４０の連続ヌクレオチドを含有する検出可能な量のポリヌクレオチドを含み得る。本明細書に開示された検出方法を含めて、ポリヌクレオチド分子についての検出のいずれの標準的な分析法も用い得る。商品は、商品中にいずれかの検出可能な量の配列番号：１または配列番号：２が存在するならば、本発明の範囲内にある。
【００６２】
したがって、本発明の植物、後代、種子、植物細胞、植物器官（例えば、花粉、胚珠、鞘、花、根または茎組織および葉）および商品は、特に、農業の目的のための事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子および／または植物器官を生成する目的で植物を生育する、植物育種および研究目的のための事象ＭＯＮ８８３０２を含む後代を生成する、産業および研究適用についての微生物学技術での使用、および消費者への販売に有用である。
【００６３】
本発明は、圃場における雑草の防除方法を提供する。事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物を圃場に植え付け、ＭＯＮ８８３０２を含む植物を損傷させることなく、圃場の雑草防除のために少なくとも１つの除草有効量のグリホサートを圃場に散布することから成る雑草防除法を提供する。また、少なくとも１つの除草有効量のグリホサートを雑草防除のために圃場に散布し、次いで、事象ＭＯＮ８８３０２を含む作物をその圃場に植え付けることから成る圃場の雑草防除のための別の方法を提供される。本発明の方法は単独で用いても併用してもよい。グリホサートの施用は、植え付け前（すなわち、事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子の播種前の任意の時点で、限定するものではないが、播種の約１４日前〜播種の約１日前あるいは事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子の播種と同時を含む）、出芽前（すなわち、事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子を播種後および事象ＭＯＮ８８３０２含む植物が出芽する前の任意の時点）および／または出芽後（すなわち、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物が出芽した後の任意の時点）であってよい。本発明の方法を実施する際、グリホサートの複数の施用、例えば、２回施用（例えば、播種前施用および出芽後施用、または出芽前施用および出芽後施用）または３回の施用（例えば、播種前施用、出芽前施用および出芽後施用）を栽培期に亘り用い得る。かくして、栽培期に亘って施用されるグリホサートの合計回数は、１以上の期内での施用を含み得、複数回の期内の施用の合計を一緒に加えてグリホサートの全施用となる。本明細書で用いる場合、雑草の生長をコントロールするのに有効なグリホサートの量（すなわち、圃場において雑草の成長をコントロールするために作物内での施用として圃場内で使用するグリホサートの除草有効量）は、栽培期全体を通じて１エーカー当たり約０．１２５ポンドのグリホサート〜１エーカー当たり約６．４ポンドのグリホサートの範囲から構成されるべきである。例えば、作物内での施用として圃場で使用するグリホサートの除草有効量は、栽培期全体をと通じて１エーカー当たり少なくとも約０．１２５、約０．５、約１．０、約１．６、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０または約６．４ポンドであり得る。
【００６４】
事象ＭＯＮ８８３０２を含む除草剤耐性の植物の生成方法が提供される。これらの方法に用いた遺伝子組換え植物は、導入遺伝子にホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。これらの方法によって生成された後代植物は、変種または雑種植物であり得；植物によって生成された種子、および／または事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物からの花粉で受精された植物によって生成された事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子から生育でき；および導入遺伝子にホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。引き続いて、後代植物を自家受粉して、真の生育系の植物、すなわち、導入遺伝子にホモ接合性の植物を生成するか、あるいは、他家交配、例えば、もう一つの無関係の植物と生育して、変種もしくは雑種種子または植物を生成し得る。
【００６５】
グリホサート除草剤の施用に耐性である植物は、配列番号：１および配列番号：２の配列を含むポリヌクレオチド分子を含む事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物ともう一つの植物とを性的交配し、それにより、種子を生成し、次いで、これを後代植物に生育することにより生成し得る。次いで、これらの後代植物はグリホサート除草剤で処理して、グリホサート除草剤に耐性である後代植物を選択し得る。別法として、これらの後代植物を分析法を用いて分析して、事象ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡを含む後代植物を選択し得る。交配に用いた他の植物は、グリホサート除草剤に耐性であっても、耐性でなくともよく、遺伝子組換えであってもなくてもよい。生成された後代植物および／または種子は、変種または雑種種子であり得る。本方法の実施において、１つの植物ともう一つの植物とを性的交配する、すなわち、他家交配する工程は、ヒト介在、例えば、ヒトの手により、１つの植物の花粉を集めて、この花粉と第２の植物の花柱または柱頭とを接触させる；ヒトの手および／またはヒトの行為により、天然の自家受粉を防止し、他家交配が、受精が生じるように発生するにちがいないように（例えば、手作業による介入または化学的ガメトサイドの適用により）植物の雄しべまたは葯を除去、破壊またはカバーする；「指令された受粉」についての位置における受粉用昆虫のヒト配置によって（例えば、果樹園または圃場にミツバチの巣を配置することによって、または受粉用昆虫を含む植物をかごに入れることによって）；ヒトにより、花の器官を咲かせるかまたは除去して、花柱または柱頭上で外来性の花粉の配置または接触を可能とする；植物の選択的な配置（例えば、受粉近傍において意図的に植物を植える）によって；および／または開花を誘発するまたは（花粉用の柱頭の）感受性を促進する化学薬品の適用によって達成または促進し得る。
【００６６】
グリホサート除草剤の施用に耐性である植物は、配列番号：１および配列番号：２の配列を含むポリヌクレオチド分子を含む事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物を自家受粉し、それにより、種子を生成し、次いで、後代植物に生育することによって生成され得る。次いで、これらの後代植物をグリホサート除草剤で処理して、グリホサート除草剤に耐性である後代植物を選択し得る。別法として、これらの後代植物は、分析方法を用いて分析して、事象ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡを含む後代植物を選択し得る。この方法を実施することにおいて、ある植物とそれ自体とを性的交配する、すなわち、自家受粉または自配する工程は、ヒト介在、例えば、ヒトの手により、植物の花粉を集めて、この花粉と同一の植物の花柱または柱頭とを接触させ、次いで、所望により、植物のさらなる受精を防止する；ヒトの手および／または行為により、天然の自家受粉を防止し、他家交配が、受精が生じるように発生するにちがいないように（例えば、雄穂除去、または化学的ガメトサイドの適用による）他の付近の植物の雄しべまたは葯を除去、破壊またはカバーする；「指令された受粉」についての位置における受粉用昆虫のヒト配置によって（例えば、受粉用昆虫を含む植物のみをかごに入れることによって）；花またはその器官のヒト操作により、自家受粉を可能する；植物の選択的配置により（例えば、受粉近傍を超えて植物を意図的に植える）；および／または開花を誘発するまたは（花粉用の柱頭の）感受性を促進する化学薬品の適用によって達成または促進し得る。
【００６７】
これらの方法によって包含され、これらの方法を用いて生成された後代植物および種子は他の植物とは異なるであろう。それは、例えば、後代植物および種子は、組換えであって、それ自体がヒト介在によって作成され；グリホサート除草剤耐性であり；本発明の導入遺伝子ＤＮＡよりなる少なくとも１つの対立遺伝子を含み；および／または配列番号：１および配列番号：２よりなる群から選択される検出可能な量のポリヌクレオチド配列を含むためである。種子は、個々の後代植物から選択でき、その種子が配列番号：１および配列番号：２を含む限りは、それは本発明の範囲内にあるであろう。
【００６８】
本発明を実施するにおいて、２つの異なる遺伝子組換え植物を交配して、２つの独立し分離する異種遺伝子を含む雑種子孫を生成できる。適切な後代の自家受粉は、双方の遺伝子にホモ接合性である植物を生成できる。また、親植物への戻し交配および非遺伝子組換え植物との他家交配は、栄養繁殖であると考えられる。異なる形質および作物に一般的に用いる他の方法の記載は、いくつかの引用文献の１つ、例えば、Ｆｅｈｒ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．  ｅｄ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，ウィスコンシン州マディソン所在（１９８７）に見出すことができる。
【００６９】
また、本明細書に開示された方法に用いる植物および種子は、１以上のさらなる導入遺伝子を含み得る。かかる導入遺伝子は、限定されるものではないが、耐虫性の増加、水使用効率の増加、収率効率の増加、耐乾燥性の増加、種子品質の増加、栄養価の改善、および／または除草剤耐性の増加を含めた望ましい形質を与えるタンパク質をコードするいずれかのヌクレオチド配列またはＲＮＡ分子であり得、ここにおいて、望ましい形質は、かかるさらなる導入遺伝子を欠く植物に関して測定される。
【００７０】
したがって、本発明の方法は、特に、農業目的または研究目的のために事象ＭＯＮ８８３０２を含む種子および／または植物器官を生成する目的で植物を生育しつつ、圃場における雑草を防除し、植物生育または研究目的のため事象ＭＯＮ８８３０２を含む後代を選択し、次いで、事象ＭＯＮ８８３０２を含む後代植物および種子を生成するのに有用である。
【００７１】
本発明の植物、後代、種子、植物細胞、植物器官（例えば、花粉、胚珠、鞘、花、根または茎組織、および葉）および商品は、ＤＮＡ組成物、遺伝子発現および／またはタンパク質発現につき評価し得る。かかる評価は、ＰＣＲ、ノーザンブロット、サザン分析、ウエスタンブロット、免疫沈降法およびＥＬＩＳＡのごとき標準的方法、あるいは本明細書において提供された検出方法および／または検出キットを用いることにより行い得る。
【００７２】
試料中の事象ＭＯＮ８８３０２に特異的な物質の存在の検出方法が提供される。１つの方法は、事象ＭＯＮ８８３０２を含む細胞、組織または植物に特異的でかつそれらに由来するＤＮＡの存在の検出よりなる。方法は、熱増幅に適切な条件に付される際に事象ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡからアンプリコン、特に、配列番号：１もしくは配列番号：２のいずれかの中の少なくとも４０の連続ヌクレオチドまたはその相補体を含むアンプリコンを生成できるプライマー対と接触するテンプレートＤＮＡ試料を提供する。テンプレートＤＮＡ分子が配列番号：１および配列番号：２に記載された特有でユニークなヌクレオチド配列を組み込む限りは、アンプリコンは、事象ＭＯＮ８８３０２に由来したテンプレートＤＮＡ分子から生成される。アンプリコンは、アンプリコンの生成における使用につき選択されたポリメラーゼに依存して、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。方法は、いずれかのかかる熱増幅反応において生成されたアンプリコン分子の検出、およびアンプリコン配列内で配列番号：１もしくは配列番号：２に対応するヌクレオチドまたはその相補体の存在を確認することを提供する。アンプリコンにおける配列番号：１もしくは配列番号：２に対応するヌクレオチドまたはその相補体の検出は、事象ＭＯＮ８８３０２に特異的なＤＮＡ、かくして試料中に事象ＭＯＮ８８３０２を含む生物学的物質の存在につき決定的および／または特徴的である。
【００７３】
もう一つの方法は、植物または植物組織に由来した物質よりなる試料中で配列番号：３および配列番号：４に対応するＤＮＡ分子の存在を検出するために提供される。その方法は、（ｉ）植物からまたは異なる植物の群からのＤＮＡ試料を抽出し、（ｉｉ）ＤＮＡ試料と、配列番号：１または配列番号：２のいずれかの中の少なくとも４０の連続ヌクレオチドを示すＤＮＡプローブ分子とを接触させ、（ｉｉｉ）プローブおよびＤＮＡ試料が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にし、次いで、（ｉｖ）プローブおよび標的ＤＮＡ試料間のハイブリダイゼーション事象を検出することよりなる。ハイブリッド組成物の検出は、ＤＮＡ試料中で場合によっては、配列番号：３または配列番号：４の存在に特徴的である。ハイブリダイゼーションの不存在は、別法として試料中の遺伝子組換え事象の不存在に特徴的である。あるいは、特定の植物が、配列番号：１もしくは配列番号：２に対応する配列のいずれかまたは双方、あるいはその相補体を含むことを決定することは、植物が事象ＭＯＮ８８３０２に対応する少なくとも１つの対立遺伝子を含むことに決定的である
【００７４】
かくして、核酸プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡハイブリダイゼーションのごときいずれかのよく知られた核酸検出方法により、本発明の核酸分子の存在を検出することは可能である。事象に特異的なＰＣＲアッセイは、例えば、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒｓら（Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ５３：  ３０４１−３０５２，  ２００５）により言及され、遺伝子組換えトウモロコシ系Ｂｔ１１、Ｂｔ１７６およびＧＡ２１、および遺伝子組換え事象ＲＴ７３についての事象に特異的な追跡システムが示されている。この研究において、事象に特異的なプライマーおよびプローブは、各事象についてのゲノム／導入遺伝子結合の配列に基づいて設計された。また、遺伝子組換え植物事象に特異的なＤＮＡ検出方法は、米国特許第６，８９３，８２６号；第６，８２５，４００号；第６，７４０，４８８号；第６，７３３，９７４号；第６，６８９，８８０号；第６，９００，０１４号および第６，８１８，８０７号に記載されている。
【００７５】
ＤＮＡ検出キットが提供される。キットの１タイプは、試料中の遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２に由来したＤＮＡの存在を検出するのに特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能する十分な長さの配列番号：３、配列番号：５または配列番号：６の連続ヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。このキットで検出されるＤＮＡ分子は、配列番号：１の中の少なくとも４０の連続ヌクレオチドを含む。別法として、このキットは、試料中の遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２に由来したＤＮＡの存在を検出するのに特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能する配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６の中の十分な長さの連続ヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。このキットで検出されるＤＮＡ分子は、配列番号：２の中の少なくとも４０の連続ヌクレオチドを含む。
【００７６】
代替キットは、標的ＤＮＡ試料が前記のごときプライマー対と接触し、次いで、配列番号：１または配列番号：２の中の少なくとも４０の連続ヌクレオチドまたはその相補体を含むアンプリコンを生成するのに十分な核酸増幅反応を行う方法を使用する。アンプリコンの検出、およびそのアンプリコンの配列内の配列番号：１または配列番号：２の中の４０以上の連続ヌクレオチドまたはその相補体の存在の決定は、ＤＮＡ試料中の事象ＭＯＮ８８３０２に特異的なＤＮＡの存在に決定的であるか、別法として、その存在に特徴的である。
【００７７】
試料中の事象ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡに特有でユニークであるＤＮＡの存在または不存在さえを決定、検出または分析するのに有用であるＤＮＡプローブとして用いるのに十分なＤＮＡ分子が、提供される。ＤＮＡ分子は、配列番号：１の中の少なくとも４０の連続ヌクレオチドもしくはその相補体、または配列番号：２の中の少なくとも４０の連続ヌクレオチドもしくはその相補体を含む。
【００７８】
核酸増幅は、熱増幅方法を含めた当該技術分野において知られた種々の核酸増幅方法のいずれによっても達成できる。事象ＭＯＮ８８３０２からの異種のＤＮＡ挿入物の配列、結合配列またはフランキング配列（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０９５５として寄託された事象ＭＯＮ８８３０２を含む代表的な種子試料を含む）は、本明細書に提供された配列に由来するプライマーを用いて、その事象からのかかる配列を増幅し、次いで、アンプリコンまたはクローン化されたＤＮＡの標準的なＤＮＡ配列決定によって確認（必要ならば修正）できる。
【００７９】
これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の技術によって検出し得る。隣接するフランキングゲノムＤＮＡ配列および挿入されたＤＮＡ配列の双方をオーバーラップさせるＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される場合、かかる１つの方法は、遺伝ビット分析（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２２：４１６７−４１７５，１９９４）である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル中で固定化される。（挿入配列中の１つのプライマーおよび隣接するフランキングゲノム配列中の１つのプライマーを用いて）注目する領域の熱増幅後に、１本鎖のアンプリコンを固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、期待された次の塩基に特異的なＤＮＡポリメラーゼおよび標識されたｄｄＮＴＰｓを用いて、一塩基伸長反応用のテンプレートとして機能させることができる。読取りは、蛍光性またはＥＬＩＳＡベースであり得る。蛍光性または他のシグナルの検出は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００８０】
もう一つの方法は、Ｗｉｎｇｅ（Ｉｎｎｏｖ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｔｅｃｈ．  ００：１８−２４，  ２０００）によって記載されたピロシーケンス（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術である。この方法において、隣接するゲノムＤＮＡおよび挿入物ＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるオリゴヌクレオチドが設計される。そのオリゴヌクレオチドは、注目する領域からの１本鎖のアンプリコンにハイブリダイズされ（挿入された配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列の１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルファートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ｄｄＮＴＰは個々に加えられ、その組み込みの結果、光シグナルが測定される。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一または多重の塩基伸長により導入遺伝子挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００８１】
Ｃｈｅｎら（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ９：４９２−４９８，  １９９９）によって記載された蛍光偏光法は、アンプリコンを検出するために用いることができる方法である。この方法を用いて、ゲノムのフランキングおよび挿入されたＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドは注目する領域からの１本鎖のアンプリコンにハイブリダイズされ（挿入ＤＮＡにおける１つのプライマーおよびフランキングゲノムＤＮＡ配列における１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰの組み込みを生じる。組み込みは、蛍光測定器を用いて偏光の変化として測定できる。偏光の変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による導入遺伝子挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００８２】
また、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用い、製造者により提供された指示を用いてＤＮＡ配列の存在を検出および／または定量し得る。略言すると、ゲノムフランキングおよび挿入物ＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよび増幅プライマー（挿入物ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つのプライマー）が熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環する。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、蛍光性部分がＦＲＥＴプローブ上の消光部分から離れて切断および遊離する。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによりフランキング／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
【００８３】
分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）は、Ｔｙａｎｇｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，  １９９６）に記載された配列検出に用いるために記載されている。略言すると、フランキングゲノムおよび挿入物ＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブのユニークな構造の結果、それは蛍光性および消光部分を密接な近接に保つ二次構造を含む。ＦＲＥＴプローブおよび増幅プライマー（挿入物ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つのプライマー）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環する。増幅の成功に続いて、標的配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、蛍光性および消光部分のプローブ二次構造および空間的分離を除去し、蛍光シグナルを生成する。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションにより、フランキング／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
【００８４】
マイクロフルイディクス（米国特許公開第２００６０６８３９８号、米国特許第６，５４４，７３４号参照）；特異的なＤＮＡ分子を検出および定量するために用いる光学色素（例えば、ＷＯ／０５０１７１８１号）；ＤＮＡ分子の検出用の電子センサーを含む検出のためのナノチューブデバイス（例えば、ＷＯ／０６０２４０２３号）；または次いで検出され得る特異的ＤＮＡ分子を結合するナノビーズなど、他に記載されている方法は、ＤＮＡ試料を分離および増幅する方法およびデバイスを提供する。
【００８５】
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示された組成物、およびＤＮＡ検出の当該技術分野では周知の方法を用いて開発できる。キットは、試料中の事象ＭＯＮ８８３０２の同定に有用であり、適切な事象ＤＮＡを含む植物を育種する方法に適用できる。キットは、配列番号：１〜６もしくはそのフラグメントまたはその相補体に同様または相補的であるＤＮＡプライマーまたはプローブを含み得る。
【００８６】
したがって、本発明のキットおよび検出方法は、特に、事象ＭＯＮ８８３０２の同定、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物品種または雑種の選択、試料中の事象ＭＯＮ８８３０２に由来したＤＮＡの存在の検出および事象ＭＯＮ８８３０２または事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物、植物器官または商品の存在および／または不存在について試料をモニタリングするのに有用である。
【００８７】
以下の実施例は、本発明のある種の好ましい具体例の例を示すために含める。以下の実施例において開示された技術が、本発明者が本発明の実施に良好な機能を見出したアプローチを表し、かくして、その実施についての好ましい様式の例を含むと考えることができることは、当業者により理解されるであろう。しかしながら、本開示に照らして、当業者ならば、多数の変更を開示された特定の具体例になすことができ、依然として、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似する結果を得ることができることを理解するであろう。
実施例
【００８８】
実施例１：セイヨウアブラナの形質転換およびＭＯＮ８８３０２事象の選択
本実施例では、遺伝子組換え事象をどのように創製し、事象ＭＯＮ８８３０２をどのように選択したかを説明する。遺伝子組換え事象ＭＯＮ８８３０２は、図１に示した遺伝子組換えＤＮＡ（配列を配列番号：５で記載）でセイヨウアブラナ細胞をアグロバクテリウム媒介形質転換によって生成した。配列番号：５として記載した導入遺伝子インサートは、エンドウマメ遺伝子（Ｔ−ＲｂｃＳ２，Ｅ９）由来の３’ＵＴＲ  ＤＮＡ分子に作動的に結合し、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ（ＣＰ４−ｓｙｎ）をコードするＤＮＡ分子に作動的に結合し、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ２、シロイヌナズナＥＰＳＰＳ）をコードするＤＮＡ分子に作動的に結合し、シロイヌナズナＴｓｆ１遺伝子（Ｉ−Ａｔ．Ｔｓｆ１）由来のイントロン配列に作動的に結合し、シロイヌナズナＴｓｆ１遺伝子（Ｌ−Ａｔ．Ｔｓｆ１）由来のリーダー分子に作動的に結合したシロイヌナズナＴｓｆ１遺伝子（Ｐ−Ａｔ．Ｔｓｆ１）由来のプロモーター分子に作動的に結合したマノハグサモザイクウイルスからの３５Ｓエンハンサー（Ｅ−ＦＭＶ．３５Ｓ）に由来するエンハンサー分子からなるキメラプロモーターを含む発現カセットである。
【００８９】
まず、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いてセイヨウアブラナからの外植片を５つの発現カセットのうちの１つで各々形質転換した。次いで、形質転換された細胞をグリホサートを含む培地で選択して、生存細胞を植物に再生した。２３，０００超の外植片を生成し、これを用いて全部で２２４の個々のＲ０事象を生成し、次のスクリーニングに用いた（表１）。
【００９０】
【表１】
0005957447.tif 000002
【００９１】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ分析を用いてＭＯＮ８８３０２事象の組織試料を選別し、多重コピー事象および／または分子複合事象を除外した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ分析によって決定した１コピーの導入遺伝子の存在およびベクター骨格配列の欠損に基づいて、最初の２２４の事象から、１０４の事象を進めた。具体的には、構築物１（最初の９７事象に関する）から３７のＲ１事象を進め、構築物２（最初の６９事象に関する）から３２のＲ１事象を進め、構築物３（最初の４３事象に関する）から１１のＲ１事象を進め、構築物４（約３０事象に関する）から１４のＲ１事象を進め、構築物５（約２５事象に関する）から１０のＲ１事象を進めた。
【００９２】
１コピーの導入遺伝子を含む１０４事象を（追加の分子分析および効力試験を含む）温室試験（ＧＨ）に進めた。Ｒ１温室分子分析には、１コピーの導入遺伝子の存在およびベクター骨格配列の欠損を確認するための最初のサザンブロット解析；３〜４葉期、ロゼット期および種子期におけるＣＰ４タンパク質発現レベルの測定；ウエスタンブロット解析によるＣＰ４プロセシングの測定（この解析には構築物４および５からの事象を含めなかった）を含めた。Ｒ１温室効力試験には、分離、クロロシス／ネクロシス、栄養（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ）耐性、初花、生長減退、花粉生存率により測定される雄株の繁殖耐性、および種子数を含めた。１０４事象についての温室での分子および効力試験の解析から、２５事象を第１年圃場試験に進めた。具体的には、圃場試験に進めたのは、構築物１については試験した３７のＲ１事象から１６のＲ２事象、構築物２については試験した３２のＲ１事象からの３のＲ２事象、構築物３については温室試験に進めた１１のＲ１事象から０のＲ２事象、構築物４については試験した１４のＲ１事象からの３のＲ２事象、構築物５については、１０のＲ１事象からの３のＲ２事象であった。
【００９３】
次いで、同じ場所の対になった区画で、農学的評価のための第１年圃場試験でこの２５のＲ２事象を分析した。農学的圃場試験を開始して植物の生育および生長に対する遺伝子挿入の影響を評価した。構築物１からの１６のＲ２事象を５カ所で評価した。構築物２からの３のＲ２事象、構築物４からの３のＲ２事象および構築物５からの３のＲ２事象を４カ所で評価した。各試験には各事象の陽性および陰性等値線（ｉｓｏｌｉｎｅ）対のほか、親の形質転換繁殖質および商業品種を含めた。農学的評価については、草勢、早期群生、初花の日付および草高を観察して植物の生育を評価した。植物の生育および生長に対する遺伝子挿入効果を示すものとして収率データも評価した。事象を全区画としておよび等値線をサブ区画として３つの複製を用いた対になった分割区画デザインを用いた。各事象の陽性および陰性の等値線を対にし、他方では、対照として商業品種および形質転換バックグラウンドを対にして含めた。必要に応じて、手による除草を加えた従来の除草剤プログラムを用いたシーズンを通じて、区画は草の無い状態を維持した。この圃場プロトコールではグリホサート処理を実施しなかった。
【００９４】
播種７〜１０日後に、各区画の出芽／群生数を測定した。土壌から完全に出た子葉を「出芽した」とみなした。尺度（〜１（優れた草勢）、５（平均）および９（草勢不良））を用いて、２〜３葉期（対になった効力試験区画の最初の除草剤施用前）の草勢を判定した。全区画が開花し始めた後に初花の日付を記録し、区画あたりの開花の割合として表した。１区画当たりの５植物の草高を土壌表面から中期から後期の花の最も高い総状花序までで測定し、ｃｍで表した。スケール（〜１（優）、５（平均）および９（不良））を用いて、均一性および立性（ｓｔａｎｄａｂｉｌｉｔｙ）を推定した。区画の大半が成熟後、各試験植物を収穫した。区画の一部は直接コンバインで刈り取り、他の区画は、一旦成熟に達したら押して、そのおよそ１０日後にｓｗａｔｈをコンバインで刈り取った。水分および個々の種子の重量を記録し（ポンド／Ａ）、種子試料を収集して油分およびタンパク質の分析に供した。各場所を分析して、場所間の平均を、統計学的ソフトウェアを使用して分析した。各場所の実験毎の第１種の誤り率５％について、ボンフェローニの調整法を用いた削除後ステューデント化残差に基づいた標準的な２パス法を用いてデータの異常値を選別した。分析前に異常値を除外した。制限付き最尤推定法を用いて分割区画デザインについての標準的な分散分析を行った。各事象の各等値線について最小２乗平均を算出し、比較毎の誤り率５％によるｔ検定を用いて、キャノーラ生育特性に対する遺伝子挿入の重要性を決定した。陽性等値線の事象形質を対応する陰性等値線の形質と比較した。事象間には成熟度の差があるため、陽性等値線と貯蔵した陰性等値線との間の比較および商業規格と形質転換バックグラウンドとの比較を除外した。
【００９５】
第１年農学的圃場試験の結果から、２つの構築物はいずれも、農学的特徴および収率が遺伝子挿入によって負の影響を受けない複数の事象を生成したことが示唆された。農学的評価に基づき、１５の事象が第２年圃場試験に進める候補となった。具体的には、構築物１からの１４の事象（圃場試験の１６のＲ２事象）および構築物２からの１事象（圃場試験の３のＲ２事象）が第２年圃場試験に進める候補となった。
【００９６】
また、農学的圃場試験と同じ試験場所に位置する第１年効力圃場試験でこの２５事象を評価した。効力圃場試験を開始して、種々の施用タイミングおよび施用量でのグリホサートの逐次施用に対する事象の栄養耐性および繁殖耐性を評価した。構築物１からの１６のＲ２事象を５カ所で評価した。構築物２からの３のＲ２事象、構築物４からの３のＲ２事象および構築物５からの３のＲ２事象を４カ所で評価した。各試験には各事象および２種の商業品種の陽性等値線を含めた。除草剤処理を全区画としておよび事象エントリーをサブ区画として、３つの複製を用いた分割区画デザインを用いた。比較のために非散布処理を含めた。
【００９７】
作物の出芽から初花にかけて施用したときの１．６ポンドＡＥ／Ａの１回の施用または０．８ポンドＡＥ／Ａの２回の逐次的施用のいずれかに対する栄養耐性および繁殖耐性について事象を評価した。１回の施用量の２倍、４倍および８倍等量の異なる３つの施用量でＲｏｕｎｄｕｐ  ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）を施用した（表２）。最初の施用は４葉期に行い、その後、２回目の施用を早熟期前に行った。界面活性剤および他の調合成分からの植物損傷の可能性を最小にするために、基準施用量としてＲｏｕｎｄｕｐ  ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）を１．６ｌｂ  ＡＥ／Ａ用い、技術的物質（界面活性剤を含まないグリホサート）を添加して所望の施用量を達成することによって、３．２および６．４ポンドＡＥ／Ａ（４倍および８倍）を送出する散布液を調製した。全施用は１０〜２０ＧＰＡを送出するように調整されたフラット・ファン・ノズルを装備したスプレーブームを搭載したトラクターを用いて行った。
【００９８】
データ収集は上記のように行った。グリホサート障害は次のように評価した。それぞれのグリホサート施用前に、処理区画および非処理区画の１区画当たり５つの植物について草高および葉数を記録した。グリホサートが事象に障害を与えたかどうかを決定するため、各グリホサート施用の７〜１０日後にパーセントクロロシスおよびパーセントネクロシスを視覚的に推定した。０％（無損傷）〜１００％（植物死滅）の尺度を用いて、１回目のグリホサート施用後に栄養損傷を評価し、２回目の施用後に繁殖クロロシス／ネクロシス（パーセント）を評価した。０〜１００％の尺度を用いて、各施用の１４〜２１日後に生長減退を評価した。１回目の施用後に栄養生長減退を評価し、逐次施用後に繁殖生長減退を決定した。グリホサート濃度と事象の各組合せについて最小２乗平均を算出し、ｔ検定を用いて事象耐性に対するグリホサートの影響の重要性を決定した。グリホサート処理からの事象収率を非処理の対照の収率および商業規格ＲＴ７３の収率と各除草剤施用量内で比較し、各事象について除草剤施用量を比較した。
【００９９】
第１年効力圃場試験の結果から、構築物１はグリホサートに対して優れた栄養耐性および繁殖耐性のある事象を生成したことが示唆される。コンセプト上の２倍の製品施用量にて観察された栄養損傷は極めて小さいもので、商業上重要なものではない。構築物１の事象については傑出した繁殖耐性が認められた。構築物１の全事象の収率は、最大の施用量（６．４ポンドＡＥ／Ａに続いて６．４ポンドＡＥ／Ａ）で有意な収率低下を示した１事象を除いて、施用量にかかわらずグリホサートによるマイナスの影響を受けなかった。構築物２由来の事象には、進めるためのグリホサートに対する十分な栄養耐性がなかった。試験したどのグリホサート施用量でも許容できないレベルの損傷が観察された。グリホサートは施用量にかかわらず構築物２の全事象の収率を有意に低下させた。構築物４および５由来の事象は構築物１由来の事象ほどは良好に機能せず、したがって、第２年圃場試験には進めなかった。第１年圃場試験に基づき、構築物１からの１３の事象を第２年圃場試験に進めた。
【０１００】
実施例２：ＲＴ７３とＭＯＮ８８３０２との比較
圃場試験をデザインし、現在市販されているＧｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ（ＲＴ７３事象）と比較してＭＯＮ８８３０２を評価した。ＭＯＮ８８３０２とＲＴ７３との比較から、ＭＯＮ８８３０２は高いグリホサート施用量に対して優れた作物耐性を与え、ひいては、タンポポ、セイヨウトゲアザミ、ホソノゲムギ、ソバカズラ、シロザおよびホウキギなどの雑草防除が困難な高いグリホサート施用量で雑草防除の改善を可能にすることが明らかとなった。また、ＭＯＮ８８３０２とＲＴ７３との比較から、ＭＯＮ８８３０２はグリホサートのより広い施用範囲に対して優れた作物耐性を与え、ひいては、出芽後から初花までのより広いウィンドウへのグリホサート施用が可能になり、ＲＴ７３を用いた場合よりも、より後の作物の生長期であっても、収率を低下させる雑草の防除が可能になることがわかった。環境条件が早期施用を制限しかつ／または作物収率を低下させるであろうより後の雑草の開芽の防除を改善する場合、ＭＯＮ８８３０２には高いグリホサート施用量に対して増強された耐性があることと、より後の作物期（ｃｒｏｐ  ｓｔａｇｅ）でのグリホサート施用に対して耐性があることとが相まって、ＲＴ７３と比較して、より後の生長期でのグリホサート施用が可能になるという利点が得られる。
【０１０１】
Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ系（事象ＲＴ７３）について現在登録されているグリホサート施用量は、最大でキャノーラ作物の６葉期まで、１回の施用で６７５ｇ  ａｅ／ｈａまたは２回の施用で４５０ｇ  ａｅ／ｈａである。グリホサートの複数の１回施用量でＲＴ７３をＭＯＮ８８３０２事象と比較した。施用はキャノーラ作物の出芽から初花まで行った。Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ系（ＲＴ７３事象）の代表は市販の開放授粉種３４−６５とし、事象ＭＯＮ８８３０２をＥｂｏｎｙ生殖質に形質転換した。
【０１０２】
８件の試験を確立し、６件で収穫を行った（１つの用地は渇水で失敗し、１つの用地は雹で失敗し、変動係数（ＣＶ）が所定のカットオフ値を超えたために、１つの収穫用地からのデータは用いなかった。）。シーズンを通して標準的なキャノーラ育成プラクティスを用い、植物の生育を最適化した。従来の発芽前および発芽後除草剤ならびに殺菌剤および殺虫剤を含んだ種子処理剤を用いて防除圧を最も低くした。試験はスプリット・ブロックデザインとして設定し、Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ（ＲＴ７３事象）系またはＭＯＮ８８３０２系をブロックし、除草剤施用量はブロック内で無作為化した。区画は２ｍ×６ｍとし、３回複製した。適した収穫期に手持ち式ブームスプレイヤーを用い、１００−１１０ｌ／ｈａの施用量で区画を散布した。カナダ用の処方のＲｏｕｎｄｕｐ  ＷｅａｔｈｅｒＭＡＸ（登録商標）（５４０ｇ／Ｌ）をグリホサート製品として用いた。主茎に４〜６枚の本葉がある状態を４〜６葉期と定義し、植物の５０％が少なくとも１つの花を付けたときを初花とした。除草剤施用７〜１０日後（ＤＡＴまたは処理後の日数）、パーセントクロロシス（％ＣＨＬＲ）を記録した。パーセントクロロシスとは、除草剤処理の結果である植物の葉の黄変量を非処理のチェックと比較して１〜１００のスケールで視覚的に評価したものである。除草剤施用１４〜２１日後（ＤＡＴ）にパーセント生長減退（％ＧＲ）を記録した。パーセント生長減退とは、限定するものではないが、処理エリアの高さおよび／または葉質の低下から構成される植物の生長減退を表すために用いる視覚的評価である。この評価は植物の地面より上の部分のみに関連するものである。パーセント生長減退を非処理のチェックと比較して１〜１００のスケールで評価した。播種後から主総状花序の種子の３０％が茶色／黒色になるまでの日数として成熟度を記録した。全区画を刈り取って列にし（ｓｗａｔｈｅｄ）、次いで、収穫しやすいように種子水分が十分に低くなるまで乾燥させた。収穫中に重量および種子水分を電子的に記録し、種子水分１０％時のブッシュル／エーカーに換算した。各場所を個別に分析し、統計ソフトを用いて場所間の平均を分析した。各場所につき実験毎の第１種の誤り５％について偽発見率（ＦＤＲ）調整を用いた削除後ステューデント化残差に基づき、２パス法を用いてデータの異常値を選別した。分析前に異常値を除外した。制限付き最尤推定法−品種との混合モデルによって分割区画デザインについての標準的な分散分析を行い、除草剤処理を固定効果として処理し、複製および場所を変量効果とした。各品種および各処理について最小２乗平均を算出し、ｔ検定（比較毎の誤り率５％）を用いて、キャノーラの生育特性に対して各除草剤処理濃度における品種と対象との間の重要性を決定した。作物損傷度、成熟度および収率を測定して利益を評価した。
【０１０３】
事象ＭＯＮ８８３０２を含んだキャノーラと比較した事象ＲＴ７３を含んだキャノーラのグリホサート耐性に関するデータを表２に示す。要約すると、ＭＯＮ８８３０２のグリホサート耐性は、増大したグリホサート施用量（ｇ  ａｅ／ｈａ）の耐性およびグリホサート施用に耐えた作物期の範囲の両方の点でＲＴ７３のグリホサート耐性よりも優れている。例えば、ＲＴ７３は４〜６葉期への１８００ｇ  ａｅ／ｈａの施用量で４．７％のクロロシスを示したが、ＭＯＮ８８３０２は同葉期に同程度の施用量でわずか１．７％のクロロシスを示し、２倍の施用量（３６００ｇ  ａｅ／ｈａ）でもクロロシスは増大しなかった。また、ＭＯＮ８８３０２事象は４〜６葉期への１８００ｇ  ａｅ／ｈａの施用量でパーセント生長減退を示さなかったが、ＲＴ７３は５．３％生長減退した。４〜６葉期および初花作物施用期に３６００ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート施用量では、ＲＴ７３は１０％のクロロシスを示したが、ＭＯＮ８８３０２はそれぞれ１．７％および４．７％に過ぎなかった。４〜６葉期および初花作物施用期に３６００ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート施用量では、ＲＴ７３はそれぞれ２０．８％および８．１％の生長減退  を示したが、ＭＯＮ８８３０２はそれぞれ０．３％および１．１％に過ぎなかった。
【０１０４】
【表２】
0005957447.tif 000003
【０１０５】
事象ＭＯＮ８８３０２を含むキャノーラと比較した事象ＲＴ７３を含むキャノーラ帯に播種後の日数に関するデータを表３に示す。要約すると、４〜６葉期施用時および初花施用時の両方で３６００ｇ  ａｅ／ｈａの施用量では、Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ系（ＲＴ７３事象）には成熟度が有意に遅延したが、これは作物損傷によるものと考えられる。ＭＯＮ８８３０２植物では、４〜６葉期の施用時に１８００ｇ  ａｅ／ｈａの施用量で成熟が有意に短縮したことを除き、成熟の遅延はみられなかった。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
事象ＭＯＮ８８３０２を含むキャノーラと比較した事象ＲＴ７３を含むキャノーラの種子水分量に関するデータを表４に示す。種子水分量は個々の区画を収穫する際に電子的に測定した。各系内の種子水分量は散布したグリホサート施用量と非散布処理との間で比較した。Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ系種子水分量は、４〜６葉期の施用および初花作物期の施用時に１８００ｇ  ａｅ／ｈａおよび３６００ｇ  ａｅ／ｈａの施用量で高かった。また、この２つの処理における種子水分量の増大は、先に記載した作物損傷の結果生じる成熟の遅延を反映している。ＭＯＮ８８３０２植物には種子水分量に対する有意な影響はみられなかった。
【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
事象ＭＯＮ８８３０２を含むキャノーラと比較した事象ＲＴ７３を含むキャノーラの収率に関するデータを表５ならびに図２および３に示す。各事象を含むキャノーラについて、異なるグリホサート施用量と非散布処理との間で収率を比較した。Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ系では、４〜６葉期および初花の施用時の１８００および３６００ｇ  ａｅ／ｈａの施用量ならびに初花の施用時の９００ｇ／ｈａの施用量では収率の有意な低下がみられた。ＭＯＮ８８３０２植物では、どの施用量またはどのタイミングでも有意な差はみられなかった。
【０１１０】
【表５】
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【０１１１】
Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ系について現在表示されているグリホサートの施用量は、１回の施用につき６７５ｇ  ａｅ／ｈａまたは２回の施用につき４５０ｇ  ａｅ／ｈａである。施用は最高６葉期まで行うことが可能である。ＭＯＮ８８３０２の施用量は、作物の初花に最大１８００ｇ  ａｅ／ｈａまで施用し得る。Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ系では、提案されたＭＯＮ８８３０２の施用量１８００ｇ  ａｅ／ｈａでは収率は１１．４％低下し、提案された２倍の施用量では収率は３０％低下した（図２）。これらの収率低下は、現在表示されている標識Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ作物への４〜６葉期の施用で観察された。ＭＯＮ８８３０２植物では有意な収率低下はみられなかった。図３はグリホサート施用量および作物期（初花）の収率を示している。Ｇｅｎｕｉｔｙ（商標）Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）キャノーラ系では、初花期より後にはどの施用量でも収率は有意に低下した。ＭＯＮ８８３０２植物には収率の有意な低下はみられなかった。
【０１１２】
実施例３：ＭＯＮ８８３０２のＤＮＡ配列の特徴付け
植物ＭＯＮ８８３０２のゲノムに挿入されたＤＮＡおよびその挿入部位に隣接するゲノム配列を詳細な分子解析によって特徴付けた。これらの解析には、挿入配列のシークエンシング、挿入数（ゲノム内の組み込み部位の数）の決定、コピー数（１遺伝子座内の導入遺伝子ＤＮＡのコピー数）の決定、挿入された遺伝子カセットの完全性の評価、フランキング配列の特徴づけを含む。
【０１１３】
１９９０年にＯｃｈｍａｎらが記載した逆熱増幅（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて事象ＭＯＮ８８３０２の導入遺伝子ＤＮＡ挿入に隣接するゲノムＤＮＡを決定した。非遺伝子組換えＥｂｏｎｙおよび実施例１に記載のセイヨウアブラナのアグロバクテリウム媒介形質転換から生じた種々の遺伝子組換え事象から植物ゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡ単離に用いた組織は標準的な温室条件下で精製した。約１ｇの若葉組織を液体窒素と混ぜ合わせ、乳鉢および乳棒を用いて微粉にした。Ｎｕｃｌｅｏｎ（商標）ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ（商標）ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＲＰＮ８５１１、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ所在）を用い、製造業者のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。最終の沈殿工程後、個々の試料からのＤＮＡを０．５ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ    ＥＤＴＡ）に再懸濁した。任意の組織（限定するものではないが、種子）からＤＮＡを抽出するために、この方法は当業者によって修正されてもよい。
【０１１４】
導入遺伝子ＤＮＡの制限分析に基づいて選択した制限エンドヌクレアーゼによって、各試料からの小分けしたＤＮＡを消化した。制限フラグメントを自己連結させた後、ＥＬＯＮＧＡＳＥ（登録商標）Ａｍｐｌｉｆｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド所在、カタログ番号１０４８１−０１８）またはＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、インディアナ州インディアナポリス所在、カタログ番号）のいずれかを用い、導入遺伝子ＤＮＡの５’および３’末端から伸びる配列を増幅する導入遺伝子ＤＮＡ配列からデザインしたプライマーを用いて熱増幅を行った。この反応から生成されたアンプリコンをアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＱＩＡＧＥＮゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア所在）を用いて精製した。ゲル精製したアンプリコンを製造業者のプロトコールに従ってｐＣＲ（登録商標）−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド所在）に複製した。標準的なＤＮＡシークエンシングプロトコールを用いて、事象ＭＯＮ８８３０２フランキングゲノム配列を含む得られたプラスミドを配列決定した。ゲノムに挿入された遺伝子組換えＤＮＡの５’末端に隣接するか、またはフランキングするゲノムＤＮＡを配列番号：３で示した（図１［Ｃ］を参照）。ゲノムに挿入された遺伝子組換えＤＮＡの３’末端に隣接するゲノムＤＮＡを配列番号：４２で示した（図１の［Ｄ］を参照されたい）。ゲノムＤＮＡに完全に組み込まれた発現カセットＤＮＡのセグメントを
配列番号：５で示す（図１［Ｅ］を参照されたい）。
【０１１５】
単離ＤＮＡ分子の配列を導入遺伝子ＤＮＡの配列と比較し、フランキング配列および同時に単離された導入遺伝子ＤＮＡフラグメントを同定した。推定フランキング配列のデータおよび既知の導入遺伝子ＤＮＡの配列に基づいて指定されたプライマーを用いた熱増幅によって、発現カセットが存在していることを確認した。事象ＭＯＮ８８３０２のフランキング配列から設計されたプライマーを用いて、導入遺伝子ＤＮＡが形質転換された系列に組み込まれたのと同じ領域に相当する野生型配列を単離した。熱増幅反応は、ＥＬＯＮＧＡＳＥ（登録商標）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド所在、カタログ番号１０４８１−０１８）を用いて行った。複数のヌクレオチドデータベースおよびタンパク質データベースについて事象ＭＯＮ８８３０２のフランキング配列およびＥｂｏｎｙ野生型配列を解析した。この情報を用いて導入遺伝子と植物ゲノムとの関係を検討し、挿入部位の完全性を評価した。このフランキング配列および野生型配列を用いて、かかる事象を同定するのに用いるＴＡＱＭＡＮエンドポイントアッセイ用のプライマーを設計した。
【０１１６】
実施例４：事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ
本実施例では試料中の事象ＭＯＮ８８３０２を同定するために開発された事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅法を記載する。事象ＭＯＮ８８３０２に特異的なエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）法に有用な条件の例は次の通りである。ステップ１：１８メガオーム水を最終量１０μｌに調整。ステップ２：５．０μｌの２ＸＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ｄＮＴＰｓ、酵素、緩衝液）を１Ｘの最終濃度に調整。ステップ３：０．５μｌのプライマー１およびプライマー２ミックス（各プライマーを濃度２０μＭまで１８メガオーム水に再懸濁）を最終濃度１．０μＭに調整（例えば、微小遠心管を用いた場合、最終濃度２０μＭで５００μｌを得るために次のものを添加する必要がある：最終濃度１００μＭのプライマーＳＱ２０９０１（配列番号：９）１００μｌ；最終濃度１００μＭのプライマーＳＱ２３７７０（配列番号：１０）；１８メガオーム水３００μｌ）。ステップ４：０．２μｌの事象６−ＦＡＭ（商標）ＭＧＢプローブＰＢ１０１６４（配列番号：１１）を０．２μＭの最終濃度に調整。ステップ５：０．５μｌ内部対照プライマーＳＱ２５６３（配列番号：１７）および内部対照プライマーＳＱ２５６４（配列番号：１８）ミックスを各プライマーにつき１．０μＭの最終濃度に調整。ステップ６：０．２μＭの内部対照ＶＩＣ（商標）プローブＰＢ０７５１（配列番号：１９）を最終濃度０．２μＭに調整。ステップ７：各試料につき３．０μｌの抽出ＤＮＡ（テンプレート）、それぞれ、１．分析用葉試料、２．陰性対照（非遺伝子組換えＤＮＡ）、３．陰性水対照（テンプレート無し）、４．陽性対照ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡを含む。ステップ８：サーモサイクラー条件は次の通りとする：５０°Ｃで２分間を１サイクル；９５°Ｃで１０分間を１サイクル；９５°Ｃで１５秒間、次いで６４°Ｃで１分間を１０サイクル（１サイクルにつき−１°Ｃ）；９５°Ｃで１５秒間、次いで５４°Ｃで１分間を４０サイクル；最終サイクルは１０°Ｃとする。
【０１１７】
この方法に有用なＤＮＡ分子は、例えば、プライマーＳＱ２０９０１（配列番号：９）およびＳＱ２３７７０（配列番号：１０）ならびに６ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１０１６４（配列番号：１１）である。他のプローブおよびプライマーは、本明細書に記載した導入遺伝子インサートの配列および／またはフランキング配列に基づいて設計し得る。ＰＢ１０１６４（配列番号：１１）と共にこれらの反応方法に用いる場合、ＳＱ２０９０１（配列番号：９）およびＳＱ２３７７０（配列番号：１０）は、事象ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡに特徴的であるアンプリコンを生成する。また、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ増幅法は、ＦａｔＡ（セイヨウアブラナ内の１コピーの内在性遺伝子である）を増幅することによってテンプレートＤＮＡの完全性を確認する。この方法に有用なＤＮＡ分子は、例えば、ＳＱ２５６３（配列番号：１７）プライマーおよびＳＱ２５６４（配列番号：１８）プライマーおよびＶＩＣ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ０７５１（配列番号：１９）である。この解析のための対照には、事象ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡを含むセイヨウアブラナからの陽性対照、非遺伝子組換えセイヨウアブラナからの陰性対照およびテンプレートＤＮＡを含まない陰性対照が含まれる。
【０１１８】
また、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅法を用い事象ＭＯＮ８８３０２についての接合状態アッセイを開発した。接合状態アッセイは、ある事象を含んだ植物が、その事象のＤＮＡ（すなわち、染色体対の各染色体上の同じ場所に外生ＤＮＡを含む）にホモ接合性であるかどうか、またはある事象ＤＮＡ（すなわち、染色体対の一方の染色体のみに外生ＤＮＡを含む）にヘテロ接合性かどうか、あるいはその事象ＤＮＡ（すなわち、野生型）にヌルかどうかを決定するのに有用である。本実施例は、試料中の事象ＭＯＮ８８３０２の接合状態を決定するために開発された事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅法を説明する。このアッセイでは、３種のプライマーアッセイを用いた（プライマーＳＱ２１９４８（配列番号：１２）は挿入された外生ＤＮＡとハイブリダイズし、その外生ＤＮＡから特異的に伸長し、プライマーＳＱ２２１７６（配列番号：１３）は挿入された外生ＤＮＡの５’側に隣接するＤＮＡとハイブリダイズし、そのＤＮＡから特異的に伸長し、プライマーＳＱ２４６３５（配列番号：１４）は挿入された外生ＤＮＡの３’側に隣接するＤＮＡとハイブリダイズし、そのＤＮＡから特異的に伸長する。この３つのプライマーは事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的である。本実施例では、プライマーＳＱ２２１７６（配列番号：１３）およびプライマーＳＱ２１９４８（配列番号：１２）ならびに６ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ４２１３（配列番号：１５）は、挿入された外生ＤＮＡのコピーが存在する場合に特徴的である。本実施例では、ＳＱ２２１７６（配列番号：１３）およびプライマーＳＱ２４６３５（配列番号：１４）ならびにＶＩＣ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１０７８７（配列番号：１６）は、挿入された外生ＤＮＡのコピーがゲノムＤＮＡ（すなわち、野生型）に存在しない場合に特徴的である。この３つのプライマーおよび２つのプローブを事象ＭＯＮ８８３０２にホモ接合性の植物から抽出したＤＮＡとＰＣＲ反応により共に混合すると、事象ＭＯＮ８８３０２にホモ接合性である植物であることを示し、特徴的である６ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ４２１３（配列番号：１５）からのみ蛍光シグナルが存在する。この３つのプライマーおよび２つのプローブを事象ＭＯＮ８８３０２にヘテロ接合性の植物から抽出したＤＮＡとＰＣＲ反応により共に混合すると、事象ＭＯＮ８８３０２にヘテロ接合性である植物であることを示し、特徴的である６ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ４２１３（配列番号：１５）およびＶＩＣ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１０７８７（配列番号：１６）の両方から蛍光シグナルが存在する。この３つのプライマーおよび２つのプローブを事象ＭＯＮ８８３０２にヌルである（すなわち、野生型）植物から抽出したＤＮＡとＰＣＲ反応により共に混合すると、事象ＭＯＮ８８３０２にヌルである植物（すなわち、野生型）を示し、特徴的であるＶＩＣ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１０７８７（配列番号：１６）からのみ蛍光シグナルが存在する。この方法に有用な条件の例は次の通りである。ステップ１：１８メガオーム水を最終量１０μｌに調整。ステップ２：５．０μｌの２ＸＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ｄＮＴＰｓ、酵素、緩衝液）を１Ｘの最終濃度に調整。ステップ３：０．５μｌの接合状態プライマーＳＱ２１９４８、ＳＱ２２１７６、ＳＱ２４６３５（各プライマーを濃度２０μＭまで１８メガオーム水に再懸濁）を最終濃度１．０μＭに調整（例えば、微小遠心管を用いた場合、最終濃度２０μＭで５００μｌを得るために次のものを添加する必要がある。濃度１００μＭで１００μｌのプライマー１；濃度１００μＭで１００μｌのプライマー２；３００μｌの１８メガオーム水）。ステップ４：０．２μｌの接合状態６−ＦＡＭ（商標）ＭＧＢプローブＰＢ４２１３（配列番号：１５）（最終濃度１０μｌまで１８メガオーム水に再懸濁）を最終濃度０．２μＭに調整。ステップ５：０．５μｌの内部対照プライマーＳＱ２２１７６（配列番号：１３）および内部対照プライマーＳＱ２４６３５（配列番号：１４）のミックス（各プライマーにつき濃度２０μＭに１８メガオーム水に再懸濁）を各プライマーにつき最終濃度１．０μＭに調整。ステップ６：０．２μＭの内部対照ＶＩＣ（商標）プローブＰＢ１０７８７（配列番号：１６）（最終濃度１０μＭまで１８メガオーム水に再懸濁）を最終濃度０．２μＭに調整。ステップ７：各試料につき３．０μｌの抽出ＤＮＡ（テンプレート）、それぞれ、１．分析用葉試料、２．陰性対照（非遺伝子組換えＤＮＡ）、３．陰性水対照（テンプレート無し）、４．陽性対照ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡを含む。ステップ８：サーモサイクラー条件は次の通りとする：５０°Ｃで２分間を１サイクル；９５°Ｃで１０分間を１サイクル；９５°Ｃで１５秒間、次いで６４°Ｃで１分間を１０サイクル（１サイクルにつき−１°Ｃ）；９５°Ｃで１５秒間、次いで５４°Ｃで１分間を３０サイクル；最終サイクルは１０°Ｃとする。Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ，  ＭＪ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２２５サーモサイクラーを使用し得る。当業者には生物学的試料中の事象ＭＯＮ８８３０２ＤＮＡの同定用のアンプリコンを生成するのに有用であろう他の方法および装置が知られている。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＧｒａｄｉｅｎｔまたはＭＪ  Ｅｎｇｉｎｅを用いて熱増幅を行う場合、そのサーモサイクラーは計算モードで試行すべきである。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００を用いて熱増幅を行う場合、そのサーモサイクラーを最大のランプ速度で設定すべきである。
【０１１９】
実施例５：ＭＯＮ８８３０２生育活動中の事象ＭＯＮ８８３０２の同定
本実施例は、事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物を用いて、いずれかの生育活動の後代内の事象ＭＯＮ８８３０２をどのように同定し得るかを記載する。ＤＮＡ事象プライマー対を用いて、事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンを生成する。事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンは、少なくとも１つの結合配列を含み、それは、本明細書において、配列番号：１または配列番号：２として供される（図１に示した各々［Ａ］および［Ｂ］）。配列番号：１（図１の［Ａ］）は、導入遺伝子挿入物の５’末端とのフランキング配列の結合部に対応するヌクレオチド配列である（配列番号：３の７６２〜８２１位［Ｃ］、図１参照）。配列番号：２（［Ｂ］、図１参照）は、導入遺伝子挿入物の３’末端とのフランキング配列の結合部に対応するヌクレオチド配列である（配列番号：４の３１３〜３７２位［Ｄ］、図１参照）。
【０１２０】
事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンを生成する事象プライマー対は、フランキング配列（配列番号：３および４）および挿入された遺伝子組換えＤＮＡ配列（配列番号：５）を用いて設計したプライマー対を含む。配列番号：１の少なくとも４０ヌクレオチドを見出す特徴的なアンプリコンを獲得するために、配列番号：３の第１〜７９１塩基に基づいた順方向プライマー分子および挿入された発現カセットＤＮＡ配列、配列番号：５の第１〜４４２７位に基づいた逆方向プライマー分子を設計し、ここに、それらのプライマー分子は、配列番号：３および配列番号：５に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの連続ヌクレオチドのものである。配列番号：２の少なくとも４０ヌクレオチドを見出す特徴的なアンプリコンを獲得するために、挿入された発現カセット、配列番号：５の第１〜４４２７位に基づいた順方向プライマー分子、および３’フランキング配列、配列番号：４の第３４３〜１２５０塩基に基づいた逆方向プライマー分子を設計し、ここに、それらのプライマー分子は、配列番号：４および配列番号：５に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの連続ヌクレオチドのものである。実際的な目的のために、限られたサイズ範囲、例えば、１００〜１０００の塩基間のアンプリコンを生成するプライマーを設計するであろう。より小さな（より短いポリヌクレオチド長）のサイズのアンプリコンは、一般的にＰＣＲ反応においてより確実に生成され、短いサイクル時間を可能とし、容易にアガロースゲル上で分離および視覚化されるか、またはエンドポントＴＡＱＭＡＮ様アッセイにおける使用に適する。より小さなアンプリコンはアンプリコン検出の当該技術分野において知られた方法によって生成および検出できる。加えて、プライマー対を用いて生成したアンプリコンはベクターにクローン化でき、増殖、単離および配列決定できるか、または当該技術分野においてよく確立された方法を用いて直接的に配列決定できる。事象ＭＯＮ８８３０２またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：３もしくは配列番号：５の組合せまたは配列番号：４および配列番号：５の組合せに由来したいずれのプライマー対も、本発明の態様である。事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：３の中の少なくとも１１の連続ヌクレオチドまたはその相補体を含む、いずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の態様である。事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：４の中の少なくとも１１の連続ヌクレオチドまたはその相補体を含む、いずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の態様である。事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：５の中の少なくとも１１の連続ヌクレオチドまたはその相補体を含む、いずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の態様である。
【０１２１】
この分析のための増幅条件の一例を実施例４に記載する。しかしながら、これらの方法、あるいは配列番号：３もしくは配列番号：４に相同的または相補的であるＤＮＡプライマーまたは事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンを生成する事象ＭＯＮ８８３０２の導入遺伝子挿入物（配列番号：５）のＤＮＡ配列の使用の変更は、本開示の範囲内にある。特徴的なアンプリコンは、少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノム結合部ＤＮＡ（配列番号：１または配列番号：２または配列番号：７または配列番号：８）、またはその実質的な部分に相同的または相補的なＤＮＡ分子を含む。
【０１２２】
試料中の事象ＭＯＮ８８３０２の分析は、事象ＭＯＮ８８３０２からの陽性対照、事象ＭＯＮ８８３０２ではない相当する植物からの陰性対照（例えば、限定されるものではないが、セイヨウアブラナ）および／またはゲノムＤＮＡを含まない陰性対照を含み得る。内因性ＤＮＡ分子を増幅するプライマー対は、ＤＮＡ増幅条件についての内部標準として機能し得る。配列番号：３，配列番号：４または配列番号：５に記載された配列から選択された配列のいずれの断片も、実施例４に示した方法によりアンプリコンの生成のためのＤＮＡ増幅プライマーとして用いることもでき、かかるアンプリコンは、事象ＭＯＮ８８３０２をかかる特徴的な増幅反応用のテンプレートとして用いる場合に、事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的であり得る。実施例４の方法に対する変更を含むこれらのＤＮＡプライマー配列の使用は、本発明の範囲内にある。事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的である配列番号：３，配列番号：４または配列番号：５から由来した少なくとも１つのＤＮＡプライマー配列により生成されたアンプリコンは、本発明の態様である。
【０１２３】
かくして、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５に由来したヌクレオチドの中の十分な長さの連続ヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含み、ＤＮＡ増幅方法に用いる場合に事象ＭＯＮ８８３０２を含む植物またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するであろうＤＮＡ検出キットを設計でき、これは本発明の態様である。ＤＮＡ増幅方法で試験した場合に事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンを植物器官または種子あるいは商品は本発明の態様である。事象ＭＯＮ８８３０２アンプリコンについてのアッセイは、本明細書に記載の事象ＭＯＮ８８３０２に特徴的なアンプリコンを生成するのに使用することができる任意のサーモサイクラーまたは核酸増幅システムを用いることによって行うことができる。
【０１２４】
上記に開示し、特許請求の範囲に引用した事象ＭＯＮ８８３０２種子の代表的試料の寄託は、ブダペスト条約に基づいて郵便番号２０１１０、バージニア州マナッサス、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ所在の米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）でなされた。この寄託のＡＴＣＣ受入番号はＰＴＡ‐１０９５５である。寄託は、３０年間、または最後の請求から５年後、あるいは特許有効期間のいずれかの長い方で、貯蔵施設に保管され、その期間中に必要に応じて交換されるであろう。
【０１２５】
本発明の原理を例示および記載してきたが、本発明はかかる原理から逸脱することなく構成および細部を変更できることは当業者には明らかであろう。本発明者らは、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内にあるすべての変更を特許請求する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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