(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0005933542.tif 000014
［式中、ＹおよびＹ’は独立してＨであるか、あるいは単糖または２〜１２の単糖の単位を含む直鎖のもしくは分岐したオリゴ糖であり、その際、ＹおよびＹ’の少なくとも１つはＨ以外であり；
ｍは、０〜３までの整数であり；
Ａは、Ｃ２−２０アルキレンまたは−Ｒ６−Ｏ−［−Ｒ６−Ｏ−］ｘ−Ｃ２−２０アルキレンであり；
Ｘは、−Ｏ−、−ＮＨ−および−ＮＲ５−からなる群から選択され；
Ｒ３は、−ＨおよびＣ１−１０アルキルからなる群から選択され；
Ｒ４は、−Ｈ、−ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯ−Ｍ＋からなる群から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１−１０アルキルであり；
Ｒ６は、−Ｃ２Ｈ４−または−Ｃ３Ｈ６−であり；
Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＮＨ４＋からなる群から選択され；かつ
ｘは、０〜２００までの整数である］のエチレン性不飽和グリコシドを製造する方法であって、式ＩＩ：
【化２】
0005933542.tif 000015
のエチレン性不飽和化合物を、グリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１０以上２０００００以下の単糖の単位を含む多糖と反応させる工程を含み、
前記多糖は、式Ｖ：
【化３】
0005933542.tif 000016
［式中、Ｒ７は、−Ｈまたは式ＶＩ：
【化４】
0005933542.tif 000017
の基であり、その際、末梢単糖単位においてＲ７はＨであり、かつｎは、括弧内における繰り返し単位に含まれる単糖の単位の数が、１０以上２０００００以下である］の化合物である、前記エチレン性不飽和グリコシドを製造する方法。
【請求項２】
Ｙ’は、Ｈである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａは、Ｃ２−６アルキレンであり；
Ｘは、−Ｏ−であり；かつ
Ｒ３は、−Ｈもしくは−ＣＨ３である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｍは、１であり；かつ
Ｙは、単糖類、二糖類および三糖類からなる群から選択される、請求項１〜３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
グリコシダーゼは、アミラーゼ、セルラーゼ、グルコシダーゼおよびガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項１〜４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
グリコシルトランスフェラーゼは、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１〜４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
多糖は、デンプン、アミロース、アミロペクチン、セルロースおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜６までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エチレン性不飽和化合物を、グリコシダーゼもしくはグリコシルトランスフェラーゼの存在下で多糖と反応させることによるエチレン性不飽和グリコシドを製造する方法に関する。
【０００２】
糖の残基を含むポリマー（糖のコポリマー）は、良好な水溶性、高い電解質安定性、熱湯中におけるコロイド安定性、綿などの表面への強い相互作用および非毒性などの典型的な糖類の性質を共有し得る。これらの特有の性質は、そのようなポリマーの多様な用途に通ずる。したがって、十分に特定されている糖のコポリマーおよびそれらの各モノマーを費用効率的に製造する方法を開発することに、強い関心がもたれている。そのようなモノマーは、糖とエチレン性不飽和アルコールとのグリコシド結合により得られる重合可能なエチレン性不飽和グリコシドであってもよい。そのようなグリコシドの合成は、いくつかの課題を有している。糖の異なるヒドロキシル基が結合形成に関与する位置異性体の形成の多くの可能性が存在する。さらに、異なるアノマー型の形成の可能性がある。したがって、糖の残基を有するほとんどのモノマーの化学合成は、一般的に実現可能ではなく、かつ所望とされるモノマーの低い収率を招く。
【０００３】
グリコシドモノマーの製造のための他のアプローチとして、酵素の適用が検討されてきた。化学合成に対し、保護されていない糖の酵素触媒反応は、それらの高い立体選択性に基づき、通常、より一層構造的に均一な生成物をもたらす。
【０００４】
一般的に、グリコシドの酵素的合成に使用される２つのアプローチがあり、そのアプローチとは、熱力学的に制御されている加水分解の逆反応（reverse hydrolysis）および動力学的に制御されているグリコシル転移である。逆反応の加水分解によるグリコシド合成のための、生体内でグリコシドの加水分解を触媒するグリコシダーゼを使用するアプローチは、例えば、I. GillおよびR.Valivetyによる、Angew. Chem. Int. Ed. 39(21):3804-3808, 2000に記載されている。酵素的に触媒化されたグリコシル転移による、第一級ヒドロキシル基を有する糖ではない化合物へのグリコシル単位の転移は、例えば、S. Matsumura他による、Makromol. Chem., Rapid Commun. 14:55-58, 1993に示されている。
【０００５】
セルロースまたはデンプンなどの多糖類は、廉価かつ容易に入手できる。したがって、本発明の課題は、グリコシル単位の供給源として多糖類を使用してエチレン性不飽和グリコシドを製造する方法を開発することであった。
【０００６】
それ故、本発明は、式Ｉ：
【化１】
0005933542.tif 000002
［式中、ＹおよびＹ’は独立してＨであるか、あるいは単糖または２〜１２の単糖の単位を含む直鎖のもしくは分岐したオリゴ糖であり、その際、ＹおよびＹ’の少なくとも１つはＨ以外であり；
ｍは、０〜３までの整数であり；
Ａは、Ｃ２−２０アルキレンまたは−Ｒ６−Ｏ−［−Ｒ６−Ｏ−］ｘ−Ｃ２−２０アルキレンであり；
Ｘは、−Ｏ−、−ＮＨ−および−ＮＲ５−からなる群から選択され；
Ｒ３は、−ＨおよびＣ１−１０アルキルからなる群から選択され；
Ｒ４は、−Ｈ、−ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯ−Ｍ＋からなる群から選択され；
Ｒ５は、Ｃ１−１０アルキルであり；
Ｒ６は、−Ｃ２Ｈ４−または−Ｃ３Ｈ６−であり；
Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＮＨ４＋からなる群から選択され；かつ
ｘは、０〜２００までの整数である］のエチレン性不飽和グリコシドを製造する方法であって、式ＩＩ：
【化２】
0005933542.tif 000003
のエチレン性不飽和化合物を、グリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの存在下で、１０またはそれより多い単糖の単位を含む多糖と反応させる工程を含む、前記エチレン性不飽和グリコシドを製造する方法を提供する。
【０００７】
好ましい実施形態において、Ｙ’はＨであり、かつＹは単糖または２〜１２の単糖の単位を含む直鎖のもしくは分岐したオリゴ糖である。
【０００８】
好ましい実施形態において、Ｙは
【化３】
0005933542.tif 000004
［式中、Ｒ７は、−Ｈまたは式ＶＩ：
【化４】
0005933542.tif 000005
の基であり、その際、末端の単糖の単位においてＲ７はＨである］である。
【０００９】
定義
本発明において使用されている「単糖」の用語は、５つの炭素原子と１つの酸素原子の六員環を含む構造で、分子間にヘミアセタールを形成しているポリヒドロキシアルデヒドの単一の単位を指す。単糖類は、例えば、αもしくはβアノマー、およびＤもしくはＬ異性体などの種々のジアステレオマ型で存在していてもよい。「オリゴ糖」は、短鎖の、共有結合された単糖の単位からなる。オリゴ糖類は、２つの単糖の単位を含む二糖類ならびに３つの単糖の単位を含む三糖類を含む。「多糖」は、長鎖の、共有結合された単糖の単位からなる。
【００１０】
「グリコシド結合」または「グリコシド連鎖（glycosidic linkage）」の用語は、糖もしくは糖誘導体（グリコン）のアノマーのヒドロキシル基と、他の糖のヒドロキシル基もしくは例えばアルコールなどの糖ではない有機化合物（アグリコン）のヒドロキシル基との間で形成される型の化学結合あるいは連鎖である。二糖または多糖の還元末端は、その構造の最後のアノマー炭素に対して位置しており、その末端は、反対方向で存在する。
【００１１】
本発明において使用されている「酵素的に触媒化された」方法または「生体触媒の」方法は、前記方法が、酵素、特にグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下で実施されることを意味している。該方法は、単離された（精製された、濃縮された）形態もしくは粗製の形態における前記グリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの存在下で実施され得る。
【００１２】
「グリコシダーゼ」の用語は、グリコシダーゼの変異体、突然変異体および酵素的な活性部位も含んでいる。
【００１３】
同様に、「グリコシルトランスフェラーゼ」の用語も、グリコシルトランスフェラーゼの変異体、突然変異体および酵素的な活性部位を含んでいる。
【００１４】
酵素の触媒量は、「Ｕ」（「Unit」もしくは「unit」）で表現され、その際、１Ｕは、特定の条件下（通常、３７℃かつｐＨ７．５）で１分あたり１μｍｏｌの基質の反応を触媒する酵素の量と等しい。それ故、例えば、１０Ｕグリコシダーゼは、１分あたり１０μｍｏｌの糖の基質の反応に必要とされる酵素の触媒量と等しい。マルトース生成アミラーゼの触媒量は、「ＭＡＮＵ」（Maltogenic Amylase Novo Unit）で表現させることができ、その際、１ＭＡＮＵは、標準条件下（１０ｍｇ／ｍｌ  マルトトリオース、３７℃、ｐＨ５．０、３０分の反応時間）で１分あたり１μｍｏｌのマルトトリオースの反応に必要とされる酵素の量と等しい。酵素の触媒量は、当該技術分野でよく知られた方法によって測定され得る。
【００１５】
「アルキル」の用語は、１〜１０の炭素原子を有する直鎖のまたは分岐した基であるＣ１−１０アルキル基を含む。それらの例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、２−ブチル、イソブチルもしくはｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピル、ヘプチル、オクチル、ノニル、およびデシル、ならびに２−エチルヘキシルなどのそれらの構造異性体である。
【００１６】
「アルキレン」の用語は、１〜２０の炭素原子を有する直鎖のまたは分岐した二価基であるＣ２−２０アルキレン二価基を含む。
【００１７】
「エチレン性不飽和」の用語は、芳香族ではない、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する化合物に関する。特に、本発明に使用されている「エチレン性不飽和グリコシド」は、エチレン性不飽和アルコールにグリコシド結合されている糖からなるグリコシドを指す。
【００１８】
本発明の方法において、多糖は、式Ｉのエチレン性不飽和グリコシドを形成するために、式ＩＩのエチレン性不飽和化合物に転移させる糖の単位の供給源として作用する。転移される糖の単位は、グルコース、ガラクトースもしくはマンノース単位などの単糖の単位；マルトース、ラクトースもしくはセロビオース単位などの二糖の単位；マルトトリオース単位などの三糖の単位；またはマルトヘキサオースなどの他のオリゴ糖の単位、あるいはそれらの混合物である。例えば、転移される糖の単位は、Ｄ−グルコース、マルトース、セロビオース、マルトトリオース、またはマルトヘキサオースの単位である。転移されるオリゴ糖の単位は、直鎖であっても分岐していてもよい。
【００１９】
本発明の方法において使用されている多糖は、１０またはそれより多い単糖の単位を含む。典型的には、多糖のうちの単糖の単位の数は、約３００〜約２０００００、例えば、約２０００〜約２０００００；約３００〜約３０００；または約３００〜１００００である。多糖類の大きさ、すなわち、モノマー単位の数は、例えば、酸および／または熱あるいはα−アミラーゼなどの酵素を用いる前処理によって減少させていてもよい。多糖類は、（１→４）−グリコシド結合によって結合されている直鎖の単糖の単位であってもよく、または、例えば、２４〜３０モノマー単位毎で、（１→６）−グリコシド結合の形成により分岐されていてもよい。糖の鎖（および側鎖）の末端の単糖の単位は、本発明において、末梢単糖単位とも呼ばれる。
【００２０】
特に、多糖は、式Ｖ：
【化５】
0005933542.tif 000006
［式中、Ｒ７は、−Ｈまたは式ＶＩ：
【化６】
0005933542.tif 000007
の基であり、その際、末梢単糖単位においてＲ７はＨであり、かつｎは、括弧内における繰り返し単位に含まれる単糖の単位の数が、１０もしくはそれより多く、例えば、約３００〜約２０００００である数である］の化合物であってもよい。
【００２１】
具体例として、多糖類は、デンプン、アミロース、アミロペクチン、セルロースおよびそれらの混合物を含む。
【００２２】
１つの実施形態において、ｍは０、すなわち、式ＩＩのエチレン性不飽和化合物は、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、Ｎ−ヒドロキシアルキル（メタ）アクリルアミド、マレイン酸のモノ（ヒドロキシアルキル）エステルおよびそれらの塩から選択されるエチレン性不飽和アルコールであるか；あるいは、エトキシ化されたそれらの誘導体、プロポキシ化されたそれらの誘導体、またはエトキシ化されかつプロポキシ化されたそれらの誘導体である。
【００２３】
他の実施形態において、ｍは、１、２または３、すなわち、式ＩＩのエチレン性不飽和化合物は、単糖、二糖もしくは三糖成分および前記エチレン性不飽和アルコールから選択されるアルコール成分からなるエチレン性不飽和モノグリコシド、ジグリコシドあるいはトリグリコシドである。
【００２４】
好ましくは、式ＩＩのエチレン性不飽和アルコールは、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレート、３−ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、マレイン酸水素（２−ヒドロキシエチル）エステルおよびそれらのグリコシドから選択される。
【００２５】
一実施形態において、ＡはＣ２−６アルキレンであり、Ｘは−Ｏ−であり、かつＲ３は−Ｈもしくは−ＣＨ３である。
【００２６】
さらなる実施形態において、ｍは１であり、Ｙ’はＨであり、かつＹは、単糖、または２〜１２の単糖の単位を含む直鎖のもしくは分岐したオリゴ糖、好ましくは単糖、二糖または三糖である。
【００２７】
本発明の方法において、多糖とエチレン性不飽和アルコールもしくはグリコシドとの反応は、グリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼから選択される酵素によって触媒される。典型的には、酵素は、触媒する反応、つまり、その反応中に関与する基質に関して高い特異性を示す。
【００２８】
グリコシドヒドロラーゼとしても知られている酵素のタイプである、グリコシダーゼは、Ｏ−グリコシド化合物およびＳ−グリコシド化合物の加水分解を触媒することができる酵素である。さらに、グリコシダーゼは、反応の平衡位置が逆転されている加水分解の逆反応を通じたグリコシド結合の形成、あるいは、グリコシド部位が、１つのグリコシド、すなわち、ドナーグリコシド（donor glycoside）から、他のグリコシド、すなわち、アクセプターグリコシド（acceptor glycoside）に転移されるグリコシル転移を触媒し、新たなグリコシドを形成するために使用され得る。グリコシダーゼは、酵素分類番号ＥＣ３．２．１．ｘに割り当てられている。
【００２９】
グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシド部位が、１つのグリコシド、すなわち、ドナーグリコシドから、他のグリコシド、すなわち、アクセプターグリコシドに転移され、新たなグリコシドを形成する反応である、グリコシル転移を触媒することができる酵素である。グリコシルトランスフェラーゼは、転移されるグリコシド部位がヘキソースであるグリコシル転移を触媒するヘキソシルトランスフェラーゼを含む。ヘキソシルトランスフェラーゼは、酵素分類番号ＥＣ２．４．１．ｘに割り当てられている。
【００３０】
酵素は、精製された形態でか、高められた濃縮物としてか、または粗製の酵素調製物として使用されていてもよい。
【００３１】
本発明の方法において存在するグリコシダーゼは、アミラーゼ、セルラーゼ、グルコシダーゼおよびガラクトシダーゼからなる群から選択されることが適切である。
【００３２】
α−アミラーゼは、酵素分類番号ＥＣ３．２．１．１を有する酵素であり、グリコゲナーゼ、エンドアミラーゼ、タカ−アミラーゼＡまたは１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼとしても知られている。α−アミラーゼは、例えば、デンプンおよびグリコゲンなどの、３またはそれより多い（１→４）−α−結合されているＤ−グルコース単位を含んだ多糖類中の（１→４）−α−Ｄ−グルコシド連鎖の内部加水分解を触媒し、それにより、α−配置における還元基を離すことができる。
【００３３】
β−アミラーゼは、酵素分類番号ＥＣ３．２．１．２に割り当てられている酵素であり、サッカロゲンアミラーゼ、グリコゲナーゼまたは１，４−α−Ｄ−グルカンマルトヒドロラーゼとしても知られている。β−アミラーゼは、例えば、デンプンおよびグリコゲンなどの多糖類中の（１→４）−α−Ｄ−グルコシド連鎖の加水分解を触媒し、それにより、多糖類鎖の非還元末端から逐次β−マルトース単位を離すことができる。
【００３４】
セルラーゼは、酵素分類番号ＥＣ３．２．１．４に割り当てられている酵素であり、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、β−１，４−エンドグルカンヒドロラーゼ、セルラーゼＡ、セルロシンＡＰ、エンドグルカナーゼＤ、アルカリセルラーゼ、セルラーゼＡ３、セルデキストリナーゼ、９．５セルラーゼ、アビゼラーゼ、パンセラーゼＳＳまたは１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼとしても知られている。セルラーゼは、セルロース、リケニンおよび穀類のβ−Ｄ−グルカンの（１→４）−β−Ｄ−グルコシド結合、ならびに１，３−結合も含むβ−Ｄ−グルカン中の１，４−結合の内部加水分解を触媒することができる。
【００３５】
α−グルコシダーゼは、酵素分類番号ＥＣ３．２．１．２０に割り当てられている酵素であり、マルターゼ、グルコインベルターゼ、グルコシドスクラーゼ、マルターゼグルコアミラーゼ、α−グルコピラノシダーゼ、グルコシドインベルターゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、α−グルコシドヒドロラーゼまたはα−１，４−グルコシダーゼとしても知られている。α−グルコシダーゼは、非還元（１→４）−結合された末端のα−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒し、それにより、α−Ｄ−グルコースを離すことができる。
【００３６】
β−グルコシダーゼは、酵素分類番号ＥＣ３．２．１．２１に割り当てられている酵素であり、ゲンチオビアーゼ、セロビアーゼ、エムルシン、エラテラーゼ、アリール−β−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−グルコシドグルコヒドロラーゼ、アルブチナーゼ、アミグダリナーゼ、ｐ−ニトロフェニルβ−グルコシダーゼ、プリメベロシダーゼ、アミグダラーゼ、リマラーゼ、サリチリナーゼまたはβ−１，６−グルコシダーゼとしても知られている。β−グルコシダーゼは、末端の非還元β−Ｄ−グルコシル残基の加水分解を触媒し、それにより、β−Ｄ−グルコースを離すことができる。
【００３７】
α−ガラクトシダーゼは、酵素分類番号ＥＣ３．２．１．２２に割り当てられている酵素であり、メリビアーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡまたはα−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼとしても知られている。α−ガラクトシダーゼは、ガラクトースのオリゴ糖およびガラクトマンナンを含む、α−Ｄ−ガラクトシド中の末端の非還元α−Ｄ−ガラクトース残基の加水分解を触媒することができる。
【００３８】
β−ガラクトシダーゼは、酵素分類番号ＥＣ３．２．１．２３に割り当てられている酵素であり、ラクターゼ、β−ラクトシダーゼ、マキシラクト、ヒドロラクト、β−Ｄ−ラクトシダーゼ、Ｓ２１０７、ｌａｃｔｏｚｙｍ、トリラクターゼ、β−Ｄ−ガラクタナーゼ、ｏｒｙｚａｔｙｍまたはｓｕｍｉｋｌａｔとしても知られている。β−ガラクトシダーゼは、β−Ｄ−ガラクトシド中の末端の非還元β−Ｄ−ガラクトース残基の加水分解を触媒することができる。
【００３９】
本発明の方法において存在するグリコシルトランスフェラーゼは、例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼまたはデキストランスクラーゼといった、ヘキソシルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼであってもよい。
【００４０】
シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼは、酵素分類番号ＥＣ２．４．１．１９に割り当てられている酵素であり、バシラス−マセランスアミラーゼ（Bacillus macerans amylase）、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルコトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、ｋｏｎｃｈｉｚａｉｍｕ、環化α−１，４−グルカン４−グリコシルトランスフェラーゼ、ＢＭＡ、ＣＧＴａｓｅ、中性シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（neutral−cyclodextrin glycosyltransferase）または１，４−α−Ｄ−グルカン４−α−Ｄ−（１，４−α−Ｄ−グルカノ）−トランスフェラーゼとしても知られている。シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼは、（１→４）−α−Ｄ−グルコシド結合の加水分解および形成、特に、多糖類から環状マルトデキストリンの形成ならびに直鎖のオリゴ糖の不均化反応を触媒することができる。
【００４１】
デキストランスクラーゼは、酵素分類番号ＥＣ２．４．１．５に割り当てられている酵素であり、スクロース６−グルコシルトランスフェラーゼ、ＳＧＥ、ＣＥＰ、スクロース−１，６−α−グルカングルコシルトランスフェラーゼまたはスクロース：１，６−α−Ｄ−グルカン６−α−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼとしても知られている。デキストランスクラーゼは、以下の反応：
スクラーゼ  ＋  [(１→６)−α−Ｄ−グルコシル]n  ＝  Ｄ−フルクトース＋[(１→６)−α−Ｄ−グルコシル]n+1
を触媒することができる。
【００４２】
酵素は、反応混合物中に溶解されていてもよく、あるいは該反応混合物と接触する固体担体上に固定されていてもよい。酵素を固定する場合、酵素は不活性担体に付着させる。適切な担体材料は、当該技術分野において知られている。適切な担体材料の例として、粘土、粘土鉱物、例えば、カオリナイト、珪藻土、パーライト、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換材料、合成高分子、例えば、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびにポリオレフィン、例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレンが挙げられる。担体に結合された酵素を製造するために、担体材料は、通常、微粉の形態で使用され、その際、多孔質形態が好ましい。担体材料の粒度は、通常、５ｍｍを超えず、特に２ｍｍを超えない。さらに、適切な担体材料は、アルギン酸カルシウムおよびカラゲナンである。酵素は、グルタルアルデヒドによって直接結合されていてもよい。固定化の方法は、当該技術分野において広く知られている（例えば、J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim）。
【００４３】
酵素的な触媒反応は、バッチ式、半バッチ式または連続的に実施され得る。反応物は反応の開始時に供給させてもよく、あるいは順次、半連続的もしくは連続的のいずれかで供給させてもよい。本発明の方法で必要とするグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの触媒量は、温度、溶剤および基質の量などの反応条件に依存する。
【００４４】
反応は、緩衝液などの水性媒体中で行われ得る。緩衝液は、反応混合物のｐＨを効果的な酵素触媒反応に好適である値に調整する。典型的に、ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ９の範囲であり、例えば、約ｐＨ５〜約ｐＨ７の範囲である。適切な緩衝液は、酢酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）およびリン酸塩の緩衝液を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
場合により、反応は、水と水混和性有機溶剤の、水対有機溶剤の質量比が０．１：１〜９：１、例えば１：１〜３：１である溶剤混合物の存在下で行われる。有機溶剤は、第一級アルコールまたは第二級アルコールではなく、それ故、多糖に対して非反応性である。適切な有機溶剤は、アルカノン、アルキルニトリル、第三級アルコールおよび環状エーテル、ならびにそれらの混合物を含み、例えば、アセトン、アセトニトリル、ｔ−ペンタノール、ｔ−ブタノール、１，４−ジオキサンおよびテトラヒドロフラン、ならびにそれらの混合物を含む。一般的に、有機溶剤の使用は好ましくない。
【００４６】
「水混和性有機溶剤」とは、水対使用される有機溶剤の質量比で水と一緒に均質な混合物を形成する有機溶剤を意味すると理解される。
【００４７】
反応物、すなわち、多糖および式ＩＩのエチレン性不飽和化合物の濃度および割合は最適な反応条件に順応されていてもよい。例えば、初期の多糖の濃度は、反応混合物の全容量に関して、１０〜４００ｇ／ｌの範囲であってもよく、例えば５０ｇ／ｌである。
【００４８】
反応温度は、適用される特定の酵素に依存し得る最適な反応条件に順応させることができる。反応は、適切には、反応混合物の凝固点および酵素の変性温度の間の温度で行われ得る。変性温度に達すると、酵素の触媒活性は失われる。例えば、反応は、０℃〜８０℃、例えば、３０℃〜６５℃の範囲の温度で実施させることができる。そのプロセスは、反応物と生成物との間で平衡に達するまで進行させることができるが、早い段階で停止させることもできる。通常の、プロセス時間は、１時間〜９６時間の範囲である。
【００４９】
本発明の方法は、製造された式Ｉのエチレン性不飽和グリコシドを回収する工程をさらに含むことができる。「回収」の用語は、反応混合物から該化合物を抽出、採取、単離または精製することを含む。該化合物の回収は、慣例的な樹脂による処理（例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）、慣例的な吸着剤による処理（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）、ｐＨの変更、溶剤抽出（例えば、アルコール、エチルアセテート、ヘキサンなどの慣例的な溶剤を用いる）、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、ｐＨ調整、凍結乾燥などを含む当該技術分野で知られているあらゆる慣例的な単離または精製方法によって実施し得るが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
単離された生成物の性質および純度は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、分光分析（例えば、ＩＲ、ＵＶ、ＮＭＲ分光法）、カラー方式、ＮＩＲＳまたは酵素分析法などの公知の技術により測定させることできる。
【００５１】
本発明の実施例を以下に記載するが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
実施例１：セルロースから２−（β−グルコシルオキシ）−エチルアクリレートのセルラーゼ触媒合成
０．５ｇのセルロースを、２−ヒドロキシエチルアクリレート１ｍｌを含むｐＨ５．０の５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌ中で懸濁させた。反応は、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）からのセルラーゼ０．０１０ｇ（６０Ｕ）の添加によって開始した。反応混合物を、３７℃で３日間攪拌した。生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（クロロホルム／メタノール  ４／１（ｖ／ｖ）、Ｒｆ０．５５）によって検出した。未反応のセルロースを濾過によって除去し、生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出液：クロロホルム／メタノール  ７／１（ｖ／ｖ））によって精製した。目的とする生成物を含むフラクションを貯留し、溶剤を回転蒸発によって除去した。収量：９．４ｍｇ（全セルロースの２％）。
【００５３】
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【００５４】
0005933542.tif 000009
【００５５】
ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓ）：計算値：３０１．０９（Ｃ１１Ｈ１８Ｏ８Ｎａ）；実測値：３０１．２５。
【００５６】
実施例２：デンプンから２−（α−マルトシルオキシ）−エチルアクリレートのアミラーゼ触媒合成
５．０ｇの可溶性デンプンを、２−ヒドロキシエチルアクリレート５０ｍｌを含むｐＨ５．０の５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液５０ｍｌ中で懸濁させた。反応は、バシラス−ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）からのマルトース生成アミラーゼ１０ｍｌ（３２０００ＭＡＮＵ）の添加によって開始した。反応混合物を、５５℃で４日間攪拌した。生成物をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール  ２／１（ｖ／ｖ）、Ｒｆ０．４５）によって検出した。残留した２−ヒドロキシエチルアクリレートを、ジエチルエーテルを用いた抽出によって除去した。水層を、３０℃で回転蒸発によって濃縮した。未反応のデンプンをイソプロパノール中で沈殿させ、濾過によって除去した。濾液を、３０℃で回転蒸発によって濃縮し、生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出液：クロロホルム／メタノール  ３／１（ｖ／ｖ））によってさらに精製した。目的とする生成物を含むフラクションを貯留し、溶剤を回転蒸発によって除去した。収量：０．４０８ｇ（８％）純度：＞８５％。
【００５７】
0005933542.tif 000010
【００５８】
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【００５９】
ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓ）：計算値：４６３．１４２２（Ｃ１７Ｈ２８Ｏ１３Ｎａ）；実測値：４６３．３３３３。
【００６０】
実施例３：デンプンから２−（β−マルトリオシルオキシ）−エチルアクリレートのシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ触媒合成
０．６３４ｇの２−（β−グルコシルオキシ）−エチルアクリレートおよび１．０ｇの可溶性デンプンを、０．０１Ｍの塩化カルシウムおよびＭＥＨＱ０．００４ｇを含むｐＨ７．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１０ｍｌ中に溶解させた。反応は、バシラス−マセランス（Bacillus macerans）からのシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ０．１ｍｌ（６０Ｕ）の添加によって開始した。反応混合物を、６０℃で１．５時間攪拌した。生成物をＴＬＣ（アセトニトリル／水／アンモニア  ６／３／１（ｖ／ｖ）、Ｒｆ０．２７）によって検出し、かつカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出液：酢酸エチル／メタノール  ４／１（ｖ／ｖ））によって精製した。目的とする生成物を含むフラクションを貯留し、溶剤を回転蒸発によって除去した。生成物：α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−β−グルコピラノシル−オキシエチルアクリレート。収量：０．２４１ｇ（３８質量％）純度：９５％。
【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓ）：計算値：６２５．１９５０（Ｃ２３Ｈ３８Ｏ１８Ｎａ）；実測値：６２５．１９５７。