(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プトレシンＮＨ２（ＣＨ２）４ＮＨ２、スペルミンＨ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２、スペルミジンＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２、またはカダベリンＮＨ２（ＣＨ２）５ＮＨ２と、粒子の形態の天然由来の多糖とを共有結合させることによって得られる１またはそれを超える錯体生成基を有する多糖を含む組成物の製造方法であって、ここに、該錯体生成基の全てまたはいくらかが、９９ｍＴｃと錯体を形成し、該製造方法が、
ｉ）粒子の形態の天然由来の多糖を、過ヨウ素酸塩と接触させる工程；
ｉｉ）酸化多糖粒子を、プトレシン、スペルミン、スペルミジンまたはカダベリンから選択される錯体生成化合物と接触させる工程；
ｉｉｉ）任意に、工程ｉｉ）で得られた多糖粒子を、還元剤と接触させる工程；および
ｉｖ）工程ｉｉ）またはｉｉｉ）で得られた多糖粒子を９９ｍＴｃと接触させる工程を含むことを特徴とする該製造方法。
【請求項２】
工程ｉｖ）を、スズ、ホウ酸塩およびその誘導体またはアスコルビン酸型の還元剤の存在下で行なうことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
プトレシンＮＨ２（ＣＨ２）４ＮＨ２、スペルミンＨ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２、スペルミジンＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２、またはカダベリンＮＨ２（ＣＨ２）５ＮＨ２と、粒子の形態の天然由来の多糖とが共有結合してなる１またはそれを超える錯体生成基を有する多糖を含み、該錯体生成基の全てまたはいくらかが９９ｍＴｃとの錯体を形成してなる組成物。
【請求項４】
粒子サイズが１０ｎｍ〜２００μｍである請求項３記載の組成物。
【請求項５】
多糖が、植物または微生物起源である請求項３または４記載の組成物。
【請求項６】
多糖が、デンプン、セルロース、アミロペクチン、アミロースまたはアガロース、それらの誘導体、およびそれらの２または複数の混合物から選択される請求項５記載の組成物。
【請求項７】
医薬的に許容される賦形剤をさらに含む請求項３〜６のいずれか１記載の組成物。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか１記載の組成物を含むヒトまたは動物薬局方の診断用または医薬組成物。
【請求項９】
医学または獣医学画像化用の診断組成物を製造するための請求項３〜７のいずれか１記載の組成物の使用。
【請求項１０】
シンチグラフィー画像化のための請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
肺塞栓症のシンチグラフィー診断のための請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
センチネルリンパ節の検出のための、またはリンパシンチグラフィーのための請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
医学画像化によって１またはそれを超える器官を可視化する診断組成物を製造するための請求項３〜７のいずれか１記載の組成物の使用。
【請求項１４】
画像化される器官が、肺、肝臓、脾臓、骨髄またはリンパ節である請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
内部放射線療法による患者または動物における癌の治療用の医薬組成物を製造するための、請求項３〜７のいずれか１記載の組成物の使用。
【請求項１６】
リンパ節または肝臓または脾臓腫瘍の治療のための請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラフト化多糖に基づく新規医薬組成物、ならびに医学画像化、特にシンチグラフィー、および内部放射線療法におけるその使用に関する。
本願は、２００７年７月２６日に出願された米国仮出願第６０／９５２０９４号の利益を主張し、該出願の内容を全ての目的のためにここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【背景技術】
【０００２】
放射性元素のベクター粒子は、医薬および生物学の分野において長期にわたって用いられており（一般的概念については、Ｈａｅｆｅｌｉ、２００１参照）、例えば、充分なサイズ（数十マイクロメートル）の非吸収性ミクロ粒子による組織血流量の推定に用いられ、該ミクロ粒子は、それらが血管網状構造に注入された際に最初に遭遇する毛細血管網状構造に隔離される。該粒子を、例えば、ガラス粒子の形態で用いて（Ｈａｅｆｅｌｉら、１９９９）、特定組織（特に、腫瘍組織）を電離放射線に曝露し得るが、該粒子は吸収性でないので、診断レベル、および多くの場合に治療レベル（標的組織の全虚血が望ましくない場合）での、日常的生体内適用を行なうことができない。
【０００３】
最も一般的な、ヒトにおけるミクロ粒子の生体内使用は、肺塞栓症のシンチグラフィー診断における使用である。この一般的な疾患（米国において毎年約６５０，０００人の新規罹患者）は、血栓（最も多くは下肢からの血栓）によるものであり、血栓が静脈系から移動し、右心を通って、肺毛細血管を塞ぐ。塞栓が重度である場合、心力不全のリスクがある。大きい塞栓に有効かつそれを予防することを目的として、広範囲の抗凝血治療計画を実施するために、小さな塞栓を早期に検出する必要がある。Ｘ線スパイラルコンピュータ断層撮影法（Ｘ線スキャナ）は、近年、広く行きわたっている方法であるが、末梢塞栓につき、その性能は低い。さらに、胸部が曝露される電離放射線量は、乳癌を発症させ得る。従って、現在、灌流シンチグラフィーはその存在価値を保持し、換気はエアロゾルまたは放射性気体によって評価される。
【０００４】
歴史的には、吸収性であることが既知である粒子の最初の使用の１つは、９９ｍＴｃで標識した酸化鉄粒子を用いる肺灌流シンチグラフィーであった（米国第３９６２４１２号および米国第４０５７６１６号）。Ｆｅ２＋鉄イオンを用いるこの方法は、過テクネチウム酸塩の減少、ならびに粒子のコアを形成する酸化および水酸化鉄における高レベルの結合を可能にした。しかしながら、この種の技術の限界は、約数十マイクロメートルの均一なサイズを得ることが困難なことであった。さらに、標識用キットの形態で用いられる該調製物の凍結乾燥の方法は、繊細であった。
【０００５】
該粒子の使用に対する別法は、タンパク質、特に卵アルブミンまたは血清アルブミン（米国第４０２４２３３号）を、粒子マトリックスとして用いることである（米国第３６６３６８５号）。均一なサイズを得る方法（例えば、米国第６７０９６５０号）があるが、それは多くの場合、製造につき比較的高レベルの複雑性を伴い、かなりのレベルのバッチ間変動を生じる。さらに、ヨウ素およびテクネチウムを用いる標識化は、比較的簡単な実績のある方法である（例えば、米国第４４１０５０７号）。これらの製品は、現在、臨床診療において肺塞栓症の診断に広く用いられている。しかしながら、これらの粒子は、ヒトにおける使用、特に、静脈注射後の肺灌流シンチグラフィーにおける使用において、３つの重要な制限：
−原位置分解動態が、多くの場合、４時間超の比較的長時間にわたって持続する。この持続時間は、血栓溶解剤での静脈処置における短い持続時間（１〜２時間）より低い好適性である（該静脈処置は早期診断を可能にし、次いで、処置直後の引き続いての有効性検査を可能にする）；
−これらの粒子は免疫原になる場合があり、これはヒト由来のタンパク質を用いるのが好ましい理由である；
−これらの粒子がヒトまたは動物起源である場合、これらの配合物は全て、感染病原体、特にウイルス感染病原体（ＨＩＶ、肝炎ウイルス等）およびプリオン（クロイツフェルト−ヤコブ病などに関与している非通常伝染性物質）を伝染させるリスクを潜在的に有し、この伝染は現在予防するのが非常に難しい。安全性を増加させる１つの方法は、６ヶ月間保存されたアルブミン溶液を用いて粒子を製造することだけである。追加コストがかかる上に、この予防措置は完全には信頼できない、なぜなら、献血者の１人が抗体陽転を受ける場合があり、または後に疾患を申告する場合があり、従って、数年の沈黙潜伏期後にキャリア（および潜在的に汚染物質）であることが見出される場合があるからである（非日常伝染性物質の場合）
を有する。
【０００６】
ある研究チームは、非毒性であるという特有の利点を有するリポソームの使用を提案している。しかしながら、凍結乾燥および再構成の際に安定な大きいリポソーム（数十マイクロメートル）を製造することは極めて困難である。さらに、リポソームを標識化する３つの主要な方法：放射性生成物を小胞の内部に組み込む（製造中、または内部で親水性になる親油性生成物を用いる；例えば、Ｉ’ＨＭＰＡＯ−９９ｍＴｃ）；脂質二重層の脂肪族コアを疎水性生成物の保持系として用いる（例えば、１１１Ｉｎ−オキシン）；または、Ｉ’ＨＹＮＩＣ−９９ｍＴｃの場合のような表面グラフト化錯体生成剤がある。前記の全ての場合に、高度の標識化を達成することは、リポソームの不安定性により困難である。
【０００７】
これらの制限を回避するために、完全合成生分解性ポリマーを用いることが提案されている（ＥＳ２０９６５２１、Ｄｅｌｇａｄｏ  Ａ．ら、２０００）。しかしながら、筆者自身の見解においてさえ、ポリエステルの使用は、安定な標識化、ならびに凍結乾燥および放出動態の高レベルの再現性を達成することが困難である。
【０００８】
有益なポリマーおよび粒子を得る補足的方法は、天然または人工の多糖を用いることである（米国第３６６３６８５号、米国第３７５８６７８号）。いくつかの該多糖の植物または微生物起源は、動物界からの病原体の感染がないことを確実にする。それらの製造の容易性、および（それらの多くの）低コストに加えて、それらの豊富な化学的作用が、それらの生分解過程を充分に制御し得るものにする。
【０００９】
従って、仏国特許出願第２２７３５１６号は、アミロペクチンマイクロキャリアビーズの使用を開示し、該ビーズは、エピクロロヒドリンによって架橋され、肺灌流シンチグラフィー用に９９ｍＴｃで標識化されている。しかしながら、アミロペクチンヒドロキシル基は、テクネチウムとの弱い結合を形成し、安定な標識化を達成できない。さらに、架橋に用いられているエピクロロヒドリンは、高毒性および変異原性であることが既知である。
【００１０】
また、少なくとも１つのイオウ原子を含むアミン錯体生成系によって、放射性元素によりグラフト化されたデンプン粒子が開示されている（仏国第２７９７７６９号）。錯体生成基による放射性元素の錯化速度は、比較的満足のいくものと考えられるが、記載されている特定配合物は、非常に速い分解速度（１０分未満）を示し、これは断層撮影法につき制限要素である。分解速度は、選択されたコーンスターチの酸化速度およびグラフト化速度に部分的に依存すると考えられる。さらに、それらは制限された貯蔵安定性を有すると考えられる。最後に、この文書に記載されている錯体生成基は、いくらかの段階の化学合成を必要とし得る比較的複雑な構造であり、これは放射性医薬組成物の毒性のリスク、およびその製造コストを増加させ得る。毒物学的レベルにおいて、研究された化合物の分解についての代謝経路は特定されておらず、潜在的に危険な二次化合物源になり得る。
【００１１】
より一般的には、放射性原子が配置された多糖ポリマーは、血管および／または間隙領域のための放射活性標識剤（９９ｍＴｃで標識されたデキストラン）として（デキストランの分子量の関数として、Ｋｅｌｌａｗａｙ  Ｉ．Ｗ．ら、１９９５）；透過性指示薬として（Ａｋｇｕｎ  Ａら、２００５）またはセンチネルリンパ節の検出のため（Ｐａｉｖａ  Ｇ．Ｒ．ら、２００６）；内部放射線治療用途において放射性原子の量を増加させる物質として（タンパク質に結合させた１３１Ｉでヨード化したデキストラン、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ａ．ら、１９９２）；さらには、ペプチドまたは抗体による活性ベクトル化のための使用において信号対雑音比を増加させるために、放射性トレーサーの腎クリアランスを増加させる物質として（９９ｍＴｃで標識されたデキストラン、Ｌｉｎｅ  Ｂ．Ｒ．ら、２０００）用いられた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
グラフト化多糖に基づく新規医薬組成物、ならびに医学画像化、特にシンチグラフィー、および内部放射線療法におけるその使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の目的によれば、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【００１４】
【化１】
0005946241.tif 000002
【００１５】
［式中、式（Ｉ）および（ＩＩ）において、
Ｒ０は、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を表わし；
Ｒ１、Ｒａは、同じかまたは異なり、水素原子、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を表わし、それらは、１またはそれを超えるハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アルキル、アルケニル、オキソ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ０、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アミノ、ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アミノ、ホスフィン、ホスフェート、ホスホネート、ジホスホネート基または非硫化ペプチド基によって同様にまたは異なるように任意に置換されてもよく；
または、Ｒ１、Ｒａは、同じかまたは異なり、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ０、オキシム基、非硫化ペプチド基、ホスホネート基またはジホスホネート基を表わし；
Ｒｂは、水素原子、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を表わし、それらは、１またはそれを超えるハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アルキル、アルケニル、オキソ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ０、ヒドロキシル、アルコキシ、チオ、アルキルチオ、ホスフィン、ホスフェート、ホスホネート、ジホスホネート基、またはペプチド基によって同様にまたは異なるように任意に置換されてもよく；
【００１６】
または、Ｒｂは、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ０、オキシム基、ペプチド基、ホスホネート基またはジホスホネート基を表わし；
Ｌ１は、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキレン基、直鎖または分岐鎖Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン基、アリーレンまたはビスアリーレン基を表わし、該基Ｌ１は、ｎ＞１につき同じかまたは異なってよく、１またはそれを超える酸素原子によって任意に中断されてもよく、ｎ＞１につき、１またはそれを超えるハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アルキル、アルケニル、オキソ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ０、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アミノ、ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アミノ、ホスフィン、ホスフェート、ホスホネート、ジホスホネート基または非硫化ペプチド基によって同様にまたは異なるように置換されてもよく；
Ｌ２は、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキレン基、直鎖または分岐鎖Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン基、アリーレンまたはビスアリーレン基を表わし、該基Ｌ２は、ｎ＞１につき同じかまたは異なってよく、１またはそれを超える酸素および／またはイオウ原子で中断されてもよく、ｎ＞１につき、１またはそれを超えるハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アルキル、アルケニル、オキソ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ０、ヒドロキシル、アルコキシ、チオ、アルキルチオ、ホスフィン、ホスフェート、ホスホネート、ジホスホネート基またはペプチド基によって同様にまたは異なるように置換されてもよく；
ｎは１〜６の整数であり、ｍおよびｐは同じかまたは異なり、０、１または２であってよく、ｍおよびｐはそれぞれ好ましくは０を表わし、
前記の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の基の全てまたは一部は、少なくとも１つの多価金属との錯体を形成する］
で示される１またはそれを超える錯体生成基が共有結合した多糖を含む組成物に関する。
【００１７】
これらの組成物は、多価原子の錯化速度の上昇の達成を可能にする点で特に有利であり、これは、患者に投与された放射性医薬組成物の投与量を放射性原子につき減少させ、医学画像化法の画質を向上させ、毒物学的リスクを減少させる。
さらに、これらの組成物は、非常に良好な肺収集を有し、用いられる投与量において毒性でなく、生物排除の既知の方法によって易生分解性であり、診断ケースの形態で包装し得る。
【００１８】
本発明による多糖は、好ましくは球状粒子、特にミクロ粒子またはナノ粒子の形態である。
粒子サイズは、毛細血管遮断用途（例えば、肺塞栓症のシンチグラフィー診断のための肺灌流シンチグラフィー）において、１０ｎｍ〜２００μｍ、好ましくは１０〜１００μｍ、より好ましくは約４０μｍであってもよい。ナノメートル粒子、すなわち、１μｍ未満のサイズの粒子（特に、１０〜５００ｎｍのサイズの粒子、特に約４０〜８０ｎｍのサイズの粒子）が、本発明の組成物の組織内投与に特に有用であり、該組織内投与は、例えば、センチネル神経節の存在の検出および／またはその可視化のため、リンパシンチグラフィーのため、静脈注射後の骨髄またはリンパ性ガングリオンの画像形成のため（標識コロイドシンチグラフィー）、または内部放射線治療における該多糖による組織の照射のために行なわれる。
【００１９】
マイクロメートル粒子、すなわち、約１μｍおよびそれを超える（約１０μｍまで）サイズの粒子は、静脈内投与することができ、肝臓、骨髄等の単核食細胞系を医学画像化によって可視化するか、または内部放射線療法によって肝臓または脾臓腫瘍を治療するのに特に有用である。
【００２０】
本発明によって用いることができる多糖は、好ましくは天然由来、特に植物または微生物由来である。その例は、特に、デンプン、セルロース、アミロペクチン、アミロース、アガロース、プルラン、キトサンまたはデキストランおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの２またはそれを超える混合物であり；デンプンが特に好ましい。
【００２１】
有利には、多糖は、タンパク質、例えば、ヒトアルブミンおよびゼラチン、一般的にブタゼラチンに基づくものと比較して、放射性医薬組成物の微生物学的リスクを減少させる。他の利点は、原位置での分解動態を、多糖の酸化またはグラフトの速度によって変更できることであり、タンパク質を用いてこれを再現的に行なうのは困難である。
【００２２】
デンプンは、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモまたはアワデンプン等、またはヒドロキシエチルアミドン（ＨＥＳ）等の誘導体であってよく、それは、静脈注射後にゆっくり分解して、循環血液量減少性ショックの場合に血管充填溶液として用いることができる。この生成物は、補体を活性化せず、従って、それによって生じる二次作用を生じない。
【００２３】
好ましくは、錯体生成基は、Ｒ１および／またはＲａが水素原子を表わす式（Ｉ）の基である。
好ましくは、ｎは１、２または３である。
好ましくは、数値ｍまたはｐの少なくとも１つは０を表わすか、またはｍおよびｐがそれぞれ０を表わす。
好ましくは、Ｌ１はアルキレン基、特にＣ２〜Ｃ５アルキレン基である。
【００２４】
式（Ｉ）の特に好ましい錯体生成基の例は、特に、プトレシンＮＨ２（ＣＨ２）４ＮＨ２、スペルミンＨ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２、スペルミジンＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２、またはカダベリンＮＨ２（ＣＨ２）５ＮＨ２と、酸化多糖との共有結合によって得られる錯体生成基である。
これらの錯体生成基は、生体ポリアミン、すなわち生物媒体に存在するポリアミンから誘導され、これらの生成物の分解方法が周知の故に組成物の毒性リスクを減少させるので、特に好都合である。さらに、これらの内因性ポリアミンは、低コストで商業的に入手可能である。
【００２５】
錯体生成基の割合は、多糖の単糖単位に基づいて０．１〜２００％、好ましくは１０〜１００％であってもよい。
組成物に存在する多価金属は、原子番号２０〜３３、３８〜５１、５６〜８４、または８８〜１０３を有する金属元素から選択できる。
【００２６】
多価金属の非限定的な例は、テクネチウムの放射性同位元素、例えば、９９ｍＴｃ、９４Ｔｃまたは９４ｍＴｃ；レニウムの放射性同位元素、例えば、１８８Ｒｅまたは１８６Ｒｅ；銅の放射性同位元素、例えば、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６４Ｃｕまたは６７Ｃｕ；ストロンチウムの放射性同位元素、例えば、８９Ｓｒ；インジウムの放射性同位元素、例えば、１１１Ｉｎまたは１１３Ｉｎ；サマリウムの放射性同位元素、例えば、１５３Ｓｍ；スズの放射性同位元素、例えば、１１３ｍＳｎ；スカンジウムの放射性同位元素、例えば、４４Ｓｃ；イットリウムの放射性同位元素、例えば、９０Ｙまたは８６Ｙ；ガリウムの放射性同位元素、例えば、６７Ｇａまたは６８Ｇａ；ガドリニウムの放射性同位元素；またはルテチウムの放射性同位元素であり；９９ｍＴｃが特に好ましい。
【００２７】
好ましくは、本発明の組成物は、医薬的に許容される媒体または賦形剤も含む。
好ましくは、該組成物は、本発明の式（Ｉ）または（ＩＩ）の錯体生成基を介して、放射性元素で標識された有効量の多糖を含有する。
【００２８】
本発明の組成物は、好ましくは、医薬用および／または診断用組成物である。
本発明の医薬組成物は、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、組織内、脳内、脊髄内または肺内投与；ＯＲＬスフェア、眼、膣または直腸粘膜を介した投与；経腸的（胃通過）投与およびエアロゾルによる投与を意図した形態で与えることができる。
従って、該組成物は、溶質、溶液または注射可能懸濁液の形態、または単回用量もしくは多回用量粉末もしくはバイアルの形態で与えられる。
非経口使用の場合、水、水溶液、生理血清および等張液が、用いるのに最も好都合な媒体である。
【００２９】
本発明の組成物は、それ自体で既知の、かつ／または当業者の知識の範囲内の、任意の方法、特に、ＬａｒｏｃｋによってＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂ．，１９８９に記載されている方法の適用または適合によるか、または下記の実施例に記載されている方法の適用または適合によって製造し得る。
【００３０】
従って、さらなる目的によれば、本発明は本発明組成物の製造方法にも関し、該方法は下記の工程：
ｉ）多糖を、制御酸化剤と接触させる工程；
ｉｉ）酸化多糖を、式（Ｉａ）または（ＩＩａ）：
【００３１】
【化２】
0005946241.tif 000003
【００３２】
［式中、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ０、Ｒ１、Ｒａ、Ｒｂ、ｍ、ｎおよびｐは、前記のように定義される］
の化合物と接触させて、多糖に共有結合した式（Ｉ）または（ＩＩ）の錯体生成基を含む多糖を得る工程；
ｉｉｉ）任意に、得られた多糖を還元剤と接触させる工程；
ｉｖ）得られた多糖を、多価金属塩と接触させる工程
を含む
【００３３】
本発明の方法は、一般的に、水中において周囲温度で行なわれる。
用い得る制御酸化剤の例は、特に、過ヨウ素酸塩、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムである。
還元剤の例は、特に、水素化ホウ素ナトリウムである。
【００３４】
いずれの特定理論にも拘束されるものではないが、多糖の制御酸化は、カルボニル官能基の形成を生じ、該官能基は、式（Ｉａ）または（ＩＩａ）の化合物のそれぞれのＨＮ−またはＨＳ−基と反応する。
例えば、デンプンは、制御酸化後に、アルデヒド官能基を形成し、該官能基はプトレシン、スペルミン、スペルミジンまたはカダベリンのＨ２Ｎ−基と反応して、特に還元後に、イミン共有結合（−ＣＨ＝Ｎ−）を形成することができる。
【００３５】
得られた多糖を多価金属塩と接触させる工程ｉｖ）（標識化反応）は、９９ｍＴｃを用いて標識化を有利に行なう場合に、スズ、ホウ酸塩およびその誘導体またはアスコルビン酸型の還元剤の存在下か、または、特にテクネチウムの場合に放射性多価金属塩を有効に還元するいずれかの他の手段によって行なうことができる。
式（Ｉａ）または（ＩＩａ）［式中、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ０、Ｒ１、Ｒａ、Ｒｂ、ｍ、ｎおよびｐは、前記の式（Ｉ）または（ＩＩ）と同意義である］の誘導体は、商業的に入手可能であるか、または文献に記載の方法に基づいて調製される。
本発明の方法は、得られた組成物を分離する後続工程も含んで成ってよい。
【００３６】
さななる目的によれば、本発明は、特に、医用、ヒト用または獣医学用画像化、特に、モノフォトニック、バイフォトニックまたはポリフォトニックシンチグラフィー画像化用の診断組成物の製造における前記組成物の使用に関する。
本発明の組成物は、患者または動物における１またはそれを超える器官、例えば、肺、肝臓、脾臓、骨髄またはリンパ節を可視化するのにも特に有用である。
本発明のいくつかの組成物は、センチネルリンパ節を可視化するのにも用い得る。
【００３７】
さらなる目的によれば、本発明組成物は、内部放射線療法による患者または動物の癌の治療用、特にリンパ節または肝臓または脾臓腫瘍の治療用の医薬組成物を製造するのに用い得る。
この文脈において、本発明の組成物は、特に肝臓および／または脾臓、またはリンパ節の、癌性腫瘍を、電離放射線に曝露するのに一般的に用いられる。
【００３８】
さらなる目的によれば、本発明は、前記に定義した多糖に共有結合した１またはそれを超える式（Ｉ）または（ＩＩ）の錯体生成基を含む多糖に関する。
これらの多糖は、実際に、本発明の組成物を製造するのに特に有用である。
本発明は、前記に定義した方法の工程ｉ）〜ｉｉｉ）によって得られる多糖に共有結合した１またはそれを超える式（Ｉ）または（ＩＩ）の錯体生成基を含む多糖にも関する。
【００３９】
前記および本発明の全ての記載で用いられている用語は、特記されない限りは、下記の意味を有するものと理解すべきである。
「多糖」なる用語は、複数の単糖単位、特に１０〜１０００個の単糖の結合によって生じるポリマーを意味する。
本発明によれば、アルキル基は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖飽和炭化水素基である。
直鎖基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル基を包含する。
イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−エチルヘキシル、２−メチルブチル、２−メチルペンチルおよび１−メチルペンチル基は、特に、分岐鎖基、または１またはそれを超えるアルキル基で置換された基として挙げられる。
【００４０】
本発明によるアルコキシ基は、式−Ｏ−アルキルで示される基であり、該アルキルは前記のように定義される。
本発明によるアルキルチオ基は、式−Ｓ−アルキルで示される基であり、該アルキルは前記のように定義される。
アルキレン基は、１〜６個の炭素原子を有する分岐鎖または直鎖の二価炭化水素基である。
アルケニレン基は、直鎖または直線の二価炭化水素基であり、１またはそれを超えるエチレン不飽和を含む。アルケニレン基は、特に、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−基を含む。
アリーレンは、６〜１０個の炭素原子を有する二価単環式または二環式芳香族炭化水素基を意味する。アリーレン基は、特に、フェニレンまたはナフチレン基を含む。
ビス−アリーレンは、６〜１０個の炭素原子を有する２個の単環式または二環式芳香族炭化水素基を有する二価の系を意味する。ビス−アリーレン基は、特に、ビスフェニレンまたはビスナフチレン基を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１：フルオレスカミンの存在下に、光学蛍光顕微鏡で観察したデンプン粒子に対するカダベリンの結合。
【図２−３】図２および３：４ＭＢｑの９９ｍＴｃで標識化された２０％酸化デンプン粒子を静脈注射されたラット（前方向撮影）の、注射直後（図２）および１５分後（図３）の典型的シンチグラフィー画像。
【図４−６】図４、５、６：４ＭＢｑの９９ｍＴｃで標識化されたカダベリンに結合した５０％酸化デンプン粒子を静脈注射されたラット（前方向撮影）の、注射後１５分（図４）、３０分（図５）および９０分（図６）の典型的シンチグラフィー画像。
【図７−９】図７、８、９：４ＭＢｑの９９ｍＴｃで標識化されたカダベリンに結合した５０％酸化デンプン粒子を静脈注射されたラット（前方向撮影）の、注射後５分（図７）、１５分（図８）および３０分（図９）の典型的シンチグラフィー画像。
【図１０−１１】図１０および１１：カダベリンとの反応前（図１０）および反応後（図１１）に標識化された５０％酸化デンプンミクロ粒子の、光学顕微鏡（倍率１０倍）で観察された形態特徴。
【図１２】図１２：Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３カウンターで測定した、カダベリンに結合した酸化デンプンミクロ粒子のサイズ分布の例。
【図１３】図１３：最終ミクロ粒子に含有された窒素のパーセンテージに対する、温度（Ｂ１）、反応時間（Ｂ２）、還元剤当量値（Ｂ３）、および最後に、還元時間（Ｂ４）の影響についての試験のグラフ。
【図１４】図１４：カルダベリンとデンプン粒子との結合収率に対する、４つの実験パラメータ（アミン／デンプン当量値；反応のｐＨ；デンプンの酸化のレベル；および反応媒体中のデンプン濃度）の影響を模倣する二次元グラフ試験。
【図１５】図１５：雄性ウィスターラットにおける、９９ｍＴｃで標識化したデンプンミクロ粒子（配合物Ｃ）の静脈注射後に撮影した典型的画像。平面画像（同一ウィンドー処理）を、１２０分間継続する動的試験の１０、２０、６０および１２０分において抜き出した（１８０  ４５秒画像）。
【図１６】図１６：雄性ウィスターラットにおける、９９ｍＴｃで標識化したデンプンミクロ粒子（配合物Ｃ）の静脈注射後に実施した動的シンチグラフィー試験から得た時間−活性曲線の例。
【図１７】図１７：雄性ウィスターラットにおける、９９ｍＴｃで標識化したデンプンミクロ粒子（配合物Ｃ）の静脈注射後に撮影した典型的画像。画像は、注射後１０、２０および９０分で行なった静止シンチグラフィー取得（同一ウィンドー処理）（６００秒静止）と共にＸ線画像化した結果である。
【図１８−２０】図１８、１９および２０：９９ｍＴｃで標識化したデンプンミクロ粒子（配合物Ｃ）の雄性ウィスターラットへの静脈注射後に収集した尿代謝産物の、ゲル透過クロマトグラフィーによる分離。  収集した種々の尿試料を、排除限界１，５００ダルトンを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１５カラムの使用（１８）、排除限界５，０００ダルトンを有するＰ６カラムの使用（１９）、および排除限界１０，０００ダルトンを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０の使用（２０）によって溶出した。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下の実施例は、本発明を例示するが、限定されるものではない。用いた出発物質は、既知の物質であるか、または既知の方法によって調製される物質である。
【００４３】
実施例１：天然ポリアミンに結合したデンプン粒子：フルオレスカミンとの反応による結合の確認
デンプン粒子の制御酸化：
３６〜５０μｍで篩にかけた１０ｇ（グルコース単位０．０５５ｍｏｌに相当）のジャガイモデンプン（ヨーロッパ薬局方のモノグラフに従った天然ジャガイモデンプン）を、水１００ｍＬに分散させた。水１００ｍＬに予め溶解させた過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）０．０２８ｍｏｌ、すなわち６ｇを添加した。その懸濁液を周囲温度で１８時間撹拌した。１８時間後、５０％酸化デンプンの粒子懸濁液を得た。酸化デンプンを、遠心分離によって収集し、次いで、水２００ｍＬで３回濯いだ。
【００４４】
天然ポリアミンへの結合による酸化デンプンの官能化：
濯いだ後、デンプン１ｇ、すなわち、グルコース単位０．００５５ｍｏｌを水６０ｍＬ中でインキュベートし、水１０ｍＬ中の天然ポリアミン（プトレシン、カダベリン、スペルミンおよびスペルミジン）０．００３８５ｍｏｌの溶液、すなわち、０．００７７ｍｏｌのＮＨ２（１．４当量）と、周囲温度で１８時間接触させた。形成されたイミンを安定化するために、ＮａＢＨ４  ０．５６ｇ、すなわち０．０１５ｍｏｌを、改質デンプン懸濁液に撹拌しながら１時間にわたって添加した。次いで、粒子をデカントし、濾過し、水２００ｍＬで３回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。
【００４５】
光学蛍光顕微鏡によるデンプン−アミン結合の確認：
デンプン粒子へのカダベリンの結合を、光学蛍光顕微鏡による観察によって確認し；３ｍｇ／ｍＬフルオレスカミン（Ｃ１７Ｈ１０Ｏ４）溶液１００μＬを、カダベリンで官能化されたデンプン粒子（水３００μＬ中１０ｍｇ）に添加する間に、蛍光錯体が形成された。蛍光顕微鏡で確認されたこの蛍光錯体の形成は、官能化デンプン粒子上の第一級アミン官能基（ＮＨ２）の存在を示し、これは、透明フルオレスカミン上での該アミンの特定反応によるものであり、次いで、該透明フルオレスカミンは緑色がかった黄色に変わり、デンプン／酸化アミン結合の有効性を裏付けている。
【００４６】
実施例２：肝臓および脾臓のシンチグラフィー画像化に用いる放射性トレーサーとしての酸化ジャガイモデンプン粒子
デンプン粒子の制御酸化：
実施例１と同様に、３６〜５０μｍで篩にかけた１０ｇ（グルコース単位０．０５５ｍｏｌに相当）のジャガイモデンプン（ヨーロッパ薬局方のモノグラフに従った天然ジャガイモデンプン）を、水１００ｍＬに分散させた。水１００ｍＬに予め溶解させた過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）０．０１１２ｍｏｌ、すなわち２．４ｇを、粒子懸濁液に添加した。その懸濁液を周囲温度で１８時間撹拌した。１８時間後、２０％酸化デンプンの粒子懸濁液を得た。酸化デンプンを遠心分離によって収集し、水２００ｍＬで３回濯ぎ、次いで、凍結乾燥した。
【００４７】
９９ｍＴｃでの標識化反応：
２０％酸化および凍結乾燥デンプン２０ｍｇを、不活性雰囲気下に、空の溶出フラスコに入れた。生理血清４ｍＬ、次いで、２０μｇのＳｎＣｌ２，２Ｈ２Ｏを添加した。１ｍＬの１８５ＭＢｑ／ｍＬ  過テクネチウム酸ナトリウム（Ｎａ＋９９ｍＴｃＯ４−）溶液を添加した。溶液を１分間撹拌し、放射化学的純度（ＲＣＰ）を、０．２２μｍフィルタで溶液１ｍＬを濾過し、生理血清５ｍＬでフィルタを濯ぐことによって検査した。放射化学的純度は、
ＲＣＰ＝（フィルタ上での活性／総活性）×１００
に相当し；実施例２において、それは９９％より大である。
【００４８】
ラットにおける静脈注射後の体内分布のシンチグラフィー可視化：
標識化した後、９９ｍＴｃで標識された４ＭＢｑの２０％酸化デンプン粒子を、体重約２００ｇの雄性ウィスターラットに静脈（陰茎静脈）注射した。３０ｋＣｐｓのシンンチグラフィー取得を、注射後すぐ、次いで、１５分後に行なった。肺（上方領域）、肝臓および脾臓（下方右側領域）の可視化段階の後、活性が、急速に（１５分以内）肝臓および脾臓（画像の下方右側領域における定点）に集中した（図２および３）。
【００４９】
実施例３：肺灌流のシンチレーション画像化に用いる放射性トレーサーとしての、カダベリンに結合した酸化ジャガイモデンプン粒子
デンプン粒子の制御酸化：
３６〜５０μｍで篩にかけた１０ｇ（グルコース単位０．０５５ｍｏｌに相当）のジャガイモデンプン（ヨーロッパ薬局方のモノグラフに従った天然ジャガイモデンプン）を、水１００ｍＬに分散させた。水１００ｍＬに予め溶解させた過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）０．０２８ｍｏｌ、すなわち６ｇを添加した。その懸濁液を周囲温度で１８時間撹拌した。１８時間後、５０％酸化デンプンの粒子懸濁液を得た。酸化デンプンを遠心分離によって収集し、次いで、水２００ｍＬで３回濯いだ。
【００５０】
カダベリンへの結合による酸化デンプンの官能化：
酸化デンプン１０ｇ、すなわち、グルコース単位０．０５５ｍｏｌを、水６００ｍＬ中でインキュベートし、水１００ｍＬに溶解させ４ｇのカダベリン（ＮＨ２（ＣＨ２）５ＮＨ２）、すなわち０．０３８５ｍｏｌのカダベリン、すなわち０．０７７ｍｏｌのＮＨ２（１．４当量）と、周囲温度で１８時間接触させた。形成されたイミンを安定化するために、ＮａＢＨ４  ５．６ｇ、すなわち０．１５ｍｏｌを、改質デンプン懸濁液に撹拌しながら１時間にわたって添加した。次いで、粒子をデカントし、濾過し、水２００ｍＬで３回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。
【００５１】
９９ｍＴｃでの標識化反応：
カダベリンに結合し、凍結乾燥したデンプン２０ｍｇを、不活性雰囲気下に、溶出フラスコに入れた。生理血清４ｍＬ、次いで、６０μｇのＳｎＣｌ２，２Ｈ２Ｏを添加した。１ｍＬの１８５ＭＢｑ／ｍＬ  過テクネチウム酸ナトリウム（Ｎａ＋９９ｍＴｃＯ４−）溶液を添加した。溶液を１分間撹拌し、放射化学的純度（ＲＣＰ）を、０．２２μｍフィルタで溶液１ｍＬを濾過し、生理血清５ｍＬでフィルタを濯ぐことによって検査した。放射化学的純度は、
ＲＣＰ＝（フィルタ上での活性／総活性）×１００
に相当し；実施例３において、それは９５％より大である。
【００５２】
ラットにおける静脈注射後の体内分布のシンチグラフィー可視化：
標識化した後、９９ｍＴｃで標識されたカダベリンに結合した４ＭＢｑの５０％酸化デンプン粒子を、体重約２００ｇの雄性ウィスターラットに静脈（陰茎静脈）注射した。３０ｋＣｐｓのシンンチグラフィー取得を、注射後すぐ、１５分後、３０分後、次いで９０分後に行なった（図４〜５）。肺の排他的可視化段階後に、脾臓、次いで腎臓の活性が急速に増加し、９０分後に肺活性が顕著に減少した。図４〜６において、どの分析時においても、肝臓における活性の有意な欠乏があることに注目すべきである。さらに、肺の初期画像の優れた可視性、ならびに肝臓および脾臓の可視化のほぼ完全な不存在も注目される。３０分後において、脾臓、および腎臓の定着の開始が観察でき、これら２つの要素は、９０分後において実質的に増加し、肺活性は顕著に減少した。
【００５３】
実施例４：肺灌流のシンチレーション画像化用の、金属還元剤（ＳｎＣｌ２）を用いない放射性トレーサーとしての、カダベリンに結合した酸化ジャガイモデンプン粒子
デンプン粒子の制御酸化：
３６〜５０μｍで篩にかけた１０ｇ（グルコース単位０．０５５ｍｏｌに相当）のジャガイモデンプン（ヨーロッパ薬局方のモノグラフに従った天然ジャガイモデンプン）を、水１００ｍＬに分散させた。水１００ｍＬに予め溶解させた過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）０．０２８ｍｏｌ、すなわち６ｇを添加した。その懸濁液を周囲温度で１８時間撹拌した。１８時間後、５０％酸化デンプンの粒子懸濁液を得た。酸化デンプンを遠心分離によって収集し、次いで、水２００ｍＬで３回濯いだ。
【００５４】
カダベリンへの結合による酸化デンプンの官能化：
酸化デンプン１０ｇ、すなわち、グルコース単位０．０５５ｍｏｌを、水６００ｍＬ中でインキュベートし、水１００ｍＬに溶解させた４ｇのカダベリン（ＮＨ２（ＣＨ２）５ＮＨ２）、すなわち０．０３８５ｍｏｌのプトレシン、すなわち０．０７７ｍｏｌのＮＨ２（１．４当量）と、周囲温度で１８時間接触させた。形成されたイミンを安定化するために、ＮａＢＨ４  ５．６ｇ、すなわち０．１５ｍｏｌを、改質デンプン懸濁液に撹拌しながら１時間にわたって添加した。次いで、粒子をデカントし、濾過し、水２００ｍＬで３回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。
【００５５】
還元剤を用いない９９ｍＴｃでの標識化反応：
凍結乾燥形態の下記化合物の混合物を含有するＩｓｏｌｉｎｋ（商標）フラスコに、１ｍＬの１８５ＭＢｑ／ｍＬ  過テクネチウム酸ナトリウム（Ｎａ＋９９ｍＴｃＯ４−）溶液を入れた：８．５ｍｇ  酒石酸ナトリウム、２．８５ｍｇ  四ホウ素酸ナトリウム、７．１５ｍｇ  炭酸ナトリウムおよび４．５ｍｇ  ナトリウムボラノカーボネート。フラスコを乾燥水浴（ｄｒｙ  ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）に１００℃で２０分間入れた。得られた溶液を、１ｍＬの０．１Ｎ  塩酸（ＨＣｌ）溶液の添加によって中和した。中和した後、カダベリンと結合した酸化デンプン２０ｍｇを含有するフラスコに、その溶液を不活性雰囲気下に入れた。
その懸濁液を１５分間撹拌し、放射化学的純度（ＲＣＰ）を、０．２２μｍフィルタで溶液１ｍＬを濾過し、生理血清５ｍＬでフィルタを濯ぐことによって検査した。放射化学的純度は、
ＲＣＰ＝（フィルタ上での活性／総活性）×１００
に相当し；実施例４において、それは９５％より大である。
【００５６】
ラットにおける静脈注射後の体内分布のシンチグラフィー可視化：
標識化した後、９９ｍＴｃで標識されたカダベリンに結合した４ＭＢｑの５０％酸化デンプン粒子を、体重約２００ｇの雄性ウィスターラットに静脈（陰茎静脈）注射した。３０秒間隔で９０分間にわたる連続動的シンチグラフィー取得を、注射後すぐに行なった（図７〜９）。５分後（図７）、肺のほぼ排他的可視化、ならびに低い肝臓および腎臓活性が観察された。安定な肺活性が、注射後１５分（図８）および３０分（図９）において観察された。図７〜９において、どの分析時においても、脾臓における有意な活性がないことに注目すべきである。さらに、肝臓および腎臓活性における増加がその時間中に観察されず（図８および９）、これは肺捕捉の高レベルの安定性によって説明される。
【００５７】
実施例５：酸化デンプンミクロ粒子と天然ポリアミンとの結合
実施例１に従って調製した５０％過ヨウ素酸塩酸化ジャガイモデンプン粒子を、カダベリンの存在下にインキュベートした（周囲温度で１８時間）。光学顕微鏡検査法による形態分析（図１０および１１）およびＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）カウンターを用いる粒度分析顕微鏡検査法（図１２）を行なった後に、カダベリンに結合した粒子は、形態（図１１）および粒度分布（図１２）の点でかなり均質であると考えられた。
肺毛細血管でブロックされる粒子の比率を増加させるために、均質粒度分布を選択することが重要であり、約２０〜４０μｍが最適である。１０μｍ未満の場合、粒子は、肺で正確に停止せず、特に肝臓および脾臓において、単核食細胞系によって捕捉される危険性がある。
【００５８】
実施例６：カダベリンに結合した粒子の製造および配合物Ａ、Ｂ、Ｃの製造の最適化
ミクロ粒子製造を最適化するため、酸化デンプンをカダベリンに結合させる反応に最適なパラメータを決定するために多くの実験計画を立てた。第１の実験計画は、結合反応に影響を与えるかまたは与えない要素を明らかにすることを可能にした。第２の実験計画は、実験パラメータの影響を量的に測定し、それによって、９９ｍＴｃを効果的に錯化し得るミクロ粒子の製造に最も適した反応条件を得ることを可能にした。
【００５９】
第１の実験計画は、１４の実験（表１）に基づいて、下記の４つの実験変数の質的影響を評価することを可能にする：Ｂ１：反応温度、Ｂ２：反応時間、Ｂ３：還元剤当量値、Ｂ４：還元時間。各実験変数を、２つのレベル（１つは低く、１つは高い）で試験した。全ての実験において、応答を、下記事項を測定することによって評価した：最終ミクロ粒子に含有されている窒素のパーセンテージ（元素分析によって測定される主要評価事項）、結合反応の収率、および得られたミクロ粒子の粒度分析的分布（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）カウンター）。得られた結果（図１３）は、最終ミクロ粒子の窒素含有量における、特定反応パラメータ（Ｂ３：還元剤当量値、Ｂ４：還元時間）の弱い影響または影響の欠如を示し、これに対して、温度および反応時間の該窒素含有量への正の有意な影響を示す。従って、温度および反応時間の増加は、カダベリンと酸化デンプンミクロ粒子との結合を増加させ、それによって、次のミクロ粒子による９９ｍＴｃの錯化に、より有利である。
【００６０】
【表１】
0005946241.tif 000004
【００６１】
第２の実験計画については、結合を量的に最適化し得るように、かつ、ミクロ粒子の窒素含有量における、種々の実験パラメータの変動への応答を模擬実験し得るように行なった。第２の実験計画は、２５の実験から成り、Ｄｏｅｌｈｅｒｔマトリックスの使用に基づいた（表２）。試験したパラメータは、アミン／デンプン当量値の数値（５つのレベルで試験した）、反応のｐＨ（７つのレベルで試験した）、デンプンの酸化度（７つのレベルで試験した）、最後に、反応媒体中のデンプン濃度（３つのレベルで試験した）であった。第１の実験計画と同様に、全ての実験について、下記を測定することによって、応答を評価した：最終ミクロ粒子に含有されていた窒素のパーセンテージおよび結合収率（元素分析による主要評価事項）、ならびに得られたミクロ粒子の粒度分析的分布（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）カウンターで測定された第２の評価事項）。得られた結果は、結合収率につき、実験パラメータの変動の関数として、応答を模擬実験することを可能にした（図１４）。図１４における円は、第２の実験計画中に試験された実験領域を２次元的に表わしている。該第２の実験計画中に、酸化デンプンとカダベリンとの結合が、１００％（図１４の円の上右側部分）に近い収率で最大になる条件を決めることができた。
【００６２】
これらの全ての結果は、酸化デンプンおよびカダベリンの結合から得られるミクロ粒子調製物の最適化を可能にした。該実験計画は、所望の用途に必要とされる特性を有するミクロ粒子調製物を得るための理想的実験条件を規定するために用いられた。それによって、医学画像化における診断用途に理想的形態特徴を有する３タイプの配合物（配合物Ａ、ＢおよびＣ）が、これらの計画から得られた。
【００６３】
【表２】
0005946241.tif 000005
【００６４】
配合物Ａの製造：
５０％酸化デンプン４ｇ、すなわち、グルコース単位０．０２２ｍｏｌを水１２０ｍＬ中でインキュベートし、水１２０ｍＬに溶解させた２２６８ｍｇのカダベリン（ＮＨ２（ＣＨ２）５ＮＨ２）と接触させた。その懸濁液を、暗所において４０℃で１８時間にわたって撹拌下に置いた。形成されたイミンを安定化するために、水１０ｍＬに溶解させたＮａＢＨ４  ４２０ｍｇを、改質デンプン懸濁液に、撹拌しながら１５分間にわたって添加した。次いで、粒子をデカントし、濾過し、水２００ｍＬで３回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。
【００６５】
配合物Ｂの製造：
５８．７５％酸化デンプン４ｇ、すなわち、グルコース単位０．０２２ｍｏｌを、水１２０ｍＬ中でインキュベートし、水２５０ｍＬに溶解させた４０４８ｍｇのカダベリン（ＮＨ２（ＣＨ２）５ＮＨ２）と接触させ、その懸濁液のｐＨを８．８に調節した。懸濁液を、暗所において４０℃で１８時間にわたって撹拌下に置いた。形成されたイミンを安定化するために、水１０ｍＬに溶解させたＮａＢＨ４  ７６０ｍｇを、改質デンプン懸濁液に、撹拌しながら６０分間にわたって添加した。次いで、粒子をデカントし、濾過し、水２００ｍＬで３回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。
【００６６】
配合物Ｃの製造：
６５％酸化デンプン４ｇ、すなわち、グルコース単位０．０２２ｍｏｌを、水１２０ｍＬ中でインキュベートし、水１５８ｍＬに溶解させた２９２０ｍｇのカダベリン（ＮＨ２（ＣＨ２）５ＮＨ２）と接触させ、その懸濁液のｐＨを８．８に調節した。懸濁液を、暗所において４０℃で１８時間にわたって撹拌下に置いた。形成されたイミンを安定化するために、水１０ｍＬに溶解させたＮａＢＨ４  ４２０ｍｇを、改質デンプン懸濁液に、撹拌しながら６０分間にわたって添加した。次いで、粒子をデカントし、濾過し、水２００ｍＬで３回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。
【００６７】
実施例７：カダベリンに結合した粒子の体内分布および代謝
９９ｍＴｃの錯化および静脈内投与後の、カダベリンに結合したミクロ粒子（実施例６の配合物Ａ、Ｂ、Ｃ）の薬物動態プロフィールを調査した。
これを行なうために、２つのタイプの試験を健康な動物において実施した：
−動的および静的シンチグラフィー試験；
−デンプンミクロ粒子の体内分布および尿代謝産物のクロマトグラフィー分離の試験。
ａ）シンチグラフィー試験
ＳｎＣｌ２（５０μｇ）ならびに実施例６に従って調製した配合物Ａ、ＢおよびＣのミクロ粒子（２０ｍｇ）を含有する種々のすぐに使用できるキットを用いて、シンチグラフィー試験を行なった。過テクネチウム酸ナトリウム（９９ｍＴｃＯ４）で標識化した後、種々のキットの放射化学的純度を調査し、その結果は、各場合において９５％より大であった（表３）。
【００６８】
【表３】
0005946241.tif 000006
【００６９】
動的試験を、雄性ウィスターラット（ｎ＝３）において１２０分間行なった（図１５）。該試験によって、時間活性曲線を形成することができ（図１６）、それによって種々の活性率を得ることができた（表３）。種々の時点でのトレーサーの分布を解剖学的に追跡するために、スキャナー画像化と共にシンチグラフィー静的取得も行なった（図１７）。
【００７０】
これらの種々の試験によって、静脈注射後のトレーサーの優勢肺局在を観察することができ（図１５および１７）、肺半減期は配合物に依存して１．５〜３時間であった（表３）。動的試験の間に得た時間活性曲線は、トレーサーの腎臓および泌尿器排泄、および経時において一定に維持される肝臓、消化器および血管活性のプロフィールを示している（図１６）。
【００７１】
配合物Ｃの生体外および生体内特性は、以下の通りである：
放射化学的純度（％）：９８±２
粒度：４〜９０μｍ
肺半減期（時）：３±０．５０
肺活性／血管活性比（ｔ＝３０分）：３１０±１１６
【００７２】
これらの特性は、肺灌流のシンチグラフィー画像化用の放射性医薬としてのそれらの臨床的使用に大いに貢献する。
【００７３】
ｂ）体内分布試験
ＳｎＣｌ２（５０μｇ）および配合物Ｃ（最も貢献するシンチグラフィー特性を有する配合物）のミクロ粒子（２０ｍｇ）を含有するすぐに使用できるキットを用いて、体内分布試験を行なった。過テクネチウム酸ナトリウム（９９ｍＴｃＯ４）溶液で標識化した後、９９ｍＴｃで標識したデンプンミクロ粒子の１０ＭＢｑ懸濁液を、雄性ウィスターラット（ｎ＝８）に静脈注射した。注射後１５分および１２０分において、動物を殺し（各時点につきｎ＝４）、それらの器官を除去し、洗浄し、秤量し、ガンマカウンターでカウントした。注射された活性の８０％超が肺で見出されたので（表４）、結果はトレーサーの肺分布を裏付けた。２０分後において、注射された活性の７０％がまだ肺に存在していたので、この肺活性は比較的安定であった。シンチグラフィー試験の間に示されたように、トレーサーの除去は主として泌尿器排泄によるものであった。
【００７４】
【表４】
0005946241.tif 000007
【００７５】
これらの体内分布結果を完全なものにするために、尿代謝産物のクロマトグラフィー分離による試験を行なった。９９ｍＴｃ標識デンプンミクロ粒子（配合物Ｃ）を雄性ウィスターラット（ｎ＝２）に静脈注射した後、トレーサーの投与後１２時間にわたって尿を収集できる代謝ケージに動物を入れた。
【００７６】
これにより種々の尿試料を、変動多孔度のゲル透過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１５、Ｐ６およびＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０）を用いて溶出することができ、これによって放射標識尿代謝産物の分子分布の第１の特徴付け行なうことができた（図１８、１９および２０）。排除限界１，５００ダルトンを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１５カラムを用いた溶出（図１８）は、尿代謝産物のほぼ５０％について、排除限界より大きい分子分布を示した。排除限界５，０００ダルトンを有するＰ６カラムを用いた溶出（図１９）は、尿代謝産物のほぼ４０％〜５０％について、排除限界より大きい分子分布を示した。最後に、排除限界１０，０００ダルトンを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０を用いた溶出（図２０）は、尿代謝産物のほぼ３０％〜４０％について、排除限界より大きい分子分布を示した。結論として、ゲル透過クロマトグラフィーは、尿代謝産物のおよその分子分布に関する情報を与え、該分布の約５０％が１，５００ダルトン（８グルコース単位に対応する）より小さい分子から成り、約１０％の分子が１，５００〜５，０００ダルトンのサイズ（８〜２７グルコース単位）であり、約１０％の分子が５，０００〜１０，０００ダルトンのサイズ（２７〜５５グルコース単位）であり、最後に、約３０％の分子が１０，０００ダルトンより大きい。
【００７７】
９９ｍＴｃで標識された改質デンプンミクロ粒子を用いて行なった全てのシンチグラフィー試験および体内分布試験は、放射性医薬の生体内使用に適合性の生物学的性能を示す。静脈注射後の肺リザーバからの９９ｍＴｃの放出制御および均一性の特性は、下記の組合せ：
−特定の均一なサイズおよび形態；
−錯化剤を結合させる化学の優れた制御；
−放射性トレーサー９９ｍＴｃの保持に有効な錯化剤の選択
の結果である。
【００７８】
参照文献
Ｈａｅｆｅｌｉ，ＵＯ  ２００１，  Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  Ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｂｕｌｔｅ  Ｊ，ｄｅ  Ｋｕｙｐｅｒ  Ｍ（ｅｄｓ）  Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｈａｅｆｅｌｉ  ＵＯ，Ｃａｓｉｌｌａｓ  Ｓ，Ｄｉｅｔｚ  ＤＷ，Ｐａｕｅｒ  ＧＪ，Ｒｙｂｉｃｋｉ  ＬＡ，Ｃｏｎｚｏｎｅ  ＳＤ，Ｄａｙ  ＤＥ，Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒａｄｉｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ  Ｕｓｉｎｇ  １８６／１８８  Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｒｈｅｎｉｕｍ  Ｇｌａｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１，ｐｐ．１８９−１９９，１９９９
Ｄｅｌｇａｄｏ  ＨＡ，Ｄｉａｚ  Ａｃｅｖｅｄｏ  ＲＶ，Ｅｖｏｒａ  Ｇａｒｃｉａ  ＣＭ，ＭａＩＩｏＩ  ＥＪ，Ｓｏｒｉａｎｏ  Ｔｏｒｒｅｓ  Ｍｌ，Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ＥＳ  ２０９６５２１，１９９７．
【００７９】
Ｄｅｌｇａｄｏ  Ａ，Ｓｏｒｉａｎｏ  Ｉ，Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｅ，Ｏｌｉｖａ  Ｍ，Ｅｖｏｒａ  Ｃ，Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００  Ｓｅｐ；５０（２）：２２７−３６
Ｋｅｌｌａｗａｙ  ＩＷ，Ｓｅａｌｅ  Ｌ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＰＳ．Ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ９９ｍＴｃ−ｄｅｘｔｒａｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍｅｄ  ｐａｗｓ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｒａｔｓ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１９９５  Ａｐｒ；１２（４）：５８８−９３
Ａｋｇｕｎ  Ａ，Ｔａｎｉ  Ａｃａｒ  Ｅ，Ｔａｎｅｒ  ＭＳ，Ｏｚｃａｎ  Ｚ，Ｏｋ  Ｅ．Ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｏｓｉｎｇ  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｏ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｔｕｒｋ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００５  Ｍａｒ；１６（１）：４１−３
【００８０】
Ｐａｉｖａ  ＧＲ，Ｆｉｌｈｏ  ＲＳ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＬＭ，Ｗａｇｎｅｒ  Ｊ，Ｎｏｇｕｅｉｒａ  ＳＡ，Ｎｏｖｏ  ＮＦ，Ｊｕｌｉａｎｏ  Ｙ，Ｒｏｃｈａ  ＪＬ．Ｐｈｙｔａｔｅ  ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍｖｅｒｓｕｓ  ｄｅｘｔｒａｎ  ５００  ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｂｉｏｐｓｙ．Ａｃｔａ  Ｒａｄｉｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；４７（１）：６５−７０
Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ａ，Ｃａｐａｌａ  Ｊ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＥＧＦ−ｄｅｘｔｒａｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ−１３１Ｉ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．１９９２  Ｎｏｖ；１４（３）：２１３−２３
Ｌｉｎｅ  ＢＲ，Ｗｅｂｅｒ  ＰＢ，Ｌｕｋａｓｉｅｗｉｃｚ  Ｒ，Ｄａｎｓｅｒｅａｕ  ＲＮ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｆｉｂｒｉｎ  Ｆａｂ’  ｗｉｔｈ  ９９ｍＴｃ−ｄｅｘｔｒａｎ．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２０００  Ｊｕｌ；４１（７）：１２６４−７０．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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