(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンネンタケ子実体の効果的な分画ＦＹＧＬであって、前記効果的な分画ＦＹＧＬは蛋白質チロシンホスファターゼ−１Ｂに対する半数阻害濃度ＩＣ50が８０μｇ／ｍＬ以下であるマンネンタケ子実体の抽出物であり、
前記効果的な分画ＦＹＧＬの1ＨＮＭＲスペクトルは化学シフトｄが０．９、１．２、１．４、１．６、２．０、２．３、２．７、３．４、３．５、３．６、３．８、３．９、４．０、４．２、４．３、４．５、４．７、４．８、５．０、５．３、５．９、６．０と６．６−７．６ｐｐｍの近くの核磁気共鳴ピークを含み、前記1ＨＮＭＲスペクトルの測定は重水を溶剤とし、テトラメチルシランの化学シフトを０．０ｐｐｍと設定して外部標準又は内部標準とするものであり、
前記1ＨＮＭＲスペクトルにおける、化学シフトｄ=３．６−３．４ｐｐｍの積分面積と化学シフトｄ=３．４−３．２ｐｐｍの積分面積との比は０．５−１．５であり、化学シフトｄ=３．０−１．０ｐｐｍの積分面積と化学シフトｄ=３．４−３．２ｐｐｍの積分面積との比は０．５−４．０であり、
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、タンパクの含有量が３ｗｔ．％−２０ｗｔ．％であり、
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、多糖成分も含み、前記多糖成分はブドウ糖、アラビノース、キシロース、ラムノース、ガラクトース、フルクトースユニットを単糖ユニットとして含み、
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、前記方法は、０−２０℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対しアルカリ抽出を行う又は前記脱脂産物に対し水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得た抽出物に対し直接乾燥して前記効果的な分画ＦＹＧＬを得る、又は前記透析で得た抽出物を分離してから前記乾燥を行って前記効果的な分画ＦＹＧＬを得る、ことを含む方法で調製された、マンネンタケ子実体の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項２】
前記乾燥は、噴霧乾燥、減圧乾燥、冷凍乾燥又は常圧乾燥から選ばれた少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項３】
前記脱脂産物は、エタノール又はエタノール水溶液によりマンネンタケ子実体を脱脂して得られたことを特徴とする請求項１に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項４】
前記アルカリ抽出温度は４〜１５℃であることを特徴とする請求項１に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項５】
前記アルカリ抽出は、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム又はアンモニア水から選ばれた少なくとも１つを含む水溶液を使用して行われたことを特徴とする請求項１に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項６】
前記水溶液は、０．５Ｍ以上の炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウム溶液、又は０．１−２Ｍの水酸化カリウム、水酸化ナトリウム又はアンモニア水溶液であることを特徴とする請求項５に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項７】
前記透析は、１ｋＤａ−３ｋＤａの透析袋で透析を行って、１ｋＤａ−３ｋＤａ以下の小分子を除去することを特徴とする請求項１又は４に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項８】
前記分離は、
（１）アルコール沈殿を行って、上澄み液を得る；又は
（２）分画分子量が１００ｋＤａ以下の限外ろ過膜で限外ろ過して分取して、分子量が前記分画分子量より大きい物質を除去する、
ことを含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項９】
前記アルコール沈殿は、エタノール水溶液により前記透析で得た抽出物を沈殿して、前記上澄み液を収集することであることを特徴とする請求項８に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項１０】
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、基本的に分子量が１ｋＤａ−１００ｋＤａの物質で構成されることを特徴とする請求項８に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項１１】
前記方法は、以下のステップ：前記分離の後、かつ前記乾燥の前に、前記抽出物に対しカラムクロマトグラフィーを行う、をも含むことを特徴とする請求項８に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項１２】
前記カラムクロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム又はマクロ多孔質吸着樹脂から選ばれた少なくとも１つのカラムクロマトグラフィー装置によって行われることを特徴とする請求項１１に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項１３】
前記カラムクロマトグラフィーは、相次いで０．１−２ＭＮａＣｌと０．１−２ＭＮａＯＨの水溶液を溶出剤として使用することを特徴とする請求項１２に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項１４】
前記方法は、以下の精製ステップ：前記カラムクロマトグラフィーの後、かつ前記乾燥の前に、フェノール−硫酸法により得られた溶出成分を測定して、反応陽性部分を収集し、１ｋＤａの透析袋で収集した反応陽性部分を透析し、透析された精製物を得る、をも含
むことを特徴とする請求項１１から１３のいずれか１項に記載の効果的な分画ＦＹＧＬ。
【請求項１５】
マンネンタケ子実体の効果的な分画ＦＹＧＬであって、前記効果的な分画ＦＹＧＬは蛋白質チロシンホスファターゼ−１Ｂに対する半数阻害濃度ＩＣ50が８０μｇ／ｍＬ以下であるマンネンタケ子実体の抽出物であり、
前記効果的な分画ＦＹＧＬの1ＨＮＭＲスペクトルは化学シフトｄが０．９、１．２、１．４、１．６、２．０、２．３、２．７、３．４、３．５、３．６、３．８、３．９、４．０、４．２、４．３、４．５、４．７、４．８、５．０、５．３、５．９、６．０と６．６−７．６ｐｐｍの近くの核磁気共鳴ピークを含み、前記1ＨＮＭＲスペクトルの測定は重水を溶剤とし、テトラメチルシランの化学シフトを０．０ｐｐｍと設定して外部標準又は内部標準とするものであり、
前記1ＨＮＭＲスペクトルにおける、化学シフトｄ=３．６−３．４ｐｐｍの積分面積と化学シフトｄ=３．４−３．２ｐｐｍの積分面積との比は０．５−１．５であり、化学シフトｄ=３．０−１．０ｐｐｍの積分面積と化学シフトｄ=３．４−３．２ｐｐｍの積分面積との比は０．５−４．０であり、
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、タンパクの含有量が３ｗｔ．％−２０ｗｔ．％であり、
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、多糖成分も含み、前記多糖成分はブドウ糖、アラビノース、キシロース、ラムノース、ガラクトース、フルクトースユニットを単糖ユニットとして含み、
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、前記方法は、０−２０℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対しアルカリ抽出を行う又は前記脱脂産物に対し水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得た抽出物に対し直接乾燥して前記効果的な分画ＦＹＧＬを得る、又は前記透析で得た抽出物を分離してから前記乾燥を行って前記効果的な分画ＦＹＧＬを得る、ことを含む方法で調製された、マンネンタケ子実体の効果的な分画ＦＹＧＬを唯一の活性成分とした薬物の調製のための前記分画ＦＹＧＬの使用方法であって、
前記薬物は糖尿病と代謝症候群の少なくとも１つの予防又は治療及に用いられる；又は、糖尿病と代謝症候群に関わるアテローム性動脈硬化、動脈硬化、肥満症、高血圧、高脂血症、脂肪肝、腎疾患、神経性疾患、網膜症、足部潰瘍又は白内障；又は、高脂血症、肥満症又は悪液質から選ばれた少なくとも１つの疾患の予防又は治療に用いられる、前記分画ＦＹＧＬを唯一の活性成分とした薬物の調製のための前記分画ＦＹＧＬの使用方法。
【請求項１６】
マンネンタケ子実体の効果的な分画ＦＹＧＬであって、前記効果的な分画ＦＹＧＬは蛋白質チロシンホスファターゼ−１Ｂに対する半数阻害濃度ＩＣ50が８０μｇ／ｍＬ以下であるマンネンタケ子実体の抽出物であり、
前記効果的な分画ＦＹＧＬの1ＨＮＭＲスペクトルは化学シフトｄが０．９、１．２、１．４、１．６、２．０、２．３、２．７、３．４、３．５、３．６、３．８、３．９、４．０、４．２、４．３、４．５、４．７、４．８、５．０、５．３、５．９、６．０と６．６−７．６ｐｐｍの近くの核磁気共鳴ピークを含み、前記1ＨＮＭＲスペクトルの測定は重水を溶剤とし、テトラメチルシランの化学シフトを０．０ｐｐｍと設定して外部標準又は内部標準とするものであり、
前記1ＨＮＭＲスペクトルにおける、化学シフトｄ=３．６−３．４ｐｐｍの積分面積と化学シフトｄ=３．４−３．２ｐｐｍの積分面積との比は０．５−１．５であり、化学シフトｄ=３．０−１．０ｐｐｍの積分面積と化学シフトｄ=３．４−３．２ｐｐｍの積分面積との比は０．５−４．０であり、
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、タンパクの含有量が３ｗｔ．％−２０ｗｔ．％であり、
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、多糖成分も含み、前記多糖成分はブドウ糖、アラビノース、キシロース、ラムノース、ガラクトース、フルクトースユニットを単糖ユニットとして含み、
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、前記方法は、０−２０℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対しアルカリ抽出を行う又は前記脱脂産物に対し水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得た抽出物に対し直接乾燥して前記効果的な分画ＦＹＧＬを得る、又は前記透析で得た抽出物を分離してから前記乾燥を行って前記効果的な分画ＦＹＧＬを得る、ことを含む方法で調製された、マンネンタケ子実体の効果的な分画ＦＹＧＬを唯一の活性成分とした薬物の調製のための前記分画ＦＹＧＬの使用方法であって、
前記薬物が蛋白質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）、α−アミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれた少なくとも１つの酵素に関する疾患の治療に用いられる、前記分画ＦＹＧＬを唯一の活性成分とした薬物の調製のための使用方法。
【請求項１７】
薬剤であって、前記薬剤は唯一の活性成分としての請求項１から１４のいずれか１項に記載のマンネンタケ子実体の効果的な分画ＦＹＧＬと薬学上に受けられるキャリアを含み、他のマンネンタケ子実体の抽出物を含まない薬剤。
【請求項１８】
前記薬剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸薬、注射剤、経口薬、沈殿防止剤、ドロップ剤、小丸薬、スプレー剤、エアゾル剤、バップ剤又はペースターであることを特徴とする請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、前記薬剤において唯一の活性成分とすることを特徴とする請求項１７又は１８に記載の薬剤。
【請求項２０】
健康食品の製剤であって、前記健康食品の製剤は、活性成分としての請求項１から１４のいずれか１項に記載のマンネンタケ子実体の効果的な分画ＦＹＧＬと食用できるキャリアを含み、他のマンネンタケ子実体の抽出物を含まない健康食品の製剤。
【請求項２１】
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、前記健康食品の製剤において唯一の活性成分とすることを特徴とする請求項２０に記載の健康食品の製剤。
【請求項２２】
前記健康食品の製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸薬、注射剤、経口薬、沈殿防止剤、ドロップ剤、小丸薬、スプレー剤、エアゾル剤、バップ剤又はペースターであることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の健康食品の製剤。
【請求項２３】
マンネンタケ子実体から効果的な分画ＦＹＧＬを抽出する方法であって、前記効果的な分画ＦＹＧＬは、蛋白質チロシンホスファターゼ−１Ｂに対する半数阻害濃度ＩＣ50が８０μｇ／ｍＬ以下であるマンネンタケ子実体の抽出物で、前記方法は、０−２０℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対しアルカリ抽出を行う又は前記脱脂産物に対し水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得た抽出物に対し直接乾燥して前記効果的な分画ＦＹＧＬを得る、又は、前記透析で得た抽出物を分離してから前記乾燥を行って前記効果的な分画ＦＹＧＬを得る、ことを含むマンネンタケ子実体から効果的な分画ＦＹＧＬを抽出する方法。
【請求項２４】
前記乾燥は、噴霧乾燥、減圧乾燥、冷凍乾燥又は常圧乾燥から選ばれた少なくとも１つであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルカリ抽出温度は、４〜１５℃であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記脱脂産物は、エタノール又はエタノール水溶液によりマンネンタケ子実体を脱脂して得られたものであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルカリ抽出は、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム又はアンモニア水から選ばれた少なくとも１つを含む水溶液を利用して行われたことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記水溶液は、０．５Ｍ以上の炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウム溶液、又は０．１−２Ｍの水酸化カリウム、水酸化ナトリウム又はアンモニア水溶液であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記透析は、１ｋＤａ−３ｋＤａの透析袋で透析を行って、１ｋＤａ−３ｋＤａ以下の小分子を除去することを特徴とする請求項２３又は２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記分離は、
（１）アルコール沈殿を行って、上澄み液を得る；又は
（２）分画分子量が１００ｋＤａ以下の限外ろ過膜で限外ろ過して分取して、分子量が前記分画分子量より大きい物質を除去する、
ことを含むことを特徴とする請求項２３から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記アルコール沈殿は、エタノール水溶液により前記透析で得た抽出物を沈殿して、前記上澄み液を収集することであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記効果的な分画ＦＹＧＬは、基本的に分子量が１ｋＤａ−１００ｋＤａの物質で構成されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法は、以下のステップ：前記分離の後、かつ前記乾燥の前に、前記抽出物に対しカラムクロマトグラフィーを行う、をも含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記カラムクロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム又はマクロ多孔質吸着樹脂から選ばれた少なくとも１つのカラムクロマトグラフィー装置によって行われることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記カラムクロマトグラフィーは、相次いで０．１−２ＭＮａＣｌと０．１−２ＭＮａＯＨの水溶液を溶出剤として使用することを特徴とする請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法は、以下の精製ステップ：前記分離の後、かつ前記乾燥の前に、フェノール−硫酸法により得られた溶出成分を測定して、反応陽性部分を収集し、１ｋＤａの透析袋で収集した反応陽性部分を透析する、をも含むことを特徴とする請求項３３から３５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬品又は健康食品の分野に属し、特に、マンネンタケ子実体における血糖降下に効果的な分画、マンネンタケ子実体から前記効果的な分画を抽出する方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンネンタケ[Ganoderma lucidum (Fr.) Karst]は、担子菌門マンネンタケ科で、昔から「仙草」、「福草」と呼ばれ、漢方医における体力をつけて基礎体力を固め、免疫力を増強する滋養強壮な貴重な漢方薬で、中国で薬用として悠久な歴史を有し、薬用としての価値が極めて高い。東漢時代に書かれた『神農本草経』において、マンネンタケが上品と位置づけられて、「補気」、「精神の安定」、「補肝」、「筋肉増強」の作用があると記載されている。『本草綱目』において、マンネンタケが「滋養強壮」、「延年益寿」、「関節に有益」、「聴覚障害の治療」などの効き目があると記載されている。現代医学では、マンネンタケが複数の生理活性物質を含み、人体の免疫力を増強、調整することができ、血圧値、血糖値、脂質値を下げることができることが証明されてきている。
【０００３】
マンネンタケ抽出物への研究分野において、近年、国内外の学者らがマンネンタケから150あまりの化合物を分離した。前記化合物がトリテルペン類、多糖類、ヌクレオシド類、フラン類、ステロール類、アルカロイド類、アミノ酸とたんぱく質類、油脂類、有機ゲルマニウム、無機イオンなどの10類に分けられる。その内の小分子トリテルペン類と高分子多糖類が主成分であり、薬理学の主な研究対象とされている。その薬理作用は、主に生物の免疫制御、腫瘍疾患の予防と治療、体の酸素不足耐性の増強、フリーラジカルの消去などに係る。
【０００４】
糖尿病（Diabetes mellitus）は、遺伝子と環境要因との相互作用により引き起こされた臨床症候群であり、インシュリン分泌の絶対的又は相対的不足とターゲット細胞のインシュリンへの感受性の減少により引き起こした糖、タンパク質、脂肪、水及び電解質などの一連の代謝症候群である。高血糖値は臨床の共同な主徴とし、長患いの場合、複数のシステムの損害をもたらすこともあり、重患重圧の場合、急性代謝症候群、たとえば、ケトアシドーシスなどになることもある。糖尿病患者においては、冠動脈疾患、脳血管疾患、失明、先端壊疽などの重度合併症を発生する人が、糖尿病患者ではない場合より明確に多い。従って、糖尿病とその合併症が人類の健康を脅す世界公共衛生問題になっている。
【０００５】
現在、糖尿病は、I型糖尿病（インシュリン依存型糖尿病、IDDM）とII型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病、NIDDM）の2種類に分けられる。糖尿病の90％以上はII型糖尿病である。WHOは、人口老齢化、肥満、不健康な食事及び運動不足の生活方式により、2025年までに、糖尿病患者数が1995年の1.35億から3億に増加すると予測している。
【０００６】
II型糖尿病は、遺伝性と環境要因とは強く関わり、かつ顕著な異質性を示し、病因が多様で複雑で、患者ごとに病態が大きく違っている。概して、その病態は、インシュリン分泌の相対的不足とインシュリン抵抗とに分類される。インシュリン抵抗とは、インシュリンに対する感受性及び／又は反応性が減少することを指し、糖尿病などの代謝症候群の主な病理学と生理学の基礎である。インシュリン抵抗は、耐糖能の低下、II型糖尿病、肥満症、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝、冠動脈疾患αサブユニットなどの臨床検査値異常とは密接に関わっている。インシュリンは、その受容体細胞の外のサブユニットと結合して、受容体細胞の内のβサブユニットのチロシンキナーゼを活性化することにより、調整構造ドメインにおける肝心なチロシン残基が自身リン酸化して、インシュリンの受容体のチロシンキナーゼを完全に活性化し、インシュリンの受容体のチロシンキナーゼがその基質をリン酸化することにより信号を伝える。細胞内のインシュリンの作用通路における可逆なチロシンのリン酸化への認識が深まるにつれて、蛋白質チロシンホスファターゼ(PTPases)の前記通路における蛋白質チロシンのリン酸化レベルをバランシングする役割がより重視されるようになった。PTPasesが前記通路において多くの役割を演じ、たとえば、自身リン酸化により活性化されたインシュリンの受容体（IR）を脱リン酸化して、受容体のキナーゼ活性を減少する；又は、たとえば、インシュリンの受容体の基質1（IRS−1）、インシュリンの受容体の基質2（IRS−2）、Shcなどのインシュリンの受容体の基質における蛋白質チロシン残基を脱リン酸化して、インシュリンが受容体に作用された通路を負調節する。
【０００７】
蛋白質チロシンホスファターゼ-1B (PTP1B)は、最初に純化され、生物学特徴が確定されたPTPasesであり、全長が約50KDである。早期研究では、体外において、効果的にインシュリンの受容体を脱リン酸化することができる。人間の胎盤から得たPTP1Bをアフリカツメガエルの卵母細胞に顕微注入したところ、インシュリンに誘導される卵母細胞の成熟とS6ペプチドのリン酸化レベルが減少した。PTP1Bは、糖尿病の発病とは密接に関わり、相同組換えによるPTP1Bノックアウトマウスは、正常に成長し、繁殖力があり、インシュリンに対する感受性が顕著に増強する。その増強作用は、肝臓と骨格筋におけるインシュリンの受容体及びインシュリンの受容体の基質のリン酸化レベルの増強と関わっている。従って、前記通路のPTP1Bに選択的作用する阻害剤を見つかり、その活性を阻害して、インシュリンの信号を増強、延長するのは、II型糖尿病を治療する新しいルートとしてもっと重視されるようになる。
【０００８】
また、疫学研究では、空腹時血糖値のレベルと食後血糖値のレベルという2つの血糖指数において、食後血糖値のレベルがもっと重要であり、耐糖能異常(IGT)の患者がII型糖尿病に発展する重要な要因である。そして、食後血糖値のレベルが糖尿病患者の大血管合併症と微小血管合併症の重要要因であり、それらの合併症は糖尿病による死亡率の上昇の主な要因の一つである。従って、食後血糖値を厳しく抑制するのは糖尿病の予防と治療に非常に重要な意義を有し、食後血糖値のレベルを顕著に降下できる糖尿病薬はもっと多くの応用価値を有する。
【０００９】
食物中の炭水化物のほとんどが澱粉とショ糖などであり、澱粉が唾液と膵液におけるα-アミラーゼによりオリゴ糖へと分解され、オリゴ糖が小腸上皮細胞のブラッシ状縁においてα-グルコシダーゼによりブドウ糖へと分解され、吸収された後、食後血糖値がピークになるので、α-アミラーゼとα-グルコシダーゼの活性を阻害するのは、食後血糖値を下げる効果的なルートの1つになる。
【００１０】
α-アミラーゼ阻害剤は、食べ物と一緒に食べれば、澱粉と競争して唾液と膵液におけるα-アミラーゼと結合し、酵素における澱粉との結合場所を占有し、澱粉の消化を阻害する。未消化の炭水化物は、小腸の下段と結腸に運送され、炭水化物の消化と吸収が小腸の全段で行われ、食後の単糖（ブドウ糖）の吸収が遅延、延長され、食後血糖値のレベルが顕著に下げられる。α-グルコシダーゼ阻害剤は、70年代後半に研究、開発された新しい経口血糖降下薬であり、アジア太平洋地域糖尿病治療薬ガイドに食後血糖降下の第一選択薬として三回推薦された。α-グルコシダーゼ阻害剤は、α-グルコシダーゼを競争的に阻害でき、炭水化物の消化を遅延、阻害でき、二糖、オリゴ糖及び多糖に由来するブドウ糖の吸収を遅延でき、食後高血糖を効果的に遅延、降下できる。それらは、長期に服用すれば、空腹時血糖値のレベルを下げることができ、I型、II型糖尿病にも適用することができる。
【００１１】
現在、臨床でよく見られる経口糖尿病治療薬は、スルホニルウレア系（D860、グリベンクラミド、グリクラジド、グリピジド、グリキドン、グルレノームなど）、ダブルグアニ
ジン系（フェンホルミン、メトホルミンなど）、α-グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース）及びインスリン感受性改善薬（チアゾリジンジオン）などの西洋薬を主としている。これらの薬物を長期的に服用すれば、効果がよくなかったり、副作用がひどくなったりとかして、肝臓、腎臓に一定的な損害を与え、低血糖反応を引き起こすこともあり、乃至は命まで脅かされる場合があった。インシュリンは糖尿病を治療する特効薬であるが、長期的に使用すれば、抗体が生じ、生物活性の低下により使用量の増大を引き起す。漢方医が違う病態により治療する理論により、II型糖尿病の特徴に基づき、全体レベルで総合的に調理することにより、II型糖尿病の症状を軽減かつ合併症の発生を遅延できる。従って、天然の薬物から血糖降下薬を選別、研究するのは重要な社会的意義と応用価値を有する。
【００１２】
マンネンタケは、甘味、温和な性質を有し、五臓に到達し、気を整えられ、体力をつけて基礎体力を固め、免疫力を増強することができる。脾臓は痰を生じる源であり、マンネンタケが脾臓に到達し、痰と湿気を除去でき、インシュリン抵抗性の漢方医の治療原則に合致する。しかし、マンネンタケ抽出物とその薬効、特に血糖降下の効き目への研究はまだ不十分で、今まで、マンネンタケ子実体から抽出した血糖降下に顕著な作用を有する効果的な分画に関する文献がなかった。
【発明の概要】
【００１３】
発明の概要の部分において、発明を実施するための形態のところでさらに説明される一連の簡略化概念が説明される。本発明の発明の概要において、保護が求められる発明の肝心な特徴と必須技術的特徴を限定しようとすることを意味しなく、保護が求められる発明の範囲を確定しようとすることも意味しない。
【００１４】
本発明は、マンネンタケ子実体から効果的な分画（前記効果的な分画が報告されたことなく、発明者によりはじめてFYGLと命名された）を抽出する方法を提供することが目的の1つである。前記方法により、マンネンタケ子実体から選択的に特定の効果的な分画FYGLを抽出される。発明者らの研究を経て証明されたように、前記効果的な分画は、蛋白質チロシンホスファターゼ-1B、α-アミラーゼ及びα-グルコシダーゼの活性に顕著な阻害作用を有するので、糖尿病又は糖尿病と関わる疾患の治療に用いることができ、血糖降下などの日常保健を目的として服用することもできる。
【００１５】
本発明の第二の目的は、マンネンタケ子実体から抽出した効果的な分画FYGLを提供することにある。
【００１６】
本発明の第三の目的は、薬物の調製において、前記効果的な分画FYGLを唯一の活性成分としての使用を提供することにある。
【００１７】
本発明の第四の目的は、前記効果的な分画FYGLを含む薬剤又は健康食品の製剤を提供することである。
【００１８】
以下、本発明に係る若干の技術態様を説明する。
【００１９】
本発明の第一態様は、マンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLに関し、前記効果的な分画FYGLは、蛋白質チロシンホスファターゼ-1Bに対する半数阻害濃度IC50が80μg/mL以下であるマンネンタケ子実体からの抽出物である。
【００２０】
本発明の第二態様は、第一態様に記載の効果的な分画FYGLを唯一の活性成分とした薬物の調製を提供し、前記薬物は糖尿病と代謝症候群の少なくとも1つの予防又は治療に用いられる；又は、糖尿病及び代謝症候群に関わる以下疾患の少なくとも1つの予防又は治療に用いられる：アテローム性動脈硬化、動脈硬化、肥満症、高血圧、高脂血症、脂肪肝、
腎疾患、神経性疾患、網膜症、足部潰瘍又は白内障；又は、高脂血症、肥満症又は悪液質から選んだ少なくとも1つの治療に用いられる。
【００２１】
本発明の第三態様は、第一態様に記載のマンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLを唯一の活性成分とした薬物の調製を提供し、前記薬物は蛋白質チロシンホスファターゼ-1B、α-アミラーゼとα-グルコシダーゼから選んだ少なくとも1つの酵素に関する疾患の治療に用いられる。
【００２２】
本発明の第四態様は、薬剤を提供し、前記薬剤が唯一の活性成分としての第一態様に記載のマンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLと、薬学に受けられるキャリアを含み、かつ他のマンネンタケ子実体の抽出物を含まない。
【００２３】
本発明の第五態様は、健康食品の製剤を提供し、前記健康食品の製剤は、唯一の活性成分として第一態様に記載のマンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLと、食用可能なキャリアを含み、かつ他のマンネンタケ子実体の抽出物を含まない。
本発明の第六態様は、マンネンタケ子実体から効果的な分画FYGLを抽出する方法を提供し、前記効果的な分画FYGLは、蛋白質チロシンホスファターゼ-1Bに対する半数阻害濃度IC50が80μg/mL以下であるマンネンタケ子実体の抽出物であり、前記方法は、0-20℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対しアルカリ抽出を行う又は前記脱脂産物に対し水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得られた抽出物に対し直接乾燥して前記効果的な分画FYGLを得る；又は前記透析で得られた抽出物を分離してから乾燥を行って前記効果的な分画FYGLを得る、ことを含む。
【００２４】
本発明の第七態様は、マンネンタケ子実体から効果的な分画FYGLを抽出する方法を提供し、前記方法は、0-20℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対しアルカリ抽出を行う又は前記脱脂産物に対し水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得られた抽出物に対し直接乾燥して前記効果的な分画FYGLを得る；又は前記透析で得られた抽出物を分離してから乾燥を行って前記効果的な分画FYGLを得る、ことを含む。
【００２５】
本発明の第八態様は、前記抽出方法により調製されたマンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLを提供する。
【００２６】
前記効果的な分画FYGLは、その体外分析と動物試験の結果に示されたように、蛋白質チロシンホスファターゼ-1B（PTP1B）、α-アミラーゼ及びα-グルコシダーゼに対し顕著な阻害作用があるので、人間の体内において明確な血糖降下効果があると推測でき、糖尿病と代謝症候群、又は糖尿病と代謝症候群に関わる疾患又は症状の治療又は予防に用いられる。そして、前記抽出方法は、簡単で操作しやすくて生産のコストも低くて、産業での押し広げと実施が便利で、良好な経済的利益が得られる。
【００２７】
発明者は、マンネンタケ子実体から抽出した前記効果的な分画FYGLに対しフェノール-硫酸法とローリー法（Lowry）による測定を行った。その結果から、前記効果的な分画FYGLには多糖とタンパク成分が含まれることが推測できる。イオンクロマトグラフィーにより、多糖成分における単糖ユニットを分析したところ、それは主にブドウ糖、アラビノース、キシロース、ラムノース、ガラクトース、フルクトースユニットであり、アミノ酸分析機により、タンパク成分を分析したところ、タンパク質におけるアミノ酸組成には自然界に存在している19の天然アミノ酸残基が含まれると分かった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図1は第1実施例に得られた産物の1H NMRスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明を徹底的に理解できるように、以下、大量の具体的な詳細情報を提供する。ところで、当業者にとって、本発明が1つ又は複数のこれらの詳細情報がなくても実施できることは明らかである。他の実施例では、本発明との混同を防ぐため、当分野の公知の一部の技術的特徴について説明していない。
【００３０】
本発明を徹底的に理解できるように、以下詳しいステップを提供して、本発明がどのようにマンネンタケ子実体から効果的な分画FYGLを抽出したかを説明する。本発明の実施が当業者によって熟知されている特定の詳細に限定されないことは明らかである。本発明の好ましい実施例は以下の通りであるが、それらの詳細的実施例以外に、本発明は他の実施例を有する。
【００３１】
効果的な分画FYGLの抽出方法
まず、本発明の1つの実施例によれば、マンネンタケ子実体から効果的な分画FYGLを抽出する方法を提供した。前記方法は、0-20℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対しアルカリ抽出を行う又は前記脱脂産物に対し水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得られた抽出物に対し直接乾燥して前記効果的な分画FYGLを得る；又は前記透析で得られた抽出物を分離してから乾燥を行って前記効果的な分画FYGLを得る、ことを含む。
【００３２】
前記技術態様は、以下の四つの実施態様と理解できる。
【００３３】
態様1、前記方法は、0-20℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対しアルカリ抽出を行い、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得られた抽出物に対し直接乾燥して前記効果的な分画FYGLを得るステップを含む。
【００３４】
態様2、前記方法は、0-20℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対しアルカリ抽出を行い、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得られた抽出物を分離してから乾燥を行って前記効果的な分画FYGLを得るステップを含む。
【００３５】
態様3、前記方法は、0-20℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対し水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得られた抽出物を分離してから乾燥を行って前記効果的な分画FYGLを得るステップを含む。
【００３６】
態様4は、前記方法は、0-20℃のアルカリ抽出温度で、マンネンタケ子実体の脱脂産物に対し水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、マンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得る；前記アルカリ抽出物に対し透析を行って小分子を除去する；そして、前記透析で得られた抽出物に対し直接乾燥して前記効果的な分画FYGLを得るステップを含む。
【００３７】
本発明の1つの好ましい実施例において、前記効果的な分画FYGLが基本的に重量平均分子量が1kDa〜100kDaの物質からなる。前記好ましい抽出物において、効果的な分画の活性
成分の濃度が更に向上された。
【００３８】
本発明の1つの好ましい実施例において、前記分離を行ってから、前記乾燥が噴霧乾燥、減圧乾燥、冷凍乾燥又は常圧乾燥から選ばれた少なくとも1つである。乾燥方式の選択は実際の抽出率に影響しないが、産物へのダメージを減少させる点で、たとえば、減圧乾燥及び／又は常圧乾燥のような温和な乾燥方法が好ましい。生産効率向上の角度から言えば、噴霧乾燥及び／又は冷凍乾燥が好ましい。
【００３９】
本発明の1つの好ましい実施例において、前記脱脂産物は、アルコール又はアルコール水溶液を利用してマンネンタケ子実体に対し脱脂を行って得られ、後続のステップの効率を高めるためには、前記脱脂手順は乾燥のステップを含むことが好ましい。
【００４０】
原料について、発明者の実験の結果に示されたように、前記効果的な分画FYGLが各地のマンネンタケ子実体に広く存在し、かつ本発明の抽出方法が前記効果的な分画に良好な選択性を有するので、本発明の抽出方法で使用されたマンネンタケ子実体が一産地のマンネンタケに限らず、言い換えれば、全国各地から採取したマンネンタケを使うことができ、産地で採れた生薬でもよいし、普通の生薬でもよい。野生のマンネンタケでもよいし、人工栽培のマンネンタケでもよい。たとえば、吉林、浙江などで採集したマンネンタケを使ってもよいし、販売業者が販売したマンネンタケ子実体（たとえば上海雷允上が販売している製品）を使ってもよい。脱脂の効率を高めるために、先に寸断機などの設備で購入したマンネンタケ子実体を寸断してから、脱脂を行うことができる。
【００４１】
脱脂時に使う脱脂剤について、アルコール溶剤又はアルコール水溶液が使われる。入手の難易度から考えれば、エタノール又はエタノール水溶液が好ましい。生産効率から考えれば、エタノール水溶液の体積濃度は、好ましくは50v/v%以上で、更に好ましくは70v/v%以上で、最も好ましくは95v/v%以上である。脱脂の回数が1-5回でよい。前記回数が使用したアルコール溶液の濃度などの要素により適当に選ぶことができ、子実体から脂質化合物を基本的に除去できればよい。たとえば、95v/v%のエタノール水溶液を使ってマンネンタケ子実体に対し3回脱脂を行うことができる。脱脂の温度について、常温でよいが、好ましくは、たとえば40℃以上の常温よりやや高い温度で行う。たとえば、約95v/v%のエタノール溶液について、その沸点温度（約78℃）で還流脱脂を行うことができる。毎回の脱脂時間は原料の量、脱脂温度、脱脂剤の濃度及び原料と脱脂剤の比率などの各要因により総合的に決定される。たとえば、20分から10時間であってもよい。指摘すべきなのは、脱脂の目的はただマンネンタケ子実体から脂質化合物を除去するだけで、脱脂の普通の方法が当業者が公知されているので、前記言及した方法以外、当業者が通常の実験手段でこの目的を達することもできる。
【００４２】
脱脂で得られた物（濾残）の乾燥ステップについて、噴霧乾燥、減圧乾燥、冷凍乾燥又は常圧乾燥から選ばれた少なくとも1つを使ってもよい。揮発性がよりよい高濃度のアルコール溶液を脱脂剤とすれば、空気乾燥が好ましい。これは、更にコストを下げられるからである。これによって、脱脂された産物を得られる。概して、脱脂の手順は乾燥ステップを含んでもよいし、直接脱脂された産物を後続のステップに使ってもよい。
【００４３】
次に、前記脱脂された産物に対しアルカリ抽出を行う。アルカリ抽出を行うときの溶液温度（即ち、アルカリ抽出温度）については、0℃（氷水浴）-20℃でよい。発明者は、前記範囲内で、より低いアルカリ抽出温度を選択することにより、得られる効果的な分画の活性を顕著に向上できることを意外にも発見した。従って、このことから考えれば、アルカリ抽出温度は低ければ低いほど好ましい。20℃より高いアルカリ抽出温度を選び、普通の抽出時間（たとえば、1時間）を使用すれば、アルカリ抽出物の効果的な分画を破壊し、タンパクと多糖との間の共有結合を断裂し、小分子化合物になり、小分子化合物がその
あとの透析ステップで除去され、最後の抽出物の量が減少し、活性が下がり、効果的な分画が減少する。すなわち、得られた抽出物が蛋白質チロシンホスファターゼ-1Bに対する半数阻害濃度IC50が80μg/mLより大きくなる。一方、温度が低ければ低いほど、アルカリ抽出スピードが遅く、必要なアルカリ抽出の回数も多くなり、かつアルカリ抽出に消耗したエネルギーが多すぎ、不経済になった。従って、前記アルカリ抽出温度は、更に好ましくは4-15℃である。例を挙げれば、1つの好ましい実施例において、アルカリ溶液を使って、10℃のアルカリ抽出温度で、抽出を1-5回行い、抽出時間が10時間以上であり、もっと好ましくは12-24時間である；もし0℃の氷水浴でアルカリ抽出を行えば、24時間を超えた後に10℃と同じようなアルカリ抽出効果を得られる。
【００４４】
用いるアルカリ溶液は、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム又はアンモニア水から選ばれる少なくとも1種を含む水溶液でもよい。好ましくは、濃度が0.5M以上の炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウム溶液である；又は0.1-2Mの水酸化カリウム、水酸化ナトリウム又はアンモニア水溶液である。より高い生産率を得られるため、適当に抽出時間を延長する（たとえば、15時間以上に延長する）こと及び／又はアルカリ性物質の濃度を高める（たとえば、水酸化ナトリウムの濃度を1.5M以上に高める、又は炭酸ナトリウムの濃度を2M以上に高める）ことができる。生産率を高めることから考えると、更に好ましくは、濃度が1.0M以上の炭酸ナトリウム又は0.5-2Mの水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム又は0.5-2Mのアンモニア水である。濃度が高ければ高いほど効率が高いが、濃度が高すぎると目標抽出物が損傷し、後続の手続きが複雑になるおそれがあるので、好ましくない。そして、アルカリ抽出を行って得られた抽出液をろ過することができる。好ましくは、ろ過した後のろ過液を塩酸又は酢酸などの酸性試薬で中性に中和して、濃縮して、後続のステップに使用する。当業者は、実際状況により、いわゆるろ過、中和及び濃縮のステップを省略することができることを理解するであろう。
【００４５】
本発明のターゲット抽出物がアルカリ抽出物に存在するが、先に脱脂産物に対し水抽出を行って、それから、水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣に対しアルカリ抽出を行って、これによって、アルカリ抽出物を得ることもできる。もちろん、先に一部の脱脂産物に対し水抽出を行って、それから、これにより得られた濾残、残渣及び他の部分の脱脂産物と一緒に、アルカリ抽出を行い、これによって、アルカリ抽出物を得ることもできる。要するに、どのような手段でも、どのような順序でも、脱脂産物からアルカリ抽出物が得られればよい。従って、当業者は、実際状況により各ルートを選ぶことができる。例えば、1つの好ましい実施例において、先に脱脂産物に対し水抽出を行って、水抽出物（中には、他の用途として用いられる効果的な分画を含む可能性がある）を得て、それから、水抽出で得られた濾残又は残渣から本発明の効果的な分画FYGLの調製に用いられるアルカリ抽出物を抽出する。言い換えれば、アルカリ抽出の使用原料は、水抽出を行った後の濾残及び／又は残渣であってもよい。前記原料は、当分野の通常の水抽出方法で捨てられる廃棄物であるので、前記実施例により、前記アルカリ抽出のコストを顕著に下げられる。
【００４６】
前記水抽出を行った場合、例えば、脱イオン水を利用して抽出することができる。その抽出温度は、通常の漢方薬の水抽出の温度であってもよい、例えば、50〜80度。しかし、生産率を高めるには、沸騰水による還流抽出が好ましい。水抽出の回数が1-5回で、抽出時間が1-5時間でよい。具体的には、実際状況により定める。
【００４７】
前記方法でマンネンタケ子実体のアルカリ抽出物を得た後、得られた効果的な分画の濃度を高めるには、前記アルカリ抽出物を透析して、小分子を除去する必要がある。前記小分子は、無機小分子、水溶性有機小分子、タンパク小分子又は糖類小分子などを含むが、それらに限らない。その内、無機小分子は、アルカリ抽出物に混ぜたアルカリ、アルカリが中和されて形成した塩及び存在可能な塩酸を含んでもよい。マンネンタケ子実体の中間抽出物であるこの混合物から言えば、当業者が、ここで小分子を除去する意味が分かる。
発明者はここで明確にしたいことは、本発明で得られた効果的な分画FYGLには、最終産物の活性成分の濃度を下げることになる、活性成分ではなく後続の分離のステップに干渉する種の小分子が含まれないことである。そのため、分離のステップに入る前に、これらの小分子は、除去されることが好ましい。透析は当業者がよく使われる小分子を除去することができる技術手段である。これを本発明の抽出方法に利用する場合、その活性成分を損失しすぎない状況で、低コストで生物高分子における小分子を除去できるのがそのメリットである。好ましくは、本発明の抽出方法において、前記アルカリ抽出物又は濃縮物を1kDa-3kDaサイズの透析袋（即ち、サイズが1kDa-3kDaにあるいかなる透析袋が使われ、例えば、1kDaと3 kDaが使われる）に入れ、透析袋を脱イオン水において得られたアルカリ抽出物又はその濃縮物に対し透析を1-3日行うことである。しかし、透析以外に、当業者が他の適当な手段（たとえば、カラムクロマトグラフィー、1kDa-3kDaの分画分子量の限外ろ過膜による分離など）で、アルカリ抽出物における小分子を除去してもよく、小分子が除去されればよい。もし、透析袋又は限外ろ過膜の分画分子量が3kDaより大きい場合、効果的な分画を損失させる可能性があるが、1kDaより小さい場合、活性が無効となった小分子、たとえば、アルカリ加水分解されたタンパクと多糖小分子が抽出物に残り、効果的な分画の濃度を顕著に下げ、効果的な成分のタンパクと多糖の含有量の定量測定に影響する。
【００４８】
次いで、小分子を除去したこれらの粗製品を直接乾燥して効果的な分画FYGLを得ることができ、又は先に分離し、その中から更に活性成分を抽出し、最終産物の活性成分の含有量を向上させて、前記乾燥を行うことができる。前記乾燥は、噴霧乾燥、減圧乾燥、冷凍乾燥又は常圧乾燥から選ばれた少なくとも1つである。本発明の1つの好ましい実施例において、前記分離は、（1）アルコール沈殿を行って、上澄み液を得る；又は（2）分画分子量が100 kDa以下の限外ろ過膜により限外ろ過して分取して、重量平均分子量が前記分画分子量より大きい物質を除去する。即ち、主にアルコール沈殿又は限外ろ過の方式により、一定的の分子量間にある特定抽出物を選ぶ。本発明において、前記分子量間は、1kDa〜100kDaであってもよいが、更に好ましくは、1kDa〜50kDaであり、更にもっと好ましくは1kDa〜30kDaである。
【００４９】
発明者は、アルコール沈殿の場合、高分子量の成分が沈殿の方式で除去され、これによって、分子量の中レベルの活性成分を得ることができる；限外ろ過の場合、限外ろ過膜の分画分子量の選択により、分子量の中レベルの活性成分を得ることできることを発見した。実験で証明されたように、分子量が100kDa以上の高分子量成分は、そのPTP1B活性を阻害する能力が明らかに減少したので、ろ過液における活性成分の濃度を更に上げるため、分画分子量が100kDa以下の限外ろ過膜で限外ろ過することが好ましく、分画分子量が70kDa以下の限外ろ過膜で限外ろ過することが更に好ましく、分画分子量が50kDa以下の限外ろ過膜で限外ろ過することが更にもっと好ましく、分画分子量が30kDa以下の限外ろ過膜で限外ろ過することが特に好ましい。
【００５０】
限外ろ過は、高分子とコロイドの濃縮と分離を同時に行う技術であり、その内、圧力差が駆動力として、ろ過液が限外ろ過膜の表面に流れた場合、高分子又はコロイドが阻止され、小分子が膜を通過した。限外ろ過膜は、平面膜、巻きフィルム、管状膜又は中空糸膜であってもよい。普通、限外ろ過膜の孔径が基本的50-10000Åであり、阻止できる粒径の半径が1-20nmであり、分子量が300〜300000である各種のタンパク質と高分子化合物に相当する。分画分子量とは、膜によって阻止される溶液における最小の溶質の分子量を指す。本発明に使用された限外ろ過膜の膜材料は、繊維素とその誘導体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリビニリデンフルオリド、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリスルホンアミド、スルホン化ポリスルホン、架橋ポリビニルアルコール、変性アクリル系高分子などであってもよい。膜材料の選択が阻止された最終産物の組成を影響しないので、本発明の方法が、限外ろ過膜の材料について制限がなく、分画分子量が
前記範囲内にあればよい。
【００５１】
アルコール沈殿による分取は、当業者の通常技術手段であり、すなわち、極性溶剤としてのエタノールと水との効果的な分画と他の成分に対する異なった溶解度を利用して分取することである。発明者は、アルコール沈殿による分取を利用して、効果的な分画FYGLと前記粗抽出物における明確な活性成分を有しない他の成分（不純物と称される）とを分離することができることを発見した。本発明において、アルコール水溶液で前記粗抽出物における不純物を沈殿させて、上澄み液を収集することが好ましい。1つの好ましい実施例において、前記透析の持続時間は2 -4日であり、そして、透析袋内の溶液を元の体積の1/3-1/5までに濃縮して、体積が濃縮液の体積の2-5倍の95v/v%のエタノールを加え、室温で12-24時間放置して、上澄み液を遠心収集する。当業者は、もっとよい抽出効率を得るため、実際状況により、前記条件を適当に調整することができる。
【００５２】
限外ろ過については、当業者が前記範囲において、限外ろ過膜の入手の難易度により前記分画分子量を、たとえば、40kDa、30kDa、20kDa及び10kDaなど、自由に選ぶことができるが、20kDaより小さくないのが好ましい。本発明の1つの実施例において、分画分子量が50kDaである限外ろ過膜により、分子量が50kDa以下の効果的な分画FYGLを得た；この前に、1kDaの透析袋で透析して分離したところ、得られる効果的な分画FYGLは基本的に分子量が1-50kDaである物質からなる。
【００５３】
また、最終産物の活性成分の含有量を高めるために限外ろ過して分取を行った場合、前記分画分子量が100kDa以下の限外ろ過膜以外に、分画分子量がより小さい限外ろ過膜を利用して前記アルカリ抽出物を限外ろ過して、分子量が前記より小さい分画分子量以下の成分を除去することができる。たとえば、分画分子量が10kDa以下（1kDa, 2kDa, 3kDa ... ... 10kDa）の限外ろ過膜を利用して先にアルカリ抽出物を限外ろ過して、分子量が前記分画分子量以下の物質を除去して、それから、得られた産物に対し分画分子量が100kDa以下の限外ろ過膜を利用して限外ろ過を行う；又は、先に分画分子量が100kDa以下の限外ろ過膜を利用して限外ろ過を行い、分子量が前記分画分子量以上の物質を除去して、それから、分画分子量が10kDa以下（1kDa, 2kDa, 3kDa ... ... 10kDa）の限外ろ過膜を利用して得られたろ過液を限外ろ過する。要するに、分子量の分布が1-100kDaの間のいかなるインターバルの活性成分を得るために、当業者が分画分子量の異なるいかなる（それぞれ前記範囲内にある）二種類の限外ろ過膜を利用して前記限外ろ過をすることができる。しかも、前記ステップには、必ず限外ろ過膜を利用して前記分子量分布を有する活性成分を取得する必要があるとは限らない。当業者がまったく別の手段（たとえば、アルコール沈殿、カラムクロマトグラフィーなど）で同様の目的を実現してもよい。好ましくは、前記分画分子量の下限が10kDaより大きくない。更に好ましくは、前記下限が5kDaより大きくない。
【００５４】
また、粗抽出液における粒と不純物により限外ろ過膜のフィルター孔を塞ぐことを阻止するため、先にろ過膜の孔径が2-15ミクロン（たとえば、3ミクロン、5ミクロン、7ミクロン、10ミクロンなど）であるフィルターで粗抽出液をプレろ過して、水に溶けない粒のより大きい不純物を更に除去し、澄ましたプレろ過液を前記限外ろ過に使用するのが好ましい。アルコール沈殿と比べて、限外ろ過は、要する時間が短いので、生産効率から見れば、更に好ましい。しかも、限外ろ過膜は、複数利用することができるので、アルコールより環境によい；アルコール沈殿と比べて、限外ろ過は、最終産物における活性成分の含有量を更に上げられるので、更に好ましい方法である。
【００５５】
分子量を分取して得られた前記上澄み液について、乾燥して本発明の効果的な分画FYGLが得られる。前記乾燥は、噴霧乾燥、減圧乾燥、冷凍乾燥又は常圧乾燥から選ばれた少なくとも1つである。
【００５６】
そうではあるが、効果的な分画の活性を上げる立場から言えば、前記乾燥の前に、蛋白質チロシンホスファターゼ-1Bに対する半数阻害濃度のもっとよい成分を選ぶために、前記効果的な分画に対しカラムクロマトグラフィーすることが好ましい。前記カラムクロマトグラフィーは、DEAE-セルロースカラム、DEAE-Sephadexカラム、DEAE-Sepharoseカラム又はマクロ多孔質吸着樹脂から選ばれた少なくとも1つのカラムクロマトグラフィー装置により行うことができる。1つの好ましい実施例において、使われた脱脂剤が相次いで0.1-2M NaClと0.1-2M NaOHの水溶液であり、その樹脂のカラム径とカラムの高さの比が15 -30であり、流速が0.5-2.5カラム体積/時間である。当業者は、前記教示により実際状況を合わせて前記条件を適当に調整することできる。
【００５７】
溶出後、更に精製ステップを実施してもよい。即ち、フェノール-硫酸法又はローリー法により得られた溶出成分を測定し、反応陽性部分を収集して、それから、1kDaの透析袋で収集した反応陽性部分を透析して、無機塩小分子と水溶性有機小分子を除去する。次いで、得られた透析袋の中の物質を減圧濃縮、乾燥して、マンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLを得る。
【００５８】
1つの好ましい実施例において、効果的な分画FYGLの調製方法は以下の通りである。
【００５９】
（1）脱脂ステップ：マンネンタケ子実体材料を取って、寸断機で寸断して、50-100% (v/v)のエタノールで1-5回脱脂し、脱脂温度が40-78℃で、毎回1-5時間で、脱脂した後の濾残を風乾して、脱脂産物を得る。
【００６０】
（2）アルカリ抽出ステップ：脱脂産物を沸騰水により、1-5回還流抽出し、毎回1-5時間で、ろ過液を抽出し、濾残を得る。濾残を、0.5M以上の炭酸ナトリウム溶液又は0.1-2Mの水酸化ナトリウム又は0.5-2Mのアンモニア水により、0-20℃（4-15℃が更に好ましい）で、1-5回抽出して、抽出時間が12-24時間で、抽出液をろ過して、ろ過液を0.1-1Mの塩酸で中性に中和して、減圧濃縮して、アルカリ抽出濃縮液を得る。
【００６１】
または、脱脂産物を直接1.0M以上の炭酸ナトリウム又は0.5-2Mの水酸化ナトリウム溶液又は1.0M以上のアンモニア水により、0-20℃（4-15℃が更に好ましい）で、1-5回抽出して、抽出時間が12-24時間で、合弁の抽出液をろ過して、ろ過液を0.1-1Mの塩酸で中性に中和して、中和した抽出液を小さい体積に減圧濃縮する。
【００６２】
（3）透析ステップ：前記アルカリ抽出液を1kDa-3kDaの透析袋で1-4日水透析し、透析袋の溶液を1/3-1/5体積に濃縮する。
【００６３】
（4）乾燥ステップ：前記透析により得られたアルカリ抽出液を直接冷凍乾燥する。
【００６４】
（5）選択可能な分離ステップ：前記透析により得られたアルカリ抽出液には、溶液体積の2-5倍の95%のエタノールを加え、室温で12-24時間放置して、上澄み液を遠心収集して、乾燥して、マンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLを得る。
【００６５】
又は、分画分子量が100kDaである限外ろ過膜により、透析して得られたアルカリ抽出液を分取して、分子量が1-100kDaにある成分を得て、乾燥してマンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLを得る。選択可能なのは、先にろ過膜の孔径が2-15マイクロンであるフィルターにより透析して得られたアルカリ抽出液をプレろ過し、水に溶けない粒径の大きい不純物を更に除去し、澄ましたプレろ過アルカリ抽出液を得て、前記限外ろ過を行うことである。
【００６６】
（6）選択可能なカラムクロマトグラフィーステップ：前記効果的な分画FYGLに脱イオン水を加えて溶けて、カラム径とカラムの高さの比が15-30のマクロ多孔質吸着樹脂に吸着。そして、次いで、0.5-2.5カラム体積/時間の流速の0.1-2M NaClと0.1-2M NaOHでグラジエント溶出する。更に、フェノール-硫酸法により溶出成分を測定し、反応陽性部分を収集し、1kDa透析袋で透析して無機塩小分子と水溶性有機小分子を除去して、減圧濃縮して、乾燥して、マンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLを得る。
【００６７】
効果的な分画FYGL
本文に記載の効果的な分画FYGLとは、蛋白質チロシンホスファターゼ-1B（PTP1B）活性を顕著に阻害できるマンネンタケ子実体の抽出物を指す。具体的に言えば、前記効果的な分画は、PTP1B活性に対する半数阻害濃度IC50が80μg/mL以下である。本発明以前に、従来技術には、PTP1B活性に対する半数阻害濃度IC50が80μg/mL以下である抽出物を得たという報告は全くなかった。発明者は、本発明の前記方法を採用すれば、PTP1B活性に対する半数阻害濃度IC50が80μg/mL以下である抽出物、即ち、効果的な分画FYGLを得ることができると発見した。抽出ステップにおける各工程の条件（たとえば、温度、加熱時間、アルカリに使用されるアルカリ溶液の種類と濃度、透析袋の分画分子量、透析時間、限外ろ過膜の選択、カラムクロマトグラフィーの各条件）の違いにより、得られた最終産物の前記阻害濃度IC50が上下する可能性がある（後述には、前記各ルートにより得られた効果的な分画FYGLの前記IC50の具体的な値を詳しく列挙する）。
【００６８】
本発明の明細書の教示により、明らかに当業者は本発明の前記方法の変換や置換えにより、PTP1Bに対する半数阻害濃度IC50が80μg/mL以下であるマンネンタケ子実体の抽出物、即ち、効果的な分画FYGLを得ることができる。従って、本発明の1つの好ましい実施例において、マンネンタケ子実体の抽出物の効果的な分画FYGLが提供され、前記効果的な分画FYGLは、PTP1Bに対する半数阻害濃度IC50が80μg/mL以下であるマンネンタケ子実体の抽出物であり、前記半数阻害濃度IC50は、更に好ましくは70μg/mL以下であり、更にもっと好ましくは50μg/mL以下であり、一層好ましくは40μg/mL以下であり、なお一層好ましくは30μg/mL以下であり、特に好ましくは20μg/mL以下である。前記半数阻害濃度IC50の下限が10μg/mLであり、好ましくは0より大きい。
【００６９】
前記阻害濃度について、数値が小さければ小さいほど、この抽出物の活性が高いことを表すので、もっと好ましい。本発明の1つの好ましい実施例において、前記好ましい効果的な分画FYGLが分子量を分取した後の産物に対しカラムクロマトグラフィーを行って得た最終産物であってもよく、実験では、そのPTP1Bに対する半数阻害濃度IC50が20μg/mL以下になり得ることが実証されている。
【００７０】
核磁気共鳴技術は、物質の各原子核の磁性の違いを利用して、分子構造と運動を明らかにする方法である。原子核が特定の外部磁界において一定のエネルギーの電磁波を吸収するとき、この吸収現象を記録して得たスペクトルは、核磁気共鳴スペクトルである。前記吸収は、核、たとえば1H核、の所在環境と緊密に関わるので、吸収スペクトルの特徴が分子構造の情報を反映できる。核の所在環境とは、化合物の官能基、リンク方式及び空間構造を指し、その吸収の特徴は、ピークの化学シフト（chemical shift、ユニット: ppm、標準試料の信号と比較する値である）、ピークの相対面積、ピークの分裂数で表され、化合物組成と構造の指紋スペクトルであり、化合物の構造と一対一に対応する。1952年、スイスの科学者フェリックス・ブロッホとアメリカの科学者Edwar Wills Purcellが核磁気の精密測定の方法を発見したので、ノーベル賞物理賞を受賞し、1953年、第一台目の30 MHzの核磁気共鳴スペクトル測定装置が作られてから、核磁気共鳴により有機分子の構造を解決する時代が始まった。1991年-2002年、二人のスイスの科学者Richard R. ErnstとKurt Wuthrichは、それぞれ多次元核磁気共鳴技術理論を発展して、生物高分子構造の解決に利用したのでノーベル賞化学賞を受賞した。核磁気共鳴スペクトルは分子構造の指紋スペ
クトルであるので、そのピークの化学シフトとピークの相対面積は、使用される磁界の強度により変化しないが、高磁場スペクトル測定装置によれば測定する信号の強度を増強でき、感度と分解能を上げられる。測定パラメーターの最適化により、同じく信号の強度を強化することができ、ベースラインのノイズを滑らかにすることができるが、化学シフトと相対的なピーク面積には影響を与えない。液体の核磁気共鳴スペクトルを測定する場合、測定する試料が重溶媒に溶ける必要があり、重溶媒が異なることにより、スペクトルの化学シフトは影響を受ける。従って、核磁気共鳴スペクトルを比べるときに注意すべきなのは、同じ重溶媒を使用し、同じ標準試料を選び、たとえば、テトラメチルシラン（tetramethylsilane、TMS)、これが通常の核磁気共鳴の参考試料であり、その1H核の唯一の共鳴吸収ピークの化学シフトの値が普通0 ppmと設定されることである。核磁気共鳴技術は単結晶X線技術以外に、分子構造を研究する最も有力なツールである。単結晶X線技術は、試料が調製しがたい単結晶でなければならないが、核磁気共鳴技術は、溶液状態であればよいので、核磁気共鳴技術は有機分子構造の解決にもっとよく使われる。核磁気共鳴波スペクトルは、よく単一化合物の指紋スペクトルとして使われるが、複数の単一化合物で一定の比率で組合せした混合物もその混合物の指紋スペクトルの特徴を有する。漢方薬の抽出方法において、生物活性実験に確認された効果的な分画を得るとき、前記効果的な分画の核磁気共鳴波スペクトルにより、各種の抽出方式により得られた抽出物を選別することができ、前記選別方法が生物活性実験と比べて、得られた抽出物に充分な効果的な分画を含むかどうかをより速く確定できる。
【００７１】
前記理論により、本発明では、1H NMRを利用して効果的な分画FYGLの具体的構造と組成を確定した。結果的には、1H NMRスペクトルには、化学シフトd=3.6-3.4ppmの積分面積が化学シフトd=3.4-3.2の積分面積との比は0.5-1.5であり、化学シフトd=3.0-1.0の積分面積が化学シフトd=3.4-3.2の積分面積との比は0.5-4.0であった。前記1H NMR測定は、重水を溶媒とし、テトラメチルシランの化学シフトを0. 0ppmと設定して外部標準とする。前記効果的な分画FYGLがPTP1Bに対する半数阻害濃度IC50を上げるために、化学シフトd=3.6-3.4ppmの積分面積が化学シフトd=3.4-3.2の積分面積との比は1.2-1.5であり、化学シフトd=3.0-1.0の積分面積が化学シフトd=3.4-3.2の積分面積との比は2.0-4.0であることが更に好ましい。化学シフトd=3.6-3.4ppmの積分面積が化学シフトd=3.4-3.2の積分面積との比は1.0-1.5であり、化学シフトd=3.0-1.0の積分面積が化学シフトd=3.4-3.2の積分面積との比は2.5-4.0であることが更にもっと好ましい。
【００７２】
多糖とタンパク質構造とその核磁気共鳴波スペクトルとの化学シフト関係及びマンネンタケ子実体の効果的な分画FYGLにおける単糖とアミノ酸組成に対する分析により、発明者は、化学シフト3.6-3.4ppmのピークが主に効果的な分画における多糖成分に含まれるブドウ糖、キシロース、ラムノースなどの単糖ユニットで構成された多糖に関し、化学シフト3.4-3.2ppmのピークが主に多糖成分に含まれるブドウ糖、キシロースなどの単糖ユニットで構成された多糖に関し、化学シフト3.0-1.0ppmのピークがタンパクとポリペプチドに関することと推測した。また、核磁気共鳴波スペクトルにおける化学シフト3.6-6.0ppmのピークが主にブドウ糖に起因する以外に、部分的にアラビノース、キシロース、ラムノース、ガラクトースと果糖など及び一部のタンパクに起因する。発明者は、前記各種のルートにより抽出された効果的な分画FYGLの1H NMRスペクトルにおける特定の区域のピークの面積比率が前記特定の範囲内にあるだけでなく、前記効果的な分画がPTP1Bに対する半数阻害濃度IC50の大きさと、一定の関係を有することを見出した（実施例のところに相応のデータと依存関係を提供する）。普通、1H核磁気共鳴スペクトルにおいては、特徴ピークの積分面積の比率は、直接的に分子の特定官能基と相応する成分の含有量との比率関係を反映する。即ち、前記比率が対応する成分の含有量の比率と正相関する。言い換えれば、比率が大きければ大きいほど、前の成分が後の成分に対する含有量の比率が大きいことを表す。従って、前記結果は、前記効果的な分画FYGLが特定のポリペプチド又はタンパク質及び多糖成分を、一定の比率関係で含むことを示している。
【００７３】
また、前記結果により、当業者は、いかなるマンネンタケ子実体の抽出物について、もしその1H NMRスペクトルに前記特徴ピークがあり、かつその積分面積比率が前記比率範囲内にあれば、PTP1B活性を顕著に阻害する能力を有することを予測できる。また、以上にのべたように、本発明の抽出方法により得られたマンネンタケ子実体の抽出物、即ち効果的な分画FYGLについて、そのPTP1B活性に対する半数阻害濃度IC50がすべて80μg/mL以下である。しかし、発明者が発見したように、その具体的な数値は、ルートの違いにより異なるが（実施例に関係データを提供する）、その1H NMRスペクトルがすべて前記条件を満たしているので、その組成は、違うルートによる明確な差異を有しないことがわかる。言い換えれば、各ルートにより得られたマンネンタケ子実体の抽出物は、PTP1B活性の阻害について似ているだけでなく、組成も基本的に同じである。
【００７４】
また、発明者は、前記ピーク以外に、好ましい効果的な分画FYGLの1H NMRスペクトルが、まだ幾つかの特徴ピーク、たとえば、0.9、1.2、1.4、1.6、2.0、2.3、2.7、3.4、3.5、3.6、3.8、3.9、4.0、4.2、4.3、4.5、4.7、4.8、5.0、5.3、5.9、6.0と6.6-7.6ppm近く（即ち、約±0.1ppm。この偏差が比較とする試料のテトラメチルシランが内部標準か外部標準かにより生じたものである）のピークを有することを見出している。アミノ酸の組成分析により、発見した自然界に存在した合計19種類のアミノ酸において（アミノ酸の組成分析を行うときに、酸により試料を処理する必要があり、トリプトファンが分解されたので、直接的に測定できない）、含有量のトップ5（いずれかは合計アミノ酸含有量の9%より大きい）のアミノ酸がアラニン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンであるので、これらが抽出物におけるタンパク成分の主なアミノ酸残基であると思われる。また、アミノ酸の含有量が合計アミノ酸含有量の2%を超えたアミノ酸がトレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、チロシン、イソロイシン、プロライン、リシン、アルギニン、ヒスチジンなどである。イオンクロマトグラフィーで、多糖を構成する単糖の成分の分析をしたところ、6種類の単糖が存在していると発見した。これらは、ブドウ糖、アラビノース、キシロース、ラムノース、ガラクトース、果糖であり、その中の主な単糖がブドウ糖であり、その含有量が総糖量の70%より大きい。アミノ酸と単糖の組成分析とこれらの1H核磁気共鳴波スペクトルにより、同時に関係文献報告を参考して、FYGLの1H NMRスペクトル帰属を表1の通りまとめた。
【００７５】
表1：FYGLの1H NMRスペクトル帰属。
【００７６】
【表１】
0005946830.tif 000002
【００７７】
効果的な分画FYGLの用途
以上に述べたように、効果的な分画FYGLは、蛋白質チロシンホスファターゼ-1B活性に
顕著な阻害能力を有するマンネンタケ子実体の抽出物であり、具体的に言えば、前記効果的な分画のPTP1Bに対する半数阻害濃度IC50は80μg/mL以下である。それ以外に、発明者は、前記すべての効果的な分画FYGLはα-アミラーゼとα-グルコシダーゼの活性にそれぞれな阻害作用を有することを発見した。従って、前記効果的な分画FYGLは薬物の調製に用いられ、これらの酵素に関する疾患の治療に用いられることができる。具体的に言えば、これらの薬物は糖尿病及び代謝症候群の少なくとも1つの予防又は治療に用いられる。これらの疾患は、糖尿病及び代謝症候群に関わる以下の疾患の少なくとも1つであってもよい：アテローム性動脈硬化、動脈硬化、肥満症、高血圧、高脂血症、脂肪肝、腎疾患、神経性疾患、網膜症、足部潰瘍又は白内障。本発明の薬剤は、活性成分としての前記いかなる1つの効果的な分画FYGLと薬学上に受けられるキャリアを含むことが可能である。これらの薬剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸薬、注射剤、経口薬、沈殿防止剤、ドロップ剤、小丸薬、スプレー剤、エアゾル剤、バップ剤又はペースターであってもよい。前記効果的な分画FYGLが薬剤において、唯一の活性成分であってもよいし、他の効果的な分画と組合せしてもよい。単独使用でも組合せして使用する場合でも、その量は実際状況により適当に確定されてもよい。前記薬剤は、当分野の通常方法で調製されてもよい。漢方薬の効果的な分画を含む薬物の調製方法は当業者に熟知される通常方法であるので、ここでは叙説しないとする。
【００７８】
製薬の用途以外に、前記効果的な分画FYGLは、全部マンネンタケ子実体から抽出されたものであり、有害化学物質を含まないので、健康食品として日常保健に用いられる。本発明の健康食品は活性成分としての前記いかなる1つの効果的な分画FYGLと食用可能なキャリアを含むことが可能である。同じく、前記効果的な分画FYGLが唯一の活性成分とする又は他の効果的な分画と組み合わせして健康食品に用いられる。単独使用でも組合せして使用しても、その量が実際状況により適当に確定されてもよい。前記健康食品の製剤は当分野の通常の調製方法により調製されてもよい。漢方薬の効果的な分画を含む健康食品の調製方法は当業者に熟知される通常方法であり、ここでは叙説しないとする。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例を挙げるのは、本発明をよりよく理解させるためであり、本発明は以下の実施例に制限されない。
【００８０】
＜第1実施例＞
10gのマンネンタケ子実体原料（雷允上から購入、産地は吉林）を95v/v%の薬用エタノールで3回脱脂し、脱脂温度が70℃であり、毎回5時間で、脱脂した後の濾残を風乾して、脱脂した干し物（脱脂産物）を1Mの炭酸ナトリウム水溶液で20℃で2回抽出して、抽出時間が12時間で、抽出液をろ過して、1Mの塩酸で中性に中和して、減圧濃縮してアルカリ抽出濃縮液を得て、1kDaの透析袋で2日間水透析して、透析袋内の溶液を1/5体積に濃縮し、直接冷凍乾燥して抽出物0.5gを得た（生産率5.0％）。
【００８１】
＜第2実施例＞
第1実施例と同じ方式で透析されたアルカリ抽出濃縮液を得て、溶液体積の5倍の95v/v%のエタノールを加え、室温で12時間放置して、上澄み液を遠心収集して、冷凍乾燥して、マンネンタケの抽出物0.42gを得た（生産率4.2％）。
【００８２】
＜第3実施例＞
10gのマンネンタケ子実体原料（雷允上から購入、産地は吉林）を95v/v%の薬用エタノールで3回還流脱脂し、脱脂温度が78℃であり、毎回5時間で、脱脂した後濾残を風乾して、脱脂した干し物（脱脂産物）を1Mの水酸化ナトリウム溶液で20℃で2回抽出して、抽出時間が24時間で、抽出液をろ過して、1Mの塩酸で中性に中和して、減圧濃縮してアルカリ抽出濃縮液を得て、1kDaの透析袋で2日間水透析して、透析袋内の溶液を1/5体積に濃縮し
、溶液体積の5倍の95v/v%のエタノールを加え、室温で12時間放置して、上澄み液を遠心収集して、冷凍乾燥してマンネンタケの抽出物0.40gを得た（生産率4.0％）。
【００８３】
＜第4実施例＞
第2実施例を再度実施し、これにより得たマンネンタケの抽出物0.42gを取り、脱イオン水を加えて溶けて、DE-32イオン交換樹脂カラムに吸着され、樹脂のカラム径とカラムの高さの比が25であり、相次いで0.6M NaClと0.2M NaOHでグラジエント溶出して、流速が1カラム体積/時間である。フェノール-硫酸法により溶出成分を測定し、その内の0.2M NaOHの溶出成分が先に塩酸で中性に中和する必要がある。フェノール-硫酸法による反応陽性部分を収集して、1kDaの透析袋で透析して小分子を除去して、減圧濃縮して、冷凍乾燥して、溶出された各成分が合計0.28gを得た（生産率2.8％）。
【００８４】
＜第5実施例＞
第2実施例を再度実施し、これにより得たマンネンタケの抽出物0.42gを取り、脱イオン水を加えて溶けて、Sephadex G75ゲルクロマトグラフィを行って、樹脂のカラム径とカラムの高さの比が35であり、0.2M NaOLで溶出し、流速が1カラム体積/時間である。フェノール-硫酸法により、溶出成分を測定して、フェノール-硫酸法による反応陽性部分を収集して、1kDaの透析袋で透析して小分子を除去して、減圧濃縮して、冷凍乾燥して、溶出された各成分が合計0.06gを得た（生産率0.6％）。
【００８５】
＜第6実施例＞
10gのマンネンタケ子実体原料（雷允上から購入、産地は吉林）を95v/v%の薬用エタノールで3回還流脱脂し（脱脂温度が78℃）、毎回4時間で、脱脂した後の濾残を風乾して、脱脂した干し物（脱脂産物）を沸騰水で2回還流抽出し、毎回3時間で、抽出液をろ過して、ろ過液を捨てる。水抽出した後の濾残を引き続き1Mの炭酸ナトリウム水溶液で20℃で2回抽出して、抽出時間が12時間で、抽出液をろ過して、1Mの塩酸で中性に中和して、減圧濃縮してアルカリ抽出濃縮液を得て、1kDaの透析袋で2日間水透析して、透析袋内の溶液を1/5体積に濃縮し、溶液体積の5倍の95v/v%のエタノールを加え、室温で12時間放置して、上澄み液を遠心収集して、冷凍乾燥して、マンネンタケの抽出物0.31gを得た（生産率3.1％）。
【００８６】
＜第7実施例＞
第1実施例と同じ方式で透析されたアルカリ抽出物を得て、先にろ過膜の孔径が5マイクロンのフィルターによりプレろ過し、分画分子量が100kDaである限外ろ過膜により、得られたプレろ過アルカリ抽出液を分取して、1kDa -100kDaの成分0.65gを得た（生産率6.5％）。
【００８７】
＜第8実施例＞
第3実施例と同じ方式で透析されたアルカリ抽出物を得て、先にろ過膜の孔径が5マイクロンのフィルターによりプレろ過し、分画分子量が100kDaである限外ろ過膜により、得られたプレろ過アルカリ抽出液を分取して、1kDa -100kDaの成分0.61gを得た（生産率6.1％）。
【００８８】
＜第9実施例＞
第1実施例と同じ方式で透析されたアルカリ抽出物を得て、先にろ過膜の孔径が5マイクロンのフィルターによりプレろ過し、分画分子量が50kDaである限外ろ過膜により、得られたプレろ過アルカリ抽出液を分取して、1kDa -50kDaの成分0.30gを得た（生産率3.0％）。
【００８９】
＜第10実施例＞
第1実施例と同じ方式で透析されたアルカリ抽出物を得て、先にろ過膜の孔径が5マイクロンのフィルターによりプレろ過し、分画分子量が30kDaである限外ろ過膜により、得られたプレろ過アルカリ抽出液を分取して、1kDa -30kDaの成分0.25gを得た（生産率2.5％）。
【００９０】
＜第11実施例＞
第9実施例と同じ方式で1-50kDaの成分0.25gを得て、分画分子量が3kDaである限外ろ過膜により、3kDa以下の成分を除去して、3-50kDaの成分0.20gを得た（生産率2.0％）。
【００９１】
＜第12実施例＞
第7実施例と同じ方式で1kDa -100kDaの成分0.65gを得て、分画分子量が50kDaである限外ろ過膜により、50kDa以下の成分を除去して、50-100kDaの成分0.40gを得た（生産率4.0％）。
【００９２】
＜第13実施例＞
第7実施例と同じ方式で1kDa -100kDaの成分0.65gを得て、第4実施例の方式でカラムクロマトグラフィーを行い、精製産物0.33gを得た（生産率3.3％）。
【００９３】
＜第14実施例＞
第1実施例を再度実施し、異なるのは、アルカリ抽出ステップにおいて、アルカリ抽出温度を20℃から0℃（氷水浴）に変え、2回抽出し、アルカリ抽出時間が24時間である。抽出物0.80gを得た（生産率8.0％）。
【００９４】
＜第15実施例＞
第2実施例を再度実施し、異なるのは、アルカリ抽出ステップにおいて、1Mの炭酸ナトリウム水溶液で10℃で2回抽出し、抽出時間が12時間である。抽出物1.10gを得た（生産率11.0％）。前記抽出物1.10gを第5実施例と同じ方式で精製し、溶出された各成分が合計0.08gを得た（生産率0.8％）。
【００９５】
＜第16実施例＞
第1実施例を再度実施し、異なるのは、アルカリ抽出ステップにおいて、アルカリ抽出温度を20℃から15℃に変え、2回抽出し、抽出時間が12時間であり、冷凍乾燥して抽出物0.62gを得た（生産率6.2％）。
【００９６】
＜対比例1＞
第7実施例で得た100kDa以上の成分を取って、乾燥して、抽出物0.9gを得た。
【００９７】
＜対比例2＞
10gのマンネンタケ子実体原料（雷允上から購入、産地は吉林）を95v/v%の薬用エタノールで3回脱脂し、脱脂温度が70℃であり、毎回5時間で、脱脂した後の濾残を風乾して、脱脂した干し物（脱脂産物）を沸騰水で2回還流抽出し、毎回3時間で、抽出液をろ過して、濾残を捨て、ろ過液を冷凍乾燥してマンネンタケの抽出物0.45gを得た。
【００９８】
＜対比例3＞
第16実施例を再度実施し、異なるのは、アルカリ抽出ステップにおいて、アルカリ抽出温度を15℃から25℃に変え、アルカリ抽出溶液を1Mの炭酸ナトリウム水溶液から0.5MNaOHに変え、かつ2回抽出し、抽出時間が12時間であり、3kDaの透析袋で水透析し、冷凍乾燥して抽出物0.25gを得た（生産率2.5％）。
【００９９】
＜対比例4＞
第16実施例を再度実施し、異なるのは、アルカリ抽出ステップにおいて、アルカリ抽出温度を15℃から65℃に変え、アルカリ抽出溶液を1Mの炭酸ナトリウム水溶液から0.5MNaOHに変え、かつ2回抽出し、抽出時間が12時間であり、3kDaの透析袋で水透析し、冷凍乾燥して抽出物0.13gを得た（生産率1.3％）。
【０１００】
以下各試料に各分析を行う。
【０１０１】
分析1
前記実施例と対比例で得た試料を赤外線スペクトル分析した結果、各実施例による試料の赤外線スペクトルが基本的似ている。実施例による試料の赤外線スペクトルにおいて、3420cm-1のところの強吸収ピークが水酸基O-H伸縮振動ピークであり、2937cm-1のところの吸収ピークがC-H伸縮振動ピークであり、1620cm-1と1400cm-1のところの吸収ピークがそれぞれタンパクのアミドIとアミドIIの振動ピークであり、1200-1000 cm-1の間の吸収ピークが多糖のC-OHとC-O-Cの特徴吸収ピークである。対比例1〜対比例4の試料において、1620cm-1と1400cm-1のところの吸収ピークが明らかに弱くなった。
【０１０２】
分析2
フェノール-硫酸法により、前記実施例と対比例で得たマンネンタケ子実体の抽出物における多糖の含有量を測定する。
【０１０３】
試薬：濃硫酸：分析純、95.5wt%。80wt%フェノール：80gのフェノール（分析純再蒸留試薬）に20gの水を加え溶けて、冷蔵庫に入れて光を避けて長期的に保存することができる。6wt%フェノール：使用する前に、80wt%フェノールにより調製する。ブドウ糖：分析純、98wt%。
【０１０４】
まず糖の含有量の標準曲線の作成：ブドウ糖20mgを正確に計って500mLのメスフラスコに入れて、水を目盛りまで加え、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL及び1.8mLをそれぞれ吸い出して、それぞれ水を2.0mLまで加え、それから6wt%フェノールを1.0mL加えて、10分間放置して、濃硫酸を5mL加え、シェイクして、室温で20分間放置して、490nmにおいて、光吸収の強度を測り、2.0mlの水を同様に操作することをブランクとし、横軸を多糖のマイクログラム数とし、縦軸を光吸収の強度とし、糖の含有量の標準曲線を得た。
【０１０５】
試料含有量の測定：40g/mLの試料溶液を1.0mL吸い出して、水を1mL加え、それから、6wt%フェノールを1.0mL加えて、10分間放置して、濃硫酸を5mL加え、シェイクして、室温で20分間放置して、490nmにおいて、光吸収の強度を測り、標準曲線により、多糖の含有量を計算する。
【０１０６】
フェノール-硫酸法により分析した各試料の多糖の含有量が表2に示される。
【０１０７】
表2：各試料の多糖の含有量
【０１０８】
【表２】
0005946830.tif 000003
【０１０９】
分析3
ローリー法により、前記実施例と対比例で得たマンネンタケ子実体の抽出物におけるタンパクの含有量を測定する。
【０１１０】
理論：タンパク質は、アルカリ溶液において、そのペプチド結合がCu2+とキレート化して、タンパク質-銅混合物を形成し、前記混合物がフェノール試薬のリンモリブデン酸を還元させ、青い化合物を生じさせ、一定的な条件で、650nmのところの青い光吸収強度とタンパク質の濃度との線形関係により、標準曲線を作成して、試料におけるタンパク質の濃度の測定に用いる。
【０１１１】
ローリー法測定試薬箱により測定した前記マンネンタケ子実体の抽出物におけるタンパクの含有量が表3の通りである。
【０１１２】
表3：各試料のタンパクの含有量
【０１１３】
【表３】
0005946830.tif 000004
【０１１４】
分析4
前記実施例と対比例で得たマンネンタケ子実体の抽出物が蛋白質チロシンホスファターゼ-1B (PTP1B)に対する阻害濃度を測定する。
【０１１５】
ニトロフェニルリン酸二ナトリウム(pNPP)がアルカリ性ホスファターゼの可溶性基質であり、人間の蛋白質チロシンホスファターゼ-1B (PTP1B、Sigma社)の触媒作用により、1つのリン酸基を脱落して、可溶性黄色い産物p-ニトロフェノールを生じて、405nmのところに光吸収を有し、陽性薬物バナジウム酸ナトリウムを対照として、一連の濃度のFYGLを加えた。ELISAリーダーにより、405nmのところの光吸収の降下を測定するのは、前記薬物が蛋白質チロシンホスファターゼ-1B活性に対する阻害濃度を測定できる。使用した緩衝液が50mMTris、pH8.0、150mMの塩化ナトリウムである。
【０１１６】
各試料の最終濃度が25μg/mLであるときのPTP1B活性に対する半数阻害濃度IC50が表4の通りである。
【０１１７】
表4：各試料の蛋白質チロシンホスファターゼ-1B (PTP1B)に対する半数阻害濃度IC50。
【０１１８】
【表４】
0005946830.tif 000005
【０１１９】
分析5
前記第13実施例で得たマンネンタケ子実体の抽出物がα-アミラーゼの活性に対する阻害を測定する。
【０１２０】
3,5-ジニトロサリチル酸(Bernfeld method)が体外においてアミラーゼの活性阻害剤を選別する通常の方法であり、可溶性澱粉がα-アミラーゼにより加水分解され還元基団を生じて、3,5-ジニトロサリチル酸を還元してニトロアミノサリチル酸を生じて、過量のNaOHアルカリ性溶液において、ニトロアミノサリチル酸がオレンジ色になり、周波数が540nmのところに最大の吸収を有する。α-アミラーゼ阻害剤が澱粉の加水分解に阻害作用を有するので、A540nm値を降下させられ、アカルボースを陽性対照薬物として、測定するものがアミラーゼ活性に対する阻害濃度を計算することができる。
【０１２１】
第13実施例で得た試料は最終濃度が15U/mLであるときのα-アミラーゼに対する半数阻害濃度IC50が83±10μg/mLである。
【０１２２】
分析6
前記第13実施例で得たマンネンタケ子実体の抽出物がα-グルコシダーゼの活性に対する阻害を測定する。
【０１２３】
p-ニトロフェニル-α-D-グルコピラノシド(pNGP)がα-グルコシダーゼの可溶性基質で
あり、α-グルコシダーゼの触媒作用により、1つのリン酸基を脱落して、黄色い可溶性産物p-ニトロフェノールを生じて、405nmのところに光吸収を有し、陽性対照薬物バナジウム酸ナトリウムを対照として、ELISAリーダーにより、FYGLがα-グルコシダーゼ活性に対する阻害を測定し、405nmのところの光吸収の降下を測定するのは、薬物がα-グルコシダーゼ活性に対する阻害を測定できる。
【０１２４】
第13実施例で得た試料は最終濃度が0.03U/mLであるときのα-グルコシダーゼ活性に対する半数阻害濃度IC50が97±10μg/mLである。
【０１２５】
分析7
上海中医薬大学薬物安全評価センターにおいて、第13実施例の抽出物についてSTZ誘発2型糖尿病モデルマウスにて薬効実験を行った。結果が表5に示される。
【０１２６】
表5：第13実施例の抽出物がSTZ誘発2型糖尿病モデルマウスにおける薬効の結果
【０１２７】
【表５】
0005946830.tif 000006
【０１２８】
投薬の方式が胃内投与であり、服用の量がそれぞれ：2型糖尿病：生理的塩類溶液20mL/kg；FYGL低用量組：50mg/kg；FYGL高用量組：150mg/kg；メトホルミン組：200mg/kg；ロシグリタゾン組：3mg/kg。各組のマウスの数：10匹/組。
【０１２９】
数週後、FYGL投薬組は空腹血糖値が2型糖尿病対照組より明確に低く、陽性組のメトホルミン組とロシグリタゾン組の血糖降下効果と基本的同じである。2型糖尿病対照組と比べて、記号（#）が p < 0.05で、即ち、顕著な差異性を有する。記号（##）が p < 0.01、即ち、非常に顕著な差異性を有する。
【０１３０】
分析8
各実施例と対比例の試料の1H NMRスペクトルを測定する。具体的な実験条件は以下の通りである。
【０１３１】
設備：ドイツBruker DMX500核磁気共鳴スペクトル測定装置、1H共振周波数が500MHzで、グラジェントフィールドにおけるWATERGATE水ピーク抑制パルス序列、1H90°パルス幅が9.4マイクロセカンドで、サンプリングの長さが2.044秒で、サンプリングポイントが32kで、スキャン回数が128である。
【０１３２】
試料の調製：20mgの試料が0.5mLの重水に溶けて、直径が5mmである核磁気共鳴グラスチューブにおいて測定する。
【０１３３】
測定条件：室温、テトラメチルシランの1H化学シフトが0.000 ppmであることを外部標準とする。
【０１３４】
各試料の1H NMRスペクトルには、化学シフトdが0.9、1.2、1.4、1.6、2.0、2.3、2.7、3.4、3.5、3.6、3.8、3.9、4.0、4.2、4.3、4.5、4.7、4.8、5.0、5.3、5.9、6.0と6.6-7.6 ppmの近くの核磁気共鳴ピークが含まれる。図1が第1実施例の1H NMRスペクトルである。各実施例と対比例の化学シフトd=3.6-3.4ppmの積分面積が化学シフトd=3.4-3.2ppmの積分面積との比率（比率Ｉと略称する）、化学シフトd=3.0-1.0ppmの積分面積が化学シフトd=3.4-3.2ppmの積分面積との比率（比率II略称する）を表6に列する。
【０１３５】
表6：各実施例と対比例の1H NMRスペクトルピーク面積の比較
【０１３６】
【表６】
0005946830.tif 000007
【０１３７】
分析9
前記第13実施例で得たマンネンタケ子実体の抽出物の単糖組成を測定する。
【０１３８】
単糖組成の分析がイオンクロマトグラフィー法を採用し、多糖の加水分解方法とクロマトグラフ条件は以下の通りである。
【０１３９】
（1）多糖の加水分解
多糖の試料1.0mgを量って試験管に入れ、2Mのトリフルオロ酢酸を1.0mL加え、封して、
100℃で、2-4時間加水分解して、それから、試験管を開け、窒素を入れて干して、水を入れて溶けて2.0mLまで定容する。0.2mmの使い捨てフィルターでろ過して直接的に試料導入分析をする。
【０１４０】
（2）クロマトグラフ条件
CarboPACTM PA10糖分離カラム（2mmi.d.*250mm）、CarboPACTM PA10糖保護カラム（2mmi.d.*50mm）、AminoPAC Trapアミノ酸捕集カラム（2mmi.d.*50mm）。流動相が14.0mM NaOHであり、流量が0.2mL/minであり、試料導入量が25mLであり、コラム温度が30℃である。試料を分析する前に、0.2mMNaOH溶液でクロマトグラフを10.0時間再生して、それから、14.0mMNaOH溶液で2時間平衡する。
【０１４１】
第13実施例で得た試料の単糖組成とその相対的含有量が表7に示される。
【０１４２】
表7：第13実施例で得た試料の単糖組成とその相対的含有量
【０１４３】
【表７】
0005946830.tif 000008
【０１４４】
分析10
前記第13実施例で得たマンネンタケ子実体の抽出物のアミノ酸組成を測定する。
【０１４５】
アミノ酸分析装置でアミノ酸組成分析を行い、前記装置は経典的な陽イオン交換クロマトグラフ分離、ニンヒドリンカラム誘導法により、タンパク質加水分解液と各種の遊離アミノ酸の成分の含有量を分析する。
【０１４６】
2mgの試料を量ってグラスチューブに入れて、2mLの6MHCl溶液を入れて、窒素を5分間入れて、封する。グラスチューブを110℃の定温乾燥箱において22-24時間加水分解する。加水分解が終わってから室温まで冷却して、グラスを開けて、10mLまで定容して、ろ過して、5mLのろ過液を真空乾燥機に入れて、55℃ぐらいで完全に乾燥された。1.0mLの超純水を入れて溶けて、シェイクして、1M HCl又はNaOHでpH値を1.7〜2.2の間（精密試験紙で測定できる）に調整して、ろ過して、適当な濃度まで希釈して、試料導入分析をする。
【０１４７】
アミノ酸分析器: Hitachi（日立）全自動アミノ酸分析装置、モデルナンバー
：日立L-8900。
【０１４８】
第13実施例で得た試料のアミノ酸組成とその相対的な含有量が表8に示される。
【０１４９】
表８：第13実施例で得た試料のアミノ酸組成とその相対的な含有量
【０１５０】
【表８】
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【０１５１】
本発明を前記実施例を通じて説明した。しかし、理解すべきなのは、前記実施例がただ例を挙げることと説明する目的に用いられ、本発明を述べた実施例の範囲内に制限する意向ではない。当業者は本発明の教示によりもっと多くの変形と修正をすることができ、これらの変形と修正が本発明の保護を求める範囲内に属する。本発明の保護の範囲は、付属する請求の範囲とその同等の範囲で限定される。
【図１】
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