(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーによって有機分子と結合しているＣＤ４受容体由来ペプチドを含んでなるコンジュゲート分子であって、
該ＣＤ４受容体由来ペプチドは、次の一般配列（Ｉ）：
【化１】
0006046060.tif 000035
（式中、
・Ｐ１は３〜６個のアミノ酸残基を表し、
・Ｐ２は２〜４個のアミノ酸残基を表し、
・Ｐ３は６〜１０個のアミノ酸残基を表し、
・ＸａａｆはＮ−アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）またはチオプロピオン酸（ＴＰＡ）を表し、
・ＸａａｇはＡｌａまたはＧｌｎを表し、
・ＸａａｈはＧｌｙまたは（Ｄ）ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、
・ＸａａｉはＳｅｒまたはＨｉｓまたはＡｓｎを表し、
・Ｘａａｊはビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、フェニルアラニンまたは［β］−ナフチルアラニンを表し、
・ＸａａｋはＴｈｒまたはＡｌａを表し、
・ＸａａｌはＧｌｙ、ＶａｌまたはＬｅｕを表し、かつ
・Ｘａａｍは−ＮＨ２または−ＯＨを表し、
Ｐ１、Ｐ２およびＰ３中のアミノ酸残基は天然または非天然の、同一または異なる残基であり、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の該残基は総てＬｙｓ残基とは異なり、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は共通または非共通の配列を有する）
を含んでなり、かつ、
該有機分子は、
・Ｓ−（Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｓ）ｎの配列（式中、ｎは、１〜５の間に含まれる整数を表し、Ｓはセリンを表し、かつ、Ｄはアスパラギン酸を表し、かつ、Ｘは、チロシン、スルホチロシン、チロシンスルホネート、アミノスベリン酸およびｐ−カルボキシメチルフェニルアラニンからなる群から選択され、かつ、個々のＸ基は同一であるかまたは異なっている）を有するアニオン性ポリペプチド、
・分子基Ａ−Ｚ
（式中、
Ａは、式−ＣＯ（ＣＨ２）３ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）２−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、−ＣＯ（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−および−ＣＯ（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−（式中、ｐは、１〜１０の間に含まれる整数を表し、ｑは、１〜１０の間に含まれる整数を表し、１位のカルボニル基はアニオン性ペプチドのＮ末端と結合している）の群の中から選択される基を含んでなり、
Ｚはハロゲン原子、チオールまたはマレイミド基を表す）、
を含んでなり、
該アニオン性ポリペプチドは、式Ａ−Ｚの該分子基によってリンカーと結合しており、該リンカーは、その一方の末端で、該ＣＤ４受容体由来ペプチドの一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミノ基（−ＮＨ２）と共有結合し、その他方の末端で、該有機分子のＺ基と共有結合している、コンジュゲート分子。
【請求項２】
Ａが式−ＣＯ（ＣＨ２）３ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）２−の基を表す、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項３】
一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドの配列が、配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択される、請求項１または２に記載のコンジュゲート分子。
【請求項４】
前記リンカーが、Ｚがチオール基を表す場合には、
【化２】
0006046060.tif 000036
（式中、ｋは、２〜２４の間に含まれる整数を表す）、
【化３】
0006046060.tif 000037
（式中、ｋ１は１、２、３、５および１０に等しい整数を表す）、
【化４】
0006046060.tif 000038
からなる群から選択され、
Ｚがマレイミド基またはハロゲン原子を表す場合には、
【化５】
0006046060.tif 000039
の中から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項５】
前記アニオン性ポリペプチドが１３個のアミノ酸からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項６】
前記アニオン性ポリペプチドが、Ｓ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｓ（配列番号１９）の配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項７】
個々のＸ基が同一である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項８】
Ｘはスルホチロシンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項９】
前記アニオン性ポリペプチドが、Ｓ−（Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ）ｎ、Ｓ−（ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ）ｎ、Ｓ−（ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ）ｎ、Ｓ−（ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ）ｎおよびＳ−（Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ）ｎ（式中、ｎは、１〜５の間に含まれる整数を表し、Ｓはセリンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表し、Ｙはチロシンを表し、ＹＳＯ３はスルホチロシンを表し、ＹＳＮはチロシンスルホネートを表し、ｐＦはｐ−カルボキシメチルフェニルアラニンを表し、Ａｓｕはアミノスベリン酸を表す）からなる群の中で選択される配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１０】
前記アニオン性ポリペプチドが、Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ（配列番号８）、Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ（配列番号４）、Ｓ−ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ−ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ−ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ（配列番号５）、Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ（配列番号６）、Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ（配列番号７）、Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ（配列番号２０）およびＳ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ（配列番号２１）（式中、Ｓはセリンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表し、Ｙはチロシンを表し、ＹＳＯ３はスルホチロシンを表し、ＹＳＮはチロシンスルホネートを表し、ｐＦはｐ−カルボキシメチルフェニルアラニンを表し、Ａｓｕはアミノスベリン酸を表す）からなる群の中で選択される配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１１】
・前記ＣＤ４受容体由来ペプチドが、配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択され、
・前記リンカーが
【化６】
0006046060.tif 000040
・前記有機分子が、式Ａ−Ｚ（式中、Ａは−ＣＯ（ＣＨ２）３ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）２−であり、Ｚはチオール基である）の分子基によって前記リンカーと結合している、請求項１０に記載の、次の配列Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓを有するアニオン性ポリペプチドを含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子と薬学的に許容可能なビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１３】
エイズの治療に使用するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子の製造方法であって、以下の工程：
ａ．請求項１に記載の一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドを、２つの活性基を有する二官能性化合物と接触させ、その結果、その２つの活性基のうちの一方が、一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミノ基（−ＮＨ２）と共有結合を形成し、該二官能性基のもう一方の活性基を有する活性化型ペプチドを得る工程、および
ｂ．工程（ａ）で得られた活性化型ペプチドを、請求項１に記載の官能基を有する有機分子と、またはチオール基（ＳＨ）が保護チオール基によって保護されている、請求項１に記載のチオール基を有する有機分子に相当する有機分子と接触させ、その結果、該活性化型ペプチドの活性基が、該有機分子の保護されているまたは保護されていない官能基と共有結合を形成し、コンジュゲート分子を得る工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ４受容体由来ペプチドと、ポリアニオン性ポリペプチドのような有機分子とを含んでなるコンジュゲート分子に関する。そのようなコンジュゲート分子は抗ウイルス治療、すなわち、エイズの治療において使用することができる。本発明は、さらに、該コンジュゲート分子の調製のための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオシド系阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド系阻害剤（ＮＮＲＴＩ）および／またはプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を併用する３剤併用療法により、多数の血清反応陽性のＨＩＶ患者でウイルス量が検出レベル下に低下する。これらの療法は逆転写とタンパク質分解を同時に標的としている。それらの療法の効力により、ＨＩＶ感染に起因する死亡数の大幅な減少がもたらされた。残念なことには、ＨＩＶ患者の約８０％は抗ウイルス薬耐性を有する遺伝子型を示し、さらに厄介なことには、ウイルス集団の４５．５％はＮＲＴＩ／ＰＩ組合せに対して耐性があり、さらに、２６％は３つの抗ＨＩＶ薬クラスの組合せに対して耐性がある(Tamalet et al., AIDS. 2003 Nov 7; 17(16):2383-8)。この報告は特に憂慮すべきであり、それは、３剤併用療法による長期治療を受けた患者の７０％に認められた有害作用（脂肪組織萎縮症、脂肪異栄養症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、神経障害など）から、コンプライアンスが低下することとなり、耐性をもたらすことの多い治療は「突然」中止となるからである。そのため、現在入手可能な医薬が市場に多数あるにもかかわらず、有害作用がより少なく、交差耐性のない、あまり過酷ではない治療形態の開発が優先事項である。この点を考慮して、逆転写およびタンパク質分解ではなくＨＩＶ複製工程を標的とすることが必要である。
【０００３】
細胞へのウイルスの侵入はウイルス感染サイクルにおいて極めて重要なステップである。このプロセスは２つの段階に分かれる：第１に、ウイルスは、細胞表面の特異的な宿主受容体と相互作用し、続いて、ウイルス遺伝物質の標的細胞への侵入が起こる。ＨＩＶに関しては、付着および侵入の機構に関与する分子パートナーは十分に証明されている。ｇｐ１２０ウイルスエンベロープ糖タンパク質は、宿主細胞の膜貫通糖タンパク質であるＣＤ４と結合することによって、ウイルス／細胞間相互作用複合体を基本的に決定する。この相互作用によってｇｐ１２０に立体構造の変化が起こり、ＣＤ４−ｉｎｄｕｃｅｄ（ＣＤ４ｉ）と呼ばれる特定のエピトープが露出され、その結果、ケモカイン受容体（基本的には、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）の結合部位が形成される。従って、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４は、細胞表面でｇｐ１２０共受容体として作用する。この第２の相互作用によって、ｇｐ１２０／ｇｐ４１タンパク質複合体が再構成され、細胞／ウイルス間膜融合が開始される。
【０００４】
ＨＩＶウイルスの細胞指向性は、利用する共受容体のタイプによって決定される。いわゆるＸ４、すなわち、「Ｔ指向性」ウイルスは、より詳しくは、表面にＣＸＣＲ４を発現している細胞系統、例えば、Ｔリンパ球などに感染する傾向がある。いわゆるＲ５、すなわち、「Ｍ指向性」ウイルスは、共受容体ＣＣＲ５を利用し、主として、マクロファージおよび単球に感染する。Ｒ５ウイルスまたはＸ４ウイルスの存在は、エイズ進展とは全く異なる段階と一般的に関係がある（Ｒ５については無症候期、Ｘ４ウイルスの出現は該疾患の不利な進行結果と関連していることが多く、共受容体ＣＸＣＲ４の利用がエイズの病因における重要な因子であることが示唆される）。ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４の認識についての構造的決定要因はｇｐ１２０にあるため、Ｒ５ウイルスおよびＸ４ウイルスが２つの別個の標的となる。
【０００５】
国際特許出願ＷＯ２００８／０１５２７３によれば、特定の活性化されたＣＤ４受容体由来ペプチドは有機分子と選択的に反応することができ、化学的に定義された共有結合コンジュゲートを与えることが示された。この活性化には、ＣＤ４受容体由来ペプチドの配列中の定められた位置への唯一のアミノ酸残基リジンの挿入が必要である。この挿入によって、ｍｉｎｉＣＤ４合成および精製後の、リンカーおよび化学による有機化合物との結合が可能になる。
【０００６】
ＷＯ２００９／０９８１４７には、リンカーによってポリアニオン性ヘパラン硫酸（ＨＳ）と特異的に結合しているＣＤ４ペプチドを含んでなるコンジュゲート分子からなる、多数の抗ウイルス性誘導体候補が開示されている。これらのコンジュゲートは強力な抗ウイルス活性を示す。ＨＳの利用は、ｇｐ１２０中に少なくとも２つの異なるＨＳ認識部位、すなわち、Ｖ３可変ループとＣＤ４によって誘導される部位（ＣＤ４ｉ）が存在することが動機とされた：ｍＣＤ４−ＨＳのＣＤ４部分は、直接相互作用によってｇｐ１２０の立体構造の変化を引き起こし、その結果として、ＣＤ４ｉエピトープの露出が起こり、そのＣＤ４ｉエピトープと、共有結合しているＨＳとが相互作用することができ、それによって、Ｘ４細胞系統およびＲ５細胞系統のＨＩＶウイルス感染が弱められると考えられている。
【０００７】
細胞へのウイルス付着を阻害することにあるこのアプローチは治療上有利であり、それは、このアプローチでは細胞自体ではなくウイルスを直接標的とするからである。そのため、このアプローチには、共受容体と結合する医薬で観察された細胞効果はない。加えて、様々なウイルス指向性に応じた関与部位が保存されることを考えると、本発明による化合物は種々のウイルス分離株のｇｐ１２０と相互作用する必要がある。耐性は決して起こらないと考えるのは誤解を招く恐れがあるが、他の治療を用いた場合よりも起こる耐性ははるかに低い割合であると予想される。実際には、共受容体との相互作用のためにポリアニオン性多糖類との結合に関与する塩基性残基のような、ｇｐ１２０のＣＤ４部位は、ＣＤ４との結合状態を続けるために完全な状態のままでなければならない。これら２つの部位のいずれかの突然変異によって、実際に、低感染性のウイルスがもたらされるはずである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、今般、細胞へのＨＩＶウイルスの侵入をブロックすることができる新規コンジュゲート分子を特定した。本発明者らは、Ｘ４細胞系統またはＲ５細胞系統へのウイルス侵入を阻害するために、ｍＣＤ４コンジュゲート分子中にヘパラン硫酸オリゴ糖が存在していることが必ずしも必要でないこと、さらに、５〜２１個、有利には、５〜１７個、とりわけ、５個、９個、１３個、１７個または２１個、好ましくは、１３個のアミノ酸からなるアニオン性ポリペプチドと、これまで使用されていたＨＳ分子を置き換えることによって非常に有効な抗ウイルス活性が得られることを示す。好ましい実施態様によれば、一部のアミノ酸は負の電荷を有し、とりわけ、少なくとも１個、有利には、少なくとも２個、好ましくは、少なくとも３個は負の電荷を有する。より好ましい実施態様によれば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個のアミノ酸は負の電荷を有する（アニオン性ポリペプチドの長さによって異なる）。最も好ましい実施態様によれば、アニオン性ポリペプチドが１３個のアミノ酸からなる場合には、９個のアミノ酸が負の電荷を有する。さらに重要なことには、本発明者らによって、驚くべきことに、これらの新規ｍＣＤ４コンジュゲート分子（該アニオン性ポリペプチドを含んでなる）は、Ｒ５ウイルスまたはＸ４ウイルスのいずれに対しても、先行技術に開示されているコンジュゲート分子よりも良好な抗ウイルス活性を有することが示された。
【０００９】
第１の態様によれば、本発明は、リンカーによって有機分子と結合しているＣＤ４受容体由来ペプチドを含んでなるコンジュゲート分子を包含し、そのコンジュゲート分子において、
該ＣＤ４受容体由来ペプチドは、次の一般配列（Ｉ）：
【化１】
0006046060.tif 000002
（式中、
・Ｐ１は３〜６個のアミノ酸残基を表し、
・Ｐ２は２〜４個のアミノ酸残基を表し、
・Ｐ３は６〜１０個のアミノ酸残基を表し、
・ＸａａｆはＮ−アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）またはチオプロピオン酸（ＴＰＡ）を表し、
・ＸａａｇはＡｌａまたはＧｌｎを表し、
・ＸａａｈはＧｌｙまたは（Ｄ）ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、
・ＸａａｉはＳｅｒまたはＨｉｓまたはＡｓｎを表し、
・Ｘａａｊはビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、フェニルアラニンまたは［β］−ナフチルアラニンを表し、
・ＸａａｋはＴｈｒまたはＡｌａを表し、
・ＸａａｌはＧｌｙ、ＶａｌまたはＬｅｕを表し、
・Ｘａａｍは−ＮＨ２または−ＯＨを表し、
Ｐ１、Ｐ２およびＰ３中のアミノ酸残基は天然または非天然の、同一または異なる残基であり、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の該残基は総てＬｙｓ残基とは異なり、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は共通または非共通の配列を有する）
を含んでなり、
該有機分子は、
・天然または非天然の、同一または異なる、５〜２１個、有利には、５〜１７個、好ましくは、１３個のアミノ酸残基からなるアニオン性ポリペプチドであって、少なくとも３個、とりわけ、３〜１５個、例えば、３〜１３個などのアミノ酸が負の電荷を有するアニオン性ポリペプチド、
・分子基Ａ−Ｚ
（式中、
Ａは、式−ＣＯ（ＣＨ２）３ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）２−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、−ＣＯ（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−および−ＣＯ（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−（式中、ｐは、１〜１０の間に含まれる整数を表し、ｑは、１〜１０の間に含まれる整数を表し、１位のカルボニル基はＮ末端セリンのαＮＨ２と結合している）の群の中から選択される基を含んでなり、有利には、Ａは式−ＣＯ（ＣＨ２）３ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）２−の基を表し、
Ｚはハロゲン原子、チオールまたはマレイミド基を表す）、
を含んでなり、
該アニオン性ポリペプチドは、式Ａ−Ｚの該分子基によってリンカーと結合しており、該リンカーは、その一方の末端で、該ＣＤ４受容体由来ペプチドの一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミノ基（−ＮＨ２）と共有結合し、その他方の末端で、該有機分子のＺ基と共有結合している。
【００１０】
好ましくは、Ｐ３は、少なくとも１個の塩基性アミノ酸を含んでなり、該塩基性アミノ酸はアルギニンであることがさらに好ましい。ＣＤ４受容体断片のこの部分における塩基性残基の存在がｇｐ１２０タンパク質との結合に寄与する。そのため、本発明者らは、Ｐ３に少なくとも１個の塩基性アミノ酸、好ましくは、アルギニンを導入することを好む。よって、これにより、ｇｐ１２０タンパク質とのｍｉｎｉＣＤ４ペプチドの結合に有用であることが見出されているｐＨ７〜８での誘導で反応しない塩基性部分が支持される。
【００１１】
本出願において、「ｍｉｎｉＣＤ４ペプチド」、「ＣＤ４ペプチド」および「ｍｉｎｉＣＤ４」という用語は、前記に定義された一般配列（Ｉ）を含んでなるまたはからなるＣＤ４受容体由来ペプチドを表して互換的に用いられる。
【００１２】
ＷＯ２００９／０９８１４７に開示されているように、本発明のｍｉｎｉＣＤ４ペプチドは唯一のリジン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基を含むこと、そして、該リジンは一般配列（Ｉ）において定義される位置に存在することが求められる。一般配列（Ｉ）中のＣｙｓ残基によって、ｍｉｎｉＣＤ４の折り返しに必要な３つのジスルフィド架橋の形成が可能になる。チオプロピオン酸（ＴＰＡ）は、一般配列（Ｉ）のペプチドのＮ末端位置にある場合、Ｎ末端の障害を減らし、アミン基の存在に打ち勝つことを可能にする。よって、好ましい実施形態によれば、Ｘａａｆは、一般配列（Ｉ）中のＴＰＡを表す。
【００１３】
Ｂｉｐは、ＣＤ４受容体のＰｈｅ  ４３が収容されている空洞内での糖タンパク質ｇｐ１２０との接触を増やす。よって、好ましい実施形態では、ＸａａｊはＢｉｐを表す。しかし、一般配列（Ｉ）においてＸａａｊとしてＰｈｅを有することが有利である場合があり、それは、構造解析によって、そのようなｍｉｎｉＣＤ４はＣＤ４を効果的に模倣し得ることが示されていることからである(Huang CC et al., Structure. 2005 May;13(5):755-68)。よって、別の好ましい実施態様によれば、ＸａａｊはＰｈｅを表す。
【００１４】
一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドは、αヘリックス構造、続いて、βシートを形成する。アミノ酸Ｘａａｇ−Ｘａａｈ−Ｘａａｉ−Ｘａａｊ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋ−Ｃｙｓ−Ｘａａｌは、ｇｐ１２０との結合に大きく関与する。これらのペプチドはｓＣＤ４（可溶性ＣＤ４）と同じようなＩＣ５０（ｇｐ１２０に対する親和性）を示す。
【００１５】
本発明のＣＤ４ペプチドは、従来の固相化学合成技術によって、例えば、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法(“Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach” W.C. Chan and P.D. White編, Oxford University Press, 2000)に従っておよび／または遺伝子組換えによって製造することができる。
【００１６】
好ましくは、前記ＣＤ４ペプチドは、配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択される。より好ましくは、本発明のＣＤ４ペプチドは、配列番号１によって表される配列を有する。
【００１７】
「リンカー」という用語は、本発明において、下に定義する二官能性化合物と、ＣＤ４受容体由来ペプチドおよび有機分子との結合によって得られるリンカーを指す。よって、該リンカーの長さは、使用される二官能性化合物に応じて変化する。
【００１８】
特に、前記リンカーは、有利には、Ｚがチオール基を表す場合には、
【化２】
0006046060.tif 000003
（式中、ｋは、２〜２４の間に含まれる整数を表し、有利には、２、４、８または１２である）、
【化３】
0006046060.tif 000004
（式中、ｋ１は、１〜１０の間に含まれる整数を表し、よって、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０に等しく、有利には、１、２、３、５または１０に等しい）、
【化４】
0006046060.tif 000005
の中から選択され、かつ、Ｚがマレイミド基またはハロゲン原子を表す場合には、
【化５】
0006046060.tif 000006
の中から選択される。
【００１９】
好ましい実施態様によれば、前記リンカーは、Ｚがチオール基を表す場合には、
【化６】
0006046060.tif 000007
（式中、ｋは、２〜２４の間に含まれる整数を表し、有利には、２、４、８または１２である）および
【化７】
0006046060.tif 000008
（式中、ｋ１は、１〜１０の間に含まれる整数を表し、よって、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０に等しく、有利には、１、２、３、５または１０に等しい）
の中から選択され、かつ、Ｚがマレイミド基またはハロゲン原子を表す場合には、
【化８】
0006046060.tif 000009
の中から選択される。
【００２０】
よって、そのようなリンカーは、二官能性化合物としての、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（式中、ｎは、２〜２４の間に含まれる整数を表し、有利には、２、４、８または１２である）、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート）およびＳＡＴＰ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート）の使用に対応する。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、前記リンカーは、
【化９】
0006046060.tif 000010
である。
【００２２】
本発明のコンジュゲート分子は、１３個のアミノ酸からなるアニオン性ポリペプチドを含んでなり、この場合、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個のアミノ酸残基が負の電荷を有する。好ましい実施形態では、該アニオン性ポリペプチドは１３個のアミノ酸からなり、この場合、９個のアミノ酸残基が負の電荷を有する。
【００２３】
有利には、本発明のアニオン性ペプチドは、Ｎ末端で式Ｉの化合物のＡ基と結合している。有利には、該アニオン性ペプチドと該Ａ基との間で形成される結合は、ペプチド結合であり、そのため、該ペプチドのアミノ（ＮＨ２）基と該Ａ基のカルボキシル基（ＣＯＯＨ）の両方が関与する。
【００２４】
特定の理論に縛られるものではないが、前記１３個アミノ酸長のアニオン性ポリペプチドは、ＣＤ４ｉ露出部位とＣＸＣＲ４（またはＣＣＲ５）ケモカイン受容体との間での相互作用を弱め、その結果として、細胞／ウイルス間膜融合の開始に支障をきたすと考えられる。
【００２５】
本発明の意味において、「アミノ酸」とは、総ての天然α−アミノ酸残基（例えば、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ））（Ｄ型またはＬ型）、ならびに非天然アミノ酸（例えば、β−アラニン、アリルグリシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、３−アミノ−アジピン酸、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、２−アミノブタン酸、４−アミノ−１−カルボキシメチルピペリジン、１−アミノ−１−シクロブタンカルボン酸、４−アミノシクロヘキサン酢酸、１−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、（１Ｒ，２Ｒ）−２−アミノシクロヘキサンカルボン酸、（１Ｒ，２Ｓ）−２−アミノシクロヘキサンカルボン酸、（１Ｓ，２Ｒ）−２−アミノシクロヘキサンカルボン酸、（１Ｓ，２Ｓ）−２−アミノシクロヘキサンカルボン酸、３−アミノシクロヘキサンカルボン酸、４−アミノシクロヘキサンカルボン酸、（１Ｒ，２Ｒ）−２−アミノシクロペンタンカルボン酸、（１Ｒ，２Ｓ）−２−アミノシクロペンタンカルボン酸  １−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸、１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸、４−（２−アミノエトキシ）−安息香酸、３−アミノメチル安息香酸、４−アミノメチル安息香酸、２−アミノブタン酸、４−アミノブタン酸、６−アミノヘキサン酸、１−アミノインダン−１−カルボン酸、４−アミノメチル−フェニル酢酸、４−アミノフェニル酢酸、３−アミノ−２−ナフトエ酸、４−アミノフェニルブタン酸、４−アミノ−５−（３−インドリル）−ペンタン酸、（４Ｒ，５Ｓ）−４−アミノ−５−メチルヘプタン酸、（Ｒ）−４−アミノ−５−メチルヘキサン酸、（Ｒ）−４−アミノ−６−メチルチオヘキサン酸、（Ｓ）−４−アミノ−ペンタン酸、（Ｒ）−４−アミノ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノフェニルプロピオン酸、（Ｒ）−４−アミノピメリン酸((R)-4-aminopimeric acid)、（４Ｒ，５Ｒ）−４−アミノ−５−ヒドロキシヘキサン酸((4R,5R)-4-amino-5-hyroxyhexanoic acid)、（Ｒ）−４−アミノ−５−ヒドロキシペンタン酸、（Ｒ）−４−アミノ−５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−ペンタン酸、８−アミノオクタン酸、（２Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−ピロリジン−２−カルボン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アミノ−ピロリジン−２−カルボン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ベンジル−ピロリジン−２−カルボン酸、（Ｓ）−４，８−ジアミノオクタン酸、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、γ−カルボキシグルタミン酸、β−シクロヘキシルアラニン、シトルリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、馬尿酸、ホモシクロヘキシルアラニン、ホモロイシン(moleucine)、ホモフェニルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、インドリン−２−カルボン酸、イソニペコチン酸、��ルホチロシン、アミノスベリン酸、ｐ−カルボキシメチルフェニルアラニン、α−メチル−アラニン、ニコペト酸(nicopetic acid)、ノルバリン、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、オルニチン、ペニシラミン、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、４−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、ピペコリン酸、プロパルギルグリシン、３−ピリジニルアラニン、４−ピリジニルアラニン、１−ピロリジン−３−カルボン酸、サルコシン、スタチン類、テトラヒドロイソキノリン−１−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、トラネキサム酸、４，４−ジフルオロプロリン、４−フルオロプロリン、α−（３，４−ジフルオロベンジル）−プロリン、γ−（３，４−ジフルオロベンジル）−プロリン、α−（トリフルオロメチル）フェニルアラニン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシン、６，６，６−トリフルオロノルロイシン、２−（トリフルオロメチル）ロイシン、２−（トリフルオロメチル）ノルロイシン 、４，４，４−トリフルオロバリン、４，４，４，４’，４’，４’−ヘキサフルオロバリン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２，３−ジフルオロフェニルアラニン、２，４−ジフルオロフェニルアラニン、２，５−ジフルオロフェニルアラニン、２，６−ジフルオロフェニルアラニン、３，４−ジフルオロフェニルアラニン、３，５−ジフルオロフェニルアラニン、３，３−ジフルオロ−３−（４−フルオロフェニル）アラニン、２，３−ジフルオロフェニルグリシン、２，４−ジフルオロフェニルグリシン、２，５−ジフルオロフェニルグリシン、３，４−ジフルオロフェニルグリシン、４，４−ジフルオロエチルグリシン、４，４，４−トリフルオロエチルグリシンおよびヘキサフルオロノルロイシン）を意味する。「アミノ酸」という用語は、従来のアミノ保護基（例えば、アセチル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたは９−フルオレニルメチルカルボニル）を有する天然および非天然アミノ酸、ならびにカルボキシル末端で保護されている天然および非天然アミノ酸（有利には、Ｃ１−Ｃ１８アルキル基、エステル、フェニルアミドまたはベンジルアミドまたは、下式：−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ１８アルキル）、−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ１８アルキル）、−ＣＯＮＨフェニル、ＣＯＮＨベンジルまたはＣＯＮＨ２のカルボキシル末端をそれぞれ与えるアミドによって保護されている）も包含する。
【００２６】
本明細書において、「アニオン性」という用語は、負の電荷を有する分子を表し、そのような分子は、例えば、電気分解において陽極に向かって移動する。また、「負の電荷を有する（負電荷）」アミノ酸とは、ｐＨ７．４において負の側鎖電荷を有するアミノ酸を表す。よって、本発明による負電荷アミノ酸残基としては、例えば、アスパラギン酸残基、チロシン残基、スルホチロシン残基、チロシンスルホネート残基、アミノスベリン酸残基、ｐ−カルボキシメチルフェニルアラニン残基およびグルタミン酸残基が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、スルホチロシン（または２−アミノ−３−（４−（スルホオキシ）フェニル）プロパン酸）とは、下式：
【化１０】
0006046060.tif 000011
を有する非天然アミノ酸である。
【００２８】
本明細書において、「チロシンスルホネート」（または「２−アミノ−３−（４−（スルホメチル）フェニル）プロパン酸」）という用語は、下式：
【化１１】
0006046060.tif 000012
を有する非天然アミノ酸を指す。
【００２９】
本発明によれば、アミノスベリン酸は、下式：
【化１２】
0006046060.tif 000013
を有する非天然アミノ酸である。
【００３０】
本明細書において、ｐ−カルボキシメチルフェニルアラニンとは、下式：
【化１３】
0006046060.tif 000014
を有する非天然アミノ酸を指す。
【００３１】
本発明の１つの実施態様によれば、前記アニオン性ポリペプチドは、１３個の同一の負電荷アミノ酸からなる。例えば、それは、１３個のアスパラギン酸残基（配列番号９）、１３個のスルホチロシン残基（配列番号１０）、１３個のチロシンスルホネート残基（配列番号１１）、１３個のアミノスベリン酸残基（配列番号１２）、１３個のｐ−カルボキシメチルフェニルアラニン残基（配列番号１３）および１３個のグルタミン酸残基（配列番号３）からなるポリペプチドであってよい。好ましい実施態様によれば、該同一アミノ酸はグルタミン酸Ｅであり、本発明のコンジュゲート分子のアニオン性ポリペプチドは配列番号３である。
【００３２】
本発明の別の実施態様によれば、本発明のアニオン性ペプチドは負電荷アミノ酸と非荷電アミノ酸を含んでなる。好ましくは、該アニオン性ペプチドは少なくとも１個の負電荷アミノ酸と少なくとも別のアミノ酸を含んでなる。好ましくは、別のアミノ酸は極性非荷電側鎖を有するアミノ酸である。そのようなアミノ酸としては、例えば、セリン、トレオニン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。さらに好ましい実施態様によれば、別のアミノ酸はセリンまたはトレオニンである。さらに好ましい実施態様によれば、別のアミノ酸はセリンである。別の好ましい実施態様によれば、該負電荷アミノ酸はアスパラギン酸である。
【００３３】
別のさらに好ましい実施態様によれば、本発明のアニオン性ポリペプチドは、少なくとも２個の異なる負電荷アミノ酸を、少なくとも１個の別のアミノ酸に加えて含んでなる。この場合、該アニオン性ポリペプチドは、配列Ｓ−（Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｓ）ｎ、例えば、Ｓ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｓ（配列番号１９）など（式中、ｎは、１〜５の間に含まれる整数であり、好ましくは、３であり、Ｓはセリンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表し、Ｘは、チロシン、スルホチロシン、チロシンスルホネート、アミノスベリン酸およびｐ−カルボキシメチルフェニルアラニンからなる群から選択され、個々のＸ基は同一であってもまたは異なっていてもよく、好ましくは、同一である）を有する。
【００３４】
この実施態様によれば、前記アニオン性ポリペプチドは、特に、次の配列：
・Ｓ−（ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ）ｎ、例えば、Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ（配列番号４）など（式中、ＹＳＯ３はスルホチロシンである）；
・Ｓ−（ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ）ｎ、例えば、Ｓ−ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ−ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ−ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ（配列番号５）など（式中、ＹＳＯ３はチロシンスルホネートである）；
・Ｓ−（ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ）ｎ、例えば、Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ（配列番号６）など（式中、ｐＦはｐ−カルボキシメチルフェニルアラニンである）；
・Ｓ−（Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ）ｎ、例えば、Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ（配列番号７）など（式中、Ａｓｕはアミノスベリン酸である）；および
・Ｓ−（Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ）ｎ、例えば、Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ（配列番号８）など（式中、Ｙはチロシンである）
のいずれかを有することができる。
【００３５】
前記アニオン性ポリペプチドはまた、次の配列：
・Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ（配列番号２０）または
・Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ（配列番号２１）
を有していてもよい。
【００３６】
最も好ましくは、本発明によれば、Ｘはスルホチロシンを表す。従って、最も好ましい実施態様によれば、本発明のアニオン性ポリペプチドは、配列：Ｓ−（ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ）ｎ、特に、Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ（配列番号４）を有する。
【００３７】
特定の実施態様によれば、本発明のコンジュゲート分子は、リンカーによって有機分子と結合しているＣＤ４受容体由来ペプチドを含んでなり、そのコンジュゲート分子において、
・該ＣＤ４受容体由来ペプチドは、配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択され、
・該リンカーは、ＣＯ−（ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ピロリジニル−２，５−ジオンであり、
・該有機分子は、Ｓ−（ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ）ｎ、Ｓ−（ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ）ｎ、Ｓ−（ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ）ｎ、Ｓ−（Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ）ｎおよびＳ−（Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ）ｎからなる群から選択される配列、特に、Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ（配列番号４）、Ｓ−ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ−ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ−ＹＳＮ−Ｄ−ＹＳＮ−Ｓ（配列番号５）、Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ（配列番号６）、Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ（配列番号７）、Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ（配列番号８）からなる群から選択される配列を有するアニオン性ポリペプチドを含んでなり、該配列は、式Ａ−Ｚ（式中、Ａは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）２−であり、Ｚはチオール基である）の分子基によって該リンカーと結合している。
【００３８】
好ましい実施態様によれば、本発明のコンジュゲート分子は、配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択されるＣＤ４受容体由来ペプチドを含んでなり、該ペプチドは、リンカーＣＯ−（ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ピロリジニル−２，５−ジオンによって有機分子と結合しており、アニオン性ポリペプチドは、配列Ｓ−（ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ）ｎ、特に、Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ（配列番号４）を有し、該配列は、式Ａ−Ｚ（式中、Ａは−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）３ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）２−であり、Ｚはチオール基である）の分子基によって該リンカーと結合している。
【００３９】
本発明のコンジュゲートは、細胞膜へのウイルスの付着をブロックし、そうすることによってウイルスの侵入をブロックすることで、ＨＩＶの細胞侵入を阻害することができる。従って、本発明のコンジュゲートは療法において使用することができる。より好ましくは、本発明のコンジュゲートは、ウイルス感染症を治療するために使用することができる。さらに好ましくは、該コンジュゲートは、エイズを治療するために使用することができる。よって、第２の面によれば、本発明は、医薬として使用するための、上に定義されたコンジュゲート分子を包含する。本発明はまた、ウイルス感染症を治療するための、特に、エイズの治療のための、前記に定義されたコンジュゲートにも関する。抗ウイルス治療用の、特に、エイズ治療用の、医薬の製造のための、前記に定義されたコンジュゲート分子の使用も本発明の対象である。
【００４０】
第３の面によれば、本発明は、前記に定義されたコンジュゲート分子および薬学的に許容可能なビヒクルとを含んでなる医薬組成物を包含する。この組成物は、好ましくは、ウイルス感染症の治療のために、より好ましくは、エイズの治療のために、医薬として使用することができる。
【００４１】
経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、局所投与または直腸投与用の、本発明の医薬組成物の場合、有効成分は、従来の医薬担体と混合された投与単位形態で、動物またはヒトへ投与され得る。好適な投与単位形態には、経口投与用形態、例えば、錠剤、ゼラチンカプセル剤、粉末、顆粒剤および経口溶液または懸濁液など、舌下投与および口内投与用の形態、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内または眼内(intraoccular)投与用の形態、ならびに直腸投与用の形態が含まれる。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、担体および本発明のコンジュゲートに加えて、様々な希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および当技術分野で周知の他の材料を含んでいてもよい。
【００４３】
本明細書において、「薬学的に許容可能な担体」とは、生理学上適合する、あらゆる溶媒、緩衝剤、塩溶液、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。担体の種類は、意図された投与経路に基づいて選択することができる。様々な実施形態によれば、担体は、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与または経口投与に適している。薬学的に許容可能な担体としては、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。薬学上活性な物質に対する媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。静脈内注入に典型的な医薬組成物は、２５０ｍｌの滅菌リンゲル液と、１００ｍｇの前記組合せを含むように構成され得る。非経口的に投与できる化合物を調製するための実際的方法は、当業者には公知であるかまたは明らかであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Science、第１７版、Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)、ならびにその第１８版および第１９版でより詳細に記載されており、これらの刊行物は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００４４】
前記組成物中のコンジュゲート分子は、好ましくは、有効量で処方される。「有効量」とは、所望の結果、例えば、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導などを達成するのに必要な用量および期間で有効な量を指す。「治療上有効な量」とは、特定の病状の治療経過に影響を及ぼすのに十分な量を意味する。薬剤の治療上有益な効果があらゆる毒性効果または有害効果を上回る量も治療上有効な量である。
【００４５】
投与計画は、最適な応答をもたらすように調整することができる。例えば、単回ボーラス投与を行ってもよいし、数回分割用量を経時的に投与してもよいし、または用量を比例的に増減してもよい。本発明の組成物は、対象におけるウイルス感染症に作用するように、対象に投与することができる。本明細書において、「対象」という用語は、ウイルス感染症にかかりやすい生存生物を含むことが意図され、具体的に言えば、哺乳類、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、ラット、サル、それらのトランスジェニック種など、好ましくは、ヒトが挙げられる。
【００４６】
治療用途では、本発明のコンジュゲート分子は、前記で議論したような薬学的に許容可能な投与形（ボーラスとしてもしくはある期間にわたって持続注入により静脈内に、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、関節内経路、滑液嚢内経路、くも膜下腔内経路、経口経路、局所経路または吸入経路によりヒトに投与し得るものを含む）で、哺乳類、好ましくは、ヒトに投与される。
【００４７】
本発明はまた、抗ウイルス治療法、好ましくは、抗エイズ治療法にも関し、その方法は、本発明によるコンジュゲート分子またはそれを含有する医薬組成物を、該治療を必要とする患者に投与することを含んでなる。
【００４８】
第４の面によれば、本発明は、前記に定義されたコンジュゲート分子の調製のための方法を提供し、その方法は、以下の工程：
ａ．前記に定義された一般配列（Ｉ）のｍｉｎｉＣＤ４ペプチドを、２つの活性基を有する二官能性化合物と接触させ、その結果、その２つの活性基のうちの一方が、一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミノ基（−ＮＨ２）と共有結合を形成し、該二官能性基のもう一方の活性基を有する活性化型ペプチドを得る工程、および
ｂ．工程（ａ）で得られた活性化型ペプチドを、チオール基（ＳＨ）が保護チオール基によって保護されているチオール基を有する前記に定義された官能基を有する有機分子と接触させ、その結果、該活性化型ペプチドの活性基が、該有機分子の保護されているまたは保護されていない官能基と共有結合を形成し、コンジュゲート分子を得る工程
を含むことを特徴とする。
【００４９】
工程（ａ）で得られた化合物は、本願において、「活性化型ペプチド」、「活性化型ｍｉｎｉＣＤ４」、「活性化型ＣＤ４ペプチド」または「活性化型ｍｉｎｉＣＤ４ペプチド」と区別せずに称する。
【００５０】
本発明による官能基とは、ハロゲン原子、マレイミド、チオールまたは保護チオール基を指す。
【００５１】
本発明において用いられる「保護チオール基」という用語は、合成手順の間に望ましくない反応からチオール基を保護するためにＳ保護基によって置換された硫黄原子を指す。一般的に使用されるＳ保護基は、Greene, “Protective Groups In Organic Synthesis” (John Wiley & Sons, New York (1981))に開示されている。Ｓ保護基には、置換されたまたは置換されていないベンジルエーテル、例えば、ｐ−メトキシベンジルまたはｐ−ニトロベンジル、トリチルエーテル、チオエーテル、チオアセタートまたはチオアセタールなどが含まれる。有利には、保護されたチオール基はチオアセチルである。
【００５２】
前記有機化合物が保護チオール基を有する場合、工程（ｂ）の前またはその間に該保護基は脱保護されて遊離チオール基に戻り、前記活性化型ペプチドの活性基とこのチオールとの結合が可能になる。
【００５３】
ＣＤ４受容体由来ペプチドの特徴は前記に定義された通りである。特に、Ｐ３は、好ましくは、少なくとも１個の塩基性アミノ酸を含んでなり、該塩基性アミノ酸は、さらに好ましくは、アルギニンである。好ましい実施形態によれば、Ｘａａｆは、一般配列（Ｉ）においてＴＰＡを表す。別の好ましい実施形態によれば、ＸａａｊはＰｈｅを表す。好ましくは、一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドの配列は、配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択され、有利には、配列番号１である。
【００５４】
本特許出願における「二官能性化合物」という用語は、２つの活性基が組み込まれている任意の化合物を指し、その２つの活性基のうちの一方は、一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミノ基（−ＮＨ２）と共有結合を形成することができ、もう一方の活性基は前記有機分子と共有結合を形成することができる。
【００５５】
本発明の枠組みの中で使用することができる二官能性化合物については、当業者ならばよく理解している。すなわち、本発明による二官能性化合物は、次の限定されないリスト：ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（式中、ｎは、２〜２４の間に含まれ、有利には、ｎ＝２、４、８または１２）、スルフォ−ＫＭＵＳ（Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］）、ＫＭＵＡ（Ｎ−ｋ−マレイミドウンデカン酸）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル  ４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート）、スルフォ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル  ４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート）、スルフォ−ＳＩＡＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）、スルフォ−ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＥＭＣＡ（Ｎ−ｅ−マレイミドカプロン酸）、ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル  ４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、スルフォ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル  ４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルフォ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル）、スルフォ−ＧＭＢＳ（Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＢＡＰ（スクシンイミジル  ３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート）、ＢＭＰＳ（Ｎ−［［β］−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル）、ＢＭＰＡ（Ｎ−［β］−マレイミドプロピオン酸）、ＡＭＡＳ  Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル）、ＳＩＡ（Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート）およびＳＡＴＰ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート）から選択することができる。
【００５６】
本発明によれば、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（式中、ｎ＝２）はスクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド(proprionamido)）−ジエチレングリコール］エステルとも呼ばれ、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（式中、ｎ＝４）はスクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド(proprionamido)）−テトラエチレングリコール］エステルとも呼ばれ、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（式中、ｎ＝８）はスクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド(proprionamido)）−オクタエチレングリコール］エステルとも呼ばれ、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（式中、ｎ＝１２）はスクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド(proprionamido)）−ドデカエチレングリコール］エステルとも呼ばれている。
【００５７】
一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミン基（−ＮＨ２）と共有結合を形成することができる活性基は任意の活性エステル基であり得る。
【００５８】
好ましくは、一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミン基（−ＮＨ２）と共有結合を形成することができる活性基は、活性基Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）またはＮ−ヒドロキシ−４−スルホ−スクシンイミドエステルであり、有利には、ＮＨＳ活性基である。さらに好ましくは、前記二官能性化合物の２つの活性基は異なり（ヘテロ二官能性基）、その２つの基のうちの一方は、ＮＨＳ活性基またはＮ−ヒドロキシ−４−スルホ−スクシンイミドエステルであり、有利には、ＮＨＳ活性基である。
【００５９】
有利には、前記有機分子の官能基と共有結合基を形成することができる、前記二官能性化合物の活性基は、前記有機分子の官能基がチオールまたは保護チオール基である場合には、ハロゲン原子またはマレイミド基であり、前記有機分子の官能基がハロゲン原子またはマレイミド基である場合には、上に定義された通り、チオールまたは保護チオール基である。
【００６０】
好ましい実施態様によれば、前記有機分子の官能基がチオール基または保護チオール基である場合には、前記二官能性化合物は、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）およびＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（ｎは２〜２４の間に含まれ、有利には、２、４、８または１２である）からなる群から選択される。
【００６１】
特に好ましい実施態様によれば、前記二官能性化合物はＳＭＰＨである。
【００６２】
ＳＭＰＨの分子構造は次の通りである。
【化１４】
0006046060.tif 000015
【００６３】
さらに別の特に好ましい実施態様によれば、前記二官能性化合物は、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ジエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドとも呼ばれる）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＯ４−マレイミドとも呼ばれる）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−オクタエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＯ８−マレイミドとも呼ばれる）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ドデカエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＯ１２マレイミドとも呼ばれる）であり、さらに好ましくは、前記二官能性化合物はＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドである。
【００６４】
ＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドの分子構造は次の通りである。
【化１５】
0006046060.tif 000016
【００６５】
別の特に好ましい実施態様によれば、前記有機分子の官能基がハロゲン原子またはマレイミド基である場合には、前記二官能性化合物は、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）およびＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）からなる群から選択される。
【００６６】
ＳＡＴＡの分子構造は次の通りである。
【化１６】
0006046060.tif 000017
【００６７】
ＳＡＴＰの分子構造は次の通りである。
【化１７】
0006046060.tif 000018
【００６８】
前記二官能性化合物はPIERCE社(Rockford, IL)から入手することができる。
【００６９】
好ましくは、さらに、本発明による方法は、ＸａａｆがＴＰＡを表す場合、一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドの調製のための予備工程を含み、該工程は、次の一般配列（ＩＩＩ）：
【化１８】
0006046060.tif 000019
（式中、Ｐ１〜Ｐ３およびＸａａｇ〜Ｘａａｍは一般配列（Ｉ）において定義される通りである）
のＣＤ４受容体由来ペプチドをＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と接触させ、一般配列（ＩＩＩ）のＣＤ４受容体由来ペプチドのＮ末端にＴＰＡを組み込むことからなる。
【００７０】
ＳＰＤＰの分子構造は次の通りである。
【化１９】
0006046060.tif 000020
【００７１】
さらに、共有結合によって有機分子と結合することができる活性基の例として、次の基を挙げることができる：マレイミドまたはブロモアセチル、Ｓ−Ｓ−ピリジニウムまたはチオアセチル。
【００７２】
保護されたチオール基（例えば、チオアセチル）によってｍｉｎｉＣＤ４を活性化させる場合、例えば、マレイミド基を有する有機分子との結合を行うことが可能である。これは、チオール基または保護されたチオール基、例えば、チオアセチルなど、によるポリアニオン性ポリペプチドの官能基化が問題をもたらす場合に可能である。従って、これは「逆カップリング」と考えられる。
【００７３】
好ましくは、前記活性基はマレイミド基である。
【００７４】
活性基がマレイミドである場合の、本発明による活性化型ペプチドの分子構造は、使用される二官能性化合物がＳＭＰＨである場合には以下である。
【化２０】
0006046060.tif 000021
【００７５】
本出願において、「ＳＭＰＨ活性化型ｍｉｎｉＣＤ４ペプチド」という用語は、アミノ酸Ｌｙｓ残基が、有利には、アミン結合によって、ＳＭＰＨ由来のリンカーを介してマレイミド活性基と共有結合している場合の、本発明による活性化型ペプチドを指す。
【００７６】
別の有利な実施態様によれば、活性基がマレイミド基である場合の、本発明による活性化型ペプチドの分子構造は、使用される二官能性化合物がＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドである場合には以下である。
【化２１】
0006046060.tif 000022
【００７７】
本出願において、「ＰＥＯ２リンカーを介するマレイミド活性化型ｍｉｎｉＣＤ４ペプチド」という用語は、アミノ酸Ｌｙｓ残基が、有利には、アミン結合によって、ＰＥＯ２リンカーを介してマレイミド活性基と共有結合している場合の、本発明による活性化型ペプチドを指す。
【００７８】
別の選択によれば、前記活性基はチオアセチル基である。
【００７９】
例えば、活性基がチオアセチル基である場合の、本発明による活性化型ペプチドの分子構造は、使用される二官能性化合物がＳＡＴＡである場合には以下である。
【化２２】
0006046060.tif 000023
【００８０】
同様に、活性基がチオアセチル基である場合の、本発明による活性化型ペプチドの分子構造は、使用される二官能性化合物がＳＡＴＰである場合には以下である。
【化２３】
0006046060.tif 000024
【００８１】
チオアセチル基はチオール基の保護された形態である。チオール基を脱保護するために、例えば、ヒドロキシルアミンを使用する。この工程は、前記有機分子にあるマレイミド基との結合と同時に行われる。
【００８２】
本出願において、「ＳＡＴＡ活性化型ｍｉｎｉＣＤ４ペプチド」および「ＳＡＴＰ活性化型ｍｉｎｉＣＤ４ペプチド」という用語は、アミノ酸Ｌｙｓ残基が、有利には、アミン結合によって、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ由来のリンカーを介して、保護されたチオール基（例えば、チオアセチル）と共有結合している場合の、本発明による活性化型ペプチドを指す。
【００８３】
よって、特定の実施態様によれば、前記活性化型ペプチドの活性基はマレイミド基であり、前記有機分子はチオールまたはチオアセチル基を有する。
【００８４】
チオールまたは保護されたチオール基、例えば、チオアセチル基など、を有する修飾アニオン性ポリペプチド（ポリアニオン）と結合している、一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドを含む、本発明によるコンジュゲート分子の分子構造は、結合のために二官能性化合物としてＳＭＰＨが使用された場合には次の通りである。
【化２４】
0006046060.tif 000025
【００８５】
また、その分子構造は、使用される二官能性化合物がＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドである場合には次のコンジュゲート分子であり得る。
【化２５】
0006046060.tif 000026
【００８６】
別の実施態様によれば、本発明によるコンジュゲート分子は、一般配列（Ｉ）、好ましくは、配列番号１の配列を含んでなるまたはからなるＣＤ４受容体由来ペプチドと、マレイミドまたはハロゲン基を有する有機分子とを含んでなる。
【００８７】
別の特定の実施態様によれば、前記活性化型ペプチドの活性基はチオアセチル基であり、前記有機分子はマレイミドまたはハロゲン基を有する。
【００８８】
例えば、マレイミド基を有する有機分子と結合している、一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドを含む上記コンジュゲート分子の分子構造は、結合のためにＳＡＴＡが使用される場合には次の通りである。
【化２６】
0006046060.tif 000027
【００８９】
本発明によれば、前記アニオン性ポリペプチド（本発明の有機分子）は、当技術分野で公知の任意の簡便な合成方法によっても調製することができる。活性化型ペプチドおよびコンジュゲート分子の調製のための本発明による方法の操作条件は、次の実施例に説明する通り、当業者には周知である。
【００９０】
下の実施例および図面により本発明を説明するが、これらによって本発明の範囲は決して限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は本発明のペプチドの構造を示している。
【図２】図２は、本発明のコンジュゲート分子中に含まれるアニオン性ポリペプチドのＨＰＬＣプロフィールを表している（上から下へ：Ｐ３ＹＳＯ３、Ｐ３Ｙ、Ｐ３ｐＦ、Ｐ３ＡｓｕおよびＥ１３）。
【図３】図３は、Ｓ−アセチルプロピオネート（ＳＡＴＰ）基と結合している、本発明のアニオン性ポリペプチドのＨＰＬＣプロフィールを表している。
【図４】図４は、本発明のコンジュゲートペプチドのＨＰＬＣプロフィールを表している。
【図５】図５は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ−Ｂｉａｃｏｒｅ）技術によって行った結合アッセイ(binding assay)の結果を表しており、その図は、１００ｎＭの：ｍＣＤ４単独（Ａ）、ｍＣＤ４−Ｐ３Ｙ（Ｂ）またはｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３（Ｃ）で前処理した、Ｘ４（ＭＮ）またはＲ５（ＹＵ２）ウイルス由来のｇｐ１２０をコーティングした表面と、ｍＡｂ１７ｂ（１５μｇ／ｍｌ）との間の相互作用を示している。表面がｍＡｂ１７ｂで覆われた場合（ＤおよびＧ）、Ｘ４由来ｇｐ１２０（ＭＮ）またはＲ５由来ｇｐ１２０（ＹＵ２）の相互作用はｍＣＤ４の存在に依存する（ｍＣＤ４はｍＡｂ１７ｂエピトープの露出を誘導する）が、ｍＣＤ４の代わりにｍＣＤ４−Ｐ３ＹまたはｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３が使用された場合には、その相互作用は十分に阻害される。表面がｓＣＤ４で覆われた場合（ＥおよびＨ）、その相互作用は、ｍＣＤ４によって部分的に阻害され、ｍＣＤ４−Ｐ３ＹまたはｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３によって十分に阻害される。表面がヘパリンで覆われた場合（Ｆ）、その相互作用はｍＣＤ４によって阻害されず、ｍＣＤ４−Ｐ３ＹおよびｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３によって部分的に阻害され、ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３がより有効である。
【実施例】
【００９２】
実施例１：本発明のコンジュゲート分子の合成
１．１．式Ｈ−γ−Ａｂｕ−ＳＸＤＸＳＸＤＸＳＸＤＸＳ−ＯＨ（式中、Ｘ＝ＹＳＯ３（Ｐ３ＹＳＯ３）、Ｙ（Ｐ３Ｙ）、Ａｓｕ（Ｐ３Ａｓｕ）またはｐＦ（Ｐ３ｐＦ））；Ｈ−γ−Ａｂｕ−ＳＹＳＯ３ＤＹＳＯ３ＳＹＳＯ３ＤＹＳＹＤＹＳ−ＯＨ（Ｎｔｅｒ３スルフェート）；Ｈ−γ−Ａｂｕ−ＳＹＤＹＳＹＤＹＳＯ３ＳＹＳＯ３ＤＹＳＯ３Ｓ−ＯＨ（Ｃｔｅｒ３スルフェート）；およびＨ−γ−Ａｂｕ−（Ｇｌｕ）１３−ＯＨ（Ｅ１３）（式中、γ−Ａｂｕ：ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ）のペプチドの合成
次の実施例で、式Ｈ−γ−Ａｂｕ−ＳＸＤＸＳＸＤＸＳＸＤＸＳ−ＯＨ（式中、Ｘ＝ＹＳＯ３（Ｐ３ＹＳＯ３）、Ｙ（Ｐ３Ｙ）、Ａｓｕ（Ｐ３Ａｓｕ）またはｐＦ（Ｐ３ｐＦ））；Ｈ−γ−Ａｂｕ−ＳＹＳＯ３ＤＹＳＯ３ＳＹＳＯ３ＤＹＳＹＤＹＳ−ＯＨ（Ｎｔｅｒ３スルフェート）；Ｈ−γ−Ａｂｕ−ＳＹＤＹＳＹＤＹＳＯ３ＳＹＳＯ３ＤＹＳＯ３Ｓ−ＯＨ（Ｃｔｅｒ３スルフェート）；Ｈ−γ−Ａｂｕ−（Ｇｌｕ）１３−ＯＨ（Ｅ１３）（式中、γ−Ａｂｕ：ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ）の修飾ペプチドの合成を記載する。この式において、本発明のアニオン性ペプチド（ペプチドＥ１３を除く）はＳＸＤＸＳＸＤＸＳＸＤＸＳ−ＯＨ（配列番号１９）（式中、Ｘは上記の通りである（同一であるかまたは異なる））に相当する。
【００９３】
結果として得られる修飾ペプチドは、
Ｐ３ＹＳＯ３（配列番号１４）：ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ
Ｐ３Ｙ（配列番号１５）：ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ
Ｐ３ｐＦ（配列番号１６）：ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ−Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ−ｐＦ−Ｄ−ｐＦ−Ｓ
Ｐ３Ａｓｕ（配列番号１７）：ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ−Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ−Ａｓｕ−Ｄ−Ａｓｕ−Ｓ
Ｅ１３（配列番号１８）：ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ−ＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥ
Ｎｔｅｒ３スルフェート（配列番号２０）：ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ
Ｃｔｅｒ３スルフェート（配列番号２１）：ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＯ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓ−ＹＳＯ３−Ｄ−ＹＳＯ３−Ｓである。
【００９４】
試薬
樹脂はＲＡＰＰ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ社から購入した。Ｆｍｏｃ  ＡＡ、ＨＡＴＵ、ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＴＦＡはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ピペリジンはＳｉｇｍａ社製であった。Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＳＯ３．ＮｎＢｕ４）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−γ−アミノブチリック−ＯＨ（γ−Ａｂｕ）はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−オクタン二酸−８−ｔｅｒ−ブチルエステル（Ａｓｕ）はＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ社製、Ｆｍｏｃ−Ｌ−４（Ｏ−ｔブチルカルボキシメチル）−Ｐｈｅ−ＯＨ（ｐＦ）はAnaspec社製であった。ＨＰＬＣグレード酢酸トリエチルアミンバッファーはＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ社製であった。Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）はＰｉｅｒｃｅ社製であった。
【００９５】
ペプチド合成の一般プロトコール
ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ社製４３３型ペプチドシンセサイザーにおいて、Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−２−ＣｌＴｒｔ−ＰＳ樹脂（１００μｍｏｌ；０．７８ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成した。Ｅ１３ペプチドは、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＰＨＢ−ＰＳ樹脂（１００μｍｏｌ；０．６１ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成した。鎖の伸長は１０当量のＦｍｏｃアミノ酸およびＨＡＴＵ／ＤＩＥＡによる活性化を用いて行った。ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５／２．５／２．５）によって室温で１時間半処理することによりペプチドを樹脂から切り出した（ただし、硫酸化ペプチドは４℃（氷浴）で行った）。冷ジエチルエーテル沈殿により粗ペプチドを単離し、３％ＮＨ４ＯＨを加えることによってそれらを水に溶解させた（ただし、硫酸化ペプチドは１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムバッファーにすぐに溶解した）。凍結乾燥後、５０ｍＭ  ＮＥｔ３−ＡｃＯＨ水溶液（硫酸化ペプチドおよびＥ１３ペプチドの場合には１００ｍＭ）と、溶出剤としてＣＨ３ＣＮを使用したＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによって粗ペプチドを精製した。精製ペプチドは、質量分析（Ｗａｔｅｒｓ社製ｉｏｎｓｐｒａｙ  Ｑ−ＴＯＦ−ｍｉｃｒｏ）によって確認し、アミノ酸分析（Ｈｉｔａｃｈｉ社製Ｌ−８８００形装置）によって定量した。ペプチド純度は、２０分間の５０ｍＭ  ＮＥｔ３−ＡｃＯＨ水溶液中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を用いた分析用Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｙｍｅｔｒｙ  Ｃ１８−３００Å、３．５μｍ、２．１×１００ｍｍカラム、流速０．３５ｍｌ／分）によって制御した。
【００９６】
【表１】
0006046060.tif 000028
【００９７】
１．２．Ｓ−アセチルチオプロピオネートペプチド（ＳＡＴＰペプチド）
ペプチドを１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ８．２に溶解した（終濃度１ｍＭ）。４０分間にわたって１０当量のＳＡＴＰ（ＤＭＳＯ中で０．２６Ｍ）を段階的に添加することによってＳ−アセチルチオプロピオネート基を導入した。１時間半後、２０分間の５０ｍＭ  ＮＥｔ３−ＡｃＯＨ水溶液中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を用いたＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８−３００Å、５μｍ、１０×２５０ｍｍカラム、流速６ｍｌ／分）によってＳ−アセチルチオプロピオネートペプチドを精製した。ＳＡＴＰ誘導ペプチドの純度は、２０分間の５０ｍＭ  ＮＥｔ３−ＡｃＯＨ水溶液中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を用いた分析用Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｙｍｅｔｒｙ  Ｃ１８−３００Å、３．５μｍ、２．１×１００ｍｍカラム、流速０．３５ｍｌ／分）によって制御した。
【００９８】
【表２】
0006046060.tif 000029
【００９９】
１．３．マレイミド活性化型ｍｉｎｉＣＤ４（ｍＣＤ４−Ｍａｌ）
本発明のｍｉｎｉ−ＣＤ４ペプチドは、ＷＯ２００９／０９８１４７およびNature Chemical Biology, 2009, 5(10), 743-748に開示されているように得られる。
Ｍｉｎｉ−ＣＤ４−ＰＥＯ２−マレイミド＝ｍｉｎｉ−ＣＤ４＋リンカー
１０ｍｇのｍＣＤ４（ＭＷ：２８９７；３．４ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ(１ｍｌ)溶液を１ｍｌのリン酸バッファー０．１Ｍ  ｐＨ８で希釈した。２０μｌのＤＭＳＯ中でこの不透明な溶液に、４．５ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミド（ＭＷ：３２５；１３．８ｍｍｏｌ；４当量）を撹拌しながら加えた。１０分後に、出発材料の８５％（ＨＰＬＣ）がマレイミド誘導体に変換された。マレイミド基のｐＨ８での安定性が低いため、ＴＦＡ０．０８％水溶液中１０％ＣＨ３ＣＮでキャリブレーションを行ったＳｅｐａＫ  Ｃ１８カラムにカップリング反応物を直接注入した。マレイミド誘導体は５０％ＣＨ３ＣＮで溶出された。凍結乾燥後、その化合物をさらにセミ分取カラムで精製した。
【０１００】
１．４．ｍＣＤ４−ペプチドコンジュゲート
ＳＡＴＰペプチドを１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２に溶解した（終濃度１ｍＭ）。１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中１００当量の０．５Ｍ  ＮＨ２ＯＨ，ＨＣｌ（ｐＨは４Ｎ  ＮａＯＨにより７．２に調整した）を加えた。ＨＰＬＣによりチオール官能基の脱保護をモニタリングした。３０分後、Ｈ２Ｏ中の０．３当量のｍＣＤ４−Ｍａｌ（１．５ｍＭ）を加えた。３０分後、２０分間の５０ｍＭ  ＮＥｔ３−ＡｃＯＨ水溶液中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を用いたＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８−３００Å、５μｍ、１０×２５０ｍｍカラム、流速６ｍｌ／分）によってｍＣＤ４−ペプチドコンジュゲートを精製した。ｍＣＤ４−ペプチドコンジュゲートは、２０分間の５０ｍＭ  ＮＥｔ３−ＡｃＯＨ水溶液中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を用いた分析用Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｙｍｅｔｒｙ  Ｃ１８−３００Å、３．５μｍ、２．１×１００ｍｍカラム、流速０．３５ｍｌ／分）、ネガティブモードでの質量分析によって制御し、アミノ酸分析によって定量した。
【０１０１】
【表３】
0006046060.tif 000030
【０１０２】
対照ペプチドであるｍＣＤ４−ＨＳ１２の合成は、ＷＯ／２００９／０９８１４７およびNature Chemical Biology, 2009, 5(10), 743-748に記載されている通りに行った。
【０１０３】
実施例２：Ｂｉａｃｏｒｅ評価
２．１．プロトコール
Ｘ４型分離株（ｇｐ１２０  ＭＮ）およびＲ５型分離株（ｇｐ１２０  ＹＵ２）を由来とする、２つの異なるｇｐ１２０を使用した。異なる分子の、種々の受容体または共受容体とのｇｐ１２０相互作用を阻害する能力は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって測定される。
【０１０４】
これを行うために、タンパク質（この場合、ｇｐ１２０エンベロープタンパク質）を、記載されている手順 (Vives et al. J. Biol. Chem. 279, 54327-54333, 2005)に従って、バイオセンサー（Ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ  ＣＭ  ４  Ｂｉａｃｏｒｅ）の表面に固定化することができる。ＭＮ（Ｘ４）またはＹＵ２（Ｒ５）のｇｐ１２０エンベロープでコーティングした表面に注入すると、ｍＣＤ４は結合し、ｍＡｂ１７ｂのエンベロープ結合に関与する、ｇｐ１２０のＣＤ４ｉエピトープを露出させる（図５Ａ）（ｍＡｂ１７ｂ抗体は、ＣＤ４によって誘導された該エピトープを認識し、共受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４とよく似ている）。ｍＣＤ４または試験対象の化合物をこれらの表面に注入すると、ｇｐ１２０とｍＡｂ１７ｂとの間の相互作用シグナルが時間の関数として測定される（図５Ａ〜Ｃ）。
【０１０５】
別の実験セットでは、ｍＡｂ１７ｂを表面にコーティングし、ｇｐ１２０単独（灰色の線）、またはｍＣＤ４もしくは試験対象の化合物とともにプレインキュベートしたｇｐ１２０をこれらの表面に注入する（図５Ｄおよび５Ｇ）。ｇｐ１２０とｍＡｂ１７ｂとの間の相互作用シグナルが時間の関数として測定される。
【０１０６】
別の実験セットでは、ｓＣＤ４を表面にコーティングし、ｇｐ１２０単独（灰色の線）、または試験対象の化合物とともにプレインキュベートしたｇｐ１２０をこれらの表面に注入する（図５Ｅおよび図５Ｈ）。ｇｐ１２０とｓＣＤ４との間の相互作用シグナルが時間の関数として測定される。
【０１０７】
別の実験セットでは、ヘパリンを表面にコーティングし、ｇｐ１２０単独（灰色の線）。または試験対象の化合物とともにプレインキュベートしたｇｐ１２０をこれらの表面に注入する（図５Ｆ）。ｇｐ１２０およびヘパリンとの間の相互作用シグナルが時間の関数として測定される。
【０１０８】
細線と太線との差は、ｇｐ１２０とバイオセンサー上に固定化されている分子との間の相互作用に関する試験化合物の阻害能力を示している。
【０１０９】
２．２．結果
ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３はｇｐ１２０／ｍＣＤ４複合体におけるｍＡｂ１７ｂ結合を十分に阻害する。
【０１１０】
ＭＮ（Ｘ４）またはＹＵ２（Ｒ５）のエンベロープでコーティングしたｇｐ１２０表面に注入すると、ｍＣＤ４は結合し、ｍＡｂ１７ｂのエンベロープ結合に関与する、ｇｐ１２０のＣＤ４ｉエピトープを露出させる（図５Ａ）。ｍＣＤ４−Ｐ３ＹおよびｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３を用いて行った同じ実験（それぞれ、図５Ｂおよび５Ｃ）では、ｍＣＤ４−Ｐ３ＹはｍＡｂ１７ｂのＭＮ（Ｘ４）との結合を部分的に阻害する（図５Ｂ）が、一方、ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３はＭＮ（Ｘ４）およびＹＵ２（Ｒ５）においてｍＡｂ１７ｂを十分に阻害する（図５Ｃ）ことが示される。
【０１１１】
ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３はｍＡｂ１７ｂおよびＣＤ４におけるＭＮ（Ｘ４）エンベロープ結合を十分に阻害し、ヘパリンにおいて部分的に阻害する。
【０１１２】
ｍＡｂ１７ｂ表面に注入すると、ＭＮエンベロープは１７ｂ表面と結合しない（ＣＤ４ｉエピトープはマスクされている、細線、図５Ｄ）。ｇｐ１２０エンベロープがｍＣＤ４と複合体を形成している場合にこの結合は起こる。ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３との複合体として注入すると、該結合は十分に阻害される（図５Ｄ）。ＭＮエンベロープはＣＤ４表面と結合する。ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３との複合体として注入すると、該結合は十分に阻害される（図５Ｅ）が、一方、ヘパリンとのＭＮの結合は、ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３によってのみ部分的に阻害される（図５Ｆ）。
【０１１３】
ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３はｍＡｂ１７ｂおよびＣＤ４におけるＹＵ２（Ｒ５）エンベロープ結合を十分に阻害する。
【０１１４】
ｍＡｂ１７ｂ表面に注入すると、ＹＵ２エンベロープは１７ｂ表面と部分的に結合する。この結合は、ｍＣＤ４／ＹＵ２複合体が注入された場合に増強される。ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３によってこの結合は十分に阻害される（図５Ｇ）。ＹＵ２エンベロープはＣＤ４表面と結合する。ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３との複合体として注入すると、該結合は十分に阻害される（図５Ｈ）。ＹＵ２エンベロープはヘパリン表面と結合しないため、ヘパリン表面における実験は行わなかった。
【０１１５】
実施例３：Ｘ４指向性ＨＩＶ−１−ＬＡＩ株およびＲ５指向性ＨＩＶ−１／Ｂａ−Ｌ株における本発明のペプチドの抗ウイルス活性
３．１．プロトコール
抗ウイルス実験は、ＷＯ／２００９／０９８１４７およびNature Chemical Biology, 2009, 5(10), 743-748に記載されている通りに行った。
【０１１６】
簡潔には、Ｘ４指向性ＨＩＶ−１−ＬＡＩ株(Barre-Sinoussi, Science 220, 868-71, 1983)またはＲ５指向性ＨＩＶ−１／Ｂａ−Ｌ株(Gartner et al, Science 233, 215-9, 1986)を増幅し、フィトヘマグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ）活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてin vitroで力価測定した。組織培養感染量は、Ｋａｒｂｅｒの式(Karber, Arch. Exp. Path. Pharmak. 162, 480-483, 1931) を用いて計算した。抗ウイルスアッセイでは、ＰＨＡ−Ｐ活性化ＰＢＭＣを、６種の濃度の各薬物（０．５μＭ〜１６０ｐＭの間の１：５希釈物）で３０分間前処理し、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）１００のＸ４指向性ＬＡＩ株またはＲ５指向性Ｂａ−Ｌ株のいずれかで感染させた。培養中、薬物を維持し、感染後７日目に細胞上清を集め、−２０℃で保存した。これらの実験ではアジドチミジン（ＡＺＴ）を内部対照として使用した。ＲｅｔｒｏＳｙｓ  ＨＩＶ  ＲＴ  ｋｉｔ(Innovagen)を使用して細胞培養上清における逆転写酵素（ＲＴ）活性を定量することによって、ウイルスの複製を測定した。同時に、７日目にメチルテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）アッセイにより非感染ＰＨＡ−Ｐ活性化ＰＢＭＣにおいてサンプルの細胞毒性を評価した。実験は三反復で行い、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを使用して５０％、７０％および９０％有効量ならびに細胞毒性量を計算した。
【０１１７】
ＰＨＡ−Ｐ活性化ＰＢＭＣを、調査中の各薬物（０．５μＭ〜１６０ｐＭの間の１：５希釈物）で処理し、１００  ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−１−ＬＡＩ（Ｘ４指向性）株または／Ｂａ−Ｌ（Ｒ５指向性）株のいずれかで感染させた。培養中、分子およびウイルスを維持し、感染後７日目に細胞上清を集め、それらの上清から逆転写酵素活性を定量した。実験は三反復で行い、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを使用して５０％、７０％および９０％有効量（ＥＤ）をｎＭ単位（±Ｓ．Ｄ．）で計算した。これらの分子の中では、１μＭまで細胞毒性を示したものはなかった。
【０１１８】
３．２．結果
単独で使用した場合、アニオン性ペプチドの中では、試験した最大濃度（５００ｎＭ）で抗ウイルス活性を示したものはなかった。しかしながら、ｍＣＤ４とコンジュゲートを形成している場合、それらはＬＡＩ株および／またはＢａ−Ｌ株に対して阻害活性を示し、５０％阻害をもたらす有効量（ＥＤ５０）は、ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３については０．５ｎＭ程度の低値であって、ｍＣＤ４−ＨＳ１２についての１．４ｎＭとよい比較対照となる（下表４を参照）。
【０１１９】
【表４】
0006046060.tif 000031
【０１２０】
これらの分子の中では、試験した最大用量（０．５μＭ）まで細胞毒性を示したものはなかった。
【０１２１】
実施例４：９２ＵＧ０２９株、ＳＦ１６２株、９２ＵＳ７２３株、９６ＵＳＨＩＰＳ４株、９２ＨＴ５９９株および９８ＩＮ０１７株におけるｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３の抗ウイルス活性
４．１．プロトコール
抗ウイルスアッセイを、９２ＵＧ０２９、ＳＦ１６２、９２ＵＳ７２３、９６ＵＳＨＩＰＳ４、９２ＨＴ５９９および９８ＩＮ０１７を含む、一連のより臨床上関連のある初代株まで拡大した。
【０１２２】
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−Ｐ活性化ＰＢＭＣを、参照リンパ球向性ＨＩＶ−１／ＬＡＩ株(Barre-Sinoussi, et al., 1983)または参照マクロファージ指向性ＨＩＶ−１／Ｂａ−Ｌ株(Gartner, et al., 1986)のいずれかで感染させた。これらのウイルスを、ＰＨＡ−Ｐ活性化血液単核細胞を用いてin vitroで増幅した。ＰＨＡ−Ｐ活性化ＰＢＭＣを用いて、ウイルス株（臨床分離株を含む）の力価を測定し、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を、Ｋａｒｂｅｒの式(Karber, 1931)を用いて計算した。ウイルス（１２５  ＴＣＩＤ５０）を、５種の濃度（５００ｎＭ〜３２０ｐＭの間の１：５希釈物）の各試験対象分子とともに３０分間インキュベートし、１５００００個のＰＢＭＣ（ｍ．ｏ．ｉ．〜０．００１）に加えた。感染後７日目に細胞上清を集め、−２０℃で保存した。一部のケースでは、ウイルス攻撃の前に化合物を細胞に加えた。Ｌｅｎｔｉ  ＲＴ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｖｉｓｉ)を使用して細胞培養上清における逆転写酵素（ＲＴ）活性を定量することによって、ウイルスの複製を測定し、ＡＺＴを参照抗ＨＩＶ−１分子として使用した。同時に、７日目にメチル−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ／ＰＭＳ）比色アッセイ(Promega)を用いて非感染ＰＨＡ−Ｐ活性化ＰＢＭＣにおいて細胞毒性を評価した。実験は三反復で行い、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを使用して５０％、７０％および９０％有効量（ＥＤ）計算した。
【０１２３】
４．２．結果
下の表５に示すように、ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３は高レベルの抗ウイルス活性を示し、ウイルス５株についてはＥＤ５０が０．２〜１．２ｎＭの範囲にあり、クレードＣウイルスであるＨＩＶ−１  ９８ＩＮ０１７については２９ｎＭであるという特徴を示している。ＬＡＩ株およびＢａ−Ｌ株に関しては、ｍＣＤ４またはＰ３ＹＳＯ３は低い活性しかないかまたは不活性であり、カップリング戦略によって非常に強い相乗作用がもたらされたことがさらに立証されている。それらの分子の中では、１μＭまで細胞毒性を示したものはなかった。
【０１２４】
【表５】
0006046060.tif 000032
【０１２５】
本発明者らは、活性にするために、ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３をウイルスとともにプレインキュベートする必要がないことも見出した。実際には、ウイルス攻撃前に細胞に前記分子を添加しても、細胞感染前のウイルスに前記分子を添加しても、同じ結果を示した（表７参照）。
【０１２６】
【表６】
0006046060.tif 000033
【０１２７】
実施例５：ＳＨＩＶｓｆ１６２ｐ３細胞におけるin celluloでのｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３の抗ウイルス活性
５．１．プロトコール
ＨＩＶ  ＬＴＲの制御下でルシフェラーゼ(Luceriferase)を発現するＴＺＮ−ｂｌ細胞を使用した。これらの細胞は高レベルのＣＤ４およびＣＣＲ５を発現し、ＨＩＶ−１／−２およびＳＩＶに感染しやすい。これらの細胞が感染すると、ウイルスのＴａｔによりルシフェラーゼの転写が誘導される。Ｌｕｃシグナルは感染の量に比例する。試験対象の化合物（ｍＣＤ４、ｍＣＤ４−ＨＳ１２またはｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３）の連続希釈物を細胞に加え、続いて、ウイルスを加える。４８時間後に、得られたＬｕｃシグナルを読み取る。
【０１２８】
試験は二反復で行った。
【０１２９】
５．２．結果
得られた結果を下の表６に示す。
【０１３０】
【表７】
0006046060.tif 000034
【０１３１】
結論
この研究によって、アニオン性ポリペプチドと結合している３ｋＤａのＣＤ４模倣体を含んでなる比較的小さな合成分子は、ＣＤ４と、ｍＡｂを認識する共受容体結合部位とを含むいくつかの大きなｇｐ１２０リガンドを効果的に模倣し得ることが示される。注目すべきことには、本発明に記載したコンジュゲートはＲ５指向性ＨＩＶ−１とＸ４指向性ＨＩＶ−１の両方を中和するが、ＣＣＲ５特異的アンタゴニストの効力からの大きな利益は、ＣＸＣＲ４を利用するウイルス株の出現によって危険にさらされる可能性があり、それに対する阻害剤はまだ得られていない。
【０１３２】
驚くべきことには、本発明のペプチドは、Ｘ４ウイルス株とＲ５ウイルス株の両方に対して、先行技術の分子（ｍＣＤ４−ＨＳ１２）より良好な抗ウイルス活性を示し、それゆえに、宿主細胞へのＨＩＶウイルス侵入の阻害を増強することができる。
【０１３３】
コンジュゲート分子ｍＣＤ４−Ｐ３ＹＳＯ３は他の試験化合物のいずれよりもはるかに良好な阻害効果を有する（Ｘ４およびＲ５に対して、ＥＤ５０がそれぞれ０．５および１．３）。
【０１３４】
略称：
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＨＡＴＵ：Ｎ［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムのヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＥＤＴ：エタンジチオール
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
ＤＴＴ：１，４−ジチオトレイトール
ＭＰＬＣ：中圧液体クロマトグラフィー
ＥＳ＋ＭＳ：エレクトロスプレー質量分析、ポジティブモード
ＧＳＨ：還元型グルタチオン
ＧＳＳＧ：酸化型グルタチオン
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＭＰＨ：スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート
ＳＡＴＰ：Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート(proprionate)
ＲＴ：室温
Ｒｔ：保持時間
Ｃｂｚ：ベンジルオキシカルボニル
ｐＭＢｎ：ｐ−メトキシベンジル
Ｂｎ：ベンジル
Ａｃ：アセチル
Ｍｅ：メチル
Ｅｔ：エチル
ｅｑ：当量
ＨＲＭＳ：高分解能質量スペクトル
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化
ＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー／質量分析
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
【図１】
0006046060.tif 000041
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
0006046060.tif 000046
【図５Ｃ】
0006046060.tif 000047
【図５Ｄ】
0006046060.tif 000048
【図５Ｅ】
0006046060.tif 000049
【図５Ｆ】
0006046060.tif 000050
【図５Ｇ】
0006046060.tif 000051
【図５Ｈ】
0006046060.tif 000052
【配列表】
0006046060000001.app