(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガロースでコートされたアガロース含有ビーズ中に生細胞サンプルを含む組成物を製造する方法であって、
（ａ）第１のアガロースサンプルを前記生細胞と混合して懸濁液を形成することと、
（ｂ）前記生細胞とアガロースを混合した懸濁液を鉱油に放出してビーズを形成することと、
（ｃ）前記形成されたビーズを鉱油から取り出すことと、
（ｄ）前記ビーズの鉱油をすすぐことと、
（ｅ）前記ビーズをトランペットツールを用いて第２のアガロース溶液に移すことと、
（ｆ）前記ビーズを第２のアガロース溶液でコートすることと、
（ｈ）前記第２のアガロース溶液でコートしたビーズをストローツールを用いて鉱油サンプルに分注することと
を含む方法において、前記鉱油サンプルを温度勾配下に維持して、前記ビーズが２０℃〜３０℃の高温の鉱油から０℃〜−８℃の低温の鉱油へ移動するようにする方法。
【請求項２】
前記生細胞は分泌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生細胞は癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生細胞は癌幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生細胞は膵島細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生細胞は幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生細胞は胚性幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生細胞は多能性細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
トランペットツールを用いて前記コートしたビーズを前記鉱油サンプルから取り出すことを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記鉱油サンプルの鉱油の最高温度と最低温度の差が２０℃〜３５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記高温は２０℃〜２５℃であり、前記低温は０℃〜−２℃である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１２年１月３１日出願の米国仮特許出願第６１／５９２，９４９号の優先権を主張するものであり、該出願の全内容を、本明細書を構成するものとしてここに援用する。
【０００２】
本発明は、透過性ビーズ又は他の構造物に捕捉され、更にアガロースでコートされた細胞（特に分泌細胞）を含む組成物を製造するための改良方法に関する。このビーズはアガロースを含んでいてもよく、アガロースで構成されていてもよい。このビーズにはリテックスアガロースが特に好ましい。
【背景技術】
【０００３】
透過性媒体に捕捉された生きた細胞を含む組成物の製造は、様々な分野、例えば、糖尿病療法や癌治療、幹細胞維持において重要であることが分かってきた。この点に関しては、例えば、特許文献１〜９を参照されたいが、これら文献の全内容を、本明細書を構成するものとしてここに援用する。
【０００４】
このような組成物を製造するためのプロセス（以下「カプセル化」と称する）は、用いる細胞の種類に関わらず、本質的には同じである。対象となる細胞を単離又は確保した後、アガロースやコラーゲン、又はそれらの組み合わせ等の剤の水溶液に細胞を懸濁させるか、又はゼラチンスポンジ等の材料に細胞を載置する。水溶液を用いる場合には、懸濁液を鉱油に入れて、対象となる細胞を含む半固体のビーズを形成する。ゼラチンスポンジを用いる場合には、細胞を含む生成物を転がして球体とした後、その上にアガロースを注いでビーズを形成する。
【０００５】
その後、例えば、テフロン（登録商標）スプーン内でビーズをアガロース溶液に接触させる。ビーズを混合物中で転がし、上述の当該技術分野においてアガロースコートマクロビーズと称されるものを形成する。
【０００６】
例えば、特許文献１や特許文献７に記載の初期の教示による分泌細胞（インスリン産生膵島や癌細胞等）のカプセル化が示された後、特許文献２に記載の改良（例えば、幹細胞のカプセル化）が行われ、また、用いる材料の改良（例えば、特許文献９に記載）を経てきたが、このような有用なものを製造するための方法に関する改良は今なお必要である。
当該分野で非常に望ましい一改良は、手作業によるプロセスを自動化できることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国再発行特許第４０，５５５号
【特許文献２】米国特許第７，８３８，２９１号
【特許文献３】米国特許第６，８１８，２３０号
【特許文献４】米国特許第６，８０８，７０５号
【特許文献５】米国特許第６，３０３，１５１号
【特許文献６】米国特許第６，２２４，９１２号
【特許文献７】米国特許第５，８８８，４９７号
【特許文献８】米国特許第５，６４３，５６９号
【特許文献９】米国特許出願公開第２００７／００７１７３２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
製造プロセスを自動化する過程で、本発明者らは、製造プロセスを容易にする特別なツールを開発した。更に、本発明者らは、温度勾配下の鉱油の容器にマクロビーズを投入することを経てプロセスを終了させると、可能と考えられていたよりも形状が均一でテクスチャーにむらのないマクロビーズを製造することができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明がどのように達成されたかを次に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】鉱油を含むマルチウェルアレイへの細胞とアガロースの自動分注を示す。
【図２】本発明の「トランペットツール」の好ましい実施形態の様々な図を示す。
【図３】トランペットツールの第２の実施形態を示す。
【図４】本発明のストローツールの様々な実施形態を示す。
【図５】本発明のプロセスの要約を示す。
【図６】本発明の操作時に温度勾配を維持するのに用いるデバイスを示す。
【図７】アガロースの濃度や種類を変えて製造したビーズからのインスリン産生のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上述の米国特許を参照すると、これら全てにおいては、該特許で定義された様々な種類の細胞（例えば、分泌細胞）を含むマクロビーズを製造するための手作業による方法が詳細に記載されている。本明細書に記載の本発明は上述の方法を改変するものであり、後述するように、アガロースコートのアガロースビーズをスプーン内又はテフロン（登録商標）表面上で鉱油と接触させる最終段階の代わりに、温度勾配下に維持された鉱油を含む容器を用いる。
【００１２】
上述の特許に記載のようなマクロビーズは、ロボット制御又は自動化によって製造することもできる。本明細書にはそのような一アプローチが記載されている。
【００１３】
一実施形態においては、図１に示すように、ロボットディスペンサ（例えば、ピペットのアレイ）によって、マルチプルウェルプレート（例えば、標準的な９６ウェルプレート）に分泌細胞を分注する。次に、溶融アガロースをウェルに添加する。その後、例えば、マルチピペットアレイ等の自動的手段によって、細胞と溶融アガロースを鉱油含有手段、例えば、単一ウェル又はマルチウェル容器（例えば、９６ウェルプレート）に移してビーズを形成する。
【００１４】
次に、ビーズをウェルから取り出すが、図２ａ〜ｃ及び３に示す所謂「トランペットツール」を用いて取り出すことが好ましい。トランペットツールは、次に詳述するように、ビーズの表面を破壊しないように設計されている。
【００１５】
更なる一実施形態においては、ウェルの底部に出口手段を設け、それによってビーズをウェルから取り出し、次の段階で用いることができる。更なる一実施形態においては、上述のプロセスで得られたビーズを自動的手段（例えば、可動プラットフォーム）によって鉱油の上部に移すことができ、また、自動システムによって鉱油含有手段からビーズを取り出すこともできる。
【００１６】
トランペットツールを用いるか、或いは出口手段を通過させてビーズを取り出し、適切な溶液（例えば、平衡塩類溶液）ですすいで付着した鉱油を除去した後、加温した新しいアガロースを含むウェルにビーズを入れる。その後、ビーズを温アガロースと共に取り出し（好ましくは、図４ａ及び４ｂに示す所謂「ストローツール」を用いて軽く吸引する）、制御された温度勾配下の鉱油を含む容器に分注する。
【００１７】
鉱油を含む容器は、例えば、試験管やキュベット、ビーカー又は他の適切なものとすることができるが、様々なサイズの試験管やキュベットが好ましい。このような容器（即ち、試験管やキュベット等）は各種材料から形成することができる。特にガラスが好ましいが、他の材料（例えば、親水性層を提供する物質でコートされた材料）を用いることもできる。
【００１８】
容器内の温度勾配は、当該技術分野で公知の如何なる方法によっても維持することができる。鉱油の温度が容器の底部よりも上部で高いことが重要である。勾配の温度と量は、例えば、容器の長さや、カプセル化される細胞の種類、用いるアガロースの種類等によって変わる。このような値を設定するのに重要な因子としては、例えば、カプセル化された細胞が生存可能な温度や、用いるアガロースが固化する温度等が挙げられる。勾配開始温度は２０℃〜８０℃であることが好ましく、２０℃〜５０℃であることがより好ましく、２０℃〜４０℃であることが更に好ましい。理想的には、開始温度は約２０℃〜約２５℃である。また、容器の底部の温度も、例えば、０℃〜−１０℃、より好ましくは０℃〜−８℃、最も好ましくは約０℃〜約−２℃の範囲とすることができる。最高温度と最低温度との差は２０℃〜５０℃であることが好ましく、約２０℃〜約３０℃であることがより好ましい。
【００１９】
本願の一部を構成する図により、先の記述を更に詳細に説明する。
【００２０】
図１は、プレートの各ウェルに細胞とアガロースの両方を分注する方法を示す。例えば、洗浄や吸引又は上述の出口手段によって鉱油を除去した後、図２ａ〜２ｃ及び３に示す上述の「トランペットツール」をウェルに挿入し、細胞が捕捉されているビーズを取り出す。このトランペットツールにはその一端に真空源が取り付けられており、ビーズの表面を破壊せずにビーズを容易に取り出すことができる。
【００２１】
１個のアガロース層と細胞で構成されたビーズを、所謂「トランペットツール」によって、第２の層（即ち、アガロースコーティング）となる加熱アガロースで満たされた新しいウェルに落とす。温アガロースと共にビーズを取り出すが、その際、好ましくは「ストローツール」（例えば、図４ａや４ｂに示すもの）を用い、好ましくは軽く吸引して取り出し、温度勾配下の鉱油を含む容器にビーズを分注する。温度勾配は、例えば、図５に示すデバイスによって維持することができるが、当業者であれば、他のオプションにも精通しているであろう。マクロビーズが容器内を移動して底部に到達すると、細長い形状のトランペットツールを用いると共に吸引を行ってマクロビーズを取り出し、媒体内で洗浄することができるが、上述のように出口手段を用いてビーズを取り出すこともできる。この時点でマクロビーズは使用できる状態にあるが、異なる状況下においては、存在する細胞の数が十分になるまで、或いは所定の生成物が細胞によって発現されるまで、ビーズ内で細胞を増殖及び／又は成熟させることが好ましい場合もある。この期間は、例えば、１週間〜数ヶ月の範囲とすることができる。
【００２２】
請求項に係る発明の図面を参照すると、図２ａ、２ｂ、２ｃ及び３は本発明に係るデバイス（所謂「トランペットツール」）の様々な図を示す。
【００２３】
図２ａはトランペットツール４０を示す。このツールが「トランペットツール」と称されるのは、逆円錐部（negative conical section）４１がトランペットに似ていることに由来する。逆円錐部４１の一端においては、リム４２が円錐端部４１に取り付けられている。円錐端部４１は中空の長手方向部４３に接続されており、長手方向部４３はその内部を流体（例えば、空気）が通過するようになっている。
【００２４】
図２ａに示すように、中空の長手方向部４３はデバイス全体に沿って延在する。逆円錐端部に対し、トランペットツールの長さの約２／３〜３／４の位置にカラー手段４４が設けられているのが分かる。カラー手段４４は、本明細書に記載の他の幾つかの特徴と共に、製造プロセスの付加的構造であり、デバイスの機能には影響を及ぼさない。
【００２５】
しかし、カラー手段４４は長手方向手段の外周が拡大する箇所を示す。デバイスの４５で示す部分は、操作時に流体（例えば、空気）源（真空手段等）にツールを接続する結合端部に相当する。接続開口部４６は、デバイスにおいて外周が最大の部分であり、例えば、真空手段へ接続するように作用する。図２ｃに示すような内部構造を設けて、真空手段の取り付けを容易にする。このような構造は、利用する装置に応じて変わり得る。
【００２６】
本デバイスには、リッジ手段４７と共に一連の突出部４８ａ、ｂ及びｃが均等に間隔を置いて配置されているのが分かるが、これらは全て、カラー手段４４と同様に、製造の付加的構造である。しかし、これらの突出部は、例えば、分注ラックの所定の位置に関連するツールを保持する上でも役立つ。
【００２７】
本デバイスの内部を図２ｂ及び２ｃの両方に示すが、これらの図から実際にデバイスがその全長に亘って中空であることが分かる。図２ｃにおける逆円錐部の表示から、該部分が、嵌め込もうとする対象物（例えば、ビーズ）よりも外周が若干小さい箇所に向かって細くなっている様子がより詳細に分かる。
【００２８】
操作時には、接続端部４６を介してデバイス４０を、例えば、真空ポンプ手段に接続し、取り出す対象物（例えば、ビーズ）に対して垂直に配置する。真空ポンプ手段（図示せず）によってツール内の空気が除去され、ビーズの取り込みは、例えば、真空手段によって生じる吸引力を制御して行い、逆円錐端部４１の構造によって、半軟質アガロースビーズ等のビーズをある場所から取り出し、他の場所（例えば、アガロースコーティング溶液）へ移動させることができる。その時点で、例えば、長手方向手段４５に空気を供給して真空圧力を変化させ、これによって、ビーズの構造を変えずにビーズを円錐端部４１からアガロース溶液に放出する。
【００２９】
図３は、図２ａ〜２ｃのデバイスの他の実施形態を示す。このデバイスは、図２ａ〜２ｃの実施形態とは異なる製造手段によって得られるが、長手方向部４３に沿ったリッジ手段を示す。また、リッジ手段４７及び４８ａ〜ｃと共に、カラー手段にも様々な変更があることにも留意されたい。しかし、逆円錐端部４１とそのリム、及び結合端部４５と結合開口部は、図２ａ〜２ｃの類似構造と同様に機能する。
【００３０】
図４ａ及び４ｂは、以下「ストローツール」と呼ぶデバイスの実施形態を示す。図４ａはストローツール５０を示す。このツールは、中空長手方向軸５１、結合端部５２及び受け入れ端部５３に沿って本質的に円筒形状を示す。
【００３１】
このストローツールは凹んだ空間５４を有し、該空間は長手方向軸５１に沿って延在し、受け入れ端部５３で開口している。
【００３２】
受容スペース５４は長手方向軸に沿って延在し、カナル部５５に隣接するが、カナル部の直径は受容スペースより小さくてもよい。このカナル部５５は接続手段５２に接合し、「５２」、「５４」及び「５５」の組み合わせによって、流体（例えば、空気や他のガス）の圧力の変化を受け入れるワーキングチャネルを形成する。操作時には、ストローツール内の流体の圧力を変化させることが可能なデバイス（例えば、空気ポンプ）に接続手段５２を接合する。次に、ストローツールを対象物（例えば、ビーズ）上に載置し、圧力の変化に応じて、ビーズをストローツールで取り出す。受け入れ端部５３の開口直径は、対象物（例えば、ビーズ）を取り出し、ビーズがツールの長手方向空洞内を垂直に移動するのに十分な大きさであることに留意されたい。一旦ビーズが所望の位置まで移動すれば、第２の圧力の変化によってビーズを落下させ、ストローツールを再使用することができる。
【００３３】
図４ａと４ｂは接続手段５２の構造が異なるが、構造の違いは製造プロセスに起因するものであり、デバイスの操作には影響を及ぼさない。
【００３４】
各デバイスにおいて、破線はストローツールが最適な真空接続手段を受け入れるための調整を示す。凹んだチャネル５６が示されているが、これによって、拡張性Ｏリング等の接続手段を受け入れることができる。また、該デバイスの特徴は、ピペットの進行を妨げるための手段５７にある。この「ピペットシェルフ」は、ピペットや流体（例えば、空気）を送達する他の手段の通過を停止させる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本明細書を詳述するが、本発明はこれらに限定されない。
【００３６】
実施例１
粉末化アガロース（リテックスＨＳＢ−ＬＶ）を最小必須培地に溶解して濃度を０．８％又は４．５％（ｗ／ｖ）とした後、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し、粘稠性融解溶液を得た。このアガロース溶液を冷却し、５１〜５３℃又は６１〜６３℃でそれぞれ維持した。
【００３７】
総数１５万個のＲＥＮＣＡ（腎癌）細胞をウェルに添加した後、０．８％アガロース溶液（０．２５ｍＬ）を添加して懸濁液を作成し、その後、この細胞／アガロース懸濁液をプラスチックボウル内の室温の鉱油、又は室温の鉱油で予め満たしたディープウェル９６プラスチックプレートに分注した。
【００３８】
ＲＥＮＣＡ細胞含有アガロースマクロビーズを、表面が平滑で細胞が均等に分布している円形ビーズとして形成した。次に、マクロビーズから鉱油を吸引除去し、マクロビーズをＲＰＭＩ細胞培養液で洗浄した。
【００３９】
マクロビーズのコーティングには４．５％ｗ／ｖ溶液を用いた。コーティングに用いたアガロースはビーズに用いたものと同じ種類であるが、種類が異なっていてもよいことに留意されたい。
【００４０】
ビーズ調製用手動モードを実施するため、６１〜６３℃に維持した４．５％アガロース（１．０ｍＬ）を含むプラスチックスプーン内で、上で調製したビーズを転がした後、室温の鉱油に落下させた。
【００４１】
本発明の方法においては、コーティング材料を６１〜６３℃で維持し、２４ウェルプレートに移した。次に、図２ａに示す上述の「トランペットツール」を用いてビーズを室温の鉱油から取り出し、ビーズを洗浄して鉱油を除去した後、第２のコート用アガロース溶液に入れた。図４ａに示すストローツール用い、軽く吸引しながらビーズを取り出し、アガロース（０．５ｍＬ）と共に、温度勾配下に維持した鉱油を含む容器へ添加した。
【００４２】
後述のように様々な温度に維持した鉱油の上部に、マクロビーズをストローツールから分注した。マクロビーズが鉱油中を降下した際に、コーティングがビーズ表面で固化して球体を形成した。鉱油の温度は容器の上部から底部に向かって低下し、後述するように底部では低温となった。次に、図２ａのトランペットツールを用いて容器からアガロース／アガロースマクロビーズを取り出した後、媒体内で洗浄した。得られたマクロビーズは通常の組織培養に使用できる状態にあった。
【００４３】
実施例２
上述の温度勾配を用い、一連の異なる実験を行った。
【００４４】
【表１】
0005986226.tif 000002
【００４５】
上述のようにビーズを回収し、洗浄した後、代謝活性について試験した。この評価は、当該技術分野でよく知られた標準ＭＴＴアッセイによって行った。代謝活性は、非カプセル化細胞に関しては０日目に測定し、カプセル化細胞に関しては製造後７日目に測定した。結果を次に要約する。
【００４６】
【表２】
0005986226.tif 000003
【００４７】
この結果から、カプセル化細胞は、温度勾配鉱油に落下させた際の開始温度に関わらず生存し、代謝活性は勾配開始時の温度に反比例した（即ち、温度が高い程、得られる代謝活性は低い）ことが分かる。
【００４８】
実施例３
鉱油温度勾配の最適開始温度が約２５℃、終了温度が約−２℃であることが確立されたことを考慮し、これを一連の実験に用いて代謝活性及び腫瘍抑制能を測定した。
【００４９】
代謝活性は上述と同様に測定した。
【００５０】
腫瘍抑制能の測定に際し、新鮮な培地（４ｍＬ）又はカプセル化細胞を５日間培養した培養物から得た培地（４ｍＬ）を含む６ウェルプレートに、ＲＥＮＣＡ細胞を播種（１５０００個／ウェル）した。遊離ＲＥＮＣＡ細胞を該培地中、３７℃及び５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養した。次に、ＲＥＮＣＡ細胞をメタノールで固定し、０．３３％（ｗ／ｖ）ニュートラルレッドで染色し、吸光度を５４０ｎｍで測定した（参照波長を６３０ｎｍとした）。処理培地と新鮮培地との間のＡｂｓ５４０ｎｍ−６３０ｎｍのパーセント差を抑制の定義とした。
【００５１】
以下の結果は代謝活性データを示す。「遊離細胞」はアガロースで全く処理しなかったＲＥＮＣＡ細胞を指し、「第１コート」は未コートのビーズを指す。
【００５２】
【表３】
0005986226.tif 000004
【００５３】
次の表に示すように、腫瘍抑制能を測定した。
【００５４】
【表４】
0005986226.tif 000005
【００５５】
この結果から、本発明に従って製造したアガロースビーズは、手作業で製造したビーズに対して関連する全ての点で同等であることが分かる。
【００５６】
実施例４
ビーズの製造を、上述のように本発明に従って行うと共に、引用した先行技術に記載の手作業による方法によって行った。７ヶ月間に亘り、１０個のビーズを無作為に選択してその直径を測定した。次の表に示す結果から、本発明に従って製造したビーズは直径がより一定であり、即ち、コーティングがより一定であることが分かる。
【００５７】
【表５】
0005986226.tif 000006
【００５８】
また、試験時に、本発明のプロセスによって細胞汚染が抑制されたことも分かった。詳細には、先行技術の手作業による方法に従ってビーズを調製した場合、細胞が完全にはカプセル化されないという問題があることが分かった。細胞が癌細胞の場合、プラークや腫瘍コロニーを形成し、それらを含む培養物中のビーズは、汚染のため廃棄する必要がある。
【００５９】
８ヶ月間に亘り、５６バッチのビーズ（各バッチには多数のペトリ皿培養物が含まれる）を手動で製造した。各バッチにおいては、少なくとも１個の培養物が汚染された。一方、本発明の方法によって同じ期間に亘り６２バッチを調製した。何らかの汚染が見られたのは６２バッチ中１２バッチのみであった。
【００６０】
実施例５
次の実施例では、アガロースコートの膵島含有アガロースビーズ（３グループ）の製造について詳述する。
【００６１】
複数回の出産歴があって２歳を超える動物から膵島を調製した。
【００６２】
コラゲナーゼ／中性プロテアーゼ（コラゲナーゼＰ（１．０ｇ／Ｌ）又はリベラーゼＭＴＦ／サーモリシン（７．５Ｕ／ｇ膵臓））及びハンクス平衡塩類溶液（ＧＢＳＳ）又は低温貯蔵精製ストック溶液で調製したＤＮアーゼＩ（０．０１ｇ／Ｌ）又はプルモザイム溶液（２．５ｍｇ／膵臓）で動物の膵臓を灌流した。
【００６３】
膵島を定量化した後、２０００ＩＥＱの分量に分割し、その後、１．５％シーケムゴールド（以下「ＳＧ」とする）、０．８％ＳＧ又は０．８％リテックス（以下「Ｌｉ」とする）の内の１種の溶液（０．５ｍＬ）に再懸濁させた。本明細書に記載の「ＩＥＱ」とは、直径が１５０μｍの膵島を意味する。従って、直径が３００μｍの膵島は２ＩＥＱであり、直径が７５μｍの膵島は０．５ＩＥＱである。リテックスアガロースは次の特性を有する。即ち、５．８〜８．７ｃＰの１．５％ゲルの場合、ゲル強度は１０００ｇ／ｃｍ２以上であり、１．５％溶液を用いた場合、ゲル化温度は４０〜４３℃であり、ＥＥＯ（電気浸透）値は０．０６〜０．１２であり、硫酸塩含量は０．３０％以下である。溶液は最小必須培地及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳで調製した。
【００６４】
懸濁液を無菌鉱油の表面下で放出し、４個の０．１２５ｍＬ球形ビーズ（直径：約５〜６ｍｍ、各ビーズは５００ＩＥＱを含有）を得た。
【００６５】
これらの未コートアガロースビーズを３７℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。５〜７日後、５％ＳＧアガロースの第２のコーティングを行い、アガロースコートの膵島含有アガロースビーズ（最終直径：８〜９ｍｍ）を得た。
【００６６】
これらのビーズを、次の実験に用いるまで、３７℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。ビーズを培地（１１ｍＭグルコース、２．５％熱不活性化ブタ血清及び１％抗生物質／抗真菌剤を追加）に入れた。培地を週１回交換し、毎週交換２４時間後に培地サンプルを解析して後述のアッセイに備えた。
【００６７】
実施例６
先の実施例に記載のように、サンプルから培地サンプルを採取し、市販のブタインスリンＥＬＩＳＡを用いてインスリン含量についてアッセイした。結果を図６に示す。インスリン産生に関しては、０．８％ＳＧ及び１．５％ＳＧのいずれかにカプセル化された膵島よりも０．８％Ｌｉにカプセル化された膵島の方が優れていることが分かる。
【００６８】
実施例７
上述のインビトロ実験を本明細書に記載のインビボ実験に拡張した。
【００６９】
これらの実験には成体（８週齢のラット）を用いた。ラットを「インスリンのみ」対照グループ又はビーズレシピエントのグループに分類した。全てのラットに尾静脈注射によってストレプトゾトシン（６５ｍｇ／ｋｇ）を投与して糖尿病を誘発した。
【００７０】
対象ラットの血液をアッセイし、非空腹時グルコース値を測定することによって糖尿病の存在を確認した。グルコース値が３日間連続して４００ｍｇ／ｄＬを超えた場合には、糖尿病が存在していると見なした。２週間以内に糖尿病を示さなかったラットには２回目のストレプトゾトシン投与を行い、その後、全てのラットは糖尿病を発症した。
【００７１】
移植物受け入れ用に選択したラットには、ガズダ（Gazda）ら、セル・トランスプラント、１６：６０９−６２０（２００７年）に従ってビーズを投与したが、該文献の全内容を、本明細書を構成するものとしてここに援用する。詳細には、１２〜１３週齢のラットをイソフルランで麻酔した。腹膜腔に沿って正中切開した後、ビーズをそこへ入れた。
【００７２】
各ラットに入れたビーズの数は、移植前３日間に亘って該ラットに投与したインスリンの最高用量をマクロビーズ１個当りの平均インスリン産生量（移植術前４週間に亘りビーズによって産生されたインスリン量に基づく）で割った値に応じて変えた。マウスには、移植術前に投与した正確なインスリン用量（１ｘ）、又はその用量の１．７倍（１．７ｘ）をもたらすのに必要な量のビーズを投与した。雌及び雄ラットには１ｘに匹敵するビーズを投与したが、雄ラットが雌ラットよりも体重が重いという理由から、雄ラットだけには１．７ｘに匹敵するビーズを投与した。
【００７３】
異なる移植種（１．５％ＳＧ、０．８％ＳＧ及び０．８％Ｌｉ）に関して、移植前のインスリン必要量に有意差は見られなかったが、１．５％ＳＧビーズの場合にはより多くのマクロビーズを必要とし、０．８％Ｌｉの場合には必要なマクロビーズが最も少なかった。
【００７４】
移植術後、ラットを９０日間維持し、血糖と体重を定期的にモニターした。
【００７５】
雌マウス（全て１ｘグループ）の場合、インスリン投与のマウス対照に比べて、血糖値が即時に正常化し、それが持続した。１ｘグループの雄ラットの場合、血糖調節が即時に改善したが、一時的なものであり、移植後約３０日までには移植前のレベルに戻った。
【００７６】
実施例８
レシピエントラットを屠殺した後、マクロビーズに関して研究を行い、構造的完全性や機能的能力について検討した。
【００７７】
肉眼的検査によって、構造的損傷が見られたのは、回収した１５４０個のマクロビーズの内、僅か２個に過ぎなかった。
【００７８】
上述の実施例では、アガロースでコートした分泌細胞含有アガロースマクロビーズに関する本発明の様々な特徴について説明したが、マクロビーズに用いたアガロースは上述のリテックスアガロースの特性を有していた。
【００７９】
本明細書に記載の「マクロビーズ」とは、直径が約４〜約１０〜１２ｍｍ（最も好ましくは直径が約６〜約８ｍｍ）の基本的に球状の構造物を意味する。第２のアガロース層は、厚さが約０．０５〜約５ｍｍであることが好ましく、厚さが約０．５ｍｍ〜約５ｍｍであることがより好ましく、厚さが約１．０ｍｍ〜約３ｍｍであることが更に好ましく、約１．０ｍｍ〜約２．０ｍｍであることが最も好ましい。第２のアガロース層は、ビーズを形成するのに用いるアガロースと同一としてもよいが、その必要はない。
【００８０】
「マクロビーズ」を好ましい構造物として用いるが、分泌細胞をカプセル化する（好ましくは、第２のアガロース層でコートする）如何なる固体アガロース構造物も本発明の特徴である。
【００８１】
分泌細胞は様々なものとすることができる。所望の分泌産物を産生する如何なる細胞やオルガネラもカプセル化することができる。膵島、癌細胞及び幹細胞は用いることのできる典型的な物質種である。各ビーズは様々な数の細胞オルガネラを含むことができるが、例えば、膵島の場合、約５０〜約５０００膵島当量（以下「ＩＥＱ」とする）であり、約１００〜約２５００ＩＥＱであることがより好ましく、約２５０〜約１０００ＩＥＱであることが更に好ましく、約４７５〜約５５０ＩＥＱであることが最も好ましい。約５００ＩＥＱであることが特に最も好ましい。
【００８２】
また、本発明の一特徴は、用いるアガロースに関わらず、マクロビーズ製造のための改良方法である。細胞をアガロースと混合した後に懸濁液とし、それを用いてビーズを形成する。次に、ビーズ（例えば、マクロビーズ）をアガロースでコートした後、得られたコートビーズを温度勾配下の鉱油サンプルに分注し、ビーズが高温で鉱油と接触し、低温の油へ降下するようにする。ビーズには如何なる所望の細胞種をも含めることができ、その例としては、分泌細胞や癌細胞、膵島、幹細胞（例えば、多機能性幹細胞）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
特に好ましい実施形態においては、本明細書に記載の「トランペット」及び「ストロー」ツールを用いて、それぞれ未コートのビーズ及びコートされたビーズを取り出す。
【００８４】
鉱油の温度勾配は様々なものとすることができる。温度勾配は２０℃〜５０℃である（即ち、最高温度と最低温度との差がこの範囲内である）ことが好ましい。この差が２０℃〜３５℃であることがより好ましい。
【００８５】
鉱油の最高温度は様々な値とすることができるが、２０℃〜３０℃とすることが好ましく、２０℃〜３５℃とすることがより好ましい。同様に、最低温度も様々な値とすることができ、０℃〜−８℃とすることができるが、０℃〜−２℃とすることがより好ましい。
【００８６】
本発明の他の様相は当業者には明らかであり、更に詳述する必要はないであろう。
【００８７】
上で用いた用語や表現は、説明の用語として使用されたもので、限定の用語として使用されたものではなく、そのような用語や表現の使用において、説明及び記載された特徴やその一部の如何なる均等物をも除外する意図はなく、本発明の範囲内で様々な変更が可能であることは理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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