(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物であって、ここで、前記組成物が、
（ｉ）以下の式：
【化１】
0005986095.tif 000061
｛式中、
ＸおよびＹのうちの１つはＣ＝Ｏであり、かつ、他方はＮＲであり、
各ｍおよびｐは、独立して、０〜６から選ばれ、
Ｒ1は、放射性核種をキレートすることのできるキレーティング基であり、以下の：
【化２】
0005986095.tif 000062
から選ばれ；
Ｒ、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1-7アルキル基であり；
Ｂは、前記キレーティング基を反応性基に連結するためのリンカー基であり、以下の式：
【化３】
0005986095.tif 000063
（式中、
各Ｑは、独立して、−ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ5Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−ＮＲ5Ｃ（Ｓ）ＮＲ5−および−Ｏ−からなる群から選ばれ、
各Ｒ5は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1-7アルキル基であり、
各ｑおよびｓは、独立して、０〜６から選ばれ、そして、
各ｒは、独立して、１〜６から選ばれる。）
により表され；
Ａ*は、Ｔに連結された反応した反応性基であり、
Ｔは、対象中の着目の標的に結合可能なターゲティング基である。｝
により表される二官能性化合物またはその塩；あるいは
（ｉｉ）前記二官能性化合物および前記二官能性化合物のキレーティング基を介して結合される放射性核種を含む二官能性分子、
を含み、
ここで、前記方法が、以下のステップ：
（ａ）前記二官能性化合物または二官能性分子が前記着目の標的に結合するように、前記二官能性化合物または二官能性分子を含む組成物を前記対象に投与するステップ；と
（ｂ）二官能性化合物を含む組成物が投与されている場合、前記二官能性化合物の前記キレーティング基Ｒ1が前記着目の標的において放射性核種をキレートするように、放射性核種を含むイメージングプローブ組成物を前記対象にさらに投与するステップ；と
（ｃ）前記放射性核種を検出して、生物系における前記着目の標的を画像化するステップ；と
を含む、前記二官能性組成物。
【請求項２】
前記生体内における分子イメージング方法が、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴである、生体内における分子イメージング方法における使用のための請求項１に記載の二官能性組成物。
【請求項３】
放射性核種治療における使用のための二官能性組成物であって、ここで、前記組成物が、
（ｉ）以下の式：
【化４】
0005986095.tif 000064
｛式中、
ＸおよびＹのうちの１つはＣ＝Ｏであり、かつ、他方はＮＲであり、
各ｍおよびｐは、独立して、０〜６から選ばれ、
Ｒ1は、放射性核種をキレートすることのできるキレーティング基であり、以下の：
【化５】
0005986095.tif 000065
から選ばれ；
Ｒ、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1-7アルキル基であり；
Ｂは、前記キレーティング基を反応性基に連結するためのリンカー基であり、以下の式：
【化６】
0005986095.tif 000066
（式中、
各Ｑは、独立して、−ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ5Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−ＮＲ5Ｃ（Ｓ）ＮＲ5−および−Ｏ−からなる群から選ばれ、
各Ｒ5は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1-7アルキル基であり、
各ｑおよびｓは、独立して、０〜６から選ばれ、そして、
各ｒは、独立して、１〜６から選ばれる。）
により表され；
Ａ*は、Ｔに連結された反応した反応性基であり、
Ｔは、対象中の着目の標的に結合可能なターゲティング基である。｝
により表される二官能性化合物またはその塩；あるいは
（ｉｉ）前記二官能性化合物および前記二官能性化合物のキレーティング基を介して結合される放射性核種を含む二官能性分子、
を含み、
ここで、前記方法が、以下のステップ：
（ａ）前記二官能性化合物または二官能性分子が前記着目の標的に結合するように、前記二官能性化合物または二官能性分子を含む組成物を前記対象に投与するステップ；と
（ｂ）二官能性化合物を含む組成物が投与されている場合、前記二官能性化合物の前記キレーティング基Ｒ1が前記着目の標的において放射性核種をキレートするように、放射性核種を含むイメージングプローブ組成物を前記対象にさらに投与するステップ；と
を含む、前記二官能性組成物。
【請求項４】
二官能性化合物前駆体、二官能性化合物または二官能性分子であって、
（ａ）前記二官能性化合物前駆体は、以下の式：
【化７】
0005986095.tif 000067
（式中、
（ｉ）ＸはＮＲであり、ＹはＣ＝Ｏであり、ｍは０〜６から選ばれ、かつｐは１〜６から選ばれるか、あるいは
（ｉｉ）ＹはＮＲであり、ＸはＣ＝Ｏであり、かつｍおよびｐは、独立に、０〜６から選ばれ、
Ｒ1およびＢは請求項１に定義されるとおりであり、
Ａは、対象中の着目の標的に結合可能なターゲティング基に連結するための反応性基である。）により表されるか、またはその塩であり；
（ｂ）前記二官能性化合物は、以下の式：
【化８】
0005986095.tif 000068
（式中、
（ｉ）ＸおよびＹのうちの１つはＣ＝Ｏであり、かつ、他方はＮＲであり、ｍは０〜６から選ばれ、かつｐは１〜６から選ばれるか、あるいは
（ｉｉ）ＹはＮＲであり、ＸはＣ＝Ｏであり、かつｍおよびｐは、独立に、０〜６から選ばれ、
Ｒ1、Ｂ、Ａ*およびＴは請求項１に定義されるとおりである。）により表されるか、またはその塩であり；そして
（ｃ）前記二官能性分子は、二官能性化合物および前記二官能性化合物のキレーティング基を介して結合される放射性核種を含み、前記二官能性分子の二官能性化合物は、以下の式：
【化９】
0005986095.tif 000069
（式中、
ＸおよびＹのうちの１つはＣ＝Ｏであり、かつ、他方はＮＲであり、
各ｍおよびｐは、独立して、０〜６から選ばれ、
Ｒ1、Ｂ、Ａ*およびＴは請求項１に定義されるとおりである。）により表されるか、またはその塩である、
二官能性化合物前駆体、二官能性化合物または二官能性分子。
【請求項５】
前記式中、ｓが、独立して０〜６から選ばれ、各ｒが、独立して１〜６から選ばれ、かつ、ｑが、１〜６から選ばれる、請求項１又は２に記載の生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物、請求項３に記載の放射性核種治療における使用のための二官能性組成物、あるいは請求項４に記載の官能性化合物前駆体、二官能性化合物または二官能性分子。
【請求項６】
前記反応性基Ａが、タンパク反応性の官能基であり、そして任意には、前記反応性基が、マレイミド、アルデヒド、エステル、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、アルコキシアミン、アルコキシアミン誘導体、アルキン、アルケンおよびアジド基から成る群から選択される、請求項１、２または５に記載の生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物、請求項３または５に記載の放射性核種治療における使用のための二官能性組成物、あるいは請求項４または５に記載の官能性化合物前駆体、二官能性化合物または二官能性分子。
【請求項７】
Ｒ1が、以下の：
【化１０】
0005986095.tif 000070
である、請求項１、２、５または６に記載の生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物、請求項３、５または６に記載の放射性核種治療における使用のための二官能性組成物、あるいは請求項４〜６のいずれか１項に記載の官能性化合物前駆体、二官能性化合物または二官能性分子。
【請求項８】
Ｂが、以下の式：
【化１１】
0005986095.tif 000071
のいずれか１つにより表される、請求項１、２、５〜７のいずれか１項に記載の生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物、請求項３、５〜７のいずれか１項に記載の放射性核種治療における使用のための二官能性組成物、あるいは請求項４〜７のいずれか１項に記載の官能性化合物前駆体、二官能性化合物または二官能性分子。
【請求項９】
前記式中、ｍが２であり、かつｐが１である、請求項１、２、５〜８のいずれか１項に記載の生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物、請求項３、５〜８のいずれか１項に記載の放射性核種治療における使用のための二官能性組成物、あるいは請求項４〜８のいずれか１項に記載の官能性化合物前駆体、二官能性化合物または二官能性分子。
【請求項１０】
以下の式：
【化１２】
0005986095.tif 000072
により表される二官能性化合物前駆体から得られる二官能性化合物または二官能性分子を含む、請求項１、２、５〜９のいずれか１項に記載の生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物、二官能性化合物または二官能性分子を含む、請求項３、５〜９のいずれか１項に記載の放射性核種治療における使用のための二官能性組成物、あるいは請求項４〜９のいずれか１項に記載の二官能性化合物または二官能性分子。
【請求項１１】
前記ターゲティング基および着目の標的が、受容体とリガンド、または抗体と抗原、またはグルコーストランスポーターなどの代謝プローブ／グルコース、低酸素状態／低酸素応答性部位、または骨塩／ビスホスホネート、またはアビジン（もしくはストレプトアビジンもしくは関連タンパク質）／ビオチンもしくはビオチン様誘導体、またはＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡであり、前記ターゲティング基が、任意に、前記着目の標的における結合パートナーに結合することのできるペプチド、タンパク質、抗体、アプタマーまたは小分子リガンドであり、かつ、前記ターゲティング基が、さらに任意に、アネキシンＶおよびシナプトタグミンのＣ２ドメイン、ＴＩＭＰ−２、ＣＥＡ、ＲＧＤペプチド、ソマトスタチン受容体ターゲティングペプチド、ボンベシン、ガストリンまたはＶＣＡＭターゲティングペプチドを包含する、請求項１、２、５〜１０のいずれか１項に記載の生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物、二官能性化合物または二官能性分子を含む、請求項３、５〜１０のいずれか１項に記載の放射性核種治療における使用のための二官能性組成物、あるいは請求項４〜１０のいずれか１項に記載の二官能性化合物または二官能性分子。
【請求項１２】
前記着目の標的が、病気の細胞または組織上で発現されるリガンドまたは受容体、病気の状態に関連する細胞表面抗原、癌特異的マーカーまたは組織特異的マーカーなどの腫瘍マーカーであるか、あるいは、前記着目の標的が、分子イメージングを受けている対象における位置、器官、組織タイプ、感染因子または生理学的性質である、請求項１、２、５〜１１のいずれか１項に記載の生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物、二官能性化合物または二官能性分子を含む、請求項３、５〜１１のいずれか１項に記載の放射性核種治療における使用のための二官能性組成物、あるいは請求項４〜１１のいずれか１項に記載の二官能性化合物または二官能性分子。
【請求項１３】
前記放射性核種が、スカンジウム、鉄、コバルト、銅、ガリウム、イットリウム、ジルコニウム、テクネチウム、インジウム、錫、レニウム、ガドリニウム、テルビウム、ホルミウムまたはルテチウムの同位体であり、前記放射性核種が、任意に、ガリウム、Ｇａ−６８、Ｇａ−６７、またはＢｉ−２１３である、請求項１、２、５〜１２のいずれか１項に記載の生体内における分子イメージング診断方法における使用のための二官能性組成物、二官能性化合物または二官能性分子を含む、請求項３、５〜１２のいずれか１項に記載の放射性核種治療における使用のための二官能性組成物、あるいは請求項４〜１２のいずれか１項に記載の二官能性分子。
【請求項１４】
前記二官能性化合物前駆体が、以下の式：
【化１３】
0005986095.tif 000073
により表される、請求項４〜９のいずれか１項に記載の二官能性化合物前駆体。
【請求項１５】
生体内における分子イメージング診断方法または放射性核種治療における使用のためのキットであって、前記キットが請求項１〜１３のいずれか１項に記載の二官能性化合物を含む二官能性組成物、及び放射性核種を含む組成物を含む、キット。
【請求項１６】
以下の式：
【化１４】
0005986095.tif 000074
のいずれかにより表されるリガンド、及び前記リガンドと錯体を形成するガリウム同位体を含むガリウムリガンド錯体。
【請求項１７】
生体内における分子イメージング診断方法または放射性核種治療における使用のための請求項１６に記載のガリウムリガンド錯体を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二官能性化合物、具体的には、分子イメージングおよび治療における使用のための化合物に関する。該化合物は、対象における特定の細胞または組織を該化合物が標的化するように、ターゲティング基（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）にコンジュゲーションされることができる。
【背景技術】
【０００２】
分子イメージングは、インビボにおける遺伝子発現、血流、生理学的変化（ｐＨ、［Ｏ2］など）、免疫反応および細胞輸送などの分子過程の三次元マッピングとして定義されることができる。それは、病気を検出しおよび診断し、最適の治療を選択し、ならびに治療の効果をモニターして有効性の読出し情報を早期に得るために使用されることができる。原理上、ポジトロン放射断層撮影法（PET）、単一光子放射断層撮影法（SPET）、光画像法（OI）および核磁気共鳴画像法（MRI）を含む、多数の異なる技術が分子イメージングに使用されることができる。PET/CTおよびSPET/CTなどのこれらのモダリティーの組み合わせ（「マルチ−モーダルイメージング」）は、改善された臨床応用を提供するようになってきている。
【０００３】
PETおよびSPETによる放射性核種イメージングは、極めて高い感度およびインビボの分子過程を混乱させない少量の投与造影剤（例えば、インビボでピコモル）という利益を有する。さらに、放射性核種イメージングについてのターゲティング原理は、放射性核種治療の標的化デリバリーにも適用可能である。典型的に、分子イメージングにおける放射性核種として使用される同位体は、分子中に取り込まれて、対象にとって医薬として許容可能な放射性トレーサーを生成する。さまざまな特性を有する多くの放射性トレーサーが開発された。例えば、フルオロデオキシグルコース（18Ｆ）は、ＰＥＴによる分子イメージングにおいてしばしば使用される標識グルコース誘導体である。
【０００４】
ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０２１９４７号は、ＭＲＩ造影剤としての使用のための三脚型キレーターを記載する。親水性のＲ基を有するヒドロキシピリジノンキレーティング基が記載される。親水性基は、キレーターの可溶化を助けるために必要とされる。さらに、キレーターは、ＭＲＩ造影剤の緩和能を増加させるために、デンドリマーなどの大分子に連結されることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
感受性の官能部位を有する放射性トレーサーを調製することは難しいことがある。例えば、放射性トレーサーへの放射性同位体の組み込みは、タンパク構造を破壊しうる高温を伴いうる。感受性の官能部位を放射性トレーサー中に含ませることが望ましいことがあり、そのためには穏やかな条件を用いて調製しうる放射性トレーサーを提供する必要がある。その結果、改善された官能性と改善された分子イメージング特性を有するイメージングコンジュゲートが生成されうる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
現在、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（DOTA）は、分子イメージングおよび標的放射性核種治療において使用されるガリウム−６８（およびＧａ−６７、Ｉｎ−１１１、Ｃｕ−６４、Ｌｕ−１７７、Ｙ−９０などの他の金属放射性同位体）のための一般的なキレーターである。しかしながら、（約６８分の68Ｇａの半減期に対して）ＤＯＴＡは約３０分という長い放射性標識時間を有する。さらに、ＤＯＴＡ誘導体によるガリウムのキレーションは、しばしば約９５℃の高い標識温度を必要とする。本発明者らは、生物学的環境中で解離に対する適度なまたはもっと言えば亢進された安定性を保持しつつ、室温で迅速に放射性核種をキレートすることのできる二官能性分子を発見した。該二官能性分子は、金属キレーティング部分に加えて、体内の細胞、組織または生体分子などを標的とすることのできるターゲティング基などの機能的部位に該二官能性分子を結合させるための反応性部分を有する。
【０００７】
もっとも一般的に、本発明は、標的群またはデリバリービヒクルのインビボでの分布および／または最終位置がモニターされうるように、放射性核種またはイメージング標識に連結するための三脚型六配座トリス（ヒドロキシピリジノン）キレーティング部分と、対象中の特定の細胞もしくは組織を標的とするためのターゲティング基または薬剤、毒素もしくは他のそのような分子をデリバリーするためのデリバリービヒクルに連結するための反応性官能基を有する二官能性分子を提供する。
【０００８】
したがって、第一の態様において、本発明は分子イメージング方法における使用のための二官能性化合物を提供し、ここで、該二官能性化合物は、以下の式：
【０００９】
【化１】
0005986095.tif 000002
【００１０】
｛式中、
ＸおよびＹのうちの１つはＣ＝Ｏであり、かつ、他方はＮＲであり、
各ｍおよびｐは、独立して、０〜６から選ばれ、
Ｒ1は、放射性核種をキレートすることのできるキレーティング基であり、以下の：
【００１１】
【化２】
0005986095.tif 000003
【００１２】
から選ばれ；
Ｒ、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1-7アルキル基であり；
Ｂは、キレーティング基を反応性基に連結するためのリンカー基であり、以下の式：
【００１３】
【化３】
0005986095.tif 000004
【００１４】
（式中、
各Ｑは、独立して、−ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ5Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−ＮＲ5Ｃ（Ｓ）ＮＲ5−および−Ｏ−からなる群から選ばれ、
各Ｒ5は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1-7アルキル基であり、
各ｑおよびｓは、独立して、０〜６から選ばれ、そして、
各ｒは、独立して、１〜６から選ばれる。）
により表され；
Ａ*は、Ｔに連結された反応した反応性基であり、
Ｔは、対象中の着目の標的に結合可能なターゲティング基である。｝
により表される化合物またはその塩である。
【００１５】
ここで、上記方法は、以下のステップ：
（ａ）上記二官能性化合物が着目の標的に結合するように、該二官能性化合物を上記対象に投与するステップ；と
（ｂ）上記二官能性化合物のキレーティング基Ｒ1が着目の標的において放射性核種をキレートするように、放射性核種を含むイメージングプローブ組成物を上記対象に投与するステップ；と
（ｃ）上記放射性核種を検出して、生物系における上記着目の標的を画像化するステップ；と
を含む。
【００１６】
第一の態様の二官能性化合物は、標的位置まで生物系を循環することができる。そして、上記放射性核種が対象中に導入されたとき、該放射性核種は迅速に上記系を通過し、二官能性化合物とキレート結合する。このようにして、放射性核種の有効性を最大化するように、放射性核種は生物系に導入されてから短時間で着目の位置に固定されることができる。
【００１７】
好ましくは、ｓは、独立して０〜６から選ばれ、各ｒは、独立して１〜６から選ばれ、qは、１〜６から選ばれる。
【００１８】
好ましくは、上記分子イメージングの方法は、ＰＥＴまたはＳＰＥＴである。
【００１９】
他の側面において、本発明は、分子イメージングにおける使用のための放射性核種をキレーティングするための二官能性化合物を提供し、ここで、該化合物は、以下の式：
【００２０】
【化４】
0005986095.tif 000005
【００２１】
｛式中、
ＸおよびＹのうちの一つはＣ＝Ｏであり、他方はＮＲであり；
ｍおよびｐはそれぞれ、独立して０〜６から選ばれ；
Ｒ1は、キレーティング基であり、以下の：
【００２２】
【化５】
0005986095.tif 000006
【００２３】
から選ばれ；
Ｒ、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1-7アルキル基であり；
Ｂは、キレーティング部分を反応性基に連結するためのリンカー基であり、以下の：
【００２４】
【化６】
0005986095.tif 000007
【００２５】
（式中、
各Ｑは、独立して、−ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ5Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−ＮＲ5Ｃ（Ｓ）ＮＲ5−および−Ｏ−からなる群から選ばれ、
各Ｒ5は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1―7アルキル基であり、
各ｑおよびｓは、独立して、０〜６から選ばれ、そして、
各ｒは、独立して、１〜６から選ばれる。）
により表され；
Ａは、生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチドまたはデリバリービヒクルに連結するための反応性基である。｝
により表される化合物またはその塩である。
【００２６】
二官能性コンジュゲート化合物は、（５分以下のオーダーの）非常に短時間で金属放射性核種をキレートすることができ、かつ、それを室温においておよそ生理学的pHの水中で行うことができる三脚型六配座トリス（ヒドロキシピリジノン）キレーティング部分を提供する。反応性部分は、キレーティング部分に連結されて、二官能性分子がターゲティング基またはポリペプチドもしくは他の生物分子、薬剤もしくはナノ粒子などの他のビヒクルとコンジュゲーションされることを可能とする。キレーティング基の迅速かつ低温での標識化は、二官能性分子が、キレーティング部分を介して68Ｇａ（Ｔ１／２=６８分）などの半減期の短い放射性核種に、および、体温を超える放射性標識温度において変性しうるポリペプチドなどの温度感受性ターゲティング基に、の両方に連結されることを可能とする。
【００２７】
キレーティング反応の効率は、非常に低いデリバリービヒクル濃度における標識化も可能とする。こうして、かなりの割合のデリバリービヒクルが放射性核種で放射性標識され、その結果として、非常に高い比放射能をもたらす。こうして、二官能性分子は、放射性標識コンジュゲートのための優れた前駆体を提供する。
【００２８】
好ましくは、反応性基Ａは、タンパク反応性の官能基である。タンパク反応性基は、タンパク質または修飾タンパク質またはペプチドまたは目的のために誘導体化された他のビヒクルと反応することができる。好ましくは、タンパク反応性基は、マレイミド基、アルデヒド、エステル、またはアルキン、アジド、アルケン、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、アルコキシアミン、アルコキシアミン誘導体、アミノキシもしくはチオール基などの「クリック」試薬である。マレイミド、アルデヒドおよびエステル基は、ペプチドチオール−またはアミン−含有残基（システイン、リジン）と効率的に反応し、それでコンジュゲートが容易に形成する。他の生体直交型官能基は、それらをアルキン、アジド、アルケン、ヒドラジン、アミノキシまたはチオール基とコンジュゲーションさせるために、ペプチドおよびタンパク質中へ工学処理されることができる。
【００２９】
好ましくは、Ｒ1は、以下の式：
【００３０】
【化７】
0005986095.tif 000008
【００３１】
により表される。
【００３２】
好ましくは、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、ＨまたはＣＨ3である。キレーティング基のキレーション部位を置換基が立体的に障害しないよう、かつ、キレーターが脂溶性となりすぎないように、比較的小さな置換基を複素環上に有することが好ましい。したがって、好ましい実施態様において、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、Ｈである。しかしながら、複素環基上の１つ以上のメチル置換基が、分子の溶解性および／または疎水性を調整するために使用されることができる。したがって、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4のうちの１つ以上がＣＨ3であることができる。
【００３３】
好ましくは、ｍは、２または３である。好ましくは、ｐは、０または１である。より好ましくは、ｍが２であり、ｐが１であるか、または、ｍが３であり、ｐが０である。これはキレーティング基Ｒ1に５原子の三脚のアーム長さを与える（ｍ＋ｐ＝３＋ＸおよびＹ）。三脚のアーム長さが５原子である場合、三脚型基は、ガリウムなどの放射性核種をキレーティングするのに適している。
【００３４】
リンカー基Ｂは、三脚型キレーティング部分と反応性官能基（およびコンジュゲーションされた場合のターゲティング基またはキャリアービヒクルなど）を接続する。リンキング基は、例えば、リンカーの長さを変えるために、基Ｑ、ｑ、ｒおよび／またはｓを変えることによって調整されることができる。
【００３５】
Ａまたは（キレーティング基を有する各アームに結合した）四級炭素のいずれかまたはその両方がＱに結合されうるように、リンカー基はいずれの方向に配置されてもよい。好ましい実施態様において、Ｂは、二官能性化合物が以下の式：
【００３６】
【化８】
0005986095.tif 000009
【００３７】
により表されるように、配置される。
【００３８】
Ｑにより表される官能基中の原子の順番は制限されない。言い換えれば、Ｑがアミド基である場合、キレーティング部分から反応性官能基に向かう基の順番は、−ＮＲ5−、ついで−Ｃ（Ｏ）−、またはその逆であってよい。
【００３９】
好ましくは、少なくとも１つのＱがアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−）である。好ましくは、ｑが１、ｒが２および／またはｓが１である。より好ましくは、ｑが１、ｒが２、およびｓが１である。好ましくは、Ｒ5は水素である。
【００４０】
好ましくは、Ｂは、以下の式：
【００４１】
【化９】
0005986095.tif 000010
【００４２】
｛式中、
ｒは、１〜６から選ばれ、かつ
ｓは、０〜６から選ばれる。｝
のうちの１つにより表される。好ましくは、ｒが２であり、および／またはｓが２である。
【００４３】
好ましい実施態様において、二官能性化合物は、以下の式：
【００４４】
【化１０】
0005986095.tif 000011
【００４５】
｛式中、
Ａ、ｓ、ｍ、Ｘ、Ｙ、ｎおよびＲ1は本明細書において定義されたとおりである。｝
により表される。
【００４６】
好ましい実施態様において、放射性核種は、テクネチウム、レニウム、銅、コバルト、ガリウム、イットリウム、ルテチウムまたは他のランタニド、インジウム、ジルコニウム、スカンジウムの同位体である。より好ましくは、放射性核種は、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｃｏ−５７、Ｉｎ−１１１、Ｃｕ−６０、Ｃｕ−６１、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｔｃ−９４ｍ、Ｇａ−６８、Ｇａ−６７、Ｇａ−６６、Ｙ−９０、Ｙ−８６、Ｓｃ−４４、Ｓｃ−４７、Ｆｅ−５２、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｔｂ−１４９、Ｇｄ−１５３、Ｈｏ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｚｒ−８９、Ｂｉ−２１３またはＣｏ−５５であり、より好ましくは、放射性核種は、ガリウムであり、最も好ましくは、Ｇａ−６８またはＧａ−６７である。
【００４７】
好ましくは、ターゲティング基は、着目の標的における結合パートナーに結合することのできる特定の結合対のメンバーである。より好ましくは、ターゲティング基と着目の標的は、受容体とリガンド、または抗体と抗原、またはグルコーストランスポーター／グルコースなどの代謝プローブ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｂｅ）、低酸素状態／低酸素応答性部位、または骨塩／ビスホスホネート、またはアビジン（もしくはストレプトアビジンもしくは関連タンパク質）とビオチン（もしくはビオチン様誘導体）、またはＲＮＡとアンチセンスＲＮＡである。
【００４８】
好ましくは、ターゲティング基は、着目の標的における結合パートナーに結合することのできるペプチド、タンパク質、抗体、アプタマーまたは小分子リガンドである。より好ましくは、ターゲティング基は、二官能性コンジュゲート組成物がアポトーシスまたは細胞死のイメージング研究において使用可能であるように、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合可能なポリペプチドである。より好ましくは、ターゲティング基は、アネキシンＶおよびシナプトタグミンのＣ２ドメイン、ＴＩＭＰ−２、ＣＥＡ、ＲＧＤペプチド、ソマトスタチン受容体ターゲティングペプチド、ボンベシン、ガストリンまたはＶＣＡＭターゲティングペプチドを包含する。
【００４９】
好ましくは、着目の標的は、インビボの分子標的である。より好ましくは、着目の標的は、（その存在量またはリガンド占有率が決定される）病気の細胞または組織上で発現されるリガンドまたは受容体、病気の状態に関連する細胞表面抗原、癌特異的マーカーまたは組織特異的マーカーまたは病気の状態において上方もしくは下方制御される正常過程のマーカーなどの腫瘍マーカーである。好ましくは、着目の標的は、分子イメージングを受けている対象における位置、器官、組織タイプまたは生理学的性質である。
【００５０】
反応性基Ａは、デリバリービヒクルに連結するためのものであることができる。本明細書に定義されたデリバリービヒクルは、小分子薬剤または毒素などの機能性分子を例えば生物系に送達する目的で該機能性分子を担持するための分子構造である。機能性分子は、デリバリービヒクル内に含まれるかまたはその表面に結合されることができる。機能性分子は、典型的に、機能性分子が生物系中の所与の位置で放出されうるように、デリバリービヒクルと可逆的に結合する。多くのかかるデリバリービヒクルが本分野で知られている。好ましくは、デリバリービヒクルは、ナノ粒子またはリポソームである。医薬品などの機能性分子は、ナノ粒子の表面に結合されるかまたはリポソーム内に含まれることができる。
【００５１】
したがって、本発明の二官能性化合物がデリバリービヒクルに連結され、かつ放射性核種がキレーティング基Ｒ1によりキレートされる場合、対象の中を通る（デリバリービヒクルにより運ばれる）薬剤の移動は、放射性核種のイメージングによりモニターされることができる。
【００５２】
反応性基は、（生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチドまたはデリバリービヒクルに加えて）二次イメージング標識に連結されるためのものであることができる。好ましくは、二次イメージング標識は、光標識（ｏｐｔｉｃａｌ  ｌａｂｅｌ）、ＳＰＩＯなどの常磁性標識、または量子ドットである。より好ましくは、該イメージング標識は、常磁性プローブを有するＭＲＩ造影剤である常磁性標識である。或いは、該イメージング標識は、蛍光またはルミネッセント特性を有する有機分子または金属錯体である光標識である。該標識は、例えば、光標識または常磁性標識の場合、二官能性化合物がマルチモーダルイメージングにおいて使用されることを可能とする。
【００５３】
反応性基Ａは、さらなる生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチドまたはデリバリービヒクルと連結することができる。例えば、二官能性化合物は、対象中の特定の細胞を標的とするためのターゲティング基および医薬品を含むリポソームに放射性核種を連結することができる。こうして、標的薬物デリバリーが、生物系を通るその移動の間、モニターされることができる。
【００５４】
分子イメージング方法は、放射性核種が生物系中に導入される前（すなわち、プレ−ターゲティング（ｐｒｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ））または放射性核種が二官能性化合物のキレーティング部分にキレートされた後（すなわち、プレ−アセンブル（ｐｒｅ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ））に、二官能性化合物（またはそのコンジュゲート）を生物系（例えば、対象）中に導入することを含んでよい。
【００５５】
二官能性化合物（またはコンジュゲート）が、放射性核種より前に生物系中に導入された場合、二官能性化合物は、好ましいまたは標的の位置まで生物系内を循環することができる。そして、放射性核種が導入されたら、放射性核種は迅速に系の中を通過し、二官能性分子（またはコンジュゲート）とキレートする。こうして、放射性核種の有効性が最大化されるように、放射性核種は生物系への導入から短時間以内で着目の位置に固定されることができる。
【００５６】
放射性核種が、生物系への導入前に二官能性化合物（またはコンジュゲート）にキレートされる場合、二官能性化合物は、該化合物に結合した生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチド、キャリアービヒクルまたは二次イメージング標識を有する二官能性化合物またはコンジュゲートの生物系内を通る移動をモニターするために使用されることができる。
【００５７】
好ましくは、生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチドまたはデリバリービヒクルが二官能性化合物に結合して、二官能性化合物組成物の生物系または対象への導入前に二官能性化合物コンジュゲートを形成する。
【００５８】
好ましくは、生物系は、病気または状態の診断または治療を受けている対象である。治療は放射性核種治療であることができる。具体的には、治療は、例えばそれに結合したデリバリービヒクルを介して二官能性分子に結合した放射性核種または化学療法剤を用いる癌の治療であることができる。好ましくは、二官能性分子は、治療剤と会合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）かまたは結合（ｂｏｕｎｄ  ｔｏ）している。或いは、対象は、その中でのターゲティング分子またはデリバリービヒクルの生体内分布が評価される対象であることができる。
【００５９】
第二の態様において、本発明は、分子イメージングにおける使用のための放射性核種をキレートするための二官能性化合物コンジュゲートを提供し、ここで、該コンジュゲートは、以下の式：
【００６０】
【化１１】
0005986095.tif 000012
【００６１】
｛式中、
ＸおよびＹのうちの１つはＣ＝Ｏであり、かつ、他方はＮＲであり、
ｍおよびｐは、独立して、０〜６であり、
Ｒ1は、キレーティング基であり、以下の：
【００６２】
【化１２】
0005986095.tif 000013
【００６３】
から選ばれ；
Ｒ、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1-7アルキル基であり；
Ｂは、キレーティング部分を反応性基に連結するためのリンカー基であり、以下の式：
【００６４】
【化１３】
0005986095.tif 000014
【００６５】
（式中、
各Ｑは、独立して、−ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ5Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−ＮＲ5Ｃ（Ｓ）ＮＲ5−、−Ｏ−からなる群から選ばれ、
各Ｒ5は、独立して、水素または場合により置換されたＣ1-7アルキル基であり、
各ｑおよびｓは、独立して、０〜６から選ばれ、そして、
各ｒは、独立して、１〜６から選ばれる。）
により表され；
Ａ*は、Ｔへの連結のための反応した反応性基であり、
Ｔは、生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチドまたはデリバリービヒクルである。｝
により表される化合物またはその塩である。
【００６６】
さらなる態様において、本発明は、以下の：本明細書に記載の二官能性化合物を有する二官能性分子組成物であって、ここで、該化合物が反応性基Ａを介して生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチドまたはデリバリービヒクルに連結されている、上記二官能性分子組成物；および本明細書に記載の放射性核種を含むイメージング組成物を含む、分子イメージングまたは治療の方法における使用のためのキットを提供する。
【００６７】
他の態様において、本発明は、以下の：本明細書に記載の二官能性化合物を有する二官能性分子組成物；および該二官能性分子に連結するための生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチドまたはデリバリービヒクルを含む、分子イメージングまたは治療の方法における使用のためのキットを提供する。該キットは、本明細書に記載の放射性核種を含むイメージング組成物も含んでよい。
【００６８】
他の態様において、本発明は、生物系における着目の標的の分子イメージングの方法を提供し、該方法は以下の：
（ａ）本明細書に記載の二官能性化合物を含む組成物を対象に投与するステップ、ここで、該化合物は、反応性基Ａを介して生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチドまたはデリバリービヒクルに連結され；と
（ｂ）放射性核種を含むイメージング組成物を上記対象に投与するステップ、ここで、上記二官能性化合物のキレーティング基Ｒ1は、上記放射性核種をキレートすることができ；と
（ｃ）上記放射性核種を検出して、上記生物系における着目の標的を画像化するステップ；と
を含む。
【００６９】
他の態様において、本発明は、生物系における着目の標的または着目の移動の分子イメージングの方法を提供し、該方法は以下の：
（ａ）本明細書に記載のキレーティング基を介して、二官能性分子に放射性核種をキレートするステップ、ここで、該化合物は、反応性基Ａを介して生体部位、ターゲティング基、タンパク質、ポリペプチドまたはデリバリービヒクルに連結されて、放射性標識二官能性分子化合物を形成し；と、
（ｂ）上記放射性標識二官能性化合物を含む組成物を対象に投与するステップ；と
（ｃ）上記生物系における着目の標的または移動を画像化するステップ；と
を含む。
【００７０】
好ましくは、放射性核種は、着目の標的に放射線治療を送達することのできる放射性核種である。好ましくは、該放射性核種は、Ｃｕ−６７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｙ−９０、Ｌｕ−１７７、Ｓｃ−４７またはＢｉ−２１３である。
【００７１】
任意の態様の好ましいおよび随意的な特徴は、任意の他の態様に適用されてよい。具体的には、二官能性化合物の好ましい特徴が分子イメージングの方法に適用でき、その逆も同様である。
【００７２】
ここに、本発明の実様態様が、付随する図面を参照して、例として非制限的に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、８０℃において３０分後の、67ＧａによるＤＯＴＡの放射性標識収率（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｙｉｅｌｄ）に比較した、室温において５分後の67Ｇａによるキレーティング部分ＣＰ２５６の放射性標識収率を示す。
【図２】図２は、67Ｇａ−クエン酸塩（Ｃ）に比較した、アポトランスフェリンとのインキュベーション後の２．２７μＭ（Ａ）および０．２２７μＭ（Ｂ）のＣＰ２５６の放射性標識溶液についての、ＰＤ１０カラムからの67Ｇａ−ＣＰ２５６の溶出プロフィールを示す。
【図３】図３は、アポトランスフェリンとのインキュベーション後の、67Ｇａ−クエン酸塩、67Ｇａ−ＣＰ２５６、67Ｇａ−ＤＯＴＡおよび67Ｇａ−ＤＴＰＡの、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターへの保持を示す。
【図４】図４は、酢酸塩バッファー中でのガリウム−６８との１５分間のインキュベーション後の、Ｃ２ＡｃおよびＣ２Ａｃ−（７）の、ＰＤ１０サイズ排除カートリッジを用いた放射能溶出プロフィールを示す。
【図５】68Ｇａ−標識コンジュゲートは、赤血球結合アッセイにおいて、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対する特異的なカルシウム依存性の結合を示した。
【図６】図６は、（ａ）Ｃ２Ａｃ−（７）−68Ｇａおよび（ｂ）キレートされていない「遊離の」68Ｇａの投与の９０分後のマウスのＰＥＴスキャンを示す。
【図７】血清中でのＣＰ２５６による68Ｇａのキレーションを示すサイズ排除放射性クロマトグラフィー（ＰＤ１０カラム）：ａ）対照、血清中でインキュベートされた68Ｇａ塩化物；ｂ）対照、血清とともにインキュベートされた、あらかじめ形成された68Ｇａ−ＣＰ２５６複合体；ｃ）対照、バッファー中でインキュベートされた68Ｇａ；およびｄ）実験的サンプル、ＣＰ２５６（２３μＭ以上）がすでに添加されている血清に添加された68Ｇａ塩化物。
【図８】バッファー中での111Ｉｎ−ＣＰ２５６に比較した、血清中での111Ｉｎ−酢酸塩および111Ｉｎ−ＣＰ２５６のインキュベーション後の111ＩｎのＰＤ１０サイズ排除クロマトグラフィープロフィール。
【図９】野生型マウス（上）またはシアロアドヘシンノックアウトマウス（下）における、67Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４（グループ１）、ＳＥＲ４の注射５分後の６７Ｇａ−クエン酸塩（グループ２）、およびＣＰ２５６−ＳＥＲ４の注射５分後の６７Ｇａ−クエン酸塩（グループ３）の生体内分布。
【図１０】野生型マウスにおける、68Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４（グループ１）、ＳＥＲ４の注射１時間後に注射された68Ｇａ−酢酸塩（グループ２）、およびＣＰ２５６−ＳＥＲ４の注射１時間後に注射された68Ｇａ−酢酸塩の生体内分布。
【図１１】図１１Ａ（左）：ＣＰ２５６−ＳＥＲ４を用いるプレ−ターゲティングを示す、グループ３からのマウスのＰＥＴ／ＣＴスキャン（最大値投影法）：ＣＰ２５６−ＳＥＲ４、続いてＧａ−６８酢酸塩を注射された８週齢のＣ５７Ｂ１／６は、肝臓／脾臓取り込みを示す。注射の１．５時間後に画像を撮影した。図１１Ｂ（右）：比較用の、Ｇａ−６８酢酸塩のみを注射されたマウスは、血液プール中の保持および関節における蓄積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
詳細な説明
Ａ：着目の部位のターゲティング
二官能性化合物がターゲティング分子への連結のためのものである場合、さまざまな一次ターゲティング基が二官能性化合物に連結されて、キレーティング基を有する該二官能性化合物を問題の生物系における着目の異なるターゲットに導くことができる。
【００７５】
一態様において、着目の標的は、それらがお互いに特別な特異性を有し、正常条件下で他の分子に優先してお互いに結合する分子対のメンバーとなるように、上記系において一次ターゲティング基に特異的に結合可能な特異的結合対のメンバーを含むだろう。特異的結合対の例は、本分野で周知であり、例えば、受容体とリガンド、酵素と基質、抗体と抗原が挙げられる。したがって、一次ターゲティング基は、特異的なインビボの分子ターゲットに結合するペプチド、タンパク質またはアプタマーなどの他の生体分子または小分子リガンドであることができる。着目の標的のクラスとして、病気の細胞または組織上に発現されるリガンドまたは受容体またはトランスポーター、病気の状態に関連した細胞表面抗原、或いは、腫瘍マーカー、例えば癌特異的マーカーまたは組織特異的マーカー、が挙げられる。
【００７６】
一次ターゲティング基の一群は、本発明の二官能性分子コンジュゲートがアポトーシスまたは細胞死のイメージング研究に使用可能であるように、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合可能なポリペプチドである。かかるポリペプチドの例として、アネキシンＶおよびシナプトタグミンのＣ２ドメインが挙げられる。１つ以上のＣ２ドメインを含むポリペプチドは本分野で周知である。いくつかのポリペプチドがＣ２ドメインを１つしか有さない一方、他は２つ以上のＣ２ドメインを有し、該ドメインは一般に、名前の最後に（アルファベット順に）文字を付することによって記述される（例えば、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂなど）。Ｃ２ドメインを１つしか含まないタンパク質については、該ドメインは単純にＣ２ドメインと呼ばれる。以下の例はラットシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインを使用するが、他の種のシナプトタグミンのＣ２Ａドメインなどの、ＰＳに結合可能な他のＣ２ドメインが代わりに使用可能であった。Ｃ２ドメインを含むタンパク質のさらなる例として、シナプトタグミン１−１３、セリン／スレオニンキナーゼ、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼδ１、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子を含む凝固カスケードにおけるコファクターならびにコピンファミリーのメンバーが挙げられるが、これらには限定されない。ヒトシナプトタグミンとして、シナプトタグミン１−７、１２および１３が挙げられる。
【００７７】
本発明において使用されることのできる他のタンパク質として、癌細胞によって発現されるマーカーに特異的に結合可能であり、それによってバイオコンジュゲートを用いて癌細胞が画像化されることを可能とするポリペプチドが挙げられる。例として、本発明は、骨髄単球細胞系統の細胞および白血病細胞などのＣＤ３３を発現する癌細胞のイメージングのために、抗−ＣＤ３３抗体またはその断片を使用することができる。Ｅｍｂｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ３０５（２）：１３５−５１，２００５を参照されたい。さらなる例は、メタロプロテイナーゼの発現が転移過程に関与するとされたため、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現の画像化のためのＴＩＭＰ−２などのメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰｓ）の使用である。Ｇｉｅｒｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １２（６）：９６４−７１，２００１を参照されたい。本発明によるコンジュゲートの作製に使用可能なポリペプチドのさらなる例は、補体受容体２（ＣＲ２）である。糖タンパク質である癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合することのできる抗体も、糖タンパク質のこのファミリーのメンバーが結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、すい臓癌細胞、肺癌細胞、甲状腺髄様癌細胞および乳癌細胞において発現されるため、一次ターゲティング基として使用されることができる。
【００７８】
さらなる例は、好適な反応性基Ａを用いてＲＧＤペプチド誘導体を二官能性化合物に連結することによって、腫瘍、動脈硬化性プラークおよび梗塞を起こした心筋層などの修復中の病気の組織において一般的にみられるような、血管新生中の組織の内皮において高度に発現されるαvβ3インテグリンへの、ペプチド配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）の親和性を利用することができる。
【００７９】
さらなる例は、好適な反応性基Ａを用いてソマトスタチン類似体ペプチドを二官能性化合物に連結することによって、癌腫、甲状腺髄様癌種および他の神経内分泌腫瘍などの癌細胞の表面において高度に発現されるソマトスタチン受容体に結合しうるペプチド、オクトレオチド、またはソマトスタチンの他の関連類似体の親和性を利用することができる。
【００８０】
他の例は、抗体の細胞接着分子への親和性を利用することができる。一例は、モノクローナル抗体、ＳＥＲ４のマクロファージ接着分子、シアロアドヘシンへの親和性である。シアロアドヘシンは、マクロファージ表面、そして、脾臓、肝臓、リンパ節、骨髄、結腸および肺のマクロファージ上などで多量に見出される。
【００８１】
当業者は、ボンベシン、ガストリンまたはＶＣＡＭターゲティングペプチドなどの他のターゲティング基を使用することができるであろう。
【００８２】
好ましくは、一次ターゲティング基は、二官能性化合物に結合するための官能基および一次ターゲティング基に連結するための反応性基を有するコンジュゲートとして、二官能性化合物に連結されることができる。これを達成するためのさまざまな可能性が当業者には明らかとなるであろう。例として、一実施態様において、一次ターゲティング基への部位特異的連結のための反応性基、例えば、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体などの生体分子中のチオール基への部位特異的連結のためのマレイミド基、が使用されてよい。その後、マレイミド基は、部位特異的にチオール基、例えば、目的のためにペプチドまたはタンパク質中に部位特異的に取り込まれたシステイン残基のチオール基、に連結されることができる。他の例において、二官能性キレーター中の反応性基は、ヒドラジンまたは類似の反応性の基が部位特異的に取り込まれて（例えば、ヒドラジノニコチン酸誘導体）、ヒドラゾンまたは類似の連結を形成しているタンパク質またはペプチドと部位特異的に反応することができるアルデヒドまたはケトン基であろう。
【００８３】
いくつかの場合に、一次ターゲティング基は、好適なポリペプチドまたはタンパク質、或いはその断片またはドメインを含むことができる。したがって、都合上、本明細書中の方法が一般に「ポリペプチド」を基準に記載されるが、これは、時には本分野ではペプチドと呼ばれる、アミノ酸のより短い配列も含むと理解されるべきである（例えば、３から１０アミノ酸までの長さから３０、４０または５０アミノ酸までの長さ）。この用語は、一般にタンパク質ならびにマルチドメインタンパク質と呼ばれる、二次、三次または四次構造を有するポリペプチドも含むと理解されるべきである。いくつかの実施態様および以下に示す例において、一次ターゲティング基として使用されるポリペプチドは、タンパク質ドメインである。「タンパク質ドメイン」は、完全長タンパク質から独立して、構造を保持する能力を有する完全長タンパク質の断片であって、典型的に安定で折りたたまれた三次元構造を形成する。多くのタンパク質は、数個の構造上のタンパク質ドメインからなり、特別なドメインがさまざまな関連タンパク質で見出されるのは一般的である。タンパク質ドメインは、約２５アミノ酸から５００アミノ酸までの間の長さ、または５０アミノ酸から２５０アミノ酸まで、または７５アミノ酸から１５０アミノ酸まで、その長さが変化する。
【００８４】
本発明において、ポリペプチドが抗体である場合、この用語は、天然または部分的もしくは全体として合成により作り出されたかにかかわらず、イムノグロブリンを表す。この用語は、抗体の抗原結合ドメイン；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む抗体断片；および二重特異性抗体を含む、任意のポリペプチドまたはタンパク質にも及ぶ。他の抗体または元の抗体の特異性を保持するキメラ分子を作り出すために、モノクローナル抗体および他の抗体を利用し、組換えＤＮＡテクノロジーの技術を用いることは可能である。かかる技術は、抗体のイムノグロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードするＤＮＡを、異なるイムノグロブリンの定常領域または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含むことができる。たとえば、欧州特許出願公開第ＥＰ０１８４１８７Ａ号明細書、英国特許出願公開第ＧＢ２，１８８、６３８Ａ号明細書または欧州特許出願公開第ＥＰ０２３９４００Ａ号明細書を参照されたい。
【００８５】
抗体は、多数の方法により修飾可能であり、用語「抗体分子」は、必要とされる特異性を有する抗体の抗原結合ドメインを有する、任意の特異的な結合メンバーまたは物質に及ぶと理解されるべきである。したがって、この用語は、天然または完全もしくは部分的に合成である、イムノグロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片および誘導体に及ぶ。したがって、他のポリペプチドに融合されたイムノグロブリン結合ドメインまたは等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、欧州特許出願公開第ＥＰ０１２０６９４Ａ号明細書および欧州特許出願公開第ＥＰ０１２５０２３Ａ号明細書に記載される。全抗体の断片が、抗原を結合する機能を発揮することが示された。結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成るＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，  Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，  ５４４−５４６（１９８９））；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ‘）２断片；（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここで、ＶＨドメインとＶＬドメインが、２つのドメインが（抗原結合部位を形成することを可能とするペプチドリンカーによって連結されている（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２；４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３，１９８８）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖダイマー（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号）；および（ｉｘ）「二重特異性抗体」、遺伝子融合により構築された多価または多重特異性断片（ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ９４／１３８０４号パンフレット；Ｈｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８，１９９３）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは二重特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の取り込みによって安定化されうる（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４：１２３９−１２４５，１９９６）。ＣＨ３ドメインとつながったｓｃＦｖを含むミニボディも、作製されることができる（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：３０５５−３０６１，１９９６）。
【００８６】
アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）も一次ターゲティング基として使用されることができる。アフィボディは、多数の標的タンパク質またはペプチドに特異的に結合することのできる小さな高親和性タンパク質である。アフィボディは、多くの点でモノクローナル抗体を模倣し、抗体模倣剤（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）に分類される。アフィボディの選定は限定的であってはならず、コンジュゲーションされていない抗ＴＮＦ−αアフィボディなどの多くのアフィボディが本分野で知られている。抗ＴＮＦ−αアフィボディは、Ｅ．コリ中で産生され、ヒトサイトカイン腫瘍壊死因子α、ＴＮＦ−αを標的とする。ＴＮＦ−αは、多面発現性炎症性サイトカインである。サイトカインは、数種の細胞によって産生されるが、特にマクロファージによって産生される。それは、局所的な炎症性免疫反応における主要な介在物として作用し、さらなる免疫調節機能を有する。ＴＮＦ−αは、サイトカインのカスケードを開始し、血管透過性を増加させ、それによってマクロファージと好中球を感染部位に動員する、急性期タンパク質である。したがって、ＴＮＦ−αは、アテローム性動脈硬化症病変における炎症および炎症に関する重要な標的である。
【００８７】
二官能性化合物はそれぞれ、複数の一次ターゲティング基に連結されることができ、それによって、（ａ）着目の標的に対する各ターゲティング基の親和性の産物として全体的な親和性が増加するときの、上記標的に対する一次ターゲティング基の親和性、および／または（ｂ）標的に対する結合比率、すなわち、標的と一次ターゲティング基のインビボでの各遭遇の結果としての結合の可能性、を増加させる。
【００８８】
Ｂ：イメージングプローブ
二官能性化合物に結合することのできるイメージングプローブは、（キレーティング基を介して結合される）放射性核種を含む。
【００８９】
本発明によって使用されるイメージングプローブ（金属性放射性同位体）は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、プレ−ターゲティングまたはプレ−アセンブルアプローチのいずれかで二官能性化合物のキレーティング部分に結合する性質を有する。これを達成するための１つの可能性は、二官能性化合物のキレーティング部分に対する固有の結合親和性を有する放射性核種を使用することである。例として、68Ｇａ3+は、キレーティング部分のヒドロキシピリジノン基に結合することができ、ＰＥＴイメージング技術において使用可能である。
【００９０】
本発明によって使用される放射性核種プローブは、プローブが目的とする用途に応じてさまざまな異なる放射性核種を使用することができる。本発明のプローブの一部をなしうる放射性核種の例としては、テクネチウム、レニウム、銅、コバルト、ガリウム、イットリウム、ルテチウム、インジウム、ジルコニウム、スカンジウムの放射性同位体、すなわち、Ｔｃ−９９ｍ、Ｇａ−６７、Ｉｎ−１１１（ＳＰＥＴ）、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６０、Ｃｕ−６１、Ｃｕ−６２、Ｔｃ−９４ｍ、Ｇａ−６８、Ｃｏ−５５、Ｚｒ−８９、Ｓｃ−４４（ＰＥＴ）、Ｃｕ−６７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｙ−９０、Ｌｕ−１７７、Ｓｃ−４７またはＢｉ−２１３（放射性核種治療）が挙げられる。本発明は、放射性核種を単独で、または組み合わせて使用することができる。
【００９１】
放射性核種は、溶媒和物、水和物、塩または弱いキレートなどの任意の形態であってよい。放射性核種の溶媒和物、水和物および弱いキレートは、本分野で知られている。放射性核種が放射性核種組成物中で対象に投与される場合（例えば、二官能性化合物が対象中の放射性核種を投与後にキレートする場合）、放射性核種は、医薬として許容可能な形態になければならない。例えば、放射性核種は金属イオンのクエン酸塩または酢酸塩であってよい。
【００９２】
本発明は、例えば、マルチモーダルイメージングの実施を可能にするための、(反応性基Ａを介して）二官能性化合物に連結されるかまたは会合することのできる光学標識または常磁性標識などの二次イメージング標識の使用も含みうる。光学プローブの例として、フルオレッセインなどのフルオロフォアおよびルミネッセント分子およびランタニド錯体などの錯体およびトリカルボニルレニウム−キノリネートコンジュゲートが挙げられる。光学プローブ並びに放射性核種およびＭＲ造影剤を組み込む可能性は、モダリティーを組み合わせて診断および検出を促進する機会を提供し、例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＴによる全身のスキャニングによって全身レベルで病気の位置が同定できる一方、同じトレーサーが手術中に可視的に検出されて、病気の組織の同定を支援しうる。同様に、ＰＥＴおよびＭＲイメージングの組み合わせは、高い感度（ＰＥＴ、ＳＰＥＴ）、シグナルの定量（ＰＥＴ）および解剖学的解像度（ＭＲ）および微小環境の測定（ＭＲコントラスト増強法）という利益を提供することができる。
【００９３】
Ｃ：コンジュゲーション化学
本発明の二官能性化合物は、生体部位、ターゲティング基、標識、タンパク質またはポリペプチドを二官能性化合物に連結するため、および／または、さらなる基および特性を本発明の二官能性化合物に導入するために、さまざまな化学および技術を使用しうる。
【００９４】
したがって、本発明においては、例えば、（タンパク質／ペプチド配列中のシステインのチオール側鎖に結合するための）反応性基がマレイミド基である場合、反応性基は二官能性化合物にターゲティング基を連結する手段を提供する。
【００９５】
本発明の用途
本発明の二官能性化合物は、癌、循環器疾患、免疫疾患などの病気、ならびに、移植、炎症、白血球トラッキング、幹細胞トラッキング、アレルギーおよび感染などの関連する状態の分子イメージングのために使用されることができる。二官能性化合物は、癌および関節炎を治療するための放射性核種治療のためにも使用されることができる。
【００９６】
本発明の二官能性化合物および放射性核種の適用として、放射性核種および／またはさらなる標識を使用することのできる、マルチモーダルイメージング研究などの広い範囲のイメージングおよび分光学的適用が挙げられる。本明細書に記載のとおり、二官能性化合物は、例えば、アポトーシスの検出のために二官能性化合物を使用する細胞死イメージングなどのインビボのイメージング適用のために特に有用である。これは、例えば（化学療法への反応をモニターすることなどの）腫瘍学、（心筋梗塞後の損傷された心筋のイメージングなどの）循環器の医薬品または（心臓同種移植片の拒絶のイメージングなどの）移植片拒絶の分野での多くの異なる医学的または研究的適用において有用でありうる。
【００９７】
本発明は特に、放射性核種から放射されたガンマ線を検出して、サンプルまたは対象中の放射性核種の分布の三次元画像を提供するイメージング技術である、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＴ）、および、サンプルまたは対象中に導入されたポジトロン放射性核種によって間接的に放射されたガンマ線対を検出することによって三次元画像を提供する、ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）などの核医学イメージング技術に関する。例として、ＳＰＥＴ研究はＩｎ−１１１を用いて、ＰＥＴ研究はＧａ−６８を用いて実施されることができる。しかしながら、当業者は、本発明において使用可能な他の好適なＳＰＥＴおよびＰＥＴ放射性核種を知っているであろう。一般に、本発明は、適切なイメージングプローブの選択により、ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＴ）、光画像法（ＯＩ）および核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のために、または適切な放射性核種の選択により（例えば、Ｙ−９０、Ｌｕ−１７７）、放射性核種治療のために使用されることができる。
【００９８】
本発明の二官能性化合物は、２つの異なる技術を用いて検出可能なイメージングプローブの検出によるか、または二官能性化合物が限局されるようになる生物系中の部位において第二の標識を提供することによるか、最も好都合には、第二の標識を上記で詳細に説明した二官能性化合物と連結するかまたは会合させることによって、２つの異なる技術から情報またはイメージが引き出されるマルチモーダルイメージングの方法において使用されることができる。マルチモーダル研究は、共記録され、２つのモダリティーによる同時イメージングを必要とするか、または２つのステップにおいて行われるかも知れないが、一般的に、２つの技術を用いて得られた空間情報が比較可能であるように、同じサンプルを使用する。マルチモーダルイメージングの例としては、ＰＥＴ／ＣＴ、ＳＰＥＴ／ＣＴ、ＰＥＴ／ＭＲおよびＳＰＥＴ／ＭＲが挙げられる。
【実施例】
【００９９】
実施例１−キレーターＣＰ２５６（化合物５２）の合成
トリスｔｅｒｔ−ブチルエステル６１および６２を、以下の確立された文献の方法によって合成した（Ｇ．Ｒ．Ｎｅｗｋｏｍｅ，Ｒ．Ｋ．Ｂｅｈｅｒａ，Ｃ．Ｎ．Ｍｏｏｒｅｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｂａｋｅｒ，  Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ，１９９１，５６，７１６２−７１６７）。
【０１００】
【化１４】
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【０１０１】
ベンジルトリメチルアンモニウムハイドロオキサイドの存在下でのニトロメタンとアクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルの反応により、ニトロトライポッド（ｎｉｔｒｏ  ｔｒｉｐｏｄ）６１を生成し、５７％の収率でエタノールから再結晶化した。次いで、６１のニトロ基をアミンに還元して、ニッケル／アルミニウム合金から特別に調製したＴ−１ラネーニッケル触媒による水素化によって６２を形成した。塩化アセチルによる６２のアセチル化およびカラムクロマトグラフィーによる精製により、７２％の収率で６３が得られた。次いで、ｔｅｒｔ−ブチル基をギ酸により除去して、生成物である化合物６４を、エタノール／石油精から９３％の収率で再結晶化した。
【０１０２】
５２を生成するための、三脚型骨格への二配座部分（ｂｉｄｅｎｔａｔｅ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のコンジュゲーションおよびその後の脱保護を、上に模式的に示す。ＤＭＦ中のＤＣＣＩおよびＨＯＢｔによるカップリング反応において、１当量の三酸６４を３．６当量の二配座化合物（ｂｉｄｅｎｔａｔｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）６０と反応させた。溶媒の除去後、保護された六配座リガンド６５をカラムクロマトグラフィーによって５０％の収率で精製した。メタノールの酸性溶液（ＨＣｌ）中での接触水素化（Ｐｄ／Ｃ）によってベンジル保護基を除去した。触媒の除去後、５２のトリスＨＣｌ塩をメタノール／ジエチルエーテルから沈殿させ、真空下で乾燥すると、白色固体として、０．４ｇ（７４％）の５２が得られた。
【０１０３】
実験の詳細
すべての化学物質を、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈおよびＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入し、それらは試薬グレード以上だった。溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈおよびＶＭＲから購入した。ＮＭＲ溶媒はＧＯＳＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ＮＭＲ管はＷｉｌｍａｄが製造した。ＴＬＣプレート（アルミニウムで裏打ちしたシリカゲル６０  ＵＶ254）およびカラムクロマトグラフィーのためのシリカゲルは、Ｍｅｒｃｋから購入した。
【０１０４】
真空ポンプ（ＢＯＣ−Ｅｄｗａｒｄｓ）につないだ真空オーブン（Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ、２５０℃以下とみなされる）中でサンプルを乾燥させた。４０ｐｓｉで自動撹拌しながらＰａｒｒ水素化装置（室温）においてサンプルを水素化した。ＫＢｒディスクを用いてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｎｅ  ＦＴＩＲにおいて赤外スペクトルを取得した。使用したソフトウエアは、「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ」と呼ばれた。
【０１０５】
４００ＭＨｚのＵｌｔｒａ−ｓｈｉｅｌｄ  ｍａｇｎｅｔ（Ｂｒｕｋｅｒ）において、ＸＷｉｎ−ＮＭＲソフトウエアを用いて1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを取得した。ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａソフトウエアバージョン５．３（Ｍｅｓｔｒｅｌａｂ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によりスペクトルを分析した。質量分析サンプルをＥＰＳＲＣ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｓｗａｎｓｅａまたはｔｈｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆａｃｉｌｉｔｙ，  Ｋｉｎｇ’ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，  Ｌｏｎｄｏｎに提出した。ＥＰＳＲＣにおけるサンプルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱ４０００四極子質量分析計（ＥＳＩ）、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ９５  ＸＰ高分解能ダブルフォーカシング質量分析計（ＥＩ、ＣＩ）またはＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＩＩ四極子質量分析計（ＥＩ）で処理した。Ｋｉｎｇ‘ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅにおけるサンプルは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＬＣＱ  ＤＥＣＡ  ＸＰイオントラップ質量分析計で処理した。
【０１０６】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｒｉｇｈｔ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒバージョン６．４６を用いて同位体分布を計算した。得られたグラフデータを抽出し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３で処理した。
【０１０７】
２−クロロメチル−５−ヒドロキシピラン−４（１Ｈ）−オン（クロロコウジ酸）（５４）
【０１０８】
【化１５】
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【０１０９】
５０ｇのコウジ酸（３５０ミリモル、１当量）を２２０ｍｌの塩化チオニルに撹拌しながら添加した。反応容器を氷で冷却し、明るい黄色の懸濁液が形成されるまで、混合物を１時間撹拌した。混合物を真空濾過して、石油精で洗浄後、粗製の白色固体が得られた。この固体を温水から再結晶化すると、４０ｇのオフホワイト結晶が７１％の収率で得られた。
【０１１０】
【数１】
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【０１１１】
２―メチル−５−ヒドロキシピラン−４（１Ｈ）−オン（アロマルトール（Ａｌｌｏｍａｌｔｏｌ））
【０１１２】
【化１６】
0005986095.tif 000018
【０１１３】
２０ｇのクロロコウジ酸（５４）（１２５ミリモル、１当量）を、１００ｍｌの蒸留水に添加し、５０℃で撹拌した。亜鉛末（１７ｇ）をゆっくりと溶液に加え、温度を７０℃に上昇させた。混合物を撹拌しながら、４０ｍｌの濃ＨＣｌをゆっくりと９０分間にわたって滴下して加えた。この時間の間にクロロコウジ酸が溶解した。７０〜８０℃でさらに３時間撹拌後、濃い茶色となった溶液を保温濾過して任意の固体を除去した。冷却後、１回あたり７０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で生成物を５回抽出した。溶液を脱水し（Ｎａ2ＳＯ4）、溶媒を真空中で除去した。粗製固体を温イソプロパノールから再結晶化すると、８．６３ｇのベージュ色の結晶が５５％の収率で得られた。
【０１１４】
【数２】
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【０１１５】
２−ヒドロキシメチル−３−ヒドロキシ−６−メチル−ピラン−４（１Ｈ）−オン（５６）
【０１１６】
【化１７】
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【０１１７】
３ｇのアロマルトール（５５）（２３．８ミリモル、１当量）を、２５ｍｌの蒸留水中１．０５ｇのＮａＯＨの撹拌した溶液に添加した。２．２ｍｌの３７％ホルムアルデヒド溶液を１０分間にわたって、滴下して加えた。溶液を、室温でさらに１８時間撹拌した。濃ＨＣｌでｐＨを１に調整し、ここで白色沈殿が形成した。沈殿を完了させるために、溶液を４℃で２４時間冷却した。固体を濾過し、冷ジエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させると、２．９２ｇの白色固体が７８％の収率で得られた。
【０１１８】
【数３】
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【０１１９】
２−ヒドロキシメチル−３−ベンジルオキシ−６−メチル−ピラン−４（１Ｈ）−オン（５７）
【０１２０】
【化１８】
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【０１２１】
６０ｍｌのＣＨ3ＯＨに１０ｇの５６（６４ミリモル、１当量）を添加し、溶液を還流温度まで加熱した。６ｍｌのＨ2Ｏ中、２．８２ｇのＮａＯＨ（７０ミリモル、１．１当量）をゆっくりと還流中の溶液に添加した。１２．０５ｇの臭化ベンジル（７０ミリモル、１．１当量）を還流中の溶液に対してゆっくりと３０分間にわたって滴下して加えた。溶液をさらに１６時間還流した。真空中で溶媒を除去し、残渣を１８０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。不溶性のＮａＢｒを濾過して除去した。１回あたり１００ｍｌの５％ＮａＯＨ水溶液で有機層を２回洗浄し、その後、１回あたり１００ｍｌの水で２回洗浄し、脱水し（Ｎａ2ＳＯ4）、そして蒸発させると、透明な黄色の油が残った。該油をＣＨ2Ｃｌ2および石油精から再結晶化させると、９．８ｇの白色固体が６２％の収率で得られた。
【０１２２】
【数４】
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【０１２３】
１，６−ジメチル−２−ヒドロキシメチル−３−ベンジルオキシピリジン−４（１Ｈ）−オン（５８）
【０１２４】
【化１９】
0005986095.tif 000024
【０１２５】
４．９２ｇの５７（２０ミリモル、１当量）を、６０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に撹拌しながら添加した。３．４ｇの３，４−ジヒドロ−２−Ｈ−ピラン（４２．５ミリモル、２．２当量）を添加し、続いて、触媒として６０ｍｇのｐ−トルエンスルホン酸を添加した。３時間撹拌後、混合物を分液漏斗に加え、４０ｍｌのＮａ2ＣＯ3（５％）で２回、続いて、４０ｍｌの蒸留水で２回洗浄した。有機層を脱水し（Ｎａ2ＳＯ4）、蒸発させると、黄色の油が得られ、これを２０ｍｌのＥｔＯＨに再溶解した。２００ｍｌのＮＨ2ＣＨ3（４０％、水溶液）を添加し、混合物を７０℃で１８時間撹拌した。真空中で溶媒を除去し、得られた油を４０ｍｌのＥｔＯＨに再溶解した。２ｍｌの濃ＨＣｌ（３７％）を添加し、溶液を４時間還流した。真空中で溶媒を除去し、１００ｍｌの蒸留水を残渣に添加した。５０ｍｌのジエチルエーテルで２回溶液を洗浄した。次いで、１０ＮのＮａＯＨ水溶液で水性相のｐＨを９に調整した。溶液を分液漏斗に加え、１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で４回抽出した。有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4で脱水し、溶媒を除去すると粗製の茶色固体が得られ、これを、ＣＨ3ＯＨおよびジエチルエーテルから再結晶化すると、２．８ｇの白色結晶が５４％の収率で得られた。
【０１２６】
【数５】
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【０１２７】
１，６−ジメチル−２−フタルイミドメチル−３−ベンジルオキシピリジン−４（１Ｈ）−オン（５９）
【０１２８】
【化２０】
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【０１２９】
８．６ｇのトリフェニルホスフィン（３２ミリモル、１．２当量）および４．８ｇのフタルイミド（３２ミリモル、１．２当量）を、０℃の１５０ｍｌのＴＨＦ中、５８（７ｇ、２７ミリモル、１当量）の撹拌した懸濁液に添加した。６．４７ｇのジイソプロピルアゾジカルボキシレート［ＤＩＡＤ］（３２ミリモル、１．２当量）を、３０分間にわたって滴下して加えた。溶液を放置して室温まで温め、さらに１７時間撹拌し、その後、該溶液を濾過した。固体を冷ＴＨＦで洗浄すると、９．９２ｇの白色無定形固体が９５％の収率で得られた。
【０１３０】
【数６】
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【０１３１】
１，６−ジメチル−２−アミノメチル−３−ベンジルオキシピリジン−４（１Ｈ）−オン（６０）
【０１３２】
【化２１】
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【０１３３】
１０ｇの５９（２６ミリモル、１当量）を１００ｍｌのＥｔＯＨに溶解した。１７ｍｌのＮ2Ｈ4（５．５％水溶液）を添加し、溶液を３時間還流した。５９は、還流が始まるまで完全には溶解しなかった。溶液を放置して冷却すると、その時点で凝固した。水を添加し、濃ＨＣｌでｐＨを１に調整した。４℃で一夜冷却後、溶液を濾過した。１０ＮのＮａＯＨで濾液のｐＨを１４に調整し、１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で５回抽出した。抽出液を併合し、Ｎａ2ＳＯ4で脱水した。真空中で溶媒を除去すると、６．２ｇの白色固体が９２％の収率で得られた。
【０１３４】
【数７】
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【０１３５】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−ニトロ−４−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチル］−ヘプタンジオエート（６１）
【０１３６】
【化２２】
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【０１３７】
１．５３ｇのニトロメタン（２５ミリモル、１当量）を、１０ｍｌの１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）に添加した。０．２５ｍｌのベンジルトリメチルアンモニウムハイドロオキサイド（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｂ）を添加し、溶液を７０℃に加熱した。９．９３ｇのアクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル（７７．５ミリモル、３．１当量）を１回あたり１ｍｌずつ、別に１回あたり０．２５ｍｌで２回のＴｒｉｔｏｎ  Ｂとともに添加して、温度を７０〜８０℃に維持した。試薬の添加を完了後、溶液を７０℃でさらに１時間加熱した。真空中で溶媒を除去し、残渣を６０ｍｌのＣＨＣｌ3に再溶解し、分液漏斗に入れた。２０ｍｌのＨＣｌ（１０％水溶液）、続いて２０ｍｌの濃ＮａＣｌ溶液で３回、有機層を洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で脱水し、濾過し、真空中で溶媒を除去した。粗生成物を温ＥｔＯＨから再結晶化し、濾過し、氷冷のＥｔＯＨで洗浄すると、６．４ｇの白色結晶が５７％の収率で得られた。
【０１３８】
【数８】
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【０１３９】
Ｔ−１ラネーニッケル触媒
１Ｌの３つ首丸底フラスコに、６００ｍｌの１０％ＮａＯＨ溶液、続いて、４０ｇのニッケル−アルミニウム合金を加えた。溶液を磁性スターラーバーで撹拌し、９０〜９５℃の温度で加熱した。４０分間の加熱後、ニッケルが磁性スターラーに付着し始め、撹拌プロセスを妨げた。ここで撹拌をガラス棒により手動で継続した。１時間後、加熱を中止し、放置してニッケルを沈殿させた。ニッケル触媒が沈殿し、溶液が冷却したら、上清をデカントして廃棄した。２００ｍｌの蒸留水で３回、５０ｍｌのエタノールで５回、触媒を洗浄した。洗浄ステップの間、確実に触媒が液体で覆われて空気に露出しないように注意した。その後、４℃の冷蔵庫中、５０ｍｌのエタノールのもとで触媒を貯蔵した。
【０１４０】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル  ４−アミノ−４−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチル］−ヘプタンジオエート（６２）
【０１４１】
【化２３】
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【０１４２】
１００ｍｌのＥｔＯＨに５ｇの６１（１１．２４ミリモル、１当量）を溶解した。４ｇのＴ−１ラネーニッケル触媒を添加した。４０ｐｓｉ（室温）で７日間、溶液を水素化した。この期間中、Ｈ2圧を４０ｐｓｉに維持し、圧力がさらに減少しなくなったら反応を停止した。最初、６１は完全には溶解しなかったが、水素化の間に完全に溶解した。セライトを通して溶液を濾過し、真空中で溶媒を除去すると、定量的収率で４．５ｇの油が得られ、これは数日そのまま置くと凝固した。
【０１４３】
【数９】
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【０１４４】
４−アセチルアミノ−４−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−エチル）−ヘプタンジオイックアシッド  ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６３）
【０１４５】
【化２４】
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【０１４６】
５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に、１ｇのトリエステル６２（２．４ミリモル、１当量）および０．３ｇのトリエチルアミン（２．９ミリモル、１．２当量）を添加した。氷浴で溶液を０℃まで冷却し、０．２３ｇの塩化アセチル（２．９ミリモル、１．２当量）を滴下して加えた。溶液をさらに４時間撹拌し、放置して室温までゆっくりと温めた。溶液を分液漏斗に注ぎ、１５ｍｌのＨＣｌ（５％水溶液）で２回、１５ｍｌの濃ＮａＣｌで１回、洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で溶液を脱水し、真空中で溶媒を除去した。最小量のＥｔＯＡｃに残渣を溶解し、シリカカラムに負荷し、ここで、ＥｔＯＡｃおよびヘキサン（１：１）によるカラムクロマトグラフィーで精製して、０．７９ｇの白色固体が７２％の収率で得られた。
【０１４７】
【数１０】
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【０１４８】
４−アセチルアミノ−４−（２−カルボキシ−エチル）−ヘプタンジオイックアシッド（６４）
【０１４９】
【化２５】
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【０１５０】
１．５ｇのトリエステル６３（３．２８ミリモル）を２０ｍｌのギ酸（９６％）に添加し、４時間撹拌した。この後、１回あたり２０ｍｌのトルエンによる５回の共沸蒸留によってギ酸を除去した。ＥｔＯＨおよび石油精から粗残渣を再結晶化すると、０．９ｇのオフホワイトの結晶が９３％の収率で得られた。
【０１５１】
【数１１】
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【０１５２】
４−アセチルアミノ−４−｛２−［（３−ベンジルオキシ−１，６−ジメチル−４−オキソ−１，４−ジヒドロ−ピリジン−２−イルメチル）−カルバモイル］−エチル｝−ヘプタンジオイックアシッドビス−［（３−ベンジルオキシ−１，６−ジメチル−４−オキソ−１，４−ジヒドロ−ピリジン−２−イルメチル）−アミド］（６５）
【０１５３】
【化２６】
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【０１５４】
１００ｍｌの丸底フラスコ中の１０ｍｌの無水ＤＭＦに、０．４ｇの６４（１．３８ミリモル、１当量）、１．２９ｇの６０（４．９８ミリモル、３．６当量）、０．６７ｇのＨＯＢｔ（４．９８ミリモル、３．６当量）および１．０３ｇのＤＣＣＩ（４．９８ミリモル、３．６当量）を添加した。Ｎ2雰囲気下、室温で４８時間、混合物を撹拌した。溶液を濾過して、沈殿したＤＣＵを除去した。真空中でＤＭＦを除去した。残渣をメタノールに溶解し、４：１のＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨの移動相を用いるカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）によって精製した。分画を併合し、脱水し（Ｎａ2ＳＯ4）、真空中で溶媒を除去すると、０．７ｇの白色固体が５０％の収率で得られた。
【０１５５】
【数１２】
0005986095.tif 000039
【０１５６】
４−アセチルアミノ−４−｛２−［（３−ヒドロキシ−１，６−ジメチル−４−オキソ−１，４−ジヒドロ−ピリジン−２−イルメチル）−カルバモイル］−エチル｝−ヘプタンジオイックアシッドビス−［（３−ヒドロキシ−１，６−ジメチル−４−オキソ−１，４−ジヒドロ−ピリジン−２−イルメチル）−アミド］トリス塩酸塩（５２）（ＣＰ２５６）
【０１５７】
【化２７】
0005986095.tif 000040
【０１５８】
０．６４ｇの６５（０．６３ミリモル、１当量）を、肉厚の水素化用フラスコ中の４０ｍｌのＣＨ3ＯＨに溶解した。２．３ｍｌのＨＣｌ（ＣＨ3ＯＨ中、１．２５Ｍ）を溶液に添加した。０．２ｇのＰｄ／Ｃ触媒を添加し、溶液を１８時間水素化した（室温、４０ｐｓｉ）。注意してフラスコを取り除き、溶液を濾過してＰｄ／Ｃを除去した。真空中で溶媒を除去した。残渣を最小量のメタノールに再溶解した。生成物（５２）をジエチルエーテルで沈殿させた。沈殿が沈んだら、上清を取り除き、冷ジエチルエーテルで沈殿を洗浄した。このプロセスを３回繰り返し、真空中で溶媒を除去すると、５２のトリス塩酸塩が０．４ｇ、白色固体として７４％の収率で得られた。
【０１５９】
【数１３】
0005986095.tif 000041
【０１６０】
実施例２−ＣＰ２５６のガリウムおよび鉄錯体の特徴づけならびにＧａ−６７標識手順
Ｇａ−ＣＰ２５６およびＦｅ−ＣＰ２５６錯体の形成は、表１および表２に示す質量分析データから明らかである。各錯体のプロトン化形態を検出し、マススペクトルからの同位体分布は表１に記録した計算値に一致する。Ｇａ−ＣＰ２５６錯体は、ガリウムが原子量６９および７１の安定な同位体を有するため、（Ｍ＋Ｈ）+に関して、ｍ／ｚ８０６およびｍ／ｚ８０８において２つの分子種を有する。１：１以外のＧａ：リガンド比を有するＧａ−ＣＰ２５６の証拠はなかった。
【０１６１】
Ｆｅ−ＣＰ２５６錯体についての質量分析データは、予測した同位体分布に一致した。
【０１６２】
【表１】
0005986095.tif 000042
【０１６３】
【表２】
0005986095.tif 000043
【０１６４】
Ｇａ−６７によるＣＰ２５６の放射性標識により、そのＨＰＬＣが「非放射性」Ｇａ−ＣＰ２５６錯体のものと同一の溶出時間を有する単一の放射能ピークを示す生成物が得られた。
【０１６５】
【表３】
0005986095.tif 000044
【０１６６】
実験の詳細
錯体の調製
Ｇａ−ＣＰ−２５６
１ｍｇのＣＰ２５６を１ｍｌのメタノールに溶解して、（ＲＭＭが８４８のＣＰ２５６のトリスＨＣｌ付加物に基づき）１．１８ｍＭのリガンド濃度とした。この溶液を０．３ｍｇの無水Ｇａ（ＮＯ3）3（ＲＭＭ２５５）に添加して、１．１８ｍＭの濃度における１：１の金属対リガンドの化学量論比が得られた。
【０１６７】
Ｆｅ−ＣＰ２５６
Ｆｅ（ＮＯ3）3・９Ｈ2Ｏ（ＲＭＭ＝３８６）を金属源とするが、Ｇａ3+錯体と類似する手順でＦｅ3+錯体を作製した。
【０１６８】
サンプルの分析
サンプルをＬＣ−ＭＳにより分析した。ＨＰＬＣシステムは、脱ガス装置、クオータナリー・ポンプ（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｐｕｍｐ）、紫外・可視光可変波長検出器およびオートサンプラーを備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００システムであった。質量分析計は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５２０  Ａｃｃｕｒａｔｅ−Ｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳであった。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍａｓｓｈｕｎｔｅｒワークステーション収集ソフトウエアを用いてサンプルを取得し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍａｓｓｈｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ分析ソフトウエアを用いてデータを分析した。使用したＨＰＬＣカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ１８カートリッジカラム（２．１ｍｍ×３０ｍｍ、３．５μｍ）であった。溶出液の流速は、０．５ｍｌ／分であり、移動相は、質量分析グレードの試薬を用いるグラジエント：Ａ＝Ｈ2Ｏ＋０．１％ギ酸（Ｆｌｕｋａ、３４６７３）およびＢ＝メタノール＋０．１％ギ酸（Ｆｕｌｋａ、３４６７１）であった。グラジエントを表３に示す。スペクトルは、ヘキサキス（１Ｈ，１Ｈ，３Ｈ−テトラフルオロプロポキシ）ホスファジン（Ｃ18Ｈ18Ｎ3Ｏ6Ｐ3Ｆ24、ｍ／ｚ＝９２２．００９８（Ｍ＋Ｈ）+）によるリファレンスマス補正（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｓｓ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を用いるポジティブモードのエレクトロスプレーイオン化を用いて取得した。
【０１６９】
【表４】
0005986095.tif 000045
【０１７０】
放射性標識サンプルのＨＰＬＣ
ＨＰＬＣ分析
直列につながれたＦＣ３６００検出器とγ検出器プローブによりＨＰＬＣ分析を実施した。ＨＰＬＣシステムは、四重ポンプ（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ  ｐｕｍｐ）、脱ガス装置、ＵＶ検出器および手動のシリンジインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズであった。すべての分析に使用したＨＰＬＣカラムは、ガードカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８（５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）であった。ラジオＴＬＣおよびラジオＨＰＬＣに使用した分析ソフトウエアは、Ｌａｕｒａ（Ｌａｂｌｏｇｉｃ）であった。すべての一般的試薬および消耗品は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。注入のための67Ｇａ−クエン酸塩溶液は、Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ  Ｍｅｄｉｃａｌから入手し、７４ＭＢｑ／ｍｌ（参照日において；６．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１３５ｍＭのＮａＣｌ、０．９％のベンジルアルコールを含む）であった。
【０１７１】
ＨＰＬＣ分析のための放射性標識手順
ＣＰ２５６の１ｍｇ／ｍｌ原液を、１ｍｌのプラスチック製の微量遠心管中のＰＢＳバッファー中で調製した。放射性標識化溶液は、１０μｌのアリコートの原液をプラスチック製の微量遠心管中の９０μｌの標識化バッファーに添加して、１００μｌ中、０．１ｍｇ／ｍｌ総リガンド濃度とした。１０μｌの67Ｇａ−クエン酸塩を添加することによって、この溶液を放射性標識した。放射性標識条件を表４に示す。
【０１７２】
【表５】
0005986095.tif 000046
【０１７３】
ＨＰＬＣ移動相
０分における１０％Ｂから１５分における９０％Ｂまでの直線勾配（Ａ＝Ｈ2Ｏ中、０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝メタノール中、０．１％ＴＦＡ）。流速は、１ｍｌ／分であった。
【０１７４】
ＨＰＬＣサンプルの注入
２０μｌのサンプルを、２５μｌのＨＰＬＣシリンジを用いて手動でＨＰＬＣに注入した。
【０１７５】
実施例３−Ｇａ−６７データによるＣＰ２５６標識効率
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により測定した、表５中の放射性標識結果は、ＣＰ２５６は、ＤＯＴＡがより高温で標識されたよりも低濃度の67Ｇａで、室温で放射性標識し、１００％の放射性標識化は１０μＭという低濃度においてであるが、ＤＯＴＡについての放射性標識収率は１０μＭでわずか３５％であった。これらの結果を、図１にグラフで示す。
【０１７６】
【表６】
0005986095.tif 000047
【０１７７】
実験の詳細
すべての一般的な試薬および消耗品は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。専門的な化学物質および消耗品は、以下のとおりに購入した：ｐＨ４．６の酢酸塩バッファー溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ３１０４８−１Ｌ）；注入用の67Ｇａ−クエン酸塩溶液（Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ）７４ＭＢｑ／ｍｌ（参照日において；６．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１３５ｍＭのＮａＣｌ、０．９％のベンジルアルコールを含む）；ガラスＴＬＣプレート（シリカゲル６０、Ｆ254、２５０ｍｍ×７５０ｍｍ）（Ｍｅｒｃｋ）；ＩＴＬＣ−ＳＧストリップ（Ｐａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１７８】
ＴＬＣプレートのスポッティングと実施手順
シリカＴＬＣプレートおよびＩＴＬＣ−ＳＧストリップに、１μｌの放射性標識錯体を、５ｍｍのところに鉛筆でマークした起点にスポットした。シリカゲルＴＬＣプレート上ではスポットを乾燥させたが、ＩＴＬＣ−ＳＧストリップでは乾燥させなかった。深さ３ｍｍの移動相を満たした展開槽（１００ｍｌの広口サンプル瓶）中にプレートを置いた。固定相および移動相を表８に列挙する。溶媒の先端が６５ｍｍの距離に到達するまで、ＴＬＣプレートを展開した。プレートを、展開槽から取り外し、８０℃に設定したオーブン中で乾燥させた。放射性化学物質の収率を、Ｌａｕｒａソフトウエアまたはインスタントイメージャーソフトウエアのいずれかを用いて決定した。
【０１７９】
ＴＬＣおよびＩＴＬＣ分析を、ＦＣ３６００検出器およびγ検出器プローブを備えたＭｉｎｉ−ｓｃａｎ  ＴＬＣスキャナーにおいて実施した。使用した分析用ソフトウエアは、Ｌａｕｒａ（Ｌａｂｌｏｇｉｃ）であった。Ｕｌｔｒｏｔｅｒｍソフトウエアを使用して、１２８２Ｃｏｍｐｕｇａｍｍａ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃ）において、放射性サンプルを１０秒間（ウインドウ１０１−１１０）カウントした。サンプル中の放射能の測定のために使用したキュリーメータは、ＣＲＣ−２５Ｒ（Ｃａｐｉｎｔｅｃ）であった。Ｉｍａｇｅｒバージョン２．０５ソフトウエアを備えたＰａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｉｍａｇｅｒにおいてエレクトロニック・オートラジオグラフィーを実施した。ガス混合物は、１％イソブタン、２．５％二酸化炭素および９６．５％アルゴンであった（Ａｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。
【０１８０】
ＴＬＣ分析による放射性化学物質収率の決定のための放射性標識手順
各リガンドの１．２５ｍＭ原液を、表６に列挙した適切な標識化バッファー中で調製した。放射性標識化バッファーの連続添加によって原液を１０倍に希釈して、１２５μＭ、１２．５μＭ、１．２５μＭ、１２５ｎＭおよび１２．５ｎＭのリガンド濃度を有する追加の溶液を作製した。８０μｌの各溶液をプラスチック製の微量遠心管に添加し、２０μｌの67Ｇａ−クエン酸塩（１．５ＭＢｑ）で放射性標識して、最終リガンド濃度が、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、および１００ｎＭの放射性標識溶液を作製した。67Ｇａ−ＤＯＴＡ溶液を加熱するために、（ウエル中に油を入れた）メタルヒーターブロックを使用した。放射性標識条件を表６に示す。
【０１８１】
【表７】
0005986095.tif 000048
【０１８２】
実施例４−Ｇａ−６７で標識したＣＰ２５６−動力学的安定性
ＰＤ１０サイズ排除によるアポ−トランスフェリン中の67Ｇａ−ＣＰ２５６の安定性
図２は、１００μＭ（Ａ）および１０μＭ（Ｂ）のＣＰ２５６の放射性標識溶液についての、ＰＤ１０カラムからの67Ｇａ−ＣＰ２５６の溶出プロフィールを示す。アポ−トランスフェリン中での希釈およびインキュベーション後、これらの溶液中のＣＰ２５６濃度は、それぞれ、２２７μＭおよび２．２７ｎＭであった。アポ−トランスフェリン中での４時間のインキュベーション後、該プロフィールは、参照バッファー中でのインキュベーションのそれとは変わらず、２．２７μＭまたは２２７ｎＭ溶液のいずれについても、67Ｇａがトランスフェリンに結合していないことまたはリガンドから67Ｇａが失われたことを示唆している。
【０１８３】
３０ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを用いる放射性医薬品の安定性
表７および図３に示す通り、すべての放射性標識トレーサーのフィルター膜への残留結合は低度であった（５％以下）。アポ−トランスフェリン中での67Ｇａ−クエン酸塩のインキュベーション由来の放射能の７３％が、４時間後にＭＷＣＯフィルターに結合していた。ＭＷＣＯ法は、４時間のインキュベーション時間にわたる、67Ｇａ−ＣＰ２５６および67Ｇａ−ＤＯＴＡ溶液中での67Ｇａからアポ−トランスフェリンへの無視できるトランスキレーション（１％以下）も示す。１００μＭのＣＰ２５６溶液（アポ−トランスフェリン中、２．２７Ｍ）の場合、参照バッファー中でのインキュベーション由来のバックグラウンド結合は、１％高かった。67Ｇａ−ＤＴＰＡは、４時間のインキュベーション時間経過後、参照バッファー中の溶液と比べて、いくらかの解離とこの溶液中の放射能のさらなる１０％のフィルターへ結合を示した。
【０１８４】
【表８】
0005986095.tif 000049
【０１８５】
実験の詳細
専門的な化学物質および消耗品は、以下のように購入した：ヒトアポートランスフェリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ５３９１−１０ＭＧ）；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００  ３０  ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＦＤＰ−８７５−０２５Ｂ）；ＰＤ１０  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）；アポ−トランスフェリンのＵＶ分光光度分析は、Ｃａｒｙ  ＷｉｎＵＶソフトウエアを備えたＣａｒｙ  ＵＶ分光光度計において実施した。波長を２８０ｎｍに設定した。
【０１８６】
【表９】
0005986095.tif 000050
【０１８７】
67Ｇａ−クエン酸塩参照溶液の調製
２００μｌのＰＢＳ中、２０μｌの67Ｇａ−クエン酸塩をインキュベートすることによって、67Ｇａ−クエン酸塩の参照溶液を作製した。メタルヒーティングブロック中、３７℃でこの溶液をインキュベートし、血清インキュベーションについてと同じやり方の分析のためにサンプルを取り出した。
【０１８８】
アポ−トランスフェリン溶液の調製
１Ｍ原液の希釈によって、５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）を調製した。重炭酸ナトリウムを２５ｍＭの濃度まで添加した。アポ−トラスフェリンの２．５ｍｇ／ｍｌ（３２μＭ）溶液をこのバッファー中で調製した。
【０１８９】
67Ｇａ−トレーサーの調製
すべてのトレーサーの溶液を、１００μＭの濃度で放射性標識した。１０μＭのＣＰ２５６溶液も調製した。放射性標識条件については、表９を参照されたい。
【０１９０】
各放射性標識トレーサーの１０μｌアリコートを３０μｌの適切なバッファーに添加して、ｐＨを７から７．５の間に中和した。酢酸塩バッファー中で標識したトレーサーの場合には、このバッファーは、２ＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）であった。67Ｇａ−ＣＰ２５６および67Ｇａ−クエン酸塩の調製のためには、バッファーはＰＢＳであった。詳細を表９に示す。
【０１９１】
【表１０】
0005986095.tif 000051
【０１９２】
アポ−トランスフェリン中でのトレーサーのインキュベーション
プラスチック製の微量遠心管中のアポ−トランスフェリン溶液（２００μｌ）を、メタルヒーティングブロック中、３７℃でインキュベートした。これに、２０μｌのｐＨ−中和した各トレーサーを添加した。２５ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌの（アポ−トランスフェリンを含まない）参照バッファー中でも、２０μｌの各トレーサーをインキュベートした。
【０１９３】
参照バッファー中でのトレーサーのインキュベーション
５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（２００μｌ、アポ−トランスフェリンを含まない）を、ヒーティングブロック中、３７℃でインキュベートした。ｐＨ調整した適切なトレーサー（２０μｌ）をインキュベーションに加えた。分析のために、適切な間隔でアリコートを採取した。
【０１９４】
ＰＤ１０カラムを用いるゲル濾過
アポ−トランスフェリンのインキュベーション
ＰＢＳ溶出バッファーに添加した２５ｍＭの重炭酸ナトリウムにより、ＰＤ１０カラムの平衡化と溶出を行った。参照バッファー（２５ｍＭの重炭酸ナトリウムを含む５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ）中でインキュベートした２０μｌの各トレーサーを加え、上記のカラムを溶出することにより、67Ｇａ−クエン酸塩、67Ｇａ−ＣＰ２５６、67Ｇａ−ＤＯＴＡおよび67Ｇａ−ＤＴＰＡの標準的な溶出プロフィールを決定した。
【０１９５】
０．５ｍｌの各分画についての総溶出放射能のパーセンテージを計算する
各カラムについての総溶出放射能を、３０個の分画それぞれについてのカウントを加算することによって計算した。そして、各分画についての溶出放射能を以下の式によって計算した。
【０１９６】
【数１４】
0005986095.tif 000052
【０１９７】
ＰＤ１０ゲル濾過カラムからのアポ−トランスフェリンのＵＶ溶出プロフィール
ＰＤ１０カラムからのトランスフェリンの溶出プロフィールを、ＵＶ分光光度法によって決定した。アポ−トランスフェリン（非放射性、５００μｌの２．５ｍｇ／ｍｌ溶液）をＰＤ１０カラムに入れ、ＰＢＳバッファーで溶出して、０．５ｍｌの分画を集めた。サンプルを１ｍｌの水晶キュベットに負荷し、追加の０．４ｍｌのＰＢＳで０．９ｍｌまで希釈した。参照基準としてＰＢＳを用い、２８０ｎｍにおける吸収を測定した。
【０１９８】
３０ｋＤａのＭＷＣＯ微量遠心分離フィルターを用いる、トレーサーの安定性の決定
管の上部（フィルター部分）に（１００μｌ、２５ｍＭの重炭酸塩を含む）ＰＢＳを加えた。各トレーサーについての（４時間後の）インキュベーション溶液（５μｌ）を添加し、微量遠心機中で、管を１０，０００ｇで８分間回転させた。さらなる１００μｌのＰＢＳを洗浄のために添加し、再度、管を１０，０００ｇでさらに８分間回転させた。管のフィルター部分を取り出し、管とは別にガンマカウンター中でカウントした。放射能のＭＷＣＯフィルターへの結合のパーセンテージを、以下の式を用いて計算した。
【０１９９】
【数１５】
0005986095.tif 000053
【０２００】
アポ−トランスフェリンのインキュベーションに関して、４時間後に三連で分析を行った。５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ参照バッファー中でのインキュベーションに関しては、６回（６つの管）行った。上記のように平均値をとった。
【０２０１】
実施例５−ＣＰ２５６−マレイミドコンジュゲートの合成
【０２０２】
【化２８】
0005986095.tif 000054
【０２０３】
実験の詳細
化合物４の合成は、先に報告されている（Ｚｈｏｕ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６，４９，４１７１−４１８２）。
【０２０４】
サクシニミド  ３−マレイミドプロパノエート３の合成
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中、β−アラニン（１．８ｇ、２０ミリモル）および無水マレイン酸（２ｇ、２０ミリモル）の溶液を室温で３時間撹拌した。固体を完全に溶解した後、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ；２．３ｇ、２０ミリモル）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；４．６ｇ、２４ミリモル）を溶液中に添加し、そして、混合物を室温で一夜撹拌した。溶液を濾過し、水（１００ｍｌ）およびジクロロメタン（１００ｍｌ）で沈殿を洗浄した。濾液を集め、５０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3で３回、塩水で１回、有機層を洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で脱水し、減圧下でジクロロメタンを除去すると、白色固体（５５％）が得られた。この固体は、さらなる精製を必要とせず、次のカップリングステップのために直接使用可能である。
【０２０５】
【数１６】
0005986095.tif 000055
【０２０６】
化合物５の合成
無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）中、活性化した酸３（６ミリモル）およびアミン４（５ミリモル）を、室温で一日、撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、クロロホルム：メタノール（８：２）を溶出液として用いるシリカゲルカラムにおいて残渣を精製し、溶出液として白色の泡を得た（８１％）。
【０２０７】
【数１７】
0005986095.tif 000056
【０２０８】
化合物６の合成
無水ＤＣＭ中のベンジル保護化合物５に、Ｎ2下で三塩化ホウ素（１２当量）を氷浴中で添加し、混合物を室温で２日間撹拌した。過剰のＢＣｌ3を、ＭｅＯＨ、続いて１ｍＬの濃塩酸を添加することによってクエンチングした。混合物を蒸発させて茶色固体を得て、これをメタノールに溶解し、アセトンを加えて沈殿させた。この手順を３回繰り返して、白色固体を得た（７２％）。
【０２０９】
【数１８】
0005986095.tif 000057
【０２１０】
化合物７の合成
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の化合物６（２０ｍｇ）に過剰のＥｔ3Ｎを添加し、混合物を室温で一夜撹拌した。蒸発させて溶媒を除去した後、残渣を１ｍＬの０．１％ギ酸溶液に溶解することによって固相抽出カラムに負荷した。カラムを最初に０．１％ギ酸（１０ｍＬ）で洗浄してトリエチルアミン塩酸塩を除去し、続いて、メタノール（１０ｍＬ）で溶出した。メタノール溶液の分画を濃縮し、真空オーブンで乾燥させると、白色粉末が得られた（８０％）。
【０２１１】
【数１９】
0005986095.tif 000058
【０２１２】
実施例６−ＣＰ２５６−クロロサクシニミド（６）またはＣＰ２５６−マレイミド（７）とＣ２Ａｃタンパク質のコンジュゲーション
Ｃ２Ａは、アポトーシスを被っている細胞上に提示されるホスファチジルセリンを認識する。それは、チオール反応性作用物質による部位特異的標識を促進するために、システイン残基が遺伝子操作されている（Ｔａｖａｒｅ  Ｒ，  Ｔｏｒｒｅｓ  Ｍａｒｔｉｎ  ｄｅ  Ｒｏｓａｌｅｓ  Ｒ，  Ｂｌｏｗｅｒ  ＰＪ，  Ｍｕｌｌｅｎ  ＧＥＤ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃ２Ａ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  Ｉ  ｗｉｔｈ  ［99mＴｃ（ＣＯ3）］+：  ａ  ｎｅｗ  ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄａｔｈ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２００９；  ２０：  ２０７１−２０８１を参照されたい）。６または７のいずれかを用いて、得られた遺伝子操作されたタンパク質（Ｃ２Ａｃ）をＣＰ２５６とコンジュゲーションした。同じ生成物を両コンジュゲーション反応から得た。
【０２１３】
Ｃ２Ａｃの平均分子量は１４９９７であり、したがって、Ｃ２Ａｃ−（７）コンジュゲートは、１５９１８．４４の平均分子量を有すると考えられる。実測の平均分子量は、１５９７０．８５であり、これは、追加の鉄原子を有し、３つの水素原子を含まないＣ２Ａｃ−（７）コンジュゲートに相当する。
【０２１４】
実験の詳細
Ｃ２Ａｃ（２ｍｇ／ｍＬの溶液中、２ｍｇ）を、３：１のモル過剰のクロロサクシニミド−六配座キレーター（６）またはマレイミド−六配座キレーター（７）で、４時間、室温で処理した。ＰＢＳであらかじめ平衡化させ、Ｃｈｅｌｅｘ上で貯蔵しておいたＰＤ−１０カラムを用いて、混合物を精製し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０２１５】
実施例７−68ＧａによるＣ２Ａｃタンパク質コンジュゲートの標識化および標識タンパク質に関する機能性データ
本明細書に記載の方法にしたがって、Ｃ２Ａｃ−（７）コンジュゲートを68Ｇａで放射性標識した。図４は、酢酸塩バッファー中で68Ｇａとわずか１５分間インキュベーションした後の、高度なキレーションを示す。68Ｇａ−標識コンジュゲートは、赤血球結合アッセイにおいてホスファチジルセリン（ＰＳ）への特異的なカルシウム依存性の結合を示した（図５を参照されたい）。
【０２１６】
実験の詳細
バッファー中のキレートされていない68Ｇａを以下のように調製した。ジェネレーターを２ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌで溶出して２５ＭＢｑの68Ｇａ溶出液を得た。１．５ｍｌの濃ＨＣｌ（３６％）を溶出液に加えて、ＨＣｌの最終濃度４Ｍとして、ガリウム四塩化物アニオンを形成し、該溶液はすべての放射能をトラップしながら陰イオン交換カラム（ＳＡＸ  ＳＰＥＣ，  Ｃｈｒｏｍａｆｉｘ  ３０−ＰＳ−ＨＣＯ３、４５ｍｇ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を通過した。次いで、カラムを２５０μｌの５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、放射能は３００μｌの蒸留水により溶出し、溶出液（ｐＨ１未満、約７０ＭＢｑ）を５μｌの１Ｍ  ＮａＯＨおよび３０μｌの酢酸アンモニウムバッファー、ｐＨ６を加え、ｐＨを７に上昇させることによって緩衝化した。１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ６をその後添加した。
【０２１７】
２００μｌの予備濃縮し、緩衝化した68Ｇａ溶液を（１００μｌ中）１００μｇのＣ２Ａｃ−（７）キレーターコンジュゲートに添加した。５分の間隔で、２μｌの混合物をＩＴＬＣ−ＳＧにスポットし、０．１Ｍクエン酸バッファーを移動相として使用してクロマトグラムを展開した。
【０２１８】
放射性標識Ｃ２Ａｃ−（７）の赤血球（ＲＢＣ）上のＰＳへの結合を、文献記載の方法にしたがって実施した（Ｔａｉｔ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｄ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．  （２００４）  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２９，  １１２−１１９を参照されたい）。保存ヒトＲＢＣの市販の調製物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ，  ＵＫ）から得た。ＲＢＣのカルシウム滴定を、キャリアータンパク質として１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ナトリウム、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＮａＮ3中で実施した。１ｎＭの68Ｇａ標識Ｃ２ＡｃＨおよびカルシウムにより反応を準備し；ＲＢＣを添加し、そして、反応（１ｍｌ）を室温で８分間インキュベートした。
【０２１９】
次いで、細胞を遠心分離し（７５００ＲＣＦで３分間）、上清を除去し、インキュベーションステップの間に使用したのと同じ濃度のカルシウムを含むアッセイバッファー１ｍｌに細胞を再懸濁した。細胞を再び遠心分離して上清を除去し、ペレットを０．７ｍｌのアッセイバッファー＋１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に再懸濁して、カルシウム依存性に結合した68Ｇａ標識Ｃ２Ａｃ−（７）を放出させた。ＲＢＣを除去するための遠心分離後、上清中の放出された標識Ｃ２Ａｃ−（７）をガンマカウンターを用いて測定した。式Ｙ＝（Ｃａ）N／（［Ｃａ］N＋ＥＣ５０N）を用いて文献記載のとおりにＥＣ５０を計算し、ここで、Ｙ＝Ｂ／Ｂｍａｘであり、Ｂは、所与のカルシウム濃度において結合した放射性標識タンパク質の実際の量であり、Ｂｍａｘは、飽和カルシウム濃度において結合した放射性標識タンパク質の濃度である。
【０２２０】
Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｒｅａｄｉｎｇ，  ＵＳ）を用いるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムに基づく日常の非線形曲線適合を用いて曲線のあてはめを実施した。
【０２２１】
実施例８−68Ｇａ−Ｃ２ＡｃコンジュゲートによるＰＥＴスキャニングおよびマウスにおける生体内分布
マウスへの68Ｇａ−Ｃ２Ａｃ−（７）コンジュゲートおよびキレートされていない（「遊離の」）68Ｇａの注入の１．５時間後に撮影したＰＥＴ画像を図６ａおよび６ｂにそれぞれ示す。68Ｇａの存在を画像中の明るい白色の領域により示す。68Ｇａ−Ｃ２Ａｃ−（７）コンジュゲートの注入は、膀胱へ排出された少量の放射能を、ほとんど独占的な腎臓での取り込みによる放射能の血液および組織からの急速なクリアランスを示した（図６ａ）。これは、その放射能がゆっくりと血液プールから主にリモデリング中の骨へと消失することが見られた「遊離の」68Ｇａの注入により得られた画像（図６ｂ）とは対照的である。
【０２２２】
【表１１】
0005986095.tif 000059
【０２２３】
実験の詳細
68Ｇａ標識Ｃ２Ａｃ−（７）コンジュゲートを上記の通りに合成した。バッファー中のキレートされていない68Ｇａを、実施例７に記載の予備濃縮（およびｐＨ７への緩衝化）法を用いて調製した。ＴＬＣ分析を実施した。注入時までは、水酸化ガリウムの沈殿は検出されなかった。注入のための溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過して、雌性Ｃ５７Ｂ／６マウス（ｎ＝４、各動物に対して１００μｌ中１０ＭＢｑ）の尾静脈に注入した。ＮａｎｏＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Ｂｉｏｓｃａｎ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を用い、ＰＥＴ収集時間１８００秒、同時計数関係（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎ）：１〜３で、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを取得した。画像再構築：ＳＳＲＢ  ２Ｄ  ＬＯＲによるＯＳＥＭ、エネルギーウインドウ：４００〜６００ｋｅＶ、フィルター：Ｒａｍｌａｋカットオフ１、相互作用／サブセットの数：８／６。動物を９０分で殺し、外植された器官は、生体内分布を決定するためにガンマカウンターでカウントした。
【０２２４】
実施例９−血清中での68ＧａによるＣＰ２５６の標識
図７は、血清中でのＣＰ２５６による68Ｇａのキレーションならびに血清中でインキュベートした68Ｇａ−塩化物、血清とともにインキュベートした、あらかじめ形成された68Ｇａ−ＣＰ２５６−（７）錯体およびバッファー中でインキュベートした68Ｇａを示すための対照実験のサイズ排除ラジオクロマトグラフィー（ＰＤ１０カラム）を示す。
【０２２５】
ＣＰ２５６による68Ｇａのキレーションの効率の尺度として、そして以下に記載のプレターゲティングアプローチの実行可能性を実証するために、標識化は血清中で行われ、したがって、血清トランスフェリンからの攻撃を伴うキレーションプロセスを表す。ＣＰ２５６と血清の混合物への68Ｇａ塩化物の添加は、ＣＰ２５６サンプル濃度が２３μＭ以上である場合に68Ｇａ−ＣＰ２５６のそれに類似するサイズ排除クロマトグラムを生じるが、血清のみへの68Ｇａの添加は、68Ｇａ−トランスフェリン錯体と「遊離の」ガリウムの混合物と一致するクロマトグラムを生じる。これは、ＣＰ２５６が血清トランスフェリンと効果的に競合することを示す。さらに、68Ｇａを最初に血清で平衡化し、次いでＣＰ２５６を添加した場合、ここでも、クロマトグラムは68Ｇａ−ＣＰ２５６での観察と類似し、ＣＰ２５６が68Ｇａ−トランスフェリン錯体から68Ｇａを抽出できることを示している。エタノール沈殿およびＩＴＬＣ実験は、ＣＰ２５６を含む血清中では、測定可能なタンパク質結合も検出可能な遊離の68Ｇａもなかったことを確認した。すべての68Ｇａは、上清のＩＴＬＣの起点に留まった。これらの観察結果は、68ＧａとＣＰ２５６のコンジュゲートが、インビボでの新規「プレターゲティングング」モードに使用可能であり、それによって、標的とされるＣＰ２５６コンジュゲートが投与され、そして標的に結合可能となり、続いて、プレターゲティングされたＣＰ２５６を位置決めするために68Ｇａが注入されることを示唆する。
【０２２６】
実験の詳細
２つの異なる放射性標識技術を使用した。方法１においては、１００μｌのキレーター（ＣＰ−２５６、ＰＢＳ／重炭酸塩バッファー中２．３５ｍＭ、１．１７ｍＭ、５８９μＭ、１１７μＭ、３４μＭおよび１１．７μＭ；ｐＨ７〜７．５）を３００μｌのヒト血清と混合する。１０〜１５分後、２０μｌの６８Ｇａ溶出液を添加し、該溶液をプラスチック管中で３８℃でインキュベートした。第２の方法においては、２０μｌの68Ｇａ溶液を３００μｌのヒト血清に添加した。１５〜２０分後、１００μｌのキレーター（ＣＰ−２５６）を添加した。各時点で５０μｌのインキュベーション溶液をＰＤ−１０カラムの上部に適用し、ＰＢＳでカラムを溶出して０．５ｍｌ分画を集めた。ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｗｉｚａｒｄ  ３１４８０自動ガンマカウンター、サンプルあたり１０秒）で分画をカウントした。インキュベートした溶液を、エタノール沈殿によっても分析し、ペレットおよび遠心分離後の上清をカウントして、タンパク質に結合した68Ｇａを決定し、そして、遠心分離された上清を、０．１Ｍクエン酸ナトリウムを移動相とするＩＴＬＣ−ＳＧにより分析した。これらの条件において、「遊離の」68Ｇａは溶媒先端とともに移動し（Ｒｆ＝１）、68Ｇａ−ＣＰ２５６は起点に留まった（Ｒｆ＝０）。
【０２２７】
実施例１０−111ＩｎによるＣＰ２５６の標識
111Ｉｎ−塩化物は、ＩＴＬＣ−ＳＧ（ＨＳＡ）により決定して、５分後に約９０％の収率でＣＰ２５６（５８９μＭ）と錯体を形成する。該錯体は、ヒト血清中で２時間インキュベートした場合、ＰＤ１０サイズ排除クロマトグラフィーにより決定して、Ｉｎ−１１１の放出または血清タンパク質への結合が２％未満であることを示した（図８）。
【０２２８】
実験の詳細
酢酸塩バッファー（ｐＨ＝６）の５０μｌアリコートを、ＨＣｌ中の111ＩｎＣｌ3（７ＭＢｑ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を入れたバイアルに添加した。ＣＰ２５６の５８９μＭ溶液を、０．５ｍｇのＣＰ２５６を１ｍｌのＰＢＳに溶解することによって調製した。このＣＰ２５６溶液の１００μｌアリコートを上記111Ｉｎ溶液の５０μＬアリコートと混合した。５分間のインキュベーション後、111Ｉｎのスペシエーションを、先にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で飽和させて乾燥したＩＴＬＣ−ＳＧストリップを用いて分析した。５：２：１の比の水、エタノールおよびアンモニアでクロマトグラムを展開した。これらの条件下、111Ｉｎは起点に留まるが、111Ｉｎ−ＣＰ２５６は溶媒先端まで移動する。
【０２２９】
実施例１１−67Ｇａによるプレターゲティングモードを介する、抗体−ＣＰ２５６コンジュゲートのインビボでのイメージング
前炎症性マクロファージにより発現されたシアロアドヘシン抗原に対するモノクローナル抗体、ＳＥＲ４を、最初に抗体ジスルフィド結合を２−メルカプトエタノールで還元し、次いで、そうして形成したチオール基をＣＰ２５６−マレイミド（７）で処理することにより、ＣＰ２５６−マレイミド（７）とコンジュゲーションして、ＣＰ２５６−ＳＥＲ４を得た。
【０２３０】
以前に観察した（非公開データ）99mＴｃで標識したＳＥＲ４のマウス中での典型的な生体内分布は、主に脾臓、そしてある程度の肝臓での取り込みによる、循環からの急速なクリアランスを反映している。
【０２３１】
67ＧａでＣＰ２５６−ＳＥＲ４を標識することにより、67Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４が得られた。野生型マウスの群に、直接的に標識67Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４（グループ１）、または（コンジュゲーションしていない）ＳＥＲ４、続いて５分後に67Ｇａクエン酸塩（グループ２）またはＣＰ２５６−ＳＥＲ４、続いて67Ｇａクエン酸塩のいずれかを注入した。
【０２３２】
同じ実験を、シアロアドヘシンノックアウトマウスを用いても実施した。すべての動物を３時間後に殺し、放射能の生体内分布を決定した。
【０２３３】
結果を図９に示す。各器官について、グループ１についての生体内分布データを左側のカラムに示し、グループ２についての生体内分布データを中央のカラムに示し、そして、グループ３についての生体内分布データを右側のカラムに示した。
【０２３４】
グループ１は、67Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４の脾臓への強力なターゲティング（３６％ＩＤ／ｇ）を示したが、グループ２は、67Ｇａクエン酸塩の非常に低い脾臓による取り込みを示した（４％ＩＤ／ｇ）。一方、グループ３は、ＣＰ２５６−ＳＥＲ４の先行注入が67Ｇａクエン酸塩の脾臓による取り込みを４％ＩＤ／ｇから１０％ＩＤ／ｇまで増加させることができたことを示し、67Ｇａがかなりの程度まで抗体コンジュゲートの位置を追跡することを示唆している。
【０２３５】
グループ１はまた、循環血中の67Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４の高い放射能（３１％ＩＤ／ｇ）を示すが、67Ｇａクエン酸塩（グループ２）はそうでなく（７％ＩＤ／ｇ）；ＣＰ２５６−ＳＥＲ４の先行投与（グループ３）が、血液プール中の保持を７％から１６％ＩＤ／ｇまで増加させたことも示している。ノックアウトマウスは、脾臓ターゲティング挙動を示さず、このパターンがシアロアドヘシン発現に関連していることと一致する。これらの実験は、67Ｇａクエン酸塩の後からの注入による、ＣＰ２５６のプレターゲティングされた非標識バイオコンジュゲートのイメージングの実行可能性を実証する。
【０２３６】
実験の詳細
ＳＥＲ４へのＣＰ２５６のコンジュゲーションのために：リン酸塩緩衝食塩水中の２ｍｇ（５ｍｇ／ｍＬ）のＳＥＲ４抗体に、２５μＬの５０ｍＭのＥＤＴＡを添加した。得られた溶液中に存在する金属イオンをキレートするために、溶液を室温で１時間放置した。
【０２３７】
そして、５０，０００ｍｗｃｏのＶｉｖａｓｐｉｎ２超遠心管中で、３０００ｒｐｍ、３×１５分の遠心分離によって抗体を洗浄した。遠心分離ステップの合間に抗体を再懸濁し、０．１Ｍの金属を含まないリン酸塩バッファー、ｐＨ７の添加により２ｍＬの体積に調整した。濃縮し、洗浄した抗体を約３００μＬの０．１Ｍリン酸塩バッファー中に集めた。
【０２３８】
抗体の還元のために、０．１Ｍリン酸塩バッファー、ｐＨ７で、２−メルカプトエタノール（５μＬ）を２０μＬに希釈した。３．８μＬ（１０００倍過剰）の希釈した２−メルカプトエタノールを抗体に添加し、室温で３０分間、還元を進行させた。
【０２３９】
０．１Ｍリン酸塩バッファーの添加により体積を１ｍｌに調整し、還元した抗体をディスポーザブルのサイズ排除カラム（ＰＤ１０）に適用した。還元した抗体を含む分画を併合し、すぐに（０．７７ｍｇを８μＬのＤＭＳＯに溶解した、４０倍過剰の）ＣＰ２５６−マレイミドを加えた。コンジュゲーション反応を３７℃で３０分間加熱した。その後、５０，０００ｍｗｃｏのＶｉｖａｓｐｉｎ２超遠心管を先のように使用するが、０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー、ｐＨ６を過剰のリガンドを除去するために使用して、コンジュゲーションされた抗体を洗浄した。濃縮したＣＰ２５６−抗体を、０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー、ｐＨ６中に集めた。
【０２４０】
４５μＬの67Ｇａクエン酸塩（０．６〜０．７５ＭＢｑ）を９０μＬ（９０μｇ）のＣＰ２５６−ＳＥＲ４に添加することによって、67ガリウム放射性標識を実施した。リン酸塩緩衝食塩水で３５０μＬに希釈する前に、放射性標識を１０分間進行させた。２５μｇの標識抗体を含む注射液を調製した。標識抗体の分析を、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸塩バッファーを移動相として用いるサイズ排除ＨＰＬＣによって実施して、動物への注入の前に、良好な放射性標識が達成されたことを確認した。
【０２４１】
野生型マウスの群（Ｃ５７Ｂ１／６、雄性８〜１０週、一群あたりｎ＝２〜３）に、直接的に標識67Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４（グループ１）、または（コンジュゲーションしていない）ＳＥＲ４、続いて５分後に67Ｇａクエン酸塩（グループ２）、またはＣＰ２５６−ＳＥＲ４、続いて67Ｇａクエン酸塩のいずれかを注入した。各ケースにおいて使用した67Ｇａの放射能および抗体の量は同じであった。同じ実験を、ノックアウトマウス（シアロアドヘシンノックアウト、Ｃ５７Ｂ１／６、雄性８〜１０週、一群あたりｎ＝２〜３）を用いても実施した。すべての動物を３時間後に殺し、組織の外植および体重測定およびカウントにより、放射能の生体内分布を決定した。
【０２４２】
実施例１２−68Ｇａによるプレターゲティングモードを介する、抗体−Ｃ２５６コンジュゲートのインビボでのイメージング
実施例１１に記載のＣＰ２５６−マレイミドとコンジュゲーションしたＳＥＲ４（７）を、実施例７に上記した通りに68Ｇａで標識することにより、68ＧＡ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４が得られた。３回の別個の時に、野生型マウスの群（Ｃ５７Ｂ１／６、雄性８〜１０週、一群あたりｎ＝２〜３）に68Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４（グループ１）、または（コンジュゲーションしていない）ＳＥＲ４、続いて１時間後に68Ｇａ酢酸塩（グループ２）、またはＣＰ２５６−ＳＥＲ４、続いて１時間後に68Ｇａ酢酸塩（グループ３）のいずれかを注入した。
【０２４３】
すべての動物を68Ｇａ注入の１．５時間後に殺し、放射能の生体内分布を決定した。結果を図１０に示す。各器官について、グループ２についての生体内分布データを左側のカラムに示し、グループ３についての生体内分布データを中央のカラムに示し、そして、グループ１についての生体内分布データを右側のカラムに示した。
【０２４４】
グループ１は、68Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４の脾臓への強力なターゲティング（３つの実験にわたり、２０〜５０％ＩＤ／ｇ）を示したが、グループ２は、68Ｇａ酢酸塩の非常に低い脾臓による取り込みを示した（２〜５％ＩＤ／ｇ）。一方、グループ３は、ＣＰ２５６−ＳＥＲ４の先行注入が68Ｇａ酢酸塩の脾臓による取り込みを２〜５％ＩＤ／ｇから１７〜４０％ＩＤ／ｇまで増加させることができたことを示し、68Ｇａがかなりの程度まで抗体コンジュゲートの位置を追跡することを示唆している。これらの実験は、68Ｇａ酢酸塩の後からの注入による、ＣＰ２５６のプレターゲティングされた非標識バイオコンジュゲートのイメージングの実行可能性を実証する。
【０２４５】
グループ３からのマウスのＮａｎｏＰＥＴ／ＣＴ画像を図１１Ａに示す。該マウスは、ＣＰ２５６−ＳＥＲ４を用いる本発明のプレターゲティング方法を用いて撮像され：ＣＰ２５６−ＳＥＲ４に続いてＧａ−６８酢酸塩を注入した８週齢のＣ５７Ｂ１／６であった。該図は、標的化された肝臓／脾臓による取り込みを示す。比較のために、Ｇａ−６８酢酸塩のみを注射したマウスを図１１Ｂに示し、血液プール中の保持および関節への蓄積を示す。
【０２４６】
実験の詳細
実施例１１の記載のとおりに、抗体をＣＰ２５６にコンジュゲーションさせた。放射性標識のために、68Ｇａを68Ｇｅ／68Ｇａジェネレーターから溶出して実施例７に記載のように濃縮して、68Ｇａ酢酸塩を得た。１５０μＬ（１０５μｇ）のＣＰ２５６−ＳＥＲ４に１５０μＬの68Ｇａ酢酸塩（１６ＭＢｑ）を添加した。放射性標識反応を室温で５分間進行させた。３５μｇの放射性標識抗体を含む注射液を調製した。放射性標識抗体の分析を実施例１１に記載の通りに実施した。
【０２４７】
野生型マウス（Ｃ５７Ｂ１／６、雄性８〜１０週、一群あたりｎ＝２〜３）に、直接的に標識68Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４（グループ１）、または（コンジュゲーションしていない）ＳＥＲ４、続いて１時間後に68Ｇａ酢酸塩（グループ２）、またはＣＰ２５６−ＳＥＲ４、続いて１時間後に68Ｇａ酢酸塩のいずれかを注入した。各ケースにおいて使用した68Ｇａの放射能および抗体の量は同じであった。すべての動物を２〜３時間後に殺し、組織の外植および体重測定およびカウントにより、放射能の生体内分布を決定した。各グループからの１匹の動物を、ＮａｎｏＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Ｂｉｏｓｃａｎ）を用いてスキャンした。68Ｇａ酢酸塩または68Ｇａ−ＣＰ２５６−ＳＥＲ４の注入直後にスキャンを開始し、１．５時間継続した。
【０２４８】
参考文献
以下の参考文献は、すべての目的のために、その全体が参照することにより明示的に組み込まれる。
【０２４９】
【表１２】
0005986095.tif 000060
【図１】
0005986095.tif 000075
【図２】
0005986095.tif 000076
【図３】
0005986095.tif 000077
【図４】
0005986095.tif 000078
【図５】
0005986095.tif 000079
【図６ａ）】
0005986095.tif 000080
【図６ｂ）】
0005986095.tif 000081
【図７】
0005986095.tif 000082
【図８】
0005986095.tif 000083
【図９】
0005986095.tif 000084
【図１０】
0005986095.tif 000085
【図１１Ａ】
0005986095.tif 000086
【図１１Ｂ】
0005986095.tif 000087