(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｐ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｐ０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｐ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、またはＰ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１Ｒａのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する、単離されたタンパク質。
【請求項２】
タンパク質が、Ｐ０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｐ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｐ０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｐ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、またはＰ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
タンパク質が、Ｐ０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｐ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、またはＰ０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）に同一のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
タンパク質が、Ｐ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）に同一のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項５】
タンパク質が、Ｐ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）に同一のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項６】
タンパク質が、Ｐ０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｐ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｐ０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｐ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、またはＰ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）に少なくとも９０％同一である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項７】
タンパク質が、Ｐ０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｐ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｐ０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｐ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、またはＰ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）に少なくとも９５％同一である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項８】
タンパク質が、Ｐ０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｐ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｐ０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｐ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、またはＰ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）に少なくとも９８％同一である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項９】
タンパク質が、Ｐ０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｐ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｐ０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｐ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、またはＰ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）に対して１５以下の置換を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
タンパク質が、Ｐ０１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｐ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｐ０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）またはＰ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）に同一である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項１１】
タンパク質が、Ｐ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）に同一である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項１２】
タンパク質が、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａよりも大きな熱安定性を有する、請求項１〜１１のいずれかの請求項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
タンパク質が、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａよりも少なくとも２度高いＴｍを有する、請求項１〜１２のいずれかの請求項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質は、細胞シグナル伝達アッセイにおいて、ＩＬ−１β（０．１ｎｇ／ｍｌ）の阻害に対し１０ｎｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜１３のいずれかの請求項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質はヒトＩＬ−１Ｒａよりも高い親和性ＫＤ、遅い解離速度、および／または早い結合速度でＩＬ−１ＲＩに結合する、請求項１〜１４のいずれかの請求項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
請求項１−１５のいずれかに記載のタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１−１５のいずれかに記載のタンパク質を含む局所用医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１−１５のいずれかに記載のタンパク質を含む眼用医薬組成物。
【請求項１９】
水性であり、０．００１−５％の濃度でタンパク質を含む、請求項１６〜１８のいずれかの請求項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
免疫または炎症反応を調節するための、１６〜１９のいずれかの請求項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
全身性自己免疫障害を有するまたはそのリスクがある被験体を治療するための、１６〜２０のいずれかの請求項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
関節リウマチを有するまたはそのリスクがある被験体を治療するための、１６〜２０のいずれかの請求項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ドライアイ疾患またはアレルギー性結膜炎を有するまたはそのリスクがある被験体を治療するための、１６〜２０のいずれかの請求項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質をコードする配列を含む単離核酸。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質をコードする配列を含む単離核酸ベクターであって、前記配列は、転写制御配列に動作可能に結合される、単離核酸ベクター。
【請求項２６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質をコードする組換え核酸を含む、組換え宿主細胞。
【請求項２７】
大腸菌宿主細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
組換えタンパク質を調製する方法であって、
請求項２６または２７に記載の宿主細胞を、組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること；
前記組換えタンパク質を細胞ライセートまたは細胞培地から精製すること；および
被験体への投与のために、前記組換えタンパク質を製剤化すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照および優先権の主張
本出願は、２０１０年７月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／３６８，７９９号、２０１１年１月２５日に出願された第６１／４３６，１７８号、２０１１年１月２５日に出願された第６１／４３６，１８４号、２０１１年６月６日に出願された第６１／４９３，９６６号、および２０１１年６月６日に出願された第６１／４９３，９６７号について優先権を主張し、米国特許出願に関し、２０１０年７月２９日に出願された第６１／３６８，７９９号、２０１１年１月２５日に出願された第６１／４３６，１８４、および２０１１年６月６日に出願された第６１／４９３，９６７号を参照により組み込む。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）およびβ（ＩＬ−１β）は、免疫調節サイトカインのファミリーのプロトタイプメンバーであり、免疫系の制御においていくつかの顕著な役割を有する。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、インターロイキン−１受容体Ｉ（ＩＬ−１ＲＩ）に結合し、二次受容体、インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）の結合へと導く。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βにより刺激されたシグナル伝達は増幅Ｔ細胞応答へと導き、未処理Ｔ細胞の増殖および生存およびＴＨ１７細胞の発生が含まれる。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書では、とりわけ、障害を治療するために、細胞受容体ならびに他の薬剤を検出しおよび／または結合するために、インターロイキン−１受容体Ｉ（ＩＬ−１ＲＩ）に応答する細胞シグナル伝達を調節するために使用することができる非自然発生的サイトカインドメインを特徴とする。
【０００４】
１つの態様では、この開示は少なくとも２つの親サイトカインドメイン由来のアミノ酸残基、例えば、少なくとも２つの親サイトカインドメイン由来の受容体結合特徴、表面特徴、βストランド、およびループを含む、サイトカインドメインを含む単離タンパク質を特徴とする。
【０００５】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインはＩＬ−１ＲＩに結合し、異なる親サイトカインドメイン由来、例えば、受容体アゴニストおよび受容体アンタゴニスト（例えばＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａ、またはＩＬ−１αおよびＩＬ−１Ｒａ）由来、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１α由来、またはＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１Ｒａの３つ全て由来の受容体結合特徴を含む。受容体結合特徴は、サイトＡおよびＢにおける残基、セグメント、または領域に対応する。サイトＡおよびＢに対応するそのような残基、セグメント、および領域に関しては、ＩＬ−１（ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、およびＩＬ−１Ｒａ）との関連で、さらに下記定義を参照されたい。
【０００６】
サイトＡに関しては、サイトカインドメインは下記を有し得る：（ａ）（ｉ）第１の親サイトカインドメインにおける対応する残基に少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるサイトＡ残基；（ａ）（ｉｉ）第１の親サイトカインドメインにおける対応する残基に少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一である拡張サイトＡ残基；（ａ）（ｉｉｉ）第１の親サイトカインドメインの対応する領域に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一であるサイトＡセグメントＡ１およびＡ２；および／または（ａ）（ｉｖ）第１の親サイトカインドメインの対応する領域に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一であるサイトＡ領域。
【０００７】
サイトＢに関しては、サイトカインドメインは下記を有し得る：（ｂ）（ｉ）第２の親サイトカインドメインにおける対応する残基に少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるサイトＢ残基；（ｂ）（ｉｉ）第２の親サイトカインドメインにおける対応する残基に少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一である拡張サイトＢ残基；（ｂ）（ｉｉｉ）第２の親サイトカインドメインの対応する領域に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一であるサイトＢセグメントＢ１、Ｂ２、およびＢ３および／または（ｂ）（ｉｖ）第２の親サイトカインドメインの対応する領域に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一であるサイトＢ領域。
【０００８】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、特徴（ａ）（ｉ）およびｂ（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）およびｂ（ｉｉ）、（ａ）（ｉｉｉ）および（ｂ）（ｉｉｉ）、または（ａ）（ｉｖ）および（ｂ）（ｉｖ）を含み、例えば、ここで、各特徴はさらに、８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一性により規定される。例えば、第１の親サイトカインドメインはＩＬ−１βとすることができ、第２の親サイトカインドメインはＩＬ−１Ｒａとすることができる。例えば、第１の親サイトカインドメインはＩＬ−１αとすることができ、第２の親サイトカインドメインはＩＬ−１Ｒａとすることができる。
【０００９】
サイトカインドメインはまた、ドメイン内の１つ以上の位置に第２の親サイトカインドメイン由来のアミノ酸を含むことができ、これはサイトカイン二次受容体（例えば、ＩＬ−１ＲＡｃＰ）との相互作用を障害する。例えば、第２の親サイトカインドメインはＩＬ−１Ｒａである。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＩＬ−１Ｒａ由来の１つ以上のサイトＣおよび／またはＤセグメント（例えば、Ｃ１、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、および／またはＤ５）、またはそのようなセグメントに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一な配列を含む。例えば、サイトカインドメインは下記を含む：（ｉ）ＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるサイトＣ残基、（ｉｉ）ＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるサイトＤ残基、（ｉｉｉ）ＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に少なくとも７０、７５、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるＣ１セグメント；または（ｉｖ）ＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に少なくとも３、４、５残基で同一であるＤ２セグメント。サイトカインドメインは特徴（ｉ）および（ｉｉ）、または（ｉｉ）および（ｉｉｉ）、（例えば、ここで、各特徴はさらに、８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一性により規定される）、または（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含むことができる。
【００１０】
ドメインは、少なくとも２つの異なるヒトＩＬ−１ファミリーサイトカインドメイン由来の領域を含むことができ、領域は、Ａ領域（Ａ１およびＡ２セグメントを有する）、Ｂ領域（Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３セグメントを有する）、Ｃ領域、およびＤ領域（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５セグメントを有する）からなる群より選択される。
【００１１】
サイトカインドメインは、異なるサイトカインドメイン由来のサイトＡ領域およびサイトＢ領域を含むことができる。サイトＡ領域は、自然発生的受容体アゴニストまたはアンタゴニスト由来とすることができ；サイトＢ領域は、自然発生的受容体アゴニスト由来とすることができる。自然発生的受容体アンタゴニスト由来のサイトＣ領域および／または自然発生的受容体アンタゴニスト由来のサイトＤ領域を含むことができる。
【００１２】
例えば、ドメインは、少なくとも５、６、１０、１５、２０、または２５アミノ酸長であり、少なくとも２つ異なる親サイトカインドメイン、例えば第１および第２の親サイトカインドメイン由来の対応するセグメントに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一であるセグメントを有するキメラドメインとすることができる。親サイトカインドメインは、ＩＬ−１ＲＩ結合サイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＩＬ−１α、およびＩＬ−１Ｒａとすることができる。いくつかの実施形態では、第１の親サイトカインドメイン由来のセグメント中に存在しないアミノ酸は、２つ以上の他の親サイトカインドメインに由来する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、第１の親サイトカインドメインの対応するセグメントに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である、少なくとも５、６、１０、１５、２０、または２５アミノ酸長の少なくとも２つのセグメントを含み、そのようなセグメント中にないアミノ酸は、主に第２の親サイトカインドメインにおける対応する残基に（例えば、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％）同一である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、（ｉ）第１の親サイトカインドメインの対応するセグメントに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である、少なくとも５、６、１０、１５、２０、または２５アミノ酸長の少なくとも２つのセグメントおよび（ｉｉ）第２の親サイトカインドメインに同一である、例えば、少なくとも５、６、７、８、１０、または１５アミノ酸長の少なくとも１、２または３つのセグメントを含む。
【００１５】
例えば、サイトカインドメインは、２０−５０、２５−５０、３０−４５、または３０−４０アミノ酸（例えば、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０）の第１のセグメント、および２０−４５、２０−４０、２５−４０、または２５−３５アミノ酸（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）の第２のセグメント（それぞれ第１の親サイトカインドメイン（例えば、ＩＬ−１Ｒａ）に同一（または少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または９８％同一））、および第２の親サイトカインドメイン（例えば、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１α）に同一（または少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または９８％同一）である第３のセグメントを含むことができる。例えば、第３のセグメントは、５５−９０、６０−９０、６０−８５、または７０−８５アミノ酸長、例えば、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５アミノ酸長とすることができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では：第１のセグメントは、ＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、本明細書ではＡ１セグメントとも呼ばれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の残基１６−４０およびＩＬ−１βナンバリングによる残基１１−３６に対応する）に対し少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％のセグメントとすることができる。第２のセグメントは、残基１２１−１３９または１２１−１４０（ＩＬ−１βナンバリングによる）に対応するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＩＬ−１Ｒａ）の残基１２０−１４０または１２０−１４１に対し少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％のセグメントとすることができる。第３のセグメントは、ＩＬ−１β由来の残基４５−１００または４２−１２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に対し少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％とすることができる。
【００１７】
場合によっては、第１のセグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の残基１４−４５（ＩＬ−１βナンバリングによる残基９−４１に対応する）に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％のセグメントとすることができる。第２のセグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の残基１２０−１４５（ＩＬ−１βナンバリングによる残基１２１−１４５に対応する）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の残基１２０−１４７（ＩＬ−１βナンバリングによる残基１２１−１４７に対応する）に対し少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％のセグメントとすることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも残基１１−４１および１２０−１４７（ＩＬ−１βナンバリングによる）は、ＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に合わせて少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第１のＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインのセグメントの１つの末端は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４１の５、４、３、２、または１のアミノ酸内に位置し、第１のＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインのセグメントの１つの末端は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１２１の５、４、３、２、または１のアミノ酸内に位置する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸４２の５、４、３、２、または１のアミノ酸内の位置のＮ−末端およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１２０の５、４、３、２、または１のアミノ酸内のC末端を有するセグメント、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１２１の５、４、３、２、または１のアミノ酸内の位置のＮ−末端およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１４５の５、４、３、２、または１のアミノ酸内のC末端を有するセグメントを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、１１−４１および１２０−１４７（ＩＬ−１βナンバリングによる）に対応する位置のドメイン中の残基は、合わせてＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一である。ドメインはまた、ＩＬ−１サイトカインファミリーメンバー由来の、例えば、前記に類似する位置の配列に基づくことができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは１、２、３つ以上の下記配列を含む：ＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；ＮＬＥＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；ＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；ＡＭＥＡＤＱＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；ＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；および／または前記に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一の配列。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、１、２、３つ以上の下記配列を含む：ＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；ＫＫＫＭＥＫＲＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）；およびＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮ  ＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；および／または前記に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一の配列。
【００２２】
いくつかの実施形態では、β１β２、β２β３、β８β９およびβ１０β１１ループの１つ以上または全てがＩＬ−１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１Ｒａ由来の対応するループに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、β４β５、β５β６、β６β７およびβ７β８ループの１つ以上または全てが、β１β２、β２β３、β８β９およびβ１０β１１ループに最も類似するヒト親サイトカインとは異なるIＬ−１ファミリーサイトカインドメイン由来の対応するループに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である。例えば、β４β５、β５β６、β６β７およびβ７β８ループの１つ以上または全てが、ＩＬ−１アゴニスト、例えばＩＬ−１β由来のそのようなループに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、β１１β１２ループはＩＬ−１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１Ｒａ由来の対応するループに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＩＬ−１Ｒａのβストランドβ２、β３、β１０およびβ１１の１、２、３、または全てに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＩＬ−１βのβ４、β６、β７、およびβ８、またはＩＬ−１βのβ４、β５、β６、β７、およびβ８の１、２、３、または全てに少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸Ｉ４６−Ｇ５９、Ａ５５−Ｇ５９、Ａ５５−Ｖ８３、Ｉ６０−Ｖ８３、Ｎ８４−Ｄ９５、Ｉ４６−Ｓ１１０、Ｖ４９−Ｓ１１０、またはＩ４６−Ｇ１１８に８０、８５、９０、９５、または１００％超同一であるセグメントを含まない。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸Ｎ７−Ｖ４１、Ｒ１１−Ｍ３６、Ｎ１０２−Ｄ１４５、またはＹ１２１−Ｄ１４５に８０、８５、９０、９５、または１００％超同一であるセグメントを含まない。
【００２５】
一般に、サイトカインドメインは、自然発生的ではない。ヒトＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインとは異なる。例えば、ＩＬ−１Ｒａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＩＬ−１β（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、および／またはＩＬ−１α（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に９８、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、または５５％未満同一である。サイトカインドメインはまた、そのようなサイトカインに少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０％同一とすることができる。例えば、キメラドメインは、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１αに３０−９５％、４０−９０％、または４５−８５％同一とすることができる。例えば、キメラドメインは、ＩＬ−１βに４０−９０％同一およびＩＬ−１Ｒａに３５−８５％同一；ＩＬ−１βに４０−８０％同一およびＩＬ−１Ｒａに４５−８０％同一；ＩＬ−１βに４５−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに４５−８０％同一；ＩＬ−１βに４５−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５３−８０％同一；ＩＬ−１βに５０−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５３−７０％同一；ＩＬ−１βに６０−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５３−６８％同一；ＩＬ−１βに６５−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５４−６０％同一；またはＩＬ−１βに６８−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５４−５７％同一とすることができる。例えば、キメラドメインは、ＩＬ−１αに４０−９０％同一およびＩＬ−１Ｒａに３５−８５％同一；ＩＬ−１αに４０−８０％同一およびＩＬ−１Ｒａに４５−８０％同一；ＩＬ−１αに４５−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに４５−８０％同一；ＩＬ−１αに４５−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５３−８０％同一；ＩＬ−１αに５０−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５３−７０％同一；ＩＬ−１αに６０−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５３−６８％同一；ＩＬ−１αに６５−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５４−６０％同一；またはＩＬ−１αに６８−７２％同一およびＩＬ−１Ｒａに５４−５７％同一とすることができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインはＩＬ−１Ｒａと異なり、受容体に結合し、自然発生的受容体アンタゴニスト（例えばＩＬ−１Ｒａ）に特徴的なサイトＣおよび／またはサイトＤを含む。例えば、ドメインは、ヒトＩＬ−１βおよび／ＩＬ−１Ｒａから９８、９５、９２、９０、８５、および８０％未満同一である。例えば、ドメインは、ＩＬ−１Ｒａに４０−９５％、４０−９０％または４５−８５％同一である。ドメインはまた、ＩＬ−１ファミリーサイトカインアゴニスト、例えばＩＬ−１αまたはＩＬ−１βに対し４０−９５％、４０−９０％または４５−８５％とすることができる。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは下記を含む：サイトカインシグナル伝達のアゴニストである第１の親サイトカインドメイン由来の少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０または８５％のアミノ酸。
【００２７】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）よりも受容体アゴニスト（例えばＩＬ−１βまたはＩＬ−１α）に対しより大きなアミノ酸同一性（例えば、少なくとも５、１０、１５、または２０％超）を有するが、ＩＬ−１ＲＩのアンタゴニストとして機能する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは完全にキメラであり、例えば、ドメイン内の各アミノ酸は、親サイトカインドメインの１つ、例えば、２つの親サイトカインドメインの１つまたは３つ以上の親サイトカインドメインの１つ由来である。例えば、親サイトカインドメインはヒトサイトカインドメインまたは非ヒト霊長類サイトカインドメインである。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは部分的にキメラであり、例えば、ドメイン内のアミノ酸全てが、親サイトカインドメインの１つに由来するわけではない。
【００２９】
例えば、単離タンパク質はＩＬ−１ＲＩに結合し、受容体によるシグナル伝達を調節する、例えば、ＩＬ−１ＲＩ受容体シグナル伝達活性を刺激するまたは拮抗する。いくつかの実施形態では、タンパク質はＩＬ−１β応答性ヒト細胞に接触されると実質的にはＩＬ−６産生を誘導せず、および／または例えば、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌの濃度では、ＩＬ−１β応答性レポーター遺伝子の産生を実質的には誘導しない。一般に、タンパク質は、ＩＬ−１βによるシグナル伝達を阻害し（例えば、本明細書で記載される細胞アッセイにおけるように０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で）、ＩＣ５０は１００、５０、２０、１０、または５ｎＭ未満である。タンパク質は、ＩＬ−１βによるシグナル伝達を阻害することができ、ＩＣ５０はＩＬ−１Ｒａのそれより低く、例えば、少なくとも１０、２０、または５０％低い。
【００３０】
ある実施形態では、サイトカインドメインは例えば、親サイトカインドメインの１つと同じか、または良好な親和性で結合する。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＩＬ−１ＲＩに１００、５０、２０、１０、５、または１ｎＭ未満、あるいは５００、４００、１００、または５０ｐＭ未満のＫＤで結合する。例えば、会合定数は、１×１０４、３×１０４、１×１０５、または１×１０６Ｍ−１ｓ−１超とすることができ、解離は１×１０−３、１×１０−４、６×１０−４、または６×１０−５ｓ−１未満とすることができる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインはＩＬ−１ＲＩに、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１Ｒａよりも、より良好な親和性（例えば、より低いＫＤ）および／またはより遅い解離速度で結合する。例えば、サイトカインドメインは、ＩＬ−１ＲＩにＩＬ−１Ｒａのそれ以下の解離定数で、および／またはＩＬ−１βのそれ以上の会合定数で結合することができる。
【００３２】
サイトカインドメインは、約１２０−１８０、１４０−１７０、または１４８−１６０、または１５０−１５６アミノ酸長とすることができる。いくつかの実施形態では、ドメインは１５２または１５３アミノ酸長である。典型的には、ドメインは少なくとも１０、１１、または１２のβ−ストランドを含み、安定に折り畳まれる。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、本明細書で記載されるように、少なくとも３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、または６４℃のＴｍを有する。５１−６１、５１−６６、５６−６１、または５６−６６℃のＴｍを有することができる。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、少なくとも４８、５０、５１、５５、５７、５８、または５９℃までアンフォールディングし始めない。例えば、生理的緩衝液中で、ＩＬ−１Ｒａおよび／またはＩＬ−１βのＴｍの少なくとも１０℃または５℃以内であるＴｍを有する。いくつかの実施形態では、生理的緩衝液中で、ＩＬ−１Ｒａおよび／またはＩＬ−１βよりも熱安定性である。例えば、ドメインは、生理的緩衝液中で、ＩＬ−１Ｒａおよび／またはＩＬ−１βのＴｍよりも少なくとも２、４、６、７、または８℃高い、例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＩＬ−１Ｒａおよび／またはＩＬ−１βのＴｍよりも約５−１２、５−１０、または７−１０℃高いＴｍを有することができる。
【００３３】
タンパク質は、本明細書で記載される他の特徴を含むことができる。
【００３４】
別の態様では、本開示は、キメラＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインを含む単離タンパク質を特徴とする。ＩＬ−１サイトカインファミリーメンバーの例としては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１Ｆ５、ＩＬ−１Ｆ６、ＩＬ−１Ｆ７、ＩＬ−１Ｆ８、ＩＬ−１Ｆ９、ＩＬ−１Ｆ１０、およびＩＬ−３３が挙げられる。サイトカインドメインは、前記サイトカインの１つの受容体結合領域または１つ以上のそのようなサイトカインの要素を含むタンパク質配列を含むことができる。例えば、サイトカインドメインは、２つ以上のＩＬ−１サイトカインファミリーメンバーのキメラを含むことができる。
【００３５】
１つの実施形態では、キメラドメインは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０アミノ酸の長さの、第１のＩＬ−１ファミリーサイトカインに対しアミノ酸同一性（または少なくとも８０、８２、８５、８７、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一性）を有する少なくとも１つのセグメント、および少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０アミノ酸の長さの、第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインに対しアミノ酸同一性（または少なくとも８０、８２、８５、８７、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一性）を有する別のセグメントを含む。キメラドメインは、第１および第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインの１つまたは両方に９０、８５、８０、７５％未満同一とすることができる。
【００３６】
１つの実施形態では、第１および第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインはＩＬ−１β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１Ｒａからなる群より選択される。別の実施形態では、第１および第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインは、ＩＬ−１Ｆ５、ＩＬ−１Ｆ６、ＩＬ−１Ｆ７、およびＩＬ−１Ｆ８からなる群より選択される。別の実施形態では、第１のＩＬ−１ファミリーサイトカインはアゴニストの群から選択され、第２は、アンタゴニストの群から選択される。いくつかの実施形態では、キメラドメインは同じ親サイトカインドメイン由来の１２０、１１０、１００、９０、または８０より少ない近接アミノ酸を含む。
【００３７】
１つの実施形態では、キメラドメインは、少なくとも位置５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０で第１のＩＬ−１ファミリーサイトカインに同一であり、少なくとも位置５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０（個々に、そのようなサイトカインの両方に同一であり得る位置を含む）で第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインに同一である。
【００３８】
１つの実施形態では、キメラドメインは、少なくとも２、３、または４つの不連続セグメントを含み、それぞれ、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、または２０アミノ酸の長さであり、第１のＩＬ−１ファミリーサイトカインの対応するセグメントに対しアミノ酸同一性（または少なくとも８０、８２、８５、８７、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一性）を有し、残りの位置では主に第２のＩＬ−１ファミリーサイトカイン由来のアミノ酸を含む。１つの実施形態では、キメラドメインは４、５、６、または７つのセグメントを含み、隣接セグメントは、異なる親ＩＬ−１ファミリーサイトカインドメイン由来である。例えば、ドメイン中の各アミノ酸は、自然発生的ヒトＩＬ−１ファミリーサイトカインドメイン由来の少なくとも５または６つのアミノ酸長のペプチド中に位置する。１つの実施形態では、キメラドメインは、少なくとも１、２、または３つの下記を含む：（ｉ）ＩＬ−１β由来の少なくとも５０、６０、６５、７０、または７５アミノ酸長のセグメント、（ｉｉ）ＩＬ−１Ｒａ由来の少なくとも１５、２０、２５アミノ酸長のセグメント；および（ｉｉｉ）ＩＬ−１Ｒａ由来の少なくとも１５、２０、２５アミノ酸長の別のセグメント。
【００３９】
１つの実施形態では、不連続セグメントは、ＩＬ−１βにおけるそのような位置のナンバリングに従い、残基（ｉ）１−６および４５−６１、（ｉｉ）１−６および８６−９５、（ｉｉｉ）４５−６１および８６−９５、（ｉｖ）１−６および１４８−１５３、（ｖ）４５−６１および１４８−１５３、または（ｖｉ）８６−９５および１４８−１５３を含む。第１のＩＬ−１ファミリーサイトカイン由来の３つの不連続セグメントは、例えば、ＩＬ−１βにおけるそのような位置のナンバリングに従い、残基１−８、４２−１２０、および１４１−１５３、残基１−１０、３７−１２５、および１３１−１５３、または残基１−６、４５−６１、８６−９５、および１４８−１５３を含むことができる。キメラドメインは、残りの位置で第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインに少なくとも８０、８２、８５、８７、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であり得る。１つの実施形態では、不連続セグメントの境界の１つ以上が第１および第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインが同一である、または保存されている位置に配置される。タンパク質は、本明細書で記載される他の特徴を有することができる。
【００４０】
別の態様では、この開示は、ＩＬ−１ＲＩに結合するＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインを含む単離されたＩＬ−１阻害剤を特徴とする。例えば、ＩＬ−１阻害剤は上記または本明細書の別の箇所の１つ以上の特徴を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは下記を含む：
（ａ）下記位置：ＡＲＧ１１、ＳＥＲ１３、ＧＬＮ１４、ＧＬＮ１５、ＧＬＵ２５、ＬＹＳ２７、ＬＥＵ２９、ＨＩＳ３０、ＬＥＵ３１、ＧＬＮ３２、ＧＬＹ３３、ＧＬＮ３４、ＡＳＰ３５、ＭＥＴ３６、ＧＬＮ３８、ＧＬＮ３９、ＡＬＡ１２７、ＧＬＵ１２８、ＡＳＮ１２９、ＭＥＴ１３０、およびＧＬＮ１４１（ＩＬ−１βのナンバリングによる）、でＩＬ−１Ｒａに同一なアミノ酸、および
（ｂ）下記位置：ＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＶＡＬ３、ＡＲＧ４、ＬＥＵ６、ＰＨＥ４６、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＳＥＲ５２、ＡＳＮ５３、ＬＹＳ５５、ＩＬＥ５６、ＰＲＯ５７、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、ＬＹＳ９４、ＬＹＳ１０３、ＧＬＵ１０５、ＡＳＮ１０８、ＧＬＮ１４９、ＰＨＥ１５０、およびＳＥＲ１５２、でＩＬ−１βに同一なアミノ酸。
いくつかの実施形態では、サイトＡセグメントＡ１およびＡ２は、ＩＬ−１Ｒａの対応するセグメントに少なくとも８０％同一（まとめて）である。いくつかの実施形態では、サイトＢセグメントＢ１、Ｂ２、およびＢ３は、ＩＬ−１βの対応するセグメントに少なくとも８０％同一（まとめて）である。例えば、サイトＡセグメントＡ１およびＡ２は、ＩＬ−１Ｒａの対応するセグメントに少なくとも９０％同一（まとめて）であり；サイトＢセグメントＢ１、Ｂ２、およびＢ３はＩＬ−１βの対応するセグメントに少なくとも９０％同一（まとめて）である。例えば、サイトＡセグメントＡ１およびＡ２は、ＩＬ−１Ｒａの対応するセグメントに同一であり；サイトＢセグメントＢ１、Ｂ２、およびＢ３はＩＬ−１βの対応するセグメントに同一である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＩＬ−１Ｒａのβストランドβ２、β３、β１０およびβ１１に少なくとも８０％同一（まとめて）である配列およびＩＬ−１βのβストランドβ４、β６、β７、およびβ８に少なくとも８０％同一（まとめて）である配列を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＩＬ−１Ｒａのβストランドβ２、β３、β１０およびβ１１に同一である配列およびＩＬ−１βのβストランドβ４、β６、β７、およびβ８に同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１βから上記で同定されたセグメントおよび特徴はＩＬ−１α、またはＩＬ−１βもしくはＩＬ−１αの組み合わせに由来する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１阻害剤は、下記特性の１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、または７つ）を含む：（ｉ）ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、またはＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に少なくとも６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるサイトＡまたはサイトＢ残基（および／または拡張サイトＡおよび拡張サイトＢ残基）；（ｉｉ）ＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に合わせて少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるＡ１およびＡ２セグメント；（ｉｉｉ）ＩＬ−１βまたはＩＬ−１αにおける対応する残基に合わせて少なくとも８０％同一であるＢ１、Ｂ２、およびＢ３セグメント；（ｉｖ）ＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるサイトＡ領域；（ｖ）ＩＬ−１βまたはＩＬ−１αにおける対応する残基に対して少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％であるサイトＢ領域；（ｖｉ）ＩＬ−１ＲａまたはＩＬ３６Ｒａにおける対応する残基に少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるサイトＣおよび／またはサイトＤ残基、（ｖｉｉ）ＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に少なくとも７０、７５、８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一であるＣ１セグメント；（ｖｉｉｉ）ＩＬ−１Ｒａにおける対応する残基に少なくとも３、４、または５残基で同一であるＤ２セグメント。サイトカインドメインは、ＩＬ−１Ｒａとは異なり、例えば、サイトカインドメインは、ＩＬ−１Ｒａに９９、９８、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０％未満同一であり、および／またはＩＬ−１Ｒａに少なくとも３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０％同一であり、例えば、ＩＬ−１Ｒａに４０−９５％、４０−９０％、または４５−８５％同一である。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸Ｉ４６−Ｇ５９、Ａ５５−Ｇ５９、Ａ５５−Ｖ８３、Ｉ６０−Ｖ８３、Ｎ８４−Ｄ９５、Ｉ４６−Ｓ１１０、Ｖ４９−Ｓ１１０、またはＩ４６−Ｇ１１８に８０、８５、９０、９５、または１００％超同一であるセグメントを含まない。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸Ｎ７−Ｖ４１、Ｒ１１−Ｍ３７、Ｎ１０２−Ｄ１４４、またはＹ１２１−Ｄ１４４に８０、８５、９０、９５、または１００％超同一であるセグメントを含まない。
【００４３】
いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＩＬ−１ＲＩに結合し、ＫＤは１００、５０、２０、１０、５、または１ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１Ｒａよりも良好な親和性（例えば、より低いＫＤ）および／またはより遅い解離速度で、ＩＬ−１ＲＩに結合する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＩＬ−１β応答性ヒト細胞と接触されても実質的にＩＬ−６発現を誘導しない。一般に、阻害剤はＩＬ−１βによるシグナル伝達を阻害し、例えば、ＩＣ５０は１００、５０、２０、１０、または５ｎＭ未満である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、１、２、３つ以上の下記配列を含む：ＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；ＮＬＥＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；ＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；ＡＭＥＡＤＱＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；ＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；および／または前記に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一な配列。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、１、２、３つ以上の下記配列を含む：ＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；ＫＫＫＭＥＫＲＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）；およびＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮ  ＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；および／または前記に少なくとも８０、８５、８８、９０、９２、９５、９８、または１００％同一な配列。阻害剤は本明細書で記載される他の特徴を含むことができる。
【００４６】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示される配列、例えば、表４または実施例１で列挙される配列、例えば、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、Ｐ０６、またはＰ０７のアミノ酸配列、または実施例１、５、６、または本明細書の他の場所における配列に少なくとも８０、８２、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。アミノ酸配列は、１５、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２より少ない非保存的置換または１５、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２より少ない総置換を含むことができる。アミノ酸配列は少なくとも１、２、３、４、または５つの置換、例えば、保存的置換を含むことができる。
【００４７】
Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、Ｐ０６、またはＰ０７のアミノ酸配列、または実施例１、５、６、または本明細書の他の場所における配列に対するメチオニンＮ末端を含む単離タンパク質、およびＰ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、Ｐ０６、またはＰ０７のアミノ酸配列、または実施例１、５、６または本明細書の他の場所の配列を含み、ここで、Ｎ−末端のアラニンが存在しない単離タンパク質もまた提供される。前記配列は、本明細書で開示される他の特徴を含むことができる。例えば、配列はさらに、タグ、例えばヘキサヒスチジン配列、例えば、ＩＬ−１ＲＩ結合配列に対するＮまたはＣ末端を含むことができる。配列はさらに、ＩＬ−１ＲＩ結合配列の安定性または薬物動態を修飾する部分を含むことができる。配列はさらに、血清アルブミンおよび／またはＦｃドメイン、またはその１つ以上のドメイン、例えば、１つ以上の免疫グロブリン定常ドメインまたは１つ以上のアルブミンドメインを含むことができる。タンパク質は本明細書で記載される他の特徴を有することができる。いくつかの実施形態では、単離タンパク質は、本明細書で開示される配列またはキメラドメインから構成され、または本質的に構成される。
【００４８】
さらに別の態様では、本開示は本明細書で記載されるサイトカインドメイン、例えば、表４に列挙されるサイトカインドメインおよび／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含むドメインの循環置換形態を有するドメインを含む単離タンパク質を提供する。タンパク質はさらに、置換え済形態のＮまたはＣ末端に、任意でリンカーにより離された異種配列（例えば、Ｆｃドメインまたはアルブミン）を含むことができる。タンパク質は本明細書で記載される他の特徴を有することができる。
【００４９】
本開示はまた、本明細書で記載される１つ以上の受容体結合剤（例えば、キメラサイトカインドメインを含むタンパク質）を含む医薬組成物を特徴とする。組成物は眼用医薬組成物、局所用組成物、非経口投与のための組成物とすることができる。
【００５０】
別の態様では、本開示は被験体において免疫または炎症反応を調節する方法を特徴とする。方法は、本明細書で記載される受容体結合剤を含む組成物を、被験体において免疫または炎症反応を調節するのに有効な量で、被験体に投与することを含むことができる。
【００５１】
別の態様では、本開示は被験体においてＩＬ−１媒介障害を治療する方法を特徴とする。方法は、ＩＬ−１ＲＩに結合することができるタンパク質、例えば、本明細書で記載される受容体結合剤を含む組成物を被験体に投与することを含む。例えば、障害は自己免疫障害、例えば、関節リウマチまたは若年性関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、炎症性腸疾患、喘息、血管炎、または乾癬とすることができる。障害は、凝集物形成と関連する障害、例えば、高尿酸血症、痛風、糖尿病（インスリン非依存性糖尿病を含む）、アルツハイマー病、続発性反応性アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、またはパーキンソン病とすることができる。障害はまた、ＣＡＰＳ（ＣＩＡＳ１関連周期性症候群）障害または本明細書で記載される他の障害とすることができる。
【００５２】
別の態様では、本開示は被験体においてＩＬ−１媒介眼障害を治療する方法を特徴とする。方法は、ＩＬ−１ＲＩに結合することができるタンパク質、例えば、本明細書で記載される受容体結合剤を含む組成物を被験体に投与することを含むことができる。例えば、組成物は、被験体の眼または周囲領域に局所的に投与される眼用組成物である。１つの実施形態では、障害は、ドライアイ障害である。いくつかの実施形態では、被験体は、全身性自己免疫疾患の徴候を示さない。いくつかの実施形態では、被験体はシェーグレン症候群を有する。いくつかの実施形態では、被験体は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有する。さらに他の実施形態では、障害はブドウ膜炎である。
【００５３】
さらに別の態様では、本開示はＩＬ−１活性を阻害する方法を特徴とする。方法は、ＩＬ−１ＲＩに結合することができる受容体結合剤を、ＩＬ−１に応答する細胞または被験体に接触させることを含む。一般に、タンパク質は、細胞と関連する、または被験体において、ＩＬ−１活性を阻害するのに有効な量で提供される。タンパク質は、エクスビボで被験体由来の細胞に接触させることができる。
【００５４】
別の態様では、この開示は、本明細書で記載されるタンパク質をコードする１つ以上の配列または本明細書で開示される核酸（例えば、表５において）、そのような核酸にハイブリダイズする、またはそのような核酸に８０、８２、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％または１００％同一である配列を含む単離核酸を特徴とする。例示的なハイブリダイズ配列は、少なくとも２００、３００、４００、４２０、または４５０ヌクレオチド長、例えば、４２０−４８０ヌクレオチド長とすることができる。核酸はまた、本明細書で開示される他の特徴を含むことができる。
【００５５】
本明細書で記載されるタンパク質およびそのポリペプチド鎖をコードする１つ以上の配列を含む核酸を含む組換え宿主細胞もまた特徴とする。受容体結合剤は、宿主細胞を、受容体結合剤の発現を可能にする条件下で維持し、任意で受容体結合剤を、例えば、細胞または宿主細胞と関連する培地から回収することを含む方法により生成させることができる。例えば、受容体結合剤は、細胞由来のライセートから精製することができる。精製された受容体結合剤は、例えば、１つ以上の賦形剤、安定剤、緩衝剤と共に製剤化することができる。
【００５６】
キメラタンパク質ドメインを提供する方法もまた特徴とする。方法は、共通の折り畳みを有する少なくとも２つの親タンパク質を同定すること（例えば、第１の親タンパク質および第２の親タンパク質）、第１の親タンパク質内の少なくとも２つセグメントを見いだすこと、および第１の親タンパク質由来の２つのセグメントおよび残りの位置に主に第２の親タンパク質由来の残基を含むキメラアミノ酸配列をコードする配列を有する核酸を構築することを含む。ドメインは、主にβ−シートから構成されるドメイン、または主にα−へリックスから構成されるドメイン、またはそのような要素の組み合わせを有するドメインとすることができる。例えば、ドメインは、サイトカインの折り畳みを有することができる。第１および第２の親タンパク質は、相同性、例えば、１０−４０％アミノ酸同一性により関連させることができる。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質由来のセグメントは、単一の折り畳みタンパク質ドメイン内にあり、キメラアミノ酸配列は第１および第２の親タンパク質における対応するドメインに非同一である折り畳みタンパク質ドメインの形態を含む。いくつかの実施形態では、２つの親タンパク質は異なる機能特性を有し、キメラドメインは、親タンパク質の１つまたは両方の特性を有することができる。いくつかの実施形態では、キメラドメインは、第１の親タンパク質由来の１つの結合面、および第２の親タンパク質由来の別の結合面を有する。
【００５７】
本明細書では、サイトＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤとの関連で、ＩＬ−１ファミリーサイトカインにおける様々な領域、セグメント、および残基に言及する。ヒトＩＬ−１β（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の配列におけるそのような残基、セグメント、および領域の場所および対応する位置は下記および図１で提供される：
【００５８】
サイトＡ．ＩＬ−１βにおけるサイトＡ残基は下記を含む：ＡＲＧ１１、ＳＥＲ１３、ＧＬＮ１４、ＧＬＮ１５、ＳＥＲ２１、ＧＬＵ２５、ＬＹＳ２７、ＬＥＵ２９、ＨＩＳ３０、ＬＥＵ３１、ＧＬＮ３２、ＧＬＹ３３、ＧＬＮ３４、ＡＳＰ３５、ＭＥＴ３６、ＧＬＵ１２８、ＡＳＮ１２９、およびＭＥＴ１３０、ならびに他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基（本明細書では「サイトＡ残基」と呼ばれる）。特定の状況では、特にＩＬ−１βに関連して、サイトＡ残基ならびにＧＬＮ１４９、およびＰＨＥ１５０、ならびに他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基を含む「拡張サイトＡ残基」に言及される。さらに、図４に示されるように「サイトＡ領域」を規定することができ、例えば、Ａ１セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１１−３６に対応する）およびＡ２セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１２５−１３１に対応する）、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーにおける対応するセグメントを含む。
【００５９】
サイトＢ．ＩＬ−１βにおけるサイトＢ残基は下記を含む：ＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＡＲＧ４、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＡＳＮ５３、ＩＬＥ５６、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、ＬＹＳ９４、ＬＹＳ１０３、ＧＬＵ１０５、およびＡＳＮ１０８、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基（本明細書では「サイトＢ残基」と呼ばれる）。特定の状況では、特にＩＬ−１βに関連して、サイトＢ残基ならびにＰＨＥ４６およびＳＥＲ１５２（図４におけるサイトＢ領域の外側にある）を含む「拡張サイトＢ残基」に言及される。さらに、図４に示されるように「サイトＢ領域」を規定することができ、例えばＢ１セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１−５に対応する）、Ｂ２セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の４８−５６に対応する）、およびＢ３セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の９２−９８に対応する）、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーにおける対応するセグメントを含む。
【００６０】
サイトＣ．ＩＬ−１βにおけるサイトＣ残基は下記を含む：ＩＬＥ１０４、ＩＬＥ１０６、ＡＳＮ１０７、ＬＹＳ１０９、ＧＬＵ１１１、ＴＨＲ１３７、ＬＹＳ１３８、ＧＬＹ１３９、ＧＬＹ１４０、ＧＬＮ１４１、ＴＨＲ１４４、およびＡＳＰ１４５および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基（本明細書では「サイトＣ残基」と呼ばれる）。さらに、図４に示されるように「サイトＣ領域」を規定することができ、例えばＣ１セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１３６−１４５に対応する）、および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーにおける対応するセグメントを含む。
【００６１】
サイトＤ．ＩＬ−１βにおけるサイトＤ残基は下記を含む：ＬＥＵ６、ＴＨＲ９、ＬＹＳ６３、ＧＬＵ６４、ＬＹＳ６５、およびＡＳＮ６６および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーの対応する残基（本明細書では「サイトＤ残基」と呼ばれる）。さらに、図４に示されるように「サイトＤ領域」を規定することができ、例えば、Ｄ１セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の６−９に対応する）、Ｄ２セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３７−４１に対応する）、およびＤ３セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の６３−６６に対応する）、Ｄ４セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の８６−９１に対応する）、およびＤ５セグメント（ＩＬ−１βにおいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１５０−１５３に対応する）および他のＩＬ１サイトカインファミリーメンバーにおける対応するセグメントを含む。
【００６２】
サイトＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対する残基および領域の場所のさらなる同定は、問題のサイトカインを図４で示される配列にアライメントすることにより見いだされ得る。
【００６３】
本明細書で言及されるＩＬ−１β（ヒト）のアミノ酸配列は下記である：ＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬＲＤＳＱＱＫＳＬＶＭＳＧＰＹＥＬＫＡＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＹＩＳＴＳＱＡＥＮＭＰＶＦＬＧＧＴＫＧＧＱＤＩＴＤＦＴＭＱＦＶＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【００６４】
本明細書で言及されるＩＬ−１α（ヒト）のアミノ酸配列は下記である：ＳＡＰＦＳＦＬＳＮＶＫＹＮＦＭＲＩＩＫＹＥＦＩＬＮＤＡＬＮＱＳＩＩＲＡＮＤＱＹＬＴＡＡＡＬＨＮＬＤＥＡＶＫＦＤＭＧＡＹＫＳＳＫＤＤＡＫＩＴＶＩＬＲＩＳＫＴＱＬＹＶＴＡＱＤＥＤＱＰＶＬＬＫＥＭＰＥＩＰＫＴＩＴＧＳＥＴＮＬＬＦＦＷＥＴＨＧＴＫＮＹＦＴＳＶＡＨＰＮＬＦＩＡＴＫＱＤＹＷＶＣＬＡＧＧＰＰＳＩＴＤＦＱＩＬＥＮＱＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
【００６５】
本明細書で言及されるＩＬ−１Ｒａ（ヒト）のアミノ酸配列は下記である：ＲＰＳＧＲＫＳＳＫＭＱＡＦＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫＩＤＶＶＰＩＥＰＨＡＬＦＬＧＩＨＧＧＫＭＣＬＳＣＶＫＳＧＤＥＴＲＬＱＬＥＡＶＮＩＴＤＬＳＥＮＲＫＱＤＫＲＦＡＦＩＲＳＤＳＧＰＴＴＳＦＥＳＡＡＣＰＧＷＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹＦＱＥＤ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。本明細書で使用されるＩＬ−１β、ＩＬ−１α、およびＩＬ−１Ｒａという用語は、個々の成熟タンパク質を示す。
【００６６】
本明細書で言及され、図４に示されるβシートは、下記配列を示す：
【表１】
0006030554.tif 000002
【００６７】
２つの配列の間の「相同性」または「配列同一性」の計算は（これらの用語は、本明細書では同じ意味で使用される）は下記の通りに実施される。配列は、本明細書で提供されるアライメントに従い整列され、または、適切なアライメントがない場合、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅアルゴリズムに実装されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２スコアリングマトリクスを、１０のギャップペナルティで、および１のギャップ拡張ペナルティで使用し、最高スコアとして決定した最適アライメントに従い整列される。Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453; Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley, and tools available from the European Bioinformatics Institute (Cambridge UK) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000), Rice, P. et al., A., Trends in Genetics 16, (6) pp. 276--277 およびhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/ align/index.html および http://emboss.open-bio.org/wiki/Appdoc:Needleで利用可能なオンラインを参照されたい。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドがその後比較される。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一である（本明細書では、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」に等しい）。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である。参照配列の群に対する対象の１つの配列の集団同一性を決定するために、位置は参照配列の群の任意の１つ以上において対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸に同一である場合、同一であると考えられる。セグメント、特徴、または領域のリストに関しては、同一性は、そのようなリストのすべてのメンバーに対してまとめて計算することができ、全体のパーセンテージ同一性が到達される。
【００６８】
本明細書では、本明細書で開示される配列に少なくとも８０、８２、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である配列が提供される。
【００６９】
本明細書では、「対応する」という用語は、参照ポリペプチドに関し対象のポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置を指定するために使用される。一般に、位置は本明細書で提供されるアライメントにより示されるものである（例えば、図４）。
【００７０】
本明細書では、「高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイぜーションおよび洗浄のための条件を記載する。ハイブリダイぜーション反応を実施するためのガイダンスは、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6（参照により組み込まれる）において見いだすことができる。水性および非水性方法が、その参考文献に記載されており、いずれかを使用することができる。高ストリンジェンシーハイブリダイぜーション条件は、約４５℃での６Ｘ  ＳＳＣにおけるハイブリダイぜーション、続いて、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおける６５℃での１つ以上の洗浄、または実質的に同様の条件を含む。本明細書では、高ストリンジェンシー条件下、本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードする核酸および本明細書、例えば、実施例１で開示される核酸にハイブリダイズする配列を含む単離核酸が提供される。
【００７１】
本明細書で言及される自然発生的タンパク質は特定的に、そのようなタンパク質のヒト型、および他の哺乳類種由来の型を含む。
【００７２】
全ての特許、公開された特許出願、および本明細書で引用される公開された参考文献は全ての目的のために参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】Ｘ線結晶学的データから決定されるＰ０４の構造の図である。ＩＬ−１Ｒａ由来の残基のバックボーンは黒色で示され、ＩＬ−１β由来の残基のバックボーンは灰色で示される。
【図２】ヒトＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメインに結合されたＰ０５タンパク質のモデルの３つの図である。Ｐ０５では、ＩＬ−１Ｒａ残基は黒色で示され、ＩＬ−１β残基は白色で示される。
【図３−１】キメラタンパク質のモデルを示し、ここで、ＩＬ−１Ｒａ残基が黒色で示され、ＩＬ−１β残基が白色で示される。モデルは、タンパク質：Ｐ０１（図３Ａ）、Ｐ０３（図３Ｂ）、Ｐ０４（図３Ｃ）。を示す。
【図３−２】キメラタンパク質のモデルを示し、ここで、ＩＬ−１Ｒａ残基が黒色で示され、ＩＬ−１β残基が白色で示される。モデルは、タンパク質：Ｐ０５（図３Ｄ）、Ｐ０７（図３Ｅ）、およびＰ０６（図３Ｆ）を示す。
【図４】いくつかのヒトＩＬ−１ファミリーサイトカインのアライメントを提供する：ＩＬ−１β（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＩＬ−１α（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＩＬ−１Ｒａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＩＬ−３３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＩＬ−３６Ｒａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＩＬ−３６α（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＩＬ−３６β（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、およびＩＬ−３６γ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。本明細書においてテキストで言及されたセグメントは、アライメント下で同定される。さらに、β-シートおよびそのようなシート間のループが同定される。
【図５−１】図５Ａは、Ｐ０１のアミノ酸配列のリスティングである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）。図５Ｂは、Ｐ０２のアミノ酸配列のリスティングである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）。図５Ｃは、Ｐ０３のアミノ酸配列のリスティングである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）。ＩＬ−１β由来のセグメントはボールドイタリックで示される。下記実施例１もまた参照されたい。
【図５−２】図５ＤはＰ０４のアミノ酸配列のリスティングである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）。図５ＥはＰ０５のアミノ酸配列のリスティングである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）。ＩＬ−１β由来のセグメントはボールドイタリックで示される。下記実施例１もまた参照されたい。
【図６】受容体結合剤を発現する大腸菌細胞由来の精製されたタンパク質の例示的な試料を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。１５および２０ｋＤａ分子量マーカーが左に示される。レーンは下記の通りである：分子量マーカー（レーン１および６）、抽出物（レーン２および７）、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製された材料（レーン３および８）、さらにアニオン交換クロマトグラフィーにより精製された材料（レーン４および９）、およびそのような材料の還元試料（レーン５および１０）。レーン２−５はＰ０５精製のものであり、レーン６−１０はＰ０４精製のものである。実施例２も参照されたい。
【図７Ａ】図７ＡはＰ０６、Ｐ０７、およびＰ０１タンパク質の、ＩＬ−１βおよび陰性対照、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）タンパク質に対するシグナル伝達を刺激する能力を示す表および付随する棒グラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、様々なＩＬ−１β濃度でのＰ０１によるＩＬ−１βの拮抗作用を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｐ０３（ヘキサヒスチジンタグ）、Ｐ０４（ヘキサヒスチジンタグ）、Ｐ０５（ヘキサヒスチジンタグ）、およびＩＬ−１Ｒａによる、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β（ヒト）の存在下でのＩＬ−１β拮抗作用を示すグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５のタグが付けられていない形態、およびＩＬ−１Ｒａを含むライセートによる、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β（ヒト）の存在下での、個々のライセート中のタンパク質濃度の推定値を使用した、ＩＬ−１β拮抗作用を示すグラフである。
【図９−１】下記タンパク質に対する固定された可溶性ＩＬ−１ＲＩの結合動力学を示すＳＰＲデータのグラフを含む：ＩＬ−１β（図９Ａ）、ＩＬ−１Ｒａ（図９Ｂ）。
【図９−２】下記タンパク質に対する固定された可溶性ＩＬ−１ＲＩの結合動力学を示すＳＰＲデータのグラフを含む：Ｐ０４（図９Ｃ）、およびＰ０５（図９Ｄ）。
【図１０Ａ】図１０Ａは実施例７で記載されるＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１β、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５の熱変性を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａのグラフの負の一次導関数を示す。
【図１１Ａ】ドライアイモデルのマウスに対する０、３、７、９、および１１日での、２つの独立した研究の各眼あたりの角膜のフルオレセイン染色により試験した平均角膜染色スコア±ＳＥＭを示す棒グラフである。マウスは、処置なし（ｎ＝１８）、１０ｍｇ／ｍｌ  Ｐ０５（ｎ＝１９）、または１．２５×ＰＢＳ、ビヒクル（ｎ＝２０）を受けた。アスタリスクは、下記のように、ビヒクルに対するＰ０５の統計的有意性を示す：＊（Ｐ＜０．０５）および＊＊（Ｐ＜０．００５）。
【図１１Ｂ】ドライアイモデルのマウスに対する０、３、７、９、および１１日での各眼あたりの角膜の平均角膜染色スコア±ＳＥＭを示す、別の実験からのデータを表す棒グラフである。マウスは、処置なし（ｎ＝８）、１．２５×ＰＢＳビヒクル（ｎ＝８）、１０ｍｇ／ｍｌマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）（ｎ＝８）、または１０ｍｇ／ｍｌ  Ｐ０５（ｎ＝９）を受けた。アスタリスクは、下記のように、マウス血清アルブミンに対するＰ０５の統計的有意性を示す：＊（Ｐ＜０．０５）および＊＊＊（Ｐ＜０．０００５）。
【図１１Ｃ】図１１Ｂと同じ実験における、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）（０．０５％シクロスポリンエマルジョン）（ｎ＝８）で処置したマウスに対するデータを含む棒グラフである。アスタリスクは、下記のように、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）に対するＰ０５の統計的有意性を示す：＊＊（Ｐ＜０．００５）および＊＊＊（Ｐ＜０．０００５）。
【図１２Ａ】図１２Ａは、その構造の計算モデル（灰色）上に重ね合わせたＰ０４のＸ線結晶構造（黒色）の構造を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ｐ０４のＫ６４およびＥ３９間の相互作用を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、Ｐ０４のＣ末端残基Ｑ１４９およびＳ１５２とＫ４０およびＲ９の間の相互作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
サイトカインのＩＬ−１ファミリーはいくつかのメンバーを含み、全てが別の６つのβ−ストランドによりキャップされたβ−バレルを形成する６つのβ−ストランドから構成される共通のβ−トレフォイル折り畳みを有する。これらのサイトカインのヒトおよび他の哺乳類形態の一次構造は知られている。いくつかのヒトＩＬ−１ファミリーメンバーの例示的な構造アライメントは図１に示される。
【００７５】
とりわけ、ＩＬ−１折り畳みは非常に柔軟であるということを我々は発見した。特に、異なるメンバー由来の要素を組み合わせて、サイトカインシグナル伝達を刺激するまたは拮抗するタンパク質を提供することができる。これらのタンパク質の例としては、キメラサイトカインドメインが挙げられ、これらは、例えば１つのサイトカイン由来の２つ以上のセグメントまたは表面残基を、別のサイトカインまたはサイトカインコンセンサス配列との関連で含み、よって、異なるＩＬ−１ファミリーサイトカイン由来の受容体相互作用部位の非自然発生的な組み合わせが生成される。
【００７６】
ＩＬ−１ファミリーサイトカインは、少なくとも２つの一次受容体相互作用部位を含むことができ、サイトＡおよびサイトＢと呼ばれる。サイトＡおよびＢは、一次サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１ＲＩ）への接触に関与する。ＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１βの場合、例えば、２つのタンパク質は、サイトＡおよびＢに関して実質的に異なり、そのため、ＩＬ−１Ｒａは、サイトＡよりもサイトＢでは、より少ない受容体接触を形成する。
【００７７】
我々は１つのサイトカイン由来のサイトＡおよび別のサイトカイン由来のサイトＢを含む機能的キメラサイトカインドメインを構築することが可能であることを見いだした。ＩＬ−１折り畳みの柔軟性により、ＩＬ−１シグナル伝達に拮抗する様々なキメラサイトカインドメインの構築が可能である。
【００７８】
さらに、ＩＬ−１ファミリーサイトカインは、２つの二次受容体相互作用部位を含むことができ、サイトＣおよびサイトＤと呼ばれ、これらは、アゴニズムおよび／または拮抗作用に関与し、サイトカインのその二次サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１ＲＡｃＰ）と相互作用する能力を決定することができる。天然受容体アンタゴニスト（例えばＩＬ−１Ｒａ）由来のサイトＣおよび／またはサイトＤ残基を含むと、アンタゴニスト特性を付与することができる。１つ以上のＩＬ−１アゴニスト（例えばＩＬ−１βおよびＩＬ−１α）および／またはＩＬ−１受容体アンタゴニスト（例えばＩＬ−１Ｒａ）由来のサイトＡおよびＢの１つまたは両方ならびにＩＬ−１受容体アンタゴニスト（例えばＩＬ−１Ｒａ）由来の部位ＣおよびＤの１つまたは両方を含むキメラサイトカインドメインを構築することができる。したがって、シグナル伝達に拮抗し、ＩＬ−１アゴニスト由来のサイトＢ残基を含むキメラサイトカインドメインを生成させることができる。
【００７９】
例示的な組み合わせはまた、下記表２で提供される：
【表２】
0006030554.tif 000003
【００８０】
起源配列は、同定されたサイトカインドメインに対するヒト配列に同一とすることができ、またはヒト配列に対し変異を含むことができ、例えば、そのため、それらは、各それぞれの領域において、ヒト配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上同一であり、例えば、それらは各領域由来の１つ以上のセグメントを含むことができる。
【００８１】
サイトＡ残基およびサイトＢ残基のための起源は、一次受容体への親和性を最大とするように選択することができる。例えば、ＩＬ−１ＲＩに結合するために、サイトＡ残基は、ＩＬ−１Ｒａ由来とすることができ、サイトＢ残基はＩＬ−１β由来とすることができる。
【００８２】
キメラサイトカインドメインは、ＩＬ−１ファミリー受容体、例えば、ヒトＩＬ−１ＲＩに結合する能力を有することができ、ＫＤは１０−８、１０−９、または１０−１０未満であり、例えば、ＫＤは、同じ条件下で天然受容体リガンド（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、またはＩＬ−１Ｒａ）の１０または１００倍以内であり、または同じ条件下で天然リガンド（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、またはＩＬ−１Ｒａ）のそれ未満である。さらに、ある実施形態では、キメラサイトカインドメインは、その親サイトカインドメインの少なくとも１つより低いＫＤ、速いＫｏｎ、または遅いＫｏｆｆで結合する。
【００８３】
ＩＬ−１ファミリー受容体に結合し、受容体シグナル伝達に拮抗するキメラサイトカインドメインは、受容体結合剤として、例えば、下記で記載されるＩＬ−１ファミリーサイトカインシグナル伝達により媒介される障害を治療するために使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、キメラサイトカインドメインはＩＬ−１ＲＩに結合し、ＩＬ−１シグナル伝達に拮抗する。例えば、１００、１０、１、０．６、または０．３ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【００８４】
ある実施形態では、サイトカインドメインは、第１のＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインに少なくとも４０、４５、または５０％同一であるが、完全に同一未満であり、例えば９５、９０、８５、または８０％同一とすることができる。同時に、サイトカインドメインはまた、第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインに少なくとも４０、４５、または５０％同一であるが、完全に同一未満であり、例えば、９５、９０、８５、または８０％未満同一とすることができる。第１および第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインは、互いに５０％未満同一とすることができる。例えば、第１のＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインはアゴニストすることができ（例えば、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１α）、一方、第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインは受容体アンタゴニストとすることができる（例えば、ＩＬ−１Ｒａ）。
【００８５】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメイン内の少なくとも８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８、９９、または１００％の位置が、そのような各位置で、存在するアミノ酸が第１のＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインまたは第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインのいずれか（または第１および第２のＩＬ−１ファミリーサイトカインが、特定の位置で同一である場合両方）に同一であるという特性を有する。サイトカインドメイン内のアミノ酸位置の１００％がこの特性を有する場合、ドメインは、２つのサイトカインの完全キメラである。キメラサイトカインドメインはまた、２を超えるサイトカインから生成させることができ、その親サイトカインに対し変異（例えば、存在するアミノ酸がその親サイトカインの各々における対応するアミノ酸とは異なる場合の、１つ以上の特定の位置）を有することができる。
【００８６】
サイトカインドメインは、異なるＩＬ−１サイトカインドメイン由来のサイトＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ残基を有することができ、同様に、異なるＩＬ−１サイトカインドメイン由来のサイトＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ領域を有することができる。
【００８７】
サイトＡ．例えば、ある実施形態では、サイトカインドメインは、上記で同定されるサイトＡ残基の少なくとも５、１０、１２、１５、１６、１７、１８で、または、上記で同定される拡張サイトＡの残基の少なくとも５、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９、または２０で受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１Ｒａ）またはアゴニスト由来の残基を含み、または、そのような残基の保存的置換、またはそのような残基の少なくとも５０、６５、７５、８０、９０、９５、または１００％を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１Ｒａ）またはアゴニスト（例えば、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１α）におけるセグメントＡ１、Ａ２、またはＡ１＋Ａ２に少なくとも７０、７５、８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である残基を含む。
【００８８】
ある実施形態では、サイトカインドメインは、本明細書で同定されるサイトＡ残基の少なくとも５、１０、１２、１５、１６、１７、または１８で、または上記で同定される拡張サイトＡ残基の少なくとも５、１０、１２、１５、１６、１７、または１８でＩＬ−１アゴニスト（例えば、ＩＬ−１β残基）に同一な残基、またはそのような残基の保存的置換、またはそのような残基の少なくとも５０、６５、７５、８０、９０、９５、または１００％を含む。
【００８９】
サイトＢ．ある実施形態では、サイトカインドメインは、本明細書で同定されるサイトＢ残基の少なくとも２、３、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５でＩＬ−１アゴニスト（例えば、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１α残基）に同一な残基、またはそのような残基の保存的置換、またはそのような残基の少なくとも５０、６５、７５、８０、９０、９５、または１００％を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、ＩＬ−１サイトカインアゴニスト（例えば、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１α）におけるセグメントＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１＋Ｂ２、Ｂ１＋Ｂ３、Ｂ２＋Ｂ３、またはＢ１＋Ｂ２＋Ｂ３に少なくとも７０、７５、８０、８５、８８、９０、９２、９５、または１００％同一である残基を含む。
【００９０】
サイトＣ．ある実施形態では、サイトカインドメインは、本明細書で同定されるサイトＣ残基の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２で受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１Ｒａ残基）に同一な残基、またはそのような残基の保存的置換、またはそのような残基の少なくとも５０、６５、７５、８０、９０、または１００％を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１Ｒａ）におけるセグメントＣ１に少なくとも５０、６５、７５、８０、９０、または１００％同一である残基を含む。
【００９１】
ある実施形態では、サイトカインドメインは、例えば、下記の１つ以上を含むことができる：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＴＨＲ１３７に対応する位置の疎水性アミノ酸（例えば、ＭｅｔまたはＩｌｅ）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＧＬＮ１４１に対応する位置の疎水性、例えば、脂肪族アミノ酸（例えば、ＶａｌまたはＩｌｅ）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＳＰ１４５に対応する位置の非酸性アミノ酸、例えば塩基性アミノ酸（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）、および他のＩＬ−１サイトカインにおけるそれらに対応する位置のそのような残基。証拠により、Ａｓｐ１４５が、ＩＬ−１ＲＡｃＰのリクルートメントには重要であることが示され、したがって非酸性残基への変異はアゴニスト活性を妨害し、アンタゴニスト特性を付与するために使用することができる。したがって、ある実施形態では、非酸性アミノ酸、例えば塩基性アミノ酸（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または疎水性アミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡＳＰ１４５に対応する位置に配置される。
【００９２】
サイトＤ．ある実施形態では、サイトカインドメインは本明細書で同定されるサイトＤ残基の少なくとも１、２、３、４、５、または６つで受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１Ｒａ残基）に同一な残基、またはそのような残基の保存的置換、またはそのような残基の少なくとも５０、６５、７５、８０、９０、９５、または１００％を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１Ｒａ）におけるセグメントＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ１＋Ｄ２、Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３、およびそれらの組み合わせに少なくとも５０、６５、７５、８０、９０、９５、または１００％同一である残基を含む。
【００９３】
ＩＬ−１βにおけるいくつかの残基はＩＬ−１ＲＩと接触し、近接し、例えば下記である：ＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＶＡＬ３、ＡＲＧ４、ＬＥＵ６、ＡＲＧ１１、ＳＥＲ１３、ＧＬＮ１４、ＧＬＮ１５、ＧＬＵ２５、ＬＹＳ２７、ＬＥＵ２９、ＨＩＳ３０、ＬＥＵ３１、ＧＬＮ３２、ＧＬＹ３３、ＧＬＮ３４、ＡＳＰ３５、ＭＥＴ３６、ＧＬＮ３８、ＧＬＮ３９、ＰＨＥ４６、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＳＥＲ５２、ＡＳＮ５３、ＬＹＳ５５、ＩＬＥ５６、ＰＲＯ５７、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、ＬＹＳ９４、ＬＹＳ１０３、ＧＬＵ１０５、ＡＳＮ１０８、ＡＬＡ１２７、ＧＬＵ１２８、ＡＳＮ１２９、ＭＥＴ１３０、ＧＬＮ１４１、ＧＬＮ１４９、ＰＨＥ１５０、およびＳＥＲ１５２。上記で記載される部位への指定に加えて、これらの残基は２つの組に分類することができる：セット１およびセット２。
【００９４】
ＩＬ−１βにおける例示的なセット１残基としては下記が挙げられる：ＡＲＧ１１、ＳＥＲ１３、ＧＬＮ１４、ＧＬＮ１５、ＧＬＵ２５、ＬＹＳ２７、ＬＥＵ２９、ＨＩＳ３０、ＬＥＵ３１、ＧＬＮ３２、ＧＬＹ３３、ＧＬＮ３４、ＡＳＰ３５、ＭＥＴ３６、ＧＬＮ３８、ＧＬＮ３９、ＡＬＡ１２７、ＧＬＵ１２８、ＡＳＮ１２９、ＭＥＴ１３０、およびＧＬＮ１４１ならびに他のＩＬ−１サイトカインファミリーメンバーにおける対応する残基。拡張セット１残基としては、相互作用セット１残基および１ＩＴＢ構造中の前記の４オングストローム内の残基が挙げられる。ＩＬ−１βにおける例示的なセット２残基としては下記が挙げられる：ＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＶＡＬ３、ＡＲＧ４、ＬＥＵ６、ＰＨＥ４６、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＳＥＲ５２、ＡＳＮ５３、ＬＹＳ５５、ＩＬＥ５６、ＰＲＯ５７、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、ＬＹＳ９４、ＬＹＳ１０３、ＧＬＵ１０５、ＡＳＮ１０８、ＧＬＮ１４９、ＰＨＥ１５０、およびＳＥＲ１５２ならびに他のＩＬ−１サイトカインファミリーメンバーにおける対応する残基。拡張セット２残基としては、相互作用セット２残基および１ＩＴＢ構造中の前記の４オングストローム内の残基が挙げられる。ある実施形態では、サイトカインドメインは、上記で同定されるセット１残基の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１でＩＬ−１β残基を含む。ある実施形態では、サイトカインドメインは、上記で同定されるセット２残基の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２でＩＬ−１β残基を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、拡張セット１残基の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１でＩＬ−１β残基を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは、拡張セット２残基の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１のＩＬ−１β残基を含む。
【００９５】
受容体結合剤として使用することができる他の変異体としては、２つ以上のＩＬ−１サイトカインファミリーメンバー由来の配列を有するタンパク質が挙げられる。そのような変異体の例としては、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａに基づくキメラドメインが挙げられる。例えば、変異体はＩＬ−１Ｒａのセット１由来の１つ以上のアミノ酸残基（例えば、ＩＬ−１Ｒａ由来の全てのセット１残基）およびＩＬ−１βのセット２由来の１つ以上のアミノ酸残基（例えば、ＩＬ−１β由来の全てのセット２残基）を含むことができる。
【００９６】
例示的なキメラタンパク質は、ＩＬ−１βに下記アミノ酸位置で（すなわち、ＩＬ−１βにおけるこれらの位置への対応に基づき）主に（例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９７、９８、９９、または１００％）同一である：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１−８、４２−１２０、および１４１−１５３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１−６、４５−６１、８６−９５、および１４８−１５３；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１−１０、３７−１２５、および１３１−１５３。
【００９７】
残りの残基はＩＬ−１Ｒａに主に（例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９７、９８、９９、または１００％）同一である。例えば、下記アミノ酸位置はＩＬ−１Ｒａに主に同一であり得る：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基９−４１および１２１−１４０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７−４４、６２−８５、および９６−１４７；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１１−３６および１２６−１３０。
【００９８】
ある実施形態では、サイトカインドメインは、ＩＬ−１βのアミノ酸位置Ｇｌｎ４８−Ａｓｎ５３に加えて少なくとも２、４、５、１０、または２０位置でＩＬ−１βに同一であり、例えば、サイトカインドメインはＩＬ−１β以外のサイトカインに主に、例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である。
【００９９】
ある実施形態では、サイトカインドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１−８に対応する位置で、ＩＬ−１βに同一な少なくとも３、４、５、６、７、または８つの残基を含む。例えば、下記の３、４、または５つ全てに対応する位置でＩＬ−１βに同一な残基を含む：ＡＬＡ１、ＰＲＯ２、ＶＡＬ３、ＡＲＧ４、およびＬＥＵ６。
【０１００】
ある実施形態では、サイトカインドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の４５−６１に対応する位置でＩＬ−１βに同一な少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７の残基を含む。例えば、下記の３、４、５、６、７または８に対応する位置でＩＬ−１βに同一な残基を含む：ＰＨＥ４６、ＧＬＮ４８、ＧＬＵ５１、ＳＥＲ５２、ＡＳＮ５３、ＬＹＳ５５、ＩＬＥ５６、およびＰＲＯ５７。
【０１０１】
ある実施形態では、サイトカインドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の８６−９５に対応する位置でＩＬ−１βに同一な少なくとも５、６、７、８、９、または１０の残基を含む。例えば、ＬＹＳ９２、ＬＹＳ９３、およびＬＹＳ９４の１、２、または３つ全てに対応する位置でＩＬ−１βに同一な残基を含む。
【０１０２】
ある実施形態では、サイトカインドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１４８−１５３に対応する位置でＩＬ−１βに同一な少なくとも３、４、５、または６つの残基を含む。例えば、ＧＬＮ１４９、ＰＨＥ１５０、およびＳＥＲ１５２の１、２、または３つ全てに対応する位置でＩＬ−１βに同一な残基を含む。
【０１０３】
ある実施形態では、サイトカインドメインはＩＬ−１βにおけるＴＨＲ１４７に対応する位置のスレオニンを含まない。例えば、この位置は芳香族、例えばチロシンとすることができる。ＩＬ−１βにおけるＴＨＲ１４７に対応する位置の芳香族は、いくつかの実施形態では位置１１（ＩＬ−１βナンバリングによる）に存在する別の芳香族（例えば、トリプトファン）に対して詰めることができる。
【０１０４】
ある実施形態では、サイトカインドメインはＩＬ−１βにおけるＣＹＳ８に対応する位置で芳香族を含まない。例えば、この位置はフェニルアラニン以外、または芳香族以外のアミノ酸とすることができる。例えば、システイン、バリン、セリン、スレオニンまたはアラニンとすることができる。この位置は他の嵩高い残基、特にＭＥＴ４４およびＭＥＴ１４８（ＩＬ−１βナンバリングによる）近くに位置する。好ましくは、３つの位置８、４３、および１４８すべてが嵩高い残基ではない。
【０１０５】
ある実施形態では、サイトカインドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３０−３６に対応する位置でＩＬ−１Ｒａに同一な少なくとも５、６、または７つの残基、例えば、ＹＬＱＧＰＮＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）に同一な少なくとも５、６、または７つの残基を含む。例えば、サイトカインドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１１−３６に対応する位置でＩＬ−１Ｒａに同一な少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６の残基を含む。サイトカインドメインはまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１４５に対応する位置で塩基性残基を含むことができる。
【０１０６】
ある実施形態では、サイトカインドメインは下記を含む：（ａ）ＩＬ−１βのＶａｌ４０に対応する位置のグルタミン酸およびＩＬ−１βのＬｙｓ６５に対応する位置のリシン；（ｂ）ＩＬ−１βのＴｈｒ９に対応する位置のアルギニンおよびＩＬ−１βのＧｌｎ１４９に対応する位置のグルタミン；および／または（ｃ）ＩＬ−１βのＶ４１に対応する位置のリシンおよびＩＬ−１βのＳｅｒ１５２に対応する位置のセリン。
【０１０７】
サイトカインドメインはまた、１２６−１３２に対応する位置でＩＬ−１Ｒａに同一な少なくとも4、５、６、または７つの残基、例えば、ＭＥＡＤＱＰＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）に同一な少なくとも４、５、６、または７つの残基を含むことができる。
【０１０８】
ある実施形態では、サイトカインドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の６２−８５に対応する位置でＩＬ−１βに同一な少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４の残基を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、サイトカインドメインは下記アミノ酸配列の１つ以上（例えば、４つ全て）：ＲＳＬＡＦＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＩＤＶＳＦＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ＫＫＭＤＫＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、およびＫＦＹＭＱＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）の１つ以上（例えば、４つ全て）；下記ＲＳＬＡＦＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＩＤＶＳＦＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ＮＫＬＳＦＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、およびＫＦＹＭＱＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）の１つ以上（例えば、４つ全て）；下記ＲＳＬＡＦＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＥＥＫＦＳＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＲＦＶＦＩＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、およびＶＴＫＦＴＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）の１つ以上（例えば、４つ全て）；下記ＲＳＬＡＦＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＥＥＫＦＳＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＦＥＳＡＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、およびＶＴＫＦＴＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）の１つ以上（例えば、４つ全て）；または下記ＬＮＣＲＩＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ＥＥＫＦＳＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＰＮＷＦＬＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、およびＫＦＹＭＱＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）の１つ以上（例えば、４つ全て）を含む。
【０１１０】
キメラタンパク質は様々な目的のために使用することができる。例えば、それらは、受容体シグナル伝達活性を増加または減少させるため、受容体を発現する細胞を検出するため、またはそれらが結合する細胞またはタンパク質を精製するために、使用することができる。
【０１１１】
ＩＬ−１βおよびＩＬ−Ｒａに基づくキメラサイトカインドメインの具体例は、下記実施例１で提供され、ＩＬ−１シグナル伝達に拮抗する下記例示的なサイトカインドメインを含む：
【０１１２】
Ｐ０１．Ｐ０１ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸Ａｌａ１２−Ｖａｌ４８、Ｉｌｅ６０−Ｖａｌ８３、およびＡｓｐ９５−Ｔｙｒ１４７に対応するＩＬ−１Ｒａ由来の３つのセグメントおよびＩＬ−１β由来の残りの４つのセグメントを含む。全体で、Ｐ０１ドメインは、ＩＬ−１β由来の１５３のアミノ酸の７４を（約４８％同一性）およびＩＬ−１Ｒａ由来の１１９のアミノ酸（約７７％同一性）有する。これらのパーセンテージは加算すると１００％を超えるが、これは、Ｐ０１および本明細書で開示される他の例示的なタンパク質中のアミノ酸の多くが、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの間で保存されるアミノ酸であり、したがってＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの両方に対するパーセンテージ同一性に寄与するからである。
【０１１３】
Ｐ０２．Ｐ０２ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸Ａｌａ１２−Ｖａｌ４８、Ｉｌｅ６０−Ｖａｌ８３、およびＳｅｒ１１０−Ｔｙｒ１４７に対応するＩＬ−１Ｒａ由来の３つのセグメント、およびＩＬ−１β由来の残りの４つのセグメントを含む。全体で、Ｐ０２ドメイは、ＩＬ−１β由来の１５３のアミノ酸の８５（約５５％同一性）およびＩＬ−１Ｒａ由来の１０８のアミノ酸（約７０％同一性）を有する。
【０１１４】
Ｐ０３．Ｐ０３ドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸Ａｌａ１２−Ｌｙｓ４５およびＰｈｅ１００−Ｌｙｓ１４５に対応するＩＬ−１Ｒａ由来の２つのセグメント、およびＩＬ−１β由来の残りの３つを含む。全体で、Ｐ０３ドメインは、ＩＬ−１β由来の１５３のアミノ酸の９４（約６１％同一性）およびＩＬ−１Ｒａ由来の９１のアミノ酸（約６４％同一性）を有する。
【０１１５】
Ｐ０４．Ｐ０４ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸Ａｌａ１２−Ｌｙｓ４５およびＡｌａ１１４−Ｌｙｓ１４５に対応するＩＬ−１Ｒａ由来の２つのセグメント、およびＩＬ−１β由来の残りの３つのセグメントを含む。全体で、Ｐ０４ドメインは、ＩＬ−１β由来の１５３のアミノ酸の１０４（約６８％同一性）およびＩＬ−１Ｒａ由来の８９のアミノ酸（約５８％同一性）を有する。
【０１１６】
Ｐ０５．Ｐ０５ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸Ａｒｇ１４−Ｌｙｓ４５およびＰｈｅ１２０−Ｔｙｒ１４７に対応するＩＬ−１Ｒａ由来の２つのセグメント、およびＩＬ−１β由来の残りの３つのセグメントを含む。全体で、Ｐ０５ドメインは、ＩＬ−１β由来の１５３のアミノ酸の１０８（約７０％同一性）およびＩＬ−１Ｒａ由来の８５のアミノ酸（約５５％同一性）を有する。
【０１１７】
他のキメラタンパク質は同様に構築することができる。例えば、キメラタンパク質は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１Ｒａ間で作製することができ、例えば、特定的にＩＬ−１Ｒａの同定されたセグメントを、上記例の各々に対し、ＩＬ−１βではなくＩＬ−１α由来の対応する残基と組み合わせて含むドメインとすることができる。
【０１１８】
タンパク質修飾および置換
タンパク質配列、例えば本明細書で記載されるものは、例えば、１つ以上の保存的置換を生成させることにより変化させることができる。機能を保持する、機能をわずかに変化させるように保存的置換を生成させることができる。例示的な保存的置換は下記表で記載される:
【表３】
0006030554.tif 000004
【０１１９】
置換は、（ａ）置換付近のバックボーン構造、例えば、シートまたはヘリカル構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のボリュームおよび分枝へのそれらの潜在的な効果に基づき選択することができる。アミノ酸残基は、側鎖の特性に基づき分類することができる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；ａｓｎ；ｇｌｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）バックボーン構造に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１２０】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと置換することを含むことができる。保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを同じクラスの別のメンバーと置換することを含むことができる。
【０１２１】
特定の残基の重要性はまた、アミノ酸に対するヒドロパシー指標との関連で評価することができる。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づきヒドロパシー指標が割り当てられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。ヒドロパシーアミノ酸指標およびその重要性の考察については、例えばKyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131を参照されたい。
【０１２２】
タンパク質の配列は任意の方法により変化させることができ、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異誘発、(Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:4331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487, 1987)、カセット変異誘発(Wells et al.、Gene、34:315、1985)、選択制限変異誘発(Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London, 317:415, 1986)、およびＰＣＲ変異誘発が挙げられる。In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition, Braman (ed.), Humana Press, (2010) ISBN: 1607616513 and PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic Engineering, Chen and Janes (ed.), Humana Press, (2002) ISBN: 0896039730も参照されたい。
【０１２３】
走査アミノ酸分析を使用して、近接配列に沿って１つ以上のアミノ酸を評価することができる。方法は、ある領域の各またはほとんど各アミノ酸を特定のアミノ酸、例えば、比較的小さい、中性アミノ酸、例えばアラニン、セリン、またはバリンに変異させることを含む。アラニンが典型的には選択され、というのも、それはβ−炭素を超える側鎖を排除し、変異体の主鎖構造を変化させる可能性が低いからである(Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085, 1989)。それはまた、最も一般的なアミノ酸であり、しばしば、埋もれたおよび露出した位置の両方で見いだされる(Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1, 1976)。走査過程はまた、より顕著な変化を生成させるように適合させることができ、例えば、荷電残基は反対の電荷の残基に変化させることができ、短い側鎖を有する残基は嵩高い側鎖を有するものと置換することができる。例えば、アルギニン走査は、アラニン走査の代わりに、またはそれに加えて使用することができるアプローチである。走査は、領域内の各残基に、または特定の特性の残基、例えば、タンパク質の表面または表面近くの、あるいはタンパク質の表面または表面近くにある可能性のある残基に適用することができる。
【０１２４】
タンパク質、そのドメインの１つ、またはタンパク質を含む複合体の構造は、例えば、相同性ベースモデリング、エネルギー極小化および／または知られている解決された構造を使用する他のモデリングを実施することによりモデル化することができる。そのような方法としては下記が挙げられる: Accelrys Software Inc., Discovery Studio（登録商標）, Release 3.0 、San Diego: Accelrys Software Inc., 2010, AMBER（商標）モデリングソフトウエア (Case et al. (2005) J. Computat. Chem. 26, 1668-1688 および Case et al. (2010), AMBER 11, University of California, San Francisco, CA USA)およびCHARMM（商標）モデリングソフトウエア(Molecular Simulations Inc.)。一般に Baker and Sali, Science 294(5540):93-6, 2001)もまた参照されたい。構造はまた、直接、例えば、Ｘ線結晶解析および／またはＮＭＲ分光法を使用して決定することができる。
【０１２５】
ＩＬ−１ファミリーサイトカインの構造を説明する例示的なＰＤＢ構造としては下記が挙げられる：１Ｉ１Ｂ、１ＩＬＲ、１ＩＲＡ、１ＩＴＢ、２Ｉ１Ｂ、２ＩＬＡ、２ＫＬＬ、４Ｉ１Ｂ、５Ｉ１Ｂ、６Ｉ１Ｂ、７Ｉ１Ｂ、８Ｉ１Ｂ、９ＩＬＢ、および１ＭＤ６(RCSB-Rutgers, Piscataway NJ, USA, およびNational Library of Medicine (Bethesda, MD, USA)からのwww.pdb.orgからのhttpにより入手可能)。例えば、単独および受容体ＩＬ−１ＲＩと複合したＩＬ−１βの構造が解析されている。例えば、Finzel et al. (1989) J. Mol. Biol. 209: 779-791, PDB 1ITB,およびVigers et al. (1997) Nature 386: 190-194を参照されたい。ＩＬ−１ＲＩとのＩＬ−１Ｒａの構造も解析されている。例えば、PDB 1IRA およびSchreuder et al., (1997) Nature 386: 194-200を参照されたい。
【０１２６】
相同性モデリングは、配列のアライメントにより、例えば、コンピュータソフトウェア、例えばＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、および／またはＭＥＧＡＢＬＡＳＴを使用して支援され得る。Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410; Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266, 460-480;およびKarlin et al., 1993, PNAS USA 90, 5873-5787を参照されたい。巨大分子(アミノ酸配列および核酸配列)を整列させるための追加のアルゴリズムとしてはＦＡＳＴＡ(Pearson, 1995, Protein Science 4, 1145-1160)、ＣｌｕｓｔａｌＷ(Higgin et al., 1996, Methods Enzymol. 266, 383-402)、ＤｂＣｌｕｓｔａｌ(Thompson et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28, 2910-2926)、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ(Chemical Computing Group, Montreal, Quebec Canada H3A 2R7)が挙げられる。さらに、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージのＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム(Myers & Miller, CABIOS 4, 11-17, 1988)が使用され得る。
【０１２７】
ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａに対するコンセンサス配列は、２つの配列を比較し、同一である、または高度に保存されている残基を同定することにより得ることができる。本明細書で記載されるキメラサイトカインドメインは、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または１００％のそのような同一残基または高度に保存された残基を有することができる。例示的なコンセンサス配列は下記であり:ＤＸＸＱＫＸ｛８−９｝Ｌ−ＡＸＸＬＱＧＸ｛１８−２８｝ＬＧＸ｛７｝ＬＳＣＶＸＸＸＤＸＸＸＬＱＬＥＸＶＸ｛８−９｝ＫＸＸＫＲＦＸＦＸ｛１０｝ＦＥＳＡＸＸＰＸＷＸＸＸＴＸＸＸＸＸＸＰＶＸＬＸ｛５−６｝ＧＸＸＸＴＸＦＸＸＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ここでＸは独立して任意のアミノ酸であり、下付き数字または範囲は、出現数である。本明細書で記載されるキメラサイトカインドメインは、コンセンサス配列に少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または１００％同一性を有することができる（ここで、Ｘ残基は同一性に対しカウントされない）。他のコンセンサス配列は、同様に同定することができる。
【０１２８】
ＩＬ−１サイトカインファミリーメンバーのさらなる変異体は、ディスプレイベースシステムまたは他のライブラリベーススクリーニングを用いて、製造、評価することができる。例えば、タンパク質変異体は、表示および発現させ、ＩＬ−１サイトカインファミリーメンバーのための受容体に結合する能力に対し、評価することができる。例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、または本明細書で記載されるサイトカインドメインの変異体は、ＩＬ−１ＲＩの可溶性細胞外ドメインへ結合する能力に対し評価することができる。ディスプレイベースシステムの一般的な説明としては下記が挙げられる：細胞ディスプレイでは、Chao et al. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68;  Colby et al. Methods Enzymol. 2004;388:348-58; Boder et al., Methods Enzymol. 2000;328:430-44)、ファージディスプレイでは(例えば., Viti et al., Methods Enzymol. 2000;326:480-505 and Smith (1985) Science 228:1315-1317)、およびリボソームディスプレイでは(例えば, Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; およびSchaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods 231(1-2):119-3。
【０１２９】
本明細書における多くの実施形態が、ヒトＩＬ−１サイトカイン配列を親ドメインとして使用して例示されているが、他の配列を使用することができる。多くの他のＩＬ−１サイトカイン、例えば、他の種由来が知られており、入手可能であり、公開データベース、例えばＥｎｔｒｅｚ(the National Library of Medicine, Bethesda MD)およびＥＢＩ−ＥＭＢＬ(Hinxton, Cambridge UK)において見いだすことができる。ＵＮＩＰＲＯＴデータベース由来のそのような配列の例（UniProt.orgで入手可能、The UniProt Consortium, Nucleic Acids Res. D142-D148 (2010)を参照されたい)は下記を含む:
【表４】
0006030554.tif 000005
【０１３０】
本明細書で記載されるサイトカインドメインはまた、ＩＬ−１ＲＩに結合することができる変異サイトカインドメイン中に存在する置換を含むことができる。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の位置２０に対応する）はＭｅｔまたはＡｓｎとすることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の位置３４に対応する）はＧｌｙ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔとすることができる。
【０１３１】
ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの追加の例示的な変異体としては、Boraschi et al. (1996) Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library 1、d270-308、Evans et al.、J. Biol. Chem.、270:11477 (1995)および Greenfeder et al.、J. Biol. Chem.、270:22460 (1995)に記載されるものが挙げられる。例えば、ＩＬ−１βの変異体としてはＲ１１Ｇ、Ｒ１１Ａ、Ｑ１５Ｈ、Ｅ１０５Ｇ、およびＴ１４７Ｇが挙げられる。例えば、Evans et alを参照されたい。ＩＬ−１Ｒａの変異体としては、Ｗ１６Ｙ、Ｑ２０Ｍ、Ｑ２０Ｎ、Ｙ３４Ｇ、Ｙ３４Ｈ、Ｙ３４Ｗ、Ｙ３４Ｍ、Ｙ１４７Ｇ、Ｙ１４７Ｈ、Ｙ１４７Ｍ、Ｋ１４５Ｄ、Ｈ５４Ｐ、Ｖ１８Ｓ、Ｔ１０８Ｋ、Ｃ１１６Ｆ、Ｃ１２２Ｓ、Ｃ１２２Ａ、Ｙ１４７Ｇ、Ｈ５４Ｐ、Ｈ５４Ｉ、およびEvans et al. and Greenfeder et al.、J. Biol. Chem.、270:22460 (1995)における他のものが挙げられる。サイトカインドメインはまた、ＩＬ−１Ｒａに前記位置の１つで同一な残基を含むことができる。サイトカインドメインはまた、前記変異の１つと、対応する位置で異なる残基を含むことができる。
【０１３２】
さらに、ＩＬ−１ファミリーサイトカインは、１つ以上の不対システイン残基を含むことができる。１つ以上の、例えば、２、３または全てのそのような不対システイン残基は、別のアミノ酸、例えば、無電荷アミノ酸、例えばアラニンまたはセリンに変異させることができる。例えば、Ｐ０１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の位置６７、７０、１１６、および１２２にシステインを含む。１、２、３、または４つ全てのそのようなシステインは、別のアミノ酸、例えば無電荷アミノ酸、例えばアラニンまたはセリンで置換することができる。Ｐ０２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の位置６７、７０、１１６、および１２２にシステインを含む。１、２、３、または４つ全てのそのようなシステインは、別のアミノ酸、例えば無電荷アミノ酸、例えばアラニンまたはセリンで置換することができる。Ｐ０３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の位置７０、１１６、および１２２にシステインを含む。１、２、または３つ全てのそのようなシステインは、別のアミノ酸、例えば無電荷アミノ酸、例えばアラニンまたはセリンで置換することができる。Ｐ０４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の位置７０、１１６、および１２２にシステインを含む。１、２、または３つ全てのそのようなシステインは、別のアミノ酸、例えば無電荷アミノ酸、例えばアラニンまたはセリンで置換することができる。Ｐ０５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１の位置８、７０、および１２２にシステインを含む。１、２、または３つ全てのそのようなシステインは、別のアミノ酸、例えば無電荷アミノ酸、例えばアラニンまたはセリンで置換することができる。
【０１３３】
ＩＬ−１ファミリーサイトカインドメイン（本明細書で記載されるキメラサイトカインドメインを含む）はまた、循環置換することができる。例えば、ドメイン由来のＣ末端セグメントを、再配置することができ、オリジナルＮ−末端に対するＮ末端およびＮ末端セグメント（一般に、Ｃ末端セグメントの切除後オリジナルタンパク質の残りを含む）となる。２つの再配置セグメントは、リンカー（例えば、約３〜１０のアミノ酸）により分離することができる。一般に、置換え前のドメイン内のアミノ酸は全て、順序の変化以外は保持される。いくつかの実施形態では、置換えのためのカットポイントは、可動性領域、例えば、可動性ループ、例えばβ６−β７（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の７１−８０に対応するアミノ酸）またはβ７−β８ループ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の８４−９９に対応するアミノ酸）内に存在し得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される受容体結合剤、例えば、ＩＬ−１ファミリーサイトカインドメインを含む受容体結合剤は、３０、２５、２２、２０、１９、１８、または約１７ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの実施形態では、受容体結合剤は、１８、１９、２０、２２、２５、３０、４０、４５、または５０ｋＤａ超の分子量を有する。例えば、受容体結合剤は、他のポリペプチド、ポリマまたは非ポリマ構成成分、例えば、薬物動態、安定性、免疫原性、および／または分子量を修飾する構成成分を含むことができる。タンパク質は他の修飾、例えば、翻訳後または合成修飾を含んでもよい。ある実施形態では、受容体結合剤はグリコシル化されない。他の実施形態では、受容体結合剤は少なくとも１つのグリコシル化を含む。
【０１３５】
例えば、本明細書で記載される受容体結合剤は、追加のドメインおよび特徴を含むことができる。例えば、受容体結合剤は、直接または間接的に、抗体タンパク質のドメイン、例えば、Ｆｃドメインまたは１つ以上の定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）に融合させることができる。例えば、ドメインはヒトドメインまたはヒトドメインの変異体とすることができる。Ｆｃドメインまたは１つ以上の定常ドメインは、受容体結合剤のＮ末端またはＣ末端に配置され得る。
【０１３６】
Ｆｃドメインは、任意の好適な免疫グロブリンから、例えば、ヒト抗体、例えば、例としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプの抗体、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができる。一例では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインのカルボキシル末端に対し、約位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基由来、または約位置Ｐｒｏ２３０由来の配列を含む。Ｆｃドメインは一般に２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ならびに任意でＣＨ４ドメインを含む。そのＦｃ領域内の置換および増加した血清半減期を有する抗体もまた、ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ０２／０６０９１９； Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004))に記載される。ＩｇＧ重鎖中の残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)におけるＥＵ指標のものであり、その中のヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体のナンバリングを参照する。
【０１３７】
１つの実施形態では、受容体結合剤は、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号およびGhetie et al.、Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000))で記載されるように、インビボ血清半減期を増加させるサルベージ受容体結合エピトープを含む。いくつかの実施形態では、エピトープは、受容体結合剤に融合されるＦｃ領域に含まれる。
【０１３８】
１つの実施形態では、受容体結合剤は、血清アルブミン配列、またはＦｃＲｎ受容体に結合するそのような配列の一部、または血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンに結合する配列を含む。例えば、血清アルブミンと結合する特定のペプチドは受容体結合剤、例えば、配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）と関連し得る。また、Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002)を参照されたい。
【０１３９】
受容体結合剤は、修飾され、その薬剤のサイズおよび安定性を増加させる配列、例えば、ＷＯ２００８／１５５１３４またはＷＯ２００９／０２３２７０に記載される配列を含むことができる。そのような配列は、一般に生物学的に不活性とすることができ、例えば、ＩＬ−１サイトカインファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達を調節しない。様々な安定化ポリペプチド配列を使用することができ、例えば、グリシンおよび／またはセリン、ならびに他のアミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニンまたはプロリンに富む配列である。例えば、配列は、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％のグリシンおよび／またはセリン残基を有するように設計することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質に結合された安定化ポリペプチド配列の合わされた長さは、少なくとも２０、２５、３５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００もしくは２０００超のアミノ酸とすることができる。安定化配列は、例えば、生物学的に活性なポリペプチド、例えば受容体結合剤のＮまたはＣ末端に融合させることができる。安定化配列の融合により、非修飾タンパク質に比べ融合タンパク質の流体力学半径が著しく増加することになり得る（例えば、超遠心分離法、サイズ排除クロマトグラフィー、または光散乱により検出できる）。いくつかの実施形態では、安定化配列は下記アミノ酸をほとんどまたは全く含まない：システイン（ジスルフィド形成および酸化を避けるため）、メチオニン（酸化を避けるため）、アスパラギンおよびグルタミン（脱アミドを避けるため）およびアスパラギン酸。安定化配列はタンパク質分解に対する感度を減少させる傾向があるプロリン残基を含むように設計することができる。
【０１４０】
結合アッセイ
受容体結合剤およびその標的の相互作用は任意の好適なアプローチ（例えばラジオイムノアッセイ、細胞結合アッセイ、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む）を用いて分析することができる。放射性ヨウ素標識タンパク質競合を使用する例示的な細胞結合アッセイがBoraschi、J. Immunol.、155(10):4719-25 (1995)で記載される。
【０１４１】
ＳＰＲまたは生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）は実時間で相互作用物のいずれも標識せずに、生体分子特異的相互作用を検出することができる。ＢＩＡチップの結合表面での質量変化（結合事象を示す）は、表面付近での光の屈折率の変化となる（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学事象）。屈折率の変化は検出可能なシグナルを発生させ、これは、生体分子間の実時間反応の指標として測定される。ＳＰＲを使用する方法は、例えば、Raether、1988、Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky、1991、Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al.、1995、Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705およびBIAcore International AB (Uppsala、Sweden)により提供されるオンライン資源において記載される。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムまたはＲｅｉｃｈｅｒｔ  ＳＲ７０００ＤＣ  Ｄｕａｌ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＳＰＲを使用して、動力学、親和性または特異性の観点で、標識を使用せずに、実時間で相互作用を比較し、ランク付けすることができる。サイトカイン受容体細胞外ドメイン（例えば、ＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメイン）に対する受容体結合剤の結合親和性は、ＳＰＲを用いておよそ生理的条件、例えば、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−２０下で測定することができる。例えば、結合および親和性を測定するために、ＳＰＲに頼らない他の方法もまた使用することができる。
【０１４２】
結合アッセイからの情報を使用して、受容体結合剤の標的への結合に対する平衡解離定数（ＫＤ）、および動力学パラメータ（例えば、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）の正確なおよび定量的測定値を提供することができる。そのようなデータを使用して、異なるタンパク質、標的、および条件を比較することができる。この情報を使用して、構造−活性関係（ＳＡＲ）を発生させることもできる。例えば、変異タンパク質の動力学および平衡結合パラメータを、参照または親タンパク質のパラメータと比較することができる。特定の結合パラメータ、例えば、高親和性および遅いＫｏｆｆと相関する一定の位置の変異アミノ酸は同定することができる。この情報は構造モデリング（例えば、相同性モデリング、エネルギー極小化、またはＸ線結晶解析またはＮＭＲによる構造決定を用いる）と組み合わせることができる。
【０１４３】
親和性を評価するために使用されるタンパク質は、組換え型で生成させることができ、精製または固定に好適なタグ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヘマグルチニンタグ、Ｈｉｓタグ、またはＦｃドメイン融合を含むことができる。受容体タンパク質（例えばＩＬ−１ＲＩ、およびＩＬ−１ＲＡｃＰ）の細胞外ドメインは、例えば、細菌または昆虫細胞において発現させることにより、例えば、Ｓｆ９細胞におけるバキュロウイルス発現を用いて、組換え型で生成させることができる。可溶性受容体タンパク質は、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて、例えば、それらのタグに結合する試薬を含むチップ、例えば、Ｆｃドメインまたは他のタグに特異的なＩｇＧでコートされたチップを用いて固定することができる。
【０１４４】
細胞活性アッセイ
受容体結合剤の受容体アンタゴニストとして機能する能力は、例えば、細胞ベースアッセイにおいて評価することができる。例えば、受容体結合剤によるＩＬ−１ＲＩ阻害を評価することができる。ＩＬ−１活性のためのいくつかの例示的なアッセイがBoraschi et alにおいて記載されており、Ｔ細胞増殖アッセイ、ＩＬ−６およびＩＬ−８生成アッセイ、およびカルシウム流入の阻害が挙げられる。
【０１４５】
１つの例示的なアッセイでは、受容体結合剤の能力がヒト線維芽細胞からのＩＬ−６のＩＬ−１β刺激放出を阻害する能力に対し評価される。ＭＲＣ５細胞におけるＩＬ−１β刺激サイトカイン放出の阻害は、薬剤の、ＩＬ−１媒介活性をインビボで阻害する能力と相関する。アッセイの詳細は、Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, Ch. 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons Inc., 2000に記載される。簡単に言うと、ヒトＭＲＣ５ヒト線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＃  ＣＣＬ−１７１、Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ、ＵＳＡ）をマルチウェルプレートにおいて培養密度まで増殖させる。細胞を滴定された用量の受容体結合剤および対照で処理する。細胞をその後、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１βと、滴定された薬剤および／または対照の存在下で接触させる。陰性対照細胞は、ＩＬ−１βで刺激しない。処理細胞の各群において放出されたＩＬ−６の量を、ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキットを用いて測定する(例えば、BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA)。使用することができる対照としては、緩衝剤のみ、ＩＬ−１Ｒａ、およびＩＬ−１βに対する抗体が挙げられる。
【０１４６】
受容体結合剤の有効性はまた、インビボで評価することができる。例示的なアッセイは、Economides et al., Nature Med., 9:47-52 (2003)に記載される。簡単に言うと、マウスに、滴定された用量の受容体結合剤および対照を腹腔内に注射する。注射２４時間後、マウスに組換えヒトＩＬ−１βを、１μｇ／ｋｇの用量で皮下に注射した。ＩＬ−１β（ピークＩＬ−６応答時間）の注射２時間後、マウスを屠殺し、血液を収集し、血清に対し処理する。血清ＩＬ−６レベルをＥＬＩＳＡによりアッセイする。パーセント阻害は、実験動物血清において検出されたＩＬ−６の対照において検出されたＩＬ−６に対する比に基づき計算することができる。
【０１４７】
インビボでのＩＬ−１活性に対する他の例示的なアッセイは、Boraschi et al.において記載されており、食欲不振、低血糖、および好中球増加症アッセイが挙げられる。
【０１４８】
生成
受容体結合剤は組換え宿主細胞での発現により生成させることができるが、他の方法、例えばインビトロ転写および翻訳ならびに化学合成によっても生成させることができる。
【０１４９】
細胞発現では、受容体結合剤をコードする１つ以上の核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）がクローニングまたは発現のために複製可能なベクターに挿入され得る。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスゲノム、ファージミド、ファージゲノム、または他の自己複製配列とすることができる。適切なコード核酸配列は、ベクター中に、様々な手順により挿入され得る。例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位を操作することができる（例えば、ＰＣＲを使用して）。その後、制限消化およびライゲーションを使用してコード核酸配列を適切な場所に挿入することができる。ベクター構成成分は一般に複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列の１つ以上を含む。
【０１５０】
受容体結合剤は、単離において組換えにより生成され得るが、また、１つ以上の他の構成成分、例えばシグナル配列、エピトープまたは精製部分、および標識への融合によっても生成される。受容体結合剤は、インターロイキン−１ファミリーメンバーのプロドメインを含むことができ、例えば、これはその後、タンパク質分解プロセシングにより除去することができる。
【０１５１】
細菌発現では、受容体結合剤はシグナル配列あり、またはなしで生成させることができる。例えば、細胞内で生成させることができ、そのため、封入体中、または可溶性画分中に蓄積する。例えば、原核生物シグナル配列、例えば、適切なリーダー配列、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ由来のものを追加することにより、分泌させることもできる。発現のための例示的な細菌宿主細胞としては、任意の形質転換性大腸菌Ｋ−１２株（例えば大腸菌ＢＬ２１、Ｃ６００、ＡＴＣＣ  ２３７２４；大腸菌ＨＢ１０１  ＮＲＲＬＢ−１１３７１、ＡＴＣＣ−３３６９４；大腸菌ＭＭ２９４  ＡＴＣＣ−３３６２５；大腸菌Ｗ３１１０  ＡＴＣＣ−２７３２５）、枯草菌株、シュードモナス、および他の桿菌が挙げられる。細菌系で生成されるタンパク質は典型的にはグリコシル化を欠く。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で記載される受容体結合剤は、実質的にグリコシル化がなく、例えば、哺乳類または他の真核細胞のグリコシル化修飾がない。
【０１５２】
受容体結合剤は酵母宿主細胞、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ボンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ハンゼヌラ（Hanseula）、またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現させることができる。酵母発現では、受容体結合剤はまた、細胞内でまたは分泌により、例えば、酵母インベルターゼリーダーまたはα因子リーダー（サッカロマイセスおよびクリベロマイセス型を含む）、または酸ホスファターゼリーダー、またはＣ．アルビカンス（C. albicans）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日に公開されたＥＰ３６２，１７９）を用いて生成させることができる。哺乳類細胞発現では、哺乳類シグナル配列、例えば同じまたは関連種の分泌されたポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダーを使用してタンパク質の分泌を誘導することができる。また、受容体結合剤は、インターロイキン−１ファミリーメンバーのプロドメイン、例えば、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βプロドメインを用いて生成させることができる。
【０１５３】
発現およびクローニングベクターはどちらもベクターが１つ以上の選択された宿主細胞で複製することを可能にする核酸配列を含む。そのような配列は様々な細菌、酵母、およびウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点がほとんどのグラム陰性細菌で好適であり；２μプラスミド開始点は酵母で好適であり；様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターで有用である。
【０１５４】
発現およびクローニングベクターは典型的には選択遺伝子またはマーカーを含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠乏を補う（例えば、サッカロマイセスにおけるＵＲＡ３マーカー）、または（ｃ）複合培地から得ることができない重大な栄養分を供給するタンパク質をコードし、例えば、桿菌ではＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。様々なマーカーがまた、哺乳類細胞に使用でき、例えば、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼである。ＤＨＦＲは、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)により記載されるように調製および増殖された、ＤＨＦＲ活性を欠く細胞系（例えばＣＨＯ細胞系）と共に使用することができる。
【０１５５】
発現およびクローニングベクターは通常、ｍＲＮＡ合成を駆動するために、受容体結合剤をコードする核酸配列に動作可能に結合されたプロモーターを含む。原核生物宿主と共に使用するのに好適な例示的なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系(Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776)、およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))が挙げられる。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、適切に配置されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含むことができる。Ｔ７ポリメラーゼ系もまた、Ｔ７プロモーターの制御下に配置された核酸コード配列の発現を駆動するために、使用することができる。例えば、ｐＥＴベクター(EMD Chemicals, Gibbstown NJ, USA)および例えば、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能なＮｏｖａｇｅｎ  Ｕｓｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＴＢ０５３およびＵＳ  ５，６９３，４８９に記載される宿主細胞を参照されたい。例えば、そのようなベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）細胞およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞と組み合わせて使用し、タンパク質、例えば、少なくとも０．０５、０．１、または０．３ｍｇ／ｍｌの細胞培養物を生成させることができる。使用することができる他の細胞系としては、Ｂ８３４、ＢＬＲ、ＨＭＳ１７４、ＮｏｖａＢｌｕｅのＤＥ３溶源菌、例えばｐＬｙｓＳプラスミドを有する細胞が挙げられる。
【０１５６】
酵母細胞と共に使用するための例示的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980))または他の糖分解酵素(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978))、例えばエノラーゼ、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、およびピルビン酸キナーゼのためのプロモーターが挙げられる。他の例示的な酵母プロモーターが誘導性であり、増殖条件により制御される転写の追加の利点を有する。誘導性プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のためのプロモーター領域が挙げられる。
【０１５７】
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの受容体結合剤をコードするｍＲＮＡの発現は例えば、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、および熱ショックプロモーターにより制御することができる。異種プロモーター系、例えば、テトラサイクリン応答性プロモーターもまた使用することができる。Urlinger, S., et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963‐7968を参照されたい。転写はまた、シスまたはトランスで配置されたエンハンサー配列により駆動させることができる。例示的な哺乳類ンハンサー配列としては、グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリンに対するものが挙げられる。追加の例としては、複製開始点の後側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは受容体結合剤のためのコード配列に対し５’または３’位でベクター中にスプライスされてもよいが、好ましくはプロモーターから５’部位に配置される。
【０１５８】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終止およびｍＲＮＡの安定化ために必要な配列を含むことができる。そのような配列は通常、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、時々３’、非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、受容体結合剤をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。発現ベクターはまた、１つ以上のイントロン配列を含み得る。
【０１５９】
受容体結合剤はまた、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９またはＳＦ２１細胞において、例えば、ｐＦＡＳＴ−ＢＡＣ（商標）系を用いて発現させることができる。追加の例示的なバキュロウイルス発現ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ，ＵＳＡから入手可能である。受容体結合剤はまた、哺乳類細胞において発現させることができる。例えば、哺乳類起源の細胞系もまた使用され得る。哺乳類宿主細胞系の例としては、サル腎細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）(Gluzman et al., Cell 23:175, 1981)、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞系、およびアフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）（McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991)により記載）が挙げられる。ＤＮＡを哺乳類細胞に導入するための確立された方法は記載されている(Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 1569)。
【０１６０】
組換え細胞における受容体結合剤の合成に対する適応に好適なさらに他の方法、ベクター、および宿主細胞はMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Sambrook et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press, (2001) (ISBN: 0879695773)に記載される。
【０１６１】
細胞中で発現されるとすぐに、受容体結合剤は、培地、封入体、細胞ライセートから回収することができる。細胞は、様々な物理的および化学的手段、例えば凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤（例えば、洗剤）により破壊することができる。
【０１６２】
受容体結合剤は、細胞ライセートまたは細胞培地中で見いだされ得る他の細胞タンパク質またはポリペプチドから精製することができる。様々なタンパク質精製方法を使用することができ、そのような方法は当技術分野において知られており、例えばDeutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990);およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (2010) (ISBN: 1441928332)において記載される。例示的な精製手順としては下記が挙げられる：イオン交換カラム上での分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、セファデックスＧ−７５を使用するゲル濾過；ＩｇＧなどの汚染物質を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；および親和性カラム（例えば、タンパク質のエピトープ−タグ形態に結合する金属キレート化カラムおよび受容体結合剤と関連する任意の精製部分に結合する様々なリガンドを有するカラム）。精製方法は、２つの異なるイオン交換クロマトグラフィーステップの組み合わせ、例えば、カチオン交換クロマトグラフ、続くアニオン交換クロマトグラフィー、またはその逆を含むことができる。受容体結合剤は、様々な方法によりイオン交換樹脂から溶離させることができ、塩および／またはｐＨ勾配またはステップが含まれる。いくつかの実施形態では、受容体結合剤は精製部分（例えば、エピトープタグおよび親和性ハンドル）を含む。そのような部分は、親和性クロマトグラフィーのために使用することができ、任意でタンパク質分解切断により除去することができる。
【０１６３】
イオン交換クロマトグラフィーはまた、イオン交換分離技術として使用され得る。イオン交換クロマトグラフィーは、分子の全体電荷間の違いに基づき分子を分離し、受容体結合剤の無傷な形態を、そのようなタンパク質の他の形態から分離するために使用することができる。
【０１６４】
アニオンまたはカチオン置換基は、クロマトグラフィーのためのアニオンまたはカチオンサポートを形成するためにマトリクスに結合させることができる。アニオン交換置換基としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）および第４級アミン（Ｑ）基が挙げられる。カチオン置換基としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）およびスルホン酸（Ｓ）が挙げられる。セルロースイオン交換樹脂、例えばＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２およびＣＭ−５２がＷｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．（Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｋｅｎｔ、Ｕ．Ｋ）から入手可能である。セファデックス（商標）および他の架橋イオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−、およびＳＰ−セファデックス（商標）ならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−およびＳ−セファロース（商標）およびセファロース（商標）Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗがＰｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢから入手可能である。ＤＥＡＥおよびＣＭ誘導体化エチレングリコール−メタクリレートコポリマ、例えばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０ＳまたはＭがＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）から入手可能である。
【０１６５】
カチオン交換表面は、共有結合された負に帯電したリガンドを有するイオン交換表面であり、よって、表面と接触する溶液中のカチオンとの交換のために遊離カチオンを有する。例示的な表面としてはカチオン交換樹脂、例えば共有結合された基がカルボン酸またはスルホン酸であるものが挙げられる。市販のカチオン交換樹脂としてはＣＭＣ−セルロース、ＳＰ−セファデックス（商標）およびＦａｓｔ  Ｓ−セファロース（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。
【０１６６】
イオン交換表面は、共有結合された正に帯電した基、例えば第４級アミノ基を有するイオン交換表面である。例示的なアニオン交換表面は、アニオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥセルロース、ＴＭＡＥ、ＱＡＥ  セファデックス（商標）およびＦａｓｔ  Ｑセファロース（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。
【０１６７】
受容体結合剤のための例示的な精製スキームは、溶解緩衝剤中に大腸菌細胞を溶解すること、続いて、深層濾過を含む。材料はその後、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）に供せられる。ＣＥＸ溶出液はその後、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）ステップにおいてアニオン交換媒質上に流される。ＡＥＸＦＴは、研磨ステップに供せられる。材料はその後、限外濾過／ダイアフィルトレーションにより処理することができ、例えば、材料が濃縮または脱塩される。限外濾過／ダイアフィルトレーション膜は、名目分画分子量（「ＮＭＷＣＯ」）に基づき選択されてもよく、よって、残余分中にタンパク質が保持され、低分子量材料、例えば塩が濾液に移行することができる。任意の緩衝溶液または滅菌水が、例えば、生成物の所望の最終ｐＨおよび伝導率によって、最終緩衝剤交換ステップ中に使用され得る。
【０１６８】
受容体結合剤は、様々な溶液、例えば水、ＰＢＳ、および緩衝溶液中で貯蔵することができる。例示的な緩衝溶液としては酢酸ナトリウムｐＨ４．５、酢酸ナトリウムｐＨ４．７、酢酸ナトリウムｐＨ４．９、酢酸ナトリウムｐＨ５．１、酢酸ナトリウムｐＨ５．３、酢酸ナトリウムｐＨ５．５、コハク酸ｐＨ５．２、コハク酸ｐＨ５．４、コハク酸ｐＨ５．６、コハク酸ｐＨ５．８、ヒスチジンｐＨ５．７、ヒスチジンｐＨ６．０、ヒスチジンｐＨ６．３、ヒスチジン６．６、リン酸ナトリウムｐＨ６．５、リン酸ナトリウムｐＨ６．７、リン酸ナトリウム７．０、リン酸ナトリウムｐＨ７．３、リン酸ナトリウムｐＨ７．７、イミダゾールｐＨ６．５、イミダゾールｐＨ６．８、イミダゾールｐＨ７．２、Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７が挙げられる。緩衝剤は、例えば、約１−１００ｍＭ、５−５０ｍＭ、１０−５０ｍＭ、または５−２５ｍＭの濃度で存在することができる。溶液はさらに、塩、例えばＮａＣｌ（例えば、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、または２５０ｍＭ、およびそれらの間の範囲）、アルギニン（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、およびそれらの間の範囲）、スクロース（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、８．５％、１０％、１５％、およびそれらの間の範囲）、および／またはグリセロール（例えば、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、８．５％、１０％、１５％、およびそれらの間の範囲）を含むことができる。
【０１６９】
受容体結合剤は組成物中に、少なくとも５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ以上の量で存在することができる。
【０１７０】
分析方法
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、受容体結合剤とは異なる調製物中のタンパク質を示し、例えば、受容体結合剤が調製された宿主細胞の内在性タンパク質、典型的には大腸菌タンパク質である。好ましくは、宿主細胞タンパク質は、１００００、１０００、９００、８００、または７００ｐｐｍ（百万分率）より少ない量で存在する。ＨＣＰは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは他の検出方法により検出することができる。例えば、ＥＬＩＳＡは、ＨＣＰに対するポリクローナル抗体を使用することができる。例示的なキットは、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＮ＃  Ｆ４１０；Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ  ＮＣ  ＵＳＡ）から入手可能である。別の例示的なキットはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術を使用する（ＡｌｐｈａＬｉｓａ（登録商標）大腸菌ＨＣＰキット、製品番号ＡＬ２６１  Ｃ／Ｆ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ  ＵＳＡ）。
【０１７１】
受容体結合剤を含むまたは潜在的に含む材料は、例えば、高圧液体クロマトグラフィーを使用して評価することができる。例示的な分析技術としては、弱カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ｗＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、逆相液体クロマトグラフィー、ＥＳＩ−ＭＳ、ターボスプレーイオン化質量分析、ナノスプレーイオン化質量分析、熱スプレーイオン化質量分析、音波スプレーイオン化質量分析、ＳＥＬＤＩ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳが挙げられる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、受容体結合剤のＮ末端領域は、ＩＬ−１βのＮ末端領域由来のペプチド、例えば、ペプチドＡＰＶＲＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）に同一な配列を含む。そのようなタンパク質を発現する組換え細胞（特に大腸菌細胞）は、無傷なタンパク質ならびに他のアイソフォーム、例えばｄｅｓ−Ａｌａアイソフォームおよび追加のメチオニン（例えば、Ａｌａ１へのＮ末端）を有するアイソフォームを生成することができる。アミノ酸位置２（ここでは、Ｎ末端残基が位置１である）にプロリンを含む受容体結合剤は、大腸菌プロテアーゼ、例えばＸ−ＰＲＯに対し切断特異性を有するアミノペプチダーゼＰによる切断を受けやすい。この切断は、Ｎ末端アミノ酸を除去することができる。例えば、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５は位置２にプロリンを有する。Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５の無傷な形態は、１５３アミノ酸長であり、アラニンから始まり、ｄｅｓ−Ａｌａ種は１５２アミノ酸長であり、プロリンから始まる。
【０１７３】
上記のものなどの分析技術を使用して、無傷な形態と他の形態、例えば、ｄｅｓ−Ａｌａ種の間で区別することができる。例示的な分析技術はｗＣＥＸ−ＨＰＬＣである。例えば、Ｐ０５は、下記実施例９で記載されるようにＤｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ−１０  ４ｘ２５０ｍｍカラム（製品番号０５４９９３）を用いて評価することができる。ＷＣＸ−ＨＰＬＣピークは質量分析とオンラインのＣ４逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣにより評価することができる。無傷なＰ０５は、理論的質量：１７７００．４Ｄａを有し、１７７００．４Ｄａとして検出できる。ｄｅｓ−Ａｌａ種は、１７６２９．４Ｄａとして検出でき、これは無傷なＰ０５の質量よりも７１Ｄａ少ない。７１Ｄａの質量の減少は、単一のアラニン残基の除去に対応する。
【０１７４】
医薬組成物
受容体結合剤は医薬組成物として製剤化することができる。典型的には、組成物は無菌であり、１つ以上の緩衝剤、薬学的に許容される塩、および賦形剤または安定剤を含む。例えば、組成物は水性組成物とすることができる。本明細書で記載される受容体結合剤は、生物製剤のための標準方法に従い、製剤化することができる。例えば、Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed.., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X); Protein formulation and delivery, McNally and Hastedt (eds.), Informa Health Care (ISBN: 0849379490) (2007)を参照されたい。
【０１７５】
医薬組成物のための受容体結合剤は、典型的には少なくとも１０、２０、５０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、または９９．９９％純粋であり、典型的にはヒトタンパク質を含まない。組成物中の唯一のタンパク質または組成物中の唯一の活性タンパク質とすることができる。また、１つ以上の他の活性タンパク質、例えば、１つ以上の他の精製活性タンパク質、例えば、関連または非関連タンパク質と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、組成物は、受容体結合剤を、約０．００１−１０％、例えば、０．００１−０．１％、０．０１−１％、または０．１％−１０％の濃度で含むことができる。
【０１７６】
したがって、本明細書では、本明細書で記載される薬剤の精製および単離形態もまた特徴とする。「単離」という用語は、そのオリジナル環境（例えば、受容体結合剤が生成される細胞または材料）から取り出された材料を示す。医薬組成物は、実質的に発熱性材料を含まず、実質的に核酸を含まず、および／または実質的に細胞酵素および構成成分、例えばポリメラーゼ、リボソームタンパク質、およびシャペロンタンパク質を含まない。
【０１７７】
医薬組成物は薬学的に許容される担体を含むことができる。本明細書では、「薬学的に許容される担体」は任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、および生理的に適合可能な同様なものを含む。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒性効果を与えない塩（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照されたい)、例えば、酸付加塩および塩基付加塩を示す。
【０１７８】
１つの実施形態では、受容体結合剤は、１つ以上の賦形剤、例えば塩化ナトリウム、およびリン酸緩衝剤（例えば、リン酸水素ナトリウム七水和物、リン酸二水素ナトリウム）、およびポリソルベートと共に製剤化される。例えば、緩衝溶液中、例えば、約５−１００、５−３０、３０−５０、または５０−１００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供することができ、２−８℃で貯蔵することができる。医薬組成物はまた、様々な他の形態とすることができる。これらとしては、例えば、液体、半固体および固体剤形、例えば液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散物または懸濁液、およびリポソームが挙げられる。好ましい形態は、対象の投与方法および治療適用に依存し得る。本明細書で記載される薬剤のための組成物は、典型的には注射可能または注入可能な溶液の形態であり、または局所または眼送達用である（下記を参照されたい）。
【０１７９】
医薬組成物は典型的には製造および貯蔵条件下で無菌および安定である。医薬組成物はまた、投与のための規制および業界標準を満たすことを保証するために試験することができる。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソーム、または他の高い薬物濃度に好適な秩序構造として製剤化することができる。無菌注射用溶液は、本明細書で記載される薬剤を、必要量で適切な溶媒中に、要求に応じて、上記で列挙された成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、続いて、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散物は、本明細書で記載される薬剤を、塩基性分散媒および上記で列挙されたものから要求される他の成分を含む無菌ビヒクル中に組み込むことにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、本明細書で記載される薬剤＋追加の所望の成分の粉末が前に無菌濾過されたその溶液から得られる。溶液の適当な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンを使用することにより、分散物の場合要求される粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤の使用により維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンの含有により操作することができる。
【０１８０】
例えば、受容体結合剤は、ポリマ、例えば、実質的に非抗原性ポリマ、例えばポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドと関連させることができる。いくつかの実施形態では、ポリマは受容体結合剤に、例えば、直接または間接的に共有結合される。好適なポリマは、実質的に重量変動する。約２００〜約３５，０００ダルトン（または約１，０００〜約１５，０００、および２，０００〜約１２，５００）の範囲の数平均分子量を有するポリマが使用され得る。例えば、受容体結合剤は、水溶性ポリマ、例えば、親水性ポリビニルポリマ、例えば、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンにコンジュゲートさせることができる。そのようなポリマの非制限的リストとしては、ポリアルキレンオキシドホモポリマ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマおよびそのブロックコポリマが挙げられ、ただし、ブロックコポリマの水溶性が維持されることを条件とする。追加の有用なポリマとしては、ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロックコポリマ（プルロニック）；ポリメタクリレート；カルボマー；サッカライドモノマＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸を含む分枝または非分枝多糖、例えばホモ多糖およびヘテロ多糖、例としてラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、デキストラン硫酸、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸ムコ多糖の多糖サブユニット、例えば、ヒアルロン酸；糖アルコールのポリマ、例えばポリソルビトールおよびポリマンニトール；ヘパリンまたはヘパランが挙げられる。
【０１８１】
ある実施形態では、受容体結合剤は、急速放出に対し化合物を保護する担体と共に調製され得る。放出制御製剤として、インプラントまたはマイクロカプセル化送達システムにより送達させることができる。生分解性、生体適合性ポリマ、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸が使用され得る。一般に、例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０１８２】
投与
受容体結合剤は、被験体、例えば、ヒト被験体に、様々な方法、例えば、ボーラスとしてまたは一定期間にわたる持続注入による静脈内投与により、筋内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、滑膜内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外注射、胸骨内注射および注入により投与することができる。さらに他の投与方法としては、局所（例えば、皮膚または粘膜）あるいは吸入（例えば、鼻内または肺内）経路が挙げられる。多くの適用に対し、投与経路は、静脈内注射または注入、皮下注射、または筋内注射の１つである。
【０１８３】
受容体結合剤は、一定用量またはｍｇ／ｋｇ用量で投与することができる。静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与することができる。受容体結合剤は、例えば、毎日、１日おき、２、３もしくは４日おき、毎週、３〜５週に一回、例えば、４週おき、または毎月投与することができる。
【０１８４】
医薬組成物は、「治療的有効量」の本明細書で記載される薬剤を含み得る。薬剤の治療的有効量は、因子、例えば個体の病態、年齢、性別、および体重、および化合物の個体における所望の応答を引き起こす能力、例えば、少なくとも１つの障害パラメータの寛解、または少なくとも１つの障害の症状の寛解（および任意で投与される任意の追加の薬剤の効果）に従い変動し得る。治療的有効量はまた、組成物の毒性または有害効果より、治療的に有益な効果が上回るものである。受容体結合剤は、典型的には治療的有効量で投与される。
【０１８５】
医薬組成物は、医療装置、例えば、インプラント、注入ポンプ、皮下針、無針皮下注射装置を使用して投与することができる。装置は、例えば、医薬組成物を貯蔵するための１つ以上のハウジングを含むことができ、単位用量の受容体結合剤、および任意で第２の薬剤を送達するように構成することができる。用量は一定用量、すなわち、治療される被験体のための単位用量として適合された物理的に別々の単位とすることができ；各単位は、医薬担体と共に、任意で別の薬剤と共に所望の治療効果を生成させるように計算された、予め決められた量の受容体結合剤を含むことができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される障害を治療するために、受容体結合剤を、障害を有する被験体に、障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標において持続する改善を誘導するのに十分な量および時間で投与することができる。改善は、被験体が１〜４週だけ離れた少なくとも２つの場合において改善を示した場合、「持続する」と考えられる。改善度は、徴候または症状に基づいて決定することができ、被験体に与えられる質問票、例えば、生活の質に関する質問票を採用することもできる。
【０１８７】
治療の量および時間が十分かどうかを決定するために疾病の程度を反映する様々な指標を評価することができる。選択した１つまたは複数の指標のためのベースライン値は、第１の用量の受容体結合剤の投与前の被験体の検査により確立される。好ましくは、ベースライン検査は第１の用量を投与する約６０日以内に実施される。
【０１８８】
改善は、被験体が選択された１つまたは複数の指標に対するベースラインを超える改善を明示するまで、ある用量の受容体結合剤を繰り返し投与することにより誘導することができる。慢性病状を治療する際には、改善度は、少なくとも１ヶ月以上、例えば、１、２、または３ヶ月以上の期間にわたり、あるいは無限に繰り返し投与することにより得られ得る。急性病状を治療する際には、薬剤は、１〜６週の期間、または単回投与で投与することができる。
【０１８９】
１つ以上の指標により、治療後の疾病の程度は改善されたように見えるが、治療は無限に同じレベルで、または低減された用量または頻度で、続けられることがある。治療はまた、例えば、症状の改善または消失時に、中断され得る。いったん治療が低減され、または中断されると、症状が再出現した場合に再開され得る。
【０１９０】
治療
受容体結合剤、例えば、ＩＬ−１ＲＩに結合し、ＩＬ−１シグナル伝達に拮抗するものは、「ＩＬ−１媒介障害」を治療するために使用することができ、その障害としては（ｉ）少なくとも一部はＩＬ−１アゴニズムにより引き起こされ、（ｉｉ）ＩＬ−１シグナル伝達構成成分（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、またはＩＬ−１ＲＩ）の活性のレベルの上昇またはＩＬ−１シグナル伝達の上昇と関連し、および／または（ｉｉｉ）ＩＬ−１活性を減少させることにより寛解される任意の疾患または病状が挙げられる。ＩＬ−１媒介障害は急性および慢性障害を含み、自己免疫障害および炎症性障害が挙げられる。ＩＬ−１媒介障害は、全身性および非全身性障害を含む。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは感染性応答ならびに炎症性疾患、例えば関節リウマチに関与する強力な炎症促進性サイトカインであることが確立している。ＩＬ−１生成の増加がいくつかの自己免疫障害、虚血、および様々な癌を有する患者において観察されており、よって、これらのおよび関連疾患にＩＬ−１が関与する。
【０１９１】
一般にSims and Smith, The IL-1 family: regulators of immunity, Nature Reviews Immunology, doi:10.1038/nri2691 (2010)もまた、参照されたい。
【０１９２】
「治療する」という用語は、本明細書で記載される薬剤の被験体、例えば患者への、統計学的に有意な程度または当業者に検出可能な程度のいずれかまでの、障害、例えば、本明細書で記載される障害と関連する病状、症状、またはパラメータを改善する、または障害の進行を防止するのに有効な量、様式および／または方法での投与を示す。治療は、障害、障害の症状または障害への素因を治す、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、是正する、寛解する、和らげる、改善するまたは影響することを意図することができる。有効量、様式、または方法は被験体によって変動し、被験体に合わせてもよい。例示的な被験体としては、ヒト、霊長類、および他の非ヒト哺乳類が挙げられる。受容体結合剤はまた、障害またはその症状の出現のリスクを減少させるために予防的に与えることもできる。
【０１９３】
ＩＬ−１媒介障害は自己免疫障害であり得る。ＩＬ−１媒介自己免疫障害の例としては下記が挙げられる：関節リウマチ、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、喘息、乾癬、Ｉ型糖尿病、および本明細書で同定される他の障害。本明細書で記載される受容体結合剤は、そのようなＩＬ−１媒介自己免疫障害を有するまたはそのリスクがある被験体に投与することができる。ＩＬ−１媒介障害は、炎症性障害、例えば下記で記載されるものとすることができる。本明細書で記載される受容体結合剤は、ＩＬ−１媒介炎症性障害を有するまたはそのリスクがある被験体に投与することができる。
【０１９４】
例示的なＩＬ−１媒介障害としては下記が挙げられる：
【０１９５】
関節リウマチおよび関連関節炎．受容体結合剤は、関節リウマチを有するまたはそのリスクがある被験体を治療するために使用することができる。関節リウマチ（ＲＡ）は、関節内の滑膜に影響し、関節軟骨を損傷する慢性全身性自己免疫性炎症性疾患である。ＲＡの病因は、Ｔリンパ球依存性であり、リウマチ因子として知られている自己抗体の生成を含み得る。リウマチ因子および抗原の複合体が形成し、関節液および血液中に蓄積する可能性があり、リンパ球、好中球、および単球の滑膜への浸潤を誘導する。関節は典型的には対称的なパターンで影響されるが、関節外疾患もまた起こることがあり、例えば、肺線維症、血管炎、および皮膚潰瘍、またはＦｅｌｔｙ症候群（好中球減少症、血小板減少症および脾腫として現れ得る）が引き起こされる。患者はまた罹患した関節の領域内のリウマトイド結節、心膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、および肺線維症を伴う間質性肺炎を示し得る。ＩＬ−１Ｒａの型が中程度〜重度に活動性ＲＡで示される。例えば、Cohen, S. et al. Arthritis & Rheumatism 46, 614-24 (2002); Fleischmann, R.M. et al. Arthritis & Rheumatism 48, 927-34 (2003); Nuki, G., et al. Arthritis & Rheumatism 46, 2838-46 (2002); Schiff, M.H. et al.  Arthritis & Rheumatism 50, 1752-60 (2004)を参照されたい。
【０１９６】
活動性ＲＡの症状としては疲労、食欲欠如、微熱、筋肉および関節痛、およびこわばりが挙げられる。筋肉および関節のこわばりは通常、午前中、不活性期間後に最も顕著である。フレア中、関節は、一般に滑膜炎の結果として、しばしば赤くなり、腫脹し、痛くなり、および圧痛がある。ＲＡおよびＲＡの症状を評価するために有用なスケールとしては、関節リウマチ重症度スケール(RASS; Bardwell et al., (2002) Rheumatology 41(1):38-45)、ＳＦ−３６関節炎特異的健康指標（Arthritis Specific Health Index ）(ASHI; Ware et al., (1999) Med. Care. 37(5 Suppl):MS40-50)、関節炎衝撃測定スケールまたは関節炎衝撃測定スケール２（Arthritis Impact Measurement Scales or Arthritis Impact Measurement Scales 2 ）(AIMS or AIMS2; Meenan et al. (1992) Arthritis Rheum. 35(1):1-10); Ｓｔａｎｆｏｒｄ健康評価質問票（ＨＡＱ）、ＨＡＱＩＩ、または改良ＨＡＱ(例えば、 Pincus et al. (1983) Arthritis Rheum. 26(11):1346-53を参照されたい)が挙げられる。
【０１９７】
本明細書で記載される受容体結合剤は、ＲＡを有するまたはそのリスクがある被験体に、発症を遅らせるおよび／または前記徴候および症状の１つ以上を寛解させるために投与することができる。被験体は、中程度〜重度の活動性ＲＡを有し得る。被験体は、ＴＮＦ阻害剤療法（例えば、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト）、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ）、またはＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）を用いた療法）に対するノンレスポンダーである可能性があり；被験体は前に、ＴＮＦ阻害剤を投与されたことがある可能性があり；または被験体はＴＮＦ阻害剤を摂取し続けている可能性がある（応答性がある、および応答性がない）。
【０１９８】
被験体はまた、メトトレキサートが投与され得る。被験体は、１つ以上の他のＤＭＡＲＤＳ（疾患修飾性抗リウマチ薬）、コルチコステロイド、および／または非ステロイド性炎症薬が投与され得る。受容体結合剤と同時投与することができるさらに他の薬物としては、ＣＤ２８の阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、ＲＡＮＫＬ、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１７の阻害剤が挙げられる。阻害剤としては、そのようなメディエーターに対する抗体、そのようなメディエーターに特異的な可溶性受容体、および／またはそのようなメディエーターのための受容体に対する抗体が挙げられる。
【０１９９】
若年性関節リウマチ．受容体結合剤は、例えば、２１、１８、１７、１６、１５、または１４歳未満の被験体において、若年性関節リウマチを治療するために使用することができる。若年性関節リウマチはいくつかの点でＲＡに類似する。被験体はリウマチ因子陽性であり得る。被験体は、その疾患の小関節、多関節、または全身型を有し得る。関節炎は、関節強直および発育遅延を引き起こす可能性があり、また、慢性前部ブドウ膜炎および全身性アミロイドーシスに至る場合もある。受容体結合剤は、そのような症状の１つ以上の発症を遅らせる、または寛解させるために使用することができる。
【０２００】
受容体結合剤は、若年性特発性関節炎、例えば全身型若年性特発性関節炎（ＳＯ−ＪＩＡ）を治療するために使用することができる。被験体は前のコルチコステロイド治療に失敗し、または０．３ｍｇ／ｋｇ以上の一日量でのコルチコステロイド治療を要求した可能性がある。例えば、Quartier et al. (2011) Ann Rheum Dis. 70(5):747-54を参照されたい。
【０２０１】
他のリウマチ性障害．本明細書で記載される受容体結合剤はまた、他のリウマチ性障害、例えば強皮症、全身性エリテマトーデス、痛風、骨関節炎、リウマチ性多発筋痛症、乾癬性関節炎および慢性ライム関節炎、随意筋および他の筋肉の炎症、例えば皮膚筋炎、封入体筋炎、多発性筋炎、およびリンパ脈管筋腫症、発熱性関節炎症候群、小児肉芽腫性関節炎（ＰＧＡ）／Ｂｌａｕ症候群、および本明細書で記載される他のリウマチ性障害を治療するために使用することができる。
【０２０２】
受容体結合剤は、代謝性リウマチ性障害、例えば、高尿酸血症と関連する障害、例えば、慢性急性痛風を含む痛風、および他の結晶媒介関節症を治療するために使用することができる。薬剤は、痛風に関連する薬剤性フレア、例えば、例としてキサンチンオキシダーゼ阻害剤、尿酸オキシダーゼ、または尿酸排泄促進薬により誘発されるフレアを治療するために使用することができる。痛風では、尿酸の結晶がインフラマソームを活性化し、ＩＬ−１βの放出を引き起こし得る。
【０２０３】
脊椎関節症．受容体結合剤は、脊椎関節症（障害、例えば強直性脊椎炎、Ｒｅｉｔｅｒ症候群、炎症性腸疾患と関連する関節炎、乾癬と関連する脊椎炎、若年発症型脊椎関節症および未分化脊椎関節症を含む）を治療するために使用することができる。脊椎関節症はしばしばＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子と関連する。被験体は、リウマチ因子を欠く可能性があり、脊椎炎および炎症性非対称性関節炎を有するまたは有しない仙腸関節炎を示す可能性がある。被験体はまたは眼炎症を有する可能性がある（下記を参照されたい）。
【０２０４】
強皮症．受容体結合剤は、強皮症または全身性硬化症を治療するために使用することができる。強皮症は、局所性または全身性であり得る皮膚の硬結により特徴づけられる。血管病変および微小血管系における内皮細胞損傷もまた存在し得る。被験体は、皮膚病変における単核細胞浸潤を示し、抗核抗体を有し得る。病因を示す他の器官としては、下記が挙げられる：胃腸管（平滑筋肉萎縮および線維症を有し、異常蠕動／運動となることがある）；腎臓（小さな弓状および小葉間動脈に影響する同心円状内皮下内膜増殖を有し、その結果、腎皮質血流が減少する可能性があり、および、タンパク質尿、高窒素血症および高血圧を引き起こし得る）；骨格筋（萎縮、間質性線維症、炎症、肺、間質性肺炎および間質性線維症を引き起こし得る）；心臓（例えば、収縮帯壊死および瘢痕／線維症を示す可能性がある）。本明細書で記載される受容体結合剤は、強皮症を有するまたはそのリスクがある被験体に、前記徴候および症状の１つ以上を寛解させるために投与することができる。
【０２０５】
シェーグレン症候群．受容体結合剤はシェーグレン症候群を治療するために使用することができる。シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症およびその後の涙腺および唾液腺の機能破壊により特徴づけられる。疾患は、炎症性結合組織疾患と関連する、またはこれを伴う可能性がある。疾患はＲｏおよびＬａ抗原（どちらも、低分子ＲＮＡ−タンパク質複合体である）に対する自己抗体産生と関連する。病変は乾性角結膜炎、口内乾燥となる可能性があり、他の徴候または関連、例えば、胆汁性肝硬変、末梢性または感覚性ニューロパチー、および触知可能紫斑病を有する。シェーグレンに関連する眼障害の治療はまた、下記で記載される。
【０２０６】
甲状腺障害．受容体結合剤は、甲状腺障害を治療するために使用することができる。例示的な甲状腺障害としては、Ｇｒａｖｅｓ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、および萎縮性甲状腺炎が挙げられ、甲状腺抗原に対する自己免疫応答の結果であり、甲状腺に存在し、しばしばこれに特異的なタンパク質と反応する抗体が産生する。自然モデルを含む実験モデルが入手可能である：ラット（ＢＵＦおよびＢＢラット）およびニワトリ（肥満ニワトリ株）およびサイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）のいずれかによる動物の免疫化により作製された誘導モデル。
【０２０７】
糖尿病＆代謝性障害．受容体結合剤は、糖尿病障害、例えば若年発症型糖尿病（自己免疫糖尿病およびインスリン−依存性糖尿病を含む）および成人発症型糖尿病（インスリン非依存性および肥満媒介糖尿病）、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病を治療するために使用することができる。例えば、Ｉ型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病は、自己抗体および自己反応性Ｔ細胞により引き起こされる膵島細胞の自己免疫破壊と関連する。さらに、ＩＬ−１β活性の減少は、グルコース制御およびβ細胞機能を改善することができ、ＩＩ型糖尿病を治療するために使用することができる。例えば、Owyang et al. Endocrinology. 2010;151(6):2515-27を参照されたい。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載される受容体結合剤を、インスリンが投与されていない被験体、例えば、インスリン依存性でない被験体に投与することができる。例えば、被験体は前糖尿病である可能性がある。被験体は、耐糖能障害または空腹時高血糖のいずれかを有し得る。被験体は肥満である、または２３、２５、３０、３５、または４０ｋｇ／ｍ２超の肥満度指数を有する可能性がある。被験体は、インスリン抵抗性であり、および／または高血糖または高インスリン血症により特徴づけられる可能性がある。被験体は、ＩＩ型糖尿病へ進行するリスクがあり得る。 Larsen, et al. (2007) NEJM 356:1517-26およびLarsen, et al. (2009). Diabetes Care 32:1663-8もまた、参照されたい。いくつかの実施形態では、被験体は、６．１、６．５、７、または８ｍｍｏｌ／Ｌを超える空腹時血糖値を有する。いくつかの実施形態では、被験体は、５．５、５．７、６、６．４、７、７．５、または８％を超えるＡ１Ｃレベルを有する。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、被験体はまた、インスリン分泌促進物質、例えば、例としてスルホニル尿素（例えば、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、トルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド）および／またはメグリチニド（例えば、レパグリニド、ナテグリニド）（インスリン分泌を促進する）が投与される。被験体はまた、ビグアナイド（例えば、メトホルミン）が投与され得る。受容体結合剤は、膵臓β細胞の損失および／またはそれへの損傷を減少させるために投与することができる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、被験体は遺伝子ＩＬ１ＲＮの５’付近に位置するｒｓ４２５１９６１のＣアレルにヘテロ接合性またはホモ接合性である。
【０２１０】
受容体結合剤による治療は、糖尿病に関連する二次的疾患、例えば糖尿病網膜症、糖尿病患者における腎臓移植片拒絶、肥満媒介インスリン抵抗性、および腎不全（それ自体、タンパク質尿および高血圧と関連し得る）の悪化を寛解または防止することを含む。
【０２１１】
胃腸障害．本明細書で記載される受容体結合剤は、炎症性胃腸障害、例えば、例としてセリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、特発性胃不全麻痺膵炎、例えば慢性膵炎、急性膵炎、炎症性腸疾患および潰瘍、例えば胃および十二指腸潰瘍を治療するために使用することができる。
【０２１２】
肺障害．受容体結合剤は、ＩＬ−１により媒介される肺疾患を治療するために使用することができる。治療することができる例示的な肺疾患としては、慢性閉塞性肺疾患（例えば、肺気腫および慢性気管支炎）、肺胞蛋白症、ブレオマイシン誘導肺疾患および線維症、肺線維症、例えば特発性肺線維症および放射線誘導肺線維症、肺サルコイドーシス、嚢胞性線維症、肺内でのコラーゲン蓄積、ＡＲＤＳ、気管支肺異形性症（ＢＰＤ）、慢性閉塞性肺疾患、および未熟児の慢性線維性肺疾患が挙げられる。さらに、本明細書で記載される受容体結合剤は、職業性肺疾患、例えば石綿肺、炭坑夫塵肺、珪肺症または微小粒子への長期暴露と関連する同様の病状を治療するために使用することができる。好酸球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎を含む炎症性および線維性肺疾患は、間違って制御された免疫−炎症反応を含む場合があり、これは受容体結合剤を使用して治療することができる。
【０２１３】
サルコイドーシスは、身体内のほぼ任意の組織中の類上皮細胞肉芽腫の存在により特徴付けられ；肺の関与が最も一般的である、病因がわかっていない病状である。病因は、疾患部位での活性化マクロファージおよびリンパ球細胞の持続が関与し、これらの細胞型により放出された局所的および全身的に活性な活性生成物の放出に起因するその後の慢性続発症が存在する。
【０２１４】
心血管障害．本明細書で記載される受容体結合剤は、心血管障害または損傷、例えば大動脈瘤、急性冠動脈症候群、動脈炎、血管閉塞、例えば大脳動脈閉塞、冠動脈バイパス術の合併症、虚血／再灌流障害、心疾患、例えばアテローム硬化性心疾患、心筋炎、例えば慢性自己免疫性心筋炎およびウイルス性心筋炎、心不全、例えば慢性心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心臓手術後または頸動脈バルーン血管形成手順後の再狭窄および／またはアテローム性動脈硬化、無症候性心筋虚血、左心室ポンプ機能不全、左心室補助装置の移植後合併症、Ｒａｙｎａｕｄ現象、血栓性静脈炎、血管炎、例えばＫａｗａｓａｋｉ血管炎、静脈閉塞症、巨細胞動脈炎、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、およびＳｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ紫斑病を治療するために使用することができる。受容体結合剤はまた、予防的に、例えば、そのような心血管障害のリスクを減少させるために提供することができる。いくつかの実施形態では、受容体結合剤は、アテローム性動脈硬化を治療するために、またはそのリスクを減少させるために患者に投与される。
【０２１５】
ＩＬ−１媒介シグナル伝達は、急性心筋梗塞により活性化され梗塞周囲心筋細胞におけるアポトーシス細胞死を開始し、梗塞ゾーンのサイズを拡張することができる。本明細書で記載される受容体結合剤は、心筋梗塞により引き起こされる損傷を減少させるために投与することができる。例えば、受容体結合剤は、心筋梗塞のリスクがある被験体、または心筋梗塞、特に急性心筋梗塞を、例えば、この２、４、６、１２、２４、または４８時間以内に経験した被験体に投与することができる。薬剤は、他の薬剤、例えば、ヘパリンおよびアスピリンと組み合わせて投与することができる。
【０２１６】
受容体結合剤はまた、脳卒中、くも膜下出血、頭部外傷または脳損傷、および／または心血管障害と関連する炎症を治療するために使用することができる。例えば、ＩＬ−１βのレベルの上昇は、脳卒中および脳損傷と関連する神経炎症を示す(Rothwell, N. J., et al., TINS 23(12): 618-625, 2000)。受容体結合剤は、そのような炎症および虚血および／または低酸素と関連する他の炎症を減少させるために投与することができる。さらに、受容体結合剤はまた、例えば、そのような障害および／またはそのような障害と関連する炎症のリスクを減少させるために、予防的に提供することができる。例えば、受容体結合剤は、脳卒中、虚血事象、他の心血管事象、または出血事象（例えばくも膜下出血）のリスクがある被験体、または脳卒中、虚血事象、他の心血管事象、または出血事象（例えば、くも膜下出血）を、例えば、この２、４、６、１２、２４、または４８時間以内に経験した被験体に投与することができる。
【０２１７】
尿生殖器および腎障害．尿生殖器系の障害もまた、本明細書で記載される受容体結合剤で治療することができる。そのような障害としては、糸球体腎炎、例えば自己免疫性糸球体腎炎、毒素への暴露による糸球体腎炎または溶血性連鎖球菌または他の感染病原体による感染に続発する糸球体腎炎が挙げられる。免疫媒介腎疾患、例えば糸球体腎炎および尿細管間質性腎炎は、腎抗原に対する自己反応性抗体またはＴ細胞の産生の結果として直接的に、または他の非腎抗原に対して反応性である抗体および／または免疫複合体の腎臓中での堆積の結果として間接的に、腎組織への抗体またはＴリンパ球媒介損傷の結果である。よって、免疫複合体の形成となる他の免疫媒介疾患はまた、間接的続発症として免疫媒介腎疾患を誘導することができる。直接および間接免疫メカニズムはどちらも、腎組織中での病変発症を生成／誘導する炎症反応となり、結果的に臓器機能障害となり、場合によっては腎不全へと進行する。体液性および細胞免疫メカニズムはどちらも病変の病因に関与し得る。
【０２１８】
受容体結合剤はまた、尿毒症症候群およびその臨床的合併症（例えば、腎不全、貧血、および肥大型心筋症）、例えば環境毒素、薬物または他の原因への暴露と関連する尿毒症症候群を治療するために使用することができる。胆嚢壁の炎症から生じ、吸収機能に変化をもたらす合併症もまた、治療することができる。そのような合併症には、胆石症（胆石）および総胆管結石症（胆管結石）ならびに胆石症および総胆管結石症の再発が含まれる。治療することができるさらなる病状は、血液透析の合併症；前立腺病状、例えば良性前立腺肥大、非細菌性前立腺炎および慢性前立腺炎；および血液透析の合併症である。受容体結合剤はまた、慢性疼痛状態、例えば慢性骨盤痛、例えば慢性前立腺炎／骨盤痛症候群、およびヘルペス後疼痛を治療するために使用することができる。
【０２１９】
血液および腫瘍障害．本明細書で記載される受容体結合剤は、様々な形態の癌、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス−陽性上咽頭癌、グリオーマ、結腸、胃、前立腺、腎細胞、頸部および卵巣癌、肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）、例えば癌関連悪液質、疲労、無力症、悪液質の傍腫瘍性症候群および高カルシウム血症を治療するために使用することができる。例えば、Voronov et al. (2003) PNAS 100:2645-2650を参照されたい。固形腫瘍、例えば肉腫、骨肉腫、および癌腫、例えば腺癌（例えば、乳癌）および扁平上皮癌もまた治療可能である。一定の腫瘍におけるＩＬ−１βの役割に関しては、例えば、Krelin et al. (2007) Cancer Res. 67:1062-1071を参照されたい。追加の癌としては、食道癌、胃癌、胆嚢癌腫、白血病、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄性白血病、慢性または急性リンパ芽球性白血病およびヘアリー細胞白血病が挙げられる。浸潤性転移性能力を有する他の悪性腫瘍、例えば多発性骨髄腫は、受容体結合剤により治療することができる。例えば、Lust et al. (2009) Mayo Clin Proc 84(2):114-122を参照されたい。
【０２２０】
受容体結合剤はまた、貧血および血液障害、例えば慢性特発性好中球減少症、慢性疾患の貧血、再生不良性貧血、例えばＦａｎｃｏｎｉ再生不良性貧血；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；血栓性血小板減少性紫斑病、骨髄異形成症候群（不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰芽球を伴う不応性貧血、過剰芽球変化を伴う不応性貧血を含む）；骨髄線維症／骨髄化生；および鎌状赤血球血管閉塞性発作を治療するために使用することができる。
【０２２１】
自己免疫溶血性貧血、免疫汎血球減少症、および発作性夜間血色素尿症は、赤血球（および場合によっては、他の血液細胞、例えば血小板）の表面で発現された抗原と反応する抗体の生成に起因する可能性があり、補体媒介溶解および／またはＡＤＣＣ／Ｆｃ−受容体媒介メカニズムを介するそれらの抗体コート細胞の除去の結果である。自己免疫血小板減少症、例えば血小板減少性紫斑病、および他の臨床的設定では免疫媒介血小板減少症では、血小板破壊／除去は、血小板への抗体または補体のいずれかの結合およびその後の補体溶解、ＡＤＣＣまたはＦＣ−受容体媒介メカニズムによる除去の結果として起こる。
【０２２２】
受容体結合剤はまた、様々なリンパ球増殖性障害、例えば自己免疫リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、慢性リンパ芽球性白血病、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ性白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス−陽性Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、Ｈｏｄｇｋｉｎ病、びまん性侵攻性リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔγリンパ球増殖性疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち、菌状息肉腫）およびＳｅｚａｒｙ症候群を有するまたはそのリスクがある被験体に投与することができる。
【０２２３】
肝障害．本明細書で開示される受容体結合剤はまた、肝臓の病状、例えば肝炎、例として急性アルコール肝炎、急性薬剤性またはウイルス肝炎、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎、硬化性胆管炎、肝類洞上皮、および未知の原因による肝臓の炎症を治療するのに有用である。
【０２２４】
聴覚障害．受容体結合剤はまた難聴を伴う、および異常ＩＬ−１発現と関連する障害を治療するために使用することができる。そのような障害としては、自己免疫過程に起因すると考えられる蝸牛神経関連難聴、例えば、自己免疫難聴、メニエール症候群および真珠腫、しばしば難聴と関連する中耳障害が挙げられる。
【０２２５】
骨障害．本明細書で記載される受容体結合剤で治療可能な骨および関節の非関節炎障害。これは、骨または関節の炎症性障害、骨減少に至る破骨細胞障害、例えば限定はされないが骨粗鬆症、例えば閉経後骨粗鬆症、骨関節炎歯の緩みまたは損失に至る歯周炎、および関節置換後の人工関節の緩み（一般に摩耗デブリに対する炎症反応と関連する）、例えば、整形外科的インプラント骨溶解を含む。
【０２２６】
アミロイド障害．さらに、本明細書で記載される受容体結合剤は、原発性アミロイドーシスおよび様々な病状を特徴とする続発性アミロイドーシス、例えばアルツハイマー病、続発性反応性アミロイドーシス；Ｄｏｗｎ症候群；および透析関連アミロイドーシスを治療するために使用することができる。さらに、受容体結合剤は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、およびパーキンソン病を治療するために使用することができる。これらの疾患はまた、凝集物およびアミロイドの形成を伴うことがあり、これが炎症反応を誘発する可能性がある。
【０２２７】
神経障害．受容体結合剤はまた、中枢および末梢神経系の神経炎症および脱髄疾患、例えば多発性硬化症；特発性脱髄多発ニューロパチーまたはＧｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群；および慢性炎症性脱髄多発ニューロパチーを治療するために使用することができる。これらの障害は、自己免疫基礎を有し、オリゴデンドロサイトまたはミエリンに直接引き起こされる損傷の結果として神経脱髄となると考えられる。多発性硬化症疾患誘導では、Ｔリンパ球が関与する。多発性硬化症は、再発寛解過程または慢性進行性過程のいずれかを有する。病変は、主にＴリンパ球媒介、ミクログリア細胞の浸潤および浸潤性マクロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、病変での主な細胞型である。オリゴデンドロサイト細胞死およびその後の脱髄のメカニズムはわかっていないが、Ｔリンパ球駆動のようである。
【０２２８】
ミオパチー．受容体結合剤は炎症および自己免疫と関連するミオパチーを治療するために使用することができる。特発性炎症性ミオパチー、例えば皮膚筋炎、多発性筋炎などは、筋力低下に至る病因のわからない慢性筋炎の障害である。筋肉損傷／炎症はしばしば、対称的で進行性である。自己抗体はほとんどの形態と関連する。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する構成成分、タンパク質およびＲＮＡに対して作られ、その機能を阻害する。
【０２２９】
血管炎障害．本明細書で記載される受容体結合剤は、血管炎障害、例えば、全身性血管炎を治療するために使用することができる。全身性血管炎は、原発病変が炎症であり、その後血管への損傷がおこり、これにより影響を受けた血管により供給される組織への虚血／壊死／変性が起こり、場合によっては最終的には末端器官機能不全となる、疾患を含む。血管炎はまた、特に免疫複合体の形成とも関連する疾患において、他の免疫−炎症性媒介疾患、例えば関節リウマチ、全身性硬化症、などに対する二次病変または続発症として起こり得る。
【０２３０】
原発性全身性血管炎群における疾患としては下記が挙げられる：全身性壊死性血管炎：結節性多発動脈炎、アレルギー性血管炎および肉芽腫症、多発性血管炎；Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症；および巨細胞動脈炎。様々な血管炎としては下記が挙げられる：皮膚粘膜リンパ節症候群（ＭＬＮＳまたはＫａｗａｓａｋｉ病）、単離ＣＮＳ血管炎、Ｂｅｈｃｅｔ病、閉塞性血栓血管炎（Ｂｕｅｒｇｅｒ病）および皮膚壊死性細静脈炎。これらの血管炎障害の発症メカニズムは、主に、免疫グロブリン複合体の血管壁中での堆積およびその後の、ＡＤＣＣ、補体活性化、または両方のいずれかを介する炎症反応の誘導によると考えられている。
【０２３１】
ＣＡＰＳ．受容体結合剤は、ＣＡＰＳ障害、すなわち、ＣＩＡＳ１関連周期性症候群を治療するために使用することができる。ＣＡＰＳは３つの遺伝的症候群を含む：新生児期発症多臓器性炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、Ｍｕｃｋｌｅ−Ｗｅｌｌｓ症候群（ＭＷＳ）、および家族性感冒自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）。(Hoffman et al. 2001 Naure 29:301-305; Feldmann et al. 2002 Am J Hum Genet 71:198-203; Aksentijevich et al. 2002 Arthritis Rheum 46:3340-3348)。ＣＡＰＳは、常染色体優性様式で孤発性または家族性パターンで遺伝する。ＣＩＡＳ１はＮＡＬＰ３、「インフラマソーム」、細胞内酵素複合体（カスパーゼ１の活性を制御する）のタンパク質構成成分をコードする。ＣＩＡＳ１の変異により、ＩＬ−１の生成および多くの病的結果が増加する(Aksentijevich et al. 2002 上記)。ＩＬ−１は、肝臓中の急性相反応物、例えばＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の生成を強く誘導する。
【０２３２】
ＣＡＰＳ障害は共通の臨床的特徴を共有し、様々な臨床的重症度として現れる。ＮＯＭＩＤは最も重篤な障害であり、ＭＷＳは幾分重篤ではなく、ＦＣＡＳが最も重篤ではない。ＣＡＰＳ障害は、いくつかの重なる特徴を有し、個体は徴候および症状の独特な群を有し得る。これらの病状全てに共通な特徴としては、発熱、蕁麻疹様皮疹、関節炎または関節痛、筋肉痛、倦怠感、および結膜炎が挙げられる。
【０２３３】
ＮＯＭＩＤでは、慢性無菌性髄膜炎は精神遅滞に至る可能性あり、これらの患者はまた、骨端および膝蓋骨での酷いおよび障害を引き起こす骨過成長を患う可能性がある。これらの患者はまた、頭蓋内圧の増加に起因する視神経萎縮による失明を患うこともある。ＭＷＳおよびＮＯＭＩＤは、通常、聴覚系、髄膜、および関節を含み得る重篤な炎症と関連する。これらの患者は、毎日、高いスパイク熱および分布および強度がしばしば変わる慢性皮疹を患う。患者は、難聴または聴覚消失を患う可能性がある。結膜炎およびうっ血乳頭がしばしば観察される。アミロイドーシスが発症し、慢性炎症および急性相反応物（特にＳＭ）の過剰産生による腎不全に至ることもある。受容体結合剤は、ＮＯＭＩＤ、ＭＷＳ、またはＦＣＡＳを有する、またはＮＯＭＩＤ、ＭＷＳ、またはＦＣＡＳと関連する遺伝子型を有すると診断された被験体に投与することができる。さらに、受容体結合剤は、ＴＲＡＰＳ（ＴＮＦ受容体関連周期性症候群）を有する被験体に投与することができる。
【０２３４】
皮膚障害．受容体結合剤は、皮膚障害、例えば炎症性皮膚障害または自己免疫もしくは免疫媒介皮膚疾患を治療するために使用することができる。例示的な障害は乾癬である。追加の自己免疫または免疫媒介皮膚疾患、例えば水疱性皮膚疾患、多形成紅斑、および接触皮膚炎は自己抗体により媒介され、その起源はＴリンパ球依存性である。乾癬はＴリンパ球媒介炎症性疾患である。病変は、Ｔリンパ球、マクロファージおよび抗原処理細胞、およびいくつかの好中球の浸潤を含む。
【０２３５】
治療することができる皮膚または粘膜の追加の障害としては、棘融解疾患、例えばＤａｒｉｅｒ病、毛包性角化症および尋常性天疱瘡が挙げられる。さらなる追加の障害としては下記が挙げられる：ざ瘡、酒さ性ざ瘡、円形脱毛症、アフタ性口内炎、水疱性類天疱瘡、火傷、湿疹、紅斑、例えば多形成紅斑および多形水疱性紅斑（Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群）、炎症性皮膚疾患、扁平苔癬、リニアＩｇＡ水疱性疾患（小児慢性水疱性皮膚症）、皮膚弾力の喪失、粘膜表面潰瘍、例えば胃潰瘍、好中球皮膚炎（Ｓｗｅｅｔ症候群）、皮膚筋炎、毛孔性紅色粃糠疹、乾癬、壊疽性膿皮症、多中心性細網組織球症、および中毒性表皮剥離症。受容体結合剤により治療可能な他の皮膚関連病状としては、疱疹状皮膚炎（Ｄｕｈｒｉｎｇ病）、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、および蕁麻疹（慢性特発性蕁麻疹を含む）が挙げられる。
【０２３６】
アレルギー性障害．受容体結合剤は、アレルギー性障害、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、アレルギー性結膜炎（下記を参照されたい）および蕁麻疹を治療するために使用することができる。これらの疾患はしばしば、Ｔリンパ球誘導炎症、ＩｇＥ媒介−炎症、または両方により媒介される。
【０２３７】
喘息は、呼吸器系が関与する慢性病状であり、しばしば１つ以上のトリガーに応答して、気道が時々狭窄し、炎症し、過剰量の粘液で覆われる。エピソードは、環境刺激物質（またはアレルゲン）例えば、冷気、暖気、湿り空気、運動または労作、情緒的ストレス、およびウイルス疾病への暴露などのことによりトリガされ得る。気道狭窄は、症状、例えば喘鳴、息切れ、胸部絞扼感、および咳を引き起こす。受容体結合剤は、喘息を治療するために使用することができ、そのような治療薬の局所または肺送達のために製剤化することができる、または非経口的に送達することができる。
【０２３８】
移植．受容体結合剤は、移植を受ける予定である、受けている、またはそれから回復している被験体に投与することができる。移植関連疾患、例えば移植片拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球機能の阻害は寛解性である。角膜移植は、血管新生と関連する可能性があり、これは、受容体結合剤による治療によって寛解され得る。受容体結合剤はまた、実質臓器移植、例えば心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺（肺移植片気道閉塞）または他の移植片、例えば骨髄移植片に起因する合併症を治療するために使用することができる。
【０２３９】
感染疾患．本明細書で記載される受容体結合剤は、原生動物疾患、例えばマラリアおよび住血吸虫症を治療する、およびらい性結節性紅斑；細菌またはウイルス髄膜炎；結核、例えば肺結核；および細菌またはウイルス感染、例えばインフルエンザ感染および感染性単核球症に続発する間質性肺炎を治療するのに有用である。
【０２４０】
遺伝的周期熱症候群、例えば家族性地中海熱、高グロブリンＤ血症および周期熱症候群およびＴＮＦ−受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、および成人発症Ｓｔｉｌｌ病、Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ症候群、および線維性肺胞炎もまた、受容体結合剤により治療可能である。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、受容体結合剤は、被験体におけるＩＬ−６の活性または発現を減少させるために、被験体に投与される。例えば、被験体は、少なくとも一部はＩＬ−６に関連するまたはこれに媒介される障害を有し得る。
【０２４２】
眼障害および眼送達
本明細書で記載される受容体結合剤は、眼障害、例えば眼の表面に影響する眼障害、炎症性眼障害、および少なくとも一部は自己免疫反応により媒介される眼障害を治療するために使用することができる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、眼障害は、眼の表面に影響するドライアイ障害である。障害は、乾性角結膜炎、乾性角膜炎、乾燥症候群、眼球乾燥症、涙膜障害、涙液産生減少、水性涙液欠乏、およびマイボーム腺機能不全とも呼ばれる病状を含む。ドライアイは、シェーグレン症候群（ＳＳ）と関連する形態、例えば、シェーグレン症候群関連乾性角結膜炎を含み得るが、関連しない形態、例えば、非シェーグレン症候群関連乾性角結膜炎も含み得る。患者は、全身性自己免疫障害の他の徴候を有する場合もあり、有さない場合もある。ＩＬ−１は、ドライアイ障害の病因に関与している。例えば、Enriquez de Salamanca et al. (2010), Mol. Vis. 16:862-873を参照されたい。
【０２４４】
ドライアイ症候群を有する被験体は、眼の乾燥の炎症を示すことがあり、ひりひり、刺すような、かゆい、焼けるまたは圧力感覚、刺激、疼痛、および発赤を経験することがある。ドライアイは、過剰な流涙および逆に不十分な涙液産生の両方と関連し得る。受容体結合剤は、１つ以上のそのような症状の発症または悪化を寛解または防止するために、そのような被験体に投与することができる。受容体結合剤はまた、疼痛、例えば、眼疼痛（例えば神経炎症による）を、そのような疼痛を経験している被験体において緩和するために使用することができる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、眼障害は、全身性自己免疫障害（例えばシェーグレン症候群および関節リウマチ）またはＩＬ−１もしくは別のＩＬ−１サイトカインファミリーメンバーと関連する障害と関連する眼障害である。患者は、全身性自己免疫障害または全身性自己免疫障害の他の徴候を有しても、有さなくてもよい。
【０２４６】
受容体結合剤はまた、眼の表面、例えば角膜に影響する他の障害を治療するために使用することができる。そのような障害としては、角膜眼表面炎症性状態、角膜血管新生、角膜炎、例えば末梢性潰瘍性角膜炎および細菌性角膜炎が挙げられる。受容体結合剤は、角膜創傷治癒を受けている被験体（例えば、角膜創傷を有する被験体）を治療するために使用することができる。受容体結合剤は、眼に関係する手順、例えば、角膜移植／角膜形成、人工角膜移植手術、表層移植、選択的内皮移植を受ける予定である、受けている、またはそれから回復している被験体に投与することができる。例えば、Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43; Dekaris et al. (1999) Curr Eye Res 19(5): 456-9;およびDana et al. (1997) Transplantation 63:1501-7を参照されたい。受容体結合剤は、結膜に影響する障害、例えば結膜瘢痕障害および結膜炎を治療するために使用することができる。受容体結合剤は、さらに他の障害、例えば類天疱瘡症候群およびＳｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群を治療するために使用することができる。本明細書で記載される受容体結合剤は、眼内またはその周りの血管新生を調節するために、被験体に投与することができる。例えば、Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43を参照されたい。
【０２４７】
受容体結合剤は、眼に影響するアレルギー性反応を有する被験体、例えば、重篤なアレルギー性（アトピー性）眼疾患、例えばアレルギー性結膜炎を経験している被験体に投与することができる。例えば、受容体結合剤は、局所的に投与することができる。例えば、Keane-Myers AM et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(12): 3041-6も参照されたい。
【０２４８】
受容体結合剤は、眼に影響する自己免疫障害を有する被験体に投与することができる。例示的な自己免疫眼障害としては、交感性眼炎、Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ  Ｈａｒａｄａ（ＶＫＨ）症候群、バードショット脈絡網膜炎、眼瘢痕性類天疱瘡、Ｆｕｃｈｓ異時性虹彩毛様体炎、および様々な形態のブドウ膜炎が挙げられる。受容体結合剤は、前記障害のいずれかを治療するために被験体に投与することができる。
【０２４９】
受容体結合剤は、糖尿病網膜症を有するまたはそのリスクがある被験体に投与することができる。例えば、Demircan et al. (2006) Eye 20:1366-1369 and Doganay et al. (2006) Eye, 16:163-170を参照されたい。
【０２５０】
ブドウ膜炎は急性および慢性形態を含み、虹彩、毛様体、および脈絡膜の１つ以上の炎症を含む。慢性形態は、全身性自己免疫疾患、例えば、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、Ｒｅｉｔｅｒ症候群、および炎症性腸疾患と関連する場合がある。別のブドウ膜炎では、炎症は主に虹彩においてである（虹彩炎もまた）。前部ブドウ膜炎は、全身性自己免疫疾患を有する被験体に影響する可能性があるが、全身性自己免疫疾患を有しない被験体にもそうである。中間ブドウ膜炎は、前部硝子体、末梢性網膜、および毛様体の炎症を伴い、しばしば、前部または脈絡網膜炎症はほとんどない。毛様体扁平部炎は、虹彩と脈絡膜の間の毛様体扁平部の炎症に起因する。後部ブドウ膜炎は、ブドウ膜および主に脈絡膜を含み、脈絡膜炎とも呼ばれる。後部ブドウ膜炎は、全身性感染または自己免疫疾患と関連する可能性がある。何ヶ月も、何年も持続する可能性がある。受容体結合剤は、ブドウ膜炎の前記形態のいずれかを治療するために、被験体に投与することができる。例えば、Tsai et al. (2009) Mol Vis 15:1542-1552 and Trittibach P et al. (2008) Gene Ther. 15(22): 1478-88も参照されたい。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、受容体結合剤は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有するまたはそのリスクがある被験体を治療するために使用される。受容体結合剤は、局所的に眼に適用され、注射され（例えば、硝子体内）または全身的に提供され得る。例えば、Olson et al. (2009) Ocul Immunol Inflamm 17(3):195-200を参照されたい。
【０２５２】
本明細書で記載される受容体結合剤は、眼疾患を治療するために任意の方法により投与することができる。薬剤は、非経口方法により送達させることができる。または、もしくはさらに、薬剤は眼に直接、または眼の付近に送達させることができる。例えば、タンパク質は、例えば、下記で記載されるように局所または眼内投与することができる。
【０２５３】
眼送達のための製剤および方法
受容体結合剤を含む眼用製剤は、局所投与のために、例えば、液滴または軟膏としての投与のため、例えば、眼の前房または結膜嚢内への移植のために送達させることができる。液滴は、点眼器を用いて送達させることができる。眼送達のために製剤化される場合、受容体結合剤は、０．０００１−０．１％、０．００１−５％、例えば、０．００５−０．５％、０．０５−０．５％、０．０１−５％、０．１−２％または１％−５％濃度で存在することができる。しばしば、眼用製剤は直接、眼に適用され、まぶたへの局所適用または眼球とまぶたの間の空間（結膜嚢）への滴下が含まれる。眼用製剤は、涙液と容易に混合し、角膜および結膜の表面にわたって広がるように設計され得る。通常の投与技術を用いると、薬物の大部分は下円蓋部中に堆積される。毛管現象、拡散力、およびまばたき反射は、薬物の前角膜への組み込みを駆動し、ここから、角膜中におよびこれを通って浸透する。
【０２５４】
眼用製剤はまた、１つ以上の他の薬剤、例えば、抗炎症性ステロイド、例えばリメキソロン、ロテプレドノール、メドリゾンおよびヒドロコルチゾン、または非ステロイド性炎症薬を含むことができる。例えば、ステロイドは、０．００１〜１％の濃度で存在することができる。いくつかの実施形態では、ステロイドは存在しない。例えば、受容体結合剤は製剤中、唯一の活性剤である。
【０２５５】
製剤はまた、下記構成成分の１つ以上を含むことができる：界面活性剤、等張化剤、緩衝剤、保存剤、共溶媒および粘性構築剤。等張化剤は、組成物の浸透圧を、例えば、天然涙に調整するために使用することができる。例えば、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、デキストロースおよび／またはマンニトールを添加して、適切な浸透圧、例えば、生理的浸透圧を達成してもよい。等張化剤は、約１５０−４５０ｍＯｓｍまたは２５０−３５０ｍＯｓｍの浸透圧を提供するのに十分な量で添加することができる。
【０２５６】
製剤はまた、眼用送達に好適な緩衝剤を含むことができる。緩衝剤は、とりわけ貯蔵条件下でのｐＨ変化に対し、１つ以上の緩衝構成成分（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）を含むことができる。例えば、緩衝剤は、ｐＨ６．０−７．５の範囲内の標的ｐＨ、例えば、６．５−７．５を提供するように選択することができる。
【０２５７】
製剤は、水性またはリン脂質担体を含むことができる。特にドライアイ障害の治療では、製剤は、短期緩和を提供する薬剤、例えば、眼を潤滑化し、涙液形成を支援する化合物を含むことができる。例えば、リン脂質担体（１つ以上のリン脂質を含む）を使用して、短期緩和を提供することができる。人工涙液担体として有用な人工涙液組成物の例としては、Ｔｅａｒｓ  Ｎａｔｕｒａｌｅ（商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、ＴＸ  ＵＳＡ）などの商品が挙げられる。例えば、１ｍｌあたり、製剤は下記を含むことができる：１ｍｇのデキストラン、７０および３ｍｇのヒドロキシプロピルメチルセルロース、および任意で、保存剤、例えばＰＯＬＹＱＵＡＤ（登録商標）（ポリクオタニウム−１）０．００１％（ｍ／ｖ）。リン脂質担体製剤の例としては、ＵＳ４，８０４，５３９号、ＵＳ４，８８３，６５８号、ＵＳ５，０７５，１０４号、ＵＳ５，２７８，１５１号、およびＵＳ５，５７８，５８６号において開示されているものが挙げられる。
【０２５８】
製剤はまた、潤滑剤または湿潤剤として機能する他の化合物を含むことができる。これらとしては、下記などの粘性剤が挙げられる：モノマポリオール、例えば、グリセロール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール；ポリマポリオール、例えばポリエチレングリコール、セルロースファミリーの様々なポリマ：ヒドロキシプロピルメチルセルロース（「ＨＰＭＣ」）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース（「ＨＰＣ」）、デキストラン、例えばデキストラン７０；水溶性タンパク質、例えばゼラチン；およびビニルポリマ、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポビドンおよびカルボマー、例えばカルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４１；カルボマー９４０、カルボマー９７４Ｐ。さらに追加の例としては、多糖、例えばヒアルロン酸およびその塩ならびにコンドロイチン硫酸およびその塩、ならびにアクリル酸ポリマが挙げられる。ある実施形態では、製剤は１〜４００ｃＰの粘度を有する。
【０２５９】
製剤は、単回または複数回投与用途のために例えば、１つの瓶中に関連する点眼器と共に、または、一組の使い捨て点眼器として、パッケージすることができる。製剤は、例えば、使用中の微生物および真菌汚染を防止するために１つ以上の保存剤を含むことができる。例示的な保存剤としては下記が挙げられ：塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、ベンゾドデシニウムブロミド、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、およびポリクオタニウム−１、０．００１〜１．０％ｗ／ｖの濃度で含まれ得る。無菌であり、その上保存剤を含まない、受容体結合剤を含む製剤を提供することも可能である。製剤は、使い捨て用途のために調製することができる。
【０２６０】
眼用パックは、眼用製剤と眼との長期接触を与えるために使用され得る。綿球を、製剤で飽和させ、その後、上または下円蓋に挿入させる。受容体結合剤はまた、イオン泳動により投与され得る。この手順は、溶液を、電極を有する眼杯中で角膜と接触させたままとする。薬物の拡散は、電位差により引き起こされる。
【０２６１】
受容体結合剤はまた、注射、例えば、結膜下注射により送達され得る。製剤は、結膜下で注射することができ、単純拡散による眼内への強膜の通過が促進される。製剤はまた、結膜およびその下の、眼のより後部の部分にあるＴｅｎｏｎ嚢下で注射することができ、毛様体、脈絡膜、および網膜に薬剤を送達させることができる。製剤はまた、眼球後注射により投与され得る。
【０２６２】
ドライアイおよび他の表面障害に関して、被験体は、下記の１つ以上のアプローチを使用して評価することができる：眼表面疾患指標（ＯＳＤＩ）、角膜および結膜染色、およびＳｃｈｉｒｍｅｒテスト。
【０２６３】
眼表面疾患指標（ＯＳＤＩ）は、眼表面炎症性障害、例えばＤＥＳと一致する眼刺激の症状、およびそれらの視覚関連機能への影響の迅速評価を提供する１２項目質問票である。例えば、Ocul Immunol Inflamm. 2007 Sep-Oct;15(5):389-93を参照されたい。ＯＳＤＩ質問票の１２項目は、０〜４のスケールでランク付けされる。スコアは応答に基づき誘導され、０〜１００のスケールでＯＳＤＩスコアを提供し、スコアが高いほど、大きな障害を表す。ベースラインからの負の変化は、視覚関連機能および眼炎症性障害の改善を示す。
【０２６４】
角膜および結膜染色：角膜染色は、典型的には眼表面炎症性障害、例えばドライアイで見られる、上皮疾患、または眼表面の上皮バリアの破壊の尺度である。重篤な眼瞼疾患、例えば後部眼瞼炎が存在する場合、臨床的に明らかなドライアイがなくても角膜染色が存在し得る。角膜染色は、多くの、全てではない患者において、眼不快と高度に相関する；一般に角膜染色は、上記で記載されるＯＳＤＩの高いスコアと関連する。角膜フルオレセイン染色では、生理食塩水で湿らせたフルオレセインストリップまたは１％ナトリウムフルオレセイン溶液を使用して、涙膜を染色する。角膜全体をその後、イエローバリアフィルタ（＃１２Ｗｒａｔｔｅｎ）およびコバルトブルー照明を備えた細隙灯評価を用いて検査する。染色は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｈｅｍａに従いランク付けする。結膜染色は同様に、上皮疾患、または眼表面の上皮バリアの破壊の尺度である。結膜染色は、細隙灯下、リサミングリーンを用いて実施する。生理食塩水で湿らせたストリップまたは１％リサミングリーン溶液を使用して、涙膜を染色し、眼瞼間結膜染色を、３０秒を超えるが２分未満の後、評価する。中程度の強度の白色光を用いて、鼻および一時的な結膜染色の眼瞼間領域のみをＯｘｆｏｒｄ  Ｓｃｈｅｍａを用いてランク付けする。
【０２６５】
Ｓｃｈｉｒｍｅｒテスト：Ｓｃｈｉｒｍｅｒテストは、麻酔ありおよびなしで、狭い濾紙ストリップ（Ｗｈａｔｍａｎ  ＃４１濾紙の５ｘ３５ｍｍストリップ）を下結膜嚢内に置くことにより実施される。このテストは薄暗い部屋で実施される。患者は、５分経過するまで彼の／彼女の眼を優しく閉じ、ストリップが除去される。涙の端は、眼から除去された後数ｍｍ進み続けるので、涙の端を正確に５分でボールペンによりマーキングする。水性涙産生は、ストリップが５分間に濡れたｍｍの長さにより測定される。麻酔なしのＳｃｈｉｒｍｅｒテストの１０ｍｍ未満および麻酔ありのＳｃｈｉｒｍｅｒテストの５ｍｍ未満の結果は、異常と考えられる。ベースラインからの正の変化は、本明細書で記載される眼炎症性障害の１つ以上の症状の改善を示す。
【０２６６】
肺送達のための製剤および方法
受容体結合剤は吸入または他の肺送達様式のため、例えば、薬剤を気道、例えば、上および下気道の組織へ投与するために製剤化することができる。薬剤を肺気道へ局所的に送達するのに使用することができる３つの普通の系としては、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）およびネブライザーが挙げられる。ＭＤＩは、受容体結合剤を可溶化形態で、または分散物として送達するために使用され得る。典型的にはＭＤＩは、フレオンまたは他の比較的高い蒸気圧噴霧剤を含み、これが、装置活性化時にエアロゾル化された薬物を気道に押し入れる。対照的にＤＰＩは一般に、乾燥粉末形態の薬物を肺に導入するために、患者の吸気効果に依存する。ネブライザーは、液体溶液にエネルギーを付与することにより吸入される薬物エアロゾルを形成させる。薬剤は、凍結乾燥形態（例えば、室温）で貯蔵され、吸入前に溶液中で再構築され得る。フルオロケミカル媒質を用いる液体換気または肺洗浄中の薬物の直接肺送達もまた、可能な送達方法である。これらのおよび他の方法を使用して、受容体結合剤を送達することができる。例えば、薬剤は少なくとも約０．０２、０．１、０．５、１、１．５、２、５、１０、２０、４０、または５０ｍｇ／パフ以上の投与単位形態で送達される。
【０２６７】
受容体結合剤は、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧提示形態で、好適な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジエリロロテトラフルオロクトリアン、二酸化炭素または他の好適なガスの使用により、都合良く送達され得る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためにバルブを提供することにより、決定され得る。吸入器または吸入具において使用するためのカプセルおよびカートリッジは、粒子が製剤化粒子である場合、受容体結合剤および好適な粉末ベース、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含むように製剤化され得る。製剤化された、または製剤化されていない受容体結合剤に加えて、他の材料、例えば１００％ＤＰＰＣまたは他の界面活性剤を共に混合し、製剤化された、または製剤化されていない受容体結合剤の送達および分散を促進することができる。粒子サイズはまた、送達が下または上気道へのものかを制御するために変動され得る。例えば、１−５μｍまたは１０−５０μｍのサイズ範囲の粒子がそれぞれ、下および上気道のために使用され得る。
【０２６８】
送達エンハンサー、例えば界面活性剤が、肺送達をさらに増強するために使用され得る。界面活性剤は、一般に親水性および親油性部分を有する化合物であり、これは、２つの非混和性相の間の界面と相互作用することにより、薬物の吸収を促進する。界面活性剤は、いくつかの理由、例えば、粒子凝集の減少およびマクロファージ食作用の減少のために乾燥粒子において有用である。界面活性剤は当技術分野においてよく知られており、ホスホグリセリド、例えば、ホスファチジルコリン、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジパルミトイル（ＤＰＰＣ）およびジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；ヘキサデカノール；脂肪酸；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリオキシエチレン−９−；アウリルエーテル；パルミチン酸；オレイン酸；ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ８５）；グリココール酸；スルファクチン；ポロキサマー；ソルビタン脂肪酸エステル；ソルビタントリオレアート；チロキサポール；およびリン脂質を含む。
【０２６９】
本明細書では、特異的に本明細書で記載されるキメラサイトカインドメインを認識する抗体もまた特徴とする。例えば、そのような抗体は任意の親サイトカインドメインに対し優先的にキメラドメインに結合する。例えば、特異抗体は第１の親サイトカインおよび第２の親サイトカイン由来のセグメント間の接合部を含むエピトープに結合することができる。
【０２７０】
核酸送達
受容体結合剤は、受容体結合剤をコードし、発現することができる核酸を送達することにより、被験体に提供することができる。例えば、受容体結合剤をコードする核酸配列を、転写制御配列の制御下に置き、遺伝子送達のための核酸ベクター、例えば、ウイルスベクター中に配置することができる。例示的なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、またはアデノ関連ウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、プラスミドまたは線形分子、例えば、線形二本鎖ＤＮＡの形態をとることができる。送達された核酸は、標的細胞のゲノムに組み込まれるように、例えば、標的細胞のゲノムに一体化するように設計され得る。また、送達された核酸は、送達後、細胞内に自律的に存在するように設計され得る。
【０２７１】
転写制御配列は一過性または恒常的発現を提供するように操作することができる。一過性制御は、例えば、外因性の要因（例えば、ステロイドホルモンまたはＦＫ５０６）または環境シグナルに応答する転写因子に対する転写応答要素を使用することにより、外因性の要因により調節される制御を含むことができる。
【０２７２】
送達された核酸上で提供される遺伝子の発現は、例えば、遺伝子によりコードされたタンパク質の検出（例えば、抗体を使用する）により、またはｍＲＮＡの検出（例えば、ＰＣＲまたはＮｏｒｔｈｅｒｎハイブリダイぜーションを使用する）により評価することができる。送達された核酸は、転写および翻訳制御ＤＮＡが受容体結合剤のためのコード配列に対し適切に配置され、よって転写が開始され、タンパク質が得られたメッセージから翻訳されるように、一般に操作される。核酸は、哺乳類細胞、特にヒト由来の転写および翻訳制御核酸配列を含むことができる。そのような配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、およびエンハンサーまたはアクチベータ配列が挙げられる。
【０２７３】
さらに、発現ベクターは追加の要素を含み得る。例えば、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つのまたは２つの配列（例えば、発現コンストラクト隣接する）を含むことができる。組み込みベクターは、ベクターに包含させるための適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞内の特定座位に誘導され得る。ベクターを組み込むためのコンストラクトは、当技術分野においてよく知られている。
【０２７４】
例示的なアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスの修飾バージョン、例えばＡｄ２またはＡｄ５を含み、この場合、ウイルスがインビボで複製するのに必要な遺伝的要素が除去されている。例えば、Ｅ１領域を除去することができ、ゲノムは、受容体結合剤をコードする発現カセットを受容するようにさらに修飾することができる。
【０２７５】
例示的なレトロウイルスベクターとしては、ＬＮＬ６、ＬＸＳＮ、ＬＮＣＸ、およびレンチウイルスベクターが挙げられる。特定のレンチウイルスベクターはPawliuk et al. (2001) Science 294:2368 and Imren et al. (2002) PNAS 99:14380により記載されており、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に限定して含む。これらのベクターは、例えば、必須遺伝子（例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ）を別々のベクター上に分離し、レトロウイルス複製を欠損にすることにより、安全であるように構築し、操作することができる。複製欠損レトロウイルスはその後、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系の使用を介して、標準技術によりビリオン中にパッケージされる。組換えレトロウイルスを生成するため、および細胞をインビトロまたはインビボでそのようなウイルスに感染させるためのプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14および他の標準研究室マニュアルにおいて見いだすことができる。レトロウイルスベクターは、受容体結合剤を発現するための配列の他に、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ；レトロウイルス排出要素、任意で逆応答要素（ＲＲＥ）；プロモーター、および遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）または他の転写インスレーター配列および右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含むことができる。レトロウイルスベクターはさらにウイルス価および導入効率を増加させるために一定のポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）またはＤＮＡフラップを含み得る。
【０２７６】
受容体結合剤をコードする配列を含む核酸は、適切な標的細胞へ、例えば、エクスビボインビボで送達させることができる。例示的な標的細胞としては、滑膜細胞、造血細胞、皮膚細胞、などが挙げられる。核酸は、眼と関連する標的細胞、例えば、角膜上皮細胞に送達させることができる。送達は、上皮の基底層を露出させるために、デブリードマン、または角膜上皮の擦過を含み得る。送達のための核酸はその後添加される。別の実施形態では、核酸は、角膜内皮細胞、角膜周囲の真下の線維柱帯網の細胞、眼の脈絡膜層の細胞、網膜、強膜または毛様体の細胞、網膜または眼脈管構造の細胞、または硝子体の細胞またはレンズの細胞、例えばレンズ上皮に送達される。
【０２７７】
送達方法としては、例えば、レトロウイルス感染、アデノウイルス感染、プラスミドによる形質転換、外因性核酸を含むリポソームによる形質転換、微粒子銃核酸送達（例えば、核酸を金または他の金属粒子上にロードし、細胞中に撃ち込むまたは注射する）、アデノ関連ウイルス感染およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス感染が挙げられる。送達は、細胞または組織中に、任意の方法、例えば針注射、皮下注射器、電子穿孔、または遺伝子銃により実施することができる。
【０２７８】
遺伝子送達のための他の方法は、例えば、Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; and Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8において見いだすことができる。
【０２７９】
例示的な第２の薬剤
本明細書で記載される受容体結合剤は、第２の薬剤と共に投与することができる。２つの薬剤は、同時投与することができ、または、例えば異なるレジームを用いて別々に投与することができる。例示的な第２の薬剤としては、抗炎症薬が挙げられる。１つの実施形態では、第２の薬剤はＩＬ−１７アンタゴニスト（全てのＩＬ−１７ファミリーメンバーのアンタゴニストを含む、例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、およびＩＬ−１７Ｅのアンタゴニスト）である。例示的なＩＬ−１７アンタゴニストとしては下記が挙げられる：ＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、およびＩＬ−１７Ｅ）に結合し、ＩＬ−１７媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）；ＩＬ−１７のための１つ以上の受容体、例えばＩＬ−１７ＲＡおよびＩＬ−１７ＲＣに結合し、ＩＬ−１７媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤（例えば、抗体および他の結合タンパク質）；ＩＬ−１７および少なくとも１つの受容体サブユニットを含む複合体、例えば、ＩＬ−１７およびＩｌ−１７ＲＡ、またはＩＬ−１７、ＩＬ−１７ＲＡ、およびＩＬ−１７ＲＣに結合し、ＩＬ−１７媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤（例えば抗体および他の結合タンパク質）；およびＩＬ−１７ＲＡおよびＩＬ−１７ＲＣの１つ以上の可溶性細胞外ドメインを含み、ＩＬ−１７媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤、例えば可溶性受容体。
【０２８０】
別の実施形態では、第２の薬剤はＩＬ−１２アンタゴニストである。例示的なＩＬ−１２アンタゴニストとしては下記が挙げられる：ＩＬ−１２（ｐ３５およびｐ４０を含む）に結合し、ＩＬ−１２媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤（例えば抗体および他の結合タンパク質）；ＩＬ−１２に対する１つ以上の受容体、例えばＩＬ−１２Ｒβ１またはＩＬ−１２Ｒβ２に結合し、ＩＬ−１２媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤（例えば抗体および他の結合タンパク質）；ｐ３５、ｐ４０および少なくとも１つの受容体サブユニット、例えば、ＩＬ−１２Ｒβ１またはＩＬ−１２Ｒβ２を含む複合体に結合し、ＩＬ−１２媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤（例えば抗体および他の結合タンパク質）；およびＩＬ−１２Ｒβ１またはＩＬ−１２Ｒβ２の１つ以上の可溶性細胞外ドメインを含み、ＩＬ−１２媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤、例えば可溶性受容体。
【０２８１】
別の実施形態では、第２の薬剤はＩＬ−２３アンタゴニストである。例示的なＩＬ−２３アンタゴニストとしては下記が挙げられる：ＩＬ−２３（ｐ１９およびｐ４０を含む）に結合し、ＩＬ−２３媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤（例えば抗体および他の結合タンパク質）；ＩＬ−２３のための１つ以上の受容体、例えばＩＬ−１２Ｒβ１またはＩＬ−２３Ｒに結合し、ＩＬ−２３媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤（例えば抗体および他の結合タンパク質）；ｐ１９、ｐ４０および少なくとも１つの受容体サブユニット、例えば、ＩＬ−１２Ｒβ１またはＩＬ−２３Ｒを含む複合体に結合し、ＩＬ−２３媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤（例えば抗体および他の結合タンパク質）；およびＩＬ−１２Ｒβ１またはＩＬ−２３Ｒの１つ以上の可溶性細胞外ドメインを含み、ＩＬ−２３媒介シグナル伝達に拮抗する薬剤、例えば可溶性受容体。
【０２８２】
ＩＬ−２３に対する例示的な抗体は記載されている。例えば、Beyer et al., J. Mol. Biol. (2008), doi:10.1016/j.jmb.2008.08.001を参照されたい。
【０２８３】
動物モデル
受容体結合剤は、動物モデルにおいて、ヒト疾患、例えば、ヒト自己免疫および／またはヒト炎症性疾患に対し評価することができる。薬剤は、動物体内の対応する標的タンパク質に対し特異性を有し得る。
【０２８４】
関節リウマチモデル．受容体結合剤は、関節リウマチの動物モデル、例えば、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて評価することができる。例えば、McIndoe et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2210-2214; Issekutz, A. C. et al., Immunology (1996) 88:569;およびCurrent Protocols in Immunology, Unit 15.5, Coligan et al. (eds.), John Wiley & Sons, Incを参照されたい。モデルは、ラット／マウスの感受性株の天然ＩＩ型コラーゲンによる免疫化により生成される。コラーゲンは、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中で乳化させ、尾基部に皮内注射する（１００μｇコラーゲン：１００μｇＣＦＡ／マウス）。対照マウスには、０．０５ｍｌの蒸留水／ＣＦＡエマルジョンを皮内注射する。完全アジュバント中のコラーゲンのブースター注射を、最初の免疫化後２１日に与える。疾患は、コラーゲンによる免疫化で誘導された自己免疫応答による。
【０２８５】
関節は、関節炎、炎症、パンヌス、軟骨障害および骨吸収に対し、規定されたスケールを用いてスコア化することができる。例えば、関節炎の重症度は下記の通りスコア化することができる：０＝関節炎の目に見える効果なし；１＝１つの指または関節の浮腫および紅斑；２＝２つの関節の浮腫および紅斑；３＝２を超える関節の浮腫および紅斑；４＝全ての足および指の重篤な関節炎、足首の強直および肢の変形を伴う。各肢に対するスコアを合計し、各個々の動物に対する関節炎指標（ＡＩ）として記録する。他のスコア化スキームもまた、これらのおよび他の基準に対し使用することができる。
【０２８６】
多発性硬化症．実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症に対する有用なマウスモデルである。受容体結合剤は、ＥＡＥモデルにおいて評価することができる。ＥＡＥは、Ｔ細胞および単核細胞炎症ならびにその後の、中枢神経系における軸索の脱髄により特徴づけられるＴ細胞媒介自己免疫障害である（例えば、Bolton, C., 1995, Multiple Sclerosis, 143を参照されたい)。例示的なプロトコルは、Current Protocols in Immunology, Unit 15.1 and 15.2; Coligan et al. (eds.), John Wiley & Sons, Incにおいて見いだすことができる。モデルはまた、ミエリン疾患に有効であり、この場合、例えば、Duncan et al., 1997, Molec. Med. Today, 554-561で記載されるように、オリゴデンドロサイトまたはＳｃｈｗａｎｎ細胞が中枢神経系中にグラフトされる。
【０２８７】
同種移植片．受容体結合剤は、動物モデルにおいて皮膚同種移植片拒絶に対し、例えば、マウス尾部−皮膚グラフトを用いて評価することができる。皮膚同種移植片拒絶はＴ細胞、ヘルパーＴ細胞およびキラー−エフェクターＴ細胞により媒介される。例えば、 Current Protocols in Immunology, Unit 4.4; Coligan et al. (eds.), 1995, John Wiley & Sons, Incを参照されたい。他の移植片拒絶モデルもまた使用することができる。例えば、Tinubu et al., 1994, J. Immunol., 4330-4338を参照されたい。
【０２８８】
ＩＢＤおよび大腸炎モデル．炎症性腸疾患に対する例示的なモデルは、ＳＣＩＤマウスに移植されたＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒｂ−高細胞の使用である。例えば、 Hirano et al., J Pharmacol Sci. 2009 Jun;110(2):169-81を参照されたい。および、トランスジェニックＩＬ−１０欠損マウスの使用である。例えば、Inaba et al., Inflamm Bowel Dis., DOI: 10.1002/ibd.21253 (2010)を参照されたい。さらに別の例示的な大腸炎モデルはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を使用して、急性大腸炎を誘発する。例えば、大腸炎はマウスにおいて、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＤＳＳ（分子量３０−４０ｋＤａ；ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を含む飲料水を自由に投与することにより誘発することができる。この処置に起因する症状は、血性下痢、体重減少、結腸短縮および好中球浸潤による粘膜潰瘍である。ＤＳＳ誘発大腸炎は、炎症性細胞の固有層への浸潤（リンパ球過形成、限局性陰窩損傷、および上皮潰瘍を伴う）により組織学的に特徴付けられる。これらの変化は、ＤＳＳの上皮への毒性効果により、および固有層細胞の食作用ならびにＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生により現れると考えられる。例えば、Hassan et al. PLoS One. 2010 Jan 25;5(1):e8868を参照されたい。
【０２８９】
ドライアイ疾患モデル．受容体結合剤は、ドライアイ疾患に対するマウスモデルで評価することができる。ドライアイはマウスにおいて、スコポラミンを皮下注射し、その後、マウスを環境制御チャンバに入れることにより誘発することができる。具体例として、正常で健康な６〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、環境制御チャンバ内で乾燥環境に連続して暴露させることにより、ドライアイを有するように誘発することができる。チャンバは、３０％未満（一般に約１９％）の低い相対湿度、高い空気流（１５リットル／分）および一定温度（約２２℃）を有する。チャンバ内に置かれたマウスはまた、スコポラミンで処置され、涙分泌が阻害される。持続放出経皮スコポラミンパッチはＮｏｖａｒｔｉｓ（Ｓｕｍｍｉｔ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能である。パッチの４分の１が脱毛されたマウスの中尾部に４８時間毎に適用される。環境制御チャンバおよびスコポラミンの組み合わせにより重篤なドライアイが比較的短い期間（約２−４日）で生じる。環境制御チャンバは、 Barbino et al., Invest. Ophthal. Vis. Sci., 46: 2766-2711 (2005)に記載されるように準備することができ、空気流、湿度、および温度の制御が可能である。
【０２９０】
マウスは、ドライアイの徴候について、例えば、下記を実行することにモニタすることができる：ａ）涙液産生を測定するためのコットンスレッドテスト（これは、一般にドライアイ患者では減少する）；ｂ）角膜フルオレセイン染色（これは角膜表面損傷のマーカーである）；および一般的な眼検査。
【０２９１】
コットンスレッドテスト：涙液産生は、フェノールレッドが含浸されたコットンスレッドテストにより測定することができる（Ｚｏｎｅ−Ｑｕｉｃｋ、Ｌａｃｒｉｍｅｄｉｃｓ、Ｅａｓｔｓｏｕｎｄ、Ｗａｓｈ）。拡大蛍光ランプの下、糸を宝石ピンセットで保持し、３０または６０秒間右眼の結膜円蓋の側方の眼角内に入れる。涙の距離を顕微鏡下、血球計のスケールを使用してｍｍで読み取る。
【０２９２】
角膜フルオレセイン染色：角膜フルオレセイン染色は、マイクロピペットにより眼の下結膜嚢中に、１．０μｌの５％フルオレセインを適用することにより評価することができる。角膜は、細隙灯生物顕微鏡により、フルオレセイン滴下後３分でコバルトブルー光を用い検査される。点状染色を、角膜表面が分割された５つの領域の各々に対し、０−３の標準化Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＥＩ）グレーディングシステムを使用してマスキング様式で記録する。
【０２９３】
診断および他の用途
本明細書で記載される受容体結合剤は、試料中のＩＬ−１Ｒ１、またはそのような受容体を発現する細胞を検出するために使用することができる。例えば、薬剤は、標識である、またはシグナルを生成する部分、例えば酵素、放射標識、エピトープ、または蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）で直接または間接的に標識することができる。薬剤は、試料または細胞と接触させることができ、例えば、標準免疫ブロット、免疫蛍光、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光エネルギー移動、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット、および他の診断および検出技術を用いて、受容体が試料中または細胞上に存在するかが決定される。
【０２９４】
受容体結合剤はまた、インビボ検出のために標識し、被験体に投与することができる。被験体は、例えば、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段により画像化することができる。例えば、結合剤は、放射標識、例えば１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈ、蛍光標識、例えばフルオレセインおよびローダミン、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナにより検出することができるポジトロン放出同位体、ケミルミネサー例えばルシフェリン、および酵素マーカー、例えばペルオキシダーゼまたはホスファターゼで標識することができる。薬剤は、コントラスト剤、例えば常磁性剤および強磁性または超常磁性（これらは主にＴ２応答を変化させる）で標識することができる。
【０２９５】
受容体結合剤はまた、結合する受容体を発現する細胞を精製するために使用することができる。例えば、受容体結合剤は、固定されたサポート（例えば、磁性ビーズまたはカラムマトリクス）に結合され、受容体を発現し得る細胞に接触され得る。サポートは例えば、生理的緩衝液で洗浄することができ、細胞はサポートから回収することができる。
【０２９６】
受容体結合剤はまた、それが結合する受容体の可溶性形態を精製するために使用することができる。例えば、可溶性受容体を含む試料は、固定された受容体結合剤に接触させられ、その後、例えば、洗浄後、固定された薬剤から回収することができる。
【０２９７】
下記非制限的実施例は、本明細書で記載される本発明の実施形態をさらに説明する。
【実施例】
【０２９８】
実施例１
表４（下記）に列挙されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を、Ｔ７プロモーターおよびアンピシリン（ｐＥＴ３１シリーズ）またはカナマイシン抵抗性遺伝子（ｐＥＴ２８シリーズ）を含むｐＥＴベクターにおいて構築し（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ  ＮＪ，ＵＳＡ）、発現させた。発現のために使用することができるコード配列の例を表５で提供する。
【表５】
0006030554.tif 000006
上記タンパク質をコードする例示的な核酸配列は表５に列挙される。いくつかの実施形態では、核酸配列はさらに、下記で列挙される第１のヌクレオチドの前にＡＴＧを含む。いくつかの実施形態では、核酸配列はさらに、下記で列挙される最後のヌクレオチドの後に終止コドン（例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）を含む。
【表６】
0006030554.tif 000007
0006030554.tif 000008
タンパク質は、下記で示されるようにＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａ由来の異なる残基の範囲を含むことができる。例Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５の間で、サイトカインドメインは、ＩＬ−１β由来の４８−７０％残基およびＩＬ−１Ｒａ由来の５５−７８％残基を有することができる。（多くのアミノ酸残基が２つのタンパク質間で保存されているので、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａに対するパーセンテージ同一性の和は、１００％を超える可能性がある）。
【表７】
0006030554.tif 000009
【０２９９】
実施例２
ヘキサヒスチジンタグを含むタンパク質を、大腸菌細胞ＢＬ２１（ＤＥＳ）株中で、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて３７℃で３時間、ＬＢブロス培地において誘導することにより、発現させた。細胞を、２０−５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０中で溶解させた。ライセートをＨｉＴｒａｐ（登録商標）プレパックドカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ、ＵＳＡ）を用いるＩＭＡＣ  クロマトグラフィーに供した。タンパク質を２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  １０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４緩衝剤中にロードした。２００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４緩衝剤を用いて溶離させた。溶離させたタンパク質を、ＰＢＳ、０．１％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４に対して広く透析し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）（１０Ｋ）フィルタを用いて濃縮し、４°または−８０℃で貯蔵した。
【０３００】
ヘキサヒスチジンタグを欠くタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。Ｐ０５タンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。発現細胞由来のライセートをＧｉｇａＣａｐＳ（商標）カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）に、低ｐＨ（およそｐＨ５．５）で、塩なしで（伝導率およそ１ｍＳ／ｃｍ）適用した。カラムをその後、ｐＨ勾配（緩衝剤Ａ＝１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．５；緩衝剤Ｂ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８）により溶離した。溶離タンパク質を含む５ｍｌ画分をその後、５ｍｌのＨ２Ｏおよび５ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８）で希釈し、その後、ＣａｐｔｏＱ（商標）樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ、ＵＳＡ）に適用し、０ｍＭ〜２５０ｍＭのＮａＣｌ勾配を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で溶離した。溶離タンパク質を、１．２５Ｘ  ＰＢＳ  ０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０または１．２５Ｘ  ＰＢＳがないＴＷＥＥＮ（登録商標）に対して広く透析し、貯蔵した。図６を参照されたい。Ｐ０３およびＰ０４タンパク質を、同様の方法を用いて精製した。
【０３０１】
Ｐ０５を発現する細胞もまた、１０ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、微量要素（１ｍｇ／ｍｌ  ＴＥＫＮＯＶＡ（商標）１０００Ｘ微量要素、＃Ｔ１００１）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ２Ｌ  ＢＩＯＳＴＡＴ（商標）Ａ＋中の抗生物質が補充された、動物質を含まないソイトーン  （＃Ｔ７６６０）を有するＴＥＫＮＯＶＡ（商標）  Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で増殖させ、ＯＤ３５−４０で、１ｍＭ  ＩＰＴＧと共に約６時間誘導した。細胞を３７℃で、３０％溶解酸素と共に、ｐＨ７．０で増殖させ、２００−８００ｒｐｍで撹拌させ、２Ｌ／分で酸素散布した。ｐＨ増加により検出されるようにグルコースが欠乏した場合、細胞に９ｇグルコース／Ｌ／ｈｒを供給する。ｐＨが減少した場合（誘導後約２．５時間）、供給を６ｇグルコース／Ｌ／ｈｒに減少させる。
【０３０２】
細胞を収集し、溶解緩衝剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ、ｐＨ８．０；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ、ｐＨ７．０；５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ、ｐＨ６．５；または５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ、ｐＨ６．０）中に溶解した。ライセートをＰｏｒｏｓ  ＸＳ（登録商標）カチオンイオン交換培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ  ＵＳＡ）上に、ｐＨ５．３で、３ｍＳ／ｃｍ（３５ｍｇ生成物／ｍｌカラム樹脂）でロードする。
【０３０３】
例示的な手順では、Ｐ０５タンパク質は、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ２５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０を含む緩衝剤を使用して、ｐＨ７．０まで１ステップにより溶離する。第１の溶離ピークを廃棄し、第２の溶離ピークをプールに収集し、これはＰ０５タンパク質を含んだ。初期プールは、ｄｅｓ−Ａｌａ種に対し、無傷なＰ０５タンパク質に富む。この溶離された材料をその後、ＣａｐｔｏＱ（商標）アニオン交換樹脂上に流す。無傷なＰ０５タンパク質を含むフロースルーを収集する。
【０３０４】
別の例示的な手順では、培地を、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ２０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０で洗浄する。Ｐ０５タンパク質を１００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ５０−５８ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０を含む緩衝剤を使用してｐＨ  ６．０まで１ステップにより溶離する。第１溶離ピークをその後のピークから分離し、無傷なＰ０５タンパク質を含んだ。この溶離された材料をその後、ＣａｐｔｏＱ（商標）アニオン交換樹脂上に流す。無傷なＰ０５タンパク質を含むフロースルーを収集する。
【０３０５】
実施例３
タンパク質またはタンパク質を含む上清を細胞ベースアッセイにおいてＩＬ−１活性に対し評価した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β応答性細胞を使用して、ＩＬ−１β活性をモニタした（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ，ＵＳＡから入手可能）。これらの細胞は、５つのＮＦ−κＢおよび５つのＡＰ−１結合部位に融合されたＩＦＮ−βミニマルプロモーターの制御下、ＳＥＡＰレポーター遺伝子を含む。細胞表面上のＩＬ−１受容体のＩＬ−１β結合は、ＮＦ−κＢ活性化およびＳＥＡＰ生成を引き起こす。ＳＥＡＰレポートは、例えば、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、ＵＳＡ）および分光光度分析を用いて検出することができる。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１β細胞懸濁液を、７０−８０％コンフルエンスまで培養した細胞から調製した。再懸濁させた細胞を、新鮮な増殖培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌグルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化胎仔ウシ血清（５６℃で３０分）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ  ＮｏｒｍｏｃｉｎＴ）中、約３３０，０００細胞／ｍｌに調節した。
【０３０６】
下記試薬を平底９６ウェル細胞培養プレートのウェルに５０μｌの最終体積まで添加した：１０μｌのＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）、１μｌの対象の薬剤および３０μｌの細胞培地。陽性および陰性対照試料を、同時に調製した。その後、１５０μｌのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１β細胞懸濁液（約５０，０００細胞）を各ウェルに添加し、プレートを一晩中３７℃で、５％ＣＯ２組織培養インキュベーターにおいて培養した。一般に、最終ＩＬ−１β濃度（２００μｌ最終体積中）は０．１ｎｇ／ｍｌであった。ＩＬ−１β活性を次の日評価した（１２−１５時間後）。定量化前、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬を、製造者の指示に従い調製した。平底９６−ウェルアッセイプレートを調製した。この場合、１５０μｌのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）溶液を各ウェルに添加した。９６ウェル組織培養プレートのウェルからの５０μｌの馴化培地を、アッセイプレートの各ウェルに添加した。プレートを、３７℃でおよそ１５−２０分間インキュベートした。ＳＥＡＰレベルをその後、分光光度計を用いて６２０−６５５ｎｍで測定した。
【０３０７】
結果．図７Ａに示されるように、このアッセイでは、Ｐ０６タンパク質はＩＬ−１ＲＩアゴニストとして挙動し、Ｐ０７タンパク質は、部分アゴニストとして挙動し、Ｐ０１タンパク質は、刺激することができなかった。実際、Ｐ０１タンパク質は、ＩＬ−１βの存在下でアッセイすると、アンタゴニストとして挙動した。図７Ｂはある範囲のＩＬ−１βタンパク質濃度での、上記ＨＥＫＢｌｕｅ（商標）細胞アッセイを使用した、Ｐ０１によるＩＬ−１β活性の拮抗作用を示す。拮抗作用は、Ｐ０１量の増加に伴い増加した（ｘ軸は、Ｐ０１を含む上清のマイクロリットルを反映する）。
【０３０８】
タンパク質Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５はそれぞれ、ＩＬ−１β活性に拮抗した。例えば、８Ａおよび８Ｂを参照されたい。Ｐ０５のＩＣ５０は、約５ｎｇ／ｍｌ未満であった。Ｐ０５はこのアッセイにおいてＩＬ−１ＲＩを刺激する能力に対し試験したが、試験した最高濃度、１ｍｇ／ｍｌでも、検出可能なアゴニスト活性を有することは観察されなかった。Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５はまた、ＭＧ−６３細胞、ＩＬ−１βに応答するヒト骨肉腫細胞系において、ＩＬ−１β誘導ＩＬ−６発現を阻害した。ドライアイ疾患のマウスモデルでは、ヘキサヒスチジンタグが付けられたＰ０５は、生物活性を有することが観察された。タグが付けられていないＰ０５については、下記実施例８も参照されたい。
【０３０９】
実施例４
可溶性組換えヒトＩＬ−１ＲＩに対するタンパク質の結合特性（ＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメインに対応する）を、表面プラズモン共鳴を用い、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ＳＲ７０００ＤＣ  Ｄｕａｌ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ＳＰＲシステムにより評価した。結合は、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するリン酸緩衝生理食塩水中で評価した。ＩＬ−１βは、８−９ｎＭのＫＤおよび２−３×１０−３ｓ−１の解離定数（Ｋｄ）を有することが観察され、別の実験では、約２ｎＭのＫＤ、１．３−１．５×１０６Ｍ−１ｓ−１の会合定数および約２．９−３．０×１０−３ｓ−１の解離定数（Ｋｄ）であった。図９Ａを参照されたい。Ｐ０１タンパク質は、ＩＬ−１βと同様の結合動力学で結合したが、結合実験の解離相中解離しなかった（約１８０秒）。よって、Ｐ０１タンパク質はＩＬ−１ＲＩに、同様の条件下では、ＩＬ−１βよりも大きな親和性で結合した。
【０３１０】
ＩＬ−１Ｒａの結合は、約０．３３ｎＭのＫＤ、約２×１０５Ｍ−１ｓ−１の会合定数（Ｋａ）、および約６．６×１０−５ｓ−１の解離定数（Ｋｄ）を有することが観察された。図９Ｂを参照されたい。キメラサイトカインドメインＰ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５は、約１２−１７００ｐＭの範囲のＫＤ、約３×１０４Ｍ−１ｓ−１〜３×１０６Ｍ−１ｓ−１の範囲の会合定数（Ｋａ）および約２×１０−５〜１×１０−３ｓ−１の範囲の解離定数（Ｋｄ）を有することが観察された。例えば図９Ｃおよび９Ｄならびに下記表７を参照されたい。
【表８】
0006030554.tif 000010
【０３１１】
実施例５
追加の例示的なキメラＩＬ−１ファミリータンパク質はまた、下記を含む：
【表９】
0006030554.tif 000011
【０３１２】
下記ポリペプチドは、ＩＬ−１α由来の少なくとも２つのセグメントおよびＩＬ−１Ｒａ由来の少なくとも２つのセグメントを含むキメラドメインである。
【表１０】
0006030554.tif 000012
【０３１３】
実施例６
循環置換ＩＬ−１キメラドメインは、分子のＮ−末端をＣ末端に、リンカー配列を用いて結合させ、末端の各々に対し新しい場所を選択することにより構築することができる。ＩＬ−１β由来の末端を有するタンパク質では、リンカー長は、５〜１０、例えば、約７アミノ酸とすることができる。新規末端の好ましい場所は、受容体から外方にあるループ、例えばβ６−β７ループ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の７１−８０に対応するアミノ酸）またはβ７−β８ループ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の８４−９９に対応するアミノ酸）内にある。
【０３１４】
そのような循環置換されたＩＬ−１キメラドメインの例としては下記が挙げられる:
DKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSSGGSGGGSAPVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKD  (SEQ ID NO:40)
および
NYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSSGGSGGGSAPVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPK  (SEQ ID NO:41)。
【０３１５】
実施例７
タンパク質Ｐ０３、Ｐ０４、Ｐ０５、ｍＩＬ−１Ｒａ（メチオニルＩＬ−１Ｒａ）、およびＩＬ−１βをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中、０．５ｍｇ／ｍｌで調製した。タンパク質をＳＹＰＲＯオレンジ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）と、ストック濃度の１：５００希釈で合わせ、示差走査蛍光定量に供した。例えば、He et al. (2010) J. Pharm. Sciences, 99 1707-1720を参照されたい。蛍光測定値をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｘ３００５  ＱＰＣＲ機器を用いてモニタしながら、温度を２５℃から９５℃まで、１℃／分で増加させた。融解温度（Ｔｍ）値を、蛍光遷移の一次導関数の最大値から誘導した。タンパク質Ｐ０３、Ｐ０４、およびＰ０５は、５０℃超の、および５９℃もの高さのアンフォールディングの開始、ならびに５９、６０、６２、および６４℃超のＴｍを有することが観察された。結果を下記表８および図１０Ａ＆１０Ｂに示す：
【表１１】
0006030554.tif 000013
【０３１６】
Ｐ０４は、ｍＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１βよりも約４度高いＴｍを有し、ｍＩＬ−１Ｒａよりも約３度高いおよびｔＩＬ−１βよりも約１０度高いアンフォールディングの開始を示す。Ｐ０３およびＰ０５は、ｍＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１βよりも約９度高いＴｍを有し、ｍＩＬ−１Ｒａよりも約１１度高いおよびＩＬ−１βよりも約１８度高いアンフォールディングの開始を示す。
【０３１７】
実施例８
精製Ｐ０５（ヘキサヒスチジンタグを欠く）を１．２５ｘＰＢＳ中で調製し、ドライアイ疾患のマウスモデルで試験した。このモデルでは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの６〜１０週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（≧３０％相対湿度、ヒドロゲル栄養補助食品、および乾燥（ｅｎｖｉｒｏｄｒｙ）環境強化を有する動物保持室中で１〜２週間順化させた）を、フルオレセイン染色に対し０日にプレスクリーニングした。フルオレセイン染色では、ＷＦＩ  Ｈ２Ｏ中、１０ｍｇ／ｍＬで希釈した、新たに作製したフルオレセインを０．４μＬで各眼に投与した。投与のおよそ８−１３分後、眼をＯｌｙｍｐｕｓ蛍光手術用顕微鏡を用いてスコア化した。点状染色を０−３の標準化Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＥＩ）グレーディングシステムを用いて、角膜表面が分割された５つの領域の各々に対して記録した（スコア範囲０−１５／眼）。ティーチングブリッジを使用して、二人のマスキングされた得点係が、マウスを同時に評価し、各眼に対し単一の集団スコアを与えた。
【０３１８】
各眼に対しスコア≦７（１５の最大スコアから）を有するマウスをドライアイチャンバ（２０％±２％湿度および一定空気流約２１Ｌ／ｍｉｎ／ケージ）に１日に置き、このチャンバ内で実験の過程中（検査を除き）維持した。３日に、マウスを再びスコア化し、ランダムに８〜１０マウス／群の治療群とした。マウスは、４〜５マウスの各ケージが大体同じ平均疾患スコアを有するようにランダム化した。３日に開始し、ランダム化後、マウスに、Ｐ０５またはビヒクル（１．２５ＸＰＢＳ）を点眼薬において３μＬ／眼ＢＩＤ頻度で局所投与した。マウスを７、９、および１１日に、角膜フルオレセイン染色に対し、上記で記載したように検査し、スコア化した。得点係は実験の過程中、治療群について知らされなかった。
【０３１９】
図１１Ａは下記ｂｉｄ治療下の２つの同一実験のマウスに対する０、３、７、９、および１１日での平均角膜染色スコア±ＳＥＭの棒グラフである：処置なし、ビヒクル（１．２５ＸＰＢＳ）、および１０ｍｇ／ｍｌ（１％）Ｐ０５。１０ｍｇ／ｍｌ  Ｐ０５は実験の７、９、および１１日に著しく角膜染色を減少させた。角膜染色の減少により評価される有効性はまた、０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｐ０５という少ない用量でも観察された。大腸菌中で生成される組換えＩＬ−１Ｒａもまた、動物モデルにおいて角膜染色を中程度に減少させた。
【０３２０】
図１１Ｂに示されるように、１０ｍｇ／ｍｌ  Ｐ０５の効果は、同じビヒクル中の１０ｍｇ／ｍｌマウス血清アルブミンとの比較に基づき特異的であった。ビヒクルに対し、１０ｍｇ／ｍｌマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）では、効果は見られず、１０ｍｇ／ｍｌ  Ｐ０５の効果は、１０ｍｇ／ｍｌマウス血清アルブミンに対し統計学的に有意であった。図１１Ｃに示されるように、１０ｍｇ／ｍｌ  Ｐ０５をまた、眼用エマルジョン中の０．０５％シクロスポリン（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））と比較した。約１週間のｂｉｄ投与後では、Ｐ０５は角膜染色を減少させたが、０．０５％シクロスポリン眼用エマルジョンでは効果は観察されなかった。
【０３２１】
実施例９
捕獲ステップが、ＢＬＲ（ＤＥ３）大腸菌細胞における発酵により生成されたＰ０５の精製のために開発されている。溶離条件は、１ｍＬカラム上での実験アプローチ（ＤＯＥ）の統計学的設計により規定した。最適条件を、中間規模（１０ｍＬカラム）で実施した。
【０３２２】
生成物を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡが添加された２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０からなる溶解緩衝剤中でのマイクロフルイダイゼーションにより抽出させる。澄んだライセートを、ｐＨ  ５．３および３ｍＳ／ｃｍの伝導率に調整する。調整済みライセートを、ＰｏｒｏｓＸＳ（強カチオン交換樹脂）に、２分の滞留時間で、２５−３０ｍｇ  Ｐ０５／ｍＬカラムの容量まで、ロードする。カラムを平衡緩衝剤で洗浄し、未結合種を除去する。ｐＨ６．０および３ｍＳ／ｃｍでの第２の洗浄を実施し、不純物集団を除去する。生成物を、ｐＨ６．０および６．６ｍＳ／ｃｍで溶離する。生成物関連種を、ｐＨ６．０および１２．４ｍＳ／ｃｍで溶離する。カラムを高塩濃度緩衝剤およびＮａＯＨで清浄にする。
【０３２３】
Ｐ０５は１７ｋＤａタンパク質であり、ｐＩは６．５８．である。ｄｅｓ−ＡＬＡ種のｐＩは６．８であり、分析用弱カチオン交換クロマトグラフィーにより容易に分離される。この種は、大腸菌内で見いだされるアミノペプチダーゼＰ活性の生成物である可能性がある。種は質量分析、ペプチドマッピング、およびＨＰＬＣ方法により同定することができる。
【０３２４】
クロマトグラフィー材料．ＰｏｒｏｓＸＳは、公称５０μｍ粒子サイズを有する架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズに基づく。クロマトグラフィーマトリクスは、スルホプロピル表面化学を有し、結合中の塩の上昇レベルを許容するように設計された。ＰｏｒｏｓＸＳ（ＣＮ  ４４０４３３９、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）材料を、バルクスラリーとして獲得し、５×５０ｍｍ  Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＣＮ２８−４０６４−０９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、最終カラム体積は１ｍＬ（５ｃｍ床高さ）とし、または１０×１５０ｍｍ  Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＣＮ２８−４０６４−１６、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、最終体積１０．５ｍＬ（１３．４ｃｍ床高さ）とした。
【０３２５】
緩衝剤．全ての緩衝剤を、容量的にＭｉｌｌｉＱ水を用いて調製した。所望のｐＨを達成するために、１０Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｍ  ＮａＯＨ（１０ｍ  ＮａＯＨのストック溶液から生成）を添加して、緩衝剤を滴定した。沈殿後、全ての緩衝剤を０．２μｍＰＥＳボトルトップフィルタを通して濾過した。全てのｐＨおよび伝導率測定は、室温（約２０−２５℃）で実施した。
【０３２６】
ＰｏｒｏｓＸＳ緩衝剤：ＣＥＸ平衡緩衝剤−１Ｌの緩衝剤あたり、０．５７ｍＬの氷酢酸および２．４４ｇのＮａＣｌを添加することにより作製した２１ｍＭ  ＮａＣｌを有する１０ｍＭ酢酸（ＨｏＡＣ）。最終ｐＨは５．３であり、最終伝導率は３ｍＳ／ｃｍであった。
【０３２７】
ＣＥＸ洗浄緩衝剤−１Ｌの緩衝剤あたり、１９．５ｇのＭＯＰＳ遊離酸、１．５ｇのＭＯＰＳナトリウム塩、および１．２８ｇのＮａＣｌを添加することにより作製した、２２ｍＭ  ＮａＣｌを有する１００ｍＭ  ＭＯＰＳ。最終ｐＨは５．７−６．６（要望通り）であり、最終伝導率は３ｍＳ／ｃｍであった。
【０３２８】
ＣＥＸ溶離緩衝剤−１Ｌの緩衝剤あたり、１９．５ｇのＭＯＰＳ遊離酸、１．５ｇのＭＯＰＳナトリウム塩、および６．９３ｇのＮａＣｌを添加することにより作製した、１１８ｍＭのＮａＣｌを有する１００ｍＭ  ＭＯＰＳ。最終ｐＨは５．７−６．６（要望通り）であり、最終伝導率は１２．４ｍＳ／ｃｍであった。
【０３２９】
ＣＥＸストリップ緩衝剤−１Ｌの緩衝剤あたり、０．５７ｍＬの氷酢酸および１７５ｇのＮａＣｌを添加することにより作製された、３Ｍ  ＮａＣｌを有する１０ｍＭ酢酸。最終ｐＨは５．３であり、最終伝導率は１８８ｍＳ／ｃｍであった。
【０３３０】
ライセート調製．ライセートのｐＨを、１Ｌの緩衝剤あたり１１．５ｍＬの氷酢酸を混合することにより作製した、ｐＨ４．５の２００ｍＭ酢酸を使用して調整した。１Ｍ  ＮａＯＨを使用して溶液を滴定して、４．５の最終ｐＨとした。この溶液を、濃または強酸の低ｐＨによる局所沈殿を回避するために使用した。
【０３３１】
これらの実験のためのロード材料は、２Ｌ流加バイオリアクター運転からの抽出物とした。細胞ペレットからの生成物の抽出は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０（１０ｍＭ  ＥＤＴＡが添加されている）を用いて実施した。新しい抽出物をＭｉｌｌｉＱ水（典型的には１：１−１．５希釈）で希釈し、３ｍＳ／ｃｍの伝導率とした。希釈された抽出物を、−２０℃で４１ｍＬアリコート中凍結させた。ロードを調製するために、アリコートを室温で解凍し、ｐＨ５．３まで、ｐＨ４．５の２００ｍＭの酢酸を用いて滴定した。滴定後、必要に応じてＭｉｌｌｉＱ水の添加により、小さな伝導率の調節を実施した。最終的に、ＣＥＸ平衡緩衝剤を使用してロードを２．５×希釈し、約１．７ｇ／Ｌの濃度とした。ロードを、０．８／０．２μｍフィルタを通して無菌濾過した。調整したロードを、調製した同じ日に使用した。
【０３３２】
宿主細胞タンパク質決定．宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを、大腸菌発現系に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（ＣＮ  Ｆ４１０、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により決定した。キットと共に供給されたプロトコルに正確に従った。ＨＣＰレベルに対してアッセイされる試料を、試料希釈剤（ＣＮ  Ｉ０２８、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１０×の最小希釈で希釈した。試料は典型的には２回希釈で実施し、各希釈に対し２組でプレーティングする。ＨＣＰレベルは、百万分率（ｐｐｍ）またはｎｇ−ＨＣＰ／ｍｇ−生成物の観点で表される。
【０３３３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による純度分析では、１ｍｍ×１０ウェルまたは１ｍｍ×１５ウェルＮｕＰＡＧＥ４−１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（それぞれ、ＣＮ  ＮＰ０３２２ＢｏｘおよびＮＰ０３２３Ｂｏｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを使用する。泳動用緩衝剤は２０×濃度から調製した１×ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝剤である（ＣＮ  ＮＰ０００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｎｏｖｅｘ鋭着色タンパク質標準（ＣＮ５７３１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を分子量指標として使用する。分析のための試料を、ＭｉｌｌｉＱ水による希釈により調製し、最終体積３０μＬとし、１０μＬの４×ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）（ＣＮ  ＮＰ０００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、１×の最終濃度とした。試料をボルテックスにより５秒間混合した。Ａ２８０／Ａ３２０測定から得られた計算タンパク質濃度を基に、３μｇ／ウェルの標的をロードした。
【０３３４】
ｗＣＥＸ．Ｐ０５を弱カチオン交換クロマトグラフィー（ｗＣＥＸ）により、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ−１０  ４ｘ２５０ｍｍカラム（製品番号０５４９９３）を用いて、１．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５（緩衝剤Ａ）および１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝剤Ｂ）の移動相溶液を用いて評価した。勾配は２０分にわたる１０％Ｂ〜２５％Ｂである。無傷なＰ０５は、ｄｅｓ−Ａｌａ種の前およそ１．５〜２．５分に、勾配の後期で溶離する。
【０３３５】
カチオン交換捕獲クロマトグラフィー．クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００クロマトグラフィーシステム上で実施した。１０ｍＬのＰｏｒｏｓＸＳカラムを充填した。材料を、４０ｍｇのＰ０５／ｍｌでロードし、または２５−３０ｍｇのＰ０５／ｍｌでロードすることができる。クロマトグラフィー方法を表９でまとめて示す。滞留時間をローディングおよび溶離ステップ中２分で一定に維持した。ニセの溶離プールを作製し、生成物回収、ＨＣＰレベル、および％無傷なタンパク質に対しアッセイした。合計２回の実行を１０ｍＬカラム上、３０％および３５％の％Ｂ、ｐＨ６．０を用いて完了した。
【表１２】
0006030554.tif 000014
【０３３６】
洗浄＃２は、主に不純物からなるピークとなる。３０％および３５％Ｂによる溶離＃１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により＞９５％純粋生成物となる。洗浄＃２の塩濃度は、少量だけ増加させることができ、溶離ピーク上の肩が除去される。
【０３３７】
実施例１０
Ｐ０４を精製し、回折品質結晶を２５％ＰＥＧ１５００、０．１Ｍ  ＰＣＢ（ｐＨ４．０）中、２０℃で成長させた。タンパク質は、空間群Ｐ２１２１２１で結晶化し、典型的な単位セル寸法は、ａ＝４４．５、ｂ＝４６．４、ｃ＝６４．８であった。結晶は高分解能まで回折し、１．４７Åまで拡張するデータベースをＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ、ビームラインＬＳ−ＣＡＴ  ２１ＩＤ−Ｆ（Ｃｈｉｃａｇｏ  ＩＬ、ＵＳＡ）で収集した。Ｐ０４のＸ線構造を、分子置換によりＰＤＢ構造１ＩＴＢおよび１ＩＲＡ由来の知られているＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａ構造の関連部分を組み込むモデルを使用して解明した(Vigers et al., (1997) Nature 386: 190-194 and Schreuder et al., (1997) Nature 386: 194-200)。最終モデルを１７．６％／２０．４％のＲｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅに精密化し、これは１のＰ０４分子（１４０残基）および９８の水分子を含む（表１０）。Ｐ０４残基１−２、４８−４９および８５−９３は、電子密度では見えず、最終モデルでは欠けている。
【表１３】
0006030554.tif 000015
【０３３８】
Ｐ０４結晶構造は、モデリングにより予測されるものと同様の折り畳みを有する。この構造の図を図１に示す。２つの構造のオーバーレイを図１２Ａに示す。バックボーン炭素に対するＲＭＳＤは、それぞれの親分子上の同じ残基と対比して、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａセグメントでは１．４１Åおよび１．０９Åであった。Ｐ０４は、ＩＬ−１β由来の残基とＩＬ−１Ｒａ由来の対応物の間の相互作用に関与する少なくとも１つの独特な塩橋および２つの独特な水素結合を有する：（ｉ）Ｇｌｕ３９−Ｌｙｓ６４（ＩＬ−１ＲＡ由来のＧｌｕ３９；ＩＬ−１β由来のＬｙｓ６４）（図１２Ｂに示される）、（ｉｉ）Ａｒｇ９−Ｇｌｎ１４９（ＩＬ−１ＲＡ由来のＡｒｇ９；ＩＬ−１β由来のＧｌｎ１４９）（図１２Ｃに示される）、および（ｉｉｉ）Ｓｅｒ１５２−Ｌｙｓ４０（ＩＬ−１ＲＡ由来のＳｅｒ１５２；ＩＬ−１β由来のＬｙｓ５０）（図１２Ｃに示される）。これらの独特な相互作用は、Ｐ０４の増加した熱安定性を説明することができる、というのも、これらの相互作用はＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａ構造には存在しないからである。これらの相互作用に関与する残基はまた、Ｐ０３およびＰ０５、同様に増加した熱安定性を有するタンパク質においても存在する。
【０３３９】
他の実施形態は下記特許請求の範囲内にある。
【０３４０】
【図１】
0006030554.tif 000016
【図２】
0006030554.tif 000017
【図３−１】
0006030554.tif 000018
【図３−２】
0006030554.tif 000019
【図４】
0006030554.tif 000020
【図５−１】
0006030554.tif 000021
【図５−２】
0006030554.tif 000022
【図６】
0006030554.tif 000023
【図７Ａ】
0006030554.tif 000024
【図７Ｂ】
0006030554.tif 000025
【図８Ａ】
0006030554.tif 000026
【図８Ｂ】
0006030554.tif 000027
【図９−１】
0006030554.tif 000028
【図９−２】
0006030554.tif 000029
【図１０Ａ】
0006030554.tif 000030
【図１０Ｂ】
0006030554.tif 000031
【図１１Ａ】
0006030554.tif 000032
【図１１Ｂ】
0006030554.tif 000033
【図１１Ｃ】
0006030554.tif 000034
【図１２Ａ】
0006030554.tif 000035
【図１２Ｂ】
0006030554.tif 000036
【図１２Ｃ】
0006030554.tif 000037
【配列表】
0006030554000001.app