(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織であるヒト生体試料中のＢｃｌ−２様タンパク質１１（ＢＩＭ）の量を測定するための方法であって、前記ヒト生体試料から調製されたタンパク質消化物中のＢＩＭフラグメントペプチドの量を質量分析を用いて検出および定量化することと、前記試料中のＢＩＭタンパク質の量を計算することと、を含み、
前記ＢＩＭフラグメントペプチドは配列番号２として示され、
前記量が相対量または絶対量である、方法。
【請求項２】
ＢＩＭフラグメントペプチドの量を検出および定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織が、パラフィン包理組織である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記組織が、腫瘍から得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記フラグメントペプチドの定量化が、１つのヒト生体試料中の前記ＢＩＭフラグメントペプチドの量を、異なる別個のヒト生体試料中の同一のＢＩＭフラグメントペプチドの量と比較することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＢＩＭフラグメントペプチドの定量化が、既知の量の添加内部標準ペプチドとの比較により、ヒト生体試料中の前記ＢＩＭフラグメントペプチドの量を決定することを含み、前記ヒト生体試料中の前記ＢＩＭフラグメントペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する同位体標識内部標準ペプチドと比較される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質消化物中の前記ＢＩＭフラグメントペプチドの量の検出および定量化が、前記ＢＩＭタンパク質の存在、および前記ヒト生体試料が得られる対象における癌との関連性を示す、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＢＩＭフラグメントペプチドの量または前記ＢＩＭタンパク質の量の検出および定量化の結果を、診断上の前記癌の病期／グレード／状態と相関させることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＢＩＭフラグメントペプチドの量または前記ＢＩＭタンパク質の量の検出および定量化の結果と診断上の前記癌の病期／グレード／状態との相関が、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの検出および定量化された量と多重形式で組み合わされて、診断上の前記癌の病期／グレード／状態に関するさらなる情報を提供する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト生体試料が得られる前記患者または対象に投与される治療薬および／または投与される前記治療薬の量を、前記ＢＩＭフラグメントペプチドの量または前記ＢＩＭタンパク質の量に基づいて選択することを補助するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本願は、２０１１年１月１３日出願の「Ｂｃｌ−２−Ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １１  ＳＲＭ／ＭＲＭ  Ａｓｓａｙ」の題目の米国仮特許出願第６１／４３２，４６２号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
導入
Ｂｃｌ−２様タンパク質１１（Ｂｃｌ２−Ｌ−１１、細胞死のＢｃｌ２相互作用メディエーター、およびＢＣＬ２Ｌ１１とも称され、また、ＢＩＭとも称される）のサブシーケンス由来の特異的ペプチドが提供される。提供されるそれぞれのペプチドに対するペプチド配列およびフラグメンテーション／遷移イオンは、質量分析ベース選択反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイ（複数を含む）（また、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイ（複数を含む）とも称され、以下、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイと称される）では特に有用である。ＢＩＭタンパク質（複数を含む）のＳＲＭ／ＭＲＭ定量分析用のペプチドの使用を記載する。ヒトＢＩＭは、少なくとも１７のイソ型を有する。本明細書に記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて、ＢＩＭタンパク質（複数を含む）由来の特異的ペプチドのうちの１つ以上の存在を検出し、相対または絶対定量値を測定することができ、したがって、生体試料から得られた所与のタンパク質調製物中の、総ＢＩＭタンパク質（複数を含む）の量だけでなく、存在する場合、イソ型の量も質量分析により測定する手段を提供することができる。
【０００３】
本明細書に記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、患者または対象組織試料、例えば、ホルマリンで固定した癌患者または対象組織から得られた細胞から調製される複合タンパク質溶解試料中のこれらのペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、この内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本特許に記載される方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能であるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬およびプロトコルを用いて好都合に行うことができる。
【０００４】
癌患者（または対象）から外科的に切除された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、病理学的実践において認められた慣例である。結果として、最も広範に入手できるこれらの患者または対象由来の組織形態は、ホルムアルデヒド／ホルマリン固定パラフィン包埋組織である。ホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、典型的に、ホルマリンと称されるホルムアルデヒドの水溶液を用いる。「１００％」のホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（約４０容量％または３７質量％のホルムアルデヒド）から構成され、酸化を、および重合の程度を制限するために、少量の安定剤、通常、メタノールを含む。組織を保存する最も一般的な方法は、１０％の中性緩衝ホルマリンと一般に呼ばれるホルムアルデヒド水溶液中に全組織を長時間（８時間〜４８時間）浸漬し、続いて、室温での長期貯蔵のために、固定した全組織をパラフィンワックス中に包埋することである。したがって、ホルマリン固定した癌組織を分析するための分子分析方法が、癌患者または対象組織の分析において、最も受け入れられ、頻繁に活用される方法であろう。
【０００５】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの結果は、組織（生体試料）を収集および保存した患者または対象の特定の組織試料（例えば、癌組織試料）内のＢＩＭタンパク質（複数を含む）の正確かつ精密な定量化レベルと相関させるために用いることができる。これは、癌に関する診療情報を提供するだけでなく、医師もしくは他の医療従事者の患者または対象に対する適切な療法の決定も可能にする。罹患組織または別の患者／対象試料中のタンパク質発現のレベルに関する診断上または治療上で重要な情報を提供するこのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、このようなアッセイは、癌の病期もしくは程度を診断し、患者または対象が応答する可能性が最も高い治療剤を決定するように設計することができる。
【発明の概要】
【０００６】
ＢＩＭタンパク質（複数を含む）由来の特定の非修飾ペプチドの相対または絶対レベルを測定するために記載されたアッセイが、本明細書に記載される。また、ＢＩＭタンパク質（複数を含む）由来の特定の修飾ペプチドの絶対または相対レベルを測定するために記載されたアッセイも、本明細書に記載される。修飾の例には、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基が含まれる。
【０００７】
ＢＩＭタンパク質（複数を含む）の相対定量化レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法、例えば、異なる試料中の個別ＢＩＭペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）ピーク面積（例えば、特徴的ピーク面積または積分フラグメントイオン強度）を比較することにより決定される。あるいは、それぞれのペプチドがそれ自体の特異的ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する、複数のＢＩＭ特徴的ペプチドの複数のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を比較し、１つ以上のさらなるまたは異なる生体試料中のＢＩＭタンパク質含量を有する１つの生体試料中の相対ＢＩＭタンパク質含量を決定することができる。こうして、ＢＩＭタンパク質由来の特定の１つ以上のペプチドの量、したがって、ＢＩＭタンパク質の量が、同一の実験条件下の２つ以上の生体試料にわたって、同一の１つ以上のＢＩＭペプチドと比較して決定される。加えて、単一の試料内のＢＩＭタンパク質由来の所与の１つ以上のペプチドの相対定量化が、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によるそのペプチドの特徴的ピーク面積を、生体試料から調製された同一のタンパク質調製物内の、異なる１つ以上のタンパク質由来の別の異なる１つ以上のペプチドの特徴的ピーク面積と比較することにより、決定され得る。こうして、ＢＩＭタンパク質由来の特定のペプチドの量、したがって、ＢＩＭタンパク質の量が、同一の試料内で相対的に決定される。これらのアプローチでは、生体試料由来のタンパク質調製物中のＢＩＭペプチドの容量に対する絶対重量または重量に対する絶対重量にかかわらず、ピーク面積により決定された量が相互に相対的である試料間および試料内の間の別の１つ以上のペプチドの量に対する、ＢＩＭタンパク質由来の個別の１つ以上のペプチドの定量化を行うことができる。異なる試料間の個別の特徴的ピーク面積に関する相対的定量データは、試料ごとに分析されたタンパク質の量に正規化される。複数のタンパク質由来の多くのペプチドおよびＢＩＭタンパク質について、単一の試料中、および／または多くの試料間で同時に相対的定量化を行い、相対的なタンパク質の量、すなわち他のペプチド／タンパク質に対する１つのペプチド／タンパク質を見抜くことができる。
【０００８】
ＢＩＭタンパク質の絶対定量化レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により決定され、それによって、１つの生体試料内のＢＩＭタンパク質由来の個別のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が、既知量の「スパイクされた」内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較される。一実施形態では、この内部標準は、１つ以上の重同位体で標識された１つ以上のアミノ酸残基を含む、全く同じＢＩＭペプチドの合成バージョンである。このような同位体で標識された内部標準が合成されるため、質量分析は、元のＢＩＭペプチド特徴的ピークとは異なり区別可能である、予測可能で一貫したＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを生成し、比較ピークとして用いることができる。したがって、内部標準が、既知量で生体試料由来のタンパク質調製物中に既知量でスパイクされ、質量分析により分析される場合、元のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較され、この数値比較は、生体試料由来の元のタンパク質調製物中に存在する元のペプチドの絶対的モル濃度および／または絶対的重量を示す。フラグメントペプチドに対する絶対定量データは、試料ごとに分析されるタンパク質の量に従って表示される。単一の試料中、および／または多くの試料間で同時に多くのペプチド、したがって、タンパク質に関し、絶対定量化を行い、個別の生体試料および個別の試料の全体コホート中の絶対タンパク質の量を見抜くことができる。
【０００９】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法は、例えば、直接的に、ホルマリン固定組織等の患者由来または対象由来の組織中の癌の病期の診断を支援し、また、どの治療剤がその患者または対象の治療に用いるのに最も有益であるかの判定を支援するのに用いることができる。外科手術、例えば、部分的または全体の腫瘍の治療的除去により、または疑わしい疾患の有無を判断するために行われる生検方法のいずれかにより患者もしくは対象から摘出された癌組織を分析し、１つ以上の特異的タンパク質がその患者もしくは対象の組織中に存在するか否か、およびどの形態のタンパク質が存在するかを判断する。さらに、１つのタンパク質または複数のタンパク質の発現レベルが決定され、健常組織中に見出される「正常」または参照レベルと比較することができる。健常組織中に見出されるタンパク質の正常または参照レベルは、例えば、癌を有さない１つ以上の個体の関連組織に由来され得る。あるいは、正常または参照レベルは、癌に罹患している個体に対し、癌に罹患していない関連組織の分析により得られ得る。
【００１０】
タンパク質レベル（例えば、ＢＩＭレベル）のアッセイを用いて、１つ以上（即ち、１つ、２つ、または３つ）のＢＩＭペプチドを用いることによって、癌と診断された患者または対象の癌の病期を診断することもできる。
【００１１】
タンパク質またはペプチドのレベルもしくは量は、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより決定されるタンパク質またはペプチドのモル、質量、もしくは重量で表される量として定義することができる。このレベルもしくは量は、分析された溶解物中のタンパク質または別の構成成分の全レベルもしくは量に正規化することができる（例えば、タンパク質のマイクロモル／マイクログラム（ｍｉｃｒｏｇｒａｍ）、またはタンパク質のマイクログラム（ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ）／マイクログラム（ｍｉｃｒｏｇｒａｍ）で表される）。加えて、タンパク質またはペプチドのレベルもしくは量は、例えば、マイクロモルもしくはナノグラム／マイクロリットルで表される容積基準において決定され得る。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより決定されたタンパク質またはペプチドのレベルもしくは量は、分析された細胞の数に正規化することもできる。したがって、ＢＩＭに関する情報は、ＢＩＭタンパク質（またはＢＩＭタンパク質のフラグメントペプチド）のレベルを正常組織中で観察されるレベルと相関させることにより、癌の病期またはグレードを決定するのを支援するために用いることができる。一旦癌の病期および／もしくはグレード、ならびに／またはＢＩＭタンパク質の発現特性が判断されると、その情報は、例えば、アッセイされた１つ以上のタンパク質（例えばＢＩＭ）の異常発現により特徴付けられる癌組織を特異的に治療するために開発された治療剤（化学および生物学的）の一覧と照合させることができる。例えば、ＢＩＭタンパク質またはタンパク質を発現している細胞／組織を特異的に標的にする治療剤の一覧へのＢＩＭタンパク質アッセイからの情報の照合により、疾患を治療するための、いわゆるオーダーメイド医療手法を規定する。本明細書に記載されるアッセイ方法は、診断および治療法の決定のための源として患者または対象自身の組織由来のタンパク質の分析を用いることによりオーダーメイド医療手法の基盤を形成する。
【００１２】
選択反応モニタリング／多重反応モニタリング（ＳＲＭ／ＭＲＭ）アッセイを用いて、ＢＩＭタンパク質由来の１つ以上の特異的ペプチドの相対または絶対定量化レベルを測定することができ、したがって、生体試料から得られた所与のタンパク質調製物中のＢＩＭタンパク質の量を質量分析により測定する手段を提供することができる。
【００１３】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、患者または対象組織試料、例えば、ホルマリンで固定した癌患者または対象組織から得られた細胞から調製された複合タンパク質溶解試料中のこれらのペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載され、この内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本特許に記載される方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能なＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬およびプロトコルを用いて好都合に行うことができる。
【００１４】
最も広範かつ好都合に入手可能な癌患者または対象の組織由来の組織形態は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織である。外科的に摘出した組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界中ではるかに最も一般的な癌組織試料を保存する方法であり、標準的病理学実践のための認められた方法である。ホルムアルデヒドの水溶液は、ホルマリンと称される。「１００％」のホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（これは、約４０容量％または３７質量％である）から構成され、酸化を、および重合の程度を制限するために、少量の安定剤、通常、メタノールを含む。組織を保存する最も一般的な方法は、１０％の中性緩衝ホルマリンと一般に呼ばれるホルムアルデヒド水溶液中に全組織を長時間（８時間〜４８時間）浸漬し、続いて、室温での長期貯蔵のために、固定した全組織をパラフィンワックス中に包埋することである。したがって、ホルマリン固定した癌組織を分析するための分子分析方法が、癌患者または対象組織の分析において、最も受け入れられ、頻繁に活用される方法であろう。
【００１５】
ある実施形態は、以下に記載される実施形態を含む説明を考慮して、当業者に明らかとなるであろう。
１．生体試料中のＢｃｌ−２様タンパク質１１（ＢＩＭ）のレベルを測定するための方法であって、生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドのレベルを、質量分析を用いて検出および／または定量化することと、試料中の修飾もしくは非修飾ＢＩＭタンパク質のレベルを計算することと、を含み、
該レベルが相対レベルまたは絶対レベルである、方法。
２．１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドのレベルを検出および／または定量化する前に、該タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．該分画ステップが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、実施形態２に記載の方法。
４．該生体試料の該タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルにより調製される、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
５．該タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
６．該タンパク質消化物が、トリプシン消化物を含む、実施形態５に記載の方法。
７．該質量分析が、タンデム型質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、もしくは飛行時間型質量分析、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
８．使用される質量分析モードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、もしくは複数の選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態７に記載の方法。
９．該ＢＩＭフラグメントペプチドが、配列番号１、配列番号２、および配列番号３として示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．該生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞、または固形組織である、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．該組織が、ホルマリン固定組織である、実施形態１０に記載の方法。
１２．該組織が、パラフィン包埋組織である、実施形態１０または１１に記載の方法。
１３．該組織が、腫瘍から得られる、実施形態１０に記載の方法。
１４．該腫瘍が、原発性腫瘍である、実施形態１３に記載の方法。
１５．該腫瘍が、二次性腫瘍である、実施形態１３に記載の方法。
１６．修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドを定量化することをさらに含む、実施形態１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．修飾もしくは非修飾フラグメントペプチドの定量化が、１つの生体試料中の配列番号１、配列番号２、および配列番号３で示されるＢＩＭの約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＢＩＭフラグメントペプチドのレベルを、異なる別個の生体試料中の同一のＢＩＭフラグメントペプチドのレベルと比較することを含む、実施形態１６に記載の方法。
１８．１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドの定量化が、既知のレベルの添加された内部標準ペプチドとの比較により、生体試料中のＢＩＭフラグメントペプチドのそれぞれのレベルを決定することを含み、該生体試料中のＢＩＭフラグメントペプチドがそれぞれ、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、実施形態１７に記載の方法。
１９．該内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、実施形態１８に記載の方法。
２０．該同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、および２Ｈ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の安定重同位体を含む、実施形態１９に記載の方法。
２１．該タンパク質消化物中の１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドのレベルの検出および／または定量化が、修飾もしくは非修飾ＢＩＭタンパク質の存在および対象における癌との関連性を示す、実施形態１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドのレベルまたは該ＢＩＭタンパク質のレベルの検出および／もしくは定量化の結果を、診断上の該癌の病期／グレード／状態と相関させることをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
２３．１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドのレベル、あるいは該ＢＩＭタンパク質のレベルの検出および／もしくは定量化の結果と診断上の該癌の病期／グレード／状態との相関が、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの検出および／もしくは定量化されたレベルと多重形式で組み合わされて、診断上の該癌の病期／グレード／状態に関するさらなる情報を提供する、実施形態２２に記載の方法。
２４．該生体試料が得られる該対象のために、１つ以上のＢＩＭフラグメントペプチドの存在、非存在、もしくはレベル、またはＢＩＭタンパク質のレベルに基づいて治療を選択することをさらに含む、実施形態１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．該生体試料が得られる該患者または対象に、治療的有効量の治療薬を投与することをさらに含み、該治療薬および／または投与される該治療薬の量は、１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドのレベルまたはＢＩＭタンパク質のレベルに基づく、実施形態１〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．該治療または該治療薬が、ＢＩＭタンパク質を発現する癌細胞に指向される、実施形態２４または２５に記載の方法。
２７．該生体試料が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルおよび試薬を用いて１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドのレベルを定量化するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織である、実施形態１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．該１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドが、表１中のペプチドのうちの１つ以上である、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
２９．表１中のペプチドの量を定量化することを含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。
３０．表１中のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、もしくは３つ全ておよび／またはそれらに対する抗体を含む、組成物。
３１．表１のペプチドのうちの１つ、２つ、もしくは３つのペプチドをコードする核酸および／または表１のペプチドのうちの１つ、２つ、もしくは３つのペプチドをコードする核酸の補体を含む、実施形態３０に記載の組成物。
３２．１つ以上のキナーゼ阻害剤（複数を含む）に対する癌の耐性を決定する方法であって、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて、癌組織またはその癌性細胞中のＢＩＭタンパク質（複数を含む）の存在またはレベルを決定することを含み、該癌組織またはその癌性細胞における細胞のアポトーシスを媒介することができる生物学的に活性なＢＩＭタンパク質（複数を含む）の存在は、該キナーゼ阻害剤（複数を含む）のうちの１つ以上に対する該癌の感受性を示す、方法。癌組織由来の癌性細胞には、ホルマリン固定組織等の組織試料中に存在する細胞、および生検を含む癌性細胞試料から顕微解剖されるか、または増殖される細胞が含まれる。
３３．１つ以上のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤（複数を含む）に対する癌の耐性を決定する方法であって、癌組織またはその癌性細胞中のＢＩＭタンパク質の存在もしくはレベルをＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて決定することを含み、該癌組織またはその癌性細胞における細胞のアポトーシスを媒介することができる生物学的に活性なＢＩＭタンパク質（複数を含む）の存在は、該阻害剤（複数を含む）のうちの１つ以上に対する該癌の感受性を示す、方法。
３４．該阻害剤（複数を含む）のうちの１つ以上が、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、組換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である、実施形態３２または３３に記載の方法。
３５．該抗体が、トラスツズマブ、セツキシマブ、およびパニツムマブ等のキナーゼ受容体を阻害する抗体が含まれるが、これらに限定されない、キナーゼ受容体阻害剤として特徴付けられる治療薬の種類から選択される、実施形態３４に記載の方法。
３６．ラパチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ペリチニブ、カネルチニブ、フォレチニブ、クリゾチニブ、アファチニブ、カボザンチニブ、アキシチニブ、バタラニブ、ＢＭＳ−５３６９２４、ＯＳＩ−９０６サラカチニブ、ポナチニブ、またはこれらの治療薬のうちの２つ、３つ、もしくは４つの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、キナーゼ阻害剤分子として特徴付けられる治療薬の種類から選択される１つ以上の治療薬に対する癌の耐性を決定する方法であって、該方法は、癌組織またはその癌性細胞中のＢＩＭタンパク質（複数を含む）の存在またはレベルをＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて決定することを含み、該癌組織またはその癌性細胞における細胞のアポトーシスを媒介することができる生物学的に活性なＢＩＭタンパク質の存在は、該治療薬に対する該癌の感受性を示す、方法。
３７．該ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが、タンパク質消化物中の１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドのレベルを検出および／または定量化することを含む、実施形態３２〜３６のいずれかに記載の方法。このような実施形態では、該タンパク質消化物は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃから選択される１つ以上のプロテアーゼの任意の組み合わせを癌組織またはその癌性細胞に接触させることにより調製され得る。特定の一実施形態では、トリプシンとＬｙｓ−Ｃの組み合わせが採用される。
３８．該フラグメントペプチドのうちの１つ以上が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチドから選択される、実施形態３７に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
原理的には、例えば、既知の特異性のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化されることにより調製されるＢＩＭタンパク質由来のいずれの予測されるペプチドも、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて試料中のＢＩＭタンパク質の存在量を測定するための代用レポーターとして用いることができる。同様に、ＢＩＭタンパク質中で潜在的に修飾されることが知られている部位のアミノ酸残基を含むいずれの予測されるペプチド配列を用いて、試料中のＢＩＭタンパク質の修飾の程度をアッセイすることができる可能性もある。
【００１７】
＝ＢＩＭフラグメントペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルの使用を含む様々な手段により生成可能である。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルおよび試薬は、組織／生体試料中のタンパク質のタンパク分解性消化により、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分光分析に適したペプチド試料を作製することができる。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルでは、組織／生体試料は、緩衝液中で、高温で長期間維持され（例えば、約８０℃〜約１００℃で、約１０分間〜約４時間の期間）、タンパク質架橋を逆転または放出する。用いられる緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または洗剤含有緩衝液）であり、有利に、質量分光分析の妨げとならない緩衝液である。次に、組織／生体試料は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃが挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上のプロテアーゼにより、この生体試料の組織と細胞構造を破壊し、この試料を液化するのに十分な時間（例えば、３７℃〜６５℃の温度で３０分間〜２４時間）処理される。加熱およびタンパク質分解の結果物は、可溶性の希釈可能な液体生体分子溶解物である。
【００１８】
一旦溶解物が調製されると、試料中のペプチドは、質量分析によるそれらの分析および測定を促進する様々な技術に供され得る。一実施形態では、このペプチドは、親和性技術、例えば、免疫学ベースの精製（例えば免疫親和性クロマトグラフィー）、イオン選択培地におけるクロマトグラフィー等の親和性技術によって分離され得るか、またはペプチドが修飾される場合、炭水化物修飾ペプチドの分離に対してレクチン等の適切な培地を用いる分離により分離され得る。一実施形態では、質量分光分析前にペプチドの免疫学的分離を採用するＳＩＳＣＡＰＡ方法が採用される。ＳＩＳＣＡＰＡ技術は、例えば、米国特許第７，６３２，６８６号に記載されている。他の実施形態では、レクチン親和性方法（例えば、親和性精製および／またはクロマトグラフィーを用いて、質量分析による分析前に溶解物からペプチドを分離し得る。レクチンベースの方法を含む、ペプチド群の分離のための方法は、例えば、Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７５２：２９３−３０６（２００１）に記載されている。免疫親和性クロマトグラフィー技術、レクチン親和性技術、ならびに親和性分離および／またはクロマトグラフィーの他の形態（例えば、逆相、サイズベースの分離、イオン交換）は、質量分析によるペプチドの分析を促進するために任意の好適な組み合わせで用いることができる。
【００１９】
驚くべきことに、ＢＩＭタンパク質由来の多くの可能性のあるペプチド配列が、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用に不適切であるか、または効果がないことが明らかになったが、理由はすぐには明らかになっていない。特に、ＢＩＭタンパク質由来の多くのトリプシンペプチドが、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で効率的にまたは全く検出され得なかったことが見出された。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに対して最も適したペプチドを予測することはできないので、ＢＩＭタンパク質用の信頼できる正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の修飾および非修飾ペプチドを実験的に特定することが必要であった。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、うまくイオン化しないか、または他のタンパク質とははっきりと異なるフラグメントを生成せず、また、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）中にうまく分解できないか、またはガラスもしくはプラスチック製品に付着する可能性があるため、一部のペプチドは、例えば、質量分析によって検出することが困難である可能性があると考えられている。したがって、ホルマリン固定組織試料から調製されたＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物（例えば、表１および２中のペプチド）中に検出され得るＢＩＭタンパク質由来のこれらのペプチドは、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイがＢＩＭタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにおいて用いられ得るペプチドである。一実施形態では、単一の試料中のＢＩＭタンパク質のフラグメントの同時前処理に用いられるプロテアーゼは、トリプシンである。別の実施形態では、用いられるプロテアーゼは、Ｌｙｓ−Ｃである。さらに他の実施形態では、用いられるプロテアーゼは、トリプシンとＬｙｓＣの組み合わせである。
【００２０】
本明細書に記載される様々な実施形態（例えば、表１および／または２）に見出されるＢＩＭペプチドは、ホルマリン固定癌組織から得た細胞から調製された複合Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物内の全タンパク質のプロテアーゼ消化によるＢＩＭタンパク質由来であった。別段の指定がなければ、それぞれの例で、プロテアーゼはトリプシンであった。次いで、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物は、次に、質量分析により分析され、質量分析により検出され分析されるＢＩＭタンパク質由来のペプチドが決定された。質量分光分析用に好ましい特異的サブセットのペプチドの特定は、次の項目に基づいている。１）タンパク質由来の１つ以上のどのペプチドがＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物の質量分析中にイオン化するかの実験的決定、および２）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を調製するのに使用されるプロトコルおよび実験条件で生き残るためのペプチドの能力。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、試料調製の間、修飾された形態で生き残るためにペプチド内の修飾アミノ酸残基の能力までも及ぶものである。
【００２１】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得た細胞由来のタンパク質溶解物を、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬およびプロトコルを用いて調製し、これは、組織の顕微解剖により試料チューブに細胞を収集し、続いて、細胞をＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）緩衝液中で長期間加熱することを伴う。一旦ホルマリン誘導架橋がマイナスの影響を受けると、組織／細胞は、例えば、プロテアーゼトリプシンを含むが、これに限定されない、プロテアーゼを用いて予想通りの形で、完全に消化される。それぞれのタンパク質溶解物は、プロテアーゼによる無傷のポリペプチドの消化により一群のペプチドへと変化する。それぞれのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を分析し（例えば、イオントラップ質量分析により）、複数のペプチドの包括的プロテオミック調査を行った。この場合、それぞれのタンパク質溶解物中に存在する全細胞性タンパク質から質量分析により特定され得る可能な限り多くのペプチドを特定するものとして、データを提示した。単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物からできる限り多くのペプチドの特定のための包括的プロファイリングを行うことが可能なイオントラップ質量分析計または別の形式の質量分析計が採用される。しかしながら、イオントラップ質量分析計が、ペプチドの包括的プロファイリングを行うための質量分析計として最適のタイプであり得る。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計において開発および実行することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。
【００２２】
一旦採用された条件下で、単一の溶解物の単一ＭＳ分析により可能な限り多くのペプチドが特定されると、ペプチドの一覧が照合され、その溶解物中に検出されたタンパク質を判定するために使用された。そのプロセスは、複数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物に対して繰り返され、ペプチドの非常に長い一覧を単一のデータセットに並べた。そのタイプのデータセットは、（プロテアーゼ消化後に）分析された生体試料のタイプ中で、具体的には、生体試料のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出可能であり、したがって、特定のタンパク質、例えば、ＢＩＭタンパク質等に対するペプチドを含む、ペプチドを表していると考えることができる。
【００２３】
一実施形態では、ＢＩＭ受容体の絶対的または相対的量の決定で有用であると特定されたＢＩＭトリプシンペプチドは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、８つ以上、または１０以上のペプチドを含み、これらのそれぞれは表１に記載される。これらのペプチドはそれぞれ、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製したＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物の質量分析により検出される。したがって、表１中のペプチドのそれぞれ、またはこれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、表１および／または表２中に示される１つ以上、２つ以上、または全てのペプチド）は、ホルマリン固定した患者または対象組織中直接を含むヒト生体試料中のＢＩＭタンパク質に対する定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するのに用いる候補である。
【表１】
0006046053.tif 000002
【００２４】
表１に記載されるＢＩＭトリプシンペプチドは、前立腺、結腸、および乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物から検出されたものを含む。これらのペプチドはそれぞれ、ホルマリン固定組織中のＢＩＭタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析では、いずれの特定の器官部位に由来するいずれの特定のペプチドに対しても、選択性は観察されなかった。したがって、これらのペプチドはそれぞれ、任意の生体試料または身体の任意の器官部位に由来する任意のホルマリン固定組織由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物におけるＢＩＭタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うために適すると考えられる。
【００２５】
一実施形態では、用いられるＢＩＭペプチドは、配列番号１のペプチドであり、ＢＩＭイソ型１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、および／または１５のうちの１つ以上のレベルが評価される。別の実施形態では、用いられるＢＩＭペプチドは、配列番号２のペプチドであり、ＢＩＭイソ型１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、および／または１５のうちの１つ以上のレベルが評価される。さらに別の実施形態では、用いられるＢＩＭペプチドは、配列番号３のペプチドであり、ＢＩＭイソ型１、２、４、７、１３、および／または１４のうちの１つ以上のレベルが評価される。
【００２６】
一実施形態では、表１中の１つ以上のペプチドまたはこれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ全て）が、免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ）を含む、これに限定されない、質量分析に依存しない方法によりアッセイされる。一実施形態では、これらのアッセイは、ホルマリン固定組織を用いて行われる。ペプチド（複数を含む）（絶対的または相対的）の量に対するどのような情報が得られるかに関わらず、この情報は、患者または対象の癌の存在を示す（診断する）こと、癌の病期／グレード／状態を決定すること、予後を示すこと、または患者または対象に対する治療薬または治療レジメンを決定すること等を含む、本明細書に記載されるいずれかの方法に用いることができる。
【００２７】
本明細書に記載される実施形態は、表１および／または２中のペプチドのうちの１つ以上、いかなる２つ以上、または３つ全てのペプチドを含む組成物を含み、同位体標識されている以外は表１および／または２中に見出される１つ以上のペプチドと同一であるペプチドを任意に含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、表１および／または２中のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または全てのペプチドを含み、これは、ペプチド、ポリペプチド、または同位体標識されている以外は表１および／または表２中に見出される１つ以上のペプチドと同一であるペプチドを含むタンパク質を任意に含むことができる。ペプチド、ポリペプチド、または表１および／または２中のペプチドを含むタンパク質が用いられる場合、プロテアーゼ処理により、同位体標識されている以外は表１および／または表２中のペプチドと同一であるペプチドを放出する。同位体標識ペプチドはそれぞれ、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される１つ以上のイソ型で標識してもよい。ＢＩＭタンパク質由来のペプチドを含む組成物は、同位体で標識していても、していなくても、そのタンパク質由来の全てのペプチド（例えば、トリプシンペプチドの完全セット）を含む必要はない。いくつかの実施形態では、組成物は、ＢＩＭ由来の組み合わせた全てのペプチド、特に、表１および／または表２中に見られる全てのペプチドを含まない。ペプチドを含む組成物は、乾燥または凍結乾燥物質、液体（例えば、水性の）溶液または懸濁液、配列、またはブロットの形態であってもよい。
【表２】
0006046053.tif 000003
【００２８】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行う上での重要な考慮すべきことは、ペプチドの分析に採用し得る装置のタイプである。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計において開発および実行することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の現在最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。そのタイプの質量分析計が、細胞内に含まれる全タンパク質由来の何十万から何百万の個別のペプチドからなり得る極めて複雑化したタンパク質溶解物内の単一の単離標的ペプチドを分析するための最適の装置であると考えることができる。
【００２９】
ＢＩＭタンパク質由来のそれぞれのペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も効率よく実施するためには、分析におけるペプチド配列に加えて情報を利用することが望ましい。そのさらなる情報は、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）を指示し、命令するために用いて、アッセイを効率的に行うことが可能となるように、正しく、的を絞った特異的標的化ペプチドの分析を行う。
【００３０】
一般に、標的ペプチド、および特定のＢＩＭペプチドに関するさらなる情報としては、それぞれのペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、およびそれぞれの遷移イオンのイオンタイプのうちの１つ以上を含んでもよい。ＢＩＭタンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために使用可能なさらなるペプチド情報は、表１中の一覧からＢＩＭペプチドのうちの３つに対する２つを示す。表１中の例により示されるペプチドに対して記載される同様のさらなる情報が、調製され、取得され、他のプロテアーゼまたはプロテアーゼ（例えば、トリプシンおよび／またはＬｙｓ  Ｃ）の組み合わせの作用により生成されるものを含む、ＢＩＭタンパク質（複数を含む）由来の他のペプチド（複数を含む）の分析に適用され得る。一実施形態では、特定のＢＩＭペプチドに関するさらなる情報には、それぞれのペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、およびＢＩＭタンパク質のＬｙｓ  Ｃタンパク質分解から得られるペプチドに対するそれぞれの遷移イオンのイオンタイプのうちの１つ以上、いずれの２つ以上、またはいずれの３つ以上が含まれる。
【００３１】
別の実施形態では、特定のＢＩＭペプチドに関するさらなる情報には、それぞれのペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、およびＢＩＭタンパク質（複数を含む）のトリプシンタンパク質分解から得られるペプチドに対するそれぞれの遷移イオンのイオンタイプのうちの１つ以上、いずれの２つ以上、またはいずれの３つ以上が含まれる。
【００３２】
さらに別の実施形態では、１つ以上の特定のＢＩＭペプチドに関するさらなる情報には、それぞれのペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、およびＢＩＭタンパク質（複数を含む）のトリプシンおよびＬｙｓ  Ｃタンパク質分解から得られるペプチドに対するそれぞれの遷移イオンのイオンタイプのうちの１つ以上、いずれの２つ以上、またはいずれの３つ以上が含まれる。以下に記載される方法は、１）ＢＩＭタンパク質の質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために使用可能なＢＩＭタンパク質由来の候補ペプチドを特定し、２）相互に関連付けるために、ＢＩＭタンパク質由来の標的ペプチドのための１つ以上の個別のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発し、かつ３）定量アッセイを癌診断および／または最適治療の選択に適用するために使用可能である。
【００３３】
アッセイ方法
Ｉ．ＢＩＭタンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの特定：
ａ．タンパク質を消化させるために、（トリプシンを含んでも、含まなくてもよい）プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）またはプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）を用いて、ホルマリン固定生体試料からＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物を調製する。
ｂ．イオントラップタンデム質量分析計において、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の全タンパク質フラグメントを分析し、ＢＩＭタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。この場合、個別フラグメントペプチドは、どのペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化等も含まない。
ｃ．イオントラップタンデム質量分析計において、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の全タンパク質フラグメントを分析し、ペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基等を有するＢＩＭタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。
ｄ．完全長ＢＩＭ完全タンパク質から特定の消化方法により生成された全ペプチドを測定することは潜在的に可能ではあるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製される複合Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物で直接質量分析により特定されるものである。
ｅ．ホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を分析する場合、患者または対象組織中で特異的に修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化）され、質量分析計中でイオン化され、それにより検出することができるペプチドは、ＢＩＭタンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして特定される。
【００３４】
ＩＩ．ＢＩＭタンパク質由来のフラグメントペプチドの質量分析アッセイ
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で特定された個別フラグメントペプチドのための三連四重極質量分析計におけるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが、ＢＩＭタンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ．ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない、最適クロマトグラフィー条件のためのフラグメントペプチドに対する最適保持時間を決定する。
ｉｉ．それぞれのペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、それぞれのペプチドに対する前駆物質電荷状態、それぞれのペプチドに対する前駆物質ｍ／ｚ値、それぞれのペプチドに対するｍ／ｚ遷移イオン、およびそれぞれのフラグメントペプチドに対するそれぞれの遷移イオンのイオンタイプを決定する。
ｉｉｉ．次いで、（ｉ）および（ｉｉ）からの情報を用いて、三連四重極質量分析計においてＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うことができ、この場合、それぞれのペプチドは、三連四重極質量分析計で行われる独特のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを明確に規定する特徴的かつ固有のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析から固有のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の関数として、検出されるＢＩＭタンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のタンパク質の相対的および絶対的量両方を示すことができるように、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行う。
ｉ．相対的定量化は、下記により得ることができる。
１．１つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出された所与のＢＩＭペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるホルマリン固定生体試料由来の少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の同一のＢＩＭフラグメントペプチドの同一のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＢＩＭタンパク質の存在の増加または減少を決定する。
２．１つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出された所与のＢＩＭペプチド由来のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、異なる別の生物学的起源由来の他の試料中の他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから生成したＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＢＩＭタンパク質の存在の増加または減少を決定し、この場合、２つの試料間のペプチドフラグメントに対するＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の比較は、それぞれの試料で分析されたタンパク質の量に正規化されている。
３．ＢＩＭタンパク質のレベルの変化を、種々の細胞条件下でそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所与のＢＩＭペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料由来の同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチド由来のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＢＩＭタンパク質の存在の増加または減少を決定する。
４．これらのアッセイは、ＢＩＭタンパク質の非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドの両方に対し適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、また、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対的量を決定するのと同一の方法で決定される。
ｉｉ．所与のペプチドの絶対的定量化は、個別の生体試料中のＢＩＭタンパク質由来の所与のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、生体試料由来のタンパク質溶解物中にスパイクされた内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより得ることができる。
１．内部標準は、アッセイされるＢＩＭタンパク質由来のフラグメントペプチドの標識した合成バージョンである。この標準は、既知量で試料中にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が、生体試料中の内部フラグメントペプチド標準および元のフラグメントペプチドの両方に対し、別々に決定され、その後、両ピーク面積が比較され得る。
２．これは、非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、また、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対的量を決定するのと同一の方法で決定され得る。
【００３５】
ＩＩＩ．フラグメントペプチド定量化の癌診断および治療への適用
ａ．ＢＩＭタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、癌の分野で十分に理解されている、ＢＩＭタンパク質発現と患者または対象腫瘍組織中の癌の病期／グレード／状態との以前決定された関連性が確認されることを実証する。
ｂ．ＢＩＭタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、異なる治療戦略から来る臨床的転帰との相関を実証し、この場合、この相関は、この分野ですでに実証されているか、または患者または対象とこれらの患者および対象由来の組織とのコホート全体の相関調査により将来実証することができる。一旦以前確立された相関関係または将来得られる相関関係のいずれかがこのアッセイにより確認されると、本アッセイ方法は、最適治療戦略を決定するために用いることができる。
【００３６】
ＢＩＭタンパク質由来のフラグメントペプチドの質量分析アッセイ
ａ．タンパク質溶解物中のＢＩＭタンパク質（複数を含む）の相対的および／または絶対的量を決定するために検出されるＢＩＭタンパク質（複数を含む）のフラグメントペプチド（複数を含む）量を決定するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ。
ｉ．相対的定量化は、下記により得ることができる。
１．１つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出された１つ以上、２つ以上、または３つ以上の所与のＢＩＭペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるホルマリン固定生体試料由来の少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の同一のＢＩＭフラグメントペプチド（複数を含む）の同一のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＢＩＭタンパク質（複数を含む）の存在の増加または減少を決定する。
２．１つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出された３つのＢＩＭペプチド（複数を含む）由来のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、異なる別の生物学的起源由来の他の試料中の他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから生成したＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＢＩＭタンパク質（複数を含む）の存在の増加または減少を決定し、この場合、２つの試料間のペプチドフラグメントに対するＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の比較は、それぞれの試料で分析されたタンパク質の量に正規化されている。
３．ＢＩＭタンパク質（複数を含む）のレベルの変化を、種々の細胞条件下でそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、ＢＩＭペプチド（複数を含む）に対するＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料由来の同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチド由来のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＢＩＭタンパク質（複数を含む）の存在の増加または減少を決定する。
４．これらのアッセイは、ＢＩＭタンパク質（複数を含む）の非修飾フラグメントペプチドの両方に対し適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、また、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対的量を決定するのと同一の方法で決定される。
ｉｉ．所与のペプチドまたはそれを由来するタンパク質の絶対的定量化は、個別の生体試料中のＢＩＭタンパク質由来の所与のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、生体試料由来のタンパク質溶解物中にスパイクされた内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより得ることができる。
【００３７】
内部標準は、アッセイされるＢＩＭタンパク質（またはタンパク質分解時に放出されるフラグメントペプチドの標識した合成バージョンを含むタンパク質もしくはポリペプチド）由来のフラグメントペプチドの標識した合成バージョンである。この標準は、既知量で試料中にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が、生体試料中の内部フラグメントペプチド標準および元のフラグメントペプチドの両方に対し、別々に決定され、その後、両ピーク面積が比較され得る。
【００３８】
これは、非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、また、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対的量を決定するのと同一の方法で決定され得る。ホルマリン固定した患者由来の組織の分析に基づく組織中のＢＩＭタンパク質レベルの評価は、それぞれの特定の患者または対象に関する診断、予後、および治療関連情報を提供することができる。
【００３９】
生体試料中のＢＩＭタンパク質のレベルを測定するための方法が、本明細書に記載され、この方法には、質量分析を用いて、該生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾もしくは非修飾ＢＩＭフラグメントペプチドの量を検出および／または定量化することと、該試料中の修飾もしくは非修飾ＢＩＭタンパク質のレベルを計算することと、を含み、該レベルは、相対レベルまたは絶対的レベルである。関連実施形態では、１つ以上のＢＩＭフラグメントペプチドの定量化が、既知のレベルの添加された内部標準ペプチドとの比較により、生体試料中のＢＩＭフラグメントペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、該生体試料中のＢＩＭフラグメントペプチドがそれぞれ、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態では、内部標準は、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはこれらの組み合わせから選択される１つ以上の安定重同位体を含む、同位体標識内部標準ペプチドである。
【００４０】
本明細書に記載される生体試料中のＢＩＭタンパク質（またはそのサロゲートとしてのフラグメントペプチド）のレベルを測定するための方法は、患者または対象における癌の診療上の指標として使用され得る。一実施形態では、ＢＩＭタンパク質のレベルの測定からの結果は、組織中に見出されるＢＩＭ受容体のレベルを、正常および／または癌性または前癌性組織中に見出されるそのタンパク質のレベルと相関させる（例えば、比較する）ことによって診断上の癌の病期／グレード／状態を決定するために採用され得る。別の実施形態では、ＢＩＭタンパク質（複数を含む）のレベルは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＰＩ３Ｋ阻害剤の、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異、ＨＥＲ２で増幅された、およびＥＧＦＲ突然変異癌、ＳＲＭ／ＭＲＭにおいてアポトーシスを誘発する能力を示す。Ｆａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１１；１：３５２−３６５（２０１１）。また、Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，“ＢＩＭ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＥＧＦＲ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＥＧＦＲ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ”  ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（１０）：１６６９−１６８０（２００７）（ｗｗｗ．ｐｌｏｓｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｏｒｇからオンラインで入手可能）およびＴａｎｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０：４０９７−４１０６（２０１１）も参照のこと。一実施形態では、ＢＩＭレベルのアッセイは、任意の１つ、任意の２つの組み合わせ、または３つ以上の治療薬のうちの任意の組み合わせによる治療を含む、様々な治療薬に対する患者または対象の癌の感受性を予測するために用いられる。このような一実施形態では、治療薬は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＰＩ３Ｋ阻害剤から選択され得る。別のこのような実施形態では、治療薬は、ラパチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ペリチニブ、カネルチニブ、フェレチニブ、クリゾチニブ、アファチニブ、カボザンチニブ、アキシチニブ、バタラニブ、ＢＭＳ−５３６９２４、ＯＳＩ−９０６サラカチニブ、およびポナチニブのうちの任意の１つ、またはそれらの治療薬のうちの１つ、２つ、３つ、もしくは４つの任意の組み合わせから選択され得る。
【００４１】
核酸およびタンパク質の両方が、同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ生体分子の調製物から分析され得るため、同一の試料から病気の診断および薬物治療法の決定に関するさらなる情報を生むことが可能である。ある細胞によるＢＩＭ発現の評価は、ＳＲＭ／ＭＲＭによって評価されるとき、細胞の状態に関する情報を提供することができ、細胞の、制御されない増殖、潜在的な薬物耐性、および癌（例えば、肺癌および／もしくは乳癌）の発生の可能性が得られ得る。同時に、ＢＩＭ遺伝子および／またはそれがコードする核酸およびタンパク質（例えば、ｍＲＮＡ分子およびそれらの発現レベルまたはスプライス変異体）の状態に関する情報は、同一の生体分子の調製物中に存在する核酸から得られ得る。例えば、ＢＩＭタンパク質（複数を含む）（例えば、イソ型）、および／または１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上のさらなるタンパク質に関する情報は、それらのタンパク質をコードする核酸を試験することによって評価され得る。それらの核酸は、例えば、単一塩基対多型、遷移、および／もしくは塩基転換が含まれるが、これらに限定されない、シークエンシング法、制限断片多型解析の実行、欠失、挿入の特定、および／または突然変異体の存在の決定等の方法のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上によって試験され得る。核酸解析に基づくＢＩＭタンパク質配列の変化の特定は、上に論じられた１つ以上の治療薬に対する感受性、および／または治療予後を評価するために、単独でまたはＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからの情報（例えば、癌におけるＢＩＭタンパク質レベルおよびイソ型分布）と組み合わせて使用され得る。
【００４２】
方法および組成物の上の説明および例示的な実施形態は、本発明の範囲を説明する。しかしながら、当業者には明らかであろう変形例のため、本開示は、上に記載される特定の実施形態に限定することを意図するものではない。
【配列表】
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