(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の４種の乳酸菌：ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５５、ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５６、ラクトバチルス  ファーメンツム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５７、及びラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＤＳＭ  ２３７５８の混合物を用いた大豆醗酵によるイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む醗酵大豆ベース混合物の調製方法。
【請求項２】
以下の工程：
ａ）該４種のラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５５、ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５６、ラクトバチルス  ファーメンツム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５７、及びラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＤＳＭ  ２３７５８乳酸菌を培養増殖させること、
ｂ）該乳酸菌の水性懸濁液で大豆ベース基質をインキュベートすること、
ｃ）３０〜３７℃、４８〜９６時間インキュベートすること
を含む又はからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｃ）を３０℃で９６時間行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
基質が全基質体積の１〜４％の量の乳酸菌の水性懸濁液で接種され、該水性懸濁液がどの株についても約ｌｏｇ  ９．０  ｃｆｕ／ｍｌの細胞密度を有するものである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
大豆ベース基質が、大豆粉、豆乳からなる群から選ばれる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記大豆粉が有機農業大豆粉である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
乳酸菌細胞を除去するためにブロス培養の遠心分離の工程ｄ）をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ブロス培養の遠心分離が１０，０００ｘｇで１５分間４℃で行われる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｄ）で得られた上清、又は工程（ｃ）で得られた培養物の乾燥又は凍結乾燥による脱水の工程（ｅ）をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシン、並びに以下の４種の乳酸菌：ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５５、ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５６、ラクトバチルス  ファーメンツム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５７、及びラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＤＳＭ  ２３７５８の混合物を含む、醗酵豆乳ベース混合物。
【請求項１１】
請求項１０に定義された醗酵豆乳ベース混合物を、一つ以上の薬学的に若しくは化粧品的に許容可能な賦形剤及び／又はアジュバントとともに含む又はからなる医薬又は化粧品組成物。
【請求項１２】
そのままで、又は一つ以上の賦形剤及び／又はアジュバントと組み合わせて、食物インテグレーターとして使用するための、請求項１０に記載の醗酵豆乳ベース混合物。
【請求項１３】
皮膚又は腸壁の障害又は疾患の治療に使用するための請求項１０に記載の醗酵豆乳ベース混合物又は請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
化粧品使用のための請求項１０に記載の醗酵豆乳ベース混合物又は請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
脱毛の治療のための請求項１４に記載の使用のための醗酵豆乳ベース混合物又は組成物。
【請求項１６】
脱毛症又は休止期脱毛の治療に使用するための請求項１０に記載の醗酵豆乳ベース混合物又は請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
以下の４種の乳酸菌ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５５、ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５６、ラクトバチルス  ファーメンツム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５７、及びラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＤＳＭ  ２３７５８の混合物。
【請求項１８】
ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５５乳酸菌。
【請求項１９】
ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５６乳酸菌。
【請求項２０】
ラクトバチルス  ファーメンツム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＤＳＭ  ２３７５７乳酸菌。
【請求項２１】
ラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＤＳＭ  ２３７５８乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシルを含む醗酵大豆ベース混合物、食品、医薬品及び化粧品分野におけるその調製方法及び使用に関する。特に、本発明は、エクオール及びルナシンに加えてダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテインのようなイソフラボン−アグリコンを含む混合物に関し、該混合物は食品マトリクスから単離された乳酸菌を用いて醗酵された大豆に基づいており、皮膚及び付属器の保護、及びヒト腸細胞の保護のための該混合物の使用は特に炎症状態の防止及びバリア機能の保護及び抜け毛治療に関連している。
【背景技術】
【０００２】
イソフラボンは様々な植物、特に大豆（ｓｏｙａ、ソーヤ）において天然に存在するジフェノール化合物である（Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．β−グルコシダーゼ産生ビフィズス菌による豆乳のイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｂｙ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．６７：３１０４−３１１３）。  イソフラボン由来の大豆及び大豆ベースの食品産物は４つのクラスの化合物に属する：アグリコン、マロニル−、アセチル−、及びβ−グルコシド共役体（Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．β−グルコシダーゼ産生ビフィズス菌による豆乳のイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｂｙ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．６７：３１０４−３１１３）．９０％超の大豆イソフラボン合計濃度はβ−グルコシド誘導体として存在する。顕著な疎水性特性及び高分子量のために、β−グルコシド誘導体はヒトには吸収されない。
【０００３】
そのため、生物利用可能性を有し、それ故に代謝可能にするために、該化合物はアグリコンへと加水分解しなければならない。ダイゼインダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテインのようなアグリコンへの加水分解は、腸内及びバクテリアのβ−グルコシダーゼの活性の結果として腸内通過の間に生じる。遊離の形態では、このようなアグリコンはエストロゲンに構造的に類似しており、ヒト体内でエストラジオール機能を真似ている（Ｓｅｔｃｈｅｌｌ及びＣａｓｓｉｄｉ，１９９９．食物イソフラボン：ヒト健康への生物学的効果と関連性（Ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｌｔｈ．）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３１：７５８  −  ７６７））。一般に、イソフラボン−アグリコンの消費はホルモン病態のリスクの低減（Ｋｒｕｚｅｒ  ２０００．大豆イソフラボンのホルモン効果：閉経前及び閉経後の女性における研究（Ｈｏｒｍｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｏｙ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ．）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３０：６６０−６６１）、及び骨粗鬆症の低出現率、心血管病態及び癌による閉経と致死性（Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．血清総コレステロール濃度の減少は日本人男女における大豆製品の高摂取に関連している（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｉｎｔａｋｅ  ｏｆ  ｓｏｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎａｓｅ  ｍｅｎ  ａｎｄ  ｗｏｍｅｎ．）Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２８：２０９−２１３）に関連している。
【０００４】
エクオールはイソフラボンクラスに属する非ステロイド性のエストロゲン化合物である。ヒトのエクオールの主要源は大豆誘導体であり、ダイゼイン及びアグリコンダイゼイン、その直接の前駆体のための最も豊富に存在する蓄積（ｍｏｓｔ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｒｅｓｅｒｖｅ）になっている（Ａｘｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４．大豆、ヒト及び動物における非ステロイド性エストロゲンエクオールの食物源（Ｓｏｙａ  ａ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｅｑｕｏｌ  ｉｎ  ｍａｎ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌｓ．）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０２：４９−５６）。他のイソフラボン−アグリコンとは異なり、エクオールは複素環内の二重結合の欠損の結果としてのコアキラル核を有する唯一のものである（Ｓｅｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．代謝物エクオールの臨床的重要性、大豆及びそのイソフラボンの有効性への糸口（Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｅｑｕｏｌ  ａ  ｃｌｕｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｓｏｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ．）Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．１２５：３５７７−３５８３）。一般にエクオールは結腸壁を介して容易に吸収され、代謝的に不活性である（Ｓｅｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．代謝物エクオールの臨床的重要性、大豆及びそのイソフラボンの有効性への糸口（Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｅｑｕｏｌ  ａ  ｃｌｕｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｓｏｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ．）Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．１２５：３５７７−３５８３）。そのダイゼイン前駆体に比較して、エクオールは興味深い一連の特性：高いエストロゲン活性（Ｍｕｔｈｙａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．エクオール、大豆イソフラボンからの天然エストロゲン代謝物：Ｒ−及びＳ−エクオールの好適な調製及び分解、並びにエストロゲン受容体α及びβを介するそれらの異なる結合及び生物学的活性（Ｅｑｕｏｌ，ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔａ  ｆｒｏｍ  ｓｏｙ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ：ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒ−  ａｎｄ  Ｓ−ｅｑｕｏｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ．）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：１５５９−１５６７）、抗酸化活性（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．化学的及び生物学的モデルシステムにおけるフィトエストロゲンの抗酸化効果（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ．）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６０：１４２−１４８）、及び抗アンドロゲン活性（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．エクオールは前立腺成長及びホルモンフ��ードバックを阻害する新規の抗アンドロゲンである（Ｅｑｕｏｌ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉ−ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ．）Ｂｉｏ．Ｒｅｐｒｏｄ．７０：１１８８−１１９５）を示す。
【０００５】
ヒトにおける大豆イソフラボン代謝は広く記載されている  （Ａｘｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４．大豆、ヒト及び動物における非ステロイド性エストロゲンエクオールの食物源（Ｓｏｙａ  ａ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｅｑｕｏｌ  ｉｎ  ｍａｎ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌｓ．）、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０２：４９−５６；Ｂａｎｎｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４．ｏ−デスメチルアンゴレンシンの同定、ダイゼイン及びマタイレシノールの代謝物、ヒト尿における動物リグナンエンテロラクトンの一つの可能性の高い植物前駆体（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏ−ｄｅｓｍｅｔｈｙｌａｎｇｏｌｅｎｓｉｎ，ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔａ  ｏｆ  ｄａｉｄｚｅｉｎ  ａｎｄ  ｏｆ  ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ，ｏｎｅ  ｌｉｋｅｌｙ  ｐｌａｎｔ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｉｍａｌ  ｌｉｇｎａｎ  ｅｎｔｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ．）Ｆｉｎｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１２０−１２５）。腸の通過の間にグルコシドイソフラボンをアグリコンに、アグリコンをエクオールに代謝する能力は、わずか西洋諸国人口の３０−５０％に過ぎない（Ｆｒａｎｋｅｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．２００５．１〜３歳離れて測定された個人のダイゼイン−代謝表現型の高い一致（Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ  ｏｆ  ｄａｉｄｚｅｉｎ−ｍｅｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  １  ｔｏ  ３  ｙｅａｒｓ  ａｐａｒｔ．）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．９４：８７３−８７６））。大豆由来のイソフラボンの生物利用性を増大させるために二つの主要な戦略を採ることができる：インシチュでそのような化合物を合成するのにふさわしい生存可能で生きているバクテリアの摂取による腸内細菌叢の消費又は調整前のアグリコン及びエクオール富化（Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．大豆胚芽を用いたイソフラボンアグリコン富化豆乳、大豆タンパク質単離物、及びビフィズス菌の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ａｇｌｙｃｏｎｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｕｓｉｎｇ  ｓｏｙ  ｇｅｒｍ，ｓｏｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅ  ａｎｄ  ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎ．３７：３０１−３１２））。様々な研究（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．乳酸菌での醗酵による豆乳におけるイソフラボングルコシドのアグリコンへの転換（Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｔｏ  ａｇｌｙｃｏｎｅｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｂｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．７２：３９−４４；Ｄｏｎｋｏｒ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ  ２００８．豆乳におけるラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、及びラクトバチルス・カゼイによるβ−グルコシダーゼの産生とイソフラボンフィトエストロゲンの加水分解（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｐ��ｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｂｙ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ．）Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．７３：１５−２０；Ｐｈａｍ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ  ２００７．脱脂粉乳で補充された豆乳におけるビフィドバクテリウム・アニマリスによるイソフラボングルコシドの生物変換（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ｐｏｗｄｅｒ．）Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．７２：３１６−３２４；Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．醗酵豆乳におけるイソフラボンアグリコンを製造するためにラクトバチルス及びビフィドバクテリウムを使用すること（Ｕｓｉｎｇ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｄ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｔｈｅ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ａｌｇｙｃｏｎｅｓ  ｉｎ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｓｏｙｍｉｌｋ．）（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１７：１２０−１２４）は、豆乳の醗酵の間、グルコシドイソフラボンのアグリコン及び／又はエクオールへの変換のためのビフィズス菌及び乳酸菌の使用を考察してきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、これらの研究においていくつかの制限が明らかとなった。（ｉ）極めて数の限られたバクテリアバイオタイプ／種しか考察されてきていない。（ｉｉ）醗酵過程に使われるバクテリアはもっぱらヒトの糞便材料に由来している。（ｉｉｉ）極めて限られた数の発酵用基質しか考察されておらず、そのうちのいずれも有機農業大豆粉の使用に関連してはいなかった。（ｉｖ）調製物はイソフラボン／アグリコン又はエクオールにのみ基づいており、エクオール製造の場合は最大濃度は０．５２１ｍｇ／１００ｍｌである（Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．β−グルコシダーゼ産生ビフィズス菌による豆乳におけるイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｂｙ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．６７：３１０４−３１１３）；（ｖ）調製物の生物学的効率、特に皮膚の保護については試験研究がされていない；及び（ｖｉ）イソフラボンアグリコン、エクオール、及びルナシンを含む配合調製物については研究がなされていない。
【０００７】
ルナシンは大豆で初めて同定された生物活性ペプチド（４３個のアミノ酸残基、分子量約５４００Ｄａ）であり（Ｇａｌｖｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．脱アセチル化ヒストンに結合し、アセチル化を阻害する大豆ペプチド（ルナシン）の化学予防特性（Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｏｆ  ａ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （Ｌｕｎａｓｉｎ）ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｈｉｓｔｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ．）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７４７３−７４７８）、引き続いてオオムギ（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００２．オオムギルナシンはｒａｓ誘発コロニー形成を抑制し、哺乳類細胞におけるコアヒストンアセチル化を阻害する（Ｂａｒｌｅｙ  ｌｕｎａｓｉｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｒａｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｏｒｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５０：５９０３−５９０８）、小麦（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７．小麦由来の癌予防性ペプチドルナシンはコアヒストンアセチル化を阻害する（Ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｕｎａｓｉｎ  ｆｒｏｍ  ｗｈｅａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｏｒｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ．）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２５５：４２−４８）、アマランス（Ｓｉｌｖａ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．アマランス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｈｙｐｏｃｈｏｎｄｒｉａｃｕｓ）種子における生物活性ペプチド（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ａｍａｒａｎｔｈ  （Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｈｙｐｏｃｈｏｎｄｒｉａｃｕｓ）ｓｅｅｄ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５６：１２３３−１２４０）においても見出された生物活性ペプチドである。
【０００８】
大豆におけるルナシンの濃度は栽培品種、培養土壌内微気象雰囲気、及び穀物が収穫後に受けてきた技術的過程によって変わり得る。ルナシンはＬｏｄａ栽培品種において非常に高濃度（約１１ｍｇ／ｇ）で見出され、他の大豆変種では（例えばＩｍａｒｉ）ではルナシン含量は５〜６ｍｇ／ｇを超えない（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８．大豆タンパク質由来ペプチドの分析、栽培品種、環境条件、及び大豆及び大豆製品におけるルナシン濃度の処理の効果（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｕｌｔｉｖａｒ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｌｕｎａｓｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｙｂｅａｎ  ａｎｄ  ｓｏｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｊ．ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎ．９１：９３６−９４４）。ルナシンはポリペプチド鎖のＣ末端に９個のアスパルギン酸残基を含む。この組成はアセチル化が低減したクロマチン領域への親和性の上昇に有利に働き、この領域にはペプチドが結合し、そのためにアセチル化−脱アセチル化の動力学を阻害し、それ故、腫瘍発生において腫瘍抑制剤として作用する。ルナシンがｒａｓ遺伝子により誘発された細胞増殖の阻害により、及びＨ３ヒストンのアセチル化阻害により、腫瘍発生現象に対する予防効果を発揮し得ることも報告されている（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．大豆から単離されたルナシンのキャラクタリゼーション（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎａｓｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｏｙｂｅａｎ．）Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５１：７９０１−７９０６）。文献データから、今までのところ、乳酸菌を使った醗酵過程による大豆誘導体のためのルナシン富化を考察した研究はないことが明らかである。
【０００９】
上記の報告された考察に基づき、いくつかの要素は著名な革新的特質を示しているようである：（ｉ）大豆ベースの基質、できれば生物学的起源のものを用いること。（ｉｉ）糞便起源ではなく食品マトリックスから単離された乳酸菌を使用すること。（ｉｉｉ）イソフラボン−アグリコン、エクオール及びルナシンのようなより高い数の機能分子を含む製剤の処方に有利に働くように適合したバイオテクノロジーの過程を最適化すること。（ｉｖ）インビトロ及びエクスビボアッセイを用いて、皮膚及びヒト腸細胞保護に関し、特に炎症状態の阻害とバリア機能維持に関し、結果的な調製物の効果を実証すること。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の著者らはここに、イソフラボン、アグリコン、エクオール、及びルナシンについて富化した醗酵大豆ベースの混合物を提供するのにふさわしい新しい方法を開発した。本発明による混合物は糞便起源ではない、専ら食品マトリックス由来の乳酸菌の特定の混合物を用いた大豆の醗酵によって得られる。本発明による混合物は、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシン、特にルナシンの高い含量により、皮膚及びヒト腸細胞保護のための特別な有効性を、特に炎症状態の防止及びバリア機能維持に関して示した。
【００１１】
本発明の著者らはここに以下の点を考察する：（ｉ）ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）についてβ−グルコシダーゼ活性に従い専ら食品マトリックス由来の１０３種の単離された乳酸菌を選択することにより、４種の乳酸菌、即ちＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＰＰＭＡ２４Ｗ（２０１０年７月８日にＤＳＭＺに寄託  ＤＳＭ番号２３７５６）及びＤＰＰＭＡＳＬ３３（２０１０年７月８日にＤＳＭＺに寄託  ＤＳＭ番号２３７５５）、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＰＰＭＡ１１４（２０１０年７月８日にＤＳＭＺに寄託  ＤＳＭ番号２３７５７）、及びＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＰＰＭＡＡＺ１（２０１０年７月８日にＤＳＭＺに寄託  ＤＳＭ番号２３７５８）を選択し、大豆粉ベースの基質の醗酵のための混合スターターとして用いることができた。（ｉｉ）１４種の異なる大豆ベースの基質を用いることにより、混合スターターを用いる醗酵のための有機農業大豆粉に基づいた最適の調製物として選択することができた。（ｉｉｉ）有機農業大豆粉基質の醗酵過程の最適化により、１．４５ｍｇ／１００ｍｌ（５７．０μＭ）のダイゼイン、３．９ｍｇ／１００ｍｌ（１４０．３μＭ）のゲニステイン、０．５８ｍｇ／１００ｍｌ（２０．４μＭ）のグリシテイン、０．９ｍｇ／１００ｍｌ（３７．３μＭ）のエクオール、及び８．４ｍｇ／１００ｍｌのルナシンを含む製剤の処方が可能になった。（ｉｖ）上記の機能的化合物に基づく製剤は皮膚上皮に対して保護効果を示し、炎症状態の阻害及び腸細胞のバリア機能に対して積極的な効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明はその好ましい態様により、特に添付の図面を参照して、説明的であって制限的でない方法で以下に記載されるであろう。
【図１】図１はｐＮＰＧ合成基質について様々な種に属する１０３種の乳酸菌バイオタイプのβ−グルコシダーゼ活性を示す。アッセイに使用するすべての乳酸菌は食品マトリックスのみから全く革新的な方法であらかじめ単離しておく。乳酸菌バイオタイプは種への対応を同定するためにコードにより示される。明細書中のプロトコルの記載を参照されたい（実施例１）。データは３つの３回の実験の平均値である。統計的な処理はボックスのプロットにより報告されている。
【図２】図２Ａは１４の異なる粉由来の豆乳の存在下で選択された混合スターターにより実施された乳酸菌プロセスを示す。図２Ｂは１４の異なる粉由来の豆乳の存在下で選択された混合スターターを含む乳酸菌バイオタイプの細胞密度を示す。データは３つの３回の実験の平均値である。統計的な処理はボックスのプロットにより報告されている。
【図３】図３は選択された混合スターターを用いた有機農業大豆粉（ＯＦＳ）由来の豆乳の醗酵中のルナシン（ｍｇ／１００ｍｌ）の合成を示す。データは３つの３回の実験の平均値である。
【図４】図４は選択された混合スターターとＰＢＳ緩衝液を用いた有機農業醗酵豆乳（ＯＦＳ）に０及び２４時間曝した後の再構成上皮（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標））の経上皮電気抵抗（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  （ＴＥＥＲ）（オームｘｃｍ２））を示す。データは３つの３回の実験の平均値である。
【００１３】
【図５】図５はＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞からの硝酸放出（μＭ）（ＮＯ）を示す。細胞は標準として使用された化合物（１０μＭ）（エクオール、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン）と、有機農業大豆粉から得られた豆乳であって、非醗酵の豆乳、又は混合選択スターターで醗酵され１０μＭのエクオール最終濃度に希釈され、滅菌ろ過された豆乳とで２４時間前処理しておいた。続いて細胞をγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）（１０００Ｕ／ｍｌ）とリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。ＤＭＳＯ（１％、ｖ／ｖ）又はメタノール（０．５％、ｖ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培養基を陰性対照として用いた。データは３つの３回の実験の平均値である。星印は陰性対照と比較した有意の差（Ｐ＜０．０１）を示す。
【図６】図６は２４、４８及び７２時間のインキュベーション後のＣａｒｏ−２／ＴＣ７細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）（オームｘｃｍ２）を示す。インキュベーションは、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下
【化１】
0005951604.tif 000002
；ＩＦＮ−γと有機農業大豆粉から得られ醗酵していない豆乳の存在下
【化２】
0005951604.tif 000003
、又は選択された混合スターターで醗酵され１０μＭのエクオール最終濃度に希釈され滅菌ろ過された豆乳の存在下（−ｘ−）で実施された。ＤＭＥＭ培養基を陰性対照として用いた
【化３】
0005951604.tif 000004
。データは３つの３回の実験の平均値である。星印は陰性対照と比較した有意の差（Ｐ＜０．０１）を示す。
【００１４】
【図７】図７はＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞からのインターロイキン−８（ＩＬ−８）の放出（ｐｇ／ｍｌ）を示す。細胞はインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）（２ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激され、続いて標準として使用された化合物（１０μＭ）（エクオール、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン）と、有機農業大豆粉から得られた豆乳であって、非醗酵の豆乳、又は選択混合スターターで醗酵され１０μＭのエクオール最終濃度に希釈され、滅菌ろ過された豆乳とで処理した（２４時間）。ＤＭＳＯ（１％、ｖ／ｖ）又はメタノール（０．５％、ｖ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培養基を陰性対照として用いた。データは３つの３回の実験の平均値である。星印は陰性対照と比較した有意の差（Ｐ＜０．０１）を示す。
【図８】図８はルナシンを含むバイオマスとルナシンを含まないバイオマスの細胞増殖に対する効果を示す。
【図９】図９はルナシンを含むバイオマスとルナシンを含まないバイオマスのＢｃｌ−２とＢａｘのタンパク質発現に対する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明による乳酸菌はラクトバチルス種に属し、中部及び南イタリアにおいてパン製造に用いられる天然酵母及びプーリア地方のペコリーノタイプの熟成された「パスタフィラータ」チーズから単離されている。一般にこのような食品マトリックスから単離された乳酸菌は、ヒトや動物の胃腸管にコロニーを形成する微生物とそうかけ離れていない代謝的及び環境的適応特性を示す。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＰＰＭＡ２４Ｗ（２０１０年７月８日にＤＳＭＺに寄託  ＤＳＭ番号２３７５６）及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＰＰＭＡＳＬ３３（２０１０年７月８日にＤＳＭＺに寄託  ＤＳＭ番号２３７５５）、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＰＰＭＡ１１４（２０１０年７月８日にＤＳＭＺに寄託  ＤＳＭ番号２３７５７）及びＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＰＰＭＡＡＺ１（２０１０年７月８日にＤＳＭＺに寄託  ＤＳＭ番号２３７５８）が選択され使用された。
【００１６】
好ましくは生物学的起源の様々な大豆粉ベースの基質について当該４種の乳酸菌による３０〜３７℃で４８〜９６時間の醗酵が関与するバイオテクノロジー的プロトコルを標準化し最適化した。醗酵過程の最後に培養基から遠心分離により、そして上清を乾燥若しくは凍結乾燥による脱水過程に付すことにより細胞を除去することも又は除去しないこともできる。
【００１７】
以下に有機農業大豆ベース製剤の醗酵のためのバイオテクノロジー的プロトコルを記載する。
【化４】
0005951604.tif 000005
【００１８】
様々な豆乳製剤の醗酵の結果として、３．９〜５７．０μＭのダイゼイン、７．８〜１４０．３μＭのゲニステイン、６．７〜２０．４μＭのグリシテイン、７．６〜３７．３μＭｎエクオール、及び約８．４ｍｇ／１００ｍｌのルナシンの合成が得られた。上記の報告された濃度の上限は有機農業大豆粉由来の豆乳の醗酵に関するものである。可能な処方の一つに従えば、有機農業大豆由来の醗酵製品の適用により、（ｉ）上皮を保護し、そのバリア機能を増大させ、（ｉｉ）γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）とリポポリサッカライド（ＬＰＳ）による誘発の後のＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞の炎症状態を阻害し、（ｉｉｉ）経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）試験により示されるようなバリア機能を刺激し、及び（ｉｖ）インターロイキン−（ＩＬ−８）の合成を阻害するのに適していることが示された。
【００１９】
微生物学的クロマトグラフィー技術とインビトロ、並びに及びエクスビボの細胞培養物についてのアッセイを用いた補完的分析により示された様に、本発明により食品マトリックスから単離され、従来の研究では使用されなかった乳酸菌種からなる混合スターターによる有機農業大豆粉の醗酵により、（ｉ）従来の研究では見られなかったアグリコン、エクオール、及びルナシンの同時合成、及び（ｉｉ）炎症状態に対する保護効果を可能にし、上皮とヒト腸細胞のバリア機能を増大する。
【００２０】
それ故、以下の４種の乳酸菌：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕ  ＤＳＭ  ２３７５５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５７、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ２３７５８の混合物を用いた大豆醗酵による、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む、醗酵大豆ベース混合物の調製方法は、本発明の特異的な目的である。本発明の方法により得られた混合物は、イソフラボン−アグリコン、ルナシン、及びエクオールが富加された混合物であり、本発明とは異なる乳酸菌を用いた方法により得られた公知の混合物に比較して、これらの化合物をより多い割合で含んでいる。
【００２１】
本発明による方法は、以下の工程を含むか、又はからなる：ａ）該４種の乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５７、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ２３７５８を培養増殖させる工程；
ｂ）該乳酸菌の水性懸濁液で大豆ベース基質をインキュベートする工程；好ましくは、基質は全基質体積の１〜４％の量の乳酸菌の水性懸濁液でインキュベートされ、該水性懸濁液は各バイオタイプについて約ｌｏｇ  ９．０  ｃｆｕ／ｍｌの細胞密度を有している；
ｃ）３０〜３７℃、好ましくは３０℃で、４８〜９６時間、好ましくは９６時間インキュベートする工程。
【００２２】
使用に適した大豆ベースの基質は、例えば、大豆粉、好ましくは有機農業大豆粉、豆乳、及び本願に従って報告されている他の商業的処方である。
【００２３】
本発明による方法はさらに、ｄ）乳酸菌から細胞を分離するためにブロス培養物を遠心分離する工程を含む。特に、ブロス培養液の遠心分離は１０，０００  ｘ  ｇで１５分間４℃で行うことができる。
【００２４】
本発明による方法はさらに、ｅ）工程ｄ）で得られた上清を乾燥又は凍結乾燥により脱水する工程を含むことができる。一態様に従えば、処方は工程ｄ）を省いた生存可能で生きている乳酸菌を含むことができる。組成物の調製は、脱水過程の最後に、状況に応じて経口又は局所使用に適した剤形の製剤を得るために、適切な賦形剤を添加した処方を包含することができる。
【００２５】
乳酸菌の除去の工程ｄ）なしで上記のように定義された方法に従って得られ得る醗酵大豆に基づく、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む混合物もまた本発明の目的である。該混合物はそれ故に上記の本発明の乳酸菌を含んでいる。報告されているように、本発明による混合物は、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを富化した混合物であり、即ち、本発明とは異なる乳酸菌を用いた方法により得られた公知の混合物よりも高い割合でこれらの化合物を含んでいる。
【００２６】
本発明はさらに、上で定義した混合物を、１種以上の薬学的に又は化粧品学的に許容可能な賦形剤及び／又はアジュバントとともに含む、又はからなる医薬又は化粧品組成物に関する。
【００２７】
更なる態様によれば、本発明による混合物は食品インテグレーターとして使用することができる。例えば、混合物は伝統的な食品、例えばパン又はパスタ製品のためにも使用することができる。
【００２８】
さらに、本発明による混合物又は組成物は皮膚又は腸の障害又は疾患の治療に用いることができる。特に、該混合物又は組成物は皮膚バリア機能の変化に対して、例えば感受性皮膚、乾燥皮膚、乾癬、アトピー皮膚炎、脂漏性皮膚炎、ふけ、刺激性皮膚炎、湿疹皮膚炎、接触皮膚炎、潰瘍、にきび、皮膚老化の予防と治療のために用いることができる。さらに、本発明による混合物及び組成物は、腸のバリア機能が変化した場合、例えばセリアック病、食物不寛容、クローン病の治療又は予防に用いることができる。
【００２９】
本発明による混合物又は組成物は化粧品分野で、例えば脱毛の治療に、又は脱毛症又は休止期脱毛の治療のために医療分野で用いることができる。
【００３０】
特に、本発明による混合物又は組成物は局所的に、例えばクリーム、ローション、ペースト、軟膏、ゲル、溶液、エマルジョン、懸濁液、又は全身的に、例えば経口的に、例えばバイアル、チュアブル錠、ピル、サシェット等により投与することができる。
【００３１】
もちろん、乳酸菌の除去工程ｄ）を含む本発明の方法により得られる混合物、又は該混合物を含む医薬若しくは化粧品組成物はまた、上記の報告された適応症に有利に用いることができるが、それは該物が、本発明とは異なる乳酸菌を用いた方法により得られる公知の混合物よりも高い割合でイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含んでいるためである。
【００３２】
さらに、以下の４種の乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５７、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ２３７５８の混合物も本発明の目的である。最後に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５５又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５６又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５７又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ２３７５８も本発明の目的である。
【実施例】
【００３３】
実施例１：食物マトリックスから単離された乳酸菌の１０３種のバイオタイプのβ−グルコシダーゼ活性
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ（１０Ｎ、２Ｂ、５Ａ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（５Ｚ、ＤＰＰＭＡ８６９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（ＬＣ１０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ（２０４７、２７５６、２７６３、２７６６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ（２７４２、２７４５、２７４９、２７５０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ（１３Ｈ５、１４Ｈ１０、１Ｈｄ、２０４２、２０８１、２７６８、２７７０、２７７１、２７７５、ＳＡＬ２３、ＳＡＬ３５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（１１８４２、Ｂ１５Ｚ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ＤＰＰＭＡ１１４、Ｄ１３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ（Ｂ３０Ｗ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（１５００９、Ｂ２６Ｗ、ＰＲ４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ（５１Ｂ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ（１５α、１５β、１６Ｒ、８Ｄ、ＤＰＰＭＡ２３８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（１２Ｈ８、１Ｈｂ、Ｂ１４Ｆ５、Ｂ１８Ｓ、Ｂ２５Ｆ３、ＰＦ６、Ｂ６１Ｆ５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｃａｒｂｕｃｋｎｅｒｉ（Ｂ１０Ｆ５、  Ｂ４８Ｆ３、Ｂ４８Ｆ５、Ｂ９Ｆ５ｔ、ＢＦ１、ＢＦ２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ（４ＤＥ、ＤＰＰＭＡ６６７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ（８ＣＦ、１２Ｈ５、１２Ｈ６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（１４Ｈ４、１７Ｎ、１９Ａ、１Ａ７、２Ａ、３０、３ＤＭ、４Ｈ１、４Ｈ１０、ＤＢ２００、ＤＰＰＭＡＳＬ３３、ＤＰＰＭＡ２４Ｗ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（１１、１９、ＤＰＰＭＡＡＺ１、ＤＰＰＭＡＡＺ２１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  （９Ｉ、ＳＡＬ１、ＳＡＬ１８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ  （１０Ａ、１５Ｒ、３Ｄ、５Ｃ１、５α、ＣＦ５１、ＣＩ３５、ＣＲ２０、Ｅ１８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ（１６α、Ａ１７、ＢＢ１２、ＤＥ９、Ｅ１９、Ｈ１０）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ（１０γ）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ（Ｃ１６Ｆ５、Ｃ２５Ｆ３、Ｃ３０Ｆ５ｔ、Ｃ６Ｆ５、Ｃ７Ｆ３、Ｃ９Ｆ５ｔ、Ｃ２９Ｆ５）、及びＷｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｉｂａｒｉａ（１０ＸＡ１６、３ＸＡ４、５Ｓ、５ＸＦ１２）種に属する乳酸菌の１０３種のバイオタイプを本研究に用いた。すべてのバイオタイプはｔｈｅ  Ｃｏｌｌｅｚｉｏｎｅ  ｄｉ  Ｃｏｌｔｕｒｅ  ｄｅｌ  Ｄｉｐａｒｔｉｍｅｎｔｏ  ｄｉ  Ｐｒｏｔｅｚｉｏｎｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｐｉａｎｔｅ  ｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ  Ａｐｐｌｉｃａｔａ  ｄｅｌｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ  ｄｅｇｌｉ  Ｓｔｕｄｉ  ｄｉ  Ｂａｒｉに属し、あらかじめ食物マトリックス（パン製造及びチーズのための天然��母）から単離された。乳酸菌のバイオタイプは３０又は３７℃で２４時間ＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）で３０℃で２４時間増殖させた。
【００３４】
細胞を２４時間培養し、遠心分離（４℃で１５分間１０，０００  ｘ  ｇ）で収集し、リン酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７で２回洗浄し、水中にｌｏｇ９．０  ｃｆｕ／ｍｌの細胞密度で再懸濁させたものを、β−グルコシダーゼ活性アッセイに用いた。β−グルコシダーゼ活性はｐ−ニトロフェノール−β−グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）基質（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から遊離されたｐ−ニトロフェノールとして定量された。リン酸緩衝液０．５Ｍ、ｐＨ７．５中の９００μｌのｐＮＰＧ（最終濃度）と１００μｌの細胞懸濁液をアッセイに用いた。混合物を４０℃でインキュベートし、反応を９５℃で５分間の熱処理によりブロックした。吸光度を４１０ｎｍで測定した。β−グルコシダーゼ活性の１単位（Ｕ）を、ｐ−ニトロフェノールの１ｎｍｏｌ／分がアッセイ条件下で遊離されるのに必要な酵素の量として定義した（Ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＣＢ１由来の細胞内ファミリー３β−グルコシダーゼの精製とキャラクタリゼーション（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＣＢ１．）Ｉｔａｌ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．１７：１３１−１４２）。
【００３５】
実施例２：豆乳の調製と醗酵
有機農業大豆（ＯＦＳ）（ＥＣｏｒＮａｔｕｒａＳｉ，Ｖｅｒｏｎａ，Ｉｔａｌｙ）、大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）（Ｓｕｐｒｏ  Ｓｏｊａ  ８０  Ａｐｔｏｎｉａ，Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ  ｄ’  Ａｓｃｑ，Ｆｒａｎｃｅ）及び様々な市販大豆粉調製物（Ｃａｒｇｉｌｌ  Ｔｅｘｔｕｒｉｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｓｏｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を豆乳の製造に用いた。ＯＦＳは洗浄して蒸留水中に一晩静置した。湿潤して膨潤した大豆を手で皮を剥き、温水（約９０℃）で１：１０の比で希釈し、ＰＢＩ国際ホモジナイザー（ミラノ、イタリア）で均一化した。均一化は１０，０００ｘｇで２分間行い、次いで１分休止し、再び１４，０００ｘｇで２分間行った。懸濁液を遠心分離し（７，０００ｘｇ、１０分、４℃）、豆乳を０．２２μｍ孔径フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ）で滅菌濾過した。ｐＨは６．２であった。ＳＰＩを蒸留水（４０℃）、０．４：１０の比で蒸留し、約５５℃で３０分間攪拌下（１２０ｒｐｍ）で熱処理した。室温で冷却後、ｐＨをＮａＯＨ５Ｍ（Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００２）を用いて６．７に調整した。滅菌をオートクレーブ中で１２１℃で１５分間行った。市販の大豆粉調製物を、Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．乳酸菌での醗酵による豆乳中イソフラボングルコシドのアグリコンへの変換（Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｔｏ  ａｇｌｙｃｏｎｅｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｂｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．７２：３９−４４）に記載の方法により、蒸留水（４０℃）で１：１０の比で希釈した。ｐＨは約６．３であった。滅菌はオートクレーブ中１２１℃で１５分間行った。
【００３６】
様々な豆乳タイプをβ−グルコシダーゼ活性に基づいて選択した４種の乳酸菌の混合細胞懸濁液で接種した（１〜４％、ｖ／ｖ）。各４種の乳酸菌バイオタイプの初期細胞密度はｌｏｇ７．０ｃｆｕ／ｍｌであった。醗酵は３０℃で９６時間攪拌下（１２０ｒｐｍ）で行った。ヒト腸細胞アッセイについては、豆乳を凍結乾燥し、ＤＭＥＭ培養液に再懸濁し、滅菌濾過した。
【００３７】
実施例３：乳酸菌のモニタリング、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンの決定
様々な豆乳タイプの醗酵の間、混合スターターとして使用した乳酸菌（ＤＰＰＭＡＳＬ３３に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５５、ＤＰＰＭＡ２４Ｗに対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５６、ＤＰＰＭＡ１１４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５７、及びＤＰＰＭＡＡＺ１に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ２３７５８）のモニタリングは、ＲＡＰＤ−ＰＣＲ法を用いて行った。二つのプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ミラノ、イタリア）を、任意に選択された配列（Ｐ７  ５’  ＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧ  ３’（配列番号：１）及びＭ１３，５’  ＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴ  ３’  （配列番号：２））とともに、プラスミドと染色体バクテリアＤＮＡの様々な領域をランダムに増幅しながら（Ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．表現型、遺伝子型及び細胞壁タンパク質分析に基づく雌羊イタリアチーズ由来の非スターター乳酸菌（ＮＳＬＡＢ）のキャラクタリゼーション（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｔａｒｔｅｒ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  （ＮＳＬＡＢ）ｆｒｏｍ  ｅｗｅｓ’  Ｉｔａｌｉａｎ  ｃｈｅｅｓｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ，ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ．）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：２０１１−２０２０；Ｒｏｓｓｅｔｔｉ  ｅ  Ｇｉｒａｆｆａ，２００５．Ｍ１３により生成したＲＡＰＤ−ＰＣＲ指紋データベースによる乳製品乳酸菌の迅速な同定（Ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄａｉｒｙ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  Ｍ１３−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ，ＲＡＰＤ−ＰＣＲ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅｓ．）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔ．６３：１３５−１４４）、タイピングに用いた。
【００３８】
醗酵豆乳試料からのイソフラボン−アグリコン及びエクオールの抽出をＯｔｉｅｎｏ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ  （Ｏｔｉｅｎｏ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ，２００７．様々な濃度の外因性の、及びプレバイオティック由来の内因性のβ−グルコシダーゼを用いた豆乳におけるイソフラボンの変換の変化の比較（Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ．）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０３：６０１−６１２）に記載された方法に従って行った。化合物の決定のためのＨＰＬＣクロマトグラフィー分析をＭａｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍａｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．高速液体クロマトグラフィーによるヒト乳房組織及び生物学的流体における大豆由来植物エストロゲンの定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７８４：１３７−１４４）により記載された方法に従って行った。
【００３９】
醗酵前に又は醗酵の間に有機農業大豆粉由来の豆乳中のルナシンの決定は、Ｃ１８  Ｘｔｅｒｒａ  Ｗａｔｅｒｓカラムと２１４ｎｍＵＶ検出器を備えたＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、５％  ＡＣＮ  ＋  ０．０５％  ＴＦＡ  （溶離液Ａ）及びＡＣＮ  ＋  ０．０５％  ＴＦＡ  （溶離液Ｂ）からなる混合溶媒で溶出するＨＰＬＣクロマトグラフィーにより行った（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８．大豆タンパク質由来ペプチドの分析及び栽培品種、環境条件の効果、並びに大豆及び大豆製品中のルナシン濃度の処理（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｕｌｔｉｖａｒ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｌｕｎａｓｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｙｂｅａｎ  ａｎｄ  ｓｏｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｊ．ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎ．９１：９３６−９４４）。合成ルナシンを標準として用いた（ＥＺＢｉｏｌａｂ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ，ＵＳＡ）。
【００４０】
実施例４：再構成上皮及びＴＥＥＲ測定（経上皮電気抵抗）についての試験
ヒト再構成上皮ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標）（再構成ヒト上皮）は、多重層としてヒト上皮の正常ケラチノサイト（角化細胞）からなる。それは、化学的に規定された培地（ＭＣＤＭ１５３）中、ウシ胎児血清を添加せずに、不活性な多孔性ポリカーボネート支持体上の気液界面で１７日間、ヒトケラチノサイトの培養後、完全に分化した上皮である。この成長段階で、形態的な分析により、生存する多層化した上皮と、１０を超える数の緻密細胞層からなる角質層が示された。ヒト再構成上皮ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標）を先に記載された手順に従って用いた（Ｄｉ  Ｃａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．ラクトバチルス  プランタルム  ＤＳＭＺ１９４６３によるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の合成：機能的ブドウの飲料及び皮膚科学的応用（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  γ−ａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ  （ＧＡＢＡ）ｂｙ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭＺ１９４６３：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒａｐｅ  ｍｕｓｔ  ｂｅｖｅｒａｇｅ  ａｎｄ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．）Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２５３−００９−２３７０４）。
【００４１】
Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ電圧電流計（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いてＴＥＥＲ測定を実行した。測定はオームｘｃｍ２で表現した。
【００４２】
実施例５：Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞での試験
ヒト起源Ｃａｃｏ−２細胞（クローンＴＣ７）を、ウシ胎児血清（１０％）を添加し、必須でないアミノ酸（１％）、ゲンタマイシン／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍＭ）及び４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル−エタンスルホン酸（１％）を添加したダルベッコ（ＤＭＥＭ）培地で培養した（Ｄｉ  Ｃａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．サワードウのラクトバチルス  プランタルムＤＣ４００における菌体密度感知機構：他の乳酸菌との共培養下でのプランタリシンＡ（ＰｌｎＡ）の誘導、並びにＰｌｎＡのバクテリア及びＣａｃｏ−２細胞への効果（Ｑｕｏｒｕｍ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＣ４００：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔａｒｉｃｉｎ  Ａ  （ＰｌｎＡ）ｕｎｄｅｒ  ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＰｌｎＡ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｃａｃｏ−２  ｃｅｌｌｓ．）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。細胞生存率はニュートラルレッド色素の取り込みアッセイにより決定した（Ｂａｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７．毒性学における評価代替方法へのアプローチ（Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．）Ｉｎ：Ｇｏｌｄｂｅｒ  Ａ．Ｍ．（Ｅｄ）．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．４５−５８）。様々な調製物で２４〜７２時間の処理の後、細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、３７℃で４時間ニュートラルレッド溶液（３３ｍｇ／ｌ）とともにインキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、溶菌溶液（１％酢酸を含む水中５０％エタノール）で処理した。プレートの読み取りをＮｏｖａｐａｔｈ  ｒｅａｄｅｒ  （Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）（Ｄｉ  Ｃａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いて行った。
【００４３】
Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞からの酸化窒素放出（ＮＯ）を酸化生成物、即ち亜硝酸及び硝酸塩を測定することにより決定した。様々な調製物とのインキュベーションの後、細胞培養物の上清を同体積のＧｒｉｅｓｓ試薬（０．５Ｍ  ＨＣｌ中１％、ｐ／ｖ、スルファニル酸、及び０．１％、ｐ／ｖ、Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩）と混合した。室温で３０分のインキュベーションの後、５４０ｎｍでの吸光度を測定し、亜硝酸塩濃度を亜硝酸ナトリウムで作成した標準曲線を参照して決定した。
【００４４】
ＴＥＥＲ測定のためＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞を、２４セルとポリエチレンフィルター（孔径０．４μｍ）を有するマイクロプレート容器内に接種した（７．５  ｘ  １０４細胞／ｍｌ）。処理の前に細胞を３７℃で２１日間インキュベートした。様々な調製物での処理を１８、２４及び４８時間行った。次いで細胞層の積層をＴＥＥＲ測定により決定した。
【００４５】
放出されたインターロイキン−８（ＩＬ−８）の測定のため、Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞を予めインターロイキン−１βでインキュベートし（２４時間）、次いで様々な調製物でさらに２４時間刺激した。前炎症性ＩＬ−８の合成をＥＬＩＳＡアッセイにより決定した（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）。定量はキットの指示に従って標準曲線を用いて行った。
【００４６】
結果
（１）β−グルコシダーゼ活性に基づく乳酸菌の選択
予備的に、食物マトリクスから単離された乳酸菌の１０３種のバイオタイプのβ−グルコシダーゼ活性をｐＮＰＧ合成基質で試験した。活性は０から２０２．３Ｕまで変化した（図１）。Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉｉ、Ｌ．ｐａｒａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌ．ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌ．ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ  ｅ  Ｗ．ｃｉｂａｒｉａ種にほぼ属する４８種のバイオタイプは、β−グルコシダーゼ活性を示さなかった。活性平均値は３Ｕであり、２５°と７５°データパーセンタイルに対応する値は０及び４５．５Ｕであった。乳酸菌の様々な種に対応する２５種のバイオタイプは５５Ｕより高いβ−グルコシダーゼ活性を示した。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＰＰＭＡ２４Ｗ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＰＰＭＡ１１４、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＰＰＭＡＡＺ１、及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＰＰＭＡＳＬ３３はより高い活性を示した（それぞれ、２０２．３５±７．０８、１６３．１５±６．５２、１４６．６０±５．８４、及び１４４．３４±７．１９Ｕ）。これらのバイオタイプのβ−グルコシダーゼ活性の値はボックスプロットのエラーバーの外に出ていた。これらの結果に基づいて４種の乳酸菌を選択し、様々な豆乳タイプの醗酵に用いるための混合スターターの配合のために用いた。
【００４７】
（２）豆乳の醗酵と機能性化合物の合成
豆乳の調製に用いる様々な大豆粉タイプの化学組成、タンパク質分散性指数及び粒径を表１に報告する。表１は、ＤＰＰＭＡＳＬ３３に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５５、ＤＰＰＭＡ２４Ｗに対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５６、ＤＰＰＭＡ１１４に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＳＭ  ２３７５７、及びＤＰＰＭＡＡＺ１に対応するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＳＭ  ２３７５８を含む選択された混合スターターによる機能性化合物製造に用いる１４種の大豆粉の化学組成、タンパク質分散性及び粒径を示す。
【００４８】
【表１】
0005951604.tif 000006
【００４９】
１４種の豆乳タイプをＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＰＰＭＡ２４Ｗ、及びＤＰＰＭＡＳＬ３３、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＰＰＭＡ１１４、及びＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＰＰＭＡＡＺ１を含む選択された混合スターターを用いて醗酵させた。すべての基質を乳酸化のプロセスに付した（図２Ａ）。９６時間の醗酵後、ΔｐＨ値は、Ｐｒｏｖａｓｏｙ  ６８２８８及び低脂肪大豆粉から得られた豆乳タイプについてそれぞれ、０．５９±０．０６から１．１９±０．０９に変化した。ΔｐＨ平均値は０．０３であり、２５°と７５°データパーセンタイル値に対応する範囲は０．７９と１．０１であった。醗酵の後、すべての豆乳タイプについてのｐＨ値は５．１〜５．３の範囲であった。
【００５０】
乳酸菌はすべての豆乳タイプの醗酵の間増殖した（図２Ｂ）。Δｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍｌ値は高脂肪から低脂肪大豆粉までの豆乳タイプについてそれぞれ、０．９９±０．２９から１．６１±０．３０まで変化した。細胞密度増大の平均値は１．３１Δlog cfu/mlで、ｌｏｇ８．３１cfu/mlの細胞密度絶対値に対応していた。２５°と７５°パーセンタイルデータ値に対応する範囲は１．２１と１．４３であった。乳酸菌の増殖は２４〜３６時間のインキュベーションにより終了した。ＲＡＰＤ−ＰＣＲタイピングにより、混合スターターに用いた乳酸菌のすべての４種類のバイオタイプは同様の細胞密度にまで、様々な豆乳タイプ上で増殖した。
【００５１】
様々な豆乳タイプでの共役イソフラボンの初期濃度は、ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）、ゲニスチン（ｇｅｎｉｓｔｉｎ）、及びグリシチン（ｇｌｙｃｉｔｉｎ）についてそれぞれ、１４２．３±１２．５から１７１．５±１０．８ｍＭまで、１０２．２±８．６から１２３．０±１１．３ｍＭまで、１０．５±１．１から１８．０±０．９ｍＭまで変化した。これとは対照的に、低濃度（０から７．８±０．５μＭまで）のアグリコンが様々な豆乳タイプで観察された（表２）。表２は、選択した混合スターターを用いて１４種の様々な粉タイプから得られた豆乳の醗酵の間のイソフラボン−アグリコン（ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシチン）とエクオールの濃度（μＭ）を示す。データは３つの三重の実験の平均値である。
【００５２】
表２  ９６時間の醗酵の間、様々な豆乳タイプについて合成したイソフラボン−アグリコン及びエクオールの濃度（μＭ）
【表２】
0005951604.tif 000007
【００５３】
高脂肪大豆粉から得られた豆乳は例外として、アグリコンの濃度はすべての豆乳タイプのインキュベーションの間増加した。９６時間のインキュベーションの後、ＯＦＳ豆乳（５７．０±４，０μＭ、１．４５ｍｇ／１００ｍｌに対応）において、次いでＰｒｏｌｉａ６８２３８（５０．７±２．１μＭ）及びＰｒｏｌｉａ６８２３７（４６．４±１．７μＭ）により最も高いダイゼインの濃度が観察された。また、ゲニステインの最終的な最高濃度は上記の３つの豆乳タイプ（ＯＦＳ、Ｐｒｏｌｉａ６８２３８及び６８２３７についてそれぞれ、１４０．３±９．４  −  ３．９ｍｇ／１００ｍｌ、１０２．９±６．４、及び９４．０±５．３μＭ）であった。他のアグリコンに比べて、グリシテイン濃度はすべての豆乳タイプにおいて低かった。Ｐｒｏｌｉａ６８２３７及び６８２３８、及びＯＦＳ豆乳タイプにおけるグリシテインの最高濃度はそれぞれ、２３．９±２．４、２２．５±１．３、及び２０．４±１．０μＭ  −  ０．５８ｍｇ／１００ｍｌであった。有機農業大豆粉（ＯＦＳ）から製造された豆乳の場合は、共役イソフラボンの対応アグリコンへの変換率は、ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）からダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ゲニスチン（ｇｅｎｉｓｔｉｎ）からゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、及びグリシチン（ｇｌｙｃｉｔｉｎ）からグリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）までについて、０．７２、０．８５、及び０．９８であった。アグリコンの濃度はインキュベーションの間増大したが、２４時間後、すべての３つの共役イソフラボンの加水分解速度は１．０〜０．９５の範囲であった。
【００５４】
インキュベーションの前、エクオールの存在は豆乳のどのタイプにも検出されなかった（表２）。様々な豆乳タイプが醗酵過程の間エクオールを合成することができなかった。インキュベーションの９６時間後、エクオールの最も高い濃度はＰｒｏｌｉａ  ６８２３８及び６８２３７の豆乳タイプで（それぞれ２０．０  ±  １．１及び１８．５  ±  ０．９  μＭ）、とりわけＯＦＳ豆乳で決定された（３７．３  ±  １．５  μＭ、０．９  ｍｇ／１００  ｍｌに対応）。ダイゼインの同時合成により、そのエクオールに対する変換速度を決定することはできなかった。イソフラボン−アグリコンで豆乳を富化するために、ヒト糞便材料から単離された、プロバイオティックの可能性のあるバクテリアの使用を様々な研究が考察してきた（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．乳酸菌での醗酵による豆乳中のイソフラボングルコシドのアグリコンへの変換（Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｔｏ  ａｇｌｙｃｏｎｅｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｂｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．７２：３９−４４；Ｄｏｎｋｏｒ及びＳｈａｈ  ２００８．豆乳中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉによるβ−グルコシダーゼの産生及びイソフラボンフィトエストロゲンの加水分解（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｂｙ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ．）Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．７３：１５−２０；Ｐｈａｍ及びＳｈａｈ  ２００７．脱脂粉乳で補充された豆乳におけるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  によるイソフラボングルコシドの生物変換（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ｐｏｗｄｅｒ．）Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．７２：３１６−３２４；Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．醗酵豆乳におけるイソフラボンアグリコンを製造するためのラクトバチルス及びビフィドバクテリウムの使用（Ｕｓｉｎｇ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｄ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｔｈｅ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ａｌｇｙｃｏｎｅｓ  ｉｎ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｓｏｙｍｉｌｋ．）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１７：１２０−１２４）。
【００５５】
使用した微生物はもっぱらビフィドバクテリア又は様々な種に属する様々な乳酸菌であった。本発明は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＰＰＭＡ２４Ｗ及びＤＰＰＭＡＳＬ３３、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＰＰＭＡ１１４、及びＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＰＰＭＡＡＺ１に対応する４種の新しいバイオタイプを選択するもので、これらは従来イソフラボン−アグリコン及びエクオールの合成には使用されたことがない。豆乳の醗酵の間におけるエクオールの合成を考察した研究も非常に数が限られている。エクオールはビフィドバクテリアで醗酵された豆乳で合成された（Ｔｓａｎｇａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．β−グルコシダーゼ産生ビフィドバクテリアによる豆乳中でのイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｓｏｙｍｉｌｋ  ｂｙ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．６７：３１０４−３１１３）。醗酵の２４時間後、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍバイオタイプを用いて得られた０．３３８及び０．４３３  ｍｇ／１００  ｍｌの産生と比較して、エクオールの最も高い濃度（０．５２１  ｍｇ／１００  ｍｌ）はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓにより合成された。この研究に従い選択された混合スターターで醗酵したＯＦＳ豆乳はより高い濃度のエクオール、即ち０．９  ｍｇ／１００  ｍｌに対応する３７．３μＭを含んでいた。
【００５６】
以前報告された結果に基づけば、有機農業大豆粉（ＯＦＳ）から生産された豆乳はイソフラボン−アグリコン及びエクオールの合成のための最良の基質と考えられた。我々の知る限りでは、今までにイソフラボン−アグリコン及びエクオールの合成のために有機農業大豆粉から得られた豆乳の使用を考察した研究はなかった。
【００５７】
それ故、ＨＰＬＣ法を用いてルナシンの濃度を定量した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８．大豆タンパク質由来のペプチドの分析、及び栽培品種、環境条件、及び大豆及び大豆生産物におけるルナシン濃度のプロセッシングの効果（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｕｌｔｉｖａｒ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｌｕｎａｓｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｙｂｅａｎ  ａｎｄ  ｓｏｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）Ｊ．ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎ．９１：９３６−９４４）。インキュベーション前、ルナシン濃度は約３．２  ｍｇ／１００  ｍｌであった（図３）。醗酵の間、選択された混合スターターはルナシンの定常的な増加に有利に働き、インキュベーションの９６時間の終わりには約８．４  ｍｇ／１００  ｍｌであった。我々の知る限り、乳酸菌で醗酵された豆乳からなる同じ調製物でイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンの同時合成を考察した研究は今まではなかった。この生物活性ペプチド（ルナシン）の生理学的効果は広く文献に記録されている（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．大豆から単離されたルナシンのキャラクタリゼーション（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎａｓｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｏｙｂｅａｎ．）Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５１：７９０１−７９０６；Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７．小麦由来の癌予防ペプチドルナシンはコアヒストンアセチル化を阻害する。（Ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｕｎａｓｉｎ  ｆｒｏｍ  ｗｈｅａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｏｒｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ．）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２５５：４２−４８）。これまでの結果に基づいて、醗酵ＯＦＳ豆乳を皮膚保護のアッセイ及びヒト腸細胞に用いた。
【００５８】
（３）再構成上皮での試験とＴＥＥＲ測定（経上皮電気抵抗）
有機農業大豆粉から得られ選択した混合スターターで醗酵したＯＦＳ豆乳をヒト再構成上皮をＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標）モデルに従い処理するためにエクオールの最終濃度１０μＭで使用した。このモデルは科学コミュニティで広く実験され受け入れられている（Ｄｉ  Ｃａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭＺ１９４６３によるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の合成：機能的グレープは飲料及び皮膚科学的適用（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  γ−ａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ  （ＧＡＢＡ）ｂｙ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＳＭＺ１９４６３）：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒａｐｅ  ｍｕｓｔ  ｂｅｖｅｒａｇｅ  ａｎｄ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２５３−００９−２３７０４）。２４時間の処理のあと、ＴＥＥＲ測定を行った。このタイプの分析は国際的な科学コミュニティで広く受け入れられており、角質層の完全性やバリア機能を参照して組織の腐食能力を評価する。特にこの検出により、角質層レベルでのコンパクトなラメラ状構造の存在、完全緊密接合（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）及び上皮厚さについての情報を得ることができる。これらの要素が全体として効率的なバリア機能を定義する。図４は醗酵ＯＦＳ豆乳の存在下でＴＥＥＲ値の顕著な増加（Ｐ＜０．０５）を示しており、これは皮膚レベルでの分子の保護作用を実証している。同様の結果が化学的に合成されたエクオールとルナシンの混合物で得られた。
【００５９】
現時点での知識によれば、これはイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む豆乳に基づく調製物が皮膚バリア機能の刺激を示す最初の応用例である。
【００６０】
（４）Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞での試験
有機農業大豆粉（ＯＦＳ）から製造された豆乳に含まれるイソフラボン−アグリコンの免疫調整特性を試験する目的で、ニュートラルレッド（ＮＲ）取り込みアッセイを用いた、５〜１００μＭの濃度での標準化合物（エクオール、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン）によるＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞に対する細胞毒性をまず評価した。ゲニステイン、グリシテイン、及びエクオールはメタノールとＤＭＳＯ（陰性対照）に類似した振る舞いを示したが、細胞増殖には有意には影響しなかった。７２時間の処理の後、ダイゼインは１００μＭより高い濃度で細胞増殖を顕著に阻害した（ｐ＜０．０３）。
【００６１】
予備的に、Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞を２４時間、ＯＦＳ醗酵豆乳で１０μＭの濃度で処理し、１０μＭのエクオール最終濃度に希釈し、又は醗酵させていない豆乳で処理した。これらの化合物又は調製物はＮＯ放出の誘発を示さなかったが、これは陰性対照、即ちメタノールとＤＭＳＯに類似した振る舞いを示した（図５）。引き続いて、Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞を２４時間当たりＩＮＦ−γ（１０００Ｕ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。この処理はＮＯ放出を有意に増加させ（Ｐ＜０．０５）、従って陰性対照、ダイゼインで又は醗酵させていないＯＦＳ豆乳で予防的に処理したＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞の炎症状態を刺激した。これとは対照的に、エクオール又は醗酵ＯＦＳ豆乳での処理はＮＯ放出を顕著に阻害した（それぞれＰ＜０．００２及びＰ＜０．００７）。ＮＯ放出のかなりの阻害がゲニステインとグリシテインでの処理でも観察された（Ｐ＜０．０５）。予備的に、試験で用いたイソフラボン−アグリコンの濃度（１０μＭ）が毒性ではないことが示されているので、Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞の死はＮＯ放出と干渉したのではないことは確かである。
【００６２】
この研究の培養条件下では、Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞は緊密な細胞間接合を含む腸細胞の形態学的及び機能的特徴を展開し、その完全性はＴＥＥＲ定量により測定される。予備的に、ＴＥＥＲは標準化合物（１０−１００μＭ）、醗酵され、１０μＭのエクオール濃度に希釈されたＯＦＳ豆乳の存在下で定量され、又は醗酵していないＯＦＳ豆乳の存在下で定量された。１００μＭ（１０００Ｕ／ｍｌ）の濃度でのエクオール化合物を例外として、７２ｈのインキュベーションの間のＴＥＥＲへの効果は観察されなかった。Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞のＩＦＮ−γ（１０００Ｕ／ｍｌ）での処理はＴＥＥＲ値の顕著な減少（Ｐ＜０．００３）に有利に働いた（図６）。ＩＦＮ−γで刺激されたＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞が醗酵ＯＦＳ豆乳でも処理されていると、ＩＮＦ−γの負の効果が顕著に低減した（Ｐ＜０．００７）。醗酵させていない豆乳の存在下では無視できる程度の効果しか観察されなかった。ゲニステイン、グリシテイン、及びとりわけエクオールは醗酵ＯＦＳ豆乳に類似した傾向を示した。ダイゼインはＩＦＮ−γにより引き起こされた負の効果と干渉しなかった。
【００６３】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）はＣ−Ｘ−Ｃケモカインファミリーのメンバーであり、好中球細胞の活性化に基本的な役割を果たしており、これにより炎症反応を開始する。Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞をインターロイキン−１β（２ｎｇ／ｍｌ）での処理にも付すと、ＩＬ−８合成の意味の或る増加（Ｐ＜０．００１）が観察された（図７）。インターロイキン−１βで刺激したＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞をエクオールとダイゼインでの処理に付すと、ＩＬ−８合成の意味のある増加（Ｐ＜０．００５）が観察された。ＩＬ−８合成の最も高い阻害（Ｐ＜０．００１）は醗酵ＯＦＳ豆乳での処理により観察された。対照的に、ゲニステイン、グリシテイン、又は醗酵ＯＦＳ豆乳での処理ではＩＬ−８合成の減少は見られなかった（Ｐ＜０．１０）。
【００６４】
報告された結果は、醗酵ＯＦＳ豆乳によるヒト腸細胞のバリア機能への抗炎症性及び刺激効果が主としてエクオールといくつかのイソフラボン−アグリコンの存在の結果であるということを明確に示している。ルナシンによる追加効果も可能である。
【００６５】
（５）ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、エクオール、及びルナシンの合成のためのバイオテクノロジー的プロトコルの開発と皮膚科学分野でのその使用
本文の他の箇所で先に概略を述べたように、イソフラボン−アグリコン（ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン）、エクオール、及びルナシンの合成のためのバイオテクノロジー的プロトコル、並びに皮膚科学分野でのその使用を開発した。当該方法は以下を含む：
ａ）ＭＲＳ培地上での純粋培養におけるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＤＰＰＭＡ２４Ｗ及びＤＰＰＭＡＳＬ３３，Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＤＰＰＭＡ１１４及びＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＤＰＰＭＡＡＺ１の培養；
ｂ）様々な豆乳タイプ、好ましくは農業生物学的方法に従い栽培され、実験室で皮をむいた大豆粉から調製された滅菌豆乳での細胞懸濁液の収集、洗浄及び接種；
ｃ）選択された混合スターターによる４８〜９６時間、好ましくは９６時間、３０〜３７℃、好ましくは３０℃での豆乳の醗酵；
ｄ）遠心分離による細胞の分離。方法変更に従って、その調製物は乳酸菌細胞を含んでいてもよい；
ｅ）乾燥又は凍結乾燥プロセスによる調製物の脱水；
ｆ）場合に応じて経口又は局所投与による使用にふさわしい形態を得るために適切な賦形剤の添加による組成物の調製。
【００６６】
実施例６：ルナシンを含むバイオマスとルナシンを含まないバイオマスの毛髪成長の刺激に対するインビトロ評価
毛髪成長のプロモータとしてルナシンを含むバイオマス（ＢＬ）をルナシンを含まないバイオマス（Ｂ）と比べたインビトロ研究
材料と方法
皮膚乳頭細胞（ＤＰＣ）を２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｘの抗真菌性かつ抗生剤的溶液（１０００ｕ  ｇ／ｍｌ  硫酸ストレプトマイシン、１０００  単位／ｍｌ  ペニシリンＧ、及び２．５  μｇ／ｍｌ  アンフォテリシンＢ）及び１０％ウシ胎仔血清を含む培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの変性Ｅａｇｌｅ培地、ＤＭＥＭ）で培養した。合流して細胞を２４時間血清なしでＤＭＥＭ中で培養し、次いで様々な濃度のルナシンを含むか若しくは含まないバイオマスで処理した。
【００６７】
細胞増殖はＭＴＴ法で定量した（Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８３）。ＤＰＣを９６穴プレート（１０４細胞／穴）に蒔種し、アッセイすべき物質を添加しながら２４時間インキュベートした。吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで５７０ｎｍで測定した。
【００６８】
さらにウェスタンブロットをＢｃ１２について実行した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ  ７．４、ＥＤＴＡ  ２  ｍＭ、リュプチン（ｌｅｕｐｔｉｎ）１００μｇ／ｍｌ、及び１００  ＮａＣｌ  ｍＭを含む緩衝液を用いてタンパク質を抽出した。
【００６９】
５０μｇのタンパク質を載せてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ及びアクチンに対するモノクローナル抗体を１：５００に希釈し、抗原−抗体複合体をＥＣＬシステムを用いて検出し、結果を画像濃度測定（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ−７００）を用いて分析した。
【００７０】
結果と議論
試験した濃度（０．０１〜０．５μＭ）の範囲内で、ルナシンを含むバイオマスはインビトロでのＤＰＣ増殖の増大を用量依存的に誘発する（ｐ＜０．０５）（図１）。
【００７１】
ルナシンを含むバイオマスの効果は、ルナシンを含まないバイオマスとは異なり、Ｂｃｌ−２タンパク質発現の増加を誘発し、Ｂａｘタンパク質発現の減少を誘発する（図２）。
【００７２】
これらの結果は、ルナシンを含むバイオマスがＤＰＣ上でのその増殖及び抗細胞死効果による毛髪成長を刺激することを示唆し、それ故、毛髪の成長期を拡大することができる。
【図１】
0005951604.tif 000008
【図２】
0005951604.tif 000009
【図３】
0005951604.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005951604.tif 000014
【図８】
0005951604.tif 000015
【図９】
0005951604.tif 000016
【配列表】
0005951604000001.app