(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子複合体の集合、均質性、および／または熱力学的安定性を決定する方法であって、以下の工程：
−緩衝系および蛍光色素を含有する試料中の１種類以上の生体高分子の複合体を提供すること；
−前記の試料の温度を、前記の試料の蛍光を熱平衡後に測定するのに適した速度で段階的に上昇させ、それにより温度の関数としての適切な波長における蛍光を決定すること、それにより前記の蛍光は前記の複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性の状態を反映する；
−以下の工程に基づいて前記の複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性を計算すること：
ａ）温度の関数としての該試料の見かけの２状態アンフォールディング蛍光曲線を、前記の曲線を２状態から６状態モデルまでの多状態アンフォールディングモデルに従って当てはめ、前記の曲線を完全な２状態曲線に対して比較することにより、同定すること；
ｂ）２状態モデル中の変曲点において前記の遷移曲線の傾きを計算すること；
ｃ）融解温度Ｔｍおよび／またはアンフォールディングのエンタルピーΔＨを計算すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記の複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性を計算する工程が、曲線の最初の部分における強い負の傾きに基づいて破棄されるべき曲線を同定することを含む、前記方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、温度の関数としての蛍光の曲線が、遷移曲線を得るために正規化され、ここで該曲線の最も低い極小が０に設定され、該曲線の最も高い極大が１０００に設定され、これらの２個のデータの点により記述される範囲の外にある実験値が前記の曲線の計算から除外される、前記方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、実験的ｐＨ値が、適切な波長の蛍光を温度の関数として示す曲線に関して、緩衝系のΔｐＫＡ／Ｔ値を用いて、アンフォールディング遷移の変曲点において決定される、前記方法。
【請求項５】
ΔＨがアンフォールディング遷移の傾きに基づいて計算される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５の方法のいずれか１つに従って同定された試料の集合、均質性および／または熱力学的安定性を少なくとも２個以上の別個の試料に関して比較し、最も安定化する条件が存在する条件を同定する工程を含む、生体高分子複合体の安定化条件を決定する方法。
【請求項７】
曲線が、予め決められたパラメーターに関してヒューリスティックに分類される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、予め決められたパラメーターが以下の順序：実験データに対するＲ２、完全な２状態モデルに対するＲ２、２状態モデルに関するアンフォールディングのΔＨ、２状態モデルに関するＴｍ、最高に当てはめられたモデルのΔＨ、最高に当てはめられたモデルのＴｍ、ならびに遷移曲線の最も低い極小および最も高い極大の下の面積；で選択される、前記方法。
【請求項９】
高い光散乱強度を有する曲線が予め破棄される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記の複合体の不安定化条件を同定する使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
リガンド結合のスクリーニングにおける使用のための、複合体形成を安定化、不安定化または阻害する化合物のスクリーニングのための、別の生物と対比してある生物から単離された複合体に対するリガンドの特異性を決定するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記の複合体のさらなる分析および処理を可能にする緩衝条件を同定するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
曲線が示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）に基づく、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
計算がソフトウェアにより達成される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４の少なくとも１項に記載の方法を実施するためのプログラムコードを有する、コンピューターで読み取り可能な媒体上に存在するコンピュータープログラム。
【請求項１６】
コンピュータープログラムであって、それがコンピューター上で作動しているか、またはコンピューター上に読み込まれる際に、コンピューターに請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施させる、前記コンピュータープログラム。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のコンピュータープログラムを含む、コンピュータープログラム記憶媒体。
【請求項１８】
請求項１〜１４の少なくとも１項に記載の方法を実施するためのプログラム命令を含有する、コンピューターで読み取り可能な記憶媒体を含むコンピューター。
【請求項１９】
示差走査蛍光定量法のための装置ならびに請求項１〜１４の少なくとも１項に記載の方法を実施するための請求項１５または１６のいずれか１項に記載のソフトウェアまたはコンピュータープログラムを含むデータ処理ユニットを含む、生体高分子複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性を示差走査蛍光定量法に基づいて決定するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
第１観点において、本発明は、生体高分子複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性を決定する方法に関する。特に、その方法は前記の複合体の最大安定性を温度の関数としての適切な波長における蛍光変化に基づいて決定することを可能にし、それにより前記の蛍光変化は生体高分子複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性の状態を反映する。前記の方法は、温度の関数としての２状態および多状態アンフォールディング蛍光曲線を、前記の曲線を多状態アンフォールディングモデルに従って当てはめることにより、同定することに基づいている。加えて、生体高分子複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性を決定するためのコンピュータープログラムおよびコンピュータープログラム記憶媒体、ならびに装置およびシステムが提供される。
【背景技術】
【０００２】
高分子複合体、例えば生体高分子複合体は、異なる、または同一の部分の超分子集合体である。例えば、生体高分子複合体は、同一の、または異なる生体分子の、さらには異なるタイプの生体分子の集合体である。そのような生体分子には、タンパク質、核酸、脂質および糖類が含まれる。典型的には、その高分子複合体は、生きた生物のような天然環境中に存在する特定の条件下で形成される。前記の高分子複合体は、生きた生物の生存に重要であり、様々な生化学的経路において重要な役割を有する。これらの高分子複合体がどのようにそれらの仕事を行うかを機構的に理解するための鍵は、それらの三次元構造に関する知識である。高分子複合体の構造および特に機能の研究に対する１つの主な障害は、その組成の複雑さ、そしてしばしば前記の構造が、特に天然環境から単離されている際に、比較的不安定であることである。すなわち、精製の間に、そして精製された状態で、または組み換えにより発現されたか、もしくは合成により生成された際に、その高分子複合体の構造の決定ならびに正確な形成および集合は困難である。すなわち、生物科学における進行中の研究は、一般的な高分子は単離状態では作動しないが代わりに超分子集合体へと組織化されることを明らかにしている。高分子複合体または分子機械と呼ばれるこれらのモジュールは活性な種であり、それは細胞の恒常性を維持するために必須の生化学反応を行う。分子機械または高分子複合体（以下高分子複合体または一般に複合体と呼ぶ）は３つの主なクラス：タンパク質のみからなる複合体、タンパク質および核酸からなる複合体、ならびに膜内在性複合体に分けることができる。
【０００３】
その高分子複合体の性質にかかわらず、細胞内でのそれぞれの作用様式への機構的洞察を得るためにはその三次元構造を決定することは不可避である。この目的のため、最近の進歩、例えば“ＴＡＰタグ付け”および組み換え多タンパク質発現技法は、多くの高分子複合体の生化学的精製を技術的に実現可能にしてきた。細胞分子機械を単離および再構成する能力における多大な進歩にもかかわらず、それらに関する構造的情報は不足したままである。この不一致は、おそらくこれらの複合体に本来備わっており精製の収率を制限する生化学的複雑さによるものである。加えて、ほとんどの分子機械は精製の際に不安定であり、しばしば立体構造的に不均質な集合体である。しかし、ほとんどの精製スキームは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）のような限られた緩衝系のセットを用いている。すなわち、精製スキームは、生体高分子複合体の精製であって、それにより前記の複合体がその天然環境中、すなわち細胞環境中に存在するままの形態である精製、を可能するための、精製に最も適した条件を満たさない。
【０００４】
さらに、その単離された高分子複合体は典型的には極めて不安定であり、従って安定化された複合体または向上した安定性を有する複合体に関する必要性が内在する。従って、多くの精製された高分子複合体、特に生体高分子複合体の安定性は、これらの集合体を構造生物学に適用することができるように、そして機能性の研究等に適したものにするために、複合体の単離および精製の間の最も早い可能な工程において最適化される必要がある。
【０００５】
一般に、タンパク質の安定性は緩衝系に依存することが知られている。ｐＨ、イオン強度、塩類およびその溶液中の濃度、添加剤、リガンド、ならびに比誘電率および粘度が、その複合体の安定性に影響を及ぼす。あらゆる高分子種の安定性を決定するための簡単な方法は、温度における増加性の（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ）上昇に反応するあらゆる所与の溶質におけるそのアンフォールディング挙動を測定することである。これは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または示差走査光散乱（ＤＳＬＳ）法のどちらかにより成し遂げることができる。第３の可能性は、その蛍光が極性環境において消光されるがアンフォールディングの際のタンパク質の疎水性中心部のような疎水性環境に曝露された際に蛍光シグナルを強く放射する色素の存在下で熱アンフォールディングを行うことである。この方法は、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ法または示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）として知られている。これらの方法は高スループット設定に適用でき、様々な緩衝条件および小分子の存在下で単一ドメインタンパク質に関する安定化条件を同定するためにも用いられてきた。最近、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ法は国際公開第２０１０／１０９２０４号において熱安定性を決定する分析法に関して記述されている。その中で記述された方法は単一ドメインタンパク質に関する安定化条件を決定することを可能にし、前記のタンパク質の融解温度Ｔｍを決定することにのみ基づいている。しかし、その中で、複合体、すなわち多ドメインタンパク質において、そのタンパク質の個々の部分が独立して融解して多数のＴＭをもたらし得ることが確認されている。より最近、Kopec J., and Schneider G., J. Structural Biol. 201 1 , doi: 10.1016/J.JSB 201 1.04.006は、タンパク質−タンパク質複合体の形成および安定性にアクセスするための蛍光および光散乱に基づく方法の比較を論じた。その中で、ＤＳＬＳおよびＤＳＦ法がタンパク質に関する安定化条件を同定するために適用されている。特に、その２つの方法の比較は、タンパク質−タンパク質複合体の緩衝条件の最適化のために適用された。しかし、その中で記述されたこれらの方法も、そのタンパク質−タンパク質複合体のＴＭを決定することにのみ基づいている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１０９２０４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kopec J., and Schneider G., J. Structural Biol. 201 1 , doi: 10.1016/J.JSB 201 1.04.006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＤＳＦの単純性および少ない試料必要量は、前記の方法を高分子複合体の安定性を決定するために特に有用なものにするであろう。しかし、タンパク質−タンパク質複合体が分析された最近のＫｏｐｅｃらの開示を除き、それぞれの個々のドメイン／サブユニットが独立してアンフォールディングして多相アンフォールディング曲線をもたらすであろうことに基づいて、前記の方法は多ドメインタンパク質および分子機械に関して有用であるとは考えられてこなかった。そのような曲線は複合体の安定性に関する情報を含有せず、個々の構成要素の安定性に関する情報のみを含有するであろう。
【０００９】
従って、生体高分子複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性の決定を可能にする方法およびシステムに関する進行中の必要性が存在する。前記の方法は前記の高分子複合体に関する安定化条件を同定するために特に有用であり、従って前記の複合体のさらなる機能分析を可能にするはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、生体高分子複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性を決定する新規方法を提供することを目的としている。高分子複合体の見かけの融解温度を計算することは、安定化条件を分析するためおよび前記の安定化条件を最適化するために十分ではないことが認識されてきた。対照的に、温度の関数としてのその試料の見かけの２状態アンフォールディング蛍光曲線を、前記の曲線を好ましくは２状態〜６状態モデルの範囲の多状態アンフォールディングモデルに従って当てはめることによって、同定することにより、既存の方法を向上させることが必要とされている。例えばレーベンバーグ・マーカートアルゴリズムによりそのアンフォールディングモデルの物理的パラメーターに従って当てはめを実施し、遷移アンフォールディング曲線を得る。次いで、最高に当てはまる曲線をさらなる処理のために用いて、そのデータの最高に当てはまるモデルに対する差が無視できるほどに小さい場合のみ２状態モデルを仮定する。
【００１１】
従って、第１観点において、以下の工程を含む、生体高分子複合体の集合、均質性、および／または熱力学的安定性を決定する方法が提供される：
−緩衝系および蛍光色素を含有する試料中の１種類以上の生体高分子の複合体を提供すること；
−前記の試料の温度を、熱平衡後に前記の試料の蛍光を測定するのに適した速度で段階的に上昇させ、それにより温度の関数としての適切な波長における蛍光を蛍光曲線として決定すること、それにより前記の蛍光は前記の複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性の状態を反映する；
−以下の工程に基づいて前記の複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性を計算すること：
ａ）温度の関数としてのその試料の見かけの２状態アンフォールディング蛍光曲線を、前記の曲線を２状態から６状態モデルまでの多状態アンフォールディングモデルに従って当てはめることにより、例えばアンフォールディング状態を遷移曲線を得るためのレーベンバーグ・マーカートアルゴリズムおよびΧ２最小化に基づいて決定して前記の曲線を完全な２状態曲線に対して比較することにより、同定すること；
ｂ）２状態モデル中の変曲点において前記の遷移曲線の傾きを計算すること；
ｃ）融解温度Ｔｍおよび／またはアンフォールディングのエンタルピーΔＨを計算すること。
【００１２】
加えて、本発明は、上記で記述した方法に従う試料の集合、均質性および／または熱力学的安定性を少なくとも２個以上の別個の試料に関して比較し、最も安定化する条件が存在する条件を同定する工程を含む、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の安定化条件を決定する方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明に従う方法は、リガンド結合に関するスクリーニング、複合体形成を不安定化もしくは阻害する、もしくは複合体形成を安定化もしくは促進する化合物に関するスクリーニング、または別の生物と対比してある生物ら単離された複合体に対するリガンドの特異性を決定するためのスクリーニングを可能にする。
【００１４】
別の観点において、本発明は、本発明に従う方法を実施するためのプログラムコードを有する、コンピューターで読み取り可能な形態上に存在するコンピュータープログラムを提供する。さらに、ＤＳＦのための装置および本発明に従う方法を実施するための本発明に従うソフトウェアまたはコンピュータープログラムを含むデータ処理ユニットを含む、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性をＤＳＦに基づいて決定するためのシステムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１：緩衝条件のＤＳＦ曲線および電子顕微鏡画像への影響の比較。最適以下の緩衝条件は多相アンフォールディング曲線を示す（最初の２列）。最適な緩衝条件の下では２状態アンフォールディング曲線が得られる（第３の列）。それらの条件下ではＥＭ画像において凝集物はもはや観察することができない。
【図２】図２：ｄＡＴＰまたはＡＴＰの非存在下または存在下でのＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ複合体の形成。示されているように、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ複合体はｄＡＴＰまたはＡＴＰのどちらかの存在下で形成される。
【図３】図３：５０ｍＭ  ＥＤＴＡで処理した際、８０Ｓリボソームは不安定になり、もはや２状態アンフォールディング挙動を示さない（中央のパネル）。最適な安定化条件はイミダゾール中ｐＨ６および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２において見出された（右のパネル）。
【図４】図４：１３個の異なるシステインを含まないグロビンドメインに加えて３個のシステインを有する小さいＮ末端の非グロビンドメインからなるＢＧＨｂ（ビオンファラリア・グラブラタ（Ｂｉｏｍａｐｈａｌａｒｉａ  ｇｌａｂｒａｔａ）のヘモグロビン）を複合体形成に関して分析する。
【図５】図５：本発明に従って実施される工程の流れ図を示す。
【図６】図６：本発明に従う異なる選択工程に基づいて選択または除外された曲線を示す。図５で示される流れ図において同定される工程を参照する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、第１観点において、以下の工程を含む、生体高分子複合体の集合、均質性、および／または熱力学的安定性を決定する方法に関する：
−緩衝系および蛍光色素を含有する試料中の１種類以上の生体高分子の複合体を提供すること；
−前記の試料の温度を、前記の試料の蛍光を測定するのに適した速度で段階的に上昇させ、それにより温度の関数としての適切な波長における蛍光を蛍光曲線として決定すること、それにより前記の蛍光は前記の複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性の状態を反映する；
−以下の工程に基づいて前記の複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性を計算すること：
ａ）温度の関数としてのその試料の見かけの２状態アンフォールディング蛍光曲線を、前記の曲線を２状態から６状態モデルまでの多状態アンフォールディングモデルに従って当てはめることにより、例えばアンフォールディング状態を遷移曲線を得るためのレーベンバーグ・マーカートアルゴリズムおよびΧ２最小化に基づいて決定して前記の曲線を完全な２状態曲線に対して比較することにより、同定すること；
ｂ）２状態モデル中の変曲点において前記の遷移曲線の傾きを計算すること；
ｃ）融解温度Ｔｍおよび／またはアンフォールディングのエンタルピーΔＨを計算すること。
【００１７】
本明細書で用いられる際、用語“Χ２最小化”はレーベンバーグ・マーカートアルゴリズムの一部である（Numerical Recipes、第３版、第１５章、p799）。
さらに、用語“アンフォールディング遷移の変曲点”は、その複合体の融点として定義されている。
【００１８】
本明細書で用いられる際、用語“Ｒ２”は、モデルの実験曲線に対する当てはめの質を指す。Ｒ２が０．９９９未満である場合、その曲線は好ましくは破棄される。Ｒ２が可能な限り１に近いことが好ましい。
【００１９】
蛍光色素はソルバトクロミック色素（ｓｏｌｖａｔｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｄｙｅ）であることが好ましい。ソルバトクロミック色素は、その蛍光放射が極性溶媒中で消光され、前記の色素が疎水性溶媒環境に移された際に強く蛍光を放射する色素である。
【００２０】
すなわち、温度を上げることにより徐々にアンフォールディングを引き起こす場合、その生体高分子複合体の疎水性残基の溶媒曝露が起こり、同時に疎水性溶媒環境の存在の増大によりそのソルバトクロミック色素の蛍光放射シグナルが増大する。当業者は適切な蛍光色素をよく知っている。すなわち、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析における使用に適した蛍光色素は周知であり、以下の色素が含まれる：ｓｙｐｒｏオレンジ、チオイノシン、およびＮ−エテノアデノシン、ホルマイシン、ダンシル誘導体、フルオレセイン誘導体、６−プロピオニル−２−（ジメチルアミノ）−ナフタレン（６−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ）（ＰＲＯＤＡＮ）、２−アニリノナフタレン（２−ａｎｉｌｉｎｏｎａｐｔｈａｌｅｎｅ）、およびＮ−アリールアミノ−ナフタレンスルホネート誘導体、例えば１−アニリノナフタレン−８−スルホネート（１，８−ＡＮＳ）、２−アニリノナフタレン−６−スルホネート（２，６−ＡＮＳ）、２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−フェニル−２−アミノナフタレン、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−フェニル−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−フェニル−Ｎ−メチル−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−（ｏ−トルイル）−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−（ｍ−トルイル）−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−（ｐ−トルイル）−２−アミノナフタレン−６−スルホネート、２−（ｐ−トルイジニル）−ナフタレン−６−スルホン酸（２，６−ＴＮＳ）、４−（ジシアノビニル）ジュロリジン（ＤＣＶＪ）、６−ドデカノイル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＬＡＵＲＤＡＮ）、６−ヘキサデカノイル−２−（（（２−（トリメチルアンモニウム）エチル）メチル）アミノ）ナフタレンクロリド（ＰＡＴＭＡＮ）、ナイルレッド、Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミン、１，１−ジシアノ−２−［６−（ジメチルアミノ）ナフタレン−２−イル］プロペン（ＤＤＮＰ）、４，４’−ジアニリノ−１，１−ビナフチル−５，５−ジスルホン酸（ビ−ＡＮＳ）、およびＤＡＰＯＸＹＬ誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）。
【００２１】
１態様において、その色素はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．から入手可能なＳｙｐｒｏオレンジである。１態様において、その蛍光は５３０ｎｍの波長において測定される。
【００２２】
放射された光を測定するための適切な機器には、適切な波長の光を放射および測定する設備を備えたあらゆる第２世代のリアルタイムＰＣＲシステム、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムおよびＢｉｏｒａｄから入手可能なＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ機械が含まれる。
【００２３】
典型的な運転に関する温度は、例えば３８４ウェルブロックに基づいて約０．０２℃／秒の温度勾配を用いておおよそ２０℃から１００℃までであろうが、所望であれば４０から１００℃までであってよい。７９００ＨＴシステムの場合、最小ランプ（ｒａｍｐ）速度は、例えば３８４ウェルブロックに基づいて０．０２℃／秒（１％パワー）であってよい。この系の最大ランプ速度は、例えば３８４ウェルブロックに基づいて２℃／秒（１００％パワー）であってよい。従って、最適な温度ランプ範囲は約０．０２〜約２℃／秒である。
【００２４】
１態様において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９４、９６、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０またはより大きい数、例えば３８４または１０２４個のタンパク質試料が同時に分析される。その機器は、そのプロセスをさらに自動化し、ヒトの介入なしで処理することができる試料の数を増大させるためのロボット設備との組み合わせで用いることができる。
【００２５】
好ましくは、その方法はＤＳＦ（示差走査蛍光定量法）に基づく。ＤＳＦは高スループットスクリーニング技法として用いることができ、それは解釈する必要があるかなりの量のデータを生成し、データ分析の自動化を可能にする。データセットまたは曲線は、間違ったシグナルのためにふるい分けされることが好ましい。これらの間違ったシグナルまたは測定結果には、気泡、ピペットエラー、色素の結晶化または高分子複合体の一部の凝集物等による間違った結果が含まれる。加えて、その方法にはデータの正規化のためのバックグラウンドの減算が含まれることが好ましい。この点において、別の好ましい態様において、温度の関数としての蛍光の曲線は遷移曲線を得るために正規化され、ここでその曲線の最も低い極小が０に設定され、その曲線の最も高い極大が１０００に設定され、これらの２個のデータの点により記述される範囲の外にある実験値は前記の曲線の計算から除外される。
【００２６】
蛍光における増大がその高分子複合体のアンフォールディングに相当することは十分に確証されている。
従って、次の工程は、温度の関数としてのその試料の蛍光曲線を２、３、４、５、および６状態を含む多状態アンフォールディングモデルに当てはめることを必要とする。安定化条件下で、見かけの２状態アンフォールディング蛍光曲線が得られる。これらの当てはめられた曲線は遷移曲線とも呼ばれる。例えば、その当てはめはレーベンバーグ・マーカートアルゴリズムおよびΧ２最小化を用いることにより実施される。さらに、完全な２状態曲線に対する類似度が、２状態に対するＲ２の決定に基づいて測定されることが好ましい。
【００２７】
さらに、好ましい態様において、その方法には２状態モデルにおける変曲点におけるその遷移曲線の傾きを計算することが含まれ、加えて、または代わりに、温度Ｔｍおよび／またはアンフォールディングのエンタルピーΔＨが計算されることが好ましい。当業者は、それぞれのパラメーターを計算するための適切な手段および方法をよく知っている。
【００２８】
さらに、さらなる好ましい態様において、その方法には、適切な波長の蛍光を温度の関数として示す曲線に関して、緩衝系のΔｐＫＡ／Ｔ値を用いて、アンフォールディング遷移の変曲点において実験的なｐＨ値を決定する工程が含まれる。
【００２９】
ΔＨは、アンフォールディング遷移の傾きの非線形当てはめに基づいて計算されることが特に好ましい。この場合、ΔＨは全てのアンフォールディングおよび解離エンタルピーの加重平均を記述する。
【００３０】
さらなる分析のため、本発明の方法は、本発明の方法に従って同定されるような試料の集合、均質性および／または熱力学的安定性を少なくとも２個以上の別個の試料に関して比較し、最高の安定化条件が存在する場合にその条件を同定する工程を含む、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の安定化条件を決定することを含む。
【００３１】
最高の安定化条件を同定するための曲線は、予め決められたパラメーターに関してヒューリスティックに分類されることが好ましい。すなわち、本発明に従う方法は、生体高分子複合体に関する最高の安定化条件を同定することを可能にする。従って、この方法は前記の複合体のための、特にこれらの複合体の単離および技術分析のための、安定化緩衝条件を決定するために特に有用である。
【００３２】
好ましい態様において、その複合体はタンパク質、核酸、糖類、および／または脂質を含む。例えば、タンパク質／タンパク質複合体を、集合、均質性および熱力学的安定性に関して調べることができる。さらに、本発明者らはタンパク質−核酸複合体をうまく分析した。
【００３３】
別の好ましい態様において、その曲線は予め決められたパラメーターに関してヒューリスティックに分類される。特に、その予め決められたパラメーターを以下の順序で選択することが好ましい：実験データに当てはめられた多相アンフォールディングモデルの結果、結果の完全な２相モデルへの当てはめ、２相モデルに関するアンフォールディングのΔＨ、２相モデルに関するＴｍ、最高に当てはめられたモデルのΔＨ、最高に当てはめられたモデルのＴｍならびに遷移曲線の最も低い極小および最も高い極大の下の囲まれた面積。
【００３４】
従って、高スループット法を用いることにより、生体高分子複合体の安定化および不安定化条件を容易且つ好都合に決定することが可能である。
その方法は異なるアプローチのために用いることができる。例えば、本発明に従う方法を用いることにより、リガンド結合をスクリーニングすることが可能である。すなわち、蛍光曲線を観察および比較することにより、リガンドの前記の複合体への結合を同定することが可能である。さらに、その方法は複合体形成を不安定化または阻害する化合物に関するスクリーニングを可能にする。一方で、本発明に従う方法は複合体形成を安定化または促進する化合物に関するスクリーニングを可能にする。さらに、本発明は異なる生物にわたる複合体へのリガンド結合の特異性を同定することを可能にする。これは、例えばある生物において効果を示すが別の生物において前記の効果を示さないはずである、例えば病原体に対して効果を有するが宿主に対しては効果を有しない、抗生物質または他の化合物の開発の分野において特に興味深い可能性がある。
【００３５】
本発明に従う方法の別の利点は、それが高スループットスクリーニングに適しており、該高スループットスクリーニングは少量の試料しか要求しない、という事実である。
驚くべきことに、様々な構成要素からなる、例えば少なくとも２個、３個、４個、またはさらに多くの異なる構成要素からなる生体高分子複合体を、示差走査蛍光定量技術を適用することにより分析することができることが決定されている。従って、これらの生体高分子複合体が関与する、新規の有効成分、例えば新規の治療剤、に関するスクリーニング法における使用のために、これらの生体高分子複合体を提供することが可能である。
【００３６】
別の観点において、本発明は、本発明に従う方法を実施するためのプログラムコードを有する、コンピューターで読み取り可能な媒体上に存在するコンピュータープログラムを提供する。さらに、本発明は、それがコンピューター上に乗っているか（ｒｉｄｉｎｇ）、またはコンピューター上で読み込まれた際にコンピューターに本発明に従う方法を実施させるコンピュータープログラムを提供する。
【００３７】
加えて、本発明は、本発明に従うコンピュータープログラムを含むコンピュータープログラム記憶媒体を提供する。
別の態様は、本発明に従う方法を実施するためのプログラム命令を含有するコンピューターで読み取り可能な記憶媒体を含む装置に関する。
【００３８】
最後に、本発明は、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の集合、均質性および／または熱力学的安定性を示差走査蛍光定量法に基づいて決定するためのシステムならびに本発明に従う方法を実施するための本発明に従うソフトウェアまたはコンピュータープログラムを含むデータ処理ユニットを提供する。
【００３９】
理論に束縛されるわけではないが、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイは用いられる色素の環境依存性の蛍光に基づいており、例えば適切な蛍光色素の代表的なものとしてのＳＹＰＲＯオレンジは極性環境では低い量子収率を示すが、それは疎水性の周囲環境において超蛍光性（ｈｙｐｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）になる。そのアッセイの間、タンパク質は、上昇した温度においてアンフォールディングして疎水性の小区画（ｐａｔｃｈｅｓ）を露出し、それが蛍光における増大をもたらす。さらに温度が上昇すると、これに続いて前に露出した疎水性の小区画を隠す急速な凝集が起こり、結果としてより低い蛍光シグナルがもたらされる。今までは、得られたＤＳＦ曲線は、蛍光の増大の間の変曲点を決定するために、曲線の単純なボルツマンモデルへの非線形回帰により解釈された。これはそのタンパク質の融点を決定し、単鎖タンパク質の安定化に関する読み出し情報（ｒｅａｄｏｕｔ）として用いられた（Niesen, F.H., et al., (2007), 2, 2212-2221）。しかし、タンパク質複合体に関しては、融点の読み出し情報のみでは十分ではない。これは、複雑な多ドメインタンパク質に関してそのタンパク質の個々の部分が独立して融解し、多数のＴｍをもたらし得ることを確認している国際公開第２０１０／１０９２０４号においても認識されている。
【００４０】
記述された挙動を仮定すると、その色素の３種類の異なる種をあらゆる時点において溶液中で見付けることができる：Ｆ０の最大蛍光を有する遊離の色素、ＦＮの最大シグナルを有する未変性状態のタンパク質に結合した色素（全ての未変性タンパク質は未変性且つ色素が結合していることを意味する）、およびＦＵに対応するアンフォールディングしたタンパク質に結合した色素。全ての時点において、測定された蛍光シグナルはそれらの３種類の種により放射されるシグナル部分の合計により記述することができる：
【００４１】
【数１】
0005986207.tif 000002
【００４２】
ここで、ｆＮ、ｆＵはそれぞれアンフォールディングした、および折り畳まれたタンパク質状態の割合である。色素はタンパク質よりも大過剰であるため、Ｆ０は実験の過程の間に変化せず、ベースライン実験を実施することにより、実験において単純に減算することができる。従って、Ｆ０は以下では無視することができる。
【００４３】
平衡定数Ｋ＝ｆＵ／ｆＮにより記述される単純な２状態モデルを仮定すると、これは結果として次の式をもたらす：
【００４４】
【数２】
0005986207.tif 000003
【００４５】
実施される実験は温度依存性であり、従って全ての方程式のパラメーターも同様である。ファントホッフ等温線を用いるＫに関して、これは次の式をもたらす：
【００４６】
【数３】
0005986207.tif 000004
【００４７】
アンフォールディングエントロピーが測定範囲において温度に依存しないと仮定すると、これはクラーク−ファーシュト方程式(Clarke, J., and Fersht, A.R. (1993), Biochemistry 32, 4322-4329)のわずかな変形をもたらし、
【００４８】
【数４】
0005986207.tif 000005
【００４９】
ここでΔＨはアンフォールディングエンタルピーを記述し、Ｔｍは未変性およびアンフォールディング状態の割合が等しい融解温度を記述する。ＦＮ（Ｔ）はスクリーンの最初の蛍光を記述し、ほとんどの場合に関して線形であると近似することができる。溶液中の界面活性剤、気泡または凝集物、ならびに複合体の未変性の立体構造中の露出した疎水性小区画は、線形挙動の逸脱をもたらし得る。それらの場合では、異なる近似が必要とされる。界面活性剤により導入される最初の高いシグナルは、その界面活性剤の臨界ミセル濃度の温度依存性に非常によく似ており、従って二次多項式と類似の方法で補正される。気泡または凝集物は結果として増大した光散乱をもたらす。これらの作用の補正はそのモデルにいくつかの未知のパラメーターを導入するであろう。これらの効果を示す曲線は、単純にここから先は（ｆｒｏｍ  ｈｅｒｅｏｎ）無視される。ＦＵ（Ｔ）は凝集挙動を記述する。実験の過程の間温度は上昇するため、凝集速度も段階的に変化する。これは得られたデータによるその曲線のこの領域の正確な記述を不可能にする。従って、単一の指数関数としての凝集の過程が唯一近似されている。
【００５０】
上記のことを考慮すると、式（５）に到達するであろう：
【００５１】
【数５】
0005986207.tif 000006
【００５２】
ここでの意味のあるパラメーターは、アンフォールディングエンタルピーに関する尺度であるタンパク質の融解温度ＴｍおよびアンフォールディングエンタルピーΔＨｍであり、ここで安定化条件に関して高いＴｍならびに高いΔＨｍを見つけることができる。タンパク質の安定性の正確な記述として、自由アンフォールディングエンタルピーΔＧＵ−Ｎを構造分析に関して望まれる温度に外挿する必要がある。アンフォールディングプロセスの間の熱容量における変化ΔＣｐが既知である場合、これはMatouschek, A. , et al., (1994), Protein Engineering 7, 1089-1095.により行うことができる：
【００５３】
【数６】
0005986207.tif 000007
【００５４】
タンパク質−タンパク質複合体に関しては、前に用いられたようなより多くの色素状態を仮定しなければならない。複合体の場合では、全ての色素は、全ての個々の折り畳まれた中間体ならびに全てのアンフォールディングされた構成要素に結合していることができる。等式（１）は次の式に変化する：
【００５５】
【数７】
0005986207.tif 000008
【００５６】
原理的に、複合体の３種類の異なる挙動をここで仮定することができる。第１に、その複合体は温度上昇により非常に急速に脱集合し、その構成要素は独立してアンフォールディングする。これは個々のアンフォールディング曲線の合計およびおそらく多相遷移につながるであろう。第２に、その複合体はゆっくりと脱集合し、一方でいくつかの既に解離した構成要素は既にアンフォールディングしている可能性がある。これは、おそらく多相の脱集合と重ね合わせられた記述された多相挙動につながるであろう。最も極端な場合には、複合体全体の脱集合ならびにその構成要素のアンフォールディングが完全に協同的な意味で同時に起こる。これは２相遷移をもたらす。
【００５７】
協同性がない場合、個々の構成要素は互いに独立してアンフォールディングすると考えられ、それは等式（３）に類似して次のように単純に記述することができ：
【００５８】
【数８】
0005986207.tif 000009
【００５９】
ここでΔＨｍ，ｉは、１つの構成要素に関するアンフォールディングおよび解離エンタルピーの和を記述する。
一般に全ての曲線は、その複合体の脱集合平衡の、個々の構成要素のアンフォールディングへの重ね合わせにより記述することができなければならず、それは次の式により与えられる：
【００６０】
【数９】
0005986207.tif 000010
【００６１】
極端な場合において、等式（８）および（９）におけるｎ＝１は、等式（４）の類似形をもたらす。これは、その複合体のアンフォールディングおよび脱集合の全体的な協同性を意味し、それは複合体に安定性を提供する力の物理的性質が単一のドメインの安定な折り畳みを提供する力の物理的性質と等しいため、実現可能である。従って、理想的な状況下では、複合体の脱会合およびその構成要素のアンフォールディングは協奏的に起こると仮定することができる。従って、等式（４）はこの仮定の記述に適したものになり、ここではΔＨが全てのアンフォールディングおよび解離エンタルピーの加重平均を記述している点が異なっている。結果として、ｎは協同性に関する尺度として用いることができ、従ってその分析に関する重要なパラメーターである。
【００６２】
上記のことから、タンパク質複合体に関する熱的シフト（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｈｉｆｔ）の単純な分析では不十分であることは明らかである。最初の２つの記述された場合では、見かけのＴｍは、いくつかの重ね合わせられたアンフォールディング曲線の結果として得られる加重平均でしかなく、複合体の安定性に関する情報は与えない。しかし、これは見かけのΔＨ値においても、従ってその曲線の峻度（ｓｔｅｅｐｎｅｓｓ）においても見ることができる。従って、ΔＨを測定することはＴｍの情報量の推定のための価値ある手段である。従って、Ｔｍのシフトは、曲線の峻度が増大するか、または一定である場合にのみ意味がある。
【００６３】
１００ｋＤａ〜５ＭＤａに至るまでの大きさの範囲の３０種類の複合体が今までに分析された（下記参照）。
全ての場合において、複合体は、高度に濃縮された緩衝物質およびアンフォールディング曲線の連続的な測定のための色素と混合された。結果として得られた曲線を全ての記述されたモデルに当てはめ、さらに分析した。さらに、等しい条件におけるその複合体の陰性染色ＴＥＭ画像を得た。多相曲線または高いｎを有する等式（８）もしくは（９）にのみ当てはまる曲線を結果としてもたらす緩衝条件は、結果として大部分がＥＭにより見られるような凝集または崩壊した試料をもたらした。
【００６４】
図１はそのような条件の例を示す。対照的に、低いｎ、高いΔＨおよび高いＴｍを有する曲線は電子顕微鏡画像において完全な粒子の単分散分布を示した（図１、３番目の列を参照）。
【００６５】
完全なアンフォールディング協同性は大きな不均質な複合体に関しては非常にありそうもなく思われるが、本発明者らは今までに試験した全ての複合体に関して２状態アンフォールディング挙動を示す適切な条件を見付けた。完全な協同性に関して、脱集合はその複合体の協同的集合と逆の様式で一致する。
【００６６】
その理論のさらなる検証のため、複合体をＧｒａＦｉｘ方法論(Kastner, B. ,et al., (2008), Nat. Methods 5, 53-55.)で処理し、ここでその複合体を、その複合体の過酷な構造変化を導入することなく、または構造的完全性を損なうことなく、グルタルアルデヒドでわずかに固定する。この方法はまた、複合体の安定性を増大させ、ならびに単分散複合体をもたらすことが分かった。本発明者らの理論に関する対照として、本発明者らはＧｒａＦｉｘ処理された試料に対してＤＳＦ実験を行い、本発明者らの方法で分析した。全ての場合において、ＧｒａＦｉｘ処理された試料は、大部分は増大したＴｍを有する見かけの２状態曲線を示すがΔＨは一定のままであることが分かった。これは、ＧｒａＦｉｘによるわずかな化学固定は少数の架橋を導入するのみであり、従って集合した状態および脱集合した状態の間のエントロピーの差を低下させる一方で、エンタルピー的寄与の大部分は変化しないままである、という仮定とよく一致している。
【００６７】
データ分析−方法の特徴
ＤＳＦは高スループットスクリーニング技法として用いることができ、それは解釈する必要があるかなりの量のデータを生成する。従って、ＤＳＦ曲線のデータ分析および解釈を最大限可能な程度まで自動化することが望ましい。最小限の使用者との対話処理しか必要としない非常に速いデータ処理を可能にする、上記で導入された理論的背景に基づくスタンドアローンのソフトウェアツールの形態での本発明に従う方法が開発されている。
【００６８】
そのソフトウェアは２個の入力ファイルを必要とする。１つのファイルは、リアルタイムＰＣＲ装置から得られたＤＳＦデータを含有する。第２の入力は、生データ中のそれぞれのＤＳＦ曲線に関する緩衝条件を指定するシンプルテキストファイルである。そのデータの初期の処理には、自動化された機能、例えばバックグラウンドの減算、データの正規化、気泡の検出およびピペット操作のエラーの補正ならびに関連のないデータセットの自動的な識別が含まれる。
【００６９】
そのデータ分析は、レーベンバーグ・マーカートアルゴリズム(Marquardt, D.W. (1963), Journal of the Society for Industrial and Applied Mathematics 11, 431-441.)をχ２測定と共に用いる全ての入力データセットに関する２〜６状態に関する本発明に従う方法による高速曲線当てはめにより行われる。
【００７０】
条件のふるい分けおよび階層的分類。
安定化条件を記述するＤＳＦ曲線を効率的に見付けるため、ふるい分けおよび階層的分類アプローチを適用することができる。
【００７１】
今まで、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒに基づくアッセイはデータ評価に関して排他的にＴｍ値に頼ってきた。これは、ΔＨがヘスの法則に従って全ての条件に関してほとんど等しくなければならないため、完全な２状態アンフォールディング挙動を示す試料に関しては合理的なアプローチである。しかし、タンパク質複合体に関しては、多くのＤＳＦ曲線がこの２状態モデルと似ているが、それらの蛍光における増大は峻度がより小さい可能性がある。より小さいΔＨ、従って異なるエンタルピー的寄与の平均値のみを意味する。Ｔｍ値のみを考慮すると、浅い曲線は、そのＴｍ値が無意味なより高い値へとシフトすると考えられるため、誤解させる結果をもたらすであろう。浅い曲線の形状は、溶液中の複合体の異なる種に帰することができるいくつかのアンフォールディング曲線の重ね合わせの結果である。従って、それは増大した試料の不均質性を示すものである。そのような誤った解釈を避けるため、ＤＳＦ曲線は曲線の峻度に従って予め分類され、それは見かけのΔＨにより記述される。
【００７２】
まとめると、最も安定化する条件に相当するＤＳＦ曲線に関する完全に自動化された検索のために、現在、データの準備およびふるい分けの３つの工程ならびに階層的分類および動的閾値処理の別の３つの工程を有するアルゴリズムが用いられている。
【００７３】
ふるい分けの工程：
（１）全ての曲線に関してバックグラウンドを減算し、それらを０〜１０００の範囲に正規化する。その曲線の最も小さい極小を０に、最も高い極大を１０００にそれぞれ設定する。この区間の間の全ての値を０〜１０００の範囲内で正規化する；この区間の範囲外の全ての値を破棄する。
（２）気泡を含有する試料の曲線は、その曲線の最初のデータの点から最も低い極小までの区間における蛍光値の曲線の平均勾配により識別される。強い負の傾きを有する全てのＤＳＦ曲線を破棄する。
（３）それぞれの曲線を２状態から６状態までのそれぞれのモデルに当てはめ、Ｒ２測定に関して最高に当てはまるものを検出する。最高に当てはまるもののＲ２が０．９９９未満である場合、この曲線は破棄される。
【００７４】
本発明に従う好ましい分類および閾値処理工程：
当てはめの質を定量化するため、Ｒ２測定が用いられる。
【００７５】
【数１０】
0005986207.tif 000011
【００７６】
ここで、Ｒ２は１から残差平方和（ＳＳｅｒｒ）を総平方和（ＳＳｔｏｔ）で割った商を引いたものである。
【００７７】
【数１１】
0005986207.tif 000012
【００７８】
および
【００７９】
【数１２】
0005986207.tif 000013
【００８０】
であり、ここで
【００８１】
【数１３】
0005986207.tif 000014
【００８２】
であり、ｙｉはデータセットの値であり、ｆｉは当てはめられたモデルからの対応する値である。
閾値処理のためのパラメーターは百分率の値として与えることができ、適用の順序は例えば次のように設定することができる：
（１）全ての残っている曲線を２状態モデルに対するそれらのＲ２値により分類し、それらの曲線の最高の５０％（切り上げ）を次の工程に進める。
（２）ここで、残っている曲線をそれらのΔＨ値により分類し、再度最高の５０％（切り上げ）のみを次のレベルに進める。
（３）この最後の工程において、その曲線をそれらのＴｍ値により分類し、最高の５０％（切り上げ）のみが最も安定化する条件を有するその試料の曲線に相当する。
【００８３】
アルゴリズムの結果：
その標本に関する最も安定化する条件に相当する３個までの曲線がこのアルゴリズムの後に残っているであろう。
【００８４】
記述された順位付けシステムは電子顕微鏡法により評価されている。最高の順位を付けられた曲線は、常に結果としてＥＭ格子上の完全な粒子の単分散分布をもたらした。これは、その試料を、結果として得られる安定化緩衝液中でＧｒａＦｉｘ方法論にさらに供する場合に特に当てはまる（Kastner et al.、上記参照）。
【００８５】
追加の特徴
本発明に従う方法は、ピペット操作のエラー、粗悪な試料または他の理由、試料が気泡、色素の結晶もしくはタンパク質凝集物を含有していること、による、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ技法におけるほとんどの一般的な問題に関して追加で補正することができる。これらの全てが、光散乱を、従って高い最初のシグナルをもたらす。そのソフトウェアはそれらの曲線を検出し、さらなる分析においてそれらを無視することができる。類似の効果が、ミセル形成により界面活性剤中で見出される。それらの場合において、そのソフトウェアは二次多項式の減算によりそれらの曲線を補正するであろう。
【００８６】
さらに、本発明に従う方法は、温度に誘導されるｐＨシフトに関して補正することができる。緩衝物質のｐＫＡ値は温度により非常に大きく変動し得るため、これに関して補正しなければならない。その曲線に関するモデル結果パラメーターは、融点に関して正確に決定される。このことは、それらがその融点におけるそのｐＨにおける安定性を記述することを意味する。複合体の安定性の依存性において、ｐＨの違いは重要であり、結果として新規の所望の緩衝液のｐＨの誤解をもたらし得る。これはその物質の供給業者により提供されるΔｐＫＡ／Ｔ値を用いた融点への直線外挿により補正される。それの曲線の形状への影響は、ΔＧＮ−ＵおよびｐＨの間の依存性（Tanford, C. (1970), in Protein Chemistry, J.J.T.E. C.B. Anfinsen, and M.R. Frederic, eds. (Academic Press), pp. 1-95.）ならびにｐＨおよびＴの間の依存性は線形であるため、単一指数関数として当てはめられたＦＵ（Ｔ）により既に補正されている。
【００８７】
さらに、全ての既に確立されたｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒの変形を、ここで大きなタンパク質の集合体に適用することができる。これには酵素学的結合アッセイならびに医薬スクリーニングが含まれる。
【実施例】
【００８８】
実験手順
ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイ
スクリーニングは９６ウェルプレート（ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ９６、白色、低プロファイル、Ｂｉｏｚｙｍｅ）中で２０μｌ反応で実施した。それぞれのウェルは、１０×ＳｙｐｒｏＯＲＡＮＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ）を補った０．１〜１μＭの複合体および適切なスクリーニングプレートの２μＬを含有していた。緩衝物質およびｐＨに関するスクリーニングはｐＨａｔ  ｓｃｒｅｅｎ（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）を用いて、添加剤に関してはＡｄｄｉｔｉｖｅ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＨＴ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を用いて実施した。全てのプレートはタンパク質を含まない、ならびにスクリーニング物質を含まない対照ウェルを含有していた。測定はＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ｕｎｉｔ（ＢｉｏＲＡＤ、米国）中で３０℃〜９５℃の温度範囲で１℃のステップ幅で実施した。それぞれの温度において反応を３０秒間平衡化させておいた。最後に、ＨＥＸチャンネルから得られたシグナルを分析した。
【００８９】
電子顕微鏡法
精製した複合体に適切なスクリーニング物質を補い、１０分間保温し、カスタムメイドの炭素薄膜上に吸着させた。ＣＭ  ２００  ＦＥＧ電子顕微鏡（ＦＥＩ、オランダ）において１６０ｋＶで画像を得た。４ｋ×４ｋ  ＣＣＤカメラ（ＴｅｍＣａｍ−Ｆ４１５；ＴＶＩＰＳ、ドイツ）をピクセルの２倍ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）および８６，０００倍の倍率で用いた。
【００９０】
本発明に従う方法を検証するため、蛍光色素Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下でｐＨＡＴ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｓｃｒｅｅｎの様々な緩衝条件下で、５００ｋＤａの天然分子量を有するホモ１０量体性複合体であるセレノシステインシンターゼ（ＳｅｌＡ）のアンフォールディング遷移を記録した。そのアンフォールディング遷移は本発明に従う方法に基づいて分析した。さらに、それぞれの条件下での試料の分散度を電子顕微鏡法（ＥＭ）により決定した。明確に多相性のアンフォールディング遷移が記録された緩衝条件下で、陰性染色ＥＭにおける大きな凝集物が観察された（図１、左の列）。部分的に３状態の遷移が記録された際、部分的な凝集を示すＥＭ画像（中央のパネル）が得られた。対照的に、見かけ上２状態のアンフォールディング遷移をもたらした条件は、ＥＭにより単一粒子の単分散領域（ｆｉｅｌｄ）を示した（右のパネル）。従って、本発明に従う方法により決定されるような単一熱アンフォールディング遷移を実際に複合体に関して得ることができ、それは高分子複合体の単分散および安定性を示している。これらの発見は、高分子複合体が上記で概説したような安定化条件下で実際に見かけ上２状態の様式でアンフォールディングすることを予測する、理論上の熱力学的考察とよく一致している。安定化条件下でのこの驚くべき複合体の挙動は、本発明に従う方法との組み合わせでのＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ法を、例えば国際公開第２０１０／１０９２０４号における以前の記載とは対照的に、高分子複合体の安定性を最適化するための有用な道具にする。
【００９１】
本発明に従う方法の有効性に関する次の原理証明において、熱アンフォールディングが単一ドメインタンパク質に関して記述されている(Ericsson et al. 2006, Analytical Biochemistry, 357:289-298)のと類似して分子機械を安定化する小さい分子を見付けるのに適しているかどうかが決定された。これに関して、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ（それぞれホモ１４量体の８００ｋＤａおよびホモ７量体の７０ｋＤａ）シャペロニン系が分析されている。シャペロニン系の２つの重要な特性は文献において十分に記述されている(Sigler et al., 1998, Annual Reviews in Biochemistry, 67:581-608; Tang et al., 2006, Cell, 125:908-914)。まず、ＧｒｏＥＬは二重の７量体性環構造を形成し、それは疎水性残基を１つの面上に露出し、そこに未変性でない基質タンパク質が結合することができる。次に、アデニン−ヌクレオチドのＧｒｏＥＬへの結合が立体構造変化を誘導し、それは前に露出した疎水性残基を埋め込ませ、それはＧｒｏＥＬの二重の環の１つの面にＧｒｏＥＳが結合するのに不可欠である。従って、等モルのＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳの本発明に従う測定は、溶媒に曝露した疎水性残基のために高い初期蛍光を生じるはずであり、それは温度ランピング（ｒａｍｐｉｎｇ）の際に徐々に低下する。ｄＡＴＰまたはＡＴＰのどちらかの存在下では、この高い初期強度は存在せず、単一の（見かけの２状態の）アンフォールディング遷移が観察され、これはＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ複合体の形成を示している（図２参照）。従って、本発明に従う方法は分子機械の小分子安定化剤を決定するのに適している。
【００９２】
次に、細胞分子機械の別の豊富なクラスである核酸−タンパク質複合体を研究した。それは、生化学および構造生物学の両方により数十年間広範囲にわたって研究されてきたリボソームを用いて開始した。様々な源からのリボソームの精製に関していくつかの十分に確立されたプロトコルが存在し、それは構造生物学を実施することができる安定な粒子をもたらす。従って、本発明者らは標準的なプロトコルに従ってＨｅＬａ細胞から８０Ｓリボソームを精製し、それらに対して本発明に従う方法を実施した。ＨｅＬａの８０Ｓリボソームは８０個より多くのタンパク質および４個のＲＮＡからなる。驚くべきことに、本発明に従う方法を用いて、８０Ｓリボソームのほとんど２状態のアンフォールディング挙動が得られた。
【００９３】
これらの単一遷移が完全な粒子に対応しているかどうかを検証するため、本発明者らはそれらに対して勾配遠心分離およびそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＨｅＬａのリボソームに関して予想されるようなおおよその８０Ｓのスベドベルグ定数を有する単分散的に沈降する粒子の種が見付かった。次いで精製した８０Ｓリボソームを５０ｍＭ  ＥＤＴＡで処理し、それに対して本発明に従う方法を実施した。これらの条件下では、８０Ｓリボソームを安定化する二価のＭｇイオンが滴定して除かれ（ｔｉｔｒａｔｅｄ  ａｗａｙ）、リボソームの４０Ｓおよび６０Ｓサブユニットの混合物が形成されることが記述されている。これは密度勾配分析により検証することができ、本発明に従って多相遷移がもたらされた（図３）。要約すると、本発明に従う方法は核酸−タンパク質複合体の安定性を決定および最適化するのにも適している。
【００９４】
最後に、本発明の方法が高分子複合体の安定性の最適化に適していることの十分な証明を提供したので、構造生物学に関して不十分にしか特性付けされていない分子機械を分析した。
【００９５】
この目的のため、ビオンファラリア・グラブラタ（Ｂｉｏｍａｐｈａｌａｒｉａ  ｇｌａｂｒａｔａ）のヘモグロビン（ＢＧＨｂ）を選択した。ＢＧＨｂは、１３個の異なるシステインを含まないグロビンドメイン、それに加えてサブユニットの二量体化のための３個のシステインを有する小さいＮ末端の非グロビンの“プラグ”ドメインからなる(Lieb et al. 2006, PNAS)。これらのサブユニットは３×２ジスルフィド結合したサブユニットの四次構造を形成することが報告されており、それは約１．４ＭＤａの総質量を形成する。ＢＧＨｂを以前に記述されたように(Lieb et al. 2006, PNAS, 103:12011-12016)陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、凝集状態をＥＭにより決定した（図４）。電子顕微鏡写真は、様々な程度の解離した粒子および凝集物を有する多分散試料を明らかにした。次いでＢＧＨｂに対して本発明に従う方法を実施した。ＢＧＨｂがアルカリ性から酸性ｐＨ値までのイミダゾール緩衝液中で徐々に安定化することが観察された。実際、８．２のｐＨからｐＨ５．８までにおいて、ＢＧＨｂの熱安定性は４５ケルビン高められた。注目すべきことに、そのｐＨＡＴ  ｓｃｒｅｅｎにおける任意の他の緩衝系中ではＢＧＨｂに関する熱アンフォールディング遷移は一切観察されておらず、これは強い不安定化を示唆している。従って、ＢＧＨｂをｐＨ５．８におけるイミダゾール中に再緩衝し、その凝集状態をＥＭにより再評価した（図４）。これらの条件において、いくらかの量の解離したサブユニットを有するＢＧＨｂの明確に識別可能な単一粒子が見付かった。ｐＨ５．８におけるイミダゾール中のＢＧＨｂに対してさらにＧｒａＦｉｘ(Kastner et al., Nature methods, 2008, 5:53-55)処理を行った際、粒子の単分散領域を有するＥＭ顕微鏡写真が得られ（図４）、それは明らかに構造生物学に適用することができる。特に、この全手順は２４時間以内に成し遂げることができた。従って、本発明に従う方法は、好ましくはＧｒａＦｉｘ(Kastner et al., Nature methods, 2008, 5:53-55)との組み合わせで、構造決定プロジェクトの方向を絶望的から非常に有望に転換する能力を有する。
【００９６】
図５および６において、本発明に従う方法が、それぞれ流れ図で、および典型的な曲線として、詳細に示されている。それぞれのプローブの温度にわたる蛍光の生データは、それぞれのプローブに関するそれぞれのデータ情報と組み合わせられる。次いで、６より多くの関連する極大を有するデータセットならびに参照試料またはプローブを除外する（図６の第１および第２の列も参照）。
【００９７】
続いて、緩衝液の参照値を平均し、データセットから減算する。加えて、そのデータセットを示されたように正規化する（図６の第３の列も参照）。加えて、気泡または結晶化のために異常な構造を示すデータセットを除外する（図６の第４の列も参照）。
【００９８】
残りのデータセットを本発明に従って２〜６状態に関するモデルに当てはめることにより、分析を継続する。従って、様々なパラメーターがそれぞれの当てはめに関して、特にそれぞれの２状態モデルに関して、計算される（図６の第５または最後の列も参照）。さらに、最高に当てはまるモデルに関する様々なパラメーターを抽出する。
【００９９】
様々なパラメーターを計算した後、そのデータセットを概説したようにその様々なパラメーターを考慮して分類する。最後に、残っている曲線を、例えばその曲線を重ねることにより比較して最高の安定化条件を同定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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