(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個からｎ個までの別個のメンバーを含む組み換えポリクローナルタンパク質を発現することができるポリクローナル細胞株の作成のための方法であって、前記方法が：
ａ）発現ベクターの１セットであって、前記ベクターの各々が前記ポリクローナルタンパク質の別個のメンバーをコードする別個の核酸の少なくとも１コピーを含むものを提供し；
ｂ）発現ベクターの細胞ゲノムへの部位特異的な組み込みを回避する条件下で、前記発現ベクターの各々で宿主細胞を別々にトランスフェクトし、それにより２からｎ個の細胞の組成物であって、各々の組成物がポリクローナルタンパク質の１つの別個のメンバーを発現するものを得て；そして
ｃ）前記２からｎ個の細胞の組成物を混合してポリクローナル細胞株を得ること
を含み、
ここで、工程ｂ）で得られたトランスフェクトされた細胞は単一細胞クローニングに付され、
前記ポリクローナルタンパク質の各別個のメンバーは所定の標的結合活性を有する、方法。
【請求項２】
発現ベクターが、宿主細胞の１つまたはそれ以上の染色体に安定的かつ無作為に組み込まれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞が、ＦＡＣＳクローニングを用いてクローン化される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
クローンが、増殖率、倍加時間、発現レベル、産生レベル、長期間にわたる産生の安定性、生存率、耐性、構造安定性、形態、およびコピー数からなる群から選択される少なくとも１つの判断基準について選択される、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
クローンが、少なくとも１つの判断基準に関する均一性について選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
倍加時間および発現レベルに関する均一性について選択することを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
１個のクローンが、各々別個のポリクローナルタンパク質のメンバーについて選択される、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
１個より多くのクローンが、各々別個のポリクローナルタンパク質のメンバーについて選択される、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項９】
発現ベクターが、ポリクローナルタンパク質をコードする配列における変動を除いて同一である、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞が、トランスフェクション前のクローン集団である、請求項１〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
ポリクローナルタンパク質が多量体タンパク質である、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
１つの発現ベクターが、１つの別個のポリクローナルタンパク質のメンバーの全てのサブユニットをコードする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）における発現ベクターのセットが発現ベクターの２つまたはそれ以上のサブセットを含み、第１のサブセットが、タンパク質の１つのサブユニットをコードする変異核酸配列を含み、第２のサブセットが、タンパク質の別のサブユニットをコードする変異核酸配列を含むものであって、各トランスフェクションが、発現ベクターの第１のサブセットのメンバーおよび第２のサブセットのメンバーを用いて実施されるものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
発現ベクターまたはさらなる発現ベクターが選択可能なマーカーをコードする、請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
選択可能なマーカーが、ポリペプチドメンバーまたは前記ポリペプチドメンバーのサブユニットもコードする転写物によりコードされるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ポリクローナルタンパク質が、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体フラグメントである、請求項１〜１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ）における発現ベクターのセットが発現ベクターの２つのサブセットを含み、第１のサブセットが、抗体重鎖をコードする変異核酸配列を含み、第２のサブセットが、抗体軽鎖をコードする変異核酸配列を含むものであって、各トランスフェクションが、発現ベクターの第１のサブセットのメンバーおよび第２のサブセットのメンバーを用いて実施されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ポリクローナル抗体が、重鎖および／または軽鎖の同一の定常領域を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞が真核細胞である、請求項１〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
真核細胞が、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、線維芽細胞、ならびにＨｅｌａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＰＥＲ．Ｃ６細胞を含む不死化ヒト細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞が、ポリクローナルタンパク質の発現のためにコードするプロモーターをトランス活性化することができる組み換えトランスアクチベーターを発現する、請求項１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
組み換えポリクローナルタンパク質の製造のための方法であって、前記方法が：
ｄ）請求項１〜２１のいずれかの方法によりポリクローナル細胞株を提供し；
ｅ）ポリクローナルタンパク質の発現を可能にする条件下で、ポリクローナル細胞株を培養し；次いで
ｆ）細胞または培地からポリクローナルタンパク質を回収し、任意選択的に精製すること
を含む、方法。
【請求項２３】
回収され、任意選択的に精製されるポリクローナルタンパク質における別個のメンバーの各々の存在を確認する工程をさらに含む、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンスーパーファミリー、例えば、ＢまたはＴ細胞受容体の可溶または膜結合形態に由来するタンパク質のごとき組み換えポリクローナルタンパク質の産生に関し、部位特異的な組み込みに依存しない産生システムを用いる。
【背景技術】
【０００２】
感染症および癌のごとき多くの疾患は効果的な治療を欠いている。モノクローナル抗体は、一般に、モノクローナル抗体の認識からの免疫エスケープを引き起こす複雑な標的の可変性や標的タンパク質の適応変異のため、これらの標的の全てに対して成功していなかった。一方で、ポリクローナル抗体は、複数の動的な標的、例えば、ウイルス、細菌、または癌細胞を標的とすることができる。また、ポリクローナル抗体は、抗原変異時に活性を維持する最も高い確率を示す。
【０００３】
異なる市販されているポリクローナル抗体治療薬は、１）正常なヒトドナーの血液から単離された正常なヒト免疫グロブリン；２）特定の疾患標的、例えば、感染またはワクチンのいずれかを通して以前に遭遇したウイルスに対する抗体を保有する個々のヒトドナーの血液に由来するヒト高力価免疫グロブリン；ならびに３）免疫された動物の血液に由来する動物高力価免疫グロブリンを含んでいる。
【０００４】
ヒト血液から精製された免疫グロブリンは、Ｂ型肝炎、呼吸器多核体ウイルス、サイトメガロウイルスおよびその他のヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ボツリヌス毒素などを用いる感染に対して、ならびに新生児アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  Ｄ）の予防において、証明された有効性を有する。ヒトＴ細胞で免疫されたウサギの血液から精製された免疫グロブリンは、移植拒絶の治療または予防においてＴ細胞免疫抑制を提供するのに用いられる（例えば、サイモグロブリン）。正常なヒト免疫グロブリンは、免疫不全患者の免疫系、ならびに様々な自己免疫疾患の治療において追加免疫するのに利用されている。
【０００５】
それにもかかわらず、広範な免疫グロブリンの使用は、原材料のドナー血液の制約された供給、バッチごとの変化、および不安定な安全性により限定されている。動物由来の免疫グロブリンは、特に、１９８０年代および１９９０年代における動物由来のモノクローナル抗体で見られたものと同じ免疫原性の問題に直面している。結局、その他の血液産物と同様に、ＨＩＶ、ヘルペスまたは肝炎ウイルスまたはプリオンのごとき感染病原体のごとき感染のリスクは残存する。したがって、治療者はポリクローナル抗体がある状況では好ましい治療薬であると認めるが、それらの使用は非常に限定されている。
【０００６】
ヒト免疫グロブリンを作成する新しいアプローチは、トランスジェニック動物技術を用いて起こった。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック動物が作出された（米国特許第６，１１１，１６６号）。これらのマウスは完全なヒト免疫グロブリンを産生し、特異的な標的に対する抗体は通常の免疫技術により作り出すことができる。しかしながら、より大きな抗体の発生は、比較的小さいマウスのサイズのために限定される。より大きな動物、例えば、ウシもまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関するトランスジェニックが作成された（Kuroiwa, Y. et al. Nature Biotechnology; 2002; 20: 889-893）。しかしながら、かかる動物の血液に由来する治療のためのポリクローナル抗体を産生することは、合併症を伴わないわけではない。第１に、動物およびヒトの免疫生理学は、生じる免疫レパートリー、機能的な再編成、および抗体反応の多様性における相違を引き起こす、大きな差異を示しうる。第２に、導入された免疫グロブリン遺伝子座の分裂不安定性が抗体の長期間の産生に影響を与えるかもしれない。第３に、例えば、動物の抗体産生がヒト抗体の産生を超えないようにするため、その動物自身の免疫グロブリン遺伝子座を欠失することは技術的な挑戦である。第４に、ウイルス、プリオンまたはその他の病原体のごとき感染病原体の感染のリスクは、動物で産生されたヒト抗体の投与に付随する。
【０００７】
最近、産生時においてドナー利用可能性に依存しない新しいタイプのポリクローナル抗体が開発された。これらのポリクローナル抗体は、所望の標的に対して免疫応答を示すドナーから核酸配列をコードする抗体を単離し、続いて所望の標的に特異的に結合する抗体についてスクリーニングすることにより作成される。ポリクローナル抗体は、適応された哺乳動物発現技術により製造されてもよく、この技術は、WO 2004/061104に記載されるごとく、１つの抗体発現プラスミドの核細胞の同一ゲノム部位への部位特異的な組み込みに基づくものである。この新しいタイプのポリクローナル抗体の一例は、アカゲザルＤに対する組み換えポリクローナル抗体である（WO 2006/007850）。部位特異的な組み込みの使用は、各細胞が単一コピーを含み、発現レベルおよび増殖率が相対的に均一であることが期待される細胞集団を生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、組み換えポリヌクレオチドタンパク質の産生のための代替的な方法を提供し、それらは部位特異的な組み込みと無関係であり、それゆえにタンパク質の多クローン性を維持しつつ、産生細胞株の選択に関する柔軟性の増加を提供する。さらに、発現レベルは、部位特異的な組み込みで見込まれるより高くなりうる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のアプローチは、目的の各遺伝子の宿主細胞への無作為な組み込み、好ましくは続いて所望の特徴を有する単一細胞のクローニングに基づくものである。各細胞クローンは、それぞれポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを産生し、次に、ポリクローナルタンパク質の産生のためのポリクローナル製造細胞株を作成するために混合される。
【００１０】
ポリクローナル抗体は、一般に、最もよく知られたポリクローナルタンパク質である。同じことがＴ細胞受容体（ＴｃＲ’ｓ）について行われ、組み換え発現系で産生される場合には、ポリクローナル抗体のような治療の可能性を有しうる可溶型形態で得ることができる。しかしながら、本発明の組み換え発現系を用いて、必ずしも相同ではないタンパク質、例えば、特定の欠損または疾患に公知の関連を有する異なるタンパク質に結合することも可能である。本発明は、ポリクローナル抗体により例示されるが、一緒に製造することが所望されうるポリクローナルＴｃＲ’ｓおよびその他のポリクローナル抗体に及ぶことが意図される。かかるタンパク質はまた、所望により融合タンパク質であってもよい。
【００１１】
本発明は、例えば、医薬組成物における使用のための、１つの容器における組み換えポリクローナルタンパク質の商業的な産生を可能にする。本発明の１つの重要な特徴は、製造プロセス間のポリクローナルタンパク質を構成する各分子の偏った発現が低いレベルで保持され、所望しないバッチ間の変動を最小にし、製造中のポリクローナル抗体のメンバーの除去を回避する。
【００１２】
１の態様において、本発明は、２からｎ個の別個のメンバーを含むポリクローナルタンパク質を発現することができるポリクローナル細胞株の作成方法であって、前記方法が：
ａ）発現ベクターの１セットであって、前記ベクターの各々が前記ポリクローナルタンパク質の別個のメンバーをコードする別個の核酸の少なくとも１コピーを含むものを提供し；
ｂ）発現ベクターの細胞ゲノムへの部位特異的な組み込みを回避する条件下において、宿主細胞を前記発現ベクターの各々で別々にトランスフェクトし、それにより２からｎ個の細胞の組成物であって、各組成物がポリクローナルタンパク質の１つの別個のメンバーを発現するものを得て；
ｃ）前記２からｎ個の細胞の組成物を混合してポリクローナル細胞株を得ること
を含む方法を関する。
【００１３】
好ましい具体例において、ポリクローナル細胞株は、ポリクローナルを製造する細胞株として使用され、凍結され、保存され、ポリクローナルマスター細胞バンク（ｐＭＣＢ）として使用され、そのサンプル（例えば、アンプル）が溶解され、組み換えポリクローナルタンパク質の製造に直接用いられうるか、またはポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＷＣＢ）の作成に用いられうる。
【００１４】
１の具体例において、発現ベクターはエピソームベクターである。別の好ましい具体例において、発現ベクターは、安定かつ無作為に宿主細胞ゲノムに組み込まれる。発現ベクターは、宿主細胞の１つまたはそれ以上の染色体における無作為な位置に安定に組み込まれてもよい。
【００１５】
好ましくは、工程ｂ）で得られたトランスフェクトされた細胞がクローン化される。１の具体例において、クローニングは、本明細書に記載されるごとくＦＡＣＳクローニングを用いて行われる。
【００１６】
クローンは、増殖率、倍加時間、発現レベル、産生レベル、長期間にわたる産生の安定性、生存率、耐性、構造安定性、形態、およびコピー数：からなる群から選択される少なくとも１つの判断基準について選択されてもよい。好ましくは、クローンは、少なくとも１つの判断基準に関する均一性について選択される。より好ましくは、クローンは、倍加時間および発現レベルに関する均一性について選択される。
【００１７】
１個のクローンまたは１個より多いクローンは、各々別個のポリクローナルタンパク質メンバーについて選択されてもよい。それゆえ、２個のクローンは、各々別個のポリクローナルタンパク質メンバーについて選択されてもよく、あるいは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のクローンが選択されてもよい。
【００１８】
異なる別個のメンバーを発現する細胞の組成物は、１：１の比率、または１：１の比率とは異なる比率で混合されてもよい。
【００１９】
好ましくは、発現ベクターは、ポリクローナルタンパク質のコーディング配列における変動を除いて同一である。
【００２０】
前記方法は、単量体および多量体タンパク質の両方に適用することができる。
【００２１】
多量体タンパク質の場合には、１つの発現ベクターは、１つの別個のポリクローナルタンパク質メンバーの全てのサブユニットをコードしてもよい。代替的に、工程ａ）における発現ベクターのセットは、発現ベクターの２つまたはそれ以上のサブセットからなり、第１のサブセットは、タンパク質の１つのサブセットをコードする変異核酸配列を含み、第２のサブセットは、タンパク質の別のサブセットをコードする変異核酸配列を含むものであって、各トランスフェクションは、発現ベクターの第１のサブセットに由来するメンバーおよび第２のサブセットに由来するメンバーを用いて実施される。このトランスフェクションは、同時であってもよく、連続的であってもよい。特に、工程ａ）における発現ベクターのセットは、発現ベクターの２つのサブセットからなっていてもよく、第１のサブセットは、抗体重鎖をコードする変異核酸配列を含み、第２のサブセットは、抗体軽鎖をコードする変異核酸配列を含むものであって、各トランスフェクションは、発現ベクターの第１のサブセットに由来するメンバーおよび第２のサブセットのためのメンバーを用いて実施される。
【００２２】
発現ベクターまたはさらなる発現ベクターは、好ましくは、選択可能なマーカーをコードする。さらに、細胞は、選択可能なマーカーを発現する細胞の増殖に適切な条件下において継続的に培養される。これは、宿主細胞が欠失する遺伝子産物を含む選択可能なマーカーを用いることにより確認されることが最良である。１の具体例における選択可能なマーカーは、ポリペプチドメンバーまたは前記ポリペプチドメンバーのサブユニットもコードする転写物によりコードされ、好ましくは、選択可能なマーカーは、最も大きなサブユニットをコードする転写物によりコードされる。
【００２３】
本発明の１の態様は、ポリクローナルタンパク質の製造方法であって、前記ポリクローナルタンパク質が２〜ｎ個の別個のメンバーであり、前記方法が：
ａ）本発明の方法を用いて得られたポリクローナル細胞株を提供し；
ｂ）ポリクローナルタンパク質の発現を可能にする条件において、ポリクローナル細胞株を培養し；次いで
ｃ）細胞または培地からポリクローナルタンパク質を回収し、任意選択的に精製すること
を含む方法に関する。
【００２４】
本発明者らは、驚くべきことに、各クローンの配分は、組み換え製剤の工業的製造のための条件の代表例である産生サイクルの模擬実験の間に維持されることを測定した。このことは、ポリクローナル抗体の各メンバーの発現ベクターが異なる位置に組み込み、さらにコピー数が異なるから、非常に驚くべきことである。このことは、発現レベルと増殖率の両方の差異を引き起こしうる。
【００２５】
予想に反して、製造は、ポリクローナル抗体の１またはそれ以上のメンバーの完全な、または部分的な喪失を生じなかった。異なる細胞株間の増殖率におけるわずかな差異であっても、長い期間のうちにはポリクローナル組成物がポリクローナル組成物の少なくとも１つのメンバーの完全な、または部分的な喪失を生じることが予想される。それゆえ、本発明の態様において、組成物の安定性は、ワーキング細胞バンクの溶解後の１０回より多い細胞分裂、好ましくは、１５回より多い細胞分裂であり、２０回より多い細胞分裂のごときであり、例えば、２５回より多い細胞分裂であり、３０回より多い細胞分裂のごときであり、例えば、４０回より多い細胞分裂であり、５０回より多い細胞分裂のごときであり、例えば、７５回より多い細胞分裂であり、１００回より多い細胞分裂のごとき間で維持される。
【００２６】
添付の実施例は、組成物の安定性が２５回より多い細胞分裂間で許容可能な限定内で維持されることを示す。
【００２７】
別々のトランスフェクションが多くの場合に好ましい一方で、トランスフェクション前の発現ベクターの貯留（ｐｏｏｌｉｎｇ）が一定条件下で可能である。ポリクローナルタンパク質が単量体である場合、これは、１つの細胞がいくつかの異なるメンバーのポリクローナルタンパク質を発現することが問題ではないため、実際の選択肢である。ポリクローナルタンパク質が多量体である場合、トランスフェクション前の発現ベクターの貯留（ｐｏｏｌｉｎｇ）は、わずか１コピーが全細胞に挿入されることを確認するのに用いられる手段があればという可能性でしかない。他にも、所望していないサブユニットのスクランブリングが生じるかもしれない。
【００２８】
発現ベクターの貯留は、限定された可能性である一方で、組成物の安定性の面であまり強力ではない製造システムを生じることが予想されるため、別々のトランスフェクションより好ましくはない。
【００２９】
本発明の両方の方法において、ポリクローナルタンパク質は、通常、発現がなされる細胞に本来的に関連しない１つであると理解されている。
【００３０】
本発明は、ポリクローナルを製造する細胞株に適当な細胞の集合物を作成するために、変異核酸配列のライブラリーが宿主細胞に導入されうることによるいくつかの方法を記載する。これらの方法は、ライブラリーを用いる細胞集合物のバルク（ｂｕｌｋ）トランスフェクション、ライブラリーのフラクションを用いる細胞のアリコートのセミバルク（ｓｅｍｉ−ｂｕｌｋ）トランスフェクションまたは、好ましくは、宿主細胞がライブラリーの各メンバーでトランスフェクトされ、続いて選択によって得られたクローンの貯留を行うことによる各トランスフェクションを含む。好ましくは、本発明は、宿主細胞株として哺乳動物細胞（細胞株または細胞タイプ）を利用する。
【００３１】
本発明の１の態様において、ポリクローナルタンパク質の各メンバーは、独自の遺伝子セグメントのペアからコードされる。各メンバーが２個またはそれ以上のポリペプチド鎖からなるポリクローナルタンパク質は、可溶型または膜結合形態の抗体およびＴ細胞受容体を含む。本発明のさらなる具体例において、遺伝子セグメントの１ペアは、抗体重鎖および軽鎖可変領域、あるいはＴ細胞受容体アルファ鎖およびベータ鎖可変領域またはＴ細胞受容体ガンマ鎖およびデルタ鎖可変領域をコードする。
【００３２】
本発明は、さらに、２からｎ個の細胞集団を含むポリクローナル細胞株を提供するものであって、各集団が組み換えポリクローナルタンパク質の別個のメンバーを発現し、細胞がゲノムに無作為に組み込まれた少なくとも１つの発現構築物を含むものである。１の具体例において、少なくとも１つの発現構築物は、染色体外エレメントに無作為に組み込まれる。別の具体例において、少なくとも１つの発現構築物は、宿主細胞の１つまたはそれ以上の染色体の無作為な位置に組み込まれる。
【００３３】
細胞株は、好ましくは、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０、ＹＢ２／０）、ＮＩＨ３Ｔ３、線維芽細胞あるいはＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞のごとき不死化細胞のごとき哺乳動物細胞株に由来する。しかしながら、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌、真菌などのごとき非哺乳動物の原核生物または真核生物の細胞もまた、使用することができる。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、構成プロモーターに作動可能に連結されたアデノウイルスタイプ５トランスアクチベーターＥ１Ａをコードする安定に組み込まれた核酸を含むＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞に関する。
【００３５】
かかる改変されたＣＨＯ細胞株は、本発明のその他の態様を導く実験により構築された。この細胞株は、本発明に記載される実施例に示されるごとく、増殖率と発現レベルの均一性およびこれらの長期間にわたる安定性に関して例外的に安定であることが判明し、それゆえ本発明の方法における使用に特に適用される。後の実験は、Ｅ１Ａ  ｍＲＮＡが２倍のサブクローン化された細胞において検出できないことを示した。これは、顕著な組成物の安定性を示す結果がＥ１Ａ発現のみを原因とし得ないことを意味する。さらに、Ｅ１Ａを安定に発現するＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞株は、極めて安定で高い発現の細胞株を生じると予想される。
【００３６】
好ましい具体例において、細胞株は、ホモ接合体ＤＨＦＲノックアウトであるＤＧ４４細胞株に由来する。この細胞株は、細胞が組み換えＤＨＦＲ発現構築物を含むため、チミジン欠乏培地のみで生存することができる。
【００３７】
好ましい具体例において、本発明の細胞株は、さらに、目的のポリペプチドをコードする安定に組み込まれた発現構築物の少なくとも１コピーを含む。目的のポリペプチドは、多量体タンパク質であってもよく、好ましくは、多量体タンパク質が抗体である。
【００３８】
チミジン欠乏培地における選択を可能にするために、目的のポリペプチドをコードする発現構築物は、さらにｄｈｆｒをコードする。
【００３９】
好ましくは、ｄｈｆｒおよび目的のポリペプチドの少なくとも１つのサブユニットは同一の転写物によりコードされ、より好ましくは、ｄｈｆｒは最も大きなサブユニットをコードする転写物によりコードされる。このことは、所望の産物、目的のポリペプチド、および選択マーカーｄｈｆｒの間に強い連結を生じ、生存する細胞が目的のポリペプチドを発現することを確認する。
【００４０】
目的のポリペプチドの発現をさらに強めるために、目的のポリペプチドの発現は、転写アクチベーターＥ１Ａによりトランス活性化可能な１つまたはそれ以上のプロモーターにより制御されてもよく、好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであるか、ＣＭＶプロモーターに由来するものである。
【００４１】
（定義）
「タンパク質」または「ポリペプチド」によると、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸鎖のいずれかが意味される。タンパク質は、２つまたはそれ以上の組み立てられたポリペプチド、タンパク質のフラグメント、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含む、単量体または多量体として存在することができる。
【００４２】
本明細書で用いられるように、用語「ポリクローナルタンパク質」または「多クローン性」は、好ましくは、免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される、異なるが、相同なタンパク質分子を含むタンパク質組成物を意味する。それゆえ、各タンパク質分子は、組成物のその他の分子に相同であるが、可変ポリペプチド配列の１つまたはそれ以上のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）も含み、ポリクローナルタンパク質の各メンバー間のアミノ酸配列における相違によっても特徴付けられる。かかるポリクローナルタンパク質の公知の例は、抗体もしくは免疫グロブリン分子または（Ｆａｂ  Ｆａｂ２；単一鎖Ｆｖｓなどのごとき）それらの誘導体、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体を含む。ポリクローナル抗体タンパク質は、タンパク質分子の特定のサブセットからなってもよく、例えば、所望の標的抗原に対するポリクローナル抗体の場合、所望の標的に対する共通の結合活性のごとき共通の特徴により定義される。
【００４３】
用語「目的のポリクローナルタンパク質」は、共通の特徴を共有する特定のポリクローナルタンパク質サブセットを含み、この共通の特徴は、例えば、標的抗原に対する結合活性または特異性により記載されるポリクローナル抗体の場合には、所望の標的に対する結合活性のごときであり、前記抗原は、１つまたはそれ以上の、例えば、別々のタンパク質、微生物、寄生虫、細胞型、アレルゲン、または炭水化物分子、あるいは特異的な抗体結合の標的でありうるいずれか他の構造物、分子、または物質、あるいは前記抗原の混合物である。
【００４４】
用語「組み換えポリクローナルタンパク質組成物の１つのメンバー」または「組み換えポリクローナルタンパク質の１つのメンバー」は、異なるが、相同なタンパク質分子を含むタンパク質組成物の１つのタンパク質分子を意味し、各タンパク質分子は、組成物のその他の分子に相同であるが、可変ポリペプチド配列の１つまたはそれ以上のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）も含み、ポリクローナルタンパク質の各メンバー間のアミノ酸配列における相違によっても特徴付けられるものである。
【００４５】
用語「可変ポリペプチド配列」および「可変領域」は、相互に交換可能に用いられる。
【００４６】
用語「組み換えポリクローナルタンパク質の別個のメンバー」は、異なるが、相同なタンパク質分子を含むタンパク質組成物の１つのタンパク質分子を意味し、各タンパク質分子は、組成物のその他のタンパク質に相同であるが、可変ポリペプチド配列の１つまたはそれ以上のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）も含み、ポリクローナルタンパク質の各メンバー間のアミノ酸配列における相違によっても特徴付けられるものである。
【００４７】
用語「抗体」は、血清の機能的な要素を記載し、しばしば、分子の集合物（抗体または免疫グロブリン）または１つの分子（抗体分子または免疫グロブリン分子）のいずれかと称される。抗体分子は、特異的な抗原決定基（抗原または抗原エピトープ）に結合するか、または反応することができ、順に免疫学的エフェクター機構の誘発を導きうる。各抗体分子は、通常、単一特異性とされ、抗体分子の組成物は、モノクローナル（すなわち、同一の抗体分子からなる）またはポリクローナル（すなわち、同一抗原における、または別個の異なる抗原においても、同一または異なるエピトープと反応する異なる抗体分子からなる）であってもよい。各抗体分子は、その対応する抗原に特異的に結合することができる独特の構造を有し、全ての天然の抗体分子は、２つの同一軽鎖および２つの同一重鎖の同じ全体基本構造を有する。抗体はまた、まとめて、免疫グロブリンとしても知られる。本明細書で用いられる用語抗体または抗体群はまた、キメラまたは単一鎖抗体、ならびにＦａｂ、ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントのごとき抗体の結合フラグメント、ならびに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＭのごとき多量体形態を含むものとされる。
【００４８】
用語「ポリクローナル抗体」は、同一または異なる抗原におけるいくつかの異なる特異的な抗原決定基と結合するか、または反応することができる異なる抗体分子の組成物を記載する。通常、ポリクローナル抗体の可変性は、ポリクローナル抗体のいわゆる可変領域に位置すると考えられている。しかしながら、本発明の文脈において、多クローン性はまた、例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ１、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、あるいはマウスアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＡのごとき２つまたはそれ以上の抗体アイソタイプを含む抗体の混合物の場合において、いわゆる定常領域に属する各抗体分子間の相違を記載すると理解することができる。
【００４９】
「目的の組み換えポリクローナル抗体」は、所望の標的または所望の標的セットに結合する能力により特徴付けられる、特定の組み換えポリクローナル抗体サブセットを記載し、前記標的は、例えば、別のタンパク質、微生物、寄生虫、細胞、アレルゲン、または炭水化物分子、あるいは特異的な抗体結合の標的でありうる別の構造、分子、または物質、あるいはこれらの混合物である。
【００５０】
用語「免疫グロブリン」は、一般に、血液または血清中で見出される抗体の混合物の総称として用いられるが、その他の供給源に由来する抗体の混合物を称するのに用いられてもよい。
【００５１】
用語「免疫グロブリン分子」は、例えば、免疫グロブリンの一部、またはポリクローナルまたはモノクローナル抗体組成物のいずれかの部分であるような、各抗体分子を意味する。
【００５２】
ポリクローナルタンパク質のメンバーが抗原に結合することをいう場合、本明細書では、１ｍＭより低く、好ましくは１００ｎＭより低く、さらにより好ましくは１０ｎＭより低い結合定数を有する結合が意味される。
【００５３】
用語「目的の変異核酸分子のライブラリー」は、「目的の組み換えポリクローナルタンパク質」をまとめてコードする核酸分子の集合物を記載するのに用いられる。トランスフェクションに用いられる場合、目的の変異核酸分子のライブラリーは、発現ベクターのライブラリーに含まれる。かかるライブラリーは、典型的に、少なくとも２、３、４、５、６、１０、２０、５０、１０００、１０４、１０５または１０６個の異なるメンバーを有する。
【００５４】
本明細書で用いられるように、用語「別個の核酸配列」は、目的のタンパク質を一緒に構成する異なるポリペプチド鎖をコードしうる核酸配列として理解されるものとする。別個の核酸配列が１つより多いコード配列からなる場合、これらの配列は、二シストロン性転写ユニットの形態であってもよく、あるいはそれらは、適当なプロモーターに作動可能に連結される場合、２つの別々の転写ユニットとして操作されてもよい。他方で、三−および四シストロン性転写ユニットの使用は、目的のタンパク質が３または４個のサブユニットからなる場合か、あるいは選択マーカーが目的のタンパク質またはそれらのサブユニットをコードする核酸と一緒に転写ユニットに含まれる場合にあり得る。好ましくは、本発明の別個の核酸配列は、例えば、ベクターのごとき核酸分子の部分である。１つより多いコード配列が目的のタンパク質の完全な分子を生じさせるのに必要となるいくつかの例は、Ｂ細胞受容体、Ｆａｂ’ｓおよび可変ドメインのごとき抗体および抗体フラグメント、あるいはＴ細胞受容体を含む。細胞に導入される場合、遺伝子は、目的の完全に組み立てられたタンパク質を一緒にコードし、同一ベクターで存在し、それゆえ１つの核酸配列中に一緒に連結される。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「目的の遺伝子」は、目的のタンパク質の１つのメンバーをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子セグメント（ゲノムまたはｃＤＮＡ）からなる核酸配列を意味する。複数形「目的の遺伝子」は、目的のポリクローナルタンパク質をコードする核酸配列のライブラリーを意味する。用語「ＧＯＩ」は、目的の遺伝子の略記として用いられる。
【００５６】
本明細書で用いられるように、用語「ベクター」は、核酸配列が異なる遺伝学的環境間の輸送のために、あるいは宿主細胞における発現のために挿入することができる核酸分子を意味する。ベクターがベクターに挿入された核酸配列の転写のための調節エレメント（少なくとも適切なプロモーター）を保有する場合、ベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。上記の同定されたベクターに導入された核酸配列が本明細書で定義された目的のタンパク質をコードする場合、以下の用語「目的のベクター」および「目的の発現ベクター」が用いられる。用語「アイソタイプをコードするベクター」は、抗体アイソタイプをコードする核酸配列を保有するベクターを意味する。本明細書において、「ファージミドベクター」および「ファージベクター」は相互に交換可能に用いられる。
【００５７】
用語「プラスミド」および「ベクター」は、相互に交換可能に用いられる。本発明は、かかるベクターのその他の形態を含むものとされ、それらは、同等の機能を供し、例えば、プラスミド、ファージミドおよびウイルスゲノムあるいは適当な宿主において所望のタンパク質の産生を指揮することができる核酸分子のいずれかである。
【００５８】
用語「目的のベクターのライブラリーの各メンバー」は、目的のベクターのライブラリーに由来する別個の核酸配列を有する各ベクター分子を記載するのに用いられ、核酸配列は、目的の組み換えポリクローナルタンパク質の１つのメンバーをコードする。
【００５９】
用語「物質移動」は、ベクターの１つの集団からベクターの別の集団への目的の核酸配列の移動を記載するのに用いられ、目的の各ＤＮＡの単離を行うことなく同時に各ＤＮＡについて行われる。かかるベクターの集団は、例えば、可変領域、プロモーター、リーダーを含むか、または目的のエレメントを高めるライブラリーでありうる。次いで、これらの配列は、例えば、ファージベクターから哺乳動物発現ベクターまで前単離することなく移動させることができる。特に、抗体配列においては、この技術は、ライブラリーを、例えば、選択ベクター（例えば、ファージディスプレイベクター）から哺乳動物発現ベクターに移動させても、ＶＨおよびＶＬ間の連結の多様性が失われていないことを確認する。これによりＶＨおよびＶＬの元々のペアリングが保たれる。
【００６０】
用語「トランスフェクション」は、外部ＤＮＡを細胞に導入することに関する広義の用語として本明細書では用いられる。この用語はまた、例えば、形質転換、感染、形質導入またはドナー細胞と受容細胞の融合のごとき、外部ＤＮＡを細胞に導入するためのその他の機能的に同等な方法を含むことが意味される。
【００６１】
用語「選択」は、ある特徴を獲得した細胞が特徴を獲得しなかった細胞から単離することを可能にする方法を記載するのに用いられる。かかる特徴は、細胞毒性薬剤に対する耐性あるいは必須な栄養素、酵素、または色の産生であり得る。
【００６２】
用語「選択可能なマーカー遺伝子」、「選択マーカー遺伝子」、「選択遺伝子」および「マーカー遺伝子」は、目的の遺伝子と一緒に細胞に共導入される選択可能なマーカーをコードする遺伝子（例えば、一定の抗生物質のごときいずれかの細胞毒性薬剤に対する耐性を付与する遺伝子、増殖培地から欠乏されうる必須な栄養素を産生することができる遺伝子、解析可能な代謝産物を産生する酵素をコードする遺伝子、または、例えば、ＦＡＣＳにより選別されうる色素タンパク質をコードする遺伝子）を記載するのに用いられる。
【００６３】
用語「組み換えタンパク質」は、タンパク質のコーディング配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞株から発現されるタンパク質を記載するのに用いられる。
【００６４】
本明細書で用いられるように、用語「作動可能に連結される」は、セグメントが別のセグメントに連結され、その他のセグメントと機能的な関係に置かれることを意味する。例えば、シグナルをコードするＤＮＡは、ポリペプチドの小胞体への移送に関与するリーダーとして発現される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。また、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写を活性化する場合、コーディング配列に作動可能に連結される。
【００６５】
用語「各細胞の大半」は、例えば、８０％より高く、好ましくは、８５％より高く、より好ましくは、９０％、９５％より高く、または９９％またはそれより高い細胞の割合を意味する。
【００６６】
本発明で用いられるように、用語「ゲノム」は、細胞に存在する染色体の通常の相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として文字通り解釈されるのみではなく、細胞に導入され、維持されうる染色体外エレメントとしても解釈される。かかる染色体外エレメントは、ミニ−染色体、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＭＡＣ（マウス人工染色体）、ＨＡＣ（ヒト人工染色体）を含むが、これらだけに限定されない。
【００６７】
用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼを結合されて転写が開始されることに関連するＤＮＡ領域を意味する。
【００６８】
用語「ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄプロモーター」は、プロモーターにより促進される２つの遺伝子フラグメントの転写が反対方向で生じるために、極めて近くに配列されるプロモーターペアを意味する。ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄプロモーターはまた、２つのプロモーター間の無関係の核酸からなるスタッファーで構築されうる。かかるスタッファーフラグメントは、５００より多くのヌクレオチドを容易に含むことができる。
【００６９】
「抗生物質耐性遺伝子」は、抗生物質が細胞で示す阻害または毒性効果を解消し、抗生物質の存在下で細胞の生存と継続的な増殖を確保することができるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００７０】
用語「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ｍＲＮＡにおける正常な５’キャップ構造とは異なる構造を記載する。両構造がＡＵＧコドンを走査し始めるリボソームにより認識されて翻訳が開始されうる。１つのプロモーター配列と２つの開始ＡＵＧを用いることにより、１番目と２番目のポリペプチド配列が単一ｍＲＮＡから翻訳されうる。それゆえ、単一の二シストロン性ｍＲＮＡから１番目と２番目のポリヌクレオチド配列の共翻訳を可能にするために、１番目と２番目のポリヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳ配列の下流にあるポリヌクレオチド配列の翻訳を可能にするＩＲＥＳ配列を含むリンカー配列を介して転写上融合されうる。この場合、転写される二シストロン性ＲＮＡ分子は、両方のキャップされた５’末端および二シストロンＲＮＡ分子の内部ＩＲＥＳ配列から翻訳され、それにより１番目と２番目のポリペプチドの両方が産生されうる。
【００７１】
用語「誘導可能な発現」は、発現が起こるためには、誘導分子の相互作用または共リプレッサー分子と調節タンパク質の解離を必要とする発現を記載するのに用いられる。
【００７２】
用語「構成的な発現」は、通常誘導されない発現を意味する。
【００７３】
用語「スクランブリング」は、ポリクローナルタンパク質の２つまたはそれ以上の別個のメンバーが各々、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーに由来する、２つまたはそれ以上の異なるポリペプチド鎖からなり、各細胞から発現される状況を記載する。この状況は、各細胞が１より多いペアの遺伝子セグメントでゲノムに組み込まれ、各ペアの遺伝子セグメントがポリクローナルタンパク質の別個のメンバーをコードする場合に、生じうる。かかる状況において、遺伝子セグメントから発現されるポリペプチド鎖の意図しない組み合わせが作成されうる。これらのポリペプチド鎖の意図されない組み合わせは、ほとんど治療効果を有さないであろう。
【００７４】
用語「ＶＨ−ＶＬ鎖スクランブリング」は、上記で定義されるスクランブリングの一例である。本実施例において、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子セグメントは、１ペアの遺伝子セグメントを構成する。スクランブリングは、ＶＨおよびＶＬポリペプチドの意図されない組み合わせが細胞から産生される時に生じ、２つの異なるＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子セグメントペアが同一細胞に組み込まれる。かかるスクランブルされた抗体分子は、元々の特異性を保持する可能性がなく、それゆえ治療効果または意図されない治療効果でさえほとんど有しえない。
【００７５】
用語「組み換えポリクローナルを製造する細胞株」は、目的の変異核酸配列のライブラリーでトランスフェクトされたタンパク質発現細胞の集団を意味し、その各細胞は、組み換えポリクローナル製造細胞株を一緒に構成し、目的の組み換えポリクローナルタンパク質の１つのメンバーをコードする目的の別個の核酸配列の１またはそれ以上のコピーを保有するものであって、各コピーは各細胞のゲノムに組み込まれるものである。組み換えポリクローナル製造細胞株を構成する細胞は、例えば、抗生物質選択により、目的の別個の核酸配列の組み込まれたコピーを保持するそれらの能力について選択される。かかる製造細胞株を構成することができる細胞は、例えば、細菌、真菌、酵母のごとき原核生物の細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞、特に、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０、ＹＢ２／０）、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６のごとき不死化ヒト細胞のごとき不死化哺乳動物細胞株でありうる。
【００７６】
用語「バイアス」は、組み換えポリクローナルタンパク質の産生時の現象であって、ポリクローナルベクター、ポリクローナル細胞株、またはポリクローナルタンパク質の組成物が、無作為な遺伝学的変異、各細胞間の増殖速度における相違、異なる発現構築配列間の発現レベルにおける相違、またはＤＮＡのクローニング効率における相違のため、長期間にわたり変化する現象を意味するのに用いられる、
【００７７】
用語「ＲＦＬＰ」は、核酸分子フラグメントの移動ゲルパターンが制限酵素を用いる切断後に解析されることによる方法である、「制限酵素断片長多型」を意味する。
【００７８】
用語「５’ＵＴＲ」は、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域を意味する。
【００７９】
用語「部位特異的な組み込みを回避する条件」は、部位特異的な組み込みを得ることが可能な方法のいずれを含まないトランスフェクション工程を意味する。部位特異的な組み込みは、例えば、宿主細胞の染色体において、リコンビナーゼおよびリコンビナーゼのための認識部位の組み合わせを用いて行うことができる。リコンビナーゼはまた、染色体上の特定の部位を認識するヌクレオチドストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）に共有結合されてもよい。部位特異的な組み込みはまた、相同組み換えを用いて達成することができる―低い効率にもかかわらず―。部位特異的な組み込みを回避することは、組み込みベクターが用いられる場合、しばしば、宿主細胞のゲノムを通じて無作為な位置に組み込みを生じる。
【００８０】
用語「無作為な組み込み」は、無作為である位置における発現ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みを意味する。無作為の辞書中の意味は、各項目、この場合、組み込み部位についての同等な機会が存在することである。細胞を全ての組み込み部位にトランスフェクトする時は、染色体のいくつかの部分が他の部分より組み込みが起きやすいため、組み込みの絶対的に同等な機会を表さない。発現ベクターを特定の組み込み部位に導く手段を何も講じられない場合、可能性のある組み込み部位のグループ内の無作為な位置に組み込まれる。それゆえ、本発明の文脈における「無作為な組み込み」は、発現構築物を所定の位置に導く手段を講じないトランスフェクション法として理解されるものである。発現ベクターを所定の位置に導く手段の非存在は、「無作為な組み込み」を確実にするのに十分である。それにより、組み込み部位は、トランスフェクトされた集団における細胞ごとに変化し、正確な組み込み部位は予測不可能とみなされうる。
【００８１】
用語「安定に組み込まれた」は、宿主細胞ゲノムへの発現ベクターの組み込みであって、この組み込みが、少なくとも２０、より好ましくは３０、より好ましくは４０、より好ましくは５０、７５のごときであり、例えば、１００世代またはそれ以上にわたり安定であり続ける組み込みを意味する。
【００８２】
略記：「ＣＭＶ」＝（ヒト）サイトメガロウイルス。「ＡｄＭＬＰ」＝アデノウイルス主要後期プロモーター。ＳＶ４０ポリＡ＝サルウイルス４０ポリＡシグナル配列。ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質。ＴｃＲ＝Ｔ細胞受容体。ＥＬＩＳＡ＝酵素連結免疫吸着アッセイ。ＬＴＲ＝末端反復配列。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ポリクローナル細胞バンクを作成するためのプロセスの模式的な概略。図１は、ポリクローナル細胞バンク、例えば、ポリクローナルマスター細胞バンクを得ることが必要とされる工程を模式的に示す。ａ）は、ポリクローナルタンパク質の異なる別個のメンバーをそれぞれコードする異なる発現ベクターＮ．Ａ．１、Ｎ．Ａ．２、Ｎ．Ａ．３などを示す。ｂ）は、発現ベクターでトランスフェクトされる宿主細胞を示す。ｃ）は、各細胞にて異なる位置と異なるコピー数における発現ベクターの組み込みを示す。ｄ）は、ポリクローナルタンパク質のメンバーの各々についての細胞クローンの選択を示す。この特定の場合には、図を簡便にするため、ポリクローナルタンパク質の別個のメンバーあたり１つのクローンのみが示される。工程ｅ）は、工程ｄ）で選択されたクローンを混合してポリクローナル細胞バンクを作成することを示す。
【図２ａ】重鎖および軽鎖をコードするプロトタイプベクター。エレメントは以下の通りである：・重鎖（ＶＨ＋ガンマ定常領域）と軽鎖（カッパ０２−２８６）のコーディング領域間にスペーサーエレメントを有する２つの同一のｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄヒトＣＭＶプロモーター・ｂＧＨ＝ウシ成長ホルモンアデニル化配列・ＳＶ４０ｐＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化配列・重鎖と軽鎖のゲノムリーダー・ＩＲＥＳ＋ＤＨＦＲ＝ＥＣＭＶ内部リボソーム進入部位およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡ・ｐＵＣ  ｏｒｉ＝ｐＵＣ複製起点・ｂｌａ、ａｍｐ＝アンピシリン耐性遺伝子
【図２ｂ】Ｅ１Ａ発現ベクターｐＭＬ２９。エレメントは以下の通りである：ベクターはｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づくものである。ＣＭＶ＝ヒトＣＭＶプロモーターＥ１ａ＝アデノウイルスタイプ５  １３ＳトランスアクチベーターのｃＤＮＡｂＧＨ＝ウシ成長ホルモンアデニル化領域ＳＶ４０ＥＰ＝ＳＶ４０初期プロモーターＮｅｏ＝ネオ耐性遺伝子ＳＶ４０ポリＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化領域ＡＭＰ＝アンピシリン耐性をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子
【図３】実験が行われた５週間における混合１〜９のＩｇＧ含有量。
【図４】開始（黒色）と５週間の培養期間の終了（青色）時における混合８の組成物を示すイオン交換クロマトグラフ。
【図５】９個の混合物に由来する最初（灰色）と最後（黒色）のサンプルがイオン交換クロマトグラフィーにより解析され、それぞれ各抗体の含有量が算出され、図示された。
【図６】シードトレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）およびバイオリアクターラン（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｒｕｎ）中の４種の混合物に由来するサンプル（実施例５）がイオン交換クロマトグラフィーにより解析され、それぞれ各抗体の含有量が算出され、図示された。  混合１Ａ〜３Ａは１抗体あたり１クローンを含有した。６個の抗体の各々を発現する細胞クローンは、混合１Ａ（図６ａ）、混合２Ａ（図６ｂ）および混合３Ａ（図６ｃ）で相違した。  混合４Ａ（図６ｄ）は１抗体あたり３個のクローンを含有した。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
組み換えポリクローナルタンパク質発現系
本発明は、好ましくは、免疫グロブリン様ドメインを有するタンパク質の１つのファミリーである免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される組み換えポリクローナルタンパク質の安定した製造方法を提供する。このメンバーのほとんどは、細胞表面認識イベントに関与する。配列解析は、抗体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ分子、いくつかの細胞接着分子およびサイトカイン受容体が高い相同性であることを示唆する。特に、可変領域を含むこのファミリーのメンバーは、本発明による組み換えポリクローナルタンパク質の作成に適当である。かかるメンバーは、抗体、膜結合抗体（Ｂ細胞受容体）、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）、可溶性ＴｃＲ、ＴｃＲ可溶性ドメインフラグメント、ポリペプチドリンカーまたはその他の抗体により連結されたＴｃＲ可溶性ドメインフラグメントあるいはＴｃＲ由来のフラグメントを含む。特に、本発明は、組み換え治療用ポリクローナル抗体とＴｃＲの大規模な製造および産生に用いることができることが意図される。
【００８５】
本発明の製造方法の主な有利な点の１つは、組み換えポリクローナルタンパク質を構成する全てのメンバーが１つまたは数個のバイオリアクターあるいはその等価物で産生することができることである。さらに、組み換えポリクローナルタンパク質組成物は、工程中に組み換えポリクローナルタンパク質を構成する各メンバーを分離することを要せず、単一調製物としてリアクターから精製することができる。対照的に、仮に、（例えば、WO 91/16074で提唱されるごとく）精製されたモノクローナル抗体を混合することにより組み換えポリクローナル抗体組成物を模倣しようとした場合、組成物中に含有される各抗体のバイオリアクターで別々に製造することが必要となるであろうし、抗体は別々に精製されるであろう。かかるモノクローナル混合物の産生は、本明細書に記載されるごとき組み換えポリクローナル抗体またはその他のポリクローナルタンパク質を産生する方法と比較して、極めて費用もかかり、時間と場所も費やすであろう。それゆえ、WO 91/16074に記載されるごとき方法は、かかる混合物に含まれうるモノクローナル抗体数に実施上の制限が当然に生じる一方で、本明細書に記載される技術は、一般に、原則として上限なく、多くの各メンバーを有するポリクローナル抗体を産生することができる。
【００８６】
用いられる宿主細胞株は、好ましくは、生物薬剤学的タンパク質の発現に典型的に用いられるものを含む哺乳動物細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０、ＹＢ２／０）、ＮＩＨ３Ｔ３、ならびにＨｅｌａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６のごとき不死化ヒト細胞である。ＣＨＯ細胞が用いられた本発明において、より好ましくは、改変ＤＧ４４クローンである。この特定の細胞株の選択は、ＣＨＯ細胞が組み換え抗体の製造が広く用いられるという理由、ならびにＤＧ４４クローンが代謝選択マーカーＤＨＦＲと組み合わせて用いられ、コードされた遺伝子の増幅をさらに可能にするという理由で行われた。
【００８７】
ＤＧ４４細胞株は、発現ベクターをコードするＥ１Ａトランスアクチベーターを用いるトランスフェクションにより改変された。これは、目的の遺伝子がＣＭＶプロモーターに作動可能に連結される場合に、全体の収量を増加させた。ＣＭＶプロモーターは、Ｅ１Ａによりトランス活性化される。この改変は、均一な増殖率および異なる抗体について均一で高い発現レベルを示す細胞クローンを供する顕著に安定な細胞株を提供した。それゆえ、改変は、長期間にわたる組成物の安定性を改善すると考えられる。改変された細胞株におけるＥ１Ａ発現を検出する試みは失敗していた。それゆえ、均一な増殖率および均一で高い発現レベルは、単にＥ１Ａ発現のためとされうる。本発明の場合にＥ１Ａ発現が検出できなかったが、なお、Ｅ１Ａ発現を用いるＣＭＶプロモーターがさらにより高く安定な発現レベルとなりうると考えられる。
【００８８】
ＢＨＫ−２１細胞またはＣＨＯ細胞は、好ましくは発現に用いられる。適当なＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ細胞を含むが、これらだけに限定されない。ＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１またはＤＧ４４のごときＣＨＯのＤｈｆｒ−マイナス変異体は、本発明の実施のための好ましい哺乳動物細胞である。これらの細胞は、当該技術分野で周知であり、例えば、メリーランド州、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ）またはニューヨーク州、コロンビア大学のローレンスチェイスン博士（ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１またはＤＧ４４）から広く利用可能である。これらの細胞は、懸濁培養において（または血清を含まない条件下で）十分に増殖させ、および／または低い血清濃度下で増殖でき、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに用いることができる。
【００８９】
細胞は、好ましくはサブクローン化され、ポリクローナルタンパク質のメンバーのうちの高く安定な発現を示すクローンについて選択される。
【００９０】
それゆえ、当業者は、ＤＧ４４クローンを他のクローンに置き換え、ＣＨＯ細胞を記載されるごとき他の哺乳動物細胞に置き換えることができるか、あるいは植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌および細菌を含む他のタイプの細胞を利用することができる。したがって、細胞タイプの選択は、本発明で限定されるものではない。
【００９１】
本発明の方法を用いて得ることができる収量は、用いられる培養条件および宿主細胞の種類を含むが、これらだけに限定されない多くのパラメーターに依存する。本発明の具体例において、収量は、好ましくは、５０ｍｇ／Ｌのタンパク質よりも多く、例えば、６０ｍｇ／Ｌより多く、例えば、７５ｍｇ／Ｌより多く、例えば、１００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、１２５ｍｇ／Ｌより多く、例えば、１５０ｍｇ／Ｌより多く、例えば、２００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、２５０ｍｇ／Ｌより多く、例えば、３００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、４００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、５００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、６００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、７００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、７５０ｍｇ／Ｌより多く、例えば、８００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、９００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、１，０００ｍｇ／Ｌより多く、例えば、２ｇ／Ｌより多く、例えば、３ｇ／Ｌより多く、例えば、４ｇ／Ｌより多く、例えば、５ｇ／Ｌより多い。
【００９２】
本発明の組み換えポリクローナルタンパク質は、異なるが相同なタンパク質分子を含むタンパク質組成物であって、本質的に可変であり、好ましい具体例において、変異核酸のライブラリーが自然発生的な多様性を含むことを意味するタンパク質組成物を網羅することが意図される。それゆえ、各タンパク質分子は、組成物のその他の分子に相同であるが、可変ポリペプチド配列の１つまたはそれ以上のストレッチも含み、このストレッチは、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバー間のアミノ酸配列における相違により特徴付けられる。可変ポリペプチド配列を構成するアミノ酸配列における相違は、わずか１つのアミノ酸であってもよい。好ましくは、アミノ酸配列における相違は、１つより多いアミノ酸を構成する。
【００９３】
通常、ポリクローナル抗体またはＴｃＲの自然の可変性は、いわゆるポリペプチド鎖の可変領域またはＶ−領域に位置すると考えられている。
【００９４】
本発明の１の態様において、ポリクローナルタンパク質における各メンバーは、約８０および１２０の間のアミノ酸長である可変領域を含む。可変領域は、超可変領域、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでもよい。
【００９５】
自然発生的なＴｃＲにおいて、各可変領域に４つのＣＤＲが存在する。自然発生的な抗体において、重鎖に３つのＣＤＲおよび軽鎖に３つのＣＤＲが存在する。
【００９６】
本発明のさらなる態様において、ポリクローナルタンパク質の各メンバーの可変領域は、１および２６の間のアミノ酸長、好ましくは、４および１６の間のアミノ酸長である、少なくとも１つの超可変領域を含む。この超可変領域は、ＣＤＲ３領域に相当しうる。抗体においては、各可変領域は、好ましくは３つの超可変領域を構成する。これらは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当しうる。ＴｃＲにおいては、各可変領域は、好ましくは４つの超可変領域を構成する。これらは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびＣＤＲ４に相当しうる。超可変領域は、本発明の組み換えポリクローナルタンパク質の可変領域内の可変配列を単独で構成してもよい。
【００９７】
本発明の文脈において、ポリペプチド配列における可変性（多クローン性）はまた、例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、あるいはマウスアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、およびＩｇＡのごとき、２つまたはそれ以上の異なる抗体アイソタイプを含む抗体の混合物の場合に、抗体ポリペプチド鎖の、いわゆる、定常領域またはＣ領域に存在する各抗体分子間の相違を示すと理解することができる。それゆえ、組み換えポリクローナル抗体は、可変領域（Ｖ領域）または定常領域（Ｃ領域）またはその両方における各抗体分子間の配列の相違により特徴付けられる抗体分子を含んでもよい。好ましくは、後の精製をかなり容易にするため、抗体は同一のアイソタイプである。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて全て一緒に精製することができるため、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４の抗体を結合することが考えられる。好ましい具体例において、ポリクローナル抗体を構成する全ての抗体は、さらに精製を容易にするため、同一の定常領域を有する。より好ましくは、抗体は、同一の重鎖の定常領域を有する。軽鎖の定常領域はまた、同一の交差した（ａｃｒｏｓｓ）別々の抗体であってもよい。
【００９８】
特定の抗原に結合するタンパク質をコードする変異核酸配列を提供するために、当該技術分野で公知の多くの方法が利用されてもよい。典型的には、本発明は、特定の抗原に結合するタンパク質をコードする核酸の同定および／または単離を可能にするスクリーニング法の使用から利益を得る。これらの方法のいくつかは、濃縮工程または、いわゆるバイオパニングを含み、Ｓｙｍｐｌｅｘ（登録商標）（Mejier et al, 2006, J. Mol. Biol, 358:764-772; WO 2005/042774）、ファージディスプレイ（Kang, A.S. et al. 1991. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 4363-4366）、リボソームディスプレイ（Schaffitzel, C. et al. 1999. J. Immunol. Methods 231, 119-135）、ＤＮＡディスプレイ（Cull, M.G. et al. 1992. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 1865-1869）、ＲＮＡ−ペプチドディスプレイ（Roberts,R.W., Szostak,J.W., 1997. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 12297-12302）、共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ）ディスプレイ（WO 98/37186）、細菌表層ディスプレイ（Fuchs, P. et al. 1991. Biotechnology 9, 1369-1372）、酵母表層ディスプレイ（Boder, E.T., Wittrup, K.D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553-557）および真核生物ウイルスディスプレイ（Grabherr,R., Ernst,W., 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 185-192）、本発明の実施において当該技術分野で知られる全ての方法および興味深い補助（ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ  ａｉｄｓ）となる全ての方法のごとき技術から公知である。ＦＡＣＳおよび磁気ビーズ選別もまた、標識された抗原を用いて濃縮（パニング）用に応用できる。ＥＬＩＳＡ（Dreher, M.L. et al. 1991. J. Immunol. Methods 139, 197-205）およびＥＬＩＳＰＯＴ（Czerkinsky, C.C. et.al.1983. J Immunol Methods. 65, 109-21）のごとき免疫検出アッセイはまた、以下のバイオパニング工程または単独のいずれかで用いることができる。
【００９９】
目的の組み換えポリクローナルタンパク質の組成物は、特定のタンパク質のサブセットを含み、それらは、例えば、所望の標的抗原に対するポリクローナル抗体の場合に、所望の標的に対する共通の結合活性のごとき共通の特徴により定められる。典型的には、ポリクローナルタンパク質組成物は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６個の別個の変異メンバーを有する。ポリクローナルタンパク質組成物において必要とされる別個のメンバー数は、標的の複雑性に依存する。抗体の場合には、標的とされる抗原の複雑性は、ポリクローナル抗体組成物で必要となる別個の変異メンバー数に影響する。小さいか、またはあまり複雑ではない標的、例えば小さいタンパク質に用いる場合、２または３および１００個の間の別個の変異メンバーを含むポリクローナル抗体組成物は、十分であり得、変異体の数は、９０個、または８０個でさえまたは７０個を超えないことが好ましい。多くの例において、別個の変異体の数は、６０個または５０個を超えることがなく、変異体の数は、５個および４０個の間、５個および３０個の間のごとくである範囲が好ましい。一方で、より複雑な標的に対して、２０個から５００個の間の別個の変異メンバーを含むポリクローナル抗体組成物が十分でありうる。抗原が多くの異なる分子を含む極めて複雑な標的では、５０個から１００００個の間の別個の変異メンバーを含むポリクローナル抗体組成物が必要とされうる。
【０１００】
哺乳動物において、抗体または免疫グロブリン分子のごとき血中に遊離しながら循環するか、あるいはＴ細胞受容体およびＢ細胞受容体のごとき細胞表面上に存在するかのどちらかの自然発生的なポリクローナルタンパク質のいくつかの公知の例が存在する。これらの自然発生的なポリクローナルタンパク質の多様性は、いくつかの哺乳動物において、これらのタンパク質の可変領域をコードする遺伝子の遺伝学的組み換えにより行われる。抗体は、さらに、体細胞の変異によりそれらの多様性を増加させることが知られている。本発明は、多様性に関連する配列（例えば、免疫グロブリン分子またはＴｃＲの可変領域またはＣＤＲ領域）を単離し、それらからライブラリーを作成することにより、これらの本質的な多様性を利用することができる。２つの独立した遺伝子セグメント、例えば、抗体可変重鎖および可変軽鎖、ＴｃＲα鎖およびβ鎖、またはＴｃＲσ鎖およびζ鎖からコードされるタンパク質においては、ライブラリーにおける各ベクターはこれらの可変領域をコードする配列の１ペアを構成する。
【０１０１】
自然発生的な多様性を含むライブラリーは、例えば、コンビナトリーライブラリー（可変領域をコードする配列の無作為な組み合わせ）ならびに同族ペアライブラリー（同一細胞に由来する可変領域をコードする配列のペア、例えば、WO2005/042774）である。単離されたＣＤＲ遺伝子フラグメントから作成されたさらなるライブラリーは適当なフレームワークに取り込まれ（例えば、Soderlind, E. et al., 2000. Nat. Biotechnol. 18, 852-856）、かかる抗体またはＴｃＲ可変領域は本発明に適用できる。好ましくは前記ライブラリーがスクリーニングされて所望の特異性を有するサブライブラリー（目的のライブラリー）が得られる。
【０１０２】
タンパク質の多様性はまた、人工的な手法、例えば、合成または変異により作成することができる。変異は、単一タンパク質をコードする核酸配列の無作為な変異または点変異のいずれかであり得、それにより単一タンパク質のポリクローナル集団を作成することができる。人工的な抗体ライブラリーを作成する別の例は、EP0859841に記載され、その方法は、別のＣＤＲライブラリーと組み合わせることができる可変領域フレームワークのライブラリーを作成することに基づく。
【０１０３】
本発明の好ましい具体例において、組み換えポリクローナルタンパク質は、組み換えポリクローナル抗体または抗体フラグメントである。
【０１０４】
本発明の別の好ましい具体例において、組み換えポリクローナルタンパク質は、組み換えポリクローナルＴｃＲまたはＴｃＲフラグメントである。
【０１０５】
それゆえ、本発明の組み換えポリクローナルタンパク質は、異なるアイソタイプまたはより好ましくは異なるサブクラスから構成されうる。免疫グロブリンの多クローン性は、免疫グロブリン分子の定常部または可変領域、あるいは定常部および可変領域の両方で生じうる。
【０１０６】
いわゆる定常領域、特に抗体の重鎖における多クローン性は、抗体の治療適用に関する目的である。様々な免疫グロブリンアイソタイプは、（表１に概略されるごとく）異なる生物学的機能を有し、免疫グロブリンの異なるアイソタイプが自然免疫応答の異なる態様で関与するかもしれないので、治療用抗体を利用する際に組み合わせることが望まれうる（Canfield and Morrison 1991. J.Exp.Med. 173, 1483-91; Kumpel et al. 2002. Transfus.Clin.Biol. 9, 45.-53; Stirnadel et al. 2000. Epidemiol. Infect.124, 153-162）。
【０１０７】
表１：ヒト免疫グロブリンアイソタイプの生物学的機能
【表１】
0005941616.tif 000002
【０１０８】
本発明のさらなる態様は、２〜ｎ個の細胞集団を含むポリクローナル細胞株を含む、組み換えポリクローナルを製造する細胞株であって、各集団が、別個のメンバーの組み換えポリクローナルタンパク質を発現し、細胞が、ゲノムに無作為に組み込まれた発現構築物を含むものである、細胞株である。発現構築物は、好ましくは、ゲノムに安定に組み込まれる。１の具体例の構築物は、１つまたはそれ以上の染色体に組み込まれる。
【０１０９】
ポリクローナル細胞株における細胞集団数、ｎは、３またはそれ以上、例えば、４またはそれ以上であり、例えば、５またはそれ以上であり、例えば、６またはそれ以上であり、例えば、７またはそれ以上であり、例えば、８またはそれ以上であり、例えば、９またはそれ以上であり、例えば、１０またはそれ以上であり、例えば、１１またはそれ以上であり、例えば、１２またはそれ以上であり、例えば、１３またはそれ以上であり、例えば、１４またはそれ以上であり、例えば、１５またはそれ以上であり、例えば、１６またはそれ以上であり、例えば、１７またはそれ以上であり、例えば、１８またはそれ以上であり、例えば、１９またはそれ以上であり、例えば、２０またはそれ以上であり、例えば、２１またはそれ以上であり、例えば、２２またはそれ以上であり、例えば、２３またはそれ以上であり、例えば、２４またはそれ以上であり、例えば、２５またはそれ以上であり、例えば、２６またはそれ以上であり、例えば、２７またはそれ以上であり、例えば、２８またはそれ以上であり、例えば、２９またはそれ以上であり、例えば、３０またはそれ以上であり、例えば、３５またはそれ以上であり、例えば、４０またはそれ以上であり、例えば、４５またはそれ以上であり、例えば、５０またはそれ以上であり、例えば、６０またはそれ以上であり、例えば、７０またはそれ以上であり、例えば、８０またはそれ以上であり、例えば、９０またはそれ以上であり、例えば、１００またはそれ以上であってもよい。
【０１１０】
ほとんどの目的において、ｎは、５０より少なく、例えば、４５より少なく、例えば、４０より少なく、例えば、３５より少なく、例えば、３０より少なくてもよい。
【０１１１】
本発明の１つの重要な具体例は、ポリクローナル細胞株を最終的に混合する前に行われる細胞クローン化工程である。この工程は、クローンのバイアスの発生を最小にすることにより、得られたポリクローナル細胞バンクの収量および安定性の改善を生じる。組み換えポリクローナルタンパク質の１つの別個のメンバーを発現する細胞は、１個またはそれ以上のクローン化細胞、例えば、２個またはそれ以上であり、例えば、３個またはそれ以上であり、例えば、４個またはそれ以上であり、例えば、５個またはそれ以上であり、例えば、６個またはそれ以上であり、例えば、７個またはそれ以上であり、例えば、８個またはそれ以上であり、例えば、９個またはそれ以上であり、例えば、１０個またはそれ以上であり、例えば、１１個またはそれ以上であり、例えば、１２個またはそれ以上であり、例えば、１３個またはそれ以上であり、例えば、１４個またはそれ以上であり、例えば、１５個またはそれ以上であり、例えば、１６個またはそれ以上であり、例えば、１７個またはそれ以上であり、例えば、１８個またはそれ以上であり、例えば、１９個またはそれ以上であり、例えば、２０個またはそれ以上であり、例えば、２１個またはそれ以上であり、例えば、２２個またはそれ以上であり、例えば、２３個またはそれ以上であり、例えば、２４個またはそれ以上であり、例えば、２５個またはそれ以上であり、例えば、２６個またはそれ以上であり、例えば、２７個またはそれ以上であり、例えば、２８個またはそれ以上であり、例えば、２９個またはそれ以上であり、例えば、３０個またはそれ以上であり、例えば、３５個またはそれ以上であり、例えば、４０個またはそれ以上であり、例えば、４５個またはそれ以上であり、例えば、５０個またはそれ以上であり、例えば、６０個またはそれ以上であり、例えば、７０個またはそれ以上であり、例えば、８０個またはそれ以上であり、例えば、９０個またはそれ以上であり、例えば、１００個またはそれ以上のクローン化細胞に由来するものであってもよい。
【０１１２】
上記具体例のさらなる具体例において、（好ましくは免疫グロブリンスーパーファミリーに由来する）ポリクローナルタンパク質をコードする変異核酸配列は、例えば、ドナーから単離された、自然発生的な配列に全て由来する。
【０１１３】
クローン多様性
ポリクローナルタンパク質の１つの特徴は、多くの各々のタンパク質により構成されており、各タンパク質分子が、ポリクローナルタンパク質のその他の分子に相同であるだけでなく、ポリクローナルタンパク質の別個のメンバー間のアミノ酸配列における相違により特徴付けられる可変性を有することである。好ましくは、相違は、ポリクローナル抗体の全体構造の異なる領域に限定される。かかる領域は、例えば、抗体の可変領域またはＴｃＲであり、可能な限り、これらの領域におけるＣＤＲ領域に限定される。この可変性はまた、核酸レベルならびにタンパク質機能レベルの両方、例えば、標的に対する特異性および親和性の相違において同定されうる、多様性として記載することができる。
【０１１４】
細胞株のクローン多様性は、組み換えポリクローナルタンパク質を発現する細胞プールから同定されたクローンにおけるＲＦＬＰにより解析されてもよい。（ＲＴ）−ＰＣＲ産物の配列決定は、クローン多様性を解析する別の可能性を示す。多様性はまた、細胞株により産生される組み換えポリクローナルタンパク質における機能テスト（例えば、ＥＬＩＳＡ）により解析することができる。WO 2006/007853は、ポリクローナル細胞株およびポリクローナルタンパク質の特徴付けの方法を開示する。これらの方法は、細胞株および生じたポリクローナルタンパク質のクローン多様性を解析するために用いることができる。
【０１１５】
クローンのバイアス（すなわち、ポリクローナル抗体を構成する各々の抗体における緩やかな変化）は、存在するならば、トランスフェクションに用いられる最初のライブラリーのクローン多様性を、組み換えポリクローナルタンパク質を発現する細胞のプール（細胞株）中で見出される多様性を比較することにより評価することができる。
【０１１６】
細胞株から発現されるポリクローナルタンパク質のクローン多様性は、ポリクローナル抗体による標的範囲として測定されてもよい。この場合、約２５〜１００％の所望の標的分子がポリクローナルタンパク質により結合される時に、十分な多様性が獲得されたと考えられる。例えば、ポリクローナル抗体の場合、標的抗原の表面上の同定されていないエピトープの少なくとも２５％への抗体の結合は、組成物中の十分な多様性を提供する。好ましくは、標的範囲によるクローン多様性は、少なくとも５０％であり、さらにより好ましくは少なくとも７５％である。抗体について、かかる標的範囲は、例えば、エピトープマッピングにより測定されうる。
【０１１７】
代替的に、クローン多様性は、ポリクローナル組成物の各々のメンバーの配分として測定することができる。この配分は、トランスフェクションにおいて細胞株に元々導入された異なるコード配列の数と比較した、最終ポリクローナルタンパク質組成物における異なる各々のメンバーの総数として測定することができる。この場合、トランスフェクション時に元々用いられたコード配列の少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％などが最終ポリクローナルタンパク質の異なる各メンバーとして同定することができる時に、十分な多様性が獲得されると考えられる。別の方法で発現される場合、ポリクローナルタンパク質の１つのメンバーのみ、あるいは２、３、４または５つのメンバーが、製造時にした場合に、クローン多様性が十分と考えることができる。
【０１１８】
ポリクローナル組成物の各メンバーの配分はまた、各メンバー間の相互の配分に関して測定することができる。この場合には、組成物の単一メンバーが最終クローナルタンパク質組成物においてタンパク質総量の７５％以上を構成する時に、十分なクローン多様性が獲得されると考えられる。好ましくは、各メンバーが、最終ポリクローナル組成物において５０％以上、さらにより好ましくは２５％、最も好ましくは１０％を超えない。ポリクローナル組成物における各メンバーの配分に基づくクローン多様性の測定は、ポリクローナル組成物の特徴付けに関して後述されるアプローチのごときＲＦＬＰ分析、配列解析およびタンパク質分析により行うことができる。
【０１１９】
クローン多様性は、ａ）発現レベルにおける相違の結果として、ｂ）細胞増殖における変動（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の結果として生じうるクローンバイアスの結果として還元されてもよい。かかるバイアスが生じる場合、クローン多様性の喪失のこれらの供給源の各々は、本明細書に記載される方法によるわずかな改変により容易に改善される。
【０１２０】
細胞株における各細胞の細胞増殖率の変動が、長期間にわたりバイアスを組み換えポリクローナルタンパク質の発現に導入し、細胞株により発現される組み換えポリクローナルタンパク質のいくつかのメンバーの存在を増加または減少させることができる。本方法は、宿主細胞のゲノムへの無作為な組み込みに基づきうるので、位置とコピー数の両方がポリクローナル細胞のメンバー間で変化する。このことは、クローン間の増殖率と発現レベルにおける相違を生じる可能性が高い。同様の増殖率を有する細胞クローンを選択することによりこの問題は最小限とされる。さらなる可能性は、ポリクローナルの各メンバーについて１個以上のクローンを用いることである。実施例は、ポリクローナルタンパク質の単一メンバーを発現する３から５個のクローンがポリクローナルタンパク質の各メンバーについてわずか１個のクローンと比較して用いられる場合に組成物の安定性が増加することを示す。
【０１２１】
このことを対処する別の方法は、増殖率、倍加時間、発現レベル、産生レベル、長期間にわたる産生の安定性、生存率、耐性、構造安定性、形態、およびコピー数からなる群から選択される１つまたはそれ以上の基準に関してある所定の範囲内で細胞が均一であることを確認する１つまたはそれ以上の選択基準を用いることである。
【０１２２】
増殖率の変動についての１つの理由は、最初のトランスフェクションに用いられる開始細胞株を構成する細胞集団が異種でありうることである。細胞株における各細胞は、長期間にわたり異なって発生することが知られる。より均一性の開始物質を確実にするために、目的の発現ベクターによるトランスフェクション前に細胞株のサブクローニングまたはサブクローニングの繰り返しは、単一細胞レベルまで細胞株の限定希釈を用いて行われてもよく、各単一細胞を細胞の新しい集団となるまで増殖させる（いわゆる、限定希釈による細胞サブクローニング）。
【０１２３】
よく定義された細胞集団を確実にする単一細胞クローニングのための代替的および好ましい方法は、トランスフェクション後に蛍光活性化細胞選別を用いることである。これは、選別手順の前に行われてもよい。蛍光標識抗体は、ＩｇＧ構築物によりトランスフェクトされた細胞のプールに由来する高い産生細胞を増やすのに用いることができる（Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155）。ＦＡＣＳ選別を用いる利点は、前記方法が（単一細胞をウェルに選別することによる）単一細胞クローニングを一緒にし、同時に各単一細胞の発現レベルについての情報を提供することである。選別法をさらに改善するために、死んだか、死んでいる細胞が捨てられるように生存株が導入されうる。ＦＡＣＳ法は、細胞をせん断応力を含むかなり厳しい条件にかける。これは、間接的に細胞がかかる条件に対する耐性について選択されることを意味する。さらに、ＦＡＣＳ法は、多くの単一細胞を選別することが可能なように自動化される。
【０１２４】
ＦＡＣＳ法はまた、同一レベルの免疫グロブリンを発現する細胞を選別するのに用い、それにより生産性に関して均一な細胞集団を作り出すことができる。同様に、標識色素５，６−カルボキシルフルオロセインジアセテートサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて標識することにより、同様の増殖率を示す細胞がＦＡＣＳ法により選択することができる。
【０１２５】
本発明の重要な具体例は、ポリクローナル抗体の各メンバーについて１つまたはそれ以上のクローン化された細胞株の作成である。単一細胞クローンの調製は、多くの一般的な技術のいずれか１つを用いて行われてもよい。しかしながら、細胞が生存率とＩｇＧレベルについて選択され、ウェルに個々に選別されるＦＡＣＳ細胞選別は、一貫して、ポリクローナルマスター細胞バンクおよび後にポリクローナルワーキング細胞バンクを調製するのに適当である安定なクローンを提供する結果となることがわかった。例えば、Ｍｔｘからの選択圧は、ＦＡＣＳ選別の前または間に取り除かれてもよいが、例えば、ヌクレオシドのない培地で増殖されることによる継続的な選択圧は、好ましくは維持される。各クローンは、好ましくは、細胞選別後に選択圧下における培養の一定日数後に選択される。クローンが選別後の同一日に選択されるので、クローンの増殖率は比較的均一である。このことに加えて、クローンが目視で検査されることにより、元々トランスフェクトされていない細胞株と比較して形態の全体的な変化と低い増殖率を示す細胞が捨てられる。最終的に、抗体発現レベルは、例えば、ＥＬＩＳＡまたはその他の分析技術を用いてアッセイすることができ、発現レベルの高く、比較的均一なクローンが選択されうる。
【０１２６】
増殖率が誘導されたバイアスが発生する場合であっても、各メンバーの喪失または過剰発現は、最終的なポリクローナルタンパク質産物の多様性の要求ならびに長期間にわたる多様性の安定性に応じて、必ずしも重大であり得ない。
【０１２７】
宿主細胞
宿主細胞は、ＤＮＡを染色体に組み込むことができるか、あるいは、ミニ染色体、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＭＡＣ（マウス人工染色体）、またはＨＡＣ（ヒト人工染色体）のごとき染色体外エレメントを保持することができるいずれかの細胞から作成することができる。ＭＡＣおよびＨＡＣは、出典明示により援用されるWO 97/40183に詳細に記載される。好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０またはＮＳ０細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３のごとき線維芽細胞、ならびに、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６のごとき不死化細胞のごとき哺乳動物細胞が用いられる。しかしながら、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌、大腸菌などのごとき非哺乳動物の真核または原核細胞もまた用いられうる。
【０１２８】
本発明の１の具体例において、開始材料として用いられる細胞株は、細胞株の単一細胞レベルへの、いわゆる限定希釈を行い、次いで各単一細胞を、目的のベクターライブラリーを用いるトランスフェクション前に細胞の新しい集団まで増殖させることにより、サブクローン化されてもよい。かかるサブクローン化はまた、所望であれば、正しい細胞株を選択する過程で後に行われうる。単一細胞のクローニングのその他の方法は、ＦＡＣＳクローニング（Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155）、ＬＥＡＰ（登録商標）技術（米国、カリフォルニア州、サンディエゴのＣｙｎｔｅｌｌｅｃｔ）、およびＣｌｏｎｅＰｉｘ（英国、Ｇｅｎｅｔｉｘ）を含む。
【０１２９】
組み込み用ベクター
以下の記載は、哺乳動物発現系の使用に関する。適切な改変を伴って細菌の発現用に本発明の方法を使用することも同様に可能である。
【０１３０】
適当なベクターは、適当な選択遺伝子を含む。哺乳動物細胞発現における使用のために適当な選択遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、グルタミン合成遺伝子（ＧＳ）、トリプトファン合成遺伝子（ｔｒｐＢ）またはヒスチジンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｉｓＤ）のごとき栄養選択可能な遺伝子を含むが、これらだけに限定されない。さらに、選択マーカーは、ヒポキサンチンとチミジン欠乏培地で選択され、さらにメトトレキサートで選択されうるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、ミコフェノール酸で選択されうるキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、真核細胞ではＧ４１８、および原核細胞ではネオマイシンとカナマイシンで選択されうるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）、ハイグロマイシンで選択されうるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ、ｈｇｈ、ｈｇｔ）遺伝子、ピューロマイシンで選択されうるピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ（ｐａｃ）、またはブラストサイジンで選択されうるブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子（Ｂｓｄ）、ゼオシンとブレオマイシンに対する耐性を介在するゼオシン耐性遺伝子（ｓｈ  ｂｌｅ）のごとき、薬剤耐性を有する代謝拮抗物質耐性遺伝子である。最終的に、例えば、フローサイトメトリーにより選別することができるタンパク質をコードする遺伝子はまた、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）またはその他のメンバーのタンパク質、またはベータ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）のごとき選択マーカーとして用いられうる。
【０１３１】
選択マーカーは、別個の発現ベクター上に位置していてもよく、それゆえ、選択マーカーをコードする発現ベクターおよび目的のタンパク質または目的のタンパク質のサブユニットをコードする１つまたはそれ以上の発現ベクターで共トランスフェクションを行ってもよい。選択マーカーはまた、目的のタンパク質をコードする発現ベクターに位置していてもよい。この後者の場合には、選択マーカーは、好ましくは、目的のタンパク質またはそのサブユニットの１つをもコードする転写物上に位置する。これは、例えば、ＩＲＥＳ構築物を用いて実施することができる。抗体のごとき多量体タンパク質の場合には、選択マーカーは、好ましくは、例えば、抗体の重鎖のごとき最も大きなサブユニットをコードする転写物上に位置する。
【０１３２】
目的の遺伝子の組み込みのためのベクターは、さらに、目的の組み換えポリクローナルタンパク質の１つのメンバーをコードするＤＮＡを含み、タンパク質の発現を指令するその哺乳動物自身のプロモーターを前に付ける。目的の組み換えポリクローナルタンパク質のメンバーが１つ以上のタンパク質鎖を含む場合、例えば、そのメンバーが抗体またはＴ細胞受容体である場合、タンパク質鎖をコードするＤＮＡは、その鎖の各々の発現の高いレベルを指示する（二方向性または一方向性の）それら自身の哺乳動物プロモーターが前に付けられうる。二方向性の発現では、ベクターにおけるｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄのプロモーター構成が用いられ、一方向性の発現においては、例えば、ＩＲＥＳ配列と結合した２つのプロモーターまたは１つのプロモーターが発現用に用いられうる。同一の転写物によりコードされ、ＩＲＥＳ配列により分けられた２つの異なるサブユニットを有する二シストロン発現ベクターが同様に考えられる。
【０１３３】
適当なｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄプロモーター構成は、例えば、両方向におけるマウスメタロチオネイン−１プロモーターと一緒のＡｄＭＬＰプロモーター、両方向における伸長因子−１と一緒のＡｄＭＬＰプロモーターまたは両方向におけるＭＰＳＶプロモーターと一緒のＣＭＶプロモーター、あるいは両方向で用いられるＣＭＶプロモーターであるが、これらだけに限定されない。
【０１３４】
抗体の場合では、細胞により発現される重鎖の量が軽鎖の量を超えるべきではないことが経験上示された。それゆえ、軽鎖の発現を指令するプロモーターは、好ましくは、少なくとも重鎖の発現を指令するプロモーターと同程度の強度である。
【０１３５】
機能的なリーダー配列または移行シグナルをコードする核酸配列は、発現ベクターに含まれることにより、遺伝子産物を、細胞小器官のごとき細胞内の小胞体または特定の場所まで指し向けることができる。強いポリアデニル化シグナルは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の３’に位置しうる。ポリアデニル化シグナルは、新生ＲＮＡ転写の終結およびポリアデニル化を確実にし、メッセージの安定性と相関性がある。目的の組み換えポリクローナルタンパク質のメンバーをコードするＤＮＡは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖の両方または抗体フラグメントをコードすることができ、各遺伝子配列は、任意選択的に、前にそれらの哺乳動物プロモーターエレメントおよび／または後に２つの鎖の各々の高いレベルの発現を指令する強いポリＡシグナルが付けられる。
【０１３６】
組み換え用発現ベクターは、組み込み部位における発現の上昇および発現の安定性のために、エンハンサー、抗抑制剤、またはＵＣＯＥ（遍在性クロマチンオープニングエレメント）のごときさらなる転写調節エレメントを保有することができる。エンハンサーは、転写に関連する核タンパク質と特異的に相互作用する核酸配列である。ＵＣＯＥは、クロマチンを開き、または開いた状態にクロマチンを保ち、（WO 00/05393およびBenton et al, Cytotechnology 38:43-46, 2002に詳細に記載される）作動可能に連結された遺伝子の再度産生可能な発現を容易にする。さらなるエンハンサーまたは強めるエレメント（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は、例えば、Girod & Mermod 2003（"Chapter 10: Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein production", pp 359-379 in Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, SC Makrides (ed), 2003, Elsevier Science BV）に記載されるごときマトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含む。抗リプレッサーエレメントは、ＳＴＡＲエレメントを含むが、これだけに限定されない（Kwaks et al Nat Biotechnol. 2003 May;21(5):553-8）。上述される１つまたはそれ以上の調節エレメントが宿主細胞の染色体に組み込まれる場合、それらは異種調節エレメントと呼ばれる。
【０１３７】
ポリクローナルワーキング細胞バンクおよびマスター細胞バンク
本発明の好ましい具体例において、使用はポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＭＣＢ）およびポリクローナルマスター細胞バンク（ｐＷＣＢ）から構成される。
【０１３８】
ｐＭＣＢは、単一アンプルの内容物を溶解し、広げることによりポリクローナルを製造する細胞株の樹立に用いることができ、各細胞株から構成される凍結ストックから作成されてもよい。かかるｐＭＣＢを作成するのに用いられる各細胞株は、ｉ）（実施例２に記載される）単一クローン、ｉｉ）（実施例２に記載される）単一クローンの混合物、またはｉｉｉ）クローンのプール（選択後に得られた単一コロニーのプール）のいずれかから得られる。クローンは、それぞれトランスフェクトされた宿主細胞から得られ、ポリクローナルタンパク質の各メンバーの安定な発現について選択された。安定な発現に関する選択は、当該技術分野で知られている方法、例えば、選択マーカー遺伝子を用いて行われる。本発明の好ましい具体例において、各細胞株は、ｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）を起源とする細胞株を、限定希釈またはｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ＦＡＣＳ解析および選別にかけることにより、あるいは、例えば、ＣｌｏｎｅＰｉｘ  ＦＬのごときロボットを用いて高い発現クローンを選択することにより、クローン化またはサブクローン化された細胞から得られる（下記参照）。上述されるごとくｐＭＣＢを作成するのに用いられる各細胞株は、各細胞株の凍結ライブラリーストック中で前もって保存されていてよく、ｐＭＣＢの作成前に、各別個の細胞株のアンプルが溶解され、広げられる。好ましくは、別個の細胞株は、ｐＭＣＢのその他のメンバーにより産生される抗体の特性とは異なる特性、例えば、異なる抗原特異性、異なる親和性、異なる可変性またはＣＤＲ領域および／または異なる定常領域を有する全長の抗体を発現する。
【０１３９】
ｐＭＣＢを作成するのに用いられる各細胞株は、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを産生する。好ましくは、ポリクローナルタンパク質の各別個のメンバーは特定の抗原に結合する。加えて、各別個のメンバーは、各宿主細胞のゲノムにおける無作為な場所に位置する複数の組み込み体から産生されることが好ましい。ｐＭＣＢは、各別個の細胞株に由来する所定数の細胞を混合することにより作成される。好ましくは、細胞が同数（１：１の比率）で混合されることであるが、その他の比率が所望されてもよい（下記参照）。細胞の混合物は、各バイアルに所定数の細胞で多くのバイアルに分注されるため、一定分量に分けて凍結される。これらのバイアルは、後の製造のために、ｐＭＣＢとして凍結され、保存される。好ましくは、ｐＭＣＢを構成するバイアル数は１０、２５、５０、７５、１００、２００、５００または１０００個のバイアルを超える。ｐＭＣＢにおける別個のバイアルは、ポリクローナルを製造する細胞株の異なるバッチを作成する異なる時点で溶解されてもよく、前記細胞株は、基本的にバッチ間で同一の組成物を有するポリクローナルタンパク質を産生することができる。
【０１４０】
本発明の代替的なアプローチにおいて、ポリクローナルを製造する細胞株は、ｐＭＣＢに由来するｐＷＣＢから広げられてもよい。ｐＷＣＢは、ｐＭＣＢから単一バイアルを溶解し、一定分量の新しい系（ｐＷＣＢ）において凍結され得る細胞の総数を産生するのに十分多くの継代細胞を広げることにより作成され、前記新しい系は、各ｐＷＣＢ一定分量において、ｐＷＣＢを作成するのに元々用いられるｐＭＣＢバイアルとおよそ同じ数の細胞を有する。ｐＷＣＢが使い尽くされた場合、ｐＭＣＢの一定分量から新しいｐＷＣＢを作成することができる。それゆえ、このアプローチは、凍結ライブラリーストックから各細胞株を広げ、新しいｐＭＣＢを混合するのに必要であろうより有意に少ない量のワークを必要とする。さらに、ｐＷＣＢが使い果たされる場面において、バッチ間で基本的に同一の組成物のポリクローナルタンパク質を産生できるポリクローナルを製造する細胞株のさらなるバッチを産生する機会は増える。
【０１４１】
別個のトランスフェクションにより得られた別個の細胞株を混合することによりｐＭＣＢを産生する利点は、ｐＭＣＢの継代前にそれぞれトランスフェクトされた細胞株のさらなる解析と選択を行うことができることである。このことは、既述の多様性の要求を満たすより安定なポリクローナル製造細胞株を確実にする。さらに、ポリクローナルタンパク質は、より再生産可能な方法で製造されてもよい。
【０１４２】
ｐＭＣＢに関して以下に記載されることはｐＷＣＢにも適用される。
【０１４３】
本発明のさらなる具体例において、上述されるごとくポリクローナルタンパク質の別個のメンバーの安定な発現について選択された別個の細胞株は、ｐＭＣＢの継代前にそれらの増殖率および／または生産性に関してさらに特徴付けされる。なおより好ましくは、同様の生産性ならびに同様の増殖率を有する細胞株がｐＭＣＢの継代について選択される。好ましくは、細胞株は、増殖率および／または生産性の特徴付け前に血清を含まない懸濁培養に適応される。代替的に、トランスフェクションに用いられる親細胞は、トランスフェクション前に、血清を含まない懸濁培養に適応される。
【０１４４】
増殖率は、当該技術分野で知られる方法により測定することができる。哺乳動物細胞株の増殖率は、１８ないし１００時間の間であるべきであり、好ましくは、２２ないし４０時間の間、最も好ましくは、２４ないし３２時間の間である。生産性は、１日あたり１細胞あたり０．５ｐｇ（ｐｇ／（細胞＊日））を超えるべきであり、好ましくは、１、１．５、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、または１００ｐｇ／（細胞＊日）を超えるべきである。さらに、細胞内染色法により測定される場合、細胞株は発現に関して均一な細胞集団を有するべきである。所望ならば、各別個の細胞株についてより均一な細胞集団は、例えば、本明細書に記載されるＦＡＣＳ選別法によるクローニングにより得られうる。
【０１４５】
本発明のさらなる具体例において、別個の細胞株は、本明細書に記載されるごとくトランスフェクションおよび選択方法後に、均一な発現レベルの細胞を同定するのにＦＡＣＳ選別される。
【０１４６】
蛍光で標識された抗体は、高いレベルの所望のタンパク質、例えば、抗体またはＴｃＲを発現する細胞を選別するのに用い、それにより生産性に関して均一な細胞集団を作り出すことができる。この技術は、分泌タンパク質がそれらを分泌する細胞の表面上で検出され、表面タンパク質の量が別個の細胞の発現レベルに明確に相当しうるという観察に基づく。それゆえ、高い産生細胞は、標識された抗体による染色、次いでＦＡＣＳによる解析により選別された単一細胞でありうる。この技術は、Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙにより示されている（Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155）。
【０１４７】
代替的な選別技術は、細胞から発現されたタンパク質、細胞の表面に特異性を有するリガンドのカップリングに基づく。例えば、抗Ｆｃ抗体または抗イディオタイプ抗体は、ビオチンを介してタンパク質を分泌する細胞の表面にカップルされうる。次いで、別個の細胞から分泌された抗体は、その細胞の表面上の抗Ｆｃ抗体により捕捉される。この後、高い産生細胞は、標識された抗体による染色によるＦＡＣＳにより選別されうる。この技術は、EP667896に記載されている。
【０１４８】
均一な高い発現レベルの細胞株を得るために、高い発現レベルを有する単一細胞は、記載される技術のうちの１つにより得られるＦＡＣＳプロファイルに基づいて解析される。次いで、別個の細胞クローンは、広げられ、増殖率および生産性に関して上述されるごとく可能性として解析される。代替的に、ＦＡＣＳプロファイルにより同定される最も高い発現レベルを有する細胞のサブプールは、選別により収集される。別個の細胞株からの細胞のサブプールは、所望であれば、増殖率および生産性に関して同様に解析されうる。
【０１４９】
本発明の代替的な具体例において、ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬロボット（英国、Ｇｅｎｅｔｉｘ）のごときロボットは、高い発現レベルおよび／または同様の増殖特性を示すクローンを選択するのに用いられる。これは以下のとおりに行われる：トランスフェクションおよび選択後に得られたコロニーは、コロニーの直近で分泌タンパク質産物を捕捉することにより、高い産生コロニーの検出を可能にする半固体培地において増殖される。各コロニーからの産生レベルは、細胞から発現されるタンパク質の免疫蛍光標識、続いて、発現レベルおよび増殖特性のごとき所定の選択基準に基づく最良のクローンのイメージソフトウェア選択の手法により調べられる。さらに、各コロニーの（細胞増殖率を反映する）サイズは、光検出イメージングを用いるロボットにより測定されうる。次いで、所望の産生および／または増殖特性を有するコロニーは、ロボットにより単離され、さらなる増殖のために９６ウェルプレートに移される。
【０１５０】
好ましくは、同様の生産性を有する別個の細胞株は、ｐＭＣＢの作成について選択される。好ましい具体例において、ｐＭＣＢを構成する別個の細胞株は、例えば、単一細胞選別、限定希釈または採集ロボットにより得られる、高い発現レベルを有するクローン化された細胞、あるいは高い発現レベルを有する細胞プールから作成される。
【０１５１】
本発明において、トランスフェクションおよび選択後に単離された細胞の単一コロニーから得られる別個の細胞株、ならびに、例えば、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ＦＡＣＳ選別により得られたクローンから得られた別個の細胞株の両方は、クローン化された細胞株と呼ばれる。好ましい具体例において、かかるクローン化された細胞株は、ｐＭＣＢを作成するのに用いられる。
【０１５２】
本発明のさらなる具体例において、別個の細胞株は、ｐＭＣＢの作成により異なる比率で混合される。別個の細胞株は、別個の細胞株および／または前記細胞株により発現される別個のタンパクメンバー質特性、例えば、特定の生産性または結合親和性に基づいて所定の基準により混合されうる。例えば、特に重要な抗原またはエピトープに結合する一定の抗体を発現する別個の細胞株は、ｐＭＣＢの残りのメンバーの細胞株を上回って、例えば、２倍、３倍、５倍または１０倍高い量で供給されうる。１つのメンバーの細胞株は、例えば、他の全てのメンバーを超えて２：１で、例えば、メンバー１の４×１０６個の細胞および残りのメンバーの細胞株の各々の２×１０６個の細胞で添加されてもよい。
【０１５３】
ｐＭＣＢにおける別個の細胞株の区別されるレベルのこのアプローチはまた、別個の細胞株間の増殖率および生産性の相違を回避するために、特に、これらが特性について類似性について選択されなかった場合に適用されてもよい。したがって、１つまたはそれ以上の別個の細胞株が、より速い増殖率により特徴付けられるポリクローナルワーキング細胞バンクのその他のメンバーと比較してより遅い増殖率、例えば、より長い倍加時間を示すが、このより遅い増殖率が特に高い生産性に関連しない場合、この特定のメンバーは、その遅い増殖を補う増加量でｐＭＣＢに添加されてもよい。例えば、５０時間の増殖率を有する細胞株は、ｐＭＣＢを構成する残りの細胞株が２２および３０時間の間の増殖率を有する場合、２：１の比率で添加されてもよい。同様に、短い倍加時間を有する細胞株の比率は、製造中にこれらが占有しないことを確実にするために減少されてもよい。さらに、ｐＭＣＢにおける別個の細胞株の比率は、ｐＭＣＢから作成されたポリクローナル製造細胞株から産生されるポリクローナルタンパク質産物の解析用に調整されてもよい。かかる調整は、例えば、ＩＥＸプロファイルまたは同等の特徴付けツールに基づいてなされてもよい。かかる解析が、１つまたはそれ以上の特定のタンパク質のメンバーが残りのメンバーと比較して増加した量で産生されることを示す場合、新しいｐＭＣＢが作成されてもよく、ここで、これらの特定のタンパク質メンバーを産生する細胞株の比率は減少される。反対に、特定のメンバーが少ない量で産生される場合、このメンバーを産生する細胞株の比率の増加を示すｐＭＣＢが作成されてもよい。
【０１５４】
培養系
本発明の組み換えポリクローナルタンパク質は、バッチ、流加培養および灌流プロセスを含むが、これらだけに限定されない適切な培養様式を用いて製造されてもよい。
【０１５５】
タンパク質の高レベル発現のための発現系の確立
核酸配列を細胞に導入する方法は、当該技術分野で知られている。これらの方法は、典型的に、目的の配列を細胞、ゲノム、染色体外エレメントに導入するＤＮＡベクターの使用を含む。細胞のトランスフェクションは、リポフェクション、化学的に介在されたトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、ＲＢＣゴースト融合、プロトプラスト融合、ウイルス形質導入、およびこれらに類似する方法を含む、当業者に知られる多くの方法により達成されてもよい。
【０１５６】
宿主細胞株のトランスフェクションにおいては、各ベクターが目的の組み換えポリクローナルタンパク質の１つのメンバーをコードする核酸配列のわずか１つのコピーを含む目的のベクターのライブラリーが用いられる。この目的の発現ベクターのライブラリーは、目的の組み換えポリクローナルタンパク質をまとめてコードする。組み換えに適切なベクターを前のセクションに記載した。
【０１５７】
組み換えポリクローナル製造細胞株の作成およびかかる細胞株からの組み換えポリクローナルタンパク質の製造は、いくつかの異なるトランスフェクションおよび製造戦略により得ることができる。
【０１５８】
図１に示されるトランスフェクションの好ましい方法は、目的のライブラリーを構成する別個のベクターを用いて宿主細胞が別々にトランスフェクトされるハイスループット法である。別々にトランスフェクトされた宿主細胞は、好ましくは別々に選択される。しかしながら、それらはまた、選択前にプールされてもよい。選択により作成された別個の細胞クローンは、発現レベル、増殖率および組み込みパターンに関して解析されてもよく、同様の増殖率、同様のコピー数、同様の発現および／または同様の構造安定性レベルを有するものがポリクローナルＧＯＩライブラリーストックを作成するのに用いられてもよい。別個の細胞クローンは、そのストックを作成する前、ストックから取り出された直後、または増殖および適応時間の直後に所望のポリクローナル細胞株を得るのに混合されうる。このアプローチは、さらに組成物の安定性を改善しうる。
【０１５９】
各細胞への１コピー以上の組み込みを可能にするトランスフェクション状況下において、発現ベクターの混合物を用いたバルクトランスフェクションは、ポリクローナルタンパク質が単量体である場合に行われうる。多量体タンパク質では、宿主細胞のゲノムへの複数の組み込みを可能にするかかるバルクトランスフェクションは、サブユニットのスクランブリングを生じるであろう。医薬用途のための組み換えポリクローナル抗体の製造などの多くの場合には、スクランブリングは回避されるものである。多量体タンパク質においては、バルクトランスフェクションは、スクランブリングが受け入れ可能である場合か、あるいはトランスフェクションが各宿主細胞のゲノムへのわずか１コピーの組み込みを確実とする条件下で実施される場合に行われうる。かかる方法の例は、レトロウイルス形質導入およびスフェロブラスト融合を含む。目的の変異核酸配列のライブラリーを構成する別個のベクターはいずれも単一組成物に一緒に混合されうるか、あるいは、好ましくは、各ライブラリーメンバーをコードする別個のベクターは、別々な組成物、または組成物中のライブラリーの約５から５０個の別個のベクターの混合物で保持することができる。
【０１６０】
別の方法は、トランスフェクションのために、組成物中のライブラリーの約５から５０個の別個のベクターを含む、フラクションに分けられたベクターのライブラリーを使用することである。好ましくは、ライブラリーのフラクションが１０から２０個の別個のベクターを構成する。次いで、各組成物は、アリコートの宿主細胞にトランスフェクトされる。この方法は、半バルク（ｓｅｍｉ−ｂｕｌｋ）トランスフェクションと呼ばれる。トランスフェクトされるアリコート数は、各フラクションにおけるライブラリーのサイズおよび別個のベクター数に依存する。ライブラリーが、例えば、１００個の別々の変異メンバーを構成し、それらが組成物中の２０個の別々の変異メンバーを含むフラクションに分けられる場合、宿主細胞の５アリコートは、元々のライブラリーの別個のフラクションを構成するライブラリー組成物でトランスフェクトされることが必要であろう。宿主細胞のアリコートは、下記のトランスフェクション後に選択される。好ましくは、別個のアリコートが別々に選択される。しかしながら、それらはまた、選択前にプールされうる。アリコートは、それらのクローン多様性について解析され、十分な多様性を有するものがポリクローナルＧＯＩライブラリーストックを作成するのに用いられる。
【０１６１】
ポリクローナル細胞株の凍結ストックは、組み換えポリクローナルタンパク質の製造の開始前に作成されてもよい。製造のための所望のポリクローナル細胞株を得るために、クローンは、凍結するストックを作成する前、ストックから取り出された直後、または増殖および適応時間の直後に混合されうる。
【０１６２】
上記に概略される製造戦略に共通する特徴は、組み換えポリクローナルタンパク質を構成する全ての別個のメンバーは、最大で約１０個のバイオリアクターのごとき１つまたは限られた数の容器中で産生されうる。
【０１６３】
発現レベルが上昇する必要がある場合、遺伝子増幅は、ＤＨＦＲ遺伝子またはグルタミン合成（ＧＳ）遺伝子、ｈｐｒｔ（ヒポキサンチンホスホリボチルトランスフェラーゼ）またはトリプトファン合成遺伝子を用いて行われうる。これは、かかる選択マーカーを含むベクターの使用を必要とする。本発明の１つの特別な特徴は、細胞の安定性を高く維持するために比較的低いコピー数を保持することである。それゆえ、細胞は、好ましくは、実施例で用いられる構築物のタイプに関して、ＭＴＸの低濃度（例えば、１〜１０ｎＭ）を含むヌクレオシドを含まない培地で比較的中程度の選択圧下で１回の選択に付される。かかる適度の選択圧は、比較的低いコピー数を生じると考えられる。適度の選択圧は、バランスのとれたコピー数を生じ、高い発現を導く一方で極めて高いコピー数の細胞の不安定性を回避すると考えられる。
【０１６４】
より高い発現レベルを達成するために、発現に用いられる細胞株は、好ましくは、ポリクローナルタンパク質の発現を制御するプロモーターを高めることができる異種性トランスアクチベーターを含む。トランスアクチベーターおよびプロモーターの適切な組み合わせの例は、以下の表に記載される（表２）。
表２．トランスアクチベーター／プロモーターペアの例
【０１６５】
【表２】
0005941616.tif 000003
【０１６６】
好ましくは、細胞株はトランスアクチベーターをコードする発現構築物でトランスフェクトされ、クローンは限定希釈または単一細胞のクローニングのためのその他の方法を用いて選択される。発現ベクターは、本明細書中で発現ベクターについて記載されるプロモーター、選択マーカーなどのごときエレメントを含んでいてもよい。好ましくは、トランスアクチベーターの発現を制御するプロモーターは、伸長因子１プロモーター、ＣＭＶプロモーター、メタロチオネイン−１プロモーターまたはその類似物のごとき構成性プロモーターである。好ましい具体例において、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【０１６７】
特に好ましいのは、アデノウイルスＥ１Ａトランスアクチベーターの使用であり、目的の遺伝子の発現を制御するＣＭＶプロモーターをトランス活性化することに加えて、それ自身における細胞を安定化するようである。他の部分に記載されるごとく、Ｅ１Ａ発現は、最初に産生された細胞株、ＥＣＨＯにおいて検出できなかった。それゆえ、Ｅ１Ａと細胞の安定性の間の関連は本実験により証明されていない。
【０１６８】
ポリクローナルタンパク質の製造において、各タンパク質メンバーは２つ以上のポリペプチド鎖からなり、鎖の組み合わせは、それらが形成するタンパク質の親和性、特異性および活性に重要でありうる。これは、例えば、抗体およびＴｃＲについて見られる。例えば、抗体の親和性および特異性に影響することが知られる抗体可変重鎖および可変軽鎖の組み合わせは、鎖から形成される。このため、ポリクローナルタンパク質の別個のメンバーを構成するポリペプチド鎖は、好ましくは、組み換えに用いられる同一のベクターに配置され、それによりそれらがプロセスを通して一緒に保持されることを確実にする。代替的に、宿主細胞は、重鎖および軽鎖の同族ペアをコードする発現ベクターのペアでトランスフェクトされうる。
【０１６９】
以下の記載は、組み換えポリクローナル抗体を発現する細胞株を得る方法の一例である。
【０１７０】
可変重鎖およびカッパまたはラムダ軽鎖の全体で囲まれたｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ構築のごとく、反対の転写方向に配列される２つのプロモーターを有する構成性発現用の普遍的なプロモーターカセットが構築されてもよく、それらは、全構築物の選択マーカーおよび重鎖定常領域を含むベクターへの移行を可能にする。誘導可能な発現のためのプロモーターカセットも用いることができるとされる。さらに、プロモーターは、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌで配置され、反対方向で転写を生じうるか、または一方向のためのｔａｉｌ−ｔｏ−ｈｅａｄで配置されうる。誘導可能なプロモーターもまた、発現の制御に用いることができる。トランスフェクション後、細胞は、好ましくは、選択条件下で培養されて安定な形質転換体が選択される。
【０１７１】
これらの条件下で生存する細胞は、後に、一般的な小培養フラスコ、Ｎｕｎｃ多層細胞ファクトリー、小さな高収量バイオリアクター（ＭｉｎｉＰｅｒｍ、ＩＮＴＥＧＲＡ−ＣＥＬＬｉｎｅ）、振蘯機、およびスピナーフラスコから中空糸およびバイオリアクターＷＡＶＥバッグ（スウェーデン、ターゲルスヴァンゲンのＷａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはその他の使い捨て管／容器のごとく異なる培養系で増殖されうる。細胞は、ＥＬＩＳＡを用いて抗体産生に関してテストされてもよい。ポリクローナル細胞株は、好ましくは、選択圧下で血清を含まない培地における長期間の懸濁培養の生存率について選択される。
【０１７２】
発現系における多クローン性の保存の評価
本発明によると、多クローン性が実際に変化した時に産生を中止できるため、発現系における多クローン性が産生中に重大に変化していないことを確認することが大抵の場合に重要である。これは、本発明では変異核酸配列の相対的な発現レベルをモニターすることにより行われうる。発現レベルは、例えば、ＲＦＬＰ解析、アレイまたはリアルタイムＰＣＲを用いるｍＲＮＡレベル、あるいは例えば、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析または様々なクロマトグラフィー技術を用いるタンパク質レベルでモニターすることができる。これらの技術を用いて、発現レベルが（全体または相対の両方で）変化したかどうかを測定するために、多くの全ての別個の発現レベルに関する基準値を確立し、次いで産生中の培養物からサンプルを取り出することができる。本発明の通常の実施において、基準値付近の値の範囲が設定され、相対的な発現レベルが範囲外に見出される場合に産生が終結される。
【０１７３】
細胞の培養および組み換えポリクローナル抗体の産生
上述のごとく産生されるポリクローナル細胞株は、細胞のゲノムに挿入される変異核酸配列によりコードされる目的のポリクローナルタンパク質を発現するために適当な条件下で適当な培地で増殖されてもよい。細胞培養は、いくつかの工程で実施されてもよい。哺乳動物細胞を用いる場合、選択される細胞は、好ましくは、懸濁ならびに血清を含まない条件における増殖に適応される。血清を含まない培地における増殖への適応はまた、ポリクローナル細胞株についてクローン化された細胞株を混合する前に有利に行われてもよい。適応は、１または２つの工程および選択圧の有無で行われうる。好ましくは、製造された薬剤の純度を落とすことなく製造中に選択できる選択系が用いられる。一般的に、医薬用途のための組み換えタンパク質の製造においては、最終産物が一切の抗生物質の痕跡を含まないことを実証することが必要となるため、例えば、抗生物質またはその他の低分子量薬物を使用することなく選択圧を供することが好ましい。
【０１７４】
ポリクローナル細胞株が適切な条件に適応される場合に大規模化が開示されうる。この時、ポリクローナルワーキング細胞ストック（ポリクローナルワーキング細胞バンク、ｐＷＣＢ）および／またはポリクローナルマスター細胞バンク（ｐＭＣＢ）が凍結されうる。好ましくは、３０と１００リットル間のバイオリアクターが用いられるが、より小さい（５〜１０リットル）またはより大きい（１０００、５０００、１００００、１５０００リットルまで、あるいはさらにより大きい）バイオリアクターが用いられてもよい。適当な産生時間およびバイオリアクターサイズの選択は、バッチからの所望のタンパク質の収量および細胞株からの発現レベルに依存する。時間は、数日から３ヶ月まで変動してもよい。発現された組み換えポリクローナルタンパク質は、細胞または上澄み液から回収されてもよい。組み換えタンパク質は、当業者により知られる手法により精製され、特徴付けられてもよい。精製法の例は以下に列挙される。特徴付けの方法の例は、例えば、WO 2006/007853に見出されうる。
【０１７５】
培養上澄み液からの組み換えポリクローナルタンパク質の精製
培養上澄み液からの特定のタンパク質の単離は、タンパク質の物理−化学的特性における相違、例えば、分子量、正味荷電、疎水性、または特定のリガンドもしくはタンパク質に対する親和性における相違を利用する様々なクロマトグラフ技術を用いることが可能である。それゆえ、タンパク質は、分子量を用いるゲルろ過クロマトグラフィーによるか、あるいは正味荷電を用いるイオン交換（陽イオン／陰イオン）クロマトグラフィー、代わりにクロマト分画により分離されてもよい。同様に、タンパク質は、疎水性を用いる疎水性相互作用または電荷誘導クロマトグラフィー、あるいは特定の固定化リガンドまたはタンパク質に対する親和性の相違を利用するアフィニティークロマトグラフィーにより分離されてもよい。それゆえ、タンパク質の複合混合物の分離は、様々なクロマトグラフ原理の連続的な組み合わせにより行われてもよい。したがって、タンパク質の混合物は、例えば、正味荷電を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより最初に分離されてもよく、同様の正味荷電のタンパク質は、後に、高濃度の選択された塩の存在下において、分子量を用いるゲルろ過クロマトグラフィーまたは疎水性を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー後に分離されてもよい。
【０１７６】
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用およびゲルろ過のごとき後の精製工程と組み合わせたアフィニティークロマトグラフィーは、異なる供給源、例えば、腹水、細胞培養上澄み液および血清からのＩｇＧ（ポリクローナルならびにモノクローナル）およびＴｃＲの精製に高頻度で用いられる。親和性精製は、分離がタンパク質とクロマトグラフマトリックスにカップルした特定のリガンド間の可逆性相互作用に基づき、簡便で迅速な方法であり、より少量で高い選択性、通常、高い能力と濃度を提供する。２つの細菌細胞表面タンパク質、プロテインＡとプロテインＧは、抗体のＦｃ領域に対して高い親和性を有し、固定化された状態において、様々な種に由来するポリクローナルＩｇＧおよびそのサブクラスの精製、ならびに免疫複合体の吸収および精製を含む、多くの通常の応用に用いられる。
【０１７７】
アフィニティークロマトグラフィー後、以降のクロマトグラフィー工程、例えば、イオン交換およびーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーは、宿主細胞タンパク質、流出したプロテインＡ、およびＤＮＡを除去するのに用いられうる。
【０１７８】
最終精製工程としてのゲルろ過は、二量体およびその他の凝集体のごとき混入分子を除去し、サンプルを保存緩衝液に移すのに用いられうる。供給源および発現状態に応じて、抗体純度の必要とされるレベルを達成するためのさらなる精製工程を含むことが必要となってもよい。それゆえ、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーは、治療用途のための抗体を精製するために、プロテインＡとゲルろ過クロマトグラフィーと組み合わせてよく用いられる。
【０１７９】
精製を容易にするために、ポリクローナル抗体の全てのメンバーが重鎖および／または軽鎖の同一の定常領域を共有することが好ましい。
【０１８０】
抗体のその他のクラスを精製するためには、プロテインＡとＧがＩｇＡとＩｇＭに結合しないため、別のアフィニティークロマトグラフィー媒体が用いられる必要がある。免疫親和性精製が用いられうるか（固体相にカップルされた抗ＩｇＡまたは抗ＩｇＭモノクローナル抗体）、または別法として、イオン交換と疎水性相互作用を含む多段階精製戦略が採用されうる。
【０１８１】
構造の特徴付け
抗体およびＴｃＲのごときポリクローナルタンパク質の構造の特徴付けは、混合物の複雑性（クローン多様性およびグリコシル化）のために高い分解能を必要とする。ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーまたは電気泳動のごとき従来のアプローチは、別個の抗体間を区別するのに十分な分解能を有さないかもしれない。二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）は、複合タンパク質混合物のプロファイリング、次いで質量分析（ＭＳ）または液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−ＭＳ（例えば、プロテオミクス）に用いられる。２Ｄ−ＰＡＧＥは、タンパク質の荷電と質量に基づいた分離を組み合わせ、血清サンプル中のポリクローナル、オリゴクローナルおよびモノクローナル間を区別するのに有用であることが証明されている。しかし、この方法はいくつかの制約を有する。クロマトグラフ技術、特に、エレクトロスプレーイオン化ＭＳにカップルされたキャピラリーおよびＬＣは、複合体ペプチド混合物の解析にますます適用されている。ＬＣ−ＭＳは、モノクローナル抗体の特徴付けに用いられる。極めて複雑なサンプルの解析は、クロマトグラフ系のより分解する力を必要とし、それは二次元（またはそれ以上）の分離により得られうる。かかるアプローチは、一次元におけるイオン交換、および任意選択的にＭＳにカップルされた二次元における逆相クロマトグラフィー（または疎水性相互作用）に基づきうる。
【０１８２】
機能的な特徴付け
ポリクローナルタンパク質は、例えば、同一の標的に対する特異性または同様の活性を有するポリクローナルタンパク質との比較研究を通して機能的に特徴付けられうる。かかる研究は、インビトロならびにインビボで実施されうる。
【０１８３】
ポリクローナル抗体のインビトロの機能的な特徴付けは、例えば、粗細胞溶解物からの標的抗原の分析分離に極めて特異的な技術である免疫沈殿により行われうる。免疫沈殿を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてタンパク質染色（クーマシーブルー、銀染色またはビオチン標識）および／または免疫ブロッティングのごときその他の技術と組み合わせることにより、抗原を検出し、定量化し、それにより抗体の機能的な特性のいずれかを評価することができる。この方法は、抗体分子数やそれらの結合親和性の概算を付与するわけではないが、標的タンパク質の視覚化とそれによる特異性を提供する。この方法は、同様に、発現工程中に抗原に対する抗体の潜在的な相違（クローン多様性の完全性）をモニターするのに用いられうる。
【０１８４】
ポリクローナル抗体のインビボ機能的な特徴付けは、例えば、感染研究でありうる。マウスのごとき実験動物は、例えば、ポリクローナル抗体が発生された特定のウイルスで感染されうる。感染が阻害されうる程度は、ポリクローナル抗体の機能を指標とする。
【０１８５】
治療用組成物
本発明の具体例において、有効成分として免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される組み換えポリクローナルタンパク質を含む治療用組成物は、哺乳動物における疾患の治療または予防が意図される。
【０１８６】
本発明の好ましい具体例において、医薬組成物は、有効成分として組み換えポリクローナル抗体または抗体フラグメントおよび医薬上許容される賦形剤を含む。
【０１８７】
本発明の別の好ましい具体例において、医薬組成物は、有効成分として組み換えポリクローナルＴ細胞受容体またはＴ細胞受容体フラグメントおよび医薬上許容される賦形剤を含む。
【０１８８】
本発明の医薬組成物は、それ自体公知の手法、例えば、従来の溶解、凍結乾燥、混合、顆粒化または調合工程により調製される。医薬組成物は、従来の薬学的な実施により製剤化されてもよい（例えば、in Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NYを参照）。
【０１８９】
可能ならば、例えば、有効成分のみ、あるいは有効成分とマンニトールのごとき担体を一緒に含む凍結乾燥組成物の場合には、使用前に溶液または懸濁液を作成するために、有効成分の溶液および懸濁液、特に等張水溶液または懸濁液が好ましく用いられる。医薬組成物は、滅菌されてもよく、および／または賦形剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤および／もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝液を含んでもよく、それ自体公知の手法、例えば、従来の溶解または凍結乾燥プロセスにより調製される。前記溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンのごとき粘度増加物質を含んでもよい。
【０１９０】
注射組成物は、無菌状態下において通常の手法で調製される；同じことが組成物をアンプルまたはバイアルに導入し、容器を密封することにも適用する。
【０１９１】
医薬組成物は、約１％から約９５％まで、好ましくは、約２０％から約９０％までの有効成分を含んでもよい。本発明による医薬組成物は、例えば、アンプル、バイアル、座剤、糖衣錠、錠剤またはカプセルの形態のごとき単位用量形態であってもよい。
【０１９２】
本発明による組成物の治療用途
本発明による医薬組成物は、哺乳動物における疾患の処置、軽減または予防に用いられてもよい。本医薬組成物で処置されうる疾患は、癌、感染性疾患、炎症性疾患、アレルギー、喘息およびその他の呼吸器疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、中枢神経系の疾患、代謝性および内分泌性疾患、移植拒絶および所望されない妊娠を含む。
【０１９３】
本発明の１の態様は、動物における疾患の処置、軽減または予防のための方法であって、組み換えポリクローナル抗体または抗体フラグメントの有効量が投与される方法である。さらなる態様において、組み換えポリクローナルＴ細胞受容体またはＴ細胞受容体フラグメントの有効量が投与される。
【０１９４】
本発明のさらなる態様は、癌、感染性疾患、炎症性疾患、アレルギー、喘息およびその他の呼吸器疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、中枢神経系の疾患、代謝性および内分泌性疾患、移植拒絶および所望されない妊娠からなる群から選択される疾患の治療のための組成物の調製のための組み換えポリクローナル抗体または組み換えポリクローナルＴ細胞受容体または抗体フラグメントまたはＴ細胞受容体の使用である。
【０１９５】
診断用途とおよび環境検出用途
本発明の別の具体例は、診断キットおよび環境検出用途のためのキットならびにこれらのキットを使用する方法を対象とする。本発明によるキットは、本発明により調製された組み換えポリクローナルタンパク質を含み、このタンパク質は、検出可能な標識で標識されてもよく、あるいは非標識用に標識されなくてもよい。標識された場合、本組み換えポリクローナルタンパク質は、標的分子を含むとされるサンプルに添加されてもよく、標識の存在または不在が標的分子の存在または不在を示す。テストされるサンプルは、血液、血清、血漿、髄液、リンパ液または尿のごとき体液サンプルあるいは混入物を有する疑いのある環境供給源からのサンプルのごとき非哺乳動物サンプルであってもよい。非哺乳動物サンプルは、水、空気または混入された土であってもよい。非標識検出は、結合によるＢＩＡｃｏｒｅにおける屈折率変化の測定を包含し、組み換えポリクローナルタンパク質は標的分子を捕捉するのに用いられる。
【０１９６】
実施例
以下の実施例は本発明を例示するが、発明の範囲を限定するものとして考慮されるべきではない。
【実施例１】
【０１９７】
抗体を発現するＣＨＯ細胞クローンの誘導
【０１９８】
発現ベクター
用いたＩｇＧ発現ベクターを図２ａに示す。
【０１９９】
Ｅ１Ａ発現ベクターを図２ｂに示す。
【０２００】
細胞株
用いた細胞株は、コロンビア大学のローレンスチェイスンから譲渡された（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２６１３−０１４からも利用可能である）ＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞株ＤＧ４４の誘導物である。ＤＧ４４細胞を、ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋（カタログ番号Ｖ７９０−２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中におけるアデノウイルスタイプ５トランスアクチベーターＥ１Ａの１３ＳバージョンのｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ受入番号ＡＹ３３９８６５、ｃＤＮＡ配列：atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataa）でトランスフェクトした。形質転換体を５００μｇ／ｍｌ濃度のジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で選択した。選択後、細胞を限定希釈により単一細胞にクローン化した。クローンを、（上に示される）抗体プラスミドによる一過性トランスフェクションによりＣＭＶプロモーターのトランス活性化（発現の改善）についてテストした。単一クローンは、トランスフェクトされていないＤＧ４４細胞株と比較して、３倍改善した一過性アッセイの発現レベルを示した。上昇した発現レベルは、実際のトランスアクチベーションの証拠ではなく、特に高い発現のサブクローンの選択により引き起こされうる。安定なトランスフェクションを用いて行った比較において、選択したプールは、野生型ＤＧ４４細胞株と比較して、４〜５倍の増加した発現レベルを示した。このクローン（ＥＣＨＯと呼ぶ）を、２回サブクローン化し、このクローンはＣＭＶプロモーターのトランスアクチベーター（発現の改善）に関して安定であるように見えた。ＣＭＶプロモーターの実際のトランスアクチベーションを測定しなかったが、それにもかかわらず、クローンはＣＭＶプロモーターの制御下で抗体の安定で高い発現を示した。
【０２０１】
抗体発現プラスミド
用いた抗体発現プラスミドを上述のごとく構築した。このために、異なるワクシニアウイルス表面タンパク質に対して指向される異なる抗体を選択した。それらの各々が、異なる抗体の混合物において同定と定量を可能にするイオン交換クロマトグラフィーの極めて特徴的なプロファイルを有するため、それらを選択した。（WO 2007/065433として公表された名称「Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody」の２００６年１２月４日付提出の同時係属中のPCT/DK2006/000686で開示される）抗体は：
・Sym002-037（クローン002-037）
・Sym002-186（クローン002-186）
・Sym002-235（クローン002-235）
・Sym002-286（クローン002-286）
・Sym002-303（クローン002-303）
・Sym002-482（クローン002-482）
であった。
【０２０２】
ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
ＩｇＧをサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。簡単に説明すると、９６−ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ）をヤギ抗ヒトＦｃ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ１０６）でコートし、次いでサンプルおよび標準物質（精製したヒトモノクローナルＩｇＧ１カッパ抗体）とインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼと抱合したヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ１００Ｐ）で検出を行った。
【０２０３】
ＥＣＨＯ細胞のトランスフェクション
ＥＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有のヌクレオシド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号３２５７１）を含むＭＥＭアルファ培地中に１フラスコあたり０．３０×１０６個の細胞密度でＴ８０フラスコに播種した。播種から１時間以内に、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてトランスフェクトした：
・１０μｌのＦｕｇｅｎｅ６を４９０μｌのダルベッコ改変イーグル培地と混ぜ、室温で５分間インキュベートする
・５μｇの発現プラスミドを添加し、混合物を室温でさらに１５分間インキュベートする
・混合物を細胞培養フラスコに添加する
翌日、トランスフェクション試薬を含む培地を吸引し、各フラスコを、１０％の透析ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む５ｍｌの（ヌクレオシドを含まない）ＭＥＭアルファ培地（ＭＥＭアルファ−）で１回洗浄し、１０ｍｌの同一培地を２ｎＭの濃度のメトトレキサートと一緒に添加した。この後、培地を１週間に１回交換した。
【０２０４】
１５日後、細胞をトリプシン処理し、全ての細胞を新しいフラスコに移した。さらに２日の培養後、培地を交換し、翌日、培地を吸引し、細胞をカウントし、生産性をＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで測定した。結果を表３に示す。生産性を、採取時の細胞数を用いて、１日あたりの１細胞あたりのピコグラムとして算出する。
【０２０５】
【表３】
0005941616.tif 000004
【０２０６】
表３
トランスフェクトされたプールの細胞カウント、培地のＩｇＧ含有量および特定の細胞生産性
【０２０７】
単一細胞クローンの産生に関して、プール中の細胞を表面結合抗体で染色し、５０％のＥＨＯ細胞で調整した培地（ＭＥＭアルファ−）および調整していない５０％の同一培地を含む９６ウェルプレートに単一細胞に選別した。
簡単に説明すると、染色プロトコルは以下のとおりであった：
１．細胞をトリプシン処理し、カウントする
２．１〜５×１０６個の細胞を滅菌ＦＡＣＳにピペットする
３．２５０ｇで４℃にて１分間スピンして落とし、上澄み液を取り除く
４．２ｍｌの滅菌ＦＡＣＳ  ＰＢＳ（ＰＢＳ＋２％  ＦＣＳ）（５ｍｌ）中の細胞を洗浄する
５．細胞を、Ａｂ／１０６個の細胞の割合で希釈した１００μｌ中に１：２０で希釈した(ヤギＦ（ａｂ）２  フラグメント抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＩＭ１６２６）で染色し、（暗中４℃で）２０分間インキュベートする
６．細胞を２ｍｌのＦＡＣＳ  ＰＢＳ（５ｍｌ）で２回洗浄する
７．ＦＡＣＳ  ＰＢＳ（２ｍｌ）中に１〜５×１０６／ｍｌに再懸濁する
８．ヨウ化プロピジウムを１０μｇ／ｍｌ  １：１００で添加する
【０２０８】
適切なゲートを設定し、細胞をＦＡＣＳ−Ａｒｉａ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて９６ウェルプレート（１抗体あたり５つのプレート）に単一細胞に選別した。
【０２０９】
約１週間後、ウェルを、単一クローンの存在について顕微鏡により検査した。
【０２１０】
約２週間後、単一クローンの入ったウェルからの上澄み液を、ＥＬＩＳＡにより１回希釈でそれぞれアッセイし、ＥＬＩＳＡ値およびウェルの目視検査に基づき、各抗体を表す２４個のクローンを継続する培養として選択した。細胞数と形態に関して、目視検査を抗体発現レベルの選択と組み合わせて用い、クローンを選択した。選択したクローンを消耗（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）アッセイでさらにテストした：簡単に説明すると、細胞を２４ウェルプレートに播種し、ほとんどの細胞が死滅するまで増殖させた。上澄み溶液をＥＬＩＳＡによりアッセイし、各抗体について上位１０個のクローンを、血清を含まない懸濁培養への適応について選択した。
【０２１１】
血清を含まない懸濁培養への適応
細胞をトリプシン処理し、カウントした。５×１０６個の細胞を遠心分離し、１０ｍｌ  ＰｒｏＣＨＯ４血清を含まない培養（Ｃａｍｂｒｅｘ）に再懸濁した。細胞を５０ｍｌの細胞培養チューブ（スイスのＴＲＰ）に移し、３７℃で振蘯機においてインキュベートした。細胞密度を１週間に２回カウントし、毎回、細胞を、１ｍｌあたり０．５×１０６個の細胞（最初の２週間について）または１ｍｌあたり０．３×１０６個の細胞（残りの期間について）に希釈した。４〜５週間後、ほとんどの細胞の倍加時間が３０時間に近づき、この時点でそれらが血清を含まない培養に適応したと考えた。
【０２１２】
適応期間の終了後、細胞をＥＬＩＳＡによりアッセイし、１０％ＤＭＳＯの培地中で凍結し、発現実験に使用した（以下の実施例２を参照）。
【実施例２】
【０２１３】
発現実験
長期間にわたる混合培養の組成物の安定性をテストするために、クローンの多くの混合物を調製した。適応期間中になされた計数に基づいて、倍加時間を可能な限り考慮に入れた。同様の倍加時間を有するクローンを合わせるように注意した。全部で９個の混合物を調製した：
・混合物１〜５：各々において、各抗体に関する単一クローンを用いた
・混合物６：各抗体に関して２つのクローンを用いた
・混合物７：各抗体に関して５つのクローンを用いた
・混合物８：各抗体に関して３つのクローンを用いた
・混合物９：各抗体に関して５〜７個の全て利用可能なクローンを用いた
【０２１４】
（１〜７個のクローンに由来する各抗体に関して）各抗体を表す細胞数が混合物中の総数の１／６を構成するようにクローンを混合した。
【０２１５】
実施例１に記載されるごとく５０ｍｌの培養チューブ中で実験を実施した。用いた培地はＰｒｏＣＨＯ４であり、総培養容積は１０ｍｌであった。１ｍｌあたり０．３×１０６個の細胞の濃度で実験を開始した。培養物を、３および４日の間隔で１週間に２回１ｍｌあたり０．３×１０６個の細胞に希釈した。１週間に１回、ＥＬＩＳＡおよびイオン交換クロマトグラフィー解析のためにサンプルを採取した。最初のサンプルを４日目に、最後のサンプルを３５日目に採取した。
【０２１６】
９個の混合物についてのＥＬＩＳＡ値を図３に示す。
【０２１７】
開始から終了までの算出した細胞分裂数は、約２５から約２７まで混合物で相違した。このことは、記載のごとく、培養物を１週間に２回希釈するが、各時点で全体の容積を保った場合、終了時の総容積が４３０００から１５２０００リットルの間で変動するであろうことを意味する。工業における大規模な哺乳動物細胞培養は、典型的に、１５０００リットルまでであって、これは、本明細書に記載される混合実験が、培養時間と継代数に関する限り、工業規模における培養の正当な模擬実験であることを意味する。
【０２１８】
細胞の生産性は、いくつかの混合物で減少の傾向を示しながら、５週間にわたり比較的一定であるように見える。
【０２１９】
ＩｇＧ組成物の解析
５〜１０ｍｌの０．２２μｍでろ過した培地上澄み液を、１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。製造業者により説明されるごとく、カラムを１０ｍｌ  ＰＢＳでｐＨ７．４にて洗浄し、０．１Ｍ  グリシンでｐＨ２．７にて溶出した。プールしたタンパク質素材を、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、ｐＨに対して２回透析し、合計のＩｇＧ濃度を、２８０ｎＭの吸光度を測定することにより調べた。
【０２２０】
６０μｇのＩｇＧ混合物を、ＰｏｌｙＬＣに由来する弱い陽イオン交換カラムＰｏｌｙＣａｔ  Ａ（１００×４、６ｍｍ、３μｍ、１５００Å）上にロードした。タンパク質を、酢酸Ｎａ中にｐＨ５．０で１５０から５００ｍＭ  ＮａＣｌの勾配を１ｍｌ／分の流入で７２分かけて適用することにより溶出した。溶出液の２１５ｎｍ吸光度をモニターし、別個のＩｇＧの相対量をシグナルの積分により決定した。
【０２２１】
図３において、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ精製後に混合物８より最初と最後に収集されたＩｇＧ組成物の陽イオン交換クロマトグラフ解析を示す。図に示されるように、別個のＡｂｓがそれらの４つがベースラインと分離して十分に分離する。それゆえ、ＵＶシグナルの積分は、サンプル中の相対的なＩｇＧ濃度の極めて正確な測定を与える。
【０２２２】
全ての混合物を上述のごとく解析し、各混合物中の各抗体含有量を算出した。
【０２２３】
６個の異なる抗体間の極めて均一な配分が開始サンプルでは見られる。観察される相違は、混合物中で用いるクローン間の異なる発現レベルを反映しうる。各サンプルの抗体含有量を図５で図示する。驚くべきことに、全ての抗体を、全ての最後のサンプルにおいて明確に同定することができた。各抗体を表す単一クローンより多くのクローンを有する混合物（混合物６〜９）において、最後のサンプルにおける抗体のより均一な配分への傾向が存在することも観察される。
【実施例３】
【０２２４】
ＥＣＨＯにおけるＥ１Ａの発現
ＥＣＨＯにおけるＥ１Ａの発現を調べるために、Ｅ１Ａ  ｍＲＮＡレベルを、ＳＹＢＲグリーンを用いる定量逆転写リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により決定した。ｑＲＴ−ＰＣＲ法は、標的配列のＰＣＲ増幅に基づく。二本鎖ＤＮＡに結合した時に緑色の光を励起するＤＮＡ結合色素、ＳＹＢＲグリーンの存在下でＰＣＲを実施する。このことは、各増幅ラウンド後における二本鎖ＤＮＡのリアルタイム定量を可能にする。
【０２２５】
ＰＣＲの開始段階で二本鎖ＤＮＡ量が少ない場合、結合したＳＹＢＲグリーン色素からのシグナルはバックグラウンドのノイズと区別できない。しかしながら、増幅プロセスの間にシグナルはノイズを上回って増加し、二本鎖の生成が従いうる。この方法において、サンプル中に最初に存在する標的の相対量を、特定の閾値を超えるためにＳＹＢＲグリーンシグナルに必要とされるサイクルに基づいて決定することができる。達成されるべき閾値の正確な値は、最初の標的量の相対的な比較に用いられうるＣｔ値である。
【０２２６】
材料と方法
総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎから提供されるＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔカタログ番号７４１０４を用いて、製造業者により推奨されるごとく、３．０Ｅ＋０６のＥＣＨＯおよびＨｅｋ２９３細胞から抽出した。ＲＮＡサンプルの濃度と品質を、Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ａｓｓａｙと一緒に、Ａｇｉｌｅｎｔから提供される２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定した。品質を、１が分解されているＲＮＡ、１０が無傷のＲＮＡを示す１〜１０の間のＲＮＡ品質ナンバー（ＲＩＮ）として調べた。ＥＣＨＯ  ＲＮＡは９．５のＲＩＮを示し、ＨＥＫ２９３は８．９のＲＩＮを示した。各サンプルのｃＤＮＡを、開始物質として８００ｎｇ  ＲＮＡを用いて、Ｑｉａｇｅｎから提供されるＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  カタログ番号２０５３１１により作成した。Ｈｅｋ２９３  ｃＤＮＡを２５×に希釈し、一方でＥＣＨＯ  ｃＤＮＡを２倍に希釈した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから提供されるＢｒｉｌｌｉａｎｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  カタログ番号６００５４８を用いてＳｔｒａｔａｇｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐにおいて行った。熱サイクリング条件：９５℃で１０分の保温；９５℃で１５秒の変性、６０℃で１分のアニーリングおよび７２℃で３０秒の伸長の４０サイクル；５５〜９５℃からの融解曲線分析。用いたプライマー（Ｅ１Ａ−６９６ｂｐＦ：５’−ＴＧＡＣＴＣＣＧＧＴＣＣＴＴＣＴＡＡＣＡＣＡ−‘３、Ｅ１Ａ−７７２ｂｐＲ：５’−ＴＣＡＣＧＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＧ−‘３）は、Ｅ１Ａ遺伝子の３’末端における７７ｂｐフラグメントを標的とする。
【０２２７】
結果
ＥＣＨＯ細胞におけるＥ１Ａの発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて解析し、それは、Ｅ１Ａ  ｍＲＮＡをこのアッセイで増幅し、検出できないことを示し、ＥＣＨＯ細胞株がＥ１Ａタンパク質を発現しないことを強く示した。陽性コントロールとして、アデノウイルスＤＮＡのフラグメントにより形質転換され、比較的高いレベルでＥ１Ａを発現することが知られるヒト２９３細胞株を用いた。
【０２２８】
ｑＲＴ−ＰＣＲは、Ｈｅｋ２９３サンプルにおける増幅、陽性コントロールＣｔ＝１８．７４を示すが、ＮＴＣ（鋳型コントロールなし）およびＥＣＨＯサンプルのどちらも増幅が見られなかった。
【０２２９】
【表４】
0005941616.tif 000005
【実施例４】
【０２３０】
バイオリアクター実験のための細胞バンクの調製
組成物の安定性の研究のためのバイオリアクター実験を行うことができるために、マスターおよびワーキング細胞バンクを調製した。この実験においては、実施例１に記載されるごとく６個の異なる抗体を発現するＥＣＨＯ細胞のクローンを使用した。用いたクローンを、培地ＰｒｏＣＨＯ４における血清を含まない懸濁培養に適応した。
【０２３１】
マスター細胞バンク
クローンを溶解し、しばらく懸濁培養で回復させた。４個の混同したマスター細胞バンクを、以下の明細書による指数増殖における細胞から調製した：
・細胞を対数増殖期に凍結した
・６個の抗体全てを各細胞バンクで示した
・各抗体を示す等量の細胞数を混合した
・混合物１Ａ〜３Ａは１抗体あたり単一クローンを含んだ
・混合物４Ａは１抗体あたり３個のクローンを含んだ
・２０×１０６個の細胞をそれぞれ含む１０個のアンプルを１つの混合物あたり凍結した
・凍結培地：１０％ＤＭＳＯを含有する培地（ＰｒｏＣＨＯ４）
【０２３２】
ワーキング細胞バンク
１つの混合物あたり１つの凍結アンプルを溶解した。混合物を、ワーキング細胞バンクの調製前に８〜１０日間培養を続けた：
・細胞を対数増殖期に凍結した
・２０×１０６個の細胞をそれぞれ含む１０個のアンプルを１つの混合物あたり凍結した
・凍結培地：１０％ＤＭＳＯを含有する培地（ＰｒｏＣＨＯ４）
【実施例５】
【０２３３】
バイオリアクターにおける組成物の安定性
ワーキング細胞バンクの１つの混合物あたり１つの凍結アンプルを溶解し、細胞を、バイオリアクター培養を開始した時点から１４日間シードトレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）として培養を続けた：
各シードトレインを、２５０ｍｌの開始培地中に０．６×１０６個の細胞／ｍｌで２つのバイオリアクターに播種するのに用いた（ＰｒｏＣＨＯ４＋５ｍＭ  グルタミン＋１／１００非必須アミノ酸）。
【０２３４】
播種後２日から１４日までフィード（ｆｅｅｄ）培地（ＰｒｏＣＨＯ４＋６ｇ／Ｌグルコース＋５ｍＭグルタミン＋１／１００非必須アミノ酸）で培養に供し、１６日目の採取で〜５８５ｍｌの体積を生じた。
【０２３５】
以下のパラメーターをＤＡＳＧＩＰバイオリアクター（単位１〜８）で調節した：
表４．一般的なバイオリアクター工程パラメーター
【０２３６】
【表５】
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【０２３７】
毎日５ｍｌのサンプルを生存率、生存細胞数、ＩｇＧ産生および代謝の解析のために採取した。類似する生存率および生存細胞数を有することが予想されたので全ての培養物について実施した。さらなる１０ｍｌを、（９日目および１４日目の）シードトレインならびにアンプルの溶解後２０日目、２４日目、２８日目および３０日目の各バイオリアクター（単位１〜８）からのイオン交換クロマトグラフィー解析によるＩｇＧ組成物の解析のために採取した。
【０２３８】
ＩｇＧ組成物の解析を上述の実施例２のごとく行った。
【０２３９】
全ての混合物を上述のごとく解析し、４つの混合物の各サンプルにおける各抗体の含有量を算出した。培養物からのＩｇＧの全収量は約１５０から２５０ｍｇ／Ｌの範囲であった。
【０２４０】
各サンプルの抗体含有量を５に図示する。驚くべきことに、全ての抗体を、全てのサンプルで明確に同定することができる。組成物は、１４日のシードトレイン培養、その後の１６日のバイオリアクターランの間、クローンが喪失したり、変化することがないようであった。組成物は入力するクローンにより異なる。
【０２４１】
混合物について特定のクローンを選択することにより最終産物中の別個の抗体の相対的な配分を調べることもできるようである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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