(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａのカチオン性脂質：
【化１】
0005957646.tif 000019
〔式中：
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、または、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に、該窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ’は、独立に、ハロゲン、Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ”またはＣＯＮ（Ｒ”）２から選択され；
Ｒ”は、独立に、Ｈおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；
Ｌ１は、Ｃ１４−Ｃ２２アルキルおよびＣ１４−Ｃ２２アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよく；
かつ
Ｌ２は、Ｃ３−Ｃ１３アルキルおよびＣ３−Ｃ１３アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよく、ただし、Ｒ’はＲ”ではない〕；
または、その任意の製薬上許容される塩もしくは立体異性体。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、各々メチルであり；
Ｌ１が、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択され；かつ
Ｌ２が、Ｃ３−Ｃ１３アルキルおよびＣ３−Ｃ１３アルケニルから選択される、
請求項１に記載の式Ａのカチオン性脂質；
または、その任意の製薬上許容される塩もしくは立体異性体。
【請求項３】
以下から選択されるカチオン性脂質：
Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物２）；
Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１）；
１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン（化合物３）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクト−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物４）；
１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン（化合物５）；
（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物６）；
（２Ｓ）１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物７）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物８）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデセ−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物９）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１０）；
（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１１）；
（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン（化合物１２）；
１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１３）；
１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１４）；
（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン（化合物１５）；
（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン（化合物１６）；
１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１７）；
１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１８）；
（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１−メチルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物１９）；
（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物２０）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン（化合物２１）；および
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物２２）；
またはその任意の製薬上許容される塩もしくは立体異性体。
【請求項４】
脂質ナノ粒子の調製のための請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子の製造のための、請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項６】
該オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
該オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、他の脂質成分、例えばコレステロールおよびＰＥＧ脂質などと組み合わせて使用して、オリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を形成すること、細胞内取り込みおよびエンドソーム脱出を促進すること、ならびにインビトロおよびインビボの両方で標的ｍＲＮＡをノックダウンすることのできる新規なカチオン性脂質を提供する。
【背景技術】
【０００２】
カチオン性脂質、および脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質の、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための使用は、これまでに開示されている。脂質ナノ粒子、および脂質ナノ粒子の、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための使用は、これまでに開示されている。オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む）およびオリゴヌクレオチドの合成は、これまでに開示されている。（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号、同第２００６／０２４０５５４号、同第２００８／００２００５８号、同第２００９／０２６３４０７号および同第２００９／０２８５８８１号ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号および同第２０１０／０５４４０６号参照）。また、Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照されたい。
【０００３】
その他のカチオン性脂質は、米国特許出願：米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号、同第２００９／０２８５８８１号、同第２０１０／００５５１６８号、同第２０１０／００５５１６９号、同第２０１０／００６３１３５号、同第２０１０／００７６０５５号、同第２０１０／００９９７３８号および同第２０１０／０１０４６２９号に開示されている。
【０００４】
従来のカチオン性脂質、例えばＣＬｉｎＤＭＡおよびＤＬｉｎＤＭＡなどは、肝臓へのｓｉＲＮＡ送達に用いられているが、高用量での肝臓毒性に加えて、最適でない送達効率が問題となっている。本発明の目的は、有効性の増加とともに、肝臓中の脂質レベルが低いことの結果として肝臓毒性が低いことを実証するカチオン性脂質足場を提供することである。本発明は、１つの短い脂質鎖を含む低分子量カチオン性脂質を用いてｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率および耐容性を強化する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０２４０５５４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書
【特許文献６】国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレット
【特許文献１４】米国特許出願公開第２０１０／００５５１６８号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２０１０／００５５１６９号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２０１０／００６３１３５号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２０１０／００７６０５５号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１０／００９９７３８号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１０／０１０４６２９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、他の脂質成分、例えばコレステロールおよびＰＥＧ脂質などと組み合わせて使用して、オリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を形成することのできる新規なカチオン性脂質を提供する。本発明の目的は、有効性の増加とともに、肝臓中の脂質レベルが低いことの結果として肝臓毒性が低いことを実証するカチオン性脂質足場を提供することである。本発明は、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率および耐容性を強化するために、１つの短い脂質鎖を含む低分子量カチオン性脂質を用いる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】マウスにおけるＬＮＰ（化合物１）の有効性を示す図である。
【図２】ラットにおけるＬＮＰ（化合物１）の有効性を示す図である。
【図３】ラットにおけるＬＮＰ（化合物１）のＬＦＴ上昇を示す図である。
【図４】ラットにおけるカチオン性脂質（化合物１）の肝臓レベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の様々な態様および実施形態は、オリゴヌクレオチド、特に、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを、任意の目的遺伝子に送達するための脂質ナノ粒子中で有用な新規なカチオン性脂質の有用性に関する。（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号、同第２００６／０２４０５５４号、同第２００８／００２００５８号、同第２００９／０２６３４０７号および同第２００９／０２８５８８１号ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号および同第２０１０／０５４４０６号参照）。また、Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照されたい。
【００１０】
本発明のカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達に有用な脂質ナノ粒子中の成分である。
【００１１】
本発明の第一の実施形態では、カチオン性脂質は、式Ａ：
【００１２】
【化１】
0005957646.tif 000002
〔式中：
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、または、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に、該窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ’は、独立に、ハロゲン、Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ”またはＣＯＮ（Ｒ”）２から選択され；
Ｒ”は、独立に、Ｈおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；
Ｌ１は、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよく；かつ
Ｌ２は、Ｃ３−Ｃ１３アルキルおよびＣ３−Ｃ１３アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよい〕；
あるいはその任意の製薬上許容される塩または立体異性体によって示される。
【００１３】
第二の実施形態では、本発明は、
Ｒ１およびＲ２が、各々メチルであり；
Ｌ１が、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択され；かつ
Ｌ２が、Ｃ３−Ｃ１３アルキルおよびＣ３−Ｃ１３アルケニルから選択される；
式Ａを有する化合物、あるいはその任意の製薬上許容される塩または立体異性体を特徴とする。
【００１４】
具体的なカチオン性脂質は、
Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物２）；
Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１）；
１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン（化合物３）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクト−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物４）；
１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン（化合物５）；
（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物６）；
（２Ｓ）１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物７）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物８）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデセ−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物９）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１０）；
（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１１）；
（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン（化合物１２）；
１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１３）；
１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１４）；
（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン（化合物１５）；
（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン（化合物１６）；
１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１７）；
１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１８）；
（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１−メチルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物１９）；
（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン（化合物２０）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン（化合物２１）；および
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物２２）；
あるいはその任意の製薬上許容される塩または立体異性体である。
【００１５】
もう一つの実施形態では、開示されるカチオン性脂質は、脂質ナノ粒子の調製に有用である。
【００１６】
もう一つの実施形態では、開示されるカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子中で有用な成分である。
【００１７】
もう一つの実施形態では、開示されるカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための脂質ナノ粒子中で有用な成分である。
【００１８】
もう一つの実施形態では、開示されるカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡの送達のための脂質ナノ粒子中で有用な成分である。
【００１９】
本発明のカチオン性脂質は、不斉中心、キラル軸、およびキラル平面を有し（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ，Ｗｉｌｅｎ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐａｇｅｓ  １１１９−１１９０に記載される通り）、ラセミ化合物、ラセミ混合物、そして個々のジアステレオマーとして生じる可能性があり、光学異性体を含むすべての起こり得るその異性体および混合物が本発明に含まれる。その上、本明細書に開示されるカチオン性脂質は、互変異性体として存在する可能性があり、たとえ１つの互変異性体構造しか示されていないとしても、両方の互変異性型が本発明の範囲に包含されることが意図される。
【００２０】
本発明のカチオン性脂質上の置換基および置換パターンは、化学的に安定であり、当技術分野で公知の技法、ならびに下に示す方法によって容易に入手可能な出発物質から容易に合成することのできるカチオン性脂質を提供するために、当業者によって選択され得ることは当然理解される。置換基自体が２個以上の基で置換されている場合、これらの複数の基は、安定した構造が生じる限り、同じ炭素上にあっても異なる炭素上にあってもよいことは当然理解される。
【００２１】
化学的に安定であり、かつ容易に入手可能な出発物質から当技術分野で公知の技法によって容易に合成することのできるカチオン性脂質を提供するために、当業者によって１個以上のＳｉ原子を本発明のカチオン性脂質に組み込むことができることは当然理解される。
【００２２】
式Ａの化合物において、原子は、その天然の同位体存在度を示してもよいし、あるいは１個以上の原子は、同じ原子番号を有するが、天然に優勢に見出される原子量または質量数とは異なる原子量または質量数を有する、特定の同位体で人工的に濃縮されていてもよい。本発明は、式Ａの化合物のすべての適した同位体変化を含むことを意図する。例えば、水素（Ｈ）の異なる同位体形には、プロチウム（１Ｈ）および重水素（２Ｈ）が含まれる。プロチウムは、天然に見出される優勢な水素同位体である。重水素を濃縮することにより、ある種の治療上の利点、例えばインビボ半減期の増加または必要用量の低下などをもたらすことができるか、または、生体試料の特徴付けに標準物質として有用な化合物を得ることができる。式Ａの中の同位体濃縮化合物は、過度の実験を行うことなく、当業者に周知の従来技法によるか、または本明細書のスキームおよび実施例に記載されるものに類似するプロセスにより、適切な同位体濃縮試薬および／または中間体を用いて調製することができる。
【００２３】
本明細書において、「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環状または分枝状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。
【００２４】
本明細書において、「アルケニル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環状または分枝状の不飽和脂肪族炭化水素を意味し、それには、限定されるものではないが、ジエン、トリエンおよびテトラエン不飽和脂肪族炭化水素が含まれる。
【００２５】
環状「アルキル」または「アルケニル」の例は：
【００２６】
【化２】
0005957646.tif 000003
である。
【００２７】
本明細書において、「ヘテロシクリル」または「複素環」は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する４〜１０員の芳香族もしくは非芳香族複素環を意味し、それには二環式基が含まれる。したがって「ヘテロシクリル」には、以下：
ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドールアジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびに、そのすべてがＲ”から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい、そのＮ−酸化物が含まれる。
【００２８】
本明細書において、「ポリアミン」は、２個またはそれ以上のアミノ基を有する化合物を意味する。例としては、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、およびスペルミンが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、「ハロゲン」は、Ｂｒ、Ｃｌ、ＦおよびＩを意味する。
【００３０】
式Ａの一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈおよび（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されているか、または、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に、該窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３１】
式Ａの一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、前記メチル、エチルおよびプロピルは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、または、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に、該窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよい、４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３２】
式Ａの一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。
【００３３】
式Ａの一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、各々、Ｈである。
【００３４】
式Ａの一実施形態では、Ｒ’は、Ｒ”である。
【００３５】
式Ａの一実施形態では、Ｒ”は、独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、前記メチル、エチルおよびプロピルは、１個以上のハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい。
【００３６】
式Ａの一実施形態では、Ｒ”は、独立に、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。
【００３７】
式Ａの一実施形態では、Ｌ１は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択される。
【００３８】
式Ａの一実施形態では、Ｌ１は、Ｃ４−Ｃ２２アルキルおよびＣ４−Ｃ２２アルケニルから選択される。
【００３９】
式Ａの一実施形態では、Ｌ１は、Ｃ４−Ｃ２２アルケニルから選択される。
【００４０】
式Ａの一実施形態では、Ｌ１は、Ｃ１２−Ｃ２２アルケニルから選択される。
【００４１】
式Ａの一実施形態では、Ｌ１は、Ｃ１８アルケニルである。
【００４２】
式Ａの一実施形態では、Ｌ１は、
【００４３】
【化３】
0005957646.tif 000004
である。
【００４４】
式Ａの一実施形態では、Ｌ１は、
【００４５】
【化４】
0005957646.tif 000005
である。
【００４６】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ３−Ｃ１３アルキルおよびＣ３−Ｃ１３アルケニルから選択される。
【００４７】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ３−Ｃ９アルキルおよびＣ３−Ｃ９アルケニルから選択される。
【００４８】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ３−Ｃ８アルキルおよびＣ３−Ｃ８アルケニルから選択される。
【００４９】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ３−Ｃ１３アルキルおよびＣ３−Ｃ１３アルケニルから選択される。
【００５０】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ３−Ｃ９アルキルおよびＣ３−Ｃ９アルケニルから選択される。
【００５１】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ３−Ｃ８アルキルおよびＣ３−Ｃ８アルケニルから選択される。
【００５２】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ３−Ｃ１３アルキルである。
【００５３】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ３−Ｃ９アルキルである。
【００５４】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ３−Ｃ８アルキルである。
【００５５】
式Ａの一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ８アルキルである。
【００５６】
式Ａの一実施形態では、「ヘテロシクリル」は、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００５７】
式Ａの一実施形態では、「単環式ヘテロシクリル」は、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００５８】
式Ａの一実施形態では、「ポリアミン」は、プトレッシン、カダベリン、スペルミジンまたはスペルミンである。
【００５９】
一実施形態では、「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖飽和脂肪族炭化水素である。
【００６０】
一実施形態では、「アルケニル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖不飽和脂肪族炭化水素である。
【００６１】
本発明には、式Ａのカチオン性脂質の遊離形態、ならびにその製薬上許容される塩および立体異性体が含まれる。本明細書において例示される一部の単離された具体的なカチオン性脂質は、アミンカチオン性脂質のプロトン化塩である。用語「遊離形態」とは、非塩形態のアミンカチオン性脂質をさす。包含される製薬上許容される塩には、本明細書に記載される具体的なカチオン性脂質について例示される単離された塩だけでなく、式Ａのカチオン性脂質の遊離形態のすべての典型的な製薬上許容される塩も含まれる。記載される具体的な塩カチオン性脂質の遊離形態は、当技術分野で公知の技法によって単離することができる。例えば、遊離形態は、塩を適した希釈塩基水溶液、例えば希釈ＮａＯＨ水溶液、炭酸カリウム水溶液、アンモニア水および重炭酸ナトリウム水溶液などで処理することにより、再生することができる。遊離形態は、ある種の物理的特性、例えば極性溶媒中の溶解度などにおいてその各々の塩形態とは多少異なる可能性があるが、酸塩および塩基塩は、その他の点で本発明の目的のその各々の遊離形態と製薬上等価である。
【００６２】
本発明のカチオン性脂質の製薬上許容される塩は、塩基性または酸性部分を含有する本発明のカチオン性脂質から従来の化学的手法によって合成することができる。一般に、塩基性カチオン性脂質の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによるか、あるいは、適した溶媒または様々な組合せの溶媒中、遊離塩基と、化学量論量または過剰量の所望の塩形成無機酸もしくは有機酸を反応させることによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機塩基または有機塩基との反応により形成される。
【００６３】
よって、本発明のカチオン性脂質の製薬上許容される塩には、塩基性の本発明のカチオン性脂質と無機酸または有機酸を反応させることにより形成されるような本発明のカチオン性脂質の従来型の無毒の塩が含まれる。例えば、従来型の無毒の塩としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸および同類のものなどから誘導される塩、ならびに有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および同類のものなどから調製される塩が挙げられる。
【００６４】
本発明のカチオン性脂質が酸性である場合、適した「製薬上許容される塩」とは、無機塩基および有機塩基を含む、製薬上許容される無毒の塩基から調製される塩をさす。無機塩基から誘導される塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩（ｍａｎｇａｎｉｃ  ｓａｌｔｓ）、第一マンガン（ｍａｎｇａｎｏｕｓ）、カリウム、ナトリウム、亜鉛および同類のものが挙げられる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウム塩である。製薬上許容される有機無毒塩基から誘導される塩としては、第一級、第二級および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタインカフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ１−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミントリプロピルアミン、トロメタミンおよび同類のものなどの塩が挙げられる。
【００６５】
上記の製薬上許容される塩およびその他の典型的な製薬上許容される塩の調製は、Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７：６６：１−１９によってより詳細に記載されている。
【００６６】
また、本発明のカチオン性脂質は内部塩または双性イオンである可能性があることにも留意されたい。これは、生理的条件下では、化合物中の脱プロトン化酸性部分、例えばカルボキシル基などはアニオン性である場合があり、その結果、この電子電荷はプロトン化またはアルキル化塩基性部分、例えば第四級窒素原子などのカチオン電荷に対して内部的に平衡をとって離れる可能性があるためである。
【実施例】
【００６７】
提供される実施例は、本発明のさらなる理解を助けることを目的とする。用いる特定の材料、種および条件は、本発明をさらに例示することを目的とし、その合理的な範囲を制限することを意図しない。カチオン性脂質を合成する際に利用される試薬は、市販のものであるか、または当業者によって容易に調製されるものである。
【００６８】
新規なカチオン性脂質の合成は、エピクロロヒドリン（ｉ）で出発する線形プロセスである。エピクロロヒドリンと脂質アルコールとの反応により、中間体エポキシドｉｉが得られる。第２の脂質アルコールによるルイス酸エポキシドの開環により、第二級アルコールｉｉｉが得られる。トリフラート形成およびアミン置換により、タイプｉｖの最終生成物が得られる。
【００６９】
一般的スキーム１
【００７０】
【化５】
0005957646.tif 000006
中間体シクロプロピル類似体（ｖｉ）の合成は、タイプｖのオレフィンのシモンズ・スミスシクロプロパン化反応により実行した。
【００７１】
一般的スキーム２
【００７２】
【化６】
0005957646.tif 000007
スキーム１
Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物１）
【００７３】
【化７】
0005957646.tif 000008
オクタノール（１．５モル、１９５ｇ）、テトラブチルアンモニウムブロマイド（７５ミリモル、２４．１ｇ）および水酸化ナトリウム（２．４モル、９６ｇ）の溶液を、３℃に冷却し、Ｒ−エピクロロヒドリンを滴下漏斗を介して添加した。混合物を３℃にて６時間攪拌した後、１６時間周囲温度まで暖まらせた。反応物を、ヘキサンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分液した。有機物を水（２×６２５ｍＬ）およびブライン（６２５ｍＬ）で洗浄し、真空蒸発させた。粗油状物質を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、０〜２０％酢酸エチル／ヘプタン）により精製して、２３６ｇ（８５％）の２−［（オクチルオキシ）メチル］オキシランの鏡像異性体の１つを透明な油状物質として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．６８（ｍ，１Ｈ）、３．４５（ｍ，２Ｈ）、３．３８（ｍ，１Ｈ）、３．１６（ｍ，１Ｈ）、２．７８（ｍ，１Ｈ）、２．５９（ｍ，１Ｈ）、１．５８（ｍ，２Ｈ）、１．３０（ｍ，１０Ｈ）、０．８３（ｍ，３Ｈ）。
【００７４】
最初に、この反応の生成物に、不斉炭素中心に変化のない、ハライド原子を有する炭素でのＳＮ２機構によって得られ得る２Ｒ立体化学を割り当てた。
【００７５】
しかし、記載した条件、すなわちルイス酸条件下での、振動円偏光二色性（ＶＣＤ）、すなわちキラル分子の絶対配置を決定するための妥当な分光学的方法（Ｒ．Ｋ．Ｄｕｋｏｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ａ．Ｎａｆｉｅ，ｉｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ｒ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ  （Ｗｉｌｅｙ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，２０００）６６２−６７６）と併せた、その後の研究（リネオリル（ｌｉｎｅｏｌｙｌ）アルコールとＳ−エピクロロヒドリンの反応での実験）により、ＳＮ２の機構によって生じた反応、すなわちその後の開環をもたらすエポキシドの末端炭素での反応が明らかとなり、その後、不斉炭素での立体化学の反転を導くインサイチュ閉環段階が続いた。
【００７６】
これらの研究の結果として、この反応の生成物に、２Ｓ立体化学：（２Ｓ）−［（オクチルオキシ）メチル］オキシランを割り当てた。
【００７７】
【化８】
0005957646.tif 000009
エポキシド（３．８６ｇ、２０．７ミリモル）およびリノレイルアルコール（６．６ｇ、２４．８ミリモル）のジクロロメタン（１００ｍＬ）中の溶液を、周囲温度にて四塩化スズ（４．４４ｇ、２．０ミリモル）で処理した。３時間攪拌した後、反応をブラインでクエンチし、ブラインとジクロロメタンとに分液した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空蒸発させた。粗油状物質を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２〜５％アセトン／ヘキサン）により精製して５．８５ｇ（６２％）のＲ−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−オールを透明な油状物質として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．３８（ｍ，４Ｈ）、３．９３（ｍ，１Ｈ）、３．４９（ｍ，８Ｈ）、２．７９（ｍ，２Ｈ）、２．４５（ｍ，１Ｈ）、２．０６（ｍ，４Ｈ）、１．５８（ｍ，６Ｈ）、１．３０（ｍ，２６Ｈ）、０．８９（ｍ，６Ｈ）。
【００７８】
【化９】
0005957646.tif 000010
化合物ｉｉｉ（５．０８ｇ、１１．２ミリモル）を、ジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解し、２，６−ルチジン（１．４４ｇ、１３．５ミリモル）で処理した。トリフル酸無水物（３．８ｇ、１３．５ミリモル）を０℃にて反応系に滴下した。２．５時間後、反応物を、ジメチルアミン（３９．３ミリモル）のジクロロメタン（８５ｍＬ）中の冷溶液の中にカニューレで挿入した。０℃で２時間後、反応を飽和重炭酸ナトリウム溶液でクエンチし、水／ジクロロメタンに分液した。有機物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空蒸発させた。粗油状物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、０〜３０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、３．６６ｇ（６５％）のＳ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミンを琥珀色の油状物質として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．３８（ｍ，４Ｈ）、３．５２（ｍ，４Ｈ）、３．４０（ｍ，４Ｈ）、２．７９（ｍ，３Ｈ）、２．４０（ｓ，６Ｈ）、２．０５（ｍ，４Ｈ）、１．５８（ｍ，４Ｈ）、１．３０（ｍ，２６Ｈ）、０．８９（ｍ，６Ｈ）。ＨＲＭＳ：計算値４８０．４７７５、観察値４８０．４７６９。
【００７９】
化合物２は、新規なカチオン性脂質であり、Ｓ−エピクロロヒドリンで出発する、上の一般的スキーム１およびスキーム１に従って調製した。
【００８０】
【化１０】
0005957646.tif 000011
化合物２
Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物２）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．３８（ｍ，４Ｈ）、３．５２（ｍ，４Ｈ）、３．４０（ｍ，４Ｈ）、２．７９（ｍ，３Ｈ）、２．４０（ｓ，６Ｈ）、２．０５（ｍ，４Ｈ）、１．５８（ｍ，４Ｈ）、１．３０（ｍ，２６Ｈ）、０．８９（ｍ，６Ｈ）。
【００８１】
化合物３〜２０を、一般スキーム１に従って化合物１に記載されるものに類似の方法で調製した。
【００８２】
【表１】
0005957646.tif 000012
0005957646.tif 000013
スキーム２
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン（化合物２１）
【００８３】
【化１１】
0005957646.tif 000014
１Ｌフラスコ中の１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−オールのＤＣＭ（１６６ｍｌ）中の溶液を、窒素下、氷／ＩＰＡ浴（−１５℃）中で冷却し、次に、ヘキサン中１Ｍジエチル亜鉛（１９９ｍｌ、１９９ミリモル）を添加し、それに続いてジヨードメタン（２４．０５ｍｌ、２９８ミリモル）を添加した。混合物を、徐々に室温に達するように冷却浴中で一晩攪拌させた。過剰な飽和塩化アンモニウムの添加により反応をクエンチした。洗浄した反応物をヘキサンおよび水と２Ｌ分液漏斗に入れ、過剰なヘキサンを添加し、激しく振盪した。下側の水層を捨て、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて１−（オクチルオキシ）−３−［（８−｛２−［（２−ペンチルシクロプロピル）メチル］シクロプロピル｝オクチル）オキシ］プロパン−２−オール（１５．５ｇ、３２．２ミリモル、収率９７％）を黄色の油状物質とした。材料はさらなる精製を行わずに使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）：４８１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００８４】
【化１２】
0005957646.tif 000015
アルコールｖｉの最終化合物２１への変換は、化合物１について記載されるように達成した。Ｃ３３Ｈ６５ＮＯ２［Ｍ＋Ｈ］、計算値５０８．５、観察値５０８．５。
【００８５】
Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン（化合物２２）は、化合物２１について記載されるのと同様の方法で調製した。Ｃ３２Ｈ６５ＮＯ２［Ｍ＋Ｈ］、計算値４９６．５、観察値４９６．５。
【００８６】
【化１３】
0005957646.tif 000016
化合物２３は、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５，１０７，２７６−２８７、米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号、および同第２００６／０００８９１０号に記載されるＤＬｉｎＤＭＡである。
【００８７】
【化１４】
0005957646.tif 000017
化合物２４は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２８，１７２−１７６、国際公開第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０４８５３６号、同第２０１０／０８８５３７号、および同第２００９／１２７０６０号に記載されるＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡである。
【００８８】
【化１５】
0005957646.tif 000018
ＬＮＰ組成
以下の本発明の脂質ナノ粒子組成（ＬＮＰｓ）は、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達に有用である：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５６．６／３８／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６７．３／２９／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ４９．３／４７／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５０．３／４４．３／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；および
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０。
【００８９】
ＬＮＰｓの合成および使用は、公知である。（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号、同第２００６／０２４０５５４号、同第２００８／００２００５８号、同第２００９／０２６３４０７号および同第２００９／０２８５８８１号ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号および同第２０１０／０５４４０６号参照）。また、Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照されたい。
【００９０】
ＬＮＰプロセスの説明：
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、衝突噴流法により調製される。この粒子は、アルコールに溶解した脂質とクエン酸塩緩衝液に溶解したｓｉＲＮＡを混合することにより形成される。脂質のｓｉＲＮＡに対する混合比は、脂質４５〜５５％およびｓｉＲＮＡ６５〜４５％を目標とする。この脂質溶液は、本発明の新規なカチオン性脂質、ヘルパー脂質（コレステロール）、ＰＥＧ（例、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ）脂質、および５〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＳＰＣを、アルコール（例えばエタノール）中９〜１２ｍｇ／ｍＬの目標で含有する。これらの脂質の比は、カチオン性脂質について２５〜９８モルパーセントの範囲（目標は３５〜６５）であり、ヘルパー脂質は、０〜７５モルパーセントの範囲（目標は３０〜５０）であり、ＰＥＧ脂質は、１〜１５モルパーセントの範囲（目標は１〜６）であり、ＤＳＰＣは、０〜１５モルパーセントの範囲（目標は０〜１２）である。ｓｉＲＮＡ溶液は、１つ以上のｓｉＲＮＡ配列を０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含有し、目標は、３．５〜５の範囲のｐＨのクエン酸ナトリウム緩衝塩溶液中０．３〜０．９ｍｇ／ｍＬである。これら２つの液体を、３０〜４０℃を目標とする、１５〜４０℃の範囲の温度に加熱した後、衝突噴流ミキサーで混合し、直ちにＬＮＰを形成した。ティー内径（ｔｅｅＩＤ）は、０．２５〜１．０ｍｍの範囲であり、全流速は１０〜６００ｍＬ／分の範囲である。流速とチューブ内径（ｔｕｂｉｎｇ  ＩＤ）の組合せは、ＬＮＰｓの粒径を３０〜２００ｎｍの間に制御する効果がある。次に、溶液を、より高いｐＨの緩衝液と、１：１〜１：３  容積：容積の範囲であるが１：２  容積：容積を目標とする範囲の混合比で混合する。この緩衝液は、３０〜４０℃を目標とする、１５〜４０℃の範囲の温度である。混合したＬＮＰｓを、アニオン交換濾過段階の前に３０分〜２時間保持した。インキュベーション中の温度は、３０〜４０℃を目標とする、１５〜４０℃の範囲である。インキュベートした後、溶液を、アニオン交換分離段階を含む０．８ｕｍフィルターに通して濾過する。この方法は、１ｍｍ  ＩＤ〜５ｍｍ  ＩＤまでのチューブ内径および１０〜２０００ｍＬ／分の流速を使用する。ＬＮＰｓを濃縮し、限外濾過法によって透析濾過し、アルコールを除去し、クエン酸塩緩衝液を最終の緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水などに交換する。限外濾過法は、タンジェンシャルフロー濾過方式（ＴＦＦ）を使用する。この方法は、公称分子量カットオフが３０〜５００ＫＤの範囲の膜を使用する。膜形式は、中空糸であってもフラットシートカセットであってもよい。適切な分子量カットオフを用いるＴＦＦ法は、ＬＮＰを保持液中に保持し、濾液または透過液は、アルコール；クエン酸緩衝液；最終の緩衝液廃棄物を含有する。ＴＦＦ法は、ｓｉＲＮＡ濃度に対する初期濃度が１〜３ｍｇ／ｍＬの多段階法である。濃縮した後、アルコールを除去して緩衝液交換を実施するために、ＬＮＰｓ溶液を、１０〜２０容積の最終緩衝液に対して透析濾過する。次に、材料をさらに１〜３倍に濃縮する。ＬＮＰ法の最終段階は、濃縮したＬＮＰ溶液を滅菌濾過し、生成物をバイアルに入れることである。
【００９１】
分析手順：
１）ｓｉＲＮＡ濃度
ｓｉＲＮＡ二本鎖濃度は、２９９６  ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を用いて、強陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）により決定される。ＬＮＰｓ（そうでなければＲＮＡｉ送達ビヒクル（ＲＤＶｓ）と呼ばれる）を、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理して全ｓｉＲＮＡを遊離し、２５４ｎｍでＵＶ検出するＤｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ  ２００（４×２５０ｍｍ）カラムを用いるＳＡＸ分離により分析した。移動相は、Ａ：２５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ  トリス、２０％  ＥｔＯＨ、ｐＨ７．０およびＢ；２５０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ  トリス、２０％  ＥｔＯＨ、ｐＨ７．０で構成され、０〜１５分の線形勾配および１ｍｌ／分の流速を用いる。ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線と比較することにより決定される。
【００９２】
２）カプセル封入率
蛍光試薬ＳＹＢＲ  ＧｏｌｄをＲＮＡ定量化に用いて、ＲＤＶｓのカプセル封入率をモニターする。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むまたは含まないＲＤＶｓを使用して、遊離ｓｉＲＮＡおよび全ｓｉＲＮＡ量を決定する。このアッセイは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）製のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅマイクロプレート分光光度計を用いて実施される。サンプルは４８５ｎｍで励起し、５３０ｎｍで蛍光発光を測定した。ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線と比較することにより決定される。
【００９３】
カプセル封入率＝（１−遊離ｓｉＲＮＡ／全ｓｉＲＮＡ）×１００％
３）粒径および多分散性
１μｇのｓｉＲＮＡを含有するＲＤＶｓを、１×ＰＢＳで希釈して最終容積３ｍｌとする。サンプルの粒径および多分散性を、ＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｉｌｅ、ＮＹ）を用いる動的光散乱法により測定する。散乱強度を、散乱角９０°で２５℃のＨｅ−Ｎｅレーザーによって測定する。
【００９４】
４）ゼータ電位分析
１μｇのｓｉＲＮＡを含有するＲＤＶｓを、１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して最終容積２ｍｌとする。サンプルの電気泳動移動度を、電極および光源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを備えたＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｉｌｅ，ＮＹ）を用いて決定する。Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉの極限を、ゼータ電位の計算において仮定する。
【００９５】
５）脂質分析
個々の脂質濃度は、コロナ荷電化粒子検出器（Ｃｏｒｏｎａ  ｃｈａｒｇｅｄ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＣＡＤ）（ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により決定する。ＲＤＶｓ中の個々の脂質は、ＣＡＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ、粒径１．８μｍ）カラムを６０℃で用いて分析する。移動相は、Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％  ＴＦＡおよびＢ：ＩＰＡ中０．１％ＴＥＡで構成される。勾配は、０時の移動相Ａ６０％および移動相Ｂ４０％から、１．００分の移動相Ａ４０％および移動相Ｂ６０％；１．００〜５．００分の移動相Ａ４０％および移動相Ｂ６０％；５．００分の移動相Ａ４０％および移動相Ｂ６０％から、１０．００分の移動相Ａ２５％および移動相Ｂ７５％；１０．００分の移動相Ａ２５％および移動相Ｂ７５％から、１５．００分の移動相Ａ５％および移動相Ｂ９５％；そして１５．００分の移動相Ａ５％および移動相Ｂ９５％から、２０．００分の移動相Ａ６０％および移動相Ｂ４０％に１ｍｌ／分の流速で変化する。個々の脂質濃度は、二次曲線の当てはめによって、ＲＤＶｓ中のすべての脂質成分を含む標準曲線と比較することにより決定される。各々の脂質の分子百分率は、その分子量に基づいて計算される。
【００９６】
上記のＬＮＰプロセスを利用して、以下の比をもつ具体的なＬＮＰｓを特定した：
公称組成：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６７．３／２９／３．７。
【００９７】
Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ
５’−ｉＢ−ＡＵＡＡＧＧＣＵＡＵＧＡＡＧＡＧＡＵＡＴＴ−ｉＢ  ３’（配列番号：１）
３’−ＵＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＡＣＵＵＣＵＣＵＡＵ−５’（配列番号：２）
ＡＵＧＣ−リボース
ｉＢ−逆位デオキシ脱塩基
ＵＣ−２’フルオロ
ＡＧＴ−２’デオキシ
ＡＧＵ−２’ＯＣＨ３
公称組成
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０
ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ
５’−ｉＢ−ＣＵＵＵＡＡＣＡＡＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＴＴ−ｉＢ（配列番号：３）
３’−ＵＵＧＡＡＡＵＵＧＵＵＡＡＧＧＡＣＵＵＵＡ−５’（配列番号：４）
ＡＵＧＣ−リボース
ｉＢ−逆位デオキシ脱塩基
ＵＣ−２’フルオロ
ＡＧＴ−２’デオキシ
ＡＧＵ−２’ＯＣＨ３
公称組成
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０
ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ
５’−ｉＢ−ＣＵＵＵＡＡＣＡＡＵＵＣＣＵＧＡＡＡＵＴｓＴ−ｉ−３’Ｂ（配列番号：５）
３’−ＵｓＵＧＡＡＡＵＵＧＵＵＡＡＧＧＡＣＵｓＵｓＵｓＡ−５’（配列番号：６）
ＡＵＧＣ−リボース
ｉＢ−逆位デオキシ脱塩基
ＵＣ−２’フルオロ
ＡＧＴ−２’デオキシ
ＡＧＵ−２’ＯＣＨ３
ＵｓＡ−ホスホロチオエート（ｐｈｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合
オリゴヌクレオチド、特に、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの合成および使用は公知である。（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号、同第２００６／０２４０５５４号、同第２００８／００２００５８号、同第２００９／０２６３４０７号および同第２００９／０２８５８８１号ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号および同第２０１０／０５４４０６号参照）。また、Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照されたい。
【実施例１】
【００９８】
有効性のマウスインビボ評価
直前に記載される公称組成の化合物１〜２を利用するＬＮＰｓを、ルシフェラーゼマウスモデルにおけるインビボ有効性および炎症性サイトカインの誘導について評価した。ｓｉＲＮＡは、ホタル（フォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼ遺伝子（受託番号Ｍ１５０７７）のｍＲＮＡ転写物を標的にする。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの一次配列および化学修飾パターンを上に表示する。インビボルシフェラーゼモデルは、ホタルルシフェラーゼコード配列がすべての細胞に存在しているトランスジェニックマウスを用いる。ダナ・ファーバー癌研究所（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から認可されたＲＯＳＡ２６−ＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−Ｌｕｃ（ＬＳＬ−Ｌｕｃ）トランスジェニックマウスを、最初にＬＳＬ配列を組換えＡｄ−Ｃｒｅウイルス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で除去することにより、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように誘導する。ウイルスの臓器親和性に起因して、尾静脈注射により送達される場合には、発現は肝臓に制限される。肝臓におけるルシフェラーゼ発現レベルを、ルシフェリン基質（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の投与の後に、ＩＶＩＳ撮像装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて発光を測定することにより定量化する。投薬前（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ）発光レベルをＲＤＶｓの投与の前に測定する。ＰＢＳ中のルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ）を、１５０μＬの量で腹腔内（ＩＰ）注射する。４分のインキュベーション期間の後、マウスをイソフランで麻酔し、ＩＶＩＳ撮像装置に入れる。ＰＢＳビヒクル中のＲＤＶｓ（ｓｉＲＮＡを含有）を、０．２ｍＬの量で尾静脈注射した。最終投与量レベルは、０．３〜３ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡの範囲であった。ＰＢＳビヒクル単独は、対照として投与した。投薬の３時間後、マウスを後眼窩から出血させてサイトカイン分析のための血漿を得た。マウスを、投薬の４８時間後に上記の方法を用いて撮像した。ルシフェリン光出力の変化は、直接にルシフェラーゼｍＲＮＡレベルに相関し、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ活性の間接的な尺度を示す。インビボ有効性の結果は、投薬前発光レベルに対する発光の阻害％として表される。血漿中サイトカイン濃度は、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ多重サイトカイン化学発光アレイ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて決定した。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ  ＲＤＶｓの全身投与は、ルシフェラーゼ発現を用量依存的に低下させた。オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（ＯＣＤ）カチオン性脂質を含有するＲＤＶを投与したマウスよりも、ＲＤＶｓを含有する化合物１を投与したマウスにおいて、より高い有効性が観察された（図１）。ＯＣＤは公知であり、国際公開第２０１０／０２１８６５号に記載されている。
【００９９】
有効性および毒性のラットインビボ評価
上記の公称組成において化合物１を利用するＬＮＰｓを、スプラーグ・ドーリー（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）雌ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）において、インビボ有効性およびアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増加について評価した。ｓｉＲＮＡは、ＡｐｏＢ遺伝子（受託番号ＮＭ  ０１９２８７）のｍＲＮＡ転写物を標的にする。ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡの一次配列および化学修飾パターンは上に表示されている。ＰＢＳビヒクル中のＲＤＶｓ（ｓｉＲＮＡを含有）を、１〜１．５ｍＬの量で尾静脈注射した。注入速度は、約３ｍｌ／分である。各々の投薬群に５匹のラットを使用した。ＬＮＰの投与後、ラットを標準的な食餌および水のあるケージに入れる。投薬の６時間後、食物をケージから取り出す。動物の解剖をＬＮＰ投薬の２４時間後に実施する。ラットを５分間のイソフランで麻酔した後、イソフランの送達を継続しながら全採血が終了するまでラットをノーズ・コーンに入れることにより麻酔下で維持する。血液は、２３ゲージバタフライ型静脈穿刺セットを用いて大静脈から採取し、血清化学分析のために血清分離器バキュテイナに等分する。切除した肝尾状葉のパンチを採取し、ｍＲＮＡ分析のためにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に入れる。保存肝組織をホモジナイズし、ＱｉａｇｅｎビーズミルおよびＱｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮＡ−Ｅａｓｙ  ＲＮＡ単離キットを製造業者の説明書に従って用いて全ＲＮＡを単離した。肝臓ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ラットＡｐｏＢの市販のプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＲＮ０１４９９０５４＿ｍｌ）を利用して精製ＲＮＡからメッセージを増幅させた。ＰＣＲ反応を、９６ウェルＦａｓｔ  Ｂｌｏｃｋを備えたＡＢＩ  ７５００機器で実施した。ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＰＰＩＢ（ＮＭ０１１１４９）ｍＲＮＡに正規化する。ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲにより市販のプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓカタログ番号Ｍｍ００４７８２９５＿ｍｌ）を用いて測定した。結果を、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ／ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡの比として表す。すべてのｍＲＮＡデータは、ＰＢＳ対照投薬量と比較して表される。血清ＡＬＴおよびＡＳＴ分析を、Ｓｉｅｍｅｎｓアラニンアミノトランスフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）試薬を利用して、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ａｄｖｉａ  １８００  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒで実施した。オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（ＯＣＤ）カチオン性脂質を含有するＲＤＶを投与したラットよりも、ＲＤＶを含有する化合物１を投与したラットにおいて、より高い有効性が観察された（図２）。その上、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡカチオン性脂質を含有するＲＤＶを投与したラットよりも、化合物１を含有するＲＤＶを投与したラットにおいて、ＬＦＴ（ＡＬＴ／ＡＳＴ）のより低い上昇が観察された（図３）。
【０１００】
ラット肝臓におけるカチオン性脂質レベルの決定
肝組織を秤量して２０ｍｌバイアルに入れ、９ｖ／ｗの水中でＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ  ２０００（ＯＰＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１６００ストローク／分、５分）を用いてホモジナイズした。各々の組織ホモジネートの５０μＬアリコートを、３００μＬの抽出／タンパク質沈殿溶媒（５００ｎＭ内部標準を含有する５０／５０  アセトニトリル／メタノール）と混合し、プレートを遠心して沈殿したタンパク質を沈降させた。次に、各々の上清の２００μＬの量を９６ウェルプレートの個々のウェルに移し、１０μｌの試料を直接、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳにより分析した。
【０１０１】
標準液は、既知量の化合物１またはＯＣＤのメタノール原液を未処理のラット肝臓ホモジネートに添加することにより調製した（肝臓１重量あたり水９容量）。各々の標準／肝臓ホモジネートのアリコート（５０μＬ）を、３００μＬの抽出／タンパク質沈殿溶媒（５００ｎＭ内部標準を含有する５０／５０  アセトニトリル／メタノール）と混合し、プレートを遠心して沈殿したタンパク質を沈降させた。各々の上清の２００μＬの量を９６ウェルプレートの個々のウェルに移し、１０μｌの各々の標準液を直接、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳにより分析した。
【０１０２】
ラット肝臓ホモジネートから調製および抽出した標準液に対する絶対定量を、ＡＰＩ  ４０００三連四重極質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に連結したＡｒｉａ  ＬＸ−２  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。各々の実験に対して、合計１０μＬの試料を、ＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ８  ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ、５０×２ｍｍ、３μｍ）に周囲温度で注入した（図４）。
【０１０３】
移動相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ／５％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸  移動相Ｂ：４０％メタノール／６０％ｎ−プロパノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸  流速は０．５ｍＬ／分であり、勾配溶出プロフィールは次の通りであった：Ａ８０％を０．２５分間保持、１．６分間でＢ１００％へ直線勾配、Ｂ１００％を２．５分間保持、次に、Ａ８０％に戻って１．７５分間保持。総実行時間は５．８分であった。ＡＰＩ  ４０００ソースパラメータは、ＣＡＤ：４、ＣＵＲ：１５、ＧＳ１：６５、ＧＳ２：３５、ＩＳ：４０００、ＴＥＭ：５５０、ＣＸＰ：１５、ＤＰ：６０、ＥＰ：１０であった。
【図１】
0005957646.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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