(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のｉ）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、免疫グロブリンＧ  Ｆｃ領域結合ポリペプチド。
ｉ）Ｘ1−（［スペーサー１］−ＫＦＤＫＥＱＱＮ  ＡＦＹＥＩＬＸ17ＬＰＸ20  ＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩ  ＱＫＬＫＤＸ36ＰＳＱＳ  ＡＥＬＬＡＥＡＫＱＬ  Ｘ５１ＥＡＱＡ−［スペーサー２］）n−ＣCTERM-1ＸCTERM
式中、互いに独立して、
Ｘ1はＰであり、
［スペーサー１］は１〜３個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、
Ｘ17は任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ20は任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ36はＥであり、
Ｘ51は任意のアミノ酸残基であり、
［スペーサー２］は０〜２０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、
ＸCTERMはＤであり、
ｎは１〜４である。
【請求項２】
［スペーサー１］がＡ、ＡＥ及びＡＥＡから選択される、請求項１記載のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ17がＨである、請求項１又は請求項２記載のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ20がＴ又はＮである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ51がＤ又はＮである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド。
【請求項６】
［スペーサー２］がＧである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド。
【請求項７】
相互作用のＫＤ値が１×１０-6Ｍ以下となるようにＩｇＧ  Ｆｃに結合する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列ｉ）が配列番号１〜４から選択される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド。
【請求項９】
各サブユニットが請求項８記載のポリペプチドである、２つ以上のサブユニットと、
その最後の残基としてＤ残基を含むＮ末端リーダーペプチドと
を含む多量体ポリペプチド。
【請求項１０】
ＩｇＧ  Ｆｃを含む分子を試料から単離する方法であって、
（ｉ）ＩｇＧ  Ｆｃを含む分子を含有する液体を用意する段階と、
（ｉｉ）前記液体を請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド又は請求項９記載の多量体ポリペプチドと接触させ、それによってＩｇＧ  Ｆｃを含む前記分子が前記ポリペプチドに結合する段階と、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ  Ｆｃを含む結合した分子を前記液体から単離する段階と
を含んでなる方法。
【請求項１１】
不溶性マトリックスに共有結合している、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド又は請求項９記載の多量体ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＧ  Ｆｃ（ＩｇＧ  Ｆｃ）に結合するポリペプチド、及びその製造方法に関する。このポリペプチドは、例えば、抗体及び／又はＦｃ融合タンパク質の製造における分離及び／又は精製において、例えば、クロマトグラフィーにおいて、工業的用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体及びＦｃ融合タンパク質の工業的製造において、精製は、クロマトグラフィーを使用して頻繁に行われる。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡは、ＩｇＧのＦｃ部分に対するプロテインＡのネイティブな親和性により、そのような用途において親和性リガンドとして長く使用されてきた。全体としてのプロテインＡ、並びにその５つの個々のＦｃ結合ドメインは、その後、向上した特性を有する、遺伝子工学的に作製される親和性リガンドの合理的な設計のための出発点として役立ってきた。
【０００３】
例えば、プロテインＡのＢドメインは、遺伝子工学的に作製される、ＩｇＧ  Ｆｃに結合する単一ドメインのプロテインＺを作り出すための出発点として役立った(Nilsson B et al, Protein Eng 1(2):107-13, 1987)。工業的クロマトグラフィープロセス中の定置洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）手順において用いられるものなどのアルカリ性条件におけるこのタンパク質の安定性を改善するために、Ｌｉｎｈｕｌｔら(Proteins 55(2):407-16, 2004)は、突然変異したアスパラギン残基を含むプロテインＺの変異体を提案した。この変異体は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ウプサラ、スウェーデン）によってさらに開発されて、市販の製品ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅとなった。ＩｇＧ  Ｆｃ親和性を有するさらなるＺ変異体は、ＷＯ２００９／１４６７５５において開示されている。
【０００４】
ネイティブなＩｇＧ  Ｆｃ結合が変化した、プロテインＺに基づく突然変異結合タンパク質は、ＷＯ２００９／０８０８１１において記載されている。
【０００５】
ネイティブなプロテインＡは、その５つの個々のＩｇＧ  Ｆｃ-結合ドメインとともに、５つのドメインのそれぞれが１個のＩｇＧに結合する能力を有するという事実にもかかわらず、ＩｇＧ２分子のみ、又は組換えＦｃ断片３分子に結合することが示されている(Birger Jansson, PhD Thesis, Stockholm, Sweden, 1996, ISBN 91-7170-656-9)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５１４３８４４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在使用されているＩｇＧ  Ｆｃ親和性リガンドは同程度に成功しているにもかかわらず、特に、化学量論比を向上させ、同時に維持し、理想的には、酸性及びアルカリ性条件に対する安定性を向上させるという複合的な要求に関して、向上が引き続き必要である。ＩｇＧ  Ｆｃに対する親和性を有する作用物質を継続して供給することは、依然として重要な関心事である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
その第１の態様によれば、本発明は、以下のｉ）及びｉｉ）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、免疫グロブリンＧ  Ｆｃ（ＩｇＧ  Ｆｃ）結合ポリペプチドを提供する。
ｉ）Ｘ1−（［スペーサー１］−ＫＦＤＫＥＱＱＮ  ＡＦＹＥＩＬＸ17ＬＰＸ20  ＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩ  ＱＫＬＫＤＸ36ＰＳＱＳ  ＡＥＬＬＡＥＡＫＱＬ  Ｘ51ＥＡＱＡ−［スペーサー２］）n−ＣCTERM-1ＸCTERM
式中、互いに独立して、
Ｘ1はＰであるか或いは存在せず、
［スペーサー１］は１〜３個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、
Ｘ17は任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ20は任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ36はＤ以外の任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ51は任意のアミノ酸残基であり、
［スペーサー２］は０〜２０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、
ＸCTERMはＤであるか或いは存在せず、
ｎは１〜４である。
ｉｉ）ｉ）で定義した配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のこの態様の一実施形態では、免疫グロブリンＧ  Ｆｃ（ＩｇＧ  Ｆｃ）結合ポリペプチドは、上記で定義されているｉ）及びｉｉ）から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００１０】
本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列は、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプロテインＡの様々なドメイン並びにプロテインＡのＢドメイン由来のプロテインＺを出発点として考慮して、最適化されたＩｇＧ  Ｆｃ結合分子を提供するために、本発明者によって考案された。天然のプロテインＡ又は以前に知られている遺伝子工学的に作製されたその変異体の分子ドメイン構造と同様に、本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ  Ｆｃ結合能を有する１つ以上の別個のドメインを提供する。特に、２つのスペーサー配列間のアミノ酸配列は、フォールディングして、ＩｇＧ  Ｆｃ結合能を有する単一の３ヘリックスバンドルドメインになると予測される。上述したように、数字ｎは、１から４の間であってよく、本発明によるポリペプチドが、スペーサー配列によって隔てられた１〜４個の別個のＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインを有し、そのようなドメインの単量体、二量体、三量体又は四量体を構成し得ることを示す。
【００１１】
プロテインＺにおいて、上記のアミノ酸配列ｉ）におけるポジション１７に対応するアミノ酸ポジションは、ヒスチジン残基が占めている。本発明のポリペプチドにおいて、Ｘ17はＨであってよいが、任意の別のアミノ酸残基によって置換されていてもよい。このポジションでの置換は、化学的に反応性のアミノ酸を回避するという一般的な必要性が動機となり得る。
【００１２】
プロテインＺにおいて、上記のアミノ酸配列ｉ）におけるポジション３６に対応するアミノ酸ポジションは、アスパラギン酸残基が占めている。しかしながら、アミノ酸配列ｉ）において、このポジションは、例えば、グルタミン酸残基又はアラニン残基によって置換されている。理論に拘束されることは望まないが、この差異は、ａ）ポリペプチドの酸安定性を増加させること、及びｂ）３へリックスバンドルドメイン内のＤＰジペプチドを除去すること（除去しなければ、酸触媒による切断に感受性である）、という２つの別々の目的を果たすと現在考えられている。下記により詳細に記載されている本発明の一態様は、分子の別の部分におけるＤＰジペプチドモチーフの感受性を使用しており、ポジション３６〜３７でのＤＰジペプチドの存在は、本発明のこの態様の実用性を減少させるであろう。
【００１３】
プロテインＺにおいて、上記のアミノ酸配列ｉ）におけるポジション４９に対応するアミノ酸ポジションは、リシン残基が占めている。しかしながら、アミノ酸配列ｉ）において、このポジションは、グルタミン残基が占めている。
【００１４】
当業者が理解するように、本発明によるポリペプチドのＩｇＧ  Ｆｃ結合能などの任意のポリペプチドの機能は、ポリペプチドの三次構造に依存している。その機能に影響を及ぼすことなく、α−ヘリックスポリペプチドにおけるアミノ酸の配列を変化させることが可能である(Taverna and Goldstein, J Mol Biol 315(3):479-84, 2002; He et al, Proc Natl Acad Sci USA 105(38):14412-17, 2008)。したがって、本発明は、得られた配列が、ｉ）によって定義されるクラスに属する配列に９５％以上同一となるような、ｉ）の変化した変異体を包含する。例えば、アミノ酸残基の特定の機能的グループ分け（例えば、疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基を、同じ機能的グループの別のアミノ酸残基で交換することが可能である。
【００１５】
異なるポリペプチドのアミノ酸配列間の同一性の程度について本明細書において言及する場合、本明細書において開示されている配列と９５％同一性の下限が与えられる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書において記載されている配列に９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一な配列を有し得る。「％同一性」という用語は、本明細書及び添付の特許請求の範囲全体にわたって使用される場合、例えば、以下の通り計算することができる。クエリ配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680(1994))を使用して標的配列に対してアラインする。アラインされた配列の最短のものに対応するウィンドウについて比較を行う。アラインされた配列の最短のものは、場合によって、２９アミノ酸残基ＨＥＲ３結合モチーフなどの標的配列であることがある。別の場合では、クエリ配列は、アラインされた配列の最短のものを構成していることがある。クエリ配列は、例えば、１０以上のアミノ酸残基、例えば、２０以上のアミノ酸残基などからなってもよい。各ポジションのアミノ酸残基を比較し、標的配列において同一な対応を有するクエリ配列中のポジションのパーセントを、％同一性として報告する。
【００１６】
本発明によるポリペプチドの一実施形態では、［スペーサー１］は、Ａ、ＡＥ及びＡＥＡから選択される。［スペーサー１］は、例えば、Ａであってもよい。
【００１７】
本発明によるポリペプチドの一実施形態では、Ｘ17は、Ｈである。
【００１８】
本発明によるポリペプチドの一実施形態では、Ｘ20は、Ｎ以外の任意のアミノ酸残基である。Ｘ20は、例えば、Ｔであってもよい。
【００１９】
代替の実施形態では、Ｘ20は、Ｎである。
【００２０】
本発明によるポリペプチドの一実施形態では、Ｘ36は、Ｅ及びＡから選択される。Ｘ36は、例えば、Ｅであってもよい。
【００２１】
本発明によるポリペプチドの一実施形態ではＸ51は、Ｎ以外の任意のアミノ酸残基である。Ｘ51は、例えば、Ｄであってもよい。
【００２２】
代替の実施形態では、Ｘ51は、Ｎである。
【００２３】
本発明によるポリペプチドの一実施形態では、［スペーサー２］のすべてのアミノ酸残基は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＶから、特に、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴから、例えば、Ｇ、Ｑ及びＳから独立して選択される。さらにより具体的な実施形態では、［スペーサー２］はＧである。
【００２４】
上記で論じたように、ｎは１から４の間の数字であり、すなわち、１、２、３又は４であってよい。
【００２５】
ｎ＞１である本発明によるポリペプチドにおいて、［スペーサー１］の複数の存在は、それぞれ個々に同じアミノ酸配列からなっていてもよく、又は異なるアミノ酸配列であってもよい。同じく、ｎ＞１である本発明によるポリペプチドにおいて、［スペーサー２］の複数の存在は、それぞれ個々に同じアミノ酸配列からなっていてもよく、又は異なるアミノ酸配列であってもよい。
【００２６】
本発明の任意の態様によるＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドは、相互作用のＫD値が、１×１０-6Ｍ以下、例えば、５×１０-8Ｍ以下などの１×１０-7Ｍ以下となるようにＩｇＧ  Ｆｃに結合し得る。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ  Ｆｃに都合よく結合するという点で有利である。特に、本発明のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合することができる。本発明のいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヒトＩｇＧのクラス１、２及び４に結合することができるが、クラス３には結合することができない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＩｇＧ  ＦｃのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの境界に結合することができる。
【００２８】
本発明によるＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドの一実施形態では、Ｘ1はＰである。
【００２９】
本発明によるＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドの一実施形態では、ＸCTERMは、Ｄである。
【００３０】
本発明によるＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドの特定の一実施形態では、Ｘ1はＰであり、ＸCTERMはＤである。
【００３１】
本発明によるポリペプチドの一実施形態では、アミノ酸配列ｉ）は、添付の図１の配列番号１〜６から選択される。アミノ酸配列ｉ）は、例えば、配列番号１であってよい。容易に分かるように、配列番号１〜２の配列ではｎ＝１であり、配列番号３〜６の配列ではｎ＝２である。配列番号１〜４は、Ｘ1がＰであり、ＸCTERMがＤである実施形態の例であり、一方、配列番号５〜６は、別の実施形態の例であることもまた、これらの配列自体から明白である。
【００３２】
関連する一態様において、本発明は、本発明の第１の態様による任意のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
上記で説明したように、本発明の第１の態様によるポリペプチドの一実施形態では、そのアミノ酸配列におけるＸ1はＰであり、ＸCTERMはＤである。Ｎ及びＣ末端アミノ酸残基のこの設計により、組換えＤＮＡ技術によって、各サブユニットがジペプチドＤＰを介して残りのサブユニットから分離されているサブユニットとして、本発明のポリペプチドのコピーを有する多量体をまず製造することによって、ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドの生産への好都合なアプローチが可能となる。アミノ酸配列ＤＰは、酸触媒による加水分解に感受性であり、そのため、サブユニット間のジペプチド部位は、多量体中のサブユニットを互いに分離するための切断部位として使用することができる。非限定的な例として、多量体は、２〜６個のサブユニット、例えば、４個のサブユニット又は６個のサブユニットなどを含んでいてもよい。この点において、多量体を構成しているサブユニットは、それら自身が、ｉ）の配列における数字ｎに関して上記で開示されている通り、１〜４個の別個のＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインを含んでいてもよいことを指摘する。ＤＰ配列によって分離されているサブユニット及び単一のＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインは、多量体において同じ構造エレメントを構成（すなわち、ｎ＝１の場合）していてもよいが、また、構築体の異なる構造エレメントを構成（ｎ＝２〜４の場合）していてもよい。
【００３４】
したがって、本発明の第２の態様において、
・各サブユニットが、Ｘ1がＰであり、ＸCTERMがＤである第１の態様によるポリペプチドである、２つ以上のサブユニット、及び
・その最後の残基としてＤ残基を含むＮ末端リーダーペプチド
を含んでなる多量体ポリペプチドが提供される。
【００３５】
したがって、切断に適したＤＰジペプチドを提供するために、Ｎ末端リーダーペプチドは、その最後の残基としてＤ残基を含まなければならない。多量体ポリペプチドにおいて、このＤ残基は、第１のサブユニットのＰ1残基と一緒にＤＰジペプチドを形成する。Ｎ末端リーダーペプチドの残部の正確な配列は、Ｄ残基の前にある任意のアミノ酸残基がＤＰジペプチドの切断を妨げない限り、本発明にとって重大ではない。リーダーペプチドの開始は、製造に使用される発現系に依存するはずである。例えば、細胞内発現を使用して、ＭＤのリーダーペプチドを生じさせ、次いでそこからＭを可溶性タンパク質からｉｎ  ｖｉｖｏで除去してもよい。発現によって封入体が形成される場合は、ＭＸＧＤのリーダーペプチド式中、Ｘは任意のアミノ酸又はＧであってよく、又は除外される）が使用されてもよい。
【００３６】
本発明はまた、直前に記載されている多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３７】
本発明は、やはり関連する態様において、上述の多量体ポリペプチドを生産する方法であって、
・上述の多量体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する宿主細胞を用意し、
・前記宿主細胞を、前記ポリヌクレオチドを発現させて多量体ポリペプチドを産生することのできる条件下で培養し、
・得られた多量体ポリペプチドを単離する
ことを含んでなる方法を提供する。
【００３８】
得られた多量体ポリペプチドが単離されたら、これらのポリペプチドは、多量体のサブユニットとして存在するため、これを本発明の第１の態様のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドの生産のための出発材料として使用してもよい。したがって、本発明はまた、第１の態様によるポリペプチドを生産する方法であって、
・直前に記載されている方法を使用して多量体ポリペプチドを生産し、
・酸触媒による加水分解を使用して配列ＤＰを含む部位で前記多量体ポリペプチドを切断し、本発明の第１の態様によるＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド及びＮ末端リーダーペプチドを生じさせ、
・前記ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドを単離する
ことを含んでなる方法を提供する。
【００３９】
それらがＤＰ配列を含んでも含まなくても、それらが以前のセクションに記載されている好都合なアプローチに従って調製されてもされなくても、本発明の第１の態様による任意のポリペプチドは、最後から２番目のポジションのシステイン残基ＣCTERM-1（これは実は、ＸCTERMが存在しなければ最後のポジションである）を含む。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中へのこのシステイン残基の組み込みにより、ポリペプチドの別の化合物への非常に用途が広い化学的カップリングが可能となる。このシステイン残基を使用してポリペプチドを直接又は間接的にマトリックスに連結することにより、例えば、モノクローナル抗体の製造のためのプロセスにおける、ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子の工業的規模の分離に有用な分離媒体の製造が可能となる。分離媒体又はクロマトグラフィー媒体中の親和性リガンドは、本発明の第１の態様によるＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドである。マトリックスは、有機又は無機材料から作られていてよい。一実施形態では、マトリックスは、架橋された炭水化物材料などの天然高分子、例えば、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ジェラン、アルギン酸塩などから調製される。天然高分子マトリックスは、逆懸濁ゲル化(S Hjerten(1964), Biochim Biophys Acta 79(2):393-398)などの標準的な方法に従って容易に調製され、任意選択により架橋される。代替の実施形態では、マトリックスは、架橋された合成ポリマーなどの合成ポリマー又はコポリマー、例えば、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどから調製される。そのような合成ポリマーマトリックスは、標準的な方法に従って容易に調製され、任意選択により架橋される。マトリックスへの直接カップリングの非限定的な例として、ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドは、ＣCTERM-1を介してマレイミドアガロース、ヨードアセチルセファロース又はアガロース、例えば、ＰｉｅｒｃｅのＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（登録商標）に結合してもよい。間接的なカップリングの非限定的な例として、ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドは、ＣCTERM-1を介してリンカーポリマーに結合し、中間体ＩｇＧ  Ｆｃ結合組成物を形成してもよい。次いで、この中間体組成物は次に、ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド又はリンカーポリマーのいずれかにおける反応基を介してマトリックスに連結してもよい。
【００４０】
好ましいリンカーポリマーは、酸及び塩基触媒による加水分解の両方に対して、並びにタンパク質分解に対して安定である。それらは親水性であり、非核酸及び非ペプチド起源のものである。規制の観点から、好ましいポリマーは、以前にｉｎ  ｖｉｖｏで使用されているものであるが、本発明はそれに限定されない。特に好ましいリンカーポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧである。連結したＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド間のリンカーポリマーの長さは、ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子と各Ｆｃ結合ドメインとの間の相互作用の１：１の化学両論比を可能にするために十分なものであるべきである。
【００４１】
本発明のＩｇＧ  Ｆｃ結合組成物において、酸又は塩基触媒による加水分解に対する安定性は、化学的に安定なリンカーポリマーを使用してフォールディングしたドメインを結びつけることによって確実となる。
【００４２】
したがって、その別の態様において、本発明は、システイン残基ＣCTERM-1を介して非ペプチド、非核酸リンカーポリマーに共有結合している、第１の態様による少なくとも１つのＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドを含んでなるＩｇＧ  Ｆｃ結合組成物を提供する。
【００４３】
関連する一態様において、本発明は、そのようなＩｇＧ  Ｆｃ結合組成物を製造する方法を提供する。この方法は、
・第１の態様による少なくとも１つのＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドを用意し、
・前記ポリペプチド中に存在するシステイン残基ＣCTERM-1を介して前記ポリペプチドを非ペプチド、非核酸リンカーポリマーに連結する
ことを含んでなる。
【００４４】
ポリマーリンカーの各分子に連結しているＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドの数は、設計によって、例えば、様々な数のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドとのコンジュゲーションのために適合させたポリマー分子の所定の混合物を使用することによって、決定され得る。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドへの１〜４個のコンジュゲーション部位を有するポリマーを、均一のＩｇＧ  Ｆｃ結合組成物の調製において使用してもよく、又は１〜４個のコンジュゲーション部位を有するポリマーの混合物を使用して、対応するＦｃ結合組成物を調製してもよい。
【００４５】
ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドがＰ1及びＤCTERMアミノ酸残基を含むケースにおいて、この製造方法の第１段階における用意は、サブユニットが酸触媒による加水分解での切断を行いやすいＤＰ配列によって分離されている、多量体中のサブユニットとしてそのようなポリペプチドを生産する方法の上記の記述に従って行ってよい。言い換えると、本発明のこの実施形態では、クロマトグラフィー媒体において親和性リガンドとして使用するための組成物は、ｉ）サブユニットとして個々のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドを含む多量体（単量体、二量体、三量体又は四量体のいずれであっても）を発現させること、ｉｉ）酸触媒による加水分解によって前記多量体をその構成サブユニットに切断すること、ｉｉｉ）得られたサブユニット（すなわち、本発明によるＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド）を、ＣCTERM-1残基を介してリンカーポリマーに連結することによって調製されてよい。
【００４６】
本発明の組成物及び上記のそれを製造する方法のいくつかの実施形態では、リンカーポリマーは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００４７】
本発明による組成物は、リンカーポリマーを介してマトリックス又はクロマトグラフィー媒体に適当に接続可能であり得る。マトリックスへの組成物の結合に使用される基の化学的性質は、好ましくは、リンカーポリマーへのＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドのコンジュゲーションに使用される基のものとは異なる。酸性及び塩基性条件の両方に関する本発明によるＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドの安定性のおかげで、反応基の活性化は、塩基又は酸のいずれかによって行うことができる。マトリックスと、最も近接したＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドとの間のポリマーの長さは、このドメインのＩｇＧ結合特性を妨げないものであるべきである。利用可能なカップリング化学の中からの選択及びそれらの本発明への適合は、当業者の能力の範囲内である。
【００４８】
本明細書において使用される「ＩｇＧ  Ｆｃ結合」及び「ＩｇＧ  Ｆｃに対する結合親和性」という用語は、例えばＢｉａｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でなど、表面プラズモン共鳴技術の使用によって試験することができるポリペプチドの特性を指す。例えば、以下の実施例において記載されているように、ＩｇＧ  Ｆｃ結合親和性は、ＩｇＧ  Ｆｃ、又はＩｇＧ  Ｆｃの断片を機器のセンサーチップ上に固定し、試験しようとするポリペプチドを含有する試料を、チップ上を通過させる実験において試験することができる。代替として、試験しようとするポリペプチドを、機器のセンサーチップ上に固定し、ＩｇＧ  Ｆｃ、又はその断片を含有する試料を、チップ上を通過させる。次いで、当業者は、そのような実験によって得られた結果を解釈して、ＩｇＧ  Ｆｃに対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的な測定を確定してもよい。例えば、相互作用についてのＫD値を決定するために、定量的測定が所望される場合、表面プラズモン共鳴法もまた使用されてもよい。結合値は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において定義することができる。ＩｇＧ  Ｆｃを、測定のセンサーチップ上に固定し、その親和性を決定しようとするポリペプチドの試料を連続希釈によって調製し、順不同で注入する。次いで、ＫD値を結果から、例えば、機器製造業者によって提供されるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアの１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して計算することができる。
【００４９】
アミノ酸置換が導入される場合、これらの置換は、ポリペプチドの基本的な構造に影響を及ぼさないものであるべきである。例えば、ポリペプチドのＣαバックボーンの全体のフォールディングは、プロテインＡのドメインのものと本質的に同じもの、すなわち、同じ順序で二次構造の同じエレメントを有するものとすることができる。したがって、この基本的な構造を有するポリペプチドは、野生型プロテインＡドメインのものと同様のＣＤスペクトルを有するはずである。当業者は、関連し得る他のパラメータを認識している。基本的な構造を保存するという要件は、置換を受けてもよいアミノ酸配列のポジションを制限する。例えば、ポリペプチドの表面に位置するアミノ酸残基は置換されていることが好ましいが、一方、ポリペプチドのコア「３へリックスバンドル」内に埋もれているアミノ酸残基は、分子の構造特性を保存するために、不変のままであるべきである。同じ理論が、本発明のポリペプチドの断片に適用される。
【００５０】
したがって、本発明にはまた、上記のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドが、さらなるアミノ酸残基がいずれかの末端に付加されたＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインとして存在する、ポリペプチド及び組成物が含まれる。これらのさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドによるＩｇＧ  Ｆｃの結合において役割を果たし得るが、例えば、ポリペプチドの生産、精製、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定化、カップリング又は検出のうちの１つ以上に関連する別の目的も同じ程度に十分に果たす。そのようなさらなるアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的で付加された１つ以上のアミノ酸残基を含んでいてもよい。そのようなさらなるアミノ酸残基は、タグに特異的な抗体との相互作用のための、Ｈｉｓ6タグ又は「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグ又は「ＦＬＡＧ」タグなどの、ポリペプチドの精製又は検出のための「タグ」を提供してもよい。
【００５１】
本発明にはまた、上述したＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドが、さらなるペプチド若しくはタンパク質又は別の官能基がＮ若しくはＣ末端に又は任意の別の残基に（特異的に又は非特異的に）、化学的コンジュゲーション（知られている有機化学方法を使用して）によって連結しているＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインとして存在する、ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドも含まれる。
【００５２】
本発明によるポリペプチドは、試薬のＩｇＧ  Ｆｃに対する親和性を利用する任意の方法において有用であり得る。したがって、ポリペプチドは、そのような方法において検出試薬、捕捉試薬又は分離試薬として使用されてもよい。特に、上記で既に記述したように、ポリペプチドは、不均一の混合物から抗体又はＦｃ融合タンパク質を分離、精製及び／又は製造することが目的であるクロマトグラフィーにおける親和性試薬として有用となるいくつかの特性を示す。ポリペプチドは、マトリックスに結合させることができ、例えば、工業的製造におけるＩｇＧ  Ｆｃを含有する治療化合物の精製に使用することができる。高い標的親和性、酸性及び塩基性の環境の両方における高い安定性及びＩｇＧ  Ｆａｂ断片よりもＩｇＧ  Ｆｃ断片に選択性があることなどの特性のために、本発明によるＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドは、非常に魅力的な親和性試薬を提供すると考えられる。
【００５３】
したがって、本発明の別の態様は、ＩｇＧ  Ｆｃを含む分子を液体から単離する方法であって、
（ｉ）ＩｇＧ  Ｆｃを含む分子を含有する液体を用意する段階と、
（ｉｉ）前記液体を本明細書に記載されているＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド又は組成物と接触させ、それによってＩｇＧ  Ｆｃを含む前記分子が前記ポリペプチド又は組成物に結合する段階と、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ  Ｆｃを含む結合した分子を前記液体から単離する段階と
を含んでなる方法である。
【００５４】
本発明の単離方法において、液体は、ＩｇＧ  Ｆｃを含む分子を発現している、哺乳動物細胞又は植物細胞などの原核生物細胞又は真核生物細胞の培養から、又は代替の発現系における、例えば小胞系における、そのような分子の発現から得られてよい。代替として、液体は、植物又は哺乳動物宿主などの宿主におけるトランスジェニック発現から得られてもよい。
【００５５】
本発明の状況において、「試料」及び「液体」という用語は、互いに交換可能に使用され得る。いずれの用語も、例えば、含まれる液体の体積又は別の特性に関して、限定を意味しない。液体は、例えば、分析の目的のための、より大量のうちのアリコートなどの少量であってよく、又は代替として、大規模精製プロセスにおいて使用される供給原料又は液体であってよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃを含む前記分子は、ＩｇＧ分子又はその断片である。例えば、それらは、ヒトＩｇＧ分子又はその断片とすることができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃを含む前記分子は、モノクローナルＩｇＧ抗体である。特に、そのようなモノクローナルＩｇＧ抗体は、ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体であってよい。例えば、それらは、クラス１、２及び／又は４のヒトモノクローナルＩｇＧ抗体である。
【００５７】
別の実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃを含む前記分子は、Ｆｃ融合タンパク質である。したがって、そのような融合タンパク質中のＦｃドメインは、有利には、融合タンパク質の単離において「親和性ハンドル」として使用することができる。多種多様のＦｃ融合タンパク質が作り出されている。例えば、治療用途を有するＦｃ融合タンパク質は、可溶性ＴＮＦ−α受容体とＦｃとの融合体であるエタネルセプト、及びＶＥＧＦ受容体ドメインとＦｃとの融合体であるＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ(Holash et al, Proc Natl Acad Sci USA(2002)99(17):11393-11398)を含む。これらの２つは非常に興味深い例示的な例であるが、それらの列挙は非限定的なものであり、本明細書において記載されている本発明のＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド又は組成物を親和性リガンドとして使用して、その特性を変化させ、その親和性精製を容易にするために、Ｆｃドメインを任意の所望のタンパク質に融合させることが原則として可能である。
【００５８】
本発明のさらに別の態様は、ＩｇＧ  Ｆｃを含む分子を製造する方法であって、
（ｉ）ＩｇＧ  Ｆｃを含む所望の分子を発現させる段階と、
（ｉｉ）ＩｇＧ  Ｆｃを含む分子を含有する液体を前記発現から得る段階と、
（ｉｉｉ）前記液体を本明細書に記載されているＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド又は組成物と接触させ、それによってＩｇＧ  Ｆｃを含む分子が前記ポリペプチド又は組成物に結合する段階と、
（ｉｖ）ＩｇＧ  Ｆｃを含む結合した分子を前記液体から単離する段階と、
（ｖ）ＩｇＧ  Ｆｃを含む結合した分子を、前記ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド又は組成物からのその溶出によって回収する段階と
を含んでなる方法に関する。
【００５９】
発現段階（ｉ）は、任意の知られている発現系、例えば、哺乳動物細胞若しくは植物細胞などの原核生物細胞若しくは真核生物細胞における、又は小胞系における組換え発現を使用して実施することができる。液体はまた、植物又は哺乳動物宿主などの宿主におけるトランスジェニック発現から得られてもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃを含む前記分子は、ＩｇＧ分子又はその断片である。例えば、それらは、ヒトＩｇＧ分子又はその断片とすることができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃを含む前記分子は、モノクローナルＩｇＧ抗体である。特に、そのようなモノクローナルＩｇＧ抗体は、ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体であってよい。例えば、それらは、クラス１、２及び／又は４のヒトモノクローナルＩｇＧ抗体である。
【００６１】
別の実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃを含む前記分子は、Ｆｃ融合タンパク質である。
【００６２】
本発明の単離及び製造する方法のいくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド又は組成物は、マトリックスに固定されている。一実施形態では、本発明のポリペプチド又は組成物は、不溶性担体の形態でマトリックスに連結されている。そのような担体は、１つ以上のビーズなどの粒子、例えば、クロマトグラフィー樹脂；又は不規則な形；メンブラン；フィルター；キャピラリー；モノリス；並びにタンパク質分離及び／又は精製において一般に使用される任意の別のフォーマットであってよい。したがって、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明によるポリペプチド及び／又は組成物を用いる方法は、フィルター又はメンブラン、マイクロタイタープレート、プロテインアレイ、バイオセンサー表面、ビーズ、フローサイトメトリー、組織切片などの様々なフォーマットにおいて実施することができる。特定の一態様において、本発明は、本明細書に記載されているＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド又は組成物が固定されているクロマトグラフィー媒体を提供する。そのような媒体は、マトリックスとして知られている任意のクロマトグラフィー材料に基づいていてよく、ポリペプチド又は組成物のマトリックスへのカップリングは、いくつかの知られている手順のいずれか１つを使用して実施することができる。
【００６３】
本発明によるポリペプチドの配列におけるアミノ酸残基の番号付け及び「ポジション」という用語の任意の使用は、相対的である。具体的に開示されているポリペプチドと同数のアミノ酸残基、すなわち、上記されているものを有する本発明によるポリペプチドにおいて、ポリペプチドにおけるアミノ酸のポジションは、開示されているポリペプチドにおけるものに正確に相当する。例えば、開示されているポリペプチドと比較してＮ末端が伸長されている状況において、非伸長ペプチドのアミノ酸残基に相当する伸長されているペプチドにおけるそれらのアミノ酸残基は、同じポジション番号を有する。例えば、伸長されているポリペプチドにおいて６個のアミノ酸残基が伸長されていれば、Ｎ末端から数えて、その変化したポリペプチドのアミノ酸番号７が、開示されているポリペプチドのポジション番号１におけるアミノ酸に相当する。
【００６４】
本発明を、以下の非限定的な例によってさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本明細書において記載されているポリペプチドについてのアミノ酸配列情報を示す表である。配列番号１〜６は、本発明によるポリペプチドの非限定的な例であり、一方、配列番号７〜９は、例示及び／又は比較の目的で開示されている。
【図２】５Ｍリン酸による処理後のＨｉｓ6−Ｚ０５４９４の試料のＨＰＬＣ／ＭＳＤ分析のクロマトグラムである。Ｉで表すピークは、切断された（７０５２Ｄａ）、切断されていない（９１７９Ｄａ）及び変化した（７２６８Ｄａ）Ｈｉｓ6−Ｚ０５４９４分子に相当する。
【図３】２Ｍ塩酸による５０℃で１時間の処理後のＨｉｓ6−Ｚ０５４９４の試料のＨＰＬＣ／ＭＳＤ分析のクロマトグラムである。Ｉで表すピークは、切断された（７０５２Ｄａ）、切断されていない（９１７９Ｄａ）及び変化した（７２６８Ｄａ）Ｈｉｓ6−Ｚ０５４９４  分子に相当する。ＩＩで表すピークは、ヘキサヒスチジンタグ（２１４５Ｄａ）に相当する。
【図４】６Ｍリン酸による５０℃で１時間の処理後のＨｉｓ6−Ｚ０５４９４の試料のＨＰＬＣ／ＭＳＤ分析のクロマトグラムである。Ｉで表すピークは、切断された（７０５２Ｄａ）及び切断されていない（９１７９Ｄａ）Ｈｉｓ6−Ｚ０５４９４分子に相当する。
【実施例】
【００６６】
実施例１
ＤＰジペプチド配列の切断
ＨＥＲ２結合Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子Ｚ０５４９４（図１の配列番号８）を、Ｚ０２８９１（図１の配列番号７）から出発して、Ｚ０２８９１のポジション３７におけるアスパラギン酸をグルタミン酸に置き換えることによって構築した。次いで、Ｚ０５４９４を、例示の目的で本明細書において記載されている実験において使用した。突然変異した遺伝子を、Ｔ７プロモーターを含有し、ヘキサヒスチジン(Ｈｉｓ6)テールに続いて酸切断を可能にするＤＰジペプチド配列をコードする発現ベクター中に挿入した。配列番号９のアミノ酸配列（図１）を有し、Ｈｉｓ6−Ｚ０５４９４で表した発現されたタンパク質を、可溶性生成物として回収し、開始メチオニンを除去した。
【００６７】
発現の後、細胞を加熱することによって溶解し、可溶性Ｈｉｓ6−Ｚ０５４９４生成物を、ＩＭＡＣ続いて逆相クロマトグラフィーによって精製した。このタンパク質を、バイアル中に１ｍｇ量及び５ｍｇ量に等分し、凍結乾燥した。
【００６８】
１２Ｍ、１０Ｍ、８Ｍ、６Ｍ、４Ｍ、２Ｍ及び０．２Ｍの希釈系列を、以下の７種の酸のそれぞれについて調製した：リン酸（Ｈ3ＰＯ4）、酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）、硫酸（Ｈ2ＳＯ4）、塩酸（ＨＣｌ）、硝酸（ＨＮＯ2）及びトリフルオロ酢酸（ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）。凍結乾燥したＨｉｓ6−Ｚ０５４９４を、脱イオン水中に、４ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。すべて２５μｌのＨｉｓ6−Ｚ０５４９４を含有している、１種の酸当たり７個のエッペンドルフチューブを調製した。２５μｌの酸を、エッペンドルフチューブに添加し、３７℃で１７時間３０分（終夜）インキュベートさせておいた。
【００６９】
酸触媒による切断を、様々な濃度のＮａＯＨ及び１２５μｌの２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８の添加によってｐＨを７．５〜８．５まで増加させることによって停止した。すべての試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＨＰＬＣ／ＭＳＤ装置に注入した。
【００７０】
ＨＰＬＣ／ＭＳＤによる分析は、弱酸である酢酸及びギ酸は、５〜６Ｍの濃度でごく少量のタンパク質を切断し、より低い濃度では全く切断しないことを示した。５Ｍリン酸は、弱酸全般の結果の例外であり、大量のＨｉｓ6−Ｚ０５４９４分子を切断した。図２は、５Ｍリン酸で処理した試料のＨＰＬＣ／ＭＳＤ分析の図であり、主な成分は、切断された分子であることが観察される。しかしながら、少量の切断されていない分子及び変化した切断された分子もまた、試料において検出された。
【００７１】
硝酸は、切断実験には強力すぎ、タンパク質を不規則に切断した。トリフルオロ酢酸は、切断部位ではタンパク質を切断せず、解釈困難な結果をもたらした。硫酸及び塩酸は、同様の結果を示した。より低い濃度、すなわち、およそ約１〜３Ｍの酸において、タンパク質の大部分が切断された。ＨＰＬＣ／ＭＳＤ分析の結果は、Ｈｉｓ6−Ｚ０５４９４分子は切断されたが、成果は完璧には程遠いものであり、切断実験が最適ではなかったことを示したことを裏付ける。ほとんどすべてのケースにおいて、＋２１６Ｄａの余分の質量を有する大量の切断された分子が検出された。
【００７２】
リン酸及び塩酸による結果は最も有望であり、さらなる実験を、これらの２つの酸を用いて実施した。ＨＣｌについて７Ｍ、６Ｍ及び４Ｍの濃度及びＨ3ＰＯ4について１２Ｍ、１０Ｍ及び８Ｍの濃度の希釈系列を作製した。異なる緩衝液（２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）を使用して、Ｔｒｉｓ緩衝液がＨｉｓ6−Ｚ０５４９４分子の変化をもたらすことができたかどうかを決定した。切断を、１００℃、８０℃及び５０℃で行い、適切な濃度のＮａＯＨ及び１２５μｌの２ＭのＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４の添加によってｐＨを増加させることによって１時間、２時間、４時間、６時間及び８時間後に停止した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分析し、ＨＰＬＣ／ＭＳＤ装置に注入した。
【００７３】
質量分析は、１００℃及び８０℃の温度は化学的切断には明らかに高すぎ、両方の酸で全体的に断片化されたタンパク質を生じたことを裏付けた。５０℃で実施された切断は、より良好な結果をもたらしたが、高濃度のＮａＨ2ＰＯ4を緩衝液として使用した場合、リン酸塩が沈殿したことから質量分析の成果に影響を及ぼしたことを裏付けた。試料中の高濃度のリン酸塩は、＋７９Ｄａの余分の質量を有する切断されたＨｉｓ6−Ｚ０５４９４分子において高度の変化をもたらした。７２６９Ｄａの質量、すなわち、＋２１６Ｄａの余分の質量を有する切断されたＨｉｓ6−Ｚ０５４９４分子もまた検出された。塩酸による最適の切断結果は、２Ｍ及び３Ｍの濃度で１〜３時間で達成された。リン酸では、最適の切断は、５〜６Ｍの酸を使用して１〜４時間で達成された。図３及び４は、それぞれ、塩酸及びリン酸による最適の結果についての図を示す。
【００７４】
要約すると、上記の実験は、ＤＰジペプチド配列が、本発明によるポリペプチドにおいて存在する３へリックスバンドルＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインなどの３へリックスバンドルタンパク質ドメインの前にあるスペーサー中に存在する場合、このジペプチドは、酸触媒による加水分解を使用してうまく切断され得ることを示す。
【００７５】
実施例２
本発明によるＩｇＧ  Ｆｃ結合組成物の調製における設計検討
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）リンカーに、それらのそれぞれのＣCTERM-1残基を介して「テール−テール（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）」で連結されている、ｎ＝１である２つのＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチド、すなわち、２つの単一のドメインを有する２つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合するための、本発明によるＩｇＧ  Ｆｃ結合組成物におけるポリマーリンカーの最適な長さを評価するために、パイロット実験を実施する。最適なリンカーは、立体障害なく２つのｍＡｂを結合することを可能にするために十分に長いが、両方のＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインが同じｍＡｂに結合するのを可能にするのに十分な程は長くない。ホモ二官能性でチオール反応性のＰＥＧ（ビス−マレイミド−ｄＰＥＧ）は、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄから購入することができる。カタログは、３個又は１１個のいずれかのエチレングリコール単位を有する変形を含むが、別の代替物が、要求に応じて利用可能である。適した長さのリンカーは、ＰＥＧによって接続された２つのＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインが同じ抗体に優先的に結合しないが、２つの別々の抗体に結合する場合に見出された。それにより、抗体及びＰＥＧコンジュゲートＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインのネットワークが可能となる。
【００７６】
最適化実験は、好ましくは、２つの市販されているリンカー長の評価から始め、次いで、中間の長さのリンカー、又は１１個のエチレングリコール単位を超える長さを続ける。２つのＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドのテール−テール配置により、同じ「軸」の周りの回転によるドメインの分離が可能であり、したがって、同じ長さのスペーサーを使用して「ヘッド−テール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）」配置が存在する状況と比較して結合表面間のより大きい距離をもたらす。「ヘッド−テール」配置は、典型的には、ペプチドスペーサーによって分離されている多量体融合タンパク質としての、連続するいくつかのＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインの組換え発現によって生じる。
【００７７】
結合ポリペプチドとｍＡｂのネットワークが得られていることを評価することを目的とする実験を、ヒトＩｇＧ１抗体（又はヒトＩｇＧ１抗体の混合物）を使用して実施する。適した条件下でのｍＡｂとのＩｇＧ  Ｆｃ結合組成物のインキュベーションに続いて、形成された複合体を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して分析し、結果を高分子量質量分析によって確認する。ＳＥＣ実験において、形成される複合体のサイズを、サイズ参照標準との比較によって決定する。主として１：１（ＩｇＧ結合ドメインの１個のＰＥＧ結合二量体と１個のＩｇＧ分子との複合体を指す）より大きいネットワーク及び複合体を生じるリンカー長から出発し、連続的に減少するリンカー長を有する形成された１：１複合体の量を調査する。最適長ＰＥＧは、見出される１：１複合体の量のはっきりした増加を示す長さより１個又は２個少ないエチレングリコール単位を含有する。好ましくは、１個少ないエチレングリコール単位を有する分子と比較して１：１複合体含有量の増加をもたらさなければ、２個少ない単位を有するＰＥＧ分子が使用される。特定の長さ未満では、リンカーは短すぎてネットワーク形成が不可能なはずである。
【００７８】
次いで、第２の最適化実験を実施して、三量体（すなわち、同じＰＥＧ鎖上に等距離で連結された３個の単量体ＩｇＧ  Ｆｃ結合ポリペプチドドメイン）が３個の別々のｍＡｂに結合することを可能とするために最適な長さを評価する。次いで、同じことを四量体でも行い、４個のｍＡｂの結合を調査する。
【００７９】
上記の全般的なセクションにおいて記載されているように、本発明による組成物は、マトリックス又はクロマトグラフィー媒体に適当に接続可能である。組成物をマトリックスに接続するポリマーリンカーの最適な長さを見出すため、出発点は、少なくとも長さがＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメイン間のリンカーと同程度であるリンカーを調査することである。さらに、マトリックスへの結合のために使用される基の化学的性質は、好ましくは、ＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインのリンカーポリマーへのコンジュゲーションのために使用されるマレイミドのものとは異なる。反応基の活性化は、両方の条件に対するポリペプチドドメインの安定性のために、塩基又は酸のいずれかによって行うことができる。適し得る化学の非限定的な例として、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄは、活性化され、独占権を持つ化学に使用することができるｔ−ブチルエステル並びにトシラート−誘導体を有するＰＥＧ、及びクリックケミストリー反応において使用することができるアジド−ＰＥＧを作製している。さらなる代替物は、当技術分野においてよく知られている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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