(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定を行う方法であって、
（ａ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の１６ｓ  ｒＲＮＡにおいて、前記細菌群に含まれる核酸に共通する領域に対して設定した配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１〜５塩基が置換、欠失、挿入、付加され、且つ、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の高感度且つ高精度な検出を妨げない塩基配列からなるプライマーと、配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１〜５塩基が置換、欠失、挿入、付加され、且つ、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の高感度且つ高精度な検出を妨げない塩基配列からなるプライマーとの組合せであるプライマーセットを使用してＰＣＲを実施する工程、
（ｂ）前記マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群に含まれる所定の細菌を、以下の(ａ)〜（ｅ）から少なくとも一つ以上選ばれるオリゴヌクレオチドプローブセットを用いるインベーダー反応を使用して検出、同定を実施する工程
を含む方法：
（ａ）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出、同定用の配列番号７で表わされるアレルプローブ及び配列番号８で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｂ）Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓの検出、同定用の配列番号１０で表わされるアレルプローブ及び配列番号１１で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｃ）Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍの検出、同定用の配列番号１３で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｄ）Ｕ．ｐａｒｖｕｍの検出、同定用の配列番号１６で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｅ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群の検出、同定用の配列番号１８又は１９で表わされるアレルプローブと配列番号２０又は２１で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項２】
前記インベーダー反応に使用されるオリゴヌクレオチドプローブセットを、同一反応容器内において複数使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、内部標準物質と該内部標準物質に対するインベーダー反応に使用するオリゴヌクレオチドプローブセットを反応容器中に同時に存在させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、配列番号３６で表される塩基配列中の第３２９番塩基またはその相補的塩基を標的核酸として設計されるオリゴヌクレオチドプローブセットである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記内部標準物質に対して特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブセットが、配列番号２３で表わされるアレルプローブ及び配列番号２４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲを実施する工程と前記インベーダー反応を使用して検出、同定を実施する工程とが同時に行われる、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＣＲを実施する工程に続いて、前記インベーダー反応を使用して検出、同定を実施する工程が行われる、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
配列番号５及び６のプライマーセット、及び、以下の(ａ)〜（ｅ）から少なくとも一つ以上選ばれるオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定用核酸プローブアッセイ試薬キット：
（ａ）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出、同定用の配列番号７で表わされるアレルプローブ及び配列番号８で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｂ）Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓの検出、同定用の配列番号１０で表わされるアレルプローブ及び配列番号１１で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｃ）Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍの検出、同定用の配列番号１３で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｄ）Ｕ．ｐａｒｖｕｍの検出、同定用の配列番号１６で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｅ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群の検出、同定用の配列番号１８又は１９で表わされるアレルプローブと配列番号２０又は２１で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項９】
更に、内部標準物質の検出、同定用の配列番号２３で表わされるアレルプローブ及び配列番号２４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、請求項８に記載のマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定用核酸プローブアッセイ試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定する方法、及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
尿路感染症は、腎臓から尿管、膀胱を通って尿道口にいたる尿の通り道に病原体が生着・増殖することにより引き起こされ、感染菌の種類に関係なく同様の病像、病態を呈する。
尿道の細菌感染は、尿道に逆行した細菌が、男性の上部尿路と下部尿路、また女性の尿道全体に存在する尿道周囲腺に、急性または慢性に繁殖することにより起こる。中でも性的交渉により感染する性行為感染症における尿路感染症では、女性では一般的に無症候性であるものの、男性では尿道炎が多く見られる。
男子尿道炎の起炎菌として病原的意義の明らかなもののほとんどは淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）とクラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）であった。尿道炎は淋菌性尿道炎と非淋菌性尿道炎に分けられ、非淋菌性尿道炎はさらにクラミジア性尿道炎と非クラミジア性尿道炎とに分類される。尿道炎の７０％を占める非淋菌性尿道炎患者においてＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓが検出されるのは３０〜４０％程度であり、多くはその症状が何に由来するか明らかでなかった。【０００３】
近年、尿道炎とマイコプラズマ属（ｇｅｎｕｓ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびウレアプラズマ属（ｇｅｎｕｓ  Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）細菌の関与が注目され、尿道炎の起炎菌としての意義についての知見が蓄積しつつある。
マイコプラズマ属（ｇｅｎｕｓ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびウレアプラズマ属（ｇｅｎｕｓ  Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）細菌は、細胞壁の欠如などから他の細菌とは区別され、自己複製機能を持った最小の微生物とされている。ヒトからはマイコプラズマ属で１３種、ウレアプラズマ属で２種の検出が報告されている。その中で、ヒトに病原性を呈するものとしては、肺炎の起炎菌であるマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）がよく知られている。また、近年では非淋菌性非クラミジア性尿道炎患者からの生殖器及び尿路からは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出が報告され、非淋菌性非クラミジア性の起炎菌として注視されている。さらに、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕ．ｐａｒｖｕｍ）が単離され、これらの細菌についても尿道炎起炎菌の可能性が考えられており、今後も上記以外の菌種の単離が報告される可能性がある。【０００４】
特にＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍは、非淋菌性尿道炎患者からの分離が報告されて以来、霊長類への接種実験の結果、健常人よりも有意に高い検出率などから、非淋菌性尿道炎の起炎菌であることが強く示唆されている。実際、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染やＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ感染を否定された男子尿道炎患者の２０〜３０％、女子子宮頚管炎患者の１０％弱に検出され、これらは無症候対照の検出率に比べて有意に高い。【０００５】
Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓは、卵管炎、羊膜炎、非特異的腟炎、及び産褥敗血症熱を引き起こす作用因子として関与しているとの報告がある一方で、無症状の女性からも単離された例が多く報告されている。
Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍは、非淋菌性尿道炎、絨毛性羊膜炎、早産に関与が指摘されており、分娩時の罹患率や死亡率についての報告がある。約４０％もの急性非淋菌性尿道炎が、ウレアプラズマにより引き起こされているとの報告がＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍよりも以前からなされている一方で、否定的な報告も近年多くなされている。例えば、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍは、重要かつ重大なヒトの罹患率及び死亡率に関連してはいるものの、同様に無症候性の健常人においても発見され得る、との報告がなされている。
Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓおよびＵ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍは、健常人との検出率に有意差が見られないとの報告もあり、その病原的な役割は未だ不明な点が多く存在する。
Ｕ．ｐａｒｖｕｍは、妊娠初期に胎盤羊膜嚢の炎症を引き起こし、不妊症へと至る可能性が示唆されている。
以上のように、非淋菌性尿道炎におけるこれらの役割を明らかにすることが望まれており、臨床検体からの確実かつ高感度な検出法が重要である。【０００６】
更に、一般にクラミジア性非淋菌性尿道炎と非クラミジア性非淋菌性尿道炎の間に差は認められないが、通常の抗菌治療後に尿道炎症状の持続あるいは再発をきたす難治例にはＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍが関与する可能性が指摘されている。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの各種抗菌薬に対する感受性はＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ等とはやや異なり、尿道炎治療の第一選択薬であるニューキノロン系よりもテトラサイクリン系やマクロライド系でより効果が高く、特にマクロライド系抗菌薬の選択が推奨されている。そのため、的確な治療方針の選択および効果判定のためにも、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属、特にはＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの細菌について早期の検出と同定が可能な検査法が必要である。【０００７】
マイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の検出、同定検査としては、分離培養法、ＤＮＡ蛍光染色、生化学性状による分類法等が実施されている。【０００８】
分離培養法は、細菌の検出、同定のゴールドスタンダードとされる方法であるが、マイコプラズマの培養は複雑な栄養条件の培養培地を必要とする上に、細胞増殖用の培養条件として二酸化炭素の添加を必要とする事から、多くの検査施設においてはマイコプラズマの培養物の単離を容易に行うことができない。そのためこれらの重要な病原性細菌の存在を真に診断することができないままとなっている。しかも、増殖は比較的緩慢であり、大多数の細菌に比べて低い細胞密度にしか達しないため、臨床診断に利用するには著しく迅速性に欠けている。更には、血清学的試験においても、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍとの間などでは交差反応が懸念されるなど特異性の面で問題があった。【０００９】
ＤＮＡ蛍光染色法は、その結果を得るまでに数日から数週間を要し、臨床診断に利用するには著しく迅速性に欠けている。【００１０】
生化学性状による分類は、マイコプラズマ属細菌が持つ構成酵素が少ないために、１００を超える細菌を幾つかのグループに分ける程度にしかできないため、臨床診断に利用するには不適である。【００１１】
近年では微生物感染の検出に分子生物学的手法であるＰＣＲ法をはじめとした核酸増幅検査が多くの検査室、検査会社、試薬会社において採用されている。核酸増幅検査は、マイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の検出にも活用され、種特異的プライマーを使用したＰＣＲ法による検出が行われるようになった結果、臨床材料からの検出が多数報告されるようになった。【００１２】
核酸増幅検査の最も一般的な方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、その他にはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＬＡＭＰ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、配列に基づく増幅アッセイ、等に基づくものが存在する。
ＰＣＲ法を利用したマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定方法としては、ＰＣＲ増幅産物をプレートハイブリダイゼーションにより検出、同定する方法（特許文献１）、ＰＣＲ産物の塩基配列を解読し、系統解析による検出、同定する方法（特許文献２）、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍをターゲットとしたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによる検出、同定および定量方法（特許文献３）が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００４−  ２４２０６号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３５２号公報
【特許文献３】特開２００２−２８１９８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したような手法を用いたマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定方法は、作業工程が多く長いアッセイ時間を必要とする方法であったり、自動化することが困難な方法であったりするため、処理能力が低く大量の検体を処理する必要がある検査室、特に検査センター等の要求を満たすことはできない。結果として、的確な治療方針の選択材料及び治療薬の効果判定材料を迅速に提供するという目的を果たすことができない事態が生じていた。
更に、非淋菌性尿道炎においては、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍをはじめ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ及びＵ．ｐａｒｖｕｍが起炎菌としてその関与が示唆されてきたが、これらの関与を解明し、的確な治療方針の選択及び効果判定をするためには、臨床検体を材料にヒトからの分離が報告されている全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を同等の感度で検出し、その種類を同定する検査法が必要である。感度、特異性、迅速性、簡便性、コストの全てについて要求を満たす検出系を構築することは非常に困難であるが、ゆえに重要で意義のある課題である。【００１５】
既存の核酸増幅を使用した検査方法の多くは種特異的プライマーを使用して開発されているが、それぞれの検出系において、目的とするマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌以外の関与については触れられていない場合がある。しかも、わずかな塩基の違いも認識できるほどの高精度な条件を設定しているにも関わらず非特異反応が多く検出されるなど、細菌の種類を正確に同定できる検査系を構築することは非常に困難であった。
一方で、共通性の高い領域を使用したプライマー設計を行うＰＣＲ等の核酸増幅方法による検査法では、同じマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌との非特異反応が検出されやすくなる。また、このような共通性の高い領域を使用した場合には、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属以外の細菌との非特異反応が検出される可能性が大きくなる。非特異反応が頻繁に検出される検査系では、再検査を実施するため、作業量が大幅に増えるだけでなく、非特異反応を陽性としてしまうリスクもある。このように、既存の検査方法では信頼性の高い情報を迅速に提供することが困難であることが問題視されていた。
本発明は上記のような問題に鑑みてなされたものであり、迅速、簡易、高精度に、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を検出、同定することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記課題を解決する手段を鋭意検討した結果、ＰＣＲによる遺伝子増幅反応法（以下ＰＣＲ法と称することがある）及び侵襲的開裂構造体切断アッセイ法（以下、インベーダー法、あるいはその反応自体をインベーダー反応と称することがある）を組み合わせることにより、多検体から迅速、簡易、高感度で、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を検出、同定することができることを見出した。【００１７】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［２５］に関する。
［１］マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定を行う方法であって、以下の工程を含む方法；
（ａ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の１６ｓ  ｒＲＮＡにおいて、前記細菌群に含まれる核酸に共通する領域に対して設定したプライマーセットを使用してＰＣＲを実施する工程
（ｂ）前記マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群に含まれる所定の細菌を、インベーダー反応を使用して検出、同定を実施する工程。
［２］前記所定の細菌がＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、及びＵ．ｐａｒｖｕｍから少なくとも一つ以上選ばれるものであり、
インベーダー反応が、前記選ばれた各細菌に含まれる核酸に対して特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブセットを使用する、［１］に記載の方法。
［３］前記所定の細菌がＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、及びＵ．ｐａｒｖｕｍから少なくとも一つ以上選ばれるものであり、
インベーダー反応が、前記選ばれた各細菌に含まれる核酸に対して共通な配列であり、且つ、前記マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群に含まれる核酸に対して特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブセットを使用する、［１］に記載の方法。
［４］前記プライマーセットが、配列番号１で表される塩基配列の５１６〜１０４９番目からなる領域を増幅可能である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記ＰＣＲプライマーセットが、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーセットである、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ検出、同定用であって、配列番号３７で表される塩基配列中の第３２０番塩基またはその相補的塩基を標的核酸として設計されるオリゴヌクレオチドプローブセットである、［１］、［２］、［４］、［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ検出、同定用であって、配列番号３８で表される塩基配列中の第１００番塩基またはその相補的塩基を標的核酸として設計されるオリゴヌクレオチドプローブセットである、［１］、［２］、［４］、［５］のいずれかに記載の方法。
［８］前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ検出、同定用であって、配列番号３９で表される塩基配列中の第３１２番塩基またはその相補的塩基を標的核酸として設計されるオリゴヌクレオチドプローブセットである、［１］、［２］、［４］、［５］のいずれかに記載の方法。
［９］前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、Ｕ．ｐａｒｖｕｍ検出、同定用であって、配列番号４０で表される塩基配列中の第３１２番塩基またはその相補的塩基を標的核酸として設計されるオリゴヌクレオチドプローブセットである、［１］、［２］、［４］、［５］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌検出、同定用であって、配列番号３７で表される塩基配列中の第２６４番塩基またはその相補的塩基を標的核酸として設計されるオリゴヌクレオチドプローブセットである、［１］又は［３］に記載の方法。
［１１］Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに含まれる核酸に対して特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブが配列番号７で表わされるアレルプローブ及び配列番号８で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットである、［６］に記載の方法。
［１２］Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓに含まれる核酸に対して特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブが配列番号１０で表わされるアレルプローブ及び配列番号１１で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットである、［７］に記載の方法。
［１３］Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍに含まれる核酸に対して特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブが配列番号１３で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットである、［８］に記載の方法。
［１４］Ｕ．ｐａｒｖｕｍに含まれる核酸に対して特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットである、［９］に記載の方法。
［１５］前記選ばれた各細菌に含まれる核酸に対して共通な配列であり、且つ、前記マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群に含まれる核酸に対して特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブが配列番号１８又は１９で表わされるアレルプローブと配列番号２０又は２１で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットである、［１０］に記載の方法。
［１６］前記インベーダー反応に使用されるオリゴヌクレオチドプローブセットを、同一反応容器内において複数使用する、［１］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］更に、内部標準物質と該内部標準物質に対するインベーダー反応に使用するオリゴヌクレオチドプローブセットを反応容器中に同時に存在させる、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、配列番号３６で表される塩基配列中の第３２９番塩基またはその相補的塩基を標的核酸として設計されるオリゴヌクレオチドプローブセットである、［１７］に記載の方法。
［１９］前記内部標準物質に対して特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブセットが、配列番号２３で表わされるアレルプローブ及び配列番号２４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットである、［１８］に記載の方法。
［２０］前記ＰＣＲを実施する工程と前記インベーダー反応を使用して検出、同定を実施する工程とが同時に行われる、［１］〜［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］前記ＰＣＲを実施する工程に続いて、前記インベーダー反応を使用して検出、同定を実施する工程が行われる、［１］〜［１９］のいずれかに記載の方法。
［２２］配列番号５及び６のプライマーセット、及び、対象とする全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通する配列を標的部位として設計したオリゴヌクレオチドプローブセット、及び／又は、対象とする全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌から選ばれる少なくとも一つ以上の菌種特異的な配列を標的部位として設計したオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定用核酸プローブアッセイ試薬キット。
［２３］配列番号５及び６のプライマーセット、及び、以下の(ａ)〜（ｅ）から少なくとも一つ以上選ばれるオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、［２２］に記載のマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定用核酸プローブアッセイ試薬キット：
（ａ）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出、同定用の配列番号７で表わされるアレルプローブ及び配列番号８で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｂ）Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓの検出、同定用の配列番号１０で表わされるアレルプローブ及び配列番号１１で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｃ）Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍの検出、同定用の配列番号１３で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｄ）Ｕ．ｐａｒｖｕｍの検出、同定用の配列番号１６で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｅ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群の検出、同定用の配列番号１８又は１９で表わされるアレルプローブと配列番号２０又は２１で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット。
［２４］配列番号５及び６のプライマーセット、及び、対象とする全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通する配列を標的部位として設計したオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定用核酸プローブアッセイ試薬キット。
［２５］更に、内部標準物質の検出、同定用の配列番号２３で表わされるアレルプローブ及び配列番号２４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、［２２］〜［２４］のいずれかに記載のマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定用核酸プローブアッセイ試薬キット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の実施の形態によれば、ＰＣＲとインベーダー反応による検出、同定反応に必要な試薬を容器内に混合して簡便に反応を行うことが可能である。そのため、作業工程が少なく短い時間でアッセイが可能であり、また、自動化することができるため、処理能力が高く大量の検体を処理できる。また、操作工程が簡便となるだけでなく、試薬混合後は容器を開封しないため、キャリーオーバー等によるコンタミネーションを回避することができる。
また、非淋菌性尿道炎と臨床検体からの分離が報告されている全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を同等の感度で検出し、かつ高い特異性でその細菌の種を同定することができるため、非特異反応を陽性としてしまうリスクを考慮せずによくなり、信頼性の高い情報を迅速に提供することができる。
また、核酸量や配列の違いに由来するインベーダー反応効率の違い、また、核酸試料の分注精度等に影響を受けて精度が落ちることを回避することができるため、交差反応が無く信頼性の高い精度で細菌の種を同定することができる。【００１９】
以上のように、感度、特異性、迅速性、簡便性、コストの要求を満たすだけでなく、臨床検体を材料にヒトからの分離が報告されている全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を同等の感度で検出し、非淋菌性尿道炎との関連が示唆されている種について同定することができるため、非淋菌性尿道炎の起炎菌についての正確な情報を蓄積する一助となり、的確な治療方針の選択材料及び治療薬の効果判定材料を迅速に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍの４種についてのＧｅｎＢａｎｋから入手した配列を、１６ｓｒＲＮＡ領域の一部についてｃｌｕｓｔａｌＷのアルゴリズムに従って配列のアライメントを実施した結果である。
【図２】図１のアライメント結果に基づいて実施例１で設計したプライマーセット及び各種オリゴヌクレオチドプローブの位置情報を記載した図である。
【図３】図１のアライメント結果に基づいて比較例１で設計したプライマーセット及び各種オリゴヌクレオチドプローブの位置情報を記載した図である。
【図４】核酸試料に含まれる鋳型量を変化させて、ＰＣＲによる増幅反応と同時にインベーダー反応を実施して蛍光を検出した時の結果である。
【図５】核酸試料に含まれる鋳型量を変化させて、ＰＣＲによる増幅反応の後にインベーダー反応を実施して蛍光を検出した時の結果である。
【図６】核酸試料に含まれる鋳型量を変化させて、ＰＣＲをサイクル数４０サイクルで増幅させた後にインベーダー反応を実施して蛍光を検出した時の結果である。
【図７】核酸試料に含まれる鋳型量を変化させて、ＰＣＲをサイクル数２０サイクルで増幅させた後にインベーダー反応を実施して蛍光を検出した時の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下において、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明するが、利用方法や試薬キットの態様についてはこれに限定されるものではない。
本発明のマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定の実施形態は、
（ａ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の１６ｓ  ｒＲＮＡにおいて、前記細菌群に含まれる核酸に共通する領域に対して設定したプライマーセットを使用してＰＣＲを実施する工程と
（ｂ）前記マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群に含まれる所定の細菌を、インベーダー反応を使用して検出、同定を実施する工程
を含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明の実施形態においては、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌が検出、同定の対象となる。例えば、ヒトからの検出が報告されている、マイコプラズマ属の１３種、ウレアプラズマ属の２種が挙げられる。特に、尿路感染症を引き起こすと示唆されているＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍを検出、同定の対象とすることが好ましい。
【００２３】
本発明の実施形態において使用される生物試料とは、試験される単数又は複数種の前記細菌を含みうる試料を含むものとされ、ヒト、ヒト以外の動物、植物、又は食物から得ることができ、例えば、尿、便、膣、鼻、直腸又は咽頭のスワブ、血液、唾液、喀痰、精液、膣又は尿道の排出物及びそれらのスワブ、涙（すなわち涙管分泌液）、バイオプシー組織試料、及び上述の分泌物及び物質がその上で堆積した表面のスワブを含むが、中でも尿路感染症との関連が強く示唆される尿を用いることが好ましい。前記生物試料は、宿主生物、例えばヒトの患者由来の細胞、組織及び／又はＤＮＡを含むことができ、該実施形態の目的はその宿主内における細菌の存在を試験することにあり、その宿主自身のＤＮＡを試験するものではない。
【００２４】
本発明の実施形態において、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子発現、コード、鋳型、プロモーター、プライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、ＰＣＲ、配列等の用語の定義に関しては、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００２５】
核酸試料とは、核酸を含有する試料であって、前記生物試料であれば、特に限定されるものではない。例えば、血液や組織等を試料として試料中の全細胞から得られるゲノムＤＮＡやＲＮＡが該当する。この核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。また、市販の核酸抽出用試薬キットを使用することもできる。
【００２６】
標的部位とは、核酸試料中に存在する標的となる核酸配列において、第一オリゴヌクレオチドプローブ（アレルプローブの３’末側配列）及び第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）がハイブリダイゼーションする核酸配列を意味し、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定に使用される。
【００２７】
標的核酸とは、標的部位の核酸配列と、インベーダー法に使用する各種オリゴヌクレオチドプローブのうち以下の２つのオリゴヌクレオチドプローブとが三重構造を形成する箇所の塩基をさす。標的核酸の塩基は、同位置にあるアレルプローブの塩基に対して相補的であり、同位置にあるインベーダープローブの塩基とは非相補的である。
【００２８】
ハイブリダイゼーションするとは、各種オリゴヌクレオチドプローブと該各種オリゴヌクレオチドプローブの対象となる核酸配列とが、その配列の全部又は一部と相補的に結合することを意味する。標的部位には、塩基の置換、挿入、欠失が含まれてもよい。また、遺伝情報をコードする配列を有する鎖（以下、センス鎖とする場合がある）を示すものであってもよいし、センス鎖に対して相補的な配列を有する鎖（以下、アンチセンス鎖とする場合がある）を示すものであってもよい。例えば、同じ領域内において複数の種を同時に検出、同定する反応系を構築する場合には、一部の種に対してアンチセンス鎖上に標的部位を設定することで、多くの種を検出、同定の対象とすることが可能となるだけでなく、非特異反応を抑えることもできる。その際、どの種の標的部位をアンチセンス鎖上に設定するかは、当業者であれば適宜設定することができる。また、遺伝情報に直接関与しない配列における核酸配列の変化も含まれるものとする。
【００２９】
本発明の実施形態においては、１６ｓ  ｒＲＮＡ領域を使用することができる。対象とする菌の検出・同定を高感度、高精度に行うことができるので好ましい。
【００３０】
ＰＣＲを実施する工程においては、対象とする全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の１６ｓ  ｒＲＮＡにおいて、前記細菌群に含まれる核酸に共通する領域に対してプライマーを設定する。該プライマーは、当業者であれば配列情報から常法により設計、合成することができるが、後述するインベーダー反応における検出、同定工程を考慮して決定することが好ましい。例えば、配列番号１で表わされる塩基配列中の５１６番目〜１０４９番目からなる領域を増幅可能であって、好ましくは、５１６番目の塩基から３’末端側に連続した塩基配列を含むプライマー、或いは、１０４９番目の塩基から５’末端側にその相補的配列にハイブリダイゼーションすることのできる連続した塩基配列を含むプライマーから成るプライマーセットを使用することができる。連続する塩基数は、後述するオリゴヌクレオチドプローブとの関係によって適宜変更して使用することができる。特に好ましくは、配列番号５と６で表わされる塩基配列の組み合わせが挙げられる。これにより、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を対象として、高感度、高精度に対象とする菌の検出・同定を高感度、高精度に行うことができる。また、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の高感度且つ高精度な検出を妨げない限り、１〜５個程度の数塩基の置換、欠失、挿入、付加を行うことができる。
なお、ＰＣＲにおいて用いられる該２種類のプライマーの各濃度は、ＰＣＲ産物として二本鎖核酸を得ることができる濃度比であれば特に限定されるものではないが、等濃度で用いることが好ましい。
【００３１】
インベーダー反応とは、フラップエンドヌクレアーゼ（クリベース）という酵素の性質を利用した標的部位の検出、同定方法である。すなわち、フラップエンドヌクレアーゼは、標的核酸の位置において標的核酸、アレルプローブ及びインベーダープローブの３つの塩基が並び三重構造体（以下、開裂構造体と称する場合がある）を形成した時に、アレルプローブの５’末端側の配列がフラップ状になっている部分を認識して、そのフラップ部分を切断する。アレルプローブは標的部位と同じ配列とＦＲＥＴプローブに相補的な配列を含むように設計されている。
次に、アレルプローブから遊離したフラップ部分は、相補的な配列をもつＦＲＥＴプローブとハイブリダイゼーションする。このとき、フラップ部分の５’末端に位置する塩基がＦＲＥＴプローブ自身の相補結合部位に割り込んで侵入し、開裂構造体を形成する。フラップエンドヌクレアーゼは再びこの開裂構造体を認識して蛍光色素を有するレポーター塩基を切断する。切断された蛍光色素は、クエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を呈する。
アレルプローブが対象とする前記標的部位と同じ配列を有さない場合、例えば、他の細菌由来の配列である場合においては、開裂構造体を形成しない。従って、フラップエンドヌクレアーゼによる切断、フラップ部分の配列の遊離も起こらないため、レポーター塩基に結合した蛍光も検出されない。
【００３２】
検出は、これらの蛍光を測定することによる。例えば、蛍光検出器によって検出される蛍光強度は反応開始から徐々に上昇し、やがてプラトーに達する。このため、反応開始から特定の時間が経過した時点における蛍光強度や、蛍光強度がプラトーに達するまでの時間とそのときの蛍光強度等から条件設定することもできる。
【００３３】
インベーダー反応は、反応試薬中に存在している過剰なシグナルプローブやＦＲＥＴプローブによって、反応が繰り返されて蛍光強度が増幅されるため、ハイブリダイゼーション単独による方法に比べてより高い標的特異性を示すことや、複数のユニバーサルＦＲＥＴプローブを使用出来るため、標的部位ごとに蛍光プローブを必要とする融解曲線法やＴａｑＭａｎ法に比べて、費用効果が高いという利点をもつ。
このようなインベーダー反応を用いた方法によれば、ＰＣＲの後に反応容器の蓋を開けるために生じうるコンタミネーションを防ぐことが可能となり、簡便且つ迅速に高感度な分析を行うことができる。
【００３４】
また、前記インベーダー反応は、ＰＣＲによる核酸増幅反応と同時に行うことができる。この方法は一般的にインベーダー法と呼ばれている。インベーダー法は、ＰＣＲ工程を分けて実施する。前半の数サイクルではＰＣＲによる核酸増幅のみを行い、後半のＰＣＲサイクルにおいて、核酸増幅反応とインベーダー反応による検出、同定を同時に実施する。インベーダー法はインベーダー反応の前にＰＣＲによる核酸増幅をするため、核酸増幅を実施する分感度が上昇し、直接核酸試料から検出を行うよりも迅速に検出が可能になる。なお、多く鋳型が持ち込まれるとバックグラウンドが上昇するため、反応系へ持ち込まれる核酸量を調節して反応条件を設定することが好ましい。
また、ＰＣＲによる核酸増幅反応に続いてインベーダー反応を行う方法があり、これはインベーダープラス法と呼ばれている。インベーダープラス法では１チューブで増幅とその後の検出ができるという長所を有する。
各々の方法は使用場面に応じて使い分けられており、例えば、インベーダー法はＳＮＰ解析への利用等、インベーダープラス法は微生物等の検出等への利用等が挙げられる。
更に、インベーダー反応によって生じる蛍光の増加量をリアルタイムに測定するリアルタイムインベーダー法によれば、核酸試料中の核酸量を正確に定量することもできる。
【００３５】
インベーダープラス法では、予め反応容器にＰＣＲ用の試薬類とインベーダー反応用の試薬類とを全て収容し、まずインベーダー反応用のオリゴヌクレオチドプローブ（ＦＲＥＴプローブ及びインベーダープローブ）がハイブリダイゼーションし、これらがＰＣＲのプライマーとはならない条件で、ＰＣＲによる核酸増幅反応を行う。
ＰＣＲ終了後にＴａｑポリメラーゼを高温で失活させた後、一定時間、インベーダー反応の至適温度に維持することによりインベーダー反応を行う。
【００３６】
インベーダー反応で使用するオリゴヌクレオチドプローブとは、ハイブリダイゼーション条件下において標的部位と安定的な水素結合を形成し得る塩基配列を有することを意味し、公知の一緒に結合された二つ以上のヌクレオシドサブユニット又は核酸塩基サブユニットを有するポリマーを意味し、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ又はそのアナログを含む。各種オリゴヌクレオチドプローブの核酸間の完全な一致は必要とされない。また、各種オリゴヌクレオチドプローブが標識化合物によって標識されているものを使用することができる。
以下、各種オリゴヌクレオチドプローブについて、標的部位がセンス鎖に設定された場合を例に説明する。
【００３７】
アレルプローブは、第一オリゴヌクレオチドプローブと第三オリゴヌクレオチドプローブとから構成され、標的核酸から標的部位の５’側末端までの塩基を含む領域とハイブリダイゼーションして相補鎖を形成しうるハイブリダイゼーション領域（第一オリゴヌクレオチドプローブ）と、標的部位の配列とは無関係な配列を有して標的部位とハイブリダイゼーションしないフラップ領域（第三オリゴヌクレオチドプローブ）とから構成され、第三オリゴヌクレオチドプローブが第一オリゴヌクレオチドプローブの５’末端側に配置されている。第一オリゴヌクレオチドプローブ中の標的核酸に対応する塩基は、第一オリゴヌクレオチドプローブの最も５’側に位置し標的核酸に特異的な配列を有する。
【００３８】
ここで特異的とは、対象細菌の標的部位の核酸配列とハイブリダイゼーションし、それ以外の細菌の核酸配列とは実質的にハイブリダイゼーションしないことを意味する。なお、原理上は他の細菌ともハイブリダイゼーションすると考えられるオリゴヌクレオチドプローブであっても、その細菌が検査される臨床検体において極めて稀にしか検出されることのない細菌である場合、或いは、通常は検出されることが極めて稀な細菌との交差反応による非特異反応が検出された場合、実際的な対象細菌の検出、同定において問題とならないため、このようなオリゴヌクレオチドプローブの使用が許容される。
後述のＦＲＥＴプローブを使用せずに、アレルプローブの５’末端側配列である、第一オリゴヌクレオチドプローブを標識化合物によって標識しておき、フラップエンドヌクレアーゼによって切断された際に蛍光を発するように設計して、目的の細菌の検出、同定に使用することもできる。
【００３９】
インベーダープローブ（以下、第二オリゴヌクレオチドプローブと称する場合がある）は非標識オリゴであって、標的核酸から標的部位の３’側末端までの塩基を含む領域とハイブリダイゼーションして相補鎖を形成する。インベーダープローブの３’末端に位置し標的核酸に対応する塩基は任意の塩基でよく、ハイブリダイゼーションしないように設計することもできる。
従って、標的核酸を含む核酸試料と、アレルプローブ、インベーダープローブをハイブリダイゼーションさせると、標的部位と第一オリゴヌクレオチドプローブとがハイブリダイゼーションした標的核酸の位置には、インベーダープローブの１塩基が割り込むように侵入し、その結果、塩基が三重に並んだ構造が部分的に形成される（第一開裂構造体）。既に述べたように、フラップエンドヌクレアーゼは、標的核酸、アレルプローブ及びインベーダープローブの３つの塩基が並び開裂構造体を形成した時に、アレルプローブの５’末端側の配列であるフラップ領域（第三オリゴヌクレオチドプローブ）を切断するため、第三オリゴヌクレオチドプローブが遊離する。この第三オリゴヌクレオチドプローブは、後述するＦＲＥＴプローブの所定の領域と相補的な配列を有しているため、ＦＲＥＴプローブとハイブリダイゼーションする。
【００４０】
検出は、ＦＲＥＴプローブ（（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｂｅ）以下、第四オリゴヌクレオチドプローブと称する場合がある）を使用して行う。
ＦＲＥＴプローブは、その５’末側の配列が自己会合してループ構造を形成するように設計されており、３つの領域から構成される。すなわち、ＦＲＥＴプローブの５’末端からループ構造までの領域（領域１）、ステムループを形成する領域（領域２）、ステムループから第三オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーションするまでの領域（領域３）である。領域１は領域２と向き合ってループ構造を形成し、相補的な配列となるように設計されている。従って、領域１は領域２と自分自身で相補鎖を形成する。更にその下流には、第一オリゴヌクレオチドプローブにおけるフラップ、すなわち第三オリゴヌクレオチドプローブと相補的な配列を有し第三オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする領域（領域３）をもつ。
ＦＲＥＴプローブは標的配列とは全く無関係な配列を有するため、標的配列の種類によらず検出、同定の目的に沿って配列を選択、設定することが可能であり、共通の配列を設定することもできる。また、標的部位特異的に設計した第一オリゴヌクレオチドプローブ及びインベーダープローブの配列と、アレルプローブのフラップ部分、すなわち第三オリゴヌクレオチドプローブの配列との最適な組合せを適宜設定することも可能である。
【００４１】
ＦＲＥＴプローブは、その５’末端の塩基にレポーターが標識されており、その下流にはクエンチャーが結合している。従って、この状態ではクエンチャーが蛍光を吸収するため、蛍光検出器では蛍光を検出できない。使用される色素としては、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＬＣ  Ｒｅｄ、Ｃｙ５、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｒｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄ等の色素の使用が可能であるが、使用可能な色素はこれらに限定されるものではなく、当業者であれば、実際に測定に使用する機器が検出可能な波長の色素を適宜選択して使用することができる。上記色素のうち、使用する測定機器において割り当てられたチャネル数に応じて、色素を選択し使用することが可能であるが、検出波長が近い場合であっても、その蛍光が互いに干渉を受けない色素どうしであれば、同時に使用することができる。例えば、例えば、ＦＡＭは励起波長４９４ｎｍ、検出波長５１８ｎｍ、ＶＩＣは励起波長５３８ｎｍ、検出波長５５２ｎｍ、ＲＯＸは励起波長５８７ｎｍ、検出波長６０７ｎｍであるため、同時に使用することが許容される。更に、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗは励起波長５３１ｎｍ、検出波長５５０ｎｍとＶＩＣとほぼ同等であるため、ＶＩＣ用に設定されたフィルターを使用して検出、同定できる。また、Ｒｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄは励起波長５７９ｎｍ、検出波長５９５ｎｍとＲＯＸとほぼ同等であるため、ＲＯＸ用に設定されたフィルターを使用して検出、同定できる。このように、複数の色素を組合せて検出、同定反応を構築することが可能である。
【００４２】
第三オリゴヌクレオチドプローブがＦＲＥＴプローブの領域３においてハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴプローブの５’末端側でループを形成した相補鎖の間に第三オリゴヌクレオチドプローブの塩基が入り込んだ形でハイブリダイゼーションするため、第三オリゴヌクレオチドプローブはインベーダープローブとなり開裂構造体が形成される（以下、第二開裂構造体と称する場合がある）。該第二開裂構造体のうちＦＲＥＴプローブのフラップ領域をフラップエンドヌクレアーゼが認識して切断すると、５’末の塩基に標識されているレポーター分子がクエンチャーから離れるため、蛍光を発する。
【００４３】
ＦＲＥＴプローブはステムループを形成する性質を利用しているため、ＦＲＥＴプローブのプローブとしての性質を左右する因子としては、自己相補的な領域の長さ、オーバーラップ領域の長さ、ワトソン−クリック塩基対及び特別に安定なループ配列の存在又は不存在によって予測されるようなヘアピン又はステムループ構造の安定性などが想定されるが、当業者であれば、ステムループを形成する配列のデザインも考慮して、これら第四オリゴヌクレオチドプローブを適宜設計することができる。
【００４４】
判定に際してはＦＲＥＴプローブから発せられる蛍光強度を測定し、検出、同定を行うが、迅速に検査結果を報告するために、判定基準を設定することもできる。例えば、プラスミドが０コピー／反応時の蛍光量をバックグランドとし、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍは６，０００、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓは６，０００、Ｕ．ｐａｒｖｕｍは１，７００、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍは８００、マイコプラズマ属およびウレアプラズマ属（以後ＡＬＬ  Ｍｙｃｏと略す）は８００、内部標準物質は１，７００をカットオフ値として設定し、各々のオリゴヌクレオチドプローブについて検出、同定の判定基準とすることができる。
【００４５】
これらオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーションする標的部位は、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定に使用する領域において種特異的な配列を有する部位を使用することができる。該標的部位は、検出、同定したい細菌に特異的な配列部分を標的核酸として、その前後の連続した塩基配列に対して設定し、例えば、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの場合には配列番号３７で表わされる塩基配列の３２０番目の塩基、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓの場合には配列番号３８で表わされる塩基配列の１００番目の塩基、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍの場合には配列番号３９で表わされる塩基配列の３１２番目の塩基、Ｕ．ｐａｒｖｕｍの場合には配列番号４０で表わされる塩基配列の３１２番目の塩基、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定用の場合には配列番号３７で表わされる塩基配列の２６４番目の塩基、内部標準物質の場合には配列番号３６で表わされる塩基配列の３２９番目の塩基を標的核酸として標的部位を設定することができる。
【００４６】
標的部位にハイブリダイゼーションする各々のオリゴヌクレオチドプローブの連続する塩基の数は、Ｔｍ値に加えて塩基の隣接計算や所与の構造の遊離エネルギー計算結果を考慮して適宜調整することができ、特定の塩基数に限定されるものではない。
インベーダー反応は、前述した通り、標的核酸の位置で検出、同定対象の核酸配列とアレルプローブ及びインベーダープローブとが三重構造体を形成させる反応を利用している。そのため、標的部位に対してアレルプローブがハイブリダイゼーションする前にインベーダープローブが侵入してハイブリダイゼーションする必要がある。従って、アレルプローブよりもインベーダープローブのＴｍ値を小さくして三重構造体を形成するように設計して使用することができる。
【００４７】
これら各種オリゴヌクレオチドプローブの設計は、通常は、配列情報に基づいて種特異的な配列を選択することにより設計できるが、当業者であれば、公知の方法に従って、適宜、設計して使用することが可能である。前述したように、インベーダー反応では、標的配列とアレルプローブとの間にインベーダープローブが入り込み開裂構造体を形成する反応を利用するため、インベーダープローブがアレルプローブに比してそのＴｍ値が小さくなるような配列にする等を考慮した上で、また、該当の配列部位の高次構造の有無や、ＧＣ含量等に基づいて適宜調整可能である。例えば、ホロジック社に委託して設計し、プライマーやプローブとの最適な組み合わせを検討して配列を選択することも可能である。また、設計された各種オリゴヌクレオチドプローブの製造は、当業者であれば公知の方法に従って、適宜製造することが可能である。例えばホロジック社などのような会社に製造を委託してもよい。
【００４８】
なお、通常、上記のような一般的な指標に基づいて複数のオリゴヌクレオチドプローブを設計し、これら複数のオリゴヌクレオチドプローブを使用して同時に複数のマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定を行うのに適したインベーダー反応の条件を適宜設定することができるが、インベーダー反応の条件を特定の条件に定めたい場合には、該条件の下で各々のオリゴヌクレオチドプローブが同等の反応性を示し、各々のオリゴヌクレオチドプローブが検出、同定の対象となる細菌の標的部位と特異性高く反応することができるように、オリゴヌクレオチドプローブ配列側を改良することも可能である。このような場合には、例えば、上記のような一般的な指標に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを設計した後、オリゴヌクレオチドプローブ配列の一部改変を行ったり、類似の配列を有する複数のオリゴヌクレオチドプローブを調製したりして、特定の条件下で最も適切な反応を示すものを選択する等により適宜確定することができる。
【００４９】
本発明によって、種特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計してマイコプラズマ属又はウレアプラズマ属細菌について各々の種を同定することができる。種ごとに設計したオリゴヌクレオチドプローブに異なる色素を標識することで、複数の種を同時に検出、同定することもできる。
【００５０】
将来新たに尿路感染症を引き起こすマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌が分離報告された場合には、前述した公知のオリゴヌクレオチドプローブ設計法に基づいて、対象となる種を追加することも可能である。その場合、新たに報告された細菌がマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌のいずれかに系統発生的に近い関係であること、すなわち、その生物が進化的意味において互いに近い関係があり、ゆえに遠い関係の生物より全体の核酸配列が高い相同性を有していればよく、該４種の細菌のみに近縁で高い相同性を有する細菌である必要はない。
【００５１】
本発明においてオリゴヌクレオチドプローブセットとは、アレルプローブとインベーダープローブを含み、ＦＲＥＴプローブを使用せずに対象とするマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定を行うこともできる。その場合、前述の通りアレルプローブ末端を標識しておき、フラップエンドヌクレアーゼによって切断された場合に蛍光を発するように設計するとよい。
また、必要に応じてＦＲＥＴプローブを含むこともできる。その場合、反応液中には、検出、同定の対象となる標的部位あたりの、第三オリゴヌクレオチドプローブ配列に続いて第一オリゴヌクレオチドプローブの配列が位置する塩基配列をもつアレルプローブ、第二オリゴヌクレオチドプローブ配列からなるインベーダープローブ、及び第四オリゴヌクレオチドプローブ配列からなるＦＲＥＴプローブが存在する。
【００５２】
オリゴヌクレオチドプローブセットは、検出、同定を実施する目的や状況に応じて、どのようなオリゴヌクレオチドプローブセットを組み合わせるか、適宜選択して使用することができる。
例えば、少なくとも一セット以上の検出、同定の対象とする種特異的なオリゴヌクレオチドプローブセットだけを使用して実施することができる。これらは、一セットのオリゴヌクレオチドプローブセットで使用してもよいし、二セット以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを組み合わせて使用してもよい。
【００５３】
例えば、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出、同定の場合には、配列番号７で表わされるアレルプローブ及び配列番号８で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓの検出、同定の場合には、配列番号１０で表わされるアレルプローブ及び配列番号１１で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍの検出、同定の場合には、配列番号１３で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット、Ｕ．ｐａｒｖｕｍの検出、同定の場合には配列番号１６で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセットを使用することで、高感度且つ高精度に対象の種を検出、同定することができるので好ましい。
【００５４】
また、必要に応じて、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を検出、同定の対象とするオリゴヌクレオチドプローブセットを追加して実施してもよい。
全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通する配列を標的部位として、該標的部位に対して特異的な第一オリゴヌクレオチドプローブを含むアレルプローブ及びインベーダープローブを設計して、各々の種特異的に設計されたオリゴヌクレオチドプローブと同時に使用することもできる。この場合、アレルプローブから切断されて遊離する第三オリゴヌクレオチドプローブ及び該第三オリゴヌクレオチドプローブが結合するＦＲＥＴプローブの配列と蛍光標識化合物は、それぞれ種特異的に設計したオリゴヌクレオチドプローブの配列及び蛍光標識化合物とは異なるように設計する。
全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通した配列を検出することで、ＰＣＲによって増幅され検出された細菌がマイコプラズマ属或いはウレアプラズマ属細菌であることを確認することができる。これにより、種特異的なオリゴヌクレオチドプローブで検出、同定されたシグナルが非特異的反応である場合などには誤判定を防ぐことが可能となり、検査精度を向上させることができる。
【００５５】
また、検出、同定の対象としている種特異的なオリゴヌクレオチドプローブによっては検出されなかったが、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を対象としたオリゴヌクレオチドプローブによって検出がされた場合には、現在尿路感染症への関与が示唆されている種類の細菌以外の新たな関与を示唆する発見が可能となり、尿路感染症の起炎菌を正確に把握することが可能となる。
【００５６】
例えば、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｌｕｍに特異的な配列を標的部位とする、第一オリゴヌクレオチドプローブ、インベーダープローブを設計する。更に、アレルプローブから切断されて遊離する第三オリゴヌクレオチドプローブと該第三オリゴヌクレオチドプローブと相補結合する、５’末端側の塩基をＦＡＭで標識したＦＲＥＴプローブを準備する。
一方で、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通する配列を標的部位として第一オリゴヌクレオチドプローブ、インベーダープローブを設計する。更に、第一オリゴヌクレオチドプローブが切断されて遊離する第三オリゴヌクレオチドプローブと該第三オリゴヌクレオチドプローブと相補結合する、５’末端側の塩基をＶＩＣで標識したＦＲＥＴプローブを準備する。
これらの試薬を全て混合し、インベーダー反応を行う。この時、ＰＣＲとインベーダー反応を同時に行うインベーダー法を行ってもよいし、ＰＣＲ反応による増幅反応終了後にインベーダー反応を行うインベーダープラス法を行ってもよい。インベーダープラス法により、更に、簡便且つ迅速に高感度な分析を行うことができるので好ましい。
【００５７】
蛍光検出器によってＦＡＭ及びＶＩＣの蛍光強度を測定して検出を行う。すなわち、検出の結果、強いＦＡＭの蛍光に加えてＶＩＣの蛍光を検出できた場合には、試料に含まれる核酸がマイコプラズマ属またはウレアプラズマ属細菌であることを意味し、更には標的部位の核酸配列がＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ特異的な配列を有することを意味し、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍであると同定することができる。また、検出の結果、ＦＡＭの蛍光のみでＶＩＣの蛍光が検出できない場合には、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ以外のマイコプラズマ属又はウレアプラズマ属細菌であると推定することができる。
【００５８】
更に、内部標準物質を検出、同定の対象とするオリゴヌクレオチドプローブセットを組合せて実施してもよい。ＰＣＲ反応時の阻害の有無を確認するために、反応溶液中に内部標準物質を添加して実施することができる。内部標準物質は、使用するプライマーセットにより増幅されるが、インベーダー反応の工程で使用される種特異的オリゴヌクレオチドプローブのいずれとも反応せず、内部標準物質の検出、同定用に設計したオリゴヌクレオチドプローブのみと反応する配列を有するものを用いる。
内部標準物質を使用するために、ＰＣＲの条件を変更したりプライマーを追加することもできるが、プライマーセットの数を増やさず反応に大きな影響を与えない程度に添加され使用されることが好ましい。例えば、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの配列（Ｘ７７３３４）の配列の一部を人為的に改変したものを使用することができる。
【００５９】
本発明の実施形態である核酸プローブアッセイ用組成物を含む試薬キットは、本発明の実施形態によるＰＣＲとインベーダー反応を使用したマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定が実施できるように構成される。
例えば、対象とする全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通する１６ｓ  ｒＲＮＡ領域に設計したプライマーセット（配列番号５、６）、対象とする全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通する配列を標的部位として設計したオリゴヌクレオチドプローブセット、及び／又は、対象とする全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌から選ばれる少なくとも一つ以上の種特異的な配列を標的部位として設計したオリゴヌクレオチドプローブセット、を含み、更に、Ｔａｑポリメラーゼ、フラップエンドヌクレアーゼを含むことができる。
【００６０】
オリゴヌクレオチドプローブセットは、検出、同定を実施する目的や状況に応じて、どのようなオリゴヌクレオチドプローブセットを組み合わせるか、適宜選択して使用することができ、選択の仕方としては、前述した検出、同定する方法に倣って組み合わせを選択することが可能である。オリゴヌクレオチドプローブセットは、アレルプローブとインベーダープローブを含み、必要に応じてＦＲＥＴプローブを含むこともできる。ＦＲＥＴプローブを使用せずに実施する場合、アレルプローブ末端を標識しておき、フラップエンドヌクレアーゼによって切断された場合に蛍光を発するように設計するとよい。
例えば、少なくとも一セット以上の検出、同定の対象とする種特異的なオリゴヌクレオチドプローブセットを含むことができる。これらは、一セットのオリゴヌクレオチドプローブセットを含んでいてもよいし、二セット以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含んでいてもよい。
具体的なオリゴヌクレオチドプローブセットとしては、以下の(ａ)〜（ｅ）から少なくとも一つ以上選ばれるオリゴヌクレオチドプローブセットを挙げることができる。
（ａ）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出、同定用の配列番号７で表わされるアレルプローブ及び配列番号８で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｂ）Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓの検出、同定用の配列番号１０で表わされるアレルプローブ及び配列番号１１で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｃ）Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍの検出、同定用の配列番号１３で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｄ）Ｕ．ｐａｒｖｕｍの検出、同定用の配列番号１６で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｅ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群の検出、同定用の配列番号１８又は１９で表わされるアレルプローブと配列番号２０又は２１で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット。
試薬キットの構成とするオリゴヌクレオチドプローブセットは、検査目的や対象とする菌種に合わせて、適宜、選択して使用することができる。
【００６１】
更に、内部標準を検査する場合には、内部標準物質、及び、内部標準物質の検出、同定用オリゴヌクレオチドプローブセットを含むこともできる。
内部標準としては、適宜、選択して使用することができるが、例えば、内部標準物質としてＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの配列の一部を改変したものを使用し、配列番号２３で表わされるアレルプローブ及び配列番号２４で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセットを含むこともできる。
【００６２】
検査目的に合わせた具体的な試薬キットの構成としては、例えば、尿路感染症との関連が強く示唆され、最も検出率の高いＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出検査に使用が想定される場合には、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出、同定用の配列番号７で表わされるアレルプローブ及び配列番号８で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、内部標準物質、及び、内部標準物質の検出、同定用のオリゴヌクレオチドプローブセットを含むこともできる。
【００６３】
また、特定の細菌の感染状況を調べる疫学調査等に使用が想定される場合には、
（ａ）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出、同定用の配列番号７で表わされるアレルプローブ及び配列番号８で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｂ）Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓの検出、同定用の配列番号１０で表わされるアレルプローブ及び配列番号１１で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｃ）Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍの検出、同定用の配列番号１３で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｄ）Ｕ．ｐａｒｖｕｍの検出、同定用の配列番号１６で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｅ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群の検出、同定用の配列番号１８又は１９で表わされるアレルプローブと配列番号２０又は２１で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
のいずれかから対象とする細菌のオリゴヌクレオチドプローブセットを選択し、含むことができる。
【００６４】
また、尿路感染症とその起炎菌との関連について調査する場合には、
（ａ）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出、同定用の配列番号７で表わされるアレルプローブ及び配列番号８で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｂ）Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓの検出、同定用の配列番号１０で表わされるアレルプローブ及び配列番号１１で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｃ）Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍの検出、同定用の配列番号１３で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｄ）Ｕ．ｐａｒｖｕｍの検出、同定用の配列番号１６で表わされるアレルプローブ及び配列番号１４で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
（ｅ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群の検出、同定用の配列番号１８又は１９で表わされるアレルプローブと配列番号２０又は２１で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
更に、内部標準物質、及び、内部標準物質の検出、同定用のオリゴヌクレオチドプローブセットを含むこともできる。
【００６５】
また、上記以外のマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属について調査研究の対象とする場合には、
（ｅ）マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌群の検出、同定用の配列番号１８又は１９で表わされるアレルプローブと配列番号２０又は２１で表わされるインベーダープローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット、
を更に含む試薬キット構成とし、いずれの種特異的オリゴヌクレオチドプローブセットとも反応しない菌が検出、同定された場合に更なる解析を実施する対象を絞り込むこともできる。
【実施例】
【００６６】
次に実施例を挙げて本発明の詳細を説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら制限されるものではない。【００６７】
（実施例１；プライマー、オリゴヌクレオチドプローブの設計）
本発明において検出、同定の対象とするＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（Ｘ７７３３４；配列番号１）、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ（Ｍ９６６６０；配列番号２）、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＦ０７３４５０；配列番号３）、Ｕ．ｐａｒｖｕｍ（Ａ０７３４５９；配列番号４）の４種について、ＧｅｎＢａｎｋ（米国国立バイオテクノロジー情報センター；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）から１６ｓ  ｒＲＮＡの配列を入手した。入手した各配列をソフトウェアＧＥＮＥＴＩＸ（ゼネティックス社製）を使用して、多重整列プログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷのアルゴリズムに従って配列のアライメントを実施した。アライメント結果を図１に示す。【００６８】
プライマー及びオリゴヌクレオチドプローブはアライメントデータを参考にして、プライマー及びオリゴヌクレオチドプローブを設計した。プライマーはこれらの種に共通する配列部位を選び出して設計した。オリゴヌクレオチドプローブは、種特異的な配列を選び出して設計した。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍはアンチセンス鎖に対してハイブリダイゼーションするようにオリゴヌクレオチドプローブを設計し、それ以外はすべてセンス鎖に対してハイブリダイゼーションするようにオリゴヌクレオチドプローブを設計した。【００６９】
ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列は以下の通りである。
Ｍｙｃｏ＿Ｕｒｅａ＿Ｆ：  ５’−ＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＡＴＡＧＧＴＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＴＣ−３’（配列番号５）
Ｒｖ１：  ５’−ＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＣＴＣ−３’（配列番号６）【００７０】
また、種別に使用したオリゴヌクレオチドプローブ配列は以下の通りである。
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ特異的オリゴヌクレオチドプローブは、以下の通りである。なお、アレルプローブ中においてフラップ配列、すなわち、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて第三オリゴヌクレオチドプローブとなる配列は小文字で記載した。
アレルプローブ
Ｍｇ＿ＳＥ＿Ｐ１＿ａｒｍ７：  ５’−ｔｃｃｇｃｇｃｇｔｃｃＡＧＧＧＡＴＣＧＣＴＣＣＧ−３’（配列番号７）
第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）
Ｍｇ＿ＳＥ＿ｉｎｖ：  ５’−ＡＧＡＴＡＣＴＴＡＡＴＧＴＧＴＴＡＡＣＴＴＣＡＣＴＡＣＣＧＡＴ−３’（配列番号８）
第三オリゴヌクレオチドプローブ：  ５’−ｔｃｃｇｃｇｃｇｔｃｃ−３’（配列番号９）
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ検出、同定用に設計した第四オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端をＦＡＭで標識されたものをホロジック社から購入した。【００７１】
Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ特異的プローブは、以下の通りである。なお、アレルプローブ中においてフラップ配列、すなわち、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて第三オリゴヌクレオチドプローブとなる配列は小文字で記載した。
アレルプローブ
Ｍｈ２＿６３＿Ｐ１＿ａｒｍ７：  ５’−ｔｃｃｇｃｇｃｇｔｃｃＣＧＧＣＴＣＧＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号１０）
第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）
Ｍｈ２＿ｉｎｖ２：  ５’−ＧＡＧＴＴＡＡＡＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＣＡ−３’（配列番号１１）
第三オリゴヌクレオチドプローブ：  ５’−ｔｃｃｇｃｇｃｇｔｃｃ−３’（配列番号１２）
Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ検出、同定用に設計した第四オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端をＦＡＭで標識されたものをホロジック社から購入した。【００７２】
Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ特異的オリゴヌクレオチドプローブは、以下の通りである。なお、アレルプローブ中においてフラップ配列、すなわち、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて第三オリゴヌクレオチドプローブとなる配列は小文字で記載した。
アレルプローブ
Ｕｕ＿６３＿Ｐ１＿ａｒｍ６：  ５’−ｃｇｃｇａｇｇｃｃｇＴＣＧＡＡＣＧＡＧＴＣＧＧＴ−３’（配列番号１３）
第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）；
Ｕｒｅａ＿Ｉｎｖ２：  ５’−ＡＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＴＣＧＧＣＡ−３’（配列番号１４）
第三オリゴヌクレオチドプローブ：  ５’−ｃｇｃｇａｇｇｃｃｇ−３’（配列番号１５）
Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ検出、同定用に設計した第四オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端をＲｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄで標識されたものをホロジック社から購入した。【００７３】
Ｕ．ｐａｒｖｕｍ特異的オリゴヌクレオチドプローブは、以下の通りである。なお、アレルプローブ中においてフラップ配列、すなわち、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて第三オリゴヌクレオチドプローブとなる配列は小文字で記載した。
アレルプローブ
Ｕｐ＿６３＿Ｐ１＿ａｒｍ１：  ５’−ｃｇｃｇｃｃｇａｇｇＣＣＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＧＴ−３’（配列番号１６）
第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）は、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍと共通の配列（配列番号１４）を設計し使用した。
第三オリゴヌクレオチドプローブ：  ５’−ｃｇｃｇｃｃｇａｇｇ−３’（配列番号１７）
Ｕ．ｐａｒｖｕｍ検出、同定用に設計した第四オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端をＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗで標識されたものをホロジック社から購入した。【００７４】
また、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通のオリゴヌクレオチドプローブは、以下の通り設計した。なお、アレルプローブ中においてフラップ配列、すなわち、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて第三オリゴヌクレオチドプローブとなる配列は小文字で記載した。
アレルプローブ
ＡＬＬ２＿ＳＥ＿Ｐ１＿ａｒｍ４：  ５’−ａｇｇｃｃａｃｇｇａｃｇＴＡＡＴＣＣＴＡＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡ−３’（配列番号１８）
ＡＬＬ２＿ＳＥ＿Ｐ１＿Ｇ＿ａｒｍ４：  ５’−ａｇｇｃｃａｃｇｇａｃｇＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣ−３’（配列番号１９）
第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）
ＡＬＬ２＿ＳＥ＿ｉｎｖ：  ５’−ＴＡＣＧＧＴＧＴＧＧＡＣＴＡＣＴＡＧＧＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号２０）
ＡＬＬ２＿ＳＥ＿ｉｎｖ＿ＣＣ：  ５’−ＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号２１）
第三オリゴヌクレオチドプローブ：  ５’−ａｇｇｃｃａｃｇｇａｃｇ−３’（配列番号２２）
全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌検出、同定用に設計した第四オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端をＲｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄで標識されたものをホロジック社から購入した。【００７５】
ウレアプラズマ属細菌（Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍ）の検出、同定用第四オリゴヌクレオチドプローブは共通した配列となるように設計し、その５’末端をＵ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ検出用オリゴヌクレオチドプローブはＹａｋｉｍａで、Ｕ．ｐａｒｖｕｍ検出用オリゴヌクレオチドプローブはＲｅｄｍｏｎｄで標識した。Ｙａｋｉｍａは励起波長５３１ｎｍ、検出波長５５０ｎｍとＶＩＣとほぼ同等であるため、ＶＩＣ用に設定されたフィルターを使用して検出、同定できる。また、Ｒｅｄｍｏｎｄは励起波長５７９ｎｍ、検出波長５９５ｎｍとＲＯＸとほぼ同等であるため、ＲＯＸ用に設定されたフィルターを使用して検出、同定できる。【００７６】
また、内部標準物質に対しても特異的なオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ設計した。なお、アレルプローブ中においてフラップ配列、すなわち、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて第三オリゴヌクレオチドプローブとなる配列は小文字で記載した。
アレルプローブ
Ｍｙｃｏ＿ＩＣ＿Ｐ＿aｒｍ１：  ５’−ｃｇｃｇｃｃｇａｇｇＣＧＡＣＡＧＣＴＡＧＴＡＴＣＴＡＴＣＧ−３’（配列番号２３）
第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）
ＩＣ＿ｉｎｖ：  ５’−ＴＧＣＡＧＧＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡ−３’（配列番号２４）
第三オリゴヌクレオチドプローブ：  ５’−ｃｇｃｇｃｃｇａｇｇ−３’（配列番号２５）
内部標準物質検出、同定用に設計した第四オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端をＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗで標識されたものをホロジック社から購入した。
なお、全ての第三オリゴヌクレオチドプローブの３’末端に位置する塩基は、第一オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に位置する塩基とホスホジエステル結合によって結合するように合成され、試薬混合時においては一つのオリゴヌクレオチドプローブとして反応溶液中に存在する。【００７７】
設計したプライマー及び各オリゴヌクレオチドプローブの位置をアライメント図２に示す。また、プライマー及び各オリゴヌクレオチドプローブの一覧を表１に示す。第三オリゴヌクレオチドプローブについては、インベーダープローブとして記載した配列中に小文字で示した。なお、表中のＩＣは内部標準物質を示す。【００７８】
【表１】
0006019134.tif 000002
【００７９】
（実施例２；材料の調製）
（菌株）
マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の菌株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ)より購入したＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍのマイコプラズマ菌株及びウレアプラズマ菌株を使用した。
また、交差試験に使用したマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌以外の４１種類の細菌、酵母についても全てＡＴＣＣから購入して使用した。表２に使用した菌株の一覧を示す。【００８０】
【表２】
0006019134.tif 000003
【００８１】
（プライマー、オリゴヌクレオチドプローブの合成）
実施例１で設計したプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの合成は、ホロジック社に委託して製造した。【００８２】
（プラスミドの調製）
検出用陽性対照として、またＰＣＲ反応の鋳型として使用するＤＮＡを作製した。検出、同定の対象とするＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍの４菌株試料として、自動化精製試薬（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＳＰ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用してＤＮＡの抽出を行った。抽出したＤＮＡを鋳型として、実施例１で設計した配列番号５及び配列番号６からなるプライマーセットを使用して、通常のＰＣＲ反応条件により増幅した。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍは５１６〜１０３７番目の塩基を、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓは５１２〜１０１９番目の塩基を、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍは４９２〜１０１３番目の塩基を、Ｕ．ｐａｒｖｕｍは４９６〜１０１７番目の塩基を増幅した。
得られたＰＣＲ増幅産物を遺伝子組み換え用プラスミド（ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ，Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。これを検出用陽性対象及びＰＣＲ反応の鋳型とした。【００８３】
（内部標準物質の作製）
ＰＣＲ反応時の阻害の有無を確認するために使用する内部標準物質を作製した。実施例２で作製したＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの配列を有するＤＮＡが挿入されたプラスミドを鋳型として、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ配列部分を通常の方法に従ってＰＣＲ反応で増幅した。
得られたＰＣＲ産物を精製した後、その塩基配列の一部（Ｘ７７３３４の７６９番目〜９３０番目に相当）を人為的に改変したものを遺伝子組み換え用プラスミド（ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ，Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングし、内部標準物質とした（配列番号３６）。【００８４】
試薬キット１として実施例１で設計した共通プライマーセット、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに特異的なオリゴヌクレオチドプローブセット、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通である（以後ＡＬＬ  Ｍｙｃｏと称する）オリゴヌクレオチドプローブセット、内部標準物質に対して設計したオリゴヌクレオチドプローブセットを、試薬キット２としてＭ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍのそれぞれに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブセットを検出する反応液として調製した。【００８５】
（実施例３：ＰＣＲ条件サイクル数の検討）
ＰＣＲ反応後にインベーダー反応による検出、同定を行う場合について、ＰＣＲ反応のサイクル数と検出状況について検討し、最適なＰＣＲ反応のサイクル数を設定した。実施例２で調製した材料を使用して、試薬キット１を使用してＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを、試薬キット２を使用してＭ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍの各細菌を検出、同定できる条件の検討を行った。鋳型としては、実施例２で調製したプラスミドを１反応あたり１０６〜１０１コピーとなるように使用した。【００８６】
ＰＣＲ反応による増幅と同時にインベーダー反応によって検出、同定する方法は、上記のように混合した試薬を、９５℃に加温したサーマルサイクラー（ＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ，アプライドバイオシステムズ社製）を使用して、ＰＣＲの増幅反応条件は（９５℃、１０秒）＋（９５℃、３０秒＋７０℃、１分）×２＋（９５℃、１５秒＋７０℃、１分）×１０＋（９５℃、１５秒＋６３℃、１分）×４０で行った。
ＰＣＲ反応後にインベーダー法による検出、同定を行うインベーダープラス法は、上記のように混合した試薬を、９５℃に加温したサーマルサイクラー（ＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ，アプライドバイオシステムズ社製）を使用して、ＰＣＲの増幅反応条件を（９５℃、１０秒）＋（９５℃、１５秒＋７０℃、１分）×３０で行った後、９９℃で１０分加熱してＴａｑポリメラーゼを不活化し、（６３℃、３０秒）×６０でインベーダー法による蛍光データ取得をした。インベーダー法とインベーダープラス法の比較結果を図４（インベーダー法）及び図５（インベーダープラス法）に示す。【００８７】
また、インベーダープラス法において、ＰＣＲ反応のサイクル数を、２０、２７、３０、４０の各サイクルとして増幅後、９９℃、１０分加熱してＴａｑポリメラーゼを不活化させた後、インベーダー反応は６３℃で６０サイクルの蛍光データを取得（６３℃で３０秒毎に３０分間蛍光データを取得）し判定を行った結果を図５（ＰＣＲ：３０サイクル）、図６（ＰＣＲ：４０サイクル）、図７（ＰＣＲ：２０サイクル）、表３に示す。【００８８】
【表３】
0006019134.tif 000004
【００８９】
一般的には、ＰＣＲによる検出はＰＣＲサイクル数を増やすことで低コピー数の核酸試料からも検出が可能となる。ＰＣＲ反応と同時にインベーダー反応を実施して検出、同定する系では、核酸試料に含まれるコピー数が高コピーである場合にも低コピーである場合にもＰＣＲ増幅産物の量と蛍光強度が経時的に増加する状況を検出することが可能である。一方で本発明の方法では、ＰＣＲ反応サイクル数の増加に伴いＰＣＲ増幅産物の量が過剰となるため、バックグラウンドの蛍光強度が上昇し、高コピー数の核酸試料において検出が困難となる。種によっては十分な核酸量があるにも関わらず検出対象外となり、誤判定の原因となりうることが分かった（図６）。【００９０】
（実施例４：マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌由来核酸の検出、同定）
実施例２で調製した材料を使用して、試薬キット１を使用してＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを、試薬キット２を使用してＭ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍの各細菌を検出、同定できることを確認した。鋳型としては、実施例２で調製したプラスミドを１反応あたり１０６〜１０１コピーとなるように使用した。【００９１】
混合した試薬を、９５℃に加温したサーマルサイクラー（ＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ，アプライドバイオシステムズ社製）を使用して、ＰＣＲの増幅反応条件は９５℃、１０秒＋（９５℃、１５秒＋７０℃、１分）×３４ｃｙｃｌｅｓ＋９９℃、１０分＋（６３℃、３０秒）×６０ｃｙｃｌｅｓで実施した。インベーダー反応は６３℃で６０ｃｙｃｌｅｓの蛍光データを取得（６３℃で３０秒毎に３０分間蛍光データを取得）し判定を行った。【００９２】
判定に際しては特異オリゴヌクレオチドプローブの蛍光検出量を測定し、検出判定基準を決定した。
プラスミドが０コピー／反応時の蛍光量をバックグランドとし、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍは６，０００、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓは６，０００、Ｕ．ｐａｒｖｕｍは１，７００、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍは８００、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌について（以後ＡＬＬ  Ｍｙｃｏと略す）は８００、内部標準物質については１，７００を判定基準とした。
検出された各種オリゴヌクレオチドプローブの蛍光量を表４に示す。いずれの各種オリゴヌクレオチドプローブについても検出された蛍光量が１反応あたり１０コピーまで判定値を上回ることが確認された。【００９３】
【表４】
0006019134.tif 000005
【００９４】
（実施例５：再現性の確認）
本発明において設計したプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブを含む試薬キットを使用して、検出感度と再現性の確認を行った。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍのＰＣＲ増幅産物を組込んだプラスミドＤＮＡの濃度が、１反応あたり１０２、１０１、０コピーとなるように３ロットを調製した。これら３ロットについて同時再現性の確認として６回測定し、さらに日を変えての日差再現性の確認測定を３回実施した。検出率が１００％となる濃度を最小の検出限界とした。検出、同定の方法は実施例４と同様にして行った。その結果、実施した１８回の測定において、検出率が１００％となるコピー数はＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、ＡＬＬ  Ｍｙｃｏが５０コピー／テスト、Ｕ．ｐａｒｖｕｍ、内部標準物質が１００コピー／テストであり、検査室において求められる検出感度を十分に満たすものであった。【００９５】
（実施例６：交差反応性試験）
実施例２で調製した試薬キットを使用したマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定法について、他の種との交差反応性について検討を行った。【００９６】
６−１．マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌内における交差反応性試験
ヒトに対して感染が確認されているマイコプラズマ属１３種、ウレアプラズマ属２種について、交差反応が起きないかを確認した結果を表５に示す。種特異的に設計した各オリゴヌクレオチドプローブは、いずれも対象とする菌とのみ反応が確認され、対象外の細菌と反応する非特異反応検出されなかった。【００９７】
【表５】
0006019134.tif 000006
【００９８】
６−２．泌尿器関連微生物に対する交差反応性試験
泌尿器への感染が報告されているマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属以外の細菌４１種を使用して、それらの細菌との交差反応性について検討を行った結果を表６に示す。
種特異的に設計した各オリゴヌクレオチドプローブは、いずれも対象とする菌とのみ反応が確認され、対象外の細菌と反応する非特異反応検出されなかった。また、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通する配列を標的部位として設計したＡＬＬＭｙｃｏプローブを使用した場合には、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＶｉｂｌｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの検出が確認されたが、その他では実施した全ての細菌、酵母からの検出はされなかった。対象種以外の種が相同性の高い配列を有する場合においても、臨床検体からの分離例がほとんど無い種については、実質的に問題にならないと思われた。【００９９】
【表６】
0006019134.tif 000007
【０１００】
（実施例７：臨床検体からの検出）
本発明の試薬キットを使用して、臨床検体７３件から対象とする４種の検出、同定を試みた。対照法としては、特開２００４−２４２０６号公報に公開されている方法（以下、対照法と称する）を使用して比較を行った。試料からの核酸抽出には、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｖｉｒｕｍ／Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて核酸試料を調製した以外は、実施例３と同様の検出、同定方法にて行った。【０１０１】
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの場合では、対照法によっては検出されなかった検体からもＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを検出、同定することができることが確認された。同様に他の種についても比較を行った結果、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ及びＵ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍについても対照法によっては検出されなかった検体からも検出、同定が可能であることが確認された。
Ｕ．ｐａｒｖｕｍについては、対照法と本発明の方法とで結果が不一致となる検体が見られた。不一致検体について検出されたＰＣＲ増幅産物について詳細を解析した結果、検体中に含まれる核酸試料が検出下限となる最小検出限界に近い低コピー数であること、また、複数の菌の感染が疑われる複合感染であることがあることが判明した。【０１０２】
（比較例１：プライマー及びオリゴヌクレオチドプローブ設計）
実施例１で実施したアライメントデータを参考にしてプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブを設計した。プライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの設計方法は実施例に準拠して行った。設計されたプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブは以下の通りである。【０１０３】
このプライマーセットは、フォワードプライマーは実施例１で設計したものと同一の配列（配列番号５）で、リバースプライマーは実施例で使用したプライマーを下流側に１２塩基ずれた設計となっている。使用したリバースプライマーの配列を以下に記す。
Ｍｙｃｏ＿Ｕｒｅａ  Ｒ６：  ５’−ＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＡ−３’（配列番号２６）【０１０４】
また、種別に使用したオリゴヌクレオチドプローブ配列は以下の通りである。なお、アレルプローブ中においてフラップ配列、すなわち、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて第三オリゴヌクレオチドプローブとなる配列は小文字で記載した。
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ特異的オリゴヌクレオチドプローブは、センス鎖に対して設計した。なお、フラップ部分の第三オリゴヌクレオチドプローブとなる部分は変更していない。
アレルプローブ
Ｍｇ＿６３＿Ｐ１＿ａｒｍ７：  ５’−ｔｃｃｇｃｇｃｇｔｃｃＴＴＣＧＧＴＡＧＴＧＡＡＧＴＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号２７）
第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）
Ｍｇ＿ｉｎｖ：  ５’−ＡＧＣＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＡＴＣＣＣＡ−３’（配列番号２８）
第三オリゴヌクレオチドプローブ
５’−ｔｃｃｇｃｇｃｇｔｃｃ−３’（配列番号２９）
第四オリゴヌクレオチドプローブは実施例１で設計したＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ検出、同定用第四オリゴヌクレオチドプローブと同じものを使用した。【０１０５】
Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ特異的オリゴヌクレオチドプローブについては、実施例１で設計した第一〜第四オリゴヌクレオチドプローブと同じものを使用した。【０１０６】
Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ特異的オリゴヌクレオチドプローブは、アレルプローブを２種類とした。また、フラップ部分の配列となる第三オリゴヌクレオチドプローブを変更し、それに伴って第四オリゴヌクレオチドプローブの配列も変更した。なお、アレルプローブ中においてフラップ配列、すなわち、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて第三オリゴヌクレオチドプローブとなる配列は小文字で記載した。
アレルプローブ
Ｕｕ＿６３＿Ｐ１＿ａｒｍ３：５’−ａｃｇｇａｃｇｃｇｇａｇＴＣＧＡＡＣＧＡＧＴＣＧＧＴ−３’（配列番号３０）
Ｕｕ＿６３＿Ｐ１＿２＿ａｒｍ３：５’−ａｃｇｇａｃｇｃｇｇａｇＴＣＧＡＡＣＧＡＧＴＣＧＧＴＴ−３’（配列番号３１）
第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）は、実施例１で設計したものと同じもの（配列番号１４）を使用した。
第三オリゴヌクレオチドプローブ
５’−ａｃｇｇａｃｇｃｇｇａｇ−３’（配列番号３２）
Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ検出、同定用に設計した第四オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端をＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗで標識されたものをホロジック社から購入した。
第四オリゴヌクレオチドプローブはＵｒｅａｐｌａｓｍａ属細菌（Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍ）について共通するものとし、ウレアプラズマ属細菌の検出、同定用として、その５’末端をＹａｋｉｍａで標識した。【０１０７】
Ｕ．ｐａｒｖｕｍ特異的プローブは実施例１で設計した第一〜第四オリゴヌクレオチドプローブと同じものを使用した。【０１０８】
全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通のオリゴヌクレオチドプローブは、以下の通りである。なお、アレルプローブ中においてフラップ配列、すなわち、フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて第三オリゴヌクレオチドプローブとなる配列は小文字で記載した。
アレルプローブ
ＡＬＬ２＿６３＿Ｐ２−２＿ａｒｍ６：  ５’−ｃｇｃｇａｇｇｃｃｇＡＧＡＴＡＣＣＣＴＡＧＴＡＧＴＣＣＡＣ−３’（配列番号３３）
第二オリゴヌクレオチドプローブ（インベーダープローブ）
ＡＬＬ２＿ｉｎｖ２：  ５’−ＡＧＧＧＴＣＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣ−３’（配列番号３４）
検出、同定用に設計した第二オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端を『（標識化合物）』で標識した。
第三オリゴヌクレオチドプローブ：
５’−ｃｇｃｇａｇｇｃｃｇ−３’（配列番号３５）
全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌検出、同定用に設計した第四オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端をＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗで標識されたものをホロジック社から購入した。【０１０９】
設計したプライマー及び各オリゴヌクレオチドプローブの位置をアライメント図３に示す。また、プライマー及び各オリゴヌクレオチドプローブの一覧を表７に示す。なお、表中のＩＣは内部標準物質を示す。【０１１０】
【表７】
0006019134.tif 000008
【０１１１】
（比較例２：マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌由来核酸の検出、同定）
実施例２の方法に準拠して、比較例１で設計したプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブを含む試薬キットを調製した。
試薬キットの構成としては、試薬キット１にはプライマーセットに加えて、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ検出、同定用オリゴヌクレオチドプローブ、内部標準物質検出、同定用オリゴヌクレオチドプローブ、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定用オリゴヌクレオチドプローブを含む。試薬キット２にはプライマーセットに加えて、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕ．ｐａｒｖｕｍのそれぞれを検出、同定するためのオリゴヌクレオチドプローブを含む。
該試薬キットを使用してマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定を試みた。
その結果、対象とした４種いずれについても検出することが可能であった。感度は、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍが１テストあたり１００コピーである以外は、いずれも１テストあたり５０コピーであった。【０１１２】
（比較例３：交差反応性試験）
比較例２で調製した試薬キットを使用したマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定法について、他の種との交差反応性について検討を行った。【０１１３】
３−１．マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌内における交差反応性試験
ヒトに対して感染が確認されているマイコプラズマ属１３種、ウレアプラズマ属２種について、交差反応が起きないかを確認した結果を表８に示す。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ特異的なオリゴヌクレオチドプローブにおいては、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ以外にＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとの反応が確認された。Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ特異的なオリゴヌクレオチドプローブでは、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ以外にＭ．ｆａｕｃｉｕｍ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ｐｒｉｍａｔｕｍ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍとの反応が確認されたことから、本試薬構成では高精度にマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定を行うには不十分であると考えられた。【０１１４】
【表８】
0006019134.tif 000009
【０１１５】
３−２．泌尿器関連微生物に対する交差反応性試験
泌尿器への感染が報告されているマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属以外の細菌４１種（表２参照）を使用して、それらの細菌との交差反応性について検討を行った結果を表９に示す。なお、表９中の細菌番号（Ｎｏ．１〜４１）は、表２の細菌番号と一致する。
その結果、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ特異的に設計したオリゴヌクレオチドプローブでは、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ以外にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの２種との反応が確認された。また、全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌に共通する配列を標的部位として設計したＡＬＬ  Ｍｙｃｏプローブを使用した場合には、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌以外の１７種類の細菌との反応が確認された。このことから、目的とする４種のマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌以外の細菌とも反応することが確認された。【０１１６】
【表９】
0006019134.tif 000010
【０１１７】
上記のプライマーセット及びオリゴヌクレオチドプローブセットを含む試薬構成でマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出同定を行った場合には、目的とする４種の細菌以外と反応し本来検出、同定の対象とする種とは異なるマイコプラズマ細菌であると同定される可能性があるだけでなく、他の属の細菌を誤ってマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌であると同定してしまう可能性が高いため、治療方針の選択材料及び治療薬の効果判定材料として提供するには危険性が高く、採用することはできない。【０１１８】
特にプライマーセットに関しては、配列情報から常法に従って設計した配列を有するプライマーセットだけでは不十分な場合があり、更に、インベーダー反応における検出、同定工程での特異性を考慮して特異性の高い反応系を構築する必要があることが分かった。
従って、公知の方法によって設計されたプライマーセット及びオリゴヌクレオチドプローブセットは、マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌の検出、同定に使用するためには不十分で使用できない場合があり、本発明において設計されたプライマー及び各種オリゴヌクレオチドプローブを使用した検査系は、特に、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、及びＵ．ｐａｒｖｕｍの４種を検出、同定するにあたって、有用であることが示された。
これらのプライマーセット及びオリゴヌクレオチドプローブセットを含む試薬を使用した検出、同定方法は、臨床検体を使用して多検体を迅速に処理することが可能であり、簡易かつ高感度で、一反応で複数のマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を検出し、交差反応が無く信頼性の高い精度で種を同定可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の実施形態によれば、ＰＣＲによる増幅反応とインベーダー法による検出、同定反応に必要な試薬を一つの容器内に一度に混合して、臨床検体を材料にヒトからの分離が報告されている全てのマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属細菌を同等の感度で検出し、非淋菌性尿道炎との関連が示唆されている種について同定することができる。また、非淋菌性尿道炎の起炎菌についての正確な情報を蓄積する一助となり、的確な治療方針の選択材料及び治療薬の効果判定材料を迅速に提供することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
配列表の配列番号７、１０、１３、１６、１８、１９、２３、２４、２７、３０、３１、３３は、それぞれ、Mg_SE_P1_arm7、Mh2_63_P1_arm7、Uu_63_P1_arm6、Up_63_P1_arm1、ALL2_SE_P1_arm4、ALL2_SE_P1_G_arm4、Myco_IC_P_arm1、IC_inv、Mg_63_P1_arm7、Uu_63_P1_arm3、Uu_63_P1_2_arm3、ALL2_63_P2-2_arm6である。配列番号９、１２、１５、１７、２２、２５、２９、３２、３５の各塩基配列は第三オリゴヌクレオチドプローブ配列である。配列番号３６の塩基配列は内部標準物質である。
【図１】
0006019134.tif 000011
【図２】
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【図３】
0006019134.tif 000013
【図４】
0006019134.tif 000014
【図５】
0006019134.tif 000015
【図６】
0006019134.tif 000016
【図７】
0006019134.tif 000017
【配列表】
0006019134000001.app