(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素を精製する方法であって、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、
（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも９５％の純度を有し、
（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも５０％の変換を有し、
（ｉｉｉ）単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、
前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも９８％は、ＳＤＳ−ＣＧＥによって判定される、前駆体形態にあり、
ａ）ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）および前記組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素を発現する哺乳動物の細胞株から分泌される、前記ＧＡＬＮＳ酵素を含有する培養培地を濾過し、前記濾過された培養培地を限外濾過／透析濾過し、それによって、前記限外濾過／透析濾過された培養培地を、２０倍に濃縮し、前記２０倍に濃縮した限外濾過／透析濾過された培養培地を、炭濾過することと、
ｂ）ステップａ）からの前記炭濾過した２０倍の限外濾過／透析濾過培養培地を、Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒａｏｓｅ  ＦＦ捕捉カラムに充填し、前記ＧＡＬＮＳ酵素が前記カラム上に保持されるような条件下で、前記カラムを洗浄し、前記カラムから前記ＧＡＬＮＳ酵素を溶出することと、
ｃ）ステップｂ）からの前記Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ捕捉カラムからの前記溶出液のｐＨを、ｐＨ４．５±０．１に調節し、前記ｐＨ４．５に調節された前記Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ捕捉カラムからの溶出液を濾過することと、
ｄ）前記ｐＨ４．５に調節された前記Ｚｎキレート化ＦＦ捕捉カラムからの溶出液またはステップｃ）からの濾液を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ陽イオン交換カラムに充填し、前記ＧＡＬＮＳ酵素が前記カラム上に保持されるような条件下で、前記カラムを洗浄し、前記カラムから前記ＧＡＬＮＳ酵素を溶出することと、
ｅ）ステップｄ）からの前記Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ陽イオン交換カラムからの前記溶出液のｐＨを、ウイルス不活性化のためにｐＨ３．５±０．１に調節することと、
ｆ）ステップｅ）からの前記ｐＨ３．５のウイルス不活性化溶出液をｐＨ５．０に調節し、次いで前記ｐＨ５．０に調節されたウイルス不活性化溶出液をＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍのポリッシングカラムに充填し、前記ＧＡＬＮＳ酵素が前記カラム上に保持されるような条件下で、前記カラムを洗浄し、前記カラムから前記ＧＡＬＮＳ酵素を溶出することと、
ｇ）ステップｆ）からの前記ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍのポリッシングカラムからの前記溶出液を緩衝液交換して、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、５０ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭアルギニンＨＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ソルビトールを含む、ｐＨ５．４の製剤にし、前記製剤中の前記ＧＡＬＮＳ酵素の濃度を、３ｍｇ／ｍＬに調節することと、
ｈ）ステップｇ）の前記緩衝液交換した製剤を、ＤＶ２０フィルタおよびＭｕｓｔａｎｇ
Ｑフィルタで濾過することによって、あらゆる残存ウイルスおよび／またはＤＮＡを除去することと、
ｉ）ステップｈ）の前記製剤に、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）まで、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）を添加することと、を含む、方法。
【請求項２】
ステップｂ）における前記Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒａｏｓｅ  ＦＦ捕捉カラムからの溶出液を、フィルタを通して濾過し、ウイルスを除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
製剤であって、
（ａ）組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素であって、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも９５％の純度を有し、
（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも５０％の変換を有し、
（ｉｉｉ）単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、
前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも９８％は、ＳＤＳ−ＣＧＥによって判定される、前駆体形態にある、酵素と、
（ｂ）（ｉ）前記ＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化を低減するのに効果的な量のリン酸緩衝液であって、ここで、前記リン酸緩衝液は、２５〜７５ｍＭの濃度のＮａＨ２ＰＯ４である、リン酸緩衝液と、
（ｉｉ）アルギニンＨＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびソルビトールからなる安定剤の安定量と、を含む、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含み、
前記製剤が、５．０〜５．８のｐＨである、製剤。
【請求項４】
前記製剤は、第２の緩衝液を、さらに含む、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記第２の緩衝液が酢酸緩衝液である、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定される場合、少なくとも９５％純粋である、請求項３に記載の製剤。
【請求項７】
前記ＧＡＬＮＳ酵素の５０％〜８０％は、マンノース−６−リン酸受容体カラムに結合する、請求項３に記載の製剤。
【請求項８】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、１〜５ｎＭの線維芽細胞内への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す、請求項３に記載の製剤。
【請求項９】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、１〜３．５ｎＭの線維芽細胞内への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
ＧＡＬＮＳ酵素の濃度は、０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬである、請求項３に記載の製剤。
【請求項１１】
前記緩衝液は、ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃおよびＮａＨ２ＰＯ４である、請求項４に記載の製剤。
【請求項１２】
ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃの濃度は、１０〜３０ｍＭである、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
アルギニンＨＣｌの濃度は、１０〜５０ｍＭであり、Ｔｗｅｅｎ−２０の濃度は、０．００５％〜０．０１５％（ｗ／ｖ）であり、ソルビトールの濃度は、１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）である、請求項３に記載の製剤。
【請求項１４】
製剤であって、
（ａ）組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素であって、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも９５％の純度を有し、
（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも５０％の変換を有し、
（ｉｉｉ）単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、
前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも９８％が、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色によって判定される、前駆体形態にある、酵素と、
（ｂ）（ｉ）緩衝剤としてのＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃおよびＮａＨ２ＰＯ４、ここで、ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃの濃度は、２０±１０ｍＭであり、ＮａＨ２ＰＯ４の濃度は、５０±２５ｍＭである、および、
（ｉｉ）安定剤としてのアルギニンＨＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびソルビトール、ここで、アルギニンＨＣｌの濃度は、３０±２０ｍＭであり、Ｔｗｅｅｎ−２０の濃度は、０．０１％±０．００５％（ｗ／ｖ）であり、ソルビトールの濃度は、２．０％±１．０％（ｗ／ｖ）である、
とを含む、
（ｉｉｉ）５．４±０．４のｐＨである、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、
を含む、製剤。
【請求項１５】
精製された組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素を含む、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の製剤の、ムコ多糖症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群を患う対象を治療するための医薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年７月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／３６６，７１４号の優先権および利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
【０００２】
本発明は、細胞生物学および分子生物学ならびに医療の技術分野に関し、特に、高度にリン酸化された活性なヒトリソソームスルファターゼ酵素の製造、ならびにリソソームスルファターゼ酵素の欠乏と関連するリソソーム蓄積症の管理におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、ならびにムコ多糖症ＩＶａ（ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群）およびＧＡＬＮＳの欠乏と関連する他のリソソーム蓄積症の管理におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソーム内での細胞廃棄物の分解に不可欠である、細胞内の特定のリソソーム酵素の欠乏によりもたらされる。このようなリソソーム酵素の欠乏は、リソソーム内に分解されない「蓄積物質」の蓄積を導き、リソソームの膨張および機能不全、ならびに最終的には細胞および組織の損傷を引き起こす。多数のリソソーム酵素が、特定されており、それらに関連する疾患と関連付けられている。欠けている酵素が特定されると、治療は、患者の罹患組織へ、補充酵素を効果的に送達するという問題だけに縮小することができる。
【０００４】
リソソーム蓄積症を治療するための１つの方法は、静脈内酵素補充療法（ＥＲＴ）による（非特許文献１）。ＥＲＴは、脈管構造を利用して、単一の投与部位から大部分の組織へ酵素を運ぶ。一旦、酵素は広範囲に分配されると、細胞内に取り込まれるはずである。細胞内への取り込みの基本原理は、リソソーム酵素の固有の特徴に見出される。リソソーム酵素は、末端マンノース残基の６位でリン酸によって画定される、糖タンパク質の別個のクラスを構成する。マンノース−６−リン酸は、ほとんどの細胞の表面上に見られる受容体によって、高い親和性および特異性で結合される（非特許文献２、非特許文献３）。ポリペプチド鎖１つ当たり２つのマンノース−６−リン酸結合部位を有する（非特許文献４）マンノース−６−リン酸受容体（ＭＰＲ）は、血液から組織への酵素の取り込みを指示し、次に、リソソームへの細胞内配送を媒介する。
【０００５】
リソソーム酵素の大規模な生成は、哺乳動物の細胞株における発現を伴う。収集および下流処理のための、周囲の増殖培地への組み換え型酵素の顕著な分泌を目標とする。リソソーム酵素の大規模な生成のための理想的なシステムにおいて、酵素は、効率的にリン酸化され、次いで、主としてリソソームではなく、主として細胞表面に向けられる（すなわち、分泌のため）。上述のように、リン酸化されたリソソーム酵素のこの区分は、正常細胞において起こることのまさに正反対である。リソソーム酵素の生成に使用する細胞株の製造は、酵素１モル当たりのマンノース−６−リン酸のレベルを最大化することに焦点を合わせるが、低い特異的生産性によって特徴付けられる。高レベルのマンノース−６−リン酸部分を含有するリソソーム酵素を生成することにおけるインビトロでの試みは、複雑な成功をもたらした（Ｃａｎｆｉｅｌｄら、特許文献１）。インビトロの酵素は、高レベルのマンノース−６−リン酸、ならびに高レベルの非修飾末端マンノースを示す。リソソーム酵素に対するマンノース−６−リン酸とマンノース受容体との間の競合は、有効性のために高用量の酵素の必要性を生み、治療されている対象の損失に対してより大きな免疫原性をもたらす可能性がある。
【０００６】
スルファターゼは、リソソーム酵素の固有のサブクラスを構成する。スルファターゼは、例えば、ステロイド、炭水化物、プロテオグリカン、および糖脂質を含む、種々の基質から硫酸エステルを切断する。全ての既知の真核性スルファターゼは、それらの触媒部位においてシステイン残基を含有する。スルファターゼ活性は、このシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への翻訳後修飾を必要とする。システインからＦＧｌｙへの翻訳後の酵素活性化は、リソソームへのスルファターゼの標的化より前に、翻訳直後に折りたたまれていないスルファターゼ上の小胞体内で生じる（非特許文献５）。この反応を触媒するホルミルグリシン生成酵素は、スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）である。この固有の翻訳後修飾の重要性を強調するのは、リソソームスルファターゼ酵素において、障害のあるＦＧｌｙ形成をもたらす、ＳＵＭＦ１の変異が、ヒトにおいて多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）を引き起こすことである（非特許文献６）。
したがって、リソソームスルファターゼ酵素調製物の治療効果は、その調製物中のマンノース−６−リン酸のレベルおよび活性酵素の存在に依存する。
したがって、当該技術分野において、このようなリソソームスルファターゼ酵素の欠乏によって引き起こされるか、またはそれと関連する、リソソーム蓄積障害の管理のために、治療的に有効な、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の大規模な製造のための、効率的かつ生産的なシステムに対する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，５３７，７８５号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｋｋｉｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，２００２  １１（５）：６７５−６８５
【非特許文献２】Ｍｕｎｉｅｒ−Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６  ２４（１）：１３３−１３６
【非特許文献３】Ｍａｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８４  ９９（６）：１９０７−１９１６
【非特許文献４】Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９  ２６４：７９６２−７９６９
【非特許文献５】Ｄｉｅｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７  ９４：１１９６３−１１９６８
【非特許文献６】Ｄｉｅｚ−Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５  ６：３５５−３７９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、エンドソーム酸性化に欠損のあるＣＨＯ−Ｋ１細胞株誘導体（Ｇ７１と示される）が、組み換え型ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）を発現するように操作される場合、修飾されたＧ７１細胞は、部分的に、製造細胞株のリソソーム区分への物質の損失を防止することによって、高収量の高度にリン酸化された活性な組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を生成するという発見に関する。一実施形態において、本発明は、組み換え型ヒトＳＵＭＦ１および組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を共発現するＥＮＤ３相補群細胞株を提供し、結果として、高収量の高度にリン酸化された活性な酵素をもたらす。例示的な細胞株は、Ｇ７１、Ｇ７１Ｓ、およびそれらの誘導体であり、Ｇ７１の所望の特性、すなわち、高収量の高度にリン酸化された活性な組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を生成する能力を保持する。組み換え型ヒトＳＵＭＦ１および組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を共発現する、ＥＮＤ３相補群が修飾されたＣＨＯ−Ｋ１細胞株のこの適用は、酵素補充療法（ＥＲＴ）によるリソソーム蓄積症の管理のために使用される、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の製造に、特に有用である。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体を、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはその誘導体において、それらの治療的使用を可能にする量で、生成する新規な方法を特徴とする。広範な実施形態において、本方法は、（ａ）ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体を培養するステップと、（ｂ）ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体において、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体を発現する能力のある、第１の哺乳動物発現ベクターを調製するステップと、（ｃ）ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体において、組み換え型ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体を発現する能力のある、第２の哺乳動物発現ベクターを調製するステップと、（ｄ）ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体を、第１および第２の発現ベクターでトランスフェクトするステップと、（ｅ）高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体を発現する、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体のトランスフェクタントを、選択およびクローニングするステップと、（ｆ）高度にリン酸化された組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体を製造するための、細胞培養プロセス方法を最適化するステップと、を含む。組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）、およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群から選択される。
【００１１】
本方法は、全てまたは一部のリソソームスルファターゼ酵素をコードするｃＤＮＡ、および全てまたは一部のヒトＳＵＭＦ１をコードするｃＤＮＡを、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体に、トランスフェクトするステップを伴う。幾つかの実施形態において、それぞれ、コードしている高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素およびヒトＳＵＭＦ１を発現する能力のある、第１および第２の発現ベクターは、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体に同時にトランスフェクトされる。幾つかの実施形態において、第１および第２の発現ベクターは、連続してＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体にトランスフェクトされる。幾つかの実施形態において、全長ヒトリソソームスルファターゼ酵素をコードするｃＤＮＡが使用され、一方で、他の実施形態においては、その生物学的に活性な断片、変異体、改変体、または誘導体をコードするｃＤＮＡが使用される。幾つかの実施形態において、全長ヒトＳＵＭＦ１をコードするｃＤＮＡが使用され、一方で、他の実施形態においては、その生物学的に活性な断片、変異体、改変体、または誘導体が使用される。幾つかの実施形態において、複数の発現ベクターが、ヒトリソソームスルファターゼ酵素およびヒトＳＵＭＦ１のｃＤＮＡを、同時または連続的に、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体に移入するために使用される。幾つかの実施形態において、単一の発現ベクターが、ヒトリソソームスルファターゼ酵素およびヒトＳＵＭＦ１のｃＤＮＡを、同時に、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体に移入するために使用される。好ましい実施形態において、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体は、Ｇ７１細胞株、Ｇ７１Ｓ細胞株、またはＧ７１もしくはＧ７１Ｓの誘導体である。
【００１２】
好ましい実施形態において、本方法は、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、例えば、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）、またはＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株またはその誘導体から生成することを含む。特に好ましい実施形態において、本方法は、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株またはその誘導体から生成することを含む。ＥＮＤ３相補群細胞株は、エンドソーム酸性化欠損等、ＥＮＤ３相補群細胞株の特性を保持する、任意の修飾されたＣＨＯ細胞株である。好ましい実施形態において、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体は、Ｇ７１細胞株、Ｇ７１Ｓ細胞株、またはＧ７１もしくはＧ７１Ｓの誘導体である。
【００１３】
第２の態様において、本発明は、リソソームスルファターゼ酵素の使用を治療的に可能にする量で、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を生成するその能力によって特徴付けられる、エンドソーム酸性化が欠損した哺乳動物細胞株を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、高収量の高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を生成する能力があり、したがって、このようなリソソームスルファターゼ酵素の大規模な生成を可能にする、Ｇ７１、Ｇ７１Ｓ、またはその誘導体と示されるＣＨＯ−Ｋ１由来のＥＮＤ３相補群細胞株を提供する。より好ましい実施形態において、細胞株は、少なくとも約０．５、好ましくは少なくとも約０．７５、より好ましくは少なくとも約１．０、およびさらにより好ましくは少なくとも約１．２５ピコグラム／細胞／日の量で、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を発現および分泌する。
【００１４】
ＥＮＤ３相補群細胞株は、エンドソーム酸性化欠損等、ＥＮＤ３相補群細胞株の特性を保持する、任意の修飾されたＣＨＯ細胞株である。一実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、Ｇ７１またはその誘導体に由来し、（ａ）組み換え型ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）の発現ベクターおよび（ｂ）組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素の発現ベクターを含み、その組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）、およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の発現ベクターを含む。より好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを発現および分泌する。別の好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、クローン４、クローン５、クローンＣ６、クローンＣ２、クローンＣ５、クローンＣ７、クローンＣ１０、クローンＣ１１、およびクローンＣ３０からなる群から選択される。より好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、クローンＣ２である。別の好ましい実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、懸濁液中での増殖に適合される。
【００１５】
第３の態様において、本発明は、本発明の方法に従って生成され、その結果、リソソームスルファターゼ酵素を治療的に使用することを可能にする量で存在する、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を提供する。リソソームスルファターゼ酵素は、全長タンパク質、またはその断片、変異体、改変体、もしくは誘導体であってもよい。幾つかの実施形態において、本発明による、リソソームスルファターゼ酵素、またはその断片、変異体、改変体、もしくは誘導体は、その安定性または薬物動態特性を強化するために、所望通りに、修飾されてもよい（例えば、ペグ化、変異誘発、融合、共役）。好ましい実施形態において、酵素は、ヒトリソソームスルファターゼ酵素、天然のスルファターゼ酵素の生物学的活性を有するヒトリソソームスルファターゼ酵素の断片、またはヒトリソソームスルファターゼ酵素と実質的なアミノ酸配列の相同性を有するポリペプチドである。幾つかの実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、ヒトまたは哺乳動物の配列、起源、または誘導のタンパク質である。他の実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、その欠損が、異染性白質ジストロフィーまたはＭＬＤ（すなわち、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ））、マロトーラミー症候群またはＭＰＳ  ＶＩ（すなわち、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ））、ハンター症候群またはＭＰＳ  ＩＩ（すなわち、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ））、サンフィリポＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＩＩａ（すなわち、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ））、サンフィリポＤ症候群またはＭＰＳ  ＩＩＩｄ（すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ））、およびモルキオＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＶａ（すなわち、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））等のヒト疾患を引き起こすようなものである。特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、その欠損が、モルキオＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＶａ（すなわち、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））を引き起こすようなものである。別の特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、その欠損が、多発性スルファターゼ欠損症またはＭＳＤ（すなわち、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））等のヒト疾患と関連するようなものである。
【００１６】
リソソームスルファターゼ酵素はまた、ヒトまたは哺乳動物の配列、起源、または誘導のものであってもよい。本発明のさらに他の実施形態において、その態様のそれぞれにおいて、リソソームスルファターゼ酵素は、アミノ酸配列が、ヒトまたは哺乳動物のリソソームスルファターゼ酵素のアミノ酸配列の対応する部分と同一である。他の実施形態において、ポリペプチド部分は、ヒトまたは哺乳動物由来の天然のリソソームスルファターゼ酵素である。他の実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドは、少なくとも約２５、５０、１００、１５０、もしくは２００アミノ酸の長さ、またはポリペプチドの全長にわたって、ヒトまたは哺乳動物の酵素の天然のリソソームスルファターゼ酵素のアミノ酸配列に、実質的に相同（すなわち、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一）である。幾つかの実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。ヒトＧＡＬＮＳのアミノ酸配列は、配列番号４に記載され、そのアミノ酸２７〜５２２は、分泌された前駆体タンパク質に対応する。幾つかの実施形態において、このＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と同一の配列を含むか、またはそれらから構成される。ＧＡＬＮＳ酵素は、好ましくは、Ｃα−ホルミルグリシンに変換することが可能な、分泌された前駆体タンパク質（配列番号４のアミノ酸７９）の位置５３のＣｙｓに対応する触媒部位のアミノ酸を、保持する。ＧＡＬＮＳ酵素はまた、荷電アミノ酸Ａｓｐ２８８、Ａｓｎ２８９、Ａｓｐ３９、Ａｓｐ５４、Ｈｉｓ２３６、Ｌｙｓ１４０、Ｈｉｓ１４２、Ｌｙｓ３１０、およびαへリックスＡｒｇ８３のうち、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８個、または全てを含む、他のアミノ酸を、活性部位の空洞に保持することができる。Ｓｕｋｅｇａｗａ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．９  １２８３−１２９０は、患者におけるＧＡＬＮＳ活性を減少させる、追加の変異について記載し、種々の変異の重大性を、酵素内のそれらのそれぞれの３次元位置と関連付け、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素が投与される対象は、ヒトである。
【００１７】
好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、エンドソーム酸性化欠損細胞株、例えば、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞株によって生成される、高度にリン酸化された組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素である。ＥＮＤ３相補群細胞株は、エンドソーム酸性化欠損等、ＥＮＤ３相補群細胞株の特性を保持する、任意の修飾されたＣＨＯ細胞株である。好ましい実施形態において、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体は、Ｇ７１細胞株、Ｇ７１Ｓ細胞株、またはＧ７１もしくはＧ７１Ｓの誘導体である。あるいは、リソソームスルファターゼ酵素は、高度にリン酸化された組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を、比較的高収量、例えば、少なくとも約０．５、少なくとも約０．７５、少なくとも約１．０、または少なくとも約１．２５ピコグラム／細胞／日の量で、発現および分泌することができる条件下で培養された、任意の宿主細胞、例えば、任意のＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞由来株によって生成することができる。
【００１８】
より好ましい実施形態において、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、高レベルのリン酸化されたオリゴ糖（すなわち、タンパク質鎖当たり、約０．２５を超える、好ましくは０．５を超える、およびより好ましくは約０．７５を超える、ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖）を有する。
【００１９】
幾つかの実施形態において、本発明は、特定の高レベルのリン酸化されたオリゴ糖を有する、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、例えば、ＧＡＬＮＳを提供する。例えば、リソソームスルファターゼ酵素は、単量体タンパク質鎖当たり０．５〜１．０のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖、または単量体タンパク質鎖当たり０．５〜０．９のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖、または単量体タンパク質鎖当たり０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖、または単量体タンパク質鎖当たり０．５〜０．７５のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖、または単量体タンパク質鎖当たり０．５４〜０．７５のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有する。他の類似範囲、例えば、単量体タンパク質鎖当たり、少なくとも０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、もしくは０．６５のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖、単量体タンパク質鎖当たり、最大０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、０．９８、もしくは１．０のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖、またはこれらの数のいずれかの任意の組み合わせが企図される。好ましい実施形態において、酵素は、例えば、配列番号４の組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００２０】
幾つかの実施形態において、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、活性部位のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への高い変換率（すなわち、少なくとも約５０％、５５％、６０％、または６５％、好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）を有する。好ましい実施形態において、酵素は、活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）であり、活性部位のシステイン残基は、位置５３のＣｙｓ（配列番号４の位置７９）である。
【００２１】
具体的な実施形態において、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、高レベルのリン酸化されたオリゴ糖、例えば、本明細書に記載される任意の範囲またはレベルの単量体タンパク質鎖当たりのビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を、システイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への高い変換率、例えば、本明細書に記載される任意の率と共に有する。好ましい実施形態において、酵素は、例えば、配列番号４の、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００２２】
前述の実施形態のいずれにおいても、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、例えば、ＧＡＬＮＳ（配列番号４）の少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８．５％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、または少なくとも６５％が、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、クマシーブルー染色によって、またはＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）によって判定される、前駆体形態にある。
【００２３】
さらに、リソソームスルファターゼ酵素、例えば、ＧＡＬＮＳ（配列番号４）は、任意で、組み換え型ヒトＳＵＭＦ１を発現しない宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ由来細胞）において生成されている同じのアミノ酸配列の対照リソソームスルファターゼ酵素の比活性よりも、少なくとも約３０％（例えば、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍）大きな比活性もまた、示す。
【００２４】
前述の実施形態のいずれにおいても、記載のリソソームスルファターゼ酵素、例えば、ＧＡＬＮＳ（配列番号４）は、約０．１〜１０ｎＭ、もしくは約０．１〜７ｎＭ、もしくは約０．５〜５ｎＭ、もしくは約１〜５ｎＭ、もしくは約１〜３．５ｎＭ、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、または約３．５ｎＭ、またはこれらの数のいずれかの任意の組み合わせの、線維芽細胞への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す。
【００２５】
前述の実施形態のいずれにおいても、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、例えば、ＧＡＬＮＳ（配列番号４）の、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％が、マンノース−６−リン酸受容体カラムに結合する。
【００２６】
本態様に従って、リソソームスルファターゼ酵素のこれらの実施形態の任意の精製された製剤が提供され、リソソームスルファターゼ酵素構成成分、例えば、ＧＡＬＮＳ（配列番号４）は、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、クマシーブルー染色によって、または純度を判定する別の方法（例えば、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてクマシーブルーもしくは銀での染色、またはＣ４逆相（ＲＰ）もしくはＣ３（ＲＰ）を含む、ＨＰＬＣによるクロマトグラフ分離、またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））によって、判定される、少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の純度を有する。幾つかの実施形態において、精製された製剤のリソソームスルファターゼ酵素構成成分のかなりの量が、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、クマシーブルー染色によって、または前駆体を検出する別の方法（例えば、クマシーブルーもしくは銀染色を用いた還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、またはＨＰＬＣ（例えば、Ｃ４逆相（ＲＰ）、Ｃ３ＲＰ）によるクロマトグラフ分離、またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、あるいは電気泳動分離とクロマトグラフ分離との組み合わせ、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてキャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ））によって判定される、分泌された前駆体形態にある（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％が前駆体）。
【００２７】
具体的な実施形態において、精製された製剤のリソソームスルファターゼ酵素構成成分は、高レベルのリン酸化されたオリゴ糖、例えば、本明細書に記載の任意の範囲またはレベルの、単量体タンパク質鎖当たりのビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を、活性部位のシステイン残基からＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への高い変換率、例えば、本明細書に記載の任意の率と共に有する。より具体的な実施形態において、精製された製剤は、本明細書に記載されるＫ取り込みを有する。
【００２８】
関連する態様において、本発明は、リソソームスルファターゼ酵素または本明細書に記載の精製された製剤のいずれかを、滅菌な薬学的に許容される希釈剤、担体、および／または賦形剤と共に含有する、滅菌組成物を提供する。このような滅菌組成物は、溶液、または任意で滅菌希釈剤の添加によって再構成可能なバイアル中の凍結乾燥粉末の形態を取ることができる。
【００２９】
第４の態様において、本発明は、本発明の方法によって生成された組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を精製するための方法を提供する。好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、（１）収集物、すなわち、ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）および組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を発現する、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株またはその誘導体由来の培養培地、を濾過するステップ、（２）濾過した収集物を、ｐＨ４．５にｐＨ調節するステップ（混入タンパク質の沈殿を誘発するため）、（３）ｐＨを調節した濾過した収集物を、色素リガンドカラム、例えば、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに充填し、カラムを洗浄し、カラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出するステップ、（４）色素リガンドカラムからの溶出液を、陽イオン交換カラム、例えばＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムに充填し、カラムを洗浄し、カラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出するステップ、ならびに（５）陽イオン交換からの溶出液を限外濾過および透析濾過するステップ、の少なくとも５つの精製ステップを含む、２カラムプロセス（色素リガンドクロマトグラフィー、例えばＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、および陽イオン交換クロマトグラフィー、例えばＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ）を使用して、精製される。任意で、ステップ（１）において濾過した収集物は、ｐＨを調節する前に、限外濾過によって、１０〜２０倍に濃縮される。任意で、ステップ（５）において限外濾過および透析濾過したリソソームスルファターゼ酵素は、製剤緩衝液中に製剤化される。特に好ましい実施形態において、リソソーム酵素は、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、（１）収集物、すなわち、ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）および組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を発現する、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株またはその誘導体からの培地を、例えばＳａｒｔｏｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（３０ｋＤａ、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ）によって、限外濾過するステップ、（２）濾過した収集物をｐＨ４．５にｐＨ調節するステップ（混入タンパク質の沈殿を誘発するため）、（３）ｐＨ調節した濾過した収集物を、捕捉カラム、例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰ（Ｍ）陽イオン交換に充填し、カラムを洗浄し、カラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出するステップ、（４）捕捉カラムからの溶出液を、中間カラム、例えば、色素リガンドＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ、Ｚｉｎｃ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、またはＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅに充填し、カラムを洗浄し、カラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出するステップ、（５）溶出液を、ポリッシングカラム、例えば、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉ−Ｓｕｂ、またはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｌｏｗ−Ｓｕｂに充填し、カラムを洗浄し、カラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出するステップ、の少なくとも５つの精製ステップを含む、３カラムプロセス（キャプチャクロマトグラフィ、例えば陽イオン交換ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ、中間クロマトグラフィー、例えば色素リガンドＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ、Ｚｉｎｃ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、もしくはＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ、およびポリッシングクロマトグラフィー、例えば、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉ−Ｓｕｂ、もしくはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｌｏｗ−Ｓｕｂ）を使用して、精製される。ステップ（５）からの溶出したリソソームスルファターゼ酵素は、製剤緩衝液中に製剤化される。任意で、ステップ（５）からの溶出したリソソームスルファターゼ酵素は、限外濾過され、その後に製剤緩衝液中に製剤化される。任意で、ステップ（４）のカラムからのリソソームスルファターゼ酵素は、ステップ（５）においてポリッシングカラムに充填する前に、低ｐＨウイルス不活性化のために、ｐＨ３．５に晒される。特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、（１）収集物、すなわち、ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）および組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を発現する、哺乳動物の細胞株、例えば、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株またはその誘導体に由来する培養培地を濾過し、濾過した収集物を、例えば、Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（３０ｋＤａ、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ）によって限外濾過／透析濾過し、例えば、２０倍濃縮の、濃縮した濾過された収集物をもたらし、濃縮した濾過された収集物を炭濾過するステップ、（２）炭濾過した濃縮された収集物を、捕捉またはＩＭＡＣカラム、例えば、色素リガンドＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ、Ｚｉｎｃ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、もしくはＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅに充填し、リソソームスルファターゼ酵素が捕捉カラムに保持されるような条件下で、捕捉カラムを洗浄し、捕捉カラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出するステップ、（３）任意で、捕捉カラムからの溶出液を、ウイルス除去のために、フィルタ、例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルタを用いて濾過するステップ、（４）溶出液または捕捉カラムからの濾過した溶出液のｐＨを、酸性ｐＨ、例えば、ｐＨ４．５±０．１に調節し、次いで、酸性ｐＨに調節された溶出液または捕捉カラムからの濾過した溶出液を濾過するステップ、（５）濾過した酸性ｐＨに調節された溶出液または捕捉カラムからの濾過した溶出液を、中間カラム、例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰ陽イオン交換カラムに充填し、リソソームスルファターゼ酵素が中間カラムに保持されるような条件下で、中間カラムを洗浄し、中間カラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出するステップ、（６）中間カラムからの溶出液のｐＨを、ウイルス不活性化のために、低ｐＨ、例えば、ｐＨ３．５±０．１に調節するステップ、ならびに（７）中間陽イオン交換カラムからの低ｐＨのウイルス不活性化溶出液を、ポリッシングカラム、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム、例えば、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉ−Ｓｕｂ、またはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｌｏｗ−Ｓｕｂに充填し、リソソームスルファターゼ酵素がポリッシングカラムに保持されるような条件下で、ポリッシングカラムを洗浄し、ポリッシングカラムからリソソームスルファターゼ酵素を溶出するステップ、の少なくとも６つの精製ステップを含む、リソソームスルファターゼ酵素のタンパク質分解を減少（すなわち、切除）させるように設計される、異なる３カラムプロセス（捕捉または固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、例えば、色素リガンドＣａｐｔｏ  Ｂｌｕｅ、Ｚｉｎｃ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、またはＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ、中間クロマトグラフフィー、例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ陽イオン交換、およびポリッシングクロマトグラフィー、例えば、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉ−Ｓｕｂ、またはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｌｏｗ−Ｓｕｂ��を使用して精製される。好ましい実施形態において、ステップ（３）は、精製プロセスに含まれる。別の好ましい実施形態において、ステップ（３）は精製プロセスにおいて、省略される。任意で、（８）ステップ（７）からの溶出したリソソームスルファターゼ酵素を、緩衝液交換して、例えば、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭアルギニンＨＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ５．４等、本明細書に記載のような製剤を含むが、これらに限定されない、製剤にし、その製剤中の溶出されたリソソームスルファターゼ酵素の濃度を、適切な濃度、例えば、３ｍｇ／ｍＬに調節し、（９）精製されたリソソームスルファターゼ酵素の製剤中に存在するあらゆる残存ウイルスおよびＤＮＡを、ウイルスフィルタおよびＤＮＡフィルタを通して除去し、（１０）非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０（ＰＳ２０またはＴｗｅｅｎ−２０）を、精製されたリソソームスルファターゼ酵素の製剤に添加する。精製されたリソソームスルファターゼ酵素（原薬（Ｂｕｌｋ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ））の最終製剤は、２〜８℃または冷凍で保管する。特に好ましい実施形態において、ステップ（８）〜（１０）は、精製プロセスに含まれる。特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【００３２】
幾つかの実施形態において、収集物は、ステップ（１）においてｐＨ約６．５で、収集される。幾つかの実施形態において、ステップ（１）における炭フィルタは、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  Ｒ５５活性炭フィルタである。幾つかの実施形態において、ステップ（２）における捕捉カラムは、Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムである。幾つかの実施形態において、Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムは、Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムである。幾つかの実施形態において、ステップ（３）におけるフィルタは、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルタである。幾つかの実施形態において、ステップ（２）または（３）からの溶出液または濾過した溶出液の酸性ｐＨは、ステップ（４）において、約４．５±０．１に調節される。幾つかの実施形態において、ステップ（５）における中間カラムは、陽イオン交換カラムである。幾つかの実施形態において、陽イオン交換カラムは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムである。幾つかの実施形態において、ステップ（６）からの中間カラムからの溶出液の低ｐＨは、ステップ（６）において、約３．５±０．１に調節される。幾つかの実施形態において、ステップ（７）におけるポリッシングカラムは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムである。幾つかの実施形態において、ＨＩＣカラムは、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムである。
【００３３】
幾つかの実施形態において、製剤は、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭアルギニンＨＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ５．４を含む。幾つかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）である。幾つかの実施形態において、製剤中のリソソームスルファターゼ酵素の濃度は、約３ｍｇ／ｍＬに調節される。幾つかの実施形態において、ウイルスフィルタは、ＤＶ２０フィルタであり、ＤＮＡフィルタは、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルタである。幾つかの実施形態において、製剤に添加される非イオン性界面活性剤は、０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）である。
【００３４】
第５の態様において、本発明は、ＧＡＬＮＳ酵素の欠損によって引き起こされる（例えば、ムコ多糖症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）もしくはモルキオＡ症候群）か、またはそれと関連する（例えば、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ））リソソーム蓄積症を患う対象の治療に有用な、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）またはその生物学的に活性な変異体、改変体、もしくは誘導体の精製された製剤を提供する。好ましい実施形態において、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＧＡＬＮＳの精製された製剤は、（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色または銀染色によって判定される、少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の純度を有し、（ｂ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）（配列番号４の位置７９）への少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の変換率を有し、（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基におけるＮ結合型グリコシル化を有し、位置１７８のアスパラギン残基に付着するオリゴマンノース鎖の幾つかは、ビスリン酸化される、（ｄ）単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜１．０、または０．５〜０．９、または０．５〜０．８、または０．５〜０．７５、または０．５４〜０．７５のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖（例えば、単量体タンパク質鎖当たり少なくとも０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、もしくは０．６５、および最大０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、０．９８、もしくは１．０のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖、またはこれらの数のいずれかの任意の組み合わせ）を有し、（ｅ）ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも６５％、または少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％）が、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、クマシーブルー染色によって、またはＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）によって判定される、前駆体形態にある、ＧＡＬＮＳ酵素構成成分を有する。さらに、ＧＡＬＮＳ酵素は、任意で、さらに（ｆ）組み換え型ヒトＳＵＭＦ１を発現しない宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ由来細胞）において生成されている、同じアミノ酸配列の対照ＧＡＬＮＳ酵素の比活性よりも、少なくとも約３０％（例えば、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍）大きい比活性を示してもよい。任意で、ＧＡＬＮＳ酵素は、約０．１〜１０ｎＭ、もしくは約０．１〜７ｎＭ、もしくは約０．５〜５ｎＭ、もしくは約１〜５ｎＭ、もしくは約１〜３．５ｎＭ、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、もしくは約３．５ｎＭ、またはこれらの数のいずれかの任意の組み合わせの、線維芽細胞への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す。
【００３５】
精製された高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＧＡＬＮＳは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、またはＳＤＳ−ＣＧＥによって判定される場合、約５５〜６０ｋＤａの大きなバンド（すなわち、前駆体ヒトＧＡＬＮＳが、可視タンパク質の少なくとも約７５％、または少なくとも８０％であり、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％であり、さらにより好ましくは、少なくとも約９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である）、ならびに約３９ｋＤａおよび約１９ｋＤａの小さなバンド（すなわち、成熟またはプロセッシングされたヒトＧＡＬＮＳが、可視タンパク質の約２５％未満、約２０％未満、好ましくは約１５％未満、より好ましくは約１０％未満であり、さらにより好ましくは約５％未満、約３％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１％未満、または約０．５％未満である）から構成される。特に好ましい実施形態において、精製された高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＧＡＬＮＳは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、またはＳＤＳ−ＣＧＥによって判定される場合、約５５〜６０ｋＤａの単一バンド（すなわち、前駆体ヒトＧＡＬＮＳ）から本質的に構成される。一実施形態において、精製された高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＧＡＬＮＳは、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群の治療に有用である。一実施形態において、精製された高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＧＡＬＮＳは、ＭＳＤの治療に有用である。
【００３６】
第６の態様において、本発明は、リソソームスルファターゼ酵素の欠損によって、全てもしくは一部が引き起こされるか、またはその欠損と関連がある、疾患を治療する方法を提供する。本方法は、本発明の方法によって生成された治療的な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を投与することを含み、リソソームスルファターゼ酵素は、ＭＰＲ受容体に結合し、細胞膜を越えて輸送され、細胞に入り、細胞内でリソソームに送達される。
【００３７】
一実施形態において、本方法は、リソソームスルファターゼ酵素の欠損を患う対象を治療することであって、前記リソソームスルファターゼ酵素の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記リソソームスルファターゼ酵素が、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体によって生成される、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体である、治療することを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、治療的な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体を、単独で、または薬学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤との組み合わせで、投与することを含む。好ましい実施形態は、リソソームスルファターゼ酵素の欠損を最も効果的に改善するために、治療される対象、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトの必要性に対して、用量を最適化することを含む。
【００３８】
このような治療的なリソソームスルファターゼ酵素は、例えば、リソソームスルファターゼ酵素の欠損によって引き起こされるリソソーム蓄積症を患う患者、例えば、異染性白質ジストロフィーまたはＭＬＤ、ムコ多糖症ＶＩ型（ＭＰＳ  ＶＩ）またはマロトーラミー症候群、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）またはハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ  ＩＩＩａ）またはサンフィリポＡ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩｄ型（ＭＰＳ  ＩＩＩｄ）またはサンフィリポＤ症候群、およびムコ多糖症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群を患う患者の治療に、特に有用である。特に好ましい実施形態において、リソソーム蓄積症は、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群であり、リソソームスルファターゼ酵素は、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。さらに他の実施形態において、本発明はまた、リソソーム蓄積症を引き起こす、欠損したリソソームスルファターゼ酵素、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。
【００３９】
別の実施形態において、本方法は、リソソームスルファターゼ酵素の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、１つ以上のリソソームスルファターゼ酵素の欠損と関連するリソソーム蓄積症を患う対象を治療することを含み、前記リソソームスルファターゼ酵素は、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体によって生成される、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体である。幾つかの実施形態において、本方法は、治療的な組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体を、単独で、または薬学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤との組み合わせで、投与することを含む。特に好ましい実施形態において、リソソーム蓄積症は、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）である。
【００４０】
特に好ましい実施形態において、ＣＨＯ由来のＥＮＤ３相補群細胞またはその誘導体は、Ｇ７１細胞株、Ｇ７１Ｓ細胞株、またはそのＧ７１もしくはＧ７１Ｓ誘導体である。
【００４１】
さらに別の実施形態において、本発明は、患者の細胞が、細胞への損傷を防止または軽減するためには不十分な量のリソソームスルファターゼ酵素を含有するリソソームを有する、酵素補充療法を必要とする対象に、リソソームスルファターゼ酵素の治療有効量を投与することによる、酵素補充療法の方法を提供し、それによって、十分な量のリソソームスルファターゼ酵素が、リソソームに入り、細胞への損傷を防止または軽減する。細胞は、ＣＮＳ内もしくは外であってもよく、または内皮細胞が、密着結合により活性剤の拡散に対して厳密に密封される毛細血管壁によって、血液から排出される必要はない。
【００４２】
具体的な実施形態において、本発明は、標的リソソーム内で低減され、欠損し、または存在せず、さらに、対象に投与される、生物学的活性を有する、活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を含む、組成物および薬学的組成物を提供する。好ましい活性なヒトリソソームスルファターゼ酵素には、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、イズロン酸−２−スルファターゼ、スルファミダーゼ／ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼは、活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素である。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明は、ＭＰＳ  ＩＶａもしくはモルキオＡ症候群、またはＭＳＤを患う対象を、本明細書に記載の組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、精製された製剤、および／または滅菌組成物の治療有効量を対象に投与することによって治療する方法を提供する。
【００４４】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、ＭＰＳ  ＩＶａもしくはモルキオＡ症候群、またはＭＳＤを患う対象の治療を、ＥＮＤ３相補群細胞によって生成される、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の治療有効量を対象に投与することによって行う方法を提供し、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳは、活性部位のシステイン残基からＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への高い変換率（すなわち、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の変換）、および高レベルのリン酸化（すなわち、タンパク質鎖当たり、約０．２５を超える、好ましくは０．５を超える、およびより好ましくは約０．７５を超える、ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖）を有する。
【００４５】
特に好ましい実施形態において、本発明は、ＭＰＳ  ＩＶａもしくはモルキオＡ症候群、またはＭＳＤを患う対象を、（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色または銀染色によって判定される、少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の純度を有し、（ｂ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）（配列番号４の位置７９）への少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の変換率を有し、（ｃ）単量体タンパク質鎖当たり０．５〜１．０、または０．５〜０．９、または０．５〜０．８、または０．５〜０．７５、または０．５４〜０．７５のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖（例えば、単量体タンパク質鎖当たり少なくとも０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、もしくは０．６５、および最大０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、０．９８、もしくは１．０のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖、またはこれらの数のいずれかの任意の組み合わせ）を有し、（ｄ）ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも６５％、または少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％）が、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、クマシーブルー染色、またはＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）によって判定される、前駆体形態にある、ＧＡＬＮＳ酵素構成成分を有する、精製された高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ製剤の治療有効量を対象に投与することによって、治療する方法を提供する。さらに、ＧＡＬＮＳ酵素は、任意で、（ｅ）組み換え型ヒトＳＵＭＦ１を発現しない宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、またはＣＨＯ由来細胞）において生成されている、同じアミノ酸配列の対照ＧＡＬＮＳ酵素の比活性よりも、少なくとも約３０％（例えば、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍）大きな比活性もまた、示してもよい。任意で、ＧＡＬＮＳ酵素は、約０．１〜１０ｎＭ、もしくは約０．１〜７ｎＭ、もしくは約０．５〜５ｎＭ、もしくは約１〜５ｎＭ、もしくは約１〜３．５ｎＭ、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、もしくは約３．５ｎＭ、またはこれらの数のいずれかの任意の組み合わせの、線維芽細胞への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す。
【００４６】
精製された高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＧＡＬＮＳは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、またはＳＤＳ−ＣＧＥにより判定する場合、約５５〜６０ｋＤａの大きなバンド（すなわち、前駆体ヒトＧＡＬＮＳが、可視タンパク質の少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％であり、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％である）、ならびに約３９ｋＤａおよび約１９ｋＤａの小さなバンド（すなわち、成熟またはプロセッシングしたヒトＧＡＬＮＳが、可視タンパク質の約２５％未満、または約２０％未満であり、好ましくは約１５未満、より好ましくは約１０％未満であり、さらにより好ましくは約５％未満、約３％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１％未満、または約０．５％未満である）から構成される。さらに特に好ましい実施形態において、精製された高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＧＡＬＮＳは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、またはＳＤＳ−ＣＧＥにより判定する場合、約５５〜６０ｋＤａの単一バンド（すなわち、前駆体ヒトＧＡＬＮＳ）から本質的に構成される。
【００４７】
幾つかの実施形態において、対象は、ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオＡ症候群を患う。幾つかの実施形態において、対象は、ＭＳＤを患う。
【００４８】
好ましくは、本発明の方法によって生成される、上述のリソソーム蓄積症の治療のための医薬品の調製における、本発明の高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の対応する使用もまた、企図される。
【００４９】
第７の態様において、本発明は、全てまたは一部がこのようなリソソームスルファターゼ酵素の欠損によって引き起こされるか、またはそれと関連する、疾患の治療に有用である、本明細書に前述の高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、本発明の方法によって生成される、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む。このような薬学的組成物は、髄腔内、非経口、局所、鼻腔内、吸入、または経口投与等、複数の経路による投与に好適であってもよい。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、非経口投与に好適である。リソソーム酵素の欠損を罹患した細胞内に、インビボ投与することができる、全長リソソームスルファターゼ酵素、またはその断片、変異体、改変体、もしくは誘導体をコードする、核酸配列を特徴とする実施形態は、本態様の範囲内である。
【００５０】
さらに好ましい実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上の緩衝剤、および１つ以上の安定剤を含む製剤中に、本発明の方法によって生成される、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む。ある実施形態において、組成物は、前記ＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化を低減するのに効果的な量のリン酸緩衝液、アミノ酸塩、アミノ酸緩衝液、およびポリオールからなる群から選択される、１つ以上の安定剤の安定量を含み、前記製剤は、約５．０〜５．８のｐＨである。
【００５１】
幾つかの実施形態において、ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、クマシーブルー染色によって判定される、少なくとも約９５％の純度と、ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約８０％の変換と、（ｉｉｉ）任意で、単量体タンパク質鎖当たり０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖と、を有し、前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも７０％が、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、クマシーブルー染色によって判定される、前駆体形態にある。幾つかの実施形態において、ＧＡＬＮＳ酵素は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定する場合、少なくとも９５％純粋である。幾つかの実施形態において、ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％が、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、クマシーブルー染色によって判定される、前駆体形態にある。幾つかの実施形態において、ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％が、ＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動によって判定される、前駆体形態にある。幾つかの実施形態において、ＧＡＬＮＳ酵素は、位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約９０％の変換を有する。幾つかの実施形態において、ＧＡＬＮＳ酵素の５０％〜８０％が、マンノース−６−リン酸受容体カラムに結合する。幾つかの実施形態において、ＧＡＬＮＳ酵素は、約１〜５ｎＭの、線維芽細胞内への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す。幾つかの実施形態において、ＧＡＬＮＳ酵素は、約１〜３．５ｎＭの、線維芽細胞内への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す。
【００５２】
ＧＡＬＮＳ、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体の製剤中の濃度は、約０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５〜５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは約０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬである。
【００５３】
ある実施形態において、製剤は、前記ＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化を低減するのに効果的な量のリン酸緩衝液を含む。関連する実施形態において、リン酸緩衝液は、ＮａＨ２ＰＯ４またはその同等物である。さらなる実施形態において、製剤は、第２の緩衝液をさらに含む。一実施形態において、第２の緩衝液は、酢酸緩衝液である。別の実施形態において、酢酸緩衝液は、ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃまたはその同等物である。例示的な緩衝液は、詳細な説明において、さらに詳細に記載される。
【００５４】
ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃまたはその同等物の製剤中の濃度は、約５〜１００ｍＭ、好ましくは約５〜５０ｍＭ、およびより好ましくは約１０〜３０ｍＭであることが企図される。関連する実施形態において、ＮａＨ２ＰＯ４またはその同等物の製剤中の濃度は、約５〜１００ｍＭ、好ましくは約２５〜１００ｍＭであり、より好ましくは約２５〜７５ｍＭである。ある実施形態において、製剤のｐＨは、約ｐＨ４．５〜６．５、好ましくは約ｐＨ５．０〜６．０であり、より好ましくは約ｐＨ５．０〜５．８である。
【００５５】
さらに別の実施形態において、製剤は、アミノ酸塩、アミノ酸緩衝液、界面活性剤、およびポリオールからなる群から選択される、１つ以上の安定剤の安定量を含む。一実施形態において、安定剤は、アルギニンまたはヒスチジンの塩または緩衝液、任意で塩酸アルギニンである。関連する実施形態において、安定剤は、ポリソルベート、任意でポリソルベート２０である。さらなる実施形態において、安定剤は、三価以上の糖アルコール、任意でソルビトールである。例示的な安定剤は、詳細な説明において、さらに詳細に記載される。
【００５６】
ある実施形態において、安定剤は、アルギニンＨＣｌまたはその同等物、Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０）またはその同等物、およびソルビトールまたはその同等物から選択される。幾つかの実施形態において、アルギニンＨＣｌまたはその同等物の製剤中の濃度は、約５〜２００ｍＭ、好ましくは約１０〜１００ｍＭであり、より好ましくは約１０〜５０ｍＭである。別の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ−２０またはその同等物の製剤中の濃度は、約０．００１〜１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．００５〜０．２％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは約０．００５〜０．０１５％（ｗ／ｖ）である。関連する実施形態において、ソルビトールまたはその同等物の製剤中の濃度は、約０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．５〜５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは約１．０〜３．０％（ｗ／ｖ）である。一実施形態において、製剤は、アルギニン塩または緩衝液、ポリソルベート、およびポリオールを含む。
【００５７】
本発明は、さらに、約２５ｍＭ〜７５ｍＭのリン酸緩衝液の最終濃度まで、ＧＡＬＮＳ酵素とリン酸緩衝液を混合することを含む、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化を防止する方法を提供する。例示的な実施形態において、脱リン酸化の量は、例えば、室温（例えば、２５℃）で１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、または６ヵ月の保管した後に試験した場合、１ｍＭリン酸緩衝液中の同じ酵素の製剤と比較して、低減される。
【００５８】
特に好ましい実施形態において、薬学的組成物は、緩衝剤としてＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃおよびＮａＨ２ＰＯ４、ならびに安定剤としてアルギニンＨＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０）、およびソルビトールを含む製剤中に、本発明の方法によって生成された、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む。製剤中のＧＡＬＮＳの濃度は、約１．０±０．５ｍｇ／ｍＬである。製剤中のＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃの濃度は、約２０±１０ｍＭであり、製剤中のＮａＨ２ＰＯ４の濃度は、約５０±２５ｍＭである。製剤のｐＨは、ｐＨ５．４±０．４である。製剤中のアルギニンＨＣｌの濃度は、約３０±２０ｍＭである。製剤中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度は、約０．０１±０．００５％（ｗ／ｖ）である。製剤中のソルビトールの濃度は、約２．０±１．０％（ｗ／ｖ）である。
【００５９】
別の態様において、本発明は、（ａ）軟骨細胞の分化の維持を促進する条件下で、リソソームスルファターゼ酵素欠損を患う患者、例えば、モルキオ症候群を患う患者に由来する軟骨細胞を培養することと、（ｂ）軟骨細胞を、ケラタン硫酸を分解するリソソームスルファターゼ酵素と接触させることと、（ｃ）細胞中のケラタン硫酸のレベルを検出することと、を含む、リソソームスルファターゼ酵素の活性を検出するための方法を提供し、リソソームスルファターゼ酵素と接触した細胞内のケラタン硫酸レベルの低下は、リソソームスルファターゼ酵素と接触していない細胞と比較して、リソソームスルファターゼ酵素活性を示す。幾つかの実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。幾つかの実施形態において、培養は、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ１）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、トランスフェリン、インスリン、およびアスコルビン酸を含む培地において行われる。幾つかの実施形態において、ケラタン硫酸は、共焦点顕微鏡法によって、または抗ケラタン硫酸抗体への結合を介して、検出される。本方法は、いずれのリソソームスルファターゼ酵素を用いて行われてもよく、天然に存在するかもしくは組み換え型のヒト酵素、またはその断片もしくは改変体を含み、前駆体ヒト酵素と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、シグナル配列またはその成熟形態を含まない、改変体を含む。
【００６０】
さらに別の態様において、本発明は、天然基質を分解する、組み換え型ヒトリソソーム酵素の活性を測定するための、細胞に基づくアッセイを提供する。本方法は、（ａ）単離したリソソーム酵素が欠損しているヒト細胞を、リソソーム酵素の天然基質が蓄積する条件下で、培養することと、（ｂ）細胞をリソソーム酵素と接触させることと、（ｃ）細胞を溶解することと、（ｄ）細胞溶解産物に、（ｉ）天然基質に対して特異的であり、（ｉｉ）天然基質から小オリゴ糖を切断する、酵素を添加することと、（ｅ）小オリゴ糖を検出可能部分で標識化することと、（ｆ）任意で、標識化した小オリゴ糖を分離することと、（ｇ）標識化した小オリゴ糖を検出することと、（ｈ）天然基質を分解する、リソソーム酵素の活性を、（ｉ）リソソーム酵素と接触した細胞に由来する標識化した小オリゴ糖の量を、（ｉｉ）リソソーム酵素と接触していない細胞に由来する標識化された小オリゴ糖の量と、比較することによって検出することと、を含み、（ｈ）（ｉｉ）と比較して、（ｈ）（ｉ）における減少は、天然基質を分解する、リソソーム酵素の活性を示す。一実施形態において、小オリゴ糖は、単糖、二糖、または三糖である。関連する実施形態において、小オリゴ糖は、二糖である。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）、およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）である。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）である。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、β−ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）である。
【００６１】
細胞に基づくアッセイに使用可能である、好適なヒト細胞には、試験されるリソソームが欠損し、その結果、リソソーム酵素に対する天然基質が蓄積する可能性のある、任意のヒト細胞が含まれる。例えば、活性における完全（１００％）または部分的な欠損、例えば、活性における３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の減少を、天然に示す細胞が使用可能である。低下した活性を有する変異酵素を発現する細胞、またはリソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症を患う患者に由来する細胞が、使用可能である。例えば、変異体を、コード遺伝子もしくはそのプロモーター、または他の調節領域に導入することを通じて、リソソーム酵素活性をノックアウトまたは低下させるように組み換えで変化させた細胞を、使用してもよい。リソソーム酵素活性を低下させるように処理された細胞、例えば、酵素発現を低下させるためにアンチセンスまたはＲＮＡｉで処理された細胞を、使用してもよい。
【００６２】
小オリゴ糖を、炭化水素から切断（消化）し、リソソーム酵素の天然基質に「特異的な」（すなわち、主に消化する）、好適な酵素は、当業者によって選択することができる。例えば、ＧＡＬＮＳまたはＧＬＢ１（ケラタン硫酸を分解する酵素）の活性の検出のために、ステップ（ｄ）の酵素は、ケラタナーゼＩＩ、または主にケラタン硫酸に作用する任意の酵素であってもよい。別の例として、ＩＤＵ、ＡＲＳＢ、ＩＤＳ、またはＧＵＳＢ（デルマタン硫酸を分解する酵素）の検出のために、ステップ（ｄ）の酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣ、または主にデルマタン硫酸に作用する任意の酵素であってもよい。別の例として、ＩＤＵ、ＩＤＳ、ＳＧＨＳ、Ｇ６Ｓ、またはＧＵＳＢ（ヘパラン硫酸塩を分解する酵素）の検出のために、ステップ（ｄ）の酵素は、ヘパラナーゼＩもしくはヘパラナーゼＩＩ、または両方であってもよい。さらに別の例として、ＧＡＡ（グリコーゲンを分解する酵素）の検出のために、ステップ（ｄ）の酵素は、α−アミラーゼ、または主にグリコーゲンに作用する任意の酵素であってもよい。
【００６３】
この細胞に基づく方法は、リソソーム酵素活性の検出において、高い感受性を可能にする。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素活性は、リソソーム酵素の濃度が、約１０ｎＭ、または約５ｎＭ、または約１ｎＭ、または約０．７５ｎＭ、または約０．５ｎＭ、または約０．２５ｎＭ、または約０．１ｎＭ、または約０．０５ｎＭ、または約０．０１ｎＭ、または約０．００５ｎＭ、または約１ｐＭ、または約０．５ｐＭ程度の低さである場合に、検出可能である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素を精製する方法であって、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＧＡＬＮＳ酵素が、
（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも約９５％の純度を有し、
（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約５０％の変換を有し、
（ｉｉｉ）任意で、単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、
前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも９７％は、ＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）によって判定される、前駆体形態にあり、
ａ）ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）および前記組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素を発現する哺乳動物の細胞株から分泌される、前記ＧＡＬＮＳ酵素を含有する培養培地を濾過し、前記濾過された培養培地を限外濾過／透析濾過し、前記限外濾過／透析濾過された培養培地を炭濾過することと、
ｂ）ステップａ）からの前記炭濾過された限外濾過／透析濾過培養培地を、捕捉カラムに充填し、前記ＧＡＬＮＳ酵素が前記捕捉カラム上に保持されるような条件下で、前記捕捉カラムを洗浄し、前記捕捉カラムから前記ＧＡＬＮＳ酵素を溶出することと、
ｃ）任意で、ステップｂ）の前記捕捉カラムからの前記溶出液を、フィルタを通して濾過し、ウイルスを除去することと、
ｄ）ステップｂ）からの前記捕捉カラムからの前記溶出液、またはステップｃ）からの前記濾液のｐＨを、酸性ｐＨに調節し、前記酸性ｐＨに調節された前記捕捉カラムからの溶出液または酸性ｐＨに調節された濾液を濾過することと、
ｅ）前記酸性ｐＨに調節された前記捕捉カラムからの溶出液または酸性ｐＨに調節されたステップｄ）からのＱ濾液を、中間カラムに充填し、前記ＧＡＬＮＳ酵素が前記中間カラム上に保持されるような条件下で、前記中間カラムを洗浄し、前記中間カラムから前記ＧＡＬＮＳ酵素を溶出することと、
ｆ）ステップｅ）の前記中間カラムからの前記溶出液を、ウイルス不活性化のために、低ｐＨに調節することと、
ｇ）ステップｆ）からの前記低ｐＨのウイルス不活性化溶出液を、ポリッシングカラムに充填し、前記ＧＡＬＮＳ酵素が前記ポリッシングカラム上に保持されるような条件下で、前記ポリッシングカラムを洗浄し、前記ポリッシングカラムから前記ＧＡＬＮＳ酵素を溶出することと、を含む、方法。
（項目２）
前記培養培地は、ステップａ）において約２０倍に濃縮される、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップａ）の前記炭フィルタは、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  Ｒ５５活性炭フィルタである、項目１に記載の方法。
（項目４）
ステップｂ）の前記捕捉カラムは、Ｚｎ固定化金属親和性クロマトグラフィー（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラムである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムは、Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムである、項目４に記載の方法。
（項目６）
ステップｃ）が実行され、前記フィルタは、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルタである、項目１に記載の方法。
（項目７）
ステップｂ）からの前記捕捉カラムからの前記溶出液またはステップｃ）の前記濾液の前記ｐＨは、ステップｄ）において、約４．５±０．１に調節される、項目１に記載の方法。
（項目８）
ステップｅ）の前記中間カラムは、陽イオン交換カラムである、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記陽イオン交換カラムは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  ＨｉＣａｐカラムである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ウイルス不活性化のための前記酸性ｐＨは、ステップｆ）で約３．５±０．１に調節される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
ステップｇ）の前記ポリッシングカラムは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＨＩＣカラムは、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
ｈ）ステップｇ）の前記ポリッシングカラムからの前記溶出液を緩衝液交換して、製剤にすることと、
ｉ）ステップｈ）からの前記緩衝液交換した製剤を、ウイルスフィルタおよびＤＮＡフィルタで濾過することによって、あらゆる残存ウイルスおよびＤＮＡを除去することと、
ｊ）ステップｉ）からの前記製剤に、非イオン性界面活性剤を添加することと、をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
ステップｈ）における前記製剤は、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭ  アルギニンＨＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ５．４を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
ステップｈ）における前記製剤中の前記ＧＡＬＮＳ酵素は、約３ｍｇ／ｍＬに調節される、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
ステップｉ）における前記ウイルスフィルタは、ＤＶ２０フィルタであり、ステップｉ）における前記ＤＮＡフィルタは、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルタである、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
ステップｊ）における前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）であり、最終形成時のＰＳ２０の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）である、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素を精製する方法であって、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、
（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも約９５％の純度を有し、
（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約５０％の変換を有し、
（ｉｉｉ）任意で、単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、
前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも９７％は、ＳＤＳ−ＣＧＥによって判定される、前駆体形態にあり、
ａ）ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）および前記組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素を発現する哺乳動物の細胞株から分泌される、前記ＧＡＬＮＳ酵素を含有する培養培地を濾過し、前記濾過された培養培地を限外濾過／透析濾過し、それによって、前記限外濾過／透析濾過された培養培地を、２０倍に濃縮し、前記２０倍に濃縮した限外濾過／透析濾過された培養培地を、炭濾過することと、
ｂ）ステップａ）からの前記炭濾過した２０倍の限外濾過／透析濾過培養培地を、Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒａｏｓｅ  ＦＦ捕捉カラムに充填し、前記ＧＡＬＮＳ酵素が前記カラム上に保持されるような条件下で、前記カラムを洗浄し、前記カラムから前記ＧＡＬＮＳ酵素を溶出することと、
ｃ）任意で、ステップｂ）における前記Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒａｏｓｅ  ＦＦ捕捉カラムからの溶出液を、フィルタを通して濾過し、ウイルスを除去することと、
ｄ）ステップｂ）からの前記Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ捕捉カラムからの前記溶出液、またはステップｃ）からの前記濾液のｐＨを、約ｐＨ４．５±０．１に調節し、前記ｐＨ４．５に調節された前記Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ捕捉カラムからの溶出液または濾液を濾過することと、
ｅ）前記ｐＨ４．５に調節された前記Ｚｎキレート化ＦＦ捕捉カラムからの溶出液またはステップｄ）からの濾液を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ陽イオン交換カラムに充填し、前記ＧＡＬＮＳ酵素が前記カラム上に保持されるような条件下で、前記カラムを洗浄し、前記カラムから前記ＧＡＬＮＳ酵素を溶出することと、
ｆ）ステップｅ）からの前記Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ陽イオン交換カラムからの前記溶出液のｐＨを、ウイルス不活性化のために約ｐＨ３．５±０．１に調節することと、
ｇ）ステップｆ）からの前記ｐＨ３．５のウイルス不活性化溶出液を、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍのポリッシングカラムに充填し、前記ＧＡＬＮＳ酵素が前記カラム上に保持されるような条件下で、前記カラムを洗浄し、前記カラムから前記ＧＡＬＮＳ酵素を溶出することと、
ｈ）ステップｇ）からの前記ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍのポリッシングカラムからの前記溶出液を緩衝液交換して、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、５０ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭアルギニンＨＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ソルビトールを含む、ｐＨ５．４の製剤にし、前記製剤中の前記ＧＡＬＮＳ酵素の濃度を、約３ｍｇ／ｍＬに調節することと、
ｉ）ステップｈ）の前記緩衝液交換した製剤を、ＤＶ２０フィルタおよびＭｕｓｔａｎｇ
Ｑフィルタで濾過することによって、あらゆる残存ウイルスおよび／またはＤＮＡを除去することと、
ｊ）ステップｉ）の前記製剤に、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）まで、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）を添加することと、を含む、方法。
（項目１９）
項目１または１８に記載の精製される組成物であって、前記組成物は、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素を含み、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＧＡＬＮＳ酵素が、
（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも約９５％の純度を有し、
（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約５０％の変換を有し、
（ｉｉｉ）任意で、単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、
前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも９８％は、ＳＤＳ−ＣＧＥによって判定される、前駆体形態にある、組成物。
（項目２０）
ムコ多糖症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群を患う対象を治療する方法であって、項目１または１８に従って精製される組成物の治療有効量を、前記対象に投与することを含み、前記組成物は、精製された組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素を含み、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＧＡＬＮＳ酵素が、
（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも約９５％の純度を有し、
（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約５０％の変換を有し、
（ｉｉｉ）任意で、単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、
前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも９８％は、ＳＤＳ−ＣＧＥによって判定される、前駆体形態にある、方法。
（項目２１）
製剤であって、
（ａ）組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素であって、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも約９５％の純度を有し、
（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約５０％の変換を有し、
（ｉｉｉ）任意で、単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、
前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも９７％は、ＳＤＳ−ＣＧＥによって判定される、前駆体形態にある、酵素と、
（ｂ） （ｉ）前記ＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化を低減するのに効果的な量のリン酸緩衝
液と、
（ｉｉ）アミノ酸塩、アミノ酸緩衝液、界面活性剤、およびポリオールからなる群から選択される、１つ以上の安定剤の安定量と、を含む、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含み、
前記製剤が、約５．０〜５．８のｐＨである、製剤。
（項目２２）
前記製剤中の前記リン酸緩衝液は、約２５ｍＭ〜７５ｍＭの濃度である、項目２１に記載の製剤。
（項目２３）
前記製剤は、任意で酢酸緩衝液である第２の緩衝液を、さらに含む、項目２１に記載の製剤。
（項目２４）
前記安定剤は、アルギニンまたはヒスチジンの塩または緩衝液、任意で塩酸アルギニンである、項目２１に記載の製剤。
（項目２５）
前記安定剤は、ポリソルベート、任意でポリソルベート２０である、項目２１に記載の製剤。
（項目２６）
前記安定剤は、三価以上の糖アルコール、任意でソルビトールである、項目２１に記載の製剤。
（項目２７）
アルギニン塩または緩衝液、ポリソルベート、およびポリオールを含む、項目２１に記載の製剤。
（項目２８）
組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化を防止する方法であって、リン酸緩衝液の最終濃度約２５ｍＭ〜７５ｍＭまで、ＧＡＬＮＳ酵素とリン酸緩衝液とを混合することを含む、方法。
（項目２９）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定される場合、少なくとも９５％純粋である、項目２１に記載の製剤。
（項目３０）
前記ＧＡＬＮＳ酵素の５０％〜８０％は、マンノース−６−リン酸受容体カラムに結合する、項目２１に記載の製剤。
（項目３１）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、約１〜５ｎＭの、線維芽細胞内への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す、項目２１に記載の製剤。
（項目３２）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、約１〜３．５ｎＭの、線維芽細胞内への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す、項目２１に記載の製剤。
（項目３３）
ＧＡＬＮＳ酵素の濃度は、約０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬである、項目２１に記載の製剤。
（項目３４）
前記緩衝剤は、ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃおよびＮａＨ２ＰＯ４である、項目２１に記載の製剤。
（項目３５）
ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃの濃度は、約１０〜３０ｍＭであり、ＮａＨ２ＰＯ４の濃度は、約２５〜７５ｍＭである、項目３４に記載の製剤。
（項目３６）
前記安定剤は、アルギニンＨＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびソルビトールである、項目２１に記載の製剤。
（項目３７）
アルギニンＨＣｌの濃度は、約１０〜５０ｍＭであり、Ｔｗｅｅｎ−２０の濃度は、約０．００５％〜０．０１５％（ｗ／ｖ）であり、ソルビトールの濃度は、約１．０％〜３．０％（ｗ／ｖ）である、項目３６に記載の製剤。
（項目３８）
製剤であって、
（ａ）組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素であって、前記ＧＡＬＮＳ酵素は、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも約９５％の純度を有し、
（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約５０％の変換を有し、
（ｉｉｉ）単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、
前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも９７％が、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されると、クマシーブルー染色によって判定される、前駆体形態にある、酵素と、
（ｂ） （ｉ）緩衝剤としてＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃおよびＮａＨ２ＰＯ４と、
（ｉｉ）安定剤としてアルギニンＨＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびソルビトールと、
（ｉｉｉ）約５．４±０．４のｐＨと、を含み、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、製剤。
（項目３９）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定される場合、少なくとも９５％純粋である、項目３８に記載の製剤。
（項目４０）
前記ＧＡＬＮＳ酵素の５０％〜８０％は、マンノース−６−リン酸受容体カラムに結合する、項目３８に記載の製剤。
（項目４１）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、約１〜５ｎＭの、線維芽細胞内への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す、項目３８に記載の製剤。
（項目４２）
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、約１〜３．５ｎＭの、線維芽細胞内への特異的取り込み（Ｋ取り込み）を示す、項目３８に記載の製剤。
（項目４３）
ＧＡＬＮＳ酵素の濃度は、約１．０±０．５ｍｇ／ｍＬである、項目３８に記載の製剤。
（項目４４）
ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃの濃度は、約２０±１０ｍＭであり、ＮａＨ２ＰＯ４の濃度は、約５０±２５ｍＭである、項目３８に記載の製剤。
（項目４５）
アルギニンＨＣｌの濃度は、約３０±２０ｍＭであり、Ｔｗｅｅｎ−２０の濃度は、約０．０１％±０．００５％（ｗ／ｖ）であり、ソルビトールの濃度は、約２．０％±１．０％（ｗ／ｖ）である、項目３８に記載の製剤。
（項目４６）
ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃの濃度は、約２０±１０ｍＭであり、ＮａＨ２ＰＯ４の濃度は、約５０±２５ｍＭである、項目４５に記載の製剤。
【００６４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の精神および範囲内における種々の変更または修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、本発明の実施形態を示しながらも、単に例示の目的で提供されることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）のヌクレオチド配列を記載する（配列番号１）。
【図２】ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）のアミノ酸配列を記載する（配列番号２）。
【図３】ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のヌクレオチド配列を記載する（配列番号３）。
【図４】ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のアミノ酸配列を記載する（配列番号４）。Ｎ末端における２６アミノ酸のシグナルペプチドは、プロセッシングされたＧＡＬＮＳにおいては存在しない。
【図５】プロセッシングされたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の構造および特徴を描写する（配列番号５）。
【図６】ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）およびヒトＧＡＬＮＳ発現ベクターをコトランスフェクトされたＧ７１Ｓ細胞由来のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の発現を示す。（Ａ）９６ウェルにおける、活性なＧＡＬＮＳに対するＧ７１Ｓクローンの選別。（Ｂ）１日１細胞当たりのピコグラム単位でのＧ７１ＳクローンのＧＡＬＮＳ産生。
【図７】ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）およびその改変体を発現する、Ｇ７１Ｓ細胞の大規模な生成のために使用される、ＷＡＶＥバイオリアクター制御器の概略を図示する。
【図８】４℃（菱形）または−７０℃（三角形）で保管した際の、精製されたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素活性の安定性を示す。
【図９】（Ａ）Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー、続いて（Ｂ）Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰクロマトグラフィーによる、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の精製を示す。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色（左）、および抗ＧＡＬＮＳ（ＩＶＡ）抗体を使用するウェスタンブロット法（右）によって、判定する。
【図１０】限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐクロマトグラフィー、Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、およびＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍクロマトグラフィーによる、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の精製を示す。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色（左上）、および抗ＧＡＬＮＳ抗体を使用するウェスタンブロット法（右上）、抗カテプシンＬ抗体（左下）、ならびに抗ＣＨＯＰ（チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質）（右下）によって、判定する。
【図１１】第Ｉ／ＩＩ相のプロセス（左）および第ＩＩＩ相のプロセス（右）に使用される、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）回収および精製プロセスのプロセスフロー図を示す。
【図１２】第Ｉ／ＩＩ相のプロセス（レーン３）または第ＩＩＩ相のプロセス（レーン５）による、精製されたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の比較を示す。５マイクログラム（５μｇ）の精製されたＧＡＬＮＳを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ゲルを、クマシーブルーで染色した。レーン１は、１５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２マーカーに相当する。ｋＤａでの分子量を、染色したゲルの左に示す。
【図１３】デルマタン硫酸基質の量における用量依存性の減少が、ＩＤＵで処理されたＧＭ０１３９１細胞に観察されたことを示す。
【図１４】デルマタン硫酸基質の量における用量依存性の減少が、ＡＲＳＢで処理されたＧＭ００５１９細胞に観察されたことを示す。
【図１５】非標識化（丸）、またはＡ４８８に共役された（四角）、もしくはＡ５５５に共役された（三角）のいずれかのヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の、培養した滑膜細胞による取り込みを示す。
【図１６】１５ｍＭ  アルギニンＨＣｌ、３０ｍＭ  アルギニンＨＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、または３０ｍＭ  ＮａＣｌ（パネルは、それぞれ５１、５２、５４、または５５と示される）を、ｐＨ５．０、ｐＨ５．４、またはｐＨ５．８（パネルは、それぞれＡ、Ｂ、またはＣと示される）で含む製剤中に示される、１または２ヶ月間、５℃、２５℃、または４０℃で保管した際の、精製されたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素の安定性を示す。安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって判定される、保管後の製剤中のＧＡＬＮＳ凝集のピーク面積パーセント（％）によって測定した。
【図１７】１５ｍＭ  アルギニンＨＣｌ、３０ｍＭ  アルギニンＨＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、または３０ｍＭ  ＮａＣｌ（パネルは、それぞれ５１、５２、５４、または５５と示されれる）を、ｐＨ５．０、ｐＨ５．４、またはｐＨ５．８（パネルは、それぞれＡ、Ｂ、またはＣと示される）で含む製剤中に示される、２ヶ月間、５℃、２５℃、または４０℃で保管した際の、精製されたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素活性の安定性を示す。
【図１８】示されるように、１５ｍＭ  アルギニンＨＣｌ、３０ｍＭ  アルギニンＨＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、または３０ｍＭ  ＮａＣｌを、ｐＨ５．０、ｐＨ５．４、またはｐＨ５．８で含む製剤中において示される、２ヶ月間、５℃、２５℃、または４０℃で保管した際の、精製されたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素のグリコシル化を示す。ビスリン酸化されたマンノース７（ＢＰＭ７）パーセントは、アスパラギンＮ−結合型オリゴ糖を切断するために、ＰＮＧａｓｅ  ＦでＧＡＬＮＳ酵素を消化した後に、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって測定した。基準は、１００ｍＭリン酸緩衝液を含む製剤中に示される、２ヶ月間、５℃、２５℃、または４０℃で保管したＧＡＬＮＳの基準ロットに対するＢＰＭ７パーセントを示す。
【図１９】１５ｍＭ  アルギニンＨＣｌ、３０ｍＭ  アルギニンＨＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、または３０ｍＭ  ＮａＣｌ（パネルは、それぞれ５１、５２、５４、または５５と示される）を、ｐＨ５．０、ｐＨ５．４、またはｐＨ５．８（パネルは、それぞれＡ、Ｂ、またはＣと示される）で含む製剤中に示される、２ヶ月間、５℃、２５℃、または４０℃で保管した際の、精製されたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素の安定性を示す。ＧＡＬＮＳ酵素の安定性は、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって判定される、保管後のＧＡＬＮＳ酵素のピーク面積の割合（％）により測定した。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明は、組み換え型リソソームスルファターゼ酵素の大規模な製造に対する必要性と、リソソームの標的化に有効であり、したがって、治療的に有効である、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素生成物の要件とを両立する、方法の発見に関する。
【００６７】
リソソーム酵素調製物の治療効果は、その調製時のマンノース−６−リン酸のレベルに依存する。リン酸を、小胞体および初期ゴルジにおいて、翻訳後修飾により標的糖タンパク質に付加する。折りたたまれたリソソーム酵素は、オリゴ糖修飾酵素によって認識される、固有の三次決定基を示す。決定基は、１組の特異的に間隔を空けられたリジンから構成され、一次配列の相同性が存在しないにも関わらず、ほとんどのリソソーム酵素上で見出される。修飾酵素であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼは、タンパク質決定基に結合し、ＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸を、結合部位に近位のオリゴ糖上の末端マンノース残基の６位に、付加し、第２の酵素であるリン酸ジエステルα−ＧｌｃＮＡｃａｓｅは、次に、ＧｌｃＮＡｃ−リン酸結合を切断し、マンノース−６−リン酸末端オリゴ糖をもたらす（Ｃａｎｆｉｅｌｄら、米国特許第６，５３７，７８５号）。マンノース−６−リン酸修飾の目的は、リソソーム酵素を、細胞内で、分泌経路からリソソーム経路へ方向転換することである。マンノース−６−リン酸を有する酵素は、トランスゴルジにおいてＭＰＲによって結合され、細胞表面ではなくリソソームに配送される。
【００６８】
リソソーム酵素のオリゴ糖上のマンノース−６−リン酸マーカーの存在に加えて、酵素のリソソーム配送は、トランスゴルジ層板の末端から発生する輸送エンドソームの酸性化に依存する。拡散性塩基性分子を有するこれらのエンドソーム内での酸性環境の化学消失は、細胞外環境への、リソソーム酵素を含む小胞内容物の噴き出しをもたらす（Ｂｒａｕｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３（３）：３１６−３２１，１９８７）。酸性化は、エンドソームの膜内に埋め込まれた、特異的な液胞ＡＴＰａｓｅを必要とする（Ｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３（２）：９４−１０３，２００２）。  このＡＴＰａｓｅの不足は、リソソーム配送を犠牲にして、リソソーム酵素の分泌を強化することが予想される。液胞ＡＴＰａｓｅに欠陥を有する細胞株の製造は、細胞内リソソーム区分へのリン酸化された組み換え酵素の非生産的な転換を防止することが予想されるであろう。
【００６９】
１９８４年、エンドソーム酸性化に特異的に欠損があるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞変異体が、生成され、特徴付けられた（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７（２）：１３７−１５０，１９９１）。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、化学的に変異誘発され、毒素の存在下において、高温での生存のために選択された。これらの毒素は、それらの致死性の完全な発現に、エンドソームの酸性化を必要とする（Ｍａｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９９（６）：１９０７−１９１６，１９８４）。先の研究において、異なる作用機構を有する２つの毒素のカクテルが、毒素特異的抵抗性の選択を回避するために選ばれた。原理は、１つの特定の毒素に対する抵抗性をもたらす偶発性変異の可能性はわずかであるが、２つの全く異なる毒素に特異的な２つの同時の偶発性変異の可能性は存在しないということである。選択は、温度感受性の変異を可能にするために、高温で行った。この遺伝子スクリーニングにより、２つの変異体をもたらし、そのうち１つは、Ｇ．７．１（Ｇ７１）と示され、高温において毒素に対して抵抗性であった。Ｇ７１における傷害は、２つの毒素の取り込みまたは作用機構によるものではなく、クローンが、高温でエンドソームを酸性化することができないことからもたらされた。この能力の欠如はまた、より少ない程度ではあったが、許容温度（３４℃）においても明らかであった。Ｇ７１細胞はまた、培地からのトランスフェリンの正常な取り込みにもかかわらず、高温において、鉄に対して栄養要求性であることが見出された（Ｔｉｍｃｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３０）：１４１５４−１４１５９，１９８６）。鉄は、低ｐＨにおいてのみ、トランスフェリンから放出されるため、正常なトランスフェリンの取り込みにもかかわらず、鉄に対する栄養要求性は、エンドソーム酸性化の不足を示した。別の研究は、酸性化の欠陥は、リソソームではなく、主にエンドソームにおいて現れたことを示した（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２０）：９８８３−９８８６，１９８７）。Ｇ７１に対するデータは、変異が、エンドソーム酸性化の原因となる液胞ＡＴＰａｓｅの不安定化をもたらしたという結論と一致していた。不安定化は、高温（３９．５℃）で最も明らかであったが、より低い温度（３４℃）でさえも部分的に現れた。Ｇ７１細胞における２つの内因性リソソーム酵素、カテプシンＤおよびα−グルコシダーゼの輸送の研究（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７（２）：１３７−１５０，１９９１）は、いずれの酵素も、高温で定量的に分泌され、酵素のグリコシル化は、影響を受けなかったことを示した。リン酸化された酸性α−グルコシダーゼの分泌は、非許容温度において、有意に強化された。
【００７０】
リソソームスルファターゼ酵素調製物の治療的効果は、マンノース−６−リン酸のレベルに依存するだけでなく、その調製時の活性酵素の存在にもまた依存する。全ての既知のスルファターゼは、それらの触媒部位にシステイン残基を有し、このシステイン残基は、酵素を活性化させるために、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に翻訳後修飾される。スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）によって触媒される、このシステインからＦＧｌｙへの翻訳後の酵素活性化は、スルファターゼをリソソームに標的化する前に、翻訳直後に、折りたたまれていないスルファターゼ上で小胞体内において生じる（Ｄｉｅｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１９６３−１１９６８，１９９７）。この固有の翻訳後修飾の重要性は、リソソームスルファターゼ酵素における障害ＦＧｌｙ形成をもたらす、ＳＵＭＦ１における変異が、ヒトにおいて多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）を引き起こすという事実によって、強調される（Ｄｉｅｚ−Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６：３５５−３７９，２００５）。
【００７１】
したがって、エンドソーム酸性化が欠損している変異体ＣＨＯ細胞であるＧ７１細胞の、組み換え型ヒトスルファターゼ修飾酵素（ＳＵＭＦ１）およびヒトリソソームスルファターゼ酵素を共発現する能力は、このようなリソソームスルファターゼ酵素の欠損によって引き起こされるか、またはそれと関連するリソソーム蓄積障害の管理に有用な、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素の大規模な生成のための機構を提供する。
Ｉ．定義
【００７２】
別段の定義がない限り、本明細書に使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されるものと同じ意味を有する。以下の参照は、当業者に、本発明に使用される多数の用語の一般的な定義を提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ  ｅｄ．１９９４）、ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）、ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ  ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００７３】
本明細書に引用される、それぞれの出版物、特許出願、特許、および他の参照は、本開示と矛盾しない範囲で、その全体が参照により組み込まれる。
【００７４】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される際、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容によってそうでない旨を明確に示さない限り、複数形への参照を含むことに留意されたい。
【００７５】
本明細書に使用される際、以下の用語は、別段の指定がない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００７６】
「対立遺伝子改変体」は、同じ遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の多型形態を指す。対立遺伝子改変体は、変異を通じて自然に発生し、集団内に、表現型多型をもたらす場合がある。遺伝子変異は、サイレント（すなわち、コードされたポリペプチドに変化がない）であってもよく、または変化されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。「対立遺伝子改変体」はまた、遺伝子対立改変体のｍＲＮＡ転写産物に由来するｃＤＮＡ、ならびにそれらによってコードされたタンパク質を指す。
【００７７】
「増幅」とは、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、およびリガーゼ連鎖反応によって、ポリヌクレオチド配列を複写し、それによってより多くのポリヌクレオチド分子に拡大する、任意の手段を指す。
【００７８】
配列が第１の配列であるポリヌクレオチドが、配列が第２の配列であるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする場合、第１の配列は、第２の配列に対して「アンチセンス配列」である。
【００７９】
「ｃＤＮＡ」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態で、ｍＲＮＡに対して相補的または同一である、ＤＮＡを指す。
【００８０】
従来の表記が、ポリヌクレオチド配列を記述するために本明細書に使用される：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と称する。新生ＲＮＡ転写産物に対するヌクレオチドの５’から３’への付加方向は、転写方向と称される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」と称され、そのＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列であり、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’に位置するものは、「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列であり、コードＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるものは、「下流配列」と称される。
【００８１】
「相補的」とは、２つのポリヌクレオチドの相互作用表面の位相的な適合性または互いに合致することを指す。したがって、２つの分子は、相補的として記載することができ、さらに、接触表面の特徴は、互いに相補的である。第１のポリヌクレオチドは、第１のヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一である場合、第２のポリヌクレオチドに対して相補的である。したがって、配列が５’−ＴＡＴＡＣ−３’であるポリヌクレオチドは、配列が５’−ＧＴＡＴＡ−３’であるポリヌクレオチドに相補的である。ヌクレオチド配列は、対象ヌクレオチド配列に対して相補的な配列が、基準ヌクレオチド配列と実質的に同一である場合、基準ヌクレオチド配列に対して「実質的に相補的」である。
【００８２】
「保存的置換」とは、アミノ酸のポリペプチドにおける、機能的に類似のアミノ酸での置換を指す。以下の６つの群は、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
【００８３】
ポリペプチドを参照して使用される際、用語「断片」は、タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端のいずれか、または両方におけるトランケーションのため、および／あるいは、タンパク質の内部の部分または領域の欠失によって、全長ポリペプチドよりも短いポリペプチドを指す。ポリペプチドの断片は、当該技術分野で既知の方法によって生成することができる。
【００８４】
ポリペプチドを参照して使用される際、用語「変異体」は、タンパク質の１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換されているポリペプチドを指す。アミノ酸置換は、上で定義されたように、保存的置換であってもよく、または非保存的置換であってもよい。変異体ポリペプチドは、当該技術分野で既知の方法によって生成することができる。
【００８５】
ポリペプチドを参照して使用される際、用語「誘導体」は、例えば、限定されるものではないが、ユビキチン化、標識化（例えば、放射性核種もしくは種々の酵素を用いて）、ペグ化等の共有ポリマー結合（すなわち、ポリエチレングリコールでの誘導体化）、およびオルニチン等のアミノ酸の化学合成による挿入または置換等の技術によって、化学的に修飾されたポリペプチドを指し、それらは、通常、ヒトのタンパク質に生じない。誘導体ポリペプチドは、当該技術分野で既知の方法によって生成することができる。
【００８６】
細胞株を参照して使用される際、用語「誘導体」は、親細胞株の子孫である細胞株を指し、例えば、この用語には、親細胞から継代またはサブクローニングされていて所望の特性を保持する細胞、所望の特性の保持のために変異および選択された親細胞株の子孫、ならびに異なる発現ベクターまたは異なる外的に付加された核酸を含むように変化させられた親細胞株の子孫が含まれる。
【００８７】
「検出」とは、試料中の検体の存在、非存在、または量を判定することを指し、試料中または試料中の細胞当たりの検体の量を定量化することが含まれる。
【００８８】
「検出可能部分」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的方法によって、検出可能である組成物を指す。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光染料、高電子密度試薬（例えば、ＥＬＩＳＡで広く使用される）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン、および抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質、または標的に対して相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能部分は、しばしば、試料中の検出可能部分の量を定量するために使用可能である、放射性、発色性、または蛍光性のシグナル等、測定可能なシグナルを生成する。検出可能部分は、共有結合、またはイオン性のファンデルワールスもしくは水素結合を通じてのいずれかで、例えば、ストレプトアビジンによって認識される、放射性ヌクレオチドまたはビオチニル化ヌクレオチドの組み込みを通じて、プライマーまたはプローブに、組み込まれるか、または結合されてもよい。検出可能部分は、直接的または間接的に検出可能であってもよい。間接的検出は、第２の直接的または間接的検出可能部分を、検出可能部分に結合することを伴ってもよい。例えば、検出可能部分は、例えば、ストレプトアビジンに対する結合パートナーであるビオチン、または相補的配列に対する結合パートナーであり、特異的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列等の、結合パートナーのリガンドであってもよい。結合パートナーは、それ自体が、直接的に検出可能であってもよく、例えば、抗体は、それ自体が蛍光分子で標識化されてもよい。結合パートナーはまた、間接的に検出可能であってもよく、例えば、相補的なヌクレオチド配列を有する核酸は、他の標識化された核酸分子でのハイブリダイゼーションを通じて次に検出可能な分枝ＤＮＡの一部であってもよい。（例えば、Ｆａｈｒｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１６５，１９８８を参照されたい）。シグナルの定量化は、例えば、シンチレーション計数、デンシトメトリー、またはフローサイトメトリーによって達成される。
【００８９】
「診断」は、病的状態の存在または性質を特定することを意味する。診断方法は、それらの特異性および選択性が異なる。特定の診断方法は、症状の決定的な診断を提供しない場合があるが、その方法が、診断に役立つ明確な指示を提供する場合、十分である。
【００９０】
用語「有効量」は、対象の健康状態、病状、および疾患に所望の結果をもたらすために、または診断目的のために、十分な投与量を意味する。所望の結果は、投与量の受容者における主観的または客観的な改善を含んでもよい。「治療有効量」は、健康に対して意図される有益な効果をもたらすために効果的な薬剤の量を指す。
【００９１】
「コードする」とは、ヌクレオチドの定義された配列（すならち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける、他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列の特有の特性、ならびにそこから得られる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、転写およびその遺伝子によって生成されたｍＲＮＡの翻訳が、細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を生成する場合、タンパク質をコードする。コード鎖、すなわちｍＲＮＡと同一であり、通常、配列表内に提供される核酸配列、および転写の鋳型として使用される、遺伝子またはｃＤＮＡの非コード鎖のいずれも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の生成物をコードすると称することができる。別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮退型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【００９２】
「等量用量」とは、同じ量の活性剤を含有する、用量を指す。
【００９３】
「発現制御配列」とは、そこに動作的に結合されるヌクレオチド配列の発現（転写および／または翻訳）を調節する、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列を指す。「動作的に結合された」とは、１つの部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が、もう１つの部分（例えば、配列の転写）に対する作用をもたらす、２つの部分間の機能的な関係を指す。発現制御配列には、例えば、限定されるものではないが、プロモーター（例えば、誘発性または構造性）、エンハンサー、転写ターミネータ、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、および終止コドンの配列が含まれる。
【００９４】
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に動作的に結合される発現制御配列を含む、組み換え型ポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他の要素は、宿主細胞またはインビトロ発現システムから提供されてもよい。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、むき出し、またはリポソームに含まれる）、および組み換え型ポリヌクレオチドを組み込むウイルス等、当該技術分野で既知のもの全てを含む。
【００９５】
「高度にリン酸化された」、「高レベルのリン酸化」、および「高レベルのリン酸化されたオリゴ糖」は、リソソームスルファターゼ酵素の少なくとも５０％が、リン酸化されたオリゴ糖を通じて、陽イオン非依存性のマンノース−６−リン酸に結合する、リソソームスルファターゼ酵素の調製物を指す。結合は、マンノース−６−リン酸との競合に対する感受性によって、さらに特徴付けられる。高度にリン酸化されたリソソームスルファターゼ酵素はまた、タンパク質鎖当たり、少なくとも０．２５、好ましくは少なくとも０．５、およびより好ましくは少なくとも０．７５のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有する、リソソームスルファターゼ酵素を指す。あるいは、高度にリン酸化されたリソソームスルファターゼ酵素（ＧＡＬＮＳ）は、線維芽細胞内の、特異的取り込みであるＫ取り込み（最大取り込み値の半分を生成する酵素／リガンドの濃度）が、約０．１〜１０ｎＭ、もしくは約０．１〜７ｎＭ、もしくは約０．５〜５ｎＭ、もしくは約１〜５ｎＭ、もしくは約１〜３．５ｎＭ、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、もしくは約３．５ｎＭ、またはこれらの数のいずれかの任意の組み合わせである、酵素を指す。
【００９６】
本明細書に使用される際、「ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖」は、リソソームスルファターゼ酵素内のアスパラギン残基にＮ結合され、２つのマンノース−６−リン酸残基を含む、マンノース含有オリゴ糖鎖を指す。典型的に、ビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖は、７つのマンノース残基を有し、すなわち、ビスリン酸マンノース７（ＢＰＭ７）であり、２つのＧｌｃＮＡｃ残基に結合し、それが、次にリソソームスルファターゼ酵素内のアスパラギン酸残基に結合される。
【００９７】
「活性な」、「活性化された」、「高レベルの活性化」とは、タンパク質の活性部位のシステイン残基の、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）へ翻訳後修飾されている、リソソームスルファターゼ酵素の調製物を指す。あるいは、「活性な」、「活性化された」、「高レベルの活性化」は、組み換え型ヒトＳＵＭＦ１を発現しない宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、またはＣＨＯ由来細胞）において生成されている同じアミノ酸配列の対照リソソームスルファターゼ酵素の比活性よりも、少なくとも約３０％（例えば、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍）大きな比活性を示す、リソソームスルファターゼ酵素の調製物を指す。リソソームスルファターゼ酵素の好適な対照調製物は、好ましくは、高度に活性な製剤と同じアミノ酸配列を有し、宿主細胞が、組み換え型ヒトＳＵＭＦ１を発現しないことを除き、同じ宿主細胞中に、同じプロモーターまたは調節配列（複数を含む）を使用して、同じ遺伝子によって発現され、同じ培養期間を含む同じまたは類似の培養条件下で生成され、任意で、高度に活性な調製物と、同じまたは類似の程度に精製される。
【００９８】
「高度にリン酸化された活性な」とは、タンパク質の活性部位のシステイン残基の、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも９５％が、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）へ翻訳後修飾されており、タンパク質鎖当たり、少なくとも０．２５、好ましくは少なくとも０．５、およびより好ましくは少なくとも０．７５のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有する、リソソームスルファターゼ酵素の調製物を指す。
【００９９】
用語「生物学的に活性な」とは、全長ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性のうち、少なくとも実質的な量（例えば、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、およびより好ましくは少なくとも約９０％）を保持する、そのポリペプチド（すなわち、酵素）断片、変異体、改変体、または誘導体を指す。リソソームスルファターゼ酵素を参照して使用される際、その生物学的に活性な断片、変異体、改変体、または誘導体は、少なくとも実質的な量のスルファターゼ活性（すなわち、その標的物質からの硫酸エステルの切断）を保持する。スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）を参照して使用される際、その生物学的に活性な断片、変異体、改変体、または誘導体は、少なくとも実質的な量のホルミルグリシン生成活性（すなわち、リソソームスルファターゼ酵素の活性部位のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への修飾）を保持する。
【０１００】
ポリペプチドを参照して使用される際、用語「純度」または「純粋」は、特定の方法を使用して検出可能な任意の混入物質と比較して分析される、ポリペプチドの量を指す。本発明の組み換え型リソソームスルファターゼ酵素については、「純度」は、スルファターゼ酵素調製物を、還元条件下、または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くクマシーブルーもしくは銀での染色による電気泳動分離に供することによって、またはＨＰＬＣ（例えば、Ｃ４逆相（ＲＰ）、Ｃ３ＲＰ）によるクロマトグラフ分離によって、あるいは、例えばサイズ排除（ＳＥＣ）等の任意の他のクロマトグラフ分離によって、判定することができる。これらの方法の任意の１つを使用して、本発明の精製された組み換え型リソソームスルファターゼ酵素は、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９７％、９８％、または９９％の純度を有する。
【０１０１】
用語「前駆体」または「前駆体形態」とは、哺乳動物細胞から分泌される、組み換え型リソソームスルファターゼ酵素の形態を指し、すなわち、シグナル配列が不足しているが、ある修飾、例えば、通常リソソーム内で生じるタンパク質の内部切断が不足している。用語「成熟した」、「成熟形態」、「プロセッシングされた」、または「プロセッシング形態」とは、通常リソソーム内に存在する、組み換え型リソソームスルファターゼ酵素の形態を指す。本発明の組み換え型リソソームスルファターゼ酵素については、「前駆体」または「前駆体形態」および「成熟した」、「成熟形態」、「プロセッシングされた」、または「プロセッシング形態」の相対存在度は、スルファターゼ酵素調製物を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くクマシーブルーもしくは銀での染色による電気泳動分離に供することによって、またはＨＰＬＣ（例えば、Ｃ４逆相（ＲＰ）、Ｃ３ＲＰ）によるクロマトグラフ分離によって、または例えばサイズ排除（ＳＥＣ）等の任意の他のクロマトグラフ分離によって、あるいは、電気泳動分離とクロマトグラフ分離の組み合わせ、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてキャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）によって、判定することができる。これらの方法を使用して、本発明の精製されたリソソームスルファターゼ酵素は、少なくとも約６５％、７０％、または７５％、好ましくは少なくとも約８０％または８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％の「前駆体」または「前駆体形態」から構成される。あるいは、これらの方法を使用して、本発明の精製された組み換え型リソソームスルファターゼ酵素は、約３５％未満、３０％未満、または２５％未満、好ましくは約２０％未満または１５％未満、より好ましくは約１０％未満、およびさらにより好ましくは約５％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、または０．５％未満の「成熟した」、「成熟形態」、「プロセッシングされた」、または「プロセッシング形態」から構成される。幾つかの実施形態において、「前駆体」または「前駆体形態」のみが検出される（すなわち、スルファターゼ酵素調製物が、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、もしくはＳＤＳ−ＣＧＥによって判定される場合に単一の検出可能バンドから、またはＨＰＬＣによって分析される場合の単一ピークから本質的に構成される）。
【０１０２】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列との関連において、用語「同一」または「同一性」パーセントとは、下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または目視検査によって測定すると、最大の一致のために比較し、並べた場合に、同じであるか、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定の割合を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
【０１０３】
「リンカー」とは、共有結合で、またはイオン性のファンデルワールスもしくは水素結合を通じてのいずれかで、２つの他の分子を接合する分子を指し、例えば、５’末端で１つの相補的配列とハイブリダイズし、３’末端で別の相補的配列とハイブリダイズし、したがって、２つの非相補的配列を接合する、核酸分子である。
【０１０４】
「低レベルのリン酸化」または「低いリン酸化」とは、線維芽細胞内への取り込みが、１０ｎＭを超える最大半濃度を有するか、またはマンノース−６−リン酸受容体カラムに結合するリソソームスルファターゼ酵素の画分が、約２５％未満である、リソソームスルファターゼ酵素の調製物を指す。
【０１０５】
対象に適用される際、「天然に存在する」とは、その対象が、自然界に見られるという事実を指す。例えば、自然の源から単離することができ、研究室で人間によって故意に修飾されていない有機体（ウイルスを含む）内に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。
【０１０６】
「薬学的組成物」とは、ヒトおよび哺乳動物を含む、対象動物における薬学的使用に好適な組成物を指す。薬学的組成物は、治療的リソソームスルファターゼ酵素の薬理学的有効量を含み、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤もまた含む。薬学的組成物は、活性成分（複数を含む）、および担体、希釈剤、または賦形剤を構成する不活性成分（複数を含む）、ならびに任意の２つ以上の成分の組み合わせ、錯体、もしくは凝集から、または１つ以上の成分の解離から、あるいは１つ以上の成分の他の種類の反応または相互作用から、直接的または間接的にもたらされる、いずれの生成物をも含む、組成物を包含する。したがって、本発明の薬学的組成物は、本発明のリソソームスルファターゼ酵素を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、混合することによって作製される、いずれの組成物をも包含する。
【０１０７】
「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」とは、あらゆる標準的な薬学的担体、希釈剤、緩衝剤、および賦形剤、例えば、限定されるものではないが、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロースの５％水溶液、およびエマルジョン、例えば、油／水、または水／油エマルジョン、ならびに様々な種類の湿潤剤および／またはアジュバントを指す。好適な薬学的担体、希釈剤、または賦形剤、および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載される。好ましい薬学的担体、希釈剤、または賦形剤は、活性剤の投与の意図される形態に依存する。典型的な投与の形態には、例えば、限定されるものではないが、腸内（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは腹腔内）投与、あるいは、局所、経皮、または経粘膜投与が挙げられる。
【０１０８】
「薬学的に許容される塩」は、薬学的使用のために、リソソームスルファターゼ酵素内に製剤化することができる、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含む、塩である。
【０１０９】
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単位から構成されるポリマーを指す。ポリヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）等の天然に存在する核酸、ならびに核酸類似体が含まれる。核酸類似体は、天然に存在しない塩基を含むもの、天然に存在するリン酸ジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの結合で会合するヌクレオチド、またはリン酸ジエステル結合以外の結合を通じて結合される塩基を含むもの、が挙げられる。したがって、ヌクレオチド類似体には、例えば、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホロトリエステル、ホスホロアミド酸、ボラノリン酸、メチルホスホン酸、キラルメチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して、合成することができる。用語「核酸」は、典型的に、大きなポリヌクレオチドを指す。用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的に、概して約５０ヌクレオチドを超えない、短いポリヌクレオチド、指す。ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表示される場合、これには、「Ｔ」が「Ｕ」で置き換えられる、ＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）もまた含まれることが理解されるであろう。
【０１１０】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造改変体、およびペプチド結合を介して結合されたその合成の天然に存在しない類似体、関連する天然に存在する構造改変体、ならびにその合成の天然に存在しない類似体から構成される、ポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して、合成することができる。用語「タンパク質」は、典型的に、大きなポリペプチドを指す。「ペプチド」は、典型的に、短いポリペプチドを指す。従来の表記が、ポリペプチド配列を表現するために使用され、ポリペプチド配列の左手末端が、アミノ末端であり、ポリペプチド配列の右手末端が、カルボキシル末端である。
【０１１１】
「プライマー」とは、指定のポリヌクレオチドの鋳型に特異的にハイブリダイズし、相補的なポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供する能力のある、ポリヌクレオチドを指す。このような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が誘発される条件下、すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼ等、重合のための物質の存在下に置かれる場合に生じる。プライマーは、典型的に、一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは、典型的に、デオキシリボ核酸であるが、広い範囲の合成および天然に存在するプライマーが、多くの適用に有用である。プライマーは、鋳型に対して相補的であり、合成開始のための部位として機能するように、それとハイブリダイズするように設計されるが、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。このような場合において、鋳型に対するプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリージェンシーに依存する。プライマーは、例えば、発色性、放射性、または蛍光性の部分を使用して標識化し、検出可能部分として使用することができる。
【０１１２】
ポリヌクレオチドを参照して使用される際、「プローブ」は、別のポリヌクレオチドの指定配列と特異的にハイブリダイズする能力のある、ポリヌクレオチドを指す。プローブは、標的の相補的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするが、鋳型の正確な相補的配列を反映する必要はない。このような場合において、標的に対するプローブの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは、例えば、発色性、放射性、または蛍光性の部分を使用して標識化し、検出可能部分として使用することができる。
【０１１３】
「予防的」治療は、疾患の兆候を示さないか、または初期の兆候のみを示す対象に、病状が発症する危険性を減少させる目的で施される治療である。本発明の化合物は、病状の発症の可能性を低減するため、または発症した場合にその病状の重症度を最小化するために、予防的治療として提供することができる。
【０１１４】
「組み換え型ポリヌクレオチド」とは、天然には一緒に接合されない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅または結集された組み換え型ポリヌクレオチドは、好適なベクター内に含むことができ、そのベクターを使用して、好適な宿主細胞を形質転換することができる。組み換え型ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組み換え型宿主細胞」と称される。遺伝子は、次に、組み換え型宿主細胞内で発現して、例えば、「組み換え型ポリペプチド」を生成する。組み換え型ポリヌクレオチドは、非コード機能（例えば、プロモーター、複製の起源、リボソーム結合部位等）もまた同様に供給することができる。
【０１１５】
「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」、または「選択的にハイブリダイズする」とは、その配列が、複合混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡ内に存在する場合に、ストリンジェント条件下で、特定のヌクレオチド配列への選択的な核酸分子の結合、二本鎖化、またはハイブリダイズを指す。
【０１１６】
用語「ストリンジェント条件」とは、プローブが、その標的サブ配列と選択的にハイブリダイズし、他の配列とは、より少ない程度でハイブリダイズするか、または全くハイブリダイズしない、条件を指す。サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験との関連において、「ストリンジェントハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメータ下において、異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２  “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見出される。一般的に、高ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、既定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列に対する熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（既定のイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対するＴｍと等しくなるように選択される。
【０１１７】
サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルタ上での、１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを有する５０％ホルマリン、４２℃であり、ハイブリダイゼーションは一晩中行われる。高ストリンジェント洗浄条件の例は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、７２℃で約１５分間である。ストリンジェント洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣ洗浄、６５℃で１５分間である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい）。しばしば、背景プローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシー洗浄に先立って、低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二本鎖のための、例示的な中程度ストリンジェンシー洗浄は、１×ＳＳＣ、４５℃で１５分間である。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二本鎖のための、例示的な低ストリンジェンシー洗浄は、４〜６×ＳＳＣ、４０℃で１５分間である。一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける、無関係のプローブに対して観察されるものよりも２倍（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【０１１８】
診断または治療の「対象」は、ヒトまたは哺乳動物もしくは霊長類を含む非ヒト動物である。
【０１１９】
２つの核酸またはポリペプチドとの関連において、語句「実質的に相同」または「実質的に同一」は、概して、下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または目視検査によって測定すると、最大の一致のために比較し、並べた場合に、少なくとも４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。好ましくは、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０残基である配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施形態において、配列は、比較バイオポリマーのいずれかまたは両方の全長にわたって、実質的に同一である。
【０１２０】
配列比較のために、典型的に、１つの配列が、試験配列が比較される基準配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および基準配列は、コンピュータに入力され、必要であれば、サブ配列の座標が指定され、配列アルゴリズムパラメータが指定される。配列比較アルゴリズムは、次に、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列と比較して試験配列（複数を含む）に対するパーセント配列同一性を計算する。
【０１２１】
比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似方法の探求によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、または目視検査によって、行うことができる。
【０１２２】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関係性およびパーセント配列同一性を示すために、プログレッシブ、ペアワイズアラインメントを使用して、関連する配列の群から、マルチプル配列アラインメントを作製する。それはまた、アラインメントを作製するために使用される、クラスタリング関係を示す、系図または樹状図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０，１９８７のプログレッシブアラインメント法の単純化を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３，１９８９によって記載される方法に類似である。このプログラムは、最大３００配列まで、それぞれ最長５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸で、並べることができる。マルチプルアラインメント手順は、２つの最も類似した配列のペアワイズアラインメントで開始し、２つの並んだ配列のクラスタを生成する。このクラスタは、続いて、次の最も関連する配列または並べられた配列のクラスタと、並べられる。配列の２つのクラスタは、２つの個別の配列のペアワイズアラインメントの単純な拡張によって、並べられる。最終的なアラインメントは、一連の、プログレッシブ、ペアワイズアライメントによって達成される。プログラムは、特定の配列および配列比較領域に対するそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定すること、ならびにプログラムパラメータを指定することによって、実行される。例えば、基準配列を、以下のパラメータ、初期ギャップ重量（３．００）、初期ギャップ長重量（０．１０）、および加重最終ギャップを使用して、他の試験配列と比較して、パーセント配列同一性の関係を判定することができる。配列のマルチプルアラインメントを生成するために有用な別のアルゴリズムは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０，１９９４）である。
【０１２３】
配列同一性および配列類似性パーセントを判定するために好適なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列内で、同じ長さの文字列と並べた際に、ある正数の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たす、クエリ配列内の長さＷの短い文字列を特定することによって、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを伴う。Ｔは、近隣文字列のスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。これらの初期近隣文字列のヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを発見するための検索を開始するための種として機能する。文字列のヒットは、次に、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って、両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致残基のペアに対するリワードスコア、常に＞０）、およびＮ（不一致残基に対するペナルティスコア、常に＜０）を使用して、計算される。アミノ酸配列については、スコア行列を使用して、累積スコアを計算する。各方向への文字列ヒットの拡張は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘ低下した場合、１つ以上の負のスコアの残基配列の累積のために、累積スコアがゼロ以下になった場合、またはいずれかの配列の終点に達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感受性および速度を判定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、文字列長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を初期値として使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を初期値として使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５，１９８９を参照されたい）。
【０１２４】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が、偶然に起こり得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と基準核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合に、基準配列と類似であると考えられる。
【０１２５】
２つの核酸配列またはポリペプチドが、実質的に同一であることのさらなる指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと、免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合に、典型的に、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が、実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子が、本明細書に記載のように、ストリンジェント条件下で、互いにハイブリダイズすることである。
【０１２６】
「実質的に純粋」または「単離された」とは、目的の種が、存在する優勢種である（すなわち、モル基準において、組成物中のあらゆる他の個別の巨大分子の種よりも豊富である）ことを意味し、実質的に精製された画分は、目的の種が、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を構成する、組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する巨大分子種の約８０％〜９０％以上が、精製された目的の種であることを意味する。目的の種は、組成物が、本質的に単一の巨大分子種から構成される場合、本質的な均質性（従来の検出方法によって、混入種を組成物中に検出することができない）まで精製される。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、安定剤（例えば、ＢＳＡ）、および元素イオン種は、この定義の目的上、巨大分子とは考えない。幾つかの実施形態において、本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、実質的に純粋であるか、または単離される。幾つかの実施形態において、本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、それらの合成において使用される巨大分子の開始物質に関して、実質的に純粋であるか、または単離される。幾つかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合された、実施的に精製されたか、または単離された治療的リソソームスルファターゼ酵素を含む。
【０１２７】
「治療的」治療とは、病状の兆候または症状を示す対象に、これらの兆候または症状を低減させるまたは排除する目的のために、施される治療である。兆候または症状は、生化学的、細胞性、組織学的、機能的、主観的、または客観的であってもよい。本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、治療的治療として、または診断のために提供されてもよい。
【０１２８】
「治療指数」とは、最小治療量を超え、許容できない毒性量に満たない用量範囲（量および／または回数）を指す。
【０１２９】
「治療」とは、予防的治療または治療的治療または診断的治療を指す。
【０１３０】
本明細書に使用される際、用語「単位投与形態」とは、ヒトまたは動物対象の単位投与量として好適な、物理的な不連続単位を指し、各単位は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、所望の効果をもたらすために十分な量で計算された、所定量の本発明のリソソームスルファターゼ酵素を含有する。本発明の新規な単位投与形態の詳細は、採用される特定のリソソームスルファターゼ酵素および達成される効果、ならびに宿主における各リソソームスルファターゼ酵素と関連する薬力学に依存する。
ＩＩ．リソソームスルファターゼ酵素の生成
【０１３１】
一態様において、本発明は、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を、このような酵素の治療的使用を可能にする量で、生成する新規な方法を特徴とする。一般的に、本方法は、ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体をコードするｃＤＮＡ、ならびに全長リソソームスルファターゼ酵素、またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは誘導体をコードするｃＤＮＡでの好適な細胞株の形質転換を特徴とする。当業者は、本明細書に明示的に記載したもの以外の発現構築物を、それを用いてトランスフェクトされた好適な細胞株における、このようなリソソームスルファターゼ酵素の最適な生成のために、調製することができる。さらに、当業者は、天然に存在する全長酵素と同じまたは類似の生物学的活性を有する、天然に存在するＳＵＭＦ１またはリソソームスルファターゼ酵素の生物学的に活性な断片、改変体、変異体、もしくは誘導体をコードするｃＤＮＡの断片を、容易に設計することができる。
宿主細胞
【０１３２】
組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を生成するために使用される宿主細胞は、このようなリソソームスルファターゼ酵素を、その酵素を治療的に使用することができる量で生成する、それらの能力によって特徴付けられる、エンドソーム酸性化が欠損した細胞株である。本発明は、Ｇ７１と示される、ＣＨＯ−Ｋ１由来のＥＮＤ３相補群細胞株を提供する。本発明はまた、Ｇ７１Ｓと示される、無血清懸濁培養液における増殖に適合されているＧ７１細胞株を提供する。本発明はまた、さらにサブクローニングされるか、または異なる発現プラスミドを含有する、Ｇ７１およびＧ７１Ｓ細胞株の誘導体を提供する。
【０１３３】
組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有および発現する細胞は、本明細書において、遺伝子修飾された細胞と称される。組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有および発現する、哺乳動物の細胞は、遺伝子修飾された哺乳動物細胞と称される。細胞内へのＤＮＡまたはＲＮＡの導入は、既知のトランスフェクション法、例えば、限定されるものではないが、電気穿孔、微量注入、微粒子銃、リン酸カルシウム沈殿、修飾されたリン酸カルシウム沈殿、陽イオン脂質処置、光穿孔（ｐｈｏｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、融合手法、受容体媒介移入、またはポリブレン沈殿によるものである。あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルスベクターでの感染によって導入されてもよい。組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを発現する、哺乳動物細胞を含む細胞の生成方法は、同時係属中の特許出願、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ  Ｓｅｌｄｅｎ、Ｄｏｕｇｌａｓ  Ａ．Ｔｒｅｃｏ、およびＭｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｈｅａｒｔｌｅｉｎによる表題「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」の米国特許第０８／３３４，７９７号（１９９４年１１月４日出願）、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ  Ｓｅｌｄｅｎ、Ｄｏｕｇｌａｓ  Ａ．Ｔｒｅｃｏ、およびＭｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｈｅａｒｔｌｅｉｎによる「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｏｒ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」の米国特許第０８／３３４，４５５号（１９９４年１１月４日出願）、ならびにＤｏｕｇｌａｓ  Ａ．Ｔｒｅｃｏ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｈｅａｒｔｌｅｉｎ、およびＲｉｃｈａｒｄ  Ｆ  Ｓｅｌｄｅｎによる表題「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｉｎｔｏ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｒ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」の米国特許第０８／２３１，４３９号（１９９４年４月２０日出願）に記載される。これらの出願のそれぞれの教示は、参照によりそれらの全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【０１３４】
好ましい実施形態において、組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を生成するために使用される宿主細胞は、リソソームスルファターゼ酵素を、その酵素を治療的に使用することを可能にする量で生成するその能力によって特徴付けられる、エンドソーム酸性化が欠損した細胞株である。好ましい実施形態において、本発明は、「定義」において特定される、ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）および組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を共発現し、したがって、高収量の高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を生成する能力があり、それによって、治療的なリソソームスルファターゼ酵素の大規模な生成を可能にする、Ｇ７１と示されるＣＨＯ−Ｋ１由来のＥＮＤ３相補群細胞株、およびＧ７１Ｓと示される無血清懸濁培養液における増殖に適合されたＧ７１細胞株を提供する。最も好ましい実施形態において、Ｇ７１もしくはＧ７１Ｓ細胞株、またはその誘導体は、少なくとも約０．５、好ましくは少なくとも約０．７５、より好ましくは少なくとも約１．０、およびさらにより好ましくは少なくとも約１．２５ピコグラム／細胞／日の量で、組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を発現および分泌する。
ベクターおよび核酸構築物
【０１３５】
ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）もしくはリソソームスルファターゼ酵素のいずれか、または両方の組み換え型タンパク質を発現させるために使用される核酸構築物は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞において染色体外で（エピソーム的に）発現されるもの、あるいは無作為に、または相同的な組み換えを通じて事前に選択された標的化部位のいずれかで、受容細胞のゲノム内に統合されるものであってもよい。染色体外で発現される構築物は、組み換え型タンパク質をコードする配列に加えて、細胞内でのタンパク質の発現に十分な配列、および任意でその構築物の複製に十分な配列を含む。それは、典型的に、プロモーター、組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡ、およびポリアデニル化部位を含む。組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡは、その発現が、プロモーターの制御下にあるような形式で、構築物内に位置される。任意で、構築物は、例えば、１つ以上の、以下のスプライス部位、エンハンサー配列、適切なプロモーターの制御下で選択可能なマーカー遺伝子、適切なプロモーターの制御下で増幅可能なマーカー遺伝子、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、またはそれが挿入される領域の発現を強化させる、当該技術分野で既知の他の要素等、追加の構成要素を含むことができる。
【０１３６】
ＤＮＡ構築物が細胞のゲノム内に統合されるような実施形態においては、組み換え型タンパク質をコードする核酸配列のみを含む必要がある。任意で、それは、プロモーターおよびエンハンサー配列、ポリアデニル化部位（１つもしくは複数）、スプライス部位（１つもしくは複数）、選択可能なマーカー（１つもしくは複数）をコードする核酸配列、増幅可能なマーカーをコードする核酸配列、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、もしくは挿入される領域の発現を強化する、当該技術分野で既知の他の要素、および／またはゲノム内で選択された部位へのＤＮＡの統合を標的化するため（ＤＮＡもしくはＤＮＡ配列を標的化するため）受容細胞におけるゲノムＤＮＡに相同性のＤＮＡを含んでもよい。
細胞培養方法
【０１３７】
組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する哺乳動物細胞は、細胞の増殖およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適切な条件下で培養される。組み換え型タンパク質を発現するような細胞は、既知の方法および本明細書に記載の方法を使用して、特定することができ、組み換え型タンパク質は、組み換え型タンパク質生成の増幅の有無に関わらず、既知の方法および本明細書に記載の方法もまた使用して、単離および精製することができる。特定は、例えば、組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在の表現型指標を示す、遺伝子修飾された哺乳動物細胞のスクリーニング、例えば、ＰＣＲスクリーニング、サザンブロット分析によるスクリーニング、または組み換え型タンパク質の発現についてのスクリーニングを通じて、実行することができる。組み込まれた組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡを含有する細胞の選択は、ＤＮＡ構築物に選択可能なマーカーを含むこと、続いて、選択可能なマーカー遺伝子を発現するもののみの生存に適切な条件下で、選択可能なマーカー遺伝子を含有するトランスフェクトまたは感染された細胞を培養することによって、達成することができる。導入されたＤＮＡ構築物のさらなる増幅は、適切な条件下で、遺伝子修飾された哺乳動物細胞を培養すること（例えば、増幅可能なマーカー遺伝子の多重複製を含有する細胞のみが生存可能な薬物濃度の存在下で、増幅可能なマーカー遺伝子を含有する遺伝子修飾された哺乳動物細胞を培養すること）によって、達成することができる。
【０１３８】
組み換え型タンパク質を発現する遺伝子修飾された哺乳動物細胞は、本明細書に記載のように、発現産物の検出によって特定することができる。例えば、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を発現する哺乳動物細胞は、サンドイッチ酵素免疫測定法によって、特定することができる。抗体は、活性剤部分に対して向けられてもよい。
リソソームスルファターゼ酵素の改変体
【０１３９】
ある実施形態において、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の変異体または改変体を調製することが可能であり、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を使用することができる種々の適用において、有用であろう。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体または改変体は、置換、挿入、もしくは欠失の変異体または改変体であってもよい。欠失変異体または改変体は、機能または免疫原活性に不可欠ではない、天然のタンパク質の１つ以上の残基が不足している。欠失変異体または改変体の一般的な種類は、分泌シグナル配列、または細胞の特定の部分に結合するようにタンパク質を指示するシグナル配列が不足しているものである。挿入変異体または改変体は、典型的に、ポリペプチド内の非末端点における物質の付加を伴う。これは、免疫反応性エピトープまたは単純に単一の残基の挿入を含んでもよい。融合タンパク質とも称される末端付加は、以下に説明される。
【０１４０】
改変体は、上述のように、修飾されていないリソソームスルファターゼ酵素と、実質的に相同または実質的に同一であってもよい。好ましい改変体は、リソソームスルファターゼ酵素の生物学的活性のうち少なくともいくらか、例えばスルファターゼ活性を保持する、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドの改変体である、他の好ましい改変体には、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼの少なくとも何らかのスルファターゼ活性を保持する、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼポリペプチドの改変体が含まれる。
【０１４１】
置換変異体または改変体は、典型的に、野生型ポリペプチドの１つのアミノ酸を、タンパク質内の１つ以上の部位の別のものに置き換え、ポリペプチドの１つ以上の特性、例えば、限定するものではないが、タンパク質分解切断に対する安定性等を、他の機能または特性を損失することなく、調整するように設計することができる。この種類の置換は、好ましくは、保存的である、すなわち、１つのアミノ酸が、類似の形状および電荷のもので置き換えられる。保存的置換は、当該技術分野で周知であり、例えば、アラニンからセリン、アルギニンからリジン、アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン、アスパラギン酸塩からグルタミン、システインからセリン、グルタミンからアスパラギン、グルタミンからアスパラギン酸塩、グリシンからプロリン、ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン、イソロイシンからロイシンまたはバリン、ロイシンからバリンまたはイソロイシン、リジンからアルギニン、メチオニンからロイシンまたはイソロイシン、フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン、セリンからトレオニン、トレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン、およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化を含む。
【０１４２】
本発明の一態様は、リソソームスルファターゼ酵素のＯまたはＮ結合型グリコシル化部位が、変異されている、グリコシル化部位変異体または改変体を生成することを企図する。このような変異体または改変体は、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の生物学的活性、物理的構造、および基質結合能に関連する重要な情報をもたらす。特定の態様において、生物学的活性を保持するが、増加または減少した基質結合活性を有する、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドの他の変異体または改変体が生成されてもよいことが企図される。このように、変化された基質結合活性を有するタンパク質変異体または改変体を生成するために、活性部位または触媒領域の変異が、特に企図される。このような実施形態において、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の配列は、他の関連する酵素のものと比較され、選択された残基は、特異的に変異される。
【０１４３】
推定上のアミノ末端から成熟タンパク質のアミノ酸を、アミノ酸番号１として番号付けし、有用な可能性のある例示的な変異には、例えば、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の位置１７８および３９７を含む、潜在的にグリコシル化されたアルパラギンの全てまたは幾つかの置換が挙げられる（図５を参照されたい）。
【０１４４】
基質結合は、リソソームスルファターゼ酵素の活性部位／その付近の変異によって、修飾されてもよい。このような変異が例示であることを考慮に入れて、当業者は、酵素配列の他の変異が、このタンパク質およびその活性についての追加の構造的および機能的情報を提供するためになされてもよいことを理解するであろう。
【０１４５】
上述のもののような変異体または改変体を構築するために、当業者は、周知の標準的な技術を採用することができる。Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、内部欠失、ならびに無作為および点変異誘発が、特に企図される。
【０１４６】
Ｎ末端およびＣ末端欠失は、例えば、ＣまたはＮ末端領域の末端付近の好適な単一の制限酵素部位の存在を利用する、欠失変異誘発の形態である。ＤＮＡは、その部位で切断され、切断末端は、ＢＡＬ３１、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、およびＳ１ヌクレアーゼ等のヌクレアーゼによって分解される。２つの末端を再接合することにより、制限酵素部位周辺に種々の寸法の欠失を有する、一連のＤＮＡを生成する。このような変異体から発現されたタンパク質は、生物学的機能、例えば、酵素活性について、当該技術分野の標準的な技術、および本明細書に記載の技術を使用してアッセイすることができる。類似の技術が、２つの好適に配置された制限酵素部位を使用し、それによって、正確に定義された欠失がなされ、末端が上述のように再連結されることを可能にすることにより、内部欠失変異体に採用されてもよい。
【０１４７】
部分的消化変異体もまた企図される。このような事例において、当業者は、反応時間の長さに応じて、多くの位置で、ＤＮＡを切断する「高頻度切断」を採用するであろう。したがって、反応条件を変化させることによって、寸法の異なる一連の変異体を生成することが可能となり、続いて、活性についてスクリーニングすることができる。
【０１４８】
無作為挿入変異もまた、例えば、ＤＮａｓｅ  ＩでＤＮＡ配列を切断すること、および３、６、９、１２等のアミノ酸をコードする一続きのヌクレオチドを挿入すること、および、末端を再結紮すること、によって行うことができる。このような変異がなされた時点で、変異体は、野生型タンパク質によって示される種々の活性について、スクリーニングすることができる。
【０１４９】
点変異誘発はまた、具体的にどのアミノ酸残基が、リソソームスルファターゼ酵素の生物学的活性と関連する特定の活性において、重要であるかを特定するために採用されてもよい。したがって、当業者は、変化コドンおよびミスセンス変異をもたらすために、ＤＮＡ鎖における単一塩基の変化を生成することができる。
【０１５０】
特定のタンパク質のアミノ酸は、同等、またはさらに改善された、第２世代の分子を作製するために、変化させることができる。このような変化は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子もしくは受容体上の結合部位等の構造との相互作用結合能力の目立った損失なしに、タンパク質の既定のアミノ酸の置換を企図する。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能力および性質であるため、あるアミノ酸置換が、タンパク質配列およびその基本的なＤＮＡコード配列においてなされ、それでもなお、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、種々の変更が、遺伝子のＤＮＡ配列において、以下に記載のように、それらの生物学的有用性または活性の目立った損失なしに、なされてもよい。
【０１５１】
このような変化を加える上で、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。アミノ酸の相対的な疎水性親水性の特徴は、次に、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、および抗原等の、他の分子とのタンパク質の相互作用を画定する、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷特性に基づいて、疎水性親水性指標を割り当てられている、ことが受け入れられている。（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７（１）：１０５−１３２，１９８２、参照により本明細書に組み込まれる）。一般的に、アミノ酸は、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する、他のアミノ酸によって置換することができ、依然として、類似の生物学的活性を有するタンパク質をもたらすことができる、すなわち、依然として生物学的な機能的に同等のタンパク質を得ることができる。
【０１５２】
さらに、同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて、効果的に行うことができる。米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最大の局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって左右されるように、タンパク質の生物学的特性と相関することについて述べ、参照により本明細書に組み込まれる。このように、アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸と置換することができ、依然として、生物学的に同等および免疫学的に同等のタンパク質を得ることができる。
【０１５３】
本発明との関連において使用可能な例示的なアミノ酸置換には、限定されるものではないが、アルギニンおよびリジン、グルタミンおよびアスパラギン酸塩、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンの交換が含まれる。タンパク質の二次構造を変化させながら、生物学的活性のいくらかまたは全てを保持する必要性を考慮する他のこのような置換は、当業者には周知であろう。
【０１５４】
本発明によるポリペプチドの調製のために企図される他の種類の改変体は、ペプチド模倣体の使用である。模倣体は、タンパク質二次構造の要素を模倣する、ペプチド含有分子である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ”  ｉｎ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，Ｐｅｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたい。ペプチド模倣体の使用の背後にある基本的な根拠は、タンパク質のペプチド骨格が、主として、抗体または抗原のもの等の分子相互作用を促進するような方法で、アミノ酸側鎖を配向するために存在することである。ペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子相互作用を可能にすることが予想される。上述の原理と併せて、これらの原理を使用して、リソソームスルファターゼ酵素の天然の特性を多数有するが、変化され、さらに改善された特徴を有する、第２世代の分子を設計することができる。
リソソームスルファターゼ酵素の修飾されたグリコシル化
【０１５５】
親ポリペプチドに対して、修飾されたグリコシル化パターン、例えば、１つ以上の炭水化物分の欠失、および／または天然のポリペプチド内に存在しない１つ以上のグリコシル化部分の付加を有する、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の改変体もまた生成することができる。
【０１５６】
グリコシル化は、典型的に、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合のための認識配列である。ポリペプチド内のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作製する。したがって、Ｎ結合型グリコシル化部位は、これらのトリペプチド配列の１つ以上を含有するように、アミノ酸配列を変化させることによって、ポリペプチドに付加することができる。Ｏ結合型グリコシル化は、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用可能であるが、最も一般的にはセリンまたはトレオニンである、ヒドロキシアミノ酸への結合を指す。Ｏ結合型グリコシル化部位は、１つ以上のセリンまたはトレオニン残基を、元のポリペプチド配列内に挿入すること、またはそれらに置換することによって、付加することができる。
ドメインスイッチング
【０１５７】
リソソームスルファターゼ酵素タンパク質の種々の部分は、相当な量の配列相同性を有する。変異は、その機能を変化させることが可能な、リソソームスルファターゼ酵素ポリペプチド内に特定することができる。これらの研究は、少なくとも２つの原因のために、潜在的に重要である。第１に、それらは、この遺伝子の他の相同体、対立遺伝子改変体、および変異体が、関連種、例えば、ラット、ウサギ、サル、テナガザル、チンパンジー、類人猿、ヒヒ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、およびネコ等において存在する可能性があるという妥当な予想を提供する。これらの相同体、改変体、および変異体の単離に際して、他の分析と併せて、ある活性または機能ドメインを特定することができる。第２に、これは、上述のような分子のさらなる変異分析の出発点を提供する。この情報を生かすことが可能な１つの方法は、「ドメインスイッチング」におけるものである。
【０１５８】
ドメインスイッチングは、異なるが、関連するポリペプチドを使用する組み換え型分子の生成を伴う。例えば、リソソームスルファターゼ酵素、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼの配列を、別の起源からの類似のリソソームスルファターゼ酵素のもの、ならびにこれらのポリペプチドの変異体および対立遺伝子改変体と比較することによって、これらの分子の機能的に重要な領域について予測を行うことができる。次いで、リソソーム蓄積障害における酵素機能および効果に対するこれらの領域の臨界を判定する目的で、これらの分子の関連ドメインを切り替えることが可能である。これらの分子は、これらの「キメラ」が、天然の分子と区別することができる点において、さらなる価値を有することができ、一方で、同じ、またはさらに強化された機能を提供する可能性がある。
【０１５９】
現在特定されている多数のリソソームスルファターゼ酵素に基づいて、変異および二次構造におけるそれらの予測効果のさらなる分析が、この理解を増加させることになる。リソソームスルファターゼ酵素間でドメインを切り替える変異体は、これらの分子およびそれらが相互作用するポリペプチドの構造的／機能的関係についての有用な情報を提供することが企図される。
融合タンパク質
【０１６０】
上述の変異に加えて、本発明は、融合タンパク質として既知の、特殊な種類の挿入改変体の生成をさらに企図する。この分子は、一般的に、天然の分子の全てまたは大部分が、ＮまたはＣ末端において、第２のポリペプチドの全てまたは部分に結合されている。例えば、融合は、典型的に、異種宿主におけるタンパク質の組み換え発現を可能にするために、他の種からのリーダー配列を採用する。別の有用な融合には、融合タンパク質の精製を促進するために、抗体エピトープ等の免疫学的に活性なドメインの付加が含まれる。融合接点またはその付近における切断部位の包含は、精製後の外来ポリペプチドの除去を促進することになる。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞標的シグナル、または膜貫通領域等の機能ドメインの結合が含まれる。
【０１６１】
本発明に使用可能な種々の市販の融合タンパク質発現システムが存在する。特に有用なシステムには、限定されるものではないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、マルトース結合タンパク質システム（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）、ＦＬＡＧシステム（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、６ｘＨｉｓシステム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）が挙げられる。これらのシステムは、組み換え型ポリペプチドの抗原性能力に影響する可能性が低い、少数の追加アミノ酸のみを有する、組み換え型ポリペプチドを生成する能力がある。例えば、ＦＬＡＧシステムおよび６ｘＨｉｓシステムのいずれも、短い配列のみを付加し、いずれも、抗原性が乏しいことが既知であり、その本来の立体配座に対するポリペプチドの折りたたみに悪影響を与えることがない。有用であることが企図される別のＮ末端融合は、タンパク質またはペプチドのＮ末端領域におけるＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。このような融合は、タンパク質発現または活性において、有益な増加をもたらすことができる。
【０１６２】
特に有用な融合構築物は、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドまたはその断片が、リソソームスルファターゼ酵素融合構築物の免疫原性を強化するために、ハプテンに融合されるものであってもよい。これは、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素に対する抗体の生成において有用であり、タンパク質の検出を可能にすることができる。他の実施形態において、融合構築物は、特異的部位または細胞に対するリソソームスルファターゼ酵素関連の組成物の標的化を強化するように作製されてもよい。
【０１６３】
他の融合構築物は、所望の特性、例えば、リソソームスルファターゼ酵素を特定の器官、組織、または細胞の種類に標的化するためのモチーフを有する、異種ペプチドを含む。好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素に融合された、骨標的化ペプチド、例えば、６アスパラギン酸残基（６ｘＡｓｐまたは６Ｄ）を含む融合構築物は、酵素を骨の特定の部位に標的化する。
【０１６４】
所望の特性、例えば、血清半減期を延長するためのＩｇ定常領域または標的化のための抗体もしくはその断片を有する異種ポリペプチドを含む他の融合構築物もまた、企図される。他の融合システムは、所望のポリペプチドからの融合パートナーを切除することが望ましい場合に、ポリペプチドハイブリッドを生成する。一実施形態において、融合パートナーは、プロテアーゼに対する特異的な認識配列を含有するペプチド配列によって、組み換え型の高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドに結合される。好適な配列の例は、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）またはＦａｃｔｏｒ  Ｘａ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）によって認識されるものである。
誘導体
【０１６５】
上述のように、誘導体とは、例えば、限定されるものではないが、ユビキチン化、標識化（例えば、放射性核種もしくは種々の酵素を用いて）、ペグ化等の共有ポリマー結合（ポリエチレングリコールでの誘導体化）、およびオルニチン等のアミノ酸の化学合成による挿入または置換等の技術によって、化学的に修飾されたポリペプチドを指す。リソソームスルファターゼ酵素の誘導体はまた、治療剤としても有用であり、本発明の方法によって生成することができる。
【０１６６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本発明の方法によって生成されるリソソームスルファターゼ酵素に結合して、インビボにおけるより長い半減期を提供することができる。ＰＥＧ基は、任意の簡便な分子量のものであってもよく、直鎖または分枝鎖であってもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは、約２キロダルトン（「ｋＤａ」）〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲となる。ＰＥＧ基は、一般的に、ＰＥＧ部分の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）を通じて、タンパク質部分の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）への、アシル化または還元的アルキル化を介して、本発明のリソソームスルファターゼ酵素に結合される。目的のポリペプチドへのＰＥＧ部分の付加は、当該技術分野で既知の技術を使用して実行することができる。例えば、国際公開第ＷＯ９６／１１９５３号および米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい。
【０１６７】
リソソームスルファターゼ酵素ポリペプチドのＰＥＧとの連結反応は、通常、水相で起こり、逆相分析ＨＰＬＣによって容易に監視することができる。ＰＥＧ化されたペプチドは、分取ＨＰＬＣによって容易に精製可能であり、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、およびレーザー脱離質量分析によって特徴付けることができる。
標識
【０１６８】
幾つかの実施形態において、治療的リソソームスルファターゼ酵素は、その検出を促進するために、標識化される。「標識」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的方法によって検出可能な組成物である。例えば、本発明での使用に好適な標識には、限定されるものではないが、放射性標識（例えば、３２Ｐ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで広く使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに例えば、放射性標識をハプテンもしくはペプチドに組み込むことによって検出できるように作製されるか、またはハプテンもしくはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用可能であるタンパク質が挙げられる。
【０１６９】
本発明における使用に好適な標識の例には、限定されるものではないが、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ローダミン等）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで広く使用されるその他のもの）、ならびにコロイド金、色ガラス、またはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）の比色分析標識が挙げられる。
【０１７０】
標識は、当該技術分野で周知の方法によって、直接的または間接的に、リソソームスルファターゼ酵素の所望の構成成分に連結することができる。好ましくは、一実施形態において、標識は、本発明による活性剤の共役のため、イソシアネート試薬を使用して、リソソームスルファターゼ酵素に共有結合される。本発明の一態様において、本発明の二官能性イソシアネート試薬を使用して、標識をリソソームスルファターゼ酵素に共役し、そこに結合される活性剤なしに、標識リソソームスルファターゼ酵素共役体を形成することができる。標的リソソームスルファターゼ酵素共役体は、本発明による標識化された共役体の中間体として使用することができ、または、リソソームスルファターゼ酵素共役体の検出に使用されてもよい。上記のように、幅広い種類の標識を使用することができ、標識の選択は、必要とされる感受性、リソソームスルファターゼ酵素の所望の構成成分との共役の容易さ、安定性要件、利用可能な器具、および処分既定に依存する。非放射性標識は、しばしば、間接的手段によって付加される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、リソソームスルファターゼ酵素に共有結合される。リガンドは、次いで、本質的に検出可能であるか、または検出可能酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物等の、シグナルシステムに共有結合するかのいずれかである、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合する。
【０１７１】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素はまた、例えば、酵素またはフルオロフォアとの共役によって、シグナル生成化合物に直接的に共役されてもよい。標識として使用するために好適な酵素には、限定されるものではないが、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ、またはオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼが挙げられる。標識としての使用に好適な蛍光化合物、すなわち、フルオロフォアには、限定されるものではないが、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられる。好適なフルオロフォアのさらなる例には、限定されるものではないが、エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロリドエリスロセイン（ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｓｃｅｉｎ）、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド等が挙げられる。標識としての使用に好適な化学発光化合物には、限定されるものではないが、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが挙げられる。本発明の方法において使用可能な種々の標識化またはシグナル生成システム評価については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０１７２】
標識を検出するための方法は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性である場合、検出方法には、シンチレーション計数器またはオートラジオグラフィーに見られるような感光性フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、蛍光色素を適切な波長の光で励起し、結果として生じる蛍光を検出することによって、検出することができる。蛍光は、電荷結合装置（ＣＣＤ）または光電子倍増管等の電子検出器の使用によって、視覚的に検出されてもよい。同様に、酵素標識は、適切な基質を酵素に提供し、結果として生じる反応生成物を検出することによって、検出することができる。比色分析または化学発光標識は、単純に、標識と関連する色を観察することによって検出することができる。本発明の方法における使用に好適な他の標識化および検出システムは、当業者には容易に明らかであろう。このような標識化された調整因子およびリガンドは、疾患または健康状態の診断に使用することができる。
【０１７３】
好ましい実施形態において、本方法は、エンドソームの輸送に欠損を有する細胞株から、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を生成するステップを含む。特に好ましい実施形態において、本方法は、ＣＨＯ細胞株Ｇ７１またはその誘導体から、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を生成するステップを含む。例えば、限定されるものではないが、ＧＡＬＮＳ等のリソソームスルファターゼ酵素の生成には、（ａ）組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、および組み換え型ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）を共発現する、Ｇ７１またはＧ７１誘導体の細胞株を成長させるステップ、（ｂ）ヒトリソソームスルファターゼ酵素およびＳＵＭＦ１を共発現する細胞株を培養するステップ、ならびに（ｃ）ヒトリソソームスルファターゼ酵素およびＳＵＭＦ１を共発現する細胞株を、リソソームスルファターゼ酵素の生成のためのバイオリアクターにスケールアップするステップが含まれる。好ましい実施形態において、ヒトリソソームスルファターゼ酵素、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、およびヒトＳＵＭＦ１のｃＤＮＡは、基本的に本明細書において以下に記載されるように、哺乳動物の発現ベクターにサブクローニングされる。
【０１７４】
細胞株の成長のために、Ｇ７１または無血清懸濁培養液内での増殖のために適合されたＧ７１クローンであるＧ７１Ｓを、ヒトＧＡＬＮＳの哺乳動物発現ベクター、ヒトＳＵＭＦ１の哺乳動物発現ベクター、および選択可能マーカー遺伝子でコトランスフェクトし、安定した形質転換体を選択した。安定なトランスフェクタントの１回目のサブクローニング後、細胞株を、蛍光基質を使用して選択し、具体的に指定した。Ｇ７１またはＧ７１Ｓ細胞株を、それぞれ、微小担体を有するスピナーまたは懸濁培養液において、細胞特異的生産性（生成物のｐｇ／細胞）を分析した。ヒトＧＡＬＮＳの最良生成細胞株を特定し、前臨床物質の生成のため、バイオリアクターにスケールアップした。
【０１７５】
別の実施形態において、本発明は、天然基質を分解する組み換え型ヒトリソソーム酵素の活性を測定するための細胞に基づくアッセイを提供する。本方法は、（ａ）単離した、リソソーム酵素が欠損しているヒト細胞を、リソソーム酵素の天然基質が蓄積する条件下で、培養することと、（ｂ）細胞をリソソーム酵素と接触させることと、（ｃ）細胞を溶解することと、（ｄ）細胞溶解産物に、（ｉ）天然基質に対して特異的であり、（ｉｉ）天然基質から小オリゴ糖を切断する、酵素を添加することと、（ｅ）小オリゴ糖を検出可能部分で標識化することと、（ｆ）任意で、標識化した小オリゴ糖を分離することと、（ｇ）標識化した小オリゴ糖を検出することと、（ｈ）天然基質を分解する、リソソーム酵素の活性を、（ｉ）リソソーム酵素と接触した細胞に由来する標識化した小オリゴ糖の量を、（ｉｉ）リソソーム酵素と接触していない細胞に由来する標識化された小オリゴ糖の量と、比較することによって検出することと、を含み、（ｈ）（ｉｉ）と比較して、（ｈ）（ｉ）における減少は、天然基質を分解する、リソソーム酵素の活性を示す。一実施形態において、小オリゴ糖は、単糖、二糖、または三糖である。関連する実施形態において、小オリゴ糖は、二糖である。
【０１７６】
幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）、およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）である。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）である。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素は、β−ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）である。
【０１７７】
細胞に基づくアッセイに使用可能である、好適なヒト細胞には、試験されるリソソームが欠損し、その結果、リソソーム酵素に対する天然基質が蓄積する可能性のある、任意のヒト細胞が含まれる。例えば、活性における完全（１００％）または部分的な欠損、例えば、活性における３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％の減少を、天然に示す細胞が使用可能である。低下した活性を有する変異酵素を発現する細胞、またはリソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症を患う患者に由来する細胞が、使用可能である。例えば、変異体を、コード遺伝子もしくはそのプロモーター、または他の調節領域に導入することを通じて、リソソーム酵素活性をノックアウトまたは低下させるように組み換え変化させた細胞を、使用してもよい。リソソーム酵素活性を低下させるように処理された細胞、例えば、酵素発現を低下させるためにアンチセンスまたはＲＮＡｉで処理された細胞を、使用してもよい。
【０１７８】
小オリゴ糖を、炭化水素から切断（消化）し、リソソーム酵素の天然基質に「特異的な」（すなわち、主に消化する）、好適な酵素は、当業者によって選択することができる。例えば、ＧＡＬＮＳまたはＧＬＢ１（ケラタン硫酸を分解する酵素）の活性の検出のために、ステップ（ｄ）の酵素は、ケラタナーゼＩＩまたは主にケラタン硫酸に作用する任意の酵素であってもよい。別の例として、ＩＤＵ、ＡＲＳＢ、ＩＤＳ、またはＧＵＳＢ（デルマタン硫酸を分解する酵素）の検出のために、ステップ（ｄ）の酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣ、または主にデルマタン硫酸に作用する任意の酵素であってもよい。別の例として、ＩＤＵ、ＩＤＳ、ＳＧＨＳ、Ｇ６Ｓ、またはＧＵＳＢ（ヘパラン硫酸塩を分解する酵素）の検出のために、ステップ（ｄ）の酵素は、ヘパラナーゼＩもしくはヘパラナーゼＩＩ、または両方であってもよい。さらに別の例として、ＧＡＡ（グリコーゲンを分解する酵素）の検出のために、ステップ（ｄ）の酵素は、α−アミラーゼ、または主にグリコーゲンに作用する任意の酵素であってもよい。
【０１７９】
この細胞に基づく方法は、リソソーム酵素活性の検出において、高い感受性を可能にする。幾つかの実施形態において、リソソーム酵素活性は、リソソーム酵素の濃度が、約１０ｎＭ、または約５ｎＭ、または約１ｎＭ、または約０．７５ｎＭ、または約０．５ｎＭ、または約０．２５ｎＭ、または約０．１ｎＭ、または約０．０５ｎＭ、または約０．０１ｎＭ、または約０．００５ｎＭ、または約１ｐＭ、または約０．５ｐＭ程度の低さである場合に、検出可能である。
ＩＩＩ．  リソソームスルファターゼ酵素の精製
【０１８０】
組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを含有するバイオリアクター物質を、０．２μｍで滅菌濾過し、４℃で保管した。バイオリアクター物質は、直接的に捕捉カラムに充填したか、または捕捉カラムへの充填前に、限外濾過によって１０〜２０倍に濃縮したかのいずれかである。バイオリアクター物質または濃縮したバイオリアクター物質を、ｐＨ４．５にｐＨ調節し、次いで、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに充填し、２０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５、および２０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で連続して洗浄し、２０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶出した。Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出液を、次にＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐに充填し、２０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、および２０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５で連続して洗浄し、２０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５０〜３５０ｍＭ  ＮａＣｌ勾配、ｐＨ５．５で溶出した。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ溶出液を、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ５．５に製剤化した。
【０１８１】
あるいは、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを含有するバイオリアクター物質を、捕捉カラムへの充填前に、限外濾過によって２０倍に濃縮した。濃縮したバイオリアクター物質を、ｐＨ４．５にｐＨ調節し、濾過し、次いで、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムに充填し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５、および１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で連続して洗浄し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で溶出した。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラム溶出液を、次いで５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に調節し、Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラムに充填し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．０で洗浄し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、９０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．０で溶出した。Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラム溶出液を、低ｐＨウイルス不活性化のためにｐＨ３．５に調節し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０に調節し、次いでＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムに充填し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で洗浄し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、０．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で溶出した。ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ溶出液を、２０ｍＭ  酢酸塩、１ｍＭ  リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５において限外濾過および透析濾過し、次いで、２０ｍＭ  酢酸塩、１ｍＭ  リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５に製剤化した。
【０１８２】
あるいは、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを含有するバイオリアクター物質を、限外濾過／透析濾過によって濾過して２０倍に濃縮し、次いで、捕捉カラムへの充填前に、活性炭を通して濾過した。濃縮したバイオリアクター物質を、伝導率約５５±５ｍＳ／ｃｍでＺｎキレート化Ｓｈｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラムに充填し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、および１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）で連続して洗浄し、次いで、７０％の緩衝液Ａと、３０％の１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０（緩衝液Ｂ）との混合液で溶出した。Ｚｎキレート化Ｓｈｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラム溶出液を、伝導率約６．０±０．５ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ７．０に調節し、潜在的なウイルス除去のためにＭｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルタに充填した。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液を、ｐＨ４．５±０．１に調節し、ＣＵＮＯ  ６０ＺＡフィルタ、続いて０．２μｍの直列フィルタを通して濾過し、次いでＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ（Ｍ）カラムに充填し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５、および８０％の緩衝液Ａ（１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、ｐＨ５．０）と２０％の緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）との混合液で連続して洗浄し、直線勾配２０％〜７５％の緩衝液Ｂ（８０％〜２５％の緩衝液Ａ中）で溶出した。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラム溶出液を、次いで、低ｐＨウイルス不活性化のために、０．２Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．４の添加により、ｐＨ３．５±０．１に調節した。低ｐＨウイルス不活性化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラム溶出液を、０．２Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０の添加により２Ｍ  ＮａＣｌおよびｐＨ５．０に調節し、次いで、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムに充填し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０（緩衝液Ａ）で洗浄し、続いて、３５％の緩衝液Ａと６５％の緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、ｐＨ５．０）の混合液で溶出した。ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ溶出液を、緩衝液交換して、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭアルギニンＨＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ５．４にし、任意で、ＧＡＬＮＳの最終濃度３ｍｇ／ｍＬに調節した。緩衝液交換および濃度調節したＧＡＬＮＳを、ウイルスフィルタ（ＤＶ２０）およびＤＮＡフィルタ（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ）を通して濾過し、あらゆる残存ウイルスおよびＤＮＡを除去した。Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０またはＰＳ２０としても既知）を、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）まで添加し、原薬（ＢＤＳ）を得た。ＢＤＳは、２〜８℃または冷凍で保管した。
【０１８３】
あるいは、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを含有するバイオリアクター物質を、濾過し、限外濾過／透析濾過によって２０倍に濃縮し、次いで、捕捉カラムへの充填前に、活性炭を通して濾過した。濃縮したバイオリアクター物質を、伝導率約５０±５ｍＳ／ｃｍでＺｎキレート化Ｓｈｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラムに充填し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、および１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）で連続して洗浄し、次いで、７０％の緩衝液Ａと、３０％の１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０（緩衝液Ｂ）との混合液で溶出した。Ｚｎキレート化Ｓｈｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラム溶出液を、１．７５Ｍ酢酸塩、ｐＨ４．０でｐＨ４．５±０．１に調節し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＯＨＣフィルタを通して濾過し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、ｐＨ  ４．５と３０：７０（ｖ／ｖ）の比率で混合し、次いで、伝導率＜７ｍＳ／ｃｍでＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ（Ｍ）カラムに充填し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５、および８０％の緩衝液Ａ（１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、ｐＨ５．０）と２０％の緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）との混合液で、連続して洗浄し、直線勾配２０％〜７５％の緩衝液Ｂ（８０％〜２５％の緩衝液Ａ中）で溶出した。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラム溶出液を、次いで、低ｐＨウイルス不活性化のために、０．４Ｍ  クエン酸緩衝液、ｐＨ３．４の添加により、ｐＨ３．５±０．１に調節した。低ｐＨウイルス不活性化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラム溶出液を、０．４Ｍ  クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０の添加により、２Ｍ  ＮａＣｌおよびｐＨ５．０５±０．１に調節し、５Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、ｐＨ５と混合して、２Ｍ  ＮａＣｌの濃度を達成し、次いで、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムに充填し、１０ｍＭ  酢酸塩／リン酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．４±０．１および１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０（緩衝液Ａ）で、連続して洗浄し、続いて、直線勾配１００％〜３２％の緩衝液Ａおよび０％〜６８％の緩衝液Ｂ（１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、ｐＨ５．０）、続いて３２％の緩衝液Ａと６８％緩衝液Ｂの混合液で、溶出した。ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ溶出液を、緩衝液交換して、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３０ｍＭアルギニンＨＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ５．４にし、任意で、ＧＡＬＮＳの最終濃度３ｍｇ／ｍＬに調節した。緩衝液交換および濃度調節したＧＡＬＮＳを、ウイルスフィルタ（ＤＶ２０）およびＤＮＡフィルタ（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ）を通して濾過し、あらゆる残存ウイルスおよびＤＮＡを除去した。Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０またはＰＳ２０としても既知）を、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）まで添加し、原薬（ＢＤＳ）を得た。ＢＤＳは、２〜８℃または冷凍で保管した。
【０１８４】
組み換え型ヒトＧＡＬＮＳの精製は、以下に詳細に記載され、上述のプロトコルから修正された手順に従う組み換え型ヒトＧＡＬＮＳの精製は、以下に詳細に記載される。
【０１８５】
組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素は、実施例ＩＩＩに記載のように、Ｇ７１Ｓ細胞において発現され、実施例Ｖまたは実施例ＶＩに記載のように精製した。本発明の精製された組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを、他の実証されたＧＡＬＮＳの調製物と比較することができる。Ｍａｓｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０：９６５−９７０，１９９１は、ヒト胎盤由来のＧＡＬＮＳの精製および特徴付けについて記載した。精製された酵素は、１２０ｋＤａの分子量を有することがわかっており、４０ｋＤａおよび１５ｋＤａのポリペプチドから構成され、後者は、糖タンパク質であることが示されている。したがって、ＭａｓｕｅらのＧＡＬＮＳ酵素は、図５に描写される、プロセッシング形態に相当すると見られる。Ｂｉｅｌｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７９：５１５−５２０，１９９１は、ヒト肝臓由来のＧＡＬＮＳの精製および特徴付けについて記載した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した際、酵素は、非還元条件で７０ｋＤａの分子量を有し、還元条件下で５７ｋＤａ、３９ｋＤａ、または１９ｋＤａの分子量を有した。Ｂｉｅｌｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３１１：３３３−３３９，１９９５は、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来の組み換え型ヒトＧＡＬＮＳの精製および特徴付について記載した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の精製された酵素は、非還元条件下で、５８〜６０ｋＤａの分子量を有し、還元条件下で、５５〜５７ｋＤａ、３９ｋＤａ、および３８ｋＤａの分子量を有することがわかった。したがって、ＢｉｅｌｉｃｋｉらのＧＡＬＮＳ酵素は、酵素のプレプロセッシング（前駆体）形態と、図５に描写されるプロセッシング形態との混合物に相当すると見られる。対照的に、本発明の組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素は、ほぼ完全に酵素の前駆体形態から構成されるか（図９および図１２を参照されたい）、または大部分が（すなわち、少なくとも約８５％）酵素の前駆体形態から構成される（図１０を参照されたい）。
ＩＶ．  リソソームスルファターゼ酵素およびリソソーム蓄積症
【０１８６】
リソソームスルファターゼ酵素は、全長酵素、または酵素の治療的または生物学的活性（例えば、スルファターゼ活性）の少なくとも実質的な量（例えば、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、およびより好ましくは少なくとも約９０％）、実質的に全て、または全てを保持する、そのあらゆる断片、変異体、改変体、もしくは誘導体である。
【０１８７】
幾つかの実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、発現もしくは生成されない場合、または発現もしくは生成が実質的に低下する場合、限定されるものではないが、リソソーム蓄積症を含む疾患を引き起こす可能性があるものである。幾つかの実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、発現もしくは生成されない場合、または発現もしくは生成が実質的に低下する場合、限定されるものではないが、リソソーム蓄積症を含む、疾患を引き起こすわけではないが、その欠乏または低下した発現もしくは生成が、その疾患と関連するものである。好ましくは、リソソームスルファターゼ酵素は、ヒトに由来するか、またはヒトから得られる。
【０１８８】
好ましくは、リソソーム蓄積症の治療において、リソソームスルファターゼ酵素は、発現もしくは生成されない場合、または発現もしくは生成が実質的に低下する場合、リソソーム蓄積症を引き起こす可能性のある細胞内に見出される酵素である。あるいは、リソソーム蓄積症の治療において、リソソームスルファターゼ酵素は、その欠乏または実質的に低下した発現または生成は、それ自体は疾患を引き起こすわけではないが、その欠乏または実質的に低下した発現もしくは生成が疾患と関連する、酵素である。好ましくは、リソソームスルファターゼ酵素は、ヒトに由来するか、またはヒトから得られる。
【０１８９】
好ましくは、酵素は、リソソームスルファターゼ酵素、例えば、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００４７８（アイソフォームａ）、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０７８８９７（アイソフォームｂ）、および他の改変体）、アリールスルファターゼＢ／Ｎ−アセチルグルコサミン４−スルファターゼ（ＡＲＳＢ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１５８４８）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１９３（アイソフォームａ）、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６１１４（アイソフォームｂ））、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１９０）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２０６７）、ならびにガラクトース６−スルファターゼ／Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５０３）等である。リソソーム蓄積症、およびそれらにおいて欠損している、治療剤として有用なリソソームスルファターゼ酵素の表が、次に続く。
【化１】
0006030553.tif 000002
【０１９０】
好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、エンドソーム酸性化が欠損した細胞株によって生成される、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素である。より好ましい実施形態において、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、「定義」において明記したように、活性であり、高レベルのリン酸化されたオリゴ糖を有する。最も好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、高度にリン酸化された活性な組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）である。
【０１９１】
したがって、本発明の方法を使用して治療または予防可能なリソソーム蓄積症には、限定されるものではないが、異染性白質ジストロフィーまたはＭＬＤ、マロトーラミー症候群またはＭＰＳ  ＶＩ、ハンター症候群またはＭＰＳ  ＩＩ、サンフィリポＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＩＩａ、サンフィリポＤ症候群またはＭＰＳ  ＩＩＩｄ、およびモルキオＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＶａが挙げられる。特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、その欠損が、モルキオＡ症候群またはＭＰＳ  ＩＶａを引き起こすようなものである。別の特に好ましい実施形態において、リソソームスルファターゼ酵素は、その欠損が、多発性スルファターゼ欠損症またはＭＳＤ等のヒトリソソーム蓄積症と関連するようなものである。
【０１９２】
したがって、上記の表によると、各疾患に対して、リソソームスルファターゼ酵素は、好ましくは、疾患において欠損している特定の活性なリソソームスルファターゼ酵素を含む。例えば、ＭＰＳ  ＩＩに関する方法のために、好ましい酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＡに関する方法のために、好ましい酵素は、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＤに関する方法のために、好ましい酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＶＡに関する方法のために、好ましい酵素は、ガラクトース６−スルファターゼ／Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼである。ＭＰＳＶＩに関する方法のために、好ましい酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼである。異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）に関する方法のために、好ましい酵素は、アリールスルファターゼＡである。多種スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）に関する方法のために、酵素は、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ／Ｎ−アセチルグルコサミン４−スルファターゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ、またはガラクトース６−スルファターゼ／Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼであってもよく、好ましい酵素は、ガラクトース６−スルファターゼ／Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼである。
Ｖ．ムコ多糖症ＩＶＡ型（モルキオ症候群、ＭＰＳ  ＩＶＡ）
【０１９３】
ムコ多糖症ＩＶＡ型（モルキオ症候群、ＭＰＳ  ＩＶａ）は、ムコ多糖類蓄積症の群に属する、遺伝性の常染色体劣性疾患である。モルキオ症候群は、ケラタン硫酸（ＫＳ）およびコンドロイチン−６−硫酸（Ｃ６Ｓ）の、２つのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に必要とされるリソソーム酵素の欠損により引き起こされる。具体的には、ＭＰＳ  ＩＶａは、酵素Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の欠乏および尿中のＫＳの排出によって特徴付けられる。ＧＡＬＮＳの不足は、骨格組織の主要構成要素である、硝子軟骨に異常に大量のムコ多糖類の蓄積をもたらす。全ての患者は、全身性の骨格形成異常を有する。他の症状は、患者によって重症度が異なり、とりわけ、聴力損失、白内障、脊髄不安定、心臓弁疾患、および呼吸器の問題が挙げられる。
【０１９４】
ＧＡＬＮＳは、ＫＳのガラクトース−６−硫酸およびＣ６ＳのＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸の硫酸エステル結合を加水分解する。ヒトＧＡＬＮＳは、潜在的なアスパラギン結合されたグリコシル化部位を２つだけ有する、５５〜６０ｋＤａの前駆体タンパク質として発現される。マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）は、ＧＡＬＮＳ分子上に存在するオリゴ糖の一部である。Ｍ６Ｐは、リソソーム細胞表面の受容体によって認識され、その結果、ＧＡＬＮＳ効果的な取り込みに不可欠である。
【０１９５】
全てのスルファターゼと同様に、ＧＡＬＮＳは、活性を得るために、スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）遺伝子によってコードされるホルミルグリシン活性化酵素（ＦＧＥ）によって、プロセッシングされる必要がある。活性部位のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への翻訳後修飾を伴う、この活性化ステップのために、組み換え型スルファターゼの過剰発現は、低い比活性を有するスルファターゼ酵素（すなわち、活性化されたスルファターゼ酵素と活性化されていないスルファターゼ酵素との混合物）、および低い生成力価（すなわち、活性化されていないスルファターゼの分解および／または非分泌）の両方の生成をもたらす可能性がある。
【０１９６】
本発明の目的は、酵素Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼの欠損によって引き起こされるか、またはそれと関連する、モルキオ症候群および他の疾患、例えば、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）の治療に有用な、高度にリン酸化された活性なヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ酵素を提供することである。このような高度にリン酸化された活性なヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ酵素は、ＫＳおよびＣ６Ｓが中に蓄積する組織に局所化する能力を有し、効果的な取り込みに適切なＭ６Ｐレベルを有し、酵素活性のために十分に高いＦＧｌｙの割合を有し、比較的高い生成レベルを有する。
【０１９７】
本明細書に記載の本発明の方法は、他のリソソームスルファターゼ酵素、例えば、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ／Ｎ−アセチルグルコサミン４−スルファターゼ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、およびＮ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）の生成に適用可能であり、それらの欠損によって、引き起こされ、または特徴づけられるリソソーム蓄積症の治療に有用である、ことが理解されるべきである。
ＶＩ．  薬学的組成物および投与
【０１９８】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、種々の経路によって投与することができる。経口製剤については、リソソームスルファターゼ酵素は、単独でか、または錠剤、粉末、顆粒、またはカプセルを作製するための適切な添加剤、例えば、従来の添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、またはジャガイモデンプンと、結合剤、例えば、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチンと、崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムと、潤滑剤、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムと、ならびに所望であれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、および香味剤との組み合わせで使用することができる。
【０１９９】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、水性または非水性溶媒、例えば、植物性油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール中に、所望であれば、従来の添加剤、例えば、可溶化剤、等張剤、乳化剤、安定剤、および保存剤と共に、それらを溶解、懸濁、または乳化させることによって、注入用の製剤に製剤化することができる。
【０２００】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、吸入を介して投与される、エアロゾル製剤に利用することができる。本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容可能な噴霧剤に、製剤化することができる。
【０２０１】
さらに、本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、乳化基剤または水溶性基剤等の種々の基剤と混合することによって、坐薬にすることができる。本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、坐薬を介して直腸に投与することができる。坐薬は、体温で融解しながらも、室温では依然として凝固状態である、ココアバター、カーボワックス、およびポリエチレングリコール等のビヒクルを含むことができる。
【０２０２】
経口または直腸投与のための、本発明のリソソームスルファターゼ酵素の単位投与形態、例えば、シロップ、エリキシル、および懸濁液を提供することができ、各投与量単位、例えば、茶さじ、大さじ、錠剤、または坐薬は、活性剤を含有する所定量のリソソームスルファターゼ酵素を含有する。同様に、注入または静脈内投与のための単位投与形態は、滅菌水、生理食塩水、または別の薬学的に許容される担体中の溶液として、リソソームスルファターゼ酵素を含むことができる。
【０２０３】
特定の使用において、本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、従来の薬学的調合技術に従って、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤との密接な混合物において、活性成分として、合わせることができる。
担体、希釈剤、または賦形剤は、例えば、経口または非経口（静脈内を含む）投与に望ましい製剤の好ましい形態に応じて、幅広い種類の形態を取ることができる。
経口投与形態のためのリソソームスルファターゼ酵素組成物の調製において、通常の薬学的媒体のうちの任意のもの、例えば、経口液体製剤、例えば、懸濁液、エリキシル、および溶液の場合、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤等、または、経口固体製剤、例えば、粉末、硬もしくは軟カプセル、および錠剤の場合、デンプン、糖類、微小結晶セルロース等の担体、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等を採用することができ、経口固体製剤が、経口液体製剤よりも好ましい。
【０２０４】
本発明は、本明細書に記載のＧＡＬＮＳ酵素調製物の任意の製剤であって、任意で約０．１〜５ｍｇ／ｍＬ（または０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ）のタンパク質濃度および任意で約５〜５．８のｐＨであり、（ｉ）前記ＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化を低減するのに効果的な量のリン酸緩衝液、および（ｉｉ）アミノ酸塩、アミノ酸緩衝液、界面活性剤、およびポリオールからなる群から選択される、１つ以上の安定剤の安定量を含む、製剤を提供する。幾つかの実施形態において、製剤は、第２の緩衝剤を含んでもよい。ある実施形態において、製剤は、本明細書に記載の組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素調製物の任意のもの、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度のリン酸緩衝液、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度の酢酸緩衝液、およびタンパク質凝集を低減させる安定剤を含む。幾つかの実施形態において、製剤は、アルギニンまたはヒスチジンの塩または緩衝液、および任意で非イオン性界面活性剤、ならびに任意で三価以上のポリオール（糖アルコール）を含む。具体的な実施形態において、製剤は、アルギニン塩または緩衝液、ポリソルベート、任意でポリソルベート２０、およびソルビトールを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、リン酸緩衝液は、ＮａＨ２ＰＯ４であってもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、酢酸緩衝液は、ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃであってもよい。
【０２０５】
第２の緩衝剤は、所望の範囲内にｐＨを維持するために好適な任意の薬剤であってもよい。好適な緩衝剤には、トリス、クエン酸、コハク酸、酢酸、グルコン酸、または他の有機酸の緩衝液が含まれる。幾つかの実施形態において、安定剤は、アミノ酸塩または緩衝液、任意でアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、またはグルタミン酸の塩または緩衝液である。幾つかの実施形態において、安定剤は、界面活性剤、任意で非イオン性界面活性剤である。好適な界面活性剤には、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０またはポリソルベート８０、ポロキサマー、例えば、ポロキサマー１８８または１８４、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシプロピレン誘導体、ナトリウムモノラウレート、およびＳＤＳが挙げられる。既知の非イオン性界面活性剤の非限定的な例には、アルキレンオキシド、一般的にエチレンオキシド、一般的に６〜３０個のエチレンオキシド基を有する、脂肪族の、第１級もしくは第２級の直鎖もしくは分枝鎖のアルコールまたはフェノールが挙げられる。他の既知の非イオン性界面活性剤には、モノまたはジアルキルアルカノールアミド、アルキルポリグリコシド、およびポリヒドロキシ脂肪酸アミドが挙げられる。既知の陰イオン性界面活性剤の非限定的な例には、アルキル硫酸、アルキルエーテル硫酸、アルカリルスルホン酸、アルキルコハク酸、アルキルスルホコハク酸、Ｎ−アルコイルサルコシネート（Ｎ−ａｌｋｏｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）、アルキルリン酸、アルキルエーテルリン酸、アルキルエーテルカルボン酸、およびα−オレフィンスルホン酸、のナトリウム塩、アンモニウム塩、ならびにモノ、ジ、およびトリエタノールアミン塩が挙げられる。アルキル基は、一般的に、８〜１８個の炭素原子を含有し、不飽和であってもよい。アルキルエーテル硫酸、アルキルエーテルリン酸、およびアルキルエーテルカルボン酸は、１つの分子当たり、１〜１０個のエチレンオキシドまたはプロピレンオキシド単位を含有することができ、好ましくは、１つの分子当たり、２〜３個のエチレンオキシドを含有する。既知の陰イオン性界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウムまたはアンモニウム、およびラウリルエーテル硫酸ナトリウムまたはアンモニウムが挙げられる。既知の両性界面活性剤の非限定的な例には、アルキルアミンオキシド、アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルスルホベタイン、アルキルグリシネート、アルキルカルボキシグリシネート、アルキルアンホプロピオネート、アルキルアミドプロピルヒドロキシスルタイン、アシルタウリン、およびアシルグルタメートが挙げられ、アルキルおよびアシル基は、８〜１８個の炭素原子を有する。
【０２０６】
幾つかの実施形態において、安定剤は、ポリオールまたは糖類、好ましくは、三価以上の糖アルコールである。安定なポリオールには、エリトリトール、アラビトール、マルチトール、セロビイトール（ｃｅｌｌｏｂｉｉｔｏｌ）、ラクチトール、マンニトール、トレイトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール、およびグリセリンが挙げられる。既知のポリオールにはまた、ラクトース、トレハロース、およびスタキオース由来のアルコールが含まれる。既知の非還元糖には、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、およびラフィノースが含まれる。既知の糖にはまた、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース、二糖、例えばラクトース、マルトース、スクロース、三糖、例えばラフィノース、および多糖、例えばデキストランが含まれる。
【０２０７】
本発明はまた、精製された組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化を防ぐ方法であって、前記ＧＡＬＮＳ酵素と、脱リン酸化を低減するために効果的な量のリン酸緩衝液、任意で最終濃度約２５ｍＭ〜７５ｍＭのリン酸緩衝液と混合することを含む、方法を提供する。幾つかの実施形態において、精製された組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素はまた、上述のあらゆる薬剤を含む、第２の緩衝剤と混合される。幾つかの実施形態において、酵素は、アミノ酸塩、アミノ酸緩衝液、界面活性剤、およびポリオールからなる群から選択される、１つ以上の安定剤の安定量と混合される。例示的な実施形態において、脱リン酸化の量は、例えば、室温（例えば、２５℃）での１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月の保管後に試験した場合、１ｍＭのリン酸緩衝液中の同じ酵素の製剤と比較して、減少する。具体的な実施形態において、加速安定性試験は、４０℃で、このような期間保管した後に実行される。
【０２０８】
ある実施形態において、ＧＡＬＮＳ製剤における脱リン酸化の減少（１ｍＭリン酸緩衝液と比較して）は、少なくとも約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％以上であり得る。別の実施形態において、製剤中のＧＡＬＮＳにおけるビスリン酸化されたマンノース７（ＢＰＭ７）のレベルは、約２５％〜約４０％、または約３０％〜３５％である。
【０２０９】
前述の製剤または方法のいずれの実施形態においても、ＧＡＬＮＳ酵素は、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素であって、配列番号４のアミノ酸２７〜５２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、（ｉ）非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるとき、クマシーブルー染色により判定される、少なくとも約９５％の純度を有し、（ｉｉ）位置５３のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約８０％の変換を有し、（ｉｉｉ）単量体タンパク質鎖当たり、０．５〜０．８のビスリン酸化されたオリゴマンノース鎖を有し、前記ＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％が、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されるときのクマシーブルー染色、またはＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）によって判定される、前駆体形態にある、酵素であり得る。
【０２１０】
経皮投与経路に関して、薬物の経皮投与のための方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９８５）に開示される。真皮または皮膚パッチは、本発明のリソソームスルファターゼ酵素の経皮送達のための好ましい手段である。パッチは、好ましくは、リソソームスルファターゼ酵素の吸収を増加させるため、ＤＭＳＯ等の吸収増進剤を提供する。経皮的な薬物送達の他の方法は、米国特許第５，９６２，０１２号、同第６，２６１，５９５号、および同第６，２６１，５９５号に開示され、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１１】
薬学的に許容される賦形剤、例えば、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤は、市販で入手可能である。さらに、薬学的に許容される補助剤、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤、安定化剤、湿潤剤等もまた、市販入手可能である。
【０２１２】
これらの態様のそれぞれにおいて、リソソームスルファターゼ酵素組成物には、限定されるものではないが、経口、直腸、局所、非経口（皮下、筋肉内、および静脈内を含む）、肺（鼻腔もしくは口腔吸入）、または鼻腔内の投与に好適な組成物が含まれるが、いかなる場合においても、最も好適な経路は、治療される症状の性質および重症度、ならびに活性成分の性質に、部分的に依存することになる。例示的な投与経路は、経口および静脈経路である。リソソームスルファターゼ酵素組成物は、簡便に、単位投与形態において存在し、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。
【０２１３】
投与の容易さのため、錠剤およびカプセルが、最も有利な経口投与単位形態を代表であり、この場合、固体の薬学的担体が明らかに採用される。所望であれば、錠剤は、標準的な水性または非水性技術によりコーティングされてもよい。これらの組成物中の活性なリソソームスルファターゼ酵素の割合は、当然ながら、多様であり、簡便には、その単位の重量の約２パーセント〜約６０パーセントであってもよい。
【０２１４】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素組成物は、ウイルスのエンベロープもしくは小胞に封入または付加するか、あるいは細胞内に組み込んで投与することができる。小胞は、通常は球状であり、しばしば脂質である、ミセル粒子である。リポソームは、二分子層膜から形成される、小胞である。好適な小胞には、限定されるものではないが、単層の小胞および多重層の脂質小胞またはリポソームが挙げられる。このような小胞およびリポソームは、広範な脂質またはリン脂質化合物、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、糖脂質、ガングリオシド等から、例えば、米国特許第４，３９４，４４８号に記載のもの等、標準的な技術を使用して、作製することができる。このような小胞またはリポソームは、細胞内にリソソームスルファターゼ酵素を投与するため、および標的器官にリソソームスルファターゼ酵素を送達するために使用することができる。目的のリソソームスルファターゼ酵素の制御された放出はまた、封入を用いて達成することができる（例えば、米国特許第５，１８６，９４１号を参照されたい）。
【０２１５】
血流内、または好ましくは、少なくとも血液脳関門の外側で、リソソームスルファターゼ酵素組成物を希釈する、任意の投与経路が使用可能である。好ましくは、リソソームスルファターゼ酵素組成物は、末梢に、最も好ましくは、静脈内、または心臓カテーテルによって投与される。頸静脈内および頸動脈内注入もまた、有用である。リソソームスルファターゼ酵素組成物は、腹腔内、皮下、または筋肉内等、局所的または局部的に投与されてもよい。一態様において、リソソームスルファターゼ酵素組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に投与される。
【０２１６】
当業者は、用量レベルが、特定のリソソームスルファターゼ酵素、症状の重症度、および副作用に対する対象の感受性に応じて、変化する可能性があることを、容易に理解するであろう。所定のリソソームスルファターゼ酵素に対する好ましい投与量は、限定されるものではないが、患者、試験動物、およびインビトロで行われる、用量反応および薬物動態評価を含む、種々の手段によって、当業者により容易に決定することができる。
【０２１７】
投与される投与量はまた、個別の必要性、所望の効果、使用される具体的なリソソームスルファターゼ酵素、および選択された投与経路にも依存する可能性がある。リソソームスルファターゼ酵素の投与量は、約０．２ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約２０ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、好ましい投与量は、２ｐｍｏｌ／ｋｇ〜２ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、特に好ましい投与量は、２ｐｍｏｌ／ｋｇ〜２００ｐｍｏｌ／ｋｇの範囲である。あるいは、リソソームスルファターゼ酵素の投与量は、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよく、好ましい投与量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよく、特に好ましい投与量は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。これらの投与量は、例えば、限定されるものではないが、特定のリソソームスルファターゼ酵素、薬学的組成物の形態、投与の経路、および特定のリソソームスルファターゼ酵素の作用部位によって、影響されることになる。
【０２１８】
本発明のリソソームスルファターゼ酵素は、動物、具体的にはヒトにおける、治療的、予防的、および診断的な診療に有用である。リソソームスルファターゼ酵素は、特定の組織において、選択的蓄積を示す場合がある。診断用途に好ましい医学的指標は、例えば、目的の標的器官（例えば、肺、肝臓、腎臓、脾臓）と関連する、任意の症状を含む。
【０２１９】
本主題の方法は、種々の異なる疾患症状の治療における使用を見出す。ある実施形態において、所望の活性を有するリソソームスルファターゼ酵素は、既に特定されているが、そのリソソームスルファターゼ酵素は、完全に満足できる治療結果をもたらすようには、標的部位、領域、または区分に十分に送達されない疾患症状における、本主題の方法の使用が、特に興味深い。このようなリソソームスルファターゼ酵素を用いて、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を生成する、本主題の方法を使用して、リソソームスルファターゼ酵素の治療効果および治療指数を強化することができる。
【０２２０】
治療は、リソソームスルファターゼ酵素の投与と関連する患者にとって有益な結果を包含することを意味し、疾患にかかる可能性の減少、疾患の予防、疾患の進行の減速、停止、もしくは逆行、または宿主を苦しめている疾患症状と関連する症状の緩和を含み、あらゆる緩和または利点は、広い意味で使用され、少なくともパラメータ、例えば、治療される病状と関連する症状、例えば関連する炎症および疼痛等の減少を指す。このように、治療には、病状、または少なくともそれと関連する症状が、完全に阻害される、例えば、発生の予防、または停止、例えば、終結され、その結果、宿主は、もはやその病状を患わないか、または少なくともその病状を特徴付ける症状をもはや患わなくなる、状況もまた含まれる。
【０２２１】
種々の宿主または対象が、本主題の方法に従って、治療可能である。一般的に、このような宿主は、「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、哺乳綱の分類内の生物を記載して広く使用され、食肉目（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、ならびに霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む。多くの実施形態において、宿主は、ヒトである。
【０２２２】
これまで本発明について一般的に記載してきたが、同様のことは、以下の参照から以下の実施例を通じて、より容易に理解することができ、これらは、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の生成および精製のための例示的なプロトコル、ならびにリソソーム蓄積症の治療におけるそれらの使用を提供する。実施例は、例示の目的でのみ提供され、決して本発明の範囲を制限するように意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関して、正確性を確保するために、努力を尽くしたが、いくらかの実験的誤差および偏差は、当然ながら、許容されるべきである。
【実施例】
【０２２３】
実施例Ｉ
ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）およびヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の哺乳動物発現ベクター
安定にトランスフェクトされた細胞内に、改善されたリン酸化レベルを有する、十分な量の活性なリソソームスルファターゼ酵素を生成するために適切な哺乳動物発現ベクターを構築することを目的とした。
【０２２４】
３７４アミノ酸ポリペプチドをコードする、全長ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）のｃＤＮＡ（２００５年６月９日公開の米国特許出願第ＵＳ２０００５／０１２３９４９号、および２００４年１１月８日公開の同第ＵＳ２００４／０２２９２５０号を参照されたく、これらの両方は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる）を、ヒトＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよび複数のクローニング部位を含む、哺乳動物発現ベクターのｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）にクローニングした。効率的な転写終結を、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の存在により確保した。選択マーカーは、ＥＭ−７プロモーターの制御下のゼオシン耐性遺伝子およびＳＶ４０初期ポリアデニル化配列であった。結果として得られたプラスミドを、ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１と示した。ヒトＳＵＭＦ１ポリヌクレオチド（配列番号１）およびポリペプチド（配列番号２）の配列を、それぞれ、図１および図２に示す。
【０２２５】
２６アミノ酸のシグナルペプチドを含む、５２２アミノ酸のポリペプチドをコードする、全長ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のｃＤＮＡ（Ｔｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１（２）：６７７−６８３，１９９１を参照されたい）を、ウサギβグロビンＩＶＳ２イントロンに結合したヒトＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよび多重クローニング部位を含む、哺乳動物発現ベクターｐＣＩＮ（ＢｉｏＭａｒｉｎ）にクローニングした。効率的な転写終結を、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の存在により確保した。選択マーカーは、酵素効率を減少させるための点変異を有する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であった。減弱化されたマーカーを、弱いＨＳＶ−ｔｋプロモーターでさらにハンディキャップをつけた。結果として得られたプラスミドを、ｐＣＩＮ  ４Ａと示した。ヒトＧＡＬＮＳポリヌクレオチド（配列番号３）およびポリペプチド（配列番号４）の配列を、それぞれ、図３および図４に示す。
【０２２６】
ＳＵＭＦ１およびＧＡＬＮＳの発現レベルを増加させるために、足場／マトリックス付着領域（ＭＡＲ）要素（Ｍｅｒｍｏｄら、米国特許第７，１２９，０６２号を参照されたい）を、ＳＵＭＦ１およびＧＡＬＮＳの発現プラスミドにクローニングした。
【０２２７】
ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１は、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃＩＩでＰ＜１＿６８  Ｘ＿Ｘ  ＮｃｏＩ充填ＭＡＲ（Ｓｅｌｅｘｉｓ）を消化し、次に、放出されたＭＡＲ断片を、ＢｇｌＩＩおよびＮｒｕＩで消化したｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１に挿入することによって作製した。
【０２２８】
ＰＭＡＲ  ＳＵＭＦ１は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでＰ＜１＿６８  ＮｃｏＩ充填（ＭＡＲ）ＳＶ４０  ＥＧＦＰ（Ｓｅｌｅｘｉｓ）を消化してＥＧＦＰ遺伝子を除去し、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでの消化により、ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１から放出された、ＳＵＭＦ１遺伝子を挿入することにより作製した。
【０２２９】
ＢＭＡＲ  ４Ａは、ＰｍｅＩおよびＳｐｅＩでＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１を消化してＳＵＭＦ１遺伝子を除去し、次いで、ＰｍｅＩおよびＳｐｅＩでの消化によりｐＣＩＮ  ４Ａから放出された、ＧＡＬＮＳ遺伝子を挿入することにより作製した。
【０２３０】
ＰＭＡＲ  ４Ａは、Ｐ＜１＿６８  ＮｃｏＩ充填（ＭＡＲ）  ＳＶ４０  ＥＧＦＰ（Ｓｅｌｅｘｉｓ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化してＥＧＦＰ遺伝子を除去し、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでの消化によりｐＣＩＮ  ４Ａから放出された、ＧＡＬＮＳ遺伝子を挿入することにより作製した。
【０２３１】
全長ヒトＧＡＬＮＳのｃＤＮＡもまた、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。ｐＣＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化してＳＵＭＦ１  ｃＤＮＡを除去し、ｐＣＩＮ  ４ＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化して、ＧＡＬＮＳ  ｃＤＮＡを単離した。ＧＡＬＮＳのｃＤＮＡ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片を、ｐｃＤＮＡ４ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片に、連結させた。結果として得られたプラスミドを、ｐｃＤＮＡ４−４Ａと示した。
【０２３２】
ｐＣＩＮ  ４Ａ、ＢＭＡＲ、およびＣＤＮＡ４−４Ａ発現ベクター内のＧＡＬＮＳ遺伝子の完全性を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した酵素を使用して、制限酵素マッピングにより確認した。ＰＭＡＲ  ４Ａ発現ベクターはマッピングしなかった。
【０２３３】
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の完全なプロセッシング形態の構造を、図５に描写する。ＧＡＬＮＳは、２６アミノ酸のシグナルペプチド配列を有する、５２２アミノ酸のポリペプチドとして発現する。４９６アミノ酸のＧＡＬＮＳポリペプチドは、約５５〜６０ｋＤａの分子量を有する酵素のプレプロセッシング（前駆体）形態として分泌される。活性なＧＡＬＮＳにおいて、前駆体または完全にプロセッシングされたＧＡＬＮＳポリペプチドの位置５３のシステイン残基（全長ＧＡＬＮＳポリペプチドの位置７９に対応する）は、スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）によってＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に変換されている。リソソームにおいて、ＧＡＬＮＳは、完全にプロセッシングされたＧＡＬＮＳポリペプチドの位置３２５の後で切断され、約４０ｋＤａおよび１９ｋＤａのＧＡＬＮＳペプチド断片をもたらす。これらのＧＡＬＮＳペプチドを、完全にプロセッシングされたＧＡＬＮＳポリペプチドの位置２８２と３９３のシステイン（Ｃ）残基間のジスルフィド架橋により結合する。完全にプロセッシングされたＧＡＬＮＳポリペプチドの位置１７８および３９７に、２つの基準のＮ結合型グリコシル化部位が存在する。２つのマンノース−６−リン酸残基を含む、ビスリン酸化されたマンノース７（ＢＰＭ７）は、Ｎ３９７ではなく、Ｎ１７８に見出されている。
実施例ＩＩ
ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）およびヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を共発現するＧ７１Ｓ細胞株
【０２３４】
改善されたリン酸化レベルを有する、活性なリソソームスルファターゼ酵素を生成する能力のある細胞株を開発することを目的とした。
【０２３５】
Ｇ７１細胞（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｋ．Ｄｒａｐｅｒ）を、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）から直接的に誘導した。Ｇ７１細胞株は、エンドソームの酸性化に関する、ＣＨＯ−Ｋ１の温度感受性変異体であり、高温において、全タンパク質の分泌および複数の酵素のマンノース残基上のリン酸化に、差を生むことが観察されている（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７（２）：１３７−１５０，１９９１、Ｍａｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９９（６）：１９０７−１９１６，１９８４）。
【０２３６】
Ｇ７１細胞を、２．５％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、ゲンタマイシン、およびアンホテリシンを補充したＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  ＵｌｔｒａＣＨＯ培地において、３４℃で維持した。
【０２３７】
タンパク質生成のための細胞株のより容易な使用を可能にするために、付着Ｇ７１細胞を、足場依存性、血清依存性の哺乳動物細胞を高密度無血清懸濁培養液に適合させるためのプロトコルを使用して、無血清増殖培地に前適合させ（Ｓｉｎａｃｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２４９−２５７，２０００）、結果として無血清懸濁培養液適合した細胞株、Ｇ７１Ｓを得た。あるいは、付着Ｇ７１細胞は、以下に記載のように安定にトランスフェクトした後に、Ｓｉｎａｃｏｒｅらに概説されるように、無血清増殖培地に適合させてもよい。
【０２３８】
ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＧＡＬＮＳの発現ベクターの対をなす組み合わせ（実施例Ｉ）、ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１とｐＣＩＮ４  ４Ａ、ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１とＢＭＡＲ  ４Ａ、またはＰＭＡＲ  ＳＵＭＦ１とＰＭＡＲ  ４Ａのいずれかを、Ｓｅｌｅｘｉｓによって記載のＭＡＲｔｅｃｈ  ＩＩプロトコルに従って、抗生抗真菌性溶液（１００ＩＵのペニシリン、１０ｍｇのストレプトマイシン、２５μｇのアンホテリシンＢ、Ｃｅｌｌｇｒｏ）を補充した培養培地で増殖させたＧ７１Ｓ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクタントのプールを、５％のγ照射ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＪＲＨ）、２００μｇ／ｍＬのＧ４１８（ＡＧ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および２００μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＵｌｔｒａＣＨＯ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）で増殖させ、同じ増殖培地において９６ウェルプレート中での限界希釈により、クローニングした。クローンの増殖を、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）撮像により監視した。酵素捕捉活性ＥＬＩＳＡを使用して、全てのクローンを、活性なＧＡＬＮＳについてスクリーニングした（実施例ＩＶを参照されたい）。細胞生産性を、４日間の期間にわたって、ＧＡＬＮＳ活性についての酵素捕捉活性ＥＬＩＳＡを、１日当たりの細胞増殖（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で割ることにより、計算した。
【０２３９】
２０２個のＧ７１Ｓクローンを生成し、活性なＧＡＬＮＳについてスクリーニングした。ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１とｐＣＩＮ  ４Ａとでコトランスフェクトしたクローン８６個、ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１とＢＭＡＲ  ４Ａとでコトランスフェクトしたクローン６５個、ＰＭＡＲ  ＳＵＭＦ１とＰＭＡＲ  ４Ａとでコトランスフェクトしたクローン５１個。クローンは、最初に、高レベルの活性なＧＡＬＮＳを基準に、９６ウェル組織培養プレートから選択した（図６Ａ）。ＧＡＬＮＳ活性を、酵素捕捉活性ＥＬＩＳＡを使用して測定し、ｎｇ／ｍＬ（ｙ軸）で表した。ｘ軸は、ＳＵＭＦ１およびＧＡＬＮＳの発現に使用した３つのコトランスフェクション条件を示す。ＭＡＲを有しないｈＣＭＶプロモーター、ＭＡＲを有するｈＣＭＶプロモーター、およびＭＡＲを有するＳＶ４０プロモーター。各棒は、それぞれの集団に由来する単一のクローンを表す。細胞密度は、この９６ウェルのクローンスクリーニングにおいては考慮せず、また、コトランスフェクトしたＧ７１Ｓクローンの全てがこの図に表示されているわけではない。
【０２４０】
最も高く活性なＧＡＬＮＳを生成するＧ７１Ｓクローンを、生産性分析のために選択した（図６Ｂ）。日毎の細胞生産性は、ｐｇ／細胞／日で測定し、ＧＡＬＮＳ活性をその日の細胞密度で割ることによって得た。この図は、５×１０５細胞／フラスコで播種した後、４日目（９６時間）を示す。クローンを、ｐｇ／細胞／日（ｙ軸）で、酵素活性ＥＬＩＳＡを使用してＧＡＬＮＳについてアッセイした。陽性対照は、ＧＡＬＮＳを発現するＢＨＫおよびＣＨＯクローンから構成された（ＢｉｏＭａｒｉｎ）。各縦棒は、単一のクローンを表す。活性なＧＡＬＮＳは、ｐＣＩＮ  ４Ａクローンによって生成されたが、アッセイの背景をわずかに上回るのみであった。
【０２４１】
９６ウェルスクリーニングおよび４日間の生産性アッセイによるクローンの分析は、ＭＡＲ要素を有する発現ベクターのコトランスフェクションが、ＭＡＲを有しない発現ベクターのコトランスフェクションと比較して、Ｇ７１Ｓクローンの生産性を増加させたことを示した。ＢＭＡＲ  ４Ａ＋ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１をコトランスフェクトされたクローンは、迅速なプール生成、急速なクローン増殖、ならびにＰＭＡＲ  ４Ａクローンよりも２倍よりも多く、ＭＡＲ要素が不足しているＣＨＯ  ４ＡおよびＢＨＫ  ４Ａクローンよりも最大１０倍増加した活性なＧＡＬＮＳを生成する能力を示した。
【０２４２】
ＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローンを、Ｓｉｎａｃｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２４９−２５７，２０００に概説されるプロトコルを使用して、無血清培地に適合させた。完全な適合を、両方の選択薬剤（ゼオシン２００μｇ／ｍＬおよびネオマイシン２００μｇ／ｍＬ）の存在下で行った。Ｔ型フラスコで培養したＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１クローンを、次のように分けた。（１）Ｃａｍｂｒｅｘ  ＵｌｔｒａＣＨＯ培地および５％ＦＢＳ（ロット＃８Ｌ２２４２）を有する１２５ｍＬのシェーカー内、（２）ＪＲＨ  ３０２Ｍ培地（生成培地）および５％のＦＢＳを有する１２５ｍＬのシェーカー内、ならびに（３）予備としてＴ型フラスコ内（ＵｌｔｒａＣＨＯ、５％ＦＢＳ）。懸濁培養液を確立した時点で、付着細胞を廃棄し、ＦＢＳからの離脱を開始した。増殖速度が３継代の間に＞０．５（１／日）に戻り、生存率が＞９５％になったときに、ＦＢＳ濃度を、５０％減少させた。細胞は、最低３回の継代の間、ある所定のＦＢＳ濃度に留めた。２．５％ＦＢＳにおける増殖に適合した時点で、細胞を無血清培地中に直接取り出した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを有する新しい培地に貯蔵した。試験的な解凍を、細胞が凍結プロセスを生存したことを確実にするために、試験した。ＢＭＡＲ  ４Ａ＋ＢＭＡＲ  ＳＵＭＦ１トランスフェクション由来の２つのＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローンである、クローン４および５は、無血清懸濁培養液への適合に、おおよそ１５回の継代を要した。ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１とｐＣＩＮ  ４Ａとのトランスフェクション由来のＧＡＬＮＳ発現クローンであるＣ６もまた、単離し、無血清培養液に適合させた。
【０２４３】
ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＧＡＬＮＳ発現ベクター（実施例Ｉ）、ｐｃＤＮＡ４  ＳＵＭＦ１とｐＣＤＮＡ４−４Ａの対をなす組み合わせを、２００μｇ／ｍＬゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を選択に使用したこと以外は、基本的に上述のようにＧ７１Ｓ細胞にトランスフェクトした。６つのＧＡＬＮＳ発現クローン、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ１１、およびＣ３０を単離し、基本的に上述のように、無血清懸濁培養液に適合させた。
実施例ＩＩＩ
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を発現するＧ７１Ｓ細胞株の大規模培養
【０２４４】
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を発現するＧ７１Ｓクローンからの酵素生成を測定することを目的とした。無血清懸濁培養液に適合させた、ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＧＡＬＮＳを共発現するＧ７１Ｓ細胞株を、大きな規模で培養し、活性なＧＡＬＮＳ酵素の生成について評価した。
【０２４５】
無血清懸濁培養液への適合が、Ｇ７１Ｓ宿主細胞株については比較的迅速であったため、生成は、灌流形式で動作するＷＡＶＥバイオリアクターで行うことができると判断した。ＷＡＶＥバイオリアクターは、スケールアップを直接的にバッグ内で行い、汚染の危険性を減少させ、物質の生成を促進することができるため、カラム内の体積において、より高い柔軟性を可能にする。図７は、ＷＡＶＥバイオリアクターの概略図を示す。図は、灌流形式において、ロードセルが、バッグの重量を判定し、供給および収集の速度を調節して所望の体積を維持することによって、バッグ内の培地量を監視することを示す。１０Ｌのバッグにおいては、ｐＨもまた、バッグ内に挿入したプローブによって、所望の設定点に制御される。
【０２４６】
ＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローン４および５由来の物質を、１Ｌのスケールで生成した。培養液のｐＨは、これらの実行中、制御しなかった。ＷＡＶＥバッグの動作限界は、１日当たり３容器量（ＶＶ／日）の処理量である。物質のあらゆる不活性化を防止するためには、標的細胞に特異的な灌流速度（ＣＳＰＲ）は、０．３ｎｌ／細胞／日であり、結果として、ＧＡＬＮＳ酵素について８時間の平均滞留時間をもたらした。したがって、バッグ内の細胞密度は、おおよそ１０〜１２×１０６細胞／ｍＬに維持された。ＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローン４および５の増殖速度は、それぞれ、０．１６および０．２０であった。標的細胞の密度を維持するための排出は、バッグから直接的に行った。
【０２４７】
ＧＡＬＮＳが、ｐＨ６で安定であることを事前に示していたため、収集流体のｐＨを、ｐＨ５．５〜６．５に調節して酵素活性を維持した。これは、リアクターから出ている収集物と順に混合された、５体積％、ｐＨ４．０のクエン酸ナトリウム緩衝液を、指定時間にボーラス添加することにより達成した。調節した収集流体を、下流処理の前に、４℃で保管した。２つのＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローン４および５は、平均して、約１．２５ｐｇ／細胞／日の関連する特異的生産性を有する、約４．２ｍｇ／Ｌの力価となった。
【０２４８】
ＧＡＬＮＳ発現Ｇ７１Ｓクローン、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ１１、およびＣ３０を、同様に、大きな規模で培養し、活性なＧＡＬＮＳ酵素の生成について評価した。
実施例ＩＶ
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の濃度および活性の測定
【０２４９】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を共発現するＧ７１Ｓクローン由来のＧＡＬＮＳ酵素の濃度および活性を測定するために展開した。
酵素捕捉活性ＥＬＩＳＡ
【０２５０】
酵素捕捉活性ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートに結合した抗ＧＡＬＮＳ特異的抗体による捕捉に続いて、固相においてＧＡＬＮＳ酵素の活性を測定する。
【０２５１】
緩衝液。緩衝液Ａ（炭酸塩緩衝液）：３．０９グラムのＮａ２ＣＯ３および５．８８グラムのＮａＨＣＯ３を９００ｍＬの脱イオン（ＤＩ）Ｈ２Ｏ中に溶解し、次いで、ＤＩ  Ｈ２Ｏを、１０００ｍＬの最終体積まで添加する。ｐＨが、９．４〜９．６であることを確認し、次いで、濾過滅菌する。１つの９６ウェルマイクロプレートを、ウェル当たり１００μＬで完全にコーティングするために、１９μＬの抗ＧＡＬＮＳ抗体を、１つの管（１２ｍＬ）の中に希釈する。緩衝液Ｂ（ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液および連続希釈緩衝液）：１倍の酸性ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および２％ＢＳＡを、酢酸でｐＨ  ６．５に調節した。緩衝液ＢＷ（洗浄緩衝液）：１００ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を、酢酸でｐＨ６．５に調節した。緩衝液Ｃ（基質緩衝液）：２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍＬ脱塩ＢＳＡ、および０．０１％  アジ化ナトリウムを、氷酢酸でｐＨ４．０に調節した。緩衝液Ｄ（β−ガラクトシダーゼ緩衝液）：３００ｍＭリン酸二ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム、および０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を、リン酸でｐＨ７．２に調節した。緩衝液Ｅ（停止緩衝液）：３５０ｍＭグリシンおよび４４０ｍＭ炭酸塩緩衝液を、６Ｍ  ＮａＯＨで、ｐＨ１０．７に調節した。
【０２５２】
試薬。抗ＧＡＬＮＳ  ＩｇＧ抗体：ポリクローナルウサギ抗体を、血清からＧタンパク質で精製する。Ｄ−ＰＢＳ中、全タンパク質＝３．１７ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）。アリコート（１９μＬ）は、それぞれ１回の使用のために−２０℃で保管する。４ＭＵ−Ｇａｌ−６−Ｓ基質（固体、４４０ＭＷ）：１００ｍＭのストックをＤＩ水中で調製し、４℃で保管した。β−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−４１５５）：使用前に、緩衝液Ｄ中で１２μｇ／ｍＬに希釈する。
【０２５３】
プロトコル：抗ＧＡＬＮＳ抗体のプレートへの結合：Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ／Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＃１２−５６５−１３５）を、緩衝液Ａ中で、最終タンパク質濃度５μｇ／ｍＬにおいて、抗ＧＡＬＮＳ抗体でコーティングする。この溶液を調製するために、１つの１９μＬアリコートを解凍し、微量遠心分離機で短時間（１０秒）回転させて、液体を収集する。１９μＬ全てを、１２ｍＬの緩衝液Ａに移す。反転によって激しく混合し、次いで、リザーバに注ぎ、その後、マルチチャネルピペッターを使用して、プレート充填を行う（ウェル当たり１００μＬ）。プレートを覆い、４℃で一晩インキュベートする。結合していない抗ＧＡＬＮＳ抗体の除去：緩衝液ＢＷを３回多量に注ぐことによりプレートを洗浄する。ブロッキング：緩衝液Ｂ（ウェル当たり３２０μＬ）でプレートをブロッキングし、次いで、プレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。ブロッキングのステップ中の、精製されたＧＡＬＮＳ標準および試験試料（未知）の希釈系列の調製：標準物は、アッセイの線形範囲の上限まで、緩衝液Ｂ中で希釈し（列Ａにおいて１２８ｎｇ／ｍＬ）、次いで、９６ウェルプレートの列Ｂ〜Ｇに連続希釈する（２倍）。レーンＨは、緩衝液のブランクである（すなわち、ＧＡＬＮＳ酵素なし）。まず、緩衝液Ｂ中で、濃度１２８ｎｇ／ｍＬで５００μＬを調製する。次いで、２ｎｇ／ｍＬに達するまで、緩衝液Ｂ中で連続２倍希釈（２５０μＬ中に２５０μＬを入れる）を行う。ブロッキング緩衝液の除去：ブロッキングステップの後、緩衝液Ｂを廃棄する。ＧＡＬＮＳ酵素の標準および試験試料の、抗ＧＡＬＮＳ抗体への結合：プレートに、１００μＬ／ウェルの連続希釈した標準および試験試料を充填する（２部で操作）。プレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。ＧＡＬＮＳ阻害剤の除去：緩衝液ＢＷを３回多量に注ぐことによりプレートを洗浄する。ＧＡＬＮＳ基質の添加（第１の反応）：ウェル当たり１００μＬの充填に十分な最終基質溶液を調製する（使用前１時間以内に調製する）。４ＭＵ−Ｇａｌ−６−Ｓストック溶液（１００ｍＭ）を、緩衝液Ｃ中で１ｍＭに希釈する。ウェル当たり１００μＬを充填する。プレートを覆い、３７℃で３０時間インキュベートする。β−ガラクトシダーゼの添加（第２の反応）：５０μＬの１２μｇ／ｍｌ  β−ガラクトシダーゼを、緩衝液Ｄ中で、各ウェルに添加する。プレートを覆い、３７℃で１５時間インキュベートする。停止反応：１００μＬの緩衝液Ｅ（停止緩衝液）を各ウェルに添加し、放出された４ＭＵをイオン化する。蛍光プレートへの移動：ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルから、２５０μＬのうち２００μＬを、黒色の未処理平底マイクロタイタープレート（Ｆｌｕｏｒｏｐｌａｔｅ，Ｃｏｓｔａｒ  ＃３９１５）に移動させる（１度に８ウェル）。蛍光の読み取り：ＳＯＦＴｍａｘ  ＰＲＯプログラム（３６６ｎｍ励起、４４６ｎｍ発光、４３５ｎｍカットオフ）を使用して、プレートを、Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で読み取る。
ＧＡＬＮＳ  ＥＬＩＳＡ
【０２５４】
ＧＡＬＮＳ  ＥＬＩＳＡは、サンドイッチ免疫学的アッセイを使用して、細胞培養馴化培地または他のプロセス試料における、ＧＡＬＮＳ酵素の濃度を測定する。
【０２５５】
緩衝液。緩衝液Ａ（炭酸塩緩衝液）：３．０９グラムのＮａ２ＣＯ３および５．８８グラムのＮａＨＣＯ３を９００ｍＬの脱イオン（ＤＩ）Ｈ２Ｏ中に溶解し、次いで、ＤＩ  Ｈ２Ｏを、１０００ｍＬの最終体積まで添加する。ｐＨが、９．４〜９．６であることを確認し、次いで、濾過滅菌する。１つの９６ウェルマイクロプレートを、ウェル当たり１００μＬで完全にコーティングするために、１９μＬの抗ＧＡＬＮＳ抗体を、１つの管（１２ｍＬ）の中に希釈した。緩衝液Ｂ（ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液および連続希釈緩衝液）：１倍の酸性ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および２％ＢＳＡを、酢酸でｐＨ６．５に調節した。緩衝液ＢＷ（洗浄緩衝液）：１００ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を、酢酸でｐＨ６．５に調節した。緩衝液Ｆ（停止緩衝液）：２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４：合計６００ｍＬ、１００ｍＬの１２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４および５００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水を添加。
【０２５６】
試薬。抗ＧＡＬＮＳ  ＩｇＧ抗体：ウサギポリクローナル抗体を、血清からＧタンパク質で精製する。Ｄ−ＰＢＳ中、全タンパク質＝３．１７ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）。アリコート（１９μＬ）は、それぞれ１回の使用のために−２０℃で保管する。ＨＲＰ共役型検出抗体（ＲＩＶＡＨ）：最終的な共役抗体を、１：１００でＤ−ＰＢＳ／１％  ＢＳＡ中に希釈し、１回の使用のために−２０℃で、１２０μＬアリコートで保管した。ＴＭＢ  ＥＩＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ  ＃１７２−１０６７）。
【０２５７】
プロトコル。抗ＧＡＬＮＳ抗体のプレートへの結合：Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ／Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＃１２−５６５−１３５）を、緩衝液Ａ中で、最終タンパク質濃度５μｇ／ｍＬにおいて、抗ＧＡＬＮＳ抗体でコーティングする。
この溶液を調製するために、１つの１９μＬアリコートを解凍し、微量遠心分離機で短時間（１０秒）回転させて、液体を収集する。１９μＬ全てを、１２ｍＬの緩衝液Ａに移す。反転によって激しく混合し、次いで、リザーバに注ぎ、その後、マルチチャネルピペッターを使用して、プレート充填を行う（ウェル当たり１００μＬ）。プレートを覆い、３７℃で（対流インキュベーター）２時間インキュベートする。ホットブロックは使用しないものとする。結合していない抗ＧＡＬＮＳ抗体の除去：緩衝液ＢＷを３回多量に注ぐことによりプレートを洗浄する。ブロッキング：緩衝液Ｂ（ウェル当たり３２０μＬ）でプレートをブロッキングし、次いで、プレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。ブロッキングのステップ中の、精製されたＧＡＬＮＳ標準および試験試料（未知）の希釈系列の調製：標準物は、アッセイの線形範囲の上限まで、緩衝液Ｂ中で希釈し（列Ａにおいて４０ｎｇ／ｍＬ）、次いで、９６ウェルプレートの列Ｂ〜Ｇに連続希釈する（２倍）。レーンＨは、緩衝液のブランクである（すなわち、ＧＡＬＮＳ酵素なし）。まず、緩衝液Ｂ中で、濃度４０ｎｇ／ｍＬで５００μＬを調製する。次いで、０．６２５ｎｇ／ｍＬに達するまで、緩衝液Ｂ中で連続２倍希釈（２５０μＬ中に２５０μＬを入れる）を行う。ブロッキング緩衝液の除去：ブロッキングステップの後、緩衝液Ｂを廃棄する。ＧＡＬＮＳ酵素の標準および試験試料の、抗ＧＡＬＮＳ抗体への結合：プレートに、１００μＬ／ウェルの連続希釈した標準および試験試料を充填する（２部実行）。プレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。洗浄：緩衝液ＢＷを３回多量に注ぐことによりプレートを洗浄する。検出抗体共役体の結合：この溶液を調製するために、１つのアリコート（１２０μＬ）をＲＩＶＡＨにより解凍し、微小遠心分離機で短時間（１０秒）回転させて、液体を収集する。１２０μＬ全てを１１．９ｍＬの緩衝液Ｂ中に希釈し、管を激しく反転させて、混合する。リザーバに注ぎ、マルチチャネルピペッターでウェル当たり１００μＬを添加する。プレートを覆い、３７℃で３０時間インキュベートする。洗浄：緩衝液ＢＷを３回多量に注ぐことによりプレートを洗浄する。ＴＭＢ基質：１．２ｍＬの溶液Ｂを、１０．８ｍＬの溶液Ａを混合することによって、最終的な基質溶液を調製する。リザーバに注ぎ、マルチチャネルピペッターでウェル当たり１００μＬを添加する。プレートを覆い、３７℃で１５時間インキュベートする。停止溶液：１２ｍＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４停止溶液を、ピペットでリザーバに取り、マルチチャネルピペッターで、ウェル当たり１００μＬを添加した。穏やかに叩いて、混合する。Ａ４５０の読み取り：プレートリーダーでプレートを読み取る。
ＧＡＬＮＳ比活性アッセイ
【０２５８】
ＧＡＬＮＳ比活性アッセイは、ＧＡＬＮＳに特異的な基質を使用して、溶液中のＧＡＬＮＳの酵素活性を測定する。
【０２５９】
緩衝液。ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏを、全ての緩衝液に対して使用する。希釈緩衝液（ＤＢ）：１ＬのＤＢに対して、１．７４ｍＬの酢酸、０．７５ｇの酢酸ナトリウム、２３３．６ｍｇのＮａＣｌ、２ｍＬの５０％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および１０ｍＬの１％アジ化ナトリウムを、ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏに溶解し、ｐＨが３．９５未満の場合は０．１Ｍ  ＮａＯＨで、ｐＨが４．０５を超える場合は０．１Ｍ酢酸で、ｐＨを４．０±０．５に調節する。最終濃度は：１９．５ｍＭ酢酸、５．５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．０１％アジ化ナトリウムである。リン酸緩衝液（ＰＢ）：１ＬのＰＢに対して、１３．９ｇのＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏおよび５５ｇのＮａＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏを、ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ中に溶解し、ｐＨを７．２に調節する。最終濃度は、３００ｍＭ  ＮａＰｉである。停止緩衝液（ＳＢ）：１ＬのＳＢに対して、２６．２ｇのグリシンおよび４６．６ｇの炭酸ナトリウムをＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ中に溶解し、ＮａＯＨでｐＨを１０．６に調節する。アッセイ緩衝液（ＡＢ）：４ＭＵ−Ｇａｌ−６Ｓストックを１：５０でＤＢ中に希釈する（最終２ｍＭ）。β−ガラクトシダーゼ緩衝液（βＧＢ）：３００ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．２中の２５μｇ／ｍＬβ−ガラクトシダーゼ。
【０２６０】
試薬。４ＭＵ−Ｇａｌ−６Ｓ：Ｈ２Ｏ中１００ｍＭ（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃａｔ．＃Ｍ３３４４８０）。β−ガラクトシダーゼ：Ｓｉｇｍａ  Ｇ−４１５５。４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ標準）：Ｓｉｇｍａ  Ｍ−１３８１（ＤＭＳＯ中の１０ｍＭストック）。
【０２６１】
プロトコル。ＧＡＬＮＳ酵素の連続希釈を行う。精製および製剤化されたＧＡＬＮＳ（約１．５ｍｇ／ｍＬ）について、１：１の連続希釈前に、試料を、ＤＢを含有する低タンパク質付着微量遠心分離管（ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃１４１５−２６００）中で１：１０，０００に希釈する。１００μＬのＤＢを、タンパク質低結合の９６ウェルプレートに設置する。第１の列に、１００μＬのＧＡＬＮＳ試料をピペットで入れる。ここで、プレートの下方向に（９６ウェルプレートのＡ〜Ｇ）、連続希釈する（１：１）。ウェルＨには試料を添加しない（ブランク）。このアッセイの線形範囲は、１〜７５ｎｇ／ｍＬである。４ＭＵの標準曲線の作成に同じ手順を使用する。ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ  ４ＭＵストックを、ＤＢ中で１：１００に希釈する。４ＭＵの標準曲線を、５０μＬの５０μＭ  ４ＭＵを第１のウェルに添加することにより開始し、続いて連続希釈する。ＡＢ中に希釈した５０μＬの基質（ＤＢ中の２ｍＭ  ４ＭＵ−ガラクトース−６Ｓ）を、９６ウェル蛍光プレートに添加する。基質を、３７℃で１０分間プレインキュベートする。ＧＡＬＮＳおよび４ＭＵの標準の１００μＬの連続希釈物のうち５０μＬを、ＡＢ中の５０μＬの基質に添加する。３７℃で３０分間インキュベートし（この第１の反応により、基質から硫酸を除去する）、第１の反応をクエンチし、５０μＬのβ−ガラクトシダーゼを添加することにより、第２の反応を開始する（β−ガラクトシダーゼストックをβＧＢ中で２５μｇ／ｍＬに希釈する）。リン酸は、ＧＡＬＮＳを阻害し、ｐＨの増加もまた、ＧＡＬＮＳ反応を停止させる。結果として得られたｐＨは、現在、β−ガラクトシダーゼの最適ｐＨ範囲内である。第２の反応を、３７℃で１５分間インキュベートする。放出された４ＭＵを、１００μＬのＳＢを添加することにより、イオン化する。９６ウェル蛍光プレートリーダーで、励起３５５、発光４６０を読み取る。酵素活性計算（ｐＨ４．０の緩衝液中、３７℃で）：１単位＝μｍｏｌ放出された４ＭＵ／分、活性＝μｍｏｌ  ４ＭＵ／分／ｍＬ、比活性＝μｍｏｌ  ４ＭＵ／分／ｍｇ。タンパク質濃度計算：ＧＡＬＮＳの吸光係数を使用（２８０ｎｍにおいて１ｍｇ／ｍＬ＝１．７０８吸光度単位）。
実施例Ｖ
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の精製
【０２６２】
大量の組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を得ることを目的とした。ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＧＡＬＮＳを共発現する、安定にトランスフェクトされたＧ７１細胞を、バイオリアクター培養条件下で増殖させ、活性なＧＡＬＮＳ酵素を細胞培地から精製した。
【０２６３】
液体クロマトグラフィー装置。Ｕｎｉｃｏｒｎ制御ソフトウェアを利用しする、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００システム。
【０２６４】
タンパク質分析方法。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシーブルー染色（Ｂ１０１−０２−ＣＯＯＭ）、ウェスタンブロット法、およびブラッドフォードタンパク質アッセイについては、標準的な手順に従った。精製作業を、活性の収量により評価し、ＧＡＬＮＳ生成物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、目視で評価した。プロセッシングされた不純物の存在を、抗ＧＡＬＮＳ抗体を使用して、ウェスタンブロット法により検出した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して測定した。最終的な精製されたＧＡＬＮＳタンパク質の濃度を、吸光係数１．７０８を使用して、Ａ２８０測定により測定した。
【０２６５】
クロマトグラフィー樹脂。Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ロット＃３０６３４６）およびＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ，ＦＣ０４０８９４４４９）。
【０２６６】
ＧＡＬＮＳ酵素活性の判定。ＧＡＬＮＳ比活性を、小分子蛍光基質４−メチルウンベリフェリル−６−Ｓ−ＧＡＬ（４−ＭＵ−６−Ｓ−ＧＡＬ）を使用して、判定した。ＧＡＬＮＳ比活性アッセイは、２ステップの反応を伴い、一定期間、ＧＡＬＮＳを基質でインキュベートした後、蛍光タグを放出するためにβ−ガラクトシダーゼの添加が必要である。測定は、蛍光プレートリーダーを使用して行う。
【０２６７】
１０ＤＧ脱塩カラム（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）を、平衡緩衝液（ＥＱＢ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．８）で平衡化した。ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏを、全ての緩衝液に使用した。３（３）ｍＬの精製されたＧＡＬＮＳ（０．５〜２ｍｇ／ｍＬ）を、脱塩カラムに充填し、溶出して、ＥＱＢを使用して、別個の試験管中の４ｍＬのアリコートに収集した。タンパク質濃度を、ＧＡＬＮＳの吸光係数を使用して、計算した（２８０ｎｍにおいて１ｍｇ／ｍＬ＝１．７０８吸光度単位）。
【０２６８】
脱塩したＧＡＬＮＳ試料を、希釈緩衝液（ＤＢ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０＋０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中で連続希釈した（１：１）。ＢＳＡストックを、ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏで事前に平衡化したＧ２５カラムに５０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡストック（５％ＣＶ以下）を充填することにより使用する前に、脱塩した。１００μＬの脱塩ＧＬＡＮＳ試料を、低タンパク質結合の９６ウェルプレートの第１の列にピペットで入れ、連続希釈したＧＡＬＮＳ試料を、プレートの下方向にピペットで入れた（９６ウェルプレートの列Ａ〜Ｇ）。１００μＬのＤＢを、最後のウェル（Ｈ）にピペットで入れた。このアッセイの線形範囲の上限は、２００ｎｇ／ｍＬであり、線形範囲は、３〜２００ｎｇ／ｍＬである。４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）（Ｓｉｇｍａ  Ｍ−１３８１、ＤＭＳＯ中１０ｍＭストック）を用いて標準曲線を作成するために、同じ手順を実行した。ＧＡＬＮＳおよび４ＭＵの連続希釈物の１００μＬのうち５０μＬを、新しい９６ウェル蛍光プレート（黒い底のプレート）に移した。５０μＬの２ｍＭ  ４ＭＵ−ガラクトース−６Ｓ（ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ中）を、アッセイを行う試料に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。この第１の反応をクエンチし、５０μＬのβ−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−４１５５、３００ｍＭ  ＮａＰｉ中で１２μｇ／ｍＬの希釈したストック、ｐＨ７．２）を添加することにより、第２の反応を開始し、３７℃で１５分間インキュベートした。放出された４ＭＵを、１００μＬの停止緩衝液（グリシン／炭酸塩、ｐＨ１０．６）の添加によりイオン化した。プレートを、９６蛍光プレートリーダーで読み取った（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）。１単位を、１μｍｏｌの４ＭＵ放出／分として定義し、酵素活性は、μｍｏｌ  ４ＭＵ／分／ｍＬで示し、比活性は、μｍｏｌ  ４ＭＵ／分／ｍｇで示し、全て、３７℃でｐＨ４．０の緩衝液におけるものであった。
【０２６９】
第１の精製プロセス。第１の精製プロセスには、限外濾過（ＵＦ）ステップ、続いて２カラム精製プロセスが含まれた。
【０２７０】
１．収集濾過（ＨＦ）：バイオリアクター物質を、０．２μｍ滅菌濾過した。
【０２７１】
２．限外濾過（ＵＦ）：バイオリアクター物質を、３０ｋＤのＳａｒｔｏｃｏｎ膜を通す限外濾過によって、１０〜２０倍に濃縮した。
【０２７２】
３．ｐＨ４．５に調節：濃縮したバイオリアクター物質（ＵＦ（２０倍））を、室温において、ｐＨ調節緩衝液（１．７５Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０）で４．５に調節し、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムへの充填前に滅菌濾過した。
【０２７３】
４．Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）：ｐＨ４．５に調節したＵＦ（２０倍）を、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに充填し、ＧＡＬＮＳタンパク質を、表１および図９Ａに示されるように、溶出した。
【表１】
0006030553.tif 000003
【０２７４】
５．Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ：Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出液を、ｐＨ４．３に調節し、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムに充填し、ＧＡＬＮＳタンパク質を、表２および図９Ｂに示されるように溶出した。
【表２】
0006030553.tif 000004
【０２７５】
溶出液中のＧＡＬＮＳタンパク質を、分画によって収集し、溶出前のショルダーおよび溶出後のテールを廃棄した。
【０２７６】
６．最終ＵＦ／ＨＦ：Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰカラムからの溶出液を、限外濾過により濃縮し、上述のように滅菌濾過した。
【０２７７】
製剤。精製したＧＡＬＮＳタンパク質を、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ５．５中に製剤化した。
【０２７８】
安定性研究。最終的な製剤化された精製したＧＡＬＮＳの安定性を、４℃〜−７０℃において、小アリコートのＧＡＬＮＳ試料をそれぞれの温度で保管することによって、時間の関数として監視した。一定の時点において、凍結試料のアリコートを、活性測定前に３７℃の水浴で解凍した。図８は、精製されたＧＡＬＮＳが、製剤緩衝液中で、少なくとも７９日までの期間にわたり、４℃および−７０℃で安定であったことを示す。
【０２７９】
第１の精製プロセスの結果。表３は、懸濁培養液バイオリアクターにおいて、Ｇ７１Ｓクローン４から生成された、ＧＡＬＮＳタンパク質の３回の調製に対する精製収率を示す。純度は、全ての場合において約９５％であると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって目視で推定した。
【表３】
0006030553.tif 000005
【０２８０】
図９は、（Ａ）Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィー、続いて、（Ｂ）Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−ＣＡＰクロマトグラフィーにより分離したＧＡＬＮＳタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ゲルを、クマシーブルー（左）または抗ＧＡＬＮＳ抗体（右）で染色した。ウエスタンブロット法については、抗ＧＡＬＮＳウサギ抗体は１：５０００に希釈し、二次抗体は、抗アルカリホスファターゼウサギ抗体であった。ＧＡＬＮＳタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、約５５〜６０ｋＤａの見かけの分子量を有し、２６アミノ酸残基シグナルペプチドが不足し、位置３２５後の切断もまた不足している酵素の分泌されるプレプロセッシング（前駆体）形態の予想寸法と一致する。
【０２８１】
Ｎ末端の特徴付け。精製されたＧＡＬＮＳタンパク質のＮ末端は、ＬＣ／ＭＳにより判定した。Ｎ末端配列は、ＡＰＱＰＰＮであり、これは、２６アミノ酸残基のシグナルペプチドが不足しているＧＡＬＮＳの分泌される形態の予測されるＮ末端に対応する（図４および図５におけるヒトＧＡＬＮＳポリペプチド配列を比較されたい）。
【０２８２】
第２の精製プロセス。第２の精製プロセスには、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）ステップ、続いて３カラム精製プロセスが含まれる。
【０２８３】
１．限外濾過（ＵＦ／ＤＦ）：バイオリアクター物質を、ｐＨ５．５において、３０ｋＤのＳａｒｔｏｃｏｎ膜を通す限外濾過／透析濾過によって、２０倍に濃縮した。
【０２８４】
２．ｐＨ４．５に調節：濃縮したバイオリアクター物質（ＵＦ／ＤＦ（２０倍））を、室温において、ｐＨ調節緩衝液（１．７５Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０）で４．５に調節し、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムへの充填前に滅菌濾過した。
【０２８５】
３．Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐ：ｐＨ４．５にｐＨ調節したＵＦ／ＤＦを、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムに充填し、１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５、および１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で連続して洗浄し、ＧＡＬＮＳタンパク質を、１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で溶出した。
【０２８６】
５．Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ：Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐカラムからの溶出液を、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に調節し、Ｚｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラムに充填し、１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０で洗浄し、ＧＡＬＮＳタンパク質を、１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、９０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０で溶出した。
【０２８７】
６．ｐＨ３．５に調節：ＧＡＬＮＳタンパク質を含有するＺｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムからの溶出液を、低ｐＨウイルス不活性化のために、ｐＨ３．５に調節し、次いで、１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０に適合させた。
【０２８８】
７．ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ：低ｐＨに調節したＺｎキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムからの溶出液を、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍカラムに充填し、１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で洗浄し、ＧＡＬＮＳタンパク質を、１０ｍＭ酢酸塩／リン酸塩、０．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で溶出した。
【０２８９】
８．最終ＵＦ／ＨＦ：ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ溶出液からの溶出液を、２０ｍＭ酢酸塩、１ｍＭ  リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５において、限外濾過および透析濾過した。
【０２９０】
製剤。精製したＧＡＬＮＳタンパク質を、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５に製剤化した。
【０２９１】
第２の精製プロセスの結果。表４は、第２の精製プロセスを使用して、懸濁培養液バイオリアクターにおいて、Ｇ７１ＳクローンＣ２から生成された、ＧＡＬＮＳタンパク質の回収率を示す。製剤化されたＧＡＬＮＳ酵素の純度（すなわち、前駆体および成熟またはプロセッシングの形態を合わせて）は、Ｃ３  ＲＰ−ＨＰＬＣにより判定すると、約９８％であった。ＧＡＬＮＳ酵素の前駆体形態の割合は、ＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動により判定すると、約８５％であった。
【表４】
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【０２９２】
図１０は、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐクロマトグラフィー、Ｚｎキレート化ＦＦＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、およびＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍクロマトグラフィーによって分離された、ＧＡＬＮＳ酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ゲルは、クマシーブルー（左上）、抗ＧＡＬＮＳ抗体（右上）、抗カテプシンＬ（左下）、および抗ＣＨＯタンパク質（ＣＨＯＰ、右下）で染色した。ウェスタンブロット法については、抗ＧＡＬＮＳラビットポリクローナル抗体は、１：５０００に希釈し、二次抗体は抗ウサギＡＰ共役体であり、抗カテプシンＬヤギポリクローナル抗体は、１：１０００に希釈し、二次抗体は抗ヤギＨＲＰ共役体であり、抗ＣＨＯＰウサギポリクローナル抗体は、１：１０００に希釈し、二次抗体は抗ウサギＨＲＰ共役体であった。前駆体ＧＡＬＮＳ酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約５５〜６０ｋＤａの見かけの分子量を有し、ＧＬＡＮＳ酵素の成熟またはプロセッシング形態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、約３９ｋＤａおよび約１９ｋＤａの見かけの分子量を有する。
【０２９３】
第１の精製プロセスの概要。ＧＡＬＮＳ酵素を、標準系列から修正した精製系列を使用して、精製した（表５を参照されたい）。バイオリアクター収集物質を、０．２μｍフィルタ滅菌濾過し、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ捕捉カラムに充填する前に４℃で保管した。濾過したバイオリアクター物質は、直接的に充填したか、または限外濾過により最大１５倍に濾過した。精製系列の修正は、下流の精製ステップ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーに続いてＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーが、十分に純粋なＧＡＬＮＳを生成しなかったため、必要であった。ＳＥ  Ｈｉ−Ｃａｐクロマトグラフィーを２つの下流精製カラムの代替として使用することにより、結果として、２カラム精製プロセスとなり、最終物質の純度は、有意に改善され、全体的なＧＡＬＮＳの回収率は、約２２％〜約８０％まで有意に増加した。ＧＡＬＮＳ酵素（本質的に、前駆体形態から構成される、図９を参照されたい）の純度は、Ｃ４−ＲＰクロマトグラフィーにより判定すると、概ね＞９５％と推定され、精製されたＧＡＬＮＳ酵素は、４℃および−７０℃の両方において、７９日を超える期間、製剤緩衝液中で安定したままであった。
【表５】
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【０２９４】
第２の精製プロセスの概要。ＧＡＬＮＳ酵素はまた、第２の精製系列を使用して精製した（表６を参照されたい）。全体的なＧＡＬＮＳの回収率は、約７０％であり、ＧＡＬＮＳ酵素の純度（前駆体および成熟またはプロセッシング形態の両方を含む、図１０を参照されたい）は、Ｃ４−ＲＰクロマトグラフィーにより判定すると、概ね約９７％であると推定された。
【表６】
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【０２９５】
これらのアッセイは、組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を調製するための上述のプロトコルが、高度に精製された酵素、特に、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の分泌されたプレプロセッシング（前駆体）形態の、大量生成のための効率的な方法を提供することを示す。
実施例ＶＩ
切除を最小限に抑えたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の精製
【０２９６】
組み換え酵素のタンパク質分解の制御は、タンパク質系治療薬の生成および製剤化における懸念である。大量の組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を、分泌されたプレプロセッシング（前駆体）形態で得ることを目的とした。プロテアーゼ、特に、カテプシンＬからの切除を最小限に抑え、ヒトＧＡＬＮＳの大規模製造を可能にする、生成プロセスを開発した。
【０２９７】
本明細書に使用される、「切除を最小限に抑える」とは、ＧＡＬＮＳが、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くクマシーブルー染色によって、またはＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）により判断すると、最終的な精製された製剤において、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％完全であることを意味する。
【０２９８】
ＧＡＬＮＳの大規模製造のための生成プロセスの開発の際、約５５ｋＤａの分泌された酵素の前駆体形態が、酸性ｐＨで活性であるプロテアーゼ、特に、カテプシンＬによるタンパク質分解に対して感受性であったことがわかった。ＧＡＬＮＳのプロテアーゼ分解は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで、約４０ｋＤａおよび約１９ｋＤａに、２つのバンドとして見られる、ＧＡＬＮＳの成熟、切除形態をもたらす。このタンパク質分解の切除は、陽イオン交換カラム捕捉ステップに必要な、低ｐＨ（すなわち、４．５〜５．０）により悪化した。このｐＨ範囲は、カテプシン等の酸性プロテアーゼが、細胞培養回収物中に存在するのに好都合な条件を提供した。
【０２９９】
細胞培養培地中に分泌されるＧＡＬＮＳを切除することができるプロテアーゼの存在および／または活性を最小化するために、ＧＡＬＮＳの回収および精製プロセスに変更を加えた。
【０３００】
ＧＡＬＮＳの大規模製造のための例示的な回収および精製プロセスを描写するフローチャートを、図１１に示す。左側のプロセスは、実施例Ｖで前述の精製系列と類似である、第Ｉ／ＩＩ相プロセスで使用される回収および精製プロセスを示し、これは、結果として、カテプシンＬの活性化のために、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ作業に続いてクマシーブルー染色（図１２、レーン３を参照されたい）により判定すると、ペプチド鎖が約６〜３０％の範囲、またはＳＤＳ−ＣＧＥ（表８を参照されたい）により判断すると、ＧＡＬＮＳの完全な前駆体形態が６５．３％〜９３．７％の範囲である、不定量の切除をもたらす。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法は、タンパク質分解に、視覚的だが、より定性的な情報を提供するが、一方で、ＳＤＳ−ＣＧＥ方法は、最終的な精製された製剤中に存在する完全なタンパク質の％に関するより定量的な情報を提供する。
【０３０１】
図１１の右側のプロセスは、第ＩＩＩ相プロセスで使用される回収および精製プロセスを示し、結果として、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ作業に続くクマシーブルー染色（図１２、レーン５を参照されたい）によって、またはＳＤＳ−ＣＧＥ（表８を参照されたい）によって判断すると、ＧＡＬＮＳの完全な前駆体形態が９８％〜９９．６％の範囲である、最小限の切除をもたらす。
【０３０２】
プロセス変更の概要。ＧＡＬＮＳ切除の範囲および変動性を減少させるために、次の２つの因子を考慮した。（ｉ）プロテアーゼは、中性ｐＨにおいて、著しく活性率が低く、（ｉｉ）陽イオン交換クロマトグラフィーおよび固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の両方のステップは、ＧＡＬＮＳからプロテアーゼを分離する。第ＩＩＩ相プロセス（図１１、右を参照されたい）は、これらの因子を有効に利用し、精製手順中のＧＡＬＮＳの切除を減少させることを助ける。これは、最初の２つのカラムステップを入れ替え、ｐＨ６．５〜７．０でＺｎ−ＩＭＡＣカラムに捕捉することによって達成した。この最初の２つのカラムの入れ替えはまた、第Ｉ／ＩＩ相のプロセス（図１１、左を参照されたい）で使用した、より酸性のｐＨ（すなわち、ｐＨ５．５）と比較して、より高いｐＨ（すなわち、ｐＨ６．５）で、細胞培養収集物を収集および保管することを便利にした。無細胞収集物のｐＨ６．５での保管は、細胞培養流体中に存在する、プロテアーゼ、例えば、カテプシンの活性化の可能性を低減させ、それによって、ＧＡＬＮＳの切除を防止または低減させる。
【０３０３】
第ＩＩＩ相プロセス。ＧＡＬＮＳの回収および精製のための例示的な第ＩＩＩ相プロセスにおけるステップのそれぞれを、以下に概説する。
【０３０４】
１．無細胞収集物（１倍）。ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＧＡＬＮＳを共発現する、安定にトランスフェクトされたＧ７１細胞を、実施例ＩＩＩに記載のバイオリアクター培養条件下で、増殖させた。ＧＡＬＮＳを含有するバイオリアクター物質（すなわち、細胞培養流体）を、ｐＨ６．５で収集し、ＣＵＮＯ  ３０ＳＰ０２Ａの濾過系列、続いて、ＣＵＮＯ  ９０ＺＡ０８Ａ、および０．２μｍのＣＵＮＯ  ＢｉｏＡｓｓｕｒｅフィルタを使用して、濾過した。
【０３０５】
２．ＵＦ／ＤＦ（２０倍）。細胞培養流体を、伝導率≦７ｍＳ／ｃｍで、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５に、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）した。ＵＦ／ＤＦステップは、３０ｋＤａのＨｙｄｒｏｓａｒｔカセットを使用して、行った。細胞培養流体を、２０倍に濃縮した。比較のために、第Ｉ／ＩＩ相プロセスのＵＦ／ＤＦステップを、ｐＨ５．５で行った。第ＩＩＩ相プロセスにおけるより高いｐＨは、無細胞収集物中に存在するプロテアーゼによるＧＡＬＮＳの切除の可能性を減少させる。
【０３０６】
３．炭フィルタ。ＵＦ／ＤＦ（２０倍）物質を、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  Ｒ５５活性炭（Ｚ１２７４）を通して濾過し、続いて、２〜８℃での保管前に、０．２μｍのフィルタを使用して、滅菌濾過した。炭フィルタは、後続のＺｎ−ＩＭＡＣカラムへの充填時に、圧力を減少させる。
【０３０７】
４．固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）。Ｚｎ−固定化金属親和性クロマトグラフィー（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラムを、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０において平衡化させ、伝導率約５５±５ｍＳ／ｃｍで、活性炭濾過したＵＦ／ＤＦ（２０倍）物質を用いて、２．５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ９．２の５０ｍＭ  リン酸緩衝液の添加によりｐＨ７．０±０．１で、充填した。充填したカラムを、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、続いて、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）で、洗浄した。ＧＡＬＮＳを、７０％の緩衝液Ａと３０％の緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  リン酸塩／酢酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）との混合液を用いて、カラムから溶出した。
【０３０８】
５．Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルタ。Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムの溶出液を、ｐＨ７．０で伝導率６．０±０．５ｍＳ／ｃｍに調節し、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルタに充填し、ウイルスを除去した。
【０３０９】
６．ｐＨの調節および濾過。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液を、ｐＨ４．５±０．１に調節し、ＣＵＮＯ  ６０ＺＡフィルタ、続いて０．２μｍの直列フィルタを使用して濾過し、次に陽イオン交換カラムに充填した。
【０３１０】
７．陽イオン交換クロマトグラフィー。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ陽イオン交換カラムを、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５中で平衡化させ、伝導率＜７ｍＳ／ｃｍにおいてｐＨ４．５±０．１に調節した、濾過したＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液を充填した。充填したカラムを１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５、続いて１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、ｐＨ５．０（緩衝液Ａ）と１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０（緩衝液Ｂ）との８０％：２０％混合液で、洗浄した。ＧＡＬＮＳを、８０％〜２５％緩衝液Ａ中の、直線勾配２０〜７５％の緩衝液Ｂ（すなわち、５０〜１９０ｍＭ  ＮａＣｌ）で、カラムから溶出した。
【０３１１】
８．ウイルス不活性化のための低ｐＨの維持。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ溶出液を、ウイルス不活性化のために、０．２Ｍ  クエン酸緩衝液、ｐＨ３．４の添加によりｐＨ３．５±０．１に酸性化し、約１時間低ｐＨで維持し、０．２Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０の添加によりｐＨ５．０±０．１に再調節し、次いで、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ポリッシングカラムに充填した。
【０３１２】
９．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ  ＨＩＣカラムを、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０中で平衡化し、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０に調節した低ｐＨウイルス不活性化Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ溶出液を充填した。充填したカラムを、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０（緩衝液Ａ）で洗浄した。ＧＡＬＮＳを、３５％の緩衝液Ａと６５％の緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  リン酸塩／酢酸塩、ｐＨ５．０）との混合液で、カラムから溶出した。
【０３１３】
１０．緩衝液交換およびｒｈＧＡＬＮＳの３ｍｇ／ｍＬへの調節。ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ  ＨＩＣ溶出液を、緩衝液交換して、２０ｍＭ酢酸、５０ｍＭリン酸、３０ｍＭアルギニン、２％（ｖ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ５．４にし、次いで、同じ緩衝液中のＧＡＬＮＳの最終濃度を３  ｍｇ／ｍＬに調節した。
【０３１４】
１１．濾過によるウイルスおよびＤＮＡの除去  緩衝液交換したＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ  ＨＩＣ溶出液を、ウイルスフィルタ（ＤＶ２０）およびＤＮＡフィルタ（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ）を使用して濾過し、あらゆる残存ウイルスおよびＤＮＡを除去した。
【０３１５】
１２．ＰＳ２０を０．０１％まで添加。ウイルスおよびＤＮＡ濾過した、緩衝液交換したＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ  ＨＩＣ溶出液を、０．０１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０（ＰＳ２０またはＴｗｅｅｎ−２０）に調節した。
【０３１６】
１３．２〜８℃または冷凍でのＢＤＳの保管。精製されたＧＡＬＮＳの最終製剤、すなわち、原薬（ＢＤＳ）を、２〜８℃または冷凍で保管した。
【０３１７】
結果。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果（図１２、レーン５を参照されたい）に見られるように、見かけの分子量の大きなバンドは、約５５ｋＤａであり、ＧＡＬＮＳ単量体に対する期待値と一致する。第Ｉ／ＩＩ相プロセス（レーン３）を使用して生成された、ロット＃ＡＰ４００８０２の、見かけの分子量約４０ｋＤａおよび約１９ｋＤａにおけるバンドの移動は、Ｑ３４８とＧ３４９の間のタンパク質分解の切除からもたらされた、ＧＡＬＮＳの分解生成物である。この切除は、第ＩＩＩ相プロセス（レーン５）を使用して生成された、ロット＃ＢＭＮ１１０−０１１０−００１において、大いに減少した。約４０ｋＤａの切断生成物よりもわずかに鈍く移動する、小さなバンドが、いずれの製剤においても存在する。
【０３１８】
さらなるプロセス変更の概要。修正された第ＩＩＩ相プロセスを、以下の特定の問題に取り組むために開発した。（ｉ）濃縮した収集物中の沈殿物の形成、（ｉｉ）Ｚｎ−ＩＭＡＣ捕捉ステップにおけるＧＡＬＮＳの損失、（ｉｉｉ）ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌステップ中の画分の洗浄におけるＧＡＬＮＳの損失、および（ｉｖ）ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌステップの溶出液中の高レベルのＣＨＯＰ不純物の存在。
【０３１９】
修正した第ＩＩＩ相プロセス。ＧＡＬＮＳの回収および精製のための例示的な第ＩＩＩ相プロセスにおけるステップのそれぞれを、以下に概説する。
【０３２０】
１．無細胞収集物（１倍）。ヒトＳＵＭＦ１およびヒトＧＡＬＮＳを共発現する、安定にトランスフェクトされたＧ７１細胞を、実施例ＩＩＩに記載のバイオリアクター培養条件下で、増殖させた。ＧＡＬＮＳを含有するバイオリアクター物質（すなわち、細胞培養流体）を、ｐＨ６．５で収集し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＤＯＨＣの濾過系列、続いて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＸＯＨＣ、および０．２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＨＣフィルタを使用して、濾過した。
【０３２１】
２．ＵＦ／ＤＦ（２０倍）。細胞培養流体を、伝導率≦７ｍＳ／ｃｍで、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５中で、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）した。ＵＦ／ＤＦステップは、３０ｋＤａのＨｙｄｒｏｓａｒｔカセットを使用して、行った。細胞培養流体を、２０倍に濃縮した。
【０３２２】
３．炭フィルタ。ＵＦ／ＤＦ（２０倍）物質を、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  Ｒ５５活性炭（Ｚ１２７４）を通して濾過し、続いて、２〜８℃での保管前に、０．２μｍのフィルタを使用して、滅菌濾過した。
【０３２３】
４．固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）。Ｚｎ−固定化金属親和性クロマトグラフィー（Ｚｎ−ＩＭＡＣ）カラムを、５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０で洗浄し、５０ｍＭ  ＺｎＳＯ４を補充し、５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０で洗浄し、次いで、５ｍＭイミダゾールを含有する、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で平衡化した。平衡化したＺｎ−ＩＭＡＣに、７５：２５（ｖ／ｖ）の比率で２．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ９．２±０．１と、Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムの充填中、順に混合することにより、ｐＨ７．０±０．１で、炭濾過したＵＦ／ＤＦ（２０倍）物質を、伝導率約５０±５ｍＳ／ｃｍにおいて充填した。充填したカラムを、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、続いて、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）で、洗浄した。ＧＡＬＮＳを、７０％の緩衝液Ａと３０％の緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）との混合液で、カラムから溶出した。
【０３２４】
５．ｐＨの調節および濾過。Ｚｎ−ＩＭＡＣカラム溶出液を、１．７５Ｍ酢酸、ｐＨ４．０で、ｐＨ４．５±０．１に調節し、次いでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＯＨＣフィルタを使用して濾過した。濾過した物質を、３０：７０（ｖ／ｖ）の比率で、陽イオン交換カラムの充填中に、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、ｐＨ４．５と順に混合した。
【０３２５】
６．陽イオン交換クロマトグラフィー。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ陽イオン交換カラムを、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５中で平衡化させ、伝導率＜７ｍＳ／ｃｍにおいてｐＨ４．５±０．１に調節した、濾過したＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液を充填した。充填したカラムを１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５、続いて１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、ｐＨ５．０（緩衝液Ａ）と１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０（緩衝液Ｂ）との８０％：２０％混合液で、洗浄した。ＧＡＬＮＳを、８０％〜２５％緩衝液Ａ中の、直線勾配２０〜７５％の緩衝液Ｂ（すなわち、５０〜１９０ｍＭ  ＮａＣｌ）で、カラムから溶出した。
【０３２６】
７．ウイルス不活性化のための低ｐＨの維持。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ溶出液を、ウイルス不活性化のために、０．４Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．４の添加によりｐＨ３．５±０．１に酸性化し、約１時間低ｐＨで維持し（温度１２〜２３℃）、０．４Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０の添加によりｐＨ５．０±０．１に再調節し、５Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸／酢酸緩衝液、ｐＨ５と混合し、最終濃度２Ｍ  ＮａＣｌを達成し、次いで、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ポリッシングカラムへの充填前に０．２μｍのフィルタを通して濾過した。
【０３２７】
８．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ  ＨＩＣカラムを、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．４中で平衡化し、濾過した、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．３〜４．４に調節した低ｐＨウイルス不活性化Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ溶出液を充填した。充填したカラムを、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．４、続いて、１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０（緩衝液Ａ）で、洗浄した。ＧＡＬＮＳを、０〜６８％の緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸塩／酢酸塩、ｐＨ５．０）中、直線勾配１００％〜３２％の緩衝液Ａ（すなわち、２．５〜０．８Ｍ  ＮａＣｌ）、続いて、３２％の緩衝液Ａと６８％の緩衝液Ｂとの混合液（すなわち、０．８Ｍ  ＮａＣｌ）で、カラムから溶出した。
【０３２８】
９．緩衝液交換、濾過によるＤＮＡおよびウイルス除去、ならびにｒｈＧＡＬＮＳの３ｍｇ／ｍＬへの調節。ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ  ＨＩＣ溶出液を、緩衝液交換して、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３０ｍＭアルギニン−ＨＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ５．４にした。緩衝液交換したＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ  ＨＩＣ溶出液を、ＤＮＡフィルタ（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ）およびウイルスフィルタ（ＤＶ２０）を使用して、濾過し、あらゆる残存ＤＮＡおよびウイルスを除去した。濾過した、緩衝液交換されたＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ  ＨＩＣ溶出液を、次いで、上述のものと緩衝液中で、最終ＧＡＬＮＳ濃度３ｍｇ／ｍＬに調節した。
【０３２９】
１０．ＰＳ２０を０．０１％まで添加。ＤＮＡおよびウイルス濾過した、緩衝液交換したＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ  ＨＩＣ溶出液を、０．０１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０（ＰＳ２０またはＴｗｅｅｎ−２０）に調節した。
【０３３０】
１１．２〜８℃または冷凍でのＢＤＳの保管。精製されたＧＡＬＮＳの最終製剤、すなわち、原薬（ＢＤＳ）を、０．２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋ  ２００フィルタを通過させて、最終保管容器に入れ、バッグで２〜８℃または冷凍で保管した。
【０３３１】
結果。この修正した第ＩＩＩ相プロセスにより、Ｚｎ−ＩＭＡＣおよびＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＢｕｔｙｌカラムへのＧＡＬＮＳの結合が改善され、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ溶出液中のＣＨＯＰ不純物が減少する。この修正された第ＩＩＩ相プロセスにより精製されたＧＡＬＮＳは、試験された特性の全て（例えば、以下の表７のもの）が、上述の第ＩＩＩ相プロセスによって精製された酵素と同程度である。
【０３３２】
第ＩＩＩ相回収および精製プロセスにより製造されたｒｈＧＡＬＮＳの特徴付け。第ＩＩＩ相プロセスを使用して精製されたＧＡＬＮＳを、第Ｉ／ＩＩ相プロセスにより精製された酵素と比較した。特徴付けの結果を、表７に示す。いずれのＧＡＬＮＳ製剤も、試験された特性の全てにおいて同程度であったが、第ＩＩＩ相プロセスにより精製された酵素は、第Ｉ／ＩＩ相プロセスにより精製されたものと比較して、著しく少ない切除を示した。
【表７】
0006030553.tif 000009
【０３３３】
表８は、ＳＤＳ−ＣＧＥ方法を使用して、第Ｉ／ＩＩ相プロセス（６５．３〜９３．７％）または第ＩＩＩ相プロセス（９８〜９９．６％）のいずれかを使用して調製されたロットにおける、最終的な精製された製剤中の完全なＧＡＬＮＳパーセントを比較する。ここで得られた値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法から得られた結果を支持し、精製プロセスに加えられた修正の結果として、切除の範囲が有意に減少したことを示す。
【表８】
0006030553.tif 000010
【０３３４】
これらのアッセイは、切除を最小限に抑えた組み換え型リソソームスルファターゼ酵素を調製するための上述のプロトコルが、高度に精製された酵素、特に、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の分泌されたプレプロセッシング（前駆体）形態の、大量生成のための効果的な方法を提供することを示す。
実施例ＶＩＩ
精製されたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の特徴付け
【０３３５】
Ｇ７１細胞株は、平均的な哺乳動物の細胞株に見られるものよりも、高いレベルで高マンノースリン酸化を有し、対応して、より低いレベルで非リン酸化高マンノース型オリゴ糖を有する、タンパク質（例えば、リソソーム酵素）を生成する。本明細書に定義される、高レベルのビスリン酸化された高マンノース型オリゴ糖を含む、リソソームスルファターゼ酵素（例えば、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））を、複合オリゴ糖を含まず、高マンノース型オリゴ糖のみを示す、Ｃａｎｆｉｅｌｄらの米国特許第６，５３７，７８５号において得られる分子と比較する。
【０３３６】
リソソームスルファターゼ酵素における、非リン酸化高マンノースのレベルを判定するために、当業者は、放出されたオリゴ糖のエキソグリコシダーゼ配列決定法（「ＦＡＣＥ配列決定法」）を使用して、非リン酸化高マンノース型オリゴ糖鎖の割合を特定することができる。通常のロット放出のＦＡＣＥプロファイリングゲル上で、非リン酸化高マンノースは、特定の複合オリゴ糖（例えば、オリゴマンノース６および完全にシアル化された二分枝複合体）と、共に移動する。非リン酸化高マンノースを、次いで、酵素配列決定法により他のオリゴ糖から分化する。
【０３３７】
Ｇ７１Ｓ細胞に発現される精製されたリソソームスルファターゼ酵素（例えば、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））が、リン酸化の増加を示すかどうかを判定するために、リソソームスルファターゼ酵素上のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）のレベル、ならびに酵素がＭ６Ｐ受容体（ＭＰＲ）に結合する能力を判定した。
【０３３８】
Ｇ７１Ｓ細胞に発現し、精製された、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素を、蛍光支援炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）、およびＭＰＲ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂でのクロマトグラフィーによって、分析した。ＦＡＣＥシステムは、糖タンパク質から放出されるオリゴ糖の分離、定量化、および判定に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する。ＦＡＣＥ上のオリゴマンノース７ビスリン酸（Ｏ７Ｐ）バンドの相対強度（Ｈａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９（１５）：２６１２−２０，１９９８）およびＭＰＲカラムに保持された活性パーセント（Ｃａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（４３）：１５１５４−６１，１９９８）は、タンパク質１モル当たりのリン酸化レベルの信頼できる尺度をもたらす。
【０３３９】
比活性。組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の比活性を、３７℃で、小分子蛍光基質４−メチルウンベリフェリル−６−Ｓ−ＧＡＬ（４ＭＵ−Ｇａｌ−６Ｓ）を使用して判定した。このアッセイを使用して、精製されたＧＡＬＮＳの比活性は、１６５μｍｏｌ／分／ｍｇ（０．１６５Ｕ／ｍｇ）であった。
【０３４０】
ヒト血清の安定性。ＧＡＬＮＳのエキソビボ血清安定性を判定した。ヒト血清（Ｓｉｇｍａ  Ｈ−４５２２）を、０．２μｍのＰＥＳフィルタを通して滅菌濾過し、４ｍＬの濾過滅菌したヒト血清を、Ｔ−２５細胞培養フラスコにおいて３７℃で１時間、１０％  ＣＯ２雰囲気下でプレインキュベートした（この時点のｐＨは７．４±０．１である）。０．４ｍＬの脱塩した精製されたＧＡＬＮＳ（２ｍｇ／ｍＬの精製されたＧＡＬＮＳを、Ｂｉｏ−ＲＡＤ  １０ＤＧカラムを使用してＰＢＳ中で脱塩した）を、プレインキュベートしたヒト血清、または０．５ｍｇ／Ｌ  ＢＳＡを含有するＰＢＳ対照に添加した。１００μＬの試料を、指定の時点（例えば、０、１、３．５、７．５、および２６時間）で回収し、９００ｍＬのクエンチ緩衝液（ＱＢ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．６＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ＋０．００１％  Ｔｗｅｅｎ−８０）に添加した。試料を、ＧＡＬＮＳ酵素活性の測定準備が整うまで、４℃で保管した。
【０３４１】
ＧＡＬＮＳ酵素活性を、酵素捕捉活性ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＧＡＬＮＳ酵素活性の％残留の指数関数的減衰曲線を外挿法により推定することによって、精製されたＧＡＬＮＳのエキソビボ血清半減期は、２１７時間であると推定した。
【０３４２】
滑膜細胞（軟骨細胞）への取り込み。ＧＡＬＮＳが滑膜細胞（軟骨細胞）内へ取り込まれる能力を判定した。
【０３４３】
軟骨細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１８３２）を、増殖培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％  ＦＢＳ）において、３７℃で５％ＣＯ２中、３７℃で、１２ウェルディッシュで培養した。３つの試料の取り込みの分析は、４×１２ウェルプレートを必要とした。精製されたＧＡＬＮＳ試料およびＧＡＬＮＳ基準を、ａｃＰＢＳ／ＢＳＡ（酸性ＰＢＳ＋２００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中で、１μＭに希釈した。１μＭのストックから、ＧＡＬＮＳ試料および基準の取り込み希釈曲線を作成した。５ｍＬの取り込みアッセイ希釈剤（ＵＡＤ、ＤＭＥＭ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中に５０．５μＬ（１μＭ  ｒｈＡＳＢ）を入れて、結果として１０ｎＭのＧＡＬＮＳ試料および基準を生じさせ、さらにＵＡＤ中での２倍連続希釈によって、５、２．５、１．２５、０．６２、０．３１、および０．１６ｎＭに連続希釈した。コンフルエントな軟骨細胞の１２ウェルディッシュ由来の増殖培地を吸引し、１ｍＬのＵＡＤ（ブランク）またはＧＡＬＮＳ試料もしくは基準物の連続希釈物をウェルに添加し、１０％  ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で４時間インキュベートした。取り込み培地を吸引し、完全にするために各ディッシュを傾斜させ、各ウェルを、１ｍＬのＰＢＳで１回すすいだ。ＰＢＳを吸引し、軟骨細胞を、１ウェル当たり０．５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン／０．１％  ＥＤＴＡ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ２５−０５３−ＣＩ、ロット２５０５３０２５））を添加することにより、分離した。プレートからの分離後、軟骨細胞を、氷上で事前冷却したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管（全３０管）に等分した。トリプシン処理した軟骨細胞を、冷却し、次いで、微量遠心分離機において低速でペレット化した（４０００ｒｐｍで３分間）。トリプシンを完全に吸引し、細胞ペレット１ｍＬ  ＰＢＳですすぎ、微量遠心分離および吸引ステップを１回繰り返した。２００μＬの細胞溶解緩衝液（ＣＬＢ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を各管に添加した。細胞ペレットを、３回パルスボルテックスすることにより、再懸濁した。再懸濁後、細胞溶解混合物を、−８０℃で一晩保管したか、または直ぐに分析した。
【０３４４】
細胞溶解物を、室温で解凍し、解凍後氷上に移した。細胞溶解物をボルテックスして、あらゆる可視固体物質を再懸濁し、次いで１４Ｋｒｐｍで１０分間、４℃において微量遠心分離機で回転させ、不溶性物質をペレット化した。上清を新しい管の組に移し、ペレットを廃棄した。次いで、ＧＡＬＮＳ活性アッセイを上清で行った。７点希釈曲線（１０ｎＭで開始し、０．１６ｎＭで終了する連続２倍希釈）を通常に行い、これは、予想されるＫ取り込みを、両側に極めて均等に包囲する。開始試料のモル濃度は、タンパク質のみの分子量を使用して、計算する。
【０３４５】
精製されたＧＡＬＮＳは、滑膜細胞への取り込みに対して、単一部位のリガンド結合に基づいて、４．９ｎＭのＫｄを有した。
【０３４６】
マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体プレート結合アッセイ。ＧＡＬＮＳが、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体に結合する能力を、プレート結合アッセイで判定した。ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ高結合プレートを、４μｇ／ｍＬ  Ｍ６Ｐ受容体でコーティングした。コーティングしたプレートを、２５０  μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（ＷＢ、ＴＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、非特異的結合を２００  μＬ／ウェルのブロッキングおよび希釈緩衝液（ＢＤＢ、Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ緩衝液、ロット＃ＣＡ４６４８５）でブロッキングした。プレートを、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。このブロッキングステップの間、精製されたＧＡＬＮＳ試料（０．５〜２ｍｇ／ｍＬ、４℃で２週間保管）を、ＢＤＢ中で１０ｎＭに希釈し、次いで、希釈緩衝液（ＤＢ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０＋０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中で連続希釈し（２５０μＬ＋２５０μＬ）、５、２．５、１．２５、０．６２、０．３１、および０．１６ｎＭまで下げた。ブロッキングしたプレートを、上述のようにＷＢで洗浄し、希釈したＧＡＬＮＳ試料を１００μＬ／ウェルで２組のウェルに分注し、室温で１時間インキュベートした。このインキュベーションステップ中に、０．１ｍＬの１００ｍＭ  ６Ｓ−ガラクトース−４ＭＵ  ストック（Ｈ２Ｏ中、−２０℃で保管）を５ｍＬのＤＢ中に希釈することによって、２ｍＭの活性基質を調製し、３７℃の水浴で事前に温めた。インキュベーション後、プレートを、上述のようにＷＢで２回洗浄し、１００μＬの希釈した基質を添加し、ＧＡＬＮＳの比活性を判定した。
【０３４７】
アッセイを使用して、精製されたＧＡＬＮＳは、Ｍ６Ｐ受容体への結合に対して、単一部位の結合に基づいて、２．４ｎＭのＫｄを有した。
【０３４８】
マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体カラム結合。ＧＡＬＮＳが、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体に結合する能力を、カラム結合アッセイで判定した。Ｍ６Ｐ受容体カラムを、製造業者の指示書に従って調製した。Ｍ６Ｐ  受容体は、Ｐｅｔｅｒ  Ｌｏｂｅｌの研究室からのものであり、カラム樹脂は、ＮＨＳの活性化樹脂（Ｂｉｏ−ＲＡＤ  Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １５）であり、カラム寸法は、０．７ｍＬであった。Ｍ６Ｐ受容体カラムを、流速０．２５ｍＬ／分において、１０カラム体積（ＣＶ）の平衡緩衝液（ＥＱ、酸性ＰＢＳ、ｐＨ６．０、５ｍＭ  β−グリセロリン酸、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭグルコース−１−リン酸、および０．０２％  ＮａＮ３を含有）で、平衡化した。６μｇの精製されたＧＡＬＮＳ（２００μｌ当たり）を、流速０．１ｍＬ／分で、Ｍ６Ｐ受容体カラムに充填した。結合していないＧＡＬＮＳを、流速０．２５ｍＬ／分で、１０ＣＶのＥＱでカラムから洗い流した。結合したＧＡＬＮＳを、勾配（１０ＣＶ）、続いて２ＣＶの１００％ＥＬの０〜１００％溶出緩衝液（ＥＬ、酸性ＰＢＳ、ｐＨ６．０、５ｍＭ  β−グリセロリン酸、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、５ｍＭマンノース−６−リン酸、および０．０２％  ＮａＮ３を含有）を使用して、カラムから溶出した。カラムを、３ＣＶのＥＱで再平衡化した。
【０３４９】
ＧＡＬＮＳ  ＥＬＩＳＡを使用して、Ｍ６Ｐ受容体に結合した精製されたＧＡＬＮＳのパーセントは、５６％であると判定した。
【０３５０】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）による全オリゴ糖分析。ＧＡＬＮＳ上のマンノース−６−リン酸化のレベルを判定するために、ＧＡＬＮＳ上の全オリゴ糖のＮ結合型炭水化物プロファイルを、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１（２２）：５１８５−５１９２，１９９９に記載のように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって、判定した。本方法は、アスパラギンＮ結合型オリゴ糖を切断するために、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを使用した。切断されたオリゴ糖を、蛍光色素で単離および誘導化し、Ｇ１０スピンカラムに適用させて、余分な色素を除去した。精製された、蛍光標識化されたオリゴ糖を、電気泳動的に分離し、ピークを、続いてＭＤＱ−ＣＥソフトウェア（３２  Ｋａｒａｔ  Ｖｅｒ．７．０）を使用して、定量化した。
【０３５１】
このアッセイを使用して、精製されたＧＡＬＮＳに対する、ビスリン酸化されたマンノース７（ＢＰＭ７）、モノリン酸化されたマンノース６（ＭＰＭ６）、およびオリゴ糖を含有するシアル酸の量は、それぞれ、０．５８ｍｏｌ／モル酵素、０．０８ｍｏｌ／モル酵素、および検出不可能であった。ＢＰＭ７を含有するＧＡＬＮＳタンパク質のパーセントは、２９％であると推定した。
【０３５２】
ビス７オリゴ糖の特徴付け。ＧＡＬＮＳ上のビスリン酸化されたマンノース７（ＢＰＭ７）オリゴ糖の位置を、判定した。位置１７８のアスパラギン（Ａｓｎ）残基は、ＢＰＭ７に対してＮ結合型でグリコシル化した。位置３９７のＡｓｎ残基は、ＢＰＭ７に対してＮ結合型グリコシル化されなかったが、主にオリゴマンノース型の糖であることがわかった。
【０３５３】
ヒドロキシアパタイト親和性。インビトロ骨モデルを開発し、ＧＡＬＮＳが、骨に標的化する能力を有するかどうかを判定した。４ｍｇ／ｍＬのＨＴＰ−ＤＮＡグレードのヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）懸濁液を調製し、ＤＢＳ＋５０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４中で平衡化した。精製したＧＡＬＮＳを、５０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡの添加後、ＤＢＳ、ｐＨ７．４中で脱塩した。おおよそ２ｍｇ／ｍＬの最終濃度の脱塩したＧＡＬＮＳを、９６ウェルプレートにおいて、ＤＢＳ＋５０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４中で連続希釈した。５０μＬの連続希釈したＧＡＬＮＳを、９６ウェルフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＭＳＧＶＮ２２１０、親水性ＰＶＤＦ、低タンパク質結合、細孔寸法２２μｍ）に移した。５０μＬのヒドロキシアパタイト懸濁液を、連続希釈したＧＡＬＮＳを含有するフィルタプレートのウェルに添加し、穏やかに揺動させながら３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、真空濾過に供した。
【０３５４】
真空フィルタの上清を、上述のように、ＨＰＬＣまたはＧＡＬＮＳ酵素活性のいずれかによって分析した。精製されたＧＡＬＮＳは、ヒドロキシアパタイトに対して３〜４．０μＭのＫｄを有した。
【０３５５】
ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）を発現するＧ７１Ｓ細胞株は、高い量の活性化（すなわち、活性部位のシステイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への変換）を有する、リソソームスルファターゼ酵素を生成する。
【０３５６】
Ｇ７１Ｓ細胞において、ＳＵＭＦ１と共発現される、精製された組み換え型リソソームスルファターゼ酵素（例えば、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ））が、活性の増加を示すかどうかを判定するために、精製されたリソソームスルファターゼ酵素における、活性部位のシステイン残基のＦｇｌｙへの変換量を判定した。
【０３５７】
ＧＡＬＮＳの活性化。ＧＡＬＮＳの活性化パーセント、すなわち、活性部位のシステイン（Ｃｙｓ）システイン残基のＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への変換パーセントを、ＬＣ／ＭＳ（ＴＦＡ）によって判定した。Ｃｙｓ、Ｆｇｌｙ、およびＧｌｙに対するＴＩＣ／１０００は、それぞれ、３９、１８４０、および１８３であり、精製されたＧＡＬＮＳの約９０％が、活性（すなわち、ＦＧｌｙ）形態であることを示す。
【０３５８】
概要。表９は、Ｇ７１Ｓクローン４細胞において発現した組み換え型ＧＡＬＮＳの特徴付けの概要を示す。表１０は、Ｇ７１ＳクローンＣ２細胞において発現した組み換え型ＧＡＬＮＳの特徴付けの概要を示す。
【表９】
0006030553.tif 000011
【表１０】
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【０３５９】
これらの結果は、精製された組み換え型ヒトＧＡＬＮＳが、高レベルの活性化、および高レベルのマンノース６−リン酸のリン酸化を有することを示す。したがって、ＳＵＭＦ１およびリソソームスルファターゼ酵素（すなわち、ＧＡＬＮＳ）を共発現するＧ７１Ｓ細胞は、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素を効率的に生成する。このようなリソソームスルファターゼ酵素における高いマンノース残基のレベルの増加は、細胞上のＭＰＲによる取り込みの増加につながる。
実施例ＶＩＩＩ
インビトロにおける、モルキオ軟骨細胞への組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の取り込みおよび活性
【０３６０】
インビトロにおいて、モルキオ軟骨細胞のリソソームによる組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の取り込み、およびＧＡＬＮＳのケラタン硫酸（ＫＳ）を分解する能力を評価した。
【０３６１】
ムコ多糖症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ、モルキオ症候群）を有する患者由来の軟骨細胞は、低減したＧＡＬＮＳ活性を有し、かつＫＳのリソソーム蓄積を示す。ＭＰＳ  ＩＶａのインビトロモデルを、ＭＰＳ  ＩＶａ患者の腸骨稜生検から単離された軟骨細胞を用いて確立した。しかしながら、初代軟骨細胞は脱分化し、培養中にそれらの軟骨細胞の特性を失う。したがって、培養条件を、インビトロで軟骨細胞の分化を誘導するために確立した。
【０３６２】
ＭＰＳ  ＩＶａ患者から単離された軟骨細胞（ＭＱＣＨと示される）を、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β、トランスフェリン、インスリン、およびアスコルビン酸（軟骨細胞増殖培地、Ｌｏｎｚａ♯ＣＣ−３２２５）の存在下で、アルギネートビーズ中で培養した。培地を、６週から１５週にかけて、実験期間の間、１週間に２回取り替えた。これらの培養条件は、軟骨細胞の表現型の発現および分化を誘導した。これらのＭＱＣＨ細胞は、ＭＱＣＨ細胞の培養から単離されたＲＮＡを用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定されるとき、性決定領域Ｙ−ｂｏｘ９（Ｓｏｘ９）、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＸ、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質およびアグレカン（ａｇｇｒｅｇａｎ）のｍＲＮＡを含む軟骨細胞マーカーを発現した。これらの培養されたＭＱＣＨ細胞はまた、細胞外のマトリックスを合成した。
【０３６３】
共焦点顕微鏡検査を、ＭＱＣＨ細胞がＫＳを蓄積したことを確認するために行った。８週の培養におけるＭＱＣＨ細胞を、トリプシン処理し、スライドガラス上にサイトスピンし（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）、アセトン中で固定し、使用まで冷凍した。解凍後、細胞を再水和し、一次抗体および二次抗体として、抗ＫＳモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびＡｌｅｘａ−４８８（緑）が共役したヤギ抗ウサギ抗体をそれぞれ用いて染色した。ＭＱ−ＣＨ細胞は、リソソームのＫＳ蓄積と一致する、点状の細胞内染色を示した。
【０３６４】
精製された組み換え型ヒトＧＡＬＮＳがＭＱＣＨ細胞によってリソソームに取り込まれ、ＫＳを分解し得るかどうかを決定するために、６週のＭＱＣＨ細胞培養物を、９週間の間、週に２回、１０ｎＭの組換え型ヒトＧＡＬＮＳと共にインキュベートした。ＧＡＬＮＳ取り込みおよびＫＳの除去を共焦点顕微鏡検査によって測定した。使用した一次抗体は、（ａ）抗ＧＡＬＮＳウサギポリクローナル抗体および抗リソソームに付随した膜タンパク質（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）−１（ＬＡＭＰ−１）モノクローナル抗体、または（ｂ）抗ＫＳモノクローナル抗体および抗ＬＡＭＰ−１ポリクローナル抗体であった。使用した二次抗体は、抗ＧＡＬＮＳ抗体もしくは抗ＫＳ抗体を検出するためのＡｌｅｘａ−４８８（緑）が共役された抗体、または抗ＬＡＭＰ−１抗体を検出するためのＡｌｅｘａ−５５５もしくは−５９４（赤）が共役された抗体であった。ＭＱＣＨ細胞調製物を、核を染色するＤＡＰＩを含有する包理剤（ｍｏｕｎｔａｎｔ）中でマウントした。
【０３６５】
ＧＡＬＮＳ酵素およびＫＳとリソソームマーカーのＬＡＭＰ−１との顕著な共局在化を、ＧＡＬＮＳで処理したＭＱＣＨ細胞において観察した。ＭＱＣＨを組み換え型ヒトＧＡＬＮＳに曝露すると、細胞内ＫＳの量が減少した。
【０３６６】
ＧＡＬＮＳ取り込みはまた、ＧＡＬＮＳ酵素捕捉ＥＬＩＳＡおよびＧＡＬＮＳ比活性ＥＬＩＳＡ（両方とも上の実施例ＩＶに記載）を用いて測定した。ＧＡＬＮＳを発現する正常なヒト軟骨細胞（ＮＨＫＣ）を、陽性対照として用いた。表１１および１２に示されるように、処理されていないＭＱＣＨ細胞は、検出可能なＧＡＬＮＳ酵素も活性も有さなかったが、一方、１０ｎＭのＧＡＬＮＳを用いて９週間処理したＭＣＱＨ細胞は、有意なＧＡＬＮＳ酵素および活性を有した。
【表１１】
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【表１２】
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【０３６７】
これらの結果は、インビトロで、精製された組み換え型ヒトＧＡＬＮＳが、モルキオ軟骨細胞によってリソソームに取り込まれ、リソソームのＫＳを分解し得ることを示す。これらのモルキオ軟骨細胞は、ＫＳを分解するＧＡＬＮＳ等のリソソームスルファターゼ酵素を試験するためのインビトロ有効性モデルとして有用である。
実施例ＩＸ
インビトロの細胞に基づくアッセイにおける、天然基質を分解する組み換え型ヒトリソソーム酵素の活性
【０３６８】
細胞に基づくインビトロのアッセイを、天然基質を分解する組み換え型ヒトリソソーム酵素、例えばリソソームスルファターゼ酵素の活性を測定するために開発した。
【０３６９】
組み換え型ヒトリソソーム酵素、例えばリソソームスルファターゼ酵素の酵素活性を、典型的に、人工の蛍光原基質を用いる無細胞のインビトロアッセイによって測定する（ＧＡＬＮＳについては実施例４を参照）。しかしながら、測定される酵素活性は、人工の基質の大きさ、すなわち、単糖類単位数に依存する。加えて、酵素活性を、インビボの状態を反映しない環境において測定する。したがって、この無細胞のインビトロアッセイは、天然基質を切断するリソソームの能力、または標的細胞に取り込まれ、リソソームに局在するリソソーム酵素の能力、そのいずれも、考慮に入れていない。
【０３７０】
細胞に基づくインビトロのアッセイを、２つの組み換え型ヒトリソソーム酵素であるα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）およびアリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）が、それらの天然基質、すなわち、細胞内のデルマタン硫酸（ＤＳ）含有基質を分解する活性を測定するために開発した。ＤＳは、変動的に硫酸化されたイズロン酸β（１−３）−Ｎ−アセチル−ガラクトサミンβ（１−４）二糖類単位を含有する。
【０３７１】
ＡＲＳＢ欠損ＧＭ００５１９ヒト線維芽細胞またはＩＤＵ欠損ＧＭ０１３９１ヒト線維芽細胞を、１２ウェルプレートにおいて密集するまで（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）培養し、この培養物を、細胞内のＤＳの蓄積を可能にするために３〜６週間、密集後維持した。
【０３７２】
次いで、密集後のＧＭ００５１９またはＧＭ０１３９１細胞を、飽和量の組み換え型ヒトＡＲＳＢ（１０ｎＭ）または組み換え型ヒトＩＤＵ（２５ｎＭ）のそれぞれに４〜５日間曝露した。処理していない細胞およびリソソームスルファターゼ酵素で処理した細胞を収集し、溶解し、遠心分離した。
【０３７３】
細胞溶解産物中のリソソーム酵素活性を、（１）細胞を溶解すること、（２）細胞溶解産物において、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（ＥＣ４．２．２．４）を用いてＤＳ含有基質を二糖類に特異的に消化すること、（３）蛍光色素（例えば、２−アミノ−アクリドン、ＡＭＡＣ）を用いてＤＳ二糖類を標識すること、（４）ＤＳ二糖類を分離すること（例えば、キャピラリーゾーン電気泳動、ＣＺＥ）、および（５）標識されたＤＳ二糖類を検出すること（例えば、レーザー誘起蛍光、ＬＩＦ）によって、細胞の残余のＤＳ含有量を決定することにより測定した。そのような方法を、例えば、Ｚｉｎｅｌｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２：２４３９−２４４７，２００７、およびＬａｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ７３０：１２９−１３３，１９９９において記載する（Ｖｏｌｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２９：３０９５−３１０６，２００８において概説する）。
【０３７４】
表１３は、優勢なＤＳ二糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸塩を含有する二糖類（４Ｓ二糖類）の量を測定することによって決定されるときの、ＡＲＳＢを用いて処理されたＧＭ００５１９細胞を用いる、ＤＳの分解率を示す。類似した結果を、ＩＤＵを用いて処理されたＧＭ０１３９１細胞を用いて得た。
【表１３】
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【０３７５】
上記のアッセイは、標的細胞が組み換え型ヒトＡＲＳＢおよびＩＤＵを取り込み、次いで、リソソームに局在し、そこで、これらの天然基質の細胞内ＤＳを分解することを示した。
【０３７６】
用量発見実験を、ＩＤＵがこの細胞に基づくアッセイにおいて律速になる濃度を決定するために行った。ＧＭ０１３９１細胞を、１２ウェルプレートにおいて培養した。密集から４週間後に、細胞を、６または２６時間、０．８ｎＭ〜２５ｎＭの種々の濃度のＩＤＵに曝露した。細胞溶解産物を、上述のように、調製し、プロセッシングした。ＩＤＵは、１ｎＭを下回る律速にならないと決定した。
【０３７７】
第２の用量発見実験では、密集から３週間後に、ＧＭ０１３９１細胞を、０．０１〜０．２ｎＭの種々の濃度のＩＤＵに２日間曝露した。細胞溶解産物を、上述のように、調製し、プロセッシングした。この実験では、既知量の内部標準単糖類のＧｌｃＮＡｃ−６Ｓを、プロセッシング中の回収を制御するために細胞溶解産物に添加した。図１３に示されるように、ＤＳ基質の量における用量依存的減少を、ＩＤＵで処理したＧＭ０１３９１細胞において観察した。
【０３７８】
同様の用量発見実験では、密集から３週間後に、ＧＭ００５１９細胞を、０．００１〜０．０６ｎＭの種々の濃度のＩＤＵに５日間曝露した。細胞溶解産物を、上述のように、調製し、プロセッシングした。この実験では、既知量の内部標準単糖類のＧｌｃＮＡｃ−６Ｓを、プロセッシング中の回収を制御するために細胞溶解産物に添加した。図１４に示されるように、ＤＳ基質の量における用量依存的減少を、ＡＲＳＢで処理したＧＭ００５１９細胞において観察した。
【０３７９】
細胞に基づくインビトロアッセイを、天然基質、すなわち、細胞内のケラタン硫酸（ＫＳ）含有基質を分解する、組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素であるＧＡＬＮＳの活性を測定するために開発した。
【０３８０】
ＧＡＬＮＳ欠損ＭＱＣＨ細胞を、上記の実施例８に記載されるように培養し、１または１０ｎＭの組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを用いて処理した。処理後、ＭＱＣＨ細胞溶解産物を調製し、大きなＫＳオリゴ糖をＫＳ二糖類に分解するケラタナーゼＩＩ（ＥＣ３．２．１）を用いて消化した。このＫＳ二糖類を、ＤＳ二糖類について上に記載されるように、ＡＭＡＣを用いて標識し、ＣＺＥによって分離し、ＬＩＦによって検出した。ＫＳ単糖類のＧｌｃＮＡｃ−６Ｓを、プロセッシング中の回収を制御するために、内部標準として細胞溶解産物に添加した。２つの特徴的なＫＳ二糖類であるＧａｌ６Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ６ＳおよびＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓの量を測定し、得られたデータを、回収されたＧｌｃＮＡｃ６Ｓの量によって補正した。表１４は、２つの特徴的なＫＳ二糖類の量を測定することによって決定されるときの、ＧＡＬＮＳで処理されたＭＱＣＨ細胞を用いたＫＳの分解率を示す。
【表１４】
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【０３８１】
上記のアッセイは、標的細胞が組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを取り込み、次いで、リソソームに局在し、そこで、ＧＡＬＮＳがその天然基質の細胞内ＫＳを分解したことを示した。
【０３８２】
全体として、これらの結果は、組み換え型ヒトリソソーム酵素であるＡＲＳＢ、ＩＤＵ、およびＧＡＬＮＳが、これらの天然基質を分解する活性を、細胞に基づくインビトロアッセイにおいて測定および定量化し得ることを示した。この細胞に基づくインビトロアッセイを、他のリソソームスルファターゼ酵素ならびに幅広く多様な組み換え型リソソーム酵素の活性を測定および定量化するために、容易に変更し得ることを認識すべきである。
実施例Ｘ
特定の組織への組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の送達
【０３８３】
Ｇ７１細胞において発現および精製された組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の能力が、マウスへのその投与時、ＧＡＬＮＳの欠乏に影響されるか、またはそれに関連する特定の組織へ送達される能力を評価した。
【０３８４】
ケラタン硫酸の高度に特異的な分布は、ムコ多糖症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶＡ）またはモルキオ症候群の非常に特徴的な表現型を与える。ケラタン硫酸は、もともと、軟骨（骨組織成長板の連結、心臓弁、喉頭、および鼻中隔）および角膜において見出され、ＭＰＳ  ＩＶＡ患者においてケラタン硫酸塩の蓄積を示すのは、これらの組織である。したがって、ＭＰＳ  ＩＶＡまたはモルキオ症候群において不足しているＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）については、長骨の骨組織成長板、心臓弁、角膜、喉頭、および鼻へのＧＡＬＮＳ酵素の送達を示すことは重要である。十分に血管新生化されていない標的であるこれらの特定の組織を調べるため、蛍光ＧＡＬＮＳの送達をマウスにおいて調査した。
【０３８５】
２つの免疫組織化学的染色方法を、マウスにおいて試験した：（１）Ａｌｅｘａ  ４８８により共役されたヒトＧＡＬＮＳおよび（２）共役されていないヒトＧＡＬＮＳ。Ａｌｅｘａ  ４８８へのヒトＧＡＬＮＳの共役を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｃ５マレイミド標識キット（Ａ−１０２５４）を用いて行った。マレイミド共役体化化学は、結果として、１：１の標識対タンパク質の比を生じた。
【０３８６】
蛍光タグがＧＡＬＮＳの取り込みを妨げなかったことを確認するため、免疫細胞学実験を、培養された滑膜細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１８３２）を用いて行った。標準取り込みアッセイを使用して、共役されていないＧＡＬＮＳと共役されたＧＡＬＮＳ（ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８またはＧＡＬＮＳ−Ａ５５５）とを比較した。細胞を、ＧＡＬＮＳ酵素と共に４時間インキュベートし、その後、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）を用いて２時間追跡した。この結果は、Ａｌｅｘａ  ４８８の共役体が、細胞内への取り込みを妨げなかったことを示した。図１５は、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８、およびＧＡＬＮＳ−Ａ５５５についての、推定されるＫｄを示す。標識が酵素を不活性化したため、この取り込みを、酵素活性ではなく細胞溶解産物の抗原ＥＬＩＳＡによって測定した。共役されていないＧＡＬＮＳ酵素および共役されたＧＡＬＮＳ酵素のＫｄは、ほぼ同等であると決定した。
【０３８７】
一旦、ＧＡＬＮＳ酵素が細胞に組み込まれると、蛍光タグの安定性を決定するために、共役されていないＧＡＬＮＳおよび共役されたＧＡＬＮＳについての免疫染色を行った。染色のために使用された一次抗体は、タンパク質Ｇで精製された１μｇ／ｍＬの濃度の抗ＧＡＬＮＳウサギ抗体であった。全ての画像を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを使用した、Ｌｅｉｃａ  ＩＲＥ２広視野落射蛍光顕微鏡上で取得した。面外光の存在のため、画像スタックのデコンボリューションを、これらの画像において共局在を測定するために必要とした。このデコンボリューションを、理論的点拡散関数（ブラインドアルゴリズム）を使用したＡｕｔｏＱｕａｎｔ／ＡｕｔｏＤｅｂｌｕｒ可視化ソフトウェアを使用して行った。
【０３８８】
この免疫染色は、ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８物質によって増幅されたシグナルと、かなり良いオーバーラップを示した。感度において観察された上昇は、一次抗体および二次抗体がともにポリクローナルであることに起因した。
【０３８９】
ＧＡＬＮＳ酵素がリソソームに標的とされたかどうかを決定するために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒまたはリソソーム中に局在する別の酵素を用いて培養された滑膜細胞の免疫染色を行った。Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅは、ＧＡＬＮＳ−４８８酵素との多少のオーバーラップを示しているようであったが、この染色は均一ではなかった。組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトースアミン−４−スルファターゼ（ｒｈＡＳＢ）、リソソーム酵素を用いた２時間の追跡は、ＧＡＬＮＳとの多少の共局在を示した。
【０３９０】
上記の実験は、ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８酵素が細胞によって取り込まれ、リソソームに局在し、かつインビボでの生体内分布を決定するために使用することができることを示した。
【０３９１】
２つのインビボ研究を行った。第１の予備的研究は、正常なＢａｌｂ／ｃマウスの尾の静脈への単一用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のボーラス注射であり、続いて、第２の研究は、正常なＢａｌｂ／ｃマウスの尾の静脈への１０ｍｇ／ｋｇの１日おきの複数回（５回）注射であった。表１５および表１６は、それぞれ、第１および第２の研究についての実験計画を記載する。
【表１５】
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【表１６】
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【０３９２】
第１の予備的研究では、心臓、肝臓、および脛骨／大腿関節を、２時間および２４時間の時点で収集した。第２の研究では、心臓、腎臓、肝臓、四頭筋およびヒラメ筋を有する骨組織を、２時間、４時間、および８時間の時点で収集した。両方の研究において、心臓、腎臓、および肝臓を、４日間、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で浸漬し、パラフィン包埋し、次いで、７μｍの厚さで薄片にした。第２の研究における筋肉を含む骨組織を、４％のＰＦＡ中で８日間浸漬し、脱石灰し、パラフィン包埋し、７μｍの厚さで薄片にした。
【０３９３】
ＧＡＬＮＳ−Ａ４８８が注射されたマウスの画像を、Ｚｅｉｓｓレーザー走査共焦点顕微鏡上で取得した。第１の予備的研究における分析のため、試料当たり１つの共焦点のスタックを心臓弁および肝臓について取得し、容量分析に用いた。２つの共焦点のスタック／試料をこの成長板について取得し、容量分析に用いた。第２の研究では、心臓弁、腎臓、および肝臓について１つの共焦点のスタック／試料を取得し、容量分析に用い、この成長板および残余の軟骨の領域（ｚｒｃ）について２つの共焦点のスタック／試料を取得し、容量分析に用いた。
【０３９４】
共焦点顕微鏡での画像化の研究からの結論は、（１）インビボで蛍光ＧＡＬＮＳを検出することが可能であった、（２）シグナルは特異的であり（バックグラウンドがない）、かつその局在はリソソームであった、（３）ＧＡＬＮＳの存在を、肝臓中の洞様毛細血管の細胞において示した、（５）心臓において、ＧＡＬＮＳ酵素は中隔および心房において存在するが、より重要なことには、複数回の注射後、より強く分布していた場合には、ＧＡＬＮＳ酵素は心臓弁のレベルにおいて、明らかに可視であった、（６）大腿／脛骨接合部において、ＧＡＬＮＳ酵素は、骨組織の鉱化された部分（骨端）、ならびに骨髄において存在した、であった。ＧＡＬＮＳは、この成長板において存在する。より具体的には、ＧＡＬＮＳは、残余の領域の軟骨細胞（または貯蔵軟骨の領域）において豊富であり、増殖性の領域の最初の部分に存在し、この成長板の末端における骨形成の領域において再び豊富に現れた。複数回の注射の累積的な効果を定量化することは困難であるが、第２の研究は、より広い分布を示していると思われた。表１７は、共焦点画像研究の概要を示す。
【表１７】
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【０３９５】
二次染色のため、最初のステップは、ＧＡＬＮＳ一次抗体の最適化であった。種々の組織をタンパク質Ｇで精製された抗ＧＡＬＮＳウサギ抗体を用いた１：１００〜１：４００の希釈物を用いて染色した。第１の予備的研究の結果は、１：１００の希釈が、高いシグナル対ノイズ比にとって最適であったことを示した。この結果を、第２の研究において確認した。残余のスライドを、１：１００の一次抗体の希釈および１：１０００の二次抗体の希釈で処理した。
【０３９６】
ＧＡＬＮＳを投与したＢａｌｂ／ｃマウスについてのシグナルは、タンパク質Ｇで精製された抗ＧＡＬＮＳ抗体を用いて染色したとき、対照（すなわち、ＰＢＳ−Ｃｙｓが投与されたマウス）を上回るシグナルを有した。ＧＡＬＮＳ酵素がリソソームに局在したことを確認するため、切片を、抗ＬＡＭＰ１抗体を用いて染色した。ＬＡＭＰ１は、リソソームについてのマーカーである。画像は、抗ＬＡＭＰ１抗体と抗ＧＡＬＮＳ抗体との間でのオーバーラップを示し、これは、ＧＡＬＮＳ酵素がリソソームに局在したことを示した。
【０３９７】
全体として、２つのインビボ研究は、ＧＡＬＮＳ生体内分布が血管新生と関係付けられる、すなわち、より血管新生化された組織が、より多くの蛍光シグナルを含むことを示す。より重要なことには、この研究は、モルキオ症候群におけるケラタン硫酸塩蓄積の部位は血管新生化が不十分であるとしても、これらの部位でのＧＡＬＮＳの存在を示す。
実施例ＸＩ
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の製剤
【０３９８】
本発明の製剤において組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の活性および構造における種々の賦形剤、例えば緩衝液、等張化剤、および安定剤の効果を調査することを目的とした。
【０３９９】
実施例Ｖにおいて記載されるように、ＧＡＬＮＳ酵素を調製した。
【０４００】
実施例ＶＩＩにおいて記載されるように、ＧＡＬＮＳ酵素が特徴付けられた。
【０４０１】
実施例Ｖにおいて、精製された組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素は、１０ｍＭのＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．００５％または０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５中に製剤化された。低濃度のリン酸緩衝液中での保存時、ＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化が生じることに留意した。したがって、リン酸緩衝液濃度は、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４まで増加させた。高濃度のリン酸緩衝液中での保存時、ＧＡＬＮＳ酵素の有意な脱リン酸化は観察されなかった。しかしながら、５℃、２５℃、または４０℃での保存時、ＧＡＬＮＳの可溶性凝集体が観察され、４０℃での保存時、ＧＡＬＮＳの不溶性凝集体が観察された。
【０４０２】
第１の研究において、組み換え型ＧＡＬＮＳの安定性における安定剤濃度およびｐＨの効果を評価した。精製された組み換え型ＧＡＬＮＳ酵素は、２０ｍＭのＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、および４％のスクロースまたは２％のソルビトール中に製剤化された。安定剤は、１５ｍＭまたは３０ｍＭの塩酸アルギニン（アルギニンＨＣｌ）および１５ｍＭまたは３０ｍＭのＮａＣｌを試験した。ｐＨは、５．０、５．４、および５．８を試験した。ｐＨ５．８の製剤は、ｐＨ５．８から６．０までさまざまであるように決定された。酵素製剤を５℃、２５℃、または４０℃で最長２ヶ月間保存した後、ＧＡＬＮＳ酵素は、実施例ＶＩにおいて記載される種々のアッセイを使用して分析された。
【０４０３】
種々の製剤中の可溶性凝集体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によってＧＡＬＮＳ酵素をプロファイリングすることによって判定された。１５ｍＭおよび３０ｍＭのアルギニンＨＣｌの両方の存在は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって判定されるように、可溶性凝集体の増殖を抑制した（図１６）。
【０４０４】
製剤中のＧＡＬＮＳ酵素活性の安定性は、インビトロ酵素活性アッセイを使用して測定された。５℃で、ＧＡＬＮＳ酵素活性は、アルギニンＨＣｌまたはＮａＣｌの存在下で安定であり、２５℃で、ＧＡＬＮＳ酵素活性は、アルギニンＨＣｌまたはＮａＣｌのいずれかの存在下で安定であり、４０℃で、ＮａＣｌ含有製剤中のＧＡＬＮＳ酵素活性は、少なくとも安定性を示した（図１７）。
【０４０５】
アスパラギンＮ結合型オリゴ糖を切断するために、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで酵素を消化した後に、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によってビスリン酸化マンノース７（ＢＰＭ７）のパーセントを測定することによって、製剤中のＧＡＬＮＳ酵素の脱リン酸化を調査した。５℃、２５℃、または４０℃で２ヶ月後、酵素製剤の全てにおけるＧＡＬＮＳ酵素が、ＢＰＭ７率においてグリコシル化プロファイルを有し、これは第Ｉ相臨床製剤中に使用されるＧＡＬＮＳの基準ロットのグリコシル化プロファイルと同程度であった（図１８）。
【０４０６】
製剤中のＧＡＬＮＳ酵素の純度は、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって酵素をプロファイリングすることによって判定された。５℃または２５℃で２ヶ月後、製剤のいずれもいかなるピーク面積の変化を示さず、４０℃で、ｐＨ５．０およびｐＨ５．４でアルギニンＨＣｌ含有製剤はまた、いかなるピーク面積を示さなかったが、ｐＨ５．０およびｐＨ５．４でＮａＣｌ含有製剤ならびにｐＨ５．８で製剤の全ては、ピーク面積の減少を示した（図１９）。ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、ピーク後のショルダーが製剤中に観察された。３０ｍＭのアルギニンＨＣｌを含有するＧＡＬＮＳ製剤は、少なくとも顕著なピーク後のショルダーを示した。
実施例ＸＩＩ
ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の例示的な製剤
【０４０７】
以下の実施例は、モルキオ症候群またはＭＰＳ  ＩＶａの治療に有用である、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）またはその生物学的に活性な断片、変異体、改変体、もしくは類似体を含む組成物を製剤化するために使用されるパラメータにおけるガイダンスを提供する。本発明のＧＡＬＮＳ組成物を製剤化するために使用されるパラメータとしては、ｐＨを維持する緩衝液、等張を調節する薬剤、安定剤の存在または不在、他の賦形剤、ビヒクル、希釈剤等の存在または不在が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０８】
実施例ＸＩにおいて、組み換え型ＧＡＬＮＳは、約１ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化された。好ましいＧＡＬＮＳは、約０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５〜５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬの範囲である濃度で製剤化される。一実施形態において、本発明のＧＡＬＮＳ組成物の製剤は、約１＋／−０．５ｍｇ／ｍＬのＧＡＬＮＳ酵素の濃度を有する。
【０４０９】
実施例ＸＩにおいて、組み換え型ＧＡＬＮＳ酵素は、２０ｍＭのＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ５．０、５．４、および５．８中に製剤化される。好ましい緩衝液は、約５〜１００ｍＭ、好ましくは約５〜５０ｍＭ、より好ましくは約１０〜３０ｍＭの範囲であるＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃの濃度を有し、約５〜１００ｍＭ、好ましくは約２５〜１００ｍＭ、より好ましくは約２５〜７５ｍＭの範囲であるＮａＨ２ＰＯ４の濃度を有する、ＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃまたはその同等物、およびＮａＨ２ＰＯ４またはその同等物である。例示的な実施形態において、本発明のＧＡＬＮＳ組成物の製剤は、約２０＋／−１０ｍＭのＮａＯＡｃ／ＨＯＡｃ緩衝液の濃度、および約５０＋／−２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液の濃度を有する。
【０４１０】
好ましい製剤のｐＨは、約ｐＨ４．５〜６．５、好ましくは約ｐＨ５．０〜６．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜５．８である。一実施形態において、本発明のＧＡＬＮＳ組成物の製剤は、約ｐＨ５．４＋／−０．４のｐＨを有する。
【０４１１】
実施例ＸＩにおいて、組み換え型ＧＡＬＮＳ酵素は、１５ｍＭまたは３０ｍＭのアルギニンＨＣｌまたはＮａＣｌ中に製剤化された。好ましい安定剤は、約５〜２００ｍＭ、好ましくは約１０〜１００ｍＭ、より好ましくは約１０〜５０ｍＭの範囲である濃度を有する、アルギニンＨＣｌまたはその同等物である。例示的な実施形態において、本発明のＧＡＬＮＳ組成物の製剤は、約３０＋／−２０ｍＭの濃度のアルギニンＨＣｌを有する。
【０４１２】
実施例ＸＩにおいて、組み換え型ＧＡＬＮＳ酵素は、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０中に製剤化された。好ましい安定剤は、約０．００１〜１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．００５〜０．２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．００５〜０．０１５％（ｗ／ｖ）の範囲である濃度を有する、Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート−２０としても知られている）またはその同等物である。一実施形態において、本発明のＧＡＬＮＳ組成物の製剤は、約０．０１％＋／−０．００５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を有する。
【０４１３】
実施例ＸＩにおいて、組み換え型ＧＡＬＮＳ酵素は、４％のスクロースまたは２％のソルビトール中に製剤化された。好ましい安定剤／抗凍結剤／等張化剤は、約０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．５〜５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約１．０〜３．０％（ｗ／ｖ）の範囲である濃度を有する、ソルビトールまたはその同等物である。本発明のＧＡＬＮＳ組成物の例示的な製剤は、約２．０％＋／−１．０％（ｗ／ｖ）のソルビトール濃度を有する。
【０４１４】
したがって、本発明のＧＡＬＮＳ酵素組成物の例示的な製剤を表１８に示す。
【表１８】
0006030553.tif 000020
実施例ＸＩＩＩ
リソソームスルファターゼ酵素活性が不足しているマウスにおける、組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）および他のリソソームスルファターゼ酵素の効果
【０４１５】
リソソームスルファターゼ酵素活性が不足しているマウスにおける、本発明の高度にリン酸化された活性なヒトリソソームスルファターゼ酵素、例えば組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の効果を評価する。
【０４１６】
組み換え型ヒトＧＡＬＮＳタンパク質は、Ｇ７１Ｓ細胞において発現され、精製される。他の組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素を、基本的には本明細書に記載された方法に従って、または当該技術分野で公知の手順によって、発現および精製し得る。
【０４１７】
ヒトリソソームスルファターゼ酵素欠乏の幾つかのマウスモデルが記載されており、これには  異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）（アリールスルファターゼＡ欠乏）（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４８２１−１４８２６，１９９６）、ムコ多糖症ＶＩ型（ＭＰＳ  ＶＩ）またはマロトーラミー症候群（アリールスルファターゼＢ欠乏）（Ｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８２１４−８２１９，１９９６）、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）またはハンター症候群（イズロン酸−２−スルファターゼ欠乏）（Ｍｕｅｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｐｐｌ．９１（４３９）：９８−９９，２００２、Ｃａｒｄｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１２２５−１２３６，２００６）、ムコ多糖症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ  ＩＩＩａ）またはサンフィリポＡ症候群（スルファミダーゼ／ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ欠乏）（Ｂｈａｕｍｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（１２）：１３８９−１３９６，１９９９）、ムコ多糖症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群（Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ欠乏）（Ｔｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３３４９−３３５８，２００３）、および多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）（スルファターゼ修飾因子１欠乏）（Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：４５０６−４５１１，２００７）が含まれる。ムコ多糖症ＩＩＩｄ型（ＭＰＳ  ＩＩＩｄ）またはサンフィリポＤ症候群（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ欠乏）のマウスモデルは、まだ記載されていない。
【０４１８】
ヒトリソソームスルファターゼ酵素欠乏のマウスモデルは、リソソーム蓄積障害を治療するための手段としての、酵素補充療法（ＥＲＴ）の実行可能性を評価するために使用され得る。例えば、ＭＰＳ  ＩＶａノックアウトマウス（ＧＡＬＮＳ−／−マウス；Ｔｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３３４９−３３５８，２００３）は、検出可能なＧＡＬＮＳ酵素活性を有さず、尿のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、すなわち、ケラチン硫酸塩およびコンドロイチン−６−硫酸塩の上昇、ならびに多数の組織および器官、例えば肝臓、腎臓、膵臓、心臓、脳、骨髄、および軟骨におけるＧＡＧの蓄積を示す。しかしながら、ＧＡＬＮＳ−／−マウスは、ヒト疾患と関連付けられる、骨格異常を示さない。不活性なヒトＧＡＬＮＳおよび変異させられた不活性な内因性のマウスのＧＡＬＮＳ（ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウス；Ｔｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４：３３２１−３３３５，２００５）を発現する、別のＭＰＳ  ＩＶａマウスモデルを開発した。検出可能なＧＡＬＮＳ酵素活性を有さないＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスにおいては、尿のＧＡＧ排出が上昇し、ＧＡＧが内臓器官、脳、角膜、骨組織、靭帯、および骨髄を含む多数の組織において蓄積し、リソソーム蓄積が多数の組織において示され、骨組織蓄積が明らかである。ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスにおける病理学的変質は、ＧＡＬＮＳ−／−マウスにおいて観察されるものとは異なる。しかしながら、ＧＡＬＮＳ−／−マウスと同様に、ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスは、ヒト疾患と関連付けられる、骨格異常を示さない。したがって、ＧＡＬＮＳ−／−またはＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスを、尿のＧＡＧの上昇および組織におけるＧＡＧの蓄積に対する、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳの投与の効果を調査するために使用し得る。
【０４１９】
４週齢のＧＡＬＮＳ−／−、ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ、または野生型マウスに、１６〜２０週齢の間、週に１回、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳ（例えば、０．１、０．３、１、３、１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照の種々の用量の静脈内注射（ｎ＝１群当たり少なくとも６または８）を与え、次いで、組織学的検査のために殺処分する。尿をマウスから収集し、尿のＧＡＧ排出を、記載されるように決定する（Ｔｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３３４９−３３５８，２００３）。種々の組織の病理学的検査を、記載されるように行う（Ｔｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３３４９−３３５８，２００３）。
【０４２０】
ＧＡＬＮＳ−／−またはＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕマウスを用いて、本発明の組み換え型ヒトＧＡＬＮＳが、（１）尿のＧＡＧ排出、（２）例えば、内臓器官、脳、角膜、骨組織、靭帯、および骨髄等の多数の組織におけるＧＡＧの蓄積、（３）多数の組織におけるリソソーム蓄積、ならびに（４）骨組織の蓄積を低減する能力を示すことが予想される。
【０４２１】
組み換え型ヒトＧＡＬＮＳの効果を、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）のマウスモデル（ＳＵＭＦ１−／−マウス；Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：４５０６−４５１１，２００７）において調査する。ＳＵＭＦ１−／−マウスは、生存の初期において頻繁に死亡を示すため、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを用いたこれらのマウスへの注射を、ＧＡＬＮＳ−／−マウスに関して上に記載したときよりも早く始める。
【０４２２】
当該技術分野で既知の手順に従って、他の組み換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素、すなわち、アリールスルファターゼＡ、アリールスルファターゼＢ、イズロン酸−２−スルファターゼ、スルファミダーゼ／ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、およびＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼの効果を、ＭＬＤのマウスモデル（ＡＳＡ−／−マウス；Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４８２１−１４８２６，１９９６）、ＭＰＳ  ＶＩのマウスモデル（Ａｓ１−ｓ−／−マウス；Ｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８２１４−８２１９，１９９６）、ＭＰＳ  ＩＩのマウスモデル（ｉｄｓｙ／−マウス；Ｃａｒｄｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１２２５−１２３６，２００６）、ＭＰＳ  ＩＩＩａのマウスモデル（Ｂｈａｕｍｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（１２）：１３８９−１３９６，１９９９）、およびＭＳＤのマウスモデル（ＳＵＭＦ１−／−マウス；Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：４５０６−４５１１，２００７）において調査する。
実施例ＸＩＶ
組み換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）および他のリソソームスルファターゼ酵素を用いたムコ多糖症ＩＶＡ型（またはモルキオ症候群）または他のリソソームスルファターゼ酵素欠乏を有するヒト患者の治療
【０４２３】
ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ  ＩＶａまたはモルキオ症候群）と診断された患者等のリソソームスルファターゼ酵素欠乏の臨床上の表現型が現れているヒト患者は、組み換え酵素、すなわち、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）を用いる酵素補充療法に対して企図される。リソソームスルファターゼ酵素欠乏を患う全ての患者は、特定のリソソーム蓄積症と関連する機能的障害の程度が異なること、またはそれと関連する健康状態が悪化することによって現されるような、内臓および軟組織のリソソームにおける蓄積物質の過度のまたは有害な蓄積等の、何らかの臨床的証拠を示す。全てのＭＰＳ  ＩＶａ患者は、機能的障害の程度が異なる、骨組織の変形、低身長および歩行異常、ならびに／または血液もしくは尿におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積等の何らかの臨床的証拠を示す。
【０４２４】
好ましくは、酵素レベルを、リソソームスルファターゼ酵素欠乏を患う患者において監視し、患者の組織におけるリソソームスルファターゼ酵素の活性の欠如または低減を確認する。１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、さらにより好ましくは１％未満のリソソーム酵素活性を有する患者（その他の点では正常な被験体である）は、適切なリソソームスルファターゼ酵素を用いる治療には適切な候補である。データは、治療の前、治療の間、および治療の後における、患者のリソソームスルファターゼ酵素活性を決定するために収集され得る。
【０４２５】
有効性は、時間とともに、リソソームスルファターゼ酵素の基質、すなわち、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の尿の排出における、パーセンテージの減少を測定することによって決定される。リソソームスルファターゼ酵素欠乏を患う患者における尿のＧＡＧレベルは、正常な排出レベル、および／または同じリソソームスルファターゼ酵素欠乏を患う治療されていない患者におけるレベル、および／またはリソソームスルファターゼ酵素を用いる治療の前の同じ患者におけるレベルと比較される。リソソームスルファターゼ酵素を用いる治療後の分解されていないＧＡＧの排出における、２５％を超える減少、好ましくは５０％を超える減少は、治療への個体の応答を評価するための有効な手段である。
【０４２６】
有効性はまた、リソソーム蓄積症と関連する病状の兆候および症状の低減によっても決定され得る。有効性は、ＧＡＧがリソソーム、細胞、または組織において低減した程度を決定するための、組織生検ならびに細胞および／またはリソソームの検査によって決定され得る。有効性は、機能的評価によって決定され得、客観的または主観的であり得る（例えば、痛みまたは機能における障害の低減、筋肉の強度または持久力の増進、心拍出量と運動耐久性の増進、体重、身長または外見における変化等）。
【０４２７】
Ｇ７１Ｓ細胞において発現され、精製され、当該技術分野で既知の手順に従って製剤化される、組み換え型ヒトＧＡＬＮＳを含む薬学的組成物。本発明の薬学的組成物を静脈に投与することが好ましい。
【０４２８】
ＭＰＳ  ＩＶａ患者への組み換え型ヒトＧＡＬＮＳの投与の効果を調査するための初期臨床的研究の基本的なデザインは、非盲検、用量増大、安全性／有効性研究を含み、これは種々の用量の酵素を、固定された間隔（例えば、限定されるものではないが、週に１回の酵素注射）で、患者に静脈内に投与する。
【０４２９】
ＭＰＳ  ＩＶａ患者に関して、有効性は、例えば、血液または尿のＧＡＧの減少（数週間以内のＥＲＴでおそらく観察される）、心臓、肺、および／もしくは運動性の機能の試験における耐久性の増進（数ヶ月以内のＥＲＴでおそらく観察される）ならびに／または、骨格の変化および／もしくは身体の成長（数年以内のＥＲＴでおそらく観察される）を測定することによって決定される。
【０４３０】
尿のＧＡＧ測定は、時間とともに、尿のＧＡＧ排出におけるパーセンテージの減少を測定することによる、適切な用量レジメンを確立すること、ならびに有効性を決定することに対して有用である。
【０４３１】
例えば、限定されるものではないが、歩行試験（６または１２分間に歩いた距離）、階段登り（１分当たりの段）、ならびに心臓の機能（ＥＣＧ、心エコー図）および肺の機能（ＦＶＣ、ＦＥＶ１、ピークフロー）等の肺／呼吸の機能を含む、種々の耐久性試験が使用され得る。
【０４３２】
長期間、治療を受けている若い患者に関しては、成長（身長）が測定され得る。
【０４３３】
本発明の方法を使用して治療または予防され得るリソソームスルファターゼ酵素活性の欠乏と関連するリソソーム蓄積症は、異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）、ムコ多糖症ＶＩ型（ＭＰＳ  ＶＩ）もしくはマロトーラミー症候群、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）もしくはハンター症候群、ムコ多糖症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ  ＩＩＩａ）もしくはサンフィリポＡ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩｄ型（ＭＰＳ  ＩＩＩｄ）もしくはサンフィリポＤ症候群、ムコ多糖症ＩＶａ型（ＭＰＳ  ＩＶａ）もしくはモルキオＡ症候群、または多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）である。各リソソーム蓄積症に対し、組み換え型リソソームスルファターゼ酵素は、特異的なリソソームスルファターゼ酵素を含む。
【０４３４】
ＭＬＤに関する方法のために、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡである。ＭＰＳ  ＶＩに関する方法のために、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＢである。ＭＰＳ  ＩＩに関する方法のために、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＡに関する方法のために、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、スルファミダーゼ／ヘパラン−Ｎ−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＤに関する方法のために、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＶＡに関する方法のために、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼである。ＭＳＤに関する方法のために、好ましいリソソームスルファターゼ酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼである。
＊＊＊＊＊
【０４３５】
上記の例示的実施例において記載されるような、本発明の多数の修正および変更が、当業者に想到することが予想される。したがって、添付の特許請求の範囲に見られる限定のみが、本発明に課されるべきである。
【図１２】
0006030553.tif 000021
【図１】
0006030553.tif 000022
【図２】
0006030553.tif 000023
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006030553.tif 000027
【図７】
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【図８】
0006030553.tif 000029
【図９】
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【図１０】
0006030553.tif 000031
【図１１】
0006030553.tif 000032
【図１３】
0006030553.tif 000033
【図１４】
0006030553.tif 000034
【図１５】
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【図１６】
0006030553.tif 000036
【図１７】
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【図１８】
0006030553.tif 000038
【図１９】
0006030553.tif 000039
【配列表】
0006030553000001.app