(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ）という名称の寄託機関に、寄託日２０１２年２月８日に寄託番号ＣＧＭＣＣ番号５７４４で寄託されたバチルス属菌。
【請求項２】
請求項１に記載のバチルス属菌を使用する工程を含む、ヒアルロニダーゼの調製方法。
【請求項３】
請求項１に記載のバチルス属菌を、斜面培養、種培養、発酵培養、遠心分離、硫酸アンモニウム分画沈殿、及び限外濾過にかけて、ヒアルロニダーゼを得る工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程：
（１）請求項１に記載のバチルス属菌を斜面培養にかけて、斜面培養株を得る工程、
（２）斜面培養株を滅菌した種培養培地に植え付け、２５℃〜４０℃、１００〜２００ｒｐｍで１０〜２４時間の条件下で培養して、種溶液を得る工程；
（３）種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、２５℃〜４０℃、１００〜３００ｒｐｍで１２〜２４時間の条件下で培養して、ヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得る工程；
（４）遠心分離により発酵ブロスを分離して、上清を得る工程；
（５）上清を硫酸アンモニウム分画沈殿、及び濾過にかけて、粗製ヒアルロニダーゼを得る工程；及び
（６）工程（５）で得られた粗製ヒアルロニダーゼをリン酸緩衝溶液中に溶解し、限外濾過により低分子量の不純物を除去して、精製ヒアルロニダーゼを得る工程
を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
工程（６）は、
（６−１）工程（５）の粗製ヒアルロニダーゼをｐＨ４．５〜８．０の緩衝溶液中に溶解して、粗製酵素溶液を得；該粗製酵素溶液を、３．０×１０３〜１．４×１０４Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに入れ、ｐＨ４．５〜８．０の緩衝溶液中に置き、４℃で終夜透析する工程；
（６−２）該透析した粗製酵素溶液を、クロマトグラフィーカラムの充填材としてＤＥＡＥアガロースゲルＦＦ媒体と勾配溶出のための０〜０．５ＭのＮａＣｌ溶液とを使用したイオン交換クロマトグラフィー分離にかけて、溶出ピークを回収する工程；及び
（６−３）工程（６−２）で得られたヒアルロニダーゼサンプルを真空凍結乾燥にかけて、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得る工程
によって実行される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２に示され；前記ポリペプチドは、ヒアルロニダーゼである、上記ポリペプチド。
【請求項７】
単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする、上記ポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドの配列は、配列番号３で示される配列又は配列番号３の相補配列である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１１】
請求項６に記載のポリペプチドを使用することにより、１０ｋＤａより大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を分解する工程を含む、オリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートの調製方法。
【請求項１２】
以下の工程：
１）ヒアルロン酸又はその塩の溶液の調製：１０ｋＤａより大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を精製水に添加して、１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの濃度を有する溶液を得る工程；
２）酵素分解：工程１）の溶液の温度を２０℃〜４８℃に、ｐＨを４〜９に調節し、次いで前記溶液に請求項６に記載のポリペプチドを添加して、ヒアルロン酸又はその塩を所望の分子量まで分解して、酵素分解溶液を得る工程；及び
３）不活性化：酵素分解溶液を５０℃〜９０℃で１０〜６０分維持して、請求項６に記載のポリペプチドを不活性化する工程
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程：
４）濾過：不活性化された酵素分解溶液に可溶性の無機塩を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、次いで０．４５μｍの濾過膜で濾過して、濾液を得る工程、ここで酵素分解溶液１００ｍＬあたり、０．１〜１０ｇの可溶性の無機塩が添加される；
５）沈殿：工程４）の濾液を、濾液の３〜２０倍の体積のアルコール又はケトンと均一に混合して、オリゴマーヒアルロナートを沈殿させる工程；及び
６）脱水及び乾燥：工程５）のオリゴマーヒアルロナートの沈殿を分離し、有機溶媒で脱水し、次いで真空乾燥し、オリゴマーヒアルロナートを得る工程
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程１）において、１ｋｇのヒアルロン酸又はその塩あたり、２×１０７〜５×１０７ＩＵの請求項６に記載のポリペプチドが添加される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程２）において、酵素分解の温度は３５℃〜４５℃であり、酵素分解のｐＨは５．５〜７．５であり、ヒアルロン酸又はその塩を酵素溶解して３０００Ｄａ以上１０４Ｄａ未満の分子量にする、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
以下のＡ〜Ｆのうち１つ又は複数を満たす、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の方法：
Ａ．工程１）において、前記ヒアルロン酸の塩は、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及び亜鉛塩からなる群より選択される；
Ｂ．工程２）において、酸又は塩基を使用して、ｐＨを４〜９に調節し、前記酸は、塩酸、氷酢酸、硫酸、及びリン酸からなる群より選択され、前記塩基は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである；
Ｃ．工程３）において、前記酵素分解溶液を５５℃〜６５℃で２０〜３０分維持することにより、請求項６に記載のポリペプチドを不活性化する；
Ｄ．工程４）において、前記可溶性の無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される；
Ｅ．工程５）において、前記アルコール又はケトンは、エタノール、アセトン、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノールである；
Ｆ．工程６）において、脱水に使用される有機溶媒は、ケトン又はアルコールである。
【請求項１７】
工程４）において、前記可溶性の無機塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛又はマグネシウムの塩化物、硫酸塩及び硝酸塩からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項６に記載のポリペプチドを使用して、１０００ｋＤａより大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を分解する工程を含む、低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートの調製方法。
【請求項１９】
以下の工程：
１）ヒアルロン酸又はその塩の溶液の調製：１０００ｋＤａよりも大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を精製水に添加して、０．１％ｗｔ／ｖｏｌ〜２％ｗ／ｖの濃度を有する溶液を調製する工程；
２）酵素分解：工程１）の溶液の温度を２０℃〜４８℃に、ｐＨを４〜９に調節し、次いで前記溶液に請求項６に記載のポリペプチドを添加して、ヒアルロン酸又はその塩を所望の分子量まで分解して、酵素分解溶液を得る工程；及び
３）不活性化：前記酵素分解溶液を５０℃〜９０℃で１０〜６０分維持して、請求項６に記載のポリペプチドを不活性化する工程；
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程：
４）濾過：不活性化された酵素による加水分解産物に可溶性の無機塩を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、０．４５μｍの濾過膜で濾過して、濾液を得る工程、ここで酵素分解溶液１００ｍＬあたり、０．１〜１０ｇの可溶性の無機塩が添加される；
５）沈殿：工程４）の濾液を、濾液の１〜１０倍の体積のアルコール又はケトンと均一に混合して、低分子量ヒアルロナートを沈殿させる工程；及び
６）脱水及び乾燥：工程５）の低分子量ヒアルロナートの沈殿を分離し、有機溶媒で脱水し、次いで真空乾燥し、低分子量ヒアルロナートを得る工程
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程１）において、１ｋｇのヒアルロン酸又はその塩あたり、１０６〜１０７ＩＵの請求項６に記載のポリペプチドが添加される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程２）において、酵素分解の温度は３５℃〜４５℃であり、酵素分解のｐＨは５．５〜７．５であり、ヒアルロン酸又はその塩を酵素溶解して、１０ｋｄａ〜１０００ｋＤａの分子量にする、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
以下のＡ〜Ｆのうち１つ又は複数を満たす、請求項２０から２２のいずれか１項に記載の方法：
Ａ．工程１）において、ヒアルロナートは、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及び亜鉛塩からなる群より選択される；
Ｂ．工程２）において、酸又は塩基を使用して、ｐＨを４〜９に調節し、前記酸は、塩酸、氷酢酸、硫酸、及びリン酸からなる群より選択され、前記塩基は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである；
Ｃ．工程３）において、前記酵素分解溶液を５５℃〜６５℃で２０〜３０分維持することにより、請求項６に記載のポリペプチドを不活性化する；
Ｄ．工程４）において、前記可溶性の無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される；
Ｅ．工程５）において、前記アルコール又はケトンは、エタノール、アセトン、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノールである；
Ｆ．工程６）において、脱水に使用される有機溶媒は、ケトン又はアルコールである。
【請求項２４】
工程４）において、前記可溶性の無機塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛又はマグネシウムの塩化物、硫酸塩及び硝酸塩からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項６に記載のポリペプチド、請求項７又は８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載の組換えベクター、又は請求項１０に記載の組換え宿主細胞を含み；任意選択で、薬学的に許容される、又は食品学的に許容されるキャリアー若しくは添加剤をさらに含む、組成物。
【請求項２６】
ヒアルロニダーゼ製造における、請求項１に記載のバチルス属菌、請求項７又は８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載の組換えベクター、又は請求項１０に記載の組換え宿主細胞の使用。
【請求項２７】
オリゴマーヒアルロン酸若しくはオリゴマーヒアルロナート、低分子量ヒアルロン酸若しくは低分子量ヒアルロナート、又は低分子量コンドロイチン硫酸の調製における、請求項６に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素学及び製薬化学の分野に関し、さらにバチルス属菌、ヒアルロニダーゼ、及びそれらの使用に関する。本発明はさらに、オリゴマーヒアルロン酸若しくはその塩又は低分子量ヒアルロン酸若しくはその塩の調製方法に関し、さらに、バチルス属菌、ヒアルロニダーゼ、オリゴマーヒアルロン酸又はその塩、低分子量ヒアルロン酸又はその塩の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、酸性ムコ多糖類の、非分岐の高分子量グリコサミノグリカンであり、Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸との二糖の反復単位からなり、動物組織の細胞間物質又はある種の細菌の莢膜に存在する。ヒアルロン酸は、医薬品、化粧品、及び食品で広く使用されており、通常、１０５〜１０７Ｄａ（ダルトン）の分子量を有する。
【０００３】
オリゴマーヒアルロン酸は、１０ｋＤａ未満の分子量を有するヒアルロン酸を指す。調査によれば、分子量がヒアルロン酸活性に著しく影響を与え、異なる分子量を有するヒアルロン酸は、まったく逆の活性を有する可能性があることが示されている（ＧＵＯ，Ｘｕｅｐｉｎｇら、低分子量及びオリゴマーヒアルロン酸（Ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄｓ）、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２００３、２４（３）：１４８〜１５０）。
【０００４】
研究により、オリゴマーヒアルロン酸は、インビボで血管新生を促進する活性、加えてインビトロで内皮細胞の増殖を促進する活性を有し、創傷治癒を促進できることが示されている（Ｗｅｓｔ  ＤＣ、Ｋｕｍａｒ  Ｓ．内皮細胞増殖及び単分子層の完全性に対するヒアルロナート及びそのオリゴ糖の作用（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９８９、１８３（１）：１７９〜９６）。オリゴマーヒアルロナートは、血管新生を促進し、創傷治癒を促進する生物活性を有し、医療及び製薬において優れた適用の展望がある。
【０００５】
炎症過程中、オリゴマーヒアルロン酸は、例えば樹状細胞及びマクロファージなどの免疫適格細胞に対して強い活性化効果を有する（Ｔｅｒｍｅｅｒ  Ｃ、Ｂｅｎｅｄｉｘ  Ｆ、Ｓｌｅｅｍａｎ  Ｊら．ヒアルロナンのオリゴ糖はＴｏｌｌ様受容体４を介して樹状細胞を活性化する（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００２、１９５（１）：９９〜１１１）。
【０００６】
インビトロにおいて、オリゴマーヒアルロン酸は、マウスＴＡ３／Ｓｔ乳癌細胞、ラットＣＧ神経膠腫細胞、ヒトＨＣＴクローン腫瘍細胞、及びヒトＬＸＩ肺癌細胞の増殖を阻害することができ、抗腫瘍機能を有する（Ｇｈａｔａｋ  Ｓ、Ｍｉｓｒａ  Ｓ、Ｔｏｏｌｅ  ＢＰ．ヒアルロナンは癌細胞におけるＥｒｂＢ２リン酸化及びシグナル伝達複合体の形成を構成的に調節する（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＥｒｂＢ２  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５、２８０（１０）：８８７５〜８３）。
【０００７】
加えて、オリゴマーヒアルロナート中のヒドロキシル基、カルボン酸基、及び他の極性基は、水分子と水素結合を形成して多くの水と結合することができ、それにより有意な保水作用がもたらされる。したがって、オリゴマーヒアルロナートは、日焼け防止、アンチエイジング、及び保湿化粧品に使用することができる。
【０００８】
現在のところ、ヒアルロン酸の分解方法は、主として３つのグループ、すなわち物理的分解、化学分解、及び生物学的分解に分けられる。物理的分解方法は、ヒアルロン酸を１０ｋＤａ又はそれ未満に分解することはほとんどできない。化学分解法や酵素的方法によりオリゴマーヒアルロン酸を調製することができるが、化学分解法は、オリゴマーヒアルロン酸の調製において最大の分解度を達成するには厳しい反応条件（例えば、高い酸及び塩基濃度）を必要とする。現状では、糖鎖のグルコシド結合が破壊されると、同様に単糖類（グルクロン酸及びアセチルグルコサミン）残基の構造も破壊され、例えば、単糖類の加水分解及び６員環の破壊によるアセチル基の除去（この現象は、欧州薬局方の標準スペクトルと比べて、赤外線スペクトル写真において一致しない）は、得られたオリゴマーヒアルロン酸の生物活性に影響を及ぼす（ＧＵＯ  Ｘｕｅｐｉｎｇら、低分子量及びオリゴマーヒアルロン酸（Ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２００３、２４（３）：１４８〜１５０）。化学分解法により調製されたオリゴマーヒアルロン酸は褐変しやすく（中国特許出願第２０１１１０００８１１０．９号）、その生産方法は環境を汚染する可能性がある。酵素的方法によりヒアルロン酸が調製される場合、単糖間のグルコシド結合のみが破壊され、他の構造は破壊されない。加えて、酵素的方法は中程度の反応条件を採用し、強酸及び強塩基を使用しない。得られたオリゴマーヒアルロン酸は、褐変しにくく、環境汚染が回避され、酵素的方法により調製されたようなオリゴマーヒアルロン酸は、一体型の構造を有し、その赤外線スペクトルは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致する。したがって、酵素的方法は、オリゴマーヒアルロン酸の調製に最も好適である。
【０００９】
ヒアルロン酸の分解に使用される酵素は、主としてヒアルロニダーゼ（また「ヒアルロン酸酵素」とも呼ばれる）であり、これは、それらのメカニズムに従って以下の３つのグループに分けられる：（１）エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、これは、加水分解酵素であり、β−１，４−グルコシド結合に作用し、主要な生成物は四糖類であり、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸に作用する可能性があり、トランスグリコシダーゼ活性を有する；（２）蛭又は鉤虫由来のヒアルロニダーゼ、これは、エンド−β−グルクロニダーゼであり、β−１，３−グルコシド結合に作用し、加水分解酵素でもあり、主要な分解生成物は四糖類であり、特異的にヒアルロン酸を分解することができる；（３）細菌性ヒアルロニダーゼ、これは、ヒアルロナートリアーゼとも呼ばれており、β−１，４−グルコシド結合に作用し、β−除去メカニズムを介して４，５−不飽和二糖類を生産する（Ｋｒｅｉｌ，Ｇ、ヒアルロニダーゼ−−軽視されている酵素のグループ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅｓ−−ａ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ、１９９５、４（９）：１６６６〜１６６９）。
【００１０】
現在のところ、オリゴマーヒアルロン酸又はその塩の工業的生産方法は、化学分解法である。ヒアルロニダーゼを含有する動物組織源は限りがあるため、いくつかの報告は、微生物から供給されるヒアルロニダーゼ発酵ブロスは、１ユニットあたり比較的低い酵素活性を有し、発酵ブロスの最大の酵素活性は、１．３×１０２ＩＵ／ｍＬであることを示しており（ＷＯ２０１０１３０８１０Ａ１；Ｅｉｌｅｅｎ  Ｉｎｇｈａｍ、Ｋ．Ｔ．Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｇ．Ｇｏｗｌａｎｄ、及びＷ．Ｊ．Ｃｕｎｌｉｆｆｅ、プロピオニバクテリウム・アクネス由来ヒアルロナートリアーゼ（ＥＣ４．２．２．１）の精製及び部分的な特徴付け（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  Ｌｙａｓｅ  （ＥＣ４．２．２．１）  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７９）、１１５、４１１〜４１８）、他の報告はいずれも、酵素活性は１００ＩＵ／ｍＬよりも低く、ヒアルロニダーゼはラージスケールで生産できないことを示しており、したがって、オリゴマーヒアルロン酸又はその塩は、酵素的方法ではラージスケールで生産できない。
【００１１】
加えて、１０４Ｄａ〜１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸は、通常、低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷ−ＨＡ）と呼ばれる。２０，０００〜６０，０００の分子量を有するＬＭＷ−ＨＡは、インビトロで培養した骨細胞の増殖を刺激して、培養培地中の骨細胞のコロニーの数とシングルコロニーの面積を高めることができる（ＵＳ５６４６１２９）。細菌性の角膜潰瘍の処理においてトブラマイシンと５００，０００の分子量を有するＨＡとを含有する点眼剤を使用することにより、トブラマイシンのみを含有する点眼剤と比較して治癒時間が有意に短縮された（Ｇａｎｄｏｌｆｉ  ＳＡ、Ｍａｓｓａｒｉ  Ａ、Ｏｒｓｏｎｉ  ＪＧ．細菌性の角膜潰瘍の処理における低分子量ヒアルロン酸ナトリウム（Ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｕｌｃｅｒｓ）ｓ［Ｊ］．Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１９９２、２３０（１）：２０〜２３）。韓国特許（ＫＲ２００８００８７９４１）は、１００，０００未満の分子量を有するＨＡの組成物を提供しており、この組成物は、人体に吸収されやすく、その経口投与により、効果的に皮膚のしわを取り除き、皮膚のはりを改善することができる。日本国特許（ＪＰ２０００−１０３７２３）は、２００，０００〜４００，０００の分子量を有するＨＡを含有する組成物を提供し、この組成物は、育毛を促進することができる。しかしながら、オリゴマーヒアルロン酸又はその塩と同様に、酵素分解法により調製されたようなＬＭＷ−ＨＡ又はその塩は、化学的方法により調製されたものよりも一体化された構造を有し、化学的方法により調製されたようなＬＭＷ−ＨＡ又はその塩は、それらの構造において開環及び脱アセチル化を有する可能性がある。
【００１２】
ＬＭＷ−ＨＡは低い相対分子量を有するために、外用で皮膚によってよく吸収され、皮膚の栄養素供給と廃棄物の排出を促進して皮膚の老化を予防し、深部への保湿を達成し、美しさを維持し、上皮細胞の増殖及び分化を促進し、フリーラジカルを捕捉し、加えて太陽光又は紫外光によって引き起こされる皮膚の傷害を修復することができる。経口ＬＭＷ−ＨＡは吸収されやすく、皮膚細胞を活性化し、皮膚の水分を維持することができ、それと同時に免疫強化機能及びアンチエイジング機能をもたらす。したがって、化粧品や健康食品で使用されるＨＡは、通常、ＬＭＷ−ＨＡである。加えて、ＬＭＷ−ＨＡはまた、血管新生、細胞免疫性の活性化、及び骨形成も促進することができ、細菌性の角膜潰瘍の処理において優れた治療効果を有するため、医薬分野で広く使用されている。
【００１３】
ＬＭＷ−ＨＡは、高分子量ＨＡを分解することにより得られ、分解方法としては、主として３つのグループ、すなわち物理的分解、化学分解、及び生物学的分解がある。物理的分解方法としての超音波分解方法は、化学物質及び酵素を使用しないが、高分子量ＨＡをほとんど分解せず、２００ｋＤａ又はそれ未満の分子量を達成できない（ＱＩＮ  Ｃａｉｆｅｎｇ、ＷＡＮＧ  Ｍｉａｏ、ＣＨＥＮ  Ｘｉａｏｆｅｎｇ、ヒアルロン酸の分解方法及び処理条件の研究（Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）、［Ｊ］．２００７、４：３２〜３６）。また機械的粉砕方法も、ＨＡの相対分子量を低くするのに有効な方法である。特許では、室温での粉砕時間は０．５時間〜１２時間であり、振動周波数は１０Ｈｚ〜３０Ｈｚであることを開示しているが、これはラージスケールでの生産にとって好適ではない（ＣＮ１０１９４２０３７Ａ）。化学分解法は、構造を破壊する可能性があり、それにより糖鎖のグルコシド結合だけでなく単糖類（グルクロン酸及びアセチルグルコサミン）残基の構造も破壊する可能性があり、例えば、アセチル基が加水分解によって除去され、単糖類の６員環が破壊される。
【００１４】
いくつかの報告は、酵素分解法による低分子量ＨＡの調製方法を示しており、それによればまず第一に発酵ブロスからＨＡを単離し、精製し、酵素分解のためにヒアルロニダーゼを添加し、続いて膜濾過、エタノール沈殿、脱水、及び乾燥させることにより、低分子量ＨＡを得ており（ＣＮ１０１０２０７２４Ａ）、本方法で使用されるヒアルロニダーゼは、ヒアルロニダーゼの完成品であり、これは極めて高価であり、工業的生産ではとても使用することはできない。現在のところ、いくつかの報告は、微生物から供給されるヒアルロニダーゼ発酵ブロスは、１ユニットあたり比較的低い酵素活性を有し、発酵ブロスの最大の酵素活性は１．３×１０２ＩＵ／ｍＬであることを示しており（ＷＯ２０１０１３０８１０Ａ１）、他の報告はいずれも、酵素活性は１００ＩＵ／ｍＬよりも低く、それゆえに、現状では、低分子量ＨＡは、酵素的方法ではラージスケールで生産できないことを示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明者らは、深い研究と発明的な努力において尽力し、その結果、バチルス、加えてヒアルロニダーゼを得た。本ヒアルロニダーゼは、最大１０５ＩＵ／ｍＬ（発酵ブロス）、及び精製後に８×１０６〜１．５×１０７ＩＵ／ｍｇの高い活性を有しており、この活性は、これまでの論文で報告されたような最大の酵素活性よりもはるかに大きい。本ヒアルロニダーゼは１２３ｋＤａの分子量を有し、最も好適な温度は４２℃であり、最も好適なｐＨは６．５であり、優れた熱安定性及びｐＨ安定性を有する。本酵素は、触媒的にヒアルロン酸とコンドロイチン硫酸を分解することができるが、アルギン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、キトサン、キチン、及びヒドロキシメチルセルロースナトリウムを分解することはできない。高分子量ヒアルロン酸を分解するのに本ヒアルロニダーゼを使用すれば、高い反応速度、中程度の反応条件、より少ない環境汚染が達成され、したがって、本酵素は、低分子量ヒアルロン酸及びオリゴマーヒアルロン酸のラージスケールでの工業的生産に適しており、低分子量コンドロイチン硫酸（本発明では、１，０００〜１０，０００の分子量を有するコンドロイチン硫酸と称され、これはさらに、ＬＭＷコンドロイチン硫酸とも称される）の生産にも使用することができる。本発明において、発酵でバチルスを使用することにより得られたヒアルロニダーゼは、中程度の条件で高い酵素活性を示し、取り扱いの簡便さ及び環境汚染がないことから、高分子量ヒアルロン酸又はその塩の分解において有用であり；加えて、得られたオリゴマーヒアルロン酸若しくはその塩又は低分子量ヒアルロン酸若しくはその塩は一体型の構造を有し、褐変しない。したがって、以下に示す発明を提供する。
【００１６】
本発明の一態様は、中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ）という名称の寄託機関に、寄託日２０１２年２月８日に寄託番号ＣＧＭＣＣ番号５７４４で寄託されたバチルス属菌に関する。
【００１７】
従来技術のヒアルロン酸又はその塩の生物学的分解における、例えば低い酵素活性、供給源の制限、及び高いコストなどの欠点を克服するために、本発明者らは、ヒアルロニダーゼを生産するバチルス（バチルス属菌）Ａ５０を空気から単離し、この株は、中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ）に、寄託日２０１２年２月８日に寄託番号ＣＧＭＣＣ番号５７４４で寄託されている。
【００１８】
本発明の別の態様は、本発明のバチルスを使用する工程を含むヒアルロニダーゼの調製方法に関し、特に、以下の工程：
本発明のバチルスを、斜面培養、種培養、発酵培養、遠心分離、硫酸アンモニウム分画沈殿、限外濾過にかけて、ヒアルロニダーゼを得る工程
を含む、ヒアルロニダーゼの調製方法に関する。
【００１９】
本発明の項目のいずれか１つに係るヒアルロニダーゼの製造方法であって、本方法は、以下の工程：
（１）本発明のバチルスを斜面培養にかけて、斜面培養株を得る工程；
（２）斜面培養株を滅菌した種培養培地に植え付け、２５℃〜４０℃、１００〜２００ｒｐｍで１０〜２４時間の条件下で培養して、種溶液を得る工程；
（３）種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、２５℃〜４０℃、１００〜３００ｒｐｍで１２〜２４時間の条件下で培養して、ヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得る工程；
（４）遠心分離により発酵ブロスを分離して、上清を得る工程；
（５）上清を硫酸アンモニウム分画沈殿、濾過（例えば、０．６５μｍの精密濾過膜を使用した濾過）にかけて、粗製ヒアルロニダーゼを得る工程；
（６）工程（５）で沈殿した粗製ヒアルロニダーゼをリン酸緩衝溶液中に溶解させ、限外濾過により低分子量の不純物を除去して、精製ヒアルロニダーゼを得る工程
を含む。
【００２０】
任意選択で、工程（６）は、以下の工程（６−１）〜（６−３）：
（６−１）：工程（５）の粗製ヒアルロニダーゼをｐＨ４．５〜８．０の緩衝溶液中に溶解させて、粗製酵素溶液を得て；粗製酵素溶液を、３．０×１０３〜１．４×１０４Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグにローディングし、ｐＨ４．５〜８．０の緩衝溶液中に置き、４℃で終夜透析する工程；
（６−２）：透析した粗製酵素溶液を、クロマトグラフィーカラムの充填材としてＤＥＡＥアガロースゲルＦＦ媒体と勾配溶出のための０〜０．５ＭのＮａＣｌ溶液とを使用したイオン交換クロマトグラフィー分離にかけて、溶出ピークを回収する工程；
（６−３）：工程（６−２）で得られたヒアルロニダーゼサンプルを真空凍結乾燥にかけて、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得る工程
によって実行することができる。
【００２１】
工程（６−１）〜（６−３）は、ヒアルロニダーゼをさらに精製するためのものである。
【００２２】
上記のヒアルロニダーゼを分離及び精製する過程において、工程（６−２）で得られたヒアルロニダーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により測定した場合、９７％又はそれより高い純度を有する。
【００２３】
上記の工程（１）において、斜面培養培地は、１００ｍＬあたり、以下の成分：０．２〜２．０ｇのペプトン、０．２〜２．０ｇの酵母粉末、０．０５〜０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５〜０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５〜１．５ｇのグルコース、２．０ｇの寒天粉末を含有し；ｐＨは、６．０〜８．０に調節され、斜面培養の温度は、２５℃〜４０℃である。
【００２４】
上記の工程（２）において、種培養培地は、１００ｍＬあたり、以下の成分：０．２〜２．０ｇのペプトン、０．２〜２．０ｇの酵母粉末、０．０５〜０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５〜０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５〜１．５ｇのグルコースを含有し；ｐＨは、６．０〜８．０に調節される。
【００２５】
上記の工程（３）において、発酵培養培地は、１００ｍＬあたり、以下の成分：０．２〜２．０ｇのペプトン、０．２〜２．０ｇの酵母粉末、０．０５〜０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５〜０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５〜１．５ｇのグルコース、０．０５ｍＬのトゥイーン８０を含有し；ｐＨは、６．０〜８．０に調節される。
【００２６】
斜面培養培地、種培養培地、及び発酵培養培地のｐＨは、塩酸、硫酸又はリン酸のうち１種又は複数を使用して調節される。
【００２７】
斜面、種培養、及び発酵のための植菌量は、独創的な作業を行わずとも従来技術で得ることができる。種培養培地のための植菌量は、発酵培養のための種溶液の植菌量を得るのに十分な量であり、発酵培養培地のための植菌量は、通常、３％〜１５％である。
【００２８】
上記の工程（４）において、発酵ブロスの遠心分離の回転速度は、１００００〜１５０００ｒｐｍであり、遠心分離時間は、１０〜２０分間である。
【００２９】
上記の工程（５）において、硫酸アンモニウム分画沈殿は、以下の工程：上清に硫酸アンモニウムを添加して、２０％ｗ／ｖ〜２５％ｗ／ｖの濃度にし、生成した沈殿を濾過により除去し、硫酸アンモニウムを濃度が３５％〜４０％ｗ／ｖになるまで連続的に添加し、ヒアルロニダーゼとして沈殿を得る工程を含む。本発明において、「ｗ／ｖ濃度」は、上清１ｍＬあたりの硫酸アンモニウムの質量（ｇ）を指す。
【００３０】
上記の工程（６）において、リン酸緩衝溶液は、好ましくは６．０のｐＨ、好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度を有するが、実際の環境に応じて変更することができる。限外濾過は、限外濾過膜を使用する。限外濾過膜は、３×１０４Ｄａの分子量カットオフを有する。
【００３１】
本発明のさらにその他の態様は、前述の項目のいずれか１つに係るヒアルロニダーゼの調製方法により得られるヒアルロニダーゼに関する。
【００３２】
本発明のバチルスにより生産されたヒアルロニダーゼは、発酵ブロス中で最大１×１０５〜３×１０５ＩＵ／ｍＬの酵素活性を有し、これは、報告されている最大の酵素活性（１．３×１０２ＩＵ／ｍＬ）よりもはるかに大きく、この酵素は、高い熱安定性とｐＨ安定性を有する。この酵素を使用して、高分子量ヒアルロン酸を分解してオリゴマー又は低分子量ヒアルロン酸を生産すれば、コストが有意に低くなり、ラージスケールでの生産に使用することができる。したがって、動物由来ヒアルロニダーゼの高いコストの問題は解決される。この酵素は、生物学的な調査や、オリゴマー又は低分子量ヒアルロン酸の生産における用途において有望である。
【００３３】
本発明はさらに、そのアミノ酸配列が配列番号２に示される単離されたポリペプチド（又はタンパク質）に関し、特に、前記ポリペプチド（又はタンパク質）は、ヒアルロニダーゼである。
【００３４】
本発明はさらに、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、特に、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３で示されるような配列又は配列番号３の相補配列である。
【００３５】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。
【００３６】
本発明はさらに、本発明の組換えベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３７】
本発明のさらにその他の態様は、オリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートの調製方法に関し、本方法は、本発明の項目のいずれか１つに係るヒアルロニダーゼ又は本発明の項目のいずれか１つに係るヒアルロニダーゼを含有する発酵ブロスを使用することにより、１０ｋＤａより大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を分解する工程を含む。
【００３８】
本発明に係るオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートの調製方法は、以下の工程：
１）ヒアルロン酸又はその塩の溶液の調製：１０ｋＤａより大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を精製水に添加して、１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの濃度を有する溶液を得る工程；
２）酵素分解：工程１）の溶液温度を２０℃〜４８℃、ｐＨ４〜９に調節し、前記溶液にバチルス由来ヒアルロニダーゼを添加し、ヒアルロン酸又はその塩を所望の分子量まで分解して、酵素分解溶液を得る工程；
３）不活性化：酵素分解溶液を５０℃〜９０℃で１０〜６０分維持して、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する工程；
を含み、好ましくは、以下の工程：
４）濾過：不活性化された酵素分解溶液に可溶性の無機塩を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、０．４５μｍの濾過膜で濾過して、濾液を得る工程、ここで酵素による加水分解産物１００ｍＬあたり、０．１〜１０ｇの可溶性の無機塩が添加される；
５）沈殿：工程４）の濾液を、濾液の３〜２０倍の体積のアルコール又はケトンと均一に混合して、オリゴマーヒアルロナートを沈殿させる工程；
６）脱水及び乾燥：工程５）のオリゴマーヒアルロナートの沈殿を分離し、有機溶媒で脱水し、真空乾燥し、オリゴマーヒアルロナートを得る工程
をさらに含む。
【００３９】
本発明に係るオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートの調製方法の工程１）において、１ｋｇのヒアルロン酸又はその塩あたり、２×１０７〜５×１０７ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼが添加される。
【００４０】
本発明に係るオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートの調製方法の工程２）において、酵素分解の温度は３５℃〜４５℃であり、酵素分解のｐＨは５．５〜７．５であり、ヒアルロン酸を酵素溶解して、３０００Ｄａ以上１０４Ｄａ未満の分子量にする。
【００４１】
本発明に係るオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートの調製方法は、以下のＡ〜Ｆのうち１つ又は複数を満たす：
Ａ．工程１）において、ヒアルロナートは、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及び亜鉛塩からなる群より選択される；
Ｂ．工程２）において、酸又は塩基を使用して、ｐＨを４〜９に調節し、前記酸は、塩酸、氷酢酸、硫酸、及びリン酸からなる群より選択され、前記塩基は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである；
Ｃ．工程３）において、酵素分解溶液を５５℃〜６５℃で２０〜３０分維持することにより、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する；
Ｄ．工程４）において、前記可溶性の無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択され；好ましくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛若しくはマグネシウムの塩化物、硫酸塩又は硝酸塩である；
Ｅ．工程５）において、前記アルコール又はケトンは、エタノール、アセトン、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノールである；
Ｆ．工程６）において、脱水に使用される有機溶媒は、ケトン又はアルコールである。
【００４２】
上記の方法において、使用されるバチルス由来ヒアルロニダーゼ、すなわちＣＧＭＣＣ番号５７４４のバチルス（バチルス属菌）Ａ５０の発酵により得られた精製ヒアルロニダーゼの特異的な活性は、８×１０６〜１．５×１０７ＩＵ／ｍｇであり、添加される酵素の量は、ヒアルロン酸又はその塩１ｋｇあたり２×１０７〜５×１０７ＩＵである。本ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸に対して優れた分解活性を有し、酵素分解中、期間の長さを制御することにより所望の分子量を有するヒアルロン酸が得られるように、好適な量のヒアルロニダーゼを添加することによってあらゆる低分子量のヒアルロン酸を得ることができる。
【００４３】
加えて、工程４）は、例えばヒアルロニダーゼなどの不純物を除去して産物の純度が改善されるように、濾過膜を使用して酵素による加水分解産物を濾過する。濾過膜は、本発明の孔径の必要条件を満たしている限り、従来技術において一般的な濾過膜である。濾過膜の孔径は０．４５μｍであり、その原料は、セルロースエステル、ポリスルホン、又はポリアミドであってもよい。
【００４４】
上記の工程６）において、脱水に使用される有機溶媒は、水と互いに可溶性の有機溶媒である；有機溶媒は、好ましくはケトン又はアルコールであり、最も好ましくはエタノール及び／又はアセトンである。いかなる理論にもとらわれるつもりはないが、前記有機溶媒がオリゴマーヒアルロナートの沈殿に添加されると、沈殿中の水の多くが除去される。
【００４５】
本発明のオリゴマーヒアルロン酸又はその塩の調製方法は、取り扱いが簡便であり、中程度の条件を使用し、生成物の構造破壊がなく、環境汚染がなく、発酵由来ヒアルロニダーゼによりコストが低く、ラージスケールでの工業的生産に好適であり、調製されたオリゴマーヒアルロナートは、一体型の構造を有し、優れた経皮吸収性を有し、高い純度を有し、細胞毒性がなく、強い抗酸化剤力を有し、さらに、化粧品、食品、及び医薬品で広く使用することができる。
【００４６】
本発明のさらにその他の態様は、本発明の項目のいずれか１つに係るオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートの調製方法により得られるオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートに関する。
【００４７】
本発明のさらにその他の態様は、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上（ｗ／ｗ）の量でＮ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸の二糖を有するオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートに関し；特に、Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸の二糖の量は、ＨＰＬＣ法により測定される。とりわけ、ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：高速液体クロマトグラフィー測定を行うための糖類分析カラムを使用すること；移動相が０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４溶液であること；流速が０．６ｍｌ／分であること；カラム温度が３５℃であること；検出波長が２３２ｎｍであること；及びサンプルのサイズが２０μＬであること。
【００４８】
例えば、以下の工程を使用することができる：
ａ．標準的な対照溶液：標準的な対照（ヒアルロン酸二糖ΔＤｉＨＡナトリウム塩、Ｈ９６４９、Ｓｉｇｍａ）の量を量り、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５ｍｍｏｌ／Ｌ）で溶解させて、１ｍｇ／ｍＬ溶液を配合することにより、標準的な対照溶液を得る。
【００４９】
ｂ．サンプルの前処理：試験されるサンプル（比較例１〜７、例１３〜２６により調製された）の量を量り、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５ｍｍｏｌ／Ｌ）で溶解させて、１ｍｇ／ｍＬ溶液を配合する。１ｍＬのサンプル溶液に１０００ＩＵのヒアルロニダーゼ（例１０〜１２で調製することができる）を添加し、４２℃の水浴に２時間入れ；酵素分解後に、酵素分解溶液を２分沸騰させて酵素を不活性化することにより、サンプルの酵素分解溶液を得る。
【００５０】
サンプルの酵素分解溶液を２０ｍＬのメスフラスコに移し、所定の目盛りまで移動相を添加し、均一に混合し、濾過して、試験される溶液を得る。
【００５１】
ｃ．標準的な対照溶液の処理：１ｍＬの標準的な対照溶液を移動相で２０倍に希釈し、予備的な使用のために濾過する。
【００５２】
ｄ．クロマトグラフィー条件：高速液体クロマトグラフィー測定を行うための糖類分析カラムを使用すること；移動相が０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４溶液であること；流速が０．６ｍｌ／分であること；カラム温度が３５℃であること；検出波長が２３２ｎｍであること；サンプルのサイズが２０μＬであること。
【００５３】
ｅ．結果の計算：標準的な対照と試験されるサンプルとのクロマトグラフィーによる分離を行うために高速液体クロマトグラフィーを使用し、外部標準法によりヒアルロン酸二糖のピーク面積を計算する；特に、以下の式を使用して、オリゴマーヒアルロン酸又はその塩の含量（Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸の二糖の含量で示される）を計算する。
【００５４】
オリゴマーヒアルロン酸又はその塩の含量：Ｃ（％）＝
【数１】
0005957096.tif 000002
Ａｘ：試験されるサンプルのヒアルロン酸二糖のピーク面積；
ＡＲ：標準的な対照のヒアルロン酸二糖のピーク面積；
Ｗｘ：試験されるサンプルの量、ｍｇ；
ＣＲ：標準的な対照溶液の濃度、ｍｇ／ｍＬ；
ｈ（％）は、試験されるサンプルの乾燥減量である。
【００５５】
その全ての内容が参照により本発明に取り入れられる公報番号ＣＮ１０２３２３３４４Ａの中国特許出願においても、具体的な方法を参照することができる。
【００５６】
本発明の項目のいずれか１つに係るオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートに関して、ＨＰＬＣ法により測定される場合のその含量と、カルバゾール法により測定される場合のその含量とでは、１％未満の差がある。
【００５７】
本発明の項目のいずれか１つに係るオリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートは、３０００Ｄａ以上１０４Ｄａ未満の分子量を有する。特に、オリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートは、酵素分解法（酵素消化法）により調製され；とりわけ、本発明のヒアルロニダーゼを使用することにより調製される。
【００５８】
本発明の項目のいずれか１つに係るオリゴマーヒアルロナートは、白色の粉末又は顆粒であり、その含量は、９５％より多く、その０．１％水溶液は、ｐＨ６〜８を有する。その赤外線スペクトルは欧州薬局方の標準スペクトルと一致し、その特性は優れており、その構造は破壊されていない。
【００５９】
本発明のさらにその他の態様は、低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートの調製方法に関し、本方法は、本発明の項目のいずれか１つに係るヒアルロニダーゼ又は本発明の項目のいずれか１つに係るヒアルロニダーゼを含有する発酵ブロスを使用して、１０００ｋＤａよりも大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を分解する工程を含む。
【００６０】
本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートの調製方法は、以下の工程：
１）ヒアルロン酸又はその塩の溶液の調製：１０００ｋＤａよりも大きい分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を精製水に添加して、０．１％ｗ／ｖ〜２％ｗ／ｖの濃度を有する溶液を得る工程；
２）酵素分解：工程１）の溶液温度を２０℃〜４８℃に、ｐＨを４〜９に調節し、次いで前記溶液にバチルス由来ヒアルロニダーゼを添加して、ヒアルロン酸又はその塩を所望の分子量まで分解して、酵素分解溶液を得る工程；
３）不活性化：酵素分解溶液を５０℃〜９０℃で１０〜６０分維持して、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する工程；
を含み、好ましくは、以下の工程：
４）濾過：不活性化された酵素分解溶液に可溶性の無機塩を添加し、完全に溶解するまで撹拌し、０．４５μｍの濾過膜で濾過して、濾液を得る工程、ここで酵素による加水分解産物１００ｍＬあたり、０．１〜１０ｇの可溶性の無機塩が添加される；
５）沈殿：工程４）の濾液を、濾液の１〜１０倍の体積のアルコール又はケトンと均一に混合して、低分子量ヒアルロナートを沈殿させる工程；
６）脱水及び乾燥：工程５）の低分子量ヒアルロナートの沈殿を分離し、有機溶媒で脱水し、真空乾燥し、低分子量ヒアルロナートを得る工程
をさらに含む。
【００６１】
本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートの調製方法の工程１）において、１ｋｇのヒアルロン酸又はその塩あたり、１０６〜１０７ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼが添加される。
【００６２】
本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートの調製方法の工程２）において、酵素分解の温度は３５℃〜４５℃であり、酵素分解のｐＨは５．５〜７．５であり、ヒアルロン酸を酵素溶解して、１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ；好ましくは１０ｋＤａ〜７７０ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜７００ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；より好ましくは１０ｋＤａ〜４００ｋＤａ；より好ましくは１０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量にする。
【００６３】
本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートの調製方法は、以下のＡ〜Ｆのうち１つ又は複数を満たす：
Ａ．工程１）において、ヒアルロナートは、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、及び亜鉛塩からなる群より選択される；
Ｂ．工程２）において、酸又は塩基を使用して、ｐＨを４〜９に調節し、前記酸は、塩酸、氷酢酸、硫酸、及びリン酸からなる群より選択され、前記塩基は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである；
Ｃ．工程３）において、酵素分解溶液を５５℃〜６５℃で２０〜３０分維持することにより、バチルス由来ヒアルロニダーゼを不活性化する；
Ｄ．工程４）において、可溶性の無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択され；好ましくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛又はマグネシウムの塩化物、硫酸塩又は硝酸塩である；
Ｅ．工程５）において、前記アルコール又はケトンは、エタノール、アセトン、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノールである；
Ｆ．工程６）において、脱水に使用される有機溶媒は、ケトン又はアルコールである。
【００６４】
本発明のさらにその他の態様は、本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートの調製方法により調製される、低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートに関する。
【００６５】
本発明のさらにその他の態様は、９０％以上又は９５％以上（ｗ／ｗ）の量でＮ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸の二糖を有する低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートに関し；特に、Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸の二糖の量は、ＨＰＬＣ法により測定される。とりわけ、ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：高速液体クロマトグラフィー測定を行うための糖類分析カラムを使用すること；移動相が０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４溶液であること；流速が０．６ｍｌ／分であること；カラム温度が３５℃であること；検出波長が２３２ｎｍであること；及びサンプルのサイズが２０μＬであること。具体的な方法はさらに、上記したオリゴマーヒアルロン酸又はその塩の含量（Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸の二糖の含量）を測定するための方法を指す場合もある。
【００６６】
本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートは、１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ；好ましくは１０ｋＤａ〜７７０ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜７００ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜６００ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；より好ましくは１０ｋＤａ〜４００ｋＤａ；より好ましくは１０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量を有する。特に、低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートは、酵素分解法（酵素消化法）により調製され；より特に、本発明のヒアルロニダーゼを使用することにより調製される。
【００６７】
本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートに関して、ＨＰＬＣ法により測定される場合のその含量と、カルバゾール法により測定される場合のその含量とでは、１％未満の差がある。
【００６８】
いかなる理論にもとらわれるつもりはないが、同じ酵素量が使用される場合、異なる分子量を有するヒアルロン酸は、異なる酵素分解時間を制御することにより得ることができ、すなわち、低分子量ヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートは、好適な酵素分解時間を制御することにより得ることができる。しかしながら、実際には、酵素活性は長期間を経た後に低下する可能性があり、ヒアルロナートの溶液が細菌で汚染される可能性があることから、異なる量の酵素の添加を制御することにより異なる分子量を有するヒアルロン酸を得ることが好ましく、例えば、低分子量ヒアルロナートの調製はより少ない量の酵素しか必要としないが、オリゴマーヒアルロナートの調製はより多くの量の酵素を必要とする。
【００６９】
生成物の分子量は、間隔を置いてサンプリングすることにより測定することができる。オリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートの分子量は、ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法又はＬａｕｒｅｎｔ法（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ方法がより便利である）により測定することができる；当業者は、当分野における知見に従って検出するために好適な時間間隔を選択することができる。
【００７０】
本発明のさらにその他の態様は、本発明の項目のいずれか１つに係るヒアルロニダーゼ、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクター、本発明の組換え宿主細胞、又は本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸若しくは低分子量ヒアルロナートを含む組成物に関し；任意選択で、本組成物は、薬学的に許容される、又は食品学的に許容されるキャリアー若しくは添加剤をさらに含み；特に、本組成物は、化粧品、食品、又は医薬品であり；とりわけ、化粧品は、日焼け防止、日焼け後の修復、アンチエイジング、又は保湿化粧品である。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、ヒアルロニダーゼ製造における、本発明のバチルス、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクター、又は本発明の組換え宿主細胞の使用に関する。
【００７２】
当分野で公知の技術的な手段を使用して、本発明に係るヒアルロニダーゼをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングして、好適な宿主細胞に形質導入して、本発明のヒアルロニダーゼを発現させることができる。
【００７３】
本発明はさらに、オリゴマーの酸若しくはオリゴマーヒアルロナート、低分子量ヒアルロン酸若しくは低分子量ヒアルロナート、又は低分子量コンドロイチン硫酸の製造における、本発明の項目のいずれか１つに係るヒアルロニダーゼの使用に関する。
【００７４】
本発明はさらに、血管新生を促進する、及び／又は創傷治癒若しくは抗酸化若しくはフリーラジカル捕捉若しくは日焼け防止若しくは日焼け後の修復を促進する、又はＨＵＶＥＣ細胞増殖を促進する、又は抗腫瘍（例えば乳房腫瘍、肺癌、又は神経膠腫）、又は免疫性を強化するための医薬品の製造における、又は食品又は健康管理製品又は化粧品の製造における、本発明の項目のいずれか１つに係るオリゴマーの酸又はオリゴマーヒアルロナート、又は本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸若しくは低分子量ヒアルロナートの使用に関し；特に、化粧品は、日焼け防止、日焼け後の修復、アンチエイジング、又は保湿化粧品である。
【００７５】
本発明のさらにその他の態様は、インビボ若しくはインビトロで、血管新生を促進する、及び／又は創傷治癒若しくは抗酸化若しくはフリーラジカル捕捉を促進する、又はＨＵＶＥＣ細胞増殖を促進する、又は腫瘍（例えば乳房腫瘍、肺癌、又は神経膠腫）を抑制する方法に関し、本方法は、対象に、本発明の項目のいずれか１つに係るオリゴマーの酸又はオリゴマーヒアルロナート、又は本発明の項目のいずれか１つに係る低分子量ヒアルロン酸若しくは低分子量ヒアルロナートの有効量を投与又は使用する工程を含み；特に、対象は哺乳動物であり、とりわけ、対象はヒトである。
【００７６】
本発明において、特に他の規定がない限り、「オリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナート」は、簡略的に「オリゴマーヒアルロン酸又はその塩」と称される場合もあり、オリゴマーヒアルロン酸又はオリゴマーヒアルロナートは、１０ｋＤａ未満の分子量を有し；好ましくは、３０００Ｄａ以上１０４Ｄａ未満の分子量を有する。オリゴマーヒアルロナートの種類は特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などが挙げられる。
【００７７】
本発明において、特に他の規定がない限り、「低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナート」は、簡略的に「低分子量ヒアルロン酸又はその塩」と称される場合もあり、低分子量ヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロナートは、１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ；好ましくは、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；より好ましくは１０ｋＤａ〜４００ｋＤａ；さらに好ましくは１０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、又は１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量を有する。低分子量ヒアルロナートの種類は特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などが挙げられる。
【００７８】
本発明において、所定の成分の含量パーセントに関して、特に他の規定がない限り、重量パーセント（ｗ／ｗ）で示される。
【００７９】
本発明のその他の用語のいくつかを以下に示す。
【００８０】
発現ベクター
また本発明は、本発明のヌクレオチド配列、プロモーター、加えて転写及び翻訳終結シグナルを含む組換え発現ベクターにも関する。上記の様々な核酸及び調節配列は一緒に連結されて、組換え発現ベクターを調製することができ、ベクターは、１つ又は複数の便利な制限部位を含んでいてもよく、これらの部位にヒアルロニダーゼをコードするヌクレオチド配列を挿入又は置換させることができる。又は本発明のヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターに本発明のヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列又はヌクレオチドコンストラクトを挿入することにより発現させてもよい。発現ベクターを調製する際、コードされた配列は、好適な発現調節配列に作動可能に連結されるようにベクター中に配置することができる。
【００８１】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ操作の実行及びヌクレオチド配列の発現に好適なあらゆるベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってもよい。ベクターは、通常、ベクターとそれが導入される宿主細胞の適合性に従って選択される。ベクターは、直鎖状のプラスミドでもよいし、又は閉ループプラスミドでもよい。
【００８２】
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、小染色体、又は人工染色体などの自己増殖ベクター（すなわち、染色体なしで複製可能な染色体外の無傷の構造）であってもよい。ベクターは、あらゆる自己複製メカニズムを含有していてもよい。又はベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに統合され、統合された染色体と共に複製されるようなベクターである。加えて、単一のベクター若しくはプラスミド、又は２つ以上のベクター若しくはプラスミドは、一般的に、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを含有し、又はトランスポゾンも使用することができる。
【００８３】
好ましくは、本発明のベクターは、形質転換した細胞を選択するための１つ又は複数の選択的なマーカーを含む。選択的なマーカーは、生成物に、殺生剤若しくはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性を付与する、又は栄養要求性を付与する遺伝子である。細菌性の選択的なマーカーの例としては、バチルス・ズブチリス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはバチルス・リケニフォルミス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｄａｌ遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、クロロマイセチン若しくはテトラサイクリンなどの抗生物質の耐性マーカーが挙げられる。
【００８４】
好ましくは、本発明のベクターは、宿主細胞のゲノムにベクターの安定な統合を確実にする、又は細胞中で細胞のゲノムに頼ることなくベクターの自己複製を確実にする要素を含む。
【００８５】
自己複製に関して、ベクターは、標的宿主細胞中での自己複製が確実に起こるようにする複製起点を含んでいてもよい。複製起点は、宿主細胞中で温度感受性型に変化させる突然変異を含んでいてもよい（例えば、ｆＥｈｒｌｉｃｈ、１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７５：１４３３を参照）。
【００８６】
遺伝学的産物の収量が増加するように、本発明のヌクレオチド配列の１つ又は複数のコピーが宿主細胞に挿入されてもよい。ヌクレオチドのコピー数の増加は、宿主細胞のゲノムに配列の少なくとも１つの追加のコピーを挿入するか、又はヌクレオチド配列と共に増幅することができる選択的なマーカーを挿入し、好適な選択的な物質の存在下で細胞を培養し、増幅したコピーを含有する選択的なマーカー遺伝子を選び出し、ヌクレオチド配列の追加のコピーを含有する細胞を得ることにより実行することができる。
【００８７】
本発明の組換え発現ベクターであるコンストラクトに上記の要素を連結させる操作は当分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９を参照）。
【００８８】
宿主細胞
本発明はさらに、ヒアルロニダーゼ生産のための本発明のヌクレオチド配列（ポリヌクレオチド）の組換えのための組換え宿主細胞に関する。本発明のヌクレオチド配列を含有するベクターは、ベクターが染色体に統合された形態で、又は自己増殖性染色体外ベクターの形態で維持されるように宿主細胞に導入することができる。用語「宿主細胞」は、複製中の突然変異による、親細胞とは異なる全ての派生物を包含する。宿主細胞の選択は、主として、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子及びそれらの源に依存する。
【００８９】
宿主細胞は、原核細胞であってもよいし、又は真核細胞であってもよく、例えば細菌又は酵母細胞などである。ベクターは当業者公知の技術により宿主細胞に導入することができる。
【００９０】
調製方法
本発明はさらに、本発明のヒアルロニダーゼの組換え生産方法に関し、本方法は、（ａ）ヒアルロニダーゼ生成に好適な条件下でヌクレオチドコンストラクトを含有する宿主細胞を培養すること、前記ヌクレオチドコンストラクトは、本ヒアルロニダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む；及び（ｂ）ペプチドを回収することを含む。
【００９１】
本発明の調製方法において、細胞は、ヒアルロニダーゼ生産に好適な培養培地中で培養される。例えば、好適な培養培地中で、ヒアルロニダーゼの発現及び／又はヒアルロニダーゼの分離を可能にする条件下で、細胞は、スモール又はラージスケールでの発酵用の振盪フラスコ、実験用又は工業用発酵タンク（例えば連続式、バッチ式、流加バッチ式、又は固体発酵式など）で培養される。炭素源及び窒素源、加えて無機塩を含有する好適な培養培地中で、当分野で公知の培養工程が使用される。好適な培養培地は、製造元によって供給されるものでもよいし、又は公知の組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載されたもの）に従って調製してもよい。培養培地にヒアルロニダーゼが分泌される場合、培養培地からヒアルロニダーゼを直接回収することができる。ヒアルロニダーゼが分泌されない場合、細胞溶解物産物からヒアルロニダーゼを回収することができる。
【００９２】
生産されたヒアルロニダーゼは、当分野で公知の方法により回収することができる。例えば、ヒアルロニダーゼは、従来の操作（例えば、これらに限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿など）により培養培地から回収することができる。
【００９３】
本発明のヒアルロニダーゼは、当分野で公知の工程により精製することができ、これらの工程としては、これらに限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除クロマトグラフィー）、ＨＰＬＣ、電気泳動（例えば、分取用等電点分画法）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ及びＬａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ編、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９を参照）が挙げられる。
【００９４】
本発明の有益な作用
本発明において、バチルスを使用して、オリゴマーヒアルロン酸若しくはその塩又は低分子量ヒアルロン酸又はその塩を生産する方法は、操作が簡単であり、中程度の条件を使用し、生成物の構造へのダメージがなく、環境汚染がなく、且つ発酵源からのヒアルロニダーゼが低コストであり、さらにラージスケールでの工業的生産に好適である。本発明のオリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートは、例えば一体型の構造、高い純度、細胞毒性がないこと、強い抗酸化能、褐変がないことなどの利点を有し、化粧品、食品、及び医薬品の分野で使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図であり、マーカーは、未染色のタンパク質分子量マーカーであり；レーン１、２、３は、それぞれ例１０、１１、１２で調製されたヒアルロニダーゼである。
【図２（Ａ）】様々な方法で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルのグラフであり、欧州薬局方に係るヒアルロン酸ナトリウムの標準の赤外線スペクトルである。
【図２（Ｂ）】様々な方法で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルのグラフであり、比較例１で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルである。
【図２（Ｃ）】様々な方法で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルのグラフであり、例１３で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルである。
【図２（Ｄ）】様々な方法で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルのグラフであり、例１４で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルである。
【図２（Ｅ）】様々な方法で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルのグラフであり、例１５で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルである。
【図２（Ｆ）】様々な方法で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルのグラフであり、例１６で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルである。
【図２（Ｇ）】様々な方法で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルのグラフであり、例１７で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルである。
【図２（Ｈ）】様々な方法で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルのグラフであり、例１８で調製されたオリゴマーヒアルロナートの赤外線スペクトルである。
【図３（Ａ）】ヒアルロニダーゼ活性に対する温度の作用を示すグラフである。
【図３（Ｂ）】ヒアルロニダーゼの熱安定性の実験結果を示すグラフである。
【図４（Ａ）】ヒアルロニダーゼ活性に対するｐＨの作用を示すグラフである。
【図４（Ｂ）】ヒアルロニダーゼのｐＨ安定性の実験結果を示すグラフである。
【図５（Ａ）】オリゴマーヒアルロナートの経皮吸収速度を示すグラフである。
【図５（Ｂ）】オリゴマーヒアルロナートのＤＰＰＨのフリーラジカル捕捉能力を示すグラフである。
【図５（Ｃ）】低分子量ヒアルロナートのＤＰＰＨのフリーラジカル捕捉能力を示すグラフである。
【図５（Ｄ）】オリゴマーヒアルロナートの還元能力を示すグラフである。
【図５（Ｅ）】低分子量ヒアルロナートの還元能力を示すグラフである。
【図６（Ａ）】ＵＶＡ放射線照射後のＬ９２９細胞へのオリゴマーヒアルロナートの修復作用を示すグラフである。
【図６（Ｂ）】ＵＶＡ放射線照射後のＬ９２９細胞への低分子量ヒアルロナートの修復作用を示すグラフである。
【図６（Ｃ）】ＵＶＡ放射線照射に対するＬ９２９細胞へのオリゴマーヒアルロナートの保護作用を示すグラフである。
【図６（Ｄ）】ＵＶＡ放射線照射に対するＬ９２９細胞への低分子量ヒアルロナートの保護作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
本発明に関する寄託された生物学的材料：
本発明のバチルス（バチルス属菌）Ａ５０を、２０１２年２月８日に中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ）に寄託番号ＣＧＭＣＣ番号５７４４で寄託し、その寄託機関の住所は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、３＃、Ｂｕｌｄ．１、Ｗｅｓｔ  Ｂｅｉｃｈｅｎ  Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、１００１０１である。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態を以下の実施例と共に詳細に例示するが、当業者であれば、以下の実施例は単に本発明を例示することを意図しており、本発明の範囲への限定とみなすべきではないことを理解しているであろう。実施例で提示されていない具体的な技術又は条件は、当分野の文献（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＨＵＡＮＧ  Ｐｅｉｔａｎｇら翻訳の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第３版、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ）で説明されている技術又は条件に従って、又は製品の説明書に従って実行された。製造元が示されていない試薬又は機器は全て、一般的な市販品であった。
【００９８】
以下の実施例又は比較例において、オリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートの分子量をＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法により測定し；含量をＨＰＬＣ法又はカルバゾール法により測定した。オリゴマーヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロン酸、及び直接的な発酵により調製されたヒアルロン酸（構造は破壊されななかった）は全て、Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸の二糖の反復単位からなるため、それらの含量はそれらの二糖の含量に等しく、オリゴマーヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロン酸又は通常のヒアルロン酸は、バチルス由来ヒアルロニダーゼで二糖に分解することができ、二糖の含量は、オリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの含量が得られるようにＨＰＬＣ法により決定することができた。またオリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの含量は、カルバゾール法により決定することもできる（ＬＩＮＧ  Ｐｅｉｘｕｅ、Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｃｈｉｎａ  Ｌｉｇｈｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００２）。ヒアルロン酸又はその塩の構造が破壊されている場合、ヒアルロニダーゼは破壊された部分のグルコシド結合を切らないと予測されるため、それにより二糖の含量の低下が起こると予想される。カルバゾール法のメカニズムは、ヘキスロン酸含量を決定することを含み、それにより直接的な発酵により得られたオリゴマーヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロン酸又はヒアルロン酸の含量を得ることができる。それゆえに、これらの２つの方法により測定された含量の差を使用して、ヒアルロン酸又はその塩の構造が破壊されたかどうか、加えてその破壊の程度を間接的に観察することができる。
【００９９】
本発明においてヒアルロン酸又はその塩の分解に使用されるヒアルロニダーゼ（すなわち、以降、バチルス由来ヒアルロニダーゼ）を、バチルスＡ５０の発酵により得られたヒアルロニダーゼ発酵ブロスを調製し、それに続いて例えば遠心分離、硫酸アンモニウム分画沈殿、限外濾過などの工程を行うことによって得た。製造方法は、斜面培養株（バチルス属菌Ａ５０、ＣＧＭＣＣ番号５７４４）を入手し、滅菌した種培養培地に植え付け、２５℃〜４０℃、１００〜２００ｒｐｍで１０〜２４時間で培養し、次いで滅菌した発酵培養培地に種溶液を植え付け、植菌量は３％〜１５％であった、２５℃〜４０℃、１００〜３００ｒｐｍで１２〜２４時間培養し、発酵手順中のｐＨを、酸を使用して６．０〜８．０に維持し、発酵が終了した後ヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得て；発酵ブロスを１００００〜１５０００ｒｐｍで１０〜２０分遠心分離し、上清を得て、上清に硫酸アンモニウムを添加して、２０％ｗ／ｖ〜２５％ｗ／ｖの濃度にし、生成した沈殿を濾過により除去し、硫酸アンモニウムを濃度が３５％ｗ／ｖ〜４０％ｗ／ｖになるまで連続的に添加し、得られた沈殿、すなわちヒアルロニダーゼをリン酸緩衝溶液中に溶解させ、最後に３×１０４Ｄａの限外濾過膜で低分子量の不純物を除去して、酵素分解において有用なヒアルロニダーゼを得ることを含んでいた。
【０１００】
使用した培養培地は以下の通りであった：
斜面培養培地（１００ｍＬ）：０．２〜２．０ｇのペプトン、０．２〜２．０ｇの酵母粉末、０．０５〜０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５〜０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５〜１．５ｇのグルコース、２．０ｇの寒天粉末；ｐＨは、６．０〜８．０に調節され、水、斜面培養の温度は、２５℃〜４０℃であった。
【０１０１】
種培養培地（１００ｍＬ）：０．２〜２．０ｇのペプトン、０．２〜２．０ｇの酵母粉末、０．０５〜０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５〜０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５〜１．５ｇのグルコース；ｐＨは、６．０〜８．０に調節された。
【０１０２】
発酵培養培地（１００ｍＬ）：０．２〜２．０ｇのペプトン、０．２〜２．０ｇの酵母粉末、０．０５〜０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５〜０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５〜１．５ｇのグルコース、０．０５ｍＬのトゥイーン８０；ｐＨは、６．０〜８．０に調節された。
【０１０３】
上記の方法により調製された発酵ブロスを中国薬局方の方法により測定したところ（中国薬局方、２０１０年版、付則ＶＩＩ．Ｃ．ヒアルロニダーゼの測定を参照）、そのヒアルロニダーゼ活性は、１×１０５〜３×１０５ＩＵ／ｍＬであり、精製ヒアルロニダーゼの特異的な活性は、８×１０６〜１．５×１０７ＩＵ／ｍｇであった。
【０１０４】
（例１）バチルス（バチルス属菌）Ａ５０の獲得及び同定
１．バチルス（バチルス属菌）Ａ５０の獲得
強化培養培地を含有するペトリ皿を覆う皿をあけて、皿を空気中に置き、空気から定着した細菌を回収し、１時間後に覆いの皿を閉じ、好気培養のために皿を２５℃〜４０℃のインキュベーターに置き、２４時間培養した後、分離により得られたシングルコロニーをスクリーニング培養培地に植え付け、２５℃〜４０℃、１５０ｒｐｍで１２〜１６時間好気培養を行い、そのヒアルロニダーゼ活性を中国薬局方の方法により測定し、最大の酵素活性を有する株を本発明の株として選んだところ、その株の酵素は、最大１０５ＩＵ／ｍＬの活性を示すことができた。
【０１０５】
上記で使用された培養培地の組成は以下の通りであった：
強化培養培地（１００ｍＬ）：０．２〜２．０ｇのペプトン、０．２〜２．０ｇの酵母粉末、０．０５〜０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５〜０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１〜１ｇのヒアルロン酸ナトリウム、２．０ｇの寒天粉末。
【０１０６】
スクリーニング培養培地（１００ｍＬ）：０．２〜２．０ｇのペプトン、０．２〜２．０ｇの酵母粉末、０．０５〜０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５〜０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１〜１ｇのヒアルロン酸ナトリウム。
【０１０７】
得られたバチルス（バチルス属菌）Ａ５０を、２０１２年２月８日に中国微生物菌株保蔵管理委員会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ）に寄託番号ＣＧＭＣＣ番号５７４４で寄託し、その寄託機関の住所は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、３＃、Ｂｕｌｄ．１、Ｗｅｓｔ  Ｂｅｉｃｈｅｎ  Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、１００１０１であった。
【０１０８】
２．バチルス（バチルス属菌）Ａ５０の形態学的特徴
バチルスは、単一の形態又は連鎖した形態で棒状の形状を有していた。細菌のコロニーは乳白色であり、しわがあった。
【０１０９】
３．バチルス（バチルス属菌）Ａ５０の分子生物学的な特徴の同定
細菌性の１６Ｓ  ｒＤＮＡ万能プライマーをＷｅｉｓｂｕｒｇの方法に従って合成した：
プライマー１：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’；（配列番号４）；
プライマー２：５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号５）。
【０１１０】
Ａ５０株の全ＤＮＡ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔｉａｎｄｚ、Ｉｎｃ．のカラムタイプの細菌性ＤＮＡｏｕｔキットを使用して抽出した）をテンプレートとして使用し、その１６Ｓ  ｒＤＮＡフラグメントを増幅し、ここでＰＣＲ増幅反応システムは以下に示す通りとした：
１０×ＰＣＲ緩衝溶液  ５．０μｌ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）  １．０μｌ
プライマー１（１０μＭ）  １．０μｌ
プライマー２（１０μＭ）  １．０μｌ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）  ０．５μｌ
ＤＮＡテンプレート（５０ｎｇ／μＬ）  ０．５μｌ
脱イオン水を添加して総体積を５０μｌにした。
【０１１１】
ＰＣＲ反応条件は以下に示す通りとした：
【化１】
0005957096.tif 000003
【０１１２】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で検出し、配列決定した（Ｗｅｉｓｂｕｒｇ  Ｗ  Ｇ、Ｂａｍｓ  Ｓ  Ｍ、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｄ  Ａ、ら、系統発生学的な研究のための１６ＳリボソームＤＮＡの増幅（１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ）［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９１、１７３（２）：６９７〜７０３）。得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列（配列番号１、１４１８ｂｐ）は、以下に示す通りであった。
gcggctggct ccttacggtt accccaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattccg gcttcatgca ggcgagttgc agcctgcaat ccgaactgag aatggtttta tgggattggc taaacctcgc ggtcttgcag ccctttgtac catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgtc ccccgaaggg gaacgtccta tctctaggag tgtcagagga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt acagaccaga aagccgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc tacacgtgga attccgcttt cctcttctgt actcaagtcc cccagtttcc aatgaccctc cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaaaggac cgcctgcgcg cgctttacgc ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtaccggcag ttactccggt acttgttctt ccctaacaac agagctttac gacccgaagg ccttcatcgc tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggcccat ctgtaagtgt cagcgtaaac cgactttcag cttttcctca tgagaggaaa aggattatcc ggtattagct ccggtttccc gaagttatcc cagtcttaca ggcaggttgc ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac caagaggtgc aagcacctca agattcgctc gacttgca（配列番号１）。
【０１１３】
（例２）ヒアルロニダーゼのクローン及び配列分析
バチルス（バチルス属）Ａ５０のゲノムＤＮＡを細菌性ゲノムＤＮＡ抽出キットで抽出し、ゲノムＤＮＡ抽出の結果を１％アガロースゲル電気泳動で検出した。ゲノムを配列決定して、その株の全ゲノムのショットガン配列を得た。その間、本ヒアルロニダーゼの部分的なアミノ酸配列を得るために、バチルス（バチルス属）Ａ５０発酵ブロスから単離され精製されたヒアルロニダーゼのＮ末端配列を決定し、トリプシン分解後に内部ペプチドセグメントの配列を決定した。アミノ酸配列と１００％の類似性を有する遺伝子セグメントを見出し、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子のだいたいの位置を発見するために、全ゲノムのショットガン配列及び部分的なアミノ酸配列を、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴツールを使用してブラスト処理した。その後、ヒアルロニダーゼのＮ末端配列、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動バンドのサイズ、及びＧｅｎｅＴｏｏｌソフトウェアを用いたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の分析に基づいて、標的遺伝子の特定の位置及び統合されたヌクレオチド配列を決定し、ヌクレオチド配列をＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアを使用してアミノ酸配列に翻訳した。
【０１１４】
ヒアルロニダーゼ（配列番号２、１１０６ａａ）のアミノ酸配列は、以下に示す通りであった。
NESTLLLNTSFEETEAPKSGWDQLGAPKWGVWRPTGSPIVTITKEASRTGEYGLKIAAAQSARAAVSQDVPVQGGQTYQLGTWLKTDNIVSGQGARLRVVLYEGTQQLGLLYSSRLTGTHDWSQIKMEVKTPANADSIRVQLFFETGTGTALFDDVSLQLIQPATSIAIEESEITIKEQETGLLHAQMVPADASSKVSWVSADPSIATVDNGKVTGVNPGGTTIMAFTDNGLAATSTVKVIKNDGIERPEVTQLDLQPKELELGSGQVRLLQAIIAPATADAEKLVWSSSNEAVASIQKGLIEAKASGTAVITVETEDGSLKSESQITVTDAVVDEYDQLRKKWKSLMTGLDSYDPTNVRMNEMIQNQTKSAETLWKTMFKNNDRSFLWINFASTDNSADIRDSYRNLTTMAKAFANEHSSLYRNPQLLKDITEALEWLYQNRYNESIAQYSNWWHWEIGVPNELNSLMVLLYDYLDQDSIHRYLKVVDHFQPDPTKSGATTPEKYREALGANRIDVSKVVGVRGVIVKDATKIAAARDALSQTFENVTEGDGFYEDGSFVQHENIAYNGSYGIVLIEGLTDMLELLSNSTWQVTDPKVTNVYDWIETAYEPFMYKGALMDMVRGRAISRNFLQDHQAGHTIIKSVIRMAQFAPEPYAEKYNSMAKYWLQEDTYLDYFKNAGNFRDITLAKQLLEKQEVTPRGDLDFHKTFASMDRVVHRKSGYAFGISMYSNRIQNYEDMNDENRKGWYTGEGMTYLYNGDLAQYSDDFWPTVDPYRMPGTTVDTMRRADGSGEHRSSESWTGGSTLKNFGSAGMSYDAWNSSLIAKKSWFMFDNEIVALGAGITSSEDRNVESIVENRKIRNDGSNQLVINGETLNLSNGGQNQTMAAKWAFLEGNVPGADIGYYFPEGKMLTIKKEERTGAWKDINYGGPAEAIKRSYTTMWFDHGVRPEQDTYSYVLLPGLNKEQTHQYSQNPDITILRNDSAVQAVQDVKENIIGANFWKDEKQSAGPLTVYQKASVTMQEKDGVLEIAVCDPTMENKGSIEIEIDGKAFKVLEADESITVENTKPSIKLKVNVNEAKGKTFTAKLKMIPSQKGNSPNSIR（配列番号２）
【０１１５】
ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３、３３２４ｂｐ、１１０６アミノ酸をコードする）は、以下に示す通りであった。
AATGAATCTACTTTACTATTGAATACTAGTTTTGAAGAGACGGAGGCGCCAAAATCAGGCTGGGATCAATTAGGTGCACCAAAATGGGGTGTCTGGAGACCTACCGGAAGCCCCATTGTAACCATTACAAAGGAAGCAAGCCGTACGGGTGAGTATGGTTTAAAAATTGCCGCGGCGCAATCTGCTAGAGCTGCCGTGTCACAGGATGTACCTGTTCAGGGCGGGCAGACCTATCAGTTAGGCACCTGGCTGAAGACAGATAATATCGTCAGCGGTCAAGGGGCGCGGCTGAGGGTTGTTTTATATGAAGGAACCCAGCAGCTGGGCTTACTTTACTCTTCAAGATTAACTGGGACCCACGATTGGTCGCAAATAAAAATGGAGGTAAAGACTCCTGCCAATGCCGATAGCATCCGTGTCCAGCTTTTCTTTGAAACAGGAACGGGTACAGCCCTATTTGATGATGTTTCACTGCAGCTCATCCAGCCAGCTACGTCGATTGCTATCGAAGAAAGTGAAATCACCATCAAAGAGCAGGAAACAGGTTTATTGCATGCACAGATGGTTCCTGCTGATGCCAGCTCCAAAGTATCTTGGGTGTCGGCGGATCCATCGATTGCCACCGTTGATAACGGTAAGGTTACGGGTGTAAATCCCGGGGGGACAACGATTATGGCTTTTACCGATAACGGGCTTGCTGCCACTAGTACCGTAAAAGTGATCAAAAATGATGGTATTGAACGGCCGGAGGTAACACAGTTGGATCTACAACCAAAGGAACTCGAGCTTGGATCAGGTCAAGTGCGATTGCTTCAGGCAATTATCGCACCAGCCACTGCCGATGCAGAAAAGTTGGTATGGAGCTCTTCCAATGAAGCAGTCGCTTCTATTCAAAAAGGACTTATTGAAGCGAAAGCCTCAGGAACTGCTGTGATTACCGTAGAAACGGAAGATGGCAGCTTAAAGAGTGAAAGCCAGATTACCGTTACCGATGCAGTCGTAGATGAATATGATCAACTTCGGAAAAAGTGGAAAAGCCTGATGACTGGTCTTGATTCGTACGACCCGACGAATGTGCGGATGAACGAAATGATTCAGAACCAGACAAAATCAGCGGAAACCCTTTGGAAAACAATGTTTAAAAATAACGATCGTTCGTTCTTATGGATTAACTTTGCAAGCACTGACAATTCGGCTGATATTCGCGACAGCTACCGGAATCTAACGACCATGGCTAAAGCGTTTGCCAATGAACACTCCAGCCTTTATCGAAATCCGCAATTGCTAAAGGATATCACGGAGGCGCTAGAGTGGCTGTACCAAAATCGCTATAACGAAAGTATTGCTCAATATAGCAATTGGTGGCATTGGGAAATCGGTGTCCCGAATGAATTAAACAGTTTAATGGTTCTTCTATATGATTATTTGGATCAAGATAGTATTCATCGCTACTTGAAAGTAGTCGACCACTTTCAACCAGATCCAACGAAATCCGGAGCCACCACTCCCGAGAAATACCGGGAAGCTCTTGGCGCCAATCGGATTGATGTCAGCAAGGTAGTCGGTGTGCGAGGGGTAATTGTGAAGGACGCCACGAAAATTGCGGCTGCACGAGATGCCCTAAGCCAAACTTTTGAAAACGTAACTGAAGGAGACGGTTTTTATGAAGATGGCTCCTTCGTTCAGCATGAGAATATCGCCTATAACGGGTCATACGGCATTGTCTTAATTGAAGGCTTGACTGACATGCTCGAACTCTTAAGTAATTCTACTTGGCAAGTGACTGACCCTAAGGTTACCAATGTTTATGACTGGATTGAAACTGCCTATGAACCATTTATGTATAAAGGTGCTTTGATGGATATGGTGAGAGGAAGAGCGATTTCACGTAATTTCCTTCAGGATCATCAGGCTGGACACACCATTATCAAAAGTGTGATTCGAATGGCACAATTTGCTCCAGAGCCATATGCAGAGAAGTATAATTCCATGGCAAAATACTGGCTTCAAGAAGATACTTACCTGGATTATTTTAAAAACGCGGGTAACTTCCGCGATATCACTCTTGCAAAGCAGCTTTTGGAAAAACAAGAGGTCACCCCTCGCGGAGATCTTGATTTTCATAAGACTTTCGCCTCCATGGACCGGGTTGTCCACAGAAAATCGGGCTATGCGTTTGGTATCAGTATGTATTCAAACAGGATTCAAAATTATGAAGACATGAATGATGAAAACCGCAAAGGCTGGTATACCGGAGAAGGGATGACCTACTTATATAATGGTGACCTCGCTCAATATAGTGATGATTTCTGGCCGACAGTGGACCCGTACCGGATGCCAGGGACAACGGTTGATACGATGAGACGAGCGGATGGAAGTGGTGAGCACAGGTCGTCAGAGTCATGGACTGGCGGTTCAACCCTAAAGAATTTTGGTTCTGCAGGAATGTCTTATGATGCTTGGAATAGTTCATTGATTGCCAAAAAGTCATGGTTTATGTTCGATAACGAAATCGTTGCCCTTGGTGCAGGGATTACTAGCAGTGAAGACCGGAATGTTGAGAGTATTGTCGAAAACCGAAAGATTCGAAATGACGGTTCCAATCAATTGGTCATCAATGGTGAAACGCTGAATTTAAGCAATGGTGGTCAAAACCAAACGATGGCCGCTAAATGGGCTTTTCTTGAAGGGAATGTCCCAGGAGCAGATATTGGTTACTATTTCCCAGAAGGTAAAATGCTGACGATTAAAAAAGAAGAACGTACCGGTGCATGGAAAGATATTAATTATGGCGGTCCAGCTGAAGCGATCAAGCGATCCTACACAACGATGTGGTTTGACCATGGTGTCCGTCCTGAGCAGGATACGTACTCCTATGTTCTATTGCCAGGTTTAAATAAGGAACAAACACACCAATATTCTCAAAATCCTGATATTACGATTTTACGAAATGATTCTGCTGTCCAAGCGGTACAAGACGTAAAGGAGAATATCATAGGGGCTAATTTCTGGAAGGATGAAAAGCAAAGTGCTGGTCCGTTAACTGTTTATCAAAAAGCCTCCGTGACCATGCAGGAGAAGGATGGAGTCCTTGAGATTGCTGTATGTGATCCGACGATGGAAAACAAGGGTTCTATCGAAATCGAAATTGATGGCAAGGCGTTCAAGGTTTTAGAAGCCGATGAAAGTATCACGGTAGAAAATACGAAGCCGTCAATCAAGTTGAAGGTCAATGTGAATGAGGCAAAAGGGAAAACGTTCACAGCGAAATTGAAAATGATTCCGAGCCAAAAGGGCAATAGCCCGAACTCAATCAGATAATAA（配列番号３）
【０１１６】
ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴソフトウェアに基づくアミノ酸配列の相同性の分析から、配列番号２のアミノ酸配列と最大の類似性を有するタンパク質は、バチルス（パエニバチルス・アルギノリチカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ））のキサンタンリアーゼＸａｌＢ前駆体であり、類似性は最大４６％であり、３１％〜４６％の類似性を有するタンパク質は、大部分がヒアルロナートリアーゼであり、加えてキサンタンリアーゼ、多糖類リアーゼ−８ファミリー、及びいくつかのその他の推定の、又は名前のないタンパク質であり、これらは全て、ムコ多糖類（ＧＡＧ）リアーゼファミリーに属していたことが示された。
【０１１７】
ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴソフトウェアに基づく遺伝子配列の相同性の分析から、配列番号３のヌクレオチド配列に相同な配列がないことが示され、これは、配列番号３のヌクレオチド配列を有するヒアルロニダーゼをコードする遺伝子が新規の遺伝子であることを意味した。
【０１１８】
（例３）ヒアルロニダーゼ（１）の調製
斜面培養培地の組成（１００ｍＬ）：０．２ｇのペプトン、２．０ｇの酵母粉末、０．０５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのグルコース、２．０ｇの寒天粉末；塩酸を使用してｐＨを６．０に調節した。
【０１１９】
種培養培地の組成（１００ｍＬ）：０．２ｇのペプトン、２．０ｇの酵母粉末、０．０５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのグルコース；塩酸を使用してｐＨを６．０に調節した。
【０１２０】
発酵培養培地の組成（１００ｍＬ）：０．２ｇのペプトン、２．０ｇの酵母粉末、０．０５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのグルコース、０．０５ｍＬのトゥイーン−８０。
【０１２１】
斜面培養株（バチルス属菌Ａ５０、ＣＧＭＣＣ番号５７４４）を滅菌した種培養培地に植え付け、２５℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養し、次いで種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、ここで植菌量は１０％であり、２５℃、２００ｒｐｍで２４時間培養し、発酵過程中に硫酸を使用してｐＨを６．０に維持し、発酵によりヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得て、発酵ブロスを１００００ｒｐｍで２０分遠心分離して、上清を得て、この上清に硫酸アンモニウムを添加して、２０％濃度にし、沈殿を濾過で取り除いて、次いでその濃度が３５％になるまで硫酸アンモニウムを連続的に添加し、得られた沈殿をヒアルロニダーゼとして採取し、得られたヒアルロニダーゼの沈殿をリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に溶解させ、最後に低分子量の不純物を３×１０４Ｄａの限外濾過膜で除去して、精製ヒアルロニダーゼを得た。
【０１２２】
発酵ブロス中のヒアルロニダーゼ活性は、１．０×１０５ＩＵ／ｍＬであり、精製ヒアルロニダーゼの特異的な活性は、中国薬局方に記載の方法を使用して測定したところ、８．０×１０６ＩＵ／ｍｇであった。
【０１２３】
（例４）ヒアルロニダーゼの調製（２）
斜面培養培地の組成（１００ｍＬ）：１．０ｇのペプトン、１．０ｇの酵母粉末、０．１ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇのグルコース、２．０ｇの寒天粉末；リン酸を使用してｐＨを７．０に調節した。
【０１２４】
種培養培地の組成（１００ｍＬ）：１．０ｇのペプトン、１．０ｇの酵母粉末、０．１ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇのグルコース；リン酸を使用してｐＨを７．０に調節した。
【０１２５】
発酵培養培地の組成（１００ｍＬ）：１．０ｇのペプトン、１．０ｇの酵母粉末、０．１ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇのグルコース、０．０５ｍＬのトゥイーン−８０。
【０１２６】
斜面培養株（バチルス属菌Ａ５０、ＣＧＭＣＣ番号５７４４）を採取し、これを滅菌した種培養培地に植え付け、３０℃、１００ｒｐｍで１５時間培養し、次いで種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、ここで植菌量は１０％であり、３５℃、３００ｒｐｍで１６時間培養し、発酵過程中に硫酸を使用してｐＨを７．０に維持し、発酵によりヒアルロニダーゼ発酵ブロスを生産して入手し、発酵ブロスを１５０００ｒｐｍで１０分遠心分離して、上清を得て、この上清に硫酸アンモニウムを添加して、２２％濃度にし、沈殿を濾過で取り除いて、次いでその濃度が最大３８％になるまで硫酸アンモニウムを連続的に添加し、得られたヒアルロニダーゼの沈殿をリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に溶解させ、最後に低分子量の不純物を３×１０４Ｄａの限外濾過膜で除去して、精製ヒアルロニダーゼを得た。
【０１２７】
発酵ブロス中のヒアルロニダーゼ活性は、３．０×１０５ＩＵ／ｍＬであり、精製ヒアルロニダーゼの特異的な活性は、中国薬局方に記載の方法を使用して測定したところ、９．５×１０６ＩＵ／ｍｇであった。
【０１２８】
（例５）ヒアルロニダーゼの調製（３）
斜面培養培地の組成（１００ｍＬ）：１．５ｇのペプトン、１．５ｇの酵母粉末、０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇのグルコース、２．０ｇの寒天粉末；硫酸を使用してｐＨを８．０に調節した。
【０１２９】
種培養培地の組成（１００ｍＬ）：１．５ｇのペプトン、１．５ｇの酵母粉末、０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇのグルコース；硫酸を使用してｐＨを８．０に調節した。
【０１３０】
発酵培養培地の組成（１００ｍＬ）：０．５ｇのペプトン、１．５ｇの酵母粉末、０．１ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇのグルコース、０．０５ｍＬのトゥイーン−８０。
【０１３１】
斜面培養株（バチルス（バチルス属菌）Ａ５０、ＣＧＭＣＣ番号５７４４）を採取し、これを滅菌した種培養培地に植え付け、３５℃、２００ｒｐｍで１３時間培養し、次いで種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、ここで植菌量は１０％であり、４０℃、１００ｒｐｍで１２時間培養し、発酵中に塩酸を使用してｐＨを７．０に維持し、発酵によりヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得て、発酵ブロスを１２０００ｒｐｍで１５分遠心分離して、上清を得て、この上清に硫酸アンモニウムを添加して、２５％濃度にし、生成した沈殿を濾過で取り除いて、次いで濃度が３５％になるまで硫酸アンモニウムを連続的に添加し、得られたヒアルロニダーゼの沈殿を採取して、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に溶解させ、最後に小さい不純物を３×１０４Ｄａの限外濾過膜で除去して、精製ヒアルロニダーゼを得た。
【０１３２】
発酵ブロス中のヒアルロニダーゼ活性は、１．２×１０５ＩＵ／ｍＬであり、精製ヒアルロニダーゼの特異的な活性は、中国薬局方に記載の方法を使用して測定したところ、９．０×１０６ＩＵ／ｍｇであった。
【０１３３】
（例６）ヒアルロニダーゼの調製（４）
斜面培養培地の組成（１００ｍＬ）：２．０ｇのペプトン、０．５ｇの酵母粉末、０．０５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇのグルコース、２．０ｇの寒天粉末；硫酸を使用してｐＨを６．５に調節した。
【０１３４】
種培養培地の組成（１００ｍＬ）：２．０ｇのペプトン、０．５ｇの酵母粉末、０．０５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇのグルコース；硫酸を使用してｐＨを６．５に調節した。
【０１３５】
発酵培養培地の組成（１００ｍＬ）：１．５ｇのペプトン、０．２ｇの酵母粉末、０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇのグルコース、０．０５ｍＬのトゥイーン−８０。
【０１３６】
斜面培養株（バチルス属菌Ａ５０、ＣＧＭＣＣ番号５７４４）を採取し、これを滅菌した種培養培地に植え付け、４０℃、１８０ｒｐｍで１０時間培養し、次いで種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、ここで植菌量は１０％であり、３６℃、２８０ｒｐｍで１５時間培養し、発酵中にリン酸を使用してｐＨを８．０に維持し、発酵によりヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得て、発酵ブロスを１００００ｒｐｍで２０分遠心分離して、上清を得て、この上清に硫酸アンモニウムを添加して、２０％濃度にし、生成した沈殿を濾過で取り除いて、濃度が４０％になるまで硫酸アンモニウムを連続的に添加し、得られたヒアルロニダーゼを採取し、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に溶解させ、最後に低分子量の不純物を３×１０４Ｄａの限外濾過膜で除去して、精製ヒアルロニダーゼを得た。
【０１３７】
発酵ブロス中のヒアルロニダーゼ活性は、１．５×１０５ＩＵ／ｍＬであり、精製ヒアルロニダーゼの特異的な活性は、中国薬局方に記載の方法を使用して測定したところ、８．２×１０６ＩＵ／ｍｇであった。
【０１３８】
（例７）ヒアルロニダーゼの調製（５）
斜面培養培地の組成（１００ｍＬ）：０．５ｇのペプトン、１．５ｇの酵母粉末、０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのグルコース、２．０ｇの寒天粉末；リン酸を使用してｐＨを７．５に調節した。
【０１３９】
種培養培地の組成（１００ｍＬ）：０．５ｇのペプトン、１．５ｇの酵母粉末、０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのグルコース；リン酸を使用してｐＨを７．５に調節した。
【０１４０】
発酵培養培地の組成（１００ｍＬ）：２．０ｇのペプトン、０．２ｇの酵母粉末、０．０５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのグルコース、０．０５ｍＬのトゥイーン−８０。
【０１４１】
斜面培養株（バチルス属菌Ａ５０、ＣＧＭＣＣ番号５７４４）を採取し、これを滅菌した種培養培地に植え付け、３６℃、１２０ｒｐｍで１４時間培養し、次いで種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、ここで植菌量は１０％であり、３０℃、１８０ｒｐｍで２０時間培養し、発酵中にリン酸を使用してｐＨを７．５に維持し、発酵によりヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得て、発酵ブロスを１００００ｒｐｍで２０分遠心分離して、上清を得て、この上清に硫酸アンモニウムを添加して、２５％濃度にし、生成した沈殿を濾過で取り除いて、次いで濃度が４０％になるまで硫酸アンモニウムを連続的に添加し、得られたヒアルロニダーゼの沈殿を採取して、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に溶解させ、最後に小さい不純物を３×１０４Ｄａの限外濾過膜で除去して、精製ヒアルロニダーゼを得た。
【０１４２】
発酵ブロス中のヒアルロニダーゼ活性は、２．０×１０５ＩＵ／ｍＬであり、精製ヒアルロニダーゼの特異的な活性は、中国薬局方に記載の方法を使用して測定したところ、９．３×１０６ＩＵ／ｍｇであった。
【０１４３】
（例８）ヒアルロニダーゼの調製（６）
斜面培養培地の組成（１００ｍＬ）：１．０ｇのペプトン、１．０ｇの酵母粉末、０．１ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇのグルコース、２．０ｇの寒天粉末；塩酸を使用してｐＨを７．０に調節した。
【０１４４】
種培養培地の組成（１００ｍＬ）：１．０ｇのペプトン、１．０ｇの酵母粉末、０．１ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇのグルコース；塩酸を使用してｐＨを７．０に調節した。
【０１４５】
発酵培養培地の組成（１００ｍＬ）：１．５ｇのペプトン、０．５ｇの酵母粉末、０．０５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇのグルコース、０．０５ｍＬのトゥイーン−８０。
【０１４６】
斜面培養株（バチルス属菌Ａ５０、ＣＧＭＣＣ番号５７４４）を採取し、これを滅菌した種培養培地に植え付け、３２℃、１５０ｒｐｍで１８時間培養し、次いで種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、ここで植菌量は１０％であり、２８℃、２００ｒｐｍで２２時間培養し、発酵中に塩酸を使用してｐＨを８．０に維持し、発酵によりヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得て、発酵ブロスを１５０００ｒｐｍで１０分遠心分離して、上清を得て、この上清に硫酸アンモニウムを添加して、２４％濃度にし、生成した沈殿を濾過で取り除いて、次いで濃度が３６％になるまで硫酸アンモニウムを連続的に添加し、得られたヒアルロニダーゼの沈殿を採取して、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に溶解させ、最後に小さい不純物を３×１０４Ｄａの限外濾過膜で除去して、精製ヒアルロニダーゼを得た。
【０１４７】
発酵ブロス中のヒアルロニダーゼ活性は、１．８×１０５ＩＵ／ｍＬであり、精製ヒアルロニダーゼの特異的な活性は、中国薬局方に記載の方法を使用して測定したところ、８．４×１０６ＩＵ／ｍｇであった。
【０１４８】
（例９）ヒアルロニダーゼの調製（７）
斜面培養培地の組成（１００ｍＬ）：２．０ｇのペプトン、１．５ｇの酵母粉末、０．０５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのグルコース、２．０ｇの寒天粉末；リン酸を使用してｐＨを７．０に調節した。
【０１４９】
種培養培地の組成（１００ｍＬ）：２．０ｇのペプトン、１．５ｇの酵母粉末、０．０５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのグルコース；リン酸を使用してｐＨを７．０に調節した。
【０１５０】
発酵培養培地の組成（１００ｍＬ）：０．５ｇのペプトン、１．５ｇの酵母粉末、０．１５ｇのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇのグルコース、０．０５ｍＬのトゥイーン−８０。
【０１５１】
斜面培養株（バチルス属菌Ａ５０、ＣＧＭＣＣ番号５７４４）を採取し、これを滅菌した種培養培地に植え付け、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間培養し、次いで種溶液を滅菌した発酵培養培地に植え付け、ここで植菌量は１０％であり、３４℃、２２０ｒｐｍで１４時間培養し、発酵中にリン酸を使用してｐＨを７．５に維持し、発酵によりヒアルロニダーゼ発酵ブロスを得て、発酵ブロスを１２０００ｒｐｍで１５分遠心分離して、上清を得て、この上清に硫酸アンモニウムを添加して、２５％濃度にし、生成した沈殿を濾過で取り除いて、次いで濃度が３８％になるまで硫酸アンモニウムを連続的に添加し、得られたヒアルロニダーゼの沈殿を採取して、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に溶解させ、最後に小さい不純物を３×１０４Ｄａの限外濾過膜で除去して、精製ヒアルロニダーゼを得た。
【０１５２】
発酵ブロス中のヒアルロニダーゼ活性は、１．２×１０５ＩＵ／ｍＬであり、精製ヒアルロニダーゼの特異的な活性は、中国薬局方に記載の方法を使用して測定したところ、８．１×１０６ＩＵ／ｍｇであった。
【０１５３】
（例１０）ヒアルロニダーゼの調製（８）
バチルス属菌Ａ５０の発酵ブロス（例えば、例３〜９のいずれか１つの発酵ブロス）を４℃で遠心分離し、細菌を除去し、上清を回収した。上清に、硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大２０％ｗ／ｖになるまでゆっくり添加し、沈殿を濾過で取り除いて、濾液に硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大４０％ｗ／ｖになるまで連続的に添加し、沈殿を濾過により回収した。沈殿を４．５のｐＨを有するＮａ２ＨＰＯ４−クエン酸緩衝溶液に溶解させ、粗製酵素溶液を得た。粗製酵素溶液を３．０×１０３Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに入れ、ｐＨ４．５のＮａ２ＨＰＯ４−クエン酸緩衝溶液中に置き、４℃で終夜透析した。透析バッグ中の溶液をイオン交換クロマトグラフィーで分離し、ここでクロマトグラフィーのカラムの充填材はＤＥＡＥアガロースゲルＦＦ媒体であり、０〜０．５ＭのＮａＣｌ溶液を用いて勾配溶出を実行し、溶出ピークを回収した。最終的に回収された溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で処理し、分離及び精製の効果を検出した。図１に、電気泳動の結果をレーン１として示した：ヒアルロニダーゼ純度は、９７．６％であった。その間に、最終的に回収された目的のプロテアーゼの溶出液を真空凍結乾燥にかけ、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得た。得られたヒアルロニダーゼは、１．３×１０７ＩＵ／ｍｇの特異的な活性を有する。
【０１５４】
（例１１）ヒアルロニダーゼの調製（９）
バチルス属菌Ａ５０の発酵ブロス（例えば、例３〜９のいずれか１つの発酵ブロス）を４℃で遠心分離し、細菌を除去し、上清を回収した。上清に、硫酸アンモニウムの固体粉末をその濃度が最大２５％ｗ／ｖになるようにゆっくり添加し、沈殿を濾過で取り除いて、濾液に硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大４０％ｗ／ｖになるまで連続的に添加し、沈殿を濾過により回収した。沈殿を６．５のｐＨを有する５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝溶液に溶解させ、粗製酵素溶液を得た。粗製酵素溶液を１．０×１０４Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに入れ、５０ｍＭのｐＨ６．５のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝溶液中に置き、４℃で終夜透析した。透析バッグ中の溶液をイオン交換クロマトグラフィーで分離し、ここでクロマトグラフィーのカラムの充填材はＤＥＡＥアガロースゲルＦＦ媒体であり、０〜０．５ＭのＮａＣｌ溶液を用いて勾配溶出を実行し、溶出ピークを回収した。最終的に回収された溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で処理し、分離及び精製の効果を検出した。図１に、電気泳動の結果をレーン２として示した：ヒアルロニダーゼ純度は、９８．１％であった。その間に、最終的に回収された目的のプロテアーゼの溶出液を真空凍結乾燥にかけ、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得た。得られたヒアルロニダーゼは、１．４×１０７ＩＵ／ｍｇの特異的な活性を有する。
【０１５５】
（例１２）ヒアルロニダーゼの調製（１０）
バチルス属菌Ａ５０の発酵ブロス（例えば、例３〜９のいずれか１つの発酵ブロス）を４℃で遠心分離し、細菌を除去し、上清を回収した。上清に、硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大２０％になるようにゆっくり添加し、沈殿を濾過で取り除いて、濾液に硫酸アンモニウムの固体粉末を濃度が最大４０％ｗ／ｖになるまで連続的に添加し、沈殿を濾過により回収した。沈殿を５０ｍＭのｐＨ８．０のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝溶液に溶解させ、粗製酵素溶液を得た。粗製酵素溶液を１．４×１０４Ｄａの分子量カットオフを有する透析バッグに入れ、５０ｍＭのｐＨ８．０のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝溶液中に置き、４℃で終夜透析した。透析バッグ中の溶液をイオン交換クロマトグラフィーで分離し、ここでクロマトグラフィーのカラムの充填材はＤＥＡＥアガロースゲルＦＦ媒体であり、０〜０．５ＭのＮａＣｌ溶液を用いて勾配溶出を実行し、溶出ピークを回収した。最終的に回収された溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で処理し、分離及び精製の効果を検出した。図１に、電気泳動の結果をレーン３として示した：ヒアルロニダーゼ純度は、９７．５％であった。その間に、最終的に回収された目的のプロテアーゼの溶出液を真空凍結乾燥にかけ、ヒアルロニダーゼとして白色の粉末を得た。得られたヒアルロニダーゼは、１．５×１０７ＩＵ／ｍｇの特異的な活性を有する。
【０１５６】
本発明のヒアルロニダーゼは、高い酵素活性、優れた熱安定性、及びｐＨ安定性を有し、ヒアルロン酸のラージスケールでの工業的な分解のための酵素量の必要条件を満たすことができ、本酵素の調製方法は、簡単であり、中程度の条件を使用し、低コストであり、例えば化学分解の環境汚染、生物学的分解酵素の源の限定、加えて低い活性及び高いコストなどの欠点を克服するものである。
【０１５７】
以下の実施例で、本発明の８×１０６〜１．５×１０７ＩＵ／ｍｇの酵素活性を有するヒアルロニダーゼを使用した酵素消化法によるオリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの調製を説明する。
【０１５８】
（例１３）オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、３００ｋｇの２×１０４Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、ｐＨを氷酢酸で４．０に調節し、温度を２０℃に高め、１．３５×１０１０ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例３で調製した）を添加し、分子量が１０４Ｄａ未満になるまで酵素分解を続け（この期間中に、連続的にサンプリングしＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法により検出した）、温度を５０℃に高め、６０分維持し、１ｋｇのＮａＣｌを添加し、酵素分解溶液を０．４５μｍの混成のセルロース濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために２０ｍ３のエタノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、白色の顆粒であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９６．８％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９７．５％であり；このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、ｐＨ６．８で８．６ｋＤａの分子量を有していた。図２（Ｃ）にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトル図２（Ａ）と一致した（欧州薬局方の標準スペクトルのサンプルは分解していなかった）。
【０１５９】
（例１４）オリゴマーヒアルロン酸カリウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、１０ｋｇの３×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸カリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、ｐＨを水酸化ナトリウムで９．０に調節し、温度を４８℃に高め、４×１０８ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例４で調製した）を添加し、分子量が１０４Ｄａ未満になるまで酵素分解を続け、温度を９０℃に高め、１０分維持し、１００ｋｇのＫＣｌを添加し、酵素分解溶液を０．４５μｍのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために５ｍ３のケトンを使用して、ヒアルロン酸カリウムの沈殿を得て、この沈殿をアセトンで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸カリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸カリウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９８．８％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．３％であり；このオリゴマーヒアルロン酸カリウムは、ｐＨ６．５で３．２ｋＤａの分子量を有していた。図２（Ｄ）にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
【０１６０】
（例１５）オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、３０ｋｇの１．６×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、ｐＨを水酸化カリウムで８．０に調節し、温度を４０℃に高め、１．２×１０９ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例５で調製した）を添加し、分子量が１０４Ｄａ未満になるまで酵素分解を続け、温度を６０℃に高め、６０分維持し、５０ｋｇのＮａＣｌを添加し、酵素分解溶液を０．４５μｍのナイロン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために１０ｍ３のプロパノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をプロパノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９７．６％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９７．８％であり；その分子量は、６．２ｋＤａであり、ｐＨは、７．１であった。図２（Ｅ）にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
【０１６１】
（例１６）オリゴマーヒアルロン酸カルシウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、６０ｋｇの８×１０５Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸カルシウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、ｐＨを氷酢酸で７．０に調節し、温度を３５℃に高め、２．４×１０９ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例６で調製した）を添加し、分子量が１０４Ｄａ未満になるまで酵素分解を続け、温度を７０℃に高め、３０分維持し、３５ｋｇのＣａＣｌ２を添加し、酵素分解溶液を０．４５μｍのポリエーテルスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために３ｍ３のイソプロパノールを使用して、ヒアルロン酸カルシウムの沈殿を得て、この沈殿をイソプロパノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸カルシウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸カルシウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９６．６％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９７．３％であり；その分子量は、５．６ｋＤａであり、ｐＨは、６．５であった。図２（Ｆ）にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
【０１６２】
（例１７）オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、２００ｋｇの２×１０５Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、ｐＨを硫酸で６．０に調節し、温度を２５℃に高め、８×１０９ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例７で調製した）を添加し、分子量が１０４Ｄａ未満になるまで酵素分解を続け、温度を８０℃に高め、２０分維持し、６０ｋｇのＮａＣｌを添加し、酵素分解溶液を０．４５μｍのポリエーテルスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために６ｍ３のメタノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をメタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９８．７％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．３％であり；その分子量は、７．６ｋＤａであり、ｐＨは、７．３であった。図２（Ｇ）にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
【０１６３】
（例１８）オリゴマーヒアルロン酸亜鉛の調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、１００ｋｇの１０５Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、ｐＨを水酸化ナトリウムで５．０に調節し、温度を２０℃に高め、４×１０９ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例８で調製した）を添加し、分子量が１０４Ｄａ未満になるまで酵素分解を続け、温度を５５℃に高め、４０分維持し、２０ｋｇのＺｎＣｌ２を添加し、酵素分解溶液を０．４５μｍのニトロセルロース濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために４．５ｍ３のエタノールを使用して、ヒアルロン酸亜鉛の沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸亜鉛を得た。このオリゴマーヒアルロン酸亜鉛は、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９６．８％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９７．６％であり；その分子量は、９．１ｋＤａであり、ｐＨは、６．８であった。図２（Ｈ）にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致した。
【０１６４】
（例１９）低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製（１）
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、１ｋｇの３×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を４８℃に制御し、ｐＨを水酸化ナトリウムで９．０に調節し、酵素分解のために１０７ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例９で調製した）を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた；温度を５０℃に高め、６０分維持した。２ｋｇのＮａＣｌを添加し、完全に溶解した後、０．４５μｍのポリプロピレン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために１ｍ３のアセトンを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をアセトンで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９８．３％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．５％であり；その分子量は、９３１ｋＤａであった。
【０１６５】
（例２０）低分子量ヒアルロン酸カリウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、２０ｋｇの１×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸カリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を２０℃に制御し、ｐＨを氷酢酸で４．０に調節し、酵素分解のために１０８ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例７で調製した）を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた；温度を９０℃に高め、１０分維持した。１００ｋｇのＫＣｌを添加し、完全に溶解した後、０．４５μｍのニトロセルロース濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために１０ｍ３のエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸カリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸カリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸カリウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９６．８％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９７．５％であり；その分子量は、１５ｋＤａであった。
【０１６６】
（例２１）低分子量ヒアルロン酸亜鉛の調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、１２ｋｇの１．６１×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を４５℃に制御し、ｐＨを氷酢酸で５．０に調節し、酵素分解のために２×１０７ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例８で調製した）を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた；温度を８０℃に高め、２０分維持した。４０ｋｇのＺｎＣｌ２を添加し、完全に溶解した後、０．４５μｍのポリエーテルスルホン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために３ｍ３のメタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸亜鉛の沈殿を得て、この沈殿をメタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸亜鉛を得た。この低分子量ヒアルロン酸亜鉛は、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９８．５％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．２％であり；その分子量は、７５４ｋＤａであった。
【０１６７】
（例２２）低分子量ヒアルロン酸カリウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、１０ｋｇの１．７７×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸カリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を３８℃に制御し、ｐＨをリン酸で６．０に調節し、酵素分解のために５×１０７ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例９で調製した）を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた；温度を６０℃に高め、３０分維持した。３０ｋｇのＫ２ＳＯ４を添加し、完全に溶解した後、０．４５μｍのポリエーテルスルホン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために５ｍ３のイソプロパノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸カリウムの沈殿を得て、この沈殿をイソプロパノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸カリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸カリウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９６．３％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９７．３％であり；その分子量は、４２１ｋＤａであった。
【０１６８】
（例２３）低分子量ヒアルロン酸マグネシウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、８ｋｇの２．５５×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸マグネシウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を４２℃に制御し、ｐＨを硫酸で５．５に調節し、酵素分解のために３×１０７ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例６で調製した）を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた；温度を５５℃に高め、５０分維持した。６０ｋｇのＭｇＣｌ２を添加し、完全に溶解した後、０．４５μｍのポリプロピレン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために２．５ｍ３のプロパノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸マグネシウムの沈殿を得て、この沈殿をプロパノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸マグネシウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸マグネシウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９７．２％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．１％であり；その分子量は、５３８ｋＤａであった。
【０１６９】
（例２４）低分子量ヒアルロン酸カルシウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、５ｋｇの２．４６×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸カルシウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を４０℃に制御し、ｐＨを氷酢酸で７．０に調節し、酵素分解のために５×１０７ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例５で調製した）を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた；温度を６５℃に高め、４０分維持した。５０ｋｇのＣａＣｌ２を添加し、完全に溶解した後、０．４５μｍのポリプロピレン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために４．５ｍ３のアセトンを使用して、低分子量ヒアルロン酸カルシウムの沈殿を得て、この沈殿をアセトンで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸カルシウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸カルシウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９８．１％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．２％であり；その分子量は、２０５ｋＤａであった。
【０１７０】
（例２５）低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、２ｋｇの２．７８×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を３５℃に制御し、ｐＨを氷酢酸で６．５に調節し、酵素分解のために２×１０７ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例４で調製した）を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた；温度を５８℃に高め、５０分維持した。７０ｋｇのＮａ２ＳＯ４を添加し、完全に溶解した後、０．４５μｍのニトロセルロース濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために４．８ｍ３のエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９８．６％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．３％であり；その分子量は、３３２ｋＤａであった。
【０１７１】
（例２６）低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３の精製水を添加し、１５ｋｇの１．４１×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を４３℃に制御し、ｐＨを水酸化ナトリウムで８．０に調節し、酵素分解のために４×１０７ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例３で調製した）を撹拌しながら添加した。所望の分子量になるまで酵素分解を続けた；温度を６５℃に高め、４０分維持した。８０ｋｇのＮａＣｌを添加し、完全に溶解した後、０．４５μｍのポリスルホン濾芯で濾過を行い、次いで沈殿のために８ｍ３のエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは、白色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９８．２％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９９．１％であり；その分子量は、３８ｋＤａであった。
【０１７２】
（例２７）低分子量コンドロイチン硫酸の調製におけるヒアルロニダーゼの使用
１ｍ３のステンレス鋼の溶解タンクに、１ｍ３のｐＨ６．０リン酸緩衝溶液を調製し、５０ｋｇの５×１０４Ｄａの分子量を有するコンドロイチン硫酸を撹拌しながら溶解タンクに添加し、完全に溶解した後、温度を３７℃に制御し、９×１０８ＩＵのバチルス由来ヒアルロニダーゼ（例えば、例３〜９のいずれか１つで調製したヒアルロニダーゼ）を添加し、分子量が５０００Ｄａになるまで酵素分解を続け、温度を５０℃に高め、６０分維持し、酵素分解溶液を０．４５μｍの濾芯で濾過し、次いで沈殿のために２０ｍ３のエタノールを使用して、低分子量コンドロイチン硫酸の沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量コンドロイチン硫酸を得た。この低分子量コンドロイチン硫酸は、白色の粉末であり、その含量は、９５．８％であり；その分子量は、５．１ｋＤａであり；そのｐＨは、６．８であった。
【０１７３】
比較例１：化学分解法によるオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムの調製（１）
１Ｌのビーカーに、１Ｌの精製水を添加し、このビーカーに、５０ｇの８×１０５Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、１０ｍＬの濃塩酸を添加し、分子量が１０４Ｄａ未満になるまで分解処理する際に、ｐＨを水酸化ナトリウムで６．２に調節し、分解溶液を０．４５μｍの混成のセルロース濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために１０Ｌのエタノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、６３．８％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．９％であり；その分子量は、８．１ｋＤａであり、ｐＨは、４．８であった。図２（Ｂ）にその赤外線スペクトルを示すが、これは、欧州薬局方の標準スペクトルと一致しなかった。
【０１７４】
比較例２：化学分解法によるオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムの調製（２）
１Ｌのビーカーに、１Ｌの精製水を添加し、このビーカーに、１００ｇの５×１０５Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、１０ｍＬの濃塩酸を添加し、分子量が１０４Ｄａ未満になるまで分解処理する際に、ｐＨを水酸化ナトリウムで６．５に調節し、分解溶液を０．４５μｍのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために１０Ｌのエタノールを使用して、ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムを得た。このオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、６０．２％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９９．２％であり；その分子量は、７．６ｋＤａであり、ｐＨは、４．２であった。
【０１７５】
比較例３：化学分解法による低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製（１）
１Ｌのビーカーに、１Ｌの精製水を添加し、このビーカーに、１０ｇの１×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、５ｇの水酸化ナトリウムを添加し、温度を６５℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、ｐＨを氷酢酸で６．５に調節し、分解溶液を０．４５μｍのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために５Ｌのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、６８．２％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９７．５％であり；その分子量は、１５ｋＤａであり、ｐＨは、６．９であった。
【０１７６】
比較例４：化学分解法による低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製（２）
１Ｌのビーカーに、１Ｌの精製水を添加し、このビーカーに、１５ｇの１．４１×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、６ｇの水酸化ナトリウムを添加し、温度を６５℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、ｐＨを塩酸で６．２に調節し、分解溶液を０．４５μｍのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために４Ｌのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、７０．５％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９６．８％であり；その分子量は、３９．２ｋＤａであり、ｐＨは、６．４であった。
【０１７７】
比較例５：化学分解法による低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製（３）
１Ｌのビーカーに、１Ｌの精製水を添加し、このビーカーに、８ｇの１．６１×１０６Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、６ｇの水酸化ナトリウムを添加し、温度を６０℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、ｐＨを氷酢酸で６．８に調節し、分解溶液を０．４５μｍのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために４Ｌのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、７３．２％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．５％であり；その分子量は、３３０ｋＤａであり、ｐＨは、６．２であった。
【０１７８】
比較例６：化学分解法による低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製（４）
１Ｌのビーカーに、１Ｌの精製水を添加し、このビーカーに、５ｇの２．２５×１０２Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、５ｇの水酸化ナトリウムを添加し、温度を６０℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、ｐＨを氷酢酸で６．６に調節し、分解溶液を０．４５μｍのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために２Ｌのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、８９．９％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９６．８％であり；その分子量は、５３０ｋＤａであり、ｐＨは、７．５であった。
【０１７９】
比較例７：化学分解法による低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製（５）
１Ｌのビーカーに、１Ｌの精製水を添加し、このビーカーに、４ｇの２．４６×１０２Ｄａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを撹拌しながら添加し、完全に溶解した後、４ｇの水酸化ナトリウムを添加し、温度を６０℃に高め、所望の分子量になるまで分解処理する際に、ｐＨを塩酸で６．２に調節し、分解溶液を０．４５μｍのポリスルホン濾過膜で濾過し、次いで沈殿のために３Ｌのエタノールを使用して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの沈殿を得て、この沈殿をエタノールで脱水し、次いで真空乾燥して、低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを得た。この低分子量ヒアルロン酸ナトリウムは淡黄色の粉末であり、ＨＰＬＣ法により測定されたその含量は、９５．８％であり；カルバゾール法により測定されたその含量は、９８．５％であり；その分子量は、７７０ｋＤａであり、ｐＨは、７．６であった。
【０１８０】
実験例１：酵素分解（酵素消化）及び化学分解により調製されたオリゴマーヒアルロナートの構造の比較
全てのオリゴマーヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロン酸、加えて通常のヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸の二糖の反復単位からなるため、それらの含量はそれらの二糖の含量に等しく、オリゴマーヒアルロン酸又は低分子量ヒアルロン酸又は通常のヒアルロン酸は、バチルス由来ヒアルロニダーゼで二糖に分解することができ、二糖の含量は、オリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの含量が得られるようにＨＰＬＣ法により決定することができた。その間に、オリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの含量もカルバゾール法により決定した。ヒアルロン酸又はその塩の構造が破壊されている場合、ヒアルロニダーゼは破壊された部分のグルコシド結合を切らないと予測されるため、それにより二糖の含量の低下が起こると予想される。ＨＰＬＣ法の測定値とカルバゾール法の測定値との差が大きければ大きいほど、オリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの破壊された部分が大きい。
【０１８１】
その全ての内容が参照により本発明に取り入れられる公報番号ＣＮ１０２３２３３４４Ａの中国特許出願においても、具体的な方法を参照することができる。
【０１８２】
例えば、ＨＰＬＣは、以下の工程により行うことができる：
ａ．標準的な対照溶液：標準的な対照（ヒアルロン酸二糖ΔＤｉＨＡナトリウム塩、Ｈ９６４９、Ｓｉｇｍａ）の量を量り、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５ｍｍｏｌ／Ｌ）で溶解させ、１ｍｇ／ｍＬ溶液を配合することにより、標準的な対照溶液を得た。
ｂ．サンプルの前処理：試験されるサンプル（比較例１〜７、例１３〜２６により調製された）の量を量り、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０、５ｍｍｏｌ／Ｌ）で溶解させて、１ｍｇ／ｍＬ溶液を配合した。１ｍＬのサンプル溶液に１０００ＩＵのヒアルロニダーゼ（例１０〜１２で調製することができる）を添加し、４２℃の水浴に２時間入れ；酵素分解後に、酵素分解溶液を２分沸騰させて酵素を不活性化することにより、サンプルの酵素分解溶液を得た。
【０１８３】
サンプルの酵素分解溶液を２０ｍＬのメスフラスコに移し、所定の目盛りまで移動相を添加し、均一に混合し、濾過して、試験される溶液を得た。
【０１８４】
ｃ．標準的な対照溶液の処理：１ｍＬの標準的な対照溶液を移動相で２０倍に希釈し、濾過して使用に備えた。
【０１８５】
ｄ．クロマトグラフィー条件：糖類分析カラムを高速液体クロマトグラフィー測定を行うために使用し；移動相が０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４溶液であり；流速が０．６ｍｌ／分であり；カラム温度が３５℃であり；検出波長が２３２ｎｍであり；サンプルのサイズが２０μＬであった。
【０１８６】
ｅ．結果の計算：標準的な対照と試験されるサンプルとのクロマトグラフィーによる分離をそれぞれ行うために高速液体クロマトグラフィーを使用し、外部標準法によりヒアルロン酸二糖のピーク面積を計算した；特に、以下の式を使用して、オリゴマーヒアルロン酸又はその塩の含量を計算した。
【０１８７】
ヒアルロナートの含量：Ｃ（％）＝
【数２】
0005957096.tif 000004
Ａｘ：試験されるサンプルのヒアルロン酸二糖のピーク面積；
ＡＲ：標準的な対照のヒアルロン酸二糖のピーク面積；
Ｗｘ：試験されるサンプルの量、ｍｇ；
ＣＲ：標準的な対照溶液の濃度、ｍｇ／ｍＬ；
ｈ（％）は、試験されるサンプルの乾燥減量である。
【０１８８】
表１に、比較例１〜２及び例１３〜１８で得られたオリゴマーヒアルロナートの含量の比較を示した。
【表１】
0005957096.tif 000005
【０１８９】
表１から、ＨＰＬＣ法とカルバゾール法とにより測定された、化学分解法により調製されたオリゴマーヒアルロナートの含量には比較的大きな差があるが、ＨＰＬＣ法とカルバゾール法とにより測定された、酵素分解法により調製されたオリゴマーヒアルロナートの含量には有意差がない、すなわちいずれも１％よりも小さい差しかないことがわかる。これは、酵素分解法により調製されたオリゴマーヒアルロナートは一体型の構造を有するが、化学分解法により調製されたヒアルロナートの構造は相対的にかなりの程度破壊されていることを示す。
【０１９０】
一方で、赤外線スペクトルから、酵素消化法により調製されたオリゴマーヒアルロナートは欧州薬局方の標準スペクトルと一致するが、化学分解法により調製されたオリゴマーヒアルロナートは、欧州薬局方の標準スペクトルとは約１６１０ｃｍ−１の波数において有意に異なることが示されており、これは、化学分解法により調製されたオリゴマーヒアルロナートの構造は破壊されているが、酵素消化法により調製されたオリゴマーヒアルロナートは一体型であることを示す。
【０１９１】
実験例２：酵素分解（酵素消化）及び化学分解により調製された低分子量ヒアルロナートの構造の比較
表２〜３に、比較例３〜７及び例１９〜２６で得られた低分子量ヒアルロナートの含量の比較を示した。
【０１９２】
具体的な工程は実験例１に記載した通りであった。
【表２】
0005957096.tif 000006
【表３】
0005957096.tif 000007
【０１９３】
表２及び３から、化学分解法により調製された低分子量ヒアルロナートの分子量が７７０，０００よりも低い場合、２つの方法により測定された含量の差は、分子量の減少に伴い増加し；一方で、酵素分解法により調製された低分子量ヒアルロナートの分子量が変化した場合、２つの方法により測定された含量の差は、常に極めて小さく、すなわちいずれも１％未満であったことがわかる。この現象から、酵素分解法により調製された低分子量ヒアルロン酸の構造は一体型であり；一方で、化学分解法により調製された低分子量ヒアルロン酸の分子量が７７０，０００未満の場合、分子量が低ければ低いほど、構造のダメージの程度がより大きくなることが示される。
【０１９４】
動物酵素の分解により得られたオリゴマーヒアルロナートは、例えば血管新生を促進すること、創傷治癒を促進すること、腫瘍と闘うこと、及び免疫を調節することなどの生物活性を有する。微生物から供給されるヒアルロニダーゼの分解により得られたオリゴマーヒアルロナートの生物活性は報告されていない。しかしながら、以下の実験的な調査から、本発明で得られたオリゴマーヒアルロナートは細胞毒性がなく、化学分解法により得られたオリゴマーヒアルロナートと比べて、これらは、フリーラジカル捕捉における強い作用、強い還元能力、日焼け防止及び日焼け後の修復における強い作用を有するため、化粧品に使用することができ；オリゴマーヒアルロナートは、小さい分子量を有し、腸で吸収されやすいため、食品に使用することができ；一方で、オリゴマーヒアルロナートは、血管新生の促進及び創傷治癒の促進において有用であるため、医薬品分野で使用することができることが示される。
【０１９５】
微生物から供給されるヒアルロニダーゼでの分解により得られた低分子量ヒアルロナートの生物活性も報告されていない。しかしながら、上記の例１９〜２６から、酵素消化により調製された低分子量ヒアルロナートは一体型の構造を有することが示され、さらに、以下の実験的研究から、本発明で得られた低分子量ヒアルロナートは、フリーラジカル捕捉における強い作用、強い還元能力、日焼け防止及び日焼け後の修復における強い作用を有するため、化粧品及び医薬品に使用することができ；低分子量ヒアルロナートはまた、皮膚の潤滑性と弾性を維持するための食品で使用することもできることが示される。
【０１９６】
実験例３：ヒアルロニダーゼ活性に対する温度の作用及びヒアルロニダーゼの熱安定性の試験
ｐＨ６．０を有するリン酸緩衝溶液を使用して、最終濃度２ｍｇ／ｍＬのＨＡ溶液を調製し、９．９ｍＬを採取し、基質溶液として使用し、１００μＬの適切に希釈された（ただし２３２ｎｍにおける吸収値が０．３〜０．７の）ヒアルロニダーゼ溶液（例えば、例３〜１２のいずれか１つで調製されたヒアルロニダーゼ）を添加し、水槽中での反応を異なる温度で３０分行い、次いで２分沸騰させ、前もって不活性化した希釈酵素溶液を対照として使用し、これらを室温に冷却したら、２３２ｎｍにおける吸収値を測定し（これらの値はヒアルロニダーゼの活性で示す）、その結果を図３（Ａ）に示すが、ここで最も適切な反応温度は４２℃であった。
【０１９７】
ヒアルロニダーゼ溶液を、一定温度でそれぞれ４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃で、異なる期間にわたり維持し、次いで残った酵素活性を測定し、その結果を図３（Ｂ）に示した：酵素活性は、４０℃及び４５℃で比較的安定であり、６時間以内ではほとんどが変化しなかったが、これは、ヒアルロニダーゼ活性は４５℃又はそれ未満で極めて安定しており、室温での工業的生産の必要条件を満たすことができることを示す。
【０１９８】
実験例４：ヒアルロニダーゼ活性に対するｐＨの作用及びヒアルロニダーゼのｐＨ安定性の試験
ｐＨ１．０〜ｐＨ１２．０の緩衝溶液をそれぞれ調製し、これらの緩衝溶液を使用して、対応するｐＨを有する２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸溶液を調製し、９．９ｍＬの異なるｐＨを有するＨＡ溶液を別々に採取し、基質溶液として使用し、１００μＬの適切に希釈された（ただし２３２ｎｍにおける吸収値が０．３〜０．７の）ヒアルロニダーゼ溶液（例えば、例３〜１２のいずれか１つで調製されたヒアルロニダーゼ）を添加し、水槽中での反応を３０分行い、次いで２分沸騰させ、前もって不活性化した希釈酵素溶液を対照として使用し、これらを室温に冷却したら、２３２ｎｍにおける吸収値を測定し、その結果を図４Ａに示した：この酵素にとって最も好適なｐＨは６．５であり、この酵素は、ｐＨ４．０以下又はｐＨ９．０以上の場合活性がなかった。
【０１９９】
ヒアルロニダーゼ（例えば、例３〜１２のいずれか１つで調製されたヒアルロニダーゼ）を異なるｐＨを有する緩衝溶液で適切に希釈し、次いで残った酵素活性を測定し、その結果を図４Ｂに示した：酵素活性は、ｐＨ５．０〜６．０で比較的安定であり、これは６時間以内でほとんど減少しなかった。
【０２００】
本発明のヒアルロニダーゼは、高い酵素活性、優れた熱安定性、及びｐＨ安定性を有し、ヒアルロン酸のラージスケールでの工業的な分解のための酵素量の必要条件を満たすことができ、本酵素の調製方法は、簡単であり、条件が中程度であり、低コストであり、例えば化学分解の環境汚染、生物学的分解酵素の源の限定、低い活性、及び高い値段などの欠点を克服することがわかる。
【０２０１】
実験例５：酵素の基質特異性の試験
最終濃度１０ｍｇ／ｍＬのコンドロイチン硫酸、アルギン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、キトサン、キチン、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムの溶液をｐＨ６．０のリン酸緩衝溶液で別々に調製し、それから各９．９ｍＬを基質溶液として採取し、１００μＬの適切に希釈された（ただし２３２ｎｍにおける吸収値が０．３〜０．７の）ヒアルロニダーゼ溶液（例えば、例３〜１２のいずれか１つで調製されたヒアルロニダーゼ）を添加し、水槽中での反応を４２℃で３０分行い、次いで２分沸騰させ、前もって不活性化した希釈酵素溶液を対照として使用し、これらを室温に冷却したら、２３２ｎｍにおける吸収値を測定した。表４に結果を示した。
【表４】
0005957096.tif 000008
【０２０２】
結果から、本ヒアルロニダーゼは、触媒的にヒアルロン酸を分解することができ、加えてコンドロイチン硫酸に作用することができるが、アルギン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、キトサン、キチン、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを分解できないことが示された。
【０２０３】
実験例６：化学分解法及び酵素消化法により調製されたオリゴマーヒアルロナートの細胞毒性の比較
実験で使用したＬ９２９マウス線維芽細胞（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの細胞バンクから購入）を観察用細胞として使用し、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を完全培地として使用し、陰性対照は、試験されるサンプルをまったく含まない完全培地であり、陽性対照は、５ｇ／Ｌフェノール溶液（完全培地に溶解させた）であり、ブランク対照は、無細胞完全培地であり、試験されるサンプルは、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムサンプルを添加した完全培地であった。７２時間培養した後、相対増殖速度（ＲＧＲ）を以下の式によって計算した。
【数３】
0005957096.tif 000009
式中：
ＲＧＲは、相対増殖速度、％であり；
Ａは、ブランクを差し引いた、試験されるサンプルのグループ（陰性グループ、陽性グループ）の吸光度であり；
Ａ０は、ブランクを差し引いた陰性対照グループの吸光度である。
【０２０４】
細胞毒性の評価尺度を表５のＲＧＲ評価標準に従って決定した。陽性対照グループが少なくとも評価尺度３の反応であり、サンプルの細胞毒性反応の程度が評価尺度２を超えない場合、その細胞毒性は許容されるとみなされた。
【表５】
0005957096.tif 000010
【表６】
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【０２０５】
結果から、化学分解法により調製されたオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、その濃度が１．０％以下の場合、細胞毒性ではなく；一方で、酵素消化法により調製されたオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、その濃度が３．０％以下の場合、細胞毒性ではないことが示される。化学分解法によるオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムと比較して、酵素消化法により調製された同じ濃度を有するオリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、細胞増殖の促進に対して有意な作用を有する（ｐ＜０．０５）。
【０２０６】
実験例７：酵素消化法により調製されたヒアルロナートの経皮吸収、抗酸化活性及び還元能力に関する研究
１．酵素消化法により調製されたオリゴマーヒアルロナートの経皮吸収に関する研究
無毛マウスの皮膚材料を経皮吸収機器の拡散セルに固定し、拡散セルのドナー側に０．５％のオリゴマーヒアルロナート（別々に例１３〜１８で調製された）の溶液を添加し、３時間ごとにサンプルを採取し、採取された溶液中のオリゴマーヒアルロナートの含量を測定した。図５（Ａ）に結果を示した。この図表から、オリゴマーヒアルロナートは皮膚内部に入り吸収され得ることが示された。
【０２０７】
２．オリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートの抗酸化活性の研究
酵素消化法及び化学分解法により調製されたオリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートを別々に、それらのＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能力及びそれらの還元能力に関して予備的に研究した。
【０２０８】
使用された試薬及び細胞株は以下に示す通りであった：
様々な分子量を有するヒアルロナート：
酵素消化されたオリゴマーヒアルロナート：例１３〜１８で調製された；
化学的方法によるオリゴマーヒアルロナート：比較例１〜２に従って調製された；
酵素消化された低分子量ヒアルロナート：例１９〜２６で調製された；
化学的方法による低分子量ヒアルロナート：比較例３〜７で調製された；
高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（分子量：１６１０，０００、ＨＡ−１６１０ｋ）：Ｆｕｒｕｉｄａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄにより生産された。
【０２０９】
１）フリーラジカル捕捉能力に関する研究
ＤＰＰＨフリーラジカルを捕捉する能力を測定するメカニズム：ジフェニル−ピクリルヒドラジン（ＤＰＰＨ）は、窒素中心を有する安定なフリーラジカルであり、メタノール溶液又はＤＰＰＨのエタノール溶液は紫色であり、波長５１０〜５３０ｎｍで最大吸光度を有し、その濃度とその吸光度とは直線関係を有していた。フリーラジカルスカベンジャーが存在する場合、フリーラジカルスカベンジャーが１つの電子を供給して、ＤＰＰＨの孤立電子対の電子と対を形成することにより退色が起こり、この退色の程度は受け取った電子と定量的な関係にあり、すなわち溶液の色が明るくなり、吸光度が減少した（Ａｌｉｓｉ、Ｃ．Ｓ．ら、薬草ヒマワリヒヨドリ（Ｃｈｒｏｍｏｌａｅｎａ  ｏｄｏｒａｔａ  Ｌｉｎｎ）のエタノール抽出物のフリーラジカル捕捉及びインビトロでの抗酸化作用（Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｈｅｒｂ  Ｃｈｒｏｍｏｌａｅｎａ  ｏｄｏｒａｔａ  Ｌｉｎｎ）．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１１，１（４）、１４１〜１５５）。フリーラジカルスカベンジャーの能力が大きければ大きいほど、吸光度はより小さくなる。５．０ｍＬの０．１ｍＭのＤＰＰＨ（２−メチル−２，３−ジヒドロ−５，６−ジフェニルピラジン）エタノール溶液、及び様々な濃度の５．０ｍＬのオリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートを別々に正確に計量し、蓋付き試験管に入れ、均一に混合した。水及び９５％エタノールの等量混合溶液をブランク対照として使用した。室温で３０分静置した後、溶液の吸光度値を５２３ｎｍで別々に測定した。
【数４】
0005957096.tif 000012
【０２１０】
オリゴマーヒアルロナートの実験結果を図５（Ｂ）に示し、化学分解オリゴマーヒアルロン酸ナトリウム（比較例１又は比較例２で調製された）と比較して、同じ濃度の酵素消化したオリゴマーヒアルロン酸ナトリウム（例１３〜１８で調製した）は、より高いＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能力を有していたことがわかる（ｐ＜０．０５）。
【０２１１】
図５（Ｃ）に低分子量ヒアルロナートの実験結果を示した。
【０２１２】
これらの図表から、化学分解低分子量ヒアルロナート又は酵素消化低分子量ヒアルロナートのいずれにおいても、フリーラジカル捕捉能力は分子量の減少に伴い増加したことが示された。しかしながら、類似の分子量を有する低分子量ヒアルロナートに関して、酵素消化低分子量ヒアルロナートは、化学分解低分子量ヒアルロナートと比較して高いフリーラジカル捕捉能力を有していた。１０００，０００よりも大きい分子量を有するヒアルロナートはほとんどフリーラジカル捕捉能力を有していなかった。
【０２１３】
２）還元能力の測定
還元能力を測定するメカニズム：ｐＨ６．６の弱酸環境におけるフェリシアン化カリウムが還元性物質により還元されて、ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウムＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６を生成し、これがさらにＦｅＣｌ３によって供給される第二鉄イオンと反応して、プルシアンブルー（Ｆｅ４［Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６］３）を生成し、これが７００ｎｍにおいて特定の吸光度を有することから、プルシアンブルーの生産量を指標として使用すれば、吸光度が大きければ大きいほど、還元能力がより強い。したがって、原材料としてヒアルロナート水溶液を使用した場合、その還元能力は、このシステムにおけるプルシアンブルーの生成量を測定することにより判断することができる（Ｏｙａｉｚｕ、Ｍ．有機溶媒及び薄層クロマトグラフィーにより分画されたグルコサミンの吹込成形産物の抗酸化活性（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｂｒｏｗｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）．Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、１９８６、４４、３０７〜３１５）。
【０２１４】
２．５ｍＬの各オリゴマーヒアルロナート（例１３〜１８で調製した）及び低分子量ヒアルロナート（例１９〜２６で調製した）の溶液、加えて２．５ｍＬのリン酸塩溶液を正確に計量して、それぞれ蓋付き試験管に入れて、２．５ｍＬの１．０％フェリシアン化カリウム溶液を添加し、均一に混合し、５０℃の水槽で２０分処理した。水槽で処理した後、それを急速に冷却し、２．５ｍＬの１０％トリクロロ酢酸溶液を添加し、３０００ｒｐｍで１０分遠心分離した。８ｍＬの上清を採取し、５ｍＬの水と１ｍＬの０．１％三塩化鉄（ＩＩＩ）溶液を添加し、三塩化鉄（ＩＩＩ）溶液の代わりに等量の水をブランク対照として使用した。室温で１０分静置した後、溶液の吸光度値を７００ｎｍで測定した。
【０２１５】
図５（Ｄ）にオリゴマーヒアルロナートの還元能力の結果を示し、この図表から、化学分解オリゴマーヒアルロナート（比較例１又は比較例２で調製された）と比較して、同じ濃度の酵素消化オリゴマーヒアルロナートは、より大きい還元能力を有していたことが示された（ｐ＜０．０５）。
【０２１６】
図５（Ｅ）に低分子量ヒアルロナートの還元能力の結果を示し、この図表から、化学分解低分子量ヒアルロナート又は酵素消化低分子量ヒアルロナートのいずれにおいても、分子量の減少に伴い還元能力が増加したことが示された。しかしながら、類似の分子量を有する低分子量ヒアルロナートに関して、酵素消化低分子量ヒアルロナートは、化学分解低分子量ヒアルロナートと比較してより大きい還元能力を有していた。１０００，０００よりも大きい分子量を有するヒアルロナートはほとんど還元能力を有していなかった。
【０２１７】
上記の実験結果から、酵素消化オリゴマーヒアルロナート（例えば、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウム）及び低分子量ヒアルロナート（例えば、低分子量ヒアルロン酸ナトリウム）は、化学分解オリゴマーヒアルロナート（例えば、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウム）及び低分子量ヒアルロナート（例えば、低分子量ヒアルロン酸ナトリウム）と比較して、より高いＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能力とより高い還元能力を有していたことが示され、したがって、人体でフリーラジカルを効果的に捕捉し、メラニン形成を低減させることができ、さらに、化粧品で使用して、例えば日焼け防止、日焼け後の修復、白化及び増白、アンチエイジングなどの機能を付与することができ；また健康管理食品及び通常の食品で使用して、体内でのフリーラジカル捕捉及びアンチエイジングの機能を付与することもでき；また体内でフリーラジカルによって引き起こされるダメージと闘うための医薬品で使用することもできる。
【０２１８】
実験例８：健康管理食品における酵素消化ヒアルロナートの機能に関する研究
１．健康管理食品における酵素消化オリゴマーヒアルロナートの機能に関する研究
例えば、主な機能的な成分としてオリゴマーヒアルロナートを含む健康管理用経口溶液において、添加されたオリゴマーヒアルロナートの量は０．０５〜２％であった。経口溶液の配合は以下の通りであった：０．５％オリゴマーヒアルロナート（例１３〜１８のいずれか１つで調製された）を添加し、次いで２５％の食用の糖又はハチミツを添加し、精製水で溶解させた。完全に溶解した後、限外濾過装置を使用して滅菌を行い、次いでこれを１０ｍＬの経口溶液ボトル（高温又は紫外オゾンで滅菌済）に注ぎ入れ、蓋をして密封し、上記全ての操作を清潔な作業場で行った。次いで生成物に品質試験を行い、オリゴマーヒアルロナートの経口溶液を得た。対象の年齢は３０〜６５歳であり、対象を、各グループ３０人の６つのグループに分け、それぞれのヒトに、１日あたり１０〜２０ｍＬのオリゴマーヒアルロナート経口溶液を連続１か月間投与し、その作用を表７に示した。別の３０人のヒトを対照グループとして使用し、彼らには食用の糖又はハチミツの溶液を毎日投与した。
【表７】
0005957096.tif 000013
【０２１９】
表７から、本オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、健康管理食品としてそのまま食べることができ、吸収が極めて容易であり、例えば免疫性を強化すること、老化を遅らせること、皮膚のつや及び弾性の復元などの多くの機能を有することがわかった。本発明のオリゴマーヒアルロナートは小さい分子量を有し、ヒト腸による吸収が可能であることから、体の組織中のヒアルロン酸含量を高め、老化により減少する可能性があるヒアルロン酸を皮膚に供給することができる。加えて、経口投与で吸収された小さい分子量のヒアルロン酸が、体内で高分子量ヒアルロン酸を生成する可能性があり、それにより皮膚が柔らかく滑らかになり、関節が柔軟になり、しわの形成が防がれ、したがって、食品分野に使用することができる。
【０２２０】
２．健康管理食品における低分子量ヒアルロナートの機能に関する研究
例えば、主要な機能的な成分として低分子量ヒアルロナートを含む健康管理用経口溶液において、添加された低分子量ヒアルロナートの量は０．０５〜２％であった。経口溶液の配合は以下の通りであった：１．０％低分子量ヒアルロナート（例１９〜２６のいずれか１つで調製された）を添加し、次いで２５％食用の糖又はハチミツを添加した。配合方法：クリーンルームで配合を行い、室温で精製水を分取し撹拌し、所定比率の低分子量ヒアルロナートを添加し、次いで完全に溶解するまで撹拌しながら食用の糖又はハチミツを添加し、水を添加して１００％にした。完全に溶解した後、湿熱滅菌で滅菌を行い、次いでこれを１０ｍＬの経口溶液ボトル（高温又は紫外オゾンで滅菌済）に注ぎ入れ、蓋をして密封し、上記全ての操作を清潔な作業場で行った。次いで生成物に品質試験を行い、低分子量ヒアルロナートの経口溶液を得た。対象の年齢は２２〜５５歳であり、対象を、各グループ３２人の８つのグループに分け、それぞれのヒトに、１日あたり２０ｍＬの低分子量ヒアルロナート経口溶液を連続１か月間投与した。別の３０人のヒトを対照グループとして使用し、彼らには食用の糖又はハチミツの溶液を毎日投与した。
【０２２１】
対象の皮膚の含水量及び水分の損失量を、投与前及び投与後に、指定されたヒトによって皮膚用水分計で測定し、ここで測定の前後で測定部位及び室温及び湿度は一定に維持された。表８にヒトの皮膚の含水量測定の結果を示した。
【表８】
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【０２２２】
表８から、対象グループは、低分子量ヒアルロナート投与の１ヶ月後に、投与前の場合と比較して、含水量の有意な増加及び水分の損失の有意な改善を示したことがわかる。対象グループのヒトは、対照グループと比較してより優れたつや、皮膚の引き締まり及び弾性を示したことが観察された。したがって、低分子量ヒアルロン酸の経口投与は、吸収されやすく、優れた水分保持力及び保湿作用を有し、皮膚細胞を活性化することができ、したがってアンチエイジング機能を有する。
【０２２３】
したがって、オリゴマーヒアルロナート又は低分子量ヒアルロナートの経口投与後、対象の皮膚のつや、弾性を改善することができ、これらは、健康管理食品、加えて通常の食品で使用することができる。
【０２２４】
実験例９：血管新生の促進における酵素消化オリゴマーヒアルロナートの作用に関する研究
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｓｈａｎｄｏｎｇ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ提供）培養試験及びニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）モデル試験（孵化した卵をＰｏｕｌｔｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｈａｎｄｏｎｇ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）を使用して、酵素消化オリゴマーヒアルロナート（例１３〜１８のいずれか１つで調製された）は血管新生を促進することができるのかどうかを研究した。表９に、ＨＵＶＥＣ増殖に対する作用とＣＡＭ血管新生に対する作用を示す。実験的工程は、例えば、ＷＡＮＧ  Ｙａｎｈｏｕ、ＷＡＮＧ  Ｆｅｎｇｓｈａｎ、ＧＵＯ  Ｘｕｅｐｉｎｇ、比較的低い分子量のヒアルロン酸の調製及び血管新生の促進に対するその作用（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ  ｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２００７，２８（２）：１０７〜１０９を参考にすることができる。
【表９】
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【０２２５】
実験結果から、オリゴマーヒアルロン酸ナトリウムは、血管新生を促進する有意な活性を有し、インビボでＣＡＭの血管新生を促進することができ、インビトロでＨＵＶＥＣ細胞の増殖を促進することができ、例えば創傷治癒などの医療分野で使用することができることが示された。
【０２２６】
実験例１０：日焼け後の修復及び日焼け防止におけるヒアルロナートの作用に関する研究
太陽光中の紫外線（主としてＵＶＡ及びＵＶＢを含む）は、皮膚の日焼け及び太陽光による老化、加えて皮膚癌を引き起こす重要な要因である。皮膚本体の３種の細胞、すなわちケラチノサイト、線維芽細胞、及びメラニン細胞は全て、紫外線に敏感である。ＵＶＡダメージは、主として皮膚線維芽細胞のＤＮＡの酸化的ダメージを引き起こすことであり、それにより、ＤＮＡ突然変異及び皮膚癌が出現する可能性がある。この実験では、マウス線維芽細胞Ｌ９２９（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの細胞バンクから購入）を所定線量のＵＶＡに晒し、次いで、ＵＶＡ照射に晒されたＬ９２９細胞に対する、様々な分解方法により調製されたヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートの作用を研究するために、細胞をヒアルロナートで処理した；さらに、マウス線維芽細胞Ｌ９２９をヒアルロナートで処理し、次いで、Ｌ９２９細胞へのＵＶＡ照射の防御に対する、様々な分解方法により調製されたヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートの作用を研究するために、細胞を所定線量のＵＶＡ照射に晒した。
【０２２７】
使用された試薬及び細胞株は以下に示す通りであった：
線維芽細胞株Ｌ９２９：Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの細胞バンクから購入した；
異なる分子量を有するヒアルロナート：
酵素消化オリゴマーヒアルロナート：例１３〜１８で調製された；
化学分解オリゴマーヒアルロナート：比較例１〜２に従って調製された；
酵素消化低分子量ヒアルロナート：例１９〜２６で調製された；
化学分解低分子量ヒアルロナート：比較例３〜７で調製された；
高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（分子量：１６１０，０００、ＨＡ−１６１０ｋ）：Ｈｕａｘｉ  Ｆｕｒｕｉｄａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄにより生産された。
【０２２８】
１．紫外線に対するヒアルロナートの修復作用に関する研究
ＵＶＡ放射線照射後のＬ９２９マウス線維芽細胞に対する様々な製造方法により調製されたヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートの修復作用、
対数増殖期中のＬ９２９細胞を採取し、膵臓の酵素で消化し、２×１０４／ｍＬの細胞密度になるように調節し、９６−ウェルの細胞培養プレートに、１ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液を植え付け、二酸化炭素インキュベーター中に置き、従来通り３７℃、５％ＣＯ２で終夜培養した。９６−ウェルプレートから培養培地を取り出し、次いで１ウェルあたり１００μＬのＰＢＳを添加した。陰性対照グループには放射線照射しなかったが、一方で他の試験グループのＬ９２９細胞には７．２Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡを照射した。放射線照射の後にＰＢＳを除去し、細胞を以下の操作で処理した：
非放射線照射グループ（陰性対照グループ）：１００μＬの完全培地を添加した；
放射線照射グループ（陽性対照グループ）：１００μＬの完全培地を添加した；
放射線照射＋ヒアルロナート：０．０６２５％のヒアルロナートを含有する１００μＬの完全培地を添加した。
【０２２９】
２４時間連続培養した後、１ウェルあたり２０μＬのＭＴＴを添加し、次いで細胞培養インキュベーター中で４時間インキュベートし続けた。培養溶液を捨て、１ウェルあたり１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、暗所で１０分振盪し、５７０ｎｍの波長で吸光度値を酵素標識装置を用いて測定した。細胞の相対増殖速度（ＲＧＲ）を以下の式で計算した：
【数５】
0005957096.tif 000016
式中Ａｃは、試験グループの吸光度値を示し、Ａｃ，０は、陰性対照グループの吸光度値を示す。
【０２３０】
図６（Ａ）及び図６（Ｂ）に結果を示し、様々な分解方法により調製されたオリゴマーヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートはいずれも、ＵＶＡ放射線照射後のダメージを受けた細胞の修復作用を有しており、酵素消化オリゴマーヒアルロナートは、最良の日焼け後の修復作用を有し、一方で化学分解オリゴマーヒアルロナートの作用はその次に良好であった。加えて、ヒアルロナートの分子量が小さくなるに従って、修復作用はより良好になった。酵素消化オリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートは、高分子量ヒアルロナートの修復作用よりも優れた日焼け後の修復作用を有していた。
【０２３１】
２．ヒアルロナートの紫外線保護作用に関する研究
Ｌ９２９マウス線維芽細胞における異なる方法で調製されたオリゴマーヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートのＵＶＡ照射に対する保護作用を研究した。
【０２３２】
この実験において、異なる分子量を有するヒアルロナートをマウス線維芽細胞株Ｌ９２９に適用し、次いで細胞を所定線量のＵＶＡ照射に晒し、Ｌ９２９マウス線維芽細胞における異なる分子量を有するヒアルロナート及び異なる方法で調製されたオリゴマーヒアルロナートのＵＶＡ照射に対する保護作用を研究した。
【０２３３】
対数増殖期中の細胞を採取し、膵臓の酵素で消化し、２×１０４／ｍＬの細胞密度になるように調節し、９６−ウェルの細胞培養プレートに、１ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液を植え付け、二酸化炭素インキュベーター中に置き、従来通り３７℃、５％ＣＯ２で終夜培養した。終夜培養した後、培養培地を取り出し、細胞をグループごとに以下のように処理し、細胞培養インキュベーターで１２時間インキュベートした。
【０２３４】
非放射線照射グループ（陰性対照グループ）：１００μＬの完全培地を添加した；
放射線照射グループ（陽性対照グループ）：１００μＬの完全培地を添加した；
放射線照射＋ヒアルロナート：０．０６２５％のヒアルロナートを含有する１００μＬの完全培地を添加した。
【０２３５】
９６−ウェルプレート中の培養溶液を捨て、次いで１ウェルあたり１００μＬのＰＢＳを添加した。非放射線照射グループを除き、全ての試験グループのＬ９２９細胞を７．２Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ照射に晒した。放射線照射の後にＰＢＳを捨て、１ウェルあたり２０μＬのＭＴＴを添加し、細胞培養インキュベーターで４時間インキュベートを続けた。培養溶液を捨て、１ウェルあたり１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、暗所で１０分振盪し、５７０ｎｍの波長で吸光度値を酵素標識装置を用いて測定した。細胞の相対増殖速度（ＲＧＲ）を以下の式で計算した：
【数６】
0005957096.tif 000017
式中、Ａｃは、試験グループの吸光度値を示し、Ａｃ，０は、陰性対照グループの吸光度値を示す。
【０２３６】
図６（Ｃ）及び図６（Ｄ）に結果を示し、異なる方法で調製されたオリゴマーヒアルロナート及び異なる分子量を有するヒアルロナートはいずれも、ＵＶＡ照射に対する保護作用を有していた。酵素消化オリゴマーヒアルロナートは、ＵＶＡ照射に対して最良の保護作用を有し、一方で酵素消化低分子量ヒアルロナートの作用はその次に良好であった。化学的方法によるオリゴマーヒアルロナート及び高分子量ヒアルロナートは、最も低い保護作用を有していた。
【０２３７】
まとめると、酵素消化オリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートはいずれも、紫外線に対する修復作用及び紫外線に対する保護作用を有し、なかでも酵素消化オリゴマーヒアルロナートは、最良の紫外線に対する修復作用及び紫外線に対する保護作用を有し；低分子量ヒアルロナートは、優れた紫外線に対する保護作用を有し、それらの紫外線に対する修復作用は化学的方法によるオリゴマーヒアルロナートの修復作用よりも劣っていたが、高分子量ヒアルロナートの修復作用よりも優れていた。したがって、酵素消化オリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートは、日焼け防止及び日焼け後の修復のための化粧品で使用することができる。
【０２３８】
上述の内容から、本発明の製造方法により得られたオリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートは、外用することにより皮膚の表皮層に透過し、皮膚への栄養素及び水分の供給、皮膚の老化予防、紫外線による損傷の予防、日焼けした皮膚細胞の修復を可能にし、したがって、化粧品に使用することができ；経口投与によって容易に吸収されることから、フリーラジカル捕捉、皮膚細胞の活性化、皮膚の保湿だけでなく、優れた免疫機能を強化する作用及びアンチエイジング機能も有し、したがって、食品及び健康管理製品に使用することができることがわかる。加えて、本オリゴマーヒアルロナート及び低分子量ヒアルロナートは、血管新生を促進する、細胞性免疫を活性化する、及び骨を形成する機能を有し、加えて優れた細菌性の角膜炎の治療効果も有し、したがって、医薬品の分野で使用することができる。
【０２３９】
本発明の具体的なモデルを詳細に例示したが、当業者であれば、これらの詳細は当分野における教示に従って改変又は変更が可能であることを理解することができ、これらの変更は全て本発明の保護範囲内である。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びそのあらゆる等価物によって定められる。
【図１】
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【図２（Ａ）】
0005957096.tif 000019
【図２（Ｂ）】
0005957096.tif 000020
【図２（Ｃ）】
0005957096.tif 000021
【図２（Ｄ）】
0005957096.tif 000022
【図２（Ｅ）】
0005957096.tif 000023
【図２（Ｆ）】
0005957096.tif 000024
【図２（Ｇ）】
0005957096.tif 000025
【図２（Ｈ）】
0005957096.tif 000026
【図３（Ａ）】
0005957096.tif 000027
【図３（Ｂ）】
0005957096.tif 000028
【図４（Ａ）】
0005957096.tif 000029
【図４（Ｂ）】
0005957096.tif 000030
【図５（Ａ）】
0005957096.tif 000031
【図５（Ｂ）】
0005957096.tif 000032
【図５（Ｃ）】
0005957096.tif 000033
【図５（Ｄ）】
0005957096.tif 000034
【図５（Ｅ）】
0005957096.tif 000035
【図６（Ａ）】
0005957096.tif 000036
【図６（Ｂ）】
0005957096.tif 000037
【図６（Ｃ）】
0005957096.tif 000038
【図６（Ｄ）】
0005957096.tif 000039
【配列表】
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