(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）および抗ＣＤ２８  ｍＡｂで標識された、宿主免疫を活性化させるサイトカインおよび表面分子の発現を引き起こす、注入媒体中の活性化された同種異系Ｔ細胞の組成物であって、ここで、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂが、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂに対して反応性の薬剤でコーティングされた生分解性マイクロスフィアとの会合によって架橋されており、該Ｔ細胞が支配的にＣＤ４＋Ｔ細胞であり、そして、該ＣＤ４＋Ｔ細胞が支配的にＴｈ１細胞である、組成物。
【請求項２】
前記活性化されたＴ細胞が、静脈内注入に適した媒体中に懸濁されたＴ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記活性化されたＴ細胞が、１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度で懸濁されたＴ細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記活性化されたＴ細胞が、１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度で、柔軟な容器もしくはシリンジ中に懸濁されたＴ細胞である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記活性化されたＴ細胞が、低温保存されたＴ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
注入媒体中に処置有効量のＴ細胞を含む同種異系細胞の集団および抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂを架橋する架橋薬剤を含有する組成物であって、該Ｔ細胞は、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂまたはその一部で標識されており、該Ｔ細胞は、宿主免疫を活性化させるサイトカインおよび表面分子の発現を引き起こすように架橋によって活性化されたＴ細胞であり、ここで、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂが、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂに対して反応性の薬剤でコーティングされた生分解性マイクロスフィアとの会合によって架橋されており、該Ｔ細胞が支配的にＣＤ４＋Ｔ細胞であり、そして、該ＣＤ４＋Ｔ細胞が支配的にＴｈ１細胞である、組成物。
【請求項７】
前記ｍＡｂを架橋する薬剤が、生分解性マイクロスフィアにコーティングされた薬剤である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｔ細胞および結合した生分解性マイクロスフィアが、静脈内注入に適した媒体中に懸濁された状態である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記Ｔ細胞および結合した生分解性マイクロスフィアが、１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度で懸濁された状態である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞および結合した生分解性マイクロスフィアが、１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度で、柔軟な容器またはシリンジ中に懸濁された状態である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、低温保存された状態である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記サイトカインおよび表面分子の発現が、患者への注入前である、請求項１または６に記載の組成物。
【請求項１３】
宿主免疫を活性化させるサイトカインおよび表面分子の発現を引き起こす、抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂで標識されたＴ細胞を注入媒体中に含む同種異系細胞を含む組成物であって、該Ｔ細胞は、腫瘍を保有する宿主免疫系と接触させた際に、対宿主性移植片応答を誘発することなく、対腫瘍性宿主応答および対移植片性宿主応答を誘発するＴ細胞であり、ここで、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂが、該抗ＣＤ３
ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂに対して反応性の薬剤でコーティングされた生分解性マイクロスフィアとの会合によって架橋されており、該Ｔ細胞が支配的にＣＤ４＋Ｔ細胞であり、そして、該ＣＤ４＋Ｔ細胞が支配的にＴｈ１細胞である、組成物。
【請求項１４】
前記対腫瘍性宿主応答が、前記腫瘍を保有する宿主に投与された際に、該腫瘍のアポトーシスを引き起こす対腫瘍性宿主応答である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ドナーから採取された単核細胞を含む、宿主免疫系を刺激するための組成物であって、ここで、該単核細胞内の抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂで標識された注入媒体中のＴ細胞が宿主免疫を活性化させるサイトカインおよび表面分子の発現を引き起こすようにエキソビボで活性化されたＴ細胞であり、該活性化されたＴ細胞は、宿主免疫系を有する宿主に投与するのに適しており、それによって、該活性化されたＴ細胞は、該宿主免疫系により拒絶されるが、該宿主免疫系を刺激して有効な免疫反応を媒介するＴ細胞であり、ここで、該活性化されたＴ細胞は、該宿主に対して同種異系であり、ここで、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂが、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂに対して反応性の薬剤でコーティングされた生分解性マイクロスフィアとの会合によって架橋されており、該Ｔ細胞が支配的にＣＤ４＋Ｔ細胞であり、そして、該ＣＤ４＋Ｔ細胞が支配的にＴｈ１細胞である、組成物。
【請求項１６】
前記宿主が疾患を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ドナーは、前記宿主に対する組織適合性を考慮せずに選択されたドナーである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記宿主は、以前に骨髄移植手順を受けていない、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記宿主は、同種異系ドナー細胞注入の定着を可能にするために設計された、免疫抑制的
化学療法および／または照射コンディショニングレジメンを受けていない、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分が、エキソビボでの活性化後に、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉナイーブ細胞から、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏ記憶細胞に分化する細胞である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞は、該Ｔ細胞の細胞表面に適用された抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂの架橋によって活性化されたＴ細胞である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞は、少なくとも６日間、活性化刺激に連続的にさらされたＴ細胞である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞は、該Ｔ細胞の細胞表面に適用された抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂとともに投与されるのに適しており、該ｍＡｂは、該ｍＡｂに対して反応性の薬剤でコーティングされた生分解性マイクロスフィアとの会合および含有によって架橋されたｍＡｂである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２４】
前記活性化されたＴ細胞の投与および続く該活性化されたＴ細胞の拒絶は、宿主の内在する疾患に対する免疫反応を刺激するものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２５】
前記エキソビボで活性化されたＴ細胞は、前記宿主への投与の前に低温保存されたＴ細胞である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ドナーが、前記宿主に対して５０％以下の組織適合性を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記宿主の疾患が、癌、血液学的悪性腫瘍、固形腫瘍、転移した固形腫瘍またはウイルス感染を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記活性化されたＴ細胞の前記宿主への投与が、該宿主に対する対宿主性移植片（ＧＶＨ）病に伴う毒性なしに抗腫瘍効果を提供する投与である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記宿主免疫反応が、以下のサイトカイン：ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−ガンマのうち少なくとも１つを含む「サイトカインストーム」の産生を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ドナーから採取された細胞が、活性化前に凍結された細胞である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項３１】
前記宿主免疫反応が、ＮＫ細胞またはマクロファージを含む生得的な細胞の活性化を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項３２】
前記活性化されたＴ細胞の投与による前記宿主免疫系の刺激が、対腫瘍宿主効果および対移植片宿主効果の対の刺激を含み、該効果の対は、同種異系移植手順の対腫瘍移植片効果および対宿主移植片効果の対をミラーするものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項３３】
前記Ｔ細胞が注入時に活性化されているＴ細胞である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項３４】
少なくとも一部のＴ細胞を含む組成物であって、該Ｔ細胞は、健康なドナー由来のもので
あり、そして、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋に起因して活性化状態であり、ここで、該Ｔ細胞は、抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂで標識されており、宿主免疫を活性化させるサイトカインおよび表面分子の発現を引き起こすＴ細胞であり、そして、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂが、該抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび該抗ＣＤ２８  ｍＡｂに対して反応性の薬剤でコーティングされた生分解性マイクロスフィアとの会合によって架橋されており、そして、該Ｔ細胞が、治療のためのヒト宿主への投与に適した注入媒体中に懸濁されたＴ細胞であり、該Ｔ細胞が支配的にＣＤ４＋Ｔ細胞であり、そして、該ＣＤ４＋Ｔ細胞が支配的にＴｈ１細胞である、組成物。
【請求項３５】
前記Ｔ細胞がシリンジまたは折り畳める容器中に懸濁されたＴ細胞である、請求項３４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、疾患を治療するための、同種細胞注入の使用に関連する。より具体的には、本発明は、対宿主性移植片（ＧＶＨ）病の毒性なしに、抗腫瘍効果を産生することを可能にする、同種細胞治療方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
同種異系細胞治療は、いくつかの型の悪性腫瘍およびウイルス性疾患の重要な治療法である。同種異系細胞治療は、患者に対する細胞の注入または移植を含み、ここで注入または移植された細胞は患者以外のドナーから得る。同種異系細胞治療プロトコールのために利用されてきた同種異系ドナーのタイプは、ＨＬＡのマッチした同胞、マッチした非血縁のドナー、部分的にマッチした家族メンバーのドナー、血縁の臍帯血ドナー、および非血縁の臍帯血ドナーを含む。同種異系ドナー細胞を、通常骨髄の採取、末梢血の採取、または出生時の臍帯血の採取によって得る。このマッチしたドナーの必要性が、同種異系細胞治療プロトコールの大きな制限である。ＨＬＡのマッチングの必要性なしに有効である、同種異系細胞治療の方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００３】
同種異系細胞治療方法は、骨髄移植（ＢＭＴ）環境において３０年以上行われてきた（ＫａｉおよびＨａｒａ  ２００３）。これらの方法は、高用量の（骨髄破壊的な）化学療法および／または照射による患者の治療を含む。この骨髄破壊的なコンディショニングは、骨髄の破壊を引き起こし、機能する免疫系の喪失を引き起こす。従って、これらの患者は、破壊された骨髄を置換し、そして免疫を修復するために、同種異系細胞移植によって「救われ」なければならない。
【０００４】
骨髄破壊的なコンディショニング、続く同種異系ＢＭＴまたは幹細胞移植（ＳＣＴ）の、ある血液の悪性腫瘍を治療する能力は、広く認められている。同種異系細胞移植によって媒介される抗腫瘍効果は、移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果として知られる（移植片対白血病効果および移植片対悪性腫瘍効果および移植片対骨髄腫効果とも呼ばれる）。同種異系細胞治療後のＧＶＴ活性は、骨髄性白血病（ＧａｌｅおよびＣｈａｍｐｌｉｎ  １９８４）、リンパ性白血病（Ｒｏｎｄｏｎ、Ｇｉｒａｌｔら  １９９６）、多発性骨髄腫（Ｔｒｉｃｏｔ  １９９６  番号２７３０）、および乳癌（Ｅｉｂｌ、Ｓｃｈｗａｉｇｈｏｆｅｒら  １９９６）を含むいくつかの癌を治療するのに有効であることが知られている。
【０００５】
しかし、同種異系ＢＭＴは、治療に関連する死亡率が３０−３５％である（Ｆｒａｓｓｏｎｉ、Ｌａｂｏｐｉｎら  １９９６）。移植関連死亡率の高いリスクは、この治療の使用をほとんど、血液の悪性腫瘍を有する他は健康な患者に制限してきた。その治療をより広い範囲の患者および疾患適応症に利用可能にするために、同種異系細胞治療の治療に関連する死亡率を有意に抑制、またはなくすことが、本発明の目的である。
【０００６】
自己由来ＢＭＴを受けた患者と比較して、同種異系ＢＭＴを受けた患者において再発率が有意に低いことが観察された時に、ＧＶＴ効果が発見された。これは、抑制された再発率は、同種異系移植片に含まれるリンパ球の抗腫瘍反応によって媒介される（ＧＶＴ効果）という発見に導いた（Ｗｅｉｄｅｎ、Ｓｕｌｌｉｖａｎら  １９８１）。
【０００７】
同種異系ＢＭＴ後に再発した慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を有する患者が、同種異系リンパ球の注入（ドナーリンパ球注入またはＤＬＩとして知られる手順）後に、完全な寛解に至った時に、初めてＧＶＴ効果の力の直接的な証拠が提供された。ＤＬＩ治療は、それ以来同種異系ＢＭＴ後の再発癌患者において、そのような腫瘍細胞の最大耐容量の化学療法／照射に対する完全な抵抗性にもかかわらず、しばしば完全な寛解を引き起こすことが示された（Ｓｌａｖｉｎ、Ｎａｐａｒｓｔｅｋら  １９９５；Ｓｌａｖｉｎ、Ｎａｐａｒｓｔｅｋら  １９９６；Ｓｌａｖｉｎ、Ｎａｐａｒｓｔｅｋら  １９９６）（Ｓｌａｖｉｎ  米国特許第５，８４３，４３５および６，１４３，２９２号も参照のこと）。
【０００８】
ＤＬＩ治療単独で、化学療法なしに、抗腫瘍効果を有し得るという観察は、悪性腫瘍の治療においてパラダイムシフトを引き起こした。中心が化学療法／照射の細胞毒性効果よりもＧＶＴ効果にある、新しい世代の治療が生まれた。この新しい世代の同種異系細胞治療プロトコールは、「ミニ移植」として知られる（例えば、Ｓｌａｖｉｎに発行された米国特許第６，５４４，７８７号、およびＳｙｋｅｓらに発行された米国特許第６，５５８，６６２号を参照のこと）。
【０００９】
ミニ移植手順は、初回の低用量、非骨髄破壊的な患者の化学療法コンディショニングを含む。低用量化学療法コンディショニングは、腫瘍抑制の目的のために提供されるのではなく、同種異系ドナー細胞注入の拒絶を予防するのに充分免疫系を弱めるためだけに設計される。コンディショニングした患者に、操作していない同種異系リンパ球または幹細胞を注入し、それが患者に定着し、そして続いてＧＶＴ効果を媒介する。
【００１０】
うまく定着した同種異系細胞を有する患者は、部分的には自己由来であり、そして部分的には同種異系移植片由来である免疫系を発達させる。この免疫学的状態の患者は、「キメラ」として知られる。キメラの形成を可能にするコンディショニングレジメは、通常１つまたはそれ以上の、フルダラビンのようなプリンアナログ、ブスルファンのようなアルキル化剤、および／またはシクロホスファミド、および／または抗白血球グロブリンのような、化学療法コンディショニング薬剤の投与を含む（Ｓｌａｖｉｎに発行された米国特許第６，５４４，７８７号を参照のこと）。
【００１１】
これらのミニ移植プロトコールは、血液学的な悪性腫瘍の治療に非常に有効であることが証明され、そして高用量の骨髄破壊的レジメより毒性が弱い（Ｃｈａｍｐｌｉｎ、Ｋｈｏｕｒｉら  １９９９；Ｃｈａｍｐｌｉｎ、ｖａｎ  Ｂｅｓｉｅｎら  ２０００）；（Ｇｒｉｇｇ、Ｂａｒｄｙら  １９９９）；（Ｓｌａｖｉｎ、Ｎａｇｌｅｒら  ２００１；Ｓｌａｖｉｎ、Ｏｒら  ２００１）。ミニ移植はまた、化学療法抵抗性の転移疾患に有効であることも示された（Ｃｈｉｌｄｓ、Ｃｈｅｒｎｏｆｆら  ２０００；Ｃｈｉｌｄｓ  ２０００；ＣｈｉｌｄｓおよびＢａｒｒｅｔｔ  ２００２；Ｃｈｉｌｄｓ  ２００２）。
【００１２】
ＧＶＴ効果は、ヒト悪性腫瘍の治療において今まで観察された最も強力および有効な抗腫瘍メカニズムであると記載されたが（ｖａｎ  Ｂｅｓｉｅｎ、Ｔｈａｌｌら  １９９７）（Ｅｉｂｌ、Ｓｃｈｗａｉｇｈｏｆｅｒら  １９９６）（Ｕｅｎｏ、Ｒｏｎｄｏｎら  １９９８）、ＧＶＴの臨床適用は、同種異系細胞注入に伴う毒性のために、依然として非常に制限されている。同種異系細胞治療の主な合併症は、対宿主性移植片（ＧＶＨ）病として知られる状態である。ＧＶＨ病は、ドナーＴ細胞が正常宿主細胞の抗原に対して反応し、標的臓器の損傷を引き起こす場合に起こり、それは多くの場合死に至る。ＧＶＨ病の主な標的臓器は、免疫系、皮膚、肝臓および腸である。
【００１３】
同種異系細胞治療において、有用なＧＶＴ効果を有害なＧＶＨ効果から分離する方法を開発する緊急の必要性が存在する。しかし、同じドナーＴ細胞が両方の効果の原因であり、ＧＶＴおよびＧＶＨは密接に関連した過程であるようなので、これは非常に困難であることが判明した。ＧＶＨ病に伴う毒性なしに抗腫瘍効果を提供する、同種異系細胞治療方法を記載することが、本発明の目的である。
【００１４】
ＧＶＨ病は、ドナーおよびレシピエントの間の組織適合性抗原（ＨＬＡ）のミスマッチに対して２次的に起こる。強力なＨＬＡミスマッチのドナー−レシピエントペア間の同種異系ＢＭＴを行う試みは、重篤なＧＶＨ病の非常に高い発生および同種異系細胞注入の定着の失敗を伴った。従って、同種異系細胞治療は、通常ドナーおよびレシピエント間のＨＬＡ抗原のマッチングを必要とする。しかし、ＨＬＡアイデンティティーのマッチングにも関わらず、おそらくマイナーＨＬＡ抗原の違いのために、かなりの数の患者が依然としてＧＶＨ病を発症する。
【００１５】
ＨＬＡがマッチしたドナーの必要性が、同種異系細胞治療の適用を厳しく制限する。およそ３人に１人の患者のみが、ＨＬＡがマッチした同胞を有するか、または表現型のマッチした非血縁のドナーを見つけることができ、そして従って大部分の患者は、同種異系細胞治療の選択肢を有さない。さらに、白血病およびリンパ腫を含む大部分の癌は、若い人よりもＧＶＨを発症しやすい、そして従って他の治療選択肢がないにもかかわらず、一般的には同種異系細胞治療の候補とは考えられない、より高齢の患者を悩ます。それに加えて、ＧＶＨ病の予防のために使用される免疫抑制剤も、２次感染の危険性を高め、そしてある型の白血病の再発率を高める。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
よって、その治療をより多くの患者集団のために利用し得るために、同種異系細胞治療プロトコールにおいてＧＶＨ病に伴う毒性を抑制またはなくし、一方ＧＶＴ効果を維持または高める大きな必要性が存在する。
【００１７】
関連するＧＶＨ病毒性なしに、少なくともＧＶＴ効果と同じくらい有効な抗腫瘍効果を誘発する、同種異系細胞治療方法を記載することが、本発明の目的である。
【００１８】
その治療から利益を得るために、以前の同種異系ＢＭＴまたは化学療法コンディショニングレジメの必要性を排除することによって、治療に関連する毒性が抑制された同種異系細胞治療方法を記載することが、本発明のさらなる目的である。
【００１９】
ＨＬＡがマッチしたドナーを必要としない同種異系細胞治療の方法を記載することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（本発明の概要）
本明細書中で開示される発明は、同種異系細胞で構成される製品に関連し、少なくともその一部はＴ細胞であり、ここで同種異系Ｔ細胞はエキソビボで増殖および分化され、そしてヒトにおいてＧＶＨ毒性なしに宿主免疫系を刺激するための同種異系細胞治療として使用され、そしてここで当該同種異系細胞は続いて宿主免疫系によって拒絶される。
【００２１】
本明細書中で開示される発明はまた、上記で記載された製品に関連し、ここで同種異系細胞はレシピエントとのＨＬＡマッチングを考慮せずに、または意図される患者集団とのＨＬＡハプロタイプの最大限のミスマッチを可能にするよう選択され、それによって最大限の同種異系潜在性および続く製品に対する宿主免疫反応を保証する。
【００２２】
本明細書中で開示される発明はまた、上記で記載される製品に関連し、ここで同種異系細胞は、以前に同種異系ＢＭＴを受けたことがない患者に注入された場合に、腫瘍に対して有効な宿主免疫反応を刺激し得る。
【００２３】
本明細書中で開示される発明はまた、上記で記載される製品に関連し、ここで同種異系細胞は、以前に免疫抑制コンディショニングレジメを受けたことがない患者に注入された場合に、腫瘍に対して有効な宿主免疫反応を刺激し得る。
【００２４】
本明細書中で開示される発明はまた、上記で記載される製品に関連し、ここで同種異系細胞治療は、宿主における炎症性「１型」モノカインおよびリンホカインの産生を刺激することによって、患者において免疫反応を刺激する。
【００２５】
本明細書中で開示される発明はまた、上記で記載される製品に関連し、ここで同種異系細胞治療は、宿主自然免疫および／またはＴｈ１適応免疫の構成成分を活性化することによって、患者において免疫反応を刺激する。
【００２６】
本明細書中で開示される発明はまた、上記で記載される製品に関連し、ここで同種異系細胞治療は、腫瘍の免疫原性を増強するサイトカインの産生を刺激する。
【００２７】
本明細書中で開示される発明はまた、上記で記載される製品に関連し、ここで同種異系細胞は腫瘍を直接破壊して、腫瘍関連抗原を、宿主１型適応免疫を刺激するために利用可能にする。
【００２８】
本明細書中で開示される発明はまた、上記で記載される製品を産生する方法に関連し、ここで製品に含まれる同種異系Ｔ細胞は増強された活性化の状態である。
【００２９】
本明細書中で開示される発明はまた、非血縁のドナーから単核細胞を回収すること、単核細胞集団中のＴ細胞を活性化すること、および宿主免疫系を有する宿主に活性化Ｔ細胞を投与することによって、宿主免疫系を刺激する方法に関連し、ここで活性化Ｔ細胞は宿主免疫系によって拒絶されるが、宿主免疫系を刺激して内在する疾患に対する有効な免疫反応を媒介する。宿主は、血液学的悪性腫瘍、固形腫瘍、転移した固形腫瘍またはウイルス感染のような、内在する疾患を有し得る。ドナーを、宿主に対する組織適合性を考慮せずに選択し、そして最大限の組織適合性ミスマッチが好ましい。宿主はまた、好ましくは以前に骨髄移植を受けていない、および好ましくは同種異系ドナー細胞注入の定着を可能にするために設計された、免疫抑制的化学療法および／または照射コンディショニングレジメを受けていない。
【００３０】
その方法はさらに、Ｔ細胞は好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞であり、そして大部分のＣＤ４＋Ｔ細胞は、エキソビボにおける活性化の後にＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉナイーブ細胞からＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏ記憶細胞に分化することを含み、そしてここでそのような細胞はＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファのような１型サイトカインを産生し、そしてＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−ベータのような２型サイトカインを産生しない。
【００３１】
本明細書中で開示される発明はまた、エキソビボ活性化の後に、細胞表面にＣＤ４０Ｌおよび／またはＴＲＡＩＬを発現する、そのようなＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
【００３２】
好ましくは、Ｔ細胞の細胞表面に適用された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂの架橋によって、Ｔ細胞が活性化される。好ましくは、当該Ｔ細胞の表面に適用される抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂは、当該ｍＡｂに対して反応性の薬剤で覆われた生物分解性のマイクロスフィアと会合することによって架橋される。
【００３３】
本明細書中で開示される発明はまた、９０％より多くのＴ細胞が、宿主免疫系との接触直前およびその時に活性化状態にある場合を含み、そして好ましい実施態様においては９５％より多くのＴ細胞が、宿主への投与時および宿主との接触直前に活性化されている。
【００３４】
本方法はまた、Ｔ細胞が、宿主への注入前に少なくとも６日間活性化刺激に連続的にさらされる場合を含む。好ましくは、Ｔ細胞は、細胞対細胞の接触を最大限にするために、少なくとも１０７細胞／ｍｌの細胞密度で維持される間に活性化される。そのような細胞対細胞の接触は、同種異系Ｔ細胞の活性化状態を増強するように作用する。
【００３５】
別の実施態様において、本方法は、同種異系Ｔ細胞の表面に適用された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂと共にＴ細胞が投与され、そしてそのｍＡｂは、ｍＡｂに対して反応性の薬剤で覆われた生物分解性マイクロスフィアとの会合および含有によって架橋される場合を含む。
【００３６】
本方法はまた、Ｔ細胞の投与が、１型サイトカインの産生を刺激する場合を含み、そしてそのようなサイトカインは、少なくとも１つの以下のものを含む：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、およびＴＮＦ−ベータ。そのようなサイトカインは、宿主自然免疫機能を含む免疫を刺激する。本方法はまた、活性化Ｔ細胞の投与が、宿主樹状および／またはマクロファージ細胞を活性化する場合を含む。
【００３７】
本発明はまた、活性化された同種異系Ｔ細胞の投与および続く活性化Ｔ細胞の拒絶が、宿主の内在する疾患に対する免疫反応を刺激する場合を含む。
【００３８】
本発明はまた、エキソビボで活性化された同種異系Ｔ細胞を、処方および宿主への投与の前に低温保存する方法を含む。
【００３９】
本発明はまた、当該ｍＡｂに対して反応性の薬剤で覆われた生物分解性マイクロスフィアで架橋された、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂで標識された同種異系Ｔ細胞の組成物を含む。標識された同種異系Ｔ細胞および会合した生物分解性マイクロスフィアを、静脈内注入のために適当な媒体に懸濁する。そのようなＴ細胞および会合した生物分解性マイクロスフィアを、１０７細胞／ｍｌまたはそれより高い細胞密度で、そして好ましくは柔軟な容器またはシリンジ内で懸濁する。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で標識したＴ細胞をまた、処方および投与の前に低温保存し得る。
【００４０】
本発明はまた、腫瘍を有する宿主免疫系と接触した場合に、毒性の対宿主性移植片（ＧＶＨ）反応を誘発することなく、宿主対腫瘍（ＨＶＴ）および宿主対移植片（ＨＶＧ）反応を誘発する、同種異系細胞材料を含む。同種異系細胞材料は、エキソビボで活性化したＴ細胞を含み、そしてここで当該活性化Ｔ細胞は、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００４１】
本発明はまた、腫瘍を有する宿主に投与した場合に、腫瘍のアポトーシスを引き起こす同種異系細胞材料を含む。同種異系細胞材料は、活性化同種異系Ｔ細胞を含み、そしてそのようなＴ細胞は、好ましくはＣＤ４＋細胞である。そのようなＣＤ４＋細胞は、好ましくは高密度で、細胞表面にＦａｓＬおよび／またはＴＲＡＩＬを発現する。そのような活性化Ｔ細胞は、好ましくはエキソビボ活性化の後に、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６３Ｌｌｏを発現する記憶細胞へ分化する。そのような同種異系Ｔ細胞は、１つまたはそれ以上の以下のサイトカインを発現する：ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ガンマ、およびＴＮＦ−アルファ、そして宿主への投与時に表面ＦａｓＬおよび／またはＴＲＡＩＬを発現する。
【００４２】
本発明はまた、治療に有効な量の同種異系細胞集団を含む組成物を含み、そのうち少なくとも一部はＴ細胞であり、そしてここで当該Ｔ細胞は活性化に有効な量の１つまたはそれ以上のモノクローナル抗体またはその一部、および架橋に有効な量のモノクローナル抗体に対して反応性の薬剤で標識される。そのような組成物のＴ細胞は、好ましくは抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂで標識される。ｍＡｂに対して反応性の薬剤は、好ましくは生物分解性マイクロスフィアをコートする。同種異系Ｔ細胞および会合した生物分解性マイクロスフィアを、静脈内注入に適当な媒体に懸濁する。そのような標識Ｔ細胞および会合した架橋生物分解性マイクロスフィアを、１０７細胞／ｍｌまたはそれより高い細胞密度で、柔軟な容器またはシリンジ内で懸濁する。組成物を、注入前に低温保存し得る。
【００４３】
好ましい実施態様において、本発明において使用される同種異系細胞は、エキソビボで活性化された精製Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞、より好ましくはエフェクターまたは記憶細胞へ分化し、そして高レベルのＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファのような１型サイトカインを産生し、そして好ましくは高密度でＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、およびＦａｓＬのようなエフェクター分子も細胞表面に発現するＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００４４】
別の好ましい実施態様において、注入のための同種異系Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化薬剤と連続的に接触して、高い細胞密度（１０７細胞／ｍｌまたはより高い）で細胞を維持する方法によって、エキソビボで処理される。
【００４５】
別の好ましい実施態様において、注入のための同種異系Ｔ細胞を、採取から注入までＴ細胞を活性化状態に維持する手段として、活性化薬剤を含む注入のために適当な媒体中で処方する。
【００４６】
別の好ましい実施態様において、９０％より多い、または好ましくは９５％より多い、注入される同種異系Ｔ細胞は、患者への注入時に、増強された活性化状態であり続ける。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
同種異系細胞の集団およびモノクローナル抗体に対して反応性の、架橋有効量の薬剤を含有する組成物であって、該細胞の少なくとも一部は、Ｔ細胞であって、該Ｔ細胞は、活性化有効量の一種以上の該モノクローナル抗体またはその一部で標識される、組成物。
（項目２）
前記Ｔ細胞が、抗ＣＤ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８  ｍＡｂで標識される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ｍＡｂに対して反応性の薬剤が、生分解性のミクロスフェアにコーティングされる、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記Ｔ細胞および結合した生分解性ミクロスフェアが、静脈内注入に適した培地中に懸濁される、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記Ｔ細胞および結合した生分解性ミクロスフェアが、１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度で懸濁される、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記Ｔ細胞および結合した生分解性ミクロスフェアが、１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度で、可撓性容器中に懸濁される、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記Ｔ細胞および結合した生分解性ミクロスフェアが、１０７細胞／ｍｌ以上の細胞密度で、シリンジ中に懸濁される、項目５に記載の組成物。
（項目８）
前記組成物が、凍結保存される、項目１に記載の組成物。
（項目９）
腫瘍が保有する宿主免疫系と接触する場合に、対宿主性移植片応答を誘発せずに、対腫瘍性宿主応答および対移植片性宿主応答を誘発する同種異系細胞物質。
（項目１０）
前記同種異系細胞物質が、エキソビボで活性化されたＴ細胞を含む、項目９に記載の同種異系細胞物質。
（項目１１）
前記活性化されたＴ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、項目１０に記載の同種異系細胞物質。
（項目１２）
腫瘍を保有する宿主に投与される場合、腫瘍のアポトーシスを引き起こす同種異系細胞物質。
（項目１３）
活性化されたＴ細胞を含む、項目１２に記載の同種異系細胞物質。
（項目１４）
前記活性化されたＴ細胞が、ＣＤ４＋細胞である、項目１３に記載の同種異系細胞物質。
（項目１５）
前記ＣＤ４＋細胞が、ＦａｓＬおよび／またはＴＲＡＩＬを発現する、項目１４に記載の同種異系細胞物質。
（項目１６）
前記活性化されたＴ細胞が、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌｌｏを発現する記憶細胞に分化する、項目１２に記載の同種異系細胞物質。
（項目１７）
前記活性化されたＣＤ４＋細胞が、以下のサイトカイン：ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのうちの一種以上を発現する、項目１２に記載の同種異系細胞物質。
（項目１８）
前記活性化されたＴ細胞がＦａｓＬを発現する、項目１２に記載の同種異系細胞物質。
（項目１９）
前記活性化されたＴ細胞がＴＲＡＩＬを発現する、項目１２に記載の同種異系細胞物質。
【００４７】
（「ミラー効果」）
従来技術の同種細胞治療プロトコールにおいて、移植片中のＴ細胞が、治療の有用なＧＶＴ効果および有害なＧＶＨ効果を媒介する原因である。本発明の目的を達成するために、新規メカニズムが記載され、ここで移植片中のＴ細胞は免疫効果を直接媒介せず、その代わりに宿主免疫系を刺激して、内在する疾患に対する有効な免疫反応を媒介するよう作用する。
【００４８】
本発明の方法によって誘発された宿主免疫反応は、従来技術の同種異系細胞治療プロトコールのＧＶＴ／ＧＶＨ効果の「ミラー」である。同種異系細胞治療において通常観察されるＧＶＴ効果の「ミラー」は、宿主対腫瘍（ＨＶＴ）効果である。同種異系細胞治療において通常観察されるＧＶＨ効果の「ミラー」は、宿主対移植片（ＨＶＧ）効果である。ＨＶＴ／ＨＶＧ効果は、下で集合的に「ミラー効果」と呼ばれる。
【００４９】
従来技術の同種異系細胞治療プロトコールの非常に毒性なＧＶＨ構成要素と違い、ミラー効果のＨＶＧ構成要素は、移植片細胞の非毒性な拒絶を引き起こすのみである。従って本発明において、ミラー効果のＨＶＴ抗腫瘍構成要素は、ＧＶＨの毒性なしに起こる。当該分野において、有効な抗腫瘍免疫反応はまた、ウイルスを含む様々な病原体に対して有効であり得ることが理解される。
【００５０】
本発明において、移植片の拒絶（ＨＶＧ）は、ミラー効果の望ましい構成要素である。従って、従来技術の同種異系細胞治療プロトコールにおいて必要であるような、移植片の拒絶を予防するために、免疫抑制的コンディショニングレジメによってレシピエント患者を治療することは必要でない。それに加えて、従来技術の同種異系細胞治療のＧＶＨ構成要素と違い、ミラー効果のＨＶＧ構成要素は、非毒性の免疫学的イベントである。従来技術の同種異系細胞治療プロトコールにおいて、ＧＶＨ効果の毒性効果を抑制するために、ＨＬＡのマッチしたドナーを選択することが必要である。ミラー効果のＨＶＧ構成要素は非毒性であるので、本発明において効果を制限する手段としてＨＬＡのマッチしたドナーを使用する必要はない。実際、本発明の実施において、宿主と完全なＨＬＡの不一致を有する同種異系ドナーを使用することが好ましい。ＨＬＡの不一致が大きいほど、宿主免疫反応の刺激が強い。
【００５１】
従来技術の同種異系細胞治療プロトコールにおいて、有用なＧＶＴ効果および有害なＧＶＨ効果は、密接にそして比例して関係している。これら従来技術の同種異系細胞治療プロトコールにおいてＧＶＴ効果の程度を制限するよう作用する少なくとも２つの力が存在するが、それはミラー効果の抗腫瘍ＨＶＴ構成要素を制限するために存在しない。これらの因子は：（１）定着およびキメラ化を可能にする、ドナー細胞に対する宿主寛容性の発達；および（２）免疫抑制薬剤によるＧＶＨ予防。
【００５２】
宿主寛容は、宿主免疫系が移植片細胞に対して反応しなくなり、そして移植片細胞が宿主細胞に対して反応しなくなる免疫メカニズムである。寛容のメカニズムは、ＧＶＴ効果の望ましくない抑制を引き起こす、免疫抑制メカニズムと相関する。ＧＶＨ病の程度を抑制するために、従来技術の同種異系細胞治療プロトコールにおいてはＧＶＨ予防が必要である。ＧＶＴおよびＧＶＨ間の比例関係のために、予防によるＧＶＨ構成要素の制限は、ＧＶＴ構成要素を比例して制限する。
【００５３】
ミラー効果において、ＨＶＴおよびＨＶＧ構成要素もまた密接におよび比例して関連している。ＨＶＴ構成要素は、ＧＶＴ効果より強力な抗腫瘍効果を提供する。これは、ＨＶＧ効果は、拒絶反応の程度を制限するために免疫抑制治療を必要としないからである。この方法において、ＧＶＨ効果と違い、ＨＶＧ効果はその自然な結果（完全な拒絶）に至ることを許され得る。ＨＶＧ効果の抗腫瘍ＨＶＴ効果との比例的性質は、拒絶反応と同時に、および比例して起こるより強力な抗腫瘍構成要素を生ずる。従って、完全にミスマッチの同種異系細胞を使用することによって、拒絶反応が制限ではなくむしろ増強されることが好ましい。ＧＶＴ効果と違い、ＨＶＴ効果は寛容誘発の制限環境で起こるのではないため、増強されたＨＶＴ抗腫瘍効果も起こる。本発明において、免疫抑制的寛容効果よりも、強力なＴｈ１による同種異系拒絶反応が媒介される。このＴｈ１同種異系拒絶反応は、ＨＶＴ効果を維持および増幅するのを助ける、傍観者効果を有する。
【００５４】
よって、本発明の同種異系細胞治療は、従来技術の方法に対して、悪性腫瘍の治療のために有意な利点を提供する：（１）ＧＶＴ効果と比較して増強された抗腫瘍効果（ＨＶＴ）；（２）致死的な毒性なしに潜在的に治癒力のある抗腫瘍効果；（３）マッチしたドナーの必要性の排除；（４）治療前の免疫抑制コンディショニングの必要性の排除；および（５）以前の同種異系ＢＭＴ（ＤＬＩプロトコールにおいて必要であるような）の必要性の排除。
【００５５】
（エキソビボ操作の必要条件）
同種異系細胞集団がミラー効果を誘発するために、その集団はＴ細胞を含まなければならない。有効であるために、同種異系Ｔ細胞を、活性化を引き起こす方法で、エキソビボで操作しなければならない。Ｔ細胞は特定の抗原で活性化される必要はないが、好ましくはポリクローナルに活性化される。好ましくは、活性化Ｔ細胞は少なくとも４世代増殖し、そして分化してエフェクター機能を得る。エフェクター機能を発現するＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、およびＴＮＦ−アルファを含む１型サイトカインを産生し、ＣＤ２５およびＨＬＡ−ＤＲのような活性化マーカーを発現し、そしてＴＲＡＩＬ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０Ｌ、およびＦａｓＬのようなＴＮＦスーパーファミリー分子のようなエフェクター分子を発現する。別の好ましい実施態様において、エキソビボで活性化された同種異系Ｔ細胞は、さらにＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌｌｏを発現する記憶細胞へ分化する。
【００５６】
Ｔ細胞は一般的に、活性化されるために２つのシグナルを必要とする。活性化に必要な最初のシグナルは、ＣＤ３複合体と会合し、そして抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＣＤ８＋Ｔ細胞）およびクラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）タンパク質によって提示されたペプチドに結合する、マルチサブユニット免疫認識受容体であるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の刺激によって起こる。最初のシグナルを、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂによって与え得る。２番目のシグナルは、典型的には補助刺激分子によって伝達される。主な補助刺激シグナルは、活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＢ７ファミリーリガンドＣＤ８０またはＣＤ８６のメンバーが、Ｔ細胞上のＣＤ２８に結合する時に起こる。２番目のシグナルを、可溶性または固定化抗ＣＤ２８ｍＡｂによって与え得る。本明細書中における目的のために、１ｍｌあたり１０６細胞より少ない細胞密度で、そして抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化されたＴ細胞を「標準条件」と呼ぶ。
【００５７】
本発明において、Ｔ細胞は、注入前に「増強された活性化」の状態に入り、そして維持するべきである。本発明の目的のために、「増強された活性化」は、増強された増殖特徴（すなわち、標準条件下で活性化された集団よりも高い増殖）を引き起こし、そして最終的に分化して、標準条件下で活性化されたＴ細胞と比較した場合に、増強されたサイトカイン産生および増強されたエフェクター分子の発現を含む、増強されたエフェクター機能を発揮する方法で活性化されたＴ細胞を意味する。
【００５８】
好ましい実施態様において、増強された活性化特徴を有する同種異系Ｔ細胞の集団を、以下のものを含む処理によって産生する：（１）白血球除去血輸血による単核細胞の採取；（２）単核細胞からのＣＤ４＋細胞の精製；（３）ＣＤ４細胞の架橋抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂとの接触；（４）少なくとも６日間、ＣＤ４細胞上の架橋ＣＤ３／ＣＤ２８ｍＡｂとの連続的な接触の維持；（５）同じ最低６日間以上増強された細胞対細胞の接触の維持；および（６）架橋ＣＤ３／ＣＤ２８ｍＡｂとの連続的な接触を維持しながら、増殖およびサイトカイン産生のピークにおけるＣＤ４細胞の処方および次いで注入。
【００５９】
従来技術の同種異系細胞治療は、一般的に未操作の同種異系細胞の、化学療法および／または照射コンディショニングレジメによって免疫系が抑制された宿主への注入を含む。これらの従来技術の手順は、同種異系細胞の定着を引き起こし、それが今度はＧＶＴ／ＧＶＨ効果を媒介する。この環境における移植細胞のエキソビボ操作は、ＧＶＴ効果を増加させ得るが、毒性のＧＶＨ効果の悪化も引き起こす。未操作同種異系細胞の、自然免疫系を有する宿主への注入は、いかなる抗腫瘍効果もなしに、単に同種異系細胞の拒絶を引き起こすのみである（ＨＶＧ）。従って、同種異系移植細胞の操作は、ミラー効果を誘発するために必要な実施態様である。
【００６０】
本発明は、有効、適切および標的化適応免疫反応の開始における自然免疫系の重要な役割、および自然免疫および適応免疫の橋渡しにおいて有する１型サイトカインの役割を含む、従来技術の同種異系細胞治療プロトコールにおけるＧＶＴ効果の公知のメカニズムを利用するよう設計される。本発明の方法は、（移植片中よりも）宿主中におけるＧＶＴ効果を媒介する公知のメカニズムを反映するよう設計される。
【００６１】
腫瘍を有する患者は、腫瘍に対して保護できなかった免疫反応を有する。これは、腫瘍に対する２型免疫反応の最初のインプリンティングおよび／または腫瘍免疫回避（ｉｍｍｕｎｏａｖｏｉｄａｎｃｅ）メカニズムのためを含む、多くの理由により得る。従来技術の同種異系細胞治療プロトコールのＧＶＴ効果は、いくつかの環境においてこれらの制限を克服し得る。これらの制限を克服するための解答は、コンディショニングレジメにより起こる腫瘍抗原の新規分断の状況における、炎症性１型サイトカインストーム（下記でより詳細に記載する）の刺激、および移植片における自然免疫の構成要素の活性化および続く腫瘍に対する新規の移植片による１型適応免疫反応のインプリンティングである。
【００６２】
本発明は、移植片よりも宿主において、これらのメカニズムを誘発するよう設計される。よって、本発明の同種異系細胞は、１型サイトカインストーム、腫瘍抗原の新規分断、腫瘍に対する宿主１型適応免疫反応を引き起こす宿主自然免疫の構成要素の活性化を誘発するよう設計される。
【００６３】
自然免疫系の主な細胞構成要素は、マクロファージ、ＮＫ細胞、好中球、ガンマ−デルタＴ細胞、アルファ−ベータ中間Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞から成る。腫瘍に対する宿主自然免疫反応の活性化は、腫瘍の死滅、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の流入領域リンパ節への分断、ＴＡＡのナイーブＴ細胞への増強された提示を引き起こし、そして続く１型適応免疫反応の広がりに指示的な役割も果たす。
【００６４】
適応免疫反応の構成要素は、協力して腫瘍を特異的に除去する。適応免疫反応は、その腫瘍に対する特異性および自己および非自己間を区別する能力によって特徴付けられる。適応抗腫瘍免疫反応の主な細胞構成要素は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞から成る。活性化樹状細胞、プラズマ細胞様の樹状細胞、およびマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＴＡＡを適応免疫系の構成要素に提示することによって、自然免疫部分および適応免疫部分間の橋渡しをするよう作用する。
【００６５】
ミラー効果の利点を全て誘発するために、同種異系細胞注入を、細胞が注入時に免疫学的メカニズムのカスケードを誘発し得るように、エキソビボで操作しなければならない。同種異系細胞が誘発すべき最初のメカニズムは、モノカインおよびリンホカイン両方から成る、１型サイトカインストームである。このサイトカインストームの存在下で、以下のメカニズムも誘発される：（１）樹状細胞の活性化；（２）ＴＡＡの分断；および（３）１型適応免疫反応の発達。
【００６６】
（１型サイトカインストーム）
２つのヘルパー（ＣＤ４）Ｔ細胞のサブセット、Ｔｈ１およびＴｈ２が定義され、それらは別々の、そして相互に排他的なサイトカイン産生のパターンによって特徴付けられる。Ｔｈ１細胞はＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファを産生し、そして炎症性の、細胞による免疫反応の誘発の原因であり、それは腫瘍、細胞内細菌、およびウイルス感染に対して保護性である。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を産生し、そして体液性免疫反応を増強し、それは一般的に特定の細胞外細菌および寄生虫感染に対して有効である。
【００６７】
ＣＤ８Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞を含む、他の型の免疫細胞が、区別できるサイトカイン極性を示すことも発見された。従って、典型的な免疫反応は、エフェクター細胞およびサイトカインの複雑な混合物を有する。サイトカインは、あらゆる免疫反応の重要な構成要素であり、そして腫瘍または病原体に対する反応におけるサイトカインのバランスが、通常生成される免疫反応の型を決定する。生成される免疫反応の型が、腫瘍または病原体が、根絶されるか、または存続を許されるかを決定する。
【００６８】
免疫反応の分類を助けるために、支配的なサイトカインプロファイルに依存して、「１型」または「２型」としてそれらを特徴付け得る。１型反応は、炎症性サイトカインによって支配され、そして２型反応は、細胞性免疫を抑制するサイトカインによって支配される。サイトカインは、１型または２型免疫反応に特徴的であるとして分類されてきた。サイトカインはその細胞性免疫を維持し、そして体液性免疫を抑制する（１型）、または体液性免疫を維持し、そして細胞性免疫を抑制する（２型）能力に対応して、１型または２型として機能的に定義される。１型サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−アルファ、およびＩＦＮ−ベータを含む。２型サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＴＧＦ−ベータを含む（ＢｅｌａｒｄｅｌｌｉおよびＦｅｒｒａｎｔｉｎｉ  ２００２）。腫瘍の場合、１型免疫反応が、保護的免疫のために決定的である（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｎａｋｕｉら  ２０００）。
【００６９】
従来技術のＧＶＴおよびＧＶＨ効果の共通メカニズムは、１型サイトカインの「サイトカインストーム」である（Ｆｏｗｌｅｒ、Ｂｒｅｇｌｉｏら  １９９６；Ｄａｓ、Ｉｍｏｔｏら  ２００１）；（Ｃａｒａｙｏｌ、Ｂｏｕｒｈｉｓら  １９９７；Ｔａｎａｋａ、Ｉｍａｍｕｒａら  １９９７；Ｂｌａｚａｒ、Ｔａｙｌｏｒら  １９９８；Ｆｌａｎａｇａｎ、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら  １９９９；ＦｏｗｌｅｒおよびＧｒｅｓｓ  ２０００）。１型サイトカインストームは、ドナーリンパ球集団における自然免疫反応および適応免疫反応両方の構成要素を活性化する（ＡｎｔｉｎおよびＦｅｒｒａｒａ  １９９２；Ｂｌａｚａｒ、Ｋｏｒｎｇｏｌｄら  １９９７；Ｔａｎａｋａ、Ｉｍａｍｕｒａら  １９９７）。本発明において、同種異系細胞の注入を、同じ１型サイトカインストームを誘発するよう設計する。しかし、サイトカインストームが、ドナーリンパ球集団よりも、宿主リンパ球集団の自然免疫反応および適応免疫反応の構成要素を活性化するよう本発明を設計する。宿主の構成要素のみが活性化されることを保証するために、宿主が免疫応答性であり、そして注入される同種異系細胞集団が自然免疫細胞を欠き、そしてＴ細胞が濃縮されている、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞が濃縮されていることが好ましい。
【００７０】
好ましい実施態様において、注入される同種異系Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、およびＩＦＮ−ガンマを含む大量の１型サイトカインを産生し、そしてＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはＴＧＦ−ベータは産生しない。注入された細胞は、注入時および患者の血液を循環中に、１つまたはそれ以上の１型サイトカインを産生する。同種異系Ｔ細胞が注入時および循環中に１型サイトカインを産生することを保証するために、Ｔ細胞は注入時に活性化しており、そして循環中に活性化状態を維持するべきである。
【００７１】
Ｔ細胞が活性化していることを保証するために、活性化シグナルを伝達する薬剤と共にそれらを処方するべきである。例えば、Ｔ細胞を最初に、マウス抗ヒトＣＤ３およびマウス抗ヒトＣＤ２８ｍＡｂのような活性化薬剤と接触させ得る。Ｔ細胞の表面上のｍＡｂを次いで架橋して、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達し得る。好ましい実施態様において、架橋を、処方媒体中にコートされた生物分解性マイクロスフィアまたはナノスフィアを含むことによって達成する。生物分解性スフィアを、Ｔ細胞上の活性化薬剤と反応し、それらを架橋させ、そして活性化シグナルを伝達する薬剤でコートする。マウスｍＡｂと使用するために適当なコーティング薬剤は、ポリクローナル抗マウス抗体またはモノクローナル抗ＦｃｍＡｂを含む。
【００７２】
本発明の方法は、充分な量の活性化同種異系Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を、宿主に導入して、宿主単核細胞を刺激して１型サイトカイン、特にＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−アルファ、およびＩＦＮ−ガンマを産生させ、そしてＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＴＧＦ−ベータの宿主細胞からの有意な産生を誘発しないことを含む。
【００７３】
１型サイトカインストームの産生は、抗腫瘍免疫において、最初の自然免疫活性化および続く適応免疫反応の間の連結において重要であることが公知である（ＢｅｌａｒｄｅｌｌｉおよびＦｅｒｒａｎｔｉｎｉ  ２００２；ＫａｄｏｗａｋｉおよびＬｉｕ  ２００２；ＬｅＢｏｎおよびＴｏｕｇｈ  ２００２）。
【００７４】
（樹状細胞の活性化）
自然免疫と適応免疫をつなぐ重要な細胞型は、樹状細胞（ＤＣ）である。従って、同種異系ミラー効果の完全な有効性を誘発するために、同種異系細胞注入が宿主ＤＣ細胞を活性化することが重要である。本発明の方法は、宿主ＤＣの活性化および成熟を刺激するために、十分な量の活性化同種異系Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を、宿主に導入することを含む。
【００７５】
活性化後、ＤＣは成熟過程を経て、そこでそれらは自然免疫および次いで適応免疫反応の開始および調節に決定的な、サイトカインおよび細胞表面分子を発現する（Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ、Ｍｅｓｓｉら  ２０００；Ｇｒａｎｕｃｃｉ、Ｖｉｚｚａｒｄｅｌｌｉら  ２００１）。特に、ＴＮＦ−アルファ、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、ＩＬ−１２、およびＳＬＡＭのような炎症性１型サイトカインが、活性化後に強力にアップレギュレートされる。ＩＬ−１２は、活性化後に単球由来のＤＣによって産生される。活性化されたＩＬ−１２産生ＤＣは、次いで１型免疫反応を刺激し得る（Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ、Ｍｅｓｓｉら  ２０００）。
【００７６】
本発明の処理によって調製された同種異系Ｔ細胞は、細胞表面にＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）を発現する。これらのＣＤ４０Ｌ発現Ｔ細胞は、宿主ＤＣを活性化する。ＣＤ４０のＤＣへの連結は、補助刺激／アクセサリー分子（ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ５８、ＣＤ８０／ＣＤ８６）の発現をアップレギュレートし、それはＤＣによる抗原提示を増強する。この相互作用は、今度はそのＩＬ−２受容体発現をアップレギュレートすることによって、ＣＤ４０Ｌ＋ヘルパー（ＣＤ４）および細胞毒性（ＣＤ８）Ｔ細胞を「刺激」することが公知であり、そしてクラスＩＩおよびクラスＩ両方に依存性の腫瘍反応性Ｔ細胞プールの拡大を引き起こすことも公知である。
【００７７】
（腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の分断）
流入領域リンパ節へのＴＡＡの分断、およびこれら抗原の活性化ＤＣによる提示が、適応免疫反応を刺激する。ＴＡＡの分断は、免疫エフェクター細胞による腫瘍細胞の死滅によって起こる。本発明において、ＴＡＡの分断を引き起こす腫瘍の死滅は、直接的および間接的両方のメカニズムによって媒介される。腫瘍死滅の直接的メカニズムは、腫瘍細胞の、ＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬのような注入同種異系細胞および／または活性化宿主Ｔ細胞の表面分子との相互作用によって媒介され、それは腫瘍細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）を刺激する。間接的メカニズムは、ＮＫ細胞および食細胞マクロファージのような、宿主自然免疫エフェクター細胞の活性化を含む。
【００７８】
本発明の方法は、ＮＫ細胞のような自然免疫系の要素による腫瘍溶解を刺激するために、十分な量の活性化同種異系Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を、宿主へ導入することを含む。本発明のさらなる方法は、十分な量の活性化同種異系Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を、宿主に導入することを含み、それがＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬのようなＴＮＦＲエフェクター分子の発現によって腫瘍のアポトーシスを媒介する。本発明のさらなる方法は、十分な量の活性化同種異系Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を、宿主に導入することを含み、それは宿主Ｔ細胞の活性化を引き起こし、ここでそのような活性化された宿主Ｔ細胞は、ＦａｓＬおよび／またはＴＲＡＩＬのようなＴＮＦＲリガンドを発現し、そして腫瘍細胞のアポトーシスを媒介する。
【００７９】
新規のＴＡＡの分断は、腫瘍の増殖を許すもの（２型）から腫瘍を死滅させそしてそれに対して保護するもの（１型）への、適応免疫反応のリプログラミングを可能にするので、ＧＶＴ効果の重要な構成要素である。移植片中のＮＫ細胞が、新規ＴＡＡ分断を媒介し得るＧＶＴ反応における主要なエフェクター細胞を構成する（Ｖｏｕｔｓａｄａｋｉｓ  ２００３）。
【００８０】
同様に、宿主ＮＫ細胞の活性化は、ミラー効果のＨＶＴ構成要素の重要な部分である。本発明の活性化同種異系Ｔ細胞に対する宿主の反応により起こる１型サイトカインストームは、宿主ＮＫ細胞を活性化し、そしてその細胞毒性能力を強力にアップレギュレートし得る。
【００８１】
活性化宿主ＮＫ細胞は、正常細胞を残しながら、広く多様な腫瘍細胞を自然に死滅させる能力を有する（Ｓｍｙｔｈ、Ｈａｙａｋａｗａら  ２００２）。重要なことに、ＮＫ細胞は、最初に抗原提示細胞による教育を必要とするＴ細胞と比較して、免疫または前活性化の必要がなく、潜在的な標的細胞を認識する。さらに、ＮＫ細胞は、主な腫瘍の免疫回避メカニズムであるＭＨＣ  Ｉ分子のダウンレギュレーションによってＴ細胞死滅を回避し得る腫瘍を認識し得る。
【００８２】
従って、本発明の方法は、宿主ＮＫ細胞の活性化および細胞毒性活性のアップレギュレーションによって、ＴＡＡの分断を引き起こす。本発明の方法によってＴＡＡの分断を誘発する別のメカニズムは、腫瘍においてアポトーシスを誘発することである。腫瘍においてアポトーシスを誘発する１つのメカニズムは、Ｆａｓ（ＣＤ９５）と呼ばれる細胞死受容体を介したシグナル伝達による。ＦａｓのそのＦａｓリガンド（ＦａｓＬ／ＣＤ１５４）との結合は、プログラム細胞死（アポトーシス）を誘発する。別のメカニズムは、その対の受容体ＴＲＡＩＬ−ＲによるＴＲＡＩＬリガンドを介したシグナル伝達による。本発明の方法によって産生された同種異系Ｔ細胞は、高レベルのＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬを発現する。しかし、多くの腫瘍は、腫瘍進行の過程でＦａｓの発現を失い、そして多くの腫瘍はまたアポトーシスに対する防御としてＦａｓＬを発現する。結腸、肺、乳房、皮膚、腎臓および脳腫瘍を代表する腫瘍細胞系統の約８０％が、ＴＲＡＩＬ誘発アポトーシスに対して感受性である。
【００８３】
本発明の方法によって誘発される１型サイトカインストームは、腫瘍細胞におけるＦａｓの発現をアップレギュレートし、それらを注入同種異系Ｔ細胞によるＦａｓＬが媒介するアポトーシスに感受性にし、そしてＦａｓＬ発現腫瘍細胞におけるＦａｓのアップレギュレーションによって引き起こされる、他の腫瘍細胞に対する同胞殺し型反応（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ  ｔｙｐｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に感受性にする。それに加えて、同じサイトカインストームが、宿主Ｔ細胞を活性化してＦａｓＬを発現させ、それは次いで腫瘍細胞のアポトーシスを媒介し得る。同じ１型サイトカインストームがまた、腫瘍細胞におけるＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩ、および補助刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をアップレギュレートし、腫瘍を続く適応免疫反応においてＣＴＬが媒介する死滅に感受性にする。
【００８４】
（１型適応免疫反応）
本発明の方法は、宿主ＤＣの活性化および１型サイトカインストームの状況におけるＴＡＡの新規分断を誘発する。これらは、腫瘍に対する宿主の１型適応免疫反応の新規発達に必要な条件である。
【００８５】
本発明の方法は、宿主腫瘍に対して向けられた宿主１型適応免疫反応を刺激するために、十分な量の活性化同種異系Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を、宿主に導入することを含む。このメカニズムは、腫瘍ワクチンに類似しており、ここで抗原はインサイチュの腫瘍死滅によって分断され、そして１型サイトカインストームが続く適応免疫反応の発達のアジュバントとして作用する。宿主におけるＴＡＡの分断および本発明のワクチン効果を、不活性化同種異系または自己腫瘍、特異的ＴＡＡペプチド、ＴＡＡをコードするＤＮＡまたはＴＡＡを発現するよう遺伝的に操作した細胞のような、ＴＡＡを含む薬剤の混注によって増強し得る。
【００８６】
ある癌患者は、腫瘍に対する１型適応免疫反応を生じ、それは保護に失敗する。これは、ある進行腫瘍の単核細胞浸潤物におけるＴｈ１細胞の検出によって知られる。従って、１型適応免疫反応の発生のみでは、治療効果を有するために不十分であり得る。１型適応免疫反応が保護に失敗する１つの理由は、強力な腫瘍による免疫回避メカニズムのためである。
【００８７】
腫瘍の免疫回避の１つの方法は、腫瘍由来の抑制的サイトカイン産生による。悪性腫瘍によるＴＧＦ−ベータ１産生は、腫瘍の進行に不可欠であり、そして腫瘍によって分泌される最も重要な免疫抑制サイトカインの１つである。別の免疫抑制的腫瘍由来サイトカインはＩＬ−１０である。ＴＧＦ−ベータ１およびＩＬ−１０は、様々な腫瘍型由来の組織標本において検出されている。ＴＧＦ−ベータ１およびＩＬ−１０は、細胞性免疫機能の強力な阻害剤であり、それは腫瘍が免疫監視およびＣＴＬによる破壊から逃れることを可能にする。
【００８８】
本発明の方法によって産生される１型サイトカインストームは、腫瘍細胞のＴＧＦ−ベータ１およびＩＬ−１０産生のダウンレギュレーションを引き起こす。従って、本発明のさらなる方法は、腫瘍のＴＧＦ−ベータ１およびＩＬ−１０のような免疫抑制サイトカインの産生をダウンレギュレートするために、十分な量の活性化同種異系Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を宿主に導入することを含む。
【００８９】
他に規定されなければ、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で記載されたものと同様なまたは等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用し得るが、適当な方法および材料を下記で記載する。本明細書中で言及された全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。対立する場合、定義を含む特許明細書が統制する。それに加えて、材料、方法および実施例は実例となるだけであり、そして制限することを意図しない。本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明より明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
（特定の実施態様の説明）
本発明のミラー効果メカニズムを刺激するために、増強された性質を有する同種異系細胞を産生する好ましい方法は、以下のものを含む：（１）正常なスクリーニングされたドナーから、白血球除去血輸血によって単核細胞原材料を採取する；（２）原材料からＣＤ４Ｔ細胞を単離する；（３）ＣＤ４＋細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で標識する；（４）標識したＣＤ４＋細胞を、ＣＤ４＋細胞上のｍＡｂを架橋し得る薬剤でコートした生物分解性マイクロスフィアまたはナノスフィアと混合する；（５）遠心分離によって生物分解性スフィアおよび標識ＣＤ４＋細胞を濃縮する；（６）混合物を、１０６細胞／ｍｌを超える細胞密度で、外来性のサイトカインなしに、血清を含まない培地で培養する；（７）インキュベーター中で２日間妨害せずに細胞を培養する；（８）さらなる標識薬剤およびコートした生物分解性スフィアを加える；（９）新しい培養混合物を遠心分離し、続いて細胞を含まない培養液体積の５０−９０％を除去する；（１０）透析フィルターを通して細胞を含まない馴化培養液の９０％を透過させる；（１１）残る１０％の馴化培養液を新しい培養液でもとの体積に戻し、そしてこの補充した馴化培養液を細胞混合物に戻し加える；（１２）工程８から１１を少なくとも毎日、少なくとも６日間の全体培養期間で繰り返す。
【００９１】
（工程１）
本明細書中で提供される好ましい方法の実施において、単核細胞の開始集団（原材料）を、ドナーから、好ましくは白血球除去血輸血手順によって採取する。原材料を提供するためにリクルートされたドナーは、健康であり、そして外来性の病原体からフリーでなければならない。ドナーは、好ましくは意図されるレシピエントに対して完全にミスマッチのＨＬＡを有する。望ましくはないが、部分的にＨＬＡのマッチしたドナー（意図されるレシピエントの同胞のような）からの原材料も、本発明の方法において使用し得る。部分的にマッチした原材料は、レシピエントの免疫系が非常に弱体化しており、ミスマッチドナーの細胞の注入がＧＶＨ病反応を引き起こし得る場合にのみ使用する必要がある。免疫系が弱体化した個人の場合でさえ、依然としてミスマッチ細胞を使用することが好ましい。これらの患者においてＧＶＨ病の危険性を最小限にするために、ミスマッチドナー細胞の投与量を抑制し得るか、またはミスマッチ細胞を注入の直前に照射し得る。
【００９２】
一般的に、ドナーを注意深くスクリーニングするべきであり、そしてドナーが輸血のために血液を提供する資格を得るような、外来性病原体に関する試験を行う。外来性病原体に関するそのような試験の例は、最低でも、抗ＨＩＶ−１、抗ＨＩＶ−２、抗ＨＣＶ（Ｃ型肝炎）、抗ＨＴＬＶ−１、および抗ＨＴＬＶ−２抗体、ＨｂｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）、および梅毒（ＲＰＲ）に関するスクリーニングを含むべきである。関連する実施態様において、ＣＭＶ、および／またはマラリアおよび／またはＧ型肝炎に関してさらにスクリーニングすることも好ましい。外来性病原体に関して試験が陽性である、いかなるドナー由来の血液も、原材料として使用すべきでない。
【００９３】
ドナーは、一般的に、許容される場合、８−１２リットルの白血球除去血輸血の手順を受ける。ドナーは、移動性を有する必要はない。原材料を、後の日に処理するために、採取後低温保存し得るが、好ましくはすぐにまたは採取から２４時間以内に材料を処理する。採取された白血球除去血輸血原材料を、最初に洗浄して血漿タンパク質、抗凝固剤を除去し、そして血小板の数を減らすことによって処理すべきである。適当な洗浄媒体は、１−５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加したＰＢＳ（カルシウムまたはマグネシウムなしで）を含む。洗浄工程を、細胞を遠心分離し、そして上清液を除去することによって行い得、それを次いでＰＢＳで置換する。その処理は、半自動化「貫流（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）」遠心分離（ＣＯＢＥ  ２９９１  Ｓｙｓｔｅｍ、ＢａｘｔｅｒまたはＣｙｔｏＭａｔｅ、Ｂａｘｔｅｒ）を用いて最も良く達成し得る。細胞を、処理する際に閉鎖系で維持する。洗浄を、必要な場合に３回まで反復し得る。洗浄の後、ＷＢＣの回収は、８５％より多く、そして血小板の回収は４０％より少なくあるべきである。
【００９４】
（工程２）
洗浄した原材料を、次に処理して純粋なＣＤ４＋細胞の集団をポジティブ選択する。ポジティブ選択は公知の最終産物を生じ、そしてより少ない試薬を必要とするので、ポジティブ選択がネガティブ選択技術より好ましい。ポジティブ選択の好ましい方法は、Ｄｙｎａｌ（Ｎｏｒｗａｙ）またはＭｉｌｔｅｎｙｉ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能な免疫磁気技術の使用である。原材料からＣＤ４＋細胞をポジティブ選択する１つの好ましい方法は、磁気微粒子およびＭｉｌｔｅｎｙｉ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって製造されたＣｌｉｎｉＭＡＣＳ細胞分離装置の使用である。細胞を最初に抗ＣＤ４−ビオチンでコートしたモノクローナル抗体で標識し、そして次いで抗ビオチン磁気粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉによって供給され、そして製造会社の指示に従って使用する）でタグ化する。標識細胞の溶液を、次いでＣＤ４細胞の保持のために磁気フィルターを通す。
【００９５】
閉鎖、滅菌操作を維持するために、ＣＤ４ポジティブ選択の調製における細胞の標識を、ＣｙｔｏＭａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈｅｒシステム（Ｂａｘｔｅｒ）によって行い得る。この処理を、ＣｙｔｏＭａｔｅ装置上で、閉鎖滅菌使い捨てキット中で行う。ついでＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒが、閉鎖滅菌使い捨てキットおよびプログラムおよび試薬の組み合わせを使用して、マイクロビーズでタグ化された細胞に対して免疫磁気ポジティブ選択を行うことによって、ＣＤ４＋細胞の濃縮集団を得る。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳは、最大で６×１０１０の全ＷＢＣ、および５×１０９の標識（ＣＤ４＋）細胞を処理し得る。白血球除去血輸血プロトコールは通常、約１０１０の単核細胞の採取を引き起こし、それから約１０８の精製ＣＤ４細胞が通常採取される。
【００９６】
この手順の間可能ならどこでも、Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｅｒｕｍｏ）を使用してバッグ間の滅菌接続を行い、そして滅菌閉鎖系を維持する。ＳＣＤの使用が不可能な場合、Ｌａｍｉｎａｒ  Ｆｌｏｗ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｃａｂｉｎｅｔにおいて厳格な無菌条件下で接続を行う。
【００９７】
ＣＤ４＋細胞のポジティブ選択において、混入ＣＤ８＋細胞は本発明の処理における次の工程においてＣＤ４＋細胞より早く増加し得るので、原材料からＣＤ８＋細胞を除去することが最も重要である。ＣＤ４＋細胞ポジティブ選択の後のマクロファージの混入は普通である。これは、いくつかのマクロファージ集団はＣＤ４分子を発現するという事実のためであり得る。しかし、マクロファージは処理の次の工程において消え、そして通常重大な問題ではない。同様に、Ｂ細胞も続く処理工程を生き延びない。まれな例において、マクロファージの混入がＣＤ４＋細胞の溶解またはＣＤ４＋細胞増殖の阻害を引き起こす。これらの場合において、ＣＤ４＋細胞選択前のマクロファージ抑制工程を示し得る。マクロファージ抑制を、プラスチック上でのプレインキュベーション、ナイロンウールカラムの通過または磁気ビーズの摂取および続く磁場における除去によるものを含む、当該分野で認識される様々な方法によって達成し得る。
【００９８】
精製ＣＤ４細胞は、ほとんどＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２ＬＨｉの表現型を有するナイーブ細胞である。ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏの表現型を有する記憶細胞の４０％までの混入は、処理に影響を与えない。しかし、もし処理におけるこの工程において記憶細胞が４０％を超えると、これは通常ドナーが正常でなく、そして従ってそのバッチは拒絶すべきであり、そして注入のための細胞を発達させるために使用すべきでないことを示す。精製ＣＤ４細胞を、２４時間まで室温で保存し得る。
【００９９】
（工程３）
処理の次の工程は、精製ＣＤ４＋細胞のエキソビボ培養である。ＣＤ４細胞を、少なくとも６日間、持続性および一定の活性化刺激にさらすことが好ましい。細胞を活性化するために、好ましくは最初に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂのような活性化薬剤で標識し、そして活性化薬剤を次いで架橋して活性化シグナルをＣＤ４細胞に伝達する。細胞を標識するために、細胞を最初に、血清を含まない培養液中で１ｍｌあたり１０７細胞の細胞密度に調整する。正常なバッチは、１０ｍｌの培養液中約１０８のＣＤ４細胞を含む。ｍＡｂをそれぞれ、少なくとも１ｍｌあたり１マイクログラム、好ましくは１ｍｌあたり１０マイクログラムの最終濃度で細胞に加える。細胞を室温または好ましくは４℃で、１５分から３０分間回転するか、または端と端を接した混合装置で、ｍＡｂと共にインキュベートするべきである。細胞を次いで洗浄して、過剰なｍＡｂを除去し、そして血清を含まない培養液に１ｍｌあたり１０７細胞で再懸濁するべきである。
【０１００】
（工程４）
好ましい架橋方法は、標識細胞を活性化薬剤と反応性の薬剤でコートした生物分解性ナノスフィアまたはマイクロスフィアと混合することである。例えば、生物分解性スフィアを、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂのＦｃ領域に特異的なｍＡｂでコートし得るか、または活性化薬剤がマウス由来である場合には、コートする薬剤はポリクローナル抗マウス抗体であり得る。標識細胞を、少なくとも１：１、好ましくは最低３：１、および最も好ましくは最低５：１のスフィア対細胞比で、コートされた生物分解性マイクロスフィアと混合する。スフィア／細胞混合物を、室温で、または好ましくは４℃で、１５から３０分間、好ましくは標識細胞とよく混合する。
【０１０１】
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡおよびＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）、またはポリ（カルプロラクトン（ｃａｒｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ））（ＰＣＬ）のような脂肪族ポリエステル、およびポリ無水物が、ナノスフィア／マイクロスフィアの生物分解性ポリマーとして使用するために好ましい材料である。生物分解性の組成物を、７日以内に、より好ましくは３日以内に生理学的な媒体中で分解するよう設計するべきである。
【０１０２】
本発明の好ましい実施態様において、生物分解性のスフィアを、乳酸およびグリコール酸の混合物を含む直線状ポリエステルポリマーから構築する。この種類のポリマーは、ヒト生物学的薬剤調製において使用するために、生体適合性および無害な最終産物への生物分解の必要条件を満たす。以下でＰＬＧＡと呼ぶこれらのポリマーは、エステル加水分解によって乳酸およびグリコール酸へ分解し、それらは体内で二酸化炭素および水に代謝される。ＰＬＧＡは、すぐれた生体適合性を有することが示されている。ＰＬＧＡの無害の性質は、これらのポリマーに基づくいくつかの非経口徐放性製剤の、米国食品医薬品局を含む、規制当局による認可によって例示され得る。
【０１０３】
Ｌ−乳酸が主な構成要素である場合の半晶質と反対に、ＤＬ−乳酸が主な構成要素である場合には不定形であるので、ＤＬ−乳酸およびグリコライドのコポリマーが、Ｌ−乳酸およびグリコライドよりも好ましい。この性質は、ポリマーの分解時間を減少させる。ポリマーの固有粘性（「Ｉ．Ｖ．」と省略される；単位はデシリットル／グラム）が、その分子量の基準である。好ましくは、ポリマーの固有粘性は、約０．１０ｄＬ／ｇから約１．０ｄＬ／ｇ（クロロホルム中で測定した場合）、より好ましくは約０．１０ｄＬ／ｇから約０．５ｄＬ／ｇ、そして最も好ましくは０．１０から０．３０ｄＬ／ｇである。
【０１０４】
適当な生物分解性ポリマー材料は、ポリ（ＤＬ−ラクチド  コ−グリコライド）の５０／５０の混合物である。ポリマーを、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）のような市販の供給業者から、Ｌａｃｔｅｌ（登録商標）の商品名で購入し得る。０．１５から０．２５ｄｌ／ｇの固有粘性を有する５０／５０ＤＬ−ＰＬＧ製品番号５０ＤＧ０２０が、本発明において使用するために好ましい材料である。別の好ましい材料は、Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ５０３の商品名でＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって製造される、０．３２から０．４４ｄｌ／ｇの固有粘性を有する５０／５０ＤＬ−ＰＬＧである。別の好ましい材料は、０．２６から０．５４の固有粘性を有する、Ｌａｃｔｅｌ（登録商標）５０／５０ＤＬ−ＰＬＧ製品番号５０Ｄ０４０（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）である。
【０１０５】
マイクロスフィアまたはナノスフィアを、溶媒の蒸発、相分離、スプレー乾燥、または低温での溶媒抽出を含む、様々な公知の方法によって調製し得る。選択される処理は、単純、再現性があり、そして大規模に実現可能であるべきである。できたマイクロスフィアは、均一な注射可能な懸濁液を産生するために、よどみなく流れ、そして凝固してはならない。マイクロスフィアはまた、滅菌でなければならない。これを、最終的な滅菌工程および／または無菌処理によって保証し得る。
【０１０６】
好ましい実施態様において、スフィアを産生するために溶媒蒸発法を利用する。この方法によってマイクロスフィアまたはナノスフィアを産生するために、疎水性の５０／５０ＤＬ−ＰＬＧポリマーを水と混合することのできない有機溶媒に溶解して、ポリマー溶液を与える。その溶液を次いで界面活性剤の水性溶液に加え、エマルションシステムを形成しそして攪拌する。攪拌スピードが速いほど、マイクロスフィアのサイズは小さくなる。続いて減圧下または加熱下であり得る連続的な攪拌によって、溶媒を蒸発させることによってマイクロスフィアを得る。
【０１０７】
水と混合することのできる有機溶媒は、体に対して無毒性である必要がある。有機溶媒の典型的な例は、酢酸、乳酸、蟻酸、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、およびＮ−メチルピロリドンおよびその混合物からなるグループから選択されるメンバーである。好ましくは、水と混合することのできる有機溶媒は、酢酸、乳酸、Ｎ−メチルピロリドン、またはその混合物からなるグループから選択されるメンバーである。水と混合することのできる有機溶媒を、単独で、または水との混合物において使用し得る。
【０１０８】
水相は、エマルション安定化剤を含み得、それは好ましくは水およびアルコールに可溶性であり、培養液中に溶解した場合に懸濁媒体（水と混合することのできるアルコール）の粘性を増加させ得、そして体に対して無毒性であり、そして環境問題を引き起こさない。エマルション安定化剤溶液の典型的な例は：ポリビニルピロリドン、ポリ（エチレングリコール）、およびポロキサマーのような水溶性合成ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体、および好ましくはポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルセルロースである。水と混合することのできるアルコール中のエマルション安定化剤の含有量は、好ましくは０．１から約５０％（ｗ／ｖ）の範囲内であり、そしてより好ましくは０．２から約２０％（ｗ／ｖ）の範囲内である。エマルション安定化剤の含有量は、必要な水と混合することのできるアルコールの粘性によって変わり得る。
【０１０９】
エマルション安定化剤が溶解している、水と混合することのできるアルコールを、１０から約８０℃の温度で、好ましくは２０から約６０℃、そして最も好ましくは室温で、２００から約２０，０００ｒｐｍのスピードで、好ましくは８００から２０００ｒｐｍのスピードで攪拌する。ポリマー溶液を、エマルション安定化剤が溶解した水と混合することのできるアルコールにゆっくりと加え、そして混合物を５分から約６０分攪拌する。攪拌を５時間まで続け、有機溶媒を蒸発させ得る。できたマイクロスフィアを次いで遠心分離によって回収し、そして徹底的に洗浄し得る。洗浄したマイクロスフィアは次いで、架橋材料との結合の準備ができている。
【０１１０】
調製したマイクロスフィアの直径は、好ましくは０．０１から３００μｍの範囲内、そしてより好ましくは０．１から１００μｍの範囲内、そして最も好ましくは０．１および１０μｍの間であるべきである。粒子サイズ（マイクロスフィアの直径）を、処理中の攪拌スピード、水と混合することのできるアルコールの粘性、およびポリマー溶液の粘性を調節することによってコントロールし得る。
【０１１１】
生物分解性スフィアの、架橋材料による後コーティングを、様々な標準的な方法によって達成し得る。好ましい実施態様において、タンパク質である最初の材料を、標準的な公知の方法による吸着によって生物分解性マイクロスフィアに結合させ得る。タンパク質を生物分解性スフィアに吸着させる好ましい方法は、マイクロスフィアを０．１Ｍのホウ酸緩衝液ｐＨ８．５に懸濁し、２または３回マイクロスフィアを遠心沈殿し、そして再懸濁することである。架橋タンパク質、例えばヤギ抗マウスポリクローナル抗体を次いで１０マイクログラム／ｍｌの濃度でホウ酸緩衝液に懸濁し、そしてマイクロスフィアに１ｍｌあたり２×１０８スフィアの密度で加える。混合物を少なくとも４時間、そして２４時間まで端から端まで混合する。混合を、好ましくは４℃で行う。混合後、マイクロスフィアを回転させ、そして上清を除去し、そしてタンパク質決定のために分析する。コートされたマイクロスフィアを次いで１−５％のウシまたはヒト血清アルブミンおよび／または０．０５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０のようなブロッキング薬剤を含むリン酸緩衝化生理食塩水のような生理学的緩衝液に再懸濁する。
【０１１２】
（工程５）
ＣＤ４細胞への活性化シグナルを増強するために、よく混合した標識細胞／スフィア混合物を、遠心機で５００から８００ｒｐｍ、４℃で２から１０分間遠心沈殿する。その力は、細胞を固く「ペレット」にするほど大きくなく、細胞を濃縮するのにちょうど十分な大きさであるべきである。遠心力が細胞およびスフィアを相互作用させ、架橋およびＣＤ４細胞へのシグナル伝達を増加させ、増強された活性化を与える。細胞を、好ましくはガス透過性バッグの培養容器において回転させる。遠心後、柔軟なバッグ容器のマッサージおよび振動によって細胞を静かに再懸濁させ、そして３７℃で５％二酸化炭素の環境のインキュベーター内に置く。
【０１１３】
（工程６）
ＣＤ４細胞を、エキソビボ培養処理中に、密接な細胞対細胞の接触を保つことも好ましい。密接な細胞対細胞の接触を、細胞を高い細胞密度で、好ましくは１ｍｌあたり１０６細胞またはそれより高い密度で培養することによって達成し得る。細胞対細胞の接触および活性化シグナルの伝達を増強するために、細胞を頻繁な遠心分離にかけることも望ましい。
【０１１４】
コートされた生物分解性スフィアと混合した精製および標識ＣＤ４＋細胞を、最初に１ｍｌあたり１０６細胞の細胞密度で、そして１：１より多い、好ましくは３：１より多い、そして最も好ましくは５：１より多いスフィア対細胞比で、培養液に懸濁するべきである。Ｘ−ＶＩＶＯ１５（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）が、好ましい培養液である。細胞が培養容器に付着しがちであるなら、培養液に１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加し得る。好ましい培養容器は、ＬｉｆｅＣｅｌｌ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｄｅａｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）のような、ガス透過性のプラスチックバッグである。
【０１１５】
（工程７）
培養の最初の２日間、細胞をインキュベーター中で妨害しないでおかなくてはならない。
【０１１６】
（工程８）
３日目に、さらなるマイクロスフィアおよびｍＡｂを培養に加え、そして完全に混合する。１００ｍｌの培養に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂをそれぞれ１００マイクログラム、３−５×１０８のコートした生物分解性マイクロスフィアと共に加える。
【０１１７】
（工程９）
生物分解性スフィアを含む培養中で細胞を高密度に維持することは、培養液の頻繁な交換を必要とする。高い細胞密度は、高率の代謝廃棄物の蓄積および利用可能な栄養素の消費を引き起こす。それに加えて、生物分解性スフィアの加水分解が、培養液のｐＨを酸性にする。しかし、早すぎる培養液の交換は、外来性のサイトカインが利用されない培養に有害であり得る。外来性サイトカインはヒトに注入された場合に毒性であり得、そして培養細胞を生存のために外来性サイトカインの存在に依存性にし得るので、細胞治療プロトコールにおいて使用する細胞を処理する場合に、外来性サイトカインを使用しないことが好ましい。従って、本発明の方法は、細胞処理において透析工程を含む。
【０１１８】
５０−９０％の培養液を除去し、そして培養細胞の活性化状態を増強するために、細胞を含まない上清を除去するのに十分細胞を濃縮するためにｍＡｂおよびスフィアの新しい混合物を、再び工程５におけるように遠心沈殿させる。培養のｐＨを７．０および７．２の間に保つために、この処理をもし必要なら１日に数回反復し得る。
【０１１９】
（工程１０）
除去した培養液の、１０，０００ダルトンまたはそれより小さい孔サイズを有する膜を通した透析は、代謝廃棄物を通過させながら、内因性サイトカインの保持を可能にする。好ましい実施態様において、培養の５０−９０％の培養液を少なくとも毎日除去し、そして除去した培養液の９０％が透析膜を通過する。
【０１２０】
（工程１１）
透析膜を通過した培養液を廃棄し、一方１０％の保持された培養液を、新しい培養液でもとの体積まで戻し、そして次いでＴ細胞／スフィア培養に戻し加える。保持された培養液は、培養液の除去前と同じ濃度で内因性サイトカインを含む。
【０１２１】
（工程１２）
工程８から１１を、少なくとも１日１回、最低３日間（培養において全部で６日）反復する。処理の典型的なバッチの流れにおいて、培養を１００ｍｌの培養液体積中約１０８の精製ＣＤ４細胞で始める（１日目）。記載した方法によって、細胞は６日目から８日目までに約１−５×１０９細胞に増殖する。この細胞数に達した時に、細胞をガス透過性バッグ中で１０００ｍｌの培養液中に再懸濁し得、そして工程８から１１を、さらに３から６日まで少なくとも毎日反復する（培養の９日目から１４日目）。この時間に、培養中の全細胞は約１−５×１０１０細胞に増殖する。
【０１２２】
（回収）
細胞を、培養の６日目以降いつでも、またはそのバッチ培養で少なくとも１０９細胞が入手可能である場合に回収し得る。最大限のサイトカイン産生を保証するために、回収のタイミングは、細胞を最後の工程８−１１サイクルから２４時間後に処方および注入するように起こるべきである。
【０１２３】
本発明の方法によって産生された細胞を、少なくとも１０８細胞、好ましくは少なくとも１０９細胞の複数の１回投与量へアリコートに分け得る。アリコートに分けた細胞の１回投与量を、注入前に保存のために凍結し得る。凍結した１回投与量形式の場合、高い細胞の生存能力を維持するために、準備細胞培養からの馴化培地を添加した凍結保護培地中で凍結させる。凍結した１回投与量を注入の２４時間以内に解凍、活性化および処方する。
【０１２４】
（処方）
回収した細胞を、細胞が注入時および循環中に活性化されたままであることを保証するために、コートされた生物分解性マイクロスフィアで架橋された細胞表面に結合した活性化ｍＡｂと共に処方する。
【０１２５】
ＣＤ４細胞およびマイクロスフィアの混合物を、注入媒体（例えば通常生理食塩水のような等張溶液、５％のデキストロース、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ）、またはＮｏｒｍａｓｏｌ（Ａｂｂｏｔｔ））に懸濁する。いくつかの実施態様において、注入媒体に、０．５％−１０％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加する。
【０１２６】
混合物を、好ましくは注入媒体１ｍｌあたり１×１０７から１×１０８細胞の間の最終Ｔ細胞濃度に調整する。好ましい実施態様において、１０９のＴ細胞を、１００ｍｌの注入媒体中に処方する。処方を次いでシリンジ、プラスチック袋、またはプラスチックボトルのような、１つまたはそれ以上の容器に包装する。
【０１２７】
（注入）
十分な数の処方ＣＤ４細胞を、疾患の症状を改善するために、レシピエントに投与する。典型的には、１０７から１０１０細胞の１回投与量を、好ましくは１０９細胞の１回投与量を単回の設定で注入する。注入を、単回の１０９細胞の投与量として、または好ましくはいくつかの１０９細胞の１回投与量に分割してのいずれかで投与する。注入の頻度は、３から３０日ごと、またはもし望ましいまたは示されるならば、より長い間隔でさえもあり得る。注入の量は一般的に、患者当たり少なくとも１回の注入、および好ましくは許容されるなら少なくとも３回の注入、または疾患の症状が改善されるまでである。細胞を、５０−２５０ｍｌ／ｈｒの速度で静脈内に注入し得る。
【０１２８】
注入された細胞が、高レベルのＦａｓＬおよびＣＤ４０Ｌを発現することが重要である。ＩＦＮ−ガンマに加えて、細胞はまた以下の１型サイトカインを産生するべきである：ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−アルファおよびＴＮＦ−ベータ。細胞は、ＣＴＬＡ−４をその細胞表面に発現するべきでなく、そしてＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４またはＩＬ−１０を産生するべきでない。同種異系末梢血単核細胞との同時培養時に、細胞は１型サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマのアップレギュレーションおよび自己ＡＰＣおよび標的細胞上のＭＨＣおよび補助刺激分子のアップレギュレーションを引き起こすべきである。それに加えて、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫおよび他のＴＮＦＲのようなエフェクター分子のアップレギュレーションが、本発明の方法によって産生された同種異系ＣＤ４細胞との混合後に、自己細胞において明らかであるべきである。
【０１２９】
（作用メカニズム）
本発明の方法によってできた細胞は、同時培養した場合に、自然免疫系の細胞を急激に活性化する。この活性化は、本発明の方法によって産生された細胞に発現するＣＤ４０Ｌおよび宿主自然免疫細胞に発現するＣＤ４０分子の相互作用によって起こる。宿主ＰＢＭＣおよび本発明の方法によって産生された同種異系ドナー細胞の同時培養時に、マクロファージおよび樹状細胞は、補助刺激細胞表面分子およびＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子をアップレギュレートし、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、およびＩ型インターフェロンのような炎症促進性のサイトカインを産生する。これは「サイトカインストーム」を産生し、これはＢＭＴプロトコールにおいて同種異系ドナーリンパ球の注入によって産生されるサイトカインストーム環境とほとんど同じである。
【０１３０】
活性化宿主マクロファージおよび樹状細胞の、取り込み（食作用およびエンドサイトーシスによる）および続く腫瘍細胞および病原性生物の破壊能力と組み合わせて、これらの特徴は抗原反応性Ｔ細胞へのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路によるこれら病原体および腫瘍の抗原性産物の増強された提示を可能にする。さらに、本発明の方法によって産生された細胞の表面表現型（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌｌｏ）は、注入細胞が炎症部位へ通行すること、およびその１型サイトカインを微小環境へ伝達することを可能にする。これは、局所の２型サイトカイン産生を抑制し、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩの発現、補助刺激分子の発現をアップレギュレートし、そして殺腫瘍性のマクロファージを腫瘍床へリクルートし得る。
【０１３１】
本発明の方法によって産生された細胞上のＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬの高い発現は、炎症部位または腫瘍床へリクルートされた自然免疫細胞のエフェクター活性と組み合わせて、アポトーシスおよび流入領域リンパ節への抗原分断を引き起こす。リンパ節には、最初のＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用から活性化された樹状細胞が多くあるべきであり、そして１型免疫反応の発達に有利なサイトカイン環境において、適応免疫系の構成要素へ抗原を提示するよう刺激される。樹状細胞のＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０活性化は、樹状細胞によるＩＬ−１２およびＴＮＦ−アルファの産生を引き起こし、それらのサイトカインは活性化されたナイーブＴ細胞を、Ｔｈ１および１型適応免疫へと偏向させることが公知である。さらに、ＩＬ−１２の産生は、さらにＴ細胞およびＮＫ細胞からのＩＦＮ−ガンマの産生を誘発し、それが今度はマクロファージからのＩＬ−１２をさらにアップレギュレートしてオートクラインフィードバックループを作り、それはマクロファージの活性化、Ｔ細胞の１型免疫への成熟を促進し、そして自然ＮＫ活性を増幅する。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例を、説明目的のためのみに含み、そして本発明の範囲を制限することを意図しない。
【０１３３】
（方法：）
（マイクロスフィア調製）
マイクロスフィアを調製するために、溶媒蒸発法を使用した。０．１５から０．２５ｄｌ／ｇの固有粘性を有する、Ｌａｃｔｅｌ（登録商標）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）５０／５０ＤＬ−ＰＬＧ製品番号５０ＤＧ０２０を、ポリマーとして使用した。ＤＬ−ＰＬＧの粉末を、２０ｍｌの塩化メチレンに、最終的にＤＬ−ＰＬＧの５％ｗ／ｖ比まで溶解した。５％のＤＬ−ＰＬＧ溶液を次いで、１２５ｍｌの０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ１．１中２．４％のヒドロキシプロピルメチルセルロースに、室温で（２５±２℃）１０００ｒｐｍで絶えず攪拌しながら１滴ずつ加えた。有機溶媒の完全な蒸発まで（約３時間）攪拌を維持した。マイクロスフィアを、１０００ｒｐｍ、４０℃で５分の遠心分離によって回収し、続いて蒸留水によって３サイクル洗浄し、ろ過および一晩乾燥させた。マイクロスフィアのサイズは、＜１０％の最大ＣＶで、３．０から７．０μｍの範囲であった。スフィアを次いで、吸着法を用いてポリクローナルヤギ抗マウス抗体でコートした。抗体を５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む３０ｍｌのＰＢＳ溶液に、１０μｇ／ｍｌの濃度で懸濁した。この溶液を使用して、乾燥したマイクロスフィアを１ｍｌあたり約２×１０８粒子の濃度で再懸濁した。マイクロスフィアおよびポリクローナル抗体を逆さにして、４０℃で８時間混合した。マイクロスフィアを次いで、ＨＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、ろ過および乾燥した。乾燥した粒子を、使用の前に７０％のイソプロパノールの溶液中で保存した。
【０１３４】
（同種異系細胞産物の調製）
下記の実施例に関して、同種異系細胞産物を、好ましい実施態様において記載された方法によって調製した。簡単には、１．２×１０１０の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、白血球除去血輸血によって健康なドナーから採取した。ＰＢＭＣを洗浄し、そして一晩室温で保存した。ＰＢＭＣを、ビオチン化抗ＣＤ４ｍＡｂで標識し、そして２次抗ビオチンｍＡｂ磁気粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合することによって、ＣＤ４＋細胞に関して濃縮した。ＣＤ４＋細胞を次いで、磁気化カラム（ＭＡＣＳ（登録商標））を通過させることによって選択した。１．３×１０８のＣＤ４＋が選択され、そしてＬｉｆｅｆｌａｓｋ（Ｂａｘｔｅｒ）ガス透過性バッグにおいて、１００ｍｌのＸＶＩＶＯ−１５培養液中に置いた。ＣＤ４＋細胞を５％ＣＯ２の雰囲気中で、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、非接着細胞を洗浄し、そして抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂで標識して、そしてヤギ抗マウス抗体でコートした生物分解性マイクロスフィアと３：１の比で懸濁した。懸濁液を、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして培養バッグを手でマッサージすることによって静かに再懸濁した。懸濁液を７２時間インキュベートし、そして細胞を再標識および新しいマイクロスフィアと懸濁した。懸濁液を１６００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上清を除去し、そして体積の９０％を透析フィルターに通した。保持された上清を、細胞懸濁液に戻し加え、そして新しい培養液で体積を１００ｍｌに戻した。この処理を、培養９日目まで毎日反復した。１０日目に、できた細胞を下記で記載する実施例に使用した。
【０１３５】
（実施例番号１：同種異系細胞産物の表現型分析）
同種異系細胞産物の試料を、表現型分析のために１日目および１０日目に取った。細胞の免疫表現型決定のために、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ４／ＣＤ２５、ＣＤ４／ＤＲ、ＣＤ４／ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４／ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４／ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４／ＣＤ１５４（ＦａｓＬ）、ＣＤ４／ＴＲＡＩＬに対する、モノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた直接蛍光技術によって、表面の標識を行った。細胞内サイトカインを検出するために、単核細胞をＦＡＣＳ透過処理溶液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって透過処理した。フローサイトメトリー分析を、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて、ＦＡＣＳｏｒｔ装置（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって行った。その結果を、全ての免疫表現型に関して、１０，０００回から計算した染色細胞のパーセントとして報告する。
【０１３６】
【表１】
0006030819.tif 000002
これらの結果は、同種異系細胞産物は、活性化記憶表現型を有する１型細胞へ分化したことを示す。
【０１３７】
（実施例番号２：同種異系細胞産物のサイトカイン遺伝子プロファイル）
同種異系細胞産物のサイトカインプロファイルを決定するために、細胞質ゾルＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そしてＲｏｃｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットを用いて逆転写した。プライマーおよびプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したか、またはＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いてデザインした。リアルタイムＰＣＲ増幅および産物の検出を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００において、製造会社の推薦する手順によって行った。遺伝子産物を、１日目および１０日目に１００，０００の値に設定したＧＡＰＤＨ発現と相対的に表す。
【０１３８】
【表２】
0006030819.tif 000003
（実施例番号３：同種異系細胞産物の宿主ＰＢＭＣ拒絶）
ステージ３の卵巣癌患者由来のＰＢＭＣを、密度勾配精製および軟膜の単離によって調製した。宿主ＰＢＭＣを、同種異系細胞産物と５０：５０の比で混合し、そして２４穴プレートで７日間培養した。同種異系細胞を、緑色細胞追跡色素、５−クロロメチルフルオレセイン二酢酸（ＣＭＦＤＡ）で標識した。培養を３組セットアップした。
【０１３９】
（結果：）
培養７日目の終わりに、各ウェルにおいて２％より少ない生きた細胞が緑色に染まり、それらは宿主ＰＢＭＣによって拒絶されたことを示す。
【０１４０】
（実施例番号４：混合した宿主ＰＢＭＣおよび同種異系産物のサイトカイン分析）
本発明の方法によって産生された同種異系細胞産物の、宿主癌患者ＰＢＭＣを刺激して１型サイトカインを産生させる能力を決定するために、同種異系細胞を、好ましい実施態様において記載されたように調製し、９日目に回収し、そして２４穴培養プレートにおいて癌患者由来の１×１０６ＰＢＭＣと混合し、そして５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気において、３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１４１】
乳房切除術前に転移乳癌を有する患者から得た末梢血の密度勾配遠心分離によってヒトＰＢＭＣを単離した。同種異系細胞産物を、１：１００、１：５０、および１：２５の比でＰＢＭＣ培養に加えた。培地単独中のＰＢＭＣをネガティブコントロールとして使用し、そしてＰＨＡで活性化したＰＢＭＣをポジティブコントロールとした。
【０１４２】
４８時間後に、上清試料を各ウェルから除去し、そしてＥＬＩＳＡによって分析した。結果を、３組の培養の平均＋／−ＳＥとしてｐｇ／ｍｌで示す。ＮＤ＝検出されない。
【０１４３】
【表３】
0006030819.tif 000004
その結果は、本発明の同種異系細胞産物は、１型サイトカイン産生の強力なアップレギュレーションを誘発し、そして２型サイトカイン産生をダウンレギュレートし得ることを示す。
【０１４４】
（実施例番号５：同種異系産物と混合した後の宿主細胞の表現型分析）
実施例番号３からの宿主ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１４＋単球を、エフェクターおよび補助刺激マーカーに関して表現型を分析した。
【０１４５】
【表４】
0006030819.tif 000005
その結果は、宿主細胞が、同種異系細胞産物の拒絶中およびサイトカインストームの存在下で、補助刺激およびエフェクター分子をアップレギュレートしたことを示す。
【０１４６】
（実施例番号６：ＮＫ細胞毒性の刺激）
Ｋ５６２標的細胞に対するＮＫ活性を、生きたＫ５６２細胞を染色するためにＤＩＯ膜色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を、および死んだ細胞を染色するためにヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）核色素を用いて、フローサイトメトリーアッセイによって評価した。特異的な溶解のパーセントを、以下の式によって計算した：
【０１４７】
【数１】
0006030819.tif 000006
癌患者由来のＰＢＭＣを、培地単独、および同種異系産物および自己ＰＢＭＣを１：１００の比で４８時間同時培養した上清中でインキュベートした。
【０１４８】
【表５】
0006030819.tif 000007
これらの結果は、本発明の方法によって誘発された１型サイトカインストームは、宿主ＮＫ活性を有意に増強し得ることを示す。
【０１４９】
（実施例番号７：サイトカインストーム上清は、腫瘍の免疫原性に影響を与える）
癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２３（肺癌）、Ｃａｋｉ−１（腎臓細胞癌）およびＡＣＨＮ（腎臓細胞癌）を、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、細胞死受容体ＦａｓおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２および補助刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現に関して分析した。細胞株を次いでトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）プレートの下部で培養した。上部ウェルにおいて、正常ドナー由来の宿主ＰＢＭＣおよび同種異系細胞産物を１００：１の細胞比で混合した。培養を９６時間インキュベートした。
【０１５０】
【表６−１】
0006030819.tif 000008
【０１５１】
【表６−２】
0006030819.tif 000009
これらの結果は、本発明の方法によって誘発されたサイトカインストームは、腫瘍細胞の免疫原性およびそのアポトーシスへの感受性を増加させ得ることを示す。
【０１５２】
本発明を好ましい実施態様に関して記載するが、当業者は、本発明の意図および範囲から離れることなく、方式および詳細において変化し得ることを認識する。