(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞ががん細胞であるか否かを分析するシステムであって、
生細胞をサイトカインによる外部刺激に暴露する暴露手段と、
前記暴露手段で前記外部刺激に暴露される前記生細胞の誘電率の経時的変化を測定する誘電率測定手段と、
前記誘電率測定手段において測定される前記生細胞の誘電率の経時的変化パターンの特性を抽出する抽出手段と、
前記抽出手段で抽出された経時的変化パターンの特性が、一相性、二相性および三相性のいずれに該当するかを判定し、正常細胞における前記経時的変化パターンの該当相性を指標として、前記生細胞ががん細胞であるか否かを評価する判定・評価手段と、
を備えることを特徴とする、生細胞の分析システム。
【請求項２】
前記判定・評価手段では、前記抽出手段で抽出された経時的変化パターンの特性が、一相性、二相性および三相性のいずれに該当するかを判定し、一相性または二相性に該当する場合は前記生細胞ががん細胞であると評価し、三相性に該当する場合は前記生細胞が正常細胞であると評価することを特徴とする、請求項１に記載の生細胞の分析システム。
【請求項３】
前記がん細胞は、胃癌細胞、前立腺癌細胞および血管肉腫細胞のいずれかであり、
前記判定・評価手段では、前記抽出工程で抽出された経時的変化パターンの特性が、一相性、二相性および三相性のいずれに該当するかを判定し、一相性に該当する場合は前記生細胞が前立腺癌細胞であると評価し、二相性に該当する場合は前記生細胞が胃癌細胞または血管肉腫細胞であると評価し、三相性に該当する場合は前記生細胞が正常細胞であると評価することを特徴とする、請求項２に記載の生細胞の分析システム。
【請求項４】
前記暴露手段では、前記生細胞をＥＧＦによる前記外部刺激に暴露し、
前記誘電率測定手段では、表面プラズモン共鳴法を用いて測定されることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の生細胞の分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞を外部刺激に暴露した際の誘電率等の経時的変化パターンを利用する、生細胞の分析方法および生細胞の分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、悪性腫瘍等の診断・分析は、肉眼観察、Ｘ線、ＣＴ（Computed Tomography）または超音波等による画像情報に基づき、最終的には病理組織標本を用いた組織構造を顕微鏡的に観察することを基として行われている。時に、これらの他に、被疑組織内の遺伝子の異常、または癌に関連するマーカー物質の発現の有無の情報が加えられることもある。
【０００３】
一方、近年、表面プラズモン共鳴現象を応用し、共鳴角度変化をリアルタイムでとらえることにより、タンパク質等の生体分子間の反応・結合量の測定および速度論解析をすることができる表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ（surface plasmon resonance）装置）が様々な研究および検査等で利用されている。
【０００４】
表面プラズモン共鳴とは、全反射条件で光が金属薄膜に入射するときに発生するエバネッセント光と、金属薄膜と測定対象との境界面を伝搬している自由電子の粗密波である表面プラズモンとが共鳴する現象である。表面プラズモン共鳴が発生すると、入射した光のエネルギーの少なくとも一部が表面プラズモン共鳴に移行し全反射した光の強度が低下する。光の強度が最も低下する入射角を共鳴角（Angle of Resonance）という。この共鳴角は、測定対象の誘電率の変化に応じて変化する。ＳＰＲ装置では、この共鳴角の変化を測定することにより、測定対象の誘電率の変化を観察することができる。
【０００５】
特許文献１には、このＳＰＲ装置を用いた生細胞に対する外部刺激の生理活性を評価する方法が記載されている。具体的には、生細胞が外部刺激に暴露された際に、ＳＰＲ装置で観察される１次シグナルの後に出現する２次シグナルを指標として、細胞に対する外部刺激の生理活性を評価する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３７９５３１２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述したような、肉眼観察、Ｘ線、ＣＴまたは超音波等による悪性腫瘍等の診断・分析は、いずれも静止した細胞および細胞により構築される組織の構造の乱れ、または細胞から抽出して得られた特定成分の異常を同定する方法である。また、特定遺伝子もしくはその他の物質の発現の有無は、構造の乱れとはやや異なる概念で捉えられるが、がんであることが疑われる生体組織または細胞を化学的に固定した後に、特定の物質の量の多寡を分析するという点で、やはりある瞬間における細胞ないし生体組織の構造の分析であることに変わりはない。
【０００８】
しかし、悪性腫瘍等の本質は、細胞の無秩序増殖および転移にある。前述した診断・分析方法では、いずれの方法も、悪性腫瘍等の潜在的な機能の可能性と、その結果としての構造の乱れとを観察しているに過ぎない。従って、細胞が無秩序に増殖する性質および転移する性質を個々の生細胞の有する機能として包括的かつ直接的に分析可能とすることは、悪性腫瘍等の診断・分析を格段に向上させることを意味する。
【０００９】
また、特許文献１に記載の発明では、生細胞が外部刺激に暴露された際のＳＰＲ装置で観察される２次シグナルを指標とし、細胞に対する外部刺激の生理活性を評価しているが、より具体的な生細胞の状態の分析方法（例えば、正常細胞とがん細胞とを区別する方法、または、癌細胞において癌の種類を同定する方法等）を解明することによって、前述したような個々の生細胞のレベルでの悪性腫瘍等の診断・分析を、より格段に向上させることが可能となる。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞の状態を、個々の生細胞のレベルにおいて、包括的かつ直接的に分析することができる、生細胞の分析方法および生細胞の分析システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らが鋭意研究を行った結果、正常細胞と癌細胞とでは、ＳＰＲ装置によるＥＧＦ（上皮成長因子、Epidermal Growth Factor）刺激に対して異なる共鳴角の経時的変化パターンの特性を示すということが解明された。さらに、病理組織学的には同じ種類の癌または癌細胞株でも、ＥＧＦ刺激に対し、異なる共鳴角の経時的変化パターンの特性を示し得るということが示された。また、ヒト血管肉腫細胞株では、正常な血管構成細胞では発現していないＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体、Epidermal Growth Factor Receptor）を発現し、ＥＧＦによる刺激に対し、前述の癌細胞での結果と同様に、異なる共鳴角の経時的変化パターンの特性を示すということも解明された（いずれも実施例参照）。
【００１２】
そこで、本発明の第１の態様に係る生細胞の分析方法は、生細胞ががん細胞であるか否かを分析する方法であって、
生細胞をサイトカインによる外部刺激に暴露する暴露工程と、
前記暴露工程で前記外部刺激に暴露される前記生細胞の誘電率の経時的変化を測定する誘電率測定工程と、
前記誘電率測定工程において測定される前記生細胞の誘電率の経時的変化パターンの特性を抽出する抽出工程と、
前記抽出工程で抽出された経時的変化パターンの特性が、一相性、二相性および三相性のいずれに該当するかを判定し、正常細胞における前記経時的変化パターンの該当相性を指標として、前記生細胞ががん細胞であるか否かを評価する判定・評価工程と、
を含むことを特徴とする。
【００１３】
好ましくは、前記判定・評価工程では、前記抽出工程で抽出された経時的変化パターンの特性が、一相性、二相性および三相性のいずれに該当するかを判定し、一相性または二相性に該当する場合は前記生細胞ががん細胞であると評価し、三相性に該当する場合は前記生細胞が正常細胞であると評価することを特徴とする。
【００１４】
また、好ましくは、前記がん細胞は、胃癌細胞、前立腺癌細胞および血管肉腫細胞のいずれかであることを特徴とする。
【００１５】
さらに好ましくは、前記判定・評価工程では、前記抽出工程で抽出された経時的変化パターンの特性が、一相性、二相性および三相性のいずれに該当するかを判定し、一相性に該当する場合は前記生細胞が前立腺癌細胞であると評価し、二相性に該当する場合は前記生細胞が胃癌細胞または血管肉腫細胞であると評価し、三相性に該当する場合は前記生細胞が正常細胞であると評価することを特徴とする。
【００１６】
より好ましくは、前記暴露工程では、前記生細胞をＥＧＦによる前記外部刺激に暴露することを特徴とする。
【００１７】
好ましくは、前記誘電率測定工程は、表面プラズモン共鳴法を用いて測定することを特徴とする。
【００１８】
本発明の第２の態様に係る生細胞の分析システムは、生細胞ががん細胞であるか否かを分析するシステムであって、
生細胞をサイトカインによる外部刺激に暴露する暴露手段と、
前記暴露手段で前記外部刺激に暴露される前記生細胞の誘電率の経時的変化を測定する誘電率測定手段と、
前記誘電率測定手段において測定される前記生細胞の誘電率の経時的変化パターンの特性を抽出する抽出手段と、
前記抽出手段で抽出された経時的変化パターンの特性が、一相性、二相性および三相性のいずれに該当するかを判定し、正常細胞における前記経時的変化パターンの該当相性を指標として、前記生細胞ががん細胞であるか否かを評価する判定・評価手段と、
を備えることを特徴とする。
【００１９】
さらに好ましくは、前記判定・評価手段では、前記抽出手段で抽出された経時的変化パターンの特性が、一相性、二相性および三相性のいずれに該当するかを判定し、一相性または二相性に該当する場合は前記生細胞ががん細胞であると評価し、三相性に該当する場合は前記生細胞が正常細胞であると評価することを特徴とする。
【００２０】
好ましくは、前記がん細胞は、胃癌細胞、前立腺癌細胞および血管肉腫細胞のいずれかであることを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記暴露手段では、前記生細胞をＥＧＦによる前記外部刺激に暴露することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の第１の態様に係る生細胞の分析方法および第２の態様に係る生細胞の分析システムによれば、細胞の状態を、個々の生細胞のレベルにおいて、包括的かつ直接的に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施の形態２に係る生細胞の分析システムの構成の一例を示すブロック図である。
【図２】実施の形態２に係る生細胞の分析システムの動作の一例のフローチャートを示す図である。
【図３】実施例１に係る野生型ヒトＥＧＦＲを強制発現させたＣＨＯ細胞での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【図４】実施例２に係るＡＴＰ結合ドメインの変異したヒトＥＧＦＲを発現させたＣＨＯ細胞での、抗リン酸化特異的ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図５】実施例２に係るＡＴＰ結合ドメインの変異したヒトＥＧＦＲを発現させたＣＨＯ細胞表面での、ＥＧＦＲの発現量の測定結果を示す図である。
【図６】実施例２に係るＡＴＰ結合ドメインの変異したヒトＥＧＦＲを発現させたＣＨＯ細胞での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【図７】実施例３に係る胃癌細胞株ＭＫＮ−１での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【図８】実施例３に係る胃癌細胞株ＭＫＮ−７での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【図９】実施例３に係る胃癌細胞株ＭＫ２８での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【図１０】実施例３に係る前立腺癌細胞株ＤＵ１４５での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【図１１】実施例３に係る前立腺癌細胞株ＬＮＣａｐでの、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【図１２】（Ａ）は、実施例４に係るヒト血管肉腫細胞株の抗リン酸化特異的ＥＧＦＲ抗体および抗ＥＧＦＲ抗体によるウェスタンブロッティングの結果を示す図である。（Ｂ）は、実施例４に係るヒト血管肉腫細胞株でのＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【図１３】実施例５に係る野生型ヒトＥＧＦＲを強制発現させたＣＨＯ細胞での、ＷＭＮ処置後ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【図１４】実施例６に係る野生型ヒトＥＧＦＲを強制発現させたＣＨＯ細胞での、１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌでのＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。
【００２５】
（生細胞の分析方法）
本発明の実施の形態１は、被検体対象とする生細胞が外部刺激に暴露された際に観察される誘電率の経時的変化パターンの特性を指標とする生細胞の分析方法に関する。具体的には、当該生細胞の分析方法は、被検体対象とする生細胞を外部刺激に暴露する暴露工程と、暴露工程で外部刺激に暴露される該生細胞の誘電率の経時的変化を測定する誘電率測定工程と、前述した誘電率測定工程において測定される該生細胞の誘電率の経時的変化パターンの特性を抽出する抽出工程とを含む。なお、本明細書における生細胞の「分析」とは、生細胞の評価、同定、分類および診断等の種々の意味を含むものとして定義され得る。
【００２６】
まず、被検体対象とする生細胞を外部刺激に暴露する暴露工程について詳細に説明する。
【００２７】
ここで、本明細書において使用される「細胞」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、どのような種類・動物の細胞でも構わない。また、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞または遺伝子改変細胞）であってもよい。「生細胞」とは、このうち生きた細胞を示す。最も好ましくは、ヒト（Homo sapience）由来の生細胞を示す。
【００２８】
また、「外部刺激」とは、細胞表面の受容体に対するリガンドの結合、温度もしくはｐＨ等の環境変化、機械的刺激または電気的刺激等を意味し、細胞の活性（例えば、細胞内の情報伝達系の賦活等）に対して作用する全ての刺激を包含している。これらのうち、細胞表面の受容体に対するリガンドの結合が好ましく、サイトカインによる外部刺激がさらに好ましい。
【００２９】
本明細書におけるサイトカインは、当該分野において公知である全ての種類のサイトカインを含有する。例えば、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、造血因子または細胞増殖因子等が挙げられるが、このうち細胞増殖因子が好ましい。細胞増殖因子には、例えば、前述したＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）またはトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）等が挙げられる。このうち最も好ましくはＥＧＦである。なお、「暴露」とは、前述したような各々の外部刺激を、各々適した暴露方法によって生細胞に与えることを意味している。
【００３０】
具体的には、次のような例が暴露工程として挙げられる。まず、被検体対象とする生細胞を準備しておく。対象となる生細胞は、生細胞の集合検体（例えば、予め生体から採取した生体組織等）を対象として行っても構わないが、個々の生細胞毎を対象として行う方がより好ましい。次に、対象生細胞を外部刺激に暴露する。暴露方法は、前述したとおり、当該外部刺激に対して各々適した方法を用いればよい。例えば、ＥＧＦでの刺激を与える場合であれば、適した濃度のＥＧＦ溶液中に、対象とする生細胞を浸潤させて刺激を与えればよい（実施例参照）。
【００３１】
次に、暴露工程で外部刺激に暴露される該生細胞の誘電率の経時的変化を測定する誘電率測定工程、および、測定された該生細胞の誘電率の経時的変化パターンの特性を抽出する抽出工程について詳細に説明する。
【００３２】
ここで、本明細書において使用される「経時的変化パターンの特性」とは、時間変化に伴う変化率の推移の特徴を意味する。具体的には、初期値、極大値および／または極小値、外部刺激に暴露してからの極大値および／または極小値となるまでの時間、ならびに、経時的変化が一相性、二相性または三相性のいずれであるか（実施例参照）等の特徴を意味する。また、本明細書において使用される「誘電率の経時的変化」または「誘電率の経時的変化パターン」には、誘電率の時間変化に伴う変化率の推移以外に、誘電率の変化に依存して変化する値（例えば、屈折率または共鳴角等）の時間変化に伴う変化率の推移も含まれる。
【００３３】
具体的には、次のような流れが誘電率測定工程および抽出工程の一例として挙げられる。まず、誘電率測定工程において、前述した暴露工程での外部刺激による対象生細胞の誘電率の経時的変化を測定器具等を用いて測定する。誘電率の経時的変化、すなわち時間変化に伴う誘電率の数値は、例えば、データ化またはグラフ化等行われる。
【００３４】
測定器具については、当該分野において公知である、誘電率または誘電率の変化に依存して変化する値を測定できる器具ならどのようなものを用いても構わない。最も好ましくは、被検体対象の生細胞における誘電率を共鳴角の経時的変化パターンとして測定可能であるＳＰＲ装置を用いて測定する。
【００３５】
抽出工程では、このような誘電率測定工程において測定される、被検体対象とする生細胞の誘電率の経時的変化パターンの特性を抽出する。ここで、本明細書において、経時的変化パターンの特性の「抽出」とは、前述したような経時的変化パターンの特性のうち、測定した経時的変化パターンの特性が、どのような特徴を持っているのかを検出、判定、および／または、判断等を行うことを意味する。当該抽出工程では、例えば、測定した誘電率（屈折率、共鳴角）の経時的変化パターンをグラフ化したものからコンピュータ等により当該経時的変化パターンの特性を抽出する。抽出工程において、最も好ましくは、経時的変化パターンが一相性、二相性または三相性のいずれに該当するかを抽出する。さらに好ましくは、例えば、コントロールとなる経時的変化パターンと比較して、一相目、二相目および／または三相目のＳＰＲシグナルのいずれが特異的な経時的変化パターンを示しているかどうかを評価することにより、腫瘍細胞内の細胞内シグナル内のどの部分に変異（タンパク質の異常）があるかまで分かる可能性が示唆される（実施例参照）。
【００３６】
このように、本実施の形態１では、誘電率（屈折率、共鳴角）の経時的変化パターンの特性を指標とし、被検体対象である生細胞の分析を行う。また、所定の誘電率の経時的変化パターンの特性と比較することによって、より詳細な生細胞の分析を行っても構わない。所定の誘電率の経時的変化パターンの特性とは、例えば、予め測定しておいた被検体対象となる生細胞の正常細胞（異常がない状態の細胞）、種々のがん細胞（上皮性・非上皮性・液性問わず全ての病変した腫瘍）、種々の癌細胞（上皮由来の悪性腫瘍）または種々の癌細胞株等の誘電率の経時的変化パターンの特性を意味する。
【００３７】
その結果、例えば、被検体対象である生細胞が正常細胞であるか否か、対象の生細胞ががん細胞もしくは癌細胞であるか否か、または、癌細胞の場合にはどのような種類・細胞株の癌細胞（例えば、胃癌細胞、前立腺癌細胞または血管肉腫細胞（後述する実施例３および実施例４参照）等）であるか等を、診断・分析することができる。
【００３８】
（生細胞の分析システム）
本発明の実施の形態２は、被検体対象とする生細胞が外部刺激に暴露された際に観察される誘電率の経時的変化パターンの特性を指標とする生細胞の分析システムに関する。具体的には、当該生細胞の分析システムは、被検体対象とする生細胞を外部刺激に暴露する暴露手段と、暴露手段で外部刺激に暴露される該生細胞の誘電率の経時的変化を測定する誘電率測定手段と、前述した誘電率測定手段において測定された該生細胞の誘電率の経時的変化パターンの特性を抽出する抽出手段とを備える。
【００３９】
図１は、本発明の実施の形態２に係る生細胞の分析システムの構成の一例を示すブロック図である。図１に示すように、例えば、生細胞の分析システムは、暴露試験部１、誘電率測定部２、誘電率経時的変化パターン特性抽出部３および表示部４から構成されている。
【００４０】
なお、当該生細胞の分析システムにおける分析の流れについては、前述の実施の形態１における生細胞の分析方法と同様であるが、以下簡単に説明する。
【００４１】
暴露試験部１は、被検体対象の生細胞を所定の条件の環境に保持し、与えられた外部刺激に被検体対象の生細胞を暴露する。誘電率測定部２は、暴露試験部１の生細胞の誘電率を計測し、計測した時刻とともに記憶する。計測する時刻の情報は、計測を開始してから相対時間でよい。計測した誘電率とその時刻の情報は、被検体対象の生細胞の誘電率の経時的変化パターンを構成する。好ましくは、誘電率測定部２は、ＳＰＲ装置を備え、表面プラズモン共鳴法を用いて生細胞の誘電率に依存する共鳴角の経時的変化を測定する。
【００４２】
誘電率経時的変化パターン特性抽出部３は、誘電率測定部２で計測した生細胞の誘電率の経時的変化パターンの特性を抽出し、例えば、前述の一相性、二相性または三相性のいずれの条件に該当するかを判定する。誘電率経時的変化パターン特性抽出部３は、抽出した誘電率経時的変化パターンの特性の情報（生細胞の状態の情報）を、表示部４に送る。表示部４は、誘電率経時的変化パターン特性抽出部３から送られた生細胞の状態の情報を表示する。
【００４３】
なお、図１の変形例として、条件が記憶されたデータベースをさらに備えても構わない。この場合、例えば、誘電率経時的変化パターン特性抽出部３は、データベースに記憶された条件を用い抽出された特性と比較し判定する。条件としては、例えば、変化パターンの極大値および極小値の有無、極大値と極小値の順序、初期値、極大値および極小値の大小、極大値および極小値をとる時間の範囲、変化率の符号と大きさ、変化率の変化率等々、変化パターンの特徴を識別する条件を設定することができる。
【００４４】
図２は、実施の形態２に係る生細胞の分析システムの動作の一例を示すフローチャートである。図２に示すように、例えば、被検体の生細胞の分析を開始すると、前述した暴露試験部１において暴露試験を行う（ステップＳ１１）。暴露試験が行われている間、誘電率測定部２において誘電率の測定（ステップＳ１２）を行う。
【００４５】
次に、誘電率経時的変化パターンの特性が抽出され（ステップＳ１３）、前述のように、例えば、抽出された特性が一相性、二相性または三相性のいずれの条件に該当するかが判定される（ステップＳ１４）。当該抽出およびその判定は、誘電率経時的変化パターン特性抽出部３において行われる。その後、抽出された特性（例えば一相性、二相性または三相性）の誘電率経時的変化パターンの特性での細胞の状態が、被検体対象となっている生細胞の状態と分析され、表示部４に送られ表示される（ステップＳ１５）。
【００４６】
本実施の形態２では、被検対象とする生細胞の分析システムについて述べたが、前述の実施の形態１と同様に、がん細胞の分析システムまたは癌細胞（例えば、胃癌細胞、前立腺癌細胞または血管肉腫細胞等）の分析システムとして用いても構わない。
【００４７】
このように、本発明に係る生細胞の分析方法および生細胞の分析システムによれば、細胞の状態を、個々の生細胞のレベルにおいて、包括的かつ直接的に分析することができる。特に、従来技術の様に細胞または組織を固定せず、かつ潜在的可能性として悪性腫瘍等を評価せずに、細胞の刺激応答パターンを動的に分析することのみによって、正常細胞、がん細胞、癌の種類および癌細胞株の種類を分析可能であることは、技術的価値が極めて高いといえる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【００４９】
（実施例１）
本実施例１では、野生型ヒトＥＧＦＲを強制発現させたＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞へＥＧＦ刺激を行った場合の経時的な共鳴角の変化について詳細に説明する。なお、ＥＧＦＲは体内の様々な細胞の増殖および臓器の発達・形成に重要な働きを示すことが周知であり、また、様々ながん細胞において過剰発現が見られることも知られている。
【００５０】
まず、空のベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（Stratagene社製）、および、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に野生型ヒトＥＧＦＲ遺伝子を組み込んだベクターを、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Fetal calf serum）を含むHam's Ｆ−１２培養液で維持したＣＨＯ細胞に、電気穿孔法を用いて遺伝子導入した。なお、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組み込んだ野生型ヒトＥＧＦＲ遺伝子は、配列表の配列番号１および配列番号２に示す塩基配列のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。遺伝子導入後、１０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８存在下において薬剤選択を行った。その後、空のベクターを導入したＣＨＯ細胞株、および野生型ヒトＥＧＦＲを高いレベルで安定発現したＣＨＯ細胞株を、１．２×１０４cells／６０μｌとなるようにセンサーチップ上に滴下し、一晩培養した。
【００５１】
培養後、センサーチップ上の細胞をHepesバッファーで灌流し、１０ｎｇ／ｍｌであるリコンビナントヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ社製）で１０分間刺激を行い、刺激後の経時的な共鳴角の変化をＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡ（モリテックス社製）を用いて測定した。当該ＳＰＲ装置での詳細な測定方法については、Hide M., Tsutsui,T., Sato,H., Nishimura,T., Morimoto,K., Yamamoto,S., Yoshizato,K.、２００２、Anal. Biochem. ３０２（１）、２８−３７、Yanase,Y., Suzuki,H., Tsutsui,T., Hiragun,T., Kameyoshi,Y., Hide,M.、２００７、Biosens. Bioelectron. ２２（６）、１０８１−１０８６、および、Yanase,Y., Suzuki,H., Tsutsui,T., Uechi,I., Hiragun,T., Mihara,S., Hide,M.、２００７、Biosens. Bioelectron. ２３（４）、５６２−５６７を参照されたい。
【００５２】
図３は、実施例１に係る野生型ヒトＥＧＦＲを強制発現させたＣＨＯ細胞での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。図３において、縦軸はＳＰＲ装置による共鳴角の変化（Change of ＡＲ（Angle of Resonance）（degree））を示し、横軸はＥＧＦ刺激からの時間（Time（sec））を示す。なお、後述する図６ないし図１１、および、図１２（Ｂ）についても同様である。
【００５３】
図３に示すように、空のベクターを導入したＣＨＯ細胞株（mock）と比較すると、野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞株（ＥＧＦＲ−ＷＴ）は、ＥＧＦ刺激に対して異なる共鳴角の経時的変化パターンを示すということがわかった。具体的には、野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞株では、典型的な三相性の共鳴角の経時的変化パターン（立ち上がった後に初期レベルよりも立ち下がり、再び立ち上がる変動パターン）を示すことが確認された。
【００５４】
（実施例２）
本実施例２では、ＡＴＰ結合ドメインの変異したヒトＥＧＦＲを発現させたＣＨＯ細胞株でのＥＧＦ刺激に係る実施例について詳細に説明する。
【００５５】
まず、ＡＴＰ結合ドメインの変異型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ−Ｋ７２１Ｍ（Chen,W.S., Lazar,C.S., Poenie,M., Tsien,R.Y., Gill,G.N., Rosenfeld.M.G.、１９８７、Nature ３２８（６１３３）、８２０−８２３参照））遺伝子を、QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）を用いて作成し、ＰＣＲ法によって増幅した。当該ＰＣＲにおいて使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列を、配列表の配列番号３および配列番号４に示す。作成したＡＴＰ結合ドメイン変異型ＥＧＦＲ遺伝子を、実施例１において述べた方法と同様の方法でＣＨＯ細胞に電気穿孔法を用いて遺伝子導入し、薬剤選択を行って安定発現細胞株を得た。
【００５６】
次に、前述した実施例１の野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞株と、ＡＴＰ結合ドメイン変異型ＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞株とを、０．２×１０６／ｍｌの濃度で６ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清を含むHam's  Ｆ−１２培養液で一晩培養した。その後、１０ｎｇ／ｍｌのｈＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）で５分間刺激し、１％ＮＰ−４０を含む細胞溶解液で処理してサンプルを作成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−polyacrylamide gel electrophoresis）で分離した。
【００５７】
分離後、ＰＶＤＦ（polyvinylidene fluoride）膜（Immobilon−Ｐ、Millipore社製）に転写して、抗リン酸化特異的ＥＧＦＲ抗体（Cell signaling社製）、抗ＥＧＦＲ抗体（Cell signaling社製）および抗ＦＬＡＧ抗体（Stratagene社製）を用い、ウエスタンブロッティングを行った。図４は、実施例２に係るＡＴＰ結合ドメインの変異したヒトＥＧＦＲを発現させたＣＨＯ細胞での、抗リン酸化特異的ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【００５８】
図４に示すように、ＡＴＰ結合ドメイン変異型ＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞（Ｋ７２１Ｍ）は、野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞（ＷＴ）と比較すると、同等レベル以上のＥＧＦＲタンパク質の発現を確認できたが、ＥＧＦ刺激を行ってもチロシンリン酸化はほとんど起こらなかった。
【００５９】
さらに、本発明者らは、ＡＴＰ結合ドメイン変異型ＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞、および、野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞において、それぞれの細胞表面でのＥＧＦＲの発現量をＰＥ標識抗ヒトＥＧＦＲ抗体（ＢＤ Biosciences社製）を用い、ＦＡＣＳCalibar（ＢＤ Biosciences社製）で測定した。図５は、実施例２に係るＡＴＰ結合ドメインの変異したヒトＥＧＦＲを発現させたＣＨＯ細胞表面での、ＥＧＦＲの発現量の測定結果を示す図である。
【００６０】
図５において、黒塗りとなっているものはアイソタイプコントロール抗体（Control）を示し、実線となっているものは野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞におけるＥＧＦＲの細胞表面発現量（ＥＧＦＲ−ＷＴ）を示し、点線となっているものはＡＴＰ結合ドメイン変異型ＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞におけるＥＧＦＲの細胞表面発現量（ＥＧＦＲ−Ｋ７２１Ｍ）を示す。図５に示すように、ＡＴＰ結合ドメイン変異型ＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞であっても、細胞表面発現量は、野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞の細胞表面発現量と同等であった。
【００６１】
また、本発明者らは、前述したＡＴＰ結合ドメイン変異型ＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞株および野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞株をセンサーチップ上に播種し、翌日に１０ｎｇ／ｍｌのｈＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）を用いて１０分間刺激を行い、経時的な共鳴角の変化をＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡ（モリテックス社製）で測定した。
【００６２】
図６は、実施例２に係るＡＴＰ結合ドメインの変異したヒトＥＧＦＲを発現させたＣＨＯ細胞での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。図６に示すように、野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞株（ＥＧＦＲ−ＷＴ）は実施例１の結果と同様の典型的な三相性の共鳴角の変化を示した。しかし、ＡＴＰ結合ドメイン変異型ＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞株（ＥＧＦＲ−Ｋ７２１Ｍ）では、ＥＧＦによる刺激に対する共鳴角の変化をほとんど起こさなかった。
【００６３】
（実施例３）
本実施例３では、種々の癌細胞株のＥＧＦ刺激に対する共鳴角の変化に係る実施例について詳細に説明する。
【００６４】
前述した実施例１および実施例２の方法と同様に、胃癌細胞株（ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−７およびＭＫ２８）ならびに前立腺癌細胞株（ＤＵ１４５およびＬＮＣａｐ）を、それぞれセンサーチップ上に滴下し、翌日にｈＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社製）で１０分間刺激を行い、経時的な共鳴角の変化をＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡ（モリテックス社製）で測定した。
【００６５】
図７は、実施例３に係る胃癌細胞株ＭＫＮ−１での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。図８は、実施例３に係る胃癌細胞株ＭＫＮ−７での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。図９は、実施例３に係る胃癌細胞株ＭＫ２８での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。図１０は、実施例３に係る前立腺癌細胞株ＤＵ１４５での、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。図１１は、実施例３に係る前立腺癌細胞株ＬＮＣａｐでの、ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。
【００６６】
図７ないし図１１において、ＥＧＦ刺激によるレセプターのリン酸化についても、実施例２において述べた方法と同様に、ウェスタンブロッティングによって確認した（各挿入図）。また、図７ないし図１１において、上グラフは各癌細胞株にＥＧＦ刺激を行った場合（ＥＧＦ）、および、各癌細胞株にＥＧＦ刺激を行わない場合（Control）による経時的な共鳴角の変化を示しており、下グラフは該経時的な共鳴角の変化の差分を示している。さらに、独立して行った実験回数ｎについても各図中に示した。
【００６７】
図７ないし図９に示すように、胃癌細胞株（ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−７およびＭＫ２８）では、ＥＧＦ刺激による二相性の経時的な共鳴角の変化パターン（（１）立ち上がって（２）下がる変動パターン）が観察された。また、図１０および図１１に示すように、前立腺癌細胞株（ＤＵ１４５およびＬＮＣａｐ）では、ＥＧＦ刺激による一相性の経時的な共鳴角の変化パターン（図１０は、（１）立ち上がりのみの変動パターン、図１１は、（２）立ち下がりのみの変動パターン）が観察された。特に、前立腺癌細胞株ＬＮＣａｐは、他の細胞株とは異なり共鳴角の増加する相を含まなかった。
【００６８】
本実施例３の結果、ならびに、実施例１および実施例２において述べた野生型ヒトＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞株の典型的な三相性の経時的な共鳴角の変化パターンの結果から、正常細胞に対する癌細胞だけでなく癌細胞株の種類までも、細胞の経時的な共鳴角の変化パターン、すなわち誘電率の経時的変化パターンの特性を指標とすることにより（例えば、一相性、二相性または三相性等による区別により）、生細胞の包括的な状態を診断・分析できるということが確認できた。
【００６９】
また、この結果から、胃癌細胞株または前立腺癌細胞株以外の種々の細胞株であっても、各々の細胞株に特異的な誘電率の経時的変化パターンの特性があることが示唆される。なお、正常細胞に対する癌細胞の診断・分析だけでなく、正常細胞とがん細胞との区別、さらには正常細胞と何らかの異常を有する細胞との区別さえも、誘電率の経時的変化パターンの特性の評価によって可能であることが示唆される。
【００７０】
（実施例４）
本実施例４では、ヒト血管肉腫細胞株と、ＥＧＦＲおよびＥＧＦ刺激に対する共鳴角の変化との関連性に係る実施例について詳細に説明する。なお、ヒト軟部肉腫細胞であるヒト血管肉腫細胞とＥＧＦＲとのより詳細な関連性については、J.-L.Yang, M.T.Hannan, P.J.Crowe、２００６、European Journal of Surgical Oncology（ＥＪＳＯ）３２、４６６−４６８、を参照されたい。
【００７１】
まず、ヒト血管肉腫細胞株（ＩＳＯ−ＨＡＳ）を、１５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）に懸濁し、０．２×１０６／ｍｌの濃度において６ウェルプレート上に播種し、一晩培養を行った。その後、ｈＥＧＦ（終濃度１００から５００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社製を使用）で５分刺激し、細胞溶解液で処理し、抗リン酸化特異的ＥＧＦＲ抗体（Cell signaling社製）および抗ＥＧＦＲ抗体（Cell signaling社製）を用い、実施例２および実施例３において述べた方法と同様の方法でウエスタンブロッティングを行った。
【００７２】
また、該ＩＳＯ−ＨＡＳ細胞をセンサーチップ上に播種し、翌日にｈＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社製）で刺激を行い、前述の実施例２および実施例３と同様に、経時的な共鳴角の変化をＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡ（モリテックス社製）で測定した。
【００７３】
図１２（Ａ）は、実施例４に係るヒト血管肉腫細胞株の抗リン酸化特異的ＥＧＦＲ抗体および抗ＥＧＦＲ抗体によるウェスタンブロッティングの結果を示す図である。図１２（Ｂ）は、実施例４に係るヒト血管肉腫細胞株でのＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。なお、図１２（Ｂ）についても、図７ないし図１１と同様に、上グラフはＩＳＯ−ＨＡＳ細胞にＥＧＦ刺激を行った場合（ＥＧＦ）、および、ＩＳＯ−ＨＡＳ細胞にＥＧＦ刺激を行わない場合（Control）による経時的な共鳴角の変化を示しており、下グラフは該経時的な共鳴角の変化の差分を示している。
【００７４】
図１２（Ａ）に示すように、本実施例４に係るヒト血管肉腫細胞株（ＩＳＯ−ＨＡＳ）では、ＥＧＦＲを発現しており、１００から５００ｎｇ／ｍｌの濃度でのＥＧＦ刺激において、ＥＧＦＲのリン酸化が確認された。また、図１２（Ｂ）に示すように、本実施例４に係るヒト血管肉腫細胞株（ＩＳＯ−ＨＡＳ）では、ＥＧＦ刺激による二相性の経時的な共鳴角の変化パターン（（１）立ち上がって（２）下がる変動パターン）が観察された。
【００７５】
（実施例５）
本実施例５では、野生型ヒトＥＧＦＲをＣＨＯ細胞に強制発現させ、ＰＩ３Ｋ阻害薬であるwortmannin（ＷＭＮ）で処置した後のＥＧＦ刺激に対する共鳴角の変化の評価に係る実施例について詳細に説明する。
【００７６】
ＷＭＮでの処置（１００ｎＭ  ３０ｍｉｎ）以外の工程にあたる、ベクターを用いた強制発現の方法、培養方法、ＥＧＦによる刺激工程（１０ｎｇ／ｍｌ）および共鳴角の変化測定に用いたＳＰＲ装置等は、前述の実施例１と同様である。
【００７７】
図１３は、実施例５に係る野生型ヒトＥＧＦＲを強制発現させたＣＨＯ細胞での、ＷＭＮ処置後ＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。図１３において、縦軸はＳＰＲ装置による共鳴角の変化を示し、横軸はＥＧＦ刺激からの時間を示す。図１３に示すように、Controlの場合（ＷＭＮ処置を行わない場合）と比較して、ＷＭＮ処置後ＥＧＦ刺激の場合（ＷＭＮ）の経時的共鳴角変化は、三相目のシグナルのみが特異的に抑制されている。この結果から、ＥＧＦ刺激由来のＳＰＲシグナルの三相目がＰＩ３Ｋによるものであることが示唆され、すなわち、当該三相目が抑制されているものは、ＰＩ３Ｋ系のシグナルに異常がある細胞と推測することが可能である。
【００７８】
（実施例６）
本実施例６では、野生型ヒトＥＧＦＲをＣＨＯ細胞に強制発現させ、１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌでのＥＧＦ刺激に対する共鳴角の変化の評価に係る実施例について詳細に説明する。
【００７９】
１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌでのＥＧＦ刺激以外の工程にあたる、ベクターを用いた強制発現の方法、培養方法および共鳴角の変化測定に用いたＳＰＲ装置等は、前述の実施例１と同様である。図１４は、実施例６に係る野生型ヒトＥＧＦＲを強制発現させたＣＨＯ細胞での、１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌでのＥＧＦ刺激による経時的な共鳴角の変化を示す図である。図１４において、縦軸はＳＰＲ装置による共鳴角の変化を示し、横軸はＥＧＦ刺激からの時間を示す。図１４に示すように、１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌで、それぞれＥＧＦ刺激を行うと、低濃度刺激である１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ刺激の方は、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ刺激と比較すると、同様のパターンの経時的な共鳴角の変化で、より弱いシグナルが観察された。すなわち、経時的変化パターンのシグナルが弱い場合には、ＥＧＦ刺激濃度を適宜調節することによって種々の生細胞のサンプルに最も適した分析が可能であることが示唆される。
【００８０】
実施例１ないし実施例６の結果から、生細胞を含むサンプルをそのまま本発明の分析の対象としても、当該サンプルに含まれる生細胞の評価・分析ができる可能性も示唆される。例えば、予め被験者から血液等の体液を採取しておき直接ＳＰＲ装置で分析することによって、何らかの腫瘍・癌細胞が含まれるか否かを評価でき、さらにはどの部分に変異（タンパク質の異常）があるかまでを判断できる技術に繋がる可能性も示唆される。
【００８１】
なお、前述の実施例では、全てＳＰＲ装置を用い生細胞の共鳴角（誘電率）の経時的変化パターンおよびその特性を観察したが、他の装置を用いて生細胞の誘電率の経時的変化パターンおよびその特性を計測等するようにしても構わない。
【００８２】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００８３】
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明者らは、表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ装置）を利用し、正常細胞と癌細胞とではＥＧＦ刺激に対して異なる共鳴角の経時的変化パターンの特性を示すということを解明した。さらに、異なる癌および癌細胞株の種類でもＥＧＦ刺激に対して異なる共鳴角の経時的変化パターンの特性を示すということも示した。また、ヒト血管肉腫細胞株についても、ＥＧＦ刺激に対して異なる共鳴角の経時的変化パターンの特性を有することを確認した。
【００８５】
そこで、本発明に係る生細胞の分析方法によれば、細胞の状態を、個々の生細胞のレベルにおいて、包括的かつ直接的に分析することができる。特に、細胞または組織を固定せず、かつ潜在的可能性として悪性腫瘍等を評価せずに、細胞の状態、がん細胞、癌の種類および癌細胞株の種類を分析可能であることは技術的価値が高い。
【符号の説明】
【００８６】
１  暴露試験部
２  誘電率測定部
３  誘電率経時的変化パターン特性抽出部
４  表示部
【図１】
0005946082.tif 000002
【図２】
0005946082.tif 000003
【図３】
0005946082.tif 000004
【図５】
0005946082.tif 000005
【図６】
0005946082.tif 000006
【図１３】
0005946082.tif 000007
【図１４】
0005946082.tif 000008
【図４】
0005946082.tif 000009
【図７】
0005946082.tif 000010
【図８】
0005946082.tif 000011
【図９】
0005946082.tif 000012
【図１０】
0005946082.tif 000013
【図１１】
0005946082.tif 000014
【図１２】
0005946082.tif 000015
【配列表】
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