(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）strain13由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列表の配列番号１）のＮ末端９３４番目から１６２５番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項２】
クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）strain13由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列表の配列番号１）のＮ末端９３４番目から１３４８番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項３】
クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）strain13由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列表の配列番号１）のＮ末端９３４番目から１４９５番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項４】
クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）strain13由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列表の配列番号１）のＮ末端９３４番目から１９２２番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項５】
消化管ムチンの糖鎖が、ＧｌｃＮＡｃα１−４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンである請求項１から４に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチドに関する。詳細には、特定の微生物由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの糖鎖結合モジュール（ＣＢＭ）領域を含むポリペプチドからなる消化管ムチン、特に胃ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチドに関する。これは、消化性潰瘍や胃癌等の原因となるピロリ菌の増殖を抑制する胃腺粘液由来ムチンを分離するために必要なポリペプチドである。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクターピロリ菌（Helicobacter pylori）は、消化性潰瘍や慢性胃炎を発症させる原因菌であり（非特許文献１、非特許文献２）、世界人口の半数に感染しているものと推察されている。
【０００３】
ピロリ菌は、胃粘膜の表層から分泌される表層粘液内に棲息するが、粘膜中ないし粘膜深層から分泌される腺粘液中に棲息していない。この腺粘液は特異的な構造を有する胃ムチンからなり、胃ムチン（ムチン型糖タンパク質）は、Ｎ−アセチルグルコサミンα残基（αＧｌｃＮＡｃ残基）とガラクトース残基（Ｇａｌ残基）とを有するＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンの糖鎖を特徴的に含んでいる。また、これらの糖鎖は、近年、胆嚢癌、膵臓癌、子宮頚癌その他の新生物出現に伴って現れることも報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
中山らは、αＧｌｃＮＡｃ残基を非還元末端に有するコア２分岐型Ｏ−グルカンが結合した糖蛋白質糖鎖がピロリ菌の増殖を抑制することを見出し、さらに、この増殖抑制が、ヘリコバクター類(ピロリ菌を含む)のみが有するグルコシルコレステロール合成酵素(ＣＨＬαＧｃＴ)（非特許文献４、非特許文献５）の酵素活性阻害であることを明らかにしている（非特許文献４）。ピロリ菌は、その増殖のためにグリコシルコレステロール成分（ＣＧＬ）を必須とするが、自らＣＧＬを合成できないため、外界からコレステロールを摂取し、菌の細胞膜付近でグルコースを付加して細胞壁を構築していると、考えられている。従ってこのようなαＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンの糖蛋白質糖鎖は、この細胞壁の構築を阻害する性質があると推察されるから、ピロリ菌特異的な増殖抑制剤としての応用が期待できるが、複雑で高分子量の糖蛋白質糖鎖であり、制御し難い反応条件で煩雑な多工程を経て調製しなければならないうえ、莫大なコストと大掛かりな製造設備を必要とし、実用的ではない。
【０００５】
また、特許文献１にＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ構造を有するオリゴ糖であるヘリコバクターピロリ結合性物質が開示されている。しかしこの物質は、多糖であって構造が複雑なため、多工程を経て調製しなければならないうえ、大量かつ簡便に調製できない。
【０００６】
一方、現在のピロリ菌感染の治療法は、これらの糖鎖を用いたものではなく、１種類のプロトンポンプ阻害薬と２種類の抗生物質との３剤併用による除菌が中心である。３剤併用療法では、耐性菌が出現して再発したり、副作用が発現したりするという問題を有する。
【０００７】
昨今の飲食品や医薬製剤に対して、特に健康保全性・安全性に関心が高まる中、安心して継続して飲食したり服用したりできる簡易な構造のピロリ菌増殖抑制剤の開発が、望まれていた。したがって、ヒトや家畜などが本来有する上記胃ムチンの活用が、ピロリ菌感染からのリスク低減化に極めて有効であると考えられる。
【０００８】
胃ムチンに特異的に結合するタンパク質、ポリペプチドは、これまで、堀田らにより見出されたモノクローナル抗体(ＨＩＫ１０８３、ＩｇＭ)を唯一挙げることができる（非特許文献６）。ＨＩＫ１０８３はαＧｌｃＮＡｃ残基を認識するモノクローナル抗体であり、病理検査などに利用されている。しかしながら、機能性物質としての胃ムチンの調製を考えた場合、高価な抗体の利用は現実的ではない。一方、胃ムチンの糖タンパク質糖鎖の非還元末端には、わずかながら、ガラクトース（Ｇａｌ）やＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が含まれるので、これらを認識するレクチン類の利用も候補に挙げることができる。しかし、抗体と同様、レクチンの調製も比較的高価であり、かつ結合性や特異性も劣るために、生産手段としての利用価値はあまり高くない。したがって、胃ムチンに多く含まれるαＧｌｃＮＡｃ残基を認識するリコンビナントタンパク質の発見が、問題の直接的な解決につながると考えられる。
【０００９】
糖結合モジュール（ＣＢＭ）は、これまで、セルロースやデンプンといった多糖類を分解する微生物由来の酵素（糖加水分解酵素）分子の一部に付随して存在し、その働きを補助する機能として、今までに多くの種類の微生物から同定されてきた。これらのＣＢＭと糖分子との結合が、結晶解析やＮＭＲといった手法により解析・同定されるようになり、糖分子への結合に必要なアミノ酸部位などが同定できるようになった。一方、近年アミノ酸配列を基にしたデータベースの発展等により、ＣＢＭは、ヒトの糖タンパク質糖鎖に対する加水分解酵素（ヒトの腸内常在菌由来）の一部にも存在することを示唆している。ＣＡＺＹサイト（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓサイト、http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html）内においてすでに公開されているＣＢＭファミリーは５９種にも及び、それらがそれぞれ何かの糖や糖鎖に結合するタンパク領域であることを推定している。しかしながら、これらのＣＢＭファミリーのうち、ヒトを含む動物が有するオリゴ糖や糖鎖、すなわちＮ−グライカンやＯ−グライカンなど（Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃやフコース（Ｆｕｃ))に結合するＣＢＭの報告例が少ないために、ＣＢＭファミリーからだけではどのような糖タンパク質糖鎖に結合するかの推定が困難である。
【００１０】
本発明者らは以前に、ＧｌｃＮＡｃがα１→４でガラクトースに結合するオリゴ糖鎖から、ＧｌｃＮＡｃを特異的に遊離させる酵素を腸内細菌より見出した（特許文献３）。この酵素はさらに、胃ムチンからＧｌｃＮＡｃを特異的に遊離させる活性を有していたことから、この酵素の性質について詳細に検討を行った。胃ムチンからＧｌｃＮＡｃを遊離させる酵素は、他に知られていない。すでにゲノムデータベースを基にした本酵素のアミノ酸配列の比較解析データ（BLAST
SEARCH）から、Ｃ末端領域に血液を共凝集させるＦＡ５８Ｃ領域を複数個有し、この領域は糖鎖に結合すると考えられる糖鎖結合モジュール（ＣＢＭ）に相同性を有することが示されている。しかしながら、これらの推定されたＣＢＭ領域は、これまでに糖分子との結合が判明している他の酵素や菌株由来のＣＢＭとの相同性は低い（最大でも３５％程度でありほとんどが２０％以下である）上に、これまでの報告により、一般的にはＣＢＭ領域が結合する糖鎖と、酵素の触媒領域、すなわち基質となる糖鎖とは通常関連性がないため、これらＣＢＭ領域が酵素の触媒をどのように補助するのか、あるいはどのような糖鎖に結合するのかは判明していなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００３−５１７０１５号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／０８４５６１号パンフレット
【特許文献３】特開２００７―２３６２０８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】マーシャル  ビージェー（Marshall  BJ）ら、ランセット（Lancet）、1984年、第Ｉ巻、p.1311-1315
【非特許文献２】ピーク  アールエム  ジュニア（Peek  RM  Jr）ら、ネイチャー  レビューズ  キャンサー（Nature  Reviews  Cancer）、2002年、第2巻、p.28-37.
【非特許文献３】ミカミ  ワイ（Mikami Y）ら、モダーン  パソロジー（ModernPathology）、2004年、第17巻、p.962-972.
【非特許文献４】ヒライ  ワイ（Hirai  Y）ら、ジャーナル  オヴ  バクテリオロジー（Journal  of  Bacteriology）、1995年、第177巻、p.5327-5333.
【非特許文献５】カワクボ  エム（Kawakubo  M）ら、サイエンス（Science）、2004年、第305巻、p.1003-1006.
【非特許文献６】イシハラ  ケイ（Ishihara  K）ら、バイオケミストリー  ジャーナル（Biochemistry  Journal）、1966年、第318巻、p.409-416.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、特異的にピロリ菌増殖を抑制するＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンを効率的に分離・抽出するためのタンパク質を提供することを目的として、消化管ムチン、特に胃ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記酵素において、触媒領域のみのポリペプチドと全長のタンパク質についての速度論定数を比較検討し、オリゴ糖鎖や合成基質（ＧｌｃＮＡｃをαで有する糖鎖、ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ―Ｒ（Ｒはパラメトキシフェニル（ｐＭＰ）など）やパラニトロフェニルＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮＰ）に対してほとんど触媒機能には差がないにもかかわらず、胃ムチンに対しては、後者がより強いＧｌｃＮＡｃ遊離活性を有することをつきとめた。したがって、Ｃ末端領域にあるＣＢＭ領域が、胃ムチンに対して強い親和性をもつのではないかと考えて検討した結果、本発明に到達した。
【００１５】
また、上記の特異性を有する酵素およびそのホモログのアミノ酸配列の一次構造の比較から、酵素の触媒領域とＣＢＭ様領域の配置がよく似た以下のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを見出した（図１）。それらは共通してＮ末端領域に一つのＣＢＭと触媒領域、Ｃ末端領域に複数のＣＢＭ領域。さらにＣ末端領域には、近年、細胞外タンパク質に共通して存在し、そのタンパク質を細胞外膜上にとどめる役割を果たすのではないかと推定されるＦＩＶＡＲ領域（Ｆｏｕｎｄ  Ｉｎ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｄｏｍａｉｎ）が見られる。以上の情報から、これらのタンパク質は消化管上もしくは消化管内に存在するムチン型糖タンパク質糖鎖と菌体（腸内細菌）の相互作用を促進させる役割があるものと推察した。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の胃ムチン結合ポリペプチドに関する。
（１）  グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの糖鎖結合モジュール（ＣＢＭ）領域を少なくとも１つ含むポリペプチドからなる、消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
（２）  グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが、クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium
perfringens）、ビフィドバクテリウム  ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ユーバクテリウム  ドリカム（Eubacterium
dolichum）、またはコリンセラ  スターコリス（Collinsella stercoris）由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである、（１）に記載の消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
（３）  クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）strain13由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＮ末端２番目から６番目までのＣＢＭ様領域を含むポリペプチドからなる、（２）に記載の消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
（４）  クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）strain13由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＮ末端２番目から６番目までのＣＢＭ様領域のうち少なくとも２つのＣＢＭ様領域を含むポリペプチドからなる、（３）に記載の消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
（５）  クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）strain13由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列表の配列番号１）のＮ末端９３４番目から１６２５番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる、（３）に記載の消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
（６）  前記ポリペプチドがα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの細胞膜上への推定アンカー領域（ＦＩＶＡＲ）を含まないことを特徴とする、（３）から（５）に記載の消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチド。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＣＢＭタンパク質を、そのまま固定化、もしくは融合体化して担体へ固定化して用いることにより、すでにヒトや家畜が本来有しているＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンに強い親和性を有するので（本発明のＣＢＭタンパク質は、結合の強さは少なくともμＭレベル（Ｋｄ≒１０−６レベル）であり、既存のレクチンに比べても糖鎖に対する結合力は強いことが予想される、実施例（２.３））、ピロリ菌に対して抗菌的に作用する安全な物質を効果的に得られる。このタンパク質は微生物により大量に調製・精製することができるので、工業的生産に適している。
【００１８】
このタンパク質は、従来の一般的な糖鎖に親和性を有する、いわゆるレクチン類とは異なり、その糖鎖に対する高い結合力、および遺伝子工学的な利便性を兼ね備えるために、産業上の利用性は高い。さらにＣＢＭ独自の利用法としては、例えばＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンが発現するような癌化に伴う病理組織検査や、そのグリカンの構造変化を検出するためのツールとしても用いることができる。また、以下に述べるようなこれらのＣＢＭタンパク、およびそのホモログを有する菌体においては、それらを高発現させた菌体をＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンが発現するような生体内部位へ移行・到達させることが可能となりうる。さらに、このようなＣＢＭタンパク質遺伝子を乳酸菌やビフィズス菌といったような善玉菌へ導入することにより、安全性の高い効果的な治療薬あるいは輸送媒体となりうる。
【００１９】
本発明により得られたピロリ菌増殖抑制剤を含有する飲食品は、胃疾患を軽減したり治癒したり予防したりするのに有用である。その物質が強いピロリ菌増殖抑制作用を発現するから、飲食品にピロリ菌増殖抑制剤を少量添加するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏する。
【００２０】
本発明のピロリ菌増殖抑制剤を含有する医薬製剤は、ピロリ菌に由来する慢性胃炎や胃潰瘍等の胃疾患の治療・症状緩和・予防に用いられる。また、糖鎖含有物質が強いピロリ菌特異的増殖抑制作用を発現するので、この医薬製剤を少量服用するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏し、副作用が発現せず、内科的治療で胃疾患を治癒するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホモログのアミノ酸配列の一次構造
【図２】調製するＣＢＭ領域
【図３】各種ＣＢＭ−ＧＳＴの糖蛋白質への結合
【図４】各種ＣＢＭ−ＧＳＴのＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有糖蛋白質への結合
【図５】各種ＣＢＭ−ＧＳＴのＬＡｃＮＡｃ含有糖鎖への結合力
【図６】各種ＣＢＭ−ＧＳＴのＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基を表層に持つ細胞への結合
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ムチンは、主にヒトやマウスなどの高等生物や一部の動物類の消化器官内に存在する糖蛋白質であり、本発明において胃ムチンとは、ヒトやマウス、およびブタなどの胃や十二指腸に存在する、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣやＭＵＣ６を含む混合物である。これらのうち、ＭＵＣ５ＡＣやＭＵＣ６は、Ｏ−結合型糖鎖が密集した構造を有していることが特徴であり、ＭＵＣ５ＡＣとＭＵＣ６はお互い混合せずに分離して存在することが示されている。特にＭＵＣ６が有するＯ−結合糖鎖の非還元末端には、以下のようなＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基が高度に結合しており、シアル酸含量が低いことから、その溶液は中性を示す。またＭＵＣ６は、胃体部粘膜下部の副細胞から分泌されるので、結果的にこれらの周辺（胃体部粘膜下部）、すなわち胃粘膜下の粘膜筋板に近い部位に多く存在することが知られている。本発明において用いるブタ胃ムチン（PGM
TypeIII(Sigma)および、PGM ClassIII(PGM TypeIIIより精製)）は、ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンを有するＭＵＣ６を比較的多く含有するムチンであることが知られている。
【００２３】
本発明において用いられるタンパク質は、クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium
perfringens strain13）由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣ末端に付随する複数のＣＢＭ領域のＮ末端２番目から６番目までを含む領域が特に好ましいが、複数のＣＢＭをＣ末端側に有するグリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのホモログは、ビフィドバクテリウム  ビフィダム(Bifidobacterium
bifidum)やユーバクテリウム  ドリカム（Eubacterium dolichum）やコリンセラ  スターコリス（Collinsella stercoris）にも見られるので、それらも本法と同様に用いることができる。これらＧＨ８９に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの複数のＣＢＭは、アミノ酸配列比較により、相同性は低いながらも（３５％程度以下）すべてＣＢＭ３２というファミリータンパクであることが推定されている。したがって、これらの複数のＣＢＭ領域がタンデムに並んだ部位を持つ上記菌体由来のホモログも、同じ糖タンパク質糖鎖に対して親和性を有する可能性が高い（図１）。
【００２４】
クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens
strain13）由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＣ末端に付随する複数のＣＢＭ領域のＮ末端２番目から６番目までのタンパク質は、特許文献３を参照して、以下の実施例のように調製することができる。また、その他のホモログからのＣＢＭも同様に調製することができる。
【００２５】
これらのＣＢＭは、担体へ固定化して用いることにより、上記物質を吸着・溶出して、最終的に抗ピロリ菌物質を得ることができる。また、これらのＣＢＭはその他のタンパク質と融合型としても用いることができるので、調製したＣＢＭを担体へ固定化したり、その他の機能性タンパク質との融合タンパク質としても用いることができる。
【００２６】
本発明において調製したタンパク質の、ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンに対する親和性を発揮する条件は、ｐＨ４から９の緩衝溶液中であれば用いることができるが、具体的には以下のようになる。
【００２７】
溶液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などの例を挙げることができ、特にリン酸緩衝化生理食塩水（ｐｈｏｓｐａｈｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）が好ましい。溶液のｐＨは、中性付近が好ましく、ｐＨ６．０からｐＨ８．０が特に好ましい。反応の温度は、１５℃から４０℃が好ましく、２５℃が特に好ましい。反応の時間は、タンパク濃度が数μＭから数百μＭで数十分から１０時間が好ましく、30分〜２時間程度が特に好ましい。しかしながらタンパク濃度が数十ｎＭ以下では5時間以上で、比較的高く結合させることができる。反応容器においては、系内の温度を制御でき、かつ溶解しているタンパク質や糖質化合物を特に吸着させるものでないかぎり、どのようなものを用いてもよい。また、反応においては、撹拌や振とうを行えば、反応時間を短縮することができる。
【００２８】
以下に、本発明の消化管ムチンの糖鎖に特異的に結合するポリペプチドを調製し、その機能を調査した実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２９】
（１．１  ＣＢＭの調製）
特許文献３を参考に、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens strain13)のゲノムを鋳型として遺伝子増幅（増幅領域と用いたプライマーを図１と表１に示す）を行い、制限酵素(SacIおよびXhoI)処理を行った後、タンパク質発現用ベクター（市販(Takara)のコールドショック系タンパク質発現用ベクター(pcold
TF)のマルチクローニングサイトへグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)遺伝子を導入したプラスミド）へ、制限酵素サイト(5'末端側にSacIと3'末端側にXhoI)で導入し、発現宿主である大腸菌(BL21(DE3))へ形質転換した。これをアンピシリン濃度50μg/mlを含有するLB培地中(2ml)で前培養し、さらに同培養液1000ml中でOD600で0.6になるまで30℃で3時間、震盪培養した。その後、IPTGを0.05mM、グルコース0.5%で添加し、１５℃、２４時間震盪培養することで、本タンパク質を発現した大腸菌を調製できた。集められた菌体へ、1mg/ml濃度でリゾチームを添加し(全量4ml)、さらにPBS溶液を加え全量を20mlとした。この懸濁溶液を氷上で超音波破砕し、20000×gで10分遠心後、上清を市販のHis-tagアフィニティーカラムを使った精製法(MN社、Protino-Ni-TED2000)、もしくはグルタチオンビーズ（ＧＥヘルスケア）を使用した精製法により精製した。溶出は200mMイミダゾール（His-tagによる精製法）もしくは20mM還元型グルタチオン（GST-tagによる精製法）を用いて行った。この溶液を、限外濾過膜(排除分子サイズ100000)を用いることにより、上記精製に用いたイミダゾールもしくは還元型グルタチオン等を除き、結果的に目的タンパク質をリッター培養あたり100-200mgで得ることができた。
【００３０】
【表１】
0005951199.tif 000002
【実施例２】
【００３１】
（２．１  調製したＣＢＭのＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンに対する親和性の調査、ドットブロットによる調査）
ＰＢＳに溶解した種々の糖蛋白質糖鎖および糖鎖（ウシ顎下腺ムチン（シグマ、Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｓ、BSM（図３））、ヒト消化管ムチン（和光、HGM（図３））、ブタ胃ムチンの粗精製物（シグマ、ＴｙｐｅＩＩＩ、PGM
TypeIII（図３））、ブタ胃ムチン（ＴｙｐｅＩＩＩムチン）の精製物（関東化学、PGM ClassIII（図３））、フェツイン（シグマ、Fetuin（図３））、アシアロフェツイン（シグマ、Asialo
Fetuin（図３））、コンドロイチン硫酸（生化学、Ｃ．Ｓ．（図３））、ヘパリン硫酸（生化学、Ｈ．Ｓ．（図３））１μｇ／μＬ溶液の１０μＬをニトロセルロースメンブレン（ＰＲＯＴＲＡＮ  ＢＡ−８０、ＷＨＡＴＭＡＮ）にスポッティングし、６０℃、１時間乾燥させた。メンブレンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳに溶解した３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ)に、室温3時間浸漬することで、ブロッキングした。各ＣＢＭ−ＧＳＴタンパク質をＰＢＳに溶解した溶液１ｍＬ（１μＭ）を、ブロッキング後のメンブレンに添加し、２５℃で２時間インキュベートした。メンブレンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ４ｍＬにて５回洗浄し、１ｍＬの西洋わさび由来のパーオキシダーゼが融合した、抗ＧＳＴモノクローナル抗体（ナカライテスク、（１：２５，０００））を添加した。室温で１時間インキュベート後、メンブレンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ４ｍｌにて５回洗浄し、結合した上記モノクローナル抗体を、ケミルミネッセンス試薬（ＥＣＬプラス、ＧＥヘルスサイエンス）による発光により検出した。結果を図２に示す。
【００３２】
以上の結果から、調製したＣＢＭは、ムチン型糖蛋白質に強い結合性を有し、特にＣＢＭ４領域を含むＧＳＴ融合体が、αＧｌｃＮＡｃ含有ＰＧＭＣｌａｓｓIIIムチン、すなわちＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンを有する糖蛋白質糖鎖に強く結合することが示された。また他の糖鎖には結合しにくいこともわかった。さらに、各ＣＢＭ−ＧＳＴの比較から、少なくともＣＢＭ４領域がＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカン、すなわち非還元末端のαＧｌｃＮＡｃへの結合に必要であることもわかった。またＣＢＭ４−５−ＧＳＴはへパリンに結合することもわかった。これは、へパリンはＧｌｃＮＡｃα−もしくはＧｌｃＮ−ＳＯ４残基を有することから、ＣＢＭ４領域がへパリンの結合にも関与することが考えられる。
【００３３】
（２．２  調製したＣＢＭのＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンに対する親和性の調査、サンドイッチイライザによる調査）
ＰＢＳ溶液に溶解させたブタ胃ムチン（ＴｙｐｅIII，シグマ）の０．５％溶液１００μＬを、ＧｌｃＮＡｃがαで結合した糖鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体（ＨＩＫ１０８３）を固定化したサンドイッチエライザキット（関東化学）のエライザプレートの各ウェルに注入した。プレートを３７℃で２時間静置した後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳの４００μＬにて５回洗浄した。次に、１００μＬの西洋わさび由来のパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）が融合した、抗ＧＳＴモノクローナル抗体（ナカライテスク、（１：２５，０００））を添加した。室温で１時間インキュベート後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ４００μＬにて５回洗浄し、結合した上記モノクローナル抗体を、キットに付属したＨＲＰ反応試薬を添加後３０分静置した後停止し、マイクロプレートリーダーで検出（４２０ｎｍ）した。結果を図４に示す。
【００３４】
結果から、ＣＢＭ２−６−ＧＳＴが強くＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有糖蛋白質へ結合することが、有意差を持って示された。尚、実施例２で示されたドットブロットの結果により、ＣＢＭ２−４−ＧＳＴ，ＣＢＭ２−５−ＧＳＴ，およびＣＢＭ２−６−ＦＩＶＡＲ−ＧＳＴもプレート上のＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基に結合していると考えられるが、本方法においてはＣＢＭ２−６−ＧＳＴに比較して、有意差を持って示されなかった。
【００３５】
以上の結果より、本発明により提供されたＣＢＭ２−６タンパク質がピロリ菌増殖抑制作用を有する糖蛋白質へ結合することが示された。また、これらの結果から、Ｃ末端領域に複数のＣＢＭ３２（もしくはＦＡ５８Ｃ）領域を含むＧＨ８９ファミリーのα―Ｎ―アセチルグルコサミニダーゼにおいては、その触媒領域よりもＣ末端方向に存在する複数のＣＢＭ領域を含むタンパク質がαＧｌｃＮＡｃ含有ムチンに結合することが推定された。すなわち、この領域を含むタンパク質の調製が、ピロリ菌増殖抑制作用を有する糖蛋白質調製にとって重要であることがわかった。
【００３６】
（２．３  調製したＣＢＭの蛍光基を含有したＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ化合物への結合力の検証）
Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ―Ｒ）の還元末端（Ｒ）を、ポリエチレングリコールを介してテトラメチルローダミン基に結合させた化合物（ＬＡｃＮＡｃ−ＴＭＲ、ＭＷ；１１４１．４）をＰＢＳに溶解させ、調製した各種ＣＢＭ−ＧＳＴ（ＣＢＭ２−３―ＧＳＴ、ＣＢＭ３−４―ＧＳＴ、ＣＢＭ４−５―ＧＳＴ、ＣＢＭ５−６―ＧＳＴ、ＣＢＭ２−６―ＧＳＴ、ＣＢＭ３−６―ＧＳＴ、ＣＢＭ４−６―ＧＳＴ、ＧＳＴをＰＢＳに終濃度（１ｎＭから１μＭ）で添加し、その時の拡散時間をオリンパスＭＦ−２０により測定した。この結果により、ＬＡｃＮＡｃ−ＴＭＲへの結合力の比較により、ＣＢＭ３−６―＞ＣＢＭ２−６―＞ＣＢＭ５−６−＞ＣＢＭ４−５−＞ＣＢＭ４−６−＞ＧＳＴ＞ＣＢＭ３−４−と推定された。
【００３７】
以上の結果とドットブロット等（実施例２．１および実施例２．２）の結果より、ＣＢＭ２とＣＢＭ５が少なくともガラクトース（Ｇａｌ）への結合に関与することが推察された。さらに、上記の方法において、同時に蛍光偏光度（ｍＰ）を蛋白質の濃度変化とともに測定することで、ＣＢＭ２−３−ＧＳＴおよびＣＢＭ２−６−ＧＳＴのＬＡｃＮＡｃ−ＴＭＲへの結合力を、解離定数（Ｋｄ）としてそれぞれ、１．４２２μＭ、４．００７μＭであることを算出することができた（図５）。
【実施例３】
【００３８】
αＧｌｃＮＡｃ残基を安定発現しているＡＧＳ細胞（非特許文献５）およびコントロール細胞に対するＣＢＭタンパクの結合性を調べた。
１２Ｗｅｌｌ細胞培養プレートの中に入れたスライドガラス上において細胞を一晩培養した。スライドガラスをＰＢＳで一回洗浄した後、３．７％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ溶液に１０分間浸漬して細胞を固定化した。さらにＰＢＳで一回洗浄した後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００溶液に５分間浸漬した。ＰＢＳにて３回洗浄した後、１％ＢＳＡ溶液を用いて３０分間ブロッキングを行った。０．４μｇ/ｍｌのＣＢＭ２−３−ＧＳＴ溶液およびＣＢＭ２−５−ＧＳＴ溶液１００μｌをスライドガラス上に載せ、室温で一時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、一次抗体である抗ＧＳＴ−tag抗体（０．５μｇ/ｍｌ）を一時間反応させ、さらにＰＢＳで３回洗浄したあと、二次抗体である抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体(０．５μg/ｍl）を３０分反応させた。ＰＢＳで十分に洗浄した後、カバーガラスを上からかけて封入し、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、α−ＧｌｃＮＡｃ安定発現ＡＧＳ細胞(α４ＧｎＴ  ｃｅｌｌ)に対して、ＣＢＭ２−５−ＧＳＴタンパクが強く結合することが明らかとなった（図６）。
【実施例４】
【００３９】
実施例１を参考に、ビフィズス菌（Bifidobacterium bifidum JCM）のゲノムを鋳型にして遺伝子増幅（Ｃ末端領域にある５つのＣＢＭをコードする領域）を行い、制限酵素処理後、タンパク質発現ベクター（pET23a、Takara）へ組み込み、実施例３と同様に目的タンパク質を発現誘導させ、精製した。このリコンビナントタンパク質を用いて、実施例２と同様の検討を行った結果、消化管ムチン、特にＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基含有Ｏ−グリカンを有する糖蛋白質糖鎖に強く結合することが示された。また同様に他の糖鎖には結合しにくいこともわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により提供されたタンパク質を用いた糖鎖分離・抽出方法は、腸内細菌類が有する糖鎖結合ツールを利用する全く新しい方法であり、用いるタンパク質は、従来の一般的な糖鎖に親和性を有する、いわゆるレクチン類とは異なり、その糖鎖に対する高い結合力、および遺伝子工学的な利便性を兼ね備えるために、産業上の利用性は高い。
【００４１】
したがって、調製したタンパクは、ムチン型糖蛋白質糖鎖に関連する加水分解酵素や糖転移酵素への融合による活性強化因子として、およびムチン型糖蛋白質糖鎖（特にＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ残基を含有する）を発現する癌組織の病理検査ツールとしても有用である。
【符号の説明】
【００４２】
ＣＢＭ  糖結合モジュール
ＦＩＶＡＲ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｄｏｍａｉｎ
ＴＭ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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