(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚上脱感作のための組成物を製造するための該アレルゲンの使用であって、
（ｉ）対象の皮膚への適用時にその皮膚の適用部位で炎症反応を生じる該アレルゲンの投与量を決定すること、
（ｉｉ）アレルゲンと皮膚との間の接触を確実にする、すぐに使える皮膚用デバイスにより、対象の皮膚へ該投与量のアレルゲンを適用して、適用部位で炎症反応を誘導すること、および
（ｉｉｉ）皮膚へのアレルゲンの反復適用により該炎症反応を持続させ、該持続が反復適用の間、アレルゲンの用量、頻度、形態または適用時間のうち一つ以上を調節することを含み、該持続された反応がＩｇＧの増加を引き起こし、対象の脱感作もたらす、
使用。
【請求項２】
ＩｇＧが、ＩｇＧ４である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｔｈ１リンパ球の方向に免疫応答をシフトすることにより、持続させることが、該アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の寛容を誘導する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
反復適用の間に炎症反応が増大した場合、持続させる炎症反応は、アレルゲンの用量、頻度、形態または適用時間のうち１つ以上を減らすことを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
反復適用の間に炎症反応が低下した場合、持続させる炎症反応は、アレルゲンの用量、頻度、形態または適用時間のうち１つ以上を増やすことを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
アレルゲンを対象の無傷の皮膚に適用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
アレルゲンが、粉末の形態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
アジュバント化合物を使用せずにアレルゲンを適用する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
すぐに使える皮膚用デバイスが、皮膚密封デバイスである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
炎症反応が少なくともリファレンスの程度に到達するまでアレルゲンまたはデバイスを皮膚上に維持する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
リファレンスの程度が、浸潤した紅斑病変としての、または湿疹状の様相を呈する、肉眼で視認できる炎症反応である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
デバイスの裏打ちが、炎症反応を見えるようにする透明領域を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
透明領域上に、炎症反応の程度を評価できるグリッドが印刷されている、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
炎症反応を見えるようにするため、デバイスが除去可能である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
異なる形態のアレルゲンに対する対象の炎症反応を決定する工程、および治療形態を選択する工程をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
アレルゲンが、食物、呼吸または皮膚アレルゲンである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、アレルギー患者を脱感作する方法に関する。より詳細には、任意の型のアレルゲンおよび患者に適用可能な皮膚上脱感作の方法に関する。本発明の方法は、本質的に非侵襲性であり、アジュバントの使用を必要としない。さらに、容易に適用することができ、実際の患者によりフォローができる。
【０００２】
アレルギーは日常的医療業務において、ますます大きな位置を占めつつある。それはＷＨＯにより第四の世界的災厄として分類されている、世界的な公衆衛生上の現象である。フランスでは三人に一人のフランス人にアレルギーがあり、また呼吸および食物アレルギーの両方が成人および子供の集団を冒し、その割合は増大しつつある。
【０００３】
脱感作は、最小量のアレルゲンを投与することにより、程度の差はあるがアレルギー現象を抑制できる技術である。それは２０００年代初めより、アレルギーを根本的に治療する唯一の方法としてＷＨＯに認められてきた。
【０００４】
現在、脱感作が、アレルゲンに対する免疫反応に、その第一段階において速やかに影響を及ぼすことが立証されており（Tij et al., 2004）、それは、脱感作が、短期アレルギー反応に関係する症状を低減させるのみならず、アレルギー「疾患」の自然経過を改変するということ、そして、脱感作が、新たなアレルゲンに対するアレルギーの発現を防止するのみならず、より重度の臨床徴候に至る症状の進行、例えばアレルギー性鼻炎から喘息への変化を防止するということを意味している。
【０００５】
限定された数のアレルゲンに感作されている重度のＩｇＥ依存性アレルギーに罹患している患者において、免疫療法が有効であることが証明されている。
【０００６】
免疫療法による処置の作用メカニズムはまだあまりよく知られていないが、免疫療法は以下の事柄：
●  ＩｇＥの生物学的効果をインビトロで遮断する抗体である、ＩｇＧ、特にＩｇＧ４画分の増加（但し、インビボにおけるこれらの効果の意義は尚、評価の必要がある）、
●  ＴＨ１反応を促進する、ＴＨ１／ＴＨ２バランスの変化
●  インターロイキン１０（ＩＬ−１０）を産生するＴ細胞の産生。ＩＬ−１０は、肥満細胞、或る種のＴリンパ球および好酸球に対する抗アレルギー性を有し、さらにＩｇＧ４の産生を促進する
によって作用し得る。
【０００７】
皮下経路による免疫療法は殆どのアレルギー学者にとって標準的な経路であり、今もなお広く使用されている。費用がかかり、各注射の際に専門医の介入を要するものの、それは今日でも尚、小児における標準的脱感作経路であると考えられている（Pajno et al., 2005）。しかしながら、死亡頻度が注射２５０万回あたり１例で、１年に平均３．４例の死亡があると見積もられていることから、リスクがない訳ではない。
【０００８】
リスクの高い反応を伴う或る種のアナフィラキシー性アレルゲンは、皮下脱感作治療の範囲内では使用されない。これは落花生および殆どの食物アレルギーに該当する。
【０００９】
皮下経路による免疫療法に代わる満足できる方法として、現在、舌下免疫療法がＷＨＯによって考慮されている。それは多くの国で評価中である。舌下に投与される一般大衆向けの最初の市販錠剤調製品は、欧州の幾つかの国で販売されており、米国で市場導入前段階にある。
【００１０】
患者の免疫寛容が非常に高いため、舌下免疫療法は多くの著者にとって他の投与経路よりも費用効率がよい。何故なら、それは医師の介入を必要とせず、患者が自己投与でき、そのことが、患者が他の経路よりも舌下法を好むことにつながるためである（Pajno et al., 2005）。
【００１１】
舌下経路による処置中の有害反応は稀であり、１０００回の投与に対して０．１〜０．２回の反応であると見積もられている。反応の大部分は軽微であり、口腔もしくは舌下領域または胃腸領域に作用する（La Rosa et al., 1999）。
【００１２】
しかしながら、有効性の点では、舌下経路は皮下経路よりも有効性が低いと考える人々もいる。落花生および牛乳に対するこの脱感作経路による試験が進行中であるとは言え、舌下経路はより大量のアレルゲン使用を要し、全てのアレルゲンについて認められる訳ではない。食物アレルギーに関してこの技術を利用することの安全性は未だ評価中である。
【００１３】
鼻内免疫療法は、１８の対照研究のうち１７において有効であると証明されている。したがってこれは、最低限アレルギー性鼻炎の際の有効且つ安全な経路である。しかしながら、一般に患者の寛容性が低く、そのことが臨床使用を次第に限定させている。
異なる脱感作経路を比較する研究において、鼻腔経路による処置は、１年たたないうちに症例の５０％近くが早期に中断し、一方、早期中止は、皮下または舌下経路で処置された子供の１０％未満に関与するだけであった（Pajno et al., 2005）。
【００１４】
これらの脱感作方法に対する好都合な代替法が、皮膚上経路、即ち、皮膚上にアレルゲンを反復適用し、一般に大幅な経皮通過を伴わずに、典型的には皮膚表層へのアレルゲンの拡散を導くことによる、免疫療法実施の可能性にある。
【００１５】
皮膚上へのアレルゲンの反復適用により該アレルゲンに対する動物の感作を引き起こすことができるということが、動物において長年にわたり立証されてきた（Golovanoff, 1926）。得られる反応は全身型のものであり、身体全体に、したがって単なる皮膚領域を遙かに超えた身体に作用する。
【００１６】
より最近になって、皮膚上経路により牛乳に対して感作されたマウスモデルが開発された（Chang）。これらの場合、誘発された免疫反応は異なる細胞集団に関連し、ＴＨ２リンパ球の活性化をもたらし、それが該アレルゲンに特異的なＩｇＥ型抗体の産生を促進するということが示されている。
【００１７】
或る研究において、刺激条件下における皮膚の自発的反応が事実上ＴＨ２型のものである場合、その皮膚を異なる刺激：
●  紫外線のような物理的手段による侵襲、
●  角質層の構造を改変する反復ストリッピングによる皮膚の機械的侵襲、
●  コレラ毒素のような微生物による侵襲、
●  皮膚浸透性の改変、
に付すことによってその反応の免疫プロファイルを改変できるということが立証できた。
【００１８】
アレルゲンの接触に対するこの種の免疫反応は、このような種々の因子により改変されることがあり、ＩｇＧ４型抗体の産生を促進するＴＨ１リンパ球の選択的活性化をもたらす。
【００１９】
皮膚上経路は５０年代にアレルギー学者により利用された。それは、週に数回アレルゲンを滴下することにより皮膚上で乱切法を実施することから成っていた（Pautrizel et al., 1957）。熟練したアレルギー学者の実施により、この技術は有効性および安全性を提供した。しかしながら、ごく小規模で実施され、あまり標準化されなかったため、依然としてさほど普及していない。最終的に、しばしば非常に長期且つ損傷性である、乱切の反復がもたらす困難が、この方法が今日放棄されている疑う余地のない理由である。
【００２０】
特許出願ＥＰ１０３１３４６号は、脱感作を獲得するための経皮デバイスおよび抗原またはアレルゲンを含むワクチンを提起しており、また、出願ＷＯ２００７／１２２２２６号は、アレルギー対象を脱感作するための皮膚用デバイスの使用を記載している。しかしながら、これらの文書に記載された方法は、サイトカインの活性を誘導する化合物（例えばアジュバント）を使用しており、アレルギー対象の有効な脱感作を可能にする寛容原性型炎症反応を標的としてはいない。
【００２１】
本発明は、有効な皮膚上脱感作方法の開発に存するものであり、これにより、先行技術の欠点および限界を克服できる。
【００２２】
より詳細には、本発明は、部分的には、アレルゲンの皮膚適用により引き起こされる特異的炎症反応が、寛容という意味で免疫細胞の反応に大きく影響し且つそれに参加するということの証明に存するものである。
【００２３】
本発明は、炎症反応を惹起するため、皮膚にアレルゲンを反復的に且つ長期間適用することから成り、その適用の継続および反復により方向付けられる該炎症反応のプロファイルは、「寛容原性」型プロファイルである。したがって、本発明は炎症反応を誘発することだけでなく炎症反応への方向付けをも目的とするものである。
【００２４】
本出願は、この炎症反応の制御が、得られる寛容の程度を調整し、且つ皮膚上脱感作プロセスの本質的要素に相当することを示す。本発明は、この特異的炎症反応の反復誘発が、寛容という意味で免疫反応を徐々に反転させるために重要であること、そしてそれが、アジュバントまたは皮膚前処置の不在下であっても皮膚上脱感作を可能にすることを示すものである。
【００２５】
したがって本発明は、皮膚へのアレルゲン適用により生ずる炎症を、この処置の間持続させるような条件の下で、対象の皮膚にアレルゲンを反復して皮膚適用することを含む、皮膚脱感作方法を初めて提起するものである。好都合なことに、本方法は、皮膚へのアレルゲン適用により生ずる炎症の程度を監視および／または評価するための少なくとも１つの工程を含み、この反応の誘発、持続および／または制御が、寛容という意味で身体の反応を該アレルゲンに向かわせる可能性を与える。
【００２６】
したがって本発明の目的は、或るアレルゲンを対象の皮膚に反復適用することによる、該アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚上脱感作のための組成物を製造するための該アレルゲンの使用に存するものであり、その使用は、処置の間炎症反応を持続させる条件の下で該アレルゲンを皮膚に適用することを特徴とする。本発明はまさに、この炎症反応の持続が、免疫系からアレルゲンへの寛容原性型反応を促進することを示している。
【００２７】
本発明のもう一つの目的は、或るアレルゲンを対象の皮膚に反復適用することによる、該アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚上脱感作のための組成物を製造するための該アレルゲンの使用に存するものであり、その使用は、処置の間、好ましくは該アレルゲンの各適用の間、該アレルゲンを皮膚に適用することにより生ずる炎症反応を制御しそして／または持続させるための工程を含むことを特徴とする。
【００２８】
本発明のもう一つの目的は、或るアレルゲンを対象の皮膚に反復適用することによる、該アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚上脱感作のための組成物を製造するための該アレルゲンの使用に存するものであり、その使用は、処置の間、皮膚への該アレルゲンの適用により生ずる炎症反応の制御および持続を含むことを特徴とする。
【００２９】
本発明のもう一つの目的は、或るアレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の免疫反応を、寛容化という意味で改変するための組成物を製造するための該アレルゲンの使用に存するものであり、その使用は、処置の間、炎症反応を持続させる条件の下で該アレルゲンを対象の皮膚に反復適用することを含む使用に存するものである。
【００３０】
本発明はさらに、或るアレルゲンを対象の皮膚に反復適用することによる、該アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚上脱感作方法に関するものであり、該アレルゲンが、処置の間、炎症反応を持続させる条件の下で皮膚に適用されることを特徴とする。
【００３１】
後に本明細書に詳述するように、この炎症反応は、処置の間、アレルゲンの用量もしくは頻度もしくは適用時間および／またはその性質を制御または調節することにより、都合良く持続する。
【００３２】
本発明のもう一つの目的は、或るアレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚上脱感作方法に存するものであり、その方法は、処置の間、皮膚への該アレルゲンの適用により生ずる炎症の程度を評価する、少なくとも１つの工程を含むことを特徴とする。炎症反応の程度を評価することにより、必要ならば脱感作の条件を調節することができる。
【００３３】
本発明はさらに、或るアレルゲンを対象の皮膚に反復適用することによる、該アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象を脱感作するための方法であって、アレルゲンの各適用において炎症反応を制御する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００３４】
本発明はさらに、或るアレルゲンを対象の皮膚に反復適用することによる、該アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象を脱感作するための方法であって、処置の間、皮膚への該アレルゲンの適用により生ずる炎症反応を持続させることを含むことを特徴とする方法に関する。
【００３５】
さらに本発明は、患者の処置をアレルゲンに対する皮膚上脱感作に適合させるため、該患者の皮膚に該アレルゲンを適用することにより生ずる炎症反応をマーカーとして使用することに関する。
【００３６】
後に本明細書に記載するように、本発明はいかなる種類のアレルゲンにも適用可能であり、また、いかなる皮膚適用デバイスによっても適用できる。それは、前もって患者の皮膚を処置する必要を伴わずに有効な脱感作をさせる。さらにそれは、アジュバント化合物の同時投与を必要としない。
【００３７】
アレルギー対象の皮膚に置くアレルゲンの使用は、アトピーパッチ試験を使用する診断分野における集積された経験によって証明されるように、全く安全である。２００４年から市販されている、すぐに使用できる最初のアトピーパッチ試験であるDiallertest（登録商標）によるフランスでの本発明者等の経験では、重度の局所作用であろうと全身型の全般性反応であろうと、有害反応は報告されていない。
【００３８】
皮膚へのアレルゲン適用後、免疫系は、全身免疫反応の局所（皮膚）炎症反応を呈することもあれば呈さないこともある。
【００３９】
本発明の特別な態様では、或るアレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚への該アレルゲンの適用は、アレルゲンが皮膚表面に存在する角化細胞およびランゲルハンス細胞と接触することにより始動する皮膚反応、特に炎症型の皮膚反応を誘発する。
【００４０】
本発明方法による皮膚免疫療法では、或るアレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚への該アレルゲンの適用により引き起こされるこの反応が、治療の間持続し、そして／または制御される。本発明はまさに、この反応の持続および制御が、該アレルゲンに対する対象の寛容という意味における、この免疫反応の漸進的方向付けをもたらすことを示す。この反応は、臨床的には、皮膚反応性の漸進的低下または完全な消失によって、そして該アレルゲンに対する寛容閾値の増大によって実体化する。
【００４１】
上に述べたメカニズムは任意のアレルゲン、特に消化器領域（例えばオボアルブミン、落花生、甲殻類などに対するような食物アレルギー）、肺領域（例えば花粉に対するような呼吸アレルギー）または皮膚領域に作用するアレルゲンに適用される。
【００４２】
したがって、本発明方法が基礎としており、後に記載する実験データによって完全に説明されている原理は、過去に或るアレルゲンに対して感作された対象の寛容を、皮膚経路を介して誘導できるということである。この効果は、該アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚にアレルゲンを維持することによって、そしてそうすることにより、寛容という意味において身体の反応を該アレルゲンに向かわせる目的で、アレルゲンに対する炎症反応の惹起、持続および制御を引き起こすことによって得られる。
【００４３】
したがって、本発明に係る皮膚上免疫療法は、或るアレルゲンに対するアレルギーを持つ対象において皮膚の免疫細胞（例えばランゲルハンス細胞、肥満細胞、マクロファージ、白血球）を該アレルゲンと接触させ、そして、特異的な、制御され持続した細胞炎症反応を介して免疫反応の転換を誘発し、その結果、該アレルギー患者による該アレルゲンに対する寛容を引き起こすことから成る、アレルギーの治療法である。本発明方法においては、脱感作に対する従来の全てのアプローチとは異なり、患者の炎症反応の性質および程度によって脱感作プロセスが監視および誘導される。このアプローチは、各患者のニーズおよび性質に合わせて調節可能な効果的な脱感作を提供し、アジュバント化合物の使用または事前の皮膚の穿孔もしくは摩耗処置を必要としない。
【００４４】
本発明方法は一般に、処置の間、或るアレルゲンに特異的な炎症反応を持続させる条件（例えば、用量および／または頻度および／または適用時間の条件）の下で、該アレルゲンに対するアレルギーを持つ対象の皮膚に、該アレルゲンを反復して、長時間、そして制御して適用することを含む。或る好都合な態様では、この適用をアジュバント化合物を使用せず、そして／または健康な皮膚上で遂行する。
【００４５】
本発明は一般に以下の相：
ａ．場合による、患者および／またはアレルゲン（用量、性質、製剤など）の選択；
ｂ．患者へのアレルゲンの適用；および、
ｃ．炎症反応の制御；工程ｂおよびｃは、処置の間、１回または数回反復するのが有利であり、アレルゲンの状態（用量、性質、製剤、適用頻度、暴露時間など）は、炎症反応を持続させるため、処置の間、適宜変化させる
を含む。
【００４６】
本発明が炎症反応の制御に基づいている限り、この処置を受けるアレルギー患者は、皮膚への最初のアレルゲン適用の際に係る反応を示すということが重要である。このためには、処置開始時に最適な反応性を与えるアレルゲン調製物が決定できるよう、患者は初回の（一連の）アレルゲン適用を受けるのが好都合である。この目的のため、患者は、前もって規定された形態および単回投与で該アレルゲンの初回適用を受けるのが好都合である。
【００４７】
対象が適当な炎症反応を発現したならば、このアレルゲンの用量／形態に基づいて処置が行われ得る。適当な反応とは、例えば、典型的には、丘疹を伴うもしくは伴わない浸潤した紅斑病変として肉眼で視認できる、または湿疹状の様相を呈する、炎症反応を指す。
【００４８】
確認された反応の強度が高く、例えば小胞または小水疱さえ含んでいたり、周辺の皮膚領域に広範囲に及んでいたり、極めて痒疹性であったりした場合は、適切な反応を得るために、治療を開始させるためのアレルゲン濃度を低下させるか、或いは皮膚へのアレルゲン適用時間を短縮する。
【００４９】
逆に、確認された反応の強度が低すぎた場合は、上に定義したような有意な初期反応を得るために、アレルゲンの用量および／または適用時間および／または同時に適用されるデバイスの数を増やす。この場合、より良好な反応性を対象に与える調製物を特定するため、他の形態のアレルゲンを試験してみることもできる。したがって実際には、アレルゲンは、アレルギー患者に種々の炎症反応を誘発させ得るような、異なる形態（完全な食品、タンパク質抽出物、ペプチド、組換えまたは合成製品など）で存在し得る。このようにして、この処置の第一相が、治療開始のために最適な形態のアレルゲンを決定させることができる。この点において、或る特別な態様では、治療初期において様々な濃度および／または形態のアレルゲンを含む一連のデバイスが患者に対して使用される。この最初の処置によって、治療を開始するためのリファレンスとして用いられる、患者ベースでの用量および／または最適な形態を決定することが可能である。必要ならば、治療の間、様々な濃度および／または形態を持つこれらのデバイスの使用を反復して、処置の間に用いられる用量／形態を、対象の反応性の変化に応じて適宜変化させることができる。
【００５０】
初回用量／形態が決定されたならば、この皮膚上免疫療法を実施できる。この処置は、皮膚へのアレルゲンの反復適用を含む。適用は、対象の背の上部または腕もしくは上腕の内面に行うのが有利である。それはまた、アレルゲンへの局所反応性が前もって確認されている好ましい条件の下では、他の任意の身体領域に実施できる。処置の間はアレルゲンを身体の様々な領域に適用できるということが理解できるであろう。この適用を、使用される治療方法に応じて様々な頻度で更新する（典型的な方法は、約６〜７２時間の初回適用時間を含む）。適用の間に様々な時間間隔をとりながら（これは例えば１日から３週間の範囲とすることができる）、連続的にまたはバッチ方式で適用を行うことができる。アレルゲンを数ヶ月間反復および長期適用すると、炎症仲介物質の局所放出および寛容という意味で免疫細胞の反応に影響を及ぼす炎症細胞の流入が起こる。典型的な方法は、約６〜７２時間の期間、約５〜１５日間の間隔を空けて、対象の脱感作に必要とされる期間（この期間は数ヶ月を超えるかも知れない）、アレルゲンを反復適用することを含む。
【００５１】
本発明は、適切な脱感作を確実とするためには、（用量および／またはアレルゲンへの暴露の時間もしくは頻度、またはその形態を調節することによる）処置の間の局所炎症反応の制御および持続が重要であることを論証している。よって本発明方法は、皮膚へのアレルゲンの反復適用により生ずる炎症の程度を定期的に評価することを含む。したがって、治療の間、アレルゲンの用量および／または期間、ならびに／または同時に使用されるデバイスの数を、皮膚の反応性の程度に応じて適合させる。処置の間の皮膚反応の強度の低下は、適用頻度および／または同時に適用されるデバイスの数および／またはアレルゲンの用量の増大、ならびに／またはその形態の改変をもたらす結果となる。逆に、皮膚反応の強度の増大は、適用頻度および／または同時に適用されるデバイスの数および／または該デバイス内のアレルゲンの濃度、および／またはその形態の低減をもたらす結果となる。
【００５２】
炎症反応、特に皮膚反応の強度の評価は、医師および／または実際の患者が行うことができる。この評価は任意の方法で実施でき、簡便に目視検査で、または対照的に例えばＥＡＡＣＩの合意的アセスメントグリッド（Allergy 61(2006) 1377-1384を参照されたい）を使用して実施できる。したがって皮膚炎症反応には様々な程度：紅斑  −  紅斑および浸潤  −  紅斑および数個の丘疹  −  多くの丘疹を伴う紅斑  −  小胞を伴う紅斑、がある。好適な炎症反応は典型的にはIII型炎症反応、即ち、紅斑および数個の丘疹を含む炎症反応である。これが、処置の間できる限り持続させようと試みられる反応の型である。無論、患者がより強度の低い反応を初めから発現していた場合は、リファレンス反応の強度は必然的により低くなり、それは患者ベースで適合させることになろう。そのうえ、処置の間、対象の脱感作のため炎症反応は低下するであろう。
【００５３】
本発明を適用するため、炎症マーカー、例えばサイトカインまたはインターフェロンを投与することにより炎症反応を評価することも可能である。
【００５４】
この処置をできる限り良好に調節するため、本発明の或る特別な態様では、対象を或る範囲の用量のアレルゲンと接触させることにより、炎症反応性を、処置の間１回または数回評価し、処置の継続にとって最も適した用量を選択することができる。
【００５５】
炎症反応の評価は、処置の間ずっと、即ちアレルゲンを新たに適用するたびに実施できる。
【００５６】
この評価を適用毎にではなく一定間隔でのみ実施することもできる。
【００５７】
さらに、処置の間ずっと炎症反応を持続させるのが好ましい場合、これは必須ではなく、有効な脱感作も、免疫学的接触が初めて確立された時、そして特異的カスケード反応（免疫学的にコンピテントな細胞の活性化ならびにサイトカインおよび抗体の産生）が充分トリガーされた時に実現され得る。したがって実際には、例えば意図する強度の皮膚反応によって表される充分なレベルに炎症反応が到達した時に、デバイスを取り除くことができ、定められてはいないがしばらく後に別のデバイスを別の皮膚領域に置くことができる。
【００５８】
本発明の別法では、アレルゲン（または適用デバイス）を、少なくとも炎症反応がリファレンスの程度に到達するまで皮膚に維持する。この程度に到達したならばアレルゲン（またはデバイス）を取り除くことができ、新たな適用を行う前に待ち時間を取る。リファレンス反応は典型的には肉眼で確認できる反応、例えば浸潤した紅斑病変であるか、または湿疹状の様相を有する。
【００５９】
アレルゲン（またはデバイス）はさらに、炎症反応を持続させるよう、皮膚に維持できる。この場合典型的には、全てのアレルゲンが拡散してしまった時、または炎症反応が強すぎる強度に達してしまった場合に適用デバイスを取り除く。
【００６０】
処置の間、これらの代替法を使用できることが理解できるであろう。
【００６１】
或る態様では、デバイスの配置には１〜２１日間の期間を経過させる。
【００６２】
アレルゲンに対する皮膚の反応性が消失または著しく低下した時、この処置が完了し且つ成功裏に遂行されたと考えることができる。治療の成功は、経口誘発試験、またはアレルギー学者の認める他の任意の手段によって確認できる。したがって、治療期間は変動的であり、アレルゲンに対する皮膚反応性の進展による。本発明方法による脱感作治療の目的は、長期接触後のアレルゲンに対する局所皮膚反応の完全な消失を引き起こすこと、または、該反応性を低下させることであり、その結果、アレルゲンに対する対象の反応性がこの皮膚上免疫療法によって有意に低下し、アレルゲンとの偶発的接触の際のアナフィラキシーショックのリスクが有意に低下すると推定される。
【００６３】
本発明は、アレルゲンと皮膚との接触を確実にする任意の皮膚投与デバイスを用いて適用できる。これらは好ましくはパッチ型のデバイス、パッチ剤または包帯剤、好ましくはパッチ剤、例えば密封パッチ剤である。
【００６４】
そのようなデバイスは典型的にはアレルゲンを固定する支持体および／またはアレルゲンを含む容器もしくはチャンバーを含む。
【００６５】
使用されるデバイスは典型的には受動拡散を行う経皮的性質を持つものであり、即ち、それは皮膚の穿孔または摩耗を惹起するいかなる手段も含まない。事実、得られたデータは、本発明方法が、予備的な皮膚の処置を行わなくても皮膚上脱感作が誘導できることを示している。しかしながら、アレルゲンに対する皮膚表層の浸透性を増大させる、および／または物理的、化学的または生物学的手段により皮膚の反応性を増大させることを目的とする性質を備えたデバイスを使用することもできる。したがって或る代替法では、この適用デバイスは、表皮基底層に限って言えば、アレルゲンの通過を促進するマイクロニードルまたは電気的手段によって浸透性に作用することができる。さらに、必要不可欠ではないものの、この脱感作処置をさらに促進させるため、デバイスの各適用の前に皮膚を前処置（例えば摩耗処置により）することが可能である。
【００６６】
１つの好ましい態様では、密封パッチ型のデバイス、例えば特許出願ＷＯ０２／０７１９５０号に記載の静電パッチ剤Viaskin（登録商標）が使用される。
【００６７】
加えて、好ましい態様では、皮膚上への維持を確実にする手段と共にこのデバイスを提供する。強い粘着性を持つ、ゴム、ポリマーまたはプラスチック型の材料を包含する任意の接着手段をこの目的のために使用できる。例えば出願番号ＦＲ０７５３７８７号に記載のようなブレスレット、または出願番号ＦＲ０７５３２６５号に記載のような剥離紙を備えたデバイスを使用することも可能である。
【００６８】
当業者により該デバイスの具体的性質および形態を適宜変化させることができ、必要な性質は、適用部位におけるアレルゲンおよび皮膚の接触を確実にすることであるということが理解できるであろう。
【００６９】
特別な態様では、この処置は少なくとも部分的に透明な裏打ちを有するデバイス（例えばVIASKIN(登録商標)デバイス）によって実施し、その結果、炎症反応（例えば紅斑の出現）が透明膜を通して直接観察できる。このデバイスの裏打ちは、患者が、デバイスを取り除くことができる皮膚反応の閾値レベルを決定するのを助けるために適合させることまでもできる。したがって特に有利な態様では、裏打ちが透明領域を有し、その上にモニタリングパターン、例えば赤色のグリッドまたは赤色の同心円が印刷されているデバイスを使用する。皮膚が反応していない時にはこの図がよく見え、皮膚反応が得られた時にこれらが消える。透明な裏打ちシステムを使用することには多くの利点があり、特に、
−  これは、不必要な長期のアレルゲンとの接触を回避し、皮膚の寛容を改善し、掻痒型の不快な二次反応を最小限とし、そして実際に受容および遵守を改善する；
−  これは、安全性の点において本方法の性能を向上させ、さらに、落花生に対する過去の多くの脱感作法に対する致死的な全身反応のリスクを最小化する；
−  これは、アレルゲンに対する可変的暴露時間という概念を工業プロセスに統合する解決策を提供する。
【００７０】
このような状況において本発明の目的は、皮膚へのアレルゲンの適用により誘発される皮膚の炎症反応がそれを通して見える透明領域を備えた裏打ちを含むことを特徴とする、対象の皮膚にアレルゲンを適用するための皮膚用デバイスに関係する。このデバイスは密封型の、そして／または受動拡散を伴うデバイスであるのが有利である。このデバイスは典型的にはパッチ剤である。
【００７１】
加えて本発明の別の目的は、該デバイスが種々の用量のアレルゲンおよび／または種々の形態のアレルゲンを含む、アレルゲンを皮膚適用するための幾つかのデバイスを含むキットに関する。
【００７２】
本発明の範囲内で使用されるアレルゲンは、様々な性質、形態および起源を有していてよい。したがってそれは、例えば食物、呼吸または皮膚アレルゲンであってよい。これらは、タンパク質（またはポリペプチドもしくはペプチド）、脂質、糖類などであってよく、抽出生成物の形態、組換え形態、および／または合成起源、例えば必要ならばそれらの性質を改変するために化学的もしくは免疫学的に修飾されたものであってよい。アレルゲンは、完全な天然の形態であっても、断片化した変性形態などであってもよい。典型的には、組み合わせとした幾つかのアレルギー誘発性抗原、および／またはコンジュゲートもしくは複合体としたアレルゲン（群）を含む調製物が使用される。本発明方法は、本質的にアレルゲンの性質と無関係であり、故に、アレルゲン、例えば食物アレルゲン（例えば落花生、甲殻類、牛乳、卵、魚、小麦、大豆など）または皮膚もしくは呼吸アレルゲン（ダニ、花粉、獣毛など）を含む任意の調製物に適用できることが理解されるであろう。
【００７３】
アレルゲンは、薬学的使用に適合させた任意の賦形剤または担体と共に都合よく製剤化される。適用されるアレルギー誘発性調製物は、例えば液体または固体といったような異なる形態にあってもよい。好ましい態様では、アレルゲンは乾燥形態、即ち脱水形態であり、特に粉末、粒子、凝集体、ウエハー、乾燥させた形態などである。この乾燥形態は単純な蒸発による凍結乾燥によって得られる。
【００７４】
特別な態様では、アレルゲンは粉末の形態である。
【００７５】
先に指摘したように、本発明の利点は、アジュバントを同時投与しなくてもアレルゲンに対する脱感作の実現が可能なことである。さらに、好ましい態様では、患者の皮膚に適用されるアレルギー誘発性調製物は、いかなるアジュバント化合物も添加されていない。本発明の意義におけるアジュバントという語は、皮膚に物理化学的および／または生物学的作用を発揮して、皮膚内への抗原の浸透を促進し、該抗原に対する免疫反応を増大させる任意の化合物を指す。本明細書で定義されるアジュバントは、物理化学的および／または生物学的働きによって角質層を攪乱することにより表皮の透過性を変化させ、それにより抗原の通過および表皮の免疫活性細胞と抗原との接触をさせるような化合物である。アジュバント化合物の例は特にコレラ毒素（ＣＴ）またはE.coliの熱不安定性毒素（ＬＴ）である。他の例には、Paul等により記載されたトランスファーソーム（Paul A, Cevc G, Bachhawat BK. 「超変形薬物担体による、巨大タンパク質を用いた経皮的免疫付与」Eur. J Immunol. 1995, 25(12):3521-4）があり、これは膜における抗原の輸送を可能にする。
【００７６】
とは言え、或る代替法においては、アレルゲンをアジュバント化合物との組み合わせとして、そして／または該アレルゲンに対する炎症反応を増幅させる性質を伴って、例えばアジュバントまたは免疫調節活性を有する化合物、例えばサイトカイン、化合物、トールレセプターリガンドなどとの組み合わせとして使用できる。「組み合わせとして使用」という表現は、インビボ協同効果を誘起するため、アレルゲンおよびその化合物が同じ対象に投与されることを指す。にもかかわらずそれらは様々な手法および経路によって投与できる。このように、それらを共に皮膚上経路により適用することができ、或いはこの化合物を別の経路で適用する。加えて、それらは必ずしも同時に適用する必要はなく、連続的に、反復的またはそうでなく、そして同じような頻度またはそうでなく適用できる。典型的には、アジュバント化合物をアレルゲンの前またはこれと同時に投与する。
【００７７】
通常の態様では、このデバイスは０．１〜１０００μg/cm2（デバイスの表面積）、好ましくは１cm2あたり２０〜５００μg、より優先的には１cm2あたり２０〜２００μgの量のアレルゲンを含む。この量は、目的、病理、処置の期間、対象などに応じて当業者により適合させ得ることが理解できるであろう。
【００７８】
後述する実験例は、このような反応性の低減が、本発明による用量の制御を利用することにより達成できることを示す。本発明の皮膚上免疫療法は現在の最新技術に比して多くの利点を含んでいる。
【００７９】
これは、或るアレルゲンに対する身体の反応を寛容に向かわせる目的で、このアレルゲンに対してアレルギーを持つ対象の皮膚に該アレルゲンを定期的且つ持続的に適用することにより炎症反応を誘発および制御することを目的とする、新規な方法である。
【００８０】
これは、アトピーバッチ試験の分野における蓄積された経験によって、そして、１０００００以上のコピーが流通している、すぐに使用できる初めてのアトピーパッチ試験であるDIALLERTEST（登録商標）がフランスに導入されて以来収集されたデータによって確認された、全く安全な方法である。この大きな使用安全性の故に、生ずるリスクのために標準的脱感作法によっては対処できない落花生または甲殻類のようなアレルゲンに対してアレルギーを持つ対象を、本発明方法によって脱感作することが可能である。
【００８１】
免疫療法は、皮膚に適用されたデバイスを取り除くことにより、いつでも中止することができ、それは、抗原を体内に投与する従来の脱感作方法では考えられない。
【００８２】
本方法の第一工程では、一方で皮膚上免疫療法に対する対象の適格性（皮膚反応を起こしている対象が適格であること）を確認すること、そして他方では、最良の場合には皮膚上免疫療法による治療の管理へと導くため、アレルゲンに対する対象の皮膚反応性の程度を測定することが可能である。したがって、皮膚寛容を最適化し最良レベルの有効性を維持するため、患者に最も適合した方法を選択できる。
【００８３】
治療中、継続的に測定される皮膚反応性の進展に応じて用量および／または投与頻度を調節できる。よって、治療処置を恒久的に最適化し、処置の間ずっと有効性を最高レベルに維持することが可能である。
【００８４】
治療期間は、治療初期に設定された治療目的およびアレルゲンに対する皮膚反応性の進展による。皮膚上で確認される、アレルゲンに対する反応性の低下という目的が、誘発試験または他の何らかのアレルギー学的手段によって達成され確認された時、または、皮膚反応性の完全な消失が確認された時、この治療が完了したと考えられる。
【００８５】
本発明のその他の局面および利点は、以下の実施例を読む時明白となるが、それらは例示的且つ非限定的と考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】Dactyle. Cの花粉に対して（ａ）８週間または（ｂ）１６週間脱感作した後に得られたプレチスモグラフィー結果。Ｃ：対照、ＮＤ：非脱感作、ＳＣＤ：皮下脱感作、ＥＰＤ：皮膚上脱感作。
【図２】オボアルブミンに対して（ａ）８週間または（ｂ）１６週間脱感作した後に得られたプレチスモグラフィー結果。Ｃ：対照、ＮＤ：非脱感作、ＳＣＤ：皮下脱感作、ＥＰＤ：皮膚上脱感作。
【図３】落花生タンパク質による８週間の脱感作の前および後における抗体レベルの監視。左のグラフ：ＩｇＥ特異的、右のグラフ：ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ特異的。ＥＰ：皮膚上、ＩＤ：皮内、ＮＤ：非脱感作。
【図４】誘発試験後に放出されたヒスタミン。ＥＰ：皮膚上、ＩＤ：皮内、ＮＤ：非脱感作。結果はnMで表す。
【図５】特異的ＩｇＥの比率の進展（Ｖ０、初期試料、Ｖ１、１ヶ月目の試料、Ｖ３、３ヶ月目の試料）。
【図６】処置中の皮膚炎症反応の観察：Ａ：顕著；Ｂ：中等度；Ｃ：減弱。
【図７Ａ】VIASKIN（登録商標）による２４時間および４８時間のアレルゲン適用の後のランゲルハンス細胞の活性化および炎症細胞の流入。２４時間の適用後、ランゲルハンス細胞が活性化され、リンパ節へのそれらの遊走が始まる。４８時間後、炎症細胞が警戒態勢となり、炎症性肉芽腫がよく見える。
【図７Ｂ】VIASKIN（登録商標）によりアレルゲン（オボアルブミン）を様々な時間適用した後の局所細胞反応の進展。６時間の適用後には細胞反応は認識できない。２４時間後、炎症細胞の局所比率の上昇がVIASKIN（登録商標）除去後も継続している。この進展は、４８時間の適用後ではより強い。
【図８】VIASKIN（登録商標）で感作した動物の皮膚にアレルゲンを持続適用（６および１２週間）した後の、局所反応プロファイルの進展。２４時間反復適用した後、反応は専らＴＨ２型である。４８時間反復適用した後には反応は混合型であり、その後専らＴＨ１となる。
【００８７】
実施例
実施例１．オボアルブミンおよび花粉に対する脱感作
１．１．方法論
ＯＶＡおよびＰＯＬの場合、水酸化アルミニウムと組み合わせたアレルゲン１０μgの皮下注射によって連続２週間（Ｄ０およびＤ７）ＢＡＬＢ／ｃマウスを感作した。Ｄ１４にアレルゲンのみを１０μg鼻腔滴下でマウスに投与した。
【００８８】
Ｄ２１から、マウスに脱感作処置を行うか、またはそれを行わなかった。処置されたマウスに、皮膚炎症反応の持続を確実にする条件下でVIASKIN（登録商標）システムにより皮膚上に、または水酸化アルミニウムと組み合わせて皮下経路で（正の対照）、アレルゲン１００μgを週に１回８週間投与した。非脱感作マウスは通常の条件でケージに維持した。
【００８９】
８週間および１６週間の脱感作の後にサンプリングした、氷中保存の血清で、抗体（ＩｇＥおよびＥｇＧ特異的）レベルの進展を追跡した。
【００９０】
ＯＶＡおよびＰＯＬ脱感作処置の有効性を、脱感作した、またはしなかったマウスの気管支過敏性を評価できるプレスチモグラフィー測定によってさらに調査した。
【００９１】
１．２．結果
VIASKIN（登録商標）で処置した、またはしなかったマウスについて気管支過敏性を測定した（図１および２）。
【００９２】
皮膚炎症反応の持続を確実にする条件下でVIASKIN（登録商標）で処置したマウスの気管支過敏性は、非処置マウスに比較して著しく（３．７〜２．６倍）低下する。皮下処置したマウスの気管支過敏性は、VIASKIN（登録商標）で処置したマウスと大きく相違しない。
【００９３】
実施例２．落花生に対する脱感作
２．１．方法論
コレラ毒素１０μgと組み合わせたＡＲＡ（落花生）タンパク質１mgを６日毎に（Ｄ１、Ｄ７、Ｄ１３、Ｄ１９、Ｄ２５、Ｄ３３）胃内投与することにより、マウスをＡＲＡに対して６週間感作した。
【００９４】
脱感作処置をＤ７５に開始し８週間の期間とする。マウスを、炎症反応の持続を確実とする条件下にVIASKIN（登録商標）システムを用いる皮膚上経路、または皮内経路でＡＲＡ製剤１００μgを投与することにより週に１回脱感作する。非脱感作マウスは感作後に特別な処置を受けない。
【００９５】
脱感作の有効性を、抗体（ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ特異的）レベルの測定および経口誘発試験後のヒスタミン放出の測定により追跡する。ヒスタミンは、肥満細胞または好塩基型免疫細胞の脱顆粒の際に放出される仲介物質である。この脱顆粒はアレルギー反応誘導のマーカーである。
【００９６】
２．２．結果
ＡＲＡ脱感作処置の解析を、マウスにおける特異抗体レベルの解析により検証した（図３）。皮膚上経路または皮内経路により脱感作されたマウスは、特異的ＩｇＥ（ＡＲＡに対するアレルギーのマーカー）レベルが低下し、特異的ＩｇＧ２ａレベルが上昇する。非脱感作マウスにおいて検出できる特異的ＩｇＥレベルは高値のままであり、特異的ＩｇＧ２ａレベルは脱感作マウスより低い。皮膚上および皮内脱感作経路の間に顕著な相違は観察されなかった。
【００９７】
脱感作した、またはしなかったマウスにおいて経口誘発試験を実施した。皮内経路または皮膚上経路により脱感作したマウスは、非脱感作マウスよりヒスタミンの放出が低値である。この結果は、脱感作マウスのアレルギー反応の低下を示す。
【００９８】
考察
異なる研究モデルおよび異なる被験アレルゲンから、
−  炎症反応の持続に基づく皮膚上免疫療法は、全身型の臨床的および生物学的反応のトリガーを可能にする；
−  経口または皮膚経路による予備感作の後に炎症反応の持続に基づく皮膚上免疫療法の恩恵を受けた動物は、皮下または皮内経路による免疫療法を受けた動物に匹敵する、誘発試験に対する反応の減弱を呈する；
−  得られた血清学的反応は、皮膚上免疫療法による寛容プロセスの誘導を裏付ける、
と思われる。
【００９９】
実施例３．臨床データ
患者の特徴：小児、６歳５ヶ月、１８．３kg。慢性下痢、嘔吐、全身性湿疹。牛乳に対してプリックテスト陽性。総ＩｇＥ ４８６IU。牛乳特異的ＩｇＥ ３２．７IU。
【０１００】
０．６mlでの牛乳による誘発試験で陽性（喉頭の掻痒、咳嗽、腹痛、蕁麻疹）。
【０１０１】
処置：牛乳タンパク質１３０μgを含むVIASKIN（登録商標）を、アレルゲン接触時の皮膚反応の持続を確実とする条件下で２日毎に更新し３ヶ月間適用。
【０１０２】
結果：結果を図５および６に示す。これらは、処置の間の炎症反応の監視結果と相関する、牛乳に対する寛容閾値における極めて実質的な改善を説明している。この免疫療法の終了時には皮膚反応の減弱が確認される。３ヶ月目における経口誘発試験は、いかなる臨床反応も伴わずに最大６４．６mlの寛容閾値を示す。
【０１０３】
実施例４．感作マウスにおけるアレルゲン適用後の細胞反応の進展
前もって感作しておいたマウスの皮膚へのアレルゲン適用は、ランゲルハンス細胞およびリンパ節へのそれらの遊走を活性化する（図７Ａ）。
【０１０４】
同時間内で活性化された細胞は、炎症細胞を皮膚表層へと誘引する炎症性サイトカインを産生する。この「第一相」反応は感作された対象において起こり、何故ならそれは記憶細胞および該アレルゲンに対する特異的ＩｇＥを持っているためである。故に、アレルゲンとの接触時に、アレルゲンを拒絶する初期反応が起こる。
【０１０５】
第二相では、急性炎症細胞（肥満細胞、マクロファージ）および慢性細胞（白血球）の流入を特徴とする局所炎症反応が出現する（図７Ａおよび７Ｂ）。前もって感作しておいたマウスにおいて、Viaskin（登録商標）による皮膚へのアレルゲン（オボアルブミン）適用では、２４時間の接触の後に軽微な炎症反応が発現し、一方２４時間の接触の後には、皮膚領域への多核球の浸潤を伴う重度の炎症反応が発現する。それは、この処置が目標とする、より複雑な反応である。
【０１０６】
感作マウスで行われた研究では、６時間、２４時間および４８時間というアレルゲンの適用が炎症反応（ここではマクロファージレベルの局所増大により実体化される）を決定付け、それは４８時間の適用後に、より顕著となる（図７Ｂ）。
【０１０７】
考察：
皮膚上脱感作処置の際、目的は、その役割が寛容プロセスに欠かせない、炎症細胞反応を再現することである。実際には、時間と共に変化するのは炎症反応の強度ではなく、特にその性質そのものである。
【０１０８】
免疫蛍光研究は、この炎症の中心的役割および適用時間により全く相違する炎症反応プロファイルの局面を裏付けている。
アレルゲンの適用時間は細胞反応誘発の必須因子である。
【０１０９】
実施例５．アレルゲンの長時間適用後の局所反応プロファイルの進展
適用時間は、目指す型の治療（寛容原性）反応を得るための十分条件ではない。マウスでは、皮膚へのアレルゲン反復投与は、その適用が「短時間」（２４時間）であるか「長時間」（４８時間）であるかに拘わらず、このアレルゲンに特異的な抗体の産生を引き起こす。適用を継続（最長８８日間）した場合、抗体レベルはやはり依然として高いままであるが、Viaskin（登録商標）を４８時間適用された対象では、Ｔｈ１／Ｔｈ２リンパ球の相対的比率がＴｈ１リンパ球が上昇する方向へと変化する（図８）。
【０１１０】
考察
実験データは、本発明方法が、アレルギー患者の皮膚にアレルゲンを単に置くことによって通常得られる反応とはその特徴が異なっている反応の誘導を目指していることを証明している。それは、Viaskin（登録商標）による「長時間」適用後にのみ得られる反応であり、それにより、Ｔｈ１リンパ球の活性化により実体化される「寛容原性」効果が得られるが、「短時間」適用後に得られる反応はＴｈ２型反応である。
【０１１１】
Viaskin（登録商標）による脱感作療法の間に、前もって感作しておいた患者の無傷の皮膚に当該アレルゲンを反復適用すると、現在アトピーパッチ試験で臨床的に観察されるような炎症細胞反応が誘発される。
【０１１２】
アレルゲンの長時間反復適用によって炎症反応を誘発し持続させることにより、特異的局所炎症状態が創成される。この反応中、平衡はＴｈ１リンパ球の方向にシフトする。
【０１１３】
したがって、皮膚への長時間および反復的アレルゲン適用は、炎症反応を惹起できるだけでなく、この反応への方向付けをさせることができるように見受けられる。
【図１ａ】
0005941246.tif 000002
【図１ｂ】
0005941246.tif 000003
【図２ａ】
0005941246.tif 000004
【図２ｂ】
0005941246.tif 000005
【図３】
0005941246.tif 000006
【図４】
0005941246.tif 000007
【図６Ａ】
0005941246.tif 000008
【図６Ｂ】
0005941246.tif 000009
【図６Ｃ】
0005941246.tif 000010
【図５】
0005941246.tif 000011
【図７Ａ】
0005941246.tif 000012
【図７Ｂ】
0005941246.tif 000013
【図８】
0005941246.tif 000014