(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物の７０〜９０体積％エタノール抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤（老化防止剤を除く。）。
【請求項２】
前記ヒリュウシダ属植物が、ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ  ｄｉｓｃｏｌｏｒ）である請求項１記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
【請求項３】
前記植物抽出物が、７０〜９０体積％エタノール抽出物から回収された水溶性画分である請求項１又は２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
【請求項４】
前記マトリックスメタロプロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
【請求項５】
シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物の７０〜９０体積％エタノール抽出物を、ＵＶＡ照射後の真皮線維芽細胞に適用することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼの産生抑制方法（ヒトに対する医療行為、及び老化を防止する方法を除く。）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は肌表面から順に表皮、真皮、皮下組織の３層で構成されている。
真皮は線維芽細胞などの細胞成分と、これらの細胞が産生する細胞外基質とから構成されており、細胞成分としては繊維芽細胞や、マクロファージ、肥満細胞、血管や神経の構成細胞があり、細胞外基質としてはコラーゲン線維や、エラスチン線維、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどがあることが知られている。細胞外基質のなかでも真皮乾燥重量の約７０％を占めると言われるコラーゲン線維は、皮膚のハリや弾力の維持に重要な役割を担っていると同時に、その他の様々な組織においても間質成分として存在し構造を保つ上でも重要である。
コラーゲン分子はα鎖２本とβ鎖１本からなる３重螺旋構造をとっており、α鎖の構造の違いから２０種類のサブタイプが存在するが、真皮に存在するコラーゲン線維の大部分はＩ型コラーゲンである。
【０００３】
マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：以下ＭＭＰと略すこともある）は細胞周辺の細胞外基質の分解代謝に関与するタンパク質分解酵素群である。ＭＭＰはその分子構造や基質特異性などの観点からいくつかのサブタイプが存在し、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９等、十数種類知られている。これらは、活性部位に亜鉛（ＩＩ）イオンを保有する細胞外マトリックス分解酵素である点は共通するが、マトリックスメタロプロテアーゼ１（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  1：以下ＭＭＰ−１と略すこともある）はＩ型コラーゲンの３重螺旋構造を分解すること、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９はゼラチンや基底膜を構成するＩＶ型コラーゲンを分解すること、マトリックスメタロプロテアーゼ８（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ８）は好中球コラゲナーゼとして知られている。
これらのＭＭＰはそのほとんどが不活性の前駆体として産生され、他のＭＭＰ等のプロテアーゼによって活性化される。例えば、ＭＭＰ−１はＭＭＰ−２を、ＭＭＰ−３はＭＭＰ−９を活性化する働きを有している（非特許文献１）ことから、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３の作用を抑制すれば、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性化も阻害され、その結果、これらのＭＭＰによる作用も抑制することができる。
【０００４】
マトリックスメタロプロテアーゼは真皮細胞外基質の代謝をコントロールしているだけでなく、細胞の浸潤やサイトカイン等の生理活性分子の活性化にも深く関与しており、種々の疾患との関連性が報告されている。例えば、皮膚においては、種々のサイトカインや成長因子、細胞の相互作用等により一過的にマトリックスメタロプロテアーゼが過剰に産生されること、創傷、火傷、潰瘍性、日光による皮膚損傷、水疱性、苔癬性、肉芽性等の各種皮膚疾患に関与していることが知られている（非特許文献２）。また、紫外線暴露により過剰に産生されたマトリックスメタロプロテアーゼにより引き起こされるコラーゲン、エラスチン等の真皮マトリックスの線維減少、変性が皮膚のシワやたるみの原因となることが明らかになっている。さらに、癌組織でもマトリックスメタロプロテアーゼが過剰に産生されており、癌細胞の浸潤や転移に深く関与することが知られている。具体的には癌細胞がマトリックスメタロプロテアーゼを分泌することで自身を保持する基底膜や組織から離脱し、あるいは癌細胞が分泌するマトリックスメタロプロテアーゼによって細胞外基質を分解しながら組織中に浸潤することで血管に到達して血管内に進入し、全身への転移を可能にする。さらにリウマチや角膜炎などの疾病においてもマトリックスメタロプロテアーゼの産生が亢進することが知られている。このように皮膚をはじめとする組織の分解代謝や細胞の浸潤、転移、生理活性分子活性化など多岐にわたる生体反応に寄与しているマトリックスメタロプロテアーゼの作用を制御することは、非常に重要である。
【０００５】
これらの背景のもと、マトリックスメタロプロテアーゼの制御という観点から様々なマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤あるいは産生抑制剤や、産生促進剤の検討がなされている。例えば特許文献１および２にはザクロ実、レモンバーム葉、ゲンノショウコ葉、キンミズヒキ葉、グアバ、菱などの植物抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ）活性阻害剤が開示されている。しかし、酵素活性を阻害するよりも、酵素の産生を抑制する方が、マトリックスメタロプロテアーゼの作用を根本的に抑制することができるため、酵母培養液を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ１産生抑制剤（特許文献３）、スルフヒドリル基を有する化合物及びジスルフィド結合を有する化合物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ１産生抑制剤（特許文献４）等が報告されている。
【０００６】
一方、従来より植物由来の成分は安全性が良好であることから、皮膚外用剤、化粧料、食品及び医薬品等の薬効成分として種々利用されている。シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物から得られた抽出物についても、皮膚外用剤又は化粧料等への利用や抗酸化剤としての利用（例えば、特許文献５）細胞賦活剤としての利用（例えば、特許文献６）、美白剤としての利用（例えば、特許文献７）、抗炎症剤としての利用（例えば、特許文献８）などが種々提案されている。しかし当該植物のマトリックスメタロプロテアーゼの産生や活性に対する作用に関してはこれまでに知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−１９６５２６号公報
【特許文献２】特開平７−２９１８７３号公報
【特許文献３】特開２００８−２４６３８号公報
【特許文献４】特開２００２−４７１７８号公報
【特許文献５】特開２００５−２３２１３１号公報
【特許文献６】特開２００３−３２１３７７号公報
【特許文献７】特開２００３−０９５９１０号公報
【特許文献８】特開２００９−２１５２５１号公報
【非特許文献１】Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｎｏ.６、１９９−２１３、１９９７、Ｋａｈｒｉ  Ｖ−Ｍ．ｅｔ  ａｌ.
【非特許文献２】ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ、ＮＯ．４４１、１３７−１４０、１９９８、Ｓｃｏｔｔ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の種々のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤には、安全性、安定性等が確認されていないものもあり、また抑制効果が十分ではない場合もある。したがって、本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼの作用を抑制する効果の高いマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題を解決するため、種々の植物抽出物について鋭意検討した結果、シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物がマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤を提供するものである。
前記ヒリュウシダ属植物が、ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）であるのが好適である。
前記植物抽出物が、アルコール類又は含水アルコール類で抽出されたものであるのが好適である。
前記アルコール類抽出物及び／又は含水アルコール類抽出物から回収された水溶性画分であるのが好適である。
前記マトリックスメタロプロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）であるのが好適である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、安全性が良好な、新規なマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＭＭＰ−１の産生比率を示す図である。ＵＶＡ照射によって、ＭＭＰ−１の産生が誘導され（中央のカラム）、ブレクナム・ディスカラー抽出物を添加するとＵＶＡ照射により誘導されたＭＭＰ−１の産生が抑制されている（右側のカラム）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書において、「〜」はその前後の数値を含む範囲を意味するものとする。
【００１３】
本発明は、シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物の群から選ばれる一種又は二種以上の抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ１抑制剤に関する。前記シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）に属する植物としては、例えば、ブレクナム
カペンセ（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｃａｐｎｓｅ）、ブレクナム ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）、ブレクナム プロセラム（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｐｒｏｃｅｒｕｍ）、ブレクナム フルヴィアタイル（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、ブレクナム モンタナム（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｍｏｎｔａｎｕｍ）、ブレクナム デュラム（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｕｒｕｍ）、ブレクナムアマバイル（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ａｍａｂｉｌｅ）、ブレクナム バチエニイ（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｂｕｃｈｔｉｅｎｉｉ）、ブレクナム カスタニュウム（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）、ブレクナム コレンソイ（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｃｏｌｅｎｓｏｉ）、ブレクナム サイカディフォリウム（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｃｙｃａｄｉｆｏｌｉｕｍ）、ブレクナム ハンコッキイ（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ
ｈａｎｃｏｃｋｉｉ）、ブレクナム ハステイタム（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｈａｓｔａｔｕｍ）、ブレクナム インディキューム（Ｂｌｅｃｈｎｕｍｉｎｄｉｃｕｍ）、ブレクナム ニグラム（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、ブレクナム ナイポニクム（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｎｉｐｏｎｉｃｕｍ）、ブレクナム オリエンテール（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）等が挙げられる。より好ましくは、ブレクナム ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）の抽出物が好適である。
【００１４】
前記シダ植物の使用する部位は、いずれの部位を用いてもよく、例えば、根、茎、幹、葉、胞子等から選ばれる１種又は２種以上のものを用いることができる。このうち、地上部分のものを用いるのが好ましく、葉及び／又は茎を用いるのがより好ましい。これらの部位は、乾燥、細切、圧搾、又は発酵などの適宜の処理を施した後に、抽出を行ってもよい。
【００１５】
前記シダ植物の抽出方法は、特に限定されない。抽出は、前記シダ植物を一定温度（低温、常温又は加温）下にて、所定期間、浸漬等にて抽出溶媒を用いて行えば良い。前記抽出溶媒としては、特に限定されないが、例えば水；アルコール類；アセトン等のケトン類；エチルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類等の一種又は二種以上を用いることができる。前記アルコール類として、メタノール、エタノール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ブタンジオール等の液状多価アルコール等が挙げられる。前記アルコール類は、１価アルコール類又は２価アルコール類（例えば、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール等のブタンジオール等）が好ましく、アルコール類の炭素数は１〜４程度であるのが好ましい。この溶媒のうち、水及び／又はアルコール類（好適には炭素数１〜４）が好ましい。前記アルコール類は、メタノール、エタノール、ブタンジオール（好適には１．３−ブタンジオール）から選ばれる１種又は２種以上のものが好ましい。さらに、前記溶媒として、水及び／又はエタノールがより好ましく、エタノール及び水−エタノール混合溶液が好ましい。また、アルコール類濃度（Ｖ／Ｖ）は、好ましくは２０体積％以上、より好ましくは４０体積％以上、さらに好ましくは７０〜１００体積％であるのが好適である。また、含水エタノールを用いる場合、エタノール濃度は７０〜９０体積％とするのが好適である。
【００１６】
前記のシダ植物抽出物は、そのまま有効成分として用いてもよいし、適宜の期間そのまま放置し、熟成させた後に用いることもできる。必要に応じて、さらに、抽出溶媒の留去、濾過やイオン交換樹脂等による脱臭、脱色等の精製処理を施した後に用いることもできる。又、液体クロマトグラフィー等の分離手段を用いて、活性の高い画分のみを用いることもできる。
【００１７】
前記シダ植物の好ましい抽出方法の例としては、前記シダ植物をアルコール類濃度０〜１００体積％のアルコール類又は水−アルコール類混合液にて、室温（例えば５〜４０℃程度）で又は加温（４０℃以上）して０．５〜５日間抽出を行う方法が挙げられる。
前記アルコール類濃度は、好ましくは４０体積％以上、より好ましくは７０体積％以上である。前記抽出温度は、好ましくは６０℃以上、より好ましくは１００℃以下、さらに好ましくは７５℃〜９５℃である。このように、水沸点に近い温度帯で有機溶媒抽出することによってマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制効果を持つ有効成分を効率良く抽出することを可能である。また、抽出期間を、０．５〜２日程度で行うことも可能である。
【００１８】
前記シダ植物抽出物のさらなる精製方法の例として、前記シダ植物粗抽出物を、アルコール類−水混合液又は水に混合した後、冷温（１〜１０℃程度）にて２日〜２週間静置して、沈殿した水不溶性画分（残渣）を除去して水溶性画分（上澄み液や濾過液など）を回収する方法が挙げられる。このときのアルコール類の濃度は、好ましくは５０体積％以下であり、より好ましくは４０体積％以下、より３０体積％以下であり、さらに好ましくは２０体積％以下の低濃度とするのが好適である。前記抽出物から水溶性画分を回収することによって、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制効果を持つ有効成分を効率良く抽出することを可能とする。また、処理期間を、４〜９日程度にするのが、前記抽出物中の水不溶性画分（残渣）を除去しやすいので、好適である。さらに、得られた水溶性画分から、活性炭等の濾過剤を用いて夾雑物や着色物等の不純物を除去した後、乾固して、シダ植物抽出精製物を得るのが、より生理活性向上の点で好ましい。
【００１９】
前記シダ植物抽出物は、液状、ペースト状、ゲル状等いずれの形態であってもよい。すなわち、抽出溶媒を含む液状の抽出液をそのままあるいは濃縮してから用いても良いし、また、抽出液を減圧乾燥、又は凍結乾燥等により乾固させて固体状とした後に用いることもできる。また、スプレードライ等により乾燥させて粉末として用いることもできる。また更には、これら固体状あるいは粉末の抽出物を適宜溶媒に再溶解して抽出液として用いても良い。
【００２０】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤は、種々の用途に用いることができる。例えばリウマチ、歯周病、角膜炎、癌等においてマトリックスメタロプロテアーゼの産生が異常亢進することが知られており、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤は、これらの治療薬としての可能性が検討されている。また本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤は、安全性も高く、また製剤中での安定性にも優れているので、食品（飲料も含む）への配合や、化粧料又は皮膚外用剤の有効成分として用いるのが好ましい。
【００２１】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤を配合する化粧料又は皮膚外用剤は、皮膚に適用することにより、マトリックスメタロプロテアーゼの過剰な産生を抑制する。その結果、皮膚の柔軟性や弾力性が維持され、しわ・たるみ等の老徴現象が予防・改善され、また種々の皮膚疾患が予防・改善される。即ち、老化防止用若しくは皮膚疾患予防用の化粧料又は皮膚外用剤、及びしわ・たるみ改善用化粧料又は皮膚外用剤として優れた効果を奏する。
【００２２】
前記化粧料又は皮膚外用剤中における、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤の配合量は特に限定されてないが、一般的には、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制の観点から全組成に対して乾燥固形分に換算して好ましくは０．００００１〜５質量％であり、より好ましくは０．０００１〜０．５質量％である。この範囲内であれば、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤を安定に配合することができ、かつ高いマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制効果を得ることができる。
【００２３】
また、前記化粧料又は皮膚外用剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、製造に通常使用される成分、例えば、水（精製水、温泉水、深層水等）、油剤、界面活性剤、金属セッケン、ゲル化剤、粉体、アルコール類、水溶性高分子、皮膜形成剤、樹脂、包接化合物、抗菌剤、香料、消臭剤、塩類、pH調整剤、清涼剤、植物・動物・微生物由来の抽出物、美白剤、消炎剤、活性酸素除去剤、血行促進剤、収斂剤、抗脂漏剤、保湿剤、キレート剤、角質溶解剤、酵素、ホルモン類、ビタミン類等を必要に応じて添加することができる。
【００２４】
本発明の化粧料又は皮膚外用剤の性状は液状、ゲル状、クリーム状、半固形状、固形状、スティック状、パウダー状等のいずれであってもよく、乳液、クリーム、化粧水、美容液、パック、洗顔料、メーキャップ化粧料等の皮膚用化粧料に属する形態；シャンプー、ヘアートリートメント、ヘアースタイリング剤、養毛剤、育毛剤等の頭髪化粧料に関する形態；等とすることができる。また、本発明の薬効剤は、上記の各種化粧料に配合できる他、分散液、軟膏、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等の皮膚外用等に配合することもできる。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
[製造例１：ブレクナム  ディスカラー抽出物の調製]
シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ  ｄｉｓｃｏｌｏｒ）の葉１００ｇを細切し、これに８０体積％含水エタノール２Ｌを加えて８５℃で加熱して１日間抽出を行った。抽出液を濾過後濃縮し、水とエタノールを添加して、エタノール濃度を２０体積％、全量を３００ｍLに調整した後に５℃に１週間静置し生じた沈殿を取り除いた。その後、活性炭を用いて濾過を行い、溶媒を留去して乾固し、固形分であるブレクナム・ディスカラー抽出物を得た。収量は３ｇであった。
【００２６】
[試験例１：マトリックスメタロプロテアーゼ１(ＭＭＰ１)産生抑制試験]
＜ＵＶＡ照射によるＭＭＰ１発現誘導＞
試験には正常ヒト真皮線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ；以下ＮＨＤＦ細胞と略す）をウシ胎児血清１０％含有ダルベッコ変性イーグル培地（以下、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と略す）にて継代培養して用いた。トリプシンで回収したＮＨＤＦ細胞を細胞培養用シャーレ（内径６ｃｍφ）に２００００個／ｃｍ２の濃度で播種し２４時間培養した後、Ｈａｎｋｓ液２ｍＬに置換してＵＶＡを１０Ｊ／ｃｍ２の強度で照射しＭＭＰ１産生を誘導した。照射終了後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地５ｍＬに置換し、製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物を３０体積％エタノール水溶液に溶解し２５μＬ添加して２４時間培養した。（ブレクナム・ディスカラー抽出物の最終濃度は０．０３ｍｇ／ｍＬである。）また、ＵＶＡ非照射およびＵＶＡ１０Ｊ／ｃｍ２照射後、製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物を含まない３０体積％エタノール水溶液を２５μＬ添加して２４時間培養したものをコントロールとした。２４時間培養後、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ＲＮＡ
Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｔ（フジフィルム社製）を用いて自動核酸抽出装置にて細胞内のＲＮＡを回収した。試験は全てＮ＝３で実施した。
＜ＲＴ−ＰＣＲによるＭＭＰ１発現量の評価＞
回収したＲＮＡ各５００ｎｇにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）２μＬを加えてＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ水で全量を１０μＬとし、３７℃１５分間逆転写反応してｃＤＮＡ溶液を得た。
このｃＤＮＡ溶液をＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ水で８０倍希釈して３μＬ分取し、ＭＭＰ１プライマー（タカラバイオ社製、最終濃度０．２μＭ）およびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（キアゲン社製）１０μＬを添加し、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ水で全量を２０μＬに調整して、アニーリング温度６２℃にてＲＴ−ＰＣＲ（サイクル数４０）を行った。内部標準としてＧＡＰＤＨ（プライマーはタカラバイオ社製）を使用し、それぞれのＧＡＰＤＨで補正したＭＭＰ１の発現比率をブレクナム・ディスカラー抽出物未添加かつＵＶＡ非照射のコントロールを１として相対的に算出し、図１に記載した。
【００２７】
図１記載のように、ＮＨＤＦ細胞にＵＶＡ１０Ｊ／ｃｍ２を照射するとＭＭＰ１の産生量が約２倍に増加したが、ＵＶＡ照射後に製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出液を添加して培養したＮＨＤＦ細胞ではＭＭＰ１の産生上昇が抑制されていた。したがって、製造例のブレクナム・ディスカラー抽出液は優れたＭＭＰ１産生抑制効果を有することが示された。
【００２８】
以下は、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤を配合する化粧料又は皮膚外用剤の例である。
［実施例２：洗顔料］
(製法)
Ａ．下記成分（１）〜（５）を加熱溶解する。
Ｂ．下記成分（６）、（７）を加熱溶解し、Ａに混合する。
Ｃ．下記成分（８）〜（１１）を加熱溶解し、Ｂに混合する。
Ｄ．Ｃを冷却後、下記成分（１２）〜（１４）を加え混合し、洗顔料を得た。
【００２９】
（成分）                                                        （質量％）
（１）ラウリン酸                                                ５．０
（２）ミリスチン酸                                            １８．５
（３）ステアリン酸                                              ６．０
（４）グリセリン                                              １２．０
（５）ポリエチレングリコール１５００                            ５．０
（６）水酸化カリウム                                            ６．５
（７）精製水                                                    残量
（８）ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                            ５．０
（９）ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム                      １．８
（１０）ポリオキシエチレン（７．５Ｅ．Ｏ．）ラウリルエーテル    ２．０
（１１）ジステアリン酸エチレングリコール                        １．０
（１２）ヒドロキシプロピルメチルセルロース１％水溶液            ５．０
（１３）製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                ０．０１
（１４）香料                                                    適量
【００３０】
［実施例３：化粧水］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（８）を混合溶解する。
Ｂ．下記成分（９）〜（１２）を混合溶解する。
Ｃ．ＡにＢを加え混合し、化粧水を得た。
【００３１】
（成分）                                                        (質量％)
（１）クエン酸                                                  ０．０５
（２）クエン酸ナトリウム                                        ０．２
（３）ピロリドンカルボン酸ナトリウム（５０％）水溶液            ０．５
（４）グリチルリチン酸ジカリウム                                ０．１
（５）グリセリン                                                ３．０
（６）１，３−ブチレングリコール                                ８．０
（７）精製水                                                    残量
（８）製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                  ０．０００１
（９）エタノール                                              １０．０
（１０）香料                                                    適量
（１１）フェノキシエタノール                                    ０．１
（１２）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                              ０．５
【００３２】
［実施例４：乳液（水中油型）］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（１３）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｂ．下記成分（１４）〜（１９）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｃ．ＡにＢを加え乳化し、更に下記成分（２０）を加え混合する。
Ｄ．Ｃを冷却し、下記成分（２１）を加え混合し、乳液を得た。
【００３３】
（成分）                                                        （質量％）
（１）ステアリン酸                                              １．０
（２）セタノール                                                ０．５
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                          ０．５
（４）流動パラフィン                                            ２．０
（５）スクワラン                                                ３．０
（６）ホホバ油                                                  ３．０
（７）パルミチン酸セチル                                        ０．２
（８）パルミチン酸レチノール                                    ０．２
（９）酢酸トコフェロール                                        ０．０５
（１０）１，２−ペンタンジオール                                ２．０
（１１）モノステアリン酸ソルビタン                              ０．３
（１２）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                              ０．５
（１３）ジブチルヒドロキシトルエン                              ０．１
（１４）トリエタノールアミン                                    ０．５
（１５）１，３−ブチレングリコール                            １５．０
（１６）グリセリン                                              ３．０
（１７）ポリエチレングリコール６０００                          ０．５
（１８）製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                ０．００５
（１９）精製水                                                  残量
（２０）カルボキシビニルポリマー１質量％水溶液                  ８．０
（２１）香料                                                    適量
【００３４】
［実施例５：クリーム］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（１４）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｂ．下記成分（１５）〜（１９）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｃ．ＡにＢを加え乳化し、更に下記成分（２０）を加え混合する。
Ｄ．Ｃを冷却し、下記成分（２１）、（２２）を加え混合し、クリームを得た。
【００３５】
（成分）                                                        （質量％）
（１）ステアリン酸                                              ２．５
（２）セタノール                                                ２．５
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                          ２．０
（４）ワセリン                                                  ２．０
（５）ジペンタエリトリット脂肪酸エステル                        ２．０
（６）ミリスチン酸イソトリデシル                                ５．０
（７）流動パラフィン                                            ８．０
（８）スクワラン                                                ５．０
（９）ミツロウ                                                  １．０
（１０）パルミチン酸セチル                                      ２．０
（１１）セスキオレイン酸ソルビタン                              ０．５
（１２）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                              １．５
（１３）コエンザイムＱ１０                                      ０．１
（１４）１，２−ペンタンジオール                                １．０
（１５）トリエタノールアミン                                    １．２
（１６）１，３−ブチレングリコール                              ８．０
（１７）グリセリン                                              ２．０
（１８）ポリエチレングリコール２００００                        ０．５
（１９）精製水                                                  残量
（２０）カルボキシビニルポリマー１％水溶液                    １０．０
（２１）製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                ０．０５
（２２）香料                                                    適量
【００３６】
［実施例６：油中水型日焼け止めクリーム］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（８）を７０℃で加熱混合した。
Ｂ．下記成分（９）〜（１１）及び（１３）（１４）を５０℃で加温混合した。
Ｃ．ＡにＢを加えて乳化し、冷却後（１２）を添加して油中水型日焼け止めクリームを得た。
【００３７】
（成分）                                                        （質量％）
（１）ポリオキシアルキレン変性オルガノポリシロキサン（注１）    ２．０
（２）パルミチン酸オクチル                                    １５．０
（３）デカメチルシクロペンタシロキサン                        ２０．０
（４）トリベヘン酸グリセリル                                    １．０
（５）微粒子酸化亜鉛                                          １２．０
（６）微粒子酸化チタン                                          ３．０
（７）パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル（注２）            ７．０
（８）４−ｔｅｒｔブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン        
（注３）                                                  １．０
（９）ジプロピレングリコール                                    ５．０
（１０）エタノール                                              ５．０
（１１）フェノキシエタノール                                    ０．２
（１２）香料                                                    適量
（１３）製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                ０．０００５
（１４）精製水                                                  残量
（注１）ＫＦ−６０１７（信越化学工業社製）
（注２）ユビナールＭＣ８０（ＢＡＳＦ社製）
（注３）ＰＡＲＳＯＬ  １７８９（Ｌ．Ｃ．ＵＮＩＴＥＤ社製）
【００３８】
［実施例７：パック化粧料］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（５）及び（１５）を７０℃で加熱混合し、室温まで冷却する。
Ｂ．Ａに下記成分（６）〜（１４）を添加混合してパック化粧料を得た。
【００３９】
（成分）                                                      （質量％）
（１）ポリビニルアルコール                                    １５．０
（２）グリセリン                                              １０．０
（３）ポリオキシエチレン（１０）メチルグルコール                ３．０
（４）トリオクタン酸グリセリル                                  ５．０
（５）ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸ナトリウム        １．０
（６）エタノール                                              ２０．０
（７）カオリン                                                  ２．０
（８）酸化チタン                                                ２．０
（９）グリチルリチン酸ジカリウム                                ０．１
（１０）乳酸（５０質量％水溶液）                                ０．５
（１１）乳酸ナトリウム（５０質量％水溶液）                      ０．５
（１２）フェノキシエタノール                                    ０．１
（１３）香料                                                    適量
（１４）製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                ０．００１
（１５）精製水                                                  残量
【００４０】
［実施例８：水中油型リキッドファンデーション］
（製法）
Ａ．下記成分（１）〜（７）を７０℃で加熱混合し、この混合物に下記成分（１３）〜（１８）を加えて混合し７０℃に保つ。
Ｂ．下記成分（８）〜（１２）を７０℃で加熱混合する。
Ｃ．ＢにＡを加えて乳化し、冷却後、下記成分（１９）〜（２０）を添加してリキッドファンデーションを得た。
【００４１】
（成分）                                                        （質量％）
（１）ジペンタエリトリット脂肪酸エステル                        ２．０
（２）流動パラフィン                                            ５．０
（３）ステアリン酸                                              ２．０
（４）セタノール                                                １．０
（５）自己乳化型モノステアリン酸グリセリル                      １．０
（６）パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル                    ８．０
（７）メチルパラベン                                            ０．０５
（８）グリセリン                                                ５．０
（９）トリエタノールアミン                                      １．０
（１０）カルボキシメチルセルロース                              ０．２
（１１）ベントナイト                                            ０．５
（１２）精製水                                                  残量
（１３）酸化チタン                                              ６．０
（１４）微粒子酸化チタン                                        ２．０
（１５）微粒子酸化亜鉛                                          ４．０
（１６）マイカ                                                  ２．０
（１７）タルク                                                  ４．０
（１８）着色顔料                                                適量
（１９）製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                ０．１
（２０）香料                                                    適量
【００４２】
[実施例９：水中油型軟膏剤]
（製法）
（製造方法）
Ａ．成分１〜３を加熱混合し、７５℃に保つ。
Ｂ．成分４〜９を混合し、７５℃に保つ。
Ｃ．ＡにＢを徐々に加え、軟膏剤を得た。
【００４３】
（成分）                                                    （質量％）
（１）ステアリン酸                                            １８．０
（２）セタノール                                                ４．０
（３）酢酸ｄｌ−α―トコフェロール（注３）                      ０．２
（４）トリエタノールアミン                                      ２．５
（５）グリセリン                                                ５．０
（６）グリチルリチン酸ジカリウム（注４）                        ０．５
（７）製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                  １．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                                  ０．１
（９）精製水                                                      残量
（注３）エーザイ社製
（注４）和光純薬工業社製
【００４４】
以下、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤を食品に配合する場合における配合例を示す。
【００４５】
[実施例１２：錠剤]
（製法）
Ａ.成分１〜７を均一に混合し、常法に従って錠剤を得た。
【００４６】
（処方）                                                          （質量％）
（１）乳糖                                                          ２４．０
（２）結晶セルロース                                                ２０．０
（３）コーンスターチ                                                １５．０ 
（４）製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                        ０．１
（５）デキストリン                                                  残量
（６）グリセリン脂肪酸エステル                                        ５．０
（７）二酸化ケイ素                                                    １．０
【００４７】
[実施例１３：清涼飲料]
（製法）
Ａ.成分１〜５を均一に混合し、常法に従って清涼飲料を得た。
【００４８】
（処方）                                                          （質量％）
１．果糖ブドウ糖液糖                                              ３０．０
２．乳化剤                                                          ０．５
３．製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物                        ０．００１
４．香料                                                            適量
５．精製水                                                          残量
【００４９】
実施例２〜実施例１３の皮膚外用剤、化粧料及び食品はいずれも変色・変臭および沈殿物などがなく、安定であった。これらはMMPの産生を抑制することにより、MMPが関与する様々な現象や疾患を予防・抑制・改善・治療するために利用することができ、老化防止用若しくは皮膚疾患予防用の化粧料又は皮膚外用剤、及びしわ・たるみ改善用化粧料又は皮膚外用剤に有用である。
【図１】
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