(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式１または２で表されるペプチド性複合体：
［構造式１］
【化１】
0005968343.tif 000006
［構造式２］
【化２】
0005968343.tif 000007
上記式中、
Ａは細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を表し、
Ｂは細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）又は細胞接着ペプチド（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を表し、
Ａ’は単核球又は腫瘍親和性細胞の細胞膜を浸透した細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を表し、
Ｍは細胞膜タンパク質を表し、
前記構造式１は、Ａ及びＢがそれぞれ細胞膜タンパク質の両末端に結合した構造を有する融合タンパク質であるペプチド性複合体を表し、
前記構造式２は、
細胞膜タンパク質の一つの末端にＡ’が結合した構造を有する細胞透過性ペプチドと細胞膜タンパク質との融合タンパク質であって、さらに蛍光物質、造影剤、薬剤学的活性成分及び／又は組織特異的結合成分と結合している融合タンパク質と
単核球又は腫瘍親和性細胞
とが結合した構造を有するペプチド性複合体を表す。
【請求項２】
細胞膜タンパク質は、オピオイド受容体デルタのトランスメンブレンドメイン１（ｏｐｉｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｌｔａ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ１（ＯＰＲＤ  ＴＭ１）を含む請求項１に記載のペプチド性複合体。
【請求項３】
細胞膜タンパク質は、配列リストの配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド性複合体。
【請求項４】
細胞透過性ペプチドは、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｔａｔ）、Ａｎｔｐ、Ｍｐｈ−１、ＶＰ２２及びＨＰ４よりなる群から選択された１つ以上である、請求項１に記載のペプチド性複合体。
【請求項５】
細胞接着ペプチドは、配列番号３（ＲＧＤＳ）、配列番号４（ＫＱＡＧＤＶ）、配列番号５（ＶＡＰＧ）、配列番号６（ＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳ、ＦＩＢ１）、配列番号７（ＡＴＬＱＬＱＥＧＲＬＨＦＸＦＤＬＧＫＧＲ、ＥＦ１ｚｚ）、配列番号８（ＡＧＴＦＡＬＲＧＤＮＰＱＧ、Ａ９９）及び配列番号９（ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫＹ、５３１）に記載されたアミノ酸配列よりなる群から選択された一つ以上である、請求項１に記載のペプチド性複合体。
【請求項６】
腫瘍親和細胞は、自然殺害細胞または大食細胞である、請求項１に記載のペプチド性複合体。
【請求項７】
構造式１で表されるペプチド性複合体がさらに蛍光物質、造影剤、薬剤学的活性成分及び／又は組織特異的結合成分と結合している、請求項１に記載のペプチド性複合体。
【請求項８】
薬剤学的活性成分が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、抗癌剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、腫瘍怪死因子、エンドトキシン、リポトックス、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性剤、プロテアーゼ阻害剤、アルキルホスホコリン、放射線同位元素で標識された成分、心血管系薬物、胃腸系薬物及び神経系薬物よりなる群から選択された一つ以上である、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド性複合体。
【請求項９】
組織特異的結合成分が、抗原、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、プロティンＡ、プロティンＧ、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）、セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、放射線同位元素標識成分及び腫瘍マーカーと特異的に結合することができる物質よりなる群から選択された１つ以上である、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド性複合体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド性複合体であって、さらに蛍光物質又は造影剤と結合しているペプチド性複合体を含む造影剤組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の構造式１で表されるペプチド性複合体であって、さらに蛍光物質又は造影剤及び標的指向性を有する細胞又は組織特異的結合成分と結合しているペプチド性複合体を含む標的指向型造影剤組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド性複合体であって、さらに蛍光物質又は造影剤及び薬剤学的活性成分と結合しているペプチド性複合体を含む同時診断または治療用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド性複合体と診断プローブとを含む多重診断プローブ。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載の構造式１で表されるペプチド性複合体であって、さらに幹細胞又は免疫細胞と結合しているペプチド性複合体を含む細胞治療剤。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載の構造式１で表されるペプチド性複合体であって、さらに内皮細胞又は血管前駆細胞と結合しているペプチド性複合体を含む医療用ステント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞伝達、追跡及び治療、分子映像システム、ステントなどの医療ツールに使用することができるペプチド性複合体であるバイオピンに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、幹細胞を利用した細胞移植、組織移植、ナノチューブ（ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、ナノ線（ｎａｎｏｗｉｒｅｓ）、マイクロ電気機械装置（ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＥＭＳ）、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、バイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）、バイオチップ（ｂｉｏｃｈｉｐ）、薬物伝達（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）などの分野において接着力調節が可能な生体素材の開発が要求されている（Ｎａｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ、２３、２５９−３１８）。しかし、幹細胞伝達を例に取れば、心筋梗塞治療用伝達細胞として可能な血管前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ、ＥＰＣｓ）を心筋組織に伝達する場合、伝達初期に細胞の大部分が洗われ、伝達された細胞の３〜５％だけが対象組織に付着されていて、その効率性が非常に低下する（Ａｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０７、２１３４−２１３９）。大部分の他の伝達細胞も、類似な結果を示し、これを克服するための様々な試みが行われているが、画期的な方法は全くない。特に接着タンパク質（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子などを細胞に伝達し、細胞付着（ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）効果を増進させようとする研究が一緒に進行されているが（Ｓｈｅｙｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．、６２、６８３−６９８）、遺伝子過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）された細胞は、遺伝的に変形された細胞（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｅｌｌｓ）であって、以後の臨床応用に規制対象となる可能性が高くて、これを適用した技術は商用化されにくい。
【０００３】
最近、多様な分野において生体親和的な素材を利用した生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）の開発研究を進行している。代表的に大豆から採取した接着剤、Ｎａｔｕｒａｌｏｃｋ社のウレタンフォーム接着剤（ｕｒｅｔｈａｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｆｏａｍ  ａｄｈｅｓｉｖｅ）、澱粉系接着剤（ｓｔａｒｃｈ−ｂａｓｅｄ  ａｄｈｅｓｉｖｅｓ）、ムラサキイガイ（ｂｌｕｅ  ｍｕｓｓｅｌ．Ｍｙｔｉｌｕｓ  Ｅｄｕｌｉｓ）由来接着剤、イガイ由来タンパク質接着剤などが工業用や医療用として開発されている（Ｃｉａｎｎａｍｅａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、１０１、８１８−８２５；Ｌｕｈｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｕｒｔｓｅｎ、２００９、Ｐｒｏｇ  Ｍｏｌ  Ｓｕｂｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４７、３５９−３８０；Ｖａｌｅｎｔａ、２００５、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、５７、１６９２−１７１２；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｏ、２００７、Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９、６６１−６８１）。しかし、これら生体接着剤は、エポキシやフェノール樹脂のような他の高分子基盤の接着剤に比べて環境親和的であるが、手術縫合用または産業用接着用途の非常に強力な素材開発を主要目的としており、細胞治療及び移植用として伝達しようとする細胞に直接接着剤を塗って応用するには適していない。
【０００４】
また、上記細胞治療及び移植用として伝達しようとする細胞が生体内に伝達されたかを確認するか、または疾病診断のための分子映像診断技術は、動物モデル水準で単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）を分離し、１１１ｉｎｄｉｕｍ  ｏｘｉｎｅを入れて、ＳＰＥＣＴ−ＣＴ映像を得るか（Ｋｉｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１７、３８８−３９５）、ヨードまたはゴールドナノ粒子造影剤を利用して大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）を映像化する研究（Ｈｙａｆｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１３、６３６−６４１）が進行されているが、このようなナノ粒子が細胞から抜け出て、生体至るところに付着しているということが診断の大きい限界として知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ、２３、２５９−３１８
【非特許文献２】Ａｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０７、２１３４−２１３９
【非特許文献３】Ｓｈｅｙｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．、６２、６８３−６９８
【非特許文献４】Ｃｉａｎｎａｍｅａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、１０１、８１８−８２５
【非特許文献５】Ｌｕｈｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｕｒｔｓｅｎ、２００９、Ｐｒｏｇ  Ｍｏｌ  Ｓｕｂｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４７、３５９−３８０
【非特許文献６】Ｖａｌｅｎｔａ、２００５、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、５７、１６９２−１７１２
【非特許文献７】Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｏ、２００７、Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９、６６１−６８１
【非特許文献８】Ｋｉｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１７、３８８−３９５
【非特許文献９】Ｈｙａｆｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１３、６３６−６４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、細胞間の接着の増加を誘導する生体連結用ペプチド性複合体であるバイオピン及びその製造方法を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、上記ペプチド性複合体であるバイオピンの細胞伝達、細胞治療、診断、医療用ツールなどの用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、下記構造式１で表されるペプチド性複合体を提供する：
［構造式１］
【化１】
0005968343.tif 000002
［構造式２］
【化２】
0005968343.tif 000003
上記式中、
Ａ及びＢは、それぞれ独立して、細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、細胞接着ペプチド（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、単核球または腫瘍親和細胞が結合された細胞透過性ペプチドあるいは細胞接着ペプチドを示し、
Ａ’は、単核球または腫瘍親和細胞が結合された細胞透過性ペプチドあるいは細胞接着ペプチドを示す。
【０００９】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む造影剤組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む標的指向型造影剤組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む同時診断または治療用組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体と、診断プローブとを含む多重診断プローブを提供する。
【００１３】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む細胞治療剤を提供する。
【００１４】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む医療用ステントを提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のペプチド性複合体は、細胞に効果的に伝達され、細胞間の結合を増加させるバイオピン（ｂｉｏｐｉｎ）であって、薬物または細胞伝達、細胞治療、分子映像、医療ツールに応用可能であり、診断や治療を目的にする素材として有用に使用されることができる。
【００１６】
また、本発明のペプチド性複合体は、特定疾患、例えば、動脈硬化、腫瘍などの病変部位を特異的に認識し、病変部位の細胞と結合することによって、疾患の同時診断または治療が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、細胞膜タンパク質を中心にＮ−末端及び／またはＣ−末端にそれぞれ細胞透過性ペプチド及び細胞接着ペプチドが融合される本発明のペプチド性複合体及び上記ペプチド性複合体の細胞間結合を示す概要図であって、ａ）は、細胞膜タンパク質を中心に両末端に細胞透過性ペプチドが融合される構造、ｂ）は、細胞膜タンパク質を中心に両末端に細胞透過性ペプチドと細胞接着ペプチドが融合される構造、ｃ）は、細胞膜タンパク質を中心に両末端に細胞透過性ペプチドと蛍光物質が融合された後、標的指向性を有する細胞が結合される構造、ｄ）は、細胞膜タンパク質を中心に一方の末端に細胞透過性ペプチドが融合される構造であって、他方の末端に細胞透過性ペプチドがないため、細胞間の結合が行われない融合ペプチドを示しており、ｅ）は、上記ｃ）構造のペプチド性複合体の細胞または組織への伝達を通じて病変部位に特異的に結合する作動メカニズムを示すものである。
【図２】図２は、細胞膜タンパク質を中心にＮ−末端またはＣ−末端に細胞透過性ペプチドまたは細胞接着ペプチドが融合されている本発明のペプチド性複合体のアミノ酸配列を示すもので、ａ）は、細胞膜タンパク質としてオピオイド受容体デルタのトランスメンブレンドメイン１（ｏｐｉｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｌｔａ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  １、ＯＰＲＤ）の一部分を使用してこれを中心にＮ−末端及びＣ−末端に細胞透過性ペプチド（ＴＡＴ）が結合された構造であり、ｂ）は、上記細胞膜タンパク質を中心にＮ−末端及びＣ−末端に細胞透過性ペプチド（ＴＡＴ）と細胞接着ペプチド（ＲＧＤ）が結合された構造であり、ｃ）は、上記細胞膜タンパク質のＣ−末端に細胞透過性ペプチド（ＴＡＴ）が結合された構造である。
【図３】図３は、本発明のペプチド性複合体の構造を示すもので、イタリック体配列は、細胞透過性ペプチドの一種であるＴＡＴ−ＣＰＰと細胞接着ペプチドの一種であるＲＧＤであり、下線で表示された配列は、オピオイド受容体デルタのトランスメンブレンドメイン１（ｏｐｉｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｌｔａ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  １、（ＯＰＲＤ））の一部分である。
【図４】図４は、本発明のペプチド性複合体（ＢＰｉｎ−４４：膜タンパク質のＣ−末端に細胞透過性ペプチドが位置するバイオピン；ＢＰｉｎ−５５：膜タンパク質の両末端に細胞透過性ペプチドが位置するバイオピン；ＢＰｉｎ−ＲＧＤ：膜タンパク質のＣ−末端に細胞透過性ペプチドが位置し、Ｎ−末端に細胞接着ペプチドが位置するバイオピン）を細胞に処理して得た共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）写真である。
【図５】図５及び図６は、緑色蛍光染料（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ、Ｄｉｌ）で染色されたラットの間葉系幹細胞に本発明のペプチド性複合体ＢＰｉｎ−４４及びＢＰｉｎ−５５をそれぞれ処理し、赤色蛍光染料（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ、ＤｉＯ）で染色された心臓細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌｓ  Ｈ９ｃ２）が敷設されている培養ディッシュに付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）させて得た蛍光顕微鏡写真（図５）と、蛍光分析機（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で吸収／放出（４８４ｎｍ／５０１ｎｍ）値を得て測定したグラフである（図６）。
【図６】図５及び図６は、緑色蛍光染料（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ、Ｄｉｌ）で染色されたラットの間葉系幹細胞に本発明のペプチド性複合体ＢＰｉｎ−４４及びＢＰｉｎ−５５をそれぞれ処理し、赤色蛍光染料（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ、ＤｉＯ）で染色された心臓細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌｓ  Ｈ９ｃ２）が敷設されている培養ディッシュに付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）させて得た蛍光顕微鏡写真（図５）と、蛍光分析機（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で吸収／放出（４８４ｎｍ／５０１ｎｍ）値を得て測定したグラフである（図６）。
【図７】図７は、緑色蛍光染料で染色されたラットの間葉系幹細胞に本発明のペプチド性複合体ＢＰｉｎ−４４及びＢＰｉｎ−ＲＧＤをそれぞれ処理し、心臓細胞が敷設されている培養ディッシュに付着させて、蛍光分析機で測定した吸収／放出（４８４ｎｍ／５０１ｎｍ）値を計算して得たグラフである。
【図８】図８は、Ｄｙｌｉｇｈｔ４０５  ＮＨＥ−ｅｓｔｅｒが修飾された本発明のペプチド性複合体ＢＰｉｎ−４４が結合され、緑色蛍光染料で染色された単核球ＴＨＰ−１細胞をＴＮＦ−ａｌｐｈａが処理された内皮細胞に付着させて、蛍光分析機で測定された吸収／放出（４８４ｎｍ／５０１ｎｍ）値から計算されたグラフである。
【図９】図９は、上記図８のＨＵＶＥＣｓの細胞溶解物に対する免疫ブロッティング結果を通じてＴＮＦ−ａｌｐｈａにより増加したＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１の水準を示すものである。
【図１０】図１０は、上記図８の過程を３次元映像で得たもので、ＨＵＶＥＣｓ（赤色）が敷設されている上にＴＨＰ−１（緑色）を同時に撮影した映像（左側写真）とＴＨＰ−１にＤｙｌｉｇｈｔ４０５  ＮＨＥ−ｅｓｔｅｒが修飾されたペプチド性複合体ＢＰｉｎ−４４（青色）が挿入されていることを証明した映像（右側写真）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、細胞内で生物学的な変化を予測しにくいし、副作用のおそれがある特定遺伝子を細胞内に伝達し、過発現させる方法ではなく、単純な細胞間の物理的結合を増加させることができるバイオピン（Ｂｉｏｐｉｎ）を開発しようとした。
【００１９】
一般的に、細胞伝達及び細胞治療技術において伝達細胞が対象臓器や組織に対して初期にどれほど効果的に付着されるかによって治療効果が変わることができる。特定遺伝子の過発現方法または高分子化合物を利用して伝達細胞を効率的に対象組織に伝達しようとする多様な試みは、これに対する反証である。したがって、従来の遺伝子操作方法あるいは高分子を利用した細胞伝達技術とは異なって、伝達細胞にペプチド性ピンを挿入して伝達しようとするバイオピンの開発は、細胞伝達及び細胞治療とこれを応用したナノバイオ分野の素材としての可能性を提示すると言える。
【００２０】
したがって、本発明は、下記構造式１で表されるペプチド性複合体を提供する：
［構造式１］
【化３】
0005968343.tif 000004
［構造式２］
【化４】
0005968343.tif 000005
上記式中、
Ａ及びＢは、それぞれ独立して、細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、細胞接着ペプチド（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、単核球または腫瘍親和細胞が結合された細胞透過性ペプチドあるいは細胞接着ペプチドを示し、
Ａ’は、単核球または腫瘍親和細胞が結合された細胞透過性ペプチドあるいは細胞接着ペプチドを示す。
【００２１】
上記構造式１の本発明のペプチド性複合体は、細胞透過性ペプチド−細胞膜タンパク質−細胞透過性ペプチド、細胞透過性ペプチド−細胞膜タンパク質−細胞接着ペプチド、細胞接着ペプチド−細胞膜タンパク質−細胞透過性ペプチド、または細胞接着ペプチド−細胞膜タンパク質−細胞接着ペプチドの構造を有することができる。上記構造は、細胞透過性ペプチド（または細胞接着ペプチド）に細胞治療剤として使用するための細胞、例えば、幹細胞、兔疫細胞、内皮細胞、血管前駆細胞など、疾病診断及び治療のための薬剤学的活性成分、組織特異的結合成分、蛍光物質、ナノ素材、造影剤などが結合された構造を有することができる。
【００２２】
上記構造式１または２の本発明のペプチド性複合体は、標的指向性を有する細胞−細胞透過性ペプチド（または細胞接着ペプチド）−細胞膜タンパク質構造または標的指向性を有する細胞−細胞透過性ペプチド（または細胞接着ペプチド）−細胞膜タンパク質−細胞透過性ペプチド（または細胞接着ペプチド）の構造を有することができる。上記構造は、疾病診断及び治療のための薬剤学的活性成分、蛍光物質、ナノ素材、造影剤などが結合された構造を有することができる。上記標的指向性を有する細胞は、単核球または腫瘍親和細胞などの病変親和的な細胞を含むことができる。上記病変親和的な細胞は、病変部位の細胞を認識して特異的に結合することができる細胞であって、例えば動脈硬化病変部位、腫瘍部位などの細胞を認識することができる。
【００２３】
上記細胞透過性ペプチドまたは細胞接着ペプチドと細胞膜タンパク質との結合は、ペプチド結合を通じて行われるか、または化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して行われることができ、これに特に制限しない。
【００２４】
上記蛍光物質、薬剤学的活性成分、組織特異的結合成分、ナノ粒子などは、化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して本発明のペプチド性複合体に結合されることができるが、これに特に制限しない。
【００２５】
上記細胞膜タンパク質において細胞透過性ペプチドまたは細胞接着ペプチドの結合部位は、制限なしに採択されることができ、例えば細胞膜タンパク質の一方の末端または両方の末端に結合されることができる。
【００２６】
上記標的指向性を有する細胞が本発明のペプチド性複合体と結合する場合、ペプチド性複合体の細胞透過性ペプチドまたは細胞接着ペプチドが上記標的指向性を有する細胞の細胞膜を浸透するか、または結合することによって、連結されることができる。
【００２７】
上記細胞膜タンパク質において細胞透過性ペプチドまたは細胞接着ペプチドの結合部位は、制限なしに採択されることができ、例えば細胞膜タンパク質の一方の末端または両方の末端に結合されることができる。
【００２８】
本明細書において「バイオピン、ｂｉｏｐｉｎ」というのは、生物学的物質、例えば、細胞を固定するためのペプチド性複合体を言う。特に、上記バイオピンに使用される二つの要素は、哺乳動物細胞の特定の膜タンパク質と細胞透過性ペプチド（または細胞接着ペプチド）よりなり、細胞の特定の膜タンパク質が頭部を、上記膜タンパク質の一方の末端または両方の末端に結合された細胞透過性ペプチド（または細胞接着ペプチド）は、それぞれ終端の部分を形成するピン構造を構成することができる。
【００２９】
一具体例によれば、細胞の特定の膜タンパク質を中間に位置させ、その細胞内側部位（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｔｅ）及び細胞外側部位（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｔｅ）の両方に細胞透過性ペプチド（または細胞接着ペプチド）が融合（ｆｕｓｉｏｎ）されるようにして製作されたペプチド性複合体の場合、これを細胞に伝達すれば、細胞膜に位置し、細胞内側部位に融合された細胞透過性ペプチドは、細胞内側に向かうようになり、外側部位に融合された細胞透過性ペプチド（または細胞接着ペプチド）は、細胞外部に露出し、対象細胞または組織に挿入されるかまたは接着されるようになる（図１参照）。外部に露出したペプチド性複合体が対象細胞または組織に挿入されるかまたは接着され、細胞間の結合が増加することは、膜タンパク質の細胞内側ドメインにのみ細胞透過性ペプチドが融合された形態のペプチド性複合体を細胞に伝達すれば、細胞膜に位置するようになるが、細胞外部に露出した細胞透過性ペプチド（または細胞接着ペプチド）がないため、対象細胞または組織に挿入されないことを通じて立証される（図１参照）。
【００３０】
他の具体例によれば、細胞の特定の膜タンパク質を中間に位置させ、その細胞内側部位（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｔｅ）及び細胞外側部位（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｔｅ）において内側部位には、細胞透過性ペプチドが融合されるようにし、細胞外側部位には、蛍光物質、造影剤、ナノ素材などが融合されるようにして、ペプチド性複合体を製造し、これを対象細胞に伝達すれば、細胞膜に位置し、細胞内側部位に融合される細胞透過性ペプチドが細胞内側に向かうようになり、蛍光物質、造影剤、ナノ素材などは、細胞外部に露出し、対象細胞または組織を認識することができる（図１参照）。上記対象細胞は、主に特定疾患の病変部位に対して結合力が強い細胞を選択することができるが、例えば、単核球、腫瘍親和的な自然殺害細胞または大食細胞などを挙げることができる。上記ペプチド性複合体が細胞膜に結合された対象細胞は、細胞または組織に伝達される場合、病変部位を認識し、病変部位の細胞との結合力が増加する（図１参照）。したがって、標的指向性を示す組織特異的結合成分が別に要求されない。
【００３１】
本明細書において言及された「ペプチド性複合体」は、２種以上のペプチドが結合された融合ペプチドを意味するもので、このうち１つのペプチドに細胞が結合された形態もペプチド性複合体と呼ばれる。後述するペプチド性複合体の製造方法は、細胞が結合されない融合ペプチドと関連したものと理解される。
【００３２】
本明細書において言及された「腫瘍親和細胞」は、腫瘍細胞に対して強い親和力を有する細胞を意味するもので、例えば、自然殺害細胞、大食細胞などを挙げることができる。
【００３３】
本明細書において言及された「標的指向性を有する細胞」は、病変部位組織または細胞に対して親和力を有する細胞を意味するもので、特に動脈硬化病変部位、腫瘍部位などを例示することができる。したがって、上記標的指向性を有する細胞は、単核球または腫瘍親和細胞などを含むことができ、上記単核球は、ＴＨＰ−１などを含むことができ、上記腫瘍親和細胞の種類は、前述した通りである。
【００３４】
上記細胞膜タンパク質は、哺乳動物細胞の膜タンパク質なら特に制限しないが、好ましくは、トランスメンブレンドメインが良い。例えば、オピオイド受容体デルタのトランスメンブレンドメイン１（ｏｐｉｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｌｔａ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ１（ＯＰＲＤ  ＴＭ１）などを含む細胞死滅などに影響を与えない細胞膜タンパク質なら特に制限しない。例えば、細胞膜タンパク質は、配列リストの配列番号１に記載されたアミノ酸配列を使用することができる。
【００３５】
上記細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＰＰ）またはタンパク質伝達体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ（ＰＴＤ））は、これらと化学的、物理的共有または非共有結合により直接または他の媒介体を利用して間接的に連結された特定タンパク質、ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂肪、炭水化物または化学的化合物を真核または原核細胞の細胞質または核内に伝達可能な物質ペプチドを言う。
【００３６】
上記細胞透過性ペプチドは、特に制限するものではないが、ヒト免疫欠乏ウイルスタイプＩ（ＨＩＶ−１）から由来するｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｔａｔ）タンパク質、キイロショウジョウバエのアンテナペディアホメオドメイン（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）であるＡｎｔｐ（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａまたはｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）ペプチド、ネズミの転写因子のＭｐｈ−１、ＨＳＶ−１のＶＰ２２及びニシンプロタミンのＨＰ４を使用することができる。
【００３７】
また、上記細胞透過性ペプチドは、特定細胞タイプまたは状態に特異性を有する細胞−特異的ＰＴＤを含むことができる。このような細胞−特異的ＰＴＤの一例は、米国特許公開第２００２−０１０２２６５号に記載されたＨｎ１合成ペプチドである。
【００３８】
また、上記細胞透過性ペプチドは、合成ペプチドであることができる。このような合成ペプチドの一例は、ＨｏなどがＨＩＶのＴａｔタンパク質がタンパク質伝達能力を最適化するようにＴａｔタンパク質の４７−５７残基を変形したペプチドである（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１（２）：４７４−７）。
【００３９】
本発明の具体的な実施例において、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶのＴａｔ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）を含んでいる。
【００４０】
上記細胞接着ペプチドは、組織工学及び傷治療分野で細胞成長及び組織形成のための機械的支持体としてスキャフォールドを利用するとき、細胞接着または生体特異細胞接着を向上させるためにスキャフォールドに共有的に結合させて使用する生活性リガンドを意味するもので、配列番号３（ＲＧＤＳ）、配列番号４（ＫＱＡＧＤＶ）、配列番号５（ＶＡＰＧ）、配列番号６（ＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳ、ＦＩＢ１）、配列番号７（ＡＴＬＱＬＱＥＧＲＬＨＦＸＦＤＬＧＫＧＲ、ＥＦ１ｚｚ）、配列番号８（ＡＧＴＦＡＬＲＧＤＮＰＱＧ、Ａ９９）または配列番号９（ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫＹ、５３１）に記載されたアミノ酸配列、または上記アミノ酸配列を少なくとも１つ以上含むアミノ酸配列、例えば配列番号１０（ＧＲＧＤＳＰ）のアミノ酸配列を使用することができるが、これに特に制限するものではない。
【００４１】
本発明の一具体例によれば、本発明のペプチド性複合体は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列の一方の末端または両方の末端に配列番号２に記載されたアミノ酸配列が結合されている形態であることができる。
【００４２】
本発明の他の具体例によれば、本発明のペプチド性複合体は、細胞透過性ペプチド（配列番号２）及び細胞接着ペプチド（配列番号３）が配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する細胞膜タンパク質の両末端に結合されている形態であることができる。
【００４３】
本発明のさらに他の具体例によれば、本発明のペプチド性複合体は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列の一方の末端または両方の末端に配列番号２に記載されたアミノ酸配列が結合されていて、これに標的指向性を有する細胞が結合されることができる。
【００４４】
本発明のペプチド性複合体は、ペプチドを合成する当該分野の公知された方法によって製造することができる。例えば、遺伝子組み換えとタンパク質発現システムまたはペプチド合成器などを通じて試験管内で合成する方法によって製造することができる。
【００４５】
したがって、本発明は、上記ペプチド性複合体を発現する組み換えベクターを提供する。
本発明において「組み換えベクター」というのは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現することができるベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物を言う。
【００４６】
上記ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。適当な発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーのような発現調節エレメント以外にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的によって多様に製造されることができる。ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であることができる。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。
【００４７】
本発明の組み換えベクターは、好ましくは、一般的な大腸菌菌株発現用ベクター、ｐＨｉｓ／ＴＡＴに細胞膜タンパク質をコーディングする核酸を挿入することによって製造されることができる。本発明の一具体例では、大腸菌発現用ベクターとしてｐＨｉｓ／ＴＡＴを使用したが、必ずこれに限定されるものではなく、一般的に使用することができるすべての大腸菌株発現用ベクターが制限なしに使用されることができる。
【００４８】
本発明の一具体例では、大腸菌菌株発現用ベクターであるｐＨｉｓ／ＴＡＴベクターを使用して本発明のＯＰＲＤ  ＴＭ１ドメインコーディング遺伝子及び細胞透過性ペプチドコーディング遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入し、組み換えベクターを製造した（図２参照）。
【００４９】
本発明の他の具体例では、大腸菌菌株発現用ベクターであるｐＨｉｓ／ＴＡＴベクターを使用して本発明のＯＰＲＤ  ＴＭ１ドメインコーディング遺伝子、細胞透過性ペプチドコーディング遺伝子及び細胞接着ペプチドコーディング遺伝子を含むＤＮＡ切片を挿入し、組み換えベクターを製造した（図２参照）。
【００５０】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を発現する組み換えベクターに形質導入された形質転換体を提供する。
【００５１】
上記形質転換は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法をも含まれ、当該分野で公知されたもののように、宿主細胞によって適当な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、シリコーンカーバイド繊維を利用した撹拌、アグロバクテリア媒介された形質転換、ＰＥＧ、デキクストランスルフェート、リポフェクタミンなどが含まれるが、これに制限されない。
【００５２】
また、宿主細胞によってタンパク質の発現量と修飾などが異なるように現われるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して使用すればよい。
【００５３】
宿主細胞としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のような原核宿主細胞があるが、これに制限されるものではない。また、真菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、酵母（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビジエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ニューロスポーラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）などのような下等真核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物などを含む高等真核生物由来の細胞を宿主細胞として使用することができる。
【００５４】
上記形質転換体は、上記組み換えベクターを任意の宿主細胞に導入させることによって、容易に製造されることができる。本発明の一具体例では、組み換えベクターｐＨｉｓ／ＴＡＴを大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体を製造した。
【００５５】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を発現する組み換えベクターに形質導入された形質転換体の培養物を分離精製する段階を含むペプチド性複合体の製造方法を提供する。
【００５６】
上記ペプチド性複合体は、通常の培養方法によって形質転換体を培養して精製することが好ましい。上記ペプチド性複合体は、組み換えベクターに導入されるインサート、すなわちコーディング遺伝子の塩基配列によってサイトカイン生産能に影響を与えない程度にアミノ酸配列の一部にいくらでも変形があり得る。上記変形は、欠失、挿入または置換による変形を意味する。
【００５７】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体に特異的に結合する多クローン性抗体を提供する。
【００５８】
上記多クローン性抗体の製造方法は、特に制限しないが、次の方法によって製造することが好ましい。
【００５９】
本発明のペプチド性複合体をＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）動物に１回〜数回注射して免疫化させる。最終免疫後、一定時間が経過した後、全血し、血清だけを取って、本発明のタンパク質に対する多クローン性抗体を得る。
【００６０】
上記免疫化動物は、通常、免疫化に使用される動物なら特に制限されないが、ラットであることが好ましい。上記免疫化のための注射回数、期間及び投与方法は、当業者水準で変形または変更可能なので、特に制限されない。
【００６１】
また、本発明のペプチド性複合体は、蛍光物質で修飾されることができる。
【００６２】
上記蛍光物質は、細胞透過性ペプチドまたは細胞接着ペプチドと化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して間接的に連結されることができる。
【００６３】
上記蛍光物質は、特に制限されないが、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８  ＮＨＥ−ｅｓｔｅｒ  ｄｙｅ、ＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＩ、ＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＯ、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ）ナノ粒子、フルオレセイン、ローダミン、ルシファー・イエロー、Ｂ−フィコエリスリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファー・イエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアナトスチルベン−２、２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、サクシニミジル−ピレンブチレート、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２、２’−ジスルホン酸誘導体、ＬＣTM−Ｒｅｄ  ６４０、ＬＣTM−Ｒｅｄ  ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミン、イソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、ジエチレントリアミンペンタアセテート、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネート、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、９−イソチオシアナトアクリジン、アクリジンオレンジ、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、イベント導体(Ｅｖｅｎ cｏｎｄｕｃｔｏr)、蛍光物質を含むシリカ、ＩＩ／ＩＶ族半導体量子ドット、ＩＩＩ／Ｖ族半導体量子ドット、ＩＶ族半導体量子ドット、または多成分混成構造体を含むことができ、好ましくは、上記蛍光物質は、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ）ナノ粒子、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＣＧ（ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ）、Ｃｙｐａｔｅ、ＩＴＣＣ、ＮＩＲ８２０、ＮＩＲ２、ＩＲＤｙｅ７８、ＩＲＤｙｅ８０、ＩＲＤｙｅ８２、Ｃｒｅｓｙ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ｎｉｌｅ  Ｂｌｕｅ、Ｏｘａｚｉｎｅ  ７５０、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ８００、ランタンナイド系及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで構成される群から選択されるいずれか１つ以上を使用することができ、上記量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ）ナノ粒子の場合には、ＩＩ−ＶＩまたはＩＩＩ−Ｖ族化合物を使用することができる。この場合、上記量子ドットナノ粒子は、ＣｄＳｅ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＴｅ／ＣｄＳ、ＣｄＴｅ／ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ／ＺｎＳ、ＺｎＴｅ／ＺｎＳｅ、ＰｂＳｅ、ＰｂＳ, ＩｎＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＧａＰ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ及びＨｇＴｅよりなる群から選択されるいずれか１つ以上のものを使用することができる。
【００６４】
また、本発明のペプチド性複合体は、化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して薬剤学的活性成分を導入することによって、疾病治療に使用することができる。
【００６５】
上記薬剤学的活性成分は、特に制限されないが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、抗癌剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、腫瘍怪死因子、エンドトキシン、リポトックス、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ 、組織プラスミノゲン活性剤、プロテアーゼ阻害剤、アルキルホスホコリン、放射線同位元素で標識された成分、心血管系薬物、胃腸系薬物、または神経系薬物などを単独または２種以上使用することができる。
【００６６】
上記抗癌剤としては、これに特に制限されるものではないが、例えば、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ゲムシタビン
（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、シクロホスファミ（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、またはメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを使用することができる。
【００６７】
また、本発明のペプチド性複合体は、化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して組織特異的結合成分を導入することによって、ペプチド性複合体に標的指向性を提供することができる。
【００６８】
上記組織特異的結合成分は、特に制限されないが、抗原、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、プロティンＡ、プロティンＧ、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）、セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、放射線同位元素標識成分または腫瘍マーカーなどを単独または２種以上使用することができる。
【００６９】
または、上記細胞透過性ペプチドは、特定細胞タイプまたは状態に特異性を有する細胞−特異的ＰＴＤ、例えば、米国特許公開第２００２−０１０２２６５号に記載されたＨｎ１合成ペプチドを含んで本発明のペプチド性複合体が標的指向性を有することができる。
【００７０】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む造影剤組成物に関する。
【００７１】
本発明のペプチド性複合体は、蛍光物質が物理化学的に結合されていて、磁気共鳴及び光学映像装置などを通じて標的部位のイメージングが可能な造影剤として使用することができる。
【００７２】
本発明の造影剤組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。上記担体は、医薬分野において通常使用される担体及びビヒクルを含み、具体的にイオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、各種リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例えば、プロタミンスルフェート、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カルリウム、塩化ナトリウム及び亜鉛塩）、膠質性シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコールまたは羊毛脂などを含むが、これに制限されない。
【００７３】
また、本発明の造影剤組成物は、上記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、または保存剤などをさらに含むことができる。
【００７４】
一様態として、本発明による造影剤組成物は、非経口投与のための水溶性溶液で製造することができ、好ましくは、ハンス溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンガー溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または物理的に緩衝された塩水のような緩衝溶液を使用することができる。水溶性注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）懸濁液は、ソジウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのように懸濁液の粘度を増加させることができる基質を添加することができる。
【００７５】
本発明の造影剤組成物の他の好ましい様態は、滅菌注射用水性または油性懸濁液の滅菌注射用製剤の形態であることができる。このような懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤（例えばツイン８０）及び懸濁化剤を使用して当該分野に公知された技術によって剤形化することができる。
【００７６】
また、上記滅菌注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば１、３−ブタンジオール中の溶液）であることができる。使用されることができるビヒクル及び溶媒としては、マンニトール、水、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、通常、滅菌非揮発性オイルが溶媒または懸濁化媒質として使用される。このような目的のために合成モノまたはジグリセリドを含んで刺激性が少ない非揮発性オイルは、いずれのものをも使用することができる。
【００７７】
本発明の造影剤組成物は、診断対象から分離した組織または細胞に投与し、蛍光ペプチド性複合体が発散する信号を感知し、映像を収得するのに利用されることができる。
【００７８】
上記蛍光ペプチド性複合体によって発散される信号を感知するためには、磁気共鳴映像装置（ＭＲＩ）と光学イメージングの利用が好ましい。
【００７９】
磁気共鳴映像装置は、強力な磁場の中に生体を入れて、特定周波数の電波を照射し、生体組織にある水素などの原子核にエネルギーを吸収させて、エネルギーが高い状態に作った後、上記電波を中断し、上記水素などの原子核エネルギーが放出されるようにして、このエネルギーを信号に変換し、コンピュータで処理して映像化した装置である。磁気または電波は、骨に邪魔されることなく、硬い骨の周囲または脳や骨髓の腫瘍に対して縦断、横断、任意の角度で鮮明な立体的な断層像を得ることができる。特に上記磁気共鳴映像装置は、Ｔ２スピン−スピン弛緩磁気共鳴映像装置であることが好ましい。
【００８０】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む標的指向型造影剤組成物に関する。
【００８１】
本発明のペプチド性複合体は、蛍光物質が結合されていて、蛍光性を有すると同時に、組織特異的結合成分が追加に結合されることができ、標的指向が可能で、磁気共鳴及び光学映像装置などを通じて標的部位のイメージングが可能な造影剤として使用することができる。
【００８２】
また、本発明の細胞透過性ペプチドに標的指向性を有する細胞が結合されたペプチド性複合体の場合、上記標的指向性を有する細胞は、特定病変部位と特異的な親和性を有する単核球、自然殺害細胞または大食細胞などが結合されていて、生体内導入時にこれら細胞が病変組織部位に移動することによって、別途の組織特異的結合成分なしに疾病の診断が可能である。例えば、上記病変組織部位は、動脈硬化病変組織または腫瘍組織であることができる。
【００８３】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む同時診断または治療用組成物に関する。
【００８４】
本発明のペプチド性複合体は、蛍光物質が結合されていて、蛍光性を有すると同時に、薬剤学的活性成分と物理化学的に結合し、磁気共鳴及び光学映像装置などを通じて生体分子の分離、診断または治療などのナノプローブ及び薬物または遺伝子伝達体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）などに利用することができる。
【００８５】
上記ペプチド性複合体を利用した生体診断の１つの代表的な例として、分子磁気共鳴映像診断または磁気弛緩センサー（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｏｒ）が挙げられる。ペプチド性複合体は、そのサイズが大きくなるにつれいて、さらに大きいＴ２造影効果を示すが、このような性質を利用すれば、生体分子を検出するセンサーとして使用されることができる。すなわち、特定の生体分子がペプチド性複合体の固まりを誘導するようになれば、これによって、Ｔ２磁気共鳴映像効果が増大する。このような差異を利用して生体分子を検出する。
【００８６】
また、本発明のペプチド性複合体は、動脈硬化または腫瘍と関連した多様な疾病、例えば、胃癌、肺癌、乳房癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌及び子宮頸部癌を診断及び／または治療するのに利用されることができる。
【００８７】
一具体例において、本発明のペプチド性複合体が単核球と結合されている場合、単核球は、動脈硬化病変部位の細胞を認識して特異的に結合するので、上記ペプチド性複合体の一部分に結合された蛍光物質の蛍光性を通じて動脈硬化を診断するか、または上記ペプチド性複合体に結合された動脈硬化を治療することができる薬物を通じて動脈硬化を特異的に治療することができる。
【００８８】
他の具体例において、本発明のペプチド性複合体が腫瘍親和細胞である自然殺害細胞、大食細胞などと結合されている場合、上記腫瘍親和細胞が癌細胞を認識して結合するので、上記ペプチド性複合体の一部分に結合された蛍光物質の蛍光性を通じて癌を診断するか、またはペプチド性複合体に結合された癌を治療することができる薬物を通じて癌を特異的に治療することができる。
【００８９】
さらに他の具体例において、腫瘍細胞は、正常細胞では、ほとんどまたは全然生産されない特定物質を発現及び／または分泌するが、これらを一般的に「腫瘍マーカー（ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒ）」と命名する。このような腫瘍マーカーと特異的に結合することができる物質が本発明のペプチド性複合体に結合されている場合、上記ペプチド性複合体は、腫瘍診断に有用に利用されることができる。当業界には、多様な腫瘍マーカーだけでなく、これらと特異的に結合することができる物質が公知されている。
【００９０】
また、上記腫瘍マーカーは、作用機作によってリガンド、抗原、受容体及びこれらをコーディングする核酸に分類することができる。
【００９１】
腫瘍マーカーが「リガンド」である場合には、上記リガンドと特異的に結合することができる物質を本発明によるペプチド性複合体に導入することができるが、上記リガンドと特異的に結合することができる受容体または抗体が適している。本発明で利用可能なリガンド及びこれと特異的に結合することができる受容体の例としては、シナプトタグミンのＣ２（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎのＣ２）とホスファチジルセリン、アネキシンＶ（ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）とホスファチジルセリン、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）とその受容体、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）とその受容体、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）とＴｉｅ２受容体、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）とその受容体、血管作動性腸管ペプチド（ｖａｓｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）とその受容体などがあるが、これに制限されるのではない。
【００９２】
腫瘍マーカーが「受容体」である代表的な例は、卵巣癌細胞で発現される葉酸受容体がある。上記受容体と特異的に結合することができる物質（葉酸受容体の場合には、葉酸）が本発明によるペプチド性複合体に導入されることができるが、上記受容体と特異的に結合することができるリガンドまたは抗体が適している。
【００９３】
腫瘍マーカーが「抗原」である場合、上記抗原と特異的に結合することができる物質を本発明によるペプチド性複合体に導入することができるが、上記抗原と特異的に結合することができる抗体が適している。本発明において利用可能な抗原及びこれと特異的に結合する抗体の例としては、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−大腸癌標識抗原）とハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原（ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ａｎｔｉｇｅｎ−乳房癌標識抗原）とハーセプチン、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−前立腺癌標識抗原）とリツキサン（ＩＤＣＥ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）などがある。
【００９４】
このような抗体は、商業的に入手するか、または当業界に公知された方法によって製造することができる。一般的に哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ウマまたはヒツジ）を適切な量の抗原で１回以上免疫化させる。一定時間後、力価が適正水準に至ったとき、哺乳動物の血清から回収する。回収した抗体は、希望する場合、公知された工程を利用して精製し、使用時まで冷凍緩衝された溶液に貯蔵することができる。このような方法の詳細な事項は、当業界によく知られている。
【００９５】
一方、上記「核酸」は、前述したリガンド、抗原、受容体またはその一部分をコーディングするＲＮＡ及びＤＮＡを含む。核酸は、当業界に知られたもののように、相補的な配列の間に塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）を形成する特徴を有しているので、特定の塩基配列を有する核酸は、上記塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸を利用して検出することができる。上記酵素、リガンド、抗原、受容体をコーディングする核酸と相補的な塩基配列を有する核酸を本発明によるペプチド性複合体に導入することができる。
【００９６】
また、核酸は、５’及び３’末端に−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＯＨなどの作用基があり、細胞透過性ペプチドと結合するのに有用に利用されることができる。
【００９７】
このような核酸は、当業界に公知された標準方法によって、例えば自動ＤＮＡ合成器（例えば、バイオサーチ、アプライドバイオシステムズなどから購入することができること）を使用して合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、文献（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８、ｖｏｌ．１６、ｐ．３２０９）に記述された方法により合成することができる。メチルホスホナートオリゴヌクレオチドは、調節されたガラス状重合体支持体を使用して製造することができる（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８８、ｖｏｌ．８５、ｐ．７４４８）。
【００９８】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体と、診断プローブとを含む多重診断プローブに関する。
【００９９】
上記診断プローブは、Ｔ１磁気共鳴映像診断プローブ、光学診断プローブ、ＣＴ診断プローブ、または放射線同位元素などを使用することができる。
【０１００】
上記多重診断プローブは、例えば、蛍光融合ペプチドにＴ１磁気共鳴映像診断プローブを結合させる場合、Ｔ２磁気共鳴映像及びＴ１磁気共鳴映像診断を同時に進行することができ、光学診断プローブを結合させる場合、磁気共鳴映像と光学イメージングを同時に行うことができ、ＣＴ診断プローブを結合させる場合、磁気共鳴映像とＣＴ診断を同時に行うことができる。また、放射線同位元素と結合させる場合、磁気共鳴映像とＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ診断を同時に行うことができる。
【０１０１】
上記Ｔ１磁気共鳴映像診断プローブとしては、Ｇｄ化合物またはＭｎ化合物などを含み、光学診断プローブとしては、有機蛍光染料（ｄｙｅ）、量子ドット、または染料標識（ｄｙｅ  ｌａｂｅｌｌｅｄ）無機支持体（例えば、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３）を含み、ＣＴ診断プローブとしては、Ｉ（ヨード）化合物、または金ナノ粒子を含み、放射線同位元素としては、Ｉｎ、Ｔｃ、またはＦなどを含む。
【０１０２】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む細胞治療剤に関する。
【０１０３】
本発明のペプチド性複合体は、細胞透過性ペプチドによって幹細胞または兔疫細胞などと結合され、細胞内に伝達される場合、標的細胞、組織または臓器の細胞膜に固定され、上記幹細胞または兔疫細胞などが長期間固定されることによって、細胞治療剤の効率を高める効果がある。
【０１０４】
上記兔疫細胞として大食細胞；補助Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、抑制Ｔ細胞などのＴ細胞；Ｂ細胞；樹枝状細胞、ランゲルハンス細胞、指状嵌入濾胞細胞 (interdigiting follicular cell) などの抗原提示細胞を含むが、これに特に制限されるものではない。
【０１０５】
また、本発明のペプチド性複合体は、化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して蛍光物質が結合され、細胞内に伝達される場合、蛍光強度を測定することによって、細胞追跡が可能である。
【０１０６】
また、本発明のペプチド性複合体は、化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して組織特異的結合成分が結合され、細胞内に伝達される場合、細胞標的指向性を高めることができる。
【０１０７】
また、本発明のペプチド性複合体は、化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して薬剤学的活性成分、例えば、心血管疾患、脳疾患などの抑制または治療用薬物が結合され、細胞内に伝達される場合、細胞の治療的効果を高めることができる。
【０１０８】
本発明は、また、本発明のペプチド性複合体を含む医療用ステントに関する。
【０１０９】
本発明のペプチド性複合体は、細胞透過性ペプチドによって内皮細胞または血管前駆細胞などと結合され、細胞内に伝達される場合、標的細胞、組織または臓器の細胞膜に固定され、上記内皮細胞または血管前駆細胞などが長期間固定されることによって、医療用ステントの治療効率を高める効果がある。
【０１１０】
また、本発明のペプチド性複合体は、化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して蛍光物質が結合され、血管内に伝達される場合、蛍光強度を測定することによって、ステント追跡が可能である。
【０１１１】
また、本発明のペプチド性複合体は、化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して組織特異的結合成分が結合され、血管内に伝達される場合、標的指向性を高めることができる。
【０１１２】
また、本発明のペプチド性複合体は、化学的、物理的共有または非共有結合によって直接または他の媒介体を利用して薬剤学的活性成分、例えば、細胞増殖抑制薬物などが結合され、血管内に伝達される場合、ステントの治療的効果を高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
以下、本発明を実施例を通じて詳しく説明する。下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。
【０１１４】
〈実施例１〉組み換え方法による細胞透過性ペプチド−細胞膜タンパク質−細胞透過性ペプチド構造のペプチド性複合体の製造
ｐＨｉｓ／ＴＡＴ発現ベクター（Ｋｗｏｎ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、３６３、３９９−４０４）を利用して製造した。ＯＰＲＤ  ｃＤＮＡを鋳型にして二つのプライマー、Ｐｒｉｍｅｒ−１、５’−ＴＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＧ−３’（下線ＢａｍＨＩ部位）及びＰｒｉｍｅｒ−２、５’−ＡＧＧＣＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＴＡＡＧＴＧＴＡＣＣＧＧＡＣＧＡＴＧＣＣＧＡＡ−３’（下線ＸｈｏＩ部位）を利用してＰＣＲしてＤＮＡ断片を得て、それぞれの制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ）で切断し、ｐＨｉｓ／ＴＡＴ発現ベクターに入れ、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現した後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを使用してタンパク質を分離精製した。このようになれば、３７２個のアミノ酸であって、７個トランスメンブレンドメインで構成されたＯＰＲＤタンパク質の一番目のドメイン部分である４８番目のアミノ酸（ロイシン、Ｌ）から７８番目のアミノ酸（スレオニン、Ｔ）まで３１個アミノ酸で構成されたペプチドを中心にＮ−末端及びＣ−末端にそれぞれＴＡＴ細胞透過性ペプチドが融合されたバイオピンが製造された（図２参照、ＢＰｉｎ−５５）。
【０１１５】
また、３１アミノ酸で構成されたＯＰＲＤペプチドの一方にのみ細胞透過性ペプチドが位置するように製造するために、Ｐｒｉｍｅｒ−１を５’−ＴＣＧＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣ−３’（下線ＮｄｅＩ部位）に代替して、ＰＣＲし、同様の方法で製造した（ＢＰｉｎ−４４）。
【０１１６】
〈実施例２〉ペプチド合成による細胞透過性ペプチド−細胞膜タンパク質−細胞透過性ペプチド構造のペプチド性複合体の製造
本発明のペプチド性複合体は、ペプチド合成器（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を利用して製造することができる。図３は、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社（ＵＳＡ）に依頼してペプチド合成器で合成されたもので、ＯＰＲＤ一番目のドメインの両方に細胞透過性ペプチドが融合されたバイオピン（ＢＰｉｎ−５５）と一方にのみ融合されたＢＰｉｎ−４４を製造した配列を示すものである。
【０１１７】
〈実験例１〉蛍光物質で修飾された実施例１のペプチド性複合体の細胞への伝達
ラットの心筋芽細胞（Ｒａｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  Ｈ９ｃ２（３×１０４ｃｅｌｌｓ）細胞を４−ウェルチャンバ（Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ、Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ）で１０％ＦＣＳと抗生剤が添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を２４時間安定化させた後、細胞標識用染料（ＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を最終５μＬ／ｍＬの濃度で処理し、３７℃  ＣＯ２培養器で３０分間放置した。その後、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で３回洗浄して準備した。
【０１１８】
二つの種類のバイオピン（ＢＰｉｎ−４４、ＢＰｉｎ−５５、図３参照）は、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社（ＵＳＡ）に依頼して合成した。バイオピンの修飾化は、次のように行った。バイオピンペプチド（ＢＰｉｎ−４４、ＢＰｉｎ−５５）０．１ｍｇにＤｙｌｉｇｈｔ  ４８８  ＮＨＥ−ｅｓｔｅｒ  ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）をそれぞれ２０．６μＬ、１５．６μＬ処理した。室温で１時間反応させた後、透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を実施し、修飾されない蛍光染料は、除去した。
【０１１９】
上記の用意した細胞にＤｙｌｉｇｈｔ  ４８８  ＮＨＥ−ｅｓｔｅｒ  ｄｙｅで修飾バイオピンを最終１μＭ濃度で処理した後、３７℃  ＣＯ２培養器で１時間放置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察するために、細胞チャンバにｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３ｄｒｏｐｓ）処理した後、ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＩ（赤色）（Ａｂｓ  ５４９ｎｍ／Ｅｍ  ５６５ｎｍ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８  ＮＨＥ−ｅｓｔｅｒ（緑色）（Ａｂｓ  ４９３ｎｍ／Ｅｍ  ５１８ｎｍ）波長で観察した。
【０１２０】
図４に示されたように、２つの種類のバイオピンがいずれも細胞膜に位置することを確認した。
【０１２１】
〈実験例２〉実施例１のペプチド性複合体による細胞間の結合の増加効果
ラットの心筋芽細胞（Ｒａｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  Ｈ９ｃ２細胞）を４−ウェルチャンバ（Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ）に１００％満たされるように培養した。細胞−標識化染料（ＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＩ）を最終５μＬ／ｍＬの濃度で処理し、３７℃  ＣＯ２培養器で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄して準備した。
【０１２２】
ラットの間葉系幹細胞は、ＭｅｓｅｎＰＲＯ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）培地で培養ディッシュで培養した後、ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡとｔｒｙｐｓｉｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを１：１比率で入れて、５分間処理し、細胞を分離し、細胞−修飾化染料（ＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で最終５μＬ／ｍＬの濃度で処理し、３７℃  ＣＯ２  培養器で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、準備した。
【０１２３】
これに上記実施例１または２で用意したペプチド性複合体を最終１μＭ濃度で処理した後、３７℃  ＣＯ２培養器で１時間左右に振りながら反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、遠心分離し、１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地４００μＬ処理し、再懸濁した。これをＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＩで染色されたＨ９ｃ２細胞の上に散布し、３７℃  ＣＯ２培養器で１０分間放置した。その後、ＰＢＳで数回洗浄し、Ｈ９ｃ２に付いていないＭＳＣｓを除去し、蛍光顕微鏡ＩＸ７１蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＳＡ）を使用してＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＩ（赤色）（Ａｂｓ  ５４９ｎｍ／Ｅｍ  ５６５ｎｍ）、ＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＯ（緑色）（Ａｂｓ  ４８８ｎｍ／Ｅｍ  ５０１ｎｍ）波長にそれぞれＨ９ｃ２細胞とＭＳＣｓを観察した。Ｈ９ｃ２に付着しているＭＳＣｓを定量化するために細胞培地を回収し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を２００μＬ添加した後、５分後に回収し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用して４８５／５３５ｎｍ波長で測定した。
【０１２４】
図５及び図６に示されたように、バイオピンＢＰｉｎ−５５が伝達された実験群で細胞間の結合が顕著に増加することを確認した。
【０１２５】
〈実施例３〉組み換え方法による細胞透過性ペプチド−細胞膜タンパク質−細胞接着ペプチド構造のペプチド性複合体の製造
ｐＨｉｓ／ＴＡＴ発現ベクター（Ｋｗｏｎ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、３６３、３９９−４０４）を利用して製造した。ＯＰＲＤｃＤＮＡを鋳型にして二つのプライマー、Ｐｒｉｍｅｒ−１、５’−ＴＣＧＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣ−３’（下線ＮｄｅＩ部位）及びＰｒｉｍｅｒ−２、５’−ＡＧＧＣＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＴＡＡＧＴＧＴＡＣＣＧＧＡＣＧＡＴＧＣＣＧＡＡ−３’（下線ＸｈｏＩ部位）を利用してＰＣＲしてＤＮＡ断片を得て、それぞれの制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ）で切断し、ｐＨｉｓ／ＴＡＴ発現ベクターに入れ、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現した後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを使用してタンパク質を分離精製した。このようになれば、３７２個のアミノ酸であって、７個のトランスメンブレンドメインで構成されたＯＰＲＤタンパク質の一番目のドメイン部分である４８番目アミノ酸（ロイシン、Ｌ）から７８番目アミノ酸（スレオニン、Ｔ）まで３１個アミノ酸で構成されたペプチドを中心にＮ−末端及びＣ−末端にそれぞれ接着ペプチド（ＧＲＧＤＳＰ）とＴＡＴ細胞透過性ペプチドが融合されたバイオピン（ＢＰｉｎ−ＲＧＤ）が製造された（図２参照）。
【０１２６】
〈実施例４〉ペプチド合成による細胞透過性ペプチド−細胞膜タンパク質−細胞接着ペプチド構造のペプチド性複合体の製造
本発明のペプチド性複合体は、ペプチド合成器（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を利用して製造することができる。図３は、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社（ＵＳＡ）に依頼してペプチド合成器で合成されたものであって、ＯＰＲＤの一番目のドメインの両方に細胞接着ペプチドと細胞透過性ペプチドが融合されたバイオピン（ＢＰｉｎ−ＲＧＤ）を示すものである。
【０１２７】
〈実験例２〉蛍光物質で修飾された実施例３のペプチド性複合体の細胞への伝達
ＤＭＥＭ培地で培養したラット心筋芽細胞（ｒａｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｂｌａｓｔ）Ｈ９ｃ２細胞をマイクロチューブに入れ、ＣｅｌｌＭａｓｋTM  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｉｎｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を最終５μｇ／ｍＬの濃度で処理し、３７℃  ＣＯ２培養器で３０分間放置した。その後、遠心分離とｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で３回洗浄し、さらにＤＭＥＭ培地５００μＬで再懸濁して準備した。
【０１２８】
ペプチド（ＢＰｉｎ−ＲＧＤ）の修飾は、次のように行った。ＤｙＬｉｇｈｔ４０５  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）をジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）１００μＬにとかした後、これにそれぞれのペプチド０．１ｍｇを入れた。室温で１時間反応させた後、透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を実施し、修飾されない染料を除去した。
【０１２９】
上記で染色で用意した細胞（５×１０４ｃｅｌｌｓ）に修飾されたペプチドを１００ｎＭ処理した後、３７℃  ＣＯ２培養器で１時間放置した。その後、遠心分離とＰＢＳ洗浄を３回繰り返した。対照群としてＢＰｉｎ−４４を使用した。
【０１３０】
共焦点顕微鏡を利用した観察のために、細胞チャンバにマウンティング溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（３滴）を処理した後、ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＣｅｌｌＭａｓｋTM  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｉｎｓ（赤色）（Ａｂｓ  ５５４／Ｅｍ  ５６７ｎｍ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４０５  ＮＨＥ−ｅｓｔｅｒ（青色）（Ａｂｓ  ４００ｎｍ／Ｅｍ  ４２０ｎｍ）波長で観察した。
【０１３１】
図４に示されたように、二つのペプチドがいずれも細胞膜に位置することを確認した。
【０１３２】
〈実験例４〉実施例３のペプチド性複合体による細胞間の結合増加効果
ラットの心筋芽細胞（Ｒａｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  Ｈ９ｃ２細胞）を４−ウェルチャンバ（Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ）に１００％満たされるように培養した。ＣｅｌｌＭａｓｋTM  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｉｎｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を最終５μｇ／ｍＬの濃度で処理し、３７℃  ＣＯ２培養器で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄して準備した。
【０１３３】
ラット間葉系幹細胞（Ｒａｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍｓ  ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）は、ＭｅｓｅｎＰＲＯ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）培地で培養ディッシュで培養した後、トリプシン−ＥＤＴＡとトリプシン−中和溶液（ｔｒｙｐｓｉｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１：１比率で入れ、５分間処理し、細胞を分離し、細胞修飾染料（ＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で最終２μＬ／ｍＬの濃度で処理し、３７℃  ＣＯ２培養器で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離して準備した。
【０１３４】
これに上記実施例３で用意したバイオピンを最終１００ｎＭ濃度で処理した後、３７℃  ＣＯ２培養器で１時間左右に振りながら反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、遠心分離し、１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地４００μＬ処理し、再懸濁した。これを染色されたＨ９ｃ２細胞の上に散布し、３７℃  ＣＯ２培養器で１０分間放置した。その後、ＰＢＳで数回洗浄し、Ｈ９ｃ２に付着していないＭＳＣｓを除去し、付着したＭＳＣｓを定量化するために、０．１％トリトンＸ−１００を２００μＬ添加した後、５分後に回収し、蛍光分析機Ｖｉｃｔｏｒ３（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用してＡｂｓ  ４８４ｎｍ／Ｅｍ  ５０１ｎｍ波長で測定した。
【０１３５】
図７に示されたように、バイオピンＢＰｉｎ−ＲＧＤが伝達された実験群で細胞間結合が顕著に増加することを確認した。
【０１３６】
〈実施例５〉蛍光物質が修飾されたペプチド性複合体−単核球製造
ＤｙＬｉｇｈｔ４０５  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）をジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）１００μＬにとかした後、これにペプチドＢＰｉｎ−４４  ０．１ｍｇを入れた。室温で１時間反応させた後、透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を使用して、修飾されない染料を除去した。
【０１３７】
単核球ＴＨＰ−１細胞は、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）で培養ディッシュで培養した後、トリプシン−ＥＤＴＡとトリプシン中和溶液（ｔｒｙｐｓｉｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１：１比率で入れ、５分間処理し、細胞を分離し、細胞−修飾染料（ＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＤｉＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で最終２μｇ／ｍＬの濃度で処理し、３７℃  ＣＯ２培養器で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離して準備した。
【０１３８】
上記細胞（５×１０４ｃｅｌｌｓ）に蛍光物質が修飾されたペプチド（ＢＰｉｎ−４４）を１００ｎＭ処理した後、３７℃  ＣＯ２培養器で１時間放置した。その後、遠心分離とＰＢＳ洗浄を３回繰り返した。
【０１３９】
〈実験例５〉実施例５の蛍光物質が修飾されたペプチド性複合体−単核球の内皮細胞に対する結合力の調査
ＨＵＶＥＣｓ（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４−ウェルプレートでＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）で培養した後、０．５％ＥＢＭ培地で４時間飢餓（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）させて、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ（１０ｎｇ／ｍＬ）を２４時間処理した。ＣｅｌｌＭａｓｋTM  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｉｎｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を最終５μｇ／ｍＬの濃度で処理し、３７℃  ＣＯ２培養器で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄して準備した。
【０１４０】
これに上記実施例５で用意した蛍光物質が修飾されたペプチドが処理されたＴＨＰ−１細胞を１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地４００μＬ処理して再懸濁した。これを染色されたＨＵＶＥＣｓの上に散布し、３７℃  ＣＯ２培養器で３０分間放置した。その後、ＰＢＳで数回洗浄し、付着していないＴＨＰ−１細胞を除去し、付着した細胞を定量化するために、０．１％トリトンＸ−１００を２００μＬ添加した後、５分後に回収し、蛍光分析機Ｖｉｃｔｏｒ３（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用してＡｂｓ  ４８４ｎｍ／Ｅｍ  ５０１ｎｍ波長で測定した。
【０１４１】
図８に示されたように、蛍光物質が修飾されたペプチドが結合された単核球をＴＮＦ−ａｌｐｈａによって刺激された内皮細胞に処理したとき、対照群（刺激を受けない内皮細胞）に比べて結合力が増加したことを確認した。
【０１４２】
また、ＴＮＦ−ａｌｐｈａによってＨＵＶＥＣｓが良好に刺激を受けたかを確認するために、抗−ＩＣＡＭ−１、抗
−ＶＣＡＭ−１抗体を使用して免疫ブロッティングを実施した結果、ＴＮＦ−ａｌｐｈａによってＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）及びＶＣＡＭ−１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ１）発現が増加した（図９）。
【０１４３】
また、ＨＵＶＥＣｓの上に結合されたＴＨＰ−１細胞に実際蛍光染料修飾されたＢＰｉｎ−４４が挿入されたものであるか否かを確認するためにＨＵＶＥＣｓ及びＴＨＰ−１同時撮影映像、ＨＵＶＥＣｓ及び蛍光染料修飾ＢＰｉｎ−４４同時撮影映像の３次元映像を通じてＴＨＰ−１細胞位置と蛍光染料修飾ＢＰｉｎ−４４位置が同一であることを確認した（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明は、細胞治療剤、診断用造影剤、医療ツールなどに使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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