(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、下記（1）および（2）の要件：
（1）POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子の6遺伝子を発現すること；
（2）（a）内在性がん抑制遺伝子の変異、および／または（b）内在性がん関連遺伝子の発現上昇の異常を有すること；
を具備することを特徴とし、
原料体細胞が、内在性がん抑制遺伝子の変異を有する哺乳動物から採取した体細胞（ただし、がん細胞株を除く）、あるいは発がんした哺乳動物の新鮮ながん組織または非がん組織から採取した非胚性の体細胞（ただし、がん細胞株を除く）であり、
前記（1）の自己複製関連遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して1/8から8倍である、誘導前がん幹細胞又は誘導悪性幹細胞である誘導がん幹細胞。
【請求項２】
NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、TDGF1遺伝子、DNMT3B遺伝子、ZFP42遺伝子、TERT遺伝子、GDF3遺伝子、SALL4遺伝子、GABRB3遺伝子、およびLIN28遺伝子を発現している、請求項1に記載された誘導がん幹細胞。
【請求項３】
ACVR2B遺伝子、CD24遺伝子、CDH1遺伝子、CYP26A1遺伝子、DNMT3B遺伝子、DPPA4遺伝子、EDNRB遺伝子、FLT1遺伝子、GABRB3遺伝子、GATA6遺伝子、GDF3遺伝子、GRB7遺伝子、LIN28遺伝子、NANOG遺伝子、NODAL遺伝子、PODXL遺伝子、POU5F1遺伝子、SALL4遺伝子、SOX2遺伝子、TDGF1遺伝子、TERT遺伝子、ZFP42遺伝子、およびZIC3遺伝子を発現している、請求項2に記載された誘導がん幹細胞。
【請求項４】
前記誘導がん幹細胞で発現している前記（1）自己複製関連遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して1/4から4倍である、請求項1に記載された誘導がん幹細胞。
【請求項５】
前記誘導がん幹細胞で発現している前記（1）自己複製関連遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して1/2から2倍である、請求項4に記載された誘導がん幹細胞。
【請求項６】
（a）前記がん抑制遺伝子が、APC遺伝子、またはRB1遺伝子である、請求項1〜5の何れかに記載された誘導がん幹細胞。
【請求項７】
（b）前記がん関連遺伝子が、血管新生関連遺伝子群、がん関連パスウェイ遺伝子群、間質バリア関連遺伝子群、上皮-間葉転換関連遺伝子群、胃がん関連遺伝子群、自律増殖関連遺伝子群、TGFβ/BMPシグナル関連遺伝子群、組織侵潤・転移関連遺伝子群、Wntシグナル関連遺伝子群、シグナル伝達関連遺伝子群、Notchシグナル関連遺伝子群、乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子群、結腸がん関連遺伝子群、低酸素シグナル関連遺伝子群、GPCRシグナル関連遺伝子群、薬剤耐性関連遺伝子群、Hedgehogシグナル関連遺伝子群、PI3K-AKTシグナル関連遺伝子群、薬物代謝遺伝子群、がん分子メカニズム遺伝子群、SMADシグナルネットワーク関連遺伝子群、膵がん関連遺伝子群、前立腺がん関連遺伝子群、肝がん関連遺伝子群、肺がん関連遺伝子群からなる群に含まれる遺伝子の群の中から選択される少なくとも1種の遺伝子群である、請求項1〜6の何れかに記載された誘導がん幹細胞。
【請求項８】
（b）前記内在性がん関連遺伝子に加え、ストレス及び毒性関連遺伝子群、エピジェネティクスクロマチン修飾酵素遺伝子群、幹細胞転写因子遺伝子群からなる群に含まれる遺伝子の群の中から選択される少なくとも1種の内在性の遺伝子に、遺伝子の発現上昇が生じている、請求項1〜7の何れかに記載された誘導がん幹細胞。
【請求項９】
更に、中内胚葉系幹細胞、または内胚葉系幹細胞に特徴的な遺伝子を発現している、請求項1〜8の何れかに記載された誘導がん幹細胞。
【請求項１０】
前記中内胚葉系幹細胞に特徴的な遺伝子がGSC遺伝子であり、前記内胚葉系幹細胞に特徴的な遺伝子が、GSC遺伝子、GATA4遺伝子、FOXA2遺伝子、SOX17遺伝子から選択された少なくとも1種である、請求項9に記載された誘導がん幹細胞。
【請求項１１】
（b）前記内在性がん関連遺伝子に加え、肝細胞特異的遺伝子群に含まれる遺伝子の群の中から選択される少なくとも1種の遺伝子に、遺伝子の発現上昇が生じている、請求項1〜10の何れかに記載された誘導がん幹細胞。
【請求項１２】
内在性がん抑制遺伝子の変異を有する哺乳動物から採取した体細胞（ただし、がん細胞株を除く）、あるいは発がんした哺乳動物の新鮮ながん組織または非がん組織から採取した非胚性の原料体細胞（ただし、がん細胞株を除く）から、請求項1の（1）および（2）の特徴を有する誘導がん幹細胞を製造する方法であって、該方法が、前記原料体細胞を、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が前記原料体細胞内に存在する状態におく誘導工程を行うことを特徴とする、誘導前がん幹細胞又は誘導悪性幹細胞である誘導がん幹細胞の製造方法。
【請求項１３】
POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の前記原料体細胞内における存在比率が、POU5F1遺伝子＞SOX2遺伝子の関係を満たす、請求項12に記載された誘導がん幹細胞の製造方法。
【請求項１４】
POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物を使用する、請求項12または13に記載された製造方法。
【請求項１５】
前記誘導工程が、原料体細胞を、bFGF、ALK阻害剤、TGF-beta RI阻害剤、およびTGF-beta RIキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を添加した培地中で培養することを含む、請求項12〜14の何れかに記載された製造方法。
【請求項１６】
前記誘導工程が、原料体細胞に、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子、TBX3遺伝子、PRDM14遺伝子、L-MYC遺伝子、c-MYC遺伝子、N-MYC遺伝子、SALL1遺伝子、SALL4遺伝子、UTF1遺伝子、ESRRB遺伝子、NR5A2遺伝子、REM2 GTPase遺伝子、TCL-1A遺伝子、Yes-associated protein（YAP）遺伝子、E-カドヘリン遺伝子、p53ドミナントネガティブ変異体遺伝子、およびp53shRNA遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子またはこれらの遺伝子産物を導入することを含む、請求項12〜15の何れかに記載された製造方法。
【請求項１７】
前記誘導工程が、原料体細胞を、誘導多能性幹細胞を誘導することが知られている化合物を添加した培地中で培養することを含む、請求項12〜16の何れかに記載された製造方法。
【請求項１８】
誘導多能性幹細胞を誘導することが知られている化合物が、FGF receptor tyrosine kinase、MEK（mitogen activated protein kinase）/ERK（extracellular signal regulated kinases 1 and 2）経路、およびGSK（Glycogen Synthase Kinase）3の三つの低分子阻害剤、MEK/ERK経路及びGSK3の二つの低分子阻害剤、ヒストンメチル化酵素G9aの阻害剤である低分子化合物、アザシチジン、トリコスタチンA（TSA）、7-hydroxyflavone、lysergic acid ethylamide、kenpaullone、TGFβ receptorI kinase/activin-like kinase 5 （ALK5）の阻害剤、TGF-βreceptor 1（TGFBR1）kinaseの阻害剤、Src-family kinaseの阻害剤、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGF-β中和抗体、A-83-01、Nr5a2、p53阻害化合物、p53に対するsiRNA、ならびにp53経路の阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項17に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記誘導工程が、原料体細胞を、低酸素下で培養することを含む、請求項12〜18の何れかに記載された製造方法。
【請求項２０】
更に、1ウェルに1細胞をソーティングして増殖させる工程を含む、請求項12〜19の何れかに記載された製造方法。
【請求項２１】
更に、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞の悪性の性質又は特異マーカーを同定して選別する選別工程を含む、請求項12〜20の何れかに記載された製造方法。
【請求項２２】
前記選別工程が、（a）内在性がん抑制遺伝子の変異を有する哺乳動物から採取した体細胞（ただし、がん細胞株を除く）、あるいは発がんした哺乳動物から採取した非胚性の原料体細胞（ただし、がん細胞株を除く）を誘導処理した細胞と、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した、誘導中内胚葉系幹細胞、誘導内胚葉系幹細胞又は誘導多能性幹細胞、若しくは、胚性幹細胞と比較し、悪性の性質又は特異マーカーを同定して選別する選別工程である、請求項21に記載された製造方法。
【請求項２３】
前記選別工程が、血管新生関連遺伝子群、がん関連パスウェイ遺伝子群、間質バリア関連遺伝子群、上皮-間葉転換関連遺伝子群、胃がん関連遺伝子群、自律増殖関連遺伝子群、TGFβ/BMPシグナル関連遺伝子群、組織侵潤・転移関連遺伝子群、Wntシグナル関連遺伝子群、シグナル伝達関連遺伝子群、Notchシグナル関連遺伝子群、乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子群、結腸がん関連遺伝子群、低酸素シグナル関連遺伝子群、GPCRシグナル関連遺伝子群、薬剤耐性関連遺伝子群、Hedgehogシグナル関連遺伝子群、PI3K-AKTシグナル関連遺伝子群、薬物代謝遺伝子群、がん分子メカニズム遺伝子群、SMADシグナルネットワーク関連遺伝子群、膵がん関連遺伝子群、前立腺がん関連遺伝子群、肝がん関連遺伝子群、肺がん関連遺伝子群からなる群に含まれる遺伝子の群の中から選択される、少なくとも1種の遺伝子に係るがん関連遺伝子の発現上昇から同定し選別する選別工程である、請求項21または22に記載された製造方法。
【請求項２４】
がん創薬標的のスクリーニング方法、がん治療薬のスクリーニング方法及びがん診断薬のスクリーニング方法の中から選択された1種のスクリーニング方法であって、該方法が、請求項1〜11の何れかに記載された誘導がん幹細胞を用いることを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項２５】
請求項1〜11の何れかに記載された誘導がん幹細胞を用いることを特徴とする、がんワクチンの作製方法。
【請求項２６】
がんワクチンが、CTL療法、樹状細胞療法、またはがんペプチドワクチン療法に有用ながんワクチンである、請求項25に記載された作製方法。
【請求項２７】
請求項1〜11の何れかに記載された誘導がん幹細胞を実験動物に移植することを特徴とする、がんモデル動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は誘導前がん幹細胞又は誘導悪性幹細胞に関し、内在性がん抑制遺伝子の変異、内在性がん関連遺伝子の発現上昇等の異常を有し、POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子、TERT遺伝子等の自己複製関連遺伝子が発現している、in vitroで自己複製可能な誘導前がん幹細胞又は誘導悪性幹細胞（以下、本発明において「誘導がん幹細胞」と総称する。）、これらの製造方法、及び、これらの細胞の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、胚性幹細胞（「ES細胞」ともいう。本明細書において以下「胚性幹細胞」と記載する）研究、さらには体細胞クローン胚性幹細胞や体細胞クローン動物の創造という体細胞クローンの研究により、エピジェネティクス（DNAメチレーション及びヒストンの修飾）をリプログラミング（「初期化」ともいう。本明細書においては、以下「リプログラミング」と記載する。）することが可能であると考えられるようになってきた。実際、除核した卵細胞にがん細胞であるマウスメラノーマ細胞の核を移植すると、該卵細胞は胚発生を開始し、その胚から得られた胚性幹細胞は、メラノサイト、リンパ球、繊維芽細胞などの細胞に分化したという実験結果が報告されている（非特許文献1）。【０００３】
最近、OCT3/4遺伝子（「OCT3遺伝子」、「OCT4遺伝子」、または「POU5F1遺伝子」と表記される場合もある）、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子及びc-MYC遺伝子（特許文献1）の導入、或いは、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF又はFGF2）存在下におけるOCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子及びKLF4遺伝子（非特許文献2）の導入により、ヒトの体細胞から、誘導多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem Cells;「iPS細胞」ともいう）という、胚性幹細胞と同様な未分化細胞にリプログラミングして作製することができるとの報告がなされた（特許文献2）。ヒトの誘導多能性幹細胞は、（1）体を形作るあらゆる細胞になり得る三胚葉への分化多能性と、（2）ヒト胚性幹細胞自己複製培養条件下においてその未分化性を維持したまま培養皿の中で無限に継代培養することのできる、自己複製能という2つの特徴を有することが知られている。そして、このヒトの誘導多能性幹細胞は、形態、遺伝子発現、細胞表面抗原、長期自己複製能、テラトーマ（in vivoでの三胚葉への分化）形成能において、ヒト胚性幹細胞に非常に類似しており（非特許文献3、非特許文献4）、更に、HLAの遺伝子型は、由来細胞である体細胞と全く同じであるという報告がなされている（非特許文献4）。これらの細胞の作製方法は、前記した遺伝子（すなわち、OCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子及びc-MYC遺伝子、或いはbFGF存在下におけるOCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子及びKLF4遺伝子）を導入するだけで、分化した体細胞が誘導多能性幹細胞へ「リプログラミング」されると考えられている。【０００４】
一方、遺伝子変異及び／又はエピジェネティクス異常に基づいて、遺伝子発現が上昇・低下又は消失するという異常が発生し、これによって細胞ががん化する。従って、前記のようなリプログラミングの技術を用いれば、がん細胞に生じた様々な異常をリプログラムし、正常な細胞に戻すこととなり、がん細胞の性質を失うものと考えられている。【０００５】
実際に、最近、国際幹細胞学会（ISSCR）において、「培養皿でヒト肝がん細胞株由来のがん幹細胞（HuH7由来のCD133陽性細胞）に抗がん剤など2種類の化学物質（非環式レチノイド及びトルレスタット）を加えると、2日後には、85〜90％のがん細胞が正常の肝臓細胞になった。更に、2遺伝子（SOX2遺伝子とKLF4遺伝子）と2種類の化学物質（5-AZAC及びTSA）を加えると誘導多能性幹細胞になり、肝細胞への分化プロトコルによって、得られた誘導多能性幹細胞を肝細胞（AFP又はALB陽性細胞）に分化させることに成功した」との発表がなされている（非特許文献5）。また、がん細胞であるマウスメラノーマ細胞を誘導多能性幹細胞へリプログラミングさせたという論文や（非特許文献6）、OCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子及びc-MYC遺伝子の導入によりリプログラミングされた結果、発がんの原因であるBCR-ABLチロシンキナーゼ活性を有する慢性骨髄性白血病細胞（CML）から、BCR-ABLチロシンキナーゼ依存性が消失した誘導多能性幹細胞が作製されたという報告がなされている（非特許文献7）。更に、がん細胞株にOCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子及びc-MYC遺伝子を導入すると、リプログラミングにより薬剤耐性や腫瘍形成能が消失するものの、長期培養によりc-MYC遺伝子の活性化を伴うがん化が起こるという報告もなされている（非特許文献8）。【０００６】
従来のがん研究では、SV40、HPVのE6遺伝子、E7遺伝子、TERT遺伝子の強制発現による細胞の不死化培養や、c-MYC遺伝子やRAS遺伝子などのがん遺伝子を導入することによるがん化などによって、がん細胞株を樹立した後、更に一般的な従来培地で培養されたがん細胞株が用いられている。【０００７】
しかしながら、一般的な従来の培地で樹立したがん細胞株では、培養後の人工的な染色体異常（転座、欠失など）、ジェネティクス異常（遺伝子変異）や、遺伝子発現異常の原因になるエピジェネティクス異常が顕著に生じるため、元々生体内で発がんの原因となった前がん細胞やがん細胞に生じた異常を、そのまま保持させることは難しいという問題がある。これらの細胞株は、何れもin vitroで自己複製させる培養により樹立された細胞株ではない。【０００８】
がん治療の研究及びがん関連創薬の研究において、このような従来の培地で樹立したがん細胞株のジェネティクス異常及びエピジェネティクス異常を解析しても、これらの異常が、哺乳動物の元々の前がん細胞やがん細胞に生じた異常であるのか、培養後に生じた人工的な異常であるのかを判別することは著しく困難であるため、これらの解析結果をもとに、適切ながんの原因の探索、創薬標的の探索、がん治療薬のスクリーニング等を行うことは不可能であった。【０００９】
また、創薬の標的としてがん幹細胞の存在が重要視されているものの、新鮮ながん組織に含まれるがん細胞は、階層的であり、且つ異質な細胞集団であり、どのがん細胞ががん幹細胞であるのか不明であるという問題もある。近年、がん細胞株又は初代培養がん細胞から、がん幹細胞を同定するための研究が報告されている（非特許文献9）が、モノクローナルながん幹細胞をin vitroで自己複製させ、長期培養できたという報告がないだけでなく、in vitroで創薬に応用したり、がん研究に用いたりするのに必要な数になるまで、自己複製させて増幅培養する技術についても未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2008-283972
【特許文献２】特開2008-307007
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Hochedlinger K, Jaenisch R et al., Genes Dev., 2004, 18:1875-1885
【非特許文献２】Nakagawa M, Yamanaka S et al., Nat Biotechnol., 2008, 26:101-106
【非特許文献３】Takahashi K, Yamanaka S et al., Cell, 2007, 131:861-872
【非特許文献４】Masaki H, Ishikawa T et al., Stem Cell Res., 2008, 1:105-115
【非特許文献５】国際幹細胞学会、2009年、抄録番号1739（285頁）
【非特許文献６】Utikal J et al., J Cell Sci., 2009, 122(Pt 19):3502-3510
【非特許文献７】Carette JE et al., Blood, 2010, 115:4039-4042
【非特許文献８】Nagai K et al., Biochem Biophys Res Commun., 2010, 395:258-263
【非特許文献９】Visvader JE, Lindeman GJ, Nat Rev Cancer., 2008, 8:755-768
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って本発明の目的は、発がんに関連する特定の遺伝子変異又は遺伝子発現異常を有する、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞およびその誘導がん幹細胞を製造する方法を提供することにある。【００１３】
本発明の別の目的は、本発明のin vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞を用いた、がん創薬標的のスクリーニング、がん治療薬のスクリーニング、がん診断薬のスクリーニング等のスクリーニング方法、あるいはこの誘導がん幹細胞を用いたがんワクチンの作製方法を提供することにある。【００１４】
本発明のさらなる目的は、本発明のin vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞を実験動物に移植する、がんモデル動物の作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第1の態様において、下記（1）および（2）の要件：
（1）POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子の6遺伝子（自己複製関連遺伝子）を発現すること；そして
（2）（a）内在性のがん抑制遺伝子の変異、または（b）内在性のがん関連遺伝子の発現上昇のいずれかの異常を有すること；
を具備することを特徴とする、in vitroで増殖可能な誘導がん幹細胞を提供する。【００１６】
本発明のこの態様においては、前記誘導がん幹細胞で発現している前記（1）自己複製関連遺伝子の発現量は、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して1/8から8倍以内であることが好ましい。【００１７】
本発明の誘導がん幹細胞としては、（b）前記内在性がん関連遺伝子の発現上昇に加え、ストレス及び毒性関連遺伝子群、エピジェネティクスクロマチン修飾酵素遺伝子群、幹細胞転写因子遺伝子群からなる群に含まれる遺伝子の群の中から選択される少なくとも1種の内在性の遺伝子に、遺伝子の発現上昇が生じている細胞であってもよく、また、（b）前記内在性がん関連遺伝子の発現上昇に加え、肝細胞特異的遺伝子群に含まれる遺伝子の群の中から選択される少なくとも1種の内在性の遺伝子に、遺伝子の発現上昇が生じている細胞であってもよい。【００１８】
本発明の誘導がん幹細胞においては、更に、中内胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞に特徴的な遺伝子を発現していてもよい。【００１９】
本発明の第2の態様において、（a）がん抑制遺伝子の変異を有する哺乳動物から採取した体細胞、並びに、発がんした哺乳動物から採取した、（a）がん抑制遺伝子の変異または（b）がん関連遺伝子の発現上昇のいずれかの異常を有する体細胞からなる群の中から選択された非胚性の原料体細胞から、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞を製造する方法であって、該方法が、前記原料体細胞を、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が前記原料体細胞内に存在する状態におく誘導工程を行うことを特徴とする、本発明の誘導がん幹細胞の製造方法を提供する。細胞が「非胚性」であるという場合、胚性幹細胞、胚、生殖細胞、始原生殖細胞の細胞ではないことを意味する。【００２０】
本発明においては、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の前記原料体細胞内における存在比率が、POU5F1遺伝子＞SOX2遺伝子の関係を満たすことができる。【００２１】
更に本発明においては、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物を使用することが好ましく、これらPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物の使用比率が、POU5F1遺伝子＞SOX2遺伝子の関係を満たすことができる。【００２２】
本発明においては、前記誘導工程に加え、更に、1ウェルに1細胞をソーティングして増殖させる工程を含んでもよい。【００２３】
本発明においては、前記誘導工程に加え、更に、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞の悪性の性質又は特異マーカーを同定して選別する選別工程を含んでもよい。この選別工程は、（a）がん抑制遺伝子の変異を有する哺乳動物から採取した体細胞、並びに、発がんした哺乳動物から採取した、非胚性の原料体細胞を誘導処理した（a）がん抑制遺伝子の変異、または（b）がん関連遺伝子の発現上昇のいずれかの異常を有する誘導がん幹細胞と、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した、誘導中内胚葉系幹細胞、誘導内胚葉系幹細胞又は誘導多能性幹細胞、若しくは、胚性幹細胞とを比較し、悪性の性質又は特異マーカーを同定して選別する選別工程であってもよい。【００２４】
特に、血管新生関連遺伝子群、がん関連パスウェイ遺伝子群、間質バリア関連遺伝子群、上皮-間葉転換関連遺伝子群、胃がん関連遺伝子群、自律増殖関連遺伝子群、TGFβ/BMPシグナル関連遺伝子群、組織侵潤・転移関連遺伝子群、Wntシグナル関連遺伝子群、シグナル伝達関連遺伝子群、Notchシグナル関連遺伝子群、乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子群、結腸がん関連遺伝子群、低酸素シグナル関連遺伝子群、GPCRシグナル関連遺伝子群、薬剤耐性関連遺伝子群、Hedgehogシグナル関連遺伝子群、PI3K-AKTシグナル関連遺伝子群、薬物代謝遺伝子群、がん分子メカニズム遺伝子群、SMADシグナルネットワーク関連遺伝子群、膵がん関連遺伝子群、前立腺がん関連遺伝子群、肝がん関連遺伝子群、肺がん関連遺伝子群からなる群に含まれる遺伝子の群の中から選択される、少なくとも1種の遺伝子に係る（b）がん関連遺伝子の発現上昇によって、前記特異マーカーを同定し選別する選別工程であってもよい。【００２５】
本発明の第3の態様において、がん創薬標的のスクリーニング方法、がん治療薬のスクリーニング方法及びがん診断薬のスクリーニング方法の中から選択された1種のスクリーニング方法であって、本発明の誘導がん幹細胞を用いることを特徴とするスクリーニング方法を提供する。【００２６】
本発明の第4の態様において、本発明の誘導がん幹細胞を用いることを特徴とするがんワクチンの作製方法を提供し、本発明の第5の態様において、本発明の誘導がん幹細胞を実験動物に移植することを特徴とするがんモデル動物の作製方法を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、（a）内在性がん抑制遺伝子の変異、または（b）内在性がん関連遺伝子の発現上昇等の異常を有すると共に、POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子、TERT遺伝子等の自己複製関連遺伝子が発現している、誘導がん幹細胞、その製造方法、及びこれらの細胞の応用を実施することができる。【００２８】
本発明の誘導がん幹細胞は、原料体細胞が有する（a）がん抑制遺伝子の変異、または（b）がん関連遺伝子の発現上昇等の異常をそのまま維持するだけでなく、幹細胞の特徴の一つである理論的に無限に自己複製可能であるという特徴を併せて有する。従って本発明の誘導がん幹細胞は実質的に長期継代培養可能であり、組織細胞の性質を有するがん細胞へ誘導しやすいため、がん創薬における標的のスクリーニング方法、がん治療薬のスクリーニング方法及びがん診断薬のスクリーニング方法などのスクリーニング方法や、がんワクチンの作製方法、がんモデル動物の作製等、がん治療の研究及びがん関連創薬の研究に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、本発明のヒト誘導悪性幹細胞GC1-5が、ヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）と比較して2倍以上発現上昇している血管新生関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト胚性幹細胞と比較した遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【図２】図2は、本発明のヒト誘導悪性幹細胞GC1-5が、ヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）と比較して2倍以上発現上昇している上皮−間葉転換関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト胚性幹細胞と比較して遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【図３】図3は、本発明のヒト誘導悪性幹細胞GC1-5が、ヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇しているTGFβ/BMPシグナル関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト誘導多能性幹細胞と比較して遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【図４】図4は、本発明のヒト誘導悪性幹細胞NGC1-1が、ヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇している組織浸潤・転移関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト誘導多能性幹細胞と比較して遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【図５】図5は、本発明のヒト誘導悪性幹細胞NGC1-1が、ヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇しているWntシグナル関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト胚性幹細胞と比較して遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【図６】図6は、本発明のヒト誘導悪性幹細胞GC1-5が、ヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）とほぼ同程度（1/2〜2倍）に発現していた自己複製関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト胚性幹細胞と比較して遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【図７】図7は、本発明のヒト誘導悪性幹細胞NGC1-1が、ヒト胚性幹細胞hES_BG03とほぼ同程度（1/2〜2倍）に発現していた自己複製関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト胚性幹細胞と比較して遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【図８】図8は、本発明のヒト誘導悪性幹細胞CC1-10が、ヒト胚性幹細胞hES_BG03とほぼ同程度（1/4〜4倍）に発現していた自己複製関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト胚性幹細胞と比較して遺伝子発現の程度が同等、上側の線は4倍、下側の線が1/4倍である。
【図９】図9は、ヒト誘導悪性幹細胞RBT203（1-1）がヒト胚性幹細胞hES_ES01（GSM194392）と比較して2倍以上発現上昇している血管新生関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト胚性幹細胞と比較した遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【図１０】図10は、ヒト誘導悪性幹細胞RBT203（1-1）がヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇しているシグナル伝達関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト誘導多能性幹細胞と比較した遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【図１１】図11は、ヒト誘導悪性幹細胞RBT203（1-1）がヒト胚性幹細胞hES_ES01（GSM194392）と比較してほぼ同程度（1/2〜2倍）発現している自己複製関連遺伝子をプロットした図である。図中、中央の線は、ヒト胚性幹細胞と比較して遺伝子発現の程度が同等、上側の線は2倍、下側の線が1/2倍である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
前述したように、現在では、体細胞が誘導多能性幹細胞にリプログラミングされるのと同様に、がん細胞をリプログラミングすることによって、がん細胞を正常な細胞に戻すことができるという概念が定着している。【００３１】
これに対し本発明者らは、一般に、新鮮がん組織及び初代培養がん細胞集団は何れも異質性（heterogeneous）があるため、一口にがん組織やがん細胞群と言っても、その中には、正常細胞と同じか又は近似したジェネティクスとエピジェネティクスをもった正常細胞や非がん細胞が混在することから、がん細胞が正常細胞にリプログラミングされるのではなく、新鮮がん組織、及び初代培養がん細胞集団中に混在する非がん細胞や正常細胞が正常な誘導多能性幹細胞に誘導される一方、新鮮がん組織及び初代培養がん細胞集団の中に存在する、がん抑制遺伝子の変異、遺伝子発現異常等を有するがん細胞から、該がん細胞に由来するがん抑制遺伝子の変異、遺伝子発現異常等を有するがん幹細胞が誘導されるという仮説を立てた。【００３２】
この仮説に基づけば、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子及びc-MYC遺伝子の導入、或いは、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子及びKLF4遺伝子の導入などの誘導多能性幹細胞作製技術を応用して、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞を作製することができ、更に、得られた誘導がん幹細胞をin vitroで自己複製させれば、ジェネティクス的又はエピジェネティクス的にがんとしての悪性の性質を維持させた、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞を、培養条件下で無限増殖させることができる可能性があると考えられる。【００３３】
そこで、本発明者らはこのような仮説のもとに鋭意研究した結果、原料として、内在性がん抑制遺伝子の変異を有する哺乳動物から採取した体細胞、並びに、発がんした哺乳動物から採取した、非胚性の細胞を用い、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物を前記原料体細胞内に存在させることにより、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞が得られることを見出した。【００３４】
更に、原料体細胞をこのような状態におく際に、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が、分化を決定づける重要な要因の一つと考えられることが判明した。【００３５】
更に、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、SOX2遺伝子等の細胞内存在比率を変えることにより、誘導中内胚葉系幹細胞、誘導内胚葉系幹細胞を作製することができることもまた見出した。すなわち、本発明者等は、SOX2遺伝子、POU5F1遺伝子及びKLF4遺伝子の翻訳産物の細胞内存在比率を変えることにより、誘導中内胚葉系前がん幹細胞又は誘導中内胚葉系悪性幹細胞、誘導内胚葉系前がん幹細胞又は誘導内胚葉系悪性幹細胞、誘導前がん多能性幹細胞又は誘導悪性多能性幹細胞などの、本発明の誘導がん幹細胞を作製することができることを見出した。【００３６】
しかも、このようにして得られた本発明の誘導がん幹細胞は、bFGFを除去した培地、胚性幹細胞用培地以外の培地での培養や、実験動物への移植等の方法により、分化誘導して自己複製を解除することにより、容易にがん細胞に誘導させることができる。【００３７】
このように、本発明者らは、遺伝子変異又は遺伝子発現の上昇、すなわち、生体内においてがんとしての悪性の性質、すなわち、原料体細胞が有する異常を維持すると共に、理論的には無限に自己複製が可能であり、実質的に長期継代培養可能な、本発明の誘導がん幹細胞を見出すと共に、これらの細胞をin vitroで創薬に応用したり、がん研究に用いたりすることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００３８】
本明細書の以下において、「がん抑制遺伝子」とは、がんの発生を抑制する機能を持つタンパク質をコードする遺伝子であり、本発明の誘導がん幹細胞において、変異を生じている遺伝子のことを意味する。本発明における「がん関連遺伝子」とは、遺伝子発現上昇の異常により細胞のがん化を引き起こす遺伝子、及び、細胞のがん化に関連する遺伝子であり、本発明の誘導がん幹細胞において、遺伝子の発現上昇を生じている遺伝子のことを意味する。【００３９】
以下、本発明の誘導がん幹細胞、これらの製造方法、及び、これらの細胞の応用について詳細に説明する。【００４０】
誘導がん幹細胞
本発明の第1の態様において、下記（1）および（2）の要件：
（1）POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子の6遺伝子（自己複製関連遺伝子）を発現すること；そして
（2）（a）内在性がん抑制遺伝子の変異、または（b）内在性がん関連遺伝子の発現上昇のいずれかの異常を有していること；
を具備することを特徴とする誘導がん幹細胞を提供する。この様な特徴を有する細胞は、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞であることが明らかになった。【００４１】
本発明において、（1）自己複製関連遺伝子、（2）（a）内在性がん抑制遺伝子、（b）内在性がん関連遺伝子等における「内在性」とは、これらの遺伝子が、遺伝子導入等により細胞に導入された外来性の遺伝子ではなく、細胞にもともと存在する遺伝子であることを意味する。【００４２】
当該技術分野において一般的に「幹細胞」と言う場合、特定の細胞に分化できる能力（分化能）と、細胞分裂を経てももとの細胞と同じ性質（分化能）を維持できる能力（自己複製能）とを持つ細胞のことをいう。このうち、自己複製能という場合、分裂して同じ細胞を作り出すことができることをいい、本発明の（1）の性質および（2）の性質を有する細胞の場合、少なくとも3日間増殖培養または継代培養が可能であることを意味する。【００４３】
本発明の誘導がん幹細胞は、「誘導前がん幹細胞」と「誘導悪性幹細胞」とを含む概念である。本発明において「誘導前がん幹細胞」とは、家族性腫瘍を引き起こす遺伝子異常を片側アリルに有している体細胞である、がん化する予備段階の前がん細胞であって、POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子の6遺伝子（自己複製関連遺伝子）を発現することにより、少なくとも自己複製能を有するように誘導された細胞を意味する。【００４４】
本発明において「誘導悪性幹細胞」とは、内在性がん関連遺伝子の発現上昇を有している細胞であって、POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子の6遺伝子（自己複製関連遺伝子）を発現することにより、少なくとも自己複製能を有するように誘導された細胞、又は家族性腫瘍を引き起こす遺伝子異常を少なくとも片側アリルに有している体細胞であり、家族性腫瘍患者のがん組織由来の細胞から作製し、POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子の6遺伝子（自己複製関連遺伝子）を発現することにより、少なくとも自己複製能を有するように誘導された細胞を意味する。【００４５】
本発明の誘導がん幹細胞には、多能性を示す誘導がん幹細胞のみならず、中内胚葉系、内胚葉系の誘導がん幹細胞が含まれる。【００４６】
ここで「中内胚葉系」の幹細胞という場合、中胚葉系又は内胚葉系の組織に属する細胞に分化する能力を有する幹細胞であって、中内胚葉系の遺伝子を発現している細胞を意味し、血管、血液細胞、筋肉、骨、軟骨、心筋、骨格筋、胃、肺、膵臓、肝臓、小腸、大腸等へと分化する細胞である。【００４７】
また「内胚葉系」の幹細胞という場合、分化の階層において、前記中内胚葉系の幹細胞の下位に存在する幹細胞であり、内胚葉系の組織に属する細胞に分化する能力を有する幹細胞であって、内胚葉系の遺伝子を発現している細胞を意味する。これらの幹細胞は、胃、肺、膵臓、肝臓、小腸、大腸等へと分化する細胞である。【００４８】
誘導がん幹細胞における遺伝子発現（1）
本発明における前記（1）の遺伝子（自己複製関連遺伝子）は、胚性幹細胞のマーカー遺伝子として知られている遺伝子である。これらの遺伝子は、本発明の誘導がん幹細胞が、理論的には無限に自己複製し、事実上in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞のまま長期継代培養可能な性質を有する細胞であることを特定する遺伝子（自己複製関連遺伝子）である。これらの遺伝子の具体的な例としては、以下の表1の遺伝子を挙げることができる。【００４９】
【表１】
0005920725.tif 000002
【００５０】
本発明においては、前記（1）表1の遺伝子群の中から選択された、POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子の6遺伝子（自己複製関連遺伝子）を発現していることが必要であるが、これ以上の遺伝子が発現していてもよい。ここで本発明において挙げられる6遺伝子は、胚性幹細胞に特異的かつ高発現している特に典型的な遺伝子であることが知られている遺伝子であり、これらの遺伝子の胚性幹細胞中での機能は、これまでよく調べられている。【００５１】
また、本発明においては、前記（1）自己複製関連遺伝子が発現していれば良く、これらの遺伝子の発現量は、特に制限されるものではないが、本発明の誘導がん幹細胞で発現している前記（1）自己複製関連遺伝子の発現量は、胚性幹細胞（例えば、hES_H9（GSM194390）、hES_BG03（GSM194391）、hES_ES01（GSM194392）の何れか）で発現している遺伝子の発現量と比較してほぼ同等、すなわち、1/8〜8倍、特に1/4〜4倍以内であることが、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞の状態を維持する上から、又は長期継代培養の観点から好ましく、1/2〜2倍以内であることが最も好ましい。【００５２】
前記した必須遺伝子（6遺伝子）の中でも、本発明の誘導がん幹細胞で発現しているPOU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して、1/8〜8倍であることが好ましく、特に、1/4〜4倍であることが好ましく、1/2〜2倍であることが最も好ましい。【００５３】
本発明においては、本発明の誘導がん幹細胞で発現している前記（1）自己複製関連遺伝子の内、胚性幹細胞で発現している遺伝子と比較して5種以上の遺伝子が1/2〜2倍、10種以上の遺伝子が1/4〜4倍、20種以上の遺伝子が1/8〜8倍の範囲で発現していることが好ましい。【００５４】
これらの中でも、本発明においては、特に、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、TDGF1遺伝子、DNMT3B遺伝子、ZFP42遺伝子、TERT遺伝子、GDF3遺伝子、SALL4遺伝子、GABRB3遺伝子、LIN28遺伝子が、胚性幹細胞で発現している遺伝子に比べて1/4〜4倍の範囲で発現しているものが好ましく、ACVR2B遺伝子、CD24遺伝子、CDH1遺伝子、CYP26A1遺伝子、DNMT3B遺伝子、DPPA4遺伝子、EDNRB遺伝子、FLT1遺伝子、GABRB3遺伝子、GATA6遺伝子、GDF3遺伝子、GRB7遺伝子、LIN28遺伝子、NANOG遺伝子、NODAL遺伝子、PODXL遺伝子、POU5F1遺伝子、SALL4遺伝子、SOX2遺伝子、TDGF1遺伝子、TERT遺伝子、ZFP42遺伝子、ZIC3遺伝子の全てを発現しているものが最も好ましい。【００５５】
誘導がん幹細胞における遺伝子発現（2）
本発明の誘導がん幹細胞は、（2）（a）内在性がん抑制遺伝子の変異、または（b）内在性がん関連遺伝子の発現上昇のいずれかの異常を有している。本発明の誘導がん幹細胞が有するこれらの異常は、誘導がん幹細胞の由来となる原料体細胞が本来有していた異常をそのまま承継するものである。【００５６】
ここで、（2）（a）内在性がん抑制遺伝子の変異という場合、どのようなタイプの変異であってもよいが、たとえば、内在性がん抑制遺伝子の片側アリルに関する生殖系列変異を例として挙げることができる。【００５７】
また、（2）（b）内在性がん関連遺伝子の発現上昇という場合、胚性幹細胞での発現と比較して、その遺伝子の発現が2倍以上に上昇している場合のことをいう。遺伝子の発現は、2倍以上であればどの程度であってもよく、たとえば、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、など発現の差が大きい方が好ましい。【００５８】
変異を生じている（a）がん抑制遺伝子、遺伝子の発現上昇が生じている（b）がん関連遺伝子としては、公知のものであれば特に制限されることはないが、以下のような遺伝子を例示することができる。【００５９】
すなわち、本発明における（a）がん抑制遺伝子としては、例えば、APC遺伝子（GenBankアクセッション番号：NM−000038.3）、RB1遺伝子（RB1、GenBankアクセッション番号：NM−000321.2）を例としてあげることができる。【００６０】
（a）内在性がん抑制遺伝子の変異として家族性腫瘍の原因遺伝子に変異が認められる本発明の誘導がん幹細胞は、家族性腫瘍に関連する遺伝子変異・遺伝子発現異常を有しているため、家族性腫瘍の発がんメカニズムの解明や分子標的の発見等のがん研究に極めて有用である。【００６１】
また、本発明における前記（b）がん関連遺伝子としては、血管新生関連遺伝子群、がん関連パスウェイ遺伝子群、間質バリア（細胞外マトリックスおよび接着分子）関連遺伝子群、上皮-間葉転換関連遺伝子群、胃がん関連遺伝子群、自律増殖関連遺伝子群、TGFβ/BMPシグナル関連遺伝子群、組織侵潤・転移関連遺伝子群、Wntシグナル関連遺伝子群、シグナル伝達関連遺伝子群、Notchシグナル関連遺伝子群、乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子群、結腸がん関連遺伝子群、低酸素シグナル関連遺伝子群、GPCRシグナル関連遺伝子群、薬剤耐性関連遺伝子群、Hedgehogシグナル関連遺伝子群、PI3K-AKTシグナル関連遺伝子群、薬物代謝遺伝子群、がん分子メカニズム遺伝子群、SMADシグナルネットワーク関連遺伝子群、膵がん関連遺伝子群、前立腺がん関連遺伝子群、肝がん関連遺伝子群、肺がん関連遺伝子群等に含まれる遺伝子を例として挙げることができる。本発明の誘導がん幹細胞においては、これらの遺伝子からなる群の中から選択される少なくとも1種の遺伝子について、（b）内在性がん関連遺伝子の発現上昇が認められることが好ましい。【００６２】
これらの遺伝子は、がん細胞で遺伝子の発現上昇が認められる遺伝子群であり、このような（b）内在性がん関連遺伝子の発現上昇などの異常がある誘導がん幹細胞について、解析を行うことにより、発がんメカニズムの解明などが期待され、がん研究及びがん創薬研究に非常に有用である。【００６３】
前記したがん関連遺伝子（b）については、下記表2〜26に記載された遺伝子を例示することできる。各遺伝子シンボルに対するGenBankアクセッション番号も例示するが、本発明は係る記載により制限されるものではない。【００６４】
血管新生関連遺伝子群としては、下記表2の遺伝子を例示することができる。【００６５】
【表２】
0005920725.tif 000003
【００６６】
0005920725.tif 000004
【００６７】
がん関連パスウェイ遺伝子群としては、下記表3の遺伝子を例示することができる。【００６８】
【表３】
0005920725.tif 000005
【００６９】
0005920725.tif 000006
【００７０】
間質バリア関連遺伝子群としては、下記表4の遺伝子を例示することができる。【００７１】
【表４】
0005920725.tif 000007
【００７２】
0005920725.tif 000008
【００７３】
上皮-間葉転換関連遺伝子群としては、下記表5の遺伝子を例示することができる。【００７４】
【表５】
0005920725.tif 000009
【００７５】
0005920725.tif 000010
【００７６】
胃がん関連遺伝子群としては、下記表6の遺伝子を例示することができる。【００７７】
【表６】
0005920725.tif 000011
【００７８】
0005920725.tif 000012
【００７９】
自律増殖関連遺伝子群としては、下記表7の遺伝子を例示することができる。【００８０】
【表７】
0005920725.tif 000013
【００８１】
0005920725.tif 000014
【００８２】
TGFβ/BMPシグナル関連遺伝子群としては、下記表8の遺伝子を例示することができる。【００８３】
【表８】
0005920725.tif 000015
【００８４】
0005920725.tif 000016
【００８５】
組織侵潤・転移関連遺伝子群としては、下記表9の遺伝子を例示することができる。【００８６】
【表９】
0005920725.tif 000017
【００８７】
0005920725.tif 000018
【００８８】
Wntシグナル関連遺伝子群としては、下記表10の遺伝子を例示することができる。【００８９】
【表１０】
0005920725.tif 000019
【００９０】
0005920725.tif 000020
【００９１】
シグナル伝達関連遺伝子群としては、下記表11の遺伝子を例示することができる。【００９２】
【表１１】
0005920725.tif 000021
【００９３】
0005920725.tif 000022
【００９４】
Notchシグナル関連遺伝子群としては、下記表12の遺伝子を例示することができる。【００９５】
【表１２】
0005920725.tif 000023
【００９６】
0005920725.tif 000024
【００９７】
乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子群としては、下記表13の遺伝子を例示することができる。【００９８】
【表１３】
0005920725.tif 000025
【００９９】
0005920725.tif 000026
【０１００】
結腸がん関連遺伝子群としては、下記表14の遺伝子を例示することができる。【０１０１】
【表１４】
0005920725.tif 000027
【０１０２】
低酸素シグナル関連遺伝子群としては、下記表15の遺伝子を例示することができる。【０１０３】
【表１５】
0005920725.tif 000028
【０１０４】
0005920725.tif 000029
【０１０５】
GPCRシグナル関連遺伝子群としては、下記表16の遺伝子を例示することができる。【０１０６】
【表１６】
0005920725.tif 000030
【０１０７】
0005920725.tif 000031
【０１０８】
薬剤耐性関連遺伝子群としては、下記表17の遺伝子を例示することができる。【０１０９】
【表１７】
0005920725.tif 000032
【０１１０】
0005920725.tif 000033
【０１１１】
Hedgehogシグナル関連遺伝子群としては、下記表18の遺伝子を例示することができる。【０１１２】
【表１８】
0005920725.tif 000034
【０１１３】
0005920725.tif 000035
【０１１４】
PI3K-AKTシグナル関連遺伝子群としては、下記表19の遺伝子を例示することができる。【０１１５】
【表１９】
0005920725.tif 000036
【０１１６】
0005920725.tif 000037
【０１１７】
薬物代謝遺伝子群としては、下記表20の遺伝子を例示することができる。【０１１８】
【表２０】
0005920725.tif 000038
【０１１９】
0005920725.tif 000039
【０１２０】
がん分子メカニズム遺伝子群としては、下記表21の遺伝子を例示することができる。【０１２１】
【表２１】
0005920725.tif 000040
【０１２２】
0005920725.tif 000041
【０１２３】
SMADシグナルネットワーク関連遺伝子群としては、下記表22の遺伝子を例示することができる。【０１２４】
【表２２】
0005920725.tif 000042
【０１２５】
0005920725.tif 000043
【０１２６】
膵がん関連遺伝子群としては、下記表23の遺伝子を例示することができる。【０１２７】
【表２３】
0005920725.tif 000044
【０１２８】
0005920725.tif 000045
【０１２９】
前立腺がん関連遺伝子群としては、下記表24の遺伝子を例示することができる。【０１３０】
【表２４】
0005920725.tif 000046
【０１３１】
肝がん関連遺伝子群としては、下記表25の遺伝子を例示することができる。【０１３２】
【表２５】
0005920725.tif 000047
【０１３３】
肺がん関連遺伝子群としては、下記表26の遺伝子を例示することができる。【０１３４】
【表２６】
0005920725.tif 000048
【０１３５】
誘導がん幹細胞における追加の遺伝子
更に、本発明の誘導がん幹細胞においては、（b）前記内在性がん関連遺伝子に加え、ストレス及び毒性関連遺伝子群、エピジェネティクスクロマチン修飾酵素遺伝子群、幹細胞転写因子遺伝子群からなる群に含まれる遺伝子の群の中から選択される少なくとも1種の内在性の遺伝子に、遺伝子の発現上昇が生じていることが好ましい。【０１３６】
これらの遺伝子群については、下記表27〜29に記載された遺伝子を例示することができる。各遺伝子シンボルに対するGenBankアクセッション番号も例示するが、本発明はかかる記載によって制限されるものではない。【０１３７】
ストレス及び毒性関連遺伝子群としては、下記表27の遺伝子を例示することができる。【０１３８】
【表２７】
0005920725.tif 000049
【０１３９】
0005920725.tif 000050
【０１４０】
エピジェネティクスクロマチン修飾酵素遺伝子群としては、下記表28の遺伝子を例示することができる。【０１４１】
【表２８】
0005920725.tif 000051
【０１４２】
0005920725.tif 000052
【０１４３】
幹細胞転写因子遺伝子群としては、下記表29の遺伝子を例示することができる。【０１４４】
【表２９】
0005920725.tif 000053
【０１４５】
0005920725.tif 000054
【０１４６】
本発明においてはまた、（b）前記内在性がん関連遺伝子に加え、肝細胞特異的遺伝子群に含まれる遺伝子からなる群の中から選択される少なくとも1種の内在性の遺伝子に、遺伝子の発現上昇が生じていてもよい。【０１４７】
肝細胞特異的遺伝子群としては、下記のような肝臓の機能に関連する遺伝子を例として挙げることができる。これらの遺伝子は、何れもがんとしての性質に関連する遺伝子として機能する場合があるため、本発明の誘導がん幹細胞においては、（b）前記がん関連遺伝子に加え、肝細胞特異的遺伝子群の遺伝子に、遺伝子の発現上昇が認められることが好ましい。【０１４８】
また、肝細胞特異的遺伝子群としては、具体的に下記表30に記載された肝細胞関連遺伝子群（Hepa）を例として挙げることができる。表中には各遺伝子シンボルに対するGenBankアクセッション番号も例示するが、本発明はかかる記載によって制限されるものではない。【０１４９】
【表３０】
0005920725.tif 000055
【０１５０】
0005920725.tif 000056
【０１５１】
本発明の誘導がん幹細胞においては、更に、中内胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞に特徴的な遺伝子が、発現していることが好ましく、特に、対照となる未分化な誘導多能性幹細胞の遺伝子の発現量と比較して発現上昇していることが好ましい。対象となる未分化な誘導多能性幹細胞としては、hiPS-201B7が用いられる。この細胞の遺伝子発現データは、前記したGene Expression Omnibus〔GEO〕から取得することが可能である。【０１５２】
中内胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞に特徴的な遺伝子としては、各幹細胞に特徴的な遺伝子であれば特に制限されることはない。特に、中内胚葉系幹細胞に特徴的な遺伝子としては、GSC遺伝子等、内胚葉系幹細胞に特徴的な遺伝子としては、GSC遺伝子、GATA4遺伝子、FOXA2遺伝子、SOX17遺伝子等を好ましい例として挙げることができる。【０１５３】
本発明の誘導がん幹細胞は、特定の組織細胞の性質を有するがん細胞へ分化誘導しやすいため、家族性腫瘍でがん化する細胞、例えば、網膜芽細胞や腸管上皮細胞に分化誘導し、網膜芽細胞腫や大腸ポリポーシスのようながん細胞に誘導することができる。【０１５４】
また、本発明の誘導がん幹細胞は3日以上増殖培養又は継代培養が可能であるが、実質的に、1カ月以上、半年或いは1年以上という長期に渡って増殖可能なin vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞であり、この事は理論的には無限に自己複製が可能であることを意味する。【０１５５】
使用する培地および培養方法
本発明の誘導がん幹細胞を増殖培養又は継代培養する培地としては、胚性幹細胞、多能性幹細胞等を増殖培養又は継代培養することが可能な培地であれば、特に制限されることはないが、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養に適した培地が好ましく用いられる。このような培地としては、例えば、ES培地〔40％のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、40％のF12培地（シグマ社製）、2 mM L-グルタミン又はGlutaMAX（シグマ社製）、1％の非必須アミノ酸（シグマ社製）、0.1 mMのβ-メルカプトエタノール（シグマ社製）、15〜20％のノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製）、10μg/mlのゲンタマイシン（インビトロジェン社製）、4〜10 ng/mlのFGF2因子〕、0.1 mMのβ-メルカプトエタノールを除いたES培地で、マウス胚性繊維芽細胞（以下MEF）を24時間培養した上清である馴化培地に、0.1 mMのβ-メルカプトエタノール及び10 ng/mlのFGF2を加えた培地（以下MEF馴化ES培地）、iPS細胞用最適培地（イプセロン社製）、フィーダー細胞用最適培地（イプセロン社製）、StemPro〔登録商標〕hESC SFM（インビトロジェン社製）、mTeSR1（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、アニマルプロテインフリーのヒトES/iPS細胞維持用無血清培地TeSR2〔ST-05860〕（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、霊長類ES/iPS細胞用培地（リプロセル社）、ReproStem（リプロセル社）、ReproFF（リプロセル社）、ReproFF2（リプロセル社）などを例示することができるが、これらの培地に制限されることはない。ヒトの細胞を用いる場合には、ヒト胚性幹細胞の培養に適した培地を用いてもよい。培養皿をコートする細胞外マトリックスとしては、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル、ラミニン、Synthemaxなどが用いられる。【０１５６】
本発明の誘導がん幹細胞を増殖培養又は継代培養する手法については、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養において当業者が通常用いる方法であれば、特に制限されることはない。例えば、細胞から培地を除きPBS（-）で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、更に、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤、mTeSR及びY-27632を加え、MEFが播種してあるゼラチンコート又はコラーゲンコートに細胞懸濁液を播種することによって、継代培養する方法などを具体的に例示することができる。【０１５７】
前記した培地には、更に、FGF2（bFGF）を添加することが好ましく、添加量は1〜100 ng/mlであることが好ましい。FGF2（bFGF）は、誘導される体細胞の種に応じて選択され、本発明においては、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ゼブラフィッシュ等を由来とするFGF2（bFGF）を用いることができる。その他、前記した下垂体抽出物、血清、LIF、Z-VAD-FMK、ALK5阻害剤、PD032591、CHIR00921等を添加することも可能である。【０１５８】
更に、Rho関連キナーゼ（Rho関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）の阻害剤であるY-27632（カルビオケム;水溶性）、或いは、ファスジル（HA1077:カルビオケム）は、継代時に培地中に添加することもできる。【０１５９】
その他にも、FGF receptor tyrosine kinase、MEK（mitogen activated protein kinase）/ERK（extracellular signal regulated kinases 1 and 2）経路、及びGSK（Glycogen Synthase Kinase）3の三つの低分子阻害剤〔SU5402、PD184352及びCHIR99021〕、MEK/ERK経路及びGSK3の二つの低分子阻害剤〔PD0325901及びCHIR99021〕、ヒストンメチル化酵素G9aの阻害剤である低分子化合物〔BIX-01294（BIX）〕、アザシチジン、トリコスタチンA（TSA）、7-hydroxyflavone、lysergic acid ethylamide、kenpaullone、TGFβ receptorI kinase/activin-like kinase 5 （ALK5）の阻害剤〔EMD 616452〕、TGF-βreceptor 1（TGFBR1）kinaseの阻害剤〔E-616452及びE-616451〕、Src-family kinaseの阻害剤〔EI-275〕、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGF-β中和抗体、A-83-01、Nr5a2、p53阻害化合物、p53に対するsiRNA、p53経路の阻害剤等を添加することもできる。【０１６０】
また、本発明の誘導がん幹細胞は、公知の方法により凍結及び解凍することが可能である。凍結方法としては、例えば、細胞から培地を除きPBS（-）で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、次いで、上清を除去した後、凍結用保存液を加えてセラムチューブに分注し、-80℃で一晩凍結させた後、液体窒素にて保管する方法等を例示することができる。また、解凍方法としては、37℃の恒温槽中で解凍し、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地に懸濁させて用いる方法等が例示できる。【０１６１】
誘導がん幹細胞の製造方法
本発明の第2の態様において、（a）がん抑制遺伝子の変異を有する哺乳動物から採取した体細胞、並びに、発がんした哺乳動物から採取した、（a）がん抑制遺伝子の変異、または（b）がん関連遺伝子の発現上昇のいずれかの異常を有する体細胞からなる群の中から選択された非胚性の原料体細胞から、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞を製造する、本発明の誘導がん幹細胞の製造方法を提供する。【０１６２】
この方法は、前記原料体細胞を、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が前記原料体細胞内に存在する状態におく誘導工程を行うことを特徴とする。これにより、前記原料体細胞に内在される前記（1）の遺伝子（自己複製関連遺伝子）が発現し、最終的に、本発明の誘導がん幹細胞が誘導される。なお、ここで「状態におく」とは、そのような状態になるように調節する場合のみならず、そのような状態になっている細胞を選択して調製する場合をも含む概念である。【０１６３】
誘導がん幹細胞の原料細胞
本発明の誘導がん幹細胞は、本発明の誘導がん幹細胞の由来となる原料体細胞が本来有していた、（a）がん抑制遺伝子の変異、または（b）がん関連遺伝子の発現上昇等の異常をそのまま継承するため、原料となる体細胞、すなわち原料体細胞は、（a）がん抑制遺伝子の変異を有する哺乳動物から採取した体細胞、並びに、発がんした哺乳動物から採取した、（a）がん抑制遺伝子の変異、または（b）がん関連遺伝子の発現上昇のいずれかの異常を有する体細胞からなる群の中から選択された体細胞であることが必要である。【０１６４】
前記原料体細胞を採取する哺乳動物としては、哺乳動物であれば特に制限されることはなく、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ミニブタなどのブタ、ウシ、ウマ、カニクイザルなどのサル等の霊長類、ヒト等を挙げることができるが、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ミニブタ、ウマ、カニクイザル、ヒトが好ましく、特にヒトが好ましく用いられる。【０１６５】
本発明の製造方法における原料体細胞は、非胚性の細胞、すなわち非生殖組織由来の細胞であることが必要である。従って、生殖組織由来の細胞は、本発明の原料体細胞には含まれない。【０１６６】
この様な非胚性の原料体細胞としては、上記したように非胚性の細胞であれば特に制限されることはなく、様々な時期の哺乳動物の各組織から採取された体細胞を用いることができる。以下具体的に例示するが、これらの記載に制限されるものではない。脳、肝臓、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、結腸、膵臓、腎臓、肺、乳腺等の各臓器から採取された体細胞のみならず、骨髄液、脂肪組織、末梢血、皮膚、骨格筋から採取された体細胞も用いることができる。これらのほとんどの細胞は、がん治療の手術時などに、医療廃棄物として容易に入手することが可能である。【０１６７】
また、臍帯組織（臍帯、臍帯血）、羊膜、胎盤、羊水由来細胞などの出産時に付随する組織も用いることが可能であり、特に新生仔の各組織のような出生直後の組織（新生仔の皮膚等）及び臍帯由来の血管に由来する組織のような臍帯組織（臍帯、臍帯血）を用いてもよい。【０１６８】
哺乳動物から採取した、前記（a）がん抑制遺伝子の変異を有する体細胞としては、このような異常を有する体細胞であれば、特に制限されることはなく、例えば、家族性腫瘍を引き起こす遺伝子異常を有する哺乳動物から採取した体細胞等を用いることができる。【０１６９】
遺伝子異常を有する哺乳動物から採取した体細胞としては、家族性腫瘍を発症した哺乳動物から採取した体細胞や、前記哺乳動物の血縁関係にある個体の家族性腫瘍を引き起こす遺伝子異常を有する体細胞を例示することができる。これらの体細胞は、家族性腫瘍を引き起こす遺伝子異常を、片側アリルに有している体細胞（前がん細胞）であっても、両側アリルに有している体細胞（悪性細胞）であっても良い。なお、前がん細胞を用いた場合には、本発明の誘導前がん幹細胞が誘導され、悪性細胞を用いた場合には、本発明の誘導悪性幹細胞が誘導される。【０１７０】
前記した片側アリルに遺伝子異常を有する体細胞としては、家族性腫瘍を発症した哺乳動物の発がん組織以外から採取した体細胞や、前記哺乳動物の血縁関係にある個体の家族性腫瘍を引き起こす遺伝子異常を有する体細胞（前がん細胞）を例示することができる。これに対し、両側アリルに遺伝子変異を有する体細胞（悪性細胞）としては、家族性腫瘍を発症した哺乳動物のがん細胞を例示することができる。【０１７１】
なお、組織中のがん細胞のみを採取することは困難であるため、実際には、実質的にがん細胞からなるがん組織の細胞が好ましく用いられる。その他にも、がん細胞を含む非がん組織の細胞も使用することができる。【０１７２】
本発明の誘導がん幹細胞を製造する際に使用される原料体細胞の由来となる胚葉は特に制限されることはない。内胚葉系の本発明の誘導がん幹細胞を製造する場合には、内胚葉系の細胞である、肝臓、胃、大腸、結腸等由来の体細胞を原料体細胞として用いることができ、特に、胃や結腸由来の体細胞が好ましく用いられる。【０１７３】
本発明の製造方法において使用される原料体細胞として、発がんした哺乳動物から採取した体細胞のがん細胞を使用してもよい。この様な細胞は、がん細胞特有の（a）がん抑制遺伝子の変異、遺伝子発現異常等の異常を有する細胞である。これらの体細胞は、発がんした哺乳動物のがん細胞および前がん細胞を含むがん組織又はがん細胞および前がん細胞を含む非がん組織から採取するが、がん細胞または前がん細胞のみを採取することは、実際には困難である。しかしながら、原料として使用した細胞が、がん細胞または前がん細胞であったか正常細胞または非がん細胞であったかは、最終的に得られた本発明の誘導がん幹細胞が、（a）がん抑制遺伝子の変異、遺伝子発現異常等の異常を有しているか否かを明らかにすることによって確認することができる（ただし、生殖系列変異は原料細胞でも変異が判別できる）。これは、最終的に得られた本発明の誘導がん幹細胞が、（a）がん抑制遺伝子の変異、遺伝子発現上昇等の異常を有している場合には、それらの異常は、原料体細胞が有する異常を引き継いだものであると認められるからである。【０１７４】
本発明の誘導がん幹細胞を製造する際に、原料体細胞の由来組織は特に制限されることはない。例えば、発がんした哺乳動物から採取した体細胞を用いる場合には、以下のような体細胞を使用することができる。誘導中内胚葉系悪性幹細胞、誘導内胚葉系悪性幹細胞を製造する場合には、それぞれ、中内胚葉系、内胚葉系の体細胞を用いることができる。従って、肝臓、胃、十二指腸、小腸、大腸、結腸、膵臓、肺等から採取された体細胞であれば、誘導中内胚葉系悪性幹細胞又は誘導内胚葉系悪性幹細胞へ誘導することができる。【０１７５】
発がんした哺乳動物のがんの種類は特に制限されることはなく、悪性腫瘍、固形がん、癌種、肉腫、脳腫瘍、造血器がん、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫等の、何れのがんであっても良い。より具体的には、口腔がん、咽頭がん、上気道がん、肺がん、肺細胞がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、膵がん、肝がん、胆のうがん、胆道がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、甲状腺がん、子宮体がん、子宮けいがん、卵巣がん、精巣がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん、皮膚がん、悪性黒色腫、脳腫瘍、骨肉腫、血液のがん等が例として挙げられる。【０１７６】
本発明の製造方法において用いられる原料体細胞は、哺乳動物から採取した後直ちに使用しても、公知の方法で保存、培養等した後使用することも可能である。培養する場合には、継代数は特に制限されるものではない
POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の各遺伝子シンボルに対するGenBankアクセッション番号は表31の通りである。【０１７７】
【表３１】
0005920725.tif 000057
【０１７８】
本発明の誘導がん幹細胞の前記誘導工程においては、前記原料体細胞を、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が前記原料体細胞内に存在する状態におくことができればよく、その方法としては、例えば誘導多能性幹細胞の誘導技術として公知の方法などがあるが、これに制限されることはない。【０１７９】
また本発明の誘導がん幹細胞の前記誘導工程においては、原料体細胞から本発明の誘導がん幹細胞への誘導時に、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が特定の比率で細胞内に存在するように調節することにより、所望とする誘導がん幹細胞を製造することもできる。【０１８０】
より具体的には、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の前記原料体細胞内における存在比率が、POU5F1遺伝子＞SOX2遺伝子とした場合には、胃、大腸、肝臓、肺、膵臓などの内胚葉系の誘導がん幹細胞が誘導される。【０１８１】
また、内胚葉系の誘導がん幹細胞を誘導する場合には、POU5F1遺伝子＞KLF4遺伝子＞SOX2遺伝子となるようにすることが好ましく、所望とする本発明の誘導がん幹細胞を高効率に誘導する観点から好ましい。中でも、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及び、SOX2遺伝子の使用比率を、4:2:1とすることが好ましい。Takahashiらの文献（Takahashi K, Yamanaka S et al., Cell, 2007, 131, 861-872；非特許文献3）及びMasakiらの文献（Masaki H, Ishikawa T et al., Stem Cell Res., 2008, 1, 105-115；非特許文献4）にある誘導多能性幹細胞の作製においては、各遺伝子は等量、すなわち、1:1:1で使用されており、標準プロトコルとして、京都大学iPS細胞研究所からも該遺伝子の等量使用の情報提供がなされている。【０１８２】
本発明の誘導がん幹細胞の前記誘導工程において、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子としては、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子そのものを用いることができる。前記原料体細胞中における前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子又はSOX2遺伝子の発現が不十分である場合には、該細胞中に不足した遺伝子又は遺伝子産物を導入し、前記細胞中の前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子又はSOX2遺伝子が発現している場合には、それ以外の遺伝子又はその遺伝子産物を、前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の代わりに導入しても良い。【０１８３】
既に、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、又はSOX2遺伝子を強く発現している細胞であれば、誘導多能性幹細胞を誘導することが知られているその他の遺伝子、例えば、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子、TBX3遺伝子、PRDM14遺伝子、L-MYC遺伝子、c-MYC遺伝子、N-MYC遺伝子、SALL1遺伝子、SALL4遺伝子、UTF1遺伝子、ESRRB遺伝子、NR5A2遺伝子、REM2 GTPase遺伝子、TCL-1A遺伝子、Yes-associated protein（YAP）遺伝子、E-カドヘリン遺伝子、p53ドミナントネガティブ変異体遺伝子、p53shRNA遺伝子等をの代わりに導入して、本発明の誘導がん幹細胞を誘導することも可能である。【０１８４】
NANOG遺伝子、LIN28遺伝子、TBX3遺伝子、及びc-MYC遺伝子の各遺伝子シンボルに対するGenBankアクセッション番号は表32に記載した通りである。【０１８５】
【表３２】
0005920725.tif 000058
【０１８６】
前記のPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が原料体細胞内に存在する状態におくことにより、自己複製関連遺伝子群のクロマチン構造が変化し、細胞内に存在するPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が、内在性の自己複製関連遺伝子群の発現誘導を起こす結果、細胞が自己複製を開始すると考えられる。【０１８７】
前記のPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子及びこれらの遺伝子の代わりに使用される遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質やmRNAなどを、前記原料体細胞中に導入する方法としては、誘導多能性幹細胞の誘導技術として公知の方法などを挙げることができるが、これに制限されることはない。例えば、これらの遺伝子の遺伝子産物である、タンパク質やmRNA等を培地に添加しても良い。【０１８８】
前記誘導工程においては、更に、誘導がん幹細胞への誘導効率を上げるために、誘導多能性幹細胞を誘導することが知られている化合物、例えば、FGF receptor tyrosine kinase、MEK（mitogen activated protein kinase）/ERK（extracellular signal regulated kinases 1 and 2）経路、GSK（Glycogen Synthase Kinase）3の三つの低分子阻害剤〔SU5402、PD184352及びCHIR99021〕、MEK/ERK経路及びGSK3の二つの低分子阻害剤〔PD0325901及びCHIR99021〕、ヒストンメチル化酵素G9aの阻害剤である低分子化合物〔BIX-01294（BIX）〕、アザシチジン、トリコスタチンA（TSA）、7-hydroxyflavone、lysergic acid ethylamide、kenpaullone、TGFβ receptorI kinase/activin-like kinase 5 （ALK5）の阻害剤〔EMD 616452〕、TGF-βreceptor 1（TGFBR1）kinaseの阻害剤〔E-616452及びE-616451〕、Src-family kinaseの阻害剤〔EI-275〕、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGF-β中和抗体、A-83-01、Nr5a2、p53阻害化合物、p53に対するsiRNA、p53経路の阻害剤等を、本発明の誘導がん幹細胞を誘導する際に用いられる培地中に添加することができる。更に、低酸素下で培養することにより、効率よく、本発明の誘導がん幹細胞を誘導することができる。【０１８９】
上記したように前記のPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子、これらの遺伝子産物に加え、更に、上記した本発明の誘導がん幹細胞の誘導効率を上げるために、前記したNANOG遺伝子、LIN28遺伝子、TBX3遺伝子、PRDM14遺伝子、L-MYC遺伝子、c-MYC遺伝子、N-MYC遺伝子、SALL1遺伝子、SALL4遺伝子、UTF1遺伝子、ESRRB遺伝子、NR5A2遺伝子、REM2 GTPase遺伝子、TCL-1A遺伝子、Yes-associated protein（YAP）遺伝子、E-カドヘリン遺伝子、p53ドミナントネガティブ変異体遺伝子、p53shRNA遺伝子等の遺伝子又はこれらの遺伝子産物、化合物、bFGF、ALK阻害剤（A-83-01など）、TGF-beta RI阻害剤、TGF-beta RIキナーゼ阻害剤などを使用することも可能である。【０１９０】
前記原料体細胞から本発明の誘導がん幹細胞を製造するために、前記哺乳動物の細胞に遺伝子を導入する方法としては、公知の方法であれば特に制限されることはないが、ウイルスベクター、プラスミド、人工染色体（HAC）、エピソーマルベクター（EBV）、ミニサークルベクター、ポリシストロニック発現ベクター、Cre/loxPシステムを応用したベクター、ファージインテグラーゼを利用したベクター、ピギーバックなどのトランスポゾンなどのベクター等を用いることができる。【０１９１】
前記原料体細胞に、遺伝子を導入するために使用可能なウイルスベクターとしては、公知のベクターであれば何れも使用することが可能である。例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、サル免疫不全ウイルスベクター（ディナベック株式会社）、アデノ随伴ウイルスベクター（ディナベック株式会社）、ゲノムに外来遺伝子が残存しないセンダイウイルスベクター（ディナベック株式会社、株式会社医学生物学研究所）、センダイミニベクター（ディナベック株式会社）、HVJ等が挙げられるが、これらに制限されることはない。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス由来レトロウイルスベクターなどがある。【０１９２】
ウイルスベクタープラスミドとしては、公知のウイルスベクタープラスミドであれば何れも使用することが可能である。例えば、レトロウイルス系としてpMXs、pMXs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo（但し、pMXs-IBはpMXs-puroのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラストシジン耐性遺伝子を搭載したベクターである）[Toshio Kitamura et. al.," Retrovirus-mediated gene transfer andexpression cloning: Powerful tools in functional genomics", Experimental Hematology, 2003, 31(11):1007-14]が好ましく、他にも、MFG[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733-6737(1995)]、 pBabePuro[Nucleic Acids Research, 18, 3587-3596(1990)]、LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG[Journal of Virology, 72, 8150-8157(1998)]等が挙げられる。また、アデノウイルス系としてはpAdex1[Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821(1995)]等を用いることができる。【０１９３】
誘導がん幹細胞の作製におけるさらなる工程
本発明の製造方法は、前記工程に加え、更に、1ウェルに1細胞をソーティングして増殖させる工程を含むことができる。この工程は、抗ALB抗体、抗FABP1抗体、抗IGF-II抗体、抗DLK1抗体、抗PDGFRα抗体、抗VEGFR2抗体、抗E-カドヘリン抗体、抗CXCR4抗体、抗PDGFRβ抗体、抗カドヘリン11抗体、抗CD34抗体、抗IGF−R1抗体から選択される何れか1つの抗体を使用した特異抗体染色を施した細胞、又は、未染色の細胞を、1ウェルに1細胞をソーティングする方法によって増殖させる工程である。【０１９４】
例えば、前記したE-カドヘリン等の特異抗体で本発明の誘導がん幹細胞を染色し、次いで、PERFLOWTM Sort（古河電気工業社製）を用いて、1細胞/ウェルとなるように、特異抗体染色を施した細胞を96ウェルプレート等にシングルソーテイングする方法が挙げられる。特殊抗体で染色した細胞の代わりに、未染色の細胞を用いることも可能である。【０１９５】
本発明の製造方法は、更に、in vitroで自己複製可能な誘導がん幹細胞の悪性の性質又は特異マーカーを同定して選別する選別工程を含むことができる。【０１９６】
ここで、悪性の性質とは、がん細胞の無限増殖能、侵潤、転移、耐性、再発などに関わる性質のことを云う。また、特異マーカーとは、タンパク質（分泌タンパク質など）又はがん細胞の表面にある特異的なタンパク質や糖鎖抗原などがん細胞を識別可能な性質のことを云う。特異マーカーとしては、たとえば（b）がん関連遺伝子の発現上昇を利用することができる。（b）がん関連遺伝子としては、血管新生関連遺伝子群、がん関連パスウェイ遺伝子群、間質バリア関連遺伝子群、上皮-間葉転換関連遺伝子群、胃がん関連遺伝子群、自律増殖関連遺伝子群、TGFβ/BMPシグナル関連遺伝子群、組織侵潤・転移関連遺伝子群、Wntシグナル関連遺伝子群、シグナル伝達関連遺伝子群、Notchシグナル関連遺伝子群、乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子群、結腸がん関連遺伝子群、低酸素シグナル関連遺伝子群、GPCRシグナル関連遺伝子群、薬剤耐性関連遺伝子群、Hedgehogシグナル関連遺伝子群、PI3K-AKTシグナル関連遺伝子群、薬物代謝遺伝子群、がん分子メカニズム遺伝子群、SMADシグナルネットワーク関連遺伝子群、膵がん関連遺伝子群、前立腺がん関連遺伝子群、肝がん関連遺伝子群、肺がん関連遺伝子群に係る内在性がん関連遺伝子の発現上昇等を挙げることができる。【０１９７】
前記選別工程は、（a）がん抑制遺伝子の変異を有する哺乳動物から採取した体細胞、並びに、発がんした哺乳動物から採取した、（a）がん抑制遺伝子の変異、または（b）がん関連遺伝子の発現上昇のいずれかの異常を有する体細胞からなる群の中から選択された非胚性の原料体細胞を誘導処理した細胞と、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した、誘導中内胚葉系幹細胞、誘導内胚葉系幹細胞、又は誘導多能性幹細胞、若しくは、胚性幹細胞とを比較する工程であってもよい。【０１９８】
前記比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞としては、様々な時期の哺乳動物の各組織から採取された体細胞であれば特に制限されることはない。このような哺乳動物の各組織としては、前記した本発明の誘導がん幹細胞を製造するための、原料体細胞として用いられる組織として例示された様々な組織を例示することができる。【０１９９】
前記比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞としては、本発明の原料体細胞としての異常を有しない正常細胞又は非がん細胞であれば、特に制限されることはないが、例えば、成体由来の体細胞、新生児由来の体細胞、新生児皮膚由来の体細胞、発がんした哺乳動物の体細胞であって、実質的に本発明の原料体細胞としての異常を有しない非がん細胞又は発がん個体の体細胞等を用いることができる。特に、体細胞の中でも、本発明の原料体細胞が有する様々な異常が少ないと考えられる成体由来の体細胞、新生児由来の体細胞、新生児皮膚由来の体細胞を用いることができる。【０２００】
なお、組織中の1個の正常細胞又は非がん細胞のみを選択して採取することは困難であるため、実際には、正常組織又は非がん組織と認められる細胞群が用いられる。【０２０１】
原料体細胞として、発がんした哺乳動物のがん細胞を用いた場合には、前記比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞として、前記発がんした哺乳動物と同一個体の正常細胞又は非がん細胞を用いることができる。特に、同一個体の同一臓器から採取した細胞を用いた場合には、個体又は臓器に特有の特徴が共通するため、両細胞の悪性度の違いが明確となる。従って、このような原料体細胞を採取した個体と同一の個体の組織を比較する工程は、誘導がん幹細胞の悪性の性質又は特異マーカーを同定するだけでなく、発がん機構の解明等の解析ツールとしても有用であり、後記する創薬標的のスクリーニング方法としても有用である。【０２０２】
なお、前記したように、組織中の1個のがん細胞のみを採取することは困難であるため、実際には、発がんした哺乳動物のがん組織又は非がん組織の細胞群が用いられる。【０２０３】
また、比較対象となる体細胞を採取する哺乳動物は、原料体細胞を採取した哺乳動物と同一であってもよく、特に、ヒトであることが好ましい。【０２０４】
また、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した、誘導中内胚葉系幹細胞、誘導内胚葉系幹細胞としては、前記の比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導されたものであれば、特に制限されることはないが、本発明の誘導がん幹細胞の誘導方法と同様の方法で誘導して得られたものが好ましく用いられる。【０２０５】
また、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した誘導多能性幹細胞としては、公知の誘導多能性幹細胞誘導方法により作製されたものであれば、特に制限されることはないが、本発明の誘導がん幹細胞の誘導方法と同様の方法で誘導して得られたものが好ましく用いられる。その他、特許文献1及び2や、「ヒトiPS細胞の樹立方法」京都大学  物質-細胞統合システム拠点iPS細胞研究センター、CiRA/M＆M, p1-14, 2008.7.4に記載された方法で誘導された誘導多能性幹細胞、理化学研究所バイオリソースセンターや京都大学等の、公知のルートから入手できる誘導多能性幹細胞や、前記したGene Expression Omnibus〔GEO〕から誘導多能性幹細胞の公知の遺伝子発現データ等を用いることも可能である。【０２０６】
更に、比較対象としては、胚性幹細胞を用いることも可能であり、公知の方法で作製されたものであれば、どのようなものであっても使用することができる。Thomson JA et al., "Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.".Science.1998 Nov 6;282(5391):1145-7.  Erratum in:Science 1998 Dec 4;282(5395):1827.や、Hirofumi Suemori et al., "Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage.", Biochemical and Biophysical Research Communications, 345, 926-32(2006)に記載された方法で得られた未分化の胚性幹細胞、理研バイオリソースセンター、京都大学再生医科学研究所等の、公知のルートから入手できる未分化の胚性幹細胞、hES_H9（GSM194390）、hES_BG03（GSM194391）、hES_ES01（GSM194392）等の公知の遺伝子発現データを用いることもできる。これらの遺伝子発現データは、前記したGene Expression Omnibus〔GEO〕から取得することが可能である。【０２０７】
本発明の誘導がん幹細胞について、（a）がん抑制遺伝子に変異が確認され同定された場合には、本発明の誘導がん幹細胞として選別される。なお、本発明においては、（a）がん抑制遺伝子に変異が確認されれば良く、必ずしも全てのゲノムについて解析を行う必要はない。【０２０８】
本発明の誘導がん幹細胞について、比較対象となる細胞と比較して、（c）がん関連遺伝子の発現上昇が確認され、同定された場合には、本発明の誘導がん幹細胞として選別することが可能である。【０２０９】
トランスクリプトーム解析とは、特定の細胞生物学的な状況下において、1個あるいは増殖した、同様の分化状態にある生物の細胞中に存在する、全てのmRNA（又は、一次転写産物、トランスクリプト）を解析するものである。mRNAは、その細胞が発生の過程で受けた細胞外からの影響の積み重ねによって色々と変化するため、現在の細胞の性質を詳細に解析することが可能となる。具体的には、マイクロアレイ等を用いて解析が行われる。【０２１０】
例えば、比較対象となる細胞と比較して、本発明の誘導がん幹細胞に、（a）変異したがん抑制遺伝子に対応するmRNA、（b）がん関連遺伝子に対するmRNAが多く存在する場合には、本発明の誘導がん幹細胞として選別することが可能である。【０２１１】
本発明の好ましい一態様としては、トランスクリプトーム解析（マイクロアレイ）の結果、（b）がん関連遺伝子の発現上昇を測定することによって、たとえば、血管新生関連遺伝子群、がん関連パスウェイ遺伝子群、間質バリア関連遺伝子群、上皮-間葉転換関連遺伝子群、胃がん関連遺伝子群、自律増殖関連遺伝子群、TGFβ/BMPシグナル関連遺伝子群、組織侵潤・転移関連遺伝子群、Wntシグナル関連遺伝子群、シグナル伝達関連遺伝子群、Notchシグナル関連遺伝子群、乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子群、結腸がん関連遺伝子群、低酸素シグナル関連遺伝子群、GPCRシグナル関連遺伝子群、薬剤耐性関連遺伝子群、Hedgehogシグナル関連遺伝子群、PI3K-AKTシグナル関連遺伝子群、薬物代謝遺伝子群、がん分子メカニズム遺伝子群、SMADシグナルネットワーク関連遺伝子群、膵がん関連遺伝子群、前立腺がん関連遺伝子群、肝がん関連遺伝子群、肺がん関連遺伝子群からなる群に含まれる遺伝子の群の中から選択される、少なくとも1種の遺伝子に係るがん関連遺伝子の発現上昇を測定することによって、特異マーカーを同定して選別することができる。これらの遺伝子に加え、ストレス及び毒性関連遺伝子群、エピジェネティクスクロマチン修飾酵素遺伝子群、幹細胞転写因子遺伝子群、肝細胞特異的遺伝子群からなる群に含まれる遺伝子の群の中から選択される、少なくとも1種の遺伝子に係る遺伝子の発現上昇によって、総合的に判断されることが好ましい。【０２１２】
誘導がん幹細胞を用いるスクリーニング方法
本発明の第3の態様において、本発明の誘導がん幹細胞を用いることを特徴とするスクリーニング方法であり、がん創薬標的のスクリーニング方法、がん治療薬のスクリーニング方法及びがん診断薬のスクリーニング方法として好適である。【０２１３】
本発明のスクリーニング方法は、本発明の誘導がん幹細胞と、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した、誘導中内胚葉系幹細胞、誘導内胚葉系幹細胞又は誘導多能性幹細胞、若しくは、胚性幹細胞に、それぞれ被検物質を接触させる工程を含むことが好ましい。【０２１４】
がん創薬標的のスクリーニング方法として、本発明の誘導がん幹細胞と、比較対象となる哺乳動物から採取した体細胞から誘導した、誘導中内胚葉系幹細胞、誘導内胚葉系幹細胞又は誘導多能性幹細胞、若しくは、胚性幹細胞とを比較することにより、がん創薬標的となりうる遺伝子やタンパク質を探索することができる。【０２１５】
探索の結果、創薬標的と推定される遺伝子の発現を抑制するアンチセンスRNA、siRNAや、その遺伝子の翻訳タンパク質（酵素等）の特異的阻害剤を、本発明の誘導がん幹細胞を培養したシャーレに添加し、添加後の細胞の性状等を確認することにより、創薬標的となりうるか否かを評価することが可能である。【０２１６】
がん治療薬のスクリーニング方法としては、抗がん剤、ワクチン（がんワクチンなど）の候補となる医薬品を、本発明の誘導がん幹細胞を培養したシャーレに添加し、細胞の性状等を評価することにより、薬効を確認することができる。【０２１７】
がん診断薬のスクリーニング方法としては、がん診断薬に、様々な種類の本発明の誘導がん幹細胞を添加し、正確にがんと診断されるかどうかを確認することにより、がん診断薬として有効であるかどうか評価することが可能である。【０２１８】
誘導がん幹細胞を用いたがんワクチンの作製方法
本発明の第4の態様において、本発明の誘導がん幹細胞を用いた、がんワクチンの作製方法である。【０２１９】
より具体的には、CTL療法、樹状細胞療法、がんペプチドワクチン療法等に有用ながんワクチンを、本発明の誘導がん幹細胞を用いて作製することが可能である。【０２２０】
CTL療法（Cytotoxic T-lymphocyte Therapy：細胞傷害性Tリンパ球療法）とは、患者から採取したリンパ球に、攻撃対象となるがんの特徴を人工的に学習させて活性化させ、細胞障害性を持った大量のTリンパ球（CTL細胞：細胞障害性Tリンパ球）を患者の体内に戻す治療方法である。【０２２１】
一般的にCTL療法では、リンパ球に学習させるために、患者自身のがん細胞の抗原で行う方法と、人工抗原を用いる方法があり、患者自身のがん細胞の抗原で行った場合の方が、より効果があると言われている。しかしながら、患者自身のがん細胞を用いる場合には、患者のがん細胞を採取する必要があるため、患者の身体的負担が大きく、更に、得られたがん細胞をあらかじめ体外で十分な数に増やす必要があるものの、その培養が困難であるため、手術で比較的大きな腫瘍が摘出され、抗原の抽出に成功した場合に限られるという問題がある。【０２２２】
本発明の誘導がん幹細胞は、in vitroで自己複製可能であるため、必要な量の誘導がん幹細胞を準備することが可能であり、加えて、がん細胞の採取によるがん患者の身体的負担を軽減することができるため、非常に有用である。【０２２３】
より具体的な製造方法としては、例えば、成分採血などにより、がん細胞を攻撃できるT細胞を患者の血液から抽出し、本発明の誘導がん幹細胞や、これらの細胞を溶解したライセート、更には、これらの細胞をもとに得られたがん抗原たんぱく質又はペプチドを加えることにより、がん抗原をT細胞に学習させる。次いで、抗CD3抗体等で活性化した後、インターロイキン2等で培養することにより、がんワクチンである細胞障害性を持った大量のTリンパ球が得られる。なお、誘導がん幹細胞や、これらの細胞を溶解したライセートをがん抗原として用いる場合には、治療を受ける患者から手術によって摘出されたがん組織、又は、前記患者の腹水等から採取したがん細胞から作製されたものが好ましく用いられる。【０２２４】
樹状細胞療法とは、患者から採取した樹状細胞に、攻撃対象となるがんの特徴を学習させ、その樹状細胞を患者の体内に戻す治療方法であり、体内に戻された樹状細胞が、Tリンパ球を刺激し、刺激されたT細胞がキラーT細胞となって、がん細胞を攻撃することによりがんを治療するものである。【０２２５】
この治療方法は、前記したCTL療法と同様に、手術で比較的大きな腫瘍が摘出され、抗原の抽出に成功した場合に限られるという問題があり、本発明の誘導がん幹細胞は、in vitroで自己複製可能であるため、必要な量の誘導がん幹細胞を準備することが可能であり、加えて、がん細胞の採取によるがん患者の身体的負担を軽減することができるため、非常に有用である。【０２２６】
より具体的な製造方法としては、例えば、成分採血等により抽出された樹状細胞に、誘導がん幹細胞や、これらの細胞を溶解したライセート、更には、これらの細胞をもとに得られたがん抗原たんぱく質又はペプチドを加えることにより、がん抗原を樹状細胞に学習させ、がんワクチンである樹状細胞が作製される。なお、誘導がん幹細胞や、これらの細胞を溶解したライセートをがん抗原として用いる場合には、治療を受ける患者から手術で摘出されたがん組織、前記患者の腹水等から採取したがん細胞から作製されたものが好ましく用いられる。【０２２７】
前記した樹状細胞は、1個の樹状細胞で数百から数千のリンパ球を刺激することが可能であるため、樹状細胞にがんの特徴を学習させ、体内に戻す治療法は、非常に効率的であると考えられる。しかしながら、樹状細胞の数は白血球の0.1〜0.5％程度であるため、血液中に数多く存在する、樹状細胞に変化可能な単球を成分分離採血法で大量に獲得し、更に、サイトカイン等の、細胞を刺激する物質を用いて前記単球を樹状細胞へと培養し、これを用いることが可能である。【０２２８】
がんペプチドワクチン療法とは、がん細胞が持つ特異的な抗原としてペプチド（ペプチドワクチン）を注射することによって、患者の有する免疫力を高めてがんの増大を抑える治療方法である。具体的には、このペプチド（9又は10個のアミノ酸がつながった小さいペプチド）を体内に投与すると、ペプチドによって刺激を受けたキラーT細胞が活性化し、更に増殖してがん細胞を攻撃するようになるという性質を利用して、がんを排除（退縮）する治療方法である。【０２２９】
本発明の誘導がん幹細胞は、in vitroで自己複製可能であり、様々な誘導がん幹細胞を大量に増幅させることが可能であるため、様々ながん患者由来のがん組織等から作製された本発明の誘導がん幹細胞を大量に培養させ、目的とするがんワクチンを作製することが可能である。このようにして得られたがんワクチンは、CTL療法又は樹状細胞療法に用いることも可能である。【０２３０】
前記したようながんワクチンは、がんの予防的治療や、化学療法、放射線療法、外科的療法等の、標準療法後の再発予防に非常に有効である。【０２３１】
誘導がん幹細胞を用いたがんモデル動物の作製方法
本発明の第5の態様において、本発明の誘導がん幹細胞を用いた、がんモデル動物の作製方法である。【０２３２】
本発明のがんモデル動物の作製方法によれば、例えば、マウス等の実験動物に本発明の誘導がん幹細胞を移植することにより、胆がんマウスを作製することができる。この胆がんマウスに抗がん剤、抗体、ワクチン等を投与した後、胆がんマウスの血液検査、尿検査、剖検等を行うことにより、その薬効を確認することができる。【０２３３】
本発明の誘導がん幹細胞は、前記したスクリーニング方法、がんワクチン作製方法、がんモデル動物の作製方法以外にも、様々な応用が可能である。【０２３４】
例えば、誘導がん幹細胞の遺伝子情報の中から分泌タンパク質及び膜タンパク質を網羅的にスクリーニングし、がん診断マーカーとして有用な、本発明の誘導がん幹細胞に特異的な膜タンパク質及び分泌タンパク質を同定し、治療又は診断用抗体を作製することができる。分泌タンパク質及び膜たんぱく質を網羅的にスクリーニングする方法としては、膜たんぱく質及び分泌タンパク質に共通して存在するシグナルシークエンスをターゲットとする遺伝子同定を特徴とする「シグナルシークエンスストラップ法」（特許第3229590号及び特許第3499528号）等が挙げられる。【０２３５】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【０２３６】
実施例1.レトロウイルスベクターの調製
POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsの3遺伝子のレトロウイルスベクタープラスミドを、Fugene HD（ロシュ社製；Cat no.4709691）を用いて、パントロピックレトロウイルスベクター調製用パッケージング細胞であるPlat-GP細胞に導入し、レトロウイルスベクター液を調製した。遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは順に4:2:1の比率で使用し、POU5F1＞SOX2の関係になるようにした。詳細は、以下の通りである。【０２３７】
＜胃がん患者がん組織由来細胞の遺伝子導入用レトロウイルスベクター液の調製＞
POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは構築したベクターである（後記表33）。【０２３８】
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs1.25μg（Cell Biolab製）、FuGENE HD45μlとした。【０２３９】
＜胃がん患者非がん組織由来細胞の遺伝子導入用レトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは構築したベクターである（後記表33）。【０２４０】
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。【０２４１】
＜結腸がん患者がん組織由来細胞の遺伝子導入用レトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは構築したベクターである（後記表33）。【０２４２】
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。【０２４３】
レトロウイルスベクタープラスミドを導入したPlat-GP細胞を、48時間以上培養した後、24時間毎に3回上清を回収し4℃で保存した。ステリフリップ-HVフィルターユニット：0.45μm径のフィルター（ミリポア社製；Cat no.SE1M003M00）でろ過を行った。以上の手順により3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）のパントロピックレトロウイルスベクター液を調製した。パントロピックレトロウイルスベクターは、様々な細胞に遺伝子導入することが可能であり、ヒト細胞へ高い効率で遺伝子導入することができる。【０２４４】
【表３３】
0005920725.tif 000059
【０２４５】
実施例2.胃がん患者のがん組織由来の細胞からの誘導悪性幹細胞の作製
保存液に数時間保存・運搬したヒト胃がん（進行がん）患者の新鮮がん組織から体細胞を単離した。得られた胃がん患者がん組織由来の細胞に、実施例1において調製したPOU5F1＞KLF4＞SOX2の関係を満たす3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導悪性幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。【０２４６】
手術時に得られた新鮮胃がん（進行がん：男性、67歳、日本人）組織の一部を、ハンクス平衡液（フェノールレッド不含）（インビトロジェン社製；Cat no.14175-095）で洗浄し、剪刀を用いて約0.1〜1 mm2に細断した。更に、ハンクス平衡液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄し、上清を除去し、組織沈殿に対して5 mlの0.1％コラゲナーゼ（和光純薬社製；Cat no.034-10533）/1×抗生物質-抗真菌剤を加え、振盪器を用いて、37℃で60分間攪拌した。【０２４７】
組織沈殿が十分消化されたことを確認後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を35 ml加えて、1000 rpm、4℃で5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を40 ml加えて、1000 rpm、4℃で5分間再度遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を5 ml加え、コラーゲンコートディッシュ60 mm（イワキ社製；Cat no.11-018-004）に播種し、初代培養した。【０２４８】
24時間後に培地を除き、5 mlの3遺伝子のレトロウイルスベクターを添加し、37℃で1日間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったフィーダー細胞であるマウス胚性繊維芽細胞を、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地5 mlに懸濁後、胃がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞を培養したコラーゲンコートディッシュ60 mm（イワキ社製；Cat no.11-018-004）に5.0×104cell/cm2播種し、共培養した。【０２４９】
その後3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入から15日後から、フィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で毎日培地交換を行った。【０２５０】
実施例を通じて使用するMEF馴化ES培地、及び、その調製方法は、以下の通りである。【０２５１】
＜MEF馴化ES培地＞
MEF
マイトマイシンC処理初代マウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製;Cat no.R-PMEF-CF）
MEF馴化用ES培地
ノックアウトD-MEM（インビトロジェン社製；Cat no.10829-018）500 ml
2 mM GlutaMAX
10％ノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製；Cat no.10828-028）
50μg/mlゲンタマイシン（インビトロジェン社製；Cat no.15750-060）
MEM非必須アミノ酸液（インビトロジェン社製；Cat no.11140-050）
10 ng/ml bFGF（ぺプロテック社製；Cat no.100-18B）
＜MEF馴化ES培地の調製＞
マイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）5×106 cellを、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地40 mlに懸濁後、ゼラチンコートディッシュ100 mm（イワキ社製；Cat no.11-020-006）4枚に播種した。24時間後に培地を除き、MEF馴化用のES培地を10 ml加えた。【０２５２】
24時間毎に回収した上清へ新たに10％ノックアウト血清リプレースメント、10 ng/ml bFGF、0.1 mM 2-メルカプトエタノールを加え、MEF馴化ES培地として用いた。【０２５３】
〔胃がん患者のがん組織由来ヒト誘導悪性幹細胞のin vitro自己複製培養〕
3遺伝子導入から25日後に、誘導悪性幹細胞のコロニーを1クローン（GC1-1）、3遺伝子導入から32日後に、誘導悪性幹細胞のコロニーを1クローン（GC1-3）、3遺伝子導入から33日後に、誘導悪性幹細胞のコロニーを3クローン（GC1-5、7、8）ピックアップし、ゼラチンコート24ウェルプレート中のマイトマイシン処理を行ったフィーダー細胞上へ移した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に5.0×104cell/cm2でゼラチンコート24ウェルプレートに播種した。【０２５４】
その後、GC1-1は遺伝導入から32日後に、24ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第1継代）を、6ウェルプレートに継代（第2継代）した。遺伝導入から43日後に、6ウェルプレートで増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第2継代）を、10 cm培養皿に継代（第3継代）した。遺伝導入から50日後に、10 cm培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第3継代）を、10 cm培養皿に継代（第4継代）と凍結保存をした。遺伝導入後から55日後に、10 cm培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第4継代）を、10 cm培養皿に継代（第5継代）と凍結保存をした。遺伝導入から58日後に、10 cm培養皿で増殖したヒト誘導悪性幹細胞（第5継代）をバッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）に溶解処理した。GC1-1と同様に他のクローンに関しても下記に継代（p）とRNA回収用キットのバッファー（RLT Buffer）へ溶解した日（遺伝子導入後日数）を簡略して示した。【０２５５】
なお、本発明の実施例において行われる細胞凍結保存は、以下の通りである。【０２５６】
細胞から培地を除き、PBS（-）を用いて、10 ml/10 cm（約60 cm2）培養皿で細胞を洗浄した後、細胞剥離液を2〜3 ml/10 cm（約60 cm2）培養皿に加えた。実施例を通じて、継代培養時の細胞剥離液としては、以下の2種類を用いた：
（i）0.25％トリプシン-1 mM EDTA溶液（インビトロジェン社製；Cat no.25200-056）
（ii）調製剥離液〔10 mg/mlタイプIVコラゲナーゼ（インビトロジェン社製；Cat no.17104-019）10 ml、100 mM塩化カルシウム溶液（シグマ）1 ml、PBS59 ml、2.5％トリプシン溶液（インビトロジェン社製；Cat no.15090-046）10 ml、ノックアウト血清リプレースメント（KSR, インビトロジェン社Catno.10828-028）20 ml；これらを溶解後、0.22μmのフィルターで濾過滅菌したもの〕。【０２５７】
37℃5分間静置したのち、細胞剥離液を除き、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を20 ml加えて、1000 rpm、4℃で5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、凍結用保存液を1 ml加えて、セラムチューブ2本に分注した。その後、セラムチューブを動物細胞凍結処理容器（バイセル／BICELL）に入れて、-80℃で一晩凍結させた後、液体窒素にて保管した。【０２５８】
凍結用保存液としては以下の2種類を用いた：
（i）セルバンカー3（日本全薬工業Cat no.BLC-3S）
（ii）50％mTeSR1、40％KSR、10％DMSOの混液。【０２５９】
GC1-1
遺伝子導入後日数32:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数43:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm（第3継代）
遺伝子導入後日数50:  継代と保存（第4継代）
遺伝子導入後日数55:  継代と保存（第5継代）
遺伝子導入後日数58:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）処理。【０２６０】
GC1-3
遺伝子導入後日数44:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数48:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm（第3継代）
遺伝子導入後日数53:  継代と保存（第4継代）
遺伝子導入後日数58:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）処理。【０２６１】
GC1-5
遺伝子導入後日数44:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数52:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm（第3継代）
遺伝子導入後日数61:  継代と保存（第4継代）
遺伝子導入後日数63:  保存とバッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）処理。【０２６２】
GC1-7
遺伝子導入後日数44:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数52:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm（第3継代）
遺伝子導入後日数61:  継代と保存（第4継代）
遺伝子導入後日数62:  保存とバッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）処理。【０２６３】
GC1-8
遺伝子導入後日数44:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数48:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm（第3継代）
遺伝子導入後日数53:  継代と保存（第4継代）
遺伝子導入後日数55:  継代と保存（第5継代）
遺伝子導入後日数58:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）処理。【０２６４】
以上のように、フィーダー細胞であるMEFと共にフィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1を用いて胃がん患者のがん組織由来の誘導悪性幹細胞をin vitroで自己複製させた。【０２６５】
実施例3.胃がん患者非がん組織由来の細胞からのヒト誘導悪性幹細胞の作製
保存液に数時間保存・運搬したヒト胃がん（進行がん）患者の新鮮非がん組織から細胞を単離し、初代培養した。得られた胃がん患者非がん組織由来の細胞に、実施例1において調製した3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子を導入することによって、ヒト誘導悪性幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。【０２６６】
手術時に得られた胃がん（進行がん：男性、67歳、日本人）患者の非がん新鮮組織の一部を、ハンクス平衡液（フェノールレッド不含）で洗浄し、剪刀を用いて約0.1〜1 mm2に細断した。ハンクス平衡液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄した後、上清を除去し、組織沈殿に対して5 ml 0.1％コラゲナーゼ/1×抗生物質-抗真菌剤を加え、振盪器を用いて37℃、60分間で攪拌した。【０２６７】
組織沈殿が十分消化されたことを確認した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を35 ml加えて、1000 rpm、4℃で5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を40 ml加えて、1000 rpm、4℃で5分間再度遠心分離した。更に、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を10 ml加え、コラーゲンコートディッシュ100 mm（イワキ社製、Cat no.11-018-006）に播種した。【０２６８】
約24時間後、培地を除き、10 mlの3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクターを添加し、37℃で約24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞を、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地10 mlに懸濁後、胃がん患者非がん組織由来の遺伝子導入された細胞が培養されたコラーゲンコートディッシュ100 mm（イワキ社製、Cat no.11-018-006）へ5.0×104cell/cm2で播種し、共培養された。【０２６９】
〔胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞のin vitro自己複製培養〕
それ以降、3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、3遺伝子導入から31日後、mTeSR1で毎日培地交換を行った。遺伝子導入から41日後にコロニーを1クローン（NGC1-1）、ピックアップし、ゼラチンコート24ウェルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞上に継代した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に5.0×104cell/cm2でゼラチンコート24ウェルプレートに播種した。【０２７０】
下記に、胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞に係る細胞を、継代（p）とRNA回収用キットのバッファー（RLT Buffer）へ溶解した日（遺伝子導入後日数）を示した。【０２７１】
NGC1-1
遺伝子導入後日数52:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数58:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm（第3継代）
遺伝子導入後日数65:  継代、保存、バッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）処理。【０２７２】
以上のように、フィーダー細胞であるMEFと共にフィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1を用いて胃がん患者非がん組織由来の誘導悪性幹細胞をin vitroで自己複製させた。【０２７３】
実施例4.結腸がん患者のがん組織由来の細胞からヒト誘導悪性幹細胞の作製
保存液に数時間保存・運搬したヒト結腸がん患者の新鮮がん組織から細胞を単離した。得られたヒト結腸がん患者の新鮮がん組織由来の細胞に、実施例1において調製した3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導悪性幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。【０２７４】
手術時に得られた結腸がん（S状結腸がん：男性、55歳、日本人）の一部をハンクス平衡液（フェノールレッド不含）で洗浄し、剪刀を用いて約0.1〜1 mm2に細断した。ハンクス平衡液（フェノールレッド不含）で上清が透明になるまで洗浄した。次いで、上清を除去し、組織沈殿に対して5 ml 0.1％コラゲナーゼ/1×抗生物質-抗真菌剤を加え、振盪器を用いて、37℃で60分間攪拌した。【０２７５】
組織沈殿が十分消化されたことを確認した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を35 ml加えて1000 rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を40 ml加えて、1000 rpm、4℃で5分間再度遠心分離した。上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を10 ml加え、コラーゲンコートディッシュ100 mm（イワキ社製、Cat no.11-018-006）に播種した。【０２７６】
約24時間後に培地を除き、10 mlの3遺伝子のレトロウイルスベクターを添加し、その5時間後、5 mlのLuc-IRES-GFPのレトロウイルスベクターを37℃で約24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったMEFを1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地10 mlに懸濁後、結腸がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞が培養されたコラーゲンコートディッシュ100 mm（イワキ社製、Cat no.11-018-006）へ5.0×104cell/cm2で播種し、共培養された。【０２７７】
〔結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞のin vitro自己複製培養〕
その後、3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入22日後から、mTeSR1で毎日培地交換を行った。遺伝子導入から31日後に、コロニーの1クローン（CC1-10）をピックアップし、ゼラチンコート24ウェルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞に継代した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に5.0×104cell/cm2でゼラチンコート24ウェルプレートに播種した。【０２７８】
下記に結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞の継代（p）とRNA回収用キットのバッファー（Buffer RLT）へ溶解した日（遺伝子導入後日数）を示した
CC1-10
遺伝子導入後日数49:  24ウェル（第1継代）→6ウェル（第2継代）
遺伝子導入後日数54:  6ウェル（第2継代）→10 cm（第3継代）
遺伝子導入後日数59:  継代と保存（第4継代）
遺伝子導入後日数63:  継代と保存（第5継代）
遺伝子導入後日数68:  一部をバッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）処理
遺伝子導入後日数71:  一部をQiazol（RNA精製前の細胞溶解液）処理
遺伝子導入後日数75:  一部をNOD-SCIDマウスへ移植。【０２７９】
以上のように、フィーダー細胞であるMEFと共にフィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1を用いて結腸がん患者がん組織由来の誘導悪性幹細胞をin vitroで自己複製させた。【０２８０】
実施例5.マイクロアレイによる定量解析
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）により、ゲノムワイドな遺伝子発現（mRNAのトランスクリプトーム）を解析した。3種類のヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）、hES_BG03（GSM194391）及びhES_ES01（GSM194392）と、誘導多能性幹細胞hiPS-201B7（GSM241846）のマイクロアレイデーターは、GEOからダウンロードして使用した。【０２８１】
＜トータルRNAとゲノムDNAの調製＞
実施例2〜4のヒト誘導悪性幹細胞（GC1-1、GC1-3、GC1-5、GC1-7、GC1-8、NGC1-1、CC1-10）のトータルRNAとゲノムDNAを、事前にバッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）で処理した溶液から、AllPrep DNA/RNA Mini Kit（50）（キアゲン社製；Cat no.80204）を用いて抽出した。【０２８２】
＜実験方法＞
（i）ゲノムDNAのクオリティーチェック
NanoDrop ND-1000（NanoDrop Technologies）で、DNA濃度及びDNAの純度の評価を行ったところ、何れのサンプルにおいても十分な濃度があり、純度も高いことが確認された。【０２８３】
（ii）トータルRNAのクオリティーチェック
RNA用LabChip（アジレント社製の登録商標）キットを用いて、Agilent 2100 Bioanalyzer（アジレント社製）でtotal RNAの品質のチェックを行ったところ、全てのRNAサンプルのクオリティーは良好であった。また、NanoDrop ND-1000（NanoDrop Technologies）で、RNA濃度及びRNAの純度の評価を行ったところ、何れのサンプルにおいてもcRNA合成に必要なtotalRNA量があることが確認され、純度も高いことが確認された。【０２８４】
（iii）cRNAの合成
各サンプルのtotalRNA（500 ng）から、Quick Amp Labeling kit（アジレント社製）を用いて、アジレント社のプロトコールに従って、2本鎖cRNAを合成した。作製したcDNAから、in vitro transcriptionによりcRNAを合成した。この際、Cyanine色素で標識されたCTP（Cyanine 3-CTP）を取り込ませ、蛍光標識を行った。【０２８５】
（iv）ハイブリダイゼーション
Gene Expression Hybridization Kit（アジレント社製）を使用して、ハイブリダイゼーション標識cRNAをハイブリダイゼーションバッファーに加え、アジレント製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）上で17時間ハイブリダイズし、洗浄後、アジレントマイクロアレイスキャナで、DNAマイクロアレイのイメージを読み取り、Feature Extraction Software（v.9.5.3.1）を用いて、各スポットの蛍光シグナルを数値化した。【０２８６】
＜遺伝子の定量解析結果＞
解析ソフトとしては、GeneSpring GX10.0（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、ノーマライゼーションは、50th percentileで行った。【０２８７】
全体の遺伝子発現の分布（各プローブの蛍光値の分布）の中央値を0として表記した。0を超えた値を示したプローブを、遺伝子発現を検出したプローブとし、遺伝子発現を有りとした。解析の結果、ヒト誘導悪性幹細胞（GC1-1、GC1-3、GC1-5、GC1-7、GC1-8、NGC1-1、CC1-10）は、ヒト誘導多能性幹細胞（hiPS201B7）と比較して内胚葉系遺伝子であるGSC遺伝子及びGATA4遺伝子、FOXA2遺伝子又はSOX17遺伝子の発現が上昇していた。特に、ヒト誘導悪性幹細胞（GC1-2、GC1-5、GC1-7、NGC1-1）は、ヒト誘導多能性幹細胞（hiPS201B7）やヒト胚性幹細胞と比較して内胚葉系遺伝子であるGSC遺伝子及びGATA4遺伝子、FOXA2遺伝子又はSOX17遺伝子の発現が2倍以上、上昇していた。【０２８８】
1）血管新生関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された血管新生関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表34〔hES_BG03 vs GC1-5〕に記載した。更に、2倍以上発現上昇している血管新生関連遺伝子のプローブをプロットした図を示す（図1）。GC1-5はがん患者の新鮮がん組織（胃がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性のがん関連遺伝子である血管新生関連遺伝子（MDK遺伝子、TIMP2遺伝子、FGFR3遺伝子、PLAU遺伝子、ID3遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０２８９】
【表３４】
0005920725.tif 000060
【０２９０】
0005920725.tif 000061
【０２９１】
2）がん関連パスウェイ遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたがん関連パスウェイ遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）及びヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表35〔hES_H9 vs NGC1-1〕及び表36〔hiPS-201B7 vs NGC1-1〕にそれぞれ記載した。NGC1-1はがん患者の新鮮非がん組織（胃の非がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性のがん関連パスウェイ遺伝子（MMP2遺伝子、TIMP1遺伝子、TIMP3遺伝子、MMP1遺伝子、CDKN1A遺伝子、S100A4遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０２９２】
【表３５】
0005920725.tif 000062
【０２９３】
0005920725.tif 000063
【０２９４】
【表３６】
0005920725.tif 000064
【０２９５】
3）間質バリア（細胞外マトリックスと接着分子）関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された間質バリア関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表37〔hES_BG03 vs GC1-5〕に記載した。GC1-5はがん患者の新鮮がん組織（胃がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性の間質バリア関連遺伝子（COL4A2遺伝子、FN1遺伝子、COL1A1遺伝子、TGFB1遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０２９６】
【表３７】
0005920725.tif 000065
【０２９７】
4）上皮-間葉転換関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された上皮-間葉転換関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、プローブ及びGenBankアクセッションナンバーを、下記表38〔hES_BG03 vs GC1-5〕に記載した。更に、2倍以上発現上昇している上皮-間葉転換関連遺伝子のプローブをプロットした図を示す（図2）。GC1-5はがん患者の新鮮がん組織（胃がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性の上皮-間葉転換関連遺伝子（VIM遺伝子、COL3A1遺伝子、COL1A2遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０２９８】
【表３８】
0005920725.tif 000066
【０２９９】
同様に、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1とヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）及びヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7、並びに、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞CC1-10とヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7を比較した結果を、表39〔hES_H9 vs NGC1-1〕、表40〔hiPS-201B7 vs NGC1-1〕、表41〔hiPS-201B7 vs CC1-10〕に示す。NGC1-1は、がん患者の新鮮非がん組織（胃の非がん組織）から調製した初代培養体細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、自己複製関連遺伝子（POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子、TERT遺伝子）を発現していることが明らかとなった。また、CC1-1は、がん患者の新鮮がん組織（大腸がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、自己複製関連遺伝子（POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子、TERT遺伝子）を発現していることが明らかとなった。【０３００】
【表３９】
0005920725.tif 000067
【０３０１】
【表４０】
0005920725.tif 000068
【０３０２】
0005920725.tif 000069
【０３０３】
【表４１】
0005920725.tif 000070
【０３０４】
5）胃がん関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された胃がん関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表42〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。NGC1-1はがん患者の新鮮非がん組織（胃の非がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性の胃がん関連遺伝子（CCND2遺伝子、TIMP3遺伝子、LOX遺伝子、RASSF1遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３０５】
【表４２】
0005920725.tif 000071
【０３０６】
6）自律増殖関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された自律増殖関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表43〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。NGC1-1はがん患者の新鮮非がん組織（胃の非がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性の自律増殖関連遺伝子（IGF2遺伝子、INHBA遺伝子、MDK遺伝子、INHBB遺伝子、BMP1遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３０７】
【表４３】
0005920725.tif 000072
【０３０８】
8）TGFβ/BMPシグナル関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたTGFβ/BMPシグナル関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_ES01（GSM194392）及びヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、それぞれ下記表44〔hES_ES01 vs GC1-5〕及び表45〔hiPS-201B7 vs GC1-5〕に記載した。【０３０９】
【表４４】
0005920725.tif 000073
【０３１０】
0005920725.tif 000074
【０３１１】
【表４５】
0005920725.tif 000075
【０３１２】
更に、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇しているTGFβ/BMPシグナル関連遺伝子のプローブをプロットした図を示す（図3）。GC1-5はがん患者の新鮮がん組織（胃がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性のTGFβ/BMPシグナル関連遺伝子（TGFB1遺伝子、IGFBP3遺伝子、INHBA遺伝子、INHBB遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３１３】
同様に、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1とヒト胚性幹細胞hES_ES01（GSM194392）及びヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞CC1-10とヒト胚性幹細胞hES_ES01（GSM194392）及びヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7を比較した結果を、下記表46〔hES_ES01 vs NGC1-1〕、表47〔hiPS-201B7 vs NGC1-1〕、表48〔hES_ES01 vs CC1-10〕、表49〔hiPS-201B7 vs CC1-10〕に示す。NGC1-1はがん患者の新鮮非がん組織（胃の非がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性のTGFβ/BMPシグナル関連遺伝子（TGFB1遺伝子、IGFBP3遺伝子、INHBA遺伝子、INHBB遺伝子）を発現していることが明らかとなった。また、CC1-10はがん患者の新鮮がん組織（大腸がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性のTGFβ/BMPシグナル関連遺伝子（TGFB1遺伝子、IGFBP3遺伝子、INHBA遺伝子、INHBB遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３１４】
【表４６】
0005920725.tif 000076
【０３１５】
0005920725.tif 000077
【０３１６】
【表４７】
0005920725.tif 000078
【０３１７】
【表４８】
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【０３１８】
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【０３１９】
【表４９】
0005920725.tif 000081
【０３２０】
9）組織侵潤・転移関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された組織侵潤・転移関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表50〔hiPS-201B7 vs GC1-5〕に記載した。GC1-5はがん患者の新鮮がん組織（胃がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来のヒト誘導悪性幹細胞であり、内在性の組織侵潤・転移関連遺伝子（FST遺伝子、BMP7遺伝子、TGFB1遺伝子、COL3A1遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３２１】
【表５０】
0005920725.tif 000082
【０３２２】
同様に、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1とヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7を比較した結果を、表51〔hiPS-201B7 vs NGC1-1〕に示す。更に、2倍以上発現上昇している組織侵潤・転移関連遺伝子のプローブをプロットした図を示す（図4）。ヒト誘導悪性幹細胞はがん患者の新鮮非がん組織（胃の非がん組織）から調製した初代培養体（非胚性）細胞由来であり、内在性の組織侵潤・転移関連遺伝子（FST遺伝子、BMP7遺伝子、TGFB1遺伝子、COL3A1遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３２３】
【表５１】
0005920725.tif 000083
【０３２４】
10）Wntシグナル関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたWntシグナル関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表52〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。更に、2倍以上発現上昇しているWntシグナル関連遺伝子のプローブをプロットした図を示す（図5）。誘導悪性幹細胞は内在性のWntシグナル関連遺伝子（CCND2遺伝子、SLC9A3R1遺伝子、LEF1遺伝子、CTNNB1遺伝子、FRZB遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３２５】
【表５２】
0005920725.tif 000084
【０３２６】
11）シグナル伝達関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたシグナル伝達関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表53〔hES_H9 vs GC1-5〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性のシグナル伝達関連遺伝子（CCL2遺伝子、CDKN1A遺伝子、HSPB1遺伝子、RBP1遺伝子、CCND1遺伝子、LEF1遺伝子、GADD45A遺伝子、BAX遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３２７】
【表５３】
0005920725.tif 000085
【０３２８】
12）Notchシグナル関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたNotchシグナル関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表54〔hES_H9 vs GC1-5〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性のNotchシグナル関連遺伝子（CD44遺伝子、FZD2遺伝子、CCND1遺伝子、HES1遺伝子、CDKN1A遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３２９】
【表５４】
0005920725.tif 000086
【０３３０】
13）乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表55〔hES_H9 vs GC1-5〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性の乳がん及びエストロジェン受容体シグナル関連遺伝子（KRT18遺伝子、KRT19遺伝子、GSN遺伝子、TFF1遺伝子、CTSB遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３３１】
【表５５】
0005920725.tif 000087
【０３３２】
0005920725.tif 000088
【０３３３】
14）結腸がん関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された結腸がん関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表56〔hES_H9 vs GC1-5〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性の結腸がん関連遺伝子（DKK3遺伝子、SPARC遺伝子、IGF2遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。
【０３３４】
【表５６】
0005920725.tif 000089
【０３３５】
15）低酸素シグナル関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された低酸素シグナル関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表57〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性の低酸素シグナル関連遺伝子（EPAS1遺伝子、TUBA4遺伝子、EEF1A1遺伝子、CDC42遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３３６】
【表５７】
0005920725.tif 000090
【０３３７】
0005920725.tif 000091
【０３３８】
16）GPCRシグナル関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたGPCRシグナル関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表58〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性のGPCRシグナル関連遺伝子（GNAS遺伝子、RGS2遺伝子、JUNB遺伝子、AGT遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３３９】
【表５８】
0005920725.tif 000092
【０３４０】
17）薬剤耐性関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された薬剤耐性関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表59〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性の薬剤耐性関連遺伝子（AQP1遺伝子、SLC16A3遺伝子、ATP6V0C遺伝子、MVP遺伝子、ABCG2遺伝子、ATP7B遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３４１】
【表５９】
0005920725.tif 000093
【０３４２】
18）Hedgehogシグナル関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたHedgehogシグナル関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表60〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性のHedgehogシグナル関連遺伝子（CTNNB1遺伝子、FGFR3遺伝子、ERBB4遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３４３】
【表６０】
0005920725.tif 000094
【０３４４】
19）PI3K-AKTシグナル関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたPI3K-AKTシグナル関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表61〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性のPI3K-AKTシグナル関連遺伝子（HSPB1遺伝子、ITGB1遺伝子、CTNNB1遺伝子、PDGFRA遺伝子、FKBP1A遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３４５】
【表６１】
0005920725.tif 000095
【０３４６】
0005920725.tif 000096
【０３４７】
20）薬物代謝遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された薬物代謝遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表62〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性の薬物代謝遺伝子（PKM2遺伝子、GSTM3遺伝子、COMT遺伝子、ALDH1A1遺伝子、BLVRB遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３４８】
【表６２】
0005920725.tif 000097
【０３４９】
21）がん分子メカニズム遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたがん分子メカニズム遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表63〔hiPS-201B7 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性のがん分子メカニズム遺伝子（BAX遺伝子、NFKBIA遺伝子、BCL2遺伝子、CASP8遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３５０】
【表６３】
0005920725.tif 000098
【０３５１】
0005920725.tif 000099
【０３５２】
22）SMADシグナルネットワーク関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたSMADシグナルネットワーク関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_ES01（GSM194392）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表64〔hES_ES01 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性のSMADシグナルネットワーク関連遺伝子（PSMC3遺伝子、HDAC5遺伝子、UBB遺伝子、ACTA2遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３５３】
【表６４】
0005920725.tif 000100
【０３５４】
0005920725.tif 000101
【０３５５】
23）膵がん関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された膵がん関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表65〔hiPS-201B7 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性の膵がん関連遺伝子を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３５６】
【表６５】
0005920725.tif 000102
【０３５７】
24）前立腺がん関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された前立腺がん関連遺伝子のプローブの内、本発明の本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表66〔hES_BG03 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性の前立腺がん関連遺伝子（SFRP1遺伝子、TIMP2遺伝子、DKK3遺伝子、DLC1遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３５８】
【表６６】
0005920725.tif 000103
【０３５９】
26）肝がん関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された肝がん関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表67〔hES_BG03 vs GC1-5〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性の肝がん関連遺伝子（CCND2遺伝子、DLC1遺伝子、CDKN1A遺伝子、DAB2IP遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３６０】
【表６７】
0005920725.tif 000104
【０３６１】
27）肺がん関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された肺がん関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表68〔hES_BG03 vs GC1-5〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性の肺がん関連遺伝子（CDKN1C遺伝子、MGMT遺伝子、RASSF2遺伝子、CADM1遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３６２】
【表６８】
0005920725.tif 000105
【０３６３】
28）ストレス及び毒性関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたストレス及び毒性関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表69〔hES_H9 vs GC1-5〕に記載した。誘導悪性幹細胞は内在性のストレス及び毒性関連遺伝子（GDF15遺伝子、GSTM3遺伝子、HMOX1遺伝子、HSPA5遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３６４】
【表６９】
0005920725.tif 000106
【０３６５】
0005920725.tif 000107
【０３６６】
30）エピジェネティクスクロマチン修飾酵素遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたエピジェネティクスクロマチン修飾酵素遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表70〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞はエピジェネティクスクロマチン修飾酵素遺伝子（HDAC5遺伝子、SMYD3遺伝子、HDAC10遺伝子、PRMT5遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３６７】
【表７０】
0005920725.tif 000108
【０３６８】
31）幹細胞転写因子遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された幹細胞転写因子遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表71〔hES_H9 vs NGC1-1〕に記載した。誘導悪性幹細胞は幹細胞転写因子遺伝子（NR2F2遺伝子、PITX2遺伝子、HAND1遺伝子、ZIC1遺伝子）を相対的に高発現していることが明らかとなった。【０３６９】
【表７１】
0005920725.tif 000109
【０３７０】
32）肝細胞関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された肝細胞関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表72〔hES_BG03 vs GC1-5〕に記載した。誘導悪性幹細胞は1）〜31）の何れかに加えて肝細胞関連遺伝子（TTR遺伝子、DLK1遺伝子、AFP遺伝子、TF遺伝子）がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較して相対的に高発現上昇していることが明らかとなった。【０３７１】
【表７２】
0005920725.tif 000110
【０３７２】
0005920725.tif 000111
【０３７３】
33）自己複製関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された自己複製関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5がヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較してほぼ同程度（1/2から2倍）発現している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表73〔hES_H9 = GC1-5〕に記載した。更に、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1とヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）を比較して、ほぼ同程度（1/2から2倍）発現している自己複製関連遺伝子のプローブをプロットしたグラフを（図6）示す。なお、表1の自己複製関連遺伝子の全てが、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞GC1-5とヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較してほぼ同程度（1/8から8倍）発現していた。【０３７４】
【表７３】
0005920725.tif 000112
【０３７５】
同様に、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1とヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞CC1-10とヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）、表74〔hES_BG03=NGC1-1〕、表75〔hES_BG03=CC1-10〕、に示す。なお、表1の自己複製関連遺伝子の全てが、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1、ヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞CC1-10、ヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較してほぼ同程度（1/8から8倍）発現していた。従って、誘導悪性幹細胞は1）〜31）の遺伝子の何れか一つに加えて自己複製関連遺伝子（POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子、TERT遺伝子）を発現し、発現量はヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較してほぼ同程度（1/8から8倍）であることが明らかとなった。【０３７６】
【表７４】
0005920725.tif 000113
【０３７７】
0005920725.tif 000114
【０３７８】
【表７５】
0005920725.tif 000115
【０３７９】
更に、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞NGC1-1とヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）を比較して、ほぼ同程度（1/2から2倍）発現している自己複製関連遺伝子のプローブをプロットしたグラフを（図7）、本発明のヒト誘導内胚葉系悪性幹細胞CC1-10とヒト胚性幹細胞hES_BG03（GSM194391）を比較して、ほぼ同程度（1/4から4倍）発現している自己複製関連遺伝子のプローブをプロットした図（図8）を示す。【０３８０】
従って、誘導悪性幹細胞は1）〜31）の遺伝子の何れか一つに加えて自己複製関連遺伝子（POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子、TERT遺伝子）を発現し、発現量はヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較してほぼ同程度（1/2から2倍）であることが明らかとなった。また、誘導悪性幹細胞は1）〜31）の遺伝子の何れか一つに加えて自己複製関連遺伝子（POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子、TERT遺伝子）を発現し、発現量はヒト胚性幹細胞hES_H9（GSM194390）と比較してほぼ同程度（1/4から4倍）であることが明らかとなった。【０３８１】
以上の結果より、ヒト誘導悪性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞等に比較して、がんの性質である悪性のマーカー遺伝子（がん関連遺伝子）が発現上昇しているだけでなく、胚性幹細胞に特徴的な自己複製関連遺伝子（POU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子、TERT遺伝子）が、ヒト胚性幹細胞と同程度に発現していることが実験的に検証された。【０３８２】
実施例6.バンド分染法とモード分析によるヒト誘導悪性幹細胞の核型の検査
実施例3の誘導悪性幹細胞（NGC1-1）について、Gバンド分染法によって20細胞/株、モード分析により50細胞/株について、核型、染色体の本数を検査した。その結果、これら誘導悪性幹細胞は全て46XYの核型であり、正常であった。誘導悪性幹細胞（NGC1-1：遺伝子導入後日数76）は、MEFの上でmTeSR1などを用いて培養した細胞を解析した。誘導悪性幹細胞は核型が正常な細胞であった。【０３８３】
実施例7.マルチカラーFISHによるヒト誘導悪性幹細胞の染色体検査
実施例3の誘導悪性幹細胞（NGC1-1）について、マルチカラーFISHによって10細胞/株について、染色体の欠失、転座を検査した。その結果、これら誘導悪性幹細胞は全て染色体が正常であった（異常が検出されなかった）。誘導悪性幹細胞（NGC1-1：遺伝子導入後日数76）は、MEFの上でmTeSR1を用いて培養した細胞を解析した。誘導悪性幹細胞は染色体異常（染色体の転座、欠失）がない細胞であった。【０３８４】
本発明の誘導悪性幹細胞（NGC1-1）の自己複製を長期（少なくとも数カ月から1年以上）にわたって維持できることが確認された。【０３８５】
実施例8.ヒト誘導悪性幹細胞培養上清中の腫瘍マーカー
誘導悪性幹細胞（NGC1-1）の培養上清を臨床検査会社SRLに解析依頼した結果、誘導悪性幹細胞はTGFβ1、AFP、プロコラ−ゲンIIIペプチド（P-III-P）、IV型コラーゲン、アポリポタンパクC-II、プレアルブミン（TTR）、IGF-Iタンパク質を産生していることが判明した。この結果から、誘導悪性幹細胞は、腫瘍マーカーを産生する細胞であることが判明した。【０３８６】
実施例9.ヒト誘導悪性幹細胞の実験動物での腫瘍形成（担がんモデルの作製）
実施例3の誘導悪性幹細胞（NGC1-1）をマウスに移植して、悪性細胞から誘導されたがん細胞の組織像の観察と担がんモデルの作製のため以下の実験を行った。【０３８７】
マウス誘導悪性幹細胞（NGC1-1）を免疫不全動物であるNOD/SCIDマウスに、各々、1匹当たり5×106細胞/100μlで200μlのマトリゲルと共にマウス背部皮下に移植した。また、5×106細胞/500μlでマウス腹腔に移植した。その結果、2〜3ヶ月後に各々誘導悪性幹細胞（NGC1-1）を移植した担がんマウスに腫瘍が形成された。正常な多能性幹細胞から形成される通常のテラトーマ（良性腫瘍）とは異なり誘導悪性幹細胞（NGC1-1）から形成された腫瘍は上皮-間葉転換を起こし、間質バリアを形成した組織であった。従って、誘導悪性幹細胞（NGC1-1）は間質バリアを形成するものもあることが判明した。【０３８８】
マウスを安楽死させた後、悪性腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン切片を作製し、ヘマトキシン・エオジン染色を行い顕微鏡下で観察した。腸管様組織と共に細胞外マトリックスと間質細胞が豊富な間質バリアを形成したがん組織が観察された。従って、移植した細胞が上皮間葉転換を起こすヒト誘導悪性幹細胞であると確認された。【０３８９】
実施例10.ヒト誘導悪性幹細胞の1細胞/ウェルのシングルソート（未染色）
実施例3の誘導悪性幹細胞（GC1-2、NGC1-1）を古河電気工業製のPERFLOWTM Sortにより、1細胞/ウェルで96ウェルプレートにシングルソーテイングした。その結果、モノクローナルな誘導悪性幹細胞（GC1-2-1、GC1-2-2、GC1-2-3、GC1-2-4、NGC1-1-1、NGC1-1-2、NGC1-1-3、NGC1-1-4）が樹立された。【０３９０】
実施例11.ヒト誘導悪性幹細胞の1細胞/ウェルのシングルソート（特異抗体による染色）
CD34（Alexa fluor 488-conjugatedマウスモノクローナル抗体 anti-human CD34；Biolegend社製；clone:581；mouseIgG1））、VEGFR2（Alexa fluor 647-conjugatedマウスモノクローナル抗体 anti-human CD309；Biolegend社製；clone:HKDR-1；mouseIgG1））、PDGFRα（PE-conjugated anti-human CD140a；Biolegend社製；clone:16A1；mouseIgG1）、DLK-1（マウスモノクローナル抗体 anti-human Pref-1/DLK-1/FA1；R＆D社製；clone#:MAB1144；mouseIgG2B）、CXCR4（Carboxyfluorescein（CFS）-conjugatedマウスモノクローナル抗体 anti-human CXCR4；R＆D社製；clone#:12G5；mouseIgG2A）、E-カドヘリン（APC-conjugated anti-human CD324；Biolegend社製；clone:67A4；mouseIgG1）、IGF-R1（マウスモノクローナル抗体 anti-human IGF-IR；R＆D社製；clone#:MAB391；mouseIgG1）、FABP1（マウスモノクローナル抗体 anti-human FABP1；R＆D社製；clone#:MAB2964；mouseIgG2a）、ALB（マウスモノクローナル抗体 anti-human serum albumin；SIGMA社製；clone:HAS-11；mouseIgG2a）で染色し、実施例3の誘導悪性幹細胞（NGC1-1）を古河電気工業のPERFLOWTMSortにより、染色陽性率を計測した。陽性率が高い場合は、陽性画分を1細胞/ウェルで96ウェルプレートにシングルソーテイングした。【０３９１】
実施例12.家族性腫瘍患者のがん組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクターの調製
実施例1と同様に、POU5F1＞SOX2の関係になるようレトロウイルスベクター液を調整した。詳細は、以下の通りである
＜家族性大腸ポリポーシス（APC）患者皮膚組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、構築したベクターである（前記表33）。【０３９２】
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs（Cell Biolab製）  1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。【０３９３】
＜網膜細胞芽腫（RB）患者皮膚組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、構築したベクターである（前記表33）。【０３９４】
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs（Cell Biolab製）  1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。【０３９５】
＜網膜細胞芽腫RB患者がん組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、構築したベクターである（前記表33）。【０３９６】
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs（Cell Biolab製）  1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。【０３９７】
＜網膜細胞芽腫（RB）患者皮膚組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製＞
POU5F1-KLF4-SOX2-pMXs 8.4 kbは、pCX-OKS-2A（8478 bp）のEcoRI-EcoRIインサート部分（3700 bp）を切り出し、pMXs（5871 bp）のEcoRI-EcoRI部分（1122 bp）と組み換えて構築したベクターである。さらに、5'末端から3'末端方向へ順向きであること確認した。（下記表76）。【０３９８】
【表７６】
0005920725.tif 000116
【０３９９】
各ベクターの量は、POU5F1-KLF4-SOX2-pMXs 3μg、Venus-pCS2 0.5μg、VSV-G-pCMV 2μg、FuGENE HD 15μlとした。POU5F1-KLF4-SOX2-pMXs の使用はPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、SOX2遺伝子は、順に1:1:1の比率で使用したことになる。1:1:1の比率は、パッケージング細胞に遺伝子を導入する時でもよく、また、別々にPOU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を作製して、1:1:1の比率で混合してもよい。【０４００】
実施例13.APC患者皮膚組織由来の細胞からヒト誘導前がん幹細胞の作製
APC患者（APC3223、25才、男性、白人、541番目のグルタミン[541 Gln、Q:CAA or CAG]のC塩基がT塩基に置換して終止コドンになる）の皮膚組織（凍結した継代数:2）の体細胞から、内在性がん抑制遺伝子であるAPCの変異を有するヒト誘導内胚葉系前がん幹細胞を以下のように樹立した。凍結保存された家族性大腸腺腫症患者の、皮膚組織に由来する細胞のバイアル1本（米国NPO Coriell Institute for Medical Research；Cat no.GM03223）を、37℃の恒温槽中で解凍し、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地に懸濁し、10 mlの細胞懸濁液を得た。家族性大腸腺腫症（APC）患者の皮膚組織由来の細胞は、生殖系列（遺伝的）に片側アリルのAPCに変異（541 Gln→ter:C→T）をもつ、前がん細胞である。【０４０１】
次いで、得られた細胞懸濁液を、1000 rpm、4℃で5分間遠心分離し、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地20 mlに懸濁して、細胞懸濁液を得た。20μg/cm2の濃度のマトリゲルで、底面を30分以上コーティングされた直径90ミリ細胞培養ペトリディッシュ（ヌンク社製；Cat no.172958）上に、得られた細胞懸濁液を10 ml/デッシュずつ加えて細胞を播種した。【０４０２】
1日後に培地を除き、10 mlの3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、37℃で24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、MEF馴化ES培地を10 ml加え、37℃で一日培養した。その後2日毎にMEF馴化ES培地の交換を続けた。【０４０３】
遺伝子導入から18日後から、フィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で、毎日培地交換を行った。遺伝子導入から28日後から32日後までMEF馴化ES培地で、毎日培地交換を行った。遺伝子導入から33日後から、フィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で、毎日新しい培地に交換した。遺伝子導入から36日後にコロニーを1クローン（1-1）、48日後にヒト誘導内胚葉系前がん幹細胞のコロニーを、3クローン（1-2、1-3、1-4）ピンセットでピックアップし、フィーダー細胞上に移した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に、5.0×104 cell/cm2でゼラチンコート24ウェルプレート（イワキ社製；Cat no.11-020-012）に播種した。【０４０４】
下記にそれぞれのクローンの継代（p）とRNA回収用キットのバッファー（Buffer RLT）へ溶解した日（day）を示した。【０４０５】
＜APC患者由来の皮膚組織由来のヒト誘導内胚葉系前がん幹細胞＞
APC（3223）1-1
遺伝子導入後日数54:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数60:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数67:  継代（第4継代）と保存
遺伝子導入後日数72:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞の溶解液）処理と保存（第5継代）。【０４０６】
APC（3223）1-2
遺伝子導入後日数59:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数75:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数79:  保存。【０４０７】
APC（3223）1-3
遺伝子導入後日数59:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数75:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数79:  保存。【０４０８】
APC（3223）1-4
遺伝子導入後日数59:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数75:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数79:  保存。【０４０９】
以上の様に、内在性がん抑制遺伝子に変異を有するヒト誘導前がん幹細胞を作製した。これらのクローンは内在性がん抑制遺伝子（APC）の片側アリルに生殖系列変異を有するヒト誘導内胚葉系前がん幹細胞であった。【０４１０】
実施例14.APC患者皮膚組織由来の細胞からヒト誘導前がん幹細胞の作製
APC患者（APC3946、22才、女性、白人、541番目のグルタミン[541 Gln、Q:CAA or CAG]のC塩基がT塩基に置換して終止コドンになる。前述のAPC3223とは兄弟関係である。）の皮膚組織（凍結した継代数:2）から、ヒト誘導内胚葉系前がん幹細胞を以下のように樹立した。凍結保存された家族性大腸腺腫症患者の皮膚組織由来の細胞のバイアル1本（CORIELL；Cat no.GM03946）を、37℃の恒温槽中で解凍し、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地に懸濁し、10 mlの細胞懸濁液を得た。【０４１１】
次いで、得られた細胞懸濁液を、1000 rpm、4℃で5分間遠心分離し、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地20 mlに懸濁して、細胞懸濁液を得た。20μg/cm2の濃度のマトリゲルで、底面を30分以上コーティングされた90ミリ細胞培養ペトリディッシュ上に、得られた細胞懸濁液を10 ml/デッシュずつ加えて細胞を播種した。【０４１２】
1日後に培地を除き、10 mlの3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、37℃で24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、MEF馴化ES培地を10 ml加え、37℃で一日培養した。その後2日毎にMEF馴化ES培地の交換を続けた。【０４１３】
遺伝子導入から18日後から、フィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で、毎日培地交換を行った。遺伝子導入から28日後から32日後までMEF馴化ES培地で、毎日培地交換を行った。遺伝子導入から33日後から、フィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で、毎日培地交換を行った。遺伝子導入から36日後にコロニーを1クローン（1-1）、40日後にコロニーを1クローン（1-2）ピンセットでピックアップし、フィーダー細胞上に移してmTeSR1で培養した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に、5.0×104 cell/cm2でゼラチンコート24ウェルプレート（イワキ社製；Cat no.11-020-012）に播種した。【０４１４】
下記にそれぞれのクローンの継代（p）とRNA回収用キットのバッファー（Buffer）へ溶解した日（day）を示した。【０４１５】
以上の様に、内在性がん抑制遺伝子に変異を有するヒト誘導前がん幹細胞を作製した。これらのクローンは内在性がん抑制遺伝子（APC）の片側アリルに生殖系列変異を有するヒト誘導内胚葉系前がん幹細胞であった。【０４１６】
＜APC患者の皮膚組織由来のヒト誘導内胚葉系前がん幹細胞＞
APC（3946）1-1
遺伝子導入後日数54:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数61:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数72:  継代（第4継代）と保存
遺伝子導入後日数77:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞の溶解液）処理と保存（第5継代）。【０４１７】
APC（3946）1-2
遺伝子導入後日数59:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数61:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数72:  継代（第4継代）と保存
遺伝子導入後日数77:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞の溶解液）処理と保存（第5継代）。【０４１８】
以上の様に、内在性がん抑制遺伝子に変異を有するヒト誘導前がん幹細胞を作製した。これらのクローンは内在性がん抑制遺伝子（APC）の片側アリルに生殖系列変異を有するヒト誘導内胚葉系前がん幹細胞であった。【０４１９】
実施例15.RB患者皮膚組織由来の細胞からヒト誘導前がん幹細胞の作製
RB患者（1才、男性、日本人、RB1の706番目のコドン[706:TGT]のG塩基がA塩基に置換している）の皮膚組織（継代数3）から、内在性がん抑制遺伝子の変異を有するヒト誘導前がん幹細胞を以下のように樹立した。凍結保存された網膜芽腫患者の皮膚組織由来の細胞1本（医薬基盤研究所；資源番号:KURB2358ロット番号:080786）を、37℃の恒温槽中で解凍し、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地に懸濁し、10 mlの細胞懸濁液を得た。【０４２０】
次いで、得られた細胞懸濁液を、1000 rpm、4℃で5分間遠心分離し、上清を除去した後、FGM-2 BulletKit 20 mlに懸濁して、細胞懸濁液を得た。20μg/cm2の濃度のマトリゲルで、底面を30分以上コーティングされた90ミリ細胞培養ペトリディッシュ上に、得られた細胞懸濁液を10 ml/デッシュずつ加えて細胞を播種した。【０４２１】
1日後に培地を除き、PBS（-）で洗浄した後、0.25％トリプシン-1 mM EDTA溶液（インビトロジェン社製、Cat no.25200-056）を加えて37℃5分間静置したのち、0.25％トリプシン-1 mM EDTA溶液を除き、次いで、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBS（インビトロジェン社製、Cat no.26140-079）を10％含むD-MEM（高グルコース）培地を20 ml加えて1000 rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去した後、FGM-2 BulletKit 80 mlに懸濁して、細胞懸濁液を得た。20μg/cm2の濃度のマトリゲルで、底面を30分以上コーティングされた90ミリ細胞培養ペトリディッシュ上に、得られた細胞懸濁液を10 ml/デッシュずつ加えて細胞を播種した。【０４２２】
1日後に培地を除き、10 mlの3遺伝子レトロウイルスベクター液を添加し、37℃で24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、MEF馴化ES培地を10 ml加え、37℃で一日培養した。その後2日毎にMEF馴化ES培地の交換を続けた。【０４２３】
遺伝子導入から16日後から、フィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で、毎日培地交換を行った。遺伝子導入から26日後にコロニーを4クローン（1-4、1-7、1-8、1-9）、33日後にコロニーを3クローン（1-2、1-5、1-6）ピンセットでピックアップし、フィーダー細胞上に移した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に、5.0×104 cell/cm2でゼラチンコート24ウェルプレート（イワキ社製；Cat no.11-020-012）に播種した。【０４２４】
下記にそれぞれのクローンの継代（p）とRNA回収用キットのバッファー（Buffer）へ溶解した日（day）を示した。【０４２５】
＜RB患者の皮膚組織由来ヒト誘導前がん幹細胞＞
RB（203）1-2
遺伝子導入後日数49:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数77:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数82:  保存。【０４２６】
RB（203）1-4
遺伝子導入後日数49:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数77:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数82:  保存。【０４２７】
RB203（1-5）
遺伝子導入後日数53:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数60:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数66:  継代（第4継代）と保存
遺伝子導入後日数69:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞の溶解液）処理と保存。【０４２８】
RB203（1-6）
遺伝子導入後日数53:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数59:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数63:  継代（第4継代）と保存
遺伝子導入後日数66:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞の溶解液）処理と保存。【０４２９】
RB203（1-7）
遺伝子導入後日数56:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数77:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数82:  保存。【０４３０】
RB203（1-8）
遺伝子導入後日数56:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数77:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数82:保存。【０４３１】
RB203（1-9）
遺伝子導入後日数56:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数59:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数82:  保存。【０４３２】
以上の様に、内在性がん抑制遺伝子に変異を有するヒト誘導前がん幹細胞を作製した。これらのクローンは内在性がん抑制遺伝子（RB1）の片側アリルに生殖系列変異を有するヒト誘導前がん幹細胞であった。【０４３３】
実施例16.RB患者がん組織由来の細胞からヒト誘導悪性幹細胞の作製
家族性腫瘍患者であるRB患者（1歳、男性、日本人、RB1遺伝子の706番目のコドン（706:TGT）のG塩基がA塩基に置換している）のがん組織（網膜芽細胞腫）から、内在性がん抑制遺伝子の変異を有するヒト誘導悪性幹細胞を以下のように樹立した。凍結保存された網膜芽腫患者の網膜芽細胞腫の凍結バイアル1本（医薬基盤研究所；資源番号:KURB2359ロット番号:091285）を、37℃の恒温槽中で解凍し、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地に懸濁し、10 mlの細胞懸濁液を得た。【０４３４】
次いで、得られた細胞懸濁液を、1000 rpm、4℃で5分間遠心分離し、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を40 ml加えて、1000 rpm、4℃で5分間、再度遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を20 ml加え、コラーゲンコートディッシュ100 mm（イワキ社製、Cat no.11-018-006）に播種した。【０４３５】
1日後に培地を除き、10 mlの3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、37℃で48時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったMEF（DSファーマバイオメディカル社製；Cat  no.R-PMEF-CF）5.0×104cell/cm2を1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地10 mlに懸濁後、RB患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞が培養されたコラーゲンコートディッシュ100 mmへ播種し、共培養した。【０４３６】
その後3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入から21日後から、フィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で毎日培地交換を行った。【０４３７】
遺伝子導入から21日後から、フィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で、毎日培地交換を行った。遺伝子導入から21日後にコロニーを5クローン（1-1、1-2、1-3、1-4、1-6）ピンセットでピックアップし、フィーダー細胞上に移した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat  no.R-PMEF-CF）であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に、5.0×104cell/cm2でゼラチンコート24ウェルプレート（イワキ社製；Cat  no.11-020-012）に播種した。【０４３８】
下記にそれぞれのクローンの継代（p）とRNA回収用キットのバッファー（Buffer）へ溶解した日（day）を示した。【０４３９】
＜RB患者のがん組織由来ヒト誘導悪性幹細胞＞
RBT203（1-1）
遺伝子導入後日数28:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数33:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数38:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞の溶解液）処理と保存。【０４４０】
RBT203（1-2）
遺伝子導入後日数32:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数56:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数61:  保存。【０４４１】
RBT203（1-3）
遺伝子導入後日数32:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数56:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数61:  保存。【０４４２】
RBT203（1-4）
遺伝子導入後日数32:  ウェルプレート（第1継代）→ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数39:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数45:  継代と保存
遺伝子導入後日数48:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞の溶解液）処理と保存。【０４４３】
RBT203（1-6）
遺伝子導入後日数32:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数39:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数45:  継代と保存
遺伝子導入後日数48:  バッファーRLT（RNA精製前の細胞の溶解液）処理と保存。【０４４４】
以上の様に、内在性がん抑制遺伝子に変異を有するヒト誘導悪性幹細胞を作製した。これらのクローンは内在性がん抑制遺伝子（RB1）の片側アリルに生殖系列変異を有するヒト誘導悪性幹細胞であった。【０４４５】
実施例17.RB患者皮膚組織由来の細胞からヒト誘導前がん幹細胞の作製
RB患者（2才、女性、日本人）の皮膚組織（継代数1）から、ヒト誘導前がん幹細胞を以下のように樹立した。凍結保存された網膜芽腫患者の皮膚組織由来の体細胞1本（医薬基盤研究所；資源番号:KURB2435ロット番号:080687）を、37℃の恒温槽中で解凍し、1×抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地に懸濁し、20 mlの細胞懸濁液を得た。【０４４６】
次いで、得られた細胞懸濁液を、1000 rpm、4℃で5分間遠心分離し、上清を除去した後、FGM-2 BulletKit 20 mlに懸濁して、細胞懸濁液を得た。20μg/cm2の濃度のマトリゲルで、底面を30分以上コーティングされた90ミリ細胞培養ペトリディッシュ上に、得られた細胞懸濁液を10 ml/デッシュずつ加えて細胞を播種した。【０４４７】
2日後に培地を除き、10 mlの3遺伝子レトロウイルスベクター液を添加し、37℃で24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、MEF馴化ES培地を10 ml加え、37℃で一日培養した。その後2日毎にMEF馴化ES培地の交換を続けた。【０４４８】
遺伝子導入から14日後にフィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で、培地交換を行った。遺伝子導入から18日後から再び2日毎にMEF馴化ES培地の交換を続けた。遺伝子導入から36日後にフィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で、培地交換を行った。遺伝子導入から38日後にMEF馴化ES培地の交換を行い、51日後からフィーダー細胞フリー用ヒトES/iPS細胞用培地mTeSR1で、毎日培地交換を行った。遺伝子導入から53日後にコロニーを2クローン（1-1、1-2）ピンセットでピックアップし、フィーダー細胞上に移した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）であり、誘導悪性幹細胞のピックアップ前日に、5.0×104 cell/cm2でゼラチンコート24ウェルプレート（イワキ社製；Cat no.11-020-012）に播種した。【０４４９】
下記にそれぞれのクローンの継代（p）とRNA回収用キットのバッファー（Buffer）へ溶解した日（day）を示した。【０４５０】
＜RB患者の皮膚組織由来ヒト誘導前がん幹細胞＞
RB（243）1-1
遺伝子導入後日数61:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数65:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数74:  保存。【０４５１】
RB（243）1-2
遺伝子導入後日数61:  24ウェルプレート（第1継代）→6ウェルプレート（第2継代）
遺伝子導入後日数65:  6ウェルプレート（第2継代）→10 cm培養皿（第3継代）
遺伝子導入後日数74:  保存。【０４５２】
以上の様に、内在性がん抑制遺伝子に変異を有するヒト誘導前がん幹細胞を作製した。これらのクローンは内在性がん抑制遺伝子（RB1）の片側アリルに生殖系列変異を有するヒト誘導前がん幹細胞であった。【０４５３】
実施例18.家族性腫瘍患者のがん組織由来の誘導悪性幹細胞のマイクロアレイによる定量解析
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）を用いて、ヒト誘導悪性幹細胞（RBT203（1-1））の解析を行った。解析ソフトは、GeneSpring GX 10.0を使用し、ノーマライゼーションは、50th percentileで行った。実験手法は実施例5と同様である。【０４５４】
＜トータルRNAとゲノムDNAの調製＞
実施例16のヒト誘導悪性幹細胞（RBT203（1-1））のトータルRNAとゲノムDNAを、事前にバッファーRLT（RNA精製前の細胞溶解液）で処理した溶液から、AllPrep DNA/RNA Mini Kit（50）（キアゲン社製；Cat no.80204）を用いて抽出した。【０４５５】
（1）ゲノムDNAのクオリティーチェック
NanoDrop ND-1000（NanoDrop Technologies）で、DNA濃度及びDNAの純度の評価を行ったところ、何れのサンプルにおいても十分な濃度があり、純度も高いことが確認された。【０４５６】
（2）トータルRNAのクオリティーチェック
RNA用LabChip（アジレント社製の登録商標）キットを用いて、Agilent 2100 Bioanalyzer（アジレント社製）でtotal RNAの品質のチェックを行ったところ、全てのRNAサンプルのクオリティーは良好であった。また、NanoDrop ND-1000（NanoDrop Technologies）で、RNA濃度及びRNAの純度の評価を行ったところ、何れのサンプルにおいてもcRNA合成に必要なtotal RNA量があることが確認され、純度も高いことが確認された。【０４５７】
（1）血管新生関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された血管新生関連遺伝子のプローブの内、本発明のヒト誘導悪性幹細胞RBT203（1-1）がヒト胚性幹細胞hES_ES01（GSM194392）と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表77〔hES_ES01 vs RBT203（1-1）〕に記載した。更に、2倍以上発現上昇している血管新生関連遺伝子のプローブをプロットした図を示す（図9）。以上から、ヒト誘導悪性幹細胞は血管新生関連遺伝子を2倍以上発現上昇している細胞であることが明らかになった。【０４５８】
【表７７】
0005920725.tif 000117
【０４５９】
0005920725.tif 000118
【０４６０】
（2）シグナル伝達関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載されたシグナル伝達関連遺伝子のプローブの内、ヒト誘導悪性幹細胞RBT203（1-1）がヒト誘導多能性幹細胞hiPS-201B7と比較して2倍以上発現上昇している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表78〔hiPS-201B7 vs RBT203-1-1〕に記載した。更に、2倍以上発現上昇しているシグナル伝達関連遺伝子のプローブをプロットした図を示す（図10）。以上から、ヒト誘導悪性幹細胞はシグナル伝達関連遺伝子を2倍以上発現上昇している細胞であることが明らかになった。【０４６１】
【表７８】
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【０４６２】
（3）自己複製関連遺伝子
アジレント社製Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）に搭載された自己複製関連遺伝子のプローブの内、ヒト誘導悪性幹細胞RBT203（1-1）がヒト胚性幹細胞hES_ES01（GSM194392）と比較してほぼ同程度（1/2から2倍）発現している遺伝子の遺伝子シンボル、GenBankアクセッションナンバー及びプローブを、下記表79〔hES_ES01=RBT203-1-1〕に記載した。更に、ほぼ同程度（1/2から2倍）発現している自己複製関連遺伝子のプローブをプロットしたグラフを（図11）示す。【０４６３】
以上から、ヒト誘導悪性幹細胞はPOU5F1遺伝子、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子の6遺伝子（自己複製関連遺伝子）を発現する細胞であることが明らかになった。【０４６４】
【表７９】
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【０４６５】
以上の結果より、家族性腫瘍患者である網膜芽細胞種（RB）患者のがん組織由来のヒト誘導悪性幹細胞は、がん関連遺伝子が発現上昇しているだけでなく、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子がヒト胚性幹細胞とほぼ同等に発現していることが実験的に検証された。
【産業上の利用可能性】
【０４６６】
本発明の誘導がん幹細胞は、原料体細胞が有する（a）がん抑制遺伝子の変異、または（b）がん関連遺伝子の発現上昇等の異常をそのまま維持（残存）しており、また無限に自己複製可能である。従って本発明の誘導がん幹細胞は実質的に長期継代培養可能であり、組織細胞の性質を有するがん細胞へ誘導しやすいため、がん創薬における標的のスクリーニング方法、がん治療薬のスクリーニング方法及びがん診断薬のスクリーニング方法などのスクリーニング方法や、がんワクチンの作製方法、がんモデル動物の作製等、がん治療研究及びがん関連創薬の研究に非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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