(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（ＩＡ）：
【化１】
0005946288.tif 000035
［式中、Ｒは分岐鎖若しくは環状のアルキル基、又はアリール基；ｎは６以上の整数である。］
、又は一般式（ＩＢ）：
【化２】
0005946288.tif 000036
［式中、Ｒはメチル基又はエチル基；ｎは６〜１０の整数である。］
で示される化合物、又はその塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグ（プロドラッグは、末端のカルボキシル基を一般式（ａ）：
−ＣＯＯＲ１
［式中、Ｒ１は炭素数１〜６のアルキル基である。］
で示される構造の基とした化合物、又はヒドロキサム酸の水酸基（窒素に結合した水酸基）を一般式（ｂ）：
−ＯＲ２
［式中、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基である。］
で示される構造の基とした化合物である）。
【請求項２】
一般式（Ｉ）：
【化３】
0005946288.tif 000037
［式中、Ｒは直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基、又はアリール基；ｎは６以上の整数である。］
で示される化合物、又はその塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグ（プロドラッグは、末端のカルボキシル基を一般式（ａ）：
−ＣＯＯＲ１
［式中、Ｒ１は炭素数１〜６のアルキル基である。］
で示される構造の基とした化合物、又はヒドロキサム酸の水酸基（窒素に結合した水酸基）を一般式（ｂ）：
−ＯＲ２
［式中、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基である。］
で示される構造の基とした化合物である）を含有する医薬。
【請求項３】
抗癌剤である、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
一般式（Ｉ）：
【化４】
0005946288.tif 000038
［式中、Ｒは直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基、又はアリール基；ｎは６以上の整数である。］
で示される化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物を含有するＫＤＭ７阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストン脱メチル化酵素であるＫＤＭ７の阻害活性及び抗癌作用を有する新規ヒドロキサム酸誘導体、及び該誘導体を用いた医薬（特にＫＤＭ７阻害剤及び抗癌剤）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒストンは、真核生物においてＤＮＡを折りたたんでクロマチン構造を形成するタンパク質であり、様々な酵素の働きによって化学修飾されている。これにより、クロマチン構造が変化し、遺伝子の発現が制御されると考えられている。近年、こうしたエピジェネティックな遺伝子制御に関する様々な知見が発見されている。
【０００３】
これらのなかでも、ヒストンリシン残基のメチル化は、エピジェネティックな遺伝子発現制御において中心的な役割を果たしている。ここで、メチル化されたヒストンリシン残基については、トリメチル化体、ジメチル化体及びモノメチル化体の３種のメチル化体が存在しており、クロマチン構造及び転写に関しては、それぞれのメチル化体が異なった影響を与えることが示唆されている。
【０００４】
ここで、ヒストンリシン残基のメチル化反応は、ヒストンメチル化酵素が担っている。従来、このヒストンのメチル化修飾は不可逆的な反応であると考えられていた。ところが最近、フランビン依存性ヒストン脱メチル化酵素、α−ケトグルタル酸依存性ヒストン脱メチル化酵素（ＪＨＤＭ）等が発見され、反応式（Ａ）：
【０００５】
【化１】
0005946288.tif 000002
【０００６】
で示されるように、ヒストンリシン残基のメチル化及び脱メチル化は、メチル化酵素及び脱メチル化酵素による酵素的可逆反応により制御されていることが明らかとなった（非特許文献１）。
【０００７】
α−ケトグルタル酸依存性ヒストン脱メチル化酵素（ＪＨＤＭ）の生物学的機能の詳細については未だ明らかとなっておらず、特に、ＪＨＤＭの一種であるＫＤＭ７（ＫＤＭ７ａ、及び、ＫＤＭ７ｂ（ＰＨＦ８とも言う））の詳細についてはほとんど明らかになっていない。しかしながら、siRNAによるＫＤＭ７の欠損は、骨肉種細胞の増殖を抑制することが明らかになった（非特許文献２）。また、前立腺癌細胞においてＫＤＭ７をノックダウンさせると、細胞増殖阻害がみられることも報告された（非特許文献３）。これらのことから、ＫＤＭ７阻害剤（特にＫＤＭ７選択的阻害剤）は、その酵素の働きを調べるバイオプローブとして有効であるのみならず、新たな作用機序の抗癌剤等の治療薬としても期待できるため、活発に研究が進められている。
【０００８】
現在知られているＪＨＤＭ阻害剤としては、
Ｎ−オキサリルグリシン（ＮＯＧ）：
【０００９】
【化２】
0005946288.tif 000003
【００１０】
２，４−ピリジンジカルボン酸（ＰＣＡ）：
【００１１】
【化３】
0005946288.tif 000004
【００１２】
等が知られている（非特許文献４及び５）。
【００１３】
しかしながら、これらの化合物は、ＪＨＤＭ阻害剤として知られているものの、ＫＤＭ７阻害活性は低く、選択性にも乏しかった。
【００１４】
一方、ＪＨＤＭ阻害剤としては、本発明者らが発見したヒドロキサム酸誘導体（ＮＣＤＭ−３２）：
【００１５】
【化４】
0005946288.tif 000005
【００１６】
等も知られている。
【００１７】
以上のように、現在知られているＪＨＤＭ阻害剤は、ＫＤＭ７阻害活性を十分有するとは言えず、また、選択性にも乏しい。そのため、バイオプローブとして使用することが困難であり、また、新たな作用機序の抗癌剤として使用するにも副作用のおそれが懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２０１１−１６８５８１号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Shi, Y. Nat. Rev. Genet. 2007, 8, 829.
【非特許文献２】Weijun Feng et al, Nat. Struct. Mol. Biol. 2010, 17, 445.
【非特許文献３】Bjorkman, M. et al, Oncogene 2011, 1.
【非特許文献４】Cloos, P. A. et al, Nature 2006, 442, 307.
【非特許文献５】Rose, N. R. et al, J. Med. Chem. 2008, 51, 7053.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
以上のように、ＫＤＭ７阻害活性を十分に有する化合物は、現在まで知られていない。また、抗癌剤として使用するためには、ＫＤＭ７阻害活性を有するとともに、癌細胞の細胞膜を通過できるような化合物であることが要請される。
【００２１】
そのため、本発明は、ヒストン脱メチル化酵素であるＫＤＭ７の阻害活性及び癌細胞増殖抑制作用を有する新規ヒドロキサム酸誘導体、及び該誘導体を用いた医薬（特にＫＤＭ７阻害剤及び抗癌剤）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の構造を有する新規ヒドロキサム酸誘導体（下記一般式（Ｉ）で示される化合物、又はその塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグ）が、ＫＤＭ７を阻害する（特に選択的に阻害する）こと、この新規ヒドロキサム酸誘導体は、癌細胞の増殖を阻害することを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、さらに研究を重ね、本発明を完成させた。
【００２３】
即ち、本発明は以下に示す新規ヒドロキサム酸誘導体、並びにそれを用いたＫＤＭ７阻害剤及び医薬を包含する。
【００２４】
項１．一般式（Ｉ）：
【００２５】
【化５】
0005946288.tif 000006
【００２６】
［式中、Ｒは直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基、又はアリール基；ｎは６以上の整数である。］
で示される化合物、又はその塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【００２７】
項１−１．ＫＤＭ７が関与する疾患（特に癌）の予防又は治療用である項１に記載の化合物、又はその塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【００２８】
項２．項１又は１−１に記載の化合物、又はその塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグを含有する医薬。
【００２９】
項２−１．ＫＤＭ７が関与する疾患（特に癌）の予防又は治療剤である、項２に記載の医薬。
【００３０】
項３．抗癌剤である、項２に記載の医薬。
【００３１】
項４．項１又は１−１に記載の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物を含有するＫＤＭ７阻害剤。
【００３２】
項５．項１又は１−１に記載の化合物、又はその塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグを含有する生物試験用試薬。
【００３３】
項６．項１又は１−１に記載の化合物、又はその塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグの有効量を摂取又は投与する、ＫＤＭ７が関与する疾患（特に癌）の予防又は治療方法。
【００３４】
項７．医薬（特にＫＤＭ７が関与する疾患（癌等）の予防又は治療剤）を製造するための項１又は１−１に記載の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物の使用。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の新規ヒドロキサム酸誘導体（上記一般式（Ｉ）で示される化合物、又はその塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグ）は、ＫＤＭ７を阻害（特に選択的に阻害）する作用を有している。このため、ＫＤＭ７の阻害作用（特に選択的阻害作用）に基づくバイオプローブ、医薬（特に抗癌剤）等として有用である。実際、本発明の新規ヒドロキサム酸誘導体は、癌細胞の細胞膜を通過し、増殖を抑制する作用を有している。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】試験例３における、ウェスタンブロッティングによるKDM7の阻害活性評価の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
１．新規化合物（ヒドロキサム酸誘導体）
本発明の化合物は、一般式（Ｉ）：
【００３８】
【化６】
0005946288.tif 000007
【００３９】
［式中、Ｒは直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基、又はアリール基；ｎは６以上の整数である。］
で示される化合物である。
【００４０】
一般式（Ｉ）において、Ｒは直鎖、分岐鎖若しくは環状のアルキル基、又はアリール基である。
【００４１】
Ｒにおける直鎖アルキル基とは、炭素数１〜６（好ましくは１〜４）程度の直鎖アルキル基が好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられる。Ｒが直鎖アルキル基である場合には、後述のＣｎＨ２ｎと合計で、炭素数９〜２６程度のアルキル基を構成することが好ましい。
【００４２】
Ｒにおける分岐鎖アルキル基とは、炭素数３〜６（好ましくは３〜５）程度の分岐鎖アルキル基が好ましい。具体的には、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ネオペンチル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等が挙げられる。
【００４３】
Ｒにおける環状アルキル基とは、炭素数３〜１０（好ましくは３〜７）程度の環状アルキル基が好ましい。具体的には、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
【００４４】
Ｒにおけるアリール基とは、炭素数６〜１４（好ましくは６〜１０）程度のアリール基が好ましい。具体的には、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００４５】
Ｒとしては、上記のうち、ＫＤＭ７阻害活性の観点からは、メチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が好ましく、シクロプロピル基、シクロヘプチル基等が特に好ましい。
【００４６】
また、Ｒとしては、上記のうち、癌細胞（ＫＹＳＥ１５０細胞、Ｈｅｌａ細胞等）増殖抑制活性の観点からは、分岐鎖アルキル基又は環状アルキル基が好ましく、特にイソプロピル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等がより好ましく、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が特に好ましい。
【００４７】
一般式（Ｉ）において、ｎは６以上の整数である。ｎを６以上の整数とすれば、十分なＫＤＭ７阻害活性を有するが、癌細胞増殖抑制活性を考慮すると、好ましくは７以上の整数である。このように、本発明の化合物において、アルキレン鎖を長くすることにより、ＫＤＭ７阻害活性をより向上させるとともに、癌細胞増殖抑制作用を向上させることもできる。なお、ｎの上限値は特に制限されるわけではないが、通常２０程度、好ましくは１０程度である。
【００４８】
上記のなかでも、本発明の化合物としては、ＫＤＭ７阻害活性の観点からは、
一般式（Ｉ−１）：
【００４９】
【化７】
0005946288.tif 000008
【００５０】
［式中、Ｒ’はメチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、シクロヘキシル基又はシクロヘプチル基（特にシクロプロピル基又はシクロヘプチル基）；ｎは６以上の整数（特に６〜１０の整数）である。］
で示される化合物が好ましい。
【００５１】
上記のなかでも、本発明の化合物としては、癌細胞増殖抑制活性の観点からは、
一般式（Ｉ−２）：
【００５２】
【化８】
0005946288.tif 000009
【００５３】
［式中、Ｒ”は分岐鎖アルキル基又は環状アルキル基（なかでもイソプロピル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基又はシクロヘプチル基（特にシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基又はシクロヘプチル基））；ｎは７以上の整数（特に７〜１０の整数）である。］
で示される化合物が好ましい。
【００５４】
特に、後述の実施例１〜１２で示す化合物が好ましい。
【００５５】
本発明の化合物は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、その水和物、その溶媒和物、そのプロドラッグ、光学異性体等のいずれをも包含する。また、本発明の化合物では、様々な結晶多形を取り得る。
【００５６】
塩としては、塩基付加塩が好ましく採用できる。
【００５７】
具体的には、本発明の化合物における酸性基である末端カルボキシル基に対して、薬学的に許容可能な塩基性化合物と塩を形成することができる。このような塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、メグルミン塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩等の有機塩基塩等が挙げられる。
【００５８】
プロドラッグとは、化合物末端の基を別の基に置換することで生体内に吸収されやすくした化合物を言う。このプロドラッグは、生体内に吸収された後に加水分解されることで本発明の化合物を再生し、本発明の効果を奏する。
【００５９】
このようなプロドラッグとしては、例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物において、末端のカルボキシル基のエステル化物、つまり末端のカルボキシル基を一般式（ａ）：
−ＣＯＯＲ１
［式中、Ｒ１は炭素数１〜６のアルキル基（メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等）である。］
で示される構造の基とした化合物等が挙げられる。
【００６０】
また、一般式（Ｉ）で示される化合物において、ヒドロキサム酸の水酸基（窒素に結合した水酸基）のエステル化物、つまりヒドロキサム酸の水酸基を一般式（ｂ）：
−ＯＲ２
［式中、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基（メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等）である。］
で示される構造の基とした化合物等が挙げられる。
【００６１】
２．製造方法
一般式（Ｉ）で示される本発明の化合物は、例えば、以下の反応式（Ｂ）： 
【００６２】
【化９】
0005946288.tif 000010
【００６３】
［式中、Ｒ及びｎは前記に同じ；Ｒ３及びＲ４は同じか又は異なり、Ｒ３はカルボキシル基の保護基であり、Ｒ４はヒドロキサム酸の水酸基の保護基；Ｘ１はハロゲン原子；Ｍ１は金属原子］
により製造することができる。
【００６４】
前記反応式（Ｂ）において、Ｒ３はカルボキシル基の保護基であり、Ｒ４はヒドロキサム酸の水酸基の保護基である。これら保護基は、同じでもよいし、異なっていてもよい。保護基としては、特に制限されるわけではないが、アルキル基（例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、３−メチルペンチル基等）、シリル基（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等）、アルコキシアルキル基（メトキシメチル基等）、ベンジル基、トリフェニルメチル基、テトラヒドロピラニル基等が挙げられる。
【００６５】
これら保護基は、一般式（６）で示される化合物を製造するまでの工程で脱保護されにくく、且つ、その後脱保護しやすい基が好ましい。具体的には、Ｒ３がアルキル基（特にメチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等）又はベンジル基等で、Ｒ４がベンジル基の組み合わせが好ましい。また、Ｒ３がｔｅｒｔ−ブチル基で、Ｒ４がベンジル基の組み合わせが特に好ましい。
【００６６】
前記反応式（Ｂ）において、Ｘ１はハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、好ましくは臭素原子である。
【００６７】
前記反応式（Ｂ）において、Ｍ１は金属原子、好ましくはアルカリ金属原子（リチウム原子、ナトリウム原子、カリウム原子等）、特にナトリウム原子である。
【００６８】
［工程１：化合物（１）⇒化合物（２）］
【００６９】
【化１０】
0005946288.tif 000011
【００７０】
［式中、Ｒ３〜Ｒ４は前記に同じである。］
この工程では、一般式（１）で示される化合物と、一般式（７）：
ＮＨ２ＯＲ４
［Ｒ４は前記に同じである］
で示される化合物とを反応させればよい。
【００７１】
この際、一般式（７）で示される化合物として、安定性のために塩酸塩等の酸性物質を使用する場合には、第三級アミン（トリエチルアミン等）、無機塩基（炭酸カリウム等）等の塩基性物質も併用することが好ましい。
【００７２】
この反応は、通常、反応溶媒の存在下で行われる。この反応溶媒としては、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル等の環状エーテル系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。これらは、１種のみを用いてよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのうち、本発明では、ジオキサン等が好ましい。
【００７３】
この工程においては、一般式（７）で示される化合物の添加量は、一般式（１）で示される化合物１モルに対して１〜５モル程度とするのが好ましい。
【００７４】
この反応は、還流下に１〜４８時間程度行うのが好ましい。また、反応雰囲気は、水を排した雰囲気とすることが好ましい。具体的には、不活性ガス雰囲気（窒素ガス雰囲気、アルゴンガス雰囲気等）が好ましい。
【００７５】
［工程２：化合物（３）⇒化合物（４）］
【００７６】
【化１１】
0005946288.tif 000012
【００７７】
［式中、Ｘ１、Ｍ１及びｎは前記に同じである。］
この工程では、一般式（３）で示される化合物のカルボキシル基の末端を金属に置換する。一般式（３）で示される化合物をそのまま後述の工程３に使用すると、工程３で一般式（５）で示される化合物が得られないからである。具体的には、一般式（３）で示される化合物と金属アルコキシド、特にアルカリ金属アルコキシド（ナトリウムエトキシド等）とを反応させることが好ましい。
【００７８】
この反応は、通常、反応溶媒の存在下で行われる。この反応溶媒としては、特に制限されないが、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール系溶媒等が好ましい。
【００７９】
この工程においては、金属アルコキシドの添加量は、一般式（３）で示される化合物１モルに対して１〜５モル程度とするのが好ましい。
【００８０】
反応温度は、特に制限されないが、０〜１００℃程度が好ましい。反応時間は特に制限されないが、１〜２４時間程度が好ましい。また、反応雰囲気は、特に制限されないが、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）、空気雰囲気等を採用できる。
【００８１】
［工程３：化合物（４）⇒化合物（５）］
【００８２】
【化１２】
0005946288.tif 000013
【００８３】
［式中、Ｒ、Ｘ１、Ｍ１及びｎは前記に同じである。］
この工程では、一般式（４）で示される化合物に、金属化合物を用いて、一般式（４）で示される化合物中のハロゲンを所望の基に置換するとともに金属を水素で置換する。
【００８４】
金属化合物としては、マグネシウム化合物と銅化合物の混合試薬が好ましい。
【００８５】
マグネシウム化合物としては、例えば、一般式（８）：
ＲＭｇＸ２
［式中、Ｒは前記に同じ；Ｘ２はハロゲン原子を示す。］
で表されるアルキルマグネシウム化合物が挙げられる。
【００８６】
Ｘ２は、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）であり、好ましくは臭素原子である。
【００８７】
上記のアルキルマグネシウム化合物は、通常、テトラヒドロフラン等の不活性溶媒中、アルキルハライドとマグネシウム金属（Ｍｇ）とを反応させて得られるグリニャール試薬を用いることができ、公知の方法を採用することができる。
【００８８】
また、銅化合物としては、Ｌｉ２ＣｕＣｌ４、ＣｕＣｌ、ＣｕＢｒ、ＣｕＩ等を使用できる。
【００８９】
この反応は、通常、反応溶媒の存在下で行われる。この反応溶媒としては、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、アセトニトリル、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性溶媒等が挙げられる。これらは、１種のみを用いてよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのうち、本発明では、テトラヒドロフラン等が好ましい。
【００９０】
この工程においては、金属化合物の添加量は、一般式（４）で示される化合物１モルに対して１〜５モル程度とするのが好ましい。マグネシウム化合物と銅化合物の混合試薬を使用する場合には、マグネシウム化合物と銅化合物の量をそれぞれ１〜５モル程度とするのが好ましい。
【００９１】
反応温度は、特に制限されないが、−５０〜５０℃程度が好ましい。反応時間は特に制限されないが、１〜２４時間程度が好ましい。また、反応雰囲気は、水を排した雰囲気とすることが好ましい。具体的には、不活性ガス雰囲気（窒素ガス雰囲気、アルゴンガス雰囲気等）が好ましい。
【００９２】
Ｒがともに直鎖アルキル基である一般式（５）で示される化合物については、市販品を使用することも可能である。
【００９３】
［工程４：化合物（２）＋化合物（５）⇒化合物（６）］
【００９４】
【化１３】
0005946288.tif 000014
【００９５】
［式中、Ｒ、Ｒ３、Ｒ４及びｎは前記に同じである。］
この工程では、一般式（２）で示される化合物と一般式（５）で示される化合物とを縮合反応させる。この際、公知の縮合剤として、カルボジイミド化合物、トリアゾール化合物等を共存させてもよい。
【００９６】
この反応は、通常、反応溶媒の存在下で行われる。この反応溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒等が挙げられる。これらは、１種のみを用いてよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのうち、本発明では、ジメチルホルムアミド等が好ましい。
【００９７】
この工程においては、一般式（５）で示される化合物の添加量は、一般式（２）で示される化合物１モルに対して１〜５モル程度とするのが好ましい。また、縮合剤の添加量は、一般式（２）で示される化合物１モルに対して１〜５モル程度とするのが好ましい。
【００９８】
反応温度は、特に制限されないが、０〜１００℃程度が好ましい。反応時間は特に制限されないが、１〜２４時間程度が好ましい。また、反応雰囲気は、特に制限されないが、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）、空気雰囲気等を採用できる。
【００９９】
［工程５：化合物（６）の脱保護］
以上のように一般式（６）で示される化合物を得た後、保護基であるＲ３及びＲ４を脱保護することにより、一般式（Ｉ）で示される本発明の化合物を得ることができる。また、Ｒ３及びＲ４の片方のみを脱保護した化合物を得た場合、脱保護していない保護基がアルキル基の場合には、得た化合物はプロドラッグとして使用し得る。
【０１００】
脱保護は、公知の方法を採用することができる。例えば、保護基がベンジル基の場合、水素／Ｐｄ−Ｃ、金属ナトリウム／アンモニア、ヨウ化トリメチルシラン、水素化リチウムアルミニウム、三臭化ホウ素、三フッ化ホウ素等と反応させるのが好ましい。また、保護基がｔｅｒｔ−ブチル基の場合、トリフルオロ酢酸、ジクロロメタン、塩酸等と反応させるのが好ましい。保護基がメチル基の場合、三フッ化ホウ素、ヨウ化トリメチルシラン、ピリジン塩酸塩等と反応させるのが好ましい。
【０１０１】
また、本発明の化合物を得た後、公知の方法により、塩、水和物、溶媒和物、プロドラッグ等を得ることができる。
【０１０２】
３．ＫＤＭ７阻害剤及び医薬
本発明は、本発明の化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物（ヒドロキサム酸誘導体）を含む医薬製剤（医薬組成物）をも提供する。かかる医薬製剤は、薬学的に許容される添加物、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の通常用いられる希釈剤又は賦形剤を使用して、本発明の化合物を一般的な医薬製剤に配合することにより得られる。
【０１０３】
本発明による医薬製剤の投与経路は限定されず、この製剤は、製剤の形態、患者の年齢及び性別、疾患の状態並びにその他の条件に応じた方法で投与することができる。例えば、錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤を経口で投与する。注射剤は静脈内、筋肉内、皮内、皮下若しくは腹腔内に投与する。坐剤は直腸内に投与する。
【０１０４】
本発明の医薬の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されないが、通常は、有効成分である一般式（Ｉ）で表される化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物（ヒドロキサム酸誘導体）の重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは一日あたり０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、非経口投与の場合には一日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回又は２〜３回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減してもよい。
【０１０５】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物（ヒドロキサム酸誘導体）は、従来の化合物では認識されていないＫＤＭ７（ＫＤＭ７ａ及びＫＤＭ７ｂ）を阻害する作用（特に選択的に阻害する作用）を有しているため、ＫＤＭ７（ＫＤＭ７ａ及びＫＤＭ７ｂ）の阻害作用（特に選択的阻害作用）に基づく医薬として有用である。特に、癌の予防及び／又は治療剤等として有用である。また、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物（ヒドロキサム酸誘導体）は、従来の化合物では認識されていないＫＤＭ７（ＫＤＭ７ａ及びＫＤＭ７ｂ）を阻害する作用（特に選択的に阻害する作用）を有しているため、その酵素の働きを調べるバイオプローブとしても有用である。
【実施例】
【０１０６】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１０７】
実施例１：３−（Ｎ−ヒドロキシ−１０−メチルウンデカンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−５３ａ）
【０１０８】
【化１４】
0005946288.tif 000015
【０１０９】
以下の経路にしたがい、目的化合物を得た。
【０１１０】
【化１５】
0005946288.tif 000016
【０１１１】
具体的には以下のとおりである。
【０１１２】
工程１：3-(ベンジルオキシアミノ)プロパン酸tertブチル（２ａ）
アクリル酸tertブチル（1a; 11.5 g）、O-ベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩（4.8 g）、トリエチルアミン（5 mL）を1,4-ジオキサン（50 mL）に溶解し、22時間加熱還流した。反応液に水（50 mL）を加え、酢酸エチル（200 mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（50 mL）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  n-ヘキサン：酢酸エチル＝8：1）で精製し、表題化合物（3.3 g, 収率44%）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.35 (5H, m), 5.83 (1H, broad s), 4.70 (2H, s), 3.17 (2H, m), 2.50 (2H, m), 1.44 (9H, s)。
【０１１３】
工程２：9-ブロモノナン酸ナトリウム塩（４ａ）
9-ブロモノナン酸（3a; 960 mg）をエタノール（10 mL）に溶解し、ナトリウムエトキシド（約20%エタノール溶液, 1.38 g）を加え、室温で1.5時間攪拌した。濃縮後、析出物をジエチルエーテルで洗浄し、70℃で減圧下乾燥し、表題化合物（991 mg, 収率94%）を得た。
1H NMR (CD3OD, 500 MHz, δ; ppm) 3.42 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.14 (2H, t, J= 7.6 Hz), 1.86-1.80 (2H, m), 1.59 (2H, m), 1.43 (2H, m), 1.33 (6H, m)。
【０１１４】
工程３：10-メチルウンデカン酸（５ａ）
前工程で得られた9-ブロモノナン酸ナトリウム塩（4a; 500 mg）を無水THF（3.0 mL）に懸濁させ、0.1Mテトラクロロ銅(II)ジリチウム溶液（200μL）を加え、-10℃で攪拌した。その後、0.75Mイソプロピルマグネシウムブロマイド溶液（3.9 mL）を滴下し、-10℃でさらに2時間攪拌した。水（20 mL）を加え、ジエチルエーテル（50 mL）で抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（30 mL）で洗浄した。水層に2N塩酸（50 mL）を加え酸性にした後、ジエチルエーテル（100 mL）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後減圧濃縮し、表題化合物（113 mg, 収率29%）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 9.70 (1H, broad s), 2.35 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.67-1.61 (2H, m), 1.51 (1H, sep, J= 6.4 Hz),1.32-1.12 (12H, m), 0.86 (6H, d, J = 6.4 Hz) 。
【０１１５】
工程４：3-(N-ベンジルオキシ-10-メチルウンデカンアミド)プロパン酸tertブチル（６ａ）
前工程で得られた10-メチルウンデカン酸（5a; 190 mg）および工程１で得られた3-(ベンジルオキシアミノ)プロパン酸tertブチル（2a; 239 mg）をジメチルホルムアミド（2.0 mL）に溶解し、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（274 mg）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（193 mg）を加え、80℃で17時間攪拌した。反応液に水（2.0 mL）を加え、酢酸エチル（30 mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（20 mL）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  クロロホルム：酢酸エチル＝5：1）で精製し、表題化合物（448 mg, 収率定量的（q.y.））を得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.38 (5H, m), 4.82 (2H, s), 3.91 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.53 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.35 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.56-1.48 (3H, m), 1.41 (9H, s), 1.25 (10H, m), 1.15-1.12 (2H, m), 0.86 (6H, d, J = 6.7 Hz)。
【０１１６】
工程５：3-(N-ヒドロキシ-10-メチルウンデカンアミド)プロパン酸tertブチル（６ｂ）
前工程で得られた3-(N-ベンジルオキシ-10-メチルウンデカンアミド)プロパン酸tertブチル（6a; 442 mg）を酢酸エチル（12 mL）に溶解し、5%パラジウム炭素（240 mg）を加え、水素雰囲気下、室温で1.5時間攪拌した。反応液をセライトで濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  n-ヘキサン：酢酸エチル＝1：2）で精製し、表題化合物（257 mg, 収率73%）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.86 (2H, m), 2.65 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.46-2.40 (2H, m), 1.58 (2H, m), 1.55-1.48 (1H, sep, J = 6.7 Hz), 1.46 (9H, s), 1.30-1.25 (10H, m), 1.15-1.12 (2H, m), 0.86 (6H, d, J = 6.7 Hz)。
【０１１７】
工程６：3-(N-ヒドロキシ-10-メチルウンデカンアミド)プロパン酸（ＮＣＤＭ−５３ａ）
前工程で得られた3-(N-ヒドロキシ-10-メチルウンデカンアミド)プロパン酸tertブチル（6b; 250 mg）をジクロロメタン（1.0 mL）に溶解し、氷冷下で4N塩酸ジオキサン溶液（1.0 mL）を滴下した。その後、室温で13時間攪拌し、反応液を減圧濃縮し、表題化合物（213 mg, 収率定量的（q.y.））を白色固体として得た。
mp 73-77℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.94 (2H, m), 2.80 (2H, m), 2.47-2.42 (2H, m), 1.64 (2H, m), 1.51 (1H, sep, J = 6.7 Hz), 1.30-1.25 (10H, m), 1.15 (2H, m), 0.86 (6H, d, J = 6.4 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 177.12, 174.49, 44.59, 39.04, 32.45, 31.42, 29.88, 29.54, 29.38, 27.98, 27.39, 25.30, 24.62, 22.66; MS (FAB) m/z 288 (MH+); HRMS calcd. for C15H30O4N, 288.21748, found 288.21602; HPLC tR = 13.12 min (Gradient (I), purity 97.1%)。
【０１１８】
実施例１の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7a：2.9 μM
KDM7b：16.3 μM
JMJD2A：92 μM
JMJD2C：55 μM
JARID1A：115 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：33 μM
Hela：26 μM
であった。
【０１１９】
実施例２：３−（Ｎ−ヒドロキシ−１０−メチルウンデカンアミド）プロパン酸メチル（ＮＣＤＭ−５３ｂ）
【０１２０】
【化１６】
0005946288.tif 000017
【０１２１】
アクリル酸tertブチルの代わりにアクリル酸メチルを用い、実施例１の工程１〜５と同様の方法により表題化合物（総収率11%）を黄色油状物として得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.94 (2H, m), 3.73 (3H, s), 2.75 (2H, m), 2.47 (2H, m), 1.59 (4H, m), 1.51 (1H, sep, J = 6.7 Hz), 1.30-1.25 (8H, m), 1.15 (2H, m), 0.86 (2H, d, J = 6.7 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 52.39, 44.59, 39.04, 32.57, 29.88, 29.54, 29.39, 27.98, 27.39, 25.30, 24.68, 22.66; MS (EI) m/z301 (MH+); HRMS calcd. for C16H31O4N, 301.22531, found 301.22442; HPLC tR= 11.81 min (Gradient (II), purity 97.9%)。
【０１２２】
実施例２の化合物について、後述の試験例２を行ったところ、
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：23 μM
Hela：22 μM
であった。
【０１２３】
実施例３：３−（Ｎ−ヒドロキシ−８−メチルノナンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−５４ａ）
【０１２４】
【化１７】
0005946288.tif 000018
【０１２５】
10-メチルウンデカン酸の代わりに8-メチルノナン酸を用い、実施例１の工程４〜６と同様の方法により表題化合物（総収率47%）を白色固体として得た。
mp 73-74℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.94 (2H, m), 2.80 (2H, m), 2.47-2.42 (2H, m), 1.63 (2H, m), 1.51 (1H, sep, J = 6.7 Hz), 1.33-1.28 (6H, m), 1.17-1.14 (2H, m), 0.86 (6H, d, J= 6.7 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 177.05, 174.24, 44.31, 38.97, 32.43, 31.36, 29.62, 29.38, 27.95, 27.24, 25.29, 24.65, 22.64; MS (FAB) m/z 260 (MH+); HRMS calcd. for C13H26O4N, 260.18618, found 260.18483; HPLC tR= 10.26 min (Gradient (I), purity 98.3%)。
【０１２６】
実施例３の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：17.4 μM
JMJD2A：79 μM
JMJD2C：57 μM
JARID1A：116 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：94 μM
Hela：160 μMより大きい
であった。
【０１２７】
実施例４：３−（Ｎ−ヒドロキシ−９−メチルデカンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−５５ａ）
【０１２８】
【化１８】
0005946288.tif 000019
【０１２９】
9-ブロモノナン酸の代わりに8-ブロモオクタン酸を用い、実施例１と同様の方法により表題化合物（総収率42%）を白色固体として得た。
mp 78-79℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.93 (2H, m), 2.80 (2H, m), 2.47-2.42 (2H, m), 1.62 (2H, m), 1.51 (1H, sep, J = 6.7 Hz), 1.31-1.26 (8H, m), 1.15 (2H, m), 0.86 (6H, d, J = 6.7 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 177.10, 174.43, 44.61, 39.02, 32.45, 31.42, 29.76, 29.40, 27.97, 27.36, 25.30, 24.62, 22.66; MS (FAB) m/z 274 (MH+); HRMS calcd. for C10H20O4N2, 274.20183, found 274.20331; HPLC tR = 12.78 min (Gradient (I), purity 96.7%)。
【０１３０】
実施例４の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：14.5 μM
JMJD2A：120 μM
JMJD2C：49 μM
JARID1A：56 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：29μM
Hela：40μM
であった。
【０１３１】
実施例５：３−（Ｎ−ヒドロキシ−１１−メチルドデカンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−５６ａ）
【０１３２】
【化１９】
0005946288.tif 000020
【０１３３】
9-ブロモノナン酸の代わりに10-ブロモデカン酸を用い、実施例１と同様の方法により表題化合物（総収率23%）を白色固体として得た。
mp 86-88℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.94 (2H, m), 2.80 (2H, m), 2.42 (2H, m), 1.65 (2H, m), 1.51 (1H, sep, J = 6.7 Hz), 1.30-1.25 (12H, m), 1.15 (2H, m), 0.86 (6H, d, J = 6.7 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 173.86, 44.69, 44.24, 39.06, 32.45, 31.01, 29.93, 29.67, 29.51, 29.38, 27.98, 27.42, 25.26, 22.67; MS (FAB) m/z 302 (MH+); HRMS calcd. for C16H32O4N, 302.23313, found 302.23263; HPLC tR = 18.43 min (Gradient (I), purity 95.8%)。
【０１３４】
実施例５の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：13.9 μM
JMJD2A：110 μM
JMJD2C：120 μM
JARID1A：170 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：18 μM
Hela：29 μM
であった。
【０１３５】
実施例６：３−（Ｎ−ヒドロキシ−１２−メチルトリデカンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−５７ａ）
【０１３６】
【化２０】
0005946288.tif 000021
【０１３７】
9-ブロモノナン酸の代わりに11-ブロモウンデカン酸を用い、実施例１と同様の方法により表題化合物（総収率32%）を白色固体として得た。
mp 89-90℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.93 (2H, m), 2.79-2.76 (2H, m), 2.47-2.42 (2H, m), 1.63 (2H, m), 1.51 (1H, sep, J = 6.7 Hz), 1.30-1.26 (14H, m), 1.15 (2H, m), 0.86 (6H, d, J = 6.7 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 177.15, 174.55, 44.59, 39.07, 33.73, 32.45, 29.95, 29.71, 29.65, 29.53, 29.38, 27.98, 27.43, 25.29, 24.71, 22.67; MS (FAB) m/z 316 (MH+); HRMS calcd. for C17H34O4N, 316.24878, found 316.24720; HPLC tR = 21.75 min (Gradient (I), purity 95.3%)。
【０１３８】
実施例６の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：15.4 μM
JMJD2A：120 μMより大きい
JMJD2C：79 μM
JARID1A：314 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：27 μM
Hela：31 μM
であった。
【０１３９】
実施例７：３−（Ｎ−ヒドロキシ−デカンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−５８ａ）
【０１４０】
【化２１】
0005946288.tif 000022
【０１４１】
10-メチルウンデカン酸の代わりにデカン酸を用い、実施例１の工程４〜６と同様の方法により表題化合物（総収率24%）を白色固体として得た。
mp 84-85℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.93 (2H, m), 2.80-2.76 (2H, m), 2.47-2.42 (2H, m), 1.61 (2H, m), 1.30-1.27 (12H, m), 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 177.20, 174.61, 44.50, 32.42, 31.88, 31.60, 29.46, 29.37, 29.28, 25.31, 24.66, 22.67, 14.11; MS (FAB) m/z 260 (MH+); HRMS calcd. for C13H26O4N, 260.18618, found 260.18719; HPLC tR= 10.37 min (Gradient (I), purity 96.8 %)。
【０１４２】
実施例７の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：11.7 μM
JMJD2A：100 μM
JMJD2C：32 μM
JARID1A：64 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：55 μM
Hela：109 μM
であった。
【０１４３】
実施例８：３−（Ｎ−ヒドロキシ−９−シクロヘキシルノナンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−５９ａ）
【０１４４】
【化２２】
0005946288.tif 000023
【０１４５】
イソプロピルマグネシウムブロマイド溶液の代わりにシクロヘキシルマグネシウムブロマイド溶液を用い、実施例１と同様の方法により表題化合物（総収率47%）を白色固体として得た。
mp 94-96℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.94 (2H, m), 2.81 (2H, m), 2.43 (2H, m), 1.69-1.67 (7H, m), 1.26-1.17 (16H, m), 0.86 (2H, m);13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 174.35, 168.35, 44.57, 44.33, 37.68, 37.55, 33.47, 32.20, 31.36, 31.04, 29.94, 29.53, 29.37, 26.86, 26.78, 26.47, 25.31, 24.63; MS (FAB) m/z 328 (MH+); HRMS calcd. for C18H34O4N, 328.24878, found 328.25015; HPLC tR = 21.86 min (Gradient (I), purity 97.8%)。
【０１４６】
実施例８の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：15.3 μM
JMJD2A：120 μMより大きい
JMJD2C：81 μM
JARID1A：89 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：19 μM
Hela：21 μM
であった。
【０１４７】
実施例９：３−（Ｎ−ヒドロキシ−９−フェニルノナンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−６０ａ）
【０１４８】
【化２３】
0005946288.tif 000024
【０１４９】
以下の経路にしたがい、目的化合物を得た。9-フェニルノナン酸を得た後、該化合物を用いて目的化合物を得た。
【０１５０】
【化２４】
0005946288.tif 000025
【０１５１】
具体的には以下のとおりである。
【０１５２】
工程３’：9-フェニルノナン酸
実施例１の工程２で得られた9-ブロモノナン酸ナトリウム塩（4a; 1.0 g）、トリス(2,4-ペンタンジオナト鉄)(III)（67 mg）、N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン（44 mg）、ヘキサメチレンテトラミン（27 mg）を無水テトラヒドロフラン（6.0 mL）に懸濁させ、氷冷下で1.0Mフェニルマグネシウムブロマイド（4.9 mL）を20分かけて滴下した。2.5時間攪拌した後、水（15 mL）を加え、ジエチルエーテル（40 mL）で抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（30 mL）で洗浄した。水層に2N塩酸（50 mL）を加え酸性にした後、ジエチルエーテル（100 mL）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後減圧濃縮し、表題化合物（610 mg, 収率67%）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.29-7.25 (2H, m), 7.18-7.16 (3H, m), 2.60 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.34 (2H, m), 1.64-1.61 (4H, m), 1.39-1.28 (8H, m)。
【０１５３】
工程４’：３−（Ｎ−ヒドロキシ−９−フェニルノナンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−６０ａ）
次に、10-メチルウンデカン酸の代わりに工程３’で得られた9-フェニルノナン酸を用い、実施例１の工程４〜６と同様の方法により表題化合物（総収率33%）を白色固体として得た。
mp 87-88℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.18-7.17 (5H, m), 3.93 (2H, m), 2.80 (2H, m), 2.59 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.46-2.41 (2H, m), 1.60 (4H, m), 1.31 (8H, m); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 177.15, 174.53, 142.88, 128.40, 128.23, 125.57, 44.40, 35.96, 31.83, 31.47, 29.34, 29.27, 29.16, 25.28, 24.68, 22.65; MS (FAB) m/z 322  (MH+); HRMS calcd. for C18H28O4N, 322.20183, found 322.20252; HPLC tR = 15.19 min (Gradient (I), purity 96.1%)。
【０１５４】
実施例９の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：28.1 μM
JMJD2A：65 μM
JMJD2C：22 μM
JARID1A：85 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：41 μM
Hela：67 μM
であった。
【０１５５】
実施例１０：３−（Ｎ−ヒドロキシ−９−シクロペンチルノナンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−６２ａ）
【０１５６】
【化２５】
0005946288.tif 000026
【０１５７】
イソプロピルマグネシウムブロマイド溶液の代わりにシクロペンチルマグネシウムブロマイド溶液を用い、実施例１と同様の方法により表題化合物（総収率30%）を白色固体として得た。
mp 101-102℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.93 (2H, m), 2.79 (2H, m), 2.42 (2H, m), 1.72 (4H, m), 1.60-1.55 (3H, m), 1.53-1.48 (2H, m), 1.30-1.26 (12H, m), 1.06-1.04 (2H, m); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 176.76, 174.28, 44.62, 44.23, 40.18, 36.26, 32.74, 32.44, 32.17, 31.32, 31.05, 29.90, 29.53, 29.38, 28.79, 25.21, 24.62; MS (FAB) m/z 314 (MH+); HRMS calcd. for C17H32O4N, 314.23313, found 314.23329; Anal. Calcd. for C17H31NO4: C, 65.14; H, 9.97; N, 4.47. Found: C, 64.75; H, 9.95; N, 4.53。
【０１５８】
実施例１０の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：73.4 μM
JMJD2A：120 μMより大きい
JMJD2C：78 μM
JARID1A：28 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：9.4 μM
Hela：20 μM
であった。
【０１５９】
実施例１１：３−（Ｎ−ヒドロキシ−９−シクロヘプチルノナンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−６３ａ）
【０１６０】
【化２６】
0005946288.tif 000027
【０１６１】
イソプロピルマグネシウムブロマイド溶液の代わりにシクロヘプチルマグネシウムブロマイド溶液を用い、実施例１と同様の方法により表題化合物（総収率32%）を白色固体として得た。
mp 86-87℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.94 (2H, m), 2.79 (2H, m), 2.41 (2H, m), 1.68-1.55 (8H, m), 1.49-1.37 (5H, m), 1.30-1.25 (10H, m), 1.18-1.11 (4H, m); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm) 174.01, 168.27, 60.43, 44.57, 44.25, 39.28, 38.24, 34.68, 32.17, 31.32, 31.04, 29.96, 29.55, 29.37, 28.58, 27.42, 26.59, 25.29, 24.63; MS (FAB) m/z 342 (MH+); HRMS calcd. for C19H36O4N, 342.26443, found 342.26507; HPLC tR = 20.82 min (Gradient (III), purity 98.7%)。
【０１６２】
実施例１１の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：5.1 μM
JMJD2A：99 μM
JMJD2C：120 μMより大きい
JARID1A：55 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：14 μM
Hela：14 μM
であった。
【０１６３】
実施例１２：３−（Ｎ−ヒドロキシ−９−シクロプロピルノナンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−６４ａ）
【０１６４】
【化２７】
0005946288.tif 000028
【０１６５】
イソプロピルマグネシウムブロマイド溶液の代わりにシクロプロピルマグネシウムブロマイド溶液を用い、実施例１と同様の方法により表題化合物（総収率13%）を白色固体として得た。
mp 86-87℃; 1H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 3.94 (2H, m), 2.79 (2H, m), 2.42 (2H, m), 1.64 (4H, m), 1.37-1.29 (10H, m), 1.19-1.15 (2H, m), 0.64 (1H, m), 0.40-0.36 (2H, m); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz, δ; ppm); 176.88, 173.92, 44.62, 44.26, 38.06, 34.75, 29.63, 29.47, 29.36, 26.50, 25.27, 24.63, 10.96, 4.36; MS (FAB) m/z 286 (MH+); HRMS calcd. for C15H28O4N, 286.20183, found 286.20242; HPLC tR = 10.27 min (Gradient (II), purity 96.1%)。
【０１６６】
実施例１２の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7b：0.7 μM
JMJD2A：120 μMより大きい
JMJD2C：83 μM
JARID1A：55 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：16 μM
Hela：40 μM
であった。
【０１６７】
比較例１：Ｎ−オクサリルグリシン（ＮＯＧ）
【０１６８】
【化２８】
0005946288.tif 000029
【０１６９】
公知のＪＨＤＭ阻害剤であるＮ−オキサリルグリシン（ＮＯＧ）を比較例１とした。
【０１７０】
比較例１の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7a：100 μMより大きい
KDM7b：250 μMより大きい
JMJD2A：253 μM
JMJD2C：523 μM
JARID1A：637 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：238 μMより大きい
Hela：714 μMより大きい
であった。
【０１７１】
比較例２：２，４−ピリジンジカルボン酸（ＰＣＡ）
【０１７２】
【化２９】
0005946288.tif 000030
【０１７３】
公知のＪＨＤＭ阻害剤である２，４−ピリジンジカルボン酸（ＰＣＡ）を比較例２とした。
【０１７４】
比較例２の化合物について、後述の試験例１及び２を行ったところ、
試験例１：酵素阻害活性試験
KDM7a：100 μMより大きい
KDM7b：250 μMより大きい
JMJD2A：4.2 μM
JMJD2C：6.1 μM
JARID1A：104 μM
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：238 μMより大きい
Hela：238 μMより大きい
であった。
【０１７５】
比較例３：３−（Ｎ−ヒドロキシ−７−メチルオクタンアミド）プロパン酸（ＮＣＤＭ−２８ａ）
【０１７６】
【化３０】
0005946288.tif 000031
【０１７７】
特許文献１の実施例２１で得た化合物（ＮＣＤＭ−２８ａ）を比較例３とした。
【０１７８】
比較例３の化合物について、後述の試験例２を行ったところ、
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：290 μM
Hela：350 μM
であった。
【０１７９】
比較例４：３−｛［９−（ジメチルアミノ）ノナノイル］（ヒドロキシ）アミノ｝プロパン酸（ＮＣＤＭ−３２ａ）
【０１８０】
【化３１】
0005946288.tif 000032
【０１８１】
特許文献１の実施例６で得た化合物（ＮＣＤＭ−３２ａ）を比較例４とした。
【０１８２】
比較例４の化合物について、後述の試験例１２を行ったところ、
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
KYSE150：476 μMより大きい
Hela：476 μMより大きい
であった。
【０１８３】
試験例１：酵素阻害活性試験
実施例１〜１２及び比較例１〜２の化合物について、ＫＤＭ７ａ、ＫＤＭ７ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＭＪＤ２Ｃ及びＪＡＲＩＤ１Ａの阻害活性試験を行った。結果を表１に示す。
【０１８４】
（１）ＫＤＭ７ａ
ＫＤＭ７ａは、全長のC末端にFLAGタグを付加した組換えタンパク質をコードするバキュロウイルスを作製し、それを感染させた昆虫細胞を用いて発現させた。感染昆虫細胞をホモジェナイザーで溶解し、その可溶性画分を抗FLAG抗体アフィニティークロマトグラフィーに供することにより、精製ＫＤＭ７ａ酵素を取得した。
【０１８５】
ＫＤＭ７ａの酵素活性は、ＫＤＭ７ａの脱メチル化反応により生成するホルムアルデヒドをNASH試薬（0.2% 2,4-ペンタンジオン、0.1M酢酸、3.89M酢酸アンモニウム）を用いて変換させたジアセチルジヒドロルチジンの定量により測定した。1.5mlチューブ内で、50mM Hepes-KOHバッファー（pH8.0）、70μM FeSO4(NH4)2・6H2O、2mMアスコルビン酸、100μM 2-オキソグルタル酸、1μgコアヒストン（ヒストンH3の9番目のリシン残基がトリチウムラベルしたメチル基で修飾されている）、0.4mg/ml ＫＤＭ７ａからなる50μlの溶液を37℃で1時間インキュベート後、酵素反応を測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50％の活性を阻害する濃度（IC50）で示した。なお、比較例４については、濃度100μMの際の阻害活性が60%であった。
【０１８６】
（２）ＫＤＭ７ｂ
ＫＤＭ７ｂ酵素の活性領域を含む1-610aa部分のN末端にグルタチオンS-トランスフェラーゼを付加した組換えタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを構築し、昆虫細胞に感染させた。感染させた昆虫細胞を超音波処理で溶解し、その可溶性画分をグルタチオンセファロース4Bに結合させて洗浄後、溶出することにより、精製ＫＤＭ７ｂ酵素を取得した。
【０１８７】
ＫＤＭ７ｂの酵素活性は、ＫＤＭ７ｂの脱メチル化反応の基質として用いた合成メチル化ペプチドのメチル基の脱離をMALDI-TOF質量分析法で解析することにより測定した。0.2mlチューブ内に、10mM Tris-HClバッファー（pH8.0）、150mM KCl、2.5%グリセロール、0.5mMジチオスレイトール、0.05mMフッ化フェニルメタンスルホニル（PMSF）、2.5mMグルタチオン還元型、20μM (+)-iron(II)-L-アスコルビン酸、20μM ZnCl2、0.5mMアスコルビン酸、0.5mM 2-オキソグルタル酸、5μMヒストンH3-リシン4トリメチル/リシン9ジメチルペプチド、0.5mg/ml ＫＤＭ７ｂからなる8μlの溶液を37℃で1時間反応させた。この溶液にマトリクス溶液(5mg/ml α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、37% アセトニトリル、0.12% トリフルオロ酢酸)75μlを加え、30秒間ソニケーション後、１μlをMALDIサンプルプレートにスポットし、風乾した。このプレートをVoyager DE-Pro MALDI-TOF質量分析計(Applied Biosystems社)にセットし、合成メチル化ペプチド基質の脱メチル化反応産物を測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50％の活性を阻害する濃度（IC50）で示した。
【０１８８】
（３）ＪＭＪＤ２Ａ
ＪＭＪＤ２Ａ酵素は、活性領域を含む1-350aa部分のN末端に6個の連続するヒスチジン残基を含むタグペプチドを付加した組換えタンパク質をコードするプラスミドで形質転換した大腸菌を用いて発現させた。組換え大腸菌を超音波処理で溶解し、その可溶性画分をHisTrapクロマトグラフィーに供することにより、精製ＪＭＪＤ２Ａ酵素を取得した。
【０１８９】
ＪＭＪＤ２Ａの酵素活性は、ＪＭＪＤ２Ａの脱メチル化反応の際に生成するホルムアルデヒドをホルムアルデヒド脱水素酵素により酸化させることで生じる3-アセチルピリジン-アデニンジヌクレオチド（APADH）で定量することにより測定した。384ウエルマイクロタイタープレート内で、20mM Hepes-KOHバッファー（pH7.5）、70μM FeSO4(NH4)2・6H2O、2mMアスコルビン酸、100μg/mlウシ血清アルブミン、0.1mg/ml E.coliホルムアルデヒド脱水素酵素、1mMグルタチオン還元型、1mM 3-アセチルピリジン-アデニンジヌクレオチド酸化型、200μM 2-オキソグルタル酸、50μMヒストンH3-リシン9トリメチルペプチド、0.37mg/ml ＪＭＪＤ２Ａからなる30μlの溶液を室温で30分間、経時的に酵素反応を測定した。酵素活性はSpectraMax M2e plate reader (Molecular Devices社)を用いて、生成物の蛍光分析(excitation 370nm、emission 465nm)により測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50％の活性を阻害する濃度（IC50）で示した。
【０１９０】
（４）ＪＭＪＤ２Ｃ
ＪＭＪＤ２Ｃ酵素は、活性領域を含む1-350aa部分のN末端に6個の連続するヒスチジン残基を含むタグペプチドを付加した組換えタンパク質をコードするプラスミドで形質転換した大腸菌を用いて発現させた。組換え大腸菌を超音波処理で溶解し、その可溶性画分をHisTrapクロマトグラフィーに供することにより、精製ＪＭＪＤ２Ｃ酵素を取得した。
【０１９１】
ＪＭＪＤ２Ｃの酵素活性は、ＪＭＪＤ２Ｃの脱メチル化反応の際に生成するホルムアルデヒドをホルムアルデヒド脱水素酵素により酸化させることで生じる3-アセチルピリジン-アデニンジヌクレオチド（APADH）で定量することにより測定した。384ウエルマイクロタイタープレート内で、20mM Hepes-KOHバッファー（pH7.5）、70μM FeSO4(NH4)2・6H2O、2mMアスコルビン酸、100μg/mlウシ血清アルブミン、0.1mg/ml E.coliホルムアルデヒド脱水素酵素、1mMグルタチオン還元型、 1mM 3-アセチルピリジン-アデニンジヌクレオチド酸化型、200μM 2-オキソグルタル酸、50μMヒストンH3-リシン9トリメチルペプチド、0.6mg/ml ＪＭＪＤ２Ｃからなる30μlの溶液を室温で30分間、経時的に酵素反応を測定した。酵素活性はSpectraMax M2e plate reader (Molecular Devices社)を用いて、生成物の蛍光分析(excitation 370nm、emission 465nm)により測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50％の活性を阻害する濃度（IC50）で示した。
【０１９２】
（５）ＪＡＲＩＤ１Ａ
ＪＡＲＩＤ１Ａ酵素の活性領域を含む1-797aa部分のN末端に6個の連続するヒスチジン残基を含むタグペプチドを付加した組換えタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを構築し、昆虫細胞に感染させた。感染させた昆虫細胞を超音波処理で溶解し、その可溶性画分をHisTrapクロマトグラフィーに供することにより、精製ＪＡＲＩＤ１Ａ酵素を取得した。
【０１９３】
ＪＡＲＩＤ１Ａの酵素活性は、ＪＡＲＩＤ１Ａの脱メチル化反応の際に生成するホルムアルデヒドをホルムアルデヒド脱水素酵素により酸化させることで生じる3-アセチルピリジン-アデニンジヌクレオチド（APADH）で定量することにより測定した。384ウエルマイクロタイタープレート内で、20mM Hepes-KOHバッファー（pH7.5）、70μM FeSO4(NH4)2・6H2O、2mMアスコルビン酸、100μg/mlウシ血清アルブミン、0.1mg/ml E.coliホルムアルデヒド脱水素酵素、1mMグルタチオン還元型、 1mM 3-アセチルピリジン-アデニンジヌクレオチド酸化型、200μM 2-オキソグルタル酸、50μM ヒストンH3-リシン4トリメチルペプチド、0.64mg/ml ＪＡＲＩＤ１Ａからなる30μlの溶液を室温で30分間、経時的に酵素反応を測定した。酵素活性はSpectraMax M2e plate reader (Molecular Devices社)を用いて、生成物の蛍光分析(excitation 370nm、emission 465nm)により測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50％の活性を阻害する濃度（IC50）で示した。
【０１９４】
【表１】
0005946288.tif 000033
【０１９５】
試験例２：細胞増殖阻害試験（ＭＴＴアッセイ）
ヒト子宮頸癌由来細胞株であるHeLa細胞、及びヒト食道癌由来細胞株であるKYSE150細胞の増殖に対する化合物の阻害活性を測定した。細胞増殖は、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT）アッセイ法により測定した。96ウエルマイクロタイタープレートにHeLa細胞及びKYSE150細胞を１ウエルあたり100μlの10%ウシ胎児血清含有RPMI1640培地に5000細胞ずつ播種し、CO2インキュベーターで24時間培養した後、化合物を添加した。48時間培養後、5mg/mlのMTT液を１ウエルあたり10μl入れ、CO2インキュベーターでさらに3時間培養した。可溶化溶液（0.04mol/l 塩酸-イソプロパノール）を１ウエルあたり100μl入れて激しくボルテックス後、FusionαFP（PerkinElmer社）で560nmの吸光度を測定し、細胞の生存量を求めた。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の比色値を100%として残存活性を測定し、その50％の活性を阻害する濃度（IC50）で示した。結果を表２に示す。
【０１９６】
【表２】
0005946288.tif 000034
【０１９７】
試験例３：ウェスタンブロッティング
N2a細胞をOPTI-MEM培地に1.0 x 105cells/mLの濃度で播種し、CO2インキュベーターで24時間培養した後、ジメチルオキサリルグリシン（DMOG；比較例１の化合物に対応）又は実施例８の化合物(NCDM-59a)を添加し、CO2インキュベーターで48時間処理した。なお、DMOG又はNCDM-59aの濃度は、DMOGについては30μM、300μM又は1 mMとし、NCDM-59aについては1μM、10μM又は30μMとした。
【０１９８】
培地を吸引除去し、1 x PBSで細胞を洗浄後、再度上澄みを吸引除去した。1 x SDSバッファーを加え細胞を溶解しさらにすり潰したものを99℃で加熱変性処理した。ブラッドフォードプロテインアッセイキット（Bio-Rad Laboratories）を用いて溶解物の蛋白質量を測定し、SDS-サンプルバッファーにより希釈し同一蛋白質量を含む電気泳動サンプルを調製した。
【０１９９】
続いて、市販の4-20% SDS-ポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad Laboratories）にサンプル20μLをアプライし、電気泳動し、ニトロセルロース膜（Bio-Rad Laboratories）に転写した。ブロッキングバッファー（TBS-Tバッファー、3% スキムミルク）を用いて転写膜を室温で30分処理した後、一次抗体（H3K27me2 一次抗体：CST、1:1000希釈）入りTBSバッファー（3% スキムミルク）中で、4℃で一晩インキュベーションした。TBSバッファーで洗浄したのち、2次抗体（sheep anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase conjugates：1:2500希釈）入りTBSバッファー（3% スキムミルク）中で振盪しながら室温で1時間半インキュベーションした。
【０２００】
TBSバッファー、TBS-Tバッファーで洗浄したのち、化学発光法により観察した。
【０２０１】
結果を図１に示す。DMOGについては、1mMまで濃度を高くしてもH3K27me2レベルの亢進は見られなかったが、本発明の化合物であるNCDM-59aについては、30μM程度の濃度でH3K27me2レベルの亢進が見られた。
【図１】
0005946288.tif 000039