(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発がんリスクを軽減するための食品成分又は食品組成物を選定するために行うスクリーニング方法であって、
腸内細菌叢におけるグラム陰性菌に対するグラム陽性菌の減少を指標とすることを特徴とする方法。
【請求項２】
発がんリスクを軽減するための食品成分又は食品組成物を選定するために行うスクリーニング方法であって、
腸内細菌叢におけるグラム陰性菌に対するクロストリジウム属に属する菌の減少を指標とすることを特徴とする方法。
【請求項３】
発がんリスクを軽減するための食品成分又は食品組成物を選定するために行うスクリーニング方法であって、
腸内細菌叢を変化させたモデル動物に、候補物質を一定期間継続して投与し、
腸内細菌叢におけるグラム陰性菌に対するグラム陽性菌の減少を指標として選定することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３記載のスクリーニング方法であって、
前記腸内細菌叢を変化させたモデル動物が高脂肪食飼育マウスであることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、腸内細菌叢のバランスを改善することによって、発がんリスクを軽減する食品成分のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  がんは多段階の遺伝子変異によって起こる病気であり、いくつかの遺伝子が損傷し、細胞が制限なく増え続けることにより起こることが明らかにされている。正常細胞にＤＮＡ損傷を引き起こすストレスが加わって、遺伝子に損傷が生じても、通常は修復機構により元通りに修復される。しかしながら、細胞に強いストレスが加わった場合には、アポトーシスと呼ばれる細胞死が起こったり、細胞周期チェックポイントで細胞周期が停止し、不可逆的に細胞増殖が停止する。この不可逆的に細胞増殖が停止する現象を「細胞老化（senescence）」と称し、アポトーシスとならぶ重要な発がん防止機構であると考えられている（非特許文献１〜４）。【０００３】  アポトーシスとは異なり、細胞老化を起こしても細胞がすぐに死滅するわけではなく、生体内に長期間生存し続ける。最近、細胞老化を起こすと様々な炎症性サイトカインが大量に分泌されることが明らかになってきた（非特許文献５、６）。この細胞老化に伴う炎症性サイトカイン分泌現象はsenescence-associated secretory phenotype（ＳＡＳＰ）又はsenescence-messaging secretome（ＳＭＳ）と呼ばれており、慢性炎症や慢性炎症を素地とする発がんの原因のひとつとなる可能性が示唆されている（非特許文献５〜７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sharpless N.E. & DePinho R.A., Cancer: crime and punishment., Nature. (2005) Vol.436(7051):636-7
【非特許文献２】Adams P.D., Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence., Mol Cell. (2009) Vol.36(1):2-14.
【非特許文献３】Collado M., & Serrano, M. Senescence in tumours: evidence from mice and humans., Nat Rev Cancer. (2010) Vol.10(1):51-7.
【非特許文献４】Kuilman, T. et al. The essence of senescence. Genes Dev. (2010) Vol.24, 2463-2479.
【非特許文献５】Coppe J.P., et al., Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor., PLoS Biol. (2008) Vol.6(12):2853-68.
【非特許文献６】Rodier F., & Campisi, J., Four faces of cellular senescence., J Cell Biol. (2011) Vol.192(4):547-56.
【非特許文献７】Kuilman, T. & Peeper, D. S. , Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nature Rev. Cancer (2009) Vol. 9, 81-94.
【非特許文献８】Ohtani N. and Hara E., Roles and mechanisms of cellular senescence in regulation of tissue homeostasis., (2013) Cancer Sci.
【非特許文献９】Davalos et al., Senescent cells as a source of inflammatory factors for tumor progression., Cancer Metastasis (2010) June; 29(2): 273-283.
【非特許文献１０】Ohanna et al., Senescent cells develop a PARP-1 and nuclear factor-kB-associated secretome (PNAS),, Genes Dev. (2011) 25: 1245-1261.
【非特許文献１２】Nagashima K. et al., Phylogenetic Analysis of 16S Ribosomal RNA Gene Sequences from Human Fecal Microbiota andImproved Utility of Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Profiling. (2006)Bioscience and Microflora, Vol.25,No.3 , pp.99-107.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  しかしながら、ＳＡＳＰと発がん機構との関連については不明の点も多い。本発明者らは、肝がん及び肺がんが多発する発がんモデルを開発し、発がん機構について解析を行った。その結果、腸内細菌叢の変化によりグラム陽性菌率が上昇し、このグラム陽性菌により産生されるデオキシコール酸の血中濃度が上昇することを明らかにした。さらに、デオキシコール酸が肝星細胞に細胞老化を引き起こし、肝星細胞がＳＡＳＰ因子を分泌するようになることでその周囲の肝実質細胞の発がんが促進されるという機構を明らかにした。【０００６】  腸内細菌叢の変化により発がんが誘発されるという機構は、本発明者らにより初めて明らかにされた機構である。当該発がん機構に鑑みれば、腸内細菌叢の改善によって、発がんリスクを軽減できる。発がんリスクの軽減は、がんによる死亡率が高いわが国をはじめ、多くの国にとって大きな課題である。【０００７】  本発明は、腸内細菌叢の変化ががん発症に関連することを明らかにしたことに基づき、腸内細菌叢のバランスを改善し、発がんリスクを軽減する食品成分又は食品組成物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の方法は、発がんリスクを軽減するための食品成分又は食品組成物を選定するために行うスクリーニング方法であって、腸内細菌叢を指標とすることを特徴とする。
【０００９】
本発明者らの研究により、がん発症の機構には、腸内細菌叢の変化が原因となっていることが明らかとなった。したがって、食品成分又は食品組成物を、腸内細菌叢を指標として解析することによってスクリーニングし、選択することが可能となる。
【００１０】  実験動物を用いた系では、候補食品成分、候補食品組成物である候補物質を一定期間投与し、腸内細菌叢の変化をモニターして解析することも可能であるし、血液、糞便等を用いて腸内細菌が産生する物質をモニターして、腸内細菌叢の変化を捉えることが可能である。【００１１】  ここで、腸内細菌叢の変化は、実験動物から採取されたサンプル中のグラム陽性菌とグラム陰性菌の比率として捉えることができる。【００１２】  また、腸内細菌叢の変化は、実験動物から採取されたサンプル中のグラム陽性菌のグラム陰性菌に対する減少として捉えることができる。【００１３】  また、腸内細菌叢の変化は、実験動物から採取されたサンプル中の嫌気性菌の増減として捉えることもできる。【００１４】  今後、対象とする動物種や発がんと変化する菌種との相関の解析が進むにつれ、どのような菌をモニターすべきかが明らかになっていくものと考えられる。【００１５】  また、本発明のスクリーニング方法は、腸内細菌の培養系に候補物質を添加し、前記細菌の増殖促進又は増殖抑制を指標とすることができる。発がんリスクを高める腸内細菌に対する候補物質の増殖抑制効果、又は、発がんリスクを低下させる腸内細菌に対する候補物質の増殖促進効果を解析することができる。【００１６】  本発明のスクリーニング方法は、前記細菌がクロストリジウム属に属する菌であることを特徴とする。【００１７】  腸内細菌の中でも嫌気性のグラム陽性細菌であるクロストリジウム属に属する菌、特にクロストリジウム属クラスターＸＩに属する菌を指標とすることが最も好ましい。本発明者らの解析結果によれば、腸内細菌の中でも、嫌気性腸内細菌、特にクロストリジウム属クラスターＸＩに属する菌が増加していることが明らかとなったことから、これを指標とすることにより、感度良くスクリーニングを行うことができる。【００１８】  本発明のスクリーニング方法は、前記細菌の培養系に候補物質を添加し、前記細菌の増殖抑制を指標とすることを特徴とする。【００１９】  腸内細菌の培養系を用いることによって、より多くの候補物質を短期間にスクリーニングすることが可能である。【００２０】  腸内細菌の培養系を用いて、候補物質を添加後、細菌の増殖や、デオキシコール酸又はリトコール酸を指標とすることにより、感度良く候補物質をスクリーニングすることが可能である  本発明のスクリーニング方法は、前記細菌の生産物が、胆汁酸代謝物であるデオキシコール酸又はリトコール酸の少なくとも１種であることを特徴とする。【００２１】  本発明者らの解明した発がん機構によって、腸内細菌の産生する二次胆汁酸であるデオキシコール酸やリトコール酸が、細胞老化を引き起こし、その周辺細胞のがん化を誘発していることが明らかとなった。【００２２】  したがって、これら二次胆汁酸を指標として、発がんリスクを高める腸内細菌の増殖を抑制する食品成分又は食品組成物を選択すればよい。【００２３】  本発明の発がんリスクを軽減するための食品成分又は食品組成物を選定するために行うスクリーニング方法は、腸内細菌叢を変化させたモデル動物に、候補物質を一定期間継続して投与し、デオキシコール酸又はリトコール酸を含む胆汁酸代謝物の少なくとも１種を指標とすることを特徴とする。【００２４】  ここで、実験動物を用いたスクリーニング方法において、サンプルとして、血液を用いれば、感度良くデオキシコール酸又はリトコール酸の検出を行うことができる。【００２５】  本発明は、前記スクリーニング方法により得られた食品成分又は食品組成物であることを特徴とする。【００２６】  本発明のいずれかのスクリーニング方法によって得られた食品成分又は食品組成物は、腸内細菌叢のバランスを改善することから、発がんリスクを軽減する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】肥満による肝がん発症の機構を模式的に示す。
【図２】野生型マウスを用いた肥満によりがんを多発する発がんモデルの作成、及び結果を示す。Ａ．高脂肪食飼育による発がんモデルの飼育スケジュールを模式的に示す。Ｂ.通常食（ＮＤ）及び高脂肪食飼育マウス（ＨＦＤ）の肝臓所見を示す。Ｃ．通常食及び高脂肪食飼育マウスのがん発症率を示す。
【図３】通常食及び高脂肪食飼育マウスの肝星細胞（α−平滑筋アクチン陽性細胞）での細胞老化マーカー、ＳＡＳＰ関連マーカー、ＤＮＡ損傷マーカーの発現割合を示す。
【図４】抗生物質投与による肝がん発症率の変化を示す。Ａ．高脂肪食飼育による発がんモデルに抗生物質投与をする場合の飼育スケジュールを模式的に示す。Ｂ．抗生物質投与によるバクテリア１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子量の変化を示す。Ｃ．抗生物質投与が肝がん発症に及ぼす効果を示す。各群の肝臓所見を示す。Ｄ．平均肝がん数とそのサイズ分布を示す。
【図５】肥満による腸内細菌叢の変化を示す。
【図６】デオキシコール酸の肝がん発症に対する影響を示す。Ａ．高脂肪食、抗生物質カクテル投与飼育マウスにデオキシコール酸を投与する飼育スケジュールを模式的に示す。Ｂ．コントロール群（高脂肪食+抗生物質カクテル投与）、及びデオキシコール酸投与群（高脂肪食+抗生物質カクテル投与+デオキシコール酸投与）における肝臓所見を示す。Ｃ．各群での平均肝がん数とそのサイズ分布を示す。Ｄ．デオキシコール酸を投与したマウスの肝星細胞（α−平滑筋アクチン陽性細胞）での細胞老化マーカー、ＳＡＳＰ関連マーカー、ＤＮＡ損傷マーカーの発現割合を示す。
【図７】Ａ．抗生物質投与による腸内細菌、クロストリジウム属クラスターＸＩに対する効果を示す。Ｂ．抗生物質投与のコレステロール（左）とデオキシコール酸（右）に対する効果を示す。
【図８】無菌環境での肝がん誘発実験を示す。Ａ．腸内細菌を保有しない無菌マウス（Germ Free）及び常在菌を保有するマウス（Control）に、ＤＭＢＡ処理後、高脂肪食飼育を与え飼育し、３０週齢時の肝臓所見を示す。Ｂ．平均肝がん数とそのサイズ分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】  本発明者らの動物モデルを用いたがん発症機構の研究により、腸内細菌叢の変化によってがん発症が引き起こされることが明らかとなった。本発明はこれに基づく、発がんリスクを軽減する食品成分のスクリーニング方法に関する。
【００２９】  まず、本発明者らが解明した腸内細菌叢の変化に関連する発がん機構について説明する（図１）。腸内細菌叢は宿主の健康状態を反映するため、個体の健康状態の変化、すなわち、図１の場合には肥満によって腸内細菌叢に変化が生じる。
【００３０】  本発明者らが開発した発がんモデルにおいて、グラム陽性菌の割合がグラム陰性菌に比べて著しく増加する。グラム陽性菌の中でも特にクロストリジウム属クラスターＸＩの細菌が増加する。
【００３１】  クロストリジウム属クラスターＸＩは、代謝によって一次胆汁酸を二次胆汁酸であるデオキシコール酸に変換する酵素を有している。クロストリジウム属クラスターＸＩの増加は、血中のデオキシコール酸濃度を増加させ、デオキシコール酸は門脈によって肝臓に運ばれる。
【００３２】  デオキシコール酸は活性酸素（ＲＯＳ）産生を介して、ＤＮＡ損傷を引き起こし、ＤＮＡ損傷は細胞老化を引き起こす。
【００３３】  がん発症マウスでは、肝星細胞で細胞老化が生じ、その結果ＳＡＳＰが起こっていることが確認された。肝星細胞から分泌されたＳＡＳＰ因子は、肝星細胞の周囲の肝実質細胞に作用し、発がんを引き起こす。
【００３４】  上記述べたように、本発明者らは腸内細菌叢の変化から、がん発症までの多段階にわたる機構を一つ一つ実験的に証明し、解明した。この機構に基づいて、腸内細菌叢の変化を指標として、発がんリスクを軽減することのできる食品成分や食品組成物を選択することができる。
【００３５】  ［リスク軽減対象のがん］  本発明者らは、肥満及び発がん物質により発がんを誘導したマウスモデルを用いて解析を行ったが、腸内細菌叢の変化が発がんを誘発するという発がん機構から、腸内細菌叢がグラム陽性菌優勢に変化する状態であれば、肥満に関わらず発がんリスクが高まるものと理解される。
【００３６】  ＳＡＳＰは肝星細胞だけでなく、様々な種類の細胞において細胞老化に伴い認められる現象であり、その細胞の周辺領域の細胞のがん化に関与することが知られている。ＳＡＳＰ現象は、メラノサイト、繊維芽細胞、内皮細胞等の種々の細胞、乳腺、前立腺、皮膚等の種々の組織で示唆されており（非特許文献９）、メラノーマの発症にＳＡＳＰが関与することも報告されている（非特許文献１０）。実施例で示すようにＳＡＳＰは血流にのったデオキシコール酸により誘導されるので、デオキシコール酸等の二次胆汁酸の血中濃度の高い個体では、肝臓の肝星細胞以外でも、ＳＡＳＰ誘導が生じると理解できる。
【００３７】  実施例で用いた発がんモデルは、肥満及び発がん物質により発がんを誘導したモデルであるが、腸内細菌叢の変化によって引き起こされるＳＡＳＰが原因となっているがんであれば対象となる。すなわち、本発明に係るスクリーニング法により選択された食品成分を含む食品を摂取することによって、発がんリスクを軽減することができると考えられる。ヒトにおいて疫学的に肥満との相関が指摘されている、食道がん、胃がん、胆嚢がん、肝がん、胆管がん、膵臓がん、大腸がん等の消化器系のがんや、実施例１の発がんモデルで、肝がんと並んで発症率の増加している肺がんは特に好ましい対象である。
【００３８】  本発明のスクリーニング方法によって選択される食品成分、及びこれを含む食品は、上記に限らず腸内細菌叢の変化を伴ういかなるがんの発がんリスクも軽減する効果がある。
【００３９】  ［食品摂取対象・動物］  本発明のスクリーニングにより選択される食品成分を含む食品は、いかなるがんの発症リスクを持つ個体に対しても有用である。
【００４０】  例えば、すでにがんに罹患し、治療後の患者にとっても、当該食品成分を含む食品を摂取することによって、腸内細菌叢を健康な状態に保つことにより、がんの再発を抑制することができる。
【００４１】  また、腸内細菌叢の変化が示唆されている症状を呈する対象、例えば、健康診断等で既にＢＭＩ値から肥満と診断された個体では、当該食品成分を含む食品を摂取することによって、腸内細菌叢を健康な状態に保つことにより、発がんリスクを軽減することができる。さらに、肥満の個体だけではなく、特定のがんについて発がんリスクが高いことが示唆される個体、例えば、肝がんについては、脂肪肝、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝）等の症状を呈する個体、また、肺がんについては、常習的に喫煙している個体に対しても、積極的に当該食品成分を含む食品を摂取することで、腸内細菌叢を健康な状態に維持し、発がんを抑制することが可能となる。
【００４２】  加えて、健常な個体が当該食品成分を含む食品を日常的に摂取することによっても、腸内細菌叢を適正な状態に保つことができるから、発がんリスクを低くすることができる。
【００４３】  ここで、本発明のスクリーニングにより選択される食品成分を含む食品は、腸内細菌叢の変化により発がんリスクが高まる動物である限り、どのような動物に対しても有用であるが、摂取の対象となる動物は、ヒト、及び、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の実験動物、イヌ、ネコ等のペット、ヤギ、ウシ、ヒツジ等の家畜等の哺乳動物が挙げられる。
【００４４】  ［スクリーニング方法］  本発明者らが解明した、腸内細菌叢の変化からがん発症までの多段階にわたる機構を基に、以下に例示するスクリーニング方法によって、発がんリスクを低減する作用を有する化合物を選択することができる。
【００４５】  例えば、このスクリーニング方法では、マウス等、実験動物を用いて腸内細菌叢の変化を指標としたり、あるいは、腸内細菌の培養系、発がんモデル培養細胞系を用いることができる。
【００４６】  （実験動物を用いたスクリーニング方法）  具体的なスクリーニング方法としては、腸内細菌叢を変化させた実験動物を用い、候補物質を一定期間投与する。ここで、腸内細菌叢を変化させた実験動物としては、例えば、実施例１の肥満モデル動物系を用いることができる。実施例１に記載のように、肥満によって、腸内細菌叢を変化させることができればマウスに限らず、一般的に用いられているラット、ウサギ等どのような動物を用いることもできる。
【００４７】  さらに、ここでは発がんモデルとして発がん物質を用いてがんを発症させているが、腸内細菌叢の変化をモニターするだけであれば、必ずしも発がんを誘導する必要はない。
【００４８】  また、腸内細菌叢は、動物の食餌に特定の細菌を混ぜて与える等により、人為的に変化させることも可能である。
【００４９】  上記のような実験動物に一定期間、候補物質を投与し、実験動物の細菌叢の変化を検出する。
【００５０】  特に食品成分の選択を目的とする場合、候補物質としては、腸内細菌叢を改善することが期待される食品自体を用いてもよいし、特定の食品成分、あるいは候補化合物を用いても構わない。実験動物を用いる場合には、食餌や飲み水に混ぜて与えることもできるし、強制的に一定量シリンジ等を用いて投与してもよい。
【００５１】  腸内細菌叢の変化は、例えば、グラム陽性菌とグラム陰性菌の比率の変化により検出することができる。グラム陽性菌とグラム陰性菌の比率は、グラム陽性菌又はグラム陰性菌のいずれか一方を検出することにより検出してもよい。検出対象となるグラム陽性菌としては、例えば、クロストリジウム属、ペプトストレプトコッカス属、ユーバクテリウム属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属、マイクロコッカス属、バチルス属、マイコバクテリウム属に属する菌を挙げることができるが、クロストリジウム属に属する菌であることが好ましい。
【００５２】  クロストリジウムに属する菌を指標にする場合、クロストリジウム属に属する全ての菌を検出してもよいが、クロストリジウム属に属する１種以上の菌、又は、クロストリジウム属の特定のクラスターに属する菌を検出してもよい。特に、クロストリジウム属クラスターＸＩに属する菌は、細胞老化を誘導するデオキシコール酸を産生することや、発がんモデルマウスにおいて著しく比率が増加していることから、発がんリスク軽減作用を有する食品成分を精度良く検出できるものと考えられる。
【００５３】  また、デオキシコール酸を産生する他の細菌、例えば、バクテロイデス属に属する菌を検出することによっても、発がんリスク軽減作用を有する食品成分を精度良く検出することができる。
【００５４】  腸内細菌叢の変化の解析は、腸内細菌が産生する物質を測定することによっても行うことができる。
【００５５】  グラム陽性菌とグラム陰性菌の比率を解析する場合、グラム陽性菌の産生する物質、及び、グラム陰性菌の産生する物質の両方を測定してもよいが、そのいずれかのみを測定してもよい。例えば、クロストリジウム属クラスターＸＩに属する菌をはじめ、クロストリジウムに属する菌は、一次胆汁酸から二次胆汁酸を産生する7α-dehydrogenaseを有しているから、二次胆汁酸を測定対象とすることができる。二次胆汁酸としては、例えば、デオキシコール酸、及び、リトコール酸が挙げられるが、デオキシコール酸であることが好ましい。
【００５６】  実験動物を用いたスクリーニング方法において、腸内細菌叢を解析するサンプルとしては、実験動物から採取され、腸内細菌が含まれるサンプルであれば特に限定されないが、例えば、糞便、尿、喀痰、消化管液、消化管洗浄液、肺洗浄液、気管洗浄液、唾液、口腔洗浄液、生検試料が好ましく、実験動物の負担やハンドリングを考慮すると、糞便又は唾液がさらに好ましく、糞便が最も好ましい。
【００５７】  また、腸内細菌が産生する物質を測定する場合のサンプルとしては、実験動物から採取され、腸内細菌が産生する物質が含まれているサンプルであれば特に限定されないが、例えば、血液、糞便、尿、喀痰、消化管液、消化管洗浄液、肺洗浄液、気管洗浄液、唾液、口腔洗浄液、生検試料が好ましく、実験動物の負担やハンドリング及び検出感度を考慮すると、糞便、尿、唾液、血液がさらに好ましく、血液が最も好ましい。
【００５８】  ここで、実施例に示すように、腸内細菌が産生する二次胆汁酸が発がんに関連しているから、腸内細菌叢を変化させるのに限らず、血中の二次胆汁酸濃度を増加させた実験動物を用い、血中の二次胆汁酸濃度を低下させる作用を有する化合物を選択してもよい。
【００５９】  （培養系によるスクリーニング方法）  腸内細菌の培養系を用いることによって、実験動物を用いるよりも多くの候補物質を短時間にスクリーニングすることが可能である。
【００６０】  具体的には、例えば、発がんリスクとの相関の高い腸内細菌を当業者に周知の方法で培養し、候補物質を作用させる。この腸内細菌の増殖を指標として、候補物質に発がんリスク軽減作用があるか否かを判定することができる。例えば、腸内細菌が発がんリスクを高める菌である場合、増殖を抑制する物質を選択すればよく、一方、腸内細菌が発がんリスクを低下させる菌である場合、増殖を促進する物質を選択すればよい。
【００６１】  あるいは、腸内細菌の産生する二次胆汁酸を指標として、候補物質に発がんリスク軽減作用があるか否かを判定することができる。又は、腸内細菌の二次胆汁酸産生活性を指標として、候補物質に発がんリスク軽減作用があるか否かを判定することができる。
【００６２】  さらに、発がんモデル培養細胞系を用いることによっても、候補物質をスクリーニングすることが可能である。
【００６３】  具体的には、例えば、培養細胞の培養液に候補物質を添加し、ここに二次胆汁酸を作用させ、細胞老化を誘導する。二次胆汁酸の作用によって、培養細胞が実際に細胞老化を示すか否かによって、候補物質が、二次胆汁酸の活性を阻害又は抑制する作用を有するか判定でき、すなわち、発がんリスク軽減作用があるか否かを判定することができる。スクリーニングの精度を考慮すると、培養細胞は、実際に発がんリスクを軽減させる対象の動物種及びがん種の培養細胞であることが好ましい。ここで、細胞老化の有無は、培養液中のＳＡＳＰ因子の測定、あるいは、細胞老化マーカーの発現の有無等、細胞老化の周知の指標を使用して調べることができる。
【００６４】  （候補物質の評価方法）  ここで、前述の実験動物を用いたスクリーニング方法、及び、培養細胞系によるスクリーニング方法において、腸内細菌叢の変化は、グラム染色剤、グラム陽性菌とグラム陰性菌を識別するＰＣＲプライマー等、グラム陽性菌と陰性菌を識別可能な試薬を適宜用いて解析することができる。ＰＣＲ法を用いる場合、検出用のプライマー、ＰＣＲ条件等は当業者が設計及び設定することが可能であるが、例えば、クロストリジウム属クラスターＸＩに属する菌を検出する場合には、非特許文献９に記載のクロストリジウム属クラスターＸＩに特異的なプライマーを用いることもできる。
【００６５】  ここで、腸内細菌が産生する物質の測定は、検出対象の物質を検出できる範囲で限定されず、例えば、ガスクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによる方法、マススペクトロメトリー法、特異的抗体を用いた検出方法が挙げられる。これらの検出方法に関する検出条件等は、当業者が適宜設定することができる。
【００６６】  上記評価方法を用いて解析し、所望の効果を与える候補物質を選択すればよい。
【００６７】  ［食品、予防方法］  本発明のスクリーニング方法により選択された食品成分又は食品組成物は、発がんリスクを軽減するため、あるいは、発がん予防のための食品として使用することができる。
【００６８】  このような食品は、特に、発がんリスクが高いと考えられる個体、例えば、健康診断等で既にＢＭＩ値から肥満と診断された個体等の腸内細菌叢の変化が示唆されている症状を呈する個体に与えられることが有効である。あるいは、特定のがんについて発がんリスクが高いことが示唆される個体、例えば、肝がんについては、脂肪肝、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝）等の症状を呈する個体、また、肺がんについては、常習的に喫煙している個体に対して与えられることが有効である。
【００６９】  さらに、発がんリスクと関連が認められた腸内細菌のうち、発がんリスクを軽減する腸内細菌自体も、発がんリスクを軽減するため、あるいは、発がん予防のための食品の食品成分として使用することができる。
【００７０】  本発明に係る食品成分は、例えば、他の食品成分と共に用い、ヨーグルト、ソフトドリンクやスープ等の液剤、カプセル剤、チュアブル錠、散剤等、いずれの食品形態に加工してもよい。
【００７１】  投与対象動物は、腸内細菌叢の変化と発がんに関連のある動物であれば特に制限されないが、ヒト、及び、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の実験動物、イヌ、ネコ等のペット、ヤギ、ウシ、ヒツジ等の家畜等の哺乳動物であることが好ましく、ヒトが挙げられる。
【００７２】  ［実施例１：がんを多発する発がんモデルの作成］  図２Ａに本発明で用いた発がんモデルの作成方法を示す。野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）の新生仔マウスに、発がん物質であるＤＭＢＡ（7,12-dimethylbenz [a] anthracene）を０．５％含むアセトン溶液を背部に１回塗布した。仔マウスは母マウスとともに、通常食（ＮＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）で４週目まで共に飼育した。高脂肪食は米国Research Diets社のD12492（Rodent Diet with 60% kcal%Fat）を用いている。生後４週で離乳させた後も、仔マウスは引き続き通常食又は高脂肪食で飼育した。３０週で肝臓及び肺を摘出し、がん発生の有無を解析した。解剖時のマウスの平均体重は通常食飼育マウスでは平均３３ｇ、高脂肪食飼育マウスでは平均５１ｇであり、高脂肪食飼育マウスは、通常食飼育マウスに比べて約１．５倍の体重であった。
【００７３】  図２Ｂは通常食、高脂肪食で飼育したマウスの肝臓の代表的な解剖所見を示す。高脂肪食で飼育したマウスの肝臓は肥大し、脂肪肝となり肝がん（△で示す）が多発している。
【００７４】  図２Ｃに食餌によるがん発生の比率を示す。正常食飼育マウス（ｎ＝９）では５％のマウスで肺がんが生じていたが、９５％のマウスはがん発生が見られなかった。これに対し、高脂肪食飼育マウス（ｎ＝１８）では６８％のマウスが肝がんを、３２％のマウスが肝がんと肺がんの両方を併発していた。
【００７５】  本発明の発がんモデルマウスは、肝がんの発症率は１００％と、高率にがんを発症するので、食餌として与える食品成分、又は食品組成物による効果を精度よく解析し、スクリーニングすることが可能である。
【００７６】  ここでは、高脂肪食飼育によって、マウスを肥満させた場合に肝がん、肺がんが多発することを示しているが、本発明者らは、遺伝的肥満マウスとして知られているob/obマウスを用いた場合でも同様の結果を得ている。すなわち、ob/obマウス新生仔をＤＭＢＡ処理後、通常食で飼育した場合でも同様に肝がんが多発する。
【００７７】  この発がんマウスモデルを用いれば、３０週でがん発症を誘導できるので、実験動物を使う系としては比較的短時間で、発がんを抑制する候補物質を効率よくスクリーニングし、目的化合物を選択することが可能となる。すなわち、図２Ａに示す飼育スケジュールのいずれかの時点で、又は継続的にマウスに候補物質を投与し、がん発症に対する効果を解析することにより、がんを抑制する食品成分のスクリーニングが可能となる。
【００７８】  ［実施例２：肝星細胞の細胞老化によるＳＡＳＰ誘導と肝がん発症］  最近、いくつかの分泌因子ががん発生リスクを増加することが示唆されており、それらの中にはＳＡＳＰ因子に分類されるものも含まれていた（非特許文献８）。
【００７９】  これまでの解析の結果、肝臓でＳＡＳＰ因子を分泌する細胞は、肝星細胞であることが明らかになった。そこで、高脂肪食飼育マウス及び正常食飼育マウスの肝臓で細胞染色を行い、肝星細胞に細胞老化が生じ、ＳＡＳＰが観察されるか解析を行った。
【００８０】  肝星細胞の細胞マーカーであるα−平滑筋アクチンと、細胞老化を誘導するｐ２１、ｐ１６、ＤＮＡ損傷応答に関わるマーカーである５３ＢＰ１、γＨ２ＡＸのｆｏｃｉ、ＳＡＳＰの主要な因子であるＩＬ−６、Ｇｒｏ‐α、ＣＸＣＬ９との二重染色を行い、細胞老化、ＳＡＳＰ因子を分泌している肝星細胞の割合を解析した。
【００８１】  図３に結果を示す。高脂肪食飼育マウスの肝臓では、細胞老化を誘導するｐ２１、ｐ１６の発現、ＤＮＡ損傷応答に関わるマーカーである５３ＢＰ１、γＨ２ＡＸのｆｏｃｉが観察されるのに対し、通常飼育マウスの肝星細胞では、これらタンパク質の発現は観察されなかった。また、高脂肪食飼育マウスの肝星細胞では細胞老化が起こりＳＡＳＰ因子を分泌していることがＩＬ−６、Ｇｒｏ‐α、ＣＸＣＬ９の発現により示された。
【００８２】  また、細胞老化の誘導因子であるｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の発現を非侵襲的に観察可能なｐ２１−ｐ−ｌｕｃマウスを用い、実施例１の発がんモデルと同様にＤＭＢＡ処理後、高脂肪食飼育によって肝がん誘発実験を行い、バイオルミネッセンスイメージングによるｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の発現を観察した。
【００８３】  データは示さないが、肝がん領域にｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の発現が観察されたことから、細胞老化と肝がん発症の相関が示された。
【００８４】  以上の結果から、肝星細胞の細胞老化によりＳＡＳＰが生じること、ＳＡＳＰが肝がん発症に密接に関わっていることが示される。［実施例３：腸内細菌叢の改善による発がん抑制効果］  図４Ａに実験系を示す。野生型マウス新生仔に対し、ＤＭＢＡ塗布を行い、高脂肪食飼育を行った。１３週から抗生物質カクテル（４Ａｂｘ、抗生物質カクテル投与群）又はバンコマイシン（ＶＣＭ、バイコマイシン投与群）を飲み水に混ぜて投与し、飼育開始から３０週目に肝臓を摘出し、肝がん発症の解析を行った。一方、コントロール群は、１３週目までと同様に飼育を続けた。抗生物質カクテルには、アンピシリン（１ｇ/ｌ）、ネオマイシン（１ｇ/ｌ）、メトロニダゾール（１ｇ/ｌ）及びバンコマイシン（５００ｍｇ/ｌ）が含まれている。バンコマイシン単独投与の場合も５００ｍｇ/ｌで投与した。
【００８５】  図４Ｂは、抗生物質投与後１７週、すなわち生後３０週の腸内細菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子量を示す。抗生物質カクテルにより完全に、また、バンコマイシンによっても、腸内細菌の量が非常に少なくなっていることが示された。
【００８６】  各群のマウスを３０週目に解剖し肝がん発症の解析を行った（図４Ｃ，Ｄ）。コントロール群では肝がん発症が認められたが、一方、抗生物質カクテル投与群、バンコマイシン投与群では、全く発症しないか、又はコントロールに比べて肝がんの数は著しく少なく、大きさは小さかった。
【００８７】  この結果は、がん発症より前の腸内細菌叢の状態が、がんを誘発することを示している。したがって、摂取する食品によってがん発症に先立つ腸内細菌叢の状態を改善することができれば、がん発症を抑制することができる。
【００８８】  ここでは、抗生物質を離乳後に継続して飲み水に混ぜることによって、マウスに投与しているが、候補物質を餌に混ぜて与えることも可能である。候補物質の水に対する可溶性や、投与する量によって、飲み水に混ぜても、餌に混ぜてもよい。また、強制的に一定量をシリンジ等を使って、経口投与しても構わない。
【００８９】  また、投与する時期に関しても、候補物質に合わせて適宜投与すればよい。さらに、母乳に分泌される物質であれば、母マウスの食餌、又は飲み水に混ぜることによって、出生時から候補物質に曝露することも可能である。
【００９０】  上記のように、本発明の実験系を用いて、候補物質を強制的に投与したり、あるいは食餌や飲み水に混ぜて与えることによって、発がんのリスクを軽減する食品成分のスクリーニングを行うことが可能となる。
【００９１】  また、発がんマウスモデルとして、Ｃ５７ＢＬ／６を用いているが、どのような系統のマウスでも用いることができるのは言うまでもない。さらに、ここではマウスを用いて解析を行っているが、ラット、ウサギ等、一般的に用いられている他の実験動物に高脂肪食を与え、腸内細菌叢の変化を解析することも可能である。
【００９２】  ［実施例４：がん発症に関連する腸内細菌の探索］  次に、実施例３で行った抗生物質投与による腸内細菌叢の変化を示す。図４Ａに示した実験系で、通常食飼育、高脂肪食飼育、高脂肪食飼育で飼育するとともにバンコマイシンを与えた群の３群で、腸内細菌叢の解析を行った。
【００９３】  腸内細菌叢の同定はＰＣＲ法により解析した（非特許文献１１、１２）。具体的には、糞便よりＤＮＡを抽出、精製し、ユニバーサルプライマーを使用して多種類の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子をＰＣＲ増幅し、さらにＶ１‐Ｖ４の超可変領域を増幅し同定を行った。
【００９４】  通常食飼育（ｎ＝５）では、グラム陰性菌が５４％〜７９％、グラム陽性菌が２０．９〜４５％（うち、クロストリジウム属クラスターＸＩ：０％）であった。高脂肪食飼育（ｎ＝４）では、グラム陰性菌が１．５〜２２％、グラム陽性菌が７７．４〜９８．４％（うち、クロストリジウム属クラスターＸＩ：３．４〜１８％）であった。バンコマイシン投与（ｎ＝２）では、グラム陰性菌が９８〜９９．８％、グラム陽性菌が０〜１．９％（うち、クロストリジウム属クラスターＸＩ：０％）であった。
【００９５】  以上の比率の平均値を図５に示す。通常食飼育マウス群（ＮＤ）は、グラム陰性菌が平均６５％であるのに対し、高脂肪食飼育マウス群（ＨＦＤ）では、平均８％と著しく減少し、平均８８％をグラム陽性菌が占めていた。グラム陽性菌の中でもクロストリジウム属クラスターＸＩが平均１３％と、非常に多くの割合を占めていた。
【００９６】  また、高脂肪食飼育で飼育するとともにバンコマイシン投与したマウス群（ＨＦＤ+ＶＣＭ）では、グラム陰性細菌叢が平均９９％とほとんどを占めていた。
【００９７】  これら腸内細菌叢の変化と、がん発症とを比較し、グラム陽性菌の比率増加と、肝がん発症のリスク上昇の相関が明らかとなった。加えて、クロストリジウム属クラスターＸＩの増加と、肝がん発症のリスク上昇の相関が明らかとなった。
【００９８】  これら腸内細菌叢の変化と、がん発症との相関から、グラム陽性菌の比率が増加することにより、がん発症のリスクが高まるものと認められる。
【００９９】  これらの結果から、腸内細菌叢のグラム陰性菌とグラム陽性菌の比率を解析し、候補物質のスクリーニングを行うことが可能である。腸内細菌叢のグラム陽性菌が増加すれば、腸内環境による発がんリスクが上昇したことを示す。したがって、グラム陰性菌とグラム陽性菌の比率、又はグラム陽性菌の増加を指標に候補物質のスクリーニングを行うことが可能となる。
【０１００】  抗生物質投与は、図４に示したように、がん発症を抑制するとともに、クロストリジウム属クラスターＸＩの量を減少させている（図５、図７Ａ）。また、抗生物質投与は、血中デオキシコール酸量も減少させていた（図７Ｂ）。
【０１０１】  ［実施例５：デオキシコール酸によるＳＡＳＰを介した発がん誘発］  高脂肪食飼育マウスに、飼育開始から１３週目から抗生物質カクテルを投与して飼育し、このマウスに体重１ｇあたり４０μｇのデオキシコール酸（ＤＣＡ）、又はコントロールとして溶媒（Ｖｅｈｉｃｌｅ）のみを週に３回経口投与した（図６Ａ）。
【０１０２】  図６Ｂに両者の代表的な肝臓所見を示す。デオキシコール酸を投与したマウスでは、多数の肝がんが生じているのに対し（図中、△で示している。）、コントロールとして溶媒のみを投与したマウス群では、がん発生がほとんど見られなかった。図６Ｃに個体あたりの平均的な肝がん数、及びその大きさを示している（ｎ＝３）。コントロールとして溶媒のみを投与したマウス群では、ほとんどがんが発生しておらず、また、発生していても、がんのサイズが小さかった。一方、デオキシコール酸投与群では、個体あたり平均２５以上と、がんが多発しており、またそのサイズも大きかった。
【０１０３】  上記解析より、デオキシコール酸が肝がん発症を引き起こしていることが示された。
【０１０４】  これらマウスの血中のデオキシコール酸を測定したところ、高脂肪食飼育マウスでは通常飼育マウスの３倍のデオキシコール酸濃度であるのに対し、抗生物質カクテルを同時に投与したものでは、デオキシコール酸は検出限界以下であった（図７Ｂ）。
【０１０５】  したがって、血中のデオキシコール酸濃度が健常者の数倍程度であっても、発がんリスクが高まることが予測される。
【０１０６】  ここにデータは示さないが、肝星細胞の培養細胞を１０％Dulbecco's modified Eagle's medium（１０％ＦＢＳ添加、３％Ｏ２、５％ＣＯ２）において培養し、に２００μＭのデオキシコール酸を添加すると、細胞老化を引き起こす活性酸素（ＲＯＳ）の増加や、ＳＡＳＰ関連因子の発現が確認された。したがって、非常に低濃度であっても、発がんリスクが高まることが示唆される。
【０１０７】  さらに、肝臓に運ばれたデオキシコール酸が、肝星細胞でＳＡＳＰを誘導していることを免疫染色法を用いて確認した。
【０１０８】  図６Ｄに示すように、デオキシコール酸投与群では、ＳＡＳＰを誘導することが知られているｐ２１、ＳＡＳＰ因子であるＩＬ−１β、ＩＬ−６，Ｇｒｏ‐αが発現しているのに対し、コントロール群では発現が確認されなかった。
【０１０９】  ［実施例６：腸内細菌叢の有無による発がんリスク］  実施例３、４に示すように、抗生物質投与によって、腸内細菌数を減少させることにより、肝発がんのリスクが減少することが示された。そこで、腸内細菌を保有しない無菌環境でマウスを飼育し、実施例１と同様に新生仔マウスにＤＭＢＡ処理し、高脂肪食で飼育し、体重が４５ｇ以上になった肥満したマウスについて３０週齢時に肝がん発症の有無を解析した。
【０１１０】  無菌マウスは腸内細菌がいないため、常在菌のいるマウス（平均体重約５７ｇ）に比べ肥満しにくく平均体重は約４８ｇであった。
【０１１１】  図８Ａに各群の典型的なマウスの肝臓所見を示す。図８Ａ中、肝がんは△で示す。図８Ｂに個体あたりの平均的な肝がん数、及びその大きさを示している。なお、コントロールマウスは６匹、無菌マウスは９匹の平均を示している。
【０１１２】  常在菌のいるマウス（コントロールマウス）では肝がん発症が見られるのに対し、腸内細菌叢を保有しない無菌マウスでは、肥満状態であるにもかかわらず、がん発症が抑制されていた。
【０１１３】  無菌マウスでは、肥満であるにもかかわらず、肝がんを発症のリスクが低いという結果は、腸内細菌の有無が肝がん発症と相関していることを示す。さらに、実施例５の結果を鑑みると、腸内細菌が二次胆汁酸を産生し、肝がん発症に深く関与していることを示す。
【０１１４】  以上、示したように、腸内細菌叢に変化を与える物質を投与することによって、発がんを抑制することができる。ここでは、腸内細菌叢に変化を与えることが明らかである抗生物質を用いているが、腸内細菌に対し、同様の効果を奏する候補物質を選択することにより、新たに発がんリスクを軽減する物質をスクリーニングすることができる。
【０１１５】  ここでは主として発がんモデルマウスを用いた系で示しているが、腸内細菌叢の変化を指標とするのであるから、通常のマウスを用いて系を組むこともできる。また、二次胆汁酸を産生する細菌、細胞株等を用いて系を組み、スクリーニングを行うことができることは言うまでもない。さらに、指標としても腸内細菌叢の変化は勿論のこと、二次胆汁酸、ＳＡＳＰ関連因子等を本発明者らが解明した発がん機構から示唆される発がんに伴う変化はいずれも指標とすることができる。
【０１１６】  そして、本発明のスクリーニング方法により得られる食品成分又は食品組成物は、発がんリスクを軽減することを本発明者らが開発したモデル動物を用いれば実験的に示すことができる。したがって、効果のある食品成分や食品組成物を短期間にスクリーニングすることが可能である。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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