(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓疾患の検出方法であって、
被検者から採取された血液中のγ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ、及びγ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅからなる群から選ばれる少なくとも一種のペプチドの含有量を測定するステップと、
前記ペプチドの含有量を健常者の基準レベルと比較するステップと、
前記ペプチドの含有量が前記基準レベルよりも高ければ、前記被験者は肝臓疾患に罹患しているとするステップと、
を含むことを特徴とする、前記肝臓疾患の検出方法。
【請求項２】
前記肝臓疾患が、肝炎であることを特徴とする、請求項１に記載の肝臓疾患の検出方法。
【請求項３】
前記肝炎が、無症状肝炎であることを特徴とする、請求項２に記載の肝臓疾患の検出方法。
【請求項４】
前記肝炎が、薬剤性肝炎、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の肝臓疾患の検出方法。
【請求項５】
肝臓疾患の検出装置であって、
被検者から採取された血液中のγ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ、及びγ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅからなる群から選ばれる少なくとも一種のペプチドの含有量を測定する手段と、
前記ペプチドの含有量を健常者の基準レベルと比較する手段と、
前記ペプチドの含有量が前記基準レベルよりも高ければ、前記被験者は肝臓疾患に罹患しているとする手段と、
を含むことを特徴とする、前記肝臓疾患の検出装置。
【請求項６】
前記肝臓疾患が、肝炎であることを特徴とする、請求項５に記載の肝臓疾患の検出装置。
【請求項７】
前記肝炎が、無症状肝炎であることを特徴とする、請求項６に記載の肝臓疾患の検出装置。
【請求項８】
前記肝炎が、薬剤性肝炎、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の肝臓疾患の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝炎キャリアの検出方法及び装置に係り、特に、各種肝臓疾患の患者を健常者と識別してスクリーニング可能な肝炎キャリアの検出方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓疾患は、薬剤性肝炎、Ｂ型、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝臓がんなど多様であり、また無症状のＢ型、Ｃ型ウイルスのキャリアの人も存在する。特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染者の７割は、慢性的な肝臓の炎症（慢性肝炎）のため、徐々に正常な幹細胞が失われ、肝臓が線維化して、肝硬変に進行し、さらには肝臓がんまで発展する。Ｃ型慢性肝炎患者の１０−１５％、肝硬変患者の８０％に肝臓がんが発生することが報告されている。慢性肝炎の状態では生命に危険が生じることはないが、肝臓がんが発生したり、肝硬変が進行して肝不全を引き起こしたりすると生命の危険がせまる。従って、早期にＣ型肝炎を診断し、ウイルスを駆除することが必要である。
【０００３】
Ｃ型肝炎は、肝硬変から肝臓がんへと症状も無く進行し、肝臓の機能が極度に低下して倦怠感や黄疸、意識障害など様々な障害がおこるが、この段階では現在有効な治療法はない。したがって、肝臓の機能が悪化する前に、なるべく早く症状の進行を検出し、インターフェロン投与などの治療などを施すことが必要である。しかし、各種の肝障害を正確かつ迅速に特定する方法は未だ確立されていないのが現状である。
【０００４】
一般に肝臓疾患が疑われると、問診、視診、触診とともに、血中のＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−ＧＴＰ、アルカリフォスファターゼ（ＡＬ−Ｐ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、ビリルビンなどの肝機能マーカーを測定する。これらの生化学検査値に異常があった場合は、Ｂ型やＣ型肝炎ウイルス検査、超音波検査、Ｘ線、ＣＴなどの画像検査が行われる。がんの判定には、血中のＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−II、ＣＥＡなどのタンパク質の腫瘍マーカーを測定する。さらに、正確な判定が必要な場合は、腹腔鏡検査や肝生検（１週間程度の入院が必要）を行う（非特許文献１）。
【０００５】
このように肝臓病を特定するには、多くの検査を受けなければならず、判定がつくまでに何日も費やす。また腹腔鏡検査や肝生検は、患者を危険に曝し、肉体的な苦痛を与える。腹腔鏡検査や肝生検は、患者の負担が大きいため、病態のチェックなどのために頻繁に行うことはできない。さらに従来法では、多くの検査や判定は専門家でなければ行うことができず、不足している医療関係者に負担を強いる。したがって、患者に負担がかからず、迅速で、正確かつ簡便な肝臓疾患の判定法が強く望まれている。
【０００６】
肝炎、肝硬変、肝臓がんなど多くの肝障害は、活性酸素の生成（酸化ストレス）と、それを除去する生体の防御システムの破たんによって惹起されることが知られている（非特許文献２）。活性酸素などの酸化ストレスに対する生体の防御の主要な一つに、グルタチオンシステムによるものがある。組織に最も高濃度に存在する抗酸化物質として還元型グルタチオン（ＧＳＨ：以下グルタチオン）があり、活性酸素や親電子物質にグルタチオンが抱合することによって、これらの物質は還元され、酸化ストレスは抑制される。
【０００７】
しかし、グルタチオンが減少すると組織や細胞は酸化ストレスに曝され、様々な病態を惹起する（非特許文献３）。実際に肝障害でも、Ｂ型やＣ型の肝炎ウイルスの感染によって、酸化ストレスが亢進してグルタチオンが減少することや、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝臓がんの患者やマウスでグルタチオンが減少することが報告されている（非特許文献２、４）。  
【０００８】
薬物の服用によって誘発される薬剤性肝炎も酸化ストレスによって惹起される。解熱鎮痛薬であるアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）は肝臓で代謝され、毒性の高い親電子物質Ｎ−アセチルベンゾキノンイミン（ＮＡＱＰＩ）が生成される。このＮＡＱＰＩは、肝臓に高濃度に存在するグルタチオン（ＧＳＨ）が抱合することによって、解毒、排泄される。しかし、親電子物質が大量に存在する場合はグルタチオンが枯渇し、親電子物質が細胞内に蓄積し（酸化ストレス）、生体高分子と反応する。その結果、細胞の機能が撹乱され、薬剤性肝炎などの病態を惹起することが知られている。
【０００９】
これまでに発明者らは、マウスにＡＰＡＰを大量に投与すると、ＡＰＡＰの代謝によって生成された親電子物質ＮＡＱＰＩを解毒するためにグルタチオンが減少し、反比例してオフタルミン酸が急増すること（図１（Ｂ）参照）、肝臓および血中のオフタルミン酸の増加は、親電子物質によって肝臓のグルタチオンが枯渇したことを示すことを見出した（特許文献１、非特許文献５）。
【００１０】
その機序は以下の通りである。図１に示すように、グルタチオン（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）とオフタルミン酸（γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ−Ｇｌｙ）は、同じ二つの酵素γ−グルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素によって生合成されるトリペプチドであり、基質（出発物質）がシステイン（Ｃｙｓ）か２−アミノ酪酸（２ＡＢ）の違いである。図１（Ａ）に示す通常の還元状態では、肝臓内にグルタチオンが大量に存在し、最初の酵素γ-グルタミルシステイン合成酵素がフィードバック（ＦＢ）阻害されている。
したがって、オフタルミン酸は、ほとんど生合成されない。しかし、図１（Ｂ）に示す酸化状態のように、親電子物質や活性酸素種が存在すると、解毒のためにグルタチオンが消費される。グルタチオンの減少によってフィードバック阻害が解除されて、γ-グルタミ
ルシステイン合成酵素が活性化し、グルタチオンとオフタルミン酸が生合成される。オフタルミン酸は肝臓内に蓄積し、血中にも排泄される。このように親電子物質などによって酸化状態になると、肝臓や血液のオフタルミン酸が増加するため、オフタルミン酸は酸化ストレスのバイオマーカーとなる。
【００１１】
又、肥満により内臓脂肪が増加すると問題になる非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）において、酸化ストレスマーカーの血清チオレドキシン（ＴＲＸ）が、肝硬変から肝臓がんに進行する非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）と、良好な経過をたどる単純脂肪肝（ＳＳ）の識別に有用であることも報告されている（非特許文献６）。
【００１２】
他方、キャピラリー電気泳動−質量分析装置（ＣＥ−ＭＳ）による試料中の代謝物質測定法による細胞内の代謝物質の網羅的な測定方法（例えば、非特許文献７〜９参照）は、ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプルの低分子化合物（代謝物質）パターンおよび／またはペプチドパターンを、定性的かつ／または定量的に決定する方法であって、ここで、該液体サンプルの代謝物質およびペプチドは、キャピラリー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、そしてオンラインでインターフェースを介して、接続された質量分析計で検出される。長期間にわたって該ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該状態を示す参照値およびサンプル値、ならびに該値から導かれた偏差および対応は、自動的にデータベースに記憶される。キャピラリー電気泳動と質量分析を組合せて陰イオン性化合物を分離分析する場合は、キャピラリーの内表面が予め陽イオン性にコーティングされたコーティングキャピラリーを用いて、電気浸透流を反転することを特徴とする陰イオン性化合物の分離分析方法（例えば、特許文献２参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００７−１９２７４６号公報
【特許文献２】特許第３３４１７６５号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Callewaert, N. et al. Nat. Med.10, 429-434, 2004.
【非特許文献２】Loguercio, Carmela et al. Free Radic. Biol. Med. 34, 1-10, 2003.
【非特許文献３】Yadav, Dhiraj et al. Am. J. Gastroenterol. 97, 2634-2639, 2002.
【非特許文献４】Moriya, K. et al. Cancer Res. 61, 4365-4370, 2001.
【非特許文献５】Soga, T. et al. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776, 2006.
【非特許文献６】谷川 久一編「酸化ストレスと肝疾患＜第５巻＞」メディカルトリビューン社, 3-37頁, 2009. 5. 7.
【非特許文献７】Soga, T. et al. J. Proteome Res.2. 488-494, 2003.
【非特許文献８】Soga, T. et al. J. Boil Chem.Vol.281, No.24, (June 16, 2006)16768-16776
【非特許文献９】Hirayama, A. et al. Cancer. Res. 69 : (II). (June 1, 2009) 4918-4925
【非特許文献１０】Pignatelli, B. et al. Am. J. Gastroenterol. 96, 1758-1766,2001.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、従来は、薬剤性肝炎、Ｂ型、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝臓がん、無症状のＢ型やＣ型ウィルスキャリア等を一回の検査で識別して特定することは困難であった。
【００１６】
本発明は、前記従来の問題点を解消するためになされたもので、血液中の低分子バイオマーカーを測定することによって、肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、無症状肝炎キャリア、無症状Ｂ型肝炎キャリア、無症状Ｃ型肝炎キャリアなどの肝炎キャリアを迅速に特定可能とすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前述のように、肝炎、肝硬変、肝臓がんなど多くの肝障害は、酸化ストレスと深い関係があるため、各肝障害でオフタルミン酸濃度が変動することが予想された。そこで、健常者（control：Ｃ）、薬剤性肝障害(drug induced liver injury：ＤＩ)、無症状Ｂ型肝炎キャリア（asymptomatic hepatitis B carrier：ＡＨＢ）、無症状Ｃ型肝炎キャリア（asymptomatic hepatitis C carrier：ＡＨＣ）、慢性Ｂ型肝炎（chronic hepatitis B carrier：ＣＨＢ）、慢性Ｃ型肝炎（chronic hepatitis C carrier：ＣＨＣ）、肝臓がん（hepatocellular carcinoma：ＨＣＣ）の患者から血液を採取し、血清中のオフタルミン酸を測定した。しかし、マウスとは異なり、健常者や薬剤性肝炎患者からは、オフタルミン酸は殆んど検出されなかった。（マウスの血清中のオフタルミン酸の濃度は約２μＭであったが、ヒトの血清中の濃度は、約１／２０程度であり、健常者や薬剤性肝炎患者では殆んど検出されなかった。）
【００１８】
しかし、発明者らは、各肝炎患者の血清中で著しく増加する物質を発見し、それらがγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類（注：Ｘはアミノ酸及びアミンを示す）であることを同定した。さらに血清中の肝機能マーカーであるＡＳＴとＡＬＴの値とγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を用いて多重ロジスティック回帰モデルによる多変量解析を行うことにより、各種の肝炎患者を他と区別することに成功した。
【００１９】
本発見によって、血液中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度を測定することによって、肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、無症状肝炎キャリア、無症状Ｂ型肝炎キャリア、無症状Ｃ型肝炎キャリアなどの肝炎キャリアを迅速に特定することが可能になった。
【００２０】
本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、肝炎キャリアの検出方法であって、被検者から採取された血液中の所定のγ−Ｇｌｕ−Ｘの含有量を測定するステップと、前記所定のγ−Ｇｌｕ−Ｘの含有量を健常者の基準レベルと比較するステップと、前記所定のγ−Ｇｌｕ−Ｘの含有量が前記基準レベル以上であれば、所定の肝炎キャリアであると決定するステップと、を含むことを特徴とする肝炎キャリアの検出方法である。
【００２１】
本発明は、又、肝炎キャリアの検出装置であって、被検者から採取された血液中の所定のγ−Ｇｌｕ−Ｘの含有量を測定する手段と、前記所定のγ−Ｇｌｕ−Ｘの含有量を健常者の基準レベルと比較する手段と、前記所定のγ−Ｇｌｕ−Ｘの含有量が前記基準レベル以上であれば、所定の肝炎キャリアであると決定する手段と、を含むことを特徴とする肝炎キャリアの検出装置を提供するものである。
【００２２】
ここで、前記所定の肝炎キャリアは肝炎であることができる。
【００２３】
又、前記肝炎はＢ型肝炎であることができる。
【００２４】
又、前記肝炎はＣ型肝炎であることができる。
【００２５】
又、前記所定の肝炎キャリアは無症状肝炎キャリアであることができる。
【００２６】
又、前記無症状肝炎キャリアは無症状Ｂ型肝炎キャリアであることができる。
【００２７】
又、前記無症状肝炎キャリアは無症状Ｃ型肝炎キャリアであることができる。
【００２８】
又、前記所定のγ−Ｇｌｕ−Ｘは、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒの少なくともいずれか一つであることができる。
【００２９】
ここで、血液中の所定のγ−Ｇｌｕ−Ｘの含有量（以下、マーカーの濃度とも称する）を測定する工程は、個体から採取した血液を個別に測定することも、複数の個体から採取した血液のプールを測定することも含む。また、測定されたマーカーの濃度を比較する工程は、各測定で得られた濃度を一つずつ比較することも、各測定で得られた濃度の積算値あるいは平均値を比較することも含む。
【００３０】
組織中の酸化ストレスを検出するために、マーカーを用いることのできる哺乳動物は、組織における酸化ストレスに従い、血中で本発明に係るマーカーが測定できる哺乳類であれば制限はなく、ヒトであることが好ましい。
【００３１】
この診断方法に用いられる血液を採取する哺乳動物は特に制限がないが、上記マーカーのうち少なくとも一つがその血液中に存在する哺乳動物であることが好ましく、マウスやラットなどのげっ歯類や、ヒト、サル、犬であることが、より好ましい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、血液中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度を測定することによって、肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、無症状肝炎キャリア、無症状Ｂ型肝炎キャリア、無症状Ｃ型肝炎キャリアなどの肝炎キャリアを迅速に特定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】親電子物質と活性酸素（酸化ストレス）によってオフタルミン酸が生合成されるメカニズムを模式的に示す図
【図２】健常者と肝臓がん患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチド類のＬＣ−ＭＳ測定結果を比較して示す図
【図３】健常者、各肝炎患者の血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の測定結果を比較して示す図
【図４】ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類による健常、各肝臓疾患のスクリーニング検査の精度を示す図
【図５】肝臓がん患者と胃がん患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度を比較して示す図
【図６】ＢＳＯ、ＤＥＭ投与マウス肝臓中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙの定量結果を比較して示す図
【図７】各種の肝障害患者でγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類が生合成されるメカニズムを模式的に示す図
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００３５】
前述のように、肝炎、肝硬変、肝臓がんなど多くの肝障害は、酸化ストレスと深い関係があることが、知られている。そこで、健常者（Ｃ）１０名、薬剤性肝障害（ＤＩ）３１名、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）８名、無症状Ｃ型肝炎キャリア（ＡＨＣ）８名、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）１０名、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）２１名、肝臓がん（ＨＣＣ）１４名の血清を測定して、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）法を用いて、オフタルミン酸濃度を測定した。しかし、別の物質が各肝炎患者で優位に増加していることを見出し、それらは、いずれもγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類（注：Ｘはアミノ酸及びアミンを示す）であることを特定した。
【００３６】
１．血清から代謝物質の抽出
健常者および各種肝炎患者から採取した血清（１００μｌ）を標準物質入りのメタノール９００μｌに入れ、酵素を失活させ、代謝の亢進を止めた。４００μｌの超純水、１０００μｌのクロロホルムを加えた後、４℃で５分間、４，６００ｇで遠心した。静置後、分離した水−メタノール相７５０μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした。ろ液を凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５０μｌを加え、それをＣＥ−ＴＯＦＭＳおよびＬＣ−ＭＳ測定に供した。
【００３７】
２．キャピラリー電気泳動−質量分析装置（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）による血清中の代謝物測定
ＣＥ−ＴＯＦＭＳを用いて、健常者および肝炎患者の血清中の低分子代謝産物を一斉に測定した。
【００３８】
ＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析条件
ａ．キャピラリー電気泳動−電気泳動（ＣＥ）の分析条件
キャピラリーには、フューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、１Ｍギ酸（ｐＨ約１．８）を用いた。印加電圧は、＋３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３秒間（約３ｎｌ）注入した。
【００３９】
ｂ．飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）の分析条件
正イオンモードを用い、イオン化電圧は４ｋＶ、フラグメンター電圧は７５Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は１２５Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液は５０％メタノール溶液を用い、質量較正用にレゼルピン（ｍ／ｚ  ６０９．２８０７）を０．５μＭとなるよう混入し１０μｌ／ｍｉｎで送液した。レゼルピン（ｍ／ｚ  ６０９．２８０７）とメタノールのアダクトイオン（ｍ／ｚ  ８３．０７０３）の質量数を用いて得られた全てのデータを自動較正した。
【００４０】
３．液体クロマトグラフィー−質量分析装置（ＬＣ−ＭＳＭＳ）による血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類測定
高感度に測定するため、血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類はＬＣ−ＭＳＭＳを用いて測定した。
【００４１】
ａ．液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の分析条件
分離カラムには、野村化学（Nomula Chemical Co.）社製Develosil RPAQUEOUS-AR-3（
内径２ｍｍ×長さ１００ｍｍ，３μｍ）を用い、カラムオーブンは３０℃に設定した。試料は１μｌ注入した。移動相Ａには０．５％ギ酸、Ｂにはアセトニトリルを用い、Ｂ液が０％（０ｍｉｎ）−１％（５ｍｉｎ）−１０％（１５ｍｉｎ）−９９％（１７ｍｉｎ）−９９％（１９ｍｉｎ）の流速０．２ｍｌ／ｍｉｎのグラジエント溶出法を用いてγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を分離した。
【００４２】
ｂ．三連四重極型質量分析計（ＱｑＱＭＳ）の分析条件
アプライドバイオシステム（Applied Biosystem）社製API3000三連四重極型質量分析計を用い、ポジティブイオンモードのＭＲＭモードで測定した。各質量分析計のパラメータを以下に示した。
イオンスプレー電圧：５．５ｋＶ
ネブライザガス圧力：１２ｐｓｉ
カーテンガス圧力：８ｐｓｉ
衝突ガス：８ｕｎｉｔ
窒素ガス温度：５５０℃
【００４３】
各γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を測定するために最適化されたＭＲＭパラメータを表１に示す。
【００４４】
【表１】
0005946104.tif 000002
【００４５】
４．肝障害バイオマーカーの探索および評価
図２に健常者と肝臓がん（ＨＣＣ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類をＬＣ−ＭＳを用いて測定した結果を示す。多くのγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類が、健常者に比べ肝臓がん患者（ＨＣＣ）で増加していることが判明した。また他の肝障害でも、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度は健常者に比べて有意に高かった。
【００４６】
図３に健常者（Ｃ）および各種の肝炎患者の血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ値およびγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の測定結果を示す。図中、矢印は最大値、最小値を示し、ボックスの上が順位で２５％の値、ボックスの下が順位で７５％の値を示し、ボックス中の横線が中央値を示す。
【００４７】
従来の肝機能検査値であるＡＳＴ、ＡＬＴ値は、薬剤性肝炎（ＤＩ）、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）では上昇したが、他の肝炎では健常者の値と有意差はなかった。
【００４８】
しかし、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒなどのγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類は、健常者（Ｃ）よりも薬剤性肝炎（ＤＩ）で高く、他の肝炎はさらに高値を示した。特に無症状Ｂ型肝炎（ＡＨＢ）や無症状Ｃ型肝炎（ＡＨＣ）や肝臓がん（ＨＣＣ）でも、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類は高値を示した。また詳細に見ると幾つかのγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類で、無症状Ｂ型肝炎（ＡＨＢ）より無症状Ｃ型肝炎（ＡＨＣ）が高かったり、無症状Ｂ型肝炎（ＡＨＢ）より慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）が高かったり、同じＣ型肝炎でも無症状（ＡＨＣ）、慢性肝炎（ＣＨＣ）、肝臓がん（ＨＣＣ）と疾患が進行するにつれて、値が低くなる傾向が見られた。
【００４９】
このように、各疾患によって、ＡＳＴ、ＡＬＴと各γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の血中濃度が異なっているため、これらの成分の値を用いれば、各疾患を分けられるのではないかと考えた。そこで、各肝臓疾患を区別するためのバイオマーカーの選定を目的に多変量解析手法の多重ロジスティック回帰分析を行った。結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
0005946104.tif 000003
【００５１】
多重ロジスティック回帰分析では、目的変数である比率ｐに対して、ｋ個の説明変数ｘ1、ｘ2、ｘ3、…、ｘkを使って、
ｌｎ(ｐ／１−ｐ)＝ｂ0＋ｂ1ｘ1＋ｂ2ｘ2＋ｂ3ｘ3＋ … ＋ｂkｘk    ・・・（１）
というｐの回帰式を求めるが、表２中のパラメータの値が、（１）式のｂ0、ｂ1、…ｂk
に入る具体的な値となる。（Intercept）は、定数項（ｂ０）の値を指す。
【００５２】
また、症例ごとに確率を計算するときは、例えば薬剤性肝炎ＤＩのグループでは、表中の（Intercept）の値２７．３をｂ0、ＡＬＴの値０．０４０１をｂ1、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈ
ｒの値２１．５をｂ2、…、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅの値４１．５をｂ5とし、ＡＬＴの定量値をｘ1、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒの定量値をｘ2、…、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅの定量値をｘ5に代
入して具体的な値を出す。推定したパラメータの標準誤差及び９５％信頼区間も表中に示す。
【００５３】
この解析結果から、健常者（Ｃ）も含めて多くの種類の肝炎患者を選択的に区別できるバイオマーカー候補が見つかった。例えば、健常者（Ｃ）を識別するバイオマーカーはγ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであり、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅの値によって、他の肝臓疾患と区別することが可能であることが判明した。又、図３から、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕを用いることもできることがわかる。
【００５４】
また薬剤性肝炎（ＤＩ）のバイオマーカーは、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであり、これらを組み合わせて、例えばロジスティック回帰分析し、ｐの値が所定値、例えば０．５より大きいことにより、他の肝臓疾患と区別することができる。この中でも、定量値ｘ1が１増加した場合に確
率ｐがどれだけ変化するのかを表すオッズ比が１を超えて最も大きいγ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅの値が薬剤性肝炎（ＤＩ）の判定に最も寄与している。一方、オッズ比が０に近いγ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕやγ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓはこれらの物質の増加が、薬剤性肝炎以外（非ＤＩ）と判定することに寄与している。ＡＬＴはオッズ比が１．０４と、変数に増加に伴うpの
変化がない１.０に近いため、寄与が小さく、省略できる可能性がある。
【００５５】
また、肝臓がん（ＨＣＣ）のバイオマーカーはＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒであり、これらを組み合わせて、例えばロジスティック回帰分析し、ｐの値が所定値、例えば０．５より大きいことにより、他の肝臓疾患と区別することができる。この中でもオッズ比が１を超えて最も大きいγ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒの値が、肝臓がん（ＨＣＣ）の判定に最も寄与している。一方、オッズ比が０に近いγ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒやγ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕはこれらの物質の増加に伴って肝臓がん以外（非ＨＣＣ）と判定することに寄与している。ＡＳＴとＡＬＴのオッズ比はそれぞれ１．１６、０．８０７と1に近く、寄与率が小さい
ために、省略できる可能性がある。
【００５６】
同様に、他の疾患についても、表２に示したそれぞれのバイオマーカー候補が見つかった。無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）は、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであり、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）は、ＡＳＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓであり、無症状Ｃ型肝炎キャリア（ＡＨＣ）は、ＡＳＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであり、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）は、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｙであった。このうち、オッズ比が1に近いもの、例えばＡＨＢを判別するときのＡＬＴ（１．０４）や、ＣＨＢを判別するときのＡＳＴ（１．０１）などは省略できる可能性もある。
【００５７】
必要最小なマーカーの組み合わせは、ステップワイズ変数選択を実施して探した。即ち、最初変数０個から始めて重要度の高いものの追加、重要度の低いものの削除を繰り返し、最適な組み合わせを求める変数増減法を採用した。今回、追加も削除もスレッシュホールドとしてｐ値＝０．２５を利用した。
【００５８】
しかし、これらのバイオマーカーの寄与率は、症例データの追加によって、モデルを再学習させて、各判別に使うバイオマーカーの組み合わせとロジスティックモデルにおける係数の修正を行い、さらにロジスティックモデルの精度を高めることもできる。
【００５９】
次に受信者動作特性曲線（receiver operating curve：ＲＯＣ曲線）によって、これらのバイオマーカーによる各肝臓疾患スクリーニング検査の精度を評価した。結果を図４及び表３に示す。
【００６０】
【表３】
0005946104.tif 000004
【００６１】
図４や表３では、ある疾患群と他のすべての疾患群を区別する多重ロジスティック回帰モデルの精度を示した。例えば、薬剤性肝障害（ＤＩ）の場合は、ＤＩとＤＩ以外全ての区別を行う。図４や表３で示したように、すべての疾患でＲＯＣ曲線下面積（area under
the receiver-operating curve：ＡＵＣ）は、０．８１から０．９９であり、これらの
バイオマーカーによる各肝臓疾患スクリーニング検査は、高精度に各疾患を特定できることが確認された。特に健常者（Ｃ：ＡＵＣ＝０．９３９）、薬剤性肝障害（ＤＩ：ＡＵＣ＝０．９９８）、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ：ＡＵＣ＝０．９３３）、無症状Ｃ型肝炎キャリア（ＡＨＣ：ＡＵＣ＝０．９４４）、肝臓がん（ＨＣＣ：ＡＵＣ＝０．９３７）は、本法により極めて高精度に特定されることがわかった。
【００６２】
５．他の疾患でのγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチドの評価
γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類が他の疾患でも上昇するか確認した。図５に肝臓がん患者（ＨＣＣ）と胃がん患者（gastric cancer：ＧＣ）の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度を示した。胃がん患者では、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度は、健常者と同等であり、肝臓がん患者のようなγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の増加は見られなかった。(注  ヘ
リコバクターピロリの感染が胃がんの原因であり、ヘリコバクターピロリの感染によって、酸化ストレスは抑制されるという報告がある（参考文献１０）。胃がんは酸化ストレスに曝されていないため、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度は低いのではと推測される。)
【００６３】
また糖尿病患者でも血中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度は低く、血中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の増加は、肝臓疾患特異的に観察された。
【００６４】
６．γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の生合成機序の解明
マウスを用いて、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の生合成機序を解明した。図１（Ｂ）に示したように、活性酸素や親電子物質による酸化ストレス条件下では、これらの物質の除去のためにグルタチオンが枯渇し、それに伴い、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＣＳ）が活性化され、各種のアミノ酸が基質（出発物質）となって、γ−Ｇｌｕ−Ｘジペプチド類やγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙトリペプチド類が生合成されることが判明した。以下に実験手順を示す。
【００６５】
ａ．ＧＣＳ阻害剤ＢＳＯおよび活性化剤ＤＥＭのマウスへの投与
一晩絶食させたオスのマウスにペントバルビタルナトリウム（体重１Ｋｇ当たり６０ｍｇ）を腹膜内注射して麻酔後、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＣＳ）阻害剤であるＢＳＯ、親電子物質（ＧＣＳ活性化剤）であるDiethylmaleate（ＤＥＭ）、さらに健常として生理食塩水を体重１Ｋｇ当たりそれぞれ４ｍｍｏｌ／ｋｇ（ＢＳＯ８８８ｍｇ、ＤＥＭ６８８ｍｇ）を腹腔内に注射した。投与１時間後にマウスから肝臓（約３００ｍｇ）を採取した（各５回）。
【００６６】
ｂ．肝臓から代謝物質の抽出
マウスから摘出した肝臓（約３００ｍｇ）は直ちに内部標準物質入りのメタノール１ｍｌに入れ、ホモジナイズして酵素を失活させ、代謝の亢進を止めた。５００μｌの純水を加えた後、３００μｌの溶液を取り出し、２００μｌのクロロホルムを加え良く攪拌後、さらに４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心した。静置後、分離した水−メタノール相３００μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした。ろ液を凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５０μｌを加え、それをＣＥ−ＴＯＦＭＳ測定に供した。
【００６７】
ｃ．酸化ストレスを示すγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類バイオマーカーの特定結果
生理食塩水（健常）、ＢＳＯ、ＤＥＭ投与後のマウスの肝臓および血清中のアミノ酸、γ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類の測定結果の一部を図６に示す。左から、それぞれの試薬を投与したマウスの肝臓から検出されたアミノ酸（Ｘ）、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチドの定量結果、右に血清中のアミノ酸（Ｘ）、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチドの定量結果を示す。
【００６８】
例えば一番上は、Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ-Ｇｌｙ（グルタ
チオン）の結果である。肝臓中のグルタチオン量は健常に比較し、ＢＳＯ、ＤＥＭ投与マウスでは急激に減少した（ＢＳＯ投与ではγ−グルタミルシステイン合成酵素が阻害されるためグルタチオンは減少し、親電子物質ＤＥＭ投与マウスでは解毒のため消費されるからグルタチオンは減少する）。血清からグルタチオン関連物質は検出されなかった。
【００６９】
検出されたγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類が、グルタチオン生合成経路で合成されていることを以下の方法で確認した。図７に示すように、これらのペプチド類がグルタチオン生合成経路で合成されていれば、肝臓中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−ＧｌｙペプチドはＢＳＯ投与で（γ−グルタミルシステイン合成酵素が阻害されるため）健常より減少し、親電子物質ＤＥＭ投与で（γ−グルタミルシステイン合成酵素が活性化されるため）増加するはずである。図６のように、グルタチオン関連のγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、ＧＳＨ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ以外の肝臓中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類物質は、健常より、ＢＳＯ投与で減少し、ＤＥＭ投与で増加しており、確かにグルタチオン生合成経路によって生成されていることが確認された。
【００７０】
つまり、これらのγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類は、活性酸素や親電子物質などの酸化ストレスによって、グルタチオンが減少した際に肝臓内で生合成されることがわかった。
【００７１】
ｄ．スレオニン同位体による生合成経路追跡
さらにスレオニン（Ｔｈｒ）の１３Ｃ、１５Ｎの同位体を腹腔内投与し、親電子物質を生じて酸化ストレスを与えるＡＰＡＰを加えたところ、マウスの肝臓からＴｈｒの１３Ｃ、１５Ｎのγ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ-Ｇｌｙが検出され、確かに、酸化
ストレス条件下では、Ｔｈｒからγ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙが生合成されることが確認された。
【００７２】
一方、マウスの血清中の物質では、健常より、ＢＳＯ投与で減少し、電子物質ＤＥＭ投与で増加するγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類は、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢとオフタルミン酸（γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ−Ｇｌｙ）のみであった（図６）。したがってマウスの場合は、親電子物質などの酸化ストレスによって、グルタチオンが減少した際に血中で増加するのは、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢとオフタルミン酸のみと考えられる。
【００７３】
しかし、各種の肝炎患者の血清測定では、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ、オフタルミン酸より、他のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度の方が高かった。この違いは、生物種間で、基質濃度、代謝酵素の基質特異性や活性、トランスポーターの種類、機能、発現量などが異なるからと推定される。
【００７４】
本発明による血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類測定による診断法は、肝硬変（cirrhosis）や非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性肝炎（ＮＡＳＨ）、
単純脂肪肝（ＳＳ）などの各種の肝障害の診断も可能である。今回は、各種の肝障害のマーカー候補のＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の組み合わせの例を記したが、それらに特定されるわけではなく、今後さらに多検体の精査を行うことで、バイオマーカー候補の種類組み合わせは変更される場合もある。
【００７５】
また今回は血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類測定には、ＬＣ−ＭＳ法を用いたが、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、チップＬＣや、チップＣＥ、それらに質量分析計（ＭＳ）を組み合わせたＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＣＥ−ＭＳ法、各種のＭＳ単独の測定法、ＮＭＲ法、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を蛍光物質やＵＶ吸収物質に誘導体化してから測定する方法、抗体を作成してＥＬＩＳＡ法などで測定するなど、測定法にこだわらず、あらゆる分析法で測定することが可能である。
【００７６】
上述したように、本発明のマーカーは、疾病の診断に用いることができる。その時、複数のマーカーを用いることによって、診断精度を上げることができる。また、本発明のマーカー以外の診断方法を組み合わせても構わない。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明で発見した生体で生じた酸化ストレスによってグルタチオンの枯渇を示すγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチドバイオマーカーは、各種の肝障害患者の迅速なスクリーニング法として有用であるばかりでなく、生体の酸化ストレスを把握するマーカーとして、幅広い生命科学分野で使用することが可能である。
【図２】
0005946104.tif 000005
【図１】
0005946104.tif 000006
【図３】
0005946104.tif 000007
【図４】
0005946104.tif 000008
【図５】
0005946104.tif 000009
【図６】
0005946104.tif 000010
【図７】
0005946104.tif 000011