(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子および第1のフェノール含有部分の第1の結合体であって、高分子がヒアルロン酸、またはデキストランを含む、結合体; ならびに
ゼラチンおよび第2のフェノール含有部分の第2の結合体
を含む複合材料であって、
第1の結合体が第2の結合体よりも低い細胞接着性であり、第1および第2の結合体の少なくとも1つが架橋されてマトリックスを形成し、かつ前記複合材料は、第1および第2の結合体の一方に富む不連続領域(discrete region)を含み、
前記複合材料は、5kPa以下の貯蔵弾性率を有し、かつ前記不連続領域は、10 nm〜500 μmの平均サイズを有する、
複合材料。
【請求項２】
複合材料ヒドロゲルである、請求項1記載の複合材料。
【請求項３】
第1のフェノール含有部分および第2のフェノール含有部分の少なくとも1つがチラミンまたはヒドロキシフェニルプロピオン酸を含む、請求項1または2記載の複合材料。
【請求項４】
第2の結合体がゼラチンおよびチラミンを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の複合材料。
【請求項５】
第2の結合体がゼラチンおよびチラミンの結合体、ならびにゼラチンおよびヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合体を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の複合材料。
【請求項６】
第1の結合体が高分子およびチラミンの結合体、ならびに高分子およびヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合体を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の複合材料。
【請求項７】
不連続領域は第2の結合体に富む、請求項1〜6のいずれか一項記載の複合材料。
【請求項８】
隣接する不連続領域間の平均距離が5 nm〜500 μmである、請求項1〜7のいずれか一項記載の複合材料。
【請求項９】
第1の結合体が細胞に対して非接着性である、請求項1〜8のいずれか一項記載の複合材料。
【請求項１０】
複合材料を形成させるための溶液中で第1および第2の結合体の前駆物質を混合する段階; ならびに
溶液中に触媒を分散させて第1および第2の結合体の少なくとも1つの架橋を触媒し、マトリックスを形成させる段階
を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の複合材料を形成させる方法。
【請求項１１】
第1および第2の結合体の一方が、予め選択された範囲のサイズを有する不連続領域中で濃縮されるように、触媒が、架橋の速度を制御するように選択された量で、溶液中に分散される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
触媒が西洋ワサビペルオキシダーゼおよびH2O2の少なくとも1つを含む、請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
触媒が西洋ワサビペルオキシダーゼおよびH2O2を含む、請求項10または11記載の方法。
【請求項１４】
溶液中の西洋ワサビペルオキシダーゼの濃度が架橋の速度を制御するように選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
溶液中のH2O2の濃度が複合材料の剛度を制御するように選択される、請求項13または請求項14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2010年4月23日付で出願され、かつ「Development of Hydrogels with Phase-Separated Structure for Tissue Engineering」という発明の名称が付されたシンガポール特許出願第SG 201002882-7号の恩典、およびその優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
本発明は広くは、複合材料および複合材料を形成させるための過程に関し、具体的には相分離された複合材料ヒドロゲルおよびその形成過程に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
複合材料ヒドロゲルのような複合生体材料は、医学的および生物学的応用を含む種々の応用において有用であることができる。例えば、それらは治療的応用、組織工学応用、または細胞培養応用において有用でありうる。生細胞を伴う応用においては、細胞周囲の微小環境を制御すること、またはさまざまな目的のために微小環境を改変できることが望ましい。
【０００４】
相互貫通高分子ネットワーク(IPN)を含有する複合材料は、光架橋高分子ネットワークの形成を通じて調製することができ、相構造およびIPNの形態がその物理的特性を決定することが報告されている。Peng et al., 「Hydrogel-elastomer composite biomaterials: 3, Effects of gelatin molecular weight and type on the preparation and physical properties of interpenetrating polymer networks」, J. Mater. Sci.: Mater.-Med. (2008) 19:997-1007 (「Peng」) (非特許文献1)を参照されたい。Pengは、大部分の研究が、IPNの構造、形態および特性に及ぼす組成および調製化学の改変の影響の理解に向けられてきたことや、照射強度、反応温度および化学構造の変化を通じたIPN形態の制御も調べられてきたことを述べている。
【０００５】
光化学的に架橋された複合材料ヒドロゲルの応用は、場合により制限されることがある。例えば、カプセル化細胞を有する3次元(3D)ヒドロゲルは、光化学技法と適合しない。酵素によって制御される架橋技法の使用は、場合により、細胞をカプセル化した移植可能なヒドロゲルを与えるため、より好ましい可能性がある。
【０００６】
注入可能なヒドロゲルもまた、光化学架橋技法と適合しない。酵素によって制御される架橋技法は、場合により、生きている生物への注入用の移植可能な複合材料ヒドロゲル系を与えるため、より好ましい可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Peng et al., 「Hydrogel-elastomer composite biomaterials: 3, Effects of gelatin molecular weight and type on the preparation and physical properties of interpenetrating polymer networks」, J. Mater. Sci.: Mater.-Med. (2008) 19:997-1007
【発明の概要】
【０００８】
概要
本発明の局面によれば、高分子および第1のフェノール含有部分の第1の結合体、ならびにゼラチンまたはコラーゲンおよび第2のフェノール含有部分の第2の結合体を含む複合材料であって、高分子が、第1の結合体が第2の結合体よりも低い細胞接着性であるように選択され、第1および第2の結合体の少なくとも1つが架橋されてマトリックスを形成し、かつ複合材料が第1および第2の結合体の一方に富む不連続領域(discrete region)を含む、複合材料が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる局面によれば、複合材料を形成させるための溶液中で第1および第2の結合体の前駆物質を混合する段階; ならびに溶液中に触媒を分散させて第1および第2の結合体の少なくとも1つの架橋を触媒し、マトリックスを形成させる段階を含む、上記の複合材料を形成させる方法が提供される。
【００１０】
本発明の別の局面によれば、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンを含む複合材料であって、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つがフェノール含有部分と結合され、高分子がゼラチンまたはコラーゲンよりも低い細胞接着性であり、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つが架橋されてマトリックスを形成し、かつ複合材料が、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの1つに富む不連続領域を含む、該複合材料が提供される。
【００１１】
本発明のさらなる局面によれば、複合材料を形成させるための溶液中で高分子およびゼラチンまたはコラーゲンを混合し、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つがフェノール含有部分と結合される段階; ならびに溶液中に触媒を分散させて高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つの架橋を触媒し、マトリックスを形成させる段階を含む、上記の複合材料を形成させる方法が提供される。
【００１２】
[本発明1001]
高分子および第1のフェノール含有部分の第1の結合体; ならびに
ゼラチンまたはコラーゲンおよび第2のフェノール含有部分の第2の結合体
を含む複合材料であって、
高分子は、第1の結合体が第2の結合体よりも低い細胞接着性であるように選択され、第1および第2の結合体の少なくとも1つが架橋されてマトリックスを形成し、かつ前記複合材料は、第1および第2の結合体の一方に富む不連続領域(discrete region)を含む、
複合材料。
[本発明1002]
複合材料ヒドロゲルである、本発明1001の複合材料。
[本発明1003]
高分子がヒアルロン酸、ポリ(エチレングリコール)、またはデキストランを含む、本発明1001または本発明1002の複合材料。
[本発明1004]
第1のフェノール含有部分および第2のフェノール含有部分の少なくとも1つがチラミンまたはヒドロキシフェニルプロピオン酸を含む、本発明1001〜1003のいずれかの複合材料。
[本発明1005]
第2の結合体がゼラチンを含む、本発明1001〜1004のいずれかの複合材料。
[本発明1006]
第2の結合体がゼラチンおよびチラミンの結合体、ならびにゼラチンおよびヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合体を含む、本発明1001〜1005のいずれかの複合材料。
[本発明1007]
第1の結合体が高分子およびチラミンの結合体、ならびに高分子およびヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合体を含む、本発明1001〜1006のいずれかの複合材料。
[本発明1008]
不連続領域は第2の結合体に富む、本発明1001〜1007のいずれかの複合材料。
[本発明1009]
不連続領域が約10 nm〜約500 μmの平均サイズを有し、かつ隣接する不連続領域間の平均距離が約5 nm〜約500 μmである、本発明1001〜1008のいずれかの複合材料。
[本発明1010]
第1の結合体が細胞に対して非接着性である、本発明1001〜1009のいずれかの複合材料。
[本発明1011]
複合材料を形成させるための溶液中で第1および第2の結合体の前駆物質を混合する段階; ならびに
溶液中に触媒を分散させて第1および第2の結合体の少なくとも1つの架橋を触媒し、マトリックスを形成させる段階
を含む、本発明1001〜1010のいずれかの複合材料を形成させる方法。
[本発明1012]
第1および第2の結合体の一方が、予め選択された範囲のサイズを有する不連続領域中で濃縮されるように、触媒が、架橋の速度を制御するように選択された量で、溶液中に分散される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
触媒が西洋ワサビペルオキシダーゼおよびH2O2の少なくとも1つを含む、本発明1011または1012の方法。
[本発明1014]
触媒が西洋ワサビペルオキシダーゼおよびH2O2を含む、本発明1011または1013の方法。
[本発明1015]
溶液中の西洋ワサビペルオキシダーゼの濃度が架橋の速度を制御するように選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
溶液中のH2O2の濃度が複合材料の剛度を制御するように選択される、本発明1014または本発明1015の方法。
[本発明1017]
高分子; および
ゼラチンまたはコラーゲン
を含む複合材料であって、
高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つがフェノール含有部分と結合され、高分子がゼラチンまたはコラーゲンよりも低い細胞接着性であり、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つが架橋されてマトリックスを形成し、かつ前記複合材料は、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの1つに富む不連続領域を含む、
複合材料。
[本発明1018]
複合材料を形成させるための溶液中で高分子およびゼラチンまたはコラーゲンを混合する段階であって、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つはフェノール含有部分と結合される、段階; ならびに
溶液中に触媒を分散させて高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つの架橋を触媒し、マトリックスを形成させる段階
を含む、本発明1017の複合材料を形成させる方法。
本発明の他の局面、特徴および態様は、添付の図面とともに本発明の具体的な態様に関する以下の説明を考慮することによって当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図中で、ほんの一例として、本発明の態様を例証する。
【図１】本発明の例示的な態様による固定した濃度のH2O2で調製されたGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの剛度を描く線グラフである。
【図２】本発明の例示的な態様による固定した濃度のH2O2で調製されたGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルのゲル化時間を描く線グラフである。
【図３】本発明の例示的な態様による別の固定した濃度のH2O2で調製されたGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの剛度を描く線グラフである。
【図４】本発明の例示的な態様による別の固定した濃度のH2O2で調製されたGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルのゲル化時間を描く線グラフである。
【図５】図5A〜Fは、異なる濃度のHRPで撮った、図1および2のGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの相分離された構造を描く共焦点像である。
【図６】図6A〜Fは、異なる濃度のHRPで撮った、図1および2のGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの相分離された構造を描く共焦点像である。
【図７】図7A〜Eは、異なる濃度のHRPで撮った、図3および4のGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの相分離された構造を描く共焦点像である。
【図８】図8A〜Fは、異なる濃度のHRPで撮った、図3および4のGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの相分離された構造を描く共焦点像である。
【図９】図9A〜Cは、異なるサンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの相分離された構造を描く共焦点像である。
【図１０】図9A、9Bおよび9Cの異なるサンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルでの経時的な細胞増殖の線グラフである。
【図１１】図11A〜Fは、別の異なるサンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの相分離された構造を描く共焦点像である。
【図１２】図11Cおよび11Fの異なるサンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルでの肝細胞によるアルブミン産生を描く棒グラフである。
【図１３】異なるサンプルGtn-HPAヒドロゲル(比較用)での経時的な肝細胞によるアルブミン産生を描く線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
複合材料は第1の結合体および第2の結合体を含む。1つの態様において、第1の結合体は高分子および第1の部分、好ましくはフェノール含有部分から形成される。第2の結合体はゼラチンまたはコラーゲンおよび第2の部分、好ましくはフェノール含有部分から形成される。複合材料は複合材料ヒドロゲルの形成でありうる。理解されるように、ヒドロゲルは、水のような液体を吸収できる高分子マトリックスを含む。本明細書において用いられる場合、ヒドロゲルは、吸収された任意の液体を有する高分子マトリックス、またはその乾燥状態にある(すなわち、吸収された液体を有さない)高分子マトリックスのいずれかをいうことができる。
【００１５】
本明細書において用いられる場合、結合体は、少なくとも1つの化学結合、例えば共有結合、または非共有結合、例えばイオン結合、および水素結合によって結合されている、少なくとも2つの成分を含むことができる。
【００１６】
第1の結合体の高分子は、第1の結合体が第2の結合体よりも低い細胞接着性であるように選択される。選択される態様において、第1の結合体は細胞に対して非接着性である。細胞接着は材料の表面への細胞の結合を伴う。材料は、細胞が材料と結合するのにより低い親和性を有する傾向があるなら、より低い細胞接着性である。材料は、細胞が材料と結合する傾向がない場合、細胞に対して非接着性と考えられる。より低い細胞接着性の材料は陽イオン性の電荷またはリガンド、例えばRGDペプチド配列を含むことができない。細胞に対する材料の接着性は、一定期間、材料表面上で細胞を培養する段階、および培養細胞が表面に接着するかどうか観察する段階によって測定することができる。例えば、材料上に細胞を播種した後に、材料を所定の期間インキュベートする。次いで培地を新鮮な培地に交換し、その後、材料に対する細胞接着性を当業者に公知の任意の適用可能な方法によって測定する。
【００１７】
選択される態様において、第1の結合体における高分子はヒアルロン酸(HA)でありうる。いくつかの態様において、高分子はポリ(エチレングリコール) (PEG)でありうる。いくつかの態様において、高分子はデキストランでありうる。高分子はそれ自体が結合体でありうる。適当な高分子はアルデヒド末端、カルボキシル末端、アミノ末端もしくはスクシンイミド末端ポリ(エチレングリコール)、アルデヒト誘導体化もしくはアミノ誘導体化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタール結合体、シクロトリホスファゼンコアフェノキシメチル(メチルヒドラゾノ)デンドリマー、チオホスホリルコアフェノキシメチル(メチルヒドラゾノ)デンドリマー、アルデヒド誘導体化、カルボキシル誘導体化、アミノ誘導体化もしくはスクシンイミド誘導体化デキストランなどを含むことができる。
【００１８】
結合体におけるフェノール含有部分は、結合体を架橋するための架橋性フェノール基を提供できる任意の適当な部分であってよい。第1のフェノール含有部分および第2のフェノール含有部分は同じであってもまたは異なってもよい。例えば、チラミン(Tyr)、ヒドロキシフェニルプロピオン酸(HPA)、カテキンに基づくフラボノイドなどをフェノール含有部分に含めることができる。フェノール含有部分はHPAおよびTyrを含むことができる。いくつかの態様において、第1のフェノール含有部分および第2のフェノール含有部分の少なくとも1つがTyrおよび/またはHPAを含む。いくつかの態様において、第1の結合体におけるフェノール含有部分はチラミンを含むことができ、第2の結合体におけるフェノール含有部分は3,4-ヒドロキシフェニルプロピオン酸(3,4-HPA)などの、ヒドロキシフェニルプロピオン酸(HPA)を含むことができる。いくつかの態様において、第1の結合体のフェノール含有部分は、第1の結合体が高分子およびHPAの結合体、ならびに/または高分子およびTyrの結合体を含むような、3,4-HPAなどのHPA、および/またはTyrを含むことができる。いくつかの態様において、第2の結合体のフェノール含有部分は、第2の結合体がゼラチンおよびHPAの結合体ならびに/またはゼラチンおよびTyrの結合体を含むような、3,4-HPAなどのHPA、および/またはTyrを含むことができる。
【００１９】
選択される態様において、フラボノイドをフェノール含有部分として用いることもできる。フラボノイドは、コアのフェニルベンジルピロン構造に由来する分子の一般的なクラスからの任意のフラボノイドであることができ、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバン-3-オール、カテキン、アントシアニジンおよびカルコンを含むことができる。特定の態様において、フラボノイドはカテキンまたはカテキンに基づくフラボノイドであることができる。カテキンまたはカテキンに基づくフラボノイドは、カテキン(またはフラバン-3-オール誘導体)として一般的に公知のクラスに属する任意のフラボノイドであり、エピカテキン、エピガロカテキン、カテキン、エピカテキンガラートおよびエピガロカテキンガラートを含めて、ならびにカテキンまたはカテキンに基づくフラボノイドの可能な全ての立体異性体を含めて、カテキンおよびカテキン誘導体を含む。選択される特定の態様において、カテキンに基づくフラボノイドは、(+)-カテキンまたは(-)-エピガロカテキンガラートである。いくつかの応用において、(-)-エピガロカテキンガラート(EGCG)が選択されうる。というのは、おそらく、このフラボノイドのトリヒドロキシB環およびC3位のガラートエステル部分により、カテキンに基づくフラボノイドの中で最も高い活性を有すると期待されるからである。例えば、第1の結合体における部分としてEGCGを含めることができる。
【００２０】
1つの態様において、第1の結合体はHA-Tyr結合体である。別の態様において、第1の結合体はPEG-EGCG結合体、PEG-Tyr結合体またはPEG-HPA結合体である。いくつかの態様において、第1の結合体は2006年11月23日付で公開されたZhouらのWO/2006/124000 (「Zhou」)に記述されている結合体であることができ、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、第1の結合体はデキストラン-Tyrまたはデキストラン-HPA結合体であることができる。いくつかの態様において、HA-Tyr結合体が好ましい。第1の結合体は、ゼラチンまたはコラーゲンおよび第2のフェノール含有部分の第2の結合体がゲルを形成できる限り、PEG、HAおよびデキストランのような未改変の高分子であることもできる。
【００２１】
選択される態様において、第2の結合体はゼラチンを含むことができる。他の態様において、第2の結合体はコラーゲンを含むことができる。いくつかの態様において、第2の結合体は、ゼラチンであってもよい、ゼラチン部分を含むことができ、またはゼラチンの変種もしくは誘導体を含むことができる。いくつかの態様において、ゼラチン部分はゼラチンおよび1つまたは複数の他の成分を含むことができる。第2の結合体は、高分子および第1のフェノール含有部分の第1の結合体がゲルを形成できる限り、未改変のゼラチンまたはコラーゲンであることもできる。
【００２２】
第1および第2の結合体は、2010年3月25日付で公開されたKurisawaらのUS 2010/0074956 (「Kurisawa」)に記述されている1つまたは複数の結合体を含むことができ、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２３】
例えば、結合体は水溶性であってよく、十分な結合度(degree of conjugation)、例えば約6の結合度、または結合率(percentage of conjugation)、例えば約90%の結合で、フェノール化合物と結合できる官能基を有してもよい。結合度または結合率はNMR測定のような、公知の方法によって好都合に測定することができる。例として、HA-Tyr結合体の場合、結合度はHAの100繰り返し単位中に結合されたチラミンの数と定義され、これはNMR測定によって容易に判定することができる。ゼラチン-HPA結合体の場合、結合前後のアミノ官能基の数をNMR測定によって評価する。結合度または結合率は、ヒドロゲルを形成でき、および/またはヒドロゲル上での細胞付着を維持できれば、十分である。適当な結合体はヒドロキシル、アミノ、カルボキシルまたはスクシンイミド基などのような官能基を有することができる。さらなる適当な結合体はデキストラン、キチン、キトサン、ヘパリンなどを含むこともできる。結合体の任意の特定の組み合わせにおいて、結合体の一方は他方の結合体よりも低い細胞接着性でなければならない。例えば、選択される態様において、第2の結合体は、細胞接着性であるように選択され、第1の結合体は、細胞非接着性であるように選択される。
【００２４】
別の態様において、第1の結合体は高分子から形成されることができ、第2の結合体はゼラチンまたはコラーゲンから形成されることができ、第1および第2の結合体の1つだけが、フェノール含有部分であってよい、部分を含む。この態様において、複合材料は高分子およびゼラチンまたはコラーゲンを含み、ここで高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つがフェノール含有部分と結合され、高分子がゼラチンまたはコラーゲンよりも低い細胞接着性であり、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの少なくとも1つが架橋されてマトリックスを形成し、かつ複合材料が、高分子およびゼラチンまたはコラーゲンの1つに富む不連続領域を含む。
【００２５】
複合材料における第1および第2の結合体の少なくとも1つが架橋されてマトリックスを形成する。結合体の分子は結合体におけるフェノール基を通じて架橋することができる。いくつかの態様において、第1の結合体の分子が架橋されてマトリックスを形成することができる。いくつかの態様において、第2の結合体の分子が架橋されてマトリックスを形成することができる。いくつかの態様において、両方の結合体の分子が架橋されてマトリックスを形成することができる。選択される態様において、例えば、第1および第2の結合体の1つがフェノール含有部分を含まない場合、マトリックスは相互貫通高分子ネットワーク(IPN)であることができる。選択される態様において、第1の結合体および第2の結合体の両方がフェノール含有部分を含む場合、2つの高分子ネットワークが共有結合され、IPNではない複合材料ヒドロゲルを形成することができる。
【００２６】
いくつかの態様において、複合材料は、1種類の結合体に富む不連続領域(「ドメイン(domain)」ともいわれる)を含むことができる。いくつかの態様において、複合材料は、第2の結合体においてゼラチンまたはコラーゲンに富んだ不連続領域(「ドメイン」)を含むことができる。不連続領域は、不連続領域における材料「M」の濃度が不連続領域周辺の隣接領域におけるよりもかなり高い場合、「M」に富む(「Mに富んだ」)。領域における「M」の濃度が隣接領域におけるよりもかなり低い場合、領域は「Mが不十分な」領域である。「Mが不十分な」領域は「M」を実質的に含まない可能性がある。不連続領域における結合体は局所的に架橋され、不連続領域において別個のヒドロゲルを形成してもよい。いくつかの態様において、不連続領域における結合体は隣接領域における結合体と架橋してもよい。
【００２７】
不連続領域がより高濃度の第1の結合体を有する(すなわち第1の結合体に富み、かつ第2の結合体が不十分である)場合、それらは細胞に対して低い接着性である。不連続領域がより高濃度の第2の結合体を有する(すなわち第1の結合体が不十分であり、かつ第2の結合体に富む)場合、それらは細胞に対して高い接着性である。高分子が細胞に対して非接着性である場合、高分子に富んだ領域は細胞に対して非接着性であることができる。例えば、HAに富んだ領域は細胞に対して一般的に非接着性であり、ゼラチンに富んだ領域またはコラーゲンに富んだ領域は細胞に対して一般的に接着性である。
【００２８】
不連続領域は異なる形状を有することができ、2次元(2D)領域または3次元(3D)領域をいうことができる。不連続領域は不規則な形状を有することができ、サイズが異なることができる。不連続領域が一般的に、球形状または円形状を有する場合、不連続領域のサイズはその直径によって測定することができる。非球形の、または非円形の不連続領域のサイズは領域のうちの最長の長さをいうことができ、あるいは必要とされる応用、利便性または精度に依り、当該の不連続領域と同じ面積または容積を有する円形または球形の参照領域の直径として計算することができる。
【００２９】
不連続領域のサイズおよびその間の距離は、約ナノメートルからマイクロメートルであることができる。いくつかの態様において、不連続領域は約10 nm〜約500 μm、例えば約10 nm〜約100 μmの平均サイズを有することができる。
【００３０】
2つの隣接する不連続領域間の距離(最短の距離)は異なることもできる。隣接する不連続領域間の平均距離は約5 nm〜約500 μm、例えば約5 nm〜約50 μmであることができる。
【００３１】
理解されるように、領域間の距離および領域のサイズは例えば、共焦点像のような、複合材料の画像の観察により、または動的レーザー測定により、測定または推定することができる。
【００３２】
理解されるように、不連続領域のサイズおよび隣接する不連続領域間の距離は複合材料における相分離度を反映する。複合材料は、第1の結合体から形成される相および第2の結合体から形成される相を有するものと考えることができる。以下でさらに論じられるように、複合材料は異なる相分離度で形成させることができる。例えば、形成過程によっては、2つの結合体が架橋されて、2相の間に明らかな分離のない統合ネットワークを形成することもありうる。2つの結合体が架橋されて、相分離された構造を有する複合材料を形成することもある。
【００３３】
好都合には、例示的な複合材料は、異なる細胞接着性を有する異なる領域(分離された相)を有する。以下でさらに記述されるように、不連続領域(ドメイン)のサイズおよび領域間の距離、換言すれば、相分離度は、形成過程中に好都合に制御することができる。したがって、例示的な複合材料は、異なるかつ所望とされる微小環境を細胞に与えるように好都合に適合させることができる。
【００３４】
複合材料は、その応用に依存して、薬物、タンパク質または細胞のような他の所望の添加物をさらに含有しうる。薬物は治療用タンパク質を含みうる。例えば、インターフェロン、ハーセプチンなどを複合材料に含めてもよい。α-アミラーゼ、リゾチームなどのような、非治療用タンパク質を溶液中に含めてもよい。細胞はヒト間充織幹細胞のような、幹細胞を含んでもよい。他の添加物の量は、特定の応用に依存して選択されうる。しかしながら、他の添加物の添加は、形成される複合材料ヒドロゲルの機械的強度(例えば剛度)または他の特性に影響を及ぼすことがあり、またはゲル化率のような、形成過程に影響を及ぼすことがあることに留意すべきである。したがって、どのようなおよびどのくらいの他の添加物を含めるかに依存して、H2O2もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)またはその両方のような、触媒の濃度を、そのような影響を相殺するように調節する必要がありうる。
【００３５】
本発明の別の例示的な態様は上記の複合材料を形成させる方法に関する。複合材料を他の方法によって調製または形成できることも理解すべきである。
【００３６】
例示的な方法において、複合材料を形成させるための溶液中で第1および第2の結合体の前駆物質を混合し、溶液中に触媒または触媒の組み合わせを加え、分散させて第1および第2の結合体の少なくとも1つの架橋を触媒し、ヒドロゲルマトリックスを形成させる。マトリックスの架橋はこのようにして、化学的におよび/または酵素的に開始される。
【００３７】
前駆物質は、架橋される所望の結合体に基づいて選択されうる。前駆物質の選択およびその調製、ならびに結合体の架橋は、使用される特定の化合物に依存して改変の有無にかかわらず、Zhou (上記)およびKurisawa (上記)に記述されているように行うことができる。特定の態様において、第1および第2の結合体は、カルボジイミド/活性エステル媒介カップリング反応を通じて、それぞれ形成されうる。
【００３８】
結合体は、触媒の存在によって触媒されうる、結合体におけるフェノール基の酸化カップリングを通じて架橋されてもよい。例示的な態様において、触媒は西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)およびH2O2を含みうる。選択される態様において、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびH2O2の両方を用いうる。理解されるように、フェノールは芳香環のオルト位炭素間のC-C連結またはオルト位炭素とフェノール性酸素との間のC-O連結のいずれかを通じて架橋することができる。
【００３９】
選択される態様において、ゲル化溶液は、結合体を架橋して複合材料ヒドロゲルを形成させるために有効量のHRPを含有する。HRPの量は、典型的には、単位(U)で規定または測定される。HRPの1単位は標準的な条件の下、1分で1 μmolの基質の反応を触媒するHRPの量である。例えば、ゲル化溶液は、約0.01〜約2.0単位/ml、または約0.02〜約0.2単位/mlのHRPを含有することができる。HRPの濃度はg/mlで代替的に表現することもできる。例えば、HRPは100 U/mgで利用可能でありえ、その場合、溶液は約0.1〜約20 μg/ml、例えば約0.2〜約2.0 μg/mlのHRPを含有すると考えられる。
【００４０】
HRPの濃度はKurisawa (上記)において説明されているように、所定の時間でゲル化点に到達するように選択されうる。いくつかの態様において、最適なHRP濃度は、第1および第2の結合体の重量比(wt比)ならびにH2O2の濃度をともに固定したところで複合材料ヒドロゲルの所望の剛度、所望のゲル化時間ならびにその結果、所望の相分離を達成するように選択されうる。例えば、反応溶液は約0.062単位/mlのHRPを含有することができる。第1および第2の結合体の重量比ならびにH2O2定数の濃度を保持しながら、より高い、例えば1つの態様では約0.2単位/ml超の、HRP濃度で、より高い剛度、より少ないゲル化時間およびより少ない相分離を有する複合材料ヒドロゲルを得ることができる。理解されるように、HRP濃度を変化させることで、ゲル化率/速度および架橋効率を変化させることができ、これによって今度は、複合材料ヒドロゲルにおける相分離に影響を与えることができる。
【００４１】
好都合には、溶液中に分散された触媒の1つまたは複数が、例えば不連続領域のサイズおよび不連続領域間の距離に反映される、相分離度を制御するために、架橋の速度を制御して結合体の1つが不連続領域中で濃縮することを可能とするように選択された量を有してもよい。例えば、HRP濃度は、架橋の速度を制御して、予め選択された範囲のサイズを有する不連続領域を得るように選択されうる。
【００４２】
このために、溶液中の、HRPなどの触媒の濃度と、2つの相の1つから形成された不連続領域のサイズとの間の相関関係は、例えば事前試験を通じて、得ることができる。触媒の量または濃度を次いで、この相関関係に基づき相分離度を制御するように選択することができる。相関関係はグラフ、表、方程式として、またはデータベース中で表現することができる。
【００４３】
同様に好都合には、HRPおよびH2O2の両方が用いられる場合、溶液中のH2O2の濃度は、形成される複合材料の剛度を制御するように選択することができる。その結果、ゲル化溶液中のHRPおよびH2O2の濃度を調節することにより、複合材料の相分離度および剛度の両方を好都合に制御することができる。
【００４４】
いくつかの態様において、結合体は水溶性であってもよい。異なる態様において、第1の結合体と第2の結合体との重量比は、約9:1から約1:9まで変化しうる。異なる態様において、重量比は9:1、8:2、8.5:1.5または7:3である。
【００４５】
今や理解されるように、例示的な方法において、H2O2もしくはHRPまたはその両方の濃度を変化させることで、複合材料の剛度を制御することができる。複合材料における相分離度は、適切なHRP濃度の選択を通じて、ゲル化率を調節することにより制御することができる。具体的には、HRP濃度を増加させることによって相分離度を低減することができる。
【００４６】
いずれかの特定の理論に限定されるものではないが、ゲル化速度が速い場合、架橋される分子はサイズを大きくするための、およびその分子量を増やすための時間が少ないものと予想される。より小さな分子量を有する分子は、異なる相へ分離する可能性が低いものと予想される。したがって、より速いゲル化速度は相分離の低減をもたらしうるものと予想することができる。
【００４７】
本明細書において記述される例示的な複合材料を用いれば、リソグラフ過程、または光開始架橋を用いることなく、細胞接着領域および細胞非接着領域の表面パターンを好都合に提供および制御することができる。複合材料を用いて、注入可能な系または活性薬剤送達性の担体を提供することができ、制御された微小環境を提供することができる。
【００４８】
異なる相分離度を有する複合材料ヒドロゲルを形成させるために、異なる結合体重量比および/または異なるHRP濃度を用いることができる。1つの態様において、Gln-HPA結合体、HA-Tyr結合体、HRPおよびH2O2を混合してGln-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルを形成させる。Gln-HPA結合体およびHA-Tyr結合体を混合の前に、蒸留水にそれぞれ溶解する。1つの態様において、重量比Gln-HPA:HA-Tyr = 9:1、別の態様において、重量比Gln-HPA:HA-Tyr = 8:2、別の態様において、重量比Gln-HPA:HA-Tyr = 8.5:1.5、別の態様において、重量比Gln-HPA:HA-Tyr = 7.0:3:0である。HRPの濃度は約0.01〜約2.0単位/mlまたは約0.02〜約0.2単位/mlに及ぶ。H2O2の濃度は0.175 mM、0.88 mM、8.5 mMまたは17 mMのような、約1 mM〜約17 mMの範囲でありうる。
【００４９】
複合材料ヒドロゲルの形成のための一般的なスキームをスキームIに示す。
スキームI
0005941457.tif 000002
【００５０】
同様に好都合には、相分離度は複合材料における第1および第2の結合体の組成または重量比を変化させずに制御できるので、複合材料は、より好都合に形成されることができ、異なる剛度および異なる細胞接着性を含め、多種多様の特性で形成されることができる。
【００５１】
複合材料は、Gtn-HPAのような、第2の結合体から形成されたヒドロゲルにおける細胞増殖と比べて、複合材料における細胞増殖を増強するように特異的にデザインおよび形成されてもよい。
【００５２】
いくつかの態様において、細胞接着領域および細胞非接着領域の両方の存在により、複合材料における細胞増殖を改善することができる。結果として、複合材料の剛度が比較的低い場合でさえ、満足のいく細胞増殖を依然として達成することができる。比較して、第2の結合体(例えばGtn-HPA)から形成されるヒドロゲルにおいては、剛度の減少は細胞増殖の低減をもたらしうる。
【００５３】
流動学的方法を用いて、ヒドロゲルの粘弾性挙動について調べることができる。具体的には、剪断歪に対する貯蔵弾性率(G'、単位 = Pa)を測定する振動流量計を用いて、ヒドロゲルの剛度およびゲル化時間を測定することができる。
【００５４】
ゲル化過程において、形成された複合材料に対するG'値を経時的に得ることができ、G'値が実質的に一定になる場合(すなわちG'がプラトーに達する場合)、架橋が完了したものと予想することができる。触媒の添加の時間からプラトーに達するG'の時間までをゲル化時間と考えることができる。反応溶液中の第1および第2の結合体の重量比によって、複合材料ヒドロゲルの剛度およびゲル化時間も変わることがある。
【００５５】
例示的な態様において、Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルは純粋なGtn-HPAヒドロゲルと比べてさらに低いG'を有することができる。反応溶液中のHRPおよびH2O2の量/濃度が一定に保たれる場合、複合材料ヒドロゲルの剛度は、複合材料ヒドロゲルにおけるHA-Tyrの割合の増加とともに減少しうる。複合材料ヒドロゲルの剛度はまた、反応溶液中のHRP濃度の増加とともに増加しうる。
【００５６】
一般に、ゲル化時間は、反応溶液中のHRP濃度が下げられると、長くなるものと予想することができる。類似の効果をH2O2について予想することができる。より高いHRP濃度は、より高い剛度およびより少ないゲル化時間を有する複合材料ヒドロゲルを生ずるものと予想することができる。
【００５７】
剛度は、H2O2濃度を増加させることによって低下させることもできる。これは、過剰量のH2O2によるHRPの非活性化に起因する可能性が最も高い。
【００５８】
共焦点像を用いて、複合材料ヒドロゲルにおける相分離について調べることができる。そのような像を得るには、結合体前駆物質の各々をまず初めに、複合材料ヒドロゲルにおける不連続ドメインを標識するために異なるフルオロフォアと結合させてもよい。異なる色の励起フルオロフォアをもたらすために異なるフルオロフォアを用い、複合材料ヒドロゲルにおける異なる相の観察を可能にする。蛍光分子を有する結合体が結合体の水溶性を低下させず、相分離された構造の観察に関して制約とならない限り、いずれのフルオロフォアが用いられてもよい。例えば、Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルでは、Gtn-HPA結合体をローダミンと結合させ、その一方でHA-Tyr結合体をフルオレセイン(Fluroscein)と結合させる。フルオロフォア結合前駆物質は、Kurisawa (上記)に記述されている手順または当技術分野において公知の他の手順にしたがい改変を加えてまたは加えず調製することができる。
【００５９】
相分離に及ぼすフルオロフォアとの付加的な結合の影響は、フルオロフォア結合度を0.5%未満にまで最適化することによって最小限に抑えることができる。フルオロフォア結合度を判定する方法は一般に、当業者に周知である。例えば、フルオロフォア結合度は、フルオロフォアを含有する標準物質のセットに対してフルオロフォアが蛍光を発する波長で、フルオロフォア結合前駆物質の吸光度値を比較することにより推定することができる。
【００６０】
例示的な態様において、Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの形成の前に、Gtn-HPAをローダミンとおよびHA-Tyrをフルオレセインと、どちらも5%未満の度合いまで結合させる。
【００６１】
所与の結合体含量で、より低いHRP濃度にて、不連続ドメインが複合材料ヒドロゲル中に生じることができ、HRP濃度が低いほど、それだけドメインサイズは大きいものと予想することができる。
【００６２】
いずれかの特定の理論に限定されるものではないが、触媒(例えばHRPおよび/またはH2O2)濃度とゲル化時間との間には相関関係が存在していること、ならびに複合材料ヒドロゲルを形成させるためのゲル化過程中に、相分離過程とゲル化過程の両方が起こりえることが予想される。より遅いゲル化速度は相分離に対してのより多くの時間を意味し、より大きな不連続ドメインが複合材料内に生じうる。対照的に、より速いゲル化速度は、より小さなサイズのドメインをもたらしうる。
【００６３】
結合体(または反応溶液中のその前駆物質)の含量も、相分離および結果的に生じる相分離された構造に影響を与えることがある。例えば、所与の結合体の含量が高い(>90%などの)場合、結合体は、複合材料の全体にわたって架橋されたネットワークを形成する可能性が高い。所与の結合体の含量が低い(<80%などの)場合、結合体は複合材料中に不連続ドメインを生じることがあり、より遅いゲル化速度はより大きな不連続ドメインの形成をもたらすことができ、より速いゲル化速度はより小さなドメインを生ずることができ、この場合に、ドメインは他の結合体により形成された連続的なネットワークに分布している。
【００６４】
したがって、複合材料ヒドロゲル中の異なる結合体の割合(または重量比)を変化させることで、異なる相分離構造を生じえることに留意すべきである。これは、少なくとも部分的には、反応における結合体前駆物質の比率がゲル化速度に影響を与えうるという事実によるものでありうる。
【００６５】
ゲル化速度に影響を与えうる別の要因は、反応温度である。例示的な態様において、反応温度は約25℃から約37℃まで変化しうる。
【００６６】
ゲル化速度に影響を与えうるさらなる要因は、結合体の前駆物質の分子量である。選択される態様において、前駆物質の分子量はHA-Tyrの場合には約5 kDa〜約10,000 kDa、Gtn-HPAの場合には約10 kDa〜約500 kDaでありうる。いくつかの態様において、Gtn-HPAの前駆物質の分子量は約80 kDa〜約140 kDaでありうる。
【００６７】
しかしながら、反応温度、前駆物質の重量比、および前駆物質の分子量を変化させることで、結果的に生じる複合材料ヒドロゲルの他の変化をもたらすことができるが、これは所望ではないこともある。そのような場合、他の考慮に基づきこれらのパラメータの値を選択すること、およびHRPのような触媒の濃度を調節することによってゲル化速度を制御することが好都合であろう。
【００６８】
今や理解されるように、本明細書において記述される例示的な態様に対する変形および変更が可能である。例えば、3種より多くの結合体を複合材料に含めることができる。第1および第2の結合体が、他の成分を含むことができる。例えば、2種またはそれ以上の適当な細胞非接着性の高分子を第1の結合体に含めることができる。
【００６９】
好都合には、例示的な複合材料は、治療的応用、組織工学応用、細胞培養応用などのような、生物医学的応用を含む、さまざまな分野および応用において有用でありうる。さらに、複合材料を応用によっては細胞外マトリックス(ECM)として用いることができる。複合材料を用いて細胞周囲の微小環境を制御することができ、または複合材料を好都合に改変してさまざまな目的のために異なる微小環境を形成させることができる。複合材料はインサイチューで形成されてもよく、複合材料を形成させるための反応溶液が生体への注入のために注入可能な系として提供されてもよい。例えば、複合材料溶液および細胞の混合物をヒトまたは動物の体内の部位へ注入することができる。いくつかの態様において、選択した複合材料を用いて細胞を培養することができ、細胞増殖、付着、機能制御、および長期生存の改善をもたらすことができる。例示的な複合材料をまた、インプラント中でまたはインプラントとして用いることができる。それらは、細胞またはタンパク質などをカプセル化した移植可能なヒドロゲルをもたらすことができ、組織、器官などを再生するために用いることができる。それらは、制御された3D環境での培養を含め、細胞培養の応用で用いることができる。それらはインビボでまたはインビトロで用いることができる。それらは初代細胞培養に適当でありうる。当業者によって理解されうるように他の使用および応用も可能である。
【００７０】
本明細書において記述される場合、いくつかの態様において、細胞(例えばヒト包皮線維芽細胞)増殖は、適切なHRP濃度を選択することによって調製できる、第2の結合体(例えばGtn-HPA)のさらに大きなドメインを有する複合材料ヒドロゲル(例えばGtn-HPA/HA-Tyr)において増強されうる。したがって、複合材料ヒドロゲルにおける細胞増殖は、適切なHRP濃度を選択することによって独立的に制御することができる。例えば、複合材料ヒドロゲル中で細胞を増殖させる方法において、複合材料ヒドロゲルは、第1の結合体、第2の結合体および触媒を含有する前駆物質の複合材料溶液から形成され、細胞はその後、前駆物質の複合材料溶液中に分散される。複合材料の前駆物質溶液中の触媒濃度は、細胞増殖のために望ましい異なる微小環境を得るように選択される。
【００７１】
いくつかの態様において、タンパク質分泌(例えば、初代ラット肝細胞からのアルブミン分泌)は、第2の結合体だけ(例えばGtn-HPA)を含有するヒドロゲルと比べて複合材料ヒドロゲル(例えばGtn-HPA/HA-Tyr)ではより良好に維持されうる。タンパク質分泌(例えば、初代ラット肝細胞からのアルブミン分泌)はまた、より低い割合の第1の結合体を含有するものと比べて、より高い割合の第1の結合体(例えばHA-Tyr)を含有する複合材料ヒドロゲル(例えばGtn-HPA/HA-Tyr)では増強されうる。好都合には、複合材料ヒドロゲルはタンパク質産生のために用いることができ、複合材料の適切な組成を選択することにより所望の量のタンパク質を所望の速度で産生することができる。
【００７２】
複合材料ヒドロゲルを用いたタンパク質産生の例示的な方法において、複合材料ヒドロゲルは、第1の結合体、第2の結合体および触媒を含有する前駆物質の複合材料溶液から形成され、前駆物質の複合材料溶液中に肝細胞が分散される。複合材料の前駆物質溶液中の触媒濃度および複合材料ヒドロゲルの組成は、所望の速度で産生される所望の量のタンパク質を得るように独立的に選択することができる。
【００７３】
例示的な複合材料をインサイチューで形成させることができ、複合材料を形成させるための反応溶液を、ゲル化が体内で主に行われるように、生体へ注入することができる。身体は組織、生物、ヒト身体、動物身体、または別の種類の生体でありうる。
【００７４】
ゲル化の前におよび溶液が体内へ注入される前に、薬物またはタンパク質または細胞を反応溶液に加えることができる。
【００７５】
例えば、1つの態様において、蒸留水中にGtn-HPA、HA-Tyr、HRPおよびH2O2を含有する反応溶液を生体へ速やかに注入する。特定の応用に依存して、HRP、H2O2およびGtn-HPA:HA-Tyr比の、選択した量を加えて、反応溶液を形成させることができる。
【００７６】
本発明の態様は細胞増殖、タンパク質産生、組織再生、または薬物送達に加えて、広範な応用のなかで有利に利用することができる。
【００７７】
本発明の例示的な態様を、限定するものであると意図されない、以下の実施例によってさらに例証する。
【実施例】
【００７８】
実施例において用いられる材料は、具体例において別段の定めがない限り以下のように得られた。
【００７９】
ゼラチン(Gtn) (MW = 80-140 kDa, pl = 5)および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP, 100単位/mg)は、Wako Pure Chemical Industries(商標)から入手した。
【００８０】
過酸化水素(H2O2)はLancaster(商標)から入手した。
【００８１】
3, 4-ヒドロキシフェニルプロピオン酸(3,4-HPA)、チラミン塩酸塩(Tyr・HCl)、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC・HCl)、ローダミンBイソチオシアネート(Rhodamine B isothiocynate)および5-アミノフルオレセインはSigma-Aldrich(商標)から購入した。
【００８２】
ヒト包皮線維芽(HFF1)細胞はATCC(USA)から入手した。
【００８３】
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ヘパトザイム(Hepatozyme)培地、ウシ胎仔血清(FBS)およびストレプトマイシンはInvitrogen(商標)から購入した。
【００８４】
コラゲナーゼ(Colleagenase)およびデキサメタゾンはSigma(商標)から購入した。
【００８５】
レポーター溶解緩衝液はPromega(商標)から購入した。
【００８６】
実施例I
実施例I-A Gtn-HPA結合体(サンプルIA)の合成
Gtn-HPA結合体は、内容全体が参照により本明細書に組み入れられるL. Wang et al., 「Injectable biodegradable hydrogels with tunable mechanical properties for the stimulation of neurogenesic differentiation of human mesenchymal stem cells in 3D culture」, Biomaterials, 2010, 31, 1148-57 (「Wang」)に記述されている手順にしたがって調製した。
【００８７】
3,4-HPA (3.32 g, 20 mmol)を蒸留水およびN,N-ジメチルホルムアミド(DMF) (3:2)の混合物250 mlに溶解して、初期溶液を形成させた。初期溶液に、NHS (3.20 g, 27.8 mmol)およびEDC・HCl (3.82 g, 20 mmol)を加えた。反応混合物を室温で5時間撹拌し、混合物のpHを4.7に維持した。その後、水性Gtn溶液(6.25 wt.%) 150 mlを反応混合物に加え、このようにして形成された混合物をpH 4.7にて室温で終夜撹拌した。溶液を、1000 Daの分子カットオフ値を有する透析管に移し入れた。この管を2日間100 mM塩化ナトリウム溶液に対して透析した: 1日目には蒸留水およびエタノール(3:1)の混合物を用い、2日目には蒸留水を用いた。精製した溶液を凍結乾燥して、Gtn-HPA結合体を得た。
【００８８】
サンプルIAを調製するための一般的な反応経路をスキームIIに示す。
スキームII
0005941457.tif 000003
【００８９】
実施例I-B Gtn-HPA-ローダミン(Gtn-HPA-Rho)結合体(サンプルIB)の合成
透析を含めて反応全体を暗所中で行った。蒸留水中の、実施例I-Aから得たGtn-HPA結合体(1 g)の水溶液へ、ローダミンBイソチオシアネート(1 mg, DMSOに溶解した)を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。このようにして形成された溶液を2日間、透析膜(1 kDaの分子量カットオフ値)を用いることにより蒸留水中で透析した。精製した溶液を凍結乾燥して、Gtn-HPA-ローダミン結合体を得た。Tecan Infinite(登録商標) M200マイクロプレートリーダーを用いて1 mg/mlのローダミン結合Gtn-HPA溶液の570 nmでの吸光度値をローダミン標準物質のセットと比較することにより、結合したローダミンの度合いを推定した。ローダミンの置換度は0.3であった。
【００９０】
実施例II HA-Tyr結合体(サンプルII)の合成
HA-Tyr結合体は、内容全体が参照により本明細書に組み入れられるF. Lee et al., 「An injectable enzymatically crosslinked hyaluronic acid-tyramine hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate」, Soft Matter 4, 880-887 (2008) (「Lee」)に記述されている手順にしたがって調製した。
【００９１】
HA (1 g, 2.5 mmol)を蒸留水100 mlに溶解し、初期溶液を形成させた。Tyr・HCl (202 mg, 1.2 mmol)を最初に、この溶液に加えた。次にEDC・HCl (479 mg, 2.5 mmol)およびNHS (290 mg, 2.5 mmol)を加えて、結合反応を開始させた。反応が進行した際に、混合物のpHを0.1 M NaOHで4.7に維持した。反応混合物を室温で終夜撹拌し、その後、pHを7.0にした。溶液を、1000 Daの分子カットオフ値を有する透析管に移し入れた。この管を2日間100 mM塩化ナトリウム溶液に対して透析した: 1日目には蒸留水およびエタノール(3:1)の混合物を用い、翌日には蒸留水を用いた。精製した溶液を凍結乾燥して、HA-Tyr結合体を得た。
【００９２】
サンプルIIを調製するための一般的な反応経路をスキームIIIに示す。
スキームIII
0005941457.tif 000004
【００９３】
実施例III HA-Tyr-フルオレセイン(HA-Tyr-Flu)結合体(サンプルIII)の合成
HA-Tyr-フルオレセイン結合体は、Lee (上記)に記述されている手順にしたがって調製した。
【００９４】
透析を含めて反応全体を暗所中で行った。HA (2 g, 5 mmol)を蒸留水100 mlに溶解して、初期溶液を形成させた。初期溶液に、Tyr・HCl (0.4 g, 2.3 mmol)および5-アミノフルオレセイン(10 mg, 1 ml DMSO中0.04 mmol)を加えた。次にEDC・HCl (960 mg, 5 mmol)およびNHS (580 mg, 5 mmol)を加え、混合物のpHを0.1 M NaOHで4.7に維持した。反応液を室温で終夜撹拌し、次いでpHを7.0にした。溶液を1等級のWhatman(商標)セルロースろ紙でろ過して、沈殿していた未結合のアミノフルオレセインを除去した。ろ液を、3500 Daの分子カットオフ値を有する透析管へ回収した。上記の実施例I-Aに記述したGtn-HPAのための透析および凍結乾燥の手順を続けて行った。Tecan Infinite(登録商標) M200マイクロプレートリーダーを用いて1 mg/mlのアミノフルオレセイン結合HA-Tyr溶液の490 nmでの吸光度値をアミノフルオレセイン標準物質のセットと比較することにより、結合したアミノフルオレセインの度合いを推定した。アミノフルオレセインの置換度は0.4であった。
【００９５】
実施例IV Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル(サンプルIV-1、IV-2、IV-3、IV-4)の流動学的測定
Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの形成の流動学的測定は、HAAKE(商標) Rheoscope 1レオメータ(Karlsruhe, Germany)により、直径35 mmおよびコーン角度0.945°のコーン・アンド・プレートジオメトリーを用いて行った。測定は、1%の一定変形および1 Hzの周波数で、動的振動モードにおいて37℃で行った。測定中のサンプルの滑りを回避するため、粗面ガラス製の下部プレートを用いた。
【００９６】
それぞれ実施例I-AおよびIIにおいて調製した、Gtn-HPAおよびHA-Tyrの溶液は、各結合体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS, pH = 7.4)に溶解することによって調製し、その際にGtn-HPA溶液およびHA-Tyr溶液の各々の最終濃度を5 wt%とした。Gtn-HPA溶液をHA-Tyr溶液と混合することにより、Gtn-HPAおよびHA-Tyrを9:1または8:2の重量比で含有する水溶液を調製した(5 wt%, 250 μL PBS)。
【００９７】
代表的な流動学的測定では、HRPのPBS溶液およびH2O2のPBS溶液を、上記の段落にしたがって調製した、Gtn-HPAおよびHA-Tyrを含有する水溶液に連続的に加えて、サンプル溶液を形成させた。複合材料ヒドロゲルを調製するための一般的な反応スキームは、上記のスキームIに提供されている。
【００９８】
次いでサンプル溶液をボルテックスし、下部プレートへ直ちに適用した。次いで上部コーンを測定ギャップ0.024 mmまで下げ、シリコンオイルの層をコーン周りに注意深く適用し、実験中の溶媒蒸発を防いだ。測定パラメータは、予備実験における線形粘弾性領域内にあるように決定した。1 Hzの周波数および1%の剪断歪を適用して、線形粘弾性を維持した。測定を37℃で行った。G'値およびそれに到達するのにかかった時間(すなわちゲル化時間)を記録した。
【００９９】
流動学的測定を測定し、その際にHRPの濃度は0.02単位/ml〜0.2単位/mlの範囲にわたり、H2O2の濃度は8.5 mMまたは17 mMのいずれかであった。
【０１００】
調製したサンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル(サンプルIV-1、IV-2、IV-3、IV-4)の成分を表Iにまとめる。
【０１０１】
（表Ｉ）サンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル(サンプルIV-1、IV-2、IV-3、IV-4)
0005941457.tif 000005
【０１０２】
比較として、HA-Tyrの添加のないGtn-HPAヒドロゲル(サンプルIA)のG'値およびゲル化時間も測定した。
【０１０３】
代表の流動学的測定結果を図1、2、3および4に示す。
【０１０４】
図1はHRP濃度に対するGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ゲルの剛度の依存性を示し、これは8.5 mMの固定したH2O2濃度でHRP濃度の関数としてサンプルIV-1およびサンプルIV-2のG'値で表示されている。図2はHRP濃度に対するGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ゲルのゲル化時間の依存性を示し、これは8.5 mMの固定したH2O2濃度でHRP濃度の関数としてサンプルIV-1およびサンプルIV-2のゲル化時間で表示されている。
【０１０５】
図3はHRP濃度に対するGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ゲルの剛度の依存性を示し、これは17 mMの固定したH2O2濃度でHRP濃度の関数としてサンプルIV-3およびサンプルIV-4のG'値で表示されている。図4はHRP濃度に対するGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ゲルのゲル化時間の依存性を示し、これは17 mMの固定したH2O2濃度でHRP濃度の関数としてサンプルIV-3およびサンプルIV-4のゲル化時間で表示されている。
【０１０６】
図1および3から分かるように、固定したHRPおよびH2O2濃度で、Gtn-HPA結合体へのHA-Tyr結合体の添加は、Gtn-HPAヒドロゲルだけでのG'値と比べた場合にGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルではいっそう低いG'値をもたらした。さらに、複合材料ヒドロゲルのG'値は0.02単位/mlから0.2単位/mlまでのHRP濃度の増加とともに増加した。
【０１０７】
図2および4に示される通り、固定したHRPおよびH2O2濃度で、Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルのゲル化時間はHA-Tyrの割合の増加とともに増加した。さらに、これらの結果は、固定したH2O2濃度でHRP濃度の減少により、ゲル化時間が一般的に長くなることを示す。
【０１０８】
したがって、図1、2、3および4から理解できるように、固定したH2O2濃度で、より高いHRP濃度によって、より高い剛度およびより少ないゲル化時間を有するGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルが得られたが、複合材料ゲルの全体の剛度は、H2O2を8.5 mMで保持した場合と比べてH2O2を17 mMで保持した場合にはより低かった。
【０１０９】
実施例V 相分離Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの共焦点像
それぞれ実施例I-BおよびIIIにおいて調製した、Gtn-HPA-RhoおよびHA-Tyr-Fluの溶液は、各結合体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS, pH = 7.4)に溶解することによって調製し、その際にGtn-HPA-Rho溶液およびHA-Tyr-Flu溶液の各々の最終濃度を5 wt%とした。Gtn-HPA-RhoおよびHA-Tyr-Fluを9:1または8:2の比で含有する水溶液を調製した(5 wt%, 250 μL PBS)。Gtn-HPA-Rho溶液をHA-Tyr-Flu溶液と混合した。
【０１１０】
代表的な共焦点像測定では、HRPのPBS溶液およびH2O2のPBS溶液を、上記の段落にしたがって調製した、Gtn-HPA-RhoおよびHA-Tyr-Fluを含有する水溶液に連続的に加えて、サンプル溶液を形成させた。次いでサンプル溶液をボルテックスし、96ウェルプレートへすぐに移し入れた。複合材料ヒドロゲルを暗所中に終夜セットし、引き続いて共焦点レーザー走査顕微鏡(Olympus(商標) FV300, Japan)で撮像する前に4時間PBS (PH = 7.4)中での浸漬を行った。
【０１１１】
共焦点像測定を繰り返し、その際にHRPの濃度は0.02単位/ml〜0.2単位/mlの範囲にわたり、H2O2の濃度は8.5 mMまたは17 mMのいずれかであった。
【０１１２】
図5A、5B、5C、5D、5E、5F、6A、6B、6C、6D、6E、6F、7A、7B、7C、7D、7E、8A、8B、8C、8D、8Eおよび8Fは、さまざまなHRP濃度: A) 0.02単位/ml、B) 0.024 単位/ml、C) 0.032単位/ml、D) 0.045単位/ml、E) 0.05単位/mlおよびF) 0.1単位/mlでのサンプルIV-1、サンプルIV-2、サンプルIV-3およびサンプルIV-4の相分離構造の各共焦点蛍光像を示す。Gtn-HPA相およびHA-Tyr相は、それぞれ、赤色および緑色で検出された。これらの図から分かるように、不連続領域の平均サイズは約0.01 μmから約50 μmの範囲にわたり、隣接領域間の平均距離は約0.01 μmから約50 μmの範囲にわたった。
【０１１３】
図5A、5B、5C、5D、5E、5F、6A、6B、6C、6D、6E、6F、7A、7B、7C、7D、7E、8A、8B、8C、8D、8Eおよび8Fにおいて示すことができるように、相分離され形成されたGtn-HPAは、H2O2の濃度を8.5 mMまたは17 mMのいずれかで固定した場合にさまざまなHRP濃度でパターンを変化させた。
【０１１４】
サンプルIV-1 (H2O2の濃度 = 8.5 mM)の場合、Gtn-HPA相はメッシュネットワークとして現れ、その一方でHA-Tyr相は複合材料ヒドロゲルサンプル全体に分散した球体として現れた(図5A、5B、5C、5D、5E、5F参照)。相分離度はHRP濃度の増加によって低くなった。
【０１１５】
対照的に、サンプルIV-2 (H2O2の濃度 = 8.5 mM)の場合、Gtn-HPA相は球体として表れ、その一方でHA-Tyr相はメッシュネットワークとして現れた(図6A、6B、6C、6D、6E、6F)。より高濃度のHRPはより小さなサイズのGtn-HPA相を粒子として生じた。この所見は複合材料ヒドロゲルのゲル化時間と良好な相関があるように思われた。
【０１１６】
また、サンプルIV-3およびIV-4において相分離構造が認められ、そのどちらも17 mM H2O2を用いて調製された。サンプルIV-3の形態(図7A、7B、7C、7D、7E)はサンプルIV-1の形態(図5A、5B、5C、5D、5E、5F)と類似の傾向を示した。しかしながら、サンプルIV-4 (図8A、8B、8C、8D、8E、8F)の場合、Gtn-HPA相はHRP濃度の増加に伴ってメッシュネットワークから球体へ移行した。
【０１１７】
実施例VI HFF1を含有するGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル
異なる微細構造を有するサンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル中でのHFF1の増殖について調べた。
【０１１８】
凍結乾燥したGtn-HPAおよびHA-Tyrを上記の実施例I-AおよびIIに記述されている手順にしたがって調製した。
【０１１９】
凍結乾燥したGtn-HPAおよびHA-Tyrを、それぞれ、10% FBS、100単位/mlのペニシリンおよび100 mg/mlのストレプトマイシンを補充したフェノールレッド不含DMEMの中に溶解することにより7.5% Gtn-HPA溶液および7.5% HA-Tyr溶液を作出した。Gtn-HPAおよびHA-Tyrを8:2の重量比で含む、7.5% Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル溶液を、上記の実施例IVに記述されている手順にしたがって0.175 mMのH2O2、ならびに濃度0.0199単位/ml、0.0437単位/mlおよび0.0596単位/mlのHRPで調製した。得られたGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルは、それぞれサンプルVI-1、VI-2およびVI-3であった。細胞220,000個/mlの密度でHFF1を有する5% Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル溶液へ各複合材料ヒドロゲル溶液を希釈するために、適切な容量のフェノールレッド不含DMEM中のHFF1を7.5% Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル溶液の各々に加えた。
【０１２０】
上記で調製されたHFF1を含有する5%複合材料ヒドロゲル溶液の液滴50 μlを48ウェルプレート(Nunc(商標), Denmark)の中に無菌条件の下で移し入れ、37℃の細胞インキュベータ内で、5% CO2および95%の湿度で終夜放置してゲル化させた。翌日、新鮮なDMEMを各ウェルに加えた。培地を2日ごとに交換した。
【０１２１】
HFF1の増殖を、各複合材料ヒドロゲルに播種した、Quant-iT (商標) PicoGreen dsDNA Kit (Invitrogen(商標))を用いて4週間、毎週分析して、その増殖を評価した。毎週末に、HFF1を含有する複合材料ヒドロゲルを、0.5 mg/mlのコラゲナーゼを用いて溶解し、1500 rpmで5分間遠心分離した。上清を除去し、レポーター溶解緩衝液200 μlを、HFF1を含有する各複合材料ヒドロゲルに加えた。得られた細胞混合物の各々を30秒間ボルテックスし、-20℃で貯蔵し、融解し、氷上で30分間超音波処理し、4℃で20分間6.0 rpmで遠心分離した。得られたサンプル上清の各々を回収し、PicoGreen DNAアッセイ法に用いた。
【０１２２】
DNA標準物質(2 μg/ml)を100 μg/mlのDNA溶液および1×TE緩衝液から調製した。PicoGreen dsDNA Quantitation試薬は、濃縮色素溶液の1:200希釈液を1×TE緩衝液中で作出することによって調製した。適切に希釈したサンプル上清100 μlを96ウェルプレートの各ウェルの中に加えた。次いで、PicoGreen試薬100 μlを各ウェルに加えた。サンプルを480 nmで励起し、Tecan Infinite(登録商標) M200マイクロプレートリーダーを用いて520 nmで蛍光強度を測定した。蛍光強度はHFF1の数に比例する。DNA標準曲線およびHFF1標準曲線をプロットした。各複合材料ヒドロゲル上に付着した細胞の数を標準曲線から計算した。
【０１２３】
図9A、9Bおよび9Cは、不連続Gtn-HPA領域(赤色に染まった)の平均サイズがHRP濃度の増加とともに増加したことを示すサンプル複合材料ヒドロゲルの、共焦点レーザー顕微鏡(Olympus(商標) FV300, Japan)を用いて撮った、共焦点像である: 図9A、図9Bおよび図9Cに用いたHRPの濃度は、それぞれ0.0199単位/ml、0.0437単位/mlおよび0.0596単位/mlであった。共焦点像を撮る前に、Gtn-HPAを上記の実施例I-Bに記述した手順にしたがってローダミンと結合させ、その一方でHA-Tyr部分を上記の実施例IIIに記述した手順にしたがってFITCと結合させた。
【０１２４】
図10は、不連続Gtn-HPA領域の平均サイズに対するHFF1増殖の依存性を示す。より多くのHFF1がより大きな不連続Gtn-HPA領域に付着したことが認められた。
【０１２５】
実施例VII: Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルおよび初代ラット肝細胞のアルブミン分泌
初代ラット肝細胞のアルブミン分泌に及ぼすサンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルの組成の影響について調べた。
【０１２６】
上記の実施例I-AおよびIIの手順にしたがって調製した、凍結乾燥Gtn-HPAおよびHA-Tyrを、それぞれ、0.1 mMのデキサメタゾン(Sigma)、100単位/mlのペニシリンおよび100 mg/mlのストレプトマイシン(Invitrogen)を補充したフェノールレッドおよびFBS不含のヘパトザイム培地(Invitrogen)の中に溶解することにより5% Gtn-HPA溶液および5% HA-Tyr溶液を作出した。異なる組成のGtn-HPAおよびHA-Tyrを有するが、しかし同じ剛度を有するサンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル溶液(G' = 690 Pa、1340 Paまたは3340 Pa)を、上記の実施例IVに記述されている手順にしたがって、それぞれ0.88 mMのH2O2およびさまざまな量のHRPを加えることにより調製した。その成分を表IIにまとめる。
【０１２７】
（表ＩＩ）サンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル(サンプルVII-1A、VII-1B、VII-1C、VII-2A、VII-2B、VII-2C、VII-3A、VII-3BおよびVII-3C)
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【０１２８】
サンプルGtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲル溶液(1ウェルあたり250 μl)を無菌条件の下で48ウェルプレートの中に沈着し、37℃の細胞インキュベータ内で終夜放置してゲル化させた。初代ラット肝細胞を1ウェルあたり細胞10,000個で播種し、その後、5% CO2および95%の湿度で37℃にてインキュベートした。12時間のインキュベーションの後、付着していない肝細胞をPBSによって洗い流し、新鮮な培地を加えた。培地を24時間ごとに交換し回収して、分泌されたアルブミンの量を、Immunology Consultants Laboratory (ICL)のラットアルブミン酵素免疫アッセイ(ELISA)定量化キットを用いて評価した。
【０１２９】
図11A、11B、11C、11D、11Eおよび11Fは、サンプル複合材料ヒドロゲルVII-2A、VII-2B、VII-2C、VII-3A、VII-3BおよびVII-3Cの、共焦点レーザー顕微鏡(Olympus(商標) FV300, Japan)を用いて撮った、共焦点像である。共焦点像を撮る前に、各サンプル中のGtn-HPAを上記の実施例I-Bに記述した手順にしたがってローダミンと結合させ、赤色で出現させたのに対し、各サンプル中のHA-Tyrを上記の実施例IIIに記述した手順にしたがってFITCと結合させ、緑色で出現させた。
【０１３０】
図11A、11B、11C、11D、11Eおよび11Fから、固定したGtn-HPAおよびHA-Tyr組成で、サンプル複合材料ヒドロゲルにおける相分離度は0.0388単位/mlから0.135単位/mlまでのHRP濃度の増加とともに減少したことが認められた。さらに、重量比Gtn-HPA:HA-Tyr = 8.5:1.5の場合、Gtn-HPA相はマトリックスネットワークとして現れたのに対し、HA-Tyr相はドメインとして現れ、Gtn-HPAマトリックスネットワークはHRP濃度の増加とともに密になった(図11A、11Bおよび11C)。重量比Gtn-HPA:HA-Tyr = 7:3の場合、Gtn-HPA相はドメインとして現れたのに対し、HA-Tyr相はマトリックスネットワークとして現れ、Gtn-HPAドメインはHRP濃度の増加とともに小さくなった(図11D、11Eおよび11F)。
【０１３１】
図12は、G' = 3340 Paの場合の、4日目および8日目の時点のサンプルGtn-HPAヒドロゲルVII-1Cとの比較時の初代ラット肝細胞サンプル複合材料ヒドロゲルVII-2CおよびVII-3Cによるアルブミン分泌を描く(t検定: ＊＊p < 0.0002; ＊＊＊p < 0.002)。所与のG' (すなわち剛度)で、複合材料ヒドロゲル中のさらに多量のHA-Tyr (サンプルVII-3C v. サンプルVII-2C)により、肝細胞によるアルブミン分泌が増強されることが認められた。複合材料ヒドロゲルの各々(サンプルVII-2CおよびVII-3C)がGtn-HPAヒドロゲルのみ(サンプルVII-1C)と比べた場合に、肝細胞によるさらに多くのアルブミンの分泌をもたらすことも認められたことから、Gtn-HPA/HA-Tyr複合材料ヒドロゲルが純粋なGtn-HPAヒドロゲルと比べて、肝細胞機能の維持でいっそう良好であることが示唆された。
【０１３２】
比較実施例: 初代ラット肝細胞を含有するGtn-HPAヒドロゲルのアルブミン分泌
初代ラット肝細胞のアルブミン分泌に及ぼすGtn-HPAヒドロゲルの剛度(G'値で示される)の影響について調べた。
【０１３３】
上記の実施例I-Aにおける手順にしたがって調製した凍結乾燥Gtn-HPAを、10% FBS、0.1 mMのデキサメタゾン(Sigma(商標))、100単位/mlのペニシリンおよび100 mg/mlのストレプトマイシンを補充したフェノールレッド不含ヘパトザイム培地の中に溶解することにより5% Gtn-HPAを作出した。G' = 231 Paおよび2118 Paを有するGtn-HPA溶液を、それぞれ0.88 mMのH2O2ならびに0.0198単位/mlおよび0.0356単位/mlのHRPを加えることにより調製した。Gtn-HPAヒドロゲルを無菌条件の下で48ウェルプレートの中で調製し、37℃のインキュベータ内で終夜放置してゲル化させた。ゲル250 μlを各ウェルに加えた。次に、肝細胞を1ウェルあたり細胞10,000個で播種し、その後、5% CO2および95%の湿度で37℃にてインキュベートした。12時間後、付着していない肝細胞をPBSによって洗い流し、新鮮な培地を加えた。培地を24時間ごとに交換し回収して、産生されたアルブミンの量を、Immunology Consultants Laboratory (ICL)のラットアルブミン酵素免疫アッセイ(ELISA)定量化キットを用いて評価した。
【０１３４】
図13は、Gtn-HPAヒドロゲルの剛度に対するアルブミン分泌の依存性を示す。Gtn-HPAヒドロゲルは組織培養プレート(TCP)対照と比べて肝細胞増殖のために良好な基材であることが認められた。加えて、肝細胞はさらに剛度の高いGtn-HPAヒドロゲル(G' = 2118 Pa)と比べて、さらに柔軟なGtn-HPAヒドロゲル(G' = 231 Pa)上での増殖時にはさらに長い期間その機能性を維持することができた。
【０１３５】
本明細書における任意の値域は所与の範囲内の任意の中間値または部分的範囲を具体的に含むものと意図され、このような全ての中間値および部分的範囲が個別的かつ具体的に開示されているものと理解されよう。
【０１３６】
「a」または「an」という語句は「1つまたは複数の」または「少なくとも1つの」を意味するものと意図され、単数形のいずれも本明細書では複数形を含むものと意図されることも理解されよう。
【０１３７】
「含む」という用語は、その任意の変化形を含めて、非制限的であると意図され、そうでないことが他に具体的に示されない限り、「含むが、限定されることはない」を意味するものとさらに理解されよう。
【０１３８】
項目リストが最後の項目の前の「または」を伴って本明細書において与えられる場合、列挙された項目のいずれか1つまたは列挙された項目の2つもしくはそれ以上の任意の適当な組み合わせを選択および使用することができる。
【０１３９】
当然ながら、上記の態様は一例にすぎず、決して限定するものではないことが意図される。記述した態様は形態、部分の配置、詳細および操作順序の多くの改変を受け入れる余地がある。本発明は、むしろ、特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲内のそのような全ての改変を包含するように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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