(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）で示される化合物。
0006040157.tif 000046
式中、Ｒ2は、−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1〜5アルキルであり；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
Ｒ8は、
0006040157.tif 000047
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ11は、ペプチド、アミノ酸、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、または共にＣ1〜2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1〜4アルキル、置換Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Hまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり；
Ｌ’は、以下の基から選択されるリンカー、
0006040157.tif 000048
ここで、ＲXは、独立に、水素、ハロゲンまたはＮＯ2であり、
ＲYは、独立に、水素またはＭｅであり、そして
ＲZは、独立に、ＮＨ、ＮＭｅ、ＯまたはＳであり；
ｎは、０〜３であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1〜7アルキルであり；
Ｔは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
【請求項２】
式中、Ｒ2は、
0006040157.tif 000049
または、C2〜5直鎖アルキルであり；
Ｘは、それぞれ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
Yは、−Hまたは−OHであり；
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC（O）R、−CO2Rであり；および
Rは、C1〜7アルキルである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式中、Ｒ2は、
0006040157.tif 000050
であり；および
Ｘは、ＯまたはＳである、
請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式中、Ｒ2は、Ｃ2〜5直鎖アルキルである、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
式中、Ｒ8は、
0006040157.tif 000051
低シクロアルキル、またはＨであり、
Ｒ3およびＲ4は、共に水素、または共にＣ1〜2アルキルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
式中、Ｒ8は、ベンジルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｖが、Ｓである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
酵素を含有すると思われるサンプルを、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物と接触させる工程、および
サンプルの発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする酵素の存在または量の検出方法。
【請求項９】
発光が、定量化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルには第２酵素が含有されると疑われ、
前記サンプルを、請求項１〜７のいずれか一項に記載の、第２酵素のための基質を含有する第２化合物と接触させる工程、および
該サンプルの発光を検出する工程、
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物をトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程、および
発光を検出する工程、
を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏで酵素の存在を検出する方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物を動物に投与する工程、
動物からサンプルを得る工程、および
サンプルの発光を検出する工程、
を含む、酵素の存在を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１０年１１月２日に出願された米国特許出願第６１／４０９，４１３号に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、酵素の存在と活性をアッセイする化合物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
酵素の存在および活性を使用して、細胞の健康状態または代謝状態を決定することができる。酵素はまた、ある酵素の出現および活性が特定の細胞にとって特有である場合が多いため、特定の細胞型のマーカーにもなり得る。例えば、ある酵素の活性を利用して、バクテリア、植物もしくは動物由来の細胞を区別したり、または酵素が由来する組織の同一性を区別したりできる。
【０００３】
グリコシドヒドロラーゼとしても知られているグリコシダーゼは、グリコシド結合の加水分解を触媒し、二つのより小さな糖を生成する。グリコシダーゼは、セルロースやヘミセルロースなどのバイオマス分解を含む天然分解、抗バクテリア防御戦略（例えば、リゾチーム）、発症機序（例えば、ウイルス・ノイラミニダーゼ）および通常の細胞機能（例えば、Ｎ結合型糖タンパク質生合成に関与するマンノシダーゼのトリミング）における役割を担う、極めて一般的な酵素である。バクテリアおよび原核生物において、グリコシダーゼは、細胞内酵素および細胞外酵素として知られており、主に栄養獲得に関与している。バクテリアにおける重要なグリコシダーゼ出現の一つとして、大腸菌におけるラクトースオペロン発現の制御に関与する酵素ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）が挙げられる。より高等な生物においては、グリコシダーゼは、N結合型糖タンパク質の処理に関与する小胞体やゴルジ体内に、また糖鎖構造の分解に関与する酵素としてリソソーム中に認められる。特定のリソソームグリコシダーゼが欠乏することにより、様々なリソソーム蓄積障害を惹起し、その結果、発達障害が発生し、あるいは死に至る場合もある。グリコシダーゼは、体内におけるグリコーゲンの生合成および分解に関与している。グリコシルトランスフェラーゼと共に、グリコシダーゼは、グリコシド結合の合成および切断のための主要な触媒機構を形成する。
【０００４】
ジアホラーゼは、ジ−およびトリ−リン酸ピリジンヌクレオチド、すなわち、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨの還元形態から、様々な化合物の還元を触媒する、ユビキタスクラスのフラビン結合型酵素であり、水素受容体の役目を担う。細胞のエネルギー代謝は、一連の酵素反応および化学反応を通じて、細胞のエネルギー蓄積を可能とする、複雑なプロセスである。細胞エネルギー代謝の一つの重要な態様は、細胞の酸素還元状態である。生きた細胞の代謝状態ならびに酵素活性および／または代謝レベルのアッセイは、レドックスが定めるコファクターのＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定することで決定され得る。
【発明の概要】
【０００５】
一つの態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物
【化１】
0006040157.tif 000002
を提供し、
式中、Ｒ2は−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1~5アルキルであり；
Ｒ2'は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
Ｒ8は、
【化２】
0006040157.tif 000003
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、または共にＣ1~2アルキルであり；
ＲAはＣ1~4アルキル、置換Ｃ1~4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたはＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールであり；
Ｌはリンカーであり；
ｎは０〜３であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1~7アルキルであり；
Ｔはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；および
破線の結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
【０００６】
別の態様では、本発明は、式（ＩＩ）の化合物
【化３】
0006040157.tif 000004
を提供し、
式中、Ｒ2は、−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1~5アルキルであり；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
Ｒ8は、
【化４】
0006040157.tif 000005
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ11は、ペプチド、アミノ酸、糖類, −Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、または共にＣ1~2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1~4アルキル、置換Ｃ1~4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Hまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり；
Ｌ’は直接結合またはリンカーであり；
ｎは０〜３であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1~7アルキルであり；
Ｔはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；および
破線の結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物
【化５】
0006040157.tif 000006
を提供し、
式中、Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
Ｒ8は、
【化６】
0006040157.tif 000007
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ12は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、またはＣ1~2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1~4アルキル、置換Ｃ1~4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり；
Ｌは直接結合またはリンカーであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；および
Ｘは、それぞれ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1~7アルキルであり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
【０００８】
別の態様では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物
【化７】
0006040157.tif 000008
を提供し、
式中、Ｒ2は−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1~5アルキルであり；
Ｒ8は、
【化８】
0006040157.tif 000009
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ16は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2またはＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、またはＣ1~2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1~4アルキル、置換Ｃ1~4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、または置換ヘテロアリール；
Ｌ’は直接結合またはリンカーであり；
ｎは０〜３であり；
Ｔはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；
Ｘは、それぞれ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1~7アルキルであり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
【０００９】
本発明はまた、上記化合物の利用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈの生物学的試験の結果を示す図である。
【図２】オプロフォルス誘導体ルシフェラーゼおよびｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈを利用したカスパーゼ３アッセイの結果を示す図である。
【図３】好適なリンカーを示す図である。
【図４】誘導体化され得るセレンテラジンを示す図である。
【図５】グリコシダーゼアッセイに有益なｐｒｏ−セレンテラジン糖類の例を示す図である。
【図６】様々なペプチド基質の酵素を示す図である。
【図７】プロテアーゼアッセイに利用されるのにふさわしいｐｒｏ−セレンテラジンを示す図である。
【図８】化合物４０および５０で測定した発光と細胞数との間に直接的な関係があることを表す、細胞数と発光との線形相関を示す図である。
【図９】本発明に従い、ｐｒｏ−セレンテラジンを用いてＮＡＤＨを検出することを示す図である。
【図１０】本発明による、その他のふさわしいｐｒｏ−セレンテラジン基質を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、サンプルにおける様々な酵素の存在と活性をアッセイする化合物および方法を提供する。
【００１２】
特段の明示的な指定がない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、本明細書の中で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」により羅列された物の他に、別の物が任意選択的に存在し得ることを示している。しかし、本発明の特定の実施形態では、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、別の物が存在しない可能性を包含する、すなわち、この実施形態の目的においては、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（から成る）」の意味を有するとして理解されるべきであることを企図している。
【００１３】
本明細書で使用される場合、以下の用語および表現は、指定された意味を有する。本発明の化合物は、非対称的に置換された炭素原子を含有し、光学的活性体またはラセミ体として単離され得ると理解され得ると理解されるであろう。光学的活性体の製造方法は、当技術分野において周知であり、例えば、ラセミ体の分解により、または光学活性の開始材料からの合成により、製造される。構造の全てのキラル体、ジアステレオ異性体、ラセミ体および全ての幾何異性体は、本発明に含まれる。
【００１４】
以下に記載のラジカル、置換基及び範囲に関する具体的な値は、説明のみを目的としている。ラジカルおよび置換基の定められた範囲内にあるその他の定められた値またはその他の値を除外するものではない。
【００１５】
（定義）
「アルキル」という用語は、炭化水素化合物から水素原子を取り除くことにより得られる一価部分を指している。アルキル基には、１〜３０個の炭素原子、または１〜１２個の炭素原子、または１〜１０個の炭素原子、または１〜６個の炭素原子、または１〜４個の炭素原子が含まれてもよい。アルキル基は、直鎖または分岐でもよく、かつ飽和でも、一部不飽和でも、または完全に不飽和でもよい。アルキル基は、任意選択的に、例えばハロで置換してもよい。直鎖アルキル基の実施例には、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、およびｎ−プロピル、ｎ−ヘキシルおよびｎ−ヘプチルが含まれるが、これらに限定されない。一つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する直鎖不飽和アルキル基の実施例には、エテニル（ビニル、−ＣＨ＝ＣＨ2），２−プロペニル（アリル、−ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ2）、およびブテニルが含まれるが、これらに限定されない。一つまたは複数の炭素−炭素三重結合を含む不飽和アルキルの実施例として、エチニルおよび２−プロピニル（プロパルギル）が含まれるが、これらに限定されない。分岐アルキル基の実施例には、イソプロピル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルおよびイソ−ペンチルが含まれる。
【００１６】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸の両方を指している。また、保護天然アミノ酸および保護非天然アミノ酸も含まれる。
【００１７】
「アリール」という用語は、芳香族環から水素原子を取り除くことにより得られる一価部分を指している。アリール基は、６〜１０個の炭素原子（Ｃ6~10アリール）を有してもよい。例えば、アリール基は、フェニルまたはナフチルであってもよい。
【００１８】
「ハロ」という用語は、Ｃｌ、Ｆ、ＢｒまたはＩなどのハロゲンを指している。
【００１９】
「ヘテロアリール」という用語は、ヘテロ芳香族環から水素原子を取り除くことにより得られる一価部分を指している。ヘテロ芳香族環は、５〜１０環原子（Ｃ5~10ヘテロアリール（「Ｃ」の使用は、原子がＣ、Ｎ、ＯまたはＳのいずれかであるに関わらず、環原子の合計数を意味すると理解されたし））を有してもよい。環原子は、炭素、窒素、硫黄または酸素であってもよい。複数のヘテロ原子が環に存在してもよい。例えば、ヘテロアリール基は、フリル、チエニル、チアゾリル、ピラゾリル、トリアゾリルまたはテトラゾリルであってもよい。
【００２０】
「リンカー」という用語は、基質部分をセレンテラジン核にリンクする２〜５０個の原子の鎖を指している。リンカーには、一つまたは複数のヘテロ原子が含まれてもよい。リンカーはまた、オキソ基、アミノ基、アルキル基、ハロゲン基およびニトロ基により置換されてもよい。リンカーはまた、アリール基を含むことが出来る。ふさわしいリンカーとして、ｐ−アミノベンジルリンカーなど、図３に示されるものが含まれる。リンカーは、「痕跡の無い（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）」または「自己分解性（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）」リンカーであることがふさわしい。「痕跡の無いリンカー」または「自己分解性リンカー」とは、リンカーから基質部分が裂けることで、自発的にリンカーがセレンテラジン核から裂けて、セレンテラジンを放つ。「自己分解性リンカー」の代表例には、図３に示されているものが含まれる。
【００２１】
「低シクロアルキル」という用語は、３〜６個の炭素原子を有する炭化水素化合物から水素原子を取り除くことにより得られる一価部分を指している。飽和低シクロアルキル基の実施例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなどの基が含まれるが、これらに限定されない。一つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する不飽和低シクロアルキル基の実施例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどの基が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
「発光酵素」という用語は、特段の指定がない限り、基質としてセレンテラジンを使用する、天然由来、組み換えまたは突然変異の酵素を指している。天然由来の発光酵素の場合、当業者であれば容易に生物から取得可能である。発光酵素が天然由来のもの、または組み換えもしくは突然変異の発光酵素である場合、すなわち、天然由来の発光酵素のルシフェラーゼ−セレンテラジン反応において活性を保持するものであれば、バクテリア、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの培養から容易に取得可能であり、変換されて発光酵素をエンコードする核酸を発現し得る。さらに、組み換えまたは突然変異の発光酵素は、ルシフェラーゼをエンコードする核酸を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞遊離系から引き出すことができる。好適な発光酵素には、生物発光十脚類由来のルシフェラーゼ、例えば、オプロフォルス由来のルシフェラーゼ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）など、ヒオドシエビ上科（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｏｉｄｅａ）から引き出されるルシフェラーゼ、刺胞動物（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ）、Ａｒｉｓｔｅｉｄａｅ、Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒｉｄａｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｄａｅ、サクラエビ科、ＰａｓｉｐｈｅｉｄａｅおよびＴｈａｌａｓｓｏｃａｒｉｄｉｄａｅ十脚目ファミリーなどの海洋生物から派生するルシフェラーゼ、ならびにエクオリンなどの発光タンパク質が含まれる。
【００２３】
「発光反応混合物」には、発光酵素により光信号、すなわちルミネセンスが生成され得る物質が含有される。混合物にはまた酵素が含有される。必要な物質、ならびに発光信号を生成するのに必要な物質の特定の濃度および／または量は、使用される発光酵素並ならびにアッセイのタイプによって異なる。多くの場合、その他の物質が溶液に加えられる。例えば、その他の物質には、適正なｐHでの反応を維持するための緩衝剤、酵素活性の維持に役立つＰＲＩＯＮＥＸまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの添加剤、還元剤、洗浄剤などが含まれる。
【００２４】
「ペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸の連続を指している。いくつかの実施形態では、ペプチドには、８０個以下のアミノ酸、または３５個以下のアミノ酸、または１０個以下のアミノ酸が含有され得る。
【００２５】
「糖類」という用語は、糖またはその他の炭水化物、特に単純な糖を指している。α−およびβ−アノマー類の両方が含まれる。糖類は、C6−ポリヒドロキシ化合物、典型的にはC6−ペンタヒドロキシであり得、しばしば、環状グリカールであり得る。既知の単純な糖およびその誘導体、ならびに２つまたはそれ以上の単糖類残渣を有する多糖類が含まれる。糖類には、ヒドロキシル基上の保護基がふくまれ得る。糖類のヒドロキシル基は、一つまたは複数のアセタミド、ハロ、またはアミノ基で置換され得る。さらに、一つまたは複数の炭素原子を酸化して、例えば、ケト基またはカルボニル基にすることもできる。好適な糖類には、ガラクトース、グルコース、グルクロン酸およびノイラミン酸（ｎｅｕｒｏｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）が含まれる。
【００２６】
「置換された」という用語は、「置換された」という表現で表される基の一つまたは複数（例えば、１、２、３、４または５、いくつかの実施形態では、１、２、または３、および他の実施形態では、１またｈ２）の水素が、指定された基（複数可）から選択した基、または当業者に既知の好適な基で置換されていることを示すことを意図している。但し、指定された原子の正常原子価は超過でなく、置換の結果安定した化合物となる。好適な置換基には、ハロ、ヒドロキシル、フェニル、−ＮＨ2、−ＮＨＭｅ、−ＮＭｅ2、−ＳＨ、−ＣＨ（ＯＭｅ）2、−ＣＦ3、−ＯＣＨ3、−ＳＣＨ3、Ｃ1~4アルキル、ピペラジニル、およびアリールで置換されたピペラジニルが含まれる。
【００２７】
（化合物）
セレンテラジンは、海洋ルシフェラーゼなど、広範な種類の生物発光タンパク質が作用すると発光することが知られている。海洋ルシフェラーゼの実施例として、ウミシイタケルシフェラーゼ、エクオリン、ガウシアルシフェラーゼ、オプロフォルスルシフェラーゼ、およびウミホタルルシフェラーゼが含まれる。
【００２８】
本発明は、非発光酵素の基質であり、また発光タンパク質のｐｒｏ−基質でもある、セレンテラジン誘導体を提供する。いったん対象の非発光酵素が作用すると、前記誘導体は、発光タンパク質の基質となり、よって、当業者に既知の方法により検出可能となる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、前記誘導体は、以下に示される式ＩからＩＶの化合物であり；（１）
【化９】
0006040157.tif 000010
式中、Ｒ2は、−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1~5アルキルであり；
R2'は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2、または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
R8は、
【化１０】
0006040157.tif 000011
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、またはＣ1~2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1~4アルキル、置換Ｃ1~4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、または置換ヘテロアリール；
Ｌはリンカーであり；
ｎは０〜３であり；
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり；
Ｔはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよく；
（２）
【化１１】
0006040157.tif 000012
式中、Ｒ2は、−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1~5アルキルであり；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
Ｒ8は、
【化１２】
0006040157.tif 000013
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ11は、ペプチド、アミノ酸、糖類, −Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、または共にＣ1~2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1~4アルキル、置換Ｃ1~4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり；
Ｌ’は直接結合またはリンカーであり；
ｎは０〜３であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1~7アルキルであり；
Ｔはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよく；
（３）
【化１３】
0006040157.tif 000014
式中、Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
Ｒ8は、
【化１４】
0006040157.tif 000015
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ12は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、またはＣ1~2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1~4アルキル、置換Ｃ1~4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり；
Ｌ’は直接結合またはリンカーであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；
Ｘは、それぞれ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1~7アルキルであり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよく；
（４）
【化１５】
0006040157.tif 000016
式中、Ｒ2は−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1~5アルキルであり；
Ｒ8は、
【化１６】
0006040157.tif 000017
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ16は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、またはＣ1~2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1~4アルキル、置換Ｃ1~4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCはアリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリール；
Ｌ’は直接結合またはリンカーであり；
ｎは０〜３であり；
Ｔはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；
Ｘは、それぞれ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1~7アルキルであり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態では、R2は、
【化１７】
0006040157.tif 000018
または、Ｃ2~5アルキルであり；
Ｘはそれぞれ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｚは−ＣＨ−または−Ｎ−であり；  Ｙは−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｗは−ＮＨ2、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ2Ｒであり；およびＲはＣ1~7アルキルである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、R2は、
【化１８】
0006040157.tif 000019
であり；および
XはOまたはSである。別の実施形態では、R2はC2~5直鎖アルキルである。ある実施形態では、R8は、
【化１９】
0006040157.tif 000020
低シクロアルキル、またはHであり、式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、またはＣ1~2アルキルである。別の実施形態では、R8はベンジルである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、VはSである。
【００３３】
本発明の化合物には、天然由来の（「天然の」）セレンテラジンならびにその類似体がふさわしく、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００３／０４０１００号および米国特許出願第１２／０５６，０７３号（パラグラフ「００８６」）に開示されているものに加えて、セレンテラジン−ｎ、セレンテラジン−ｆ、セレンテラジン−ｈ、セレンテラジン−ｈｃｐ、セレンテラジン−ｃｐ、セレンテラジン−ｃ、セレンテラジン−ｅ、セレンテラジン−ｆｃｐ、ｂｉｓ−デオキシセレンテラジン（“セレンテラジン−ｈｈ”）、セレンテラジン−ｉ、セレンテラジン−ｉｃｐ、および２−メチルセレンテラジンが含まれる。本発明に従って誘導体化され得る追加の好適なセレンテラジンとして、図４に示されているものが含まれる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明のセレンテラジン誘導体は、グリコシダーゼの基質である。好適な誘導体として、図５に示されているものが含まれる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明のセレンテラジン誘導体は、カスパーゼ２、カスパーゼ３／７、カスパーゼ６、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰＩＶ）、カルパイン、キモトリプシン様プロテアソーム、トリプシン様プロテアソーム、カスパーゼ様プロテアソーム、グランザイムＢ、カテプシンＢ／Ｌ／Ｋ、トロンビン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、およびＳＡＲＳプロテアーゼなどのプロテアーゼの基質である。好適なペプチドおよびアミノ酸、およびそれらが基質となる酵素には、図６に羅列されているものが含まれる。好適な追加の誘導体には、図７に羅列されているものが含まれる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明のセレンテラジン誘導体は、チトクロームＰ４５０酵素の基質である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明のセレンテラジン誘導体は、ジアフォラーゼ酵素の基質である。
【００３８】
（利用方法）
本発明のセレンテラジン誘導体は、チトクロームＰ４５０酵素、プロテアーゼまたはグリコシダーゼなどの非発光酵素の存在または活性を検出するために、アッセイ試薬で使用され得る。発光酵素およびその基質を使用するアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、発光酵素、発光反応混合物および非発光酵素の基質であるセレンテラジン誘導体を、非発光酵素含有と思われるサンプルに加えてもよい。もし非発光酵素がサンプルに存在するなら、非発光酵素がセレンテラジン誘導体に作用して、発光酵素により認識され、発光信号を産生する。代わりに、非発光酵素が、発光性セレンテラジン誘導体を非発光性形態、すなわち信号アッセイの喪失状態に変換することもできる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、アッセイにおいて、セレンテラジンの化学発光を利用してもよい。例えば、非発光酵素の基質であるセレンテラジン誘導体を、非発光酵素を含有すると思われるサンプルに加えてもよい。もし、非発光酵素がサンプルに存在すれば、非発光酵素がセレンテラジン誘導体に作用し、化学発光となり、周知の技術で検出可能となり得る。
【００４０】
セレンテラジン誘導体を、発光酵素の前にまたは同時に、サンプルに加えてもよい。ある実施形態では、サンプルは細胞でもよい。細胞は真核細胞でもよく、例えば、酵母、鳥類細胞、植物細胞、昆虫細胞、サル、ネズミ、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギもしくはブタの細胞などを含むがこれに限定されない哺乳動物細胞、または原核細胞、または２つもしくはそれ以上の異なる生物由来の細胞でもよく、または細胞溶液もしくはその上清であってもよい。細胞は、組み換え技術により遺伝子工学的に修飾されたものでもよい。ある態様では、細胞は、トランスジェニックなどの動物のものでもよく、または、血液、血漿、尿、粘液の分泌物などの生理液でもよい。
【００４１】
サンプルは、検出され得る複数の非発光酵素を含有してもよい。この場合、複数の発光酵素が使用され得る。さらに、複数の基質も使用され得る。複数の基質および／または発光酵素を使用して、複数の非発光酵素またはその他の対象分子（複数可）、例えば試験化合物を、例えば多様な反応において、同時に検出してもよい。
【００４２】
セレンテラジン誘導体はまた、細胞を分析するｉｎ  ｓｉｔｕ方法において有益である。ルシフェラーゼを利用して細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ分析を行う方法は、当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，９９８，２０４号を参照されたし。セレンテラジン誘導体は、非発光酵素ヘの曝露前は、発光酵素の基質ではない。しかし、非発光酵素に曝露すると同時に、前記誘導体は、発光酵素の存在下で、発光反応において容易に検出され得る化合物に変換する。よって、ｉｎ  ｓｉｔｕイメージングにより、非発光酵素が細胞のどこに位置づけられるかを決定し得る。これは、発光酵素を発現する細胞をセレンテラジン誘導体と接触させることにより行い得る。
【００４３】
代わりに、発光酵素の遺伝子を発現するトランスジェニック動物に、対象の特定の非発光酵素の基質であるセレンテラジン誘導体と投与することができる。その後、イメージング技術（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏバイオフォトニックイメージング）を用いて、生きたインタクトな動物における発光酵素発現の部位で発光を測定することができる。よって、発光酵素を発現するトランスジェニック動物に、対象の適切な非発光酵素が発現される組織において発光酵素の基質に変換するセレンテラジン誘導体を投与し得る。また、発光酵素が組織で発現される場合、発光信号が産生され、任意の好適な手段により検出され得る。よって、薬剤などの試験化合物は、動物ベースのアッセイで試験され得る。試験化合物は、セレンテラジン誘導体前に動物に投与するべきである。代わりに、トランスジェニック動物由来の組織を、組織ベースのアッセイで使用することもできる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、非トランスジェニック動物へ、対象の特定の非発光酵素の基質であるセレンテラジン誘導体を投与してもよい。誘導体は、適切な非発光酵素が発現される組織において、発光酵素の基質へと変換する。血液、血清、胆汁、尿、糞便、または組織などの生物サンプルは、動物から取得可能であり、発光酵素と接触させることができる。その結果得られる信号は、任意の好適な手段により検出可能である。よって、薬剤などの試験化合物は、動物ベースのアッセイで試験され得る。試験化合物は、セレンテラジン誘導体の前に動物に投与するべきである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、候補薬剤などの試験化合物をスクリーニングし、その活性を評価することができる。例えば、（１）非ルシフェラーゼ酵素の基質、（２）非ルシフェラーゼ酵素の阻害剤、誘導剤または活性剤などの制御剤、または（３）細胞状態（例えば、生存力、反応性酸素種の増加、または還元可能性の増加）の調節剤などが挙げられる。セレンテラジン誘導体はまた、基質と非ルシフェラーゼ酵素との区別のために用いられ得る。スクリーニングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで行い得る。
【００４６】
さらに、本明細書に記載の任意の生物発光アッセイに関しては、その他の試薬を、ルシフェラーゼの不活性化を阻害または防止するものを含むがこれに限定されない反応混合物に加えてもよく、そうでなければ、発光信号を拡張または強化してもよい。
【００４７】
（キット）
本発明はまた、一つまたは複数の非ルシフェラーゼ酵素の存在または活性を決定するためのキットを提供する。キットには、以下のうち一つまたは複数が含まれ得る。すなわち、セレンテラジン誘導体（複数可）、非ルシフェラーゼ酵素（複数可）、セレンテラジン−依存性発光酵素（複数可）、および反応緩衝剤（複数可）である。反応緩衝剤は、非ルシフェラーゼ酵素反応および発光酵素反応のための個々の調剤に存在してもよく、または単独ステップアッセイの単独調剤に存在してもよい。本発明のキットにはまた、非ルシフェラーゼ酵素（複数可）の阻害剤、活性剤および／または強化剤が含まれ得る。本発明のキットにはまた、アッセイの陽性対照および／または陰性対照が含まれ得る。
【００４８】
本発明はさらに、以下の非限定的実施例により記載される。
【実施例】
【００４９】
実施例１：ｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈ（化合物２１）の合成
【化２０】
0006040157.tif 000021
【００５０】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−４−オキソブタノエート（１３）：
フラスコにＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ (６．７ｇ、１６．２８ｍｍｏｌ）および１００ｍｌの乾燥ＴＨＦを入れた。この溶液に、周囲温度で、無水Ｎ−メチルモルホリン（１．９ｍＬ、１７．２８ｍｍｏｌ）を加え、溶液を−２０℃まで冷却した。無水イソブチルクロロホルメート（２．２ｍＬ、１６．９６ｍｍｏｌ）をシリンジで加え、得られた懸濁液を１０分間攪拌した。アミノアルコール（２．０ｇ、１６．２４ｍｍｏｌ）を一回分加え、反応混合物を１０分間攪拌し、その後、冷浴から取り出し、周囲温度で２時間攪拌を継続した。前記反応混合物を３００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、その混合物を５０ｍＬの水で２回、５０ｍＬの０．５ＭのＨＣｌ、５０ｍＬのブライン溶液で２回と、連続して洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、真空下で濃縮した。残渣を、ヘプタン／酢酸エチルの勾配を用いたシリカクロマトグラフィーにかけた。これにより、白色固体として５．２ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）の産物を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄｍｓｏ）、ｄ１０．０２（ｓ、１Ｈ）、７．８９（ｄ、Ｊ＝７．５、２Ｈ）、７．８１〜７．６７（ｍ、３Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．４、２Ｈ）、７．４７〜７．２７（ｍ、４Ｈ）、７．２４（ｄ、Ｊ＝８．４、２Ｈ）、５．０９（ｔ、Ｊ＝５．７、１Ｈ）、４．５１（ｍ、１Ｈ）、４．４３（ｄ、Ｊ＝５．７、２Ｈ）、４．３７〜４．１６（ｍ、３Ｈ）、２．７６〜２．５１（ｍ、２Ｈ）、１．３７（ｓ、９Ｈ）。
【００５１】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（（４−（クロロメチル）フェニル）アミノ）−４−オキソブタノエート（１４）：
フラスコに、アルコール（１３）（０．５ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）および１５ｍＬの乾燥ベンゼンを入れた。この溶液に、周囲温度で、無水トリエチルアミンを加え、２分間攪拌した後、混合物を氷／水浴槽で１０分間冷却した。これに、無水塩化チオニル（７８μＬ、１．０７ｍｍｏｌ）を加え、２分後に冷浴槽を取り除き、周囲温度で３時間攪拌を継続した。反応混合物を、セライトパッドを通じて濾過し、濾過ケークを３０ｍＬの乾燥ベンゼンで濯いだ。濾過液を真空下で濃縮し、塩化メチレンを用いたシリカカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製した。これにより、粘着性白色固体として、４５７ｍｇ（０．８５ｍｍｏｌ）の産物を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄｍｓｏ）δ１０．１６（ｓ、１Ｈ）、７．８９（ｄ、Ｊ＝７．５、２Ｈ）、７．７９（ｄ、Ｊ＝８．１、１Ｈ）、７．７６〜７．６８（ｍ、２Ｈ）、７．６１（ｄ、Ｊ＝８．５、２Ｈ）、７．４４〜７．２７（ｍ、６Ｈ）、４．７２（ｓ、２Ｈ）、４．５８〜４．４４（ｍ、１Ｈ）、４．３３〜４．１８（ｍ、３Ｈ）、２．６３（ｄｄｄ、Ｊ＝６．０、１４．６、２１．８、２Ｈ）、１．３７（ｓ、９Ｈ）。
【００５２】
化合物１７および１８：
乾燥フラスコに、アルゴン雰囲気下で、セレンテラジン−ｈ（７）（２００ｍｇ、  ．３７ｍｍｏｌ）および１５ｍＬの無水、脱酸素ＤＭＦを入れた。この溶液に、周囲温度で、ヨウ化カリウム（３１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（５１ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を約２時間攪拌した。これに、化合物１４を加え、その混合物を１８時間攪拌した。産物を逆相および順相クロマトグラフィー双方により精製した。
【００５３】
化合物１９および２０：
３ｍＬのジクロロメタンに化合物１７または１８のいずれか（３６５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を周囲温度で混ぜた溶液に、７ｍＬのジクロロメタンにピペリジン（２ｍＬ）を混ぜた溶液を加えた。反応混合物を３０分間攪拌し、５０ｍＬのトルエンで希釈し、真空下で濃縮した。残渣を、０．１％ＴＦＡ／水とアセトニトリルの勾配を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製し、アセトニトリルにした。位置異性体の混合物（１３３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を２ｍＬの乾燥ＤＭＦで分解し、ＨＯＢｔ（３０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）およびｚ−ＤＥＶＤ−ＣＯ2Ｈ（１４０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液に、周囲温度で、ＥＤＣ（４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を一晩中攪拌した。前記粗反応混合物を１ｍＬのアセトニトリルで希釈し、２０ｍＭの酢酸アンモニウムとアセトニトリルの勾配を用いて、逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、５４ｍｇの化合物１９および６９ｍｇの化合物２０を得た。
【００５４】
化合物２１：
化合物１９および２０の粗混合物を、２ｍＬのジクロロメタンで分解し、周囲温度でこの溶液に、４ｍＬのトリフルオロ酢酸、２ｍＬのジクロロメタン、０．４ｍＬのトリイソプロピルシラン、および０．４ｍＬのチオアニソールを含む脱保護カクテルを加えた。反応混合物を３時間攪拌し、３０ｍＬのジエチルエーテルで希釈した。この懸濁液を遠心分離し、その固体を１０ｍＬのジエチルエーテルで２回すりつぶした。残渣を、２ｍＬのメタノールで分解し、２０ｍＭの酢酸アンモニウムとアセトニトリルの勾配を用いて、逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、オレンジ色の固体として、９ｍｇの化合物２１を得た。
【００５５】
実施例２： ｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈ（化合物２１）の生物試験
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７．２、２ｍＭのＤＴＴ、および０．５％ＣＨＡＰＳの中で、化合物２１（５０μＭ）を、ウミシイタケルシフェラーゼ（６．５μｇ／ｍｌ、ウミシイタケ−ＧＳＴ融合）と混ぜ合わせ、２０分間培養し、ウミシイタケルシフェラーゼの基質となり得る任意の遊離セレンテラジン誘導体を取り除いた。精製されたカスパーゼ−３酵素（５０Ｕ／ｍｌ）または緩衝剤コントロールを、最終濃度がそれぞれ２５μＭのＺ−ＤＥＶＤ−セレンテラジンｈ誘導体基質、２５Ｕ／ｍｌのカスパーゼ−３および３．２５ｕｇ／ｍｌルシフェラーゼを１：１の容積比で加えた。発光は、１１０分間かけて測定した。経時的に、カスパーゼを含有しない対照サンプルと比べて、１００倍の発光増加が観察されたが、これはすなわち、セレンテラジンの酵素放出を示しており、本発明のセレンテラジン化合物が、カスパーゼ酵素（図１）の検出に用いられ得ることを実証したものである。
【００５６】
実施例３：ｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈ（化合物２１）の代替的合成
【化２１】
0006040157.tif 000022
【００５７】
（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−アミノ−４−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−４−オキソブタノエート（Ｃ）
２５０ｍＬの丸フラスコの中で、ｂ（６ｇ、０．０１１ｍｏｌｅ）をジメチルホルムアミド（６０ｍＬ）で分解した。ピペリジン（１０ｍＬ）を加えた。４時間後、ＴＬＣが反応の完了を示した。溶媒を蒸発させた。残渣を、シーライト（２５０ｍＬのＥｔＯＡｃ中１５ｇ）上に載せ、ＭｅＯＨ（ＤＣＭ中１０％）に向かって勾配するＤＣＭを用いて、シリカ（８０ｇ）上で溶出することにより精製した。混ぜ合わされた分画を蒸発させた。収率（７６％）；Ｒｆ＝０．２（５０／５０Ｈｅｐｔ／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄｍｓｏ）δ７．５６（ｄ、Ｊ＝８．３、２Ｈ）、７．２２（ｄ、Ｊ＝８．３、２Ｈ）、５．０６（ｔ、Ｊ＝５．４、１Ｈ）、４．４１（ｄ、Ｊ＝４．６、２Ｈ）、３．６１（ｔ、Ｊ＝６．５、１Ｈ）、２．５９（ｄｄ、Ｊ＝５．８、１５．５、１Ｈ）、２．４１（ｄｄ、Ｊ＝７．２、１５．６、１Ｈ）、１．３５（ｓ、９Ｈ）；ｍ／ｚ。
【００５８】
（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｒ，１４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル５−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエチル）−８−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−３−オキソプロピル）−１４−（４−（ヒドロキシメチル）フェニルカルバモイル）−１１−イソプロピル−３，６，９，１２−テトラオキソ−１−フェニル−２−オキサ−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１６−オエートｄ）
１００ｍＬの丸底フラスコに、Ｚ−Ｄ（ｔＢｕ）Ｅ（ｔＢｕ）Ｖ−ＯＨ（３．９６ｇ、６．５ｍｍｏｌ）、ｃ（１．６ｇ、５．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．９１５ｇ、５．９ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（２５ｍＬ）を加えた。攪拌する溶液に、ＥＤＡＣ（１．１５ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を加えた。１８時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で再分解した。溶液をクエン酸（３０％、５０ｍＬ）、重炭酸塩（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅsat）（５０ｍＬ）、水（２×５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。材料をシーライト（１５ｇ）上で吸着し、ヘプタンからＥｔＯＡｃへ勾配するシリカ上で精製した。収率（７４％）。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄｍｓｏ）δ９．８５（ｓ、１Ｈ）、８．３３（ｄ、Ｊ＝７．７、１Ｈ）、７．９５（ｄ、Ｊ＝８．１、１Ｈ）、７．８３（ｄ、Ｊ＝８．３、１Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝８．３、１Ｈ）、７．５３（ｄ、Ｊ＝８．５、２Ｈ）、７．４３〜７．２６（ｍ、５Ｈ）、７．２１（ｄ、Ｊ＝８．６、２Ｈ）、５．０６（ｔ、Ｊ＝５．７、１Ｈ（Ｄ２Ｏシェーク上で消失））、５．０２（ｄ、Ｊ＝４．７、２Ｈ）、４．７０（ｑ、Ｊ＝７．７、１Ｈ）、４．４１（ｄ、Ｊ＝５．６、２Ｈ（Ｄ２Ｏシェーク上でｓへコラプス））、４．３８〜４．２５（ｍ、２Ｈ）、４．１７〜４．０９（ｍ、１Ｈ）、２．７９〜２．６３（ｍ、１Ｈ）、２．６２〜２．３５（ｍ、４Ｈ）、２．２６〜２．１１（ｍ、２Ｈ）、２．００〜１．７９（ｍ、２Ｈ）、１．７３（ｄ、Ｊ＝６．０、１Ｈ）、１．３４（ｄｄ、Ｊ＝４．７、７．４、３１Ｈ）、０．８１（ｔ、Ｊ＝６．３、６Ｈ）。ＭＳ：Ｃ45Ｈ65Ｎ5Ｏ13の計測値８８３．５；実測値８８３．７。
【００５９】
（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｒ，１４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル５−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエチル）−８−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−３−オキソプロピル）−１４−（４−（クロロメチル）フェニルカルバモイル）−１１−イソプロピル−３，６，９，１２−テトラオキソ−１−フェニル−２−オキサ−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１６−オエート（ｅ）
１００ｍＬのＲＢフラスコへ、ベンゼン（５０ｍＬ）と共にｄ（３．５６ｇ、４ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を蒸発させ、高真空下で、一晩中蓄積した。乾燥ベンゼン（７０ｍＬ）をＴＥＡ（６１０μＬ、４．４ｍｍｏｌ）と共に固体に添加した。溶液を氷浴で氷冷し、ＳＯＣｌ2（３２０μＬ、４．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。溶液が室温になるまで放置した。４時間後、追加のＴＥＡ（２４１μＬ）およびＳＯＣｌ2（１００μＬ）を加えた。さらに２時間後、反応混合物をシーライト（１０ｇ）上で吸着し、ＤＣＭからＤＣＭ中５％ＭｅＯＨへと勾配するシリカ上で溶出した。収率（３３％）。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄｍｓｏ）δ１０．００（ｓ、１Ｈ）、８．３５（ｄ、Ｊ＝７．８、１Ｈ）、７．９５（ｄ、Ｊ＝７．８、１Ｈ）、７．８４（ｄ、Ｊ＝８．３、１Ｈ）、７．６７（ｄ、Ｊ＝８．６、３Ｈ）、７．４１〜７．２２（ｍ、７Ｈ）、５．１１〜４．９１（ｍ、２Ｈ）、４．７７〜４．５９（ｍ、３Ｈ）、４．４３〜４．２１（ｍ、２Ｈ）、４．１９〜４．０４（ｍ、１Ｈ）、３．３０（ｓ、（水））、２．７９〜２．３２（ｍ、４Ｈ＋ＤＭＳＯ）、２．２６〜２．０７（ｍ、２Ｈ）、２．００〜１．７９（ｍ、２Ｈ）、１．７７〜１．６０（ｍ、１Ｈ）、１．４０〜１．２４（ｍ、２７Ｈ）、０．８１（ｔ、Ｊ＝６．４、６Ｈ）。
【００６０】
（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｒ，１４Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル５−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソエチル）−８−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−３−オキソプロピル）−１４−（４−（（２，８−ジベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イルオキシ）メチル）フェニルカルバモイル）−１１−イソプロピル−３，６，９，１２−テトラオキソ−１−フェニル−２−オキサ−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１６−オエート（２０）。
セレンテラジン−ｈ（５０ｍｇ、１２２μｍｏｌ）およびＫ2ＣＯ3（３４ｍｇ、２４５μｍｏｌ）を含有する、アルゴンガスで脱気したガラス瓶へ、ＤＭＦ（５００μＬ）にｅ（１３３ｍｇ、１４７μｍｏｌ）を混ぜた脱気溶液を加えた。２時間後、ＰＲ−ＨＰＬＣに直接反応を注入し、０．１％ＴＦＡ（ａｑ）からアセトニトリルへの勾配で溶出した。主要ピークを単離し、蒸発させた。収率（１３％）。ＵＶ：ピークは２５０、３００、および４２０ｎｍ。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄｍｓｏ）δ９．７９（ｓ、１Ｈ）、８．２７（ｄ、Ｊ＝７．５、１Ｈ）、７．９２（ｄ、Ｊ＝８．０、１Ｈ）、７．８５（ｄ、Ｊ＝１０．１、１Ｈ）、７．５８（ｄ、Ｊ＝８．３、１Ｈ）、７．５３（ｄ、Ｊ＝８．７、２Ｈ）、７．４５〜７．１４（ｍ、１５Ｈ）、７．０９〜６．８０（ｍ、６Ｈ）、６．７２（ｄ、Ｊ＝８．８、２Ｈ）、５．１３〜４．９０（ｍ、２Ｈ）、４．７３〜４．５３（ｍ、１Ｈ）、４．２２（ｄｄ、Ｊ＝５．０、１７．７、３Ｈ）、４．１６〜４．０１（ｍ、３Ｈ（Ｄ2Ｏシェーク後２H））、３．２５〜３．０１（ｍ、Ｊ＝１０．０、１６．５、４Ｈ）、２．７６〜２．５３（ｍ、Ｊ＝１５．６、２Ｈ）、２．５１〜２．３３（ｍ、２Ｈ＋ＤＭＳＯ）、２．２４〜２．０４（ｍ、２Ｈ）、１．９９〜１．７７（ｍ、２Ｈ）１．７６〜１．６１（ｍ、１Ｈ）、１．４０〜１．０７（ｍ、２７Ｈ）、０．８９〜０．６２（ｍ、６Ｈ）。ＭＳ：Ｃ７１Ｈ８４Ｎ８Ｏ１４の計算値は１２７２．６；実測値は１２７２．８。
【００６１】
実施例４：３０の合成
【化２２】
0006040157.tif 000023
２０ｍｌのメチレンジクロライドの中で、セレンテラジンアセチルエステル（０．５０ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）、キノントリメチルロックC２−ジアミンカルボニルクロリド（０．４３６ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１３９ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．１１５ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の混合物を一晩中、室温で攪拌した。前記化合物を、ヘプタン／酢酸エチルを溶出剤として用いて、シリカクロマトグラフィで精製し、２０％（０．１８４ｇ）の収率を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）δ８．４７（ｓ、１Ｈ）、８．０４（ｄ、２Ｈ）、７．５５（ｄ、２Ｈ）、７．０〜７．５（ｍ、９Ｈ）、４．５７（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２）、４．１６（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２）、３．２〜３．７（ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２）、２．７〜３．２（ｍ、８Ｈ、２ＮＣＨ３＋ＣＨ２）、２．３０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．０〜２．２（ｍ、１５Ｈ、ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：７９６．５（Ｍ＋）。
【００６２】
実施例５：４０の合成
【化２３】
0006040157.tif 000024
３０の調製方法（実施例４）と類似の方法を活用して４０を作成した。ヘプタン／酢酸エチルを溶出剤として用いて、シリカクロマトグラフィで精製し、６０％（０．３２ｇ）の収率を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ２Ｃｌ２）δ８．４７（ｓ、１Ｈ）、８．０３（ｍ、２Ｈ）、７．５７（ｄ、２Ｈ）、７．１〜７．５（ｍ、７Ｈ）、６．３３（ｓ、１Ｈ）、６．１７（ｓ、１Ｈ）、４．５８（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２）、４．１９（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２）、３．３〜３．７（ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２）、２．７〜３．２（ｍ、８Ｈ、２ＮＣＨ３＋ＣＨ２）、１．０〜２．２（ｍ、１５Ｈ、ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：７２８．５（Ｍ＋）。ＨＰＬＣ精度：２６２ｎｍで９０％
【００６３】
実施例６：５０の合成
【化２４】
0006040157.tif 000025
ＰＢＩ４４４２の調製方法と類似の方法（実施例２０）を活用して５０を作成した。ヘプタン／酢酸エチルを溶出剤として用いて、シリカクロマトグラフィで精製し、１７％（０．１５ｇ）の収率を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ２Ｃｌ２）δ８．４２（ｓ、１Ｈ）、７．９９（ｍ、２Ｈ）、７．５７（ｄ、２Ｈ）、７．１〜７．５（ｍ、１０Ｈ）、４．５８（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２）、４．１９（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２）、３．３〜３．７（ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２）、２．７〜３．２（ｍ、８Ｈ、２ＮＣＨ３＋ＣＨ２）、１．０〜２．２（ｍ、１５Ｈ、ＣＨ３）。ＭＳ（ｍ／ｅ）：７３８．５（Ｍ＋）。ＨＰＬＣ精度：２６２ｎｍで９５％。
【００６４】
実施例７：キノン誘導体を用いて代謝活性細胞を測定する
本実施例では、代謝活性細胞の量を測定するために、キニーネ含有セレンテラジン誘導体の使用を示す。生細胞は代謝活性状態を維持するが、細胞が損傷すると、その状態が失われれるのは不可避である。生きた細胞に入ると、キノンセレンテラジンは、オプロフォルスルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼなど、セレンテラジンを利用したルシフェラーゼの基質であるセレンテラジン誘導体に還元する。キノンセレンテラジンの変換は、代謝活性細胞の数に比例し、よって、ルシフェラーゼ反応により産生される光をモニタリングすることで量的に測定することが可能である。
【００６５】
ジャーカット細胞の２倍の段階希釈をＰＢＳで調製し、ウェル毎に５０μｌずつ９６ウェルプレートのウェルに移した。化合物４０および５０をＰＢＳで希釈して、それぞれ５０μＭおよび１００μＭのストックを作成した。調製した化合物ストック１０μｌを細胞に加え、その細胞を３７℃、５％ＣＯ2の培養器に置いた。３０分の培養後、前記細胞を培養器から取り出し、室温で１０分間冷却し、５０μｌのオプロフォルスルシフェラーゼ検出試薬を直接ウェルに加えた。サンプルを混ぜ合わせ、室温で２０分間培養し、発光を測定した。図８に細胞数と発光の線形相関が示したが、これはすなわち、発光と細胞数との間に直接的関係のあることを表している。
【００６６】
実施例８：オプロフォルスルスルシフェラーゼと化合物２１を用いたカスパーゼ３アッセイ
オプロフォルスルスルシフェラーゼ（ＯｇＬｕｃ）異形、９Ｂ８ｏｐｔを、ＤＥＶＤカスパーゼ−３切断配列を含むｐｒｏ−セレンテラジン基質を用いた生物発光アッセイに使用した。精製したカスパーゼ−３酵素を、製造者の取扱説明書に従って、ＨＡＬＯＬＩＮＫ（商標）樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した異形９Ｂ８ｏｐｔを発現する大腸菌の溶解物サンプルと混ぜ合わせ、１００ｍＭのＭＥＳｐＨ６．０、１ｍＭのＣＤＴＡ，１５０ｍＭのＫＣｌ、３５ｍＭのチオ尿素、２ｍＭのＤＴＴ、０．２５％のＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、０．０２５％ＭＡＺＵ（登録商標）を含有し、１００ｍＭのＨＥＲＰＥＳｐＨ７．５中の２３．５μＭｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈを含むかまたは含まない緩衝剤で、１０倍に希釈した。カスパーゼ−３酵素を、室温で３時間、溶解物サンプルで培養し、様々な時点において、Ｔｕｒｎｅｒ  ＭＯＤＵＬＵＳ（商標）ルミノメーターで発光を検出した。バクテリア溶出物のみを含有するサンプルおよびカスパーゼ−３のみを含有するサンプルを対照として使用した。３つの複製物が使用された。図２および表１は、本発明のｐｒｏ−セレンテラジン基質を用いることで、対象の酵素が検出可能であることを示している。
【表１】
0006040157.tif 000026
【００６７】
別のオプロフォルスルスルシフェラーゼ異形Ｌ２７Ｖ０２（「Ｌ２７Ｖ」）を、ＤＥＶＤカスパーゼ−３切断配列を含むｐｒｏ−セレンテラジン基質を用いた生物発光アッセイに使用した。１００ｍＭのＭＥＳｐＨ６（５０μＬ）中の精製されたカスパーゼ−３酵素（１ｍｇ／ｍＬ）を、５０μＬアッセイ緩衝剤（１００ｍＭのＭＥＳｐＨ６、３５ｍＭのチオ尿素、０．５％のＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）ＮＰ−９（ｖ／ｖ）、１ｍＭのＣＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴおよび１５０ｍＭのＫＣｌ）中の２２７ｎＭのＬ２７Ｖ０２異形および４７μＭのＰＢＩ−３７４１（ｚ−ＤＥＶＤ−セレンテラジン−ｈ）と混ぜ合わせた。反応物を３時間室温で培養し、上記の通り発光を検出した。Ｌ２７Ｖ０２異形によるアッセイを、ホタルルスルシフェラーゼによるアッセイ、カスパーゼ−３／７Ｇｌｏ（カスパーゼ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）と比較した。表２は、本発明の化合物を生物発光アッセイに用いることで、対象の酵素が検出可能であることを表している。
【表２】
0006040157.tif 000027
【００６８】
予言的実施例９：Ｏ−（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン−イル）ガラクトシド（２５）
【化２５】
0006040157.tif 000028
【００６９】
典型的なβ糖ｐｒｏ−セレンテラジンの典型的な合成
(Ｏ−（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン−イル）３，４，５，６−テトラアセトキシ−β−ガラクトシド）
【００７０】
１００ｍＬの丸底フラスコに、適切なアセトブロモ−α糖（例えば、アセトブロモα−Ｄ−ガラクトース）（１．１ＥＱ）、適切なセレンテラジン (例えば、（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン）（１．０ＥＱ、１００ｍｇ）、およびトリフルオロメタンスルホン酸（６７ｍｇ、１ＥＱ）を加え、３０分間アルゴンで脱気する。２ｍＬのジクロロメタンおよび７０μＬのテトラメチル尿素を注入し、室温で３時間攪拌する。４ｍＬのアセトニトリルを加え、固体を濾過する。調製用の２５０×４１ｍｍのＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに上清を注入することによりサンプルを精製し、水とアセトニトリルまたはその他の適切な溶剤との勾配で溶出することにより、適切な分画を収集する。分画を蒸発させて化合物を得ることができる。
【００７１】
上記サンプルに、１ｍＬのメタノールを加え、氷浴で０℃に冷却する。その後、メタノールまたはＴＨＥ中のポタジウムメトキシド（５．２ＥＱ）溶液を加えることができる。３０分後、正確に５．２当量の酢酸を加える。その後、３ｍLのアセトニトリルを加え、サンプルを濾過することができる。調製用の２５０×４１ｍｍのＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに上清を注入することによりサンプルを精製し、水とアセトニトリルまたはその他の適切な溶剤との勾配で溶出することにより、適切な分画を収集することができる。分画を蒸発させて化合物（２５）を得ることができる。
【００７２】
予言的実施例１０：様々なP４５０基質の合成
【化２６】
0006040157.tif 000029
DMF中でセレンテラジンと１．１当量ポタジウム炭酸塩とを混ぜ合わせた混合物に、アルゴン雰囲気下で、１当量メチルヨウ化物を室温で加えることができる。薄層クロマトグラフィーにより反応進行をモニタリングすることができる。反応が完了すると同時に、混合物を数分間、氷浴で数分間冷却し、反応物容積と当量容積の水を加えることができる。得られた混合物は、好適な有機溶媒（例えば、酢酸エチル）で抽出することができ、その抽出物を濃縮して粗化合物１を産生する。前記材料をさらにシリカゲルクロマトグラフィーで精製してもよい。
【００７３】
【化２７】
0006040157.tif 000030
ＤＭＦ中でセレンテラジンと１．１当量のポタジウム炭酸塩およびポタジウムヨウ化物とを混ぜ合わせた混合物に、アルゴン雰囲気下で、１当量のｐ−メトキシベンジル臭化物を室温で加えることができる。薄層クロマトグラフィーにより反応進行をモニタリングすることができ、反応が完了すると混合物を数分間、氷浴で数分間冷却し、その後、反応物容積と当量容積の水を加えることができる。得られた混合物は、好適な有機溶媒（例えば、酢酸エチル）で抽出することができ、その抽出物を濃縮して粗化合物２を産生する。前記材料をさらにシリカゲルクロマトグラフィーで精製してもよい。
【００７４】
【化２８】
0006040157.tif 000031
ＴＨＦ中で３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−アミン（６）（１当量）、（Ｅ）−３−（４−（（３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−イル）オキシ）フェニル）−２−オキソプロパン酸（５）（１．５当量）およびカンファースルホン酸（１．５当量）とを混ぜ合わせた混合物を、モレキュラシーブの存在下で、開始材料の濃縮が完了するまで環流で加熱する。反応混合物を酢酸エチルで容積の３倍に希釈し、水およびブライン溶液で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、真空下で溶媒を取り除き、化合物７を含有する残渣を乾燥ＤＭＦで分解した。得られた溶液を無水酢酸（１．５当量）およびピリジン（１．５当量）で、室温で処理する。ＴＬＣにより反応の進行をモニタリングすることができ、いったん完了すると、反応混合物を氷浴で数分間冷却し、その後、反応物容積と当量容積の水を加える。得られた混合物は、好適な有機溶媒（例えば、酢酸エチル）で抽出し、その抽出物を濃縮して粗化合物８を産生する。前記材料をメタノールで分解し、約０℃に冷却し、産物生成が完了するまで、水素化ホウ素ナトリウム（５〜１０当量）を少量ずつ使用して処理する。冷めたまま、反応混合物を、先に添加された水素化物の分子と当量の酢酸で処理することができ、反応混合物を真空下で濃縮することができる。残渣を水で数回すりつぶすと、粗化合物３を得ることができる。この材料をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することもできる。
【００７５】
【化２９】
0006040157.tif 000032
ＴＨＦ中で３−ベンジル−５−（４−（３，３−ジメトキシプロポキシ）フェニル）ピラジン−２−アミン（１０）（１当量）、２−オキソ−３−フェニルプロピオン酸（９）（１．５当量）およびカンファースルホン酸（ＣＳＡ）（１．５当量）と混ぜ合わせた混合物を、モレキュラシーブの存在下で、開始材料の濃縮が完了するまで環流で加熱する。反応混合物を酢酸エチルで容積の３倍に希釈し、水およびブライン溶液で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、真空下で溶媒を取り除き、１１を含有する残渣を乾燥ＤＭＦで分解した。得られた溶液を無水酢酸（１．５当量）およびピリジン（１．５当量）で、室温で処理する。ＴＬＣにより反応の進行をモニタリングすることができ、いったん完了すると、反応混合物を氷浴で数分間冷却し、その後、反応物容積と当量容積の水を加える。得られた混合物は、好適な有機溶媒（例えば、酢酸エチル）で抽出することができ、その抽出物を濃縮して粗化合物１２を産生する。前記材料をメタノールで分解し、約０℃に冷却し、産物生成が完了するまで、水素化ホウ素ナトリウム（５〜１０当量）を少量ずつ使用して処理する。冷めたまま、反応混合物を、先に添加された水素化物の分子と当量の酢酸で処理し、反応混合物を真空下で濃縮する。残渣を水で数回すりつぶすと、粗化合物４が得られる。この材料をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することもできる。
【００７６】
実施例１１：ＮＡＤＨの測定
本発明のジアホラーゼ検出用ｐｒｏ−セレンテラジン基質を使用して、サンプルに存在するＮＡＤＨの量を測定した。ＮＡＤＨ、ジアホラーゼ、ｐｒｏ−セレンテラジン基質、およびエステラーゼを混ぜ合わせて、サンプルに存在するＮＡＤＨを検出した。ジアホラーゼにより利用されるｐｒｏ−セレンテラジンをセレンテラジンに変換した。生成されたセレンテラジンの量は、オプロフォルスルスルシフェラーゼ異形により検出され、生成された発光は、サンプルに存在するＮＡＤＨの量に比例する。
【００７７】
アッセイのために、１０μLのＮＡＤＨ（６０μＭから０μＭへとすりつぶす）、ＰＢＳ中の１０μＬの１２Ｕ／ｍＬジアホラーゼ酵素、ＰＢＳ中の１０μＬの１６５Ｕエステラーゼ、およびＰＢＳ中の１０μＬの６０μＭＰＢＩ−４６００を、１時間室温で培養した。培養後、オプロフォルスルスルシフェラーゼ異形（Ｌ２７Ｖ）を１０9希釈で含有するオプロフォルスルスルシフェラーゼ検出試薬（１００ｍＭのＭＥＳｐＨ６、１ｍＭのＣＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ、３５ｍＭのチオ尿素、１ｍＭのＤＴＴ、０．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌおよび０．０５％Ｍａｚｕ）を加えた。５分後と１時間後に発光を測定した（図９）。データによると、本発明の化合物を用いて、ＮＡＤＨを利用する酵素を検出することによりサンプル中のＮＡＤＨを測定することができる。
【００７８】
全ての刊行物、特許および特許出願書は、参照により本明細書に援用される。前述の明細書では、本発明はそのある実施形態に関連して記載されたが、詳細の多くは説明を目的とするものであって、当業者であれば、本発明が追加の実施形態に対しても実行可能であり、本明細書に記載のある詳細は、本発明の基本的原則が逸脱しない限りにおいて、かなり多様であり得ると理解するであろう。
本発明の好ましい態様は以下の通りである。
１．式（ＩＩ）で示される化合物。
0006040157.tif 000033
式中、Ｒ2は、−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1〜5アルキルであり；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
Ｒ8は、
0006040157.tif 000034
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ11は、ペプチド、アミノ酸、糖類, −Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、または共にＣ1〜2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1〜4アルキル、置換Ｃ1~4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Hまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり；  Ｌ’は直接結合またはリンカーであり；
ｎは、０〜３であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1〜7アルキルであり；
Ｔは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい；
の化合物。
２．式（Ｉ）
0006040157.tif 000035
式中、Ｒ2は、−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1〜5アルキルであり；
Ｒ2'は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
Ｒ8は、
0006040157.tif 000036
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、または共にＣ1〜2アルキルであり；
ＲAはＣ1〜4アルキル、置換Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり；  Ｌは、リンカーであり；
ｎは、０〜３であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1〜7アルキルであり；
Ｔは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
３．式（ＩＩＩ）で示される化合物。
0006040157.tif 000037
式中、Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒから成る群から選択され；
Ｒ8は、
0006040157.tif 000038
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ12は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2または−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、またはＣ1〜2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1〜4アルキル、置換Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり；  Ｌ’は直接結合またはリンカーであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；および
Ｘは、それぞれ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1〜7アルキルであり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
４．式（ＩＶ）で示される化合物。
0006040157.tif 000039
式中、Ｒ2は、−（ＣＨ2）n−ＴまたはＣ1〜5アルキルであり；
Ｒ8は、
0006040157.tif 000040
水素または低シクロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ16は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−Ｏ−ＲA、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ＲA、−Ｎ（ＲB）2またはＮＨＣ（Ｏ）ＯＲAから成る群から選択され；
式中、Ｒ3およびＲ4は共に水素、またはＣ1〜2アルキルであり；
ＲAは、Ｃ1〜4アルキル、置換Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ2−ＲCまたは−ＣＨ2−Ｖ−ＲCであり；
ＲBは、それぞれ独立して、−Ｈまたは−ＲAであり；
ＲCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、または置換ヘテロアリール；
Ｌ’は、直接結合またはリンカーであり；
ｎは０〜３であり；
Ｔは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり；
Ｖは、−Ｓ−または−Ｏ−であり；
Ｘは、それぞれ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｒは、それぞれ独立して、Ｃ1〜7アルキルであり；および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
５．式中、Ｒ2は、
0006040157.tif 000041
または、C2〜5直鎖アルキルであり；
Ｘは、それぞれ独立して、−Ｓ−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
Yは、−Hまたは−OHであり；
Wは、−NH2、ハロ、−OH、−NHC（O）R、−CO2Rであり；および
Rは、C1〜7アルキルである、
上記１，２および４のいずれか一項に記載の化合物。
６．式中、Ｒ2は、
0006040157.tif 000042
であり；および
Ｘは、ＯまたはＳである、
上記５に記載の化合物。
７．式中、Ｒ2は、Ｃ2〜5直鎖アルキルである、上記５に記載の化合物。
８．式中、Ｒ8は、
0006040157.tif 000043
低シクロアルキル、またはＨであり、
Ｒ3およびＲ4は、共に水素、または共にＣ1〜2アルキルである、上記１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
９．式中、Ｒ8は、ベンジルである、上記１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
１０．Ｖが、Ｓである、上記１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
１１．酵素を含有すると思われるサンプルを、上記１〜１０のいずれか一項に記載の化合物と接触させる工程、および
サンプルの発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする酵素の存在または量の検出方法。
１２．発光が、定量化されている、上記１１に記載の方法。
１３．サンプルには第２酵素が含有されると疑われ、
前記サンプルを、上記１〜１０のいずれか一項に記載の、第２酵素のための基質を含有する第２化合物と接触させる工程、および
該サンプルの発光を検出する工程、
を含む、上記１１に記載の方法。
１４．上記１〜１０のいずれか一項に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与する工程、および
発光を検出する工程、
を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏで酵素の存在を検出する方法。
１５．上記１〜１０のいずれか一項に記載の化合物を動物に投与する工程、
動物からサンプルを得る工程、および
サンプルの発光を検出する工程、
を含む、酵素の存在を検出する方法。
１６．
0006040157.tif 000044
0006040157.tif 000045
から成る群から選択される化合物。
【図１】
0006040157.tif 000052
【図２】
0006040157.tif 000053
【図３】
0006040157.tif 000054
【図４】
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【図５】
0006040157.tif 000056
【図６】
0006040157.tif 000057
【図７】
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【図８】
0006040157.tif 000059
【図９】
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【図１０】
0006040157.tif 000061