(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマスを提供するステップと；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素を提供するステップと；
ｃ）原核生物エタノール産生体を提供するステップと；
ｄ）撹拌用のインペラを含むバイオリアクター内で、ａ）の前記前処理バイオマス、ｂ）の前記糖化酵素、およびｃ）の前記原核生物エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物を調製するステップと；
ｅ）前記糖化発酵混合物中で前記原核生物エタノール産生体を培養するステップであって、前記糖化発酵混合物中の総投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも１６％であり、１００μｍ〜６００μｍのサイズのバイオマス粒子の存在下で前記撹拌により総糖化発酵混合物１ｋｇ当たり０．２ワット以下の出力が前記糖化発酵混合物に供給され、
前記原核生物エタノール産生体がエタノールを産生する、ステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。
【請求項２】
ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマス；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素；および
ｃ）原核生物エタノール産生体
を含んでなる糖化発酵システムであって、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前記バイオマス、前記酵素、前記エタノール産生体がバイオリアクター内で回転撹拌機を用いて撹拌しながら糖化発酵混合物として組み合わされ、総投入不溶性固形物濃度が乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも１６％であり、１００μｍ〜６００μｍのサイズのバイオマス粒子の存在下で前記撹拌により総糖化発酵混合物１ｋｇ当たり０．２ワット以下の出力が前記糖化発酵混合物に供給される、糖化発酵システム。
【請求項３】
原核生物エタノール産生体が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属の一員である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
原核生物エタノール産生体が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属の一員である、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前処理バイオマスが、セルロース性バイオマスをアンモニアで処理することにより生成され、前記アンモニアが前記バイオマスの乾燥質量に対して１２質量％未満である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前処理バイオマスが、セルロース性バイオマスをアンモニアで処理することにより生成され、前記アンモニアが前記バイオマスの乾燥質量に対して１２質量％未満である、請求項２記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／２８９７４９号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、セルロース性バイオマスからエタノールを製造する方法に関する。具体的には、高濃度のエタノールを製造するために、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を特定の同時糖化発酵工程条件下で使用する。
【背景技術】
【０００３】
再生可能資源から製造される燃料エタノールは、世界的な化石燃料不足、エネルギーコストの上昇、および二酸化炭素増大に関連した地球温暖化効果に対する長期的な解決策の１つである。再生可能資源からの燃料エタノールは、糖類の発酵によって製造される。目下米国では、トウモロコシ穀粒に由来するグルコースが、エタノール製造のための最も豊富な糖原料である。飼料および食物供給としてのトウモロコシ穀粒に対する需要のために、（ヘミセルロースをはじめとする）様々な各種セルロース性バイオマスを発酵性糖類に転換する方法が開発されている。このバイオマス資源に由来する糖は、ヘキソース類とペントース類であり、主にグルコースとキシロースの混合物である。セルロース性バイオマス加工が進歩した結果、これらの糖類が高濃度で放出され、発酵において高濃度で使用されて、低減した水消費量とより高い処理能力で、エタノールを製造することもできる。したがってバイオマスからエタノールへの変換には、潜在的に採算の合う化石燃料代替え物を提供することで環境影響を改善する、多大な可能性がある。
【０００４】
セルロース性バイオマスをエタノールに変換する典型的な方法は、以下の３つの工程を含んでなる：バイオマスのリグニン含量を低下させ、多糖類を酵素的加水分解で利用できるようにする、バイオマスの化学的および／または物理的処理；多糖類を酵素的に発酵性糖類に変換する、糖化または消化または加水分解；エタノール製造のために、発酵性糖類がエタノール産生体によって消費される発酵。ある場合には、エタノール産生体の状態および性質次第では、糖化および発酵工程を組み合わせることが、エネルギー的に最も効率的なこともある。高濃度のエタノール製造のためには、これらの工程それぞれの最適化が必要である。
【０００５】
エタノール産生体は、典型的には、酵母（例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））または細菌（例えばザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ））であった。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、一般に頑強であり、比較的高いグルコース濃度中で成長し、遺伝子操作して、キシロースおよびアラビノース（一般的な糖化産物）などのＣ５糖類をエタノール発生のために利用するようにし得るので、エタノール製造に適している。しかしザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を効果的に利用するには、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）をエタノール産生体として使用する工程の改善が必要である。
【０００６】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のエタノール産生体としての使用は、既知である（Ｓａｄｄｌｅｒら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８２），２８（１２），１３１１−１９：Ｇｏｌｉａｓら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２６  Ｊｕｎｅ，２００２）（９６）２，ｐｐ．１５５１６８；Ｍａら，Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ（２００９）３４：１４６６−１４７０）が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、バイオマス前処理方法の多くによって生成する、高濃度の酢酸に対して感受性である。酢酸レベルの低下は、前処理バイオマスの洗浄などの方法によって達成し得る（Ｔｅｉｘｅｉｒａら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（Ｓｐｒｉｎｇ，２０００）Ｖｏｌ．８４−８６，ｐｐ．１１１−１２７）。
【０００７】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を利用した、同時糖化発酵におけるキシロースの使用もまた知られており、バイオマスは水酸化ナトリウム、引き続いて過酢酸で処理され、洗浄される（Ｔｅｉｘｅｉｒａら前出）。Ｅｋｌｕｎｄら（Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５），１７（３），２５５−９）は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）をエタノール産生体として使用して、同時糖化発酵を実証しており、バイオマスは蒸気および二酸化硫黄で前処理され、洗浄されて、次に発酵は、フラスコおよび発酵槽の双方において総不溶性固形物濃度約１０％であり、いくらか撹拌されて、エタノール生成量は約２８ｇ／Ｌであった。
【０００８】
さらにＭｃＭｉｌｌａｎら（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）Ｖｏｌ．７７−７９：６４９−６６５．）は、同時糖化発酵工程においてザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の使用を実証し、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株はポプラ加水分解産物に適応され、バイオマスは希釈酸で前処理されて次にＭＴＢＥ抽出され、糖化酵素はセルラーゼであり、発酵は発酵槽内において１５０ＲＰＭで撹拌されて、不溶性固形物１１．５％で実施された。この方法を使用して、上記著者らは、約３５ｇ／Ｌのエタノール生成量を達成することができた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記方法は、エタノール製造のための同時糖化発酵工程において、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を使用してもよいことを実証する。しかしこれらの方法を使用したエタノールの生成量は低く、商業的なエタノール製造を行うためには、工程を最適化する必要があることは明白である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の方法は、糖化および発酵混合物中で高投入量の不溶性固形物を使用できるようにして、高いエタノール生成量を達成するように、原核生物エタノール産生体による生成をサポートする条件を同定することを通じて、同時糖化発酵（ＳＳＦ）工程における原核生物エタノール産生体の使用を最適化する問題の解決を図る。本方法を使用したエタノール生成量は、６０ｇ／Ｌを超え得る。
【００１１】
したがって本発明は、
ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマスを提供するステップと；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素を提供するステップと；
ｃ）原核生物エタノール産生体を提供するステップと；
ｄ）撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内で、ａ）の前処理バイオマス、ｂ）の糖化酵素、およびｃ）の原核生物エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物を調製するステップと；
ｅ）前記原核生物エタノール産生体を前記糖化発酵混合物中で培養するステップであって、前記糖化発酵混合物中の総投入不溶性固形物濃度は、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％であり、前記原核生物エタノール産生体がエタノールを産生する、ステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法を提供する。本発明の一態様では、本発明の撹拌手段は、総糖化発酵混合物１ｋｇ当たり約０．２ワット以下の出力を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、
ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる、粒度が約１００μｍ以下または粒度が約６００μｍ以上の前処理バイオマスを提供するステップと；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素を提供するステップと；
ｃ）原核生物エタノール産生体を提供するステップと；
ｄ）撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内で、ａ）の前処理バイオマス、ｂ）の糖化酵素、およびｃ）の原核生物エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物を調製するステップと；
ｅ）前記原核生物エタノール産生体を前記糖化発酵混合物中で培養するステップであって、
１）前記糖化発酵混合物中の総投入不溶性固形物濃度は、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％であり；
２）前記原核生物エタノール産生体がエタノールを産生する、ステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法を提供する。
【００１３】
別の態様では本発明は、
ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマス；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素；および
ｃ）原核生物エタノール産生体
を含んでなる糖化発酵システムを提供し、ａ）のバイオマス、ｂ）の酵素、およびｃ）のエタノール産生体は、糖化発酵混合物中で組み合わされて、前記糖化発酵混合物中の総投入不溶性固形物濃度は、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６質量％である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１ｇのグルカン＋キシラン当たり１５ｍｇのＨ３Ａタンパク質を用いて、組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）および希釈アンモニア前処理トウモロコシ穂軸を使用したＳＳＦに対する、固体投入量および撹拌ＲＰＭの影響を示すグラフである。
【図２】１ｇのグルカン＋キシロース当たり１５ｍｇのＨ３Ａタンパク質を用いて、希釈アンモニア前処理トウモロコシ穂軸を使用したＳＳＦ条件下における、組換えザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の生存度に対する、ＲＰＭおよび固体投入量の影響を示すグラフである。
【図３Ａ】２５％固体投入量で、異なる粒度のＢａｌｌｏｔｉｎｉガラスビーズを使用した組換えザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）を使用した発酵に対する、異なる粒度の効果を示すグラフである。ＡおよびＢは、異なる粒度範囲を使用した異なる実験である。
【図３Ｂ】２５％固体投入量で、異なる粒度のＢａｌｌｏｔｉｎｉガラスビーズを使用した組換えザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）を使用した発酵に対する、異なる粒度の効果を示すグラフである。ＡおよびＢは、異なる粒度範囲を使用した異なる実験である。
【図４】１００ＲＰＭで回転する２台のラシュトン６枚羽根インペラ（４５ｍｍ径）を用いた１ＬのＳＳＦスケールアップからのエタノール、キシロース、およびグルコース濃度を示すグラフである。
【図５】１５０ＲＰＭで回転する２台のラシュトン６枚羽根インペラ（４５ｍｍ径）を用いた１ＬのＳＳＦスケールアップからのエタノール、キシロース、およびグルコース濃度を示すグラフである。
【図６Ａ】２５質量％の初期バイオマス添加を用いて、２５０または７５０ＲＰＭの撹拌で実施されるＳＳＦ内のエタノール生産量を示すグラフである。
【図６Ｂ】分割バイオマス添加を用いて、８０または２５０ＲＰＭの撹拌で実施されるＳＳＦ内のエタノール生産量を示すグラフである。
【図７Ａ】２つの異なる酵素投入量で、２２．５％固形分を用いてＡＲ３  ７−３１株を使用して実施されるＳＳＦの経時的撹拌速度（Ｎｊｓ）のグラフである。
【図７Ｂ】同一ＳＳＦ操作におけるエタノール生産量のグラフである。
【図８】トウモロコシ茎葉加水分解産物および２つの異なる酵素投入量を使用したＳＳＦ操作における、エタノール生産量のグラフを示す。
【図９】生体触媒として酵母、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、またはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を使用したサンプルのＳＳＦ操作における、グルコース、キシロース、およびエタノール濃度のグラフを示す。
【００１５】
生物学的寄託および配列説明
出願人らは、「特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約」の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。
【００１６】
寄託株情報
0005946773.tif 000002
【００１８】
Ｆｖ４３Ｄのアミノ酸配列の位置１〜２０は予測されるシグナル配列に対応する。
【００１９】
未熟なＦｖ３Ａのアミノ酸配列の位置１〜２３は予測されるシグナル配列に対応する。
【００２０】
未熟なＦｖ５１Ａの位置１〜１９は予測されるシグナル配列に対応する。
【００２１】
未熟なＸｙｎ３の位置１〜１６は予測されるシグナル配列に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、セルロース性バイオマスからエタノールを製造するための、同時糖化発酵（ＳＳＦ）工程、またはハイブリッド糖化発酵（ＨＳＦ）工程における、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）などの原核生物エタノール産生体の使用に関する。燃料添加剤として使用するための再生可能資源からのエタノールの製造は、化石燃料不足に対処して、エネルギーコストを削減し、地球温暖化に影響を与える。ＳＳＦまたはＨＳＦ工程は、セルロース性バイオマス原料からエタノールへの変換の全体的効率を増大させるので、エタノール生産において望ましい。
【００２４】
特許請求の範囲および明細書の解釈のために、次の略語および定義を使用する。
【００２５】
特に断りのない限り、本明細書に引用される全ての米国特許第号明細書および米国特許出願は、その内容全体を参照によって援用する。さらに、ある量、濃度または他の値もしくはパラメーターが、ある範囲、好ましい範囲、または好ましい上位値と好ましい下位値の一覧として与えられている場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の範囲上限または好ましい値と、任意の範囲下限または好ましい値との任意の組から形成される全ての範囲を具体的に開示していると理解すべきである。ある範囲の数値が本明細書に列挙されている場合、特に断りのない限り、この範囲はその終点、ならびにこの範囲内のすべての整数および分数を含むものとする。本発明の範囲は、ある範囲を定義する際に列挙される特定値に限定されるものではない。
【００２６】
本明細書の用法では、本発明の構成要件または構成要素に先行する冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、構成要件または構成要素の事例（すなわち発生）数に関して、非制限的であることが意図される。したがって「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、数が明らかに単数を意味するのでない限り、構成要件または構成要素の単数語形は複数形もまた含む。
【００２７】
本明細書の用法では、「含んでなる」という用語は、特許請求の範囲で言及される、表明された特徴、整数、ステップ、または構成要素の存在を意味するが、それは１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、構成要素またはそれらの群の存在または添加を除外しない。「含んでなる」という用語は、「から本質的になる」および「からなる」という用語に包含される実施形態を含むことが意図される。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語に包含される実施形態を含むことが意図される。
【００２８】
本明細書の用法では、本発明のまたは用いられる成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば、現状で濃縮物を作成しまたは溶液を使用するのに使用される、典型的な液体の計量および取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物を作成しまたは方法を実施するのに用いられる、製造、原料、または成分純度の差違を通じて；生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語は、特定の初期混合物に起因する、組成物の異なる平衡状態条件が原因で異なる量もまた包含する。「約」という用語によって修飾されるかどうかに関わりなく、特許請求の範囲は、量の同等物を含む。
【００２９】
本明細書で用いる「発明」または「本発明」という用語は非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一の実施形態のみを指すことは意図されず、本明細書および特許請求の範囲に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００３０】
「エタノール産生体」という用語は、炭水化物源の代謝を通じてエタノールを産生する生物を指す。
【００３１】
「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」という用語は、バイオマスが糖化され、糖化から生じる発酵性糖類が生体触媒により使用されて、全て同時に、典型的には同一反応容器内で、生成物が生じる工程を指す。
【００３２】
「ハイブリッド糖化発酵（ＨＳＦ）」という用語は、限定的にバイオマスが糖化される工程（不完全または部分的糖化）と、それに続く同時発生連続的糖化および発酵を指す。
【００３３】
「発酵性糖（類）」という用語は、発酵工程中で微生物によって炭素源として使用され得る、オリゴ糖類および単糖類を指す。
【００３４】
「部分的糖化」という用語は、放出される発酵性糖類が、糖化が完了するまで実施された場合に放出されるであろう総発酵性糖類に満たない、バイオマスの限定的糖化を指す。
【００３５】
「セルロース系材料」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースおよびリグニンをはじめとする追加的構成要素とを含んでなる組成物を指す。
【００３６】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖類の生成を指す。
【００３７】
「前処理バイオマス」という用語は、糖化に先だって前処理されているバイオマスを意味する。
【００３８】
「バイオマス」は、あらゆるセルロース系またはリグノセルロース系材料を指し、セルロースが含まれ、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類がさらに含まれてもよい、材料を含む。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的構成要素を含んでなってもよい。バイオマスは単一原料に由来してもよく、またはバイオマスは１種を超える原料に由来する混合物を含んでなり得る。例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなることもあり得る。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草、小麦、麦わら、大麦のわら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、穀物製粉から得られる構成要素、樹木、枝、根、葉、木くず、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、花、および家畜糞尿が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３９】
「バイオマス加水分解産物」とは、バイオマスの糖化から得られる生成物を指す。バイオマスはまた、糖化に先だって前処理されてもよい。
【００４０】
「糖化酵素」という用語は、バイオマス構成要素の発酵性糖類への変換を触媒し得る酵素を指す。典型的には酵素は、バイオマスが前処理されている場合に、より効果的である。
【００４１】
「不溶性固形物」という用語は、溶液に溶解しない固形物を指す。
【００４２】
「総投入不溶性固形物」という用語は、糖化発酵混合物に含まれるバイオマス不溶性固形物の総乾燥質量を指す。バイオマスを複数部分に分けて添加する場合、各部分の不溶性固形物の乾燥質量を合計して総投入不溶性固形物が得られる。糖化発酵混合物中の不溶性固形物濃度は、１リットル当たりの乾燥質量％として言及され、総糖化発酵混合物１リットル当たりのグラム乾燥質量を意味し、したがって例えば、１リットル当たりの乾燥質量１６％は、総糖化発酵混合物１リットル当たり１６０グラムの乾燥質量を意味する。
【００４３】
「撹拌手段」という用語は、それを通じて混合物に力を掛けて、混合物構成要素の混合を引き起こしてもよい機序を指す。典型的には、撹拌手段を通じて混合を引き起こす機序の回転運動がある。
【００４４】
本明細書で一連の数値が提供される場合、特に断りのない限り、それは範囲の端点を包含するものと理解される。数値は、提供される有効桁数の精度を有するものと理解すべきである。例えば、１の数は、０．５〜１．４の範囲を包含すると理解される一方、１．０の数は記載範囲の終点を含めた０．９５〜１．０４の範囲を包含すると理解される。
【００４５】
本発明は、ＳＳＦ工程においてザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を使用した、エタノールを製造する方法に関する。方法は、低撹拌エネルギー条件下、少なくとも１種の糖化酵素の存在下で、前処理されて、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物中に高い不溶性固形物濃度で含まれる、セルロース性バイオマスを用いて進行する。結果として得られる工程は、６０ｇ／Ｌを超えるエタノールを生成することもできる。
【００４６】
前処理バイオマス
本方法のバイオマスは、糖化中に発酵性糖類を効果的に放出するために、バイオマスを調製するあらゆる工程によって前処理されてもよい。前処理は当該技術分野で良く知られており、例えば、酸性または塩基性化学物質による処理、および／またはサイズ低下のための機械的処理が挙げられる。前処理バイオマスは、不溶性固形物、（典型的には不溶性固形物の一部である）多糖類、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の成長およびエタノール産生を阻害することもあるその他の構成要素を含有する。本方法で使用される前処理バイオマスは、前処理バイオマスを含有する糖化発酵混合物中で、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）などの原核生物エタノール産生体による最大の成長と産生を可能にするように、発酵阻害物質が十分に低濃度であることが所望される。
【００４７】
例えば、酢酸はザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）阻害性の前処理バイオマスの構成要素である。前処理バイオマス中の酢酸含有量は、前処理バイオマスを洗浄して、酢酸および他の阻害物質を除去することにより低下させてもよい。代案としては、特定の前処理が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の成長および産生に適合する酢酸レベルをもたらすこともできる。前処理におけるアンモニアの使用は、前処理バイオマスにおいて、酢酸などの阻害物質のより低いレベルをもたらしてもよい。出願人らは、アンモニア処理バイオマスが、約１を超えるアセトアミド対酢酸モル比と、例えば約６５％を超え、または約７０％を超えるなど、６０％を超えるアセチル転化率を有し得ることを発見した。したがってより低い阻害物質濃度では、改善された糖収率を得るために、濾過および洗浄工程は必要なく、これらの工程に付随する経費は方法の経済性に悪影響を及ぼすので、バイオマスの濾過および洗浄は実施しないことが好ましい。
【００４８】
したがってアンモニア前処理バイオマスが、本方法で使用するのに望ましい。同一譲受人の米国特許第７，７８１，１９１号明細書で開示される前処理方法と同じく、バイオマス乾燥質量に対して、約１２質量％未満のアンモニア濃度を使用することが好まれる。
【００４９】
これに加えて、異なるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）または他のエタノール産生体株は、前処理バイオマス中に存在する酢酸および／または他の阻害物質に対して、異なる耐性レベルを有し得る。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、４〜５ｇ／Ｌなどの酢酸レベルに対して感受性であってもよい。これに加えて、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、例えば同一譲受人の同時係属米国特許出願公開２００９−０２０３０９９−Ａ１号明細書で開示される遺伝子操作によって、酢酸に対して改善された耐性を有するように調製することもできる。これに加えて、酢酸に対する改善された耐性は、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレットとして公開される、同一譲受人の同時係属米国特許出願第１２／６４１６４２号明細書で開示される、酢酸含有培地中で適応させることで達成されてもよい。開示される適応過程を使用して生成されるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、適切には少なくとも約９〜１０ｇ／Ｌの酢酸に対して耐性である。最大のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）成長およびエタノール産生のために、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の耐性レベルを基準にして、糖化（ｓａｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）発酵混合物を含有する前処理バイオマス中の酢酸レベルと、エタノール生産に使用されるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の酢酸耐性レベルとの間に適合性があり、耐性とは、酢酸がより少ないまたは皆無の培地と比較して、特定レベルの酢酸がある培地中で同様に成長し、エタノールを産生する株の能力を指す。
【００５０】
同時糖化発酵
本方法は、同時糖化発酵（ＳＳＦ）に関する。前処理バイオマスと、原核生物エタノール産生体と、前処理バイオマスの多糖類を発酵性糖類に変換する少なくとも１つの酵素とを含む糖化発酵混合物が調製される。糖類、塩、成長促進剤、および／またはエタノール産生体細胞中の抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質などの追加的培地構成要素は、典型的には必要でないが、含め得る。前処理バイオマスの構成要素は、糖化酵素の１つ以上によって、糖化または加水分解され、グルコースやキシロースなどの発酵性糖類が放出される。糖類は、前処理バイオマスから経時的に放出される。放出糖類はエタノール産生体によって代謝され、生成物としてエタノールが生じる。
【００５１】
糖化
糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）でレビューされている。少なくとも１つの酵素が使用され、典型的には、１種以上のグリコシダーゼを含む糖化酵素共同体が使用される。グリコシダーゼは、ジ−、オリゴ−、および多糖類のエーテル結合を加水分解し、酵素分類の一般群「加水分解酵素」（ＥＣ３．）のＥＣ３．２．１．ｘにある（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、補遺１（１９９３）、補遺２（１９９４）、補遺３（１９９５）、補遺４（１９９７）、および補遺５［それぞれＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０  １９９９］）。本方法で有用なグリコシダーゼは、それらが加水分解するバイオマス構成要素によって分類し得る。本方法で有用なグリコシダーゼとしては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノ−キシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、およびデンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。さらに、糖化酵素共同体に、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）、およびフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などの他の活性を追加して、バイオマスの他の構成要素から多糖類を放出させるのを助けることが有用かもしれない。当該技術分野では、多糖類加水分解酵素を産生する微生物は、異なる基質特異性を有するいくつかの酵素または一群の酵素（または「酵素共同体」）によって触媒される、セルロース分解などの活性を示すことが多いことが良く知られている。したがって微生物からの「セルラーゼ」は、その１つ以上または全てがセルロース分解活性に寄与してもよい一群の酵素を含んでなってもよい。セルラーゼなどの商業的または非商業的酵素製剤は、酵素製剤を得るのに利用される精製スキーム次第で、多数の酵素を含んでなってもよい。
【００５２】
糖化酵素は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ，Ｉｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ，Ｉｎｃ．）などの単離形態で、商業的に得られてもよい。さらに糖化酵素は、未精製で、細胞抽出物またはホールセル調製品の一種として提供されてもよい。酵素は、複数の糖化酵素を発現するように遺伝子操作された組換え微生物を使用して、生成されてもよい。
【００５３】
当業者であれば、本ＳＳＦ法で使用される酵素の有効量を測定する方法、およびＳＳＦにおける最適酵素活性のために条件を調節する方法を認識するであろう。当業者であれば、また、選択された条件下で、所定の前処理バイオマスの最適糖化を得るのに要する、酵素活性の種類を最適化する方法を認識するであろう。
【００５４】
ハイブリッド糖化発酵
これに加えて、本方法は、ハイブリッド糖化発酵（ＨＳＦ）として実施されてもよい。この工程では、発酵に先だって糖化が起きて、部分的であって完全でない糖化が起きる。この工程では、発酵不在下でいくらかの糖化が起きるように、前処理バイオマスおよび糖化酵素が合わされた後に、エタノール産生体が添加される。エタノール産生体が添加される前の期間は変動してもよく、エタノール産生体が添加される時に、発酵性糖類が放出されて既に望ましい濃度で存在するように、典型的には１から数時間の範囲である。ＨＳＦは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、糖化酵素添加の１時間後に添加される、実施例４で例示される。
【００５５】
原核生物エタノール産生体
本糖化発酵混合物は、最初に、原核生物エタノール産生体株からの種細胞接種材料を含む。エタノールを効果的に産生するあらゆる原核細胞をエタノール産生体として使用することができる。使用される細胞は、天然でエタノールを産生してもよく、エタノールを産生するように遺伝子操作されていてもよく、または改善されたエタノール産生のために遺伝子操作された天然のエタノール産生菌であってもよい。原核生物エタノール産生体の例としては、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｍｅｒ（２００５）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７１：４６７２−４６７８）、エタノール産生のために遺伝子操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（米国特許第５，０００，０００号明細書）、エタノール生産のために遺伝子操作されたゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）株（Ｃｒｉｐｐｓら（２００９）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：３９８−４０８）、エタノール生産のために遺伝子操作されたクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）株（Ｏｈｔａら（１９９１）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５７：２８１０−２８１５）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）  （Ｙａｎａｓｅら（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５６】
原核生物エタノール産生体として望ましいのは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）であり、これは天然ではグルコースを発酵してエタノールを生成する。キシロース資化のために遺伝子操作されているザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株（米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第５，７１２，１３３号明細書、米国特許第６，５６６，１０７号明細書、ＰＣＴ特許出願国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８：３５４−３６１、Ｚｈａｎｇら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３）は、本方法で有用である。エタノール産生にかかわる特性が改善されているザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、遺伝子操作および／または適応によって作られている。遺伝子操作されおよび／または適応された複数の改善があるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を本方法で使用して、エタノール生成を最大化することが望ましい。存在してもよい実施された改善としては、１）キシロース資化改善のための遺伝子操作および適応（米国特許第７，２２３，５７５号明細書および同一譲受人の米国特許第７，７４１，１１９号明細書、米国特許公開第２００９−０２４６８７６−Ａ１号明細書、および米国特許公開第２００９−０２４６８４６−Ａ１号明細書）；２）エタノール生成に有害な副産物の合成低下（同一譲受人の米国特許第７，７４１，１１９号明細書）；３）酢酸耐性改善のための遺伝子操作（同一譲受人の同時係属米国特許出願公開２００９−０２０３０９９−Ａ１号明細書、および国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレットとして公開された米国特許出願第１２／６４１６４２号明細書）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレットで開示される方法などによって生成された酢酸に対する耐性が改善されているザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が、本方法で使用するのに好ましい。これらの株を使用することにより、前処理バイオマスから酢酸を除去する徹底的な洗浄なしに、エタノール生成に有害でない酢酸レベルを保ちながら、前処理バイオマスを高濃度で本糖化発酵混合物に含めることもできる。
【００５８】
典型的には、所望のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が種培養として培養される。種培養は、例えば、５〜２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２〜４ｇ／Ｌのリン酸水素カリウム、１〜５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、および１００〜２００ｇ／Ｌのグルコースからなる培地中で、ＯＤ６００ｎｍが１０になるまで３２℃〜３３℃、ｐＨ５．５〜５．８で培養してもよい。種培養を使用して、糖化発酵混合物体積の約１０％に相当する体積を添加することで、ＳＳＦを開始する。
【００５９】
ＳＳＦ中の不溶性固形物
ＳＳＦ中のエタノール生成を最大化するために、前処理バイオマス中に存在する不溶性固形物の一定量が、糖化発酵混合物に高レベルで含まれる。含まれる前処理バイオマス不溶性固形物量は、ＳＳＦ中に生成され得る発酵性糖類量に比例し、次に発酵性糖類量は、発酵性糖類を代謝することによりザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞から生成され得るエタノール量に比例する。
【００６０】
前処理バイオマス調製品中の固形物量と比較した不溶性固形物量は、使用する特定の前処理に応じて、ならびに洗浄工程が含まれるか否かに応じて変動するであろう。洗浄は不溶性でない固形物を可溶化し、全固形物中により高い割合の不溶性固形物を残す。酸前処理によっては、３０％程度の未処理バイオマス固形物を可溶性固形物に変換し、全固形物の７０％が不溶性として残ってもよい。対照的に、低アンモニア前処理では、固形物量および不溶性固形物量が、前処理バイオマス中で同様であってもよい。前処理バイオマスサンプル中の全固形物量と比較して、不溶性固形物量は、典型的には約７０％〜約９９％の範囲である。例えば、本明細書の実施例で使用される低アンモニア前処理バイオマスでは、不溶性固形物は全固形物の９０％〜９１％である。本方法では、原核生物エタノール産生体によるエタノール産生に対する入力の影響にとって重要なのは、糖化発酵混合物に含まれる前処理バイオマスからの総投入不溶性固形物の量である。本方法では、糖化発酵混合物中に投入される不溶性固形物の総量は、総糖化発酵混合物１リットル当たり少なくとも約１６０グラムの乾燥質量、すなわち１６％である。
【００６１】
糖化発酵混合物の混合を助けるために、前処理バイオマスを２つ以上の部分に分けて添加することもできる。最初の部分の添加では、不溶性固形物濃度は１６％未満であってもよい。ｐＨおよび温度の調節は、より低い不溶性固形物濃度において容易である。次に総投入不溶性固形物が少なくとも約１６％になるように、追加的な前処理バイオマスを添加してもよい。追加的バイオマスは、酵素および／またはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）投入の前または後に添加してもよい。追加的バイオマスは、１つ以上の部分で添加してもよい。投入される総投入不溶性固形物は、少なくとも約１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２４％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上であってもよく、列挙される数値間のあらゆる整数が含まれる。
【００６２】
ＳＳＦの進行と共に、ＳＳＦ中に存在する糖化酵素によって前処理バイオマスが糖化されるに従って、不溶性固形物量は低下する。不溶性固形物は、典型的には約１２０時間の所定のＳＳＦ操作後に、元の量の約半分以下に低下してもよい。
【００６３】
撹拌手段の動力
糖化発酵混合物は、撹拌手段を使用してバイオリアクター内で撹拌され、前処理バイオマス、糖化酵素、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が含まれ、他の培地構成要素が含まれていてもよい、構成要素の混合が提供される。出願人らは、例えば約２５％以上の不溶性固形物を含有する糖化発酵混合物の撹拌中に多量のエネルギーが提供されると、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エタノール産生体によるエタノール産生に悪影響が及ぶことを発見した。２５％不溶性固形分の濃度を有する混合物の活発な振盪（２００ＲＰＭ）が、エタノール生成減少とザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生存度低下をもたらす一方で、１２％固形分を有する混合物の活発な振盪は、そのような影響を及ぼさない。
【００６４】
したがってＳＳＦ中に混合が必要ではあるが、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞のエタノール産生能力を維持する必要がある。出願人らは、本明細書の実施例５で記載されるように、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エタノール産生体と少なくとも約２２．５％の不溶性固形分とを含有する糖化発酵混合物に、撹拌機が提供してもよい力を計算して、所望のエタノール産生をサポートした。本方法では、撹拌手段によって、１ｋｇの総糖化発酵混合物当たり約０．２ワット以下の動力が提供される混合が提供される。エタノール産生を最大化するのに望ましいのは、１ｋｇの総糖化発酵混合物当たり約０．２、０．１５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、または０．００３ワット未満の入力である。撹拌手段は、ラシュトン（６枚羽根）などのあらゆるタイプのインペラをはじめとするあらゆる回転撹拌機、およびあらゆる種類の傾斜羽根（マリン、４枚羽根、３セグメント）であってもよい。個々のインペラ動力の和が約０．２ワット／ｋｇ未満である、２枚以上のインペラ羽根を使用してもよい。動力は、バイオマス糖化のために糖化発酵混合物の粘度が低下するのに連れて、経時的に変動してもよい。
【００６５】
これに加えて、活発な撹拌がある場合、１００μｍ〜６００μｍのサイズ範囲内のガラスビーズの存在下で、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のエタノール産生能力が低下することが分かった。したがってバイオマス粒度がこの範囲である場合、上述のように、最大のエタノール産生のために撹拌を低減させる。バイオマス粒度が約１００μｍ未満または約６００μｍを超える場合は、活発な撹拌を使用することもできる。しかし前処理バイオマスは、最初に粒度がより大きくてもよく、粒度低下がＳＳＦ操作中に起きることもある。ガラスビーズによって実証されたように、あらゆるタイプのバイオマスの粒度が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に対してこの効果を有するかもしれない。
【００６６】
ＳＳＦ条件
糖化発酵混合物は、エタノール製造のために、撹拌手段を用いてバイオリアクター内で維持管理される。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）による糖化および発酵のために好ましい条件が、保たれる。ｐＨは、苛性溶液（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなど）と、硫酸またはリン酸のいずれか、とを使用して、典型的には約５〜約７の間に保たれる。典型的にはｐＨは、塩基としてＮａＯＨ、酸としてＨ2ＳＯ4を使用して、５．８に保たれる。温度は約２８℃〜約３７℃に保たれる。典型的には温度は約３３℃に保たれ、または３３℃〜２８℃の間で変動する。ＳＳＦは、少なくとも約４０時間継続され、１２０時間以上の実施が典型的である。
【００６７】
発酵はｐＨ調節などの最小変更がなされるバッチ式、またはＳＳＦが進行するに連れて、糖化発酵混合物に構成要素を供給することもできる流加式であってもよい。バッチおよび流加培養法は一般的であって、当該技術分野で良く知られており、実例はＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，  ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）にある。本方法では、流加操作中に添加されてもよい構成要素は、追加的前処理バイオマスおよび／または追加的糖化（ｓａｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）酵素を含んでもよい。
【００６８】
エタノール濃度
本方法を使用して、高いエタノール生産量を達成可能である。本ＳＳＦ法で生成するエタノールの特定量は、使用される特定のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株、バイオマスタイプ、バイオマス前処理、不溶性固形分濃度、および糖化酵素などの条件に応じて変動する。典型的にはエタノールは、約４０ｇ／Ｌを超えて生成され得る。エタノールは、例えば、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、または約８５ｇ／Ｌで生成され得る。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の望ましい実施形態を示唆しながら、例示としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適合させ得る。
【００７０】
使用した略語の意味は次のとおり。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」または「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ＲＰＭ」または「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ｈ．ｐ．」は馬力を意味し、「ｖ％」は体積％であり、「ａｔｍ」は気圧を意味し、「ｗｔ％」は質量％であり、「ＣＦＵ」はコロニー形成単位であり、「〜」はおよそを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ρ」は密度を意味し、「μ」は粘度を意味し、「ＤI」はインペラ直径を意味し、「ＲＰＳ」は毎秒回転数を意味し、「ＥＦＴ」は経過発酵時間を意味する。
【００７１】
一般方法：
細菌培養の維持および培養に適した材料および方法についてもまた、当該技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，１９９４、またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９８９にある。細菌細胞の培養と維持のために使用された全ての試薬および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【００７２】
穂軸前処理
同一譲受人の米国特許第７，７８１，１９１号明細書に記載される低アンモニア法を使用した酵素的加水分解に先だって、トウモロコシ穂軸を前処理した。
【００７３】
前処理のために、容器本体周囲に蒸気を通過させるジャケットを包含する水平Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ  Ｄａｙ  １３０Ｌ反応装置を使用して、ＳＳＬ２１と称する前処理穂軸を作成した。湿潤穂軸ベースで４６ｖ％の反応器充填になるように、容器に種トウモロコシ処理からの穂軸（サイズ１ｍｍ未満）を投入した（５７．５ポンド）。穂軸は、１．０ｍｍ篩付きの大型ミクロ粉砕機（モデル番号１ＳＨ、シリアル番号１００１９）を使用して、サイズを１ｍｍ未満に低下させた。必要に応じて、粉砕前に１掬いのドライアイスを穂軸に添加して、装置の加熱を防止した。ミクロ粉砕機の主駆動源は５馬力のモーターであり、最大回転速度は９，６００ＲＰＭである。それは６本の回転ハンマー；シェルを有し、対向する衝撃端で裏打ちされる。
【００７４】
穂軸は、０．４２０ｇ／ｃｍ3の湿潤嵩密度と、７．５質量％の水分を有した。容器を真空にして０．１気圧にしてから、２８．９質量％の水酸化アンモニウム溶液（１１．２ポンド）および水（２０．１ポンド）を容器の上端近くまで投入し、乾燥質量バイオマスに対して６質量％のＮＨ3、および容器内に６０質量％の固形物を提供する。表１は、ＳＳＬ２２と称される第２の前処理バッチについて、穂軸特性および水酸化アンモニウムと水の使用量を列挙する。どちらの場合も、反応装置撹拌機は７０ｒｐｍに設定し、容器のジャケットに蒸気を通過させた。容器が８０℃の初期温度に達したら、蒸気を容器の上端近くに導入し、初期容器温度を１４５℃に上昇させた。この温度を２０分間維持した。１５分間の保持時間で、ジャケットを通過する蒸気流を停止させた。前処理の終わりに、排気冷却管を通じて反応装置を圧抜きして大気圧にする。引き続いて１５分間真空（およそ１気圧未満）にして温度を６０℃未満に低下させ、容器底面バルブを開けて前処理バイオマスを回収する前に、前処理穂軸からアンモニアおよび水をさらに除去する。表２は、ＳＳＬ２１およびＳＳＬ２２バッチについて、前処理穂軸の特性を列挙する。乾燥固形物１００ｋｇ当たり０．３ｋｇのＮＨ3未満の残留アンモニア、ならびに１．０を超えるアセトアミド対酢酸比率が所望される。
【００７５】
ＳＳＬ２１前処理穂軸バッチでは、不溶性固形物は全固形物の９０％〜９１％と測定された。
【００７６】
表１：第２の前処理バッチ（ＳＳＬ２２）の穂軸特性および水酸化アンモニウムと水の使用量
0005946773.tif 000003
【００７７】
表２：ＳＳＬ２１およびＳＳＬ２２バッチの前処理穂軸特性
0005946773.tif 000004
【００７８】
穂軸組成
開始穂軸中のグルカンおよびキシランの量は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｇｏｒａｔｏｒｙ（Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）のＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６１８（２００８年４月改訂版）で詳細に述べられる、ＡＳＴＭ  Ｅ１７５８−０１「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｂｙ  ＨＰＬＣ」などの当該技術分野で良く知られている方法を使用して測定した。組成は、乾燥質量を基準にして、３４．８質量％グルカン、２９．２質量％キシラン、および１２．８質量％リグニンと測定された。
【００７９】
茎葉前処理
同一譲受人の同時係属米国特許出願公開第２００７／００３１９１８−Ａ１号明細書に記載される低アンモニア法を使用した酵素的加水分解に先だって、トウモロコシ茎葉を前処理した。
【００８０】
第２パストウモロコシ茎葉を２ｍｍの平均ｄ５０粒度に製粉した。茎葉は０．１８３ｇ／ｃｍ3の嵩密度と、８．７３質量％の水分を有した。約１０９〜１１７ｋｇの予備製粉茎葉を、１７００Ｌの水平円柱圧力容器に投入した。容器を真空にして０．１気圧にしてから水酸化アンモニウム溶液と水を供給し、乾燥物質ベースで約１１％のＮＨ3にした。操作全体を通じて、容器内のインペラをおよそ３７ｒｐｍで回転させ、蒸気を容器ジャケットに通過させた。蒸気を容器に導入して、容器内温度を約１５０℃に上昇させた。約８バール（絶対圧力；０．８Ｍパスカル）の一定反応装置圧力下で、この温度を３０分間保った。前処理の終わりに、排気冷却管を通じて反応装置を圧抜きし、大気圧にした。引き続いて４〜８分間真空（およそ１気圧未満）にして温度を６０℃未満に低下させ、容器底面バルブを開けて前処理バイオマスを回収する前に、前処理茎葉からアンモニアおよび水をさらに除去した。
【００８１】
第２パストウモロコシ茎葉は、その組成を分析しなかったが、組成構成要素は先の茎葉測定に基づいて、表３に見積もった。
【００８２】
表３：第２パストウモロコシ茎葉の推定組成
0005946773.tif 000005
【００８３】
セルラーゼおよびヘミセルラーゼ産生株
Ｈ３Ａ株は、次のようにして調製された組換えトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株である。ＲＬ−Ｐ３７に由来し、高セルラーゼ産生について選択された、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）変異株（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ＧらＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６−５３）をβ−グルコシダーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、β−グルコシダーゼ１コード領域、ｃｂｈ１ターミネーター、およびａｍｄＳ遺伝子を含んでなる）；およびエンドキシラナーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、エンドキシラナーゼコード領域、およびｃｂｈ１ターミネーターを含んでなる）によって、エレクトロポレーションを使用して同時形質転換した。１形質転換体は、＃２２９株と称された。＃２２９株をβ−キシロシダーゼＦｖ３Ａ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、ａβ−キシロシダーゼコード領域、ｃｂｈ１ターミネーター、およびａｌｓ遺伝子を含んでなる）；β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇ１プロモーター、ａβ−キシロシダーゼコード領域、および天然ターミネーターを含んでなる）；およびＦｖ５１Ａα−アラビノフラノシダーゼ発現カセット（ｅｇ１プロモーター、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼコード領域、および天然ターミネーターを含んでなる）によって、エレクトロポレーションを使用して同時形質転換した。Ｈ３Ａ株は、この形質転換工程から単離された。
【００８４】
Ｈ３Ａ株の発酵中に生成した細胞外タンパク質を遠心分離によって細胞集団から分離し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  １０ｋＤ分画分子量膜を通過させて膜限外濾過により濃縮して、ｐＨ４．８に調節した。総タンパク量は、ＷｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍおよびＧｏｒｎａｌｌにより改変されたビウレット法の変法を使用して、ウシ血清アルブミンを較正物質として使用して測定した（Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ，１９６０，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．１６：４０；Ｇｏｒｎａｌｌら，１９４９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １７７：７５２）。本明細書でＨ３Ａタンパク質とも称されるこのＨ３Ａ細胞外タンパク質調製品は、セルラーゼとヘミセルラーゼ調製品の組み合わせとして使用され、ＳＳＦ中に複合糖質加水分解をもたらした。
【００８５】
Ｈ３Ａ株の発酵中に生成した細胞外タンパク質を遠心分離によって細胞集団から分離し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  １０ｋＤ分画分子量膜を通過させて膜限外濾過により濃縮して、ｐＨ４．８に調節した。総タンパク量は、ＷｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍおよびＧｏｒｎａｌｌにより改変されたビウレット法の変法を使用して、ウシ血清アルブミンを較正物質として使用して測定した（Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ，１９６０，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．１６：４０；Ｇｏｒｎａｌｌら，１９４９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １７７：７５２）。本明細書でＨ３Ａタンパク質と称されるこのＨ３Ａ細胞外タンパク質調製品は、セルラーゼとヘミセルラーゼ調製品の組み合わせとして使用され、ＳＳＦ中に複合糖質加水分解をもたらした。
【００８６】
生体触媒および接種調製品
同時糖化発酵（ＳＳＦ）で使用されるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株の起源
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース利用エタノール産生株を、ＳＳＦにおいて使用し得る。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株は、ここで手短に再び述べるようにしてＺＷ８０１−４株から生成された。ＺＷ８０１−４は、参照によって本明細書に援用する同一譲受人の米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載される、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組換えキシロース利用株である。ＺＷ８０１−４株は、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載されるように、ＺＷ６５８株由来のＺＷ８００株に由来する。ＺＷ６５８は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース利用遺伝子を含有する、２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔを、逐次遺伝子転位事象を通じてＺＷ１（ＡＴＣＣ  ３１８２１）ゲノムに組み込み、続いてキシロースを含有する選択培地上で適応させて構築された。ＺＷ６５８はＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８５８として寄託された。ＺＷ６５８中では、宿主媒介性二重交叉相同的組換えを使用して、グルコース果糖酸化還元酵素をコードする遺伝子が挿入的に不活性化され、スペクチノマイシン耐性を選択可能マーカーとしてＺＷ８００が作り出された。ｌｏｘＰ部位と境を接するスペクチノマイシン耐性マーカーは、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用した部位特異的組換えによって除去され、ＺＷ８０１−４が作られる。
【００８７】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ８０１−４株の培養物を、参照によって本明細書に援用する国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレットとして公開された米国特許出願第１２／６４１６４２号明細書で開示されるストレス条件下で次のように培養した。ＺＷ８０１−４の連続培養は、２５０ｍｌの撹拌されるｐＨおよび温度制御発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ；Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で実施した。発酵基礎培地は、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１５ｍＭリン酸アンモニウム、１ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、１０ｍＭソルビトール、５０ｇ／Ｌキシロース、および５０ｇ／Ｌグルコースであった。高濃度の酢酸およびアンモニア存在下における成長への適応は、９７日間にわたって、特定希釈率での測定によって確立された成長率を維持しながら、上の連続培地に添加する酢酸アンモニウムの濃度を徐々に増大させることで達成された。酢酸アンモニウムは、１６０ｍＭの濃度に増大された。アンモニウムイオン濃度のさらなる増大は、１３９日間の連続培養の終わりまでに、リン酸アンモニウムを２１０ｍＭの最終総アンモニウムイオン濃度に添加することで達成された。ＺＷ７０５株は、単一コロニーを播種して、１個の選択コロニーを増幅することで、適応集団から単離された。
【００８８】
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＲ３  ７−３１株（適応７−３１とも称される）は、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属出願、代理人整理番号ＣＬ５３３２に記載されるように、加水分解産物培地内での成長に適応させることで、ＺＷ７０５株から派生された。適応は連続流培養装置であるタービドスタット中で行われ、米国特許６６８６１９４号明細書に記載されるように、培養濁度が特定の狭い区間に保たれるように培地流を調製することで、培養中の細胞濃度が一定に保たれた。連続培養装置内で培養を増殖させるために、静止培地（培地Ａ）と、チャレンジ培地（培地Ｂ）の２種の培地が利用可能であった。培養を濁度設定点まで成長チャンバー内の静止培地上で培養し、次に細胞密度を維持するように設定された希釈率に希釈した。希釈は、１０分毎に１回規定体積の培地を添加することで実施した。タービドスタットが培地チャレンジモードに入ると、前回の培地添加後に設定点に復元する速度に基づいて、チャレンジ培地または静止培地添加の選択を行った。成長チャンバー内の培地の定常状態濃度は培地Ａと培地Ｂの混合であり、２種の培地の比率は、設定希釈率で設定細胞密度を維持できるようにする、各培地からの抜き取り速度に左右される。成長チャンバー内の細胞集団を代表する細胞サンプルを１週間間隔で、タービドスタット（ｔｕｒｂｏｓｔａｔ）の流出物（トラップチャンバー内）から回収した。細胞サンプルをＭＲＭ３Ｇ６培地中で１回培養して、グリセロールストックとして−８０℃で保存した。
【００８９】
培養を５０％ＨＡｃ／ＹＥおよび５０％ＭＲＭ３Ｇ６．５Ｘ４．５ＮＨ4Ａｃ１２．３である静止培地と、ＨＡｃ／ＹＥであるチャレンジ培地とを使用して培養した。毎週採取されたサンプルをグルコースおよびキシロース利用、およびエタノール生成について、ＨＡｃ／ＹＥ培地中でアッセイした。３週目のサンプルからコロニーを単離して、ＭＲＭ３Ｘ２およびＭＲＭ３Ｇ２プレート上で良好に成長したものを選択した。これらのコロニーからの株をグルコースおよびキシロース利用、およびエタノール生成について、ＨＡｃ／ＹＥ培地中でスクリーニングした。静止培地としてＨＡｃ／ＹＥ、チャレンジ培地としてＨＡｃ／ＹＥ＋９質量％エタノールを使用した、追加的な一連の適応のために、１２−１８Ｘ−２−３６株を選択した。ＨＡｃ／ＹＥ＋９質量％エタノール培地中で培養した際にグルコースおよびキシロース利用が増大し、エタノール生成が増大していたことから、適応からの株のスクリーニングに続いて、２週目のサンプルから、適応７−３１と称される株（ＡＲ３  ７−３とも称される）を選択した。
【００９０】
適応で使用される培地
ＨＡｃ／ＹＥ：粉砕トウモロコシ穂軸バイオマスを低濃度アンモニアで前処理し、続いて酵素糖化して生成される、トウモロコシ穂軸加水分解産物含有する。加水分解産物に、６．２ｇ／Ｌ酢酸アンモニウムおよび０．５％酵母抽出物を補給した。
ＭＲＭ３は１リットル当たり次を含有する：酵母抽出物（１０ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（２ｇ）、およびＭｇＳＯ4.７Ｈ2Ｏ（１ｇ）
ＭＲＭ３Ｇ６．５Ｘ４．５ＮＨ4Ａｃ１２．３：６５ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌキシロース、および１２．３ｇ／Ｌ酢酸アンモニウムを添加したＭＲＭ３
ＭＲＭ３Ｇ６：６０ｇ／Ｌグルコースを添加したＭＲＭ３
ＭＲＭ３Ｘ２：２０ｇ／Ｌキシロースを添加したＭＲＭ３
ＭＲＭ３Ｇ２：２０ｇ／Ｌグルコースを添加したＭＲＭ３
【００９１】
ＳＳＦのための種培養の培養
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５は、−８０℃で凍結された２０％グリセロールストックとして維持した。培養を開始するために、２ｍｌのストックを解凍して使用し、次からなる４５ｍｌの培地に接種した。１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／Ｌリン酸水素カリウム、５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、および６０ｇ／Ｌグルコース、ｐＨ５．８（ＭＲＭ３Ｇ６）でＯＤ６００ｎｍは０．４。培養は、緩く栓をした５０ｍｌ試験管内において３３℃で約２．５のＯＤ６００ｎｍまで培養して使用し、１５０〜２００ｇ／Ｌグルコース、２ｇ／Ｌカリウム二水素リン酸塩、５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、および１０〜２０ｇ／Ｌ酵母抽出物でｐＨ５．５の最終種培養に接種した。この培養をｐＨ制御撹拌発酵槽内において、ＯＤ６００ｎｍが約１０であって、約１２０ｇ／Ｌのグルコースが消費される残留グルコース濃度まで、３３℃で培養した。１０％のＳＳＦ最終発酵体積に相当する１０ＯＤ種培養の体積を抜き取って使用し、ＳＳＦを開始した。
【００９２】
ＨＰＬＣ分析
発酵サンプルを指定時間間隔で採取し、ＥｔＯＨ、残留糖類、および酢酸やグリセロールについてなどのその他の代謝産物について、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム（Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）またはＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣのどちらかを使用して分析した。条件＝０．６ｍＬ／分の０．０１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4、注入量＝５μＬ、オートサンプラー温度＝１０℃、カラム温度＝５５℃、実施時間＝２５分間、屈折率による検出（４０℃に維持される）。ＨＰＬＣカラムは、ＢｉｏＲａｄ（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ，ＢｉｏＲａｄＩｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。分析物は、既知の基準と比較して屈折率検出によって定量化した。
【００９３】
同時糖化発酵（ＳＳＦ）
フラスコＳＳＦ
ＳＳＦフラスコ発酵を適切なザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）発酵条件下で、嫌気的に実施した。特に断りのない限り、希釈アンモニア前処理トウモロコシ穂軸基質を使用したＳＳＦ実験は、典型的には３３℃、ｐＨ５．８、および２５質量％の固体投入量で実施した。２５％固形分（１２．５ｇ乾燥質量）の前処理トウモロコシ穂軸を最初に１２５ｍＬエルレンマイアーフラスコ内に投入し、基質のｐＨを５．８に滴定するのに要する量の６Ｎ硫酸と予備混合された脱イオン水の添加がそれに続いた。上述のＨ３Ａタンパク質を糖化酵素として使用し、バイオマス基質中１ｇの（セルロース＋キシラン）当たりの総Ｈ３Ａタンパク質ｍｇを基準とする量で添加した。追加的栄養素を添加せずに、１０％質量のザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株の種菌（５ｇ）を反応混合物に添加して、発酵を開始した。フラスコの栓として使用したゴム栓から突出する２３ゲージ針によって、嫌気性環境およびＣＯ2ガス放出を維持した。発酵開始時に、全てのＳＳＦ操作は、フラスコ内に５０ｇの初期総反応質量を有し、反応混合物は、前処理トウモロコシ穂軸、水、硫酸、酵素、およびＺＷ７０５細胞からなった。振盪培養器（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｎｏｖａ  ４４，  Ｅｄｉｓｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）内において、５０または２００ＲＰＭでフラスコを振盪し、１日目は３３℃から３０℃に、２日目は２８℃に温度を低下させた。
【００９４】
ＳＳＦスケールアップ−撹拌タンク反応装置
１２５ｍＬフラスコの代わりに、３リットルの皿底ガラス反応装置（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｚ６１１０１Ｃ００６，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用した。反応装置内の１０００ｇの総反応質量で、１４４時間にわたりＳＳＦを実施した。スケールアップ研究のために、２５質量％（２５０ｇ）の固体投入量を使用した。およそ７５％の乾燥固形物を無菌ミリＱ水に添加して、ｐＨを２Ｎ硫酸でｐＨ５．８に調節した。この初期混合物を３３℃に上昇させて、一定に保った。次に酵素（２０ｍｇのＨ３Ａタンパク質／ｇ（セルロース＋キシラン））およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）種菌を、残りの乾燥固形物と共に添加した。温度を２４時間目に３０℃に、次に４８時間目に２８℃に低下させた。  反応装置外面周囲に巻かれた電気加熱テープによって反応装置の温度を維持し、ラシュトンまたはマリン傾斜羽根インペラのどちらかにより混合した。反応のヘッドスペースを窒素でフラッシュしてザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の酸素曝露を減少させ、ガス放出は１９ゲージ針で穿刺したゴム栓を用いて調節した。
【００９５】
総生菌数（ＴＶＣ）
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を含有するＳＳＦサンプルの総生菌数は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定することで経時的にモニターした。サンプルを無菌濾過ミリＱ水中で段階希釈し、次にＭＲＭ３プレート（１５ｇ寒天、５０ｇグルコース、１０ｇ酵母抽出物、１ｇのＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、２ｇのＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ５．５に調節、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌）上に播種し、プレートをパラフィルムで密封することによって、嫌気的に３３℃で４８時間培養した。１０〜１０００コロニー間の希釈プレートを、コロニー形成単位（ＣＦＵ）について計数した。平板計数が希釈範囲外である場合、ＣＦＵは数えていない希釈プレート未満またはそれを超えると報告した。
【００９６】
実施例１
ＳＳＦに対するＲＰＭおよび固体投入量の影響
この実施例は、希釈アンモニア前処理トウモロコシ穂軸および組換えザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株を使用したＳＳＦ工程に対する、ＲＰＭおよび固体投入量の影響を実証する。ＳＳＦは、フラスコＳＳＦの一般方法に記載されるように実施した。試験は、３つの異なる固体投入量（６％、１２％、および２５％）および２つの異なるＲＰＭ（５０ＲＰＭおよび２００ＲＰＭ）で、１ｇのグルカン＋キシラン当たり１５ｍｇの用量のＨ３Ａタンパク質を用いて実施した。サンプルを３日後に採取して、材料と方法に記載されるようにＨＰＬＣによってアッセイした。
【００９７】
図１に提示する結果は、ＲＰＭが、高固体投入量（２５％）においてＳＳＦ工程に対して驚くべき強力な影響を及ぼすことを示した。ＲＰＭが２００で固形分が２５％のＳＳＦは、３日目にわずか７．７ｇ／ＬのＥｔＯＨしか生成されず、それは主として、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）種菌からの持ち越しエタノールであった。同時に、２９．５ｇ／Ｌのグルコースおよび４７．８ｇ／Ｌのキシロースが蓄積し、Ｈ３Ａ酵素製剤がこれらの条件下で依然として効果的であることが示唆された。対照的に、より低い固体投入量（６％および１２％）では、２００ＲＰＭへのＲＰＭ増大は、ＳＳＦ工程の能力低下をもたらさなかった。
【００９８】
上の発酵からの総生菌数は、一般方法に記載するように、実験経過中に０、４、２４、４８、および７２時間目に経時的にモニターした。図２に示す結果は、２５％固形分および２００ＲＰＭにおけるＳＳＦ操作能力の損失が、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＦＵ損失と直接関連することを示唆する。全てのＳＳＦ操作で、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、接種（０時間）から４時間までの間に迅速に成長する。総生菌数は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生存度（ＣＦＵ）に２４時間以内で３対数の減少、４８時間以内で５対数の減少が見られた２５％固形分および２００ＲＰＭを除いて、全ての発酵で４時間後に２〜９×１０9ＣＦＵ／ｍＬで安定化する。したがってＲＰＭの増大はザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の生存度に悪影響を及ぼすが、それは高固体投入量（２５％）の場合だけである。他方、より低い固形分のＳＳＦ工程（６％および１２％）は、ＲＰＭの増大に影響されない。
【００９９】
実施例２
高固形分模擬ＳＳＦにおけるエタノール生成に対する粒度の影響
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵に対する粒度の影響を研究するために、前処理トウモロコシ穂軸の代わりに、Ｂａｌｌｏｔｉｎｉソーダガラスビーズ（ＶＷＲ、カタログ番号３３９９７−５００／５３６／５６０／５６２／５６８／５８４、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を模擬ＳＳＦ操作で使用した。以下の直径範囲を有するビーズを使用前に洗浄し、滅菌して乾燥させた。０〜５０μｍ、１００〜２００μｍ、４００〜６００μｍ、１２５０〜１５５０μｍ（１．２５〜１．５５ｍｍ）、および２８５０〜３３００μｍ（２．８５〜３．３０ｍｍ）。フラスコＳＳＦで記載したのと同様の条件で、ガス放出のための２１ゲージ針を装着した閉鎖１２５ｍＬエルレンマイアーフラスコ内において、反応サイズを５０ｇおよび２５％全固形分（ガラスビーズ）に固定した。標準ＳＳＦ反応中の利用可能炭水化物を模倣するために、水中の８０ｇ／Ｌグルコースおよび７０ｇ／Ｌキシロースからなる培地を調製して投入した。培地を高圧蒸気滅菌よって、１２１℃で１５分間滅菌した。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）種菌を反応混合物に１０質量％で投入し、この例では酵素を添加しなかった。振盪培養器内において、１００または２００ＲＰＭで撹拌して温度を一定３３℃に保ち、各反応を実施した。
【０１００】
図３Ａに示すエタノール生成の結果は、１００〜２００μｍまたは４００〜６００μｍどちらかの粒度の２５％固形物分存在下、高ＲＰＭ（２００ＲＰＭ）でザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵を実施した際の能力損失を明らかに示唆する。２００ＲＰＭでは他のいかなる試験粒度範囲でも測定可能な能力低下は見られず、１００ＲＰＭではいかなる粒度範囲でも能力低下は見られなかった。同様の影響は、２００ＲＰＭで実施した１００〜２００μｍおよび４００〜６００μｍビーズにおいてＣＦＵの２対数の減少が見られたＣＦＵデータにも見られた。表４中のデータは、発酵能力の損失が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生存度の直接の結果であることを示唆する。
【０１０１】
表４．図３の発酵のＣＦＵ測定
0005946773.tif 000006
【０１０２】
０〜５０μｍ、４０〜７０μｍ、および１００〜２００μｍの直径範囲のビーズを使用して、実験を繰り返した。図３Ｂに提示する結果は、２００ＲＰＭの撹拌および４０〜７０μｍのビーズを用いた模擬ＳＳＦからのエタノール生成が、１００ＲＰＭでの実施から生成するエタノールと同様であることを示す。
【０１０３】
試験条件下（２５％固形分、１２５ｍＬフラスコ内の５０ｇの反応体積、２００ＲＰＭ）でＢａｌｌｏｔｉｎｉビーズを使用して判定された、エタノール生成および細胞生存度を低下させる臨界粒度範囲は、１００μｍ〜６００μｍの範囲であった。
【０１０４】
実施例３
撹拌タンク反応装置内のＳＳＦ
試験１
材料と方法に記載されるＳＳＦスケールアップにおいて、１００ＲＰＭで回転する２台のラシュトン６枚羽根インペラ（４５ｍｍ径）を使用した。インペラは軸に沿って３ｃｍ間隔で相隔たっており、底面のインペラは反応装置底から２ｃｍ離れていた。糖化酵素はＨ３Ａタンパク質で、それを１ｇのグルカン＋キシラン当たり２０ｍｇのタンパク質で投入した。使用された２５％固体投入量では、ラシュトンインペラは適切な混合を提供しなかった。視覚的観察からは、大量の固形物沈殿、軸方向混合不良、反応スラリー中に捕捉されたＣＯ2蓄積、およびインペラ周囲に高度に局在化する放射状混合が明らかになった。不均一な混合のために、ＳＳＦ操作中の入力の推定はできなかった。しかしグルコース、キシロース、およびエタノール濃度は、１４０時間にわたり試料採取とＨＰＬＣ分析によって測定され、グルコース、キシロース、およびエタノールの蓄積パターン（図４に示す）は、正常な糖化速度であるが不完全な発酵を示唆した。インペラの設計変更によって不均一混合を補正して、第２の試験を実施した。
【０１０５】
試験２
２台のラシュトンインペラを２台のマリン６枚羽根インペラ（４５ｍｍ径）で置き換えたこと以外は、上のようにして第２のＳＳＦスケールアップを実施した。インペラは軸に沿って３ｃｍ間隔で相隔たっており、底面のインペラは反応装置底から２ｃｍ離れていた。インペラ速度は１５０ＲＰＭに増大させた。マリンインペラはラシュトン（Ｒｕｓｔｏｎ）インペラと比較して、最大剪断速度の低下を示すことが知られている（Ｓｈｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｇｉ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ２８７（２００２）Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ）。これは液体中のガス分散および移動不良をもたらすかもしれないが、発酵は嫌気性であるのであまり問題にならない。インペラ交換は、先に試験１で見られた混合問題を軽減した。完全に懸濁した残留不溶性固形物、および均質な混合が視覚的に観察された。グルコース、キシロース、およびエタノール濃度は、１４０時間にわたり試料採取とＨＰＬＣ分析によって測定した。図５に提示する結果は、より良い軸方向混合が、糖の蓄積を最小限にしながら、より高速なエタノール生成と、７２時間を過ぎた後も持続するエタノール生成をもたらすことを示す。エタノール生成の増加は、試験１と比較して、基質の液化および糖化に改善があったことを示唆する。グルコース、キシロース、およびエタノールの６日目の力価は、それぞれ９．００、１２．６４、および８５．８８ｇ／Ｌであった。
【０１０６】
実施例４
撹拌タンク反応装置内のＳＳＦに対する撹拌の影響
異なる混合条件下において、１．７Ｌ反応装置内で同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応を実施した。下の実施例５に記載される撹拌羽根、約１０４０ｇの総反応質量、上述の前処理トウモロコシ穂軸を約２４％固体投入量で使用して、前処理バイオマス中に存在する１ｇのグルカン＋キシラン当たり１４ｍｇのＨ３Ａタンパク質の酵素投入量で、３３℃（低下させない）およびｐＨ５．８で、発酵生物としてＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５を用いて、一般方法に記載される撹拌タンク反応装置ＳＳＦと同様にして、ＳＳＦを実施した。ヘッドスペースは窒素でフラッシュしなかった。
【０１０７】
前処理固形物を２６質量％で水に入れて２５０または７５０ｒｐｍで撹拌し、２つの反応を実施した。前処理穂軸調製品ＳＳＬ２１を使用した。各混合物を撹拌し、温度とｐＨを調節しながら均質性を確実にした。ひとたびｐＨと温度が所望の値に達したら、酵素の全用量を添加した。酵素添加の１時間後に、混合を所望の値に設定し、一般方法に記載される１０％（最終体積）の即時収穫可能Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５の種培養を添加して、最終固形物を２３．６質量％にした。
【０１０８】
２５０または８０ｒｐｍで撹拌して２つの反応を実施して、ＳＳＬ２２前処理固形物を次のような３バッチで添加した。１）５５４ｇ水＋２１７ｇ前処理バイオマス（６９．１％乾燥固形分）＋２１．８１ｍＬ（約２１．８１ｇ）酵素＝７９２．８ｇ反応混合物（１４９．９ｇの乾燥固形分）で開始した。１８．９％固形分（この時点での反応混合物質量基準）、または１４．４％固形分（１０４０．８ｇの最終反応混合物質量基準）がもたらされた。ひとたびｐＨおよび温度が所望の値に達したら、酵素の全用量を添加した。
２）酵素添加の５分後、混合を所望の値に設定し、１０％（最終体積）の即時収穫可能Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５種培養を添加した。１０４ｍｌの即時収穫可能ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）種培養（約１０４ｇ）が添加され、なおも１４９．９ｇの乾燥固形分がある、８９６．８ｇの反応混合物があった。１６．７％の固形分（この時点での反応混合物質量基準）、または１４．４％の固形分（１０４０．８ｇの最終反応混合物質量基準）がもたらされた。
３）酵素添加の１時間後に、別の固形物バッチを添加した。７２ｇ（６９．１％乾燥物質）の第２の固形物バッチ＝９６８．８ｇの反応混合物（１９９．７ｇ乾燥固形分）を添加した。２０．６％の固形分（この時点での反応混合物質量基準）、または１９．２％の固形分（１０４０．８ｇの最終反応混合物質量基準）がもたらされた。
４）酵素添加の２時間後、固形物の最終バッチを添加した。７２ｇ（６９．１％）の乾燥材料の最終固形物バッチ＝１０４０．８ｇの反応混合物（２４９．５ｇの乾燥固形分）を添加した。２４．０％の固形分（この時点での反応混合物質量基準）、または２４．０％の固形分（１０４０．８ｇの最終反応混合物質量基準）がもたらされた。
【０１０９】
様々な時点で、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために各反応からアリコートを取り出した。図６Ａは、２５質量％の初期固形分を用いた２５０ｒｐｍおよび７５０ｒｐｍでの実施における、経時的なエタノール濃度を示す。図６Ｂは、分割された固形物添加を用いた８０ｒｐｍおよび２５０ｒｐｍでの実施の経時的なエタノール濃度を示す。７５０ｒｐｍでは、エタノールは、種培養による持ち越し分を超えて生成されなかった（図６Ａ）。２５０ｒｐｍでは、約５０時間で約４０ｇ／Ｌのエタノールが生成した（図６Ａ）。分割バイオマス添加を用いた８０ｒｐｍでは、約５０時間で約６５ｇ／Ｌのエタノールが生成した（図６Ｂ）。分割バイオマス添加を用いた２５０ＲＰＭでは、約５０時間で約４０ｇ／Ｌのエタノールが生成した（図６Ｂ）。
【０１１０】
実施例５
ＳＳＦに対する入力効果の計算
実施例４で使用した皿底ガラス反応容器は、直径１１ｃｍで高さ１８ｃｍであった。容器に約１Ｌを充填すると、約１０．５ｃｍの作用高さがもたらされ、０．９６のｈ／ｄが提供された。混合は、上述のｒｐｍ値で作動する２台のインペラシステムによる撹拌を通じて提供された。底部インペラは、（底から約３．７ｃｍ離れた）約３５０ｍＬの液体体積に位置する、４．８ｃｍ径３セグメントインペラ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）であり、セグメントはアップポンピング４５度の角度で配置されていた。上部インペラは（底から約７．４ｃｍ離れた）約７００ｍＬの液体体積に位置する、４．５ｃｍ羽根径および２．５ｃｍ円盤の６枚羽根タービンインペラ（ラシュトン）であった。混合計算のために、密度（ρ）を１０５０ｋｇ／ｍ3と仮定し、粘度（μ）を３３℃の水の粘度（０．０００７５ｋｇ／ｍｓ）と仮定した。インペラレイノルズ数（Ｒｅ）はＲＰＳ＊ＤＩ2＊ρ／μとして計算され、式中、ＲＰＳは毎秒回転数でありＤＩはインペラ直径である。いかなる場合でもインペラレイノルズ数は４０００を超え、したがってインペラ動力数は「高レイノルズ漸近線」値と見なされた（３セグメントインペラでは１．５、ラシュトンインペラでは５）。インペラは十分に間隔が開いているので、総インペラ混合力は、個々のインペラ混合力の和と見なされた。インペラ動力は、インペラ動力数＊密度＊（ＲＰＳ3）＊（ＤＩ5）として計算された。動力／質量（Ｐ／ｍ）は、総インペラ動力を総反応質量で除して得られた。先端の動力／質量は、総インペラ動力／（ＤＩ3＊ρ）として計算された。渦サイズは、［（μ／ρ）3／（動力／質量）］1/4として計算された。実施例４の８０、２５０、および７５０ｒｐｍでの実施では、総インペラ混合力は、０．００３２、０．０９９、および２．７Ｗ（０．００３２、０．０９９、および２．７Ｗ／ｋｇの動力／質量）であった。これら３例でのインペラ先端速度は、それぞれ０．１９、０．５９、および１．８ｍ／ｓであった。これら３例での渦サイズは、それぞれ１０４、４４、および１９μｍであった。先端での渦サイズは、先端における動力／質量で、渦サイズの式中の動力／質量を置き換えることにより、計算し得る。表５に結果を一覧にする。
【０１１１】
表５．撹拌反応装置内におけるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５のＳＳＦ反応の混合パラメーターおよび最終エタノール力価（実施例４）
0005946773.tif 000007
*２０ｍｇ／ｇの酵素を使用する実施例３の試験２からの結果
#ＮＤＩはＲＰＳ*ＤＩである
【０１１２】
表５は、混合がＳＳＦの成功に及ぼす強力な影響を例示する。混合強度が増大すると、エタノール力価は低下した。激しい混合条件の下では、エタノールは種培養の持ち越し分を超えて形成しなかった。総反応質量の０．２Ｗ／ｋｇ未満の特定の入力は、高固形物濃度のＳＳＦ中において効果的な発酵を与えた。
【０１１３】
実施例６
エタノール力価および撹拌要件に対する酵素投入量の影響
同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応を３組の４枚羽根、４５度ダウンポンピングインペラがある、２Ｌ反応装置内で実施した。約２１４０ｇの総反応質量、上述の前処理トウモロコシ穂軸を約２２．５％の最終固体投入量で使用して、前処理バイオマス中に存在する１ｇのグルカン＋キシラン当たり１４または２８ｍｇのどちらかのＨ３Ａタンパク質の酵素投入量で、３３℃（低下させない）およびｐＨ５．８で、発酵生物としてＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＲ３  ７−３１を用いて、一般方法に記載される撹拌タンク反応装置ＳＳＦと同様にして、ＳＳＦを実施した。ヘッドスペースは、窒素でフラッシュしなかった。
【０１１４】
固形物を流加式に投入した。６５．３％の乾燥物質を含有する、前処理穂軸調製品ＳＳＬ２７を使用した。最初に９４ｇの前処理穂軸と１１２０ｇの水を反応装置入れて、５％固形分のスラリーを作成した。ｐＨおよび温度をそれぞれ５．８および３３℃の設定値に調節した。次に４０．２ｇ（１４ｍｇ／ｇの場合）または８０．５ｇ（２８ｍｇ／ｇの場合）のＨ３Ａ酵素を添加して（それぞれＦＢＲ７４６およびＦＢＲ７４７）、それに２００ｍｌのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の添加がすぐに（５分以内）続いた。続く７時間にわたり、残りの６３７ｇの前処理穂軸を１時間毎に（全部で７回の添加）、均等に添加した。１ＮのＨ2ＳＯ4または１ＮのＮａＯＨのどちらかを使用して、ｐＨを手動で調節してｐＨ５．８に保った。
【０１１５】
容器のガラス壁を通した視覚的観察に基づいて固形物が懸濁したままであるように、各固形物の添加間に、そして発酵の残り全体で日に２回、撹拌速度を調べて必要ならば１０ｒｐｍ単位で調節した。この撹拌速度はＮJS（ＪＳ＝「最小懸濁」）と称される。
【０１１６】
１４ｍｇ／ｇの酵素負荷反応装置、および２８ｍｇ／ｇの酵素負荷反応装置のＮJSのグラフを図７Ａに示す。酵素投入量が２倍の反応装置は、発酵全体を通じて懸濁を保つのに、より低い撹拌速度を要した。２８ｍｇ／ｇの酵素投入量を使用する実施に要する最大撹拌速度が１１０ｒｐｍであったのに対し、１４ｍｇ／ｇ酵素投入量での実施は最大１４０ｒｐｍを要した。動力は撹拌速度の三乗に対応する（Ｐ〜Ｎ3）ので、これは酵素が２倍の実施と比較して、より低い酵素での実施中に懸濁状態を保つ動力のおよそ２倍に相当する。入力は実施例５と同様に計算され、１１０ｒｐｍでは０．０２５Ｗ／ｋｇ、１４０ｒｐｍでは０．０５２Ｗ／ｋｇが得られた。
【０１１７】
様々な時点で、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために、（一般方法のように）各反応からアリコートを取り出した。図７Ｂは、双方の反応装置の経時的エタノール濃度を示す。２８ｍｇ／ｇの酵素投入量の反応装置が、５０時間で約７７ｇ／Ｌに達したのに対し、１４ｍｇ／ｇの酵素投入量の反応装置は、同一時間で約６２ｇ／Ｌに達した。
【０１１８】
実施例７
トウモロコシ茎葉を使用したＳＳＦ
実施例４および５に記載されるように、１．７Ｌ反応装置内で同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応を実施した。トウモロコシ茎葉を用いたＳＳＦは、一般方法に記載される撹拌タンク反応装置ＳＳＦ法と同様にして実施した。
【０１１９】
（典型的な茎葉組成を基準にして）１ｇのグルカン＋キシラン当たり１７ｍｇのＨ３Ａタンパク質／の酵素投入量で、３３℃（低下させない）およびｐＨ５．３で、発酵生物としてＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５を用いて、一般方法に記載されるように調製されたトウモロコシ茎葉を約２０．６％の最終固体投入量で使用した。ヘッドスペースは、窒素でフラッシュしなかった。発酵槽には、約３５０ｍＬに装着された３セグメントインペラと、約７００ｍＬに装着されたに６枚羽根タービンインペラ（ラシュトン）が装備され、最終反応質量は約８１０ｇであった。固形物を流加式に投入した。使用した前処理茎葉調製品は、４３．８％の乾燥物質を含有した。最初に９５ｇの前処理茎葉および２７９．１ｇの水を反応装置に入れて、１０％固形分スラリーを作成した。ｐＨおよび温度をそれぞれ５．３および３３℃の設定値に調節した。混合速度を２５０ｒｐｍに設定した。次に２０．６ｍｌのＨ３Ａ酵素を添加して、それに１００ｍｌのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の添加がすぐに（２０分以内）続いた。酵素添加の１、４．３、および７時間後に、９５ｇの固形物の追加的用量を添加した。固形物添加中はｐＨが上昇するままにして、最終固形物の添加後、究極的に５．８の値に達した。動力は０．１１１Ｗ／ｋｇと計算された。
【０１２０】
様々な時点で、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために、反応からアリコートを取り出した。２７．４時間で４０ｇ／Ｌに達し、４４．７時間で４５．７ｇ／Ｌに達したエタノール濃度は、約０．１Ｗ／ｋｇの混合動力を使用した、ＳＳＦ中のトウモロコシ茎葉の成功裏の使用をさらに実証する。
【０１２１】
実施例８
トウモロコシ茎葉を用いたＳＳＦおよび酵素投入効果
１Ｌ反応装置内で、同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応を実施した。一般方法に記載される撹拌タンク反応装置ＳＳＦと同様にして、トウモロコシ茎葉を用いた２つのＳＳＦ試験を実施した。
【０１２２】
実験ＳＲ−１２では、一般方法で記載されるように調製された、４３．７％乾燥物質を含有するトウモロコシ茎葉を使用した。バイオマス中１ｇのグルカン＋キシラン当たり１４ｍｇのＨ３Ａタンパク質／の酵素投入量で、３３℃（低下させない）および初期ｐＨ５．５で、発酵生物としてＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５を用いて、８３０ｇの反応質量中に、固形物を約２３．３％の最終固体投入量で流加式に徐々に投入した。ヘッドスペースは窒素でフラッシュしなかった。発酵槽には、最終反応装置充填高さのおよそ１４％のフラットタービン翼と、最終反応装置充填高さのおよそ４２％の４５度の傾斜タービン翼２組のインペラが装着された。最初に５３．０ｇの前処理茎葉および２５０ｇの水を反応装置に入れて、７．６％固形分のスラリーを作成した。ｐＨおよび温度をそれぞれ５．５および３３℃の設定値に調節した。撹拌または混合速度は、１６８ｒｐｍに設定した。次に１５．２ｍＬのＨ３Ａ酵素を添加し、そのおよそ４０分後に７８ｍｌのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の添加が続いた。続く３６時間にわたり、所望のｐＨを保つのに必要な場合は１ＮのＨ2ＳＯ4および１ＮのＮａＯＨと共に、追加的用量の３７．０ｇの固形物を１０の等分量で添加した。最初の約２０時間は、（周期的モニタリングと手動調節によって）ｐＨを５．５に調製した。２０時間後、引き続く固形物の添加中、および発酵の残りの部分でｐＨを５．８に調節した。撹拌速度は最初の１２時間は１６８ｒｐｍに保ち、次におよそ５０時間まで２１２ｒｐｍに上昇させた。最初の１２時間中の入力は０．０４２〜０．０５７Ｗ／ｋｇであり、変動は固形物の撹拌による反応増大に起因した。発酵の残りの部分の入力は０．０６４〜０．０８４Ｗ／ｋｇであり、これも反応装置への質量の添加のために変動した。
【０１２３】
実験ＳＲ−１３はＳＲ−１２と完全に同じように実施したが、４３ｇのみの水および３０．５ｍｌの酵素を使用した。これは先の実施の２倍の酵素投入量、または１ｇのグルカン＋キシラン当たり２８ｍｇのタンパク質に相当する。ｐＨ調節、固形物添加、および撹拌は、上で述べた先の実験と同じ方法で、同一のおよそのタイミングで処理された。
【０１２４】
様々な時間に、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために各反応からアリコートを取り出した。図８は、双方の実施の経時的エタノール濃度を示す。実験ＳＲ−１２が５１．２時間で４９．５ｇ／Ｌのエタノールに達したのに対し、実験ＳＲ−１３は５０．０時間で５２．３ｇ／Ｌのエタノールに達し、トウモロコシ茎葉ＳＳＦ中でより高い酵素投入量を使用することで、より高いエタノール力価およびより高い速度が達成され得ることが実証された。
【０１２５】
実施例９
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対するＳＳＦ中のＲＰＭの影響の比較
本実施例は、希釈アンモニア前処理トウモロコシ穂軸と、組換えザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および市販のサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ登録商標）；Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ、ＬｅｓａｆｆｒｅＧｒｏｕｐ）をはじめとする多様なエタノール産生体を使用したＳＳＦ工程に対する、ＲＰＭおよび固体投入量の影響を実証する。ＳＳＦは、一般方法でフラスコＳＳＦについて記載されるように実施した。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）スタータカルチャは、乾燥Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）を２０ｇ／Ｌグルコース溶液に添加し、３０℃で１時間培養して調製した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではスタータカルチャを調製せず、１ｍｌのＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞を解凍して、ＳＳＦ反応に直接添加した。試験は、１つの固体投入量（２５％）と、２つの異なるＲＰＭ（１００ＲＰＭおよび２００ＲＰＭ）で、１ｇのグルカン＋キシラン当たり１４ｍｇの用量のＨ３Ａタンパク質を用いて実施した。サンプルを３日後に採取し、材料と方法に記載されるようにして、ＨＰＬＣによりアッセイした。
【０１２６】
図９に提示する結果は、異なる微生物を用いたＳＳＦ中の４８時間目における、エタノール力価に対するＲＰＭの影響を示す。実施例１の図１にも示されるように、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｓ）ＺＷ７０５を用いたＳＳＦ中のエタノール力価は混合に対して感受性であり、１００ＲＰＭでの実施が５０ｇ／Ｌを超えるエタノール力価をもたらすのに対し、２００ＲＰＭでの実施は１０ｇ／Ｌに達しなかった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もまた混合に対して感受性であるが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）と同程度ではなく、１００ＲＰＭでは２００ＲＰＭよりも５０％多いエタノールを産生し（それぞれ１１．８対７．７ｇ／Ｌ）、残留グルコースがより少なくなった。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は双方の混合実施において２５〜３０ｇ／Ｌのエタノールを産生し、力価は２００ｒｐｍの実施でわずかにより高かった。したがって試験された原核生物エタノール産生体にはＲＰＭの増大は悪影響を及ぼす一方で、真菌エタノール産生体には悪影響がなかった。
本発明のその他の実施態様を例示的に以下に列挙する。
（１）ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマスを提供するステップと；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素を提供するステップと；
ｃ）原核生物エタノール産生体を提供するステップと；
ｄ）撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内で、ａ）の前記前処理バイオマス、ｂ）の前記糖化酵素、およびｃ）の前記原核生物エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物を調製するステップと；
ｄ）前記糖化発酵混合物中で前記原核生物エタノール産生体を培養するステップであって、前記糖化発酵混合物中の投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％であり、前記原核生物エタノール産生体がエタノールを産生する、ステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。
（２）総糖化発酵混合物１ｋｇ当たり約０．２ワット以下の出力を提供する、（１）に記載の方法。
（３）原核生物エタノール産生体が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属の一員である、（１）に記載の方法。
（４）撹拌手段が少なくとも１つのインペラを含んでなる、（１）に記載の方法。
（５）ｃ）の前記エタノール産生体が、ｂ）の前記糖化酵素の添加後、部分的糖化が起きた時に添加される、（１）に記載の方法。
（６）前処理バイオマスが、合わせて、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％の総投入不溶性固形物濃度を与える、少なくとも２つの部分として添加される、（１）に記載の方法。
（７）糖化発酵混合物中の総投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約２０％である、（１）に記載の方法。
（８）原核生物エタノール産生体が、糖化発酵混合物中の酢酸濃度に耐性である、（１）に記載の方法。
（９）バイオマスが、スイッチグラス、古紙、製紙汚泥、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、草、小麦、麦わら、干し草、大麦のわら、稲わら、サトウキビバガス、ソルガム、穀物加工から得られる構成要素、樹木、枝、根、葉、木くず、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、花、および家畜糞尿からなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（１０）前処理バイオマスが、セルロース性バイオマスをアンモニアで処理することにより生成される、（１）に記載の方法。
（１１）アンモニアが、バイオマスの乾燥質量に対して約１２質量％少ない、（１０）に記載の方法。
（１２）少なくとも１つの糖化酵素が、セルロース加水分解グリコシダーゼおよびヘミセルロース加水分解グリコシダーゼからなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（１３）少なくとも１つの糖化酵素が、酵素共同体の一員である、（１）に記載の方法。
（１４）糖化酵素共同体が、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノ−キシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼ、およびフェルロイルエステラーゼからなる群から選択される酵素を含んでなる、（１３）に記載の方法。
（１５）多糖類が、キシランおよびグルカンを含んでなる、（１）に記載の方法。
（１６）発酵性糖類が、キシロースおよびグルコースを含んでなる、（１）に記載の方法。
（１７）生成されるエタノール濃度が少なくとも約４０ｇ／Ｌである、（１）に記載の方法。
（１８）ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる、粒度が約１００μｍ以下または粒度が約６００μｍ以上の前処理バイオマスを提供するステップと；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素を提供するステップと；
ｃ）原核生物エタノール産生体を提供するステップと；
ｄ）撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内で、ａ）の前記前処理バイオマス、ｂ）の前記糖化酵素、およびｃ）の前記原核生物エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物を調製するステップと；
ｅ）前記原核生物エタノール産生体を前記糖化発酵混合物中で培養するステップであって、
１）前記糖化発酵混合物中の総投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％であり；
２）前記原核生物エタノール産生体がエタノールを産生する、ステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。
（１９）原核生物エタノール産生体（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｙ）が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属の一員である、（１８）に記載の方法。
（２０）ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマス；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素；および
ｃ）原核生物エタノール産生体
を含んでなる糖化発酵システムであって、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前記バイオマス、前記酵素、前記エタノール産生体が糖化発酵混合物中で組み合わされて、総投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％である、糖化発酵システム。
（２１）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前記バイオマス、前記酵素、および前記エタノール産生体が、総糖化発酵混合物１ｋｇ当たり約０．２ワット以下の出力を提供する機能的撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内に収容される、（２０）に記載のシステム。
（２２）前記原核生物エタノール産生体が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される、（２０）に記載の糖化発酵システム。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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