(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロプレートの表面に配置された試験ウェルの壁境界を特定する方法であって、
マイクロプレートを照明し前記マイクロプレートのデジタル画像を取り込み、
画素強度情報を少なくとも部分的に利用して前記マイクロプレートのデジタル画像を解析して、試験ウェルの壁境界の特徴を検出し、
前記壁境界の特徴を使用して、前記マイクロプレートの候補エッジ画像であって前記壁境界の１以上のセグメントの位置を表す候補エッジ画像を生成し、
アルゴリズムを使用して前記候補エッジ画像を解析して、１以上の試験ウェルの壁の外周境界を計算し、かつ前記マイクロプレートの表面上の前記外周境界の空間的位置を決定し、
画素強度情報を少なくとも部分的に利用して前記１以上の試験ウェルの壁の外周境界を解析して、前記１以上の試験ウェルの壁の内周境界の空間的位置を決定し、
前記内周境界の空間領域画像を前記マイクロプレート上にマッピングして、前記マイクロプレートの表面上の試験ウェル領域を識別する
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
前記ウェル境界の特徴が、強度特徴、エッジ特徴、曲率評価のための固有値、テクスチャ特徴、管特徴、コーナー検出特徴、線幅特徴、線連続性特徴、グレイレベル特徴又はこれらの組合せを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
候補エッジ画像を生成することが、エッジ検出フィルタ、画素閾値、輪郭抽出モジュール、ハフ変換、画素分類及びクラスタリング又はこれらの組合せを適用することを含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
１以上の試験ウェルの壁の外周境界を計算することが、円フィッティング解析、最良弧解析、矩形フィッティング解析、凸包解析、ハフ変換、輪郭を円若しくは矩形のモデルにフィットさせる際に残余誤差を評価すること、潜在的境界の両側のテクスチャ特徴を解析すること又はこれらの組合せを含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記外周境界から内方にトレースを行い内側境界を多数決によって選択することによって、前記ウェルの内周境界を検出するウェル壁精選段階を更に含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
マイクロプレートの表面を横断する撮像経路を指示するための撮像装置の走査計画、照明マスク又はこれらの組合せを生成することを更に含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記走査計画、照明マスク又はこれらの組合せに基づいて、前記マイクロプレートの追加のデジタル画像を取り込むことを更に含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記試験サンプルが、細胞培養物、組織培養物、有機体全体又はこれらの組合せを含む、請求項６又は請求項７記載の方法。
【請求項９】
マイクロプレートの表面に配置された試験ウェルの壁境界を特定するための装置であって、
１以上の倍率で画像を取得するための１以上の対物レンズ、及びマイクロプレートを保持するためのステージを有する撮像顕微鏡と、
前記ステージ上で前記マイクロプレートを照明するための励起源と、
前記マイクロプレートのデジタル画像を取得するための、前記顕微鏡に接続されたデジタル画像デバイスと、
前記マイクロプレートのデジタル化画像を格納することができる、前記デジタル画像デバイスと通信するストレージデバイスと、
前記ストレージデバイスと通信するプロセッサと
を備えてなり、前記プロセッサが、
画素強度情報を少なくとも部分的に利用して前記マイクロプレートのデジタル画像を解析して、試験ウェルの壁境界の特徴を検出し、
前記壁境界の特徴を使用して、前記マイクロプレートの候補エッジ画像であって前記壁境界の１以上のセグメントの位置を表す候補エッジ画像を生成し、
アルゴリズムを使用して前記候補エッジ画像を解析して、１以上の試験ウェルの壁の外周境界を計算し、前記マイクロプレートの表面上の前記外周境界の空間的位置を決定し、
画素強度情報を少なくとも部分的に利用して前記１以上の試験ウェルの壁の外周境界を解析して、前記１以上の試験ウェルの壁の内周境界の空間的位置を決定し、
前記マイクロプレートの二値画像であって前記試験ウェルの内周境界及び外周境界の位置の空間領域画像である二値画像を生成し、
前記空間領域画像を前記マイクロプレート上にマッピングして、前記マイクロプレートの表面上の試験ウェル領域を識別する
ことができる、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロプレートのウェル壁境界を識別するための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロタイタープレート又はマイクロプレートは、分析研究及び臨床診断試験施設における標準的ツールとなっている。それらは、蛍光、発光、放射、吸光度及び光イメージングなどの画像取得システムに関わる様々な検出手順で一般的に使用される。マイクロプレートは、通常、矩形マトリックスに配置された６、２４、９６、３８４個又はそれより多くのサンプルウェルを有し、各ウェルは、細胞培養物及び組織培養物、並びにゼブラフィッシュのような生物全体などのサンプルを保持するように設計されている。
【０００３】
ハイスループット顕微鏡法では、顕微鏡に取り付けられた画像取得システムは、顕微鏡のステージ上に装着されたウェルプレート全体を１以上の視野で単一の画像として撮像するか或いはやはり１以上の視野で各試験ウェルを別々に撮像するように構成し得る。ほとんどのマイクロプレートは、円形のウェルからなるが、矩形ウェルも珍しくない。マイクロプレートの各ウェルは、数十ナノリットル乃至数ミリリットルの液体を保持することができる。
【０００４】
幾つかのシステムでは、マイクロプレートの表面を横断する撮像経路を指示するため走査計画が用いられることがある。単純な方法では、システムはマイクロプレート全体を見て、一般に細胞及び組織培養体又は生物である試験サンプルの位置を識別しなければならない。次いで、試験サンプルが、領域包絡線に変換される。次いで、その領域の座標が、顕微鏡ステージの位置空間にマッピングされる。これにより、顕微鏡の動きが、マイクロプレートの適切な区域をカバーし、組織サンプル間の不要な区域又はマイクロプレートの場合にはサンプルを含まないサンプルウェルを避けるようにプログラムすることができる。走査計画は、照明マスクと呼ばれることもあり、マスクされたマイクロプレートの特定の領域は、撮像されない。しかし、走査計画の手作業での作成は時間がかかることがあり、また不正確なことも多い。
【０００５】
したがって、マイクロプレートのハイスループット画像処理を提供するための代替的プロセス、例えば、マイクロプレートのサンプルウェル壁境界を効率的に検出するようなプロセスが所望される。ウェル壁の位置の正確な識別は、関連するプレート部分の高解像度画像の取得の高速化に利用することができ、その後のマイクロプレートの画像取得及び画像解析のための前処理段階でも利用することができる。したがって、内側ウェル領域のマスクは、ウェル壁の外側での不必要な処理を回避し、後続の画像処理速度を向上するのに役立てることができる。また、マスクは、ウェル内部又は外部に輝点がある場合、照度補正又はフラットフィールド補正（flat field correction）の複雑度を低減するのに役立てることもできる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５２７５９５１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、マイクロプレート上の試験ウェルの画像処理方法及びシステムであって、そのマイクロプレートの試験ウェル壁境界が識別される方法及びシステムに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施形態では、マイクロプレートの表面に配置された試験ウェルの壁境界を特定する方法が説明される。この方法は、マイクロプレートを照明しマイクロプレートのデジタル画像を取り込み、画素強度情報を少なくとも部分的に利用して画像を解析して、試験ウェルの壁境界の特徴を検出し、その壁境界の特徴を使用して、壁境界の１以上のセグメントの位置を表す候補エッジ画像を生成することを含む。この方法は更に、候補エッジ画像を解析して、１以上の試験ウェルの外周境界の空間的位置を計算し、その情報を使用して内周境界の空間的位置を決定することを含む。次いで、境界の空間領域をマイクロプレートの表面にマッピングして、試験ウェル領域を識別する。
【０００９】
本発明の第２の実施形態では、マイクロプレートの表面に配置された試験ウェルの壁境界を特定するための装置であって、撮像顕微鏡と、励起源と、デジタル画像デバイスと、記憶装置と、プロセッサとを備える装置が開示される。プロセッサは、画素強度情報を少なくとも部分的に利用してマイクロプレートのデジタル画像を解析して、試験ウェルの壁境界の特徴を検出し、壁境界の１以上のセグメントの位置を表すマイクロプレートの候補エッジ画像を生成することができる。プロセッサは更に、アルゴリズムを使用して候補エッジ画像を解析して、１以上の試験ウェルの外周境界を計算することができる。次いで、外周境界の空間的位置を使用して、内周境界の空間的位置を決定する。この情報を使用して、試験ウェルの位置の空間領域画像であるマイクロプレートの二値画像を生成する。この情報をマイクロプレートの表面上にマッピングして、試験ウェル領域を識別する。
【００１０】
本発明の上記及び他の特徴、態様及び利点は、添付図面を参照して以下の詳細な説明を読むと、より良く理解されよう。図面では、その全体を通して同様の符号が同様の部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】マイクロプレート上の試験ウェル壁境界を識別する方法を示す流れ図である。
【図２】典型的な画像からの特徴の抽出及び候補エッジの生成を示す顕微鏡写真図であり、Ａは、画像内の着目すべき特徴を有する点を示し、Ｂは、候補エッジを得るための点の絞込み選択を示す図である。
【図３】輪郭抽出を示す顕微鏡写真図であり、Ａは、図２に用いた原画像に重ね合わせた候補エッジから抽出した輪郭を示し、Ｂは、輪郭にフィットした対応する円を示し、Ｃは、最適な弧を得るために輪郭上の曲率点を解析するプロセスを示す図である。
【図４】試験ウェル壁の凸包解析の結果を示す顕微鏡写真図である。
【図５】内側境界の推定を示す顕微鏡写真図であり、Ａは、外側境界からのトレースの方向を示し、Ｂは、ウェル壁の厚さの推定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書及び特許請求の範囲では、幾つかの用語について言及するが、これらの用語は、以下の意味をもつものとして定義される。
【００１３】
単数形で記載したものであっても、文脈から別途明らかでない限り、標記のものが複数存在する場合も含む。
【００１４】
「サンプル」は、マイクロプレートの試験ウェル内に含まれる化学的又は生物学的試験材料を指す。サンプルは、細胞培養物及び組織培養物、並びにゼブラフィッシュなどの生物全体であってよい。試験ウェルは、複数の生物のなど１以上のサンプルを含むこともできる。一般的検出モードは、吸光度、蛍光強度、発光、時間分解発光及び蛍光偏光を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
組織サンプルはまた、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の一部とすることができる。したがって、組織サンプルは、単一のスライドに配置された試験ウェル内に含まれる複数のサンプルのうちの１つである。試験ウェルの個数、ひいては単一スライド上の個々の組織サンプルの個数は、アレイ設計に応じて可変である。例えば、各個別の組織サンプルが、間隔０．７〜０．８ｍｍで直径０．６ｍｍの円形試験ウェルで、よって各組織サンプルの表面積が０．２８２ｍｍ2となる円形試験ウェルを備えるように、ＴＭＡを設計することができる。より大きい及びより小さいＴＭＡも容易に利用可能である。
【００１６】
本明細書及び特許請求の範囲で用いる近似表現は、数量を修飾し、その数量が関係する基本機能に変化をもたらさない許容範囲内で変動し得る数量を表現するために適用される。したがって、「約」のような用語で修飾された値はその厳密な数値に限定されない。場合によっては、近似表現は、その値を測定する機器の精度に対応する。
【００１７】
本発明は、例えば、ハイコンテントスクリーニング、ハイコンテントアナリシス、検体検出、組織化学、免疫組織化学又は免疫蛍光のような解析、診断及び予後の用途に適用可能な方法に一般に関係する実施形態を含む。
【００１８】
開示された発明は、マイクロプレートの表面に配置された試験ウェルの境界を低解像度走査で識別し、試験ウェルの二値空間画像を生成する方法を説明する。二値空間画像は、次いで、試験ウェルにおけるサンプルの解析に使用し得る。例えば、内側ウェル領域を特定する照明マスクを使用して、ウェル壁の外側の不必要な処理を回避し、後続の解析の速度を高めることができる。また、ウェル壁の検出は、画像取得時に顕微鏡を案内するための走査計画の作成に使用することができる。低解像度走査でウェルプレートの境界を正確に識別することによって、高倍率の走査でウェル壁内部のみを撮像するように、顕微鏡を案内して、走査スループットを増大させ、画像記憶要件を低減することができる。ウェル壁検出はまた、ウェルの内側と外側が異なる取扱いをされる照明補正アルゴリズムの前処理段階であってもよい。本方法は、壁の一部分のみが画像に含まれている場合、又は壁が部分的に閉塞されている場合であっても、ウェルがサンプルを含んでいるか否かを問わず、明視野像と蛍光像の一方又は両方でウェル壁を検出することを含む。
【００１９】
図１は、試験ウェルの境界を識別するために使用できる方法を示す流れ図である。一実施形態では、図１に示すように、画像取得及び処理段階（Ａ）を用いて、ウェルプレートから画像を得るが、画像は明視野顕微鏡法又は蛍光顕微鏡法で得ることができる。ウェルプレートに配置された試験ウェルの特徴を、画素強度情報に少なくとも部分的に基づいて、画像から検出及び抽出する（Ｂ）。幾つかの実施形態では、検出及び抽出される画像の特徴としては、特に限定されないが、強度特徴、エッジ特徴、曲率評価のための固有値、テクスチャ特徴、管状特徴、コーナー検出特徴、線幅特徴、線連続性特徴、グレイレベル特徴又はこれらの組合せが挙げられる。
図１に示すように、抽出した特徴を解析及び再構成して、可能な壁境界の１以上のセグメントの位置を表す候補エッジ画像を形成する（Ｃ）。候補エッジ画像の生成には、幾つかの方法があり、特に限定されないが、エッジ検出フィルタ、画素閾値、輪郭抽出モジュール、ハフ変換、画素分類及びクラスタリング又はこれらの組合せを適用することが挙げられる。
【００２０】
候補エッジ画像は更に、試験ウェルの１以上の外周境界を計算するために解析される（Ｄ）。幾つかの実施形態では、外周境界の位置と低解像度画像からの画素情報とを使用して、試験ウェルの１以上の内周境界も計算される（Ｅ）。その結果として、試験ウェルの境界の位置の二値画像が得られる。境界は、内側境界でも、外側境界でも、或いはその両方であってもよい。次いで、ウェル境界画像は、マイクロプレートのウェル境界の空間的位置の画像マップの作成に使用することができ（Ｆ）、画像マップは、走査計画、照明マスクの作成又は後続の解析に有用である。
【００２１】
マイクロプレートから取り込まれた画像は大きく、長い処理時間を要することが多い。例えば、マイクロプレート内のウェルの画像は、２０４８×２０４８画素の解像度でカメラによる単一ビューで取り込まれることがある。幾つかの実施形態では、画像処理段階（Ａ）は、特徴検出の精度を損なわずに処理速度を上げるために画像をダウンサンプリングすることを含む。例えば、上述のウェルプレートの２５％のダウンサンプリングは、５１２×５１２画素の解像度をもたらす。幾つかの実施形態では、ガウス平滑化によってダウンサンプリングを達成することができる。
【００２２】
画像が得られると、選択された特徴を検出し抽出するために、フィルタを画像に適用することができる。幾つかの実施形態では、単純な水平及び垂直のソーベルフィルタを使用して、画素強度に基づいて階調強度（gradient magnitude）値を各画素に割り当てることができる。閾値は、エッジ画像の統計量に基づいて動的に選ぶことができ、閾値未満のそれらの画像が抑圧され、候補エッジ画像が作成される。
【００２３】
例えば、Ｅｈ及びＥｖがそれぞれ水平及び垂直のソーベルエッジフィルタであるとすると、各対応する画素について、エッジ強度画像Ｅmは以下の通り計算される。
【００２４】
【数１】
0005920994.tif 000002
結果は、各画素の位置での画像強度の階調度である。計算されたＥm値のヒストグラムが作成され解析される。このヒストグラムでは、上位ｐ％の範囲の階調度を有する画像のみが選択され、ｐは通常、上位５％〜１０％の数値である。これらの選択された画素は、エッジが通常高い強度の階調度を有するため、二値エッジ画像の作成に使用することができる。
【００２５】
他の実施形態では、２つの閾値が適用される。例えば、画素は、高い強度値を示すそれらの画素に基づき５％の閾値を使用して選択される。次いで、第２の組の画像が、１０％の閾値に基づいて選択される。候補エッジ画像を得るために両方の画素集合を解析する際に、ヒステリシス閾値法が使用される。この方法は、第２の閾値を上回る画素値を考慮し、第１の閾値を上回る画素値の最近傍を有することで機能する。候補エッジ画像は、不完全な区域である隙間を有することがあるが、それらは、候補エッジ画像に対する二段階処理を使用して補正される。平滑且つ実際的なエッジマップを生成するために、候補画像の更なる補正又は形態学的閉合（morphological closing）を行うことができる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、輪郭抽出は、ＯｐｅｎＣＶ（Open Source Computer Vision）ライブラリで利用可能なｃｖＦｉｎｄＣｏｎｔｏｕｒｓのような二値エッジ画像の輪郭が識別される輪郭抽出モジュールを使用して、候補エッジ画像に適用することができる。規則ベースの方法を使用して、二値エッジ画像から抽出される輪郭の集合から、ウェル壁の候補輪郭が選択される。規則ベースの方法は、指定の最小長を設定し、検出されるが最小長より短い輪郭を除去することを含む。例えば、円形ウェルを参照すると、最小期待周囲は、所与のウェルプレートにおけるウェルの既知の寸法又は取得された画像の寸法に基づいて計算することができる。円形ウェルプレートの壁を検出すると、輪郭も円にフィットし、残余誤差の大きな輪郭を除去することが可能である。
【００２７】
幾つかの例では、輪郭検出は、画像内のアーチファクトの存在又はウェル壁に接触している撮像中の生物によって影響を受けることがある。検出されたままの輪郭にフィットする試みは、大きな残余誤差をもたらす可能性がある。これを回避するために、幾つかの実施形態では、円に類似する輪郭の最長セグメントが輪郭−円類似度メトリクスによって選択される最良弧解析（best arc analysis）を使用することができる。円に沿った輪郭は均一であることが期待されるため、高い曲率の不連続点は、アーチファクト又は望ましくない物体とウェル壁の相互作用を示している。これらの点は棄却されてよい。したがって、高い曲率のこれらの点は、隔離又は切断されて弧が得られ、弧は次いで別個に処理される。
【００２８】
幾つかの実施形態では、可能な最長の「最良弧」を得るために、隣接する弧が併合される。図３は、図２に示した試験ウェル画像を使用する典型的な候補エッジ画像の輪郭上の曲率の解析を示す顕微鏡写真図である。図３の画像Ａは、原画像に重ね合わせた抽出した輪郭を示し、Ｂは、輪郭に対応するフィットした円を示し、Ｃは、輪郭を弧及びセグメントに分解し、次いで隣接する弧を併合するプロセスを示す。
【００２９】
一実施形態では、円フィッティング解析を使用して、所与の輪郭又は輪郭の弧に対応する円を推定することができる。例えば、円の輪郭上の点０，１，２，…，ｎの式は、中心（ｘc，ｙc）及び半径ｒが未知の場合、以下の通り表すことができる。
【００３０】
【数２】
0005920994.tif 000003
この方程式系の解は次の通りである。
【００３１】
【数３】
0005920994.tif 000004
円を表す多角形Ｐは、中心及び半径に基づいて、１度間隔でθをサンプリングすることによって生成することができる。Ｐ上の各点は次の通り計算される。
【００３２】
【数４】
0005920994.tif 000005
上記の式は、各輪郭／弧に対応する円を推定するために使用される。輪郭上の点と対応するフィットした円上の最接近点との間の平均／中央値距離である輪郭−円計量、並びに円状多角形上の各点からの距離が輪郭上の最接近点に対し計算される円−輪郭計量は共に、輪郭の円への適合性の評価に使用することができる。アルゴリズムは、画像内のすべての輪郭を反復して処理して、最良適合円のみを考慮に入れる。輪郭上の点とフィットした円上の点との平均／中央値距離、並びに輪郭−円計量が閾値未満である場合、円の最良適合が認められる。平均／中央値距離及び対応するウェル半径を解析することで、最良適合円のうちから単一の円が選択される。
【００３３】
幾つかの実施形態では、ウェル壁候補エッジ画像からのウェル壁の選択及び抽出のために領域解析方法を使用することができる。この方法は、領域の全体でも或いは一部であってもよい候補ウェル壁の周りの凸包を生成することを含む。凸包は、所与の平面内の所与の非空有限集合を含む最小凸集合の境界として定義される。点が共線でない限り、凸包は、単純な多角形の閉路である。凸包を表す式は、一般に、入力点の数ｎと凸包上の点の数ｈとに関して評価される。円は凸構造であるため、円の計算された凸包は、やはり円となる。凸包は、領域内に存在する円形境界と完全に重なるが、非境界セグメントとは正確に重ならない。
【００３４】
これは、検出された部分的試験ウェル壁の凸包解析の結果を示す顕微鏡写真図である図４に示されている。エッジマップにおいてエッジと重なる凸の最長平滑部分を選択することにより、領域境界の円形部分が与えられる。候補選択方法の頑強性を改善するために、特にウェル内のサンプルがウェル壁に付着する可能性がある場合、凸包領域は、（ａ）より広い面積又はウェルの既知の面積に匹敵する面積、（ｂ）円形ウェルで予期されるため、同様の高さ及び幅、並びに（ｃ）単にノイズ又はアーチファクトであることの閾値よりも大きい寸法を有することが選好される。
【００３５】
図１を再び参照すると、候補画像が更に解析されることにより、候補画像が更に精選され、外周境界（Ｄ）から内周境界の二値画像が計算される（Ｅ）。ウェル壁精選段階を使用して、試験ウェルの内側境界を強調することもできる。その情報がウェル境界画像を生成するために使用される。次いで、ウェル境界画像は、マイクロプレートのウェル境界の空間的位置の画像マップの作成に使用することができ（Ｆ）、画像マップは、走査計画、照明マスクの作成又は後続の解析に有用である。
【００３６】
段階（Ｄ）及び（Ｅ）は、ウェル壁の全体又はウェル壁の一部分のみが可視である画像において使用されてよい。
【００３７】
部分的なウェル壁のみが画像内に存在する場合、検出された円形ウェル壁は、円の推定に使用された弧のサイズが小さいために、画像上に正確に中心を置くことができないことがある。円検出は、ハフ変換を使用して更に改善し得る。ウェルの近似半径が、フィットした円を使用して計算される。着目すべき環状領域が近似半径に基づいて選択されることで、ハフ変換アルゴリズムの実行時間が著しく減少する。
【００３８】
円形外側境界が識別された後、円形外側境界を垂線方向に沿ってトレースして、ウェル壁の内側境界を識別することができる（段階（Ｅ））。幾つの実施形態では、これは、ウェル壁の厚さが所与のウェルの全周に対して一定であることを想定することで達成し得る。内側ウェル壁を特定するために、外側境界の周りの等距離点がトレースされる。例えば、外側境界の各点が、垂線方向に沿って段階的にトレースされ、画素強度が記録される。同じ強度を有する連続した画素が、ウェル壁の部分として識別される。トレースが、つまり同じ強度を有する画素が、所定の距離、例えば、ウェルの半径の１５％よりも長い場合は、この測定値は、サンプルの部分又は異常物がその点で壁に付着していることを示唆しているので、この点での厚さは記録されないことになる。外側境界上のすべての点がトレースされた後、多数決法を用いてウェル壁の厚さが推定される。推定された厚さは、内壁に沿った画像及び点に適用される。トレースによって達成された内壁の点の位置は、推定されたウェル壁の厚さに従って調整される。
【００３９】
ウェル壁のトレース結果を示す図５において推定技法の例が示される。図５Ａは、外側境界上の各点のトレース方向を示す。図５Ｂは、内側境界に向かってトレースされた外側境界上の個々の点及び多数決に基づき推定されたウェル壁の厚さを使用して調整した後の内側ウェル壁上の点の最終位置を示す。
【００４０】
上述の方法は、６．４ｍｍの円形ウェルの３４０枚の画像、４．５ｍｍの円形ウェルの１００枚の画像、及びウェルが存在しない９６枚のスライド画像を使用して成功裏に試験された。６．４ｍｍのウェル画像については、結果画像の平面図の１００％が、実際の内側ウェル壁の平面図と合致した。４．５ｍｍのウェル画像については、ウェルの１１％が、ウェル壁と背景の間の低コントラストのため識別されず、また１％が誤検出であった。ウェル壁が存在しない９６枚のスライド画像については、ウェル壁の誤検出が０％であり、つまり成功率が１００％であった。更により検出精度を向上させるために、ウェルのサイズ及び形状に関するユーザの提供情報を利用することができる。
【００４１】
幾つかの実施形態では、マイクロプレートの追加のデジタル画像を、空間領域マップ又は照明マスクを使用して取得することができる。これにより、ウェル壁の外側の領域を回避しながら、より高い解像度の画像を取得することを可能にできる。また、これにより、画像平面内でウェルを中央に置くために、ＸＹステージの横方向の位置決めを補正する方法を提供することができる。
【００４２】
更に他の実施形態では、先行の画像からのデータ又はアイクロアレイの寸法からのデータを、ウェル境界画像の生成を増強するために使用することができる。例えば、試験ウェルの全体的形状、サイズ範囲又は顕微鏡ステージ上の配置に関連する情報を、潜在的な候補画像の数を削減又は低減するために使用することができる。これにより、例えば、特に限定されないが、取得速度、解像度設定値、信号対ノイズ比、忠実度、特定性又はそれらの組合せなど多くの分野でプロセスを改善する結果をもたらすことができる。
【００４３】
円形ウェルを有するマイクロプレートと同様に、矩形ウェルを有するマイクロプレートもまた解析することができ、内側及び外側境界を識別することが可能である。円形ウェルと異なり、境界は、より矩形状であるため、直線の集合として検出し得る。
【００４４】
一実施形態では、画像内の直線を検出するためにハフ変換を使用することができる。直交する直線が連結されて、四角形、即ち潜在的なウェル壁境界を形成する。四角形の内側及び外側の区域が解析し得る。内側と外側の領域の差を最大化する四角形がウェル境界として選択し得る。次いで、円形ウェル壁に使用されたのと同様のトレース手順を使用して、ウェル壁の厚さを推定することができる。
【００４５】
別の実施形態では、直線が画像の一端に置かれ、この直線が画像の中心に向かって内方へ漸進的に移動させられる。両側のテクスチャ特徴が解析され、線の両側の間の最大の差の点が注目される。この点で、ウェル壁がわずかに回転されている可能性に対処するために、線が、＋３０度〜−３０度の範囲内で回転させられる。同様の手順が、画像の他の３つの辺について繰り返される。画像の１辺又は２辺からの線は、両側のテクスチャの差が大きくない場合は、棄却し得る。これは、画像がウェルの一部を含んでいるだけで、ウェル壁の内側が、画像の辺に接触していることを示している。そして、許容された線は、ウェルの辺とみなされる。
【００４６】
背景強度はウェルの内側と外側の間でたいてい変わるので、更に別の実施形態では、画像の初期平滑化の後に、局所近傍で強度特徴を使用し画像内のすべての画素をクラスタリングすることができる。クラスタの数を３と５の間に設定することにより、ウェルの外側が、画像の端に最も近いクラスタ領域として選択し得る。次いで、この領域の内部からウェル境界を得ることができる。
【００４７】
矩形壁検出のためのすべての実施形態において、円形ウェル壁に使用されたのと同様のトレース手順を使用して、ウェル壁の厚さを推定することができる。
【００４８】
本発明は、その趣旨又は本質的特徴から逸脱することなく他の具体的形態で実施することができる。したがって、以上の実施形態は、本明細書に記載の発明を限定するものではなく、あらゆる点で例示とみなされるべきである。よって、本発明の範囲は、以上の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示されており、したがって、特許請求の範囲の均等物の意義及び範囲に含まれるすべての変更は、特許請求の範囲に包含されるものとする。
【符号の説明】
【００４９】
Ａ  画像の取得及び処理
Ｂ  特徴の検出及び抽出
Ｃ  候補エッジ画像を生成する
Ｄ  外周境界が計算される
Ｅ  内周境界が計算される
Ｆ  マイクロプレート上への空間領域マッピング
【図１】
0005920994.tif 000006
【図２】
0005920994.tif 000007
【図３】
0005920994.tif 000008
【図４】
0005920994.tif 000009
【図５】
0005920994.tif 000010