(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）を予測、診断、または監視するためのデータを取得する方法であって、
該対象から得た生物学的なサンプルにおいて配列番号１９のアミノ酸配列からなるＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルを測定すること、および、該サンプルの該ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のレベルを、ＡＣＤを有さないコントロール対象のＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルと比較することを含み、
該コントロール対象のレベルよりも高いＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）測定レベルはＡＣＤを示す、方法。
【請求項２】
対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）の処置に対する反応を監視するためのデータを取得する方法であって、
該対象から得た生物学的なサンプルにおいて配列番号１９のアミノ酸配列からなるＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルを測定すること、および、該サンプルの該ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のレベルを、処置後の同じ対象から得られた別のサンプルのＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルと比較することを含み、
該測定したサンプルのＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）測定レベルの変化は、該処置に対する反応を示す、方法。
【請求項３】
前記ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルが、前記ＡＣＤの開始の最初の２時間以内、または、前記ＡＣＤによる臨床提示の最初の２時間以内に測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルの反復測定が行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルにおける、２０から３００ｐｍｏｌ／Ｌ、２５から２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、３０から１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、３５から１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、４０から１２０ｐｍｏｌ／Ｌ、４０から９０ｐｍｏｌ／Ｌ、又は４５から８０ｐｍｏｌ／Ｌのいずれかの範囲のＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルは、前記ＡＣＤを示す、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記コントロール対象のレベルまたは処置後の同じ対象から得られた別のサンプルのレベルよりも４から１０倍高い、前記サンプルのＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルは、前記ＡＣＤを示す、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＣＤが、急性冠状動脈症候群、心虚血症、急性心臓傷害、急性薬物中毒による急性心臓損傷、および急性心筋症からなる群より選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記急性冠状動脈症候群が、心電図（ＥＣＧ）記録においてＳＴ上昇を伴う急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、不安定狭心症、および、非ＳＴ上昇ＭＩから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的なサンプルが、血液、血漿、血清、唾液、間質液、尿、または心臓組織サンプルである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定工程が、ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）と、ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）に選択的に結合する抗体またはその抗体の抗原認識領域を含む断片との間の結合を検出することを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、またはヒト化抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体またはその断片が、モノクロナール抗体またはその断片である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体またはその断片が、固相の上に固定されている、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のレベルが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光アッセイから選ばれるアッセイを用いて測定される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のレベルが、質量分析を用いて測定される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記質量分析が、表面強調レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、またはフーリエ変換イオンサイクロトン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＣＤの、一つ以上の非ＢＮＰ−ＳＰマーカーのレベルを測定することをさらに含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記非ＢＮＰ−ＳＰマーカーが、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびＨ−ＦＡＢＰからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１９のアミノ酸配列からなるＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のためのアッセイであって、
イムノアッセイまたは質量分析を用いてサンプルにおけるＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のレベルを検出し、測定することを含む、アッセイ。
【請求項２０】
ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のレベルが、表面強調レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、およびフーリエ変換イオンサイクロトン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ）から選択される質量分析を用いて測定される、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のレベルが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光アッセイから選ばれるイムノアッセイを用いて測定される、請求項１９に記載のアッセイ。
【請求項２２】
前記測定が、基質に付着するＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）抗体を含むＳＥＬＤＩプローブを提供すること、該抗体を前記生物学的なサンプルに接触させること、および、ＳＥＬＤＩを用いて結合したＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のレベルを測定することを含む、請求項２０に記載のアッセイ。
【請求項２３】
０．１から５００ｐｍｏｌ／Ｌ、１から４００ｐｍｏｌ／Ｌ、１０から３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、２０から３００ｐｍｏｌ／Ｌ、２５から２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、３０から１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、３５から１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、または４０から１２０ｐｍｏｌ／Ｌのいずれかの範囲のＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルを測定するように較正される、
請求項１９から２２のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項２４】
ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）のコントロールレベルよりも４から１０倍高い範囲のＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルを測定するように較正される、
請求項１９から２３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項２５】
配列番号１９のアミノ酸配列からなるＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）、またはその抗原性断片または変異体に選択的に結合する、ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）抗体またはその抗体の抗原認識領域を含む断片。
【請求項２６】
検出可能マーカーをさらに含む、請求項２５に記載のＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）抗体またはその抗体の抗原認識領域を含む断片。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載のＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）抗体またはその抗体の抗原認識領域を含む断片を含む、急性心臓障害（ＡＣＤ）を予測、診断、または監視するためのキットであって、該キットは、前記ＡＣＤの開始の２時間以内、または前記ＡＣＤによる臨床提示の２時間以内に対象から得られる生物学的なサンプルとともに使用される、キット。
【請求項２８】
請求項２５または２６に記載のＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）抗体またはその抗体の抗原認識領域を含む断片を含む、急性心臓障害（ＡＣＤ）を予測、診断、または監視するためのキットであって、０．１から５００ｐｍｏｌ／Ｌ、１から４００ｐｍｏｌ／Ｌ、１０から３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、２０から３００ｐｍｏｌ／Ｌ、２５から２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、３０から１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、３５から１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、または４０から１２０ｐｍｏｌ／Ｌのいずれかの範囲の、配列番号１９のアミノ酸配列からなるＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）レベルを測定するように較正する手段を含む、キット。
【請求項２９】
前記抗体またはその抗体の抗原認識領域を含む断片が固定される固相をさらに含む、請求項２７または２８に記載のキット。
【請求項３０】
被験体における、急性心臓障害（ＡＣＤ）を予測、診断、または監視するための指示をさらに含む、請求項２７から２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
配列番号１９によって定義されるＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＮＰシグナルペプチド（ＢＮＰ−ＳＰ）、および、循環中にバイオマーカーの放出をもたらす、急性冠状動脈症候群を含む急性心臓障害の、対象における予後判定、診断、および監視における該ＢＮＰ−ＳＰの使用に関する。さらに詳細には、本発明は、対象における急性心臓障害を予測、診断、または監視する方法であって、その障害の開始後間もなく、またはその障害の臨床的な提示時に採取されたサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定することによって実行する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）を含む、急性心臓障害は、不安定狭心症から急性心筋梗塞（ＡＭＩ）に亘る、広範囲の心臓虚血性事象を含む。ＡＭＩは、これらの事象の中でももっとも重大なものとして現れ、したがって、速やかで、正確な診断を必要とする。記載の特徴（虚血性胸部不快の既往歴、連続心電図（ＥＣＧ）記録における進行性変化、および、血漿における心臓バイオマーカーの上昇および下降）の内の二つ以上を提示する患者は、ＡＭＩを罹患するものとはっきりと特定される。１しかしながら、擬似ＡＭＩを提示する患者の相当の割合（４０％−５０％）が、典型的症状である、ＥＣＧ上の連続変化を示さない。このため、正確な診断のために、大きな重点が、循環性バイオマーカー濃度に対して置かれている。２−４
心筋梗塞の、正確な早期診断は、再還流処置、例えば、効果的で、経皮的な、または血栓分解性の血流再開、および補助的な、抗凝固および抗血小板治療を含む処置の、すみやかな導入を促進する。このような処置は、診断および管理における遅延の時間毎に、死亡率および罹患率低減効果を漸次減少させる。２−４この臨床状況において最終的判断の加速が要求されるのであるから、急性心臓障害、特にＡＭＩの、早期で、特異的診断を実現する、循環性バイオマーカーの特定については相当の関心がある。
【０００３】
従来、この目的のためにいくつかのバイオマーカー、例えば、クレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、トロポニンＴ（ＴｎＴ）、トロポニンＩ（ＴｎＩ）、およびミオグロビンなどが提案されているが、これらの使用には限界がある。心臓バイオマーカー血漿レベルの、検出可能な、または異常な上昇が起こるまでの時間は、６時間（ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ）から１２時間（ＴｎＴ、ＴｎＩ）であり、ピークレベルは、障害の開始から２４−４８時間後になって初めて起こる。これは、正確な診断および処置に対し、ある遅延枠を課す。１−４さらに、ミオグロビンおよびＣＫ−ＭＢは共に非特異的であり、心臓以外の起源から、特に、外傷または手術時分泌される可能性がある。１この目的のために有用な他のバイオマーカーとして、ＢＮＰ（ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ  １０３−１３４）、およびＮ−ＢＮＰ（ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（２７−１３４）、別にＮＴ−ｐｒｏＢＮＰとも呼ばれる（図１参照）がある。両ペプチドとも循環の中に分泌される。
【０００４】
ＡＭＩ発生後早期における、ＢＮＰおよびＮ−ＢＮＰ血漿濃度の測定は、強力な予後判定価値を有し２，６，７、治療処方の中にこれらのペプチドの血漿濃度を組み込むことによって、心不全患者の臨床結果の著明な改善を実現することが可能である。８これは特に、ＢＮＰよりもほぼ１４倍も長い半減期を持ち５、したがって、ＡＭＩ後の、長期の心臓機能に関してさらに余分の重要情報を提供するＮ−ＢＮＰについて当てはまる。
【０００５】
前述の心臓バイオマーカー同様、ＢＮＰおよびＮ−ＢＮＰも、障害の開始後６から１２時間は、検出可能な、または異常なレベルに達せず、ピークレベルは、開始後２４から４８時間まで出現しないことがある。したがって、ＢＮＰおよびＮ−ＢＮＰの、長期の診断／予後判定能力は、急性心臓外傷などの急性心臓障害について、臨床兆候の最初の数時間内に、早期の、特異的診断を提供するという付帯的能力には欠ける。したがって、このような早期マーカーが求められている。
【０００６】
比較的最近、ＢＮＰ−ＳＰが、心臓病の診断に有用である可能性が示唆されている（米国特許出願公開第２００５／０２４４９０４号、特許文献１）。概して、ＢＮＰ−ＳＰのレベルは、正常患者よりも心不全患者においてより高いことが示されている。ＢＮＰ−ＳＰレベルを測定すべき時点に関する経時情報は与えられていない。ＢＮＰ−ＳＰレベルは、Ｎ−ＢＮＰと共同して上昇することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０５／０５２５９３号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
急性心臓障害の早期マーカーに対する要求の実現へ向けて少しでも歩を進めること、および／または、少なくとも公衆に有用な一選択肢を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
ヒトのＢ型ナトリウム利尿シグナルペプチド（ＢＮＰ−ＳＰ）、またはｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（１−２６）は、ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（１−１３４）配列番号１から切り離される２６アミノ酸ペプチドである。ＢＮＰ−ＳＰは、別に配列番号２１に示される。
【００１０】
本出願人らは、急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）が疑われる臨床症状の開始後最初の数時間に、または提示時に、ＢＮＰ−ＳＰの循環濃度が最高になるという驚くべき発見をした。この最初の数時間において、ピークは、正常なコントロール集団よりも４から１０倍、通常、５から８倍のオーダーで高くなる。
【００１１】
したがって、第１局面において、本発明は、対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）を予測、診断、または監視する方法であって：
ＡＣＤの開始の２時間以内、または、ＡＣＤの提示の２時間以内に該対象から得た生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定すること；および、前記ＢＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールのＢＮＰ−ＳＰレベルと比較することを含み、コントロールレベルよりも高いＢＮＰ−ＳＰ測定レベルはＡＣＤを示す、方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）の処置に対する反応を監視する方法であって、ＡＣＤの開始の２時間以内、または、ＡＣＤの提示の２時間以内に該対象から得た生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定すること；および、前記ＢＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールのＢＮＰ−ＳＰレベルと比較することを含み、コントロールレベルに対するＢＮＰ−ＳＰ測定レベルの変化は、処置に対する反応を示す、方法を提供する。
【００１３】
別の局面では、本発明はさらに、対象において心臓移植拒絶エピソードを予測、診断、または監視する方法であって、心臓移植後２時間以内に対象から得た生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定すること、および、前記ＢＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールのＢＮＰ−ＳＰレベルと比較することを含み、コントロールレベルよりも高いＢＮＰ−ＳＰ測定レベルは、移植拒絶を示す、方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、対象において肺障害と、急性心臓障害（ＡＣＤ）とを区別する方法であって、該障害による提示の２時間以内に対象から得た生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定すること；および、前記ＢＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールのＢＮＰ−ＳＰレベルと比較することを含み、コントロールレベルよりも高いＢＮＰ−ＳＰ測定レベルはＡＣＤを示す、方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測、診断、または監視する方法であって、ＡＣＤ、心臓移植拒絶もしくはＡＣＤ／肺障害の開始、または提示後の最初の２時間以内に該対象から得た生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定することを含む方法を提供する。
【００１６】
好ましくは、ＢＮＰ−ＳＰの測定レベルは、コントロールのＢＮＰ−ＳＰレベルと比較され、コントロールレベルよりも高い、ＢＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤまたは心臓移植拒絶を示す。
【００１７】
本発明の方法は、インビトロ法であることが好ましい。
【００１８】
一実施態様では、ＢＮＰ−ＳＰレベルの測定は、開始または提示の１時間以内、好ましくは３０分以内に行われる。
【００１９】
生物学的なサンプルは、血液、唾液、腸液、血漿、尿、血清、または心臓組織であることが好ましい。
【００２０】
一実施態様では、測定工程は、ＢＮＰ−ＳＰと、ＢＮＰ−ＳＰに選択的に結合する結合因子の間の結合を検出することを含む。この結合因子は、抗体、または抗体断片であることが好ましい。もっとも一般的には、抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、またはヒト化抗体である。モノクロナール抗体が好ましい。
【００２１】
別の実施態様では、ＢＮＰ−ＳＰレベルは、質量分析を用いて測定される。
【００２２】
抗体によって選択的に結合されるＢＮＰ−ＳＰは、ヒトの、完全長ＢＮＰ−ＳＰ分子（配列番号２１）、または、その抗原性変異体または断片である。断片は、少なくとも５アミノ酸長であることが好ましい。抗体は、ＢＮＰ−ＳＰのＮ−末端またはＣ−末端に結合することが望ましい。
【００２３】
結合因子が、選択的に結合する特異的抗原性ペプチドとしては、ヒトのＢＮＰ−ＳＰ（１−１０）（配列番号１３）、ＢＮＰ−ＳＰ（１−１７）（配列番号１５）、ＢＮＰ−ＳＰ（３−１５）（配列番号２３）、ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）（配列番号１９）、ＢＮＰ−ＳＰ（１２−２３）（配列番号１７）、およびＢＮＰ−ＳＰ（１−２６）（配列番号２１）、またはその変異体が挙げられる。
【００２４】
ＢＮＰ−ＳＰの結合は、固相支持体に固定される抗体、または抗体断片を用いて測定することが好ましい。
【００２５】
ＢＮＰ−ＳＰのレベルは、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫アッセイ、免疫蛍光アッセイ、質量分析、および免疫放射測定アッセイから選ばれるアッセイによって測定するのが有用である。
【００２６】
したがって、本発明はさらに、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、または、ＡＣＤ／肺障害の開始から２時間以内、またはその提示の２時間以内に対象から得た生物学的なサンプルにおけるＢＮＰ−ＳＰのためのアッセイであって、任意の公知の方法を用いて、該サンプルにおけるＢＮＰ−ＳＰのレベルを検出し、測定することを含むアッセイを提供する。
【００２７】
アッセイは、インビトロアッセイであることが好ましい。
【００２８】
本発明の方法はさらに、前記ＡＣＤ、または心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の、一つ以上の、非ＢＮＰ−ＳＰマーカーのレベルを測定すること、および、該レベルを、コントロールのマーカーレベルと比較することを含んでもよく、その場合、該測定レベルの、非ＢＮＰ−ＳＰマーカーのコントロールレベルからの偏差は、ＢＮＰ−ＳＰのコントロールレベルよりも高いＢＮＰ−ＳＰの測定レベルと組み合わせて、ＡＣＤの予測または診断を実行するか、または、前記ＡＣＤ、心臓移植拒絶もしくはＡＣＤ／肺障害の監視のために使用することが可能である。
【００２９】
急性冠状動脈症候群の関連を意図して使用されるマーカーとしては、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、および心臓特異的脂肪酸結合タンパク（Ｈ−ＦＡＢＰ）が挙げられる。
【００３０】
別局面において、本発明はさらに、対象における急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の予測、診断、または監視に使用される、ＢＮＰ−ＳＰ、またはその抗原性断片または変異体に選択的に結合する、ＢＮＰ−ＳＰ結合因子であって、該急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害においては、該急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の開始の２時間以内、またはその提示の２時間以内に該対象から得られる生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰが出現することを特徴とする、ＢＮＰ−ＳＰ結合因子を提供する。
【００３１】
一実施態様では、結合因子は、抗体またはその断片であることが好ましい。
【００３２】
別実施態様では、結合因子は、ＢＮＰ−ＳＰに結合することが可能な、任意の固体または非固体物質である。
【００３３】
さらに本発明の主題とするものは、対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を評価するための、予後判定、診断、または監視ツールの製造におけるＢＮＰ−ＳＰ結合因子の使用であって、該急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の開始の２時間以内、またはその提示の２時間以内に評価を実行する、使用である。
【００３４】
本発明はさらに、予後判定、診断、または監視ツールが、０．１から５００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１から４００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０から３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２０から３００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２５から２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３０から１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３５から１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、および好ましくは４０から１２０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲のＢＮＰ−ＳＰレベルを測定するように較正される、本発明の使用に関する。
【００３５】
別局面では、本発明は、急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測、診断、または監視するための、本発明のＢＮＰ−ＳＰ結合因子を含むキットであって、急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の開始後、またはその提示の２時間以内に対象から得られる生物学的なサンプルとともに使用されるキットを提供する。
【００３６】
本発明はさらに、急性心臓障害（ＡＣＤ）を予測、診断、または監視するための、本発明のＢＮＰ−ＳＰ結合因子を含むキットであって、０．１から５００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１から４００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０から３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２０から３００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２５から２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３０から１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３５から１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、および好ましくは４０から１２０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲のＢＮＰ−ＳＰレベルを測定するように較正されるキットを提供する。
【００３７】
好ましくは、キットはさらに、急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害について、その開始後、または提示の２時間以内に取得された生物学的なサンプルにおいて測定されたＢＮＰ−ＳＰレベルから、開始後、または提示の２時間以内の対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測、診断、または監視するための指示を含む。
【００３８】
別局面では、本発明は、本発明のＢＮＰ−ＳＰをコードする核酸分子であって、
（ａ）配列番号１４；
（ｂ）配列番号１６；
（ｃ）配列番号１８；
（ｄ）配列番号２０；
（ｅ）（ａ）から（ｄ）のいずれか一つの相補体；
（ｆ）配列が、ｃｃａｇｔｇｃａｃａａｇｃｔｇｃｔｔｇｇｇｇａｇｇｃｇａｇａか、または配列番号２２ではない限りにおいて、ストリンジェントな条件下に、（ａ）から（ｅ）のいずれか一つの配列にハイブリダイズすることが可能な、少なくとも１５ヌクレオチド長の配列、
から選ばれる核酸分子に関する。
【００３９】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含む遺伝子構築体、該遺伝子構築体を含むベクター、該遺伝子構築体またはベクターを含む宿主細胞、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチド、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体、および、本発明のポリペプチドを組み換え的に生産するための方法を提供する。
【００４０】
したがって、別局面において、本発明は、
（ａ）配列番号１３；
（ｂ）配列番号１５；
（ｃ）配列番号１７；および、
（ｄ）配列番号１９；
から選ばれる、単離ＢＮＰ−ＳＰポリペプチドを提供する。
【００４１】
次に、付属の図面の画像を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】遊離シグナル、Ｎ−ＢＮＰ、およびＢＮＰペプチドの生成をもたらす、ヒトｐｒｅｐｒｏＢＮＰの処理過程を概観する模式図である。
【図２Ａ】７種の動物種におけるｐｒｅｐｒｏＢＮＰ配列の、１文字略号表示式である。シグナルペプチド領域は、ボールド体で下線を施す。
【図２Ｂ】ｐｒｅｐｒｏＢＮＰシグナルペプチド配列の、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．８３  ＪＡＬＶＩＥＷ複数配列整列である。この整列では、下記のようにＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのデフォールトパラメータを用いた：ＤＮＡ  Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  １５．０；ＤＮＡ  Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ６．６６；ＤＮＡ  ｍａｔｒｉｘ  ＝  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  １０．０；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ０．２；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  ＝  Ｇｏｎｎｅｔ；Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ  ＝  −１；Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ  ＝  ４．アミノ酸は、ピアソン（ｆａｓｔａ）方式で処理した。９
【図３】ＢＮＰ−ＳＰ標準曲線（黒丸）と平行な、ヒトの血漿抽出物（白四角）希釈物に関するラジオイムノアッセイの結果を示す。
【図４】健康なヒトにおけるＢＮＰ−ＳＰの血漿濃度は、年齢とまったく相関を示さないことを実証するラジオイムノアッセイ結果である。
【図５】健康な正常ヒト（ｎ＝１３）のＢＮＰおよびＮ−ＢＮＰの血漿レベルは、緊密な相関を示すが（左パネル）、ＢＮＰ−ＳＰ濃度は、Ｎ−ＢＮＰと相関しない（右パネル）ことを実証するラジオイムノアッセイの結果である。
【図６】ヒト血漿におけるＢＮＰ−ＳＰの、ラジオイムノアッセイＳＥＨＰＬＣ（上段パネル）およびＲＰＨＰＬＣ（下段パネル）の結果であり、後者は、ＢＮＰ−ＳＰが、合成ＢＮＰ−ＳＰの近傍に溶出することを示唆する（下向き矢印、下段パネル）。
【図７】ラジオイムノアッセイ結果。上段：図示の入院後時点においてＡＭＩ患者（ｎ＝１０）から採取された血漿におけるＢＮＰ−ＳＰ（白六角）、ＢＮＰ（黒丸）、およびＮ−ＢＮＰ（白四角）の濃度。入院後２４時間でピークを示すＢＮＰおよびＮ−ＢＮＰレベルとは対照的に、ＢＮＰ−ＳＰレベルの最高レベルは、入院時に見られ、平均して、健康な正常個人において測定されたレベル（白丸）よりもほぼ７倍高かった。下段パネル：上段と同じ患者における、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、およびＴｎＴの、比較対照的、経時濃度プロフィール。
【図８】ＢＮＰ−ＳＰ抗血清の交差反応データの表を示す。
【図９】患者におけるＢＮＰ−ＳＰの循環濃度は、心臓起源のものであることを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
定義
急性心臓障害（ＡＣＤ）としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、急性冠状動脈症候群：ＥＣＧ記録においてＳＴ上昇を伴う（ＡＭＩ）、不安定狭心症、および、急性、非ＳＴ上昇ＭＩ；心虚血症；急性心臓傷害；急性薬物中毒による急性心臓損傷、急性心筋症、および心臓移植拒絶が挙げられる。これらの障害の、完全な記述的定義は、文献１の中に見出される。
【００４４】
ＡＣＤ／肺障害とは、診断が確定されないか、または疑われるＡＣＤまたは肺障害を有する対象を指す。
【００４５】
急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）は、広汎な心虚血事象、例えば、不安定狭心症、心電図記録（ＥＣＧ）においてＳＴ上昇を伴う急性心筋梗塞、不安定狭心症、および、ＥＣＧにおいてＳＴセグメントの上昇を伴わない急性心筋梗塞などの事象を含む。
【００４６】
「抗体」という用語は、該抗体を合成するために使用される抗原、またはそれと近縁の抗原を含む分子に対し特異的相互作用を有する（結合する）特異的構造を有する免疫グロブリン分子を指す。抗体が、本発明のＢＮＰ−ＳＰポリペプチドに対し選択的または特異的に結合するとは、該抗体が、該ＢＮＰ−ＳＰに対し優先的に結合する場合、例えば、非ＢＮＰ−ＳＰポリペプチドに対しては、例えば、２５％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは１％未満の交差反応性しか持たない場合である。通常、抗体は、抗原に対し、１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、好ましくは１０−９Ｍ以下の結合アフィニティー（解離定数（Ｋｄ）値）を有する。結合アフィニティーは、表面プラズモン共鳴を用いて評価してもよい。
【００４７】
本明細書で用いる生物学的なサンプルとは、スクリーニングされる対象から得られる任意のサンプルを意味する。このサンプルは、ＢＮＰ−ＳＰが検出可能であれば、当該技術分野で既知のいずれのサンプルであってもよい。含まれるものは、いずれの体液であってもよく、例えば、血漿、血液、唾液、腸液、血清、尿、滑液、脳脊髄液、リンパ、精液、羊水、心膜液、および腹水の外、組織、例えば、ただし限定されないが、心臓組織がある。さらに含まれるものは、急性心臓傷害の既往歴を持たない、健康な正常対象からのサンプルがある。
【００４８】
ＢＮＰ−ＳＰという用語は、ヒトのｐｒｅｐｒｏＢＮＰ配列の、完全な２６アミノ酸ＢＮＰシグナルペプチド（配列番号１）を指す。ＢＮＰ−ＳＰは、別に、配列番号２１に示される。用語ＢＮＰ−ＳＰにさらに含まれるものは、ＢＮＰ−ＳＰの変異体または断片である。
【００４９】
本明細書および特許請求項において使用される「含む（形容詞）」という用語は、「少なくとも部分的に．．．から成る」ことを意味する。すなわち、本明細書および特許請求項において、「含む」を含む文章を解釈する場合、各文章においてこの用語によって先行される特徴は全て存在する必要があるが、他の特徴も存在する可能性がある。「含む（動詞）」および「構成される」などの関連用語も同様に解釈しなければならない。
【００５０】
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド（単数または複数）」は、任意の長さの、１本鎖または２本鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、非限定的例として、遺伝子のコードおよび非コード配列、センスおよびアンチセンス配列、エキソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組み換えポリヌクレオチド、単離および精製された天然ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマー、断片、遺伝子構築体、ベクター、および修飾ポリヌクレオチドが挙げられる。核酸分子に対する参照も同様に理解しなければならない。
【００５１】
本発明において提供されるポリヌクレオチドの「断片」とは、対象標的、例えば、少なくとも１０ヌクレオチド長の配列に対し、特異的にハイブリダイズすることが可能な、連続ヌクレオチドのサブ配列である。本発明の断片は、配列番号２２のポリヌクレオチドの内、１０ヌクレオチド、好ましくは１５ヌクレオチド、好ましくは１６、好ましくは１７、好ましくは１８、好ましくは１９、好ましくは２１、好ましくは２２、好ましくは２３、好ましくは２４、好ましくは２５、好ましくは２６、好ましくは２７、好ましくは２８、好ましくは２９、好ましくは３０、好ましくは３１、好ましくは３２、好ましくは３３、好ましくは３４、好ましくは３５、好ましくは３６、好ましくは３７、好ましくは３８、好ましくは３９、好ましくは４０、好ましくは４１、好ましくは４２、好ましくは４３、好ましくは４４、好ましくは４５、好ましくは４６、好ましくは４７、好ましくは４８、好ましくは４９、好ましくは５０、好ましくは５１、好ましくは５２、好ましくは５３、好ましくは５４、好ましくは５５、好ましくは５６、好ましくは５７、好ましくは５８、好ましくは５９、好ましくは６０、好ましくは６１、好ましくは６２、好ましくは６３、好ましくは６４、好ましくは６５、好ましくは６６、好ましくは６７、好ましくは６８、好ましくは６９、好ましくは７０、好ましくは７１、好ましくは７２、好ましくは７３、好ましくは７４、好ましくは７５、好ましくは７６、好ましくは７７個の連続ヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドの断片は、マイクロアレイに含まれるプライマー、プローブとして、または、本明細書に記載される、ポリヌクレオチド使用の選択法において使用することが可能である。
【００５２】
「プライマー」という用語は、短いポリヌクレオチドであって、鋳型にハイブリダイズする、遊離３’ＯＨ基を有し、標的に対して相補的なポリヌクレオチドの重合を提供するために使用されるポリヌクレオチドを指す。
【００５３】
「プローブ」という用語は、短いポリヌクレオチドであって、ハイブリダイゼーション依存アッセイにおいて、該プローブに対して相補的なポリヌクレオチド配列を検出するために使用されるポリヌクレオチドを指す。このプローブは、本明細書において定義されるポリヌクレオチドの「断片」から成ってもよい。
【００５４】
本明細書で用いる「ポリペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸さを含むが、しかし、アミノ酸残基が共有ペプチド結合で連結される、完全長ＢＮＡ−ＳＰタンパク（配列番号２１）の内の、好ましくは少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも６、好ましくは少なくとも７、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも９、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１１、好ましくは少なくとも１２、好ましくは少なくとも１３、好ましくは少なくとも１４、好ましくは少なくとも１５、好ましくは少なくとも１６、好ましくは少なくとも１７、好ましくは少なくとも１８、好ましくは少なくとも１９、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも２１、好ましくは少なくとも２２、好ましくは少なくとも２３、好ましくは少なくとも２４、好ましくは少なくとも２５、好ましくは少なくとも２６を含む。本発明において有用なポリペプチドは、精製天然産物であってもよく、または、組み換えまたは合成技術によって部分的または全体的に生産されてもよい。本用語は、ポリペプチド、ポリペプチドの凝集体、例えば、ダイマーまたは他のマルチマー、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、または、その誘導体を指してもよい。
【００５５】
あるポリペプチドの「断片」とは、該ポリペプチドのサブ配列であって、該ポリペプチドの生物活性または結合のために必要な機能を実行する、および／または、その３次元構造を与える、サブ配列である。本用語は、前記シグナルペプチド活性を実行することが可能な、ポリペプチド、ポリペプチドの凝集体、例えば、ダイマーまたは他のマルチマー、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、または、その誘導体を指してもよい。
【００５６】
本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される「単離」という用語は、その天然の細胞環境から取り出された配列を指すために使用される。単離分子は、任意の方法で、または、生化学、組み換え、および合成技術を含む諸方法の任意の組み合わせによって取得してもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、少なくとも一つの精製工程によって調製することが可能である。
【００５７】
「組み換え」という用語は、ポリヌクレオチド配列であって、その天然環境においてそれを取り巻く配列達から取り出される、および／または、その天然環境には存在しない配列達と組み換えられるポリヌクレオチド配列を指す。
【００５８】
「組み換え」ポリペプチド配列は、「組み換え」ポリヌクレオチド配列から翻訳によって生産される。
【００５９】
本明細書で用いる「変異体」という用語は、特に指定される配列とは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列であって、一つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、欠失、置換、または付加されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。変異体は、天然の対立遺伝子変異体か、または非天然変異体であってもよい。変異体は、同じか、または異なる動物種由来のものであってもよく、ホモローグ、パラローグ、およびオルソローグを含んでもよい。ある実施態様では、本発明において有用なポリペプチドの変異体は、親ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのものと同一か、または同様の生物活性を示す。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対する「変異体」という用語は、本明細書に定義される全ての形態のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを包含する。
【００６０】
変異ポリヌクレオチド配列は、本発明の配列に対し、少なくとも５０％、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。本発明のポリヌクレオチドに対し、少なくとも１０ヌクレオチド位置、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド位置、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド位置、好ましくは少なくとも２７ヌクレオチド位置、好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド位置、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド位置の比較ウィンドウにおいて、もっとも好ましくはその全長において、同一性が認められる。
【００６１】
ポリヌクレオチド配列の同一性は、候補および対象ポリヌクレオチド配列間の重複の全長に亘って、グローバル配列整列プログラム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）を用いて計算することが可能である。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバル整列プログラムの完全実装は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのｎｅｅｄｌｅプログラムの中に見られる（Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．ＥＭＢＯＳＳ：  Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｊｕｎｅ  ２０００，ｖｏｌ  １６，Ｎｏ  ６．ｐｐ．２７６−２７７）。これは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／から取得することが可能である。このＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサーバーはさらに、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／において、二つの配列の間でＥＭＢＯＳＳ−ｎｅｅｄｌｅグローバル整列を実行するための設備を提供している。
【００６２】
それとは別にＧＡＰプログラムを用いてもよい。これは、末端ギャップにペナルティーを課すことなく、二つの配列の最適グローバル整列を計算する。ＧＡＰは、下記の論文に記載される：Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０，２２７−２３５。
【００６３】
ポリヌクレオチド変異体はさらに、特別に指定した配列の一つ以上に対し、それらの配列の機能的等価性を保存すると見られるほどの類似性を示すが、普通に考えれば、ランダムな偶然では起こり得ないと予測される配列をも包含する。このプログラムは、配列間において類似性領域を見出し、その各類似領域について、固定参照サイズを含むランダム配列のデータベースにおいて偶然にそのようなマッチが現れることが予想される期待数である「Ｅ値」を報告する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムでは、このデータベースのサイズは、デフォールトで設定されている。１よりもはるかに小さい、小Ｅ値の場合、Ｅ値は、ほぼ、そのようなランダムなマッチの確率となる。
【００６４】
変異ポリヌクレオチド配列は、特に指定した配列のいずれか一つと比較した場合、
好ましくは１×１０−５、より好ましくは１×１０−６、さらに好ましくは１×１０−９、さらに好ましくは１×１０−１２、さらに好ましくは１×１０−１５、さらに好ましくは１×１０−１８、もっとも好ましくは１×１０−２１未満のＥ値を示す。
【００６５】
本発明によるポリヌクレオチド変異体に対する配列同一性の決定には、ＢＬＡＳＴＮの使用が好ましい。
【００６６】
ポリヌクレオチド配列同士の同一性は、下記のＵＮＩＸ（登録商標）コマンドラインパラメータを用いて調べることが可能である：
ｂｌ２ｓｅｑ−ｉ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１−ｊ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２−ＦＦ−ｐ  ｂｌａｓｔｎ
パラメータ−ＦＦは、低複雑度セクションのフィルタリングをスイッチオフする。パラメータ−ｐは、この配列ペアのために適切なアルゴリスムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、配列同一性を、“Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝”の行の中に、同一ヌクレオチドの数およびパーセントとして報告する。
【００６７】
ポリヌクレオチド配列の同一性および類似性はさらに、下記のようにして決定することも可能である。対象ポリヌクレオチド配列を、候補ポリヌクレオチド配列と比較する場合、配列整列アルゴリスム、および配列類似性探索ツール、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ、およびその他のデータベースに用意されているものなどが用いられる。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：１−１０および１１−１６，２００１は、オンラインリソースの例を提供する。ＢＬＡＳＴＮ（ＢＬＡＳＴ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．１３  Ｍａｒｃｈ  ２００７  ｉｎ  ｂｌ２ｓｅｑ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９），Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９−３４０２（１９９７））は、ＮＣＢＩから一般的に（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）、またはＮＣＢＩ  ａｔ  Ｂｅｓｔｈｅｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡから取得することが可能である。低複雑度部分のフィルタリングをスイッチオフしなければならない場合を除き、ｂｌ２ｓｅｑのデフォールトパラメータが利用される。
【００６８】
それとは別に、変異ポリペプチドは、該指定のポリヌクレオチド配列、またはその相補体に対し、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする。
【００６９】
「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする」という用語、および、それと文法的に等価な表現は、温度および塩濃度の定められた条件において、標的ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡブロット、例えば、サザーンブロットまたはノーザンブロットにおいて固定される標的ポリヌクレオチド分子）に対し、あるポリヌクレオチド分子がハイブリダイズする能力を指す。ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする能力は、比較的厳格でない条件下で先ずハイブリダイズさせ、次いで、厳格度を所望の厳格度に増大させることによって定量することが可能である。
【００７０】
約１００塩基長を超えるポリヌクレオチド分子に関しては、典型的に厳格なハイブリダイゼーション条件は、天然の２本鎖の融解温度（Ｔｍ）よりも２５から３０℃未満（例えば、１０℃）低い（一般的案内として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，１９８７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい、なお、参照によりこれらを本明細書に含める）。約１００塩基よりも大きいポリヌクレオチド分子のＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ＋）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，１９８７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ，１９６２，ＰＮＡＳ  ８４：１３９０）によって計算することが可能である。１００塩基長を超えるポリヌクレオチドの典型的ストリンジェントな条件は、例えば、６Ｘ  ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳの溶液におけるプレ洗浄；６５℃、６Ｘ  ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳにおいて一晩ハイブリダイゼーション；次いで、６５℃において、それぞれ１Ｘ  ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにおいて３０分の、２回の洗浄；６５℃において、それぞれ０．２Ｘ  ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにおいて３０分の、２回の洗浄のハイブリダイゼーション条件と考えられる。
【００７１】
一実施態様では、ストリンジェントな条件は、４２℃における、５０％フォルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト液、超音波処理サケ精液ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランに、４２℃で０．２ｘＳＳＣ、５５℃で５０％フォルムアミドによる洗浄を加え、次いで、５５℃において、ＥＤＴＡ含有０．１ｘＳＳＣを含む洗浄を使用する。
【００７２】
１００塩基よりも低い長さを持つポリヌクレオチド分子に関しては、例示の厳格ハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍの下５から１０℃である。平均して、１００ｂｐ未満の長さを持つポリヌクレオチド分子のＴｍは、ほぼ、（５００／オリゴヌクレオチド長）℃だけ下がる。
【００７３】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９１  Ｄｅｃ  ６；２５４（５０３７）：１４９７−５００）とも呼ばれるＤＮＡ擬似体に関しては、Ｔｍ値は、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのものよりも高く、Ｇｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｎｏｖ  １；２６（２１）：５００４−６に記載される式を用いて計算することが可能である。１００塩基未満の長さを持つＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの、例示のハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍの下５から１０℃である。
【００７４】
変異ポリヌクレオチドはさらに、本発明の配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重のために、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと類似の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変えない配列変化は、「サイレント変動」である。ＡＴＧ（メチオニン）およびＴＧＧ（トリプトファン）を除き、同じアミノ酸に対する他のコドン同士は、例えば、特定の宿主生物におけるコドン発現を最適化するために、当該技術分野で認識済みの技術を用いて変えることが可能である。
【００７５】
コードされるポリペプチド配列において、その生物活性を顕著に変えることなく、一つ、またはいくつかのアミノ酸の保存的置換をもたらす、ポリヌクレオチド配列変化も本発明の中に含まれる。熟練した当業者であれば、表現型としてはサイレントなアミノ酸置換を実行するための方法を承知している（例えば、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１３０６を参照されたい）。
【００７６】
コードされたポリペプチド配列にサイレント変動および保存的置換をもたらすことによって得られる変異ポリヌクレオチドは、前述のようにｔｂｌａｓｔｘアルゴリスムを介してｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用することによって決めることが可能である。
【００７７】
ポリペプチドに関して「変異」という用語はさらに、天然、組み換え、および合成的に生産されるポリペプチドを包含する。変異ポリペプチド配列は、本発明の配列に対し、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。本発明において使用されるポリヌクレオチドに対し、少なくとも５アミノ酸位置、好ましくは少なくとも７アミノ酸位置、好ましくは少なくとも１０アミノ酸位置、好ましくは少なくとも１５アミノ酸位置、好ましくは少なくとも２０アミノ酸位置の比較ウィンドウにおいて、もっとも好ましくはその全長において、同一性が認められる。
【００７８】
ポリペプチド変異体はさらに、特別に指定した配列の一つ以上に対し、それらの配列の機能的等価性を保存すると見られるほどの類似性を示すが、普通に考えれば、ランダムな偶然では起こり得ないと予測される配列をも包含する。
【００７９】
ポリペプチド配列の同一性および類似性は、下記のようにして決定することが可能である。対象ポリペプチド配列を、候補ポリペプチド配列と比較する場合、ＢＬＡＳＴＰが用いられる（ＢＬＡＳＴ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．１４［Ｍａｙ  ２００６］）  ｉｎ  ｂｌ２ｓｅｑ。これは、一般向けに公開されるＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から取得することが可能である。低複雑度領域のフィルタリングをスイッチオフしなければならない場合を除き、ｂｌ２ｓｅｑのデフォールトパラメータが利用される。
【００８０】
ポリペプチド配列同士の同一性は、下記のＵＮＩＸ（登録商標）コマンドラインパラメータを用いて調べることが可能である：
ｂｌ２ｓｅｑ−ｉ  ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ１−ｊ  ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ２−ＦＦ−ｐ  ｂｌａｓｔｐ
変異ポリヌクレオチド配列は、特に指定した配列のいずれか一つと比較した場合、
好ましくは１×１０−５、より好ましくは１×１０−６、さらに好ましくは１×１０−９、さらに好ましくは１×１０−１２、さらに好ましくは１×１０−１５、さらに好ましくは１×１０−１８、もっとも好ましくは１×１０−２１未満のＥ値を示す。
【００８１】
パラメータ−ＦＦは、低複雑度セクションのフィルタリングをスイッチオフする。パラメータ−ｐは、配列ペアのために適切なアルゴリスムを選択する。このプログラムは、配列間において類似性領域を見出し、その各類似領域について、固定参照サイズを含むランダム配列のデータベースにおいて偶然にそのようなマッチが現れることが予想される期待数である「Ｅ値」を報告する。１よりもはるかに小さい、小Ｅ値の場合、Ｅ値は、ほぼ、そのようなランダムなマッチの確率となる。
【００８２】
ポリペプチド配列の同一性は、候補および対象ポリペプチド配列間の重複の全長に亘って、グローバル配列整列プログラムを用いて計算することが可能である。さらに、前述のように、ＥＭＢＯＳＳ−ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／において入手可能）、およびＧＡＰ（Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０，２２７−２３５）も、ポリペプチド配列同一性を計算するのに好適な、グローバル配列整列プログラムである。
【００８３】
本発明によるポリペプチド変異体の決定には、前述のＢＬＡＳＴＰの使用が好ましい。
【００８４】
好ましい変異体としては、ペプチドであって、その配列が、本明細書の、ヒトＢＮＰ−ＳＰ（１−２６）とは、該ペプチドの生物活性に影響を及ぼさない、一つ以上の保存的アミノ酸置換、欠失、付加、または挿入によって異なるペプチドが挙げられる。通常、保存的置換は、一つのアミノ酸の、類似の特徴を持つ別のアミノ酸による置換、例えば、下記の群における置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン類、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン、である。保存的置換の例はさらに、図２Ａおよび２ＢのＢＮＰ−ＳＰの配列の中に見出すことが可能である。これらの図では、ヒトの配列と比べた場合の、様々な哺乳動物種における置換が示される。他の保存的置換として、下記の表１から取り上げることが可能である。
【００８５】
【表１】
0005994121.tif 000002
【００８６】
天然残基は、一般的側鎖特性に基づいていくつかの群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および、
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００８７】
非保存的置換は、これらのクラスの一つにおけるメンバーの、別のクラスのメンバーとの交換を要求する。例えば、ＢＮＰ−ＳＰ２５において、ＲがＨによって置換されるのを参照されたい。
【００８８】
他の変異体として、ペプチドの安定性に影響を及ぼす修飾を有するペプチドが挙げられる。そのような類縁体は、例えば、ペプチド配列の中に、（ペプチド結合を置換する）一つ以上の、非ペプチド結合を含んでもよい。さらに含められるのは、天然のＬアミノ酸以外の残基、例えば、Ｄアミノ酸、または、非天然の、合成アミノ酸、例えば、ベータまたはガンマアミノ酸、および環状類縁体を含む類縁体である。
【００８９】
置換、欠失、付加、または挿入は、当該技術分野で既知の、突然変異誘発法によって実行してもよい。当業者であれば、表現型としてサイレントなアミノ酸置換を実行するための方法を承知している。例えば、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１３０６１０を参照されたい。
【００９０】
さらに本発明のポリペプチドの中に含まれるものは、例えば、ビオチニル化、ベンジル化、グリコシル化、リン酸化、アミド化による合成の際、またはその後、ブロック／保護基などによる誘導体形成によって修飾されるものである。このような修飾は、ポリペプチドの安定性または活性を増してもよい。
【００９１】
「遺伝子構築体」という用語は、通常２本鎖ＤＮＡであるポリヌクレオチド分子であって、その中に、別のポリヌクレオチド分子（挿入ポリヌクレオチド分子）、例えば、ただしこれに限定されないが、ｃＤＮＡ分子を挿入させる場合のあるポリヌクレオチド分子を指す。遺伝子構築体は、この挿入ポリヌクレオチド分子の転写、かつ、必要に応じて、転写物のポリペプチドへの翻訳を可能とする必要要素を含んでもよい。挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞から得られてもよいし、あるいは、異なる細胞または生物から得られてもよいし、および／または、組み換えポリヌクレオチドであってもよい。一旦宿主細胞の中に入ると、この遺伝子構築体は、宿主の染色体ＤＮＡの中に組み込まれてもよい。遺伝子構築体はベクターに連結されてもよい。
【００９２】
「ベクター」という用語は、宿主細胞の中に遺伝子構築体をトランスロケーションするために使用される、通常は２本鎖ＤＮＡであるポリヌクレオチド分子を指す。ベクターは、少なくとも一つの、さらに別の宿主システム、例えば、大腸菌において複製可能であってもよい。
【００９３】
「発現構築体」という用語は、挿入ポリヌクレオチドの転写を可能とし、かつ、必要に応じて転写物のポリペプチドへの翻訳を可能とする必要要素を含む遺伝子構築体を指す。発現構築体は、５’から３’方向に向けて：
ａ）構築体が形質転換される宿主細胞において機能的なプロモーター、
ｂ）発現されるポリヌクレオチド、および、
ｃ）構築体が形質転換される宿主細胞において機能的なターミネーター
を含む。
【００９４】
「コード領域」または「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）という用語は、適切な制御配列の調節下において、転写産物および／またはポリペプチドを生産することが可能な、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。コード配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳終止コドンの存在によって特定される。遺伝子構築体の中に挿入されると、「コード配列」は、プロモーターおよびターミネーター配列、および／または他の制御要素に動作可能的に連結された場合、発現が可能とされる。
【００９５】
「動作可能的に連結される」とは、発現される配列が、制御要素、例えば、プロモーター、転写調節配列、翻訳調節配列、複製起点、組織特異的制御要素、時間制御要素、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リプレッサー、およびターミネーターなどの制御要素の調節下に置かれることを意味する。
【００９６】
「非コード領域」という用語は、翻訳開始部位の上流、および翻訳終止部位の下流にある未翻訳配列を指す。これらの配列はまた、それぞれ、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲとも呼ばれる。これらの領域は、転写開始および終止、および、翻訳効率の制御のために必要な要素を含む。
【００９７】
ターミネーターとは、転写を終結する配列で、翻訳される配列の下流遺伝子の、３’未翻訳末端の中に見出される。ターミネーターは、ｍＲＮＡ安定性の重要な決定因子であり、ある場合には、空間制御機能を有することが認められている。
【００９８】
「プロモーター」という用語は、コード領域の上流にあって、遺伝子の転写を制御する、非転写ｃｉｓ−制御要素を指す。プロモーターは、転写開始部位を特定するｃｉｓ−イニシエーター要素、および、ＴＡＴＡボックスなどの保存ボックス、および、転写因子によって結合されるモチーフを含む。
【００９９】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「発現を変える」、および「変更発現」という用語は、本発明のポリヌクレオチドに相当するゲノムＤＮＡが修飾されて、そのため、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現変化がもたらされる状況を含有することが意図される。ゲノムＤＮＡの修飾は、遺伝子変換、または、突然変異誘発のための、当該技術分野で公知のその他の方法によって実行されてもよい。「発現変化」は、生産されるメッセンジャーＲＮＡおよび／またはポリペプチドの量における増減に関わることが可能であり、生産されるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の変化によってポリペプチドの活性変化をもたらしてもよい。
【０１００】
本明細書で用いる「対象」は、哺乳動物であることが好ましく、ヒト、および非ヒト哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカ、マウス、ラット、霊長類（ゴリラ、赤毛ザル、およびチンパンジーを含む）、ｐｏｓｓｕｍｓ、および、その他の飼育または動物園動物を含む。この哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【０１０１】
本明細書で用いる「提示（presentation）」という用語は、クリニックまたは病院などの医療施設における対象の提示を指す。
【０１０２】
「処置する」、「処置的」、または「処置」および「予防」とは、ＡＣＤまたは心臓移植拒絶、またはその作用、特にＡＣＳの緩和、寛解、管理、予防、抑制、停止、または進行逆転を実行する、治療的または予防的方策を指す。対象は、ＴｎＩ、ＢＮＰ、Ｎ−ＢＮＰの一つ以上、および、当業者に公知の、他の、通常の、臨床マーカーにおいて、改善を示す、観察可能、または測定可能な（統計的に有意な）低下を示してもよい。
【０１０３】
本明細書に開示される、ある範囲の数（例えば、１から１０）に対する参照は、その範囲内の、全ての関連数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、および１０）に対する参照を含み、さらに、その範囲内の、有理数の、任意の範囲（例えば、２から８、１．５から５．５、および３．１から４．７）を含む。したがって、本明細書において明言的に開示される全ての範囲の、そのサブ範囲も全て明言的に開示される。上記は、特異的に意図される事柄のほんの数例であり、数え上げられた最低値および最高値の間の数値同士の、可能な組み合わせが全て、同様に、本出願においてはっきりと明言されると見なされる。
【０１０４】
発明の詳細な説明
ヒトのＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、心臓のナトリウム利尿ペプチドファミリーのメンバーである。図１に示すように、ｐｒｅｐｒｏＢＮＰは、１３４アミノ酸分子である。シグナルペプチドＢＮＰ−ＳＰ（１−２６）が切り離されて、ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（２７−１３４）を与える。次に、ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（２７−１３４）がさらに処理されて、生物活性形ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（１０３−１３４）、およびｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（２７−１０２）を与える。ＢＮＰ−ＳＰは、シグナルペプチダーゼ（ＳＰＰ）によって、通常、ＢＮＰ−ＳＰ（１−２６）の疎水性中央領域近くで変性されて、さらに小さな断片になるようである。
【０１０５】
ＢＮＰ−ＳＰの機能的役割は、小胞体におけるＢＮＰ輸送の調節に限定されるものと長い間考えられてきた。これが達成されると、このシグナルペプチドは、細胞から全く分泌されることなく分解されるものと考えられていた。
【０１０６】
ごく最近、ＢＮＰ−ＳＰが循環中に現れることが認められた（国際公開第２００５／０５２５９３号；米国特許出願公開第２００５／０２４４９０４号）。この所見に基づいて、ＢＮＰ−ＳＰを心臓病の循環性バイオマーカーとして使用することが示唆された。本出願人らは、さらに別の、まったく思いがけない発見をした。急性心筋梗塞（ＡＭＩ）では、患者の症状の開始後最初の数時間で−実際には、病院またはクリニックへの到着時、ＢＮＰ−ＳＰの循環濃度は最高になる。これは、ＢＮＰ−ＳＰレベルは、Ｎ−ＢＮＰレベルと相関すると考えられるから、ＡＣＤ、心臓移植拒絶の開始後または提示後、あるいは未診断または疑わしいＡＣＤまたは肺障害による提示後、１２から２４時間においてそのピークに達するであろうとする予想とはまったく異なる。この最初の数時間に観察されるレベルは驚くほど高く、しばしば、正常なコントロール集団のレベルよりも約４から１０倍、普通に５から８倍も高いピークに達する。
【０１０７】
ＢＮＰ−ＳＰレベルは、提示後の最初の測定から少なくとも６週間は、コントロール集団のＢＮＰ−ＳＰレベルよりも最大３倍の高レベルを維持する。これらの所見は、ＢＮＰ−ＳＰが、心臓移植拒絶、ＡＭＩ、特に非ＳＴ上昇ＭＩなどの急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）を含むＡＣＤ、急性心虚血症の、ごく初期段階のマーカーとして有用であること、ＡＣＤを肺障害から区別するために使用することが可能であることを示唆する。
【０１０８】
これらの驚くべき所見に基づいて、本出願人らは、障害開始の２時間以内に、または提示時に対象から採取された生物学的なサンプルにおいて、循環性のＢＮＰ−ＳＰ、またはその変異体または断片、および、ＢＮＰ−ＳＰをコードするヌクレオチド配列、またはその変異体または断片に関してスクリーニングすることは有用であると考えられると始めて判断した。
【０１０９】
本発明において有用なのは、少なくとも５アミノ酸長の、ＢＮＰ−ＳＰの抗原性断片または変異体である。特に有用な断片は、ＢＮＰ−ＳＰのＮ末端またはＣ末端である。特異的抗原ペプチドの例として、ＢＮＰ−ＳＰ（１−１０）（配列番号１３）、ＢＮＰ−ＳＰ（１−１７）（配列番号１５）、ＢＮＰ−ＳＰ（１２−２３）（配列番号１７）、およびＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）（配列番号１９）がある。対応するヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１４、１６、１８、および２０に示される。これらの配列は、本出願人らによって始めて提供される。これらの核酸分子とペプチドは両方とも、本発明の局面を形成する。
【０１１０】
したがって、第１局面では、本発明は、本発明のＢＮＰ−ＳＰをコードする核酸分子であって、
（ａ）配列番号１４；
（ｂ）配列番号１６；
（ｃ）配列番号１８；
（ｄ）配列番号２０；
（ｅ）（ａ）から（ｄ）のいずれか一つの相補体；
（ｆ）配列が、ｃｃａｇｔｇｃａｃａａｇｃｔｇｃｔｔｇｇｇｇａｇｇｃｇａｇａではなく、または配列番号２２ではない限りにおいて、ストリンジェントな条件下に、（ａ）から（ｅ）のいずれか一つの配列にハイブリダイズすることが可能な、少なくとも１５ヌクレオチド長の配列、
から選ばれる核酸分子を提供する。
【０１１１】
本発明はさらに、本発明の核酸分子によってコードされる単離ＢＮＰ−ＳＰポリペプチドを提供する。
【０１１２】
本発明の特異的ポリペプチドとしては、全て付属の配列リストに記載される、配列番号１３、１５、１７、および１９のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。さらに考慮の対象とされるのは、本明細書に定義されるこれらのペプチドの、機能的に等価な変異体および断片である。
【０１１３】
本発明の核酸分子、またはその他の形で本明細書に記載される核酸分子は単離されるのが好ましい。これらの分子は、当業者に公知の様々な技術を用いて生物学的なサンプルから単離することが可能である。例示として挙げると、そのようなポリペプチドは、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．１９９４  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒに記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて単離することが可能である。本発明の核酸分子は、本発明のポリヌクレオチド配列から得られる、本明細書で定義する通りのプライマーを用いて増幅することが可能である。
【０１１４】
ポリヌクレオチドを単離するための別の方法としては、本発明のポリヌクレオチド、特に、配列番号１９に記載される配列を有するポリヌクレオチドの全て、または部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いることが挙げられる。ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜などの固体支持体の上に固定されたポリヌクレオチドに対して標識ポリヌクレオチドをハイブリダイズする技術は、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用することが可能である。同様に、プローブはビーズに結合させ、標的配列にハイブリダイズさせてもよい。単離は、磁気分離などの、当該技術分野で公知のプロトコールを用いて実行することが可能である。例示の厳格ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は前述した通りである。
【０１１５】
ポリヌクレオチド断片は、当該技術分野で周知の技術、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化およびオリゴヌクレオチド合成によって生産してもよい。
【０１１６】
サンプル中の対応する完全長ポリヌクレオチドを特定するには、当該技術分野で周知の方法にしたがって、部分的ポリヌクレオチド配列をプローブとして用いてもよい。そのような方法として、ＰＣＲ利用法、５’ＲＡＣＥ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８：３４０−５６（１９９３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、および、ハイブリダイゼーション利用法、コンピュータ／データベース利用法が挙げられる。検出をやり易くするために、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、および生物発光標識などの検出可能標識を用いてもよい。さらに逆ＰＣＲは、既知の領域に基づくプライマーで始めて、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに側接する未知配列の取得を可能とする（Ｔｒｉｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６，８１８６，（１９９８））。この方法は、遺伝子の既知領域の中に好適な断片を生成するためにいくつかの制限酵素を用いる。次に、この断片は、分子間連結によって環状とされ、ＰＣＲ鋳型として使用される。この既知の領域から分岐プライマーが設計される。完全長クローンを物理的に集合するために、標準的分子生物学法の利用が可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。本発明のポリヌクレオチドの増幅を可能とするプライマーおよびプライマーペアも、本発明のさらに別の局面を形成する。
【０１１７】
変異体（オルソログを含む）は、記載の方法によって特定することが可能である。変異ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ利用法によって特定することが可能である（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．１９９４  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ）。通常、ＰＣＲによる、ポリヌクレオチド分子の変異体を増幅するのに有用な、プライマーのポリヌクレオチド配列は、対応するアミノ酸配列の保存領域をコードする配列に基づいてもよい。
【０１１８】
変異ポリヌクレオチドを特定するための、さらに別の方法は、前述のようにゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして、特定のポリヌクレオチドの全て、または部分を使用することが挙げられる。通常、対応アミノ酸配列の保存領域をコードする配列に基づくプローブが使用される。ハイブリダイゼーション条件も、プローブと同一の配列を求めてスクリーニングする場合に用いられる条件よりも厳格度は低くてよい。
【０１１９】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両変異体を含む、変異配列はさらに、前述のコンピュータ利用法によって特定してもよい。
【０１２０】
一群の関連配列の、複数の配列整列は、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０（１９９４），ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｉｇｂｍｃ．ｕ．−ｓｔｒａｂｇ．ｆｒ／ＢｉｏＩｎｆｏ／ＣｌｕｓｔａｌＷ／Ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）、またはＴ−ＣＯＦＦＥＥ（Ｃｅｄｒｉｃ  Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：２０５−２１７（２０００））、または、進行性ペア対向整列を用いるＰＩＬＥＵＰ（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．２５，３５１（１９８７））によって実行することが可能である。
【０１２１】
モチーフまたはシグナチャ配列を見出すためには、パターン認識ソフトウェアアプリケーションが市販されている。例えば、ＭＥＭＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｔｉｆ  Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ）は、一組の配列の中にモチーフおよびシグナチャ配列を見出し、ＭＡＳＴ（Ｍｏｔｉｆ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）はこれらのモチーフを用いて、クエリ配列の中に類似か、または同じモチーフを特定する。ＭＡＳＴの結果は、適切な統計データを添えた、一連の整列、および、見出されたモチーフの視覚的概観として提供される。ＭＥＭＥおよびＭＡＳＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏで開発された。
【０１２２】
ＰＲＯＳＴＬＥ（Ｂａｉｒｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，３５８３（１９９４）；Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，２１５（１９９９））は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列から翻訳された、特徴未解明タンパクの機能を特定する方法である。このＰＲＯＳＴＬＥデータベース（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ，ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ）は、生物学的に重要なパターンおよびプロフィールを含み、かつ、既知のタンパクファミリーに新規配列を割り当てたり、または、配列の中にどの既知のドメイン（単数または複数）があるか（Ｆａｌｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０，２３５（２００２））を判断するための、適切なコンピュータツールと共に使用することが可能となるように設計される。Ｐｒｏｓｅａｒｃｈは、任意の配列パターンまたはシグナチャを用いてＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよべＥＭＢＬデータベースを探索することが可能なツールである。
【０１２３】
タンパクは、同じゲノム（パラローグ）、または別のゲノム（オーソローグ）の他のタンパクに対するその配列近縁性にしたがって分類することが可能である。オーソロガス遺伝子は、共通の先祖遺伝子から種分化によって進化した遺伝子であり、通常、それが進化してきたものと同じ機能を保持する。パラロガス遺伝子は、ゲノム内で重複する遺伝子であって、これらの遺伝子は、新規種分化、または、元の機能と関連する修飾機能を取得する可能性がある。系統発生分析法は、Ｔａｔｕｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，６３１−６３７，１９９７に総覧される）。
【０１２４】
前述のコンピュータ／データベース法の外に、ポリペプチドは、物理的方法、例えば、本発明のポリペプチドに対して惹起された抗体を用いて発現ライブラリーをスクリーニングすること（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）、これもＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載される組み換えＤＮＡ技術によって、または、上記のような抗体の助けを借りて天然供給源のポリペプチドを特定することによって特定してもよい。
【０１２５】
変異ポリペプチドを含むポリペプチドは、当該技術分野において周知の、ペプチド合成法、例えば、固相技術によるペプチドの直接合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，ｉｎ  Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９；Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１，１９８１）、自動化合成、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から市販されるＳｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒによる合成法を用いて調製してもよい。さらに、ポリペプチドの変異形は、合成法、例えば、Ａｄｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ；ＤＮＡ  ２，１８３（１９８３）によって記載されるように、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発法を用いて生成してもよい。
【０１２６】
本発明のポリペプチドおよび変異ポリペプチドは単離されることが好ましい。これらのポリペプチドは、当該技術分野で周知の種々の技術（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０，Ｅｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いて天然源から単離または精製されてもよい。技法としては、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫クロマトグラフィーが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２７】
それとは別に、ポリペプチドおよび変異ポリペプチドは、後述するように、適切な宿主細胞において組み換え的に発現され、該細胞から分離されてもよい。このポリペプチドおよび変異体は、いろいろある用途の中でも特に、抗体の生成、およびリガンドの生成に有用である。
【０１２８】
本明細書に記載される遺伝子構築体は、開示のポリヌクレオチド配列の一つ以上、および／または、本発明の開示のポリペプチドをコードするポリペプチドを含み、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳類、または植物生物体を形質転換するのに有用であってもよい。本発明の遺伝子構築体は、本明細書に定義される発現構築体を含むように意図される。含まれるものは、ベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵ１９、Ｍｐ１８、Ｍｐ１９、ＣｏｌＥ１、ＰＣＲ１、およびｐＫＲＣ）、ファージ（例えば、ラムダｇｔ１０）、およびＭ１３プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＴ１２７、ＲＰ４、ｐ１Ｊ１０１、ＳＶ４０、およびＢＰＶ）、コスミド、ＹＡＣＳ、ＢＡＣシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３、ＰＡＴ２８トランスポゾン（例えば、米国特許第５，７９２，２９４号に記載されるもの）などである。
【０１２９】
構築体は、選択遺伝子、または選択可能マーカーを含んでいると好都合である。通常、アンピシリン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンなどの抗生物質耐性マーカーが使用される。
【０１３０】
構築体において有用なプロモーターとしては、当該技術分野で周知の、β−ラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン、およびｔａｃプロモーターシステムが挙げられる。酵母プロモーターとしては、３−フォスフォグリセリン酸キナーゼ、エノラーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グルコキナーゼ、およびグリセルアルデヒドレート−３−フォスフォネートデヒドロゲナーゼが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１３１】
転写を強化するためにプロモーターに作用するようにエンハンサーを用いてもよい。本発明において使用するのに好適なエンハンサーとしては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス早期プロモーターエンハンサー、グロビン、アルブミン、インスリンなどが挙げられる。
【０１３２】
遺伝子構築体およびベクターを生産し、使用するための方法は、当該技術分野で周知であり、その概略は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７に記載される。ベクターによって選ばれた宿主細胞を形質転換する方法も公知であり、例えば、塩化カルシウム処理は、Ｃｏｈｅｎ，ＳＮ；ＰＮＡＳ  ６９，２１１０，１９７２によって記載される。
【０１３３】
記述される遺伝子構築体およびベクターを含む宿主細胞は、前核細胞起源または真核細胞起源、例えば、酵母、細菌、真菌、昆虫（例えば、バキュロウィルス）、動物、哺乳動物、または植物生物体から得られてもよい。一実施態様では、宿主細胞は、単離宿主細胞である。宿主細胞としてもっとも一般的に用いられる前核細胞は大腸菌株である。他の前核細胞宿主としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられるが、しかしこれらに限定されない。
【０１３４】
組み換えタンパクの発現用の真核細胞としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、２９３、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびＣＯＳ細胞の外、前立腺癌細胞系統、例えば、ＰｒＥＣ、ＬＮＣａＰ、Ｄｕ１４５、およいＰＷＰＥ−２が挙げられる。これらの細胞は、ＡＴＣＣ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから取得することが可能である。
【０１３５】
本発明の核酸分子の発現に適合する前核細胞プロモーターとしては、当該技術分野で公知の構成的プロモーター（例えば、ラムダバクテリオファージのｉｎｔプロモーター、および、ｐＢＲ３２２のベータ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、および制御プロモーター（例えば、ｌａｃＺ、ｒｅｃＡ、およびｇａｌ）が挙げられる。コード配列上流のリボソーム結合部位も、発現に必要とされる場合がある。
【０１３６】
発現構築体などの遺伝子構築体を含む宿主細胞は、ポリペプチドの組み換え生産法において有用である。このような方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）。方法は、一般に、本発明のポリペプチドの発現および選択に好適な、または誘導的な適切な媒体中で宿主細胞を培養することを含む。さらに、選択可能マーカーを含む細胞を、本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞の選択に好適な媒体の上で培養してもよい。本発明のポリペプチドを発現する、形質転換宿主細胞を選択し、該ポリペプチドの発現のために好適な条件下で培養する。この発現された組み換えポリペプチドは、当該技術分野において周知の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動など（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｅｄ，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １８２，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いて、培養媒体から分離し、精製してもよい。宿主細胞は、本発明の発現ポリペプチドによって生成される産物の生産法において有用である場合がある。
【０１３７】
別局面では、本発明は、対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）を予測、診断、または監視する方法であって：ＡＣＤの開始の２時間以内、または、ＡＣＤの提示の２時間以内に採取された生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定すること；および、前記ＢＮＰ−ＳＰレベルを、コントロールのＢＮＳ−ＳＰレベルと比較することを含み、コントロールレベルよりも高いＢＮＰ−ＳＰレベルはＡＣＤであることを示す、方法を提供する。
【０１３８】
別局面において、本発明は、対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）の処置に対する反応を監視する方法であって、ＡＣＤの開始の２時間以内、または、ＡＣＤの提示の２時間以内に該対象から得た生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定すること；および、前記ＢＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールのＢＮＰ−ＳＰレベルと比較することを含み、コントロールレベルに対する、ＢＮＰ−ＳＰ測定レベルの変化は処置に対する反応を示す、方法を提供する。
【０１３９】
心臓移植拒絶エピソードの予測または診断、肺起因性の呼吸困難（呼吸窮迫）と循環起因性の区別に、ｐｒｏＢＮＰ２７−１０２、ｐｒｏＢＮＰ２７−４７などのＢＮＰ前駆体の使用が可能であることは、当該技術分野で公知である。米国特許出願公開第２００５／０２４４９０２を参照されたい。したがって、ＢＮＰ−ＳＰを、心臓組織分析に基づいて心臓移植拒絶の早期マーカーとして、かつ、肺障害と急性心臓障害とを区別するために使用することが可能であることは同様に予測が可能である。
【０１４０】
したがって、本発明はさらに、対象において心臓移植拒絶エピソードを予測、診断、または監視する方法であって、心臓移植後２時間以内に対象から得た生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定すること、および、前記ＢＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールのＢＮＰ−ＳＰレベルと比較することを含み、コントロールレベルよりも高いＢＮＰ−ＳＰ測定レベルは、移植拒絶を示す、方法を提供する。
【０１４１】
本発明はさらに、対象において肺障害と、急性心臓障害（ＡＣＤ）とを区別する方法であって、該障害による提示の２時間以内に対象から得た生物学的なサンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定すること；および、前記ＢＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールのＢＮＰ−ＳＰレベルと比較することを含み、コントロールレベルよりも高いＢＮＰ−ＳＰ測定レベルはＡＣＤを示す、方法を提供する。
【０１４２】
一実施態様では、本発明は、対象において急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測、診断、または監視する方法であって、ＡＣＤ、心臓移植拒絶もしくはＡＣＤ／肺障害の開始、または提示後の最初の２時間以内に該対象から得た生物学的なサンプルのＢＮＰ−ＳＰレベルを測定することを含む方法を提供する。
【０１４３】
好ましくは、ＢＮＰ−ＳＰの測定レベルは、コントロールのＢＮＰ−ＳＰレベルと比較され、コントロールレベルよりも高い、ＢＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤまたは移植拒絶を示す。
【０１４４】
熟練した読者であれば、評価目的のためには、マーカーは、参照値またはコントロール値との相関を必要とすることが了解されるであろう。
【０１４５】
本明細書で用いるコントロールは、ＢＮＰ−ＳＰサンプルが採取され、ＢＮＰ−ＳＰの平均レベルが定量される個体または群であってもよい。通常、該個体または群は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶もしくはＡＣＤ／肺障害に罹患することが知られていない、健康な正常個体、または個体群を含む。大抵の個体におけるＢＮＰ−ＳＰレベルは、０−１５ｐｍｏｌ／Ｌの間にあり、平均コントロールレベルは、約１０ｐｍｏｌ／Ｌである。それとは別に、コントロールレベルは、以前に試験された個体または群から得られた、複数の読み取り値に基づいて評価することも可能である。コントロールレベルのもう一つの例は、心臓組織におけるＢＮＰ−ＳＰおよびＢＮＰレベルの間の放射性測定値である。対象のＢＮＰ−ＳＰレベルは、前記コントロール集団の平均ＢＮＰ−ＳＰレベルと比べることが可能である。心臓病コントロール集団のＢＮＰ−ＳＰレベルは、正常なコントロール集団のＢＮＰ−ＳＰレベルよりも１．５から３倍、通常、２から３倍、または２．５から３倍高い場合がある。それとは別に、コントロールは、同じ対象から、より早い時期に得られた、一つ以上の読み取り値、またはそのような読み取り値の平均であってもよい。特定の方法について適切なコントロールおよびコントロールレベルを確認することは、当該技術分野において周知である。
【０１４６】
開始または提示の２時間以内の期間は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、または、未診断または疑われるＡＣＤ／肺障害の開始、または、医療施設における到着後１分から１２０分（１２０分を含む）までを含む。好ましくは、測定は、開始または提示後１時間以内（１分から６０分（６０分を含む）まで）に、開始または提示後、好ましくは５から４５分、好ましくは１５から４０分、好ましくは２０から３５分、最適には２５から３０分以内に行われる。
【０１４７】
コントロール「よりも高い」レベル、すなわち、コントロールからの変化または偏差は、統計的に有意であることが好ましい。コントロールレベル、または平均コントロールレベルよりも高いレベル、それからの偏差または変化は、そのレベルが、コントロールレベルと比べ、５％以上、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上該コントロールレベルと異なる場合、存在すると見なすことが可能である。それとは別に、Ｐ≦０．０５として統計的有意を計算してもよい。さらに別の方法として、より高レベル、偏差および変化は、アッセイの参照限界または参照間隔を用いることによって決めることが可能である。これらは、直感的評価またはノンパラメトリック法に基づいて計算することが可能である。大雑把に、これらの方法は、０．０２５および０．９７５フラクタイルを、０．０２５＊（ｎ＋１）および０．９７５（ｎ＋１）として計算する。このような方法は、当該技術分野において周知である。２３，２４コントロールに不在の、マーカーの存在も、より高レベル、偏差または変化と見なされる。
【０１４８】
サンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定する工程は、単一サンプルに対する単一回測定であってもよいし、いくつかのサンプルに対する反復測定であってもよい。したがって、測定は、開始または提示後最初の２時間、好ましくは１時間以内に採取されたサンプルにおいて、ＢＮＰ−ＳＰの１から２０回測定、好ましくは１から１０回、好ましくは１から５回、好ましくは１から３回、好ましくは１または２回、好ましくは２または３回の測定を含んでもよい。さらに、前記２時間期間外の、単一回または反復測定も、ＢＮＰ−ＳＰレベルが、正常なコントロールレベルか、または心臓病コントロールレベルに納まるかを定めるために行ってよい。
【０１４９】
好ましい一実施態様では、方法は、開始または提示後の最初の１時間以内に採取された１または２サンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定し、次いで、開始または提示後、または、ＢＮＰ−ＳＰレベルの初回測定後２から４時間以内、好ましくは２から３時間以内に採取された１または２サンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰレベルを測定することを含む。
【０１５０】
前述のように、開始または提示後の最初の２時間以内に測定されるＢＮＰ−ＳＰレベルは、正常なコントロールにおいて測定されるＢＮＰ−ＳＰレベルよりも、通常４から１０倍、よく見られるのは５から８倍高い。既述のように、さらにこの範囲に含まれるものは、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から１０、７から９、７から８、８から１０、８から９、および９から１０倍の特異的範囲である。
【０１５１】
別の実施態様では、サンプルにおける、２０から３００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２５から２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３０から１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３５から１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは４０から１２０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは４０から９０ｐｍｏｌ／Ｌ、および好ましくは４５から８０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲のＢＮＰ−ＳＰレベルは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶を示すか、または、ＡＣＤを、肺障害から区別する。
【０１５２】
既述のように、前記範囲はさらに、前記範囲内の任意の数値、例えば、２０から１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、５０から２００ｐｍｏｌ／Ｌ、４０から１３０ｐｍｏｌ／Ｌ、５０から１００ｐｍｏｌ／Ｌ、４５から１６０ｐｍｏｌ／Ｌなどを含む。
【０１５３】
生物学的なサンプルは、ＢＮＰ−ＳＰが存在するか、または分泌されることが可能である限り、いずれの生物物質であってもよい。サンプルは、任意の組織液または体液、例えば、血液、唾液、腸液、血清、血漿、尿、心膜液、および脳脊髄液を含んでもよいが、ただしこれらに限定されない。好ましくは、生物学的なサンプルは、循環性生物学的なサンプル、例えば、血液、血清、または血漿である。一実施態様では、生物学的なサンプルは心臓組織である。
【０１５４】
サンプルにおけるマーカーの存在およびその発現レベルは、当該技術分野で公知の方法、例えば、サザーンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＦＩＳＨ、または、ｍＲＮＡの転写を定量化する定量的ＰＣＲ［（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏ．ＮＡＨ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：５２０１−５２０５  １９８０）、（Ｊａｉｎ  ＫＫ，Ｍｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００４  Ｍａｙ；１５（４）：１４−７）］、または、本発明において提供されるマーカー配列に基づいて適切に標識されたプローブの使用による、インシトゥハイブリダイゼーションによって決定してもよい。
【０１５５】
したがって、本発明はさらに、サンプルにおいて本発明の核酸分子の存在を検出するアッセイであって：
（ａ）厳格ハイブリダイゼーション条件下に、該核酸配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブにサンプルを接触させること；および、
（ｂ）サンプルにおいてハイブリダイゼーション複合体の存在を検出すること、
を含む方法を提供する。
【０１５６】
このハイブリダイゼーションプローブは標識プローブであることが好ましい。標識の例としては、蛍光、化学発光、放射性酵素、およびビオチン−アビジン標識が挙げられる。標識化、および標識プローブの可視化は、前述のものなど、当該技術分野で公知の方法にしたがって実行される。
【０１５７】
好都合とするため、核酸プローブは、固相支持体、例えば、樹脂（ポリサッカリドなど）、炭水化物（セファローズなど）、プラスチック（ポリカーボネートなど）、およびラテックスビーズなどの上に固定されてもよい。
【０１５８】
前述のように、核酸分子プローブは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡ分子であることが好ましい。好ましいプローブとしては、配列番号：１４、１６、１８、２０、および２２が挙げられる。
【０１５９】
厳格ハイブリダイゼーション条件は前述の通りである。
【０１６０】
核酸マーカーの発現レベルは、当該技術分野で公知の技術、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、および、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む電気泳動技術を用いて決定してよい。これらの技術を用いて、対象サンプルにおける、本発明の核酸分子のＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列は増幅され、ＤＮＡまたはｃＤＮＡまたはＲＮＡのレベルは測定される。
【０１６１】
別法では、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡレベルは、増幅無しに直接サンプルにおいて測定してもよい。
【０１６２】
現在好ましい方法は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析である。ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析において使用されるプローブは、本発明において特定されるマーカー配列に基づいて調製してもよい。プローブは、好ましくは参照配列の内の、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２４、少なくとも３０、少なくとも３６、好ましくは少なくとも４２、好ましくは少なくとも５１、好ましくは少なくとも６０、好ましくは少なくとも７０以上の連続ヌクレオチドを含む。
【０１６３】
それとは別に、発現レベルは、該核酸配列に対して特異的なプライマーによる、逆転写利用ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを用いて測定してもよい。望むなら、サンプル中のマーカーレベルの比較は、その発現が、測定されるパラメータまたは条件から独立する、コントロール核酸分子を参照して行うことも可能である。コントロール核酸分子とは、そのレベルが、障害または移植拒絶部位と、健康状態との間で変わらない分子を指す。コントロール分子のレベルは、比較される複数集団におけるレベルを正規化するために使用することが可能である。そのようなコントロール分子の一例は、ＧＡＰ−ＤＨである。本発明はマーカーは、障害と共にレベルを変える。
【０１６４】
一実施態様では、測定工程は、ＢＮＰ−ＳＰと、ＢＮＰ−ＳＰ、またはその断片または変異体に選択的に結合する結合因子との間の結合を検出することを含む。結合因子は、生物事象の他のマーカー、より詳細にはＢＮＰまたはＮＴ−ＢＮＰとの交差反応性が低いことが好ましい。結合因子は、抗体またはその断片であることが好ましい。
【０１６５】
本発明はさらに、そのような抗体、または、該抗体の断片に関する。ＢＮＰ−ＳＰに結合する抗体、またはその断片または変異体は、いずれの形態をとってもよく、例えば、全てのクラスのポリクロナール、モノクロナール、単一鎖、ヒト、ヒト化抗体、および、遺伝子組み換えによって生産されるキメラ抗体などであってもよい。さらに含まれるのは、ＢＮＰ−ＳＰ、またはその断片または変異体によって、マウス、ラット、またはウサギなどの動物を免疫化することによって得られる抗血清である。
【０１６６】
さらに、抗体の断片または修飾抗体も、それが、ＢＮＰ−ＳＰ、またはその断片または変異体に結合する限り、本発明において使用してよい。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）、およびＦｃ、またはＦｖ断片、または、Ｈ鎖およびＬ鎖のＦｖ断片が、適切なリンカーによって連結される単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３（１９８８））であってもよい。抗体の“Ｆｃ”部分とは、重鎖定常域ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の、一つ以上を含むが、重鎖の可変域ドメインを含まない、免疫グロブリン重鎖の部分を指す。
【０１６７】
抗体の調製法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９８）１１を参照されたい）。もっとも普通に使用される抗体は、適切な宿主哺乳動物を免疫化することによって生産される。ＢＮＰ−ＳＰを含む融合タンパクも、免疫原として使用することが可能である。
【０１６８】
抗体は、種々の分子、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に接合させることによって修飾してもよい。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって取得することも可能である。これらの修飾法は、当該技術分野では常法である。
【０１６９】
それとは別に、抗体は、非ヒト抗体から得られる可変域、および、ヒト抗体から得られる定常域の間のキメラ抗体、あるいは、非ヒト抗体由来の相補性決定域（ＣＤＲ）、ヒト抗体由来の枠組み構造領域（ＦＲ）、および定常域を含む、ヒト化抗体として取得されてもよい。このような抗体は、当該技術分野で公知の方法を用いて調製することが可能である。
【０１７０】
簡単に言うと、ポリクロナール抗体の調製法は、熟練した当業者には公知である。哺乳動物において、例えば、免疫化因子と、要すればアジュバントを１回以上注入することによってポリクロナール抗体を惹起することが可能である。通常、この免疫化因子および／またはアジュバントは、複数回の皮下または腹腔内注射によって該哺乳動物に注入される。免疫化因子は、ＢＮＰ−ＳＰ、またはその断片または変異体、またはその融合タンパクを含んでもよい。免疫化される哺乳動物において免疫原性であることが知られるタンパクに対し、この免疫化因子を接合することは有用である場合がある。このような免疫原性タンパクの例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン、および大豆トリプシンインビターが挙げられる。用いてもよいアジュバントの例としては、例えば、フロインドの完全アジュバント、およびＭＰＬ  ＴＤＭアジュバント（モノフォスフォリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコール酸）が挙げられる。免疫化プロトコールは、当業者であれば、無用の実験を要することなく選択することが可能である。
【０１７１】
モノクロナール抗体は、当該技術分野で周知のハイブリドーマ法を用いて調製してよい。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５１２、および米国特許第４，１９６，２６５号を参照されたい。ハイブリドーマ細胞は、適切な培養媒体において培養してもよいが、それとは別に、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腹水としてインビボで育成してもよい。好ましい恒久細胞系統は、マウス骨髄細胞系統であるが、これは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手することが可能である。対象抗体を分泌する恒久細胞系統を選別するためのスクリーニングに免疫アッセイを用いてもよい。ＢＮＰ−ＳＰ、またはその断片または変異体の配列をスクリーニングに使用してもよい。
【０１７２】
したがって、本発明においてさらに考慮の対象となるものは、ＢＮＰ−ＳＰ特異的モノクロナール抗体を分泌することが可能な恒久細胞系統である、ハイブリドーマである。
【０１７３】
ハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクロナール抗体の結合特異性を決めるための周知の手段としては、例えば、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、およびウェスタンブロット（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４（１９８８））が挙げられる。免疫化された動物からのサンプルは、ポリクロナール抗体の存在に関して同様にスクリーニングされてもよい。
【０１７４】
検出をやり易くするために、本発明の抗体および断片は、検出可能マーカー、例えば、蛍光、生物発光、および化学発光化合物、並びに、放射性同位元素、磁気ビーズ、およびアフィニティー標識（例えば、ビオチンおよびアビジン）によって標識してもよい。結合の間接測定を可能にする標識の例としては、基質が、蛍光着色産物を提供する酵素が挙げられ、適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。蛍光色素（例えば、テキサスレッド、フルオレセイン、フィコビリタンパク、およびフィコエリスリン）は、蛍光活性化セルソーターと共に使用することが可能である。標識化技術は当該技術分野で周知である。
【０１７５】
細胞によって分泌されるモノクロナール抗体は、通例の免疫グロブリン精製手順、例えば、タンパクＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによって、培養媒体または腹水から単離または精製することが可能である。
【０１７６】
モノクロナール抗体または断片はさらに、組み換えＤＮＡ手段によって生産することも可能である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。ＤＮＡ修飾、例えば、マウスの相同配列の代わりに、ヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列による置換も可能である（上記米国特許第４，８１６，５６７号）。抗体は、１価抗体であってもよい。１価抗体の調製法は当該技術分野で周知である。キメラ２価抗体の生産も、本発明の考慮の対象とされる。
【０１７７】
本発明の抗体はさらに、ヒト化抗体、またはヒト抗体を含んでもよい。ヒト化抗体は、ヒトの免疫グロブリンであって、該レシピエントの相補性決定域（ＣＤＲ）の残基が、非ヒト動物種のＣＤＲの残基によって置換される免疫グロブリンを含む。ウサギ、ラット、およびマウスなどの非ヒト起源のヒト化抗体の生産は周知である。１３、１４、１５
ヒト抗体はさらに、当該技術分野で公知の種々の技術、例えば、ファージディスプレイライブラリー１６；およびトランスジェニック法、例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  １９９６１７；およびＶａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８１８を参照、を用いて生産することが可能である。
【０１７８】
二重特異性抗体も有用である場合がある。これらの抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有する、モノクロナールの、好ましくは、ヒト、またはヒト化抗体である。例えば、ＢＮＰ−ＳＰ、またはその変異体または断片、および、ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ、ＢＮＰ、ＣＫ−ＭＢ、ＴｎＴ、ＴｎＩ、およびミオグロビンからなる群より選択される抗原である。二つよりも大きい特異性を有する抗体、例えば、３重特異性も、本発明の考慮の対象とされる。
【０１７９】
２重特異性抗体の作製法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ  １９８３１９，Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６２０、およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５２１を参照されたい。
【０１８０】
この抗体によって特異的に結合されるＢＮＰ−ＳＰは、前述のＢＮＰ−ＳＰ、またはその抗原性変異体または断片である。
【０１８１】
望ましくは、抗体は、ＢＮＰ−ＳＰのＮ末端またはＣ末端に結合する。結合因子が選択的に結合する、特異的抗原性ペプチドの例としては、ＢＮＰ−ＳＰ（１−１０）配列番号１３、ＢＮＰ−ＳＰ（１−１７）配列番号１５、ＢＮＰ−ＳＰ（１２−２３）（配列番号１７）、ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）配列番号１９、およびＢＮＰ−ＳＰ（１−２６）配列番号２１が挙げられる。
【０１８２】
ＢＮＰ−ＳＰの結合は、当該技術分野で公知の任意の手段、例えば、特異的（抗体利用）および非特異的（例えばＨＰＬＣ固相）を含む手段によって検出することが可能である。もっとも一般的には、本発明の抗体は、前述のＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどのアッセイによって検出される。単独、または、クロマトグラフィー方式などの非特異的結合と組み合わせた、競合結合アッセイ、サンドイッチアッセイ、非競合アッセイ、蛍光免疫アッセイ、免疫蛍光アッセイ、またはラジオイムノアッセイ、発光アッセイ、化学発光アッセイ、および質量分析、例えば、表面強調レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、フーリエ変換イオンサイクロトン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ）も実行可能である。
【０１８３】
ＢＮＰ−ＳＰ／抗体複合体の洗浄および単離をやり易くするために、固相基質に対して抗体を固定可能とすると好都合である。固相支持体に対する抗体の結合は、当該技術分野で公知の技術を用いて実現することが可能である。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８６）を参照されたい。抗体のために有用な固相基質としては、ガラス、ナイロン、紙、およびプラスチックが挙げられる。同様に、ＢＮＰ−ＳＰは、固相基質、例えば、吸着性シリカ、または樹脂粒子、または、必要に応じて、イオン交換、逆相（例えば、Ｃ１８コーティング）、または他の物質をコートするか、誘導体形成させたシリコンチップに吸着させることも可能である。基質は、ビーズ、プレート、チューブ、スチック、またはバイオチップの形状を取ってもよい。番地割り当て可能な地点、および点状マイクロタイタープレートを有するバイオチップまたはプレートは特に有用である。使用に好ましいのはさらに、複数の分析対象を指向する抗体を含むビーズを用いて、単一サンプルにおいてそれら複数の分析対象のレベルを測定する、マルチシステムである。測定される分析対象は、ＢＮＰ−ＳＰ、またはその変異体または断片ばかりでなく、他の心臓マーカーを含んでもよい。本発明において使用される、好適な多重ビーズシステムの一例は、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｆｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍである。
【０１８４】
抗体アッセイ法は、当該技術分野において周知であって、例えば、米国特許第５，２２１，６８５号、米国特許第５，３１０，６８７号、米国特許第５，４８０，７９２号、米国特許第５，５２５，５２４号、米国特許第５，６７９，５２６号、米国特許第５，８２４，７９９号、米国特許第５，８５１，７７６号、米国特許第５，８８５，５２７号、米国特許第５，９２２，６１５号、米国特許第５，９３９，２７２号、米国特許第５，６４７，１２４号、米国特許第５，９８５，５７９号、米国特許第６，０１９，９４４号、米国特許第６，１１３，８５５号、米国特許第６，１４３，５７６号を参照されたく、未標識アッセイについては、米国特許第５，９５５，３７７号および米国特許第５，６３１，１７１号を参照されたく、さらに、アッセイ方式および条件の記述に関しては、Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｐｐ１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ  １９８７），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９９８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、および米国特許出願公開第２００５／００６４５１１号を参照されたい。なお、上記文献全てについて、その全体を引用により本明細書に含める。
【０１８５】
免疫アッセイの分析専門業者は周知であり、中でも、十分に記載される２２Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｃｃｅｓｓ、Ａｂｂｏｔｔ  ＡｘＳｙｍ、Ｒｏｃｈｅ  ＥｌｅｃＳｙｓ、およびＤａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｓｔａｔｕｓ  ｓｙｓｔｅｍｓが挙げられる。
【０１８６】
ＢＮＰ−ＳＰおよび抗体が結合して複合体を形成する様は、直接または間接に検出することが可能である。直接的検出は、標識、例えば、蛍光、発光、放射性核種、金属、染料などを用いて実行する。間接的検出としては、ジゴキシンなどの検出可能な標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリフォスファターゼなどの酵素を結合させ、標識されたＢＮＰ−ＳＰ抗体を形成し、次いで、検出試薬を加えることによって該標識を検出することを含む。
【０１８７】
当該技術分野で公知のように、西洋ワサビペルオキシダーゼは、例えば、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）などの基質、および過酸化水素と共にインキュベートして着色産物を生成し、その吸光度を測定することが可能であるし、あるいは、ルミノールおよび過酸化水素とインキュベートして化学発光を生成し、それを光度計で測定することが可能である。ビオチンまたはジゴキシンは、それに対し強力に結合する結合剤と反応させることが可能である。例えば、タンパク質アビジンおよびストレプトアビジンは、ビオチンに対して強力に結合する。次に、さらに別の、測定可能な標識を、該タンパクとの直接的反応によるか、または、一般的に利用が可能な、ＭＣＳおよびカルボジイミドなどの架橋剤の使用、またはキレート剤の添加によって、該タンパクに対し共有的に結合または連結させる。
【０１８８】
一般に、複合体は、複合体未形成試薬から、例えば、遠心によって分離される。抗体が標識される場合、複合体の量は、検出される標識の量に反映される。それとは別に、ＢＮＰ−ＳＰを、抗体に結合させることによって標識し、競合アッセイにおいて、該抗体標識ＢＮＰ−ＳＰを、未標識ＢＮＰ−ＳＰを含む生物学的なサンプルとインキュベートし、結合された標識ＢＮＰ−ＳＰの低下を測定することによって検出してもよい。他の免疫アッセイ、例えば、サンドイッチアッセイを使用してもよい。
【０１８９】
一例では、通常一晩１８から２５時間４℃で、または１から２から４時間２５℃から４０℃で抗体と接触させた後、該結合因子（抗体）と結合させた標識ＢＮＰ−ＳＰを、未結合標識ＢＮＰ−ＳＰから分離する。液相アッセイでは、分離は、セルロースまたは磁気物質などの固相粒子に結合させた、抗ガンマグロブリン抗体（二次抗体）の付加によって実現してもよい。この二次抗体は、一次抗体に使用される動物種とは異なる動物種において惹起され、この一次抗体に結合する。したがって、全ての一次抗体は、二次抗体を介して固相に結合する。この複合体は、遠心または磁気牽引によって溶液から取り出され、結合標識ペプチドは、それに結合した標識を用いて測定される。遊離標識から結合標識を分離するための他の選択肢としては、溶液から沈殿する、免疫複合体の形成、ポリエチレングリコールによる抗体の沈殿、遊離標識ペプチドの木炭に対する結合、および、ろ過の遠心による溶液からの取得が挙げられる。分離された結合または遊離相における標識は、上述のものなど適切な方法によって測定される。
【０１９０】
競合結合アッセイは、上述のものよりも簡単に実行され、したがって好ましい固相アッセイとして構成することが可能である。この種のアッセイは、ウェル付きプレート（一般に、ＥＬＩＳＡまたは免疫アッセイプレートと呼ばれる）、固相ビーズ、またはチューブの表面を使用する。一次抗体は、プレート、ビーズ、またはチューブの表面に、吸着されるか、または共有的に結合されるか、あるいは、プレートに吸着または共有的に結合される、二次抗ガンマグロブリン、またはＦｃ域抗体を介して間接的に結合される。サンプルおよび標識ペプチド（上述と同じ）は、一緒にまたは継時的にプレートに加えられ、サンプル中のＢＮＰ−ＳＰと標識ペプチドの間で抗体結合をめぐる競合が起こることを可能とする条件下でインキュベートされる。次いで、未結合標識ペプチドは吸引除去され、プレートは洗い濯がれ、プレートに付着する、抗体結合標識ペプチドが残される。次に、この標識ペプチドは、前述の技術を用いて測定することが可能である。
【０１９１】
サンドイッチ型アッセイは、特異性、スピード、および比較的広い測定範囲のためにより好まれる。この種のアッセイでは、固相競合結合アッセイに関して前述したように、ＢＮＰ−ＳＰに対する一次抗体の過剰量が、吸着、共有結合、または、抗Ｆｃまたはガンマグロブリン抗体を介して、ＥＬＩＳＡプレート、ビーズ、またはチューブに付着される。サンプル液または抽出物を、固相に付着させた抗体に接触させる。抗体は過剰なので、この結合反応は通常急速である。さらに、ＢＮＰ−ＳＰに対する二次抗体が、サンプルと共に、一次抗体と同時に、または継時的にインキュベートされる。この二次抗体は、ＢＮＰ−ＳＰにおいて、一次抗体の結合部位とは異なる部位に結合するように選ばれる。これら二つの抗体反応によって、サンプルのＢＮＰ−ＳＰが二つの抗体の間に挟まれるサンドイッチが得られる。二次抗体は、通常、競合結合アッセイで上に詳述したように、直ぐに測定できる化合物によって標識される。それとは別に、二次抗体に特異的に結合する標識三次抗体をサンプルに接触させてもよい。未結合物質を洗い流した後、結合標識抗体は、上に競合結合アッセイに関して概説した方法によって測定および定量することが可能である。
【０１９２】
さらに、ディップスティック型アッセイを使用してもよい。これらのアッセイは当該技術分野において周知される。このアッセイは、例えば、特異的抗体を付着させた小型の粒子、例えば、金、または着色ラテックス粒子を用いてもよい。該粒子をあらかじめ負荷させた膜または紙の一端に、測定される液体サンプルを加えて放置し、ストリップにそって移動するにまかせる。粒子に対する、サンプル中の抗原の結合は、粒子に対する結合因子、例えば、抗原または抗体を含む、捕捉部位に対する粒子の結合能を修飾し、さらにストリップにそって移動する。この部位における着色粒子の蓄積は、発色をもたらすが、サンプル中の競合抗原の濃度に依存する。他のディップスティック法は、サンプル中の抗原を捕捉するために、紙または膜ストリップに共有的に結合した抗体を用いてもよい。西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素と結合した二次抗体による後続反応、および基質とのインキュベーションは発色をもたらし、蛍光または化学発光のアウトプットによってサンプル中の抗原の定量化が可能となる。
【０１９３】
下記の実施例で論じるように、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、近年好まれる検査技術である。一ＲＩＡでは、放射性標識抗原および未標識抗原が、抗体との競合結合に用いられる。一般的放射性標識としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、および１４Ｃが挙げられる。
【０１９４】
特異的抗体によるＢＮＰ−ＳＰの沈殿、および放射性標識抗体結合タンパクを含むラジオイムノアッセイは、サンプル中のＢＮＰ−ＳＰ量に比例するものとして、該沈殿物における標識抗体の量を測定することを可能とする。それとは別に、標識ＢＮＰ−ＳＰを生成し、未標識抗体結合タンパクを使用する。次に、試験される生物学的なサンプルを加える。標識ＢＮＰ−ＳＰのカウントの低下は、サンプル中のＢＮＰ−ＳＰの量に比例する。
【０１９５】
ＲＩＡにおいてはさらに、遊離ＢＮＰ−ＳＰから結合したＢＮＰ−ＳＰを分離することが可能である。これは、二次抗体によってＢＮＰ−ＳＰ／抗体複合体を沈殿することを含む。例えば、もしもＢＮＰ−ＳＰ抗体複合体が、ウサギ抗体を含むのであれば、ロバ抗ウサギ抗体を用いて該複合体を沈殿させ、標識の量をカウントすることが可能である。例えば、ＬＫＢでは、Ｇａｍｍａｍａｓｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒが使用される。Ｈｕｎｔら２２を参照されたい。
【０１９６】
本発明の方法はさらに、ＡＣＤ、心臓移植拒絶もしくはＡＣＤ／肺障害の、一つ以上の非ＢＮＰ−ＳＰマーカーのレベルを測定することを含む。他の、一つまたは複数のマーカーのレベルは、コントロール集団の平均コントロールレベルと比較してもよい。平均コントロールレベルからの、測定レベルの偏差は、ＡＣＤ、または心臓移植拒絶に関して予測的または診断的である。
【０１９７】
これまで本発明の方法は、ＡＣＤまたは心臓移植拒絶を示す、ＢＮＰ−ＳＰの比較的高いレベルまたは増加に関して記述されてきたが、ある事象または障害では、ＢＮＰ−ＳＰのレベルは降下することも可能である。平均レベルを下回る偏差を測定することも考慮の対象とされる。
【０１９８】
本発明において特に有用な、その他のマーカーとしては、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ  ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｈ−ＦＡＢＰ、エンドテリン、アドレノメジュリン、レニン、およびアンギオテンシンＩＩが挙げられる。１これらのマーカーは全て、心不全または心臓病に関与する。ＢＮＰ−ＳＰを他のマーカーと相関させることは、ＢＮＰ−ＳＰの予測、診断、または監視価値を増大させることが可能である。
【０１９９】
ＡＣＤ、心臓移植拒絶もしくはＡＣＤ／肺障害の場合、既知の心臓マーカーとＢＮＰ−ＳＰマーカーレベルを組み合わせることは、患者の、その後の結果に関する予測的または診断的価値を増す可能性がある。
【０２００】
いくつかのペプチドマーカーの分析は、単一試験サンプルを用いて、同時に、または別々に実行することが可能である。同時で、二つ以上の複数部位方式アッセイが好ましい。多重の、ビーズ、マイクロアッセイ、またはバイオチップシステムは特に有用である。ビーズ、アッセイ、またはチップは、いくつかの、不連続で、多くの場合番地割り当て可能な地点であって、ＢＮＰ−ＳＰを含む一つ以上のマーカーに対する抗体を含む地点を有することが可能である。この一つ以上のマーカーは、一つを超えるＢＮＰ−ＳＰマーカーを含む。例えば、ＢＮＰ−ＳＰのＮ末端およびＣ末端断片について定量し、その定量結果を組み合わせることは有用である場合がある。このような、他の、多くのマーカーの組み合わせが実行可能である。米国特許出願公開第２００５／００６４５１１号は、本発明において有用なチップおよび技術に関する記述を提供する。Ｌｕｍｉｎｅｘは、本発明において有用な多重ビーズシステムを提供する。
【０２０１】
対象を監視している際、時間経過と共にいくつかの生物学的なサンプルを採取してもよい。連続サンプリングによって、マーカーレベル、特にＢＮＰ−ＳＰの経時的変化を測定することが可能になる。サンプリングによって、治療スケジュールを合わせてもよい、事象、事象の重度の近似開始時点、用いる治療スケジュールに対する反応、および長期の予後判定に関する情報を得ることが可能である。分析は、例えば、救急搬送、医師の診察室、提示、入院時、外来診療、または通例の健康診断における医療実施時点において実行してよい。
【０２０２】
本発明の方法はさらに、一つ以上の危険因子、例えば、ただしこれらに限定されないが、年齢、体重、性別、および、心臓病などの事象に関する家族歴の分析と組み合わせてもよい。試験結果はさらに、本発明の方法と組み合わせて使用することも可能である。例えば、ＥＣＧ結果および臨床検査である。一つ以上の、別の危険因子または試験結果と一緒に、ＢＮＰ−ＳＰの循環レベルにおける統計的に有意な上昇を用いると、対象の状態をより正確に診断または予後判定できる場合がある。
【０２０３】
本発明の方法はさらに、治療ガイドとして使用することが可能である。例えば、最初にどの治療を行うべきか、治療監視、治療の陽性作用、または有害作用、例えば、抗有糸分裂剤の心臓毒性の検出、および、必要とされる場合の治療スケジュールの調整などを何時行うべきかは、結果に依存する。これは、患者における、短期的、中期的、および長期的結果を改善することが可能である。治療ガイドに関しては、Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎら８を参照されたい。
【０２０４】
急性心臓障害
本出願人らは、完全長ＢＮＰ−ＳＰ分子（１−２６）、およびその各種断片の濃度が、急性心臓障害と関連することを示した。さらに、ＢＮＰレベルは、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を疑われて提示した患者の場合、提示時にその最高点にある。急性心臓障害、特に、急性心虚血症を抱えて提示した患者は、その後、心筋梗塞（ＭＩ）を経験する場合もあるし、しない場合もある。ＭＩを経験しない群は、現今の臨床技術およびマーカーではすぐには診断することができない。したがって、本出願人らは始めて、ＭＩに相関する心筋傷害の、有用な、早期特異的マーカーを提供したことになる。これは、有害事象（ＡＥ）による心筋障害の早期診断を可能とし、医師が、他の急性冠状動脈症候群からばかりでなく、胸部痛の他の原因からも、これらの症例を区別することを可能とする。例えば、狭心症、消化器病、肺／胸膜障害など。これは、ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ、ＴｎＴ、およびＴｎＩなどの、現今の心臓バイオマーカーのレベル上昇を待つために現在経験される６から１２時間のウィンドウを著明に短縮する。したがって、より正確な診断および処置をより早く実行することが可能となり、これは、罹患率および死亡率を下げ、よりよい予後結果を与える。
【０２０５】
本発明は、心臓病患者における再還流処置において特別用途を有する。再還流処置は、通常、経皮的冠状動脈処置（例えば、血管形成術）および／または薬理学的処置を含む。薬理学的処置では、血管再生のために血小板溶解剤が通常使用される。補助治療としては、抗凝固および抗血小板療法が挙げられる。再還流処理は、診断後できるだけ早く用いるともっとも効果的である。診断を加速するためのＢＮＰ−ＳＰ試験は、再還流処置の速やかな導入を可能とする。さらに、処置の有効性は、反復試験によって監視することが可能であり、治療は、適宜調整することが可能である。再還流処置の包括的議論については、本明細書におけるＢｒａｕｎｗａｌｄら１を参照されたい。
【０２０６】
心臓病
本発明の方法はさらに、対象において心臓病を診断または予測するために使用することが可能である。
【０２０７】
本出願人らは、急性心臓障害を抱える患者において、ＢＮＰ−ＳＰレベルは、心臓事象後少なくとも６週間は上昇を保つことを示した。心臓病を抱えるか、または心臓病の危険性のある患者は、コントロール集団の、平均コントロールレベルよりも高レベルのＢＮＰ−ＳＰを示すことも同様に予測可能である。本出願人らは、ＢＮＰ−ＳＰのレベルは、ＢＮＰと違って、集団の年齢によって左右されないことを示した。このことは、ＢＮＰ−ＳＰが、心臓病のマーカーとして広い用途を持つことを示唆する。
【０２０８】
心臓移植拒絶
本発明はさらに、心臓移植、一般に、心臓同種移植、通常の組織バイオプシーによる拒絶の、移植中および後におけるＢＮＰ−ＳＰ測定による監視において用途を有する。コントロールレベルに対する、心臓移植後２時間以内に測定されたＢＮＰ−ＳＰレベルの増加は、拒絶発作について予測的または診断的である場合がある。
【０２０９】
本発明はさらに、急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の開始の２時間以内、または提示の２時間以内に対象から得られた生物学的なサンプルにおけるＢＮＰ−ＳＰのアッセイであって、公知の任意の方法を用いて、該サンプルにおけるＢＮＰ−ＳＰレベルを検出および測定することを含むアッセイを提供する。このアッセイはインビトロアッセイであることが好ましい。このような方法としては、前述の公知のアッセイ技術全ての外、ゲル電気泳動技術、ウェスタンブロット、気相スペクトロスコピー、原子間力顕微鏡検査、表面プラズモン共鳴、質量分析が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。２３
一実施態様では、アッセイは、本発明のＢＮＰ−ＳＰ核酸配列の一つ以上に結合する、一つ以上の核酸配列を含む。本発明の核酸配列から、きわめて広範囲のセンスおよびアンチセンスプローブおよびプライマーを設計することが可能である。ＢＮＰ−ＳＰ配列の発現レベルは、前述の、当該技術分野で公知の技術を用いて特定される。アレイは、固相基質、例えば、米国特許第５，７４４，３０５号に記載されるような「チップ」であってもよいし、ニトロセルロース膜であってもよい。
【０２１０】
さらに、本発明のＢＮＰ−ＳＰマーカーによって発現されるタンパクは、アッセイで用い、結果を、正常なコントロールサンプルにおいて発現される同じタンパクの発現レベルと比較することも可能である。タンパクの有無および量は、当該技術分野で公知で、前述したアッセイ方式を用いて評価してもよい。
【０２１１】
サンプルにおけるＢＮＰ−ＳＰの存在は、本発明の抗体などの結合因子に対してＢＮＰ−ＳＰを結合させ、結合したＢＮＰ−ＳＰの量の存在を測定することによって検出するのが好ましい。
【０２１２】
前述のように、その変異体および断片を含むＢＮＰ−ＳＰに対して選択的な抗体は、本発明のさらに別の一局面を形成するが、該抗体は、前述の技術によって調製してもよい。抗体は、本発明の方法およびアッセイにおいて有用である。
【０２１３】
さらに別局面では、本発明は、急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測、診断、または監視するためのキットであって、本発明のＢＮＰ−ＳＰ結合因子を含み、ＡＣＤ、心臓移植拒絶もしくはＡＣＤ／肺障害の開始後、またはその提示の２時間以内に対象から得た生物学的なサンプルとともに使用されるキットを提供する。
【０２１４】
本発明はさらに、急性心臓障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測、診断、または監視するためのキットであって、０．１から５００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１から４００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０から３５０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２０から３００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２５から２５０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３０から１８０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３５から１５０ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは４０から１２０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲のＢＮＰ−ＳＰレベルを測定するように較正されるキットを提供する。
【０２１５】
アッセイの較正は、当該技術分野で公知の技術、例えば、既知レベルのＢＮＰ−ＳＰを含有する血液サンプル、または、それぞれに、異なる既知のレベルのＢＮＰ−ＳＰを含有する、一組の較正体にしたがって実行することが可能である。診断キットに使用される試験ストリップは、通常、製造時に較正される。例えば、米国特許第６，７８０，６４５号を参照されたい。このキットは、生物学的なサンプルにおけるＢＮＰ−ＳＰレベルを測定するのに有用である。検出試薬は、ＢＮＰ−ＳＰ、または該ＢＮＰ−ＳＰマーカーの断片に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列であってもよいし、あるいは、該マーカーによってコードされるポリペプチドに結合する抗体であってもよい。試薬は、前述の固相基質に結合されていてもよいし、あるいは、それらを基質に結合させるための試薬と共にパックされてもよい。固相マトリックスまたは基質は、全て前述した通りの、ビーズ、プレート、チューブ、ディップスティック、ストリップ、またはバイオチップ形状を取ってもよい。
【０２１６】
検出試薬は、洗浄試薬、および結合抗体の検出が可能な試薬（例えば、標識二次抗体）、または、標識抗体との反応が可能な試薬を含む。
【０２１７】
キットはさらに、コントロール試薬（陽性および／または陰性）、および／または、核酸または抗体を検出するための手段を含むと好都合である。キットにはさらに、使用案内、例えば、ＡＣＤ、心臓移植拒絶もしくはＡＣＤ／肺障害の開始後または提示の２時間以内に対象から生物学的なサンプルを採取すること、該サンプルにおいてＢＮＰ−ＳＰのレベルを測定すること、それをコントロールレベルと比較すること、および、結果を心臓状態と関連させることが含められてもよい。一般に、コントロールに対する、ＢＮＰ−ＳＰマーカーレベルの上昇は、ＡＣＤ、または心臓移植拒絶、または、肺障害ではなくＡＣＤであることを示す。
【０２１８】
もっとも一般的には、キットは、当該技術分野で公知のアッセイに相応しい方式を取るが、比較的一般的には、当該技術分野で公知の、ＰＣＲ、ノーザンハイブリダイゼーション、またはサザーンＥＬＩＳＡアッセイ用の方式を取る。
【０２１９】
キットはさらに、ＡＣＤ、移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害のための、一つ以上の追加マーカーを含んでもよい。ＡＣＳの場合、追加マーカーとしては、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｈ−ＦＡＢＰ、エンドテリン、アドレノメジュリン、レニン、およびオングロテンシンＩＩが挙げられる。一実施態様では、これらのマーカーの全てがキットの中に含まれる。
【０２２０】
キットは、一つ以上の容器から構成され、さらに、採集装置、例えば、瓶、バッグ（例えば、静脈内輸液バッグ）、バイアル、シリンジ、および試験管を含んでもよい。少なくとも一つの容器は、ＡＣＤ（特にＡＣＳ）、移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測、診断、監視するのに有効な産物を保持する。この産物は、通常、本発明の核酸分子、ポリペプチド、または結合因子、または、これらの内のいずれかを含む組成物である。好ましい実施態様では、容器の上の、または容器と関連づけられる案内またはラベルは、組成物が、ＡＣＤ（特に、ＡＣＳ）、移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の予測、診断、または監視のために使用されることを示す。他の成分として、針、希釈剤、およびバッファーを含んでもよい。通常、キットは、薬学的に受容可能なバッファー、例えば、リン酸バッファー生理的食塩水、リンゲル液、およびデキストロース液を含む少なくとも一つの容器を含んでもよい。
【０２２１】
ＢＮＰ−ＳＰに選択的に結合する結合因子が、キットに含まれることが望ましい。好ましくは、この結合因子は抗体である。アッセイおよびキットに使用される抗体は、モノクロナールでもポリクロナールでもよく、前述の、任意の哺乳動物において調製されてもよい。抗体は、本発明のＢＮＰ−ＳＰ核酸配列、ＢＮＰ−ＳＰ（１−２６）によってコードされるか、または示される天然ペプチド、またはそれに基づく合成ペプチドに対して調製されてもよく、あるいは、本発明のＢＮＰ−ＳＰペプチドをコードする核酸配列に対して融合される外来配列に対して惹起されてもよい。
【０２２２】
一キット実施態様では、ＢＮＰ−ＳＰ検出試薬は、少なくとも一つのＢＮＰ−ＳＰ検出部位を形成するために、多孔性ストリップなどの固相基質の上に固定される。多孔性ストリップの測定または検出領域は、複数の検出部位、例えば、ＢＮＰ−ＳＰ検出試薬を含む検出部位を含んでもよい。これらの部位は、バー、クロス、ドット、またはその他の配列として配置してもよい。試験ストリップはさらに、陰性および／または陽性コントロール用の部位を含んでもよい。それとは別に、コントロール部位は、異なるストリップの上に設けてもよい。この異なる検出部位は、異なる量の、固定核酸または抗体、例えば、第一検出部位には比較的高い量、後続部位にはより低い量を含んでもよい。試験生物学的なサンプルを添加した場合、検出可能な信号を示す部位の数は、該サンプル中に存在するＢＮＰ−ＳＰの量に関する定量的表示を与える。
【０２２３】
さらにキットの中に含まれてもよいものとして、サンプル分析用デバイスであって、サンプル試験を実行するための適切な成分（マーカー、抗体、および試薬）を含む、ディスポーザブル試験カートリッジを含むデバイスがある。このデバイスは、試験ゾーンおよび試験結果ウィンドウを含むと好都合である。免疫クロマトグラフィーカートリッジは、このようなデバイスの例である。例えば、米国特許第６，３９９，３９８号；米国特許第６，２３５，２４１号、および米国特許第５，５０４，０１３号を参照されたい。
【０２２４】
それとは別に、デバイスは、測定されるマーカーのインプット、保存、および、コントロールレベルおよび他のマーカーレベルに対する該測定マーカーレベルの評価を可能とする電子デバイスであってもよい。米国特許出願公開第２００６／０２３４３１５号は、そのようなデバイスの例を提示する。
【０２２５】
本明細書では、特許明細書、他の外部文書、またはその他の情報源に対して参照がなされてきたが、これは、一般に、本発明の特徴を議論するための背景を示すためである。特に別様に発言しない限り、このような外部文書に対する参照は、このような文書、または、このような情報源が、いかなる法的措置においても、従来技術である、または、当該技術分野における、通常の一般的知識の一部を形成するものであることの承認と見なしてはならない。
【実施例】
【０２２６】
次に、下記の実施例を非限定的に参照しながら、本発明を具体的に説明する。
【０２２７】
（実施例１）
方法
ヒト・プロトコールは全て、ニュージーランド保健省のＵｐｐｅｒ  Ｓｏｕｔｈ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、ヘルシンキ宣言にしたがって実行された。
【０２２８】
化学薬品
合成ヒトＢＮＰシグナルペプチドＢＮＰ−ＳＰ（１−１０）、ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）、およびＢＮＰ−ＳＰ（１−２６）（配列番号１）は、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（オーストラリア）によって合成された。バッファー試薬は全て、ＢＤＨおよび／またはＳｉｇｍａから購入した。ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）は、指向性担体結合のためにＣ末端をシステインによって伸長させて合成した。ＢＮＰ−ＳＰ（１７−２６）も、同じペプチドにおいてトレーサー調製のために、Ｃ末端をチロシル残基によって伸長させた。
【０２２９】
ヒト実験
健康なボランチアによる参照範囲実験のために、１３名の健康なボランチア（６名の女性、平均年齢４３±１２歳（範囲２２−６０歳）、ＢＭＩ  ２４．４±３．９ｋｇ／ｍ２）から、一晩の絶食後、血液サンプルを得た。
【０２３０】
急性心臓傷害におけるＢＮＰ−ＳＰ濃度の分析のために、我々は、Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＣｏｒｏｎａｒｙ  Ｃａｒｅ  Ｕｎｉｔの外来に現れた連続１０名の患者を調べた（４名の女性、平均年齢７０±８歳（範囲５９−７９歳））。患者は、胸痛の開始後、および、血漿トロポニンＴ（ＴｎＴ）の上昇および下降を伴う、ＳＴ上昇急性ＭＩの明白な兆候の出現後６時間以内に外来に到着した。５名の患者は以前に高脂質血症と診断され、４名は高血圧、１名は比較的初期のＭＩを患い、１名は心不全で治療されたことがあり、２名は糖尿病を患っていた。到着時の投薬は、利尿剤（２名の患者）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（２名の患者）、アスピリン（７名の患者）、βブロッカー（２名の患者）であった。１名の患者は、一次的経皮経管環状動脈形成術（前部ＭＩのためのＰＴＣＡ）を受け、９名の患者は、血栓溶解術を受けていた。７名の患者は、病院滞在中ＥＣＧを受けた。全ての患者について見ると、平均駆出割合は５４％であった（範囲、２４−７５％）。平均入院期間は６．６日であった（範囲、３−１５日）。胸痛の開始と、基準線（時間０）の静脈血サンプルの採取の間の時間は、３．９±０．３時間であった。採血のために、１８ゲージの静脈カニューレを前腕静脈に挿入した。Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ｃａｒｅ  Ｕｎｉｔへの提示時に静脈血サンプル（１０ｍｌ）を採取し、その後、入院患者として０．５、１、４、８、１２、２４、および７２時間目、および、通院患者として１、６、および１２週目に採取した。サンプルは氷上の試験管に取り、＋４℃において２７００ｇで５分遠心し、血漿は、分析時まで−８０℃で保存した。
【０２３１】
血漿抽出
血漿サンプルは全て、以前に記載する通り２２、ＳｅｐＰａｋメーカー水、ＵＳＡカートリッジで抽出し、乾燥し、−２０℃で保存し、ＲＩＡおよびＨＰＬＣに備えた。
【０２３２】
ホルモン濃度分析
血漿サンプルは、Ｅｌｅｃｓｙｓ２０１０において不均一免疫アッセイを用い、ＴｎＴ、ＣＫ−ＭＢ、およびミオグロビンに関して定量した。そのために、メーカーの標準的プロトコール、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ１８にしたがってルテニウム標識ビオチニル化抗体を用いた。免疫反応性（ＩＲ）の、ＢＮＰおよびＮ−ＢＮＰ濃度を、我々が以前に記載したアッセイ６−８を用いて測定した。ＢＮＰ−ＳＰは、特異的ＲＩＡによって下記のように測定した。
【０２３３】
ＢＮＰ−ＳＰ  ＲＩＡ
候補のヒトＢＮＰ−ＳＰ  ＩＲペプチドを測定するために、我々は、ヒトのｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（１−２６）シグナル配列（配列番号１）のアミノ酸１７−２６を指向する新規で、特異的なＲＩＡを作製した。
【０２３４】
抗体作製
ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ  Ｃｙｓ２５（１７−２６）を、室温で穏やかに攪拌することによって、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）においてマレミド処理Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシスクシニミドエステル（ＥＭＣＳ）誘導体形成ＢＳＡに結合させた。結合ペプチドを、フロインドのアジュバントで乳化し、２匹のニュージーランド白ウサギに対し、一月間隔で４−５箇所において皮下注射した。注射１２日後に、抗体力価を評価するためにウサギから採血し、これを十分なレベルが実現されるまで行った。ＲＩＡにおいて、ＩＲは、抗血清を１：６０００の最終希釈度で用いて定量した。この抗血清は、ヒトのｐｒｏＢＮＰ（１−１３）、ｐｒｏＢＮＰ（１−７６）、ｐｒｏＡＮＰ（１−３０）、ＡＮＰ、ＢＮＰ、エンドテリン１、アンギオテンシンＩＩ、アンギオテンシン（１−７）、ウロテンシンＩＩ、ＣＮＰ、ｐｒｏＣＮＰ（１−１５）、アドレノモジュリン、ウロコルチンＩおよびウロコルチンＩＩと検出可能な交差反応性を持たない（全て＜０．０１％）。
【０２３５】
ヨウ素化およびアッセイ法
ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ  Ｔｙｒ２５（１７−２６）は、以前に記載した通りに２２、クロラミンＴ法によってヨウ素化し逆相ＨＰＬＣで精製した。サンプル、標準、放射性トレーサー、および抗血清液は全て、カリウム系アッセイバッファーで希釈した。２２１００μＬの抗血清と混ぜ合わせた、１００μＬのサンプルまたは標準（０−６４０ｐｍｏｌのヒトｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（１７−２６））から成るアッセイインキュベーション体を、渦巻き攪拌し、４℃で２４時間インキュベートした。次に、１００μＬのトレーサー（４０００−５０００ｃｐｍ）を加え、さらに４℃で２４時間インキュベートした。遊離および結合免疫活性体は、最終的に、固相二次抗体法（ロバ抗ウサギＳａｃ−Ｃｅｌ）によって分離し、Ｇａｍｍａｍａｓｔｅｒカウンター（ＬＫＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でカウントした。
【０２３６】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
血漿抽出物に対し、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷペプチドカラム（Ｔｏｙｏｓｏｄａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）において、０．２５／ｍｌ／分の流速下６０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸のイソクラティック条件を用い、室温でサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を行った。分画を１分間隔で収集し、これに対しＢＮＰ−ＳＰ  ＲＩＡを行った。ＳＥ−ＨＰＬＣカラムは、デキストランブルー（Ｖｏ）、チトクロームＣ（約Ｍｒ  １２，４００）、ラットＢＮＰ４５（約Ｍｒ  ５，０００）、アンギオテンシンＩＩ（約Ｍｒ  １，０４５）、およびグリシン（Ｖｔ）を用いて較正した。次に、ＳＥ−ＨＰＬＣ／ＲＩＡによって特定されたＢＮＰ−ＳＰ  ＩＲについてさらに、その特性を、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）で解明した。溶出は、１ｍｌ／分の流速下、１２％−４８％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの直線的溶出勾配４０分であった。１分時分画を収集し、気流で乾燥し、ＳＥ−ＨＰＬＣと同様にしてＲＩＡを行った。ＲＰ−ＨＰＬＣは、合成ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（１７−２６）を用いて較正した。
【０２３７】
統計学的分析
結果は全て平均±ＳＥＭで表した。経時データは、反復測定については二元配置分散分析、次いで最小有意差多重比較を用いて分析した。血漿のホルモン濃度の相関分析は、一般的直線回帰モデルを用いて実行した。全ての分析においてＰ値＜０．０５を有意と見なした。
【０２３８】
結果
ＢＮＰの２６アミノ酸ＳＰ、またはそれから得られる断片が、ヒトの循環中に存在するかどうかを決めるために、我々は、ｐｒｅｐｒｏＢＮＰ（１−２６）の残基１７−２６（ＢＮＰ−ＳＰ、図２）を指向する、特異的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を開発した。血漿抽出物の希釈は、標準曲線と平行関係を示し（図３）、健康なヒトにおけるＢＮＰ−ＳＰの血漿濃度は、９．６±２．２ｐｍｏｌ／Ｌ（ｎ＝１３）であった。健康なヒトでは、ＢＮＰ−ＳＰ  ＩＲの血中濃度は、年齢との有意な相関を示さない（図４）。しかしながら、ＢＮＰ−ＳＰの血漿レベルは、その近縁ペプチドＢＮＰおよびＮ−ＢＮＰのものと似てはいるものの、いずれのペプチドとも相関しない（図５）。
【０２３９】
逆相（ＲＰ）およびサイズ排除（ＳＥ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるＩＲ血漿ＢＮＰ−ＳＰの生化学的分析から、我々の特異的ＲＩＡは、ＳＥ−ＨＰＬＣでは、ほぼＭｒ  １，０００−２，０００において、ＲＰ−ＨＰＬＣでは、合成ＢＮＰ−ＳＰの溶出時間と近似して溶出する、ＢＮＰ−ＳＰ断片（単数または複数）を検出することが示唆される（図６）。
【０２４０】
ＩＲ  ＢＮＰ−ＳＰペプチドがヒトの血漿に存在することを確かめたので、次に我々は、ＡＭＩと診断された患者（ｎ＝１０、図７）においてＩＲ  ＢＮＰ−ＳＰの経時濃度を測定した。ＩＲ  ＢＮＰ−ＳＰの最高濃度は、入院時に観察され、６週間に亘って安定レベルにゆっくりと降下した。重要なことは、入院時の平均ピークレベルは、健康な正常ボランチアのレベルよりも７倍高く（範囲４−１２倍）、６週まで３倍の高値を持続した。このパターンは、そのピークレベルが、入院後２４時間にして始めて現れるＢＮＰおよびＮ−ＢＮＰのそれと対照的である（図７）。ミオグロビンのピーク濃度は、入院後１−２時間で出現したが、一方、ＴｎＴおよびＣＫ−ＭＢのピークレベルは、入院後８−１２時間まで達成されなかった。
【０２４１】
（実施例２）
臨床的に安定な、ＡＣＳを疑われる３２名の患者にカテーテルを挿入し、複数の器官部位から血液サンプルを採取した：挿入部位は、大腿動脈（ＦＡ）、肝静脈（ＨＶ、下大静脈（ＩＶＣ）、心臓冠状洞静脈（ＣＳ）、および肺動脈（ＰＡ）である。血液は、冷却ＥＤＴＡチューブに採取し、遠心によって血漿から調製し、この血漿に対してＢＮＰ−ＳＰ  ＲＩＡを行った。図９は、ＢＮＰ−ＳＰ濃度の、もっとも高い部位が、心臓、特に心室からの血液を排出する静脈、ＣＳであることをはっきりと示す。これは、心臓が、ＢＮＰ−ＳＰ分泌の主要部位であることの強力な証拠であり、従来から心臓でもっとも高いとされているＢＮＰの遺伝子発現パターンと一致する。
【０２４２】
結論
臨床的に安定な患者におけるＢＮＰ−ＳＰの循環濃度は、心臓に由来する。この顕著な心臓分泌は、ＢＮＰ−ＳＰが心臓ホルモンであるとする考えと一致する。
【０２４３】
考察
本証拠は、ｐｒｅｐｒｏＢＮＰのシグナルペプチドが、ＡＣＤ患者の提示の２時間以内、またはＡＣＤの開始の２時間以内に、循環および細胞外空間に存在することを記録する最初のものである。我々は、第１例として、血中のＢＮＰ−ＳＰの測定は、急性心臓虚血症および／またはその後の傷害に関する高速バイオマーカーとなる可能性を有すること、第２例として、その事象後のＢＮＰ−ＳＰ測定は、長期の予後および結果判定に関するマーカーとして有益に利用される可能性を有することを示す。
【０２４４】
当業者であれば、上述の説明は、例示のために与えられるものであり、本発明はこれらに限定されるものではないことを当然了解されるであろう。
【０２４５】
（参考文献）
【０２４６】
【化１】
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【０２４７】
【化２】
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【０２４８】
【化３】
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【０２４９】
このリストおよび本明細書全体を通しての全ての参考文献および引用文献（特許明細書を含む）は、それらの全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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