(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体系活性化部位への補体モジュレーターの標的化送達が可能な、構築物を含む可溶性組成物であって、該構築物が、
(a)補体レセプター2(CR2)の少なくとも最初の二つのN末端ショートコンセンサスリピート(SCR)ドメインを含むCR2部分と;
(b)補体阻害物質又はその生物活性断片である、補体モジュレーター部分と
を含み、
該CR2部分が、CR2部分が配列番号2の配列を有する構築物と比較して、EBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を低下させる、配列番号2のN11及びY64からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含有するか、又は該CR2部分が、CR2部分が配列番号2の配列を有する構築物と比較して、インターフェロンα(IFNα)に対するCR2部分の結合親和性を低下させる、配列番号2のS42及びK50からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、
該CR2部分における該少なくとも一つのアミノ酸置換が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンへの置換である、可溶性組成物。
【請求項２】
置換される前記少なくとも一つのアミノ酸が配列番号2のN11又はY64であり、前記構築物がEBV gp350に対する低下した結合親和性を示す、請求項1に記載の可溶性組成物。
【請求項３】
置換される前記少なくとも一つのアミノ酸が配列番号2のS42又はK50であり、前記構築物がIFNαに対する低下した結合親和性を示す、請求項1に記載の可溶性組成物。
【請求項４】
前記構築物が融合タンパク質である、請求項1に記載の可溶性組成物。
【請求項５】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片が、ヒトH因子(配列番号5)若しくはその生物活性断片、マウスH因子(配列番号8)若しくはその生物活性断片、抗補体成分5(C5)抗体若しくはその抗原結合断片、抗因子B抗体若しくはその抗原結合断片、抗D因子抗体若しくはその抗原結合断片、抗プロパージン抗体若しくはその抗原結合断片、ヒト膜補体タンパク質(MCP)(配列番号10)若しくはその生物活性断片、ヒト崩壊促進因子(DAF)(配列番号11)若しくはその生物活性断片、マウスDAF(配列番号12)若しくはその生物活性断片、マウス補体レセプター1-関連遺伝子/タンパク質y(Crry)(配列番号4)若しくはその生物活性断片、ヒトCD59(配列番号3)若しくはその生物活性断片、マウスCD59アイソフォームA(配列番号6)若しくはその生物活性断片、マウスCD59アイソフォームB(配列番号7)若しくはその生物活性断片、及びヒト補体レセプター1(CR1)(配列番号9)若しくはその生物活性断片からなる群から選択される、請求項1に記載の可溶性組成物。
【請求項６】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がヒト膜補体タンパク質(MCP)(配列番号10)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項７】
ヒトMCP(配列番号10)の前記生物活性断片が、SCR1-4(配列番号10のアミノ酸35〜285)、SCR1-4とセリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号10のアミノ酸35〜326)、及びMCPの細胞外ドメイン(配列番号10のアミノ酸35〜343)からなる群から選択される、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項８】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がヒトDAF(配列番号11)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項９】
ヒトDAF(配列番号11)の前記生物活性断片が、SCR1-4(配列番号11のアミノ酸25〜285)及びSCR1-4とO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号11のアミノ酸25〜353)からなる群から選択される、請求項8に記載の可溶性組成物。
【請求項１０】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がマウスDAF(配列番号12)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項１１】
マウスDAF(配列番号12)の前記生物活性断片が、SCR1-4(配列番号12のアミノ酸35〜286)及びSCR1-4とO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号12のアミノ酸35〜362)からなる群から選択される、請求項10に記載の可溶性組成物。
【請求項１２】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がCrry(配列番号4)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項１３】
Crry(配列番号4)の前記生物活性断片が、SCR1-5(配列番号4のアミノ酸41〜400)及びマウスCrryタンパク質の細胞外ドメイン(配列番号4のアミノ酸41〜405)からなる群から選択される、請求項12に記載の可溶性組成物。
【請求項１４】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がヒトCD59(配列番号3)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項１５】
ヒトCD59(配列番号3)の前記生物活性断片が、GPIアンカーを欠損しているヒトCD59の細胞外ドメイン(配列番号3のアミノ酸26〜101)を含む、請求項14に記載の可溶性組成物。
【請求項１６】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がマウスCD59アイソフォームA(配列番号6)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項１７】
マウスCD59アイソフォームA(配列番号6)の前記生物活性断片が、GPIアンカーを欠損しているマウスCD59、アイソフォームAの細胞外ドメイン(配列番号6のアミノ酸24〜95)を含む、請求項16に記載の可溶性組成物。
【請求項１８】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がマウスCD59アイソフォームB(配列番号7)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項１９】
マウスCD59アイソフォームB(配列番号７)の前記生物活性断片が、GPIアンカーを欠損しているマウスCD59、アイソフォームBの細胞外ドメイン(配列番号7のアミノ酸24〜103)を含む、請求項18に記載の可溶性組成物。
【請求項２０】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がヒトCR1(配列番号9)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項２１】
ヒトCR1(配列番号9)の前記生物活性断片がSCR1-3(配列番号9の42〜234のアミノ酸)、SCR1-4(配列番号9のアミノ酸42〜295)、SCR1-10(配列番号9のアミノ酸42〜684)、SCR8-10(配列番号9の491〜684のアミノ酸)、SCR8-11(配列番号9のアミノ酸491〜745)、SCR15-17(配列番号9の941〜1134のアミノ酸)、SCR15-18(配列番号9のアミノ酸941〜1195)、及びSCR22-28(配列番号9のアミノ酸1394〜1842)からなる群から選択される、請求項20に記載の可溶性組成物。
【請求項２２】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がヒトH因子(配列番号5)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項２３】
ヒトH因子(配列番号5)の前記生物活性断片が、SCR1-4(配列番号5のアミノ酸21〜262)、SCR1-5(配列番号5のアミノ酸21〜320)、SCR1-8(配列番号5のアミノ酸21〜507)、及びSCR1-18(配列番号5のアミノ酸21〜1104)からなる群から選択される、請求項22に記載の可溶性組成物。
【請求項２４】
前記補体阻害物質又はその生物活性断片がマウスH因子(配列番号8)又はその生物活性断片を含む、請求項5に記載の可溶性組成物。
【請求項２５】
マウスH因子(配列番号8)の前記生物活性断片が、SCR1-4(配列番号8のアミノ酸19〜264)、SCR1-5(配列番号8のアミノ酸19〜322)、SCR1-8(配列番号8のアミノ酸19〜507)、及びSCR1-18(配列番号8のアミノ酸19〜1109)からなる群から選択される、請求項24に記載の可溶性組成物。
【請求項２６】
前記構築物が、CR2部分が前記少なくとも一つのアミノ酸置換を含有していない構築物と比較して、補体成分3(C3)タンパク質分解断片の少なくとも一つに対して同等の結合親和性を示す、請求項1〜25のいずれか一項に記載の可溶性組成物。
【請求項２７】
前記C3タンパク質分解断片の少なくとも一つが、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2に結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される、請求項26に記載の可溶性組成物。
【請求項２８】
前記構築物のCR2部分中の前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、アミノ酸アラニンへの置換である、請求項1〜27のいずれか一項に記載の可溶性組成物。
【請求項２９】
前記構築物が、リンカーを有する又は有さない融合タンパク質である、請求項1〜28のいずれか一項に記載の可溶性組成物。
【請求項３０】
静脈注射、腹腔内注射若しくは眼球内注入、又は経口投与用に製剤化された、請求項1〜29のいずれか一項に記載の可溶性組成物。
【請求項３１】
補体関連疾患又は症状を治療するための、請求項1〜30のいずれか一項に記載の可溶性組成物。
【請求項３２】
一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合するが、EBV gp350又はIFNαに選択的に結合しない構築物の作製方法であって、
(a)配列番号2のN11及びY64からなる群から選択される位置で、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップと、
(b)配列番号2のS42及びK50からなる群から選択される位置で、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップと
を含み、
前記構築物が、
(i)補体レセプター2(CR2)タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含むCR2部分と;
(ii)補体阻害物質又はその生物活性断片と
を含み、
前記CR2部分中の前記一つ又は複数のアミノ酸が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンへ変異される、方法。
【請求項３３】
前記構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数の変異がアミノ酸アラニンへの変異である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
配列番号2のR13、Y16、A22、R28、S32、R36、K41、K48、K57、K67、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される位置で、前記構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップをさらに含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
(a)補体レセプター2(CR2)の少なくとも最初の二つのN末端ショートコンセンサスリピート(SCR)ドメインを含むCR2部分と;
(b)補体阻害物質又はその生物活性断片と
を含む構築物の、EBV-gp350に対する結合親和性を低下させる方法であって、配列番号2のN11及びY64からなる群から選択されるCR2部分の少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させることを含み、前記CR2部分の前記少なくとも一つのアミノ酸残基が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンへ変異される、方法。
【請求項３６】
(a)補体レセプター2(CR2)の少なくとも最初の二つのN末端ショートコンセンサスリピート(SCR)ドメインを含むCR2部分と;
(b)補体モジュレーター部分と
を含む構築物の、IFNαに対する結合親和性を低下させる方法であって、配列番号2のS42及びK50からなる群から選択されるCR2部分の少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させることを含み、前記CR2部分の前記少なくとも一つのアミノ酸残基が、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、又はロイシンへ変異される、方法。
【請求項３７】
補体関連疾患又は症状を有する被験体を治療するための医薬の調製における、請求項1〜30のいずれか一項に記載の可溶性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2010年5月14日出願の米国仮特許出願第61/345,035号の優先権を主張するものであり、当該出願の開示をこれによりその全内容を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【０００２】
技術分野
本願は、補体阻害物質を含む治療用製剤を炎症部位へ標的化送達するための改善された組成物に関係する。
【０００３】
連邦支援の委託研究又は開発に関する記述
本発明は、国立衛生研究所から助成金番号RO1-CA53617の支援を受けた業務の間に一部なされたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト補体レセプター2(CR2/CD21)は、15又は16のショートコンセンサスリピート(SCR)細胞外ドメイン、28アミノ酸の1回膜貫通ドメイン及び34アミノ酸の短い細胞内ドメインから構成される145キロダルトン(「kDa」)の膜貫通型タンパク質である(1-5)。それぞれの細胞外SCRは、約60〜70個のアミノ酸残基を含み、3〜8個のアミノ酸残基のリンカー領域により連結されている。全てのSCRは、4個のシステイン残基を含む多数の保存的アミノ酸残基を含有しており、それらはCys1-Cys3及びCys2-Cys4を連結するジスルフィド架橋のパターンを形成する。CR2は主としてB細胞上に存在しており、そこでは、正常な体液性及び細胞性免疫反応を促進する他の膜タンパク質との複合体で見られる(6-9)。最も末端に配置されている(すなわちアミノ末端の)SCRドメイン、SCR1-2を用いて、CR2は、次の四つの分類のリガンドと結合する:補体成分3(C3)タンパク質分解断片iC3b、C3dg及びC3d(10、11);エプスタインバーウイルス(EBV)糖タンパク質gp350/220(gp350)(12-14);低親和性IgEレセプターCD23(15、16);並びにサイトカインインターフェロンα(IFNα)(17-19)。
【０００５】
CR2の主な役割は、増強されたシグナル伝達による抗原介在性B細胞活性化に対するB細胞コレセプターとして機能することである(20、21)。C3dが抗原に共有結合で結合される場合、この機能はC3d及び表面IgMを介してコライゲーションにより行なわれる(22-28)。またCR2は、エンベロープ表面糖タンパク質gp350を介した、EBVに対する絶対的細胞レセプター(obligate cellular receptor)でもある(12、20、29-31)。実際の細胞EBV感染は、gp350へのCR2のライゲーションがウイルスを細胞表面の十分間近に連結した後(14、32、33)、ウイルスgp42をヒト白血球抗原クラスII分子に結合させ(34、35)、続いて、三つのさらなるウイルス糖タンパク質gB、gH及びgLを介した宿主細胞融合を誘発させる(36-38)ことにより生じる。IFNαはCR2のリガンドであることが明らかになっているが、その相互作用の生理学的重要性については依然として解明されていない(17-19)。しかし、IFNα及びCR2が自己免疫疾患全身性エリテマトーデスの発症に関与している可能性があることが示唆されている(39-41)。
【０００６】
CR2-gp350相互作用に関する構造的研究とは別に突然変異誘発研究からは、相互作用に必要なCR2上の残基が示唆されている(20、42、43)。ELISA及びフローサイトメトリーを用いて、gp350及びCR2の結合に対するCR2変異体候補が試験された(20、42、43)。最近の研究では、変異した場合にgp350結合に対して悪影響を及ぼすことが分かったCR2上の特定の残基には、R13、S15、R28、R36、K41、K57、K67、R83及びR89が含まれていた(42、43)。別の研究において、SCR1の第1の保存的システイン間領域内の残基P8〜S15及びSCR1とSCR2の間のリンカー領域もまた、gp350の結合の発生に必須であることが明らかにされた(20)。これらのデータは、gp350分子をターゲットとする個別の突然変異誘発分析と併用して、ソフトドッキングプログラムHADDOCKを利用するコンピューターでのCR2-gp350相互作用モデルを作動させるために用いた(43-45)。この分析からは、CR2上の主要相互作用がSCR1と、SCR2へSCR1を結合するリンカー領域との間にあり、またgp350に関しては、ドメイン1とドメイン2の間のリンカー領域にあることが示唆された(43)。
【０００７】
IFNαがgp350結合及びC3d結合の両方を擬態するとの知見から、さらに三つのリガンド全部がCR2上の類似領域に結合するという観察から、CR2がIFNαに対するレセプターとして示唆された(18、19)。その上、この擬態は機能性であることも示された(18)。C3d及びIFNαの両構造が解明された後に、推定上のCR2結合配列が類似の構造モチーフを有していることが判明した。IFNαは、程度の差はあるが、完全長からSCR1-2までのCR2の様々な形態に結合し得ると記載されている(17)。CR2はIFNαに対するレセプターであることがわかったが、CR2 SCR1-2内のIFNα結合部位は未知である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
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【非特許文献８】Holers, V. M. (1995) Mosby, 363-391.
【非特許文献９】Tolnay, M., and Tsokos, G. C. (1998) Clin. Immunol. Immunopathol. 88, 123-132.
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらのリガンドへの結合に関与する具体的なアミノ酸残基を同定するために公知のリガンドを用いてCR2相互作用をさらに分析することにより、それぞれの公知のCR2リガンド(例えば、C3タンパク質分解断片iC3b、C3dg及びC3d;EBV糖タンパク質gp350;CD23;並びにIFNα)に対して規定の結合特異性を持つ改変CR2分子を設計することが可能となろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書は、補体活性のモジュレーターを選択的に送達することができる可溶性タンパク質に向けた組成物及び方法を提供する。これらのモジュレーターの標的化送達は、CR2の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインに対応する組成物のターゲティングタンパク質部分中の特定アミノ酸を選択的に変異させることにより達成される。ターゲティング部分へ導入される変異の特定の組み合わせに応じて、補体活性モジュレーターは、補体系の活性化又は抑制が望まれる部位のCR2の特定リガンドに選択的に送達され得る。
【００１１】
したがって、一態様において、本明細書は、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と;(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。
【００１２】
特定の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、補体阻害物質又はその生物活性断片は、ヒト膜補体タンパク質(MCP)(配列番号10)、ヒト崩壊促進因子(DAF)(配列番号11)、マウスDAF(配列番号12)、マウス補体レセプター1-関連遺伝子/タンパク質y(Crry)(配列番号4)、ヒトCD59(配列番号3)、マウスCD59アイソフォームA(配列番号6)、マウスCD59アイソフォームB(配列番号7)、ヒト補体レセプター1(CR1)(配列番号9)、ヒトH因子(配列番号5)、及びマウスH因子(配列番号8)からなる群から選択される。
【００１３】
特定の実施形態において、補体阻害物質はヒト膜補体タンパク質(MCP)(配列番号10)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ヒトMCP(配列番号10)の生物活性断片は、SCR1-4(配列番号10のアミノ酸35〜285)、SCR1-4とセリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号10のアミノ酸35〜326)、及びMCPの細胞外ドメイン(配列番号10のアミノ酸35〜343)からなる群から選択される。特定の実施形態において、補体阻害物質はヒトDAF(配列番号11)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ヒトDAF(配列番号11)の生物活性断片は、SCR1-4(配列番号11のアミノ酸25〜285)及びSCR1-4とO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号11のアミノ酸25〜353)からなる群から選択される。特定の実施形態において、補体阻害物質はマウスDAF(配列番号12)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、マウスDAF(配列番号12)の生物活性断片は、SCR1-4(配列番号12のアミノ酸35〜286)及びSCR1-4とO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号12のアミノ酸35〜362)からなる群から選択される。特定の実施形態において、補体阻害物質はCrry(配列番号4)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、Crry(配列番号4)の生物活性断片は、SCR1-5(配列番号4のアミノ酸41〜400)及び細胞外ドメインマウスCrryタンパク質(配列番号4のアミノ酸41〜405)からなる群から選択される。特定の実施形態において、補体阻害物質はヒトCD59(配列番号3)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ヒトCD59(配列番号3)の生物活性断片は、GPIアンカーを欠損しているヒトCD59の細胞外ドメイン(配列番号3のアミノ酸26〜101)を含む。特定の実施形態において、補体阻害物質はマウスCD59アイソフォームA(配列番号6)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、マウスCD59アイソフォームA(配列番号6)の生物活性断片は、GPIアンカーを欠損しているマウスCD59、アイソフォームAの細胞外ドメイン(配列番号6のアミノ酸24〜95)を含む。特定の実施形態において、補体
阻害物質はマウスCD59アイソフォームB(配列番号7)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、マウスCD59アイソフォームB(配列番号７)の生物活性断片は、GPIアンカーを欠損しているマウスCD59、アイソフォームBの細胞外ドメイン(配列番号7のアミノ酸24〜103)を含む。特定の実施形態において、補体阻害物質はヒトCR1(配列番号9)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ヒトCR1(配列番号9)の生物活性断片は、SCR1-3(配列番号9の42〜234のアミノ酸)、SCR1-4(配列番号9のアミノ酸42〜295)、SCR1-10(配列番号9のアミノ酸42〜684)、SCR8-10(配列番号9の491〜684のアミノ酸)、SCR8-11(配列番号9のアミノ酸491〜745)、SCR15-17(配列番号9の941〜1134のアミノ酸)、SCR15-18(配列番号9のアミノ酸941〜1195)、及びSCR22-28(配列番号9のアミノ酸1394〜1842)からなる群から選択される。特定の実施形態において、補体阻害物質はヒトH因子(配列番号5)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ヒトH因子(配列番号5)の生物活性断片は、SCR1-4(配列番号5のアミノ酸21〜262)、SCR1-5(配列番号5のアミノ酸21〜320)、SCR1-8(配列番号5のアミノ酸21〜507)、及びSCR1-18(配列番号5のアミノ酸21〜1104)からなる群から選択される。特定の実施形態において、補体阻害物質はマウスH因子(配列番号8)又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、マウスH因子(配列番号8)の生物活性断片は、SCR1-4(配列番号8のアミノ酸19〜264)、SCR1-5(配列番号8のアミノ酸19〜322)、SCR1-8(配列番号8のアミノ酸19〜507)、及びSCR1-18(配列番号8のアミノ酸19〜1109)からなる群から選択される。
【００１４】
特定の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、補体活性化物質又はその生物活性断片は、ヒトIgG1、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM、マウスIgM Fcドメイン及びコブラ毒因子(CVF)からなる群から選択される。
【００１５】
特定の実施形態において、CR2又はその生物活性断片がいかなるアミノ酸置換も含有していない構築物と比較して、構築物はEBV-gp350又はIFNαに対する低下した結合親和性を示す。特定の実施形態において、CR2又はその生物活性断片がいかなるアミノ酸置換も含有していない構築物と比較して、構築物はEBV-gp350に対する低下した結合親和性を示す。特定の実施形態において、CR2又はその生物活性断片は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、CR2又はその生物活性断片がいかなるアミノ酸置換も含有していない構築物と比較して、構築物はIFNαに対する低下した結合親和性を示す。特定の実施形態において、CR2又はその断片は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基への少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する。
【００１６】
別の態様においては、本明細書は、構築物の結合親和性を低下させる方法であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有しているCR2部分と;(b)補体モジュレーター部分とを含み、EBV-gp350に関し、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させることを含む方法を提供する。
【００１７】
別の態様においては、本明細書は、構築物の結合親和性を低下させる方法であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有しているCR2部分と;(b)補体モジュレーター部分とを含み、IFNαに関し、S42及びK50からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させることを含む方法を提供する。
本発明はまた、以下に関する。
[１]
構築物を含む補体系活性化部位への補体モジュレーターの標的化送達が可能な可溶性組成物であって、構築物が、
(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と;
(b)補体モジュレーター部分
とを含み、
CR2部分が、EBV gp350及びインターフェロンα(IFNα)に対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物。
[２]
EBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも一つのアミノ酸置換がN11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択され、IFNαに対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも一つのアミノ酸置換がS42及びK50からなる群から選択される、[１]に記載の可溶性組成物。
[３]
構築物が融合タンパク質である、[１]に記載の可溶性組成物。
[４]
補体モジュレーター部分が補体阻害物質又はその生物活性断片を含む、[１]に記載の可溶性組成物。
[５]
補体阻害物質又はその生物活性断片が、ヒト膜補体タンパク質(MCP)(配列番号10)、ヒト崩壊促進因子(DAF)(配列番号11)、マウスDAF(配列番号12)、マウス補体レセプター1-関連遺伝子/タンパク質y(Crry)(配列番号4)、ヒトCD59(配列番号3)、マウスCD59アイソフォームA(配列番号6)、マウスCD59アイソフォームB(配列番号7)、ヒト補体レセプター1(CR1)(配列番号9)、ヒトH因子(配列番号5)、及びマウスH因子(配列番号8)からなる群から選択される、[３]に記載の可溶性組成物。
[６]
補体阻害物質がヒト膜補体タンパク質(MCP)(配列番号10)又はその生物活性断片を含む、[４]に記載の可溶性組成物。
[７]
ヒトMCP(配列番号10)の生物活性断片が、SCR1-4(配列番号10のアミノ酸35〜285)、SCR1-4とセリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号10のアミノ酸35〜326)、及びMCPの細胞外ドメイン(配列番号10のアミノ酸35〜343)からなる群から選択される、[５]に記載の可溶性組成物。
[８]
補体阻害物質がヒトDAF(配列番号11)又はその生物活性断片を含む、[４]に記載の可溶性組成物。
[９]
ヒトDAF(配列番号11)の生物活性断片が、SCR1-4(配列番号11のアミノ酸25〜285)及びSCR1-4とO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号11のアミノ酸25〜353)からなる群から選択される、[７]に記載の可溶性組成物。
[１０]
補体阻害物質がマウスDAF(配列番号12)又はその生物活性断片を含む、[４]に記載の可溶性組成物。
[１１]
マウスDAF(配列番号12)の生物活性断片が、SCR1-4(配列番号12のアミノ酸35〜286)及びSCR1-4とO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号12のアミノ酸35〜362)からなる群から選択される、[９]に記載の可溶性組成物。
[１２]
補体阻害物質がCrry(配列番号4)又はその生物活性断片を含む、[４]に記載の可溶性組成物。
[１３]
Crry(配列番号4)の生物活性断片が、SCR1-5(配列番号4のアミノ酸41〜400)及びマウスCrryタンパク質の細胞外ドメイン(配列番号4のアミノ酸41〜405)からなる群から選択される、[１１]に記載の可溶性組成物。
[１４]
補体阻害物質がヒトCD59(配列番号3)又はその生物活性断片を含む、[４]に記載の可溶性組成物。
[１５]
ヒトCD59(配列番号3)の生物活性断片が、GPIアンカーを欠損しているヒトCD59の細胞外ドメイン(配列番号3のアミノ酸26〜101)を含む、[１３]に記載の可溶性組成物。
[１６]
補体阻害物質がマウスCD59アイソフォームA(配列番号6)又はその生物活性断片を含む、[４]に記載の可溶性組成物。
[１７]
マウスCD59アイソフォームA(配列番号6)の生物活性断片が、GPIアンカーを欠損しているマウスCD59、アイソフォームAの細胞外ドメイン(配列番号6のアミノ酸24〜95)を含む、[１５]に記載の可溶性組成物。
[１８]
補体阻害物質がマウスCD59アイソフォームB(配列番号7)又はその生物活性断片を含む、[４]に記載の可溶性組成物。
[１９]
マウスCD59アイソフォームB(配列番号７)の生物活性断片が、GPIアンカーを欠損しているマウスCD59、アイソフォームBの細胞外ドメイン(配列番号7のアミノ酸24〜103)を含む、[１７]に記載の可溶性組成物。
[２０]
補体阻害物質がヒトCR1(配列番号9)又はその生物活性断片を含む、[３]に記載の可溶性組成物。
[２１]
ヒトCR1(配列番号9)の生物活性断片がSCR1-3(配列番号9の42〜234のアミノ酸)、SCR1-4(配列番号9のアミノ酸42〜295)、SCR1-10(配列番号9のアミノ酸42〜684)、SCR8-10(配列番号9の491〜684のアミノ酸)、SCR8-11(配列番号9のアミノ酸491〜745)、SCR15-17(配列番号9の941〜1134のアミノ酸)、SCR15-18(配列番号9のアミノ酸941〜1195)、及びSCR22-28(配列番号9のアミノ酸1394〜1842)からなる群から選択される、[１９]に記載の可溶性組成物。
[２２]
補体阻害物質がヒトH因子(配列番号5)又はその生物活性断片を含む、[４]に記載の可溶性組成物。
[２３]
ヒトH因子(配列番号5)の生物活性断片が、SCR1-4(配列番号5のアミノ酸21〜262)、SCR1-5(配列番号5のアミノ酸21〜320)、SCR1-8(配列番号5のアミノ酸21〜507)、及びSCR1-18(配列番号5のアミノ酸21〜1104)からなる群から選択される、[２１]に記載の可溶性組成物。
[２４]
補体阻害物質がマウスH因子(配列番号8)又はその生物活性断片を含む、[４]に記載の可溶性組成物。
[２５]
マウスH因子(配列番号8)の生物活性断片が、SCR1-4(配列番号8のアミノ酸19〜264)、SCR1-5(配列番号8のアミノ酸19〜322)、SCR1-8(配列番号8のアミノ酸19〜507)、及びSCR1-18(配列番号8のアミノ酸19〜1109)からなる群から選択される、[２３]に記載の可溶性組成物。
[２６]
補体モジュレーター部分が補体活性化物質又はその生物活性断片を含む、[１]に記載の可溶性組成物。
[２７]
補体活性化物質又はその生物活性断片がヒトIgG1、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM、マウスIgM Fcドメイン及びコブラ毒因子(CVF)からなる群から選択される、[２５]に記載の可溶性組成物。
[２８]
CR2又はその生物活性断片がいかなるアミノ酸置換も含有していない構築物と比較して、構築物がEBV-gp350又はIFNαに対する低下した結合親和性を示す、[１]に記載の可溶性組成物。
[２９]
CR2又はその生物活性断片がいかなるアミノ酸置換も含有していない構築物と比較して、構築物がEBV-gp350に対する低下した結合親和性を示す、[２７]に記載の可溶性組成物。
[３０]
CR2又はその生物活性断片がN11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、[２８]に記載の可溶性組成物。
[３１]
CR2又はその生物活性断片がいかなるアミノ酸置換も含有していない構築物と比較して、構築物がIFNαに対する低下した結合親和性を示す、[２７]に記載の可溶性組成物。
[３２]
CR2又はその断片が、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基への少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、[３０]に記載の可溶性組成物。
[３３]
一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合するが、EBV gp350又はIFNαに選択的に結合しない構築物の作製方法であって、
(a)N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップと、
(b)S42及びK50からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップ
とを含み、
前記構築物が、
(i)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と;
(ii)補体モジュレーター部分
とを含む、方法。
[３４]
構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数の変異がアミノ酸アラニンへの変異である、[３３]に記載の方法。
[３５]
R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップをさらに含む、[３３]に記載の方法。
[３６]
N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させることを含む、EBV-gp350に対する[１]に記載の構築物のCR2部分の結合親和性を低下させる方法。
[３７]
S42及びK50からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させることを含む、IFNαに対する[１]に記載の構築物のCR2部分の結合親和性を低下させる方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】NMR滴定分析が、CR2のSCR1及びSCR2が共にgp350のライゲートに関係することを示す図である。gp350の量を増加させながら滴定する間に収集した15N-標識化CR2 SCR1-2(1/3X PBS中、0.6mM)の2つの重ね合わせた1H-15N横緩和最適化スペクトロスコピー−異核単一量子コヒーレンス(Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy-Heteronuclear Single Quantum Coherence: TROSY-HSQC)スペクトル。黒はgp350なし、灰色は飽和量のgp350。挿入図は化学シフト変化の詳細図。CR2に関してここで使用したナンバリング方法は、成熟タンパク質に関するアミノ酸配列に基づく。
【図２】NMR滴定分析が、CR2のSCR1及びSCR2が両方ともIFNαのライゲートに関係することを示す図である。IFNαの量を増やしながら滴定する間に収集した15N-標識化CR2 SCR1-2(1/3X PBS中、0.6mM)の5つの重ね合わせた1H-15N TROSY-HSQCスペクトル。
【図３】NMRによるCR2-リガンド結合残基の比較。ヒストグラムは、C3d、IFNα又はgp350結合時のCR2 SCR1-2の骨格アミドで誘発された化学シフト変化を示す。
【図４】図4A、4B及び4Cは、NMRにより測定されたリガンド結合残基とのリガンド結合状態(C3dは示さず)におけるCR2 SCR1-2 X線結晶構造の表面表現を示す図である。図4Aは、NMRにより測定したgp350結合残基を示す図である。灰色の残基は、gp350滴定に影響されない残基を表す。SCR1、リンカー領域及びSCR2上の黒色の残基は、CR2 SCR1-2に結合しているgp350に関与する残基を表す。図4Bは、NMRにより測定したIFNα結合残基を示す図である。灰色の残基は、IFNα滴定に影響されない残基を表す。SCR1、リンカー領域及びSCR2上の黒色の残基は、CR2 SCR1-2に結合しているIFNαに関与する残基を表す。図4Cは、NMRにより測定されたリガンド特有の結合残基及び共有されている結合残基を示す図である。黒色の残基は、IFNα及びgp350へのCR2結合に特異的に関与する残基を表す。濃い灰色の残基は、C3dへのCR2結合に特異的に関与する残基を表す。薄い灰色の残基は、三つのCR2リガンド結合事象全てに関与する残基を表す。
【図５】NMRによるCR2-gp350リガンド結合残基を強調した、HADDOCK CR2-gp350ドッキングモデルを示す図である。Youngら(43)のモデル。黒色のリボンはgp350を表し、薄い灰色は、gp350の表面を修飾するグリコシル基を表す。濃い灰色のリボンはCR2 SCR1-2を表す。挿入の拡大図は、Youngらのドッキングモデルにマッピングされた、NMRによる結合残基とgp350との間の理論的な側鎖相互作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
【表１】
0005986990.tif 000002
【表２】
0005986990.tif 000003
【００２０】
配列の簡単な説明
配列番号1は、ヒト補体レセプター2(CR2)の完全アミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号2は、ヒトCR2のショートコンセンサスリピート(SCR)ドメイン1及び2の完全アミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号3は、ヒトCD59タンパク質の完全アミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号4は、マウス補体レセプター1-関連遺伝子/タンパク質y(Crry)の完全アミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号5は、ヒトH因子の完全アミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号6は、マウスCD59Aタンパク質の完全アミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号7は、マウスCD59Bタンパク質の完全アミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号8は、マウスH因子の完全アミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号9は、ヒト補体レセプター1(CR1)の完全アミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号10は、ヒト膜補因子タンパク質(MCP)の完全アミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号11は、ヒト崩壊促進因子(DAF/CD55)の完全アミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号12は、マウス崩壊促進因子(DAF/CD55)の完全アミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号13は、モノクルコブラ(Naja kaouthia)由来のコブラ毒因子(CVF)の完全アミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号14は、ヒトIgG1重鎖、Cドメインの完全アミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号15は、ヒトIgG1軽鎖、Cドメインの完全アミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号16は、ヒトIgG1のFcドメインの完全アミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号17は、ヒトIgM重鎖、Cドメインの完全アミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号18は、ヒトIgM軽鎖、Cドメインの完全アミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号19は、ヒトIgMのFcドメインの完全アミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号20は、マウスIgG3重鎖、Cドメインの完全アミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号21は、マウスIgG3軽鎖、Cドメインの完全アミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号22は、マウスIgG3 Fcドメインの完全アミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号23は、マウスIgM重鎖、Cドメインの完全アミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号24は、マウスIgM軽鎖、Cドメインの完全アミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号25は、マウスIgM Fcドメインの完全アミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号26は、ヒトCR2の最初の二つのN末端SCRの間の結合配列である。
【００４６】
配列番号27は、ヒトCR2の最初の二つのN末端SCRの間の結合配列である。
【００４７】
配列番号28は、ヒトCR2の第4のN末端ショートコンセンサスリピートドメインと第5のN末端ショートコンセンサスリピートドメインの間の結合配列である。
【００４８】
詳細な説明
補体は免疫の重要な成分であるが、補体系の不適当かつ過度の活性化は多数の病理学的症状及び炎症性症状に関わる。組織損傷に介在する補体活性化産物は、補体経路の様々な段階で生成される。細胞表面上の補体活性化によって、血清補体成分3(C3)の切断と、細胞表面に免疫エフェクター細胞のオプソニンとしての機能を果たすC3断片の共有結合が生じる。生じるC3断片には、C3a(強力なアナフィラトキシンである可溶性ペプチド)及びC3b(代替補体経路C3転換酵素の成分)が含まれる。その後、この経路では、血清補体成分5(C5)が切断されて、別の強力なアナフィラトキシン及び広範囲の生物活性特性を有する走化因子の可溶性C5aを放出する。またC5が切断することで、細胞膜中で構築し、最終的にオプソニン化細胞の溶解をもたらす、細胞溶解性タンパク質複合体の膜侵襲複合体(MAC)も形成され始める。
【００４９】
補体成分3(C3)は酵素前駆体である。正常なC3は高濃度(1〜2mg/ml)で循環する。M. Janziら、Mol. Cell. Proteomics (2005) 4(12):1942-1947。補体活性化中に、C3全体が切断され、C3b(代替補体経路C3転換酵素の成分)が形成される。これはターゲット表面に共有結合で結合されるようになる。内在性補体制御タンパク質は組織結合C3bを不活性化し、iC3b及び最終的には35キロダルトン(「kD」)C3d断片を形成する。C3d断片は組織に固定されたままで、補体媒介性炎症の持続的マーカーとしての役割を果たす。I. Leivoら、J. Cell. Biol. (1986) 103:1091-1100。
【００５０】
補体活性化部位及び疾患部位に補体阻害物質を標的化送達することは、それら阻害剤の効果を改善し得る。補体は、宿主防御及び免疫の形成において、また免疫複合体異化及びアポトーシス性細胞クリアランスなどの免疫ホメオスタシス機序において重要な役割を果たすことから、補体阻害物質の標的化送達は、全身性補体阻害(特に長期にわたる補体阻害)から生じる重篤な副作用の可能性を低減する。
【００５１】
一般的技術
本発明の実施は、特段の指示のない限り、当業者には公知の従来の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学及び核酸化学の技術を用いる。このような技術は、文献(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,  第2版  (Sambrookら、1989)及びMolecular Cloning: A Laboratory Manual,  第3版  (Sambrook and Russell, 2001)、(併せて本明細書では「Sambrook」ともいう); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら編、1987, 2001までの補完を含む); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullisら編、1994); Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000), Handbook of Experimental Immunology,  第4版  (D. M. Weir & C. C. Blackwell編、Blackwell Science Inc., 1987);並びに、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos編、1987))で十分に説明されている。
【００５２】
補体レセプター2
CD21とも称されるヒト補体レセプター2(CR2/CD21)(配列番号1及び配列番号2)は、かかるタンパク質に特徴的な構造単位である、15又は16のショートコンセンサスリピート(SCR)ドメインを含む、C3結合タンパク質ファミリーの〜145kD膜貫通型タンパク質である。CR2は成熟B細胞及び濾胞樹状細胞において発現され、体液性免疫に重要な役割を果たす。J. Hannanら、Biochem. Soc. Trans. (2002) 30:983-989; K.A. Youngら、J. Biol. Chem. (2007) 282(50):36614-36625。CR2タンパク質は完全なC3タンパク質には結合しないが、CR2タンパク質の最初の二つのアミノ末端ショートコンセンサスリピート(「SCR 1-2」)内に位置している結合部位を介して、C3b、iC3b及びC3d切断断片を含むその分解産物に結合する。それゆえ、CR2のSCR1-2ドメインは、C3の切断された(即ち、活性化された)形態と循環している完全C3とを識別する。したがって、ターゲティング基として、CR2のSCR 1-2は、循環しているC3と補体活性化中に生成されたC3断片を識別することができる。C3dに対するCR2の親和性は620〜658nMしかないが(J. Hannanら、Biochem. Soc. Trans. (2002) 30:983-989; J.M. Guthridgeら、Biochem. (2001) 40:5931-5941)、クラスター化C3dに対するCR2の結合力は、補体活性化部位へ分子をターゲティングする有効な方法となる。
【００５３】
C3が切断されると、まず、活性化細胞表面においてC3bの生成及び付着が生じる。C3b断片は、補体カスケードを増幅する酵素複合体の生成に関与する。細胞表面において、C3bは、特に補体活性化調節因子を含有する宿主表面(すなわち、大部分の宿主組織)に付着した場合、速やかに不活性のiC3bに変換される。膜結合型の補体調節因子が不在の場合でさえも、実質的なレベルのiC3bは、血清H因子及び血清I因子の作用により形成される。iC3bは、I因子及び他のプロテアーゼ及び補因子によって、膜結合型断片C3dgに、次いでC3dに連続的に消化されるが、このプロセスは比較的ゆるやかである。したがって、CR2に対するC3リガンドは、一度これらが生成され、補体活性化部位で高濃度に存在すれば、比較的長時間存続する。
【００５４】
定義
「本組成物」又は「組成物」という一般的な言及は、本発明の組成物を包含し、かつ適用できる。
【００５５】
本明細書では、「一つの(a)」「一つの(an)」及び「本(当該)(the)」という記載の単数形は、特段の指示のない限り、複数の言及を包含する。例えば、「生物活性CR2断片」という句は、一つ又は複数の生物活性CR2断片を包含している。
【００５６】
本明細書の数値又はパラメーターの「約」という言及は、その数値又はパラメーターそのものを対象とする実施形態を包含する(及び記載する)。例えば、「約X」に関する記載は、「X」の記載を包含している。
【００５７】
本明細書に記載されている本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態からなることを包含し、かつ/又は態様及び実施形態から本質的になることを包含するものと理解する。
【００５８】
本明細書では、用語「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、限定するものではないが、実験動物、家畜、農業動物、スポーツ用動物、ペット、霊長類、マウス及びラットが挙げられる。特定の実施形態においては、個体はヒトである。特定の実施形態においては、個体はヒト以外の個体である。特定の実施形態においては、個体は代替補体経路が関与している疾患に関する研究用動物モデルである。
【００５９】
本明細書全体にわたって記載されているすべての最大数値限界は、すべてのそれより低い数値限界を、あたかもそのような低い数値限界が明確に本明細書に記載されているかのように包含するものとする。本明細書全体にわたって記載されているすべての最小数値限界は、すべてのそれより高い数値限界を、あたかもそのような高い数値限界が明確に本明細書に記載されているかのように包含するものとする。本明細書全体にわたって記載されているすべての数値範囲は、そのような幅の広い数値範囲内に入る、より狭い数値範囲を、あたかもそのようなより狭い数値範囲が本明細書にすべて明確に記載されているかのように包含するものとする。
【００６０】
アミノ酸置換
一般に、20個のアミノ酸がタンパク質中で確認されている。これらのアミノ酸は、アミノ酸の側鎖の化学的性質に基づいて、九つの分類又は群に分類することができる。一個のアミノ酸残基を同一分類又は同一群の中の別のアミノ酸残基に置換することは、本明細書においては「保存的」置換と呼ぶ。保存的アミノ酸置換は、タンパク質のコンホメーション又は機能を有意に変えることなく、高い頻度で、タンパク質中で行うことができる。一個のアミノ酸残基を異なる分類又は群の別のアミノ酸残基に置換することは、本明細書においては「非保存的」置換と呼ぶ。非保存的アミノ酸置換は、逆に、タンパク質のコンホメーション及び機能を破壊する傾向がある。
【表３】
0005986990.tif 000004
【００６１】
特定の実施形態においては、保存的アミノ酸置換は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)及びロイシン(L)のいずれかで、これらの脂肪族アミノ酸のいずれか他のものを置換すること;トレオニン(T)をセリン(S)に置換すること、及びその逆;グルタミン酸(E)をアスパラギン酸(D)に置換すること、及びその逆;アスパラギン(N)をグルタミン(Q)に置換すること、及びその逆;アルギニン(R)をリシン(K)に置換すること、及びその逆;フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)及びトリプトファン(W)で、これらの芳香族アミノ酸のいずれか他のものを置換すること;システイン(C)をメチオニン(M)に置換すること、及びその逆を含む。別の置換も、特定のアミノ酸の環境、及びタンパク質の三次元構造におけるその役割に応じて、保存的であると考えることができる。例えば、グリシン(G)及びアラニン(A)は、アラニン(A)及びバリン(V)が可能なように、高い頻度で交換可能となり得る。比較的疎水性であるメチオニン(M)は、高い頻度でロイシン及びイソロイシンと交換可能であり、時にはバリンと交換可能である。リシン(K)及びアルギニン(R)は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であって、しかもこれらの2種のアミノ酸残基の異なるpKは重要ではない位置において、高い頻度で交換可能である。さらに別の交換は、特定の環境において「保存的である」と考えることができる(例えば、BIOCHEMISTRY、13〜15ページ、第2版、Lubert Stryer編  (Stanford University); Henikoffら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1992) 89:10915-10919; Leiら、J. Biol. Chem. (1995) 270(20):11882-11886を参照)。
【００６２】
特定の実施形態において、非保存的アミノ酸置換は、セリン(S)、トレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、リシン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、システイン(C)、ヒスチジン(H)及びプロリン(P)のいずれかを、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)及びロイシン(L)のいずれかに置換することを含む。特定の実施形態において、非保存的アミノ酸置換は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、リシン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、システイン(C)、ヒスチジン(H)及びプロリン(P)のいずれかを、セリン(S)及びトレオニン(T)のいずれかに置換することを含む。特定の実施形態において、非保存的アミノ酸置換は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、リシン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、システイン(C)、ヒスチジン(H)及びプロリン(P)のいずれかを、アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)のいずれかに置換することを含む。特定の実施形態において、非保存的アミノ酸置換は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、セリン(S)、トレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リシン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、システイン(C)、ヒスチジン(H)及びプロリン(P)のいずれかを、グルタミン(Q)及びアスパラギン(N)のいずれかに置換することを含む。特定の実施形態において、非保存的アミノ酸置換は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、セリン(S)、トレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、システイン(C)、ヒスチジン(H)及びプロリン(P)のいずれかを、リシン(K)及びアルギニン(R)のいずれかに置換することを含む。特定の実施形態において、非保存的アミノ酸置換は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、セリン(S)、トレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、リシン(K)、アルギニン(R)、メチオニン(M)、システイン(C)、ヒスチジン(H)及びプロリン(P)のいずれかを、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)及びトリプトファン(W)のいずれかに置換することを含む。特定の実施形態において、非保存的アミノ酸置換は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、セリン(S)、トレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、リシン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、ヒスチジン(H)及びプロリン(P)のいずれかを、メチオニン(M)及びシステイン(C)のいずれかに置換することを含む。特定の実施形態において、非保存的アミノ酸置換は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、セリン(S)、トレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、リシン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、システイン(C)及びプロリン(P)のいずれかを、ヒスチジン(H)に置換することを含む。特定の実施形態において、非保存的アミノ酸置換は、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、セリン(S)、トレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、リシン(K)、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、システイン(C)及びヒスチジン(H)のいずれかを、プロリン(P)に置換することを含む。
【００６３】
補体活性のモジュレーター
本明細書では、用語「補体モジュレーター」とは、補体活性をモジュレートする(例えば、阻害又は活性化する)、化合物、組成物若しくはタンパク質又はそれらの生物活性断片を指す。補体モジュレーターは、補体阻害物質又は補体活性化物質となり得る。
【００６４】
本明細書では、用語「補体阻害物質」とは、補体活性を軽減又は除去するすべての化合物、組成物若しくはタンパク質又はそれらの生物活性断片を指す。補体活性の低減は、増加性(例えば、活性における10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%若しくは90%の低減)であってもよいし、完全であってもよい。補体阻害物質は、可溶性タンパク質又は膜結合型タンパク質、例えば、膜補因子タンパク質(MCP)、崩壊促進因子(DAF/CD55)、CD59、マウス補体レセプター1-関連遺伝子/タンパク質y(Crry)、ヒト補体レセプター1(CR1)及びH因子であってもよく、或いは補体経路の成分に特異的な抗体、例えば、エクリズマブ(商標名Soliris(登録商標)で販売されている抗C5抗体)、パキセリズマブ(エクリズマブの抗原結合性断片を含む単鎖抗体(scFv))、抗因子B抗体(例えば、ATCC寄託番号PTA-6230により産生されたモノクローナル抗体1379)、抗プロパージン抗体、抗D因子抗体などであってもよい。あるいは、補体阻害物質は小分子又は直鎖ペプチド若しくは環状ペプチド、例えば、コンプスタチン、N-アセチルアスパルチルグルタミン酸(NAAGA)などであってもよい。
【００６５】
本明細書では、用語「補体活性化物質」とは、補体活性を増加又は活性化する、すべての化合物、組成物若しくはタンパク質又はそれらの生物活性断片を指す。補体活性における増加は、増加性(例えば、活性における10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%又は90%の増加)であってもよい。補体活性化物質は、可溶性タンパク質又は膜結合型タンパク質、例えば、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、及びマウスIgM Fcであってもよく、さらに、コブラ毒因子(CVF)及びそれらの生物活性断片であってもよく、例えば、Igタンパク質のFcドメイン、例えば、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、及びマウスIgM Fcドメインであってもよい。また補体活性化物質としては、例えば、CVF部分及び補体成分3(C3)部分を含むハイブリッドCVF分子、例えば、Fritzingerら、「Functional characterization of human C3/cobra venom factor hybrid proteins for therapeutic complement depletion」、Develop. Comp. Immunol. 33(1):105-116 (2009)に記載されているものであってもよい。それらのハイブリッドは、C3の113又は315のC末端残基が対応するCVF配列と置換されたタンパク質を含む。
【００６６】
補体阻害物質タンパク質
本明細書では、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と;(b)補体阻害物質部分とを含み、CR2部分が少なくとも一個のアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態においては、構築物は融合タンパク質である。補体を阻害する、多数の内在性可溶性タンパク質及び膜結合型タンパク質が同定されている。これらの補体阻害物質タンパク質としては、限定するものではないが、膜補因子タンパク質(MCP)、崩壊促進因子(DAF/CD55)、CD59、マウス補体レセプター1-関連遺伝子/タンパク質y(Crry)、ヒト補体レセプター1(CR1)及びH因子が挙げられる。特定の実施形態において、構築物の補体モジュレーター部分は、補体阻害物質又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、補体阻害物質は、ヒトMCP、ヒトDAF、マウスDAF、ヒトCD59、マウスCD59アイソフォームA、マウスCD59アイソフォームB、マウスCrryタンパク質、ヒトCR1、ヒトH因子、若しくはマウスH因子又はそれらの生物活性断片からなる群から選択される。
【００６７】
膜補因子タンパク質(MCP)
本明細書では、用語「膜補因子タンパク質」、「MCP」又は「CD46」とは、宿主細胞において補体活性化を阻害し、C3b及びC4b(それらの相同体を含む)のI因子介在性切断の補因子として機能を果たす、広く分布しているC3b/C4b結合細胞表面糖タンパク質を指す。T.J. Oglesbyら、J. Exp. Med. (1992) 175:1547-1551。MCPは、補体活性化の調節因子(「RCA」)として知られているファミリーに属する。ファミリーメンバーは、典型的には長さが60〜70アミノ酸の様々な数のショートコンセンサスリピート(SCR)ドメインを含む、特定の構造的特徴を共有する。アミノ末端で開始して、MCPは、四つのSCR、セリン/トレオニン/プロリンリッチ領域、不確定機能の領域、膜貫通疎水性ドメイン、細胞質アンカー及び細胞質尾部を含む。種及び株の変形が、開示されたペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に対して存在すること、また、ヒトMCP又はその生物活性断片が種及び株の変形をすべて包含することを理解されたい。
【００６８】
配列番号10は、完全長のヒトMCPアミノ酸配列を表す(例えば、UniProtKB/Swiss-Prot. アクセッション番号P15529を参照)。アミノ酸1〜34はシグナルペプチドに対応し、アミノ酸35〜343は細胞外ドメインに対応し、アミノ酸344〜366は膜貫通ドメインに対応し、アミノ酸367〜392は細胞質ドメインに対応する。細胞外ドメインにおいて、アミノ酸35〜96はSCR 1に対応し、アミノ酸97〜159はSCR 2に対応し、アミノ酸160〜225はSCR 3に対応し、アミノ酸226〜285はSCR 4に対応し、アミノ酸302〜326はセリン/トレオニンリッチドメインに対応する。種及び株の変形が、開示されたペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に対して存在すること、また、MCP又はその生物活性断片が種及び株の変形をすべて包含することを理解されたい。本明細書では、用語、MCPの「生物活性」断片とは、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの両方を欠損しているすべての可溶性断片を指し、完全長のヒトMCPタンパク質の補体阻害活性を一部又は全部有する、セリン/トレオニンリッチドメインの有無に関わらず、一、二、三若しくは四つのSCRドメインを含んでなる断片、又は一、二、三若しくは四つのSCRドメインから実質的になる断片、又は一、二、三若しくは四つのSCRドメインからなる断片を包含する。特定の実施形態において、補体阻害物質部分は、完全長のヒトMCP(配列番号10のアミノ酸35〜392)、ヒトMCPの細胞外ドメイン(配列番号10のアミノ酸35〜343)、又はヒトMCPのSCR 1-4(配列番号10のアミノ酸35〜285)を含む。
【００６９】
一態様において、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と;(b)MCPとを含み、CR2部分が少なくとも一個のアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、EBV gp350に選択的に結合する。本明細書において「選択的に結合する」とは、構築物があるリガンドへの結合増強を示し、且つ/又は異なるリガンドへの結合低下を示すことを意味する。例えば、「選択的に結合する」とは、次のような場合を意味し得る:1)改変された構築物が第1のリガンドに対して、改変していない構築物の第1のリガンドに対する結合親和性と似た結合親和性を有するが、改変された構築物が、改変していない構築物で行う場合よりも第2のリガンドに対して低親和性を有しており、したがって、改変された構築物は、改変していない構築物の二つのリガンドに対する結合と比較して、第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;2)改変された構築物が、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があるが、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合に似た第2のリガンドへの結合を維持しており、したがって、構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;又は3)改変された構築物が、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があり、しかも、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合と比べて第2のリガンドに対する低結合親和性を有しており、したがって、改変された構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」が第2のリガンドには「選択的に結合しない」場合。特定の実施形態においては、構築物は融合タンパク質である。特定の実施形態においては、構築物の補体阻害物質部分は完全長のヒトMCP(配列番号10)を含む。特定の実施形態においては、構築物の補体阻害物質部分は、ヒトMCP(配列番号10)の生物活性断片を含む。特定の実施形態においては、ヒトMCPの生物活性断片は、SCR1-4(配列番号10のアミノ酸35〜285)、SCR1-4とセリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号10のアミノ酸35〜326)��及びMCPの細胞外ドメイン(配列番号10のアミノ酸35〜343)からなる群から選択される。
【００７０】
崩壊促進因子(DAF)
CD55とも称される崩壊促進因子(DAF/CD55)(配列番号11及び配列番号12)は、宿主細胞において補体活性化を阻害する、〜70キロダルトン(kDa)の膜結合型糖タンパク質である。他の様々な補体調節タンパク質と同様に、DAFは、ショートコンセンサスリピート(SCR)と呼ばれる、複数の約60アミノ酸の繰り返しモチーフを含む。
【００７１】
本明細書では、用語「崩壊促進因子」、「DAF」又は「CD55」とは、四つのショートコンセンサスリピート(SCR)ドメイン、続いて、膜表面から分子を高くする、C末端で高度にO-グリコシル化されたセリン/トレオニンリッチドメイン、続いて、グリコシルホスファチジルイノシトール(「GPI」)アンカーを含む、70キロダルトン(「kD」)の膜糖タンパク質を指す。DAFは、補体タンパク質C3の切断と補体カスケードの増幅に必要とされる膜結合型C3転換酵素を解離することにより、細胞表面を補体活性化から保護する。DAFは、会合を妨げるか、代替補体経路及び古典補体経路のC3-転換酵素及びC5-転換酵素両方の崩壊を促進する。
【００７２】
配列番号11は、完全長のヒトDAFアミノ酸配列を表し(例えば、UniProtKB/Swiss-Prot. アクセッション番号P08173を参照)、配列番号12は、完全長のマウスDAFアミノ酸配列を表す(例えば、UniProtKB/Swiss-Prot. アクセッション番号Q61475)。ヒトDAF配列において、アミノ酸1〜34はシグナルペプチドに対応し、アミノ酸35〜353は成熟タンパク質に現われ、アミノ酸354〜381は翻訳後にポリペプチドから除かれる。成熟タンパク質内では、アミノ酸35〜96はSCR 1に対応し、アミノ酸96〜160はSCR 2に対応し、アミノ酸161〜222はSCR 3に対応し、アミノ酸223〜285はSCR 4に対応し、アミノ酸287〜353はO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメインに対応する。GPIアンカーは、353位置のセリンでヒトDAFに結合される。マウスDAF配列において、アミノ酸1〜34はシグナルペプチドに対応し、アミノ酸35〜362は成熟タンパク質に現われ、アミノ酸363〜390は翻訳後にポリペプチドから除かれる。成熟タンパク質内では、アミノ酸35〜96はSCR 1に対応し、アミノ酸97〜160はSCR 2に対応し、アミノ酸161〜222はSCR 3に対応し、アミノ酸223〜286はSCR 4に対応し、アミノ酸288〜362はO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメインに対応する。GPIアンカーは、362位置のセリンでマウスDAFに結合される。種及び株の変形が、開示されたペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に対して存在すること、また、DAF又はその生物活性断片が種及び株の変形をすべて包含することを理解されたい。本明細書では、用語、DAFの「生物活性」断片とは、GPIアンカー及び/又はそれが結合しているアミノ酸(すなわちSer-353)を欠損しているすべての断片を指し、完全長のDAFタンパク質の補体阻害活性を一部又は全部有する、O-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメインの有無に関わらず、一、二、三若しくは四つのSCRドメインを含んでなる完全長DAFタンパク質のすべての断片、又は一、二、三若しくは四つのSCRドメインから実質的になる完全長DAFタンパク質のすべての断片、又は一、二、三若しくは四つのSCRドメインからなる完全長DAFタンパク質のすべての断片を包含する。
【００７３】
一態様において、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)DAFとを含み、CR2部分が少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分はIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、EBV gp350に選択的に結合する。本明細書では、「選択的に結合する」とは、構築物があるリガンドへの結合増強を示し、且つ/又は異なるリガンドへの結合低下を示すことを意味する。例えば、「選択的に結合する」とは次のような場合を意味し得る:1)改変された構築物が第1のリガンドに対して、改変していない構築物の第1のリガンドに対する結合親和性と似た結合親和性を有するが、改変された構築物が、改変していない構築物で行う場合よりも第2のリガンドに対して低親和性を有しており、したがって、改変された構築物は、改変していない構築物の二つのリガンドに対する結合と比較して、第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;2)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増大があるが、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合に似た第2のリガンドへの結合を維持しており、したがって、構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;又は3)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があり、しかも、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合と比べて第2のリガンドに対する低結合親和性を有しており、したがって、改変された構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」が第2のリガンドには「選択的に結合しない」場合。特定の実施形態においては、構築物は融合タンパク質である。特定の実施形態においては、構築物の補体阻害物質部分は完全長のヒトDAFを含む。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は、ヒトDAF(配列番号11)の生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ヒトDAFの生物活性断片は、SCR1-4(配列番号11のアミノ酸25〜285)及びSCR1-4とO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号11のアミノ酸25〜353)からなる群��ら選択される。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は完全長のマウスDAF(配列番号12)を含む。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分はマウスDAFの生物活性断片を含む。特定の実施形態において、マウスDAFの生物活性断片は、SCR1-4(配列番号12のアミノ酸35〜286)及びSCR1-4とO-グリコシル化セリン/トレオニンリッチドメイン(配列番号12のアミノ酸35〜362)からなる群から選択される。
【００７４】
CD59
本明細書では、用語「CD59」とは、補体の膜侵襲複合体(MAC)を強力に阻害する、膜結合型128アミノ酸糖タンパク質を指す。CD59は、会合中にMACのC8成分及び/又はC9成分に結合し、MAC中心部での浸透圧溶解性細孔(osmolytic pore)の完全形成に必要なC9の複数コピーの組込みを最終的に妨げることにより作用する。CD59は、N-グリコシル化及びO-グリコシル化される。N-グリコシル化は、一部の部位に存在する可変シアリル化と共に、ラクトサミン及び外腕フコース残基の有無に関わらず、主として二分岐構造又は三分岐構造を含む。DAFと同様、CD59は、アミノ酸102でアスパラギンに結合されている、グリコシルホスファチジルイノシトール(「GPI」)アンカーによって細胞膜に固着される。CD59の可溶性形態(sCD59)が製造されているが、sCD59は、特に血清の存在下では、一般にin vitroにおいて機能的活性が低く、改変されていないsCD59には治療効力がほとんどないか、まったくないことが示唆されている。例えば、S. Meriら、「Structural composition and functional characterization of soluble CD59: heterogeneity of the oligosaccharide and glycophosphoinositol (GPI) anchor revealed by laser-desorption mass spectrometric analysis」、Biochem. J. 316:923-935 (1996)を参照。
【００７５】
配列番号3は完全長のヒトCD59アミノ酸配列(例えば、UniProtKB/Swiss-Prot. アクセッション番号P13987を参照)を表し、配列番号6は完全長のマウスCD59配列、アイソフォームA(例えば、UniProtKB/Swiss-Prot. アクセッション番号O55186を参照)を表し、配列番号7は完全長のマウスCD59配列、アイソフォームB(例えば、UniProtKB/Swiss-Prot. アクセッション番号P58019を参照)を表す。ヒトCD59配列において、配列番号3のアミノ酸1〜25はリーダーペプチドに対応し、配列番号3のアミノ酸26〜102は成熟タンパク質に対応し、配列番号3のアミノ酸103〜128は翻訳後に除かれる。GPIアンカーは、配列番号3の位置102のアスパラギンでCD59に結合される。マウスCD59配列のアイソフォームAにおいて、配列番号6のアミノ酸1〜23はリーダーペプチドに対応し、配列番号6のアミノ酸24〜96は成熟タンパク質に対応し、配列番号6のアミノ酸97〜123は翻訳後に除かれる。GPIアンカーは、配列番号6の位置96のセリンでCD59に結合される。マウスCD59配列のアイソフォームBにおいて、配列番号7のアミノ酸1〜23はリーダーペプチドに対応し、配列番号7のアミノ酸24〜104は成熟タンパク質に対応し、配列番号7のアミノ酸105〜129は翻訳後に除かれる。GPIアンカーは、配列番号7の位置104のアスパラギンでCD59に結合される。種及び株の変形が、開示されたペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に対して存在すること、また、CD59又はその生物活性断片が種及び株の変形をすべて包含することを理解されたい。
【００７６】
本明細書では、用語、ヒトCD59の「生物活性」断片とは、GPIアンカー及び/又はそれが結合しているアミノ酸(すなわちAsn-102)を欠損している、ヒトCD59のすべての断片を指し、完全長のCD59タンパク質の補体阻害活性の一部又は全部を有する完全長のヒトCD59タンパク質の任意の断片を包含する。また、用語、マウスCD59の「生物活性」断片とは、GPIアンカー及び/又はそれが結合しているアミノ酸(すなわち、アイソフォームAのSer-96、若しくはアイソフォームBのAsp-104)を欠損している、マウスCD59アイソフォームA又はアイソフォームBのすべての断片を指し、完全長のCD59タンパク質の補体阻害活性の一部又は全部を有する完全長のマウスCD59タンパク質アイソフォームのいずれかの任意の断片を包含する。
【００７７】
一態様において、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)CD59とを含み、CR2部分が少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、EBV gp350に選択的に結合する。本明細書では、「選択的に結合する」とは、構築物があるリガンドへの結合増強を示し、且つ/又は異なるリガンドへの結合低下を示すことを意味する。例えば、「選択的に結合する」とは次のような場合を意味し得る:1)改変された構築物が第1のリガンドに対して、改変していない構築物の第1のリガンドに対する結合親和性と似た結合親和性を有するが、改変された構築物が、改変していない構築物で行う場合よりも第2のリガンドに対して低親和性を有しており、したがって、改変された構築物は、改変していない構築物の二つのリガンドに対する結合と比較して、第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;2)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があるが、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合に似た第2のリガンドへの結合を維持しており、したがって、構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;又は3)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があり、しかも、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合と比べて第2のリガンドに対する低結合親和性を有しており、したがって、改変された構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」が第2のリガンドには「選択的に結合しない」場合。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は完全長のヒトCD59(配列番号3)を含む。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は、ヒトCD59(配列番号3)の生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ヒトCD59の生物活性断片は、そのGPIアンカーを欠損するヒトCD59の細胞外ドメイン(配列番号3のアミノ酸26〜101)を含む。特定の実施形態において、構��物の補体阻害物質部分は完全長のマウスCD59、アイソフォームA(配列番号6)を含む。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は、マウスCD59、アイソフォームA(配列番号6)の生物活性断片を含む。特定の実施形態において、マウスCD59、アイソフォームAの生物活性断片は、そのGPIアンカーを欠損しているマウスCD59、アイソフォームAの細胞外ドメイン(配列番号6のアミノ酸24〜95)を含む。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は完全長のマウスCD59、アイソフォームB(配列番号7)を含む。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分はマウスCD59、アイソフォームB(配列番号7)の生物活性断片を含む。特定の実施形態において、マウスCD59、アイソフォームBの生物活性断片は、そのGPIアンカーを欠損するマウスCD59、アイソフォームBの細胞外ドメイン(配列番号7のアミノ酸24〜103)を含む。
【００７８】
マウス補体レセプター1-関連遺伝子/タンパク質y(Crry)
本明細書では、用語「マウス補体レセプター1-関連遺伝子/タンパク質y」又は「Crry」とは、補体活性化を調節する膜結合型マウス糖タンパク質(それらの相同体を包含する)を指す。Crryは、補体I因子、宿主組織に付着されているC3b及びC4bを切断する、セリンプロテアーゼに対する補因子として機能を果たすことにより、補体活性化を調節する。またCrryは崩壊促進因子としても作用し、C4b2a及びC3bBb(補体カスケードの増幅転換酵素)の形成を阻害する。
【００７９】
配列番号4は、完全長のマウスCrryタンパク質アミノ酸配列を表す。アミノ酸1〜40はリーダーペプチドに対応し、配列番号4のアミノ酸41〜483は、細胞外ドメインに対応する配列番号4のアミノ酸41〜405、膜貫通ドメインに対応する配列番号4のアミノ酸406〜426、及び細胞質のドメインに対応する配列番号4のアミノ酸427〜483を含む、成熟タンパク質に対応する。細胞外ドメインにおいて、配列番号4のアミノ酸83〜143はSCR1に対応し、配列番号4のアミノ酸144〜205はSCR2に対応し、配列番号4のアミノ酸206〜276はSCR3に対応し、配列番号4のアミノ酸277〜338はSCR4に対応し、配列番号4のアミノ酸339〜400はSCR5に対応する。種及び株の変形が、開示されたペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に対して存在すること、また、マウスCrryタンパク質又はその生物活性断片が種及び株の変形をすべて包含することを理解されたい。本明細書では、用語、マウスCrryタンパク質の「生物学的活性」断片とは、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠損しているすべてのマウスCrryの可溶性断片を指し、完全長マウスCrryタンパク質の補体阻害活性を一部又は全部有する完全長マウスCrryタンパク質のすべての断片を包含し、一、二、三、四若しくは五つのSCRドメインを含んでなる断片、又は一、二、三、四若しくは五つのSCRドメインから実質的になる断片、又は一、二、三、四若しくは五つのSCRドメインからなる断片を包含する。
【００８０】
一態様において、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)Crryとを含み、CR2部分が少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、EBV gp350に選択的に結合する。本明細書では、「選択的に結合する」とは、構築物があるリガンドへの結合増強を示し、且つ/又は異なるリガンドへの結合低下を示すことを意味する。例えば、「選択的に結合する」とは次のような場合を意味し得る:1)改変された構築物が第1のリガンドに対して、改変していない構築物の第1のリガンドに対する結合親和性と似た結合親和性を有するが、改変された構築物が、改変していない構築物で行う場合よりも第2のリガンドに対して低親和性を有しており、したがって、改変された構築物は、改変していない構築物の二つのリガンドに対する結合と比較して、第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;2)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があるが、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合に似た第2のリガンドへの結合を維持しており、したがって、構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;又は3)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があり、しかも、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合と比べて第2のリガンドに対する低結合親和性を有しており、したがって、改変された構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」が第2のリガンドには「選択的に結合しない」場合。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は完全長のマウスCrryタンパク質(配列番号4)を含む。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は、マウスCrryタンパク質(配列番号4)の生物活性断片を含む。特定の実施形態において、マウスCrryタンパク質の生物活性断片は、SCR 1-5(配列番号4のアミノ酸41〜400)及びマウスCrryタンパク質の細胞外ドメイン(配列番号4のアミノ酸41〜405)からなる群から選択される。
【００８１】
補体レセプター1(CR1)
本明細書では、用語「補体レセプター1」、「CR1」又は「CD35」とは、推定分子量が220キロダルトン(「kD」)の2039アミノ酸のタンパク質(その相同体を含む)をコードしているヒト遺伝子を指す。この遺伝子は、主に赤血球、単球、好中球及びB細胞上で発現するが、一部のTリンパ球、マスト細胞及び糸球体上皮細胞上にも存在する。CR1タンパク質は、典型的には、一細胞当たり100〜1000コピーで発現される。CR1は、補体オプソニン化免疫複合体の処理及びクリアランスに関するメインシステムである。CR1は、補体カスケードを負に調節し、免疫付着反応及び食細胞運動を媒介し、古典的補体経路及び代替補体経路の両方を阻害する。完全長のCR1タンパク質は、42アミノ酸のシグナルペプチド、1930アミノ酸の細胞外ドメイン、25アミノ酸の膜貫通ドメイン及び43アミノ酸のC末端細胞質ドメインを含む。CR1の細胞外ドメインは、25のN-グリコシル化シグナル配列候補を有し、また、それぞれ60〜70アミノ酸長の、30のショートコンセンサス(「SCR」)ドメイン(補体調節タンパク質(CCP)リピート又はsushiドメインとしても知られている)を含む。SCR間の配列相同性は、60〜99パーセントの範囲にある。30のSCRドメインは、それぞれCR1タンパク質の約45kDセグメントをコードしている、ロングホモロガスリピート(「LHR」)と呼ばれる四つの比較的長い領域へさらにグループ化され、LHR-A、LHR-B、LHR-C及びLHR-Dと表される。最初の三つはそれぞれ七つのSCRドメインを含むが、LHR-Dは九つのSCRドメインを含む。CR1タンパク質の細胞外ドメイン上の活性部位は、アミノ酸42〜295を含むSCR 1-4中のC3bに対して低親和性を有するC4b結合部位、アミノ酸490〜745を含むSCR 8-11中のC4bに対して低親和性を有するC3b結合部位、アミノ酸940〜1196を含むSCR 15-18中のC4bに対して低親和性を有するC3b結合部位、及びアミノ酸1394〜1842を含むSCR 22-28中のC1q結合部位を包含する。
【００８２】
配列番号9は完全長のヒトCR1アミノ酸配列を表す(例えば、UniProtKB/Swiss-Prot. アクセッション番号P17927を参照)。アミノ酸1〜41はシグナルペプチドに対応し、アミノ酸42〜2039は、細胞外ドメインに対応するアミノ酸42〜1971、膜貫通ドメインに対応するアミノ酸1972〜1996、及び細胞質ドメインに対応するアミノ酸1997〜2039を含む成熟タンパク質に対応する。細胞外ドメインにおいて、アミノ酸42〜101はSCR1に対応し、102〜163はSCR2に対応し、アミノ酸164〜234はSCR3に対応し、アミノ酸236〜295はSCR4に対応し、アミノ酸295〜355はSCR5に対応し、アミノ酸356〜418はSCR6に対応し、アミノ酸419〜489はSCR7に対応し、アミノ酸491〜551はSCR8に対応し、アミノ酸552〜613はSCR9に対応し、アミノ酸614〜684はSCR10に対応し、アミノ酸686〜745はSCR11に対応し、アミノ酸745〜805はSCR12に対応し、アミノ酸806〜868はSCR13に対応し、アミノ酸869〜939はSCR14に対応し、アミノ酸941〜1001はSCR15に対応し、アミノ酸1002〜1063はSCR16に対応し、アミノ酸1064〜1134はSCR17に対応し、アミノ酸1136〜1195はSCR18に対応し、アミノ酸1195〜1255はSCR19に対応し、アミノ酸1256〜1318はSCR20に対応し、アミノ酸1319〜1389はSCR21に対応し、アミノ酸1394〜1454はSCR22に対応し、アミノ酸1455〜1516はSCR23に対応し、アミノ酸1517〜1587はSCR24に対応し、アミノ酸1589〜1648はSCR25に対応し、アミノ酸1648〜1708はSCR26に対応し、アミノ酸1709〜1771はSCR27に対応し、アミノ酸1772〜1842はSCR28に対応し、アミノ酸1846〜1906はSCR29に対応し、アミノ酸1907〜1967はSCR30に対応する。種及び株の変形が、開示されたペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に対して存在すること、また、CR1タンパク質又はその生物活性断片が種及び株の変形をすべて包含することを理解されたい。本明細書では、用語、CR1タンパク質の「生物活性」断片とは、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠損しているCR1のすべての可溶性断片を指し、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30のSCRドメインを含むか、それらから実質的になるか、又はそれらからなる断片を包含し、例えば、完全長のCR1タンパク質の補体阻害活性の一部又は全部を有する完全長のCR1タンパク質の任意の断片を包含する。
【００８３】
一態様において、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)CR1とを含み、CR2部分が少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、EBV gp350に選択的に結合する。本明細書では、「選択的に結合する」とは、構築物があるリガンドへの結合増強を示し、且つ/又は異なるリガンドへの結合低下を示すことを意味する。例えば、「選択的に結合する」とは次のような場合を意味し得る:1)改変された構築物が第1のリガンドに対して、改変していない構築物の第1のリガンドに対する結合親和性と似た結合親和性を有するが、改変された構築物が、改変していない構築物で行う場合よりも第2のリガンドに対して低親和性を有しており、したがって、改変された構築物は、改変していない構築物の二つのリガンドに対する結合と比較して、第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;2)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があるが、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合に似た第2のリガンドへの結合を維持しており、したがって、構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;又は3)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があり、しかも、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合と比べて第2のリガンドに対する低結合親和性を有しており、したがって、改変された構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」が第2のリガンドには「選択的に結合しない」場合。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は完全長のヒトCR1タンパク質(配列番号9)を含む。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は、ヒトCR1タンパク質(配列番号9)の生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ヒトCR1タンパク質の生物活性断片は、SCR 1-3(配列番号9のアミノ酸42〜234)、SCR 1-4(配列番号9のアミノ酸42〜295)、SCR 1-10(配列番号9��アミノ酸42〜684)、SCR 8-10(配列番号9のアミノ酸491〜684)、SCR 8-11(配列番号9のアミノ酸491〜745)、SCR 15-17(配列番号9のアミノ酸941〜1134)、SCR 15-18(配列番号9のアミノ酸941〜1195)及びSCR 22-28(配列番号9のアミノ酸1394〜1842)からなる群から選択される。
【００８４】
H因子(FH)
本明細書では、用語「補体H因子」、「H因子」又は「FH」とは、補体H因子、すなわち単一ポリペプチド鎖血漿糖タンパク質(その相同体を包含する)を指す。このタンパク質は、それぞれ2〜6アミノ酸のショートリンカー配列により分離される、一連のビーズのように連続的に配置された、約60アミノ酸の20の保存ショートコンセンサスリピート(SCR)ドメインからなる。H因子はC3bに結合し、代替経路C3転換酵素(C3bBb)の崩壊を促進し、C3bのタンパク質分解不活性化の補因子として作用する。H因子の存在下において、I因子によるタンパク質分解がC3bを切断し、不活性化する。H因子は、C3bに対する少なくとも三つの異なる結合ドメインを有し、それらドメインはSCR 1-4、SCR 5-8及びSCR 19-20内に位置している。H因子の各部位は、C3bタンパク質内の異なる領域に結合する。N末端部位は天然のC3bに結合し;H因子の中央領域に位置している第2の部位はC3c断片に結合し、SCR19及びSCR20内に位置している部位はC3d領域に結合する。さらに、H因子はヘパリンに対する結合部位も含有する。それらの部位は、H因子のSCR 7、SCR 5-12及びSCR 20内に位置しており、C3b結合部位の位置とオーバーラップする。構造分析及び機能分析によって、H因子の補体阻害活性に関するドメインは最初の四つのN末端SCRドメイン内に位置していることが明らかになった。
【００８５】
配列番号5は完全長のヒトH因子アミノ酸配列を表す(例えば、UniProtKB/Swiss-Prot. アクセッション番号P08603を参照)。配列番号8は完全長のマウスH因子アミノ酸配列を表す(例えば、UniProtKB/Swiss-Prot. アクセッション番号P06909を参照)。ヒトH因子配列において、配列番号5のアミノ酸1〜18はシグナルペプチドに対応し、配列番号5のアミノ酸19〜1231は成熟タンパク質に対応する。そのタンパク質の内部で、配列番号5のアミノ酸21〜80はSCR 1に対応し、配列番号5のアミノ酸85〜141はSCR 2に対応し、配列番号5のアミノ酸146〜205はSCR 3に対応し、配列番号5のアミノ酸210〜262はSCR 4に対応し、配列番号5のアミノ酸267〜320はSCR 5に対応する。マウスH因子配列において、配列番号8のアミノ酸1〜18はシグナルペプチドに対応し、配列番号8のアミノ酸19〜1234は成熟タンパク質に対応する。そのタンパク質の内部で、配列番号8のアミノ酸19〜82はSCR 1に対応し、配列番号8のアミノ酸83〜143はSCR 2に対応し、配列番号8のアミノ酸144〜207はSCR 3に対応し、配列番号8のアミノ酸208〜264はSCR 4に対応し、配列番号8のアミノ酸265〜322はSCR 5に対応する。種及び株の変形が、開示されたペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に対して存在すること、また、H因子又はその生物活性断片が種及び株の変形をすべて包含することを理解されたい。
【００８６】
本明細書では、用語、H因子の「生物活性」断片とは、完全長のH因子タンパク質の一部又は全部の補体阻害活性を有する、H因子タンパク質の任意の部分を指し、例えば、限定するものではないが、下記に詳細に記載するような、SCR 1-4、SCR 1-5、SCR 1-8、SCR 1-18、SCR 19-20を含むH因子断片又は天然由来のH因子の任意の相同体又はそれらの断片を包含する。特定の実施形態において、H因子の生物活性断片には、以下に示す一つ又は複数の特性がある:(1)C反応性タンパク質(CRP)に結合すること、(2)C3bに結合すること、(3)ヘパリンに結合すること、(4)シアル酸に結合すること、(5)内皮細胞表面へ結合すること、(6)細胞インテグリンレセプターに結合すること、(7)病原菌に結合すること、(8)C3b補因子活性、(9)C3b崩壊促進活性、及び(10)代替補体経路を阻害すること。
【００８７】
一態様において、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)FHとを含み、CR2部分が少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合し、しかもIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分はIFNαに選択的に結合し、しかもEBV gp350に選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、EBV gp350に選択的に結合する。本明細書では、「選択的に結合する」とは、構築物があるリガンドへの結合増強を示し、且つ/又は異なるリガンドへの結合低下を示すことを意味する。例えば、「選択的に結合する」とは次のような場合を意味し得る:1)改変された構築物が第1のリガンドに対して、改変していない構築物の第1のリガンドに対する結合親和性と似た結合親和性を有するが、改変された構築物が、改変していない構築物で行う場合よりも第2のリガンドに対して低親和性を有しており、したがって、改変された構築物は、改変していない構築物の二つのリガンドに対する結合と比較して、第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;2)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があるが、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合に似た第2のリガンドへの結合を維持しており、したがって、構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;又は3)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があり、しかも、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合と比べて第2のリガンドに対する低結合親和性を有しており、したがって、改変された構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」が第2のリガンドには「選択的に結合しない」場合。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は完全長のヒトH因子(配列番号5)又はマウスH因子(配列番号8)を含む。特定の実施形態において、構築物の補体阻害物質部分は、ヒトH因子(配列番号5)又はマウスH因子(配列番号8)の生物活性断片を含む。特定の実施形態において、ヒトH因子(配列番号5)の生物活性断片は、SCR 1-4(配列番号5のアミノ酸21〜262)、H因子のSCR 1-5(配列番号5のアミノ酸21〜320)、H因子のSCR 1-8(配列番号5のアミノ酸21〜507)及びH因子のSCR 1-18(配列番号5のアミノ酸21〜1104)からなる群から選択される。特定の実施形態において、マウスH因子(配列番号8)の生物活性断片は、SCR 1-4(配列番号8のアミノ酸19〜264)、H因子のSCR 1-5(配列番号8のアミノ酸19〜322)、H因子のSCR 1-8(配列番号8のアミノ酸19〜507)、及びH因子のSCR 1-18(配列番号8のアミノ酸19〜1109)からなる群から選択される。特定の実施形態において、ヒトH因子(配列番号5)又はマウスH因子(配列番号8)の生物活性断片は、少なくともH因子の最初の四つのN末端SCRドメインを含み(特定の実施形態においては、それらからなり、又はそれらから実質的になり)、例えば、H因子の最初の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18又はそれ以上のN末端SCRドメインの少なくともいずれかを包含する。
【００８８】
補体活性化タンパク質
本明細書は、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含んでなる補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有する、CR2部分と;(b)補体活性化部分とを含み、CR2部分が少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。補体を活性化する多数の内在性可溶性タンパク質も同定されている。これらの補体活性化物質としては、限定するものではないが、各種の免疫グロブリン(Ig)タンパク質、例えば、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、及びマウスIgM Fc、さらにコブラ毒因子(CVF)及びそれらの生物活性断片が挙げられる。Igタンパク質の補体活性化活性はFcドメインに局在していた。したがって、補体活性化ヒトIgタンパク質及びマウスIgタンパク質の生物活性断片は、Fcドメイン、例えば、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン及びマウスIgM Fcドメインを含む。
【００８９】
免疫グロブリンタンパク質
本明細書では、用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、タンパク質の免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーの糖タンパク質を指す。抗体又は免疫グロブリン(Ig)分子は、2本の等しい軽鎖ポリペプチド及び2本の等しい重鎖ポリペプチドを含む、四量体である。2本の重鎖はジスルフィド結合によって一緒になって結合されており、それぞれの重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に結合されている。それぞれの完全長Ig分子は、特異的な標的又は抗原に対して少なくとも二つの結合部位を含有する。
【００９０】
免疫系は様々な異なる分類のIg分子(アイソタイプ)を生成し、例えば、存在する特定の分類の重鎖ポリペプチド:IgAで見られるアルファ(α)、IgDで見られるデルタ(δ)、IgEで見られるイプシロン(ε)、IgGで見られるガンマ(γ)、及びIgMで見られるミュー(μ)によってそれぞれ識別される、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが挙げられる。IgGで見られる少なくとも五つの異なるγ重鎖ポリペプチド(アイソタイプ)があるのに対し、カッパ(κ)鎖及びラムダ(λ)鎖と呼ばれる、軽鎖のみのポリペプチドアイソタイプがある。抗体アイソタイプの特有の特性は、重鎖の定常ドメインの配列によって定義される。
【００９１】
IgG分子は、ジスルフィド結合によって互いに結合されている、2本の軽鎖(κ形態又はλ形態)及び2本の重鎖(γ形態)を含む。IgG軽鎖のκ形態及びλ形態は両方とも、可変領域と呼ばれる(「VL-領域」、「Vκ-領域」又は「Vλ-領域」など様々に呼ばれる)、比較的可変的なアミノ酸配列のドメインと、定常領域(CL領域)と呼ばれる、比較的保存されたアミノ酸配列のドメインとを含有する。同様に、それぞれのIgG重鎖は、可変領域(VH-領域)及び一つ又は複数の保存領域を含有する。完全IgG重鎖は、三つの定常ドメイン(「CH1-領域」、「CH2-領域」及び「CH3-領域」)並びに一つのヒンジ領域を含有する。それぞれのVL-領域又はVH-領域内において、超可変領域(相補性決定領域(「CDR」)としても知られている)は、比較的保存されたフレームワーク領域(「FR」)に点在している。一般に、軽鎖ポリペプチド又は重鎖ポリペプチドの可変領域は、以下の順のポリペプチドに沿って配列されている四つのFR及び三つのCDRを含有している:NH2-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-COOH。CDR及びFRは一緒になって、IgG結合部位の三次元構造、ひいては、そのIgG分子が結合する特異的標的タンパク質又は抗原を決定する。それぞれのIgG分子は、2種の抗原分子を結合することが可能である二量体である。プロテアーゼのパパインを用いて二量体IgGを切断すると二つの等しい抗原結合性断片(「Fab」)及び「Fc」断片又はFcドメイン(容易に結晶するのでそう命名された)を生成する。
【００９２】
一部の実施形態において、本組成物は構築物を含み、当該構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン及びマウスIgM Fcドメインからなる群から選択される補体活性化物質部分とを含み、CR2部分が少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片を選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片を選択的に結合し、しかもEBV gp350を選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片を選択的に結合し、しかもIFNαを選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分はIFNαを選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分はIFNαを選択的に結合し、しかもEBV gp350を選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分はEBV gp350を選択的に結合する。本明細書では、「選択的に結合する」とは、構築物があるリガンドへの結合増強を示し、且つ/又は異なるリガンドへの結合低下を示すことを意味する。例えば、「選択的に結合する」とは次のような場合を意味し得る:1)改変された構築物が第1のリガンドに対して、改変していない構築物の第1のリガンドに対する結合親和性と似た結合親和性を有するが、改変された構築物が、改変していない構築物で行う場合よりも第2のリガンドに対して低親和性を有しており、したがって、改変された構築物は、改変していない構築物の二つのリガンドに対する結合と比較して、第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;2)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があるが、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合に似た第2のリガンドへの結合を維持しており、したがって、構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;又は3)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があり、しかも、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合と比べて第2のリガンドに対する低結合親和性を有しており、したがって、改変された構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」が第2のリガンドには「選択的に結合しない」場合。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。特定の実施形態において、構築物の補体活性化物質部分は、Igタンパク質又はその生物活性断片を含む。特定の実施形態において、Igタンパク質又はその生物活性断片は、ヒトIgG1、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM及びマウスIgM Fcドメインを含む。
【００９３】
コブラ毒因子(CVF)
本明細書では、用語「コブラ毒因子」、「CVF」及び「C3b(コブラ)」は、コブラ毒の非毒性補体活性化成分を指す。天然のヒトC3bと同様、CVF(配列番号13)は、補体成分B因子及びD因子と複合体(すなわち転換酵素)を形成する。このCVFBbD転換酵素は、代替補体経路を介して様々な種でC3を活性化することができる。CVFBbD転換酵素はH因子耐性であり、したがって、I因子又はCR1の活性により阻害されず、C3のほぼ100%をC3断片及びC5断片に変換することができる。iC3b、C3a、SC5b-9、C5a及びB因子分解産物Bbのレベルは、CVF処理血清においてすべて非常に高い。モノクルコブラ(Naja kaouthia)由来のCVFのクローニング及びシーケンシングは、Fritzingerら、「Molecular cloning and derived primary structure of cobra venom factor」、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91(26):12775-779 (1994)の中で報告されている。その配列は、アクセッション番号U09969でGenBankデータベースに登録された。Fritzingerらの参考文献及びアクセッション番号U09969のGenBankに登録されている配列は、両方とも、参照により本明細書に組み入れるものとする。また用語「コブラ毒因子」、「CVF」及び「C3b(コブラ)」は、CVF部分及び補体成分3(C3)部分を含む、ハイブリッドCVF分子も指す。例えば、Fritzingerら、「Functional characterization of human C3/cobra venom factor hybrid proteins for therapeutic complement depletion」、Develop. Comp. Immunol. 33(1):105-116 (2009)に記載されているものがあり、当該参考文献は参照により本明細書に組み入れるものとする。これらのハイブリッドは、C3の113又は315のC末端残基が対応するCVF配列で置換されたタンパク質を含む。両ハイブリッドは、異なる速度ではあるが、C3の切断活性を示した安定性転換酵素を形成した。どちらの転換酵素もC5を切断しなかった。両転換酵素は、H因子及びI因子による不活性化に対する部分的な耐性を示し、それによりヒト血清中の補体を激減させることができる。
【００９４】
一態様において、本組成物は、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)CVFとを含む、構築物を含む。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片を選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片を選択的に結合し、しかもEBV gp350を選択的に結合する。一部の実施形態においては、CR2部分は、C3d、iC3dg、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの細胞結合断片からなる群から選択される一つ又は複数のC3タンパク質分解断片を選択的に結合し、しかもIFNαを選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分はIFNαを選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分はIFNαを選択的に結合し、しかもEBV gp350を選択的に結合する。一部の実施形態において、CR2部分はEBV gp350を選択的に結合する。本明細書では、「選択的に結合する」とは、構築物があるリガンドへの結合増強を示し、且つ/又は異なるリガンドへの結合低下を示すことを意味する。例えば、「選択的に結合する」とは次のような場合を意味し得る:1)改変された構築物が第1のリガンドに対して、改変していない構築物の第1のリガンドに対する結合親和性と似た結合親和性を有するが、改変された構築物が、改変していない構築物で行う場合よりも第2のリガンドに対して低親和性を有しており、したがって、改変された構築物は、改変していない構築物の二つのリガンドに対する結合と比較して、第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;2)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があるが、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合に似た第2のリガンドへの結合を維持しており、したがって、構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」場合;又は3)改変された構築物は、改変していない構築物の第1のリガンドへの結合と比べて第1のリガンドへの結合増強があり、しかも、改変していない構築物の第2のリガンドへの結合と比べて第2のリガンドに対する低結合親和性を有しており、したがって、改変された構築物が、改変していない構築物の二つのリガンドへの結合と比べて第1のリガンドに「選択的に結合する」が第2のリガンドには「選択的に結合しない」場合。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。
【００９５】
本発明の組成物
特定リガンドへの選択的結合に関与するCR2中のアミノ酸残基
本明細書に記載のEBV gp350、IFNα、及びC3dに結合するCR2の構造分析(実施例1を参照)により、それらのそれぞれのリガンドの結合にとって重要な多数のCR2アミノ酸残基を同定した。これらのアミノ酸残基の一部は三つのリガンドすべての結合にとって重要であるが、その他のものは、一つの特定のリガンド(例えば、EBV gp350、IFNα又はC3d)の結合にとって重要である。
【００９６】
例えば、CR2-EBV gp350結合相互作用にとって重要であると判定された残基は、N11、R13、A22、R28、S32、R36、K41、K57、Y64、K67、Y68、R83、G84及びR89である(表2を参照)。CR2-EBV gp350結合相互作用にとって重要であるが、CR2-C3d結合相互作用又はCR2-IFNα結合相互作用にとっては重要でないと判定された残基はN11、R36、K41、Y64及びK67である(表2を参照)。CR2-IFNα結合相互作用にとって重要であると判定された残基は、R13、Y16、R28、S42、K48、K50、Y68、R83、G84及びR89である(表2を参照)。CR2-IFNα結合相互作用にとって重要であるが、CR2-C3d結合相互作用又はCR2-EBV gp350結合相互作用にとっては重要でないと判定された残基は、S42及びK50である(表2を参照)。CR2-C3d結合相互作用にとって重要であると判定された残基は、I9、R13、Y16、A22、R28、Y29、C31、S32、G33、T34、K48、D56、K57、Y68、S70、R83、G84、R89、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128である(表2を参照)。CR2-C3d結合相互作用にとって重要であるが、CR2-gp350結合相互作用又はCR2-IFNα結合相互作用にとっては重要でないと判定された残基は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128である(表2を参照)。CR2-C3d結合相互作用にとって重要であると判定されたアミノ酸残基は、他の細胞表面結合C3断片(例えばC3dg及びiC3b)とのCR2結合相互作用にとって重要である可能性が高い。CR2-gp350、CR2-IFNα及びCR2-C3d結合相互作用にとって重要であると判定された残基は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89である。これらのアミノ酸残基がCR2と二つ以上のそのリガンドとの間の結合相互作用にとって重要であることから、それらの一つ又は複数の位置でアミノ酸残基を変異させることで、C3d及び/又は他のCR2リガンドに対するCR2部分のターゲティング能力を改善することもできる。
【００９７】
CR2及びEBV-gp350、CR2及びIFNα、並びに/或いはCR2及びC3dの間の結合相互作用にとって重要な各種アミノ酸残基での少なくとも一つ又は複数の変異を含む、本明細書に記載の改善されたターゲティング基は、米国特許出願公開第2008/0267980 A1号、米国特許出願公開第2008/0221011 A1号及び米国特許出願公開第2005/0260198 A1号(これら文献はすべて、参考文献により本明細書に組み入れるものとする)に記載されている、CR2ターゲティング基の使用に好適な任意の生理学的部位(例えば、炎症部位)に対し補体モジュレーター(例えば補体阻害物質又は補体活性化物質)を送達するために使用することができる。
【００９８】
CR2と特異的リガンドの間の結合相互作用にとって重要であると判定されたCR2アミノ酸残基の変異は、恐らくは、その他のリガンドに対するCR2の結合親和性に比較的影響を及ぼさないまま、その特異的リガンドに対するCR2の結合親和性を低下させる。例えば、CR2(配列番号1)中のアミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67の少なくとも一つの変異は、C3d及びIFNαに対する結合親和性に変化を起こさないようにしながら、EBV gp350に対するCR2の結合親和性を低下させ得る。同様に、アミノ酸残基S42及びK50の少なくとも一つの変異は、C3d及びgp350に対する結合親和性に変化を起こさないようにしながら、IFNαに対するCR2の結合親和性を低下させ得る。アミノ酸残基I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128の少なくとも一つの変異は、IFNα及びgp350に対する結合親和性に変化を起こさないようにしながら、C3dに対するCR2の結合親和性を低下させ得る。
【００９９】
本明細書では、構築物を含む可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、構築物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合するが、IFNα又はEBV gp350に結合しないか、IFNα又はEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、IFNαに選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片を結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、EBV gp350に選択的に結合するが、IFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、IFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。
【０１００】
特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも六つのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも七つのアミノ酸置換を含有する。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一、二、三、四、五、六又は七つのアミノ酸置換は、保存的置換であってもよい。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一、二、三、四、五、六又は七つのアミノ酸置換は、非保存的置換であってもよい。
【０１０１】
特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、またCR2部分は、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、またCR2部分は、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、またCR2部分は、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、またCR2部分は、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有し、またCR2部分は、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一、二、三、四又は五つのアミノ酸置換は、保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一、二、三、四又は五つのアミノ酸置換は、非保存的置換であってもよい。
【０１０２】
特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、またCR2部分は、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、またCR2部分は、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一又は二つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一又は二つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。
【０１０３】
特定の実施形態において、CR2部分は、CR2タンパク質のリガンド結合部位の一部又は全部を含有するポリペプチドを含み、例えば、限定するものではないが、完全長のCR2タンパク質(例えば、配列番号1で示したヒトCR2)、可溶性CR2タンパク質(例えば、CR2の細胞外ドメインを含むCR2断片)及びCR2の他の生物活性断片、例えば、SCR1-2(配列番号2)を含むCR2断片、又は、下記に詳細に記載されているような天然型CR2の任意の相同体若しくはそれらの断片を包含する。特定の実施形態において、CR2部分は、以下の一つ又は複数のCR2の特性を有する:(1)C3タンパク質分解断片C3dに選択的に結合する能力、(2)C3タンパク質分解断片iC3bに選択的に結合する能力、(3)C3タンパク質分解断片C3dgに選択的に結合する能力、(4)CR2の二つのN末端SCRドメインに結合する、C3タンパク質分解断片C3bの一つ又は複数の細胞結合断片に選択的に結合する能力、(5)EBV gp350に選択的に結合する能力、及び(6)IFNαに選択的に結合する能力。
【０１０４】
特定の実施形態において、CR2部分は、CR2の最初の二つのN末端SCRドメインを含む(配列番号2のアミノ酸23〜146)。特定の実施形態において、CR2部分は、CR2の最初の三つのN末端SCRドメインを含む(配列番号1のアミノ酸23〜212)。特定の実施形態において、CR2部分は、CR2の最初の四つのN末端SCRドメインを含む(配列番号1のアミノ酸23〜271)。特定の実施形態において、CR2部分は、例えば、CR2の少なくとも最初の3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15のSCRドメインのいずれかを含む、CR2の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含む(一部の実施形態においては、それらからなる、又はそれらから実質的になる)。
【０１０５】
特定の実施形態において、本明細書に記載の構築物のCR2部分は、少なくとも一、二、三、四、五、六、七又はそれ以上のアミノ酸置換を含む(一部の実施形態においては、それらからなる、又はそれらから実質的なる)。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、アミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的置換及び非保存的置換の混合であってもよい。
【０１０６】
補体系活性化の領域に対して補体モジュレーターを標的化送達するための組成物
一部の態様において、構築物を含む補体系活性化の部位への補体モジュレーターの標的化送達が可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、EBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一、二、三、四又は五つのアミノ酸置換は、保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一、二、三、四又は五つのアミノ酸置換は、非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、N11A、R36A、K41A、Y64A及びK67Aからなる群からのアミノ酸に一つ又は複数の置換を含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3b、C3dg、CR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片、CD23及びIFNαからなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はEBV gp350に結合しない。別の実施形態において、構築物は、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸置換は、EBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マ��スIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１０７】
一部の態様において、構築物を含む補体系活性化の部位への補体モジュレーターの標的化送達が可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、IFNαに対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかもIFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかもIFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一つ又は二つのアミノ酸置換は、保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一つ又は二つのアミノ酸置換は、非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、S42A及びK50Aからなる群からのアミノ酸に一つ又は複数の置換を含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3b、C3dg、CR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片、CD23及びEBV gp350からなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はIFNαに結合しない。別の実施形態において、構築物は、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸置換は、IFNαに対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１０８】
一部の態様において、構築物を含む補体系活性化の部位への補体モジュレーターの標的化送達が可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、EBV gp350及びIFNαに対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも二つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも二つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも二つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、N11A、R36A、K41A、Y64A及びK67Aからなる群からのアミノ酸に一つ又は複数の置換、並びにS42A及びK50Aからなる群からの変異を含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3b、C3dg、CR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片、及びCD23からなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はIFNα及びEBV gp350に結合しない。別の実施形態において、構築物は、IFNα及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも二つのアミノ酸置換は、IFNα及びEBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１０９】
一部の態様において、構築物を含む補体系活性化の部位への補体モジュレーターの標的化送達が可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、EBV gp350及びIFNαに対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも三つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、しかもEBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも三つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも三つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、N11A、R36A、K41A、Y64A及びK67Aからなる群からのアミノ酸に一つ又は複数の置換、並びに変異S42A及びK50Aを含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、C3d、iC3b、C3dg、CR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片、及びCD23からなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はIFNα及びEBV gp350に結合しない。別の実施形態において、構築物は、IFNα及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも三つのアミノ酸置換は、IFNα及びEBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モ���ュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１１０】
エプスタインバーウイルスの感染部位に対して補体モジュレーターを標的化送達するための組成物
一部の態様において、構築物を含むエプスタインバーウイルスの感染部位に対して補体モジュレーターを標的化送達することが可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した
結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも六つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも七つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも八つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも九つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十一のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十二のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十三のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十四のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128での十五のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、又は十五のアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも、一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、又は十五のアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、CD23、EBV gp350、及びIFNαからなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物は一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しない。別の実施形態において、構築物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸置換は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１１１】
一部の態様において、構築物を含むエプスタインバーウイルスの感染部位に対して補体モジュレーターを標的化送達することが可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも二つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群��ら選択されるアミノ酸残基での少なくとも六つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも七つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも八つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも九つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十一のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十二のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十三のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十四のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、S42及びK50からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらにアミノ酸残基I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128での十五のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも二つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも二つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、S42A及びK50Aからなる群からのアミノ酸の置換を含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、CD23及びEBV gp350からなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はIFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しない。別の実施形態において、構築物は、IFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも二つのアミノ酸置換は、IFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１１２】
一部の態様において、構築物を含む補体系活性化の部位への補体モジュレーターの標的化送達が可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも三つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも六つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも七つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも八つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも九つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十一のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十二のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十三のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十四のアミノ酸置換を含���し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基S42及びK50でのアミノ酸置換を含有し、さらにアミノ酸残基I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128での十五のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも三つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも三つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸S42A及びK50Aの置換を含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、CD23及びEBV gp350からなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はIFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しない。別の実施形態において、構築物は、IFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも三つのアミノ酸置換は、IFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１１３】
インターフェロンα産生部位に対して補体モジュレーターを標的化送達するための組成物
一部の態様において、構築物を含むIFNα産生部位に対して補体モジュレーターを標的化送達することが可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも二つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さ���に、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも六つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも七つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも八つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも九つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十一のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十二のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断��及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十三のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十四のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、さらにアミノ酸残基I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128での十五のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも二つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、N11A、R36A、K41A、Y64A及びK67Aからなる群からのアミノ酸の一つ又は複数の置換を含有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも二つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、CD23及びIFNαからなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はEBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しない。別の実施形態において、構築物は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも二つのアミノ酸置換は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質���、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１１４】
一部の態様において、構築物を含むIFNα産生部位に対して補体モジュレーターを標的化送達することが可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも三つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さ���に、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも六つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも七つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも八つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも九つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十一のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十二のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断��及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十三のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十四のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、さらにアミノ酸残基I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128での十五のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも三つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも三つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、N11A、R36A、K41A、Y64A及びK67Aからなる群からのアミノ酸の一つ又は複数の置換を含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、CD23及びIFNαからなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はEBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しない。別の実施形態において、構築物は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも三つのアミノ酸置換は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質���、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１１５】
一部の態様において、構築物を含むIFNα産生部位に対して補体モジュレーターを標的化送達することが可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも四つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さ���に、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも六つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも七つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも八つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも九つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十一のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十二のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断��及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十三のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十四のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、さらにアミノ酸残基I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128での十五のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも四つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも四つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、N11A、R36A、K41A、Y64A及びK67Aからなる群からのアミノ酸の一つ又は複数の置換を含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、CD23及びIFNαからなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はEBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しない。別の実施形態において、構築物は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも四つのアミノ酸置換は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。他の実施形態において、これらの補体阻害物質の一部は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化���質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１１６】
一部の態様において、構築物を含むIFNα産生部位に対して補体モジュレーターを標的化送達することが可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも五つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さ���に、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも六つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも七つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも八つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも九つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十一のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十二のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断��及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十三のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十四のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、さらにアミノ酸残基I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128での十五のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも五つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも五つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、N11A、R36A、K41A、Y64A及びK67Aからなる群からのアミノ酸の一つ又は複数の置換を含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、CD23及びIFNαからなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はEBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しない。別の実施形態において、構築物は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも五つのアミノ酸置換は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質���、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１１７】
一部の態様において、構築物を含むIFNα産生部位に対して補体モジュレーターを標的化送達することが可能な可溶性組成物であって、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含み、CR2部分が、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対するCR2部分の結合親和性を低下させる少なくとも六つのアミノ酸置換を含有する、可溶性組成物を提供する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも一つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも二つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも三つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも四つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも五つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも六つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合し��いか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも七つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも八つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも九つのアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十一のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十二のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十三のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合���ないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらに、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも十四のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。特定の実施形態において、CR2部分は、アミノ酸残基N11、R36、K41、Y64及びK67での五つのアミノ酸置換を含有し、さらにアミノ酸残基I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128での十五のアミノ酸置換を含有し、しかも一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも六つのアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも六つのアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。特定の実施形態において、CR2部分は、N11A、R36A、K41A、Y64A及びK67Aからなる群からのアミノ酸の一つ又は複数の置換を含有する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、CR2部分は、CD23及びIFNαからなる群からの一つ又は複数のタンパク質に選択的に結合する。一部の実施形態において、構築物はEBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しない。別の実施形態において、構築物は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、少なくとも六つのアミノ酸置換は、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対するCR2部分の結合親和性を、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下させる。一部の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体阻害物質である。これらの実施形態の一部において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。別の実施形態において、補体モジュレーター部分は補体活性化物質である。これらの実施形態の一部において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。
【０１１８】
補体モジュレーターを標的化送達するための別のCR2置換
本明細書に記載のいずれかの組成物に関するいずれかの実施形態において、CR2部分は、CR2部分中の別の位置での少なくとも一、二、三、四、五、六、七、八、九、十又は十一の追加のアミノ酸置換をさらに含有することができる。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも二つのアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも三つのアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも四つのアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも五つのアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも六つのアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも七つのアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも八つのアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも九つのアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも十のアミノ酸置換をさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも十一のアミノ酸置換をさらに含有する。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一、二、三、四、五、六、七、八、九、十又は十一のアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも一、二、三、四、五、六、七、八、九、十又は十一のアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。
【０１１９】
リンカータンパク質
本明細書に記載した実施形態のいずれかにおいて、CR2部分又はその生物活性断片と、ヒトCD59、マウスCD59アイソフォームA、マウスCD59アイソフォームB、マウスCrryタンパク質、ヒトH因子、マウスH因子、ヒトCR1、ヒトMCP、ヒトDAF若しくはマウスDAF又はそれらの生物活性断片を含む補体阻害物質部分とを含む構築物はまた、CR2部分と補体阻害物質部分(例えば、ヒトCD59、マウスCD59アイソフォームA、マウスCD59アイソフォームB、マウスCrryタンパク質、ヒトH因子、マウスH因子、ヒトCR1、ヒトMCP、ヒトDAF若しくはマウスDAF又はそれらの生物活性断片)を連結するアミノ酸リンカー配列も含む。
【０１２０】
本明細書に記載した実施形態のいずれかにおいて、CR2部分又はその生物活性断片と、ヒトIgG1、ヒトIgM、マウスIgG3、マウスIgM若しくはCVF又はそれらの生物活性断片を含む補体活性化物質部分とを含む構築物はまた、CR2部分と補体活性化物質部分(例えば、ヒトIgG1、ヒトIgM、マウスIgG3、マウスIgM若しくはCVF又はそれらの生物活性断片)を連結するアミノ酸リンカー配列を含む。
【０１２１】
リンカー配列の例は当技術分野では公知であり、例えば、(Gly4Ser)、(Gly4Ser)2、(Gly4Ser)3、(Gly3Ser)4、(SerGly4)、(SerGly4)2、(SerGly4)3及び(SerGly4)4が挙げられる。また連結配列は、補体因子の異なるドメイン間に見られる「天然の」連結配列を含むこともできる。例えば、VSVFPLE(配列番号26)又はEYFNKYSS(配列番号27)(ヒトCR2の最初の二つのN末端ショートコンセンサスリピートドメインの間の連結配列)を使用することができる。一部の実施形態において、ヒトCR2(EEIF)(配列番号28)の第4及び第5のN末端ショートコンセンサスリピートドメイン間の連結配列が用いられる。一部の実施形態において、リンカー配列は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90又は100(またこれらの数の間の任意の数値を含める)アミノ酸を含む。
【０１２２】
医薬組成物
別の態様において、本明細書は、本明細書に記載したいずれかの構築物及び/又は融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載したいずれかの構築物及び/又は融合タンパク質を含む医薬組成物は、通常、アメリカ食品医薬品局の全適正製造基準(GMP)規則に完全に従って、滅菌済みの実質的に等張の医薬溶液として処方される。特定の実施形態において、組成物は病原菌を含んでいない。注射製剤に関して、医薬組成物は、例えば、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水又はリンゲル液などの生理学上適合するバッファー中の溶液の形態であることが可能である。さらに、本明細書で提供される医薬組成物は固体形態であってもよく、使用直前に再溶解又は再懸濁される。凍結乾燥した組成物もまた該当する。
【０１２３】
経口投与に関して、医薬組成物は、例えば、製薬上許容可能な添加剤、例えば、結合剤(例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶性セルロース若しくはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク若しくはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプン若しくはデンプングリコール酸ナトリウム);又は湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)を用いる慣用の手段により調製される錠剤又はカプセル剤の形態をとることができる。経口投与用の液状製剤は、例えば溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとることができるか、使用前に水又は別の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品としてそれらを提供することができる。そのような液状製剤は、製薬上許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用脂);乳化剤(例えば、レシチン又はアラビアゴム);非水性ビヒクル(例えば、分留油、油状エステル、エチルアルコール又は分留植物油);及び防腐剤(例えば、メチル-p-ヒドロキシ安息香酸エステル若しくはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸エステル又はソルビン酸)を用いる慣用の手段によって調製することができる。また製剤は、緩衝塩、香味剤、着色剤及び甘味剤を必要に応じて含有することもできる。
【０１２４】
特定の実施形態において、組成物は、注射剤に適合した医薬組成物として常法に従って製剤化される。特定の実施形態において、本明細書で提供される医薬組成物は、静脈注射、腹腔内注射又は眼球内注入用に製剤化される。一般的に、注射用組成物は滅菌済み等張水性バッファー溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位での疼痛を緩和するために、リグノカインなどの局所麻酔薬を含んでいてもよい。通常、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又は袋(sachette)などの密封容器中の凍結乾燥粉末又は水非含有の濃縮物として、別々に供給されるか、単位剤形中で一緒に混合される。組成物が点滴によって投与されることになっている場合、滅菌済みの医薬グレードの水又は生理食塩水を含有する点滴ボトルで投与することができる。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合できるように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１２５】
医薬組成物は、追加の成分、例えば、防腐剤、バッファー、浸透圧剤、酸化防止剤、安定剤、非イオン性湿潤剤又は清澄剤、増粘剤などをさらに含んでもよい。
【０１２６】
溶液で使用する適切な防腐剤は、ポリクオタニウム-1、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、EDTA二ナトリウム、ソルビン酸、塩化ベンゼトニウムなどが挙げられる。一般的に(しかし必ずではない)、そのような防腐剤は、0.001重量%から1.0重量%の濃度で用いられる。
【０１２７】
適切なバッファーは、約pH6〜pH8、好ましくは約pH7〜pH7.5のpHを維持するのに十分な量のホウ酸、炭酸水素ナトリウム及び炭酸水素カリウム、ホウ酸ナトリウム及びホウ酸カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどが挙げられる。
【０１２８】
適切な浸透圧剤としては、注射用溶液の塩化ナトリウム当量が0.9プラスマイナス0.2%の範囲であるような、デキストラン40、デキストラン70、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【０１２９】
適切な酸化防止剤及び安定剤は、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム(sodium thiosulfite)、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤剤及び清澄剤としては、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー282及びチロキサポールが挙げられる。適切な増粘剤としては、デキストラン40、デキストラン70、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース（hydroxmethylpropylcellulose）、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
【０１３０】
医薬組成物は、例えば、全身投与又は局所性投与をはじめとする、本明細書に記載した様々な投与方法に適し得る。医薬組成物は、注射用溶液の形態又は経口投与に好適な形態とすることができる。本明細書に記載した医薬組成物は、単一投与単位又は多重投与形態で包装することができる。特定の実施形態において、医薬組成物は、経口投与又は静脈注射をはじめとする、本明細書に記載した任意の投与経路による個体、脊椎動物、哺乳動物又はヒトへの投与に好適である。
【０１３１】
本発明の方法
補体系モジュレーションのための標的化構築物を作製する方法
本明細書は、CR2の一つ又は複数のリガンドに選択的に結合する構築物を作製する方法であって、方法が構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップを含み、構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、構築物は融合タンパク質である。一部の実施形態において、構築物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合するが、IFNα又はEBV gp350に結合しないか、IFNα又はEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、IFNαに選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、構築物は、EBV gp350に選択的に結合するが、IFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、IFNα及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。
【０１３２】
一態様において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合するが、EBV gp350又はIFNαに選択的に結合しない構築物を作製する方法であって、(a)N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップと:(b)S42及びK50からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップを含み、構築物が、(i)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(ii)補体モジュレーター部分とを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数の変異は、アミノ酸アラニンへの変異である。一部の実施形態において、本方法は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17又は18のアミノ酸のいずれかを変異させるステップを含む。
【０１３３】
一態様において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに選択的に結合しない構築物を作製する方法であって、S42及びK50からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップを含み、当該構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数の変異は、アミノ酸アラニンへの変異である。一部の実施形態において、本方法は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13のアミノ酸のいずれかを変異させるステップを含む。
【０１３４】
一態様において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に選択的に結合しない構築物を作製する方法であって、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップを含み、当該構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数の変異は、アミノ酸アラニンへの変異である。一部の実施形態において、本方法は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又は16のアミノ酸のいずれかを変異させるステップを含む。
【０１３５】
一態様において、IFNαに選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合しない構築物を作製する方法であって、(a)N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップと:(b)I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップとを含み、構築物が、(i)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(ii)補体モジュレーター部分とを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数の変異は、アミノ酸アラニンへの変異である。一部の実施形態において、本方法は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又は31のアミノ酸のいずれかを変異させるステップを含む。
【０１３６】
一態様において、EBV gp350及びIFNαに選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合しない構築物を作製する方法であって、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップを含み、当該構築物が、(a)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(b)補体モジュレーター部分とを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数の変異は、アミノ酸アラニンへの変異である。一部の実施形態において、本方法は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のアミノ酸のいずれかを変異させるステップを含む。
【０１３７】
一態様において、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合しない構築物を作製する方法であって、(a)S42及びK50からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップと:(b)I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群からの構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップとを含み、構築物が、(i)配列番号1のCR2タンパク質又はその生物活性断片を含む補体レセプター2(CR2)部分であって、CR2タンパク質の少なくとも最初の二つのN末端SCRドメインを含有するCR2部分と、(ii)補体モジュレーター部分とを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数の変異は、アミノ酸アラニンへの変異である。一部の実施形態において、本方法は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の一つ又は複数のアミノ酸を変異させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、構築物の補体レセプター2(CR2)部分中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27又は28のアミノ酸のいずれかを変異させることを含む。
【０１３８】
結合親和性を低下させる方法、又は一つ若しくは複数のリガンドに対する構築物のCR2部分の結合キネティクスを変化させる方法
別の態様において、本明細書は、一つ又は複数のCR2リガンドに対する本明細書に開示の構築物のいずれかのCR2部分の結合親和性を低下させる方法であって、構築物のCR2部分のアミノ酸配列に一つ又は複数の変異を導入するステップを含み、一つ又は複数の変異が、一つ又は複数のCR2リガンドに対する構築物のCR2部分の結合親和性を低下させる、方法を提供する。
【０１３９】
特定の態様において、EBV gp350及びIFNαに対する本明細書に開示の構築物のいずれかのCR2部分の結合親和性を低下させる方法であって、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるCR2部分中の少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるCR2部分中の少なくとも二つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるCR2部分中の少なくとも三つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるCR2部分中の少なくとも四つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるCR2部分中の少なくとも五つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるCR2部分中の少なくとも六つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択されるCR2部分中の七つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、少なくとも一、二、三、四、五、六又は七つの変異は、保存的アミノ酸置換である。特定の実施形態において、少なくとも一、二、三、四、五、六又は七つの変異は、非保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態において、EBV gp350及び/又はIFNαに対する構築物の結合親和性は、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下する。
【０１４０】
特定の態様において、EBV gp350に対する本明細書に開示の構築物のいずれかのCR2部分の結合親和性を低下させる方法であって、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される少なくとも二つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される少なくとも三つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される少なくとも四つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、本方法は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される少なくとも五つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、少なくとも一、二、三、四又は五つの変異は、保存的アミノ酸置換であってもよい。特定の実施形態において、少なくとも一、二、三、四又は五つの変異は、非保存的アミノ酸置換であってもよい。一部の実施形態において、EBV gp350に対する構築物の結合親和性は、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下する。
【０１４１】
特定の態様において、IFNαに対する本明細書に開示の構築物のいずれかのCR2部分の結合親和性を低下させる方法であって、S42及びK50からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、S42及びK50からなる群から選択される少なくとも二つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、少なくとも一又は二つの変異は、保存的アミノ酸置換であってもよい。特定の実施形態において、少なくとも一又は二つの変異は、非保存的アミノ酸置換であってもよい。一部の実施形態において、IFNαに対する構築物の結合親和性は、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテージの間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、低下する。
【０１４２】
別の態様において、一つ又は複数のCR2リガンドに対する本明細書に開示の構築物のいずれかのCR2部分の結合親和性を低下させる方法は、CR2部分中の別の位置で少なくとも一、二、三、四、五、六、七、八、九、十又は十一のアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも二つのアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも三つのアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも四つのアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも五つのアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも六つのアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも七つのアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも八つのアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも九つのアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される少なくとも十のアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。特定の実施形態において、CR2部分は、R13、Y16、A22、R28、S32、K48、K57、Y68、R83、G84及びR89からなる群から選択される十一のアミノ酸置換を場合によりさらに含有する。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも、一、二、三、四、五、六、七、八、九、十又は十一のアミノ酸置換は保存的置換であってもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも、一、二、三、四、五、六、七、八、九、十又は十一のアミノ酸置換は非保存的置換であってもよい。
【０１４３】
別の態様において、本明細書は、別のCR2リガンド(例えば、EBV gp350及びIFNα)に比べて、C3、C3(H2O)又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスを変化させる方法を提供する。特定の実施形態において、この変化により、C3の細胞表面結合タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが改善され、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択される構築物のCR2部分中の少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、この変化により、C3の細胞表面結合タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが改善され、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択される構築物のCR2部分中の少なくとも二つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、この変化により、C3の細胞表面結合タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが改善され、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択される構築物のCR2部分中の少なくとも三つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、この変化により、C3の細胞表面結合タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが改善され、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択される構築物のCR2部分中の少なくとも四つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、この変化により、C3の細胞表面結合タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが改善され、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択される構築物のCR2部分中の少なくとも五つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、この変化により、C3の細胞表面結合タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが改善され、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択される構築物のCR2部分中の少なくとも六つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、この変化により、C3の細胞表面結合タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが改善され、本方法は、N11、R36、K41、S42、K50、Y64及びK67からなる群から選択される構築物のCR2部分中の少なくとも七つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、C3の細胞表面結合断片は、C3d、C3dg及びiC3bからなる群から選択される。特定の実施形態において、C3の細胞表面結合断片はC3dである。特定の実施形態において、C3の細胞表面結合断片はC3dgである。特定の実施形態において、C3の細胞表面結合断片はiC3bである。特定の実施形態において、少なくとも一、二、三、四、五、六又は七つの変異は、保存的アミノ酸置換であってもよい。特定の実施形態において、少なくとも一、二、三、四、五、六又は七つの変異は、非保存的アミノ酸置換であってもよい。一部の実施形態において、この変化により、C3の細胞表面結合タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが、少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%のいずれかの割合、改善される。
【０１４４】
特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも二つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも三つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも四つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも五つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも六つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも七つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも八つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タ���パク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも九つのアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも十のアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも十一のアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも十二のアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも十三のアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される少なくとも十四のアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の態様において、この変化により、C3、C3(H2O)及び/又は細胞表面結合C3タンパク質分解断片(例えば、限定するものではないが、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが悪化し、本方法は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される十五のアミノ酸残基を変異させるステップを含む。特定の実施形態において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15の変異は、保存的アミノ酸置換であってもよい。特定の実施形態において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15の変異は、非保存的アミノ酸置換であってもよい。一部の実施形態において、この変化により、C3の細胞表面結合タンパク質分解断片(例えば、C3d、C3dg及びiC3b)に対する構築物のCR2部分の結合キネティクスが、約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は100%(またこれらのパーセンテー���の間の任意の数値を含める)のいずれかの割合、悪化する。
【０１４５】
補体関連疾患又は症状の治療方法
本明細書は、個体に本明細書に記載のいずれかの組成物を投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法を提供する。本明細書では、「個体」とは、脊椎動物、哺乳動物又はヒトであってよい。詳細には、本明細書で使用する場合、「哺乳動物」とは、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ウシ又はウマであってもよい。個体への組成物の投与は、限定するものではないが、症状の徴候の低減、症状の重症度の低減、又は症状の完全な消失の効果を有し得ると理解されたい。
【０１４６】
補体活性を阻害することによる治療方法
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体に投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体阻害物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を阻害する、治療方法を提供する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に選択的に結合するが、IFNα及びEBV gp350に結合しないか、IFNα及びEBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。
【０１４７】
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体に投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体阻害物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を阻害し、補体関連疾患又は症状が炎症性疾患である、治療方法を提供する。一部の実施形態において、補体関連疾患又は症状としては、炎症性症状、例えば、限定するものではないが、喘息、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、反応性関節炎、脊椎関節炎、全身性脈管炎、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験的アレルギー性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、移植片対宿主疾患、クローン病を含む炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、虚血再潅流障害、心筋梗塞、アルツハイマー病、移植拒絶反応(同種及び異種)、熱傷、すべての免疫複合体誘発性炎症、糸球体腎炎、重症筋無力症、大脳ループス、ギラン−バレー症候群、脈管炎、全身性硬化症、アナフィラキシー、カテーテル反応、アテローム、不妊、甲状腺炎、成人呼吸窮迫症候群(ARDS)、バイパス後症候群、血液透析、若年性関節リウマチ、ベーチェット症候群、溶血性貧血、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、卒中、アテローム性動脈硬化及び硬皮症が挙げられ得る。一部の実施形態において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。
【０１４８】
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体に投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体阻害物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を阻害し、補体関連疾患又は症状がウイルス感染である、治療方法を提供する。一部の実施形態において、ウイルス感染は、限定するものではないが、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、呼吸器合胞体ウイルス、デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー熱ウイルス、西ナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルスA、ロタウイルスB、ロタウイルスC、シンドビスウイルス、ハンタウイルスが挙げられ得る。一部の態様において、補体関連疾患又は症状は、ウイルス系ベクターに対する個体の応答の結果である。特定の実施形態において、ウイルス系ベクターとしては、限定するものではないが、アデノウイルス、牛痘ウイルス、アデノ随伴ウイルス、修飾ワクシニアアンカラウイルス、サイトメガロウイルス、又は当技術分野で公知の別のウイルス系ベクターが挙げられる。一部の実施形態において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分はS42A及��K50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64、K67、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。
【０１４９】
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体に投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体阻害物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を阻害し、補体関連疾患又は症状が真菌感染症である、治療方法を提供する。カンジダ属が、CR2と同様の結合特性を有するCR3様タンパク質を発現することは、当技術分野において理解されている。カンジダCR3様タンパク質は、病因に関与しているようである。したがって、本発明の実施形態は、治療が補体を阻害するだけでなく、真菌-「CR3」機能を遮断する、真菌感染症に罹患している個体の治療方法であって、本明細書に記載の組成物のいずれかを対象に投与することを含み、組成物の補体モジュレーター部分が補体阻害物質又はその生物活性断片を含む、治療方法に関する。一部の実施形態において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分はS42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結��しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64、K67、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。
【０１５０】
正常な発育中に生じるアポトーシスは非炎症性であり、免疫寛容の誘導に関与する。アポトーシス性細胞死は、それがどのように、どのような細胞の種類で活性化されるかによって炎症性となる可能性があるが(例えば、Fasをライゲートする治療薬は炎症を誘発し得る)、壊死性細胞死は、放出された細胞含有物によって、また刺激を受けた食細胞により放出された前炎症性サイトカインによって媒介される、持続的で強力な炎症反応をもたらす。アポトーシス性細胞及び小胞は、通常、食細胞によって除去されるので、細胞溶解の炎症誘発の影響が阻止される。これに関して、アポトーシス細胞及びアポトーシス小体が直接補体を固定すること、補体は、アポトーシス細胞のオプソニン作用及び食細胞運動増強により抗炎症応答を維持することができることが明らかになっている。
【０１５１】
炎症は、先天性及び適応性の免疫応答に影響しうる免疫細胞の非特異的動員に関係する。アポトーシスに基づく腫瘍療法中に補体活性化をモジュレートしてアポトーシス細胞/小体の食作用性取り込みを阻害することは、腫瘍環境内の炎症性/先天性免疫応答を増強する。さらに、アポトーシス細胞は、免疫原性自己抗原のソースとなる可能性があり、除去されないアポトーシス小体は、自己免疫化を生じうる。増強された免疫刺激環境を作り出すことに加えて、腫瘍細胞を誘導してアポトーシスを受けさせる部位で補体をモジュレートすることは、さらに、宿主が正常には寛容する腫瘍に対して特異的な免疫を増大又は誘発する。
【０１５２】
したがって、一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体に投与することを含む、個体におけるアポトーシスに基づいた治療(例えばFasリガンドを発現するアデノウイルスによる遺伝子療法)の結果の増強方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体阻害物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を阻害する、増強方法を提供する。一部の実施形態において、補体阻害物質は、MCP、DAF、CD59、Crry、CR1及びFHからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインへ結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において���組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64、K67、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。
【０１５３】
補体活性を増強することによる治療方法
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体へ投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体活性化物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を増強する、治療方法を提供する。一部の実施形態において、補体活性の増強は、限定するものではないが、症状の徴候の低減、症状の重症度の低減、又は症状の完全な除去の効果を有し得る。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインへ結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。
【０１５４】
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体へ投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体活性化物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を増強し、補体関連疾患又は症状ががんである、治療方法を提供する。開示された補体を増強する組成物を治療に用いることができるがんの代表的な例示(限定するものではない)として、リンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞性リンパ腫、菌状息肉腫、多発性骨髄腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳腫瘍、神経系がん、頭頸部がん、頭頚部扁平上皮癌、腎臓がん、肺がん(例えば、肺小細胞がん及び肺非小細胞がん)、尿路上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、腺腫、低酸素性腫瘍、髄腫、エイズ関連リンパ腫又は肉腫、転移がん、神経芽細胞腫/膠芽腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、肝臓がん、メラノーマ、口腔、喉、喉頭及び肺の扁平上皮細胞癌、結腸がん、子宮頸がん、子宮頸癌、乳がん、及び上皮がん、腎がん、尿生殖器のがん、肺がん、食道癌、頭頸部の癌、大腸がん、造血系がん、精巣がん、結腸がん及び直腸がん、胃がん、前立腺がん、ヴァルデンストレーム疾患又は膵がんが挙げられる。別の実施形態において、補体関連疾患又は症状は、前癌症状、例えば、限定するものではないが、頸部及び肛門の形態異常、他の形態異常、重度異形成、過形成、非定型的過形成、及び新形成である。特定の実施形態において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分はS42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64、K67、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。
【０１５５】
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体へ投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体活性化物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を増強し、補体関連疾患又は症状がウイルス感染症である、治療方法を提供する。開示した補体を増強する組成物を治療に使用することができるウイルス感染症の代表例(これに限定するものではない)としては、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8、天然痘ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、はしかウイルス、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、呼吸系合胞体ウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デング熱ウイルス、耳下腺炎ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、黄熱病ウイルス,エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー熱ウイルス、西ナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルスA、ロタウイルスB、ロタウイルスC、シンドビスウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス1型、ハンタウイルス、風疹ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス1型、及びヒト免疫不全ウイルス2型が挙げられる。特定の実施形態において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分はS42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64、K67、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。
【０１５６】
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体へ投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体活性化物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を増強し、補体関連疾患又は症状が細菌感染症である、治療方法を提供する。開示した補体を増強する組成物を治療に使用することができる細菌感染症の代表例(これに限定するものではない)としては、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)、ウシ型結核菌(M. bovis)、ウシ型結核菌BCG株(M. bovis strain BCG)、BCG亜株(BCG substrains)、マイコバクテリウム・アビウム(M. avium)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(M. intracellulare)、マイコバクテリウム・アフリカヌム(M. africanum)、マイコバクテリウム・カンサシイ(M. kansasii)、マイコバクテリウム・マリヌム(M. marinum)、マイコバクテリウム・ウルセランス(M. ulcerans)、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核菌(M. avium subspecies paratuberculosis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、他のノルカジア属の種(other Nocardia species)、レジュネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、他のレジオネラ属の種(other Legionella species)、チフス菌(Salmonella typhi)、他のサルモネラ属の種(other Salmonella species)、シゲラ種(Shigella species)、ペスト菌(Yersinia pestis)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、他のパスツレラ属の種(other Pasteurella species)、アクチノバシラス・プルロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア・イバノビイ(Listeria ivanovii)、ブルセラ・アボルツス(Brucella abortus)、他のブルセラ属の種(other Brucella species)、コードリア・ルミナンチウム(Cowdria ruminantium)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumonia)、クラミジア・トラコーマチス(Chlamydia trachomatis)、オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)、コクシエラ・バーネッティ(Coxiella burnetti)、他のリケチア属の種(other Rickettsial species)、エーリキア種(Ehrlichia species)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、バシラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、大腸菌(Escherichia coli)、コレラ菌(Vibrio cholera)、カンピロバクター種(Campylobacter species)、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、ナイセリア淋菌(Neisseria gonorrhea)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、他のシュードモナス種(other Pseudomonas species)、インフルエンザ菌(Haemophilus Influenzae)、軟性下疳菌(Haemophilus ducreyi)、他のヘモフィルス属の種(other Hemophilus species)、破傷風菌(Clostridium tetani)、他のクロストリジウム属の種(other Clostridium species)、エルシニア・エンテロリチカ(Yersinia enterolitica)、及び他のエルシニア属の種(other Yersinia species)による細菌感染症が挙げられる。特定の実施形態において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下��た結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分はS42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64 K67、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。
【０１５７】
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体へ投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体活性化物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を増強し、補体関連疾患又は症状が寄生虫感染である、治療方法を提供する。開示した補体を増強する組成物を治療に使用することができる寄生虫感染の代表例(これに限定するものではない)としては、トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、他のプラスモディウム属の種(other Plasmodium species)、トリパノソーマ・ブルーセイ(Trypanosoma brucei)、トリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)、森林型熱帯リーシュマニア(Leishmania major)、他のリーシュマニア種(other Leishmania species)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、他の住血吸虫種(other Schistosoma species)、及び赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)が挙げられる。特定の実施形態において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分はS42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、IFNαに結合しないか、IFNαに対���る低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64、K67、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。
【０１５８】
一部の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかを個体へ投与することを含む、個体における補体関連疾患又は症状の治療方法であって、組成物の補体モジュレーター部分が補体活性化物質又はその生物活性断片を含み、組成物の投与が補体活性を増強し、補体関連疾患又は症状が真菌感染である、治療方法を提供する。開示した補体を増強する組成物を治療に使用することができる真菌感染の代表例(これに限定するものではない)としては、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplama capsulatum)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidiodes brasiliensis)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermitidis)、ニューモシスティス・カリニ(Pneuomocystis carnii)、アオカビ(Penicillium marneffi)、及びアルテルナリア・アルテルナータ(Alternaria alternate)が挙げられる。特定の実施形態において、補体活性化物質は、ヒトIgアイソタイプG1(IgG1)、ヒトIgアイソタイプM(IgM)、マウスIgアイソタイプG3(IgG3)、マウスIgM Fc、ヒトIgG1 Fcドメイン、ヒトIgM Fcドメイン、マウスIgG3 Fcドメイン、マウスIgM Fcドメイン及びCVFからなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に選択的に結合するが、IFNαに結合しないか、IFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに選択的に結合するが、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNαに選択的に結合するが、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、EBV gp350及び一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、IFNα及びEBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、組成物は、EBV gp350に選択的に結合するが、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合親和性を有する。一部の実施形態において、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片は、C3d、iC3b、C3dg、及びCR2の二つのN末端SCRドメインに結合するC3bの一つ又は複数の細胞結合断片からなる群から選択される。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109及びS128からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350に結合しないか、EBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分はS42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、IFNαに結合しな���か、IFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、N11、R36、K41、Y64及びK67からなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びEBV gp350に対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、I9、Y29、C31、G33、T34、D56、S70、H90、D92、S93、A97、T100、N101、S109、S128、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに結合しないか、一つ又は複数のC3タンパク質分解断片及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。一部の実施形態において、組成物のCR2部分は、N11、R36、K41、Y64、K67、S42A及びK50Aからなる群から選択される一つ又は複数の変異を有し、EBV gp350及びIFNαに結合しないか、EBV gp350及びIFNαに対する低下した結合効率を有する。
【０１５９】
実施例
これらの実施例は、本発明を単に例示するものであり、したがって、決して本発明を限定するものと考えるべきでないが、上記で述べた本発明の態様及び実施形態について記述し詳述する。前述の例示及び詳細な記載を例証として提供するが、限定するものではない。本明細書に引用されているすべての刊行物、特許出願及び特許は、あたかも、それぞれの刊行物、特許出願又は特許が詳細に、かつ別々に示されて参照により組み入れられる如く、参照により本明細書に組み入れるものとする。特に、本明細書に引用されたすべての刊行物は、本発明に関連して用いられる組成物及び方法論について記述し開示する目的で、参照により本明細書に明確に組み入れられる。前述の発明は理解を明確にする目的で解説及び例示によりいくらか詳細に記載してきたが、特定の変更及び修正が添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明に対して行なわれ得ることは、本発明の教示を考慮して当業者には容易に理解されるであろう。
【実施例１】
【０１６０】
EBV gp350及びIFNαとのCR2結合相互作用にとって重要なアミノ酸残基の同定
実験方法
組換えタンパク質の発現及び精製
NMR及び等温滴定熱量計(「ITC」)試験用のヒトCR2 SCR1-2は、既に記載されているように(46)、BioFlo(商標) 110発酵槽(New Brunswick Scientific, Edison, NJ)を使用して、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)で発現させた。簡潔に説明すると、単一コロニーを、1%グリセロールを含有する5mlのピキア属の基礎塩培地(BMG、1リットル当たり:85%リン酸26.7ml、硫酸カルシウム0.93g、硫酸カリウム18.2g、硫酸マグネシウム七水和物14.9g、水酸化カリウム4.13g、グリセロール10.0g、蒸留脱イオン水で1リットルとする)中で、30℃及び250rpmで一晩増殖させ、50mlのBMGに拡大し(24時間)、最終的に300mlのBMGに拡大した(24時間)。接種培養物を2500×g、25℃の遠心分離にかけ、30mlのBMGに再懸濁した。30mlの接種培養物を使用し、40gのグリセロールを含有する1Lの最小ピキア属基礎塩培地に接種した。溶解O2濃度を40%、温度を30℃、2MのKOHを使用してpHを5.0に維持した。最初の供給はバッチグリセロール供給であった;メタノールへの移行はメタノール注入により容易に行われ、その後、指数関数的なメタノール供給プロファイルが開始された。メタノール導入は2日間続けられ、その後、培養物を遠心分離にかけて細胞残屑を除去した。上清を10mMのギ酸塩pH 4.0へ交換した後、SP-セファロースカラム(2×5mL SP HiTrap(商標)カラム, GE Biosciences, Pittsburgh, PA)、続いて、GST-C3dをGSTrap(商標)カラム(GE Biosciences, Pittsburgh, PA)に結合させることによりインハウスで作製したCR2親和性カラムを通過させた。CR2は、1/3Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、1.6mM MgCl2、0.9mM KCl、0.5mM KH2PO4、45.6mM NaCl、2.7mM Na2HPO4 pH7.4)中の増加直線的NaCl勾配0〜1.0Mによって溶出させた。最後に、CR2 SCR1-2はサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。CR2の純度及び識別はSDS-PAGE、ウエスタンブロット分析及び質量分析によりモニターした。15N及び15N-13Cの両方で同位体標識したタンパク質を、この方法を用いて調製した。15Nで同位体標識したCR2については、15N-硫酸アンモニウムを使用した。15N-13C同位体標識したCR2については、15N-硫酸アンモニウム、13C-グリセロール及び13C-メタノールを使用した。同位体濃縮された化学物質は、Isotec Inc., Miamisburg, OHから購入した。
【０１６１】
ITC研究用のヒトCR2 SCR1-2は、既に記載されているようにして(42、43)、大腸菌でpMAL-P2X(商標)発現系(New England Biolabs, Ipswich, MA)を使用して産生した。アンピシリン耐性コロニーを用いて一晩培養を開始し、1Lまで拡大し、0.3のA600が得られるまで37℃で増殖させた。培養物を、30℃で一晩、0.3mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)により誘導し、その後、遠心分離により回収した。回収したペレットをアミロースカラムバッファー(20mM Tris-HCl、pH 7.4、0.2M NaCl、1mM EDTA)中に再懸濁し、超音波処理により溶解した。溶解物を遠心分離により清澄化し、アミロース樹脂カラム(New England Biosciences, Ipswich, MA)にアプライした。結合MBP-CR2 SCR1-2は、アミロースカラム溶出バッファー(アミロースカラムバッファー＋10mMマルトース)を使用して、カラムから溶出させた。最後に、MBP-CR2 SCR1-2をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。MBP-CR2の純度及び識別は、SDS-PAGE及びウエスタンブロット分析によりモニターした。
【０１６２】
ITC試験用のヒトC3dは、既に記載されているように(47)、大腸菌におけるpGEX(商標)発現系(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を用いて産生した。簡単に説明すると、アンピシリン耐性コロニーを用いて一晩培養を開始し、1Lまで拡大し、A600が0.3に達するまで37℃で増殖させた。培養物を一晩30℃で0.3mM IPTGにより誘導し、その後、遠心分離により回収した。回収ペレットをGSTカラムバッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、250mM NaCl、1mM EDTA)中に再懸濁し、超音波処理により溶解させた。溶解物は遠心分離によって清澄化し、GSTrap(商標)カラム(GE Biosciences, Pittsburgh, PA)にアプライした。C3dは一晩4℃で50Uのトロンビンを用いて消化することによりカラムから切断し、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。C3dの純度はSDS-PAGEによりモニターした。
【０１６３】
NMR滴定及びITC試験用の野生型タンパク質の残基1〜470を含むEBV gp350の切断型構築物の精製は、既に記載されているように実施した(46)。gp350は、gp350パッケージバキュロウイルス粒子(pVI-Bac転移ベクター、C末端ポリヒスチジン標識)により感染多重度(MOI)3でSf9昆虫細胞を感染させることにより作製した。バキュロウイルス上清を濃縮し、10mMイミダゾール含有の10mM Tris-HCl(pH 7.4)で緩衝化し、5mLのHiTrap(商標)カラム(GE Biosciences, Pittsburgh, PA)にアプライし、続いて直線的イミダゾール勾配で溶出した。gp350の純度及び識別はSDS-PAGE及びウエスタンブロット分析によりモニターした。
【０１６４】
NMR滴定及びITC試験用のヒトIFNαは、既に記載されているように(48)、大腸菌においてpMAL(商標)発現系(New England Biolabs, Ipswich, MA)を用いて作製した。アンピシリン耐性コロニーを用いて一晩培養を開始し、1Lまで拡大し、A600が0.3に達するまで37℃で増殖させた。培養物を一晩25℃で0.3mMのIPTGにより誘導し、その後、遠心分離により回収した。回収ペレットをアミロースカラムバッファー(20mM Tris-HCl、pH 7.4、0.2M NaCl、1mM EDTA)中に再懸濁し、超音波処理により溶解させた。溶解物は遠心分離によって清澄化し、アミロース樹脂カラム(New England Biosciences, Ipswich, MA)にアプライした。結合MBP-IFNαをアミロースカラム溶出バッファー(アミロースカラムバッファー＋10mMマルトース)を用いてカラムから溶出させた。溶出後、MBP標識は、Factor Xa(New England Biosciences, Ipswich, MA)を用いて一晩4℃にて切断した。最後に、IFNαをサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。IFNαの純度及び識別は、SDS-PAGE及びウエスタンブロット分析によりモニターした。
【０１６５】
NMR分析
NMR試験は、University of Colorado Denver School of Medicine (UCDSOM)キャンパスのRocky Mountain地域NMR設備(600及び900MHz)並びにUniversity of Colorado BoulderキャンパスのW. M. Keck高磁場NMR設備(800MHz)に収容されている600、800及び900MHz変動磁石にて行なわれた。1/3X PBS中の均一に15N-13C標識したCR2のSCR1-2ドメインを用いて、HNCACB(50)、CBCA(CO)NH(51)及び15N edited NOESY-HSQC(52)の三次元スペクトルを使用することにより15N-TROSY-HSQC(49)に連続的に帰属させた。NMRデータはnmrPipe(53)で処理し、ccpNMR(54)で分析した。化学シフト変化は、フリーCR2 SCR1-2、及び濃度増加のEBV gp350又はIFNαを伴うCR2 SCR1-2から得られるTROSY-HSQCスペクトルをオーバーレイすることによりccpNMRを使用してモニターした。
【０１６６】
等温滴定熱量計(「ITC」)分析
ITC実験は、UCDSOMキャンパスのBiophysics Core設備に収容されている、Microcal VP-ITC(GE Healthcare, Piscataway, NJ)にて実施した。20℃で実施した滴定試験に、1/3X PBS中のCR2 SCR1-2を使用した。それぞれの滴定試験は、C3d、gp350又はIFNαの5μl注入と、段階的濃度の10μlの26注入により構成した。データは、単一部位結合モデル又は二部位結合モデルを使用し(55)、製造者によって提供されているソフトウェア(Origin、バージョン7.0 MicroCal)を使用して分析した。
【０１６７】
化学シフト分析
既に記載されている共鳴帰属(48)を用い、完全長のリガンドEBV gp350及びIFNαを均一に15N標識したCR2 SCR1-2試料へ滴定し、1H-15N化学シフトをモニターした(図1〜3)。EBV gp350を用いた滴定からは、強固な結合相互作用を示す、特異的な共鳴の消失及び再出現を特徴とする結合の単一モードが得られた。EBV gp350による化学シフト変化を示す、CR2 SCR1-2上の残基は、N11、R13、A22、R28、S32、R36、K41、K57、Y64、K67、Y68、R83、G84及びR89であった。これらの残基は、SCR1、SCR2、及びCR2のSCR1-2間のSCR間リンカー領域を含む(図3及び図4A)。化学シフト変化の強度を図3に示す。これらの結果は、SCR1-2とSCR1上のリッジの間のSCR間リンカーが、gp350のCR2へのライゲートの際に最も重要な役割を果たすことを示唆している(図3)。この相互作用はNMR時間スケール上のスローエクスチェンジ下にあるので、上限Kdのみ計算することができる。Kdは、フリー共鳴と結合共鳴の間の最小限の認められた化学シフト差(約60Hz)を使用して計算した;〜108M-1s-1の速度の拡散律速と仮定して、結合定数に対する上限は〜60μMとして計算された(表I)。
【０１６８】
また、完全長IFNαを均一に15N標識したCR2 SCR1-2試料へ滴定し、1H-15N化学シフトをモニターした(図2)。サイトカインIFNαとの滴定により、gp350ライゲーションと同様の結合単一モードが得られ、強固な相互作用が示された。化学シフト変化を示すCR2 SCR1-2上の残基は、R13、Y16、R28、S42、K48、K50、Y68、R83、G84及びR89である。これらの残基はSCR1、SCR2及びCR2のSCR間リンカー領域を含む(図3及び4B)。化学シフト変化の強度を図3に示す。これらの結果は、IFNαの結合表面は、C3d結合表面のものと類似していることを示唆している(図3)。gp350化学シフト変化と同様に、IFNαに対する化学シフト変化は、NMR時間スケールによって明らかである以上に強固であることが示唆され;上限Kdを前述のように算出したところ、〜70μMであった(表I)。
【０１６９】
比較のため、C3d、gp350及びIFNαによるライゲーションに必要とされるCR2上の特有の残基及び共有される残基を図4Cに示す。各ライゲーション状態に関する化学シフトの強度変化は図3に示す。
【０１７０】
結果
化学シフト分析
既に記載されている共鳴帰属を用い(48)、完全長のリガンドEBV gp350及びIFNαを均一に15N標識したCR2 SCR1-2試料へ滴定し、1H-15N化学シフトをモニターした(図1-3)。EBV gp350を用いた滴定からは、強固な相互作用を示す、特異的共鳴の消失及び再出現を特徴とする単一モードの結合が得られた。化学シフト変化を示すCR2 SCR1-2上の残基は、N11、R13、A22、R28、S32、R36、K41、K57、Y64、K67、Y68、R83、G84及びR89である。これらの残基は、CR2のSCR1、SCR2及びSCR間リンカー領域を包含する(図3及び4A)。化学シフト変化の強度は図3に示す。これらの結果は、SCR間リンカー及びSCR1上のリッジがCR2へのgp350のライゲートの際に最も重要な役割を果たすことを示唆している(図3)。この相互作用はNMR時間スケール上のスローエクスチェンジ下にあるので、上限Kdのみ計算することができる。Kdは、フリー共鳴と結合共鳴の間の最小限の認められた化学シフト差(約60Hz)を使用して計算した;〜10X8M-1s-1の速度の拡散律速と仮定して、結合定数に対する上限は〜60μMとして計算された(表I)。
【０１７１】
また、完全長IFNαを均一に15N標識したCR2 SCR1-2試料へ滴定し、1H-15N化学シフトをモニターした(図2)。サイトカインIFNαとの滴定により、gp350ライゲーションと同様の結合単一モードが得られ、強固な相互作用が示された。化学シフト変化を示すCR2 SCR1-2上の残基は、R13、Y16、R28、S42、K48、K50、Y68、R83、G84及びR89である。これらの残基はSCR1、SCR2及びCR2のSCR1-2間のSCR間リンカー領域を包含する(図3及び4B)。化学シフト変化の強度を図3に示す。これらの結果は、IFNαの結合表面は、C3d結合表面のものと類似していることを示唆している(図3)。gp350化学シフト変化と同様に、IFNαに対する化学シフト変化は、NMR時間スケールによって明らかである以上に強固な結合相互作用が示唆され;上限Kdを前述のように算出したところ、〜70μMであった(表I)。比較のため、C3d、gp350及びIFNαによるライゲーションに必要とされるCR2上の特有の残基及び共有される残基を図4Cに示す。各ライゲーション状態に関する化学シフトの強度変化は図3に示す。
【０１７２】
CR2-リガンド相互作用の熱力学
ITCを用いて、CR2-リガンド相互作用の結合親和性を測定した。NMR化学シフト分析と一致して、CR2とC3dの間の相互作用は、単一部位結合モデルではなく二部位の結合モデルの適合度に基づき、二部位結合であると判定された。二つの親和性は、0.13±0.05μM及び160±20μMである。CR2とgp350の間の相互作用は単一部位結合モデルを使用して適合され、0.014±0.009μMの親和性を得た。CR2とIFNαの間の相互作用は単一部位結合モデルを使用して適合され、0.035±0.008μMの親和性を得た。NMR及びITCにより導かれた親和性からの熱力学パラメーターのすべての結果を表1に記載する。
【０１７３】
考察
本明細書に記載した試験では、流動相におけるEBV gp350及びIFNαを用いたCR2-リガンド相互作用を検討するために二つの手法を用いた:(1)完全長gp350又はIFNαを15N標識したCR2 SCR1-2へ滴定し、化学シフトをモニターしたNMRスペクトロスコピー試験;(2)各CR2-リガンド相互作用に対するさらなる特性決定を行い、結合定数を判定するITC。
【０１７４】
以前の分析では、SCR1及びSCR2の両方がgp350の結合に必要とされることがわかっている(1、12、20、56、57)。さらに、SCR1-2の特定の領域がgp350の結合に重要であることも報告されている(20、58)。これらの領域は、SCR1の第1のシステイン残基と第2のシステイン残基の間、第2のシステイン残基と第3のシステイン残基の間、そしてSCR2の後半の間にあり、アミノ酸は、SCR2中のR89〜R96及びT100〜S128を包含していた(58)。またリンカーとの相互作用は、リンカーへの糖鎖付加部位の導入がgp350結合を消失させるがC3d結合を消失させないという知見により推論された(20、31、57)。さらに最近では、CR2 SCR1-2の表面に特異的相互作用するアミノ酸があることがわかった。突然変異誘発試験から、残基R13、S15、R28、R36、K41、K56、K67、R83及びR89が、CR2-gp350相互作用で最も重要な残基であることが示唆された(42、43)。さらに、HADDOCKの使用により、gp350のドメイン1と2の間のリンカー領域がCR2のSCR1とSCR2の間のリンカーと相互作用する、相互作用のモデルが確定された(43)。
【０１７５】
しかし、CR2とgp350の間の相互作用において重要である重要領域(より最近ではアミノ酸)の示唆はあったが、これらの生じている相互作用の物理的証拠はなかった。本明細書に記載したデータは、CR2-gp350相互作用にとって重要なアミノ酸残基を示している(図4A)。CR2-gp350の相互作用にとって重要であると確定された残基は、N11、R13、A22、R28、S32、R36、K41、K57、Y64、K67、Y68、R83、G84及びR89である。リンカー領域内では多数の相互作用があるので、gp350に結合する際のリンカー領域についてSCRドメインの再構成を推測することは可能であり、よって、接触点すべてに対応することができる。もしそうであるとしたら、相互作用にとって重要な本明細書で同定したこれらの残基の一部は結合時に構造的な再構成に関与し得るが、アミノ酸接触部位までは詳しくない。一部の共鳴は、ライゲートされた複合体のサイズが大きいこと(約110kDa)と、得られるタンブリング時間の増加ゆえに消失する。このため、そのような共鳴を確認するのには、代替の標識化技術が必要である。
【０１７６】
このデータは、リンカー領域がCR2-gp350相互作用において重要であることを確認できるように思われる。リンカー相互作用は、突然変異誘発から導かれたデータ、並びにHADDOCKから得たソフトドックモデルにおいて重要なことが明らかになっている(43)。SCR1とSCR2の間のリンカー領域は、SCR含有タンパク質で最長のものの一つである、八つのアミノ酸である。したがって、多数のリガンド相互作用を媒介するのに十分に可撓性があると考えられる。CR2-C3d相互作用とは異なり、本発明者らのデータは、リンカー領域の二つの残基(K67及びY68)がCR2-gp350相互作用において重要であることを示唆している。したがって、荷電残基のK67及びヒドロキシル含有残基のY68の両方によって、リンカーとの相互作用は、CR2-C3d相互作用の場合よりもCR2-gp350相互作用においてより強固であると思われる。この情報は、CR2がどのように多数の特異的リガンド相互作用を介在することができるかを明らかにするきっかけを提供する。
【０１７７】
CR2-C3d相互作用の場合(59、60)の通り、CR2-gp350相互作用における重要なものの中で多数の荷電残基により明白なように、CR2-gp350相互作用は、大部分は静電的相互作用によって作動されるようである。大多数のこれらの荷電残基はSCR1上で見つかっており、このドメインがCR2-gp350相互作用において、より重要な役割を果たすことが示唆されている。興味深いことに、R83もCR2-gp350において重要であると判定されたが、R83付近の他の多くの残基は、CR2-C3d相互作用中に化学シフトの変化を示すことは確認されなかった。このデータは、CR2-C3d相互作用で確認された弱い相互作用とともに、R83相互作用が、重要なアミノ酸接触よりもCR2に対するgp350の初期静電引力でより重要であることを意味し得る。この試験で同定された荷電残基は、HADDOCKモデル(42、43)と一致する。さらに、CR2-C3d NMR結合マップの場合のように、本発明者らは、CR2-gp350相互作用に関与するわずかな荷電残基よりもさらに多くの残基があることを確認した。特に、三個のヒドロキシル含有アミノ酸(S32、Y64及びY68)がCR2-gp350相互作用において重要である。これらの側鎖相互作用は、水素結合相互作用であると思われる。この新しいデータは、CR2-gp350結合部位及びCR2-C3d結合部位が類似していると考えられることを示唆し、リガンドがクロス競合する理由を説明するが、選択的結合がどのように生じるのかを説明する実質的な相違がある。
【０１７８】
HADDOCKモデルは、NMRで決定したCR2-gp350結合残基と十分に一致した(図5)。二個の残基(K57及びA22)以外はすべて、HADDOCKモデルから導かれた仮説の結合面の内にあることが確認される。A22の化学シフトは、恐らく、gp350を結合するCR2上のSCR1のわずかな構造変化によるものと思われる。NMRにより記載されているK57相互作用は、異なる潜在的低エネルギードッキングモデルを作動するために使用することができるが、Youngら(43)のシミュレートしたドッキング手法においては活性残基として利用されなかった。
【０１７９】
CR2-IFNα相互作用は、様々な方法で特性決定されている。まず、C3d及びgp350上の提示されたCR2結合部位の間の配列類似性を調査することで開始した(19)。さらに有望な結合相互作用を確認するために、IFNα上の提示されたCR2結合部位のペプチド配列に対する抗体が、細胞結合アッセイにおいてCR2-C3d相互作用を阻害することが分かった。またさらに、CR2に結合するIFNαは、細胞結合アッセイにおいてCR2-C3d複合体形成を阻害することがわかった。加えて、IFNαがgp350によるCR2のキャッピングを阻害する結果、EBVの初期感染の抗ウイルス阻害剤として作用することがわかった(18)。さらに最近では、生物物理学的試験がCR2-リガンド相互作用の熱力学的特性に関して行われ、CR2とIFNαの物理的結合が示唆されている(17)。本明細書で示したデータは、CR2-IFNα相互作用に関する結合部位又は結合表面をさらに規定する。NMR滴定試験を用いて、以下のアミノ酸、R13、Y16、R28、S42、K48、K50、Y68、R83、G84及びR89をCR2-IFNα相互作用に関与するものとして同定した。
【０１８０】
別のCR2-リガンド相互作用のように、CR2-IFNα相互作用は、静電的相互作用により大部分は作動される。CR2-IFNα相互作用は、C3d相互作用に最も密接な関係があると思われる。なぜなら、C3d及びIFNαの提示されたCR2結合モチーフが最も近いからである。その上、同一リンカー領域残基(Y68)は、C3d及びIFNαのいずれかの添加時の有意な摂動、並びに、両相互作用に関与する残基の全体的な同様のレイアウトがあるように思われる(図4C)。
【０１８１】
CR2-リガンド相互作用に関する熱力学試験では、わずかに異なる結果が得られた(表2)。以前に報告されているように、CR2-C3d相互作用は、二部位結合相互作用又は単一部位結合相互作用のいずれかとして記載されている(17、48)。本明細書で示したITCデータは、160μMの弱Kdを有し、0.13μMの強力な相互作用を有する二部位モデルに非常に適合した。このKdは、表面プラズモン共鳴(SPR)系の生物物理学試験から以前に確定されたKdにかなり近い(17)。ITCを使用し、本発明者らは、初めて、流動相で、二つの特有の結合事象に対する二つの個別の親和性を測定することができた。CR2-C3d相互作用は、すべての他の特性決定されたCR2-リガンド相互作用がシンプルな1対1結合の等温線に適合するという点で独特である。対照的に、CR2-gp350相互作用に関する最新のITC試験は、Kd 0.014μM(これは、SPRによって確定されている0.077μMの以前に報告されたKdよりもごくわずかに強力な親和性)の単一結合の等温線に極めて一致する。ここでの親和性の差は、それぞれの試験の異なる実験条件による可能性がある。最後に、CR2-IFNα相互作用に関するITCデータは、Kdが0.036μM(これは、SPRによって確定されている0.042μMの以前に報告されたKdと極めてよく一致している親和性)の単一結合の等温線に非常に一致している。また、この差は、使用したバッファーの違い、並びに、溶液中で純粋にCR2及びIFNαを使用するITC試験と、固体担体に固定されたCR2を使用するSPR試験との各種アッセイにおける違いによるものと思われる。結合強度の順位は、IFNα結合及びgp350結合が共にCR2に対するC3d結合を阻害するということで意味があり、これは既に報告されている(17、18)。
【０１８２】
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【実施例２】
【０１８３】
結合アッセイ
実験方法
組換えタンパク質の発現及び精製
結合試験用の天然ヒトCR2 SCR1-2及び突然変異CR2 SCR1-2は、既に記載のように(46)、また上記の実施例1で述べたように、BioFlo(商標) 110発酵槽(New Brunswick Scientific, Edison, NJ)を使用して、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)で発現させる。簡単に説明すると、単一コロニーを、1%グリセロールを含有する5mlのピキア属基礎塩培地(BMG、1リットル当たり:85%リン酸26.7ml、硫酸カルシウム0.93g、硫酸カリウム18.2g、硫酸マグネシウム7H2O 14.9g、水酸化カリウム4.13g、グリセロール10.0g、蒸留脱イオン水で1Lとする)中で、一晩30℃及び250rpmで増殖させ、50mlのBMGに拡大し(24時間)、最後に300mlのBMGに拡大させる(24時間)。接種培養物を2500×g、25℃で遠心分離にかけ、30mlのBMG中に再懸濁させる。30mlの接種培養物を使用し、40gのグリセロールを含有する1Lの最小ピキア属基礎塩培地に接種する。溶解O2濃度を40%で維持し、30℃の温度、2MのKOHを使用してpH 5.0を維持する。最初の供給はバッチグリセロール供給であり;メタノールへの移行はメタノール注入により容易にした後、指数関数的なメタノール供給プロファイルが開始する。メタノール導入は2日間続け、その後、培養物を遠心分離にかけて細胞残屑を除去する。上清を10mMのギ酸塩  pH 4.0へ交換した後、SP-セファロースカラム(2×5mL SP HiTrap(商標)カラム、GE Biosciences, Pittsburgh, PA)を通過させ、続いて、GST-C3dをGSTrap(商標)カラム(GE Biosciences, Pittsburgh, PA)に結合させることによりインハウスで作製したCR2親和性カラムを通過させる。CR2は、1/3Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、1.6mM MgCl2、0.9mM KCl、0.5mM KH2PO4、45.6mM NaCl、2.7mM Na2HPO4 pH 7.4)中の増加直線状NaCl勾配0〜1.0Mによって溶出させる。最後に、天然ヒトCR2 SCR1-2及び突然変異体CR2 SCR1-2はサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。CR2の純度及び識別はSDS-PAGE、ウエスタンブロット分析及び質量分析によりモニターする。
【０１８４】
結合試験用のヒトC3dは、前述のようにして(47)、また上記実施例1に記載のようにして、大腸菌におけるpGEX(商標)発現系(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を用いて作製する。簡単に説明すると、アンピシリン耐性コロニーを用いて一晩培養を開始し、1Lまで拡大し、A600が0.3に達するまで37℃で増殖させる。培養物を一晩30℃で0.3mMのIPTGにより誘導し、その後、遠心分離により回収する。回収ペレットをGSTカラムバッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、250mM NaCl、1mM EDTA)中に再懸濁し、超音波処理により溶解させる。溶解物は遠心分離によって清澄化し、GSTrap(商標)カラム(GE Biosciences, Pittsburgh, PA)にアプライする。C3dは4℃で一晩50Uのトロンビンを用いて消化することによりカラムから切断し、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。C3dの純度はSDS-PAGEによりモニターする。
【０１８５】
EBV gp350は、市販の抗gp350抗体及び標準手順を用いて、免疫親和性クロマトグラフィーにより培養物中の感染細胞から単離する。ヒトIFNαは市販のメーカーから購入する。
【０１８６】
結合アッセイ
天然ヒトCR2 SCR1-2のEBV gp350、IFNα及びC3dに対する結合は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により、CR2とEBV gp350又はIFNαのいずれかの間の結合相互作用にとって必須であることが確定されたアミノ酸に一つ又は複数の変異を含有するヒトCR2 SCR1-2変異体の結合と比較する。初期結合アッセイは、アラニン含有CR2変異体で実施する。というのは、当該変異体は、主鎖コンホメーションを変化させることなく(グリシン又はプロリンが時々行う)、又は極端な静電効果若しくは立体効果を強いることなく、アミノ酸のβ-炭素を越える側鎖を除去するからである。個別の実験で、EBV gp350に対する結合及びC3dに対する結合に関して、以下のCR2 SCR1-2変異体を試験する:SCR1-2 N11A、SCR1-2 N11A+R36A、SCR1-2 N11A+R36A+K41A、SCR1-2 N11A+R36A+K41A+Y64A、及びSCR1-2 N11A+R36A+K41A+Y64A+K67A。個別の実験で、IFNαに対する結合及びC3dに対する結合に関して、以下のCR2 SCR1-2変異体を試験する:S42A及びS42A+K50A。CR2結合キネティクス及び別の特性(例えば結合特異性)に関するアミノ酸置換の効果を、EBV gp350又はIFNαのいずれか及びC3dに対するCR2 SCR1-2変異体の結合と、同じリガンドに対する天然CR2 SCR1-2の結合とを比較することにより評価する。代替の保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換は、後続の実験で試験する。
【０１８７】
マイクロウェルELISAプレート(Corning Life Sciences, New York, N.Y., USA)は、4℃で一晩、0.1MのNaHCO3、pH 8.6中の上記のようにして得た適量の精製EBV gp350、IFNα又はC3dでコーティングを施す。次いで、コーティングを施したプレートは、それぞれ1分間1X PBSで3回洗浄し、次いで、37℃で1時間、ブロッキング溶液200μL(PBST中、5mg/mlのウシ血清アルブミン(BSA))とインキュベートする。各ウェルは、それぞれ1分間、PBST(80mM Na2HPO4、20mM NaH2PO4、100mM NaCl、0.05%-0.1%(v/v)Tween-20)で6回洗浄する。次に、プレートは、37℃で1時間30分、PBS中の天然ヒトCR2 SCR1-2及び各種のCR2 SCR1-2変異体の濃度を増加してインキュベートする。
【０１８８】
結合反応終了後、プレートは再度、それぞれ1分間、PBSTで6回洗浄する。次に、プレートを抗CR2一次抗体とインキュベートし、ブロッキング溶液でそれぞれ1分間6回洗浄し、次いで、PBST+5mg/ml BSA中で1:10,000に希釈された二次抗体、Fcγに特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マウス抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)と室温で1時間インキュベートする。再度プレートを室温にてPBST+5mg/mlのBSAで6回洗浄し、50mMリン酸クエン酸塩で調製した3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)溶液を100μl添加することによって発色させる。TMB溶液を添加した後、プレートを室温で30分間インキュベートし、次いで、吸光度を450nmでMRXマイクロプレートリーダー(Dynex Technologies)を用いてメーカーの使用説明書に従い測定する。結合曲線を生データから構築し、結合親和性を推定する。
【０１８９】
別法として、結合親和性は、例えば、BIACore(商標) 4000 SPRシステム(Biacore Life Sciences, GE Healthcare, Piscataway, NJ)を使用して、表面プラズモン共鳴分析によって、より正確に測定する。ELISAと同様、マイクロウェルプレートをEBV gp350、IFNα、又はC3dでコーティングし、次いで、天然ヒトCR2 SCR1-2又はCR2 SCR1-2変異体の濃度を増加しながらインキュベートする。しかし、ELISAとは異なり、SPRは結合親和性を直接測定し、検出可能な標識の使用は必要ない。
【０１９０】
EBV gp350に対する結合親和性に関し、SCR1-2 N11A、SCR1-2 N11A+R36A、SCR1-2 N11A+R36A+K41A、SCR1-2 N11A+R36A+K41A+Y64A、及びSCR1-2 N11A+R36A+K41A+Y64A+K67A変異体を試験する。天然CR2 SCR1-2のようにC3dに対する同様の結合親和性を本質的に維持しながら、EBV gp350に対する結合親和性が徐々に低下することが確認される。IFNαに対する結合親和性に関して、SCR1-2 S42A及びSCR1-2 S42A+K50A変異体を試験する。天然CR2 SCR1-2のようにC3dに対する同様の結合親和性を本質的に維持しながら、IFNαに対する結合親和性が徐々に低下することが確認される。
【０１９１】
配列
配列番号1 [ヒト補体レセプター2(CR2)の完全アミノ酸配列]:  MGAAGLLGVFLALVAPGVLGISCGSPPPILNGRISYYSTPIAVGTVIRYSCSGTFRLIGEKSLLCITKDKVDGTWDKPAPKCEYFNKYSSCPEPIVPGGYKIRGSTPYRHGDSVTFACKTNFSMNGNKSVWCQANNMWGPTRLPTCVSVFPLECPALPMIHNGHHTSENVGSIAPGLSVTYSCESGYLLVGEKIINCLSSGKWSAVPPTCEEARCKSLGRFPNGKVKEPPILRVGVTANFFCDEGYRLQGPPSSRCVIAGQGVAWTKMPVCEEIFCPSPPPILNGRHIGNSLANVSYGSIVTYTCDPDPEEGVNFILIGESTLRCTVDSQKTGTWSGPAPRCELSTSAVQCPHPQILRGRMVSGQKDRYTYNDTVIFACMFGFTLKGSKQIRCNAQGTWEPSAPVCEKECQAPPNILNGQKEDRHMVRFDPGTSIKYSCNPGYVLVGEESIQCTSEGVWTPPVPQCKVAACEATGRQLLTKPQHQFVRPDVNSSCGEGYKLSGSVYQECQGTIPWFMEIRLCKEITCPPPPVIYNGAHTGSSLEDFPYGTTVTYTCNPGPERGVEFSLIGESTIRCTSNDQERGTWSGPAPLCKLSLLAVQCSHVHIANGYKISGKEAPYFYNDTVTFKCYSGFTLKGSSQIRCKRDNTWDPEIPVCEKGCQPPPGLHHGRHTGGNTVFFVSGMTVDYTCDPGYLLVGNKSIHCMPSGNWSPSAPRCEETCQHVRQSLQELPAGSRVELVNTSCQDGYQLTGHAYQMCQDAENGIWFKKIPLCKVIHCHPPPVIVNGKHTGMMAENFLYGNEVSYECDQGFYLLGEKNCSAEVILKAWILERAFPQCLRSLCPNPEVKHGYKLNKTHSAYSHNDIVYVDCNPGFIMNGSRVIRCHTDNTWVPGVPTCIKKAFIGCPPPPKTPNGNHTGGNIARFSPGMSILYSCDQGYLVVGEPLLLCTHEGTWSQPAPHCKEVNCSSPADMDGIQKGLEPRKMYQYGAVVTLECEDGYMLEGSPQSQCQSDHQWNPPLAVCRSRSLAPVLCGIAAGLILLTFLIVITLYVISKHRERNYYTDTSQKEAFHLEAREVYSVDPYNPAS
【０１９２】
配列番号2 [ヒトCR2のショートコンセンサスリピート(SCR)ドメイン1及び2のアミノ酸配列]:  ISCGSPPPILNGRISYYSTPIAVGTVIRYSCSGTFRLIGEKSLLCITKDKVDGTWDKPAPKCEYFNKYSSCPEPIVPGGYKIRGSTPYRHGDSVTFACKTNFSMNGNKSVWCQANNMWGPTRLPTCVS
配列番号3 [ヒトCD59タンパク質のアミノ酸配列]:  MGIQGGSVLFGLLLVLAVFCHSGHSLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP
配列番号4 [マウス補体レセプター1-関連遺伝子/タンパク質y(Crry)のアミノ酸配列]:  MEVSSRSSEPLDPVWLLVAFGRGGVKLEVLLLFLLPFTLGELRGGLGKHGHTVHREPAVNRLCADSKRWSGLPVSAQRPFPMGHCPAPSQLPSAKPINLTDESMFPIGTYLLYECLPGYIKRQFSITCKQDSTWTSAEDKCIRKQCKTPSDPENGLVHVHTGIQFGSRINYTCNQGYRLIGSSSAVCVITDQSVDWDTEAPICEWIPCEIPPGIPNGDFFSSTREDFHYGMVVTYRCNTDARGKALFNLVGEPSLYCTSNDGEIGVWSGPPPQCIELNKCTPPPYVENAVMLSENRSLFSLRDIVEFRCHPGFIMKGASSVHCQSLNKWEPELPSCFKGVICRLPQEMSGFQKGLGMKKEYYYGENVTLECEDGYTLEGSSQSQCQSDGSWNPLLAKCVSRSISGLIVGIFIGIIVFILVIIVFIWMILKYKKRNTTDEKYKEVGIHLNYKEDSCVRLQSLLTSQENSSTTSPARNSLTQEVS
【０１９３】
配列番号5 [ヒトH因子のアミノ酸配列]:  MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR
【０１９４】
配列番号6 [マウスCD59Aタンパク質のアミノ酸配列]:  MRAQRGLILLLLLLAVFCSTAVSLTCYHCFQPVVSSCNMNSTCSPDQDSCLYAVAGMQVYQRCWKQSDCHGEIIMDQLEETKLKFRCCQFNLCNKSDGSLGKTPLLGTSVLVAILNLCFLSHL
配列番号7 [マウスCD59Bタンパク質のアミノ酸配列]:  MRAQRGLILLLLLLAVFCSTAVSLKCYNCFQFVSSCKINTTCSPNLDSCLYAVAGRQVYQQCWKLSDCNSNYIMSRLDVAGIQSKCCQWGLCNKNLDGLEEPNNAETSSLRKTALLGTSVLVAILKFCF
【０１９５】
配列番号8 [マウスH因子のアミノ酸配列]:  MRLSARIIWLILWTVCAAEDCKGPPPRENSEILSGSWSEQLYPEGTQATYKCRPGYRTLGTIVKVCKNGKWVASNPSRICRKKPCGHPGDTPFGSFRLAVGSQFEFGAKVVYTCDDGYQLLGEIDYRECGADGWINDIPLCEVVKCLPVTELENGRIVSGAAETDQEYYFGQVVRFECNSGFKIEGHKEIHCSENGLWSNEKPRCVEILCTPPRVENGDGINVKPVYKENERYHYKCKHGYVPKERGDAVCTGSGWSSQPFCEEKRCSPPYILNGIYTPHRIIHRSDDEIRYECNYGFYPVTGSTVSKCTPTGWIPVPRCTLKPCEFPQFKYGRLYYEESLRPNFPVSIGNKYSYKCDNGFSPPSGYSWDYLRCTAQGWEPEVPCVRKCVFHYVENGDSAYWEKVYVQGQSLKVQCYNGYSLQNGQDTMTCTENGWSPPPKCIRIKTCSASDIHIDNGFLSESSSIYALNRETSYRCKQGYVTNTGEISGSITCLQNGWSPQPSCIKSCDMPVFENSITKNTRTWFKLNDKLDYECLVGFENEYKHTKGSITCTYYGWSDTPSCYERECSVPTLDRKLVVSPRKEKYRVGDLLEFSCHSGHRVGPDSVQCYHFGWSPGFPTCKGQVASCAPPLEILNGEINGAKKVEYSHGEVVKYDCKPRFLLKGPNKIQCVDGNWTTLPVCIEEERTCGDIPELEHGSAKCSVPPYHHGDSVEFICEENFTMIGHGSVSCISGKWTQLPKCVATDQLEKCRVLKSTGIEAIKPKLTEFTHNSTMDYKCRDKQEYERSICINGKWDPEPNCTSKTSCPPPPQIPNTQVIETTVKYLDGEKLSVLCQDNYLTQDSEEMVCKDGRWQSLPRCIEKIPCSQPPTIEHGSINLPRSSEERRDSIESSSHEHGTTFSYVCDDGFRIPEENRITCYMGKWSTPPRCVGLPCGPPPSIPLGTVSLELESYQHGEEVTYHCSTGFGIDGPAFIICEGGKWSDPPKCIKTDCDVLPTVKNAIIRGKSKKSYRTGEQVTFRCQSPYQMNGSDTVTCVNSRWIGQPVCKDNSCVDPPHVPNATIVTRTKNKYLHGDRVRYECNKPLELFGQVEVMCENGIWTEKPKCRDSTGKCGPPPPIDNGDITSLSLPVYEPLSSVEYQCQKYYLLKGKKTITCTNGKWSEPPTCLHACVIPENIMESHNIILKWRHTEKIYSHSGEDIEFGCKYGYYKARDSPPFRTKCINGTINYPTCV
【０１９６】
配列番号9 [ヒト補体レセプター1(CR1)のアミノ酸配列]:  MGASSPRSPEPVGPPAPGLPFCCGGSLLAVVVLLALPVAWGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLNYECRPGYSGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKGIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGDTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIIPNKCTPPNVENGILVSDNRSLFSLNEVVEFRCQPGFVMKGPRRVKCQALNKWEPELPSCSRVCQPPPDVLHAERTQRDKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLRGAASMRCTPQGDWSPAAPTCEVKSCDDFMGQLLNGRVLFPVNLQLGAKVDFVCDEGFQLKGSSASYCVLAGMESLWNSSVPVCEQIFCPSPPVIPNGRHTGKPLEVFPFGKAVNYTCDPHPDRGTSFDLIGESTIRCTSDPQGNGVWSSPAPRCGILGHCQAPDHFLFAKLKTQTNASDFPIGTSLKYECRPEYYGRPFSITCLDNLVWSSPKDVCKRKSCKTPPDPVNGMVHVITDIQVGSRINYSCTTGHRLIGHSSAECILSGNAAHWSTKPPICQRIPCGLPPTIANGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIIPNKCTPPNVENGILVSDNRSLFSLNEVVEFRCQPGFVMKGPRRVKCQALNKWEPELPSCSRVCQPPPDVLHAERTQRDKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLRGAASMRCTPQGDWSPAAPTCEVKSCDDFMGQLLNGRVLFPVNLQLGAKVDFVCDEGFQLKGSSASYCVLAGMESLWNSSVPVCEQIFCPSPPVIPNGRHTGKPLEVFPFGKAVNYTCDPHPDRGTSFDLIGESTIRCTSDPQGNGVWSSPAPRCGILGHCQAPDHFLFAKLKTQTNASDFPIGTSLKYECRPEYYGRPFSITCLDNLVWSSPKDVCKRKSCKTPPDPVNGMVHVITDIQVGSRINYSCTTGHRLIGHSSAECILSGNTAHWSTKPPICQRIPCGLPPTIANGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNLGSRGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIIPNKCTPPNVENGILVSDNRSLFSLNEVVEFRCQPGFVMKGPRRVKCQALNKWEPELPSCSRVCQPPPEILHGEHTPSHQDNFSPGQEVFYSCEPGYDLRGAASLHCTPQGDWSPEAPRCAVKSCDDFLGQLPHGRVLFPLNLQLGAKVSFVCDEGFRLKGSSVSHCVLVGMRSLWNNSVPVCEHIFCPNPPAILNGRHTGTPSGDIPYGKEISYTCDPHPDRGMTFNLIGESTIRCTSDPHGNGVWSSPAPRCELSVRAGHCKTPEQFPFASPTIPINDFEFPVGTSLNYECRPGYFGKMFSISCLENLVWSSVEDNCRRKSCGPPPEPFNGMVHINTDTQFGSTVNYSCNEGFRLIGSPSTTCLVSGNNVTWDKKAPICEIISCEPPPTISNGDFYSNNRTSFHNGTVVTYQCHTGPDGEQLFELVGERSIYCTSKDDQVGVWSSPPPRCISTNKCTAPEVENAIRVPGNRSFFSLTEIIRFRCQPGFVMVGSHTVQCQTNGRWGPKLPHCSRVCQPPPEILHGEHTLSHQDNFSPGQEVFYSCEPSYDLRGAASLHCTPQGDWSPEAPRCTVKSCDDFLGQLPHGRVLLPLNLQLGAKVSFVCDEGFRLKGRSASHCVLAGMKALWNSSVPVCEQIFCPNPPAILNGRHTGTPFGDIPYGKEISYACDTHPDRGMTFNLIGESSIRCTSDPQGNGVWSSPAPRCELSVPAACPHPPKIQNGHYIGGHVSLYLPGMTISYTCDPGYLLVGKGFIFCTDQGIWSQLDHYCKEVNCSFPLFMNGISKELEMKKVYHYGDYVTLKCEDGYTLEGSPWSQCQADDRWDPPLAKCTSRAHDALIVGTLSGTIFFILLIIFLSWIILKHRKGNNAHENPKEVAIHLHSQGGSSVHPRTLQTNEENSRVLP
【０１９７】
配列番号10 [ヒト膜補因子タンパク質(MCP)のアミノ酸配列]:  MEPPGRRECPFPSWRFPGLLLAAMVLLLYSFSDACEEPPTFEAMELIGKPKPYYEIGERVDYKCKKGYFYIPPLATHTICDRNHTWLPVSDDACYRETCPYIRDPLNGQAVPANGTYEFGYQMHFICNEGYYLIGEEILYCELKGSVAIWSGKPPICEKVLCTPPPKIKNGKHTFSEVEVFEYLDAVTYSCDPAPGPDPFSLIGESTIYCGDNSVWSRAAPECKVVKCRFPVVENGKQISGFGKKFYYKATVMFECDKGFYLDGSDTIVCDSNSTWDPPVPKCLKVLPPSSTKPPALSHSVSTSSTTKSPASSASGPRPTYKPPVSNYPGYPKPEEGILDSLDVWVIAVIVIAIVVGVAVICVVPYRYLQRRKKKGTYLTDETHREVKFTSL
配列番号11 [ヒト崩壊促進因子(DAF/CD55)のアミノ酸配列]:  MTVARPSVPAALPLLGELPRLLLLVLLCLPAVWGDCGLPPDVPNAQPALEGRTSFPEDTVITYKCEESFVKIPGEKDSVICLKGSQWSDIEEFCNRSCEVPTRLNSASLKQPYITQNYFPVGTVVEYECRPGYRREPSLSPKLTCLQNLKWSTAVEFCKKKSCPNPGEIRNGQIDVPGGILFGATISFSCNTGYKLFGSTSSFCLISGSSVQWSDPLPECREIYCPAPPQIDNGIIQGERDHYGYRQSVTYACNKGFTMIGEHSIYCTVNNDEGEWSGPPPECRGKSLTSKVPPTVQKPTTVNVPTTEVSPTSQKTTTKTTTPNAQATRSTPVSRTTKHFHETTPNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT
配列番号12 [マウス崩壊促進因子(DAF/CD55)のアミノ酸配列]:  MIRGRAPRTRPSPPPPLLPLLSLSLLLLSPTVRGDCGPPPDIPNARPILGRHSKFAEQSKVAYSCNNGFKQVPDKSNIVVCLENGQWSSHETFCEKSCVAPERLSFASLKKEYLNMNFFPVGTIVEYECRPGFRKQPPLPGKATCLEDLVWSPVAQFCKKKSCPNPKDLDNGHINIPTGILFGSEIFNSCNPGYRLVGVSSTFCSVTGNTVDWDDEFPVCTEIHCPEPPKINNGIMRGESDSYTYSQVVTYSCDKGFILVGNASIYCTVSKSDVGQWSSPPPRCIEKSKVPTKKPTINVPSTGTPSTPQKPTTESVPNPGDQPTPQKPSTVKVSATQHVPVTKTTVRHPIRTSTDKGEPNTGGDRYIYGHTCLITLTVLHVMLSLIGYLT
【０１９８】
配列番号13 [モノクルコブラ(Naja kaouthia)由来のCVFのアミノ酸配列]:  MERMALYLVAALLIGFPGSSHGALYTLITPAVLRTDTEEQILVEAHGDSTPKQLDIFVHDFPRKQKTLFQTRVDMNPAGGMLVTPTIEIPAKEVSTDSRQNQYVVVQVTGPQVRLEKVVLLSYQSSFLFIQTDKGIYTPGSPVLYRVFSMDHNTSKMNKTVIVEFQTPEGILVSSNSVDLNFFWPYNLPDLVSLGTWRIVAKYEHSPENYTAYFDVRKYVLPSFEVRLQPSEKFFYIDGNENFHVSITARYLYGEEVEGVAFVLFGVKIDDAKKSIPDSLTRIPIIDGDGKATLKRDTFRSRFPNLNELVGHTLYASVTVMTESGSDMVVTEQSGIHIVASPYQIHFTKTPKYFKPGMPYELTVYVTNPDGSPAAHVPVVSEAFHSMGTTLSDGTAKLILNIPLNAQSLPITVRTNHGDLPRERQATKSMTAIAYQTQGGSGNYLHVAITSTEIKPGDNLPVNFNVKGNANSLKQIKYFTYLILNKGKIFKVGRQPRRDGQNLVTMNLHITPDLIPSFRFVAYYQVGNNEIVADSVWVDVKDTCMGTLVVKGDNLIQMPGAAMKIKLEGDPGARVGLVAVDKAVYVLNDKYKISQAKIWDTIEKSDFGCTAGSGQNNLGVFEDAGLALTTSTNLNTKQRSAAKCPQPANRRRRSSVLLLDSNASKAAEFQDQDLRKCCEDVMHENPMGYTCEKRAKYIQEGDACKAAFLECCRYIKGVRDENQRESELFLARDDNEDGFIADSDIISRSDFPKSWLWLTKDLTEEPNSQGISSKTMSFYLRDSITTWVVLAVSFTPTKGICVAEPYEIRVMKVFFIDLQMPYSVVKNEQVEIRAILHNYVNEDIYVRVELLYNPAFCSASTKGQRYRQQFPIKALSSRAVPFVIVPLEQGLHDVEIKASVQEALWSDGVRKKLKVVPEGVQKSIVTIVKLDPRAKGVGGTQLEVIKARKLDDRVPDTEIETKIIIQGDPVAQIIENSIDGSKLNHLIITPSGCGEQNMIRMAAPVIATYYLDTTEQWETLGINRRTEAVNQIVTGYAQQMVYKKADHSYAAFTNRASSSWLTAYVVKVFAMAAKMVAGISHEIICGGVRWLILNRQQPDGAFKENAPVLSGTMQGGIQGAEEEVYLTAFILVALLESKTICNDYVNSLDSSIKKATNYLLKKYEKLQRPYTTALTAYALAAADQLNDDRVLMAASTGRDHWEEYNAHTHNIEGTSYALLALLKMKKFDQTGPIVRWLTDQNFYGETYGQTQATVMAFQALAEYEIQMPTHKDLNLDITIELPDREVPIRYRINYENALLARTVETKLNQDITVTASGDGKATMTILTFYNAQLQEKANVCNKFHLNVSVENIHLNAMGAKGALMLKICTRYLGEVDSTMTIIDISMLTGFLPDAEDLTRLSKGVDRYISRYEVDNNMAQKVAVIIYLNKVSHSEDECLHFKILKHFEVGFIQPGSVKVYSYYNLDEKCTKFYHPDKGTGLLNKICIGNVCRCAGETCSSLNHQERIDVPLQIEKACETNVDYVYKTKLLRIEEQDGNDIYVMDVLEVIKQGTDENPRAKTHQYISQRKCQEALNLKVNDDYLIWGSRSDLLPTKDKISYIITKNTWIERWPHEDECQEEEFQKLCDDFAQFSYTLTEFGCPT
【０１９９】
配列番号14 [ヒトIgG1重鎖、Cドメインのアミノ酸配列]:  ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号15 [ヒトIgG1軽鎖、Cドメインのアミノ酸配列]: TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号16 [ヒトIgG1のFcドメインのアミノ酸配列]:  EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２００】
配列番号17 [ヒトIgM重鎖、Cドメインのアミノ酸配列]:  GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
配列番号18 [ヒトIgM軽鎖、Cドメインのアミノ酸配列]:  GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPV
配列番号19 [ヒトIgMのFcドメインのアミノ酸配列]:  GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRSKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
【０２０１】
配列番号20 [マウスIgG3重鎖のアミノ酸配列]:  TTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSP
配列番号21 [マウスIgG3軽鎖のアミノ酸配列]:  IVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVRSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYDSSPSITFGAGTKLELK
配列番号22 [マウスIgG3 Fcドメインのアミノ酸配列]:  EPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPGK
【０２０２】
配列番号23 [マウスIgM重鎖、Cドメインのアミノ酸配列]: SQSFPNVFPLVSCESPLSDKNLVAMGCLARDFLPSTISFTWNYQNNTEVIQGIRTFPTLRTGGKYLATSQVLLSPKSILEGSDEYLVCKIHYGGKNRDLHVPIPAVAEMNPNVNVFVPPRDGFSGPAPRKSKLICEATNFTPKPITVSWLKDGKLVESGFTTDPVTIENKGSTPQTYKVISTLTISEIDWLNLNVYTCRVDHRGLTFLKNVSSTCAASPSTDILTFTIPPSFADIFLSKSANLTCLVSNLATYETLNISWASQSGEPLETKIKIMESHPNGTFSAKGVASVCVEDWNNRKEFVCTVTHRDLPSPQKKFISKPNEVHKHPPAVYLLPPAREQLNLRESATVTCLVKGFSPADISVQWLQRGQLLPQEKYVTSAPMPEPGAPGFYFTHSILTVTEEEWNSGETYTCVVGHEALPHLVTERTVDKSTGKPTLYNVSLIMSDTGGTCY
配列番号24 [マウスIgM軽鎖、Cドメインのアミノ酸配列]:  SQSFPNVFPLVSCESPLSDKNLVAMGCLARDFLPSTISFTWNYQNNTEVIQGIRTFPTLRTGGKYLATSQVLLSPKSILEGSDEYLVCKIHYGGKNRDLHVPIP
配列番号25 [マウスIgM Fcドメインのアミノ酸配列]:  ASPSTDILTFTIPPSFADIFLSKSANLTCLVSNLATYETLNISWASQSGEPLETKIKIMESHPNGTFSAKGVASVCVEDWNNRKEFVCTVTHRDLPSPQKKFISKPNEVHKHPPAVYLLPPAREQLNLRESATVTCLVKGFSPADISVQWLQRGQLLPQEKYVTSAPMPEPGAPGFYFTHSILTVTEEEWNSGETYTCVVGHEALPHLVTERTVDKSTGKPTLYNVSLIMSDTGGTCY
【０２０３】
配列番号26 [ヒトCR2の最初の二つのN末端ショートコンセンサスリピートドメインの間の結合配列]:
VSVFPLE 
配列番号27 [ヒトCR2の最初の二つのN末端ショートコンセンサスリピートドメインの間の結合配列]:  
EYFNKYSS
配列番号28 [ヒトCR2の第4のN末端ショートコンセンサスリピートドメインと第5のN末端ショートコンセンサスリピートドメインの間の結合配列]:
EEIF
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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