(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子上に帽子状ナノ金属が真空蒸着又はスパッタリングにより形成された金属付着微粒子が吸着された基材を備え、
前記金属付着微粒子を液体中に浸漬することで前記ナノ金属の総面積及び金属種類に基づいて発生する金属イオンを、細胞又は生体組織に取り込ませるよう供給し、
さらに、前記金属付着微粒子を前記基材から剥離して液体中に浮遊させ、前記発生した金属イオンと同じ濃度の金属イオンとともに金属付着微粒子も、前記細胞又は前記生体組織に取り込ませるよう供給することを特徴とする金属イオン供給システム。
【請求項２】
前記基材は、容器の底面であることを特徴とする請求項１に記載の金属イオン供給システム。
【請求項３】
前記基材は、基板であることを特徴とする請求項１に記載の金属イオン供給システム。
【請求項４】
前記基板を複数用い、各基板に吸着された金属付着微粒子のナノ金属は、異なる金属の種類であることを特徴とする請求項３に記載の金属イオン供給システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属イオン又は金属ナノ粒子が生物個体群や生物群集に与える影響を試験する場合等に用いられる金属イオン供給システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、使用・廃棄されるナノ材料によって生じる人健康・環境・生態系へのリスクが懸念されている。化学物質の毒性評価にはＯＥＣＤテストガイドライン等で定められた方法があるが、ナノ材料の毒性評価については、多くが難溶、不溶であることを含めて従来法の盲点を突いた形となっている。
【０００３】
すなわち、主原料が既存化学物質（炭素、金属など）であること、ナノサイズに基づく特異的な酸化活性による毒性を評価する試験法がないことなどである。毒性のスクリーニング及びメカニズムの解明が試験法確立と毒性評価のために必須である。
【０００４】
金属ナノ粒子の中でも、特に、酸化活性によるものとされる高い抗菌活性を持つ銀ナノ粒子は、使用・廃棄後に排水に混入した場合、下水処理場の生物処理（活性汚泥）の機能低下を引き起こすことが知られている。さらに、銀ナノ粒子の水環境への流亡と水生生物（水生植物、藻類、ミジンコ、魚類）個体群への毒性による水圏生態系へのリスク及び生物多様性への影響が懸念されており、化学物質の安全性を国際的に評価するＯＥＣＤなどで議論されている。
【０００５】
銀ナノ粒子の毒性としては、活性汚泥の硝化作用阻害、藻類の光合成阻害、ミジンコへの取り込み、ゼブラフィッシュの胚発達阻害と孵化率低下が報告されている程度である。例えば、非特許文献１に示されるように、銀ナノ粒子によるファットヘッドミノーの胚への影響を実験したものがある。
【０００６】
しかしながら、銀ナノ粒子の毒性作用機能及び生態リスクは未確認である。一方で、銀ナノ粒子の毒性について、銀ナノ粒子そのものは無害だが、ｐＨ依存的に解離する銀イオンによる影響が重要という報告がある。このため、解離銀イオンの影響も注目されているが、銀イオンのみの毒性試験法は確立していない。
【０００７】
銀ナノ粒子は、環境生態系への影響が懸念されるため、生物個体群へのリスク評価及び銀毒性が生物群集に与える影響を定量化する手法の確立がＯＥＣＤ等で求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Geoff Laban et al., Ecotoxicology (2010) 19:185-195 “The effects of silver nanoparticles on fathead minnow embryos”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生態リスクのガイドラインを策定するにあたり、標準物質としての銀ナノ粒子の作製方法を確立する必要がある。同じ貴金属である金ナノ粒子の場合には、様々なサイズ及び形状のコロイド粒子を作製するプロトコールが確立されているが、銀コロイドに関しては、入手可能なサイズ及び形状は極めて限定されている。
【００１０】
銀ナノ粒子の毒性メカニズムとして、銀ナノ粒子が細胞内に取り込まれることによる影響と、ｐＨ依存的に解離する銀イオンの２つの影響が考えられるが、液中に浮遊する銀ナノ粒子を用いる限り、区別することは困難である。
【００１１】
その他にも、ＴｉやＣｄ等による金属イオンの生体への影響等が議論されているが、同様に、液体中に浮遊する金属ナノ粒子を用いる限り、イオンと粒子を区別することは困難である。このように、イオン化可能な金属については、粒子とイオンとを定量的に分離できないという問題があった。
【００１２】
本発明は、上述した課題を解決するために創案されたものであり、液体中における金属ナノ粒子と金属イオンとを完全に分離して、金属イオンを供給できるようにした金属イオン供給システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明の金属イオン供給システムは、微粒子上に帽子状ナノ金属が真空蒸着又はスパッタリングにより形成された金属付着微粒子が吸着された基材を備え、前記金属付着微粒子を液体中に浸漬することで前記ナノ金属の総面積及び金属種類に基づいて発生する金属イオンを供給することを主要な特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、液体中に浸漬される金属付着微粒子は、基材上に吸着されているために、通常の状態では液体中で剥離することがなく、浮遊金属ナノ粒子となることがない。一方、液体中に浸漬された金属付着微粒子のナノ金属からは、金属イオンが解離して液体中に拡散する。したがって、液体中には、金属ナノ粒子が存在せずに、解離金属イオンのみとなり、この金属イオンだけを、例えば、細胞や生体組織に供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の金属イオン供給システムに用いられる固相化された金属付着微粒子を示す断面図である。
【図２】金属イオン供給システムの一製造工程を示す図である。
【図３】金属イオン供給システムの一製造工程を示す図である。
【図４】金属付着微粒子を容器の底面から剥離する方法を示す図である。
【図５】細胞培養において細胞が解離金属イオンに晒された状態と、金属付着微粒子を取り込む状態を示す図である。
【図６】金属付着微粒子が固相化された基板を細胞培養に適用した構成を示す図である。
【図７】ｐＨと銀イオンとの関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照して本発明の一実施形態を説明する。構造に関する図面は模式的なものであり、現実のものとは異なる。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれている。
【００１７】
図１は、本発明の金属イオン供給システムに用いられる基本的構造を示す。ガラス、プラスティックやシリコン等の基材１の上に、微小球形状の金属付着微粒子１０が形成されている。金属付着微粒子１０は、例えば、粒径３０ｎｍから１０μｍの微小球形状の微粒子２と微粒子２に付着したナノ金属層３とで構成されている。基板１上に微粒子２が固相化されており、微粒子２の表面の上半分程度がナノ金属層３で帽子状に被覆されている。微粒子２はポリマー又はシリカ粒子等で構成される。ナノ金属層３は、銀、アルミ、チタン、カドミウム等のイオン化可能な金属で構成されている。ナノ金属層３の厚さは、微粒子２の直径に対して、１％から２００％程度に形成される。
【００１８】
本発明では、特性の評価を行いたい金属ナノ粒子の量と同じ量の基材上に固相化された金属付着微粒子１０を用意する。浮遊した金属ナノ粒子は、生体組織内に取り込まれる可能性があるのに対して、固相化された金属付着微粒子１０は取り込まれない。また、同じ個数の金属付着微粒子を集めさえすれば、その総面積は変わらずに一定であることから、金属付着微粒子に形成されたナノ金属から液体中に解離される金属イオンの濃度は、一定になる。したがって、金属付着微粒子の数を制御することにより、金属イオンの濃度を制御することができるとともに、金属イオンを安定的に供給できる。
【００１９】
そこで、まず、容器を使ったシステムについて説明する。容器の基底（底面）に微粒子を吸着させるものである。すなわち、図１の基材１が容器の基底に相当する。培養用プレートなどの容器の基底表面上に粒径３０ｎｍから１０μｍの樹脂若しくはシリカの微粒子を単層として吸着させる。吸着の方法としては、基底表面と微粒子表面に官能基を導入し共有結合により微粒子を吸着させる方法がある。あるいは、イオン濃度を上昇させることにより、微粒子間の斥力を抑制することにより物理的に微粒子を吸着する方法がある。以下の実施例では、イオン濃度を上昇させることにより、微粒子間の斥力を抑制することにより物理的に微粒子を吸着する方法を用いた。
【００２０】
まず、微粒子２を吸着させるためには、次の前処理が必要となる。微粒子２にポリスチレン粒子を用いる場合は、まず、図２（ａ）に示す容器２０の基底２０Ａの表面に厚さ１０ｎｍ以上の金属膜を真空蒸着法等により形成する（図示せず）。次に、微粒子２となるポリスチレン微粒子の懸濁液に同等量の塩化マグネシウム水溶液を加える。濃度は、１ｍＭ（１×１０−３ｍｏｌ／ｍ３）から５００ｍＭとする。
【００２１】
図２（ａ）に示すように、この混合液２１を容器２０に加え、１分から１０分間ゆっくり撹拌する。添加量は、容器２０の面積１ｃｍ２当たり、１００μＬから１ｍＬとする。次に、多量の純水を加え（図２（ｂ））、過剰量の微粒子２を除去する（図２（ｃ））。図３（ｄ）と図３（ｄ）の点線部分の拡大図である図３（ｅ）に示すように、容器２０の基底２０Ａに吸着された微粒子２を乾燥させる。次に、図３（ｆ）に示すように、真空蒸着装置にて銀等のイオン化可能なナノ金属層３を微粒子２上に蒸着して金属付着微粒子１０を形成する。ナノ金属層３の厚さは、微粒子２の直径に対して、１％から２００％とする。
【００２２】
微粒子２にシリカ微粒子を用いる場合は、ガラス表面を用いることが望ましい。したがって、ガラスにより形成されている容器２０を用い、容器２０にアミノプロピルメルトキシシランもしくはアミノプロピルエトキシシラン（０．１％から１０％重量比）を加え、１分から１０分間撹拌する。添加量は、容器２０の面積１ｃｍ２当たり、２０μＬから２００μＬとする。次に多量の純水により容器２０を洗浄し乾燥させる。さらにシリカ微粒子懸濁液に同等量の塩化マグネシウム水溶液を加える。濃度は、１ｍＭ（１×１０−３ｍｏｌ／ｍ３）から５００ｍＭとする。
【００２３】
この混合液２１を容器２０に加え、１分から１０分間ゆっくり撹拌する（図２（ａ））。添加量は、容器２０の面積１ｃｍ２当たり、１００μＬから１ｍＬとする。次に、多量の純水を加え（図２（ｂ））、過剰量の微粒子を除去する（図２（ｃ））。図３（ｄ）と図３（ｄ）の点線部分の拡大図である図３（ｅ）に示すように容器２０の基底２０Ａに吸着された微粒子２を乾燥させる。図３（ｆ）に示すように、真空蒸着装置にて銀等のイオン化可能なナノ金属層３を蒸着して金属付着微粒子１０を形成する。ナノ金属層３の厚さは、微粒子２の直径に対して、１％から２００％とする。
【００２４】
上記のように、基材１に相当する基底２０Ａ上に、高密度に吸着された微粒子２を真空蒸着法又はスパッタリング法により金属コーティングすることにより、微粒子の表面に帽子状の金属ナノ粒子となるナノ金属層３が形成される。
【００２５】
上記の方法で調製された金属付着微粒子１０は、超音波に晒すことにより、容易に剥離できる。金属付着微粒子１０を剥離するためには、厚さ３ｍｍから２０ｍｍ程度の平坦なガラス基板もしくは金属基板からなる剥離用基板を用いる。形状は容器の形状とほぼ同じとする。すなわち、容器が円形であれば円形とし、長方形であれば長方形とする。大きさとしては、容器のサイズに対して３０％〜９５％とすることが望ましい。
【００２６】
図４（ａ）に示すように、ガラス基板もしくは金属基板からなる剥離用基板２５を容器２０の中に設置する。次に、容器２０と剥離用基板２５の間の領域が完全に浸漬される程度の純水又はエタノール、メタノール等のアルコールによる液体２６を加える。次に容器２０を超音波洗浄装置内部の容器３０に浮かせ、剥離用基板２５や容器２０等が矢印の方向に振動するように超音波を加える（図４（ｂ））。剥離用基板２５を金属付着微粒子１０の方へ若干押し付けることにより、より効率良く微粒子を剥離することができる（図４（ｃ））。吸着された金属ナノ粒子と同じ数の浮遊金属ナノ粒子を調製するには、吸着された金属付着微粒子１０をすべて剥離することにより可能となる。
【００２７】
上記のように、容器２０を簡易超音波洗浄装置中に置き超音波を発生させると、容器２０の基底と剥離用基板２５との間に振動が発生し、金属付着微粒子１０は数分以内に完全に剥離する。
【００２８】
容器の基底に、直接金属付着微粒子１０を形成する方法以外にも、図６のように、浮遊金属微粒子がない所定の濃度の金属イオンのみが存在する状態を形成することができる。樹脂、金属又はガラスの薄いシートからなる基板１１上に金属付着微粒子１０を吸着させておき、図６（ａ）に示すように、この基板１１を容器２０に入れ、水溶液中に沈めても良い。また、図６（ｂ）に示すように、フィルター等の多孔質状のシートからなる基板１２の表面の両面に金属付着微粒子１０を形成して、複数枚数の基板１２を容器２０の基底に沈めても良い。図６（ｃ）は、図６（ｂ）の点線部分の拡大図を示す。
【００２９】
図６（ｃ）のように、培養液中には、複数の基板１２が存在するが、基板毎に基板表面に吸着している金属付着微粒子のナノ金属層の金属の種類を変えるようにしても良い。このようにすれば、複数の種類の解離金属イオンによる影響を検査することができる。
【００３０】
また、容器２０については、樹脂又はガラス製のシャーレ、又は４〜９６の穴が形成されているマルチプレートの容器とし、この中に金属付着微粒子１０を形成することが望ましい。このようにすれば、金属付着微粒子１０の形成後に、細胞及び生体組織に直接金属イオン等を供給することができるからである。
【００３１】
銀のナノ金属層３を持つ金属付着微粒子１０を細胞培養に適用した例を図５に示す。図２〜図３の方法により得られた容器２０の基底に吸着された金属付着微粒子１０を用い、培養液２７を加え、単離細胞２３を播種する（図５（ａ））。すると、細胞が培養されてコロニー２２Ａが形成されるとともに、コロニー２２Ａ内の培養された細胞が解離銀イオン（Ａｇ＋）に晒される。このとき、浮遊した金属微粒子は、細胞内に取り込まれる可能性があるのに対して、基底に吸着された金属付着微粒子１０は取り込まれない。したがって、銀イオンのみの細胞に対する影響を測定することができる。
【００３２】
次に、一旦、容器２０を洗浄し、図４の方法で、容器２０の基底に吸着された金属付着微粒子１０を基底から剥離する。次に、培養液２７を加え、単離細胞２３を播種する（図５（ｂ））。すると、細胞が培養されてコロニー２２Ｂが形成されるとともに、コロニー２２Ｂ内の培養された細胞が銀イオン（Ａｇ＋）に晒される。また、培養液２７中に、金属付着微粒子１０は浮遊しているので、コロニー２２Ｂ内の培養された細胞には、図５（ｂ）の点線部の拡大図である図５（ｃ）に示すように、一部の金属付着微粒子１０が取り込まれる。以上のように、銀ナノ粒子の取り込みによる影響と銀イオンに晒されることによる影響の２つの影響を測定することができる。
【００３３】
すなわち、図５（ａ）と図５（ｂ）では、同じ数の金属付着微粒子（金属ナノ粒子）が容器２０には存在するので、解離銀イオンの濃度は、図５（ａ）の溶液中と図５（ｂ）の溶液中で同じである。したがって、図５（ｂ）の細胞への影響を測定し、この測定結果から図５（ａ）の細胞への影響を測定した結果を引き算すれば、金属付着微粒子（金属ナノ粒子）の取り込みによる細胞への影響を算出することができる。
【００３４】
また、図６のように、フィルター等の多孔質状の基板１２表面の両面に金属付着微粒子１０を形成して、複数枚数のシートを容器２０の基底に沈めた場合でも同様に、細胞が銀イオンに晒されることによる影響と金属付着微粒子（金属ナノ粒子）の取り込みによる細胞への影響を別々に検出することができる。
【００３５】
図５（ｂ）に示すように、金属付着微粒子１０が吸着された基板１２を培養液２７中に沈めておき、単離細胞２３を播種する。すると、コロニー２２が形成され、コロニー２２の細胞が、培養液中に解離している銀イオンに晒されることなる。また、銀の金属層が形成されている金属付着微粒子１０は、基板１２に固定されているので、培養液中に浮遊することがない。したがって、銀イオンによる影響のみを測定することができる。
【００３６】
一方、容器２０を洗浄し、図４のように、容器２０内にシート１２を液体２６中に沈め、超音波洗浄装置により振動させて、金属付着微粒子１０を剥離し、その後、培養液２７、単離細胞２３を加えてコロニー２２を成長させる。コロニー２２の細胞は、解離された銀イオンによる影響と浮遊している金属付着微粒子１０を取り込んだ影響との２つの影響を測定することができる。したがって、シート１２を培養液２７中に沈めて測定した結果と金属付着微粒子１０を剥離して培養液中に浮遊させて測定した結果との差を取れば、金属付着微粒子（金属ナノ粒子）の取り込みによる細胞への影響を算出することができる。
【００３７】
なお、銀イオン濃度は、図７に示すように、制御することができる。図７の横軸はｐＨを、縦軸は銀イオン（Ａｇ＋）濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。これは、水溶液中に１０ｍｇ／Ｌの銀ナノ粒子を入れて測定した。図７に示すように、銀ナノ粒子が入った溶液のｐＨを小さく（酸性を強くする）すれば、解離する銀イオン濃度を上げることができ、逆にｐＨを大きく（アルカリ性を強く）すれば、解離する銀イオン濃度を下げることができる。銀イオン濃度を高くしたい場合は、例えば、塩酸等を溶液に加えて酸性を強くすれば良い。銀イオン濃度を低くしたい場合は、例えば、水酸化ナトリウム等を溶液に加えてアルカリ性を強くすれば良い。
【００３８】
図５で、銀イオン濃度を制御する場合は、図５（ａ）の溶液中と図５（ｂ）の溶液中で同じ銀イオン濃度としておくために、両方の培養液のｐＨは同じにしておく必要がある。
【００３９】
以上のように、浮遊金属ナノ粒子に細胞もしくは生体組織を晒した場合であっても、浮遊金属ナノ粒子が細胞又は生体組織に金属ナノ粒子が取り込まれることにより発生する効果と、浮遊金属ナノ粒子に基づいて生じる解離金属イオンに晒されることにより発生する効果を区別することができる。
【００４０】
これにより、金属毒性のメカニズムが解明されスクリーニング試験法確立と毒性評価が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の金属イオン供給システムは、金属イオン又は金属ナノ粒子が生物個体群や生物群集に与える影響の試験、リスク評価等に適用することができる。
【符号の説明】
【００４２】
１      基板
２      微粒子
３      ナノ金属層
２０    容器
２０Ａ  基底
２１    混合液
１０    金属付着微粒子
【図１】
0005920759.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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