(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソソームの免疫調節活性を検出するステップと、ここで、前記免疫調節活性が、ビグリカン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ０９２９５４）、エンドプラスミン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０４０２２６）、ＨＳＰ６０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３４６６４．１，ＡＡＡ３６０２２．１）、ＨＳＰ７０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２３４２０．１，ＢＡＡ７５０６２．１）、β−デフェシン２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０００１５２）、フィブリノーゲンアルファ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２１８７１）、フィブリノーゲンベータ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１８４７４１）、フィブリノーゲンガンマ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００５０９）、フィブロネクチン（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿２１２４８２）、テネイシン−Ｃ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００２１６０）、Ｓ１００タンパク質Ｓ１００Ａ１１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ３８５８３）、Ｓ１００タンパク質Ｓ１００Ａ１３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ０９７１３２）、Ｓ１００タンパク質Ｓ１００Ａ８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ００５９２８）、Ｓ１００タンパク質Ｓ１００Ａ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０４７６８１）、およびＳ１００タンパク質Ｓ１００Ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６５６１４）からなる群から選択される、エキソソームのまたはエキソソーム中のタンパク質の活性の検出によって検出され、
前記タンパク質の活性が検出された場合に前記エキソソームが治療的活性を有すると決定するステップと
を含む、間葉系幹細胞エキソソームが自己免疫疾患における組織の修復を増強させる、または、自己免疫疾患における疾患の進行を阻害するための治療的活性を有するかどうかを決定する方法。
【請求項２】
前記エキソソームが、ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞から生産されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己免疫疾患が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、多発性硬化症、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記エキソソームが、自然免疫系を介した抑制適応免疫応答を含む炎症性および抗炎症性の自然免疫応答を活性化することができ、かつ／または、炎症性適応免疫応答を活性化しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）分子量、サイズ、形状、組成、または生物学的活性に基づいて他の成分からエキソソームを分離することを含む、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）からエキソソームを単離するステップと、（ｂ）前記単離されたエキソソームにおいて請求項１に記載の活性を検出するステップとを含む方法。
【請求項６】
エキソソームを生産する方法であって、（ａ）間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を得るステップと、（ｂ）前記間葉系幹細胞馴化培地を濃縮するステップと、（ｃ）前記濃縮された間葉系幹細胞馴化培地を、サイズ排除クロマトグラフィーにかけるステップと、（ｄ）動的光散乱を示すＵＶ吸光画分を選択するステップと、ここで、ステップ（ｄ）が、１１〜１３分の保持時間で溶出する画分を回収するステップを含み、前記エキソソームにおける請求項１に記載の活性を検出するステップとを含む、方法。
【請求項７】
前記（ｂ）の濃縮が、＞１０００ｋＤａ膜での限外ろ過によるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｃ）のサイズ排除クロマトグラフィーが、ＴＳＫ  ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍ（商標名）またはＴＳＫゲルＧ４０００  ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍカラム（商標名）を使用するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記（ｄ）のＵＶが２２０ｎｍであり、動的光散乱が準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）によって検出されるものである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、細胞生物学、分子生物学、および遺伝学の分野に関する。本発明は、医薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキソソームはかつて、細胞が不要なタンパク質を廃棄するための「ごみ袋」であると考えられていた１。しかし、エキソソームは次第に、特に細胞伝達において重要な生理学的機能を有していると考えられてきている。
【０００３】
エキソソームは、多くの細胞型によって分泌される５０〜１００ｎｍの脂質二重膜小胞である２。これらは、分泌された細胞生産物の分類に属し、全ての分泌された膜小胞を広く含む微粒子として知られている。エキソソーム以外に、微粒子には、微小胞（１００〜１０００ｎｍ）、エクトソーム（５０〜２００ｎｍ）、膜粒子（５０〜８０ｎｍ）、エキソソーム様小胞（２０〜５０ｎｍ）、およびアポトーシス小胞（５０〜５００ｎｍ）が含まれる。これらの異なるクラスの微粒子を区別するための主要なパラメータは、それらのサイズであり、最も明確に定義されている分類はエキソソームである。
【０００４】
エキソソームは、１０００００ｇで沈殿させた場合に１．１０から１．１９ｇ／ｍｌのショ糖密度を有し、スフィンゴミエリン、セラミド、脂質ラフト、および曝露したホスファチジルセリンを含有する、コレステロールに富んだ脂質膜を有する。エキソソーム生合成のプロセスは複雑であり、生合成経路およびエンドサイトーシス経路を介する複雑な細胞内膜輸送およびカーゴ選別を伴う。この複雑な生合成の証拠として、エキソソームの顕著な特徴に、小胞体のおよびＡｌｉｘタンパク質、Ｔｓｇ１０１タンパク質、Ｒａｂタンパク質などのエンドソームのマーカーがある。エキソソームは、多小胞体（ＭＶＢ）と原形質膜との融合を介する放出の前は、多小胞体内に保存されている。
【０００５】
エキソソームは、特に免疫細胞または腫瘍細胞における細胞間伝達を仲介することが示されている３−８。最近、本発明者らは、この機能を、組織修復を含むまでに拡張し、その際、本発明者らは、心筋虚血再かん流（ＭＩ／Ｒ）傷害のマウスモデルにおいて、ヒトＥＳＣ由来のＭＳＣによって分泌されるエキソソームが梗塞サイズを約５０％低減させることを報告した９,１０。これらのエキソソームは、ＨＰＬＣでのサイズ排除によって直径が約５０〜１００ｎｍの均質なサイズの微粒子の集団として精製され、これらは、タンパク質負荷およびＲＮＡ負荷の両方を有している９,１１,１２。
【０００６】
しかし、ＭＳＣエキソソームによるこの心保護効果の根底にある（１つまたは複数の）メカニズムは、依然として解明されていない。その理由の一部は、本発明者によるエキソソームの生物学的能力の理解が全体として欠如していることに起因し得る。様々な細胞型および生体液からのエキソソームの広範囲なプロテオミクスおよびＲＮＡプロファイリングにも関わらず、エキソソームにおけるタンパク質およびＲＮＡの生物学的能力は、依然としてほとんど調査されていない。生物学的能力についてのこれまでのほとんどの研究は、免疫細胞、特に樹状細胞からのエキソソームによって引き起こされる免疫応答に限定されているが２、これらの生物学的応答の分子的または生化学的基礎は、依然として解明されていない。
【発明の概要】
【０００７】
この欠如に対処するために、本発明者らは、ＨＰＬＣ精製されたエキソソームの包括的なプロテオミクスプロファイリングを行って、これらのエキソソーム内に存在するタンパク質をまず同定し、次いで、これらのタンパク質を用いて、エキソソームにおける生物学的活性または生物学的能力のタイプを予測した。これを次に、生化学的または細胞的アッセイによって立証した。
【０００８】
全部で８６６の固有の遺伝子産物を検出し、これらは、３２の出現頻度の高い生物学的プロセスに機能的にクラスター化することができ、このことは、エキソソームが、広範な生化学的または細胞的影響を及ぼす能力を有することを示す。この能力を評価するために、本発明者らはタンパク質を選択し、当該タンパク質は、その生化学的および／または細胞的活性を評価するためのアッセイが利用可能なものであり、このアッセイは、組み合わせて、エキソソームにおける広範な生化学的および細胞的能力を実証し、ＭＳＣエキソソームの心保護特性のための候補分子メカニズムを提供するものである。
【０００９】
本発明において調査されたタンパク質には、グルコースを分解してＡＴＰおよびＮＡＤＨを生成するための糖分解酵素、糖分解を増大させるＰＦＫＢ３、アデノシン受容体を介してシグナル伝達カスケードを活性化し得るアデノシンにＡＭＰを加水分解するＣＤ７３、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を阻害するＣＤ５９、ならびに２０Ｓプロテアソームが含まれる。
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、本発明者らは、治療用エキソソームを検出する方法を提供する。本方法は、エキソソームの活性を検出するステップを含み得る。本方法は、免疫調節活性を含み得る。これは、補体阻害活性を含み得る。これは、プロテアソーム活性を含み得る。これは、糖分解酵素活性を含み得る。これは、抗酸化活性を含み得る。これは、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性を含み得る。これは、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を含み得る。これは、イオンホメオスタシス活性を含み得る。これは、シャペロン活性を含み得る。これは、上記のいずれか１つまたは複数を含み得る。
【００１１】
活性は、免疫調節活性を含み得る。免疫調節活性は、表Ｄ１０に示されるタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００１２】
活性は、補体阻害活性を含み得る。補体阻害活性は、表Ｄ１に示されるタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００１３】
活性は、プロテアソーム活性を含み得る。プロテアソーム活性は、表Ｄ２に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００１４】
活性は、糖分解酵素活性を含み得る。糖分解酵素活性は、表Ｄ３に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００１５】
活性は、抗酸化活性を含み得る。抗酸化活性は、表Ｄ４に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００１６】
活性は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性を含み得る。細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性は、表Ｄ５に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００１７】
活性は、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を含み得る。ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性は、表Ｄ６に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００１８】
活性は、イオンホメオスタシス活性を含み得る。イオンホメオスタシス活性は、表Ｄ７に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００１９】
活性は、シャペロン活性を含み得る。シャペロン活性は、表Ｄ８に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００２０】
活性は、免疫調節活性を含み得る。免疫調節活性は、表Ｄ１０に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
【００２１】
活性が検出される場合、エキソソームは、補体介在性の細胞溶解を阻害し得る可能性があり得る。これはまた、あるいは、またはそれに加えて、例えば心筋虚血および再かん流傷害のマウスモデルもしくはブタモデルにおいて測定されたとき、梗塞サイズを低減させ得るか、または、例えば過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）誘発性の細胞死のインビトロアッセイにおいて測定されたとき、酸化ストレスを低減させ得る。これは、上記の活性の両方を有し得る。
【００２２】
活性が検出される場合、エキソソームは、治療的活性を有する治療用エキソソームを含む可能性があり得る。
【００２３】
治療的活性は、心保護活性を含み得る。
【００２４】
治療的活性は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、および変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚のＴ細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失を含む慢性的な組織リモデリングをもたらす炎症および免疫異常調節を誘発する初期の傷害を特徴とする病的状態、腎臓虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎、または整形外科的疾患からなる群から選択される１つまたは複数の疾患に対するものであり得る。
【００２５】
本発明の第２の態様によれば、（ａ）分子量、サイズ、形状、組成、または生物学的活性に基づいて他の成分からエキソソームを分離することを場合によって含む、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）からエキソソームを単離するステップ、および（ｂ）上記に記載されるような１つまたは複数のタンパク質の活性を好ましくは検出することによって、単離されたエキソソームにおいて上記に記載されるような活性を検出するステップを含む方法が提供される。
【００２６】
本発明者らは、本発明の第３の態様によれば、エキソソームを生産する方法を提供し、本方法は、（ａ）間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を得るステップと、（ｂ）例えば＞１０００ｋＤａの膜上での限外濾過によって、間葉系幹細胞馴化培地を濃縮するステップと、（ｃ）濃縮された間葉系幹細胞馴化培地を、ＴＳＫ  ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍ、またはＴＳＫゲルＧ４０００  ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍカラムを用いるような、サイズ排除クロマトグラフィーにかけるステップと、（ｄ）準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）によって検出されるもののような動的光散乱を示す、例えば２２０ｎｍでのＵＶ吸光画分を選択するステップとを含み、ステップ（ｄ）は、例えば、１１〜１３分、例えば１２分の保持時間で溶出する画分を回収すること、および、上記に記載されるような１つまたは複数のタンパク質の活性を好ましくは検出することによって、エキソソームにおける上記に記載されるような活性を検出することを含む。
【００２７】
本発明の第４の態様として、エキソソームが治療的活性を含むかどうかを検出する方法が提供され、本方法は、上記に記載されるような酵素活性を検出することを含み、ここで、酵素活性が検出される場合、エキソソームは治療的活性を含む。
【００２８】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を採用し、これらは当業者の能力の範囲内である。このような技術は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５および定期的な増補、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、チャプター９、１３、および１６、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、およびＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．Ｉ  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（編者）、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編者）（１９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２）、１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ編（２００１、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）；ならびにＬａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ、Ｊａｎｅ  ＲｏｓｋａｍｓおよびＬｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ編、２００２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの一般的なテキストのそれぞれは、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＭＳＣ馴化培地において事前に同定された７３９のタンパク質と、精製されたエキソソームにおいて同定された８６６のタンパク質との共通集合を示す図である。
【図２】エキソソームタンパク質のプロテオミクス分析を示す図である。エキソソームにおける８６６の遺伝子産物を、３２の出現頻度の高い生物学的プロセスおよび３つの出現頻度の低い生物学的プロセスに機能的にクラスター化した（ｐ＜０．００１）。馴化培地（ＣＭ）において見られたがエキソソームにおいては見られなかった４２１のタンパク質を、１１の出現頻度の高い生物学的プロセスおよび２つの出現頻度の低い生物学的プロセスに機能的にクラスター化した。黒いバーは、エキソソームにおける遺伝子産物についてのプロセスを表し、白いバーは、ＣＭにおけるものであるがエキソソームにおけるものではない遺伝子産物についてのプロセスを表す。
【図３Ａ−３Ｄ】エキソソームが糖分解を調節することを示す図である。
【図３Ａ】糖分解の略図である。
【図３Ｂ】ゲラルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼｍ２アイソフォーム（ＰＫｍ２）、およびｐＰＦＫＦＢ３についての、馴化培地（ＣＭ）およびエキソソーム（Ｅｘｏ）のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図３Ｃ】ＭＳＣエキソソームにおけるＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、およびＰＫｍ２の酵素活性を、市販されているアッセイキットを用いて、ＡＴＰまたはピルビン酸の生産によって決定した図である。１単位（Ｕ）の酵素活性を、３７℃で１分当たり１μモルの生成物を生成するための活性であると規定する。
【図３Ｄ】オリゴマイシン処理した細胞におけるＡＴＰ生産に対するエキソソームの影響を示す図である。Ｈ９Ｃ２心筋細胞をタイロード緩衝液で２回洗浄し、次いで、２０μｍｏｌのミトコンドリア阻害剤、オリゴマイシン、６ｍｍｏｌのグルコースを含有し、０．１μｇ／ｍｌのエキソソームを含むまたは含まないタイロード緩衝液内で１５分、３０分、および６０分間インキュベートした。細胞のＡＴＰ濃度を、ＡＴＰｌｉｔｅ  １ステップ発光ＡＴＰ検出アッセイ系を用いて測定し、１５分でのエキソソームを有さない試料のＡＴＰ濃度に対して正規化した。＊ｐ＝０．０１７３、＊＊ｐ＝０．００９０
【図４Ａ−４Ｂ】エキソソームにおける２０Ｓプロテアソームを示す図である。
【図４Ａ】ＰＭＳＡ１〜７ペプチドに特異的な抗体を用いる、ＭＳＣ馴化培地（ＣＭ）およびエキソソーム（Ｅｘｏ）のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図４Ｂ】ＭＳＣエキソソームにおけるプロテアソーム活性を、市販されているプロテアソーム活性アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて決定した。プロテアソーム活性は、プロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの不存在下または存在下での蛍光発生ペプチドの分解速度によって測定した。１単位（Ｕ）の酵素活性を、３７℃で１分当たり１μモルの生成物を生成するための活性であると規定する。＊ｐ＝０．０００２３
【図５Ａ−５Ｃ】ＮＴ５Ｅ（エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼＣＤ７３）を介する、エキソソームのリン酸化されたＥＲＫおよびＡＫＴを示す図である。
【図５Ａ】特異的抗体を用いる、ＣＤ７３についてのＭＳＣ  ＣＭおよびエキソソームのウェスタンブロット分析を示す図である。
【図５Ｂ】馴化培地（ＣＭ）およびエキソソーム（Ｅｘｏ）におけるＣＤ７３活性がＡＭＰの加水分解からのリン酸イオンの生産によって測定されたことを示す図である。
【図５Ｃ】Ｈ９Ｃ２細胞を一晩血清飢餓とし、次いで、１ｍＭのテオフィリンを含むまたは含まない培地と共に１時間インキュベートしたことを示す図である。細胞を次に、５０μＭのＡＭＰ、０．１μｇ／ｍｌのエキソソーム、またはＡＭＰおよびエキソソームと共に３０分間プレインキュベートした培地に５分間曝露した。細胞を次に採取し、溶解した。１０μｇの全タンパク質を、１：２０００希釈のウサギ抗ｐＥＲＫ１／２、１：２０００希釈のウサギ抗ＥＲＫ１／２、１：５００希釈のウサギ抗ｐＡＫＴ、または１：５００希釈のウサギ抗ＡＫＴを用いてイムノブロットした。
【図６Ａ−６Ｂ】エキソソームが膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を阻害したことを示す図である。
【図６Ａ】ＣＤ５９特異的抗体を用いる、ＭＳＣ馴化培地（ＣＭ）およびエキソソーム（Ｅｘｏ）のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図６Ｂ】ＳＲＢＣを洗浄し、次いで、エキソソームの存在下または不存在下で、Ｃ５ｂ６およびＣ７を有するＰＢＳ内に再懸濁した。混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、その後、Ｃ８およびＣ９を、ブロックＣＤ５９抗体を伴ってまたは伴わずに添加して、さらに３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、上清内の、溶解したＳＲＢＣによって放出されたヘモグロビンの量を、４１５ｎｍでの吸光度によって測定した。陽性対照（全溶血）は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で完全に溶解した細胞からの上清であった。陰性対照は、補体成分を添加していない試料である。陽性対照の吸光値を１００％に対して正規化した。＊ｐ＝２．８Ｅ−０６、＊＊ｐ＝３．５１Ｅ−０８。
【図７】ＭＳＣエキソソームがＴＬＲリガンドを有することを示す図である。
【図８】ＭＳＣエキソソームがＴＬＲ２を活性化させないことを示す図である。
【図９】ＭＳＣエキソソームがＴＬＲ４を活性化させることを示す図である。
【図１０】ＭＳＣエキソソームがＴＨＰ−１細胞による炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの生産を誘発することを示す図である。
【図１１】Ｔｒｅｇ細胞（ａ）またはＴｈ１７細胞（ｂ）へのＣＤ４＋マウスＴ細胞の分化を誘発することを示す図である。
【図１２Ａ−１２Ｂ】自然免疫を介する適応免疫の調節を示す図である。
【図１３】エキソソームについてのコンカナバリンＡで活性化したリンパ球の増殖アッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
哺乳動物細胞は、タンパク質およびＲＮＡを含有するエキソソームを分泌する。仮定上は、これらのエキソソームは、健康な細胞から採取および精製することができ、罹患細胞またはストレスを受けた細胞における細胞資源を補充および強化するために用いられ、これらの細胞に回復および修復を開始させ得る。例えば、本発明者らは、ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞からのエキソソームが急性心筋虚血再かん流傷害後の細胞死から心筋細胞を救い得ることを実証している。ここで、本発明者らは、これらのエキソソームの生化学的特性を説明する。これらの特性は、罹患細胞またはストレスを受けた細胞の治療における治療的能力についてエキソソーム調製物を同定、選択、または評価するために用いることができる。
【００３１】
傷害または疾患の結果ストレスを受けている細胞は、類似の細胞機能障害を有していることが多い。これらは、ミトコンドリアの膜浸透性が増大しており、その結果、ＡＴＰおよびＮＡＤＨの生産が低減し、ＲＯＳレベルが増大し、そしてＮａ、Ｃａ、Ｋ、およびＣｌを含むイオンホメオスタシスを喪失している。また、ＥＲストレスおよび封入体の形成および過剰な自然免疫応答をもたらす、変性タンパク質の蓄積も存在する。回復および修復のプロセスを開始するためには、細胞はこれらの細胞機能障害をまず修正しなくてはならない。エキソソームは、タンパク質およびＲＮＡを含有する分泌型のリン脂質小胞であるため、これらの細胞機能障害を修正するために必要な細胞活性を迅速に開始し得る酵素およびＲＮＡを送達する能力を有し得る。
【００３２】
ここで、本発明者らは、治療用エキソソームの生化学的特性を説明する。これらの生化学的特性には、
ａ．補体活性の阻害（以下の表Ｄ１）
ｂ．変性タンパク質を分解するためのプロテアソーム活性（以下の表Ｄ２）
ｃ．ＡＴＰおよびＮＡＤＨを生成するための糖分解酵素（以下の表Ｄ３）
ｄ．ＮＡＤＰＨを生成するためのペントースリン酸経路酵素
ｅ．抗酸化活性（以下の表Ｄ４）
ｆ．ＭＭＰ／ＴＩＭＰ活性（以下の表Ｄ５）
ｇ．生存シグナル伝達経路を活性化させるためのＣＤ７３エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性（以下の表Ｄ６）
ｈ．イオンホメオスタシス、例えばカルシウム、ナトリウム、プロトン、カリウム、および塩化物のチャネルを回復させるためのＡＴＰａｓｅ膜チャネルまたは輸送体（以下の表Ｄ７）
ｉ．タンパク質の構造的完全性を維持するためのシャペロン活性（以下の表Ｄ８）
が含まれる。
【００３３】
潜在的な治療用のエキソソームは、これらの生化学的活性のためのタンパク質を有するだけではなく、タンパク質が酵素的に活性ではなくてはならない。これらのタンパク質の酵素活性は、したがって、エキソソーム調製物の治療的有効性についての代替マーカーであり得る。
【００３４】
本発明者らは、したがって、治療用エキソソームを規定、同定、および評価するための多くの生化学的アッセイを提供する。
【００３５】
＜治療用エキソソームについてのアッセイ＞
本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から由来可能である粒子、例えばエキソソームの、生物学的特性、特に生化学的特性を記載する。
【００３６】
本明細書において記載される方法および組成によれば、（ａ）補体阻害活性、（ｂ）プロテアソーム活性、（ｃ）糖分解酵素活性、（ｄ）抗酸化活性、（ｅ）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性、（ｆ）ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性、（ｇ）イオンホメオスタシス活性、（ｈ）シャペロン活性の１つまたは複数を含むエキソソームは、治療的活性および（ｉ）免疫調節活性を含み得る。
【００３７】
このような特性を含むエキソソームは、以下に記載されるように、多くの疾患に対して治療的な性質であり得、言い換えると、治療用エキソソームであり得る。用語「エキソソーム」が本明細書において用いられる場合、文脈から可能である場合、「治療用エキソソーム」も含むことが理解されよう。
【００３８】
エキソソームは、いくつかの手段のいずれかによって、例えば、ＭＳＣからの分泌、出芽、または分散によって、ＭＳＣから由来可能であり得る。例えば、エキソソームは、ＭＳＣから生産、滲出、放出、流出され得る。ＭＳＣが細胞培養物内にある場合、エキソソームは、細胞培養培地内に分泌され得る。
【００３９】
エキソソームは、小胞を特に含み得る。本明細書において記載される治療用エキソソームは、本明細書において記載されるエキソソームの特性のいずれか１つまたは複数を含み得る。
【００４０】
エキソソームは、脂質二重層によって限定された小胞または平坦な球体を含み得る。エキソソームは、４０〜１００ｎｍの直径を含み得る。エキソソームは、エンドソーム膜の内側への出芽によって形成され得る。エキソソームは、約１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有し得、ショ糖勾配で浮遊し得る。エキソソームは、コレステロールおよびスフィンゴミエリン、ならびにＧＭ１、ＧＭ３、フロチリン、およびｓｒｃタンパク質キナーゼＬｙｎなどの脂質ラフトマーカーに富んでいる可能性がある。エキソソームは、間葉系幹細胞または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）内に存在する１つまたは複数のタンパク質、例えばＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭに特徴的または特異的なタンパク質を含み得る。
【００４１】
本発明者らは、ＭＳＣまたはＭＳＣ培養物によって馴化された培地において見られる１つまたは複数の遺伝子を含み、かつ治療的活性を含む、エキソソームを提供する。このような治療用エキソソームは、（ａ）補体阻害活性、（ｂ）プロテアソーム活性、（ｃ）糖分解酵素活性、（ｄ）抗酸化活性、（ｅ）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性、（ｆ）ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性、（ｇ）イオンホメオスタシス活性、（ｈ）シャペロン活性、および（ｉ）免疫調節活性からなる群から選択される１つまたは複数の活性を示すエキソソームを検出することによって同定することができる。
【００４２】
エキソソームは、ＭＳＣによって分泌される分子を含み得る。このようなエキソソーム、および、特にタンパク質またはポリペプチドを含む、エキソソームに含まれるいずれかの分子の組み合わせは、例えば疾患の治療または予防の目的で、ＭＳＣもしくはＭＳＣによって馴化された培地の活性を補うために、またはＭＳＣもしくはＭＳＣによって馴化された培地の代わりに、用いることができる。
【００４３】
エキソソームは、細胞骨格において見られる細胞質性のタンパク質、例えばチューブリン、アクチン、およびアクチン結合タンパク質、細胞内の膜融合体および膜輸送、例えばアネキシンおよびｒａｂタンパク質、シグナル伝達タンパク質、例えばタンパク質キナーゼ、１４−３−３、およびヘテロ三量体Ｇタンパク質、代謝酵素、例えばペルオキシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、脂質キナーゼ、およびエノラーゼ−１、ならびにテトラスパニンファミリー、例えばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ８２を含み得る。特に、エキソソームは、１つまたは複数のテトラスパニンを含み得る。エキソソームは、ｍＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡを含み得る。
【００４４】
本明細書において用いられる用語「粒子」は、エキソソームを含むものであるが、個別の実体を意味するために用いられ得る。粒子は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から単離されるものであり得る。粒子は、少なくともＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの活性に関与し得る。粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの機能の実質的にほとんどまたは全てに関与し得、それを実行し得る。例えば、粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの代替物（または生物学的代替物）であり得る。
【００４５】
用語「粒子」が本明細書において用いられる場合（かつ、文脈から可能である場合）、エキソソームと同義語を含むと理解されよう。
【００４６】
エキソソームは、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭが使用され得る治療的目的のいずれかに用いることができる。
【００４７】
エキソソームは、好ましくは、治療的特性などの、間葉系幹細胞の少なくとも１つの特性を有する。エキソソームは、生物学的活性などの生物学的特性を有し得る。エキソソームは、ＭＳＣの生物学的活性のいずれかを有し得る。エキソソームは、例えば、ＭＳＣの治療的活性または回復活性を有し得る。
【００４８】
ＭＳＣによって馴化された培地（例えば、以下に記載されるような、間葉系幹細胞馴化培地またはＭＳＣ−ＣＭ）は、ＭＳＣの生物学的活性を含むことが知られており、ＭＳＣ自体を代替し得る。例えば、ＷＯ２００９／１０５０４４を参照されたい。ＭＳＣの生物学的特性または生物学的活性は、したがって、間葉系幹細胞馴化培地の生物学的特性または生物学的活性に対応し得る。したがって、エキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の１つまたは複数の生物学的特性または生物学的活性を含み得る。
【００４９】
本明細書において記載される治療用エキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から単離することができ、（ａ）補体阻害活性、（ｂ）プロテアソーム活性、（ｃ）糖分解酵素活性、（ｄ）抗酸化活性、（ｅ）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性、（ｆ）ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性、（ｇ）イオンホメオスタシス活性、（ｈ）シャペロン活性、および（ｉ）免疫調節活性の１つまたは複数の存在について試験することができる。
【００５０】
＜活性の検出＞
上記の活性のそれぞれは、当技術分野において知られている多くの手段によって治療用エキソソームにおいて検出することができる。例えば、関連する活性は、治療用エキソソームにおける活性に関与するタンパク質またはポリペプチドの存在の検出によって検出することができる。これは、例えば、同族抗体の使用、ならびに当技術分野において知られているような免疫アッセイおよびウェスタンブロットなどによる抗体とタンパク質との間の結合の検出によって行うことができる。
【００５１】
全体を通して、１単位（Ｕ）の酵素活性は、１分当たり１μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される。
【００５２】
＜活性の検出のためのウェスタンブロットプロトコル＞
タンパク質またはポリペプチドを介する活性を検出するためのウェスタンブロットハイブリダイゼーションを用いる例示的なプロトコルを以下に記載する。
【００５３】
１２μｇのエキソソームを４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜をＳＮＡＰ  ｉ．ｄ．系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の膜ホルダーに移し、ブロックし、そして、マウス抗ＧＡＰＤＨ（１：１００希釈）、マウス抗ＰＧＫ（１：６０）、マウス抗ＰＧＤ（１：６０）、ウサギ抗ＰＦＫＦＢ３（１：６０）、マウス抗ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ、１：２００）、マウス抗２０Ｓプロテアソームα１〜７（１：２００）、マウス抗ＣＤ７３（１：６０）、およびマウス抗ＣＤ５９（１：２００）を含む一次抗ヒト抗体と共にインキュベートした。ブロットを次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートした。用いた二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１２５０）またはロバ抗ウサギＩｇＧ（１：１２５０）であった。全ての抗体は、Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手したマウス抗ＰＫを除いて、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手した。ブロットを次に、ＨＲＰで増強した化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と共にインキュベートし、次いで、Ｘ線フィルムに曝露した。
【００５４】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）または質量分析（ＭＳ）
質量分析などの他の方法もまた、エキソソームにおけるタンパク質またはポリペプチドの存在を検出するために用いることができる。ＬＣ−ＭＳは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／Ｌｉｂｒａｒｙ／Ｓｕｐｐｏｒｔ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ａ０５２９６．ｐｄｆにある文献「Ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  ＬＣ／ＭＳ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において詳細に記載されている。
【００５５】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）または質量分析（ＭＳ）を用いる例示的なプロトコルを以下に記載する。
【００５６】
文献（２０）に記載されているように、２ｍｌの透析されたエキソソームにおけるタンパク質を還元し、アルキル化し、そしてトリプシン消化した。試料を次に、消化された混合物を、馴化されたＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８  ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に通すことによって脱塩し、３％アセトニトリル（ＡＣＮ）（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）および０．１％ギ酸（ＦＡ）の緩衝液で２回洗浄し、そして７０％ＡＣＮおよび０．１％ＦＡの緩衝液で溶出した。溶出された試料を次に、真空遠心分離機において有機溶媒を除去することによって、その最初の容積の約１０％まで乾燥させた。試料の複雑性を低減させるために、オフラインペプチド分画を、Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌ  ＳＣＸカラム（２００ｍｍ×４．６ｍｍ）（ＰｏｌｙＬＣ、ＵＳＡ）を通すＨＰＬＣ系（株式会社島津製作所、日本）で行った。１ｍｌ／分での、移動相Ａ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル）および移動相Ｂ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル＋３５０ｍＭのＫＣｌ）。８つの画分を回収し、真空遠心分離機で乾燥させた。分画された試料を、ナノスプレー源を取り付けたＬＴＱ−ＦＴ  Ｕｌｔｒａリニアイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｂｒｅｍｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にオンラインで繋いだ株式会社島津製作所のマイクロＨＰＬＣ系の自動サンプラー内にロードした。注入されたペプチドを、Ｚｏｒｖａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８濃縮カラム（５ｍｍ×０３ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で捕捉および脱塩し、そしてナノレベルの穴を有するＣ１８パックカラム（７５μｍ×１００Å、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）内に溶出した。２００ｎｌ／分の２０の有効流速の一定流速での１分勾配へのスプリッターでの９０ｌ／分を用いて、ペプチドを質量分析計内に溶出した。ＦＴＭＳにおける各ＭＳスキャンから得られる最も強いピークの８つについてＭＳ／ＭＳスキャンを行うことによって、ＬＴＱをデータ依存モードで操作した。各実験で、８つのＳＣＸ画分のＭＳ／ＭＳ（ｄｔａ）スペクトルを、自作のプログラムによるシングルマスコットジェネリックファイル内に組み合わせた。タンパク質の同定は、社内のＭａｓｃｏｔサーバ（バージョン２．２．０４、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を介して、組み合わされたデータをＩＰＩヒトタンパク質データベース（バージョン３．３４、６９１６４の配列、２９０６４８２５の残基）に対してサーチすることによって行った。サーチパラメータは、トリプシンを用いる切断の失敗が最大で２カ所であること；固定された修飾がシステインのカルバミノメチル化であり、可変の修飾がメチオニンの酸化であること、であった。質量許容差は、ペプチド前駆体および断片イオンについてそれぞれ１０ｐｐｍおよび０．８Ｄａに設定した。タンパク質の同定は、２つの異なるペプチドがホモロジースコアよりも大きなスコアを有することが明らかになった場合に、真陽性であると認められた。
【００５７】
＜補体阻害活性＞
補体阻害活性は、表Ｄ１に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
【００５８】
【表１】
0006046640.tif 000002
【００５９】
あるいは、またはそれに加えて、補体介在性細胞溶解活性を、以下に記載するアッセイを行うことによって検出することができる。
【００６０】
＜補体介在性細胞溶解アッセイ＞
簡潔に述べると、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を購入し（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、その後、ＰＢＳ１ｍｌ当たり１×１０８個の細胞で再懸濁した。精製補体成分、Ｃ５ｂ６、Ｃ８、およびＣ９は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、Ｃ７はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＳＲＢＣへのインタクトＣ５ｂ−９の会合を、最終濃度が０．１μｇ／ｍｌのエキソソームの存在下または不存在下で、それぞれ１ｍｌのＣ５ｂ６（０．１μｇ／ｍｌ）およびＣ７（０．４μｇ／ｍｌ）と共に１５分間インキュベーションすること（３７℃）によって開始させた。ＳＲＢＣを次に洗浄し、最終濃度が０．０５μｇ／ｍｌのブロックＣＤ５９抗体を含むまたは含まない、それぞれ１ｍｌのＣ８（０．４μｇ／ｍｌ）にＣ９（０．４μｇ／ｍｌ）を加えたものと共にさらに３０分間インキュベートした。その後、ＳＲＢＣを遠心分離し、上清内の溶解ＳＲＢＣによって放出されたヘモグロビンの量を、４１５ｎｍでの吸光度によって測定した。全（１００％）溶血を、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で細胞を処理することによって得た。
【００６１】
＜プロテアソーム活性＞
プロテアソーム活性は、表Ｄ２に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
【００６２】
【表２】
0006046640.tif 000003
【００６３】
あるいは、またはそれに加えて、プロテアソーム活性を、以下に記載するアッセイを行うことによって検出することができる。
【００６４】
＜２０Ｓプロテアソームアッセイ＞
プロテアソーム活性を、特異的２０Ｓプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの存在下または不存在下で、２０Ｓプロテアソームによる標識された基質ＬＬＶＹ−ＡＭＣからの切断後のフルオロフォア７−アミノ−４メチルクマリン（ＡＭＣ）を検出することに基づく、２０Ｓプロテアソーム活性アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定した。簡潔に述べると、４μｇのエキソソームを、２５μＭのラクタシスチンの存在下または不存在下で、ＬＬＶＹ−ＡＭＣを含有する反応緩衝液と共にインキュベートした。試料およびＡＭＣ標準を３７℃でインキュベートし、Ｅｘ／Ｅｍ＝３８０／４６０ｎｍでの蛍光強度を２時間モニタリングした。
【００６５】
＜単位活性の規定＞
２０Ｓコア粒子の１単位の酵素活性は、１分当たり１μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される。
【００６６】
エキソソームは、タンパク質１μｇ当たり５．０μＵの２０Ｓコア粒子活性を含有することが分かる。
【００６７】
＜糖分解酵素活性＞
糖分解酵素活性は、表Ｄ３に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によってエキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
【００６８】
【表３】
0006046640.tif 000004
【００６９】
＊ＡＴＰおよびＮＡＤＨはタンパク質ではないことが理解される。これらは、しかし、エキソソームにおける糖分解酵素活性を検出するために検出することができ、したがって、エキソソームが治療用エキソソームであるかどうかを決定するために用いることができる。同様に、細胞におけるＡＴＰおよびＮＡＤＨの還元（または両方）の検出を用いることができる（上記を参照されたい）。
【００７０】
したがって、本明細書の文脈において、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」がＡＴＰおよびＮＡＤＨなどの低分子を含み得ることが理解されよう。実体がタンパク質ではないが実際は何らかの他のタイプの実体、例えば低分子である場合、このような表（または本明細書の他の箇所）における表見出し「タンパク質」の下にある実体の検出についてのこのような言及には、不都合な重要性を持たせるべきではない。したがって、本明細書（例えば表Ｄ３）におけるいくつかの表見出しおよび他の言及は、「タンパク質」に言及する便宜のためのものであり得るが、（実際にはタンパク質ではなくとも）ＡＴＰ、ＮＡＤＨなどへの言及も含み得る。これらは、上記のように、治療用エキソソームの決定のために検出することができる。
【００７１】
さらに、糖分解酵素活性は、エキソソームに曝露された細胞内に移され、その結果、ＡＴＰおよびＮＡＤＨの生産を増大させ得るため、細胞によるＡＴＰまたはＮＡＤＨの生産（または両方）の検出を、生産されたエキソソームにおける糖分解酵素活性を検出する手段として用いることができ、それによって、それを治療用エキソソームと同定することができる。
【００７２】
＜ピルビン酸キナーゼアッセイ＞
５μｇのエキソソーム（１２μｌ内）を、細胞抽出キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて溶解した。溶解されたエキソソームの抽出物を、市販されているＰＫアッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）の５０μｌの反応ミックスと共にインキュベートした。このアッセイにおいて、ＰＫによって生産されたピルビン酸をピルビン酸キシダーゼによって酸化して、蛍光を生じさせた（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８７ｎｍ）。蛍光強度の増大は、したがって、生産されたピルビン酸の量に比例する。
【００７３】
＜ＧＡＰＤＨおよびＰＧＫアッセイ＞
ＧＡＰＤＨおよびＰＧＫの活性を、２つの市販されているキット、すなわちＫＤａｌｅｒｔ  ＧＡＰＤＨアッセイキット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびＡｐｏＳＥＮＳＯＲ  ＡＤＰ／ＡＴＰ比率アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて、その下流生成物、すなわち糖分解反応におけるＡＴＰに基づいて測定した。簡潔に述べると、エキソソームを、細胞抽出キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて溶解した。ＧＡＰＤＨ活性を測定するために、１０μｇの溶解したエキソソームを、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、ＮＡＤ＋、およびＰｉを含有するＫＤａｌｅｒｔ反応緩衝液に添加して、１，３−ビスホスホグリセレート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋を形成させた。２５０Ｕ／ｍｌのＰＧＫおよび６０μＭのＡＤＰを次に添加して、１，３−ビスホスホグリセレートおよびＡＤＰを３−ホスホグリセレートおよびＡＴＰに変換した。ＧＡＰＤＨ活性に比例する生産されたＡＴＰの量を次に、ＡＴＰルシフェラーゼアッセイを用いて測定した。ＰＧＫ活性を測定するために、１０μｇの溶解したエキソソームを、上記のアッセイから生産された１，３−ビスホスホグリセレートに添加した。ＡＤＰを添加して、ＡＴＰを形成させた。ＰＧＫ活性に比例するＡＴＰの量を次に、ＡＴＰルシフェラーゼアッセイを用いて定量した。
【００７４】
＜糖分解細胞に基づくアッセイ＞
Ｈ９Ｃ２心筋細胞を、ウェル当たり３００００個細胞で（ポリリジン被覆された）９６ウェルプレート上に平板培養した。５時間後、細胞をタイロード緩衝液で２回洗浄し、その後、２０μｍｏｌのオリゴマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、６ｍｍｏｌのグルコースを含有し、０．１μｇ／ｍｌのエキソソームを含むまたは含まないタイロード緩衝液内で１５分、３０分、および６０分間インキュベートした。細胞のＡＴＰ濃度を、ＡＴＰｌｉｔｅ  １ステップ発光ＡＴＰ検出アッセイ系（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｚａｖｅｎｔｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて測定した。
【００７５】
＜単位活性の規定＞
ＧＡＰＤＨ（ＡＦ２６１０８５．１）の１単位の酵素活性は、１分当たり１μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される。
【００７６】
エキソソームは、タンパク質１μｇ当たり１．１μＵのＧＡＰＤＨ活性、タンパク質１μｇ当たり３．５９μＵのＰＧＫ（Ｌ００１５９．１）活性、およびタンパク質１μｇ当たり５．５μＵのＰＫｍ２（Ｍ２３７２５．１）活性を含有することが分かる。
【００７７】
＜抗酸化活性＞
抗酸化活性は、表Ｄ４に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
【００７８】
【表４】
0006046640.tif 000005
【００７９】
＜細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性＞
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性は、表Ｄ５に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
【００８０】
【表５】
0006046640.tif 000006
【００８１】
＜ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性＞
ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性は、表Ｄ６に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
【００８２】
さらに、細胞をＡＭＰの存在下でＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性に曝露すると、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２のリン酸化が誘発され、エキソソーム内のまたはエキソソームの、リン酸化されたＡＫＴ（すなわち、リン酸化されたＡＫＴ１、リン酸化されたＡＫＴ２、またはリン酸化されたＡＫＴ３）またはリン酸化されたＥＲＫ１もしくはリン酸化されたＥＲＫ２（またはこれらのあらゆる組み合わせ）の検出を、エキソソームにおけるＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ酵素活性を検出する手段として用いることができ、それによって、それを治療用エキソソームと同定することができる。
【００８３】
【表６】
0006046640.tif 000007
【００８４】
＜ＣＤ７３アッセイ＞
エキソソームにおけるＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）酵素活性を、５０μＭのＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する１００μｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）内で２．５μｇのエキソソームをインキュベートすることによって決定した。ＡＭＰの加水分解から放出されたリン酸イオンの量を次に、製造者の指示通りに、Ｃｏｌｏｒｌｏｃｋ  Ｇｏｌｄキット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によって決定した。
【００８５】
＜単位活性の規定＞
１単位のエクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ酵素活性は、１分当たり１μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される。
【００８６】
エキソソームは、タンパク質１μｇ当たり２２．０４μＵのエクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を含有することが分かる。
【００８７】
＜イオンホメオスタシス活性＞
イオンホメオスタシス活性は、表Ｄ７に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
【００８８】
【表７】
0006046640.tif 000008
【００８９】
＜シャペロン活性＞
シャペロン活性は、表Ｄ８に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
【００９０】
【表８】
0006046640.tif 000009
【００９１】
＜免疫調節活性＞
治療用エキソソームは免疫調節活性を示し得る。
【００９２】
＜自然免疫細胞による適応免疫の調節（概説１〜３）＞
免疫系は、非自己細胞または非自己組織を破壊すること、感染性物質または毒性物質を中和すること、および細胞残屑、例えば死滅細胞または死滅しかけている細胞を除去することによって、生物を疾患から保護するために主に存在する。脊椎動物において、免疫系は、自然免疫系および適応免疫系からなる。自然免疫細胞には、樹状細胞、マクロファージ、および好中球が含まれ、これらの細胞は、感染性／毒性物質、ストレスシグナル、死滅／死滅しかけている細胞、または非自己細胞の不変の特徴を認識するように遺伝的にプログラムされている。これは進化的に保存されており、防御の第一線を提供する。適応免疫細胞は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球である。これらは、それぞれの外来の、毒性の、または非自己の作用物質に、これらの物質に対して特異的な受容体をデノボで生成してそれらを中和または破壊のために標的化することによって適合する。他方、自然免疫細胞は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子１様ＲＮＡヘリカーゼ、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体、およびＣ型レクチン受容体を含むような、生殖細胞系列にコードされたパターン認識受容体（ＰＰＲ）を介して、病原体関連分子パターンおよびストレスシグナルと一般に呼ばれている微生物病原体内の保存された分子署名を認識する。感染性作用物質または毒性作用物質に対する特異的受容体を生成するための適応免疫細胞の活性化は、複雑であり、自然免疫細胞によって調節される。ＰＰＲの中でも、ＴＬＲは、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、およびＩｇＡ抗体の生産、ならびにＴＨ１細胞、ＴＨ１７ＣＤ４＋細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化などの適応免疫応答の調節に関して最も特徴付けされたＰＰＲである。
【００９３】
ＴＬＲは、高度に保存された１型内在性膜糖タンパク質である。ヒトにおいて、１０のＴＬＲがこれまでに同定されている。ＴＬＲ３を除く全てのＴＬＲは、直接的にまたはＴＩＲＡＰと組み合わせて、ＭｙＤ８８依存性経路を介してシグナル伝達し、最終的には、ＮＦκＢの活性化および核移行をもたらすか、タンパク質１（ＡＰ１）を活性化するか、またはこれらの両方をもたらして、炎症性サイトカインの生産をもたらす。ＴＬＲ３およびＴＬＲ４は、ＭｙＤ８８依存性でＴＲＩＦ依存性シグナル伝達経路を開始させ、ＮＦκＢまたはＩＲＦ３の活性化および核移行をもたらして、炎症性サイトカインおよび１型インターフェロンをそれぞれ生産する。異なるＴＬＲは、異なるクラスの病原体関連分子パターンを認識し、例えば、ＴＬＲ４は細菌細胞表面リポ多糖を認識し、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２はペプチドグリカンを認識し、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６はリポタンパク質を認識し、ＴＬＲ３はウイルス二本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８はウイルス一本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は細菌およびウイルスのＣｐＧを認識し、ＴＬＲ５はフラジェリンを認識する。
【００９４】
＜ＴＬＲの内因性リガンド（概説４）＞
感染性作用物質およびそれらの生成物に対する宿主免疫の仲介におけるＴＬＲの非常な重要性にもかかわらず、無菌性炎症応答を引き起こすための内因性リガンドによるＴＬＲシグナル伝達の活性化は、ＴＬＲの重要な機能であるとますます考えられている。これまで、異なるＴＬＲについて多くの内因性リガンドが同定されている（以下の表Ｄ９）。ＴＬＲは、虚血および再かん流傷害、組織の修復および再生、自己免疫疾患、ならびに腫瘍形成および腫瘍進行に関与している。
【００９５】
【表９】
0006046640.tif 000010
【００９６】
＜ＭＳＣの免疫調節活性＞
ＭＳＣは、アロ抗原、マイトジェン、およびＣＤ３ライゲーションによって誘発されるＴ細胞増殖の阻害などのインビトロでの免疫調節特性を示し、Ｂ細胞の増殖およびナチュラルキラー細胞の活性を阻害する５。ヒトＧＶＨＤ６およびクローン病７についてのＭＳＣに基づいた介入の治療的有効性を試験する臨床試験が奨励されている。しかし、ＭＳＣの免疫調節特性の根底にあるメカニズムは、依然としてほとんど理解されていない。次第に、これらの特性はＭＳＣからのパラクリン分泌によって仲介されていると考えられている８。
【００９７】
２００８年に、本発明者らのグループは、ヒト胚性幹細胞由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）によって馴化された培養培地が虚血／再かん流傷害のブタモデルおよびマウスモデルにおいて相対的な梗塞サイズを低減させること９、ならびに慢性虚血のブタモデルにおいて心臓機能を向上させること１０を実証し、活性成分は、５０〜２００ｎｍの推定直径を有する。この成分は、その後ＨＰＬＣによって精製され、エキソソームとして同定された１１。プロテオミクス分析によって、これらのエキソソームがＴＬＲ２およびＴＬＲ４の内因性リガンドを含有することが明らかになった（表１）。したがって、ＭＳＣエキソソームは、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４を活性化させる能力を有し、ＭＳＣの免疫調節活性に寄与する。
【００９８】
免疫調節活性は、表Ｄ１０に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
【００９９】
【表１０】
0006046640.tif 000011
【０１００】
＜間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）＞
間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）などの馴化細胞培養培地は、細胞培養培地において間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、その子孫、またはそれに由来する細胞株を培養すること、および細胞培養培地を単離することによって得ることができる。間葉系幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーを分散させることによって細胞を得ることを含むプロセスによって生産することができる。細胞またはその子孫は、ＦＧＦ２を含む無血清培地において、共培養物の不存在下で増殖し得る。
【０１０１】
エキソソームは、多くの方法で生産または単離することができる。このような方法は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からエキソソームを単離することを含み得る。このような方法は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）からエキソソームを単離することを含み得る。エキソソームは、例えば、エキソソームのあらゆる特性に基づいて非関連成分から分離することによって、単離することができる。例えば、エキソソームは、分子量、サイズ、形状、組成、または生物学的活性に基づいて単離することができる。例えば、本明細書の他の箇所の分子量アッセイにおいて記載されているような、適切な分子量カットオフまたはサイズカットオフを有する膜での濾過を用いることができる。エキソソームの１つまたは複数の生物学的活性を、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の分画の間のその活性を追跡するために用いることができる。
【０１０２】
＜免疫調節活性アッセイ＞
エキソソームの免疫調節活性は、ＴＨＰ−１細胞および遺伝子修飾されたＴＨＰ細胞株／ＨＥＫレポーター細胞株を用いて評価することができる。このような細胞株は、以下の実施例において記載されている。
【０１０３】
エキソソームの免疫調節活性は、サイトカイン生産を誘発するエキソソームの能力をアッセイすることによって、未修飾ＴＨＰ−１を用いて評価することができる。これは、以下の実施例２３において詳細に記載されている。あるいは、サイトカイン生産は、実施例において記載されているような代替レポーター細胞株を用いて評価することができる。例えば、実施例１９において記載されているように、ＮＦｋＢプロモーターの転写制御下にある安定的にトランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を有するＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ、またはＭｙＤ８８活性が欠損しているＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤを用いることができる。
【０１０４】
エキソソームの免疫調節活性はまた、コンカナバリンＡで活性化されたリンパ球の増殖を阻害するそれらの能力によってアッセイすることができる。これは、実施例２８において詳細に記載されている。
【０１０５】
エキソソームの免疫調節活性をアッセイする他の方法を用いることができる。これらには、ＣＤ４＋Ｔ細胞をエキソソーム処理した単球、例えばＴＨＰ−１に曝露して、これらがＴｒｅｇｓまたはＴｈ１７の生産を増強させるかどうかを決定することが含まれる。これは、実施例２６において詳細に記載されている。
【０１０６】
＜エキソソーム特性＞
間葉系幹細胞の特性は、間葉系幹細胞によって馴化された培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の特性を含み得る。このような間葉系幹細胞馴化培地を生産する方法は、当技術分野において知られており、例えばＷＯ２００９／１０５０４４の実施例１において記載されている。
【０１０７】
特性は、生物学的活性などの生物学的特性を含み得る。生物学的活性の例には、心保護、酸化ストレスの低減、および梗塞サイズの低減が含まれる。
【０１０８】
＜心保護＞
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、心保護を含む間葉系幹細胞および／または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の特性を有し得る。心保護は、虚血および／または再かん流の間の心臓機能の回復または維持を含み得る。
【０１０９】
＜心保護についてのアッセイ＞
心保護は、例えば、ＷＯ２００９／１０５０４４の実施例５、１０、１４、および２０において記載されている方法のいずれか１つまたは複数を用いてアッセイすることができる。
【０１１０】
酸化ストレス
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、酸化ストレスを低減させる能力（または細胞保護）を含む間葉系幹細胞および／または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の特性を有し得る。
【０１１１】
＜酸化ストレスについてのアッセイ＞
酸化ストレスの低減は、例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）誘発性の細胞死のインビトロアッセイを用いてアッセイすることができる。要約すると、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）介在性の酸化ストレスはヒト白血病性ＣＥＭ細胞において誘発され、細胞の生存能力はトリパンブルー排除によってモニタリングされる。ヒト白血病性ＣＥＭ細胞を、エキソソーム、馴化培地、または間葉系幹細胞（生理食塩水を対照とする）と共にインキュベートし、５０μＭのＨ２Ｏ２で処理して、酸化ストレスを誘発させる。細胞の生存能力を、Ｈ２Ｏ２処理の１２、２４、３６、および４８時間後にトリパンブルー排除を用いて評価する。
【０１１２】
酸化ストレスの低減はさらに、ＤＮＡ酸化のインビボアッセイを用いてアッセイすることができる。インビボでの酸化ストレスはまた、以下のようにアッセイすることができる。ブタをエキソソーム、馴化培地、または間葉系幹細胞で処理する（生理食塩水を対照とする）。ブタ心臓の組織切片を得る。処理されたおよび未処理のブタの組織切片における核酸化ストレスを、酸化ＤＮＡについて８−ＯＨｄＧ免疫染色によって定量する。組織切片を、ＤＮＡ酸化および酸化ストレスの指標である強力な核染色についてアッセイする。
【０１１３】
＜梗塞サイズ＞
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、梗塞サイズを低減させる能力を含む間葉系幹細胞および／または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の特性を有し得る。
【０１１４】
＜梗塞サイズについてのアッセイ＞
梗塞サイズは、例えば、ＷＯ２００９／１０５０４４の実施例６および１３において記載されている方法のいずれか１つまたは複数を用いてアッセイすることができる。
【０１１５】
＜エキソソームサイズ＞
エキソソームは、１００ｋＤａを超える分子量を有し得る。エキソソームは、５００ｋＤａを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、１０００ｋＤａを超える分子量を有し得る。
【０１１６】
分子量は、様々な手段によって決定することができる。原則的に、分子量は、関連する分子量カットオフを有する膜を介するサイズ分画および濾過によって決定することができる。エキソソームサイズは、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの成分タンパク質の追跡分離または生物学的アッセイによって決定することができる。
【０１１７】
＜ＨＰＬＣ動的光散乱によるエキソソームサイズのアッセイ＞
機器の設定は、株式会社島津製作所（京都、日本）のＣｌａｓｓ  ＶＰソフトウェアによって操作される、バイナリポンプ、自動注入器、恒温カラムオーブン、およびＵＶ可視検出器を備えた液体クロマトグラフィー系から構成された。用いたクロマトグラフィーカラムは、東ソー株式会社（東京、日本）のＴＳＫ  ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍ、およびＴＳＫゲルＧ４０００  ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍであった。Ｄａｗｎ  ８（光散乱）、Ｏｐｔｉｌａｂ（屈折率）、およびＱＥＬＳ（動的光散乱）という検出器を、ＵＶ可視検出器の後に順に接続した。最後の３つの検出器は、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）のものであり、ＡＳＴＲＡソフトウェアによって操作した。試料の成分をサイズ排除によって分離し、すなわち、大きめの分子を小さめの分子よりも先に溶出させる。用いた溶離液緩衝液は、ｐＨ７．２の、１５０ｍＭのＮａＣｌを有する２０ｍＭのリン酸緩衝液であった。この緩衝液を０．１μｍの孔サイズを介して濾過し、使用する前に１５分間脱気した。クロマトグラフィー系を、Ｄａｗｎ８におけるシグナルがおよそ０．３の検出器圧力単位で安定化するまで、０．５ｍｌ／分の流速で平衡化した。ＵＶ可視検出器を２２０ｎｍで設定し、カラムを２５℃にオーブン平衡化した。溶出モードはアイソクラチックであり、実行時間は４０分であった。注入した試料の容積は、５０から１００ｍｌの範囲であった。エキソソームピークと全ての他のピークとの領域％を、ＵＶ可視検出器から積分した。流体力学的半径Ｒｈを、ＱＥＬＳ検出器およびＤａｗｎ８検出器によって計算した。ピーク頂点での最高計数率（Ｈｚ）をＲｈとして得た。２２０ｎｍで視覚化された、分離した成分のピークを、さらなる特徴付け研究のための画分として回収した。
【０１１８】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量のアッセイ＞
エキソソームは、１００ｋＤａを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、濾過すると、１００ｋＤａ未満の分子量を有するエキソソームのほとんどのタンパク質が１００ｋＤａの分子量を超える残りの画分に分離されるようなものであり得る。同様に、５００ｋＤａのカットオフを有する膜での濾過を行うと、５００ｋＤａの分子量未満を有するエキソソームのほとんどのタンパク質は、５００ｋＤａの分子量を超える残りの画分に分離され得る。このことは、エキソソームが５００ｋＤａを超える分子量を有し得ることを示す。
【０１１９】
＜生物学的活性による分子量のアッセイ＞
エキソソームは、１０００ｋＤａを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、１０００ｋＤａの分子量カットオフを有する膜での濾過を行うと、関連する生物学的活性が実質的にまたは主に残りの画分に残るようなものであり得る。あるいは、またはそれに加えて、生物学的活性は、濾液画分内に存在しない可能性がある。生物学的活性は、本明細書の他の箇所に記載されるエキソソームの生物学的活性のいずれかを含み得る。
【０１２０】
＜梗塞サイズによる分子量のアッセイ＞
例えば、生物学的活性は、心筋虚血および再かん流傷害のあらゆる適切なモデルにおいてアッセイされるような、梗塞サイズの低減を含み得る。例えば、生物学的活性は、ＷＯ２００９／１０５０４４の実施例において記載されているように、マウスモデルまたはブタモデルにおいてアッセイすることができる。
【０１２１】
要約すると、心筋虚血を、縫合糸結紮による３０分の左冠動脈（ＬＣＡ）閉塞によって誘発し、再かん流を、縫合糸の除去によって開始させる。マウスを、再かん流の５分前に、エキソソーム（未分画ＭＳＣ−ＣＭなど）、濾液（＜１００または１０００ｋＤの画分など）、残り部分（＞１０００ｋＤの残り部分など）を含有する液体、または生理食塩水で、尾静脈を介して静脈内で処理した。２４時間後、心臓を切除した。切除の前に、ＬＣＡを再連結し、大動脈を介してエバンスブルーをかん流させることによって、虚血領域（ＡＡＲ）を決定する。
【０１２２】
ＡＡＲは、染料によって染色されていない領域と規定され、左心室壁領域に対するパーセンテージとして表される。梗塞サイズは、エバンスブルーおよびＴＴＣを用いて２４時間後に評価する。相対的な梗塞サイズが、生理食塩水と比較して、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）および残りの（＞１０００ｋＤなど）画分で処理した動物において有意に低減している場合、このことは、エキソソームが膜の関連するカットオフよりも高い分子量（例えば、１０００ｋＤａ超）を有することを示す。
【０１２３】
＜エキソソームの分子量＞
エキソソームは、２ｎｍを超えるサイズを有し得る。エキソソームは、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、または５０ｎｍを超えるサイズを有し得る。エキソソームは、１００ｎｍを超えるサイズ、例えば１５０ｎｍを超えるサイズを有し得る。エキソソームは、ほぼ２００ｎｍ以上のサイズを有し得る。
【０１２４】
１つまたは複数のエキソソームは、様々なサイズ、例えば２ｎｍから２０ｎｍ、２ｎｍから５０ｎｍ、２ｎｍから１００ｎｍ、２ｎｍから１５０ｎｍ、または２ｎｍから２００ｎｍの間のサイズを有し得る。１つまたは複数のエキソソームは、２０ｎｍから５０ｎｍ、２０ｎｍから１００ｎｍ、２０ｎｍから１５０ｎｍ、または２０ｎｍから２００ｎｍの間のサイズを有し得る。１つまたは複数のエキソソームは、５０ｎｍから１００ｎｍ、５０ｎｍから１５０ｎｍ、または５０ｎｍから２００ｎｍの間のサイズを有し得る。１つまたは複数のエキソソームは、１００ｎｍから１５０ｎｍまたは１００ｎｍから２００ｎｍの間のサイズを有し得る。１つまたは複数のエキソソームは、１５０ｎｍから２００ｎｍの間のサイズを有し得る。
【０１２５】
サイズは、様々な手段によって決定することができる。原則的に、サイズは、関連するサイズカットオフを有する膜を介するサイズ分画および濾過によって決定することができる。エキソソームサイズは、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの成分タンパク質の追跡分離または生物学的アッセイによって決定することができる。
【０１２６】
サイズはまた、ＷＯ２００９／１０５０４４の実施例２１において記載されているように、電子顕微鏡法によって決定することができる。
【０１２７】
＜組成＞
エキソソームは、間葉系幹細胞によって分泌される１つまたは複数のタンパク質を含み得る。エキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）内に存在する１つまたは複数のタンパク質を含み得る。
【０１２８】
例えば、エキソソームは、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、または７０％以上のこれらのタンパク質を含み得る。エキソソームは、ほぼ約７５％のこれらのタンパク質を含み得る。タンパク質は、遺伝子リストのタンパク質または遺伝子産物のリストを参照することによって規定され得る。
【０１２９】
エキソソーム内に含まれ得るタンパク質および遺伝子産物は、例えばＷＯ２００９／１０５０４４において記載されている。
【０１３０】
＜エキソソーム＞
再かん流傷害に対する心保護を付与するエキソソームなどの、分泌物中の活性成分は、当技術分野において知られている手段、および例えばＷＯ２００９／１０５０４４において記載されている手段によって単離することができる。活性成分は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）によって分泌されるエキソソームを含み得る。
【０１３１】
エキソソームは、後期エンドサイトーシス区画（多小胞体）内に形成される小さな膜小胞であり、これは、１９８３年に網状赤血球によって分泌されることが最初に記載され、その後、様々な造血細胞、造血由来または非造血由来の腫瘍、および上皮細胞を含む、多くの細胞型によって分泌されることが明らかになった。これらは、同様にエキソソームと呼ばれる、さらに最近記載された「リボヌクレアーゼ複合体」とは異なる実体である。
【０１３２】
エキソソームは、形態学的パラメータおよび生化学的パラメータによって規定することができる。したがって、本明細書において記載されるエキソソームは、これらの形態学的パラメータまたは生化学的パラメータの１つまたは複数を含み得る。
【０１３３】
エキソソームは、４０〜１００ｎｍの直径を有する脂質二重層によって限定された「ソーサー様」小胞または平坦な球体として従来規定されており、エンドソーム膜の内側への出芽によって形成される。全ての脂質小胞のように、そしてアポトーシス細胞によって放出されるタンパク質凝集物またはヌクレオソーム断片とは異なり、エキソソームは、約１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有し、ショ糖勾配で浮遊する。エキソソームは、コレステロールおよびスフィンゴミエリン、ならびにＧＭ１、ＧＭ３、フロチリン、およびｓｒｃタンパク質キナーゼＬｙｎなどの脂質ラフトマーカーに富んでおり、このことは、それらの膜が脂質ラフトに富んでいることを示唆している。
【０１３４】
異なる細胞型に由来する、種が異なるエキソソームの分子組成が調べられている。通常、エキソソームは、細胞型特異的な全てのエキソソームおよびタンパク質に共通であると考えられている遍在的タンパク質を含有する。また、同一の細胞型に由来するが種が異なるエキソソームにおけるタンパク質は、高度に保存されている。遍在的なエキソソーム関連タンパク質には、細胞骨格において見られる細胞質タンパク質、例えばチューブリン、アクチン、およびアクチン結合タンパク質、細胞内の膜融合体および膜輸送、例えばアネキシンおよびｒａｂタンパク質、シグナル伝達タンパク質、例えばタンパク質キナーゼ、１４−３−３、およびヘテロ三量体Ｇタンパク質、代謝酵素、例えばペルオキシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、脂質キナーゼ、およびエノラーゼ−１、ならびにテトラスパニンファミリー、例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ８２が含まれる。テトラスパニンはエキソソームにおいて非常に富んでおり、大きな分子複合体および膜サブドメインの組織化に関与することが知られている。
【０１３５】
エキソソームにおける細胞型特異的なタンパク質の例は、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞からのエキソソームにおけるＭＨＣクラスＩＩ分子、樹状細胞由来エキソソームにおけるＣＤ８６、Ｔ細胞由来エキソソーム上のＴ細胞受容体などである。特に、エキソソームは、核、ミトコンドリア、小胞体、またはゴルジ体由来のタンパク質を含有しない。また、非常に富んだ原形質膜タンパク質はエキソソーム内には存在せず、このことは、これらが単純に原形質膜の断片であるわけではないことを示唆している。報告されている遍在的なエキソソーム関連タンパク質の多くはまた、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ分泌物のプロテオミクスプロファイルにおいて存在する。
【０１３６】
エキソソームはまた、別の細胞に送達され得、この新たな位置で機能的であり得る、ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含有することが知られている。エキソソームの生理学的機能は、依然としてあまり規定されていない。これは、古いタンパク質を完全に無くすこと、タンパク質を再利用すること、プリオンおよびウイルスなどの感染性粒子の伝達を仲介すること、補体耐性を誘発すること、免疫細胞の細胞伝達を促進すること、ならびに細胞シグナル伝達を行うことを促進すると考えられている。エキソソームは、がん治療のための免疫療法において用いられている。
【０１３７】
＜間葉系幹細胞からの治療用エキソソームの使用＞
治療用エキソソームを含むエキソソームは、上記および下記のように、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの代替物として用いることができる。
【０１３８】
具体的には、治療用エキソソームは、ＭＳＣもしくはＭＳＣ−ＣＭを現在使用しているかまたは将来使用することができる治療目的のいずれかに用いることができる。
【０１３９】
本明細書において記載される方法および組成が間葉系幹細胞からの治療用エキソソームの生産を可能にすることが明白となろう。したがって、間葉系幹細胞のあらゆる使用は、間葉系幹細胞からの治療用エキソソームに等しく付随する。
【０１４０】
本明細書において記載される方法および組成によって生産される間葉系幹細胞および分化細胞は、疾患の治療に用いることができるか、または疾患の治療のための医薬組成物の調製に用いることができる。このような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病など、およびがんを含む、再生治療によって治療可能な疾患を含み得る。したがって、ＭＳＣからの治療用エキソソームは、このような疾患を治療するために用いることができる。
【０１４１】
本明細書において記載される方法および組成に従って作製されるもののような、間葉系幹細胞からの治療用エキソソームは、様々な商業的に重要な調査、診断、および治療の目的で用いることができる。
【０１４２】
間葉系幹細胞からの治療用エキソソームは、特に、疾患の治療のための医薬組成物の調製に用いることができる。このような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病など、およびがんを含む、再生治療によって治療可能な疾患を含み得る。
【０１４３】
本明細書において記載される方法および組成によって作製される間葉系幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に類似または同一の特性を有する。したがって、間葉系幹細胞およびこれらから作製されたあらゆる分化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームは、ＢＭ−ＭＳＣが使用されることが知られている適用、またはＢＭ−ＭＳＣを用いることが可能な適用のいずれかにおいて用いることができる。
【０１４４】
＜間葉系幹細胞からのエキソソームによって治療可能な疾患＞
ＭＳＣのプロテオームの分析は、発現するタンパク質が、代謝、防御応答、ならびに血管化、造血、および骨格の発生を含む組織の分化という３つの生物学的プロセスに関与することを示す。したがって、本明細書において記載されるＭＳＣからの治療用エキソソームは、その機能がこれらの生物学的プロセスのいずれか１つもしくは複数における役割を有し得る疾患、またはその修復もしくは治療にこれらの生物学的プロセスのいずれか１つもしくは複数が関与する疾患を治療するために用いることができる。同様に、単独で、または組み合わせて、好ましくは本明細書において記載される治療用エキソソームの形態により、ＭＳＣによって発現されるタンパク質は、このような疾患を例えば治療または予防する目的で、ＭＳＣもしくはＭＳＣによって馴化された培地の活性を補うために、またはＭＳＣもしくはＭＳＣによって馴化された培地に代わって、用いることができる。
【０１４５】
ＭＳＣによって発現される２０１の遺伝子産物は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路、およびｍＴＯＲシグナル伝達経路などの、心血管生物学、骨の発生、および造血における重要なシグナル伝達経路を活性化することが示されている。したがって、ＭＳＣなどからの治療用エキソソームは、これらのシグナル伝達経路のいずれかが関与している疾患、またはその原因論がこれらのシグナル伝達経路のいずれか１つもしくは複数における１つもしくは複数の不具合を伴う疾患を予防または治療するために用いることができる。
【０１４６】
したがって、このような治療用エキソソームは、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、および変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびがんを治療するために用いることができる。
【０１４７】
このような治療用エキソソームはまた、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性的肉芽腫性疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失を含む慢性的な組織リモデリングをもたらす炎症および免疫異常調節を誘発する初期の傷害を特徴とする病的状態、腎臓虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎、または整形外科的疾患を治療するために用いることができる。
【０１４８】
治療用エキソソームは、個体における創傷治癒、瘢痕の低減、骨形成、骨移植、または骨髄移植を促進するために用いることができる。
【０１４９】
文脈から別段のことが示されない限り、用語「馴化培地」は、ＭＳＣに曝露された細胞培養培地だけではなく、馴化培地内に存在する１つまたは複数の、好ましくはほぼ全てのポリペプチドを含むこのような組成物も含むものであると解釈されるべきである。
【０１５０】
治療用エキソソームはまた、ＭＳＣによって分泌または発現されるタンパク質のいずれかのための由来源として用いることができる。本発明者らは、したがって、治療用エキソソームに含まれるポリペプチドを生産する方法を提供し、本方法は、記載されたように治療用エキソソームを得ること、および治療用エキソソームからポリペプチドを単離することを含む。
【０１５１】
＜治療用エキソソームの送達＞
本明細書において記載される治療用エキソソームは、あらゆる適切な手段によってヒトまたは動物の体に送達することができる。
【０１５２】
本発明者らは、したがって、本明細書において記載されている治療用エキソソームを標的である細胞、組織、器官、動物の体、またはヒトの体に送達するための送達系、および治療用エキソソームを標的に送達するために送達系を使用するための方法を記載する。
【０１５３】
送達系は、治療用エキソソームの由来源、例えば治療用エキソソームを含有する容器を含み得る。送達系は、治療用エキソソームを標的に分配するためのディスペンサーを含み得る。
【０１５４】
したがって、本発明者らは、本明細書において記載されている治療用エキソソームの由来源と、治療用エキソソームを標的に送達するために機能可能なディスペンサーとを含む、治療用エキソソームを送達するための送達系を提供する。
【０１５５】
本発明者らはさらに、治療用エキソソームを標的に送達する方法におけるこのような送達系の使用を提供する。
【０１５６】
流体を体内に送達するための送達系は、当技術分野において知られており、米国特許第６，１３９，５２４号において記載されているもののような、注射、外科的点滴、カテーテル（かん流カテーテルを含む）、例えば、米国特許７，１２２，０１９号において記載されているもののような薬剤送達カテーテルを含む。
【０１５７】
鼻腔内送達を含む、肺または鼻の管への送達は、例えば、当技術分野において知られている（例えば、米国意匠第Ｄ５４４，９５７号において示されている）経鼻スプレー、噴出器、吸入器などを用いて行うことができる。
【０１５８】
腎臓への送達は、米国特許第７，２４１，２７３号において記載されているもののような、大動脈内腎臓送達カテーテルを用いて行うことができる。
【０１５９】
当然のことながら、特定の送達が、最適な治療を行うために、所要の量の治療用エキソソームを適切な間隔で送達するために、設定可能でなければならない。
【０１６０】
治療用エキソソームは、例えば、アテローム性動脈硬化症を治療または予防するために用いることができる。ここで、治療用エキソソームのかん流を、アテローム動脈硬化性プラークを安定化させるためまたはプラークにおける炎症を低減させるために静脈内で行うことができる。治療用エキソソームは、静脈内かん流による敗血性ショックを治療または予防するために用いることができる。
【０１６１】
治療用エキソソームは、心不全を治療または予防するために用いることができる。これは、リモデリングを遅らせるためまたは心不全を遅らせるための治療用エキソソームの長期的な冠動脈内または心筋内のかん流によって達成することができる。治療用エキソソームは、鼻腔内送達による肺の炎症を治療または予防するために用いることができる。
【０１６２】
治療用エキソソームは、皮膚の症状、例えば乾癬を治療または予防するために用いることができる。治療用エキソソームの長期間の送達を、症状がなくなるまで、経皮マイクロインジェクション針を用いて行うことができる。
【０１６３】
当然のことながら、送達方法は、治療用エキソソームが送達される特定の器官に応じ、当業者であれば、どの手段を採用するかをそれに応じて決定することができる。
【０１６４】
例えば、心臓の炎症の治療では、治療用エキソソームは、例えば、胸壁を介する直接的な冠動脈内注射によって、または、心筋などの組織への直接的な注射のための、もしくは体腔内に挿入されたステントもしくはカテーテルから阻害剤を注入するための、蛍光透視による誘導下での標準的な経皮的カテーテルに基づく方法を用いて、心臓組織（すなわち、心筋、心膜、または心内膜）に送達することができる。
【０１６５】
あらゆる様々な冠動脈カテーテルまたはかん流カテーテルを、化合物を投与するために用いることができる。あるいは、治療用エキソソームは、冠状血管内に置かれるステント上に被覆または含浸させることができる。
【０１６６】
＜組織の再生＞
本明細書において記載される方法および組成に従って作製された間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームはまた、それを必要とするヒト患者における組織の再構成または再生に用いることができる。細胞は、その細胞を意図した組織部位に移植すること、および機能が欠損している領域を再構成または再生することを可能にする様式で投与される。
【０１６７】
例えば、本明細書において記載される方法および組成は、幹細胞の分化を調節するために用いることができる。間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームは、皮膚移植片の成長などのための組織の操作に用いることができる。幹細胞の分化の調節は、人工の器官もしくは組織のバイオエンジニアリングに、またはステントなどの人工装具に用いることができる。
【０１６８】
＜がん＞
本明細書において記載される方法および組成によって作製される間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームは、癌の治療に用いることができる。
【０１６９】
用語「がん」および「がん性」は、調節されていない細胞の成長を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を言うか、それを説明するものである。がんの例には、限定はしないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれる。
【０１７０】
このようながんのさらに特定の例には、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん、膵臓がん、グリア細胞腫、例えば膠芽腫および神経線維腫症、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓がん、腎臓部のがん、前立腺がん、外陰部のがん、甲状腺がん、肝臓癌腫、ならびに様々なタイプの頭頚部がんが含まれる。さらなる例は、結腸がん、乳がん、肺がん、および前立腺がんを含む充実性腫瘍がん、白血病およびリンパ腫を含む造血器悪性腫瘍、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚がん、ならびに家族性腺腫性ポリポージスである。さらなる例には、脳新生物、結腸直腸新生物、乳房新生物、子宮頚部新生物、眼の新生物、肝臓新生物、肺新生物、膵臓新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚新生物、精巣新生物、新生物、骨新生物、栄養膜新生、卵管新生物、直腸新生物、結腸新生物、腎臓新生物、胃新生物、および副甲状腺新生物が含まれる。乳がん、前立腺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣がん、子宮頸がん、および胆道癌腫もまた含まれる。
【０１７１】
本明細書において記載される方法および組成に従って作製される間葉系幹細胞および分化細胞はまた、エンドスタチンおよびアンジオスタチンなどの抗癌物質、または細胞傷害物質、または化学療法物質と組み合わせて用いることができる。例えば、薬剤、例えばアドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチナム、エトポシド、タキソール、タキソテール、およびアルカロイド、例えばビンクリスチン、ならびに代謝拮抗物質、例えばメトトレキサート。本明細書において用いられる用語「細胞傷害物質」は、細胞の機能を阻害もしくは予防する、および／または細胞の破壊を生じさせる物質を言う。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法物質、および毒素、例えば細菌、真菌、植物、または動物に由来する酵素的に活性な毒素、またはその断片を含むことが意図される。
【０１７２】
また、この用語には、ＷＯ９４／２２８６７において開示されている二環式アンサマイシンなどのがん遺伝子産物／チロシンキナーゼ阻害剤、ＥＰ６００８３２において開示されている１，２−ビス（アリールアミノ）安息香酸誘導体、ＥＰ６００８３１において開示されている６，７−ジアミノ−フタラジン−１−オン誘導体、ＥＰ５１６５９８において開示されている４，５−ビス（アリールアミノ）−フタルイミド誘導体、またはＳＨ２含有基質タンパク質へのチロシンキナーゼの結合を阻害するペプチド（例えば、ＷＯ９４／０７９１３を参照されたい）が含まれる。「化学療法物質」は、がんの治療において有用な化学的化合物である。化学療法物質の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照されたい）、メルファラン、および他の関連するナイトロジェンマスタード、ならびに内分泌療法（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗薬剤、プロゲスチン、抗プロゲスチンなど）が含まれる。
【０１７３】
＜間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の獲得＞
本明細書において記載される、治療用エキソソームを含むエキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から単離または生産することができる。馴化培地およびエキソソームの生産における使用に適したＭＳＣは、当技術分野において知られているあらゆる方法によって作製することができる。
【０１７４】
特に、ＭＳＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーまたはその子孫を、ＦＧＦ２を含む無血清培地内で共培養物の不存在下で分散させることによって得られた細胞を増殖させることによって作製することができる。これは、以下の節において詳細に記載される。
【０１７５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ様細胞をｈＥＳＣから得る先行技術の方法は、分化中のｈＥＳＣへのヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子のトランスフェクション（Ｘｕら、２００４）、またはマウスＯＰ９細胞株との共培養（Ｂａｒｂｅｒｉら、２００５）を伴う。これらの誘導プロトコルにおける外因性遺伝物質およびマウス細胞の使用は、腫瘍形成性または人獣共通感染性物質感染の受け入れ難いリスクを生じさせる。
【０１７６】
エキソソームは、したがって、分化中のｈＥＳＣから類似のまたは同一の（例えば均質な）ＭＳＣ集団を単離するための臨床的に関連するおよび再現可能なプロトコルの使用によって誘導されるＭＳＣから作製することができる。通常、この方法は、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーを細胞内に分散させることを含む。細胞を次いで、平板培養し、増殖させる。細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得るために、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含む無血清培地内で共培養物の不存在下で増殖させる。
【０１７７】
したがって、プロトコルは、血清、マウス細胞の使用、または遺伝子操作を必要とせず、操作および時間をあまり必要とせず、したがって非常に拡張可能である。このプロトコルは、２つの異なるｈＥＳＣ系であるＨｕＥＳ９およびＨ−１、ならびにまた第３の系であるＨｅｓ−３からのＭＳＣの単離に用いることができる。本明細書において記載される方法および組成によって得られるヒトＥＳ細胞由来のＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）は、骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）に著しく類似している。
【０１７８】
胚性幹細胞培養物は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培養物を含み得る。
【０１７９】
１つの実施形態において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法は、ＦＧＦ２および場合によってＰＤＧＦ  ＡＢを補った培地においてフィーダーサポートを伴わずにｈＥＳＣをトリプシン処理し、増殖させ、その後ＣＤ１０５＋ＣＤ２４−細胞を選別することを含む。
【０１８０】
本方法は、ＦＧＦ２を補った培地におけるフィーダー無しの増殖の１週間後に、トリプシン処理したｈＥＳＣからＣＤ１０５＋ＣＤ２４−細胞を選別することを含み得、場合によって、少なくともいくつかの、例えばほぼ全てのまたは全ての細胞が互いに類似しているかまたは同一（例えば均質）であるｈＥＳＣ−ＭＳＣ細胞培養物を生成するために、ＰＤＧＦ  ＡＢが生成される。
【０１８１】
この方法によって生産されるＭＳＣは、エキソソームがそれから単離され得る間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を生産するために用いることができる。
【０１８２】
＜胚性幹細胞コロニーの分離＞
間葉系幹細胞を生産する１つの方法は、胚性幹細胞コロニーを細胞に分散または分離させることを含み得る。
【０１８３】
胚性幹細胞コロニーは、ｈｕＥＳ９コロニー（Ｃｏｗａｎ  ＣＡ、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ、ＭｃＭａｈｏｎ  Ｊ、Ａｔｉｅｎｚａ  Ｊ、Ｗｉｔｍｙｅｒ  Ｊら、（２００４）Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：１３５３〜１３５６）またはＨ１  ＥＳＣコロニー（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ、Ｓｈａｐｉｒｏ  ＳＳ、Ｗａｋｎｉｔｚ  ＭＡ、Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ  ＪＪら、（１９９８）Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５〜１１４７．）を含み得る。
【０１８４】
コロニー内の細胞は、かなり、すなわち少なくとも塊に、分離または分散させることができる。コロニーは、コロニー内の全ての細胞が単独になる程度、すなわちコロニーが完全に分離する程度まで、分離または分散させることができる。
【０１８５】
分離は、分散剤を用いて行うことができる。
【０１８６】
分散剤は、コロニー内の少なくともいくつかの胚性幹細胞を互いに離し得るあらゆるものであり得る。分散剤は、コロニー内の細胞間の接着、または細胞と基質との間の接着、またはその両方を妨害する試薬を含み得る。分散剤は、プロテアーゼを含み得る。
【０１８７】
分散剤は、トリプシンを含み得る。トリプシンでの処理は、例えば、３７℃で３分間ほど続けることができる。細胞は次いで、中和、遠心分離、および培地内に再懸濁し、その後、取り出して平板培養することができる。
【０１８８】
本方法は、ヒト胚性幹細胞のコンフルエントなプレートをトリプシンで分散させ、細胞を取り出して平板培養することを含み得る。
【０１８９】
分離は、以下の一連のステップの少なくともいくつかを含み得る。吸引、すすぎ、トリプシン処理、インキュベーション、取り外し、失活、再播種、およびアリコート化。以下のプロトコルは、Ｈｅｄｒｉｃｋ  Ｌａｂ、ＵＣ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｄｒｉｃｋｌａｂ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ＣＯＳＣｅｌｌ．ｈｔｍｌ）からの出典である。
【０１９０】
吸引ステップにおいて、培地は、フラスコなどの容器から吸引されるかまたは全体的に取り出される。すすぎステップにおいて、細胞は、ある容積、例えば５〜１０ｍｌの、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まなくてもよい緩衝培地ですすがれる。例えば、細胞は、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳですすぐことができる。トリプシン処理ステップにおいて、緩衝液内のある量の分散剤が容器に添加され、容器は回転させられて、表面がだんだんと分散剤溶液で被覆される。例えば、ハンクスＢＳＳ内のトリプシン１ｍｌをフラスコに添加することができる。
【０１９１】
インキュベーションステップにおいて、細胞は、一定温度である程度の時間放置される。例えば、細胞は、３７℃で数分間（例えば２から５分間）放置することができる。取り外しステップにおいて、細胞は、機械的作用によって、例えば解体することによって、または容器の側面を手で叩くことによって、取り外すことができる。細胞はシート内に落下し、表面を滑り落ちる。
【０１９２】
失活ステップにおいて、ある容積の培地がフラスコに添加される。培地は、分散剤の作用を停止させるための中和物質を含み得る。例えば、分散剤がトリプシンなどのプロテアーゼである場合、培地は、プロテアーゼの活性を停止させる血清タンパク質などのタンパク質を含有し得る。特定の実施例において、３ｍｌの血清を含有する細胞培養培地をフラスコに添加して、全部で４ｍｌとする。細胞をピペッティングして、細胞を取り外すかまたは分散させることができる。
【０１９３】
再播種ステップにおいて、細胞は、新たな培養容器内に再播種され、新鮮な培地が添加される。多くの再播種は、異なるスプリット比で行うことができる。例えば、細胞は、１／１５希釈および１／５希釈で再播種することができる。特定の実施例において、細胞は、１滴の細胞を２５ｃｍ２のフラスコに添加し、３滴を、培養物を再播種するための別のフラスコに添加することによって、再播種することができ、７〜８ｍｌの培地を次に各フラスコに添加して、例えば７５ｃｍ２のフラスコから１／１５希釈および１／５希釈を得る。アリコート化ステップにおいて、細胞は、新たな皿にアリコート化することができるか、または、どのようなスプリット比が望ましくても、培地が添加される。
【０１９４】
具体的な実施形態において、本方法は、以下のステップを含む：ヒトＥＳ細胞を非接着様式で懸濁させてまず成長させて、胚様体（ＥＢ）を形成させる。５〜１０日齢のＥＢを次にトリプシン処理し、その後、ゼラチンで被覆した組織培養プレート上で接着細胞として平板培養する。
【０１９５】
＜細胞培養物としての維持＞
分離した細胞は、平板培養し、細胞培養物として維持することができる。
【０１９６】
細胞は、ゼラチン化されたプレートなどの培養容器または基質上に平板培養することができる。重要なことに、細胞は、共培養物の存在を伴わずに、例えばフィーダー細胞の不存在下で、成長および増殖させる。
【０１９７】
細胞培養物内の細胞は、例えば５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）および場合によって血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ  ＡＢ）などの１つまたは複数の増殖因子を補った無血清培地内で成長させることができる。細胞培養物内の細胞は、トリプシン、洗浄、再平板培養での処理によって、コンフルエントである場合には１：４でスプリットまたは二次培養することができる。
【０１９８】
＜共培養物の不存在＞
細胞は、共培養物の不存在下で培養することができる。用語「共培養物」は、共に成長させられる２つ以上の異なる種類の細胞の混合物、例えば間質性フィーダー細胞を言う。
【０１９９】
したがって、典型的なＥＳ細胞培養物において、培養皿の内部表面は通常、分裂しないように処理されているマウス胚皮膚細胞のフィーダー層で被覆されている。フィーダー層によって、ＥＳ細胞の付着および成長を可能にするための接着表面が提供される。さらに、フィーダー細胞は、ＥＳ細胞の成長に必要な栄養を培養培地内に放出する。本明細書において記載される方法および組成において、ＥＳ細胞およびＭＳＣ細胞は、このような共培養の不存在下で培養することができる。
【０２００】
細胞は、単層として、またはフィーダー細胞の不存在下で培養することができる。胚性幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を確立させるために、フィーダー細胞の不存在下で培養することができる。
【０２０１】
解離または分離した胚性幹細胞は、培養基質上に直接的に平板培養することができる。培養基質は、ペトリ皿などの組織培養容器を含み得る。容器は前処理することができる。細胞は、ゼラチン化された組織培養プレート上に平板培養することができるか、またはゼラチン化された組織培養プレート上で成長させることができる。
【０２０２】
皿のゼラチン被覆についての例示的なプロトコルを以下に示す。蒸留水中の０．１％ゼラチン溶液を作製し、オートクレーブにかける。これは室温で保存することができる。組織培養皿の底をゼラチン溶液で被覆し、５〜１５分間インキュベートする。ゼラチンを除去すると、プレートが使えるようになる。培地は、低張の溶解を避けるために、細胞を添加する前に添加すべきである。
【０２０３】
＜無血清培地＞
解離または分離した胚性幹細胞は、無血清培地を含み得る培地内で培養することができる。
【０２０４】
用語「無血清培地」は、血清タンパク質、例えばウシ胎児血清を含まない細胞培養培地を含み得る。無血清培地は、当技術分野において知られており、例えば米国特許第５，６３１，１５９号および米国特許第５，６６１，０３４号において記載されている。無血清培地は、例えばＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。
【０２０５】
無血清培地は、タンパク質、加水分解物、および組成が未知の成分を欠いている可能性があるという点で、無タンパク質であり得る。無血清培地は、全ての成分の化学構造が分かっている化学的規定培地を含み得る。化学的規定無血清培地は、再現可能性の向上およびさらに一貫性のある性能を可能にする可変性を排除し、偶発的な作用物質による汚染物質の可能性を減少させる、完全に規定された系を提供するため、有利である。
【０２０６】
無血清培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を含み得る。
【０２０７】
無血清培地には、例えば５％、１０％、１５％などの濃度で、血清置換培地などの１つまたは複数の成分を補うことができる。無血清培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の１０％血清置換培地を含み得るか、補うことができる。
【０２０８】
＜増殖因子＞
解離または分離した胚性幹細胞を培養する無血清培地は、１つまたは複数の増殖因子を含み得る。ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＦＧＦ、ＮＧＦ、エリスロポエチン、ＴＧＦ−ｂ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩを含む多くの増殖因子が、当技術分野において知られている。
【０２０９】
増殖因子は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含み得る。培地はまた、血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ  ＡＢ）などの他の増殖因子を含有し得る。これらの増殖因子の両方は、当技術分野において知られている。本方法は、ＦＧＦ２およびＰＤＧＦ  ＡＢの両方を含む培地において細胞を培養することを含み得る。
【０２１０】
あるいは、またはそれに加えて、培地は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含み得るかまたはさらに含み得る。ＥＧＦの使用によって、ＭＳＣの成長が増強し得る。ＥＧＦは、あらゆる適切な濃度、例えば５〜１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで用いることができる。ＥＧＦは、ＰＤＧＦの代わりに用いることができる。ＥＧＦは、当技術分野において周知のタンパク質であり、記号ＥＧＦ、Ａｌｔ．記号ＵＲＧ、Ｅｎｔｒｅｚ  １９５０、ＨＵＧＯ  ３２２９、ＯＭＩＭ  １３１５３０、参照配列ＮＭ＿００１９６３、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１１３３と呼ばれる。
【０２１１】
したがって、本発明者らは、（ｉ）ＦＧＦ２、（ｉｉ）ＦＧＦ２およびＰＤＧＦ、ならびに（ｉｉｉ）ＦＧＦ２およびＥＧＦ、ならびに他の組み合わせを含む培地の使用を開示する。
【０２１２】
ＦＧＦ２は、多くの組織および細胞型において低レベルで発現し、脳および下垂体で高濃度に達する、広範なマイトジェン性の、血管形成性の、および神経栄養性の因子である。ＦＧＦ２は、四肢の発生、血管新生、創傷治癒、および腫瘍成長を含む多数の生理学的および病理学的なプロセスに関与している。ＦＧＦ２は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から商業的に入手することができる。
【０２１３】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、線維芽細胞、平滑筋、および結合組織を含む広範な細胞型にとっての強力なマイトジェンである。Ａ鎖およびＢ鎖と呼ばれる２つの鎖の二量体からなるＰＤＧＦは、ＡＡもしくはＢＢホモ二量体として、またはＡＢヘテロ二量体として存在し得る。ヒトＰＤＧＦ−ＡＢは、１３．３ｋＤａのＡ鎖および１２．２のＢ鎖から構成される２５．５ｋＤａのホモ二量体タンパク質である。ＰＤＧＦ  ＡＢは、例えばＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）から商業的に入手することができる。
【０２１４】
ＦＧＦ２および場合によってＰＤＧＦ−ＡＢなどの（１つまたは複数の）増殖因子は、約１００ｐｇ／ｍｌの濃度、例えば約５００ｐｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌ、例えば約３ｎｇ／ｍｌ、例えば約４ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌで培地内に存在し得る。いくつかの実施形態において、培地は、約５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。培地はまた、約５ｎｇ／ｍｌなどのＰＤＧＦ  ＡＢを含有し得る。
【０２１５】
＜スプリット細胞＞
培養物内の細胞は通常、接触阻止によって細胞の分裂および成長が停止するコンフルエンスとなるまで、成長し続ける。このような細胞は次に、基質またはフラスコから解離させ、組織培養培地への希釈および再平板培養によって「スプリット」、二次培養、または継代することができる。
【０２１６】
本明細書において記載される方法および組成は、したがって、継代、または培養の間のスプリットを含み得る。細胞培養物内の細胞は、１：２以上、例えば１：３、例えば１：４、１：５、またはそれ以上の比でスプリットすることができる。用語「継代」は、細胞株のコンフルエントな培養物のアリコートを得ること、新鮮な培地に接種すること、および細胞株をコンフルエンスまたは飽和が得られるまで培養することから構成されるプロセスを指す。
【０２１７】
＜選択、スクリーニング、または選別ステップ＞
本方法はさらに、間葉系幹細胞をさらに単離または選択するための選択または選別ステップを含み得る。
【０２１８】
選択または選別ステップは、１つまたは複数の表面抗原マーカーを用いて細胞培養物から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を選択することを含み得る。選択または選別ステップの使用はさらに、ＭＳＣについての選別特異性および選択特異性のストリンジェンシーをさらに増強させ、さらに、胚性幹細胞からの考えられる汚染物質、例えば出発材料からのｈＥＳＣおよび他のｈＥＳＣ誘導体を低減させる能力を有する。このことは次に、奇形腫形成のリスクをさらに低減させ、本発明者らが記載するプロトコルの臨床的妥当性をさらに増大させる。
【０２１９】
抗原の発現に基づく選択または選別のために多くの方法が知られており、これらのいずれも、本明細書において記載される選択または選別ステップにおいて用いることができる。選択または選別は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて行うことができる。したがって、当技術分野において知られているように、ＦＡＣＳは、細胞を、細胞によって発現された抗原に結合しそれを標識する標識抗体などのレポーターに曝露させることを伴う。抗体を生産し、それを標識してレポーターを形成する方法は、当技術分野において知られており、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅにおいて記載されている。細胞を次いで、標識に基づいて細胞を互いに選別するＦＡＣＳ機器の中に通す。あるいは、またはそれに加えて、細胞を選別するために磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いることができる。
【０２２０】
本発明者らは、多くの候補表面抗原、例えばＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ４（ＣＤ４９ｄ）、ＰＤＧＦＲＡが、ＭＳＣに関連することが知られているが、ＭＳＣ関連表面抗原のいくつか、例えばＣＤ２９およびＣＤ４９はまた、ｈＥＳＣなどのＥＳ細胞においても高度に発現されること、ならびにそれらの発現がＦＡＣＳ分析によって検証されることに気付いた。表面抗原とＭＳＣとの関連は、抗原をｈＥＳＣなどのＥＳ細胞からＭＳＣを単離するための選択マーカーとみなすためには十分ではない可能性がある。したがって、選択または選別ステップは、ＭＳＣとＥＳ細胞との間で差次的に発現している抗原を採用し得る。
【０２２１】
本発明者らの方法の選択または選別ステップは、抗原の発現に基づいて間葉系幹細胞について正の選択をすることができる。このような抗原は、例えば、ｈＥＳＣおよびｈＥＳＣＭＳＣの遺伝子発現プロファイルを比較することによって同定することができる。特定の実施形態において、選択または選別は、以下の表Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂに示される抗原のいずれかを具体的に用い得る。
【０２２２】
本発明者らの方法の選択または選別ステップは、ＭＳＣ上で発現するがｈＥＳＣなどのＥＳ細胞上では発現しないと同定される抗原の発現に基づいて、間葉系幹細胞について正の選択をすることができる。
【０２２３】
ＣＤ７３はＭＳＣ上で高度に発現されるが、ｈＥＳＣ上では高度に発現されない。ＣＤ７３およびＣＤ１０５の両方は、ＭＳＣにおける高度に発現する表面抗原であり、ｈＥＳＣと比較してｈＥＳＣ−ＭＳＣにおいて最も高度に発現する２０の表面抗原に含まれ、ＣＤ７３またはＣＤ１０５（または両方）を推定ＭＳＣについての選択マーカーとして用いることは、分化中のｈＥＳＣによって生成した推定ＭＳＣについての選別において等しく効果的である。
【０２２４】
あるいは、またはそれに加えて、選択または選別ステップは、ｈＥＳＣなどの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）上で表面抗原として高度に発現するが例えばｈＥＳＣ−ＭＳＣなどの間葉系幹細胞では高度に発現しない表面抗原に基づいて、抗原に対して負の選択をし得る。選択または選別は、既知のまたは以前に同定されたｈＥＳＣ特異的な表面抗原、例えばＭＩＢＰ、ＩＴＧＢ１ＢＰ３およびＰＯＤＸＬ、ならびにＣＤ２４に基づき得る。
【０２２５】
ＦＡＣＳ分析によって、ＣＤ２４がｈＥＳＣ上では発現するがｈＥＳＣ−ＭＳＣ上では発現しないことが確認される。したがって、ＣＤ２４は、それ自体で、または分化中のｈＥＳＣの培養物から推定ＭＳＣを単離するための正の選択マーカーであるＣＤ１０５と組み合わせて、負の選択マーカーまたは選別マーカーとして用いることができる。
［実施例］
【実施例１】
【０２２６】
＜材料および方法−エキソソームの調製＞
エキソソームを、先に記載されたようにＨＰＬＣを用いて、ｈｕＥＳ９．Ｅ１由来のＭＳＣ馴化培地（ＣＭ）から精製した。簡潔に述べると、ＭＳＣ培養物から回収したＣＭを、１００ｋＤａのＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を有する膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって、５０倍に濃縮した。
【０２２７】
その後、ＣＭを、クロマトグラフィーカラム（ＴＳＫ  ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍ、およびＴＳＫゲルＧ４０００  ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、東ソー株式会社、東京、日本）に通した。
【０２２８】
エキソソームを溶出の第１のピークから回収し、１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて濃縮した。エキソソームを、保存または使用する前に、０．２２μｍのフィルターで濾過した。
【実施例２】
【０２２９】
材料および方法−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
記載されているように、２ｍｌの透析されたエキソソーム内のタンパク質を還元し、アルキル化し、そしてトリプシン消化した（２０）。
【０２３０】
試料を次に、消化された混合物を、馴化されたＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８  ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に通すことによって脱塩し、３％アセトニトリル（ＡＣＮ）（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）および０．１％ギ酸（ＦＡ）の緩衝液で２回洗浄し、そして７０％ＡＣＮおよび０．１％ＦＡの緩衝液で溶出した。
【０２３１】
溶出された試料を次に、真空遠心分離機において有機溶媒を除去することによって、その最初の容積の約１０％まで乾燥させた。
【０２３２】
試料の複雑性を低減させるために、オフラインペプチド分画を、Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌ  ＳＣＸカラム（２００ｍｍ×４．６ｍｍ）（ＰｏｌｙＬＣ、ＵＳＡ）を通すＨＰＬＣ系（株式会社島津製作所、日本）で行った。
【０２３３】
１ｍｌ／分での、移動相Ａ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル）および移動相Ｂ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル＋３５０ｍＭのＫＣｌ）。
【０２３４】
８つの画分を回収し、真空遠心分離機で乾燥させた。
【０２３５】
分画された試料を、ナノスプレー源を取り付けたＬＴＱ−ＦＴ  Ｕｌｔｒａリニアイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｂｒｅｍｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にオンラインで繋いだ株式会社島津製作所のマイクロＨＰＬＣ系の自動サンプラー内にロードした。
【０２３６】
注入されたペプチドを、Ｚｏｒｖａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８濃縮カラム（５ｍｍ×０３ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で捕捉および脱塩し、そしてナノレベルの穴を有するＣ１８パックされたカラム（７５μｍ×１００Å、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）内に溶出した。
【０２３７】
有効流速２００ｎｌ／分へのスプリッターを用いる一定流速２０μｌ／分での９０分の勾配を用いて、ペプチドを質量分析計内に溶出した。
【０２３８】
ＦＴＭＳにおける各ＭＳスキャンから得られる最も強いピークの８つについてＭＳ／ＭＳスキャンを行うことによって、ＬＴＱをデータ依存モードで操作した。
【０２３９】
各実験で、８つのＳＣＸ画分のＭＳ／ＭＳ（ｄｔａ）スペクトルを、自作のプログラムによるシングルマスコットジェネリックファイル内に組み合わせた。
【０２４０】
タンパク質の同定は、社内のＭａｓｃｏｔサーバ（バージョン２．２．０４、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を介して、組み合わされたデータをＩＰＩヒトタンパク質データベース（バージョン３．３４、６９１６４の配列、２９０６４８２５の残基）に対してサーチすることによって行った。
【０２４１】
サーチパラメータは、トリプシンを用いる切断の失敗が最大で２ヶ所であること；固定された修飾がシステインのカルバミノメチル化であり、可変の修飾がメチオニンの酸化であること、であった。
【０２４２】
質量許容差は、ペプチド前駆体および断片イオンについてそれぞれ１０ｐｐｍおよび０．８Ｄａに設定した。
【０２４３】
タンパク質の同定は、２つの異なるペプチドがホモロジースコアよりも大きなスコアを有することが明らかになった場合に、真陽性であると認められた。
【実施例３】
【０２４４】
＜材料および方法−抗体アレイ＞
５００μｌの非馴化培地および３つの独立した調製物からのエキソソームを、製造者の指示に従って（ＲａｙＢｉｏ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  Ｉを用いて、サイトカインおよび他のタンパク質の存在についてアッセイした。
【０２４５】
シグナル強度が非馴化培地よりも２倍高い（ｐ＜０．０５）場合に、サイトカインおよび他のタンパク質がエキソソーム内に存在するとみなした。
【実施例４】
【０２４６】
＜材料および方法−ウェスタンブロットハイブリダイゼーション＞
１２μｇのエキソソームを、４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。
【０２４７】
膜をＳＮＡＰ  ｉ．ｄ．系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の膜ホルダーに移し、ブロックし、そして、マウス抗ＧＡＰＤＨ（１：１００希釈）、マウス抗ＰＧＫ（１：６０）、マウス抗ＰＧＤ（１：６０）、ウサギ抗ＰＦＫＦＢ３（１：６０）、マウス抗ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ、１：２００）、マウス抗２０Ｓプロテアソームα１〜７（１：２００）、マウス抗ＣＤ７３（１：６０）、およびマウス抗ＣＤ５９（１：２００）を含む一次抗ヒト抗体と共にインキュベートした。
【０２４８】
ブロットを次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートした。
【０２４９】
用いた二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１２５０）またはロバ抗ウサギＩｇＧ（１：１２５０）であった。
【０２５０】
全ての抗体は、Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手したマウス抗ＰＫを除いて、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手した。
【０２５１】
ブロットを次に、ＨＲＰで増強した化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と共にインキュベートし、次いで、Ｘ線フィルムに曝露した。
【実施例５】
【０２５２】
＜材料および方法−酵素アッセイ−ピルビン酸キナーゼアッセイ＞
５μｇのエキソソーム（１２μｌ内）を、細胞抽出キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて溶解した。
【０２５３】
溶解されたエキソソームの抽出物を、市販されているＰＫアッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）の５０μｌの反応ミックスと共にインキュベートした。
【０２５４】
このアッセイにおいて、ＰＫによって生産されたピルビン酸を、ピルビン酸キシダーゼによって酸化して、蛍光を生じさせた（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８７ｎｍ）。
【０２５５】
蛍光強度の増大は、したがって、生産されたピルビン酸の量に比例する。
【実施例６】
【０２５６】
＜材料および方法−酵素アッセイ−ＧＡＰＤＨおよびＰＧＫアッセイ＞
ＧＡＰＤＨおよびＰＧＫの活性を、２つの市販されているキット、すなわちＫＤａｌｅｒｔ  ＧＡＰＤＨアッセイキット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびＡｐｏＳＥＮＳＯＲ  ＡＤＰ／ＡＴＰ比率アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて、その下流生成物、すなわち糖分解反応におけるＡＴＰに基づいて測定した。
【０２５７】
簡潔に述べると、エキソソームを、細胞抽出キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて溶解した。
【０２５８】
ＧＡＰＤＨ活性を測定するために、１０μｇの溶解したエキソソームを、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、ＮＡＤ＋、およびＰｉを含有するＫＤａｌｅｒｔ反応緩衝液に添加して、１，３−ビスホスホグリセレート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋を形成させた。
【０２５９】
２５０Ｕ／ｍｌのＰＧＫおよび６０μＭのＡＤＰを次に添加して、１，３−ビスホスホグリセレートおよびＡＤＰを３−ホスホグリセレートおよびＡＴＰに変換した。
【０２６０】
ＧＡＰＤＨ活性に比例する生産されたＡＴＰの量を次に、ＡＴＰルシフェラーゼアッセイを用いて測定した。
【０２６１】
ＰＧＫ活性を測定するために、１０μｇの溶解したエキソソームを、上記のアッセイから生産された１，３−ビスホスホグリセレートに添加した。
【０２６２】
ＡＤＰを添加して、ＡＴＰを形成させた。
【０２６３】
ＰＧＫ活性に比例するＡＴＰの量を次に、ＡＴＰルシフェラーゼアッセイを用いて定量した。
【実施例７】
【０２６４】
＜材料および方法−酵素アッセイ−２０Ｓプロテアソームアッセイ＞
プロテアソーム活性を、特異的２０Ｓプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの存在下または不存在下で、２０Ｓプロテアソームによる標識された基質ＬＬＶＹ−ＡＭＣからの切断後のフルオロフォア７−アミノ−４メチルクマリン（ＡＭＣ）を検出することに基づく、２０Ｓプロテアソーム活性アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定した。
【０２６５】
簡潔に述べると、４μｇのエキソソームを、２５μＭのラクタシスチンの存在下または不存在下で、ＬＬＶＹ−ＡＭＣを含有する反応緩衝液と共にインキュベートした。
【０２６６】
試料およびＡＭＣ標準を３７℃でインキュベートし、Ｅｘ／Ｅｍ＝３８０／４６０ｎｍでの蛍光強度を２時間モニタリングした。
【実施例８】
【０２６７】
＜材料および方法−酵素アッセイ−ＣＤ７３アッセイ＞
エキソソームにおけるＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）酵素活性を、５０μＭのＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する１００μｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）内で２．５μｇのエキソソームをインキュベートすることによって決定した。
【０２６８】
ＡＭＰの加水分解から放出されたリン酸イオンの量を次に、製造者の指示通りに、Ｃｏｌｏｒｌｏｃｋ  Ｇｏｌｄキット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によって決定した。
【実施例９】
【０２６９】
＜材料および方法−細胞アッセイ−糖分解＞
Ｈ９Ｃ２心筋細胞を、ウェル当たり３０，０００個細胞で９６ウェルプレート（ポリリジン被覆された）上に平板培養した。
【０２７０】
５時間後、細胞をタイロード緩衝液で２回洗浄し、その後、２０μｍｏｌのオリゴマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、６ｍｍｏｌのグルコースを含有し、０．１μｇ／ｍｌのエキソソームを含むまたは含まないタイロード緩衝液内で１５分、３０分、および６０分間インキュベートした。
【０２７１】
細胞のＡＴＰ濃度を、ＡＴＰｌｉｔｅ−１ステップ発光ＡＴＰ検出アッセイ系（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｚａｖｅｎｔｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて測定した。
【実施例１０】
【０２７２】
＜材料および方法−細胞アッセイ−アデノシン介在性のシグナル伝達＞
Ｈ９Ｃ２心筋細胞を、ウェル当たり２００，０００個細胞で６ウェルプレート上で平板培養し、一晩血清飢餓とした。
【０２７３】
細胞を次に、１ｍＭのテオフィリンを含むまたは含まない新鮮な無血清培地と共にさらに１時間インキュベートした。
【０２７４】
その間に、２シリーズの無血清培地を調製した。
【０２７５】
一方のシリーズは、補足物なし、５０μＭのＡＭＰのみ、０．１μｇ／ｍｌのエキソソームのみ、または５０μＭのＡＭＰおよび０．１μｇ／ｍｌのエキソソームの組み合わせを含有していた。
【０２７６】
第２のシリーズは、培地が１ｍＭのテオフィリンを含有していたことを除いて、第１のシリーズに類似していた。
【０２７７】
両シリーズを、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２７８】
第１のシリーズを用いて、無血清培地のみで培養された細胞の培地を置換し、第２のシリーズを用いて、テオフィリン含有培地において培養された細胞の培地を置換した。
【０２７９】
５分後、細胞を採取し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で、市販されている哺乳動物細胞抽出キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて溶解した。
【０２８０】
タンパク質濃度を、標準的なブラッドフォードアッセイによって決定した。
【０２８１】
１０μｇの全タンパク質を、１：２０００希釈のウサギ抗ｐＥＲＫ１／２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９１０１Ｓ）、１：２０００希釈のウサギ抗ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２７１Ｓ）、１：５００希釈のウサギ抗ＥＲＫ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−９４）、および１：５００希釈のウサギ抗ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２７２Ｓ）を用いて、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。
【実施例１１】
【０２８２】
＜材料および方法−細胞アッセイ−補体介在性細胞溶解＞
簡潔に述べると、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を購入し（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、その後、ＰＢＳ１ｍｌ当たり１×１０８個細胞で再懸濁した。
【０２８３】
精製補体成分、Ｃ５ｂ６、Ｃ８、およびＣ９は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、Ｃ７はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【０２８４】
インタクトなＣ５ｂ−９のＳＲＢＣへの会合を、最終濃度が０．１μｇ／ｍｌのエキソソームの存在下または不存在下で、それぞれ１ｍｌのＣ５ｂ６（０．１μｇ／ｍｌ）およびＣ７（０．４μｇ／ｍｌ）と共に１５分間インキュベーションすること（３７℃）によって開始させた。
【０２８５】
ＳＲＢＣを次に洗浄し、最終濃度が０．０５μｇ／ｍｌのブロックＣＤ５９抗体を含むまたは含まない、それぞれ１ｍｌのＣ８（０．４μｇ／ｍｌ）にＣ９（０．４μｇ／ｍｌ）を加えたものと共にさらに３０分間インキュベートした。
【０２８６】
その後、ＳＲＢＣを遠心分離し、上清内の溶解したＳＲＢＣによって放出されたヘモグロビンの量を、４１５ｎｍでの吸光度によって測定した。
【０２８７】
全（１００％）溶血を、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で細胞を処理することによって得た。
【実施例１２】
【０２８８】
＜結果−エキソソームのプロテオミクスプロファイリング＞
エキソソームを、以前に記載されているように、ＨＰＬＣによって９，１０、ヒトＥＳＣ由来の間葉系幹細胞であるＨｕＥＳ９．Ｅ１１３によって馴化された培養培地から精製した。質量分析および抗体アプローチを用いるプロテオミクスプロファイリングを、以前に記載されているように９−１１、ＨＰＬＣ精製されたエキソソームの３つの独立して調製されたバッチに対して行った。全部で８６６のタンパク質を検出し、分析を容易にするためにこれらのタンパク質をその遺伝子記号によって示した（表Ｅ１）。これらのうち、３１８の遺伝子産物が、分画されていない馴化培地において先に同定された７３９のタンパク質において見られた９，１０（図１）。
【０２８９】
培養細胞および生体液から精製されたエキソソームに対して行われた１５のプロテオミクス分析のデータ分析に基づいて、Ｔｈｅｒｙらは、約１７のタンパク質、すなわちグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、真核生物翻訳伸長因子１Ａ１（ＥＥＦ１Ａ１）、乳脂肪球ＥＧＦ因子８タンパク質（ＭＦＧＥ８）、テトラスパニン、１４−３−３タンパク質、Ｇαタンパク質、クラスリン、Ａｌｉｘ（ＰＤＣＤ６ＩＰ）、ＭＨＣクラス１、アネキシン（ＡＮＸ）、Ｒａｂタンパク質、エズリン（ＶＩＬ２）、ラジキシン（ＲＤＸ）およびモエシン（ＭＳＮ）（ＥＲＭ）、アクチン、チューブリン、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０の組み合わせが、特徴付けされたエキソソームの少なくとも５０％において見られることを観察した２。予想通り、これらのタンパク質のほとんどはまた、ＨＰＬＣ精製されたＭＳＣエキソソームのプロテオームにおいても見られた（表Ｅ１）。エンドソーム由来のエキソソームとも一致して、本発明者らは、Ａｌｉｘ（ＰＤＣＤ６ＩＰ）およびＲａｂ（表Ｅ１）などのエンドソーム関連タンパク質の存在を検出した。
【０２９０】
【表１１Ａ】
0006046640.tif 000012
【表１１Ｂ】
0006046640.tif 000013
【表１１Ｃ】
0006046640.tif 000014
【実施例１３】
【０２９１】
＜結果−エキソソームプロテオームの計算分析＞
エキソソームにおけるタンパク質の生物学的有意性をさらに良く理解するために、生物学的プロセスへの８６６のタンパク質の機能的クラスター化を、ＰＡＮＴＨＥＲ（進化的関係を介するタンパク質分析）分析ソフトウェアを用いて行った１４，１５。各生物学的プロセスにおけるエキソソームプロテオームからの観察された遺伝子頻度を、その生物学的プロセスについてのＮＣＢＩデータベースにおける参照遺伝子頻度と比較した。８６６の遺伝子産物を、出現頻度の高かった（ｐ＜０．００１）３２の生物学的プロセスおよび出現頻度の低かった（ｐ＜０．００１）３つの生物学的プロセスにクラスター化することができた（図２）。
【０２９２】
これらの生物学的プロセスをさらに、エキソソーム生物学、例えば伝達、細胞の運動性、炎症、およびエキソソーム生合成に関連するいくつかの活性にさらに分類することができた。エキソソームは全体として、細胞間伝達およびモルフォゲンシグナル伝達４，１６ならびに免疫活性のメディエーター２の媒体として機能すると仮定されるため、シグナル伝達経路、細胞構造、細胞の運動性、および免疫応答におけるエキソソームタンパク質の関与は当然のことであった。本発明者らが「エキソソーム生合成」と暫定的に呼ぶ、第４のクラスのプロセスは、エンドソームの関与、ＥＳＣＲＴ介在性の選別および多小胞体の形成、ならびに原形質膜との融合を介する、エキソソームの生合成および放出を基本的に反映していた。したがって、トランスゴルジネットワーク、細胞内のタンパク質輸送、一般的な小胞輸送、エンドサイトーシス、受容体介在性のエンドサイトーシス、他のタンパク質の標的化および局在化、ならびにエキソサイトーシスに関与するもののようなタンパク質は、当然のことながらエキソソームにおいて富んでいる。組織の修復および再生として本発明者らが分類した他の生物学的プロセスには、骨格の発生および血管新生を含む中胚様性および外肺葉性の組織の発生および分化に関与するプロセスが含まれる。これらの生物学的プロセスは、間葉系幹細胞１７の分化能力に一致し、エキソソームが細胞由来であることを反映していた。本発明者らの代謝分類において、本発明者らは、成長および再生のためのエネルギーおよび構成成分を生産する、異化作用性または同化作用性の代謝に関与するプロセスを含めた。血液凝固もまた、本発明者らが組織傷害の改善において重要であり得ると仮定した、有意に出現頻度の高い生物学的プロセスであった。３つの出現頻度の低い生物学的プロセスの全ては、当然のことながら、転写レベルでの遺伝子発現の調節に関与していた。これらのプロセスに関与するほとんどのタンパク質は、核内に効率的に輸送されて、エキソソームとあまり関連しないようになる傾向がある。本発明者らはまた、馴化培地（ＣＭ）において見られる４２１のタンパク質がエキソソーム内に存在しないこと（図１）およびこれらのタンパク質が１１の出現頻度の高い生物学的プロセスおよび２つの出現頻度の低い生物学的プロセスに機能的にクラスター化され得ることを観察した。出現頻度の高いプロセスのうち、６つは、エキソソームにおいて見られる８６６のタンパク質のクラスター化においても見られたが、残りの５つ、すなわちアミノ酸活性化、タンパク質のフォールディング、染色体のパッケージングおよびリモデリング、タンパク質複合体の会合、ならびにｍＲＮＡのスプライシングは見られなかった。２つの出現頻度の低い生物学的プロセスはまた、エキソソームタンパク質については出現頻度が低いことが分かった。ＭＳＣエキソソームにおける多種多様なタンパク質は、これらが広範な生化学的活性および細胞的活性に関与する能力を有することを示した。この仮説を試験するために、本発明者らは、タンパク質を選択し、当該タンパク質は、その生化学的および細胞的活性を試験するためのアッセイが利用可能なものであり、このアッセイは、組み合わせて、エキソソームにおける広範な活性の指標を提供するものである。
【実施例１４】
【０２９３】
＜結果−エキソソームは糖分解を介する細胞ＡＴＰ生産を増強させた＞
エキソソームプロテオームの１つの顕著な特徴は、糖分解（図３Ａ）のＡＴＰ生成段階における５つの酵素の全て、すなわち、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、エノラーゼ（ＥＮＯ）、およびピルビン酸キナーゼｍ２アイソフォーム（ＰＫｍ２）の存在であった。これらのうち、ＡＴＰまたはＮＡＤＨを生成する３つの酵素、すなわちＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、およびＰＫｍ２は、イムノブロッティングによって存在することがさらに確認された（図３Ｂ）。その酵素の活性は、１単位（Ｕ）の酵素活性が１分当たり１μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される場合に、タンパク質１μｇ当たりそれぞれ１．１μＵ、３．５９μＵ、および５．５μＵであることが決定された（図３Ｃ）。
【０２９４】
さらに、エキソソームは、フルクトース６−ホスフェートをフルクトース２，６−ビスホスフェートに変換するＰＦＫＦＢ３を含有する。ＰＦＫＦＢ３は、４つの異なる遺伝子によってコードされる４つのＰＦＫＦＢアイソフォームであるＰＦＫＦＢ１、２、３、および４の１つである。ＰＦＫＦＢは、糖分解への関与を触媒する、ホスホフルクトキナーゼの強力なアロステリック活性化剤であるフルクトース−２，６−ビスホスフェート１８の細胞レベルを維持することに関与する。これらは、がん細胞における高い糖分解率または「ワールブルク効果」に関与すると考えられている１９。ＰＦＫＦＢ３のキナーゼ活性は、ｃＡＭＰ依存性のタンパク質キナーゼおよびタンパク質キナーゼＣなどのタンパク質キナーゼによるリン酸化によって上方調節される。質量分析によって、エキソソームにおけるＰＦＫＦＢ３の存在が明らかになり、イムノブロッティングによって、この酵素がリン酸化されたことがさらに実証された（図３Ａ）。
【０２９５】
エキソソームにおける、ＡＴＰを生成する糖分解酵素およびリン酸化されたＰＦＫＦＢ３の存在によって、エキソソームへの細胞の曝露が糖分解フラックスおよびＡＴＰ生産を増大させ得ることが予測された。これを試験するために、本発明者らは、これらのエキソソームがオリゴマイシン処理されたＨ９Ｃ２細胞においてＡＴＰ合成を増大させ得るかを決定した。オリゴマイシンはミトコンドリアＡＴＰａｓｅを阻害するため２０、オリゴマイシン処理した細胞は、糖分解をその主要な細胞ＡＴＰ源として利用しなくてはならない。糖分解酵素およびＰＦＫＦＢ３の存在、ならびに本発明者らによる、Ｈ９Ｃ２細胞がＭＳＣエキソソームを取り込み得るという以前の実証１２と一致して、エキソソームは、オリゴマイシン処理した細胞において、それぞれエキソソームに１５から３０分曝露させると、糖分解の増大を介して、ＡＴＰレベルを７５．５±２８．８％または５５．８±１６．５％増大させた。
【実施例１５】
【０２９６】
＜結果−エキソソームにおける２０Ｓプロテアソームは酵素的に活性である＞
ＭＳＣエキソソームの質量分析は、２０Ｓコア粒子の７つのα−サブユニット（ＰＭＳＡ１〜７）の全ておよび７つのβ−サブユニット（ＰＭＳＢ１〜７）の全ての存在を検出しただけではなく、「免疫プロテアソーム」の３つのβ−サブユニットであるＰＭＳＢ８（β５ｉまたはＬＭＰ７）、ＰＭＳＢ９（β１ｉまたはＬＭＰ２）、ＰＭＳＢ１０（β２ｉまたはＬＭＰ１０）遺伝子産物も検出した２１。２０Ｓプロテアソームペプチドのいくつかの存在は、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによってさらに確認された（図４Ａ）。２０Ｓコア粒子の７つのα−サブユニットの全ておよび７つのβ−サブユニットの全ての存在は、ＭＳＣエキソソームが無傷の２０Ｓプロテアソーム複合体を含有し、したがって、２０Ｓプロテアソーム酵素活性を潜在的に有することを示唆する。
【０２９７】
これと一致して、ＭＳＣエキソソームは、５．００μＵ／μｇのタンパク質の酵素活性を有する短い蛍光発生ペプチドを分解し得、この分解は、特異的プロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンによって阻害された（図４Ｂ）。本発明者らはまた、上記の糖分解酵素アッセイとは異なり、エキソソームにおける２０Ｓプロテアソーム活性が、エキソソームの溶解を伴わずに検出され得ることを観察した。このことは、２０Ｓプロテアソームがエキソソームの内腔ではなく表面上に存在し得ることを示唆した。
【０２９８】
２０Ｓプロテアソームがホスファチジルイノシトール脂質単層、ＥＲ、およびゴルジ脂質フィルム２２上の「エンドオン」立体構造に優先的に会合し、その結果２０Ｓプロテアソームへの入り口が膜に垂直となることが、以前に観察された。したがって、これと本発明者らの所見とを組み合わせると、エキソソーム内の２０Ｓプロテアソームが外部膜表面に付着し、その入り口がエキソソーム膜に垂直であったことを示唆している。
【実施例１６】
【０２９９】
＜結果−エキソソームはＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼを介してＥＲＫおよびＡＫＴをリン酸化した＞
エクト−５'−ヌクレオチダーゼ（ＮＴ５ＥまたはＣＤ７３）は、エクトアピラーゼ（ＣＤ３９）と共に、前駆ヌクレオチドをアデノシンに酵素的に変換する。細胞の傷害の間、細胞はＡＴＰおよびＡＤＰを放出する２３。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰおよびＡＤＰをＡＭＰに加水分解し、これは次に、エクト−５'−ヌクレオチダーゼによってアデノシンに分解される。
【０３００】
アデノシンは、ヒト血液において１０秒の半減期を有する。これは、強力な血管拡張物質であるが、作用が非常に短いため、血管拡張物質として臨床的には用いられていない。これは、上室性頻拍症の迅速な治療に用いられる。アデノシンは、４つの既知のアデノシン受容体サブタイプ（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３）を介して多くの生理学的プロセスを仲介する内因性プリンヌクレオシドである２４。
【０３０１】
ＮＴ５Ｅは、質量分析によってＭＳＣエキソソームに存在することが明らかになり、イムノブロッティングによって確認された（図５Ａ）。それらの酵素活性は、タンパク質１μｇ当たり２２．０４μＵであると決定された。エキソソームがＡＭＰのＣＤ７３介在性の加水分解を介して細胞内のアデノシンシグナル伝達を活性化し得るかを決定するために、Ｈ９Ｃ２心筋細胞を一晩血清不足とし、次に、エキソソームおよびＡＭＰに曝露した。細胞溶解物を次に、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化について分析した（図５Ｂ、図５Ｃ）。
【０３０２】
一晩血清不足とした後、エキソソームおよびＡＭＰへの曝露によって、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化が誘発された。ＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化は、非選択的なアデノシン受容体アンタゴニストであるテオフィリン、拮抗されたＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３受容体の存在下で消失した２５。
【実施例１７】
【０３０３】
＜結果−エキソソームは膜侵襲複合体の形成を阻害した＞
補体系は、抗体の機能を補う、自然免疫系の一部である。活性化すると、生化学的カスケードが開始して、いくつかの鍵となる生成物、すなわち、病原体の表面に結合しこれらの病原体の食作用を増強させるＣ３ｂ、走化性による炎症細胞の動員を助けるＣ５ａ、ならびにＣ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびポリマー性Ｃ９からなるＭＡＣの形成を開始させるＣ５ｂを生成する。標的細胞上に堆積したＭＡＣは膜貫通チャネルを形成し、これによってその後の細胞溶解が生じる。補体経路の異常な活性化は、虚血再かん流傷害において有害な役割を有すると考えられる２６。
【０３０４】
ＭＳＣエキソソームは、質量分析によってＣＤ５９を含有することが明らかになり、このことは、イムノブロッティングによって確認された（図６Ａ）。ＣＤ５９はＭＡＣの形成を阻害するため２７、このことは、エキソソームが補体活性化およびその後の補体介在性の細胞溶解を阻害し得ることを示唆した。この仮説と一致して、エキソソームは、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の補体介在性の溶解を阻害した（図６Ｂ）。この阻害は、ＣＤ５９ブロッキング抗体をエキソソームの前処理に用いた場合に無効となり、このことは、エキソソームのＣＤ５９が補体溶解の阻害に直接的に関与することを示す。
【実施例１８】
【０３０５】
＜考察（実施例１から１７について）＞
この報告において、本発明者らは、独立して調製された３種類の、ＨＰＬＣ精製されたＥＳＣ由来のＭＳＣエキソソームのプロテオームを、質量分析およびサイトカインアレイを用いてプロファイリングし、８６６のタンパク質を同定した。これらのタンパク質は、他のエキソソームにおいて共通して見られる多くのタンパク質を含んでいた。
【０３０６】
その機能に従った、これらのタンパク質クラスター化によって、エキソソームが多くの生物学的プロセスを駆動する能力を有することが示唆された。この仮説的な生物学的能力を評価するために、本発明者らは、その生化学的活性および細胞的活性についてのアッセイが利用可能であること、ならびにグループとしてそれらが広範な活性多様性を説明することに基づいて選択されたタンパク質セットを試験した。さらに重要なことに、これらの選択されたタンパク質の生化学的活性および細胞的活性は、急性心筋虚血／再かん流傷害における組織傷害を改善する能力を有し得る。
【０３０７】
ＭＳＣエキソソームのプロテオームは、多様なタンパク質を含有していた。重要な画分は、生合成経路およびエンドサイトーシス経路を介する高度に調節され複雑な細胞内膜輸送および選別に関与するタンパク質であり２８、これらのタンパク質の存在は、おそらく、多くの細胞型によって分泌される基本的に小さな脂質二重膜小胞であるエキソソームの生合成の反映である。異なる細胞源からのエキソソームが共通のタンパク質セットを有し、その多くがそれらの生合成を反映することが以前に観察された２９。エキソソームの生合成ならびにタンパク質およびＲＮＡカーゴのロードの選択的ロードにおける複雑性は、細胞資源の多くが用いられること、およびこのような関与が重要な生理学的機能によって支えられているに違いないことを示唆する。
【０３０８】
エキソソームは発見されて３０年を超えるが、エキソソームの生物学的重要性は、明らかにされ始めたばかりである。エキソソームは、ますます多くの重要な生理学的および病理学的プロセス、例えば不要なタンパク質の処分１、抗原提示３０、遺伝子交換３１、免疫応答３２，３３、および腫瘍の転移３２−３７に関与している。総合すると、これらの所見は、グループで、または個別に、エキソソームが多くの生物学的プロセスを調節し得ることを示唆する。後者の可能性は、エキソソームにおいて見られている広範なタンパク質およびＲＮＡによって裏付けられる１２，３８。上記に列挙したエキソソームの機能に加えて、本発明者らは、最近、ＭＳＣによって分泌されるエキソソームが急性心筋虚血／再かん流傷害のマウスモデルにおいて梗塞サイズを低減させ得ることを観察した９。根底にある分子メカニズムを調べ、解明するために、本発明者らは、ＭＳＣエキソソームの体系的なプロテオミクスの疑問に着手して、これらのエキソソームの細胞的能力および生化学的能力を明らかにし、急性心筋虚血／再かん流傷害における組織傷害を改善し得る候補生物学的活性を同定した９。
【０３０９】
本発明者らはまず、ＡＴＰおよびＮＡＤＨの生成に関与する糖分解酵素１８がエキソソーム内に存在するだけではなく生化学的にも活性であることを決定した。さらに、エキソソームはまた、ホスホフルクトキナーゼの強力なアロステリック活性化剤であるフルクトース−２，６−ビスホスフェートの形成を触媒する活性なリン酸化形態のＰＦＫＢ３を含有していた。これらの所見は、ＭＳＣエキソソームが、ミトコンドリア機能に依存せずに、糖分解を介して細胞ＡＴＰおよびＮＡＤＨを回復させる能力を有することを示した。ＡＴＰ生産の主要な部位である上に、ミトコンドリアはまた、細胞死の調節における主要なオルガネラである３９。ミトコンドリアの機能の喪失およびその後のＡＴＰの枯渇は、通常、急性心筋虚血／再かん流傷害などの病的状態の間の細胞死をもたらすカスケードにおける初期のステップに相当する。細胞生存能力の主要な指標であるＡＴＰの欠如は、ミトコンドリアの機能障害の鍵となる結果である。ＭＳＣエキソソームは細胞によって取り込まれ得るため１２、エキソソームは、ミトコンドリアが損傷した細胞における糖分解酵素またはリン酸化ＰＦＫＢ３の細胞含有量を増大させることによって細胞ＡＴＰレベルを回復させる能力を有する。実際、Ｈ９Ｃ２細胞におけるミトコンドリアのＡＴＰａｓｅがオリゴマイシンによって阻害されると、エキソソームは、これらの細胞においてＡＴＰ生産を増大させ得る。
【０３１０】
２０Ｓプロテアソームを共に構成する７つのαサブユニットおよびβサブユニットの全ての存在、ならびにエキソソームにおける２０Ｓプロテアソーム酵素活性のその後の検証は、ＭＳＣエキソソームの治療的活性が２０Ｓプロテアソームの存在に部分的に起因し得ることを示唆した。２０Ｓプロテアソームは、細胞内の酸化的に損傷したタンパク質の全ての約９０％の分解の原因であり４０、プロテアソーム活性の低減は、加齢に関連する神経変性疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病４１，４２または心血管疾患４３−４５の発症の要因であると仮定されている。
【０３１１】
ＣＤ７３によってＡＭＰをアデノシンに加水分解し、その後、アデノシン受容体を介してＡＫＴおよびＥＲＫ１／２のリン酸化を誘発する、ＭＳＣエキソソームの生化学的能力によって、ストレスを受けた細胞および刺激された生存シグナル伝達経路によって放出されるＡＭＰを加水分解する、ＭＳＣエキソソームの能力が説明された。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙの最近の方針書は、アデノシン受容体の活性化およびプロ生存キナーゼ、例えばＰＩ３キナーゼであるＡＫＴおよびＥＲＫ１／２のリン酸化を、再かん流傷害を限定する役割を有する可能性があると協調していた４６。したがって、心保護性であることが示されているアデノシン受容体の活性化４６，４７はまた、エキソソームによる再かん流傷害の改善を仲介する分子メカニズムであり得る。
【０３１２】
エキソソーム上のＣＤ５９による赤血球の補体介在性の溶解の阻害は、エキソソームの心保護効果のさらに別の候補メカニズムに相当する。補体活性化は、腸、心臓、および腎臓などの組織における虚血／再かん流傷害の既知のメディエーターであり、その減衰または阻害は、組織傷害を改善することが示されている４８−５０。
【０３１３】
要約すると、エキソソームプロテオームについての本発明者らの疑問および生化学的検証は、広範な生化学的活性および細胞的活性を明らかにし、エキソソームの心保護効果のためのいくつかの候補経路を同定した。これらの候補経路の１つまたは複数が急性心筋傷害の治療における再かん流傷害の低減におけるＭＳＣエキソソームの有効性に寄与したかを決定するためには、適切な動物モデルにおけるさらなる検証研究が必要である５１。ＭＳＣエキソソームにおける多くの生化学的能力は、２つ以上の組織傷害メディエーターを同時に標的化し、組み合わせ薬剤療法において観察されるものと類似の治療的相乗効果を潜在的に誘発する可能性を提供する。複数の傷害メディエーターを標的化し得るというこの可能性は、これらの標的化活性を駆動するための酵素の使用によってさらに増強される。酵素活性は、その微小環境、例えば基質の濃度またはｐＨによって決定されるため、エキソソームの酵素に基づく治療的活性は、疾患促進微小環境の程度に比例して活性化され得るかまたは弱められ得る。結果として、エキソソームに基づく治療の有効性は、疾患促進微小環境に非常に応答性であり得、当該環境によってさらに限定され得る。総合すると、これらの特徴は、エキソソームに基づく治療を、本質的に安全でさらに有効なものとし得る。
【実施例１９】
【０３１４】
＜結果−ＭＳＣエキソソームによるＴＬＲの活性化＞
ＭＳＣエキソソームを、ヒトＴＬＲのほとんどを発現することが知られているヒト急性単球性白血病細胞株であるＴＨＰ−１に由来する２つの細胞株を用いて、ＴＬＲを活性化する能力についてまず評価した。第１の株は、ＮＦ−ｋＢプロモーターの転写制御下にある安定的にトランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を有するＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅである。第２の株は、ＭｙＤ８８活性が欠損しているＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤであり、その結果、ＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅの活性化およびＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤの非活性化は、ＴＬＲリガンドの存在を示す。０．１μｇ／ｍｌでは、ＭＳＣエキソソームは、０．０１μｇ／ｍｌのＬＰＳと同程度までＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅを活性化させ、この活性化は、ＬＰＳの活性化とは異なり、ポリミキシンＢによって消失せず、これによって、ＭＳＣエキソソーム調製物におけるＬＰＳ汚染は除外された。ＭＳＣエキソソームおよびＬＰＳの両方は、ＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤを活性化できず、このことは、ＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅの活性化がＴＨＰ−１細胞上に存在するＴＬＲのいくつかの活性化によってのみ仲介されたことを示す（図６）。
【０３１５】
ＭＳＣエキソソームはＴＬＲ２およびＴＬＲ４の推定リガンドを含有するため、これらを、ヒトＴＬＲ２またはＴＬＲ４で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫレポーター細胞株、およびＳＥＡＰレポーター系を用いて、これらの受容体を活性化させる能力について試験した（図７および図８）。ＭＳＣエキソソームはＴＬＲ２およびＴＬＲ４の両方の内因性リガンドを含有していたが、ＴＬＲ４のみが０．１μｇ／ｍｌのエキソソームで活性化した。１．０μｇ／ｍｌのエキソソームでは、ある程度の小さな、しかし有意な（ｐ＜０．０１）ＴＬＲ２活性化が存在し、このことは、ＭＳＣエキソソームによるＴＬＲ２活性化の能力が少なくとも１０倍低かったことを示す。エキソソームによるＴＬＲ４活性化はポリミキシンＢによって消失しなかったため、このことによって、ＭＳＣエキソソーム調製物におけるＬＰＳ汚染は除外された。したがって、ＭＳＣエキソソームは、ＴＬＲ４を活性化し得るが、ＴＬＲ２は活性化し得ない。
【実施例２０】
【０３１６】
＜ＭＳＣエキソソームはＴＬＲリガンドを有する−方法＞
ＭＳＣエキソソーム上のＴＬＲリガンドの存在を、ヒトＴＬＲのほとんどを発現することが知られているヒト急性単球性白血病細胞株であるＴＨＰ−１に由来する２つの細胞株を用いて決定した。第１の株は、ＮＦ−ｋＢプロモーターの転写制御下にある安定的にトランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を有するＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅである。第２の株は、ＭｙＤ８８活性が欠損しているＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤである。ウェル当たり１０５個の細胞を９６ウェルプレート内に播種し、ＬＰＳを結合および不活化する抗生物質であるポリミキシンＢを有するかまたは有さない１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ０２６：Ｂ６、Ｓｉｇｍａ）または０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣ由来のエキソソーム（ＭＳＣ−Ｅｘｏ）と共に２４時間インキュベートした。ＳＥＡＰレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いてアッセイした。
【０３１７】
結果を図７に示す。
【実施例２１】
【０３１８】
＜ＭＳＣエキソソームはＴＬＲ２を活性化しない−方法＞
ＭＳＣエキソソームのＴＬＲ２活性化能力を、ヒトＴＬＲ２、ＭＤ２、およびＣＤ１４で安定的にコトランスフェクトされている市販のＨＥＫ２９３細胞株、ならびにＮＦ−κＢプロモーターの制御下にある最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を用いて評価した。この細胞株、すなわちＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ｈＴＬＲ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェル当たり１０４個細胞で９６ウェルプレートに播種し、１０μｇ／ｍｌのリポタイコ酸（ＬＴＡ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｉｇｍａ）または０．１、０．５、および１．０μｇ／ｍｌのＭＳＣ由来エキソソーム（ＭＳＣ−Ｅｘｏ）と共に２４時間インキュベートした。ＳＥＡＰレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いてアッセイした。
【０３１９】
結果を図８に示す。
【実施例２２】
【０３２０】
＜ＭＳＣエキソソームはＴＬＲ４を活性化する−方法＞
ＭＳＣエキソソームのＴＬＲ４活性化能力を、ヒトＴＬＲ２、ＭＤ２、およびＣＤ１４で安定的にコトランスフェクトされている市販のＨＥＫ２９３細胞株、ならびにＮＦ−κＢプロモーターの制御下にある最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を用いて評価した。この細胞株、すなわちＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ｈＴＬＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェル当たり１０４個細胞で９６ウェルプレートに播種し、ＬＰＳを結合および不活性化する抗生物質であるポリミキシンＢを有するかまたは有さない１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ０２６：Ｂ６、Ｓｉｇｍａ）または０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣ由来エキソソーム（ＭＳＣ−Ｅｘｏ）と共に２４時間インキュベートした。ＳＥＡＰレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いてアッセイした。
【０３２１】
結果を図９に示す。
【実施例２３】
【０３２２】
＜ＭＳＣエキソソームはＴＨＰ−１細胞による炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの生産を誘発する＞
＜方法＞
ＴＨＰ−１細胞を１×１０６個細胞／ｍｌの濃度で２４ウェル培養プレートに播種し、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣ−Ｅｘｏで０．５、１、３、６、１２、２４、４８、７２、９６、および１２０時間刺激した。細胞を採取し、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによってサイトカイン生産について分析した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ  Ｐ／Ｎ．４３６８８１３）を用いて逆転写した。ＰＣＲを、１０μｌの２×Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ、Ｐ／Ｎ  ４３８５６１２）反応緩衝液、１μｌのｃＤＮＡ、および１μｌのオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で、２０μｌの全容積で、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ  Ｐ／Ｎ．４３７６５９２）で行い、最初の変性ステップは９５℃で１０分間であり、その後、９５℃で３秒での変性、６０℃で３０秒のアニーリングおよび伸長を４０サイクル行った。用いたプライマーは、ＩＬ−１β（ＦＷ：５’−ＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡ−３’；ＲＶ：５’−ＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＡ−３’）、ＴＮＦ−α（ＦＷ：５’−ＣＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴＡＡＴＣ−３’；ＲＶ：５’−ＧＧＴＴＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡ−３’）、ＩＬ−６（ＦＷ：５’−ＴＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＧＧＡＡＣＧＡＡ−３’；ＲＶ：５’−ＧＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＣＧＣＴ−３’）、ＩＬ−１２ｐ４０（ＦＷ：５’−ＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＡ−３’；ＲＶ：５’−ＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＴ−３’）、ＩＬ−１０（ＦＷ：５’−ＧＴＧＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡ−３’；ＲＶ：５’−ＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴ−３’）、ＴＧＦ−β１（ＦＷ：５’−ＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡ−３’；ＲＶ：５’−ＡＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＡＴＴＴ−３’）、ＧＡＰＤＨ（ＦＷ：５’−ＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴ−３’；ＲＶ：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡ−３’）であった。各試料で、ｍＲＮＡの含有量をヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの含有量に対して正規化し、未処理対照と比較してｎ倍の発現であると記載する。各試料を３回ずつ試験した。データは、製造者の指示に従って、比較ΔＣＴ法およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅソフトウェアバージョン２．０．１を用いて、分析した。
【０３２３】
＜結果＞
＜ＴＨＰ−１細胞によるサイトカイン生産に対するＭＳＣエキソソームの影響＞
【０３２４】
ＴＬＲは、自然免疫の活性化を調節する受容体の主要なクラスであるため、そしてＭＳＣエキソソームは、ヒト単球細胞においてＴＬＲを活性化し得るため、本発明者らは、この活性化によってサイトカインが生産されるかを決定した（図１０）。
【０３２５】
ＭＳＣエキソソームは、それぞれ３および７２〜９６時間でピークとなる、炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの二相性の生産を誘発した。
【実施例２４】
【０３２６】
＜ＭＳＣエキソソームによる適応免疫の調節＞
ＭＳＣエキソソームによるＴＬＲの活性化ならびに炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの誘発は、ＭＳＣエキソソームが適応免疫を調節し得ることを示唆する。具体的には、本発明者らは、ＭＳＣエキソソームがＴｒｅｇまたはＴｈ１７の分化に対する何らかの影響を有するかを試験した。Ｔｒｅｇは、調節性Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞として知られているＴ細胞亜集団を言う１２。これらは免疫系を下方調節し、自己抗原に対する耐性を維持する。これらの細胞は、アレルギーおよびぜんそくなどの免疫疾患、糖尿病、移植拒絶反応などに対する免疫療法において用いられている１３  １４。Ｔｈ１７細胞はＣＤ４＋記憶Ｔ細胞であり、ＩＬ−１７サイトカインの特徴的な分泌によって規定される。これらは、自己免疫疾患の発症にとって重要であると考えられる１５。
【０３２７】
Ｔｒｅｇ細胞またはＴｈ１７細胞へのＣＤ４＋マウスＴ細胞の分化に対するＭＳＣエキソソームの影響を試験するために、ＣＤ４＋マウス細胞をＭＳＣエキソソームと共にインキュベートした。陽性対照として、ＣＤ４＋マウス細胞を、ＴＧＦ−β１によってＴｒｅｇ細胞に分化するように、そしてＩＬ−６およびＴＧＦ−β１によってＴｈ１７細胞に分化するように誘発し、いずれも、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３Ｌ＋ＴｒｅｇまたはＴｈ１７細胞へのＣＤ４＋マウスＴ細胞の分化に対する影響を与えなかった（図１１）。
【実施例２５】
【０３２８】
Ｔｒｅｇ細胞（ａ）またはＴｈ１７細胞（ｂ）へのＣＤ４＋マウスＴ細胞の分化の誘発
マウス脾細胞を、以前に記載されているように、６から８週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスから調製した１６。簡潔に述べると、マウス脾臓を取り出し、細かく刻み、漉した。赤血球を次に溶解させた。ＣＤ４＋細胞を、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたラット抗マウスＣＤ４抗体をＥａｓｙＳｅｐ  ＦＩＴＣ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に用いて採取し、純度を、フローサイトメトリーによって＞９５％であることを検証した。精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３ｍＡｂおよび５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ｍＡｂを用いて活性化させた。
【０３２９】
ａ）Ｔｒｅｇの分化については、培養培地に１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦ−β１または０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣ−Ｅｘｏを補った。６日後、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、およびマウスＦｏｘｐ３＋細胞として規定されるＴｒｅｇ細胞の数を、標準的な抗体染色技術を用いてＦＡＣＳによって決定した。
【０３３０】
ｂ）Ｔｈ１７の分化については、培養培地に２０ｎｇ／ｍｌのｒＩＬ−６および１ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦ−β１または０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣ−Ｅｘｏを補った。６日後、ＣＤ４＋細胞、ＩＬ１７ａ＋細胞として規定されるＴｈ１７細胞の数を、標準的な抗体染色技術を用いてＦＡＣＳによって決定した。
【０３３１】
ａおよびｂにおけるＴｒｅｇ細胞およびＴｈ１７細胞を、未処理細胞に対して正規化した。
【実施例２６】
【０３３２】
＜ＭＳＣエキソソームによる適応免疫の調節＞
ＭＳＣエキソソームはＴＨＰ−１細胞に対する大規模な活性化効果を与え、自然免疫は適応免疫応答の調節において重要な役割を有するため、本発明者らは、エキソソームが自然免疫に対するその影響を介して適応免疫を調節し得ると仮定した。この仮説を試験するために、本発明者らは、ある程度の修正を加えて、図１１において記載されている実験を反復した。Ｔｒｅｇ細胞またはＴＨ１７細胞へのＣＤ４＋Ｔ細胞の分化の間、Ｔ細胞を、６日間エキソソームに曝露されたＴＨＰ−１細胞と共にインキュベートした（図１２）。陽性対照として、Ｔ細胞を、それぞれＴＧＦ−β１またはｒＩＬ−６＋ＴＧＦ−β１と共にインキュベートした。ＭＳＣエキソソームに４８時間曝露されたＴＨＰ−１細胞は、Ｔｒｅｇ細胞へのＴ細胞の分化を誘発したが、ＴＨ１７細胞への分化は誘発せず、このことは、ＭＳＣエキソソームが、免疫抑制性であるが炎症性ではないＴ細胞応答を誘発し得ることを示唆している。
【実施例２７】
【０３３３】
＜自然免疫を介する適応免疫の調節＞
ＣＤ４＋マウスＴ細胞を、図１１において記載されているように精製および活性化した。
【０３３４】
ａ）Ｔｒｅｇの分化については、培養培地に１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦ−β１、ＴＨＰ−１細胞、または０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣエキソソームに４８時間曝露されたＴＨＰ−１細胞を補った。ＴＨＰ−１細胞は、１０００のＣＤ４＋マウスＴ細胞に対して１のＴＨＰ−１の割合で添加した。６日後、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、およびマウスＦｏｘｐ３＋細胞として規定されるＴｒｅｇ細胞の数を、標準的な抗体染色技術を用いてＦＡＣＳによって決定した。
【０３３５】
ｂ）Ｔｈ１７の分化については、培養培地に２０ｎｇ／ｍｌのｒＩＬ−６および１ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦ−β１、または０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣエキソソームに４８時間曝露されたＴＨＰ−１細胞を補った。ＴＨＰ−１細胞は、１０００のＣＤ４＋マウスＴ細胞に対して１のＴＨＰ−１の割合で添加した。６日後、ＣＤ４＋細胞、ＩＬ１７ａ＋細胞として規定されるＴｈ１７細胞の数を、標準的な抗体染色技術を用いてＦＡＣＳによって決定した。
【０３３６】
ａおよびｂにおけるＴｒｅｇ細胞およびＴｈ１７細胞を、未処理細胞に対して正規化した。
【実施例２８】
【０３３７】
＜ＭＳＣエキソソームのコンカナバリンＡで活性化されたリンパ球の増殖アッセイ＞
ＭＳＣエキソソームを、コンカナバリンＡで活性化されたリンパ球の増殖を阻害する能力によって評価することができる。図１３を参照されたい。
【０３３８】
マウス脾細胞を単離し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。ＣＦＳＥ標識した脾細胞を、５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の存在下または不存在下で、異なる濃度のＭＳＣエキソソーム（０．１、０．５、１、および４μｇ／ｍｌ）と共に３日間インキュベートした。
【０３３９】
ＭＳＣエキソソームを、以前に記載されているように調製した（以下のＬａｉら）。各治療群の蛍光細胞数を、ＦＡＣＳによって定量した。データを未処理対照に対して正規化し、３組の試料の平均（±ＳＤ）として表した。
【０３４０】
ＭＳＣ−Ｅｘｏは脾細胞の増殖に影響せず（ｐ＞０．０５）、４．０μｇ／ｍｌのＭＳＣ−Ｅｘｏは、ＣｏｎＡで刺激された脾細胞の増殖を有意に阻害した（＊ｐ＜０．０１）。
【０３４１】
Ｒ．Ｃ．Ｌａｉ、Ｆ．Ａｒｓｌａｎ、Ｍ．Ｍ．Ｌｅｅ、Ｎ．Ｓ．Ｓｚｅ、Ａ．Ｃｈｏｏ、Ｔ．Ｓ．Ｃｈｅｎ、Ｍ．Ｓａｌｔｏ−Ｔｅｌｌｅｚ、Ｌ．Ｔｉｍｍｅｒｓ、Ｃ．Ｎ．Ｌｅｅ、Ｒ．Ｍ．Ｅｌ  Ｏａｋｌｅｙ、Ｇ．Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ、Ｄ．Ｐ．ｄｅ  Ｋｌｅｉｊｎ、Ｓ．Ｋ．Ｌｉｍ、Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ＭＳＣ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、４（２０１０）２１４〜２２２を参照されたい。
【実施例２９】
【０３４２】
＜結論（実施例１９から２８について）＞
ＭＳＣエキソソームは、炎症性および抗炎症性の自然免疫応答を活性化し得るが、抑制適応免疫応答を、自然免疫系を介して間接的にのみ誘発し得る。これらは、炎症性適応免疫応答を直接的にも間接的にも活性化しない。
【０３４３】
したがって、ＭＳＣエキソソームは、自己免疫疾患、例えばＧＶＨＤ、クローン病、ＳＬＥ、１型糖尿病、多発性硬化症、ＡＬＳにおいて、組織の修復を増強させるため、および疾患の進行を阻害するために用いることができる。
【実施例３０】
【０３４４】
［参考文献（実施例１９から２９について）］
【表１２Ａ】
0006046640.tif 000015
【表１２Ｂ】
0006046640.tif 000016
【０３４５】
［参考文献］
【表１３Ａ】
0006046640.tif 000017
【表１３Ｂ】
0006046640.tif 000018
【表１３Ｃ】
0006046640.tif 000019
【表１３Ｄ】
0006046640.tif 000020
【表１３Ｅ】
0006046640.tif 000021
【０３４６】
出願手続き中の出願および特許のそれぞれ（「出願引用文献」）を含む、本明細書において言及される各出願および特許、ならびに上記の各出願および特許において引用または参照される各文献、ならびに各出願および特許といずれかの出願引用文献とにおいて引用または言及されるあらゆる製品についてのあらゆる製造者の指示またはカタログは、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書において引用される全ての文献、本明細書において引用される文献において引用または参照される全ての文献、および本明細書において引用または言及されるあらゆる製品についてのあらゆる製造者の指示またはカタログは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４７】
本発明の記載された方法および系の様々な修正および変更は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかとなろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求の範囲に記載された発明が、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されよう。実際、分子生物学または関連する分野の当業者に自明の、本発明を実施するための記載された態様の様々な修正は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【図１】
0006046640.tif 000022
【図２】
0006046640.tif 000023
【図３Ａ】
0006046640.tif 000024
【図３Ｂ】
0006046640.tif 000025
【図３Ｃ】
0006046640.tif 000026
【図３Ｄ】
0006046640.tif 000027
【図４Ａ】
0006046640.tif 000028
【図４Ｂ】
0006046640.tif 000029
【図５Ａ】
0006046640.tif 000030
【図５Ｂ】
0006046640.tif 000031
【図５Ｃ】
0006046640.tif 000032
【図６Ａ】
0006046640.tif 000033
【図６Ｂ】
0006046640.tif 000034
【図７】
0006046640.tif 000035
【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006046640.tif 000038
【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
0006046640.tif 000042