(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルス（Ni-CE株のGタンパク質の333位をアルギニン又はリジン以外のアミノ酸に置換したNi-CE変異株を除く。）。
【請求項２】
前記Nタンパク質の273位がロイシン、前記Nタンパク質の394位がヒスチジン、前記Gタンパク質の333位がグルタミン酸である請求項１記載の変異狂犬病ウイルス。
【請求項３】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するNタンパク質、及び、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するGタンパク質を構造タンパク質として含有する請求項１又は請求項２記載の変異狂犬病ウイルス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の変異狂犬病ウイルスを含有する狂犬病ワクチン製剤。
【請求項５】
請求項４記載のワクチン製剤を投与する、非ヒト動物の狂犬病予防・治療方法。
【請求項６】
培養細胞を用いて、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルス（Ni-CE株のGタンパク質の333位をアルギニン又はリジン以外のアミノ酸に置換したNi-CE変異株を除く。）を人工合成する工程を含む、狂犬病ワクチン製剤製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルス、このウイルスを含有する狂犬病ワクチン製剤、狂犬病予防・治療方法、狂犬病ワクチン製造方法、狂犬病ワクチン製剤製造のための使用などに関連する。
【背景技術】
【０００２】
狂犬病は、狂犬病ウイルスの咬傷などからの感染によって起こる人獣共通感染症である。治療法は未だに確立されておらず、発症した場合、重篤な神経症状を伴って、ほぼ100%死亡する。【０００３】
狂犬病ウイルスは非常に広い宿主域を有し、ヒトを含む全ての哺乳類に感染するとされている。発展途上国などでは犬が、先進国などではキツネ、アライグマ、スカンク、コウモリなどの野生動物が主な感染源となっており、現在でも、毎年50,000人以上が狂犬病で死亡していると推定されている。【０００４】
狂犬病は、ワクチン接種により予防できるとされ、現在、不活化狂犬病ワクチンが広く用いられている。しかし、不活化ワクチンの場合、充分な効果を得るためには多量の抗原が必要であり、ワクチンがコスト高になる。一方、弱毒生ワクチンは、不活化ワクチンよりも安価に製造できるが、安全性の懸念がある。そのため、特に発展途上国などで、ワクチンが充分に普及していない。【０００５】
狂犬病ウイルスはラブドウイルス科リッサウイルス属に分類される。ウイルス粒子は幅60〜110nm、長さ130〜250nmの弾丸状の形態を有し、Gタンパク質、Mタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質の5つの構造タンパク質を含む。ウイルスゲノムは、全長約12,000塩基、マイナス鎖一本鎖のRNAで、上流(3’末端側)より、N、P、M、G、Lの順で、5つの構造タンパク質をコードする遺伝子を含む。【０００６】
近年、狂犬病ウイルスの病原性決定因子の研究などの進展に伴い、Gタンパク質の333位のアミノ酸をアルギニン又はリジン以外のアミノ酸に置換することにより、ウイルスを弱毒化できることが明らかにされた(非特許文献１など参照)。また、Gタンパク質の333位のアミノ酸を弱毒型に置換したウイルスが、ヨーロッパなどにおいて、野生動物の経口免疫用の弱毒生ワクチンとして実際に用いられている(特許文献１など参照)。【０００７】
この弱毒変異型ウイルスについては、Gタンパク質の333位が弱毒型に変異していても、突然変異でGタンパク質の194位がリジンに変異することにより強毒化することが報告されている（非特許文献２参照）。このため、Gタンパク質の194位の突然変異による病原性復帰が懸念されており、Gタンパク質の333位のみの弱毒変異型ウイルスは安全性が必ずしも充分ではない。【０００８】
本発明者らは、狂犬病弱毒株のNi-CE株において、狂犬病のNタンパク質の273位と394位のアミノ酸が、RIG-I(Retinoic  acid-inducible  gene  I)を介した抗ウイルス応答及び病原性に重要であることを報告している（非特許文献３参照）。【０００９】
その他、非特許文献４及び非特許文献５は、後述するリバース・ジェネティクス法による狂犬病ウイルス変異株の人工合成に関する文献である。
【特許文献１】US2011/0064764  A1
【非特許文献１】Dietzschold  B  et  al,  “Characterization  of  an  antigenic  determinant  of  the  glycoprotein  that  correlates  with  pathogenicity  of  rabies  virus.”  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  80:70-74,  1983
【非特許文献２】Milosz  Faber  et  al,  “A  single  amino  acid  change  in  rabies  virus  glycoprotein  increases  virus  spread  and  enhances  virus  pathogenicity.”  Journal  of  Virology,  vol.79,No.22  p14141-14148.2005
【非特許文献３】Tatsunori  Masatani  et  al,  “Amino  acids  at  position  273  and  394  in  rabies  virus  nucleoprotein  are  important  for  both  evasion  of  host  RIG-I-mediated  antiviral  response  and  pathogenicity.”  Virus  Research  155(2011)168-174.
【非特許文献４】Naoto  Ito  et  al,  “Rescue  of  rabies  virus  from  cloned  cDNA  and  identification  of  the  pathogenicity-related  gene:  Glycoprotein  gene  is  associated  with  virulence  for  adult  mice.”  Journal  of  Virology  Vol.75,No.19  p9121-9128  2001.
【非特許文献５】Naoto  Ito  et  al,  “Improved  recovery  of  rabies  virus  from  cloned  cDNA  using  a  vaccinia  virus-free  reverse  genetics  system.”  Microbiol  Immunol.  2003;47(8):613-7.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の通り、狂犬病の弱毒生ワクチンは、不活化ワクチンよりも安価に製造できるが、病原性復帰などの安全性の懸念がある。そこで、本発明では、安全性が高く、有効かつ安価な狂犬病ワクチンを提供することなどを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、Gタンパク質の333位のアミノ酸が置換された弱毒化狂犬病ウイルスについて、Gタンパク質の333位に加えて、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸を変異導入することにより、免疫原性及び安全性を向上でき、かつGタンパク質の194位がリジンに変異した場合にも強毒化しないことを新規に見出した。【００１２】
そこで、本発明では、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルス、これらの変異狂犬病ウイルスを含有する狂犬病ワクチン製剤などを提供する。【００１３】
Gタンパク質の333位のアミノ酸に変異導入することにより狂犬病ウイルスを弱毒化するとともに、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸に変異導入することにより免疫原性を向上できる。また、Gタンパク質の333位に加えて、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸を変異導入することにより、Gタンパク質の333位にのみ変異を加えた場合と比較して、少ない接種量で充分な免疫効果を奏するため、接種量を少なくでき、より安全性を高めることができる。【００１４】
加えて、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸に変異導入することにより、Gタンパク質の194位がリジンに変異した場合にも強毒化を防止できるため、突然変異による病原性復帰が起こる可能性を低減でき、安全性をより高めることができる。【００１５】
従って、本発明は、変異狂犬病ウイルスを含有する狂犬病ワクチン製剤として有用であり、このワクチン製剤を投与することにより、狂犬病を有効に予防・治療できる。【００１６】
その他、この組換えウイルスは、培養細胞を用いて人工合成することもできるため、例えば、弱毒生ワクチンとして用いる場合には、比較的安価に狂犬病ワクチン製剤を製造できるという有利性がある。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、免疫原性を高めることができる。また、突然変異による病原性復帰などの安全性への懸念が少なく、効果的かつ安価な狂犬病ワクチンを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
＜本発明に係る変異狂犬病ウイルスについて＞
本発明は、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルスをすべて包含する。即ち、本発明は、ウイルスの作出手段などによって狭く限定されず、例えば、鶏胚及び／又は培養細胞などで継代して得られた変異ウイルス、クローンcDNAなどを用いて人工合成された変異ウイルスなども広く包含する。【００１９】
狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位のフェニルアラニンをそれ以外のアミノ酸に、Nタンパク質の394位のチロシンをそれ以外のアミノ酸に、Gタンパク質の333位のアルギニン又はリジンをそれ以外のアミノ酸にそれぞれ置換することにより、狂犬病ウイルスを弱毒化でき、免疫原性及び安全性を向上でき、かつ突然変異による病原性復帰などの危険性を低く抑えることができる。【００２０】
Nタンパク質の273位、Nタンパク質の394位、Gタンパク質の333位以外の部分のアミノ酸配列は、公知の狂犬病ウイルス株における配列と実質的に同一であればよく、特に限定されない。アミノ酸配列が公知の狂犬病ウイルス株として、例えば、CVS株、ERA株、西ヶ原株、HEP-Flury株、LEP-Flury株、SAD  Bern株、SAD  B19株などが挙げられる。なお、「実質的に同一」とは、該当領域のアミノ酸配列が、80〜100％、さらに好適には90〜100％の同一性を有するものをいう。【００２１】
Nタンパク質の273位のアミノ酸は、フェニルアラニン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されない。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、トリプトファン、アスパラギンサン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジンのいずれかが好適であり、バリン、ロイシン、イソロイシンのいずれかがより好適であり、ロイシンが最も好適である。【００２２】
Nタンパク質の394位のアミノ酸は、チロシン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されない。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギンサン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジンのいずれかが好適であり、アルギニン、リジン、ヒスチジンのいずれかがより好適であり、ヒスチジンが最も好適である。【００２３】
Gタンパク質の333位のアミノ酸は、アルギニン又はリジン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されない。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギンサン、グルタミン酸、ヒスチジンのいずれかが好適であり、グリシン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、グルタミン酸のいずれかがより好適であり、グルタミン酸が最も好適である。【００２４】
Nタンパク質の273位がロイシン、Nタンパク質の394位がヒスチジン、Gタンパク質の333位がグルタミン酸である変異狂犬病ウイルスとして、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するNタンパク質、及び、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するGタンパク質を構造タンパク質として含有する変異狂犬病ウイルスが挙げられる。【００２５】
＜本発明に係る狂犬病ワクチン製剤について＞
本発明は、上述の変異狂犬病ウイルスを少なくとも含有する狂犬病ワクチン製剤を全て包含する。【００２６】
本発明に係る変異狂犬病ウイルスは、弱毒生ワクチンと不活化ワクチンのいずれにも適用できるが、上述の通り、比較的安価に狂犬病ワクチン製剤を製造でき、かつワクチンとしての効果も高いという点から、弱毒生ワクチンとして用いる方がより好適である。【００２７】
ワクチンには、目的・用途などに応じて、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜添加してもよい。【００２８】
緩衝剤の好適な例として、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液などを用いることができる。【００２９】
等張化剤の好適な例として、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトールなどを用いることができる。【００３０】
無痛化剤の好適な例として、例えば、ベンジルアルコールなどを用いることができる。【００３１】
防腐を目的とした薬剤の好適な例として、例えば、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸、その他、各種防腐剤、抗生物質、合成抗菌剤などを用いることができる。【００３２】
抗酸化剤の好適な例として、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などを用いることができる。【００３３】
その他、この薬剤には、補助成分、例えば、保存・効能の助剤となる光吸収色素(リボフラビン、アデニン、アデノシンなど)、安定化のためのキレート剤・還元剤(ビタミンC、クエン酸など)、炭水化物(ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、シュークロース、グルコース、デキストランなど)、カゼイン消化物、各種ビタミンなどを含有させてもよい。【００３４】
ワクチン製剤の剤型などについては、公知のものを採用でき、特に限定されない。例えば、液体製剤として用いてもよいし、経口投与用に、凍結乾燥などの処置の後、餌などに混入させてもよい。【００３５】
一方、不活化ワクチン製剤として用いる場合、公知の方法、例えば、培養液に対し、物理的処理(紫外線照射、X線照射、熱処理、超音波処理など)、化学的処理(ホルマリン・クロロホルムなどによる有機溶媒処理、酢酸などの弱酸による酸処理、アルコール・塩素・水銀などによる処理)などにより、不活化を行うことができる。【００３６】
例えば、培養液にホルマリンを0.001〜2.0％、より好適には0.01〜1.0％の容量濃度で添加し、培養液を4〜30℃で、1〜3日間感作することにより、ホルマリンによる不活化を行うことができる。例えば、緩衝液などで不活化処理ウイルスを洗浄してホルマリンなどの不活化剤を除去したり、不活化処理ウイルスに中和剤を添加して中和したりしてもよい。また、膜ろ過や遠心分離などにより不活化処理ウイルスを回収してもよい。【００３７】
不活化ワクチンに含まれる不活化ウイルスの量は、特に制限はないが、例えば、不活化前のウイルスの量が103〜1011FFUの範囲が好適で、104〜1011FFUの範囲がより好適である。【００３８】
不活化ワクチン製剤として用いる場合、公知のアジュバントを添加してもよい。公知のアジュバントとして、例えば、動物油(スクアレンなど)又はそれらの硬化油、植物油(パーム油、ヒマシ油など)又はそれらの硬化油、無水マンニトール・オレイン酸エステル、流動パラフィン、ポリブテン、カプリル酸、オレイン酸、高級脂肪酸エステルなどを含む油性アジュバント、PCPP、サポニン、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸マンガン、可溶性酢酸アルミウム、サリチル酸アルミニウム、アクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、無水マレイン酸コポリマー、アルケニル誘導体ポリマー、水中油型エマルジョン、第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質などの水溶性アジュバント、水酸化アルミニウム(ミョウバン)、水酸化ナトリウムなどの沈降性アジュバント、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの微生物由来毒素成分、その他、ベントナイト、ムラミルジペプチド誘導体、インターロイキンなどが挙げられる。また、これらを混合したものでもよい。【００３９】
その他、このワクチン製剤は、他の疾患に対する一又は複数のワクチンとの混合ワクチン製剤であってもよい。【００４０】
＜本発明に係る狂犬病ワクチン製剤製造方法について＞
本発明は、培養細胞を用いて、上述の変異狂犬病ウイルスを人工合成する工程を含む狂犬病ワクチン製剤製造方法をすべて包含する。【００４１】
この変異狂犬病ウイルスは、リバース・ジェネティクス法により、培養細胞を用いて人工合成することもできるため、比較的安価に、かつロット差の少ないワクチン製剤を製造できる。【００４２】
まず、組換え狂犬病ウイルスのゲノム・プラスミドを作製する。【００４３】
狂犬病ウイルスの親株には、例えば、上述のものを用いることができる。狂犬病ウイルスの親株のゲノム全長cDNAのうち、Nタンパク質273位及び394位、並びにGタンパク質333位の三カ所のアミノ酸をコードする塩基配列に変異導入する。変異導入は、オーバーラップPCR法など、公知の点変異導入法により行うことができる。【００４４】
変異導入したcDNA断片を、制限酵素切断及びライゲーションなどにより、プラスミドベクターのマルチクローニングサイトに挿入する。その際、例えば、そのcDNA断片の上流域(3'末端側)にT7プロモーターの配列を、下流(5'末端)にD型肝炎ウイルスリボザイムをコードする塩基配列を配置することにより、T7  RNAポリメラーゼによって転写される人工プラス鎖ゲノムRNAの3'末端を本来のウイルスと同様の配列にすることができる。【００４５】
プラスミドベクターには、公知のものを用いることができ、特に限定されない。【００４６】
続いて、培養細胞にその組換え狂犬病ウイルスのゲノム・プラスミドをトランスフェクションし、培養上清に組換えウイルスを発現させる。トランスフェクションは、公知の方法を用いることができ、特に限定されない。また、培養細胞も、BHK細胞など、公知のものを広く用いることができるが、例えば、T7  RNAポリメラーゼによってウイルスを発現させる場合には、T7  RNAポリメラーゼ恒常発現している培養細胞を樹立して用いてもよい。【００４７】
組換え狂犬病ウイルスのゲノム・プラスミドをトランスフェクションする際には、ヘルパー・プラスミドとして、狂犬病ウイルスのNタンパク質を発現するプラスミド、同じくPタンパク質を発現するプラスミド、同じくLタンパク質を発現するプラスミドを同時にトランスフェクションすることにより、変異狂犬病ウイルスを効率的に合成できる。【００４８】
続いて、培養上清に発現した組換え狂犬病ウイルスを培養細胞に添加して、組換えウイルスを大量発現させる。その際に用いる培養細胞には、例えば、マウス神経芽細胞腫由来NA細胞、Vero細胞などを用いることができる。【００４９】
ウイルスの回収は、遠心分離・膜ろ過など、公知の方法により行うことができる。また、回収したウイルスをさらに培養細胞に添加することにより、組換えウイルスのスケールアップ、大量生産が可能になる。【００５０】
組換えウイルスを弱毒生ワクチンとして用いる場合には、例えば、回収したウイルスに、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜添加して製品化する。組換えウイルスを不活化ワクチンとして用いる場合には、例えば、公知の方法でウイルスを不活化した後、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜添加して製品化してもよい。【００５１】
＜本発明に係る狂犬病ワクチン製剤製造のためのウイルスの使用について＞
本発明は、上述の変異狂犬病ウイルスの、狂犬病ワクチン製剤製造のための使用をすべて包含する。【００５２】
狂犬病ワクチン製剤製造のために、この変異狂犬病ウイルスを使用することにより、病原性復帰などの安全性の懸念が少なく、ワクチン効果の高い狂犬病ワクチンを比較的安価にかつ大量に製造できる。【００５３】
＜本発明に係る狂犬病予防・治療方法について＞
本発明は、上述の変異狂犬病ウイルスを少なくとも含有する狂犬病ワクチン製剤を投与する処置を少なくとも含む狂犬病予防・治療方法をすべて包含する。【００５４】
本発明は、狂犬病に感染しうる動物、例えば、ヒト、及び、犬、ネコ、キツネ、アライグマ、スカンク、コウモリ、ネズミなどの非ヒト動物などに適用できる。【００５５】
例えば、健常な個体にこの狂犬病ワクチン製剤を投与して免疫することにより、狂犬病罹患を予防してもよいし、咬傷による狂犬病ウイルスの暴露を受けた直後から集中的にこの狂犬病ワクチン製剤を投与し、免疫反応を惹起させて狂犬病を治療してもよい。【００５６】
この狂犬病ワクチン製剤は、液剤を皮下・皮内・筋肉注射などにより投与してもよいし、野生動物などの場合では、餌などに混入させて経口投与してもよい。弱毒生ワクチンの製剤を用いる場合、皮下・皮内・筋肉注射などでは、例えば、一回当たり、103〜1011FFU、経口投与では、例えば、一回当たり、104〜1011FFU投与する。不活化ワクチンの製剤を用いる場合、皮下・皮内・筋肉注射などでは、例えば、一回当たり、ウイルス数で103〜1011個、経口投与では、例えば、一回当たり、ウイルス数で104〜1011個投与する。投与回数は、特に限定されないが、1回又は1週間〜3カ月間隔で数回が好適である。また、1年に1回以上の投与が好適である。
【実施例１】
【００５７】
実施例１では、リバース・ジェネティクス法により、組換え狂犬病ウイルスの人工合成を試みた。【００５８】
狂犬病ウイルスの強毒固定株の一つであるERA株のゲノム全長cDNAの上流域(3'末端側)にT7プロモーターの配列を、下流(5'末端)の直下にD型肝炎ウイルスリボザイムをコードする塩基配列をそれぞれ配置したcDNA断片をPCR法により増幅した。なお、D型肝炎ウイルスリボザイムのコード配列は、T7  RNAポリメラーゼによって転写される人工プラス鎖ゲノムRNAの3'末端を本来のウイルスと同様の配列にするために挿入した。【００５９】
制限酵素切断及びライゲーションにより、プラスミドベクターpUC19のマルチクローニングサイトにそのcDNA断片を挿入した。以上の手順で、ERA株のゲノム全長cDNAを保有するゲノム・プラスミド（以下、「ERA株ゲノム・プラスミド」とする。）を作製した。【００６０】
次に、ERA株のゲノム全長のうち、Nタンパク質273位及び394位、並びにGタンパク質333位の三カ所のアミノ酸がそれぞれロイシン、ヒスチジン、グルタミン酸に置換されるように塩基配列を変異させたcDNA断片を、ERA株ゲノム・プラスミドを鋳型とし、オーバーラップPCR法により増幅した(非特許文献４参照)。【００６１】
制限酵素切断及びライゲーションにより、ERA株ゲノム・プラスミド上におけるゲノム全長cDNAのコード領域を、変異させたゲノム全長cDNA断片に置き換えた。以上の手順で、ERA株のゲノム全長のうち、三カ所のアミノ酸配列を変異させた変異株(ERA-N273/394-G333株)のゲノム全長cDNAを保有するゲノム・プラスミド（以下、「ERA-N273/394-G333株ゲノム・プラスミド」とする。）を作製した（ERA-N273/394-G333株ゲノムの塩基配列については、配列番号3参照。）。【００６２】
その他、ERA株のゲノム全長のうち、Gタンパク質333位のアミノ酸をグルタミン酸に置換させた変異株(ERA- G333株)のゲノム全長cDNAを保有するゲノム・プラスミド（以下、「ERA-G333株ゲノム・プラスミド」とする。）についても、同様の手順で作製した。【００６３】
シークエンス解析を行った結果、目的の変異が各ゲノム・プラスミド上に存在することを確認した。【００６４】
続いて、これらのゲノム・プラスミドを用いて、各組換えウイルスの人工合成を試みた。【００６５】
まず、ヘルパー・プラスミドとして、狂犬病ウイルスのNタンパク質を発現するプラスミド、同じくPタンパク質を発現するプラスミド、同じくLタンパク質を発現するプラスミドを準備した(非特許文献５参照)。【００６６】
前日、T7  RNAポリメラーゼ恒常発現BHK細胞(以下、「BHK/T7-9細胞」とする。)を、24穴組織培養プレートに播種した。当日、BHK/T7-9細胞に、ゲノム・プラスミド(2μg/穴)、及び、3種類のヘルパー・プラスミド(各0.4、0.1、0.2μg/穴)をコトランスフェクションし、4〜5日間培養した後、その培養上清を回収し、-80℃で保存した。【００６７】
また、トランスフェクションしたBHK/T7-9細胞を固定した後、抗狂犬病ウイルスNタンパク質モノクローナル抗体で蛍光染色した。そして、蛍光シグナルの拡大を指標として、ウイルス変異株の存在を確認した。【００６８】
続いて、組換えウイルスのストック作製を試みた。【００６９】
回収した培養上清を添加してマウス神経芽細胞腫由来NA細胞を培養し、細胞変性効果により約50%の細胞が脱落した時点でその培養上清を回収した。その培養上清を遠心分離し、その上清をウイルス変異株のストックとして、-80℃で保存した。【００７０】
以上の手順で人工合成した組換えウイルスについて、ウイルス力価を測定した。【００７１】
24穴組織培養プレート上のNA細胞に、10倍段階希釈した各ウイルス液を100μL/穴接種した。37℃で1時間静置し、ウイルスを細胞に吸着させた後、細胞を洗浄した。0.5％メチルセルロースを含む培養液を細胞に加え、37℃で2日間培養した。感染細胞を固定した後、抗狂犬病ウイルスNタンパク質モノクローナル抗体で蛍光染色し、1穴当たりの蛍光フォーカス数をカウントした。ウイルス力価として、同一希釈の3穴に出現した平均フォーカス数に基づき、フォーカス形成単位(FFU;  Focus  forming  unit)/mLを算出した。
【実施例２】
【００７２】
実施例２では、組換えウイルス(ERA-N273/394-G333株)の増殖性を検討した。【００７３】
T-25培養フラスコにシートさせたVero細胞に、感染多重度=0.01の条件で、ERA株又はあるいはERA-N273/394-G333株を接種した。37℃で1時間静置し、ウイルスを細胞に吸着させた後、細胞を洗浄した。1フラスコ当たり7mLの培養液を細胞に加え、37℃で培養した。感染3、5、7、9、11日目に培養液をそれぞれ100μL回収し、実施例１と同様の手順でウイルス力価を測定した。【００７４】
その結果、Vero細胞におけるERA-N273/394-G333株のウイルス力価は、感染後7日目で1×106FFU/mL以上、感染後11日目で1×108FFU/mL以上であり、ERA株のウイルス力価とほぼ同等であった。この結果より、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、Nタンパク質273位及び394位、並びにGタンパク質333位の三カ所のアミノ酸を同時に変異しても、ウイルス増殖能は障害されないことが示された。
【実施例３】
【００７５】
実施例３では、組換えウイルス(ERA-N273/394-G333株)の免疫原性を検討した。【００７６】
104FFUのERA-G333株又はERA-N273/394-G333株を1群5匹のddYマウス（6週齢、雌）に筋肉内接種することにより免疫した。【００７７】
接種後2週目に免疫マウスから採血し、その血清を2倍希釈した後、56℃、30分間非動化した。次に、2倍階段希釈された血清（25μL）と、50%組織培養感染量の200倍に相当するCVS株を含むウイルス液（25μL）を混和させた。この混合液を4℃で一晩感作させることにより、希釈血清中の中和抗体をウイルスに感作させた。【００７８】
96穴組織培養プレート上にNA細胞浮遊液（3×105個/mL、0.1mL/穴）を播種し、血清-ウイルス混合液を接種した。細胞を37℃で3日間培養した。感染細胞を固定した後、抗狂犬病ウイルスNタンパク質モノクローナル抗体で蛍光染色し、ウイルス中和抗体価をReed  and  Munch法により計算した。同時に、国際獣疫事務局（OIE）から入手した標準血清(0.5国際単位[IU/mL])についても同様の測定を行い、中和抗体価を国際単位[IU/mL]に換算した。【００７９】
結果を図１に示す。図１は、ERA-N273/394-G333株でマウスに免疫した場合におけるマウス血清の中和抗体価を示すグラフである。図１中、横軸の「ERA-G333」はERA-G333株でマウスに免疫した場合の結果を、「ERA-N273/394-G333」はERA-N273/394-G333株でマウスに免疫した場合の結果をそれぞれ表わし、縦軸はマウス血清の中和抗体価(単位：IU/mL)を表す。【００８０】
図１に示す通り、104FFUの組換え狂犬病ウイルスを筋肉内接種することにより免疫した場合、ERA-N273/394-G333株では、全ての個体でマウス血清の中和抗体価が0.5IU/mL以上であり、ERA-G333株と比較して高い値であった。この結果より、ERA-N273/394-G333株はERA-G333株と比較して高い免疫原性を有していることが示された。
【実施例４】
【００８１】
実施例４では、組換えウイルス(ERA-N273/394-G333株)のED50(50%有効投与量)を検討した。【００８２】
102〜105FFUのERA-G333株又はERA-N273/394-G333株を1群5匹のddYマウス（6週齢、雌）に筋肉内接種することにより免疫した。接種後6週目に、50%致死量の25倍のワクチン検定用標準攻撃株(CVS株)を免疫マウスに脳内接種した。各マウスを14日間観察し、その生存率から、各株のED50(50%有効投与量)を算出した。【００８３】
結果を図２に示す。図２は、ERA-N273/394-G333株のED50(50%有効投与量)を示すグラフである。図２中、横軸の「ERA-G333」はERA-G333株の結果を、「ERA-N273/394-G333」はERA-N273/394-G333株の結果をそれぞれ表わし、縦軸はED50(50%有効投与量、単位：FFU)を表す。【００８４】
図２に示す通り、ERA-N273/394-G333株のED50(50%有効投与量)は5,000FFU以下であり、ERA-G333株と比較して約1/3量で同等の効果が得られた。【００８５】
この結果は、Gタンパク質の333位とNタンパク質の273位及び394位に変異を加えた株では、Gタンパク質の333位にのみ変異を加えた場合と比較して、免疫原性が向上することを示唆する。また、免疫原性の向上により、接種量を少なくしても同等の免疫効果を期待できるため、本結果は、接種量を少なくすることにより、結果として、より安全性を高めることができることを示唆する。【００８６】
以上、実施例３及び実施例４の結果より、ERA-N273/394-G333株が高い免疫原性と安全性を有すること、即ち、狂犬病に対する弱毒生ワクチンとして有用であることが示された。
【実施例５】
【００８７】
上述の通り、Gタンパク質333位のアミノ酸に変異を加えて狂犬病ウイルスを弱毒化した場合でも、Gタンパク質194位のアミノ酸がリジンに突然変異で置換した場合、ウイルスが強毒化し、病原性が復帰することが知られている。そこで、実施例５では、ERA-N273/394-G333株のGタンパク質194位のアミノ酸がリジンに変化した場合に、ウイルスの強毒化が起こるかどうかについて、検討した。【００８８】
ERA-N273/394-G333株ゲノム・プラスミド又はERA-G333株ゲノム・プラスミドに、実施例１と同様の方法で、Gタンパク質194位のアミノ酸がリジンに置換されるように変異導入した。そのゲノム・プラスミドを用いて、実施例１と同様の方法により、ERA株のゲノム全長のうち、上述の三カ所のアミノ酸配列とGタンパク質194位を変異させた変異ウイルス(ERA-N273/394-G194/333株)、及び、Gタンパク質333位及び194位のアミノ酸を変異させた変異ウイルス(ERA-G194/333株)を人工合成した。【００８９】
102〜10４FFUのERA-N273/394-G194/333株又はERA-G194/333株を1群5匹のddYマウス（6週齢、雌）に脳内接種した。各マウスを18日間観察し、その生存率の推移を調べた。【００９０】
結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａは、ERA-G194/333株を脳内接種した場合における生存率を表すグラフ、図３Ｂは、ERA-N273/394-G194/333株を脳内接種した場合における生存率を表すグラフである。両図中、横軸はウイルス接種後日数を、縦軸は生存率(%)を、各グラフはウイルスを投与しなかった場合(非感染)又はウイルスを102〜104FFU接種した場合の結果を、それぞれ表す。【００９１】
ERA-G194/333株を脳内接種した場合では、図３Ａに示す通り、102FFU接種した際の接種後17日における生存率が20%、103FFU接種した際の接種後17日における生存率が40%で、ウイルスの強毒化が起こっていたのに対し、ERA-N273/394-G194/333株を脳内接種した場合では、図３Ｂに示す通り、いずれの濃度でも、生存率が100%で、ウイルスの強毒化は観察されなかった。【００９２】
この結果は、ERA-N273/394-G333株では、Gタンパク質194位のアミノ酸が突然変異によりリジンに置換した場合でも、ウイルスが強毒化しないことを示し、Gタンパク質の333位に加えて、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸を変異導入することにより、Gタンパク質の194位がリジンに置換した場合にも強毒化しないこと、即ち、突然変異による病原性復帰の危険性が低いことを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】実施例３において、ERA-N273/394-G333株でマウスに免疫した場合におけるマウス血清の中和抗体価を示すグラフ。
【図２】実施例４において、ERA-N273/394-G333株のED50(50%有効投与量)を示すグラフ。
【図３Ａ】実施例５において、ERA-G194/333株を脳内接種した場合における生存率を表すグラフ。
【図３Ｂ】実施例５において、ERA-N273/394-G194/333株を脳内接種した場合における生存率を表すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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