(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNAi分子を含む、EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子の優性点突然変異が非小細胞肺癌の発症に関与している、優性アレル発現抑制剤であって、
前記RNAi分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、それぞれ配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４で示されるオリゴヌクレオチドペアからなる、前記優性アレル発現抑制剤。
【請求項２】
RNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む、EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子の優性点突然変異が非小細胞肺癌の発症に関与している、優性アレル発現抑制剤であって、
前記RNAi分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、それぞれ配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４で示されるオリゴヌクレオチドペアからなる、前記優性アレル発現抑制剤。
【請求項３】
RNAi分子がsiRNAである、請求項１または２に記載の抑制剤。
【請求項４】
RNAi分子がshRNAである、請求項１または２に記載の抑制剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項６】
製薬上許容可能な担体を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優性点突然変異を含む変異型アレルの発現を選択的に、かつ効果的に抑制することのできるRNAi分子を含む優性アレルの発現抑制剤、その発現抑制剤を含む医薬組成物、及びRNAi分子の設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化合物及び抗体と並ぶ新たな医薬又は診断薬として、生体内で特定の遺伝子の発現を制御する機能性核酸が注目され、その医療応用に向けての様々な研究及び開発が世界各国で進められている。【０００３】
機能性核酸には、RNAi（RNA interference: RNA干渉）を介した遺伝子サイレンシングによって標的遺伝子の発現を転写後に抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）及びmiRNA（micro RNA)や、転写因子等の標的物質と特異的に結合して、その機能を抑制する核酸アプタマー、標的mRNAに結合してその翻訳を抑制するアンチセンス核酸、転写因子結合ドメイン等の調節領域をデコイ配列として包含し、標的物質を捕捉することによりその転写因子による遺伝子発現を抑制するデコイDNA、標的遺伝子のmRNA前駆体におけるポリアデニル化を特異的に阻害して不安定化させた後、それを分解に導くU1アダプター等が知られている。いずれも次世代の医薬又は診断薬として期待されているが、中でもsiRNAやshRNAによるRNAiは、その標的特異性、応用性の広さ、及び作用効果の確実性から、所望の遺伝子発現を抑制できる強力な遺伝子発現制御ツールとして脚光を浴びている。【０００４】
RNAiの応用であるアレル特異的遺伝子サイレンシング（allele-specific RNAi: ASP-RNAi）は、所望のアレルの発現を特異的に抑制できることから、野生型アレルの発現に影響を及ぼすことなく、疾患を引き起こす変異アレルの発現のみを特異的に抑制できる。それ故、疾患治療法上極めて有用な方法と考えられている。【０００５】
例えば、常染色体優性遺伝疾患の一つとして知られる難治性の進行性骨化性線維異型症（Fibrodysplasia Ossificans Progressiva:FOP）は、原因遺伝子であるALK2（Activin-like kinase 2:アクチビン様キナーゼ２）遺伝子上の６１７番目のG（グアニン）がA（アデニン）に置換した点突然変異又は１０６７番目のGがAに置換した点突然変異によってもたらされる。これらの点突然変異のいずれかを有するアレルは、優性であるため、野生型ALK2遺伝子を持つヘテロ接合体であってもFOPを発症してしまうことが知られている（非特許文献１〜３）。しかしながら、この疾患の発症や進行を抑制する有効な方法は知られていない。これと同様のケースは、点突然変異に起因する他の多くの常染色体優性遺伝疾患においても見られる。ここで、ASP-RNAiにより、点突然変異を有する変異型アレルの発現のみを抑制し、野生型アレルの発現を許容することができれば、FOPをはじめとする常染色体優性遺伝疾患の発症を抑制することができ、また既に発症している患者であれば、その進行を阻止することが可能となる。【０００６】
しかし、上記のような点突然変異を有する変異型アレルと野生型アレルとでは、その遺伝子間の塩基配列は、わずか１〜数塩基しか相違しない。したがって、このようなASP-RNAiを実現させるためには、極めて特異性の高いsiRNA又はshRNAの開発が不可欠となってくる。その一方で、siRNA等の設計においては、点突然変異部位を含む周辺の塩基配列を標的領域としなければならないため、設計領域が必然的に制限される。それ故、公知の有効なsiRNAの標的配列選択方法を必ずしも適用することができず、その結果、特異性が高く、かつ効果的なsiRNA等を常に設計できないという問題があった。【０００７】
さらに、特異性の極めて高いsiRNA等を開発しようにもASP-RNAiによる変異型アレルと野生型アレルを的確に識別し、それぞれの発現抑制効果を定量的に評価することが困難であるという問題があった。【０００８】
非特許文献４では、ルシフェラーゼ遺伝子を利用したレポーターシステムを開示している。また、このシステムを用いて変異型アレルの発現抑制効果を定量化し、得られた結果に基づいてASP-RNAiをもたらすsiRNAの設計ガイドラインを提唱している。通常、ASP-RNAi効果を正確に評価する際には、野生型アレルと変異型アレルの正確な識別と的確な抑制が必要であり、そのためには野生型アレルと変異型アレルのそれぞれの発現抑制効果を同一細胞内で評価する必要がある。しかし、本文献で使用されたレポーターシステムは、変異型アレルの発現抑制のみを独立に検出するものであり、siRNAが野生型アレルに与える影響については十分な検証がなされていない。したがって、本文献のレポーターシステムを用いて得られたアレル特異的siRNAのガイドラインの精度と効果は、十分なものとは言い難かった。【０００９】
一方、本発明者らは、非特許文献５で基質特異性の高いホタル・ルシフェラーゼ（Photinus luciferase）遺伝子とウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子を用いたレポーターアレル評価システムを開発し、それを開示した。当該システムによれば、前記ルシフェラーゼ遺伝子の3’UTRに標的遺伝子である変異型アレルの配列と非標的遺伝子である野生型アレルの配列を挿入した発現ベクターをsiRNAと共に培養細胞に導入し、それぞれの発現ベクター由来のルシフェラーゼ活性を発光によって検出することで、該siRNAによる変異型アレルと野生型アレルのそれぞれの発現抑制効率を同一細胞内で、かつ特異的に定量化できる。したがって、当該レポーターアレル評価システムを利用することでASP-RNAi効果のより正確な評価やより高いsiRNA等の開発が可能となる。【００１０】
前記レポーターアレル評価システムを用いたASP-RNAi評価の具体例として、非特許文献６では、ヒトプリオン遺伝子の変異型アレルに対するsiRNAやshRNAの配列中に1ヵ所のミスマッチ変異を人為的に導入したものを設計し、塩基長やミスマッチ変異の位置を様々に変えた結果が記載されている。この文献の方法では、比較的顕著なASP-RNAi効果が得られている。しかしながら、実験に用いられた遺伝子は、ヒトプリオン遺伝子のみである。一般にRNAiは、標的遺伝子に対する標的塩基配列、すなわちsiRNAやshRNAが包含する標的遺伝子と相同な塩基配列によって、その効果が大きく左右される。したがって、ミスマッチ変異の導入により、ASP-RNAi効果を向上できたとしても、実験に用いたその標的塩基配列特有の効果である可能性が高く、一般性があるとは言い難い。それ故、非特許文献５の結果から、ASP-RNAi効果の高いsiRNAやshRNAの設計ガイドラインを導き出すには至らなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Shore EM., et al., 2006, Nature Genetics, Vol. 38: 525-527
【非特許文献２】Nakajima M., et al., 2007, Journal of Human Genetics, Vol.52: 473-475
【非特許文献３】Furuya H., et al., 2008, American Journal of Medical Genetics Part A, Vol. 146A: 459-463
【非特許文献４】Huang H., et al. 2009, Nucleic Acid Research, Vol. 37: 7560-7569
【非特許文献５】Ohnishi Y., et al., 2006, Journal of RNAi and Gene Silencing, Vol. 2: 154-160
【非特許文献６】Ohnishi Y., et al., 2008, PloS One, Vol. 3, Issue 5: e2248
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、野生型又は所望のアレルの発現を許容し、特定の優性アレルの発現のみを選択的かつ効果的に抑制することのできるRNAi分子を開発し、その設計ガイドライン及び当該RNAi分子を有効成分として含む優性アレル発現抑制剤の提供を目的とする。【００１３】
本発明は、優性アレルの発現により発症する遺伝性疾患を治療する治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定のアレルの発現を選択的、かつ効果的に抑制することが可能なsiRNA等の構造的一般法則性を見出した。すなわち、標的とする優性アレルの優性点突然変異を基準点として、該基準点から5’末端までの塩基長を所定の長さとなるように設定し、かつ該基準点から下流側の所定の位置に標的遺伝子の配列とは異なるミスマッチ塩基を一つ導入した構造を有するRNAi分子は、優性アレルの発現を選択的、かつ効果的に抑制する一方で、野生型アレルをはじめとする他方のアレルの発現に対しては、抑制効果をほとんど示さないことが明らかとなった。このような構造を有するRNAi分子は、塩基配列によることなく、いかなるアレルに対してもその効果を発揮し得ることも明らかとなった。したがって、当該構造は、ASP-RNAiの新規ガイドラインとなり得ると考えられた。本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、以下を提供する。【００１５】
（１）RNAi分子を含む、標的遺伝子の優性アレル発現抑制剤であって、前記RNAi分子がRNAiセンス鎖領域と、それに相補的な塩基配列からなるRNAiアンチセンス鎖領域を含み、ここで前記RNAiセンス鎖領域は優性点突然変異を少なくとも一つ含む連続する１６〜３０塩基のいずれか一の前記優性アレルのセンス鎖塩基配列に一致する塩基配列からなり、並びに前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の優性点突然変異から、上流側に向かって７〜１０番目のいずれか一の塩基がRNAi分子における5’末端塩基を構成し、かつ前記いずれか一の優性点突然変異から、下流側に向かって３〜８番目のいずれか一の塩基が前記優性アレルのセンス鎖塩基配列上の塩基とは唯一異なるミスマッチ塩基を有する、前記優性アレル発現抑制剤。【００１６】
（２）RNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む、標的遺伝子の優性アレル発現抑制剤であって、RNAiセンス鎖領域と、それに相補的な塩基配列からなるRNAiアンチセンス鎖領域を含み、ここで前記RNAi分子が優性点突然変異を少なくとも一つ含む連続する１６〜３０塩基のいずれか一の前記優性アレルのセンス鎖塩基配列に一致する塩基配列からなり、並びに前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の優性点突然変異から、上流側に向かって７〜１０番目のいずれか一の塩基がRNAi分子における5’末端塩基を構成し、かつ前記いずれか一の優性点突然変異から、下流側に向かって３〜８番目のいずれか一の塩基が前記優性アレルのセンス鎖塩基配列上の塩基とは異なるミスマッチ塩基を有する、前記優性アレル発現抑制剤。【００１７】
（３）5’末端塩基を構成する塩基が前記優性点突然変異から上流側に向かって７〜９番目のいずれか一の塩基である、（１）又は（２）に記載の抑制剤。【００１８】
（４）ミスマッチ塩基が前記優性点突然変異から下流側に向かって３〜５番目のいずれか一の塩基である、（１）〜（３）のいずれかに記載の抑制剤。【００１９】
（５）RNAi分子がsiRNAである、（１）〜（４）のいずれかに記載の抑制剤。【００２０】
（６）RNAi分子がshRNAである、（１）〜（４）のいずれかに記載の抑制剤。【００２１】
（７）優性点突然変異が機能獲得型である、（１）〜（６）のいずれかに記載の抑制剤。【００２２】
（８）前記優性点突然変異が疾患の発症に関与する、（１）〜（７）のいずれかに記載の抑制剤。【００２３】
（９）疾患が悪性新生物である、（８）に記載の抑制剤。【００２４】
（１０）悪性新生物が非小細胞肺癌であり、かつ標的遺伝子がEGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子である、（９）に記載の抑制剤。【００２５】
（１１）RNAi分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、それぞれ配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４で示されるオリゴヌクレオチドペアからなる、（１０）に記載の抑制剤。【００２６】
（１２）疾患が進行性骨化性線維異形成症であり、かつ標的遺伝子がALK2（アクチビン様キナーゼ２）遺伝子である、（８）に記載の抑制剤。【００２７】
（１３）RNAi分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、それぞれ配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０、配列番号３５及び３６、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０、配列番号４１及び４２、配列番号４３及び４４、及び配列番号９１及び９２で示されるオリゴヌクレオチドペアからなる群から選択される、（１２）に記載の抑制剤。【００２８】
（１４）疾患がハンチントン病であり、かつ標的遺伝子がハンチンチン遺伝子である、（８）に記載の抑制剤。【００２９】
（１５）RNAi分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、それぞれ配列番号５５及び５６、配列番号５７及び５８、配列番号５９及び６０、配列番号６１及び６２、配列番号６３及び６４、配列番号６７及び６８、及び配列番号６９及び７０で示されるオリゴヌクレオチドペアからなる群から選択される、（１４）に記載の抑制剤。【００３０】
（１６）（１）〜（１５）のいずれかに記載の抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物。【００３１】
（１７）製薬上許容可能な担体を含む、（１６）に記載の医薬組成物。【００３２】
（１８）標的遺伝子の優性アレルの発現を選択的に抑制するRNAi分子の設計方法であって、標的遺伝子の優性アレルの塩基配列上に存在する一の優性点突然変異部位を基準変異点として設定する工程、優性アレルの塩基配列上において前記基準変異点から上流側に向かって７〜１０番目のいずれか一の塩基を5’末端塩基として定める工程、設定した5’末端塩基を起点として下流側１６〜３０塩基長をRNAiセンス鎖領域として、優性アレルのセンス鎖塩基配列から選択する工程、選択したRNAiセンス鎖領域内において、前記基準変異点から下流側に向かって３〜８番目のいずれか一の塩基にミスマッチ塩基を導入する工程を含む、前記設計方法。【００３３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-139925号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の優性アレル発現抑制剤によれば、他のアレルの発現に大きな影響を及ぼすことなく、標的とする優性アレルの発現のみを選択的に、また効果的に抑制することが可能となる。【００３５】
本発明の優性アレル発現抑制剤の有効成分であるRNAi分子の設計方法によれば、疾患の原因となる優性点突然変異を基準点として設計が可能であり、かつ当該基準点の周辺の塩基配列に大きく影響されることがない、応用性の高い設計方法を提供できる。【００３６】
本発明の医薬組成物によれば、遺伝性疾患において、野生型アレルの発現を維持させながら疾患原因となる優性アレルの発現を選択的に抑制することにより、その疾患を治癒することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】RNAi分子の構造の概念図を示す。（A）二本鎖RNAi分子（siRNA）の場合及び（２）一本鎖RNAi分子（shRNA）の場合をそれぞれ示す。
【図２】RNAi分子の設計方法のフローを示す。破線で示すミスマッチ塩基導入工程（0204）は、当該工程を基準変異点設定工程（0201）、5’末端塩基設定工程（0202）又はRNAiセンス鎖領域選択工程（0203）のいずれの工程後に行なってもよいことを示す。
【図３】変異型ALK2-G356Dに対するALK2-G356D-siRNAのASP-RNAi効果を示す。Aは、各ALK2-G356D-siRNAを用いたときの識別比(プロット)及びASPスコア(棒グラフ)を示す。また、Bは、野生型の非標的ALK2（WT-ALK2）断片と変異型の標的ALK2(MT-ALK2)断片の発現を示すルシフェラーゼ発現量の相対値を示す。
【図４】変異型ALK2-R206Hに対するALK2-R206H-siRNAのASP-RNAi効果を示す。Aは、各ALK2-G356D-siRNAを用いたときの識別比(プロット)及びASPスコア(棒グラフ)を示す。また、Bは、野生型の非標的ALK2配列（WT-ALK2）断片と、変異型の標的ALK2配列(MT-ALK2) 断の発現を示すルシフェラーゼ発現量の相対値を示す。
【図５】全長の野生型及び変異型ALK2に対するタンパク質レベルでのALK2-R206H-siRNA及びALK2-G356D-siRNAのASP-RNAi効果を示す。A及びCは、ウェスタンブロッティングの結果であり、B及びDは、それぞれA及びCのバンドを数値化したものである。A及びBにおけるMTは、R206Hの点突然変異を含むALK2を示し、C及びDにおけるMTは、G356Dの点突然変異を含むALK2を示す。図中、**は、統計学的有意性（ｐ<0.01）がみられることを、また、n.s.は、統計学的有意性がみられない（not statistically significant）ことを、示す。siControlは、RNAiを誘導しないコントロールsiRNA（QIAGEN社）である。
【図６】変異型HTTに対するHTT-siRNAのASP-RNAi効果を示す。Aは、各HTT-siRNAを用いたときの識別比(プロット)及びASPスコア(棒グラフ)を示す。また、Bは、野生型の非標的HTT断片と変異型のHTT断片の発現を示すルシフェラーゼ発現量の相対値を示す。
【図７】全長の野生型及び変異型HTTに対するタンパク質レベルでのHTT-siRNAのASP-RNAi効果を示す。
【図８】変異型EGFRに対するEGFR-siRNAのASP-RNAi効果を示す。Aは、各EGFR-siRNAを用いたときの識別比(プロット)及びASPスコア(棒グラフ)を示す。また、Bは、野生型EGFR（T790T）断片と変異型EGFR（T790M）断片の発現を示すルシフェラーゼ発現量の相対値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
１．優性アレル発現抑制剤
１−１．概要
本発明の第１の実施形態は、優性アレルの発現抑制剤である。本発明の抑制剤は、RNAi分子及び／又はそれをコードする発現ベクターを有効成分として含み、そのRNAi分子が、優性アレルを標的としてその発現を選択的に抑制することを特徴とする。
【００３９】
１−２．RNAi分子の構成
本明細書において、「RNAi分子」とは、生体内においてRNA干渉を誘導し、標的とする遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を転写後翻訳前に抑制（サイレンシング）することができる分子をいう。RNAi機構を介して遺伝子の発現を抑制できる分子であれば、一本鎖分子又は二本鎖分子のいずれであってもよい。例えば、siRNAのような二本鎖分子、shRNA又はmiRNAのような一本鎖分子が挙げられる。RNA干渉については、例えば、Bass B.L., 2000, Cell, 101, 235-238；Sharp P.A., 2001, Genes Dev., 15 ,485-490；Zamore P.D., 2002, Science, 296, 1265-1269；Dernburg ,A.F. & Karpen, G.H., 2002, Cell, 111,159-162を参照されたい。なお、本明細書では、RNAi機構を介した転写後の遺伝子サイレンシングを、以下、「遺伝子の発現抑制」として表す。
【００４０】
本明細書において、RNAi分子は、核酸からなる。ここでいう「核酸」とは、天然型核酸、非天然型核酸及び／又は核酸類似体をいう。
【００４１】
本明細書において、「天然型核酸」とは、ヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した自然界に存在する生体高分子をいう。通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したRNA及び／又はアデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したDNAが該当する。本発明のRNAi分子では、特に、RNAが主な構成成分であることが好ましい。
【００４２】
本明細書において、「非天然型核酸」とは、非天然型ヌクレオチドを含む又はそれからなる核酸をいう。ここで「非天然型ヌクレオチド」とは、人工的に構築された又は人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドであって、前記天然に存在するヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオチド、又は天然に存在するヌクレオシド若しくは塩基に類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオシド若しくは塩基を含むヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシドが挙げられる。さらに、置換五単糖（2'-O-メチルリボース、2'-デオキシ-2'-フルオロリボース、3'-O-メチルリボース、1'，2'-デオキシリボース）、アラビノース、置換アラビノース糖；置換六単糖及びアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。また、非天然型ヌクレオチドは、人工的に構築された塩基類似体又は人工的に化学修飾された塩基（修飾塩基）を包含するヌクレオチドも含む。「塩基類似体」には、例えば、2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、5位置換-2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-オキサゾリル）プリン-9-イル基等が挙げられる。「修飾塩基」には、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-メチル型DNA/RNA等の化学修飾核酸や核酸類似体も含むこともできる。
【００４３】
本明細書において「核酸類似体」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された化合物をいう。例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が挙げられる。
【００４４】
また、本発明のRNAi分子を構成する核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖及び／又は塩基が核酸用標識物質で標識されていてもよい。核酸用標識物質は、当該分野で公知のあらゆる物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。
【００４５】
「アレル（アレル：allele）」とは、対立遺伝子とも呼ばれ、原則としてゲノム上の相同の遺伝子座に存在する遺伝子多型を構成する個々の遺伝子をいう。ただし、同一遺伝子の多型であれば、必ずしも相同する遺伝子座に存在する必要はなく、転座や重複によって他の遺伝子座に存在していてもよい。本発明において、アレルは、ゲノム上に先天的に存在するものの他、変異により後天的に獲得されたものも含む。さらに、各アレルは、個体を構成する全ての細胞中に存在する必要はなく、個体における一部の細胞、組織又は器官にのみ存在してするものであってもよい。例えば、一の個体において、正常細胞中には存在せず、癌細胞中にのみ存在する変異型アレルが挙げられる。
【００４６】
本明細書において「優性アレル」とは、個体においてそのアレルに基づく形質が表現型として顕在化するものをいう。例えば、二倍体の常染色体上における異なる２つのアレルの場合、その形質が個体に現れるいずれか一方のアレルが該当する。そのアレルが正常機能を有するタンパク質をコードしているか否かは問わない。例えば、一方が機能異常のタンパク質をコードし、他方が正常機能するタンパク質をコードするアレルであっても、機能異常のタンパク質による異常な機能が正常機能するタンパク質の機能を凌駕するか又は阻害することによって、結果的にその個体における当該タンパク質の機能がその異常な表現型として現れる場合には、機能異常のタンパク質をコードするアレルが優性アレルとなる。このような具体例としては、常染色体優性遺伝性疾患の原因となるアレルが挙げられる。
【００４７】
本明細書で「点突然変異」とは、野生型アレルの塩基配列と比較したときに、対応する塩基配列上に見られる一塩基置換をいう。ここでいう「野生型アレル」とは、同種遺伝子のアレル集団内において自然界に最も多く存在し、かつそれがコードするタンパク質がそのタンパク質本来の機能を有するものをいう。点突然変異には、通常、プリン間又はピリミジン間の置換であるトランジション変異、又はプリンとピリミジン間の置換であるトランスバージョン変異があるが、本発明においてはいずれの変異であってもよい。また、本発明の点突然変異は、先天的に存在する変異及び後天的に獲得された変異のいずれであってもよい。さらに、点突然変異は、その変異によってアミノ酸の置換をもたらすミスセンス変異、縮重コドンへの置換であって、アミノ酸置換を生じないサイレント変異、終止コドンをもたらすナンセンス変異及びスプライス部位の変異が知られるが、本発明のRNAi分子の点突然変異に関しては、ミスセンス変異、ナンセンス変異又はスプライス部位の変異が好ましい。
【００４８】
「優性点突然変異」とは、そのアレルに優性形質をもたらす点突然変異、又は優性突然変異と連鎖した同―転写産物内の点突然変異をいう。優性突然変異と連鎖した同―転写産物内の点突然変異には、例えば、優性形質をもたらすトリプレットリピート病に代表される異常伸長したトリプレットリピート繰り返し配列等の優性突然変異と連鎖した一塩基多型（SNP）部位が該当する。本発明では、優性点突然変異の特性に特に制限はない。例えば、優性形質をもたらす点突然変異であれば、機能獲得型変異（gain of function mutation）又は機能喪失型変異（loss of function mutation）が挙げられる。機能獲得型変異は、タンパク質に量的上昇（過剰発現：overexpression）又は活性上昇（構成的活性化：constitutive active又は機能亢進型：hyper active）を示す形質をもたらすハイパーモルフ変異（hypermorph mutation）、新規機能活性を示す形質をもたらすネオモルフ変異（neomorph mutation）、及び野生型アレル由来のタンパク質と拮抗又はそれを抑制し、野生型アレルの形質発現を抑制するアンチモルフ変異（antimorph mutation: dominant negative）を含む。また、機能喪失型変異は、アレルが形質発現能を完全に失ったアモルフ変異（amorph mutation）及びアレルの形質発現能の低下をもたらすハイポモルフ変異（hypomorph mutation）が挙げられる。ただし、機能喪失型変異の場合、その効果が優性となるものに限る。好ましくは機能獲得型の優性点突然変異である。また、優性突然変異と連鎖した同―転写産物内の点突然変異であれば、特段の制限はなく、例えば、SNPにおける縮重変異のようなアミノ酸置換をもたらさない変異であってもよい。標的とする優性アレルの塩基配列上には、優性点突然変異は、一個又は複数個存在しても構わない。
【００４９】
本実施形態において、標的となる遺伝子の種類、及びその遺伝子が由来する生物種は、特に限定はしない。優性点突然変異を含む優性アレルであれば、あらゆるタンパク質をコードする遺伝子が本実施形態の抑制剤の標的となり得る。また、生物種は、動物、植物のいずれであってもよく、それらのあらゆる種類を包含する。動物であれば、好ましくは脊椎動物、より好ましくは魚類、鳥類又は哺乳動物である。魚類の中でさらに好ましくは水産資源用魚種（例えば、サケ科、スズキ科、タラ科、ニシン科、ヒラメ科、カレイ科、アジ科、イカナゴ科、タイ科及びメバル科の魚種）である。鳥類の中でさらに好ましくは食用種（例えば、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、カモ、合鴨、七面鳥、ウズラ、ダチョウ等）である。哺乳動物の中でさらに好ましくは家畜（ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）、実験用動物（げっ歯類、ウサギ、イヌ、サル）、競争馬、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ、サル、げっ歯類）又はヒトである。一層好ましい生物種は、ヒトである。一方、植物であれば、好ましくは種子植物、より好ましくは被子植物、さらに好ましくは食用植物種（例えば、イネ科、マメ科、ナス科、ヒルガオ科、バラ科、アブラナ科、アカザ科、セリ科、タデ科、ウリ科、キク科、ユリ科、サトイモ科、ブドウ科、ミカン科、ブナ科、ヤシ科等に属する食用の植物種）、繊維資源用植物種（例えば、ワタ、アサ等）、木材資源用植物種（例えば、スギ、ヒノキ、モミ、ツガ、マツ、イチイ、サクラ、カエデ、カシ、ナラ、ブナ、ニレ、ケヤキ、クルミ、ホウ、カツラ、チーク、ラワン、黒檀、マホガニー、ポプラ、ユーカリ等）である。
【００５０】
前記優性点突然変異が関与する形質も、特に限定はしないが、好ましくはその発現を抑制したい形質である。例えば、疾患の発症に関与する変異、異常形態に関与する変異等が挙げられる。ここでいう疾患は、例えば、前述の常染色体優性変異疾患であって、その変異が点突然変異によるものや、後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた点突然変異によるものを含む。より具体的には、ヒト常染色体優性変異疾患であれば、例えば、ハンチンチン遺伝子の変異を原因とするハンチントン病、ALK2（アクチビン様キナーゼ２）遺伝子の変異を原因とする進行性骨化性線維異形成症（FOP）、トランスサイレチン遺伝子の変異を原因とする家族性アミロイドポリニューロパチー、LDL受容体（LDL-R）遺伝子の変異を原因とする家族性高コレステロール血症（FH）、HNF-4α遺伝子（MODY1）、グルコキナーゼ遺伝子（MODY2）及びHNF-1α遺伝子（MODY3）の各変異を原因とする若年発症成人型糖尿病（MODY）、フィブリン１遺伝子の変異を原因とするマルファン（Marfan）症候群、ミオトニンキナーゼ遺伝子の変異を原因とする優性進行性筋ジストロフィー症、コラーゲン１型遺伝子の変異を原因とする優性骨形成不全症、ロドプシン遺伝子又はペリフェン／RDS遺伝子の変異を原因とする優性網膜色素変性症、アクアポリン（AQP0）遺伝子の変異を原因とする優性先天性白内障、TSC1又はTSC2遺伝子の変異を原因とする結節性硬化症、PKD1遺伝子又はPKD2遺伝子の変異を原因とする優性多発性嚢胞腎（ADPKD）、ケラチン遺伝子、ロリクリン遺伝子、デスモグレイン１遺伝子又はデスモブラキン遺伝子の変異を原因とする遺伝性手掌角皮症、APC遺伝子の変異を原因とする家族性大腸ポリポーシス、Rb遺伝子の変異を原因とする網膜芽細胞腫、NF1遺伝子の変異を原因とする神経線維腫等が挙げられる。また、後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた点突然変異による疾患には、新生物（腫瘍）、特に悪性新生物（悪性腫瘍、いわゆる癌）が挙げられる。より具体的な例としては、上皮成長因子受容体（EGFR）遺伝子の変異を原因とする非小細胞肺癌（NSCLC）、K-ras遺伝子の変異を原因とする膵臓癌や大腸癌、RET遺伝子の変異を原因とする甲状腺髄様癌がある。
【００５１】
１−３．RNAi分子の構造
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子の構造における概念図を図１に示す。この図で示すように、RNAi分子は、二本鎖分子（図１A）又は一本鎖分子（図１B）を包含する。
【００５２】
（RNAi分子共通構成要素）
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子は、一本鎖分子又は二本鎖分子のいずれの場合にもRNAiセンス鎖領域（0101）、RNAiアンチセンス鎖領域（0102）及びミスマッチ塩基（0103）を必須の構成要素として含む。以下、RNAi分子に共通する構成要素について説明をする。
【００５３】
「RNAiセンス鎖領域」（0101）とは、後述するミスマッチ塩基を除いて優性アレルのセンス鎖塩基配列に一致する塩基配列であって、その塩基配列内に優性アレルの優性点突然変異（0104）を少なくとも一つ含む。ただし、本実施形態のRNAi分子は、前述のように、主としてRNAで構成されることから、優性アレルのセンス鎖塩基配列上のT（チミン）に相当する塩基は、原則としてU（ウラシル）となる。また、優性アレルのセンス鎖塩基配列に一致する塩基長は、連続する１６〜３０塩基、１８〜２５塩基又は１９〜２３塩基である。RNAiセンス鎖領域は、少なくとも優性点突然変異部位（0104）において、前記優性アレルに対応する野生型アレルの塩基配列とは異なる。RNAiセンス鎖領域は、優性アレルのセンス鎖塩基配列に含まれる優性点突然変異を少なくとも一つ含んでいれば、前記塩基長の範囲内においてセンス鎖塩基配列上のいずれの配列と一致していてもよい。
【００５４】
RNAi分子は、RNAiセンス鎖領域において、前記RNAiセンス鎖領域上のいずれかの一の優性点突然変異（以降、この優性点突然変異を「基準変異点」と呼ぶ）（0104）から、上流側に向かって７〜１０番目の塩基がRNAiセンス鎖領域の5’末端塩基に相当することを特徴とする。換言すれば、RNAiセンス鎖領域における基準変異点の位置は、5’末端から８〜１１番目となる。RNAiセンス鎖領域が優性点突然変異を二以上含む場合、基準変異点はそれらのうちのいずれであってもよい。本実施形態のRNAi分子が二本鎖分子（図１A）の場合、RNAiセンス鎖領域の前記5’末端塩基は、RNAiセンス鎖領域を含む一方の鎖（ポリヌクレオチド鎖）の5’末端塩基と一致する（図１A）。また、本実施形態のRNAi分子が一本鎖分子（図１B）の場合、RNAiセンス鎖領域の5’末端塩基は、その一本鎖分子の5’末端塩基と一致する（図１B）。このRNAiセンス鎖領域における基準変異点から5’末端塩基までの距離が、本実施形態のRNAi分子の構成上必須の構成要件となる。
【００５５】
「RNAiアンチセンス鎖領域」（0102）とは、前記RNAiセンス鎖領域（0101）に完全に相補的な塩基配列である。したがって、その塩基配列中には、前記基準変異点に相補的な塩基及び後述するミスマッチ塩基に相補的な塩基を含む。また、RNAiセンス鎖領域のA（アデニン）に相補する塩基は、Uとなる。
【００５６】
RNAiアンチセンス鎖領域は、本実施形態のRNAi分子が二本鎖分子（図１A）の場合には、RNAiセンス鎖領域を含むポリヌクレオチド鎖とは異なる他方のポリヌクレオチド鎖に含まれるが、一本鎖分子（図１B）の場合には、RNAiセンス鎖領域と同一のポリヌクレオチド鎖に含まれる。
【００５７】
「ミスマッチ塩基」（0103）とは、前記優性アレルのセンス鎖塩基配列上の塩基とは唯一一致しない、すなわち、ミスマッチするRNAiセンス鎖領域上の塩基であって、かつ、優性アレルのアンチセンス鎖塩基配列上の対応する塩基とも塩基対合のできない塩基である。例えば、優性アレルのアンチセンス鎖塩基配列上の対応する塩基がAであれば（この場合、優性アレルのセンス鎖塩基配列上の本来の塩基はTである）ミスマッチ塩基は、Aと塩基対合できないA、G（グアニン）又はC（シトシン）である。優性アレルのアンチセンス鎖塩基配列上の対応する塩基がTであれば（この場合、優性アレルのセンス鎖塩基配列上の本来の塩基はAである）ミスマッチ塩基は、Tと塩基対合できないU又はCである。また、優性アレルのアンチセンス鎖塩基配列上の対応する塩基がGであれば（この場合、優性アレルのセンス鎖塩基配列上の本来の塩基はCである）ミスマッチ塩基は、Gと塩基対合できないG又はAである。さらに、優性アレルのアンチセンス鎖塩基配列上の対応する塩基がCであれば（この場合、優性アレルのセンス鎖塩基配列上の本来の塩基はGである）ミスマッチ塩基は、Cと塩基対合できないC、A又はUである。
【００５８】
ミスマッチ変異は、RNAiセンス鎖領域上の所定の位置に存在する。この所定の位置は、前記基準変異点を０番目とした時に下流側に向かって３〜８番目、好ましくは３〜５番目及び７〜８番目、より好ましくは３〜５番目のいずれか一の塩基である。ただし、RNAiセンス鎖領域の3’末端にミスマッチ塩基が位置することはない。
【００５９】
（二本鎖RNAi分子の構成要素）
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子がsiRNAのような二本鎖分子の場合、前記図１Aに示すように、上記RNAi分子共通構成要素であるRNAiセンス鎖領域（0101）、RNAiアンチセンス鎖領域（0102）及びミスマッチ塩基（0103）に加えて、さらにそれぞれのポリペプチド鎖の3’末端に3’末端付加塩基（0105）を含むことができる。「3’末端付加塩基」（0105）は、TT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）の２塩基で構成される。この塩基を付加したRNAi分子は、RNAi抑制効率を高めることができる（Tuschl T et al., 1999, Genes Dev, 13(24):3191-7）。
【００６０】
（一本鎖RNAi分子の構成要素）
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子がshRNAのような一本鎖分子の場合、前記図１Bに示すように、上記RNAi分子共通構成要素であるRNAiセンス鎖領域（0101）、RNAiアンチセンス鎖領域（0102）及びミスマッチ塩基（0103）に加えて、さらにRNAiセンス鎖領域（0101）とRNAiアンチセンス鎖領域（0102）とを連結する短いスペーサ配列（0106）を含む。スペーサ配列は、通常３〜２４塩基、好ましくは、４〜１５塩基からなる自己塩基対合しない任意の塩基配列とすることができる。したがって、RNAi分子が一本鎖の場合、分子全体として、３５塩基（１６×２＋３）〜８４塩基（３０×２＋２４）からなる。RNAi分子内では、RNAiセンス鎖領域とRNAiアンチセンス鎖領域が互いに塩基対合し、その間に位置するスペーサ配列がループ構造を形成することによって、分子全体がヘアピン型のステム−ループ構造をなす。前記構造を有する一本鎖RNAi分子が細胞内に導入されると、細胞質内でDicerと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによって二本鎖siRNAに加工され、そのうちRNAiアンチセンス鎖領域がRISC（RNA-induced silencing complex）複合体に取り込まれた後、前述の二本鎖RNAi分子と同様のRNAi機構によって標的遺伝子の転写後翻訳前発現を抑制することができる。
【００６１】
１−４．発現ベクターの構成
本明細書において「発現ベクター」とは、本実施形態の阻害剤に含まれる有効成分であって、前記RNAi分子をコードするDNAを発現可能なように発現用ベクター内に挿入したベクターである。
【００６２】
本実施形態の発現ベクターは、RNAi分子がsiRNAのような二本鎖分子の場合、RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域のそれぞれをコードするDNA断片を、異なる二つの発現用ベクターに挿入していてもよく、また一つの発現用ベクター内に独立に発現制御されるDNA断片として挿入していてもよい。一方、RNAi分子がshRNAのような一本鎖分子の場合、当該一本鎖RNA分子をコードするDNA断片が発現用ベクター内の所定の位置に挿入されていればよい。
【００６３】
本明細書において、「発現用ベクター」とは、本実施形態の発現ベクターにおける骨格部分、すなわち、本実施形態の発現ベクターにおいて実施形態１のRNAi分子をコードするDNA断片以外の部分をいう。発現用ベクターの種類は、特に限定はしないが、プラスミド又はウイルスが好ましい。これらは、導入する宿主に応じて適宜選択すればよい。例えば、導入する宿主がヒトの場合には、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス、あるいは非ウイルスベクターを基礎とするベクターのような公知の発現ベクターを使用することができる。また、導入する宿主が植物の場合には、pBI系若しくはpRI系のバイナリーベクター等のプラスミドやカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメゴールデンモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等のウイルスを利用することができる。さらに、導入する宿主が大腸菌の場合には、例えば、pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系（stratagene社）等のプラスミドを利用することができる。この他、各ライフサイエンスメーカーから市販されている様々な各種宿主用発現ベクターを利用してもよい。
【００６４】
前記発現用ベクターは、プロモータ、エンハンサ、若しくはターミネータのような調節領域、又は選抜マーカー遺伝子のような標識領域を含むことができる。それぞれの種類は、特に限定されない。発現ベクターを導入する宿主に応じて当該分野で公知のものを適宜選択すればよい。
【００６５】
大腸菌中で動作可能なプロモータとしては、例えば、lac、trp若しくはtacプロモータ又はファージ由来のT7、T3、SP6、PR若しくはPLプロモータ等が挙げられる。酵母で動作可能なプロモータとしては、例えば、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、TPI1、ADH2-4cプロモータ等が挙げられる。植物細胞で動作可能なプロモータとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモータ、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモータ（Pnos）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモータ、イネ由来のアクチンプロモータ、タバコ由来PRタンパク質プロモータ等が挙げられる。昆虫細胞で動作可能なプロモータとしては、例えば、ポリヘドリンプロモータ、P10プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、バキュロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモータ等が挙げられる。そして、ヒトをはじめとする動物細胞内で動作可能なプロモータとしては、RNAポリメラーゼII(PolII)系のプロモータやRNAポリメラーゼIII(Pol III)系のプロモータが好適に用いられる。好ましくは、Pol III系のプロモータ、特に好ましくはU6及びH1等のプロモータである。また、いずれの宿主の場合にも、生体内の特定の部位でのみ発現を誘導する部位特異的プロモータを使用することもできる。なお、異なる二つの発現用ベクターのそれぞれにRNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域をコードするDNA断片を挿入した場合、各RNA鎖が同程度の量で発現するように、プロモータは、同一のプロモータ又は同程度の発現活性を有する異なるプロモータを用いることが好ましい。
【００６６】
１−５．RNAi分子の設計と製造
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子の設計方法について説明をする。本設計方法は、図２で示すように、基準変異点設定工程（0201）、5’末端塩基設定工程（0202）、RNAiセンス鎖領域選択工程（0203）、ミスマッチ塩基導入工程（0204）及びRNAiアンチセンス鎖領域設定工程（0205）を含む。基準変異点設定工程、5’末端塩基設定工程RNAi、センス鎖領域選択工程及びRNAiアンチセンス鎖領域設定工程は、この順序で進めるが、ミスマッチ塩基導入工程は、基準変異点設定工程、5’末端塩基設定工程又はRNAiセンス鎖領域選択工程のいずれの工程後に行なってもよい。以下、それぞれの工程について説明をする。
【００６７】
「基準変異点設定工程」（0201）とは、標的遺伝子の優性アレルにおいて、その塩基配列中に存在する一の優性点突然変異部位を基準変異点として定める工程である。優性アレル中に優性点突然変異部位が１塩基のみの場合には、その塩基が基準変異点となる。また、優性アレルにおいて優性点突然変異部位が２塩基以上存在する場合には、いずれか一の塩基を基準変異点として選択すればよい。望ましくは、その選択によって必然的に定まるRNAiセンス鎖領域内のGC含有量が、20〜80％、好ましくは30〜70％、より好ましくは40〜60％となるような優性点突然変異部位である。
【００６８】
「5’末端塩基設定工程」（0202）とは、優性アレルの塩基配列上の基準変異点から上流側に向かって７〜１０番目の塩基をRNAiセンス鎖領域の5’末端塩基として定める工程である。前述のように、本工程で定めた5’末端塩基が、二本鎖RNAi分子の場合にはRNAiセンス鎖領域を含むポリヌクレオチド鎖側の、また一本鎖RNAi分子の場合には当該分子の、5’末端塩基となる。したがって、本工程によりRNAi分子の一方の端部が決定される。
【００６９】
「RNAiセンス鎖領域選択工程」（0203）とは、前記5’末端塩基設定工程で5’末端塩基として定めた優性アレルの塩基配列上の塩基を起点として下流１６〜３０塩基の塩基配列をRNAiセンス鎖領域として優性アレルのセンス鎖塩基配列から選択する。本工程によってRNAi分子の優性アレルに対する標的領域が定まる。なお、DNA配列である優性アレルの塩基配列上のTに相当する塩基は、RNAiセンス鎖領域の塩基配列ではUに置換しておくことが望ましい。
【００７０】
「ミスマッチ塩基導入工程」（0204）とは、設定したRNAiセンス鎖領域内にミスマッチ塩基を導入する工程である。ミスマッチ塩基は、基準変異点から下流側に向かって３〜８番目の塩基を一つ選択し、優性アレルのセンス鎖塩基配列の相当する塩基とは異なる塩基に置換する。好ましくは３〜５番目及び７〜８番目、より好ましくは３〜５番目の塩基である。このとき、置換後の塩基が優性アレルのアンチセンス鎖塩基配列の対応する塩基とは塩基対合できない塩基を選択するように留意する。例えば、優性アレルのアンチセンス鎖の対応する塩基がAであれば、A、G又はCに、アンチセンス鎖の対応する塩基がTであれば、U又はCに、アンチセンス鎖の対応する塩基がGであれば、G又はAに、アンチセンス鎖の対応する塩基がCであれば、C、U又はAにすればよい。
【００７１】
「RNAiアンチセンス鎖領域設定工程」（0205）とは、設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域として設定する工程である。これによって、二本鎖RNAi分子の基本構造が定まる。
【００７２】
以上の工程は、本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子が一本鎖RNAi分子及び二本鎖RNAi分子のいずれであっても共通する工程である。次に、二本鎖RNAi分子及び一本鎖RNAi分子のそれぞれに特有の工程として、3’末端付加工程及びスペーサ連結工程を以下で説明する。
【００７３】
「3’末端付加工程」は、二本鎖RNAi分子に特有の任意の工程である。本工程は、前記で設計したRNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域のそれぞれの3’末端にTT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）を付加することを特徴とする。
【００７４】
「スペーサ連結工程」は、一本鎖RNAi分子に特有の必須の工程である。本工程は、前記で設計したRNAiセンス鎖領域の3’末端とRNAiアンチセンス鎖領域の5’末端をそれぞれスペーサ配列の3’末端と5’末端に連結して一本鎖分子にする工程である。スペーサ配列は、３〜２４塩基、好ましくは４〜１５塩基からなる任意の塩基配列でよい。好ましくは、スペーサ配列内で塩基対合を形成しない塩基配列である。
【００７５】
本実施形態のRNAi分子は、前述の方法によって設計された塩基配列に基づいて、化学的合成法によって合成することができる。RNAi分子の化学合成は、各ライフサイエンスメーカー（例えば、シグマアルドリッチ社、ベックス社、タカラバイオ社、インビトロジェン社等）が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。
【００７６】
また、本実施形態のRNAi分子は、前述の方法によって設計された塩基配列を一旦DNA配列に変換し、その配列に基づいてDNAを化学合成したものをクローニングした後に、当該分野で公知のin vitro RNA転写法によってRNAとして調製することができる。in vitro RNA転写法は、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照すればよい。また、Ui-Teiらの方法（Nucleic Acids Res., 32:936-948, 2004）、Reynoldsらの方法（Nat. Biotechnol., 22:326-330, 2004）、Amarzguiouiらの方法（Biochem. Biophys. Res. Commun., 316: 1050-1058, 2004）を参考にすることができる。
【００７７】
１−６．発現ベクターの調製
本実施形態の抑制剤に含まれる発現ベクターの調製方法は、基本的には、当該分野で公知の方法、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法に従って調製することができる。
【００７８】
具体的な例を挙げると、まず、前述の「１−５．RNAi分子の設計と製造」の項で説明した方法に従い、RNAi分子の塩基配列を決定する。続いて、それに対応するDNA配列に基づき、センス鎖DNA及びアンチセンス鎖DNAを化学合成法等によってそれぞれ合成する。このとき各鎖の両末端に適当な制限部位を付加するか、各鎖のアニーリング後に適当なコヘシブ末端が形成されるようにしておくことが好ましい。DNA合成は、ライフサイエンス関連メーカー各社が受託合成サービスを行っており、それを利用することもできる。合成後の両鎖を混合してアニーリングさせ、二本鎖DNA断片を調製した後、末端に制限部位を付加していた場合には、必要に応じてその制限酵素で切断する。さらに、各鎖の5’末端を必要に応じてT4ポリヌクレオチドキナーゼ等でリン酸化する。続いて、発現用ベクターのプロモータ下流の対応する制限部位に前記調製した二本鎖DNA断片を連結する。DNA断片は、一旦適当なクローニングベクターに連結してクローン化した後、それから切り出したものを発現用ベクターに連結してもよい。
【００７９】
１−７．効果
本実施形態の優性アレル発現抑制剤によれば、有効成分のRNAi分子が、アレル間の塩基配列の相違がわずか１塩基であっても、非標的アレルの発現にはほとんど又はあまり影響を及ぼすことなく、標的アレルの発現を選択的、かつ効率的に抑制することができる。
【００８０】
本実施形態の抑制剤によれば、細胞内に導入した場合、RNAi分子を有効成分とする場合にはそのRNAi分子がそのままで、また発現ベクターを有効成分とする場合にはその発現ベクターに含まれるDNAにコードされたRNAi分子が発現した後に、標的とする優性アレルに作用してその発現をRNAiサイレンシング機構によって抑制することができる。したがって、抑制剤がRNAi分子を含む場合には、ASP-RNAi効果を投与した細胞等に短時間で付与することができる。一方、抑制剤が発現ベクターを含む場合には、投与後の細胞内で発現ベクターが維持されている限りASP-RNAi効果を継続的に付与し続けることができる。故に、これらを組合わせて用いることで、効果的に優性アレルの発現を抑制することができる。
【００８１】
本実施形態の抑制剤を用いれば、後述する医薬組成物に加えることで、従来その治療が困難であった優性アレルによる様々な疾患を治療又は軽減することができる他、動植物の品種改良等にも利用することができる。
【００８２】
２．医薬組成物
本発明の第２の実施形態は、前記実施形態１の抑制剤を含む医薬組成物である。
【００８３】
２−１．構成
本発明の医薬組成物は、有効成分であるRNAi分子及び／又は発現ベクターの媒体を含む。媒体には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアレルアルコール、ポリオキシ化イソステアレルアルコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類のような溶媒が挙げられる。このような媒体は、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【００８４】
本発明の医薬組成物において、医薬組成物中の有効成分であるRNAi分子及び／又は発現ベクターの含有量は、治療対象となる疾患の原因遺伝子の種類、その遺伝子の発症作用機序、RNAi分子の作用効果及び安定性、発現ベクターの発現量、医薬組成物の剤形、使用する担体の種類、及び投与方法、投与する被検体の状態等の様々な条件によって異なる。これらは、当該分野の公知技術に基づいて適宜選択すればよい。本発明のRNAi分子又は発現ベクターの含有量の具体例は、他の医薬の併用を必要としないヒト成人男子（体重60 kg）に対して注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約0．01％(w/v)〜約20％(w/v)、好ましくは約0.1％(w/v)〜約10％(w/v)で含まれていればよい。具体的には、例えば、１回1m1の注射剤中にはsiRNAが通常1μg〜200μg含まれていればよい。また、本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で、本発明の核酸の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
【００８６】
賦形剤としては、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが例として挙げられる。
【００８７】
結合剤としては、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が例として挙げられる。
【００８８】
崩壊剤としては、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が例として挙げられる。
【００８９】
充填剤としては、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が例として挙げられる。
【００９０】
乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
【００９１】
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
【００９２】
このような担体は、主として前記剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、前記RNAi分子が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、注射剤の場合であれば、抗生物質を所定量含有していても良い。
【００９４】
さらに、実施形態の医薬組成物は、製薬上許容可能な範囲内で、かつ実施形態１の抑制剤中のRNAi分子及び／又は発現ベクターを失活させない範囲において、他の有効成分を包含する、いわゆる複合製剤とすることができる。
【００９５】
本実施形態の医薬組成物の剤形は、抑制剤中の有効成分であるRNAi分子又は発現ベクター、さらには他の付加的な有効成分を不活化させない形態であれば特に限定しない。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形又は液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形が挙げられる。RNAi分子又は発現ベクターを有効成分とする抑制剤を含む本実施形態の医薬組成物の場合、剤形は注射剤であることが好ましい。
【００９６】
２−２．投与方法
本実施形態の医薬組成物は、目的とする疾患の治療のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００９７】
本明細書において「製薬上有効な量」とは、本発明の医薬組成物に含まれる抑制剤の有効成分であるRNAi分子及び／又は発現ベクターが、対象とする疾患を治療する又は症状を軽減する上で必要な用量（具体的には疾患原因である優性アレルの形質発現を抑制することができる用量）であって、かつ投与する生体に対して有害な副作用（例えば、野生型アレルの発現抑制等）がほとんどないか又は全くない用量をいう。その具体的な量は、標的とする遺伝子の種類、優性アレルにおける優性点突然変異の位置、優性アレルの形質発現効果、使用する剤形、被検体（ヒトの場合には被験者）の情報及び投与経路によって異なる。ヒトに投与する場合には、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、一般に細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被験者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被験者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。
【００９８】
本発明のRNAi分子は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射などにより発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明のRNAi分子を十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、転移性癌のように治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、限定はしないが、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明のRNAi分子を全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
【００９９】
本発明のRNAi分子は、含有される有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
【０１００】
注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。標的分子に対して本発明のRNAi分子又は発現ベクターから生産されるRNAi分子がその機能を発揮し、医薬組成物の目的を達し得ればいずれの部位であってもよい。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。前述のように血流を介して本発明の医薬組成物を全身に行き渡らせることが可能であり、また侵襲性も比較的低いからである。
【０１０１】
２−３．用法
本発明の医薬組成物は、疾患の治療用として使用される。例えば、常染色体優性遺伝疾患のような優性アレルの発現を原因とする疾患において適用することで、優性アレルの発現を選択的に抑制し、同時に他方のアレル（例えば、正常な機能を有するタンパク質をコードする野生型アレル）の形質を顕在化できることから、従来その治療が困難であった遺伝病や癌等の治療の他、動植物の品種改良等に利用することができる。したがって、本実施形態の医薬組成物の対象となる疾患は、抑制剤に含まれるRNAi分子又は発現ベクターから発現されるRNAi分子が、標的とする優性アレルの優性形質に基づく疾患である。このような疾患の具体例としては、例えば、ハンチントン病、進行性骨化性線維異形成症（FOP）、家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性高コレステロール血症、若年発症成人型糖尿病（MODY）、マルファン（Marfan）症候群、優性進行性筋ジストロフィー症、優性骨形成不全症、優性網膜色素変性、優性先天性白内障、結節性硬化症、遺伝性手掌角皮症、家族性大腸ポリポーシス、優性多発性嚢胞腎、網膜芽細胞腫、神経線維腫のようなヒト常染色体優性変異疾患の他、非小細胞肺癌（NSCLC）、膵臓癌、大腸癌、甲状腺髄様癌のような悪性新生物が挙げられる。したがって、本実施形態の医薬組成物は、治療対象となる疾患に応じて、その原因遺伝子である優性アレルに対するRNAi分子又はそれをコードするDNAを含む発現ベクターを有効成分として用いることで、様々な疾患に対して適用できる。
【実施例】
【０１０２】
＜実施例１：ALK2遺伝子に対するsiRNAのASP−RNAi効果の検証＞
ヒト常染色体優性変異疾患として知られる進行性骨化性線維異形成症（FOP）の原因遺伝子であるALK2遺伝子に対するsiRNA（ALK2-siRNA）を設計し、優性アレルと野生型アレルのそれぞれにおけるASP-RNAi効果について検証した。【０１０３】
（１）ALK2-siRNAの設計と調製
FOP患者では、ヒトALK2遺伝子（アクセッションNo. NM_001105）における６１７番目（開始コドンのAを１番目とする。以下、同じ）の塩基GがAに（R206Hアミノ酸変異、すなわち、開始メチオニンから２０６番目のリジンをヒスチジンに置換する変異をもたらす）又は１０６７番目の塩基GがAに（G356Dアミノ酸変異、すなわち、３５６番目のグリシンをアスパラギン酸に置換する変異をもたらす）置換した点突然変異を有する。そこで、それぞれの点突然変異を基準変異点として定め、実施形態１に記載のRNAi分子の設計方法に従って様々なALK2-siRNAを設計した。表１に６１７番目（R206Hアミノ酸変異）を基準変異点として設計したALK2-siRNAセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列を、また表２に１０６７番目（G356Dアミノ酸変異）を基準変異点として設計したALK2-siRNAセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列を示す。ただし、各表で示す塩基配列は、センス鎖及びアンチセンス鎖の3’末端におけるUUからなるオーバーハング配列を記載便宜上、除いている。
【表１】
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【表２】
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【０１０４】
それぞれの表において、siRNA名は、以下のように命名した。「siR206H_8s(A5U)19-ss」を例に挙げれば、「siR206H」はR206Hのアミノ酸置換をもたらす617番目の基準変異点を含むsiRNAであることを示し、「8s」は基準変異点（standard mutation point）の上流側に８塩基(8ヌクレオチド)を有することを示し、「（A5U）」のようなカッコは、ミスマッチ塩基で、かつ基準変異点の下流側５番目のAをUに置換したことを示し、続く数値「１９」はsiRNAの全塩基数(全ヌクレオチド数)を意味し、最後の「ss」はsiRNAのセンス鎖配列であることを示す。同様に最後の「as」はsiRNAのアンチセンス鎖配列であることを示す。また、カッコのないsiRNAは、ミスマッチ塩基を有さないことを意味する。【０１０５】
各表中のセンス鎖塩基配列においては、基準変異点を太字で、ミスマッチ塩基を下線付文字で示した。【０１０６】
表１及び２の塩基配列に基づき、siRNAの化学合成を行なった。合成は、シグマアルドリッチ社に委託した。合成siRNAは、対を成すべきセンス鎖及びアンチセンス鎖がアニーリング処理されており、それを実験に使用した。【０１０７】
（２）レポーターアレル発現プラスミドの構築
前記（１）で調製したALK2-siRNAにおけるASP-RNAi効果の評価及び好適なALK2-siRNAの選定のために、ホタル・ルシフェラーゼ（Photinus luciferase）遺伝子を発現するpGL3-TK （Ohnishi et al., 2005）と及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子を発現するphRL-TK プラスミド（Promega社）を用いて、siRNAの標的となる優性変異型と非標的の正常型のレポーターアレル発現プラスミドの構築を行った。【０１０８】
優性点突然変異部位を含む優性アレルに相当する合成オリゴDNAの設計、レポータープラスミドへの挿入、選定方法については、非特許文献６に従った。具体的には、FOPの病因となるALK2遺伝子の６１７番目又は１０９７番目の優性点突然変異部位をそれぞれ含む３９塩基からなるオリゴDNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ合成した（シグマアルドリッチ社）。点突然変異を持たない正常型アレルについても同様に、オリゴDNA合成した。それぞれの具体的な塩基配列を表３に示す。これらのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ALK2遺伝子断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両端に制限酵素切断部位を構成するリンカー配列を含んでいる。表中、基準変異点(野生型では、それに対応する位置の塩基)を太字で、またリンカー配列を下線で示している。
【表３】
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【０１０９】
次に、合成した各鎖オリゴDNAのアニーリング処理を行った。具体的には、最終容量10μLとなるように、センス鎖及びアンチセンス鎖の一本鎖オリゴDNA（最終濃度：それぞれ１μM）、10×アニーリングバッファ（インビトロジェン社、最終濃度：1×）及び滅菌水を混合し、80℃で５分間熱処理をした後、室温に３０分間放置し、二本鎖を形成させた。【０１１０】
続いて、二本鎖オリゴDNAを制限酵素処理した前記２種のプラスミドに挿入した。具体的には、pGL3-TK プラスミドとphRL-TK プラスミドを制限酵素XbaI及びNotIで処理した後、正常型アレルはｐGL3−TKプラスミドにおける、また優性変異型アレルはphRL-TKプラスミドにおける、各レポーター遺伝子の3’非翻訳領域（3’UTR）内に挿入して、正常型ALK2レポーターアレル発現プラスミド及び優性変異型ALK2レポーターアレル発現プラスミドを構築した。また、正常型及び優性変異型アレルに対してレポーター遺伝子を入れ替えたレポーターアレル発現プラスミドも同様に構築した。【０１１１】
（３）細胞培養
ヒト由来株化細胞であるHeLa細胞を10%ウシ胎仔血清（FBS；Invitrogen社）及び抗生物質（100ユニット/mL ペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン；Wako社）含有のDMEM培養液（Wako社）を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。【０１１２】
（４）トランスフェクション及びレポーターアッセイ
遺伝子導入の前日に、HeLa細胞をトリプシン消化により分散させた後、細胞密度1×105 cells/cm2となるように調整して９６ウェル培養プレートに播種し、抗生物質不含のDMEM培養液で培養を行った。２４時間後、３種類のプラスミド、すなわち、（a）正常型ALK2レポーターアレル発現プラスミドであるpGL3-TKバックボーンプラスミド（60ng/ウェル）、（ｂ）変異型ALK2優性レポーターアレルの各発現プラスミドであるphRL-TKバックボーンプラスミド（20ng/ウェル）及び（c）内部コントロールとしてRNAiによる発現抑制を受けないβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現プラスミドであるpSV-β-ガラクトシダーゼ対照用プラスミド（Promega社）（10ng/ウェル）を前記HeLa細胞にALK2優性変異型アレルを標的として設計した表1又は２で示す様々なALK2-siRNA（終濃度20nM）と共に導入した。ネガティブコントロールとして、終濃度20nMのRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）を用いた。これらの核酸の導入には、リポフェクタミン2000（Invitrogen社）を用いた。トランスフェクション法は、添付されたプロトコールに従った。核酸を導入して２４時間後、Dual-Luciferase reporter assay system （Promega社）のキットに添付された（Dual-Luciferase reporter assay system）細胞溶解バッファ（Passive lysis buffer）を用いて細胞抽出液を調製し、発現したそれぞれのレポーターアレル（及び２種のルシフェラーゼ）とコントロールのβ-ガラクトシダーゼの活性をDual-Luciferase reporter assay system （Promega社）及びBeta-Glo assay system （Promega社）を用いてそれぞれ測定した。測定にはFusion Universal Microplate Analyzer （Perkin Elmer社）を用いた。さらに、レポーターに関して、使用した２種のルシフェラーゼ活性の違いによる測定差異の可能性を排除するため、各変異部位（R206H、G356D）に対しレポーター遺伝子を入れ替えた実験も行った。【０１１３】
（５）結果
前記レポーターアレル発現プラスミドを用いたレポーターアッセイによってALK2の各変異部位（R206H、G356D）に対して設計した様々なALK2-siRNAのASP-RNAi効果及びASP-RNAi誘導に好適なRNAi分子の構造的一般法則性について検討した。【０１１４】
各siRNAによる発現抑制効果は、野生型ALK2及び変異型ALK2のそれぞれのレポータールシフェラーゼ活性に基づいて算出される識別比及びASPスコアによって評価した。【０１１５】
ここで、「識別比」（DR: Discrimination Ratio）とは、DR=（正常型アレルの発現量）/（変異型アレルの発現量）の式から得られる正常型アレルの変異型アレルに対する相対的発現比である。識別比は、その値が大きいほどsiRNAが正常型アレルと変異型アレルを識別していることを意味する。【０１１６】
また、「ASPスコア」（Allele-SPecificity score）とは、本発明者らが考案した評価法で、下記式によって得られる値である。ASPスコアは、変異型アレルに対する「特異性」と「抑制効果」の両者を反映する。【０１１７】
ASPスコア＝[（正常型アレルの発現量）−（変異型アレルの発現量）]×（正常型アレルの発現量）
上記の式は、RNAi分子の変異型アレルに対する抑制効果の程度を正常型アレルの発現量との「差」で反映させ、そして「正常型アレルの発現量」を乗ずることにより正常型が受ける非特異的な影響を加味させたものである。前記識別比の評価方法は、有用な評価方法ではあるが、ASP-RNAiにおいて重要な要素である正常型アレルに対する非特異的な抑制の影響、換言すれば、RNAiが正常型アレルに与える副作用を加味することができなかった。しかし、ASPスコアによれば、変異型アレルに対する「特異性」と「抑制効果」の両者を反映した評価が可能となる。例えば、識別比の値が高く、野生型と変異型アレルを特異的に識別可能なsiRNAであっても、野生型アレルの発現を少なからず抑制する場合には、ASPスコアは低い値となる。【０１１８】
結果を図３及び４に示す。図３はALK2-G356D-siRNAを、図４はALK2-R206H-siRNAをそれぞれ用いたときのRNAiの結果である。図３及び４において、Aは、各siRNAを用いたときの識別比(プロット)及びASPスコア(棒グラフ)を示す。また、Bは、野生型の非標的ALK2配列（WT−ALK2）と、変異型の標的ALK2配列(MT−ALK2)のルシフェラーゼ活性に基づいて算出された発現量の相対値を示す。【０１１９】
図３では、ALK2-G356D変異を標的とし、基準変異点から上流側に向かって９個のヌクレオチドを有し、かつミスマッチ塩基を有さない全長１９塩基からなるsiG356D_9s19をコントロールに用い、これにミスマッチ塩基の位置を一つずつずらして導入し、ASP-RNAiに最適の位置を検証した。siG356D_9s19の識別比は1.64で、ASPスコアは0.02であった。この結果は、siG356D_9s19は野生型と変異型アレルの識別能が低く、かつ変異型アレルと共に野生型アレルの発現をも強く抑制してしまうことを示している。一方、基準変異点から下流側に向かって２〜９番目にそれぞれミスマッチ塩基を導入したsiG356D_9s(C2G)19〜siG356D_9s(U9A)19に関しては、３〜８番目にミスマッチ塩基を導入したsiG356D_9s(U3A)19〜siG356D_9s(C8G)19において、コントロールであるsiG356D_9s19と比較して、非常に高い識別比及びASPスコアが得られた。これらの結果は、基準変異点の下流に向かって３〜８番目の位置にミスマッチを導入したsiRNAは、野生型と変異型アレルの識別能が高く、かつ変異型アレルを強く抑制する一方で野生型アレルの発現量の抑制能がほとんどないか又は非常に低いことを示している。すなわち、これは、ASP-RNAi効果の高い非常に有用なsiRNAであることを意味する。この結果から、ミスマッチ塩基の位置は、基準変異点から3〜8番目が好適であることが示唆された。【０１２０】
上記結果の一般性を確認するために、上流側に向かって１０個のヌクレオチドを有する全長１９塩基のsiG356D_10s19をコントロールとして、これにsiG356D_9s19で効果のみられた位置（基準変異点の下流に向かって３〜７番目に、同様にミスマッチ塩基を導入したsiRNA（siG356D_10s(U3A)19〜siG356D_10s(A7U)19）についてそのASP-RNAi効果を検証した。その結果、コントロールのsiG356D_10s19では、識別比が1.0で、ASPスコアが0.00と、siG356D_9s19とほぼ同程度であったのに対し、ミスマッチ塩基を導入したsiRNAでは、いずれもコントロールと比較して高い識別比とASPスコアが得られた。【０１２１】
図４は、ALK2-R206H変異を標的とし、siR206H_8s19をコントロールに用いて、これに前述のsiG356D_9s19でASP-RNAi効果のみられた位置（ここでは、基準変異点の下流に向かって４番目と５番目）にミスマッチ塩基を導入したsiRNAについての結果を示す。ALK2のR206H変異でもG356D変異と同様に基準変異点から４又は５番目の位置にミスマッチを導入したsiRNAでは、コントロールと比較して高い識別比とASPスコアが得られた。また、ミスマッチ部位の塩基の違いによるASP-RNAi効果を検証するため５番目のミスマッチ塩基をU、G及びCと変えてみた（図中、siR206H_8s(A5U)19、siR206H_8s(A5G)19、siR206H_8s(A5C)19で示す）。その結果、塩基間に大きな差異は認められず、ミスマッチを形成する塩基であれば、いずれの塩基であってもよいことが明らかとなった。さらに、ここで用いたsiRNAの多くは、基準変異点から上流側に向かって８個のヌクレオチドを有するが、８個であっても９個及び１０個を用いたG356DのsiRNAと同様の効果がみられることも判明した。加えて、７塩基のヌクレオチドを有するsiR206H_7s（A5U)18とsiR206H_7s（A5U)19を検証したところ、同様の高い識別比とASPスコアが得られた。【０１２２】
以上の結果から、ASP-RNAi誘導に好適なRNAi分子の構造的特徴は、センス鎖の5’末端が基準変異点から5’側上流に向かって７〜１０番目に位置し、さらに基準変異点から下流側に向かって３〜８番目にミスマッチ塩基が導入されたものが好適であることが明らかとなった。【０１２３】
＜実施例２：ALK2-siRNAを用いた細胞内BMPシグナル伝達経路の活性＞
実施例１で変異型ALK2（R206H及びG356D）に対して、効果的な発現抑制効果を示したALK2−siRNAを選択し、全長の変異型ALK2に対してタンパク質レベルで同様の効果が見られるか否かを検証した。 
（１）細胞培養
マウスの筋芽細胞であるC2C12細胞を、15%ウシ胎仔血清（FBS；Invitrogen社）及び抗生物質（100ユニット/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン；Wako社）含有のDMEM培養液（Wako社）を用いて、それぞれ培養を行なった。【０１２４】
（２）トランスフェクション
上記の細胞を遺伝子導入の前日にトリプシン消化によって分散させた後、細胞密度1×105 cells/cm2となるように調整して、２４ウェル培養プレートに播種し、抗生物質を含まないDMEM培養液にて培養を行った。２４時間後、各ウェルに２種類のプラスミド、すなわち、（１）V5タグを付加した完全長の正常型ALK2遺伝子(V5-WT-ALK2)と（２）疾患原因のR206H変異型ALK2遺伝子発現プラスミド(V5-R206H-ALK2)又はG356D変異型ALK2遺伝子発現プラスミド(V5-G356D-ALK2)を200 ng/ウェル、そして（３）上記アッセイで評価したALK2-RNAi誘導を惹起するsiR206H_8s(A5C)19又はsiG356D_9s(U3A)19を20 nM/ウェル、共導入した。基本的方法は、前記実施例１の「（４）トランスフェクション及びレポーターアッセイ」の方法に準じた。比較対照としてRNAiを誘導しないsiControl （QIAGEN社）（終濃度20 nM）を用いて同様の実験も行った。核酸導入して４８時間後、細胞溶解液（50mM, Tris-HCl, p.H 7.5, 0.1% Triton-X100）を用いて細胞抽出液を調製した。【０１２５】
(３)ウェスタンブロッティング
前記各細胞から調製した細胞抽出液におけるタンパク質濃度をProtein Quantification kit （DOJINDO社）を用いて、添付されたプロトコールに従って測定した。各サンプル10μgを４×サンプルバッファ（0.25 M Tris-HCl, 40% グリセロール, 8% SDS, 0.04% ブロモフェノールブルー, 8% β-メルカプトエタノール）と混合し、100℃で５分間加熱処理を行った。熱処理したタンパク質サンプルを10% SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法（CV 50V、30分間；その後、CV 75V、２時間）によって展開し、その後PVDFメンブレン（Immobilon P; Millipor社）にエレクトロ・ブロット（CC 100mA、４５分間）した。メンブレンは、室温で１時間ブロッキング溶液（5% Difco skim milk （BD社）、1×PBS （Wako社）、0.1% Tween-20）に浸し、1×PBS （Wako社）で洗浄した後、PBSで5,000倍希釈した一次抗体マウスモノクローナル抗V5抗体（Invitrogen社）と反応（4℃、１６時間）させた。次にメンブレンをPBS-T（1×PBS（Wako社）、0.1% Tween-20）で室温にて数回洗浄し、二次抗体（1:5,000希釈）である抗マウスIgGペルオキシダーゼ結合抗体（SIGMA社）と反応（室温、１時間）させた。PBS-Tで室温にて数回洗浄後、Immobilon Western Chemilum HRP Substrate （Millipore社）を用いて添付のプロトコールに従って抗体と反応したタンパク質を検出した。タンパク質バンドの検出後、メンブレン上の抗体をRe-Blot Plus Strong Solution （Millipore社）を用いて除去し、PBS-Tで洗浄した。ブロッキング処理を上記と同様に施した後、一次抗体（1:10,000希釈）マウスモノクローナル抗αチューブリン抗体（SIGMA社）と反応（4℃、16時間）させた。その後の操作は上記と同様に行った。露光フィルムにバンドとして検出されたタンパク質（図５A及びC）は、スキャナーにて画像を取り込んだ後、Scion Image （Scion社）によって数値化することで定量化を行った（図５B
及びD）。【０１２６】
（４）結果
図５に結果を示す。図A及びCで「未処理」のサンプルは、トランスフェクションを行なっていないC2C12細胞から抽出されたタンパク質である。この図で示すように、siR206H_8s（A5C)19又はsiG356D_9s(U3A)19は、正常型ALK2（WT）の発現を抑制することなく、各変異型ALK2（MT）ALK2−R206H、又はALK2-G356Dに対してのみ顕著かつ特異的に発現抑制効果を示し、好適なASP-RNAi誘導が可能であることがタンパク質レベルで実証された。【０１２７】
＜実施例３：ハンチンチン遺伝子に対するsiRNAのASP−RNAi効果の検証＞
ハンチントン病（HD：Huntington’s disease）の原因遺伝子である変異型ハンチンチン(HTT: Huntingtin)遺伝子の対立遺伝子特異的発現抑制のため、該遺伝子転写配列内に存在する一塩基多型（SNP: Single nucleotide polymorphism）を標的としたsiRNA（HTT-siRNA）を設計し、設計した様々なHTT-siRNAの２種類のアレルに対するASP-RNAi効果について検証した。【０１２８】
（１）HTT-siRNAの設計と調製
HD患者では、ヒトHTT遺伝子（アクセッションNo.NM_002111.6）のエキソン１内に存在するCAG繰り返し配列が異常伸長した変異を有する。そのCAG繰り返し配列は、正常型アレルにも存在するため、CAG繰り返し配列を直接RNAiの標的とする場合、標的アレルだけでなく正常型アレルの発現も抑制されてしまう。そこで、該疾患原因遺伝子の転写配列内に存在するアレル間でヘテロ接合を示すSNP部位を基準変異点として、本発明の設計方法を用いて様々なHTT-siRNAを設計し、それぞれのRNAi効果を評価した。表４に、２つのSNP部位(rs363099及びrs362331)に対して設計したHTT-siRNA（それぞれsiRs099及びsiRs331で表す）のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列を示す。ただし、各表で示す塩基配列は、センス鎖及びアンチセンス鎖の3’末端におけるUUからなるオーバーハング配列を記載便宜上、除いている。
【表４】
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【０１２９】
表３の塩基配列に基づき、実施例１と同様の方法でsiRNAの化学合成及びアニーリング処理を行なった。【０１３０】
（２）レポーターアレル発現プラスミドの構築
前記（１）で調製したHTT-siRNAのRNAi効果の評価及び好適なHTT-siRNAの選定のために、「実施例１（２）」で記載した方法と同様に、アレル間においてヘテロ接合度の高いSNPとその周辺配列を各ルシフェラーゼ遺伝子の3‘UTRに挿入することでレポーターアレル発現プラスミドの構築を行った。【０１３１】
具体的にはHTT遺伝子転写配列内に存在する２つのSNP部位（アクセッションNo.rs363099及びrs362331）の両SNPアレル塩基をそれぞれ基準変異点部位として含む４１塩基からなるオリゴDNA（センス鎖及びアンチセンス鎖）をそれぞれ化学合成した（シグマアルドリッチ社に委託）。表５に各オリゴDNAの具体的な配列を示す。表中、各センス鎖上のSNP部位を太字で、また、リンカー配列を下線を付して示す。
【表５】
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【０１３２】
次に、前記「実施例１（２）」と同様の方法で、合成した各鎖オリゴDNAのアニーリング処理、及びプラスミドへの挿入操作を行い、レポーターアレル発現プラスミドを構築した。【０１３３】
（３）細胞培養
前記「実施例１（３）」と同様の方法を用いて、HeLa細胞（ヒト由来株化細胞）を培養した。【０１３４】
（４）トランスフェクション及びレポーターアッセイ
前記「実施例１（４）」と同様の方法を用いて、細胞を播種後、前記のHTT-siRNA及びレポーターアレル発現プラスミドをトランススフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した後、各SNPの両塩基に対して設計した様々なHTT-siRNAの評価を行った。【０１３５】
（５）結果
HTT遺伝子の転写配列内に存在する前記２箇所のSNP部位の対立する２つの塩基（ここでは、それぞれのSNP部位が共にCとTのアレルを持つ；表５参照）に対して好適なHTT−siRNAを選定すると同時に、各SNP部位の両塩基をそれぞれ基準変異点として定め、ミスマッチ部位等の構造的特徴を変化させたときの影響について評価を行い、ASP-RNAi誘導に好適なRNAi分子の構造的一般法則性について検討を行った。【０１３６】
各siRNAによる発現抑制効果は、実施例１と同様に、一方のHTT-SNPアレル（C塩基アレルとする）及び他方のHTT-SNPアレル（T塩基アレルとする）のそれぞれのレポータールシフェラーゼ活性に基づいて算出される識別比及びASPスコアによって評価した。本実施例では、前記２箇所のSNP部位に対してそれぞれC塩基アレルを、標的アレル（すなわち、変異型アレルとみなす）とする。【０１３７】
図６に結果を示す。Aは、各siRNAを用いたときの識別比(プロット)及びASPスコア(棒グラフ)を示す。また、Bは、C塩基アレルのHTTと、T塩基アレルのHTTのルシフェラーゼ発現量を示す。【０１３８】
rs362331について、実施例１と同様に、基準変異点から上流側に向かって８個のヌクレオチドを有し、かつミスマッチ塩基を有さない全長１９塩基からなるsiRs331_8s19をコントロールとして設計し、これにミスマッチ塩基の位置を一つずつずらして導入したsiRNAのASP-RNAi効果について検証した。コントロールの識別比は2.89で、ASPスコアは0.04であった。これに対して、基準変異点から下流に向かって４〜８番目にミスマッチ塩基を導入したsiRNA（それぞれ、siRs331_8s(G4C)19〜siRs331_8s(G8C)19）は、いずれもコントロールと比較して高い識別比とASPスコアが得られた。この結果は、実施例１の結果と矛盾しない。【０１３９】
さらに、別のSNP部位（rs363099）について、基準変異点から上流側に向かって８個のヌクレオチドを有し、かつミスマッチ塩基を有さない全長１９塩基からなるsiRs099_8s19をコントロールとして、基準変異点から下流に向かって４及び５番目にミスマッチ塩基を導入したsiRNA（それぞれ、siRs099_8s(U4A)19及びsiRs099_8s(G5C)19)について検証した。この結果も、所定の位置にミスマッチを導入したsiRNAの方がコントロールと比較して識別比、ASPスコアともに高かった。【０１４０】
以上の結果から、本発明の設計方法に基づいた構造的特徴を有するsiRNAは、遺伝子に特定されず、かつSNP変異であっても高いASP-RNAi効果を有することが示された。【０１４１】
＜実施例４：HTT-siRNAを用いた内在性変異型ハンチンチン遺伝子のASP-RNAi効果＞
（１）細胞培養
HD患者由来株化細胞（C0221；国立精神・神経センター病院・神経内科より分与）を10%ウシ胎仔血清（FBS；株式会社ジャパンバイオシーラム）、ピルビン酸ナトリウム（１10mg/L；Wako社）、D−グルコース（4500mg/L；Wako社）、及び抗生物質（100ユニット/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン；GIBCO社）含有のRPMI1640培養液（Wako社）を用いて、5% CO2、37℃にて培養した。コントロールとして、HDに関して健常人由来の株化細胞(国立精神・神経センター病院、神経内科より分与)を、上記と同様に培養した。【０１４２】
（２）エレクトロポレーション法によるHTT-siRNAの導入
前記（１）で培養した２種類の細胞、すなわち、HD患者由来株化細胞（C0221リンパ芽球様細胞）と健常人株化細胞をそれぞれ遠心（120G、５分間）によって回収し、約1×106個の細胞をHTT-siRNA（終濃度5μM）を含む100μLのエレクトロポレーションバッファ（Amaxa Cell Line Nucleofector Solution V、Amaxa社）にて懸濁した。前記エレクトロポレーション用サンプルを２つ調製し、添付されたプロトコールに従ってエレクトロポレーション（プログラム：U-005, 遺伝子導入システムNucleofector, Amaxa社）によって核酸の導入を行なった。導入した核酸は、RNAiを誘導しないコントロールsiRNA（QIAGEN社）、siRs099_8s(G5C)19である。【０１４３】
核酸を導入した前記２つのC0221細胞、及び未処理のC0221細胞及び健常人株化細胞は、前記（１）の培養液を用いて、６ウェル培養プレートにて培養を行い、４８時間後に回収した。【０１４４】
（３）ウエスタンブロット法
前記（２）で回収した各細胞を1×プロテアーゼ阻害剤（Roche社）を含む細胞溶解液(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100)で溶解し、タンパク質濃度をProtein Quantification kit （DOJINDO社）を用いて、添付されたプロトコールに従って測定した。各サンプル20 μgを４×サンプルバッファ （0.25 M Tris-HCl、40% グリセロール、8% SDS, 0.04% ブロモフェノールブルー、 8% β−メルカプトエタノール）と混合し、100℃で５分間加熱処理を行った。熱処理したタンパク質サンプルは、改変型SDS-ポリアクリルアミドゲル及びトリシン系泳動バッファ（Tris/Tricine/SDS buffer、 BioRad社)を用いた電気泳動法（CV 50V、2時間；その後、CV 100V、約３０時間）によって展開し、その後PVDFメンブレン（Immobilon P; Millipor社）にエレクトロ・ブロット（CC 100mA、1時間）した。具体的な改変型SDS-ポリアクリルアミドゲルの組成は以下の通りである。（分離ゲル：5〜20％アクリルアミド濃度のステップ・グラジエント・ゲル(acrylamide / N, N’-メチレンビスアクリルアミド＝30：0.135)、濃縮ゲル：4％アクリルアミドゲル（(アクリルアミド / N, N’-メチレンビスアクリルアミド＝37.5：1)）。エレクトロ・ブロット後のメンブレンは、室温で1時間ブロッキング溶液（5% Difco skim milk （BD社）、1×PBS （Wako社）、0.1% Tween-20）に浸し、1×PBS （Wako社）で洗浄した後、PBSで3,000倍希釈した一次抗体マウスモノクローナル抗ハンチンチン抗体（clone 1HU-4C8: Millipore社）と反応（4℃、１６時間）させた。次にメンブレンは、PBS-T（1×PBS（Wako社）、0.1% Tween-20）で室温にて数回洗浄し、二次抗体（1:5,000希釈）である抗マウスIgG ペルオキシダーゼ結合抗体（SIGMA社）と反応（室温、１時間）させ、PBS-Tで室温にて数回洗浄後、Immobilon Western Chemilum HRP Substrate （Millipore社）を用いて添付されたプロトコールに従って抗体と反応したタンパク質を検出した。タンパク質バンドの検出後、メンブレン上の抗体をRe-Blot Plus Strong Solution （Millipore社）を用いて除去し、PBS-Tで洗浄、ブロッキング処理を上記と同様に施した後、一次抗体（1:10,000希釈）マウスモノクローナル抗αチューブリン抗体（SIGMA社）と反応（4℃、１６時間）させた。その後の操作は実施例２と同様に行った。【０１４５】
（４）結果
図７に結果を示す。健常人ではHTTタンパク質が正常型のバンドのみなのに対して、HD患者では正常型HTTタンパク質に加え、変異型HTTタンパク質のバンド（C塩基アレル由来）が認められる。このHD患者由来の細胞を本発明の設計方法で作製したsiRs099_8s(G5C)19で処理したサンプルでは、標的アレルであるC塩基アレル由来HTTタンパク質のバンドが消失している。この結果から、実施例３でASP-RNAi効果が確認されたsiRs099_8s(G5C)19は、全長タンパク質レベルでもASP-RNAi効果を有することが明らかとなった。また、内在性変異型HTT遺伝子のSNPタイプが異なっていても、そのSNP型に対応するHTT-siRNAを導入することで好適なASP-RNAi誘導され、正常なHTTタンパク質を残して疾患原因の変異型HTTタンパク質だけを特異的に発現抑制できることも立証された。【０１４６】
＜実施例５：EGFR遺伝子に対するsiRNAのASP−RNAi効果の検証＞
後天的に発生する優性変異アレルとして知られる非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer；NSCLC）の原因遺伝子である変異型EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNA（EGFR-siRNA）を設計し、優性アレルと野生型アレルのそれぞれにおけるASP-RNAi効果について検証した。【０１４７】
EGFRの細胞外ドメインに上皮成長因子（EGF）等のリガンドが結合すると、細胞内ドメインのチロシンキナーゼ活性化され、自己リン酸化作用によって下流の細胞内シグナル伝達経路が作動される。非小細胞肺癌は、EGFR遺伝子の特定の塩基に点突然変異や欠失が生じ、機能獲得型となることによって発生すると考えられている（Paez G.J. et al., Science, 2004, 304；1497-1500）。それ故、本発明のEGFR-siRNAが変異したEGFR遺伝子の発現のみを特異的に抑制することができれば、非小細胞肺癌に対する効果的な治療剤となり得る。【０１４８】
（１）EGFR-siRNAの設計と調製
非小細胞肺癌患者では、ヒトEGFR遺伝子（アクセッションNo.NM_005228）における2369番目（開始コドンのAを１番目とする。以下、同じ）の塩基CがTに（T790M、すなわち、開始メチオニンから790番目のトリプトファンをメチオニンに置換する変異をもたらす）置換した点突然変異を有する。そこで、この点突然変異を基準変異点として定め、実施形態１に記載のRNAi分子の設計方法に準じて、３つのEGFR-siRNAを設計した。表６に設計したセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列を示す。siT790M_8s18は、実施例１と同様に、前記基準変異点から上流側に８個のヌクレオチドを有し、かつミスマッチ塩基を有さない全長１８塩基からなる。siT790M_8s(G4C)18及びsiT790M_8s(U6A)18は、siT790M_8s18における基準点の下流４番目及び６番目にミスマッチ塩基を導入したEGFR-siRNAである。ただし、各表で示す塩基配列は、センス鎖及びアンチセンス鎖の3’末端におけるUUからなるオーバーハング配列を記載便宜上、除いている。
【表６】
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【０１４９】
表６の塩基配列に基づき、実施例１と同様の方法でsiRNAの化学合成及びアニーリング処理を行なった。【０１５０】
（２）レポーターアレル発現プラスミドの構築
前記（１）で調製したEGFR-siRNAのRNAi効果の評価の選定のために、「実施例１（２）」で記載した方法と同様に、優性変異型EGFR遺伝子と正常型EGFR遺伝子のレポーターアレル発現プラスミドの構築を行った。【０１５１】
具体的には、非小細胞肺癌の病因となるEGFR遺伝子の２３６９番目の優性点突然変異部位をそれぞれ含む３５塩基からなるオリゴDNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ合成した（シグマアルドリッチ社）。優性点突然変異部位を持たない正常型アレルについても同様に、オリゴDNA合成した。それぞれの具体的な塩基配列を表７に示す。
【表７】
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【０１５２】
次に、前記「実施例１（２）」と同様の方法で、合成した各鎖オリゴDNAのアニーリング処理、及びプラスミドへの挿入操作を行い、レポーターアレル発現プラスミドを構築した。【０１５３】
（３）細胞培養
前記「実施例１（３）」と同様の方法を用いて、HeLa細胞（ヒト由来株化細胞）を培養した。【０１５４】
（４）トランスフェクション及びレポーターアッセイ
前記「実施例１（４）」と同様の方法を用いて、細胞を播種後、前記のEGFR-siRNA及びレポーターアレル発現プラスミドをトランススフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した後、設計したEGFR-siRNAの評価を行った。【０１５５】
（５）結果
図８に結果を示す。Aは、各siRNAを用いたときの識別比(プロット)及びASPスコア(棒グラフ)を示す。また、Bは、野生型のEGFR配列（T790T(WT)）と、変異型の標的EGFR配列(T790M(MT))のルシフェラーゼ発現量を示す。【０１５６】
基準変異点から下流に向かって４番目と６番目にミスマッチ塩基を導入したsiT790M_8s(G4C)18及びsiT790M_8s(U6A)18は、コントロールであるsiT790M_8s18の識別比及びASPスコアと比較していずれも高い値が得られた。この結果は、実施例１及び３の結果と矛盾しない。【０１５７】
以上の結果から、本発明の設計方法に基づいた構造的特徴を有するsiRNAは、様々な遺伝子に対して高いASP-RNAi効果を有することが示された。【０１５８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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