(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビタ−１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＡＩ−１）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＣＤＫＩ）Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、平滑筋α−アクチン（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  α−ａｃｔｉｎ；α−ＳＭＡ）又はフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）のタンパク質発現を特異的に抑制する活性成分としてプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を含み、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）がラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）（受託番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）であり、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の含有量が糖尿病による腎線維化を有効に予防する量である、糖尿病による腎線維化の予防用医薬組成物。
【請求項２】
前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）が、生菌又は不活化菌である請求項１に記載の糖尿病による腎線維化の予防用医薬組成物。
【請求項３】
前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）が、シグナル伝達性転写因子１（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  １；ＳＴＡＴ１）のリン酸化を特異的に抑制することに用いられる請求項１に記載の糖尿病による腎線維化の予防用医薬組成物。
【請求項４】
更に少なくとも一つの他の菌株を含み、前記その他の菌株が、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、発酵乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ.  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノーサス・ＧＧ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ）及び前記の任意の組み合わせからなる群より選ばれた請求項１に記載の糖尿病による腎線維化の予防用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロバイオティクス菌株の用途に関し、特に、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）が糖尿病による腎線維化の治療に用いられる組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血糖が糖尿病性腎症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ；ＤＮ）を誘発する主な原因であり、透析を受けている患者において、糖尿病による糖尿病性腎症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ；ＤＮ）患者が４０％を占め、それに糖尿病性腎症が末期腎不全（ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＥＳＲＤ）を誘発する主な原因でもある。糖尿病性腎症は、通常、糖尿病発症後の１５〜２０年から臨床反応が発生し、高い割合で末期腎不全に発展してしまう。同時に、例えば、高血圧症、高血脂症、高尿酸症、心血管疾患などの他の疾病が伴う可能性もある。
【０００３】
糖尿病性腎症は、おおよそ過剰濾過（ｈｙｐｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）期、静止期（ｓｉｌｅｎｔ  ｐｈａｓｅ）、微量アルブミン尿（ｍｉｃｒｏａｌｂｕｍｉｎｕｒｉａ）期、タンパク尿（ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ）期及び末期腎不全である五つの時期に分けられる。一般的に、糖尿病性腎症の治療は血糖制御、血圧制御、飲食制御、薬物制御を多く採用し、それによって、血糖、血圧、タンパク質の摂食量を制御する。
【０００４】
数多くの研究において、腸内菌叢が体の健康に影響を与えることが提示されている。菌叢のバランスを維持する方法としては、プロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ又はｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）を摂取する方法がある。プロバイオティクスは、一般的に人体内からの、腸内健康に有益な生菌を指し、外部から補充され、体に有益になる可能性がある微生物をも指しており、例えば、乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ；ＬＡＢ）と一部の酵母菌が挙げられ、その内、乳酸菌は、乳糖又はその他の糖類を乳酸に転換する微生物の総称である。乳酸菌はグラム陽性菌に属し、常に食品工業における発酵に用いられる。
【０００５】
近年、流行病学に関する研究から、乳酸菌は、アレルギーに関する疾病及び胃腸病、例えば炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＩＢＤ）などを改善できることが知られてきた。そして、更に乳酸菌が免疫反応を刺激することができ、無害のアレルゲン（ｉｎｎｏｃｅｎｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ）に対しての免疫寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を発達させる。その他の研究において、乳酸菌が人間や家畜の抗生剤に関する下痢（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ）、旅行者下痢（ｔｒａｖｅｌｌｅｒｓ’  ｄｉａｒｒｈｅａ）、小児下痢（ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｄｉａｒｒｈｅａ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アトピー性疾患（ａｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）などを有効に改善できることも示されている。
【０００６】
しかし、前記研究において、プロバイオティクス菌株が糖尿病による腎線維化に応用できるかどうかについて殆ど検討せず、プロバイオティクス菌株の関与可能な制御機構も提示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記事情に鑑みて、糖尿病による腎線維化の治療におけるプロバイオティクス菌株の新用途を提供し、プロバイオティクス菌株をその他に応用するよう開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明の一態様において、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を含み、その含有量が糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）と血糖濃度を有効に低下させることができ、体重と腎重を正常な範囲に回復させて、更に糖尿病による腎線維化を治療する、糖尿病による腎線維化の治療用組成物が提供される。
【０００９】
本発明の他の一態様において、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の用途が提供され、このプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、ヤヌスキナーゼ２（Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ  ２；ｐ−ＪＡＫ２）／シグナル伝達性転写因子１（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  １；ｐ−ＳＴＡＴ１）のシグナル伝導経路を特異的に抑制し、腎線維化に関するタンパク質の発現を抑制することによって、糖尿病による腎線維化を有効に治療することができる。
【００１０】
本発明の前記態様によれば、糖尿病による腎線維化の治療に用いられる組成物が提供される。一実施例において、この組成物は、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を含み、このプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、例えばラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）  ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）（中国典型培養物保蔵センターに寄託されており、受託番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）であってもよい。
【００１１】
本発明の一実施例によれば、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）が生菌又は不活化菌である。
【００１２】
本発明の一実施例によれば、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ１のリン酸化を特異的に抑制し、腎線維化に関するタンパク質の発現を特異的に抑制することに用いられる。腎線維化に関するタンパク質としては、例えばプラスミノーゲン・アクチベーター・インヒビタ−１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＡＩ−１）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＣＤＫＩ）Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、平滑筋α−アクチン（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  α−ａｃｔｉｎ；α−ＳＭＡ）又はフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）が挙げられる。
【００１３】
本発明の一実施例によれば、前記組成物は、医薬組成物、補助飲食品、食品又はその組成分である。
【００１４】
本発明の他の一態様によれば、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の用途が提供され、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、ＪＡＫ２とＳＴＡＴ１のリン酸化を特異的に抑制し、ＰＡＩ−１、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、α−ＳＭＡ、フィブロネクチンのタンパク質発現を抑制することができる。
【００１５】
本発明の、糖尿病による腎線維化の治療におけるプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の用途を応用する場合、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を用いて、糖化ヘモグロビンと血糖濃度を低下させ、体重と腎重を正常な範囲に回復させて、更にＪＡＫ２／ＳＴＡＴ１のシグナル伝導経路を特異的に抑制し、腎線維化に関するタンパク質（例えばＰＡＩ−１、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、α−ＳＭＡ、フィブロネクチン等）の発現を抑制することによって、糖尿病による腎線維化を有効に治療する。それに従い、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）をその他に応用するようも開発する。
【発明の効果】
【００１６】
前述によれば、本発明は、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）が糖尿病による腎線維化の治療に用いられる組成物及びその用途を提供し、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を用いて組成物を製造し、このプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の含有量が糖尿病による腎線維化を有効に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
下記の図面の詳細な説明は、本発明の前記又はその他の目的、特徴、利点及び実施例をより分りやすくするためのものである。
【００１８】
【図１】ＡとＢは本発明の一実施例による各ラットの糖化ヘモグロビン（ｇｌｙｃａｔｅｄ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）濃度（図１Ａ）と血糖濃度（図１Ｂ）を示す棒グラフである。
【図２】ＡとＢは本発明の一実施例による各ラットの体重（図２Ａ）と左腎の重量（図２Ｂ）を示す棒グラフである。
【図３】本発明の一実施例による各ラットの腎臓皮質組織のウェスタンブロッティング解析図である。
【図４】Ａは図５のβ−アクチンの発現量によって標準化された図３のリン酸化ＪＡＫ２を示す棒グラフであり、Ｂは図５のβ−アクチンの発現量によって標準化された図３のリン酸化ＳＴＡＴ１を示す棒グラフである。
【図５】本発明の他の実施例による各ラットの腎臓皮質組織を示すウェスタンブロッティング解析図である。
【図６】Ａはβ−アクチンの発現量によって標準化された図５のＰＡＩ−１発現量を示す棒グラフであり、Ｂはβ−アクチンの発現量によって標準化された図５のＰ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現量を示す棒グラフであり、Ｃはβ−アクチンの発現量によって標準化された図５のα−ＳＭＡ発現量を示す棒グラフであり、Ｄはβ−アクチンの発現量によって標準化された図５のフィブロネクチン発現量を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ここで、本発明の「プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）」とは、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）であり、中国典型培養物保存センター（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＣＣＴＣＣ；中国湖北省武漢市武昌珞珈山）に寄託され、その受託番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３である（なお、寄託時の微生物名は、ラクトバチルス・ロイテリＧＭＮＬ−２６３とされている）。
【００２０】
前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、従来の方法、例えば、健康な大人の消化管から候補菌株を選別し、従来の菌種同定方法、例えば、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析及び菌種の生理生化学特性を同定する市販品により、プロバイオティクス菌株がラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）であると同定することができるが、ここで詳しく述べない。
【００２１】
簡単に言えば、前記同定されたプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）はＭＲＳブロス培地（ｂｒｏｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ；ＤＩＦＣＯ（登録商標）０８８１、最終ｐＨ  ６.５±０.２）を用いて、３７℃の温度で、嫌気又は好気で培養される。他の一例において、前記ＭＲＳブロス培地を用いる菌液を寒天培地に画線接種（ｓｔｒｅａｋ  ｐｌａｔｉｎｇ）することができる。
【００２２】
一実施例において、生体内の（ｉｎ  ｖｉｖｏ）動物実験によって、本発明のプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、確かに糖化ヘモグロビン（ｇｌｙｃａｔｅｄ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）と血糖（ｂｌｏｏｄ  ｓｕｇａｒ）濃度を低下させ、体重と腎重を正常な範囲に回復させ、更にＪＡＫ２／ＳＴＡＴ１のシグナル伝導経路を特異的に抑制し、腎線維化に関するタンパク質（ＰＡＩ−１、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、α−ＳＭＡ、フィブロネクチン等）の発現を特異的に抑制することによって、糖尿病による腎線維化を有効に治療できることが証明されている。
【００２３】
ここで特に説明すべきことは、本発明の「動物実験」には、例えばストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ；ＳＴＺ）のような薬物を用いることによって、糖尿病を人為的に誘発した実験動物を含み、これにより糖尿病による腎線維化に対するプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の治療効果を評価することができる。
【００２４】
ここで補充するのは、一実施例において、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）（例えば、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）；受託番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）は、糖尿病による腎線維化の治療用組成物を製造することに用いられる場合、生（ｌｉｖｅ）菌又は不活化（ｉｎａｃｔｉｖｅ）菌であってもよい。一例において、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、医薬組成物、補助飲食品、食品又はその組成分であってもよい。他の一例において、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は凍結乾燥の形にしてもよく、また、このプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）はその他の成分を更に含んでもよく、例えばグルコース、マルトデキストリン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）、乳児用調製粉乳、フラクトオリゴ糖（ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、ヨーグルト香料（ｙｏｇｕｒｔ  ｓｐｉｃｅｓ）、その他の分離しにくい成分、又は前記の任意の組み合わせを更に含んでもよい。
【００２５】
また、その他の実施例において、前記プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）（例えば、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）；受託番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）は更にその他の混合菌株を選択的に含んで、糖尿病による腎線維化の治療用組成物を製造することに用いることもできる。一例において、前記その他の混合菌株は、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、発酵乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ.  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノーサス・ＧＧ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ）又は前記の任意の組み合わせを含むが、これらに限られない。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を用いて本発明の応用を説明したが、それは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、種々の変更及び修正することができる。
【００２７】
実  施  例  １：
動物評価モデルの作製
１．プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の同定と調製
この実施例では、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）（受託番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）を用いて、動物実験を行い、糖尿病による腎線維化を治療するプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の効果を評価した。
【００２８】
このプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１；ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）は、健康な大人の胃腸管から選別された分離株の種別を同定するために、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析及び菌種の生理生化学特性を同定する市販品（例えば、ＡＰＩ同定システム）を用いた。前記１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析及びＡＰＩ同定システムに関する技術は、当業者に熟知されているので、ここで詳しく述べない。
【００２９】
プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１；ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）の１６Ｓ  ｒＤＮＡの一部の配列解析の結果は、配列番号１に示されたヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列のようであり、この１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析は、財団法人食品工業発展研究所に委託して行った。配列番号１に示された１６Ｓ  ｒＤＮＡには、５６０個のヌクレオチドがあり、配列を対比したところ、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）と９９％の類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有することが示された。
【００３０】
次に、例えばＡＰＩ（登録商標）  ５０  ＣＨＬ同定システム（ＡＰＩ（登録商標）  ５０  ＣＨＬ  ｓｙｓｔｅｍ；ｂｉｏＭeｒｉｅｕｘ  Ｉｎｃ.,  Ｆｒａｎｃｅ）又は機能が相当する他の商品のような、菌種の生理生化学特性を同定する市販品によって、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ；ＡＴＣＣ  ２３２７２）のような標準菌株と比べることで、プロバイオティクス菌株の「種（ｓｐｅｃｉｅｓ）」別を同定した。
【００３１】
表１は、ＡＰＩ（登録商標）  ５０ＣＨＬ同定システムによってこのプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１；ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）を分析した結果を示す。
【００３２】
【表１−１】
0005941248.tif 000002
【表１−２】
0005941248.tif 000003
【００３３】
前記１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析と表１の結果によれば、このプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１；ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）の配列類似度と生理代謝活性は、いずれもラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ；ＡＴＣＣ  ２３２７２）に近い。よって、このプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１；ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）はラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）であることが判明した。
【００３４】
前記同定されたラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、ＭＲＳブロス培地（ｂｒｏｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ；ＤＩＦＣＯ（登録商標）０８８１、最終ｐＨ  ６.５±０.２）を用いて、３７℃の温度で、嫌気又は好気で培養される。又は、前記ＭＲＳブロス培地を用いる菌液を寒天培地に画線接種（ｓｔｒｅａｋ  ｐｌａｔｉｎｇ）することができる。動物実験に供するために、このラクトバチルスロイテリを大量に培養してもよい。
【００３５】
動物実験を行う場合に、ラクトバチルスロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）（受託番号ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）の菌量は、１ｇあたり約１×１０６から約１×１０１１まで、または１×１０８までのコロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ；ＣＦＵ）（ＣＦＵ／ｇ）であってもよい。このラクトバチルスロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）（受託番号ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）は、凍結乾燥の形にしてもよく、また、その他の成分を含んでもよく、例えば賦形剤、グルコース、マルトデキストリン、脱脂粉乳、乳児用調製粉乳、フラクトオリゴ糖、ステアリン酸マグネシウム、ヨーグルト香料、その他の分離しにくい成分、又は前記の任意の組み合わせを含んでもよい。一例として、このラクトバチルスロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）（受託番号ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）は凍結乾燥の形である場合に、前記賦形剤は、脱脂粉乳、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、フラクトオリゴ糖を含んでもよく、その割合（ｗ／ｖ）については、例えば、約２：１：１であってもよい。
【００３６】
２.アレルゲン感作動物実験モデルの作製
この実施例では、１２週齢の雄のラット（品系：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｓ.Ｄ.）  Ｒａｔ；供給源：台湾台北楽斯科生物科技股▲ふん▼有限公司）で糖尿病動物実験モデルを作製した。まず、実験ラットに１８時間禁食させてから、ストレプトゾトシン（１０ｍＭのクエン酸ナトリウムに溶解した,  ｐＨ  ４.５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）を５０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。二日間を経て、糖尿病の誘発に成功したかどうかを確認するために、グルコースオキシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）法によって血糖を測定し、血糖濃度が１６ｍｍｏｌ／Ｌ以上のラットを選んだ。この糖尿病になったラットの血糖濃度を毎日監視した。
【００３７】
健康ラットと糖尿病ラットを５群に分け、それぞれは、健康ラット対照群（６匹；２０.６０％の脂肪、５６.５７％の炭水化物及び２２.８３％のタンパク質を含む標準飼料を給与した。以下、健康対照群と略称する）、糖尿病ラット対照群（６匹；標準飼料を給与し、以下、糖尿病ラットと略称する）、インシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（６匹；標準飼料を給与し、インシュリン注射量が４−５Ｕ／キログラム／日である。、以下、糖尿病ラット＋インシュリンと略称する）、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与した健康ラット対照群（６匹；標準飼料を給与し、各ラットに対する毎日の飼育菌量が約１×１０９コロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ；ＣＦＵ）であった。以下はＧＭ−２６３と略称する）、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与した糖尿病ラット（６匹；標準飼料を給与し、各ラットに対する毎日の飼育菌量が約１×１０９  ＣＦＵであった。以下、糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３と略称する）であった。
【００３８】
各群のラットは、摂食量には顕著な差異がなく、毎日約２５.６±０.７７ｇ（ｐ＝０.１７４７）であった。実験材料の全ては０.５ｍＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に調合され、毎日二回投与した。
【００３９】
ストレプトゾトシンを注射してから２８日後、全てのラットを屠殺して、各ラット毎の体重と左腎の重量を記録し、その後、特定タンパク含有量分析を行うために、解剖して腎臓の皮質を取り出した。
【００４０】
ラットの飼育温度は２５±１℃、相対湿度は６５±５％であり、１２時間毎の明暗サイクルに維持し、標準実験室レベルの飼料（Ｌａｂｄｉｅｔ（登録商標）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ＃５００１,  ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ.,  Ｕ.Ｓ.Ａ）で飼育し、飼育期間中に飼料及び水を自由摂取させた。ラットの飼育条件は、全て台湾の衛生研究院より公表されている実験動物管理ガイドにより行った。
【００４１】
実  施  例  ２：
生理に対するプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の影響の評価
１.糖尿病ラットの糖化ヘモグロビンと血糖濃度に対するプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の影響の評価
図１Ａと図１Ｂは、本発明の一実施例によるラットの糖化ヘモグロビン（ｇｌｙｃａｔｅｄ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）濃度（図１Ａ）及び血糖濃度（図１Ｂ）を示す棒グラフである。図１Ａの縦軸は糖化ヘモグロビン濃度（ＨｂＡ１ｃ）の百分率（％）を示し、図１Ｂの縦軸は血糖濃度（ｍｇ／ｄｌ）を示す。図１Ａと図１Ｂの横軸は、それぞれ健康ラット対照群（健康対照群と略称）、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与した健康ラット対照群（ＧＭ−２６３と略称）、糖尿病ラット対照群（糖尿病ラットと略称）、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与した糖尿病ラット（糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３と略称）、インシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（糖尿病ラット＋インシュリンと略称）を示す。図面記号＊は、健康対照群と比べて、ｐ＜０.０５であることを示し、図面記号＃は、糖尿病ラットと比べて、ｐ＜０.０５であることを示す。
【００４２】
図１Ａと図１Ｂの結果から分かるように、ストレプトゾトシンを注射してから２８日後、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与したＧＭ−２６３群の糖化ヘモグロビン濃度と血糖濃度は、健康対照群に近いが、糖尿病ラットの糖化ヘモグロビン濃度（＞７.５％）と血糖濃度（＞３５０ｍｇ／ｄｌ）は、健康対照群やＧＭ−２６３群より著しく高い。しかしながら、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３を経口投与された糖尿病ラット（糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３）は、その糖化ヘモグロビン濃度と血糖濃度の値が、インシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（糖尿病ラット＋インシュリン）に近いことから、糖尿病ラットに実施例１のプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与することによって、確かに糖化ヘモグロビンと血糖濃度を低下できることを示した。
【００４３】
２.糖尿病ラットの体重と腎重に対するプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の影響の評価
図２Ａと図２Ｂは、本発明の一実施例によるラットの体重（図２Ａ）と左腎の重量（図２Ｂ）を示す棒グラフである。図２Ａの縦軸は体重（ｇ）を示し、図２Ｂの縦軸は左腎の重量（ｇ）を示す。図２Ａと図２Ｂの横軸は、それぞれ健康ラット対照群（健康対照群と略称）、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与した健康ラット対照群（ＧＭ−２６３と略称）、糖尿病ラット対照群（糖尿病ラットと略称）、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与した糖尿病ラット（糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３と略称）、インシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（糖尿病ラット＋インシュリンと略称）を示す。図面記号＊は、健康対照群と比べて、ｐ＜０.０５であることを示し、図面記号＃は、糖尿病ラットと比べて、ｐ＜０.０５であることを示す。
【００４４】
図２Ａと図２Ｂの結果から分かるように、ストレプトゾトシンを注射してから２８日後、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与したＧＭ−２６３群の体重と左腎の重量は、健康対照群に近いが、糖尿病ラットの体重は、健康対照群やＧＭ−２６３群より著しく低く、糖尿病ラットの左腎の重量は、健康対照群やＧＭ−２６３群より著しく高かった。上記の内、腎重の変化は腎線維化を評価する指標の一つである。
【００４５】
しかしながら、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与された糖尿病ラット（糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３）は、その体重（図２Ａ）が再び上昇する傾向があり、インシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（糖尿病ラット＋インシュリン）に近かった。なお、図２Ｂに示すように、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与された糖尿病ラット（糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３）は、その左腎の重量（図２Ｂ）が糖尿病ラットより著しく低く、インシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（糖尿病ラット＋インシュリン）に近いことから、糖尿病ラットに実施例１のプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与することによって、確かに糖尿病による腎線維化の状況を改善できることを示した。
【００４６】
実  施  例  ３：
遺伝子制御と細胞内タンパク質の発現に対するプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６
３（ＡＤＲ−１）の影響の評価
１.腎臓組織の抽出
実施例１で取り出された腎臓皮質を、この組織約５０ｍｇに対し、０.１％のドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）溶解バッファー（ＳＤＳ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）１ｍＬの割合で加え、氷上に４℃で保持した後、組織ホモジナイザーで砕き、約１０分間静置反応させ、腎臓皮質組織を十分に均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）して、腎臓皮質細胞内のタンパク質をさらに溶出した。
【００４７】
前記ＳＤＳ溶解バッファーは、５０ｍＭの塩化トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ；Ｔｒｉｓ−Ｃｌ,  ｐＨ  ８.０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）溶液、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０.０２％のアジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）、１％の界面活性剤ＮＰ−４０（ＮＯＮＩＤＥＴ  ｐ−４０  ｅｔｈｙｌ  ｐｈｅｎｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）、０.０５％のオルトバナジン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ  ;  Ｎａ３VＯ４；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）、１００μｇ／ｍＬのフェニルメチルスルホニルフッ化物（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）、１μｇ／ｍＬのアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）、プロテイナーゼ・インヒビター・カクテル（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）を含んでもよい。
【００４８】
その後、得られたホモジネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）を約１２０００ｒｐｍの回転速度で、４℃において、約２０分間遠心した。そして、上澄みを回収して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質の濃度を測量した後、−７０℃に保存し、その後、評価を行った。
【００４９】
２.ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
前記のように得られたホモジネートに対して、１０％のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）を行った。１００Ｖの電圧で、タンパク質電気泳動緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ;  １.２５  Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ;  １％  ＳＤＳ）において、電気泳動を約３時間行った。その後、１９２ｍＭのグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）と２０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含む２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ  ８.３）により、１５分間平衡化した。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの調製と関連設備は、当業者が既に熟知しているので、ここで詳しく述べない。
【００５０】
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動ゲルは、ウェスタンブロッティング分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を続けて行ってもよい。この実施例において、ウェスタンブロッティングキットによって（例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｕｎｉｔ）、１００Ｖで、タンパク質電気泳動緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ;  １.２５  Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ;  １％  ＳＤＳ）により、電気泳動を約３時間行い、前記電気泳動ゲルのタンパク質を転写膜に転写した。転写膜としては、例えばＰｒｏｔｒａｎTMニトロセルロースメンブレーン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、孔径０.４５μＭ；Ｓｃｈｉｅｉｃｈｅｒ  &  Ｓｃｈｕｅｌｌ,  Ｋｎｅｅｎｅ,  ＮＨ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）であってもよい。
【００５１】
その後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（例えば、５％の脱脂粉乳をＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０.１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ  ７.４）に溶解する）で、室温で約１時間反応後、一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（抗体結合溶液で希釈し、抗体結合溶液の組成は後述する）を入れ、４℃で一晩反応させた。そして、ＴＢＳ緩衝液で三回洗浄した。各回の洗浄時間は１０分間であった。続いて、ＴＢＳ緩衝液により４０００倍に希釈した二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）をいれて、３７℃で１時間反応させてから、ＴＢＳ緩衝液で三回洗浄した。各回の洗浄時間は１０分間であった。その後、例えば増強化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍｉＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；ＥＣＬ）反応キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ.,  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ,  ＩＬ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）などの冷光呈色剤を転写膜に入れて、冷光法によりＬＡＳ−３０００のルミノ・イメージアナライザ（例えばＦｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ−３０００  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ,  Ｔｏｋｙｏ,  Ｊａｐａｎ）に現像させ、結果を分析した。
【００５２】
前記一次抗体は、例えば、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ１、ＰＡＩ−１、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、α−ＳＭＡ（上記製品がＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,  Ｉｎｃ.,  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ,  ＣＡ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.より）、フィブロネクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ,  Ｔｅｍｅｃｕｌａ,  ＣＡ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.）、リン酸化ＪＡＫ２、リン酸化ＳＴＡＴ１（上記製品がＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,  Ｉｎｃ.,  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ,  ＣＡ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.より）、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ,  Ｓｔ.  Ｌｏｕｉｓ,  ＭＯ,  Ｕ.Ｓ.Ａ）に対するモノクロナール抗体であってもよい。
【００５３】
前記二次抗体は、例えば、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を結合したヤギ抗マウスＩｇＧ  （ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）、又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ  （ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）  （上記製品がＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ.,  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ,  ＩＬ,  Ｕ.Ｓ.Ａ.より）であってもよい。
【００５４】
前記抗体結合溶液は、例えば、ＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅ,  １００ｍＭ  ＮａＣｌ,  ０.１％  Ｔｗｅｅｎ−２０,  ｐＨ  ７.４を含む）を含んでもよい。
【００５５】
ウェスタンブロッティングのバンド強度は、デンシトメトリー分析（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）法により定量される。その結果は、目標タンパクとβ−アクチンとのバンド強度の割合で表す。それに、ここでいう毎群のサンプルは、少なくとも三回繰り返したものであり、得られた数値は、「平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）」で示す。統計分析は、Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡにより分析し、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ型多重比較検定法（Ｔｕｋｅｙ−ｔｙｐｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）によってスチューデント化残差（ｓｔｕｄｅｎｔｉｚｅｄ）で各群の差異顕著性を比較した。各群の差異がｐ＜０.０５の場合、顕著性差異があると考えられる。
【００５６】
３.糖尿病ラットの腎臓皮質のＪＡＫ２とＳＴＡＴ１のリン酸化に対するプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の影響の評価
過去の研究によれば、糖尿病動物の高血糖により腎線維化を誘発した過程において、ＪＡＫ／ＳＴＡＴｓシグナル伝導経路（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）は、重要な遺伝子制御の役割を担っている。そこで、この実施例は、更に糖尿病ラットの腎臓皮質のＪＡＫ２とＳＴＡＴ１のリン酸化に対するプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の影響を評価した。
【００５７】
図３は、本発明の一実施例による糖尿病ラットの腎臓皮質組織を示すウェスタンブロッティング解析図である。その内、レーン１−２は健康対照群を示し、レーン３−４は糖尿病ラット群を示し、レーン５−６はラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与した糖尿病ラット群（糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３）を示し、レーン７−８はインシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（糖尿病ラット＋インシュリン）を示す。図３は、糖尿病ラットの腎臓皮質組織内のＪＡＫ２（約１２０ｋＤａ）、ＳＴＡＴ１（約９０ｋＤａ）、リン酸化ＪＡＫ２（約１２０ｋＤａ）、ＳＴＡＴ１（約９０ｋＤａ）の発現を分析するものである。また、図５のβ−アクチンは、前記蛋白の発現量を標準化するものである。
【００５８】
図４Ａは、β−アクチンの発現量によって標準化された図３のリン酸化ＪＡＫ２を示す棒グラフであり、縦軸はβ−アクチンの発現量によって標準化されたリン酸化ＪＡＫ２の相対量（即ち、ＪＡＫ２リン酸化／β−アクチンの相対発現量、任意単位（ａｒｂｉｔａｒｙ  ｕｎｉｔｓ））を示す。また、健康対照群のＪＡＫ２リン酸化／β−アクチンの相対発現量を１.０とする。
【００５９】
図４Ｂは、β−アクチンの発現量によって標準化された図３のリン酸化ＳＴＡＴ１を示す棒グラフであり、縦軸はβ−アクチンの発現量によって標準化されたリン酸化ＳＴＡＴ１の相対量（即ち、リン酸化ＳＴＡＴ１／β−アクチンの相対発現量、任意単位）を示す。また、健康対照群のＳＴＡＴ１リン酸化／β−アクチンの相対発現量を１.０とする。図４Ａと図４Ｂの図面記号＊は、健康対照群と比べて、ｐ＜０.０５であることを示し、図面記号＃は、糖尿病ラットと比べて、ｐ＜０.０５であることを示す。
【００６０】
図３、図４Ａ、図４Ｂの結果からわかるように、ストレプトゾトシンを注射してから２８日後、糖尿病ラットのＪＡＫ２（図３の上からの二列のレーン３−４）とＳＴＡＴ１（図３の下からの二列のレーン３−４）のリン酸化の相対量は、いずれも健康対照群（図３のレーン１−２）より著しく高いことから、糖尿病ラットの腎臓皮質のＪＡＫ２とＳＴＡＴ１は高度に活性化されている状態になることが示された。
【００６１】
しかしながら、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与された糖尿病ラット（糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３）は、そのＪＡＫ２とＳＴＡＴ１のリン酸化の相対量（図３のレーン５−６）が著しく低下して、インシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（糖尿病ラット＋インシュリン）（図３のレーン７−８）に近いことから、実施例１のプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与することによって、確かにＪＡＫ２とＳＴＡＴ１のリン酸化を特異的に抑制できることを示した。
【００６２】
４.糖尿病ラットの腎臓皮質の細胞内タンパク質の発現に対するプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の影響の評価
図５は、本発明の他の実施例による糖尿病ラットの腎臓皮質組織を示すウェスタンブロッティング解析図であり、レーン１−２は健康対照群を示し、レーン３−４は糖尿病ラット群を示し、レーン５−６はラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与した糖尿病ラット群（糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３）を示し、レーン７−８はインシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（糖尿病ラット＋インシュリン）を示す。図５は、糖尿病ラットの腎臓皮質組織内のＰＡＩ−１（約５０ｋＤａ）、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１（約２０ｋＤａ）、α−ＳＭＡ（約４２ｋＤａ）、フィブロネクチン（約２００ｋＤａ）の発現量を分析するものである。また、β−アクチンは、前記タンパクの発現量を標準化するものである。
【００６３】
図６Ａは、β−アクチンの発現量によって標準化された図５のＰＡＩ−１発現量を示す棒グラフであり、縦軸はβ−アクチンの発現量によって標準化されたＰＡＩ−１の相対発現量（即ち、ＰＡＩ−１／β−アクチンの相対発現量、任意単位）を示す。また、健康対照群のＰＡＩ−１／β−アクチンの相対発現量を１.０とする。
【００６４】
図６Ｂは、β−アクチンの発現量によって標準化された図５のＰ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現量を示す棒グラフであり、縦軸はβ−アクチンの発現量によって標準化されたＰ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の相対発現量（即ち、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１／β−アクチンの相対発現量、任意単位）を示す。また、健康対照群のＰ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１／β−アクチンの相対発現量を１.０とする。
【００６５】
図６Ｃは、β−アクチンの発現量によって標準化された図５のα−ＳＭＡ発現量を示す棒グラフであり、縦軸はβ−アクチンの発現量によって標準化されたα−ＳＭＡの相対発現量（即ちα−ＳＭＡ／β−アクチンの相対発現量、任意単位）を示す。また、健康対照群のα−ＳＭＡ／β−アクチンの相対発現量を１.０とする。
【００６６】
図６Ｄは、β−アクチンの発現量によって標準化された図５のフィブロネクチン発現量を示す棒グラフであり、縦軸はβ−アクチンの発現量によって標準化されたフィブロネクチンの相対発現量（即ち、フィブロネクチン／β−アクチンの相対発現量、任意単位）を示す。また、健康対照群のフィブロネクチン／β−アクチンの相対発現量を１.０とする。
【００６７】
図５、図６Ａ乃至図６Ｄの結果からわかるように、ストレプトゾトシンを注射してから２８日後、糖尿病ラットのＰＡＩ−１（図５の上から一列目のレーン３−４）、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１（図５の上から二列目のレーン３−４）、α−ＳＭＡ（図５の上から三列目のレーン３−４）、フィブロネクチン（図５の最後の列のレーン３−４）のリン酸化の相対量は、健康対照群（図５のレーン１−２）より著しく高いことから、糖尿病ラットの腎臓皮質のＰＡＩ−１、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、α−ＳＭＡ、フィブロネクチンは高度に発現されている状態になり、糖尿病ラットの腎線維化を引き起こしたことを示した。
【００６８】
しかし、ラクトバチルス・ロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与された糖尿病ラット（糖尿病ラット＋ＧＭ−２６３）は、そのＰＡＩ−１、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、α−ＳＭＡ、フィブロネクチンの相対量（図５のレーン５−６）が著しく低下し、それにＰ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１とα−ＳＭＡの低下程度が、インシュリンを投与した糖尿病ラット対照群（糖尿病ラット＋インシュリン）（図５のレーン７−８）よりも低いことから、実施例１のプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を経口投与することによって、確かにＰＡＩ−１、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、α−ＳＭＡ、フィブロネクチンの発現量を特異的に抑制できることを示した。
【００６９】
以上をまとめていえば、本発明のプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）（ラクトバチルスロイテリＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１））（受託番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０９２６３）は、糖尿病による腎線維化の治療に応用できることが証明されており、また、本発明は、乳酸菌の関与可能な制御機構、即ち、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ１のシグナル伝導経路を特異的に抑制し、腎線維化に関するタンパク質（ＰＡＩ−１、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、α−ＳＭＡ、フィブロネクチン）の発現を抑制する制御機構を提示し、それによって、糖尿病による腎線維化を有効に治療でき、それに従い、プロバイオティクス菌株をその他に応用するよう開発する。
【００７０】
ここで補充するのは、本発明は、特定の菌株、特定の分析方式、特定の動物モデル、特定の反応条件、特定の使用方法、特定の材料又は特定の設備等を例として、本発明の、糖尿病による腎線維化の治療におけるプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の用途を説明するが、当業者が理解するように、本発明はこれらに限られず、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、本発明のプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）がその他のプロバイオティクス菌株、その他の分析方式、その他の動物モデル、その他の反応条件、その他の使用方式、その他の同等レベルの材料又はその他の設備等によって行ってもよい。また、本発明のプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を、例えば医薬組成物、補助飲食品、食品又はその組成分などの、糖尿病による腎線維化を治療する組成物の製造に用いる場合、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、生菌又は不活化菌であってもよく、また、凍結乾燥の形であってもよい。なお、本発明のプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）は、更にその他の成分を含んでもよく、例えばグルコース、マルトデキストリン、乳児用調製粉乳、フラクトオリゴ糖、ステアリン酸マグネシウム、ヨーグルト香料、その他の分離しにくい成分、又は前記の任意の組み合わせを更に含んでもよい。
【００７１】
本発明の前記実施例から分かるように、本発明の、糖尿病による腎線維化の治療におけるプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）の用途は、その利点がプロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）を用いて、糖化ヘモグロビンと血糖濃度を低下させ、体重と腎重を正常な範囲に回復させて、更に、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ１のシグナル伝導経路を特異的に抑制し、腎線維化に関するタンパク質（例えばＰＡＩ−１、Ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、α−ＳＭＡ、フィブロネクチン等）の発現を抑制することによって、糖尿病による腎線維化を有効に治療し、それに従い、プロバイオティクス菌株ＧＭ−２６３（ＡＤＲ−１）をその他に応用するよう開発する。
【００７２】
本発明を複数の実施例によって以上のように開示したが、これは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、各種の変更及び修飾することができる。本発明は、特許請求の範囲の記載によって限定される。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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