(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚表面から皮膚内部のラマン分光スペクトルを測定し、該スペクトル中の脂質分子に由来するピークの強度を指標とする、皮膚の水分透過バリア機能の評価方法であって、該ラマン分光スペクトルが、皮膚表面からの深さ４〜１２μｍの範囲において測定するものであり、該脂質分子に由来するピークが、スペクトル中２８８０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピークである評価方法。
【請求項２】
水分透過バリア機能の評価が、美容目的である、請求項１記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の水分透過バリア機能の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、体内からの水分や生体成分の損失、及び外部からの異物の進入を防ぐ機能を有しており、これらは皮膚のバリア機能と呼ばれている。特に水分の損失に係わる皮膚の水分透過バリア機能が低下すると、乾燥や肌荒れなどの皮膚トラブルを生じることから、化粧料を塗布して皮膚をケアすることは、美容分野において非常に重要である。皮膚の水分透過バリア機能を評価する方法として、経表皮水分蒸散量（Transepidermal water loss：ＴＥＷＬ）の測定が広く用いられている。ＴＥＷＬを測定して皮膚の水分透過バリア機能を正しく把握することは、化粧品の研究や化粧品による美容方法の研究等、美容分野において有用である。
【０００３】
従来のＴＥＷＬ測定としては、両端が開口した円筒式プローブの一方に皮膚を接触させ、プローブ内部に設置された温湿度センサを利用し、皮膚表面から蒸散する水分量を測定する方法が存在する。この方法を採用した測定装置として、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社のＴｅｗａｍｅｔｅｒ（登録商標）  ＴＭ３００がある。しかし、この方法は、外気の影響を受け易く、安定性が低いため、測定に時間を要するという特徴があった。そこで、片側のみが開口した円筒型プローブの開口部に皮膚を接触させて、短時間で皮膚から蒸散する水分蒸散量を測定する方法が報告されている（特許文献１）。
【０００４】
皮膚の水分透過バリア機能の主体は、皮膚の最外層をなす角層であると考えられ、特にセラミド、コレステロール、脂肪酸等から構成される角層細胞間脂質の状態は、バリア機能の発揮に重要であると考えられている。角層細胞間脂質の状態を解析する方法としては、Ｘ線回折法（例えば、非特許文献１）、電子線回折法（例えば、非特許文献２）、赤外分光法（例えば、非特許文献３）、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法（例えば、特許文献２）等が知られており、これらの方法を利用することで、角層細胞間脂質の状態を解析することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６９６６８７７号明細書
【特許文献２】特開２００８−０３９７６１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Investigative Dermatology, 114, 654-660, 2000
【非特許文献２】Journal of Investigative Dermatology, 111, 403-409, 1999
【非特許文献３】Biochimica et Biophysica Acta, 1808, 1529-1537, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の皮膚の水分透過バリア機能の評価方法は、ＴＥＷＬという皮膚からの水分蒸散量を基に評価されるため、皮膚からの水分蒸散量に影響する精神的刺激、体温上昇、運動に伴う発汗等の皮膚機能以外の生理現象によって、評価結果が左右されるおそれがあった。また、エタノールやプロピレングリコールなどの有機溶剤は温湿度センサによる測定を妨げることが知られており、これらの物質が配合されている化粧料を使用したときの水分透過バリア機能については、正確に評価できない可能性があった。
【０００８】
皮膚の水分透過バリア機能の発揮に重要であるとされる角層細胞間脂質の状態は、Ｘ線回折法、電子線回折法、赤外分光法、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法により解析可能であるが、測定のために皮膚の切除や角層の剥離が必要であり、被験者に負担となる場合があった。そこで、被験者の負担の少ない非侵襲的な評価方法が望まれていた。
【０００９】
従って、本発明の課題は、皮膚機能以外の生理現象や有機溶媒の存在に影響されることなく、非侵襲的な皮膚の水分透過バリア機能の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、非侵襲的に皮膚の内部を構成する物質の定性的、定量的な評価が可能である共焦点ラマン分光測定に着目し、そのスペクトルを測定し、スペクトルの解析を行った。その結果、ラマン分光スペクトル中の脂質分子に由来するピークがＴＥＷＬと相関することを見出し、その信号強度を指標とすることで皮膚機能以外の要因に影響されず、非侵襲的に皮膚の水分透過バリア機能を評価できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち本発明は、皮膚表面から皮膚内部のラマン分光スペクトルを測定し、該スペクトル中の脂質分子に由来するピークの強度を指標とする、皮膚の水分透過バリア機能の評価方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、皮膚機能以外の要因に影響されず、また、非侵襲的に皮膚の水分透過バリア機能を評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】皮膚表面から８μｍの深さにおけるラマン分光スペクトルを示す図である。
【図２】皮膚表面から８μｍの深さにおけるラマン分光スペクトルの２８８０±１０［ｃｍ-1］のピーク強度と経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の逆数との相関関係を示す図である。
【図３】ラマン分光スペクトルを測定した皮膚表面からの深さと、各深さにおけるラマン分光スペクトルの２８８０±１０［ｃｍ-1］のピーク強度と経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の逆数の相関係数との関係を示す図である。
【図４】脱脂処理前後でのＴＥＷＬの変化を示す図である。
【図５】脱脂処理前後での皮膚表面から深度４μｍにおけるラマン分光スペクトルの２８８０±１０［ｃｍ-1］のピーク強度の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の評価方法に使用されるラマン分光スペクトルは、ラマン分光装置により測定される。ラマン分光装置としては、例えば、Ｊ．Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．，ｖｏｌ．３１，ｐ８１３−８１８（２０００）に開示されているような共焦点ラマン分光装置が挙げられるが、皮膚内部のラマン分光スペクトルを非侵襲的に測定できるラマン分光装置であれば、共焦点ラマンに限らずコヒーレントアンチストークスラマン、誘導ラマン等いずれでも用いることができ、特に限定されない。
【００１５】
ラマン分光スペクトルは共焦点装置により、皮膚表面から３００μｍ程度の深さまでの任意の深さのスペクトルを測定することが可能である。皮膚の水分透過バリア機能の主体は皮膚の最外層をなす角層であると考えられることから、本発明の評価方法では、角層の一般的な厚さが２０μｍ前後であることを考慮し、皮膚表面からの深さ１〜２０μｍの範囲内で測定されたラマン分光スペクトルを用いるのが好ましい。特にこの範囲のうち、ラマン分光スペクトル中の脂質分子に由来するピークの強度と水分透過バリア機能の指標であるＴＥＷＬとの間で、より高い相関関係が得られる深さにおいて測定されたラマン分光スペクトルを用いるのが好ましい。より高い相関関係が得られる深さは、皮膚の状態や施した処理等により変化する場合があるので一概に規定することはできないが、一般的には、皮膚の表面から２μｍ以上、好ましくは４μｍ以上であり、その上限は１８μｍ以下が好ましく、１５μｍ以下がより好ましく、１４μｍ以下がさらに好ましく、１２μｍ以下がさらに好ましい。具体的な深さは、皮膚表面から２〜１８μｍの深さが好ましく、より好ましくは２〜１５μｍであり、さらに好ましくは４〜１４μｍであり、さらに好ましくは４〜１２μｍである。これらの範囲内で測定されたラマン分光スペクトルを用いることにより、より正確に皮膚の水分透過バリア機能を評価することが可能である。
【００１６】
図１に、皮膚表面からの深さ８μｍで測定したラマン分光スペクトルを示す。スペクトル中、２８５０±１０［ｃｍ-1］、２８８０±１０［ｃｍ-1］、２９３０±１０［ｃｍ-1］に比較的大きなピークが検出されている（図１矢印）。２８５０±１０［ｃｍ-1］と２８８０±１０［ｃｍ-1］のピークは、それぞれＣＨ2対称伸縮振動モードとＣＨ2逆対称伸縮振動モードに由来することが知られており、皮膚の場合、脂質分子の炭化水素鎖の配列構造性を反映していると考えられる。特にこれら２つのピークは、角層において特異的に検出されることから、角層における水分透過バリア機能の本体を考えら得る角層細胞間脂質のラメラ構造を反映しているものと推察される。一方、２９３０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピークはＣＨ3対称伸縮振動モードに由来するピークであり、このピークは、角層に限らず、角層を含めた皮膚全層において検出される。
【００１７】
後述するように、皮膚内部のラマン分光スペクトルのうち、脂質分子に由来するピークの強度は、皮膚の水分透過バリア機能の指標であるＴＥＷＬと相関関係を有しており、本発明の評価方法は、皮膚内部のラマン分光スペクトル中の脂質分子に由来するピークの強度を指標として、皮膚の水分透過バリア機能を評価するものである。より詳細には、皮膚内部のラマン分光スペクトルの脂質分子に由来するピークの強度は、ＴＥＷＬの逆数と正の相関関係にあることから、当該ピーク強度と皮膚の水分透過バリア機能とは正の相関関係を有する。本発明の評価方法で指標として用いるラマン分光スペクトル中の脂質分子に由来するピークは、特に限定されないが、上述したように、角層の水分透過バリア機能の本体と考えられる角層細胞間脂質分子に密接に関係する２８５０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピーク（ＣＨ2対称伸縮振動モード由来）又は２８８０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピーク（ＣＨ2逆対称伸縮振動モード由来）を指標とするのが好ましい。さらに比較的ピーク強度が大きくより安定的に検出可能であることから、スペクトル中２８８０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピークを指標とするのが特に好ましい。また、ラマン分光スペクトルは、蛍光等の影響により強度に差異が生じることがあるため、ピーク強度として測定値をそのまま用いるのではなく、スペクトル中で安定的に検出されるピークの強度を基準とした相対値を用いたほうが、より評価の精度が上がるため好ましい。本発明の評価方法では、ＣＨ3対称伸縮振動モードに由来し、皮膚全層に渡って検出される２９３０±１０［ｃｍ-1］のピークを基準ピークとして用いるのが好ましい。
【００１８】
本発明の評価方法は、美容面からの皮膚の水分透過バリア機能の研究、バリア機能強化のための化粧品や美容方法の研究等、美容目的において利用することができる。
【００１９】
次に本発明の実施態様及び好ましい実施例を示す。
【００２０】
＜１＞皮膚表面から皮膚内部のラマン分光スペクトルを測定し、該スペクトル中の脂質分子に由来するピークの強度を指標とする、皮膚の水分透過バリア機能の評価方法。
【００２１】
＜２＞皮膚表面から皮膚内部のラマン分光スペクトルを、皮膚内部のラマン分光スペクトルを非侵襲的に測定できるラマン分光装置で測定する＜１＞の評価方法。
＜３＞ラマン分光装置が、共焦点ラマン分光装置、コヒーレントアンチストークスラマン分光装置又は誘導ラマン分光装置である＜２＞の評価方法。
＜４＞ラマン分光スペクトルが、皮膚表面からの深さ１〜２０μｍ、好ましくは２μｍ以上、より好ましくは４μｍ以上であり、１８μｍ以下、好ましくは１５μｍ以下、より好ましくは１４μｍ以下、さらに好ましくは１２μｍ以下で測定するものである＜１＞〜＜３＞のいずれかの評価方法。
＜５＞ラマン分光スペクトルが、皮膚表面からの深さ２〜１８μｍ、好ましくは２〜１５μｍ、より好ましくは４〜１４μｍ、さらに好ましくは４〜１２μｍの範囲において測定するものである＜１＞〜＜４＞のいずれかの評価方法。
＜６＞脂質分子に由来するピークが、スペクトル中２８５０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピーク、又はスペクトル中２８８０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピークであり、好ましくは２８８０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピークである＜１＞〜＜５＞のいずれかの評価方法。
＜７＞脂質分子に由来するピークの強度が大きい場合に、皮膚の水分透過バリア機能が高いと判断する＜１＞〜＜６＞のいずれかの評価方法。
＜８＞
水分透過バリア機能の評価が、美容目的である＜１＞〜＜６＞のいずれかの評価方法。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
試験例1（ラマン分光スペクトルとＴＥＷＬの相関）
健常男性３７名を被験者とし、前腕屈側部におけるラマン分光スペクトルとＴＥＷＬを測定し、両者を比較した。測定は恒温恒湿環境（２２℃、湿度５０％）に１５分間馴化させた後に行った。
ラマン分光スペクトルは、共焦点ラマン分光装置（Ｍｏｄｅｌ３５１０；Ｒｉｖｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＢＶ社）により測定した。測定は、皮膚表面から２０μｍの深さまで２μｍ毎に行った。２７００〜３１００［ｃｍ-1］の範囲についての測定を３回繰り返して平均した値を使用した。得られたラマン分光スペクトル中、２８８０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピーク強度を解析に供した。尚、ピーク強度は、２９３０±１０［ｃｍ-1］に検出されるピークの強度を１とし、これに対する相対強度に変換した。
ＴＥＷＬは、水分蒸散量測定装置（Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ（登録商標）  ＴＭ３００；Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）により測定した。測定は、約１５０ｓｅｃ行い、数値的に安定している連続した６０ｓｅｃの値を平均した値を解析に供した。
【００２４】
皮膚表面からの深度毎に得られた被験者３７名分のピーク強度をＴＥＷＬの値を元に、各深度における両データの相関関係の解析を行った。図２に示すのは、皮膚表面から８μｍにおけるピーク強度とＴＥＷＬの相関関係であり、縦軸はＴＥＷＬの逆数（１／ＴＥＷＬ）、横軸は相対値で表した２８８０±１０［ｃｍ-1］のピーク強度である。１／ＴＥＷＬとピーク強度の間の相関係数は０．４６９６で、両者の間に有意な正の相関があることが示された。このことは、皮膚表面から８μｍの深さで測定されたラマン分光スペクトル中の２８８０±１０［ｃｍ-1］のピーク強度が強いとＴＥＷＬが低いことを示しており、このピークの強度は皮膚の水分透過バリア機能と相関することが示された。
【００２５】
図３に示すのは、ラマン分光スペクトルを測定した皮膚からの深さと、その深さにおける２８８０±１０［ｃｍ-1］のピーク強度と１／ＴＥＷＬとの間の相関係数の関係である。図３からは、ラマン分光スペクトルを測定した皮膚表面からの深さで相関係数が変化することが示されている。図３からは、深度２〜１５μｍ、特に４〜１２μｍの範囲で測定したラマン分光スペクトルが、比較的高いＴＥＷＬとの相関関係を有することが分かる。
【００２６】
試験例２（脱脂処理した皮膚における評価）
皮膚の脱脂処理は、人工的に荒れ肌を惹起させるために用いられる処理のひとつで、この処理により皮膚の水分透過バリア機能が損なわれ、ＴＥＷＬが上昇することが知られている。脱脂処理による水分透過バリア機能への影響を本発明の評価方法を用いて評価した。
健常男性３名を被験者とし、恒温恒湿環境（２２℃、湿度５０％）に１５分間馴化させた後に、前腕屈側部におけるラマン分光スペクトルとＴＥＷＬを測定した。測定は、試験例１と同様の装置と方法で行った。脱脂処理は皮膚表面近くに及ぼす影響が大きいことから、評価には皮膚から４μｍの深さで測定したラマン分光スペクトルを用いた。測定終了後、直径約２ｃｍのガラス製カップを、前腕屈側部の脱脂処理部にカップを伏せた状態でゴムバンドで固定した。ガラス製カップには溶媒の出し入れ口が設けてあり、ここから脱脂用溶媒（アセトン／ジエチルエーテル等量混合液）１０ｍＬを注入した。２０分間静置した後、新たな脱脂用溶媒に交換し、更に１０分間静置して脱脂処理を行った。脱脂処理から６０分経過後、再度ラマン分光スペクトルとＴＥＷＬを測定し、脱脂処理前後でのラマンスペクトル中の２８８０±１０［ｃｍ-1］のピーク強度とＴＥＷＬの変化について調べた。
【００２７】
図４は、脱脂処理前後でのＴＥＷＬの変化を示したもので、脱脂処理により皮膚の水分透過バリア機能が損なわれ、ＴＥＷＬが上昇、すなわち皮膚からの水分の損失量が増えたことが分かる。一方、図５は、脱脂処理前後での皮膚表面から深度４μｍにおけるラマン分光スペクトルの２８８０±１０［ｃｍ-1］のピーク強度の変化を示したもので、脱脂処理によりピーク強度が低下したことが分かる。
以上から、脱脂処理によりＴＥＷＬが上昇するという、皮膚の水分透過バリア機能の低下という現象が、本発明の評価方法によりピーク強度の低下として捉えられていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により、皮膚機能以外の要因に影響されず、より正確に皮膚の水分透過バリア機能を非侵襲的に計測することが可能となり、紫外線照射等の外的要因、加齢等の内的要因で低下する水分透過バリア機能に基く皮膚の乾燥に対処するための化粧品や美容方法の開発等において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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