(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチドである治療成分微粒と、補助成分としてのＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２の微粒と、前記治療成分を徐放する生物分解性ポリマーとを含むミクロスフィア形態にある組成物。
【請求項２】
前記生物分解性ポリマーは、ポリ乳酸−ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びポリカプロラクトン（ＰＣＬ）からなる群より選ばれたものであり、人体に用いられるポリマーである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチド微粒及びＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２の微粒は、直径が１０μｍ未満にあるとともに、前記生物分解性ポリマーに封入される請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチド微粒及びＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２の微粒は、直径が１μｍにある請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチドは、エキセナチドである請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ａ）微粒状のＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチド及び微粒状の補助成分としてのＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２を生物分解性ポリマーの有機溶液に懸濁させるステップと、
ｂ）ステップａ）で調製された懸濁液を水相連続相に分散させ、胚胎ミクロスフィアを形成するステップと、
ｅ）ステップｂ）で調製された胚胎ミクロスフィアから有機溶媒を除去して、硬化させるステップと、
を含む請求項１に記載のミクロスフィア形態にある組成物を調製するための方法。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチド微粒及びＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２の微粒は、直径が１０μｍ未満にあるとともに、前記生物分解性ポリマーに封入される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチド微粒及びＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２の微粒は、直径が１μｍにある請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチド微粒及びＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２の微粒は、直径が１０μｍ超であり、
ａ）ＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチドを極性有機溶媒に溶解するステップと、
ｂ）Ｍｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２を水に溶解するステップと、
ｃ）ステップａ）で調製されたＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチドの溶液とステップｂ）で調製されたＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２の溶液を生物分解性ポリマーの有機溶液に撹拌・分散させ、直径が１０μｍ以下の微粒に沈殿させるステップと、
を含み、インサイチュ沈殿法によって微粒を得る請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップｃ）において、ステップａ）で調製されたＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチドの溶液とステップｂ）で調製されたＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、又はＺｎ（ＯＨ）２の溶液を生物分解性ポリマーの有機溶液に撹拌・分散させ、直径が１μｍの微粒に沈殿させる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記極性有機溶媒は、ＤＭＳＯ又はＤＭＦである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物分解性ポリマーの有機溶液の溶媒は、ジクロロメタン、又は酢酸エチルである請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物分解性ポリマーは、ポリ乳酸−ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、及びポリカプロラクトン（ＰＣＬ）からなる群より選ばれたものである請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記の水相連続相に表面活性剤としてのポリビニルアルコールを添加する請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニスト様ペプチドは、エキセナチドである請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照と関連出願
本願は、２０１１年１２月５日に出願された中国特許出願ＣＮ２０１１０３９７４７１７の優先権を主張する。上記出願の内容は参照により本願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ペプチドであるエキセナチドの徐放剤型の組成物及びこの剤型の製剤方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ペプチド又は他の水溶性成分の、ポリマーに基づく徐放剤型の技術的挑戦は、初期バースト放出、不完全放出、初期又はあらゆる段階での遅延放出、及び活性成分がポリマー分解により発生した酸性によって分解されることを含む。徐放剤型を注射できるようにするために、薬物を担持するポリマーは通常直径が数十ミクロンのミクロスフィアに調製され、活性物質をその中に封入する。この場合、ミクロスフィアの封入効率とサイズの制御は、治療実行上で可能なミクロスフィア製剤にとって、肝心な点となっている。若干のペプチド充填ミクロスフィア製剤はすでに発売されているが、上記問題はうまく解決されていない。これらの問題は現在販売しているエキセナチドミクロスフィアにおいも明らかである。即ち、一週間にわたって放出されるエキセナチドは、注射後の三週目から初めて放出が始まる。本発明は、上記のミクロスフィア製剤の問題を解決できるミクロスフィア組成物と製剤方法を開示し、特にペプチド、例えば、エキセナチドに適用できる。
【０００４】
ミクロスフィアには種々な調製方法があり、例えば、溶媒揮発法、コアセルベーション法、噴霧乾燥法、噴霧凍結乾燥法、超音波補助アトマイゼーション、及び微流化法(microfluidization)。最も汎用な方法は、薬物を担持したポリマー溶液をそれと互いに溶け合わない連続相の中で乳化させて胚胎ミクロスフィアが形成した後の溶媒を揮発又は抽出することを含む。薬物がペプチド又は他の水溶性成分である時、多重乳化、即ち１つの乳液を別の連続相の中でさらに乳化させることが必要となる。
【０００５】
単回乳化法は、徐放制御としてのポリマーと共に有機溶媒に溶解できる脂溶性成分の封入にのみ適用可能である。形成された共溶液はさらに水性相に分散され、胚胎ミクロスフィアを形成し、さらに揮発又は抽出による溶媒除去によって固形化される。しかし、多くの場合では、生物物質、例えばタンパクとペプチドは水だけに溶解し、複乳化法が必要となる。後のステップの乳化の連続相は水溶液であれば、ポリマー有機相の液滴に封入されたタンパク又はペプチド溶液が親水連続相に漏れてしまい、封入率が低下する。崩れやすいコンホメーションを有するタンパクにとって、有機相／水相界面はタンパク変性と凝集を引き起こす有害要因である可能性がある。
【０００６】
マイクロ封入プロセスにおいて、活性成分の連続相への漏れを避けるために、ポリマー溶液と互に溶け合わない非水相液体、例えばシリコン油は後のステップの薬物を担持したポリマー溶液を乳化させる連続相として用いられる。多数のタンパクとペプチドがシリコン油に溶解しないため、封入率が実質的に向上できる。シリコン油又は他の非水連続相を採用する主な欠点は、それをミクロスフィア表面から取り除く必要があることである。シリコン油と互に溶け合える有機溶媒は、ミクロスフィアを洗浄することに相当な量を用いなければならなく、環境問題を引き起こす。
【０００７】
封入効率を改善するためのもう１つの変更方法は、タンパク又はペプチド成分を予め固体粒子に調製し、さらにマイクロ封入を行うことである。このマイクロスフィア形成方法は「水中油中固体」（Ｓ／Ｏ／Ｗ）法と呼ばれる。本発明はＳ／Ｏ／Ｗ法を利用しており、その中でもタンパク又はペプチドを固体粒子に転換する点は新規である。
【０００８】
注射の便利さから、ミクロスフィアの直径が数ミクロンから２００ミクロンの間である必要があり、多くの場合では２０〜２００ミクロンであることが望ましい。従って、封入されるタンパク又はペプチドの初期粒子は、最終形態のミクロスフィアより実質的に小さくなければならない。タンパク又はペプチド粒子の合理的な直径は、数ミクロン又はそれより小さく調整すべきである。
【０００９】
初期粒子のサイズを小さくするために、研究者らはペプチド水溶液に水と互に溶け合う低極性溶媒を添加することで沈殿させた。しかし、これらの水と互に溶け合う溶媒の揮発性が比較的に低く、蒸発により容易に除去できない。このような場合は、抽出法がこれらの溶媒を除去するための有効な方法になる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、徐放ミクロスフィア剤型の組成物を開示し、設計された時間帯に線形模式に近いペプチド放出を提供することができる。また本発明は、このミクロスフィア製剤を調製する方法を開示した。このミクロスフィア製剤は少なくとも一種のペプチド（又は他の活性成分、例えば分子量が１０Ｋ未満のタンパク−以下、小分子量と定義できる）及び一種の補助成分（例えば溶解度がｐＨによって変化するｐＨ敏感成分）を含有し、しかも両方とも微粒状であり、及び少なくとも一種の生物分解性ポリマーを含有する。このｐＨ敏感成分（補助成分の一種）は、ポリマー分解で発生した酸性の緩衝（中和）を補助し、さらにポリマー分解の前後のプロセスで浸透圧を制御することで、薬物の放出を加速する。このミクロスフィア組成物（剤型）を処方する方法として、ペプチドの微細粒子及び直径が十分に小さい（零点数ミクロンから数ミクロン）ｐＨ敏感成分は、まず当該ポリマーを溶解した溶液から沈殿させることにより調製される。そして、形成された懸濁液を水相連続相に分散（乳化）させ、胚胎ミクロスフィアを形成し、さらに固形化させる。このプロセスを以下のステップで示す。
【００１１】
ａ）治療成分（例えばエキセナチド）を極性溶媒（第１溶液と称し、例えばＤＭＳＯ又はＤＭＦ）に溶解するステップ、
ｂ）補助成分（例えばｐＨ敏感成分）を水に溶解するステップ、
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）で調製された溶液と極性が比較的に低い溶媒（第２溶媒と称し、例えば分解性ポリマーを溶解するジクロロメタン）を任意の順番で混合し、ペプチドとｐＨ敏感成分を沈殿させるステップ、
ｄ）ステップｃ）で調製された懸濁液を水相連続相に分散し、胚胎ミクロスフィアを形成するステップ、
ｅ）ポリマー中の有機溶媒（第１溶媒と第２溶媒）を除去し、胚胎ミクロスフィアを固形化させるステップ；
【００１２】
上記の組成物及びプロセスに記載したペプチド又は小分子量のタンパクは、エキセナチド、他のＧＬＰ−１アナログ、インシュリン、カルシトニン、リュープロレリン、トリプトレリン、オクトレオチド、及び類似する治療性ペプチドを含む。上記組成物の中で、ｐＨ敏感剤は、Ｍｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、Ｚｎ（ＯＨ）２及びＺｎＣＯ３から選ばれうる。上記組成物の中で、徐放又は制御放出を実現するためのポリマーは、ポリ乳酸−ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、又はポリＣＢＺ−偽セリンラクトン（poly-CBZ-pseudo-serine lactone）でりうる。ポリマーは、薬物（例えばペプチド又はタンパク）をインサイチュ沈殿することができる第２溶媒に溶解すべきである。
【００１３】
このミクロスフィア（組成物）デザイン及びその製剤方法がマイクロ封入（薬物担持）効率を大幅に向上させることができ、ペプチド又はタンパクの長時間徐放サイクルでの分解を低下させ、薬物の放出プロフィールの直線性を改善する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】インサイチュ形成したエキセナチド粒子及びエキセナチドを担持したミクロスフィアの形態を示す図である。
【図２】エキセナチド累積放出曲線を示す図である。放出媒質：ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）、Ｍｇ（ＯＨ）２の含有量：（０．０％◆；６．０６％▲；８．８２５●；１１．４３％■）。
【図３】Ｃ５７マウスがエキセナチドミクロスフィアを経皮注射した後の血糖濃度を示す図である。ミクロスフィアを注射するエキセナチドの分量は、それぞれ１．２５μｇ／２０ｇ、２．５μｇ／２０ｇ、５μｇ／２０ｇと１０μｇ／２０ｇである。
【図４】エキセナチドミクロスフィア（◆）と空のミクロスフィア（▲）を経皮注射した後のＳＤラット体内での血薬濃度曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
組成物の設計
本発明は、ペプチド及びタンパクのための改善したミクロスフィア剤型、並びにマイクロ封入プロセス、即ち、水中油中固体（Ｓ／Ｏ／Ｗ）と称するものを含み、前記ミクロスフィア剤型（組成物）を調製するために用いる。前記組成物及びその調製方法の改善は、ペプチド（又は構造安定性問題のないタンパク）及び／又はｐＨ敏感剤を、ポリマーが溶解した溶液（上述した第２溶媒）において、沈殿させることによって微細粒子を形成することを含む。望ましい高い封入率と放出動力学を保障するためには、これらの沈殿の粒子の直径は１０μｍ以下が望ましく、最も望ましくは約１μｍである。
【００１６】
作用原理
ペプチド（又はタンパク）の固形化処理は、疎水性ポリマーマトリックス中でのペプチド（又はタンパク）の溶解速度を大幅に減少させたので、Ｓ／Ｏ／Ｗ法のマイクロ封入プロセスにおいて、少量だけの水が浸入し、ペプチド（又はタンパク）が水相連続相に滲み出る機会が阻害される。
【００１７】
体内（又は体外）に徐放するプロセスにおいて、生物分解性ポリマー（例えばＰＬＧＡ）がミクロスフィアを形成したマトリックスは体液（又は水）を吸収することで、注射後のミクロスフィアを徐々に膨潤させることができる。有限量の体液（又は水）がポリマーマトリックスに浸入した段階で、ｐＨ敏感剤が速やかに溶解し、有効な浸透圧が生じ、ポリマーの膨潤を加速させると共に、ペプチドの放出を加速させる。より大量の水（又は体液）がポリマーマトリックスに浸入した時、ｐＨ敏感試薬はすでに飽和溶解度に達し、浸透圧はこれ以上向上しない。徐放速度が一般的に低下する後期段階において、ｐＨ敏感剤の溶解度はポリマー（例えばＰＬＧＡ）分解で発生した酸環境の中で増加する。
【００１８】
ミクロスフィア（組成物）設計の作用メカニズムが有効であることを確保するために、ペプチド（又はタンパク及び他の活性成分）粒子のサイズは十分に小さいことが必要である。一般的な法則は、内部粒子（他の粒子即ちミクロスフィアに封入された粒子）のサイズは（それを封入する）ミクロスフィアのサイズの５％未満である必要がある。これほど小さいサイズと相対的に均一な薬物及び助剤（例えばｐＨ敏感な試薬）の内部粒子を達成するために、インサイチュ沈殿するステップがこの調製プロセスに含まれている（方法）。ｐＨ敏感剤はＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、Ｚｎ（ＯＨ）２とＺｎＣＯ３から選ぶことができるが、ペプチド（又はタンパク又は他の薬物）及び補助剤（例えばｐＨ敏感試薬）のインサイチュ沈殿はそれを良溶媒と貧溶媒との混合により実現できる。具体的な作業プロセスは、薬物と助剤を良溶媒に溶解することを含み、そして、形成された溶液をその貧溶媒と混合し、沈殿形成を促進する。しかし、その貧溶媒は、制御放出作用を奏する生物分解ポリマーの良溶媒である。徐放又は制御放出を実現するポリマーは、ポリ乳酸−ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリクロロギ酸ベンジルエステル−偽セリンラクトン（ＰＣＢＺ−ｐＳＬ）を含む。このようなポリマーは、第２溶媒に溶解しやすいが、薬物（タンパク又はペプチド）はその溶液中に粒子沈殿をインサイチュ形成しやすいものである。
【００１９】
調製プロセス
作用原理を理解すると、操作プロセスはわかりやすくなる。基本的なステップは本発明の概要に記載した内容と同じであるが、わかりやすく理解してもらうために、改めて調製ステップを以下に示す：
ａ）治療成分（例えばエキセナチド）を極性溶媒に溶解する（第１溶媒、例えば：ＤＭＳＯ又はＤＭＦ）ステップ、
ｂ）助剤（例えば、溶解度がｐＨ値の変化によって変化するｐＨ敏感剤）を水に溶解するステップ、
ｃ）上記のステップａ）とｂ）で調製された溶液及び低極性溶媒（第２溶媒、例えば生物分解性のポリマーを溶解した溶媒ジクロロメタン）を任意の順番で混合し、ペプチドとｐＨ敏感剤を沈殿させるステップ、
ｄ）上記のステップｃ）で形成した懸濁液を水相連続相に分散させ、胚胎ミクロスフィアを形成するステップ、
ｅ）ポリマー相の有機溶媒（第１溶媒と第２溶媒）を除去することで、上記のステップｄ）で形成した胚胎ミクロスフィアを硬化させるステップ。
【００２０】
第１溶媒（ペプチド又はタンパクを溶解した溶媒）と第２溶媒、及び補助剤（例えばｐＨ敏感試薬）水溶液の混合順番について、作業者は任意に手配でき、例えば１）ペプチド（又はタンパク）溶液を第２溶媒に加える、２）第２溶媒をペプチド溶液に加える；３）ｐＨ敏感剤水溶液を第２溶媒に加える、４）第２溶媒をｐＨ敏感剤水溶液に加える、又は全ての溶液を共に混合することができる。この組成物の中のｐＨ敏感剤はＭｇ（ＯＨ）２、ＭｇＣＯ３、Ｚｎ（ＯＨ）２とＺｎＣＯ３から選ばれたものである。
【００２１】
微粒がポリマー溶液に分散する系が一旦形成（Ｓ／Ｏ）したら、公知文献、例えば水中油中固体（Ｓ／Ｏ／Ｗ）、噴霧乾燥法、又は噴霧凍結乾燥法（冷液体の中で、例えば液体窒素の中で）によりミクロスフィアに調製することができる。
【００２２】
ペプチドを溶解する極性溶媒の揮発性が極めて小さい場合では、抽出法は調製されたミクロスフィア中の溶媒を除去するオプションとなる。
【００２３】
薬物粒子と親水性助剤粒子を均一に油中固（Ｓ／Ｏ）懸濁液に分布させるために、この助剤水溶液に表面活性剤を加えても良い。表面活性剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸、両者の混合又はこれらの混合物を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明は、エキセナチド（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を一例として、ミクロスフィア組成物とその調製方法を説明する。エキセナチドは、アメリカ西南ヒラ毒トカゲが食事するときの唾液から分泌された３９個のアミノ酸を有するペプチドである。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４はグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の類似体であり、哺乳類動物ＧＬＰ−１アミノ酸配列との相同性は、５３％であり、有効なＧＬＰ−１受容体アゴニストである。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ブドウ糖濃度依存性血糖制限作用を発揮し、インシュリン分泌を促進することができ、分泌グルカゴンを抑制することと、膵島β細胞消滅を抑制することと、胃内容排空を遅延させることと、胃腸管蠕動を抑制すること及び他の生理活性を有し、２−型糖尿病を治療することに適用できる。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のこれらの生理活性はＧＬＰ−１に類似するが、ＧＬＰ−１は体内で２つのペプチド分解酵素ＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によって速やかに分解される。ＧＬＰ−１の半減期はたった１〜２分間であり、速やかに分解される。しかし、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、一定の耐性を有するため、ＤＰＰＩＶ酵素により容易に分解できず、体内でのサイクル時間は６０〜９０分間に増加する。従って、エキセナチドは次世代の理想的なＩＩ型糖尿病を治療する治療物質とされている。
【００２５】
全てのペプチドとタンパク（それら構造安定性問題のないタンパク）は高度に類似した分子構造と物理化学性質を有するため、実施例においてエキセナチドのために用いた溶媒と製剤プロセスは、すべてのペプチド及び小さなタンパクに適用できる。従って、実施例は本発明の理解を補助するための一例であり、本発明の保護範囲を限定するものではない。
【００２６】
もう一つの代表的な権利を限定しない例では、ポリマーはポリ乳酸又はポリグリコール酸コポリマー、又はそれらの混合物であってもよい。好ましくは、それが低極性の第２溶媒での濃度は５％〜２５％Ｗ／Ｖであり、より好ましい濃度は７．５％〜２０％Ｗ／Ｖである。
【実施例】
【００２７】
この実施例で用いたポリマーは、ポリ乳酸−ポリグリコール酸（乳酸−グリコール酸共重合体：ＰＬＧＡ、乳酸：グリコリド＝５０：５０、分子量が１４〜１６ｋであり、固有粘度：０．３９）である。
【００２８】
改善したＳ／Ｏ／Ｗマイクロ封入方法
エキセナチドミクロスフィアの調製は、Ｓ／Ｏ／Ｗインサイチュ乳化溶媒揮発法を利用した。エキセナチドのＤＭＳＯ溶液と一定量のＭｇ（ＯＨ）２を、１００ｍｇのＰＬＧＡを含有する２ｍｌのジクロロメタン溶液に加え、混合して油中固（Ｓ／Ｏ）の乳液を形成する。上記乳液を水相（１％のＰＶＡ溶液）に移し、水中油−油中固（Ｓ／Ｏ／Ｗ）乳液を形成した。同時に２５０回転／分の速度で攪拌し、室温において４時間抽出を行いミクロスフィア残留の溶媒が除去された。そして、ミクロスフィアを遠心収集し、二次蒸留水でミクロスフィアを三回洗浄した。
【００２９】
薬物負荷量と封入率の分析
凍結乾燥したＰＬＧＡミクロスフィア（１０〜１５ｍｇ）を０．５ｍｌのジクロロメタンに溶解した。激しく振動させた後、この懸濁液を遠心し（５０００回転／分、５分間）た。そして２００μｌを取って液体クロマトグラフィー（ＨＬＰＣ）分析（アジレント１０００、アジレントテクノロジー、アメリカ）に用い、分離は逆相Ｃ−１８カラムを用い、移動相では、０．１％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡは緩衝溶液Ａとして、０．１％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡ＋８０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルは緩衝溶液Ｂとして、グラジエント溶離は６０〜４０％Ｂで４０分間溶離した。エキセナチド定量検出の波長は２８０ｎｍである。また、薬物の負荷量＝封入された実際の薬物負荷量×１００／ミクロスフィア重量で、封入率＝試験測定薬物負荷量×１００／理論上の薬物負荷量である。薬物負荷量と封入率は以下の表１の通りであり、全ての剤型の封入率はいずれも９０％以上である。
【００３０】
【表１】
0005933025.tif 000002
【００３１】
ミクロスフィアの形態と粒子粒径分布
ＰＬＧＡミクロスフィアの粒径と表面形態は日本ＪＳＭ−６７００Ｆ（ＪＥＯＬ、日本）走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察した。測定試料は両面導電粘着テープで金属スタブに固定し、そしてＪＦＣ−１６００噴霧フィルムコーターを用いて５Ｐａより低い真空下で、単層の金膜（厚みは約６０ｎｍ）をメッキした。図１に示すように、エキセナチド微粒の平均粒径は２００ｎｍ未満であり、ミクロスフィアを用いてマイクロ封入を行うことに適している。図１には、インサイチュＳ／Ｏ／Ｗ法でＳＰＧ膜と結合して調製されたエキセナチドミクロスフィアのＳＥＭ画像を示す。形成されたエキセナチドミクロスフィアの粒径は約６０μｍであり、狭い範囲内に分布している。
【００３２】
ミクロスフィアのインビトロ放出試験
２０〜３０ｍｇのＰＧＬＡミクロスフィアを試験管に取り、１ｍｌＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を加えた。この混合物を３７℃において１００ｒｐｍでゆるやかに振動した。そして一定時間おきに、遠心サンプルから上澄みを１００μｌ取り、ＨＰＬＣ分析（アジレント１１００、アジレントテクノロジー、アメリカ）に用いた。同時に試験管内に１００μｌの新鮮なＰＢＳを補充し、総体積を一定に維持した。その後、これらの混合物を激しく振動させ、改めてミクロスフィアを懸濁させた。懸濁液を再び３７℃において１００ｒｐｍでゆるやかに振動した。異なるＭｇ（ＯＨ）２の含有量のＰＬＧＡミクロスフィアからのエキセナチド放出プロフィールを調べ、図２に示す。Ｍｇ（ＯＨ）２のない処方では、７日後、累積放出が２０％未満であった；しかし１１．４３％のＭｇ（ＯＨ）２を含有する場合、２７日後、累積放出が７７％を超え、８．８２％のＭｇ（ＯＨ）２の累積放出が６６．３３％であった。Ｍｇ（ＯＨ）２が初期放出速度を加速したことはわれわれが望んだ通りのことであり、それは水が速やかにミクロスフィアに入ることで、Ｍｇ（ＯＨ）２の溶解により発生した浸透圧がエキセナチドの放出速度を加速したためである。放出初期において、薬物の放出速度は主にミクロスフィア内部に拡散した水により制御される。その後、Ｍｇ（ＯＨ）２のミクロスフィアがなくなり、迅速な放出期間が現れ、その後６０％の放出は７日目から１６日目に由来し、一方のミクロスフィアの放出全量は３０％には及ばない。この放出期間において、ＰＬＧＡ材料が分解し始まって酸を作り、より一層ＰＬＧＡの分解を加速する。この放出期間において、薬物の放出速度は通常ＰＬＧＡの分解速度で決められる。Ｍｇ（ＯＨ）２を含有するミクロスフィアでは、Ｍｇ（ＯＨ）２はＰＬＧＡ分解によって発生した酸を中和することができ、Ｍｇ（ＯＨ）２のないミクロスフィアに比べてＰＬＧＡ分解の速度が遅くなる。最終的に全てのミクロスフィアの累積放出が３０日間で完全に済む。６．０６％のＭｇ（ＯＨ）２を含有するミクロスフィアが放出期間において、ほぼ零級放出動力学に達する。
【００３３】
Ｃ５７マウスに対するエキセナチドミクロスフィアの薬効評価
エキセナチドの効果は、雄のＣ５７マウスにより評価した。ランダムに６組に分け、一組にエキセナチド溶液を与え、ほかの４組にそれぞれ４つの異なる分量のミクロスフィアを与え、最後に残った一組に生理食塩水を与えた。実験する前に、全ての動物に対して空腹での血糖検査を行い（空腹１２時間）、さらにその基礎血糖を調べた。結果が正常になってから正式な実験を開始した。血糖を測る３０分前に糖負荷を腹腔に注射し、分量は２０％のブドウ糖水溶液、０．２ｍｌ／２０ｇｂ．ｗ．であった。そしてもう一回血糖の濃度を測定した。基礎血糖の変化値に対して、血糖は薬効を評価することに用いられる。血糖の濃度変化測定は、ブドウ糖酸化酵素キットでマウスの尾静脈血の血糖を測定した。全ての動物に対し、実験する前の日の午後５時に糖溶液を腹腔に注射し、翌日の午前９時に血糖測定を受けた。毎回糖負荷する前に、エキセナチド溶液組（経皮注射薬品投与）の分量は０．０２５μｇ／２０ｇであり、エキセナチドミクロスフィア組の四つの分量はそれぞれ６．２５μｇ／２０ｇ、１２．５μｇ／２０ｇ、２５μｇ／２０ｇ、と５０μｇ／２０ｇであった。生理食塩水組は０．２ｍｌ／２０ｇの生理食塩水であった。このような方法で調製したエキセナチドミクロスフィアの薬効学を評価するために、われわれが６．０６％のＭｇ（ＯＨ）２を含有するエキセナチドミクロスフィアを選んでＣ５７マウスに対して経皮投与した。図３に示すように、薬品投与する前には、全ての組の基礎血糖には顕著な差がないが、しかし各組が糖負荷した後、ミクロスフィア組は１０日後に、血糖の低下が溶液組に比べて遥かに多かった。ミクロスフィアの中でエキセナチド含有分量が２．５μｇと５μｇの組では、１７日間の糖を下げる効果が得られた。分量が１０μｇ／２０ｇまで増加した時、血糖を調節するレベルは２０日間に達成できた。
【００３４】
ＳＤラットにおけるエキセナチドの血漿濃度
エキセナチドの薬動学は雄ＳＤラットで評価した。ＳＤラットに一回２ｍｇ／ｍｌ／ｋｇのエキセナチドミクロスフィアを含むＣＭＣ−Ｎａとマンニトール懸濁補助液を経皮注射した。均一に分散したミクロスフィアは２分間以内で注射を完成した。血液サンプルの採集はヘパリンナトリウム含有の真空采血管を利用し尾静脈採血を行った。採血時刻は薬品投与する前、薬品投与してから４時間後、と１、３、５、７、１０、１３、１６、２０日後であった。そして５０００ｇの遠心力で血液サンプルを遠心し、血漿サンプルを収集し、エキセナチドの含有濃度を分析するまで血漿サンプルを−２０℃の冷蔵庫に貯蔵した。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のＥＬＩＳＡキットで血液中のエキセナチド濃度（Ｅｋ−０７０−９４、フェニックスファーマスーティカル、ＣＡ、アメリカ）を測定した。ＥＬＩＳＡキットで提供されたエキセナチド標準は連続的に１０％のラット血漿で希釈され、血漿の妨害を低減した。図４に、エキセナチドミクロスフィア（６．０６％のＭｇ（ＯＨ）２を含有し、分量は２ｍｇ／ｋｇである）が経皮注射した後にＳＤラット体内での血薬濃度曲線を示す。エキセナチドの血漿濃度が速やかに向上し、４時間以内で２２．７ｎｇ／ｍｌに達し、そしてエキセナチドの濃度が１６日目まで２２．７ｎｇ／ｍｌｌ以上を保っている。１３日目のＣｍａｘは相変わらず５７．１ｎｇ／ｍｌに達し、少なくとも平均の血漿濃度の３倍である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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