(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織であるヒト生体試料中のヒトエストロゲン受容体（ER）タンパク質の量を測定する方法であって、質量分析を用いて、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中のSEQ ID NO:2のER断片ペプチドの量を検出および定量すること、および前記生体試料中のERタンパク質の量を計算することを含み、
前記量が相対的レベルまたは絶対的レベルである方法。
【請求項２】
前記ER断片ペプチドの量を検出および定量する前に、タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組織が腫瘍から取得される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ER断片ペプチドの定量が、１つの生体試料の前記ER断片ペプチドの量を、異なる別の生体試料の同じER断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ER断片ペプチドの定量が、同じアミノ酸配列を持つ既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中の前記ER断片ペプチドの量を決定することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質消化物中の前記ER断片ペプチドの量の検出および／または定量が、修飾または未修飾ERタンパク質の存在および被験者におけるがんとの関連性を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ER断片ペプチドの量、または前記ERタンパク質の量の検出および／または定量の結果を、前記がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けるための情報を提供することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ER断片ペプチドの量、または前記ERタンパク質の量の検出および／または定量の結果を前記がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けるための情報と、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの検出および／または定量された量の情報とを、多重フォーマットで組み合わせることにより、前記がんの診断病期／悪性度／状態についての追加情報を提供するための、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ER断片ペプチドの量またはERタンパク質の量に基づいて、前記生体試料が取得される患者に投与される治療薬および／または治療有効量の治療薬を選択することを補助するための、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療薬が、ERタンパク質を発現しているがん細胞に対するものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
PRおよびKi67断片ペプチドからなる群から選択される、前記タンパク質消化物中の少なくとも１種の追加断片ペプチドの量を、質量分析を用いて検出および定量すること、および、前記生体試料中のPRおよび／またはKi67タンパク質の量を計算することをさらに含み、前記量が相対的レベルまたは絶対的レベルである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記追加断片ペプチドがPR断片ペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記追加断片ペプチドがKi67断片ペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本出願は、「がんの評価のための多重MRMアッセイ」と題する米国特許出願第61/537,918号（2011年9月22日出願）に対する優先権を主張し、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
序論
エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）、および抗原Ki67（Ki67）タンパク質の下位配列に由来する特異ペプチドが提供されている。ペプチド配列および各ペプチドの断片化／遷移イオンは、質量分析ベースの選択反応モニタリング（SRM）で特に有用であり、これは多重反応モニタリング（MRM）アッセイとも呼ばれる。このようなアッセイは本明細書ではSRM／MRMとも呼ばれる。これらのタンパク質のSRM／MRM定量分析のためのペプチドの使用（個別に、同時に、またはさまざまな組み合わせで）についての情報が記述されている。
【０００３】
SRM／MRMアッセイの結果は、（ER）、プロゲステロン受容体（PR）、および抗原Ki67（Ki67）タンパク質からの特異ペプチドの1つ以上の相対的または絶対的定量レベルの測定のために使用できる。タンパク質が個別に、同時に、またはさまざまな組み合わせで分析される場合、これらのアッセイを使用して、組織（生体試料）が採取・保存される患者または被験者の特定胸部組織（例えば、がん組織サンプル）、または胸部以外の任意のその他の原発組織内のタンパク質の正確かつ精密な定量レベルを関連付けることができる。これは、乳がんについての診断情報を提供するだけでなく、これにより医師またはその他の医療専門家は乳がん患者に対して適切な治療を決定することが可能となる。罹患組織またはその他の患者サンプルのタンパク質発現レベルについての診断的で治療上重要な情報を提供するこのようなアッセイは、「コンパニオン診断」アッセイと呼ばれる。例えば、このようなアッセイは、乳がんまたは他の任意のがんの病期または程度を診断し、患者が反応する可能性の最も高い治療薬を決定するように設計されうる。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に記述されたアッセイは、ER、PRおよびKi67タンパク質からの特異未修飾ペプチドの相対的または絶対的レベルを測定するためのアッセイである。また、ER、PRおよびKi67タンパク質からの特異修飾ペプチドの相対的または絶対的レベルを測定するためのアッセイが本明細書に記述されている。修飾の例には、ペプチドに存在するリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンおよびホスホトレオニン）およびグリコシル化アミノ酸残基（例えば、グリコシル化アスパラギン残基）が含まれる。
【０００５】
ER、PR、およびKi67タンパク質の相対的定量レベルは、例えば、異なるサンプル中の個別ER、PR、および／またはKi67ペプチドのSRM／MRM特徴ピーク面積（例えば、特徴ピーク面積または積分断片イオン強度）を比較するなど、SRM／MRM手法によって決定される。または、各ペプチドがそれ自体の特異的SRM／MRM特徴ピークを持つ場合、1つの生体試料中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質の相対的含量を、1つ以上の追加的または異なる生体サンプルのER、PRおよび／またはKi67タンパク質含量で決定するために、複数のER、PRおよび／またはKi67特徴ペプチドに対する複数のSRM／MRM特徴ピーク面積を比較することが可能である。このように、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの特定のペプチドの量（またはレベル）、従ってER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量は、同じ実験条件下の2つ以上の生体試料にわたる同じER、PRおよび／またはKi67ペプチドに対して決定される。さらに、SRM／MRM手法で、そのペプチドの特徴ピーク面積を、同じ生体試料からの同じタンパク質調製品中の異なるタンパク質からの別の異なるペプチドの特徴ピーク面積と比較することによって、単一サンプル中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの所定のペプチドに対して相対的定量を決定することができる。このように、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの特定のペプチドの量、従ってER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量は、同じサンプル内で互いに対して決定される。これらのアプローチは、生体試料からのタンパク質調製品のER、PRおよび／またはKi67ペプチドの容積に対する絶対重量または重量に対する重量に関わらず、サンプル間およびピーク面積によって決定された量が互いに対するものであるサンプル内での、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの個別ペプチドの別のペプチドに対する定量をもたらす。異なるサンプル間の個別の特徴ピーク面積についての相対的定量データは、サンプルあたりの分析されたタンパク質量に対して正規化される。相対的定量は、単一サンプルおよび／または多くのサンプルにわたって、複数のタンパク質およびER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの多くのペプチドにわたって同時に実施でき、1つのペプチド／タンパク質のその他のペプチド／タンパク質に対する相対的タンパク質量についての見識を得ることができる。
【０００６】
ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の絶対的定量レベルは、例えば、1つの生体試料中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの個別ペプチドのSRM／MRM特徴ピーク面積が、外部から追加された「混入」内部標準のSRM／MRM特徴ピーク面積に比較される、SRM／MRM手法によって決定される。1つの実施形態では、内部標準は、1つ以上の重同位体で標識された1つ以上のアミノ酸残基を含む全く同一のER、PRおよび／またはKi67ペプチドの合成版である。適切な同位体標識内部標準は、質量分析で分析された時、それが天然ER、PRおよび／またはKi67ペプチド特徴ピークとは異なりかつ区別できるため対照ピークとして使用できる、予測可能で一貫性のあるSRM／MRM特徴ピークを生成するように合成される。従って、生体試料からのタンパク質調製品に既知量の内部標準が混入され、質量分析で分析される時、同じものからの天然ペプチドのSRM／MRM特徴ピーク面積を、内部標準ペプチドのSRM／MRM特徴ピークと比較することができる。この数的比較によって、生体試料からの最初のタンパク質調製品に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量のいずれかが提供される。断片ペプチドの絶対的定量データは、サンプルあたりの分析されたタンパク質量に従って示されている。絶対的定量は、多くのペプチド、従ってタンパク質にわたって、単一サンプルおよび／または多くのサンプルにわたって同時に実施でき、個別の生体試料および個別サンプルのコホート全体の絶対的タンパク質量についての見識を得ることができる。
【０００７】
SRM／MRMアッセイ法は、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来組織中のがんの病期を直接診断するのに役立ち、また、その患者の治療に使用するために最も有利な治療薬の決定の一助として使用できる。腫瘍の部分的または全体の治療的除去などの手術によって、または疑われる疾患の有無を決定するために実施される生検方法のいずれかによって、患者から取り出される乳がん組織を含むがん組織を分析し、特異タンパク質がその患者組織に存在するかどうか、またどの形態のタンパク質が存在するかを決定する。さらに、ERなどの個別タンパク質、またはER、PRおよび／またはKi67などの複数タンパク質の発現レベルは、個別または同時の形で、健常組織で見られる各タンパク質またはタンパク質の一群に対する「正常」または参照レベルと比較して決定できる。健常組織に見られるタンパク質の正常または参照レベルは、例えば、がんを持たない1人以上の人の関連組織から由来しうる。または、がんを持つ人の正常または参照レベルは、がんの影響を受けていない関連組織の分析によって得られうる。
【０００８】
タンパク質レベル（例えば、ER、PRおよび／またはKi67レベル）のアッセイは、がんと診断された患者または被験者のがん（乳がんを含む）の病期を、ER、PRおよび／またはKi67レベルを使用して診断するためにも使用できる。タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、SRM／MRMアッセイで決定されたタンパク質またはペプチドの質量または重量である、モルで表される数量として定義される。レベルまたは量は、分析された溶解物中のタンパク質または別の成分の合計レベルまたは量に対して正規化されうる（例えば、タンパク質のマイクロモル／マイクログラムまたはタンパク質のマイクログラムで表される）。さらに、タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は容積基準で決定でき、例えばマイクロモルまたはナノグラム／マイクロリットルで表される。SRM／MRMアッセイで決定されるタンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、分析される細胞の数に対しても正規化できる。このようにER、PRおよび／またはKi67に関する情報は、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質（またはER、PRおよび／またはKi67タンパク質の断片ペプチド）のレベルを正常組織で見られたレベルと関連付けることによって、がんの病期または悪性度を決定するために使用できる。
【０００９】
がん（乳がんを含む）の病期および／または悪性度、および／またはER、PRおよび／またはKi67タンパク質発現特性が決定されたら、その情報を、例えば、分析されたタンパク質（例えば、ER、PRおよび／またはKi67）の異常発現を特徴とするがん組織を特に治療するために開発された治療薬（化学的および生物学的）のリストに適合させることができる。ER、PRおよび／またはKi67タンパク質アッセイと、例えばER、PRおよび／またはKi67タンパク質またはそのタンパク質を発現する細胞／組織を特に標的とする治療薬のリストの適合情報は、疾患治療に対するオーダーメイド医療アプローチと呼ばれるものを定義する。本明細書に記述されたアッセイ法は、患者自身の組織からのタンパク質の分析を診断および治療決定のソースとして使用することによって、オーダーメイド医療アプローチの基礎を形成する。これらのタンパク質（ER、PRおよび／またはKi67）は、オーダーメイド医療のアプローチにおいて乳がんだけでなくその他の任意のがん細胞に対しても、個別で、2つで、または3つすべてを同時に使用できる。このタンパク質の一群は、乳がんの診断および治療に最も有利に適用される。
【００１０】
本開示のこれらおよびその他の態様は、以下に記述される説明を考慮して当業者には明らかになる。
【発明の具体的説明】
【００１１】
選択反応モニタリング／多重反応モニタリング（SRM／MRM）アッセイは、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの特異ペプチドの1つ以上の相対的または絶対的定量レベルを、個別に、組み合わせて、または同時に測定し、従って、生体試料から取得された所定のタンパク質調製物中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量を質量分析で測定する方法を提供するために使用できる。
【００１２】
より具体的には、SRM／MRMアッセイは、ホルマリン固定がん患者組織などの患者組織サンプルから入手した細胞から調製された複合タンパク質溶解物中のこれらのペプチドを直接測定できる。ホルマリン固定組織からタンパク質サンプルを調製する方法は、米国特許第7,473,532号に記述されており、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第7,473,532号に記述されている方法は、Liquid TissueTM試薬およびExpression Pathology Inc.（メリーランド州ロックビル）から入手可能なプロトコルを使用して都合よく実施されうる。
【００１３】
最も幅広く有利に入手できるがん患者組織からの組織形態は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織である。外科的に除去された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、がん組織サンプルを保存するための世界でもはるかに最も一般的な方法であり、標準的病理技法の許容された慣習である。ホルムアルデヒドの水溶液はホルマリンと呼ばれる。「100%」ホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（これは約40体積%または37質量%）と、少量の安定剤（通常は、酸化および重合の程度を制限するためのメタノール）から成る。組織が保存される最も一般的な方法は、組織全体を長時間（8時間〜48時間）ホルムアルデヒド水溶液（一般的には10%中性緩衝ホルマリンと呼ばれる）に浸し、次に固定された組織全体を、室温での長期保存のためにパラフィンワックス中に包埋することである。このように、ホルマリン固定がん組織を分析するための分子分析法は、がん患者組織の分析のために最も許容され多く利用される方法となるであろう。
【００１４】
原則として、例えば既知の特異性を持つプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化されることによって調製されたER、PRおよび／またはKi67タンパク質から由来する任意の予測ペプチドを、サンプル中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質の存在度を質量分析ベースSRM／MRMアッセイを使用して決定するための代理レポーターとして使用できる。同様に、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質で修飾されている可能性のあることが知られているアミノ酸残基を含む任意の予測ペプチド配列も、サンプル中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質の修飾の程度を分析するために使用しうる可能性がある。
【００１５】
1つの実施形態によると、ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドは、米国特許第7,473,532号に記述されているLiquid TissueTMプロトコルを使用することを含め、さまざまな方法で生成されうる。Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬は、組織／生体試料のタンパク質消化によって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分析に適したペプチドサンプルを生成する。適切な試薬およびプロトコルは、OncoPlexDx（旧Expression Pathology Inc.、メリーランド州ロックビル）からも市販されている。
【００１６】
Liquid TissueTMプロトコルでは、タンパク質架橋結合を逆転または解除するために、組織／生体試料は緩衝液中長時間（例えば、約80°C〜約100°Cで約10分〜約4時間）加熱される。使用される緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または洗剤を含む緩衝液）である。熱処理に続いて、組織／生体試料は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテイナーゼLys-Cを含むがこれに限定されない1つ以上のプロテアーゼで、生体試料の組織および細胞構造を破壊し、サンプルを液化するのに十分な時間処理される。プロテアーゼ処理の模範的条件は、37°C〜65°Cの温度で30分〜24時間である。有利なことに、同時または連続的のいずれかで使用されるエンドプロテアーゼ、および特に2つまたは3つのエンドプロテアーゼの組み合わせは、サンプルを液化するために用いられる。例えば、プロテアーゼの適切な組み合わせは、トリプシンとエンドプロテイナーゼLys-Cなど、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys-Cおよびキモトリプシンの組み合わせを含みうるがこれに限定されない。加熱およびタンパク質消化の結果は、液体で可溶性の希釈可能な生体分子溶解物である。有利なことに、この液体溶解物は、遠心分離で溶解物から分離できる固体または粒子状物質を持たない。
【００１７】
驚くべきことに、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの多くの潜在的ペプチド配列は、すぐには明らかでない理由で、質量分析ベースのSRM／MRMアッセイでの使用には不適切または無効であることが判明した。MRM／SRMアッセイに対して最も適したペプチドを予測することは不可能であったので、実際のLiquid TissueTM溶解物中の修飾および未修飾ペプチドを実験的に特定して、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の確実で正確なSRM／MRMアッセイを開発する必要があった。いかなる理論にも束縛されるものではないが、一部のペプチドは、例えば、うまくイオン化しないか、またはその他のタンパク質から生成されるものと異なる断片を生成しないために、質量分析で検出することが困難な場合があると考えられている。ペプチドは、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）でうまく分割できないか、またはガラスもしくはプラスチック容器に接着することもある。
【００１８】
本開示のさまざまな実施形態で見られるER、PRおよび／またはKi67ペプチド（例えば、以下の表1および2）は、ホルマリン固定がん組織から生成された細胞から調製される複合Liquid TissueTM溶解物内のすべてのタンパク質のプロテアーゼ消化によって、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質から派生した。特に断りのない限り、各例でのプロテアーゼはトリプシンであった。Liquid TissueTM溶解物は次に質量分析で分析され、質量分析で検出・分析されるER、PRおよび／またはKi67タンパク質から派生するこれらのペプチドを決定した。質量分析のために好ましいペプチドの特定のサブセットの特定は、1）Liquid TissueTM溶解物の質量分析で、タンパク質からのどのペプチドが質量分析でイオン化するかについての実験的決定、および2）Liquid TissueTM溶解物の調製に使用されるプロトコルおよび実験条件で生き残るためのペプチドの能力に基づく。この後者の特定は、ペプチドのアミノ酸配列だけでなく、サンプル調製中に修飾された形態で生き残るためのペプチド内の修飾アミノ酸残基の能力にも及ぶ。
【００１９】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接生成された細胞からのタンパク質溶解物は、Liquid TissueTM試薬およびプロトコルを使用して調製された。これには、組織の顕微解剖によって試験管に細胞を採取し、その後Liquid TissueTM緩衝液中、細胞を長時間加熱することを伴う。ホルマリン誘導架橋結合が悪影響を受けると、次に組織／細胞は、トリプシンなどのプロテアーゼを使用して、予想可能な方法で最後まで消化される。当業者であれば、その他のプロテアーゼ、特にエンドプロテアーゼは、トリプシンの代わり、またはそれに加えて使用されうることを理解するであろう。各タンパク質溶解物は、無傷のポリペプチドのプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせを使用した消化によって一群のペプチドを調製するために使用された。各タンパク質溶解物は、無傷のポリペプチドのプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせを使用した消化によって一群のペプチドを調製するために使用される。各Liquid TissueTM溶解物は、ペプチドの複数の全体的プロテオーム調査を実施するために（例えば、イオントラップ質量分析によって）分析され、各タンパク質溶解物中にあるすべての細胞タンパク質の質量分析によって特定できる可能な限り多くのペプチドの同定としてデータが提示された。イオントラップ質量分析計または単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物からできるだけ多くのペプチドの同定に対する全体的プロファイリングを実施できる別の形態の質量分析計が採用される。しかし、イオントラップ質量分析計が、ペプチドの全体的プロファイリングを実行するために最適なタイプの質量分析計でありうる。SRM／MRMアッセイは、MALDI、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計で開発・実施できるが、SRM／MRMアッセイのために有利な機器プラットフォームは、多くの場合、三連四重極機器プラットフォームであると考えられる。
【００２０】
用いられた条件下での単一溶解物の単一質量分析で、できるだけ多くのペプチドが特定されると、次に特定されたペプチドのリストが照合され、その溶解物で検出されたタンパク質を決定するために使用された。このプロセスは、複数のLiquid TissueTM溶解物に対して反復され、非常に大きなリストのペプチドが単一のデータセットへと順に並べられた。結果得られたデータセットは、分析されたタイプの生体試料で（プロテアーゼ消化後に）、特に生体試料のLiquid TissueTM溶解物で検出できるペプチドを表し、従って、例えばER、PRおよび／またはKi67タンパク質などの特異タンパク質に対するペプチドを含む。
【００２１】
1つの実施形態では、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の絶対的または相対的量の決定に有用なER、PRおよび／またはKi67トリプシンペプチドには、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9および／またはSEQ ID NO:10の1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、8つ以上、9つ以上が含まれ、このそれぞれが表1に記載されている。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製されたLiquid TissueTM溶解物の質量分析によって検出された。このように、表1のペプチドのそれぞれ、またはこれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、表1に記載のこれらのペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、8つ以上、または10以上、および特に表2に見られるペプチドの組み合わせ）は、ホルマリン固定患者組織、より具体的にはホルマリン固定乳がん患者組織中の直接的なものを含む、ヒト生体試料中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質の定量的SRM／MRMアッセイでの使用に対する候補である。表2は、表1に示されるペプチドの一部に関する追加情報を示す。
【表１】
0006046147.tif 000002
【表２】
0006046147.tif 000003
【００２２】
表1に記載されたER、PRおよび／またはKi67トリプシンペプチドには、前立腺、結腸および胸部を含むヒトの異なる臓器の複数の異なるホルマリン固定組織のLiquid TissueTM溶解物から検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織のER、PRおよび／またはKi67タンパク質の定量的SRM／MRMアッセイのために有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析で、任意の特定臓器部位からのいかなる特異ペプチドに対しても優先傾向がないことが示された。従って、これらのペプチドのそれぞれは、任意の生体試料または身体の任意の臓器部位から由来する任意のホルマリン固定組織のLiquid TissueTM溶解物についてのER、PRおよび／またはKi67タンパク質のSRM／MRMアッセイの実施に適していると考えられる。
【００２３】
SRM／MRMアッセイを実施するための1つの考慮事項は、ペプチドの分析に用いられうる機器のタイプである。SRM／MRMアッセイは、MALDI、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計で開発・実施できるが、SRM／MRMアッセイのために最も有利な機器プラットフォームは、多くの場合、三連四重極機器プラットフォームであると考えられる。その質量分析計のタイプは、細胞内に含まれるすべてのタンパク質からの何百何千から何百万もの個別ペプチドから成りうる非常に複雑なタンパク質溶解物中の単一単離標的ペプチドを分析するために最も適した機器であると考えられうる。
【００２４】
ER、PRおよび／またはKi67タンパク質から由来する各ペプチドに対してSRM／MRMアッセイを最も効率的に実施するためには、分析のペプチド配列に加えて情報を利用することが望ましい。その追加情報は、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）に指図・指示し、特異的標的ペプチドの分析を集中的に正しい方法で実施することで、アッセイが効率的に実施されるようにする。
【００２５】
標的ペプチド一般について、および特異ER、PRおよび／またはKi67ペプチドについての追加情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体の荷電状態、前駆体のm/z値、m/z遷移イオン、および各遷移イオンのイオン型の1つ以上を含みうる。表2は、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質のSRM／MRMアッセイを開発するために使用されうる、表1に示されるいくつかのペプチドに対する追加情報を示す。
【００２６】
下記の方法は、1）ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の質量分析ベースのSRM／MRMアッセイに使用できるER、PRおよび／またはKi67タンパク質から候補ペプチドを特定するため、2）乳がんと関連付けるために、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質に対する個別SRM／MRMアッセイ、または多重アッセイを開発するため、および3）定量アッセイを乳がん診断および／または乳がんおよび記述のSRM／MRMアッセイで分析されるその他の任意のがんに対する最適治療の選択に適用するために使用できる。
【００２７】
アッセイ方法
I.  ER、PRおよび／またはKi67タンパク質に対するSRM／MRM候補断片ペプチドの特定：
a. タンパク質を消化するために、プロテアーゼ（トリプシンを含むことも含まないこともある）を使用してホルマリン固定生体試料からLiquid TissueTMタンパク質溶解物を調製する。
b. Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、個別の断片ペプチドがリン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含まない、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質からのすべての断片ペプチドを特定する。
c. Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、例えばリン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を持つER、PRおよび／またはKi67タンパク質からのすべての断片ペプチドを特定する。
d. 全長ER、PRおよび／またはKi67タンパク質全体から特定の消化方法で生成されたすべてのペプチドを測定できる可能性があるが、SRM／MRMアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Liquid TissueTM溶解物中で直接、質量分析によって特定されるものである。
e. 患者組織で特に修飾（リン酸化、グリコシル化など）され、ホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物を分析する時、質量分析計内でイオン化され、そのため検出されるペプチドは、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質のペプチド修飾のアッセイのための候補ペプチドとして特定される。
【００２８】
II.  ER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの断片ペプチドに対する質量分析アッセイ
a. Liquid TissueTM溶解物中で特定された個別の断片ペプチドに対する三連四重極質量分析計でのSRM／MRMアッセイが、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質からのペプチドに適用される。
i. ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない、最適なクロマトグラフィー条件に対する断片ペプチドの最適保持時間を決定する。
ii. 各ペプチドに対するSRM／MRMアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆体の荷電状態、各ペプチドの前駆体のm/z値、各ペプチドのm/z遷移イオン、および各断片ペプチドに対する各遷移イオンのイオン型を決定する。
iii. 次にSRM／MRMアッセイは、（i）および（ii）からの情報を使用して三連四重極質量分析計で実施できるが、ここで各ペプチドは固有のSRM／MRMアッセイを三連四重極質量分析計で実施したものとして正確に定義する特徴および固有SRM／MRM特徴ピークを持つ。
b. SRM／MRM質量分析からの固有SRM／MRM特徴ピーク面積の関数として検出されるER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量が、特定のタンパク質溶解物中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質の相対的および絶対的量の両方を示すことができるように、SRM／MRM分析を実施する。
i. 相対的定量は以下によって達成しうる。
1. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物中で検出される所定のER、PRおよび／またはKi67ペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のホルマリン固定生体試料からの少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のLiquid TissueTM溶解物中の同じER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの同じSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の存在の増加または減少を決定する。
2. ペプチド断片に対する2つのサンプル間のSRM／MRM特徴ピーク面積の比較が各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される場合、1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物で検出された所定のER、PRおよび／またはKi67ペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積を、異なる別の生体起源から由来するその他のサンプルのその他のタンパク質の断片ペプチドから作成されたSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の存在の増加または減少を決定する。
3. さまざまな細胞条件下で発現レベルが変化しないその他のタンパク質に対してER、PRおよび／またはKi67タンパク質の変化するレベルを正規化するために、所定のER、PRおよび／またはKi67ペプチドに対するSRM／MRM特徴ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料の同じLiquid TissueTM溶解物内の異なるタンパク質から由来するその他の断片ペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の存在の増加または減少を決定する。
4. 修飾がリン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの相対的レベルが未修飾ペプチドの相対的量を決定するのと同じ方法で決定される場合、これらのアッセイは、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドの両方に適用できる。
ii. 所定のペプチドの絶対的定量は、個別の生体試料のER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの所定の断片ペプチドに対するSRM／MRM特徴ピーク面積を、その生体試料からのタンパク質溶解物に混入した断片ペプチド内部標準のSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって達成されうる。
1. 内部標準は、調査しているER、PRおよび／またはKi67タンパク質からの断片ペプチドの標識合成版である。この標準は既知量をサンプルに混入し、SRM／MRM特徴ピーク面積は、生体試料中の断片ペプチド内部標準および天然断片ペプチドの両方に対して別々に決定でき、その後両方のピーク面積の比較ができる。
2. 修飾がリン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの絶対レベルが未修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で決定できる場合、これは未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドに適用できる。
【００２９】
III.  がん診断および治療への断片ペプチド定量の適用
a. ER、PRおよびまたはKi67タンパク質の断片ペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量を実施し、がん分野でよく知られた、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質発現と患者腫瘍組織のがんの病期／悪性度／状態との以前に決定された関連性が確認されることを実証する。
b. ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の断片ペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量を、個別に、組み合わせで、またはすべて同時に実施し、異なる治療戦略の臨床転帰との相関関係を実証するが、ここでこの相関関係は本分野ですでに実証されているか、または患者のコホートおよびこれらの患者からの組織にわたる相関関係研究を通して将来実証できる。以前に確立された相関関係または将来生じる相関関係のいずれかがこのアッセイによって確認されたら、次にこのアッセイ方法を使用して最適な治療戦略を決定できる。
【００３０】
表2に示される情報は、三連四重極質量分析計でのER、PRおよび／またはKi67タンパク質の定量のためのSRM／MRMアッセイを開発するために望ましい。これらのER、PRおよび／またはKi67ペプチドについての特異的かつ固有の特徴は、イオントラップおよび／または三連四重極質量分析計でのすべてのER、PRおよび／またはKi67ペプチドの分析によって作成された。その情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体の荷電状態、前駆体のm/z値、前駆体の遷移m/z値、および特定された遷移のそれぞれのイオン型を含む。その情報は、ホルマリン固定組織からのLiquid TissueTM溶解物で直接、すべての候補SRM／MRMペプチドに対して実験的に決定されなければならないが、その理由は、興味深いことに、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質からのすべてのペプチドが本明細書に記述されるSRM／MRMを使用して、このような溶解物中で検出できるわけではないからであり、検出されないER、PRおよび／またはKi67ペプチドは、ホルマリン固定組織からのLiquid TissueTM溶解物の直接的ペプチド／タンパク質定量で使用するためのSRM／MRMアッセイを開発するための候補ペプチドとは見なすことができないことを示す。
【００３１】
この情報を利用して、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質に対する定量的SRM／MRMアッセイを開発することができ、ホルマリン固定した乳がん患者由来組織の分析に基づいた組織中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質レベルの評価で、それぞれの特定の乳がん患者および／または乳がんでない異なるがんを持つがん患者についての、診断、予後、および治療関連情報を提供することができる。
【００３２】
1つの実施形態で、本開示は、生体試料中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質のレベルを測定する方法を記述しており、これは、生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドを、質量分析を使用して検出すること、およびサンプル中の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67タンパク質のレベルを計算することを含み、ここでそのレベルは相対的または絶対的レベルである。関連する実施形態では、本開示は1つ以上のER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの定量方法を提供するが、ここで方法は、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中のER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの1つ以上の量を決定することを含み、生体試料中のER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドのそれぞれは、同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される。一部の実施形態では、内部標準は、18O、17O、34S、15N、13C、2Hまたはその組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含む同位体標識内部標準ペプチドである。
【００３３】
本明細書に記述された生体試料（またはその代理としての断片ペプチド）中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質のレベルを測定する方法は、患者または被験者のがんの診断指標として有用である。1つの実施形態では、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質のレベルの測定結果を用いて、組織で見られたER、PRおよび／またはKi67タンパク質のレベルと、正常および／またはがんもしくは前がん組織で見られたこれらのタンパク質レベルを関連付ける（例えば、比較する）ことにより、乳がん、または胸部を起源としない別のがんの診断病期／悪性度／状態を決定しうる。
【００３４】
実施形態：
1.  生体試料中のER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量を測定する方法であって、質量分析を用いて生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの量を検出および／または定量すること、およびサンプル中の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量を計算することを含み、前記量が相対的レベルまたは絶対的レベルである方法。
2.  1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの量を検出および／または定量する前に、タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、実施形態1の方法。
3.  分画ステップが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、および逆相高性能液体クロマトグラフィーから成るグループから選択される、実施形態2の方法。
4.  生体試料のタンパク質消化物がLiquid TissueTMプロトコルによって調製される、実施形態1〜3のいずれかの方法。
5.  タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、実施形態1〜3のいずれかの方法。
6.  タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、実施形態5の方法。
7.  質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI-TOF質量分析、MALDI質量分析、または飛行時間型質量分析、またはその任意の組み合わせを含む、実施形態1〜6のいずれかの方法。
8.  使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（SRM）、多重反応モニタリング（MRM）、または多重選択反応モニタリング（mSRM）、またはその任意の組み合わせである、実施形態7の方法。
9.  1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、およびSEQ ID NO:10として規定されるものから独立して選択される2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つまたは10の異なるアミノ酸配列を含む、実施形態1〜8のいずれかの方法。
10.  生体試料が血液サンプル、尿サンプル、血清サンプル、腹水サンプル、喀痰サンプル、リンパ液、唾液サンプル、細胞、または固体組織である、実施形態1〜9のいずれかの方法。
11.  組織がホルマリン固定組織である、実施形態10の方法。
12.  組織がパラフィン包埋組織である、実施形態10または11の方法。
13.  組織が腫瘍から取得される、実施形態10の方法。
14.  腫瘍が原発腫瘍である、実施形態13の方法。
15.  腫瘍が二次腫瘍である、実施形態13の方法。
16.  修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドを定量することをさらに含む、実施形態1〜15のいずれかの方法。
17.  修飾または未修飾断片ペプチドの定量に、1つの生体試料のSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10に示されるような約8〜約45のER、PRおよび／またはKi67のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む1つ以上のER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの量を、異なる別の生体試料の同じER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態16の方法。
18.  1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの定量が、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中の前記1つ以上のER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、生体試料中のER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドのそれぞれが、同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される、実施形態17の方法。
19.  内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、実施形態18の方法。
20.  同位体標識内部標準ペプチドが、18O、17O、34S、15N、13C、および2H、またはその任意の組み合わせから成るグループから選択される1つ以上の安定重同位体を含む、実施形態19の方法。
21.  タンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの量の検出および／または定量が、修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67タンパク質の存在および被験者におけるがん、特に乳がんとの関連性を示す、実施形態1〜20のいずれかの方法。
22.  1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの量、またはER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量の検出および／または定量の結果を、がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けることをさらに含む、実施形態21の方法。
23.  1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの量、またはER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量の検出および／または定量の結果を、がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けることが、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの検出および／または定量された量と多重フォーマットで組み合わされて、がんの診断病期／悪性度／状態についての追加情報を提供する、実施形態22に記載の方法。
24.  生体試料が取得される被験者に対して、1つ以上のER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの有無またはその量またはER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量に基づいて治療を選択することをさらに含む、実施形態1〜23のいずれか1つに記載の方法。
25.  生体試料が取得される患者に治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、治療薬および／または投与された治療薬の量が、1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの量またはER、PRおよび／またはKi67タンパク質の量に基づいている、実施形態1〜24のいずれか1つに記載の方法。
26.  治療または治療薬が、ER、PRおよび／またはKi67タンパク質を発現しているがん細胞に対するものである、実施形態24または25の方法。
27.  生体試料が、Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬を用いて、1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドの量を定量するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織である、実施形態1〜26の方法。
28.  前記1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび／またはKi67断片ペプチドが、表1のペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上である、実施形態1〜27のいずれかの方法。
29.  表2のペプチドの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたは7つの量の定量を含む、実施形態1〜28のいずれかの方法。
30.  表1のペプチドまたはそれに対する抗体の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10を含む組成物であって、前記組成物がSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のペプチドでないER、PRおよび／またはKi67の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上のペプチドを随意に除外する組成物。
31.  表2のペプチドまたはそれに対する抗体の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つを含む組成物であって、前記組成物がSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、または7のペプチドでないER、PRおよび／またはKi67の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上のペプチドを随意に除外する実施形態30の組成物。
【００３５】
模範的態様を示す際の、説明、具体的な例およびデータは、例示のために与えられており、本開示を制限することを目的としないことが理解されるべきである。本開示内のさまざまな変更および修正は、本明細書に含まれる考察、詳細説明、およびデータから当業者には明らかとなり、従って本明細書の主題の一部と見なされる。
【配列表】
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