(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚皮に対して、0.01〜0.5Mの酢酸溶液下で0.1〜10時間超音波処理を行い、コラーゲン抽出物を得るステップであって、前記超音波処理は、20kHzの周波数で、かつ、0.1〜1000Wの出力でなされる第1ステップと、
前記コラーゲン抽出物からコラーゲンと超音波処理された魚皮とを分離する第2ステップと、を含み、
前記超音波処理された魚皮に対して、前記第１ステップ及び第２ステップを繰り返して遂行するコラーゲンの抽出方法。
【請求項２】
前記超音波処理は0〜10℃で行われることを特徴とする請求項１に記載のコラーゲンの抽出方法。
【請求項３】
前記超音波処理は24時間行われることを特徴とする請求項１に記載のコラーゲンの抽出方法。
【請求項４】
魚皮に対して、酸性溶液下で超音波処理を行い、コラーゲン抽出物を得るステップであて、前記超音波処理は、20kHzの周波数で、かつ、0.1〜1000Wの出力でなされる第1ステップと、
前記コラーゲン抽出物からコラーゲンと超音波処理された魚皮とを分離する第2ステップと、を含み、
前記超音波処理された魚皮に対して、前記第１ステップ及び第２ステップを繰り返して遂行するコラーゲンの抽出方法。
【請求項５】
魚皮が収容される試料タンクと、前記試料タンクから前記魚皮を供給されてコラーゲンに分離し、分離された前記コラーゲンを前記試料タンクに再供給する分離ユニットと、前記コラーゲンの分離時に発生する熱を遮断できるように前記分離ユニット側へ冷却水を供給する冷却部と、前記魚皮を前記コラーゲンに分離するための超音波を発生させるように前期分離ユニットに接続される超音波発生ユニットと、を含む、超音波を利用したコラーゲン分離装置であって、
前記分離ユニットは、
前記試料タンクから魚皮を供給され、これをコラーゲンに分離する処理部と、
前記処理部の外周面から一定間隔離隔され、前記処理部の外部を密閉することにより、前記冷却部から供給される冷却水が流入および流出する空間を提供する第1冷却水流出入部と、を含み、
前記超音波発生ユニットは、
前記処理部の外周面に結合され、超音波を発生させる少なくとも一つの振動子と、
前記振動子の出力レベルを調節する振動調節コントローラと、を含み、
前記振動子により発生する超音波の周波数は20kHzであり、前記振動調節コントローラの出力は0.1〜1000Wであることを特徴とする超音波を利用したコラーゲン分離装置。
【請求項６】
前記試料タンクは、
前記魚皮が格納される格納部と、
前記格納部の外周面から一定間隔離隔され、前記格納部の外部を密閉することにより、前記冷却部から供給される前記冷却水が流入および流出する空間を提供する第2冷却水流出入部と、を含むことを特徴とする請求項５に記載の超音波を利用したコラーゲン分離装置。
【請求項７】
前記振動子は、相互間で超音波の影響を受けないように、互いに5〜6cm離隔して配置される複数の振動子であることを特徴とする請求項５に記載の超音波を利用したコラーゲン分離装置。
【請求項８】
前記冷却部は、
冷却本体と、
前記冷却本体から前記第1冷却水流出入部側へ冷却水が流入するように、前記冷却本体の下側から前記第1冷却水流出入部の下側に延長する第1冷却水流入管と、
前記第1冷却水流出入部から前記冷却本体側へ冷却水が流出するように、前記第1冷却水流出入部の上側から前記冷却本体の上側に延長する第1冷却水流出管と、
前記冷却本体から前記第2冷却水流出入部側へ冷却水が流入するように、前記冷却本体の下側から前記第2の冷却水流出入部の下側に延長する第2冷却水流入管と、
前記第2冷却水流出入部から前記冷却本体側へ冷却水が流出するように、前記第2冷却水流出入部の上側から前記冷却本体の上側に延長する第2冷却水流出管と、を含むことを特徴とする請求項６に記載の超音波を利用したコラーゲン分離装置。
【請求項９】
前記格納部から前記処理部側へ魚皮を供給できるように、前記格納部の下側と前記処理部の下側とを相互接続する試料供給管と、
前記分離ユニットによって分離されたコラーゲンを前記試料タンク側に排出できるように、前記処理部の上側と前記格納部の上側とを相互に接続する試料排出管と、をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の超音波を利用したコラーゲン分離装置。
【請求項１０】
前記魚皮および前記コラーゲンが前記試料供給管と前記試料排出管に沿って強制的に循環されるように、前記試料供給管の延長経路上に設けられる循環ポンプと、
前記魚皮および前記コラーゲンの循環量を調節できるように、前記循環ポンプの駆動レベルを調節する循環量調節コントローラと、をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の超音波を利用したコラーゲン分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超音波によりコラーゲンを抽出する方法及びその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、皮膚、血管、骨、内臓等のほぼ全ての組織に含まれており、身体を構成するたんぱく質の約30％を占める主なたんぱく質である。人体を構成するコラーゲンの約40％は皮膚に存在し、20％は骨や軟骨に含まれており、その他、血管、内臓等に広く分布している。このようなコラーゲンは、かつてからゼラチン等の形で食用されており、最近は、このようなコラーゲンが、消化管内の酵素によって分解され、ペプチドやアミノ酸の形で吸収され、免疫機能を向上させ、細胞の再生作用を促進させ、関節を丈夫にし、皮膚の代謝活性化および保湿力の維持を通じて皮膚美容に優れた効果をもたらすことが知られている。コラーゲンは、主に動物の皮、骨、関節等から抽出されるが、最近は、BSE、口蹄疫等の発生の影響から、動物性コラーゲンに対する認識が悪くなっており、魚の皮、鱗等から抽出したマリンコラーゲンの価値が高まりつつある。
【０００３】
一方、従来には、酸、アルカリ、塩等のような化学物質を使用してコラーゲンを抽出するが、これに伴う環境汚染や廃水処理費用等の問題点が存在する。
【０００４】
従って、できるだけ化学物質を使用せず、コラーゲンを環境に優しく抽出する方法の研究開発が求められている。 
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、超音波処理によるコラーゲンの抽出方法であって、化学物質の使用を最小限に抑え、魚皮からコラーゲンの収率を最大限にして抽出する方法及びその装置を提供することに、その目的がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明の一実施例においては、魚皮を0.01〜0.5Mの酢酸溶液下で0.1〜10時間、超音波処理を行い、コラーゲン抽出物を得る第1ステップと、前記コラーゲン抽出物からコラーゲンと超音波処理された魚皮を分離する第2のステップと、前記超音波処理された魚皮に対して、前記第1ステップと第2ステップを繰り返して遂行することによりコラーゲンを抽出する方法を提供する。また、前記超音波処理は20kHzの周波数で行うことができ、前記超音波の振幅が75〜85％でありえ、前記超音波処理が0〜10℃で行うことができ、前記コラーゲン抽出物を遠心分離して上澄液を得、この上澄液に塩化ナトリウム（NaCl）を加えて沈殿させることによりコラーゲンを抽出または分離でき、前記第1ステップ及び第2ステップを8回行う場合には、超音波の振幅が20〜40％で24時間遂行することができる。
【０００７】
本発明の一実施例においては、上記の方法によって抽出されたコラーゲンを提供する。本発明の一実施例においては、魚皮を酸性溶液下で超音波処理し、コラーゲン抽出物を得る第1ステップと、前記コラーゲン抽出物からコラーゲンと超音波処理された魚皮を分離する第2ステップと、前記超音波処理された魚皮に対して、第１ステップと第2ステップを繰り返して遂行することによりコラーゲンを抽出する方法を提供する。
【０００８】
本発明の一実施例においては、魚皮が収容される試料タンクと、前記試料タンクから前記魚皮を供給されてコラーゲンに分離し、分離された前記コラーゲンを前記試料タンクへ再供給する分離ユニットと、前記魚皮を前記コラーゲンに分離するための超音波を発生させるように前記分離ユニットに接続されている超音波発生ユニットとを含むことを特徴とする超音波を利用したコラーゲン分離装置を提供する。
【０００９】
前記超音波を利用したコラーゲン分離装置は、前記コラーゲンの分離時に発生する熱を遮断できるように前記分離ユニット側へ冷却水を供給する冷却部をさらに備え、前記分離ユニットは、上記試料タンクから魚皮を供給され、これをコラーゲンに分離する処理部と、前記処理部の外周面から一定間隔離隔され、前記処理部の外部を密閉することにより、前記冷却部から供給される前記冷却水が流入および流出される空間を提供する第1冷却水流出入部とを含むことができる。
【００１０】
前記試料タンクは、前記魚皮が格納されている格納部と、前記格納部の外周面から一定間隔離隔され、前記格納部の外部を密閉することにより、前記冷却部から供給される前記冷却水が流入および流出される空間を提供する第2冷却水流出入部とを含むことができる。
前記超音波発生ユニットは、前記処理部の外周面に結合され、超音波を発生させる少なくとも一つの振動子と、前記振動子の出力レベルを調節する振動調節コントローラとを含むことができる。
【００１１】
前記振動子は、相互間で超音波の影響を受けないように、互いに5〜6cm離隔して配置される複数の振動子でありえる。前記振動子により発生する超音波の周波数は20kHzでありえる。前記振動調節コントローラの出力は、0.1〜1000Wでありえる。
【００１２】
前記冷却部は、冷却本体と、前記冷却本体から前記第1冷却水流出入部側へ冷却水が流入するように前記冷却本体の下側から前記第1冷却水流出入部の下側へ延長する第1冷却水流入管と、前記第1冷却水流出入部から前記冷却本体側へ冷却水が流出するように前記第1冷却水流出入部の上側から前記冷却本体の上側へ延長する第1冷却水流出管と、前記冷却本体から前記第2の冷却水流出入部側へ冷却水が流入するように、上記冷却本体の下側から前記第2の冷却水流出入部の下側へ延長する第2冷却水流入管と、前記第2の冷却水流出入部から前記冷却本体側へ冷却水が流出するように、前記第2の冷却水流出入部の上側から前記冷却本体の上側へ延長する第2冷却水流出管とを含むことができる。
【００１３】
前記超音波を利用したコラーゲン分離装置は、前記格納部から前記処理部側へ魚皮を供給できるように、前記格納部の下側と前記処理部の下側を相互接続する試料供給管と、前記分離ユニットによって分離されたコラーゲンを前記試料タンク側へ排出できるように、前記処理部の上側と前記格納部の上側を相互接続する試料排出管とをさらに含むことができる。
【００１４】
前記超音波を利用したコラーゲン分離装置は、魚皮とコラーゲンが前記試料供給管と前記試料排出管に沿って強制的に循環されるように、前記試料供給管の延長経路上に設けられる循環ポンプと、前記魚皮とコラーゲンの循環量を調節できるように、前記循環ポンプの駆動レベルを調節する循環量調節コントローラとをさらに含むことができる。
【００１５】
本発明における“魚皮”とは、可溶性の海洋生物由来のマリンコラーゲンを含むものであって、魚類の鱗が取り除かれたものをいう。これは、その特性上、酸性溶媒を加えずに超音波処理のみする場合、コラーゲン繊維の構造変化を起こしにくく、コラーゲンの分離のためには、酸性溶媒が必ず必要である。本発明においては、酸性溶媒の存在下で超音波処理を並行するため、最小濃度の酸性溶媒下でも高い収率でコラーゲンを溶出させることができる。したがって、コラーゲンの分離に使用される酸の量を大幅に減らすことができる。
【００１６】
本発明における“コラーゲン”は、動物の結合組織、骨、腱、皮膚、軟骨、血管等を構成する繊維状構造のたんぱく質であって、基本構造単位はトロポコラーゲン（tropocollagen）であり、分子量の約10万である3つのポリペプチドからなる3重螺旋構造を有するもので、３つのポリペプチド鎖が互いに水素結合して安定化されているが、加熱すると、これらの疎水結合が切断されてランダムコイル状のゼラチンになり、物性が変化する。
【００１７】
本発明における“超音波処理”は、超音波エネルギーが対象の粒子を振動させて対象を破壊するか非活性化することであって、生化学においては、主に細胞膜を破壊して細胞内容物が排出されるようにする目的で使用され、これに限定されないが、可聴周波数領域（約20kHz以下）よりも高い振動数の音波を使用する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明におけるコラーゲンの抽出方法は、超音波処理を繰り返して実行することにより、従来のコラーゲン抽出方法よりも、酸性溶液の濃度を低減し、高収率でコラーゲンを抽出することができる。また、本発明のコラーゲン抽出方法によれば、コラーゲンの加水分解物の形ではなく、高分子量のコラーゲンを基本構造そのままに抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例1〜4の方法でコラーゲンを分離する場合、コラーゲンの分離収率を示す。
【図２】実施例1〜4の方法でコラーゲンを分離する場合、コラーゲンの分離収率を示す。
【図３】実施例1〜4の方法でコラーゲンを分離する場合、コラーゲンの分離収率を示す。
【図４】実施例1〜4の方法でコラーゲンを分離する場合、コラーゲンの分離収率を示す。
【図５】比較例1〜4の方法で分離する場合、コラーゲンの分離収率を示す。
【図６】実施例1〜4の方法で分離する場合、コラーゲンの最大収率を示す。
【図７】比較例1〜4の方法で分離する場合、コラーゲンの最大収率を示す。
【図８】実施例1と実施例3の方法でコラーゲンを分離する場合、分離されたコラーゲンのSDS−PAGEパターンを示す。
【図９】比較例2〜4の方法でコラーゲンを分離する場合、分離されたコラーゲンのSDS-PAGEパターンを示す。
【図１０】0.5M酢酸で24時間処理した際と同じ収率を示すまで、酸性溶媒の存在下で超音波処理をした場合にかかる時間を示す。
【図１１】分離されたコラーゲンとコラーゲンをゼラチン化させた場合、消化力を評価してコラーゲンを証明した結果を示す。
【図１２】超音波処理の繰り返し回数によるコラーゲンの抽出収率を示したグラフである。
【図１３】超音波処理の繰り返し回数による、分離されたコラーゲンのSDS−PAGEパターンを示す。
【図１４】本発明の一実施例に係る、超音波を利用したコラーゲン分離装置の概略的な模式図である。
【図１５】図14の超音波を利用したコラーゲン分離装置において、分離ユニットの概略図である。
【図１６】図14の超音波を利用したコラーゲン分離装置を使用してコラーゲンを分離する方法を示したフローチャートである。
【図１７】図14の超音波を利用したコラーゲン分離装置を使用してコラーゲンを分離する場合のコラーゲン収率を示したグラフである。
【図１８】図14の超音波を利用したコラーゲン分離装置を使用して分離されたコラーゲンをSDS−電気泳動法で分析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を下記の実施例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するだけであり、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
（実施例１  試料の予備処理）
試料は、（株）オソン養魚場からスズキの冷凍魚皮を提供され、使用した。魚皮は、内側に残存するスズキ筋肉と鱗を取り除いた後、氷水で洗浄して不純物を除去し、1.0cm×1.0cmの大きさに細切りした。魚皮についている塩溶性たんぱく質を完全に取り除くために、魚皮重量に対して20倍の0.5MNaCl溶液を加えた後、よく攪拌して、6,000rpmで10分間遠心分離し、上澄液を除去した。このような操作を3回繰り返し、すべての操作は4℃以下で行った。
【００２２】
遠心分離で得られた沈殿物を、さらに4℃以下で保存した精製水で洗浄した後、沈殿物に対して約20倍の重量の冷エタノールを添加し、4℃で24時間攪拌しながら脱脂してこれを精製試料とした。精製試料は、−20℃以下で保存し、必要に応じて取り出して使用した。
【００２３】
（実施例２  コラーゲンの抽出）
2−1  超音波処理によるコラーゲンの抽出
上記実施例1で用意された魚皮に約200倍の重量の0.01〜0.5Mの酢酸を加えた後、4℃で下記表1の条件にて超音波処理を行った。パルスon/offは、20sec/20secとした。超音波処理後、得られた粘性の溶液を6,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄液を分離し、上澄液にNaClを5wt％となるように添加し、白色沈殿を得た。上記白色沈殿を遠心分離し、精製水で透析した後、凍結乾燥してコラーゲンを抽出した。
【００２４】
【表１】
0005946843.tif 000002
2-2  酸可溶性コラーゲンの抽出
試料重量に対して、下記表2の条件にて200倍量の0〜0.5M酢酸を添加し、4℃で24時間攪拌しながら抽出した。得られた粘性の溶液を6,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄液を分離し、上澄液にNaClを5wt％となるように添加し、白色沈殿を得た。上記白色沈殿を遠心分離し、精製水で透析した後、凍結乾燥をしてコラーゲンを抽出した。
【００２５】
【表２】
0005946843.tif 000003
2−3  超音波処理の繰り返しによるコラーゲンの抽出
前記実施例1で用意された魚皮に約200倍の重量の0.01Mの酢酸を加えた後、4℃で3時間40％〜80％の増幅に超音波処理を行った。パルスon/offは20sec/20secにした。超音波処理後、得られた粘性の溶液を6,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄液（コラーゲン）を分離し、沈殿（残渣）に更に200倍重量の0.01Mの酢酸を加えた後、4℃で3時間40％〜80％の増幅に超音波処理を行った。遠心分離でコラーゲンを分離し、残りの残渣に再び0.01M酢酸を加えて繰り返す作業を合計4回〜8回を行ってコラーゲンを分離した。上記のように合計4回〜8回の作業にかけて集められた上澄液を凍結乾燥してコラーゲンを抽出した（図１２参照）。
【００２６】
（実施例３  コラーゲン収率の測定）
前記製造例および比較例で得られた試料を15,000×gで20分間遠心分離して得た上澄液をBiuret法（Gornall、A、G.等、1949）を利用して、たんぱく質含有量を測定した。コラーゲン収率は、総たんぱく質含有量に対する超音波処理後のたんぱく質含有量の比であって、次のような式によって算出した。
【００２７】
コラーゲン収率（％）＝（上澄液中のたんぱく質濃度/総たんぱく質濃度）×100
処理時間に応じたコラーゲン収率を図1〜図5に示した。図1〜4は、製造例1〜4の酢酸濃度によるコラーゲンの収率を示し、図5は、比較例1〜5の酸濃度に応じたコラーゲンの収率を示したものである。図1〜4によれば、超音波処理を行うことにより、超音波処理を行っていない図5と比較して、コラーゲンの収率が急速に増加することが分かった。さらに、増幅が大きくなるにつれて、増加する速度が速くなった。図5によれば、超音波処理をせずに、0.01Mの低濃度の酢酸での処理のみする場合には、コラーゲンがほとんど分離されなかったが、図1によれば、20kHzにおいて増幅20％の超音波で処理した場合、0.01Mの低濃度の酢酸の下でも、コラーゲンの分離量が増加し始めた。また、図2〜4によれば、濃度が高くなればなるほど、コラーゲンの増加幅もより大きくなり、同じ条件下で増幅が大きければ大きいほど、その増加速度はさらに速くなった。したがって、コラーゲンの分離能は、酢酸の濃度と超音波増幅に依存して増加するものと見られる。
【００２８】
また、超音波繰り返し抽出によって得られたコラーゲンの収率を図12に示した。3時間40％増幅の超音波処理を8回抽出したコラーゲンの収率は、従来の方法である0.01Mの酢酸の下で24時間抽出したコラーゲンの収率よりも3倍以上増加した。そして、3時間80％増幅の超音波処理を4回抽出したコラーゲンの収率は、従来の方法である0.01Mの酢酸の下で12時間抽出したコラーゲンの収率よりも約2倍増加した。従って、超音波を繰り返し抽出したときにコラーゲンの収率は、超音波の抽出回数に比例することがわかった。
【００２９】
（コラーゲンの最大収率の測定）
上記製造例1と同様の方法でコラーゲンの収率を測定し、収率が増加すると、その速度（ki）を次の式で算出した。
【００３０】
Ki  ＝（nt−no）
nt：超音波処理t時間後の溶解度
no：超音波処理前の溶解度
t：超音波処理時間
その結果は、図6および図7に示す。図6は、製造例1〜4の酸性溶媒下で超音波で処理した場合と、比較例1〜4の酸性溶媒のみで処理した場合とのコラーゲン最大収率を示す。図6において、それぞれの記号は、0％（●）、20％（○）、40％（▼）、60％（▽）および80％（■）の増幅を示す。図7は、コラーゲン収率の増加率を示したものである。
【００３１】
図6によると、酢酸の濃度が増加するにつれ、超音波の増幅が増加するにつれ、コラーゲンの最大収率も高くなり、酢酸の濃度が0.1Mのときの最大収率と、0.5Mのときの最大収率とは類似して、酢酸の濃度が0.5M以上に増加しても、最大収率の増加は微々たるものであることが推測される。また、酢酸を添加せずに超音波処理を行う場合にも、コラーゲンの分離はほとんど起こらなかった。酸性溶媒のみで処理する比較例の場合にも、酢酸の濃度が増加するにつれて、最大収率も増加したが、超音波処理を並行する場合よりも増加率が低かった。また、酢酸の濃度が0Mの場合、コラーゲンの分離が起こらず、コラーゲンの分離には酸が必要であることがわかった。
【００３２】
図7によると、コラーゲン収率の増加率に及ぼす、超音波の増幅と酢酸濃度との関係を詳細に調べた結果、どのような条件の下においても直線関係を示し、これらのそれぞれの関係式は次のようだった。すなわち、0.01Mの酢酸と増幅との関係式は、y＝0.0198x＋0.2296を、0.1Mではy＝0.0418x＋0.6832を、0.5Mではy＝0.044x＋1.2633を示した。この式によると、酢酸の濃度に応じて傾きが異なり、0.01M酢酸よりも0.1M以上での傾きが増加し、0.1M以上酢酸の下でコラーゲンの分離が早く起こった。また、0.1Mと0.5M酢酸を比較すると、傾きがほぼ同じで0.5M以上の酢酸濃度の場合は、酢酸の濃度がコラーゲンの収率増加率に大きな影響を与えないことが分かった。
【００３３】
（実施例４  分離されたコラーゲンのSDS−PAGE  pattern）
上記製造例および比較例によって得られたコラーゲンのサブユニット（subunit）組成をSDS電気泳動（SDS−PAGE）で検討した。SDS−PAGEは、Lammli法（Lammli、V.K.等、1970）により7.5％slab  gelを用いて行った。上記製造例および比較例から分離されたコラーゲン試料に、8M要素（urea）、2％メルカプトエタノール（mercaptoethanol）、2％SDS、20mM  Tris-HCl（pH8.0）を添加して溶解し、100℃で2分間加熱した。Fixingとstainingは、Neuhoff（Neuhoff  V.等1988）の方法によりクマシブリリアントブルー（Coomassie  brilliant  blue）を利用して実施した。増幅40％の超音波で処理した製造例の結果は図8に示し、酢酸の濃度を変えて処理した比較例2〜4の結果は、図9に示した。
【００３４】
図8によると、0.01M酢酸の存在下で40％増幅の超音波で処理した場合、4時間後にコラーゲンに相当する成分が観察され始め、超音波処理時間が長くなればなるほど、α1、α2、β、およびγ鎖（chain）が確実に観察された。このような傾向は、コラーゲンのポリマーと推測される成分がゲルの一番上から観察されたことからも分かる。増幅60％で処理した場合、全体的な傾向は、増幅20％で処理した場合と同じだった。しかし、超音波処理時間が長くなればなるほど、コラーゲンの分解物と推定される成分が観測され始めた。特に、0.5M酢酸の下で超音波処理を24時間行った場合、コラーゲンの主要なサブユニットであるα1およびβ鎖の減少が生じ、これと共に、ゲルのバックグラウンド（background）が染色される不特定のペプチドが生成されることが観察された。
【００３５】
図9によると、酸性溶媒のみで処理して分離したコラーゲンのサブユニット組成を検討した結果、0.01M酢酸下では、反応6時間後にコラーゲンに相当するα1およびβ鎖が観察され始め、24時間後には、これらと共にα2およびγ鎖が観察された。このような現象は、酢酸濃度が高くなり、より顕著に観察され始め、反応時間の経過に沿って量的にもα1、α2、β、およびγ鎖が増加することが観察された。
【００３６】
その結果、酸性溶媒下で超音波処理を行う場合、コラーゲンに相当するα1、α2、β、およびγ鎖がより早く増加し、酸性溶媒下で超音波処理を行った場合、短時間でコラーゲンの分離が起こることが分かった。
【００３７】
また、図13から、超音波処理を繰り返して遂行して、抽出されたコラーゲンも典型的なコラーゲンの構造を有することが確認できた。
【００３８】
（実施例６  コラーゲンの確認）
製造例において、酸性溶媒下で超音波処理を並行して分離したコラーゲンが、コラーゲンの形で分離されたか又はゼラチンの形で分離されたかを確認するために、ペプシン（1:10,000、Yakuri  pure  chem、co.,ltd.  Japan）によるコラーゲンの消化力を検討した。コラーゲンの特性は、その構造が強固で一般的な消化酵素では分解が起こらず、コラゲナーゼ（Collagenase）で分解が起こることが知られている。しかし、コラーゲンが熱によってゼラチン化されると、消化酵素で分解が起こる。したがって、このような特性を利用して、超音波によって分離されたコラーゲンをペプシン処理し、消化が起こると、ゼラチンの形で分離されたと、消化が起こらないと、コラーゲンの形で分離されたと判断することができる。
【００３９】
コラーゲン濃度を1mg／mlに調整した後、100℃で5分間加熱してゼラチン化した。コラーゲンとゼラチンの濃度に対して0.5％ペプシンを添加し、10℃で0〜30分間処理した後、それぞれの試料に8MSDS、2％メルカプトエタノール（mercaptoethanol）、20mM  Tris-HCl（pH  8.0）を加えて、100℃で2分間加熱して酵素活性を停止させた。その後、SDS−PAGE（Lammli法）によって消化パターンを分析した。このとき、コラーゲン標準物質は、Acid  soluble  Collagen（TypeII、from  white  rabbit  skin.,Sigma.USA）を使用した。その結果は、図11に示す。図11において、No.1は基準となるTYPEIのコラーゲンであり、No.2は0.01Mの酢酸から80％amplitudeで12時間超音波処理をして分離したコラーゲンであり、No.3、4、5は、これをペプシンで処理した結果である。No.6は、No.2のコラーゲンを100℃で熱処理してゼラチン化したものであり、No.7、8、9は、前記ゼラチンをペプシンで処理したものを分析した結果である。
【００４０】
図11において、各No.が意味するところは、次のとおりである：
S：molecular  weight  marker
No.1：I  type  collagen（acid  soluble）
No.2：Collagen  of  fish  skin  Isolated  by  sonication  with  acetic  acid
No.3,4,5：Collagen  treated  with  pepsin  for  10、20  and  30mim
No.6：Gelatin  obtained  from  collagen（No.2）by  heating  at  100℃
No.7,8,9：Gelatin（No.6）treated  with  pepsin  for  10、20  and  30mim
図11によると、酸性溶媒下で超音波によって分離されたコラーゲン（No.2）は、ペプシン処理を行っても、コラーゲンの主要成分であるαおよびβ鎖の変化が起こらなかった（No.3、4および5）。しかし、コラーゲンを熱処理してゼラチン化（No.6）させた後、ペプシン処理を行うと、コラーゲンの主要成分であるαおよびβ鎖が完全に消失し、低分子成分が増加することが観察された（No.7、8および9）。したがって、以上の結果から、超音波によって分離された成分は、ゼラチンやコラーゲンの加水分解物ではなく、コラーゲンであることが確認された。
【００４１】
以下、添付図面を参照して本発明の好適な実施例を詳細に説明すると、次の通りである。ただし、本発明を説明するにあたって、既に公知された機能または構成についての説明は、本発明の要旨を明瞭にするために省略する。
【００４２】
図14は、本発明の一実施例に係る超音波を利用したコラーゲン分離装置の概略的な模式図であり、図15は、図14の超音波を利用したコラーゲン分離装置における分離ユニットの概略的な模式図である。
【００４３】
これらの図を参照すると、超音波を利用したコラーゲン分離装置100（以下“コラーゲン分離装置100”という）は、魚皮が収容される試料タンク110と、試料タンク110から魚皮を供給されてコラーゲンに分離し、分離されたコラーゲンを試料タンク110に再供給する分離ユニット130と、魚皮をコラーゲンに分離するための超音波を発生させるように分離ユニット130に接続されている超音波発生ユニット150と、コラーゲンの分離時に発生する熱を遮断できるように設けられる冷却部170と、試料タンク110から分離ユニット130側へ魚皮を供給する試料供給管180aと、分離ユニット130により分離されたコラーゲンを試料タンク110側へ再び供給する試料排出管180bと、魚皮とコラーゲンが試料供給管180aと試料排出管180bに沿って強制的に循環されるように試料供給管180aの延長経路上に設けられる循環ポンプ191と、循環ポンプ191の駆動レベルを調節する循環量調節コントローラ192を含む。
【００４４】
試料タンク110は、分離ユニット130側へ供給され、コラーゲンに分離される魚皮（試料）が収容される構成であって、魚皮が格納される格納部111と、格納部111の外部を完全に密閉することにより、冷却部170から供給される冷却水が流入および流出することができる空間を提供する第2冷却水流出入部113とを含む。
【００４５】
格納部111は、試料として使用される魚皮が格納されるための空間を提供する中空円筒状の構成である。もちろん、本発明の権利範囲は、格納部111の形状によって制限されず、本発明の他の実施例に基づいて、格納部111は四角形状等に設けられることもある。
【００４６】
格納部111には、魚皮だけでなく、魚皮をコラーゲンに分離するのに必要な酸性溶液が共に格納されるが、このような酸性溶液は、魚皮からコラーゲンを分離するために、従来にも使用されているものであるところ、詳細な説明は省略する。
【００４７】
格納部111の下側は、後述する試料供給管180aによって分離ユニット130の下側（より正確には、処理部131の下側）に接続され、魚皮が分離ユニット130側へ供給されるようになり、その上側は試料排出管180bによって分離ユニット130の上側（より正確には、処理部131の上側）へ接続され、分離されたコラーゲンが再び格納部111側へ排出される。
第2冷却水流出入部113は、第2冷却水流入管175aに沿って冷却水が冷却本体171から流入されるか、第2冷却水流出管175bに沿って冷却水が冷却本体171側へ流出されるためのスペースを提供する構成である。
【００４８】
このため、第2冷却水流出入部113は、格納部111の外周面から一定間隔離隔され、格納部111の外部を完全に密閉することができるように設けられ、まさにこのような格納部111と第2冷却水流出入部113との間に設けられる空間を介して冷却水が流出入することができるようになる。もちろん、前述した格納部111と同様に、本発明の権利範囲は、第2冷却水流出入部113の形状によって制限されない。
【００４９】
一方、分離ユニット130は、試料タンク110から魚皮を供給され、これをコラーゲンに分離し、分離されたコラーゲンを試料タンク110側に再び供給する構成である。
【００５０】
分離ユニット130は、魚皮がコラーゲンに分離される処理部131と、処理部131の外部を完全に密閉することにより、冷却部170から供給される冷却水が流入および流出することができる空間を提供する第1冷却水流出入部133とを含む。
【００５１】
処理部131は、後述する超音波発生ユニット150に接続され、試料タンク110から魚皮を供給され、これをコラーゲンに分離するか分離されたコラーゲンを再び試料タンク110側へ供給する中空円筒状の構成である。もちろん、本発明の権利範囲は、処理部131の形状によって限定されない。
【００５２】
処理部131の下側と格納部111の下側とが、処理部131の上側と格納部111の上側とが、それぞれ試料供給管180aと試料排出管180bによって接続されるのは、前述のとおりである。
【００５３】
一方、第1冷却水流出入部133は、第1冷却水流入管173aに沿って冷却水が冷却本体171から流入するか、第1冷却水流出管173bに沿って冷却水が冷却本体171側へ流出するためのスペースを提供する構成である。
【００５４】
このため、第1冷却水流出入部133は、処理部131の外周面から一定間隔離隔され、処理部131の外部を完全に密閉することができるように設けられ、これらの処理部131と第1冷却水流出入部133との間に設けられる空間を介して冷却水が流出入することができるようになる。もちろん、本発明の権利範囲は、第1冷却水流出入部133の形状によって制限されない。
【００５５】
一方、超音波発生ユニット150は、魚皮をコラーゲンに分離するための超音波を発生させるように、分離ユニット130に接続される構成である。超音波発生ユニット150は、処理部131の外周面に結合される複数の振動子151と、振動子151の出力レベルを調節する振動調節コントローラ153を含む。振動子151は、振動調節コントローラ153の制御に応じて一定の振動を発生させることにより、処理部131の内部に超音波を発生させる構成である。
【００５６】
多数の振動子151は、相互に超音波の影響（干渉）を受けないように、互いに5〜6cm離隔して処理部131の外周面に沿って取り付けられる。本実施例において、振動子151によって発生する超音波の周波数は20kHz程度であり、これは、この周波数で最も高い効率で魚皮をコラーゲンに分離させることができるからである。
【００５７】
ただし、処理部131の容量、処理部131に格納された魚皮の格納量等に応じて、超音波の周波数は、他の数値に変更することができる。
【００５８】
振動調節コントローラ153は、振動子151の出力レベル、すなわち、振動子151によって発生する超音波の周波数を制御することができるように設けられる構成である。振動調節コントローラ153と振動子151は、RF  Wire（Radio  Frequency  Wire）で接続され、振動調節コントローラ153によって制御される信号が振動子151に提供される。
【００５９】
本実施例における振動調節コントローラ153の出力は、0.1〜1000Wで設けられるが、前述した振動子151の周波数が変更可能な範囲に対応して、振動調節コントローラ153の出力も変わる場合がある。
【００６０】
一方、冷却部170は、コラーゲンの分離時に発生する熱を遮断できるように、第1冷却水流出入部133側へ冷却水を供給する構成である。また、冷却部170は、第2冷却水流出入部113側へも冷却水を供給することにより、コラーゲンの分離時に発生する熱を効率的に遮断する役割もする。
【００６１】
冷却部170は、冷却水が流入したり流出したりする冷却本体171と、冷却本体171と第1冷却水流出入部133を相互接続する第1冷却水流入管173aおよび第1冷却水流出管173bと、冷却本体171と第2冷却水流出入部113を相互接続する第2冷却水流入管175aおよび第2冷却水流出管175bとを含む。
【００６２】
冷却本体171は、第1冷却水流出入部133または第2冷却水流出入部113に供給される冷却水が格納される構成である。冷却本体171の一側には、第1冷却水流出入部133または第2冷却水流出入部113に供給される冷却水の循環量を調節するためのコントローラ171aが設けられ、作業者は、コラーゲンの分離時に発生する熱を考慮してコントローラ171aを調整することにより、冷却水の循環量を決定することができるようになる。
【００６３】
第1冷却水流入管173aは、冷却本体171の下側と第1冷却水流出入部133の下側とを相互接続することにより、冷却本体171から第1冷却水流出入部133側へ冷却水が供給される構成であり、第1冷却水流出管173bは、冷却本体171の上側と第1冷却水流出入部133の上側とを相互接続することにより、第1冷却水流出入部133から冷却本体171側へ冷却水が流出する構成である。
【００６４】
すなわち、第1冷却水流入管173a及び第1冷却水流出管173bによって、冷却水は、冷却本体171と第1冷却水流出入部133との間を継続循環するようになり、冷却水の循環によって、魚皮をコラーゲンに分離する場合、処理部131から発生する熱を効率的に遮断することができるようになる。
【００６５】
第2冷却水流入管175aは、冷却本体171の下側と第2冷却水流出入部113の下側とを相互接続することにより、冷却本体171から第2冷却水流出入部113側へ冷却水が供給される構成であり、第2冷却水流出管175bは、冷却本体171の上側と第2冷却水流出入部113の上側とを相互接続することにより、第2冷却水流出入部113から冷却本体171
側へ冷却水が流出する構成である。
【００６６】
すなわち、第2冷却水流入管175aと第2冷却水流出管175bによって、冷却水は、冷却本体171と第2冷却水流出入部113との間を継続循環するようになり、冷却水の循環によって、魚皮をコラーゲンに分離する場合、処理部131から発生する熱を効率的に遮断することができるようになる。
【００６７】
一方、処理部131の外部ではなく、試料タンク110外部にも、別の冷却水を供給するのは、処理部131で分離されたコラーゲンが再び試料タンク110の格納部111側へ供給されるためである。
【００６８】
すなわち、処理部131に収容された魚皮が、超音波によって一度に、そのすべてがコラーゲンに分離されるのではないため、後述するように、かなりの時間をかけて魚皮に超音波を加えてからこそ、ある程度のコラーゲンを得ることができる。
【００６９】
この時間の間、魚皮は継続的にコラーゲンに分離され、処理部131と格納部111との間を循環するので、処理部131から格納部111側へ流入する魚皮とコラーゲンの混合状態の物質は、ある程度の熱を持った状態になり、すぐにこの熱を遮断する必要性が生じるのである。これにより、本実施例では、処理部131の外部と格納部111の外部に、それぞれ第1冷却水流出入部133と第2冷却水流出入部113を設けることによって、魚皮がコラーゲンに分離される場合に発生する熱を効率的に遮断できるようにするものである。
【００７０】
また、第1冷却水流入管173aを、冷却本体171の下側と第1冷却水流出入部133の下側とを接続するように配置し、第2冷却水流入管175aを、冷却本体171の下側と第2冷却水流出入部113の下側とを接続するように配置することは、魚皮をコラーゲンに分離する場合に発生する熱を効率的に遮断するためである。
【００７１】
すなわち、格納部111に格納された魚皮（もちろん、本コラーゲン分離装置100の使用により、コラーゲンも混じるようになる）と、処理部131に供給された魚皮とは、それぞれ格納部111および処理部131に完全に満たされるのではないので、冷却本体171に格納された冷たい冷却水が、このような格納部111と処理部131の下側から供給され、格納部111と処理部131の熱を冷まして上側へ流出するようにすることにより、冷却水による冷却効率を向上させることができる。
【００７２】
一方、試料供給管180aは、格納部111から処理部131側へ魚皮が供給されるように、設けられる構成であり、試料排出管180bは、処理部131によって分離されたコラーゲンが格納部111側へ排出されるように設けられる構成である。もちろん、前述したように、ここで魚皮とコラーゲンは、本コラーゲン分離装置100の使用によって相互に一定に混合された状態の物質をいう。
【００７３】
また、試料供給管180aの延長経路上には循環ポンプ191が設けられ、この循環ポンプ191は、循環量調節コントローラ192によって、その駆動レベルが制御される。
【００７４】
作業者は、循環量調節コントローラ192を調節することにより、循環ポンプ191の駆動レベルを調節することになり、循環ポンプ191の駆動度合いに応じて格納部111から一定量の魚皮が処理部131側へ供給されるとともに、処理部131に保存されたコラーゲンも格納部111側へ排出され、魚皮とコラーゲンが継続的に循環することができるようになる。
【００７５】
また、循環ポンプ191を試料排出管180b側ではなく、試料供給管180a側に設けることは、処理部131に供給された魚皮は、それぞれ格納部111と処理部131に完全に満たされるのではないことを考慮したものである。
【００７６】
本実施例のコラーゲン分離装置100は、従来のように酸性溶液のみでコラーゲンを得るのでなく、超音波も使用してコラーゲンを得るため、コラーゲンを分離するために用いられる酸の使用量を減らすことによって、環境に優しい方法でコラーゲンを分離できるようにしながらコラーゲンの収率を向上させることができるという利点を有する。
【００７７】
さらに、本実施例のコラーゲン分離装置100は、魚皮をコラーゲンに分離する時に使用される場合に限定して説明されたが、ゼラチンをコラーゲンペプチドに分離する時にも使用することができる。すなわち、本発明の権利範囲は、魚皮をコラーゲンに分離する場合だけでなく、魚皮をゼラチンに代えることによって、コラーゲンの代わりにコラーゲンペプチドを得る場合まで含む。
【００７８】
図16は、図14における超音波を利用したコラーゲン分離装置を使用してコラーゲンを分離する方法を示したフローチャートであり、図17は、図14における超音波を利用したコラーゲン分離装置を使用してコラーゲンを分離する場合のコラーゲン収率を示したグラフであり、図18は、図14における超音波を利用したコラーゲン分離装置を使用して分離されたコラーゲンをSDS−電気泳動法で分析した結果を示すグラフである。
【００７９】
これらの図を参照すると、本実施例のコラーゲン分離装置100を使用して魚皮をコラーゲンに分離するためには、まず魚皮と酸性溶液を試料タンクに格納し（S1段階）、試料タンクから魚皮と酸性溶液を供給される分離ユニットと、分離ユニットに接続され、一定時間の間に超音波を発生させる超音波発生ユニットとを使用して魚皮をコラーゲンに分離し（S2段階）、分離されたコラーゲンと分離されていない魚皮を、分離ユニットから試料タンク側へ再び伝達し（S3段階）、一定の収率に達するまで、S2段階とS3段階を繰り返す（S4段階）過程を経る。
【００８０】
上記コラーゲンの分離方法に応じて一定の処理条件（酸性溶液：0.01M酢酸、冷却水の温度：4℃、試料供給速度：0.5L／分、超音波の周波数：20kHz）の下で、魚皮をコラーゲンに分離する場合のコラーゲン収率は、図17に示すとおりである。
【００８１】
すなわち、処理2時間後には約15％程度の魚皮がコラーゲンに分離され、4時間後には約33％程度、12時間後には約53％程度の魚皮がコラーゲンに分離されたことが分かった。また、15時間後には、魚皮に継続的に超音波を加えても、コラーゲンの収率に大きい影響は及ぼさないことが分かった。
【００８２】
一方、上記のような方法で分離されたコラーゲンを、SDS−電気泳動法で分析した結果、図18で示されるように、典型的なコラーゲン構造を維持しており、分離されたコラーゲンをコラゲナーゼ以外の酵素で処理しても分解が起こらないことを見るに、分離された成分がコラーゲンであることが確認できた。
【００８３】
前に、本発明の特定の実施例が説明され、図示されたが、本発明は、記載された実施例に限定されるものではなく、本発明の思想および範囲を離れることなく、様々な修正および変形ができることは、この技術の分野における通常の知識を有する者にとって自明のことである。したがって、そのような修正例、変形例は、本発明の技術的思想や観点から個別に理解してはならず、変形された実施例は、本発明の特許請求の範囲に属していなければならない。
【符号の説明】
【００８４】
100  コラーゲン分離装置
110  試料タンク
111  格納部
113  第2冷却水流出入部
130  分離ユニット
131  処理部
133  第1冷却水流出入部
150  超音波発生ユニット
151  振動子
153  振動調節コントローラ
170  冷却部
171  冷却本体
180a  試料供給管
180b  試料排出管
191  循環ポンプ
192  循環量調節コントローラ
【図１】
0005946843.tif 000004
【図２】
0005946843.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005946843.tif 000011
【図９】
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【図１０】
0005946843.tif 000013
【図１１】
0005946843.tif 000014
【図１２】
0005946843.tif 000015
【図１３】
0005946843.tif 000016
【図１４】
0005946843.tif 000017
【図１５】
0005946843.tif 000018
【図１６】
0005946843.tif 000019
【図１７】
0005946843.tif 000020
【図１８】
0005946843.tif 000021