(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞に由来する細胞の集団を含み、
前記人工多能性幹細胞に由来する細胞の集団の構成比は、心筋細胞３０〜７０％、内皮細胞０．１〜２０％及び壁細胞１〜４０％である、心筋シート。
【請求項２】
前記人工多能性幹細胞に由来する細胞の集団におけるＴＲＡ−１−６０陽性細胞の構成比が１０％以下である、請求項１記載の心筋シート。 
【請求項３】
前記人工多能性幹細胞に由来する細胞の集団におけるＴＲＡ−１−６０陽性細胞の構成比が２．２％以下である、請求項２記載の心筋シート。
【請求項４】
前記人工多能性幹細胞に由来する細胞の集団におけるＴＲＡ−１−６０陽性細胞の構成比が０．１％以上である、請求項２又は３記載の心筋シート。
【請求項５】
心疾患患者への移植のための心筋シートである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の心筋シート。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の心筋シートが複数含まれる、心筋シートの積層体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の心筋シートを含む、心疾患の治療方法において使用するための治療剤。
【請求項８】
請求項６記載の積層体を含む、心疾患の治療方法において使用するための治療剤。
【請求項９】
構成比が、心筋細胞４０〜８０％、内皮細胞１〜２０％及び壁細胞１〜４０％である、心筋シートに含まれるための、人工多能性幹細胞に由来する細胞の集団。
【請求項１０】
ＴＲＡ−１−６０陽性細胞の構成比が１０％以下である、請求項９記載の細胞の集団。
【請求項１１】
ＴＲＡ−１−６０陽性細胞の構成比が２．７％以下である、請求項１０記載の細胞の集
団。
【請求項１２】
前記人工多能性幹細胞に由来する細胞の集団におけるＴＲＡ−１−６０陽性細胞の構成比が０．１％以上である、請求項１０又は１１記載の細胞の集団。
【請求項１３】
心筋シートが心疾患患者への移植のためのシートである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の細胞の集団。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の心筋シートの製造方法であって、この方法は、人工多能性幹細胞に由来する混合細胞を温度応答性ポリマーを被覆した培養器材を用いて培養する工程、及び、心筋シートを回収する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞を用いて心筋および血管系混合細胞群を製造する方法に関する。本発明はまた、上記の方法によって得られた心筋および血管系混合細胞群を含む心疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人の心筋細胞は、ほとんど増殖しないため、虚血性心疾患等で欠損した心筋細胞は不可逆的な損傷となる。現在、臨床的に使用されるどの薬剤も処置も、機能性収縮組織で心筋瘢痕を置換することにおいて、効力を示していない。そこで、正常な心筋細胞を再生するための新規な治療が所望されており、別途製造された心筋細胞を投与する補充療法が提案されている。このような補充療法において、心筋細胞はレシピエントの心臓へ生着させるためシート状にして投与することが検討されている（非特許文献１、特許文献１）。さらに、シートにおける細胞量が不十分であるため期待された治療効果が得られないことから、シートを積層化して投与する必要があると考えられている（非特許文献２）。
一方、シート作製のための心筋細胞の供給元として、胎児心筋細胞、筋芽細胞、脂肪組織由来幹細胞由来の心筋芽細胞、胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いた方法が例示されている（特許文献２、非特許文献３および特許文献３（特願２０１１−０７６２３５））。
しかし、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来の分化細胞で形成された心筋シートの投与による効果によって心機能が改善されたとの報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００２／００８３８７号パンフレット
【特許文献２】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献３】特開２０１２−２１０１５６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４，２３０９−２３１６，２００３
【非特許文献２】Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０：７０８−１０，２００６
【非特許文献３】Ｂｅｌ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１２２：Ｓ１１８−２３，２０１０
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、人工多能性幹細胞由来の心筋細胞のみならず内皮細胞および壁細胞を含む強固な心筋シートを製造する方法およびそれによって得られた心筋シートを含む心疾患治療剤に関する。したがって、本発明の課題は、人工多能性幹細胞から心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を同時に分化誘導させて、得られた混合細胞から作製した心筋シートを提供することである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、人工多能性幹細胞を、特定の因子を含む培養条件下で培養することにより、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を一定の割合で含む心筋シートが得られることを見出した。さらに、このシートを移植することで、心機能を改善できることを確認した。本発明はそのような知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は：
［１］  人工多能性幹細胞から心筋細胞、内皮細胞および壁細胞から構成される混合細胞を製造する方法であって、下記の工程：
（ａ）人工多能性幹細胞から心筋細胞を製造する工程、および
（ｂ）前記心筋細胞をＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の存在下で培養する工程、
を含む、方法、
［２］  前記ＶＥＧＦの濃度が、５０ｎｇ／ｍＬ以上、１００ｎｇ／ｍＬ以下の範囲である、［１］に記載の方法、
［３］  前記混合細胞において、内皮細胞の含有率が３％以上である、［１］または［２］に記載の方法、
［４］  前記工程（ａ）が２〜１５日間および前記工程（ｂ）が５〜１５日間である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法、
［５］  前記工程（ａ）が５日間および前記工程（ｂ）が１０日間である、［４］に記載の方法、
［６］  前記工程（ａ）が、下記の工程：
（ｉ）人工多能性幹細胞を、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａを含む培地で培養する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）の後、さらに、ＢＭＰ４（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）とｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）とを含む培地で培養する工程、
を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法、
［７］  前記工程（ｉ）が１〜５日間および前記工程（ｉｉ）が１〜１０日間である、［６］に記載の方法、
［８］  前記工程（ｉ）が１日間であり、前記工程（ｉｉ）が４日間である、［７］に記載の方法、
［９］  前記工程（ｂ）で得られた細胞から、ＴＲＡ−１−６０陰性細胞を選択する工程をさらに含む、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法、
［１０］  ［１］〜［９］のいずれかに記載の方法で得られた混合細胞を含む、心疾患治療剤、
［１１］  ［１］〜［９］のいずれかに記載の方法で製造された混合細胞を温度応答性ポリマーを被覆した培養器材を用いて培養する工程を含む、心筋シートを製造する方法、
［１２］  前記シートを積層化する工程をさらに含む、［１１］に記載の方法、
［１３］  前記積層化が３層である、［１２］に記載の方法、
［１４］  前記工程が、混合細胞を血清を含有する培地で培養する工程である、［１１］に記載の方法、
［１５］  前記混合細胞がヒト細胞である、［１］〜［９］および［１１］〜［１４］のいずれかに記載の方法、
［１６］  前記混合細胞がヒト細胞である、［１０］に記載の心疾患治療剤、および
［１７］  ［１１］〜［１５］のいずれかに記載の方法で得られた心筋シートを含む、心疾患治療剤、
を提供するものである。
本発明の方法により、人工多能性幹細胞から、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を一定の割合で含む心筋シートを製造することが可能となる。また、得られた心筋シートを用いて、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症、拡張型心筋症などの心疾患の治療が可能となる。さらに、本発明の方法により得られた心筋シートは、心臓の細胞・組織モデルとして、薬剤の安全性試験や創薬スクリーニングのために使用することができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である米国特許仮出願６１／６１１，３４０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、ヒトｉＰＳ細胞からの分化誘導段階の後期においてＶＥＧＦの存在下で培養することにより同時に分化誘導された心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の細胞構成比を示す。図中、ｃＴｎＴ＋、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎおよびＰＤＧＦＲｂは、それぞれ心筋細胞、内皮細胞および壁細胞のマーカーを示す。
図２は、シート化前（Ｐｒｅ−ｓｈｅｅｔ）およびシート化後（Ｐｏｓｔ−ｓｈｅｅｔ）における心筋細胞（ＣＭ）、内皮細胞（ＥＣ）、壁細胞（ＭＣ）および未分化細胞（Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）の細胞構成比を示す。図中、Ｎはサンプル数を示す。
図３Ａは、ＭＥＤ６４プローブ上に接着されたシート像を示す。図３Ｂは、各電極での細胞外電位を示す。図３Ｃは、図３Ｂで測定した電位の分布を模式的に示す。ｐｅａｋ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌの最も高い電極（図の下部）をゼロ点として、そこから各電極のｐｅａｋ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌへの時間差（秒）にて色分けを行った。下部より上部に向かう伝導を認める。
図４は、ＩｎｄｉｃａｔｏｒとしてＦｌｕｏ８（ナカライテスク）を用いた、緑色の蛍光検出によるカルシウム濃度変化の結果を示す（ＡおよびＢ）。蛍光検出は、ＢＺ−９０００（キーエンス）により行われた。
図５は、細胞シート積層化の方法の模式図を示す。
図６Ａは、積層化後シートの肉眼的所見を示す。図６Ｂは、積層化後シートの光学顕微鏡像を示す。
図７は、移植後４週までの心臓超音波検査の結果を示す。Ａは、左室内径短縮率（ＦＳ）、Ｂは、収縮期壁厚増加率の経時的変化をそれぞれ示す（いずれも収縮能の指標）。Ｃは、非収縮範囲（ＡＬ）の経時的変化を示す（梗塞部位範囲の指標）。Ｄは、左室拡張期の直径（ＬＶＤｄ）の変化を示す（心拡大の指標）。図中、ＰｒｅＭＩ；心筋梗塞前，ＰｒｅＴｘ；治療前，Ｔｘ２ｗ；治療後２週目，Ｔｘ４ｗ；治療後４週目。＊ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ  Ｓｈａｍ／‡Ｐ＜０．００１  ｖｓ  ＰｒｅＭＩ。
図８は、移植後３カ月までの心臓超音波検査の結果を示す。Ａは、左室断面変化率（ＦＡＣ）、Ｂは、収縮期壁厚増加率の経時的変化をそれぞれ示す（いずれも左室収縮能の指標）。Ｃは、非収縮範囲（ＡＬ）の経時的変化を示す（梗塞部位範囲の指標）。Ｄは、左室拡張期の直径の変化を示す（左室拡大の指標）。図中、ＰｒｅＭＩ；心筋梗塞前，ＰｒｅＴｘ；治療前，Ｔｘ１ｍ；治療後１カ月，Ｔｘ２ｍ；治療後２カ月，Ｔｘ３ｍ；治療後３カ月。＊ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ  Ｓｈａｍ。
図９は、大型化させた心筋シートの肉眼的所見を示す。左上が１２ｗｅｌｌで作製したラット移植用の心筋シート、右が大型化させた心筋シート、左下が５００円硬貨を示す。大型化させた心筋シートは、直径約３４ｍｍであった。
図１０は、ＴＲＡ１−６０陽性細胞を除いた細胞をラットへ移植した後の心臓超音波検査の結果を示す。Ａは、左室内径短縮率（ＦＳ）、Ｂは、収縮期壁厚増加率（いずれも収縮能の指標）、Ｃは、非収縮範囲（ＡＬ）（梗塞部位範囲の指標）、Ｄは、左室拡張期の直径化（ＬＶＤｄ）（心拡大の指標）を示す。図中、Ｔｘ（１ｓｔ）：第１世代シート（ＴＲＡ−１−６０陽性細胞の除去工程を含まない方法で作製されたシート）を用いた治療、Ｔｘ（２ｎｄ）：第２世代シート（ＴＲＡ−１−６０陽性細胞の除去工程を含む方法で作製されたシート）を用いた治療。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明を以下において詳細に説明する。
本発明は、上記のとおり、（ａ）人工多能性幹細胞から心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を製造する工程、および（ｂ）当該心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を用いてシートを形成させる工程を含む、人工多能性幹細胞から心筋シートを製造する方法およびこの方法によって得られた心筋シートを含む心疾患の治療剤に関する。
＜人工多能性幹細胞の製造方法＞
本発明において、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ある特定の核初期化物質を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６、Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２、Ｊ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０、Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：１０１−１０６、国際公開ＷＯ  ２００７／０６９６６６および国際公開ＷＯ  ２０１０／０６８９５５）。核初期化物質は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子またはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｋｌｆ４，Ｋｌｆ１，Ｋｌｆ２，Ｋｌｆ５，Ｓｏｘ２，Ｓｏｘ１，Ｓｏｘ３，Ｓｏｘ１５，Ｓｏｘ１７，Ｓｏｘ１８，ｃ−Ｍｙｃ，Ｌ−Ｍｙｃ，Ｎ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴ，ＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＰＶ１６  Ｅ６，ＨＰＶ１６  Ｅ７，Ｂｍｉｌ，Ｌｉｎ２８，Ｌｉｎ２８ｂ，Ｎａｎｏｇ，Ｅｓｒｒｂ，ＥｓｒｒｇまたはＧｌｉｓ１が例示される。これらの初期化物質は、ｉＰＳ細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも１つ、２つもしくは３つ含む組み合わせであり、好ましくは４つを含む組み合わせである。
上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列並びに当該ｃＤＮＡにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、ＷＯ  ２００７／０６９６６６に記載のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓを参照すること、またＬ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｅｓｒｒｂ、ＥｓｒｒｇおよびＧｌｉｓ１のマウスおよびヒトのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列情報については、それぞれ下記ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓを参照することにより取得できる。当業者は、当該ｃＤＮＡ配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
遺伝子名          マウス                    ヒト
Ｌ−Ｍｙｃ        ＮＭ＿００８５０６        ＮＭ＿００１０３３０８１
Ｌｉｎ２８        ＮＭ＿１４５８３３        ＮＭ＿０２４６７４
Ｌｉｎ２８ｂ      ＮＭ＿００１０３１７７２  ＮＭ＿００１００４３１７
Ｅｓｒｒｂ        ＮＭ＿０１１９３４        ＮＭ＿００４４５２
Ｅｓｒｒｇ        ＮＭ＿０１１９３５        ＮＭ＿００１４３８
Ｇｌｉｓ１        ＮＭ＿１４７２２１        ＮＭ＿１４７１９３
これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、ＤＮＡの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Ｐｒｏｃ  Ｊｐｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．８５，３４８−６２，２００９）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭｏＭｕＬＶＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが挙げられる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃ等が挙げられる（Ｋａｊｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ，４５８：７７１−７７５、Ｗｏｌｔｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ，４５８：７６６−７７０、ＷＯ  ２０１０／０１２０７７）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＢＫウイルスおよび牛乳頭腫（Ｂｏｖｉｎｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）の起点とその複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、ＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰもしくはＬａｒｇｅ  ＴおよびＳＶ４０ｏｒｉ配列を含むことが挙げられる（ＷＯ  ２００９／１１５２９５、ＷＯ  ２００９／１５７２０１およびＷＯ  ２００９／１４９２３３）。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、ＩＲＥＳまたは口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域により結合されていてもよい（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８およびＷＯ  ２００９／０９２０４２、ＷＯ  ２００９／１５２５２９）。
核初期化に際して、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ  ２９ｍｅｒ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば５’−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、ＢＩＸ−０１２９４（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８（２００８））等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、Ｇ９ａｓｉＲＮＡ（ｈｕｍａｎ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｇｏｎｉｓｔ（例えばＢａｙｋ８６４４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４（２００８））、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，４７５−４７９（２００８））、Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（例えばｓｏｌｕｂｌｅ  Ｗｎｔ３ａ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５（２００８））、ＬＩＦまたはｂＦＧＦなどの増殖因子、ＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６：８０５−８（２００９））、ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ阻害剤、ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（ＰｌｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６（１０），２２３７−２２４７（２００８））、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５などのｍｉＲＮＡ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９−４６１（２００９））、等を使用することができる。
薬剤によって核初期化物質の内在性のタンパク質の発現を上昇させる方法における薬剤としては、６−ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ、ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−５−ｎｉｔｒｏ−３’−ｏｘｉｍｅ、ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ  、２−（３−（６−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌ−４−ｙｌ）−１，５−ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ  、１−（４−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−（４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２−ｉｍｉｎｏ−３（２Ｈ）−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）ｅｔｈａｎｏｎｅ  ＨＢｒ（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａｌｐｈａ）、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｊ２およびｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２等が例示される（ＷＯ  ２０１０／０６８９５５）。
ｉＰＳ細胞誘導のための培養培地としては、例えば（１）１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培地（これらの培地にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、（２）ｂＦＧＦまたはＳＣＦを含有するＥＳ細胞培養用培地、例えばマウスＥＳ細胞培養用培地（例えばＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）または霊長類ＥＳ細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒト＆サル）ＥＳ細胞用培地（リプロセル、京都、日本）、ｍＴｅＳＲ−１）、などが含まれる。
培養法の例としては、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で体細胞と核初期化物質（ＤＮＡまたはタンパク質）を接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培地で培養し、該接触から約３０〜約４５日またはそれ以上ののちにＥＳ細胞様コロニーを生じさせることができる。また、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、５−１０％と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
あるいは、その代替培養法として、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜約３０日またはそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
本明細書中で使用する「体細胞」は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
本発明において、体細胞を採取する由来となる動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座あるいはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。
＜人工多能性幹細胞から心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を同時に製造する方法＞
本発明において心筋細胞とは、少なくとも心筋トロポニン（ｃＴｎＴ）またはαＭＨＣを発現している細胞を意味する。ｃＴｎＴは、ヒトの場合ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００３６４が例示され、マウスの場合、ＮＭ＿００１１３０１７４が例示される。αＭＨＣは、ヒトの場合ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿００２４７１が例示され、マウスの場合、ＮＭ＿００１１６４１７１が例示される。
本発明において内皮細胞とは、ＰＥ−ＣＡＭ、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎおよびフォン−ウィルブラント因子（ｖＷＦ）のいずれか一つを発現している細胞を意味する。また、壁細胞とは、Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（ＳＭＡ）を発現している細胞を意味する。ここで、ＰＥ−ＣＡＭは、ヒトの場合ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００４４２が例示され、マウスの場合、ＮＭ＿００１０３２３７８が例示される。ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、ヒトの場合ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿００１７９５が例示され、マウスの場合、ＮＭ＿００９８６８が例示される。ｖＷＦは、ヒトの場合ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０００５５２が例示され、マウスの場合、ＮＭ＿００１１７０８が例示される。ＳＭＡは、ヒトの場合ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿００１１４１９４５が例示され、マウスの場合、ＮＭ＿００７３９２が例示される。
本発明は、次の工程により、人工多能性幹細胞から心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を同時に製造することができる；
（ａ）人工多能性幹細胞から心筋細胞を製造する工程、および
（ｂ）前記心筋細胞をＶＥＧＦの存在下で培養する工程。
ここで、人工多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法として、例えばＬａｆｌａｍｍｅ  ＭＡらにより報告された多能性幹細胞を心筋細胞を製造することができる（Ｌａｆｌａｍｍｅ  ＭＡ  ＆  Ｍｕｒｒｙ  ＣＥ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，Ｒｅｖｉｅｗ）。この他にも特に特定されないが、例えば、人工多能性幹細胞を浮遊培養により細胞塊（胚様体）を形成させて心筋細胞を製造する方法、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する物質の存在下で心筋細胞を製造する方法（ＷＯ２００５／０３３２９８）、Ａｃｔｉｖｉｎ  ＡとＢＭＰを順に添加させて心筋細胞を製造する方法（ＷＯ２００７／００２１３６）、カノニカルＷｎｔシグナル経路の活性化を促す物質の存在下で心筋細胞を製造する方法（ＷＯ２００７／１２６０７７）および人工多能性幹細胞からＦｌｋ／ＫＤＲ陽性細胞を単離し、シクロスポリンＡの存在下で心筋細胞を製造する方法（ＷＯ２００９／１１８９２８）が例示される。
本発明はさらに、上記の工程により作製された心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の混合細胞から未分化な細胞を除去する工程を含むことができる。
〔人工多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法〕
本発明では、好ましくは、次の工程による心筋細胞を製造する方法が例示される；
（ｉ）人工多能性幹細胞を、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａを含む培地で培養する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）の後、さらに、ＢＭＰ４とｂＦＧＦとを含む培地で培養する工程。
（ｉ）Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａを含む培地で培養する工程
本工程では、前述のように得られた人工多能性幹細胞を任意の方法で分離し、浮遊培養により培養してもよく、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養してもよい。好ましくは、接着培養である。ここで、分離の方法としては、力学的、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）およびＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離液を用いてもよい。好ましくは、コラゲナーゼ活性のみを有する分離液を用いて解離し、力学的に細かく分離する方法である。ここで、用いる人工多能性幹細胞は、使用したディッシュに対して８０％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを用いることが好ましい。
ここで浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、もしくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
また、接着培養においては、コーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養する。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。より好ましくは、マトリゲルでコーティング処理された培養皿へ人工多能性幹細胞を接着させ、さらにマトリゲルを添加することで、人工多能性幹細胞全体をマトリゲルでコーティングするマトリゲルサンドイッチ法による接着培養である。
本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＲＰＭＩ  １６４０培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２  サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７  サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有しうる。本発明において好ましい増殖因子とは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、ＴＧＦ−β、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＧＤＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦが挙げられる。少なくとも、本工程ではＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（例えば、（組換え）ヒトＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ）を増殖因子として用いることが望ましい。
本発明において好ましい培地として、Ｌ−グルタミン、Ｂ２７  サプリメントおよびＡｃｔｉｖｉｎ  Ａを含有するＲＰＭＩ培地が例示される。
培地に添加されるＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬまたは、２００ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。好ましくは、培地に添加されるＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの濃度は、１００ｎｇ／ｍＬである。
培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。培養時間は、例えば１日から５日間の培養であり、好ましくは１日である。
（ｉｉ）ＢＭＰおよびｂＦＧＦを含む培地で培養する工程
本工程では、前工程が浮遊培養で行われた場合、得られた細胞集団をそのままコーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養してもよい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。または、前工程が接着培養で行われた場合、培地の交換により培養を続けてもよい。
本工程で用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＲＰＭＩ  １６４０培地である。培地には、血清が含まれていないことが望ましい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム含有）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２  サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７  サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有しうる。本発明において好ましい増殖因子とは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、ＴＧＦ−β、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＧＤＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦが挙げられる。少なくとも、本工程ではＢＭＰ４（例えば、（組換え）ヒトＢＭＰ４）およびｂＦＧＦ（例えば、（組換え）ヒトｂＦＧＦ）を増殖因子として用いることが望ましい。
本発明において好ましい培地として、Ｌ−グルタミン、Ｂ２７サプリメント、ＢＭＰ４およびｂＦＧＦを含有するＲＰＭＩ培地が例示される。
培地に添加されるＢＭＰ４の濃度は、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１７．５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬまたは５０ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。好ましくは、培地に添加されるＢＭＰ４の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬである。
培地に添加されるｂＦＧＦの濃度は、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１７．５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬまたは５０ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。好ましくは、培地に添加されるｂＦＧＦの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬである。
培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。培養時間は、例えば１日から１０日間の培養であり、好ましくは４日である。
〔ＶＥＧＦの存在下で心筋細胞を培養する方法〕
本工程では、前述した方法で得られた心筋細胞をさらにＶＥＧＦの存在下で培養することにより、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞が所望の構成比率から成る混合細胞を製造することができる。
例えば、得られた心筋細胞は、前工程が、浮遊培養後の細胞集団の場合、コーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で培養してもよい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。または、本工程では前述の工程で接着培養により得られた細胞を、培地の交換により培養を続けてもよい。
本工程で用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＲＰＭＩ  １６４０培地である。培地には、血清が含まれていないことが望ましい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム含有）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２  サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７  サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有しうる。本発明において好ましい増殖因子とは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、ＴＧＦ−β、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＧＤＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦが挙げられる。少なくとも、本工程ではＶＥＧＦを増殖因子として用いることが望ましい。
本発明において好ましい培地として、Ｌ−グルタミン、Ｂ２７サプリメントおよびＶＥＧＦを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地が例示される。
培地に添加されるＶＥＧＦの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ〜９０ｎｇ／ｍＬまたは６５ｎｇ／ｍＬ〜８５ｎｇ／ｍＬの範囲内であり得る。好ましくは、培地に添加されるＶＥＧＦの濃度は、５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである。また、培地に添加されるＶＥＧＦの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬまたは２００ｎｇ／ｍＬであってもよいがこれらに限定されない。好ましくは、培地に添加されるＶＥＧＦの濃度は、７５ｎｇ／ｍＬである。
培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。培養時間は、例えば４日から２０日間（例えば、５〜１５日間）の培養であり、好ましくは１０日である。
本方法により作製された心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の細胞構成比は、以下のものに限定されないが、心筋細胞４０〜８０％、内皮細胞１〜２０％、壁細胞１〜４０％、未分化細胞０．１〜１０％である。少なくとも、内皮細胞は、３％程度含有していることが好ましい。心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の構成比は、心筋細胞６２．７％、内皮細胞７．９％、壁細胞１８．３％、未分化細胞２．７％の構成比の混合細胞が例示される。本発明による心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の細胞構成比は、ＶＥＧＦの濃度およびその他の種々の培養条件により、任意に変化させることが可能であり、細胞をシート化した際に適度な強度を保つことができる範囲内で任意に変化し得る。
〔未分化な細胞（ＴＲＡ−１−６０陽性細胞）を除去する工程〕
本発明はさらに、上記の工程により作製された心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の混合細胞から未分化な細胞を除去する工程を含むことができる。
本工程は、混合細胞中の心筋細胞、内皮細胞および壁細胞と未分化な細胞を分離し得る任意の方法を採用することができる。心筋細胞、内皮細胞および壁細胞と未分化な細胞の分離は、未分化な細胞の指標をもとに混合細胞から未分化な細胞のみを取り出す方法であってもよく、または心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の指標をもとに混合細胞から心筋細胞、内皮細胞および壁細胞を取り出す方法であってもよい。好ましくは、本工程において前者の方法が用いられる。
未分化な細胞の指標は、例えば、未分化な細胞に特異的に発現している遺伝子またはタンパク質であり得る。これらの遺伝子またはタンパク質は、当分野において十分に知られており（Ｃｅｌｌ．，２００５  Ｓｅｐ  ２３；１２２（６）：９４７−５６，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２００４；２２（１）：５１−６４，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．，２００２  Ａｐｒ；１３（４）：１２７４−８１）、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ（以上、転写因子）、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１（以上、細胞表面抗原）などが挙げられるがこれらに限定されない。本工程における指標は、好ましくは、細胞表面抗原が用いられ、特に好ましくは、ＴＲＡ−１−６０が指標として用いられる。
心筋細胞、内皮細胞および壁細胞それぞれの指標としては、例えば、ｃａｒｄｉａｃｔｒｏｐｏｎｉｎ−Ｔ（ｃＴｎＴ）（心筋細胞）、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（内皮細胞）、ＰＤＧＦＲｂ（壁細胞）などが用いられるがこれらに限定されない。
本工程における未分化な細胞の除去は、上記の指標をもとに、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）などの方法を用いて行われる。好ましくは、ＭＡＣＳが用いられる。
本発明の好ましい態様において、混合細胞から未分化な細胞を除去する工程は、ＴＲＡ−１−６０抗体により未分化な細胞を捕捉し、捕捉した未分化な細胞（ＴＲＡ−１−６０陽性細胞）を免疫磁性的な方法（ＭＡＣＳ）で除去することにより行われる。
未分化な細胞を除去する工程を行った後の混合細胞は、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞のみで構成されていてもよく、または心筋細胞、内皮細胞および壁細胞に加えて任意の細胞が含まれていてもよい。任意の細胞の中には、未分化な細胞が含まれていることもあり得る。
＜心筋シートを製造する方法＞
本発明において、心筋シートとは、心臓または血管を形成する各種細胞から成り、細胞間結合により細胞同士が連結されたシート状の細胞集合体を意味する。ここで、心臓または血管を形成する各種細胞とは上述の心筋細胞、内皮細胞および壁細胞が例示される。
本発明において好ましい心筋シートは、自己拍動しており、細胞間の電気的結合および配向性を有しており、拍動に応答して一様なカルシウムイオン濃度勾配の変化を有する。
心筋シートは、少なくとも、上述の方法で同時に作製された心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の混合細胞をさらに培養することによって製造される。
上記培養には、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（特開２０１０−２５５００１）、又はビニルエーテル誘導体を重合させた温度応答性ポリマーを被覆した培養器材を用いてもよく、好ましくは、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを固定した培養器材である。尚、本培養器材は、ＵｐＣｅｌｌとしてＷＡＫＯ社より購入することもできる。
上記培養に用いられる培養器材は、さらに任意のコーティング剤によりコーティング処理されていてもよい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、ゼラチンである。
本工程で用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、αＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ  １６４０培地である。培地には、血清が含まれていることが望ましいが、必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム含有）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素などに代替されてもよい。本培地には、さらに、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有しうる。本発明において好ましい増殖因子とは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、ＴＧＦ−β、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＧＤＦ、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦが挙げられる。少なくとも、本工程ではＶＥＧＦを増殖因子として用いることが望ましい。さらに、低分子化合物として、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤が例示される。
ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６−９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３−２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Ｕｅｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９９０−９９４（１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例えば、Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５−２３２（２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９−３２４（２００３）参照）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物またはそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。
本発明において好ましい培地として、血清、Ｙ−２７６３２およびＶＥＧＦを含有するαＭＥＭ培地または血清およびＶＥＧＦを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地が例示される。
本工程において、培養に供する各細胞の細胞数は、所望のシートの大きさによって適宜変更できるが、例えば１×１０４〜１×１０８であるが、心筋シートの大きさは培養器材に依拠して変化させることができる。また、培養日数は、１日から１０日でよく、好ましくは４日である。
上述の方法で同時に作製された心筋シートに含有される心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の細胞構成比はシートの形成前後で変化していても良く、前記構成比は、以下のものに限定されないが、心筋細胞３０〜７０％、内皮細胞０．１〜２０％、壁細胞１〜４０％、未分化細胞０．１〜１０％である。例えば、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の構成比は、心筋細胞４７．０％、内皮細胞４．１％、壁細胞２２．５％、未分化細胞２．２％である。
心筋シート製造のための培養において、心筋シート移植後の腫瘍の形成を防ぐ目的で多能性を保持している未分化細胞を除外して培養することが望まれる。多能性を保持している未分化細胞は、例えば、ＮａｎｏｇまたはＯｃｔ３／４により認識することが可能である。
作製した心筋シートは、積層化して用いても良く、好ましくは、３層重ねた心筋シートである。積層化は、心筋シートを培養液中で重ねた（好ましくは、各心筋シートをずらして重ねた）後、培養液を除去する事によって接合させることができる。複数枚重ねる場合は、一度に同作業を行っても良く、好ましくは、１層ごとに同作業を行う。
＜心疾患の治療＞
上記方法でえられた心筋細胞、内皮細胞および壁細胞から構成される混合細胞および心筋シートは、動物（好ましくはヒト）の心疾患の治療剤として用いることができる。心疾患の治療方法は、混合細胞である場合、直接心臓の心筋層へ投与してもよい。この時、細胞単体で投与してもよく、好ましくは、生着を促すような足場材と共に投与され得る。ここで足場材とは、コラーゲンなどの生体由来の成分やこれに代替するポリ乳酸などの合成ポリマーが例示されるが、これらに限定されない。心筋シートを投与する場合、所望の部分を覆うように配置することによって達成される。ここで、所望の部分を覆うように配置することは、当該分野において周知技術を用いて行うことができる。配置に際し、所望の部分が大きい場合は、組織を取り巻くように配置してもよい。また、投与は、所望の効果を得るため、同部分へ数回の配置を行うこともできる。数回の配置を行う場合、所望の細胞が組織へ生着し、血管新生を行うために十分な時間をおいて行うことが望ましい。このような心疾患の治療の機序は、心筋シートの生着により生じる効果であってもよく、あるいは細胞の生着によらない間接的な作用（例えば、誘引物質を分泌することによるレシピエント由来細胞の損傷部位への動員による効果）であってもよい。
本発明における心筋シートは、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞に加えて、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞足場材料（スキャホールド）を含んでいてもよい。あるいは、本発明における心筋シートは、心筋細胞、内皮細胞および壁細胞以外の任意の細胞（複数も可）を含んでいてもよい。
心疾患の治療において用いられる前記混合細胞または心筋シートは、疾患の対象となる動物種、疾患の治療部位の大きさ、疾患の治療方法などに応じて任意の細胞数もしくは任意の大きさまたは数のシートを用いることができる。一般には、動物種や個体の大きさの巨大化に伴い、治療のために必要とされる細胞数の増加もしくは心筋シートのサイズの大型化またはシート数の増加がなされる。
本発明において治療される心疾患は、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症、拡張型心筋症などの疾患または障害による欠損等が挙げられるがこれらに限定されない。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０００８】
〔実施例１：ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞、内皮細胞および壁細胞への分化誘導〕
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ６）は、京都大学の山中教授より受領し、以前に報告された方法（Ｕｏｓａｋｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１；６：ｅ２３６５７）と同様の方法を用いて維持培養を行った。詳細には、次のとおりである。未分化ｈｉＰＳ細胞を、マトリゲル（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ，１：６０希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングされたＦＡＬＣＯＮ培養皿（１０ｃｍ）に播種し、マウス胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）からのｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ（培養上清）（ＭＥＦ−ＣＭ）に４ｎｇ／ｍＬのヒトｂＦＧＦ（ｈｂＦＧＦ，ＷＡＫＯ）を添加した培地を用いて培養維持を行った。この際、１０ｃｍ  ｄｉｓｈに対して１０ｍｌの培地を使用した。Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍの基礎培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）４７１ｍＬ，Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）１２０ｍＬ，ＮＥＡＡ  ６ｍＬ，２００ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ３ｍＬ，５５ｍＭ  ２−ＭＥ（メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ），４ｎｇ／ｍｌ  ｈｂＦＧＦ）を混合することにより作製された。ＭＥＦは、Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ−Ｃ（ＭＭＣ）（ＷＡＫＯ）により２．５時間処理されたものを用いた。
４−６日毎に、ＣＴＫ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１％  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ，０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ，２０％  ＫＳＲ，および１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ））を用いて細胞コロニーを剥離し、セルストレーナーでｓｍａｌｌ  ｃｌｕｍｐの状態にして継代培養した。
続いて、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃で３−５分間インキュベートすることにより、ｈｉＰＳ細胞を培養皿から剥離した。Ｖｅｒｓｅｎｅを吸引した後、ＭＥＦ−ＣＭにてピペッティングし、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌにて回収した後、遠心分離して細胞数をカウントした。１００，０００細胞／ｃｍ２をマトリゲルでコーティングした６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種した。培地としては、４ｎｇ／ｍＬ  ｈｂＦＧＦ添加したＭＥＦ−ＣＭ（６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに対し５ｍｌ）を用いた。培地の交換なしに２−３日間培養し、コンフルエントになった段階で、マトリゲル（１：６０希釈）および４ｎｇ／ｍＬ  ｈｂＦＧＦを含んだＭＥＦ−ＣＭで培地交換を行った（マトリゲルサンドイッチ）。
２４時間後に、心筋細胞を分化誘導するために、１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（ＡｃｔＡ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地（ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ），２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｘ１  Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ（ＧＩＢＣＯ））に交換した（この日を分化誘導０日目とする）。２４時間の培養後、１０ｎｇ／ｍＬ  ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＢＭＰ４；Ｒ＆Ｄ）と１０ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地に交換した（１日目）。４日間の培養後、内皮細胞および壁細胞をさらに誘導するため３種の濃度（０、５０または１００ｎｇ／ｍｌ）のＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ，ＷＡＫＯ）を添加したＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地に交換した（５日目）。２日おきに同様の培地にて培地交換を行い、１０日間の培養後、ＡｃｃｕＭａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞を回収し、一部をＦＡＣＳ解析に用いた（１５日目）。
ＦＡＣＳによる解析には、下記の抗体を用いた。
Ａ）心筋細胞に対しては、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ−Ｔ（ｃＴｎＴ）（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）（Ｚｅｎｏｎ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８にて標識したものを使用）；
Ｂ）内皮細胞に対しては、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）；および
Ｃ）壁細胞に対しては、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＰＤＧＦＲｂ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）。
その結果、細胞構成比は、（１）０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦの場合：０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦの場合心筋細胞（ＣＭ）：５５．７％，内皮細胞（ＥＣ）：０．４％，壁細胞（ＭＣ）：３４．４％、（２）５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦの場合：ＣＭ：５４．１％，ＥＣ：１３．４％，ＭＣ：１６．９％、および（３）１００ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦの場合；ＣＭ：３５．７％，ＥＣ：２７．４％，ＭＣ：１８．０％であることが示された（図１）。
〔実施例２：心筋シートの作製〕
実施例１の方法により作製された心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の混合細胞（１，０００，０００細胞／ｗｅｌｌ）を、５０ｎＭ  ＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ，ＷＡＫＯ）と１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｒｏｃｋｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＷＡＫＯ）を添加した１ｍｌのａＭＥＭ＋ＦＢＳ培地（ａｌｐｈａ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ），１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および５．５ｍＭ  ２−ＭＥ）中、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）コートした温度感受性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ，ＷＡＫＯ）１２−ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ上に播種し、３７℃にて培養した。培養２日後、培地を５０ｎＭ  ＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ，ＷＡＫＯ）を添加したＲＰＭＩ＋ＦＢＳ培地（ＲＰＭＩ  １６４０，Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅおよび１０％ＦＢＳ）に交換した。さらに２日間の培養後、ＵｐＣｅｌｌを３７℃から室温にもどすことにより、細胞をシート状に剥離させ、心筋シートを得た。
〔実施例３：心筋シートの細胞構成〕
実施例２の方法により作製された心筋シートを用いてＦＡＣＳ解析を行った。解析には、下記の抗体を用いた。
Ａ）心筋細胞に対しては、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ−Ｔ（ｃＴｎＴ）（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）（Ｚｅｎｏｎ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８にて標識したものを使用）；
Ｂ）内皮細胞に対しては、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）；
Ｃ）壁細胞に対しては、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＰＤＧＦＲｂ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）；および
Ｄ）未分化細胞に対しては、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＲＡ１−６０−ＦＴＴＣ（ＢＤ）。
シート化前の細胞（ＵｐＣｅｌｌに播種する直前の細胞：Ｐｒｅ−ｓｈｅｅｔ）およびシート化後の細胞（４日間の心筋シート作製工程を経て作製された心筋シートの回収直後の細胞：Ｐｏｓｔ−ｓｈｅｅｔ）を用いて各々ＦＡＣＳ解析を行った。その結果、シート化前の細胞構成比は、ＣＭ：６２．７±１１．７％，ＥＣ：７．９±４．９％，ＭＣ：１８．３±１１．０％および未分化細胞（Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）：２．７±１．３であったが、シート化後では、ＣＭ：４７．０±１５．９％，ＥＣ：４．１±３．７％，ＭＣ：２２．５±１５．７％およびＵｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ：２．２±１．１であることが示された（図２）。
〔実施例４：心筋シートの電気生理学的評価〕
電気生理学的評価を行うため、０．１％ゼラチンにてコーティングした電極付き培養皿（ＭＥＤ６４  ｓｙｓｔｅｍ，アルファメッド・サイエンス）の電極上に、上記方法により作製した心筋シートを静置した。続いて、培地を吸引することで電極とシートを固定した後、ゆっくり培地を加え、培養継続した。２日後、それぞれの電極の電位を測定することにより、シート上での電位の伝導を記録した。その結果を図３に示す。細胞外電位測定により、拍動が電気的に連続して一方向性に伝導することを確認した。また、不整脈の誘因となりうる不規則で周囲との同期を認めないような異常電位発生部位は観察されなかった。
〔実施例５：心筋シートのカルシウム濃度変化による評価〕
カルシウム濃度変化による評価を行うために、実施例４と同様の方法で心筋シートをＦＡＬＣＯＮ培養皿上に固定させ、培養を継続した。培養の２日後に、最終５μＭの濃度になるようにＦｌｕｏ８（ナカライテスク）を溶解させた培地へ交換した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、ＰＢＳにて２回洗浄し、Ｆｌｕｏ８を含まない培地を入れた。ＢＺ−９０００（キーエンス）にて、蛍光を検出することでカルシウム濃度変化を測定したところ、自己拍動に沿って一様な濃度勾配の変化が観察された（図４）。
〔実施例６：心筋シートの積層化〕
ゼラチンにてコーティングしたディッシュ上に、実施例１および２の方法で作製した心筋シートを広げて静置し、培地を吸引し培養皿とシートを固定後、培地を加えて３７℃にて３０分インキュベートした。別の心筋シートを広げてディッシュに固定したシートの上へ静置し、培地を吸引して積層させた。同様の工程を３層分繰り返し、２，３層目は元のシートから少しずつ位置をずらして積層化させた。その後、ピペットマンを用いて培養皿底面を沿わせるように培地を流し、積層化された細胞シートを培養皿からはがした（図５および６）。
〔実施例７：疾患モデルラットに対する心筋シート移植および心機能評価〕
１０−１３週齢、２５０〜３３０ｇの無胸腺免疫不全ラット（Ｆ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ）（日本クレア）より次の方法で亜急性期心筋梗塞（ＭＩ）モデルを作成した。当該ラットをラット用人工呼吸器にて呼吸管理し、イソフルラン吸引により麻酔した。続いて、少量の酸素による人工呼吸下で左肋間開胸による心膜切開より心臓を露出後、前下行枝を第一中隔枝末梢で６−０ポリプロピレン糸にて結紮した。末梢灌流領域の収縮低下および色調変化を確認（それらを認めない場合再度結紮を施行）した後、４−０ポリプロピレン糸にて閉創した。６日後に心臓超音波検査（Ｖｉｖｉｄ７，ＧＥ横河メディカル）にてＭＩの有無を確認した。左室内径短縮率（ＦＳ）が４０％を超えるものは不適モデルとして除外した。このようにＭＩ導入後７日目に、上記の方法において作製した３枚の心筋シートを積層化して用いた。移植は、ＭＩモデルラットに対しジエチルエーテルにて麻酔導入後、ラット用人工呼吸器にて呼吸管理し、イソフルランにて麻酔を維持した。左肋間開胸にて開胸、肺・胸壁との癒着を慎重に剥離し心筋梗塞部を露出させ、積層化心筋シートを梗塞部に移植した。１５分静置ののち４−０ポリプロピレン糸にて閉創した。Ｓｈａｍ手術群に対しては心筋梗塞部露出を同様に行い、１５分後に同様に閉創した。
移植後４週および３カ月に心臓超音波検査により心機能を測定した。治療群とＳｈａｍ群についてそれぞれ評価し比較した（移植後４週：ｎ＝２０（治療群）／１８（Ｓｈａｍ群）、移植後３カ月：ｎ＝１１（治療群）／８（Ｓｈａｍ群））。
心臓超音波検査は次の方法で行った。ジエチルエーテルにて麻酔導入後、ラット用人工呼吸器にて呼吸管理し、イソフルランにてＲＲ間隔１２０〜２００ｍｓｅｃになるような深度で麻酔を維持した。続いて、１０Ｓ  プローブ（４．０〜１１．０ＭＨｚ）を用いて測定した。Ｍモードにて拡張期および収縮期の中隔径、左室内腔径、後壁径を測定し、左室内径短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ；ＦＳ）および収縮期壁厚増加率（ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ）を計算した。Ｂモードにて拡張期および収縮期の左室内腔面積および左室周囲長を測定し、左室断面積変化率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ａｒｅａ  ｃｈａｎｇｅ；ＦＡＣ）および非収縮範囲（ａｋｉｎｅｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ；ＡＬ）を計算した。測定時には、人工呼吸を停止し、呼吸によるバイアスを除いた。その結果、左室収縮能を示すＦＳ，ＦＡＣおよびｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇは、治療群において、治療後４週および３カ月で治療前に比べ改善を認め、Ｓｈａｍ群に比べ有意に高値であることが示された。またＡＬで示される梗塞範囲についても治療前に比べ４週および３カ月で縮小し、Ｓｈａｍ群と比較して有意に限定されていた。左室拡張期の直径については、４週の段階でＳｈａｍ群は治療群に対して有意に左室拡大を認めた（図７および８）。
〔実施例８：大型シートの作製〕
実施例１の方法により作製された心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の混合細胞（８，０００，０００−１０，０００，０００細胞／ｗｅｌｌ）を、５０ｎＭ  ＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ，ＷＡＫＯ）と１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｒｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＷＡＫＯ）を添加した１７ｍＬのａＭＥＭ＋ＦＢＳ培地（ａｌｐｈａ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ），１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および５．５ｍＭ  ２−ＭＥ）中、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）コートした温度感受性培養皿（１０ｃｍ  ＵｐＣｅｌｌ  ｄｉｓｈ，ＷＡＫＯ）上に播種し、３７℃にて培養した。培養の２日後、培地を５０ｎＭ  ＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ，ＷＡＫＯ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０＋Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋１０％  ＦＢＳ培地に交換した。さらに２日間の培養後、ＵｐＣｅｌｌを３７℃から室温にもどすことにより、細胞をシート状に剥離させ、大型心筋シートを得た。
〔実施例９：混合細胞からのＴＲＡ−１−６０陽性細胞の除去〕
実施例１の方法により得られた１５日目の心筋細胞、内皮細胞および壁細胞の混合細胞を、ＡｃｃｕＭａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて回収した。回収した細胞にＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＴＲＡ−１−６０−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ）を加えて、室温にて２０分間インキュベートした。続いて、Ａｎｔｉ−ＦＩＴＣ  ＭＡＣＳ  ｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を加えて、４℃にて２０分間インキュベートした。洗浄後、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ｄｅｐ１０２５モードにてＴＲＡ−１−６０陽性細胞を免疫磁性的に除去した。ＴＲＡ−１−６０陰性細胞の回収率を表１に示す。
【表１】
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〔実施例１０：心筋シートの作製〕
実施例９の方法により作製されたＴＲＡ−１−６０陽性細胞除去後の混合細胞（１，０００，０００細胞／ｗｅｌｌ）を用いて、実施例２と同様の方法により、心筋シートを作製した。
〔実施例１１：疾患モデルラットに対する心筋シート移植および心機能評価〕
実施例７と同様の方法により、実施例１０の方法により作製された心筋シートの疾患モデルラットへの移植後の心機能を評価した。心機能は、左室内径短縮率（ＦＳ）、収縮期壁厚増加率、非収縮範囲（ＡＬ）、左室拡張期の直径（ＬＶＤｄ）についてそれぞれ評価した。結果を図１０に示す。
この結果、実施例１０の方法により作製された心筋シートは、疾患モデルラットへの移植後２週間で心機能の回復を認め、以後４週間においてもその効果を認めた。また、この４週後までの観察において、腫瘍の形成は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明の心筋シートは、それを患者の心疾患患部に移植することによって、正常な心筋細胞が増殖するとともに、血流を伴った血管新生をも促進することができる。このことから、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症、拡張型心筋症などの心疾患の治療のための再生医療に本発明の心筋シートを使用することができる。また、本発明の心筋シートは、心臓の細胞・組織モデルとして、薬剤の安全性試験や創薬スクリーニングのために使用することもできる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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