(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）３５℃を超え、９５℃以下の温度で固体から液体に転移し、冷却すると固体又は半固体構造に転移する、スキャホールド形成物質から形成されたマトリックスを含むスキャホールド；
（ｂ）染料物質と結合した粘土鉱物を含む染料複合体であって、前記染料物質は、微生物の存在下に、検出可能なシグナルをもたらし、前記染料複合体は、前記スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体
を含むバイオセンサー。
【請求項２】
染料複合体が、前記スキャホールドの細孔中に少なくとも部分的に埋め込まれている、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
染料物質が、発色団又はフルオロフォアから選択される、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
アルカノールをさらに含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
アルカノールがエタノールである、請求項１から４までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
ポリマー物質が、多糖、ケイ素系ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド又はポリアミドからなる群から選択される、請求項１から５までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
ポリマー物質が、寒天、キトサン、セルロース、アラビノキシラン、デンプン、グリコーゲン及びキチンからなる群から選択される多糖を含む、請求項６に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
多糖が寒天である、請求項７に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
染料物質が、微生物の代謝産物の存在に応答する、請求項１から８までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
染料物質が、微生物の代謝産物の存在下で化学変化を受ける、請求項９に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
染料物質が、テトラゾリウム化合物のファミリーに属する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
染料物質が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（レッドテトラゾリウム）、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリド（テトラゾリウムバイオレット）、３，３’−（４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ネオテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ブルーテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ニトロブルーテトラゾリウム）、又は３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４−４’ビフェニレン）ビス［２，５−ビス（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（テトラニトロブルーテトラゾリウム）からなる群から選択されるテトラゾリウム化合物である、請求項１１に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
テトラゾリウム化合物が、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリドである、請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
粘土鉱物が、カオリン、スメクタイト、イリテム（Ｉｌｌｉｔｅｍ）緑泥石、海泡石及びアタパルジャイトからなる群から選択される、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
粘土鉱物がカオリンである、請求項１４に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
粘土鉱物と染料物質の間の結合が、非共有結合性化学結合を含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
染料複合体が３００ｇ／モルから１５００ｇ／モルの範囲の分子量を有する、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
染料複合体の埋め込みが、染料物質の少なくとも一部がポリマースキャホールドの外に露出したままであるような、前記ポリマースキャホールドの細孔中への前記複合体の物理的な取り込みを含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
上表面及び底表面を有する積層物の形態にあり、染料物質が少なくとも前記上表面において露出している、請求項１８に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
容器中に懸濁された粒子状物質の形態にあり、染料物質が粒子状物質の外側表面に露出している、請求項１９に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
（ａ）微生物の存在下に、検出可能なシグナルをもたらす、粘土鉱物及び染料物質を含む染料複合体を、３５℃を超え、９５℃以下の温度で固体から液体に転移し、冷却すると固体又は半固体構造に転移するスキャホールド形成物質と混合するステップであって、染料複合体及びスキャホールド形成物質が水性流体混合物の状態にある温度で混合するステップと、
（ｂ）前記流体混合物に非電解質試薬を添加するステップと、
（ｃ）前記非電解質試薬との前記流体混合物を、混合物が固体又は半固体に転移する温度まで冷却するステップと
を含み、それによって、スキャホールド、及び前記スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている前記染料複合体を含むバイオセンサーが形成される、バイオセンサーを調製するための方法。
【請求項２２】
染料複合体がスキャホールドの細孔中に少なくとも部分的に埋め込まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
染料複合体が、染料物質を粘土鉱物と、前記染料物質と前記粘土鉱物の間における非共有結合を可能にする条件下で混合することによって形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
染料物質と粘土鉱物の間の混合が、４から６の範囲のｐＨにおいてである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｐＨが４．５±０．５である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
粘土鉱物が、カオリン、スメクタイト、イリテム（Ｉｌｌｉｔｅｍ）緑泥石、海泡石及びアタパルジャイトからなる群から選択される、請求項２１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
粘土鉱物がカオリンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
染料物質が、発色団及びフルオロフォアから選択される、請求項２１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
染料物質が、テトラゾリウム化合物のファミリーに属する、請求項２１から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
染料物質が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（レッドテトラゾリウム）、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリド（テトラゾリウムバイオレット）、３，３’−（４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ネオテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ブルーテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ニトロブルーテトラゾリウム）、又は３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４−４’ビフェニレン）ビス［２，５−ビス（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（テトラニトロブルーテトラゾリウム）からなる群から選択されるテトラゾリウム化合物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
テトラゾリウム化合物が、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
染料複合体及びスキャホールド形成物質が、３５℃から９５℃の範囲の温度で混合される、請求項２１から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
スキャホールド形成物質と染料複合体の混合物が、４：１の化学量論比である、請求項２１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
非電解質試薬がアルカノールである、請求項２１から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
アルカノールがエタノールである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
非電解質との混合物が、１０℃〜３５℃の範囲の温度まで冷却される、請求項２１から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
スキャホールド形成物質が、多糖、ケイ素系ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド又はポリアミドからなる群から選択される、請求項２１から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ポリマースキャホールドが、寒天、キトサン、セルロース、アラビノキシラン、デンプン、グリコーゲン又はキチンからなる群から選択される多糖を含む、請求項２１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
多糖が寒天である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）カオリン及びテトラゾリウムバイオレットを含む染料複合体を寒天と、前記染料複合体及び前記寒天を水性流体の形態に維持する、３５℃から８５℃の範囲の温度で混合するステップと、
（ｂ）前記混合物にエタノールを添加するステップと、
（ｃ）エタノールとの前記混合物を２０℃〜２５℃の範囲の温度まで冷却するステップと
を含み、それによって、寒天中に少なくとも部分的に埋め込まれている前記染料複合体を含むバイオセンサーが形成される、バイオセンサーを調製するための方法。
【請求項４１】
流体連通している、少なくとも１個の流体流入口及び少なくとも１個の流体流出口；
前記少なくとも１個の流体流入口と前記少なくとも１個の流体流出口の間に位置するバイオセンシングチャンバーであって、それによって、流体が、前記流体流入口から前記バイオセンサーチャンバー上に層流の状態で供給され、前記チャンバーから流体流出口を通して排出され、前記バイオセンシングチャンバーは、
（ｉ）３５℃を超え、９５℃以下の温度で固体から液体に転移し、冷却すると固体又は半固体構造に転移するスキャホールド形成物質から形成されたマトリックスを含むスキャホールド；
（ｉｉ）粘土鉱物及び染料物質を含む染料複合体であって、前記染料物質は、微生物の存在下に、検出可能なシグナルをもたらす、上記染料複合体
を含み、前記染料物質は、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている、バイオセンサーを含む上記バイオセンシングチャンバー
を含む装置。
【請求項４２】
流入口の後、かつバイオセンシングチャンバーの前にある流体ダンピングベイスンであって、バイオセンサー上の流体の層流を可能にするように構成された上記流体ダンピングベイスンを含む、請求項４１に記載の装置。
【請求項４３】
温度制御ユニットを含む、請求項４１又は４２に記載の装置。
【請求項４４】
シグナル検出ユニットを含む、請求項４１から４３までのいずれか一項に記載の装置。
【請求項４５】
バイオセンサーが、請求項１から２０までのいずれか一項に記載されたものである、請求項４１から４４までのいずれか一項に記載の装置。
【請求項４６】
染料物質が、発色団又はフルオロフォアから選択される、請求項４１から４５までのいずれか一項に記載の装置。
【請求項４７】
（ａ）水性流体流動システムからの水性流体試料を、
（ｉ）３５℃を超え、９５℃以下の温度で固体から液体に転移し、冷却すると固体又は半固体構造に転移するスキャホールド形成物質から形成されたマトリックスを含むスキャホールド；
（ｉｉ）粘土鉱物及び染料物質を含む染料複合体であって、前記染料物質は、微生物の存在下に、検出可能なシグナルをもたらし、前記スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体
を含むバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｂ）前記微生物の存在と関連する、前記バイオセンサーにおけるシグナル強度であって、前記流体流動システムの生物付着を形成する可能性と相関する上記シグナル強度を検出するステップと
を含む、流体流動システム中の生物付着を予測するための方法。
【請求項４８】
接触させることが、バイオセンサー上の水性流体試料の層流を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
接触させることが、１５℃から３５℃の範囲の温度においてである、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
層流が、３００から２，０００の間のレイノルズ数によって特徴付けられる、請求項４７から４９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
水性流体試料が水である、請求項４７から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
シグナル強度が、予め決定された生物付着指数と比較される、請求項４７から５１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
シグナル強度が定量的に測定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
バイオセンサーが、請求項１から２０までのいずれか一項に記載されたものである、請求項４７から５３までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般に生物付着（biofouling）に関し、詳細には、脱塩システム等の流体システムにおける生物付着を予測し、低減させるための方法及びデバイスに関する。
本発明の背景
膜、パイプ、冷却塔及び他の水が接触する表面の生物付着の問題は、水関連プロセス及びシステム、特に水の脱塩プロセスにおいて継続中の問題である。
膜表面上の生物付着の発生は、逆浸透（ＲＯ）技術に基づく、特に二次処理後の処理された廃水の脱塩のための脱塩プラントの操作における重大な問題の１つをもたらす。
膜上の生物付着の層は、流入圧力の増加、生成物流量の低下、及び供給側と濃縮側の間の膜の表面における圧力低下を引き起こす。これらの変化は、脱塩施設の生産の低下、エネルギー消費量の増加及び生物付着層を除去するために膜の頻繁な化学的清浄化の必要性をもたらす。
【０００２】
生物付着の発生は、供給水中に見られる微生物の膜表面上での吸着及び増殖に起因する。
生物付着の予測にいくつかの方法が利用可能であり、ＡＯＣ（同化性有機炭素）、ＢＤＯＭ（生分解性溶解有機物質）ＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）、ＤＯＣ（溶解有機炭素）、ＴＢＣ（総微生物数）、ＴＯＣ（総有機炭素）を包含する実験室試験が利用可能である。実地試験に関しては、ほとんどの測定法が測定表面における生物膜の成長に基づくものである。いくつかの市販の生物膜同定キットが入手可能であり、これらは、生物膜の存在を検出する；これらの中で最も一般的なものは、生物学的活性反応試験（ＢＡＲＴ）キット又はＨｙｄｒｏＢｉｏ  Ｔｅｓｔキットである。
【０００３】
微生物を検出するための染料も記載されている。［Ｔｕｒｎｅｒ  Ｎｉｋｋｉ，Ｗ．Ｅ．Ｓａｎｄｉｎｅ，Ｐ．Ｒ．Ｅｌｌｉｋｅｒ、ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｄａｙ、「乳酸連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｌａｃｔｉｓ）及びストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の分化のための寒天培地中のテトラゾリウム染料の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｄｙｅｓ  ｉｎ  ａｎ  Ａｇａｒ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｌａｃｔｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｃｒｅｍｏｒｉｓ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４６：３８０−３８５（１９６３）；Ｈａｙａｓｈｉ  Ｓｈｕｈｅｉ，Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ａｎｄ  Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｈｏｎｄａ、「有機溶媒耐性細菌をスクリーニングするためのテトラゾリウムバイオレット着色法を用いた単純で迅速な細胞増殖アッセイ（Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｖｉｏｌｅｔ  ｃｏｌｏｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９６（４）：３６０−３６３（２００３）］。
本開示の概要
【０００４】
一側面によれば、本開示は、スキャホールド、及び染料物質と結合した粘土物質を含む染料複合体であって、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体を含むバイオセンサーを提供する。
さらに他の側面において、本開示は、（ｉ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体をスキャホールド形成物質と、染料複合体及びスキャホールド形成物質が水性流体混合物の状態にある温度で混合するステップと；（ｉｉ）当該流体混合物に非電解質試薬を添加するステップと；（ｉｉｉ）非電解質試薬との流体混合物を、混合物が凝固する温度まで冷却するステップを含み、それによって、スキャホールド及びスキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている染料複合体を含むバイオセンサーが形成される、バイオセンサーを調製するための方法を提供する。
さらに他の側面において、本開示は、流体連通している、少なくとも１個の流体流入口及び少なくとも１個の流体流出口；流体流入口と流体流出口の間に位置するバイオセンシングチャンバーであって、（ｉ）スキャホールド並びに（ｉｉ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体であって、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体を含むバイオセンサーを含む上記バイオセンシングチャンバーを含む装置を提供する。
【０００５】
別の態様では、本開示は、
（ａ）水性流体試験試料を、（ｉ）スキャホールド、並びに（ｉｉ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体であって、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体を含むバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｂ）水性流体試験試料中に微生物が存在することを示す、バイオセンサーのシグナル強度を検出するステップと
を含む、水性流体試験試料中の生存可能な微生物を検出するための方法を提供する。
さらに別の側面において、本開示は、
（ａ）水性流体流動システムからの水性流体試料を、（ｉ）スキャホールド、並びに（ｉｉ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体であって、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体を含むバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｂ）流体流動システムの生物付着を形成する可能性と相関する、バイオセンサーのシグナル強度を検出するステップと
を含む、流体流動システム中の生物付着を予測するための方法を提供する。
他の側面によれば、本開示は、
（ａ）１種又は２種以上の水性流体の試料を、１種又は２種以上の異なる濃度の殺菌剤と接触させるステップと、
（ｂ）殺菌剤を含有する１種又は２種以上の試料のそれぞれを、（ｉ）スキャホールド、並びに（ｉｉ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体であって、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体を含むバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｃ）１種又は２種以上の試料のそれぞれに対して、バイオセンサーのシグナル強度を検出するステップと、
（ｄ）シグナル強度が、前記水性流体に対して又は前記殺菌剤に対して有効な処理であると決定された範囲内にある試料を選択するステップであって、選択された試料に添加された殺菌剤の濃度が、水性流体を殺菌するのに有効な濃度である上記ステップと
を含む、水性流体を殺菌するのに必要な殺菌剤の濃度を決定するための方法を提供する。
【０００６】
本発明を理解し、実際にそれがいかに実施し得るかを確認するために、態様を付随の図面を参照して、非限定的な例にすぎないものとして説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の態様によるバイオセンシング装置（１０）の概略的横断面図である。
【図２】本発明の態様によるバイオセンサーを用いて決定した、３つの異なる（逆浸透脱塩システムにおける、ステージＩ、ステージＩＩ及びステージＩＩＩへの）供給水に対する生物膜指数を示すグラフである。
【図３】１５日後に逆浸透（ＲＯ）膜上で成長した生物膜の、３つの異なる（ステージＩ、ステージＩＩ及びステージＩＩＩへの）供給水ステージに対する生物体積（単位μｍ３）を示すグラフであり、生物体積は共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）で測定した。
【図４】水中の総塩素濃度の関数としての生物付着指数を示すグラフである。
【図５】クロラミンを有していないステージＩへの供給水（供給水Ｉ）、及びクロラミンを有するステージＩへの供給水（供給水Ｉ＋ＣＡ）に対する、１５日後にＲＯ膜上で成長した生物膜の、ＣＬＳＭで測定した生物体積を示すグラフである。
【図６】１５日後に、ステージＩへの供給水（供給水Ｉ）、及びクロラミンを有するステージＩへの供給水（供給水Ｉ＋ＣＡ）によりＲＯ膜上で成長した生物膜の、ＣＬＳＭで測定した厚さを示すグラフである。
【図７】バイオセンサー試験で決定された低添加量のクロラミンを有するパイロットプラントに対する、操作時間の関数としての正規化された透過流量を示すグラフである。詳細な態様の説明
【０００８】
本開示は、流動液体中の少量の微生物であっても検出を可能にする固定されたバイオセンシング材料の開発に基づいている。バイオセンシング材料は、このようにして流体連通システムに組み込まれて、生物付着の予測を可能にし、それによって、生物付着生成の結果としての膜の目詰まりを防止する。
本開示は、生物付着生成の可能性を決定するための、信頼のおける、定量的な及び再現性のある領域で、リアルタイムのバイオセンサー及びそれを含む装置を提供する。
さらに、以下に論じるように、バイオセンサーは、その測定値と流入流体（流動流体、例えば流水）中の生物付着の可能性の相関関係、及び当該相関関係の結果に基づいて可能な流体処理プロトコールを決定することを可能にする。
したがって、第１の側面によれば、本開示は、スキャホールド、並びに染料物質及び染料物質と結合した粘土物質を含む染料複合体であって、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体を含むバイオセンサーを提供する。
【０００９】
第２の側面によれば、本開示は、
（ａ）粘土物質及び染料物質を含む混合染料複合体をスキャホールド形成物質と、染料複合体及びスキャホールド形成物質が水性流体混合物の状態にある温度で混合するステップと、
（ｂ）流体混合物に非電解質試薬を添加するステップと、
（ｃ）非電解質試薬との流体混合物を、混合物が凝固する温度まで冷却するステップと
を含み、それによって、スキャホールド及びスキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体を含むバイオセンサーが形成される、バイオセンサーを調製するための方法を提供する。
【００１０】
「スキャホールド」は、いかなるスキャホールド形成物質からでも形成されるマトリックスである。スキャホールド形成物質は、３５℃を超え、時には５０℃を超え、さらに６５℃を超える、固体から液体への相転移温度を有する、天然、半合成又は合成のスキャホールド形成物質であってもよい。いくつかの態様では、相転移温度は９５℃以下である。スキャホールドは、微生物がそれに付着することができ、付着された微生物が、その上に増殖することが可能なタイプである。さらに、スキャホールドは、その寸法が薬品又は物理的条件の存在下で操作される細孔／空隙で特徴付けられる。例えば、スキャホールド形成物質の脱水が、スキャホールドの空隙の収縮を生じさせ得る。脱水をスキャホールド形成物質をアルコールに曝すことによって達成してもよい。
【００１１】
冷却すると、スキャホールド形成物質は凝固する。本開示の状況では、凝固には、固体及び半（準）固体の形態への転移が包含される。
いくつかの態様では、スキャホールド形成物質はポリマー物質である。いくつかの態様によれば、スキャホールドを形成するポリマーを、多糖、ケイ素系ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド又はポリアミドからなる群から選択してもよい。
一態様では、スキャホールド形成物質は、１種又は２種以上の多糖を含む。ポリセッカライド（ｐｏｌｙｓｅｃｃｈａｒｉｄｅｓ）の非限定的なリストには、寒天、キトサン、セルロース、アラビノキシラン、デンプン、グリコーゲン及びキチンが包含される。
一態様では、スキャホールドは寒天であり、これは藻類から製造され、２種の多糖、すなわちアガロースとアガロペクチンの混合物からなることが知られている。寒天は当技術分野でよく知られているが、表１Ａ及び１Ｂは、本開示により使用することができる寒天の一部の特性を示す。
【００１２】
表１Ａ及び１Ｂは、それぞれ、いくつかの寒天の特性及び寒天の無機成分を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄ．ｃｏｍ／ｄｓ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ／ｉｎｓｅｒｔｓ／Ａｇａｒ．ｐｄｆから得られた）。
【表１】
0005986590.tif 000002
【表２】
0005986590.tif 000003
【００１３】
「染料複合体」は、染料物質及び粘土物質の間のいかなる物理的な結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（結合（ｂｏｎｄｉｎｇ））も包含し、ここで、染料物質は、粘土物質と非共有結合性相互作用を形成するものと理解される。非共有結合性相互作用（非共有結合性化学結合）には、これに限定されることなしに、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用が包含され得る。染料物質と粘土物質の間の相互作用は、さらに以下で論じられる。
「染料物質」は、微生物の存在下で、それに応答して（例えば微生物の代謝の結果として）、検知可能なシグナルを示すいかなる化合物も包含されるものと理解される。この目的のために、当該化学的物質は、微生物に対して少なくとも非毒性であり、微生物の代謝産物の存在下で変化を受ける（微生物の存在に応答する）タイプのものであるべきである。
一般に、染料物質は、概して２つの群に分類することができる：
（ｉ）環境に応答して、例えば、ｐＨの変化に応答して（ｐＨ指示薬）又は還元酸化反応に応答して（酸化還元指示薬）シグナルを示す染料物質。
（ｉｉ）その化学構造が変化することによりシグナルを示す染料物質。例えば、微生物の酵素的活性（例えば代謝）に起因する化合物中の化学式又は構造（立体化学）の化学的変化。
【００１４】
上記によれば、染料物質は、発色団又はフルオロフォアから選択され得る。
染料物質は、９６ウェルプレート中に加えられた試験媒体中の微生物の存在を判定するためにすでに使用された。本開示は、以前に記載されたように［Ｔｕｒｎｅｒ  Ｎｉｋｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４６：３８０−３８５（１９６３）；Ｈａｙａｓｈｉ  Ｓｈｕｈｅｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９６（４）：３６０−３６３（２００３）］静止した流体中ではなく、今回、流動する又は循環する流体、例えば流水中の微生物を検出するために染料物質を利用する。
【００１５】
例えば、水中の大腸菌の存在は、クロロフェノールレッドβ−ｄ−ガラクトピラノシド（これは、β−ｄ−ガラクトシダーゼの存在下でその色を黄色から赤色に変化する）を用いて同定してもよい。
地下水中の嫌気性条件下のトルエン分解性微生物は、分解した場合その色を黄色に変化するトリフルオロ−ｍ−クレゾールの使用により同定し得る。
いくつかの態様によれば、本発明により使用される染料物質は、テトラゾリウム化合物のファミリーに属する。
テトラゾリウム化合物は、主に、無色であるか又は弱く着色されており、微生物の電子伝達連鎖においてデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼによって還元されて、発色団、すなわち、以下に図示するホルマザンを形成する。
【化１】
0005986590.tif 000004
【００１６】
ホルマザンは、テトラゾール環に結合された様々な有機基（Ｒ部分で表される）によって決まる、テトラゾリウム化合物の本来の化学的特性に応じて、暗青色から、濃赤色から橙色までの範囲の様々な色を有する。変色は、可視光で又は紫外線下で数時間以内に検出し得る。
一般に、テトラゾリウム化合物は、微生物細胞によるテトラゾリウム化合物還元活性な位置に応じてサブグループに分けられ得る。
（ｉ）水溶性であるホルマザン誘導体を生成するテトラゾリウム化合物。このようなテトラゾリウム化合物の還元は、微生物細胞の外側で行われる。
（ｉｉ）水不溶性であるホルマザン誘導体を生成するテトラゾリウム化合物。このようなテトラゾリウム化合物、特にモノテトラゾリウム群は、細胞表層に侵入し、それによって還元反応が細胞中で行われる。
【００１７】
テトラゾリウム化合物を、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、２−（４，５−ジメチルチアゾリル）−３，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、ナトリウム２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−、分子内塩（ＸＴＴ）、５−［３−（カルボキシメトキシ）フェニル］−３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩（ＭＴＳ）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、ナトリウム５−（２，４−ジスルホフェニル）−２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩（ＷＳＴ−１）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（レッドテトラゾリウム）、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリド（テトラゾリウムバイオレット）、３，３’−（４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ネオテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ブルーテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ニトロブルーテトラゾリウム）、又は３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４−４’ビフェニレン）ビス［２，５−ビス（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（テトラニトロブルーテトラゾリウム）からなる非限定的な群から選択してもよい。
【００１８】
好ましい態様では、染料物質は微生物中で代謝されるタイプである。これは、いったんバイオセンサーを流動流体と接触させ、そのシグナルが生じると、このシグナルはバイオセンサーから洗い流せないことを保証する。
この態様によれば、いくつかのテトラゾリウム化合物、好ましくはモノテトラゾリウム化合物を使用してもよい。
表２は、細胞に侵入して還元反応を受けて、色が生じる、特定のモノテトラゾリウム化合物の例を示す。
【表３】
0005986590.tif 000005
【００１９】
一態様によれば、テトラゾリウム化合物は、テトラゾリウムバイオレット（２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリドとしても知られている）である。
染料物質の取り込みを確実にするために、粘土物質と共に複合体を形成させて、染料のアンカーとしての機能を果たす。染料物質と粘土物質の間の相互作用（結合）は、上記で論じたように非共有結合性である。一態様では、相互作用は、正荷電の染料物質と負荷電の粘土物質の間のイオン性相互作用に基づき、高分子量の染料複合体が生じる。
「粘土物質」は、主として粒状の鉱物からなるあらゆるアルミニウムケイ酸塩を表すものと理解される。
一態様では、粘土物質は粘土鉱物を含む。粘土鉱物は、可変量の鉄、マグネシウム、アルカリ金属、アルカリ土類及びその他のカチオンを含む含水アルミニウム層状ケイ酸塩である。
【００２０】
粘土鉱物は、これに限定されるものではないが、カオリン、スメクタイト、イリテム（Ｉｌｌｉｔｅｍ）緑泥石、海泡石及びアタパルジャイトからなる群から選択してもよい。
好ましい態様では、粘土鉱物はカオリンである。カオリンは、主としてカオリナイト鉱物及びジッカイト、ハロイサイト及びナクライト等の他の鉱物を含む白色粉状物質である。カオリンは当技術分野でよく知られており、種々の形態で市販されている。
カオリン及び他の粘土鉱物は、粘土物質は通常その表面上に負荷電を含み、それによって正荷電の種を吸着し、保持することが可能であるので、「カチオン交換体」と称される。
理論に拘泥するものではないが、染料物質と粘土物質の間の結合には、イオン性粘土物質の表面上に吸着された正荷電の染料物質の間の相互作用が関与し、それによって、染料複合体が形成される。
【００２１】
粘土物質としてカオリン用いる利点は、その生来の白い色にあり、バイオセンサーの表面上の変色の明確な検出を可能にする背景色としての役割を果たす。
本発明の非限定的な例において、７０ｃｍ２の表面積を有するスキャホールドの表面上に露出したままでいる染料物質の量は、少なくとも４０  ＣＦＵ／ｍｌの微生物の検出を可能にするのに、（少なくとも１．２ｍｇ／ｌのＴＯＣで）十分であった。
いくつかの態様によれば、染料複合体は、３００ｇ／モルから１５００ｇ／モルの範囲、好ましくは５００ｇ／モルから１３００ｇ／モルの範囲、より好ましくは７００ｇ／モルから１３００ｇ／モルの範囲の分子量を有する。
【００２２】
取り込み又は埋め込み（これは、染料複合体のスキャホールドへの物理的（機械的）な取り込みであるが）は、スキャホールド形成物質を、スキャホールド形成物質の収縮をもたらす非電解質試薬等の薬品に曝露させることにより達成され得る。非電解質試薬は、水性溶液中でイオンの形態で存在しない、あらゆる化学的物質を表すものと理解される。
収縮は、以下でさらに論じるように、染料複合体の存在下、スキャホールド形成物質の（完全な又は部分的な）脱水によって達成され得る。その結果、染料複合体は、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている又は閉じ込められる。この文脈では、「スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている」ということは、流体中の微生物の存在に応答する染料物質の一部は、スキャホールドから外に露出しているが、それでも染料複合体はスキャホールド中に安定的に閉じ込められていることを意味するものと理解される。
一態様によれば、スキャホールド中の染料複合体の埋め込みは、スキャホールド形成物質をアルカノールに曝露させることによって提供される。したがって、本発明のいくつかの態様によれば、バイオセンサーはアルカノールを含む。
【００２３】
本発明の状況では「アルカノール」は、飽和又は不飽和、直鎖又は分枝、脂肪族又は芳香族のヒドロキシル含有炭水化物を表す。いくつかの態様では、アルカノールはアルコール、例えばＣ１〜Ｃ２０アルコールである。これは、これに限定されるものではないが、メチルアルコール（メタノール）、エチルアルコール（エタノール）ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール（ｓｅｃ−プロピルアルコール）、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール（ｓｅｃ−ブチルアルコール）を包含してもよい。
好ましい態様では、アルコールはエタノールである。
【００２４】
本発明によれば、理論に拘泥するものではないが、スキャホールド及び染料複合体に添加されたアルカノール等の非電解質試薬は、スキャホールドの細孔を収縮させ、それによって、染料複合体を物理的に保持し、例えば流動流体の存在下で、ポリマーのスキャホールドからの染料複合体の拡散を防止するように思われる。
非電解質試薬をスキャホールド形成物質と染料複合体材料の混合物に、流体の形態のときに添加する。この目的のために、成分、すなわちスキャホールド形成物質と染料複合体材料の混合物を加熱する。いくつかの態様では、加熱は、３５℃から９５℃の間、時には５５℃から８５℃の間の温度、さらに時には、４５℃〜８５℃又はさらに６５℃から８５℃の範囲の温度までである。次いで、所定量の非電解質試薬を添加し、その量は、所望の収縮レベルと相関関係にある。
いくつかの態様では、染料物質と粘土物質をｐＨ４からｐＨ６の範囲で混合する。特定の一態様において、混合は４．５±０．５のｐＨにおいてである。
このようにして形成された均一な混合物を、次いで、混合物が固体又は半固体構造物を形成する温度まで冷却する。いくつかの態様では、前記温度は、１０℃から３５℃の間、好ましくは２０℃から３０℃の間、時には２０℃から２５℃の間であってもよい。いくつかの態様では、スキャホールド形成物質を染料物質に対して過剰に添加する。一態様では、混合物は、スキャホールド形成物質と染料複合体の間で、２：１、時には３：１、さらに４：１の化学量論比である。
【００２５】
固体又は半固体の状態のバイオセンサーは、種々の形態で供給され得る。一態様では、スキャホールド中に埋め込まれた染料複合体は、プレート上の積層物又は層として提供される。この目的のために、流体混合物をプレート等のテンプレート中に、プレートの表面を覆って注型してもよい。積層物の形態のバイオセンサーは、上表面及び底表面を有し、染料物質が少なくとも積層物の上表面に露出しているものと定義できる。
【００２６】
前記プレートは、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート又はシクロオルフェイン（ｃｙｃｌｏ−ｏｌｆｅｉｎｓ）から選択される材料から調製されたマイクロタイタープレート（マイクロプレート又はマイクロウェルプレートとしても知られている）であってもよい。マイクロプレートは、いくつのウェルを有していてもよい。市販のプレートは、６、１２、２４、４８、９６、３８４又はさらに１５３６個の試料ウェルを含む。
いくつかの他の態様によれば、バイオセンサーは、染料物質が粒子状物質の外側表面に露出している、粒子状物質の形態である。粒子は、公知のスプレー技術又はビーズを形成するのに知られているいかなる他の技術を用いて得られてよい。
粒子状のバイオセンシング材料を、次いで、容器中で適した緩衝液中に懸濁させるか又はカラム中に収納してもよい。粒状の場合、直径は変化してもよく、いくつかの態様では、粒子状物質のサイズ分布は、０．０１マイクロメートルから１０マイクロメートルであり得る。粒子は、サイズが均一であっても又はサイズが変化していてもよい。
【００２７】
バイオセンサーは、単回使用のための使い捨てであってもよく、複数回の試験のために再使用してもよい。複数回使用される場合、使用の間にパージされる。パージは、染料複合体を新規な染料複合体で置換することによって達成される。
バイオセンサーを調製するための方法において、スキャホールドがその細孔中に物質をトラップする能力は、ポリマーの孔径に依存すること、及び細孔のサイズは、スキャホールド形成物質を通常の濃度より高く（製造者によって推奨されたものより高く）用いて調整することができることが判明した。減少された孔径は、スキャホールド中にトラップされた染料複合体の拡散係数（流出量）を低下させる。
したがって、例えば、通常の生育培地寒天は、蒸留水中で１．８％の濃度で使用される（これは、寒天製造者によって推奨された濃度である）が、本発明者らは、寒天中の染料複合体の最適な取り込み（流体がバイオセンサー上を流動した後、染料複合体がバイオセンサーから放出されないという意味の最適）を得るために、流体混合物中の寒天濃度を少なくとも２倍、時には３倍、さらには４倍の増分で増加させるべきであり、特定の例では７．２％まで増加されることを見出している。
【００２８】
特定の一態様において、バイオセンサーは、カオリン及び寒天（スキャホールド）中に埋め込まれたテトラゾリウムバイオレットの染料複合体を含む。
寒天は、室温でゲルであり、６５℃の高さの温度でも固体のままであることに留意されたい。寒天は、約８５℃で溶融し、次いで約４５℃未満の温度で、特に３２℃から４０℃の範囲の温度で凝固する。
この態様に沿って、バイオセンサーは、
（ａ）カオリン及びテトラゾリウムバイオレットを含む染料複合体を寒天と６５℃から８５℃の範囲の温度で混合して、染料複合体及び寒天を水性流体の形態に維持する流体混合物を形成するステップと、
（ｂ）流体混合物にエタノールを添加するステップと、
（ｃ）エタノールとの流体混合物を２０℃〜２５℃の範囲の温度まで冷却するステップと
を含み、それによって、寒天中に少なくとも部分的に埋め込まれている染料複合体を含むバイオセンサーが形成される方法によって調製される。
【００２９】
さらに本開示によって提供されるものは、
−流体連通している、少なくとも１つの流体流入口及び少なくとも１つの流体流出口、
−流体流入口と流体流出口の間に位置するバイオセンシングチャンバーであって、
（ｉ）スキャホールド、
（ｉｉ）染料物質と結合した粘土物質を含む染料複合体であって、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体
を含むバイオセンサーを含む上記バイオセンシングチャンバー
を含む装置である。
【００３０】
本発明の態様によるバイオセンシング装置の横断面図を図１に示す。
それに沿って、バイオセンシング装置（１０）は、基部（１２）及びサイドウォール（１４）及び（１４‘）、バイオセンシングチャンバー（１６）、バイオセンシングチャンバー（１６）中のダンピングベイスン（２０）に流体を供給するための、サイドウォール（１４）近位の基部における流体流入口（１８）及びバイオセンシングチャンバー（１６）から外に流体を排出するための他方のサイドウォール（１４‘）近位の流出口（２２）を含む。
バイオセンシングチャンバー（１６）は、スキャホールド、及び染料物質と結合した粘土物質を含む染料複合体であって、スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体を含むバイオセンサー（２４）を含む。
バイオセンシングチャンバー（１６）は、（図１に示すように）１個の又は一連のバイオセンサー（図示せず）を有するように構成されてもよい。１個又は２個以上のバイオセンサーが、一方が他方に隣接して配列され、及び／又は流体がその間を流動することが可能なように一方の上に他方が積層されていてもよい。
場合によってサイレンシングベイスンと称されてもよいダンピングベイスン（２０）は、バイオセンシングチャンバー（１６）に入る流体を静かにさせる、すなわち、バイオセンシングチャンバー（１６）に入る流体の振動が除去されない場合は低減して、バイオセンサー（２４）上の流体の薄い静かな層流（２６）を形成するために使用される。振動は、流体をバイオセンシング装置中に引き込むためのポンプ（図示せず）のストロークの結果起こり得る。
【００３１】
ダンピングベイスン（２０）の寸法は、流入口（１８）を経由して入り込む流体の振動が最小であり、バイオセンサー上に一定の層流が形成されるように計算される。
バイオセンサー（２４）上の層流を維持するためには、２，０００未満、さらには１，０００未満、時にはさらに好ましくは３００から８００の間のレイノルズ数（Ｒｃ）を得ることができるような条件を計算することが必要であった（２，０００を超えるレイノルズ数は乱流と相関を持つ）。レイノルズ数は、次式により計算される。
【数１】
0005986590.tif 000006
式中、Ｑｃは体積流量（ｃｍ３／ｓ）であり；Ｌは、流体がそれを通って流動する水路の水力半径（ｃｍ）であり；Ａはフロー断面積（ｃｍ２）であり；νは動粘度（ｃｍ２／ｓ）である。
【００３２】
これに関しては、２０００未満のレイノルズ数の直線水路を通るフローは、通常層流タイプであると考えられ、２０００を超えるレイノルズ数は乱流を示すことに留意されたい。
本開示の状況では、層流とは、バイオセンサー上に基本的に均一な深さを有する、バイオセンサー上を流動する流体層の形成を意味し、前記深さは、０．５ｍｍ〜１０ｍｍの間、さらに１ｍｍ〜５ｍｍ、さらには１ｍｍ〜３ｍｍの間である。
したがって、９２．１６ｃｍ３（高さ１．８ｃｍ、長さ４．０ｃｍ及び幅１２．８ｃｍ）の体積；及び約０．３ｃｍのバイオセンサー上の流体の深さで特徴付けられる層流を有するダンピングチャンバーに対して、７１８のレイノルズ数が得られた。
装置流入口（１８）及び装置流出口（２２）は、流体連通されている。詳細には、流入口（１８）は、試験流体をバイオセンサー（２４）と反応させるために、バイオセンシングチャンバー（１６）中に移動させ得て、流出口（２２）は、試験流体をバイオセンシングチャンバー（１６）から排出物回収装置（図示せず）に移動させ、又は流体を流入口（１８）中に再循環させ得る。
【００３３】
いくつかの態様では、当該装置はポンプ（２８）を含んでもよく、これは、装置中で流体フローを促進し得て、又は流出口（２２）から流入口（１８）に流体を再循環するために使用し得る（「循環ポンプ」）。
前記装置は、流体をバイオセンシングチャンバー（１６）中に導入し、分析する前に、保持するための貯蔵器（３０）を備えていてもよい。貯蔵器（３０）は、流体注入系統（３２）を経由して流体供給源から流体を受け入れ、流体排出系統（３４）を経由して流体を排出する。流体注入系統（３２）及び流体排出系統（３４）を経由する流入及び流出する流体の制御は、それぞれバルブ（３６）及び（３８）によって制御してもよい。
【００３４】
いくつかの態様では、当該装置は、１つ又は２つ以上の次のユニット：
−例えば、微生物の増殖を維持するための、少なくともバイオセンシングチャンバー中の温度を制御する温度制御ユニット、
−シグナル検出ユニット（シグナル検出ユニットは、色検出器又はＵＶ検出器等を備えた顕微鏡を含んでもよく、これは製造者の説明書に従って使用される）、
−１つ又は２つ以上のバイオセンサーの画像を走査する、例えば、色の光学的走査ためのスキャナ、
−検出器又はスキャナからの入力データを受け取る又はバイオセンサーのシグナル強度を示すパラメータを出力するためのプロセシングユニット（プロセシングユニットは、様々なバイオセンサーのデータベース、及び様々な流体生物付着指数を保有するコンピュータ等のエンドユーザーモジュールの一部であってもよい）、
−流量、温度等を包含する、バイオセンシング装置の操作を制御するための制御ユニット（制御ユニットは、誤作動等を通知するために、既定の限界値を超える生物付着レベルを通知するアラームシステムを備えていてもよい）
を含むバイオセンシングシステムの一部であってもよい。
【００３５】
本発明の装置を自動的に運転してもよい。アラームシステムを用いた場合、ヒト操作員の直接的関与は最小化し得る。
制御ユニットは、マイクロプロセッサによって運転してもよく、ソフトウエアで制御し得る。
本開示はまた、
（ａ）水性流体試験試料を本明細書で定義されたバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｂ）バイオセンサーのシグナル強度（流体試験試料中の生存可能な微生物の存在を示す）を検出するステップと
を含む、流体試験試料中の生存可能な微生物を検出するための方法を提供する。
【００３６】
いくつかの態様では、流体は水等の水性流体である。水は、天然の汗水（例えば、泉、不足、池、川等からの）又は天然の塩水、例えば海水、又は処理水、例えば、浄化水、脱塩水、脱塩プロセスにおける水等、又は廃水であってもよい。
「接触させる」とは、水性流体と染料複合体が密着することを保証するように、バイオセンサー上に水性流体の層流を供給する程度までである。
上記のように、バイオセンサーにおけるシグナルは、バイオセンサー上を層流で循環する流体中の生存可能な微生物の存在により決まる、微生物の代謝産物の形成から生じたものである。
以下に例示されるように、シグナル（色）の変化は、バイオセンサー上を流動する流体が、微生物及び適切な栄養の組合せを含んでいる場合のみバイオセンサーの表面上に出現する。これらの要素の一方が欠ける又は循環流体から除去された場合、対照（例えば循環する生理食塩水）に比較してシグナルは出現しない。換言すると、バイオセンサー上の微生物の増殖、すなわち生物付着は、試験流体中に元来存在する食物の存在下の代謝活性にもっぱら起因する。
【００３７】
いくつかの態様では、試験流体は、デステネーションプラントで処理された水、例えばＲＯろ過のあらゆるステージの水である。この目的のためには、脱塩プラントにおけるＲＯシステム等の、流体流動システム中の生物付着を予測するための、本明細書に開示されたバイオセンサーを使用することが望ましい。
したがって、
（ａ）水性流体流動システムからの水性流体試料を本明細書で定義されたバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｂ）バイオセンサーにおけるシグナル強度を検出する（試料に微生物が存在する場合、シグナルはその代謝産物に応答してもたらされ）ステップであって、シグナル強度は流体流動システムの生物付着を形成する可能性と相関するステップと
を含む方法が提供される。
【００３８】
本方法の状況において、流体の可能性とは、たとえ生物付着がすでに起こっていなくても、流体中の微生物の存在に起因する、バイオセンサーに付着することが可能な確率を意味するものと理解される。
上記の方法に沿って、バイオセンサー上のシグナル強度と、流体、例えば、例えば脱塩施設におけるＲＯ膜上に成長した生物膜体積（生物体積）によって測定された水質の間には直線的な正の相関関係が存在することが判明した。
【００３９】
別の側面によれば、本開示は、
（ａ）水性流体の１つ又は２つ以上の試料を１つ又は２つ以上の異なる濃度の殺菌剤と接触させるステップと、
（ｂ）殺菌剤を含有する１つ又は２つ以上の試料のそれぞれを、本明細書で定義されたバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｃ）１つ又は２つ以上の試料のそれぞれに対する、バイオセンサーのシグナル強度を検出するステップと
（ｄ）シグナル強度が、前記水性流体に対して、又は前記殺菌剤に対して有効な処理であると決定された範囲内にある試料を選択するステップ
を含み、選択された試料に添加された殺菌剤の濃度は、水性流体を殺菌するために必要な濃度である、水性流体を殺菌するために必要な殺菌剤の濃度を決定するための方法を提供する。
【００４０】
一般に、浄水プラントで処理された都市の廃水は、約２〜１０ｍｇ／Ｌの間で変化する値の濃度のアンモニア（ＮＨ３）を含む。例えば次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）等の殺菌剤を水に添加した場合、塩素がアンモニアに結合し、クロラミン（ＮＣｌ３、ＮＨＣｌ２、ＮＨ２Ｃｌ）がもたらされる。
この側面によれば、殺菌剤は、水処理用のいかなる通常の薬品でもよい。
塩素は、水処理に使用するために最も広範に使用されている化学殺菌剤であり、多くの形態で販売されている。水に添加された塩素は、有機及び無機物質、並びに微生物と反応する。処理水によって消費された塩素量は、「塩素要求量」と呼ばれる。塩素要求量が満たされた後に水中に残留する塩素量は、「残留塩素」と呼ばれる。
【００４１】
通常の塩素ベースの水処理化合物には、元素の塩素（塩素ガスとして使用される）、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム、ナトリウムジクロル、ナトリウムジクロロイソシアヌレート（ＮａＤＣＣ）、ナトリウムジクロロイソシアルレート二水和物（ＮａＤＣＣ．２Ｈ２Ｏ）、カリウムジクロロイソシアルレート（ＫＤＣＣ）、トリクロロイソシアヌル酸（ＴＣＣＡ）、クロラミン、二酸化塩素、亜塩素酸ナトリウム、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム、過酸化水素、オゾン及びこれらの混合物が包含される。
殺菌剤にはまた、銀、銅、臭素化合物、過ヨウ素酸、光触媒及びその組合せが包含されてもよい。
一態様では、殺菌剤は次亜塩素酸ナトリウムである。
【００４２】
水処理溶液を調製するために、固体の化学殺菌剤を予備的に別個の容器中で溶解し、次いで、水処理溶液となる生じた混合物を適切な注入ポンプで汲み出し、処理する水に供給する。
これに関して、逆浸透膜は、クロラミンに対して耐性があるが、塩素に対しては耐性がなく、塩素は膜の表面を酸化し、生成物流量の低下及び流入圧力の増加をもたらすことに留意することが重要である。したがって、遊離の塩素が流入水中に残留し、それによって場合によって膜に損害を与えることを防止するために、次亜塩素酸ナトリウムの注入用量を減少することが非常に重要である。
いくつかの非限定的な例の詳細な説明
材料
以下の例において以下の材料を使用した。
【表４】
0005986590.tif 000007
システム
バイオセンシング装置の概略図を図１に示す。
総論
各実験の前に、装置を塩素溶液で殺菌し、残留する塩素の痕跡を除去するために蒸留水で数回洗い流した。
（例１）バイオセンサーの開発及び試験
サンプリング位置及び水質
以下の非限定的な例のための水試料は、別な記載がされた場合を除き、Ｓｈａｆｄａｎ浄水プラント（Ｓｈａｆｄａｎ、イスラエル）から得た。Ｓｈａｆｄａｎ浄水プラントは、Ｄａｎ地区（イスラエル）の市街からの廃水の浄化に対して責任を持ち、
−１３０ミクロンの前置フィルター
−０．０２ミクロンの細孔膜を含む限外ろ過（ＵＦ）前処理システム
−９０％の回収率を有する、３つの脱塩ステージ（各ステージは先の段階のブラインを脱塩する）を含む逆浸透（ＲＯ）システム
を含む、水の脱塩施設を運転する。
【００４３】
異なるサンプリング時間及び位置における水のパラメータ（「サンプリング点」）を、ＡｍｉｎｏＬａｂ（イスラエル）で実施した標準的プロトコールによって測定し、表３に要約する。
総有機炭素（ＴＯＣ）は、標準方法５３１０Ｂ高温燃焼法で測定した。
総細菌数（ＴＢＣ）は、コロニー形成単位法（ＣＦＵ／ｍｌ）によって測定した。
生物化学的酸素要求量（ＢＯＤ）は、標準方法５２１０Β−５日間ＢＯＤ試験によって測定した。
導電率は、マルチパラメータ分析器Ｃｏｎｓｏｒｔ  Ｃ５３２（ベルギー）によって測定した。
【表５】
0005986590.tif 000008
バイオセンシング材料の調製
テトラゾリウムバイオレット（０．１５ｍｇ）を（０．５％の原液濃度を得るために）ＤＤＷ３０ｍｌにボルテックスしながら溶解した（すなわち渦中での混合）。次いで、溶液を０．４５μのろ紙を通してろ過することによって滅菌した。ろ液を４℃の温度において、アルミニウムフォイルで包んだ、密閉した試験管中で保管した。
【００４４】
２．５％の濃度のカオリン溶液を得るために、カオリン（１．５グラム）を蒸留水６０ｍｌ中に溶解し、０．１Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨを約４．５のｐＨに調整した。カオリン溶液を１２０℃のオートクレーブ中で１７分間滅菌し、室温で冷却させておいた。次いで、テトラゾリウムバイオレット原液３ｍｌを添加して、０．０２５％の濃度を得た。前記溶液を、光が入らないようにアルミニウムフォイルで包んだエルレンマイヤーフラスコ中で２４時間撹拌した。
寒天（２１．６グラム）を蒸留水２４０ｍｌ中に溶解し、溶液を室温において磁気撹拌機で５分間混合して、９．０％の濃度の寒天溶液を得た。寒天溶液を１２０℃のオートクレーブ中で１７分間滅菌し、次いで寒天溶液を約６５℃まで冷却させておいた。次いで、カオリン−テトラゾリウムバイオレット溶液６０ｍｌを、寒天溶液がカオリン−テトラゾリウムバイオレット溶液で１：５の比（寒天溶液４部及びカオリン溶液１部）に希釈されるように、寒天溶液に添加して、寒天７．２％カオリン０．５％及びテトラゾリウムバイオレット０．００５％の最終濃度を得た。
【００４５】
２種の溶液を６５℃の一定温度で（一定温度は、温水浴を用いて得られた）１０分間混合後、均一な溶液が得て、次いで、３ｍｌのエタノール（ＥｔＯＨ）を均一な溶液に、溶液中で１％のエタノール濃度に達するまで混合しながら添加した。この最終溶液は、以下の例においてバイオセンシング培地と称される。
６５℃の温度のバイオセンシング培地を、９６ウェルプレート中に注いだ。凝固が生じている間、光への曝露を防止するために直ちにプレートをアルミニウムフォイルでカバーした。
色検出の予備評価
９６ウェルプレートを大きな容器に収納し、プレートが流動するのを防止するために、プレートの端に重しをつけた。プレートをサンプリング点１から得られた水の溶液で、プレートの上部表面上１ｃｍの高さまで覆った（プレートを完全に覆うために）。
対照用に、２個のペトリ皿を使用した：一方は無菌の蒸留水、他方は試験水を有する。
【００４６】
プレート及び２個の皿をアルミニウムフォイルで包み、温度３５℃のインキュベータに入れた。
９６ウェルプレートを４８時間及び７２時間後に写真撮影した。紫色は２４時間後にすでにプレート上に検出され、７２時間後にはより強くなり、色の強度が、増加した微生物の存在によって影響を受けたことを示していた。対照の皿（生理食塩水のみを有する）を７２時間後に撮影した。
【００４７】
すべての実験において、以下の条件を維持した。
ａ．すべての実験を通して栄養を添加せず、あらゆる微生物の増殖は、使用した様々な流体中の栄養から生じたものであった。
ｂ．操作前に、バイオセンサー中で２時間循環される塩素溶液を用いて殺菌を実施し、その後、殺菌剤の残留する痕跡を除去するために、バイオセンサーを蒸留水で数回洗い流した。
ｃ．対照試料には、（ｉ）無菌の溶液、又は（ｉｉ）サンプリング点１からサンプリングした水；（ｉｉｉ）サンプリング点１からサンプリングした水であって、それから微生物をろ過して取り出された上記水；及び（ｉｖ）サンプリング点１からの水からろ過された微生物を有する生理食塩水を有する同数のウェルが包含されていた。
ｄ．寒天層中にトラップされた蛍光性物質に対する損害を防止するために、可能な限り、バイオセンサーを暗所で操作した。
確認実験
バイオセンサーの活性及び感受性を決定するための実験
【００４８】
Ａ．先ず、インキュベータの条件における、プレート中での微生物の増殖を検証した。この目的のために、無菌生理食塩水又はサンプル点１からの水のいずれかを、それぞれペトリ皿上に置いて、インキュベータ中に保持した。
Ｂ．次いで、９６ウェルプレート中のバイオセンシング材料上の紫色の出現又は出現の欠如を異なる温度で確認するために、表４に特定された異なる試料における試料試験の実験を実施した。本明細書に説明したように（図１も参照されたい）、各試料をバイオセンサー装置中で循環させた。実験をバッチで実施し、各バッチに試料番号／バッチ番号として番号を付けた。循環時間は、４８、７２又は９６時間であり、循環の間、プレートの画像を撮った。さらに、すべての試料に対して、装置中の流体流量は９０ｍｌ／分であり、試験試料の体積は２Ｌであった。試験試料を装置中で循環させ、ここでバイオセンシングチャンバーは９６ウェルプレートを保持し、各ウェルはバイオセンシング材料を含んでいた。
【表６】
0005986590.tif 000009
結果
インキュベータ条件における微生物の増殖
培地の色の変化は視覚的に検出された。カメラ（ＰｏｗｅｒＳｈｏｔ  Ａ９５、Ｃａｎｏｎ）を用いて得られた画像を、３００ｄｐｉの走査解像力のＰｅｒｆｅｃｔｉｏｎ  １０スキャナ（Ｅｓｐｏｎ、日本）を用いて走査した。
【００４９】
第１の対照ペトリ皿（無菌の蒸留水を有する）の結果は、培地の色の変化がないことを示し、一方、第２のペトリ皿（サンプル点１からの水を有する）においては、微生物の代謝活性が起こり、これが培地の色の有意な（目視可能）変化、すなわち強い紫色の出現をもたらした。
様々な試料及び条件による変色試験
以下の確認実験において、循環する溶液の極端な状況：微生物を有さない無菌溶液、微生物を含む、栄養を有していない溶液、栄養を含むが、微生物を含まない溶液、及びＳｈａｆｄａｎの水の溶液を包含する、様々な溶液（表４に示された）をバイオセンサーの表面上に循環させて、様々な状況における色の指示反応を調べた。さらに、異なる温度も試験した。
【００５０】
異なる実験に対して得られた結果を表５に示す。
【表７】
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上記実験の結果は、微生物と栄養の組合せが存在する場合のみ、紫色がバイオセンサーの表面上に出現したことを示す。循環溶液からこれらの要素の１つが欠けると、色は元のままであった。さらに、循環の期間がより長いほど、バイオセンサーの表面上の紫色の強度及び表面カバー範囲がより大きかった。
したがって、実験の結果は、バイオセンサーの表面上で増殖する微生物の量とバイオセンシング培地上に出現する紫色の量及び強度の間には直線的な依存関係が存在していたことを示している。すべての実験において、バイオセンサーの表面上に現れた場合、紫色は均一であった。さらに、循環の４日後、色はバイオセンシング培地から循環する流体中に洗い流されることはなかった。
【００５１】
最後のバッチの実験（バッチ５、これは海水脱塩施設への流入に使用される海水の循環が関与する）は、このタイプの水でも同様に、たとえ７２時間より長い循環時間後に始めてであっても、色が出現することを示した。紫色の出現に長時間を要したことは、海水の低いＴＯＣによって説明することができる。これらの結果は、前記バイオセンサーを様々なタイプの流体に使用することが可能であることを示している。
（例２）生物付着指数付け及び検討
【００５２】
これらの実験の目的は、生物付着指数を定義すること、及び異なる水源を用いて、生物付着指数に従ったバイオセンサー上の色／強度とＲＯ膜の表面上で成長した生物膜の量の間の相関関係を決定するために生物付着指数を使用することである。
この目的のために、表３で定義された３種の流入溶液（サンプリング点Ｎｏ．３、４及び５）を、バイオセンシングチャンバー中で２４時間、又はＳｈａｆｄａｎ施設におけるＲＯ小型模型膜を通して１５日間循環させ、ＲＯ膜の表面上のこれらの溶液からの実際の生物膜の成長を、バイオセンサー上の成長と比較して測定した。
バイオセンサー上の生物付着の増殖
【００５３】
バイオセンサー上の色の変化を、上記のように６回反復して各水試料に対して測定した。
循環条件：循環流量：９０ｍｌ／分；循環容器体積：２Ｌ；循環期間：２４時間、温度３５℃。
ＲＯ膜上の生物付着の増殖
密閉されたチャンバー中に保持された膜を有するデバイス中に装備された、小型模型ＲＯ膜（ＥＳＮＡ１−ＬＦ、Ｈｙｄｒａｎａｕｔｉｃｓ、米国）の表面上で生物膜を成長させた。前記チャンバーは、流体のための供給水流入口、ブライン流出口及び透過水流出口を含み、この場合、圧力は脱塩パイロットの圧流から得る。
膜の表面積は、３３．４４ｃｍ２（３８×８８ｍｍ）であった。各水試料に対して３回の反復を前もって決めた（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ）。
実験の間、生物膜の成長の結果、膜の産出量の起こり得る変化を監視し、記録するために、圧力、水流量、導電率、温度及びｐＨ等のパラメータを記録した。
循環実験（１５日の循環）の完了後、膜をチャンバーから取り出し、４℃の温度の滅菌した生理食塩水溶液中で貯蔵した。
生物膜の分析のために、膜の５×５ｍｍのセグメントをそれぞれの試験膜から採取した。各セグメントを０．２４％滅菌ＴＲＩＳ溶液（ｐＨ７．２）２ｍｌを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管中に挿入し、試験管を逆さまに数回緩やかに回転させた。
【００５４】
次いで、溶液の一部（１ｍｌ）をＴＲＩＳ溶液の新規な体積（１ｍｌ）と３回置き換えることによって膜のすすぎを実施した。各セグメントの置換えの間、試験管を逆さまに数回緩やかに回転させた。
次いで、すすいだ膜を、微生物を染色するために使用される、ＳＹＴＯベースの染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国、調製法を下記に説明する）、及び生物体の細胞外高分子表面（ＥＰＳ）を染色するために使用され、したがって生物体積生成に対するマーカーとして使用されるテトラメチルローダミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国、調製法を下記に説明する）で染色する。
【００５５】
表６は、色調及び励起及び発光下のこれらの染色の波長を示す。
【表８】
0005986590.tif 000011
染色のために、市販のＳＹＴＯ染料をＴＲＩＳ−ＨＣｌで０．３％（体積／体積）の濃度まで希釈し、７０μｌのアリコートでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管中に、さらに使用するまで−２０℃で保管した。
市販のテトラメチルローダミン染料を５ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）中に溶解して、２ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。この原液をさらに使用するまで−２０℃で保管した。
染色のために、テトラメチルローダミンの原液を０．２４％ＴＲＩＳ−ＨＣｌで希釈して、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。希釈溶液を７０μｌの少量のアリコートで−２０℃で保管した。
【００５６】
すすいだ膜のセグメントを大きなペトリ皿に入れ、３５μｌのＳＹＴＯ９を、均一に分布させるように膜セグメント上に添加した。ペトリ皿を密閉し、２５分間暗色の環境を維持するためにアルミニウムフォイルでカバーした。
２５分後、各染色した膜セグメントを、２ｍｌの０．２４％滅菌ＴＲＩＳ溶液（ｐＨ７．２）を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管中に挿入し、試験管を逆さまに数回緩やかに回転させた。
次いで、溶液の一部（１ｍｌ）を新規なＴＲＩＳ溶液の体積（１ｍｌ）と３回置き換えることによって膜のすすぎを実施した。各部分の置換えの間、試験管を逆さまに数回緩やかに回転させた。
【００５７】
すすいだ後、セグメントを大きなペトリ皿に入れ、３５μｌのテトラメチルローダミンを、均一に分布させるように膜の上に添加した。ペトリ皿を密閉し、２５分間暗色の環境を維持するためにアルミニウムフォイルでカバーした。
２５分後、染色した膜セグメントを前記の通りにすすいだ。
２種の染料物質で染色され、すすいだ膜セグメントを大きなペトリ皿に入れ、５０μｌのＴＲＩＳ溶液を膜上に添加した。
顕微鏡分析に先立って、カバーガラス上に１滴の浸漬油を添加した。
共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）（Ｌｅｉｃａ，Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて膜の検査を実施し、一方、ＳＴＯＹ９及びテトラメチルローダミンをそれぞれ、４８８ｎｍ及び５３２ｎｍの波長で励起した。
結果
生物付着指数
サンプリング点３、４及び５からの３種の測定された溶液の結果を使用して、生物付着指数を得た。
【００５８】
循環実験の前の供給水の特性決定：
サンプリング点３／供給水１：微生物量：コロニー生成単位（ＣＦＵ）／ｍｌ−５８８；総有機炭素（ＴＯＣ）−１４．２ｍｇ／ｌ；導電率１，６２０μｍｈｏ；ｐＨ＝６．７；生物化学的酸素要求量（ＢＯＤ）＝６ｍｇ／ｌ
サンプリング点４／供給水ＩＩ：微生物量；コロニー生成単位（ＣＦＵ）／ｍｌ−１８，０００；総有機炭素（ＴＯＣ）−３９ｍｇ／ｌ；導電率４，００５μｍｈｏ；ｐＨ＝７．１９；生物化学的酸素要求量（ＢＯＤ）＝２５ｍｇ／ｌ
サンプリング点５／供給水ＩＩＩ：微生物量：コロニー生成単位（ＣＦＵ）／ｍｌ−４８，０００；総有機炭素（ＴＯＣ）−６８．５ｍｇ／ｌ；導電率６，７４０μｍｈｏ；ｐＨ＝７．４２；生物化学的酸素要求量（ＢＯＤ）＝１０３ｍｇ／ｌ。
３種のサンプリング点からの各試験試料（供給水Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩと称される）の色強度の解析を定量化し、生物付着指数として指数付けをした。
【００５９】
生物付着指数を以下の通り求めた。
生物付着指数＝１００×ＰＰＰ×（１−ＰＰＰ）＋（１００−ＬＬ）×ＰＰＰ
式中：
生物付着指数−生物付着レベルを定義する数値
ＰＰＰ（紫色画素百分率）−紫色である画素の百分率（小数）
ＬＬ（明度）−強度
図２は、異なる水による色強度（それぞれ６回の反復の平均）を示す。
【００６０】
簡単にするため、生物付着指数を、生物付着の範囲に応じて、生物付着スコア、Ａ、Ｂ、Ｃ、…Ｆに置き換え、より低い生物付着範囲は、低い生物付着を表し、スコアＡと分類される。相関スコアは、表７で特定される。
【表９】
0005986590.tif 000012
ＲＯ膜上の生物付着
サンプリング点からの流体試料をまた、ＲＯ膜上の生物付着を決定するために使用した。
ＳＹＴＯ９及びテトラメチルローダミンによるＲＯ膜の染色は、それぞれ、微生物及び細胞外高分子物質（ＥＰＳ）の存在及び量についての情報を提供した。ＣＬＳＭ画像を走査し、生物膜の生物体積に関して、ＣＬＳＭデータの量子化（ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ）を可能にするＰＨＬＩＰソフトウエア（ｈｔｔｐ／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｐｈｌｉｐ／）で解析した。図３は、各流体、供給水Ｉ、供給水ＩＩ及び供給水ＩＩＩに対して得られた生物体積を示す。
バイオセンサーの結果の信頼性
２４時間の水循環後に得られた生物膜指数（図２、これは、生物付着指数（表７）の決定を導いた）、及び水循環の１５日後にＲＯ膜上に発生した生物膜の生物体積（図３）の結果に関して統計的ｔ−検定を適用すると、０．９を超える有意の正の相関関係を示した。
（例３）：バイオセンサー反応のための最小限の条件の調査
バイオセンサーの感度、すなわち最小限の検知可能なＴＯＣ及び微生物濃度を特定するために、サンプリング点Ｎｏ．２からの試料（ＳＰ２）を、（３種の希釈溶液（表８）を得るために）生理食塩水で希釈した。すべての試験試料において、ｐＨは７．３であり、ＢＯＤは＜５ｍｇ／ｌであった。
【表１０】
0005986590.tif 000013
【００６１】
以下の条件を適用した：循環流量：９０ｍｌ／分、２Ｌの循環体積；３５℃の温度で循環期間２４時間。
結果
バイオセンサー装置中で２４時間の循環後、バイオセンサー上に出現する色の強度（紫色）を測定し、生物付着指数を用いてレベルＢにランク付けした。したがって、この結果は、本発明のバイオセンサーは低レベルの微生物において、すなわち約３ｍｇ／ｌの低ＴＯＣ及び７８ＣＦＵ／ｍｌの低微生物数において、生物付着を検出することができるという結論を導いた。
（例４）：バイオセンサーの適用
この例の目的は、生物付着を防止するのに必要な次亜塩素酸塩（殺菌剤）の最小量を決定することである。
【００６２】
試験水の供給源（Ｓｈａｆｄａｎ）は、約２〜１０ｍｇ／Ｌの間で変化する値のアンモニア（ＮＨ３）を含む。次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）を添加した場合、クロラミン、例えば、ＮＣｌ３、ＮＨＣｌ２、ＮＨ２Ｃｌが生成され、これらは生物付着を防止するために使用される。残留塩素は、ＲＯ膜に損害を与える。したがって、一方で生物付着を防止し、他方でＲＯ膜への損害を防止するために、最小量の次亜塩素酸ナトリウムを使用することが非常に重要である。
方法
次亜塩素酸塩を溶解して、１４０ｍｇ／Ｌの原液を得た。この原液の希釈液は、表９に詳述された通りである。希釈液をバイオセンシング装置中で循環する水中に注入し、総塩素濃度を各希釈液に対して測定した。対照として、いかなる次亜塩素酸塩も添加しなかった。
【００６３】
循環条件：流量：９０ｍｌ／分；循環容器体積：２Ｌ；循環期間：３５℃の温度で２４時間
さらに、サンプリング点Ｎｏ．３（ＳＰ３）からの水を同時に、膜の表面上に生物膜を成長させるために、小型模型膜施設を通して（上記の通り）１５日間流動させた。１５日後、生じた生物体積を測定するために、膜を上記のように処理し、解析した。
結果
２４時間の循環後の試験試料中の総クロラミン及び生物付着指数を表９に示す。生物付着指数を総塩素の関数として図４に示す。
【表１１】
0005986590.tif 000014
【００６４】
次亜塩素酸塩の添加は、生物付着指数の低下（ＣからＢへ）を示した。最小生物付着指数は、１．４［ｍｇ／Ｌ］以上の総塩素濃度に対して得られ、その場合の生物付着指数は０に近かった（図４）。したがって、有害な塩素の存在物を生じさせることなく、０に近い生物付着のためには、４．２ｍｇ／ｌの次亜塩素酸塩量が生物付着を防止するのに十分であることになる。
クロラミンを含有する流入水によるＲＯ膜上の生物膜の成長
前の結果に基づいて、４．２ｍｇ／Ｌの次亜塩素酸塩の注入によって得られる、１．５ｍｇ／Ｌの総クロラミン濃度を使用することが決定した。ステージＩ（ＳＰ１）流入水中に次亜塩素酸塩を注入する期間は、毎日、１日当たり４時間であった。
１５日後、膜を取り外し、ＣＬＳＭ顕微鏡下で検査した。総計４個の膜を検査し、２個を対照（次亜塩素酸塩を添加せず）として使用した。データプロセシングを上記に詳述したのと同様の方法で実施した。
【００６５】
図５は、予測装置によって推奨された濃度（１．５ｍｇ／Ｌ）のクロラミン生じさせるために流入水中に次亜塩素酸塩を注入した場合、各膜上に発生した生物膜の生物体積を、次亜塩素酸塩を有していない同じ流入水中の膜上に発生した生物膜と比較して示す。結果を１８個の走査及び計算したポイントの平均として計算した。
図５に示した結果は、４．２ｍｇ／Ｌの次亜塩素酸塩の添加によって得られる、クロラミンの１．５ｍｇ／Ｌの低用量を生じさせると、膜上の生物膜の発生を防止し；生物体積は、次亜塩素酸塩の添加なしで同じ循環条件下で膜の上に発生した生物膜体積の約１／５であったことを示している。
【００６６】
図６は、生物膜厚さを示し、クロラミンの存在下（すなわち、次亜塩素酸塩を添加した場合）、１５日後の生物膜の厚さは、クロラミンの非存在下で発生した生物膜の厚さの約１／５であったことを示している。
また試験されたことは、４．２ｍｇ／Ｌの次亜塩素酸塩を添加した場合、膜表面上の生物膜の発生を防止する効果であった。３２０時間の正規化された流量は、影響を示さず、詳細には、透過水流量の低下をステージＩにおいても、ステージＩＩ及びステージＩＩＩにおいても示さなかったことが見出されている（図７）。次亜塩素酸塩による処理は、膜上の生物付着を減少させたことも判明した（データは示されていない）。
本発明に包含され得る諸態様は、以下のとおり要約される。
［態様１］
（ａ）スキャホールド；
（ｂ）染料物質と結合した粘土物質を含む染料複合体であって、前記スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体
を含むバイオセンサー。
［態様２］
染料物質が、発色団又はフルオロフォアから選択される、上記態様１に記載のバイオセンサー。
［態様３］
アルカノールをさらに含む、上記態様１又は２に記載のバイオセンサー。
［態様４］
アルカノールがエタノールである、上記態様１から３までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
［態様５］
スキャホールドが、多糖、ケイ素系ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド又はポリアミドからなる群から選択されるポリマーを含むポリマースキャホールドである、上記態様１から４までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
［態様６］
ポリマースキャホールドが、寒天、キトサン、セルロース、アラビノキシラン、デンプン、グリコーゲン及びキチンからなる群から選択される多糖を含む、上記態様５に記載のバイオセンサー。
［態様７］
多糖が寒天である、上記態様６に記載のバイオセンサー。
［態様８］
染料物質が、微生物の代謝産物の存在に応答する、上記態様１から７までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
［態様９］
染料物質が、微生物の代謝産物の存在下で化学変化を受ける、上記態様８に記載のバイオセンサー。
［態様１０］
染料物質が、テトラゾリウム化合物のファミリーに属する、上記態様１から９までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
［態様１１］
染料物質が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（レッドテトラゾリウム）、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリド（テトラゾリウムバイオレット）、３，３’−（４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ネオテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ブルーテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ニトロブルーテトラゾリウム）、又は３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４−４’ビフェニレン）ビス［２，５−ビス（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（テトラニトロブルーテトラゾリウム）からなる群から選択されるテトラゾリウム化合物である、上記態様１０のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
［態様１２］
テトラゾリウム化合物が、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリドである、上記態様１１に記載のバイオセンサー。
［態様１３］
粘土物質が粘土鉱物を含む、上記態様１から１２までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
［態様１４］
粘土鉱物が、カオリン、スメクタイト、イリテム（Ｉｌｌｉｔｅｍ）緑泥石、海泡石及びアタパルジャイトからなる群から選択される、上記態様１３に記載のバイオセンサー。
［態様１５］
粘土鉱物がカオリンである、上記態様１４に記載のバイオセンサー。
［態様１６］
粘土物質と染料物質の間の結合が、非共有結合性化学結合を含む、上記態様１から１５までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
［態様１７］
染料複合体が３００ｇ／モルから１５００ｇ／モルの範囲の分子量を有する、上記態様１から１６までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
［態様１８］
染料複合体の埋め込みが、染料物質の少なくとも一部がポリマースキャホールドの外に露出したままであるような、前記ポリマースキャホールドの細孔中への前記複合体の物理的な取り込みを含む、上記態様１から１７までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
［態様１９］
上表面及び底表面を有する積層物の形態にあり、染料物質が少なくとも前記上表面において露出している、上記態様１８に記載のバイオセンサー。
［態様２０］
容器中に懸濁された粒子状物質の形態にあり、染料物質が粒子状物質の外側表面に露出している、上記態様１９に記載のバイオセンサー。
［態様２１］
（ａ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体をスキャホールド形成物質と、染料複合体及びスキャホールド形成物質が水性流体混合物の状態にある温度で混合するステップと、
（ｂ）前記流体混合物に非電解質試薬を添加するステップと、
（ｃ）前記非電解質試薬との前記流体混合物を、混合物が凝固する温度まで冷却するステップと
を含み、それによって、スキャホールド、及び前記スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている前記染料複合体を含むバイオセンサーが形成される、バイオセンサーを調製するための方法。
［態様２２］
染料複合体が、染料物質を粘土物質と、前記染料物質と前記粘土物質の間における非共有結合を可能にする条件下で混合することによって形成される、上記態様２１に記載の方法。
［態様２３］
染料物質と粘土物質の間の混合が、４から６の範囲のｐＨにおいてである、上記態様２２に記載の方法。
［態様２４］
ｐＨが４．５±０．５である、上記態様２３に記載の方法。
［態様２５］
粘土物質が粘土鉱物を含む、上記態様２１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
［態様２６］
粘土鉱物が、カオリン、スメクタイト、イリテム（Ｉｌｌｉｔｅｍ）緑泥石、海泡石及びアタパルジャイトからなる群から選択される、上記態様２５に記載の方法。
［態様２７］
粘土鉱物がカオリンである、上記態様２６に記載の方法。
［態様２８］
染料物質が、発色団及びフルオロフォアから選択される、上記態様２１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
［態様２９］
染料物質が、テトラゾリウム化合物のファミリーに属する、上記態様２１から２８までのいずれか一項に記載の方法。
［態様３０］
染料物質が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（レッドテトラゾリウム）、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリド（テトラゾリウムバイオレット）、３，３’−（４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ネオテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ブルーテトラゾリウムクロリド）、３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（ニトロブルーテトラゾリウム）、又は３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４−４’ビフェニレン）ビス［２，５−ビス（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド］（テトラニトロブルーテトラゾリウム）からなる群から選択されるテトラゾリウム化合物である、上記態様２９に記載の方法。
［態様３１］
テトラゾリウム化合物が、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−１−テトラゾリウムクロリドである、上記態様３０に記載の方法。
［態様３２］
染料複合体及びスキャホールド形成物質が、３５℃から９５℃の範囲の温度で混合される、上記態様２１から３１までのいずれか一項に記載の方法。
［態様３３］
スキャホールド形成物質と染料複合体の混合物が、４：１の化学量論比である、上記態様２１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
［態様３４］
非電解質試薬がアルカノールである、上記態様２１から３３までのいずれか一項に記載の方法。
［態様３５］
アルカノールがエタノールである、上記態様３４に記載の方法。
［態様３６］
非電解質との混合物が、１０℃〜３５℃の範囲の温度まで冷却される、上記態様２１から３５までのいずれか一項に記載の方法。
［態様３７］
スキャホールド形成物質が、多糖、ケイ素系ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド又はポリアミドからなる群から選択されるポリマーを含む、上記態様２１から３６までのいずれか一項に記載の方法。
［態様３８］
ポリマースキャホールドが、寒天、キトサン、セルロース、アラビノキシラン、デンプン、グリコーゲン又はキチンからなる群から選択される多糖を含む、上記態様２１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
［態様３９］
多糖が寒天である、上記態様３８に記載の方法。
［態様４０］
（ａ）カオリン及びテトラゾリウムバイオレットを含む染料複合体を寒天と、前記染料複合体及び前記寒天を水性流体の形態に維持する、３５℃から８５℃の範囲の温度で混合するステップと、
（ｂ）前記混合物にエタノールを添加するステップと、
（ｃ）エタノールとの前記混合物を２０℃〜２５℃の範囲の温度まで冷却するステップと
を含み、それによって、寒天中に少なくとも部分的に埋め込まれている前記染料複合体を含むバイオセンサーが形成される、バイオセンサーを調製するための方法。
［態様４１］
ａ）水性流体試験試料を、
（ｉ）スキャホールド；
（ｉｉ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体であって、前記スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体
を含むバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｂ）前記水性流体試験試料中に微生物が存在することを示す、前記バイオセンサーのシグナル強度を検出するステップと
を含む、水性流体試験試料中の生存可能な微生物を検出するための方法。
［態様４２］
接触させることが、１５℃から３５℃の範囲の温度においてである、上記態様４１に記載の方法。
［態様４３］
接触させることが、バイオセンサー上の流体の層流を含む、上記態様４１又は４２に記載の方法。
［態様４４］
層流が、３００から２，０００の間のレイノルズ数によって特徴付けられる、上記態様４３に記載の方法。
［態様４５］
バイオセンサーが、上記態様１から２０までのいずれか一項に記載されたものである、上記態様４１から４４までのいずれか一項に記載の方法。
［態様４６］
水性流体試験試料が水である、上記態様４１から４５までのいずれか一項に記載の方法。
［態様４７］
染料物質が、発色団又はフルオロフォアから選択される、上記態様４１から４６までのいずれか一項に記載の方法。
［態様４８］
流体連通している、少なくとも１個の流体流入口及び少なくとも１個の流体流出口；
前記少なくとも１個の流体流入口と前記少なくとも１個の流体流出口の間に位置するバイオセンシングチャンバーであって、
（ｉ）スキャホールド；
（ｉｉ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体であって、前記スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体
を含むバイオセンサーを含む上記バイオセンシングチャンバー
を含む装置。
［態様４９］
流入口の後、かつバイオセンシングチャンバーの前にある流体ダンピングベイスンであって、バイオセンサー上の流体の層流を可能にするように構成された上記流体ダンピングベイスンを含む、上記態様４８に記載の装置。
［態様５０］
温度制御ユニットを含む、上記態様４８又は４９に記載の装置。
［態様５１］
シグナル検出ユニットを含む、上記態様４８から５０までのいずれか一項に記載の装置。
［態様５２］
バイオセンサーが、上記態様１から２０までのいずれか一項に記載されたものである、上記態様４８から５１までのいずれか一項に記載の装置。
［態様５３］
染料物質が、発色団又はフルオロフォアから選択される、上記態様４８から５２までのいずれか一項に記載の装置。
［態様５４］
（ａ）水性流体流動システムからの水性流体試料を、
（ｉ）スキャホールド；
（ｉｉ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体であって、前記スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体
を含むバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｂ）前記バイオセンサーにおけるシグナル強度であって、前記流体流動システムの生物付着を形成する可能性と相関する上記シグナル強度を検出するステップと
を含む、流体流動システム中の生物付着を予測するための方法。
［態様５５］
接触させることが、バイオセンサー上の水性流体試料の層流を含む、上記態様５４に記載の方法。
［態様５６］
接触させることが、１５℃から３５℃の範囲の温度においてである、上記態様５４又は５５に記載の方法。
［態様５７］
層流が、３００から２，０００の間のレイノルズ数によって特徴付けられる、上記態様５４から５６までのいずれか一項に記載の方法。
［態様５８］
水性流体試料が水である、上記態様５４から５７までのいずれか一項に記載の方法。
［態様５９］
シグナル強度が、予め決定された生物付着指数と比較される、上記態様５４から５８までのいずれか一項に記載の方法。
［態様６０］
シグナル強度が定量的に測定される、上記態様５９に記載の方法。
［態様６１］
バイオセンサーが、上記態様１から２０までのいずれか一項に記載されたものである、上記態様５４から６０までのいずれか一項に記載の方法。
［態様６２］
（ａ）水性流体の１つ又は２つ以上の試料を１つ又は２つ以上の異なる濃度の殺菌剤と接触させるステップと、
（ｂ）前記殺菌剤を含有する前記１つ又は２つ以上の試料のそれぞれを、
（ｉ）スキャホールド；
（ｉｉ）粘土物質及び染料物質を含む染料複合体であって、前記スキャホールド中に少なくとも部分的に埋め込まれている上記染料複合体
を含むバイオセンサーと接触させるステップと、
（ｃ）前記１つ又は２つ以上の試料のそれぞれに対する、前記バイオセンサーのシグナル強度を検出するステップと、
（ｄ）シグナル強度が前記水性流体又は前記殺菌剤に対して有効な処理であると決定された範囲内にある試料を選択するステップと
を含み、選択された試料に添加された殺菌剤の濃度が、前記水性流体を殺菌するために有効な濃度である、水性流体を殺菌するために必要な殺菌剤の濃度を決定するための方法。
［態様６３］
水性流体が水である、上記態様６２に記載の方法。
［態様６４］
接触させることが、バイオセンサー上の水性流体試料の層流を含む、上記態様６２から６３までのいずれか一項に記載の方法。
［態様６５］
層流が、３００から２，０００の間のレイノルズ数によって特徴付けられる、上記態様６４に記載の方法。
［態様６６］
接触させることが、１５℃から３５℃の範囲の温度においてである、上記態様６２から６５までのいずれか一項に記載の方法。
［態様６７］
バイオセンサーが、上記態様１から２０までのいずれか一項に記載されたものである、上記態様６２から６６までのいずれか一項に記載の方法。
［態様６８］
シグナル強度が、予め決定された生物付着指数と比較される、上記態様６２から６７までのいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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