(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）酵素的切断、
（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（c）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（d）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（e）陰イオン交換クロマトグラフィー
を含み、
最初に工程（a）を実施し、次いで工程（b）を実施し、最後に工程（c）から（e）を任意の順序で実施することを特徴とする、
副甲状腺ホルモンを精製するための方法。
【請求項２】
酵素的切断が組換えエンテロキナーゼ酵素によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
陰イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
陰イオン交換体がジエチルアミノエチル官能基化アガロース、モノ-4級アンモニウム官能基化アガロースおよび4級アンモニウム官能基化アガロース、好ましくは4級アンモニウム官能基化アガロースから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
陽イオン交換体がスルホプロピル官能基化ヒドロキシル化メタクリレートポリマー、スルホプロピル官能基化アガロース、スルホメチル-トリ(エチレングリコール)-官能基化ポリスチレン／ジビニルベンゼンポリマー、カルボキシ官能基化アクリルポリマー、カルボキシメチル官能基化アガロースから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
強陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がスルホプロピル官能基化ヒドロキシメタクリレートポリマーである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
弱陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がカルボキシメチル官能基化アガロースである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで、限外ろ過-ダイアフィルトレーション工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ダイアフィルトレーション媒体が、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
（a）細胞の破砕、
（b）細胞ライセートからの封入体塊の単離、
（c）封入体の可溶化、
（d）酵素的切断による、融合パートナータンパク質-PTH複合体からの副甲状腺ホルモンの分離、
（e）リコンディショニング、
（f）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（g）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（h）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（i）限外ろ過／ダイアフィルトレーション（UF/DF）、
（j）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（k）限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換、
（l）0.22μmでの最終ろ過
を含み、
最初に工程（a）を実施し、次いで工程（b）から（f）の順に実施し、最後に工程（g）から（l）を任意の順序で実施することを特徴とする、
粗製混合物から副甲状腺ホルモンを精製するための、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
副甲状腺ホルモンが組換え副甲状腺ホルモンである、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
副甲状腺ホルモンが切断部位を介して融合パートナーと融合されている、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明では、組換え副甲状腺ホルモン（rhPTH1〜34またはテリパラチド）の精製の改良された方法が提供される。本発明に従ったPTHの精製プロセスは、陽イオン交換クロマトグラフィーの使用に先立ち、第一の工程において陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することを含む。そのような精製プロセスによって、精製のプロセスでHPLCカラム工程を使用せずに、99％より高い純度の高度精製されたrhPTH1〜34が得られる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景 
組換えヒト副甲状腺ホルモン（rhPTH1〜34）またはテリパラチドは、内因性ヒト副甲状腺ホルモン（PTH）の生物学的に活性なN-末端断片である。治療的には、テリパラチドは骨折のリスクの高い骨粗鬆症を有する男性および閉経後女性の治療に使用される。その使用によって骨密度が増加し、椎体骨折および非椎体骨折のリスクが低減される。
【０００３】
本発明の発明者らは、遺伝子操作した大腸菌細胞を宿主系として用い、組換えDNA技術によって独自の方法でテリパラチドを開発した。34個の天然アミノ酸からなるテリパラチドは、理論上4117.8 Daの分子量を有する。テリパラチドはシステインを含まないポリペプチド鎖である。
【０００４】
ヒトの体内では、PTHは主に副甲状腺主細胞によって、84個のアミノ酸からなる一本鎖ポリペプチド（9.5 kDa）として合成され分泌される。血流中に放出された際に、PTHは骨や腎臓に主に存在する特異的な膜受容体に結合し、血清のCa2+レベルを維持する。ホルモンと受容体の相互作用から、典型的なカスケード系によってcAMP依存性プロテインキナーゼAシグナル伝達経路とカルシウム依存性プロテインキナーゼCシグナル伝達経路の双方の活性化が導かれる。
【０００５】
循環においては、内因性の天然型PTHの半減期は2〜5分であり、そのクリアランスの90％より多くは肝臓および腎臓によって仲介される。
【０００６】
複数の生化学的研究および構造的研究により、遺伝子組換え技術または合成によって作製されたPTHのN-末端の1〜34アミノ酸断片は、受容体との結合およびその活性化について十分に活性を保持していることが認められた。最適な受容体結合活性のためには、N-末端部分、即ちPTH1〜34ポリペプチド鎖の1〜27アミノ酸が生物学的活性に不可欠であることが見出されている。PTH1〜34のN-末端部分は、その受容体への結合の際にcAMPの刺激を誘発する一方、PTH1〜34のC-末端部分はcAMPの活性化を導かず、結合エネルギーの多くを供給することに役立っている。
【０００７】
PTHはCa2+の恒常性において重要な役割を担う。循環血液中のCa2+濃度が低いときには（低カルシウム血症）、膜結合血漿カルシウムセンサーを介して副甲状腺細胞からPTHの放出が誘発される。低カルシウム血症が持続すると、その後副甲状腺の肥大および過形成が起きる。一方、血漿中のCa2+濃度の上昇によっては、負のフィードバック機構によりPTHの放出が抑制される。
【０００８】
本発明は、組換えPTHの精製に関連する。先行技術においてはいくつかの精製プロセスが知られている。そのような精製プロセスは、高価であり操作中に大量の有機溶媒を必要とする高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の使用を含む。工業的規模でHPLCによってPTHを精製する場合、当装置のコストが高いこと、耐火性の製造プラントが必要となること、および移動相として使用される高価で高品質の有機溶媒が大量に必要となることが大きな制限要因である。
【０００９】
国際公開公報第2009019715号（特許文献1）により、98％より高い純度の標的タンパク質を得る、陽イオン交換クロマトグラフィーと、任意でそれに次ぐHICまたはRP-HPLCから選択される分取クロマトグラフィーとを含む、rhPTH（1〜34）の2工程の直行（orthogonal）精製プロセスが開示されている。
【００１０】
国際公開公報第2003102132号（特許文献2）は、アフィニティークロマトグラフィーではないクロマトグラフィーとHPTFFとの組み合わせに関わる、タンパク質の精製方法に関連する。
【００１１】
インド特許出願第2991/MUM/2010号（特許文献3）では、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを含むPTHの精製プロセスが開示されている。
【００１２】
本発明において説明されるPTHの精製のためのプロセスは、該ポリペプチド分子の精製プロセスにおいて、移動相として有機溶媒が使用されるカラムクロマトグラフィーやHPLCカラムクロマトグラフィーを全く含まない。したがって、本発明は、高度精製されたrhPTH1〜34を得るための、簡単な、費用効果の高い、高度にスケーラブルな、工業的に実行可能であり環境的に好ましい精製プロセスを開示する。本発明において開示する精製プロセスは、任意のプロセスによって作製されたrhPTH1〜34を含有する粗製混合物からPTHを精製するために使用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開公報第2009019715号
【特許文献２】国際公開公報第2003102132号
【特許文献３】インド特許出願第2991/MUM/2010号
【発明の概要】
【００１４】
本発明では、副甲状腺ホルモン（PTH）、好ましくは組換えPTHを精製する方法が提供される。
【００１５】
ある局面において本発明は、水相において複数のクロマトグラフィー工程を使用することを含む、PTH、好ましくは組換えPTHを精製するための、HPLCではないプロセスを提供する。
【００１６】
別の局面において本発明では、高度精製された形態の所望のポリペプチド分子を得る、不純物を除去するための第一カラム精製としての陰イオン交換クロマトグラフィーと、それに次ぐ、さらなる精製のための陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、PTHを精製するための、HPLCではないプロセスが提供される。
【００１７】
ある好ましい局面において本発明では、部位特異的切断を行って所望のPTHのポリペプチド鎖を融合パートナータンパク質複合体から単離した後に、該複合体からPTHを精製するプロセスが提供される。
【００１８】
別の好ましい態様において本発明では、酵素的切断に特異的なシグネチャー配列を介して融合パートナーがPTH分子と結合されているため切断の際にはPTH分子がそのN-末端位置から単離されるような、融合パートナータンパク質複合体の使用を開示する。融合パートナータンパク質は、（理論上）7.2またはそれ未満のpI値を有することが公知の、特異的な切断反応に必要とされる配列のものと同様のシグネチャー配列をポリペプチド鎖には含まないと考えられるタンパク質分子群より選択することが可能である。
【００１９】
好ましい態様において本発明では、以下の工程を含む、PTH、好ましくは組換えPTHの精製プロセスが提供される：
1．部位特異的な切断
2．弱陰イオン交換クロマトグラフィー
3．弱陽イオン交換クロマトグラフィー
4．強陽イオン交換クロマトグラフィー
5．限外ろ過およびダイアフィルトレーション
6．弱陰イオン交換クロマトグラフィー。
【００２０】
さらなる態様においては、工程3〜6のうち任意のカラム精製工程を任意の順序で行うことができる。
【００２１】
別の態様においては、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで酵素的切断反応を行うことができる。
【００２２】
本説明において使用される略語は以下のように定義される：
DEAEセファロース：ジエチルアミノエチルセファロース
CMセファロース： カルボキシメチルセファロース
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
RP-HPLC：逆相-高速液体クロマトグラフィー
HIC：疎水性相互作用クロマトグラフィー
HPTFF：高性能タンジェンシャルフローろ過
r-Enk：組換えエンテロキナーゼ
MWCO：分画分子量
WFI：注射用水。
[本発明1001]
以下の必須の工程：
（a）酵素的切断、
（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、それに次ぐ他の好適な精製工程
を含み、工程（a）と（b）を任意の順序で実施することができる、副甲状腺ホルモンを精製するための方法。
[本発明1002]
酵素的切断が組換えエンテロキナーゼ酵素によって行われる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
陰イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
陰イオン交換体がDEAEセファロース、Mono QおよびQセファロースXL、好ましくはQセファロースから選択される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
（a）酵素的切断、
（b）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（c）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（d）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（e）陰イオン交換クロマトグラフィー
を含み、
酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができ、
工程（c）から（e）は任意の順序で実施することができる、
前記本発明のいずれかの副甲状腺ホルモンを精製するための方法。
[本発明1006]
陽イオン交換体がSP-5PW、SPセファロース、MonoS、Bio-rex70、CMセファロースから選択される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
強陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がSP-5PWである、本発明1005の方法。
[本発明1008]
弱陽イオン交換クロマトグラフィーのための陽イオン交換体がCMセファロースである、本発明1005の方法。
[本発明1009]
第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで、限外ろ過-ダイアフィルトレーション工程をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1010]
ダイアフィルトレーション媒体が、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、およびそれらの組み合わせから選択される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
（a）細胞の破砕、
（b）細胞ライセートからの封入体塊の単離、
（c）封入体の可溶化、
（d）酵素的切断による、融合パートナータンパク質-PTH複合体からの副甲状腺ホルモンの分離、
（e）リコンディショニング、
（f）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（g）弱陽イオン交換クロマトグラフィー、
（h）強陽イオン交換クロマトグラフィー、
（i）限外ろ過／ダイアフィルトレーション（UF/DF）、
（j）弱陰イオン交換クロマトグラフィー、
（k）限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換、
（l）0.22μmでの最終ろ過
を含み、
酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができ、
工程（g）から（l）は任意の順序で実施することができる、
粗製混合物から副甲状腺ホルモンを精製するための、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
副甲状腺ホルモンが組換え副甲状腺ホルモンである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
副甲状腺ホルモンが切断部位を介して融合パートナーと融合されている、前記本発明のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】rhPTH1〜34の精製プロセスにおいて用いられた、第一の弱陰イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルを表す。rhPTH1〜34産物は陰イオン交換マトリックスには結合せず、カラムフロースルーおよび洗浄画分に現れる。強く結合した混入タンパク質は、より高い塩濃度（500 mM NaCl）を用いてカラムから除去される。
【図２】rhPTH1〜34の精製プロセスにおいて用いられた、弱陽イオン交換カラム精製のクロマトグラフィーのプロファイルを表す。rhPTH1〜34をマトリックスに結合させて、200 mM NaClを用いたグラジエント溶出で（示されるように）所望の画分にカラムから示差的に溶出する。溶出に先立ち、150 mM NaClを加えたバッファーでカラムを洗浄する。
【図３】rhPTH1〜34の精製プロセスにおいて用いられた、強陽イオン交換カラム精製のクロマトグラフィーのプロファイルを表す。タンパク質溶液のローディングに次いで、最初に平衡化バッファーによってカラムのマトリックスを洗浄し、第二の洗浄は平衡化バッファーより高い電気伝導度で行う。溶出は、pHおよび電気伝導度が第二の洗浄バッファーより高いバッファーを用いて行う。図に示すように、溶出の間にrhPTH1〜34の所望の画分がさらなる処理のために収集される。
【図４】rhPTH1〜34の精製プロセスにおいて用いられた、第二の弱陰イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルを表す。rhPTH1〜34産物は陰イオン交換マトリックスには結合せず、カラムフロースルーおよび洗浄画分に現れる。示すように、強く結合した残留混入タンパク質はより高い塩濃度（500 mM NaCl）にてカラムから除去される。
【図５】第二の弱陰イオン交換カラムから回収されたrhPTH1〜34ポリペプチドの、非還元SDS-PAGEによるプロファイルを表す。ゲル上に分離、展開されたタンパク質のバンドを銀染色した。SDS-PAGE分析から、rhPTH1〜34のシングルバンドの純度は明らかである。残存混入タンパク質の除去はレーン3において示された。
【図６】RP-HPLCによる、精製されたrhPTH1〜34原薬の純度を表す。精製されたrhPTH1〜34原薬材料については、rhPTH1〜34の主要ピークで99％より高い純度が認められる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明によって、PTH、好ましくは組換えPTH（rhPTH1〜34）の、HPLCではない精製プロセスが提供される。
【００２５】
ある態様において本発明では、粗製混合物からPTHを精製するために、最初に陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することと、次いで他のカラム精製を使用することを含む、PTHの精製プロセスが提供される。粗製混合物は、所望のタンパク質に加えて混入タンパク質、内因性タンパク質、産物関連物質、および他の不純物を含み得る。
【００２６】
ある態様においては本発明によって、複数のイオン交換カラムクロマトグラフィー工程を含む、HPLCではないPTHの精製プロセスが提供される。
【００２７】
ある好ましい態様においては本発明によって、PTHが特異的切断部位を介して融合パートナーと結合されている、可溶性の融合パートナータンパク質-PTH複合体からPTHを精製するプロセスが提供される。しかし本発明は、当技術分野において公知の任意の従来的な発酵プロセスによって合成される融合パートナータンパク質-切断部位-PTH複合体に特異的な遺伝子を含有するベクターによって形質転換された細胞からの、PTHの精製を想定している。
【００２８】
好ましい態様においては、融合パートナータンパク質-PTH複合体からのPTHの精製は以下の工程によって実施される：
1．粗製混合物中に存在する可溶性の融合パートナー-PTH複合体からPTHを切断するための酵素反応
2．陰イオン交換クロマトグラフィー
3．陽イオン交換クロマトグラフィー
4．陽イオン交換クロマトグラフィー
5．限外ろ過およびダイアフィルトレーション
6．陰イオン交換クロマトグラフィー。
【００２９】
ある態様においては、酵素的切断は、第一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に次いで行うことができる。
【００３０】
別の態様においては、工程3〜6は任意の順序で行うことができる。
【００３１】
好ましい態様においては、融合パートナータンパク質-PTH複合体を含む粗製混合物からのPTHの精製は、以下の工程によって実施される：
1．酵素的切断
2．弱陰イオン交換クロマトグラフィー
3．弱陽イオン交換クロマトグラフィー
4．強陽イオン交換クロマトグラフィー
5．限外ろ過およびダイアフィルトレーション
6．弱陰イオン交換クロマトグラフィー。
【００３２】
PTH（rhPTH1〜34）産物の精製の下流プロセスは、以下の工程を含む：
−細胞の破砕
−細胞ライセートからの封入体塊の単離
−封入体の可溶化
−酵素的切断による、融合パートナータンパク質-PTH複合体からのrhPTH1〜34の分離
−リコンディショニング
−弱陰イオン交換クロマトグラフィーによる融合パートナータンパク質の除去
−弱陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
−強陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
−限外ろ過／ダイアフィルトレーション（UF/DF）
−弱陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
−限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換
−0.22μmでの最終ろ過
−-20℃以下における原薬の保存。
【００３３】
好ましい態様においては、上流プロセスは以下のように実施される。
【００３４】
発酵バッチを採取した後に、遠心分離法によって大腸菌細胞を収集し、溶解用バッファーに再懸濁する。高圧細胞ホモジナイザーを使用して細胞を破砕し、ペレットの形態でライセートから不溶性封入体塊を単離する。単離された封入体塊を可溶化し、酵素反応に供する。融合パートナータンパク質-PTH複合体からの所望のPTHポリペプチド鎖の酵素的切断を好適な条件下において5〜6時間行う。反応終了時に反応混合物をリコンディショニング工程に供し、次いでカラム精製を行う。
【００３５】
本発明において使用されるクロマトグラフィー法：
陰イオン交換クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーにおいては、固定相は正に帯電しており、負に帯電したタンパク質がカラムのマトリックスを通過する間に結合する。本発明に従って陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するために同様に使用できる他の陰イオン交換体は、DEAEセファロース、Mono Q、Qセファロース、QセファロースXL、Capto Q等から選択される。本発明においては陰イオン交換体にDEAEセファロースを使用した。
【００３６】
陽イオン交換クロマトグラフィー
陽イオン交換クロマトグラフィーにおいては、固定相は負に帯電しており、正に帯電したポリペプチド分子がカラムのマトリックスを通過する間に結合する。陽イオン交換クロマトグラフィーにおいては、陽イオン交換体はSP-5PW、SPセファロース、MonoS、Bio-rex70、CMセファロース等から選択することができる。本発明においては、特定の工程において、弱陽イオン交換体としてCMセファロースを使用し、強陽イオン交換体としてSP-5PWを使用した。
【００３７】
RP-HPLC
0.1％TFAを加えた移動相Aで満たした逆相C18カラムを使用して、RP-HPLC分析を行う。TFAアセトニトリル溶液（移動相B）を用いて、流速1 mL/分、40℃でrhPTH1〜34原薬の分離を行う。
【００３８】
本発明においては、PTH産物の精製にHPLCカラム精製工程は使用されなかった。
【００３９】
本発明に従ったrhPTH1〜34の精製の好ましい方法は下記に説明されるが、いかなるものも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４０】
工程1：細胞の破砕
遠心分離によって13±2 Lの発酵ブロス（ワーキングボリューム）から細胞塊を採取した後、pH 8.0のTrisバッファー中に細胞ペレットを懸濁した。冷却条件下（2℃〜15℃）において単一パッセージで圧力900〜1100 barで高圧細胞ホモジナイザーを使用することによって細胞を破砕した。
【００４１】
工程2：細胞ライセートからの封入体塊の単離
冷却条件下における10,500 g×1時間の遠心分離によって細胞ライセートから封入体塊を単離した。pH 8.0のTrisバッファーを用いて、ペレット化した封入体塊を再懸濁し、還元条件下で低濃度の尿素、好ましくは0.5〜1 Mの尿素の存在下における遠心分離法によって洗浄した。
【００４２】
工程3：封入体塊の可溶化
洗浄後に封入体塊を、還元条件下で、8 Mの尿素を含むpH 8.0のTrisバッファーによって1時間、周囲温度で可溶化した。可溶化した封入体塊を、2℃〜8℃で10,500 g×1時間、遠心分離した。可溶性の融合パートナータンパク質-rhPTH1〜34複合体を他の混入物と共に含む透明な上清画分を、融合パートナー複合体からのPTHの酵素的切断に供した。
【００４３】
工程4：酵素的切断による、融合パートナータンパク質複合体からのrhPTH1〜34の分離
融合パートナータンパク質-rhPTH1〜34複合体および他の混入物を含む上清画分1〜2 mg/mL（総タンパク質）を、酵素的切断のために還元条件下でr-エンテロキナーゼによって5〜6時間周囲温度で処理した。エンテロキナーゼは、融合パートナー-rhPTH1〜34複合体を特異的な部位で切断し、タンパク質複合体からrhPTH1〜34を切り離した。エンテロキナーゼは、融合パートナータンパク質とrhPTH1〜34分子の間に存在していたシグネチャー配列のC末端のLys残基（Asp）4Lysにて切断を行った。酵素反応は、酢酸の添加による酸性化によって特定の時点で終わらせた。混合物をデプスフィルターに通し、不溶性物質または酸性化中に生じた沈殿物から可溶性画分を分離させた。酸性化に続き、混合物をデプスフィルターに通し、透過液中にrhPTH1〜34を主に含む可溶性タンパク質画分を回収した。
【００４４】
工程5：切断後の可溶性PTH1〜34のリコンディショニング
デプスフィルターに通した後に、rhPTH1〜34および他の少量の混入物を含む可溶性タンパク質画分を、次のカラム精製工程の平衡化条件に適合させるために、pH調整についてのリコンディショニング工程に供した。溶液のpHはTrisまたはNaOH溶液を用いて8.2に調整した。
【００４５】
工程6：弱陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
リコンディショニング後に、タンパク質溶液を弱陰イオン交換カラムに通し、カラムフロースルーおよび洗浄画分中の混合物からrhPTH1〜34産物の大部分を回収した。切断されていない融合パートナータンパク質および他のタンパク質混入物は陰イオン交換カラムのマトリックスに結合したまま残り、より高い電気伝導度にてカラムから除去された。RP-HPLC分析によって評価すると、本工程では、フロースルーおよび洗浄画分において回収されたrhPTH1〜34産物が90％より高い純度を示すことが認められた。
【００４６】
陰イオン交換カラム条件の詳細：
カラムの寸法：13 cm（高さ）×20 cm（内径）
カラムのベッドボリューム：4 L
平衡化バッファー：Tris-Cl、pH 8.2
流速：28〜47 cm/時間
カラムの洗浄：Tris-Cl、pH 8.2、500 mM NaClを含む
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
弱陰イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルは、図1に示す。
【００４７】
工程7：弱陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
弱陰イオン交換カラムクロマトグラフィー工程に次いで、弱陽イオン交換カラムをpH 5.0、結合-溶出モードで使用することによってrhPTH1〜34産物をさらに精製した。本カラム精製工程は主に宿主細胞に由来する混入産物、または産物に関連しない不純物を除去するために行われた。カラムへのローディングに先立ち、希釈酢酸を添加することによってrhPTH1〜34溶液をpH 5.0に調整した。カラムのマトリックスに結合させ、同じpHにおけるステップワイズ法で175〜200 mM NaClを用いてrhPTH1〜34産物をカラムから溶出した。rhPTH1〜34の溶出に先立ち、150 mM NaClを用いた中間バッファー洗浄にカラムを供した。弱陽イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルは図2に示す。RP-HPLC分析によって評価すると、弱陽イオン交換カラム精製工程の後溶出されたrhPTH1〜34は95％より高い純度を示す。
【００４８】
弱陽イオン交換カラム条件の詳細：
カラムの寸法：13 cm（高さ）×20 cm（内径）
平衡化バッファー：20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0
カラムのベッドボリューム：4 L
流速：47 cm/時間
溶出：20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0、175〜200 mM NaClを含む
カラムの洗浄：酢酸ナトリウム、pH 5.0、250 mM NaClを含む
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
【００４９】
工程8：強陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
pH 5.0における強陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって主に産物関連物質を除去するために、rhPTH1〜34を含む弱陽イオン交換カラム-溶出画分をさらに、第三のカラム精製工程に供した。pH 5.0、結合-溶出モードでカラム精製を行った。ローディングに次いで、pH 6.2の110 mM酢酸ナトリウムバッファーでカラムを洗浄した。pH 7.2の150 mM酢酸ナトリウムバッファーでrhPTH1〜34の溶出を行った。ショルダーピークを伴ってrhPTH1〜34産物がカラムから溶出され、画分ごとに収集された。所望の画分のプールまたは選択を行う以前に、異なるピークの画分をRP-HPLC分析によって分析した。97％より高い純度（RP-HPLCによる）を有する主要ピークのrhPTH1〜34含有画分を、さらなる処理のためにプールした。
【００５０】
強陽イオン交換カラム条件の詳細：
カラムの寸法：23〜26 cm（高さ）×10 cm（内径）
カラムのベッドボリューム：2 L
平衡化バッファー：20 mM酢酸ナトリウム、pH 5.0
流速：92 cm/時間
溶出：150 mM酢酸ナトリウム、pH 7.2
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
強陽イオン交換カラムからのrhPTH1〜34溶出の、クロマトグラフィーのプロファイルは、図3に示す。
【００５１】
工程9：限外ろ過−ダイアフィルトレーション
電気伝導度およびpHを各々およそ1.5（±1）mS.cm-1および5.0に調整して、次のカラム精製工程の平衡化バッファー条件に合わせるために、強陽イオン交換カラム-溶出rhPTH1〜34溶液を限外ろ過-ダイアフィルトレーション工程に供した。残分の電気伝導度およびpHが最初のダイアフィルトレーションバッファーのものと同じになるまで、1 kDaまたは2 kDaの膜をpH 5.0の低イオン強度の酢酸バッファーと共に用いてrhPTH1〜34溶液の定容ダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーション後、次のカラム精製工程の平衡化バッファーのpHに合わせるために、1 M Tris-base（溶液）を用いてrhPTH1〜34溶液のpHをpH 8.2に調整した。
【００５２】
工程10：弱陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
ダイアフィルトレーション後、残存の融合パートナータンパク質混入物（産物関連不純物）を除去するため、rhPTH1〜34産物溶液はさらに、弱陰イオン交換カラムを通過させた。所望のrhPTH1〜34産物はカラムフロースルーおよび洗浄画分において回収された一方、混入産物関連物質はマトリックスに結合したままとなる。
【００５３】
弱陰イオン交換カラム条件の詳細：
カラムの寸法：25 cm（高さ）×10 cm（内径）
カラムのベッドボリューム：2.5 L
平衡化バッファー：Tris-Cl、pH 8.2
流速：28 cm/時間
カラムの洗浄：500 mM NaClを含むTrisバッファー、pH 8.2
カラムのクリーニング：0.5 N NaOH
弱陰イオン交換カラム精製工程のクロマトグラフィーのプロファイルは図4に示す。
【００５４】
本工程において、カラムフロースルーおよび洗浄画分において回収された精製rhPTH1〜34産物は、図5に示すように、SDS-PAGE分析後銀染色するとゲル上にブロードなシングルバンドとして現れる。
【００５５】
工程11：限外ろ過／ダイアフィルトレーションによるバッファー交換
第二の陰イオン交換カラム精製工程から回収された所望のrhPTH1〜34産物溶液を初めに酢酸溶液と混合してpH 5.0とし、その後限外ろ過-ダイアフィルトレーションに供した。残分のpHおよび電気伝導度がダイアフィルトレーションバッファーのものと同じになるまで、冷却条件下（2℃〜15℃）で1 kDaまたは2 kDaのMWCOの膜を使用し、pH 4.0の酢酸ナトリウムバッファーを用いて定容ダイアフィルトレーションを行う。本工程を行い、精製rhPTH1〜34産物の原薬保存用バッファー溶液が得られた。精製rhPTH1〜34産物の最終濃度はおよそ1 mg/mLに維持された。
【００５６】
工程12：0.22μmでの最終ろ過
限外ろ過-ダイアフィルトレーションによるバッファー交換後、精製rhPTH1〜34産物溶液を0.22μmフィルターに無菌的に通し、好適な保存容器において、rhPTH1〜34の冷凍バルク『原薬』として-20℃以下で保存した。
【００５７】
rhPTH1〜34の最終精製原薬は、図6に示すように、RP-HPLC分析により99％より高い純度を示している。
【００５８】
結果および考察
したがって、本発明のプロセスにより、HPLCではない、粗製混合物からのrhPTH1〜34の効率よい精製プロセスが提供される。該プロセスからは、RP-HPLC分析で評価すると99％より高い純度を有する、高度精製されたrhPTH1〜34調製物が得られる。そのように高度精製されたrhPTH1〜34調製物は、当業者に公知の従来技術による製剤化後の、ヒトにおける治療的な使用に好適であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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