(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体抵抗ネットワークであって、
第1の流体入口と流体連通された第1のマイクロ流体チャネルと、
第2の流体入口と流体連通された第2のマイクロ流体チャネルと、
を有し、
当該マイクロ流体抵抗ネットワークは、さらに、第1の希釈ステージ入口としての前記第1のマイクロ流体チャネルと、第2の希釈ステージ入口としての前記第2のマイクロ流体チャネルと、を有する交差型の希釈ステージを有し、
前記第1の希釈ステージ入口および第2の希釈ステージ入口は、第1のジャンクションを構成し、
前記希釈ステージは、さらに、
前記第1のマイクロ流体チャネルからの第1の流体の一部と、前記第2のマイクロ流体チャネルからの第2の流体を受容する、第1のマイクロ流体出口チャネルと、
前記第1の流体の残りを受容する第2のマイクロ流体出口チャネルと、
を有し、
前記第1のマイクロ流体出口チャネルおよび前記第2のマイクロ流体出口チャネルは、前記第1のジャンクションの反対側に、第2のジャンクションを形成し、
前記第1のマイクロ流体チャネルと前記第2のマイクロ流体チャネルの交点を通り、前記第1のマイクロ流体チャネルと前記第2のマイクロ流体チャネルの間の角度を分割する虚軸に対して、前記第1のマイクロ流体出口チャネルと前記第2のマイクロ流体出口チャネルの交点が、所定の距離ずれており、当該所定の距離は、前記第1のマイクロ流体出口チャネルが受容する前記第1の流体と前記第2の流体の比率を規定することを特徴とするマイクロ流体抵抗ネットワーク。
【請求項２】
前記第1の流体はサンプルであり、前記第2の流体は希釈剤であることを特徴とする請求項1に記載のマイクロ流体抵抗ネットワーク。
【請求項３】
前記第2のマイクロ流体チャネルからの前記第2の流体と混合された、前記第1のマイクロ流体チャネルからの前記第1の流体の一部と、前記第1の流体の残りの間の比は、当該マイクロ流体抵抗ネットワーク内の圧力によって、少なくとも一部が定められることを特徴とする請求項1に記載のマイクロ流体抵抗ネットワーク。
【請求項４】
前記交差型の希釈ステージは、さらに、前記第1のジャンクションを前記第2のジャンクションに結合する中間区画を有することを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一つに記載のマイクロ流体抵抗ネットワーク。
【請求項５】
前記中間区画は、前記第1のジャンクションから前記第2のジャンクションまで延在する長さを有し、前記中間区画では、前記サンプルと前記希釈剤の間の拡散が無視できることを特徴とする請求項4に記載のマイクロ流体抵抗ネットワーク。
【請求項６】
前記ネットワークは、作動時に、前記交差型の希釈ステージに入る前記第1の流体と前記第2の流体のそれぞれの流速の比が、1：5〜5：1の範囲となるように調整されることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一つに記載のマイクロ流体抵抗ネットワーク。
【請求項７】
前記第1のマイクロ流体出口チャネルは、前記交差型の希釈ステージよりも下流の混合ステージと流体連通されることを特徴とする請求項1乃至6のいずれか一つに記載のマイクロ流体抵抗ネットワーク。
【請求項８】
前記交差型の希釈ステージは、一連の直列接続された交差型の希釈ステージの一つであり、
前記第2のマイクロ流体チャネルは、複数のブランチを有し、
該ブランチの各々は、前記一連の前記交差型の希釈ステージの一つの前記入口の一つを提供し、
前記一連の前記第1の交差型の希釈ステージの他の入口は、前記第1のマイクロ流体チャネルに結合され、
前記残りの交差型の各々の希釈ステージの他の入口は、前記一連の前述の交差型の希釈ステージの前記第1のマイクロ流体出口チャネルに結合されることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一つに記載のマイクロ流体抵抗ネットワーク。
【請求項９】
体液分析システム用の使い捨て式カートリッジであって、
請求項1乃至8のいずれか一つに記載のマイクロ流体抵抗ネットワークを有することを特徴とする使い捨て式カートリッジ。
【請求項１０】
マイクロ流体装置であって、
請求項1乃至8のいずれか一つに記載のマイクロ流体抵抗ネットワークと、
前記第1のマイクロ流体出口チャネルと流体連通されたサンプルチャネルを有する測定装置と、
を有し、
前記サンプルチャネルは、測定手段を有することを特徴とするマイクロ流体装置。
【請求項１１】
前記測定手段は、インピーダンス測定を実施するため、第1の電極組と、該第1の電極組よりも下流の第2の電極組とを有することを特徴とする請求項10に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１２】
当該マイクロ流体装置は、体液分析を行うように適合されることを特徴とする請求項10または11に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１３】
さらに、前記測定手段は、ヘモグロビン算定を測定するための光学測定セルを有することを特徴とする請求項10乃至12のいずれか一つに記載のマイクロ流体装置。
【請求項１４】
当該マイクロ流体装置は、使い捨て式カートリッジを有し、
前記マイクロ流体抵抗ネットワークは、前記使い捨て式カートリッジに形成されていることを特徴とする請求項10乃至13のいずれか一つに記載のマイクロ流体装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル入口と流体連通する第1のマイクロ流体チャネルおよび希釈剤入口と流体連通する第2のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体抵抗ネットワークに関する。
【０００２】
さらに、本発明は、そのようなマイクロ流体抵抗ネットワークを有するマイクロ流体装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘルスケアの分野では、いわゆるポイントオブケア（POC）装置の開発がトレンドとなっている。この装置は、小型装置であり、しばしばカートリッジのような使い捨て部材を有し、大型で高価な解析装置の代替として、患者の診断および処置に使用することができる。
【０００４】
広く使用されている診断テストには、全血球算定（FBC）テストがあり、これは、血液の細胞（セル）組成の測定に使用される診断テストである。これは、患者の免疫システムの状態に関する情報、酸素を運搬する血液の機能に関する情報、および／または有効に凝固する血液の機能に関する情報を提供する。例えば、これは、しばしば、「汎用の」診断ツールとして、またはより限定的なモニタリング対策として使用される基本テストである。モニタリングツールとしての全血球算定を含むケアサイクルの一例は、腫瘍、関節炎、およびクローン病を含む。毎年、先進国では、300万ものFBCテストが実施されている。さらに、FBCテストは、化学療法モニタリング、獣医血液分析用途等にも使用されている。
【０００５】
現在、FBCを含む全ての測定は、血液学的分析器として知られる大型の市販の実験設備を用いて自動で実施されている。静脈血の必要性に結びつく、これらの装置の高コストおよび複雑性は、これらが主として大型の中央集中型設備であることを意味する。患者の近くで、特に、疾病の経過および／または処置のモニタリングのため全血球算定が要求される用途において、FBCを実施することに対して明確な臨床的要望がある。
【０００６】
これまで、マイクロ流体のポイントオブケア装置は、FBCの個々の成分を測定できるように開発されてきた。この領域では、Hb測定装置、白血球細胞を識別できるWBCカウンタ、および任意で赤血球のサイズを算定、決定する血小板算定装置が利用できる。現在のセル算定用の血液学的分析は、通常、電気的コールター（coulter）計数法および／または光散乱法を利用し、白血球を算定識別するとともに、赤血球および血小板のサイズを算定決定する。
【０００７】
現在のところ、マイクロ流体コールター計数技術には、僅かの例しかない。ある例では、コールター算定をHb測定に組み合わせる。別の例では、セル算定は、流入インピーダンス測定法によって行われる。これは、フロー血球計算解析法であり、マイクロ流体フォーマットに特に適する。この技術は、溶解血液中のリンパ球、単球、および好中球の間の識別が可能であり、赤血球および血小板の算定および寸法測定が可能である。
【０００８】
Hb測定の現在の「ゴールドスタンダード」は、ヘモグロビンメトリーの標準化II，シアン化ヘミグロビン法、Clin  Chim  Acta，1961，6，p38-44に記載されている、測光シアンメトヘモグロビン法（HbCN）である。この方法は、赤血球の化学的溶解，およびその後の全てのHbのラベル化処理を含み、この処理で、これらのセルはシアン化物イオンとともに放出される。ラベルは、最大540nmの定められた吸収プロファイルを生成する。540nmでの光吸収を測定することにより、Hb濃度を決定することができる。また、HbCNの高安定性により、較正標準を供給することが容易となる。
【０００９】
最も一般的な赤血球溶解／シアン化変換試薬は、ドラブキン（Drabkin）試薬として知られている。ドラブキン試薬は、シアン化カリウムを含み、これは極めて有毒である。この試薬は、全血液に対して極めて低濃度に希釈してのみ有効となる（1：251）。これは、赤血球溶解は、浸透圧衝撃が生じるような試薬の低いイオン強度に依存しているからである。この大幅な希釈により、この方法には固有の不正確性が生じる。また、540nmでの光吸収を測定するには、〜1cmの、極めて長い光路長が必要となる。さらに、ある病理学上のサンプルでは、濁度によって光吸収の読み取りに誤差が生じ、これが不正確なHb濃度につながる。
【００１０】
有毒性および濁度に関する問題を回避するため、Hb測定用の多くの他の光学手段が開発されている。既知のポイントオブケア装置は、アジ化ナトリウムを使用して、Hbをアジ化物配位Hb誘導体に変換する（アジドメトヘモグロビン、HbN3）。乾燥試薬では、血液全体に対して希釈する必要がないため、この方法自体は、吸収スペクトルの短路化（0.1mm）に役立つ。2つの吸収読み値によって、HbN3濃度が定められる。すなわち吸収最大値（565nm）での値と、濁度の補正のための800nmでの値である。
【００１１】
ポイントオブケアWBC／Hb算定器の場合、RBC溶解液が調製され、この液は、WBCを保存するとともに、Hb分子をイミダゾールでラベル化する。前述の方法と同様の方法により、2つの波長において、イミダゾールでラベル化されたHb種の光吸収が測定される。一つは、吸収ピークでの値であり、他方は、濁度と、白血球の散乱効果との補正用である。同じ溶液がコールター算定器を通過し、セル算定が実施される。
【００１２】
別の既知の溶解／Hb変換試薬は、ラウリル硫酸ナトリウム／ドデシル硫酸ナトリウム
（SLS／SDS）に基づくものである。SDSは、全ての血液セルを溶解し、Hbをラベル化し、SDS配位誘導体が得られる。SDSは、界面活性剤分子であり、濁度補正が必要ではないため、535nmでの単一の吸収読み値から、Hb濃度が決定される。この方法は、高希釈のHbを想定しており、HbCN測定において存在する固有の不正確性は、HbSDS測定でも同様に残る。
【００１３】
前述の全ての装置および技術では、指に指した血液から、特定の測定を実施できる。しかしながら、前述の装置および技術では、単一のPOC測定において、FBCに必要な全てのパラメータを測定することは難しい。最近、国際公開第WO2010／086786号に、単一のPOC測定において、FBCを実施することが可能なマイクロ流体装置が開示された。このマイクロ流体装置は、2つのサンプル準備ステージを有する。一つのステージでは、白血球算定のため、血液サンプルの一部が溶解剤および急冷溶液で希釈され、希釈された部分がインピーダンス測定手段に提供される。第2の希釈ステージでは、ヘモグロビン測定のため、血液サンプルの別の部分が希釈剤で希釈され、希釈された別の部分が、RBC算定、HB算定、および血小板算定のような、赤血球の特性を定める測定手段に提供される。希釈剤は、数回（すなわち、マイクロ流体抵抗ネットワークの異なる点で）、血液サンプルに供給され、高い希釈比が得られる。その結果、RBC算定サンプルの一部のみが実際のRBC算定に使用され、各種希釈ステージの90％を超える部分は、廃棄のため排出される。
【００１４】
国際公開第WO2010／086786号に記載されているマイクロ流体装置にあるような、抵抗マイクロ流体ネットワークでは、サンプルの希釈は、サンプルを輸送するマイクロ流体チャネルと、溶解剤または冷却溶液のような希釈剤を輸送するマイクロ流体チャネルの間に、ブランチを提供することにより行われる。その結果、主要チャネル（希釈剤チャネル）と、主要チャネルから分岐した第2のチャネル（サンプルチャネルの分岐）を有する、Y型の希釈ステージが得られる。さらなる希釈のため、そのようなY型のブランチを使用して、希釈されたサンプルの極僅かが分岐されるが、希釈されたサンプルのバルク部分は、廃棄のため排出される。
【００１５】
理論的には、必要な希釈比を得るため、それぞれのマイクロ流体チャネルの寸法を調整して、所与の時間の間にチャネルを通過する体積を低減させることは可能である。しかしながら、ほとんどの製造プロセスでは、そのようなチャネルの寸法を、製造プロセスによって定められるある限界未満にまで小さくすることを実際に実現することは難しい。そのような状況では、正確な流体量を分岐させるため、ブランチを通る流速を、例えばブランチの流体抵抗を調整することにより、低減させる必要がある。
【００１６】
しかしながら、そのような低流速に関する問題は、抵抗マイクロ流体ネットワークを介して流体を流す始動時に、前述のブランチのような低流速を示すネットワークのこれらの部分において、気泡がトラップされることである。これにより、マイクロ流体装置の初期化の期間が延びる。気泡は、装置が使用状態となる前に、装置から除去される必要があるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第2010／086786号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、始動時にトラップされる気泡のリスクが少なくとも抑制される、マイクロ流体ネットワークを提供することを目的とする。
【００１９】
さらに、本発明では、そのような抵抗マイクロ流体ネットワークを有するマイクロ流体装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第1の態様では、マイクロ流体抵抗ネットワークが提供され、このマイクロ流体抵抗ネットワークは、
第1の流体入口と流体連通された第1のマイクロ流体チャネルと、
第2の流体入口と流体連通された第2のマイクロ流体チャネルと、
を有し、
当該マイクロ流体抵抗ネットワークは、さらに、第1の希釈ステージ入口としての前記第1のマイクロ流体チャネルと、第2の希釈ステージ入口としての前記第2のマイクロ流体チャネルと、を有する交差型の希釈ステージを有し、
前記第1の希釈ステージ入口および第2の希釈ステージ入口は、第1のジャンクションを構成し、
前記希釈ステージは、さらに、前記第2の流体で希釈された前記第1の流体の一部を提供する第1のマイクロ流体出口チャネルと、前記第1の流体の残りを受容する第2のマイクロ流体出口チャネルと、を有し、
前記第1のマイクロ流体出口および前記第2のマイクロ流体出口は、前記第1のジャンクションの反対側に、第2のジャンクションを形成することを特徴とする。
【００２１】
本発明は、サンプルのような第1の流体は、X型の希釈ステージにおいて正確に希釈されるという認識に基づくものである。このX型の希釈ステージでは、出口チャネルは、第2の流体、例えば希釈剤ストリームの全体と、第1の流体ストリームの一部とが第1のマイクロ流体出口チャネルに供給され、第1の流体ストリームの残りが第2のマイクロ流体出口チャネルに供給されるように寸法化される。その結果、例えば、サンプルの一部を希釈ステージに提供するため、低流速に調整された第1のマイクロ流体チャネルからチャネルを分岐させる代わりに、第1の流体の全体積がX型希釈ステージに提供され、過度の低流速チャネルの必要性がなくなり、従って、気泡がトラップされるリスクが軽減される。第1のマイクロ流体出口チャネルおよび第2のマイクロ流体出口チャネルに分岐される適当な量の流体は、それぞれ、マイクロ流体抵抗ネットワーク内の圧力（抵抗）を調整することによって得られる。
【００２２】
ある実施例では、前記第1のジャンクションは、中心点を有し、該中心点では、前記第1のマイクロ流体チャネルと前記第2のマイクロ流体チャネルのそれぞれの側壁が出会い、
前記中心点を通る虚軸は、前記第1のマイクロ流体チャネルと前記第2のマイクロ流体チャネルの間の角度を分割し、
前記第2のジャンクションは、別の中心点を有し、該別の中心点では、前記第1のマイクロ流体出口チャネルと前記第2のマイクロ流体出口チャネルのそれぞれの側壁が出会い、
前記別の中心点は、前記虚軸に対して所定の距離で配置される。
【００２３】
X型希釈ステージに導入される2つの流体ストリームは、相互に分離されたまま維持される。分離境界は、第1のジャンクションを分離する軸によって定められ、すなわち第1のジャンクションの中心点を通る虚軸は、第1のマイクロ流体チャネルと第2のマイクロ流体チャネルの間の角度を2つに分離する。この流体ストリーム境界に対して所定の距離で、第2のジャンクションの別の中心点を設置することにより、前記別の中心点は、第1の流体ストリーム、例えばサンプルストリームの経路の内側に位置するようになり、前記別の中心点は、第1の流体ストリームの分割器として機能し、第1の流体の主要部分は、出口チャネルの一つに分岐され、第1の流体の残りと第2の流体ストリームは、他の出口チャネルに分岐される。このように、極めて簡単かつ正確に、サンプルのような流体の希釈が行われる。この実施例は、高流速、すなわちレイノルド数R≧1を有する流速の流体ストリームにおいて、特に有益である。流速が小さくなると、前述のマイクロ流体抵抗ネットワークの圧力の調整により、同じ技術的効果を得ることが可能になる。
【００２４】
交差型の希釈ステージは、さらに、第1のジャンクションを第2のジャンクションに結合する中間区画を有することが好ましい。そのような中間区画により、第1の流体流と第2の流体流の間に、より確実に平衡流プロファイルが得られるようになり、希釈ステージの設計が簡単になる。
【００２５】
中間区画は、第1のジャンクションから第2のジャンクションまで延在する長さを有することが好ましく、前記中間区画では、第1の流体と第2の流体の、実質的に相互の分離が維持され、ジャンクションでの滞留時間は、流体が相互に顕著に拡散する時間に比べて短くなる。その結果、希釈率は、単に、第2のジャンクションの中心点の位置によって、あるいはマイクロ流体抵抗ネットワークの圧力を調整することによって、定められる。
【００２６】
マイクロ流体抵抗ネットワークは、作動時に、交差型の希釈ステージに挿入される第1および第2の流体のそれぞれの流速の比が、1：5〜5：1の範囲となるように調整されることが好ましい。第1のマクロ流体チャネルおよび第2のマイクロ流体チャネルの寸法が、この範囲外の流速が生じるように選定された場合、低流速チャネルにおいて、抵抗マイクロ流体ネットワークの始動時に、気泡のトラップに対する感度が高まることが見出されている。
【００２７】
ある実施例では、第1のマクロ流体出口チャネルは、前記交差型の希釈ステージよりも下流の混合ステージと流体連通される。そのような混合ステージによって、第1の流体部分と第2の流体部分とが適正に混合されるようになり、あるいは例えば、サンプル中の細胞（セル）物質を溶解する溶解剤を含む希釈剤の場合、混合ステージの出口で、第1の流体の一部と第2の流体の間で意図した反応が完遂するようになる。
【００２８】
好適実施例では、交差型の希釈ステージは、一連の直列接続された交差型の希釈ステージの一つであり、第2のマイクロ流体チャネルは、複数のブランチを有し、該ブランチの各々は、前記一連の前記交差型の希釈ステージの一つの前記入口の一つを提供し、前記一連の前記第1の交差型の希釈ステージの他の入口は、前記第1のマイクロ流体チャネルに結合され、前記残りの交差型の各々の希釈ステージの他の入口は、前記一連の前述の交差型の希釈ステージの前記第1のマイクロ流体出口チャネルに結合される。これは、単一の入口に希釈剤を提供し、この希釈剤を複数の交差型の希釈ステージに供給し、これらの各ステージのサンプルをさらに希釈することにより、サンプルに高い希釈率が得られる点で有意である。そのようなマイクロ流体抵抗ネットワークは、例えば、国際公開第WO2011／086786号に記載のマイクロ流体装置のような、単一ステップのFBC分析用のマイクロ流体装置に使用することができる。
【００２９】
本発明のマイクロ流体抵抗ネットワークは、体液分析システム用の使い捨て式カートリッジ内に装着されても良い。当該マイクロ流体抵抗ネットワークは、例えば、適当な高分子材料においてマイクロ流体抵抗ネットワークを具体化することにより、比較的低コストで製造されるため、経済的に実現可能な方法で、多用途の体液分析システムを提供することができる。ある実施例では、カートリッジは、さらに、希釈されたサンプルに対して所望の測定を実施する測定チップを有しても良い。
【００３０】
本発明の別の実施例では、本発明の一実施例によるマイクロ流体抵抗ネットワークと、第1のマイクロ流体出口チャネルと流体連通されたサンプルチャネルを有する測定装置とを有するマイクロ流体装置が提供される。前記サンプルチャネルは、測定手段を有する。そのようなマイクロ流体装置は、本発明のマイクロ流体抵抗ネットワーク内での気泡のトラップに対する危険性が抑制されることにより、始動時間を抑制することができ、不具合のリスクを低減することができる点で有意である。
【００３１】
ある実施例では、測定手段は、インピーダンス測定を実施するため、第1の電極組と、該第1の電極組よりも下流の第2の電極組とを有する。そのような測定手段は、例えば、サンプルが血液サンプルの場合、インピーダンス測定により、例えばRBCまたはWBC算定のような、血液セル算定を実施することに適する。
【００３２】
ある実施例では、マイクロ流体装置は、さらに、ヘモグロビン算定を測定するための光学測定セルを有し、マイクロ流体装置は、単一ステップのFBC分析に使用されても良い。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】マイクロ流体装置を概略的に示した図である。
【図２】インピーダンス測定チップおよびそのようなチップで形成される信号を概略的に示した図である。
【図３】従来の希釈ステージを概略的に示した図である。
【図４】本発明の実施例による希釈ステージを概略的に示した図である。
【図５】ビデオ実証から、本発明の希釈原理を示した図である。
【図６】本発明の実施例によるマイクロ流体装置を概略的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
添付図面を参照して、非限定的な例により、本発明の実施例について詳しく説明する。
【００３５】
図面は、単に概略的に示されており、スケールは示されていないことに留意する必要がある。また、図面を通じて、同じまたは同様の部分を示す際に、同じ参照符号が使用されていることに留意する必要がある。
【００３６】
本発明は、マイクロ流体ネットワーク、および単一の部材としての測定ステージを有するマイクロ流体装置に関する。また、本発明は、複数の別個の部材、特に、使い捨てカートリッジの形態であっても良い、マイクロ流体抵抗ネットワーク、および別個の測定チップを有するマイクロ流体装置に関する。マイクロ流体抵抗ネットワークは、サンプルを調製する目的を有し、調製されたサンプルは、測定チップに提供される。本願において、「マイクロ流体」と言う用語は、形状的に小さな、典型的には、例えばμl、nl、pl、fl体積のような、サブミリリットルの体積スケールに拘束される流体の挙動、流体の正確な制御および操作に関する。
【００３７】
図1には、そのようなマイクロ流体装置10の非限定的な一例を概略的に示す。この装置は、使い捨て式のマイクロ流体抵抗ネットワーク20、および測定チップ50を有する。マイクロ流体抵抗ネットワーク20は、サンプル入口22で、FBCサンプルのようなサンプルを受容するように構成される。マイクロ流体抵抗ネットワーク20は、さらに、希釈剤を受容する希釈剤入口24を有し、これは、3つの異なるブランチに分岐される。第1のブランチは、サンプル入口22でサンプルと混合され、その後、例えばスネークステージのような、サンプル混合または希釈ステージ34に供給される。一方、第2のブランチは、ジャンクション36において、サンプルをさらに希釈するために使用される。通常、ジャンクション36は、例えば国際公開第WO2010／086786号に記載されているような特定の方法で、希釈剤によりサンプルの所望の希釈率が得られるように形状化される。例えばマイクロ流体スネークステージである、サンプル希釈ステージ38は、サンプルが所定の時間の間、例えばサンプルの希釈が完了するのに必要な期間、希釈剤と接触するように構成され、必要な流体抵抗を提供する。
【００３８】
ジャンクション36では、希釈ステージ34から受容された希釈サンプルの相当の部分が、排出チャネル43に供給される一方、希釈されたサンプルの一部（少量）は、希釈入口24の第2のブランチからの希釈剤と混合され、サンプル希釈ステージ38に供給される。ジャンクション40では、サンプル希釈ステージ38内の希釈されたサンプルは、再度、排出チャネル44に供給される部分が分離され、残りの部分は、希釈入口24の第3のブランチから受容される希釈剤によってさらに希釈され、その後、測定チャネル42を介して測定チップ50に供給される。前述の理由により、ジャンクション40と測定チップ50の間に、スネークステージ（図示されていない）が設けられても良い。通常、ジャンクション40は、サンプル希釈ステージ38から受容される希釈サンプルが希釈剤により所望の希釈率となるように、特定の方法で形状化される。希釈剤の好適実施例は、例えば、国際公開第WO／2010／086786号に記載されている。前述のように、希釈剤と混合されたサンプルの一部を輸送するこれらのジャンクションのチャネルを通る流速は、サンプルの大部分が廃棄のため排出され、例えば図1に示した排出チャネル43および44に供給される程度まで、減少させる必要がある。しかしながら、これは、前述のように、低流速チャネルに気泡がトラップされるリスクを高める。
【００３９】
図1に示すマイクロ流体装置10は、FBCサンプルの処理およびその後の分析に特に適する。しかしながら、マイクロ流体抵抗ネットワーク20の構成は、異なるタイプのサンプル、例えば尿または唾液サンプル、および非医療評価用サンプル、例えば環境サンプル、食物サンプル等の調製のため、変更されても良いことは当業者には理解される。
【００４０】
図2には、インピーダンス測定チップ50をより詳しく示す。そのようなインピーダンス測定配置の詳細な記載は、「インピーダンス測定フロー血球算定：オンチップのラベルフリーセル識別」，Cheung，K．，S．Gawad，P．Renaud，Cytometry  A，2005．65(2)：p124-132に認められる。図2には、励起電極52、62と検出電極54、64の間を通るサンプルセル80、およびチップ50を通るマイクロ流体チャネルの側面図を示す。励起電極52および検出電極54は、第1の電極組を構成し、励起電極62および検出電極64は、第2の電極組を構成する。
【００４１】
励起電極52、62は、それぞれ、電流入力信号源58、68、例えば交流または直流の入力信号源に接続される。電極での電解を抑制するため、交流入力信号源が好ましい。ある実施例では、励起電極52、62は、同じ交流入力信号源を利用する（すなわち58＝68）。検出電極は、通常、異なる電位検出回路70に接続され、これは、検出電極をほぼ設置電位に維持することが好ましい。第1および第2の電極組の間の流体を通過する電流は、増幅され、その差異は、いかなる適当な方法で、例えば既知のアナログ電子機器を用いて定められても良い。得られる（交流）信号の同相および異相部分は、標準的なロックイン技術を用いて測定される。電極間を通過する粒子がない場合、測定信号は、理想的にゼロとなるが、実際には、チップの非対称性のため、および電子部材の起こり得る精度不足のため、常時ずれが存在する。左側から来る粒子が第1の電極組を最初に通過すると、第2の電極組は、第1の電極組の参照電極として機能するため、正のほぼガウシアン状の信号が形成される。その後、粒子が第2の電極組を通過すると、第1の電極組が第2の電極組の参照電極として機能するため、負のガウシアン状の信号が形成される。図2には、得られる逆対称ダブルガウシアン信号形状が示されている。セル信号は、両方の電極組の間の電流差を測定するロックイン増幅器の出力であっても良い。この方法では、例えばRBCまたはWBCなどの、異なるセル用のインピーダンス測定法が実施される。
【００４２】
マイクロ流体装置10のマイクロ流体抵抗ネットワーク20において、希釈剤によるサンプルの希釈は、通常、図3に示すように行われる。例えば血液サンプルを受容するための
第1のマイクロ流体チャネル82は、サンプル入口22と流体連通される。第1のマイクロ流体チャネル82は、ブランチ83を有し、このブランチは、第1のマイクロ流体チャネル82を、希釈剤入口24と流体連通された第2のマイクロ流体チャネル84に接続する。マイクロ流体抵抗ネットワーク20は、サンプルの一部のみが第1のマイクロ流体チャネル82から第2のマイクロ流体チャネル84に迂回されるように調整される。これは、ネットワークの全ての他のラインに沿って、抵抗を調整することにより行われても良い。生じる圧力差は、流れおよび抵抗により平衡化される。図3には、従来の希釈ステージを通る流体の一例としての流速を示す。流速（単位μl／s）は、流体流の方向を表す各矢印の頂上部に示されている。従って、図3から明らかなように、第1のマイクロ流体チャネル82を通るサンプルのわずか1％の流れが、マイクロ流体抵抗ネットワーク20の調整により、第2のマイクロ流体チャネル84の方に分岐される。通常、サンプルのバルク（図3の例では99％）は、使用されず、これは、第1のマイクロ流体チャネル82において、ブランチ83よりも下流の39.6μl／sの流速によって表されているように、廃棄のため排出される。
【００４３】
そのような希釈ステージの問題は、乾燥状態からマイクロ流体抵抗ネットワーク20の始動の際に、ブランチ83内で気泡がトラップされることを回避することが難しいことである。これは、ネットワーク20は、ブランチ82および84よりも小さな寸法のブランチ83を提供することにより、あるいはブランチ83にわたって小さな圧力低下を提供することにより、ブランチ83を通るだけの小さな流速、例えば図3の例で示されているように、0.4μl／sの流速が生じるように調整されているためである。
【００４４】
本発明では、図4に示すような一実施例としての新たな希釈ステージ構造を提供することで、この問題に対処する。図3に示した従来の希釈ステージ構造に比べて、本発明の希釈ステージでは、被希釈流体、例えばサンプルを希釈ステージに供給する前に、この一部を分離する必要はない。代わりに、交差型の（すなわちX型の）希釈ステージ100は、第1のマイクロ流体チャネル112、例えばサンプルチャネルによって形成された第1の入口と、第2のマイクロ流体チャネル114、例えば希釈剤チャネルによって形成された第2の入口とを有する。第1のマイクロ流体チャネル112および第2のマイクロ流体チャネル114は、希釈ステージ100の第1のジャンクション110を定め、中心点116は、第1のマイクロ流体チャネル112と第2のマイクロ流体チャネル114の間の交点を定める；換言すれば、中心点116は、第1のマイクロ流体チャネル112と第2のマイクロ流体チャネル114の側壁が出会う位置を定める。完全化のため、図1に示したマイクロ流体抵抗ネットワーク20のサンプル入口と希釈剤入口のように、第1のマイクロ流体チャネル112は、入口22と流体連通され、第2のマイクロ流体チャネル114は、入口24と流体連通されることに留意する必要がある。
【００４５】
虚軸118は、第1のマイクロ流体チャネル112と第2のマイクロ流体チャネル114の間の角度αを分離し、すなわち、虚軸118と第1のマイクロ流体チャネル112および第2のマイクロ流体チャネルの一方の間の角度がα／2となるようにαを分割する。第1のマイクロ流体チャネル20と第2のマイクロ流体チャネル114を通る流速が異なる必要がある場合、第1のマイクロ流体チャネル112と第2のマイクロ流体チャネル114は、異なる寸法を有しても良いことに留意する必要がある。しかしながら、第1のマイクロ流体チャネル112を通る流速と、第2のマイクロ流体チャネル114を通る流速の比は、μl／s単位で、5：1〜1：5の範囲にあることが好ましい。この範囲から逸脱する比の場合、小さな流速のマイクロ流体チャネルが気泡をトラップする傾向が強まるため、そのような気泡が再度トラップされる危険性が高まることが認められている。
【００４６】
虚軸118は、第1のマイクロ流体チャネル112から流れる第1の流体、例えば血液サンプルまたは別の適当なサンプルと、第2のマイクロ流体チャネル114から流れる第2の流体、例えば希釈剤の間の境界を定める。第1の流体の第2の流体への拡散またはその逆の拡散が無視できるように、すなわち2つの流体ストリームの（顕著な）混合が生じないように、希釈ステージ100を寸法化することは重要である。その結果、希釈ステージ100を通る第1の流体と第2の流体の間で、適正に定められた界面が維持され、この界面は虚軸118と一致する。
【００４７】
希釈ステージ100は、さらに、第2のジャンクション120を有する。このジャンクションは、第1のジャンクション110の反対側に設けられる。第2のジャンクションは、第1のマイクロ流体出口チャネル122と、第2のマイクロ流体出口チャネル124とを有し、中心点126は、第1のマイクロ流体出口チャネル122と第2のマイクロ流体出口チャネル124の間の交点を定める。換言すれば、中心点126は、第1のマイクロ流体出口チャネル122と第2のマイクロ流体出口チャネル124の側壁が出会う位置を定める。第1のマイクロ流体出口チャネル122および第2のマイクロ流体出口チャネル124が異なる出口流速を形成する場合、第1のマイクロ流体出口チャネル122は、第2のマイクロ流体出口チャネル124とは異なる寸法を有する。ここでも、これらの流速間の比は、単位μl／sの範囲で、出口流速の5：1〜1：5の範囲にあることが好ましい。比がこの範囲から外れる場合、小さな流速のマイクロ流体出口チャネルがそのような気泡のトラップに対してより感度を示すようになることから、気泡がトラップされる危険性が高まることが認められている。
【００４８】
第1の流体の一部を第1のマイクロ流体出口チャネル122に分岐させるため、中心点126は、該中心点126が第1のマイクロ流体出口チャネル112から生じる流体ストリーム、例えば血液サンプルの経路の内側となるように、虚軸118に対して配置される。その結果、中心点126は、第1の流体ストリームの一部を第1のマイクロ流体出口チャネル122に迂回させることにより、第1の流体ストリームのくさびとして機能し、一方、第1の流体ストリームの残りは、第2のマイクロ流体出口チャネル124に分岐されるようになる。図4に示されているように、オフセットパラメータr（すなわち、ずれた距離r）の値は、第1のマイクロ流体チャネル112から生じる第1の流体の、第1のマイクロ流体出口チャネル122に分岐される部分のサイズを定める。第2のマイクロ流体チャネル114から生じる第2の流体ストリーム、例えば希釈剤は、完全に第1のマイクロ流体出口チャネル122に供給されることが理解される。中心点126の位置は、この流体の流れと干渉しないためである。
【００４９】
希釈ステージ100は、任意で、中間区画130を有しても良く、この区画は、第1のジャンクション110を第2のジャンクション120から分離する。そのような中間区画130は、希釈ステージ100を通って流れる流体の流れプロファイルが確実に平衡に達する点で有益である。中間区画130の長さ、すなわち第1のジャンクション110と第2のジャンクション120の間の分離距離は、第1の流体の第2の流体への拡散およびその逆の拡散が無視できるように選定されることが好ましい。
【００５０】
この点に関し、図4に示した交差型のジャンクション100の実施例は、本発明の非限定的な例であることが強調される。図4に示した特定の構造、すなわち第1のジャンクション110と第2のジャンクション120の間のずれを用いて、サンプルの一部を第1のマイクロ流体出口チャネル122に分岐させる構造は、例えばReが少なくとも約1である流速のような、比較的高流速が維持されるジャンクションに対して、特に適する。小さな流速（Re≪1）では、ジャンクション110と120の間のずれは、無視され、第1のマイクロ流体出口チャネル122に分岐されるサンプルの必要な部分は、交差型ジャンクション100を有するマイクロ流体抵抗ネットワーク20のそれぞれのチャネルの圧力（抵抗）を調整することにより、正確に定められる。
【００５１】
図5には、本発明の実施例による希釈ステージ100のビデオ映像からのフレームを示す。明確化のため、中間ステージ130と第2のジャンクション120のみが示されている。図5から明らかなように、暗い液体ストリーム（血液）および明るい流体ストリーム（フィルタ化生理食塩水バッファによって形成された希釈剤）は、中間ステージ130を通って平行して流れ、この段階では混合は生じない。第2のジャンクション120の中心点126は、血液ストリームの内側に配置され、血液サンプルの少しの部分が、希釈剤の完全な流れとともに、底部のマイクロ流体出口チャネルに分岐される。図5において、血液サンプルの一部は、白い矢印で示されている。血液サンプルの分岐流は、約35s間のビデオ撮影された希釈実験の間を通じて、一定の流速に維持されていることが認められる。これにより、本発明のマイクロ流体抵抗ネットワーク20の希釈ステージ100の精度が明確に示された。
【００５２】
1または2以上の希釈ステージ100を有するマイクロ流体抵抗ネットワーク20は、国際公開第WO2010／086786号に記載されたマイクロ流体装置のような、いかなる適当なマイクロ流体装置に組み込まれても良い。図6には、本発明の一実施例によるマイクロ流体装置200の非限定的な例が示されている。マイクロ流体装置200は、単一の血液サンプルに対してFBCを実行するように構成される。このため、マイクロ流体装置200は、ギ酸／サポニン混合物のようなWBC溶解剤を受容する入口25を有する、図1に示したような赤血球を溶解するWBC溶解ステージにおける第1の血液サンプル入口22と、溶解サンプルを冷却して白血球の溶解を防止する冷却剤を受容する入口26とを有する。適当な冷却剤の非限定的な例は、NaCl／NaHCO3溶液である。溶解ステージは、いかなる適当な数のスネークステージを有しても良い。2つのスネークステージ35、37は、非限定的な例として示されている。溶解ステージの出口チャネル46は、測定チップ50に接続され、非限定的な例では、これは、図2に示したような、それぞれ、WBC算定とRBC／血小板分析用の、2つの測定チャネルを有する測定チップであっても良い。
【００５３】
さらに、マイクロ流体装置200は、第2の血液サンプル入口22’を有し、これは、赤血球／血小板の処理ステージに接続される。第1の血液サンプル入口22および第2の血液サンプル入口22’は、単一の血液サンプル入口（図示されていない）の別個のブランチであっても良く、あるいは別個の血液サンプル、例えば同じ血液サンプルの別個の部分、を用いて、独立に供給されても良い。血液セル／血小板処理ステージは、さらに、希釈サンプル入口24を有し、これは、多くのブランチに分割される。非限定的な例として、3つのブランチが示されている。いかなる適当な数を選定しても良いことが理解されることに留意する必要がある。第1のブランチには、血液サンプル入口22’が供給され、ここに導入された血液サンプルは、所定の比、例えば20：1に希釈される．第2および第3のブランチには、本発明の交差型のジャンクションの実施例、すなわち、それぞれ、ジャンクション100および100’が接続され、ここで希釈剤が血液サンプルと混合される。2つのそのような直列接続されたジャンクションが示されているが、ここでも、本発明の一連の直列接続された交差型ジャンクションは、いかなる適当な数のそのようなジャンクションを有しても良いことは明らかである。結果的に、少量の希釈剤で大きな希釈率が得られ、マイクロ流体装置200において、いかなる希釈剤も排気されない。
【００５４】
ジャンクション100および100’の各々は、全ての導入希釈剤を用いて、導入サンプルの少量の混合物が形成される第1の出力、すなわち、それぞれ、出力122および122’と、それぞれが導入サンプルのみの多くの部分を含み、実質的に廃棄ストリームを形成する第2の出力124および124’とを有する。これらのジャンクション100および100’での混合比は、先に図4および図5を用いてより詳しく説明されている方法で得られる。各種流体チャネルは、例えばステージ34、38のような、1または2以上のスネークステージを有しても良く、これらは、良く知られているように、流体チャネルの流体抵抗、および混合比を調整するように導入されても良い。ジャンクション100’のサンプル出力122は、赤血球算定を測定する測定チップ50のサンプルチャネルに接続されても良い。一方、ジャンクション100および100’の廃棄出力124および124’は、結合され、廃棄に接続されても良い。図6では、結合された排出チャネルは、測定チップ50を介して接続されるが、これは完全に任意である。
【００５５】
図6において、第1のジャンクション100からの排出チャネル124は、Hb吸収測定用の血液サンプルの未使用部分を準備するための光学測定セルを含むHbサンプルチャンバ230に向かって分岐される。Hbサンプルチャンバは、Hb測定実施のため、血液サンプルを溶解しラベル化する、乾燥形態のいくつかの試薬を含有しても良い。この配置では、Hb吸収測定のため、少量の血液サンプルのみがラベル化されれば良く、これは、ラベル化試薬が、例えばシアン化合物を含むような有毒の場合、有意である。これらは必要な分だけHbに結合される。
【００５６】
図6には、本発明のマイクロ流体装置200の非限定的な例が示されていることが指摘される。マイクロ流体装置200は、例えば、国際公開第WO2010／086786号に記載のマイクロ流体装置であっても良い。図6において、サンプルの一部は、調製ステージ230において、Hb測定準備のためRBC算定準備ステージに分岐される。Hbサンプル準備のためWBC算定準備ステージからサンプルの一部を分岐させることは容易であることが理解される。あるいは、マイクロ流体装置200は、血液サンプル入口22から、3つの別個のブランチが形成されるように配置され、すなわち一つのブランチは、RBC／血小板算定サンプル調製用であり、一つのブランチは、WBCサンプル調製用であり、一つのブランチは、Hb測定サンプル調製用である。他の変更例は、当業者には明らかである。測定チップ50は、例えば、インピーダンス測定チップ50であり、別個の部材であっても良く、例えばマイクロ流体抵抗ネットワーク20およびインピーダンス測定チップ50は、異なる製造プロセスで製造されても良い。これは、コストの点から好ましい。なぜならインピーダンス測定チップ50に必要な解像度は、通常、マイクロ流体抵抗ネットワーク20に必要な解像度よりも高いからである。図2に示すような電極配置を有する測定チップ50は、ガラス基板内に実現されることが好ましいが、マイクロ流体抵抗ネットワーク20は、高分子材料内の使い捨て式カートリッジとして実現されることが好ましい。しかしながら、マイクロ流体抵抗ネットワーク20と同じプロセスで、測定チップ50を製造するようにすることも等しく可能である。
【００５７】
希釈ステージ100’の第2のマイクロ流体出口チャネル124’は、整合素子（図示されていない）を有し、第1のマイクロ流体出口チャネル122と第2のマイクロ流体チャネル124が同じオーダの流体抵抗を示すように、第2のマイクロ流体出力チャネル124の流体抵抗を、測定チップ50を通るサンプルチャネルと整合させても良い。これは、測定チップ50を通るサンプルチャネルの寸法は、通常、第1のマイクロ流体出口チャネル122および第2のマイクロ流体出口チャネル124の寸法よりも小さいため、必要である。そのような整合素子がない場合、実質的に全てのサンプルおよび希釈剤は、排出チャネル、すなわち第2のマイクロ流体チャネル124’に向かうようになる。
【００５８】
図6には、本発明のマイクロ流体装置200の非限定的な例が示されていることが指摘される。本発明のマイクロ流体抵抗ネットワーク20の好適適用範囲は、人または獣医診断のFBC分析であるが、本発明は、そのような用途範囲に限定されるものではない。本発明のマイクロ流体抵抗ネットワークは、非限定的な例として、例えば環境サンプル分析または食物サンプル分析用のマイクロ流体装置のような、いかなる好適な用途範囲にも適用できる。
【００５９】
また、マイクロ流体抵抗ネットワーク20は、調整されたマイクロ流体抵抗ネットワーク20、すなわち、マイクロ流体抵抗ネットワーク20の各種部材の寸法が、これらの部材を通る適正に定められた流速が得られるように構成されたネットワークであることが好ましいことが理解される。これは、各種流体ストリームの流速をポンプによって制御する必要がないため、そのようなマイクロ流体抵抗ネットワーク20を最小数のポンプを用いて作動できる点で有意である。
前述の実施例は、本発明を限定するものではなく一例であり、当業者は、特許請求の範囲から逸脱しないで、多くの代替実施例を構成することができることに留意する必要がある。請求項では、括弧内に示されたいかなる参照符号も、請求項を限定するものと解してはならない。「有する」と言う用語は、請求項に記載されたもの以外の素子またはステップが存在することを排斥するものではない。素子の前の「一つの」と言う用語は、そのような素子が複数存在することを排斥するものではない。本発明は、いくつかの識別可能な素子を有するハードウェアにより実施することができる。いくつかの手段が列挙された装置の請求項において、これらの手段のいくつかは、ハードウェアの同じ部品によって実行され得る。単にある手段が別の従属請求項に記載されていることから、それらの手段の組み合わせが有意に利用できないと解してはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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