(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブメタニドまたはその類似体を含有する、耳鳴の治療または予防に使用するための医薬組成物であって、
上記ブメタニドまたはその類似体は、以下の群より選ばれる、医薬組成物；
ブメタニド、ブメタニドアルデヒド、ブメタニドメチルエステル、ブメタニドシアノメチルエステル、ブメタニドエチルエステル、ブメタニドイソアミルエステル、ブメタニドオクチルエステル、ブメタニドベンジルエステル、ブメタニドジベンジルアミド、ブメタニドジエチルアミド、ブメタニドモルフォリノエチルエステル、ブメタニド−３−（ジメチルアミノプロピル）エステル、ブメタニド−Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドエステル、ブメタニド−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミドエステル、ブメタニドピバキセチルエステル、ブメタニドプロパキセチルエステル、ブメタニドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチルエステル、ブメタニドベンジルトリメチルアンモニウム塩およびブメタニドセチルトリメチルアンモニウム塩、ブメタニド［−（Ｃ＝Ｏ）−ＳＨ］チオ酸、ブメタニド−Ｓ−メチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−シアノメチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−エチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−イソアミルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−オクチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−ベンジルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−（モルフォリノエチル）チオエステル、ブメタニド−Ｓ−［３−（ジメチルアミノプロピル）］チオエステル、ブメタニド−Ｓ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミド）チオエステル、ブメタニド−Ｓ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミド）チオエステル、ブメタニド−Ｓ−ピバキセチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−プロパキセチルチオエステル、ブメタニドＳ−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチル］チオエステル、ブメタニド［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−］ベンジルトリメチル−アンモニウムチオ酸塩およびブメタニド［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−］セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、準安定性ブメタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−ＯＨ］チオ酸、ブメタニド−Ｏ−メチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−シアノメチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−エチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−イソアミルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−オクチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−ベンジルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−（モルフォリノエチル）チオエステル、ブメタニド−Ｏ−［３−（ジメチルアミノプロピル）］チオエステル、ブメタニド−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミド）チオエステル、ブメタニド−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミド）チオエステル、ブメタニド−Ｏ−ピバキセチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−プロパキセチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチル］チオエステル、ブメタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−Ｏ−］ベンジルトリメチル−アンモニウムチオ酸塩およびブメタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−Ｏ−］セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、ブメタニドチオアルデヒド、ブメタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−ＳＨ］ジチオ酸、ブメタニドメチルジチオエステル、ブメタニドシアノメチルジチオエステル、ブメタニドエチルジチオエステル、ブメタニドイソアミルジチオエステル、ブメタニドオクチルジチオエステル、ブメタニドベンジルジチオエステル、ブメタニドジベンジルチオアミド、ブメタニドジエチルチオアミド、ブメタニドモルフォリノエチルジチオエステル、ブメタニド−３−（ジメチルアミノプロピル）ジチオエステル、ブメタニド−Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドジチオエステル、ブメタニド−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミドジチオエステル、ブメタニドピバキセチルジチオエステル、ブメタニドプロパキセチルジチオエステル、ブメタニドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチルジチオエステル、ブメタニドベンジルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩およびブメタニドセチルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩。
【請求項２】
１つ以上のカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤、特にはアセタゾラミド、ジクロルフェナミド、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、および／またはメタゾラミドと組み合わせて用いられる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
同時のまたは時間をずらした療法プロトコルにおける共治療プロトコルにおいて、１つ以上のＧＡＢＡ作動性作用物質および／または１つ以上のグリシン作用物質と組み合わせて用いられる、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
１つ以上のカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤および／またはＧＡＢＡ作動性作用物質および／またはグリシン作用物質をさらに含有する、請求項１〜３の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
液状、半液状、または粘質状の形態において提供される、請求項１〜４の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ゲル様状態において提供される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
生物分解性ポリマーを含有する、請求項１〜６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
上記生物分解性ポリマーは、ヒアルロン酸／ヒアルロン酸塩、レシチンゲル、（ポリ）アラニン誘導体、酸化エチレンおよび酸化プロピレンに基づくブロックコポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポロキサマ、キトサン、キシログルカン、コラーゲン、フィブリン、ポリエステル、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）またはそれらの共重合体ＰＬＧＡ、スクロース酢酸イソ酪酸エステル、およびグリセロールモノオレートからなる群より選ばれる、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
上記耳鳴の治療または予防において、全身的または局所的に投与される、請求項１〜８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
上記耳鳴の治療または予防において、局所的に投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
上記耳鳴の治療または予防において、中／内耳の境界面に投与される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
上記耳鳴の治療または予防において、正円窓膜および／または卵円窓膜に投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
上記耳鳴の治療または予防において、耳の上または中へ局所的に投与される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤および／またはＧＡＢＡ作動性作用物質および／またはグリシン作用物質と組み合わせて用いられる、請求項１〜１３の何れか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、耳鳴の治療に関する。より正確には、本発明は、耳鳴の治療に使用するための、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物（塩素イオン共輸送体モジュレータ）に関する。さらに、本発明は、このような塩素イオン共輸送体モジュレータを活性剤として含有する医薬組成物、このような塩素イオン共輸送体モジュレータを投与することによる耳鳴の治療方法、および塩素イオン共輸送体を調節可能な化合物を同定ならびにキャラクタリゼーションするためのスクリーニング方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
１０人のうち１人の成人が耳鳴、すなわち、外部の聴覚刺激によらない音を感知している。さらに、少なくとも１００人に１人の成人が、耳鳴によって睡眠、リラックス、または集中力に対して深刻な影響を受け、また疲労、苛立ち、不安、絶望、失望、または憂鬱な気分になっている。効果が証明された薬物はこれまでないため、耳鳴治療には、満たされていない大きな医療的需要が残されている。多くの試みが行われ、耳鳴の病態を明らかにし、薬理学的治療法および他の治療法を同定したにもかかわらず、これまで、どの試みも治療効果を約束できるほどのものではなかった（Langguth et al., 2009）。
【０００３】
耳鳴は聴覚経路の異なる部分におけるニューロン活動の変化によって起こる、ということが現在まで提唱されてきた（Langguth et al., 2009）。この仮説によると、抑制性の減少および／または興奮性の増大が、聴覚系における興奮性−抑制性の不均衡を生み出す。この不均衡が、聴覚経路において神経系の興奮性亢進を引き起こし、幻聴が聞こえるようになると考えられる。この点において、例えば、騒音への過剰な暴露または聴覚毒性のある薬物によって引き起こされる蝸牛機能障害が、中枢性聴覚構造への導入血液拍出量の減少および中枢性聴覚構造における抑制性の減少につながり、その結果、自発的な興奮頻度が増加することが実験的に示されている（Eggermont and Roberts, 2004）。
【０００４】
これに関連し、中枢性聴覚構造における抑制性のこのような喪失を防ぐ候補メカニズムとして、聴覚経路の代表的な抑制性神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）によって仲介される抑制性の下方制御が提唱されてきた（Bauer and Brozoski, 2007）。同様に、ＧＡＢＡ作動性薬剤の投与も聴覚系の抑制性を高め、耳鳴知覚を和らげると期待されていた。
【０００５】
このような理由から、動物モデルまたは臨床試験における耳鳴治療剤として、様々なＧＡＢＡ作動性薬剤の可能性が試されてきた。より正確には、ベンゾジアゼピンなどのＧＡＢＡＡ受容体リガンド、バクロフェンなどのＧＡＢＡＢ受容体リガンド、バルプロエートなどのＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤、またはガバペンチンなどのＧＡＢＡ類似体が、その耳鳴治療効果について試されてきた。
【０００６】
しかしながら、バクロフェン（Westerberg et al., 1996）またはガバペンチン（Piccirillo et al., 2007）を用いた研究では、何の効果も示されなかった。バルプロエートを用いた実験に基づく証明は矛盾しており、耳鳴を和らげる報告と耳鳴を誘発する報告とがなされている（Menkes and Larson, 1998）。Brozoski et al., 2007は、騒音外傷によって誘発される慢性耳鳴の動物モデルにおいて、別のＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤であるビガバトリンを試験した。耳鳴の行動相関はビガバトリン治療によって可逆的に抑制されるが、これはビガバトリンによる中枢聴覚経路への効果によることが著者らによって説明された。様々なベンゾジアゼピンを用いた臨床試験が行われたが、決定的なものはなかった（Dobie 2004、Langguth et al., 2009）。また、クロナゼパムとガバペンチンとを組み合わせて投与することによって耳鳴の制御に成功したという研究もあるが、ランダム化デザインも対照デザインも行われていない（Shulman et al., 2002）。
【０００７】
ＧＡＢＡをベースとした仮説と同様の論理により、別の代表的な抑制性神経伝達物質であるグリシンによって仲介される抑制性が、耳鳴治療におけるターゲットとして提案されてきた。これに関し、国際公開公報ＷＯ２００９／０８０２６８号において、蝸牛におけるグリシン受容体の存在が開示され、耳鳴治療のためのグリシン作動体の局所投与が教示されている。しかしながら、このようなアプローチが成功していることを証明するデータはこれまで示されていない。しかしながら、グリシンはＮＭＤＡ受容体のグルタメートとの共作動体であるため、反対の作用である興奮作用も有している可能性がある。
【０００８】
以上から、ＧＡＢＡ作動性および／またはグリシン作動性薬剤を用いた効果的な耳鳴治療の臨床的証拠は、提案されている作用メカニズム同様、むしろ混乱を招くものであり、まだ知られていない様々な要因に依存している可能性があることは明白である。
【０００９】
したがって、耳鳴治療に効果のある新規な化合物を得るためには、この分野では、上述した聴覚系の興奮性−抑制性の不均衡の基礎をなすメカニズムをより良く理解することが必要である。
【００１０】
中枢神経系は聴覚系に比べ、はるかに解明が進んでいるが、その中枢神経系において、ＧＡＢＡＡ受容体およびグリシン受容体を介したシナプス電流の強さおよび極性は、これらの受容体が浸透できるイオン（特に、塩素イオンおよび炭酸水素イオン）の膜内外濃度勾配を変更することによって制御可能であることが知られている。例えば、中枢神経系のニューロン内の塩素イオン濃度は通常非常に低い。それゆえ、塩素イオン濃度の小さな変化が膜内外勾配に大きな影響を与えることが考えられ、ＧＡＢＡＡまたはグリシン受容体チャネルを流れるイオン電流がいかに中枢神経系の膜電位を変更するのか、ということに重大な影響を与えている（De Koninck, 2007）。
【００１１】
さらに、中枢神経系における細胞の塩素イオンホメオスタシスは、他の分子成分の間で、カチオン−塩素イオン共輸送体（ＣＣＣ）およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換体によって維持されることが知られている（De Koninck, 2007）。哺乳類のＣＣＣファミリーは、Ｓｌｃ１２ａｌ−９遺伝子によってコードされた９つのファミリーメンバーからなる（Blaesse et al., 2009）。機能面から考えると、ＣＣＣはＮａ−Ｋ−２Ｃｌ共輸送体（ＮＫＣＣ、アイソフォームＮＫＣＣ１、およびＮＫＣＣ２）、Ｎａ−Ｃｌ共輸送体（ＮＣＣ）、およびＫ−Ｃｌ共輸送体（ＫＣＣ、アイソフォームＫＣＣ１−４）の３つのカテゴリーに分類される。中枢神経系のニューロンに対する２つの優勢なＣＣＣのうち、ＮＫＣＣ１は通常塩素イオンの取り込みを仲介し、ＫＣＣ２は通常塩素イオンを排出する（De Koninck, 2007）。結局、共輸送体は両者とも、Ｎａ−Ｋ−ＡＴＰａｓｅによって構築された勾配に依存し、それぞれＫ＋およびＮａ＋勾配を用いてＣｌ−イオンを排出または導入している（ Payne et al., 2003）。
【００１２】
ＮＫＣＣ１は体中に広く分布している。ＮＫＣＣ１はナトリウム、カリウム、および塩素イオンを細胞に輸送する。また、ＮＫＣＣ１は、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびシュワン細胞上に発現しており、神経系の全体にわたって見出されている（Lenart et al., 2004）。別のアイソフォームであるＮＫＣＣ２は、尿からナトリウム、カリウム、および塩素イオンを抽出する腎臓において主に見出される（Haas, 1994）。細胞からのおよび細胞へのＣｌ−輸送の調節は、細胞内の体積と、少なくとも２つのイオン共輸送体によって調節されるＧＡＢＡ応答性ニューロンの興奮性の維持に重要な役割を担っている：Ｃｌ−の流入はＣｌ−流入を仲介するＮＫＣＣ１およびＣｌ−流出を仲介するＫＣＣ１またはＫＣＣ２によって仲介されている（Kahle et al., 2005）。細胞内外の電解質ホメオスタシスの維持は、一般的な機能（例えば、細胞体積の適切な維持）、特化した細胞機能（例えば、ニューロン興奮性の制御）、および包括的な機能（例えば、血圧の調節）など必須の生理的プロセスにおいて幅広い範囲で求められる。このホメオスタシスは、イオンチャネル、共輸送体、交換体、および膜内外電解質流動を行うポンプによって細胞膜を通してＮａ＋、Ｋ＋、およびＣｌ−を調節移動させて行う（Kahle, et al., 2005）。細胞における細胞内体積を細胞外張度の変化に応じて維持する優勢なメカニズムが細胞内のＣｌ−濃度を上げたり下げたりし、それによって膜内外水分流動が最小限に抑えられる。細胞内のＣｌ−濃度は、Ｃｌ−の取り込みと排出とのバランスを変化させることによって調節される。Ｃｌ−の取り込みの主な仲介物質はＮＫＣＣ１であり、Ｃｌ−の排出の主な仲介物質はＫＣＣ１である。これら共輸送体はどちらも細胞外張度によって調節されており、高張の場合は、ＮＫＣＣ１が活性化されＫＣＣ１が抑制され、低張の場合は、高張の場合と反対の効果を持つ（Kahle et al., 2005）。
【００１３】
上述したように、中枢神経系のニューロンにおける細胞内Ｃｌ−濃度は通常条件下において低く保たれており、ニューロンにおけるＣｌ−逆転電位（ＥＣｌ）は静止電位と略同一かそれ以下である。ＧＡＢＡまたはグリシンがそれぞれＧＡＢＡＡチャネルまたはグリシンチャネルをゲートするときはいつでも、ＥＣｌがさらにマイナスであるか、あるいは静止電位と同程度であるかに応じて、過分極する塩素イオン流入を介して、あるいは抑制性を切り替えることによって、通常は抑制性を生じさせる（Payne et al., 2003）。しかしながら、Ｃｌ−ホメオスタシスの崩壊が細胞内のＣｌ−レベルを上昇させた場合、静止電位の方がＥＣｌよりマイナスになることもある。その場合、ＧＡＢＡＡまたはグリシンチャネルの開くことによって抑制性が殆どまたは全くなくなり、最終的には、正味の脱分極、興奮効果を伴う細胞からのＣｌ−流出を引き起こす。
【００１４】
これに関連し、ＢＤＮＦに誘発されたｔｒｋＢの活性化が、海馬の脳切片におけるＫＣＣ２の発現を下方制御し、塩素イオン依存性の即効性ＧＡＢＡ作動性抑制を妨げることが示された（Rivera et al., 2002）。脊髄の後角においても同様の観察がなされた（Coull et al., 2005）。より正確には、病理学的条件下において、ＢＤＮＦの分泌がＫＣＣ２の発現を下方制御し、それによって中枢神経系の細胞の塩素イオン排出量が減少することが示されている。したがって、Ｃｌ−が、細胞内で蓄積しＥＣｌを変化させ、それによって中枢神経系の細胞の抑制性を減少させる（Rivera et al., 2002、De Koninck, 2007）。このような状況でアニオンの流れが逆行し、グリシンだけでなくＧＡＢＡも脱分極していき、実質的に細胞の興奮性が増長すると考えられる。さらに、ＮＫＣＣ１の上方制御がＫＣＣ２の下方制御と相乗的に作用することも知られている（De Koninck, 2007）。最近では、Ｓｅｒ９４０の脱リン酸化がプロテインホスファターゼ１によって仲介されたときにＫＣＣ２の機能の喪失（例えば、グルタメートレベルの上昇に起因する）が観察されたため、ＫＣＣ２の機能がＳｅｒ９４０のリン酸化に依存している可能性が考えられている（Lee et al. (2011)の刊行物）。それゆえ、ＫＣＣ２の下方制御の土台となるメカニズムは、Ｓｅｒ９４０のリン酸化反応状態に基づいている可能性がある。
【００１５】
最近では、ＧＡＢＡＡ受容体チャネルだけでなくグリシン受容体も、生理的条件下において、Ｃｌ−だけでなくＨＣＯ３−によっても運ばれるかなりの電流を伝達することが示された（Asiedu et al., 2010）。したがって、Ｃｌ−排出能力の減少は、特に細胞質カルボニックアンヒドラーゼを備えた中枢神経系のニューロンにおいて、チャネルを介したＨＣＯ３−の流出の脱分極を助ける。この酵素は、チャネルを仲介した正味の流出が起こっている間に細胞内のＨＣＯ３−を迅速に再び満たすことができるため、ＨＣＯ３−依存性が減少し、その結果、進行中のニューロンネットワーク活動の間にＧＡＢＡ作動性またはグリシン作動性の興奮が起こる。したがって、カルボニックヒドラーゼを阻害すると、ＨＣＯ３−を介した興奮性ＧＡＢＡ作動性および／またはグリシン作動性の電流が減少することが示唆される。
【００１６】
上述したすべての発見が、中枢神経系のニューロン細胞に適用できる。しかしながら、神経細胞から発達した中枢神経系のニューロン細胞が、聴覚系においてプラコードから発達したニューロン細胞とは、発達、構造、および挙動において異なっていることはよく知られている。例えば、海馬のニューロンは１つの神経突起と複数の樹状突起とを有する多極性細胞であり、一方、蝸牛のニューロンは双極性、すなわち、１つの神経突起と１つの樹状突起とを有する。また、ＣＮＳニューロンには、ＧＡＢＡ−グリシン作動性介在ニューロンから抑制性が直接的に入力され、一方で、末梢における聴覚ニューロンには、軸索樹状突起間の神経末端を介して求心性末梢ニューロンへフィードバックする脳幹においてシナプスのネットワーク（上オリーブ複合体）を通じて抑制性が間接的に入力される。それゆえ、上述した中枢神経系における発見の全てを聴覚系に当てはめられるわけではない。聴覚系は、そのメカニズムに関する研究がはるかに少ない。
【００１７】
したがって、上述した中枢神経系に関する発見が、聴覚系の興奮性−抑制性の不均衡の土台になっていると仮定することはできない。実際、蝸牛におけるいかなる興奮性−抑制性の不均衡も、そのバランスの興奮性側および／または抑制性側への崩壊状態によって引き起こされると考えられる。また、それらは、無数のメカニズム（興奮性および／または抑制性のチャネル発現への変更、チャネルの伝導度、シナプスの強さと結合性、または、静止状態の膜電位を記録するイオン勾配、膜抵抗、もしくはカギとなるイオンの逆転電位の崩壊が挙げられる）によって引き起こされることも考えられる。
【００１８】
聴覚系に関しては、生存促進性であり再生促進性であるニューロトロフィンＢＤＮＦが、通常の聴覚の発達および成人のニューロンの生存にとって必要な聴覚保護剤であることが知られているだけである（Meltser et al., 2010）。さらに、聴覚外傷を誘引する耳鳴を経験させたラットの螺旋神経節ニューロンにおいて、ＢＤＮＦの発現が顕著に上昇したことが報告されている（Tan et al., 2007）。これは、下丘におけるＢＤＮＦおよびＧＡＢＡの発現の増大に伴って起きる。しかしながら、これによって耳の外皮におけるＢＤＮＦの発現が顕著に減少する。
【００１９】
一方で、欧州特許第１８４３７５７号には、急性耳鳴が起こっている間、すなわち、３か月未満の間継続する耳鳴の間に、脳由来の神経成長因子である「ＢＤＮＦ」の発現が増大することが開示されている。さらに、欧州特許第１８４３７５７号には、ＧＡＢＡ受容体作用物質の投与によって、蝸牛ニューロンにおけるＢＤＮＦの発現が顕著に減少し、急性耳鳴の症状が緩和されたことが開示されている。しかしながらＢＤＮＦの効果（すなわち、ＢＤＮＦシグナル伝達カスケード上における）は、ＢＤＮＦ受容体ｔｒｋＢなどの特定の受容体を介したものであるため、ＧＡＢＡ受容体作用物質とｔｒｋＢのＢＤＮＦシグナル伝達カスケード上流とが相互作用していることが示唆されてきた。
【００２０】
さらに、ＫＣＣ２、ＫＣＣ３、およびＫＣＣ４の発現は、蝸牛（Yang et al., 2008）、蝸牛神経核（Vale et al., 2005）、および外側上オリーブ（Balakrishnan et al., 2003）において確認されている。動物を用いた研究では、蝸牛のＫＣＣ３およびＫＣＣ４の破壊が難聴を引き起こすことがわかった。これに関し、このような破壊は、いくつかの要因のうち、蝸牛管内電位を維持するために必須の蝸牛のカリウム循環が妨げられた結果であるとの仮説がある。ＫＣＣ２が、螺旋神経節ニューロンの脱分極または過分極を切り替えている可能性、またＧＡＢＡの機能において重要な役割を担っている可能性も示唆されてきた（Yang et al., 2008）。ＮＫＣＣ１も同様に動物の蝸牛に局在化しており、経上皮のＫ＋の輸送および蝸牛管内電位の維持においてこの共輸送体が非常に重要な役割を担っているということが示されてきており、またＮＫＣＣ１を欠いたマウスは、完全に難聴になってしまうことが分かっている（Flagella et al., 1999）。
【００２１】
カルボニックアンヒドラーゼは、蝸牛の螺旋神経節細胞だけでなく有毛細胞にも局在化しており（Okamura et al., 1996）、少なくともラットの聴覚脳幹ニューロンの発達させることが報告されている（Backus et al., 1998）。これに関連して、Anderson et al.による国際公開公報ＷＯ２００７／０１２０６４号には、カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤と利尿薬ゾニサミドとを単独で、もしくは耳鳴を含む聴覚障害の治療のための他の化合物と組み合わせて使用することが記載されている。ゾニサミドの投与は、１）セロトニンおよびドーパミンの送達を高めることによって、および、２）ナトリウムおよびカルシウムチャネルをブロックすることによって、ノルエピネフリン−エピネフリン再吸収阻害剤の薬理学を補うものであるため、治療法として教示されている。
【００２２】
国際公開公報ＷＯ０３／１０００７５号は、耳鳴を含む内耳の病気を治療するためのＣｌＣ−Ｋ／ｂａｒｔｔｉｎチャネルの機能を変化させる物質の使用を教示している。ＣｌＣ−Ｋ／ｂａｒｔｔｉｎチャネルは電圧作動型であり、線条周辺細胞から内リンパへのカリウム分泌に重要な役割を担っており、内リンパ電位の維持に寄与していることが報告されている（Lang et al., 2008）。しかしながら、耳鳴への効果が期待された、国際公開公報ＷＯ０３／１０００７５号に開示された物質のメカニズムは開示されていなかった。
【００２３】
さらに、内リンパ水腫またはメニエール病の治療用として、それぞれループ利尿剤またはカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤の使用がそれぞれ知られている。どちらも、細胞体積を減らし、耳の液圧を和らげるとされている。例えば、米国特許公開公報第２００３／２２９３３３号では、利尿剤（チアジド、トリアムテレン、およびカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない）などの薬剤を内耳へ運ぶ徐放性薬物送達デバイスが記載されている。
【００２４】
この目的は、利尿によって内耳液体体積を減らすことにある。利尿薬は蝸牛管内電位を下げるため、聴神経の炎症をも和らげ、耳鳴を治療できるとされてきた（Risey et al., 1995）。ループ利尿剤フロセミドは、可逆的であり、全ての患者に対してというわけではないが、実際に耳鳴を抑える働きがあることが示され、また、その効果は、中枢性の耳鳴よりもむしろ蝸牛の耳鳴に対してのみ報告がなされている（Risey et al., 1995）。しかしながら、同時に、高用量でフロセミドが投与されると、場合によっては不可逆的に、一時的な耳鳴および失聴を引き起こすことも知られている。フロセミドは、多くの酵素または輸送体システム（Ｋ＋−Ｃｌ−交換、Ｎａ＋−Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送、カルボニックアンヒドラーゼ、Ｃｌ−／ＨＣＯ３-交換、およびいくつかのＧＡＢＡＡ受容体）に影響を及ぼしたり抑制したりするため、作用の位置および耳鳴に対する具体的な効果を同定するのが難しい（Saley, 2002）。フロセミドの主な効果は、細胞に塩素イオンが加えられている場合にＣｌ−排出を抑制できることであるが、もしニューロンがＣｌ−を激減させている場合、主な効果はＣｌ−の取り込みを抑制することである（Saley, 2002）。耳鳴および聴力機能障害は、カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤アセタゾールアミドの副作用としてこれまでにも報告されている。
【００２５】
国際公開公報ＷＯ２０１０／０８５３５２号には、耳鳴などのＧＡＢＡＡ受容体に関連する病気、障害、および症状を治療するためのブメタニド、フロセミド、ピレタニド、アゾセミド、およびトルセミド類似体が開示されている。Brozoski et al., 2007およびＮＫＣＣ１の破壊が難聴を引き起こすという既知の事実とを参照し、発明者らは、ＧＡＢＡ作動性システムおよび／またはＮＫＣＣ１をターゲットとする治療が耳鳴治療に役立つ可能性があると結論付けた。開示されているものは、ＮＫＣＣ１および／またはＧＡＢＡＡに拮抗する化合物である。特に、国際公開公報ＷＯ２０１０／０８５３５２号は、ＧＡＢＡの放出の増加と続く中枢神経系における興奮性および抑制性のバランスを回復させる抑制性シグナリングの増加とを引き起こすα４ＧＡＢＡＡ変異体に特化した拮抗物質を開示している。好ましい実施形態においては、利尿効果などを有するブメタニドなどの化合物がＮＫＣＣ１に作用することを防ぐため、これら化合物を薬品化学の方法によって非利尿性とされる。このように、国際公開公報ＷＯ２０１０／０８５３５２号の発明者らはＮＫＣＣ１に関し、矛盾するアプローチを開示している。Brozoski et al., 2007を参照すると、国際公開公報ＷＯ２０１０／０８５３５２号の発明者らは、中枢聴覚経路における慢性の耳鳴を治療しようとしているのであり、急性または亜急性の耳鳴および蝸牛における耳鳴を治療することが目的ではない。耳鳴治療に対するこれら化合物の効果を示す実験データは提供されていない。
【００２６】
すなわち、上述した先行技術の要約からわかるように、一般的に、聴覚系のメカニズム、特に耳鳴を引き起こすメカニズムは極めて複雑であり、答えの出ていない疑問および観察結果が多数あり、まだよく理解されていない。
【００２７】
よって、上述した聴覚系の興奮性−抑制性の不均衡に対する正確なメカニズムをより良く理解することができれば、大きな突破口になるだろう。このことが、早急に必要とされる、耳鳴の治療のための新規で効果的な化合物につながるだろう。
【００２８】
したがって、本発明の目的は、興奮性−抑制性の不均衡を防ぐのに好適である、それゆえ特定の標的とする耳鳴の治療に用いるのに好適である新規な化合物を提供することである。さらに、本発明は、耳鳴の治療のための新規な医薬組成物および新規な方法を提供することを目的としている。
【００２９】
本発明の目的は、ある好ましい実施形態においては、耳鳴の治療に用いるための、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物によって解決される。特に、当該目的は、ＮＫＣＣ１拮抗物質によってＮＫＣＣ１を調節し、ＮＫＣＣ１がＫＣＣ２の活性および／または発現を上方制御することによって解決される。
【００３０】
さらに好ましい実施形態では、本発明の目的が、本発明に係る塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物を活性剤として含有する医薬組成物によって解決される。
【００３１】
また、本発明の目的は、好ましい実施形態において、治療に効果的な量の、本発明に係る塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１または医薬組成物を投与する工程を含む耳鳴の治療方法によって解決される。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は塩素イオン輸送体ＮＫＣＣ１を調節することができる化合物を同定およびキャラクタリゼーションするためのスクリーニング方法に関する。
【００３３】
本発明において行われた実験の結果、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物が耳鳴の治療または予防に好適であることが分かった。
【００３４】
特に、聴覚系における塩素イオンホメオスタシスの障害と耳鳴知覚との間に相関があることがわかった。より正確には、病理的に変質したＫＣＣ２の発現／活性と、耳鳴として認識される異常な聴覚神経伝達との間に相関があることが実験によって証明された。
【００３５】
この点について、本発明の発明者らは、聴覚系に対する損傷、例えば、聴覚外傷から、内有毛細胞および螺旋神経節ニューロンなどの聴覚系内における塩素イオン共輸送体ＫＣＣ２の有意な下方制御が起こること（実施例１）、および、その現象が耳鳴の存在に特有であること（実施例２）を発見した。
【００３６】
さらに、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節することによって細胞内の塩素イオンレベルを調節する化合物の使用が、耳鳴を抑えること（実施例３）、および、ＫＣＣ２の活性および／または発現の増加に効果的であることが示された。
【００３７】
したがって、聴覚系の知覚神経構造における塩素イオン共輸送体ＫＣＣ２の発現の変調による塩素イオンホメオスタシスの変調によって耳鳴が引き起こされることが実験によって証明された。このことから、ＫＣＣ２の下方制御は失聴には繋がらないが、耳鳴を引き起こすということが結論付けられる。また、ＮＫＣＣ１の拮抗作用が病態生理学的メカニズムを妨げることも示された。したがって、ＮＫＣＣ１拮抗物質として働く化合物は急性または慢性の耳鳴治療または予防に用いてもよい。ＮＫＣＣ１拮抗作用は塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減らしてもよく、聴覚系の知覚神経構造において当該発現および／または活性を減らすことが好ましく、蝸牛の有毛細胞、螺旋神経節ニューロン、または聴覚経路に沿ったその他の神経系細胞において発現および／または活性を減らすことがさらに好ましい。当該拮抗作用は例えば、ＮＫＣＣ１発現（転写および／または翻訳レベル）の下方制御または、例えば競合的または非競合的にＮＫＣＣ１塩素イオン取り込み活性をブロックすることによって引き起こされることがある。本発明のＮＫＣＣ１拮抗化合物は、聴覚系における病態生理学的細胞の細胞内の塩素イオンレベルを調節、好ましくは減らすことができる。後述に示すように、ＮＫＣＣ１の活性／発現を調節する化合物が細胞内の塩素イオンレベルを下げるのに用いられ、それが最終的に耳鳴の予防または治療に繋がる。
【００３８】
本発明の化合物によって、聴覚系の興奮性−抑制性バランスが再構築され、耳鳴の幻聴現象がなくなる。共輸送体ＫＣＣ２の下方制御は細胞内の塩素アニオンの蓄積によって引き起こされる。これは、これまでの理論にとらわれずに考えると、膜内外塩素イオン勾配を崩壊させ、細胞の過分極性抑制を減少させる可能性があり、実際に、ほとんどの場合、アニオン流動は転換され、（グリシン同様に）ＧＡＢＡも減少し、実質的に細胞の興奮性を高める（de Koninck, 2007）。これが興奮性−抑制性の不均衡を引き起こす。ＫＣＣ２の下方制御がＮＫＣＣ１の上方制御と協働して起こるため、ＮＫＣＣ１も耳鳴を引き起こす興奮性−抑制性の不均衡に関与している。したがって、拮抗モードによってＮＫＣＣ１塩素イオン輸送を調節する化合物は、ＫＣＣ２の発現および／または活性を上方制御することになり、本発明に係る急性もしくは慢性の耳鳴治療または予防に用いても良い。好ましくは、当該化合物は聴覚系における知覚神経構造のＮＫＣＣ１共輸送体を調節し、さらに好ましくは、蝸牛の有毛細胞、螺旋神経節ニューロン、または聴覚経路に沿った他の神経系細胞のＮＫＣＣ１共輸送体を調節する。
【００３９】
ＫＣＣ２活性および／または発現の「上方制御」または「増加」は、本明細書で用いられる場合、計測技術に内在する誤差限界より大きい、計測可能な性質における数量的変化を広く指し、好ましくは非病理学的レベルの少なくとも６０％までの増加、より好ましくは少なくとも８０％までの増加、最も好ましくは非病理学的レベルの９０％までもしくは１００％の増加（すなわち、ＫＣＣ２活性および／または発現の完全な回復）を指す。特に、ＫＣＣ２活性および／または発現の「上方制御」または「増加」という用語は、本明細書で用いられる場合、その転写および／または翻訳を高めることによってＫＣＣ２の発現を高め、それによって、細胞で計測されるＫＣＣ２活性が増加することを広く指す。あるいは、ＫＣＣ２タンパク質の活性、すなわち、その共輸送体活性を高めることによって（例えば、Ｓｅｒ９４０の脱リン酸化を防ぐことによって）細胞のＣｌ−ホメオスタシスを維持するＫＣＣ２タンパク質の活性を指す。
【００４０】
本発明において、用語「聴覚系の知覚神経構造」は、蝸牛、螺旋神経節ニューロン、聴神経、菱形体、蝸牛の細胞核、上オリーブ核、外側絨帯、下丘、視床、および聴覚の外皮を含む聴覚経路を指す。「聴覚系の知覚神経構造」は、聴覚経路への体性知覚のニューロンおよび神経経路も含む。これは、頭頸部の不均衡、または顎関節、顎、もしくは眼球外筋肉の障害などの病的逸脱が、症状として耳鳴を引き起こすためである。また、用語「上方制御」は、活性の上方制御（例えば、発現レベルの上方制御、または活性の上方制御もしくは増加を引き起こす他の現象などによって起こり得る）を含むことが意図される。
【００４１】
したがって、第一の局面において、本発明は急性または慢性の耳鳴の治療または予防に用いるための、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物に関する。好ましくは、このような化合物が聴覚系における知覚神経構造の塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節し、さらに好ましくは、蝸牛の有毛細胞、螺旋神経節ニューロン、または聴覚経路に沿った他の神経系細胞の塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する。より詳細には、本発明のＮＫＣＣ１拮抗化合物は、さらに、内有毛細胞および螺旋神経節ニューロンにおける塩素イオン共輸送体ＫＣＣ２の下方制御を相殺することによって、部分的に、もしくは完全に、聴覚系に対する損傷から引き起こされるＫＣＣ２の病態生理学的な下方制御（耳鳴を引き起こす）を回復させる。
【００４２】
より詳細には、化合物調節共輸送体ＮＫＣＣ１は、細胞内の塩素イオンレベルを減少させ、好ましくは聴覚系における知覚神経構造の塩素イオンレベルを減少させ、さらに好ましくは蝸牛の有毛細胞、螺旋神経節ニューロン、または聴覚経路に沿った他の神経系細胞の塩素イオンレベルを減少させる。塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物は、好ましくは細胞内の塩素イオンレベルを減少させてもよく、それによってＫＣＣ２の活性および／または発現を増加させることとなる。好ましくは聴覚系における知覚神経構造のＫＣＣ２の活性および／または発現を増加させ、さらに好ましくは蝸牛の有毛細胞、螺旋神経節ニューロン、または聴覚経路に沿った他の神経系細胞のＫＣＣ２の活性および／または発現を増加させる。ここで、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物は、特に塩素イオン共輸送体ＫＣＣ２の発現または活性を増加させてもよく、好ましくは聴覚系における知覚神経構造の発現または活性を増加させてもよく、さらに好ましくは、蝸牛の有毛細胞、螺旋神経節ニューロン、または聴覚経路に沿った他の神経系細胞の塩素イオン共輸送体ＫＣＣ２の発現または活性を増加させてもよい。
【００４３】
好ましくは、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減少させる化合物は、ＫＣＣ２と全く結合しない。ＮＫＣＣ１拮抗化合物は、いくつかの例では、ＫＣＣ２に対して（少し）拮抗する効果があってもよいが、ＫＣＣ２と直接的な相互作用のない（すなわち、ＫＣＣ２と全く結合しない）化合物を用いることがさらに好ましく、ＫＣＣ２の発現および／または活性を増加させる拮抗方法において直接的にＫＣＣ２と相互作用することがそれよりさらに好ましい。それによって、本発明のＮＫＣＣ１拮抗化合物がＫＣＣ２に対し作動する（すなわち、相互的な）効果を示すことが好ましい。
【００４４】
好ましくは、耳鳴の治療および／または予防に用いられる塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減少させるＮＫＣＣ１拮抗化合物は、スルホンアミド（例えば、アセタゾールアミド、アゾセミド、ブメタニド、クロルタリドン、クロパミド、フロセミド、ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴ、ＨＣＴＺ、ＨＺＴ）、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、ピレタニド、トリパミド  キシパミド、ジクロルフェナミド（ＤＣＰ）、ドルゾラミド、エトキスゾラミド、スルチアム、およびゾニサミド、ならびにそれらの類似体）を含む群より選ばれる。あるいは、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減少させる化合物は、チアジドおよびチアジド様利尿薬（例えば、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド、ポリチアジド、トリクロロ−メチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、およびキネサゾン、ならびにそれらの類似体など）の類より選ばれる。あるいは、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減少させる化合物は、スルホニル尿素（トルセミドなど）またはフェノキシ酢酸誘導体（エタクリン酸など）またはムゾリミンを含む群より選ばれる。
【００４５】
「類似体」は、本明細書で用いられる場合、親化合物における１つ以上の化学分子部分の修飾または置換を広く指し、親化合物の誘導体、位置異性体、およびプロドラッグを包含してもよい。
【００４６】
ブメタニド、フロセミド、ピレタニド、アゾセミド、およびトルセミド、またはそれらの類似体などのループ利尿剤が好ましい。これらの名称は強力な利尿効果に由来している。ループ利尿剤は、ヘンレ係蹄の太い上行脚におけるＮａ＋Ｋ＋Ｃｌ−共輸送体（例えば、ＮＫＣＣ１）の拮抗物質であり、Ｃｌ−結合サイトと競争することによってナトリウムおよび塩素イオンの再吸収を阻害する働きをする（Russell, 2000も参照）。利尿薬、特にループ利尿剤は細胞内の塩素イオンレベルを減少させるカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤として作用してもよい。その限りにおいて、カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤としては、アセタゾマリド、ジクロルフェナミド、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、およびメタゾラミドからなる群より選ばれる利尿薬が好ましい。
【００４７】
本発明によれば、耳鳴の治療および／または予防のための、ＮＫＣＣ１拮抗効果を有するブメタニドまたはその類似体の使用が好ましい。特に、下記式Ｉで表される化合物が好ましい。
【００４８】
【化１】
0005941159.tif 000002
【００４９】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルケニル、アルケニル、シクロアルケニル、アルコキシ、カルボキシ、アルキルハロ、アリール、アリールオキシ、アルカリールオキシ（alkaryloxy）、アルカリール（alkaryl）、アルキルアミノ（ジ）アルキル、またはアルキルヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、カルボキシ、アミノ、置換アミノ、アルキル、アルキレン、またはハロである。
【００５０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、および／またはＲ４において、置換基として生体適合ポリマーを選んでもよい。そのような生体適合ポリマーは、式Ｉで表される化合物として適切な他の群の何れかにおいて、式Ｉと、（リンカー部分を通じて、もしくはリンカー部分なしで）共有結合によって結合されていてもよい。
【００５１】
「アルケニル」は、本明細書で用いられる場合、１つ以上の二重結合をしており、２〜２０の炭素原子を含む直鎖状または分岐状鎖の炭化水素を広く指す。アルケニル基の例としては、プロペニル、ブテニル、およびペンテニルなどが挙げられる。「シクロアルケニル」または「環式アルケニル」は、本明細書で用いられる場合、ヘテロ原子を含まない炭素環を指し、単環式、二環式、および三環式の飽和炭素環、ならびに縮合環系が挙げられる。シクロアルケニル基の例としては、シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロペンタジエニル、およびシクロヘキサジエニルなどが挙げられる。そのようなアルケニル基およびシクロアルケニル基は、本明細書中に記載したように任意で置換されていてもよい。
【００５２】
「アルキル」は、本明細書で用いられる場合、直鎖状または分岐状鎖の飽和炭化水素ラジカルを広く指す。また、「アルキル」は、環式（すなわち、シクロアルキル）アルキル基も広く指す。アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどの直鎖状アルキル基、ならびにイソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソアミル、ネオペンチル、およびイソアミルなどの分岐状アルキル基などが挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルキル」または「環式アルキル」は、本明細書で用いられる場合、ヘテロ原子を含まない炭素環を指し、単環式、二環式、および三環式の飽和炭素環、ならびに縮合環系が挙げられる。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。シクロアルキルは置換されていてもいなくてもよく、環式アルキル基としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。そのようなアルキル基は、本明細書中に記載されているように任意で置換されていてもよい。
【００５３】
「アルキルハロ」は、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード）と結合した、直鎖状または分岐状鎖の、飽和または部分的に不飽和の炭化水素を広く指す。
【００５４】
「アルカリール」は、本明細書で用いられる場合、アリール基と結合した直鎖状または分岐状鎖の飽和炭化水素ラジカルを広く指す。アルカリール基の例としては、ベンジル、４−クロロベンジル、メチルベンジル、ジメチルベンジル、エチルフェニル、およびプロピル−（４−ニトロフェニル）などが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアルカリール基は本明細書中に記載されているように任意で置換されていてもよい。
【００５５】
「アリール」または「Ａｒ」は、本明細書で用いられる場合、芳香族基または１つ以上が任意に置換された芳香族基に縮合した任意に置換された芳香族基を広く指し、任意に置換された適切な置換基とは、低級アルコキシ、低級アルキルスルファニル、低級アルキルスルフェニル、低級アルキルスルホニル、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、任意にアルキルで置換されたアミノ、カルボキシ、任意にアルキルに置換されたカルバモイル、任意にアルキルに置換されたアミノスルホニル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ニトロ、シアノ、ハロゲン、または低級パーフルオロアルキルが挙げられるが、これらに限定されず、また、多置換度も許容される。アリールの例としては、フェニル、２−ナフチル、および１−ナフチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
「アルコキシ」は、本明細書で単独でまたは別の基の一部として用いられる場合、本明細書中で定義しているように、オキシ基を介して親分子に付加されたアルキル基を広く指す。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、またはＮ）が割り込んでいてもよい。アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、およびエチルオキシエチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
「アルカリールオキシ」または「オキシアルカリール」は、本明細書で用いられる場合、−Ｏ−アルキル−アリールの基を広く指し、ここでＡｒはアリールである。例としては、ベンジルオキシ、オキシベンジル、２−ナフチルオキシ、およびオキシ−２−ナフチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
「アルカリールオキシアルキル」または「アルキルオキシアルカリール」は、本明細書で用いられる場合、−アルキル−Ｏ−アルキル-アリールの基を広く指し、ここでＡｒはアリールである。例としては、ベンジルオキシエチルが挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
「アリールオキシ」は、本明細書で用いられる場合、−ＡｒＯの基を広く指し、ここでＡｒはアリールもしくはヘテロアリールである。例としては、フェノキシ、ベンジルオキシ、および２−ナフチルオキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
「生体適合ポリマー」は、本明細書で用いられる場合、実質的に無毒性であり実質的な免疫反応、クロット、その他有害な作用をもたらさないポリマー部分を広く指す。本発明のいくつか実施形態において、ポリアルキレングリコールは、本明細書で用いられる場合、ポリアルキレングリコールが、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリブチレングリコールなどの直鎖状または分岐状ポリアルキレングリコールを指し、さらにポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルも包含する生体適合ポリマーである。本発明のいくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコールポリマーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール部分、またはポリブチレングリコール部分などの低級アルキルポリアルキレングリコール部分である。ＰＥＧは、式−ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨで表され、ここでｎは、約１〜約４０００以上であり得る。いくつかの実施形態において、ｎは１〜１００であり、他の実施形態においては、ｎは５〜３０である。ＰＥＧ部分は直鎖状であってもよいし、分岐状であってもよい。さらに他の実施形態では、ＰＥＧはヒドロキシル、アルキル、アリール、アシル、またはエステルなどの基と結合することができる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧ（またはｍＰＥＧ）などのアルコキシＰＥＧであってもよく、ここで１つの末端は比較的不活性のアルコキシ基であり、もう一方の末端はヒドロキシル基である。
【００６１】
「カルボキシ」は、本明細書で用いられる場合、−ＣＯＯＨ基を広く指す。
【００６２】
「シクロアルキル」は、本明細書で用いられる場合、ヘテロ原子を含まない炭素環を指し、単環式、二環式、および三環式の飽和炭素環、ならびに縮合環系を包含する。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなどが挙げられる。シクロアルキルは、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。
【００６３】
「ハロ」は、本明細書で用いられる場合、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨードを広く指す。また、用語「ハロゲン化物」は、本明細書で用いられる場合、臭化物、塩化物、フッ化物、またはヨウ化物を広く指す。
【００６４】
「ヒドロキシ」は、本明細書で用いられる場合、−ＯＨ基を広く指す。
【００６５】
「ヘテロアリール」は、本明細書で用いられる場合、少なくとも１つの原子がヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、またはＮ）からなり、残りの原子が炭素である、芳香族の五または六員環を指す。五員環は２つの二重結合を有し、六員環は３つの二重結合を有する。ヘテロアリール基は、（縮合または非縮合の）単環式または二環式であり得る。単環式のヘテロアリール基の例としては、フラニル、チオフェン−イル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、およびトリアジニルなどが挙げられる。二環式のヘテロアリール基の例としては、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェン−イル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、およびプテリジニルなどが挙げられる。ヘテロアリール基は、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。
【００６６】
「ヘテロシクロアルキル」は、本明細書で用いられる場合、環の炭素原子のうち少なくとも１つがヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、またはＮ）に置換されているシクロアルキル基を指す。ヘテロシクロアルキル基は（縮合または非縮合の）単環式または二環式であり得る。単環式のヘテロシクロアルキル基の例としては、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１−オキソチオモルホリニル、１，１−ジオキソチオモルホリニル、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイソキサゾリル、テトラヒドロイミダゾリル、テトラヒドロピラゾリル、テトラヒドロチアゾリジニル、テトラヒドロイソチアゾリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロピリダジニル、および４−ピペラドニルなどが挙げられる。二環式の非縮合ヘテロシクロアルキル基の例としては、キヌクリジニル、アダマンチル、および２−アゾビシクロ［３．２．１］オクチルなどが挙げられる。縮合ヘテロシクロアルキル基の例としては、別のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基と縮合した、上記単環式ヘテロシクロアルキル基の何れもが挙げられる。ヘテロシクロアルキル基は、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。
【００６７】
「置換」は、本明細書で用いられる場合、当業者に公知の置換基によって置き換えられた基の１つ以上の水素原子を置き換えることを広く指し、後述するように安定した化合物になる。好適な置換基としては、例えば、アルキル、アシル、アルケニル、アルキニルシクロアルキル、アリールアルカリール、ヒドロキシル、チオアルコキシ、アリールオキシ、アシル、アミノ、アミド、カルボキシ、カルボキシアルキル、チオカルボキシアルキル、カルボキシアリール、チオカルボキシアリール、ハロ、オキソ、メルカプト、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、アミジノ、カルバモイル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、カルボキシル酸、カルボキサミド、ハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキル、トリハロアルコキシ、アルキルチオ、アラルキル、アルキルスルホニル、アリールチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、グアニジノ、ウレイド、およびニトロなどが挙げられるが、これらに限定されない。置換は、意図した目的のために安定した化合物をつくるような組み合わせである限り認められる。例えば、置換は、得られる化合物が反応混合物から有用な純度を得るための単離に耐えられ、治療剤もしくは診断剤、または試薬への調合に対して十分な耐久性があれば認められる。
【００６８】
本明細書中に開示されているＮＫＣＣ１拮抗化合物は、例えば式Ｉによれば、例えば、異性体、互変異性体、双極性イオン、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ酸、またはそれらの立体化学混合物として提供される。これらは、典型的には、例えば、医薬的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、またはそれらの組み合わせとして提供され、典型的には、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせた医薬組成物として調合される。
【００６９】
「医薬的に許容可能な塩」は、本明細書で用いられる場合、医薬品として使用または調合でき、特定の化合物の遊離酸および遊離塩基の生物学的効果を維持し、生物学的にまたは他の点で有害でない、化合物の塩の形態を広く指す。本明細書に記載の化合物の医薬的に許容可能な塩は、医薬品として使用または調合でき、特定の化合物の遊離酸および遊離塩基の生物学的効果を維持し、生物学的にまたは他の点で有害でない、化合物の塩の形態を包含する。このような塩の例は、Wermuth and Stahl, (Eds.) (2002) Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-Verlag Helvetica Acta, Zurich（その全体が援用によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。このような塩としては、例えば、遊離酸および遊離塩基のアルカリ金属塩および付加塩が挙げられる。医薬的に許容可能な塩としては、例えば、硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γーヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、およびマンデル酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、医薬的に許容可能な塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、トリアルキルアリールアンモニウム塩、およびテトラアルキルアンモニウム塩が挙げられる。
【００７０】
「水和物」は、本明細書で用いられる場合、溶媒が水である場合の化合物を広く指す。「溶媒和物」は、本明細書で用いられる場合、このような化合物の生物学的効果を維持するある特定の化合物、例えば、１つ以上の溶媒分子と化合物との物理的会合から得られる化合物、の医薬的に許容可能な溶媒和物の形態を広く指す。溶媒和物としては、例えば、水、１−プロパノール、２−プロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、エチルアセテート、酢酸、またはエタノールアミンと組み合わせた本発明の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減少させる化合物は、ＫＣＣ２との親和性が低いこと（１０−７未満、好ましくは１０−６Ｍ未満、より好ましくは１０−５Ｍ未満）、または少なくともＮＫＣＣ１との親和性の方がＫＣＣ２との親和性よりもずっと高いこと（少なくとも２桁、好ましくは少なくとも４桁、より好ましくは少なくとも５桁、および最も好ましくは少なくとも６桁より多い結合定数（少なくとも１０−９、好ましくは１０−１０より大きい））、またはＫＣＣ２とは全く結合しないことが好ましい。特に、ＮＫＣＣ１拮抗化合物はＫＣＣ２に対していかなる拮抗効果も有するべきではない。より好ましくは、ＮＫＣＣ１拮抗化合物はＫＣＣ２に対し、作動（すなわち、相互的な）効果を有するべきである。塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減少させる化合物は、ブメタニドまたはその誘導体もしくは類似体であることが、ＮＫＣＣ１と特異的に拮抗するため好ましい。対照的に、例えば、フロセミドはＮＫＣＣ１およびＫＣＣをほぼ等しい効能でブロックするため、フロセミドは細胞内の塩素イオンレベルに対しては反対の効果を同時に発揮でき、一方ブタメニドはＫＣＣ２よりもＮＫＣＣ１に対してずっと高い親和性を示す（Blaesse et al., 2009）。したがって、本発明によれば、ＫＣＣ２に対する拮抗効果が弱い化合物、さらに好ましくはＫＣＣ２に対する作動効果を発揮することによってその活性および／または発現を増加させる（同時に、ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減少させる）化合物が好ましい。
【００７２】
上記化合物の何れの誘導体または類似体も、薬品化学アプローチ（例えば、親油性の増加または利尿効果の減少を用いる）によって得てもよい。例えば、耳鳴治療のためのＮＫＫＣ１拮抗物質として使用される利尿薬の類似体、例えば、ブメタニド、フロセミド、ピレタニド、アゾセミド、およびトルセミドの類似体、特に式Ｉで表される類似体は、通常、例えば、ブメタニド、フロセミド、ピレタニド、アゾセミド、およびトルセミド自体よりも利尿効果が弱い。
【００７３】
ＮＫＣＣ１拮抗物質として作用し、耳鳴の治療および／または予防のために有用な、このような既知の利尿剤の類似体は、式ＩＩ〜ＶＩＩ、または、それらの医薬的に許容可能な塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは水和物によって定義され、
【００７４】
【化２】
0005941159.tif 000003
【００７５】
【化３】
0005941159.tif 000004
【００７６】
【化４】
0005941159.tif 000005
【００７７】
【化５】
0005941159.tif 000006
【００７８】
【化６】
0005941159.tif 000007
【００７９】
【化７】
0005941159.tif 000008
【００８０】
ここで、
Ｒ１は、存在しないか、Ｈ、Ｏ、またはＳであり；
Ｒ２は、存在しないか、Ｈ、または、Ｒ１がＯもしくはＳの場合、Ｒ２は置換または無置換の、水素、アルキル、アラルキル、アリール、アルキルアミノジアルキル、アルキルカルボニルアミノジアルキル、アルキルオキシカルボニルアルキル、アルキルカルボニルオキシアルキル、アルキルアルデヒド、アルキルケトアルキル、アルキルアミド、アルカリールアミド、アリールアミド、アルキルアンモニウム基、アルキルカルボキシル酸、アルキルヘテロアリール、アルキルヒドロキシ、生体適合ポリマー（アルキルオキシ（ポリアルキルオキシ）アルキルヒドロキシル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールエステル（ＰＥＧエステル）、およびポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧエーテル）など）、メチルオキシアルキル、メチルオキシアルカリール、メチルチオアルキル、およびメチルチオアルカリールからなる群より選ばれ、Ｒ１が存在しない場合は、Ｒ２は、置換または無置換の、水素、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルカリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アルカリールアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノ、およびＮ−アルカリール−Ｎ−アリールアミノからなる群より選ばれ；
Ｒ３は、置換または無置換の、アリール、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、およびアリールオキシからなる群より選ばれ；
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素、アルキルアミノジアルキル、カルボニルアルキル、カルボニルアルカリール、カルボニルアリール、およびそれらの塩（ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、トリアルキルアリールアンモニウム塩、およびテトラアルキルアンモニウム塩など）からなる群より選ばれ、
以下の条件が好ましい：Ｒ１がＯであり且つＲ２、Ｒ４およびＲ５がＨである場合は、式ＩＩのＲ３はフェニルオキシではなく、より詳細には、いくつかの実施形態において、式ＩＩの化合物はブメタニドではない；Ｒ１がＯであり且つＲ２、Ｒ４およびＲ５がＨである場合、式ＩＶのＲ３はＣｌではなく、より詳細には、いくつかの実施形態において、式ＩＶの化合物はフロセミドではない；Ｒ１がＯであり、Ｒ３がＣｌであり且つＲ４およびＲ５がＨである場合、式ＩＶのＲ２はメチルではなく、より詳細には、いくつかの実施形態において、式ＩＶの化合物はフロセミドメチルエステルではない；Ｒ１がＯであり且つＲ２、Ｒ４およびＲ５がＨである場合、式ＶＩのＲ３はフェニルオキシであり、より詳細には、いくつかの実施形態において、式ＶＩの化合物はピレタニドである。
【００８１】
本発明における好ましい実施形態では、式ＩＩの化合物は、ブメタニド、ブメタニドアルデヒド、ブメタニドメチルエステル、ブメタニドシアノメチルエステル、ブメタニドエチルエステル、ブメタニドイソアミルエステル、ブメタニドオクチルエステル、ブメタニドベンジルエステル、ブメタニドジベンジルアミド、ブメタニドジエチルアミド、ブメタニドモルフォリノエチルエステル、ブメタニド−３−（ジメチルアミノプロピル）エステル、ブメタニド−Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドエステル、ブメタニド−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミドエステル、ブメタニドピバキセチルエステル、ブメタニドプロパキセチルエステル、ブメタニドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチルエステル、ブメタニドベンジルトリメチルアンモニウム塩、およびブメタニドセチルトリメチルアンモニウム塩であり得る。特定の実施形態において、上記化合物はブメタニドではない。
【００８２】
あるいは、式ＩＩの化合物は、ブメタニド［−（Ｃ＝Ｏ）−ＳＨ］チオ酸、ブメタニド−Ｓ−メチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−シアノメチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−エチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−イソアミルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−オクチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−ベンジルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−（モルフォリノエチル）チオエステル、ブメタニド−Ｓ−［３−（ジメチルアミノプロピル）］チオエステル、ブメタニド−Ｓ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミド）チオエステル、ブメタニド−Ｓ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミド）チオエステル、ブメタニド−Ｓ−ピバキセチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−プロパキセチルチオエステル、ブメタニド−Ｓ−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチル］チオエステル、ブメタニド［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−］ベンジルトリメチル−アンモニウムチオ酸塩、およびブメタニド［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−］セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩であり得る。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態において、式ＩＩＩの化合物は、準安定ブメタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−ＯＨ］チオ酸、ブメタニド−Ｏ−メチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−シアノメチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−エチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−イソアミルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−オクチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−ベンジルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−（モルフォリノエチル）チオエステル、ブメタニド−Ｏ−［３−（ジメチルアミノプロピル）］チオエステル、ブメタニド−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミド）チオエステル、ブメタニド、Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミド）チオエステル、ブメタニド−Ｏ−ピバキセチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−プロパキセチルチオエステル、ブメタニド−Ｏ−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチル］チオエステル、ブメタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−Ｏ−］ベンジルトリメチル−アンモニウムチオ酸塩、およびブメタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−Ｏ−］セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩であり得る。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態において、式ＩＩＩの化合物は、ブメタニドチオアルデヒド、ブメタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−ＳＨ］ジチオ酸、ブメタニドメチルジチオエステル、ブメタニドシアノメチルジチオエステル、ブメタニドエチルジチオエステル、ブメタニドイソアミルジチオエステル、ブメタニドオクチルジチオエステル、ブメタニドベンジルジチオエステル、ブメタニドジベンジルチオアミド、ブメタニドジエチルチオアミド、ブメタニドモルホリノエチルジチオエステル、ブメタニド−３−（ジメチルアミノプロピル）ジチオエステル、ブメタニド−Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドジチオエステル、ブメタニド−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミドジチオエステル、ブメタニドピバキセチルジチオエステル、ブメタニドプロパキセチルジチオエステル、ブメタニドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチルジチオエステル、ブメタニドベンジルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩、およびブメタニドセチルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩であり得る。
【００８５】
本発明の他の実施形態において、式ＩＶの化合物は、フロセミド、フロセミドアルデヒド、フロセミドメチルエステル、フロセミドシアノメチルエステル、フロセミドエチルエステル、フロセミドイソアミルエステル、フロセミドオクチルエステル、フロセミドベンジルエステル、フロセミドモルフォリノエチルエステル、フロセミド−３−（ジメチルアミノプロピル）エステル、フロセミド−Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドエステル、フロセミド−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミドエステル、フロセミドピバキセチルエステル、フロセミドプロパキセチルエステル、フロセミドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチルエステル、フロセミドベンジルトリメチルアンモニウム酸塩、およびフロセミドセチルトリメチルアンモニウム酸塩であり得る。特定の実施形態において、上記化合物はフロセミドではない。本発明のさらなる実施形態において、式ＩＶの化合物は、フロセミド［−（Ｃ＝Ｏ）−ＳＨ］チオ酸、フロセミド−Ｓ−メチルチオエステル、フロセミド−Ｓ−シアノメチルチオエステル、フロセミド−Ｓ−エチルチオエステル、フロセミド−Ｓ−イソアミルチオエステル、フロセミド−Ｓ−オクチルチオエステル、フロセミド−Ｓ−ベンジルチオエステル、フロセミド−Ｓ−（モルフォリノエチル）チオエステル、フロセミド−Ｓ−［３−（ジメチルアミノプロピル）］チオエステル、フロセミド−Ｓ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミド）チオエステル、フロセミド−Ｓ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミド）チオエステル、フロセミド−Ｓ−ピバキセチルチオエステル、フロセミド−Ｓ−プロパキセチルチオエステル、フロセミド−Ｓ−［メトキシ（ポリエチレンオキシ)ｎ−１−エチル］チオエステル、フロセミド［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−］ベンジルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、およびフロセミド［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−］セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩であり得る。
【００８６】
本発明の他の実施形態において、式Ｖの化合物は、準安定フロセミド［−（Ｃ＝Ｓ）−ＯＨ］チオ酸、フロセミド−Ｏ−メチルチオエステル、フロセミド−Ｏ−シアノメチルチオエステル、フロセミド−Ｏ−エチルチオエステル、フロセミド−Ｏ−イソアミルチオエステル、フロセミド−Ｏ−オクチルチオエステル、フロセミド−Ｏ−ベンジルチオエステル、フロセミド−Ｏ−（モルフォリノエチル）チオエステル、フロセミド−Ｏ−［３−（ジメチルアミノプロピル）］チオエステル、フロセミド−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミド）チオエステル、フロセミド−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミド）チオエステル、フロセミド−Ｏ−ピバキセチルチオエステル、フロセミド−Ｏ−プロパキセチルチオエステル、フロセミド−Ｏ−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチル］チオエステル、フロセミド［−（Ｃ＝Ｓ）−Ｏ−］ベンジルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、およびフロセミド［−（Ｃ＝Ｓ）−Ｏ−］セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩であり得る。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態において、式Ｖの化合物は、フロセミドチオアルデヒド、フロセミド［−（Ｃ＝Ｓ）−ＳＨ］ジチオ酸、フロセミドメチルジチオエステル、フロセミドシアノメチルジチオエステル、フロセミドエチルジチオエステル、フロセミドイソアミルジチオエステル、フロセミドオクチルジチオエステル、フロセミドベンジルジチオエステル、フロセミドジベンジルチオアミド、フロセミドジエチルチオアミド、フロセミドモルホリノエチルジチオエステル、フロセミド−３−（ジメチルアミノ［ｒｈｏ］ロピル）ジチオエステル、フロセミド−Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドジチオエステル、フロセミド−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミドジチオエステル、フロセミドピバキセチルジチオエステル、フロセミドプロパキセチルジチオエステル、フロセミドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチルジチオエステル、フロセミドベンジルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩、およびフロセミドセチルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩であり得る。
【００８８】
本発明のまたさらなる実施形態において、式ＶＩの化合物は、ピレタニド、ピレタニドアルデヒド  ピレタニドメチルエステル、ピレタニドシアノメチルエステル、ピレタニドエチルエステル、ピレタニドイソアミルエステル、ピレタニドオクチルエステル、ピレタニドベンジルエステル、ピレタニドジベンジルアミド、ピレタニドジエチルアミド、ピレタニドモルフォリノエチルエステル、ピレタニド−３−（ジメチルアミノプロピル）エステル、ピレタニド−Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドエステル、ピレタニドジメチルグリコールアミドエステル、ピレタニドピバキセチルエステル、ピレタニドプロパキセチルエステル、ピレタニドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチルエステル、ピレタニドベンジルトリメチルアンモニウム塩、およびピレタニドセチルトリメチルアンモニウム塩であり得る。特定の実施形態においては、上記化合物はピレチニドではない。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態において、式ＶＩの化合物は、ピレタニド［−（Ｃ＝Ｏ）−ＳＨ］チオ酸、ピレタニド−Ｓ−メチルチオエステル、ピレタニド−Ｓ−シアノメチルチオエステル、ピレタニド−Ｓ−エチルチオエステル、ピレタニド−Ｓ−イソアミルチオエステル、ピレタニドＳ−オクチルチオエステル、ピレタニド−Ｓ−ベンジルチオエステル、ピレタニド−Ｓ−（モルフォリノエチル）チオエステル、ピレタニド−Ｓ−［３−（ジメチルアミノプロピル）］チオエステル、ピレタニド−Ｓ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミド）チオエステル、ピレタニド−Ｓ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミド）チオエステル、ピレタニド−Ｓ−ピバキセチル チオエステル、ピレタニド−Ｓ−プロパキセチルチオエステル、ピレタニド−Ｓ−[メトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチル］チオエステル、ピレタニド［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−］ベンジルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、およびピレタニド［−（Ｃ＝Ｏ）−Ｓ−］セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩であり得る。
【００９０】
本発明のさらなる実施形態において、式ＶＩＩの化合物は、準安定ピレタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−ＯＨ］チオ酸、ピレタニド−Ｏ−メチルチオエステル、ピレタニド−Ｏ−シアノメチルチオエステル、ピレタニド−Ｏ−エチルチオエステル、ピレタニド−Ｏ−イソアミルチオエステル、ピレタニド−Ｏ−オクチルチオエステル、ピレタニド−Ｏ−ベンジルチオエステル、ピレタニド−Ｏ−（モルフォリノエチル）チオエステル、ピレタニド−Ｏ−［３−（ジメチルアミノプロピル）］チオエステル、ピレタニド−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミド）チオエステル、ピレタニド、Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミド）チオエステル、ピレタニド−Ｏ−ピバキセチルチオエステル、ピレタニド−Ｏ−プロパキセチルチオエステル、ピレタニド−Ｏ−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチル］チオエステル、ピレタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−Ｏ−］ベンジルトリメチルアンモニウムチオ酸塩、およびピレタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−Ｏ−］セチルトリメチルアンモニウムチオ酸塩であり得る。
【００９１】
いくつかの実施形態において、式ＶＩＩの化合物は、ピレタニドチオアルデヒド、ピレタニド［−（Ｃ＝Ｓ）−ＳＨ］ジチオ酸、ピレタニドメチルジチオエステル、ピレタニドシアノメチルジチオエステル、ピレタニドエチルジチオエステル、ピレタニドイソアミルジチオエステル、ピレタニドオクチルジチオエステル、ピレタニドベンジルジチオエステル、ピレタニドジベンジルチオアミド、ピレタニドジエチルチオアミド、ピレタニドモルホリノエチルジチオエステル、ピレタニド−３−（ジメチルアミノプロピル）ジチオエステル、ピレタニド−Ｎ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドジチオエステル、ピレタニド−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリコールアミドジチオエステル、ピレタニドピバキセチルジチオエステル、ピレタニドプロパキセチルジチオエステル、ピレタニドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−１−エチルジチオエステル、ピレタニドベンジルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩、およびピレタニドセチルトリメチルアンモニウムジチオ酸塩であり得る。
【００９２】
あるいは、式ＶＩＩＩで表される化合物、またはそれらの医薬的に許容可能な塩、溶媒化合物、互変異性体、もしくは水和物が、耳鳴の治療および／または予防に使用されることが開示され：
【００９３】
【化８】
0005941159.tif 000009
【００９４】
ここで、
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、上記で定義されたものであり；
Ｒ６は、非置換または置換の、アルキルオキシカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニルアルキル、アルキルアミノジアルキル、アルキルヒドロキシ、生体適合ポリマー（アルキルオキシ（ポリアルキルオキシ）アルキルヒドロキシル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールエステル（ＰＥＧエステル）、およびポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧエーテル）など）、メチルオキシアルキル、メチルオキシアルカリール、メチルチオアルキル、およびメチルチオアルカリールからなる群より選択され、
いくつかの実施形態において、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６がＨである場合、式ＶＩＩＩのＲ３はＣｌではなく、より具体的には、いくつかの実施形態において、式ＶＩＩＩの化合物はアゾセミドではないことが好ましい。
【００９５】
ある実施形態において、式ＶＩＩＩの化合物は、テトラゾリル置換アゾセミド（メトキシメチルテトラゾリル置換アゾセミド、メチルチオメチルテトラゾリル置換アゾセミド、およびＮ−ｍＰＥＧ３５０−テトラゾリル置換アゾセミドなど）、アゾセミドベンジルトリメチルアンモニウム塩および／またはアゾセミドセチルトリメチルアンモニウム塩であり得る。
【００９６】
式ＩＸに係る、耳鳴の治療および／または予防に使用するための他の化合物、または、それらの医薬的に許容可能な塩、溶媒化合物、互変異性体、もしくは水和物：
【００９７】
【化９】
0005941159.tif 000010
【００９８】
ここで、
Ｒ７が存在しない、または、非置換もしくは置換の、水素、アルキルオキシカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニルアルキル、アルキルアミノジアルキル、アルキルヒドロキシ、生体適合ポリマー（アルキルオキシ（ポリアルキルオキシ）アルキルヒドロキシル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールエステル（ＰＥＧエステル）およびポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧエーテル）など）、メチルオキシアルキル、メチルオキシアルカリール、メチルチオアルキル、およびメチルチオアルカリールからなる群より選ばれ；
Ｘ−は、臭化物、塩化物、フッ化物、ヨウ化物、またはアニオン部分（メシレートまたはトシラートなど）などのハロゲン化合物であるか；あるいは、Ｘ−は存在せず、化合物は「分子内」または双性イオン性の塩を形成する（Ｒ７がＨである）、
いくつかの実施形態において、Ｒ７は常に存在しており、Ｘ−は常に存在していないことが好ましい。より具体的には、いくつかの実施形態において、式ＩＸの化合物はトルセミドではない。
【００９９】
いくつかの実施形態において、式ＩＸの化合物は、ピリジン置換トルセミド第四級アンモニウム塩またはそれに対応する分子内塩（双性イオン）であり得る。例として、メトキシメチルピリジニウムトルセミド塩、メチルチオメチルピリジニウムトルセミド塩、およびＮ−ｍＰＥＧ３５０−ピリジニウムトルセミド塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
置換基Ｒ１〜Ｒ７の定義は、上記式Ｉにおいて定義されたものに以下の定義を加える。
【０１０１】
用語「アミノ」は、本明細書で用いられる場合、１つまたは両方の水素原子がアルキルもしくはアリールまたは任意で置換されているアルキルもしくはアリールに任意で置き換えられていてもよい、−ＮＨ２を指す。
【０１０２】
「アルキルチオ」または「チオアルキル」は、本明細書において単独でまたは別の基の一部として用いられる場合、硫黄部分を通じて親分子部分に付加したアルキル基（本明細書に定義のとおり）を指す。アルキルチオの代表的な例としては、メチルチオ、チオメチルエチルチオ、チオエチル、ｎ−プロピルチオ、チオ−ｎ−プロピル、イソプロピルチオ、チオ−イソプロピル、ｎ−ブチルチオ、およびチオ−ｎ−ブチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
「アリールチオ」または「チオアリール」は、本明細書で用いられる場合、−ＡｒＳ基を指し、ここで、Ａｒはアリールである。例としては、フェニルチオ、チオフェニル、２−ナフチルチオ、およびチオ−２−ナフチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
「アルカリールチオ」または「チオアルカリール」は、本明細書で用いられる場合、−Ｓ−アルキル−アリール基を指し、ここで、Ａｒはアリールである。例としては、ベンジルチオ、チオベンジル、２−ナフチルチオおよび、チオ−２−ナフチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
用語「第四級アンモニウム」は、本明細書で用いられる場合、「オニウム」状態で窒素上に正電荷を有する窒素への４つの結合を有する化学構造、すなわち、「Ｒ４Ｎ＋」または「第四級窒素」を指し、ここで、Ｒはアルキルまたはアリールなどの有機置換基である。用語「第四級アンモニウム塩」は、本明細書で用いられる場合、第四級アンモニウムカチオンとアニオンとの会合を指す。
【０１０６】
あるいは、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減少させる化合物も、共輸送体のＳＰＡＫ自己リン酸化および基質リン酸化を介した、プロテインキナーゼ阻害薬スタウロスポリンおよびＫ２５２ａなどの非利尿性化合物、または、スルフヒドリル薬剤Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、およびジアミドから選択されることが好ましい（Gagnon et al., 2006）。
【０１０７】
別の実施形態において、ＮＫＣＣ１拮抗化合物は（ｉ）塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の発現および／または活性を減少させ、（ｉｉ）さらに塩素イオン共輸送体ＫＣＣ２の発現および／または活性レベルが増加するよう（ＫＣＣ２作動）にＫＣＣ２を調節する、ＮＫＣＣ１拮抗化合物も同様に開示される。このような化合物は、聴覚系の知覚神経構造に作用することが好ましく、蝸牛の有毛細胞、螺旋神経節ニューロン、神経節周囲のグリア細胞（ＳＧＣ）または聴覚経路に沿ったその他のグリア細胞もしくは神経系細胞に作用することがさらに好ましい。ＮＫＣＣ１拮抗およびＫＣＣ２作動の双方の効果を発揮する化合物は、ＣＣＣ−相互作用タンパク質（ＣＩＰ１）、プロテインホスファターゼＰＰ１、ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）およびスタウロスポリンからなる群より選択されることが好ましい。
【０１０８】
細胞内の塩素イオンレベルは、（ｉ）ＣＣＣ（カチオン塩素イオン共輸送体）−相互作用タンパク質（ＣＩＰ１）または（ｉｉ）全長ＣＩＰ１のＮＫＣＣ１拮抗特性およびＫＣＣ２作動特性を示し、それによってＮＫＣＣ１を阻害し、ＫＣＣ２を相互的に活性化させる（ｉ）由来のペプチド（長さが一般的に１０〜５０アミノ酸）を投与することによって減少させてもよい（Wenz et al., 2009）。さらに、プロテインホスファターゼＰＰ１はＮＫＣＣ１を不活性化し、ＫＣＣ２を活性化することが知られている。ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）およびスタウロスポリンにも同様の相乗効果が報告されており、これらも本発明の範囲に含まれるものである。
【０１０９】
抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ）２，二重特異性抗体、ＳＣＦＶ、ＦＶ、および低分子化抗体）を認識し、ＮＫＣＣ１に結合してその活性をブロックまたは減少させる、拮抗性のＮＫＣＣ１抗体または拮抗性のＮＫＣＣ１エピトープも同様に、本発明の範囲内として用いることができる。また、抗体はヒト化型で提供されてもよい。
【０１１０】
発現レベルを減少させるＮＫＣＣ１拮抗化合物については、ＮＫＣＣ１は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡによって、具体的にはＮＫＣＣ１  ｍＲＮＡのセグメントに結合することによって抑制されてもよい。ｓｉＲＮＡは、典型的には、ＮＫＣＣ１  ｍＲＮＡの領域と相補性のある２１〜２３ヌクレオチドの長さを有する。ＮＫＣＣ１  ｍＲＮＡの標的領域を特異的に認識するリボザイムも同様に、ＮＫＣＣ１発現レベルを拮抗させるために用いられてもよい。さらに、このような化合物は、ＮＫＣＣ１  ｍＲＮＡに結合してその翻訳をブロックするアンチセンスＲＮＡ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）であってもよい。あるいは、ＮＫＣＣ１の発現レベルは、聴覚系の関連する細胞内におけるＮＫＣＣ１遺伝子の転写に直接作用する化合物によって減少させてもよい。このような化合物は、例えばプロモーター活性をブロックすること、または、ＮＫＣＣ１遺伝子が転写するために必要とする転写因子をブロックすることによって、例えばＮＫＣＣ１遺伝子の制御領域に干渉してもよい。
【０１１１】
好ましくは、細胞を例えば細胞死に至らしめ得る潜在的な悪影響を避けるために、ＮＫＣＣ１に対する効果に起因してＫＣＣ２の上方制御に間接的に効果を示し得るＮＫＣＣ１拮抗化合物は何れも、健康な細胞におけるＫＣＣ２の生理学的レベルを超える過剰発現または過活性を生じさせるべきではない。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態において、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物は、聴覚機能（すなわち、聴力）に干渉しないか、臨床的に重大でないように、および／または可逆的にのみ干渉する。Ｃｌ−は様々な生理学的および病態生理学的プロセスに関連する主要な生体イオンの１つであるため、耳鳴を和らげるための塩素イオンレベルの調節はどのようなものであれ潜在的に聴覚系、特に蝸牛のイオンのホメオスタシスに干渉する可能性がある。また、蝸牛内での塩素イオンレベルの変化は、Ｎａ＋またはＫ＋レベルの変化を誘発する可能性がある。本発明に係る化合物の選択および投薬は、上記化合物の投与が内リンパの電位および聴力機能に影響を与えることがないよう選択されることが好ましい。
【０１１３】
第２の局面において、本発明は、本発明に係る塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物を活性剤として含む医薬組成物に関する。このような医薬組成物は様々な剤形で処方されてもよい。本発明の医薬組成物を調製するにあたっては、少なくとも１つの化合物またはその医薬的に許容可能な塩を有効成分として、医薬製剤分野における当業者に公知の技術に基づいて、適切な担体および添加剤とよく混合する。The Science And Practice of Pharmacy. 20th Edition. (Gennaro, A. R., Chief Editor), Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000の全体が参照によって組み込まれる。
【０１１４】
本発明に係るこのような医薬組成物は、典型的には、本明細書に開示される活性剤と共存できる賦形剤である「担体材料」を含有しており、標的とする耳構造および放出特性は、医薬的調合物が耳へ投与されることを許容できる。
【０１１５】
このような担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、潤滑剤、湿潤剤、および希釈剤などが挙げられる。耳に適合する薬学的担体材料」としては、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼインナトリウム、ダイズレシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロース、セルロース複合体、糖類  ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
用語「希釈剤」は、本明細書に開示する活性剤を、送達に先立って希釈するために用いられ、標的とする耳構造に適合する化学化合物を指す。
【０１１７】
「分散剤」および／または「粘度調整剤」は、液状の媒体を介して、本明細書に開示する活性剤の拡散と同質性を制御する材料である。拡散促進剤／分散剤としては、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ６０または８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；市場ではプラスドンとして知られている）、炭水化物をベースとした分散剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＣＰＣ−ＳＬ、およびＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ  Ｋ１００、ＨＰＭＣ  Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ  Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ  Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート（ＨＰＭＣＡＳ）、非晶質セルロースなど）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体（Ｓ６３０）、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドとあわせた４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノールポリマー（チロキサポールとしても知られる）、ポロキサマ（例えば、酸化エチレンと酸化プロピレンとのブロック共重合体である、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ６８、Ｆ８８、およびＦ１０８）、ならびにポロキサミン（例えば、酸化プロピレンと酸化エチレンをエチレンジアミドに逐次付加したことによって得られる四官能性のブロック共重合体であり、ポロキサミン９０８としても知られるＴｅｔｒｏｎｉｃ９０８（ＢＡＳＦ社，ニュージャージー州パーシッパニー））、ポリビニルピロリドンＫｉ  ２、ポリビニルピロリドンＫｉ  ７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有する）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ガム（例えば、トラガカントガム、アカシアガム、グアーガム、キサンタン（キサンタンガムが挙げられる）など）、糖類、セルロース化合物（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化されたソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化されたソルビタンモノラウレート、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。セルロースまたはトリエチルセルロースのなど可塑剤もまた分散剤として用いられる。本明細書に開示される活性剤のリポソーム分散および自己乳化型分散に有用な任意の分散剤としては、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルグリセロール、コレステロールおよびイソプロピルミリステートである。アニオン���で非硫酸型のグリコサミノグリカンもまた好ましい。特に、二糖類のポリマーであり、自身がＤ−グルクロン酸とＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンとで構成されており、β−１，４グリコシド結合およびβ−１，３グリコシド結合が交互に行われることによって連結している、ヒアルロン酸塩／ヒアルロン酸も同様に使うことができる。ヒアルロン酸塩／ヒアルロン酸の分子量は５０．０００〜５．０００．０００Ｄａであることが好ましい。
【０１１８】
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、硫酸ラウリルナトリウム、ドクサートナトリウム、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁酸塩、ポリエチレングリコール２００−６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの、耳が許容できる（ear-acceptable）化合物を指す。
【０１１９】
「安定剤」とは、標的とする耳構造の環境に適合する、酸化防止剤、バッファ、酸、防腐剤などの化合物を指す。安定剤は（１）注射器やガラス瓶などの容器、または送達系と賦形剤との適合性を向上させること、（２）組成物の成分の安定性を向上させること、または（３）製剤の安定性を向上させること、の何れか１つを担う薬剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、Ｔｗｅｅｎ６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリソルベート、ポロキサマ、胆汁酸塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化エチレンと酸化プロピレンとの共重合体（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（ＢＡＳＦ））などの、耳が許容できる化合物を指す。他の界面活性剤としては、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリドと植物油（例えば、ポリオキシエチレン（６０）硬化ヒマシ油）；ポリオキシエチレンアルキルエーテルとアルキルフェニルエーテル（例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０）が挙げられる。いくつかの実施形態において、界面活性剤は物理安定度の向上またはその他の目的のために含まれる。
【０１２１】
上記組成物は、合成または天然由来のポリマー（好ましくは生体適合性）を好適に含んでいてもよい。これらのポリマーは、放出制御ポリマーを含んでいてもよい。上記組成物がゲルとして提供される場合、ゲルを形成するポリマーは、例えば、ヒアルロン酸／ヒアルロン酸塩、レシチンゲル、（ポリ）アラニン誘導体、プルロニック、ポリ（エチレングリコール）、ポロキサマ、キトサン、キシログルカン、コラーゲン、フィブリン、ポリエステル、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）またはそれらの共重合体ＰＬＧＡ、スクロース酢酸イソ酪酸エステル、およびグリセロールモノオレートであることが好ましい。他の成分は担体（例えば、液状製剤、水中油製剤、油中水製剤用の水）であってよい。さらに、上記医薬品は増粘剤または減粘剤を含んでもよい。上記製剤はミクロスフェア、ミクロ粒子、リポソーム、ナノカプセル、ナノスフェア、またはナノ粒子をベースとしてもよい。
【０１２２】
好ましくは、上記医薬組成物は、全身投与（例えば、経口投与、筋肉経路または静脈経路によって）されるが、耳に対する局所的な投与に適している投与形態で提供されることが好ましい。上記医薬組成物は、耳に対する局所的な投与に適している形態、特に中耳と内耳との接点である正円窓または卵円窓への投与に適している形態であることがさらに好ましい。耳鳴が発症している間は聴覚系におけるＫＣＣ２の発現が減少し、内有毛細胞、聴神経、螺旋神経節ニューロンまたはその周辺および中央の突起部が主に影響を受けるため、好ましくは内耳の正円窓への局所投与が特に適している。いくつかの実施形態において、送達系は、鼓膜を貫通し、耳の正円窓膜に直接アクセスすることが可能な注射器および針の装置を備える。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する組成物０．２〜０．５ｃｃｓを中耳に注入し、正円窓膜および／または卵円窓に行き渡るように拡散させる。いくつかの実施形態において、上記組成物は、穿刺、外耳道鼓膜弁によって、または通気管を介して中耳に送達される。本明細書に開示する組成物はまた、例えば、あぶみ骨底板の切開などによって内耳に直接投与してもよく、開窓によって蝸牛に投与してもよい。本明細書に開示する組成物はまた、例えば、前庭器官（例えば、半規管または前庭）に投与してもよい。
【０１２３】
耳に対する局所投与が適している投与形態には、作用部位を標的として物質を投与できるという利点があり、少量の作用物質で治療を成功させられる。このため、治療を受ける患者の体の患部以外の部分にかかるストレスが減り、副作用が大幅に減少する。
【０１２４】
本発明に係るこのような医薬組成物は、マイクロカテーテル（例えば患者へ移植されることによる）、マイクロメーターシステム、（マイクロ）ガーゼ、または鼓室内投与、人工内耳、ポンプ装置、薬物注入ポンプ、もしくは注射、灌流などによる蝸牛内への送達によって、局所的に投与されてもよい。
【０１２５】
局所投与の際、上記医薬組成物は液状、半液状、粘質状で提供される。好ましくは、上記医薬組成物はゲルとして提供され、特にヒドロゲルをベースとした担体マトリックス、クリーム、顔料、泡、または軟膏と共に提供されることが好ましい。したがって、上記医薬組成物は、例えばヒドロゲル、その場で形成する（in situ forming）スポンジ材料、化学線硬化ゲル、または熱可逆性ゲルの形態で提供されてもよい。一実施形態において、上記組成物は放出制御製剤として提供されてもよい。
【０１２６】
ゲル様製剤は、例えばものを飲み込むなどして耳管が開放された場合にも、中耳の正円窓膜または卵円窓膜上のそれぞれに上記組成物が確実にとどまるようにするため好ましい。ゲルは単相または二相の系を包含する。単相ゲルは、分散した高分子と液体との間に明確な境界が存在しないよう、液体中に均一に分布する有機高分子で構成されている。いくつかの単相ゲルは合成高分子（例えば、カルボマー）または天然ガム（例えば、トラガカントゴム）から調製される。いくつかの実施形態において、単相ゲルは一般的に水性であるが、アルコールおよび油を用いても作製される。二相ゲルは細かい離散分子のネットワークで構成される。ゲルはまた、疎水性のものと親水性のものとに分類することができる。ある実施形態において、疎水性ゲルの基剤は、コロイドシリカでゲル状にしたポリエチレンまたは脂肪油を含む液体パラフィン、またはアルミニウムもしくは亜鉛石鹸からなる。一方、疎水性ゲルの基剤は、通常、水、グリセロール、または適切なゲル化剤（例えば、トラガカントガム、デンプン、セルロース誘導体、カルボキシビニルポリマー、およびケイ酸アルミニウムマグネシウム）を用いてゲル状にしたプロピレングリコールからなる。ある実施形態において、本明細書に開示する組成物のレオロジーは、偽塑性、可塑性、揺変性、または拡張性である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される、耳が許容できる高粘度製剤は、室温では液状ではない。ある実施形態において、当該高粘度製剤は、室温と体温との間の相転移を特徴とする。いくつかの実施形態において、当該相転移は、体温よりも１℃、２℃、３℃、４℃、６℃、８℃、または１０℃低い温度で発生する。
【０１２７】
本発明に係る医薬組成物は、ＮＫＣＣ１の活性および／または発現を調節する（特にＮＫＣＣ１の活性および／または発現を拮抗することによる）化合物を、活性剤として含むことが好ましい。このＮＫＣＣ１に対する拮抗作用によって、本発明に係る医薬組成物は、好ましくはＫＣＣ２の活性および／または発現を増加させる。このＫＣＣ２の活性および、または発現の増加は、本発明のＮＫＣＣ１拮抗化合物による間接的な効果である。
【０１２８】
好ましい一実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、追加的な活性剤として、ＧＡＢＡ作動性作用物質および／またはグリシン作用薬をさらに含む。このような場合、本発明に係る、塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物が、１つ以上のＧＡＢＡ作動性剤および／または１つ以上のグリシン作用薬とともに、急性または慢性の耳鳴治療または防止に用いられる。このような組み合わせは、併用療法（上記ＮＫＣＣ１拮抗物質とその他の活性剤を別個に投与すること）、または本明細書において医薬組成物として用いられている単一の製剤として調製されてもよい。薬剤が別個に調製される場合、それらの薬剤は治療情報リーフレットともにキットとして提供されてもよい。併用療法の薬剤の投与は同時に行われてもよいが、時間差治療プロトコル（staggered treatment protocol）に規定されるような、連続した投与が好ましい。ＧＡＢＡおよび／またはグリシン作用物質と、本発明に係るＮＫＣＣ１拮抗化合物との同時投与は、拮抗物質が作用薬の興奮性作用をブロックするため、治療において相乗効果をもたらす。
【０１２９】
本発明の医薬組成物に用いられる、または、このような併用療法に用いられるＧＡＢＡ作動性作用物質またはグリシン作用薬は、ミダゾラム、ジアゼパム、フルラゼパム、オキサゼパム、ニトラゼパム、フルニトラゼパム、クロナゼパム、トリアゾラム、クロバザムおよびブロチゾラム、バクロフェン、γ−ビニルＧＡＢＡ、γ−アセチレンＧＡＢＡ、プロガビド、ムスシモール、イボテン、バルプロ酸ナトリウムまたはテトラヒドロイソキサゾロピリジン（ＴＨＩＰ）からなる群より選択されることが好ましい。
【０１３０】
別の局面において、本発明は、治療に効果的な量の、本発明に係る塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１を調節する化合物または本発明に係る医薬組成物を含む、急性または慢性、好ましくは慢性の耳鳴の治療または予防方法に関する。好ましくは、本発明に係る急性または慢性の耳鳴の治療または予防方法は、耳鳴を和らげるためにＮＫＣＣ１に拮抗することによって聴覚系の知覚神経構造における細胞内の塩素イオンレベルを減少させる化合物を、全身的にまたは局所的に、投与することに関する。このような効果を得るためには、開示された拮抗化合物は、蝸牛の有毛細胞、螺旋神経節ニューロン、神経節周囲のグリア細胞（ＳＧＣ）、または聴覚経路に沿った他のグリア細胞もしくは神経系細胞における塩素イオン共輸送体ＮＫＣＣ１の機能または発現を調節してもよい。これらの化合物の二次的、間接的効果として、ＮＫＣＣ１の活性または発現の阻害が、ＫＣＣ２の活性および発現の上方制御をもたらすことが好ましい。
【０１３１】
好ましい実施形態において、上記治療方法は全身投与または耳への局所投与を含む。本発明の化合物は、最終的には、明確な作用メカニズムに依存した他の化合物（例えば、上記にて説明したＧＡＢＡ作動性化合物またはグリシン作動性化合物）と組み合わせて投与されてもよい。
【０１３２】
本発明の別の局面は、塩素イオン共輸送体（例えば、ＮＫＣＣ１またはＫＣＣ２）を調節することができる化合物、好ましくはＮＫＣＣ１の活性および／または発現に拮抗することによってＫＣＣ２の発現および／または活性を増加させることができる化合物を同定およびキャラクタリゼーションするためのスクリーニング方法に関する。本発明に使用できる化合物を同定するためのスクリーニング方法は、ＮＫＣＣ１の活性の下方制御／喪失を判定するによって、好ましくはＫＣＣ２の発現および／または活性の増加を判定することによって行われてもよい。例えばＫＣＣ２の発現／活性に対する試験化合物の阻害可能性を判定するようなアッセイは、インジケーター分子（例えば、放射性のインジケーターイオン（例えば、８６Ｒｂ＋、Ｃｓ＋））の選択を含んでもよい。インジケーターは放射性標識に基づいていてもよいが、チャネルを介して輸送されたカチオンが、そのようなカチオンと結合した蛍光標識によって検知され得ることが好ましい。このような蛍光標識はＢＴＣ−ＡＭ染料であってもよく、それによってカチオンと蛍光標識との会合が検知可能な蛍光変化を生じてもよい。このようなＢＴＣ−ＡＭ染料に結合し得るカチオンは、例えばＴｌ＋であってもよい。その後、このようなインジケーターは（例えば上記カチオンの）（細胞内および／または細胞外への）流量、通常は細胞内への流量を測るために用いられ得る。カチオン性のインジケーターは、塩素イオン共輸送タンパク質によって、Ｃｌ−と共に細胞膜を横切って共輸送されるように選択されるべきである。（例えばＫＣＣ２などの）双方向輸送能の輸送体活性を測定する場合、輸送方向は既存のイオンの勾配に左右される。外部からカチオンを細胞懸濁液に添加することで、例えばＫＣＣ２については、通常は(細胞への)流入がそのようなアッセイ様式によって測定される。
【０１３３】
したがって、本発明は、（ａ）１つ以上の塩素イオン輸送体を安定して発現する細胞を用意する工程、（ｂ）試験化合物を当該細胞に添加する工程、（ｃ）輸送体カチオンを添加する工程、および（ｄ）細胞膜を横切る当該カチオンの輸送を測定する工程、によって、１つ以上の塩素イオン輸送体を調節することができる化合物を同定およびキャラクタリゼーションするためのスクリーニング方法に関する。
【０１３４】
このようなアッセイに用いられる細胞は、ヒト細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）であってよく、好ましくは、組み換えヒトＫＣＣ２および／またはＮＫＣＣ１を異種的に（in a heterologous way）安定して発現するものであってよい。
【０１３５】
これについて、細胞を典型的にプレートに播き、インジケーターを当該細胞にロードする。その後、当該細胞を、例えばアッセイバッファ（例えば、ＨＥＰＥＳバッファ）で洗浄し、ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー）などの測定装置に載せてもよい。その後、スクリーニングした試験候補化合物を上記細胞にロードし、短時間（例えば、１〜１０分間）インキュベートした後、例えばアッセイバッファにおいて、通常溶解しているカチオンを添加することによってデータ取得を開始する。カチオンとしてＴｌ＋を含む塩として、ＴｌＮＯ３を用いてもよい。
【０１３６】
カチオンの輸送の読み出しは、例えば蛍光シグナルを（例えば、ＦＬＩＰＲ装置によって）測定することで行われる。このような条件下では、蛍光発光シグナルは、典型的には１〜１０分間計測される。輸送（例えば、Ｔｌ＋輸送）の初速度は、典型的には、カチオン添加後の最初の３０秒、好ましくは最初の１０秒以内の蛍光シグナルの直線的増加の分析から演繹する。輸送初速度（例えば、相対的Ｔｌ＋）について測定したシグナルに基づき、コントロールのパーセンテージとして算出することによって、データ分析を行ってもよい。典型的には、測定結果は、大きな増加で始まり、段々と遅くなる増加の相に続き、平衡状態相で典型的に終わる曲線となる。チャネル輸送体活性の算出は、カチオンの輸送の初速度（シグナル増加の最初の直線の相）によって確実に測定されてもよい。（試験候補化合物の添加がない方法のセットアップと比較して）試験候補化合物の添加による輸送体活性の違いを判定してよく（カチオンチャネル輸送の初期速度がより早いか遅いか）、化合物がポジティブなモジュレータまたは阻害モジュレータとして分類されるかどうか結論づけてもよい。上記モジュレータの濃度依存性も同様に評価してもよい。
【０１３７】
好ましい実施形態において、スクリーニングアッセイは、共輸送体活性によって上記スクリーニング方法に干渉する可能性のある特定のチャネルをブロックすることで行ってもよい。もし、例えばＫＣＣ２活性を避けるのであれば、上記アッセイは例えばＫＣＣ２活性を（特に）ブロックすることによって行われてもよい。ＫＣＣ２阻害剤（例えば、フロセミドまたはアルカン酸ＤＩＯＡ）をアッセイ系に添加することによってＫＣＣ２活性のブロックが達成されてもよい。
【０１３８】
したがって、本発明のスクリーニング方法は、（ｉ）１つ以上の輸送体を異種発現する細胞を提供する工程、（ｉｉ）輸送体カチオンに結合する蛍光色素をさらに添加する工程、（ｉｉｉ）カチオンの輸送の初速度を測定する工程、および（ｉｖ）別の輸送体の輸送体活性への干渉をブロックする（例えば、当該別の輸送体の阻害剤を添加することによる）工程：のうちの１つ以上の工程を追加的に含んでもよい。
【０１３９】
好ましい一実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、候補化合物が、１つ以上の塩素イオン共輸送体の活性および／または発現を調節することによって、細胞における細胞内塩素イオンレベルを調節することができ、ひいては耳鳴の予防および治療に有用であるかどうかを決定する工程を含む。
【０１４０】
本発明のスクリーニング方法は、試験化合物の存在下および非存在下において塩素イオン輸送体遺伝子発現（例えば、ＫＣＣ２）のアッセイを行う工程を含んでもよい。そのような遺伝子発現は、対応するＲＮＡまたはタンパク質の検出によって測定されてもよいし、転写制御因子を含む適切なレポーターコンストラクト（通常、レポーター遺伝子と操作可能に連結されたこのような塩素イオン輸送体またはＫＣＣ２遺伝子と結合されている）の使用によって測定してもよい。ＫＣＣ２のポジティブモジュレータは、例えば、Zhang et al., 2010において提示されているように、蛍光イメージングプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）を用いた蛍光に基づくタリウム輸送アッセイなどのハイスループットスクリーニングを行うことによって同定されてもよい。
【０１４１】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、耳鳴を引き起こす聴覚外傷（１２０ｄＢ、１０ｋＨｚ、２時間）が、ラットの内有毛細胞および螺旋神経節ニューロンにおけるＫＣＣ２の発現の減少につながることを示す。
Ａ）蝸牛の中回転（midbasal turn）における螺旋神経節ニューロンのin situハイブリダイゼーション。曝露から１４日後、騒音に曝露された動物（ＡＴ）のＫＣＣ２  ｍＲＮＡの下方制御がはっきりと認められた（ｂ）。偽曝露されたコントロール動物との比較は（ａ）に示されている。
Ｂ）ＫＣＣ２のウェスタンブロット。第１レーンは、１４０ｋＤａの明確なバンド（ＫＣＣ２である）を有するポジティブコントロールとしての海馬組織を示す。第２レーンは曝露されていないコントロール動物の、曝露から７日後の蝸牛組織に対応し、第３レーンは騒音に曝露された動物の、曝露から７日後の蝸牛組織に対応している。騒音に曝露された動物（右レーン）において、コントロール動物と比べて、ＫＣＣ２タンパク質の下方制御がはっきりと確認できる。
【０１４２】
図２は、騒音外傷（１０ｋＨｚ、１２０ｄＢ、それぞれ１時間、１．５時間）から６日後または３０日後の、ラットの蝸牛の中回転の内有毛細胞および螺旋神経節ニューロンにおけるＫＣＣ２の下方制御が、耳鳴の病態生理に特有なものであり、失聴には関係がないことを示す。
Ａ）蝸牛の中回転における螺旋神経節ニューロンのin situハイブリダイゼーション。騒音外傷から６日後に、耳鳴行動を示さない動物（ｂ）と比べて、耳鳴行動を示す動物のＫＣＣ２  ｍＲＮＡの下方制御がはっきりと認められた（ａ）。騒音外傷から３０日後の（ｃ）および（ｄ）においても、同様の状態が認められた。
Ｂ）ラットの蝸牛への騒音曝露または偽曝露から２週間後の内有毛細胞のリボンシナプスの数（コントロールに対する割合として）。ＡＰで処理した耳のうち、偽曝露された動物に比べ、騒音に曝露された耳の中回転（グラフの中央の棒）および基底回転（グラフの右の棒）において、リボンの有意な減少が認められた。一方、騒音に曝露され、ＮＫＣＣ１拮抗物質ブメタニドを投与された耳における減少数は、偽曝露動物と比べて有意ではなかった。しかし、騒音に曝露された耳のうち、ＡＰで処理された耳とブメタニドで処理された耳との間にはリボン数に有意な差が生じた。頂回転は内有毛細胞ほどの変化を示さなかった。頂回転は高周波の外傷にはほとんど影響を受けなかった。
【０１４３】
図３は、ＮＫＣＣ１阻害剤ブメタニドを局所投与することで、騒音外傷に曝露されたラットの蝸牛におけるＫＣＣ２の下方制御が防止され、耳鳴との形態学的相関が和らげられることを示す。
Ａ）騒音の曝露から２週間後（黒色の棒）、偽曝露後から２週間後（薄い灰色の棒）の蝸牛組織におけるＫＣＣ２発現およびＡＰまたはブメタニドによるラットの蝸牛に対する処理のリアルタイムＰＣＲ。人工外リンパ液（ＡＰ）で処理された偽曝露の蝸牛をコントロールとした（白色の棒）。１８ＳｒＲＮＡおよびβ−アクチンをハウスキーピング遺伝子として用いた。騒音に曝露され、ＡＰで処理された動物において、統計的に有意なＫＣＣ２の下方制御が認められた。このようなＫＣＣ２の下方制御は、ブメタニドで処理された偽曝露動物または曝露動物には見られなかった。ＡＰで処理された騒音曝露動物とブメタニドで処理された騒音曝露動物との間にもまた、ＫＣＣ２の発現に統計的に有意な差があった。
Ｂ）騒音曝露または偽曝露から２週間後のラットの蝸牛における内有毛細胞リボンシナプスの数。内有毛細胞（ＩＨＣ）１つあたりのリボンの数が示されている。ＡＰで処理された耳のうち、騒音に曝露された耳の中回転（グラフ中央の棒）および基底回転（グラフ右の棒）には、偽曝露状態の動物と比べてリボン数の有意な減少が認められた。一方、ブメタニドを投与された、騒音に曝露された耳(黒色の棒）では、偽曝露動物（薄い灰色の棒）と比べて有意な減少は見られなかった。しかし、騒音に曝露された耳のうち、ＡＰで処理された耳（濃い灰色の棒）とブメタニドで治療された耳（黒色の棒）との間には有意な差があった。頂回転（左）は内有毛細胞ほどの変化を示さなかった。頂回転は高周波の外傷にほとんど影響を受けなかった。
【０１４４】
〔実施例〕
＜実施例１＞
（目的）
ループ利尿薬フロセミドは耳鳴の（可逆性の）治療薬として提案されてきた。フロセミドは蝸牛内の電位を低下させることによって聴神経の炎症を和らげるとの仮定が立てられてきた（Risey et al., 1995）。しかしながら、同時に、フロセミドの副作用として耳鳴があることも知られている。本発明者らは、耳鳴に対する新規な薬物療法の開発の出発点を特定するために、耳鳴を誘発しやすい蝸牛への損傷後、蝸牛内の塩素イオン共輸送体の発現が変化するのかどうか、そして、もし変化するのであればどのように変化するのかを解明しようと努めた。
【０１４５】
（材料および方法）
消音ブースにおいて、麻酔を投与した１３匹のメスの成体ウィスターラットの耳内に、ＳＰＬ強度１２０ｄＢ、周波数１０ｋＨｚの音を２時間継続的に曝露した。この曝露はラットに耳鳴を誘発させやすい（例えば、Tan et al., 2007）。この聴覚刺激は、上記動物の頭の高さで出るように調整した。麻酔を投与した４匹のコントロール動物を、スピーカーを切った状態で消音ブースに同じ時間置いた。１４日後、音に対する曝露または偽曝露を行った動物を殺した。蝸牛を採取し、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、１２５ｍＭスクロース（１００ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．４に溶解）に２時間浸漬することで固定した。これらの蝸牛はＲａｐｉｄ  Ｂｏｎｅ  Ｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｒ（Ｅｕｒｏｂｉｏ社，Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ  Ｃｅｄｅｘ，フランス）中で脱灰したのち、２５％スクロースを含むハンクス緩衝食塩水中で一晩インキュベートした。翌日、蝸牛をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，Ｉｎｄ.，社，アメリカ）に包埋した。使用前に、in situハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学のために、組織サンプルを１０μｍの厚さにおいて凍結切片にし、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（登録商標）／ｐｌｕｓ  顕微鏡スライドに載せて、−２０℃で保管した。
【０１４６】
免疫組織化学のために、スライドを室温で３０分間乾燥させた。その後、スライドをＰＢＳ＋０．１％トリトンを用いて３分間透過化処理し、ＰＢＳで洗浄して、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。スライドを、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した一次抗体（ＫＣＣ２  １：１５０、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，ハンブルク，ドイツ）と共に一晩インキュベートした。翌日、スライドをＰＢＳで洗浄し、二次抗体（Ｃｙ３−抗ウサギ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社，サフォーク，イギリス）と共に１時間インキュベートした。スライドを再度洗浄し、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，バーリンゲーム，カリフォルニア州，アメリカ）に載せた。スライドを、オリンパスＡＸ７０顕微鏡を用いて観察した。
【０１４７】
in situハイブリダイゼーションのために、スライドを、アルカリフォスファターゼと共役させた抗ジゴキシゲニンン抗体（１：７５０、Ｒｏｃｈｅ社，マンハイム，ドイツ）と共にインキュベートした。その後、ニトロブルーテトラゾリウム塩と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社，ミュンヘン，ドイツ）とを含む基質溶液中で切片を発色させた。切片を異なる時間枠で観察し、基質が発色生成物になる様子をモニターした。コントロールおよび曝露動物からの切片も同時に停止し、スライドに載せて、オリンパスＡＸ７０顕微鏡を用いて観察した。
【０１４８】
ウェスタンブロット分析のために、ＸＣｅｌｌ  Ｓｕｒｅ  Ｌｏｃｋ  Ｍｉｎｉ  ＣｅｌｌおよびＮｕＰａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Invitrogen社，カールスルーエ，ドイツ）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（製造元の指示通りに用いた）によって、ラットの蝸牛および脳組織由来のタンパク質を分離させた。免疫ブロッティングのために、Ｘｃｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、タンパク質（１レーンあたり４０μｇ）をポリフッ化ビニリデン転写膜上に転写した。ＫＣＣ２抗体（Blaesse et al., 2006；HG Nothwang氏およびE Friauf氏の御厚意により提供）を、適切な希釈液中、４℃で一晩プレインキュベートした。Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社，フライブルク，ドイツ）を用いて、結合した抗体を可視化した。定量化のために、Ｃｅｌｌ＾Ｆソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ社，ハンブルク，ドイツ）を用いて、濃度測定分析を行った。コントロールのバンドの強さと、曝露組織のバンドの強さを測定し、互いに比較した。
【０１４９】
（結果）
耳鳴を誘発しやすい過度の騒音に曝露された動物は、曝露から１４日後、明らかなＫＣＣ２の下方制御を示した（図１ａ）。免疫組織化学は、曝露されていないコントロール動物と比較して、内有毛細胞におけるＫＣＣ２タンパク質の発現が著しく減少したことを示した。また、in situハイブリダイゼーションによって、騒音に曝露された蝸牛の螺旋神経節ニューロンにおいて、曝露されていない蝸牛と比べると、明らかなＫＣＣ２  ｍＲＮＡの下方制御が示された。ウェスタンブロット分析によって、図１ｂに示すように、騒音に曝露された動物の蝸牛組織におけるＫＣＣ２タンパク質が、コントロール動物と比較して、明確に下方制御（７．８倍現象）されることが示された。この実験の結果は、聴覚外傷などによる蝸牛への損傷に伴い、ＫＣＣ２の発現が下方制御させることを初めて示すものであった。この実験の結果に対し、この下方制御が失聴に関連するのか、耳鳴に関連するのか、または両方に関連するのかについての解明が残る。したがって、さらなる解明を行うために、実施例２を設定した。
【０１５０】
＜実施例２＞
（目的）
第２の実験のねらいは、最初の実験で認められたＫＣＣ２の下方制御が失聴の病態生理に関連するのか、耳鳴の病態生理に関連するのか、または両方の病態生理に関連するかどうかを分析することである。この下方制御は、フロセミドによる耳鳴の誘発が一般的に推測されているような蝸牛内電位の緩和（例えば、Risey et al., 1995）に関連することよりも、むしろフロセミドがＫＣＣ２に及ぼす公知の効果に関連することの示唆となり得るものである。この目的のため、Ruttiger et al., 2003に記載されている行動モデルを用いて、耳鳴を有する動物と耳鳴がない動物とを識別した。
【０１５１】
（材料および方法）
３６匹のメスの成体ウィスターラットを、一定の音が発生している際は液体給餌器に積極的にアクセスするよう条件付けチャンバ内で訓練を行った。無音の間は報酬を与えなかった。条件付けは、動物が無音の期間よりも音が存在する期間に報酬用の給餌器にアクセスするようになったところで完了した。
【０１５２】
０日目、条件付けをされたラットに麻酔を投与し、消音ボックスにおいて、ＳＰＬ強度１２０ｄＢ、周波数１０ｋＨｚの音を、ラットの耳内に１時間（Ａ群；ｎ＝１８）または１．５時間（Ｂ群；ｎ＝１８）継続的に曝露した。音響刺激は動物の頭の高さで出るように調整された。全ての動物を耳鳴行動に応じてグループ分した。Ａ群においては、５匹が耳鳴の症状を示し、１０匹が耳鳴の症状がなく、３匹が死亡した。一方、Ｂ群においては、５匹が耳鳴を発症し、１２匹が耳鳴の症状がなく、１匹が死亡した。Ａ群の動物を音響曝露または偽曝露から６日後に殺し、Ｂ群の動物を音響曝露または偽曝露から３０日後に殺した。
【０１５３】
組織の調製、免疫組織化学、およびin situハイブリダイゼーションを、実施例１に記載のものと同様に行った。
【０１５４】
内有毛細胞のリボンシナプスの計数を行った。切片を、落射蛍光照明（倍率１００×、ＮＡ＝１．３５）と電動Ｚ軸とを装備したオリンパスＡＸ７０顕微鏡を用いて観察した。ＣＣＤカメラおよび画像ソフトウェアＣｅｌｌ＾Ｆ（ＯＳＩＳ  ＧｍｂＨ社，ミュンスター，ドイツ）を用いて、画像を取得した。蝸牛の凍結切片上でオトフェルリンおよびＣｔＢＰ２／ＲＩＢＥＹＥの免疫陽性スポットの計数は、Ｚ軸に沿った画像のスタック（Ｚ軸スタック）において、ＩＨＣの核の全体およびそれを超える範囲を対象とし、距離８μｍにわたって画像化することによって行った。通常Ｚ軸スタックは１層あたり０．２７６μｍの増分３０層で構成されており、各層について、蛍光色素ごとの画像を取得した。Ｚ軸スタックは、最隣接アルゴリズムを用いたＣｅｌｌ＾Ｆ’ｓ  ＲＩＤＥモジュール（ＯＳＩＳ  ＧｍｂＨ社，ミュンスター，ドイツ）を用いて３次元のデコンヴォルーションを行った。
【０１５５】
（結果）
Ａ群およびＢ群の何れにおいても、騒音曝露から６日後および３０日後には、耳鳴の行動相関を示す動物において、耳鳴行動を示さない動物と比べて、ＫＣＣ２の発現が著しく下方制御された（図２ａに示されるとおり）。免疫組織化学は、耳鳴症状のない動物と比べて、耳鳴症状のある動物の内有毛細胞におけるＫＣＣ２タンパク質の発現が明らかに低下していることを示す。in situハイブリダイゼーションにおいてもまた、耳鳴症状のない蝸牛に比べて、耳鳴症状のある動物の螺旋神経節ニューロンにおけるＫＣＣ２  ｍＲＮＡの下方制御が明らかになった。さらに、耳鳴症状のない動物に比べて、聴力に障害を受けた耳鳴症状を有する動物のＩＨＣリボンは、中回転および基底回転において大幅に減少した（動物数ｎ＝４、二元ＡＮＯＶＡに関してｐ＜０．００１、試験後のスチューデントのｔ検定（両側検定）に関してｐ＜０．０２、何れもα＝０．０５）（図２ｂ参照）。
【０１５６】
結論として、実施例２から得られた結果は、騒音障害に伴う内有毛細胞および螺旋神経節ニューロンにおけるＫＣＣ２の下方制御は、失聴に何ら関連がなく、むしろ耳鳴の病理生態学に固有であることを初めて示した。この発見は、ＮＫＣＣ１およびＫＣＣ２に作用するフロセミドなどの利尿剤による耳鳴の誘発は、ＫＣＣ２阻害の結果である可能性が高く、一方で上記利尿剤の反対の効果は、典型的には異なる濃度でのＮＫＣＣ１拮抗によるものであることを示唆している。結果として、細胞内のＣｌ−レベルを低下させるために、耳鳴治療の戦略は、ＮＫＣＣ１の下方制御からなる。
【０１５７】
＜実施例３＞
（目的）
第３の実験のねらいは、耳鳴を誘発する騒音外傷を受けた後の蝸牛細胞内の塩素イオンレベルに対する薬理学的調節が耳鳴を抑制できるかどうかを分析することである。ブメタニドは、ＫＣＣ２に比べてＮＫＣＣ１に対してかなり高い親和性を有する（Payne et al., 2003）ため、本発明のこれまでの発見を鑑みると、ＮＫＣＣ１に対する阻害効果がＫＣＣ２に対するあらゆる（望ましくない）阻害効果よりも優位となることから、ブメタニドの投与によって細胞内のＣｌ−レベルが低下することを考慮にいれるべきである。
【０１５８】
（材料および方法）
２０匹のメスの成体ウィスターラットに、これまでの実施例と同様に麻酔を投与した。まず、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）の測定を行った。実施例２と同様に、ラットに、消音ブースにおいて、ＳＰＬ強度１２０ｄＢ、周波数１０ｋＨｚの音を１.５時間継続的に曝露し（Ａ群；ｎ＝１０）、また同様の設定で偽曝露（Ｂ群；ｎ＝１０）を行った。
【０１５９】
騒音外傷後直ちに、動物に対し２通り、すなわち人工外リンパ液（ＡＰ）またはブメタニド（Ｓｉｇｍａ Ｂ３０２３, Ｌｏｔ ０２７Ｋｏ９８８）の何れかで処理した。ＡＰは、Guitton et al., 2003（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に従って調製した。ブメタニド（３００μＭ）は、５０ｍｇのブメタニド粉末を６．８７ｍｌのＡＰに希釈し、この２０ｍＭのストック溶液を１：６６になるようにＡＰ（ストック溶液を１５．１５μＬ、およびＡＰを９８４．８５μＬ）に希釈して調製した。Ａ群およびＢ群から５匹ずつ（計１０匹）にＡＰを与え、Ａ群およびＢ群から５匹ずつ（計１０匹）にブメタニドを与えた。
【０１６０】
局所処理投与のために、耳の後ろの毛を除去し、耳後法で骨胞を露出させた。正円窓窩のちょうど上側の骨胞に、小さな穴を注意深く開けた（直径０．６〜１ｍｍ）。粘膜を切開し、正円窓周辺の領域の分泌液を注意深く乾燥させた。上記穴を通じて、小さなゲル泡ペレット（Ｇｅｌｉｔａ  Ｔａｍｐｏｎ；Ｂｒａｕｎ社，メルスンゲン，ドイツ）を正円窓窩に挿入した。ゲルローダーチップを備えた精密ピペットを用いてブメタニド溶液５〜８μｌまたはＡＰを上記ゲル泡につけて、ゲルの下に気泡が入るのを避けた。外観検査では、正円窓窩が完全に充填され、ゲルで覆われていることが示された。耳骨胞の穴はその後筋肉組織で外から覆われ、傷口は手術用の糸（Ｖｉｃｒｙｌ，Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ社，ノルダーシュテト，ドイツ）で縫合された。手術後、ラットの覚醒時まで体温を制御し保温した。
【０１６１】
ＡＢＲ測定のために、麻酔薬としてドミトールのみを与えた。手術の１５分前、フェンタニルを追加で皮下投与（ｓ．ｃ．）した。手術後、リマダイルを鎮痛剤として皮下投与した。動物を数時間睡眠状態に置いた後、ドミトールの効果は、皮下投与されたアンチセダンによって拮抗された。
【０１６２】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社，ヒルデン，ドイツ）を用いて、全ＲＮＡを前述のとおり単離した（Tan et al., 2007）。簡潔に述べると、β−メルカプトエタノールと混合した溶解物バッファを用いて組織を溶解した。凍結融解の工程を３回行ったのち、サンプルを遠心分離し、上清を洗浄用バッファを用いたさらなる洗浄工程のために残した。ＲＮＡを、４０μｌのＲＮａｓｅフリー水で溶離させた。Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いて、全ＲＮＡを前述のとおりｃＤＮＡに転写した（Tan et al., 2007）。簡潔に述べると、５０ｎｇのＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリー水およびＯｌｉｇｏ  ｄＴ１５  Ｐｒｉｍｅｒと共に、６５℃で１０分間インキュベートした。ＲＮＡｓｉｎおよびＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔを添加したのち、酵素サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。リアルタイムＰＣＲ反応については、１ウェルあたり、１２．５μｌのサイバーグリーン（ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ，Ｑｉａｇｅｎ社）、１μｌのＰｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ、７．５μｌのｄｄＨ２Ｏ、および４μｌのｃＤＮＡを用いた。全てのサンプルは、ネガティブコントロール（ｃＤＮＡ非添加）と同様、用いた各プライマーについて、３回試験した。ハウスキーピング遺伝子として、１８ＳｒＲＮＡおよびβ−アクチンを用いた。
【０１６３】
免疫組織化学を上述のとおり行い、実験２と同様、内有毛細胞のリボンシナプスの計数を行った。
【０１６４】
前述のとおり、麻酔を投与した動物においてＡＢＲを記録した（Knipper et al., 2000、Schimmang et al., 2003）。端的にいえば、動物の耳、頭頂部および背中の皮下に設置した銀線電極を用いて、フリーフィールドでのクリック音（１００μs）および純音（３ｍｓ、１ｍｓ勾配）の音響刺激に対する電気脳幹反応を記録した。増幅後（１００，０００倍）、与えられた各音圧（５ｄＢ刻みでＳＰＬ０〜１００ｄＢ）における反復回数６４〜２５６の平均シグナルを求めた。閾値は、騒音レベルとは視覚的に明らかに異なる電位を発生させた最も低い音圧によって決定した。ＡＢＲの測定の時点は、それぞれ、騒音直前、偽外傷、処理直後、処理後１日、２日、７日、および１５日とした。
【０１６５】
（結果）
偽曝露された耳（Ｂ群）において、ＡＰまたはブメタニドのどちらで処理されたかにかかわらず、処理後１５日経過した蝸牛組織サンプルからのＫＣＣ２のリアルタイムＰＣＲに違いはみられなかった。しかしながら、騒音に曝露された耳（Ａ群）において、偽曝露のみと比較して統計的に有意なＫＣＣ２の下方制御が、ＡＰで処理した耳においてみられた（スチューデントのｔ検定（両側検定）においてｐ＜０．０５）が、ブメタニドで処理した耳ではみられなかった。騒音に曝露され、ブメタニドで処理した耳におけるＫＣＣ２の発現は、偽曝露された耳におけるレベルと類似していたが、騒音に曝露され、ＡＰで処理した耳とは統計学的に有意に異なっていた（ｐ＜０．０１）（図３ａ参照）。
【０１６６】
驚くことに、内有毛細胞のリボンシナプスの計数を行った際にも同様の結果が認められた（図３ｂ参照）。ＡＰで処理した耳のうち、騒音に曝露された耳の蝸牛の中回転および基底回転において、偽曝露動物と比べて有意なリボン数の減少がみられた（ｐ＜０．０１）。反対に、騒音に曝露され、ブメタニドが投与された耳における減少は、偽曝露動物との比較において有意ではなかった。しかしながら、騒音に曝露されＡＰで処理した耳と、騒音に曝露されブメタニドで処理した耳とでは、リボンの数に有意な差があった（ｐ＜０．０２）。頂回転の内有毛細胞は、高周波の外傷に対してほとんど影響を受けないため、頂回転ではそれほど大きな変化は示されなかった。
【０１６７】
要約すると、これらの結果は、内有毛細胞における細胞内Ｃｌ−濃度の薬理学的調節は実行可能であり、しかも、内有毛細胞におけるＫＣＣ２発現の上方制御は、ＮＫＣＣ１を阻害することによって達成することができることを、初めて示すものである。このような阻害は、ＮＫＣＣ１拮抗物質によって発揮されるが、ＮＫＣＣ１拮抗物質はＫＣＣ２活性または発現の増加に対しては直接的な効果を発揮しない。むしろ、当該効果は、ＮＫＣＣ１阻害によって仲介され、それによってＫＣＣ２活性または発現に影響を及ぼす（すなわち、増加）。ＮＫＣＣ１阻害剤ブメタニドの適用は内有毛細胞のリボンの喪失の低減という結果をもたらした。耳鳴の存在についてのバイオマーカーとして、この結果は、この治療戦略によって耳鳴の緩和および抑制が見込めることを示している。
【０１６８】
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【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】図１は、耳鳴を引き起こす聴覚外傷（１２０ｄＢ、１０ｋＨｚ、２時間）が、ラットの内有毛細胞および螺旋神経節ニューロンにおけるＫＣＣ２の発現の減少につながることを示す。Ａ）蝸牛の中回転（midbasal turn）における螺旋神経節ニューロンのin situハイブリダイゼーション。曝露から１４日後、騒音に曝露された動物（ＡＴ）のＫＣＣ２  ｍＲＮＡの下方制御がはっきりと認められた（ｂ）。偽曝露されたコントロール動物との比較は（ａ）に示されている。Ｂ）ＫＣＣ２のウェスタンブロット。第１レーンは、１４０ｋＤａの明確なバンド（ＫＣＣ２である）を有するポジティブコントロールとしての海馬組織を示す。第２レーンは曝露されていないコントロール動物の、曝露から７日後の蝸牛組織に対応し、第３レーンは騒音に曝露された動物の、曝露から７日後の蝸牛組織に対応している。騒音に曝露された動物（右レーン）において、コントロール動物と比べて、ＫＣＣ２タンパク質の下方制御がはっきりと確認できる。
【図２】図２は、騒音外傷（１０ｋＨｚ、１２０ｄＢ、それぞれ１時間、１．５時間）から６日後または３０日後の、ラットの蝸牛の中回転の内有毛細胞および螺旋神経節ニューロンにおけるＫＣＣ２の下方制御が、耳鳴の病態生理に特有なものであり、失聴には関係がないことを示す。Ａ）蝸牛の中回転における螺旋神経節ニューロンのin situハイブリダイゼーション。騒音外傷から６日後に、耳鳴行動を示さない動物（ｂ）と比べて、耳鳴行動を示す動物のＫＣＣ２  ｍＲＮＡの下方制御がはっきりと認められた（ａ）。騒音外傷から３０日後の（ｃ）および（ｄ）においても、同様の状態が認められた。Ｂ）ラットの蝸牛への騒音曝露または偽曝露から２週間後の内有毛細胞のリボンシナプスの数（コントロールに対する割合として）。ＡＰで処理した耳のうち、偽曝露された動物に比べ、騒音に曝露された耳の中回転（グラフの中央の棒）および基底回転（グラフの右の棒）において、リボンの有意な減少が認められた。一方、騒音に曝露され、ＮＫＣＣ１拮抗物質ブメタニドを投与された耳における減少数は、偽曝露動物と比べて有意ではなかった。しかし、騒音に曝露された耳のうち、ＡＰで処理された耳とブメタニドで処理された耳との間にはリボン数に有意な差が生じた。頂回転は内有毛細胞ほどの変化を示さなかった。頂回転は高周波の外傷にはほとんど影響を受けなかった。
【図３】図３は、ＮＫＣＣ１阻害剤ブメタニドを局所投与することで、騒音外傷に曝露されたラットの蝸牛におけるＫＣＣ２の下方制御が防止され、耳鳴との形態学的相関が和らげられることを示す。
【０１７０】
Ａ）騒音の曝露から２週間後（黒色の棒）、偽曝露後から２週間後（薄い灰色の棒）の蝸牛組織におけるＫＣＣ２発現およびＡＰまたはブメタニドによるラットの蝸牛に対する処理のリアルタイムＰＣＲ。人工外リンパ液（ＡＰ）で処理された偽曝露の蝸牛をコントロールとした（白色の棒）。１８ＳｒＲＮＡおよびβ−アクチンをハウスキーピング遺伝子として用いた。騒音に曝露され、ＡＰで処理された動物において、統計的に有意なＫＣＣ２の下方制御が認められた。このようなＫＣＣ２の下方制御は、ブメタニドで処理された偽曝露動物または曝露動物には見られなかった。ＡＰで処理された騒音曝露動物とブメタニドで処理された騒音曝露動物との間にもまた、ＫＣＣ２の発現に統計的に有意な差があった。
Ｂ）騒音曝露または偽曝露から２週間後のラットの蝸牛における内有毛細胞リボンシナプスの数。内有毛細胞（ＩＨＣ）１つあたりのリボンの数が示されている。ＡＰで処理された耳のうち、騒音に曝露された耳の中回転（グラフ中央の棒）および基底回転（グラフ右の棒）には、偽曝露状態の動物と比べてリボン数の有意な減少が認められた。一方、ブメタニドを投与された、騒音に曝露された耳(黒色の棒）では、偽曝露動物（薄い灰色の棒）と比べて有意な減少は見られなかった。しかし、騒音に曝露された耳のうち、ＡＰで処理された耳（濃い灰色の棒）とブメタニドで治療された耳（黒色の棒）との間には有意な差があった。頂回転（左）は内有毛細胞ほどの変化を示さなかった。頂回転は高周波の外傷にほとんど影響を受けなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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