(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブミクロン粒子を含むサンプルを解析する方法であって、ナノ粒子追跡解析によって、前記サンプル中の粒子のサイズおよび粒子の数についての第１の情報を決定する工程と；動的光散乱によって、前記サンプル中の粒子の平均粒径についての第２の情報を決定する工程と；動的光散乱によって得られる結果に対する前記サンプル中の粒子の理論的影響を表す第３の情報を、前記第１の情報から決定する工程と；前記第３の情報を用いて前記第２の情報を調整して、平均粒径についての調整された情報を表す第４の情報を生成する工程とを含む方法。
【請求項２】
前記第１および第２の情報が、同じサンプルから同時に得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、液体中の固体粒子の懸濁液または他の分散体を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、好適に集束された放射線ビーム、典型的にレーザービームによって照射される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の情報が、粒子の輝度／スペクトル特性についての情報をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の情報が、粒径分布についての情報もさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の情報および前記第２の情報が、それぞれの検出システムを用いて得られる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の情報が、前記サンプル中の粒子の粒径の１つ以上についての理論的相関曲線または関数を生成するのに使用される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記相関関数が、サイズで重み付けされ、より大きい粒子には、より大きい重みが与えられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
異なる粒径についての前記相関関数が合計される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の情報が、各検出された粒子によって散乱される光の相対量についての情報を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、タンパク質を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、蛍光性の粒子を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記粒子が、ユーザが印加した外部電場および／または磁場に曝されながら、前記第１および／または第２の情報が得られる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を行うように適合され、構成された装置であって：
前記サンプルを照射するために好適に集束された放射線ビームを生成するための光源手段と；
ＮＴＡを用いて、前記第１の情報を得るための第１の検出システムと；
動的光散乱を用いて、前記第２の情報を得るための第２の検出システムと；
前記第１の情報から前記第３の情報を決定するようにプログラムされたデータ処理手段とを含む装置。
【請求項１６】
前記データ処理手段が、前記第３の情報を用いて前記第２の情報を調整して、第４の情報を生成するようにさらにプログラムされる、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記第１および第２の検出システムが、空間的に共通であり、かつ時間的に共通である、請求項１５または１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記第１および第２の検出システムが、空間的に共通であるが、時間的に異なる、請求項１５または１６に記載の装置。
【請求項１９】
前記第１および第２の検出システムが、空間的に異なるが、時間的に共通である、請求項１５または１６に記載の装置。
【請求項２０】
前記第１および第２の検出システムに共通の１つ以上の構成要素が存在する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子、特に、ナノ粒子を含むサブミクロン粒子、すなわち１００μｍ未満、一般に、５０μｍ未満の主要寸法を典型的に有する粒子の光学的な検出および解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子の解析は、幅広い業種の至る所で必要とされている。製品の性能および安定性は、汚染物質または凝集体を存在させずに、粒子懸濁液を微細な公差（ｆｉｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）で製造する能力に左右されることが多い。このような解析で第一に挙げられるのは、粒径およびサイズ分布測定であり、そのための多くの技術が、十分に確立され、日常的な品質管理ならびに研究および開発環境において一般的に用いられている。求められる製品の性質および粒子特性に応じて、電子顕微鏡法、動的光散乱（ＤＬＳ）、フラウンホーファー散乱、単一粒子検出技術、光学顕微鏡法などを含む様々な解析方法の１つ以上が用いられる。ただし、ナノスケールの粒子の場合、これらの例のうちの最初の２つのみが使用されることが多い。両方とも、広く普及しているが、資本コストおよび運転コスト、解析の所要時間、および、動的光散乱の場合、粒径分布プロファイルを分析する（ｒｅｓｏｌｖｅ）限られた能力を含む欠点を有する。
【０００３】
動的光散乱（ＤＬＳ）
光子相関分光法（ＰＣＳ）などの動的光散乱技術は、何千もの粒子の大きな集合体を解析し、これらの粒子から、ｚ−平均粒径、すなわち強度で重み付けされた平均粒径のみが、粒径分布の幅を示す多分散性指数とともに得られる（Ｐｅｃｏｒａ，Ｒ．，（Ｅｄ）（１９８５）Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。この技術は、典型的に、好適に集束された（ｆｏｃｕｓｓｅｄ）コヒーレントな、直径約１００μｍの単色レーザービームによって照射される、液体中のナノ粒子の懸濁液を含むサンプルにおいて実施され、このレーザービームからの散乱光が、光子計数光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）によって検出される。検出器は、サンプルによって遠視野に散乱される光からの１つのみのコヒーレンス領域またはスペックルを観察するために、ピンホールとスリットの組合せまたはシングルモード光ファイバーによって構成される。コヒーレンス領域内の光の強度は、ナノ粒子のランダムなブラウン運動の結果としての干渉効果によって変動し、強度の変動の特性時間スケールが、デジタル相関器によって解析される。強度の変動の変化の平均速度は、粒子拡散係数（Ｄｔ）として表すことができ、粒子拡散係数（Ｄｔ）から、レーザービームの経路における粒子の球相当流体力学直径が推定され得る。２〜３ｎｍ程度の小ささの粒子の最大寸法、例えば直径は、このように決定され得る。しかしながら、全ての粒子がＤＬＳで同時に測定されると、比較的少ない数の高度に散乱するより大きい粒子（例えば、汚染物質または凝集体）が、信号を支配し、存在し得るより小さい粒子の大部分の存在を事実上覆い隠し得ることが多い。ある限られた状況では、様々なデコンボリューションアルゴリズムの適用によって、得られた結果から粒径分布構造（例えば二峰性分布）を得ることが可能であるが、この手法は、２つの集団が、それ自体、過度に多分散性でなく、またはサイズが互いに過度に近似していない場合にのみ確実である。実際には、３未満の比率だけ直径が異なる粒子は、通常、分析することができない。これは、粒径分布についての正確な情報が必要とされる用途において厳しい制限であるが、サンプルは、より大きい粒子（例えば、汚染物質または凝集体）を含有し、より大きい粒子は、結果を著しく偏らせ、部分的にまたは完全により小さい粒子の存在を覆い隠すことがある。同様に、広範囲の粒径を含む本質的に複雑な、多分散性でかつ不均質なサンプルは、多くの場合、存在するより大きい粒径にひどく偏った（ｂａｄｌｙ  ｓｋｅｗｅｄ）分布を生じる。最終的に、アンサンブル法（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）であるため、特定の粒径またはサイズクラスの数に関する直接の情報をＤＬＳから何ら得ることはできない。
【０００４】
ナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）
ナノ粒子追跡解析は、液体中のナノ粒子の直接およびリアルタイムの可視化および解析のための最近開発された方法である。例えば、国際公開第０３／０９３８０１号パンフレットを参照されたい。レーザー照射される顕微鏡的技術に基づいて、ナノ粒子のブラウン運動が、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによってリアルタイムで解析され、各粒子は、同時であるが別々に可視化され、専用の粒子追跡画像解析プログラムによって追跡される。各粒子が、別々に可視化され、解析されるため、粒径および粒径分布の得られる推定値には、このサイズ領域の粒径測定の従来のアンサンブル法、例えば、上述される動的光散乱（ＤＬＳ）において通常である、強度で重み付けされたｚ−平均分布であるという制限はない。粒径および粒子の散乱強度を同時に測定するＮＴＡの能力により、不均質粒子混合物を分析することができ、重要なことには、粒子の濃度を直接推定することができ、ＮＴＡによって得られる粒径分布プロファイルは、直接の数／頻度分布である。
【０００５】
ＮＴＡは、関連分野の当業者によって認識される専門用語になっている。ＮＴＡを用いて収集されたデータについて言及している２５０を超える科学論文および発表がある。さらに、この用語は、例えば、ＡＳＴＭインターナショナル（ＡＳＴＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（旧米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ））、米国環境保護庁（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）（ＥＰＡ）、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）およびＮＩＨによって使用されている。
【０００６】
ＮＴＡによって解析可能な粒径の範囲は、粒子のタイプに左右される。上述されるように、各粒子が検出され、追跡されるために、十分な光が、各粒子によって散乱されなければならないことを考慮すると、サイズの下限は、粒径および粒子の屈折率によって画定される。コロイド金などの、非常に高い屈折率を有する粒子の場合、サイズの正確な測定は、約１０ｎｍの最大寸法を有する粒子にいたるまで行うことができる。生物由来の粒子などの、より低い屈折率の粒子の場合、最小検出サイズは、２５〜５０ｎｍの範囲になり得る。したがって、ＮＴＡは、特定のサイズ未満の粒子を検出するその能力によって制限される。
【０００７】
ＮＴＡを用いると、個別に検出される十分な光をそれぞれが散乱させる粒子の存在および解析が、例えば、それぞれが個別に検出されるには小さ過ぎるが、散乱光のバックグラウンドヘイズ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｈａｚｅ）を集団で形成するのに十分高い濃度で存在する非常に小さい粒子（タンパク質分子、１０ｎｍ未満の無機材料、ポリマー溶液、ナノエマルジョンなど）の集団を含む「バックグラウンド」材料の存在下でもなお行うことができる。このバックグラウンドは、ＮＴＡによって解析することができないが、このバックグラウンド内に組み込まれた個別の光散乱物体として見える粒子は、ＮＴＡによって解析され得る。当然ながら、このバックグラウンドの強度は、最小検出サイズとしてＮＴＡの感度の限度を決定する。さらに、ＮＴＡは、好適なサイズの粒子を、多数のより大きい粒子を含有する不均質材料中にそれらが存在する場合でも、同定し、追跡し、解析することが可能である。
【０００８】
ＮＴＡは、適切な蛍光励起光源および好適な蛍光フィルタの使用によって、非蛍光バックグラウンドの存在下で蛍光性ナノ粒子または蛍光標識ナノ粒子を検出し、解析することがさらに可能である。ＮＴＡは、複数のフィルタまたはカラーカメラを用いて、サンプル内の２つ以上の蛍光波長を測定することがさらに可能である。
【０００９】
したがって、ＤＬＳは、２〜３ｎｍのサイズまでのナノ粒子のサイズの解析の要求を果たすことができるが、サンプル中のより大きい粒子（汚染物質または凝集体など）に強度の重み付けがひどく偏り、粒子数についての情報を提供することができない一方、ＮＴＡは、例えば１０〜５０ｎｍのサイズまでの個々の粒子を検出し、解析し、計数することができるが、存在する場合、バックグラウンドヘイズとして現れる、このサイズ限度未満の粒子を検出し、解析することができない。ＮＴＡで検出可能な粒子は、本明細書において、比較的大きい粒子または汚染物質粒子と呼ばれ、ＮＴＡによって検出できないより小さい粒子は、本明細書において、比較的小さい粒子、ヘイズまたはバックグラウンドと呼ばれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、サブミクロン粒子を含むサンプルを解析する方法であって、ナノ粒子追跡解析によって、サンプル中の粒子のサイズおよび粒子の数についての第１の情報を決定する工程と；動的光散乱によって、サンプル中の粒子の平均粒径についての第２の情報を決定する工程と；動的光散乱によって得られる結果に対する検出された粒子の理論的影響を表す第３の情報を、第１の情報から決定する工程と；第３の情報を用いて第２の情報を調整して、平均粒径についての調整された情報を表す第４の情報を生成する工程とを含む方法が提供される。
【００１１】
本発明は、サイズ、相対的な光散乱強度および光学的に分析できない（ｎｏｎ−ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｓｏｌｖａｂｌｅ）ナノ粒子材料のバックグラウンド（ヘイズ）中に存在する個別に検出可能な比較的大きい粒子（汚染物質粒子）の数についてのＮＴＡ解析によって得られる情報（第１の情報）を用いて、このようなサンプルのＤＬＳ解析によって得られる結果（第２の情報）を修正し、向上させることができるという発見に基づくものである。本発明者らは、このデータを用いて、このようなサンプルのＤＬＳ測定に対してこのような比較的大きい粒子がなし得る寄与（第３の情報）をモデル化し、ひいては推定し、ＤＬＳ解析に対するこのような粒子の影響を除き、したがって、「汚染物質を補正した（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）」ＤＬＳの結果（第４の情報）を得ることができることを示した。このように、これまでに可能であったよりも正確な情報が、比較的小さい粒子について得られる。
【００１２】
したがって、本発明は、比較的小さい粒子のＤＬＳ解析の利益を、これまでのような、このような比較的小さい粒子の解析の正確性に悪影響を与える比較的大きい粒子の存在を除外して得ることができる。
【００１３】
したがって、本発明は、異なるサイズ、特に複数の異なるサイズを有する粒子を含み、特に、約１０〜５０ｎｍ未満の最大寸法を有する比較的小さい粒子、および汚染物質として働く比較的大きい粒子の両方を含むサンプルに適用可能である。
【００１４】
第１および第２の情報は、同じサンプルから同時に得られるのが好ましい。しかしながら、隣接する領域が類似した粒径分布の統計的に類似した数の粒子を含有するように測定体積中に十分に多数の粒子を含有するサンプルの場合、第１および第２の情報の測定は、正確性が、著しく悪影響を受けることなく、サンプルの異なる領域から得られ得る。サンプルが時間とともに著しく変化しない場合、第１および第２の情報は、同時に得られる必要はないが、これは、例えば、粒子のサイズが、例えば凝集、沈殿、溶解、分散などによって、時間とともに変化する場合には適切でない。
【００１５】
サンプルは、必ずしもではないが、典型的に、粒子の懸濁液または他の分散体を含む液体を含む。粒子は、固体であってもよく、または場合により液体（例えば、エマルジョン中の微細液滴）であってもよい。液体サンプルは、必ずしもではないが、通常、水性液体であろう。
【００１６】
好都合なサンプルの体積は、典型的に、５００μｌまたは２５０μｌであり、サンプルは、好都合には、好適なサンプルセルに収容されている。
【００１７】
サンプルは、好適に集束された放射線ビーム、典型的にレーザービームによって照射される。
【００１８】
ＮＴＡは、一般に、例えば、国際公開第０３／０９３８０１号パンフレットに記載されるような従来の方法で行われ得る。
【００１９】
ＮＴＡによって得られる第１の情報は、望ましくは、粒子の輝度／スペクトル特性、ならびに粒径および粒子の数についての情報を含む。
【００２０】
ＤＬＳは、一般に、例えば上述されるような従来の方法で行われ得る。
ＤＬＳによって得られる第２の情報は、ｚ−平均粒径の形態の平均粒径についての情報を含み、任意に、粒径分布についての情報も含む。
【００２１】
ＮＴＡおよびＤＬＳは、典型的に、それぞれの検出システムを用いて行われ、検出システムは、従来の構造でできていてもよく、それぞれが、好適な光検出器、典型的にＣＣＤを含む。しかしながら、カメラが好適な効率およびＤＬＳに対する反応速度を有する場合、ＮＴＡおよびＤＬＳ測定の両方に単一のＣＣＤカメラを使用することが可能であり得る。ＤＬＳは、通常、アバランシェフォトダイオード（Ａｖａｌａｎｃｈｅ  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）（ＡＰＤ）などの光子検出器／乗算器を用いてもよい。
【００２２】
第１の情報は、好ましくは、検出される粒径の１つ以上についての理論的相関曲線または関数（ｇ２（τ））を生成するのに使用される。相関関数は、好ましくはサイズで重み付けされ、より大きい粒子には、より大きい重みが与えられる。好ましくはサイズで重み付けされた異なる粒径についての相関関数は、次に合計され得る。
【００２３】
望ましくは、第１の情報は、例えば、各粒子によって散乱された光のスポットを撮像するＣＣＤカメラ画素からのグレースケール値を合計することによる、各検出された粒子によって散乱される光の相対量についての情報を含む。この情報を用いて、ＮＴＡで検出された各粒子が、第３の情報を生成するために、ＤＬＳによって検出された信号全体に寄与し得る程度を直接推定することができる。
【００２４】
比較的小さい粒子は、典型的に、タンパク質を含み、サンプルは、より大きい粒子、例えば汚染物質、タンパク質凝集体なども含有する。
【００２５】
比較的大きい（ＮＴＡで検出可能な）粒子は、本質的に生体粒子、例えば、ＤＮＡなどの高分子またはウイルスなどの超分子構築物であってもよい。比較的大きい粒子は、あるいは人工（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ナノ粒子を含み得る。
【００２６】
一実施形態において、サンプルは、細胞質ゾル（比較的小さい、ＰＣＳで測定可能なバックグラウンド粒子である）および比較的大きい粒子、例えば人工ナノ粒子を含む。
【００２７】
粒子、特に、比較的大きい粒子は、蛍光性であってもよく、または、おそらく、スペクトル的におよび空間的に区別され得る異なる蛍光特性を有するいくつかの異なる蛍光部分を用いて、１つ以上の蛍光部分で標識されていてもよい。
【００２８】
より大きい粒子についてのＮＴＡデータを用いて、ＰＣＳで測定可能な材料の相対量または濃度の変化（またはその他）を監視することができる。
【００２９】
サンプルは、より大きいＮＴＡで検出可能な粒子が、バックグラウンド材料の凝集または沈殿によって、現れて、サイズが大きくなり、したがって、検出および計数され得るようなものであり得る。
【００３０】
サンプルは、より大きいＮＴＡで検出可能な粒子が、溶解、分散または溶融によって徐々に消失し、サイズが減少して、ＰＣＳで測定可能なバックグラウンド材料になり得、したがって、プロセス全体にわたる複数の段階で検出および計数され得るようなものであり得る。
【００３１】
ＰＣＳで検出可能な試薬（例えばタンパク質）の２つの集団は、相互作用または反応して、ＮＴＡで検出可能な構造を形成し得る（例えば、サイズの変化あるいは蛍光などの光学的に検出可能なパラメータの増大または発展によって）。
【００３２】
ＮＴＡで検出可能な粒子は、特に、より小さいバックグラウンド粒子の存在下で運動させるために、原動力（電力、磁力、重力など）の印加によって操作され得る。したがって、例えば、粒子は、ユーザが印加した電場における電気泳動、またはユーザが印加した磁場における磁気泳動を行いながら、ＮＴＡによって解析され得る。
【００３３】
ＮＴＡで検出可能な粒子は、運動性であり得る。
バックグラウンド粒子は、ＤＬＳの一形態におけるレーザードップラー速度計測によって解析可能な運動で運動させられ得る。
【００３４】
バックグラウンド粒子およびより大きい汚染物質粒子の運動の差が測定され得る。
例えばゲル化または溶融に起因するか、あるいは化学的電荷（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｈａｒｇｅ）（例えばｐＨ）に起因するＰＣＳで測定可能なバックグラウンドの、レオロジー的性質の変化は、より大きいＮＴＡで検出可能な粒子の挙動を変更させ得る。ＮＴＡで検出可能な粒子の変化を監視することによって、バックグラウンド粒子の変化が監視され得る。
【００３５】
ＮＴＡ粒子は、ＰＣＳで検出可能なバックグラウンド粒子の挙動および性質を変更する。
【００３６】
ＮＴＡから得られる第１の情報を用いて、ＤＬＳ／ＰＣＳの二次データの捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）を（時間的にまたは空間的に）リアルタイムで変更することができる。
【００３７】
第２の態様において、本発明は、第１の態様の方法を行うのに使用するための装置であって：
サンプルを照射するために好適に集束された放射線ビームを生成するための光源手段と；
ＮＴＡを用いて、粒子についての第１の情報を得るための第１の検出システムと；
動的光散乱を用いて、粒子についての第２の情報を得るための第２の検出システムと；
第１の情報から第３の情報を決定するようにプログラムされたデータ処理手段と
を含む装置を提供する。
【００３８】
好ましい実施形態において、データ処理手段は、第３の情報を用いて第２の情報を調整して、サンプル中の粒子の平均サイズについての調整された情報を表す第４の情報を生成するようにさらにプログラムされる。
【００３９】
本発明の装置のいくつかの異なる実施形態が、考えられ、これらには、以下のカテゴリーが含まれる：
（ａ）空間的に共通（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｍｏｎ）かつ時間的に共通（ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ  ｃｏｍｍｏｎ）である（すなわち、第１および第２の検出システムが、照射されたサンプルの実質的に同じ部分を、実質的に同時にインターロゲートする（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）のに使用される）；
（ｂ）空間的に共通であるが、時間的に異なる（すなわち、第１および第２の検出システムが、照射されたサンプルの実質的に同じ部分を、ただし実質的に異なる時間に、例えば連続してインターロゲートするのに使用される）；および
（ｃ）空間的に異なるが、時間的に共通である（すなわち、第１および第２の検出システムが、照射されたサンプルの異なる部分を、実質的に同時にインターロゲートするのに使用される）。
【００４０】
（ｄ）第１および第２の検出システムが空間的にかつ時間的に異なる第４のカテゴリーがあるが、このようなカテゴリーは、好ましいカテゴリー（ａ）〜（ｃ）に勝る大きな利点を提供しない。
【００４１】
カテゴリー（ａ）の装置には、少なくとも２つのサブカテゴリーがある：
（ｅ）両方の検出システムが互いに対して角度を付けられて、それらが、照射されたサンプルの同じ部分を、異なる角度からでもインターロゲートすることを可能にする（これは、角度が第２の検出システムについて知られている限り、困難でない）；または
（ｆ）サンプルからの光路が分割され、１つの部分が、ＮＴＡのためにＣＣＤなどへ通っており、他方の部分が、ＤＬＳのためにＡＰＤなどへ通っている。この実施形態において、両方の検出システムの光路が、少なくとも最初は共通であることが暗示されている。例えば、光路は、共通の顕微鏡対物レンズの下流に位置するビームスプリッタによって分割され得る。分割は、２つの検出システム間で５０：５０であってもよいが、これは必須ではない。
【００４２】
本発明のある実施形態において、少なくとも、第１および第２の検出システムに共通の、レンズおよびビームスプリッタを含むがこれらに限定されない１つ以上の構成要素が有利に存在し得るという結果になる。
【００４３】
上で言及されたカテゴリー（ｂ）の本発明の装置は、サンプルの実質的に同じ部分を、ただし、異なる時間にインターロゲートする第１および第２の検出システムを含む。これは、サンプルの特性が、第１の検出システムによるインターロゲーションと、第２の検出システムによるインターロゲーションとの間で大きく変化しない場合、許容可能であろう。典型的に、サンプルチャンバー中へのサンプルの流れまたは侵入は、この要件が満たされ得るように、コンピューター化されたモーター制御下で行われるであろう。
【００４４】
カテゴリー（ｃ）の装置の潜在的な欠点は、第１および第２の検出システムが、（確実であるように）照射されたサンプルの異なる部分をインターロゲートしており、サンプルが実質的に均質でなければならないだけでなく、サンプルがそれぞれの検出システムによってインターロゲートされている２つの箇所で照射が実質的に同一でなければならないことであり、これは、特に、２つの箇所が互いにそれほど近接していない場合、配置するのが困難であろう。
【００４５】
誤解を避けるために、「好ましい」、「望ましい」、「有利な」、「好都合な」などと本明細書に記載される特徴は、文脈上特に指示がない限り、本発明において個別に存在しても、またはそのように記載される任意の１つ以上の他のこのような特徴との任意の組合せで存在してもよいことが、本明細書に明示的に記載される。さらに、本発明の一態様に関連して、「好ましい」、「望ましい」、「有利な」、「好都合な」などと記載される特徴は、文脈上特に指示がない限り、本発明の他の態様に同様に適用可能であることが理解されるであろう。
【００４６】
本発明は、以下の非限定的な実施例において、および添付の図面を参照して、例示として、さらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の方法を行うのに好適な装置の様々な実施形態の概略図である。
【図２】本発明の方法を行うのに好適な装置の様々な実施形態の概略図である。
【図３】本発明の方法を行うのに好適な装置の様々な実施形態の概略図である。
【図４】粒子のシミュレートされたサンプルの粒径（ｎｍ）に対する信号強度（任意単位）のグラフである。
【図５】実施例２に記載される異なる相関関数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
図１を参照すると、この略図は、参照符号２によって全体的に示される、ＮＴＡを行うための装置、および、参照符号４によって全体的に示される、ＤＬＳを行うための装置を示し、ＮＴＡ装置２およびＤＬＳ装置４は、空間または時間（ただし両方ではない）が一致するサンプルを解析するように構成される。ＮＴＡ装置２は、レーザービーム１２によって照射されるサンプルの体積を解析するように構成された、ＣＣＤまたはＥＭＣＣＤカメラ６、レンズ８、および顕微鏡対物レンズ１０を含む。
【００４９】
ＤＬＳ装置４は、レーザービーム１２によって照射されたサンプルの体積または領域を解析するように構成された、光子計数型検出器１４、光ファイバー１６、およびマイクロレンズ１８を含み、ＮＴＡ装置２と同時に、サンプルの異なる体積または領域を解析するか、あるいはＮＴＡ装置によって解析されるのと同じ、サンプルの体積または領域を、ただし異なる時間に解析するかのいずれかである。
【００５０】
図２を参照すると、略図が、本発明の方法を行うための装置の第２の実施形態を概略的に示す。機能的に同等の構成要素は、図１に使用されるのと同じ参照符号によって示される。示される実施形態は、空間的にかつ時間的に共通の配置であり、ここで、ＮＴＡ装置２およびＤＬＳ装置４は、同時に、ただし異なる角度でサンプルの同じ体積または領域を解析するのに使用される（ＮＴＡ装置は、レーザービームに対して直角であり、ＤＬＳ装置は、角度θ、２０である）。
【００５１】
図３は、本発明の方法を行うための装置の第３の実施形態を概略的に示す。同様に、機能的に同等の構成要素は、図１および２に使用されるのと同じ参照符号によって示される。示される実施形態は、空間的にかつ時間的に共通の配置であり、ここで、ＮＴＡ装置２およびＤＬＳ装置４は、（図２に示される配置と対照的に）同時に、および同じ角度でサンプルの同じ体積または領域を解析するのに使用され、これは、ビームスプリッタまたはダイクロイックミラー２２によって行われる。
【実施例】
【００５２】
実施例１
典型的な実施形態において、ＤＬＳによって検出できない統計的に有意な数のより大きい粒子（例えば汚染物質または凝集体）を含有するサンプル、例えばタンパク質材料（比較的小さいＤＬＳで検出可能な粒子である）が、サンプルセルを通過するレーザービームの経路に導入される。
【００５３】
ＤＬＳ測定−照射レーザービームの選択された領域（測定体積）中に存在する粒子から所定の角度で散乱される光が、好適に構成された検出器によって検出され、上記の従来のＤＬＳ方法によって解析される。結果は、集団のｚ−平均（強度加重）平均として表される。相関関数が、好適なデコンボリューションアルゴリズム（例えばフーリエ変換）によって解析される場合、粒径分布プロファイルも生成され得る。結果は、それぞれ、集団の強度加重平均または粒径分布プロファイルのいずれかであり、この粒径分布プロファイルも、サンプル中のより大きい（例えば汚染物質）粒子に対して強度で重み付けされ、粒径分布解析の不良条件に当てはまる性質（ｉｌｌ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｆｉｔ  ｎａｔｕｒｅ）によって分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が制限される。これらの結果は、第２の情報を構成する。
【００５４】
ＮＴＡ測定−顕微鏡対物レンズおよびＣＣＤカメラを含む第２の検出システムを用いて、同じ測定体積から散乱される光が、ＮＴＡによって、好ましくは同時に解析される。結果は、粒子のブラウン運動の解析によって個別に同定され、サイズ決定されるのに十分に大きい粒子の直接の数頻度粒径分布プロファイルとして表される。これらの結果は、第１の情報を構成する。しかしながら、ＮＴＡは、個別の光散乱中心、例えば、凝集されていない／汚染されていないタンパク質バックグラウンドとして分析することができないモノマーナノ粒子の存在、サイズまたは数を報告することができないであろう。
【００５５】
２つのデータセットの統合−第１および第２の情報は、以下の方法で、ここで組み合わせられ得る：
ＮＴＡによって検出され、サイズ決定される各個々の粒子については、サイズを得た温度、Ｔおよび粒子をその温度で解析した溶媒の粘度、ηを認識していれば、ＤＬＳ解析で、各粒子半径、ｒｈから生じた理論的な二次自己相関曲線、ｇ２（τ）を生成することが可能である。
【００５６】
粒径の単一値（すなわち単一の拡散係数Ｄｔ）については、得られた自己相関関数は、指数関数を表す。
ｇ２（τ）＝Ａｅ−２Гτ
（式中、Г＝ｑ２Ｄｔであり、
【００５７】
【数１】
0006030131.tif 000002
【００５８】
（式中、ＫＢが、ボルツマン定数である）および
【００５９】
【数２】
0006030131.tif 000003
【００６０】
（式中、ｎ０が溶媒屈折率であり、λが波長であり、θが散乱角である）を所与とすると、ｇが一次自己相関関数であり、τがサンプル時間であり、Ａが切片であり、ｅが指数であり、ｑが散乱ベクトルであり、Ｄが拡散係数である）。
【００６１】
ＮＴＡによって測定される粒径の分布を含むサンプルでは、結果は、対応する自己相関関数を生成するのにそれぞれが使用され得る個々の粒子のサイズの分布であり、この自己相関関数は、このような粒径の分布のＤＬＳ測定の多指数関数の性質をシミュレートするために全て合計され得る。
【００６２】
当然ながら、ＤＬＳにおいて、得られる多指数関数の自己相関関数は、ほとんどの光を散乱させる集合体中の粒子に強度で重み付けされる。ＮＴＡによって得られる粒径情報の組み込みによるＤＬＳデータの有意義な補正のために、各粒子について本来は強度で重み付けされていないＮＴＡデータを同様に重み付けする必要がある。各検出された粒子がＮＴＡによって別々に測定される場合、Ｍｉｅ理論の適用によって（Ｋｅｒｋｅｒ，Ｍ（１９６９），Ｔｈｅ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ａｎｄ  Ｂｏｈｒｅｎ，Ｃ．Ｆ．ａｎｄ  Ｈｕｆｆｍａｎ，Ｄ．Ｒ．，（１９８３）Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｉｇｈｔ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）、粒子のサイズの関数として各粒子によって散乱された光の量を計算することが可能であるが、この計算は、粒子の形状およびその屈折率の事前の知識ならびに溶媒、照射光の波長、偏光および強度、光集束角の事前の知識も必要とする。
【００６３】
しかしながら、上記のことを行うためのより直接的かつより簡単な方法がある。ＮＴＡが、粒子のブラウン運動の解析によって粒子のサイズを測定するが、各粒子によって散乱される光のスポットを撮像するＣＣＤカメラ画素からのグレースケール値を合計することによって、各粒子が散乱している光の相対量も測定し得る場合、ＮＴＡで検出された各粒子が、第３の情報を生成するために、ＤＬＳによって検出された信号全体に寄与し得る程度を直接推定することができる。
【００６４】
ここで、ＮＴＡ粒径数分布プロットは、粒子ごとに強度で重み付けされて、強度で重み付けされたГが得られる。
【００６５】
測定された全てのサイズおよび数または粒子について強度で重み付けされたＮＴＡプロット、Ｉ（Г）を所与とすると、合計された理論的二次自己相関曲線ｇ２ ＮＴＡ（τ）が、下式によって得られる。
【００６６】
【数３】
0006030131.tif 000004
【００６７】
ＮＴＡによって得られる理論的相関曲線（第３の情報）によって補正することによる従来のＤＬＳ相関曲線（第２の情報）の調整は、例えば、前者から後者を差し引くことによって行うことができ、残差は、「汚染物質が補償された（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）」ＤＬＳプロット（第４の情報）である。
【００６８】
異なるサンプルは、異なる量のＮＴＡで分析できない、ＰＣＳで測定可能な材料（バックグラウンドヘイズ）またはＰＣＳを汚染する、ＮＴＡで検出可能な粒子（汚染物質）のいずれかを含有し得る。サンプル測定領域を撮像するＣＣＤアレイ全体からの総グレースケール値を合計し、個別のＮＴＡで検出された汚染物質に関連する全てのグレースケール値の和からこの値を差し引くことによって、サンプル全体（ヘイズおよび汚染物質の両方）によって散乱される光の総量を測定することによって、ＤＬＳ相関曲線の下の領域と比較されるＮＴＡでモデル化された相関曲線の下の領域を調整して、存在する２つの種類の材料の相対量についての情報を得ることができる。
【００６９】
上記の方法が、ＤＬＳ測定からＮＴＡで検出可能な粒子の影響を除くのに使用され得る一方、ＮＴＡは、（粒径および屈折率に応じて）所定のレベルまでの粒子のみを検出することができる。凝集体を含有するタンパク質材料などのより低い屈折率の粒子の場合、このＤＬＳで測定可能であるがＮＴＡで対処できない領域は、例えば、５ｎｍ〜５０ｎｍのサイズ範囲内の粒子を網羅し得る（５ｎｍは、主要タンパク質分子を表し、５０ｎｍは、ＮＴＡで検出できない凝集体の上限を表す）。したがって、この領域は、ＮＴＡで補償することができない５０ｎｍ未満のタンパク質凝集体をさらに含む。したがって、これは、任意の他のＤＬＳ測定と同じ制限を受け得る従来の強度加重粒子分布である。したがって、このＮＴＡで対処できない領域は、その多峰性に関して、ＣＯＮＴＩＮ（Ｐｒｏｖｅｎｃｈｅｒ，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０，２０１（１９７９）；Ｐｒｏｖｅｎｃｈｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７，２１３（１９８２）；およびＰｒｏｖｅｎｃｈｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７，２２９（１９８２）を参照）またはＮＮＬＳ（Ｒｏｉｇ  ＆  Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉ  ２００６：“Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｔｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ  Ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ”  Ｐａｒｔ．Ｐａｒｔ．Ｓｙｓｔ．Ｃｈａｒａｃｔ．２３，４３１−４３７）を参照）などの従来のＰＣＳデコンボリューションアルゴリズムのうちの１つによって解析される必要があるであろう。
【００７０】
他の好適な技術としては、最大エントロピー解析（Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ  ＆  Ｂｒｙａｎ，“Ｍａｘｉｍｕｍ  ｅｎｔｒｏｐｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９１，２４（２３），６３４６−６３４８を参照）；最尤法（Ｓｕｎ  ＆  Ｗａｌｋｅｒ：“Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｄａｔａ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”  Ｍｅａｓ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９を参照）；および指数関数サンプリング（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，“Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，１９８１  Ｏｐｔｉｃａ  Ａｃｔａ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｐｔｉｃｓ  ２８（８）を参照）が挙げられる。
【００７１】
実施例２
標準的なＤＬＳと比較した粒径分布プロファイルの正確な推定値を得るためのＮＩＷＤＬＳおよびＮＴＡの使用の実施例
それぞれ４０ｎｍおよび１２０ｎｍの直径の２つの粒子集団（それぞれが、粒径分布における１０％の標準偏差を示す）を含むシミュレートされたサンプルを、１０００：１の数の比率で一緒に加えた。図４は、粒径分布（粒径（ｎｍ）に対する信号強度（任意単位））を示すグラフである。「実際の分布」は、図４において、一点鎖線（ｄａｓｈ／ｄｏｔ／ｄａｓｈ）プロットによって表される。
【００７２】
この混合物のＮＴＡ解析を計算し、図４（点線のプロット）に示し、図中、より小さい４０ｎｍ粒子の存在は、ＮＴＡの検出限界未満であるため検出されていない。
【００７３】
サイズと散乱強度との間のレイリー散乱の関係を仮定して、数分布を、動的光散乱によって見られる強度分布およびその結果として得られる相関曲線として再計算した（実線、図５）。ＣＯＮＴＩＮ（ＤＬＳ相関関数からの粒径分布の計算のためのデコンボリューションアルゴリズム）による解析にかけた際、得られたプロファイル（実線のプロット、図４）は、ＤＬＳで典型的に得られる強度で重み付けされたプロファイルを示し、このプロファイルにおいて、混合は、実際のピーク間にある実質的に単一のピークとして表現され（ＤＬＳは、４０および１２０ｎｍの付近の二峰性の混合を分析することができない）、３００〜４００ｎｍにおいていくらかのノイズが出ている。二峰性分布の存在は、これらの数の比率で、従来のＤＬＳでは見落とされることに留意されたい。
【００７４】
ＮＴＡによって得られる検出可能な１２０ｎｍの粒子のプロファイルを用いて、相関関数を計算し（点線、図５）、「実際の」ＤＬＳ相関関数から差し引いた。得られた曲線（「ＮＩＷＤＬＳ（ＤＬＳ−ＮＴＡ）」破線のプロット、図５）を、ＣＯＮＴＩＮ粒径分布解析にかけ、再度プロットした（図４の破線）、ＮＩＷＤＬＳ（ＣＯＮＴＩＮ））。
【００７５】
図４に見られるように、実際の分布（一点鎖線）は、誤ったサイズの不正確なプロファイル（実線のプロット）としてＤＬＳによって誤って測定される。ＮＴＡは、「ＮＴＡで視認できる」１２０ｎｍの粒子の真のサイズを正確に測定することができるが、より小さい４０ｎｍの粒子を検出することができない（４０ｎｍの粒子は個々に見るには小さ過ぎるため）。しかしながら、このようなサイズおよび分布幅の粒子から得られた相関関数を逆算し、これを、ＤＬＳによって得られた相関関数から差し引くことによって、強度の重み付けの影響を除いた相関関数および結果として得られるＣＯＮＴＩＮプロファイル（または任意の他の好適なデコンボリューションアルゴリズム）を得ることが可能である。この強度で重み付けされていない動的光散乱（ＮＩＷＤＬＳ）プロファイル（図４の破線）は、ＮＴＡプロファイル（図４の点線）と組み合わされて、真のナノ粒子集団（図４の一点鎖線）を正確に反映することができる。推定される相関関数を差し引くというこの単純な手法は、ＤＬＳ相関関数とともに、ＮＴＡ分布および推定される相関関数を事前の情報として取得するために、所与のデコンボリューションアルゴリズム（ＣＯＮＴＩＮ、最大エントロピー、最尤法、指数関数サンプリング、ＮＮＬＳを含むがこれらに限定されない）の好適な変更の代わりになり得る。
【図１】
0006030131.tif 000005
【図２】
0006030131.tif 000006
【図３】
0006030131.tif 000007
【図４】
0006030131.tif 000008
【図５】
0006030131.tif 000009