(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＴＰＲＫタンパク質活性の阻害剤を含有してなり、前記阻害剤が、スチボグルコネートまたはその塩である、非寄生虫性創傷の治療に使用するための治療剤。
【請求項２】
哺乳動物の創傷の治療に使用するために製剤化されている、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍および褥瘡を含む慢性創傷の治療に使用するために製剤化されている、請求項１または２に記載の治療剤。
【請求項４】
ヒトの創傷の治療に使用するために製剤化されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項５】
局所適用のために製剤化されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項６】
包帯材または包帯材への含浸のために製剤化されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の治療剤を、薬学的に許容可能な担体とともに含有する、非寄生虫性創傷の治療に使用するための薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の治療剤を、薬学的または獣医学的に許容可能な担体またはビヒクルと併せるまたは混合することを含む、請求項７に記載の薬学的組成物の調製方法。
【請求項９】
（ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載の少なくとも一の治療剤または請求項７に記載の組成物と、
（ｂ）創傷に適用するための少なくとも一の包帯材
とを具備する、非寄生虫性創傷を治療するためのキット。
【請求項１０】
（ａ）ＰＴＰＲＫタンパク質活性の阻害剤であって、スチボグルコネートまたはその塩である阻害剤と、
（ｂ）少なくとも一の更なる治療剤
とを含有する、非寄生虫性創傷を治療するための併用治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、創傷、特に人の創傷を治癒または治療するための少なくとも一の分子標的に関する。より具体的には、分子標的は、慢性創傷の治療に適用される。さらに、本発明は、前記分子標的を伴う、前記創傷を治療するための新規の治療剤および前記創傷を治療するための新規の遺伝子治療アプローチに関する。さらに、本発明は、前記治療剤または前記遺伝子治療を用いた創傷の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
どのような形にせよ、慢性および治癒不良の創傷は、英国医療制度への大きな負担になっている。さらに、ＥＵのある特定の加盟国においては、創傷治癒に関する医療費は、すでに、健康管理財源の高額な出費の第３位に近づきつつある。
【０００３】
慢性創傷は、本明細書では、治癒プロセスの予測可能な段階に沿って進まない遅延型または不完全な治癒を示すものとして定義される（後述）。一般的に、慢性創傷は、静脈潰瘍、糖尿病、および褥瘡の３つの広いカテゴリーに分類される。長期静脈不全は、慢性創傷の７０％〜９０％を占め、一般的に高齢者に多い。静脈不全により静脈高血圧症が生じ、血流が止まりその後に虚血が生じる。静脈不全は、静脈流出の閉塞やバルブの損傷に起因する逆流の結果として発生しうる。ある一定期間の虚血の後、組織が灌流し再灌流障害が生じ、組織が損傷を受け創傷が形成される。
【０００４】
慢性足部潰瘍は、糖尿病の主な合併症であり、糖尿病を含む全ての入院の２５％以下を占めており、毎年、英国国民健康保険に£２億５０００万の費用がかかっている。慢性足部潰瘍は、実質的な病的状態を引き起こし、生活の質を損ない、下肢切断の主な原因となっている。足部ケアへの注意深い配慮にも関わらず、２５％もの糖尿病患者が生存期間中に足部潰瘍を発症する。下肢潰瘍の原因は、糖尿病において非糖尿病と同じであり、すなわち、神経障害、虚血、および外傷である。しかしながら、この「３病因」は、創傷を感染させる素因となり、その感染もまた、創傷の非治癒性の一因となり得る。
【０００５】
褥瘡はもう一つの主な財源の医療経費である。典型的には、褥瘡は日常的な看護または医療的ケアが提供されないことにより生じる。英国では、毎年４１２，０００人の人々がこの種の創傷に罹患し、£１４億〜２１億の費用がかかっている。
【０００６】
さらに、慢性創傷は、手術、火傷、皮膚炎、血管炎または放射線のいずれによって生じたかによっても分類することができる。
【０００７】
現在の創傷治療方策は、その領域から圧力を除去すること、デブリードマン、創傷包帯、および感染の管理を含む：より進行した疾患において外科的切除および血管再構築が必要とされる場合があり、最終的には切断術を必要とすることもある。これら方策は一般に、細菌負荷、虚血およびプロテアーゼの不均衡といった慢性創傷と関連する問題に対処するものであり、これらすべてが創傷治癒過程にさらに影響しうる。
【０００８】
創傷の治癒は、様々な数の細胞型を含む複雑な生物学的プロセス、細胞と組織の間の複雑な相互作用、免疫系の活性化、および血管新生プロセスの活性化によって制御されている。さらに、これらプロセスのすべてには多くの分子が関与する。
【０００９】
典型的な治癒プロセスは、凝固段階、急性炎症段階、マトリックス沈着段階、毛細血管形成段階、および再上皮化段階といった５つの、別々だが密接に関連した段階に分けることができる。様々な数の因子が関与し、これらの段階のそれぞれを制御する。このプロセスのいずれかの局面に欠陥があると、不完全な創傷治癒を生じる可能性がある。したがって、「正常な」治癒プロセスは、内因子または外因子のいずれかの結果として不完全となる可能性があり、それは、「異常な非治癒性」または「慢性」創傷として顕在化する。それが、患者の生活の質にとって最大の難題となり、医療制度に費用の増大を課すこれらの「非治癒性」または慢性創傷である。
【００１０】
慢性創傷は、創傷治癒の正常な段階に沿って進行しないことから生じることが多く、創傷となった初期損傷が続いて修復されない。高濃度の炎症性サイトカインまたはプロテアーゼや低濃度の増殖因子といった、慢性創傷の分子環境内に変化が生じ、これら変化は治癒プロセスを遅らせる化または停止させ、敗血症感染の可能性を増加させる。創傷治癒に寄与する因子を亢進するかまたはコントロールすることによって、プロセスを正し、慢性創傷の発生可能性を低減する、あるいはその後の修復を加速させることが可能となりうる。
【００１１】
ＰＴＰＲＫ
プロテインチロシンホスファターゼレセプタータイプＫ（ＰＴＰＲＫ）は、ＤＫＦＺｐ６８６Ｃ２２６８、ＤＫＦＺｐ７７９Ｎ１０４５およびＲ−ＰＴＰ−カッパとしても知られる。プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリのメンバーである。ＰＴＰは、細胞増殖、分化、細胞分裂周期および発癌性形質転換を含む、様々な細胞プロセスを調節するシグナル伝達分子であることが知られている。ＰＴＰＲＫは、細胞外領域、単一膜貫通領域および２つのタンデム触媒ドメインを持つため、レセプタータイプのＰＴＰを表す。細胞外領域はメプリン−Ａ５抗原ＰＴＰｍｕ（ＭＡＭ）ドメイン、Ｉｇ様ドメインおよび４つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ様リピートを含む。また、ＰＴＰＲＫは、おそらく接着結合におけるβ−およびγ−カテニンとの相互作用を介して、ホモフィリック細胞間相互作用を媒介することが示されている。ＰＴＰＲＫ遺伝子の発現は、ケラチノサイト増殖の阻害のために重要であるかもしれないＴＧＦ−ベータ１によって刺激されることが明らかとされている。発明者らの乳癌における近年の研究(Sun et al, SABCS, Cancer Res 2010)によって示すように、癌では、ＰＴＰＲＫは悪性の腫瘍を抑制することが明らかとされている。
【００１２】
ＰＴＰファミリの生化学的機能はある程度知られているが、ＰＴＰＲＫ酵素の治療的関与は、特に創傷治癒との関連ではほとんど研究されていなかった。
【００１３】
したがって、発明者らは、驚くべきことに、ＰＴＰＲＫが創傷治癒する役割を持っていることを発見した。実際、発明者らは、このタンパク質の発現が創傷治癒プロセスを阻害することを発見した。また、ＰＴＰＲＫの阻害により創傷治癒が促される。
【００１４】
ＰＴＰＲＫの阻害剤が知られている。最も容易に入手可能なものはスチボグルコネートの塩である。スチボグルコン酸ナトリウムは、リーシュマニア症を治療するために使用される薬剤である。この疾患は、寄生虫のリーシュマニア種の２０以上の異なる種の一つによる感染に起因する。スチボグルコン酸ナトリウムは五価アンチモン化合物として知られる医薬のクラスに属する。リーシュマニア寄生虫に対するその正確な殺虫効果は不明であるが、グルコース異化反応が阻害され、ＡＴＰ合成が低減し、それによってその後の巨大分子の合成が減少し、複製が妨げられることによって寄生虫が死に至ると考えられている。
【００１５】
スチボグルコン酸ナトリウムはＰｅｎｔｏｓｔａｍＴＭ（グラクソ・スミスクライン社製）として英国で販売されており、現在注射による投与のためにのみ利用可能である。残念なことに、この医薬に対する耐性が広がっておりスチボグルコン酸ナトリウムの有用性を制限しており、世界の多くの地域で、アムホテリシンまたはミルテホシンがリーシュマニア症を治療するために代わりに使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
要約すると、発明者らは、創傷、特に人の創傷を治療するための少なくとも一の分子標的を同定した。排他的でなく、より具体的には、前記分子標的は、慢性創傷の治療へ適用される。分子標的はＰＴＰＲＫであり、ゆえに、本発明は、ＰＴＰＲＫ発現またはＰＴＰＲＫ活性のいずれかまたは両方の阻害剤を含む新規の治療剤に関する。前者の例では、本発明は新規の遺伝子治療アプローチを伴い、後者の例では、新規のタンパク質治療アプローチを伴う。したがって、本発明は、ＰＴＰＲＫ発現またはＰＴＰＲＫ活性のいずれかまたは両方の阻害剤を含む新規の治療剤に関する。前者の例では、本発明は新規の遺伝子治療アプローチを伴い、後者の例では、新規のタンパク質治療アプローチを伴う。
【００１７】
本明細書中でＰＴＰＲＫへの言及は、図１６にその相同性が示されている遺伝子またはタンパク質を指す。
【００１８】
本発明者らの発明は、新規の創傷が慢性状態へ悪化しないことを確認することによって患者の生活の質を改善することができ、既存の慢性創傷は、治癒が積極的に促される方法で治療されうる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明の一態様では、創傷の治療に用いるための、ＰＴＰＲＫ遺伝子発現またはＰＴＰＲＫタンパク質活性のいずれかないしは両方の阻害剤を含む治療剤が提供される。
【００２０】
前者の例では、本発明は新規の遺伝子治療アプローチを伴い、後者の例では、新規のタンパク質治療アプローチを伴う。ゆえに、一実施形態では、新規の治療剤はＰＴＰＲＫ遺伝子発現の阻害剤を含み、この阻害剤は、ネイキッドな、またはプラスミドやウイルスベクターの形態でのアンチセンスＤＮＡないしはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムであり得る。当業者であれば前述の阻害性分子を知っているので、ＰＴＰＲＫの発現が慢性創傷の表現型に関与していることさえ知れば本発明を実施することができるであろう。しかしながら、他の実施形態では、新規の治療剤はＰＴＰＲＫタンパク質機能の阻害剤を含み、この阻害剤は、結合して、可逆的ないしは不可逆的にタンパク質機能を阻害する抗体や既知ないしは合成されたＰＴＰＲＫアンタゴニストなどのＰＴＰＲＫ結合剤か、またはＰＴＰＲＫシグナル伝達機構の上流または下流でＰＴＰＲＫのシグナル伝達を阻害するように働き、創傷組織においてＰＴＰＲＫタンパク質の発現の効果を無効にする薬剤であり得る。当業者であれば前述の阻害性分子を知っているので、ＰＴＰＲＫの発現が慢性創傷の表現型に関与していることさえ知れば本発明を実施することができるであろう。
【００２１】
本発明の好適な実施形態では、治療剤は、本明細書中に記載のトランスジーン１またはトランスジーン２またはトランスジーン３などのＰＴＰＲＫ遺伝子阻害剤を含む。これら分子は、抗ＰＴＰＲＫリボザイム／ＲＮＡトランスジーンと称する。トランスジーン１は以下の短いオリゴを用いたＰＴＰＲＫ遺伝子の転写によって製造される。
抗ＰＴＰＲＫトランスジーン１Ｆ、および、
Ctgcagagtgagttacacagcctgatgagtccgtgagga
抗ＰＴＰＲＫトランスジーン１Ｒ
ActagtgacaaaaactgaccaggatttgtAtttcgtcctcacggact
トランスジーン２は以下の短いオリゴを用いたＰＴＰＲＫ遺伝子の転写によって製造される。
抗ＰＴＰＲＫトランスジーン２Ｆ、および、
Ctgcaggatgataggaccatcgccaatctgatgagtccgtgagga
抗ＰＴＰＲＫトランスジーン２Ｒ
ActagtgatccaactaaatgccaactcgAtttcgtcctcacggact
トランスジーン３は以下の短いオリゴを用いたＰＴＰＲＫ遺伝子の転写によって製造される。
抗ＰＴＰＲＫトランスジーン３Ｆ、および、
Ctgcagtttgctcttttttacaattaatatctgatgagtccgtgagga
抗ＰＴＰＲＫトランスジーン３Ｒ
ActagttcatcctccttctcctagttGtttcgtcctcacggact
【００２２】
これら生成物は、アンチセンス・ハンマーヘッド型ＲＮＡとしても知られるアンチセンス・ハンマーヘッド型リボザイムであり、理想的には、ｐｓｔＩおよびＳｐｅＩなどの選択した制限酵素部位に隣接しており、さらに理想的には、ｐＥＦ６／Ｖ５Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)などのクローニングベクターにクローニングされている。
【００２３】
トランスジーン１の配列構造は、5'Ctgcagagtgagttacacagcctgatgagtccgtgaggacgaaa  tacaaatcctggtcagtttttgtt actagt'3である。
トランスジーン２の配列構造は、5'Ctgcaggatgataggaccatcgccaatctgatgagtccgtgaggacgaaa  tcgagttggcatttagttggatcactagt'3である。
トランスジーン３の配列構造は、Ctgcagtttgctcttttttacaattaatatctgatgagtccgtgaggacgaaa  caactaggagaaggaggatgaactagt'3である。
【００２４】
本発明の好適な実施形態では、治療剤は、限定するものではないが、スチボグルコネート(GSK)または(Santa Cruz Biotechnologies Inc., Tocris and Sigma-Aldrich)などの市販のＰＴＰＲＫプロテイン阻害剤を含む。
【００２５】
本発明の更なる好適な実施形態では、治療剤は、ペントスタムＴＭ（グラクソ・スミスクライン社）などの市販のＰＴＰＲＫプロテイン阻害剤を含む。
【００２６】
本発明の治療剤は、理想的には哺乳動物の創傷、より理想的には慢性の哺乳動物の創傷、さらに理想的には慢性のヒトの創傷の治療に使用するためのものである。本発明を用いて治療されるのが好ましい慢性創傷は静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍および褥瘡である。好ましくは治療する創傷は寄生虫性でない、すなわち寄生虫に起因しないまたは寄生虫によって生じないものである。
【００２７】
本発明で使用するための抗体はモノクローナル抗体またはヒト化抗体であることが最も理想的である。
【００２８】
本発明の上記の態様および実施形態では、治療剤は局所適用のために製剤化される。
【００２９】
あるいは、本発明の上記の態様および実施形態では、治療剤は経口適用のために製剤化される。
【００３０】
あるいは、本発明の上記の態様および実施形態では、治療剤は包帯材への適用または包帯材への含浸への適用のために製剤化される。
【００３１】
本発明の治療剤は、抗生物質や抗菌剤と組み合わせて投与されてよい。このような薬剤には多くが知られており、実務者であれば適切に選択できるであろう。
【００３２】
本発明の他の態様では、本発明の治療剤を、薬学的に許容可能な担体とともに含有する、創傷の治療に使用するための薬学的組成物が提供される。
【００３３】
治療する創傷に適切または望ましいと思われる場合には、他の活性物質も薬学的組成物に含めてよい。例えば、組成物は皮膚軟化剤なども含有してよい。
【００３４】
担体、２以上存在する場合にはそれぞれの担体は、製剤の他の成分と混合可能であり、受容者に有害でないという意味では許容されるものでなければならない。
【００３５】
製剤には、局所（点眼剤を含む）、経口（口腔および舌下を含む）、直腸、経鼻または膣投与に適したものを含み、製薬業界でよく知られる任意の方法によって調製されてよい。
【００３６】
本発明の治療剤と担体とを集めることによって調製してよい。一般に、製剤は、活性剤を、液体担体または微細な固形単位ないしはこの両方と均一かつ密接に関連させ、次いで必要であれば生成物を成形することによって調製される。本発明は、本発明の治療剤を薬学的または獣医学的な許容可能な担体またはビヒクルと併せる、または関連させることを含む、薬学的組成物の調整方法に関する。
【００３７】
皮膚への局所適用のために、従来用いられる化合物は、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁液等に作製されてよい。組成物に用いられうるクリームまたは軟膏製剤は、当該技術分野においてよく知られる従来の製剤であり、例えば、英国薬局方などの薬剤学の標準的教科書に記載されている。
【００３８】
本発明の経口投与用の製剤は、カプセル、小袋または錠剤といったそれぞれが所定量の活性剤を含む個別の単位として、粉末または顆粒として、水溶液または非水溶液中の活性剤の溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョンとして、又はボーラス等として提示されてよい。
【００３９】
経口投与用の組成物（例えば錠剤およびカプセル剤）のために、「許容可能な担体」なる用語には、一般的な賦形剤などのビヒクル、例えば結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよび澱粉；充填剤および担体、例えばトウモロコシデンプン、ゼラチン、乳糖、ショ糖、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸；およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムおよび他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン油、タルクワックス、油およびコロイド状シリカなどの潤滑剤が包含される。
【００４０】
ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバーなどの香味剤を使用することもできる。剤形を容易に識別可能にするために着色剤を添加することが望ましい場合がある。錠剤はまた、当技術分野でよく知られる方法によってコーティングしてよい。
【００４１】
経口投与に適した他の製剤には、風味を付けた基剤または不活性な基剤に活性剤を含むトローチ剤、および適当な液体担体に活性剤を含むうがい薬が包含される。
【００４２】
本発明の他の態様では、哺乳動物の創傷、典型的には慢性創傷の治療方法であって、
ＰＴＰＲＫ遺伝子発現またはＰＴＰＲＫタンパク質活性のいずれかないしは両方を阻害する治療剤を前記創傷に投与することを含む方法が提供される。
【００４３】
さらにまたはあるいは、本発明の他の態様は、場合によって、哺乳動物の創傷、典型的には慢性創傷を治療するための新規の方法であって、
ＰＴＰＲＫ遺伝子発現またはＰＴＰＲＫタンパク質活性のいずれかないしは両方を阻害する治療剤を前記創傷に投与することを含む方法が提供される。
【００４４】
本発明のさらに他の態様によると、創傷、好ましくは慢性創傷を治療するためのキットであって、
（ａ）前述の少なくとも一の治療剤と、
（ｂ）前記創傷に適用するための少なくとも一の包帯材
とを具備するキットが提供される。
【００４５】
本発明のさらに他の態様によると、ＰＴＰＲＫ遺伝子発現の阻害剤とＰＴＰＲＫタンパク質活性の阻害剤とを含有する、創傷を治療するための併用治療剤が提供される。
【００４６】
本発明の他の態様によると、ＰＴＰＲＫプロテインの阻害剤またはそのホモログを含有する、創傷を治療するための治療剤が提供される。
【００４７】
本発明の他の態様によると、創傷を治療するための医薬の製造における、ＰＴＰＲＫプロテインの阻害剤またはそのホモログの使用が提供される。
【００４８】
本発明の他の態様によると、創傷を治療するための、ＰＴＰＲＫの阻害剤またはそのホモログの使用が提供される。
【００４９】
本明細書中で用いる「ホモログ」なる用語は、ＰＴＰＲＫのアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の相同性があり、ＰＴＰＲＫ配列の生物学的活性を持つアミノ酸配列を指す。相同性は、ＰＴＰＲＫペプチド配列に対して少なくとも７５％の相同性、望ましい順に、ＰＴＰＲＫペプチド配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%または99%であることが好ましい。
【００５０】
本明細書中に記載の創傷の治療には、ヒトまたは動物用への言及が含まれる。
【００５１】
以下に続く特許請求の範囲において、および本発明の前の記載において、文脈上、明確な言語または必然的な含意により他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」なる言葉、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、包括的な意味で用いられ、すなわち、述べられた特徴の存在を特定するために用いられるが、本発明の様々な実施形態においてさらなる特徴の存在または追加を排除するために用いるのではない。
【００５２】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して記載される場合がある。
【００５３】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、（添付の特許請求の範囲および図面を含む）本明細書に開示された特徴の任意の新規な１つ、または任意の新規な組合せにまで及ぶ。ゆえに、本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物または化学的部分は、本明細書に記載された任意の他の態様、実施形態、または実施例に、それらと適合しないことがない限り、適用できることは理解されているはずである。
【００５４】
さらに、他の記述がない限り、本明細書に開示された任意の特徴は、同じまたは類似した目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。
【００５５】
本発明を、図１〜２１を特に参照し、次に続く実施例を用いて以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ヒトＰＴＰＲＫ  ｍＲＮＡの二次構造を示す。
【図２】抗ＰＴＰＲＫトランスジーンによってＰＴＰＲＫを欠損させた後のＨａＣａＴ細胞は細胞接着の増加を示した。４０００Ｈｚおよび３２０００Ｈｚでのトレース（上２つのパネル）と４０００Ｈｚおよび５００Ｈｚでの３Ｄモデリング（下２つのパネル）を示す。
【図３】細胞の接着およびＰＴＰＲＫ阻害剤であるスチボグルコネートへの応答に対する、内皮細胞におけるＰＴＰＲＫノックダウンの効果を示す。左：ＥＣＩＳアッセイにおける細胞応答のトレース。右：Ａ：ＨＥＣＶ  ＷＴ、Ｂ：ＨＥＣＶ／ＰＴＰＲＫｒｉｂ、Ｃ：ＨＥＣＶ  ｗｔ＋スチボグルコネート、およびＤ：ＨＥＣＶ／ＰＴＰＲＫｒｉｂ＋スチボグルコネート。
【図４】細胞の遊走およびＰＴＰＲＫ阻害剤であるスチボグルコネートへの応答に対する、内皮細胞におけるＰＴＰＲＫノックダウンの効果を示す。左：ECISアッセイにおける細胞応答のトレース。右：Ａ：ＨＥＣＶ  ＷＴ、Ｂ：ＨＥＣＶ／ＰＴＰＲＫｒｉｂ、Ｃ：ＨＥＣＶ  ｗｔ＋スチボグルコネート、およびＤ：ｃＨＥＣＶ／ＰＴＰＲＫｒｉｂ＋スチボグルコネート。細胞は３０秒間６Ｖで損傷させ、損傷後直ちにトレースした。
【図５】準備した濃度のスチボグルコネートへ応答するＨａＣａＴ（ＷＴ）のトレース（３通り）を示す。
【図６】準備した濃度のスチボグルコネートへ応答するＨａＣａＴ（ＷＴ）接着の３Ｄモデリングを示す。
【図７】準備した濃度のスチボグルコネートへ応答するＨａＣａＴ（ＷＴ）のトレース（２通り）を示す。１００ｈＺでのトレースを示す。
【図８】準備した濃度のスチボグルコネートへ応答するＨａＣａＴ（ＷＴ）遊走の３Ｄモデリングを示す。１０００Ｈｚでの３Ｄモデリングを示す。
【図９】Ｒｂモデリング法を用いたところ、細胞遊走の濃度依存的刺激も示された。５時間の損傷アッセイを平均＋ＳＤとともにグラフに示す。
【図１０】スチボグルコネートの市販される形態であるペントスタムＴＭ（グラクソ・スミスクライン）の、細胞の遊走に対する濃度関連効果を示す。
【図１１】創傷治癒の速度に対する、ＩＰ経路によるスチボグルコン酸ナトリウムの全身投与の効果を示す。
【図１２】ｄｂ／ｓｂモデルにおける創傷治癒に対するスチボグルコネートの効果を示す。化合物は１日おきに局所的に与えた。
【図１３】創傷治癒の速度に対する、週１回送達するスチボグルコネートの効果を示す。
【図１４】創傷治癒の速度に対する、週２回送達するスチボグルコネートの効果を示す。
【図１５】２週間の処置（週１回）後の創傷のサイズに対するスチボグルコネート濃度の散乱プロットを示す。
【図１６】ＰＴＰＲＫのアミノ酸およびｃＤＮＡ配列構造を示す。
【図１７】週１回投薬計画または週２回投薬計画において第３週から第４週の処置を除去した効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
表１は、本明細書中に記載する抗ヒトＰＴＰＲＫリボザイムトランスジーンの構築と検証に用いたプライマーとオリゴヌクレオチドを示す。
【００５８】
材料と方法
細胞
ヒトケラチノサイト細胞株であるＨａＣａＴはＧｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ヒト血管内皮細胞であるＨＥＣＶはＩｎｔｅｒｌａｂ、ミラノ、イタリアから、ＤＢ／ＤＢマウスはＨａｒｌａｎ  ＵＫから購入した。
【００５９】
抗ヒトＰＴＰＲＫリボザイムトランスジーンの構築
トランスジーンはヒトＰＴＰＲＫ  ｍＲＮＡ二次構造（図１）に基づいた。表１に列挙したそれぞれのオリゴを用いて、ＡＴＣおよびＧＴＣ部位を標的とする３つのトランスジーンを作製した。タッチダウンＰＣＲによりリボザイムを作製し、その後２％アガロースゲルを用いて確認した。正しいリボザイムをｐＥＦ６／Ｖ５Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)にライゲートし、その後Ｔｏｐ１０大腸菌にライゲートした生成物を形質転換した。３０秒間の熱ショックと２分間の氷上での回復の後、細菌をＳＯＣ培地に懸濁し、振とう機（２００ｒｐｍ）上で１時間生育させた。次いで、形質転換した細菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢアガーディッシュに塗り広げた。３７℃で終夜プレートをインキュベートした後、別々のコロニーを識別し、ＲＢＢＭＲおよびＲＢＴＰＦプライマーに対してＴ７Ｆプライマーを用いた定位特異的ＰＣＲにより、リボザイムの存在および挿入物の定位についてスクリーニングした。正しいコロニーを拾い上げ、アンピシリンを含むＬＢ培地で生育させた。プラスミドを抽出し、精製し、さらに定方向特異的ＰＣＲ（Ｔ７ＦおよびＲＢＢＭＲに対してＲＢＴＯＰを用いる）によって確認した。
【００６０】
ＰＴＰＲＫの差次的発現を有するヒトケラチノサイトおよび内皮細胞の亜系統の生成
ＰＴＰＲＫについて陽性であるＨａＣａＴおよびＨＥＣＶ細胞に、電気穿孔（２７０ｖ）によって抗ＰＴＰＲＫトランスジーンを形質移入した。選択培地（１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＤＭＥＭ）にて１０日間かけて選択した後、選択した細胞のコロニーをプールし、その後の分析に用いた。
【００６１】
インビボ耐性試験
第一の耐性試験は胸腺欠損ＣＤ−１（チャールズリバー研究所）にて行った。簡単に言うと、４〜６週齢の２０ｇ重量のＣＤ−１を上部フィルターケージに収容した。ＰＴＰＲＫ阻害剤として知られるスチボグルコン酸ナトリウムを毎日腹腔内投与した。化合物は、１００μｌの容積中１００終濃度（およそ１０ｍｇ／ｋｇ体重に等しい）とした。ＣＤ−１は毎日観察し、週２回体重を計測した。更なる耐性および有効性試験はｄｂ／ｄｂ系統を用いて行った。
【００６２】
インビボ有効性試験および創傷治癒
ｄｂ／ｄｂの糖尿病系統はHarlanから入手した。 20ｇ体重の4〜6週齢を用いた。創傷は最近記載された方法に従って生成した。簡単に言うと、一週間収容した後、ｄｂ／ｄｂはまず、直径1ミリメートルの傷（穴）を作るために穿孔機を使って耳を切った。創傷を作った次の日、すべてのｄｂ／ｄｂの体重を量り、デジタルカメラを用いて創傷を撮影した。処置は全身（ＩＰ投与）または局所（創傷領域に化合物を含むゲルを手動で充てる）により行った。両処置は１日おき、週２回または週１回行った。毎週画像を撮影した。創傷のサイズは画像分析ソフトウエアを用いて決定し、ピクセルで領域を示す。
【００６３】
細胞の機能に対するＰＴＰＲＫノックダウンの効果
スクリーニングにはＥＣＩＳ  ９６００、モデリングには  ＥＣＩＳ１６００ＲおよびＥＣＩＳ  Ｚθといった、３つのＥＣＩＳ機器のモデルを用いた。すべての系で、８Ｗ１０アレイを用いた(Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA) (Giaever and Keese 1991, Kees et al 2004)。アレイ表面をシステイン溶液にて処理した（またはＥＣＩＳ  Ｚθのアレイ安定化手順）後、アレイを完全培地にて１時間インキュベートした。電気的変化は２４時間まで連続的にモニターした。９６００系では、モニタリングは３０Ｈｚに固定した。１６００ＲおよびＥＣＩＳ  Ｚθ系では、細胞を６２．５、１２５、２５０、５００、１，０００、２，０００、４，０００、８，０００、１６，０００、３２，０００および６４，０００Ｈｚでモニターした。接着は集積Ｒｂモデリング法によって分析した。
【００６４】
結果
ＨａＣａＴおよび内皮細胞のＰＴＰＲＫのノックダウンにより細胞接着および遊走が加速された
ＨａＣａＴ細胞においてＰＴＰＲＫをノックダウンした後、細胞接着が急速に増加したことが明らかとなった（図２）。ＰＴＰＲＫの欠失の後、内皮細胞はＥＣＩＳアッセイによると接着速度が速くなった。同様に、スチボグルコネートにて処理したHECV/WTもまた、電極表面への接着が速くなった。スチボグルコネートに対するHECV/PTPRKrib細胞の応答がHECV/WTの応答と比較して著しく低減したことが観察されたことは興味深い。内皮細胞モデルの電気創傷アッセイを用いたところ細胞遊走でも同様な変化が見られた（図３および図４）。
【００６５】
ヒトケラチノサイトはＰＴＰＲＫ阻害剤であるスチボグルコネートに対して用量依存的な応答を示した
ECIS Theta96モデルを用いて、発明者らは、一定範囲濃度のスチボグルコネートに対する細胞の応答を試験した。ＨａＣａＴ細胞は試験した濃度範囲にわたって応答し、０．１６〜２０μＭでは細胞接着の増加が見られ、２０μＭでは最大効果を示した（図５および６）。同様に、細胞はスチボグルコネートに応答し、１６０ｎＭ〜１００μＭほどの低い濃度から遊走を増やした（図７、８および９）。
【００６６】
また、発明者らは、スチボグルコネートの市販される形態であるペントスタムＴＭ（グラクソ・スミスクライン社）の、細胞遊走に対する濃度関連効果を試験した（図１０）。
【００６７】
スチボグルコネートはインビボで十分な耐性があった
第一の耐性試験は胸腺欠損ＣＤ−１（チャールズリバー研究所）にて行った。簡単に言うと、４〜６週齢の２０ｇ重量のＣＤ−１を上部フィルターケージに収容した。スチボグルコン酸ナトリウムを毎日腹腔内投与した。化合物は、１００μｌの容積中１００終濃度（１０ｍｇ／ｋｇ体重に等しい）とした。ＣＤ−１は毎日観察し、週２回体重を計測した。更なる耐性および有効性試験はｄｂ／ｄｂ系統を用いて行った。
【００６８】
スチボグルコネートはインビボで創傷治癒を促す
化合物の製剤
１．  全身適用のために、スチボグルコン酸ナトリウムをＢＳＳに溶解し、必要な濃度にまで同溶液で希釈した。１００μｌが正しい量の化合物を含む溶液を調製し、等分して、使用時まで−２０℃などに保存した。化合物は１日おきにＩＰ経路により投与した。
２．  局所適用のために、発明者らは、近年創傷ケアで用いられている２つの担体ゲル、すなわちバクトロバンとアクアゲルを用いた。スチボグルコン酸ナトリウムの濃縮したマスター貯蔵物から、１００μｌの貯蔵溶液を２グラムの各ゲルと混合し、その後携帯ホモジナイザーを用いて２分間低速で均質化した。強さや安定性の変化の徴候がない新規に製剤化したゲルを使用時まで４℃で保存した。使用の際には、少量（１５０μｌ）のゲルを創傷領域に適用し、優しく指で擦り合わせた。
３．  スチボグルコン酸ナトリウムは十分な耐性があった。
発明者らは、２週間、１日おきにｄｂ／ｄｂに化合物を全身投与した。試験期間の間、発明者らはいずれの副作用も観察しなかった。いずれのグループでも体重減少は見られなかった。
４．  スチボグルコン酸ナトリウムはいずれの副作用も生じることなく創傷治癒の速度を増加させた。
スチボグルコン酸ナトリウムは１００μＭで全身投与した。１週間後、治療した創傷は、図１に示すように、コントロール群よりも小さくなった（p=0.0927対コントロール）。
しかしながら、スチボグルコン酸ナトリウムの局所適用では、バクトロバンおよびアクアゲルのいずれの場合でも１週間後に顕著な効果は見られなかった（図２および３）。
【００６９】
投薬効果に関するインビボ試験とスチボグルコネートの最適適用手段の調査
同じｄｂ／ｄｂマウスを用いて、発明者らはさらに、２ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌのスチボグルコネートを局所塗布により適用して生じる用量反応を試験した。同時に、発明者らは、薬剤を週１回の原則で適用する、または週２回の原則で適用するといった２つの処置方法を試験した。発明者らは、週１回を原則に創傷のサイズを測定した。週１回および週２回の適用により、創傷治癒の速度は明らかに速まった。また、スチボグルコネートの治療効果は用量に依存していることも明らかであり、特に、用いた最も高い濃度、すなわち１００ｍｇ／ｍｌは本試験で用いるすべての濃度の中で最も効果が高いようであった。ツーウエイＡＮＯＶＡ(Holm-Sidak model)を用いたところ、両処置投薬計画において、処置群とコントロール群との間で非常に顕著な違いが示された。週２回処置群では、2mg/ml、20mg/mlおよび100mgそれぞれに対してコントロール群p=0.013、0.10および0.009であり、週１回処置群では、p=0.05、0.013、0.009であった。
【００７０】
スピアマンの相関係数を用いたところ、発明者らは、２週間の処置の後、創傷のサイズは濃度と有意に相関したことを発見した(p=0.049, r= - 0.950)。
さらに、発明者らは、週１回または週２回の投薬計画において完全に治癒する前に中断処置を行うと、治癒プロセスに有意な影響が生じ、創縫合が顕著に低減することも示した（図１７）。
【００７１】
要約
本研究の主な結果は以下のように要約することができる。
創傷組織では、PTPRKはケラチノサイトの遊走の重要な調節因子である。 PTPRKは、ケラチノサイトの接着および特に遊走と血管内皮細胞の遊走を増加させることによってＰＴＰＲＫ阻害剤であるスチボグルコネートに応答する。また、スチボグルコネートは、ケラチノサイトの遊走に対して濃度依存的な効果を持っている。インビボでは、チボグルコネートの局所および全身投与は、顕著な副作用を生じることなく創傷治癒の速度を増加させた。インビボでの創傷治癒に対するスチボグルコネートの効果は用量依存的であると思われる。週１回および週２回のスチボグルコネートの投与はいずれも、創傷治癒の速度を有意に増加させるが、週２回投与はわずかにより効果的であると思われる。治療投薬計画を中断すると、治癒プロセスに悪影響を与える。
【００７２】
まとめると、これらの発見は、ＰＴＰＲＫが創傷の治癒および遊走を制御する際に重要であることを示す。ゆえに、インビトロおよび臨床データは、ＰＴＰＲＫが創傷において重要な治療標的であることを示唆している。
【００７３】
表１  本試験に用いたプライマーおよびオリゴ配列
【表１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７】
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【配列表】
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