(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の成分を重量％で含有する、腫瘍細胞検出のための検出用製剤組成物であって、
葉酸と葉酸複合物は同時に０％にならない、検出用製剤組成物。
葉酸              ０〜５％
葉酸複合物        ０〜１０％
メチレンブルー    ０．０１〜５％
糖類還元剤        ０．１〜１０％
酢酸              ２〜６％
水                ３〜９５％
【請求項２】
葉酸を０〜４．５％含有する、請求項１に記載の検出用製剤組成物。
【請求項３】
葉酸を０〜１％含有する、請求項１に記載の検出用製剤組成物。
【請求項４】
葉酸複合物を０〜８％含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物。
【請求項５】
葉酸複合物を０〜１％含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物。
【請求項６】
メチレンブルーを０．０５〜４．５％含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物。
【請求項７】
メチレンブルーを０．０５〜０．５％含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物。
【請求項８】
糖類還元剤は、糖類およびその誘導体から選ばれるものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物。
【請求項９】
前記糖類還元剤は、グルコース、果糖、ガラクトース、ヘキソース、乳糖、マルトースおよびその誘導体からなる群より選ばれるものである、請求項８に記載の検出用製剤組成物。
【請求項１０】
前記酢酸を３〜５％含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物。
【請求項１１】
前記検出用製剤組成物は、上皮腫瘍細胞の検出用製剤組成物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物。
【請求項１２】
（ａ）葉酸および/または葉酸複合物を含水溶媒に溶かす工程、
（ｂ）メチレンブルーを上記溶液に添加して撹拌し溶解させる工程、
（ｃ）該溶液に糖類還元剤を添加する工程、
（ｄ）該溶液を３０分間撹拌する工程、および
（ｅ）酢酸を添加して撹拌する工程
を含み、常温、常圧で上記工程を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物およびキャリアを含む、上皮腫瘍細胞の検出用キット。
【請求項１４】
前記キャリアは、脱脂綿棒、ガーゼ、マイクロカプセル、セルロースフィルム、濾紙、ナノ材料、エアロゾルからなる群より選ばれる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記葉酸複合物は、葉酸γ-システイン、（Ｒ）−２−（２−（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−カルボニル−２，５−ジヒドロフラン）−２−ヒドロキシエチル−４−（６−（２−アミノ−４−カルボニル−３，４−ジヒドロプテリジン）メチルアミノ）安息香酸エステルである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の検出用製剤組成物。
【請求項１６】
前記葉酸複合物は、葉酸γ-システイン、（Ｒ）−２−（２−（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−カルボニル−２，５−ジヒドロフラン）−２−ヒドロキシエチル−４−（６−（２−アミノ−４−カルボニル−３，４−ジヒドロプテリジン）メチルアミノ）安息香酸エステルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記葉酸複合物は、葉酸γ-システイン、（Ｒ）−２−（２−（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−カルボニル−２，５−ジヒドロフラン）−２−ヒドロキシエチル−４−（６−（２−アミノ−４−カルボニル−３，４−ジヒドロプテリジン）メチルアミノ）安息香酸エステルである、請求項１３または１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出用製剤組成物、特に上皮腫瘍細胞の、色の変化に基づく検出用製剤組成物に関する。本発明は、前記検出用製剤組成物の製造方法、および前記検出用製剤組成物を含むキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、人体の上皮腫瘍細胞に生体染色をする方法として、主に酢酸のアルビノ反応に基づいた方法、ヨウ素実験、トルイジンブルーテスト、メチレンブルー染色、ヘマトキシリン染色等がある。
【０００３】
具体的に言えば、酢酸のアルビノ反応は、酢酸溶液、例えば３〜５％の酢酸溶液を、子宮頚/膣の上皮組織に塗り付け、一定の時間後、塗り付けられた上皮組織に酢酸のアルビノ反応域があるかを観察する。アルビノ反応域がある場合に、該上皮組織に腫瘍細胞があると推測される。しかし、この方法は感度が高いが、特異性が劣る。腫瘍細胞の他に、一部の炎症細胞も酢酸のアルビノ反応を起こすので、偽陽性の結果になってしまう。それに、該方法の特異性は、取扱い者の技術レベルと経験に大きく影響される。
【０００４】
ヨウ素実験の原理はグリコーゲン反応であり、ルゴールヨウ素液を子宮頚上皮組織に塗り付け、そして上皮細胞のヨウ素染色現象を観察することで検出するものである。正常な上皮はレッドブラウンか黒色を呈するが、異常な上皮は厚いマスタード黄色かカーキ色を呈する。しかし、上皮に炎症がある時、これらの区域はヨウ素染色されず、無色の充填となる可能性があるので、ヨウ素実験は上皮細胞の染色に対する特異性は低い［１］。
【０００５】
トルイジンブルーを使用する方法は、中性白血球と細菌の核破片が着色しやすく、偽陽性結果が多い。また、表面に角化した粘膜白斑とガンが着色し難く、偽陰性になりやすい［２］。
【０００６】
上皮組織をヘマトキシリン染色した後、高倍率の顕微鏡で観察する必要があるので、取扱いが比較的に複雑であり、取扱い者の専門技術と経験に対する要求は高く、検査に時間がかかる。
【０００７】
メチレンブルーとガン細胞の親和性により、悪性組織はブルーに染色されやすい。それを食道上皮組織の位置発見、生検取材に用いる研究もあり、生検の陽性率を高める作用がある［３］。しかし、従来技術には、メチレンブルーの酸化還元変色反応を葉酸、葉酸複合物と組み合わせて染色と色の変化反応により上皮腫瘍細胞をすばやく見つけて検出する報道はない。
【０００８】
本分野は、感度の高く、特異性の強く、取扱いが簡単かつ迅速である、染色と色変化により上皮腫瘍細胞、特に子宮頚/膣の上皮組織腫瘍細胞を検出する組成物が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は、葉酸および/または葉酸複合物を腫瘍細胞に過剰発現した葉酸受容体と結合し、エンドサイトーシスし、還元態メチレンブルーを腫瘍細胞の酸化還元システムに参加させ、メチレンブルーが酸化還元反応での色変化を利用して、異常な上皮組織に対して特異性染色を迅速に且つ正確にすることができ、さらにそれを正常な組織と区別し、本発明組成物の色変化により、テストされた組織細胞が腫瘍細胞であるかをすばやく示すことで、迅速、簡単、正確かつ鋭敏に異常な上皮組織を発見・検出し、本発明に至った。本発明の検出用製剤組成物は感度が高く、特異性が高く、取扱いが簡単で、検査時間も短く、しかも取扱い者に技術的なトレーニングをする必要はない。この他、メチレンブルーは臨床で広く使用される試薬として、有効的、安全、安い且つ入手しやすいメリットを有するので、本発明の組成物と方法もこのような利点を有する。
【００１０】
よって、本発明は、下記の成分を含有する（重量％）検出用製剤組成物を提供する。
【００１１】
葉酸            ０〜５％
葉酸複合物      ０〜１０％
メチレンブルー  ０．０１〜５％
糖類還元剤      ０．１〜１０％
酢酸            ２〜６％
水              ３〜９５％
上記検出用製剤組成物の好ましい実施形態として、組成物は、葉酸を０〜４．５％、好ましくは０〜１％含有する。
【００１２】
好ましいもう一形態として、組成物は、葉酸複合物を０〜８％、好ましくは０〜１％含有する。
【００１３】
好ましいもう一形態として、組成物は、メチレンブルーを０．０５〜４．５％、好ましくは０．０５〜０．５％含有する。
【００１４】
好ましいもう一形態として、組成物は、好ましくは酢酸を３〜５％含有する。
【００１５】
本発明の検出用製剤組成物に用いられる糖類還元剤は、各糖類およびその誘導体を含み、好ましくは、グルコース、果糖、ガラクトース、ヘキソース、乳糖、マルトースおよびその誘導体からなる群より選ばれるものである。
【００１６】
本発明のもう一方面は、本発明の検出剤を製造する方法に係り、前記方法は、下記の：
（ａ）上記重量比に従って葉酸および/または葉酸複合物を含水溶媒に溶かして溶液を得る工程、
（ｂ）上記重量比に従ってメチレンブルーを溶液（ａ）に添加して撹拌し溶解させる工程、
（ｃ）上記重量比に従って糖類還元剤を溶液（ｂ）に添加する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた溶液を３０分間撹拌する工程、および
（ｅ）上記重量比に従って酢酸を溶液（ｄ）に添加して撹拌・混合する工程
を順次に含み、或いは上記の工程からなる。上記の各工程は、常温、常圧で行う。
【００１７】
好ましい方面として、本発明の検出剤、または本発明の方法により製造された検出剤を上皮腫瘍細胞の検出に用いる。
【００１８】
本発明はさらに、上皮組織の病変を検出する方法に関する。前記方法は、
（ａ）本発明の生細胞検出剤をキャリアを介して被験者の上皮組織の表面に使用する工程、
（ｂ）キャリア上の色変化を観察する工程、および
（ｃ）色変化によってテストされた上皮組織が病変したかを判定する工程
を含む。
【００１９】
好ましい一形態として、本発明の、上皮組織の病変を検出する方法はさらに、
（ｄ）本発明の生細胞検出剤を使用した上皮組織の表面区域は、酢酸アルビノ反応が起きたかを観察する工程
を含む。
【００２０】
好ましい一形態として、本発明の、上皮組織の病変を検出する方法において、目視で工程（ｂ）の観察をする。
【００２１】
好ましい一形態として、本発明の、上皮組織の病変を検出する方法において、工程（ｂ）と（ｃ）の観察と検出は、下記の標準に従って行われる。すなわち、キャリアは変色しない場合、上皮組織には病変はないことをヒントする。キャリアはライトブルーグリーンになる場合、上皮組織には異常な病変はないことをヒントする。キャリアはダークブルーグリーン/濃い緑/ダークパープルになる場合、上皮組織には異常な病変があることをヒントする。さらに、キャリアは濃い緑/ダークパープルになる場合に、患者の診察条件を保証できない条件下、しかも患者の同意を求めた前提下で、上皮組織の、酢酸アルビノ反応が起こった区域から生体組織を取り、病理学的検査・分析をする。
【００２２】
好ましい一形態として、前記異常な病変は、上皮組織内の新生組織形成（≧ＣＩＮ  ＩＩ）と癌化である。
【００２３】
なお、異なる方式で本発明の上皮組織腫瘍細胞の検出用製剤組成物を使用することができる。前記使用方式として、塗り付けを含み、しかしそれに限られていない。前記使用はキャリアで行われることができる。前記キャリアとして、脱脂綿棒、ガーゼ、マイクロカプセル、セルロースフィルム、濾紙、ナノ材料、エアロゾルを含むが、これらに限られていない。
【００２４】
本発明の上皮組織腫瘍細胞の検出用製剤組成物は、子宮頚、膣、口腔、食管および胃腸などの上皮組織を含む、異なる部位にある上皮組織に使用されることができ、しかも前記の上皮組織に限られていない。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
葉酸受容体はほとんどの腫瘍細胞の表面に過剰発現されるが、正常な細胞にはすくなく存在していると臨床研究は証明した。そこで、葉酸および葉酸複合物（葉酸誘導体）は、腫瘍特異性標的仲介分子として腫瘍の診断と治療に用いることができる［４−５］。
【００２６】
本発明において、「葉酸複合物」とは、葉酸分子と、一つ以上のその他の成分とを結合してなる複合物をいう。葉酸のカルボキシル基は、カップリングまたは共役等の方式で前記一つ以上のその他の成分と結合する。前記一つ以上のその他の成分として、薬物、放射性核種、染料、遺伝子、現像剤などが挙げられる。前記葉酸複合物の実例として、葉酸-マイトマイシン複合物、葉酸-ＤＴＰＡ複合物などが挙げられる。本発明の組成物と方法において、葉酸および/または葉酸複合物を同時に使用してもよいし、それぞれ単独に使用してもよい。本発明の検出用製剤組成物に用いられる葉酸複合物は、各種の小分子化合物と葉酸をカップリングして形成する葉酸結合体を含む。葉酸γ-システイン、（Ｒ）−２−（２−（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−カルボニル−２，５−ジヒドロフラン）−２−ヒドロキシエチル−４−（６−（２−アミノ−４−カルボニル−３，４−ジヒドロプテリジン）メチルアミノ）安息香酸エステル等を含むが、これらに限られていない。
【００２７】
本発明の組成物は葉酸を重量パーセンテージで０〜５％、好ましくは０〜４．５％、０〜４％、０〜３．５％、０〜３％、０〜２．５％、０〜２％、０〜１．５％、より好ましくは０〜１％含有する。本発明の組成物は葉酸複合物を重量パーセンテージで０〜１０％、好ましくは０〜８％、０〜７％、０〜６％、０〜５％、０〜４％、０〜３％、０〜２％、より好ましくは０〜１％含有する。
【００２８】
メチレンブルーは臨床上でよく使用される染色剤であり、その染色、変色原理は主に、酸化状態と還元状態の色が違うことである。詳しくは、還元状態のメチレンブルーは無色であるに対して、酸化状態のメチレンブルーの水溶液は青色である。また、メチレンブルーが本発明の組成物に存在する場合に、酸化するとブルーグリーンと濃い緑（ブラウングリーン）、ダークパープルを呈することもある。生物学的染料としてのメチレンブルーは、ガン細胞およびメラニンに高い親和性を有し、その酸化還元性により、メチレンブルーは腫瘍組織の酸化還元状態において異なる変色反応スペクトルを示し、この色の変化を目視で直接且つ迅速に観察・鑑定することができる。
【００２９】
腫瘍組織の抗酸化能力は、一般の正常な組織と比べて顕著に増強されたが、明らかな酸化ストレス状態がある［６］。酸化ストレス（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ）状態は、組織が酸化・損傷したことを示し、潜在的な組織病理が漸進的に変化する過程である。腫瘍組織の還元性は増強されたものの、腫瘍細胞が自滅または抑制状態にあることを除き、その酸化還元のバランスは酸化に傾いている。そこで、このような生細胞の細胞内環境において、本発明の組成物のメチレンブルーは酸化し、酸化状態の緑色、ブルーグリーン、濃い緑色、およびダークパープルを呈する。
【００３０】
本発明の組成物において、葉酸複合物および少しの葉酸は、メチレンブルーと葉酸-メチレンブルー複合物を形成できる。葉酸分子と、腫瘍細胞の表面に過剰発現される葉酸受容体との結合作用で、酢酸の促進の下で、葉酸-メチレンブルー複合物は細胞に入りやすく、還元状態のメチレンブルーを釈放する。腫瘍細胞の酸化ストレス状態では、メチレンブルーは早く酸化し、色変化をする。腫瘍の悪性転化の程度は違うと、メチレンブルーはダークブルーグリーン、濃い緑色、ダークパープルに変色する。炎症性病変、生殖器疣贅（ＨＰＶウイルス感染）またはＣＩＮ  Ｉ病変の場合は、メチレンブルーは緑色またはライトブルーグリーンを呈する。
【００３１】
本発明の「糖類還元剤」とは、還元性を有するいかなる糖類、その誘導体およびそれらの組み合わせをいう。前記糖類は、単糖、二糖類、多糖を含むが、これらに限られていない。詳しく言えば、前記糖類還元剤として、グルコース、果糖、ガラクトース、ヘキソース、乳糖、マルトースなどが挙げられる。本文でいう「糖類誘導体」は、糖類物質は重合、エステル化、酸化などの反応によって形成する多糖、糖タンパク質、有機酸などの誘導体のことである。糖類還元剤が本発明の組成物と方法における量は、０．１〜１０％、好ましくは０．３〜８％、０．１〜３％、０．０５〜１％である。
【００３２】
本発明の組成物と方法の糖類還元剤は、酸化状態のメチレンブルーを無色の還元状態のメチレンブルーに還元する。葉酸および/または葉酸複合物は、腫瘍細胞の表面の葉酸受容体と結合し、ｐＨ５．０〜５．５の酸性環境では、葉酸および/または葉酸複合物仲介の還元状態のメチレンブルーは内面化して細胞質ゾルに釈放され、還元状態のメチレンブルーは腫瘍組織の酸化ストレス状態に参加し、還元状態のメチレンブルーは還元状態から酸化状態に転換すると同時に、細胞内液の浸透圧は高くなり、酸化状態のメチレンブルーは細胞外に逸脱してしまい、すぐに異なる変色反応を示す。細胞外に逸脱するメチレンブルーは、本発明を使用するキャリアに付着することができ、前記キャリア上の組成物がすぐに色変化を示す。詳しく言えば、組成物はライト黄褐色から、ダークブルーグリーン、濃い緑色、ダークパープルに変える。また、腫瘍細胞の細胞核は大きくなり、核タンパク質の量が多くなり、酢酸にて沈殿することにより凝集し、過度性反応を起こし、異常な上皮組織はアルビノ反応区となり、異常な上皮組織に対する病理的取材に位置を示すことができる。
【００３３】
本発明でいう「酢酸」は醋酸のことである。本発明の組成物は、酢酸を２〜６重量％含む。本発明の組成物およびその製造方法に使用される酢酸により酸性のｐＨが提供されており、ｐＨ５．０〜５．５が好ましい。この他、酢酸を使用すると、本発明の組成物は細胞を迅速に貫通でき、細胞の中身と相互作用して呈色反応を促す。また、上述のように、色変化を示すための成分としてのメチレンブルーは細胞外に逸脱した後、酢酸は異常な上皮組織細胞に対して起こしたアルビノ反応もさらに、異常な上皮組織の位置づけに根拠を提供した。
【００３４】
本発明の組成物で染色可能な細胞は腫瘍細胞であり、好ましくは上皮組織腫瘍細胞である。前記上皮組織は、子宮頚上皮、膣上皮、胃腸上皮、口腔上皮などを含み、これらに限られていない。前記細胞は、組織の生検サンプルからのものであってもよい。
【００３５】
本発明でいう細胞は、哺乳動物被験者からのものであってもよい。前記哺乳動物はヒトを含むが、これに限られていない。
【００３６】
次は実施例と比較例を通して本発明についてさらに説明する。下記の実施例と比較例において、子宮頚上皮組織を検査対象とし、子宮頚組織の病理学的な検査結果を参照基準とし、敏感性で検出剤の検出率を説明する。敏感性が高いほど、異常な上皮組織を発見する能力は強い。特異性で検出剤の正確性を説明し、特異性が高いほど、検出した異常な上皮組織は、病理学的な検査の結果との一致率が高い。
【００３７】
本発明で、敏感性と特異性を下記のように定義し計算する。
【００３８】
敏感性＝真陽性人数/（真陽性人数＋偽陰性人数）＊１００％
特異性＝真陰性人数/（真陰性人数＋偽陽性人数）＊１００％
実施例１
常温と常圧下で、それぞれ下記表１に指定される各成分により薬用レベルの葉酸を含水溶媒に溶かし、生物検出剤であるメチレンブルーを添加して撹拌し溶解させ、還元剤であるグルコースを添加して３０分間撹拌してから、分析用の酢酸を添加して混合し、検出用製剤組成物を作成した。ビッグ綿棒を用いて検出用製剤組成物につけ、子宮頚上皮組織に塗り付けてからすぐに綿棒を取り出し、綿棒の色変化を観察する。綿棒の色はライト黄褐色になると、上皮組織に病変がないことをヒントする。綿棒の色はライトブルーグリーンになると、炎症性病変、生殖器疣贅（ＨＰＶウイルス感染）およびＣＩＮ  Ｉ病変をヒントする。綿棒の色はダークブルーグリーン、濃い緑色、ダークパープルになると、ＣＩＮ  ＩＩ以上の異常な病変をヒントする。それと同時に膣鏡検査が勧められ、複数の部位で生組織を取材して組織病理学的検査を行う。そして組織病理学の検査結果を標準として、検出剤の敏感性と特異性をテストし、その結果を表１に示す。
実施例２
葉酸の代わりに葉酸γ-システインを使用する他、下記表１に指定の各成分の含有量で実施例１の方法を繰り返して、その結果を表１に示す。
実施例３
葉酸を葉酸複合物（Ｒ）−２−（２−（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−カルボニル−２，５−ジヒドロフラン）−２−ヒドロキシエチル−４−（６−（２−アミノ−４−カルボニル−３，４−ジヒドロプテリジン）メチルアミノ）安息香酸エステルとともに含水溶媒に溶かす他、下記表１に指定の各成分の含有量で実施例１の方法を繰り返して、その結果を表１に示す。
実施例４
葉酸を葉酸複合物（Ｒ）−２−（２−（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−カルボニル−２，５−ジヒドロフラン）−２−ヒドロキシエチル−４−（６−（２−アミノ−４−カルボニル−３，４−ジヒドロプテリジン）メチルアミノ）安息香酸エステルとともに含水溶媒に溶かすと同時に、還元剤のグルコースの代わりに還元剤であるヘキソース誘導体を使用する他、下記表１に指定の各成分の含有量で実施例１の方法を繰り返して、その結果を表１に示す。
比較例１
常温と常圧下で、酢酸５ｍｌを蒸留水９５ｍｌに入れて混合し、５％の酢酸溶液を作成した。ビッグ綿棒を用いて該溶液につけ、子宮頚上皮組織に塗り付けてから１分間を待ち、子宮頚の、スケールコラムジャンクションに近いところに、上皮組織上に酢酸アルビノ反応があるかを観察し、そのボーダー、厚み、色、反応時間などをも観察する。ボーダーがはっきりした酢酸白斑区域が出ると、ＣＩＮ  Ｉ以上の病変をヒントする。膣鏡検査を行い、複数の部位で生組織を取材して組織病理学的検査を行う。そして組織病理学の検査結果を標準として、５％酢酸溶液の敏感性と特異性をテストし、その結果を表１に示す。
比較例２
常温と常圧下で、ヨウ化カリウム１０ｇを蒸留水１００ｍｌに溶かし、ヨウ素５ｇを入れて撹拌し溶解させ、ルゴール（Ｌｕｇｏｌ’ｓ）ヨウ素液を作成した。ビッグ綿棒を用いて液につけ、子宮頚上皮組織に塗り付けてから、上皮組織上にヨウ素染色があるかを観察する。正常な上皮はブラウンまたは黒色を呈するが、異常な上皮は厚いマスタード黄色またはカーキ色を呈し、ＣＩＮ  Ｉ以上の病変をヒントする。膣鏡検査を行い、複数の部位で生組織を取材して組織病理学的検査を行う。そして組織病理学の検査結果を標準として、ルゴールヨウ素液の敏感性と特異性をテストし、その結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
0006040258.tif 000002
上記表１から分かるように、本発明の検出用製剤組成物を採用した各実施例は、比較例と比べ、敏感性、特異性の面でいずれも顕著な優位を示し、本発明の組成物は、異常な上皮組織を敏感的且つ特異的に検出できることを表した。
参考文献：
1、▲喬▼友林、章文華、趙方輝、潘秦鏡、李凌、『子宮頚ガンのスクリーニングおよび早期発見と早期治療方案』、２００３年７月；
2、Mashberg,  A:J.  Amer.  Dent.Assoc,  1983.106-112；
3、Canto  MI,  Setrakian  S,  Willis  J,  et  al,  Methylene  blue-directed  biopsies  improve  detection  intestinal  metaplasia  and  dysplasia  in  Barrett’s  esophagus  [J].Gastrointest  Endosc,  2000,5:560；
4、Zhao  XB,  Lee  RJ.  Tumor-selective  targeted  delivery  of  genes  and  antisen  seo  ligo  deoxyribonuc  leo  tides  via  the  folate  receptor  [J].Adv  Drug  Deliv  Rev,2004,56(8):191-193；
5、Reddy  JA,  Allagadda  Vm,  Leamon  CP.  Targeting  therapeutic  and  imaging  agents  to  folate  recep  tor  positive  tumors  [J].Current  Pham  Biotech,2005,6,131-150；
6、呉▲ちぇん▼▲はん▼、悪性腫瘍組織の酸化還元状態、抗酸化能力の変化と細胞自滅の関係およびメカニズムについての初歩的な研究、２００５年４月２６日；
7、Link  EM,  Blower  PJ,Costa  DC,  et  al,  Early  detection  of  melanoma  metastases  with  radioiodinated  methylene  blue  [J].Eur  J  Nuclear  Med,  1998,25(9):1322.
8、Leamon  CP,Deprince  RB,Hendren  RW.  Folate-mediated  drug  delivery:effect  of  alternative  conjugation  chemistry  [J].Drug  Target,1999,7:157-169.
9、Leamon  CP,Cooper  SR,  Hardee  GE.  Folate-liposome-mediated  antisense  oligodeoxynucleotide  targeting  to  cancer  cells:  evaluation  in  vitro  and  vivo  [J].  Bioconjug  Chem,  2003,14:738-747.