(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む方法であって、該工程が、
（ａ）１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子をＳｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部にパッケージングして、ＤＮＡがパッケージングされた頭部を形成する工程、ならびに
（ｂ）該ＤＮＡがパッケージングされた頭部を１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質および／または１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質に曝し、該ＤＮＡがパッケージングされた頭部と、該ＤＮＡがパッケージングされた頭部の表面にディスプレイされた該１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質および／または該１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質とを含むファージＴ４  ＤＮＡパッケージングマシンを形成する工程、
であり、
該Ｓｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部が、ゲノムＤＮＡの一部を保持し、かつｇｐ１７パッケージングモーターによって結合されており、そして
該１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質が、Ｈｏｃに融合された樹状細胞特異的リガンドＣＤ４０Ｌを含み、そして該１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質が、Ｓｏｃに融合された樹状細胞特異的リガンドＣＤ４０Ｌを含む、方法。
【請求項２】
前記方法が、工程（ａ）の前に、以下の工程：
Ｓｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部の頂点ポータルタンパク質ｇｐ２０に前記ｇｐ１７パッケージングモーターを結合させる工程、
を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子が、２つまたはそれ以上の異なる外来遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記２つまたはそれ以上の異なる遺伝子が、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ファージＴ４  ＤＮＡパッケージングマシンを含む産物であって、
ゲノムＤＮＡの一部を保持し、かつｇｐ１７パッケージングモーターによって結合されているＳｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部と、
該Ｓｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部にパッケージングされた１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子と、
該Ｓｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部の表面にディスプレイされた１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質および／または１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質と、
を含み、
該１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質が、Ｈｏｃに融合された樹状細胞ＣＤ４０リガンドを含み、そして該１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質が、Ｓｏｃに融合された樹状細胞ＣＤ４０リガンドを含む、産物。
【請求項６】
前記１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子が、２つまたはそれ以上の異なる遺伝子を含む、請求項５に記載の産物。
【請求項７】
前記２つまたはそれ以上の異なる遺伝子が、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子である、請求項６に記載の産物。
【請求項８】
前記Ｓｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部、ｇｐ１７パッケージングモーター、ＡＴＰおよび前記１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子をインビトロで混合し、該Ｓｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部に該１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子をパッケージングする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子が、１つまたはそれ以上のプラスミド、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、および／またはコンカテマー化されたＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡがパッケージングされた頭部の表面にあるＨｏｃまたはＳｏｃ結合部位の各総数に対する、前記１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質または前記１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質の分子のコピー数の比率が調節され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡがパッケージングされた頭部の表面にあるＨｏｃまたはＳｏｃ結合部位の各総数に対する、前記１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質または前記１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質の分子のコピー数の比率が２０：１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子が、ペスト菌由来の組換えＦ１−Ｖ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、
前記１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質が、ペスト菌由来の組換えＦ１−Ｖタンパク質に融合されたＨｏｃを含み、そして
前記１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質が、ペスト菌由来の組換えＦ１−Ｖタンパク質に融合されたＳｏｃを含む、方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む方法であって、該工程が、
１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子をＳｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部にパッケージングして、ＤＮＡがパッケージングされた頭部を形成する工程、ならびに
該ＤＮＡがパッケージングされた頭部を１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質および／または１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質に曝し、該ＤＮＡがパッケージングされた頭部と、該ＤＮＡがパッケージングされた頭部の表面にディスプレイされた該１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質および／または該１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質とを含むファージＴ４  ＤＮＡパッケージングマシンを形成する工程、
であり、
該Ｓｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部が、ゲノムＤＮＡの一部を保持し、かつｇｐ１７パッケージングモーターによって結合され、
該１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質が、Ｈｏｃに融合されたプロテインＧのＩｇＧ結合ドメインを含むＨｏｃ−ＧＧ融合タンパク質を含み、
該１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質が、Ｓｏｃに融合されたプロテインＧのＩｇＧ結合ドメインを含むＳｏｃ−ＧＧ融合タンパク質を含み、そして
該ＤＮＡがパッケージングされた頭部の表面に、該Ｈｏｃ−ＧＧ融合タンパク質および／または該Ｓｏｃ−ＧＧ融合タンパク質への結合を介して、樹状細胞特異的レセプターモノクローナル抗体がディスプレイされる、方法。
【請求項１５】
前記１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子が、２つまたはそれ以上の異なる外来遺伝子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、
前記１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質が、ペスト菌由来の組換えＦ１−Ｖタンパク質に融合されたＨｏｃを含み、そして
前記１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質が、ペスト菌由来の組換えＦ１−Ｖタンパク質に融合されたＳｏｃを含む、方法。
【請求項１７】
以下の工程を含む方法であって、該工程が、
１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子をＳｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部にパッケージングして、ＤＮＡがパッケージングされた頭部を形成する工程、ならびに
該ＤＮＡがパッケージングされた頭部を１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質および／または１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質に曝し、該ＤＮＡがパッケージングされた頭部と、該ＤＮＡがパッケージングされた頭部の表面にディスプレイされた該１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質および／または該１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質とを含むファージＴ４  ＤＮＡパッケージングマシンを形成する工程、
であり、
該Ｓｏｃ−Ｈｏｃ−ファージＴ４頭部が、ゲノムＤＮＡの一部を保持し、かつｇｐ１７パッケージングモーターによって結合されており、そして
該１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質が、Ｈｏｃ−ＣＰＰ融合タンパク質を含み、そして該１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質が、Ｓｏｃ−ＣＰＰ融合タンパク質を含む、方法。
【請求項１８】
前記Ｈｏｃ−ＣＰＰ融合タンパク質が、Ｈｏｃ−ＣＰＰ−Ｔａｔおよび／またはＨｏｃ−ＣＰＰ−Ａｎｔｐを含み、そして前記Ｓｏｃ−ＣＰＰ融合タンパク質が、Ｓｏｃ−ＣＰＰ−Ｔａｔおよび／またはＳｏｃ−ＣＰＰ−Ａｎｔｐを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子が、２つまたはそれ以上の異なる外来遺伝子を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１３年１２月４日に出願された「In Vitro and In Vivo Delivery of Genes and Proteins Using the Bacteriophage T4 DNA Packaging Machine」という名称の米国非仮特許出願第１４／０９６，２３８号の優先権の利益を請求し、この米国非仮特許出願は、２０１３年３月８日に出願された「In Vitro and In Vivo Delivery of Genes and Proteins Using the Bacteriophage T4 DNA Packaging Machine」という名称の米国仮特許出願第６１／７７４，８９５号の優先権の利益を請求するものであり、これらの出願の全体を参照により援用する。
【０００２】
この出願は、以下の米国特許および米国特許出願、すなわち、２００７年３月１日に出願された「Liposome-Bacteriophage Complex as Vaccine Adjuvant」という名称の米国仮特許出願第６０／９０４，１６８号、２００８年２月２９日に出願された「Liposome-Bacteriophage Complex as Vaccine Adjuvant」という名称の米国特許出願第１２／０３９，８０３号であり、現在は、２０１２年４月３日に発行された米国特許第８，１４８，１３０号、２００４年１２月１７日に出願された「Methods and Compositions Comprising Bacteriophage Nanoparticles」という名称の米国特許出願第１１／０１５，２９４号、２００３年１２月１７日に出願された「Methods and Compositions Comprising Bacteriophage Nanoparticles」という名称の米国仮特許出願第６０／５３０，５２７号、２０１０年４月９日に出願された「Promiscuous DNA Packaging Machine From Bacteriophage T4」という名称の米国仮特許出願第６１／３２２，３３４号、２０１１年４月８日に出願された「Protein and Nucleic Acid Delivery Vehicles, Components and Mechanisms Thereof」という名称の米国特許出願第１３／０８２，４６６号、および２０１２年１１月２９日に出願された「Designing a Soluble Full-Length HIV-1 GP41 Trimer」という名称の米国仮特許出願第６１，７３１，１４７号も参照し、その内容および開示の全体を参照により本明細書に援用する。
【０００３】
（政府の利益に関する陳述）
米国政府は、国立衛生研究所による助成金の契約第ＮＩＡＩＤ  Ｕ０１−ＡＩ０８０８６号およびＡＩ０８１７２６号に従って本発明において権利を有する。
【０００４】
本発明は、概して、タンパク質および核酸送達成分、組成物、機構ならびにその送達の方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
標的細胞内への遺伝子およびタンパク質の送達は、機構を理解するためにも新規な生物医学的療法を探究するためにも不可欠である。例えば、癌やＡＩＤＳのような複雑な遺伝性および感染性疾患の将来の治療法は、遺伝子およびタンパク質の適切な組合せでの送達を含み得る。現在のところ、遺伝子およびタンパク質の両方を標的細胞内へ効率的に送達し得るプラットフォームは存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願は、本明細書中に記載のような従来技術の欠点を克服する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の広い局面によれば、本発明は、以下の工程を含む方法であって、当該工程が、個体の細胞をＴ４  ＤＮＡパッケージングマシンに曝し、それによって上記Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンを上記細胞に結合させる工程であり、上記Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンが、上記Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンにパッケージングされたＤＮＡの１つまたはそれ以上の分子を含み、頭部にディスプレイされた１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質が存在し、上記頭部にディスプレイされた１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質が存在し、工程（ａ）によって上記細胞内での上記Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンのインターナリゼーションが起こり、上記細胞内での上記Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンのインターナリゼーションによって上記パッケージングされたＤＮＡが上記細胞のそれぞれのサイトゾルに放出され、上記パッケージングされたＤＮＡの１つまたはそれ以上の分子が上記細胞のそれぞれのサイトゾルに放出されることによって上記ＤＮＡの１つまたはそれ以上の分子が上記細胞のそれぞれの核に入り、上記ＤＮＡの１つまたはそれ以上の分子が細胞のそれぞれの核に入ることによって上記ＤＮＡの転写および上記ＤＮＡによってコードされるタンパク質の過剰発現が起こる、方法を提供する。
【０００８】
第２の広い局面によれば、本発明は、以下の工程を含む方法であって、当該工程が、Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンの頭部を１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質に曝し、それによって上記１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質を上記頭部にディスプレイする工程であり、上記Ｔ４頭部の内部に１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子がパッケージングされ、上記頭部上にディスプレイされた１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質が存在する、方法を提供する。
【０００９】
第３の広い局面によれば、本発明は、Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンを含む産物であって、上記Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンが、上記Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンの頭部にパッケージングされた１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子と、上記Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンの上記頭部上にディスプレイされた１つまたはそれ以上のＨｏｃ融合タンパク質と、上記Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンの上記頭部にディスプレイされた１つまたはそれ以上のＳｏｃ融合タンパク質とを含む、産物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係るバクテリオファージＴ４  ＤＮＡパッケージングマシンの概略図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係るプロ遺伝子送達のための実験デザインを概略的に示す図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に係る精製されたＴ４頭部のクライオ電子顕微鏡写真である。
【図４】図４は、ＭｌｕＩ線状化ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドＤＮＡ（上のパネル）およびＢａｍＨＩ線状化ｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドＤＮＡ（下のパネル）の、ＤＮＡの比率を増加させた時の、Ｈｏｃ−Ｓｏｃ−Ｔ４頭部内へのパッケージングを示す顕微鏡写真である。矢印４１２および矢印４１４は、本発明の一実施形態に係るパッケージングされたＤＮＡを示す。
【図５】図５は、本発明の一実施形態に係る２つのプラスミド、すなわち、コンカテマー化された（concatemerized）ルシフェラーゼＤＮＡおよびＰＣＲ増幅されたルシフェラーゼ発現カセットのパッケージングを示す顕微鏡写真である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態に係るＴ４頭部上の細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）のインビトロでのアセンブリを示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、本発明の一実施形態に係るＣＰＰ装飾Ｔ４頭部を用いたルシフェラーゼＤＮＡの哺乳類細胞内への用量依存的送達を示すグラフである。
【図８】図８は、ルシフェラーゼＤＮＡ送達量がＣＰＰのコピー数の増加に伴って増加する様子を示すグラフである。
【図９】図９は、Ｈｏｃ−ＣＰＰ装飾頭部がＳｏｃ−ＣＰＰ頭部よりも効率的に遺伝子を送達する様子を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態に係る、Ｈｏｃ−ＴおよびＳｏｃ−Ｔ  ＣＰＰの両方で頭部が装飾されたときに遺伝子送達量が最も高かったことを示すグラフである。
【図１１】図１１は、送達のためのＨｏｃ−ＣＰＰで装飾されたかまたは装飾されていない、ｅＧＦＰ  ＤＮＡパッケージ頭部と、ＣＰＰの存在下／非存在下でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞とを示す一連の顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、プラスミド、コンカテマーまたはＰＣＲ産物としてパッケージングされて送達されたルシフェラーゼ遺伝子の発現を示すグラフである。
【図１３】図１３は、Ｔ４、ＡＡＶ−ＤＪおよびリポフェクタミンの送達効率の比較を表すグラフである。
【図１４】図１４は、ＧＧドメインを通じたＴ４頭部上のＤＥＣ２０５ｍＡｂのディスプレイを示す顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、ルシフェラーゼ遺伝子をコントロールＨｅｐ３Ｂ細胞内へは送達せずにＤＣ２．４細胞内へ送達するターゲティングした送達を示すグラフである。
【図１６】図１６は、ディスプレイされたＤＥＣ２０５ｍＡｂの存在下または非存在下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）頭部が形質導入されたＤＣ２．４細胞の一連の位相差顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、Ｓｏｃ結合部位に対するβ−ガラクトシダーゼＳｏｃ分子の種々の比率でＴ４頭部に４量体β−ガラクトシダーゼをディスプレイする顕微鏡写真である。
【図１８】図１８は、図１７の各レーンに対応するディスプレイされたβ−ガラクトシダーゼのＸ−ｇａｌ切断活性を示す顕微鏡写真である。
【図１９】図１９は、機能的β−ガラクトシダーゼをＤＣ２．４細胞内へ送達するβ−ガラクトシダーゼおよびＣＰＰがディスプレイされたＴ４頭部の一連の顕微鏡写真である。
【図２０】図２０は、機能的β−ガラクトシダーゼをＤＣ２．４細胞内へ送達するβ−ガラクトシダーゼおよびＤＥＣ２０５ｍＡｂがディスプレイされたＴ４頭部の一連の顕微鏡写真である。
【図２１】図２１は、送達に用いられる、内部にルシフェラーゼおよびＧＦＰ  ＤＮＡがパッケージングされ、外部にβ−ガラクトシダーゼおよびＣＰＰがディスプレイされたＴ４頭部の一連の顕微鏡写真である。
【図２２】図２２は、送達に用いられる、内部にルシフェラーゼおよびＧＦＰ  ＤＮＡがパッケージングされ、外部にβ−ガラクトシダーゼおよびＤＥＣ２０５ｍＡｂがディスプレイされたＴ４頭部の一連の顕微鏡写真である。
【図２３】図２３は、ｐＬｕｃｉプラスミドがパッケージングされ、外面がリガンドで装飾されていないかまたはＤＥＣ２０５ｍＡｂ、ＣＤ４０ＬもしくはＣＰＰで装飾されたＴ４頭部を筋肉内注射したマウスを示す一連の画像である。
【図２４】図２４は、Ｔ４頭部内へのパッケージングのために用いられたルシフェラーゼ発現カセットであって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有さないものと有するものとの概略図である。
【図２５】図２５は、発現カセットにＩＴＲが隣接する場合にルシフェラーゼシグナルがより長時間にわたってとどまる様子を示す一連の画像である。
【図２６】図２６は、樹状細胞内へのターゲティングした送達のさらなる解析の一連の画像である。
【図２７】図２７は、リガンドなし群およびＣＤ４０Ｌ群の両方が同レベルの抗ルシフェラーゼ抗体を誘導したことを示すＥＬＩＳＡ滴定のグラフである。
【図２８】図２８は、５つの群のマウスに対して図２９に示す種々の製剤を用いて筋肉内経路によって行ったワクチン接種を示すフローチャートである。
【図２９】図２９は、５つの群のマウスに筋肉内経路によるワクチン接種を行うために用いられた種々の製剤の概要を示す表である。
【図３０】図３０は、本発明に記載の手順に従って行われたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図３１】図３１は、本発明に記載の手順に従って行われたエリスポットアッセイの結果を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書中に援用されそして本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の典型的な実施形態を示し、上に挙げた一般的な記載および下に挙げる詳細な説明とともに、本発明の特徴を説明することに供する。
【００１２】
（定義）
用語の定義が当該用語の一般的に使用される意味から逸脱する場合、特に表示のない限り、出願人は、以下に提供された定義を利用することを意図する。
【００１３】
本発明の目的のために、用語「結合」、用語「結合する」および用語「結合された」は、化学的および物理的結合のいずれものタイプを言い、そしてこれらとしては、限定されないが、共有結合、水素結合、静電結合、生物学的テザー、膜貫通付着、細胞表面付着および発現が挙げられる。
【００１４】
本発明の目的のために、用語「生物学的試料」および用語「生物学的標本」は、インビトロまたはインビボでのヒト、動物、微生物または植物の一部または全部のいずれかを言う。その用語には、限定されないが、ヒト、動物、微生物または植物の組織片、細胞または組織培養物、ヒト、動物、微生物または植物細胞の懸濁液またはその単離物、ヒトまたは動物の生検、血液試料、細胞含有流体および分泌物のような、ヒト、動物、微生物または植物由来の物質が挙げられる。
【００１５】
本発明の目的のために、用語「カプシド」および用語「カプシド殻」は、タンパク質のいくつかの構造サブユニットを含むウイルスのタンパク質殻を言う。カプシドはウイルスの核酸コアを包む。単数形または複数形の用語「プレヘッド」、「プロヘッド」または「プロカプシド」、「不完全頭部」または「不完全に充填された頭部」、「完全頭部」および「ファージ頭部」は、ウイルスのカプシド殻の成熟の異なる段階を言う。「プレヘッド」は、会合当初の正確な大きさのカプシド殻または等尺性カプシドを言い、多くの場合、単一タイプのタンパク質サブユニットがタンパク質スカフォールドの周りで重合している。タンパク質スカフォールドが取り除かれてカプシド殻の内部に空間が作られると、その構造は、プロヘッドまたはプロカプシドと言われる。不完全頭部、完全頭部およびファージ頭部は全て成熟の段階に達したカプシドを言い、この段階では、それらは、ＤＮＡと会合した、より大きくより安定した粒子になる。用語「不完全頭部」は、ＤＮＡの一部のみがその中にパッケージングされた成熟カプシド殻を言うか、または一旦ＤＮＡが完全に充填された後、ＤＮＡが殻から放出され、ＤＮＡのほんの一部のみが後に残された成熟カプシド殻も言い得る。用語「完全頭部」は、ＤＮＡが完全に充填された成熟カプシド殻を言う。完全頭部はバクテリオファージゲノムの１０５％まで充填し得る。これは、Ｔ４バクテリオファージに関して、約１６５〜１７０ｋｂである。同様に、他のウイルスのカプシドもまた、それらのゲノム量よりも多くを収容するようにパッケージングされ得る。カプシドは、エンベロープに包まれたものでも包まれていないものでもあり得る。ＨＫ９７のようなバクテリオファージ内のカプシドの成熟プロセスは、例えば、Lataら、２０００年（参考文献４２）に記載されている。
【００１６】
本発明の目的のために、用語「免疫応答」は、抗原または免疫原に対する動物の免疫系の特定の応答を言う。免疫応答は、抗体の生産および細胞性免疫を含み得る。
【００１７】
本発明の目的のために、用語「免疫」は、感染生物または物質に対する、ヒトを含む被検動物の抵抗の状態を言う。感染生物または物質は広く定義され、そして寄生生物、毒性物質、癌細胞および他の細胞、ならびに細菌およびウイルスを含むと理解され得る。
【００１８】
本発明の目的のために、用語「免疫化条件」は免疫応答に影響する因子を言い、ヒトを含む被検動物に送達される免疫原またはアジュバントの量および種類、送達の方法、接種の数、接種の間隔、被検動物の種類およびその体調を含む。「ワクチン」は、免疫を誘導し得る医薬製剤を言う。
【００１９】
本発明の目的のために、用語「免疫化用量」は、免疫応答を促進するために必要な抗原または免疫原の量を言う。この量は、種々のアジュバントの存在および有効性で変動し得る。この量は、動物および抗原、免疫原および／またはアジュバントで変動し得るが、一般的に一接種あたり約０．１μｇ／ｍｌ以下と約１００μｇとの間であり得る。免疫化用量は、統計的に有効な宿主動物免疫化およびチャレンジ研究を行うことによるような、当業者に周知な方法によって容易に決定される。
【００２０】
本発明の目的のために、用語「免疫原」および用語「免疫原性」は、単独でまたはアジュバントと一緒に免疫応答を誘導し得る物質または材料（抗原を含む）を言う。天然および合成物質の両方が免疫原であり得る。免疫原は一般的に、タンパク質、ペプチド、多糖類、核タンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチド、あるいはタンパク質、ペプチド、多糖類、核タンパク質、リポタンパク質または合成ポリペプチドに結合したハプテンあるいは他の細菌、ウイルスまたは原生動物画分である。「免疫原」、または「免疫原性」である組成物は、アジュバントを付随しなければ免疫応答を生じない（または治療上効果のない免疫応答のみ引き起こす）物質（例えば、小ペプチド）を含むことが理解され得る。本発明の目的のために、そのような免疫原は「アジュバント必須」免疫原と言われる。
【００２１】
本発明の目的のために、用語「個体」は哺乳類を言う。例えば、用語「個体」は、ヒト個体を言い得る。
【００２２】
本発明の目的のために、用語「免疫原性量」は、動物にて臨床的に検出可能な防御応答を惹起する、目的の抗原調製物の量または生物毒素の量である。
【００２３】
本発明の目的のために、用語「首部タンパク質」および用語「尾部タンパク質」は、ウイルス粒子、特にバクテリオファージの首部または尾部のいずれかの部分のアセンブリに関与するタンパク質を言う。尾状バクテリオファージはカウドウイルス目に属し、３つの科を含む：サイフォウイルス科は、長い柔軟な尾部を有し、そして尾状ウイルスの大部分を構成する。ミオウイルス科は、長い剛性の尾部を有し、そして細菌宿主へのファージ付着の際に収縮する尾鞘によって完全に特徴付けられる。尾状ウイルスの最小の科はポドウイルス（短い足のような尾部を持つファージ）である。例えば、Ｔ４バクテリオファージでは、ｇｐ１０は、ｇｐ１１と会合して基盤の尾部ピンを形成する。尾部ピンアセンブリは、尾部アセンブリの第１段階である。バクテリオファージＴ４の尾部は、剛性のチューブを囲み、そして多タンパク質基盤内で終結する収縮性の鞘からなり、そこへファージの長いおよび短い尾部繊維が付着している。一旦頭部にＤＮＡがパッケージングされると、タンパク質ｇｐ１３、ｇｐ１４およびｇｐ１５が会合して、パッケージングされた頭部を封止する首部を構築する。ｇｐ１３タンパク質がＤＮＡパッケージング後にポータルタンパク質ｇｐ２０と直接相互作用し、そして次いでｇｐ１３プラットフォーム上でｇｐ１４およびｇｐ１５が会合する。Ｔ４バクテリオファージ内の首部および尾部タンパク質は、限定されないが、タンパク質ｇｐ６、ｇｐ２５、ｇｐ５３、ｇｐ８、ｇｐ１０、ｇｐ１１、ｇｐ７、ｇｐ２９、ｇｐ２７、ｇｐ５、ｇｐ２８、ｇｐ１２、ｇｐ９、ｇｐ４８、ｇｐ５４、ｇｐ３、ｇｐ１８、ｇｐ１９、ｇｐ１３、ｇｐ１４、ｇｐ１５およびｇｐ６３が挙げられ得る。Ｔ４バクテリオファージおよび他のウイルス内の首部および尾部アセンブリタンパク質の局面は、例えば、Rossmannら、２００４年（参考文献４１）にさらに記載されている。
【００２４】
本発明の目的のために、用語「天然に生じるものではない」または「単離された」は、目的の成分が、自然界で天然に付随し、そして自然界で見られるような少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的には含まないことを言う。
【００２５】
本発明の目的のために、用語「パッケージングマシン」は、コンパートメント、モーター、およびモーターをコンパートメントへ連結する成分または任意の他の付着機構を含む完全なパッケージング単位を言う。例えば、Ｔ４パッケージングマシンは、殻（主にｇｐ２３からなるプロカプシド）、頂点ポータルタンパク質（１２量体ｇｐ２０）およびｇｐ１７パッケージングモーターを含む。Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンは、例えば、Zhangら、２０１１年にさらに記載されている。
【００２６】
本発明の目的のために、用語「パッケージングモーター」は、化学エネルギーを使用し、核酸の機械的な転移を進めそして核酸をコンパートメント内にパッケージし得る分子モーターまたは分子マシンを言う。例えば、Ｔ４バクテリオファージ内のパッケージングモーターは、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを使用し、ＤＮＡをカプシド殻内に転移させそしてパッケージングする。パッケージングモーターは、１つまたはそれ以上のタンパク質サブユニットを含むタンパク質複合体であり得、そして核酸をパッケージングすることを助ける酵素活性を有し、それは、限定されないが、ＡＴＰアーゼ、ヌクレアーゼ、およびトランスロカーゼが挙げられる。例えば、Ｔ４バクテリオファージパッケージングモーターは、巨大なターミナーゼタンパク質、５量体遺伝子産物（ｇｐ）１７を言う。用語「パッケージングモーター」はまた、実際のモーターの活性を制御するかまたは高めるさらなるタンパク質を包含することもまた考えられ得る。例えば、Ｔ４パッケージングモーターは、小さいターミナーゼタンパク質ｇｐ１６もまた含み得る。Ｔ４  ＤＮＡパッケージングモーターは、例えば、Sunら、２００８年にさらに記載されている。
【００２７】
本発明の目的のために、用語「ペプチド様」は、短鎖ペプチド、ならびにタンパク質、リポタンパク質および糖タンパク質を言うが、便宜上、非タンパク質性分子、例えばアミノ酸含有分子もまた含み得る。ある実施形態では、ペプチド様治療剤は、他の薬剤に加えて、ビタミン、ステロイド、アジドチミジン、および遊離プリマキンをさらに含み得る。１つの有用なペプチド類は、インターロイキン、コロニー刺激因子およびインターフェロンのような免疫調整剤である。別の有用なクラスのタンパク質は、ワクチンに使用されるような抗原および免疫原である。
【００２８】
本発明の目的のために、用語「精製された」は、成分が比較的純粋な状態にあること、例えば、少なくとも約９０％の純度または少なくとも約９５％の純度もしくは少なくとも約９８％の純度を言う。
【００２９】
本発明の目的のために、用語「ターゲティングリガンド」は、樹状細胞および抗原提示細胞のような細胞の表面にディスプレイされたタンパク質またはレセプターを言う。抗原提示細胞または樹状細胞へのターゲティングリガンドの結合は、細胞活性化および種々の下流効果の誘導に必要である。
【００３０】
本発明の目的のために、用語「ターゲティング分子」は、開発中の薬を作用させようとする目的の病状に関与する、天然に存在する細胞構造または分子構造を言う。
【００３１】
本発明の目的のために、用語「ウイルス粒子」は、ウイルスおよびウイルス様生物を言う。
【００３２】
（説明）
細胞内への組換え遺伝子およびタンパク質の送達は、分子生物学およびバイオテクノロジーの中核をなす。遺伝子を送達するために多数の方法、少し例を挙げると、エレクトロポレーション（Neumannら、２０１１年（参考文献１））、ウイルスベクター（Kay、２０１１年（参考文献２））およびマイクロインジェクション（Demayoら、２０１２年（参考文献３））が開発されている一方で、タンパク質送達はそれほど一般的ではない（Yanら、２０１０年；Kaczmarczykら、２０１１年（参考文献４および参考文献５））。しかしながら、遺伝子およびタンパク質の両方を効率的に送達することができるプラットフォームは現在のところ存在しない。ゲノミクスおよびタンパク質ネットワークデータベースが爆発的に発展する中で、標的細胞内への遺伝子およびタンパク質の送達は、機構を理解するためにも新規な生物医学的療法を探究するためにも不可欠である。例えば、癌やＡＩＤＳのような複雑な遺伝性および感染性疾患の将来の治療法は、遺伝子およびタンパク質の適切な組合せでの送達を含み得、これを本明細書中では「プロ遺伝子送達」と言う。
【００３３】
一実施形態において、本発明は、標的細胞内への哺乳類の遺伝子およびタンパク質の効果的な送達のために独自に設計された、カスタマイズされたバクテリオファージを提供する。本発明の方法および組成物は、効果的なワクチン療法および遺伝子治療のために用いられ得る。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、高容量のプロ遺伝子送達媒体を提供するためにファージＴ４  ＤＮＡパッケージングマシンを用いる。尾状ファージは、カプシド内部の強く負に帯電したＤＮＡゲノムを結晶密度（＞５００ｍｇ／ｍｌ）近くまで凝縮するために、強力な分子マシンを用いる。これらのマシンは、ＤＮＡ圧縮に抵抗する静電反発力および曲げエネルギーに対抗するために、８０ｐＮという大きい力を発生させる（Smithら、２００１年（参考文献６））。最も速く（大体２０００ｂｐ／秒までのパッケージング速度）、最も強力な（出力密度、大体５０００ｋＷ／ｍ３）（Fullerら、２００７年（参考文献７））パッケージングマシンの１つであるファージＴ４パッケージングマシンは、２つの必須成分、すなわち、空のプロヘッドと、巨大なターミナーゼタンパク質ｇｐ１７の５つのサブユニットで構成される分子モーターとからなる（Casjens、２０１１年（参考文献８）；Raoら、２００８年（参考文献９）；Sunら、２００８年（参考文献１０））（図１）。図１において、１１２は、１２量体ポータル頂点１１６に会合した５量体モーター１１４をリボンモデル１１８で示すファージＴ４パッケージングマシンの構造モデルである（Sunら、２００４年（参考文献１０）；Fokineら、２００４年（参考文献１１））。
【００３５】
図１に示すように、ファージＴ４頭部カプソメア（表面図１２０；リボンモデル１２２）は、２つの外部カプシドタンパク質、つまり、Ｈｏｃ（高抗原性外部カプシドタンパク質；１５５コピー／頭部）とＳｏｃ（小さい外部カプシドタンパク質；８７０コピー／頭部）とで装飾されている（Fokineら、２００４年（参考文献１１））。カプソメアの表面図１２０は、主要なカプシドタンパク質ｇｐ２３  １２４と、Ｓｏｃ３量体１２６と、Ｈｏｃ繊維１２８との配置を示す。カプソメアのリボンモデル１２２は、ｇｐ２３  １３０、Ｓｏｃ１３２およびＨｏｃ１３４のリボンモデルを示す。ＨｏｃおよびＳｏｃについてのナノモル親和性結合部位は、プロヘッドがカプシドタンパク質ｇｐ２３における主要な立体構造変化である「拡張」を経た後に現れる（Blackら、１９９４年（参考文献１２））。オタマジャクシ形状のＳｏｃ（９ｋＤａ）は、準３回軸において３量体として会合し、隣接するカプソメアを噛んで（champing）、殻の周りに補強ケージを形成する（Qinら、２０１０年（参考文献１３））（１２０、１２２およびＳｏｃ３量体リボンモデル１３６を参照。Ｓｏｃ３量体リボンモデル１３６は、露出したＮ末端およびＣ末端を示す（Qinら、２０１０年（参考文献１３））。それぞれが一列に並んだ４つのドメインを有し、そのうちの３つのドメインはＩｇＧ様である、Ｈｏｃ（４１ｋＤａ）の長さ約１８０Åの線状繊維が、６量体カプソメアの中心で会合する（Fokineら、２０１１年（参考文献１４））（１２０、１２２およびＨｏｃ繊維１３８を参照。Ｈｏｃ繊維１３８は、当該繊維の先端にて露出したＮ末端を示す。（Fokineら、２０１１年（参考文献１４））。Ｃ末端Ｈｏｃドメイン４は、カプシドに結合するが、その構造はまだ解明されていないため、繊維の基部における塊１４０として示している。Ｈｏｃは、ファージの細菌への付着を容易にする。ＳｏｃおよびＨｏｃは、ファージ感染には必須ではないが、ウイルスに生存上の利点を提供する（Ishiiら、１９７７年（参考文献１５））。ＳｏｃのＮ末端およびＣ末端は、１３６および１３８によって示すように、良好に露出し、カプシド表面上の外来タンパク質の効率的なディスプレイを可能にする（Liら、２００６年（参考文献１６）；Sathaliyawalaら、２００６年（参考文献１７））。
【００３６】
最近、パッケージングされた頭部を蓄積する、首部なし（１３ａｍ）尾部なし（１０ａｍ）ｈｏｃおよびｓｏｃ欠失変異体が構築された（Zhangら、２０１１年（参考文献１８））。従来のアセンブリ経路においては、パッケージングモーターはプロヘッド上で会合し、頭部成熟および（頭部一杯の）ゲノムパッケージングの後、モーターは解離する。次いで、首部タンパク質ｇｐ１６、ｇｐ１４およびｇｐ１５が、ポータルに付着し、パッケージングされた頭部を封鎖する。尾部および尾部繊維が、首部に付着し、感染性ビリオンを生産する（Leimanら、２０１０年（参考文献１９））。首部なし変異体において、パッケージングされた頭部は、不安定になり、大体６ＭＰａつまりシャンパンボトル内の圧力の１０倍よりも高いと見積もられる内圧により、ＤＮＡを放出する（Smithら、２００１年（参考文献６）；Landerら、２００６年（参考文献２０））。予想外に、パッケージングモーターは、この完全に成熟した、空になったファージ頭部上で再会合し、任意のＤＮＡで再充填することができることが発見された（Zhangら、２０１１年（参考文献１８））。このため、Ｔ４パッケージングマシンは、乱雑であり、会合する頭部もパッケージングするＤＮＡも識別しない。
【００３７】
これらの発見は、ファージパッケージングマシンを、哺乳類細胞内へ遺伝子およびタンパク質を送達するように構成変更することが可能かどうかという疑問を提起した。考えられるところでは、各頭部は、内部にいくつかの遺伝子を大体１７０ｋｂまでパッケージし、外部にいくつかのタンパク質を大体１，０２５分子までディスプレイし、そして全「ペイロード」を細胞内へ送達することができるであろう。このような系は、その容量が大きいという理由だけではなく、Ｔ４が非感染性、非毒性で、先在する免疫を有さない点でも、魅力的であろう。本明細書中に開示された実施形態は、レポーター遺伝子、ワクチン遺伝子、機能酵素およびターゲティングリガンドの組合せがＴ４頭部に組み込まれ、哺乳類細胞内へほとんど１００％の効率まで送達され得ることを示している。開示された実施形態は、送達がインビトロおよびインビボの両方で抗原提示樹状細胞にターゲティングされ得ることをさらに実証している。Ｔ４頭部の内部にパッケージングされたペスト菌由来の組換えＦ１−Ｖ遺伝子と外部にディスプレイされたＦ１−Ｖタンパク質とを含有する「プライムブースト」ペストワクチンの単回投与で免疫化されたマウスは、頑強な抗体および細胞性免疫応答を惹起し、これによって、新規なワクチン療法および遺伝子治療につながり得る、他にない、ファージに基づいた哺乳類遺伝子およびタンパク質送達系を初めて確立した。
【００３８】
好適な実施形態において、Ｔ４によるプロ遺伝子送達を定量解析するために、詳細な実験スキームを開発した。図２に示すように、工程２００において、まず、空のファージ頭部２０２の１２量体ポータル（ｇｐ２０）にｇｐ１７サブユニットを結合させることによって、Ｔ４  ＤＮＡパッケージングマシンを会合させた。工程２１０において、ＡＴＰによって刺激されて、マシンは、ＤＮＡを頭部２１２内に大体１７０ｋｂまでパッケージし、頭部２１４を作る。工程２２０においては、２２２に示すように、カプシド表面にＳｏｃ融合タンパク質が付加され、ディスプレイされた。工程２３０においては、２３２に示すように、カプシド表面を装飾するためにＨｏｃ融合タンパク質が付加された。次いで、頭部粒子２３２が、非特異的に（一般送達、工程２４０）または宿主レセプター２４４を通じて（ターゲティングされた送達、工程２５０）、細胞２３４に結合し、インターナライズされる（工程２６０）。表面にディスプレイされたβ−ガラクトシダーゼ２６２のようなタンパク質と、被包されたＤＮＡ、すなわちルシフェラーゼ遺伝子２６４を含むＤＮＡ２６４および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むＤＮＡ２６６とが、工程２７０においてサイトゾル２６８内に放出される。ＤＮＡ２６４および２６６は、工程２８０において核２７２に入り、強力なＣＭＶプロモーター（図示せず）下での転写（２８２）とルシフェラーゼ（２８６）およびＧＦＰ（２８８）タンパク質の過剰発現（２８４）とを開始させる。
【００３９】
（Ｔ４プロ遺伝子粒子はインビトロで効率的に会合される）
別の実施形態によれば、図３に見られるように、まず、１０ａｍ１３ａｍｈｏｃ−ｓｏｃ−変異体を感染させた大腸菌細胞から首部なし頭部を単離した。これらの頭部の大部分、大体９０％は、ウイルスゲノムを自発的に放出し、それはＤＮアーゼＩで消化された。空になった頭部は、大体８ｋｂのＤＮＡを内部に保持し、残りの大体１６２ｋｂの空間が、外来ＤＮＡのために利用可能であった。頭部を、ＣｓＣｌ勾配遠心分離およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、ｇｐ１７と混合して、機能的パッケージングマシンを再構成した。これらのマシンは、バルクおよび単一分子アッセイによって示されるように、頭部を高効率で再充填した。クライオ電子顕微鏡によって、マシンの大部分が能動的にＤＮＡをカプシドで包んでいることが分かった。単一（図４）もしくは複数のプラスミド、大体８０ｋｂの長い連結されたＤＮＡ（大体１７０ｋｂまで）または２．３ｋｂの短いＰＣＲ増幅されたＤＮＡ（図５）が、効率的にパッケージングされた。図５のレーン１に沿って、ルシフェラーゼが矢印５１２によって示され、ｅＧＦＰが矢印５１４によって示されている。レーン２ではコンカテマー化されたＤＮＡが矢印５１６によって示されており、レーン３のＰＣＲ増幅されたルシフェラーゼ発現カセットが矢印５１８によって示されている。矢印５２０、矢印５２２および矢印５２４は、頭部内に存在する８ｋｂのＴ４  ＤＮＡを示している。図４に示すように、ＤＮＡと頭部の比率が大体３０：１であったとき、平均して、１頭部あたり１０分子までのプラスミドＤＮＡがパッケージングされた。２つ（またはそれ以上）のプラスミドＤＮＡが存在しているときは、その両方がほぼ等しい頻度でパッケージングされた（図５、レーン１）。次いで、Ｓｏｃ融合組換え体およびＨｏｃ融合組換え体を反応混合物に加えることによって、外来ペプチド（細胞透過ペプチド；ＣＰＰ）とタンパク質（β−ガラクトシダーゼ、ＤＥＣ２０５ｍＡｂ、ＣＤ４０リガンド等）とを、表面に配列した（図６）。図６において、矢印６１２は、結合したＳｏｃ−ＴおよびＳｏｃ−Ｐを示し、矢印６１４は、結合したＨｏｃ−ＴおよびＨｏｃ−Ｐを示し、コントロールレーンは、精製された頭部を示す。カプシドに結合したＳｏｃおよびＨｏｃは、結合部位に対するＳｏｃまたはＨｏｃ融合タンパク質分子の比率を変えることによって、単純な１次をたどった（図６および図７）。比率が２０：１のとき、ほとんど全てのカプシド結合部位が占有された。
【００４０】
（遺伝子操作したＴ４粒子が遺伝子を哺乳類細胞内へ効率的に送達した）
本発明の初期実験は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へのルシフェラーゼ遺伝子のＴ４送達が非常に不十分であることを示した。しかしながら、粒子をＣＰＰ−Ｔａｔ（ＣＰＰ−Ｔ）またはＣＰＰ−Ａｎｔｐ（ＣＰＰ−Ｐ）で装飾した場合は（図６）、細胞ライセート中の高いルシフェラーゼ活性の出現によって示されるように、送達は効率的であった（図７、図８、図９および図１０）。ＣＰＰは、付着したカーゴ分子の細胞膜通過を容易にする塩基性アミノ酸に富む、２０〜３０アミノ酸ペプチドである。ＴａｔおよびＡｎｔｐは、それぞれ、ＨＩＶ−１トランスアクチベータータンパク質、ショウジョウバエアンテナペディアホメオボックスタンパク質のＣＰＰを言う（Frankelら、１９８８年（参考文献２１）；Joliotら、１９９１年（参考文献２２））。ルシフェラーゼ活性は、１細胞あたり１０５頭部で最大に達した（図７）。活性は、早くも５時間後までに出現し、約１６時間後までにピークに達し、少なくとも３０時間は持続した。
【００４１】
ルシフェラーゼ活性はＣＰＰのコピー数の増加に伴って増加した（図８）が、所与のコピー数のとき、ＣＰＰ−ＴはＣＰＰ−Ｐよりも３．３倍効率が良かった（図９）。これは、おそらく、Ｈｏｃ融合ＣＰＰがカプシド表面から大体１８０Å離れて位置しており（Ｈｏｃ繊維の高さ）、それにより、カプシド壁にほとんどへばりついた状態のＳｏｃ−ＣＰＰと比較すると、哺乳類細胞の細胞膜に接触するのにより長いリーチを有しているためであろう（Qinら（参考文献１３）、２０１０年；Fokineら、２０１１年（参考文献１４））（図１）。Ｈｏｃ−ＣＰＰとＳｏｃ−ＣＰＰとを組み合わせることによって、送達効率がさらに１．９倍高まった（図１０）。送達効率は、パッケージングされたＤＮＡがプラスミドであろうと、短いＰＣＲ増幅ＤＮＡであろうと、または、長いコンカテマーに連結されていようと、ほぼ同じであった（図１２）。別のプラスミド、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を用いた並行実験でも同様の結果が得られ、ほとんど１００％の細胞が緑色蛍光を示した（図１１）。図１１においては、Ｈｏｃ−ＣＰＰで装飾されなかった（パネル１１１２）かまたはＨｏｃ−ＣＰＰで装飾された（パネル１１１４）かのどちらかであるｅＧＦＰ  ＤＮＡパッケージ頭部が、送達に用いられている。パネル１１１６およびパネル１１１８は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の位相差顕微鏡写真であり、パネル１１１６がＣＰＰの非存在下、パネル１１１８がＣＰＰの存在下である。パネル１１２０およびパネル１１２２は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡写真であり、パネル１１２０がＣＰＰの非存在下、パネル１１２２がＣＰＰの存在下である。
【００４２】
プロヘッドまたは等尺性ファージ頭部も送達媒体として用いることができるが、完全に成熟した空になったファージ頭部が、極めて安定していて大量に生産可能（培養液１リットルあたり大体５×１０１３粒子）であり、最適な頭部であった。インヒビターを用いた予備実験は、Ｔ４頭部送達が、エネルギー依存的でアクチン重合を必要とするがクラスリンやカベオリンを必要としないエンドサイトーシス経路によって媒介されていることを示した。１細胞あたり１０６頭部粒子の比率までであっても、Ｔ４送達後に著しい毒性は観察されなかった。
【００４３】
Ｔ４送達効率は、１細胞あたり１０５発光単位という多さに近づいており、非常に高いと評価された（図１３）。この効率が、現在利用可能な２つの最も効率的なトランスフェクション系であるリポフェクタミンおよびＡＡＶと比較してどうかを判定するために、これらの系のそれぞれに最適な条件下で、ルシフェラーゼ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に送達した。データは、Ｔ４効率は、リポフェクタミンと同様であったが、これまでに報告されている最も効率的なＡＡＶベクターであるＡＡＶ−ＤＪベクターよりも大体３．３倍高かったことを示した（Grimmら、２００８年（参考文献２３））（図１３）。
【００４４】
（Ｔ４による遺伝子およびタンパク質の樹状細胞内へのターゲティングされた送達）
Ｔ４送達が特定の細胞にターゲティングされ得るかどうかをテストするために、抗原提示樹状細胞を選択した。樹状細胞は、ワクチン取込みならびに体液性および細胞性免疫応答の誘導にとって重要である（Steinmanら、２００７年（参考文献２４））。本発明の開示された実施形態における仮説は、カプシド格子上に樹状細胞特異リガンドをディスプレイすることによって、Ｔ４が樹状細胞を捕らえることが可能になり、付着カーゴのエンドサイトーシスおよび送達につながるというものである。この仮説をテストするために、樹状細胞特異的なＤＥＣ２０５レセプター（Bonifazら、２００４年（参考文献２５）；Jiangら、１９９５年（参考文献２６））およびＣＤ４０（参考文献２７）をそれぞれ認識したＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）のＤＥＣ２０５ｍＡｂをＴ４頭部にディスプレイした。まず、頭部にルシフェラーゼおよび／またはｅＧＦＰ遺伝子をパッケージし、Ｈｏｃ−ＧＧ融合タンパク質とＤＥＣ２０５ｍＡｂと共にインキュベートした。ＧＧ融合物は、ストレプトマイセス由来の、プロテインＧの２つの直列に連結した１２２アミノ酸ＩｇＧ結合ドメインを含んでおり（Akerstromら、１９８５年（参考文献２８））、これらは、Ｈｏｃを通じてＴ４頭部に付着すると、Ｆｃ領域を捕らえ、レセプター結合Ｆａｂ領域が良好に露出した状態で頭部上にＤＥＣ２０５ｍＡｂのアレイを形成した（図１４および図１９）。図１４において、Ｈｏｃ−ＧＧ、Ｓｏｃ−ＧＧおよびＤＥＣ２０５ｍＡｂバンドに、矢印１４１２および矢印１４１４（Ｈｏｃ−ＧＧ）、矢印１４１６および矢印１４１８（Ｓｏｃ−ＧＧ）、ＤＥＣ２０５ｍＡｂ（１４２０、１４２２、１４２４および１４２６）が付けられている。これらの粒子は、パッケージングされたルシフェラーゼ遺伝子をマウスＤＣ２．４細胞内に効率的に送達した（Shenら、１９９７年（参考文献２９））が、レセプターを欠いているＨｅｐ３Ｂ細胞のような非特異的細胞内へはそうすることができなかった（図１５）。送達効率は、いくつかの独立した実験においてほとんど１００％であった（図１６）。図１６において、１６１２および１６１４は、それぞれ、ディスプレイされたＤＥＣ２０５ｍＡｂの非存在下でＧＦＰ頭部が形質導入されたＤＣ２．４細胞の位相差顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真である。１６１６および１６１８は、それぞれ、ディスプレイされたＤＥＣ２０５ｍＡｂの存在下でＧＦＰ頭部が形質導入されたＤＣ２．４細胞の位相差顕微鏡写真および蛍光顕微鏡写真である。ルシフェラーゼ遺伝子およびｅＧＦＰ遺伝子の両方が同じ頭部にパッケージングされた場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ルシフェラーゼシグナルおよび緑色蛍光シグナルの両方の存在によって示されるように、頭部は両方の遺伝子を１００％近い効率で送達したが、コントロール細胞では、そうではなかった。ＨｏｃのＮ末端に融合させたディスプレイされたＣＤ４０Ｌを用いても同様の結果が得られた。
【００４５】
開示された実施形態では、１５９ｋＤａの大腸菌β−ガラクトシダーゼをモデルタンパク質として用いた樹状細胞内へのタンパク質送達もテストした。β−ガラクトシダーゼが４量体としてのみ機能するため、これはストリンジェントなテストである（Jacobsonら、１９９４年（参考文献３０））。従って、Ｓｏｃ融合タンパク質を、多量体化して５００ｋＤａよりも大きい複合体とし、Ｔ４頭部に効率的にディスプレイさせなければならず（図１７）、結果として得られた頭部は、β−ガラクトシダーゼ活性を示した（図１８）。図１７における矢印１７１２は、結合したβ−ガラクトシダーゼＳｏｃを示し、４０：０レーンは、頭部の非存在下でβ−ガラクトシダーゼＳｏｃの非特異的結合を示さないコントロールレーンである。次いで、Ｈｏｃ融合ＣＰＰ−ＴまたはＤＥＣ２０５ｍＡｂを、同じ頭部に装飾した（図１９および図２０；パネル１９１２およびパネル２０１２）。これらの頭部は、樹状細胞と共にインキュベートすると、青色Ｘ−ｇａｌの出現によって示されるように、それらの細胞のほとんど１００％内へのβ−ガラクトシダーゼの送達を示した（図１９および図２０；パネル１９１８およびパネル２０１８）。ターゲティングリガンドを含まない（図１９および図２０；パネル１９１６およびパネル２０１６）かまたは可溶性酵素のみを含む（図１９および図２０；パネル１９１４およびパネル２０１４）コントロール粒子は、不十分なシグナル〜シグナルなしを示した。
【００４６】
Ｔ４が遺伝子およびタンパク質の両方を同時に細胞内に送達できるかどうかを確かめるために、頭部にまずルシフェラーゼおよびｅＧＦＰプラスミドをパッケージし、表面をＳｏｃ融合物としてのβ−ガラクトシダーゼとＨｏｃ融合物としてのＣＰＰ（図２１）またはＤＥＣ２０５ｍＡｂ（図２２）とで装飾し、全ペイロードが樹状細胞内に送達され得るかどうかをテストした。図２１において、パネル２１１２は、ＣＰＰを含まないコントロールのパッケージングされた頭部を形質導入したＤＣ２．４細胞の位相差顕微鏡写真を示し、パネル２１１４は、ＣＰＰを含まないコントロールのパッケージングされた頭部を形質導入したＤＣ２．４細胞の蛍光顕微鏡写真を示し、パネル２１１６は、β−ガラクトシダーゼ活性のためにＸ−ｇａｌで染色したＤＣ２．４細胞を示し、パネル２１１８は、ＦＩＴＣ標識抗体での染色後のｅＧＦＰの蛍光画像であり、パネル２１２０は、ローダミン標識抗体での染色後のルシフェラーゼの蛍光画像であり、パネル２１２２は、ｅＧＦＰおよびルシフェラーゼの合成蛍光画像である。図２２において、パネル２２１２は、ＤＥＣ２０５ｍＡｂを含まないコントロールのパッケージングされた頭部を形質導入したＤＣ２．４細胞の位相差顕微鏡写真を示し、パネル２２１４は、ＤＥＣ２０５ｍＡｂを含まないコントロールのパッケージングされた頭部を形質導入したＤＣ２．４細胞の蛍光顕微鏡写真を示し、パネル２２１６は、β−ガラクトシダーゼ活性についてＸ−ｇａｌで染色したＤＣ２．４細胞を示し、パネル２２１８は、ＦＩＴＣ標識抗体での染色後のｅＧＦＰの蛍光画像であり、パネル２２２０は、ローダミン標識抗体での染色後のルシフェラーゼの蛍光画像であり、パネル２２２２は、ｅＧＦＰおよびルシフェラーゼの合成蛍光画像である。図２１および図２２に示すように、ほとんど１００％の細胞が、３つのマーカーの全てについて強いシグナルを示し、Ｔ４ナノ粒子が２つの異なる遺伝子も巨大な多量体複合体も樹状細胞内へ効率的に送達したことを実証した。炭疽菌由来の防御抗原、ペスト菌由来のＦ１−Ｖ融合タンパク質、ＨＩＶ−１由来のｇｐ１４０エンベロープ３量体を含む、頭部にディスプレイされた一連の他のタンパク質を用いても、同じことが観察された。
【００４７】
（インビボＴ４送達）
別の実施形態において、マウスモデルを用いてインビボＴ４送達をテストした。４つの群のマウスに、ルシフェラーゼプラスミドがパッケージングされたＴ４頭部を筋肉内注射した。第１の群には、ディスプレイされたリガンドを含まない頭部を与え、第２、第３および第４の群には、それぞれ、ＤＥＣ２０５ｍＡｂ、ＣＤ４０ＬおよびＣＰＰ−Ｔがディスプレイされた頭部を与えた。注射後の異なる時点で、マウスに生物発光基質Ｄ−ルシフェリンを注射し、全身を撮像した。予想外に、ディスプレイされたリガンドを含まない頭部を与えた第１の群において強いルシフェラーゼシグナルが観察された（図２３）。これらの同じ粒子は、インビトロでは非常に不十分な送達を示していた（図７および図１１のパネル１１１２）。さらに、シグナルは注射から早くも６時間後までに現れており、筋肉細胞がＴ４ナノ粒子を取り込み、送達されたＤＮＡを注射部位で効率的に発現したことを示唆していた。経時的解析は、標準のルシフェラーゼ発現カセットを用いるとルシフェラーゼシグナルが少なくとも１４日間にわたり、カセットにＡＡＶ逆方向末端反復配列が隣接している場合は少なくとも３０日間にわたることを示した（ＩＴＲが送達された遺伝子のＤＮＡ複製を開始させる）（Asokanら、２０１２年（参考文献３１））（図２４および図２５）。他方で、ＤＥＣ２０５ｍＡｂおよびＣＤ４０Ｌがディスプレイされた粒子は、弱いルシフェラーゼシグナル〜ルシフェラーゼシグナルなしを示し、シグナルは急速に消滅した。１６時間後までに注射部位に残っているシグナルはほとんどなくなった（図２３、パネル３およびパネル４、パネル５およびパネル６を、パネル１およびパネル２と比較）。これらのデータは、ＤＥＣ２０５ｍＡｂまたはＣＤ４０ＬがディスプレイされたＴ４粒子を取り込んだ樹状細胞が体の他の部分、例えばリンパ節および脾臓に移動し、それによってシグナルが生物発光イメージングの感度未満まで希釈されたことを示唆していた（以前の研究において同様の観察がなされた（Yangら、２００８年）（参考文献３２））。ＣＰＰがディスプレイされた群も同様にふるまった（図２３、パネル７およびパネル８）が、これが樹状細胞の移動によるものであったのかどうか、かつ／または、他の種類の細胞も関与していたかどうかについては、さらなる調査が必要である。シグナルの欠乏が送達の欠乏ではなく樹状細胞の移動によるものであることをさらに確認するために、リガンドを含まないかまたはディスプレイされたＣＤ４０Ｌを含む頭部を用いて同量のルシフェラーゼＤＮＡをマウスに送達することによって、別のコントロール実験を行った（図２６、パネル２）。図２６において、パネル１は、同量のｐＩＴＲ-ルシフェラーゼがリガンドで装飾されなかった（レーンＩ）かまたはＣＤ４０で装飾された（レーンＩＩ）Ｔ４頭部にパッケージングされたものを示す。レーンＭは、分子サイズ標準を示す。図２６のパネル２において、ディスプレイされたリガンドを含まないＴ４頭部の注射部位で強いルシフェラーゼシグナルが見られた。図２６のパネル３において、樹状細胞特異リガンドＣＤ４０ＬがディスプレイされたＴ４頭部の注射部位ではシグナルは見られなかった。また、樹状細胞をターゲ���ィングした群は、加えて、強い細胞性免疫応答を惹起した（下記参照）。総合すると、上記のデータは、Ｔ４送達がインビボで効率的であり、いずれにせよ送達を筋肉に局在させることができた（シグナルペプチドを付着させることによって体内に分泌させることもできたが）が、その一方で、ターゲティング群においては、遺伝子産物およびそれに由来するペプチドが移動するが、重要なことには、樹状細胞と相互作用するＴ細胞やＢ細胞のような細胞に提示されるということを実証している（Steinmanら、２００７年）（下記参照）。
【００４８】
（単回投与のＴ４送達されたペストワクチンが頑強な体液性および細胞性免疫応答を誘導した）
理想的なワクチンは、免疫系の体液性（Ｔｈ２）および細胞性（Ｔｈ１）両方の腕を刺激する（Rappuoliら、２００７年（参考文献３３））。ワクチンを両方の形態、つまり抗原および発現可能なＤＮＡとして送達することによって、免疫系をプライムおよびブーストし（「プライムブースト」ワクチン）、Ｔｈ１およびＴｈ２応答を刺激し得る（Davtyanら、２００９年（参考文献３４））。このことは、これまでの方法では効果的なワクチンがまだ開発されていないＨＩＶ−１、マラリアおよびＴＢのような複雑な感染病原体と闘うために特に重要であり得る。
【００４９】
ペスト菌によって起こる、黒死病としても知られるペストも、抗体および細胞性免疫応答の誘導が必要であり得る（Smileyら、２００８年（参考文献３５））。ペストワクチンの２つの主要な候補は、被膜タンパク質（capsular protein）（Ｃａｆ１またはＦ１、１６ｋＤａ）と、３型分泌系の主要成分である低カルシウム応答Ｖ抗原（ＬｃｒＶまたはＶ、３７ｋＤａ）である（Williamsonら、２００９年（参考文献３６））。Ｆ１およびＶ組換えタンパク質を含む現在のペストワクチンは、強い抗体応答を惹起するが、細胞性免疫応答は不十分である（Doら、２００８年（参考文献３７））。これは、従来のサブユニットワクチンが遭遇する共通の問題である（Carlaら、２０１０年（参考文献３８））。本発明の開示された実施形態では、Ｆ１−Ｖ  ＤＮＡとＦ１−Ｖタンパク質との両方を送達するＴ４ナノ粒子が免疫応答の質を変えられるかどうかをテストした。さらに、Ｔ４送達された遺伝子は数週間にわたって過剰発現され続けるため、開示された実施形態では、強い免疫応答を誘導するのに単回投与のワクチンが十分であるかどうかもテストした。
【００５０】
上記２つのテストを実施するために、可溶性単量体Ｆ１−Ｖ融合タンパク質を生産する変異Ｆ１−Ｖ遺伝子を、強力なＣＭＶプロモーターの制御下でクローニングした。次いで、変異Ｆ１−Ｖタンパク質をＳｏｃのＮ末端に融合し、融合タンパク質をカプシド表面にディスプレイした。マウスの群を、種々の組合せの単回投与のＦ１−Ｖワクチンで、筋肉内投与により免疫化した（図２８および図２９）。プライムブーストワクチン接種（群５）のために、マウスに、大体２５μｇのＦ１−Ｖ  ＤＮＡがパッケージングされ、かつ大体３０μｇのＦ１−Ｖタンパク質がディスプレイされたＴ４頭部（大体５×１０１１粒子）と、１頭部あたり大体１００コピーのＤＥＣ２０５ｍＡｂとを注射した。コントロール群は、ナイーブと、ミョウバンをアジュバントとしたＦ１−Ｖタンパク質と、Ｆ１−Ｖ  ＤＮＡがパッケージングされた頭部と、Ｆ１−Ｖタンパク質がディスプレイされた頭部とを含んでいた。Ｔ４ワクチン投与された群のいずれにもアジュバントは含まれなかった。免疫化から４週間後の血清のＥＬＩＳＡは、全ての群において強い抗体応答が誘導されたことを示した。マウスの中には、７．５×１０４という高いエンドポイント力価を達成したものもあった（図３０）。しかし、強い細胞性応答が惹起されたのは、上記群のうちの２つ、すなわち、Ｔ４  ＤＮＡ群およびＦ１−Ｖ  ＤＮＡとＦ１−Ｖタンパク質との両方を樹状細胞に送達したＴ４プライムブースト群のみであった（図３１）。実際に、後者の群は最も強いＩＦＮγ応答を生じさせた。予想外に、この群からの脾細胞は、ＦＩ−Ｖ抗原での刺激がなくてもエリスポットの高い頻度（incidence）を示した（図３１；群５における赤色の刺激なしの縦棒をその他の群のものと比較）。カウントはＦ１−Ｖ刺激によってさらに増加した（図３１）。これらの結果は、樹状細胞内へのＴ４ワクチン送達がＦ１−Ｖの過剰発現と長期間にわたる免疫系への提示とを誘導し、それがまたＴ細胞の継続刺激につながるという仮説と一致する。
【００５１】
上記の結果は、プライムブーストワクチン接種のためのＴ４プロ遺伝子送達の応用を実証するものである。アジュバントなしの単回投与のＴ４ワクチンが免疫系の両方の腕を刺激しただけでなく、従来のワクチンとは異なり、Ｔ４ワクチン投与された動物における免疫系は免疫化後数週間にわたって活性化されたままである。このため、Ｔ４は、有効なプライムブーストワクチンの将来の開発のための良好なプラットフォームであると思われる。
【００５２】
（結論）
上記の一連の実験によって、他にないタイプの遺伝子およびタンパク質送達プラットフォームとしてのファージＴ４  ＤＮＡパッケージングマシンが確立された。よく理解された構造的および機構的特徴（図１）、すなわち、１７０ｋｂの容量の頭部と、乱雑なパッケージングモーターと、１，０２５分子の容量の表面格子と、末端が露出したＳｏｃタンパク質と、標的細胞を捕らえるための大体１８０Åの長さのＨｏｃ繊維とを有して、Ｔ４は、多種多様な用途のためにナノ粒子を遺伝子操作するための多くの選択肢を提供する。たいていの場合特徴が１つであり、容量が限られている既存の系とは異なり、Ｔ４の応用例は、遺伝子およびタンパク質の単純なインビトロ送達から、病気を治療するために遺伝子、タンパク質、多量体複合体およびターゲティング分子の組合せを必要とする複雑なインビボ送達にまで及ぶ。これらの広範囲の応用例を実証するために、一連の重要な実験を選択した。データは、Ｔ４が、単一または複数の遺伝子を、プラスミド、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡまたはコンカテマー化されたＤＮＡとして効率的に送達したことを示す。同時に、単一または複数のタンパク質が、短いペプチド、完全長のタンパク質または巨大な多量体複合体として送達された。異なる課題を実行するためにナノ粒子の異なる部分を遺伝子操作したが、所望の結果を生み出すために統合した。例えば、一部分（Ｈｏｃ）を、ナノ粒子に特定の細胞をターゲティングするのに割り当て、その一方で、別の部分（Ｓｏｃ）を、過渡的に新しい機能を発現するように、さらに別の部分（カプシド内部）を、長時間にわたって抗原を過剰発現させるように、設計した。このため、Ｔ４は、組換えＤＮＡおよびタンパク質分子の送達のための高度な系を提供する。
【００５３】
ファージＴ４プラットフォームは、それをいかなる研究室にも容易に適応可能にするいくつかの技術的利点がある。Ｔ４は、細菌由来であるので、非感染性、非毒性であって、先在する免疫を持たない。Ｔ４プラットフォームの２つの主要成分である頭部とパッケージングモーター（ｇｐ１７）は、比較的容易に、大腸菌から大量に（培養液１リットルあたり、大体５×１０１３頭部または５ｍｇのｇｐ１７）調製することができる。どちらも非常に安定しており、少なくとも２年間−７０℃で貯蔵した後も活性を保持する。アセンブリ工程は、比較的簡単であり、１つのチューブ内で行われ、約３時間のうちに完了し、各工程が定量化可能である。図示したように、遺伝子およびタンパク質の異なる組成を有する一連のカスタマイズされたナノ粒子を１回の実験で調製することができた。
【００５４】
Ｔ４プロ遺伝子送達は、有用な生物医学的療法を開発するための新たな道を提供する。開示された実施形態は、強い抗体および細胞性免疫応答を惹起する、肺ペストに対するプライムブーストワクチン接種手法を実証した。この手法は、ＨＩＶ−１、マラリアおよびＴＢのような感染病原体に対する有効なワクチンを開発するために広く用いることができる。外部にディスプレイされたリコンビナーゼおよびターゲティング分子と、内部にパッケージングされたゲノムＤＮＡおよびｓｉＲＮＡ遺伝子とを送達するＴ４頭部は、癌治療において、アポトーシスの誘導によって癌細胞を殺すためかまたはある特定の癌遺伝子を遮断することによって癌表現型を反転させるために用いることができる（Leuschnerら、２０１１年（参考文献３９））。Ｔ４送達は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４のような転写因子遺伝子およびタンパク質を送達するとともに、長いゲノムＤＮＡのインビボ送達によって欠陥遺伝子を機能的遺伝子に置き換えることによって、多能性幹細胞の安全で効率的な再プログラミングを可能にし得る（Mikiら、２０１２年（参考文献４０））。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
（１０−アンバー  １３−アンバー  ｈｏｃ（高抗原性外部カプシドタンパク質）−ｄｅｌ  ｓｏｃ（小さい外部カプシドタンパク質）−ｄｅｌ  頭部の精製）
１０−アンバー１３−アンバー．ｈｏｃ−ｄｅｌ．ｓｏｃ−ｄｅｌ変異体を標準の遺伝子交雑によって構築した。この変異体を感染させた大腸菌Ｐ３０１（ｓｕｐ−）細胞（５００ｍＬ）を、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮアーゼＩおよびクロロホルム（１ｍＬ）を含む４０ｍＬのＰｉ−Ｍｇバッファ（２６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／６８ｍＭ  ＮａＣｌ／２２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．５）中で溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。ライセートを低速（６，０００×ｇで１０分間）および高速（３５，０００×ｇで４５分間）で２回遠心分離し、最終的な頭部ペレットを２００μＬのＴｒｉｓ−Ｍｇバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で再懸濁し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離法によって精製した。５ｍＬの勾配の底から約１／３に沈降した主要頭部バンドを抽出し、Ｔｒｉｓ−Ｍｇバッファに対して一晩透析した。頭部をＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーによってさらに精製した（Neumannら、２０１１年）。ピーク頭部画分を濃縮し、−８０℃で貯蔵した。
【００５６】
（実施例２）
（インビトロＤＮＡパッケージング）
インビトロＤＮＡパッケージングアッセイを前述の手順によって行った（Kay、２０１１年）。反応混合物は、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＡＴＰを含有するバッファを用いて、精製されたＨｏｃ−Ｓｏｃ−頭部［または、記載されている場合は野生型（ＷＴ）頭部］（大体２×１０１０粒子）と、精製されたｇｐ１７（大体１．５μＭ）と、ＤＮＡ（大体３００ｎｇ）とを含んでいた。ＤＮＡは、制限酵素での消化によって生産された線状化された分子であった。例として、ｅＧＦＰ発現カセットを含むＭｌｕＩ−線状化された４．７ｋｂ  ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドおよびルシフェラーゼ発現カセットを含むＢａｍＨＩ線状化６．２ｋｂ  ｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドが挙げられる。いくつかの実験においては、発現カセットに対応するＰＣＲ増幅した２．３ｋｂのＤＮＡまたは大体８０ｋｂの連結されたプラスミドコンカテマーをパッケージング基質として用いた。パッケージングされていないＤＮＡを消化するためにＤＮアーゼＩを添加することによってパッケージング反応を終了させた。カプシドに包まれたＤＮアーゼＩ抵抗性ＤＮＡをプロテイナーゼＫでの処理によって放出させ、アガロースゲル電気泳動によって解析した。パッケージングされたＤＮＡをQuantity Oneソフトウェアによって定量化した。各実験は、必須のパッケージング成分、すなわち、頭部、ｇｐ１７、ＡＴＰまたはＤＮＡのうちの１つが欠如した１〜数個のネガティブコントロールを含んでいた。パッケージング効率とは、パッケージング反応において用いられた頭部粒子の数あたりのパッケージングされたＤＮＡ分子の数として定義される。
【００５７】
（実施例３）
（インビトロでのＨｏｃ−Ｓｏｃ−Ｔ４頭部上のディスプレイ）
インビトロでの融合タンパク質のＴ４カプシド上のディスプレイを、記載のように実行した（Demayoら、２０１２年；Yanら、２０１０年）。ルシフェラーゼおよび／またはｅＧＦＰ  ＤＮＡを上記のようにパッケージングした後、Ｈｏｃ−Ｓｏｃ−Ｔ４頭部（２〜３×１０１０粒子）を、同じチューブ内のＳｏｃおよび／またはＨｏｃ融合タンパク質と共に、Ｓｏｃ融合物については４℃、Ｈｏｃ融合物については３７℃で、３０分間インキュベートした。ＤＥＣ２０５ｍＡｂのディスプレイのために、ＨｏｃまたはＳｏｃ融合ＧＧドメインとｍＡｂとを同時に反応混合物に添加した。カプシド上のそれぞれの結合部位に対する融合タンパク質の比率を調節した。カプシド上の結合部位は、融合タンパク質によって占有され、反応混合物に含まれる１つのタンパク質またはタンパク質の組合せで頭部を装飾している。頭部を３４，０００×ｇで４５分間遠心沈殿させ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭ  ＮａＣｌで２回洗浄することによって結合していないタンパク質を除去した。頭部ペレットを、形質導入のためにOpti-MEMで、または、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析のためにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、再懸濁させた。ゲルをクーマシーブルーＲ２５０で染色し、タンパク質バンドをレーザーデンシトメトリーによって定量化した。Ｈｏｃ、Ｓｏｃ、ｇｐ２３＊およびｇｐ１８（主な尾鞘タンパク質；７０ｋＤａ）バンドの密度をレーンごとに別々に測定し、１カプシドあたりの結合ＨｏｃまたはＳｏｃ分子の数を、ｇｐ２３＊の既知のコピー数（１頭部あたり９３０コピー）またはｇｐ１８の既知のコピー数（１ファージあたり１３８コピー）を用いて算出した。１カプシドあたりの結合Ｓｏｃ分子数（Ｙ）と結合反応における結合していないタンパク質の濃度（Ｘ）とを関係付ける飽和結合曲線は、Ｓ字状ではなく、隣接するＨｏｃまたはＳｏｃ結合部位間に協同性がないことを示した。見かけのＫｄ（会合定数）とＢｍａｘ（１カプシドあたりの結合したＳｏｃの最大コピー数）とを、GraphPad PRISM-4ソフトウェアにプログラムされているように、式Ｙ＝ＢｍａｘＸ／（Ｋｄ＋Ｘ）を用いて決定した。
【００５８】
（実施例４）
（Ｔ４頭部のための遺伝子送達）
細胞（ＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅｐ３Ｂについては１ウェルあたり２×１０５細胞、ＤＣ２．４については１ウェルあたり１．５×１０５細胞）を２４ウェルプレートに播種し、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣＯ２中で３７℃で一晩インキュベートした。次いで、培地を５００μＬのopti-MEM培地と交換し、１００μＬの遺伝子操作されたＴ４頭部（ＨＥＫ２９３ＴもしくはＨｅｐ３Ｂ細胞については２×１０１０頭部またはＤＣ２．４細胞については１．５×１０１０頭部あるいは図に示された通り）を各ウェルに直接添加した。２４時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ発現を標準のプロトコルに従って定量化した。わずか２時間のインキュベーション後に培地を変更した場合は、ルシフェラーゼシグナルの有意な差は観察されなかった。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ウェルあたり１６０μＬの受動溶解バッファを添加して室温で３０分間振盪することによって溶解した。各ライセートの２０μＬアリコートを９６ウェルホワイトプレートに移し、１００μＬのＬＡＲＩＩバッファと混合した。発光シグナルをルミノメーターによって検出した。並行して、β−アクチンを用いたウエスタンブロッティングによって同量の細胞ライセートをβ−アクチンについて解析し、アッセイごとに同数の細胞が取り込まれたことを確認した。
【００５９】
（実施例５）
（Ｔ４頭部によるタンパク質送達）
β−ガラクトシダーゼＳｏｃをＨｏｃ−Ｓｏｃ−Ｔ４頭部と共に４℃で４５分間インキュベートした。Ｈｏｃ−ＴまたはＨｏｃ−ＧＧおよびＤＥＣ２０５ｍＡｂを同じ反応チューブに添加し、さらに４５分間、４℃でインキュベートした。頭部を３４，０００×ｇで４５分間遠心沈殿させ、上記のようにバッファで２回洗浄することによって結合していないタンパク質を除去した。頭部ペレットを、形質導入のためにopti-MEMに、または、β−ガラクトシダーゼ活性の測定のためにＰＢＳに、再懸濁した。後者については、Ｘ−Ｇａｌをチューブに添加し、室温で１０分間インキュベートした。上記のように送達を行い、β−ガラクトシダーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ染色キットを用いてＸ−Ｇａｌで染色することによって、頭部の添加から３時間後または２４時間後に顕微鏡法で可視化した。
【００６０】
（実施例６）
（単一分子光ピンセットＤＮＡパッケージング）
光ピンセットパッケージングを用いた単一パッケージングマシンによるパッケージングを前述の手順に従って行った（Kaczmarczykら、２０１１年；Smithら、２００１年）。精製した頭部（４×１０９粒子）を、パッケージングバッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）からなる１０μＬの反応容量中で、１ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓの存在下で、精製したｇｐ１７（１μＭ）および１２５ｂｐの「プライミング」ＤＮＡ（０．４４μＭ）と混合した。３７℃で３０分間インキュベートした後、Ｔ４ファージ抗体被覆ポリスチレンビーズ（１．５μＬ）（直径０．７９μｍ、Spherotech社）を添加した。ＰＣＲ増幅した１０ｋｂの一端をビオチン標識したλＤＮＡを、ストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズ（直径０．８６μｍ、Spherotech社）に添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって、ＤＮＡビーズを調製した。較正済みのデュアルトラップ光ピンセットを用いて、１００Ｈｚで、パッケージングが５ｐＮの一定の力に対して起こるようにした「フォースフィードバック」モードで、計測値を得た。１ｍＭ  ＡＴＰをフローセル内に注入することによって、テザー形成およびパッケージングを開始させた。５３ｎｍの持続長、１，２００ｐＮ／ｎｍの伸長弾性係数および０．３４ｎｍの塩基対あたりの距離を仮定したミミズ鎖モデルを用いて、計測された力およびビーズ間の伸びから、ＤＮＡの輪郭長を算出した。０．１秒（１０データ点）のスライディングウィンドウにわたる輪郭ｆＤＮＡのリニアフィットからＤＮＡパッケージングの速度を決定した。
【００６１】
（実施例７）
（単一分子蛍光ＤＮＡパッケージング）
蛍光標識オリゴヌクレオチドの単一分子パッケージングを前述の基本的手順に従って行った（Neumannら、１９８２年）。個々のＴ４パッケージングマシンを、ＰＥＧ表面不動態化カバーガラスに付着させたＴ４ファージ抗体を通じて固定化した。結合していない頭部を洗い流し、パッケージングバッファ中のＡＴＰおよび３９ｂｐのＣｙ５  ＤＮＡを、［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、ｐＨ８．０／５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１ｍＭ  スペルミジン／１ｍＭプトレシン／６０ｍＭ  ＮａＣｌ、および酸素スカベンジャー系（０．８％デキストロース／０．１ｍｇ／ｍＬ  グルコースオキシダーゼ／０．０２ｍｇ／ｍＬ  カタラーゼ、および３ｍＭ  トロロクス）］に流し込んだ。単一マシンによるＣｙ５  ＤＮＡのパッケージングを、ＣＣＤカメラによって１００ミリ秒の時間分解能で撮像した。
【００６２】
（実施例８）
（組換えプラスミドの構築）
細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）組換え遺伝子の全てを、２回のＰＣＲによって増幅した。１回目のＰＣＲは、ＨｏｃまたはＳｏｃ遺伝子を１２アミノ酸リンカーおよびＣＰＰの一部を含む配列に融合することによって行った。このＰＣＲ産物を、ＣＰＰ配列の残りと適切な制限部位とを含む末端プライマーを用いる２回目のＰＣＲのためのテンプレートとして用いた。結果として得られた制限酵素部位−ＣＰＰ−リンカー−Ｈｏｃ／Ｓｏｃ−制限酵素部位を含む断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、適切な制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したゲル精製ｐＥＴ−２８ｂベクターＤＮＡと連結させた。Ｈｏｃ融合ＤＮＡ断片の挿入の結果、ヘキサヒスチジン配列をＮ末端に含む２３アミノ酸ベクター配列とのインフレーム融合が生じた。Ｓｏｃ融合ＤＮＡ断片の挿入の結果、ヘキサヒスチジン配列をＣ末端に含む８アミノ酸ベクター配列とのインフレーム融合が生じた。組換え構築物の残り（ＧＧドメイン、β−ガラクトシダーゼ）については、ＳｏｃおよびＨｏｃを個別に適切なプライマーで増幅した。精製したＰＣＲ産物を適切な制限酵素で消化した。３つの制限酵素消化断片（Ｈｏｃ−ＧＧについては、ＧＧドメイン、ｐＥＴ−２８ｂおよびＨｏｃ；Ｓｏｃ−ＧＧについては、ＧＧドメイン、ｐＥＴ−２８ｂおよびＳｏｃ；βｇａｌ−Ｓｏｃについては、β−ガラクトシダーゼ、ｐＥＴ−２８ｂおよびＳｏｃ）を一方向性に連結して適切な融合産物を生成した。組換えＤＮＡの挿入の結果、ヘキサヒスチジン配列をＮ末端に含む２３アミノ酸ベクター配列とのインフレーム融合が生じ、Ｓｏｃ融合物の場合には、２つ目のヘキサヒスチジンタグも組換え体のＣ末端に付加された。連結されたＤＮＡを大腸菌ＸＬ１０ゴールド細胞に形質転換し、形質転換細胞からアルカリ溶解によってミニプレッププラスミドＤＮＡを調製し、各クローンの配列をＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した。次いで、組換えタンパク質のＩＰＴＧ誘導過剰発現のために、組換えＤＮＡを発現株大腸菌ＲＩＰＬに形質転換した。
【００６３】
（実施例９）
（組換えタンパク質の精製）
組換えタンパク質を、以下に説明する基本的プロトコルに従って精製した。組換えクローンを内部に持つＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＰＬ細胞を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで３０℃にて２時間誘導した。細胞を、遠心分離（４，０００×ｇで４℃にて１５分間）によって回収し、５０ｍＬのHisTrap結合バッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０／２０ｍＭ  イミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で再懸濁した。細胞をフレンチプレスを用いて溶解し、Ｈｉｓタグが付いた融合タンパク質を含む可溶性画分を３４，０００×ｇで２０分間遠心分離することによって単離した。上清をHisTrapカラムにロードし、バッファを含む５０ｍＭ  イミダゾールで洗浄し、タンパク質を２０〜５００ｍＭの直線イミダゾール勾配で溶出させた。ピーク画分を濃縮し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファ中でHi-Load 16/60 Superdex-200（プレップグレード）ゲルろ過カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ピーク画分を濃縮し、−８０℃で貯蔵した。
【００６４】
（実施例１０）
（ＤＥＣ２０５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の精製）
ＤＥＣ−２０５に対してラットＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株ＨＢ−２９０をＡＴＣＣから入手し、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣＯ２中、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ１６４０で、３７℃に増殖させた。ｍＡｂは、プロテインＧカラム上でアフィニティークロマトグラフィーによって上清から精製した。細胞培地を低速で遠心分離して細胞破片を除去し、上清のバッファ組成物を、タンジェンシャルフローろ過システムを通すことによって２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７）に対して調節した。次いで、試料をプロテインＧカラムにロードし、ｍＡｂを０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．８）で溶出させた。溶出液を中和し、ｍＡｂの機能を保存するために、ｍＡｂ画分を８０μＬの１Ｍ（ｐＨ９）を含有するチューブに回収した。
【００６５】
（実施例１１）
（アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター生産）
今回の研究では、８つの異なる天然の血清型からハイブリッドカプシドを作成するためにＤＮＡファミリーシャッフリングによって遺伝子操作されたＡＡＶ血清型ＤＪキットを用いた（Fullerら、２００７年）。ＡＡＶ−ＤＪベクターは、天然の血清型と比較して、広範囲の組織および細胞型にわたって、著しく高い感染率を示した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子をＡＡＶベクターにクローニングし、３つのプラスミドを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞への同時トランスフェクションによりルシフェラーゼ−ＡＡＶを生産した。トランスフェクションの７０時間後に、ＡＡＶを回収し、製造業者の説明書に従って精製した。QuickTiterＴＭ  ＡＡＶ定量化キットによってＡＡＶ力価を決定した。
【００６６】
（実施例１２）
（間接免疫蛍光顕微鏡法）
細胞（ＨＥＫ２９３Ｔについては１ウェルあたり４×１０５細胞、ＤＣ２．４については１ウェルあたり３×１０５細胞）を２チャンバースライドに播種し、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で一晩インキュベートした。形質導入から２４時間後に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、上記のようにβ−ガラクトシダーゼ活性を調べるためにＸ−Ｇａｌ染色した。次いで、細胞を４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドでさらに固定し、０．１％Surfact-Amps X-100で透過処理した。ヤギ抗ルシフェラーゼ一次抗体（１：１，０００希釈）またはマウス抗ＧＦＰ一次抗体（１：２，０００希釈）と共に３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を、それぞれ、ローダミン標識したウサギ抗ヤギ二次抗体（１：１，０００希釈、KPL社）またはＦＩＴＣ標識したウサギ抗マウス二次抗体（１：２，０００希釈）で探索した。倒立型AX10 Observer Dl顕微鏡で細胞を撮像し、β−ガラクトシダーゼ活性、ｅＧＦＰ蛍光およびローダミン蛍光を呈する細胞の画像を順次取得し、AxiovisionＴＭソフトウェアで解析した。
【００６７】
（実施例１３）
（ＥＬＩＳＡ）
９６ウェルプレートの各ウェルを、コーティングバッファ（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．６）で希釈した０．１μｇのタンパク質で、４℃で一晩被覆した。次いで、プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡで、３７℃で１時間遮断した。等容量の血清試料を希釈バッファ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％ＢＳＡを含む）で連続的に希釈し、各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファＰＢＳ−Ｔ（０．１％ツイーン２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄した。希釈バッファ中で１：２，０００に希釈したヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Invitrogen社）を二次抗体として用いた。二次抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした後、TMB Microwell Peroxidase Substrate Systemを用いて発色させ、TMB BlueSTOP（KPL社）溶液を添加することによって反応を停止させた。波長６５０ｎｍでのＯＤ値をＥＬＩＳＡリーダーによって読み取った。
【００６８】
（実施例１４）
（エリスポット）
合計５５匹の５〜６週齢のBalb/cJマウスに、Ｆｌ−Ｖ  ＤＮＡおよび／またはタンパク質を含むファージＴ４頭部粒子を筋肉内経路（i.m.）でワクチン接種した。２１日目に、各ワクチン接種群における３匹のマウスから脾臓を摘出し、それぞれのマウスから脾細胞を単離し、群ごとにプールした。脾細胞（１ｍＬあたり１０６）を３連で平板培養し、５μｇ／ｍＬのＦｌ−Ｖ、組換えマウスＩＦＮ−γまたは培地で刺激し、３７℃で２４時間インキュベートした。マウスＩＦＮ−γエリスポットキットを用いて、製造業者の説明書に従って、単一細胞脾臓懸濁液中のＩＦＮ−γ発現細胞の相対数を測定した。Immunospot Series 1 Analyzer Elispot Readerは、１ウェルあたりのスポット形成細胞数を定量化する。
【００６９】
（実施例１５）
（動物のライブイメージング系）
約２〜５×１０１１の頭部粒子を、各Balb/cJマウスに筋肉内経路（i.m.）で注射した。注射から６時間後、１０時間後、１６時間後、３０時間後、５０時間後、１４日後および３０日後に、マウスに３０μｇのRediJect D-Luciferin Ultraを腹腔内（i.p.）注射し、５分後に、マウスにイソフルオラン下で軽く麻酔をかけた後、IVIS 200生物発光および蛍光全身イメージングワークステーション（Caliper社）を用いてマウスのインビボイメージングを行った。生物発光スケールは、図に示されるが、放射輝度（radiance intensity）に基づいて段階付られた「強い」（赤色）から「最も強くない」（紫色）にわたっている。
【００７０】
（実施例１６）
（統計的解析）
結果を平均±ＳＤとして表す。２つの群の間の統計的比較を、スチューデントのｔ検定によって評価し、多重比較のためにＡＮＯＶＡによって補正した。Ｐ＜０．０５の値であれば統計的有意性を示していると考えた。
【００７１】
本発明を特定の実施形態を参照して開示したが、添付の特許請求の範囲において定められるように、本発明の領域および範囲から逸脱することなく、記載の実施形態に対する多くの変形、改変および変更が可能である。したがって、本発明は、記載の実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲の文言およびその等価物により規定される全ての範囲を有することが意図される。
【００７２】
参考文献
以下の参考文献は、上記および／または本発明と共に用いられ得る技術を記載するために言及したものであり、そして以下の参考文献の内容および開示は参照により本明細書中に援用される：
１．Neumann, E, Schaefer-Ridder M, Wang Y, and Hofschneider PH Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J 1(7):841-45 (1982).
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【００７３】
本願において引用した全ての文書、特許、学術文献および他の資料は、参照により本明細書中に援用される。
【００７４】
本発明を特定の実施形態を参照して開示したが、添付の特許請求の範囲において定められるように、本発明の領域および範囲から逸脱することなく、記載の実施形態に対する多くの変形、改変および変更が可能である。したがって、本発明は、記載の実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲の文言およびその等価物により規定される全ての範囲を有することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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