(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
dynAPと、p150Gluedおよびdynamitinから選択されるdynactin複合体を構成するタンパク質とを被験物質の存在下で接触させ、両タンパク質の結合を阻害した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
dynAPと、p150Gluedおよびdynamitinから選択されるdynactin複合体を構成するタンパク質とを発現する細胞を被験物質と接触させ、両タンパク質の結合をレポーター遺伝子の発現により測定し、該結合を阻害した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
dynAPとp150Gluedとを発現する細胞を被験物質と接触させ、p150Gluedのリン酸化を促進した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
dynAPを発現する細胞を被験物質と接触させ、以下の（ａ）〜（ｈ）のいずれかの作用を示した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法。
（ａ）散在したゴルジ装置を含む細胞数を増加させる
（ｂ）Aktの発現および／またはリン酸化を阻害する
（ｃ）GSK3βのリン酸化を阻害する
（ｄ）β-カテニンの発現を阻害する
（ｅ）サイクリンD1、c-MycおよびE-カドヘリンから選択される1以上の遺伝子の発現を阻害する
（ｆ）p53および／またはp21のタンパク質レベルを上昇させる
（ｇ）Mst1、カスパーゼ-8およびPARPから選択される1以上のタンパク質の切断を亢進させる
（ｈ）血清刺激に対する細胞応答を減弱させる
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるdynAPの発現または機能を阻害する物質を含有してなる、dynAPを発現するがんの治療または予防剤。
（ａ）dynAPをコードするRNAに対するアンチセンス核酸
（ｂ）dynAPをコードするRNAに対するリボザイム核酸
（ｃ）dynAPをコードするRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
（ｄ）dynAPに対する中和抗体
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規抗がん剤およびそのスクリーニング方法に関する。より詳細には、本発明は、dynactin結合タンパク質（dynactin-associated protein；以下、「dynAP」と略記する場合がある）の機能阻害を指標とする抗がん剤のスクリーニング方法、並びにdynAPの発現もしくは機能を阻害する物質を有効成分とする新規抗がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム配列の解読が完了したことにより、生理学的機能が不明なままのタンパク質をコードする多くの遺伝子の存在が明らかとなった。酵母細胞は、最も単純な真核細胞として、ヒトタンパク質の機能同定や、治療薬開発のためのリード化合物となり得る化学物質のスクリーニングに幅広く使用されている。例えば、ヒトがん細胞の増殖促進に関連する多くのタンパク質が、酵母の増殖を抑制することが報告されており（非特許文献１−３）、これを利用して、酵母の増殖回復をモニタリングしてヒトタンパク質の阻害剤を選択することによる、抗がん剤のハイスループットなスクリーニング系が構築されている（非特許文献４）。しかし、この種のスクリーニングには、これまで専ら野生型の酵母細胞が利用されており、特定のタンパク質を欠損した変異酵母を使用した例は報告されていない。
【０００３】
ヒトC18orf26タンパク質は、第18番染色体上の遺伝子にコードされる機能未知のタンパク質であるが、種々のがん組織で発現していることが報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biochem. Biophys. Res. Commun., 250: 791-799 (1998)
【非特許文献２】Oncogene, 27: 5431-5442 (2008)
【非特許文献３】Cancer Res., 61: 4175-4183 (2001)
【非特許文献４】Nature Rev. Cancer, 4: 481-492 (2004)
【非特許文献５】Human Protein Atlas data, C18ORF26 expression profiles (http://www.proteinatlas.org/tissue_profile.php?antibody_id=11148&g_no=ENSG0000017869)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の第一の目的は、特定のタンパク質を欠損した変異酵母を使用し、当該酵母の増殖阻害を指標とすることにより、野生型酵母では選択することのできない新規がん治療ターゲットを選択可能なスクリーニング方法を提供することであり、当該変異酵母の増殖回復を指標とする、当該がん治療ターゲットの阻害剤、即ち抗がん剤のスクリーニング方法を提供することである。
本発明の第二の目的は、選択されたがん治療ターゲットとなり得るタンパク質を用いた、抗がん剤のスクリーニング方法を提供することである。
本発明の第三の目的は、選択されたがん治療ターゲットとなり得るタンパク質の発現もしくは機能を阻害し得る物質、並びに上記スクリーニング方法により選択された物質を有効成分とする抗がん剤を提供することである。
本発明の第四の目的は、選択されたがん治療ターゲットとなり得るタンパク質あるいはそれをコードする遺伝子の発現量を指標とする、がんの診断方法およびそのための診断剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記第一の目的を達成すべく、本発明者らは、紡錘体集合チェックポイント複合体の構成成分であるMad2を欠失する出芽酵母を用いた。紡錘体集合チェックポイントは、M期後期で、紡錘体の形成が正常で分裂期の後期に移行できる状況かをチェックしている。紡錘体の形成に失敗していると、Mad2が微小管と結合していない動原体依存的に活性化され、分裂後期開始に必要なCdc20の活性を阻害して染色体の分裂を停止する。細胞分裂の紡錐体集合チェックポイントの欠損は、染色体異数性を引き起こす。染色体異数性はヒト固形がんで広く観察され、抗がん剤開発の治療標的として重要である〔Kops, G.J.ら、ネイチャー・レビューズ・キャンサー（Nat Rev Cancer，10，773 (2005)〕。約10,000種のヒトcDNAを該変異酵母および野生型酵母にそれぞれ導入して、変異酵母の増殖を阻害するが、野生型酵母の増殖を阻害しないヒトcDNAをスクリーニングした。いくつかのポジティブなcDNAの中から、本発明者らは、種々のがん組織での発現が知られているC18orf26遺伝子座にコードされるタンパク質を選択した。
【０００７】
次に、本発明者らは、C18orf26遺伝子産物を過剰発現するMad2欠損変異酵母を用い、C18orf26起因性の増殖阻害を回復させ得る化合物を得るべく、真菌および細菌の培養液をスクリーニングした。その結果、冬虫夏草菌Isaria sp. NBRC 104353株の培養液の活性フラクションから単離されたエルゴスタン誘導体である新規化合物 (3β,12β,14β,16β)-22,23-エポキシ-3,12,14,16-テトラヒドロキシエルゴスタ-5,7-ジエン-11-オンが、増殖回復作用を示す化合物として同定された。そこで、この化合物の類縁体について同様に増殖回復作用を試験した結果、3-ヒドロキシアンドロスタン-11-オン骨格を有する化合物が、Mad2欠損変異酵母の増殖を回復させ得ることを見出した。これらの化合物のヒトがん細胞に対する作用を調べたところ、C18orf26遺伝子を発現するがん細胞に対して増殖抑制作用、アポトーシス誘導作用を示す化合物が得られた。
【０００８】
一方で、本発明者らは、C18orf26遺伝子産物のN末端付近（19-32位のアミノ酸配列）を認識する抗体を用いて、種々のがん細胞株における当該タンパク質の発現を調べた。その結果、このタンパク質は調べたがん細胞株の約半数で発現していることが確認された。また、GFPやFLAGでタグ化したC18orf26を用いて当該タンパク質の細胞内局在や相互作用するタンパク質の同定を試みた。その結果、このタンパク質は原形質膜およびゴルジ膜に局在し、細胞質dyneinモーターとともに微小管およびオルガネラ間の相互作用に介在するdynactin複合体の少なくとも2つのサブユニット（p150Gluedとdynamitin (dynactin2、p50とも呼ばれる)）と結合することが示された。かかる知見に基づいて、本発明者らは、C18orf26遺伝子産物をdynactin結合タンパク質（dynactin-associated protein；dynAP）と命名した。
【０００９】
酵母を用いたスクリーニングにより得られた化合物のヒトがん細胞に対する効果のメカニズムを解明すべく、本発明者らはさらに研究を重ねた結果、これらの化合物に対するがん細胞の感受性はdynAPの発現レベルに依存すること、当該化合物により誘導されるアポトーシスに先行してゴルジ装置の散在化、さらに断片化が生じること、当該化合物がp150Gluedのリン酸化を促進し、当該リン酸化に応じてp150GluedとdynAPとの相互作用が消失すること、当該化合物がAktの発現およびリン酸化を阻害し、それによってGSK3βが活性化してβ-カテニンの発現が抑制され、c-Myc遺伝子やサイクリンD1遺伝子の転写活性化が阻害されること等を見出して、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）哺乳動物由来の試験タンパク質をコードする核酸を導入した、細胞周期チェックポイント因子を欠損する変異酵母および対応する野生型酵母を培養し、変異酵母の増殖を阻害するが野生型酵母の増殖を阻害しない試験タンパク質を、がん治療標的タンパク質の候補として選択することを特徴とする、がん治療標的タンパク質のスクリーニング方法。
（２）細胞周期チェックポイント因子が紡錘体集合チェックポイント因子である、上記（１）記載の方法。
（３）紡錘体集合チェックポイント因子がMad2である、上記（２）記載の方法。
（４）試験タンパク質ががん細胞の増殖に関与するものである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）哺乳動物がヒトである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）選択されたタンパク質を発現するがん細胞において該タンパク質の発現もしくは機能を阻害し、がん細胞の増殖が抑制されることを確認することをさらに含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法により得られたがん治療標的タンパク質をコードする核酸を導入した、細胞周期チェックポイント因子を欠損する変異酵母を、被験物質の存在下で培養し、該変異酵母の増殖を回復させた被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法。
（８）選択された物質を、該タンパク質を発現するがん細胞に接触させ、がん細胞の増殖が抑制されることを確認することをさらに含む、上記（７）記載の方法。
（９）該タンパク質がdynAPである、上記（７）または（８）記載の方法。
（１０）dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質とを被験物質の存在下で接触させ、両タンパク質の結合を阻害した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法。
（１１）dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質とを発現する細胞を被験物質と接触させ、両タンパク質の結合をレポーター遺伝子の発現により測定し、該結合を阻害した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法。
（１２）dynactin複合体を構成するタンパク質がp150Gluedまたはdynamitinである、上記（１０）または(１１)記載の方法。
（１３）dynAPとp150Gluedとを発現する細胞を被験物質と接触させ、p150Gluedのリン酸化を促進した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法。
（１４）dynAPを発現する細胞を被験物質と接触させ、以下の（ａ）〜（ｈ）のいずれかの作用を示した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法。
（ａ）散在したゴルジ装置を含む細胞数を増加させる
（ｂ）Aktの発現および／またはリン酸化を阻害する
（ｃ）GSK3βのリン酸化を阻害する
（ｄ）β-カテニンの発現を阻害する
（ｅ）サイクリンD1、c-MycおよびE-カドヘリンから選択される1以上の遺伝子の発現を阻害する
（ｆ）p53および／またはp21のタンパク質レベルを上昇させる
（ｇ）Mst1、カスパーゼ-8およびPARPから選択される1以上のタンパク質の切断を亢進させる
（ｈ）血清刺激に対する細胞応答を減弱させる
（１５）dynAPを発現する細胞がサイクリンD1遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むものである、上記（１４）記載の方法。
（１６）以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるdynAPの発現を阻害する物質を含有してなる、dynAPを発現するがんの治療または予防剤。
（ａ）dynAPをコードするRNAに対するアンチセンス核酸
（ｂ）dynAPをコードするRNAに対するリボザイム核酸
（ｃ）dynAPをコードするRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
（１７）以下の（ａ）および（ｂ）から選択されるdynAPの機能を阻害する物質を含有してなる、dynAPを発現するがんの治療または予防剤。
（ａ）dynAPに対する中和抗体
（ｂ）dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質との結合を阻害する化合物
（１８）dynactin複合体を構成するタンパク質がp150Gluedまたはdynamitinである、上記（１７)記載の剤。
（１９）dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質との結合を阻害する化合物が、下記式（Ｉ）で表わされる、上記（１７）記載の剤。
【００１１】
【化１】
0005920904.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それらが付いている環に対して少なくとも１種の置換基を表し、各々の存在につき独立して、水素原子、ヒドロキシ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基、置換基を有していてもよい（Ｃ３−Ｃ６）アルキニル基、置換基を有していてもよい（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル基、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、チオール基またはシアノ基を表し；
実線と破線は単結合もしくは二重結合を表す。）
（２０）dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質との結合を阻害する化合物が、下記式（ＩＩ）で表される、上記（１８）記載の剤。
【００１３】
【化２】
0005920904.tif 000003
【００１４】
（式中、実線と破線は単結合もしくは二重結合を表す。）
（２１）下記式（ＩＩＩ）で表される化合物。
【００１５】
【化３】
0005920904.tif 000004
【００１６】
（２２）dynAPのN末端領域を認識する抗体を含有してなる、dynAPを発現するがんの診断剤。
（２３）上記（２２）記載の診断剤と組み合わせて使用される、上記（１６）〜（２０）のいずれかに記載の剤。
【発明の効果】
【００１７】
dynAPはがんの診断マーカー、抗がん剤の創薬ターゲットとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（Ａ）dynAPの過剰発現が紡錘体集合チェックポイント因子欠失酵母の増殖を阻害することを示す図である。dynAPの全長cDNA（dynAP）または空のベクター（Vector）を野生型（WT）および変異酵母（Δmad1、Δmad2、Δmad3、Δbub3）に導入し、対数増殖期の形質転換体を5倍系列希釈し、ガラクトース培地（Gal）またはグルコース培地（Glu）にスポットして1-2日間インキュベートした。（Ｂ）dynAPを過剰発現するMad2欠失変異酵母（Δmad2）の増殖回復活性を試験した化合物(#1-#8)の構造式を示す図である。（Ｃ）化合物(#1-#8)の増殖回復活性を示す図である。対数増殖期にある、dynAPの全長cDNAまたは空のベクターを含むΔmad2変異株を、種々の濃度の化合物(#1-#8)を含むガラクトース培地で48時間インキュベートした後、培養液のODを測定して増殖回復活性を算出した。
【図２】（Ａ）ヒトdynAPの構造を示す模式図である。膜貫通ドメイン（113-133）およびスレオニン−リッチドメイン（172-207）をボックスで示す。「antigen」はポリクローナル抗体の作製に用いた抗原ペプチド（19-32）を示す。（Ｂ）ヒトdynAPおよびそのサル、チンパンジー、イヌおよびマウスホモログのアラインメントを示す図である。
【図３】（Ａ）GFP-dynAPを安定発現するHeLa細胞（stable #1および#2）および対照HeLa細胞抽出液の抗GFP抗体および抗dynAP抗体を用いたイムノブロット分析を示す図である。約70kDaのバンドがGFP-dynAP、約45kDaのバンドが内在性dynAPに相当する。（Ｂ）種々のヒト細胞におけるdynAPの発現をイムノブロット分析で調べた結果を示す図である。45kDaのバンドのシグナル強度をNIHイメージを用いて測定し、α-チューブリンのバンド強度に対する相対強度を算出した。パネル下の数値は、ACHN細胞のdynAP強度を100%とした各細胞の相対値を示す。（Ｃ）種々の細胞におけるdynAP mRNAレベルを示す図である。dynAP cDNAの全長および内部標準としてGAPDHの一部をRT-PCRにて増幅した。
【図４】dynAPが原形質膜およびゴルジ膜に局在することを示す図である。（Ａ）GFP-dynAPを安定発現するKMST-6およびHeLa細胞をメタノールで固定した。DNAはDAPIで染色した（青色）。スケールバーは5 μmを示す。（Ｂ）−（Ｄ）GFP-dynAPを一過的に発現するHeLa細胞をメタノールで固定し、抗GM130抗体（Ｂ）、抗β-チューブリン抗体（Ｃ）、抗p150Glued抗体（Ｄ）で免疫染色した。（Ｅ）ACHN細胞の膜、核および細胞質フラクションのイムノブロット分析結果を示す。
【図５】dynAPがdynactin構成成分のp150Gluedおよびdynamitinと結合することを示す図である。ACHN細胞の抽出液を抗p150Glued抗体（Ａ）、抗dynamitin抗体（Ｂ）または抗dynAP抗体で免疫沈降（IP）し、各タンパク質に対する抗体でイムノブロット分析を行った。抗c-myc抗体（Ａ、Ｂ）および免疫前血清（Pre.）をコントロールとして使用した。「Total」は細胞抽出液中のタンパク質を各タンパク質に対する抗体で検出した。
【図６】dynAPがp150Gluedおよびdynamitinと共免疫沈降することを示す図である。種々の細胞の抽出液を抗dynAP抗体で免疫沈降（IP）し、各タンパク質に対する抗体でイムノブロット分析を行った。免疫前血清（Pre.）をコントロールとして使用した。「Total」は細胞抽出液中のタンパク質を各タンパク質に対する抗体で検出した。DLD-1細胞におけるdynAPの発現は非常に低いが、dynactin構成成分との物理的相互作用は明瞭に観察される。
【図７】（Ａ）5 μMの化合物#1-#8に24時間曝露後の生存ACHN細胞数を示す図である。0時間の初期細胞密度は3.2×105細胞/ml。エラーバーは3回の実験の標準偏差を示す。（Ｂ）5 μMの化合物#1-#4に24時間曝露後のアポトーシスを起こした（sub-G1）ACHN細胞の割合を示す図である。（Ｃ）5 μMの化合物#1-#8に24時間曝露後のACHN細胞におけるカスパーゼ-8およびPARPの切断を示す図である。Full lengthはnativeな形態、Cleavedは切断された形態をそれぞれ示す。（Ｄ）化合物#4により誘導されるアポトーシスに対する感受性が、細胞のdynAPレベルに依存して異なることを示す図である。種々の濃度の化合物#4に24時間曝露後のACHN、HeLaおよびDLD-1細胞におけるアポトーシス細胞の割合（sub-G1細胞のフラクション）をフローサイトメトリーにより調べた。（Ｅ）化合物#4により誘導されるカスパーゼ-8およびPARPの切断に対する感受性が、細胞のdynAPレベルに依存して異なることを示す図である。ACHN、HeLaおよびDLD-1細胞を、5 μMの化合物#4に24時間曝露した後、細胞抽出液をイムノブロット分析してnativeおよび切断された形態のカスパーゼ-8およびPARPを検出し、PARPのシグナル強度から切断割合を算出した。
【図８】5 μMの化合物#1-#4に24時間曝露した後のACHN細胞におけるアポトーシス細胞の割合（sub-G1細胞のフラクション）を示す図である。曝露終了後、細胞をおだやかにトリプシン処理し、フローサイトメトリーで分析した。
【図９】化合物#4により誘導されるがん細胞のアポトーシス死がdynAPレベルに依存することを示す図である。化合物#4に24時間曝露した後、ACHN、HeLaおよびDLD-1細胞をおだやかにトリプシン処理し、フローサイトメトリーで分析した。アポトーシス細胞の割合（sub-G1細胞のフラクション）を示す。
【図１０】DLD-1細胞におけるカスパーゼ-8介在性のアポトーシス経路が欠損していないことを示す図である。種々の濃度のスタウロスポリンに24時間曝露した後、DLD-1細胞におけるカスパーゼ-8の切断をモニタリングした。
【図１１】（Ａ）化合物#4により誘導されるMst1の切断がdynAPレベルに依存することを示す図である。種々の濃度の化合物#4に24時間曝露した後、ACHN、HeLaおよびDLD-1細胞細胞抽出液をイムノブロット分析してMst1の切断を検出した。Full lengthはnativeなMst1形態、Cleavedは切断されたMst1形態をそれぞれ示す。（Ｂ）カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKが、カスパーゼ-8およびPARPだけでなくMst1の切断も阻害することを示す図である。化合物#4および／またはZ-VAD-FMKに24時間曝露したACHNおよびHeLa細胞の抽出液をイムノブロット分析してカスパーゼ-8、PARPおよびMst1の切断を検出した。（Ｃ、Ｄ）外因性のdynAPの発現が化合物#4により誘導されるカスパーゼ-8（Ｃ）およびMst1（Ｄ）の切断を促進することを示す図である。GFP-dynAPを安定発現するHeLa細胞と対照HeLa細胞とを化合物#4で24時間処理し、細胞抽出液をイムノブロット分析してカスパーゼ-8（Ｃ）およびMst1（Ｄ）の切断を検出した。（Ｅ）dynAPのshRNAノックダウンによって化合物#4依存的なプロカスパーゼ-8およびMst1の切断が抑制されることを示す図である。dynAPに対するshRNAまたは非特異的shRNAを導入した細胞におけるMst1、カスパーゼ-8およびPARPの切断をイムノブロット分析により検出した。（Ｆ）化合物#4により誘導されるMst1の切断がカスパーゼ-8およびPARPの切断と同時に起こることを示す図である。ACHNおよびHeLa細胞を化合物#4で処理した後、種々の時間で細胞抽出液を調製し、イムノブロット分析してカスパーゼ-8、PARPおよびMst1の切断を検出した。
【図１２】（Ａ）化合物#4および#8がゴルジ断片化を引き起こすことを示す図である。2.5 μMの化合物#1-#8に16時間曝露した後、ACHN細胞をメタノールで固定し、抗GM130抗体で染色して散在したゴルジ装置を含む細胞の割合を調べた。（Ｂ、Ｃ）化合物#4により誘導されるゴルジ断片化が細胞のdynAPレベルに依存して異なることを示す図である。ACHN、HeLaおよびDLD-1細胞を、2.5 μMの化合物#4に曝露した。16時間後（Ｂ）または2時間おき（Ｃ）にゴルジ断片化の割合を調べた。（Ｄ）化合物#4はACHN細胞におけるp150Gluedのリン酸化を誘導するが、DLD-1細胞では誘導しないことを示す図である。25 μMの化合物#4に24時間曝露する前後のACHNおよびDLD-1細胞の抽出液をイムノブロット分析してp150Gluedを検出した（左）。化合物#4処理後のACHN細胞でのp150Gluedの移動度が上方にシフトしていることはp150Gluedのリン酸化を示唆する。化合物#4で処理したACHN細胞の抽出液を抗p150Glued抗体で免疫沈降し、λ-プロテインフォスファターゼ（λ-PPase）とインキュベートすると、p150Gluedの移動度が下方にシフトしたことから、化合物#4はp150Gluedのリン酸化を誘導することが示された（右）。（Ｅ）化合物#4はdynAPとp150Gluedとの相互作用を減弱することを示す図である。種々の濃度の化合物#4に24時間曝露したACHN細胞の抽出液を抗dynAP抗体（中）または抗p150Glued抗体（右）で免疫沈降し、イムノブロット分析でdynAPおよびp150Gluedを検出した。「Total」は細胞抽出液中のdynAPおよびp150Gluedを各タンパク質に対する抗体で検出した。
【図１３】化合物#4がゴルジ断片化を誘導することを示す図である。スケールバーは5 μmを示す。（Ａ）2.5 μMの化合物#1-#8に16時間曝露した後、ACHN細胞を固定し、抗GM130抗体で染色した（赤色）。DNAはDAPIで染色した（青色）。（Ｂ）2.5 μMの化合物#4に16時間曝露した後、ACHN、HeLaおよびDLD-1細胞を固定し、抗GM130抗体で染色した（赤色）。DNAはDAPIで染色した（青色）。
【図１４】化合物#4により誘導されるゴルジ断片化がカスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKによって影響を受けないことを示す図である。化合物#4および／またはZ-VAD-FMKに10時間曝露したHeLa細胞を固定し、抗GM130抗体で染色した（赤色）。DNAはDAPIで染色した（青色）（右パネル）。スケールバーは5 μmを示す。散在したゴルジ装置を含む細胞を計数した（左パネル）。
【図１５】正常線維芽細胞におけるdynAPの発現と化合物#4に対するその感受性を示す図である。HUC-fm：臍帯線維芽細胞、WI-38：肺線維芽細胞、VA-13：SV-40でトランスフォームしたWI-38細胞。（Ａ）各細胞におけるdynAP発現を示す。ACHN細胞でのdynAP発現を100%とした相対レベルを示した。（Ｂ）化合物#4により誘導されるカスパーゼ-8の切断を示す。細胞を種々の濃度で24時間処理し、抽出液をイムノブロット分析してカスパーゼ-8の切断を検出した。（Ｃ、Ｄ）化合物#4により誘導されるゴルジ断片化を示す。2.5 μMの化合物#4に16時間曝露した後、細胞を固定し、抗GM130抗体で染色した（赤色）。DNAはDAPIで染色した（青色）（Ｃ）。スケールバーは5 μmを示す。散在したゴルジ装置を含む細胞を計数した（Ｄ）。
【図１６】（ＡおよびＢ）化合物#4が細胞のdynAPレベル依存的にサイクリンD1レベルを減弱させることを示す図である。（Ａ）ACHN、HeLaおよびDLD-1細胞を、5または25 μMの化合物#4に曝露した後、細胞抽出液をイムノブロット分析してサイクリンD1を検出した。（Ｂ）5または25 μMの化合物#4に曝露したHeLa細胞におけるAkt、リン酸化GSK3β、β-カテニン、c-MycおよびサイクリンD1レベルをイムノブロット分析により調べた（上段）。5または10 μMの化合物#4に曝露したHeLa細胞におけるサイクリンD1 mRNAレベルをRT-PCRにより調べた（下段）。（Ｃ）全長Mst1（Mst1 Full）、活性化Mst1（Mst1N）、機能欠損型Mst1N（59位のLysをArgで置換した変異体; Mst1N KD）またはベクターのみ(Vec)を導入した細胞におけるAktレベルをイムノブロット分析により調べた。（Ｄ）活性化型のMst1の過剰発現により、化合物#4で処理した場合（Ｂ）と同様の効果が奏されることを示す図である。野生型の活性化Mst1（Mst1N WT）、機能欠損型Mst1N（Mst1N KD）またはベクターのみ(Vec)を導入した細胞におけるAkt、リン酸化GSK3β、β-カテニン、c-MycおよびサイクリンD1レベルをイムノブロット分析により、サイクリンD1の転写レベルをRT-PCRにより調べた。（Ｅ）化合物#4依存的なサイクリンD1レベルの減少が、転写抑制だけでなくサイクリンD1タンパク質の不安定化によっても誘導されることを示す図である。FLAGでタグ化したサイクリンD1を過剰発現する細胞における導入サイクリンD1および内因性サイクリンD1タンパク質のレベルをイムノブロットにより、サイクリンD1のmRNA発現をRT-PCRにより調べた。（Ｆ）化合物#4処理によりp53およびp21のタンパク質レベルが上昇することを示す図である。5または25 μMの化合物#4に曝露した細胞抽出液をイムノブロット分析してp53およびp21を検出した。（Ｇ）活性化型のMst1の過剰発現によっても、化合物#4で処理した場合（Ｆ）と同様p21のタンパク質レベルが上昇することを示す図である。野生型の活性化Mst1（Mst1N WT）、機能欠損型Mst1N（Mst1N KD）またはベクターのみ（Vec）を導入した細胞におけるp21レベルをイムノブロット分析により調べた。（Ｈ）化合物#4処理によりE-カドヘリン遺伝子の転写が抑制されることを示す図である。5または10 μMの化合物#4に曝露したACHNおよびHeLa細胞におけるE-カドヘリン遺伝子の発現をRT-PCRにより調べた。
【図１７】dynAPの発現および化合物#4がAktリン酸化に及ぼす効果を示す図である。（Ａ）GFP-dynAPを発現するHeLa細胞と対照HeLa細胞の抽出液をイムノブロット分析してS473リン酸化Akt（pS473）および全Akt（total）、T389リン酸化S6K（pT389）および全S6K（total）を検出した。（Ｂ）正常線維芽細胞WI-38およびそれをSV-40でトランスフォームしたVA-13細胞（dynAPを発現する）におけるS473リン酸化Akt（pS473）および全Akt（total）レベルを、イムノブロット分析により調べた。（Ｃ）dynAPをshRNAノックダウンした細胞の抽出液をイムノブロット分析してS473リン酸化Akt（pS473）および全Akt（total）を検出した。（Ｄ）化合物＃4処理によりAktのリン酸化が阻害されることを示す。10 μMの化合物#4に曝露したGFPでタグ化したdynAPを過剰発現するHeLa細胞、ACHN細胞およびDLD-1細胞におけるS473リン酸化Akt（pS473）および全Akt（total）レベルを、イムノブロット分析により調べた。Aktリン酸化を制御するPI3キナーゼの阻害剤LY294002をコントロールとして用いた。（Ｅ）化合物#4により誘導されるプロカスパーゼ-8およびMst1の切断がAkt活性依存的であることを示す図である。Aktを過剰発現するHeLa細胞を化合物#4に曝露した後、細胞抽出液をイムノブロット分析した。
【図１８】（Ａ）dynAP依存的なAktのリン酸化に牛血清（FBS）が必要であることを示す図である。FBSを含まない培地で24時間培養するとdynAP依存的なS473リン酸化Akt（pS473）が減弱し、10％ FBS添加により回復する。（Ｂ）dynAPはC末端が細胞膜より突出していることを示す図である。N-末端およびC-末端にそれぞれFLAG、V5を連結したdynAP融合タンパク質を発現させたHeLa細胞をパラホルムアルデヒドで固定後、透過処理をして、あるいは透過処理をせずに、抗FLAG抗体もしくは抗V5抗体にて免疫染色した。（ＣおよびＤ）dynAPのshRNAノックダウンまたは化合物#4への曝露がFBS添加後の細胞形態の戻りを遅くすることを示す図である。（Ｃ）dynAPをshRNAによりノックダウンしたHeLa細胞を24時間、FBSを含まない培地で培養した後、10％ FBSを培地に添加し、30分後に細胞をメタノール固定し、抗a-tubulin抗体で免疫染色した。（Ｄ）HeLa細胞を24時間、化合物#4を添加したFBS不含培地で培養した後、10％ FBSを培地に添加し、30分後に細胞をメタノール固定し、抗a-tubulin、抗b-actin抗体で免疫染色した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［１］がん治療標的タンパク質のスクリーニング方法
本発明は、変異酵母を利用したがん治療標的タンパク質の新規スクリーニング方法を提供する。がん細胞の増殖促進に関連するタンパク質が酵母の増殖を抑制することを利用して、酵母の増殖回復をモニタリングして該タンパク質の阻害剤を選択することによる抗がん剤のスクリーニング方法はいくつか報告されているが、それらのスクリーニング系には、これまで専ら野生型の酵母細胞が利用されていた。本発明者らは、細胞周期チェックポイント因子を欠損する変異酵母を用いて同様のスクリーニングを実施し、変異酵母の増殖を阻害するが野生型酵母の増殖を阻害しないタンパク質を選択することに成功した。従って、本スクリーニング方法は、従来の野生型酵母を用いたスクリーニング系では選択し得なかった新規ながん治療ターゲットを提供し得るものである。
【００２０】
本発明のがん治療標的タンパク質のスクリーニング方法に使用される変異酵母は、細胞周期チェックポイント因子のいずれかを欠損するものであれば特に制限はなく、例えば、DNA未複製チェックポイントに関与するATR-Chk1など、紡錘体集合チェックポイントに関与するMad1、Mad2、Mad3、Bud3など、染色体分離チェックポイントに関与するCdc2、Cyclin Bなど、DNA損傷チェックポイントに関与するATM/ATR、Chk1/2、p53、Baxなどに欠損を有する変異酵母が挙げられるが、好ましくは紡錘体集合チェックポイント因子を欠損する酵母であり、より好ましくはMad2を欠損する酵母である。酵母の種も特に制限はなく、例えば、サッカロミセス属（例：サッカロミセス・セレビシエ等）、ピキア属（例：ピキア・パストリス等）、クリベロミセス属（例：クリベロミセス・ラクティス等）、シゾサッカロミセス属（例：シゾサッカロミセス・ポンベ）などが挙げられる。
これらの変異酵母は、例えば、対応する野生型酵母の標的遺伝子を、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を用いた相同組換えにより破壊することにより調製することができる。Mad2欠損変異酵母については、サッカロミセス・ゲノム欠失プロジェクト（www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/project_desc.html）により野生型サッカロミセス・セレビシエBY4742株から調製された変異酵母を入手して用いることができる。
【００２１】
変異酵母およびそれに対応する野生型酵母に導入される試験タンパク質をコードする核酸は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギなど、好ましくはヒト）由来のタンパク質をコードするDNAであれば特に制限はないが、好ましくは、がん細胞で高発現することが知られているタンパク質をコードするものである。試験タンパク質をコードするDNAは、cDNAもしくはゲノムDNAであってよいが、好ましくはcDNAである。試験タンパク質をコードするcDNAは、その塩基配列情報に基づいて自体公知の方法により単離することができる。
試験タンパク質をコードするDNAは、酵母細胞で機能的な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）などが用いられる。プロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどを用いることができる。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。
【００２２】
酵母の形質転換は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)などに記載の方法に従って行うことができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。培養に使用される培地としては液体培地が好ましく、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。好適な培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
【００２３】
培養終了後、変異酵母および野生型酵母の培養液中の酵母菌体密度を測定し、比較することにより、変異酵母の増殖を阻害するが野生型酵母の増殖を阻害しない試験タンパク質を、がん治療標的タンパク質の候補として選択することができる。
【００２４】
選択されたタンパク質ががん治療標的タンパク質として有用であることを確認するために、該タンパク質を発現するがん細胞において、該タンパク質の発現もしくは機能を阻害した場合に、がん細胞の増殖が抑制されるか否かを試験することができる。該タンパク質の発現もしくは機能を阻害する方法としては、例えば、公知の該タンパク質の阻害剤を添加するか、該タンパク質に対する中和抗体、該タンパク質をコードするRNAに対するsiRNAやアンチセンス核酸などを用いる方法などが挙げられるが、これらに限定されない。試験の結果、がん細胞の増殖が抑制された場合には、該タンパク質はがん治療標的タンパク質として有用であると判定することができる。
【００２５】
本発明者らは、約10,000のヒトcDNAについて上記のスクリーニングを実施し、変異酵母の増殖を阻害するが野生型酵母の増殖を阻害しないいくつかのタンパク質を選択することに成功した。その中で種々のヒトがん細胞での発現が報告されているdynAPを、新規がん治療標的タンパク質として同定した。
【００２６】
［２］抗がん薬のスクリーニング方法（Ｉ）
本発明はまた、上記の方法により得られたがん治療標的タンパク質をコードする核酸を導入した、細胞周期チェックポイント因子を欠損する変異酵母を用いた、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニング方法は、当該酵母を被験物質の存在下で培養し、該変異酵母の増殖を回復させた被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする。変異酵母の培養は上記と同様に行うことができる。
【００２７】
被験物質としては、例えば、蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
【００２８】
被験物質の酵母細胞との接触は、例えば、上記の培地の中に被験物質を添加して、細胞を一定時間培養することにより実施することができる。添加される被験物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。培養時間としては、例えば、約24時間〜約72時間が挙げられる。
【００２９】
培養の結果、被験物質の存在下および非存在下で培養した変異酵母の培養液中の酵母菌体密度を測定し、比較することにより、該変異酵母の増殖を回復させた被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することができる。
【００３０】
選択された物質が抗がん薬として有用であることを確認するために、標的タンパク質を発現するがん細胞に該物質を接触させ、がん細胞の増殖が抑制されるか否かを試験することができる。該物質のがん細胞との接触は、上記酵母細胞との接触と同様に、がん細胞の培地の中に該物質を添加して、がん細胞を一定時間培養することにより実施することができる。添加される物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。培養時間としては、例えば、約24時間〜約72時間が挙げられる。試験の結果、がん細胞の増殖が抑制された場合には、該タンパク質はがん治療標的タンパク質として有用であると判定することができる。
【００３１】
上述のように、本発明者らは、新規がん治療標的タンパク質としてdynAPを見出した。従って、本発明の抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法における特に好ましいがん治療標的タンパク質はdynAPである。
即ち、好ましい実施態様において、dynAPをコードする核酸を導入した、細胞周期チェックポイント因子、好ましくは紡錘体集合チェックポイント因子、特に好ましくはMad2を欠損する変異酵母を、被験物質の存在下で培養し、該変異酵母の増殖を回復させた被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
【００３２】
dynAPをコードする核酸の好ましい例としては、配列番号：１で表される塩基配列を含むヒトdynAP cDNA（RefSeq Accession No. NM_173629.1）、あるいは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ（例えば、マウス（RefSeq No. AK009098）、ラット（RefSeq No. XM_001055577.1）、チンパンジー（RefSeq No. XM_001134656.1）、イヌ（RefSeq No. XM_848179.1）等）、さらにはそれらのスプライスバリアント、アレル変異体、多型などのcDNAがあげられる。ヒトdynAP cDNAは、例えば、実施例に示されるdynAPを発現するがん細胞（例えば、ACHN細胞など）から、配列番号：１で表される塩基配列に基づいて適当なプライマーもしくはプローブを合成し、RT-PCRやコロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法などの常法を用いて調製することができる。
【００３３】
dynAPをコードする核酸を導入した変異酵母を用いたスクリーニングにより選択された物質が抗がん作用を有することの確認は、実施例に示されるdynAPを発現するがん細胞（例えば、ACHN細胞など）に上記の方法に従って該物質を接触させ、がん細胞の増殖が抑制されるか否かを試験することにより行うことができる。
【００３４】
［３］抗がん薬のスクリーニング方法（ＩＩ）
dynAPはdynactin複合体を構成するタンパク質と相互することによりその生理学的作用を発揮していると考えられることから、当該相互作用を阻害する物質は、dynAPを発現するがんに対して抗がん作用を示すはずである。従って、本発明はまた、dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質とを被験物質の存在下で接触させ、両タンパク質の結合を阻害した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００３５】
dynAPは、例えば、実施例に示されるdynAPを発現するがん細胞（例えば、ACHN細胞など）から、自体公知のタンパク質分離精製技術により単離することができる。あるいは、上記がん治療標的タンパク質のスクリーニング方法や抗がん薬のスクリーニング方法（Ｉ）において使用されるdynAPをコードする核酸を導入した酵母細胞を培養して、その培養物からdynAPタンパク質を回収してもよい。
dynactin複合体を構成するタンパク質としては、例えば、p150Glued、dynamitin（p50）、p24、p62などが挙げられるが、好ましくはp150Gluedまたはdynamitinである。p150Gluedやdynamitinも実施例に示されるdynAPを発現するがん細胞（例えば、ACHN細胞など）から、自体公知のタンパク質分離精製技術により単離することができる。あるいは、例えば、ヒトp150GluedをコードするcDNA（Refseq No. NM_004082.3）、ヒトdynamitinをコードするcDNA（Refseq No. NM_006400.3）を含む発現ベクターを適当な宿主に導入し、得られる形質転換体を培養し、当該タンパク質を回収することによっても調製することができる。
【００３６】
被験物質としては、例えば、蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
【００３７】
dynAPおよびdynactin複合体を構成するタンパク質と被験物質との接触は、例えば、各種緩衝液（例えば、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に、dynAPおよびdynactin複合体を構成するタンパク質と被験物質とを添加して、一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される被験物質の濃度は化合物の種類（溶解度等）により異なるが、例えば、約0.1〜約100μg/mlの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約10分〜約24時間が挙げられる。
結合量の測定は、例えば、標識した抗dynAP抗体およびdynactin複合体を構成するタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロット解析、dynAPまたはdynactin複合体を構成するタンパク質のいずれかを標識（例えば、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで）しての結合アッセイやゲルシフトアッセイ、あるいは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などにより行うことができる。
上記のスクリーニング方法において、dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質との結合を阻害した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することができる。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法（ＩＩ）の第二の態様は、dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質との結合の度合を、いわゆるtwo-hybrid系を用いてレポーター遺伝子の発現を指標として測定するというものである。
本実施態様においては、dynAPをコードするcDNA、あるいはdynactin複合体を構成するタンパク質をコードするcDNAの一方を、GAL4等の転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（BD）との融合蛋白質として発現するように含む発現ベクターと、他方のcDNAを、VP16等の転写因子の転写活性化ドメイン（AD）との融合蛋白質として発現するように含む発現ベクターとを宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を被験物質の存在下及び非存在下に培養して、得られる培養物におけるレポーター遺伝子の発現量を測定・比較する。当該宿主細胞は、BDが認識・結合し得るシスエレメント（BD応答エレメント）をプロモーター領域に含むレポーター遺伝子を担持するものである。細胞内で発現したBD融合蛋白質はBD応答エレメントに結合するが、dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質とが相互作用すれば、BD応答エレメント上にBDとADのhybridが形成され、その下流に位置するレポーター遺伝子の転写が活性化される。
したがって、被験物質の存在下において、非存在下に比べて当該レポーター遺伝子の転写活性が有意に抑制されれば、被験物質を抗がん作用を有する物質の候補として選択することができる。
宿主細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の細胞、就中ヒト由来細胞であることが好ましい。具体的には、COP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH3T3、ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、BHK、CHO等のハムスター由来細胞、COS1、COS3、COS7、CV1、Vero等のサル由来細胞、およびHeLa、293T等のヒト由来細胞などの宿主哺乳動物細胞が例示される。形質転換は、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)に記載の方法を用いることができる。形質転換細胞は、例えば、約5〜20%の胎仔牛血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122巻,501(1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology,8巻,396(1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association,199巻,519(1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などの培地中で培養することができる。培地のpHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30〜40℃で行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
また、宿主細胞として酵母を用いた酵母Two-Hybrid Systemを用いることもできる。
【００３９】
後記実施例に示されるとおり、dynAPの阻害剤は、細胞内のdynAPレベルに依存してp150Gluedをリン酸化し、当該リン酸化によりdynAPとp150Gluedとの相互作用が消失する。従って、p150Gluedのリン酸化を指標として、dynAP阻害剤、すなわち抗がん作用を有する物質の候補を選択することができる。即ち、本発明はまた、dynAPとp150Gluedとを発現する細胞を被験物質と接触させ、p150Gluedのリン酸化を促進した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００４０】
dynAPとp150Gluedとを発現する細胞としては、例えば、実施例に示されるdynAPを発現するがん細胞（例えば、ACHN細胞など）を挙げることができる。あるいは、前記したdynAPをコードするcDNAおよびdynactin複合体を構成するタンパク質をコードするcDNAを、適当な宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞であってもよい。宿主細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の細胞、就中ヒト由来細胞であることが好ましい。具体的には、COP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH3T3、ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、BHK、CHO等のハムスター由来細胞、COS1、COS3、COS7、CV1、Vero等のサル由来細胞、およびHeLa、293T等のヒト由来細胞などの宿主哺乳動物細胞が例示される。
【００４１】
被験物質の上記細胞との接触は、例えば、該細胞の培地や各種緩衝液（例えば、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被験物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される被験物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約10分〜約24時間が挙げられる。
【００４２】
p150Gluedのリン酸化の検出は、例えばリン酸化p150Glued特異的抗体を用いたイムノブロット解析や、基質蛋白質における[32P]標識ATPの取込みをゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより検出する等の方法により行うことができる。
【００４３】
さらに別の態様においては、dynAPを発現する細胞を被験物質と接触させ、以下の（ａ）〜（ｈ）のいずれかの作用を示した被験物質を、抗がん作用を有する物質の候補として選択することを特徴とする、抗がん作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
（ａ）散在したゴルジ装置を含む細胞数を増加させる
（ｂ）Aktの発現および／またはリン酸化を阻害する
（ｃ）GSK3βのリン酸化を阻害する
（ｄ）β-カテニンの発現を阻害する
（ｅ）サイクリンD1、c-MycおよびE-カドヘリンから選択される1以上の遺伝子の発現を阻害する
（ｆ）p53および／またはp21のタンパク質レベルを上昇させる
（ｇ）Mst1、カスパーゼ-8およびPARPから選択される1以上のタンパク質の切断を亢進させる
（ｈ）血清刺激に対する細胞応答を減弱させる
【００４４】
dynAPを発現する細胞としては、例えば、実施例に示されるdynAPを発現するがん細胞（例えば、ACHN細胞など）を挙げることができる。あるいは、前記したdynAPをコードするcDNAを、適当な宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞であってもよい。被験物質の上記細胞との接触は、上記p150Gluedのリン酸化を指標とする場合と同様に行うことができる。散在したゴルジ装置を含む細胞は顕微鏡観察により、Akt、β-カテニン、サイクリンD1、c-Myc、E-カドヘリンの発現はRT-PCRやイムノブロット解析などにより、Akt、GSK3βのリン酸化は、各リン酸化タンパク質に特異的な抗体を用いたイムノブロット解析などにより、p53、p21のタンパク質レベル、Mst1、カスパーゼ-8、PARPの切断はイムノブロット解析などにより、血清刺激に対する細胞応答は、細胞を、試験化合物の存在下、無血清もしくは低血清（例、0-5％、好ましくは0-2％）培地で6-24時間培養した後、血清を添加（例、10-20％）して10-120分インキュベートして細胞形態の変化を観察する（例、α-チューブリンおよび／またはβ-アクチンの局在を免疫染色にて調べる）ことなどにより、それぞれ検出することができる。あるいは、dynAPを発現する細胞に、サイクリンD1遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を導入し、該レポーター遺伝子の発現を指標として、サイクリンD1遺伝子の発現を評価することもできる。
【００４５】
［４］dynAPを発現するがんの治療または予防剤
本発明はまた、dynAPの発現を阻害する物質を含有してなる、dynAPを発現するがんの治療または予防剤を提供する。
dynAP mRNAからタンパク質への翻訳を特異的に阻害する（あるいはmRNAを分解する）物質として、好ましくは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。mRNAの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列とは、哺乳動物の生理的条件下において、該mRNAの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る（あるいは該標的配列を切断する）程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、該mRNAの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、mRNAの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、特に好ましくは約97％以上の相同性を有する塩基配列である。
本発明における「塩基配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
【００４６】
より具体的には、dynAP mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、(a)配列番号：１で表される塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、または(b)「配列番号：１で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする配列」と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列が挙げられる。
ストリンジェントな条件とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
【００４７】
「dynAP mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、該mRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害（あるいは該mRNAを分解）し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約20塩基以上含むものである。
【００４８】
具体的には、dynAP mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸として、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのものが好ましく例示される。
（ａ）dynAPをコードするRNAに対するアンチセンス核酸
（ｂ）dynAPをコードするRNAに対するリボザイム核酸
（ｃ）dynAPをコードするRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
【００４９】
（ａ）dynAPをコードするRNAに対するアンチセンス核酸
本発明における「dynAPをコードするRNAに対するアンチセンス核酸」とは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンや、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００５０】
上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、dynAPの初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、dynAPのcDNA塩基配列とをBLAST、FASTA等のホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
【００５１】
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、タンパク質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。
【００５２】
さらに、本発明のアンチセンス核酸はmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
【００５３】
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
【００５４】
RNAの糖部のコンフォーメーションはC2’-endo（S型）とC3’-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2’酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。
【００５５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、dynAPのcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。
【００５６】
（ｂ）dynAPをコードするRNAに対するリボザイム核酸
dynAP RNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイム核酸が挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。
【００５７】
（ｃ）dynAPをコードするRNAに対するsiRNA又はmiRNA
本明細書においては、dynAPのmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、dynAPのmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。
siRNAは、標的遺伝子のcDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら（Genes Dev., 15, 188-200 (2001)）の提唱する規則に従って設計することができる。siRNAの標的配列としては、例えばAA+(N)19、AA+(N)21もしくはNA+(N)21（Nは任意の塩基）等が挙げられるが、それらに限定されない。標的配列の位置も特に制限されるわけではない。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。例えば、AA+(N)19、AA+(N)21もしくはNA+(N)21（Nは任意の塩基）を標的配列とする場合、特異性の確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19-21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19-21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるショートヘアピンRNA（shRNA）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
【００５８】
siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）及びpSilencerTM Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）、RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるシングルヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【００６０】
本明細書においては、生体内でdynAPのmRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸もまた包含される。そのような核酸としては、上記したshRNAやsiRNAを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば5〜25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAやsiRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより2本鎖のsiRNA（dsRNA）を形成するというものである。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成するというものである。プロモーターとしては、polII系プロモーター（例えば、CMV前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。
このようにして構築したsiRNAもしくはshRNA発現カセットを、次いでプラスミドベクターやウイルスベクターに挿入する。このようなベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミドなどが用いられる。
【００６１】
dynAPのmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療に適用されたり、付加された形態で与えられたりすることができる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端または5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端または5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００６２】
上記（ａ）〜（ｃ）の核酸を含有する医薬はそのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
【００６３】
上記核酸をがんの治療または予防剤として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、本発明の核酸を単独で用いてもよいし、あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入することもできる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
【００６４】
上記（ａ）〜（ｃ）の核酸は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、該核酸と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００６５】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、鼻腔内投与剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記（ａ）〜（ｃ）の核酸を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００６６】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００６７】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。上記（ａ）〜（ｃ）の核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通常0.01〜500mg程度含有されていることが好ましい。
【００６８】
上記（ａ）〜（ｃ）の核酸を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、該核酸を１回量として、通常0.0001〜20mg/kg体重程度を、１日〜６ヶ月に１回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００６９】
本発明はまた、dynAPの機能を阻害する物質を含有してなる、dynAPを発現するがんの治療または予防剤を提供する。
【００７０】
具体的には、dynAPの機能を阻害する物質として、例えば、dynAPに対する中和抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。dynAPは一回膜貫通型の膜タンパク質であることから、好ましくはdynAPに対する中和抗体は、dynAPの細胞外領域を認識するものであり得る。
【００７１】
好ましい一実施態様において、dynAPに対する中和抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
【００７２】
dynAPの機能を阻害する物質は、細胞膜透過性に優れた物質であることが望ましい。したがって、dynAPの機能を阻害するより好ましい物質は、dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質との結合を阻害する、Lipinski's Ruleに見合った低分子化合物である。そのような化合物は、例えば、上述の本発明のスクリーニング法を用いて取得することができる。
【００７３】
dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質、好ましくはp150Gluedまたはdynamitinとの結合を阻害する低分子化合物の具体的な例として、下記式（Ｉ）で表わされる化合物が挙げられる。
【００７４】
【化４】
0005920904.tif 000005
【００７５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それらが付いている環に対して少なくとも１種の置換基を表し、各々の存在につき独立して、水素原子、ヒドロキシ基、ハロゲン、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基、置換基を有していてもよい（Ｃ３−Ｃ６）アルキニル基、置換基を有していてもよい（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル基、置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、チオール基またはシアノ基を表し；
実線と破線は単結合もしくは二重結合を表す。）
【００７６】
本明細書中の「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
【００７７】
本明細書中の「（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルなどが挙げられる。
本明細書中の「（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基」としては、例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブタ−３−エン−１−イル、ペンタ−４−エン−１−イル、へキサ−５−エン−１−イルなどが挙げられる。
本明細書中の「（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル基」としては、例えば、エチニル、プロパ−２−イン−１−イル、ブタ−３−イン−１−イル、ペンタ−４−イン−１−イル、へキサ−５−イン−１−イルなどが挙げられる。
本明細書中の「（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基」としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
本明細書中の「（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基」としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２−エチルブトキシなどが挙げられる。
本明細書中の「（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ基」としては、例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオなどが挙げられる。
本明細書中の「（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル基」としては、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、プロピルスルフィニル、イソプロピルスルフィニル、ブチルスルフィニル、ｓｅｃ−ブチルスルフィニル、ｔｅｒｔ−ブチルスルフィニルなどが挙げられる。
本明細書中の「（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル基」としては、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル、ｓｅｃ−ブチルスルホニル、ｔｅｒｔ−ブチルスルホニルなどが挙げられる。
【００７８】
本明細書中の「置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基」における「（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基」、「置換基を有していてもよい（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基」における「（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基」、「置換基を有していてもよい（Ｃ３−Ｃ６）アルキニル基」における「（Ｃ３−Ｃ６）アルキニル基」、「置換基を有していてもよい（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基」における「（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基」、「置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基」における「（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基」、「置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ基」における「（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ基」、「置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル基」における「（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル基」、および「置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル基」における「（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル基」は、それぞれ置換可能な位置に１から５個、好ましくは１から３個の置換基を有していてもよい。
このような置換基としては、例えば、
（１）ハロゲン、
（２）ヒドロキシ基、
（３）アミノ基、
（４）ニトロ基、
（５）シアノ基、
（６）置換基を有していてもよいイミノ基、
（７）置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ３）アルキリデン基、
（８）ハロゲン化されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基、
（９）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルオキシ基、
（１０）（Ｃ６−Ｃ１４）アリールオキシ基、
（１１）（Ｃ７−Ｃ１６）アラルキルオキシ基、
（１２）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ基、
（１３）ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ基、
（１４）（Ｃ６−Ｃ１４）アリールアミノ基、
（１５）ジ（Ｃ６−Ｃ１４）アリールアミノ基、
（１６）（Ｃ７−Ｃ１６）アラルキルアミノ基、
（１７）ジ（Ｃ７−Ｃ１６）アラルキルアミノ基、
（１８）Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｎ−（Ｃ６−Ｃ１４）アリールアミノ基、
（１９）Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｎ−（Ｃ７−Ｃ１６）アラルキルアミノ基、
（２０）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボニルアミノ基、
（２１）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ基、
（２２）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル基、
（２３）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル基、
（２４）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニルオキシ基、
（２５）エステル化されていてもよいカルボキシ基、
（２６）置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボニル基、
（２７）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボニルオキシ基、
（２８）（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル基、
（２９）置換基を有していてもよい（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−カルボニル基、
（３０）（Ｃ７−Ｃ１６）アラルキル−カルボニル基、
（３１）（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ−カルボニル基、
（３２）複素環−カルボニル基、
（３３）カルバモイル基、
（３４）チオカルバモイル基、
（３５）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルバモイル基、
（３６）ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルバモイル基、
（３７）１から３個の（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−カルバモイル基、
（３８）ジ（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−カルバモイル基、
（３９）スルファモイル基、
（４０）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルファモイル基、
（４１）ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルファモイル基、
（４２）（Ｃ６−Ｃ１４）アリールスルファモイル基、
（４３）ジ（Ｃ６−Ｃ１４）アリールスルファモイル基、
（４４）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、
などからなる群が挙げられる。
【００７９】
「置換基を有していてもよいイミノ基」としては、例えば、
（１）ヒドロキシ基；または
（２）(i)カルボキシ基、
(ii)（Ｃ６−Ｃ１４）アリール基（例、フェニル）、
(iii)（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ−カルボニル基（例、エトキシカルボニル）、および
(iv)（Ｃ１−Ｃ３）アルキリデン基（例、メチリデン）
からなる群から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ）；
で置換されていてもよいイミノ基が挙げられる。
【００８０】
「置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ３）アルキリデン基」の「（Ｃ１−Ｃ３）アルキリデン基」としては、例えば、メチリデン（ＣＨ２＝）、エチリデン（ＣＨ３ＣＨ＝）、プロピリデン（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ＝）が挙げられる。
該「（Ｃ１−Ｃ３）アルキリデン基」は、置換可能な位置に１から３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、エステル化されていてもよいカルボキシ基などが挙げられる。
【００８１】
「置換基を有していてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボニル基」の「（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボニル基」は、置換可能な位置に１から５個、好ましくは１から３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、
（１）ハロゲン；
（２）ヒドロキシ基；
（３）（i）ハロゲン（例、フッ素）、
（ii）ヒドロキシ基、
（iii）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基（例、シクロプロピル）、および
（iv）ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ基（例、ジメチルアミノ）、
からなる群から選択された１から３個の置換基で置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基；
（４）アミノ基；
（５）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ基；
（６）ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ基；
（７）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ基；
（８）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル基；
（９）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基；
（１０）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボニル基；
（１１）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボニルオキシ基；
（１２）エステル化されていてもよいカルボキシ基；
などが挙げられる。
【００８２】
「置換基を有していてもよい（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−カルボニル基」の「（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−カルボニル基」は、置換可能な位置に１から５個、好ましくは１から３個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、
（１）ハロゲン（例、フッ素）；
（２）ヒドロキシ基；
（３）ハロゲン化されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基;
（４）（i）ハロゲン（例、Ｆ）、
（ii）ヒドロキシ基、
（iii）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基（例、シクロプロピル）、および
（iv）ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ基（例、ジメチルアミノ）
からなる群から選択された１から３個の置換基で置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ基；
（５）アミノ基；
（６）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ基；
（７）ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ基；
（８）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ基；
（９）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル基；
（１０）（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル基；
（１１）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボニル基；
（１２）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボニルオキシ基；
（１３）エステル化されていてもよいカルボキシ基；
などが挙げられる。
【００８３】
好ましくは、dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質との結合を阻害する化合物は、下記式（ＩＩ）で表される。
【００８４】
【化５】
0005920904.tif 000006
【００８５】
（式中、実線と破線は単結合もしくは二重結合を表す。）
【００８６】
本発明はまた、下記式（ＩＩＩ）で表される新規化合物を提供する。
【００８７】
【化６】
0005920904.tif 000007
【００８８】
当該化合物は、例えば、冬虫夏草菌Isaria sp. NBRC 104353（独立行政法人  製品評価技術基盤機構（NITE）  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（NBRC）、〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8より購入可能）の培養抽出液から、dynAPの過剰発現による酵母細胞の増殖阻害の回復活性を指標として、単離精製することができる。
【００８９】
式（Ｉ）で表される化合物は遊離体であっても塩の形態であってもよい。該化合物の塩としては、薬理学的に許容しうる塩等が挙げられ、例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ケイ皮酸、フマル酸、ホスホン酸、塩酸、硝酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、スルファミン酸、硫酸等の酸との酸付加塩；例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の金属塩；例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン等の有機塩基との塩等が挙げられる。
【００９０】
式（Ｉ）で表される化合物（化合物（Ｉ）ともいう）はプロドラッグの形態であってもよい。化合物（Ｉ）のプロドラッグとは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により化合物（Ｉ）に変換する化合物、すなわち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして化合物（Ｉ）に変化する化合物、胃酸等により加水分解などを起こして化合物（Ｉ）に変化する化合物をいう。化合物（Ｉ）のプロドラッグとしては、化合物（Ｉ）のアミノ基がアシル化、アルキル化またはリン酸化された化合物（例えば、化合物（Ｉ）のアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソール−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化またはｔｅｒｔ−ブチル化された化合物など）、化合物（Ｉ）の水酸基がアシル化、アルキル化、リン酸化またはホウ酸化された化合物（例えば、化合物（Ｉ）の水酸基がアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、サクシニル化、フマリル化、アラニル化またはジメチルアミノメチルカルボニル化された化合物など）、あるいは、化合物（Ｉ）のカルボキシ基がエステル化またはアミド化された化合物（例えば、化合物（Ｉ）のカルボキシ基がエチルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化またはメチルアミド化された化合物など）等が挙げられる。これらの化合物は自体公知の方法によって化合物（Ｉ）から製造することができる。
【００９１】
また、化合物（Ｉ）のプロドラッグは、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような、生理的条件で化合物（Ｉ）に変化するものであってもよい。
【００９２】
化合物（Ｉ）が、光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体等の異性体を有する場合には、いずれか一方の異性体も、異性体の混合物も化合物（Ｉ）に包含される。例えば、化合物（Ｉ）に光学異性体が存在する場合には、ラセミ体から分割された光学異性体も化合物（Ｉ）に包含される。これらの異性体は、自体公知の合成手法、分離手法（濃縮、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶など）によりそれぞれを単品として得ることができる。
【００９３】
化合物（Ｉ）は、結晶であっても無晶形であってもよい。化合物（Ｉ）が結晶である場合、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても化合物（Ｉ）に包含される。結晶は、自体公知の結晶化法を適用して、結晶化することによって製造することができる。
【００９４】
化合物（Ｉ）は、溶媒和物（例えば、水和物等）であっても、無溶媒和物であってもよく、いずれも化合物（Ｉ）に包含される。
【００９５】
化合物（Ｉ）は、同位元素（例、３Ｈ，１４Ｃ，３５Ｓ，１２５Ｉなど）などで標識されていてもよい。
【００９６】
化合物（Ｉ）は、例えば、図１に示される市販の化合物などを原料として、自体公知の有機合成法により製造することができる。
【００９７】
dynAPに対する中和抗体や、dynAPとdynactin複合体を構成するタンパク質、好ましくはp150Gluedまたはdynamitinとの結合を阻害する低分子化合物を含有する医薬は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
【００９８】
上記の抗体や低分子化合物は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００９９】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、鼻腔内投与剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体もしくは低分子化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
【０１００】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【０１０１】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体や低分子化合物は、投薬単位剤形当たり通常0.1〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。
【０１０２】
上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、抗体もしくは低分子化合物を1回量として、通常0.0001〜20mg/kg体重程度、低分子化合物であれば１日１〜５回程度、経口または非経口で、抗体であれば１日〜数ヶ月に１回、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【０１０３】
［５］がんの診断剤・診断方法
本発明はまた、dynAPのN末端領域を認識する抗体を含有してなる、dynAPを発現するがんの診断剤を提供する。dynAPのC末端領域を認識する抗体は公知であるが、本発明で提供されるdynAPのN末端領域を認識する抗体は、がん細胞におけるdynAPの発現をより高感度・高精度に検出することができる。より好ましくは、本発明の診断用抗体は、配列番号：２で表されるヒトdynAPの19-32位のアミノ酸配列を特異的に認識するものである。
さらに、dynAPは神経芽細胞腫、前立腺がんおよび腎細胞がんで特に高頻度に発現することから、これらのがんの診断に特に有用である。従来、dynAPがこれらのがんで高頻度に発現しているとの報告はない。したがって、本発明はまた、被験者由来の生体試料におけるdynAPの発現量を測定することを特徴とする、神経芽細胞腫、前立腺がんまたは腎細胞がんの診断方法を提供する。
本発明によれば、dynAPはC末端領域が細胞膜から突出している。従って、例えばPET診断などの抗dynAP抗体のインビボ投与によるdynAP高発現組織の検出を目的とする場合、抗dynAP抗体としてはdynAPのC末端領域を認識する抗体がむしろ好ましい。
【０１０４】
本発明の診断用抗体を用いる本発明の検査方法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。
【０１０５】
被験試料は特に限定されず、例えば、患者から採取した生検サンプルが挙げられるが、検出可能な範囲で、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、など生体から容易に採取できるものを用いることもできる。
【０１０６】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。
【０１０７】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
【０１０８】
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被験試料を反応させ（1次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（2次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被験試料中の本発明のペプチド量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
【０１０９】
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
競合法では、被験試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原（B）とを分離し（B/F分離）、B，Fいずれかの標識量を測定し、被験試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被験試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被験試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被験試料中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被験試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【０１１０】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
【０１１１】
上記の検査方法により、dynAPを発現するがんであると判定されたがん患者に、上記のdynAPの発現もしくは機能を阻害する物質を含有してなる、がん治療剤を使用することができる。当該治療剤はがん細胞におけるdynAPレベル依存的に治療効果を発揮するので、投与対象となるがん患者がdynAPを発現するがんを有することを事前に確認しておくことは重要である。
【実施例】
【０１１２】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。
【０１１３】
［材料と方法］
１．プラスミド、細胞培養およびトランスフェクション
出芽酵母におけるヒトcDNAのスクリーニングに使用したプラスミドはGatewayクローニングシステム（Invitrogen）を用いて構築した。エントリーベクター上の約10,000クローンをpYES-DEST52（Invitrogen）に導入した。GFPもしくはV5でタグ化したdynAPのヒト細胞における発現用に、pcDNA-DEST53もしくはpcDNA-DEST54（Invitrogen）ベースのプラスミドを、同システムを用いて構築した。標準的なPCR法を用いて、dynAP、Akt1、サイクリンD1、Mst1の全長cDNA、活性化Mst1（N末端の326アミノ酸）をコードするDNA断片をそれぞれpFLAG-CMV2（Sigma）にサブクローニングし、pFLAG-dynAP、pFLAG-Akt1、pFLAG-cyclinD1、pFLAG-Mst1 FullおよびpFLAG-Mst1N WTを得た。機能欠損型Mst1N発現用ベクター（pFLAG-Mst1N KD）は、pFLAG-Mst1N WTをテンプレートとし、Quikchange (Stratagene) キットを用いて、K59R変異を導入することにより作製した。サイクリンD1およびAktの安定発現株の作製用ベクターには、pEGFP-N1（Clonetech）のKan/Neo耐性遺伝子をPCR増幅してpFLAG-CMV2に導入した。安定発現HeLa細胞株は終濃度750μg/mlのG418含有培地で選択した。本発明で使用した酵母変異株は野生型BY4742株から派生したものであり、サッカロミセス・ゲノム欠失プロジェクト（www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/project_desc.html）により構築された。出芽酵母に標準的な技術と培地を用いた。ヒト細胞株：ACHN, Caki-1, CoLo205, DLD-1, Kato III, KB, LNCap.FGC, MCF-7, MKN7, SW480およびWiDr-TCはthe Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku Universityから；HCC38, HCT-116, MDA-MB-231, MDA-MB-468およびSH-SY5Yはthe American Type Culture Collectionから；A549, HEK293, HT1080, HUC-Fm, KMST-6, NB-1, NH-12, SK-MEL-26, VA-13およびWI-38はthe RIKEN Bioresource Centerから；KYSE150, SW13およびU-251MGはthe Japanese Collection of Research Bioresourcesから；Saos2はR. Takahashi (Doshisha Women’s College of Liberal Arts)から；HeLaはT. Nishio (Kinki University) から、それぞれ分与された。ヒト細胞は、10% FCS, 100 U/ml ペニシリンおよび100 μg/ml ストレプトマイシン (Nacalai Tesque) を添加したRPMI1640, MEM, DMEM (Nacalai Tesque), MEM-ALPHAまたはMcCoy’s 5A (Gibco) 中で維持した。ネオマイシン耐性細胞の選択用には、上記培地に400-750 μg/ml ジェネティシン(Wako) をさらに添加した。Lipofectamine 2000またはLTX (Invitrogen) を製造者のプロトコールに従って用い、細胞をプラスミドでトランスフェクトした。
【０１１４】
２．化学物質
図１に使用した8種の化合物の構造式を示す。化合物#5は、冬虫夏草菌Isaria sp. NBRC 104353（独立行政法人  製品評価技術基盤機構（NITE）  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（NBRC）、〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8から購入した）の培養抽出液から、活性を指標にして単離した。Isaria sp. NBRC 104353をポテト-デキストロース培地（24 g/l ポテト-デキストロース；BD Biosciences, San Jose, CA, USA）15 mlを含む50 ml試験管中で培養した。該試験管を往復振とう培養機（355 rpm）を用いて27℃で3日間振とうした。培養液（1 ml）をオートミール（Quaker, Chicago, IL, USA）3 gおよびV8 Mix Juice (Campbell Soup Company, Camden, NJ, USA) 10 mlからなる固形培地を含む100 ml三角フラスコに移し、27℃で14日間静置培養した。培養物（20フラスコ）を80%アセトンで抽出した。減圧濃縮後、水性濃縮物を酢酸エチル100 mlで3回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固させた。乾燥残渣（0.58 g）を順相中圧液体クロマトグラフィー（MPLC; Purif-Pack SI 60 μm, size:60, Moritex, Tokyo, Japan）に供し、n-ヘキサン-酢酸エチルおよびクロロホルム-メタノールでステップワイズに連続的に溶出し、クロロホルム-メタノール（19:1）溶出液中に活性フラクション（73.0 mg）を得た。活性フラクションを、クロロホルム-メタノール (99 : 1, 49 : 1, 連続的) を用い、順相カラムで再クロマトグラフした。最後に、活性フラクション（9.5 mg）を、0.1% 蟻酸を含む80%メタノール-水を展開したSenshu Pak PEGASIL ODS column (20 i.d. × 150 mm; Senshu Scientific, Tokyo, Japan) を用いた分取逆相HPLC（流速：10 ml/min）によって精製し、化合物#5（3.4 mg、保持時間19.7分）を得た。
化合物#5は無色不定形の固体として得られ（([α]24D+4.0°, c 0.12, in MeOH; UV λ240 nm, sh, in MeOH）、HR-エレクトロスプレーイオン化（ESI）-MSにより、その分子式はC28H42O6と決定された（m/z 475.3078, C28H43O6の理論値：475.3060）。化合物#5のIR（νmax 1714 cm-1）スペクトルからカルボニル基の存在が示唆された。各プロトンおよび炭素間の直接結合性を、異核単一量子相関（HSQC）スペクトルより決定した。化合物#5の13Cおよび1H NMRスペクトルデータを表１に示す。
【０１１５】
【表１】
0005920904.tif 000008
【０１１６】
他のエルゴスタン関連化合物はSigma (#4, #6および#7)、Nacalai Tesque (#1および#2) 並びにTokyo Kasei Kogyo (#3) からそれぞれ購入した。化合物#8は、化合物#6（0.6 mg）を1 M水酸化ナトリウムで処理することによって得た。酸性化した後、粗生成物を、酢酸エチル-ヘキサンの勾配（1:4, 1:1および1:0）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物#8（0.5 mg）を得た。
[α]D+115 (c 0.013, MeOH); CD (MeOH) Δε302 +0.58, Δε201 +5.6; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δH0.62 (3H, s, H3-18), 0.77 (3H, d, J= 7.0 Hz, H3-21), 0.78 (3H, d, J= 7.0 Hz, H3-26), 0.85 (3H, d, J= 7.0 Hz, H3-27), 0.87 (3H, d, J= 7.0 Hz, H3-28), 1.02 (3H, s, H3-19), 2.23 (1H, d, J = 12.1 Hz, H-12), 2.48 (1H, ddd, J = 13.5, 3.5, 3.5 Hz, H-9), 2.52 (1H, d, J = 12.1 Hz, H-12), and 3.57 (1H, m, H-3); HRESITOFMS m/z 439.3559 [M+Na]+ (Calcd for C28H48O2Na: 439.3552)
Z-VAD-FMKはBioMolから、LY294002はCayman Chemical Co.からそれぞれ購入した。化合物#5およびZ-VAD-FMK はDMSOに溶解し、他の化合物はエタノールに溶解した。これらの化合物の細胞に及ぼす効果を試験する際は、DMSOまたはエタノールの終濃度をそれぞれ1%および0.25%となるように調整した。コントロール実験はこれらの濃度の溶媒のみで実施した。
【０１１７】
３．抗dynAP抗体
合成14-merペプチド（dynAPの19-32位のアミノ酸に相当）に対するウサギポリクローナル抗体を、旭硝子に委託して作製した。抗体は、抗原ペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いて精製した。dynAPのC末端領域（143-210位のアミノ酸に相当）に対するウサギポリクローナル抗体（HPA011148）はSigmaから購入した。
【０１１８】
４．細胞抽出液の調製とイムノブロッティング
回収した細胞をPBS（Sigma）で1回リンスし、1 mM PMSFおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Nacalai Tesque）を含む溶解バッファー（CytoBuster Protein Extract Reagent; Novagen）中で溶解した。細胞溶解物を氷上で15分間インキュベートし、13,000×gで15分間遠心分離した。
以下の一次抗体を用いた：抗α-チューブリン抗体（Dr. Andrea Baines, Sir William Dunn School of Pathology, UNIVERSITY OF OXFORDより供与された）；抗カスパーゼ-8抗体および抗PARP抗体（BD PharMingen）；抗E-カドヘリン抗体、抗p150Glued抗体、抗dynamitin抗体および抗GM130抗体（BD Transduction Laboratories）；抗Mst1抗体（Cell Signaling Technology）；抗GFP抗体（Roche）；抗V5抗体（MBL）；抗Akt抗体（Epitomics Inc.）；抗リン酸化Akt抗体（Epitomics Inc.）；抗GSK3β抗体（Calbiochem）；抗リン酸化GSK3β抗体（Epitomics Inc.）；抗β-カテニン抗体（MBL）；抗サイクリンD1抗体（Santa cruz biotechnology Inc.）；抗p53抗体（Santa cruz biotechnology Inc.）；抗p21抗体（Cell signaling technology）；抗S6K抗体（Epitomics Inc.）；抗リン酸化S6K抗体（Epitomics Inc.）。
二次抗体として、HRP標識したヤギ抗マウスまたは抗ウサギIgG抗体（(BioSource）を用いた。IgGバンドの強度を減弱する必要のある場合は、TrueBlot抗マウスまたは抗ウサギIgG-HRP（eBioscience）を二次抗体として用いた。
【０１１９】
５．共免疫沈降
抗c-myc抗体 (Covance)、p150Glued、dynamitinおよびdynAP、あるいはpreimmune serumを、ExtraCruz IP Matrix (Santa Cruz Biotechnology Inc.)を用いて2時間予備インキュベーションした。溶解バッファーで3回洗浄後、100-500 μgの細胞抽出液を加え、さらに2時間インキュベートした。免疫沈降物を溶解バッファーで3回洗浄後、イムロブロット解析に供した。
【０１２０】
６．細胞分画
基本的にJ Biol Chem 275: 32482-32490 (2000)に記載の方法に従った。約1×106 のACHN細胞を用いた。超遠心処理はHimac CS-150GXL (Hitachi) とS140AT ローターを用いて行った。
【０１２１】
７．RT-PCR
RNeasy Mini Kit (Qiagen) を製造者のプロトコルに従って用い、全RNAを単離した。RT-PCRは、全RNA各0.8 mgとdynAP cDNA全長を増幅するプライマーを用い、ReverTra Ace-α (Toyobo) にて行った。内部標準としてGAPDH mRNAを用いた。使用したプライマーは以下の通りである。
dynAP
5'-ATGGTTGCAGATATAAAGGG-3' (forward)（配列番号：３）
5'-TTATAAATGATCGGTAGGTG-3' (reverse)（配列番号：４）
GAPDH
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (forward)（配列番号：５）
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (reverse)（配列番号：６）
サイクリンD1
5’- CCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTTCATTTC -3’ (forward)（配列番号：７）
5'- TTAGATGTCCACGTCCCGCA -3' (reverse)（配列番号：８）
E-カドヘリン
5’- TTGAGCACGTGAAGAACAGC -3’ (forward)（配列番号：９）
5'- GGCGTTGTCATTCACATCAG -3' (reverse)（配列番号：１０）
【０１２２】
８．免疫蛍光顕微鏡観察
poly-L-Lys-コーティングしたスライドガラス（IWAKI）上で増殖させたヒト細胞を、70％メタノールまたは3％パラホルムアルデヒドで10分間固定し、1% BSAおよび0.1% Triton X-100 (Nacalai Tesque)を含むPBSで、30分間ブロッキング、浸透した。不透過条件では、上記バッファーからTriton X-100を除いた。次いで、細胞をバッファーで適当に希釈したα-tubulin、β-tubulin (Lab Vision)、β-actin、FLAG、GM130およびp150Gluedに対する抗体と1時間インキュベートした。二次抗体として、Cy3もしくはAlexa488 (Invitrogen) 標識したロバ抗ウサギもしくは抗マウス抗体(Jackson ImmunoResearch)を用い、上記バッファーで希釈して1時間反応させた。V5でタグ化したdynAPの染色には、Cy3標識した抗V5抗体を用いた。最後にDNAを4’6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で染色した。Axioskop 2 plus microscope (Carl Zeiss)を用いて画像化した。
【０１２３】
９．フローサイトメトリー
トリプシン処理後、細胞を遠心してペレット状にし、氷冷70％エタノールで固定した。エタノールを除去した後、細胞を2.5 μg/ml propidium iodideおよび0.5 mg/ml RNaseA (Nacalai Tesque)を含有するPBSに再懸濁し、JSAN Cell Sorter (Bay Bioscience)を用いて分析した。
【０１２４】
１０．dynAPの結合パートナーの探索
Anal Chem 74: 4725-4733 (2002)に記載の方法に従った。FLAGでタグ化したdynAPを一過的に発現するHeLa細胞およびHEK293細胞から調製した抽出液を、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降させた後、FLAGペプチドで溶出した。Lys-Cエンドペプチダーゼで溶出タンパク質を消化した後、得られたペプチドを高感度ダイレクトナノフローLC-MS/MS法を用いて解析した。配列決定したペプチドをデータベースで検索して、dynamitinをHeLa細胞およびHEK293細胞におけるdynAPの結合パートナーとして予測した。
【０１２５】
１１．dynAPのshRNAノックダウン
下記のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR（Invitrogen）にクローニングし、pdynAP_shRNA_1を得た。
センス：5’-TGCTGTTGAGCTGCCAGTATCACAAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTTGTGATTGGCAGCTCAA-3’
（配列番号：１１）
アンチセンス：5’-CCTGTTGAGCTGCCAATCACAAGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCTTGTGATACTGGCAGCTCAAC-3’
（配列番号：１２）
pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miRに導入したpcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR-neg control（Invitrogen）を対照として用いた。得られたプラスミドを常法によりHeLa細胞に導入した後、細胞抽出液をイムノブロット分析に供した。
【０１２６】
１２．血清刺激
血清不含培地で細胞を24時間培養した後、10％ FBSを添加し、30分後に細胞をメタノールで固定し、抗α-tubulin抗体、抗β-actin抗体で染色した。
【０１２７】
［結果］
１．酵母を用いたヒトタンパク質と低分子化合物のスクリーニング
誘導性GAL1プロモーターの制御下にある約10,000のヒトcDNAを、野生型酵母および紡錘体集合チェックポイントの主要調節因子であるMad2を欠失する変異酵母に導入した。次に、本発明者らは、該変異酵母の増殖を阻害するが野生型酵母の増殖を阻害しないcDNAを調査した。いくつかのポジティブなcDNAの中から、本発明者らは、C18orf26遺伝子座にコードされる推定上のタンパク質を調べることに決定した。他の紡錘体チェックポイント因子Mad1, Mad3およびBub3を欠損する変異酵母におけるこのタンパク質（以下、dynAPと略記する）の発現は、Mad2欠損細胞と同じ表現型を示した（図1A）。酵母の増殖が阻害される分子機構は大部分が不明のままであるが、dynAP起因性の増殖阻害を回復させ得る低分子化合物は、治療薬の候補になり得るだけでなく、ヒト細胞におけるdynAPの機能に関する研究にも有用であろうから、本発明者らはそのような化合物の探索を試みた。即ち、dynAPを発現するMad2欠損細胞の増殖を回復させる低分子を得るべく、真菌および細菌の培養から調製された培養液をスクリーニングした。その結果、主たるヒット化合物として、新規なエルゴステロール関連化合物 (3β,12β,14β,16β)-22,23-epoxy-3,12,14,16-tetrahydroxyergosta-5,7-dien-11-one (BIR-14と命名; 図1Bの#5) が同定された。その類縁体をさらに研究した結果、化合物#4、#7および#8が酵母の増殖を回復させることができた（図1Bおよび1C）。
【０１２８】
２．dynAPの特性解析
dynAP cDNAのヌクレオチド配列から、分子量22.5 kDaの、膜貫通ドメイン（アミノ酸113-133）およびスレオニンリッチドメイン（アミノ酸172-207）を含む210アミノ酸残基のタンパク質をコードするmRNAが予測される（図2A）。アミノ酸配列のアライメントから、これらのドメインは哺乳動物間で高度に保存されていることが分かった（図2B）。酵母、ハエおよび線虫では相同性のある遺伝子は見出されなかった。
dynAP中のペプチド（図2A）に対するポリクローナル抗体と、GFP標識したdynAPを安定発現するHeLa細胞とを用いて、dynAPの発現を試験した。抗dynAP抗体によりGFPタグ化dynAPに相当する70 kDaのバンドと、内因性dynAPと思われる45 kDaのバンドが検出され、一方、抗GFP抗体によってもGFPタグ化dynAPに相当する70 kDaのバンドが検出された（図3A）。尚、市販の抗dynAP抗体（HPA011148）について、FLAG標識したdynAPを一過的に発現させたHeLa細胞を用いて同様の実験を行ったところ、当該抗体を用いた場合ラダー状の多数のバンドが検出され、抗FLAG抗体によるバンドパターンと一致しなかったことから、以後の実験では、すべて新規に作製したN末端側を認識する抗dynAP抗体を使用した。
次に、抗dynAP抗体を用いて、種々のヒトがん細胞株におけるdynAPの発現を調べた。その結果、試験した40のヒトがん細胞株のうち、ACHNやHeLaを含む19細胞株（47.5%）が45 kDaのサイズのdynAPを発現していた（図3B、表2）。
【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
dynAP発現のがん種特異性を検討した結果、神経芽細胞腫と前立腺がん、腎細胞がんでの中〜高発現率が、それぞれ4/4、3/3、2/2であり、母数は少ないが、特異的な発現を示唆した（表３）。
【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
HeLa細胞はこのタンパク質を比較的低レベルで発現していたが、DLD-1を含む他の細胞株はほとんど検出限界以下でしかこのタンパク質を発現していなかった。イムノブロット分析と一致して、dynAP mRNAの発現はACHNおよびCaki-1細胞で豊富で、HeLa細胞ではもっと少なく、DLD-1細胞ではほとんど検出できなかった（図3C）。dynAPのサイズ（45 kDa）は、そのヌクレオチド配列から予測されるサイズよりずっと大きかった。SDS-PAGEは還元条件下で実施したので、このdynAPの大きなサイズは、ジスルフィド結合を介したダイマー形成ではなく、他の翻訳後修飾によるのかもしれない。
次に、GFP標識したdynAPを発現するHeLaおよびKMST-6細胞を用いて、dynAPの局在化を調べた。アミノ酸配列に基づく予測と一致して、GFP標識タンパク質は原形質膜に局在していた（図4A）。特に、dynAPは細胞と細胞の境界に非常に密に集中していた。さらに、GFP標識タンパク質の局在は、ゴルジマーカータンパク質であるGM130の局在と重複しており、dynAPが核周辺のゴルジ膜にかなり集中していることがわかった（図4B）。
dynAPの細胞での機能に関する手掛りを得るべく、本発明者らは、FLAGでタグ化したdynAPを発現するHeLaおよびHEK293細胞由来の免疫沈降物を分析することにより、dynAPと結合し得るタンパク質を探索した。dynAPとβ-チューブリンおよびp150Gluedとの共局在が観察されたことは（図4CおよびD）、dynAPが後述するようにdynactin構成成分と相互作用するという観察結果と一致した。p150Gluedは細胞質dyneinモーター、微小管およびオルガネラ間の相互作用に介在するdynactin多タンパク質複合体のサブユニットである。細胞内分布の生化学的分析により、dynAPが膜タンパク質であるとの顕微鏡観察の結果が確認された（図4E）。
dynamitin（dynactin 2またはp50としても知られる）はどちらの細胞種でもdynAPと相互作用すると予測された。dynamitinはdynactin複合体の主要な構成成分である。dynactinはdynein複合体を形成し、細胞内カーゴを輸送するマイナス端指向性微小管モーターとして機能する。dynactin複合体と微小管との相互作用はまた、ゴルジ装置を核周辺領域に維持するのにも必要である。dynAPと2つのdynactin構成成分（dynamitinおよびp150Glued）との物理的相互作用が免疫化学的に実証された（図5）。dynAPとdynactin構成成分との共免疫沈降は他の細胞株でも観察された（図6）。GFP-dynAPはp150Gluedと共局在するので（図4D参照）、dynAPは細胞内でこれらのdynactin構成成分と結合している可能性が高い。
【０１３３】
３．ヒト細胞に及ぼす低分子化合物の効果
次に、本発明者らは、選択された化学物質のヒト癌細胞に及ぼす効果を試験した。ACHN細胞を化合物#4または#8の存在下で培養すると細胞数が減少したが、その他の化合物では影響がなかった（図7A）。
フローサイトメトリー分析の結果、アポトーシスにおけるDNA断片化の指標であるsub-G1フラクションが、化合物#4の存在下で培養した後に増加することが明らかとなった（図7Bおよび図8）。プロカスパーゼとPARPの切断はアポトーシス細胞死の分子的特徴である。ACHN細胞を化合物#4または#8で処理すると、切断された形態のカスパーゼ-8とPARPを生じるが、これらはその他の化合物で処理した後では検出されなかった（図7C）。
化合物#4により誘導されるアポトーシスがdynAPレベルに依存するか否かを調べるために、ACHN、HeLaおよびDLD-1細胞（それぞれdynAPを高発現、低発現および非常に低発現している、図3B参照）を化合物#4で処理した。ACHN細胞のsub-G1フラクションは、低用量（5 μM）の化合物#4で増加したのに対し、DLD-1細胞のsub-G1フラクションは、高用量（25 μM）の化合物#4でも非常に低いままであった（図7Dおよび図9）。HeLa細胞は、化合物#4に対する感受性に関してACHN細胞とDLD-1細胞との中間であり、dynAPレベルとよく相関した。同様に、カスパーゼ-8とPARPの切断を検出することによっても、dynAPレベルと化合物#4に対する感受性との間の密接な相関が認められた（図7E）。スタウロスポリンはDLD-1細胞においてカスパーゼ-8を活性化したことから（図10）、この細胞においてカスパーゼ-8の切断が検出されないのは、このアポトーシス経路の欠失によるものではない。
カスパーゼ-8介在性のアポトーシスに関与する既存の分子の中で、本発明者らは、化合物#4がACHNおよびHeLa細胞においてMst1の切断を引き起こすが、DLD-1細胞では引き起こさないことを見出した（図11A）。Mst1はユビキタスに発現するセリン−スレオニンキナーゼであり、出芽酵母のSte20と相同性を有する。カスパーゼが介在するMst1の切断によりC末端調節ドメインが除去され、高活性のMst1が得られる。全てのカスパーゼの阻害剤であるZ-VAD-FMKは、カスパーゼ-8およびPARPの切断だけでなくMst1の切断も減弱させた（図11B）。プロカスパーゼ-8およびMst1の切断は、HeLa細胞内のGFP-dynAPの発現により刺激され（図11CおよびD）、一方、dynAPをshRNAによりノックダウンすると、化合物#4依存的なカスパーゼ-8およびPARPの切断が抑制された（図11E）。これらの結果は、dynAPレベルが細胞を化合物#4に対してより感受性にするという仮説とよく一致する。タイムコース実験により、Mst1の切断はプロカスパーゼ-8およびPARPの切断と同時に起こることが示された（図11F）。
ゴルジ装置の核周辺部への位置決めは、dynein-dynactin複合体を含む、微小管細胞骨格および微小管モータータンパク質によって高度に制御されている。dynAPがdynactin構成成分と相互作用し、ゴルジ装置に局在することから、本発明者らは、上記化合物のゴルジの位置決めに及ぼす効果を試験した。ACHN細胞を化合物#4または#8で処理すると、散在したゴルジ装置を含むACHN細胞が有意に増加したが、その他の化合物で処理した場合は増加は認められなかった（図12Aおよび図13A）。化合物#4により誘導されるアポトーシスと一致して、ゴルジ断片化はdynAPの発現レベルに依存し、dynAPの発現が高いほど化合物#4に対する感受性が高くなった（図12Bおよび図13B）。
タイムコース実験の結果、散在したゴルジ装置を含むACHN細胞数の増加は、HeLa細胞に比べて早い時間に起こるのに対し、散在したゴルジ装置を含むDLD-1細胞は観察されなかった（図12C）。特に、ゴルジ断片化は10時間以内に最大に達したのに対し、カスパーゼ-8の活性化は当該期間内ではほとんど検出されなかったことから、ゴルジ装置の断片化は化合物#4により誘導されるカスパーゼの活性化に先行していた。カスパーゼ阻害剤（Z-VAD-FMK）は化合物#4により誘導されるアポトーシス事象を阻害したが（図11B参照）、ゴルジ断片化は阻害せず（図14）、当該断片化がカスパーゼ活性化の開始前に起こるという上記観察結果と一致した。
本発明者らはまた、ACHN細胞ではp150Gluedが化合物#4で処理した後にリン酸化されるのに対し、DLD-1細胞ではそのような効果が観察されないことを見出した（図12D）。当該リン酸化に対応して、p150GluedとdynAPとの間の相互作用が消失した（図12E）。p150Gluedのリン酸化は微小管へのそのアフィニティーを低下させることが示されており、そのことがゴルジ断片化に寄与しているかもしれない。p150GluedとdynAPとの相互作用が、化合物#4により誘導されるp150Gluedのリン酸化を何らかの形で促進し、それによってゴルジ断片化を誘発する可能性がある。
本発明者らは、2つの正常線維芽細胞株（臍帯由来のHUC-fmおよび肺由来のWI-38）並びにSV-40でトランスフォームしたWI-38VA-13細胞株を試験した。正常細胞は非常に低レベルでしかdynAPを発現していなかったが、トランスフォームされた細胞では実質的なdynAP発現が観察された（図15A）。癌細胞での観察結果と一致して、正常細胞は、カスパーゼ活性化およびゴルジ断片化に関して化合物#4に抵抗性であったのに対し、トランスフォームされた細胞はこれらの効果に対して感受性であった（図15B、CおよびD）。
【０１３４】
４．dynAP阻害剤の作用メカニズム
ACHN、HeLaおよびDLD-1細胞を化合物#4で24hr処理し、化合物#4添加によるサイクリンD1レベルへの影響をイムノブロットにて調べた（図16A）。アポトーシスが起きる細胞(ACHN、HeLa)では、サイクリンD1レベルの減少が観察された。HeLa細胞を同一条件(化合物#4添加24hr後）で処理したところ、サイクリンD1の制御に関与しているAkt/PKBレベルの減少、Akt/PKBによりリン酸化されるGsk3βのSer9リン酸化レベルの減少(Gsk3βの活性化)、Gsk3βの活性化によると考えられるβ-カテニン（c-Myc、サイクリンD1の転写活性化に関与）レベルの減少、c-Mycレベルの減少が起こっていた（図16B、上段）。また、同一条件で、HeLa細胞よりtotal RNAを抽出し、RT-PCRを行った。実際、サイクリンD1の転写が抑えられていた（図16B、下段）。HeLa細胞で活性化型のMst1を過剰発現させると、化合物#4で処理した場合と同様の、Akt、リン酸化Gsk3β、β-カテニンおよびサイクリンのレベルの減弱が認められた（図16CおよびD）。FLAGでタグ化したサイクリンD1（FL-cyclinD1）を過剰発現（β-カテニンおよびLef/Tcfの発現制御を受けない）させたHeLa細胞株を化合物#4で処理すると、内因性のサイクリンD1だけでなくFL-cyclinD1レベルも減少することから（図16E）、化合物#4依存的なサイクリンD1レベルの減弱は、転写抑制だけでなく、サイクリンD1タンパク質の不安定化によっても誘導されることがわかった。化合物#4処理したHeLa細胞におけるp53およびp21レベルを調べた結果、化合物#4は濃度依存的にp53およびp21レベルを上昇させた（図16F）。p21の蓄積は活性化型Mst1の過剰発現によっても誘導された（図16G）。これらの結果は、化合物#4の種々の効果はカスパーゼによるMst1の切断・活性化を促進することによりもたらされることを示唆している。dynAPを高発現しているACHN細胞および低発現しているHeLa細胞を化合物#4で処理した際のE-カドヘリン遺伝子の転写レベルを調べた結果、化合物#4は該遺伝子の転写を減弱させることがわかった（図16H）。
さらに、dynAP過剰発現HeLa細胞株では、対照HeLa細胞に比べて、抗アポトーシス作用を示すAktの活性化(ser473のリン酸化は活性化に必須）が見られた（図17A）。また、WI-38をSV-40により癌化させたVA-13株(VA-13株ではdynAPの発現が亢進している)でも、Aktのリン酸化が亢進していた（図17B）。一方、shRNAを用いてdynAPをノックダウンすると、Aktのリン酸化が抑制された（図17C）。さらに、HeLa細胞、ACHN細胞およびDLD-1を10 μMの化合物#4で処理すると、ser473のリン酸化が消失するか顕著に抑制されていた(図17D)。FLAGでタグ化したAktを安定発現するHeLa細胞株を化合物#4で処理した際のプロカスパーゼ-8およびMst1の切断を調べた結果、化合物#4の濃度依存的にAktのリン酸化が抑制される一方、カスパーゼ-8、PARPおよび活性化Mst1の生成が促進された（図17E）。
以上より、dynAPの発現とdynAP阻害剤の効果はAktの発現および活性化に影響を与えていることが分かった。
【０１３５】
５．血清刺激に対する細胞応答
HeLa細胞およびGFPでタグ化したdynAPを過剰発現するHeLa細胞をFBSを含まない培地で培養すると、dynAP依存的なAktのリン酸化が減弱した（図18A）。N末端にFLAGを、あるいはC末端にV5をそれぞれ連結したdynAP融合タンパク質を発現させたHeLa細胞をパラホルムアルデヒドで固定した後、透過処理をした場合としない場合とで、dynAPのN末端を認識する抗体とC末端を認識する抗体とを用いて免疫染色を行った。その結果、C末端を認識する抗体では透過処理の有無を問わず細胞が染色されたのに対し、N末端を認識する抗体では透過処理した場合にのみ染色されたことから（図18B）、dynAPはC末端側を細胞外に露出していることがわかった。dynAPをshRNAノックダウンしたHeLa細胞をFBSを含まない培地で24時間培養するか、HeLa細胞を25 μMの化合物#4を含むFBS不含培地で24時間培養した後、10％ FBSを添加して30分後にα-tubulinおよびβ-actinを免疫染色すると、これらの細胞は、dynAPをノックダウンしていないHeLa細胞や化合物#4に曝露されていないHeLa細胞に比べて、血清刺激後の細胞形態の戻りが遅れることがあわかった（図18CおよびD）。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明の方法を用いることにより、新規ながん治療ターゲットを探索することができ、さらに簡便かつ迅速に該ターゲットタンパク質に対する阻害剤、従って、がん治療および／または予防薬の候補化合物を選択することができる。また、本発明の方法で得られたdynAP阻害剤は、がん治療および／または予防薬開発のためのリード化合物として有用である。さらに、本発明で得られた新規抗dynAP抗体は、高感度かつ高精度ながんの診断薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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