(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース及び/又はヘミセルロース由来の、セロビオース、セロオリゴ糖類、キシロース、アラビノース、グルコースからなる群より選択されるいずれかを基質として含む環境（medium）で、エンテロコッカス・ムンヅティ(Enterococcus mundtii)に属する乳酸菌であって、下記の性質を有するもの（但し、エンテロコッカス・ムンヅティ(Enterococcus mundtii) NITE BP-965を除く。）を培養し、L-乳酸を得る工程を含む、L-乳酸の生産方法。
1.形態：球菌である。
2.生化学的性質：カタラーゼ陰性である。
3.運動性：なし
4.酸素要求性：通性嫌気性である。
5.グルコースを基質としてホモ乳酸発酵によりL-乳酸を産生する。
6.下記の糖資化性を有する。
【表１】
0005986527.tif 000020
【請求項２】
環境がセロオリゴ糖類を基質として含み、セロオリゴ糖類が、セロトリオース及びセロテトラオースを含む、請求項1に記載の生産方法。
【請求項３】
環境がキシロースを基質として含み、さらにグルコース及び/又はセロビオースを基質として含み、キシロースの濃度が、10 g/L〜150 g/Lである、請求項1又は2に記載の生産方法。
【請求項４】
開放系、及び/又は非滅菌の環境で実施される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の生産方法。
【請求項５】
回分式で繰り返し実施される、請求項4に記載の生産方法。
【請求項６】
非食用バイオマス原料を分解してセルロース及び/又はヘミセルロースを生成させる工程を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の生産方法。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか1項に定義されたL-乳酸の生産のための工程、及びL-乳酸を重合する工程を含む、ポリ乳酸の生産方法。
【請求項８】
エンテロコッカス・ムンヅティ(Enterococcus mundtii) NITE BP-965である、乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳酸菌を用いて、ペントースやセロオリゴ糖存在下で、高純度のL-乳酸を効率よく生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ乳酸（PLA）は、生分解性のみならず、最近では、バイオマスを原料として製造できるという特性から、持続的な社会における基礎材料として期待されている。
【０００３】
ポリ乳酸の原料となる乳酸モノマーは、商業的には化学合成又は微生物発酵により製造される。乳酸の化学合成は常にラセミ混合物をもたらすが、微生物発酵では、選択した微生物に応じて、光学的に純度の高いL-又はD-乳酸が生産できる。原料乳酸の光学純度は、ポリ乳酸の物理的特性に大きな影響を与える。L体のみを重合させたポリ-L-乳酸（PLLA）、D体のみを重合させたポリ-D-乳酸（PDLA）は、D-乳酸、L-乳酸のランダムな重合体であるポリ-DL-乳酸（poly-DL-lactic acid, PDLLA）より結晶性が高く、耐熱性も高い。そのため光学純度の高い乳酸の発酵生産が重視されている。
【０００４】
一方、種々の発酵生産に用いられるバイオマス原料は、主としてトウモロコシやサトウキビであるが、いずれも食用部分（デンプン、ショ糖）を使用している。非食用作物や木質バイオマス、稲わら等の非食用バイオマス原料が発酵生産に適用できれば、食料・飼料生産と競合することもなく、望ましい。
【０００５】
非食用バイオマスを利用する場合、デンプンではなく、セルロースやヘミセルロースが主な発酵原料（炭素源）となる。しかし、セルロースやヘミセルロースは、乳酸菌による乳酸発酵には直接的には利用できず、乳酸発酵に際しては、前処理（液化や糖化）が必要である。
【０００６】
前処理方法は、酸・アルカリなどを用いる物理化学的な方法と、微生物や酵素を用いる生化学的な方法とに大別できる。しかしながら、前者に関しては、セルロースを単糖にまで分解しようとすれば比較的強烈な条件で処理しなければならず、その際にフルフラールなどの発酵阻害物質が副生する。一方、比較的穏和な条件で処理すると、セルロース由来のオリゴ糖（セロオリゴ糖）が混在した処理物となり、セロオリゴ糖はほとんどの発酵微生物が資化できないので、発酵収率が低くなるという不利益を生じる。後者の生化学的な方法では、セルロースを分解する酵素そのものの研究開発が進行中ではあるが、酵素により、セルロースをすべてを単糖にするには、多種・多量の酵素の使用と長い時間を要する。さらに、これらのセルロース分解酵素の製造コストは極めて高く、また加水分解生成物であるグルコース（C6糖）及びセロビオース（C6二糖）は、CBH及びBGLの強力な阻害物質でもある（非特許文献1〜3）。
【０００７】
他方、ヘミセルロースを加水分解すると、キシロース（C5糖）やそのオリゴ糖（C5オリゴ糖）が得られるが、それらを乳酸発酵に用いると、C6糖を用いた場合と比較して、乳酸のモル収率が通常半減する（非特許文献4〜7）。
【０００８】
非食用バイオマスからの乳酸生産に関しては、ヘテロ乳酸発酵、D-乳酸発酵については複数の報告がある（非特許文献4〜10）。しかしながら、ポリL-乳酸の原料であるL-乳酸に関しては、非食用バイオマスを原料とした混合糖やセロオリゴ糖存在下での発酵生産のための実用的な方法はこれまでに見出されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Romero-Garcia S, Hernandez-Bustos C, Merino E, Gosset G, Martinez A (2009) Homolactic fermentation from glucose and cellobiose using Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 8:23 doi:10.1186/1475-2859-8-23,http://www.microbialcellfactories.com/content/8/1/23
【非特許文献２】Okano K, Zhang Q, Yoshida S, Tanaka T, Ogino C, Fukuda H,Kondo A (2010) D-lactic acid production from cellooligosaccharides and s-glucan using L-LDH gene-deficient and endoglucanase-secreting Lactobacillus plantarum. Appl Microbiol Biotechnol 85:643-650
【非特許文献３】Joshi DS, MS Singhvi MS, Khire JM, Gokhale DV (2010) Strain improvement of Lactobacillus lactis for D-lactic acid production. Biotechnol lett 32:1573-6776
【非特許文献４】キシロースからの乳酸発酵：K. Tanaka, A. Komiyama, K. Sonomoto, A. Ishizaki, S.J. Hall and P.F. Stanbury.: Two different pathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration on the yield coefficient of L-lactate in mixed-acid fermentation by the lactic acid bacterium Lactococcus lactis IO-1, Appl. Microbiol. Biotechnol., 60(1-2), 160-167 (2002.10)
【非特許文献５】キシロオリゴ糖からの乳酸発酵：Hitomi Ohara, Michiko Owaki & Kenji Sonomoto.: Xylooligosaccharide fermentation with Leuconostoc lactis, J. Biosci. Bioeng., 101(5), 415-420 (2006.5.25)
【非特許文献６】キシロースからの乳酸発酵：Hitomi Ohara, Michiko Owaki & Kenji Sonomoto.: Calculation of metabolites from xylose in Lactococcus lactis, J. Biosci. Bioeng., 103(1), 92-94 (2007.1.25)
【非特許文献７】キシロースからの乳酸発酵：Mugihito Oshiro, Hideaki Shinto, Yukihiro Tashiro, Noriko Miwa, Tatsuya Sekiguchi, Masahiro Okamoto, Ayaaki Ishizaki & Kenji Sonomoto.: Kinetic modeling and sensitivity analysis of xylose metabolism in Lactococcus lactis IO-1, J. Biosci. Bioeng., 108(5), 376-384 (2009.11.25)
【非特許文献８】同時糖化発酵によるセルロースからの乳酸生産：S. Abe and M. Takagi.: Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to lactic acid, Biotechnol. Bioeng., 37, 93-96 (1991)
【非特許文献９】同時糖化発酵によるセルロースからの乳酸生産：K. V. Venkatesh.: Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to lactic acid, Bioresour. Technol., 62, 91-98 (1997)
【非特許文献１０】キシランを直接資化する乳酸菌について：M. Ishikawa, K. Nakajima, Y. Itamiya, S. Furukawa, Y. Yamamoto and K. Yamasato.: Halolactibacillus halophilus gen. nov., sp. nov. and Halolactibacillus miurensis sp. nov., halophilic and alkaliphilic marine lactic acid bacteria constituting a phylogenetic lineage in Bacillus rRNA group 1., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 2427-2439 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
非食用バイオマスのL-乳酸発酵に際しては、同時糖化・発酵ができるように、セルロースやヘミセルロースを酵素的又は物理・化学的に処理してできるオリゴ糖（C6オリゴ糖、C5オリゴ糖など）や混合糖（C6糖、C5糖など）からなる混合物を原料とできることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下を提供する：
［1］  セルロース及び/又はヘミセルロース由来の、セロビオース、セロオリゴ糖類、キシロース、アラビノース、グルコースからなる群より選択されるいずれかを基質として含む環境（medium）で、L-乳酸を生産可能な乳酸菌を培養し、L-乳酸を得る工程を含む、L-乳酸の生産方法。
［2］  乳酸菌が、エンテロコッカス・ムンヅティ（Enterococcus mundtii）に属する乳酸菌である、［1］に記載の生産方法。
［3］  環境がセロオリゴ糖類を基質として含み、セロオリゴ糖類が、セロトリオース及びセロテトラオースを含む、［1］又は［2］に記載の生産方法。
［4］  環境がキシロースを基質として含み、さらにグルコース及び/又はセロビオースを基質として含み、キシロースの濃度が、10 g/L〜150 g/Lである、［1］〜［3］のいずれか一に記載の生産方法。
［5］  開放系、及び/又は非滅菌の環境で実施される、［1］〜［4］のいずれか一に記載の生産方法。
［6］  回分式で繰り返し実施される、［5］に記載の生産方法。
［7］  バイオマス原料が、非食用バイオマス原料である、［1］〜［5］のいずれか一に記載の生産方法。
［8］  ［1］〜［7］のいずれか一に定義されたL-乳酸の生産のための工程、及びL-乳酸を重合する工程を含む、ポリL-乳酸の生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】QU25を改変MRS培地（pH制御したもの/制御したしないもの）中で回分培養した際の、セロビオースを用いた細胞増殖（A）及び乳酸形成（B）のプロファイル。記号：（◇）、pH非制御；（■）、pHを5.5に設定；（▲）、pHを6.0に設定；（×）、pHを6.5に設定；（●）、pHを7.0に設定；（△）、pHを7.5に設定。
【図２】種々のpH値に設定したQU25によるセロビオースからのL-（＋）-乳酸産生の収率、光学純度、及び最大生産率。白色バー、乳酸収率％；灰色バー、光学純度％；◆、最大乳酸生産速度。
【図３】QU25によるグルコース/セロビオース混合物からのL-乳酸生産のタイムコース。発酵は、200 rpm、pH 7.0及び43℃で、1LのmMRS培地を入れた0.4 L容のジャーファーメンター内において、回分発酵で実施された。記号：○, dry cell weight ●, lactic acid; □, cellobiose; ■, glucose。データ点は、3回の独立した実験からの結果の平均及び標準偏差を表わす。誤差バーが見えない場合、その標準偏差は記号のサイズ未満である。
【図４】セロビオース濃度150gを用いたQU25による発酵に際しての、乳酸生産、セロビオース利用、酢酸、エタノール、及び増殖のプロファイル。発酵は、200 rpm、pH 7.0及び43℃で、0.2 Lの培地を入れたジャーファーメンターで実施された。記号：○, dry cell weight ●, lactic acid; ■, acetic acid; ▲, ethanol; □, ellobiose。データ点は、3回の独立した実験からの結果の平均及び標準偏差を表わす。誤差バーが見えない場合、その標準偏差は記号のサイズ未満である。
【図５】QU25によるキシロースを用いた乳酸発酵のプロファイル。発酵は、1 Lの培地を用い、0.4 L容のジャーファーメンターを使用し、43℃、pH 7.0、200 rpmで実施した。キシロースの初濃度は334 mM (A)、480 mM (B)及び691 mM (C)であった。○はキシロース濃度、●は乳酸濃度、△は酢酸濃度、▲はギ酸濃度、□はエタノール濃度、■は乾燥菌体重量を表す。データは、3つの独立した実験からの結果の平均値と標準偏差を示す。エラーバーがない箇所はシンボルのサイズより標準偏差が小さい。
【図６】QU25における、予想されるキシロース代謝経路。重要な酵素、LDH及びPFLを下線で示した。発酵生産物、乳酸、ギ酸、酢酸及びエタノールを囲んだ。ピルビン酸からのギ酸、酢酸、及びエタノールのための経路を破線矢印で示した。Pはリン酸基、FBPはフルクトース1,6-二リン酸、 GAPはグリセルアルデヒド3-リン酸、DHAPはジヒドロキシアセトンリン酸を示す。
【図７】QU25によるグルコース-キシロース混合物を用いた乳酸生産。DCW; Dry Cell Weight。発酵は、200 rpm、pH 7.0、43℃で実施された。
【図８】QU25によるグルコース-キシロース-セロビオース混合物を用いた乳酸生産。DCW; Dry Cell Weight。発酵は、200 rpm、pH 7.0、43℃で実施された。
【図９】QU25による、グルコース-キシロース混合物を用いた乳酸生産、及びグルコース-キシロース-セロビオース混合物を用いた乳酸生産における副産物（酢酸、ギ酸、エタノール）のまとめ。
【図１０】L−乳酸産生のためのEnterococcus mundtii QU25を用いた開放反復回分発酵の時間経過。（A）グルコースを含む回分番号1〜11（B）混合グルコース及びキシロースを含む回分番号12。記号：▲、グルコース（g/L）；△、キシロース（g/L）；○、乳酸（g/L）。矢印の上の数字は回分番号を示す。2つ組測定より、標準誤差を計算した。
【図１１】L−乳酸産生のためのEnterococcus mundtii QU25を用いた開放反復回分発酵の細胞増殖プロファイル（DCW、g/L）。（A）グルコースを含む回分番号1〜11（B）混合グルコース及びキシロースを含む回分番号12。矢印の上の数字は回分番号を示す。2つ組測定より、標準誤差を計算した。
【図１２】MRS（A及びB）、及びmMRS（C；10 g/Lペプトン/8 g/L牛肉エキス/4 g/L酵母エキスの代わりに5 g/L酵母エキスを入れた貧栄養培地）中で増殖させたE. mundtii QU25を用いた開放反復回分発酵の（A）1番目の回分培養、（B）6番目の回分培養、及び（C）7番目の回分培養、の動力学。それぞれの初発グルコース濃度は100 g/Lであった。記号：▲、グルコース（g/L）；○、乳酸（g/L）；●；DCW（g/L）。
【図１３】貧栄養MRS（A及びB）（10 g/Lペプトン/8 g/L牛肉エキス/4 g/L酵母エキスの代わりに5 g/L酵母エキス（A）及び10 g/L酵母エキス（B）のみを入れた貧栄養培地）、及び完全MRS（C）中で増殖させたE.  mundtii  QU25を用いた開放反復回分発酵の（A）8番目の回分培養、（B）9番目の回分培養、及び（C）10番目の回分培養、の動力学。それぞれの初発グルコース濃度は130 g/Lであった。記号：▲、グルコース（g/L）；○、乳酸（g/L）；●；DCW（g/L）。
【図１４】E. mundtii QU25を用いた開放反復回分発酵の（A）11番目の流加培養、及び（B）12番目の混合糖回分培養、の動力学。（A）初期グルコース濃度は100 g/Lであり、そして発酵開始4時間後にグルコース濃度が50 g/L増加するようにグルコースを供給した。（B）初期グルコース及びキシロースは、それぞれ、45及び37.5 g/Lであった。記号：▲、グルコース（g/L）；△、キシロース、○、乳酸（g/L）；●；DCW（g/L）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明により、乳酸菌を用いた高純度L-乳酸の効率的な生産方法が提供される。
【００１４】
［乳酸菌］
本発明で「乳酸菌」というときは、特に記載した場合を除き、多量に乳酸を生産(炭水化物を発酵し、生成する酸の50％以上)すると共に、炭水化物を含む培地によく繁殖し、グラム陽性で、運動性がなく、胞子をつくらない菌群をいう。本発明でいう乳酸菌は、エンテロコッカス(Enterococcus) 属に属する微生物、ラクトバシラス(Lactobacillus) 属に属する微生物、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属に属する微生物、ラクトコッカス (Lactococcus) 属に属する微生物、ペディオコッカス (Pediococcus)属に得する微生物、及びロイコノストック(Leuconostoc)属に属する微生物を含む。
【００１５】
本発明に用いるのに適した乳酸菌は、天然源から得た試料から、次のようにスクリーニングすることにより、得ることができる。少量の試料を改変MRS培地（例えば、MRS培地に、セロビオース又はグルコースを各2% [wt/vol]濃度で添加したもの）に加え、30℃で3日又は 7日間、嫌気的条件で培養し、培養物の一部を段階的に希釈し、CM-セロビオース寒天プレートに広げ、コロニーの採取、希釈、画線培養を適宜行い、単一のコロニー群を得る。単離菌は、定法により、カタラーゼについて試験し、カタラーゼ陰性のものについて、CM-セロビオース寒天培地を用いてさらに選抜し、乳酸の収率及び光学純度が高いものを選択する。
【００１６】
本発明には、エンテロコッカス・ムンヅティ（Enterococcus mundtii）に属する乳酸菌を好適に用いることができる。特に、Enterococcus mundtii NITE BP-965を好適に用いることができる。この菌株は、本発明者らが、日本国福岡市動物園（日本国福岡県福岡市中央区南公園1番1号）で集められた羊の糞試料から単離したものであり、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）へ、2010年7月15日付で受託番号NITE BP-965として寄託されている。本明細書では、この菌株をQU25と称することがある。
【００１７】
このQU25は、乳酸発酵に関し、下記の性質を有する：
（1）光学純度が99.0以上（好ましくは99.5％以上、より好ましくは99.75％以上、更に好ましくは99.9％以上）であるL-乳酸を生産可能であり；かつ
（2）20g/Lのセロビオースを含む培地で、pHを 7.0に制御し、43℃で20時間以上培養したときに、20g/LのL-乳酸を生産可能である。
【００１８】
本発明で乳酸を「生産可能」というときは、特に記載した場合を除き、特定の範囲であることが規定された条件項目（例えば、温度、時間）については、その範囲で、また特定されていない条件項目（例えば、攪拌速度、通気の有無・程度）については発酵生産に適する条件とした場合に、その純度及び濃度で生産できることをいう。また基質濃度をいうときは、特に記載した場合を除き、培養開始時の培地の基質濃度（初発濃度ということもある。）をいう。
【００１９】
本願は、QU25のみならず、それと均等な微生物、具体的には下記の微生物も、好適に用いることができる。
[1] 下記の性質を有するEnterococcus mundtiiに属する乳酸菌：
（1）光学純度が99.0以上（好ましくは99.5％以上、より好ましくは99.75％以上、更に好ましくは99.9％以上）であるL-乳酸を生産可能であり；かつ
（2）20g/Lのセロビオースを含む培地で、pH 7.0、43℃で20時間以上培養したときに、20g/LのL-乳酸を生産可能であるもの；
[2] QU25と同じ、下記の菌学的性質を有する、乳酸菌；
1.形態：球菌である。
2.生化学的性質：カタラーゼ陰性である。
3.運動性：なし
4.酸素要求性：通性嫌気性である。
5.グルコースを基質としてホモ乳酸発酵によりL-乳酸を産生する。
6.下記の糖資化性を有する。
【００２０】
【表１】
0005986527.tif 000002
【００２１】
なお本発明における乳酸発酵に関する各種の値（例えば、pH、糖濃度、光学純度）は、慣用な方法で適宜測定可能であるが、測定法により値が異なる場合は、特に記載した場合を除き、本明細書の実施例の項に記載した方法により測定した値である。また本発明における乳酸発酵に関する各種の発酵パラメータは、当業者にはよく知られているが、特に記載した場合を除き、本明細書の実施例の項に定義されたものを指す。
【００２２】
QU25及びその均等微生物は、蒸留水1L中に、ペプトンを10g、牛肉エキスを8g、酵母エキスを4g、グルコースを20g、Tween80を1g、K2HPO4を2g、酢酸ナトリウム三水和物を5g、クエン酸水素二アンモニウムを2g、MgSO4・H2Oを0.2g、MnSO4・nH2Oを0.05g含むMRS培地（又はその改変培地）にグルコース、セロビオース等の基質を適切な濃度になるように添加したものを用いて良好に培養することができる。
【００２３】
なお、本明細書においては、本発明をQU25を用いた場合を例に説明することがあるが、特に記載した場合を除き、その説明は、QU25の均等微生物を含む他の好適な乳酸菌を用いた場合にも当てはまる。
【００２４】
［pHの影響］
QU25は、pHを5.5〜6.0に低く制御した場合、pH6.5〜7.5にpH制御した場合に比較して、細胞増殖が阻害されうる。低いpHで増殖できないのは遊離酸（H+）に対する抵抗性が低いことに起因すると思われる。pH 5.5〜6.0では、糖消費はきわめて低速で進行し、完全に消費されない場合がある。最大乳酸生産速度は、pHが高いほど大きくなり得、pH7.5付近で最大となり得る。pH制御により、制御しない場合に比較して、数倍高い最大乳酸生産速度が得られうる。
【００２５】
したがって、生産効率の観点からは、本発明においては、環境のpHは、6.0以上、より好ましくは6.5以上、さらに好ましくは6.7以上であることが好ましい。pHの上限値は、いずれの場合も、7.5未満であることが好ましく、7.4未満であることがより好ましく、7.3未満であることがさらに好ましい。至適なpHの一例は、7.0である。このような環境pHの範囲は、生成乳酸の光学純度の観点からも好ましいであろう。
【００２６】
［温度の影響］
QU25は、乳酸産生及び乳酸収率に関して30〜45℃の広い温度範囲にわたって良好な生物活性を保ちうる。特に、40〜44℃において、最大増殖速度及び最大乳酸生産速度を発揮しうる。45℃を超える高い温度では、QU25は良好な細胞増殖も高い乳酸産生も示左内場合がある。
【００２７】
したがって、効率的にL-乳酸を生産するとの観点からは、本発明においては、温度は、30℃以上、より好ましくは35℃以上、さらに好ましくは40℃以上であることが好ましい。温度の上限値は、いずれの場合も、45℃未満であることが好ましく、44℃未満であることがより好ましいであろう。至適な温度の一例は、43℃である。
【００２８】
［基質（炭素源）の影響］
本発明において、乳酸菌のための環境に含まれる成分に関し、「基質として」というときは、特に記載した場合を除き、その微生物が資化可能な量(濃度)で、その成分が含まれていることをいう。
【００２９】
QU25は、様々な濃度のセロビオースをグルコースと同じように消費しうる。糖消費速度に関しては、グルコースとセロビオースとでは近似しうる。
【００３０】
したがって、本発明によれば、グルコースとセロビオースの糖混合物を用いて、高純度、高濃度のL-乳酸を、高収率で生産することができる。
【００３１】
リグノセルロースからの一般的な糖化プロセスでは、多種類の糖を含有する原料が得られる。そのため、リグノセルロース由来の糖化物原料を用いて生成物収率及び生産性を最大にするためには、混合糖を完全利用することができれば望ましい。一方、大部分の微生物がグルコースを他の糖より優先的に利用するため、混合糖を乳酸生産に用いる場合、糖類の逐次利用のために、生産性が低下することが多い。しかしながら本発明によれば、セロビオースを効率的に利用するだけでなく、セロビオースとグルコースを同時に消費することができ、これによりセルロース系材料から糖化により生成する糖類を、高効率・高速度で完全に利用することが期待できる。本発明は、微生物による乳酸生産のためのグルコースとセロビオースの同時利用に関する最初の発明である。
【００３２】
本発明における環境のグルコース濃度、セロビオース濃度は、当業者であれば基質の総量が、培地に対して0.5〜50％（重量）の範囲内で適宜設計することができる。典型的には、初発の、又は培養期間を通じてのグルコース濃度及びセロビオース濃度は、それぞれ独立して、5 g/L以上とすることができ、20 g/L以上とすることが好ましく、50 g/L以上とすることがよりに好ましく、100 g/L以上とすることがさらに好ましい。いずれの場合においても、グルコース濃度及びセロビオース濃度は、それぞれ独立して、400 g/ L以下とすることができ、300 g/L以下とすることもでき、250 g/L以下とすることもできる。
【００３３】
環境のグルコース濃度及びセロビオース濃度はまた、グルコース：セロビオースの重量比が1:0.01〜100、より特定すると1:0.1〜10となるように決定することができる。
【００３４】
なお本発明において、成分の濃度又は比について値を示す場合は、特に記載した場合を除き、その値は重量に基づく値である。また環境中の濃度又は比について示した値は、特に記載した場合を除き、初発（培養開始時）の、又は培養期間を通じての値である。
【００３５】
本発明者らの検討によると、本明細書の実施例の条件では、QU25の増殖挙動は、環境のセロビオース濃度が150g/Lの場合であっても、より低濃度である場合と類似していた。増殖挙動が高糖濃度においても変わらないことは、QU25の増殖に対する基質阻害がほとんどないことを示唆している。しかしながら、乳酸収率に関しては、セロビオース濃度が上昇するのに伴って低下した。このことは、基質濃度は一般には収率及び生産量に対しては大きな作用をもたないと報告されていることから、生成物阻害若しくは乳酸生成のために必要な栄養素の枯渇、又はそれらの組み合わせによるものと考えられる。一方、乳酸生産において高い糖濃度を使用することは、経済的な側面からは望ましい。本発明におけるセロビオース濃度の上限値は、このような観点からも設計することができる。本発明においては、環境のセロビオースの濃度の上限を、100g/Lとしてもよい。
【００３６】
本発明者らの検討によると、QU25はキシロースの濃度によって発酵収率が変化しうる。詳細には、キシロースのみを基質とする場合、キシロースが比較的低濃度の場合は、副産物が生成され、乳酸の収率は低くなる場合があるが、キシロースが比較的高濃度である場合は、副産物はほとんど生産されず、高収率で乳酸が得られうる。その一方で、キシロースに関しては、さらに高い濃度においては、生産速度や収率が減じる場合がある。これは高い基質濃度による阻害によるものだと理解される。参考のため、QU25における、予想されるキシロース代謝経路を図6に示した。
【００３７】
したがって、このような観点からは、本発明におけるキシロースの濃度は、20 g/L以上であることが好ましく、40 g/L以上であることがより好ましい。いずれの場合においても、150 g/L以下であることが好ましく、103 g/L以下（691 mM以下）であることがより好ましい。
【００３８】
本発明によれば、キシロースがよく消費され、またキシロースを用いる場合も、グルコースやセロビオースを用いる場合と同様、pH 7.0、43℃付近で乳酸を生産することができる。
【００３９】
本発明によれば、グルコース及びキシロースの混合物を基質として、乳酸を生産することができる。混合物が用いられる場合、典型的には、初発のグルコース濃度及びキシロース濃度は、それぞれ独立して、5〜250 g/Lとすることができる。また、環境のグルコース濃度及びキシロース濃度は、それぞれ独立して決定してもよく、グルコース1重量部に対し、キシロースが1重量部未満、より特定すると0.75重量部未満となるように決定してもよい。このような重量比であれは、いずれの濃度においても、同じように糖が消費されうる。
【００４０】
本発明においては、グルコース、キシロース及びセロビオースの混合物を基質として、乳酸を生産することができる。この場合のそれぞれの濃度は、独立して決定してもよく、グルコース1重量部に対し、キシロース及びセロビオースが、それぞれ独立して、1重量部未満、より特定すると0.75重量部未満となるように決定してもよい。このような態様においては、まず、グルコース及びセロビオースが迅速に消費されうる。有力なセルラーゼインヒビターでもあるセロビオースの迅速な消費は、リグノセルロース系バイオマスからの商業的な乳酸生産において、非常に有利であると考えられる。
【００４１】
上述したように、本発明においては、キシロースを、それのみを基質として比較的低い濃度で用いる場合に、少量の副産物が生成しうるが、グルコース、セロビオースと混合してキシロースを用いる場合には、副産物の生成が減少しうる。総じて、本発明において他の糖とともにキシロースを用いる場合、キシロースの濃度は、5 g/L以上とすることができ、10 g/Lとすることが好ましく、15 g/Lとすることがより好ましい。いずれの場合も、上限値は150 g/Lとすることができ、103 g/Lとすることが好ましい。
【００４２】
QU25は、セロオリゴ糖類、すなわちセロトリオース（C6三糖）、セロテトラロース（C6四糖）及びセロペントース（C6五糖）を資化しうる。特に、セロトリオース及びセロテトラロースから、約100%の収率でL-乳酸（光学純度、100%）を生産することができる。
【００４３】
したがって、本発明によれば、次の効果が期待できる：
（1）非食用バイオマスの前処理工程の簡便化・コストダウン；
（2）非食用バイオマスからのL-乳酸収率の実質的な向上；
（3）前処理工程に酵素分解反応を用いる場合、オリゴ糖による酵素反応阻害を考慮する必要性の低下。
【００４４】
非食用バイオマスは、主としてセルロース、ヘミセルロース、リグニンより構成される。物理化学的に分解する場合、単糖までの分解は可能であるが、厳しい条件を必要とし、その場合はコスト・労力がかかる上、単糖がさらに分解してしまう恐れがある。一方、やや穏やかな条件で処理を行うこと、単糖以外に、大量のオリゴ糖が生じることとなる。本発明によれば、キシロオリゴ糖及びセロオリゴ糖が、有効に資化されうる。
【００４５】
混合糖、キシロース、セロオリゴ糖に対する特性から、本発明は、バイオマス原料からの同時糖化発酵に適用可能であるといえる。特に、非食用バイオマスを用いた同時糖化発酵への適用が期待できる。同時糖化発酵については、前掲の非特許文献8及び9を参照することができる。
【００４６】
L-乳酸を生産するための基質としては、効率（速度、収率の両方で。副産物は作らない。）の観点からは、グルコースである。しかしながら、非食用バイオマスを原料とする場合、グルコース単独の炭素源はあり得ず、セルロースやヘミセルロースの前処理によってできてくるグルコースのようなヘキソースのほか、キシロースやアラビノースのようなペントース、さらにはそれらのオリゴ糖等の混合物が、現実の炭素源となる。それらの炭素源に対応可能であり、かつL-乳酸を効率よく（速度、収率の両方で、副産物は作らない。）生産でき、基質・生成物阻害が少なく、カタボライト抑制が少ない、等の種々の特性を備えた菌株があるとよい。本発明の好ましい態様においては、このような菌株としてQU25を用いることができる。
【００４７】
［開放系培養］
本発明による乳酸生産は、開放系として、又は非滅菌条件下で、実施することができる。「開放系」又は「非滅菌」は、生産のために用いる培地を滅菌しないこと、回分式で乳酸を生産する場合に、ある回分培養から次の回分培養への引き継ぎの無菌条件下での実施を要しないことを含む。
【００４８】
本発明による乳酸生産は、反復回分式で、実施することができる。
【００４９】
開放又は非滅菌生産系は（i）滅菌中のメイラード反応が回避可能であり；（ii）装置の必要性及びエネルギー消費を低下させることも可能であり；そして（iii）工程を単純化し、そして労力を省くことも可能であるため、好ましい（Bioresource Technology 101 (2010) 6494-6498）。
【００５０】
さらに、反復回分（repeated batch）操作は、回分式と比較して、時間及び労力両方の点で節約につながる。これらには、発酵槽の洗浄及び滅菌に必要な時間がより少ないこと、シードを調製する時間が省略できること、増殖率が高いこと、そして初期の菌体接種体積が大きいため、本培養時間が短いことが含まれる。
【００５１】
開放系及び反復回分操作を組み合わせることによって、さらにエネルギー効率が優れ、労力及び時間が節約された操作戦略を確立することも可能である。
【００５２】
開放反復回分系は、乳酸菌に関しては報告されてきていない。開放反復回分系は、L-乳酸産生を、はるかにより取り扱いやすくそしてエネルギー効率の優れたものにすると考えられる。一方、この系に用いる株は頑強である必要があり、特に光学的に非常に純粋な乳酸を産生するとの観点からは、開放反復中の汚染の可能性増加に抵抗するものでなければならない。
【００５３】
なお、現在まで、細菌による乳酸の開放発酵産生に関して公表された論文は1報のみである（前掲Bioresource Technology 101 (2010) 6494-6498）。この論文の著者らは、乳酸菌であるLactobacillus casiの株及び非乳酸菌であるBacillus属の株を用いている。しかし、彼らの報告においては、Bacillus属の株については、種々のデータ及び動力学パラメータが示されているが、96〜98.4％の光学純度を除いては、Lactobacillus属の株に関するデータには言及されていない。本発明者らの見解としては、ここでの乳酸濃度は低く、そしてまた残存グルコース濃度が高いようであり（ほとんどの場合、約30〜50 g/Lである）、また、発酵時間が長く（〜37-47時間）、そして本発明者らのデータに比較して生産性が低い。
【００５４】
本発明は、乳酸菌を用いた開放反復回分式の乳酸生産を初めて報告するものであり、また本発明の開放反復回分式の態様によれば、光学純度の高いL-乳酸を、14.1 g/L/hという高い生産速度で生産しうる。
【００５５】
［バイオマス原料］
本発明で「バイオマス(原料)」というときは、特に記載した場合を除き、再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたものをいう。本発明には、発生場所、現在の利用状況及び形態に制限されず、乳酸発酵のための原料として用いることができるあらゆるバイオマス原料を用いることができる。バイオマス原料の例は、さとうきび、米、とうもろこし、さつまいも、菜種、落花生、大豆、バカス、葉茎、稲わら、もみ殻、籾殻、麦わら、ゴルフ場などで大量に発生する刈芝、林地残材、間伐材、オイルパーム樹木、製材所の廃材(例えば、端材、おが屑、樹皮)、建設廃材(木屑)、古紙、畜糞尿、屠場残渣、水産加工残渣、廃棄物として発生するバイオマス有機汚泥、パルプ廃液、食品加工残渣、使用済み食用油、生ごみ、下水汚泥、魚貝類、昆布類、植物プランクトンが含まれる。
【００５６】
本発明で「食用バイオマス(食糧バイオマス、食料バイオマスということもある。)(原料)」というときは、特に記載した場合を除き、ヒト又は家畜食糧とすることもできるバイオマス原料をいう。食用バイオマスは、さとうきび、米、とうもろこし、さつまいもを含む。
【００５７】
本発明で「非食用バイオマス(原料)」というときは、特に記載した場合を除き、食用以外のバイオマス原料をいう。本発明には、非食用バイオマス原料を適用することが好ましい。
【００５８】
［用途］
本発明を用いて産生したL-乳酸は、ポリL-乳酸の原料として用いることができる。また、ポリL-乳酸とポリD-乳酸とのステレオコンプレックスを製造するための原料として用いることができる。このようなステレオコンプレックスは、耐熱性が高い生分解性プラスチックとなり得る。
【００５９】
光学的に純粋なL-（＋）-乳酸は、重合して繊維及び配向フィルムの製造に適した高結晶ポリマーになり、液晶の製造にも有用であると期待される。
【００６０】
さらに、ポリL-乳酸は現在、多数の医療用途に用いられている。例えば、縫合糸、ステント、透析媒体、及び薬物送達デバイスである。それは組織工学のための材料としても評価されつつある。それは生分解性であるのでバイオプラスチックの製造にも使用でき、ルーズフィル（loose-fill）パッケージング、コンポストバッグ、食品パッケージング、及び使い捨て食器の製造に有用である。したがってポリL-乳酸は、将来の持続的な社会システムにおいて使用するのに適切な資源リサイクル材料としての可能性をもつ。
【００６１】
なお、本発明はL-乳酸の生産に関するが、本明細書では便宜上、本発明による生産物を単に「乳酸」と表現している場合がある（例えば、「乳酸生産速度」という場合、等）。当業者であれば、文脈から、「乳酸」がL-乳酸を指すものであることは適宜理解できる。
【実施例】
【００６２】
[分析法]
実施例全体を通じて、特に記載した場合を除き、下記の方法又はそれと同等の分析方法を用いた。
【００６３】
細胞密度は、波長562nmにおける細胞懸濁液の光学濃度（OD562）を分光光度計（UV-1600可視光線分光光度計、Bio-spec、島津、日本、東京）で測定することにより分析した。OD562-対-乾燥重量に関する予め決定した標準曲線から乾燥細胞重量を計算した。
【００６４】
pHは、卓上pHメーター（HM-25R）で測定した。
セロビオース及び発酵生成物は、SUGAR SH-1011カラム（Shodex、日本、東京）を備えたHPLC（US HPLC-1210、Jasco、日本、東京）の使用により測定した。1mlの試料培養物を卓上遠心機（Tomy、マイクロ遠心機、モデルMX-300）の使用により2000gで10分間、4℃において遠心した後、上清を超純水で希釈し、Dismic 13-HP045フィルター（Advantec、日本、東京）で濾過し、次いで下記の条件下でクロマトグラフに注入した：カラム温度50℃、移動相としての流速1.0ml/分の3mM HClO4、及び注入容量20μl。標準溶液から求めた検量曲線を用いて、残留糖類及び発酵生成物の濃度を計算した。
【００６５】
乳酸の光学純度は、BF-5バイオセンサー（王子計測器、日本、兵庫）により製造業者のプロトコルに従って測定した。
【００６６】
[発酵パラメーター]
実施例で評価した発酵パラメーターは、特に記載した場合を除き、以下のものであった。
【００６７】
(1)比増殖速度（μ）
下記のように計算した。
【００６８】
【数１】
0005986527.tif 000003
【００６９】
ここで（x）はOD562であり、（t）はサンプリング時間（h）である。
【００７０】
(2)消費された基質を基準とした乳酸の収率（Y，g/g）
消費された糖（g/L）に対する生成した乳酸（g/L）の比率として定義した。
【００７１】
(3)乳酸生産速度
発酵時間（h）に対する生成した乳酸濃度（g/L）の比率として計算した（各サンプリング期間の間で計算）。
【００７２】
(4)L-乳酸の純度
下記のように評価した。
【００７３】
【数２】
0005986527.tif 000004
【００７４】
(5)発酵の全糖類取込み（qs）及び比乳酸生産率（qp）
次式により計算した。
【００７５】
【数３】
0005986527.tif 000005
【００７６】
ここで△s及び△pはそれぞれ、期間△tにわたる糖濃度及び乳酸濃度の変化であり；χavは△tにわたる細胞密度の平均である。
【００７７】
［培地］
特に記載した場合を除き、mMRS培地を用いた。これは、下記のものを含有していた（リットル当たり）：10 gのペプトン（Difco、ミシガン州デトロイト）、8 gの牛肉エキス（Nacalai Tesque、日本、京都）、4 gの酵母エキス（Nacalai Tesque）、2 gのK2HPO4（Nacalai Tesque）、5 gのCH3COONa・3H2O（Nacalai Tesque）、2 gのクエン酸三アンモニウム（Nacalai Tesque）、0.2 gのMgSO4・7H2O（Nacalai Tesque）、0.05 gのMnSO4・4H2O（Nacalai Tesque）、1 mlのTween 80（Nacalai Tesque）。特に示した場合を除き、リフレッシュ及び前培養のためには10 g/L（1％）、主発酵のためには20 g/Lのグルコースを含んでいた。また、場合により、D-セロビオース（Sigma）、グルコース、アラビノース等を所定の濃度で含んでいた。
【００７８】
［実施例1：培養条件の検討］
（1）材料及び方法
QU25をこの研究に用いた。
【００７９】
A.フラスコ培養
1 mlのグリセロール保存培養物を、15mlスクリューキャップ試験管に9 mlのmMRS-糖（1％［wt/vol］）を入れた試験管に接種し（10％［vol/vol］）、30℃で24時間インキュベートした。得られた培養物の一部を、200 ml容フラスコ中の100 mlのmMRS-セロビオース（2% [wt/vol]）培地に接種し（10％［vol/vol］）、30℃で72時間培養した。培養開始時のpHは6.5であった。
【００８０】
B.ジャーファーメンター培養
フラスコ培養の場合と同様にリフレッシュして得た培養物4 mlを、同じ培地36mlを入れた50 mlスクリューキャップ試験管中の新たな増殖培地へ移した。接種物を30℃で8時間インキュベートした後、（10％［vol/vol］）でジャーファーメンターへ接種した。
【００８１】
発酵は、200 rpmの撹拌速度で、1L容のジャーファーメンター（Biott、日本、東京）内において、種々の量の糖を補充したmMRSを用い、0.4 Lスケールで（ただし、糖濃度150 g/L培養では0.2 Lスケールで）実施した。糖溶液を独立してオートクレーブ処理し、そして残りのmMRS培地と混合した。
【００８２】
各サンプリング時点で5 mlの培養物を無菌的に各ジャーから分離し、その後の分析のために-20℃で凍結した。乾燥細胞重量（dry  cell  weight）（DCW）、残留糖類及び発酵生成物をアッセイした。
【００８３】
最適pHを調べるために、発酵中に自動pH制御装置（PH  C2201、Biott）に接続した蠕動ポンプで5 M  NaOHを添加することによりpHを制御し、及び制御せずに、アッセイを実施した。pHをそれぞれ5.5、6.0、6.5、7.0及び7.5に制御した。この菌株の発酵プロファイルを30℃で24時間の増殖後に測定した。
【００８４】
乳酸生産に対する温度の作用を調べるために、それぞれ30、37、43、45、47及び50℃に制御した種々の温度で、5 M  NaOHの自動添加により7.0に設定したpH制御発酵においてアッセイを実施した。発酵はmMRS-セロビオース（2.0％［wt/vol］）中で実施した。
【００８５】
糖混合物の作用を、発酵培地に比率1：1のグルコース/セロビオースをそれぞれ10、15及び20 g/Lの濃度で補充することにより調べた。基質濃度の作用を、セロビオース濃度50、100 g若しくは150 g/L、又はグルコース濃度150 g/LのmMRS培地を用いて調べた。発酵はいずれも、43℃、pH 7.0に制御下（10M又は15MのNaOHの自動添加）で実施した。糖濃度150 g/Lの培養では、酵母エキスを培養8時間、60時間、96時間の時点で、それぞれ1%、0.25%、0.25%[wt/vol]で補った。
【００８６】
（2）結果
A.タイムコース試験からの増殖及び乳酸産生プロファイル
フラスコ培養によりタイムコース試験を実施して、pHを制御しない条件下でのQU25の増殖及び乳酸プロファイルを作成した。この回分発酵において、セロビオース消費の速度（容量当たり）はきわめて低速で起きた。DCW測定に基づくと、QU25は速やかに増殖し、約0.91 g/Lで水平になった（図1）。21時間後にpHが4.85に落ちた。L-（＋）-乳酸の最大生産濃度は、60時間後、7.04 g/Lであった。副生産物の生成はなかった。
【００８７】
B.pH制御条件下での乳酸発酵
結果を下表に示した。
【００８８】
【表２】
0005986527.tif 000006
【００８９】
HPLC分析により、本発酵はホモ乳酸発酵であり、わずかな量の酢酸の生成があったほかは、他の副生産物のピークは見られなかった。図2に、収率、光学純度及び最大生産速度を示した。
【００９０】
pHを5.5〜6.0に低く制御した場合、pH6.5〜7.5にpH制御した場合に比較して、細胞増殖が明らかに阻害された。pH 5.5〜6.0では、セロビオース消費はきわめて低速で進行し、発酵の終了時まで枯渇しなかった。最大乳酸生産速度は、pHが高いほど大きく、pH 7.0で2.1 g/L/hと高い値が得られた。これはpH制御しない発酵で得られたものより4倍高い数値であった。表2に示した結果より、乳酸収率なども考慮した結果、最適pHは7であると考えられる。このpHではセロビオースの完全枯渇に要したのはわずか16〜20時間であった。
【００９１】
C.種々の温度下での乳酸発酵
結果を下表に示した。
【００９２】
【表３】
0005986527.tif 000007
【００９３】
QU25は、乳酸産生及び乳酸収率に関して30〜45℃の広い温度範囲にわたって良好な生物活性を示した。43℃において、20時間の培養ですべてのセルビオースが消費された。しかし、乳酸濃度は30〜43℃でほぼ同じであったが、最大乳酸生産率は20℃での2.54 g/L/hから43℃での3.44 g/L/hまで、温度とともに上昇した。同様に、最大増殖速度も温度の上昇に伴って43℃での0.675 h-1まで上昇した。細胞増殖は、高い温度ではセロビオース基質が枯渇した直後に死滅期に入り、一方、より低い温度では長い定常期を示した。45℃を超える高い温度では、QU25は良好な細胞増殖も高い乳酸産生も示さなかった。したがって、最適温度は43℃であると考えられる。
【００９４】
D.グルコース/セロビオース混合物からの乳酸発酵
結果を下表に示した。
【００９５】
【表４】
0005986527.tif 000008
【００９６】
図3に、グルコース及びセロビオース濃度が各10 g/Lの場合の糖消費と乳酸生産を示した。QU25はセロビオースをグルコースと同じように消費し、発酵は6時間以内に終了た。糖消費速度は、グルコース及びセロビオースについてそれぞれ1.69 g/L/h及び1.53 g/L/hで、ほぼ類似していた。
糖混合物に関して、高濃度の乳酸が高収率で生産された。これらのデータは、QU25が糖混合物を単一の炭素源と同じように同時利用することを示唆している。
【００９７】
E.セロビオース濃度の影響
結果を下表に示した。
【００９８】
【表５】
0005986527.tif 000009
【００９９】
図4にセロビオース濃度が150 g/Lである場合のプロファイルを示した。プロファイルは、基質濃度に伴って延長する発酵時間以外は、基質濃度が異なっても全般的に類似していた。興味深いことに、きわめて短い誘導期があり、その後、対数期においては細胞増殖速度は多かれ少なかれ同じであった。増殖挙動は、QU25の増殖に対する基質阻害作用がないことを示唆している。細胞増殖曲線は短い静止期を経過し、次いで死滅期に入った。
【０１００】
50 g/Lのセロビオースについて、発酵は20時間でほぼ完了したが、100 g/Lを消費するにはさらに約50時間、150 g/Lを消費するには約76時間を要した。また、150 g/Lのグルコースについても150 g/Lのセロビオースとほぼ同様の発酵プロファイルを示した。
【０１０１】
以上から、乳酸発酵における基質阻害作用は無視しうると結論できる。
【０１０２】
［実施例2：キシロースの影響］
（1）方法
培地として、前述の実施例において使用したmMRS培地において、糖としてキシロースを補充したものを用いた。キシロース濃度は、リフレッシュの際は10 g/Lとした。また、pH制御及び温度の影響の検討の際には、ジャーファーメンター（1 L容のものを使用）を用い、最終キシロース濃度は166 mM（25 g/L）とした。また、334 mM (50.1 g/L) 、480 mM (72.0 g/L)及び691 mM (103 g/L)の3つのレベルの最終キシロース濃度で発酵プロファイルを検討した。QU25の培養条件は、実施例1に準じた。
【０１０３】
（2）結果
A.pH制御及び温度の影響
結果を下表に示した。
【０１０４】
【表６】
0005986527.tif 000010
【０１０５】
30℃では、pH 7.0で最も高い乳酸生産速度が観察された。pHを7.0とした場合には、30℃〜43℃の範囲においては、温度が上昇するに従い、乳酸生産速度が高くなった。QU25は、キシロースをよく消費し、またキシロース消費の観点からも、pH 7.0、43℃付近での培養
条件が適することが分かった。
【０１０６】
B.キシロース濃度の影響
結果を下表及び図5に示した。
【０１０７】
【表７】
0005986527.tif 000011
【０１０８】
334 mM (50.1 g/L) (図5A)、480 mM (72.0 g/L) (図5B)及び691 mM (103 g/L) (図5C)の3つのレベルのキシロース濃度で発酵プロファイルを検討した。わずかな量の酢酸（≦ 17 mM）、ギ酸（≦13 mM）、及びエタノール（≦ 34 mM）の生成資化観察されなかった。この現象はC5糖からの野生株を用いた乳酸発酵としてはきわめて珍しく、C5糖から高効率で乳酸が得られることを示している。
キシロース濃度が691 mMでは、生産速度や収率が減じた（データ示さず）。これは高い基質濃度による阻害によるものだと理解された。高い糖濃度で発酵を行うことは、経済的な観点からは望ましいが、QU25による乳酸生産における現実的なキシロース濃度は、691 mMであると考えられた。
【０１０９】
［実施例3：発酵様式に与えるキシロース濃度の検討］
当初の研究で、キシロース濃度がその発酵特性、すなわち乳酸などの生産物の割合に影響を与えていることが明らかとなっていたので、ここではその詳細を調べた。
【０１１０】
（1）方法
最適発酵条件であるpH 7.0、43℃において、キシロース濃度を変え、QU 25の回分培養を行った。
【０１１１】
（2）結果
結果を下表に示した。
【０１１２】
【表８】
0005986527.tif 000012
【０１１３】
QU 25は基質濃度によって発酵収率が変化することが明らかとなった。すなわち、キシロース低濃度下では、副産物が生成され、乳酸の収率は低くなるが、キシロース高濃度下では、酢酸やギ酸といった副産物はほとんど生産されず、乳酸の収率は高い値を示した。
この結果より、 QU 25を用いて、キシロース高濃度仕込みから高濃度のL-乳酸を副産物をほとんど伴わずに高収率で生産することができることが明らかとなった。
【０１１４】
［実施例4：セロオリゴ糖の資化性試験］
（1）方法
培地として、前述の実施例において使用したmMRS培地において、糖としてセロオリゴ糖（Cellotriose 4.23 g/L、Cellotetraose 2.67 g/L、又は Cellopentose 3.64 g/L）を用いた。QU25は、mMRS-cellobiose培地で培養したものを、10％接種することにより培養を開始した。培養は、43 oC、初発 pH 7.0 (未制御)で行った。
【０１１５】
（2）結果
結果を下表に示した。
【０１１６】
【表９】
0005986527.tif 000013
【０１１７】
Medium componentsは糖源なしの培地を用いた系、μmaxは最大比増殖速度、Xmaxは最大菌体量を表す。
【０１１８】
上表に示すように、セロトリオース（C6三糖）、セロテトラロース（C6四糖）及びセロペントース（C6五糖）を用いて資化性試験を行った結果、セロトリオース及びセロテトラロースから、約100%の収率でL-乳酸（光学純度、100%）を生産した。QU 25は、セロオリゴ糖を効率よく代謝し、L-乳酸を生産することが示された。
【０１１９】
[実施例5: アラビノースの資化性実験]
QU 25株の、キシロースと同様のペントース(C5単糖)であるアラビノースの発酵特性について検討した。
【０１２０】
4-1.アラビノースから乳酸生産に及ぼすpHの影響
(1)方法
培地として、mMRSにアラビノース(200 mM)を添加したものを用いた。培地に、mMRS-アラビノース培地で培養した増殖期にあるQU25を10％接種し、43 ℃で、培養開始時のpH 7.0でその後は制御せず、又はpH 6.0、6.5、7.0若しくは7.5に制御（10 M又は15 MのNaOHの自動添加による）して、培養した。
【０１２１】
(2)結果
結果を下表に示した。
【０１２２】
【表１０】
0005986527.tif 000014
【０１２３】
pHを制御せず、43 ℃で培養した結果、アラビノースを約46 mM資化して約72 mMの乳酸を生産した。乳酸収率は1.57 mol/molであった。この高い乳酸収率は、PP/解糖系経路を経由する最大理論収率（1.67 mol/mol）に近い結果となった。また、ギ酸、酢酸などの副産物が少ないことから、低コストで乳酸精製を行うことができると考えられる。
【０１２４】
pH 6.0で制御しながら培養すると、副産物が最も少なく、約193 mMの乳酸を生産した。このときの乳酸収率は、1.44 mol/molであった。最大菌体量は、pH 6.5から7.5までで得られた量より少なかった。一方、pH 6.5で培養した結果、乳酸生産量は、224 mMであり、最も高かったが、同時に高い濃度の副産物も生産された。さらに、pH 7.0以上での培養では、副産物の産生が多くなり、乳酸収率が大きく低下した。このような観点から、pH 6.0又は6.5に制御するとよいと考えられる。
【０１２５】
4-2.アラビノース濃度の検討
(1)方法
4-1と同様、mMRS-アラビノース培地で培養した増殖期にあるQU25を10％接種し、43 ℃で、pHを6.5又は6.0に制御して培養した。培地のアラビノース濃度は、107.6、199.55、202.14、326、477.02、606.93 mMとした。
【０１２６】
(2)結果
pHを6.5に制御した場合の結果を下表に示した。
【０１２７】
【表１１】
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【０１２８】
pH 6.5で培養を行った結果、初発濃度606.9 mMのアラビノースから763 mMの乳酸を生産した。副産物を生産せず、乳酸の対アラビノース収率は1.29 mol/molであった。しかしながら、326 mM以下のアラビノース濃度では、副産物が生産された。主に、ギ酸が副生されたことから、PP/解糖系経路がアラビノースの主な代謝経路であることを示唆された。
この結果から、QU 25株での代謝とその制御は同じペントースであるキシロースとアラビノースでは異なることが予想される。
pH 6.0で培養を行った結果を下表に示した。
【０１２９】
【表１２】
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【０１３０】
初発濃度329.4 mMのアラビノースから445.14 mMの乳酸を生産した。副産物を生産せず、1.39 mol/molの収率であった。しかし、より高いアラビノース濃度（>329 mM）では、基質阻害により、アラビノース消費と乳酸生産の両方に著しい減少が見られた。Table 2-5のpH 6.5での培養挙動と明らかに異なるものであり、6.0と6.5という僅かに異なるpH制御値によって大きく代謝が変化する興味深い発酵現象であった。
【０１３１】
[実施例6:糖混合物からの乳酸生産]
A. グルコース/キシロース混合物
グルコース:キシロースの重量比2:1の混合物からの乳酸発酵について検討した。発酵はいずれも、43℃、pH7.0に制御下（10 M又は15 MのNaOHの自動添加）で実施した。
【０１３２】
結果を下表に示した。また、初発グルコース濃度40 g/Lにおける培養結果を図7に示した。
【０１３３】
【表１３】
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【０１３４】
QU 25は、いずれの濃度においても、同じように糖を消費した。副産物はなく、光学純度も高かった。
【０１３５】
B. グルコース/キシロース/セロビオース混合物
本実施例のAと同様に、ただしさらにセロビオースを添加して、混合物からの乳酸発酵について検討した。
【０１３６】
結果を図8に示した。グルコース及びセロビオースが迅速に消費された。有力なセルラーゼインヒビターでもあるセロビオースの迅速な消費は、セルロースやヘミセルロースを多く含むバイオマスからの商業的な乳酸生産において、非常に有利であると考えられる。
【０１３７】
また、キシロースのみを炭素源として、低い濃度（<25 g/L）用いた場合には、少量の副産物の生成がみられたが、他の糖と混合して用いた場合には、副産物の生成が顕著に減少した（図9）。
【０１３８】
[実施例7:  QU25による非滅菌反復発酵］
本発明者らの検討によると、他の乳酸菌と比較して、QU25は熱耐性株であり、非滅菌発酵において使用可能であることが分かっている。
本実施例では、QU25を用いて、非滅菌条件下で、反復回分発酵を試みた。
【０１３９】
(1)方法
リフレッシュし、そして前培養（MRS−20 g/Lグルコース）したQU25を、43 ℃で、培養した。pHは7.0に制御した。中和には、1〜7回分に関しては、10 N  NaOH、8〜12回分に関しては、15 N  NaOHを用いた。
【０１４０】
12回分すべてで、培地を滅菌しなかった。各回分（実行/周期）終了時に遠心分離によって細胞を収集し、そして次の回分（実行）に10％接種したが、例外として、回分6では接種は14％とした。
【０１４１】
開放反復発酵を12周期行った。周期1〜10、及び12は回分培養であり；周期11のみ流加培養とした。各回分の培養時間は、培養条件次第で多様であった。
【０１４２】
最初の5回の実行では、100 g/Lグルコースを含むmMRS培地を用いて、L−乳酸産生に対する回分反復の影響を調べた。回分6では、14％より高い細胞密度を用いて、最初の5回の回分で用いたのと同じ栄養が、より高い初期細胞密度の増殖を補助しうるかどうかを試験した。
【０１４３】
回分7〜10では、5、10、及び各実行で言及するような多様なグルコース濃度を用いることによって、栄養必要条件を研究した。回分11では、流加回分を行って、より高い基質濃度を用いた。回分12では、混合糖発酵を行った。
【０１４４】
【表１４】
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【０１４５】
（2）結果
結果を下表に示した。
【０１４６】
【表１５】
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【０１４７】
最初の6回分では、乳酸生産性は、細胞密度が増加するにつれて次第に増加した（図10）。乳酸生産性は、第一の回分の2.21 g/L/時間から、回分番号6の14.1 g/L/時間まで有意に増加した。乳酸収率は〜80％でほぼ同じであった（上表）。
【０１４８】
回分7では、5 g/Lの酵母エキスのみ（mMRS培地の4 g/L酵母エキス＋10 g/Lペプトン＋8 g/L牛肉エキスの代わりに）を用いることによって、乳酸産生及び生産性に対する栄養条件の影響を研究した。興味深いことに、初期細胞密度が先の回分（すなわち回分4〜6）より低いにもかかわらず、先の回分と同じ収率で、わずかにより高いレベルの乳酸が産生された（図12）。
【０１４９】
さらに興味深いことに、先の回分と同じ培地（5 g/Lの酵母エキスのみを添加）とともに、より高い濃度の基質を添加することによって（回分8）、乳酸収率及び産生レベルが改善された。対照的に、乳酸生産性は有意に半分まで減少した（すなわち10.61 g/L/h〜5.29 g/L/h）（上表及び図13）。
【０１５０】
回分9において、同じ初期グルコース濃度（130 g/L）で、10g /Lの酵母エキス（5g/Lの代わりに）を用いた。乳酸濃度、収率、及び生産性がわずかに改善されることが見出された（上表）。
【０１５１】
窒素供給源として少量の酵母エキスのみ（5g/L）を用いた場合、発酵中に細胞密度が次第に減少する一方、MRS培地の4g/L酵母エキス＋10g/Lペプトン＋8g/L牛肉エキスでは、細胞密度が増加することがわかった（図11）。
【０１５２】
回分10において、130g/Lグルコースを含むMRSを用いた。すべての発酵パラメータが増加した（上表）。0.90 g/gの収率及び8.19 g/L/hの高い生産性で、114.7 g/Lの乳酸を得ることができた（図13）。
【０１５３】
発酵様式を周期（実行）番号11で流加培養に変更した。それぞれ、7.74 g/L/h及び0.85 g/gの高い生産性及び収率で、144.5 g/Lグルコースから131.6 g/Lの乳酸を得ることができた（図14）。
【０１５４】
最後に、当モル比で、混合糖（グルコース及びキシロース）を用いた。興味深いことに、乳酸は、0.82 g/gの高収率及び4.64 g/L/hの高生産性で、ホモ発酵的に産生された。
【０１５５】
乳酸の光学純度は、すべての培養区で高く維持された（≧99％）（上表）。
【０１５６】
本実施例のデータは、光学的に純粋な乳酸産生に関する、乳酸菌を用いた反復開放回分の能力を立証する最初の報告である。QU25を用いた開放反復回分は、発酵能のいかなる喪失も伴わずに、12周期に関して、成功裡に実行された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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