(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多形神経膠芽腫を有する哺乳類対象を処置するための医薬組成物であって、有効量の下式:
【化１】
0006046702.tif 000048
の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、
医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物が:
【化２】
0006046702.tif 000049
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化合物が薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記化合物が薬学的に許容される塩である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物が経口投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物が１日あたり１または２用量で経口投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象に投与する前記化合物の量が約５０mg/kg〜約５００mg/kgである、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記化合物が４−（２−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロへキシルアミノ）ベンゾチアゾール−６−イルオキシ）−Ｎ−メチルピコリンアミドまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物と、
イリノテカンと併用するかまたは併用しないベバシズマブ、ニトロソウレア、プラチン、アルキル化剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ウクライン、およびカンナビノイドから選択される付加的ながん治療剤と
を含む、組合せ医薬。
【請求項１０】
前記付加的ながん治療剤がアルカリ化剤である、請求項９に記載の組合せ医薬。
【請求項１１】
前記アルカリ化剤がテモゾロミドである、請求項１０に記載の組合せ医薬。
【請求項１２】
前記組合せ医薬が経口投与される、請求項９〜１１のいずれかに記載の組合せ医薬。
【請求項１３】
前記組合せ医薬が１日あたり１または２用量で経口投与される、請求項９〜１１のいずれかに記載の組合せ医薬。
【請求項１４】
前記化合物が４−（２−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロへキシルアミノ）ベンゾチアゾール−６−イルオキシ）−Ｎ−メチルピコリンアミドまたはその薬学的に許容される塩である、請求項９〜１３のいずれかに記載の組合せ医薬。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脳および神経系のがんは、最も処置が難しいもののうちの１つである。これらのがんの患者の予後は、腫瘍のタイプおよび位置、ならびにその進行段階に依存する。多くの種類の脳がんにおいて、症候が発症した後の平均余命は、数ヶ月または１もしくは２年である。処置は、主に外科的な切除および放射線治療からなる；化学療法も用いられるが、適当な化学療法剤の範囲は限られたものである。これは、ほとんどの治療剤は血液脳関門を通過せず、脳腫瘍を適切に処置できないためである。公知の化学療法剤を外科手術および放射線照射とともに用いても、外科手術および放射線照射単独の場合を大きく超えて生存をのばすことはめったにない。したがって、脳腫瘍のための、治療上の選択肢が改善されることが必要である。
【０００２】
神経膠腫（グリオーマ）は一般的な種類の脳腫瘍である。神経膠腫は、神経細胞の位置および機能を維持する、グリア細胞からなる神経支持組織より生じる（そのため、グリオーマという名称である）。神経膠腫は、類似するグリア細胞のタイプによって以下に分類される：星状細胞腫 (神経膠芽腫を含む)は、星状アストロサイトグリア細胞に似ており、乏突起神経膠腫は、オリゴデンドロサイトグリア細胞に似ており、そして、上衣腫は、脳内の液腔の裏打ちを形成する、上衣グリア細胞に似ている。腫瘍は、これらのタイプの細胞が混合したものを含んでいる場合もあり、混合膠腫とよばれる。
【０００３】
現在の、脳がんの典型的な処置は、腫瘍組織の大部分の外科的な切除であり、これは、侵襲手術または生検もしくは抽出的な方法（extractive methods）によって行われうる。しかし、神経膠腫は不規則に散在する傾向があり、完全に除去するのが非常に困難である。結果として、腫瘍を切除したすぐ後に、ほとんどいつも再発が起こる。放射線治療および／または化学療法は、切除と組み合わせて用いうるが、これは生存時間をごくわずかにのばすのみであるのが一般的である。例えば、最近の統計によって、米国で神経膠芽腫と診断された患者は、現在の標準的な組み合わせ治療で処置されていても、診断から１年後には、約半分しか生存しておらず、２年後でも生存しているのは約２５％にすぎないことが示された。
【０００４】
多形膠芽腫（ＧＢＭ；Glioblastoma multiforme)は、最も一般的な成人の原発性脳腫瘍であり、その死亡率と、現在の処置アプローチに対する反応がないことで有名である。不幸なことに、近年、処置の選択肢に実質的な改善はなく、ＧＢＭの患者の生存の見通しはごくわずかしか改善されていない。したがって、神経膠腫のような脳のがんの処置を改善することは、未だに緊急に必要とされている。
【０００５】
神経膠腫は、脳の実質組織中に、がん細胞そのものに加えて、さまざまな多くの種類の細胞からなる、複合組織の微小環境で発症する。腫瘍関連マクロファージ(ＴＡＭ)は、存在する間質細胞のうちで顕著なものの１つであり、腫瘍組織内の細胞の実質組織部分を占めることがしばしばである。ＴＡＭの起源は確実にわかっていない: これらのＴＡＭは、ミクログリアか、脳内のマクロファージ集団から生じるのかもしれないし、または末梢からリクルートされるのかもしれない。
【０００６】
ＴＡＭは、組織特異的に、腫瘍の開始および進行を調節しうる：ある場合には、ＴＡＭは、がんの進行を抑制していると考えられるが、現在までの研究の大部分においては、腫瘍の進行を亢進している。実際、マクロファージの浸潤が増加しているがんの約８０%において、ＴＡＭレベルの上昇は、疾患のさらなる悪性度の高さおよび患者の予後の悪さと相関している。いくつかの研究により、ヒト神経膠腫では、ＴＡＭの細胞数が増加し、これが腫瘍のグレードの進行と相関しており、そして、ＴＡＭは典型的に、神経膠腫における主な免疫細胞であることが示されている。しかし、神経膠腫の形成におけるＴＡＭの機能は未だによくわかっておらず、これらの細胞を標的とすることが、実行可能な治療戦略なのかどうかも現在わかっていない。実際、文献では、腫瘍成長に対して、対立する効果が報告されており、これは、同様の実験戦略を用いて、同一の同所性の神経膠腫移植モデルでマクロファージを枯渇させた場合でも見られた。いくつかの研究では、ＴＡＭによって産生されたＴＮＦ−αまたはインテグリンβ３は、神経膠腫の成長の抑制に関連しているが、一方別の報告では、ＣＣＬ２およびＭＴ１−ＭＭＰは腫瘍の成長および浸潤を促進する因子であることが提唱されている。
【０００７】
ＣＳＦ−１Ｒシグナルの阻害は、異種移植脛骨内腫瘍を含むいくつかの腫瘍学的状況で使用されてきた新規で、技術移転的に関連のあるアプローチ方法である。しかし、脳腫瘍で効果的であることは未だ示されていない。非脳がんには、腫瘍細胞そのものを直接標的とするよりも、腫瘍細胞に関連があるか、または腫瘍細胞を支持している様々な細胞種に影響を与える化合物を用いて標的化されているものがある。例えば、ＰＬＸ３３９７は、３つの標的(ＦＭＳ、ＫｉｔおよびＦｌｔ３−ＩＴＤ)を共阻害し、マクロファージ、ミクログリア、破骨細胞および肥満細胞を含む様々な細胞種を下方調節することが報告されている。ＰＬＸ３３９７は、ホジキンリンパ腫の処置について試験が行われている。しかし、ＰＬＸ３３９７の文献によると、ホジキンリンパ腫は種々の化学療法に対してよく反応するが、脳腫瘍は化学療法に対してはるかに耐性を示し、処置は成功していない。しかし、本明細書中に示すように、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤は、培養状態の神経膠芽腫細胞の増殖には直接効果をもたらさず、処理動物の腫瘍中のマクロファージ細胞の数を減少させなかった。したがって、本明細書中に示すように、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤が、生体内で脳腫瘍の成長を効果的に阻害し、進行期のＧＢＭの腫瘍体積を減少させ、さらには、いくつかの神経膠芽腫を根絶しうることは驚くべきことである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、脳腫瘍、特に神経膠芽腫が、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤で処置しうるということの実証に基づくものである。本明細書中に記載のＣＳＦ−１Ｒ阻害剤の有効性は、存在するＴＡＭの細胞数を著しく減少させるとは考えられなくても、ＴＡＭの特定の活性を阻害することによるものであると考えられており、また、これらの化合物が脳腫瘍を有する対象の血管脳関門を効率よく通過できるという、実証された機能によるものと考えられる。これらの方法は、必要性の高い、脳腫瘍、特に神経膠芽腫と診断された患者のための、新しい治療上の選択肢を提供する。
【０００９】
コロニー刺激因子１ (ＣＳＦ−１)は、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)ともよばれ、その受容体であるＣＳＦ−１Ｒ (ｃ−ＦＭＳとしても知られる) を通ってシグナル伝達し、マクロファージの分化、増殖、リクルートおよび生存を調節する。他の受容体チロシンキナーゼ阻害剤と同様に、活性部位へのＡＴＰ結合と競合し、受容体のリン酸化を妨害する、低分子のＣＳＦ−１Ｒ阻害剤が開発されてきた。本発明は、強力で、選択的なＣＳＦ−１Ｒ阻害剤であって、ＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ/Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−マウスモデルの神経膠腫形成で示すように、血液脳関門(ＢＢＢ; blood-brain barrier)を通過し、神経膠腫におけるＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達を妨害する。この、遺伝子操作された神経膠腫モデルは、免疫適応状態において、ヒトＧＢＭの特徴を全て再現するため、ヒトＧＢＭのモデルとして、前臨床試験を行うのに理想的である。このモデルは、ヒトＧＭＢ、特に前神経性ＧＢＭの近接なモデルであるため、このモデルの有効性が、ヒト神経膠芽腫、例えば多形神経膠芽腫および混合膠腫についての臨床的な有効性に転換されることが期待される。
【００１０】
本発明は、脳に侵入することのできる任意のＣＳＦ−１Ｒ阻害剤を用いて実行しうる。かかる化合物のいくつかは、ＷＯ２００７/１２１４８４に開示されている、６−Ｏ−置換ベンゾキサゾールおよびベンゾチアゾール化合物であり、具体的には、当文献中の式ＩＩａおよびＩＩｂの化合物、ならびに本明細書中に記載の化合物である。 
【００１１】
局面の一において、本発明は、哺乳類対象において脳腫瘍を処置する方法であって、有効量の式（Ｉ）:
【化１】
0006046702.tif 000002
［式中、
Ｒ１がアルキルピラゾールまたはアルキルカルボキサミドであり、そして、
Ｒ２がヒドロキシシクロアルキルである。］
の化合物またはその薬学的に許容される塩を、該対象に投与することを含む方法、を提供する。
【００１２】
本発明の方法は、脳腫瘍と診断された患者、しばしばヒト対象の処置に用いうる。本発明のさらなる態様は以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】腫瘍組織においてＣＤ４５ (全白血球のマーカー)およびＣＤ１１ｂ (骨髄細胞マーカー)染色陽性を示す細胞の増加率を測定し、正常な脳と神経膠芽腫組織におけるＤＡＰＩ-陽性(DAPI-positive)生存細胞の相対量を示すグラフ。蛍光励起セルソーティング(ＦＡＣＳ)データも示す。
【図１Ｂ】正常な脳組織由来およびグレードＩＶの神経膠芽腫由来の、ＣＤ６８を染色した脳細胞を表し、腫瘍組織中でマクロファージの浸潤が大量に見られることを示す。実施例１参照。
【図１Ｃ】ハウスキーピング遺伝子のユビキチンＣ (Ｕｂｃ)に対する、ＣＤ６８、ＣＳＦ−１ＲおよびＣＳＦ−１の、正常脳組織に対するＧＢＭ組織での、相対的なｍＲＮＡレベルの上昇を示す。
【図１Ｄ】腫瘍細胞に対する、ＣＤ１１ｂ、ＴＶＡ、ＣＳＦ−１およびＣＳＦ−１ＲのＴＡＭにおける相対量を示す。
【図２】マウスのコホートをＢＬＺ９４５で処理後のいくつかのタイムポイントにおける、ＧＢＭを含む脳の左半分由来および、同じ脳のＧＢＭが見られない右半分由来の、血漿、脳組織中のＢＬＺ９４５の量を表す。
【図３Ａ】骨髄由来マクロファージ (ＢＭＤＭ)細胞における、ＣＳＦ−１刺激後の、ＢＬＺ９４５によるＣＳＦ−１Ｒリン酸化の阻害を示す。
【図３Ｂ】未処理のＢＭＤＭ細胞の集団倍加速度を示し、かかる細胞を６７nM ＢＬＺ９４５で処理すると、ＣＳＦ−１刺激が存在しないのと同じ影響を集団倍加速度に及ぼすことを示す。
【図３Ｃ】〜
【図３Ｅ】Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−マウス由来のＢＭＤＭ細胞、正常マウス脳細胞ＣＲＬ−２６４７および２つのマウスＧＢＭ培養細胞の増殖速度を表す。
【図３Ｆ】ニューロスフェアの総数およびサイズは６７０nMのＢＬＺ９４５によって影響を受けなかったことを示す。
【図４Ａ】ビヒクルのみか、ビヒクル＋ＢＬＺ９４５で処理したＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ/Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−マウスの無症候性の生存を示す。実施例４参照。
【図４Ｂ】２６週の試験終了時点における処理マウスおよび未処理マウスの腫瘍のグレードを表す。対照マウスは全てグレードがＩＩＩまたはＩＶの腫瘍を有していた。
【図５Ａ】ＢＬＺ９４５処理の最初の６日間に、処理マウスおよび対照マウスについてＭＲＩで測定した腫瘍サイズのデータを示す。
【図５Ｂ】ＢＬＺ９４５の投与開始から最初の６日間の、個々の対照マウス（上側のグラフおよび）処理マウス（下側のグラフ）の腫瘍体積を示す。
【図５Ｃ】〜
【図５Ｄ】開始時点で大きな腫瘍(体積＞４０mm3)を有しているＢＬＺ−９４５処理動物における、ＭＲＩで測定した腫瘍体積を示し、大きな腫瘍を有していても、腫瘍体積がほとんど全ての対象において低下したことを表す。
【図５−２Ａ】実施例５の対照群の個々の動物についての腫瘍体積のデータを表す。
【図５−２Ｂ】実施例５の処理群の個々の動物についての腫瘍体積のデータを表す。
【図５−２Ｃ】実施例５において、ＢＬＺ９４５処理を受けた、腫瘍の大きな対象の腫瘍サイズデータを示す。
【図６Ａ】実施例５における、ビヒクル群、処理群および「大きい腫瘍」群の動物の脳内の、Ｏｌｉｇ２＋細胞のパーセント比率を示す。
【図６Ｂ】ブロモデオキシウリジン(ＢｒｄＵ)標識で測定されたように、腫瘍細胞の画分は活発に分裂していたことを示す。
【図６Ｃ】切断型カスパーゼ３ (ＣＣ３)染色により測定した、腫瘍細胞におけるアポトーシスのレベルを表し、ＢＬＺ９４５が腫瘍細胞のアポトーシスを促進することを示す。
【図７Ａ】実施例７における遺伝子発現解析において、細胞のＦＡＣＳによる分離に用いた工程を示す。
【図７Ｂ】処理動物および未処理動物について、処理により発現上昇した遺伝子および発現低下した遺伝子から、ＳＶＭ遺伝子サインが同定されたことを示す。
【図７Ｃ】〜
【図７Ｅ】Ｍ２−関連因子およびＥＧＲ２標的因子の選択的な発現上昇を示す。
【図８Ａ】ＳＶＭ遺伝子サインにおいて、発現が変化している遺伝子を分類するのに用いた発現上昇の度合いと、統計的適切性をグラフで示す。
【図８Ｂ】５遺伝子Lasso回帰サインを示す。
【図８Ｃ】TCGAデータセットにおける、前神経性ＧＢＭ腫瘍についてのLasso遺伝子サイン予測を示す。
【図８Ｄ】組み合わせデータセットにおける、前神経性ＧＢＭ腫瘍についてのLasso遺伝子サイン予測を示す。
【図８Ｅ】TCGAデータセットにおける、前神経性ＧＢＭ腫瘍についてのＳＶＭ遺伝子サイン予測を示す。
【図８Ｆ】組み合わせデータセットにおける、前神経性ＧＢＭ腫瘍についてのＳＶＭ遺伝子サイン予測を示す。
【図８Ｇ】TCGAおよび組み合わせデータセットについての、前神経性、古典的、間葉系および神経性のＧＢＭ腫瘍についてのＢＬＺ９４５遺伝子サインハザード比を表し、全てのデータの前神経性ＧＢＭの統計的な相関を強調する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、脳腫瘍の処置に用いるための式（Ｉ）の化合物、および式（Ｉ）の化合物を用いた、脳腫瘍を処置する方法を提供する。式（Ｉ）の化合物は以下の式:
【化２】
0006046702.tif 000003
［式中、
Ｒ１はアルキルピラゾールまたはアルキルカルボキサミドであり、そして、
Ｒ２はヒドロキシシクロアルキルである。］
を有し、この化合物の薬学的に許容される塩ならびに中性化合物を含有する。
【００１５】
本発明の範囲内の特定の化合物は、以下にさらに記載する。
【００１６】
脳腫瘍の処置は、本明細書中で、かかる腫瘍を有するマウスの処置によって示すような、脳腫瘍の成長の速度を阻害すること（腫瘍増殖の遅延化）、もしくは脳腫瘍の成長の逆転（すなわち、腫瘍体積の減少）、または、腫瘍の実質的な除去も包含しうる。具体的には、かかる処置は、神経膠芽腫の進行を遅らせるか、または逆転させうる。かかる処置は、脳腫瘍の大部分を取り除くことを含む、他の処置と組み合わせて用い得るものであり、外科的もしくは生検的な方法により脳腫瘍を除去した後に、残存している腫瘍組織の再成長を遅延化もしくは逆転させるか、または残存腫瘍組織の体積もしくは質量を低下させるのに用いうる。該化合物はまた、他の化学療法と組み合わせて使用しうる。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１が、アルキル置換されたピラゾールまたはカルボキサミド、例えばＣ１〜Ｃ４アルキルピラゾールまたは式−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ（式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基である。）のカルボキサミドである、化合物を包含する。好ましい態様において、該アルキル基は、ＭｅまたはＥｔである。本発明の使用に好ましい特定の化合物は、以下に記載する。これらの方法のいくつかの態様において、Ｒ１は、
【化３】
0006046702.tif 000004
［式中、Ｒ’はＭｅまたはＥｔである。］
である。好ましくは、該ピラゾール環は、４位に結合する、すなわち:
【化４】
0006046702.tif 000005
である。
【００１８】
これらの化合物においてＲ２は、以下:
【化５】
0006046702.tif 000006
のようなヒドロキシシクロヘキシル基であるか、または、２−ヒドロキシシクロペンタ−１−イル基である。
【００１９】
特に好ましい化合物は以下の化合物:
【化６】
0006046702.tif 000007
または
【化７】
0006046702.tif 000008
のいずれか、またはこれらの化合物の任意の２つ以上の混合物、またはこれらのいずれかの薬学的に許容される塩を含む。
【００２０】
これらの化合物およびその薬学的に許容される塩は、それぞれ、本発明の目的の好ましい態様である。これらの化合物の好ましい態様はまた、以下の式の化合物を含む：
【化８】
0006046702.tif 000009
および
【化９】
0006046702.tif 000010
［式中、Ｒ’はＭｅ、Ｅｔまたはプロピルであり、好ましくはメチルである。］。
これらの化合物の特定の態様は、 (Ｒ，Ｒ) 絶対立体化学または(Ｓ，Ｓ) 絶対立体化学でありうる。
【００２１】
これらの化合物は、物理化学的性質が非常にＢＬＺ９４５に類似していることに基づき、同様に血液脳関門を通過することが予期され、それ故に本発明の処置方法での使用に適している。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物は、当該分野で公知のものであり、その製造方法は、例えば、ＷＯ２００７/１２１４８４に開示されているが、それらの神経膠腫の処置における有用性および血液脳関門の通過については、以前は知られていなかった。化合物 (Ｉｃ)は、本明細書中に記載の、試験管内および生体内の試験に使用した、ＢＬＺ９４５に相当する。
【００２３】
シクロヘキシル環に、(１Ｓ，２Ｓ) 立体化学を有する、式(Ｉｈ)の化合物は、新規なものである。これらの化合物は、予想外に優れたＰＤＧＦＲβ阻害剤である一方、ＣＳＦ−１Ｒをも非常に効率的に阻害する (本明細書中のデータ参照)。したがって、この式
【化１０】
0006046702.tif 000011
［式中、Ｒ’はＭｅ、Ｅｔまたはプロピルである。］
の新規化合物は、本明細書中に記載の処置方法で有効性を上昇させることが予期される、二重阻害効果を提供する、本発明の他の局面である。
【００２４】
本発明の化合物は、単独で用いるか、または、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および、しばしば少なくとも２つの薬学的に許容される賦形剤をも含む、医薬組成物に製剤化されうる。薬学的に許容される賦形剤は、典型的に滅菌されることは理解されるであろう。適当な賦形剤のいくつかは、本明細書中に記載されており、いくつかの態様において、該化合物は、カプチゾル(captisol)、例えば２０%カプチゾルを含む、組成物として製剤化される。
【００２５】
いくつかの態様において、脳腫瘍は、脳転移、星状細胞腫 (神経膠芽腫を含む)、乏突起神経膠腫、上衣腫および混合膠腫から選択される。好ましい態様において、脳腫瘍は神経膠腫、特に多形神経膠芽腫である。他の態様において、脳腫瘍は、脳転移、すなわち、体のどこか別の場所に起こったがんから生じた転移性腫瘍である。
【００２６】
いくつかの態様において、患者は、神経膠芽腫を有する患者である。具体的な態様において、対象は、前神経性神経膠芽腫(proneural glioblastoma)と診断された対象である(参照： Verhaak, et al., Cancer Cell 17(1):98-110 (2010))。この神経膠芽腫のサブタイプは、若年の対象に起こり、ＴＰ５３、ＩＤＨ１およびＰＤＧＦＲＡの変異を伴う傾向がある。Verhaakらは、前神経性神経膠芽腫の患者は、他のサブタイプ (古典的、神経性、間葉系)よりも、２０１０年の論文で使用した強い化学療法に対して応答が少ないことを報告しており、さらに、かかる処置はこれらの患者には禁忌であることすら提唱した。本発明の方法は、本明細書中で用いる前神経性ＧＢＭ動物で示すように、前神経性神経膠芽腫の処置に特に効果的である。ＢＬＺ９４５で処理したマウスのＴＡＭに見られた特異的な遺伝子サインは、平均よりも生存期間が長かった、前神経性神経膠芽腫のヒトの患者のものと一致することがわかった。この相関は他の神経膠芽腫のサブタイプの患者と比較した場合には起こらなかった。したがって、かかる遺伝子サイン情報は、本明細書中に記載するように、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤で処置する患者の選択、またはかかる処置を受けている対象の予後を評価するのに用いうる。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明の方法は、腫瘍の除去などの他の処置方法の前に、対象を処置するのに用いられる。他の態様において、本発明の方法は、他の処置方法、例えば、外科的もしくは生検方法のいずれかによる腫瘍除去と組み合わせて、または放射線治療と組み合わせて、または腫瘍除去と放射線治療の両方と組み合わせて、対象の処置に用いられる。
【００２８】
他の化学療法剤を、上記の化合物および方法とともに用いてもよい。これらの方法で用いる、付加的な化学療法剤の適当なものは、神経膠芽腫の処置に慣用的に用いられるものとして当該分野で公知のものである。かかる化学療法剤のいくつかは、抗血管新生剤、イリノテカンと併用するか、または併用しないベバシズマブ、ニトロソウレア、例えばカルムスチン(ＢＣＮＵ)、プラチン、例えばシスプラチナム (シスプラチン)、アルキル化剤、例えばテモゾロミド、チロシンキナーゼ阻害剤 (ゲフィチニブまたはエルロチニブ)、ウクラインおよびカンナビノイドを含む。これらの付加的な治療剤 (共治療剤) は、ＣＳＦ−１Ｒと共治療剤の混合による同時投与によって、または連続的に投与して、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤と同時に用いてよい。好ましい態様は、本明細書中に記載の式Ｉの化合物から選択される化合物 (例えば、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、ＩｇまたはＩｈ)を、テモゾロミドまたはプラチン化合物と組み合わせて用いることを含む。
【００２９】
さらに、マクロファージは、乳がんにおける治療応答の低下および、放射線治療後の、神経膠芽腫の異種移植における、血行再建の上昇に関連している。これらのマクロファージの効果は、他の治療の有効性を低下させるものであるため、生体内において、神経膠芽腫のマクロファージの活性を阻害する本発明の化合物は、他の治療剤または放射線治療と組み合わせて用いた場合に、相乗効果をもたらすことが予期されうる。
【００３０】
いくつかの態様において、本明細書中に記載の方法は、式(Ｉｃ)の化合物を用いて行われる。他の態様において、本発明の方法は、式(Ｉｃ)の化合物でない、式（Ｉ）の化合物、例えば本明細書中に記載の他の種を用いて行われうる。
【００３１】
いくつかの態様において、式（Ｉ）の化合物はまた、少なくとも１つの他の標的を阻害し、抗腫瘍効果の亢進をもたらす。例えば、以下の式:
【化１１】
0006046702.tif 000012
および
【化１２】
0006046702.tif 000013
の化合物は、典型的な治療用量、例えば、本明細書中に記載の用量で達成される濃度で、ＰＤＧＦＲも阻害する。したがって、これらの化合物は、二重の作用機序が望ましい場合、および、上記方法の任意の方法において使用しうる。
【００３２】
式ＩｇおよびＩｈの代表的な化合物は、ＣＳＦ−１ＲおよびＰＤＧＦＲに対する相対活性を示す、以下の表に挙げられる。かかる化合物の多くは、当該分野で公知であり（ＷＯ２００７/０６６８９８参照）、これらの化合物を製造する方法もまたよく知られている。以下の表で示すように、式Ｉの化合物は、シクロヘキシル環の立体化学に関わらず、ＣＳＦ−１Ｒに対してかなりの活性を示す。種々の異性体のうち、Ｓ，Ｓ異性体はまた、ＣＳＦ−１Ｒと同様に、ＰＤＧＦＲ-βにも高い活性を示すため、２つの機序で神経膠腫に作用し、有効性の亢進をもたらしうる。
【表１】
0006046702.tif 000014
【００３３】
以下に列挙する態様は、本発明の代表的なものである:
１.  哺乳類対象において脳腫瘍を処置する方法であって、該対象に有効量の式（Ｉ）:
【化１３】
0006046702.tif 000015
［式中、
Ｒ１は、アルキルピラゾールまたはアルキルカルボキサミドであり；そして
Ｒ２は、ヒドロキシシクロアルキルである。］
の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
２.  Ｒ１が、
【化１４】
0006046702.tif 000016
［式中、Ｒ’はＭｅまたはＥｔである。］
である、態様１に記載の方法。
３.  Ｒ２が、
【化１５】
0006046702.tif 000017
である、態様１または２に記載の方法。
４.  脳腫瘍が、神経膠腫、好ましくは、前神経性神経膠芽腫である、上記態様のいずれかの方法。
５.  神経膠腫が、多形神経膠芽腫である、態様４に記載の方法。
６.  脳腫瘍が脳転移、星状細胞腫 (神経膠芽腫を含む)、乏突起神経膠腫、上衣腫または混合膠腫である、態様１〜３のいずれかに記載の方法。
７.  式（Ｉ）の化合物が、
【化１６】
0006046702.tif 000018
もしくは
【化１７】
0006046702.tif 000019
またはその薬学的に許容される塩;またはこれらの１つの単離された立体異性体である、上記態様のいずれかに記載の方法。
８.  式（Ｉ）の化合物が:
【化１８】
0006046702.tif 000020
である、態様７に記載の方法。
９.  式（Ｉ）の化合物が:
【化１９】
0006046702.tif 000021
である、態様７に記載の方法。
１０.  式（Ｉ）の化合物が:
【化２０】
0006046702.tif 000022
である、態様７に記載の方法。
１１.  式（Ｉ）の化合物が:
【化２１】
0006046702.tif 000023
である、態様７に記載の方法。
１２.  対象に有効量の付加的ながん治療剤、抗血管新生剤、イリノテカンと併用するか、または併用しないベバシズマブ、ニトロソウレア、例えばカルムスチン (ＢＣＮＵ)、プラチン、例えばシスプラチナム（シスプラチン）、アルキル化剤、例えばテモゾロミド、チロシンキナーゼ阻害剤 (ゲフィチニブまたはエルロチニブ)、ウクライン、およびカンナビノイドを投与することをさらに含む、上記態様のいずれかに記載の方法。
１３.  式（Ｉ）の化合物が経口投与される、上記態様のいずれかに記載の方法。
１４.  対象に投与される式（Ｉ）の化合物の量が、１日あたり約５０mg/kg〜約５００mg/kg、または１日あたり５〜５００mg/kgまたは１００〜３００mg/kgである、上記態様のいずれかに記載の方法。
１５.  対象が前神経性神経膠芽腫を有している、上記態様のいずれかに記載の方法。
１６.  対象がＰＤＧＦまたはＰＤＧＦＲシグナルのレベルが上昇しているために選択された対象である、上記態様のいずれかに記載の方法。
１７.  対象が、ＰＤＧＦＲ阻害剤と同時に処置されるか、または、ＰＤＧＦＲ阻害剤として、サブナノモル活性を有するＣＳＦ−１Ｒ阻害剤、例えば化合物 (Ｉｄ)または(Ｉｆ)で処置される、上記態様のいずれかに記載の方法。
１８.  対象がヒトである、上記態様のいずれかに記載の方法。
１９.  脳腫瘍の処置に使用するための、態様１に記載の化合物。
２０.  脳腫瘍が神経膠芽腫である、態様１９に記載の化合物。
２１.  神経膠芽腫が前神経性神経膠芽腫である、態様２０に記載の化合物。
２２.  共治療剤とともに用いるために製剤化される、態様２０に記載の化合物。
２３.  式:
【化２２】
0006046702.tif 000024
［式中、Ｒ’はＭｅ、Ｅｔまたはプロピルである。］
で示される化合物。
２４.  Ｒ’がＭｅである、態様２３に記載の化合物。
２５.  態様２３または２４に記載の化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【００３４】
本明細書で用いる用語「塩 (複数の場合を含む)」は、本発明の化合物の酸付加塩または塩基付加塩をさす。「塩」は、特に「薬学的に許容される塩」を含む。用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の生物学的有効性および性質を保持した塩であって、典型的には生物学的にまたはそれ以外の点で望ましくない点がないものをさす。
【００３５】
薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸と形成され、例えば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロルテオフィロナート(chlortheophyllonate)、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩(napsylate)、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクツロ酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびトリフルオロ酢酸塩であり得る。
【００３６】
塩が由来し得る無機酸は、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸およびリン酸などを含む。
【００３７】
塩が由来し得る有機酸は、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸およびスルホサリチル酸などを含む。
【００３８】
薬学的に許容される塩基付加塩は無機および有機塩基と形成されうる。
【００３９】
塩が由来しうる無機塩基は、例えばアンモニウム塩および周期表の第Ｉ〜第ＸＩＩ列の金属を含む。特定の態様において、塩はナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛および銅より得られ、特に適当な塩はアンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩を含む。
【００４０】
塩が由来しうる有機塩基は、例えば第一級、第二級および第三級アミン、天然に発生する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂などを含む。特定の有機アミンは、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リジン、メグルミン、ピペラジンおよびトロメタミンを含む。
【００４１】
本発明の薬学的に許容される塩は、慣用的な化学方法により合成しうる。一般的にかかる塩は、これらの化合物の遊離酸形態のものを化学量論的な量の適当な塩基（例えばＮａ、Ｃａ、ＭｇまたはＫの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩など）と反応させるか、またはこれらの化合物の遊離塩基形態のものを化学量論的な量の適当な酸と反応させることにより製造しうる。かかる反応は、典型的に水中もしくは有機溶媒中、またはこれら２つの混合物の中で行われる。一般的に、実行可能な場合は非水系媒体、例えばエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルを使用するのが望ましい。さらなる適当な塩の一覧は、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」、20th ed., Mack Publishing Company，Easton，Pa.,（1985）およびStahlとWermuthによる「Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection, and Use」（Wiley−VCH、Weinheim、Germany、2002）に見られる。
【００４２】
本明細書内で示される式はいずれも、化合物の同位体標識形態ならびに非標識形態を表すことを意図している。同位体標識された化合物は１つ以上の原子が選択された原子量または質量数を持つ原子で置換されていることを除いては、本明細書内で示される式に表される構造を有する。本発明の化合物に取り込まれうる同位体の例は水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素および塩素の同位体、例えばそれぞれ２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、１２５Ｉを含む。好ましい態様において、本発明の化合物は標識されていない；すなわち、すべての原子について、ほとんど天然同位体を多量に含んでいる。他の態様において、本発明の化合物は、式（Ｉ）の化合物中の１つの原子について、量が豊富になった非天然同位体を選択的に取り込むことによって標識される。本発明は本明細書内で定義される、同位体標識された様々な化合物、例えば３Ｈおよび１４Ｃのような放射性同位体または２Ｈおよび１３Ｃのような非放射性同位体が中に存在する化合物を含む。かかる同位体標識された化合物は代謝試験（１４Ｃを用いる）、反応力学の試験（例えば２Ｈまたは３Ｈを用いる）、検出もしくはイメージング技術、例えば薬剤または基質の組織内分布アッセイを含む陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）もしくは単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）または患者の放射線治療において有用である。具体的には、１８Ｆまたは標識された化合物は特にＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ試験に望ましいものでありうる。同位体標識された式（Ｉ）の化合物は、一般的に、式Ｉの化合物の合成についての記載、例えば米国特許公開番号第２００８/００４５５２８号(ＷＯ２００７/１２１４８４)を参考にして、当業者に公知の慣用的な技術によって製造しうる。ＢＬＺ９４５は、そのいくつかの異性体とともに、当該文献に記載されている。当該文献の実施例１７３および１７４には、１Ｒ,２Ｒ−アミノシクロヘキサノールを用いた、ピラゾール化合物(Ｉｅ)の合成が記載されており、これは、標識および非標識両方の、式Ｉの他のピラゾール化合物の合成に適用しうる。同文献の１６３頁には、１Ｒ,２Ｒ−および１Ｓ,２Ｓ−アミノシクロヘキサノールの合成が両方記載されており、これを実施例１７３の方法に代入して、標識および非標識両方の、(Ｉｆ)および他の式Ｉの化合物を製造することは容易なことである。
【００４３】
さらに、重同位元素、具体的には重水素（すなわち２ＨもしくはＤ）での置換は、代謝安定性がより大きくなっていること、例えば生体内の半減期が大きいこと、または必要な用量が少ないこと、または治療指数の改善による、特定の治療学的な利点を提供しうる。この文脈において、重水素は、式（Ｉ）の化合物の置換基とみなされると理解される。かかる重同位元素、特に重水素の濃度は、同位体濃縮係数により規定しうる。本明細書内で使用する用語「同位体濃縮係数」は、特定の同位体の同位体存在量と自然存在量の比を意味する。本発明の化合物の置換基が重水素をさすとき、かかる化合物は指定した重水素原子それぞれについて少なくとも３５００（各指定重水素原子について５２．５％の重水素の取り込み）、少なくとも４０００（６０％の重水素取り込み）、少なくとも４５００（６７．５％の重水素取り込み）、少なくとも５０００（７５％の重水素取り込み）、少なくとも５５００（８２．５％の重水素取り込み）、少なくとも６０００（９０％の重水素取り込み）、少なくとも６３３３．３（９５％の重水素取り込み）、少なくとも６４６６．７（９７％の重水素取り込み）、少なくとも６６００（９９％の重水素取り込み）または少なくとも６６３３．３（９９．５％の重水素取り込み）の存在量濃縮係数を有する。
【００４４】
本明細書で用いる用語「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者に公知である、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存料(例えば抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩類、保存料、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味料、風味剤、色素など、およびそれらの組み合わせを含む(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp.1289−1329を参照のこと)。いずれの慣用の担体も、有効成分と不適合でない限り、治療用組成物または医薬組成物におけるその使用が意図される。
【００４５】
本発明の化合物についての用語「治療上有効量」は、対象の生物学的または医学的応答、例えば酵素または蛋白質の活性を減少させるもしくは阻害する、または症状を寛解させる、状態を緩和する、疾患の進行を遅らせる、または疾患を予防する、などを生じさせる、本発明の化合物の量をさす。非限定的な態様の一において、用語「治療上有効量」は、対象に投与された場合に、(１)（ｉ）ＣＳＦ−１Ｒを介する、または(ｉｉ)ＣＳＦ−１Ｒ活性に関連する、または(ｉｉｉ)ＣＳＦ−１Ｒの(正常なまたは異常な)活性によって特徴付けられる症状または障害または疾患を、少なくとも一部、緩和する、阻害する、予防するおよび／または寛解させる；または(２)ＣＳＦ−１Ｒ活性を低下させるかまたは阻害する、または（３）ＣＳＦ−１Ｒの発現を低下させるかまたは阻害するのに有効である、本発明の化合物の量をさす。他の非限定的な態様において、本発明の化合物についての用語「治療上有効量」は、細胞、組織、または非細胞生物学的物質、または培地に投与した場合に、ＣＳＦ−１Ｒ活性を少なくとも一部、低下させるかまたは阻害するのに、または、ＣＳＦ−１Ｒの発現を少なくとも一部、低下させるかまたは阻害するのに有効である、本発明の化合物の量をさす。上述したＣＳＦ−１Ｒについての態様で示した用語「治療上有効量」の意味はまた、他の任意の関連する蛋白質／ペプチド／酵素、例えばＰＤＧＦＲなどについて同じ意味で適用する。
【００４６】
本明細書で用いる用語「対象」は、動物をさす。典型的には、動物は哺乳類である。また、対象は、例えば霊長類(例えばヒト、男性または女性)、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚類、鳥類などをさす。特定の態様において、対象は、霊長類である。さらに他の態様において、対象はヒトである。
【００４７】
本明細書で用いる用語、「阻害する」、「阻害」または「阻害すること」は、特定の症状、徴候または障害、または疾患の軽減もしくは抑制、または、生物活性またはプロセスのベースライン活性の著しい減少をさす。
【００４８】
本明細書で用いる用語、任意の疾患または障害を「処置する」、「処置すること」または「処置」は、態様の一において、疾患または障害を寛解させる(すなわち疾患またはその少なくとも１つの臨床症状の進行を遅らせる、停止させるまたは減少させる)ことをさす。他の態様において、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、患者に認識されなくてよいものを含む、身体的パラメーターの少なくとも一つを緩和するまたは寛解させることをさす。また、他の態様において、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害を、身体的に(例えば認識可能な症候の安定化)、生理学的に(例えば身体的パラメーターの安定化)またはその両方で調節することをさす。また別の態様において、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害の発症または発達または進行を、予防するかまたは遅らせることをさす。脳腫瘍については、「処置すること」は、典型的には、腫瘍の成長速度または、腫瘍の大部分を除去した後の腫瘍の再成長の速度を遅らせること、または腫瘍もしくは腫瘍の大部分を取り除いた後の腫瘍の残遺物のサイズを減少させることを含む。
【００４９】
本明細書中において、対象が、処置により、生物学的、医学的にまたはクォリティー・オブ・ライフにおいて利益を得るならば、対象はかかる処置を「必要」とする。典型的には、該対象は脳腫瘍、しばしば神経膠芽腫の一形態、好ましくは多形神経膠芽腫であると診断されている。
【００５０】
本明細書において、本発明の文脈(特に特許請求の範囲の文脈)で用いる用語「単数表現」および同様の用語は、特にことわらない限り、または、文脈に明らかに矛盾しない限り、単数と複数の双方を含むと解釈されるべきである。
【００５１】
本明細書中に記載の全ての方法は、特にことわらない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適当な順序で行ってよい。本明細書中の、任意の、および全ての例または例示的表現(例えば「のような」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特記しない限り、本発明の範囲を限定しない。
【００５２】
いくつかの態様において、本発明は、本発明の化合物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を使用する。該医薬組成物は、例えば経口投与、非経口投与、および直腸投与などの特定の投与経路用に製剤しうる。さらに、本発明の医薬組成物は、固体形態（カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤または坐剤を含むが、これらに限定されない）または液体形態（液剤、懸濁剤または乳剤を含むが、これらに限定されない）で製造されうる。該医薬組成物は、滅菌のような慣用的な薬学的な操作をうけてよく、ならびに／または、慣用的な、不活性希釈剤、滑剤または緩衝剤、およびアジュバント、例えば保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤および緩衝剤などを含みうる。
【００５３】
いくつかの態様において、該医薬組成物は、有効量の、テモゾロミドのような付加的な化学療法剤を、少なくとも１つ含む。
【００５４】
典型的には、医薬組成物は、有効成分を、以下のうちの１つである少なくとも１つの賦形剤、例えばカプチゾル（本明細書中の実施例で使用）とともに含む、錠剤またはゼラチンカプセル剤であり、
ａ) 希釈剤、例えば乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；
ｂ) 滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコール；
錠剤についてはさらに、
ｃ) 結合剤、例えばケイ酸アルミニウムマグネシウム、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン；
所望するならば、
ｄ) 担体、例えば、カプチゾル、ＰＥＧ、グリセリン、シクロデキストリンなどのような、共溶解物質を含む水性ビヒクル
ｅ) 崩壊剤、例えば澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または、発泡性混合物；および／または
ｆ) 吸収剤(absorbent)、着色料、風味剤および甘味料；
も含む。
【００５５】
錠剤は、当該技術分野で公知の方法により、フィルムコートまたは腸溶性コートされうる。
【００５６】
好ましくは、本発明の化合物または組成物は、経口投与用に、例えば、式（Ｉ）の化合物の錠剤またはカプセル剤として、または液剤または懸濁剤として製剤化され、カプセルのような、一用量の容器に包装されてよい。
【００５７】
経口投与に適当な組成物は、錠剤、トローチ剤、水性または油性懸濁剤、分散散剤または顆粒剤、乳剤、硬または軟カプセル剤、またはシロップ剤またはエリキシル剤の形態で、有効量の本発明の化合物を含む。経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造について当該技術分野で公知の、任意の方法にしたがって調製され、かかる組成物は、薬学的に洗練された、のみやすい製剤を提供するために、甘味料、風味剤、着色料および保存剤からなる群から選択される１種以上の薬剤を含みうる。錠剤は、錠剤の製造に適当な、非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合した有効成分を含み得る。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；造粒剤および崩壊剤、例えばトウモロコシ澱粉またはアルギン酸；結合剤、例えば澱粉、ゼラチンまたはアラビアゴム；および滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。錠剤は、コーティングされていないか、または、消化器中での崩壊および吸収を遅らせ、それによって長期間にわたり、持続した作用を提供するために公知の方法によってコーティングされる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような時間遅延物質が用いられうる。経口使用のための製剤は、有効成分を不活性な固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合した硬ゼラチンカプセル剤として、または、有効成分を水または油性媒体、例えば落花生油、液体パラフィンまたはオリーブ油と混合した軟ゼラチンカプセル剤として、提供されうる。
【００５８】
いくつかの態様において、本発明の化合物または組成物は、注射によって投与されるように調製される。特定の注射可能な組成物は、水性等張性液剤または懸濁剤であり、坐剤は、有利なに、脂肪性乳剤または懸濁剤から製造される。該組成物は、滅菌処理されてもよく、ならびに／または、アジュバント、例えば保存料、安定剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調整用塩および／または緩衝剤を含んでもよい。さらに、それらはまた、他の治療上有益な物質を含んでもよい。該組成物は、それぞれ、慣用的な混合法、造粒法またはコーティング法にしたがって製造され、約０.１〜７５％、または、約１〜５０％の有効成分を含む。
【００５９】
いくつかの態様において、本発明の化合物または組成物は、局所的に投与されるように調製される。経皮適用に適当な組成物は、有効量の本発明の化合物を適当な担体とともに含む。経皮送達に適当な担体は、宿主の皮膚の通過を助ける、吸収可能な薬理学的に許容される溶媒を含む。例えば、経皮デバイスは、裏打ち材(backing member)を含み、担体と共に化合物を含む貯蔵部、所望により、宿主の皮膚に、制御され予め定められた速度で長時間かけて本化合物を送達するための速度制御障壁を含んでよく、ならびに、皮膚にデバイスを固定するための手段を含むバンデージの形態である。
【００６０】
例えば、皮膚および眼のような局所適用に適当な組成物は、水性液剤、懸濁剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、または、例えばエアロゾルなどによって送達するための噴霧可能な製剤を含む。かかる局所送達系は、具体的には、皮膚適用、例えば皮膚がんの処置に適切であり、例えば日焼け止めクリーム、ローション剤、スプレー剤などにおける予防的使用に適切である。したがって、それらは特に、当該技術分野で周知の、化粧用製剤を含む局所製剤における使用に適している。かかる製剤は、可溶化剤、安定剤、張性増加剤(tonicity enhancing agent)、緩衝剤および保存料を含んでもよい。
【００６１】
本明細書で用いる場合、局所適用はまた、吸入または鼻腔内適用に関するものでありうる。それらは、好都合に、乾燥粉末(単独でまたは混合物として、例えば乳糖との乾燥混合物で、または例えばリン脂質との混合成分粒子として)の形態で、乾燥粉末吸入器から、または、エアゾールスプレー製剤の形態で、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザーまたはネブライザーから、適当な噴射剤を使用してまたは使用せずに送達されうる。
【００６２】
いくつかの態様において、式（Ｉ）の化合物の有効量は、１日あたり約１０mg/kg〜約５００mg/kgである。具体的な態様において、有効量は、１日あたり約２５mg/kg〜約３００mg/kg、例えば、１日あたり約１００〜約２５０mg/kgである。該用量は、１日あたり、１〜４用量で投与してもよく、また、１日おきに投与してもよい。好ましい態様において、用量は、１日当たり約２００mg/kgであり、１日あたり１または２用量で、経口投与される。
【００６３】
水は特定の化合物の分解を促進し得るため、本発明はさらに、有効成分として本発明の化合物を含む、無水の医薬組成物および剤形を提供する。
【００６４】
無水の本発明の医薬組成物および剤形は、無水または水分含量の低い成分を用いて、そして水分の少ないまたは湿度の低い条件を用いて調製されうる。無水の医薬組成物は、無水の性質が維持されるように調製され保存されうる。したがって、無水の組成物は、適当な製剤キットに包含されうるように、水への曝露を防止するための公知の物質を用いて包装される。適当な包装の例としては、密封されたホイル、プラスチック、単位用量容器(例えばバイアル)、ブリスター・パック、およびストリップ・パックが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明は、さらに、有効成分としての本発明の化合物が分解する速度を低下させる１種以上の薬剤を含む医薬組成物および剤形を提供する。かかる薬剤を本明細書中で「安定剤」とよび、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、ｐＨ緩衝剤、または塩緩衝剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書中に記載の化合物および方法は、種々の脳腫瘍の処置に有用であるが、これは、実証するように、血液脳関門を通過でき、そして脳内の腫瘍の中および／または周辺でのＴＡＭの集積の阻害しうることに基づく。いくつかの態様において、該脳腫瘍は、体内のどこか他の場所で発生したがんの転移である。他の態様において、脳腫瘍は、多形神経膠芽腫のような神経膠腫である。
【００６７】
遊離形態または塩形態の式Ｉの化合物は、有益な薬理学的性質、例えば、次節で試験管内および生体内試験で示すように、ＣＳＦ−１Ｒおよび、任意で、ＰＤＧＦＲを調整する性質を示し、そのため、治療に用いることが示唆される。
【００６８】
したがって、さらなる態様として、本発明は、式（Ｉ）の化合物の使用または治療における使用を提供する。さらなる態様において、かかる治療は、ＣＳＦ−１Ｒの阻害によって処置しうる疾患から選択される。他の態様において、該疾患は、上記に列挙したものから選択され、任意の脳腫瘍であるのが適切であり、多形神経膠芽腫のような神経膠芽腫であるのがより適切である。
【００６９】
他の態様において、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒの阻害によって処置される疾患の処置方法であって、治療上許容される量の、式（Ｉ）の化合物または、これらの化合物についての、本明細書中に記載の任意の態様を、投与することを含む、方法を提供する。さらなる態様において、疾患は、上記に列挙したものから選択され、任意の脳腫瘍、例えば、具体的には多形神経膠芽腫を含む、神経膠腫の１つであるのが適切である。
【００７０】
本発明の医薬組成物または組み合わせは、約５０〜７０kgの対象に対して、有効成分約１〜１０００mgの単位用量、または有効成分が約１〜５００mgもしくは約１〜２５０mgもしくは約１〜１５０mgもしくは約０.５〜１００mgもしくは約１〜５０mgの単位用量でありうる。化合物、医薬組成物またはその組み合わせの治療上有効用量は、対象の種、体重、年齢および処置する個々の症状、障害もしくは疾患、またはその重症度に依存する。通常の技術を有する医者、臨床医または獣医であれば、本発明の記載に基づいて、障害または疾患の進行を処置または阻害するのに必要な有効量をそれぞれ決定するのは容易なことである。
【００７１】
上記の、用量についての性質は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サルまたは単離した器官、組織およびその標本を有利に用いた試験管内および生体の試験で示すことができる。本発明の化合物は、試験管内では、溶液、例えば水性溶液の形態で適用でき、生体内では、例えば、懸濁剤または水性液剤の形態で、経腸、非経口、有利には、静注で、適用しうる。試験管内の用量は、約１０−３モル濃度〜１０−９モル濃度の範囲で変わりうる。生体内の治療上有効量は、投与経路によって、約０.１〜５００mg/kg、典型的には１０〜４００mg/kgまたは約１００〜３００mg/kg、または１〜１００mg/kgで変わりうる。いくつかの態様において、約２００mg/kgの用量が、神経膠芽腫の処置に適切であり、経口投与されうる。
【００７２】
本発明の化合物の活性は、以下の試験管内および生体内の方法によって評価しうる。 
【００７３】
米国特許公開番号第２００８−００４５５２８号に記載の試験アッセイ方法を用いて、本発明の化合物は、ＣＳＦ−１Ｒを阻害することを示しうる。本明細書中に記載のように、これらの化合物は、血液脳関門を容易に通過することができ、また、脳内の腫瘍の成長を阻害または逆転しうる。好ましくは、該腫瘍は公知の方法により検出可能であり、処置の進行は、公知の方法によりモニターしうる。いくつかの態様において、処置の進行は、ＭＲＩ (磁気共鳴画像法) を用いてモニターされ、腫瘍のサイズおよび転移がないかが測定される。
【００７４】
本発明の化合物は、１つ以上の他の治療剤、例えば本明細書中に記載の共治療剤と、同時に、または、その前後に投与しうる。本発明の化合物は、同じもしくは異なる投与経路で別々に投与するか、または他の剤と同じ医薬組成物内でともに投与してよい。
【００７５】
態様の一において、本発明は、組み合わせ製剤として、同時に、別々に、または連続的に治療に用いるための、式（Ｉ）の化合物と少なくとも１つの他の治療剤とを含む、製品を提供する。態様の一において、該治療は、ＣＳＦ−１Ｒの阻害を介する、疾患または症状の処置である。組み合わせ製剤として提供される製品は、式（Ｉ）の化合物と他の治療剤とを同じ医薬組成物の中に含む組成物、または、別々の形態、例えばキットの形態の、式（Ｉ）の化合物と他の治療剤を含む、組成物を含む。
【００７６】
態様の一において、本発明は、式（Ｉ）の化合物と、他の治療剤を含む医薬組成物を提供する。上述したように、かかる医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤または、１つ以上のかかる共治療剤を含んでよい。
【００７７】
態様の一において、本発明は、２以上の別個の医薬組成物を含み、その少なくとも１個に式（Ｉ）の化合物が含まれるキットを提供する。態様の一において、該キットは、該組成物を別々に保持する手段、例えば容器、分割されたボトルまたは分割されたホイルの包みを含む。かかるキットの例は、典型的に錠剤、カプセル剤などの包装に用いられる、ブリスターパックである。
【００７８】
本発明のキットは、例えば経口と非経腸などの異なる剤形を投与するために、異なる投与間隔で別々の組成物を投与するために、または、別々の組成物を互いにタイトレートするために用いうる。コンプライアンスを助けるために、本発明のキットは、典型的に、投与のための説明書を含む。
【００７９】
本発明の併用療法において、本発明の化合物および他の治療剤は、同一または異なる製造者によって製造および／または製剤化されてよい。さらに、本発明の化合物および他の治療剤は、一緒に、（ｉ）組み合わせ製品が医師の手に渡る前に(例えば本発明の化合物とかかる他の治療剤とを含むキットの場合)；(ｉｉ)投与直前に医師自身によって(または医師の指導の下で)；(ｉｉｉ)患者自身によって、例えば本発明の化合物および他の治療剤の連続投与の間に、併用療法に用いられ得る。
【００８０】
したがって、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒを介する疾患または症状の処置のための式（Ｉ）の化合物の使用であって、医薬が、式Ｉの化合物と組み合わせて用いるのに適していると本明細書中に記載した、付加的な化学療法剤の１つを含む、他の治療剤と共に投与するために製造される、使用を提供する。本発明はまた、ＣＳＦ−１Ｒを介する、疾患または症状を処置するための、他の治療剤の使用であって、薬剤が式（Ｉ）の化合物と共に投与される、使用を提供する。
【００８１】
本発明はまた、ＣＳＦ−１Ｒを介する疾患または症状の処置方法で用いるための、式（Ｉ）の化合物であって、式（Ｉ）の化合物が他の治療剤とともに投与されるように製剤化される、化合物を提供する。本発明はまた、ＣＳＦ−１Ｒを介する疾患または症状の処置方法で用いるための、他の治療剤であって、他の治療剤が式（Ｉ）の化合物とともに投与されるように製剤化される、治療剤を提供する。本発明はまた、ＣＳＦ−１Ｒを介する疾患または症状の処置方法で用いるための式（Ｉ）の化合物であって、式（Ｉ）の化合物が他の治療剤とともに投与される、化合物を提供する。本発明はまた、ＣＳＦ−１Ｒを介する疾患または障害の処置方法で用いるための他の治療剤であって、かかる他の治療剤が式（Ｉ）の化合物とともに投与される、治療剤を提供する。
【００８２】
本発明はまた、ＣＳＦ−１Ｒを介する疾患または症状の処置のための式（Ｉ）の化合物の使用であって、患者が前 (例えば２４時間以内) に、他の治療剤で処置を受けている、使用を提供する。本発明はまた、ＣＳＦ−１Ｒを介する疾患または症状を処置するための他の治療剤の使用であって、患者が前(例えば、２４時間以内)に、式（Ｉ）の化合物で処置を受けている、使用を提供する。
【００８３】
態様の一において、かかる他の治療剤は、抗血管新生剤、イリノテカンと併用するかまたは併用しないベバシズマブ、ニトロソウレア、例えば、カルムスチン (ＢＣＮＵ)、プラチン、例えばシスプラチナム（シスプラチン）、アルキル化剤、例えばテモゾロミド、チロシンキナーゼ阻害剤 (ゲフィチニブまたはエルロチニブ)、ウクライン、およびカンナビノイドから選択される。いくつかの態様において、他の剤は、抗血管新生化合物、カンナビノイド、およびテモゾロミドから選択される共治療剤である。
【００８４】
特に処置に有益をもたらしうる個々の具体的な組み合わせは、テモゾロミドと組み合わせた、化合物Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、ＩｇまたはＩｈである。この組み合わせは、本明細書中に記載するように、種々の脳腫瘍、例えば多形神経膠芽腫を処置するために、経口投与しうる。
【００８５】
処置方法、化合物および医薬組成物に加え、ＧＢＭ処置用のＣＳＦ−１Ｒ化合物の有効性に関連する、特定の遺伝子サインの変化もまた同定された。以下の実施例は、これらの変化についての情報を提供し、本明細書中に記載の処置方法と組み合わせて使用しうる遺伝子サインまたはバイオマーカーを同定する。技術を有する読者には明らかなように、本明細書に記載するLassoサインおよびＳＶＭサインのデータは、患者から試料を得、該試料について、遺伝子発現データを、陽性の予後および／または生存の延長と相関すると本明細書中に記載の遺伝子発現の変化およびサインと比較することによって、この方法で処置した患者の予後を決定するのに用いうる。
【実施例】
【００８６】
本発明の化合物は、当該分野で公知の方法、具体的には、ＷＯ２００７/１２１４８４に記載の方法にしたがって製造された。
【００８７】
化合物および／または中間体は、2695分離モジュールを備えたWaters Milleniumクロマトグラフィーシステム (Milford, MA)を用いた高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により、特性を明らかにした。分析カラムは、Alltech (Deerfield, IL)の、逆相Phenomenex Luna C18-5、4.6 x 50mmであった。勾配溶出液(流速２.５mL/分)は、１０分間にわたって、典型的には、５% アセトニトリル/９５% 水からはじめて、１００%アセトニトリルで用いた。全ての溶媒は、０.１% トリフルオロ酢酸 (ＴＦＡ)を含んでいた。化合物は、２２０または２５４nmのいずれかで、紫外線(ＵＶ)吸光度により検出した。ＨＰＬＣ溶媒は、Burdick and Jackson (Muskegan, MI)またはFisher Scientific (Pittsburgh, PA)のものであった。
【００８８】
質量分析は、以下の２つのLCMS機器のうちの１つで行った: Waters System (Alliance HT HPLCおよびMicromass ZQ質量分析器; カラム: Eclipse XDB C18、2.1 x 50mm; 勾配: ０.０５% TFAを含む水中５〜９５% (または３５〜９５%または６５〜９５% または９５〜９５%) アセトニトリル、４分間; 流速０.８mL/分; 分子量範囲 ２００〜１５００; コーン電圧 ２０V; カラム温度４０℃) か、または、Hewlett Packard System (Series 1100 HPLC; カラム: Eclipse XDB-C18、2.1x50mm; 勾配: ０.０５% TFAを含む水中５〜９５% アセトニトリル、４分間; 流速０.８mL/分; 分子量範囲１５０〜８５０; コーン電圧５０V; カラム温度３０℃) 。全ての質量は、プロトン化した親イオンのものとして報告した。
化合物(Ｉｆ)についての分析データ: ＨＰＬＣ保持時間１.９３分。分子イオン(MH+): m/z = ４２２.１ (LC/MS RT = ０.５０分)。
【００８９】
実施例１: マクロファージ数は正常な脳と比較して、神経膠腫形成マウスモデルで増加する
この実施例により、ＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ/Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−マウスモデルにおける、腫瘍関連マクロファージ(ＴＡＭ)の神経膠腫形成への寄与が示された。これらのマウスでは、成体内で腫瘍の発生が誘導されると、発生する病変の大部分は高グレードの多形神経膠芽腫 (ＧＢＭ)であり、これは組織学的にヒトＧＢＭのモデルとなっている。図１(Ａ)注入を受けていないＮｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−マウス (正常な脳)由来の大脳／前脳または症候性の ＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ/Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/− (ＰＤＧ) マウス由来のグレードＩＶの腫瘍 (ＧＢＭ)を、パパインで処理して単細胞浮遊液とし、フローサイトメトリーに用いた (各ｎ=５)。ＣＤ４５＋白血球は、３.６±０.６%から、１３.１±２.０%に顕著に増加した。ＣＤ１１ｂ＋骨髄系細胞/マクロファージは、白血球の圧倒的大部分(ＣＤ４５＋細胞の８９.９〜９８.５%)をしめ、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は、正常な脳 (３.３±０.５%)と比べて、腫瘍中(１２.７±２.０%)では３.８倍に増加しており、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ−細胞集団については違いは見られなかった。(Ｂ) 症候性のＰＤＧマウス由来の正常な脳またはＧＢＭ組織領域を、免疫蛍光法によりＣＳＦ−１Ｒ、ＣＤ６８ (マクロファージ)およびＤＡＰＩについて共染色した。(Ｃ)正常な脳およびＧＢＭ腫瘍 (各ｎ=３)を、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲに用いた。アッセイは、３つ組みで行い、各試料について、発現はユビキチンＣ(Ｕｂｃ)で標準化した。発現量は、正常な脳に対する相対量で表す。(Ｄ) 症候性のＰＤＧマウス由来の正常な脳またはＧＢＭ組織領域を、マクロファージマーカーのＦ４/８０およびＣＤ１１ｂならびに、Ｉｂａ−１ (マクロファージ/ミクログリア)と組み合わせた、Ｆ４/８０、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ６８と組み合わせて、ＣＳＦ−１Ｒについて染色した。ＤＡＰＩは核の対比染色に用いた。スケールバー、５０μm。データは平均＋ＳＥＭで表す。Ｐ値は、独立両側Studentｔ−検定を用いて得た; ＊Ｐ＜０.０５; ＊＊Ｐ＜０.０１。
【００９０】
マクロファージ細胞の数は、マクロファージ特異的な抗体ＣＤ６８での染色で見られるように、正常な脳に比べ、ＧＢＭ組織でかなり高かった（図１Ｂ）。これは、腫瘍関連白血球(ＣＤ４５＋) が、腫瘍体積の１３.１%をなし、その大部分がマクロファージ(ＣＤ１１ｂ＋)であったという、フローサイトメトリー解析により確認された (図１Ａ)。ＧＢＭと比較した、正常な脳の発現解析から、ＣＳＦ−１およびＣＳＦ−１ＲのｍＲＮＡレベルが、ＣＤ６８と同様に、腫瘍内で上昇していることが明らかになった (図１Ｃ)。
【００９１】
また、様々な細胞種特異的な集団が、ＧＢＭから得られ、ＣＳＦ−１およびその受容体の供給源を決定した。腫瘍細胞画分にのみ存在するＴＶＡ受容体とＴＡＭにのみ存在するＣＤ１１ｂの発現により、個々の集団の純度を確認した。ＣＳＦ−１は腫瘍細胞およびＴＡＭの両方に発現していたのに対し、ＣＳＦ−１ＲはＴＡＭにしか発現していなかった (図１Ｄ)。図１Ｄのそれぞれ各群の、３つうちの最初の棒グラフは、混合した細胞であり、二番目はＦＡＣＳで精製した腫瘍細胞であり、三番目はＦＡＣＳで精製したＴＡＭ細胞である; 混合細胞を１として、データを標準化した。グラフにより、ＴＶＡは腫瘍細胞のみを染色し、ＴＡＭを染色しない一方、腫瘍細胞ではＣＤ１１ｂの発現がないこと、およびＣＳＦ−１Ｒの発現がないことならびに、ＣＳＦ−１が腫瘍とＴＡＭ細胞の両方で、ほぼ等量存在していることが示されている。これらの発見は、免疫染色によって確認され、ＣＳＦ−１Ｒ＋細胞は全て、ＣＤ６８についても陽性であった (データは示さない)。このことは、このモデルにおける、ＣＳＦ−１Ｒ阻害後の腫瘍形成に対する効果は、いずれもマクロファージ依存性であることを示している。
【００９２】
実施例２: ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤であるＢＬＺ９４５の解析:薬物動態学および細胞アッセイ
ＢＬＺ９４５ (化合物Ｉｃ) は、骨中の腫瘍誘導性溶骨性病変を抑制するための、選択的なｃ−ｆｍｓ (ＣＳＦ−１Ｒ) キナーゼ阻害剤として開示されている。ＢＬＺ９４５は、生化学的アッセイでは１nMでＣＳＦ−１Ｒを阻害するＡＴＰ競合的阻害剤であり、約６７nMのＩＣ−５０でＣＳＦ依存性の細胞増殖を阻害する。それに対して、試験した＞２００個の種々のキナーゼの大半についてのＩＣ５０値は＞１０μM (１０,０００nM)であり、ｃＫＩＴおよびＰＤＧＦＲβについてのＩＣ−５０は、それぞれ３.５μM (３５００nM)と５.９μM (５９００nM)である。Ambit（登録商標）キナーゼアレイによって数百個のキナーゼについてスクリーニングを行うと、該化合物は、ＣＳＦ−１Ｒ、ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβについてのみ、対照の５０％未満の活性を示し、直接阻害分析(direct inhibition assay)では、２つのＰＤＧＦＲに対する活性は、ＣＳＦ−１Ｒに対する活性よりもはるかに低かった。本明細書中で記載したように、ＢＬＺ９４５に類似しているが、 (Ｓ，Ｓ) 立体化学を有する化合物は、ＣＳＦ−１Ｒに対する高い活性と同等のレベルでＰＤＧＦＲβに対する活性を示す。
【００９３】
脳の右半分にのみＧＢＭが検出できるマウスをＢＬＺ９４５で処理し、その後、血漿ならびに、脳の右半分および左半分の化合物濃度を様々なタイムポイントで測定した（１５分、２時間、８時間、２４時間)。図２に示すように、血漿濃度は、１００μMを少し超えるところまで急速に上昇し、８時間時点で５０μMを超えたままであり、その後、２４時間時点までに、低いレベルに減少した。脳組織内の濃度は、同様のパターンをたどり；血漿のレベルよりも少し低いままであるが、１５分および２時間時点で５０μMを超えた値までよく上昇する。このことは、ＢＬＺ９４５が血液脳関門(ＢＢＢ)を通過すること、ならびに、マクロファージの増殖および／または生存を阻害するのに十分な量が脳内で達成しうることを示している。このことはまた、該化合物が、脳の腫瘍を有する半分と腫瘍のない半分に同等のレベルで浸透していることを示し、浸透が腫瘍の存在により生じたＢＢＢの病変に依存的なものではないことを示唆している。このことは、血液脳関門の浸透が、培養マクロファージ細胞を効果的に阻害するのに必要なレベルよりも遙かに高い、治療上有効な薬剤レベルを脳内でもたらすのに十分な速度でおこっていることを示している。
【００９４】
実施例３:試験管内での、様々な細胞腫に対するＢＬＺ９４５の阻害活性
骨髄由来マクロファージ (ＢＭＤＭ)を単離し、以前文献に記載されている通りに分化させ、その後、６７nM ＢＬＺ９４５で処理した。ＢＬＺ９４５により、各タイムポイント（１．５分、３分、５分）において、ＣＳＦ−１刺激の後のＣＳＦ−１Ｒのリン酸化が明らかに阻害された (図３Ａ)。
【００９５】
ＢＬＺ９４５のマクロファージに対する効果についても検討した：６７nM〜６７００nMの範囲の用量は、マクロファージの生存を劇的に妨害し、その効果はＣＳＦ−１の除去と匹敵するものだった (図３Ｂ)。
【００９６】
Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆヌルのマウス (ＧＢＭモデルの遺伝的バックグラウンド)由来のＢＭＤＭについても、ＢＬＺ９４５の存在下および非存在下で試験をした。図３Ｃにより、これらのＢＭＤＭは、野生型マウス由来のＢＭＤＭと同様に、６７nM以上の濃度のＢＬＺ９４５により実質的に阻害されたことが示される (図３Ｄ)。したがって、ＢＬＺ９４５は、マクロファージの生存率の完全な妨害につながる、ＣＳＦ−１Ｒシグナルの効果的な阻害剤である。図３Ｃ〜３Ｅには、Ｉｎｋ４ａ/ＡＲｆ−/−マウス由来のＢＭＤＭ細胞の増殖が、６７nM以上の濃度のＢＬＺ９４５により、ＣＲＬ−２４６７細胞 (正常なマウスの脳)と同程度に強く阻害されたことが示されているが、その一方、６７００nMの濃度であっても、４種のマウスの神経膠芽腫培養細胞および１種のヒト神経膠芽腫培養細胞の増殖にはほとんどもしくは全く効果をもたらさないことが示されている。
【００９７】
ＢＬＺ９４５が、腫瘍細胞に対して直接効果を持たないことを確定するために、ヒト神経膠腫細胞株および初代腫瘍細胞のシリーズおよびニューロスフェアを、マクロファージの増殖に対して効果的であるとわかった濃度と同等の濃度のＢＬＺ９４５で処理した。ヒトＧＢＭ由来である、Ｕ８７−ＭＧ細胞は、培養においても生体内においてもＰＤＧＦＲシグナルに依存していることが示されているが、この細胞は、上記と同濃度のＢＬＺ９４５処理によって影響を受けなかった(図３Ｅ)。同様に、初代ニューロスフェア(ＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ/Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−マウスＧＢＭ由来)からの、二次ニューロスフェアの形成は、ＢＬＺ９４５処理により変化しなかった(図３Ｆ)。ニューロスフェアの数およびサイズは、どちらもＢＬＺ９４５による有意な影響を受けなかった。最後に、二次マウスＧＢＭニューロスフェアから樹立された多発性腫瘍細胞株に対する、ＢＬＺ９４５の効果を検討したが、この場合もまた、差異は見られなかった (図３Ｆ)。まとめると、これらの実験から、ＢＬＺ９４５によるＣＳＦ−１Ｒ阻害はマクロファージ特異的なものであり、腫瘍細胞に対しては、認識可能な直接的な結果はもたらさないことが示される。
【００９８】
実施例４:ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤ＢＬＺ９４５の処理は、神経膠腫の進行を妨害する
マクロファージ細胞アッセイにおける、ＢＬＺ９４５の強力な阻害効果および、実証されたように、血液脳関門を通過できることを考えると、この阻害剤をＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ/Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−モデルにおける前臨床試験で試験するのが望ましいと考えられる。この遺伝子操作を受けたマウスに、５〜６週齢でＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡウイルスに感染したＤＦ−１細胞を注入し、以下の文献に記載されているように、神経膠腫の形成を開始させた(Hambardzumyan, et al., Transl. Oncol., vol. 2, 89-95 (2009))。腫瘍の開始から２.５週間後に、マウスのコホートに経口経管栄養を介して、２００ mg/kgの、２０%カプチゾル中のＢＬＺ９４５または、対照としてのビヒクル (２０% カプチゾル) のどちらかを毎日投与した。続いて、マウスの無症候状態での生存期間を評価した。ビヒクル処理を受けたコホートの平均生存期間は５.７１週間(４０日)だった一方、ＢＬＺ９４５処理コホートの６４.４%は、注入後２６週間の試験終了時 (３１〜３２週齢)でも未だ生存していた (図４Ａ、Ｐ＜０.０００１)。Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−バックグラウンドのマウスは、約３０週齢で、自発性の腫瘍、主にリンパ腫および肉腫の発生が始まるため、より長期の試験では、神経膠腫表現型の解釈が複雑になるため、この試験終了時点を決定した。図４Ａのデータからは、対照マウス（ビヒクルのみ）は、ウイルス注入８週後には、無症候のものがいなかったのに対し、処理マウスでは、２６週間の終了時点で、半分より多くのマウスが無症候であった。注: １２週時点で、組織試験のために４匹の処理マウスを屠殺した。これらのうち、３匹は腫瘍がなく、１匹はグレードＩＩの神経膠腫を有していた。
【００９９】
両方のマウスのコホートについて、腫瘍のグレードを決定した (図４Ｂを参照)。最終段階では、ビヒクル処理マウスは全て高いグレードの腫瘍を有しており、１４匹のマウスのうち１３匹は、グレードＩＶのＧＢＭ病変を有していた。対照的に、ＢＬＺ９４５処理動物では、悪性腫瘍が有意に少なく:８０%はグレードＩＩであるか腫瘍がなく; 残りの２０%は、グレードＩＩＩの腫瘍を有していた。２６週の試験終了時点で生存していたマウスの５６%は、病変が検出されなかった(図４Ｂ)。ＢＬＺ９４５処理マウスのうちの５匹を、試験中に症候性として屠殺し(ｎ=５)、試験終了時点で屠殺した、未だ無症候性の群と比較した(ｎ=９)。両方の群において、ビヒクル処理動物と比較すると、腫瘍のグレードが有意に低下していた。このことは、ＢＬＺ９４５処理によって、この長期間試験における生存が劇的に上昇し、ならびに腫瘍の悪性化が低下することを示している。
【０１００】
実施例５: ＢＬＺ９４５の腫瘍成長に対する効果をモニターするためのＭＲＩイメージング
腫瘍を誘導したマウスでの、短期間の、７日間のＢＬＺ９４５についての試験を、通常のＭＲＩスキャンによりモニターし、腫瘍の成長が速い場合には、短期処理期間での腫瘍サイズの変化を測定した。ＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ/Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−マウスの腫瘍体積を、ＭＲＩによって決定し、腫瘍が少なくとも４.５mm3またはそれより大きかった場合、マウスを試験に加えた。上述したように、マウスをＢＬＺ９４５またはビヒクル対照で７日間処理した。ＭＲＩスキャンは、処理を開始する前日、処理の中間点、試験期間の終了の前日に行った。図５Ａに示すように、ビヒクル処理マウスでは、この短期間の試験の間に腫瘍体積が進行性で、劇的に増加し、平均腫瘍体積は、約５倍増加した。ＢＬＺ９４５処理は、ＭＲＩで測定されるように、腫瘍の進行を妨害し、同じ短期間の間、腫瘍サイズは増加しなかった(図５Ａ)。処理対象 (下の直線)は、腫瘍の拡大をほとんどまたは全く示さなかったが、溶媒処理対象では、腫瘍体積は急速に増加した。図５Ｂは、個々の対照マウス(上のグラフ) および処理マウス(下のグラフ)の、ＢＬＺ９４５の投与を開始してから最初の６日間の腫瘍体積を表す。ほとんど全てのＢＬＺ９４５処理マウスでは、腫瘍サイズがほとんどまたは全く増加していないのに対し、対照動物は全て、腫瘍体積が大幅に増加していることが示されている。
【０１０１】
図５Ｂに示すように、未処理の腫瘍は、この期間の間に約１５０〜８５０%体積が増加したのに対し、処理マウス１１匹のうち７匹は、腫瘍サイズが減少し、処理動物のうち２匹だけが、腫瘍体積が５０%をこえて増加した。図５−２Ａおよび５−２Ｂは、１１匹の試験動物および対照動物の全てについての腫瘍体積のデータを表し、未処理の腫瘍は６日間の処理の間にかなり成長したのに対し、処理により腫瘍サイズの増加が大幅に止められたことを示す。これらの結果は、ＣＳＦ−１Ｒシグナルおよび、仮定されるＣＳＦ−１Ｒ依存的なマクロファージの寄与が、このマウスモデルにおける神経膠腫の進行に重大なものであること、および、ＢＬＺ９４５はヒト神経膠芽腫と相関性の高い哺乳類モデルの脳腫瘍の成長を予防しうることを示している。
【０１０２】
同じＧＢＭモデル(「大きな腫瘍」コホート)における、大きな腫瘍についての、第二の生体内試験において、４８.７〜１３２mm3の腫瘍体積のマウスをＢＬＺ９４５で処理し、腫瘍体積の変化を６日間の期間でＭＲＩによりモニターした。腫瘍体積は、ほとんど全ての試験動物で実際に減少し、処理動物１８匹のうち６匹は、腫瘍サイズが少なくとも３０%減少した(図５Ｄおよび５−２Ｃ)。対照動物は、終了時まで生存していないと予測されるため、この試験には含まれなかった。
【０１０３】
実施例６: ＢＬＺ９４５処理腫瘍における、がんの特徴的な性質の解析
ＣＳＦ−１Ｒ阻害の、神経膠腫形成に対する著しい効果を確認したことにより、我々は、この応答の根底にある機構を調査し、ＢＬＺ９４５処理がどのようにがんの特徴的な性質のいくつかに影響するかを決定した。短期間試験（実施例５参照）から得られた組織について、異なる処理群由来の腫瘍を、同じ規定の終了時点で比較できるように解析を行った。以前、神経膠腫細胞を同定するのに用いられていたオリゴデンドロサイトのマーカーであるＯｌｉｇ２を用いて、腫瘍細胞の密度を調べた。Ｏｌｉｇ２は、ビヒクル対照に比べ、ＢＬＺ９４５処理群では有意に減少しており、このことは、ＢＬＺ９４５が腫瘍細胞数を有意に減少させたことを示している (図６Ａ)。
【０１０４】
ブロモデオキシウリジン (ＢｒｄＵ)の取り込みの測定によって、増殖しているＯｌｉｇ２＋細胞の比率を解析したことにより、ＢＬＺ９４５群では有意に減少していることが明らかになった(図６Ｂ)。また、ＢＬＺ９４５は、腫瘍細胞の増殖を有意に減少させた。
【０１０５】
また、これらの細胞のアポトーシスのレベルを評価した。アポトーシス細胞は、細胞質の切断型カスパーゼ (ＣＣ３)＋染色および核凝縮があるものを数えた。図６Ｃに示すように、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤処理は、特に、早期段階でのアポトーシスの増加を引き起こすが、７日目時点での大きな腫瘍コホートでは、染色はほとんど見られなかった。
【０１０６】
実施例５からの試料について行った組織学的分析を以下の表にまとめる。
【表２】
0006046702.tif 000025
【０１０７】
腫瘍体積の変化は、１日目に対する、終了時点（６日目）での体積であり、報告している変化は、対照（ビヒクル）群に対する相対値である。
【０１０８】
これらの解析をあわせると、ＣＳＦ−１Ｒシグナルを阻害することにより、腫瘍細胞の増殖を減少させ、かつ細胞死を増加させるという複合効果により、神経膠腫の成長と悪性化が効果的に妨害される。
【０１０９】
まとめると、これらのデータはＣＳＦ−１Ｒ阻害剤であるＢＬＺ９４５が、マウスの非常に悪性度の高い神経膠腫モデルにおいて、腫瘍の進行を妨害する、新規の強力な治療法であることを示している。該化合物は、神経膠腫形成の前臨床マウスモデルにおいて、生存を劇的に亢進し、腫瘍成長速度を急速に減少させ、また、短期間および長期間の試験期間において、腫瘍サイズも減少させた。長期間試験では、ＢＬＺ９４５は有意な個数のマウスにおいて可視腫瘍を除去し、処理マウスのほとんどにおいて腫瘍のグレードを急速に低下させると考えられる。
【０１１０】
マクロファージの浸潤の増加が、ヒト神経膠腫の悪性化と相関していることが示されたため、このマウスモデルにおけるＢＬＺ９４５の効力は、ＧＢＭの対象のＴＡＭを治療上の標的にしていることによると考えられ、ヒトを含む他の哺乳類の神経膠芽腫に対する効力に転換されることが期待される。マクロファージを含む骨髄系細胞は、乳がんモデルにおける化学療法応答の鈍化および、ＧＢＭ異種移植モデルにおける、放射線照射の後の適応応答の亢進に関連しているため、このＣＳＦ−１Ｒ阻害剤および類似の阻害剤は、神経膠腫のがん細胞に対する治療と組み合わせると、効果的である可能性があり、これはさらなる検討に値する可能性である。具体的には、例えば、
【化２３】
0006046702.tif 000026
および
【化２４】
0006046702.tif 000027
のような化合物は、同じ濃度でＣＳＦ−１ＲおよびＰＤＧＦＲを標的とできることが示されているため、ＢＬＺ９４５よりもさらに効果的でありうる。実際、化合物 (Ｉｄ) は、ＣＳＦ−１ＲについてのＩＣ５０よりもわずかに約４倍高いだけのＩＣ５０で、ＰＤＧＦＲを阻害する。したがって、治療上有効な濃度のこれらの化合物のいずれかは、標的部位の両方に影響し、神経膠腫に対して相乗的な活性を示すことが予期される。
【０１１１】
実施例７
ＴＡＭの明らかな枯渇もヒトＧＢＭ細胞に対する直接的な抗増殖効果も見られないにもかかわらず、ＢＬＺ９４５処理ＴＡＭが生体内で著しい抗腫瘍応答を引き起こす機構を調べるために、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１−ＴＡＭをビヒクルまたはＢＬＺ９４５で処理したマウスから単離し、マイクロアレイ発現プロファイルを行った (図７参照)。マイクロアレイ解析により、 群間で有意に異なる発現をしていたものとして、２５７遺伝子が同定され: ５２遺伝子は発現上昇し、２０５遺伝子は発現低下していた (図７Ｂ;また８Ａを参照)。これらのうち、GSEA（gene set enrichment analysis）解析により、ＣＳＦ−１Ｒシグナルの下流の転写因子である、Ｅｇｒ２の標的因子がＢＬＺ９４５処理ＴＡＭで発現減少していることが明らかになった(図７Ｃ)。Ｍ２相に関連する遺伝子は、不釣り合いに発現が上昇していた (図７Ｄおよび７Ｅ)。
【０１１２】
実施例８  ＣＦＳ−１Ｒ（CFR-1R）阻害剤により誘導される遺伝子発現変化
２つの処理群を最もよく区別する最小数の遺伝子を決定するために、Lasso回帰モデルを採用した。これにより、ＢＬＺ９４５処理についての、Ａｄｍ (adrenomedullin)、Ａｒｇ１ (arginase １)、凝血因子のＦ１３ａ１、Ｍｒｃ１ (mannose receptor C type 1)/ ＣＤ２０６および、プロテアーゼ阻害剤のｓｅｒｐｉｎＢ２からなる５つの遺伝子サインが同定された(図８Ｂ)。興味深いことに、これらの遺伝子はそれぞれ、代替活性化/Ｍ２マクロファージの極性化に関連しており、５遺伝子のうちの４つは、ＢＬＺ９４５処理後に発現が減少した。５遺伝子サインの中で、唯一発現増加した遺伝子であるＳｅｒｐｉｎＢ２ (ＰＡＩ２とも知られる)は、一般的に、特に乳がん患者における生存の上昇と正に相関する。
【０１１３】
多くの組織状況において、ＴＡＭはよりＭ２に極性化していることがわかっており、これがＴＡＭの免疫抑制機能および腫瘍形成促進機能に関連している。さらに、ヒト神経膠腫中のマクロファージは、腫瘍の高グレードに関連している、スカベンジャー受容体ＣＤ１６３およびＣＤ２０４のレベルの増加により決定される、Ｍ２様の表現型を示す。限定した５遺伝子サインの中にＭ２遺伝子が顕著に濃縮されていることを考慮し、２５７の遺伝子リストを検討し、ＢＬＺ９４５処理後に変化しているＭ２関連マーカーがさらにあるかどうかを決定した。この結果、さらに１０個の遺伝子 [Ａｌｏｘ１５ (arachidonate 15-lipoxygenase); Ｃｄｈ１ (カドヘリン); ＣＤ１６３ (ＣＤ１６３抗原); Ｆｐｒ２ (formyl peptide receptor 2); Ｈｍｏｘ１ (heme oxygenase (decycling) 1); ｉｌ１ｂ (interleukin 1 beta); およびＳｔａｂ１ (stabilin 1)]が明らかになり、これらの大部分は発現が減少していた(図７Ｄ、表２)。古典的活性化/Ｍ１極性化遺伝子は、インターロイキン-１-ベータ受容体以外は、相応して発現上昇することはなかった (図７Ｅ)。これらのデータから、ＢＬＺ９４５によるＣＳＦ−１Ｒ阻害に応答して、ＴＡＭはそのＭ２極性化を失い、抗腫瘍形成機能を獲得しうることが示唆される。
【０１１４】
このことはまた、バイオマーカーとしてこれらの遺伝子の発現をモニターすれば、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤で処置を受けた神経膠腫患者の予後について有用な情報をもたらしうることを示唆している。遺伝子発現プロファイルが、ここで観察した変化と同じまたは類似したパターンで変化する、処置を受けた対象は、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤による処置に対して陽性に応答することが期待でき、かかる遺伝子発現変化を示さない対象は、ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤だけでは、予後が陰性であるため、代替のまたは付加的な処置を受ける必要がありうる。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【０１１５】
表中、発現が低下した遺伝子については、負の倍率変化数を表示し、発現増加した遺伝子については正の値を示す。見かけ上のｐ値は、両側Studentｔ−検定から得た。
【０１１６】
さらに、マウスのＢＬＺ９４５処理ＴＡＭから作成した遺伝子サインは、ＧＢＭ患者における、差次的な生存期間に関連していると考えられる。サポートベクターマシン(ＳＶＭ)およびLassoサインを用いて、The Cancer Gene Atlas (TCGA)から得たＧＢＭデータおよび一連のＧＢＭデータセットを組み合わせた第二のデータセットの解析を行い、ならびに、患者を「ＢＬＺ９４５」または「ビヒクル」に分けて分類した。これらの解析により、Lassoサインを用いた、TCGA前神経性患者（proneural patients）についての１０ヶ月 (図８Ｃおよび８Ｄ) から、ＳＶＭサインによる組み合わせたデータセットの３１.５ヶ月の範囲で、平均生存が増加していることが明らかになった(図８Ｅおよび８Ｆ)。興味深いことに、この生存の増加は、他のサブタイプのＧＢＭでは明らかではなく、Ｇ−ＣＩＭＰ＋前神経性患者の割合が多いことによるものではない。
【表４】
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【０１１７】
関連ハザード比の解析により、TCGAおよび組み合わせデータセットの両方において、前神経性に特異的に生存について利点があることが示された (図８Ｇ)。かかる前神経特異性は、前神経性ＧＢＭを最も密接に表す、ＰＤＧ神経膠腫形成モデルから元来作成されたものである、ＴＡＭサインと一致する。このことは、これらの遺伝子サインが化学療法の処置を受けている対象、具体的にはＣＳＦ−１Ｒ阻害剤の処置を受けているＧＢＭ患者にとって、有用な予後の目安を提供しうることを示している。前神経ＧＢＭは、その他のサブタイプと比べて、強い化学療法および放射線治療に応答しないため、予後の値がこれらのサインと関連しているという発見は、この群の患者にとって重要な橋渡しとなる可能性を有しうる。観察された相関に基づき、化学療法を受けている患者であって、LassoまたはＳＶＭ遺伝子サインのどちらかに少なくとも約８０%類似している遺伝子サインを示す患者は、当該化学療法に陽性に応答することが期待される。具体的には、この相関性は、ＣＳＦ−１Ｒの阻害剤、特に本明細書中に記載の式（Ｉ）の化合物で処置されている対象にとって有用であると予期される。
【０１１８】
【表５】
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【表６】
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【０１１９】
使用した方法と材料
マウス
全ての動物試験は、Memorial Sloan-Kettering Cancer Centerの動物管理使用委員会の承認を受けている。Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−マウスモデル (混合系統バックグラウンド)は、以前に記載されている (参照： E. Tchougounova et al., Oncogene 26, 6289 (2007))。野生型 (ＷＴ) Ｃ５７ＢＬ/６ マウスおよびβ−アクチン−ＧＦＰ (Ｃ５７ＢＬ/６) マウスはそれぞれ、Charles River LaboratoriesおよびJackson Laboratoriesから購入し、また、我々の動物施設でも繁殖させた。
【０１２０】
脳内注射
成体マウスにおけるＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ発現腫瘍の形成は、以前に記載されている (A. H. Shih et al., Cancer Res 64, 4783 (2004))。端的には、マウスを１０mg/ml ケタミン/１mg/ml キシラジンで全身麻酔し、局所麻酔０.２５%ブピバカイン５０μlを手術部位に皮下注射した。５〜６週齢のマウスに、２ x １０５個のＤＦ−１:ＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ細胞を含む１μlを、固定定位器具(Stoelting)を用いて脳内に注射した。注射は、右前頭葉の、ブレグマから約１.５mm外側および１mm尾側で、２mmの深さで行った。
【０１２１】
細胞種特異的なＣＳＦ−１およびＣＳＦ−１Ｒの発現をフローサイトメトリーで分取した細胞集団の中で調べるために、以前に記載されているように、ＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ-ＳＶ４０−ｅＧＦＰ (ＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−ＧＦＰ)で、マウスに腫瘍を形成させた(E. I. Fomchenko et al., PloS ONE 6, e20605 (2011))。Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ;Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−の仔は、出生２日後に、皮質の左側の眼と耳の間に、ＤＦ−１:ＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ−ＧＦＰ細胞 １μlを注入した。
【０１２２】
ＢＬＺ９４５阻害剤及び処置
ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤ＢＬＺ９４５は、１２.５mg/mlの濃度で、２０% カプチゾル内で製剤した。ビヒクル対照である、２０%カプチゾルは、同じ方法で加工した。ＢＬＺ９４５試験のために、マウスは１日２００mg/kg ＢＬＺ９４５またはビヒクル (２０% カプチゾル) を経口胃管栄養法により投与された。
【０１２３】
薬剤が血液脳関門を通過できるかどうか決定するために、担がんマウスを、単一用量のＢＬＺ９４５で処理し、処理後、異なるタイムポイントで屠殺した。血漿および脳の左(対側) および右 (担がん) 半球を、その後の組織内のＢＬＺ９４５濃度の解析のために、液体窒素で瞬間凍結した。長期間の生存試験については、ＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡの注入後１７日/２.５週間後に、投与を開始した。固定タイムポイント試験については、先に記載(Transl Oncol 2, 89 (2009))されているように、マウスはＲＣＡＳ-ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡの注入後４〜５週間でＭＲＩスキャンを行った。
【０１２４】
腫瘍体積を決定するために、関心領域(ＲＯＩ) をＴ２強調画像上で限局し、その相当面積（mm2）を高さ０.７mmの切片で増幅した。総腫瘍体積は、各切片のＲＯＩ体積の合計であり、腫瘍が見られる最初と最後の切片の体積については、台形の体積と同じように半分にする。腫瘍体積が４.５〜４０mm3であった場合、動物を無作為に処理群に割り当てた。４０mm３より大きい腫瘍を持つ第三のコホートも、ＢＬＺ９４５で処理を行った(ＢＬＺ９４５大と表記)。ビヒクル処理マウスは、試験の終了時点まで生存できないため、サイズの合ったビヒクル処理コホートは、この大きな腫瘍負荷を有するコホートには含まれなかった。
【０１２５】
マウスの屠殺および組織回収
マウスを、図の説明文に記載した、規定のタイムポイントまたは腫瘍によりマウスが毛づくろい行動欠如、傾眠、体重減少、猫背(hunhcing)、巨頭症またはてんかんを含む症候が現れた場合に、マウスに麻酔をかけた。
【０１２６】
組織を単離して液体窒素で瞬間凍結するために、マウスを二酸化炭素で窒息させて安楽死させるか、またはアベルチン (２,２,２-トリブロモエタノール、Sigma) で全身麻酔し、頸部を脱臼させた後に、組織を回収した。フローサイトメトリーについては、マウスをアベルチンで全身麻酔し、ＰＢＳ ２０mlで経心腔的灌流した。その後、脳を単離し、腫瘍を周囲の正常な組織から切り出した（macrodissected）。増殖アッセイについては、マウスの腹腔内に、１００mg/gブロモデオキシウリジンを(ＢｒｄＵ; Sigma)、屠殺する２時間前に注入した。凍結組織診用に組織を単離するために、マウスをアベルチンで全身麻酔し、ＰＢＳ １０ml、次いで４% ＰＢＳ中パラホルムアルデヒド (ＰＦＡ) １０mlで経心腔的灌流した。脳をＰＦＡ中で一晩、後固定し、他の組織は４℃で、３０%スクロース中で凍結保存した。後固定の後、脳を３０%スクロースに移し、脳が完全に平衡化して、チューブの底に沈むまで（典型的には２〜３日間）４℃でインキュベートした。その後、全ての組織をＯＣＴ (Tissue-Tek)に包埋し、１０μmのクライオスタット組織切片を、続く全ての解析に用いた。
【０１２７】
組織診断、免疫組織化学的検査および解析
腫瘍の悪性度をグレード化するため、ヘマトキシリン・エオシン (Ｈ＆Ｅ) 染色を行い、組織を独立の神経病理学者が盲検的にスコア付けした。
【０１２８】
免疫蛍光法については、１０μm厚の凍結切片を融解し、室温で乾燥させ、その後、ＰＢＳ中で洗浄した。標準的な染色プロトコールで、組織切片を室温で少なくとも１時間、または４℃で一晩まで、０.５% ＰＢＳ中ＰＮＢでブロッキングし、次いで、０.２５% ＰＮＢ中の一次抗体で、室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。一次抗体の情報および希釈率は表６に記載するとおりである。その後、切片をＰＢＳ中で洗浄し、０.２５% ＰＮＢ中で１:５００に希釈した、適当なフルオロフォア結合二次抗体(Molecular Probes)と１時間室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、組織切片をＤＡＰＩ (５mg/ml原液をＰＢＳに１:５０００で希釈)で５分間対比染色した後、ProLong Gold Antifade mounting media (Invitrogen)を用いてマウントした。
【０１２９】
血管新生および増殖の解析については、最初に組織切片を抗原脱マスキング溶液(蒸留水中０.９４% v/v; Vector Laboratories)に浸し、半分の出力で１０分間マイクロ波を照射し、次いで少なくとも３０分間室温に冷却することで、クエン酸緩衝液による抗原の賦活化を行った。血管新生解析については、その後組織をＰＢＳ中で洗浄し、マウスIgブロッキング試薬 (Vector Laboratories) を用いて、製造者の説明にしたがって１時間室温でブロッキングした。増殖解析については、抗原賦活化後、組織切片を室温で１５分間２M ＨＣｌとインキュベートして、ＤＮＡを変性させ、その後、０.１Mホウ酸ナトリウム中和緩衝液 (ｐＨ８.５) 中で５分間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、標準的なプロトコールにしたがって染色法の残りの操作を行った。
【０１３０】
貪食性の解析のための染色には、１０μm厚の凍結切片を融解し、室温で乾燥させ、その後ＰＢＳ中で洗浄した。組織切片を室温で少なくとも１時間０.５% ＰＢＳ中ＰＮＢでブロッキングし、その後、０.５% ＰＮＢで１:５００に希釈した、ウサギ抗切断型カスパーゼ−３一次抗体で一晩４℃インキュベートした。翌日、スライドをＰＢＳで５分間、６回洗浄した後、ヤギ-抗-ウサギＡｌｅｘａ５６８二次抗体 (０.５% ＰＮＢ中１:５００)と、１時間室温でインキュベートした。その後、組織切片をＰＢＳで５分間６回洗浄し、ＰＢＳ中に、５% ロバ血清、３% ウシ血清アルブミンおよび、０.５% ＰＮＢを含む新しい緩衝液で、一晩４℃でブロッキングした。翌日、スライドを次の一次抗体のセット： ＰＢＳ中５% ロバ血清、３% ウシ血清アルブミンおよび０.５% ＰＮＢで希釈した、ウサギ抗Ｏｌｉｇ２(１:２００) およびラット抗ＣＤ１１ｂ (１:２００)と２時間、室温でインキュベートした。スライドをＰＢＳで５分間６回洗浄した後、０.５% ＰＮＢ中のロバ抗ウサギＡｌｅｘａ６４７ (１:５００) およびロバ抗ラットＡｌｅｘａ４８８ (１:５００)二次抗体と、１時間室温でインキュベートした。その後、組織切片をＰＢＳで５分間４回洗浄した後、ＤＡＰＩ (５mg/mL 原液をＰＢＳで１:５０００に希釈) で５分間染色し、ＰＢＳでさらに５分間２回洗浄し、ProLong Gold Antifade mounting media (Invitrogen)を用いてマウントした。ＣＳＦ−１Ｒ (１回目の一次抗体)およびＩｂａ１ (２回目の一次抗体)の共染色を、初めにクエン酸緩衝液抗原賦活化を加えて、同様の方法で連続して行った。
【０１３１】
組織切片はApotomeを備えたCarl Zeiss Axioimager Z1顕微鏡で可視化した。免疫蛍光染色、細胞数、増殖、アポトーシスおよび共局在の解析は、先に記載(Journal Immunol Methods 237, 39 (2000))されているように、TissueQuest analysis software (TissueGnostics) を用いて行った。
【０１３２】
血管新生解析用に染色した神経膠腫由来の組織切片の全体像を、TissueGnostics acquisition softwareで個々の２００xの像を合わせることで作成した。血管新生の全てのパラメーターは、先に記載(V. Gocheva, et al., Biol Chem 391, 937 (2010))されているように、Metamorph (Molecular Devices)を用いて定量した。
【０１３３】
貪食の解析のために、腫瘍内から、６３x油浸対物レンズ(合計倍率６３０x)およびApotomeを用いて無作為に選択した１５個の視野を得、細胞が同一の光学切片にあることを確認した。陽性の細胞をVolocity (PerkinElmer)を用いて手作業で数え、ＤＡＰＩ+核の存在によって区別した。アポトーシス細胞は、細胞質に切断型カスパーゼ３ (ＣＣ３)＋ 染色および核凝縮を有する細胞を数えた。細胞が、細胞の境界の少なくとも２／３を、近接するＣＤ１１ｂ＋環に囲まれていた場合、その細胞はマクロファージにより貪食されているとみなした。解析したマウスの数は図の説明文に具体的に記載している。
【０１３４】
蛋白質単離およびウェスタンブロッティング 
マウスをＢＬＺ９４５またはビヒクルで処理し、最後の投与の１時間後に屠殺し、腫瘍を回収した。試料は先に記載されているように、生化学的に分画した。シナプトソーム膜画分をＮＰ−４０可溶化緩衝液 (０.５% ＮＰ−４０、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ [ｐＨ７.５]、５０ mM ＮａＣｌ、１x complete Mini protease inhibitor cocktail (Roche)、１x PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail (Roche)) で可溶化し、BCA assay (Pierce)を用いて蛋白質を定量した。蛋白質可溶化液をSDS-PAGEゲルにロードし(９０μg/レーン)、免疫ブロッティングのためにPVDFメンブレンに転写した。
【０１３５】
メンブレンをリン酸化-ＣＳＦ−１Ｒ Ｙ７２１ (１:１０００; Cell Signaling Technology)、ＣＳＦ−１Ｒ (１:１０００; Santa Cruz Biotechnology),またはＧＡＰＤＨ(１:１０００; Cell Signaling Technology)に対する抗体でプローブし、ＨＲＰ結合抗ウサギ (Jackson Immunoresearch) 抗体を用いて、化学発光検出(Millipore)によって検出した。ウェスタンブロッティングのバンドを、ImageJ softwareのGel analysis moduleを用いて、ダイナミックレンジ内で定量した。
【０１３６】
初代骨髄由来マクロファージ(ＢＭＤＭ)は、図Ｓ２で示すタイムポイントで、ＣＳＦ−１非存在下で１２時間培養した後、６７nM ＢＬＺ９４５の存在下または非存在下でＣＳＦ−１ (１０ng/ml)で刺激した。全蛋白質可溶化液を、上述したようにＮＰ４０可溶化緩衝液を用いて単離し、ウェスタンブロッティングによって検出した。
【０１３７】
単細胞浮遊液の調製とフローサイトメトリー 
脳マクロファージ集団のフローサイトメトリー解析または分取のために、腫瘍をパパイン消化溶液 ５ml (０.９４mg/ml パパイン [Worthington]、０.４８mM ＥＤＴＡ、０.１８mg/ml NAcety-L-システイン [Sigma]、０.０６mg/ml ＤＮａｓｅ Ｉ [Sigma]をEarl平衡塩類溶液に希釈し、少なくとも３０分間室温で活性化させた)とインキュベートすることで、消化して単細胞浮遊液とした。消化後、０.７１mg/ml オボムコイド (Worthington)２mlを添加して酵素を不活化した。その後、細胞懸濁液を４０μmメッシュを通して未消化の組織を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液 (ＰＢＳ中１% IgG不含有ＢＳＡ [Jackson Immunoresearch])で洗浄し、７５０rpm (Sorvall Legend RT)の低速度で遠心し、細片を除いて細胞沈殿を得た。多くの免疫細胞エピトープはパパイン感受性であるため、フローサイトメトリー解析による免疫細胞の浸潤の検討には、腫瘍をカルシウムおよびマグネシウムとともに、１x Hanks平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中の１.５mg/ml コラゲナーゼＩＩＩ (Worthington) ５mLと０.０６mg/mL ＤＮａse Ｉと３７℃で１０分間インキュベートして、消化し、単細胞浮遊培養液とした。
【０１３８】
細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、４０μmメッシュを通して未消化の組織を取り除いた。ミエリンの細片を取り除くために、細胞沈殿を、室温の原液の等張Percoll (９０% Percoll [Sigma], １０% １０x HBSS)から調製した２５% Percoll １５mlに再懸濁し、その後、加速器とブレーキを１に設定して、１５００rpmで１５分間遠心した(Sorvall Legend RT)。次に、細胞沈殿を１x HBSSで洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。計数後、細胞を１００万個ごとにFc Block １μlと、少なくとも１５分間４℃でインキュベートした。その後、細胞を適切な抗体を用いて１０分間４℃で染色し、生／死細胞を除くために、ＤＡＰＩ (５mg/ml、１:５０００希釈)を含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーに用いた抗体は表６に記載する。
【表７】
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【０１３９】
解析のために、試料はBD LSR II (Becton Dickstein)に流し、続く全ての補正およびゲーティングは、FlowJo analysis software (TreeStar)を用いて行った。分取については、サンプルをBD FACSAria (Becton Dickstein)セルソーターに流し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に回収した。その後、細胞を遠心し、５００μl Trizol (Invitrogen)に再懸濁した後、液体窒素で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。
【０１４０】
マウス初代神経膠腫培養細胞、ニューロスフェアおよび神経膠腫細胞株の誘導 
切り出した腫瘍を上述したように３７℃で８〜１２分間インキュベートして消化し、単細胞浮遊培養液とした。該細胞懸濁液をNeural Stem Cell (NSC) Basal Media (Stem Cell Technologies)で洗浄し、低速度(７５０rpm Sorvall Legend RT)で遠心し、細片を除去した。マウス初代神経膠腫培養細胞を得るために、該細胞沈殿を１０% ＦＢＳ (Gibco)を含むＤＭＥＭに再懸濁した。この初代培養細胞を初期継代(Ｐ２〜Ｐ３)で使用し、これらの細胞は、免疫蛍光染色が示すように、腫瘍細胞、マクロファージおよび星状膠細胞を含む、神経膠腫で見られる様々な種類の細胞の混合を含む。初代神経膠腫培養細胞は、ポリ−Ｌ−リジンコートしたカバーグラス上(BD Biocoat)で２４時間培養した。その後、細胞を０.１Mリン酸緩衝液中４% ＰＦＡを用いて４℃で一晩固定し、０.１% Triton-Xで５分間透過し、０.５% ＰＮＢで少なくとも１時間ブロッキングした。マクロファージ、腫瘍細胞および星状膠細の存在は、それぞれＣＤ１１ｂ (１:２００)、Ｎｅｓｔｉｎ (１:５００)およびＧＦＡＰ (１:１０００)の免疫蛍光染色を用いて調べた(表７)。
【表８】
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【０１４１】
ニューロスフェアの形成については、細胞沈殿をマウスNSC Basal Media、NSCproliferation supplements、１０ng/ml EGF、２０ng/ml 塩基性ＦＧＦおよび１mg/ml ヘパリンからなるニューロスフェア培地に再懸濁した (Stem Cell Technologies)。新鮮な培地を７２時間ごとに２週間加えた。初代ニューロスフェアを回収し、機械的に脱凝集させて単細胞浮遊培養液にし、連続継代して、増殖させた。神経膠腫細胞株を作成するために、二次ニューロスフェアを解離させて単細胞浮遊培養液にし、ＤＭＥＭ＋１０% ＦＢＳ中で、単層で培養した。多発性神経膠腫細胞株は、本明細書中ではＧＢＭ１〜４と表すマウスから独立して得た。神経膠腫細胞に、先に記載(O. Florey, et al., Nat Cell Biol 13, 1335 (2011))されているようにpBabe-H2B-mCherryコンストラクトを感染させた。
【０１４２】
骨髄由来マクロファージ(ＢＭＤＭ)の単離
骨髄を単離し、その後マクロファージを得るために、Ｃ５７ＢＬ/６ ＷＴ、Ｃ５７ＢＬ/６ β−アクチン−ＧＦＰまたはＮｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ; Ｉｎｋ４ａ/Ａｒｆ−/−マウスをアベルチン(Sigma)で麻酔をかけ、その後、頸部を脱臼させて屠殺した。大腿骨および脛骨を両方の脚から滅菌条件下で回収し、洗浄した。骨髄を４０μmのフィルターに通し、３０ml Teflon（登録商標）バッグ(PermaLife PL-30) 内で１０ng/ml 組み換えマウスＣＳＦ−１(R&D Systems)とともに培養した。骨髄細胞はTeflon（登録商標）バッグ内で７日間培養し、古い培地は１日おきにＣＳＦ−１を含む新鮮な培地とおきかえ、マクロファージの分化を誘導した。
【０１４３】
さらなる細胞株Ｕ−８７ ＭＧ (ＨＴＢ−１４) 神経膠腫およびＣＲＬ−２４６７ミクログリア細胞株はATCCより購入した。Ｕ−８７ ＭＧ細胞株をＤＭＥＭ＋１０% ＦＢＳで培養した。ＣＲＬ−２４６７細胞株は３０ng/ml 組み換えマウスＣＳＦ−１を含む、ＤＭＥＭ＋１０% ＦＢＳで培養した。
【０１４４】
神経膠腫細胞調節培地 (ＧＣＭ)実験
無血清培地で神経膠腫腫瘍細胞を２４時間増殖させた調製培地を、０.２２μm フィルターに通して細胞細片を除いた。この培地は、本明細書中では神経膠腫細胞調節培地（ＧＣＭ）とよぶ。ＧＣＭは、分化したＣ５７ＢＬ/６ ＷＴまたはβ-アクチン−ＧＦＰ＋ＢＭＤＭを刺激するのに用いた。対照のマクロファージには、１０% ＦＢＳおよび１０ng/ml組み換えマウスＣＳＦ−１を含む新鮮な培地を与えた。必要な場合は、分化ＢＭＤＭは、実験解析の前に、ビヒクルとしてのＤＭＳＯもしくは、６７nM ＢＬＺ９４５、６７０nM ＢＬＺ９４５のいずれかを含むＧＣＭか、または１０ng/ml マウス組み換えＣＳＦ−１および１０ng/ml ＩＬ−４ (R&D Systems) を含む通常の培地で、２４時間または４８時間、培養した。
【０１４５】
フローサイトメトリーによるＭｒｃ１/ＣＤ２０６の発現解析 
マウス初代神経膠腫培養細胞 (腫瘍細胞、ＴＡＭ、星状膠細胞などの混合集団を含む)について、１ x １０６個の細胞をＤＭＥＭ＋１０% ＦＢＳ中で、ＢＬＺ９４５またはビヒクルとしてのＤＭＳＯの存在下で培養した。ＢＭＤＭについては、１ x １０６個の細胞を、組み換えマウスＣＳＦ−１を加えたＤＭＥＭまたはＧＣＭ中で、ＢＬＺ９４５またはビヒクルとしてのＤＭＳＯの存在下で培養した。４８時間後、細胞を掻爬し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を計数し、１０６個の細胞ごとにFc Block (BD Pharmingen) １μlとともに、少なくとも１５分間４℃でインキュベートした。その後、細胞をＣＤ４５およびＣＤ１１ｂ抗体で、１０分間４℃で染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。BD Cytofix/CytopermTM キット (BD Biosciences) を製造者の説明にしたがって使用して細胞を固定し、透過した。続いて、細胞を抗ＣＤ２０６抗体で染色した。解析には、試料をBD LSR II (Becton Dickstein)に流し、その後の全ての補正とゲーティングはFlowJo analysis software (TreeStar)を用いて行った。
【０１４６】
細胞周期解析
β−アクチン−ＧＦＰ＋マウス由来の対照またはＧＣＭで前刺激したマクロファージを１ x １０５個の血清飢餓ｍＣｈｅｒｒｙ−陽性神経膠腫細胞 (上記で得られた細胞株由来)と１:１比で、６７０nM ＢＬＺ９４５またはビヒクルとしてのＤＭＳＯの存在下で、４８時間共培養した。共培養した細胞をトリプシン処理して回収した後、ウェルをさらに培地でリンスし、この量の培地を回収し、細胞培養ディッシュに強く接着するマクロファージ細胞を全て確実に回収した。次に、試料をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、次いで、０.１mg ＤＡＰＩ (Invitrogen)を含む透過緩衝液(１０mM ＰＩＰＥＳ、０.１M ＮａＣｌ、２mM ＭｇＣｌ２、０.１% Triton X-１００、ｐＨ６.８)中で、１０分間室温でインキュベートした。UVレーザー (３５０〜３６０nm)を用いてLSR II flow cytometer (BD)でデータを取得した後、神経膠腫腫瘍細胞の細胞周期の状態を細胞周期解析用Flow Jo Dean-Jett-Fox programを用いて解析した。
【０１４７】
増殖アッセイ
細胞増殖速度をMTT cell proliferation kit (Roche)を用いて決定した。端的には、細胞を３つ組みで、６.７〜６７００nMのＢＬＺ９４５の存在下または非存在下で９６ウェルプレートに播いた(神経膠腫細胞株については、１ x １０３個/ウェルならびに、ＢＭＤＭおよびＣＲＬ−２４６７細胞については５ x １０３個/ウェル)。培地は４８時間ごとに変えた。特にことわらない限り、ＢＭＤＭおよびＣＲＬ−２４６７細胞に、それぞれ１０ng/mlおよび３０ng/ml 組み換えマウスＣＳＦ−１を加えた。MTT標識試薬１０μlを各ウェルに加え、その後、３７℃で４時間インキュベートした後、MTT可溶化試薬１００μlを一晩加えた。該混合物を優しく再懸濁し、spectraMax 340pcプレートリーダー (Molecular Devices)を用いて、吸光度を５９５nmおよび７５０nmで測定した。
【０１４８】
二次ニューロスフェア形成アッセイ
初代ニューロスフェアを脱凝集させて単細胞浮遊培養液にし、５ x １０３個の細胞をＢＬＺ９４５またはビヒクルとしてのＤＭＳＯの存在下で、ニューロスフェア培地中で、６ウェルに播種した。培地は４８時間ごとに変えた。二次ニューロスフェア形成を、２週間後に得られたニューロスフェアの数を計数することでアッセイした。
【０１４９】
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成および定量リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡをTrizolにより単離し、ＤＮａse処理して、０.５μgのＲＮＡをｃＤＮＡ合成に用いた。ＣＤ１１ｂ (Mm00434455_m1)、ＣＤ６８ (Mm03047343_m1)、ＣＳＦ−１ (Mm00432688_m1)、ＣＳＦ−１ｒ (Mm00432689_m1)、Ｉｌ３４ (Mm０0712774_m1)、Ｍｒｃ１ (Mm00485148_m1)およびＴＶ−ａ(カスタム)用のTaqmanプローブ(Applied Biosystems)をｑＰＣＲに用いた。アッセイは３つ組みで行い、各試料について、発現量はユビキチンＣ(Mm01201237_m1) で標準化した。
【０１５０】
マイクロアレイおよび遺伝子発現プロファイル 
全ての試料の調製および加工は、MSKCCのgenomics core facilityが行った。ＲＮＡはTrizolを用いて単離し、品質をAgilent Bioanalyzerを用いて評価した。総ＲＮＡの７５ngを逆転写し、Genechip 3' IVT Express Kit (Affymetrix)を用いて標識した。得られたｃＲＮＡをAffymetrix MOE 430A 2.0チップにハイブリダイズさせた。生の発現データをGCOS 1.4 (Affymetrix)を用いて解析した。データを、標的強度（target intensity）を５００に標準化して、全体的なチップ強度の差異を説明した。
【０１５１】
マイクロアレイ解析
全てのバイオインフォマティクス解析は、Bioconductor Suiteのパッケージを用いてＲで行った。ＲＭＡ (Robust Multi-Array Average) 発現値を、「affy」のパッケージを用いて得、分位数正規化を行った(R. A. Irizarry et al., Nucleic Acids Res 31, e15 (2003); L. Gautier, et al., Bioinformatics 20, 307 (2004)。ビヒクル処理試料とＢＬＺ９４５処理試料間で発現が異なる遺伝子を同定するために、「limma」パッケージ (G. K. Smyth, Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 3, Article 3 (2004)) を用いた。差次的な発現は、偽陽性率１０%で、発現が＋/−２倍変化していれば有意とみなした。先に記載(15)されているように、GSEA (Gene set enrichment analysis) を用いた。その後の分析およびヒトのデータセットとの比較のために、マウスの発現値は全ての試料で平均化した。
【０１５２】
遺伝子サイン同定のためのLasso回帰法 
マウスの発現データを上述のように正規化し、平均化した。発現の異なる遺伝子をさらなる解析に用いた。「glmnet」パッケージを用いてビヒクルおよびＢＬＺ９４５処理試料を区別するようにLasso回帰モデルを照準化した (J. Friedman, et al., Journal of Statistical Software 33, 1 (2010))。Lasso回帰の正規化パラメーターは４倍交差検定（4-fold cross validation）によって選択した。
【０１５３】
患者のデータセット
TCGA発現データは、TCGAデータポータルサイトからダウンロードしたものであり、全ての臨床データは以下のデータポータルサイト＜http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp＞よりダウンロードしたものである。Rembrandtデータセットについての臨床データおよび発現データは、＜https://caintegrator.nci.nih.gov/rembrandt/＞よりダウンロードした。Freije (GSE4412)、Murat (GSE7696)およびPhillips (GSE4271) データセットは、NCBI ＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/＞よりダウンロードした。Freijeデータセットについては、HGU133A プラットホームで実験した試料のみを考慮に入れたが、これはHGU133Bプラットホームの試料は残りのデータセットと重複する部分が最小であったためである。各データセットを別々に「Affy」パッケージを用いて取り込み、ＲＭＡ発現値を得た。全てのデータセットを分位数正規化し、各遺伝子を全ての患者で平均化した。 
【０１５４】
非TCGA患者のサブタイプ化
公に入手可能なデータセットにおけるサブタイプ特異的なの生存の違いのを検討するために、先に記載されたサブタイプ分類指標(R. G. Verhaak et al., Cancer Cell 17, 98 (2010)) を用いて、サポートベクターマシン(ＳＶＭ)を照準化した。ClacNc分析に、Verhaakらが用いた８４０個の遺伝子を用いて、データセットをサブセット化した。次に、上記の全ての患者のデータセットに存在するといわれる遺伝子について、データセットをサブセット化した。残る７７６遺伝子を用いて、TCGAデータセットのコア試料についてマルチクラスＳＶＭを照準化した。ＳＶＭは、「kernlab」パッケージを用いて、Gaussianラジアル規定カーネル関数を使用して完了した (A. Karatzoglou, et al., J. Statistical Software, 11, 9 (2004))。その後、このＳＶＭを用いて、TCGA患者および公共のデータセットの残りのサブタイプを予測した。
【０１５５】
患者の分類
ＳＶＭをマウスの発現データについて照準化し、「ビヒクル」または「ＢＬＺ９４５」に患者を分類した。患者の発現データを全てのデータセットに共通の遺伝子およびマウスホモログが知られている遺伝子についてサブセット化した。同様に、マウス発現データを全ての患者試料で共通のヒトホモログのある遺伝子についてサブセット化した。次に、マウスのデータを、「limma」パッケージを用いて同定した発現の異なる遺伝子についてサブセット化した。ヒトのデータを、これらの発現の異なる遺伝子のヒトホモログについてサブセット化した。これにより、２５７の発現の異なる遺伝子から、全ての患者のデータセットに共通し、ヒトのホモログが知られている、発現の異なる２０６の遺伝子への特徴縮小が見られた。その後、バニラカーネル関数を用いて、ＳＶＭをマウス発現データについて照準化するのに、「kernlab」パッケージを用いた。次に、このＳＶＭを用いて、患者を、「ビヒクル」かまたは「ＢＬＺ９４５」のいずれに分類されるかを予測した。
【０１５６】
同等のアプローチを用いて、Lasso回帰モデルで患者を分類した。患者およびマウスデータのサブセット化は上述のものと同じであった。「kernlab」パッケージではなく、「glmnet」パッケージを用いてLasso回帰モデルを照準化した。次に、このモデルを用いて、患者が、「ビヒクル」か「ＢＬＺ９４５」のどちらに分類されるか予測した。Ｇ−ＣＩＭＰ患者の状態は、以下に述べるように、患者のメチル化データの階層クラスタリングによって決定した(H. Noushmehr et al., Cancer Cell 17, 510 (2010))。
【０１５７】
Ｇ−ＣＩＭＰ状態による患者の階級化
実験的には、「ＢＬＺ９４５」処置サインによって提供される延命効果は、以前全体的な生存の改善と関連があることが示された(Noushmehr)、神経膠腫ＣｐＧアイランドメチル化形質(ＧＣＩＭＰ; Glioma CpG island Methylator Phenotype) の患者の割合が高くなったためではないと考えられる。TCGAデータセット由来の、解析した４５３個のＧＢＭ試料のうち、２６３個の試料には、ゲノムのメチル化データもあり、先に記載されているようにメチル化クラスターに分類した。２１人のＧ−ＣＩＭＰ患者のうち、２０ (９５%) 人は 「ＢＬＺ９４５」に分類され、このことはＧ−ＣＩＭＰ患者にＢＬＺ９４５試料が強く濃縮されていることを示す。この濃縮度にもかかわらず、ＧＣＩＭＰ陰性であることがわかっている前神経性患者(全前神経性患者のうち、６７/１３３)の生存分析から、「ＢＬＺ９４５」分類群は、それでも約１０.８ヶ月生存期間の増加を示すことが明らかになった (Ｐ= ０.０１４)。
【０１５８】
さらに、コックス比例ハザードモデルによって、「ＢＬＺ９４５」分類が示す生存の上昇は、Ｇ−ＣＩＭＰ患者によるものではないことが示された。ＢＬＺ９４５サインに関連するハザード比は、Ｇ−ＣＩＭＰ患者の有無に関わらず有意であった。また、ＢＬＺ９４５サインを混合モデルで考えた場合、Ｇ−ＣＩＭＰ層のハザード比は、有意なものではなかった。したがって、Ｇ−ＣＩＭＰ患者は擬似「ＢＬＺ９４５」分類試料中で明らかに濃縮されているが、この分類により提供される延命効果は、ＧＣＩＭＰの状態に依存するものではない。
【０１５９】
生存分析
生存分析は、「survival」パッケージを用いてＲで行った(T. Therneau、R package version 2.36-12.(2012))。ハザード比は、「survival」パッケージから、「coxph」関数を用いて決定した。患者は、Lasso回帰分類モデル、Ｇ−ＣＩＭＰ状態またはその両方の確率に基づいて階級化した。Ｐ値はWald検定を用いて得た。
【０１６０】
患者解析のプロット
全てのKaplan-Meier生存曲線、ヒートマップ、および火山型プロット（volcano plot）は、「gplots」パッケージを用いてR v 2.14.1で作成した (G. R. Warnes et al., R package version 2.10.1, (2011))。ハザード比の森林プロット(forest plot)は、GraphPad Prism Pro５で作成した。
【０１６１】
データの表示および統計学的分析
データはGraphPad Prism Pro5を用いて、それぞれの標準誤差(SEM)とともに平均で表すか、または統計的散布図で表す。特にことわらない限り、数値データは、独立両側Student ｔ−検定を用いて解析した。生存曲線については、Log Rank (Mantel-Cox)検定を用いてＰ値を得、組織学的な腫瘍のグレード付けにはFisherの直接検定を用いた。Ｐ=０.０５を、統計学的に有意と見なした。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  哺乳類対象における脳腫瘍を処置する方法であって、該対象に有効量の式（Ｉ）:
【化２５】
0006046702.tif 000038
［式中、
Ｒ１は、アルキルピラゾールまたはアルキルカルボキサミドであり;そして、
Ｒ２は、ヒドロキシシクロアルキルである。］
の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、
方法。
［２］  Ｒ１が、
【化２６】
0006046702.tif 000039
［式中、Ｒ’がＭｅまたはＥｔである。］
である、［１］に記載の方法。
［３］  Ｒ２が、
【化２７】
0006046702.tif 000040
である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］  脳腫瘍が神経膠腫である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  神経膠腫が多形神経膠芽腫である、［４］に記載の方法。
［６］  脳腫瘍が脳転移、星状細胞腫(神経膠芽腫を含む)、乏突起神経膠腫、上衣腫または混合膠腫である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［７］  式（Ｉ）の化合物が、
【化２８】
0006046702.tif 000041
もしくは
【化２９】
0006046702.tif 000042
またはその薬学的に許容される塩;またはこれらの１つの単離された立体異性体である、
［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］  式（Ｉ）の化合物が:
【化３０】
0006046702.tif 000043
である、［７］に記載の方法。
［９］  式（Ｉ）の化合物が
【化３１】
0006046702.tif 000044
である、［７］に記載の方法。
［１０］  式（Ｉ）の化合物が
【化３２】
0006046702.tif 000045
である、［７］に記載の方法。
［１１］  式（Ｉ）の化合物が
【化３３】
0006046702.tif 000046
である、［７］に記載の方法。
［１２］  対象に付加的ながん治療剤、抗血管新生剤、イリノテカンと併用するかまたは併用しないベバシズマブ、ニトロソウレア、例えばカルムスチン (ＢＣＮＵ)、プラチン、例えばシスプラチナム（シスプラチン）、アルキル化剤、例えばテモゾロミド、チロシンキナーゼ阻害剤 (ゲフィチニブまたはエルロチニブ)、ウクライン、およびカンナビノイドを投与することをさらに含む、［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］  式（Ｉ）の化合物が経口投与される、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］  対象に投与する式（Ｉ）の化合物の量が１日あたり約５０mg/kg〜約５００mg/kgである、［１］〜［１３］に記載の方法。
［１５］  対象が前神経性神経膠芽腫である、［１］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］  対象が、ＰＤＧＦまたはＰＤＧＦＲシグナルのレベルが上昇しているために選択された対象である、［１］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］  対象が同時にＰＤＧＦＲ阻害剤で処置される、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］  対象がヒトである、［１］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］  脳腫瘍を処置するために用いる、［１］に記載の化合物。
［２０］  該脳腫瘍が神経膠芽腫である、［１９］に記載の化合物。
［２１］  該神経膠芽腫が前神経性神経膠芽腫である、［２０］に記載の化合物。
［２２］  以下の式
【化３４】
0006046702.tif 000047
［式中、Ｒ’がメチル、エチルまたはプロピルである。］
で表される化合物。
［２３］  Ｒ’がメチルである、［２２］に記載の化合物。
［２４］  態様２２に記載の化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【図１Ａ】
0006046702.tif 000050
【図１Ｃ】
0006046702.tif 000051
【図１Ｄ】
0006046702.tif 000052
【図２】
0006046702.tif 000053
【図３Ａ】
0006046702.tif 000054
【図３Ｂ】
0006046702.tif 000055
【図３Ｃ】
0006046702.tif 000056
【図３Ｄ】
0006046702.tif 000057
【図３Ｅ】
0006046702.tif 000058
【図３Ｆ】
0006046702.tif 000059
【図４Ａ】
0006046702.tif 000060
【図４Ｂ】
0006046702.tif 000061
【図５−２Ａ】
0006046702.tif 000062
【図５−２Ｂ】
0006046702.tif 000063
【図５−２Ｃ】
0006046702.tif 000064
【図５Ａ】
0006046702.tif 000065
【図５Ｂ】
0006046702.tif 000066
【図５Ｃ】
0006046702.tif 000067
【図５Ｄ】
0006046702.tif 000068
【図６Ａ】
0006046702.tif 000069
【図６Ｂ】
0006046702.tif 000070
【図６Ｃ】
0006046702.tif 000071
【図７Ａ】
0006046702.tif 000072
【図７Ｂ】
0006046702.tif 000073
【図７Ｃ】
0006046702.tif 000074
【図７Ｄ】
0006046702.tif 000075
【図７Ｅ】
0006046702.tif 000076
【図８Ａ】
0006046702.tif 000077
【図８Ｂ】
0006046702.tif 000078
【図８Ｃ】
0006046702.tif 000079
【図８Ｄ】
0006046702.tif 000080
【図８Ｅ】
0006046702.tif 000081
【図８Ｆ】
0006046702.tif 000082
【図８Ｇ】
0006046702.tif 000083
【図１Ｂ】
0006046702.tif 000084