(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィーダー細胞層を使用せず、かつレンチウィルスのトランスフェクション効率を増大させる剤を使用せずに、羊水由来細胞から多能性幹細胞を作製する方法であって、
１）ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧを羊水由来細胞に、形質導入する工程であって、前記形質導入はレンチウィルスのトランスフェクション効率を増大させる剤を含まない培地中でレンチウィルスによって媒介される、前記工程および、
２）形質導入された細胞を、Ｒｈｏキナーゼ活性を阻害する剤を補充した培地中で、マトリゲルで被膜した組織培養プレート上に移す工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／２５６，１４９号（２００９年１０月２９日出願）の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は成体細胞から多能性幹細胞を作製する方法を提供する。特に本発明は、フィー
ダー細胞層又はレトロウイルストランスフェクション効率を増大させる剤を使用せずに、
体細胞から多能性幹細胞を作製する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つのアプローチは、例えば、胚性幹細胞、又は成体細胞から作製される多能性幹細胞などの多能性幹細胞から機能性β細胞を作製することである。
【０００３】
成体細胞から作製される多能性幹細胞、又は「人工多能性幹細胞」、又は「ＩＰＳ細胞」は、特定の遺伝子の「強制された」発現を誘導することにより例えば成体体細胞などの非多能性細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞のタイプである。人工多能性幹細胞は、ある体細胞遺伝子及びタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、並びに作用強度及び分化能などの多くの点で胚性幹細胞などの天然多能性幹細胞と同一であると考えられる。
【０００４】
１つの例では、Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、「我々は、４つの因子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４をＥＳ細胞培養条件下で導入することにより、マウス胚性又は成体線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導を実証する」と言明している（Ｃｅｌｌ  １２６：６６３〜６７６，２００６）。
【０００５】
別の例では、Ｌｉらは、「我々は、奇形腫を生じさせ、広くキメララットに寄与することができる、ラットｉＰＳＣ（ｒｉＰＳＣ）を生じさせ、維持する、複合遺伝的リプログラミング及び化学的条件を明らかにする。同一の戦略は、また、ｍＥＳＣのそれと類似のコロニー形態及び自己再生条件／シグナル応答を呈する、非定型ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）を生じさせるのに充分である」と言明している。（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：１６〜１９，２００９）。
【０００６】
別の例では、Ｍａｈｅｒａｌｉらは、「４つの転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４の異所性発現が線維芽細胞ゲノムへの多能性状態の付与に充分であり、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生じさせる。これらの４つの因子により誘導された核リプログラミングが、分化細胞と多能性細胞との間の遺伝外の差異を全体的にリセットするかどうかは未知のままである。ここで、我々は、新規な選択アプローチを用いて、線維芽細胞からｉＰＳ細胞を生じさせて、その遺伝子外の状態のキャラクタリゼーションを行った。女性のｉＰＳ細胞は、体細胞で沈黙させられたＸ染色体の再活性化を示し、分化時にランダムなＸ不活性化を受けた。２つのキーとなるヒストン修飾物の全ゲノムでの解析は、ｉＰＳ細胞がＥＳ細胞に高度に類似しているということを示した。これらの観察と軌を一にして、ｉＰＳ細胞は、生殖細胞系列への寄与と共に生存可能な高度なキメラを生じた。これらのデータは、転写因子誘導リプログラミングが体細胞型エピゲノムのＥＳ様状態への全面的な復帰を起こさせるということを示す」と言明している（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５〜７０，２００７）。
【０００７】
別の例では、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄらは、「我々は、ドキシサイクリン誘導可能なレンチウイルス系を生じさせて、４つのリプログラミング因子、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、及びＳｏｘ２を線維芽細胞中に一時的に発現させた」と言明している（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：２３０〜２４０）。
【０００８】
別の例では、Ｎａｋａｇａｗａらは、「我々は、Ｍｙｃレトロウイルスを必要としないｉＰＳ細胞の作製に対する改変されたプロトコルを記述する。このプロトコルによって、我々は著しく少数の非ｉＰＳバックグラウンドの細胞を入手し、作製されたｉＰＳ細胞は常に高品質のものであった。Ｍｙｃ−ｉＰＳ細胞から作製されたマウスは、試験期間には腫瘍を発現しなかった。このプロトコルは、薬物を選択せずにｉＰＳ細胞を効率的に単離することも可能にした。更には、我々は、ＭＹＣ無しで成体真皮線維芽細胞からヒトｉＰＳ細胞を生じさせた」と言明している（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１０１〜１０６，２００８）。
【０００９】
別の例では、Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、「我々は、同一の４つの因子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃにより成体ヒト真皮線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の作製を実証する」と言明している（Ｃｅｌｌ  １３１：８６１〜８７２，２００７）。
【００１０】
別の例では、Ｏｋｉｔａらは、「我々は、多能性幹細胞が、Ｏｃｔ３／４（Ｐｏｕ５ｆ１とも呼ばれる）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のレトロウイルス導入、及びそれに続く、Ｆｂｘ１５（Ｆｂｘｏ１５とも呼ばれる）発現に対する選択によりマウス線維芽細胞から誘導可能であるということを以前に示した。これらの人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞（以降、Ｆｂｘ１５  ｉＰＳ細胞と呼ぶ）は、形態、増殖及び奇形腫形成において胚性幹（ＥＳ）細胞に類似している；しかしながら、これらは、遺伝子発現及びＤＮＡメチル化パターンに関して異なり、成体キメラを生じることができない。ここでは、我々は、Ｎａｎｏｇ発現に対する選択が、Ｆｂｘ１５  ｉＰＳ細胞と比較して増加したＥＳ−細胞様遺伝子発現及びＤＮＡメチル化パターンの生殖細胞系ｉＰＳ細胞を生じるということを示す」と言明している（Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３１３〜３１７，２００７）。
【００１１】
別の例では、Ｗｅｒｎｉｇらは、「線維芽細胞が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４によりｃ−Ｍｙｃの不存在において多能性状態にリプログラミング可能である」と言明している（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１０〜１２，２００８）。
【００１２】
別の例では、Ｐａｒｋらは、「我々は、健康な研究用被験者の皮膚生検から単離される真皮線維芽細胞を含む、胎児、新生児及び成体のヒト一次細胞からｉＰＳ細胞を作製した」と言明している（Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１４１〜１４６，２００８）。
【００１３】
別の例では、Ｙｕらは、「我々は、４つの因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８）が、ヒト体細胞の胚性幹（ＥＳ）細胞の本質的な特性を呈する多能性幹細胞へのリプログラミングに充分であるということ示す」と言明している（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７〜１９２０，２００７）。
【００１４】
しかしながら、この見込みは、一部、体細胞から誘導された多能性幹細胞を多能性状態で日常的に誘導すること、継代すること、及び維持することが困難であることにより未だ充分に試されていない。体細胞から誘導された多能性幹細胞の安定的及び恒常的な長期間培養に対する１つの特徴的な制限は、多能性幹細胞を細胞のフィーダー層上で作製するという要求である。フィーダー細胞、通常、有糸分裂的に不活性な線維芽細胞は、体細胞から誘導された多能性幹細胞の接着、生長及び継代を支持する、不完全に定義された培養成分の源を提供する。しかしながら、フィーダー細胞に固有な変動により、フィーダー層培養は、培養条件の標準化に、また、体細胞から誘導された多能性幹細胞の直接分化にも障害をもたらす。結果として、体細胞から誘導された多能性幹細胞は、特性付け及び制御を充分に行った培養及び分化を行うために、通常、細胞外マトリックスタンパク質から構成される吸着層上でのフィーダーをベースとする培養から、フィーダーを含まない培養へと変更される。残念ながら、体細胞から誘導された多能性幹細胞を、フィーダー細胞上の培養からフィーダーを含まない系へと変更する方法は、細胞にストレスを加え、自発的な分化及び／又は核型の不安定性を生じる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
それゆえ、品質的に充分であり、増産して、現行の臨床的なニーズに対応することができる、人工多能性幹細胞を作製する顕著な必要性がなお存在する。本発明は、多能性幹細胞がフィーダー細胞層を使用せずに体細胞から形成される、人工多能性幹細胞を作製する代替的なアプローチを利用する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
１つの実施形態では、本発明は、フィーダー細胞層又はウイルストランスフェクションの効率を増加させる剤を使用せずに体細胞から多能性幹細胞を作製する方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、フィーダー細胞層又はウイルストランスフェクションの効率を増加させる剤を必要としない方法を用いる羊水由来細胞に由来する多能性幹細胞の集団を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒト胚性幹細胞株Ｈ１及びＣＲＬ２５２２細胞株から誘導された多能性幹細胞の細胞中の多能性に関連する遺伝子の発現を示す。
【図２】多能性幹細胞コロニーの形態を示す。パネルＡ及びＢは、羊水由来細胞から誘導された多能性幹細胞コロニーの代表的な顕微鏡写真を示す。パネルＣ及びＤは、５回の継代後羊水由来細胞（ＡＦＤ１）から誘導された多能性幹細胞を示す。パネルＥは、非形質導入の羊水由来細胞を示す。
【図３】羊水由来細胞から得られる多能性幹細胞における多能性に関連する遺伝子の発現を示す。
【図４】表示の継代回数においてフローサイトメトリーにより検出される、羊水由来細胞（ＡＦＤ１）から誘導された多能性幹細胞中の多能性に関連する遺伝子の発現を示す。
【図５】継代５において免疫蛍光法により検出される、羊水由来細胞（ＡＦＤ１）から誘導された多能性幹細胞中の多能性に関連する遺伝子の発現を示す。
【図６】ＣＲＬ２５２２細胞株から誘導された様々な多能性幹細胞中の多能性に関連する遺伝子の発現を示す。
【図７】羊水由来細胞から誘導された多能性幹細胞の２つの集団における胚体内胚葉系に特徴的なマーカーの発現を示す。
【図８】ＣＲＬ２５２２細胞株から誘導された多能性幹細胞の集団中の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーの発現を示す。
【図９】羊水由来細胞から誘導された多能性幹細胞の集団における膵臓内分泌系に特徴的なマーカーの発現を示す。
【図１０】羊水由来細胞、ＣＲＬ２５２２細胞及びヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞から誘導された多能性幹細胞を用いて形成される胚様体を示す。様々な胚様体の遺伝子発現プロフィールの比較も示される。
【図１１】羊水由来細胞から誘導された多能性幹細胞の生長及びフィーダー細胞層及び吸着層を欠いた表面への結合を示す。
【図１２】フィーダー細胞層及び吸着層を欠いた表面上で培養された、羊水由来細胞から誘導された多能性幹細胞中の多能性に関連する遺伝子の発現を示す。
【図１３】フィーダー細胞層及び吸着層を欠いた表面上で培養された、羊水由来細胞から誘導された多能性幹細胞の集団における胚体内胚葉系に特徴的なマーカーの発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
開示を明確にするため、及び限定ではなく、本発明の「発明を実施するための形態」を、本発明の特定の特徴、実施形態又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００２０】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにおいて自己再生及び分化して、自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞を含む、後代細胞を生成する、能力で定義される未分化細胞である。幹細胞は、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化する能力、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じ、及び胚盤胞への注入後、全部ではないとしても大部分の組織に実質的に寄与する能力によっても特徴付けられる。
【００２１】
幹細胞は、発生上の潜在性によって、（１）すべての胚性細胞及び胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、（２）すべての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、多能性、（３）細胞系のサブセットであるが、すべて特定の組織、臓器、又は生理学的システム内のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び血液の通常の成分であるすべての細胞種及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を生じ得る）、（４）分化多能性幹細胞よりも限定された細胞系のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性、及び（５）単一の細胞系（例えば、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する、分化単能性に分類される。
【００２２】
分化は、非特殊化（「未確定」）又は低特殊化細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「確定した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「確定した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で低特殊化（又は確定）した状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発生及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、未確定の細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用可能である。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」、又は「ステージ１細胞」、又は「ステージ１」は、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３  β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、エオメソデルミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞には、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、ＮＫＸ６．１、又はＨＢ９のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞には、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ３  β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１のマーカーを発現する。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「マーカー」は、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差次的な発現は、陽性マーカーの発現レベルの上昇、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で充分高いか又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００２７】
本明細書で使用するとき、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００２８】
本発明の人工多能性幹細胞の作製
１つの実施形態では、本発明の多能性幹細胞は、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を導入することによりフィーダー細胞層を使用せずに体細胞から誘導される。少なくとも１つの遺伝子を、例えば、核酸トランスフェクション、ウイルス形質導入、又は少なくとも１つの遺伝子によりコードされたタンパク質の直接導入などの任意の好適な手段により体細胞の中に導入してもよい。
【００２９】
少なくとも１つの遺伝子をウイルス形質導入により導入する場合には、レトロウイルスを用いて体細胞を形質導入してもよい。体細胞の中に少なくとも１つの遺伝子を導入することができるいかなるレトロウイルスも本発明での使用に好適である。１つの実施形態では、このレトロウイルスはレンチウイルスである。
【００３０】
別の実施形態では、体細胞がウイルスを用いて形質導入されてもよい。体細胞の中に少なくとも１つの遺伝子を導入することができるいかなるウイルスも本発明での使用に好適である。例えば、本発明の方法で使用されるウイルスは、アデノウイルスであってもよい。あるいは、本発明の方法で使用されるウイルスは、バキュロウイルスであってもよい。
【００３１】
ウイルス又はレトロウイルストランスフェクションの効率を増加させる剤は、体細胞の細胞膜上のウイルス粒子とシアル酸との間の電荷反発を中和することにより作用する。このような剤としては、例えばポリブレンが挙げられる。
【００３２】
１つの実施形態では、多能性幹細胞は、フィーダー細胞層又はレトロウイルストランスフェクションの効率を増加させる剤を使用せずに体細胞から誘導され、
ａ．組織培養基質上に体細胞をプレーティングする工程、
ｂ．プレーティングされた体細胞を、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸を含有する少なくとも１つのレトロウイルスにより形質導入する工程、
ｃ．形質導入された細胞を３日間培養し、次いで形質導入された細胞を細胞外マトリックスタンパク質で被覆した組織培養プレート上に移し、移した細胞を、Ｒｈｏキナーゼ活性阻害する剤及びｂＦＧＦをサプリメントとした培地中で１週間培養する工程、並びに
ｄ．培養した細胞を細胞外マトリックスタンパク質で被覆した組織培養プレート上に継代し、ｂＦＧＦをサプリメントとした馴化培地中で継代した細胞を培養する工程が含まれる。
【００３３】
少なくとも１つのレトロウイルスは、少なくとも１つの遺伝子の１つ、又は１つ以上をコードする核酸を含有してもよい。１つの実施形態では、体細胞は、少なくとも１つの遺伝子を単独でコードする核酸を含有するレトロウイルスを用いて形質導入される。
【００３４】
１つの実施形態では、馴化培地は、マウス胚性線維芽細胞を用いて馴化される。
【００３５】
１つの実施形態では、プレーティングされた体細胞は、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸を含有するレンチウイルスにより形質導入される。別の実施形態では、プレーティングされた体細胞は、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧをコードする核酸を含有する、レンチウイルスにより形質導入される。別の実施形態では、プレーティングされた体細胞は、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを単独でコードする核酸を含有する少なくとも１つのレンチウイルスにより形質導入される。
【００３６】
１つの実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ活性を阻害する剤は、Ｙ−２７６３２、ファスジル、（Ｓ）−（＋）−４−グリシル−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピンジヒドロクロリド（本明細書ではＨ１１５２−グリシルと呼ぶ）及びヒドロキシファスジルからなる群から選択される。
【００３７】
細胞外マトリックスは、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、トロンボスポンジンなどであってもよい。１つの実施形態では、細胞外マトリクスはＭＡＴＲＩＧＥＬである。
【００３８】
１つの実施形態では、体細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃに譲渡された、米国特許出願第１１／４２０，８９５号に開示されている、羊水由来細胞であってもよい。
【００３９】
別の実施形態では、体細胞は、国際公開第２００３／０４２４０５号に開示されている、羊水由来細胞であってもよい。
【００４０】
別の実施形態では、体細胞は、米国特許出願公開第２００５／００５４０９３号に開示されている、羊水由来細胞であってもよい。
【００４１】
別の実施形態では、体細胞は、Ｉｎｔ’Ａｎｋｅｒｅｔａｌ，Ｂｌｏｏｄ  １０２：１５４８〜１５４９，２００３に開示されている、羊水由来細胞であってもよい。
【００４２】
別の実施形態では、体細胞は、Ｔｓａｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １９，１４５０〜１４５６，２００４に開示されている、羊水由来細胞であってもよい。
【００４３】
別の実施形態では、体細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃに譲渡された、米国特許出願第１１／７６２，７１４号に開示されている、漿膜絨毛由来細胞であってもよい。
【００４４】
別の実施形態では、体細胞は、Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｊｏｎｅｓ、Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ８：３６７〜３７８，１９８８に開示されている、漿膜絨毛由来細胞であってもよい。
【００４５】
別の実施形態では、体細胞は、Ｒｏｎｇ−Ｈａｏｅｔａｌ、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １１：１３２８〜１３３３，１９９６に開示されている、漿膜絨毛由来細胞であってもよい。
【００４６】
別の実施形態では，体細胞は、ＷＯ２００３／０４２４０５に開示されている、漿膜絨毛由来細胞であってもよい。
【００４７】
別の実施形態では、体細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃに譲渡された、国際公開第２００６／０９４２８６号に開示されている、膵臓由来細胞であってもよい。
【００４８】
別の実施形態では、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃに譲渡された、米国特許出願第１２／１０８，８７２号に開示されている細胞から形成されてもよい。
【００４９】
体細胞からの多能性幹細胞の生成を支持するのに好適ないかなる培養培地も本発明の方法で使用されてもよい。しかしながら、他のタイプの細胞が培地で培養されることから利益をもたらし得、本発明の組成物が制限なしでこのような目的に使用されてもよいということは認識されている。
【００５０】
本発明の１つの態様では、馴化培地は次の方法により作製され、この方法は本質的に、
ａ．馴化因子を供給する細胞を培養すること、
ｂ．基本培地を細胞に添加すること、
ｃ．培地を馴化するのに充分な時間にわたって基本培地を細胞に曝露すること、及び
ｄ．馴化培地を取り出すことを含む。
【００５１】
本発明の１つの態様では、馴化培地は次の方法により作製され、この方法は本質的に、
ａ．馴化因子を供給する細胞を培養すること、
ｂ．細胞を不活性化すること、
ｃ．馴化因子を供給する細胞を再プレーティングすること、
ｄ．基本培地を細胞に添加すること、
ｅ．培地を馴化するのに充分な時間にわたって基本培地を細胞に曝露すること、
ｆ．馴化培地を取り出すこと、及び
ｇ．馴化培地を取り出すことを含む。
【００５２】
「基本培地」は、本明細書で使用されるとき、培養において非多能性細胞の生長を支持するのに効果的である塩及び栄養物の溶液を指す。
【００５３】
「馴化培地」は、本明細書で使用されるとき、フィーダー細胞に由来する可溶性因子を更にサプリメントした基本培地を指す。
【００５４】
「フィーダー細胞」は、本明細書で使用されるとき、多能性幹細胞をプレーティングした非多能性幹細胞を指す。非多能性幹細胞は、プレーティングした多能性幹細胞の生長を促す環境を提供する。
【００５５】
馴化に使用される基本培地は、いくつかの異なる配合物のいずれでも有することができる。培地は、培地の馴化に使用される少なくとも細胞株の繁殖を支持することができなければならない。この培地がまた、馴化後の多能性幹細胞の細胞株の繁殖も支持するということが好都合である。しかしながら、代替策としては、培地は、他の因子によりサプリメント可能であるか、さもなければ培地を馴化した後に多能性幹細胞の繁殖に適合させるように処理可能である。
【００５６】
フィーダーを含まない培養において多能性幹細胞を繁殖するのに好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％のＤＭＥＭ基礎培地；２００ｍＭのＬ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ  ＃  ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １３２５６−０２９などから調製可能である。
【００５７】
基本培地は、細胞による多能性幹細胞の繁殖成分の培地の中への放出が可能な環境中で培地の馴化に使用される細胞と一体化される。場合により、培地の馴化に使用される細胞を、例えば放射線、例えばミトマイシンｃなどの化学的な不活性化剤による処理により、又は任意の他の有効な方法により不活性化（すなわち、実質的な複製の不能化）させることができる。多能性幹細胞培養の支持で使用する前に培地を馴化細胞から分離する場合には、細胞の不活性化は必要でない。
【００５８】
培地の馴化に使用される細胞を、放出される因子の濃度（又は培地成分の消費）を適切にすることにより多能性幹細胞の繁茂の支持培地の無分化での作製を可能させる、充分な時間培地中で培養させる。典型的には、３７℃で２４時間培養することにより馴化される培地は、多能性幹細胞の培養を２４時間支持する培地を生じる。しかしながら、培養期間は上方又は下方に調整可能であり、何が適切な期間を構成するかは経験的に（又は必須の因子の濃度を検定することにより）決定される。あるバッチの馴化培地を集めた後、この細胞を使用して、更なる培養期間にわたって、細胞が培地を適切な方法で馴化する能力を保持する限り、所望の回数のサイクルの間、更なるバッチの培地を馴化することができる。
【００５９】
本発明の人工多能性幹細胞の増殖及び培養
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現している（Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８）。多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１（存在する場合）の発現が減少し、ＳＳＥＡ−１の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ｃａｌｉｆ．）の説明書に従ってＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄを基質として発生させることによって検出可能である。未分化の多能性幹細胞は、ＯＣＴ４及びＴＥＲＴも通常発現し、ＲＴ−ＰＣＲにより検出される。
【００６０】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の全３胚葉の細胞に分化する潜在性である。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚細胞層由来の細胞種の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。あるいは、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより、多能性を決定してもよい。
【００６１】
増殖した多能性幹細胞株を、標準的なＧバンド法を使用して核型決定し、確立された対応する霊長類種の核型と比較してもよい。細胞が正倍数体であり、全ヒト染色体が存在し、かつ著しく変更されてはいないことを意味する、「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましい。
【００６２】
本発明の方法により形成される多能性幹細胞の培養
一実施形態では、本発明の方法により形成される多能性幹細胞は、多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で様々な方法で培養される。あるいは、本発明の方法により形成される多能性幹細胞は、フィーダー細胞を本質的に含まないが、それにもかかわらず実質な分化を行わずに、多能性幹細胞の増殖を支持する培養系中で培養される。フィーダーを含まない培養において本発明の方法により無分化で形成される多能性幹細胞の生長は、別の細胞型と共に以前に培養することにより馴化培地中で支持される。あるいは、フィーダーを含まない培養において本発明の方法により無分化で形成される多能性幹細胞の生長は、化学的に定義された培地を用いて支持される。
【００６３】
例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９８：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）は、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層を用いるヒト胚盤胞からの多能性幹細胞株の培養を開示している。
【００６４】
Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１種類の異なるヒト成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力の評価を行った。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、「成人の皮膚線維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と言明している。
【００６５】
米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、フィーダーを含まない培養において霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるか又は胚性幹細胞から分化された間葉系かつ線維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、また、この細胞系の１次フィーダー細胞層としての使用も開示している。
【００６６】
別の例で、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でヒト多能性幹細胞を長期にわたって増殖させるための方法を開示している。
【００６７】
別の例で、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５  ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自然分化により誘導されたフィーダー細胞システムを開示している。
【００６８】
更なる別の例で、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。
【００６９】
Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ  ６８：２１５０〜２１５６、２００３年）は、ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。
【００７０】
別の例で、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒトの出生直後産児の包皮線維芽細胞からのフィーダー細胞層を開示している。
【００７１】
米国特許第６６４２０４８号は、フィーダーを含まない培養における霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ線維芽細胞様の細胞系を含む。こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を本開示で説明及び図示する」と言明している。
【００７２】
別の例で、国際公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための馴化培地を開示している。国際公開特許第２００５０１４７９９号は、「本発明に従って製造される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と称される分化及び不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化される」と述べている。
【００７３】
別の例で、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られる馴化培地を開示している。
【００７４】
別の例で、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための合成培地を開示している。
【００７５】
代替的な培養システムは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子をサプリメントとした無血清培地を使用している。例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ  ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生の誘発が可能な異なる増殖因子をサプリメントとした非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持されている、フィーダー細胞を含まずかつ血清を含まない培養システムを開示している。
【００７６】
別の例で、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：５６８〜５７４，２００６）は、ｂＦＧＦをサプリメントとした培地を使用して、線維芽細胞又は馴化培地の非存在において、胚性幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
【００７７】
別の例で、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、無血清でかつ線維芽細胞フィーダー細胞を含まない合成培地でのヒト胚性幹細胞の培養方法であって、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代替物を含有し、哺乳動物胎児血清を本質的に含まず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有する培地中で、幹細胞を培養することを含み、増殖因子が線維芽細胞フィーダー層だけでなく他の供給源からも供給され、培地がフィーダー細胞又は馴化培地を用いなくとも、未分化状態の幹細胞の増殖を支持する、方法を開示している。
【００７８】
別の例で、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞などの幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液では、培地は培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養において、特定の培地は、基本培地及び実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸を含有する。
【００７９】
別の例で、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態では、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基本培地を含み、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地が提供される。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な栄養素血清、並びにフィーダー細胞及びフィーダー細胞から誘導された細胞外支持体成分からなる群から選択される支持体と組み合わされる。この培地は、更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む。」と言明している。
【００８０】
別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「一態様では、本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。１つの方法は、哺乳動物の胎児血清を本質的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも本質的に含まない）培地中、及び線維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で、幹細胞を培養する。好ましい形態では、充分な量の線維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた線維芽フィーダー細胞層が不必要となる。」と言明している。
【００８１】
更なる例で、国際特許出願公開第２００５０６５３５４号は、ａ．基本培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持する上で充分な量のｂＦＧＦ、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持する上で充分な量のインスリン、及びｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持する上で充分な量のアスコルビン酸を含み、本質的にフィーダーを含まずかつ無血清の定義された等張培地を開示している。
【００８２】
別の例で、国際公開第２００５０８６８４５号は、細胞を未分化な状態に維持するのに充分な量の、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリータンパク質の構成員、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリータンパク質の構成員、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間幹細胞を曝露することを含む、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示している。
【００８３】
本発明の方法により形成される多能性幹細胞は、好適な培養基質上にプレーティングされてもよい。一実施形態では、好適な培養基材は、例えば基底膜から作製されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。一実施形態では、好適な培養基材は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ  Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性製剤であって、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００８４】
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。これには、増殖させる細胞型に応じて、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を単独で又は様々な組み合わせで挙げてもよい。
【００８５】
本発明の方法により形成される多能性幹細胞は、好適な分布で、並びに所望の特性の細胞の生き残り、繁殖、及び保持を促進する培地の存在において基質上へプレーティングされ得る。これらすべての特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益が得られ、かつ当業者により容易に決定可能である。
【００８６】
好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％のＤＭＥＭ基本培地、２００ｍＭのＬ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １５０３９−０２７；非不必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ  ＃  ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃  １３２５６−０２９などから作製可能である。
【００８７】
本発明の方法を用いて作製される多能性幹細胞遺伝子の分化
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞は、当該術分野の任意の好適な方法によって様々な他の細胞型に分化され得る。例えば、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、神経細胞、心臓細胞、肝細胞などに分化させてもよい。
【００８８】
例えば、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、国際公開第２００７０３０８７０号に開示されている方法に従って神経前駆細胞及び心筋細胞に分化させてもよい。
【００８９】
別の例では、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、米国特許第６，４５８，５８９号に開示されている方法に従って肝細胞に分化させてもよい。
【００９０】
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、当該技術分野の任意の方法により胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
【００９１】
例えば、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
【００９２】
例えば、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，１６５１〜１６６２（２００４）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
【００９３】
例えば、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，２９〜３８（２００７）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
【００９４】
例えば、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
【００９５】
別の例で、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された、米国特許出願公開第１１／７３６，９０８号に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させてもよい。
【００９６】
別の例で、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された、米国特許出願公開第１１／７７９，３１１号に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させてもよい。
【００９７】
別の例で、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された、米国特許出願公開第１２／４９３，７４１号に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させてもよい。
【００９８】
別の例で、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された、米国特許出願第１２／４９４，７８９号に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させてもよい。
【００９９】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定され得る。多能性幹細胞は、一般にこのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【０１００】
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞の膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞は、当該技術分野の任意の方法により胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。
【０１０１】
例えば、多能性幹細胞を、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させてもよい。
【０１０２】
例えば、本発明の方法に従って得られる、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理し、次いで線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去した後に、レチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【０１０３】
例えば、本発明の方法に従って得られる、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された、米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従ってレチノイン酸、１つの線維芽細胞増殖因子により所定の時間処理することにより、膵臓の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。
【０１０４】
例えば、本発明の方法に従って得られる、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４で処理し、次いでＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４を含有している培地を除去し、続いてエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地で細胞を培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【０１０５】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン４を含有している培地で培養し、次にエキセンディン４を含有している培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有している培地で培養することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１０６】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４を含有している培地で培養することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１０７】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン４を含有している培地で培養することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１０８】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された、米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。
【０１０９】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、米国特許出願第１１／７７９，３１１号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。
【０１１０】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、米国特許出願第６０／９５３，１７８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。
【０１１１】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６０／９９０，５２９号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。
【０１１２】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３  β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明での使用に好適なのは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の一態様で、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様で、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様で、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【０１１３】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なのは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【０１１４】
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞の膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞は、膵臓系内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞に当該技術の任意の方法によって分化され得る。
【０１１５】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン４を含有している培地で培養し、次にエキセンディン４を含有している培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有している培地で培養することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１６】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４を含有している培地で培養することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１７】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン４を含有している培地で培養することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１８】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された、米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。
【０１１９】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された、米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２０】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６０／９５３，１７８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２１】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６０／９９０，５２９号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１２２】
膵臓内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ−１  αからなる群から選択される。一実施形態では、膵臓内分泌細胞は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのホルモンの少なくとも１つを発現する能力がある。本発明で使用するのに好適なのは、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってよい。
【０１２３】
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１並びに、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３  β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６の転写因子の少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【０１２４】
治療
一態様では、本発明は、Ｉ型糖尿病に罹患しているかあるいはＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を培養すること、多能性幹細胞をβ細胞系にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させること、及びβ細胞系の細胞を患者に移植することを包含する。
【０１２５】
適切であるならば、移植した細胞の生存及び機能を亢進する医薬品又は生理活性物質で患者を更に処置してもよい。それらの薬剤には、例えば、特に、インスリン、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンを挙げてもよい。他の医薬化合物には、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２模倣体（mimetibody）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物のようなＭＡＰＫ阻害剤などが挙げられる。
【０１２６】
体細胞から作製される多能性幹細胞を、患者に移植する前にインスリン生成細胞に分化させてもよい。特定の実施形態では、体細胞から作製される多能性幹細胞を、患者に移植する前にβ−細胞に分化させてもよい。あるいは多能性幹細胞を、未分化又は一部が分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化をレシピエント中で行ってもよい。
【０１２７】
胚体内胚葉細胞、又は代替的には膵臓内胚葉細胞、又は代替的にはβ細胞を、分散した細胞として移植してもよく、又は肝門静脈内に注入され得るクラスターに形成してもよい。あるいは、細胞を、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス中で提供してもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入してもよい。細胞を、レシピエント内の適切な部位内に移植してもよい。移植部位には、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。
【０１２８】
移植された細胞の更なる分化、生存又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前、投与と同時、又は投与後に投与してもよい。ある実施形態では、増殖因子は、投与された細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで分化させるように使用される。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にｉｎ  ｓｉｔｕで曝露されてもよい。移植された細胞を誘導して、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の増殖因子の任意の組み合わせにより分化させることができる。
【０１２９】
移植に使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に依存し、当業者により決定され得る。
【０１３０】
一態様では、本発明は、糖尿病に罹患しているかあるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をβ細胞系にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させ、この細胞を３次元支持体に埋め込むことを含む。細胞は、患者に移植する前に、この支持体上にｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持してもよい。あるいは、細胞を含む支持体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで更に培養することなく直接患者に移植してもよい。所望によっては、支持体を、埋め込まれた細胞の生存及び機能を促進する少なくとも１つの医薬品と共に組み込んでもよい。
【０１３１】
本発明の目的のために使用するのに好適な支持体材料には、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア及びリザーバが挙げられる。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に好適である。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、同第６，０２２，７４３号、同第５，５６７，６１２号、同第５，７５９，８３０号、同第６，６２６，９５０号、同第６，５３４，０８４号、同第６，３０６，４２４号、同第６，３６５，１４９号、同第６，５９９，３２３号、同第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３  Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号及び同第６，３３３，０２９号に開示されている材料を参照のこと。
【０１３２】
医薬品が組み込まれた支持体を形成するために、薬剤を、支持体を形成するのに先立ち、ポリマー溶液と混合することもできる。あるいは加工された支持体上に、医薬品を好ましくは医薬担体の存在下で被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の他の適切な物理的形態として存在し得る。あるいは医薬品の放出速度を変更するために、支持体に賦形剤を加えてもよい。別の実施形態では、抗炎症性化合物である少なくとも１種の医薬化合物（例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示される化合物）を支持体に組み込む。
【０１３３】
支持体には、抗アポトーシス化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示されている化合物を組み込んでもよい。
【０１３４】
支持体には、線維症阻害剤である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１３５】
支持体には、血管新生を促進させることができる少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び同第２００４／０２０９９０１号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１３６】
支持体には、免疫抑制化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１３７】
例えば支持体には、特に、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの増殖因子である、少なくとも１種の医薬化合物も組み込まれ得る。他の医薬化合物には、例えばニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−Ｉ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、並びにＩＩ、エキセンディン４、ノダル、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞−及びヘパリン−結合ドメインを含む生物ペプチド、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物などのＭＡＰＫ阻害剤を挙げることができる。
【０１３８】
骨格内への本発明の細胞の組み込みは、細胞を骨格上に単に沈着させることにより達成できる。細胞は、単純拡散により骨格に入り込ませることができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１  Ｐｔ  ２）：３〜９（１９８８））。細胞播種の効率を向上させるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸骨格上に播種する際に、スピナーフラスコが使用された（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２（１９９８））。細胞播種のための他の手法は遠心法の使用であり、これは播種する細胞に与えるストレスを最小にし、かつ播種効率を高める。例えば、Ｙａｎｇらは、遠心分離細胞固定法（ＣＣＩ）と呼ばれる細胞播種方法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６（２００１））。
【０１３９】
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
ＳＴＥＭＧＥＮＴ（商標）ヒトトランスフェクション因子キットを用いるフィーダー細胞による体細胞からの多能性幹細胞の作製
Ｓｔｅｍｇｅｎｔ（商標）ヒトトランスフェクション因子キットに説明されている方法を用いて、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ（商標）ヒトＴＦレンチウイルスセット（Ｃａｔ．Ｎｏ．００−０００５）を用いて、多能性幹細胞を成体包皮線維芽細胞細胞から作製した。ＡＴＣＣからのＣＲＬ２５２２細胞（Ｓｔｅｍｇｅｎｔプロトコル中で「ＢＪ」細胞と呼ばれるヒト包皮線維芽細胞）を、４０〜５０％の密集度を生じる、１００，０００細胞／穴の密度で生長培地中の６穴プレートにプレーティングした。生長培地は、４５０ｍＬのＥＭＥＭ、５０ｍＬのＥＳ用ＦＢＳ、５ｍＬの１０ｍＭ非必須アミノ酸、５ｍＬのペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍＬ）、５ｍＬの２００ｍＭのＬ−グルタミン、及び０．９ｍＬの５５ｍＭのβ−メルカプトエタノール（本明細書ではＢＪ細胞生長培地と呼ぶ）からなるものであった。細胞をプレーティングした翌日に、培地を２．５ｍＬの全容積（条件＃１及び２、表１）の新しいＢＪ細胞生長培地プラスポリブレン及びレンチウイルスに変えた。レンチウイルスウイルス力価をｐ２４カプシド抗原ＥＬＩＳＡ検定を用いてメーカーにより測定した。ウイルス力価は次の通りであった：ＳＯＸ２−レンチウイルス力価６８．８０ｎｇ／ｍＬ；ＯＣＴ４−レンチウイルス力価６．６４ｎｇ／ｍＬ；ＬＩＮ２８−レンチウイルス力価６８．８０ｎｇ／ｍＬ；及びＮＡＮＯＧ−レンチウイルス力価８２．８０ｎｇ／ｍＬ。
【０１４１】
細胞培養皿を穏やかにゆすることにより、培地が均一に分布していることを確認した後、細胞を３７℃及び５％  ＣＯ2で一夜インキュベートした。形質導入の２４時間後、細胞をトリプシン処理し、２００×ｇで５分間遠心分離し、ＢＪ細胞生長培地中に再懸濁し、６穴の３穴中で前日に播種したＣＦ−１ＭＥＦフィーダー細胞上に１〜３プレーティング比で再プレーティングした。ウイルス形質導入したＣＲＬ２５２２細胞を、フィーダー細胞上で３７℃及び５％  ＣＯ2で一夜インキュベートした。再播種後２４時間で、ＢＪ細胞生長培地を、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞培養培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地−２００ｍＬ、ノックアウト血清リプレイサー−５０ｍＬ、２００ｍＭのＬ−グルタミン＋２−メルカプトエタノール溶液−１．２５ｍＬ、非必須アミノ酸１００Ｘ溶液−２．５ｍＬ、及びＢ−ＦＧＦ溶液を含む、最終濃度４ｎｇ／ｍＬ）で置き換えた。最初の７日間ＥＳ／ｉＰＳ細胞培養培地を毎日交換した。７日後培地を、ＭＥＦで馴化培地（ＭＥＦＣＭ）に置き変えた。ＥＳ／ｉＰＳ細胞培養培地をマウス胚性線維芽細胞に曝露することにより、ＭＥＦＣＭを作製した。
【０１４２】
培養の３８日後に細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び５μＭのＲｈｏキナーゼインヒビターＹ２７６３２をサプリメントするＭＥＦＣＭ中でディスパーゼによりＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）に酵素的に継代した。その後、細胞に１０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦをサプリメントする新しいＭＥＦＣＭを毎日流加した。ウイルス形質導入の４２日後に最初の小さい多能性コロニーを観察した。コロニーが典型的なヒトＥＳ形態を示すまで、細胞の継代を継続した。１２のクローン株を作製した。細胞株を継代６においてバンク化及び低温保存し、３つのクローンを培養で１５回継代させた。このクローンは多能性形態及び多能性幹細胞の特性を維持する。更には、胚様体検定を用いて、この細胞を、全３胚葉に分化させることができ、定義されたプロトコルを用いてその分化を特定の方向付けして、胚体内胚葉を形成することができる。典型的な多能性幹細胞コロニーの顕微鏡写真を図１に示す。
【０１４３】
（実施例２）
フィーダー細胞を使用せずＳＴＥＭＧＥＮＴ（商標）ヒトトランスフェクション因子キットを使用する体細胞からの多能性幹細胞の作製
米国特許出願第１１／４２０，８９５号に開示されている方法に従って単離された１００，０００の羊水由来細胞を、６穴皿の１０ｃｍ2穴中でＡＭＮＩＯＭＡＸ（商標）培地にプレーティングした。翌日表１中の条件＃７に従って細胞にレンチウイルスウイルスを形質導入した。培地を、２．５ｍＬの全容積の新しいＡＭＮＩＯＭＡＸ（商標）培地＋レンチウイルスに変えた。レンチウイルスウイルス力価を、ｐ２４カプシド抗原ＥＬＩＳＡ検定を用いてメーカーにより測定した。ウイルス力価は次の通りであった：ＳＯＸ２−レンチウイルス力価６８．８０ｎｇ／ｍＬ；ＯＣＴ４−レンチウイルス力価６．６４ｎｇ／ｍＬ；ＬＩＮ２８−レンチウイルス力価６８．８０ｎｇ／ｍＬ；及びＮＡＮＯＧ−レンチウイルス力価８２．８０ｎｇ／ｍＬ。
【０１４４】
この実施例で使用したウイルス形質導入は、形質導入増進剤のポリブレンを使用しなかった（翌日表１中の条件＃７に従って細胞にレンチウイルスウイルスを形質導入した）。３日目に細胞を分割し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）の１：３０希釈液で被覆した表面にプレーティングし、ＭＥＦＣＭには継代ゼロ（ｐ０）に対して８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（ＭＥＦＣＭ８）及び５μＭのＲＯＣＫインヒビターＹ２７６３２をサプリメントした。細胞をプレーティングし、新しいＭＥＦＣＭ８を毎日流加した。
【０１４５】
培養の１週後、細胞を、新しいＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）１：３０希釈液で被覆したプレートにディスパーゼ継代した（第１継代＝ｐ１）。１０日後ほぼ２０のヒト胚性幹細胞様コロニーを観察した（図２のＡ及びＢ）。最密の「胚性幹細胞様」コロニーを手で選択し、継代するために組み合わせた。この培養物を細胞株ＡＦＤ１と表示した（図２のＣ及びＤ）。単一のコロニーを継代するために手で選択し、ＡＦＤ２と表示した。
【０１４６】
細胞株ＡＦＤ１及び２を、継代５においてバンク化及び低温保存し、培養で１１〜１２回継代したが、多能性幹細胞の多能性形態及び特性を維持していた。
【０１４７】
（実施例３）
フィーダー細胞の使用無しでＳＴＥＭＧＥＮＴ（商標）ヒトトランスフェクション因子キットを使用した体細胞からの多能性幹細胞の作製
ポリブレンを使用せずにフィーダー細胞上でＭＥＦ細胞のフィーダー層を使用して、多能性細胞を作製することができなかった（条件＃３〜６、表１を参照のこと）。ＣＲＬ２２４２９細胞（包皮線維芽細胞、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ  ＵＳＡ））又はＡＦ細胞を、別々の６穴皿の１０ｃｍ2の穴の中で１００，０００細胞の濃度で一夜プレーティングした。翌日細胞を、推薦量のウイルスを含有する新しい培地によりポリブレン無しで２４時間処理した。３日目細胞をＴｒｙｐＬＥ処理し、接着を促進するために、５μＭのＲＯＣＫインヒビターＹ２７６３２を含むｈＥＳＣ／ｉＰＳ細胞培地中ＭＥＦ細胞上に継代した。多能性幹細胞コロニー形成を改善すると報告されている３つの化合物：１００ｎＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＢＩＸ０１２９４、及び２μＭのＲ（Ｔ）Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４により平行の細胞集団も処理した。培地を１４日間各日交換した。フィーダー及びＡＦ細胞を含む穴は、培養１４日後相当な死亡を呈した。
【０１４８】
細胞を救助する試みとして、これらを、サプリメント化合物無しでｈＥＳＣ／ｉＰＳ細胞培地中の新しいフィーダー層上にコラゲナーゼ継代した。追加の時間培養後コロニーは観察されなかった。ＣＲＬ２４２９及びフィーダー細胞を含む穴は、培養６週後生存可能の状態を保った。培養６週後細胞をコラゲナーゼを含む１：３０マトリゲル上に継代したが、コロニーは観察されなかった。化合物の添加にもかかわらず、ＣＲＬ２４２９細胞とフィーダーとの共培養物と比較して、ＡＦ細胞とフィーダーとの共培養物中で顕著な細胞死が観察された。
【０１４９】
（実施例４）
本発明の方法に従って誘導された多能性幹細胞のキャラクタリゼーション
多能性幹細胞を実施例１及び２の方法に従って誘導した。多能性幹細胞を、ｑＲＴ−ＰＣＲ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、及び位相差顕微鏡によりキャラクタリゼーションして、多能性幹細胞に共通の遺伝子発現及び形態を確認した。
【０１５０】
ｑＲＴ−ＰＣＲ（図３）を用いて、継代４（ｐ４）における細胞株ＡＦＤ１での多能性に特徴的な遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ、及びＣＲＩＰＴＯ）の発現がヒト胚性幹細胞株Ｈ１に匹敵するレベル（発現レベル１．０に設定）であるということが観察された。継代１（ｐ１）におけるウイルス形質導入１３日後であったが、細胞の多能性コロニーが出現する以前にはＡＦ細胞（ＡＦＤ）の親集団は、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ、及びＣＲＩＰＴＯの顕著な発現を有さず、ｐ４においてはＡＦＤ１よりもずっと低いＮＡＮＯＧの発現を有するということも認められた。これらの結果は、ｐ４におけるＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧの発現が内因性の発現によるものであり、ウイルス構築物によるものでなく、ウイルス形質導入後の体細胞の多能性状態への完全転換がウイルス構築物のサイレンシングを必要とするという公表された観察と一致するということが示される。興味深いことには、ｐ１におけるＯＣＴ４のＡＦＤの発現は、ｈＥＳＣ株Ｈ１に匹敵するレベルであり、かつｐ４において高い状態を保ち、多能性状態の導入には初期的及び持続的なＯＣＴ４発現が必要とされるということが示唆される。
【０１５１】
同様に、ＣＲＬ２５２２細胞から誘導された多能性幹細胞は、多能性細胞に特徴的な遺伝子も発現した：ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＦＧＦ４及びＣＤＨ１を、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１に匹敵するレベル（発現レベル１．０に設定）で発現し、親ＣＲＬ２５２２細胞株で観察される発現レベルよりも著しく高いレベルで発現した。
【０１５２】
位相差顕微鏡（図２）による細胞のキャラクタリゼーションも行い、ＡＦＤ１多能性幹細胞コロニーがヒト胚性幹細胞コロニー外観と一致する滑らかな縁、及びＡＦ細胞の親集団と著しく異なる形態を持つ密な中心を有するということを実証した。継代４、５、及び６においてフローサイトメトリーにより検定した場合、ＡＦＤ１細胞は、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＴＲＡ−１６０、及びＴＲＡ−１８１を含む多能性幹細胞（図４）に特徴的なマーカーの高表面発現を有し、タンパク質は親ＡＦ細胞上に発現されないということが観察された。ＳＳＥＡ４の発現を免疫蛍光法により観察し、発現パターンがＯＣＴ４（図５）に観察されるものに類似しているということも観察された。これらの結果は、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１に見出される発現パターンと一致し、ＣＲＬ２５２２細胞（図１）から誘導された多能性幹細胞についても反復された。更には、細胞の核密度は、非形質導入親ＣＲＬ２５２２線維芽細胞細胞よりも著しく高く、ＳＳＥＡ４発現（図１）に対して陰性であった。
【０１５３】
継代６においてフローサイトメトリーにより検定した場合、ＣＲＬ２５２２細胞から誘導された多能性幹細胞は、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＴＲＡ−１６０、及びＴＲＡ−１８１を含む多能性幹細胞（図６）に特徴的なマーカーの高表面発現を有し、タンパク質は親ＣＲＬ２５２２細胞上に発現されないということが観察された。ＳＳＥＡ４の発現を免疫蛍光法により観察し、発現パターンがＯＣＴ４（図１）に観察されるものに類似しているということも観察された。これらの結果はｈＥＳＣ株Ｈ１に見出される発現パターンと一致し、ヒト包皮線維芽細胞ＣＲＬ２５２２「ＢＪ」細胞（図１）から多能性幹細胞が誘導されたということが示される。
【０１５４】
（実施例５）
本発明の方法に従って誘導される多能性幹細胞の分化
本発明の方法に従ってヒト包皮線維芽細胞又は羊水細胞から作製される多能性幹細胞を、いくつかの異なる方法を用いて分化させて、その多能性を確認した。多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞及び膵性細胞内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させた。加えて、本発明の方法により作製される多能性幹細胞は、非接着性サスペンジョン培養の中に置かれると胚様体を形成することが示された。
【０１５５】
多能性幹細胞を、２％の脂肪酸不含仔牛血清アルブミン（ＦＡＦＢＳＡ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａを含むＤＥ培地により処理することにより、本発明の多能性幹細胞を、胚体内胚葉系（ＤＥ）に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させた。分化の２日目及び３日目にＷｎｔ３ａをＤＥ培地から取り除いた。培養の３日後試料をＴｒｙｐＬＥ（商標）処理によりリフトし、フローサイトメトリーにより胚体内胚葉の形成に相関するマーカーＣＤ１８４（タンパク質ＣＸＣＲ４）の発現について検定した。羊水由来多能性幹細胞１及び２（ＡＦＤ１及びＡＦＤ２）は、胚体内胚葉に分化するように方向付けされた場合、Ｈ１ヒト胚性幹細胞と比較して類似のレベルのＣＸＣＲ４及びＣＤ９９を発現した。これらの結果は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより確認され、ヒトＥＳ株Ｈ１に対するＤＥ（ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、及びＦＯＸＡ２）に特徴的な遺伝子の著しく類似の誘導が示された（図７）。
【０１５６】
類似の結果を、ヒト包皮線維芽細胞、ＣＲＬ２５２２由来多能性幹細胞について観察した。ＣＲＬ２５２２由来多能性幹細胞の８つのクローンを胚体内胚葉に分化させ、それぞれＣＸＣＲ４に対して６０％陽性であるＨ１  ｈＥＳ細胞コントロールに対して２３．４％〜５８．３％陽性の範囲の発現レベルで高レベルのＤＥマーカーのＣＸＣＲ４が発現された（表２）。ＤＥに分化したＣＲＬ２５２２由来多能性幹細胞の試料も免疫蛍光法により検出される高レベルのＳＯＸ１７、胚体内胚葉に特徴的でかつ必要とされる転写因子を発現することが観察された（図８）。これらの結果は、ＡＦ及びＣＲＬ２５２２由来の多能性幹細胞が、フローサイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、及び免疫蛍光法により測定して、ヒト胚性幹細胞株、Ｈ１によるＤＥ形成と一致する速度で胚体内胚葉を形成するということを示す。
【０１５７】
正常の発達においては、胚体内胚葉は、肺、腸、肝臓、膵臓、胸腺、及び甲状腺を含む、多重系列に寄与する。Ｈ１ヒト胚性幹細胞における膵臓となる運命を促進するように示されるプロトコルを用いて、ＤＥから膵臓内胚葉系の特徴的なマーカーを発現する細胞に分化を方向付けした。ＤＥ形成の第１段階以降の追加の分化段階には、段階２−２％のＦＡＦ  ＢＳＡ、０．２５μＭのＳａｎｔ−１、及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地、２日間；段階３−０．５ＸのＩＴＳ、０．１％のＢＳＡ、０．２５μＭのＳａｎｔ−１、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７、１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ、２０ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ、及び２μＭのＲＡを含有するＤＭＥＭ高グルコース培地、４日間；段階３．５−０．５ＸのＩＴＳ、０．１％のＢＳＡ、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７、及び１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎを含有するＤＭＥＭ高グルコース培地、３日間；段階４−０．５ＸのＩＴＳ、０．１％のＢＳＡ、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７、１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ、及び１μＭのＡＬＫ５インヒビターを含有するＤＭＥＭ高グルコース培地、３日間；及び段階５−０．５ＸのＩＴＳ、０．１％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ、及び１μＭのＡＬＫ５インヒビターを含有するＤＭＥＭ高グルコース培地、７日間が包含された。
【０１５８】
この方法を用いて、羊水細胞及びＣＲＬ２５２２細胞の両方から作製されるＰＳＣにおいて、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定して膵臓ホルモン、インスリン、グルカゴン、及びソマスタチンの発現の顕著な増加、並びにＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、及びＮＥＵＲＯＤを含む膵臓ランゲルハンス島β細胞に共通の転写因子の増加が観察された（表３）。免疫蛍光法により測定して、段階５から分化された羊水由来多能性幹細胞におけるＮＫＸ６．１発現及びＰＤＸ１発現も観察された（図９）。これらの結果は、ＡＦ又はＣＲＬ２５２２細胞のいずれかから誘導された多能性幹細胞が内胚葉層の形成能があり、膵臓に分化可能であるということを示す。
【０１５９】
方向付けされた分化によるＡＦ及びＣＲＬ２５２２由来多能性幹細胞の多能性の決定に加えて、細胞が胚様体形成検定を用いて全３胚葉を形成することができるかを試験した。ＡＦ又はＣＲＬ２５２２細胞から誘導された多能性幹細胞を、マトリゲル被覆培養表面上で成長させ、細胞を０．１％のディスパーゼ溶液によりインキュベートし、１０％のＦＢＳをサプリメントしたＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄し、細胞をラバースクレーパーによりリフトし、次いで非接着性のサスペンジョン培養のために１０％のＦＢＳをサプリメントしたＤＭＥＭ培地中の細胞を低結合性培養皿に移すことにより表面からリフトした。高血清含有培地中サスペンジョン培養で生長させた多能性幹細胞は、胚様体；全３胚葉系から構成される球状の多セル構造物を自発的に形成する。この系の形成を、ｑＲＴ−ＰＣＲ検定により、この系（中胚葉、内胚葉、及び外胚葉）のそれぞれに共通な遺伝子発現について確認する。ＡＦ又はＣＲＬ２５２２細胞のいずれかから誘導された多能性幹細胞は胚様体を形成し、全３胚葉が存在するということを示す遺伝子発現パターンを有していた（図１０）。
【０１６０】
ニューロン／外胚葉系のマーカー（ＣＤＨ２及びＯＴＸ）が上昇し、一方、中内胚葉（Ｔ）及び胚体内胚葉に対する初期のマーカー（ＳＯＸ１７、ＡＦＰ、ＦＯＸＡ２、及びＣＸＣＲ４）も、中胚葉及び胚体内胚葉に共通なマーカー（ＧＳＣ、ＣＥＲ１、ＧＡＴＡ４及びＭＩＸＬ１）及び運動ニューロン及びβランゲルハンス島細胞中に見出されるマーカー（ＭＮＸ）も上昇した（図１０）。これらの結果は、ＡＦ又はＣＲＬ２５２２細胞から作製される多能性幹細胞が事実多能性であり、３つの胚葉のそれぞれからの組織の形成能があるということを示す。
【０１６１】
（実施例６）
細胞をフィーダー細胞又は細胞外マトリックスタンパク質の不存在において培養した場合の本発明の多能性幹細胞の培養に及ぼすＲｈｏキナーゼ阻害の影響
多能性幹細胞株ＡＦＤ１を、生長因子を低下させたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）の１：３０希釈液により試験前に処理したＮｕｎｃｌｏｎ  Ｄｅｌｔａ（商標）プレート上のＭＥＦ馴化した培地中で維持した。１ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ解離処理により継代するために細胞を表面から解離させた。次いで、ＡＦＤ１細胞を表面改質プレート４（６穴形式）の非処理穴上に播種した。平行して、ＡＦＤ１細胞を、生長因子を低下させたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）の１：３０希釈液により処理したＮｕｎｃｌｏｎ  Ｄｅｌｔａ（商標）プレート上にプレーティングして、陽性コントロールを得た。すべての処理について、細胞はＭＥＦ調整培地中に維持した。
【０１６２】
表面改変されたプレート４上に播種されたＡＦＤ１細胞は結合はするものの、結合効率はコントロールプレート上よりもずっと低かった（図１１）。Ｒｈｏキナーゼインヒビターを培地に添加することにより、結合効率は大きく増大した。培養における最初の２４時間Ｙ−２７６３２を１０μＭ濃度で添加するか、又はＨ１１５２−グリシルを３μＭ濃度で添加するかのいずれかによって、細胞のプレーティング効率がコントロールプレートで観察されるのと類似の速度まで著しく増大した（図１１）。その後、細胞を、日々の培地変更と共に一定の１０μＭのＹ−２７６３２濃度又はＨ１１５２−グリシルの低下させた１μＭ濃度に維持した。
【０１６３】
細胞を、表面改変されたプレート４上Ｙ−２７６３２又はＨ１１５２−グリシルの存在において２回継代し、多能性と関連する遺伝子の発現についてｑＲＴ−ＰＣＲにより試験した（図１２）。多能性と関連しかつ要求される遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ、及びＣＲＩＰＴＯ／ＴＤＧＦ）の発現を、コントロールプレート上で生長させた細胞に対して改変された表面４上で生長させたＡＦＤ１細胞中で維持した。胚体外外胚葉又は栄養芽細胞の運命への自発的な分化と関連するいくつかの遺伝子（ＡＦＰ、ＨＡＮＤ２、及びＧＡＴＡ２）の相対的な発現が著しく低下するということも観察された。これは、胚体外外胚葉又は栄養芽細胞関連遺伝子の発現を抑制することにより、分化を阻害するＮＡＮＯＧの発現の増加によるものであり得る。加えて、胚体外外胚葉又は栄養芽細胞関連遺伝子の発現のこの減少は、コントロールプレートに対して改変された表面４上での高多能性かつ低分化の細胞の分化接着及び増殖により起こる可能性がある。
【０１６４】
胚体内胚葉を分化させる能力を試験することにより、改変された表面４上で生長させた細胞の多能性も確認した。ＲｈｏキナーゼインヒビターをサプリメントしたＭＥＦで馴化した培養培地中改変された表面４上でいくつかの継代を生長させた後にＤＥに分化させた細胞が、ＤＥへのＨ１  ｈＥＳ分化について観察される発現レベル及びパターンに匹敵する、ＤＥ分化に関連する遺伝子のロバスト発現を示すということが観察された（図１３）。加えて、フローサイトメトリーにより検定した場合、Ｒｈｏキナーゼインヒビターと共に２つの継代に対して生長させ、改変された表面４上で分化させたＡＦＤ１細胞は、胚体内胚葉形成と相関するＣＸＣＲ４、表面タンパク質の発現に対して６３％陽性であり、発現のこのレベルはＤＥに分化させたＨ１  ｈＥＳ細胞中で観察される発現レベルと一致するものであった（６０％  ＣＸＣＲ４陽性、表２）。
【０１６５】
【表１】
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【０１６６】
【表２】
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【０１６７】
【表３】
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【０１６８】
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全容を本明細書に援用するものである。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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