(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）株、又はトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）株において生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減又は除去するための方法であって、以下の：
(ａ)  アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）株、又はトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）株のゲノムに、第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチドと、第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドとに作用可能なように結合されたプロモーターを含む二本鎖転写可能核酸構築物を挿入する工程、ここで前記第一転写可能領域が、前記標的遺伝子に対してホモロジーを有し、第二転写可能領域は、前記標的遺伝子に対して有効なホモロジーを有さず、第二転写可能領域が、互いに対して逆向きに相補的な２つのセグメントを含み、そして第一及び第二転写可能領域が単一のｍＲＮＡ分子として転写される、工程；並びに
(ｂ)  二本鎖転写可能核酸構築物のＲＮＡ転写産物を産生する条件下で、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）株、又はトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）株を培養することにより、二次的ＲＮＡｉのプロセスによりサイレンシングされる標的遺伝子の配列を含む低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の産生を誘導する工程であって、
上記ＲＮＡ転写産物は次にｓｉＲＮＡに変換され、当該ｓｉＲＮＡは標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用して生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減するか又は除去する、工程
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
前記第一転写可能領域が、前記標的遺伝子の配列、又は前記標的遺伝子の配列に対して９０％の同一性を有する配列の全長配列又は断片であり、前記標的遺伝子に対応する少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二転写可能領域が、少なくとも１９のヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一及び第二ポリヌクレオチドが、１５０ヌクレオチド未満の介在配列により分離されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
互いに対して逆向きに相補的である前記２つのセグメントが、少なくとも４のヌクレオチドの結合配列により分離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的遺伝子の発現が、少なくとも２０％低下する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
生物由来物質をコードする標的遺伝子に対してホモロジーを有する第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチド、及び標的遺伝子に対し有効なホモロジーを有さない第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドに作用可能なように結合されたプロモーターを含む二本鎖転写可能核酸構築物を含むアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）株、又はトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）株であって、ここで当該第二転写可能領域は互いに対して逆向きに相補的な２つのセグメントを含む第二転写可能領域を含み、そして当該第一及び第二転写可能領域は、単一のｍＲＮＡ分子として転写され、ここで二次的ＲＮＡｉのプロセスによりサイレンシングされる標的遺伝子の配列を含む低分子ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の産生が、二本鎖転写可能核酸構築物のＲＮＡ転写産物を産生する条件下で、前記株を培養することにより誘導され、当該ＲＮＡ転写産物は次にｓｉＲＮＡに変換され、当該ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用して、生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減又は除去する、前記株。
【請求項８】
前記第一転写可能領域が、前記標的遺伝子の配列、又は前記標的遺伝子の配列に対して９０％の同一性を有する配列の全長配列又は断片であり、前記標的遺伝子に対応する少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の株。
【請求項９】
前記第二転写可能領域は、少なくとも１９ヌクレオチドを含む、請求項７又は８に記載の株。
【請求項１０】
前記第一及び第二ポリヌクレオチドが、１５０ヌクレオチド未満の介在配列により分離されている、請求項７〜９のいずれか一項に記載の株。
【請求項１１】
互いに対して逆向きに相補的である前記２つのセグメントが、少なくとも４のヌクレオチドの結合配列により分離される、請求項７〜１０のいずれか一項にに記載の株。
【請求項１２】
前記標的遺伝子の発現が、少なくとも２０％低下する、請求項７〜１１のいずれか一項にに記載の株。
【請求項１３】
生物由来物質の産生方法であって、以下の：
(ａ)  目的の生物由来物質の産生を促進する条件下でアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）株、又はトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）株を培養する工程であって、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）株、又はトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）株が、不所望な生物由来物質をコードする標的遺伝子に対してホモロジーを有する第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチド、及び当該標的遺伝子に対して有効なホモロジーを有さない第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドに作用可能なように結合したプロモーターを含む二本鎖転写可能核酸構築物を含み、
ここで当該第二転写可能領域が、互いに対して逆向きに相補的な二つのセグメントを含み、そして当該第一及び第二転写可能領域は、単一のｍＲＮＡ分子として転写され、当該二本鎖転写可能核酸構築物のＲＮＡ転写産物は、上記ＲＮＡ転写産物を産生する条件下で、前記株を培養することにより産生され、当該ＲＮＡ転写産物は次に、二次的ＲＮＡｉのプロセスによりサイレンシングされる上記標的遺伝子の配列を含む低分子干渉ＲＮＡ(siRNA)に変換され、当該低分子干渉ＲＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用して、不所望な生物学的な物質をコードする標的遺伝子の発現の低減又は除去し；そして    アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）株、又はトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）株が、上記目的の生物由来物質をコードする第三のポリヌクレオチドを含む；そして
(ｂ)  上記目的の生物由来物質を、上記培養培地から回収する  を含む生物由来物質の生産方法。
【請求項１４】
前記第一転写可能領域が、前記標的遺伝子の配列、又は前記標的遺伝子の配列に対して９０％の同一性を有する配列の全長配列又は断片であり、前記標的遺伝子に対応する少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一及び第二ポリヌクレオチドが、１５０未満の介在配列により分離されている、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
互いに対して逆向きに相補的である前記２つのセグメントが、少なくとも４の結合配列により分離される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的遺伝子の発現が、少なくとも２０％低下する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌株の１以上の遺伝子の発現を低減又は除去する方法に関する。
【０００２】
配列表についての参照
本出願は、コンピューターが読み取り可能な形態の配列表を含む。当該コンピューターが読み取り可能な形態は、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の記載
糸状菌株は、商業的価値を有する生物由来物質(biological substance)の生産のために広く用いられる。しかしながら、生物由来物質を多く発現しそして分泌するという所望の特徴を有する糸状菌株は、良好な発酵に最も望ましい特徴を必ずしも有しているわけではない。生物由来物質の産生は、当該生物由来物質を分解する他の物質、例えば酵素、又は当該生物由来物質の回収及び精製を複雑にしうる当該生物由来物質と一緒に精製される他の物質の産生を伴うことがある。
【０００４】
これらの問題の一の解決法は、不所望の物質の生産に関わる遺伝子(１又は複数)を不活性化することである。不活性化は、当該技術分野に周知の方法を用いて、遺伝子(１又は複数)を欠失するか又は妨害することにより達成することができる。しかしながら、幾つかの場合において、遺伝子の不活性化は、ゲノムの相同領域への標的化が乏しいために難しいこともある。不活性化は、意図した標的遺伝子に対して必ずしも特異的ではないランダムな突然変異誘導により達成することができ、そして他の変異がしばしば宿主生物に導入される。他の場合では、当該遺伝子及びその産物は、糸状菌株の生存に必須であることもある。複数の遺伝子が、欠失又は妨害により不活性化される場合、その手順はかなり煩わしく、そして時間がかかることもある。高度に相同な遺伝子ファミリーのメンバーが存在する場合、全てのメンバーの欠失又は妨害は、極めて退屈かつ困難であることもある。
【０００５】
近年、さまざまな形態のエピジェネティック遺伝子制御が記載されてきた(Selker, 1997, Trends Genet. 13: 296-301; Matzke and Matzke, 1998, Cell. Mol. Life. Sci. 54: 94-103)。これらのプロセスは、マイクロＲＮＡ(Morel et al., 2000. Curr. Biol. 10: 1591-1594; Bailis and Forsburg, 2002, Genome Biol. 3, Reviews 1035; Grewal and Moazed, 2003, Science 301: 798-802)を介してメッセンジャーＲＮＡのレベルを調節することにより遺伝子発現に影響する(Hammond and Baulcombe, 1996, Plant Mol. Biol. 32: 79-88; Xisong Ke et al., 2003, Current Opinion in Chemical Biology 7: 516-523)。
【０００６】
ショウジョウバエ(Drosophila)及び線虫(Caenorhabditis elegans)の遺伝的研究に基づき、(植物における)転写後の遺伝子サイレンシングとしても知られているＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)は、相同ＲＮＡの分解を標的化するタンパク質-ＲＮＡエフェクターヌクレアーゼ複合体の集合によって遺伝子発現をサイレンシングすることに関与ることが理解される(Hannon, 2002, Nature 418: 244-251)。二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)へとプロセッシングすることは、ダイサーとして知られている酵素ファミリーにより達成される(Bernstein et al., 2001, Nature 409: 363)。ｄｓＲＮＡを特異的に切断するエンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーであるダイサーは、ｄｓＲＮＡを２０〜２５ヌクレオチドのｓｉＲＮＡに切断することに関与する(Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494)。これらのｓｉＲＮＡは次に、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)と会合する(Elbashir et al., 2001, Genes and Dev. 15: 188; NyKanen et al., 2001, Cell 197: 300; Hammond et al., 2001, Science 293: 1146)。十分に理解されてはいないが、ＲＩＳＣは、アンチセンス断片の由来元であるｍＲＮＡを標的とし、続いてｍＲＮＡのエンド及びエキソヌクレアーゼ切断は、当該遺伝子の発現を効果的にサイレンシングする。ＲＮＡｉは、植物、線虫、昆虫、哺乳動物、及び糸状菌において示された(Matzke and Matzke, 1998, supra; Kennerdell et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18: 896-8; Bosher et al., 1999, Genetics 153: 1245-56; Voorhoeve and Agami, 2003, Trends Biotechnol. 21: 2-4; McCaffrey et al., 2003, Nat. Biotechnol. 21: 639-44; WO 03/050288; WO 01/49844; WO 98/53083; 及びWO 05/056772)。
【０００７】
拡散としても知られている二次的ＲＮＡｉ(Transitive RNAi)は、特定の遺伝子を超えたサイレンシングシグナルの移動を指す。植物では、二次的サイレンシングは、二本鎖ＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの標的とされたｍＲＮＡの上流及び下流の両方で生じることが発見された(Fabian et al., 2002, Plant cell 14: 857-867; Garcia-Perez et al., 2004, The Plant Journal 38: 594-602; Vaistij et al., 2002, The Plant Cell 14: 857-867; Van Houdt et al., 2003, Plant Physiol. 131: 245-253)。線虫では、二次的ＲＮＡｉは、標的ｄｓＲＮＡの上流の転写産物をサイレンシングするものとして記載された(Alder et al., 2003, RNA J. 9: 25-32; Hannon, 2002, Nature 418: 244-251; Sijen et al., 2001, Cell 107: 465-476)。線虫では、二次的ＲＮＡｉの記載により、おそらくＲＮＡ-依存性ＲＮＡポリメラーゼ(ＲｄＲＰ)及びダイサー活性の結果として、ｄｓＲＮＡ標的由来のｓｉＲＮＡに加えて、５'隣接配列とホモロジーを有する第二次ｓｉＲＮＡ（secondary siRNA）が生成するということが示唆される(Bleys et al., 2006, RNA J. 12: 1633-1639; Petersen et al., 2005, Plant Molecular Biology 58: 575-583)。二次的ＲＮＡｉは、昆虫及び哺乳動物においてユビキタスなものではない(Chi et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6343-6346; Hoa et al., 2003, Insect Biochemistry and Molecular Biology 33: 949-957; Roignamt et al., 2003, RNA J. 9: 299-308)。
【０００８】
二次的ＲＮＡｉは、幾つかの点で慣用のＲＮＡｉとは異なっている。二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉと二次的ＲＮＡｉの両方の誘導物質として作用するが、ＲＮＡｉ単独ではＲｄＲＰを必要としない一方、二次的ＲＮＡｉはＲｄＲＰを必要とするようである。結果として、二次的ＲＮＡｉを示す生物において、遺伝子サイレンシングは、二本鎖ＲＮＡの境界により限定されず、そして遺伝子サイレンシングは、隣接配列へと拡張することができる。しかしながら、二次的ＲＮＡｉを欠く生物では、遺伝子サイレンシングは、二本鎖の領域内に限定される。
【０００９】
株の開発及び改良、機能的ゲノム学、及び糸状菌株の遺伝子操作法において、１以上の遺伝子の発現を低減又は除去する代替方法を提供することは、当該技術分野において利点となる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、糸状菌株の１以上の遺伝子の発現を低減又は除去する方法に関する。
【００１１】
本発明は、糸状菌株において生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減又は除去する方法であって、以下の：
(ａ)  糸状菌株のゲノムに、生物由来物質をコードする標的遺伝子に対してホモロジーを有する第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチド、及び標的遺伝子に対して有効なホモロジーを有さない第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドに作用可能なように結合されたプロモーターを含む二本鎖転写可能核酸構築物を挿入し；ここで第二転写可能領域は、逆向きに互いに相補的な２つの断片を含み、そして第一及び第二転写可能領域は、単一のｍＲＮＡ分子として転写される
(ｂ)  二次的ＲＮＡｉのプロセスによりサイレンシングされる標的遺伝子の配列を含む低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の生産を、二本鎖転写可能核酸構築物のＲＮＡ転写産物を産生する条件下で糸状菌を培養することにより誘導し、ここで当該二本鎖転写可能核酸構築物は次にｓｉＲＮＡに変換され、当該ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用して、生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減するか又は除去する
を含む方法に関する。
【００１２】
本発明は、生物由来物質をコードする標的遺伝子にホモロジーを有する第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチド、及び標的遺伝子に対して有効なホモロジーを有さない第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドに作用可能なように結合されたプロモーターを含む二本鎖転写可能核酸を含む糸状菌株にも関し、ここで、当該第二の転写可能領域は、互いに対して逆向きに相補的である２つの断片を含み、そして第一及び第二転写可能領域は、単一のｍＲＮＡ分子として転写され、ここで、二次的ＲＮＡｉのプロセスによりサイレンシングされる標的遺伝子の配列を含む低分子干渉ＲＮＡ(siRNA)の産生は、ｓｉＲＮＡに変換される二本鎖転写可能核酸構築物のＲＮＡ転写産物を産生する条件下で、糸状菌株を培養することにより誘導されて、当該siRNAは生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低下又は除去する。
【００１３】
本発明はさらに、目的の生物由来物質を生成する方法であって、以下の：
(a)生物由来物質の産生につながる条件下で糸状菌株を培養し、ここで当該糸状菌株が、不所望の生物由来物質をコードする標的遺伝子に対してホモロジーを有する第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチド、及び標的遺伝子に対して有効なホモロジーを有さない第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドに作用可能なように結合されたプロモーターを含む二本鎖転写可能核酸構築物を含み、ここで当該第二転写可能領域が、逆向きに互いに対して相補的である２つの断片を含み、かつ当該第一及び第二転写可能領域は、単一のｍＲＮＡ分子として転写され、ここで二本鎖転写可能核酸構築物のＲＮＡ転写産物は、糸状菌を培養することにより産生され、当該転写産物は次に、二次的ＲＮＡiのプロセスによりサイレンシングされる標的遺伝子の配列を含む低分子干渉ＲＮＡ(siRNA)へと変換され、当該ＳｉＲＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用して、不所望な生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減するか又は除去し；そしてここで当該糸状菌株は、生物由来物質をコードする第三のポリヌクレオチドを含み；そして
(ｂ)  培養倍地から生物由来物質を回収する
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、糸状菌における二次的ＲＮＡ干渉の模式図を示す。
【図２】図２は、ｐＣＷ０９８の制限酵素地図を示す。
【図３】図３は、ｐＣＷ０９９の制限酵素地図を示す。
【図４】図４は、ｐＥＦｅｒ１４の制限酵素地図を示す。
【図５】図５は、ｐＤＭ２６１の制限酵素地図を示す。
【図６】図６は、ｐＤＭ２６６の制限酵素地図を示す。
【図７】図７は、ｐＡｍＦｓ０３１の制限酵素地図を示す。
【図８】図８は、ｐＡＬ０１の制限酵素地図を示す。
【図９】図９は、ｐＡＬ０２の制限酵素地図を示す。
【００１５】
「二次的ＲＮＡ干渉」：「二次的ＲＮＡ干渉」又は「二次的ＲＮＡi」という語句は、特定の遺伝子を越えたサイレンシングシグナルの移動として本明細書で定義される。二次的ＲＮＡｉでは、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)は、新たなｄｓＲＮＡの合成のために、テンプレートとして機能することができ、当該新たなｄｓＲＮＡから得られ、標的配列とホモロジーを有するｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡに沿った新たな配列のサイレンシングの伸張又は拡張をもたらす。
【００１６】
「低分子干渉ＲＮＡ」：「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」という語句は、２０〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ断片、つまり二本鎖ＲＮＡのダイサーに媒介される切断のの生成物、として定義される。
【００１８】
互いに対して逆向きに相補的な二つの断片：「互いに対して逆向きに相補的な二つの断片」という語句は、他のＤＮＡと適合して、全体としてワトソンクリック塩基対を構成し、かつ当該塩基対を形成できる幾つかのＤＮＡ鎖又はＤＮＡ片として定義される。
【００１９】
二次的にサイレンシングされる標的配列：「二次的にサイレンシングされる標的配列」は、本明細書において、遺伝子サイレンシングの目標であるｄｓＲＮＡ配列であって、隣接配列からのｓｉＲＮＡ伸張の結果生じるｄｓＲＮＡ配列として定義される。
【００２０】
同一性：２つのアミノ酸配列の間の、又は２つのヌクレオチド配列の間の関連性が、「同一性」というパラメーターにより記載される。
【００２１】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ(ＥＭＢＯＳＳ：欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート、Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277)(好ましくはバージョン３.０.０以降)のＮｅｅｄｌｅプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ-Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)を用いて決定される。使用される任意選択のパラメーターは、ギャップオープンペナルティー：１０、ギャップイクステンションペナルティー：０.５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２(ＥＭＢＯＳＳ、ＢＬＯＳＵＭ６２バージョン)置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性(-nobrief optionを用いて得られる)」の出力は、同一性割合として用いられ、かつ以下のように計算される：
(同一残基×１００)／(アライメント長-アライメントにおける合計ギャップ数)
【００２２】
本発明の目的では、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ(ＥＭＢＯＳＳ：欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート、Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277)(好ましくはバージョン３.０.０以降)のＮｅｅｄｌｅプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ-Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970、前掲)を用いて決定される。使用される任意選択のパラメーターは、ギャップオープンペナルティー：１０、ギャップイクステンションペナルティー：０.５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ(ＮＣＢＩ ＮＵＣ４.４のＥＭＢＯＳＳバージョン)置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性(-nobrief optionを用いて得られる)」の出力は、同一性割合として用いられ、かつ以下のように計算される：
(同一デオキシヌクレオチド×１００)／(アライメント長-アライメントにおける合計ギャップ数)
【００２３】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という語句は、本明細書中では、真核細胞から得られた成熟型スプライス済みｍＲＮＡ分子から逆転写することにより調製することができる(Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T, 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡに存在するイントロン配列を欠いている。最初の初期ＲＮＡ転写産物は、成熟型スプライス済みｍＲＮＡが生成する前に一連のステップを通してプロセッシングされる前駆分子である。これらのステップは、スプライシングと呼ばれるプロセスによりイントロン配列を除去することを含む。ｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡは、その結果、全てのイントロン配列を欠失している。
【００２４】
核酸構築物：本明細書に使用される場合「核酸構築物」という語句は、天然遺伝子から単離されるか、又は改変されなければ天然には存在しない様式の核酸断片若しくは合成核酸断片を含む様に改変される核酸分子(一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよい)を指す。核酸構築物という語句は、当該核酸構築物がコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合、「発現カセット」という語句と同じ意味を有する。
【００２５】
制御配列：「制御配列」という語句は、本明細書において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必須な全ての成分を含むように定義される。各制御配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して元来のもの又は外来のものであってもよいし、又は互いに元来のもの又は外来のものであってもよい。かかる制御配列として、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されることはない。最小の場合でも、制御配列は、プロモーター及び転写終結シグナル及び翻訳終結配列を含む。制御配列を、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域にライゲーションする制御配列のライゲーションを促進する特異的制限部位を導入するためのリンカーが制御配列に提供されてもよい。
【００２６】
プロモーター：「プロモーター」という語句は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてポリメラーゼを、下流の正しい生物由来物質をコードする核酸配列の転写開始部位に仕向けて、転写を開始させるＤＮＡ配列として定義される。ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適切なＤＮＡ鎖に相補的なメッセンジャーＲＮＡの組み立てを効率的に触媒する。「プロモーター」という語句には、ｍＲＮＡに転写された後に、翻訳のために、(プロモーターと翻訳開始部位)との間に５'非コード領域、エンハンサーなどのシス-作用転写制御エレメント、及び転写因子と相互作用できる他のヌクレオチド配列を含むことが理解されたい。
【００２７】
変異プロモーター：「変異プロモーター」という語句は、本明細書において、元のプロモーターの１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、及び／又は挿入を含むヌクレオチド配列を有するプロモーターとして定義され、ここで当該変異プロモーターは、対応する元のプロモーターよりも高いか又は低いプロモーター活性を有する。「変異プロモーター」という語句は、天然突然変異、並びに当該技術分野において周知の方法、例えば従来の突然変異誘導、部位特異的突然変異誘導、及びＤＮＡシャッフリングなどを用いて得られるインビトロで作成された変異を包含する。
【００２８】
ハイブリッドプロモーター：「ハイブリッドプロモーター」という語句は、本明細書において、２以上のプロモーターの部分であって、融合して２以上のプロモーターの融合物である配列を生成する部分として定義され、コード配列に作用可能なように結合された場合に、コード配列のｍＲＮＡへの転写を媒介するものとして定義される。
【００２９】
タンデムプロモーター：「タンデムプロモーター」という語句は、本明細書において、タンデムに配置され、コード配列のｍＲＮＡへの転写を媒介するためにコード配列に作用可能なように結合した２以上のプロモーター配列として定義される。
【００３０】
作用可能なように結合：「作用可能なように結合する」という語句は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に配置されて、その結果制御配列が、ポリペプチドのコード配列の発現を仕向ける配置を指す。
【００３１】
コード配列：本明細書に使用される場合、「コード配列」という語句は、そのタンパク質のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般的に、オープンリーディングフレームにより決定され、オープンリーディングフレームは通常、ＡＴＧ開始コドンで始まるか、又はＧＴＧ及びＴＴＧなどの代替開始コドンで始まり、そして停止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡなどで終わる配列である。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は組み替えヌクレオチド配列であってもよい。
【００３２】
発現：「発現」という語句は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むポリペプチド産生に関与する任意のステップを含むが、それに限られるものではない。
【００３３】
発現ベクター：「発現ベクター」という語句は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む直線状又は環状ＤＮＡ分子として本明細書において定義され、そしてその発現を提供するさらなるヌクレオチドに作用可能なように結合する。
【００３４】
宿主細胞：「宿主細胞」という語句は、本明細書に使用される場合、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターで形質転換、トランスフェクション、形質導入を受け入れることができる任意の細胞型を含む。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、糸状菌株において生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減又は除去する方法であって、以下の：
(ａ)生物由来物質をコードする標的遺伝子に対してホモロジーを有する第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチド、及び標的遺伝子に対して有効なホモロジーを有さない第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドに作用可能なように結合するプロモーターを含む二本鎖転写可能核酸構築物を糸状菌株のゲノムに挿入し、ここで、当該第二転写可能領域は、互いに対して逆向きに相補的な２個の断片を含み、かつ第一及び第二転写可能領域は、単一のｍＲＮＡ分子として転写され；そして
(ｂ)次にsiRNAに変換される二本鎖転写可能核酸構築物のＲＮＡ転写産物を産生する条件下で糸状菌株の培養をすることによって、二次的ＲＮＡiのプロセスによりサイレンシングされる標的遺伝子の配列を含む低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の産生を誘導し、当該ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用して、生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減するか又は除去する
を含む方法に関する。
【００３６】
図１は、二次的ＲＮＡ干渉を示す。形質転換体は、３'において標的遺伝子とはホモロジーを有さない逆反復が隣接した標的断片から構成される転写産物を生産する。ＩＲのフォールディング及びアニーリングにより産生された二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)は、ダイサーによりプロセッシングされて、ＩＲとホモロジーを有するsiRNAを生成する。テンプレートとして転写産物を用い、ｓｉＲＮＡの一部は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(ＲｄＲＰ)により、標的配列に入り込むＩＲの５'境界を越えて伸張される。連続伸張は、標的によりコードされるｄｓＲＮＡを産生し、ＲＮＡiを開始した。
【００３７】
本発明の方法は、糸状菌株において、株開発及び改良、機能ゲノミクス、及び遺伝子操作経路のための新たな機会を提供する。例えば、本方法は、遺伝子操作及び遺伝子操作経路を用いた糸状菌株の開発のツールとして、又は時間が掛かるアプローチでありかつ成功率が変化する遺伝子ノックアウトの代替法として使用することができる。遺伝子は、遺伝子ノックアウトなどの当該技術分野において知られている標準的方法による不活性化に対し抵抗性であることもある。本発明の方法は、このような遺伝子の発現を低減又は除去するための解決方法を提供する。遺伝子ノックアウトは、部位特異的遺伝子置換による。この方法の真菌における効率は、染色体遺伝子座、置換構築物及びゲノムにより共有されるＤＮＡ配列、及び／又は共有ホモロジーの長さにより影響をうける。記載された二次的遺伝子サイレンシングの実現は、逆方向反復から構成される第二配列の上流の標的配列の一部をクローニングすることにのみ依るものである。当該方法は、特定の糸状菌株における高度に発現された遺伝子を低減又は除去するために特に有用でありかつ有効であり、これは例えば生産宿主として生物を開発する際にかなり重要である。この能力は、本発明の方法の長所を示している。当該方法は、互いに対して高度に相同である複数の遺伝子、特に同一ファミリーの遺伝子又は生合成経路又は代謝経路におけるホモログ遺伝子、の発現を低減するか又は除去するのに有用である。本方法は、生物由来物質の発現を如何ようにも低下させるように操作できるのでさらに有用である。この変動性は、生物由来物質をコードする遺伝子の完全なノックアウトが特定の糸状菌株に対して致死的となる場合、例えば目的の生合成経路へと流れ込む二次的経路において、特に重要である。
【００３８】
本発明の方法では、標的遺伝子とホモロジーを有する第一転写可能領域を含む。第二ポリヌクレオチドは、標的遺伝子に対して有効なホモロジーを有さない第二転写可能脳領域を含み、ここで第二転写可能領域は、互いに対して逆向きに相補的である２つの断片を含む。
【００３９】
生物由来物質をコードする標的遺伝子に対してホモロジーを有する第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチド、及び標的遺伝子に対して有効なホモロジーを有さない第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドは、二本鎖転写可能核酸構築物において、第一及び第二ポリヌクレオチドにほとんどホモロジーを有さないか又は全くホモロジーを有さないヌクレオチド配列であるポリヌクレオチド介在配列により分離されてもよいし、分離されていなくてもよい。二本鎖転写可能核酸構築物のポリヌクレオチド配列は、ゲノムの配列、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成複製起点、又はその任意の組み合わせであってもよい。
【００４０】
好ましい態様では、第一ポリヌクレオチド及び第二ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド介在配列により分離される。介在配列は、好ましくは、１５０未満のヌクレオチド、より好ましくは１００未満のヌクレオチド、より好ましくは６０未満のヌクレオチド、より好ましくは４０未満のヌクレオチド、さらにより好ましくは２０未満のヌクレオチド、そして最も好ましくは１０未満のヌクレオチドからなる。
【００４１】
より好ましい態様では、第一及び第二ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド介在配列により分離されない。
【００４２】
介在配列は、第一又は第二ポリヌクレオチドにホモロジーを有さない任意のヌクレオチド配列でありうるし、そして好ましくは、不所望の標的／組み換えを最小化するために糸状菌株のゲノムの配列にホモロジーをほとんど有さないか又は全く有さない。
【００４３】
プロモーター
プロモーター配列は、第一相同転写可能領域に対して元来のものであるか、又は外来(異種)であってもよいし、そして糸状菌株に対して元来のものであるか又は外来のものであってもよい。本発明の方法では、プロモーターは、元来のプロモーター、異種プロモーター、突然変異プロモーター、ハイブリッドプロモーター、又はタンデムプロモーターであってもよい。
【００４４】
本発明の方法において有用なプロモーターの例としては、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)  TAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)中性αアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリ(Aspergillu awamori)グルカミラーゼ(glaA)、リゾムコール・ミーヘイ・リパーゼ、アスペルギルス・オリゼー・アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼー・トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)アセトアミダーゼ、フサリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)アミログルコシダーゼ(WO 00/56900)、フサリウム・ベネナツム ダリア(WO 00/56900)、フサリウム・ベネナツム・キン(WO 00/56900)、フサリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼ(WO 96/00787)、トリコデルマ・レセイ(Trichoderma reesei)β-グルコシダーゼ、トリコデルマ・レセイ セロバイオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レセイ セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レセイ エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・レセイ エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レセイ キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ βキシロシダーゼの遺伝子から得られるプロモーター、及びＮＡ２-ｔｐｉプロモーター(アスペルギルス ニガー中性αーアミラーゼ様の遺伝子及びアスペルギルス・オリゼー トリオースホスフェートイソメラーゼ由来のプロモーターのハイブリッド)；並びにそれらの変異、切り詰め、及びハイブリッドプロモーターを含む。
【００４５】
好ましい態様では、プロモーターは、ＮＡ-２-ｔｐｉプロモーターである。別の好ましい態様では、プロモーターは、ＴＡＫＡ／ＮＡ２-ｔｐｉリーダーハイブリッドプロモーターである。
【００４６】
相同転写可能領域
「標的遺伝子に対してホモロジーを有する転写可能領域」という語句は、標的遺伝子のオープンリーディングフレームに相同であるヌクレオチド配列、又はその一部として定義され、そしてＲＮＡ、例えばｎｃＲＮＡ(非コードＲＮＡ)、ｔＲＮＡ(トランスファーＲＮＡ)、ｒＲＮＡ(リボソーマルＲＮＡ)、ｍｉＲＮＡ(マイクロＲＮＡ)、又はｍＲＮＡ(メッセンジャーＲＮＡ)に翻訳され、適切な調節配列の制御の下に置かれた場合、これらは生物由来物質、例えばポリペプチドに翻訳されることもあるし、又は翻訳されないこともある。転写可能領域の境界は、一般的に、ｍＲＮＡの５'末端においてオープンリーディングフレームのすぐ上流に位置する転写開始部位により、そしてｍＲＮＡの３'末端においてオープンリーディングフレームのすぐ下流に位置する転写終結配列により一般的に決定されている。相同な転写可能領域は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成、及び組み替え核酸配列を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４７】
本発明の方法では、標的遺伝子に相同な転写可能領域は、標的遺伝子の対応領域に同一であってもよいし、それらのホモログであってもよい。
【００４８】
標的遺伝子の発現低下又は不活性化を達成するために必要とされる標的遺伝子の対応領域とホモログとの間の同一性の程度は、標的遺伝子に依るようである。全体の標的遺伝子に対してホモログのヌクレオチド配列が小さくなればなるほど、配列間の同一性の程度は、好ましくはかなり高いか又は同一であるべきである。全体の標的遺伝子に対してホモログのヌクレオチド配列が大きくなればなるほど、配列間の同一性の程度は、低くなりうる。
【００４９】
本発明の方法において、標的遺伝子の対応配列に対するホモログのヌクレオチド配列の同一性の程度は、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％である。本発明の目的では、２つの核酸配列の間の同一性の程度は、本明細書に定義されるように決定される。
【００５０】
或いは、さまざまなストリンジェンシー条件下で、互いに対してハイブリダイズするホモログと標的遺伝子の対応領域の能力は、標的遺伝子の発現の不活性化又は低下に必要とされる関連性の程度の指標を提供することもできる。しかしながら、ホモログと標的遺伝子の対応領域との間でハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェンシー条件が低くなればなるほど、標的遺伝子の発現の不活性化又は低下は、有効ではなくなってくるようである。
【００５１】
好ましい態様では、ホモログと標的遺伝子の対応する領域は、低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。より好ましい態様では、ホモログ及び標的遺伝子の対応する領域は、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。さらにより好ましい態様では、ホモログと標的遺伝子の対応領域は、中〜高程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。最も好ましい態様では、ホモログと標的遺伝子の対応する領域は、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。さらに最も好ましい態様では、ホモログと、標的遺伝子の対応領域は、かなり高いストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する。
【００５２】
少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブでは、かなり低い〜かなり高いストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＰＥ、０.３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌのせん断かつ変性されたサケ精子ＤＮＡ、及びかなり低いストリンジェンシー及び低いストリンジェンシーでは２５％のホルムアミド、中程度及び中〜高ストリンジェンシーでは３５％ホルムアミド、又は高及びかなり高いストリンジェンシーでは５０％ホルムアミド中において４２℃でのハイブリダイゼーション前及びハイブリダイゼーション時、それに続き好ましくは１２〜２４時間標準サザンブロット法を行うこととして定義される。
【００５３】
少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブでは、キャリア物質は、最終的に、好ましくは少なくとも４５℃(かなり低いストリンジェンシー)、より好ましくは少なくとも５０℃(低いストリンジェンシー)、より好ましくは少なくとも５５℃(中程度のストリンジェンシー)、より好ましくは少なくとも６０℃(中〜高程度のストリンジェンシー)、さらにより好ましくは少なくとも６５℃(高いストリンジェンシー)、そして最も好ましくは少なくとも７０℃(かなり高いストリンジェンシー)で２×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ用いて１５分間、３回洗浄した。
【００５４】
約７０のヌクレオチド長に対する約１５ヌクレオチドのプローブでは、ストリンジェンシー条件は、Bolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390)に従った計算を用いて計算されたＴｍから約５〜約１０℃低い温度で０.９Ｍ ＮａＣｌ、０.０９Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ７.６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％ ＮＰ-４０、１×デンハート溶液、１ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸二水素ナトリウム、０.１ｍＭ ＡＴＰ、及び０.２ｍｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ中において、ハイブリダイゼーション前、ハイブリダイゼーション時、及びハイブリダイゼーション後において洗浄し、それに続き好ましくは１２〜２４時間標準サザンブロット法を行うこととして定義される。
【００５５】
約７０ヌクレオチド長に対する約１５ヌクレオチドのプローブでは、キャリア物質は、１５分間、６×ＳＣＣ＋０.１％ＳＤＳで１回洗浄し、そして６×ＳＳＣを用いて、計算されたＴｍから５℃〜１０℃低い温度で１５分間２回洗浄した。
【００５６】
第一相同領域は、好ましくは、少なくとも１９ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、そしてもっとも好ましくは少なくとも２００ヌクレオチドからなる。第一相同領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム全体、又はそのホモログからなりうる。
【００５７】
非相同転写可能領域
二本鎖転写可能核酸構築物は、標的遺伝子又は宿主ゲノムに対して有効なホモロジーを有さない第二転写可能領域を含み、ここで当該第二転写可能領域は、逆向きに互いに対して相補的な２つの断片を含む。
【００５８】
好ましい態様では、第二転写可能領域は、任意の遺伝子の任意の転写可能部分、例えば遺伝子の５'-非翻訳領域、コード配列、又は３'-非翻訳領域であり、これらは標的遺伝子又は宿主ゲノムにたいして有効なホモロジーを有さないものである。
【００５９】
より好ましい態様では、第二転写可能領域は、標的遺伝子又は宿主ゲノムに対して有効なホモロジーを有さない遺伝子のコード配列に対応する。
【００６０】
別のより好ましい態様では、第二転写可能領域は、標的遺伝子又は宿主ゲノムに対して有効なホモロジーを有さない遺伝子の５'非翻訳領域に対応する。
【００６１】
別のより好ましい態様では、第二転写可能領域は、標的遺伝子又は宿主ゲノムに対して有効なホモロジーを有さない遺伝子の３'非翻訳領域に対応する。
【００６２】
もっとも好ましい態様では、第二転写可能領域は、標的遺伝子又は宿主ゲノムに対してホモロジーを有さない非内在性遺伝子の一部であり、例えば大腸菌(Ｅ.ｃｏｌｉ)のハイグロマイシン抵抗性遺伝子である。
【００６３】
第二転写可能領域は、好ましくは少なくとも１９のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２５０のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも５００のヌクレオチド、もっとも好ましくは少なくとも７５０のヌクレオチド、そしてさらにもっとも好ましくは少なくとも１０００のヌクレオチドからなる。
【００６４】
互いに対して逆向きに相補的である２つの断片は、ポリヌクレオチドリンカーにより分離することができる。当該リンカーは好ましくは、少なくとも４のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８０のヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１００のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも２５０のヌクレオチド、そしてさらに最も好ましくは少なくとも５００のヌクレオチドからなる。
【００６５】
標的遺伝子
標的遺伝子は、代謝産物(以下、「生物由来物質」と呼ぶ)の生合成に関与する生物学的活性を有するポリペプチドをコードする生物学的活性又は任意の遺伝子であってもよい。生物由来物質は、ＲＮＡ(例えば、ｎｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍＲＮＡ)であってもよい。生物由来物質は、生物学的活性を有するペプチドであってもよい。生物学的活性を有する物質は、糸状菌株にもともとあるものであってもよいし、又は当該株に対して異種であるか又は外来のモノであってもよい。外来又は異種物質は、細胞に対して生来の物質であるか；又は構造的な修飾がなされて生来の物質を変化させた物質である。
【００６６】
好ましい態様では、生物由来物質は、生物学的活性を有するポリペプチドである。ポリペプチドは、生物学的活性を有する任意のポリペプチドであってもよい。「ポリペプチド」という語句は、本明細書中において、エンコードされた生成物の特定の長さをさすことを意味し、その結果ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を包含する。「ポリペプチド」という語句は、コードされた生成物を形成するように組み合わされた２以上のポリペプチドを包含する。ポリペプチドは、ハイブリッドポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、少なくとも２の異なるポリペプチドから得られた部分又は完全なポリペプチドを含み、ここで１以上は、真菌細胞に対して異種である。ポリペプチドは、さらに、天然アレル及び上記ポリペプチドとハイブリッドするポリペプチドの遺伝子操作バリエーションを含む。
【００６７】
好ましい態様では、ポリペプチドは抗体、抗原、抗菌ペプチド、酵素、増殖因子、ホルモン、免疫調節因子、神経伝達因子、受容体、レポータータンパク質、構造タンパク質、及び転写因子である。
【００６８】
より好ましい態様では、ポリペプチドは、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。最も好ましい態様では、ポリペプチドは、アセチルキシラン、エステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ウロキナーゼ、又はキシラナーゼである。
【００６９】
別の好ましい態様では、ポリペプチドは、アルブミン、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン又はゼラチンであるか；又はそれらのバリアント又はハイブリッドである。
【００７０】
生物由来物質は、選択可能なマーカーの製品であってもよい。選択可能なマーカーは、遺伝子産物が殺生物剤又はウイルス抵抗性、重金属抵抗性、原栄養性から栄養要求性などを与える遺伝子である。選択可能なマーカーは、ａｍｄＳ(アセトアミダーゼ)、ａｒｇＢ(オルチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、ｂａｒ(ホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ)、ｈｙｇＢ(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、ｎｉａＤ(硝酸レダクターゼ)、ｐｙｒＧ(オロチジン-５'-ホスフェート・デカルボキシラーゼ)、ｓＣ(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、ｔｒｐＣ(アントラニル・シンターゼ)、並びにそれらの同等物を含むが、それらに限定されるものではない。
【００７１】
標的遺伝子を単離することが、本発明の実施において必須であることもある。遺伝子を単離又はクローニングするために使用される技術は、当該技術分野に知られており、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組み合わせを含む。かかるゲノムＤＮＡからの遺伝子のクローニングは、周知のポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いて行うことができる。例えば、Innis ら、1990、ＰＣＲプロトコル：A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York.を参照のこと。クローニング法は、生物由来物質をコードする遺伝子を含む所望の核酸断片を切り出し、そして単離し、当該断片をベクター分子に挿入し、そして組み替えベクターを糸状菌細胞に取り込ませることに関することもある。ここで核酸配列の複数コピー又はクローンが複製されるであろう。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源であってもよいし、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００７２】
好ましい態様では、標的遺伝子の発現は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、そしてさらに最も好ましくは１００％低減される。
【００７３】
５'非翻訳領域、コード配列、又は３'非翻訳領域内の標的配列を使用することが望ましい場合、これらの領域のうちの任意の１の内側に逆方向反復で構築された遺伝子サイレンシングベクターは、さらにサイレンシングベクター内に存在するコード配列に相同である遺伝子のサイレンシングをさらに可能にすることもある。その結果、生物内の遺伝子のホモログをサイレンシングすることが望まれる場合、５'非翻訳領域、コード配列、又は３'非翻訳領域内に相同性を有する二次的発現標的配列を含むサイレンシングベクターの構築物は、構築物中のコード配列と配列相同性を示す１以上の遺伝子の発現の除去又は低下を可能にすることもある。「相同性」又は「相同性の」という語句は、通常、幾つかの共通する祖先構造を有し、そして活性領域における高度の配列類似性を示す配列を指す。
【００７４】
好ましい態様では、干渉ＲＮＡは、標的遺伝子の１以上のホモログのＲＮＡ転写産物と相互作用して、標的遺伝子の１以上のホモログの発現を低減するか又は除去する。
【００７５】
より好ましい態様では、標的遺伝子の１以上のホモログの発現は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、そしてさらに最も好ましくは１００％低下する。
【００７６】
糸状菌株
生物学的構造をコードする標的遺伝子にホモロジーを有する第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチド、及び標的遺伝子に有効なホモロジーを有さない第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドに作用可能なように結合されたプロモーターを含む二本鎖転写可能核酸構築物を含む糸状菌株に関する。ここで、当該第二転写可能領域は、互いに逆向きに相補的である２つの断片を含み、そして第一及び第二転写可能領域は１のｍＲＮＡ分子として転写される。ここで二次的ＲＮＡｉのプロセスによりサイレンシングされる標的遺伝子の配列を含む低分子干渉ＲＮＡ(siRNA)の産生は、二本鎖転写可能核酸構築物のＲＮＡ転写産物を産生する条件下で、糸状菌株を培養することにより誘導され、低分子干渉ＲＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用して、生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低下又は除去する。
【００７７】
糸状菌株は、本発明の方法において有用である任意の糸状菌株であってもよい。「糸状菌」は、(Hawksworthら、Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International University Press, Cambridge, UKにより定義されるように)真菌類及び卵菌類亜門の全ての糸状菌株を含む。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合体多糖類から構成される菌壁(mycelial wall)により特徴付けられる。栄養増殖は、菌糸伸張によっており、そして炭素異化は、偏性好気性である。対照的に、サッカロマイシス・セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの酵母による栄養増殖は、単細胞性葉状体の発芽によっており、そして炭素異化は、発酵性である。
【００７８】
好ましい態様では、糸状菌株は、アクレモニウム(Acremonium)属、アスベルギルス(Aspergillus)属、オーレオバシディウム(Aureobasidium)属、ジェルカンデラ(Bjerkandera)属、セリポリオプシス(Ceriporiopsis)属、クリソスポリウム(Chrysosporium)属、ヒトヨタケ(Coprinus)属、カワラタケ(Coriolus)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フィリバシジウム(Filibasidium)属、フサリウム(Fusarium)属、フミコラ(Humicola)属、マグナポルテ(Magnaporthe)属、ケカビ(Mucor)属、マイセリオソラ(Myceliophthora)属、ネオカリマスティクス(Neocallimastix)属、, ニューロスポラ(Neurospora)属、ペシロマイセス(Paecilomyces)属、ペニシリウム(Penicillium)属、ファネロカエテ(Phanerochaete)属、フェルビア(Phlebia)属、ピロマイシス(Piromyces)属、ヒラタケ(Pleurotus)属、スエヒロタケ(Schizophyllum)属、タラロマイシス(Talaromyces)属、サーモアスクス(Thermoascus)属、チエラビア(Thielavia)属、トリポクラジウム(Tolypocladium)属、トラメテス(Trametes)属、又はトリコデルマ(Trichoderma)属である。
【００７９】
より好ましい態様では、糸状菌株は、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フミガーツフ(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス フォエチヅス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニジュラス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、又はアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)株である。別の最も好ましい態様では、糸状菌株は、フサリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フサリウム セレアリス(Fusarium cerealis)、フサリウム クロオクウェレンス(Fusarium  crookwellense)、フサリウム クルモルム(Fusarium culmorum)、フサリウム グラミネアルム(Fusarium  graminearum)、フサリウム グラミヌム(Fusarium graminum)、フサリウム ヘテロスポルム(Fusarium  heterosporum)、フサリウム ネグンジ(Fusarium negundi)、フサリウム オキシスポルム(Fusarium  oxysporum)、フサリウム レチクラツム(Fusarium reticulatum)、フサリウム ロソイム(Fusarium  roseum)、フサリウム サンブシヌム(Fusarium sambucinum)、フサリウム サルコクロウム(Fusarium  sarcochroum)、フサリウム スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フサリウム スルフロイム(Fusarium  sulphureum)、フサリウム トルロスム(Fusarium torulosum)、フサリウム トリコテシオイデス(Fusarium  trichothecioides)、又はフサリウム ベネナツム(Fusarium venenatum)株である。別の最も好ましい態様では、糸状菌株は、ブジェルカンデラ アズスタ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス カレギエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス ギルベセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス パンノドンタ(Ceriporiopsis pannodnta)、セリポリオプシス リブロサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス スブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス スッベルミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、クリソスポリウム ケラチノフィルム(Chrysosporium keratinophilum)、クリソスポリウム ルックノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、クリソスポリウム トロピクム(Chrysosporiumtropicum)、クリソスポリウム メルダリウム(Chrysosporium merdarium)、クリソスポリウム イノプス(Chrysosporium inops)、クリソスポリウム パンニコラ(Chrysosporium pannicola)、クリソスポリウム クェエンスランジクム(Chrysosporium queenslandicum)、クリソスポリウム ゾナツム(Chrysosporiumku zonatum)、コプリヌス シネロイス(Coprinus  cinereus)、コリオルス ヒルスツス(Coriolus hirsutus)、フミコラ インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコル ミエヘイ(Mucor miehei)、マイセリオソラ テルモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ クラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム プルプロゲヌム(Penicillium purpurogenum)、ファネロカエト クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア ラジアタ(Phlebia radiata)、プロイロツス エリンギイ(Pleurotus eryngii)、チエラビア テレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス ビロサ(Trametes villosa)、トラメテス ベルシコロル(Trametes versicolor)、トリコデルマ ハルジアヌム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ コニンギイ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ ロンギブラキアツム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ レエセイ(Trichoderma reesei)、又はトリコデルマ ビリド(Trichoderma iride)株である。
【００８０】
最も好ましい態様では、アスペルギルス・オリゼー株は、受託番号ＩＦＯ４１７７のアスペルギルス・オリゼー株である。別の最も好ましい態様では、フサリウム・ベネナツム株は、フサリウム・ベネナツムＡ３／５(もともとフサリウム・グラミネアルム(Fusarium  graminearum)ATCC 20334として寄託されており、そしてYoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80 及び O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67により、フサリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)として近年再分類された株である)、並びに現在知られている株名にかかわらず、フサリウム・ベネナツムの分類学的等価株である。別の最も好ましい態様では、フサリウム・ベネナツム株は、ＷＯ ９７／２６３３０に開示されるフサリウム・ベネナツムＡ３／５又はフサリウム・ベネナツムＡＴＣＣ２０３３４の形態学的変異株である。別の最も好ましい態様では、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)株は、トリコデルマ・リーセイ。ＡＴＣＣ56765である。別の最も好ましい態様では、アスペルギルス・ニガー株は、アスペルギルス・ニガー(Bo-1 (DSM 12665)である。別の最も好ましい態様では、アスペルギルス・ニガー株は、アスペルギルス・ニガーＢｏ-１(ＤＳＭ１２６６５)である。別の最も好ましい態様では、アスペルギルス・ニガー株は、ＷＯ２００４／０９０１５５に開示されるアスペルギルス・ニガーＢｏ-１(ＤＳＭ１２６６５)の変異株である。
【００８１】
糸状菌株は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含むプロセスにより、それ自体知られている様式で形質転換されうる。アスペルギルス及びトリコデルマ株の形質転換の適した方法は、ＥＰ２３８ ０２３及びYelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 : 1470-1474に記載されている。フサリウム株を形質転換する適切な方法は、Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156及び WO 96/00787により記載されている。酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920により記載される方法を用いて形質転換されてもよい。
【００８２】
不所望な生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低下又は除去することは、標的生物由来物質に対して特異的である当該技術分野に既知の方法を用いて検出されてもよい。これらの検出方法は、特異的抗体、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動酵素生成物の形成、酵素基質の消失、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、又は例えば胞子の色などの表現系の消失又は出現を用いることを含んでもよい。例えば、酵素アッセイは、酵素活性を決定するために使用されてもよい。酵素活性を測定する方法は、多くの酵素について当業者に知られている(例えば、D. Schomburg and M. Salzmann (共著),Enzyme Handbook, Springer-Varlag, New York, 1990)。
【００８３】
生成方法
本発明は、目的の生物由来物質を生産する方法であって、
(ａ)目的の生物由来物質の産生に寄与する条件下で糸状菌株を培養し、ここで当該糸状菌株は、不所望の生物由来物質をコードする標的遺伝子に相同性を有する第一転写可能領域を含む第一ポリヌクレオチド及び標的遺伝子に対して有効な相同性を有さない第二転写可能領域を含む第二ポリヌクレオチドに作用可能なように結合されたプロモーターを含む二本鎖転写可能核酸構築物を含み、ここで当該第二転写可能領域は、互いに対して逆向きに相補性である２つの断片を含み、そして第一及び第二転写可能領域は、単一のｍＲＮＡ分子として転写され、ここで二本鎖転写可能核酸構築物のＲＮＡ転写産物は、ＲＮＡ転写産物を産生する条件下で糸状菌株を培養することにより産生され、当該転写産物は次に二次的ＲＮＡｉのプロセスによりサイレンシングされる標的遺伝子の配列を含む低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)に変換され、当該ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用して、不所望の生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減又は除去し、そしてここで当該糸状菌株が、目的の生物由来物質をコードする第三のポリヌクレオチドを含み、そして
(ｂ)目的の生物由来物質を培養培地から回収すること
を含む。
【００８４】
目的の生物由来物質は、本明細書に記載される任意の生物由来物質であってもよい。好ましい態様では、目的の生物由来物質は、生物学的活性を有するポリペプチドである。当該物質は、糸状菌株に生来の物質、又は外来の物質であってもよい。不所望の生物由来物質をコードする標的遺伝子の発現を低減又は除去することは、目的の生物由来物質の発現増加を導くことができる。不所望の生物由来物質は、目的の生物由来物質の生成又は発現に直接影響することができる。例えば、不所望の生物由来物質は、目的の生物由来物質を攻撃するプロテアーゼである場合があり、それにより、生成された目的の生物由来物質の量を低下させることがある。プロテアーゼの発現を低下又は除去することにより、より多くの目的の生物由来物質が発現されそして産生されるであろう。あるいは、不所望の生物由来物質は、(１又は複数の)細胞プロセス、例えば転写因子又は分泌経路、を、目的の生物由来物質と共有し、それにより、産生される目的の生物由来物質の量が低下する場合もある。不所望の生物由来物質の発現を低下又は除去することにより、１又は複数の細胞プロセス、例えば発現制御転写要素、のより多くが目的の生物由来物質に利用できるようになり、それにより発現されそして産生される目的の生物由来物質の量を増加させる。さらに、不所望の生物由来物質は、目的の生物由来物質を、特定の適用、例えば食品加工における酵素、に使用することを妨げる目的の生物由来物質に混入する毒素であることもある。
【００８５】
本発明の生成方法では、糸状菌株は、当該技術分野において既知の方法を用いて目的の生物由来物質の産生に適した栄養培地中で培養される。例えば、当該株は、生物由来物質が発現し及び／又は単離することを可能にする適切な培地及び条件下において、撹拌フラスコ培養、及び研究室又は工業用発酵槽における小規模又は大規模発酵(連続培養、回分培養、流加培養、又は固体培養)により培養されてもよい。培養は、炭素及び窒素源、及び無機塩を含む適切な栄養培地で、当該技術分野に知られている方法を用いて行われる。適切な培地は、商業的供給元から利用できるか、又は(例えば、米国培養細胞系統保存機関のカタログに)公表された組成にしたがって調製されてもよい。生物由来物質が栄養媒地中に分泌される場合、培地から直接回収することができる。生物由来物質が分泌されない場合、細胞ライセートから回収することができる。
【００８６】
目的の生物由来物質は、生物由来物質に対して特異的である当該技術分野に知られている方法を用いて検出されてもよい。これらの検出方法は、特定の抗体、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリークロマトグラフィー、酵素生成物の形成、酵素の基質の消失、又はＳＤＳ-ＰＡＧＥの使用を含む。例えば、酵素の活性を測定するために酵素アッセイが使用されてもよい。酵素活性のための方法は、多くの酵素について当業者に知られている(例えば、D. Schomburg and M. Saizmann (共著), Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York, 1990)。
【００８７】
生成した目的の生物由来物質は、当該技術分野において知られている方法を用いて単離されてもよい。例えば、目的のポリペプチドは、例えば非限定的に、遠心、ろ過、抽出、スプレー乾燥、蒸発又は沈殿を含む慣用方法により培養培地から単離されてもよい。単離されたポリペプチドは、次にさらに、例えば非限定的にクロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマト分画、及びサイズ排除)、電気泳動手法(例えば、調製等電点電気泳動(ＩＥＦ)、示差溶解度(例えば硫酸アンモニウム沈殿)、又は抽出(例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York 1989を参照のこと)を含む当業者に周知のさまざまな方法によりさらに精製されてもよい。目的の代謝生成物は、例えば抽出、沈殿、又は示差溶解度により、又は当該技術分野に知られている任意の方法により培養培地から単離されてもよい。単離された代謝生成物が、代謝生成物に適した方法を用いてさらに精製されてもよい。
【００８８】
生物由来物質をコードするポリヌクレオチド
目的の生物由来物質をコードする単離されたポリヌクレオチド配列は、任意の原核生物、真核生物、又は他のソースから得ることができる。本発明の目的では、所定のソースと組み合わせて本明細書において使用される「得られる」という語句は、生物由来物質が当該ソースにより産生されるか、又は当該ソース由来の遺伝子が挿入された細胞により産生されるということを意味するものとする。
【００８９】
目的の生物由来物質をコードするポリヌクレオチドを単離又はクローニングするために使用される技術は、当該技術分野に知られており、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組み合わせを含む。かかるゲノムＤＮＡ由来のポリヌクレオチドのクローニングは、例えば、周知のポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いることにより行うことができる。例えば、Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照のこと。クローニング法は、生物由来物質をコードするポリヌクレオチドを含む所望の核酸断片を切り出し、そして単離し、当該断片をベクター分子に挿入し、そして核酸配列の複数のコピー又はクローンを複製する突然変異糸状菌細胞に当該組換えベクターを取り込ませることに関する。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００９０】
核酸構築物
目的の生物由来物質をコードする単離ポリヌクレオチドは、糸状菌株中の核酸構築物中に含まれてもよい。核酸構築物は、調節配列に適合する条件下で糸状菌株中においてヌクレオチド配列の発現を仕向ける少なくとも１のプロモーター及び１以上の調節配列に作用可能なように結合する目的の生物由来物質をコードするヌクレオチド配列を含む。発現は、非限定的に、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む目的の生物由来物質の産生に関与する任意のステップを含むことが理解されたい。
【００９１】
目的の生物由来物質をコードする単離ポリヌクレオチドは、生物由来物質の発現を提供するさまざまな方法でさらに操作されてもよい。ベクター中への挿入前にヌクレオチド配列を操作することは、発現ベクターに応じて望ましいこともあるし又は必須であることもある。組み換えＤＮＡ法を利用するヌクレオチド配列の改変のための技術は、当該技術分野において周知である。
【００９２】
ポリヌクレオチドは、１以上の生来の調節配列を含んでもよいし、又は１以上の生来の調節配列は、宿主細胞中におけるコード配列の発現を改善するために当該ヌクレオチドに対して外来である１以上の調節配列で置き換えられてもよい。かかる調節配列は、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写終結配列を含むがそれらに限定されるものではない。最低でも、調節配列は、プロモーターと転写停止シグナル及び翻訳停止シグナルを含む。目的の生物由来物質をコードするヌクレオチド配列のコード領域と調節配列とのライゲーションを容易にする特異的な制限酵素部位を導入するために、調節配列にリンカーを取り付けることもある。
【００９３】
調節配列は、適切なプロモーター配列、生物由来物質をコードするポリヌクレオチド配列を発現するために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列、であってもよい。プロモーター配列は、生物由来物質の発現を仲介する転写調節配列を含む。プロモーターは、変異、切り詰め、そしてハイブリッド型のプロモーターを含む、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってもよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られることもある。
【００９４】
糸状菌宿主株において核酸構築物の転写を仕向ける適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー中性α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリ・グルコアミラーゼ(ｇｌａＡ)、リゾムコール・ミーヘイ・リパーゼ、アスペルギルス・オリゼー・アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼー・トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュラスアセトアミダーゼ、フサリウム・ベナツム・アミログルコシダーゼ(WO 00/56900)、フサリウム・ベネガツム・ダリア(WO 00/56900)、フサリウム・ベネナツム・キン(WO 00/56900)、フサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼ(WO 96/00787)、トリコデルマ・リーセイ・β-グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイ・セッロバイオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ・セロバイオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーセイ・エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーセイ・キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイ・β-キシロシダーゼ、及びＮＡ２-ｔｐｉプロモーター(アスペルギルス・ニガー中性α-アミラーゼとアスペルギルス・オリゼートリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるプロモーターのハイブリッド)の遺伝子から得られるプロモーター；並びにそれらの突然変異、切り詰め型、及びハイブリッドプロモーターである。
【００９５】
調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、宿主細胞により認識されて転写を終結させる配列、であってもよい。ターミネーター配列は、生物由来物質をコードする核酸配列の３'末端に作用可能な様に結合される。選択された糸状菌株において機能的である任意のターミネーターが、本発明において使用されてもよい。
【００９６】
糸状菌株についての好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスアンスラニレート・シンターゼ、アスペルギルス・ニガー・α-グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼについての遺伝子から得られる。
【００９７】
調節配列は、適切なリーダー配列、糸状菌株による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域、であってもよい。リーダー配列は、生物由来物質をコードする核酸配列の５'末端に作用可能なように結合される。選択された糸状菌株において機能的である任意のリーダー配列が本発明において使用されてもよい。
【００９８】
糸状菌株についての好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス・トリオース・ホスフェート・イソメラーゼ、フサリウム・ベネナツム・トリプシン、及びフサリウム・ベネナツム・グルコアミラーゼの遺伝子から得られる。
【００９９】
調節配列は、ポリアデニル化配列、転写された場合に転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を加えるシグナルとして宿主細胞により認識される核酸配列の３'末端に作用可能なように結合される配列であってもよい。選択された糸状菌株において機能的である任意のポリアデニル化配列は、本発明において使用されてもよい。
【０１００】
糸状菌株についての好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアンスラニレート・シンターゼ、フサリウム・オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガー・α-グルコシダーゼから得られる。
【０１０１】
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコードし、エンコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に仕向けるシグナルペプチドをコードする領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５'末端は、分泌ポリペプチドをコードするコード領域の断片と読み込み枠においてもともと結合されているシグナルペプチドをコードする領域をそもそも含む。或いは、コード配列の５'末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドをコードする領域を含んでもよい。外来のシグナルペプチドをコードする領域は、コード配列がもともとシグナルペプチドコード領域を含まない場合に必要とされる場合がある。あるいは、外来シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を高めるために、単に天然シグナルペプチドコード領域と置き換えられてもよい。しかしながら、発現されたポリペプチドを、選択された真菌宿主細胞の分泌経路に仕向ける任意のシグナルペプチドコード領域が、本発明で使用されてもよい。
【０１０２】
糸状菌株に対する有効なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス・オリゼーのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソーレンスのセルラーゼ、及びフミコラ・ラヌギノーサリパーゼから得られるシグナルペプチドコード領域である。
【０１０３】
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってもよい。得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド(又は幾つかの場合酵素前駆体)として知られている。プロポリペプチドは、一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドから、プロペプチドを触媒的に又は自己触媒的に切断することにより成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、サッカロマイシス・セルビシエのα因子、リゾムコール・ミーヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、及びマイセリオソラ テルモフィラのラッカーゼ(ＷＯ ９５／３３８３６)の遺伝子から得ることができる。
【０１０４】
シグナルペプチド領域及びプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に位置する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置しており、そしてシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【０１０５】
糸状菌株の増殖に対して生物由来物質の発現の調節を可能にする調節配列を加えることが望ましいこともある。調節システムの例は、化学又は物理的刺激、例えば調節化合物の存在に応答して、遺伝子発現をオン又はオフにすることができるシステムである。糸状菌株ではＴＡＫＡα-アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼプロモーター、及びフサリウム・ベネナツムのグルコアミラーゼプロモーターが調節配列として使用されてもよい。調節配列の他の例は、遺伝子の増幅を可能にする配列である。真核生物のシステムでは、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロフォレート・レダクターゼ遺伝子、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合、目的の生物由来物質をコードするヌクレオチド配列は、調節配列に作用可能なように結合される。
【０１０６】
発現ベクター
目的の生物由来物質をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、生物由来物質をコードするヌクレオチド配列、及び転写終結シグナル及び翻訳終結シグナルを含む組み換え発現ベクターに含まれてもよい。本明細書に記載される様々な核酸及び調節配列は、組み合わされて、制限酵素部位にポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入又は置換することを可能にする１以上(幾つかの)便利な制限酵素部位を含みうる組み換え発現ベクターをもたらす。或いは、ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列又は当該配列を含む核酸構築物を、発現に適したベクターに挿入することにより、ポリヌクレオチド配列を発現できる。発現ベクターを作成する際に、コード配列をベクター中に位置させ、その結果コード配列は、発現に適した調節配列に作用可能なように結合する。
【０１０７】
組み換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法にうまくかけることができ、かつヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクター(例えば、プラスミド又はウイルス)であってもよい。ベクターの選択は、典型的に、当該ベクターを導入する宿主細胞と、ベクターとの適合性に左右されよう。ベクターは、直線状又は閉じた環状プラスミドであってもよい。
【０１０８】
ベクターは、自己複製ベクター、つまり、複製が染色体複製とは独立している染色体外要素として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム、又は人工染色体であってもよい。ベクターは、自己増殖を確実におきるようにするための任意の手段を含んでもよい。或いは、当該ベクターは、宿主細胞に導入される場合、ゲノムに組み込まれ、そしてベクターが組み込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであってもよい。さらに、単一のベクター又はプラスミド、又は２以上のベクター又はプラスミドであって、一緒になって宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含むもの、或いはトランスポゾンが使用されてもよい。
【０１０９】
ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞、トランスフェクションされた細胞、形質導入された細胞、又は同様の細胞の簡単な選別を許容する１以上の(幾つかの)選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーは、遺伝子産物が殺生物剤又はウイルス抵抗性、重金属抵抗性、原栄養性から栄養要求性を与える遺伝子である。糸状菌宿主細胞において使用するための選択可能なマーカーとしては、ａｍｄＳ(アセトアミダーゼ)、ａｒｇＢ(オルチニン・カルバモイルトランスフェラーゼ)、ｂａｒ(ホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ)、ｈｐｈ(ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ)、ｎｉａＤ(硝酸レダクターゼ)、ｐｙｒＧ(オロチジン-５'-ホスフェート・デカルボキシラーゼ)、ｓＣ(サルフェート・アデニルトランスフェラーゼ)、及びｔｒｐＣ(アントラニトレート・シンターゼ)、並びにそれらの同等物が挙げられるが、それらに限られるものではない。アスペルギルス細胞に使用するのに好ましいものは、アスペルギルス・ニジュランス又はアスペルギルス・オリゼーのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子であり、そしてストレプトマイシス・ハイグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)のｂａｒ遺伝子である。
【０１１０】
ベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの組み込みを許容するか、又はゲノムからは独立して細胞中でベクターの自己複製を可能にする要素を含む。
【０１１１】
宿主細胞ゲノムへの組み込みについて、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、又は相同組換え若しくは非相同組換えによりゲノム中への組み込みをするためのベクターの任意の他の要素によってもよい。或いは、ベクターは、染色体の正確な位置において宿主細胞のゲノム中に相同組換えによる組換えを仕向ける追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。正確な位置への組み込む可能性を増加させるために、組み込み要素は、好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する標的配列に対して高い同一性を有する十分な数の核酸、例えば１００〜１００００塩基対、好ましくは４００〜１００００塩基対、そして最も好ましくは８００〜１００００塩基対を含む。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおいて標的配列と相同性である任意の配列であってもよい。さらに、組み込み要素は、非コード又はコードヌクレオチド配列であってもよい。他方、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【０１１２】
自立複製について、問題の宿主細胞においてベクターが自立的に複製することを可能にする複製起点をベクターがさらに含んでもよい。複製起点は、細胞内で機能する自己複製を媒介する任意のプラスミド・レプリケーターであってもよい。「複製起点」又は「プラスミドレプリケーター」という語句は、in vivoにおいてプラスミド又はベクターの複製を可能にするヌクレオチド配列として定義される。
【０１１３】
糸状菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１(Gems et al., 1991, Gene 98: 61 - 67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 0024883)である。ＡＭＡ１遺伝子の単離及び当該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、WO 00/24883に開示される方法に従って達成することができる。
【０１１４】
２以上のコピーのポリヌクレオチドは、遺伝子産物の産生を増加するために、宿主細胞に挿入されてもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも１の追加コピーを、宿主細胞ゲノムに組み込むことにより、又は当該ポリヌクレオチドを有する増幅可能な選択可能マーカーを含めることにより、得ることができる。ここで選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、それによりポリヌクレオチドの追加のコピー数を含む細胞は、細胞を適切な選択薬剤の存在下で細胞を培養することにより選択されうる。
【０１１５】
上記要素をコンストラクトにライゲーションするために使用される方法は、当業者に周知である(例えば、Sambrookら、1989、前掲)を参照のこと。)
【０１１６】
本発明は、以下の実施例によりさらに記載される。当該実施例は本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきでない。
【実施例】
【０１１７】
ａｍｄＳ  オーバーレイアガーは、１Ｌあたり、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、２７３.８ｇのスクロース、８ｇのＮｏｂｌｅアガー、１０ｍＭのアセトアミド、及び１５ｍＭ・ＣｓＣｌ、ｐＨ５.０から構成された。
【０１１８】
ＡＭＧ微量金属溶液は、１Ｌあたり、１４.３ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２.５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０.５ｇのＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、１３.８ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８.５ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、及び３.０ｇのクエン酸から構成された。
【０１１９】
セルロース誘導培地は、１Ｌあたり、２０ｇのＡｌｂｏｃｅｌ-天然セルロース繊維(J.RettenmaierUSA LP)、１０ｇのトウモロコシ浸漬固体(corn steep solid)、１.４５ｇの(ＮＨ4)2ＳＯ4、２.０８ｇのＫＨ2ＰＯ4、０.２８ｇのＣａＣｌ2、０.４２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０.４２ｍｌのトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma Ressei）の微量金属溶液、及び２滴のプルロン酸(pluronic acid)から構成された。ｐＨは、オートクレーブ前に、１０ＮのＮａＯＨで６.０に調節した。
【０１２０】
ＣＯＶＥ選択プレートは、１リットルあたり、３４２.３ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍＭのアセトアミド、１５ｍＭのＣｓＣｌ2、及び２５ｇ又は３０ｇのＮｏｂｌｅアガーから構成された。
【０１２１】
ＣＯＶＥ２プレートは、１リットルあたり、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、７６ｇのＫＨ2ＰＯ4、及び５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液から構成された。
【０１２２】
ＣＯＶＥ塩溶液は、１リットルあたり、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、７６ｇのＫＨ2ＰＯ4、及び５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液から構成された。
【０１２３】
ＣＯＶＥ微量金属溶液は、１リットルあたり０.０４ｇのＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ2Ｏ、０.４ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１.２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０.７ｇ又は１ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０.８ｇのＮａ2ＭｏＯ2・２Ｈ2Ｏ、及び１０ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏから構成された。
【０１２４】
ＣＯＶＥ Ａ塩溶液は、１リットルあたり２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4、７６ｇのＫＨ2ＰＯ4、及び５０ｍｌｎｏＣＯＶＥ Ａ希元素溶液から構成された。
【０１２５】
ＣＯＶＥ Ａ希元素溶液は、１リットル当たり、０.０４ｇのＮａＢ4Ｏ7-１０Ｈ2Ｏ、０.４ｇのＣｕＳＯ4-５Ｈ2Ｏ、０.８ｇのＦｅＳＯ4-７Ｈ2Ｏ、０.８ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０.８ｇのＮａ2ＭｏＯ2・２Ｈ2０、１０ｇのＺｎＳＯ4-７Ｈ2Ｏ、及び１０ｇのクエン酸から構成された。
【０１２６】
ＣＯＶＥ Ａ-尿素＋アセトアミド選択プレートは、１リットル当たり、２０ｍｌのＣＯＶＥ Ａ塩溶液、２２０ｇのソルビトール、１０ｇのグルコース、１０ｍＭアセトアミド、及び３０ｇのバクトラガー、ｐＨ５.２から構成された。
【０１２７】
Ｍ４１０は、１リットル当たり、５０ｇのマルトース、５０ｇのグルコース、２ｇのＭｇＳＯ4-７Ｈ2Ｏ、２ｇのＫＨ2ＰＯ4、４ｇのクエン酸、８ｇの酵母抽出物、２ｇの尿素、０.５ｍｌのＡＭＧ微量金属溶液、及び０.５ｇのＣａＣｌ2、ｐＨ６.０から構成された。
【０１２８】
最小培地は、１リットルあたり、６ｇのＮａＮＯ3、０.５２ｇのＫＣｌ、１.５２ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｍｌのＣＯＶＥ希元素溶液、１０ｇのグルコース、０.５ｇのグルコース、０.５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０.００４ｇのＤ-ビオチンから構成された。
【０１２９】
最小培地アガーは、１リットルあたり、６ｇのＮａＮＯ3、０.５２ｇのＫＣｌ、１.５２ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｍｌのＣＯＶＥ希元素溶液、２０ｇのＮｏｂｌｅアガー、１０ｇのグルコース、０.５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０.００４ｇのＤ-ビオチンから構成された。
【０１３０】
ＰＤＡプレートは、１リットルあたり３９ｇのＤＩＦＣＯ（登録商標）ポテトデキストロースシュガー(Becton Dickinson and Co., Sparks, MD, USA)から構成された。
【０１３１】
ＰＥＧは、６０％ＰＥＧ４０００(Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA)、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ６.５から構成され、フィルター滅菌された。
【０１３２】
ＳＰＣは、４０％ＰＥＧ ４０００、５０ｍＭのＣａＣｌ2、及び０.８Ｍソルビトール、ｐＨ４.５〜５.５から構成され、フィルター滅菌された。
【０１３３】
２０×ＳＳＣは、１リットルあたり、１７５.３ｇのＮａＣｌ及び８８.２ｇのクエン酸ナトリウムｐＨ７.０から構成された。
【０１３４】
０.５×ＳＳＣは、１リットルあたり、４.３８ｇのＮａＣｌ及び２.２ｇのクエン酸ナトリウムｐＨ７.０から構成された。
【０１３５】
ＳＴＣは、１Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ2、及び１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ６.５から構成され、フィルター滅菌された。
【０１３６】
トリコデルマ リーセイ(Trichoderma reesei)微量金属溶液は、１リットルあたり、２１６ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、５８ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、２.４ｇのＨ３ＢＯ３、及び３３６ｇのクエン酸から構成された。
【０１３７】
ＹＰＧは、１リットル当たり、１０ｇの酵母抽出物(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)、２０ｇのＢＡＣＴＯ（登録商標）ペプトン(Becton Dickinson and Co., Sparks, MD, USA)、及び２０ｇのグルコースから構成された。
【０１３８】
上に記載される要素をライゲーションして、組換え発現ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知である(例えば、上記Sambrook et al.、 1989、を参照のこと)。
【０１３９】
本発明はさらに、以下の実施例により記載されており、これらは本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【０１４０】
実施例１：プラスミドｐＣＷ０９８の構築
プラスミド ｐＣＷ０９８は、ＴＡＫＡ／Ｎａ２-tpiリーダーハイブリッド・プロモーター(米国特許第6,461,837号)、大腸菌(Escherichia coli)のハイグロマイシン抵抗性遺伝子の一部から作成された逆反復 (hyg IR)、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)アミログルコシダーゼ(ＡＭＧ)ターミネーター(Hata et al., 1991, Agric. Biol. Chem. 55: 941-949, 及びアスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans) ｐｙｒＧ遺伝子(Ballance and Turner, 1985, Gene 36: 321-331)を選択可能マーカーとして含むように構築された。
【０１４１】
大腸菌aph(4)(hyg B)遺伝子(Kasterら,1983 上記)に由来する二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を発現するために、逆反復の半分のうちの１つ、aph(4)遺伝子のオープンリーディングフレーム内の１９９塩基対、を、以下に記載するようにＮｏｔＩ制限酵素部位を有するセンス鎖プライマー及び５'ＳｍａＩ又はＸｍａＩ制限部位を有するアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【化１】
0005951924.tif 000002
ｈｙｇＢのコード配列部分を大文字で示す。
【０１４２】
増幅反応液(５０μｌ)は、１×ＴＨＥＲＭＯＰＯＬ(商標)反応緩衝液(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)、０.４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１００ｎｇのｐＳＭａｉ１５５(ＷＯ ０５／０７４６４７)、５０ｐｍｏｌのセンスプライマー、５０ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー、及び５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)から構成された。反応液を、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で１分(最終伸張では７分)を各３０サイクルとプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)中でインキュベートした。
【０１４３】
２１４ｂｐのＰＣＲ産物を、ＴＡＥ緩衝液(１リットルあたり４.８４ｇのＴｒｉｓ塩基、１.１４ｍｌの氷酢酸、及び２ｍｌの０.５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０)中の１％アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてさらにＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ抽出キット(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)を用いてさらに精製した。２１４ｂｐのＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２.１-ＴＯＰＯ（登録商標）とライゲーションし、そして製品説明書にしたがってＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０化学処理コンピテント大腸菌セルに形質転換した。幾つかの形質転換体からえたプラスミドＤＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)を用いて精製し、そしてＤＮＡシーケンスにより分析して、所望のｈｙｇＢインサートを含むプラスミドを同定した。予期されるＤＮＡ配列を有する１のプラスミドをＭＰ＃３と名づけた。
【０１４４】
１００塩基対のスペーサーを含む逆反復のうちの半分のうちのもう一方は、以下に示される５'Ｐａｃ制限部位を有するセンス鎖プライマーと、５'ＳｍａＩ又はＸｍａＩ制限酵素部位を有するアンチセンスプライマーを用いて増幅された；ｈｙｇＢ配列を大文字で示す：
【化２】
0005951924.tif 000003
【０１４５】
増幅反応液(５０μｌ)は、１×ＴＨＥＲＭＯＰＯＬ(商標)反応緩衝液、０.４ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのｐＳＭａｉ１５５、５０ｐｍｏｌのセンスプライマー、５０ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー、及び５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼから構成された。反応液を、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１分(最終伸張７分)で各々３０サイクルにてプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ （登録商標） ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）中でインキュベートした。
【０１４６】
３１４ｂｐのＰＣＲ産物を、ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを用いてさらに精製した。３１４ｂｐのＰＣＲ産物を、製品説明書に従いＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２.１-ＴＯＰＯ（登録商標）とライゲーションし、そしてＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０化学処理コンピテント大腸菌セルに形質転換した。幾つかの形質転換体に由来するプラスミドＤＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００を用いて精製し、そしてＤＮＡシーケンスにより分析して、所望のｈｙｇＢインサートを含む形質転換体を同定した。予測されたＤＮＡ配列を有する１のプラスミドは、ＭＰ＃９と名づけられた。
【０１４７】
ＭＰ＃３をＮｏｔＩ及びＸｍａＩで切断した。ＭＰ＃９をＰａｃＩ及びＸｍａＩで切断した。両方のｈｙｇＢ  ＤＮＡ断片を、ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを用いて抽出した。断片を、ＮｏｔＩ／ＰａｃＩで切断済みのベクターｐＡＩＬｏ２(ＷＯ05/056772、実施例２１)にライゲーションしてｐｃＷ０９８(図２)を作成した。
【０１４８】
実施例２：プラスミドｐＣＷ０９９の構築
プラスミドｐＣＷ０９９を、ＴＡＫＡ／ＮＡ２-ｔｐｉリーダーハイブリッドプロモーター、アスペルギルス・オリゼーのｗＡ遺伝子の断片(全長ゲノムＤＮＡ配列について配列番号５、及び推定のアミノ酸配列について配列番号６)、大腸菌ｈｙｇＢ逆反復(ｈｙｇＩＲ)、アスペルギルス・ニガーのアミログルコシダーゼ(ＡＭＧ)ターミネーター、及びアスペルギルス・ニジュランスのｐｙｒＧ遺伝子を選択可能マーカーとして含むように構築した。
【０１４９】
アスペルギルス・オリゼーのｗＡ遺伝子(ＤＮＡ配列について配列番号７、及び推定のアミノ酸配列について配列番号８)の１７６ｂｐ断片は、プラスミド＋アスペルギルスオリゼー株Ｐ２-５.１(ＷＯ05/056772、実施例２７及び２８)からレスキューされたｗＡフランキング配列から、以下に示すプライマーcwwanco.1corr(センス)及びcwwanot.1a(アンチセンス)を用いてＰＣＲ増幅された。センスプライマーは、５'-末端でＮｃｏＩ部位を有し、そしてアンチセンスプライマーは、５'末端にＮｏｔＩ部位を有するように作成された。
【化３】
0005951924.tif 000004
ｗＡ配列を大文字で示す。
【０１５０】
増幅反応液(５０μｌ)は、１×ＴＨＥＲＭＯＰＯＬ(商標)反応緩衝液、０.４ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのアスペルギルス・オリゼーＰ２-５.１ＤＮＡ(ＷＯ05/056772)、５０ｐｍｏｌのプライマーcwwanco. 1forr、５０ｐｍｏｌのプライマーcwwanot.1a、及び５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼから構成された。反応液を、９４℃で３０秒、５５℃３０秒、７２℃で１分(７分の最終伸張)で各３０サイクルにてプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３中でインキュベートした。
【０１５１】
１８８ｂｐのＰＣＲ産物を、ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを用いてさらに精製した。１８８ｂｐのＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ（登録商標）ｔＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２.１-ＴＯＰＯ（登録商標）とライゲーションし、そして製品説明書にしたがってＯＮＥＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０化学処理コンピテント大腸菌セル中に形質転換した。幾つかの形質転換体から得たプラスミドＤＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００を用いて精製し、そしてＤＮＡ配列により分析して、所望のｗＡインサートを含むことを同定した。予期されたＤＮＡ配列を有する１のプラスミドは、ＭＰ＃１０と名づけられた。
【０１５２】
ＭＰ＃１０ＤＮＡを、ＮｃｏＩとＮｏｔＩで切断し、そしてＴＡＥ緩衝液中で１％アガロースゲル電気泳動により精製した。ｗＡ断片を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを用いて抽出した。精製された断片は、ＮｃｏＩ/ＮｏｔＩにより切断されたｐＣＷ０９８にライゲーションして、ｐＣＷ０９９を作成した(図３)。
【０１５３】
実施例３：プラスミドｐＥＦｅｒ１４の構築
ＴＡＫＡ/ＮＡ２-ｔｐｉリーダーハイブリッドプロモーター、アスペルギルス・オリゼーのｗＡ遺伝子の１７６ｂｐ断片、大腸菌ｈｙｇＢ逆反復(ｈｙｇＩＲ)、アスペルギルス・ニガーのアミログルコシダーゼ(ＡＭＧ)ターミネーター、及びアスペルギルス・ニジュランスの全長ａｍｄＳ遺伝子を選択マーカーとして含むようにプラスミドｐＥＦｅｒ１４を構築した。
【０１５４】
ＮｃｏＩ及びＰａｃＩで切断されたプラスミドｐＣＷ０９９を、ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル電気泳動により精製した。１７６ｂｐのｗＡ断片とｈｙＢ逆反復を含む６９８ｂｐ断片を、製品説明書に従ってＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＤＡカラムを用いて抽出した(Millipore、Billercia、MA、USA)。精製された断片を、NcoI/PacIで切断されたpＡＩＬｏ１(WO 05/056772、実施例１)にライゲーションして、ｐＥＦｅｒ１４を作成した(図４)。
【０１５５】
実施例４：プラスミドｐＤＭ２６１の構築
プラスミドｐＤＭ２６１を、ＴＡＫＡ／ＮＡ２-ｔｐｉリーダーハイブリッドプロモーター、大腸菌ｈｙｇＢ逆反復(ｈｙｇＩＲ)、アスペルギルス・ニガー・アミログルコシダーゼ(ＡＭＧ)ターミネーター、及び全長アスペルギルス・ニジュランスａｍｄＳ遺伝子を選択マーカーとして含むように構築した。
【０１５６】
ＮｃｏＩ及びＰａｃＩで切断したプラスミドｐＣＷ０９８を、ＴＡＥ緩衝液中で１％アガロースゲル電気泳動により精製した。ｈｙｇＢ逆反復を含む５２７ｂｐ断片を、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＤＡ-カラムを用いて抽出した。精製された断片を、ＮｃｏＩ/ＰａｃＩで切断されたｐＡＩＬｏ１にライゲーションして、ｐＤＭ２６１を作成した(図５)。
【０１５７】
実施例５：プラスミドｐＤＭ２６６の構築
プラスミドｐＤＭ２６６を、ＴＡＫＡ/ＮＡ２-ｔｐｉリーダーハイブリッドプロモーター、アスペルギルス・オリゼーｗＡ遺伝子の４９９ｂｐ断片、大腸菌ｈｙｇＢ逆反復(ｈｙｇＩＲ)、アスペルギルス・ニガーアミログルコシダーゼ(ＡＭＧ)ターミネーター、及びアスペルギルス・ニジュランス全長ａｍｄＳ遺伝子を選択マーカーとして含むように構築した。
【０１５８】
ｗＡ遺伝子の４９９ｂｐ断片を、以下に示すプライマーｗＡ５００ＦＷＤ(センス)とｗＡ５００ＲＥＶ(アンチセンス)を用いて、アスペルギルス・オリゼーＡ１５６０株(ＩＦＯ４１７７)のゲノムＤＮＡから増幅した。センスプライマーは、５'末端にＮｃｏＩ部位を有するように作成され、そしてアンチセンスプライマーは、５'末端にＮｏｔＩ部位を有するように作成された。製品説明書に従って、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉキット(QIAGEN Inc., valencia, CA, USA)を用いてアスペルギルス・オリゼーＡ１５６０株(ＩＦＯ４１７７)を調製した。
【化４】
0005951924.tif 000005
ｗＡ配列を大文字で示す。
【０１５９】
増幅反応液(５０μｌ)は、１×ＴＨＥＲＭＯＰＯＬ(商標)反応緩衝液、０.２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１００ｎｇのアスペルギルス・オリゼー・Ａ１５６０株のゲノムＤＮＡ、５０ｐｍｏｌのプライマー(ｗＡ５００ＦＷＤ)、５０ｐｍｏｌのプライマー(ｗＡ５００ＲＥＶ)、及２.５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼから構成された。反応液を、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で３０秒(最終伸張では１０分)を各３０サイクルとプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)中でインキュベートした。
【０１６０】
５１３ｂｐのＰＣＲ産物を、ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてさらにＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＤＡカラムを用いて精製した。ｗＡ断片をＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキットを用いてｐＣＲ２.１-ＴＯＰＯ（登録商標）とライゲーションし、そして製品説明書にしたがってＯＮＥ ＳＨＯＴ（登録商標）ＴＯＰ１０化学処理コンピテント大腸菌セルに形質転換した。幾つかの形質転換体から得たプラスミドＤＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)を用いて精製し、そしてＤＮＡシーケンスにより分析して、所望のｗＡインサートを含むプラスミドを同定した。予期されるＤＮＡ配列を有する１のプラスミドをＭＰ＃８と名づけた。
【０１６１】
ＭＰ＃８ＤＮＡを、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで切断し、そしてＴＡＥ緩衝液中で１％アガロースゲル電気泳動により精製した。ｗＡ断片を、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＤＡカラムを用いて抽出した。精製された断片を、ＮｃｏＩ/ＮｏｔＩで切断されたｐＤＭ２６１にライゲーションして、ｐＤＭ２６６を作成した(図６)。
【０１６２】
ｐＤＭ２６６中の４９９ｂｐのｗＡ断片(ｗＡ遺伝子の２６０７-３１０６の塩基対)は、ｐＣＷ０９９及びｐＥＦｅｒ１４中の１７６ｂｐのｗＡ断片と同一の３'末端を有する。
【０１６３】
実施例６：アスペルギルス・オリゼーの形質転換及び形質転換体の分析
アスペルギルス・オリゼーＪＡＬ２５０株(ＷＯ98/11203)を、２０ｍＭのウリジンを添加したＰＤＡプレート上で７日間、34℃で増殖させた。５ｍｌの０.０１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)を加え、滅菌された植菌用ループを用いてプレートの表面を掻き取り、そして５ｍｌピペットを用いて胞子懸濁液を回収することにより胞子を回収した。約２〜５×１０7胞子を、５００ｍｌの撹拌フラスコに入れた１００ｍｌのＹＰＧ培地に加え、そして１６〜１８時間３０〜３４℃及び１４０ｒｐｍでインキュベートした。滅菌０.２μｍ５００ｍｌＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）フィルターユニットを用いて菌糸体を回収した。増殖培地から菌糸体をろ過して取り除き、そして１００ｍｌの０.７Ｍ ＫＣｌで２回洗浄した。菌糸体を、２０ｍｌのプロトプラスト溶液[５ｍｇ/ｍｌ ＧＬＵＣＡＮＥＸ(商標)(Novozymes A/S、Bagsvaerd、Denmark)＋０.５ｍｇ／ｍｌキチナーゼ(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)を入れた０.７ＭのＫＣｌ]に再懸濁した。菌糸体を、１２５ｍｌの撹拌フラスコに移し、そして３４℃、８０ｒｐｍで３０〜９０分間インキュベートした。プロトプラストをＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）で覆われた滅菌漏斗(Calbiochem, San Diego, CA, USA)を通して滅菌５０ｍｌのポリプロピレンチューブに注いだ。プロトプラストを、Sorfvall RT6000D遠心機中にて室温、１３０３×ｇで２０分間遠心した。上清を捨て、そしてプロトプラストを２０ｍｌのＳＴＣ中に再懸濁した。プロトプラストを上記のように遠心し、そして２０ｍｌのＳＴＣ中で再懸濁した。２０μｌの量を取り、そしてＳＴＣで希釈した。プロトプラストは、ヘモサイトメーターを用いて計数した。プロトプラストを、上に記載されるように遠心し、そして適切な体積のＳＴＣ中に再懸濁して、２×１０7プロトプラスト／ｍｌを得た。
【０１６４】
５μｇのｐＥＦｅｒ１４、ｐＤＭ２６１、又はｐＤＭ２６６ＤＮＡを、１００μｌのアスペルギルス・オリゼーＪａＬ２５０プロトプラストに加えた。室温で３０分間インキュベートした後に、プロトプラスト／ＤＮＡ混合物は、ＳＴＣで９ｍｌに調整され、３つのアリコートに分割し、そして２０ｍＭウリジン及び１％のマルトースを添加した３個の１５０ｍｍＣＯＶＥプレートに撒いた。次にプレートを３４℃でインキュベートした。アセドアミド上での増殖は、各発現プラスミドに存在するａｍｄＳ遺伝子の発現を必要とする。
【０１６５】
４日のインキュベートの後に、成熟胞子の色が明らかになる前に、プラスミドｐＥＦｅｒ１４、ｐＤＭ２６１、及びｐＤＭ２６６を用いて得られる２５又は３０の初期形質転換体を、２０ｍＭウリジン及び１％マルトースを添加したＣＯＶＥ２プレート上にストリークした。ｐＤＭ２６１の形質転換体から得られた全てのコロニーが、均一な暗緑色であった。対照的に、ｐＥＦｅｒ１４又はｐＤＭ２６６の形質転換体から得たコロニーは、淡黄色〜暗緑色の範囲で胞子の色が多様であった。形質転換体は、２０ｍＭウリジン及び１％マルトースを添加したＣＯＶＥ２プレートに胞子をストリークし、そして次に単離されたコロニーを拾い上げて、同じ培地のプレートに入れることにより精製した。全てのプレートを、３４℃でインキュベートした。
【０１６６】
結果を表１に示す。３０の胞子精製されたｐＤＭ２６６(４９９ｂｐ  ｗＡ)形質転換体の４０％は、野生型より明るい胞子色を示した。３０胞子の精製ｐＥＦｅｒ１４(１７６ｂｐ ｗＡ)形質転換体の３０％は、野生型よりも明るい胞子色を示した。２５の胞子精製されたｐＤＭ２６１(ｗＡなし)形質転換体のうちの１００％が、野生型胞子色を示した。
【０１６７】
【表１】
0005951924.tif 000006
【０１６８】
ｐＤＭ２６６及びｐＥＦｅｒ１４形質転換体の明るい胞子色を示す結果は、二次的ＲＮＡｉによるｗＡ遺伝子の抑制と一致する表現形を示した。
【０１６９】
実施例７：ｗＡ遺伝子がサイレンシングされたアスペルギルス・オリゼーの形質転換体のサザンブロット分析
サザンブロット分析を行い、実施例６から得られた６の形質転換体(以下の表２に挙げられる)における様々な胞子の色が、遺伝子破損の結果ではないことを立証した。ミュータントアスペルギルス・オリゼーＰ２-５.１(WO 2005／056772)は、ｗＡ遺伝子の破損を含んだ。
【０１７０】
【表２】
0005951924.tif 000007
【０１７１】
上記アスペルギルス・オリゼーの各々に由来するゲノムＤＮＡは、製品説明書に従って、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いて調製した。２μｇの各ゲノムＤＮＡを、ＳａｐＩ及びＣｌａ  Ｉで一晩３７℃にて切断した。切断されたゲノムＤＮＡを、ＴＡＥ緩衝液中の０.７％アガロースゲル電気泳動により１７時間分画し、そして、製造者の推奨に従いＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ(商標)(Schleicher & Schell, BioScience, Keene, NH, USA)を１４〜１６時間用いてＮＹＴＲＡＮ(商標)ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅｄ膜(Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA)上にブロットした。
【０１７２】
最初に、膜を４６３ｂｐのジオキシゲニン標識されたアスペルギルス・オリゼーｗＡプローブとハイブリダイゼーションし、当該プローブは、以下のｗＡ５ｐｒｉｍｅＦＷＤ(センス)及びプライマーｗＡ５ｐｒｉｍｅＲＥＶ(アンチセンス)を用いたＰＣＲによりジオキシゲニン-１１-ｄＵＴＰを取り込むことにより合成された：
【化５】
0005951924.tif 000008
【０１７３】
増幅反応液(５０μｌ)は、１×ＴＨＥＲＭＯＰＯＬ(商標)反応緩衝液、５μｌのＰＣＲ ＤＩＧ標識混合液(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)、１０ｎｇのアスペルギルス・オリゼーＪａＬ２５０ゲノムDNA(ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Plant Maxi Kitを用いて調製)、１０ｐｍｏｌのプライマーｓＡ５ｐｒｉｍｅＦＷＤ、１０ｐｍｏｌのプライマーｗＡ５ｐｒｉｍｅＲＥＶ、及び２.５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼから構成された。当該反応液を、９５℃で３０秒、５２℃で３０秒、そして７２℃で１分(最終伸張では７分)を各３０サイクルとプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）中でインキュベートした。ＰＣＲ反応液を、ＴＡＥ緩衝液中の０.８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここでジオキシゲニンの取り込みは、分子量の増加により示された。４６３ｂｐの生成物のバンドをゲルから切り出し、そして製品説明書に従いＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）Ｇｅｌ抽出キット(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)を用いて精製した。
【０１７４】
ハイブリダイゼーションを、ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ緩衝液(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)中で４２℃で１５〜１７時間行った。次に膜を室温で５分間、２×ＳＳＣ＋０.１％ＳＤＳ中において高度にストリンジェンシー条件下で２回洗浄し、続いて６５℃で各１５分間、０.５×ＳＳＣ＋０.１％ＳＤＳ中で２回洗浄した。製品説明書に従って、プローブ標的ハイブリッドを化学発光アッセイ(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)により検出した。
【０１７５】
形質転換体について行われたサザンブロット分析により、全ての形質転換体において、ハイブリダイゼーションバンドが、Ｐ２-５.１における有意に小さいハイブリダイズされたバンドと比較して、全長ｗＡ遺伝子を含むアスペルギルス・オリゼー宿主株ＪａＬ２５０のサイズと同じサイズであったことが明らかにされた。この結果により、非野生型の胞子の色が、遺伝子破損の結果ではないということが示された。
【０１７６】
実施例８：アスペルギルス・オリゼー形質転換体からのＲＮＡの抽出
様々な胞子の色を示す６のアスペルギルス・オリゼー形質転換体(実施例６)を、２０ｍＭのウリジン及び１％のマルトースを添加したＣＯＶＥ２プレート上に撒き、そして３４℃で７日間培養した。形質転換されていないアスペルギルス・オリゼーＪａＬ２５０の胞子は、２０ｍＭウリジンを添加されたＰＤＡプレート上に撒き、そして３４℃で７日間培養した。
【０１７７】
５ｍｌの０.０１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の添加に続き、各株の胞子は、滅菌ディスポーザブルスプレッダーを用いてプレートの表面を掻きとることにより回収した(Bioscience, Rochester, NY, USA)。各胞子の懸濁液を、滅菌５ｍｌの血清用ピペットに取り、５００ｍｌの撹拌フラスコ中の１０ｍＭのウリジンと１％のマルトースの添加済み７５ｍｌの最小培地(ｐＨ６.５)に加え、そして２２〜２４時間３４℃で６５ｒｐｍで培養した。４７ｍｍの硝酸セルロースファイバー(Whatman Inc., Florham Park, NJ, USA)を、滅菌０.２μｍ２５０ｍｌ・ＭＦ７５フィルターユニット(Nalgene, Rochester, NY, USA)中のフィルター膜の上部に配置した。２５〜７５ｍｌの各培養ブロスの全てを、別の硝酸セルロースに配置し、そして吸引ろ過にかけて、フィルター上に菌糸体の薄層をもたらした。硝酸セルロースフィルター＋菌糸体を、１０ｍＭウリジン及び１％マルトースを添加した最小培地アガー(ｐＨ６.５)６０ｍｍのペトリ皿に移した。アガープレートを、プラスチックバッグに配置し、密封し、そして３７℃でインキュベートした。
【０１７８】
アスペルギルス・オリゼーＪａＬ２５０対照において着色した分生子が出現し始めた際(４２〜４８時間)、１２０ｍｇの菌糸体を、スパチュラを用いて各フィルターから掻き取り、そして各々を１ｍｌのＲＮＡＰＲＯ（登録商標）溶液(Q-Biogene, Irvine, CA, USA)を含む溶解マトリクスＣチューブ(Q-biogene, Irvine, CA, USA)に各々移した。溶解マトリクスＣチューブを、ねじ式キャップを締めて、ホモジェナイズの間に漏れることを予防した。サンプルチューブを４０秒間、ＦＡＳＴＰＲＥＰ(商標)ＦＰ１２０装置(Q-Biogene, Irvine, CA, USA)においてスピード６で４０秒間処理し、そして２分間氷上においた。サンプルチューブをスピード６で４０秒間さらに処理し、そして氷上に２分間配置した。サンプルを１３,４００×ｇでＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）５４１５Ｄ微小遠心管中で４℃で５分間遠心した。得られた上清を、１.７ｍｌの微小遠心管に移し、そして室温で５分間インキュベートした。３００μｌのクロロホルムをサンプルチューブに加え、そして１０秒間ボルテックスにかけた。室温で５分間インキュベートした後に、サンプルを、４℃で５分間ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）５４１５Ｄ微小遠心機において１３,４００×ｇで遠心した。上相を１.７ｍｌの微小遠心管に移した。５００μｌの氷冷エタノールをサンプルチューブに加え、そして-２０℃で３０分間インキュベートした。サンプルを４℃で２０分間ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）５４１５Ｄ微小遠心機において１３,４００×ｇで遠心した。得られた上清を取り除き、そしてペレットを７５％エタノールで洗浄した。エタノールを取り除き、そしてペレットを５分間室温で風乾した。ペレットを１００μｌのジエチルピロカルボネート(ＤＥＰＣ)処理水中に懸濁し、続いて５０μｌの８Ｍ塩化リチウム(VWR West Chester, PA, USA)を加えた。サンプルを-２０℃で１時間インキュベートした。インキュベートした後に、サンプルを、４℃で２５分間、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）５４１５Ｄ微小遠心機で１３,４００×ｇで遠心した。上清をサンプルチューブから取り除き、そしてＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した。エタノールを取り除き、そしてＲＮＡペレットを２５〜４０μｌのＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー水(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)中に再懸濁した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）１０００分光光度計(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA)を用いてＲＮＡ濃度を定量した。
【０１７９】
実施例９：アスペルギルス・オリゼーＲＮＡのＤＮＡｓｅ処理
ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ(商標)キット(Ambion, Austin, TX, USA)を用いて、コンタミしているゲノムＤＮＡを、アスペルギルスオリゼーＲＮＡサンプル(実施例８)から取り除いた。３μｇの抽出ＲＮＡを、１×ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ(商標)緩衝液(Ambion, Austin, TX, USA)と混合し、そしてＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー水を用いて１０μｌの体積に調節した。１ユニットのＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ(商標)(Ambion, Austin, TX, USA)をサンプルに加え、そして３７℃で３０分間インキュベートした。別の１ユニットのＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ(商標)を加え、そしてサンプルを３７℃で１時間インキュベートした。２μｌのＤＮａｓｅ不活性化試薬(Ambion, Austin, TX, USA)を加えた。サンプルチューブの内容物を、室温で２分間のインキュベート時間の間に３回混合して、ＤＮａｓｅ不活性化試薬を再分散させた。ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）５４１５Ｄ微小遠心機中で９３００×ｇで２分間遠心することによりペレット化した。各上清９μｌを０.６５ｍｌ微小遠心管に移した。１μｌのＤＮａｓｅ処理したＲＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）１０００分光光度計を用いて計測して、ＲＮＡ濃度を測定した。
【０１８０】
実施例１０：アスペルギルス・オリゼーのトータルＲＮＡサンプルからの第一鎖ｃＤＮＡの合成
第一鎖ｃＤＮＡを、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を用いて、抽出アスペルギルス・オリゼーＲＮＡの各サンプル(実施例９)から合成した。１μｇのＤＮａｓｅ処理ＲＮＡを、１.２ｎｍｏｌのランダムヘキサマープライマー(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)と混合し、そしてＤＥＰＣ処理水で１３μｌの体積に調節した。サンプルを、６５℃で１０分間インキュベートし、そして氷上に配置した。１３μｌのサンプルを、１×ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＲＴ反応緩衝液(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)、２０ユニットのプロテクターＲＮａｓｅ阻害剤(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)、１０ｍＭのデオキシヌクレオチド・ミックス、及び１０ユニットのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ 逆転写酵素(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)と、最終体積は２０μｌに混合した。反応混合液を２５℃で１０分間、５０℃で６０分間、及び８５℃で５分間インキュベートした。合成後、サンプルチューブを氷上に置いた。
【０１８１】
ゲノムＤＮＡのコンタミの除去を確認し、そしてｃＤＮＡの完全性を調べるため、サンプルを、以下に示すイントロンに跨るｗＡ及びアクチンのプライマーセットで増幅した。
【化６】
0005951924.tif 000009
【０１８２】
増幅反応液(５０μｌ)は、１×ＴＨＥＲＭＯＰＯＬ(商標)反応緩衝液、０.４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌのテンプレートｃＤＮＡサンプル、５０ｐｍｏｌのプライマー２ｗＡＦＷＤ、５０ｐｍｏｌのプライマー２ｗＡＲＥＶ、及び２.５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼから構成された。対照増幅反応液(５０μｌ)は、１×ＴＨＥＲＭＯＰＯＬ(商標)反応緩衝液、０.４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１０ｎｇのアスペルギルス オリゼーＪａＬ２５０ゲノムＤＮＡ(ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉキットを用いて調製)、５０ｐｍｏｌのプライマー２ｗＡＦＷＤ、５０ｐｍｏｌのプライマー２ｗＡＲＥＶ、及び２.５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼから構成された。反応液を、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で１分(最終伸張では７分)を各３０サイクルとプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）中でインキュベートした。ＰＣＲ反応液を、ＴＡＥ緩衝液中の０.８％アガロースゲル電気泳動により精製した。この結果は、ｃＤＮＡテンプレートを用いたＰＣＲ反応が、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて対照ＰＣＲ反応よりも少ないアンプリコンをもたらしたことを示した。ゲノムＤＮＡから作成されたＰＣＲアンプリコンが、ｃＤＮＡから作成された対応するアンプリコンより大きいであろう。その結果、ｃＤＮＡ調製は、検出可能な量のゲノムＤＮＡを含まない。
【０１８３】
実施例１１：リアルタイムＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)による定常状態ｗＡのｍＲＮＡアスペルギルスオリゼーの検出
形質転換体におけるアスペルギルス・オリゼーｗＡ発現レベルの測定は、ＲＴ-ＰＣＲを用いて行った。実施例１０に記載される様に各形質転換体から合成される相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)をＲＴ-ＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。ｗＡ遺伝子は標的ＤＮＡ配列として機能する一方、アスペルギルス オリゼーのアクチン遺伝子(ＤＮＡ配列について配列番号１９、及び推定のアミノ酸配列について配列番号２０)は、内部コントロール並びにレファレンスＤＮＡ配列として機能する。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｌｙ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｇｕｉｄｅ  (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)に従って、プライマー及びその対応する単色の加水分解プローブが選択され、そして設計される。プローブは、最初に、エキソン-エキソンスプライス結合点の付近の所望の転写ＤＮＡ配列に基づき選択される。次にプライマーセットは、同一のエキソン-エキソンスプライス結合点又はイントロンにまたがる標的を増幅するように設計された。以下のプローブ：
【化７】
0005951924.tif 000010
を選択した。以下のプライマー：
【化８】
0005951924.tif 000011
を用いた。
【０１８４】
相対定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を用いて行った。各ＲＴ-ＰＣＲ反応(２０μｌ)は、１×ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)、２００ｎＭセンスプライマー、２００ｎＭアンチセンスプライマー、１００ｎＭプローブ、及びさまざまな希釈度(つまり、未希釈、１：１０、１：１００、１：１０００)のｃＤＮＡテンプレートから構成された。ＲＴ-ＰＣＲ反応を、９５℃で１０秒の変性、及び６０℃で３０秒の増幅生成物の定量及び伸張について各４５サイクルとプログラムされたＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムで行った。各サンプルを、３８４ウェルプレート(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を用いて三回調製した。テンプレートｃＤＮＡを、ＰＣＲ品質の水で置き換えたネガティブコントロールを、推定の擬陽性結果を試験するために試験した。
【０１８５】
ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムから得たデータを、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０相対定量ソフトウェア(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を用いて分析した。相対定量法において、各サンプルは、最初のサンプル濃度の相違、ロードするサンプルのバリエーション、ピペット操作の誤差、又はｃＤＮＡ合成効率における不一致により引き起こされる品質及び量の差異を、非調節レファレンス遺伝子に対する標的遺伝子濃度を計算することにより是正した。標的遺伝子／レファレンス遺伝子の比は、測定されるだけでなく、標的及びレファレンス遺伝子のＰＣＲ効率における任意の差異について是正するための較正機により正規化される。相対的定量分析の結果は、サンプルにおける標的ＤＮＡ配列対レファレンスＤＮＡ配列の比が、標準サンプルにおける同一の２つの配列の比、又は較正機により割られた正規化済の比として表された。
【０１８６】
標準曲線は、標的及びレファレンスの両方について、形質転換されていないアスペルギルス・オリゼーＪａＬ２５０を標準サンプルとして用いることにより作成した。標準曲線は、それぞれ、標的及びレファレンスに対して０.９９６及び０.９９５のＲ2値をもたらした。Ｒｏｃｈｅ ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０相対定量ソフトウェアにより計算されたＰＣＲ効率値は、標的およびレファレンスに対して、それぞれ１.７５７(誤差０.０４４９)及び１.９０７(誤差０.０２８７)であった。実施例７に列挙された株の全てにわたるｍＲＮＡの相対発現レベルを比較するために、リアルタイムＰＣＲ反応は、上に記載されるように行った。データーを回収し、そしてＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０相対定量ソフトウェアを用いて分析し、そしてRoche LIGHTCYCLER（登録商標）４８０相対定量ソフトウェアマニュアル(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)に従って以前に作成された標準曲線と比較された。相対定量分析を用い、アスペルギルス・オリゼーＤＬＭ１６１０-４５-ｐＤＭ２６１＃２(野生型胞子色を有する形質転換体)におけるｗＡのｍＲＮＡの発現レベルは、形質転換されていないアスペルギルス・オリゼーＪａＬ２５０株に匹敵した。アスペルギルス・オリゼーＤＬＭ１６４１-７４-ｐＥＦｅｒ１４＃３及びアスペルギルス・オリゼーＤＬＭ１６４１-７４-ｐＤＭ２６６＃２４(明るい色の胞子を有する形質転換体)におけるｗＡのｍＲＮＡの相対発現レベルは、野生型の胞子色を有する株におけるｗＡｍｒＮＡ発現レベルに比べて、それぞれ６７％及び６２％の低下を示した。アスペルギルス・オリゼーＤＬＭ１６４１-７４-ｐＤＭ２６６＃１７及びアスペルギルス・オリゼーＤＬＭ１６４１-７４-ｐＤＭ２６６＃２９(白色の胞子を有する株)は、野生型の胞子の色を有する株に比べて、ｗＡ ｍＲＮＡの７３％及び８１％の低下を示した。
【０１８７】
実施例１２：プラスミドｐＡｍＦｓ０３１の構築
二次的ＲＮＡｉ発現ベクターを、アスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ１０１５ポリケチドシンターゼ遺伝子(ｃＤＮＡ配列について配列番号２５及び推定のアミノ酸配列について配列番号２６)の発現を抑制するために構築した。
ＴＡＫＡ／ＮＡ２-ｔｐｉリーダーハイブリッドプロモーター、アスペルギルス・ニガーのポリケチドシンターゼ遺伝子のオープンリーディングフレームの断片、大腸菌ｈｙｇＢ逆反復(ｈｙｇＩＲ)、アスペルギルス・ニガー・アミログルコシダーゼ・ターミネーター、及び全長アスペルギルス・ニジュランスａｍｄＳ遺伝子(Kelly and Hynes, 1985, EMBO J. 4: 475-479)を選択可能なマーカーとして含むようにプラスミドｐＡｍＦｓ０３１を構築した。アスペルギルス・ニガー・ポリケチドシンターゼ遺伝子が、糸状菌における分生子色素の声望正に関与する他のポリケチドシンターゼに配列同一性を有するので、サイレンシングの標的として選択された。
【０１８８】
アスペルギルス・ニガーのポリケチドシンターゼのオープンリーディングフレーム(ＤＮＡ配列について配列番号２７、及び推定上のアミノ酸配列について配列番号２８)内の５０２の塩基対断片を、５'ＮｃｏＩ制限部位を有するセンス鎖プライマー及び以下に示す５'ＮｏｔＩ制限部位を有するアンチセンスプライマーを用いて、アスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０株(ＷＯ2004/090155)から単離されたゲノムＤＮＡから増幅した。
【化９】
0005951924.tif 000012
ポリケチドシンターゼをコードする配列を大文字で示した。
【０１８９】
増幅反応液(５０μｌ)は、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ(商標)反応緩衝液(Strategne, La Jolla, CA, USA)、０.２ｍＭのｄＮＴＰ,１２８ｎｇのアスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０のゲノムＤＮＡ(DNEASY（登録商標）Plant Maxi Kitを用いて調製)、２０ｐｍｏｌのセンスプライマー、２０ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー、及び２.５ユニットのＨＥＲＣＵＬＡＳＥ ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA, USA)から構成された。当該反応液を、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で１分(最終伸張では７分)を各３０サイクルとプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３中でインキュベートした。
【０１９０】
５０２ｂｐの得られたＰＣＲ生成物、及びｐＤＭ２６１を、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＴＡＥ緩衝液中で０.７５％アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてさらに、ＰＣＲ生成物についてＭＩＮＥＬＵＴＥ（登録商標）キットを用いて、或いはプラスミドについてＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを用いてさらに精製した。ＦＡＳＴ-ＬＩＮＫ(商標)ＤＮＡライゲーションキット(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)を用いて、ＰＣＲ産物をｐＤＭ２６１プラスミド断片とライゲーションし、そして製品説明書に従ってＳＵＲＥ(商標)ＩＩ化学処理コンピテント大腸菌セル(Stratagene, La Jolla, CA, USA)に形質転換した。幾つかの形質転換体から得たプラスミドＤＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００を用いて精製し、そしてＤＮＡシーケンスにより分析して、所望のポリケチド合成インサートを風ｋムプラスミドを同定した。予期されるＤＮＡ配列を有する１のプラスミドをｐＡｍＦｓ０３１と名づけた(図７)。
【０１９１】
実施例１３：アスペルギルス・ニガーの形質転換、及び形質転換体の分析
アスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０株を、ＰＤＡプレート上で３４℃で１４日間増殖させた。７ｍｌの０.０１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)を加え、滅菌された植菌用ループを用いてプレートの表面を掻き取り、そして５ｍｌピペットを用いて胞子懸濁液を回収することにより胞子を回収した。１Ｍスクロースを添加した２５ｍｌのＹＰＧ培地を含む５００ｍｌのガラス撹拌フラスコを、約２.６×１０8胞子で植菌し、そして２８℃で１５時間１５０ｒｐｍでインキュベートした。た。滅菌０.２μｍ５００ｍｌＥＸＰＲＥＳＳ(商標)フィルターユニット(Millipore, Billerica, MA, USA)を用いて菌糸体を回収した。増殖培地から菌糸体をろ過して取り除き、そして１５０ｍｌの１Ｍソルビトールで２回洗浄した。菌糸体を、１ｍｌあたり２０ｍｇのＧＬＵＣＡＮＥＸ(商標)及び０.４ｍｇのキチナーゼ(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)を入れた１Ｍのソルビトールを含む３０ｍｌのプロトプラスト溶液に再懸濁した。菌糸体を、１２５ｍｌの撹拌フラスコに移し、そして３４℃、１００ｒｐｍで４５分間インキュベートした。プロトプラストをＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）で覆われた滅菌漏斗(Calbiochem, San Diego, CA, USA)を通して滅菌５０ｍｌのポリプロピレンチューブに注いだ。当該チューブを氷冷１Ｍソルビトールで充填した。プロトプラストを、Sorvall RT6000D遠心機中にて室温、１３０３×ｇで５分間遠心した。上清を捨て、そしてプロトプラストを５０ｍｌの１Ｍソルビトール中に再懸濁した。プロトプラストをＳｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｄ遠心機で遠心し、そして１０ｍｌのＳＴＣ中に再懸濁した。２０μｌの量を取り出し、そしてＳＴＣで希釈した。経も差異とメーターを用いてプロトプラストを計数した。プロトプラストをＳｏｒｖａｌｌＲＴ６０００Ｄ遠心機で遠心し、そして適切な体積のＰＥＧ４０００(Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA)中に再懸濁して、２×１０7プロトプラスト／ｍｌを生成した。
【０１９２】
５μｇのｐＡｍＦｓ０３１又はｐＤＭ２６１のＤＮＡを、１００μｌのアスペルギルス・ニガー ＭＢｉｎ１２０プロトプラストに加えた。氷上で３０分間インキュベートした後に、１ｍｌのＳＰＣをプロトプラスト／ＤＮＡ溶液に加え、そしてゆっくり混合した。溶液を室温で３０分間インキュベートした。次に、５０℃に冷却した１０ｍｌの溶解ａｍｄＳ上層アガーを、形質転換混合物に加え、そして１５０ｍｍＣＯＶＥプレートに撒いた。次にプレートを３４℃でインキュベートした。アセトアミド上での増殖は、各発現プラスミド上に存在するａｍｄＳ遺伝子の発現を要求する。
【０１９３】
４日間のインキュベートの後に、ｐＡｍＦｓ０３１及びｐＤＭ２６１の各々について１０の初期形質転換体を得た。形質転換体を、１％マルトースを添加したＣＯＶＥ Ａ-尿素＋アセトアミドのプレート上にストリークした。対照的に、ｐＡｍＦｓ０３１形質転換体から得られたコロニーは、白色〜暗茶色の範囲で胞子色が多様であった。形質転換体を、１％マルトースを添加したＣＯＶＥ Ａ-尿素＋アセトアミドプレートに対して胞子をストリークすることにより形質転換体を精製し、そして次に単離されたコロニーを拾い上げて同じ培地のプレートに移した。株精製を、合計で４回繰り返した。全てのプレートを３４℃でインキュベートした。
【０１９４】
精製されたｐＡｍＦＳ０３１形質転換体の１０の胞子のうち３つは、野生型よりも明るい胞子の色を示した。精製されたｐＤＭ２６１(空ベクター)形質転換体の１０の胞子の全てが、野生型の胞子の色を示した。ｐＡＭＦｓ０３１形質転換体について明るい胞子の色を示すこれらの結果は、ポリケチドシンターゼ遺伝子の二次的ＲＮＡｉに伴う抑制と一致する表現系を示す。
【０１９５】
実施例１４：ポリケチドシンターゼがサイレンシングされたアスペルギルス・ニガー株及び対照アスペルギルス・ニガー株の増殖、及びトータルＲＮＡの抽出
以下のアスペルギルス・ニガー株：白色胞子を有する２つのアスペルギルス・ニガーｐＡｍＦｓ０３１株(ｐＡｍＦｓ０３１-Ｗ１及びｐＡｍＦｓ０３１-Ｗ２と名づける)、黒色の胞子を有する１のアスペルギルス・ニガーｐＡｍＦｓ０３１株(ｐＡｍＦｓ０３１-Ｂ１と名づける)、及びｐＤＭ２６１で形質転換された１のアスペルギルス・ニガー株を、１％マルトースを添加したＣＯＶＥ Ａ-尿素＋アセトアミドプレート上で７日間、３４℃で増殖させた。形質転換されていない対照のアスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０は、ＰＤＡプレートで増殖させた。５ｍｌの０.０１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を添加し、滅菌植菌用のループを用いてプレートの表面を掻きとり、そして１０ｍｌのピペットで胞子の懸濁液を回収することにより、胞子を回収した。４０μｌの胞子懸濁液を、１０ｍｌのＭ４１０培地と混合し、そしてこの混合液の１ｍｌを２４ウェルポリスチレン・マイクロタイタープレート(Corning Incorporated, Corning, NY, USA)の各ウェルに加えた。各株を別のマイクロタイタープレート中で増殖させて相互コンタミを避けた。プレートを湿度調節されたチャンバー内において４日間３４℃でインキュベートし、この時点で真菌は、ウェルにわたり菌糸体が増殖した連続マットを形成し、そして着色された分生子が全ての株について存在していた。
【０１９６】
ＲＮＡＰＲＯ（登録商標）ＰｒｏＲｅｄキット(Q-Biogene, Irvine, CA, USA)を用いて菌糸体マットからトータルＲＮＡを抽出した。マットをウェルから取り出し、そしてペーパータオルに配置して過剰量の培地を全て吸着させた。合計で２００ｍｇの各菌糸体マット組織を、１ｍｌのＲＮＡＰＲＯ（登録商標）溶液(Q-Biogene, Irvine, CA, USA)を含むＦＡＳＴＲＮＡ（登録商標）ＰｒｏＲｅｄチューブに移した。ＦＡＳＴＰＲＥＰ(商標)ＦＰ１２０装置を用いて、スピード６で菌糸体を４０秒間ホモジェナイズした。各サンプルをＳｏｒｖａｌｌ ＭＣ１２Ｖ微小遠心機内で４℃、５分間、１３,４００×ｇで遠心した。水相を１.７ｍｌの微小遠心管に移した。サンプルを室温で５分間インキュベートしました。３００μｌのクロロホルムを加え、そしてサンプルを１０秒間ボルテックスし、次に室温で５分間インキュベートした。サンプルをＳｃｒｖａｌｌ ＭＣ１２Ｖ微小遠心機中で、１３,４００×ｇで５分間４℃にて遠心した。上相を新たな１.７ｍｌ微小遠心管に移した。上に記載されるようにサンプルを再びクロロホルムで抽出した。５００μｌの氷冷エタノールを加え、そしてサンプルを１時間-２０℃で貯蔵した。サンプルを、４℃で２０分間Ｓｏｒｖａｌｌ ＭＣ１２Ｖ微小遠心管の中で１３４００×ｇで遠心した。エタノールを取り出し、そしてペレットを７５％エタノールで洗浄した。エタノールを取り除き、そしてペレットを５分間風乾した。ＲＮＡサンプルを１００μｌのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁した。５０μｌの８Ｍ・ＬｉＣｌを加え、そしてサンプルを１時間-２０℃で貯蔵した。Ｓｏｒｖａｌｌ ＭＣ１２Ｖ微小遠心管中において２５分間４℃で、１３４００×ｇで遠心した。ＬｉＣｌを取り除き、そして５００μｌの７５％エタノールをペレットに加え、そして取り除いた。ペレット化サンプルを５分間風乾させた。ＲＮＡサンプルを３０μｌのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁した。ＲＮＡ濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）１０００分光光度計を用いて計測した。サンプルを-８０℃で貯蔵した。
【０１９７】
実施例１５：第一鎖ｃＤＮＡ合成
実施例１４に記載されたアスペルギルス・ニガー株の各々に由来するＲＮＡサンプルを、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ(商標)キット(Ambion, Inc., Austin, TX, USA)の試薬を用いてＤＮａｓｅで処理してゲノムＤＮＡを取り除いた。３μｇのＲＮＡを１μｌのＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ(商標)緩衝液(Ambion, Inc., Austin, TX, USA)と混合し、そしてＤＥＰＣ処理水で１０μｌの体積に調節した。０.５μｌの量のＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ(商標)(Ambion, Inc., Austin, TX, USA)を加え、そしてサンプルを３７℃で３０分間インキュベートした。第二の０.５μｌの量のＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ(商標)を加え、そしてサンプルを再び３７℃で３０分間インキュベートした。２μｌの不活性化試薬(Ambion, Inc., Austin, TX, USA)を加え、そして室温での２分間のインキュベートの間にサンプルを３回混合した。サンプルをＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）５４１５Ｄ微小遠心機において９３００×ｇで２分間遠心した。９μｌの上清を０.６ｍｌ微小遠心管に移した。ＲＮＡ濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）１０００分光光度計を用いて計測した。サンプルを-８０℃で貯蔵した。
【０１９８】
第一鎖ｃＤＮＡを、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を用いて合成した。実施例１４に記載される５のアスペルギルス・ニガー株の各々について、２μｌのランダムヘキサマープライマー(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)と混合され、そしてＤＥＰＣ処理水で１３μｌに調節された１〜２μｌの体積中にさまざまな量のＤＮａｓｅ-処理ＲＮＡ：３００ｎｇ、６００ｎｇ、９００ｎｇ、及び１.２μｇを用いて、実施例１４に記載される５のアスペルギルス・ニガーの各々についての４つのライブラリーを作成した。サンプルを６５℃で１０分間インキュベートし、次に氷上に配置した。６.５μｌの量のＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素マスターミックス(４μｌのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素緩衝液、０.５μｌのＰｒｏｔｅｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ阻害剤、及び２μｌのｄＮＴＰミックス)をチューブに加え、続いて０.５μｌの量のＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素を加えた。サンプルを氷から取り出し、そして２５℃で１０分間、５５℃で６０分間、そして次に８５℃で５分間とプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３に移した。サンプルを-８０℃で貯蔵した。
【０１９９】
実施例１６：リアルタイムＰＣＲによるアスペルギルス・ニガーのポリケチドシンターゼｍＲＮＡの検出
実施例１４に記載されたアスペルギルス・ニガー株による、アスペルギルス・ニガーポリケチド・シンターゼの相対発現レベルを、ＲＴ-ＰＣＲにより定量した。トータルＲＮＡを各株から抽出して、実施例１５に記載されるように第一鎖ｃＤＮＡ合成についてのテンプレートとして機能させる。第一鎖ｃＤＮＡは、ＲＴ-ＰＣＲのテンプレートとして機能する。アスペルギルス・ニガーのアクチン遺伝子を、レファレンス標準(つまり内部対照)として用いた。プローブ及びプライマーを、Ｒｏｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｖｅＬｉｂｒａｒｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を用いて設計した。以下のプレイマー及びプローブ対が使用される：
【化１０】
0005951924.tif 000013
【０２００】
ＲＴ-ＰＣＲアッセイを、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムを用い、そして上記Ｒｏｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｂｅｓを用いて行った。当該プローブは、５'末端においてフルオレセインで、そして３'末端付近でダーククエンチャーダイで予め標識されていた。各反応混合物は、１０μｌのＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス、０.１μＭのＲｏｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｂｅ、０.２μＭフォワードプライマー、０.２μＭリバースプライマー、及び２μｌの第一鎖ｃＤＮＡ(さまざまな量のトータルＲＮＡから、実施例１５に記載される用に調製される)を合計体積２０μｌで含む。全てのＲＴ-ＰＣＲ反応を、３８４ウェルプレートで行った(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)。ＲＴ-ＰＣＲ反応を、９５℃で１０分間、４.８℃／ｓを１サイクル；９５℃で１０秒、４.８℃／ｓ；５５℃で１５秒、２.５℃／ｓ；７２℃で１秒、４.８℃／ｓ(シングル収集モード)の定量分析モードを用いて４５サイクルの増幅；そして４０℃で１０秒、２℃／ｓの冷却を１サイクルとなるようにプログラムされたＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムで行った。標的(ポリケチドシンターゼ遺伝子)及びレファレンス(アクチン遺伝子)に対するＰＣＲ効率値及び標準曲線を作成するため、４つの連続希釈を、２のｃＤＮＡライブラリーから作成した。これらの連続希釈液の各々は、別々の反応において標的及びレファレンスのプローブ／プライマーセットの両方で、４回アッセイされた。標準曲線は、標的及びレファレンスに対してそれぞれ０.９９６及び０.９９８のＲ2値をもたらした。ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０相対定量ソフトウェアにより計算されるＰＣＲ効率値は、標的及びレファレンスに対して１.９５０(誤差０.０２６６)及び１.８５４(誤差０.０１８１)であった。全ての５のアスペルギルス・ニガー株についてポリケチドシンターゼｍＲＮＡの相対レベルと比べるために、３の希釈液を、ｃＤＮＡライブラリーの各々について３回試験した。ＲＴ-ＰＣＲ反応は、別々の反応で各希釈液及び複製物について標的及びレファレンスに対するプローブ／プライマーセットの両方を用いて行われた。これらのデータは、製品説明書に従ってＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０相対定量ソフトウェアを用いて標準曲線と比較された。この分析方法を用い、処理されたサンプルの発現量は、未処理の対照サンプルに比較して計算された。処理されたサンプルの量は、未処理の対照サンプルの量により割られた標準曲線から決定された。こうして未処理サンプルは、１×サンプルと名づけられ、そして全ての他の量が、未処理サンプルに対してｎ倍の差異として表現された。次に処理されたサンプル量を内部対照であるアクチンに対して正規化して、各反応に加えられたトータルＲＮＡの量における差異を表した。
【０２０１】
相対定量分析を用いて、アスペルギルス・ニガーのポリケチドシンターゼｍＲＮＡの相対発現レベルを、アスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０のｐＡｍＦｓ０３１-Ｂ１、アスペルギルス・ニガーのＭＢｉｎ１２０のｐＤＭ２６１、又は非形質転換アスペルギルス・ニガー ＭＢｉｎ１２０株に比較して、ｐＡｍＦｓ０３１-Ｗ１及びｐＡｍＦｓ０３１-Ｗ２株において有意に低下したかを決定した、これを観察された胞子の色の変化と相関させた。アスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０ｐＡｍＦｓ０３１-Ｗ１及びアスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０ｐＡｍＦｓ０３１-Ｗ２株は、「空ベクター」対照株に比べて、ポリケチド・シンターゼｍＲＮＡにおいて６８％及び８２％の低下を示した。実施例１７に記載されるように、同じ株についてサザンブロットを行って、ポリケチドシンターゼ遺伝子全体の存在を確認し、そして転写の低下が、ポリケチドシンターゼ遺伝子自体の破損のため生じる可能性を除去した。
【０２０２】
サザンブロットによるアスペルギルス・ニガーポリケチドシンターゼ遺伝子の検出
以下のアスペルギルス・ニガー株(実施例１６に記載される)：非形質転換アスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０、アスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０のｐＡｍＦｓ０３１-Ｗ１、アスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０のｐＡｍＦｓ０３１-Ｗ２、アスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０のｐＡｍＦｓ０３１-Ｂ１、及びアスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０のｐＤＭ２６１から、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉキットを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。各株からの合計２μｇのゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで１７時間３７℃で切断した。切断されたゲノムＤＮＡ及びＤＮＡ分子量マーカーＩＩ、ＤＩＧ標識(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を、ＴＡＥ緩衝液中の０.７％アガロースゲルにロードし、そして２２Ｖの電流を１７時間かけた。２０×ＳＣ転写緩衝液を用いてＤＮＡをゲルからＮＹＴＲＡＮ(商標)ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅｄ膜に転写した。紫外線照射を用いてＤＮＡを膜に架橋させ、そして４２℃で３０分間ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液(Roche Applied, Science, Indianapolis, IN, USA)中で平衡化させた。ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液中に懸濁したＤＩＧ標識された４３４ｂｐの２０μｌＰＣＲ産物で、４２℃で１８時間プローブした。４３４ｂｐのＤＩＧ標識ＤＮＡプローブを、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)及び以下に示すプライマー：
【化１１】
0005951924.tif 000014
を用いて合成した。
【０２０３】
増幅反応液(５０μｌ)は、１×ＰＣＲ緩衝液、５μｌのＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ合成ミックス、５０μＭのセンスプライマー、５０μＭのアンチセンスプライマー、及び２.６ユニットのExpand High Fidelityポリメラーゼ、及び５０ｎｇのアスペルギルス・ニガーＭＢｉｎ１２０ゲノムＤＮＡ(上に記載されるように精製)から構成された。当該反応液を、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で１分(最終伸張では７分)を各３０サイクルとプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３中でインキュベートした。プローブ配列は、アスペルギルス・ニガーポリケチドシンターゼ遺伝子のプロモーター(５'非翻訳領域)に相補的であり、その配列は、８.８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩゲノムＤＮＡ断片内に含まれる。
【０２０４】
膜をプローブ化した後に、膜を、２×ＳＳＣ＋０.１％ＳＤＳの低ストリンジェンシー緩衝液で室温にて５分洗浄し、続いてそれぞれ室温で１５分間６５℃にて０.５×ＳＳＣ＋０.１％ＳＤＳの高ストリンジェンシー洗浄で２回洗浄した。ハイブリダイズしたＤＩＧ標識プローブと分子量マーカーを、製品説明書に従って、ＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を用いて可視化した。ブロットを、Ｂｉｏｍａｘ ＸＡＲフィルム(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)にさらし、そしてＫｏｎｉｃａ ＳＲＸ-１０１Ａフィルムプロセッサー(Konica Minolta Medical Imaging USA Inc., Wayne, NJ, USA)を用いて現像して、標識ＤＮＡを可視化した。結果により、全ての株が予期された８.８ｋｂのバンドを示したということが示され、全長遺伝子が、試験された全ての株において傷ついていないことが示唆された。
【０２０５】
実施例１８：トリコデルマ・リーセイの二次的ＲＮＡｉ発現ベクターｐＡＬ０２の構築
二次的ＲＮＡｉ発現ベクターを、トリコデルマ・リーセイβ-キシロシダーゼ遺伝子の発現を抑制するために構築した(ＤＮＡ配列について配列番号３７及び推定のアミノ酸配列について配列番号３８)。
二次的ＲＮＡｉプラスミドｐＥｖＦｚ-１４を、ＰａｃＩ及びＭｌｕＩで切断して、ハイグロマイシン逆反復を単離した。５２７ｂｐの断片を、ＴＡＥ緩衝液中の１.０％アガロースゲル電気泳動により分離し、そうしてゲルから切り出した。製品説明書に従って、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを用いて断片を精製した。精製された断片を、Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を用いてＰａｃＩ及びＭｌｕで切断されたｐＭＪ０９(WO 2005/056772)にライゲーションした。
【０２０６】
２μｌのライゲーション混合物を用いて、製品説明書に従い、ＳＵＲＥ(商標)化学処理コンピテント大腸菌セルに形質転換した。いくつかの形質転換体から得たプラスミドＤＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００を用いて精製し、そしてＰａｃＩ及びＭｌｕＩで切断することにより分析した。制限酵素で切断された生成物を、ＴＡＥ緩衝液中の１.０％アガロースゲル電気泳動により分離した。１の形質転換体を、ＤＮＡ配列分析により、５２７ｂｐのハイグロマイシン逆反復を有することを確認し、そしてｐＡＬ０１と名づけた(図８)。
【０２０７】
テンプレートとして機能するトリコデルマ・リーセイ ＲｕｔＣ３０から得たゲノムＤＮＡを用いて、トリコデルマ・リーセイ・β-キシロシダーゼコード領域(ＤＮＡ配列について配列番号３９及び推定のアミノ酸配列について配列番号４０)の一部を含む５００ｂｐの断片を増幅するために、ＰＣＲを用いた。トリコデルマ・リーセイ ＲｕｔＣ３０から得たゲノムＤＮＡを、製品説明書に従って、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いて単離した。５'末端にＮｃｏＩ部位を取り込むようにセンスプライマーを設計し、そして以下に示すようにＭｌｕＩ部位を５'末端に取り込むようにリバースプライマーを設計した。
【化１２】
0005951924.tif 000015
【０２０８】
増幅反応液(５０μｌ)は、１９×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ(商標)反応緩衝液(Strategne, La Jolla, CA, USA)、０.８ｍＭのｄＮＴＰ、２００ｎｇのトリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ３０のゲノムＤＮＡ(実施例７に記載されるように調製)、１ｎｇのプライマー、及び２.５ユニットのＨＥＲＣＵＬＡＳＥ ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA, USA)から構成された。当該反応液を、９２℃で２分間１サイクル；９２℃で３０秒、５８℃で３０秒、そして６８℃で１分を各３０サイクル；そして１０分の最終伸張とプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３中でインキュベートした。反応性生物は、ＴＡＥ緩衝液中の１.０％アガロースゲル電気泳動により単離し、ここで５００ｂｐのバンドをゲルから切り出し、そして製品説明書に従ってＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを用いて精製した。精製ＰＣＲ断片を、ＮｃｏＩ及びＭｌｕＩで切断し、そしてＲａｐｉｄＬｉｇａｔｉｏｎキットを用いて、すでにＮｃｏＩとＭｌｕで切断されたｐＡＬ０１にライゲーションした。ライゲーション混合物を用いて、製品説明書に従って、ＳＵＲＥ(商標)化学処理コンピテント大腸菌セルを形質転換した。次に形質転換体を、コロニーＰＣＲによりスクリーニングして、所望のβーキシロシダーゼインサートを含む形質転換体を同定した。反応液(２０μｌ)は、２μｌの１０×ＴＨＥＲＭＯＰＯＬ(商標)反応緩衝液、０.４μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μｌの大腸菌形質転換体コロニーを５０μｌの脱イオン水に懸濁した溶液、及び１ｐｍｏｌのβ-キシロシダーゼ増幅プライマーから構成された。反応液は、９４℃で２分間を１サイクル；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒を各々１７サイクル、そして最終伸張を５分間とプログラムされたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３プログラム中でインキュベートした。増幅生成物を、ＴＡＥ緩衝液中の１.０％アガロースゲル電気泳動により単離した。５００ｂｐのβキシロシダーゼ増幅生成物を含む幾つかの形質転換体から得たプラスミドＤＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００を用いて精製し、そしてＤＮＡシーケンスにより分析した。５００ｂｐのβ-キシロシダーゼ増幅生成物を含む１のプラスミドのＤＮＡ配列分析は、予期されたインサートを確認し、そしてｐＡＬ０２と名づけた(図９)。
【０２０９】
実施例１９：トリコデルマ・リーセイにおける、トリコデルマ・リーセイのβ-キシロシダーゼ遺伝子の二次的ＲＮＡｉの形質転換及び決定
５μｇのｐＡＬ０２を用いて、トリコデルマ・リーセイＳａＭｅ１３、ｃｂｈ１欠失株(ＷＯ２００５／０３０９２６)を形質転換した。トリコデルマ・リーセイＳａＭｅ１３の胞子を、成熟トリコデルマリーセイのＣＯＶＥ２プレート上に２０ｍｌの０.０１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を注ぐことにより回収し、そして胞子を、ペトリ皿スプレッダーで掻き取った。胞子混合物を２０ｍｌピペットで採取した。およそ２〜５×１０7の胞子を、２％グルコースと１０ｍＭウリジンで添加した１００ｍｌのＹＰ培地中でインキュベートし、そして２７℃９０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。菌糸体を、５００ｍｌのＳＴＥＲＩＣＵＰ（登録商標）フィルターユニット(Millipore, Burlington, MA, USA)を用いて回収し、そして２回１００ｍｌの脱イオン水で洗浄した。菌糸体を２５０ｍｌの１.２Ｍソルビトールで２回洗浄した。洗浄した菌糸体を、２０ｍｌの１.２Ｍソルビトール、１ｍｌあたり５ｍｇのＧＬＵＣＡＮＥＸ(商標)及び１ｍｌあたり０.５ｍｇのキチナーゼに再溶解した。混合物を、３４℃で１５〜２５分間９０ｒｐｍでインキュベートした。フラスコを５分間氷の上に配置し、続いてＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）を介してろ過した。プロトプラストを含むフィルターを、５０ｍｌのＦＡＬＣＯＮ（登録商標）チューブ(VWR International, West Chester, PA, USA)に入れた。チューブを３７０×ｇで１０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｄ遠心機内で遠心した。上清を捨て、そしてプロトプラストペレットを、２５ｍｌの１.２Ｍソルビトール中に再懸濁飼、そしてＳｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｄ遠心機中で１０分間３７０ｇで遠心した。上清を捨て、そしてペレットを、１.２Ｍソルビトール２５ｍｌ中に再懸濁した。１０μｌを取り、そしてチューブを上に記載されるように遠心し、その間にプロトプラストをヘモサイトメーターで計数した。上清を捨て、そして１ｍｌのＳＴＣあたり、１×１０8のプロトプラストの濃度でペレットを再懸濁した。
【０２１０】
１００μｌのプロトプラスト懸濁液、１〜１０μｇのプラスミドＤＮＡを含む１０μｌのＳＴＣ、及び２５０μｌのポリエチレングリコールをゆっくり混合した。混合液を室温で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＴＣを加え、混合し、そして１５０ｍｍのＣＯＶＥプレートに注いだ。プレートを２８℃で１０〜１４日間インキュベートした。
【０２１１】
２４の形質転換体、ＡＬ０２-１-ＡＬ０２-２０、及びｐＡＬ０１を含む４の対照形質転換が選択され、そして１のコロニーから得た胞子を、ＣＯＶＥプレートにストリークし、そして２８℃で５日間インキュベートした。これらのプレートから得た胞子を、２５ｍｌのセルロース誘導性培地を含む１２５ｍｌののバッフル撹拌フラスコに植菌し、そして２８℃及び２００ｒｐｍで5日間培養した。培養ブロスの１ｍｌのサンプルを、植菌後5日間で取り、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）遠心機５４１５Ｄ中で１０分間６０００×ｇで遠心し、そして上清を新たなＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）チューブに移した。２つのブロスサンプルを用いて、β-キシロシダーゼ活性及びβ-グルコシダーゼ活性を決定した。
【０２１２】
上記上清を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｂｉｏｍｅｋ３０００、Ｂｉｏｍｅｋ ＮＸ、及びＯＲＣＡロボットアーム(Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, USA)を用いて、β-キシロシダーゼ活性についてアッセイした。培養上清を、およそ０.１Ｍコハク酸、０.０１％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ-１００、ｐＨ５.０(サンプル緩衝液)に希釈し、続いて０倍〜１/３倍〜１/９倍の希釈サンプルに連続希釈した。全体で２０μｌの各希釈液を９６ウェルの平底プレートに移した。１ｍｌの０.１Ｍコハク酸、ｐＨ５.０あたり１ｍｇのパラ-ニトロフェニル-β-Ｄ-キシロピラノシドを含む２００μｌの基質溶液を各ウェルに加え、そして室温で４５分間インキュベートした。インキュベート期間の完了の後に、５０μｌの１ｍ・Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ９を各ウェルに加えて反応を停止した。９６ウェルプレートについて４０５ｎｍの光学密度で終点を計測した。
【０２１３】
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｂｉｏｍｅｋ３０００、Ｂｉｏｍｅｋ ＮＸ、及びＯＲＣＡロボットアームを用いて、上記上清を、βグルコシダーゼ活性についてアッセイした。培養上清を、約０.１Ｍコハク酸、ＴｒｉｔｏｎＸ-１００ｐＨ５.０(サンプル緩衝液)中に希釈し、続いて０倍〜１／３倍〜１/９倍の希釈サンプルを連続希釈した。合計で２０μｌの各希釈液を、９６ウェルの平底プレートに移した。１ｍｌあたり１ｍｇのパラ-ニトロフェニル-β-Ｄ-グルコピラノシドを含む２００μｌの基質溶液を、各ウェルに加え、そして次に室温で４５分間インキュベートした。インキュベート期間の完了の際に、５０μｌの１ＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ９を、各ウェルに加えて、反応を止めた。９６ウェルプレートについて４０５ｎｍの光学密度で終点を計測した。サンプル活性を、以下の式を用いることにより測定した：
[(｛ＯＤ４０５／消滅係数｝×１×１０6)／インキュベート時間]／サンプル体積
[式中、消滅係数＝１７,７４９、インキュベート時間＝４５、及びサンプル体積＝０.０２]
【０２１４】
β-キシロシダーゼ活性アッセイから得られたＯＤと、βグルコシダーゼアッセイから得られた活性との間の比を、ＢＸ／ＢＧとして計算し、そして報告した。β-グルコシダーゼはもともと生じるので、その活性は、形質転換体の間の増殖の際について正規化する手段として用いた。結果を以下の表３に示す：
【表３】
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1β-キシロシダーゼ活性は、パラ-ニトロフェニル-β-Ｄ-キシロピラノシドを基質として使用して計測した。数値は、吸光度単位±標準偏差(サンプルＡＬ０３ｅｖを除きｎ＝２、ＡＬ０３ｅｖではｎ＝４)として表される。
2β-グルコシダーゼ活性は、ｐ-ニトロフェニル-β-グルコピラノシドを基質として用いて計測した。数値は、加水分解された基質μｍｏｌ／分／ｍｌ(培養ブロス)±標準偏差(サンプルＡＬ０３ｅｖを除きｎ＝２、ＡＬ０３ｅｖではｎ＝４)として表される。
3タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ試薬を用いて測定した。数値は、ｍｇ／ｍｌ(培養ブロス)±標準偏差(サンプルＡＬ０３ｅｖを除きｎ＝２、ＡＬ０３ｅｖではｎ＝４)として表されれる。
4β-キシロシダーゼとβ-グルコシダーゼ活性の比±標準偏差(サンプルＡＬ０３ｅｖを除きｎ＝２、ＡＬ０３ｅｖではｎ＝４)
およそ５／２０の形質転換が、対照の３６〜５５％の値を有するＢＸ／ＢＧを発現するようである。これらの結果により、二次的ＲＮＡｉが、トリコデルマ・リーセイにおいて遺伝子発現をうまくノックダウンするために使用することができる。
【０２１５】
本出願に記載されそして特許請求される発明は、本明細書に開示した特定の実施態様により範囲を限定すべきではない。なぜなら、これらの実施態様は、本発明の幾つかの態様を例示するものとして意図されるものであるからである。任意の同等の実施態様は、本発明の範囲内であることが意図される。実際、本発明に示されそして記載される発明に加えて発明の様々な変更は、先の記載から当業者に明らかであろう。このような変更は、添付の特許性球の範囲の範囲内になることが意図される。訴訟においては、定義を含む本開示は、コントロールするであろう。
様々な文献が本明細書で引用されており、その開示は、その全てを本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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