(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、炭素数３〜２２のアミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜に糖化合物を上記アミノオキシアルキル基を介して直接結合させてなる、糖化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えることを特徴とする糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
【請求項２】
上記アミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランが、下記式（１）
【化１】
0006019944.tif 000010
（式中、Ｒ1は、炭素数３〜２２の直鎖状のアルキレン基である。Ｒ2〜Ｒ4は、それぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
で表されることを特徴とする請求項１記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
【請求項３】
上記糖化合物が、単糖又は糖鎖であることを特徴とする請求項１又は２記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
【請求項４】
上記単糖が、キシロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、グルクロン酸及びイズロン酸から選ばれることを特徴とする請求項３記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
【請求項５】
上記糖鎖が、キシロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、グルクロン酸及びイズロン酸から選ばれる少なくとも１つの単糖に由来する構成単位を含むことを特徴とする請求項３記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
【請求項６】
上記半導体上に、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む
第２の絶縁層が形成され、該第２の絶縁層の上に、上記糖化合物及び生物学的物質のいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜を形成してなる、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部として備えることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス上に固定化された糖化合物と生物学的物質とを相互作用させる工程と、
該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程と
を含むことを特徴とする生物学的物質の検出方法。
【請求項８】
上記生物学的物質が、糖結合タンパク質、ウイルス、細菌又は細胞であることを特徴とする請求項７記載の生物学的物質の検出方法。
【請求項９】
上記糖結合タンパク質が、レクチン又は抗糖鎖抗体であることを特徴とする請求項８記載の生物学的物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化合物固定化半導体センシングデバイス及び生物学的物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）は、生体分子の検出に非常に有望なツールである。ＦＥＴを用いると、生体分子の吸着に伴うゲート表面の電荷密度変化を電気信号として直接検出するため、ラベルフリー検出が可能であり、低コストで迅速な生体分子の検出が可能である。それゆえ、ＦＥＴを用いた生体分子の検出に関する研究が広く行われている。
【０００３】
ＦＥＴバイオセンサーの臨床応用に関して、生体分子の検出は、生物活性が高く、リアルタイムで計測可能であるという観点から、生理的条件下にて行われることが理想的である。
【０００４】
しかし、生理的条件下においては溶液中のカウンターイオンによる高い遮蔽効果によって生体分子が有する電荷が遮蔽されるため、生理的条件下におけるＦＥＴによるタンパク質の検出は非常に困難であるという問題があった。また、従来のタンパク質を検出するためのバイオセンサーは抗体等のタンパク質をプローブとして使用するため、その変性に伴って感度が低下するという問題があった。また、抗体等のタンパク質は分子サイズが大きいので、固定化密度にも限界があった。
【０００５】
ＦＥＴによるタンパク質検出はデバイ長内に存在するタンパク質由来の電荷を検出することで可能となるため、デバイ長の外の領域に存在する電荷は原理上検出が困難である。生理的条件下においては、デバイ長は１ｎｍ以下であり、検出可能範囲が狭い。抗体等のタンパク質は分子サイズが大きく、抗原との結合部位が界面から離れてしまうため、生理的条件下における検出を原理的に困難にしていた。
【０００６】
このような問題を解決するため、小さなレセプター分子として、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメントを固定化する方法が提案されている。しかし、このような方法では、手順が煩雑になったり、大量の試薬を必要としたりする等の問題があった。
【０００７】
糖鎖は、単糖分子がグリコシド結合を介して結合した構造を有する化合物であり、生体内においては、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質、脂質に糖鎖が結合した糖脂質等の形で存在している。また、糖鎖は、生体内において重要な働きをしていることが明らかになってきている。例えば、タンパク質が糖鎖修飾されることでその機能を発現したり、糖鎖と細胞表面レセプター等のタンパク質とが相互作用することで細胞間の分子認識、細胞接着、細胞内への物質取り込み（エンドサイトーシス）等の生物機能等に関わっていたりすることが報告されている。
【０００８】
また、ウイルス感染や細菌感染にも糖鎖が関わっていることが報告されている。例えば、インフルエンザウイルスは、その表面に発現しているヘマグルチニンが細胞表面の糖鎖のシアル酸を認識して結合することで感染することが知られている。
【０００９】
更に、がん等の疾患によって糖タンパク質や細胞表面の糖鎖構造が変化することも知られており、このような糖鎖が、例えばバイオマーカーとして利用されている。
【００１０】
これまでに、糖鎖を解析するための方法や糖鎖と糖結合タンパク質等の相互作用を解析する方法が提案されている（例えば、特許文献１：特開２０１０−１０７４９６号公報）。一般に、糖鎖とレクチンのような糖結合タンパク質との親和性は、抗体と抗原との親和性に比べて小さいことが知られている。そのため、高感度で糖鎖と糖結合タンパク質等の生物学的物質との相互作用を検出できる方法の開発が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１０−１０７４９６号公報
【特許文献２】特開２００４−４００７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Nakamura et. al., Chem. Lett., vol. 39., pp. 1245-1247 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、上記問題を解決するため、ストレプトアビジン−ビオチン化糖鎖複合体を固定化した半導体センシングデバイス及びこれを用いたレクチンの検出について報告している（非特許文献１：Nakamura et. al., Chem. Lett., vol. 39., pp. 1245-1247 (2010)）。しかし、この方法では手順が煩雑であり、高感度化が難しい等の問題があった。
【００１４】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、生理的条件下で簡便かつ高感度な生物学的物質の検出を可能にする糖化合物固定化半導体センシングデバイス、及び該デバイスを用いた生物学的物質の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を行った結果、プローブとしてタンパク質に比べて分子サイズの小さな糖化合物を用いた、糖化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備える糖化合物固定化半導体センシングデバイスにより、生理的条件下でも生物学的物質の検出が簡便かつ高感度に可能であることを見出し、本発明をなすに至った。
【００１６】
したがって、本発明は、下記糖化合物固定化半導体センシングデバイス及び生物学的物質の検出方法を提供する。
請求項１：
半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、炭素数３〜２２のアミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜に糖化合物を上記アミノオキシアルキル基を介して直接結合させてなる、糖化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えることを特徴とする糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
請求項２：
上記アミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランが、下記式（１）
【化１】
0006019944.tif 000002
（式中、Ｒ1は、炭素数３〜２２の直鎖状のアルキレン基である。Ｒ2〜Ｒ4は、それぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
で表されることを特徴とする請求項１記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
請求項３：
上記糖化合物が、単糖又は糖鎖であることを特徴とする請求項１又は２記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
請求項４：
上記単糖が、キシロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、グルクロン酸及びイズロン酸から選ばれることを特徴とする請求項３記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
請求項５：
上記糖鎖が、キシロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、グルクロン酸及びイズロン酸から選ばれる少なくとも１つの単糖に由来する構成単位を含むことを特徴とする請求項３記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
請求項６：
上記半導体上に、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む
第２の絶縁層が形成され、該第２の絶縁層の上に、上記糖化合物及び生物学的物質のいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜を形成してなる、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部として備えることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス。
請求項７：
請求項１乃至６のいずれか１項記載の糖化合物固定化半導体センシングデバイス上に固定化された糖化合物と生物学的物質とを相互作用させる工程と、
該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程と
を含むことを特徴とする生物学的物質の検出方法。
請求項８：
上記生物学的物質が、糖結合タンパク質、ウイルス、細菌又は細胞であることを特徴とする請求項７記載の生物学的物質の検出方法。
請求項９：
上記糖結合タンパク質が、レクチン又は抗糖鎖抗体であることを特徴とする請求項８記載の生物学的物質の検出方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、タンパク質に比べて分子サイズが小さい糖化合物を有機単分子膜に直接固定化できるため、高い固定化密度で固定化することが可能である。また、糖は分子構造が単純で化学的に安定であるため、変性がなく感度の維持が可能である。また、標的となる物質との結合部位が有機単分子膜界面から近くなるため、生理的条件下における検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の糖化合物固定化半導体センシングデバイスを示す断面図であり、（Ａ）は電界効果トランジスタ、（Ｂ）は電界効果トランジスタのゲート電極の絶縁層上に有機単分子膜を形成した状態、（Ｃ）は有機単分子膜に糖化合物が直接固定化された状態を示す。
【図２】オンチップデバイスのユニット構成例を示し、（Ａ）は部分平面図、（Ｂ）はその拡大断面図である。
【図３】本発明の糖化合物固定化半導体センシングデバイスを用いた糖化合物−生物学的物質相互作用による生物学的物質検出の概念図である。
【図４】実施例２で測定したヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン添加前後のデバイス特性の評価結果を示すグラフであり、（Ａ）は、ゲート電圧−１．５Ｖ〜１．５Ｖの範囲における電流−電圧曲線を示し、（Ｂ）は、ゲート電圧１．０Ｖ〜１．５Ｖの範囲における（Ａ）の拡大図である。
【図５】比較例１で測定したヒト血清アルブミン添加前後のデバイス特性の評価結果を示すグラフであり、（Ａ）は、ゲート電圧−１．５Ｖ〜１．５Ｖの範囲における電流−電圧曲線を示し、（Ｂ）は、ゲート電圧１．０Ｖ〜１．５Ｖの範囲における（Ａ）の拡大図である。
【図６】実施例２及び比較例１で測定したゲート電圧シフト値を示すグラフである。
【図７】実施例３で測定したゲート電圧シフト値を示すグラフである。
【図８】実施例４及び比較例２で測定したゲート電圧シフト値を示すグラフである。
【図９】実施例５、６及び比較例３で測定したゲート電圧シフト値を示すグラフである。
【図１０】実施例４及び比較例４で測定したゲート電圧シフト値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について、更に詳しく説明する。
なお、本明細書において、「糖化合物」とは、単糖と糖鎖の両方を含むものとする。「糖鎖」とは、同一又は異種の２以上の単糖分子及びその誘導体がグリコシド結合を介して結合した化合物のことであり、いわゆる「二糖」、「三糖」、「オリゴ糖」、「多糖」等と称されるものを全て含むものとする。
【００２０】
本発明の糖化合物固定化半導体センシングデバイスは、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、炭素数３〜２２のアミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜に糖化合物を上記アミノオキシアルキル基を介して直接結合させてなる、糖化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである。
【００２１】
上記検出部のうち、絶縁層／半導体構造部分は、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層が形成された電界効果トランジスタを利用することができ、その構成は従来公知のものを利用することができる。上記絶縁層は、シリコン酸化物であることが好ましい。電界効果トランジスタは、ｎ型でもｐ型でもよい。この電界効果トランジスタとしては、例えば、図１（Ａ）に示されるようなものが例示される。なお、図１中、１はシリコン基板、２はシリコン酸化物又は無機酸化物（ガラス、アルミナなど）を含む絶縁層、４はゲート電極、５はソース電極、６はドレイン電極、７はドープ領域を示す。
【００２２】
そして、図１（Ｂ）に示されるように、絶縁層２上に第１の有機単分子膜３が形成される。ここで、本発明においては、基本原理として、絶縁層表面上の糖化合物と生物学的物質との結合反応に伴う表面電位変化を電気信号として検出する構成とする。なお、上記絶縁層の厚さは、１０〜１００ｎｍ、特に１０〜５０ｎｍが好ましい。
【００２３】
上記第１の有機単分子膜は、炭素数３〜２２のアミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる。
【００２４】
上記アミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランは、下記式（１）で表されるものであることが好ましい。
【化２】
0006019944.tif 000003
（式中、Ｒ1は、炭素数３〜２２の直鎖状のアルキレン基である。Ｒ2〜Ｒ4は、それぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
【００２５】
上記Ｒ1で示される直鎖状のアルキレン基は、炭素数が３〜２２であり、炭素数が３〜１８であることが好ましく、炭素数が３〜８であることがより好ましい。炭素鎖が短い方が、有機単分子膜の有する疎水性が弱くなり、タンパク質の疎水性相互作用に起因する非特異的吸着を抑制することができるため好ましい。
【００２６】
上記Ｒ1の具体例としては、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基、ウンデカメチレン基、ドデカメチレン基、トリデカメチレン基、テトラデカメチレン基、ペンタデカメチレン基、ヘキサデカメチレン基、ヘプタデカメチレン基、オクタデカメチレン基、ノナデカメチレン基、エイコサメチレン基、ヘンエイコサメチレン基、ドコサメチレン基が挙げられる。これらのうち、炭素数３〜１８のものが好ましく、炭素数３〜８のものがより好ましい。
【００２７】
また、上記Ｒ2〜Ｒ4は、それぞれ独立に炭素数１〜５、好ましくは１〜２の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５、好ましくは炭素数２〜３の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。上記Ｒ2〜Ｒ4の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等が挙げられる。これらのうち、特にメチル基、エチル基、２−メトキシエチル基等が好ましい。
【００２８】
上記式（１）で表されるアルコキシシランは、下記スキームにしたがって合成できる。
【化３】
0006019944.tif 000004
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、上記と同じ。Ｒ5は、Ｒ1から炭素数が２減少した直鎖状のアルキレン基である。）
【００２９】
上記式（１）で表されるアルコキシシランは、トリアルコキシヒドロシランとＯ−アルケニルヒドロキシルアミンとを白金系触媒で処理することによって調製することができる。例えば、窒素雰囲気下、トリアルコキシヒドロシランとＯ−アルケニルヒドロキシルアミンとの混合物に、ヘキサクロロ白金（ＩＶ）酸等の白金系触媒を加え、１０〜２００℃で１〜１，２００時間、より好ましくは６０℃〜１２０℃で１２〜４８時間反応させることにより調製できる。成膜操作には、過剰のトリアルコキシヒドロシランを例えば蒸留などの操作により除去したものを使用することが好ましい。
【００３０】
第１の有機単分子膜は、上記アミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランを気相化学反応又は液相反応によって絶縁層上に形成し、その最適化、例えば、有機分子の自己集積化機能によって単分子が最密パッキングされた膜が形成される。気相化学反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、容器に基板及びアミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランを封入し、ドライルーム中で好ましくは８０〜２００℃で１〜２４時間、より好ましくは１００〜１３０℃で２〜５時間反応させることで成膜できる。液相反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、アミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランを含む有機溶媒中に基板を浸漬し、好ましくは２０〜８０℃で１分間〜２４時間、より好ましくは５５〜６５℃で１５〜２０分間静置することで成膜できる。
【００３１】
上記有機溶媒としては、トルエン、メタノール、エタノール等が挙げられ、特にトルエン、メタノール等が好ましい。
【００３２】
上記電界効果トランジスタの半導体上には、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第２の絶縁層を形成することができる。この第２の絶縁層の上には、第２の有機単分子膜として、糖化合物及び生物学的物質のいずれとも反応しない有機分子で構成された単分子膜を形成し、この単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることができる。なお、反応ゲート絶縁部と参照ゲート絶縁部とを電位変化測定において互いに影響を与えない程度に離間させれば、反応ゲート絶縁部の第１の絶縁層と参照ゲート絶縁部の第２の絶縁層とを同一層内に設けることもできる。
【００３３】
図２は有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部９及び参照部８に適用したオンチップデバイスのユニット構成例を示す。なお、図２中、１はシリコン基板、２は絶縁層、１０はテンプレート部である。このデバイスのユニット構成は図示した構成に限定されず、検出部と参照部とは必ずしも１対１の関係で配置する必要はなく、必要に応じて検出部及び参照部の数並びに組合せを適宜変更して配置することができる。また、検出部及び参照部は各々数〜数１０μｍのサイズで形成可能である。
【００３４】
上記第２の有機単分子膜としては、フッ素化されていてもよい炭素数８〜２２の直鎖状アルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜が好ましい。なお、有機単分子膜としてアルコキシシランの単分子膜を用いる場合、上記第２の絶縁層はシリコン酸化物で形成されたものが好ましい。
【００３５】
第２の有機単分子膜は、絶縁層上に均一な膜を形成させるため、自己集積化膜であることが望ましい。具体的には、下記式（２）
【化４】
0006019944.tif 000005
（式中、Ｒ6は、炭素数８〜２２、好ましくは炭素数１０〜１８の直鎖状アルキル基であり、水素原子の一部又は全部がフッ素原子で置換されていてもよい。Ｒ7〜Ｒ9は、それぞれ独立に炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜２の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５、好ましくは炭素数２〜３の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
で表されるトリアルコキシシランの単分子膜であることが好ましい。
【００３６】
上記Ｒ6として具体的には、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル基、ｎ−ノナデシル基、ｎ−エイコシル基、ｎ−ヘンエイコシル基、ｎ−ドコシル基が挙げられる。
【００３７】
上記Ｒ7〜Ｒ9として具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等が挙げられる。
【００３８】
上記トリアルコキシシランとして具体的には、
ＣＨ3(ＣＨ2)7Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)7Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)8Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)8Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)9Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)9Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)10Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)10Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)11Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)11Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)12Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)12Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)13Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)13Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)14Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)14Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)15Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)15Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)16Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)16Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)17Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)17Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)18Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)18Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)19Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)19Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)20Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)20Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＨ3(ＣＨ2)21Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＨ3(ＣＨ2)21Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)5(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)5(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)6(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)6(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)7(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)7(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)8(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)8(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)9(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)9(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)10(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)10(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)11(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)11(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)12(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)12(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)13(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)13(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)14(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)14(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)15(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)15(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)16(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)16(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)17(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)17(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)18(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)18(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3、
ＣＦ3(ＣＦ2)19(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣＨ3)3、ＣＦ3(ＣＦ2)19(ＣＨ2)2Ｓｉ(ＯＣ2Ｈ5)3
等が挙げられる。
【００３９】
なお、第１及び第２の有機単分子膜は、パターニングにより所望の位置に形成することができる。特に、オンチップでの集積化デバイスを形成するためには、有機単分子膜のパターニングが有効である。例えば、検出部の絶縁層表面には、糖化合物固定化のために反応性官能基を有する有機分子で構成された第１の単分子膜を、一方で、参照部、更には非ゲート部（テンプレート部）においては、生物学的物質の非特異的な吸着を避けるために、糖化合物及び生物学的物質のいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜をパターニングにより位置選択的に形成する。
【００４０】
参照部としては、第２の有機単分子膜としてアミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜に、検出対象の生物学的物質と相互作用しない糖化合物を固定化したものを利用することも可能である。すなわち、検出対象の生物学的物質と相互作用しない糖化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることもできる。この場合、参照部は、上述した検出部における有機単分子膜形成方法及び後述する糖鎖固定化方法と同じ方法にしたがって形成することができる。
【００４１】
本発明の糖化合物固定化半導体センシングデバイスには、上記検出部の第１の有機単分子膜に糖化合物が直接結合される。例えば、図１（Ｃ）に示されるように、第１の有機単分子膜３に糖化合物１１が直接結合される。
【００４２】
固定化する糖化合物は、単糖でも糖鎖でもよい。上記アミノオキシアルキル基を有するアルコキシシランのアミノ基による、上記単糖又は糖鎖の還元末端のアルデヒド基（−ＣＨＯ）の還元的アミノ化によって結合が形成される。
【００４３】
糖化合物を上記有機単分子膜に直接固定化するには、該糖化合物を含む水溶液中で、２０〜１００℃で１０分〜２４時間反応させればよい。好ましくは、５０〜７０℃で７０〜９０分間反応させればよい。上記糖化合物の濃度は、１ｎＭ〜１，０００μＭが好ましく、１０μＭ〜１００μＭがより好ましい。
【００４４】
上記水溶液のｐＨは、４〜７が好ましく、特に５〜６の弱酸性であることが好ましい。この場合、用いる酸としては、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、ギ酸、酢酸、クエン酸、スルホン酸等の有機酸が好ましい。弱酸性水溶液としては、上記例示した酸の水溶液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の緩衝液が好ましい。例えば、上記弱酸性水溶液として酢酸水溶液を用いる場合、酢酸の濃度は、１．０×１０-6〜０．１体積％が好ましく、１．０×１０-5〜１．０×１０-3体積％がより好ましい。
【００４５】
上記固定化する単糖としては、炭素数３〜９、特に炭素数５〜９のものが好ましい。具体的には、キシロース（Ｘｌｙ）等のペントース；グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース（Ｇａｌ）等のヘキソース；フコース（Ｆｕｃ）等のデオキシヘキソース；グルコサミン（ＧｌｃＮ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）等のヘキソサミン；Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等のヘキソサミン誘導体；ノイラミン酸（Ｎｅｕ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）等のシアル酸（Ｓｉａ）；グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、イズロン酸（ＩｄｏＡ）等のウロン酸等が挙げられる。また、上記単糖のアミノ基又はヒドロキシ基に、アセチル基、硫酸基、メチル基、リン酸基等の置換基が付加した誘導体も好ましく使用することができる。
【００４６】
上記固定化する糖鎖としては、特に限定されないが、上記単糖から選ばれる少なくとも１つの単糖に由来する構成単位を含むものであることが好ましい。この場合、上記単糖は、そのアミノ基又はヒドロキシ基に、アセチル基、硫酸基、メチル基、リン酸基等の置換基が付加した誘導体であってもよい。上記糖鎖としては、特に、上記単糖及び／又はその誘導体がグリコシド結合を介して結合したものであることが好ましい。なお、上記グリコシド結合は、α−グリコシド結合であってもβ−グリコシド結合であってもよい。固定化する糖鎖の具体例としては、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、シアリルＴｎ抗原、ルイスＡ、シアリルルイスＡ、ルイスＸ、シアリルルイスＸ、ＡＢＯ式血液型抗原等の糖鎖抗原；レクチンリガンド等の既知のＮ−グリカン及びＯ−グリカン；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン等のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）；スフィンゴ糖脂質等の糖脂質に含まれる糖鎖部位等が挙げられる。
【００４７】
本発明の生物学的物質の検出方法は、上記糖化合物固定化半導体センシングデバイス上に固定化された糖化合物と生物学的物質とを相互作用させる工程と、該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程とを含む。
【００４８】
図３に、本発明の糖化合物固定化半導体センシングデバイスを用いた糖化合物−生物学的物質相互作用に基づく生物学的物質の検出方法の概念を示す。この検出方法では、有機単分子膜上に直接固定化された糖化合物に対し、生物学的物質を相互作用させ、この相互作用により生じる絶縁層の表面電位変化を電気信号として検出する。なお、図３中、１２は生物学的物質である。また、他の構成は、図１と同一の参照符号を付して、その説明を省略する。
【００４９】
生物学的物質にはその表面に電荷が存在するため、デバイス上に固定化された糖化合物と生物学的物質とが相互作用した場合、ゲート電極上の表面電位がシフトする。この場合、電流一定下においては電位シフトを、電圧一定下においては電流のシフトをシグナルとして検出することができる。なお、ｎ型の電界効果トランジスタを用いた場合とｐ型の電界効果トランジスタを用いた場合とでは、閾値電圧のシフトは互いに逆になる。
【００５０】
デバイス上に固定化された糖化合物と生物学的物質とを相互作用させるには、該生物学的物質を含む溶液を、必要に応じて希釈して、ゲート電極上に載せればよい。このとき、上記溶液としては、生物学的物質の検出に用いられている一般的な溶液を用いることができるが、特に生理的条件を満たすものが好ましい。例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＭＥＳ緩衝生理食塩水、ＭＯＰＳ緩衝生理食塩水、ＰＩＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が好ましく使用できる。また、上記溶液としては、細胞や細菌の培養培地等も好ましく使用できる。なお、上記溶液のｐＨは、５〜１０が好ましく、６〜８がより好ましい。
【００５１】
また、上記溶液に、Ｃａ2+、Ｍｇ2+等のイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標） Ｐ−４０等の界面活性剤等を加えてもよい。上記イオンを加える場合、その濃度は、０．１〜１０ｍＭが好ましく、０．５〜５ｍＭがより好ましい。上記キレート剤を加える場合、その濃度は、０．１〜１０ｍＭが好ましく、０．５〜５ｍＭがより好ましい。界面活性剤を加える場合、その濃度は、０．００１〜１０体積％が好ましく、０．０５〜５体積％がより好ましい。
【００５２】
デバイス上に固定化された糖化合物と生物学的物質とを相互作用させるときの温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３０℃がより好ましく、室温（２０〜２５℃）が更に好ましい。反応時間は、３０秒間〜１時間が好ましく、１〜３０分間がより好ましく、５〜１５分間が更に好ましい。
【００５３】
また、デバイス上に固定化された糖化合物と生物学的物質とを相互作用させる工程と、該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程との間に、洗浄工程を設けてもよい。上記洗浄工程において使用する洗浄液は、上述したデバイス上に固定化された糖化合物と生物学的物質とを相互作用させるときに用いる生理的条件を満たす溶液が好ましい。また、上記洗浄液には、更に上述したイオン、キレート剤、界面活性剤等を加えてもよい。この場合、上述した濃度になるように添加することが好ましい。
【００５４】
本発明において検出の対象となる生物学的物質は、糖化合物と相互作用をする性質を有する生物学的物質であり、例えば、糖結合タンパク質、ウイルス、細菌、細胞等が挙げられる。糖結合タンパク質とは糖化合物と相互作用をするタンパク質のことであり、具体的には、レクチン、抗糖鎖抗体等が挙げられる。
【００５５】
ここで、本明細書においてレクチンとは、糖化合物に結合する能力を有するタンパク質であって、抗糖鎖抗体以外のもののことを意味し、動物レクチン、植物レクチン、真菌レクチン、糖結合活性を有するサイトカイン、ＧＡＧ結合タンパク質、微生物アドヘシン、細菌毒素、ウイルスヘマグルチニン等を含むものとする。
【００５６】
上記動物レクチンとしては、シグレック等のＩ型レクチン；アシアロ糖タンパク受容体、セレクチン、コレクチン等のＣ型レクチン；ガレクチン等が挙げられる。上記植物レクチン及び真菌レクチンとしては数多くのレクチンが広く知られており、例えば、タチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）、セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）、インゲンマメレクチン（ＰＨＡ−Ｅ、ＰＨＡ−Ｌ）、イヌエンジュレクチン（ＭＡＬ、ＭＡＨ）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、トウゴマレクチン（ＲＣＡ）、ダイズレクチン（ＳＢＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、マッシュルームレクチン（ＡＢＡ）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−１）、チョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）等が挙げられる。
【００５７】
上記サイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−８、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子等が挙げられる。上記ＧＡＧ結合タンパク質としては、アンチトロンビン、ＣＤ４４等が挙げられる。細菌毒素としては、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、ベロ毒素等が挙げられる。ウイルスヘマグルチニンとしては、インフルエンザヘマグルチニン等が挙げられる。
【００５８】
検出可能な糖結合タンパク質の濃度はその種類によって異なるが、例えばレクチンや抗糖鎖抗体の場合、０．１ｐｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬが好ましく、１ｐｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬがより好ましく、１０ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬが更に好ましい。
【００５９】
本発明の方法によれば、ウイルス、細菌又は細胞を直接検出することも可能である。ウイルスや細菌には、その表面にヘマグルチニンやアドヘシンを発現しているものがあり、また、細胞の中には、細胞表面にセレクチン等の動物レクチンを発現しているものがあり、そのようなウイルス、細菌、細胞は検出が可能である。
【００６０】
検出可能なウイルスとして具体的には、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ノロウィルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ロタウィルス、手足口病ウイルス、デング熱ウイルス等が挙げられる。検出可能な細菌として具体的には、大腸菌、ヘリコバクターピロリ菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、結核菌等が挙げられる。検出可能な細胞としては、肝細胞がん、胃がん、肺がん、大腸がん、膵臓がん等のがん細胞；Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、単球、マクロファージ等の免疫細胞；肝細胞、内皮細胞その他糖結合タンパク質を細胞表面に発現している細胞が挙げられる。
【００６１】
ウイルスを検出する場合、その濃度は、１０0〜１０10ｐｆｕ／ｍＬが好ましく、１０1〜１０5ｐｆｕ／ｍＬがより好ましい。また、細菌を検出する場合、その濃度は、１０0〜１０8ｃｆｕ／ｍＬが好ましく、１０1〜１０3ｃｆｕ／ｍＬがより好ましい。細胞を検出する場合、その濃度は、１０0〜１０8個／ｍＬが好ましく、１０1〜１０3個／ｍＬがより好ましい。
【００６２】
本発明において、上記糖化合物固定化半導体センシングデバイスに固定化する糖化合物は、検出する対象にあわせて適宜選択すればよい。例えば、インフルエンザヘマグルチニンを検出する場合には、ヒトインフルエンザヘマグルチニンのリガンドである非還元末端にＳｉａα２−６Ｇａｌを有する糖鎖や、トリインフルエンザヘマグルチニンのリガンドである非還元末端にＳｉａα２−３Ｇａｌを有する糖鎖等を上記デバイスに固定化すればよい。
【００６３】
動物レクチンを検出する場合、上記デバイスに固定化する糖鎖としては、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（４）ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、Ｓｉａα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌ等のシグレックリガンド、シアリルルイス抗原、硫酸化されたシアリルルイス抗原等のセレクチンリガンド等が挙げられる。なお、上記式中、β１−３（４）とは、β１−３グリコシド結合でもβ１−４グリコシド結合でもよいことを表す。
【００６４】
植物レクチンや真菌レクチンを検出する場合は、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉａα２−６Ｇａｌ、Ｓｉａα２−６ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃα１−３Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃα１−３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα１−６ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｌ−Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ等の構造を有するレクチンリガンドとして既知の糖鎖を上記デバイスに固定化すればよい。
【００６５】
抗糖鎖抗体、サイトカイン又は細菌毒素を検出する場合は、それらが結合する糖鎖を上記デバイスに固定化すればよい。ＧＡＧ結合タンパク質を検出する場合は、それが結合するＧＡＧを上記デバイスに固定化すればよい。
【００６６】
また、ウイルス、細菌又は細胞を検出する場合には、その表面に発現している糖結合タンパク質のリガンドとなる糖鎖を上記デバイスに固定化すればよい。このような糖鎖は、多数が報告されている。例えば、インフルエンザウイルスを検出する場合は、上述したインフルエンザヘマグルチニンのリガンドとなる糖鎖を固定化すればよい。
【００６７】
本発明のデバイスは、糖を高密度に固定できるため、生物学的物質を高感度に検出することが可能である。また、生物学的物質との結合部位が有機単分子膜界面から近くなるため、生理的条件下における生物学的物質の検出が可能となる。本発明の方法は、生体試料中のウイルスの検出、バイオマーカー検出等にも好適に使用できる。
【実施例】
【００６８】
以下、合成例、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００６９】
［合成例１］アミノオキシプロピルトリエトキシシランの合成
トリエトキシシラン０．５ｍＬ及びＯ−アリルヒドロキシルアミン塩酸塩０．１０ｇの混合物に、０．１Ｍヘキサクロロ白金（ＩＶ）酸イソプロパノール溶液５μＬを加え、窒素雰囲気下９０℃で４８時間撹拌した。ＮＭＲにてＯ−アリルヒドロキシルアミン塩酸塩の消失を確認した後、過剰のトリエトキシシランを留去し、乾燥トルエンを用いて３回共沸し、残渣を真空ラインで乾燥し、アミノオキシプロピルトリエトキシシラン０．２１ｇ（収率７７％）を得た。
【００７０】
［実施例１］糖化合物固定化半導体センシングデバイスの構築
糖化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備え、かつ、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部として備えるデバイスを構築した。絶縁層としてはシリコン酸化物を用いた。検出部の第１の有機単分子膜として、アミノオキシプロピルトリエトキシシランを用いてアミノオキシ系単分子膜を形成した。
【００７１】
アミノオキシ系単分子膜の形成及び糖鎖の固定化は以下の方法で行った。
まず、アミノオキシ系単分子膜をゲート電極表面に修飾した。アミノオキシプロピルトリエトキシシランを０．１質量％含むトルエン中にデバイスを浸漬し、６０℃で１５分間静置することで、ゲート上へアミノオキシ系単分子膜を成膜した。次に、有機単分子膜のアミノオキシ基と糖鎖とを結合するために、糖鎖としてα２，６−シアリルラクトース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ社製）を含む酢酸水溶液（糖鎖濃度０．１ｍＭ、酢酸濃度８．０×１０-4体積％、ｐＨ５．３）中で、６０℃で１時間反応させることで、アミノオキシ系単分子膜に糖鎖を固定化した。リン酸緩衝生理食塩水（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４、以下、１×ＰＢＳと表記する。）３ｍＬで基板を洗浄し、次いで０．０１×ＰＢＳ３ｍＬを用いてリンスを行い、α２，６−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスを構築した。
また、α２，３−シアリルラクトース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ社製）を用いた以外は上記と同じ方法でα２，３−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスを構築した。
【００７２】
［実施例２］ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）の検出
実施例１で作製したα２，６−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスをホルダーに設置し、デバイスの検出部を０．０１×ＰＢＳ０．５ｍＬに１０分間浸漬した。浸漬後、室温で、糖鎖固定化デバイスの電流−電圧曲線を、Ｈｇ／Ｈｇ2ＳＯ4参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧−３Ｖ〜１．５Ｖ、ドレイン電圧１Ｖとした。更に、ゲート表面上に１０μｇ／ｍＬのヒトＨＡ（Ｈ１Ｎ１，Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含む１×ＰＢＳを添加し、１０分静置した後、１体積％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ１０ｍＬで洗浄し、次いで０．０１×ＰＢＳ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上に０．０１×ＰＢＳを０．５ｍＬ添加して１０分間静置した後、タンパク質吸着デバイスの電流−電圧曲線を測定し、タンパク質添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
【００７３】
［比較例１］
比較例として、α２，６−シアリルラクトースに結合活性を示さないタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する応答を以下の通り評価した。実施例１で作製したα２，６−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスをホルダーに設置し、デバイスの検出部を０．０１×ＰＢＳ０．５ｍＬに１０分間浸漬した。浸漬後、室温で、糖鎖固定化デバイスの電流−電圧曲線を、Ｈｇ／Ｈｇ2ＳＯ4参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧−３Ｖ〜１．５Ｖ、ドレイン電圧１Ｖとした。更に、ゲート表面上に１０μｇ／ｍＬのＨＳＡ（和光純薬工業（株）製）を含む１×ＰＢＳを添加し、１０分静置した後、１体積％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ１０ｍＬで洗浄し、次いで０．０１×ＰＢＳ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上に０．０１×ＰＢＳを０．５ｍＬ添加して１０分間静置した後、デバイスの電流−電圧曲線を測定し、タンパク質添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
【００７４】
α２，６−シアリルラクトース固定化デバイスに対するＨＡ添加前後のデバイス特性の評価結果（実施例２）を図４に、ＨＳＡ添加前後のデバイス特性の評価結果（比較例１）を図５に示す。なお、図４及び５において、（Ａ）は、ゲート電圧−１．５Ｖ〜１．５Ｖの範囲における電流−電圧曲線を示し、（Ｂ）は、ゲート電圧１．０Ｖ〜１．５Ｖの範囲における（Ａ）の拡大図である。
【００７５】
実線がタンパク質添加前のデバイス特性、破線がタンパク質添加後のデバイス特性をそれぞれ表す。糖鎖固定化デバイスにＨＡを添加した場合、電流−電圧曲線が正方向にシフトした。一方で、糖鎖固定化デバイスにＨＳＡを添加した場合、電流−電圧曲線の変化はほとんど確認されなかった。ゲート電圧シフト値を示すグラフを図６に示す。このことより、作製された糖鎖固定化デバイスがタンパク質識別能を有し、認識したタンパク質が保有する電荷を検出可能であることが示された。
【００７６】
［実施例３］
実施例２の方法と同様にして、下記表１記載の濃度のＨＡの添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。結果を表１及び図７に示す。なお、図７中、ｃｏｎｔｒｏｌとは、１０μｇ／ｍＬのＨＳＡを添加したものである。表１及び図７より、濃度依存的なＨＡの検出が可能なことが示された。
【００７７】
【表１】
0006019944.tif 000006
【００７８】
［実施例４、比較例２］ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）の検出
実施例１で作製したα２，６−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスをホルダーに設置し、デバイスの検出部を０．０１×ＰＢＳ０．５ｍＬに１０分間浸漬した。浸漬後、室温で、糖鎖固定化デバイスの電流−電圧曲線を、Ｈｇ／Ｈｇ2ＳＯ4参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧−３Ｖ〜０．５Ｖ、ドレイン電圧０．１Ｖとした。更に、ゲート表面上に下記表２記載の濃度のヒトＨＡ（Ｈ１Ｎ１，Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含む１×ＰＢＳを添加し、１０分静置した後、１体積％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ１０ｍＬで洗浄し、次いで０．０１×ＰＢＳ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上に０．０１×ＰＢＳを０．５ｍＬ添加して１０分間静置した後、タンパク質吸着デバイスの電流−電圧曲線を測定し、タンパク質添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した（実施例４）。
また、比較例として、実施例４と同じ方法で、下記表１記載の濃度のトリＨＡ（Ｈ５Ｎ１，Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）の添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した（比較例２）。
結果を表２及び図８に示す。
【００７９】
【表２】
0006019944.tif 000007
【００８０】
表２及び図８より、α２，６−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスを用いることで濃度依存的なヒトＨＡの検出が可能であることが示された。一方、α２，６−シアリルラクトースに結合活性を示さないトリＨＡを用いた場合は、ゲート電圧シフトは検出されなかった。
すなわち、α２，６−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスを用いることで特異的にヒトＨＡを検出できることが示された。
【００８１】
［実施例５、６、比較例３］トリインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）の検出
実施例１で作製したα２，３−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスを用いた以外は、実施例４の方法と同様にして、下記表３記載の濃度のトリＨＡの添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。なお、トリＨＡとしては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のＨ５Ｎ１，Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（実施例５）、及びＨ５Ｎ１，Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５（実施例６）を用いた。
また、比較例として、下記表３記載の濃度のヒトＨＡ（Ｈ１Ｎ１，Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）の添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した（比較例３）。
結果を表３及び図９に示す。
【００８２】
【表３】
0006019944.tif 000008
【００８３】
表３及び図９より、α２，３−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスを用いることで濃度依存的なトリＨＡの検出が可能であることが示された。一方、α２，３−シアリルラクトースに結合活性を示さないヒトＨＡを用いた場合は、ゲート電圧シフトは検出されなかった。
すなわち、α２，３−シアリルラクトース固定化半導体センシングデバイスを用いることで特異的にトリＨＡを検出できることが示された。
【００８４】
［比較例４］抗体固定化半導体センシングデバイスの構築及びヒトＨＡの検出
糖鎖固定化半導体センシングデバイスが抗体固定化半導体センシングデバイスに比べて有利であることを示すため、比較例として、抗ヒトＨＡ抗体を固定化した半導体センシングデバイスを構築して、ヒトＨＡに対する応答を評価した。
【００８５】
抗体固定化半導体センシングデバイスとして、抗体／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備え、かつ、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部として備えるデバイスを構築した。絶縁層としてはシリコン酸化物を用いた。検出部の第１の有機単分子膜として、アミノプロピルトリエトキシシランを用いてアミノ系単分子膜を形成した。
【００８６】
アミノ系単分子膜の形成、抗体の固定化及びヒトＨＡの検出は以下の方法で行った。
まず、アミノ系単分子膜をゲート電極表面に修飾した。アミノプロピルトリエトキシシランを１質量％含むトルエン中にデバイスを浸漬し、６０℃で７分間静置することで、ゲート上へアミノ系単分子膜を成膜した。その後、有機単分子膜のアミノ基と抗体とを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、末端がアミノ基の単分子膜が形成された上記デバイスの検出部を、２．５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０．０１ｍＬ中に室温で３０分間浸漬することにより実施した。基板洗浄後、デバイスをホルダーに設置し、デバイスの検出部を０．０１×ＰＢＳ０．５ｍＬに３０分間浸漬した。浸漬後、グルタルアルデヒド修飾デバイスにデジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）にて電圧掃印を行った。電圧掃印条件は掃印電圧−３〜０Ｖとし、連続して３回行った。電圧印加後、上記０．０１×ＰＢＳ０．０２ｍＬをデバイスホルダーに残し、０．１ｇ／Ｌの抗ヒトＨＡ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含むＰＢＳを０．０２ｍＬ添加し、室温で１時間反応させることで、架橋分子に抗体を固定化した。
【００８７】
基板洗浄後、デバイスの検出部を０．０１×ＰＢＳ０．５ｍＬに１０分間浸漬した。浸漬後、室温で、抗体固定化デバイスの電流−電圧曲線を、Ｈｇ／Ｈｇ2ＳＯ4参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧−３Ｖ〜０．５Ｖ、ドレイン電圧０．１Ｖとした。更に、上記０．０１×ＰＢＳ０．０２ｍＬをデバイスホルダーに残し、ゲート表面上に下記表４記載の濃度のヒトＨＡ（Ｈ１Ｎ１，Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含む１×ＰＢＳを添加し、１０分静置した後、１体積％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ１０ｍＬで洗浄し、次いで０．０１×ＰＢＳ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後，ゲート表面上に０．０１×ＰＢＳを０．５ｍＬ添加して１０分間静置した後、デバイスの電流−電圧曲線を測定し、タンパク質添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
結果を表４及び図１０に示す。また、比較のため実施例４の結果も併記する。
【００８８】
【表４】
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【００８９】
表４及び図１０より、糖鎖固定化半導体センシングデバイスを用いた方が、抗体固定化半導体センシングデバイスを用いた場合に比べて、検出感度や検出範囲の点で有利であることが示された。
【符号の説明】
【００９０】
１  シリコン基板
２  絶縁層
３  第１の有機単分子膜
４  ゲート電極
５  ソース電極
６  ドレイン電極
７  ドープ領域
８  参照部
９  検出部
１０  テンプレート部
１１  糖化合物
１２  生物学的物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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