(57)【特許請求の範囲】
【請求項２】
スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）を有効成分として含有する肺線維症の予防、治療及び／又は進行抑制用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維症、特に肺線維症を予防し、進行を抑制し、及び／又は治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
間質性肺炎は、肺の間質（肺胞以外の部分）の炎症を特徴とする難治性の疾患である。間質性肺炎の患者のうち、５０％が特発性肺線維症に移行し、重症化することが知られている。肺線維症は、肺が硬くなって縮小し、ガス交換が不十分になる疾患である。この症状が進行すると、最終的に、呼吸困難に陥り、死に至る。特発性肺線維症患者は、日本では１．５万人、米国では５万人といわれている。【０００３】
現在、この疾患に関しては、有効な薬や治療が患者や医師から強く望まれており、製薬企業が注目して研究開発に力を入れている。それにもかかわらず、有効な薬剤や治療方法は確立されておらず、生存期間は２〜３年である。【０００４】
スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）は、魚類のエラから発見され、哺乳類にも分布する、２量体糖蛋白質ホルモンである。ＳＴＣ１は、リンやカルシウムの代謝のほか、ミトコンドリアの酸化的リン酸化促進や神経細胞及び心筋保護作用、骨代謝促進作用など、様々な生理活性を有することが知られている。【０００５】
具体的には、以下の知見が報告されている。ＳＴＣ１は、脱共役タンパク質２（ＵＣＰ２）の誘導を介して細胞内ミトコンドリアの膜電位を低下させる（非特許文献１〜３）。このＵＣＰ２を介したミトコンドリア膜電位の低下は、細胞内過酸化物質（ＲＯＳ）の低下につながり、ミトコンドリアのグルコース依存度の低下とミトコンドリアの脂質代謝上昇をもたらす（非特許文献１〜３）。また、ＳＴＣ１は、嫌気性代謝又は好気性代謝のどちらでもない、脱共役代謝（乳酸量増大、酸素消費量増大、脂質代謝量増大をもたらす）を誘導する。脱共役代謝は、飢餓時（あるいは障害環境）においては、より多くのエネルギーを消費可能で、過酸化ストレスも軽減するため、障害環境下では生存に有利と考えられている（非特許文献３、４）。【０００６】
非特許文献５及び特許文献１には、腎炎を惹起させる物質（Ａｎｔｉ−ＧＢＭ  Ａｂ）を投与することにより腎炎モデルマウスを作製すると、マウスの腎組織に線維化が生じることが開示されている。そして、野生型（ＷＴ）マウス及びＳＴＣ１高発現マウスにそれぞれ腎炎惹起物質を投与した場合、ＳＴＣ１高発現マウスの腎は、ＷＴマウスよりも腎組織の線維化が減少していることが明らかとなったことが記載されている。【０００７】
しかし、このモデルマウスを用いた実験では、腎炎が生じた結果、線維化が生じるのであって、腎の炎症組織が線維化している。これらの文献には、ＳＴＣ１に抗線維化作用（線維芽細胞増殖抑制作用など）があることを示す記載はない。また、肺線維症に関する記載もない。【０００８】
ＳＴＣ１については、脂肪細胞の分化又は成熟抑制活性、骨形成促進、神経保護作用などの種々の生理活性に基づいた医薬組成物としての利用が提案されてきた（特許文献２〜５）。しかし、肺線維症に対する医薬としての可能性を示す先行技術は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１０／０５１３４７号公報
【特許文献２】特開２０００−２２９８８０号公報
【特許文献３】特開平７−１８８０５１号公報
【特許文献４】再表０２／００４０１３号公報
【特許文献５】再表００／０１６７９５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Cancer Res, 2008, 68:(13)5198-5205
【非特許文献２】Cancer Res, 2009, 69:(6)2163-2166
【非特許文献３】Tohoku University Global COE Network Medicine Winter Camp of GCOE 2010, Feb, 5th, 2011, Akiu, Sendai, Japan
【非特許文献４】Journal of Leukocyte Biology, 2009, 86:981-988
【非特許文献５】The American Journal of Pathology, 2009, 174:(4)1368-1378
【非特許文献６】呼吸と循環(医学書院）2008年9月号  肺線維症の動物実験モデル(海老名雅仁）
【非特許文献７】PNAS, 2003:(14) 8407-8411
【非特許文献８】AJRCCM, 2000:(162) 225-231
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、線維症、特に肺線維症の予防及び治療薬として有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＳＴＣ１はＲＯＳストレスを軽減することから、ＳＴＣ１が低酸素下での肺細胞の生存を延長し又は機能を活性化させる可能性を期待して研究した。そして、ＳＴＣ１を気管内投与した実験的肺線維症モデルマウスにおいて、肺線維化が顕著に抑制されることを見出し、本発明を完成した。【００１３】
したがって、本発明によれば、
〔１〕  ＳＴＣ１を有効成分として含有する線維症の予防、治療及び／又は進行抑制用医薬組成物；
〔２〕  線維症が、肺線維症である、上記〔１〕記載の医薬組成物
が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の医薬組成物によれば、肺の線維化が顕著に抑制され、それとともに過酸化ストレスが顕著に抑制される。したがって、本発明の医薬組成物は、線維症、特に肺線維症の予防、進行抑制及び／又は治療が可能である。
線維症の改善にも利用されることがある従来の薬剤と比較して、ＳＴＣ１は有利である。プレドニン、シクロスポリンＡ（cyclosporin-A）、ＦＫ５０６等は、免疫を強力に抑制するため、易感染性の原因となる。これに対し、ＳＴＣ１は、免疫系の抑制を起こさないことが報告されている（Transgenic Res (2010) 19:1017？1039）ことから、易感染性の問題がないと期待される。また、Ｎ−アセチルシステイン（N-acetylcystein；ＮＡＣ）は静脈投与ができないという欠点があり、ＳＴＣ１はＮＡＣと比較してもその点で有利であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＳＴＣ１投与群のある個体の肺組織の染色像を示す図である。パネルＡは、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像、パネルＢはエラスィカマッソン（ＥＭ）染色像をそれぞれ表す（以下、図２〜５も同じ）。
【図２】図２は、ＳＴＣ１投与群の別の個体の肺組織の染色像を示す図である。
【図３】図３は、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）投与群のある個体の肺組織の染色像を示す図である。
【図４】図４は、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）投与群の別の個体の肺組織の染色像を示す図である。
【図５】図５は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）投与群のある個体の肺組織の染色像を示す図である。
【図６】図６は、正常肺組織の染色像を示す図である。パネルＡはＨＥ染色像、パネルＢはＥＭ染色像、パネルＣは８−ヒドロキシデオキシグアノシン（8-Hydroxydeoxyguanuosine；８ＯＨＤＧ）染色像をそれぞれ表す。
【図７】図７は、ブレオマイシン（パネルＡ、Ｄ、Ｇ）、ＳＴＣ１（パネルＢ、Ｅ、Ｈ）、ＮＡＣ（パネルＣ、Ｆ、Ｉ）投与群の肺組織の染色像を示す図である。パネルＡ〜ＣはＨＥ染色像、パネルＤ〜ＦはＥＭ染色像、パネルＧ〜Ｉは８ＯＨＤＧ染色像をそれぞれ表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の線維症予防又は治療用医薬組成物は、ＳＴＣ１を有効成分として含有することを特徴とする。本発明において使用されるＳＴＣ１としては、動物細胞又は組織等から得られる天然のＳＴＣ１分子又は天然のＳＴＣ１と同一のアミノ酸配列を有する組換え型ＳＴＣ１、遺伝子工学技術により改変されたＳＴＣ１遺伝子に基づいて産生される組換え型ＳＴＣ１、合成されたＳＴＣ１のほか、ＳＴＣ１の活性フラグメントなどの機能的等価物のいずれであってもよい。したがって 、本発明に関して用語「スタニオカルシン１」（ＳＴＣ１）は、特に示さない限り、これらの種々のＳＴＣ１をも包含する意味で用いられる。
【００１７】
本発明において使用されるＳＴＣ１としては、ヒト由来のアミノ酸配列を有するもの又はヒト由来のアミノ酸配列に基づいて機能を損なうことなく改変されたものが好ましい。ヒトＳＴＣ１のアミノ酸配列及び塩基配列は公知であり、登録番号NP#003146.1、NM#003155.2としてバンクに登録されている。ヒト以外の動物のＳＴＣ１についても、多くの動物由来のＳＴＣ１のアミノ酸配列及び塩基配列が知られており、これらはいずれも、ヒトのＳＴＣ１に対して、例えば魚類（ギンザケ）９４％、鳥類（ニワトリ）９５％、各種哺乳類１００％の高い相同性を有することが知られている（表１）。
【００１８】
【表１−１】
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【００１９】
【表１−２】
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【００２０】
したがって、本発明において使用可能なＳＴＣ１は、ヒトＳＴＣ１のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９４％以上の相同性を有するものである。特に、ヒトＳＴＣ１配列（例えば２９３細胞由来のヒトＳＴＣ１配列）と１００％一致するアミノ酸配列を有する、天然又はリコンビナントＳＴＣ１（ｒＳＴＣ１）を用いることが好ましい。本発明においては、これらのＳＴＣ１の１種又は２種以上を適宜選択して用いることができる。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、ＳＴＣ１を唯一の必須成分とするが、所望により、線維症の改善に有効な作用を持つと考えられている成分を含むことができる。例えば、プレドニン等のステロイド製剤、Ｎ−アセチルシステイン等の還元剤、パーフェニドン（pirfenidone）等の抗線維化薬、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６等の免疫抑制薬や、グルコース輸液、リンゲル輸液の成分等が挙げられ、これらの他の有効成分をさらに含有させることによって、一層の線維症改善作用を期待できる。また、本発明の医薬組成物は、これらの薬剤等と併用することができる。
なお、本発明に関して線維症の「改善」は、予防及び治療（軽快、治癒を含む）を包含する意味で用いられる。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、製薬又は食品業界で公知の種々の成分などを用いて製剤化して投与することができる。投与経路は、公知のいずれの経口的又は非経口的経路であってもよく、例えば、経口、経皮、注射、経腸、直腸内等の任意の経路を選択することができる。好ましい投与経路としては、気管投与、また、ホルモン製剤の場合のように、経口、又は注射もしくは点滴が挙げられる。
【００２３】
したがって、医薬組成物の形態としては、注射用組成物、点滴用組成物、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物には、添加剤として、製薬産業において公知の賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、流動性促進剤、着色剤、安定剤、香料などを適宜添加して所望の剤型の医薬組成物とすることができる。
【００２４】
例えば、注射用組成物の場合、塩化ナトリウムなどの等張剤や、燐酸塩又はクエン酸塩などの緩衝剤、ｐＨ調整剤、グルコースなどの糖類、安定化剤、可溶化剤など、一般的に注射剤に用いられる任意成分を用いることができる。注射剤として投与する場合、本発明の医薬組成物は、生理食塩水等の水性担体に溶解し、滅菌した液体を投与してもよく、あるいは、注射用粉末製剤を製造し、水性担体に溶解した溶液を用時調製して投与してもよい。
【００２５】
また、例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、デンプン、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチなどの糖類、及び無機塩類などを用いて常法によって製剤化することができる。これらの製剤には、前記のような賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用することができる。
【００２６】
このような各種製剤の製造方法は、当業者には充分公知である。なお、本発明に関して「医薬組成物」という場合、人間に対して適用するもののほか、ヒト以外の動物に対して適用するものをも含む。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、所定の血中濃度を維持するように投与することが望ましい。好ましい血中濃度は、２０〜２００ng/ml程度であることができ、５０〜１００ng/ml程度が好ましい。
【００２８】
本発明の医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、及び投与される対象の種類、年齢、体重、病状などによって異なり、それらに応じて各々に適した量で投与することができる。上記のような血中濃度を維持するためには、たとえば体重１kgあたり２mg／日以上とすることができる。ヒトに投与する場合、一般的には、有効成分量として、１日あたり８０mg〜１６０mg、例えば、成人１人当たり１日１２０mg以上の量であることができる。このような１日あたりの用量を、一度に又は分割して、予防又は治療が必要とされている対象に対し、投与することができる。
【００２９】
ＳＴＣ１が線維症を改善するメカニズムは、以下のように考えられる。ＳＴＣ１は、ＵＣＰ２をアップレギュレーションすることにより、ミトコンドリア膜電位を低下させ、これによって、過酸化物質量（ＲＯＳ）を減少させる。また、脱共役呼吸を誘導し、障害環境下のエネルギー効率を改善することにより、障害軽減作用を発揮する。その結果、細胞の線維化が改善される。これらの機序はＳＴＣ１の公知の活性の作用メカニズムとはまったく異なるものである。
【実施例】
【００３０】
１．病態モデルマウスにおけるＳＴＣ１の線維化抑制効果
病態モデルマウスとして、抗ガン剤であるブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）の有糸分裂阻害作用を利用した肺線維症モデルを使用し、ＳＴＣ１の作用を調べた。【００３１】
ヒトリコンビナント（ｒ）ＳＴＣ１は、BioVender社により製造した。具体的には、２９３細胞にＴＡＧ構造を付加したヒト由来ＳＴＣ１遺伝子を導入し、ＴＡＧ配列を用いてｒＳＴＣ１を分離した。【００３２】
具体的には、１群４匹ずつのＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（雌、１０週齢）を、麻酔薬（塩酸ケタミン３００μg＋キシラジン１６０ngを１００μLの生理食塩水に希釈したもの）を腹腔内に投与することにより麻酔した。その後、頚部を切開し気管を露出させ、２３Ｇのサーフロー針の外套を気管に挿入した。さらに、各群のマウス気管内にサーフロー外套から以下の薬剤をそれぞれ投与した。【００３３】
（１）生食コントロール群：  ブレオマイシン含有生理食塩水５０μL（ブレオマイシン濃度４００ng/mL）
（２）ＳＴＣ１投与群：  ＳＴＣ１  ５００ng＋ブレオマイシン含有生理食塩水５０μL
（３）ＮＡＣ投与群（ポジティブコントロール）：  ＮＡＣ  ３mg＋ブレオマイシン含有生理食塩水５０μL
（４）正常肺群：  生理食塩水５０μL【００３４】
１週間後、上記と同様の麻酔を施した後、頸動脈を切断することによりマウスを安楽死させ、その後肺を摘出した。常法により、摘出した肺組織に病理組織染色（ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色、ＥＭ（エラスィカマッソン染色）、８ＯＨＤＧ染色）を施し、光学顕微鏡で観察した。【００３５】
結果を図１〜６、及び図７に示す。
ＨＥ染色は組織の全体像を表す。ＥＭ染色は線維化の程度を表し、色が濃くなっているのは弾性線維が増えて肺の線維化が悪化していることを示す。また、８ＯＨＤＧ染色は過酸化物の量を表し、過酸化物が多いほど濃く染色される。【００３６】
図１〜６では、パネルＡがＨＥ染色、パネルＢがＥＭ染色を表す。生食コントロール群（図３、４）では線維化が惹起されているが、ＳＴＣ１投与群（図１、２）、ＮＡＣ投与群（図５）では線維化が抑制されていた。すなわち、ＳＴＣ１の気道内投与はブレオマイシン肺線維症モデルにおいて、肺線維症の進行を抑制し、ＳＴＣ１で著効、ＮＡＣで改善を示した。【００３７】
図７には、８ＯＨＤＧ染色の結果を併せて示す。８ＯＨＤＧで染色した場合、生食コントロール群（パネルＧ）は有意に染まったが、ＳＴＣ１投与群（パネルＨ）、ＮＡＣ投与群（パネルＩ）では染まりが悪く、正常肺群（図６、パネルＣ）と同程度であった。したがって、ＳＴＣ１は、ＮＡＣと同様、ブレオマイシンによる過酸化ストレスを抑制していることが示唆された。【００３８】
以上の結果を表２にまとめて示す。【００３９】
【表２】
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【００４０】
この出願は、平成２３年７月９日出願の日本特許出願、特願２０１１−１５２３９２に基づくものであり、特願２０１１−１５２３９２の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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