(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒及び／又は水を含む系においてリゾ型リン脂質（但し、水素添加物を除く）にホスホリパーゼDを作用させて得られる反応物に、ナトリウム塩を添加した後、反応物から溶媒を除去することを含む環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法であって、前記リゾ型リン脂質が大豆由来リン脂質にホスホリパーゼA2を作用させて得られたリゾ型リン脂質であり、前記ホスホリパーゼDが、アクチノマジュラ属由来のホスホリパーゼＤである、製造方法。
【請求項２】
ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、請求項１に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項３】
有機溶媒及び／又は水を含む系においてリゾ型リン脂質にホスホリパーゼDを作用させて得られる反応物に、キレート剤の存在下においてナトリウム塩を添加する、請求項１又は２に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項４】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項３に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項５】
大豆由来リン脂質にホスホリパーゼA2を作用させて得られた反応物から、リゾ型リン脂質を単離精製することなく有機溶媒及び／又は水を含む系に溶解し、ホスホリパーゼDを作用させる、請求項１から４の何れか１項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項６】
４０％以上の純度を有する環状ホスファチジン酸ナトリウム含有組成物が得られる、請求項１から５の何れか１項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項７】
1mg/mL以上の環状ホスファチジン酸ナトリウムを含有する溶液が得られる、請求項１から５の何れか１項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項８】
環状ホスファチジン酸ナトリウムを含有する溶液が、水溶液である、請求項７に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法、並びに上記製造方法により得られる環状ホスファチジン酸ナトリウムを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ホスファチジン酸（以下、ｃPAと略すこともある）は、がん細胞の転移および浸潤を阻害する等の生理活性を有することが知られ（非特許文献１）、抗腫瘍剤を含む医薬品や機能性食品としての用途が期待されており、また、生体内のヒアルロン酸合成促進作用を有することから、化粧品に添加されている。
【０００３】
従来、このような環状ホスファチジン酸の製造方法としては、化学的に合成する方法（特許文献１及び２）や、リゾ型リン脂質にホスフォリパーゼDを作用させることによる酵素反応を利用した方法（特許文献３及び４）が知られている。環状ホスファチジン酸は脂質であり水に不溶であるため、ナトリウム塩などの水溶性の塩とすることが必要であり、化学的に合成した環状ホスファチジン酸を、水素化ナトリウムや水酸化ナトリウムなどの強塩基で処理し、ナトリウム塩に変換する方法で環状ホスファチジン酸ナトリウムが調製されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−２２８１６９号公報
【特許文献２】特開平７−２５８２７８号公報
【特許文献３】特開２００１−１７８４８９号公報
【特許文献４】特開２００８−２２２６４３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biochemica et Biophysica Acta 15288(2002),p.1-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
環状ホスファチジン酸は不安定であることから、上述の科学的合成法に記載されたような強塩基を用いる方法は好ましくなく、また、化学的合成法では環状ホスファチジン酸を高収率および高純度で得ることは困難であり、温和で簡便な方法で環状ホスファチジン酸ナトリウムを高収率かつ高純度で調製する方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、環状ホスファチジン酸ナトリウムの調製方法について鋭意検討した結果、有機溶媒及び／又は水を含む系においてリゾ型リン脂質（但し、水素添加物を除く）にホスホリパーゼDを作用させて得られる反応物に、塩化ナトリウムを添加した後、反応物から溶媒を除去することにより、極めて穏和な条件下で簡便な方法で、高収率かつ高純度で環状ホスファチジン酸ナトリウムを調製することができることを見出した。本発明は係る知見に基づいてなされたものである。
【０００８】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）  有機溶媒及び／又は水を含む系においてリゾ型リン脂質（但し、水素添加物を除く）にホスホリパーゼDを作用させて得られる反応物に、ナトリウム塩を添加した後、反応物から溶媒を除去することを含む環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（２）  ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、（１）に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（３）  有機溶媒及び／又は水を含む系においてリゾ型リン脂質にホスホリパーゼDを作用させて得られる反応物に、キレート剤の存在下においてナトリウム塩を添加する、（１）又は（２）に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【０００９】
（４）  キレート剤がＥＤＴＡである、（３）に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（５）  リゾ型リン脂質が大豆由来リン脂質あるいは卵黄由来リン脂質あるいはトウモロコシ由来リン脂質にホスホリパーゼA2を作用させて得られたリゾ型リン脂質である、（１）から（４）の何れか１項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（６）  リゾ型リン脂質が大豆由来リン脂質あるいは卵黄由来リン脂質あるいはトウモロコシ由来リン脂質にホスホリパーゼA2を作用させて得られた反応物から、リゾ型リン脂質を単離精製することなく有機溶媒及び／又は水を含む系に溶解し、ホスフォリパーゼDを作用させる、（１）から（５）の何れか１項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【００１０】
（７）  （１）から（６）の何れか１項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法により得られる、４０％以上の純度を有する環状ホスファチジン酸ナトリウム含有組成物。
（８）  （１）から（６）の何れか１項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法により得られる、1mg/mL以上の環状ホスファチジン酸ナトリウムを含有する溶液。
（９）  環状ホスファチジン酸ナトリウムを含有する溶液が、水溶液である、（８）に記載の溶液。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、有機溶媒及び／又は水を含む系においてリゾ型リン脂質にホスホリパーゼDを作用させることで、極めて穏和で簡便な方法で、高収率かつ高純度で環状ホスファチジン酸ナトリウムを製造できる。本発明によれば、反応物をナトリウム塩で処理するだけで、環状ホスファチジン酸を単離、精製することなく、環状ホスファチジン酸ナトリウムを調製することができるため、大豆などの天然物を原料とした環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造法として特に有用である。本発明の製造条件によって得られる環状ホスファチジン酸ナトリウムは、特に大豆由来のリン脂質あるいは卵黄由来リン脂質あるいはトウモロコシ由来リン脂質を原料とした場合、室温での水溶性が高く、特に精製することなく水溶液を調製することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、有機溶媒及び／又は水を含む系においてリゾ型リン脂質（但し、水素添加物を除く）にホスホリパーゼDを作用させて得られる反応物に、塩化ナトリウムを添加した後、反応物から溶媒を除去することを特徴とする。
【００１３】
環状ホスファチジン酸ナトリウムの調製に関しては、水素添加大豆由来リゾホスファチジルコリンを水に溶解し、酢酸ナトリウム緩衝液および２Mの塩化ナトリウムを添加、ホスホリパーゼDと反応させた後、水酸化ナトリウム水溶液で中和、クロロホルム/メタノールで抽出し、有機溶媒層を回収して溶媒を溜去し、環状ホスファチジン酸ナトリウムを得たとの記載がある（特許文献４）が、得られた物質の脂肪酸組成が記載されているのみであり、ナトリウム含有量などの記載はなく、環状ホスファチジン酸ナトリウムであることが明確に示されていない。
【００１４】
本発明者らはホスホリパーゼDの酵素反応はカルシウムイオンが存在しなくても十分に進行し、塩化ナトリウムは酵素反応を阻害することを見出した。更にリゾ型リン脂質を有機溶媒及び／又は水を含む系に溶解し、酢酸緩衝液を添加して、ｐHを5.5〜6.5に調整し、ホスホリパーゼDの酵素反応を行なうことにより、反応を効率よく進行させるとともに、反応終了後に、ナトリウム塩の水溶液を添加することで、環状ホスファチジン酸ナトリウムを収率良く製造することに成功した。また、また、大豆由来のリン脂質あるいは卵黄由来リン脂質あるいはトウモロコシ由来リン脂質を原料としホスホリパーゼA2を作用させてえられるリゾ型リン脂質を単離精製することなく、連続してホスホリパーゼDの反応を行なう場合は、反応液中に少量のカルシウムイオンが残存し、環状ホスファチジン酸のカルシウム塩が精製するが、反応終了後にナトリウムイオンと共にキレート剤を併用することで高純度の環状ホスファチジン酸ナトリウムを得ることができる。
【００１５】
本発明において用いられるナトリウム塩としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム等を使用できるが、好ましくは塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、より好ましくは塩化ナトリウムである。好ましく使用できる塩化ナトリウム濃度は0.5M〜3Mであるがより好ましくは2〜3Mである。
【００１６】
本発明において用いられるキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、クエン酸、酒石酸、フィチン酸等であるが、好ましくはエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、最も好ましくはEDTAである。
【００１７】
本発明において用いられる有機溶媒としては、クロロホルム、メチレンクロライド、トルエン、エチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン等を使用できるが、好ましくは、クロロホルム、メチレンクロライド、トルエン、より好ましくはクロロホルム、トルエンである。
【００１８】
本発明において用いられるリゾ型リン脂質は、ホスホリパーゼDの基質特異性を考慮すると、リゾホスファチジルコリン（LPC）であることが好ましく、大豆由来のリン脂質あるいは卵黄由来リン脂質あるいはトウモロコシ由来リン脂質を原料とし、ホスホリパーゼA2をさせて得られるLPCが最も好ましい。本発明で用いるリゾ型リン脂質としては、水素添加リゾ型リン脂質は除外され、水素未添加のリゾ型リン脂質が使用される。
【００１９】
本発明において用いられるホスホリパーゼDは、上記リゾ型リン脂質に作用させた場合に、ｃPAを生成するものであれば特に限定されるものではないが、ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）またはアクチノマヂュラ  エスピー（Actinomadula sp.）に由来するホスホリパーゼDが特に好ましく用いられる。
【００２０】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼDとの反応は、酵素が活性を発現できる条件であれば、特に限定されないが、好ましくはリゾ型リン脂質をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、酢酸緩衝液を添加してｐHを５．０から７．０に調整し、１０〜１００単位/mlのホスホリパーゼDを添加して、２５℃〜５０℃に加温し連続的に攪拌しながら５〜３０時間程度反応させることにより行なう。反応終了後2〜３Mの塩化ナトリウム、０．１から０．３MのEDTAを添加して連続的に攪拌した。反応物を遠心分離（３０００回転、５分間）にかけ有機溶媒層を回収し溶媒を溜去すれば環状ホスファチジン酸ナトリウムを粉末固形物として得ることができる。反応終了後必要に応じてメタノールなどの有機溶媒を添加して有機溶媒層を回収しても良い。更に高純度の環状ホスファチジン酸ナトリウムを得る場合には、シリカゲルや吸着樹脂などを用いて精製すれば良い。
【００２１】
本発明によれば、上記した本発明による環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法により得られる、４０％以上の純度を有する環状ホスファチジン酸ナトリウム含有組成物が提供される。純度は、好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上である。本発明で言う純度とは、標準品(９７％純度品）をコントロールとして、薄層クロマトグラフのスポットをデンシトメーターにより測定し、面積比で定量した結果として得られる純度である。標準品(９７％純度品）は、実施例３で得た高純度環状ホスファチジン酸ナトリウムを再クロマトにより精製したものであり、実施例５に記載の脂肪酸組成を有するものである。
【００２２】
更に本発明によれば、上記した本発明による環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法により得られる、1mg/mL以上の環状ホスファチジン酸ナトリウムを含有する溶液が提供される。環状ホスファチジン酸ナトリウムの濃度は1mg/mL以上であれば特に限定されず、2mg/mL以上、3mg/mL以上、又は5mg/mL以上でもよい。
【００２３】
以下の実施例で本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１；環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の製造方法
大豆リン脂質（レシチン含量：７０％）（水素未添加物）１０ｇを０．３Ｍ塩化カルシウムを含有する１００ｍＬの１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ６．５）で溶解させた後、６０００単位のストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼA2を添加し、４０℃で１８時間攪拌して反応させた。反応液をpＨ２．５に調整して酵素を失活させた後、１００ｍＬのクロロホルム、５０ｍＬのメタノールを添加して十分攪拌混合し脂質成分を抽出した。クロロホルム層を集め、ロータリーエバポレータで減圧乾固させた。固形分に１００ｍＬのアセトンを加えリン脂質を沈殿させ遊離脂肪酸を除去した。沈殿物５gを４０ｍＬのクロロホルムに溶解させ、１Ｍ酢酸バッファー（pＨ５．５）１０ｍＬを加え、更に１５００単位のアクチノマジュラ属由来のホスホリパーゼDを添加して４０℃で１８時間攪拌しながら反応を行った。反応液に２０ｍＬの３Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＬの０．１Ｍ  EDTA溶液を添加して４０℃で１時間攪拌を行った。更に２０ｍＬのメタノールを添加して十分攪拌した後、３０００回転、５分間遠心分離してクロロホルム層を集めた。この溶液をロータリーエバポレータで減圧乾固させ環状ホスファチジン酸ナトリウム塩３．８ｇを得た。収率はレシチン含量７０％（１０g中７ｇ）から環状ホスファチジン酸Naを３．８ｇを得たので５４．３％であった。環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の純度分析は、シリカゲルプレートを用い、クロロホルム：メタノール：酢酸：５％二亜硫酸ナトリウム（１００：４０：１２：５、V/V）で展開後、５％酢酸銅：８％燐酸：２％硫酸混合液に短時間浸漬し風乾後、１８０℃で約１０分加熱した後、生成したスポットをスキャナー（アトー社製）法によって行った。即ち、標準品(９７％純度品）をコントロールとして、薄層クロマトグラフのスポットをデンシトメーターにより測定し、面積比で定量した。上記工程で得られた生成物中環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の純度は５４％であった。
【００２５】
実施例２；キレート剤を用いない環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の製造方法
大豆リン脂質（レシチン含量：７０％）（水素未添加物）１０ｇを０．３Ｍ塩化カルシウムを含有する１００ｍＬの１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ６．５）で溶解させた後、６０００単位のストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼA2を添加し、４０℃で１８時間攪拌して反応させた。反応液をpＨ２．５に調整して酵素を失活させた後、１００ｍＬのクロロホルム、５０ｍＬのメタノールを添加して十分攪拌混合し脂質成分を抽出した。クロロホルム層を集め、ロータリーエバポレータで減圧乾固させた。固形分に１００ｍＬのアセトンを加えリン脂質を沈殿させ遊離脂肪酸を除去した。沈殿物５gを４０ｍＬのクロロホルムに溶解させ、１Ｍ酢酸バッファー（pＨ５．５）１０ｍＬを加え、更に１５００単位のアクチノマジュラ属由来のホスホリパーゼDを添加して４０℃で１８時間攪拌しながら反応を行った。反応液に２０ｍＬの３Ｍ塩化ナトリウムを添加して４０℃で１時間攪拌を行った。更に２０ｍＬのメタノールを添加して十分攪拌した後、３０００回転、５分間遠心分離してクロロホルム層を集めた。この溶液をロータリーエバポレータで減圧乾固させ環状ホスファチジン酸ナトリウム塩３．７ｇを得た。収率はレシチン含量７０％（１０g中７ｇ）から環状ホスファチジン酸Naを３．７ｇを得たので５２．９％であった。環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の純度分析は、実施例１記載の方法で行なった。本工程で得られた生成物中環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の純度は５３％であった。
【００２６】
実施例３；高純度環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の製造方法
実施例１で得られた環状ホスファチジン酸ナトリウム塩５００ｍｇを５ｍＬの１０％メタノールを含むクロロホルムに溶解させ、シリカゲルカラムにかけ、同一溶媒で展開、更に２０％メタノールを含むクロロホルムで展開し、１０ｍＬの画分に分取した。実施例１に示したTLC法によって環状ホスファチジン酸ナトリウム塩を含有する画分を確認して集め、ロータリーエバポレータで減圧乾固させ環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の粉末３２０ｍｇを得た。本試料の環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の純度は９５％であった。
【００２７】
実施例４；イオンクロマト法によるナトリウム含量の分析
実施例１及び実施例２で得た環状ホスファチジン酸ナトリウム塩について、イオンクロマト法によってナトリウム含量を測定した。カラムはIonPac  CS14（日本ダイオネクス社製）、移動相は10ｍＭメタンスルホン酸水溶液を用い、流速１．０ｍＬ/分、カラム温度は３０℃、注入量は１０μＬとし、検出は電気伝導度検出器で行なった。標準溶液は陽イオン混合標準液II（Li+ 0.5mg/L, Na+ 2mg/L, NH4+ 2mg/L, K+ 5mg/L, Ca2+ 5mg/L, Mg2+ 5mg/L）を用いた。カラム温度は３０℃、注入量は１０μＬとした。分析の結果、環状ホスファチジン酸と等モルのナトリウムを検出したことから１ナトリウム塩であることがわかった。
【００２８】
実施例５；
実施例３で得られた高純度環状ホスファチジン酸ナトリウムの脂肪酸組成をガスクロマトグラム法により分析した。試料２０ｍｇ／ｍＬになるように塩酸メタノールに溶解し、６５℃で３０分間加温した。室温に戻した後、棟梁の水、次いで棟梁のヘキサンを加えて十分に攪拌混合した。３０００回転、５分間遠心分離を行い、ヘキサン層２μＬをキャピラリーカラムに注入し構成脂肪酸を分析した。分析は以下である。
脂肪酸                含量（％）
パルミチン酸          ２３．９
ステアリン酸          ５.４
オレイン酸            ８．６
リノール酸            ５３．４
リノレン酸            ４．９
その他の脂肪酸        ３．８
【００２９】
実施例６；環状ホスファチジン酸ナトリウム水溶液の状態
実施例１及び実施例２で得た環状ホスファチジン酸ナトリウムの１ｍｇ/ｍＬの水溶液を調製し、６６０ｎｍでの吸光度を測定した。実施例１で得た試料の吸光度は０．０５、実施例２で得た試料の吸光度は０．１５であった。実施例１で得た試料では、キレート剤を用いた製造方法で得た試料であることから、カルシウム塩が存在せずに透明になった。
【００３０】
比較例１；環状ホスファチジン酸ナトリウム水溶液の状態
実施例１に記載した大豆リン脂質の代わりに水素添加大豆リン脂質を用い、実施例１の記載と同様の操作により環状ホスファチジン酸ナトリウムを得た。この環状ホスファチジン酸ナトリウムの１ｍｇ／ｍＬの水溶液を調製し、６６０ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度は０．３３であった。
【００３１】
実施例７：環状ホスファチジン酸ナトリウム塩の製造方法
大豆リン脂質（レシチン含量：７０％）（水素未添加物）１０ｇを０．３Ｍ塩化カルシウムを含有する１００ｍＬの１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ６．５）に溶解させた後、６０００単位のストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼA2を添加し、４０℃で１８時間攪拌して反応させた。反応液をpＨ２．５に調整して酵素を失活させた後、ｐＨを５．５に調整した。次いでこの反応液に１５００単位のアクチノマジュラ属由来のホスホリパーゼＤを添加して４０℃で１８時間攪拌しながら反応を行った。この反応液にヘキサン１００ｍＬを添加し室温で３０分間攪拌抽出を行った。遠心分離によりヘキサン層を集め、これに１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ６．５、０．５Ｍ塩化ナトリウムからなる水溶液５０ｍＬを加え室温で３０分間攪拌した後、遠心分離によりヘキサン層を集め、ロータリーエバポレーターで濃縮させた。これにアセトン５０ｍＬを加え十分攪拌し遠心分離によりアセトン層を除去した。この操作を２回繰り返し遊離脂肪酸を除去した。アセトン不溶物を集め減圧乾燥して環状ホスファチジン酸ナトリウム３．６ｇを得た。