(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１１２番目のアミノ酸残基がＶａｌに置換され、かつ３７８番目のアミノ酸残基がＡｒｇに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるホモログ蛋白質（以下、YwfEホモログ蛋白質という。）のアミノ酸配列において、YwfEホモログ蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列とをアラインメントしたときに、YwｆEホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の１１２番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＶａｌに置換され、かつ３７８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＡｒｇに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ、カルノシン合成活性を有する蛋白質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の蛋白質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３記載のDNAを含有する組換え体DNA。
【請求項５】
請求項４記載の組換え体DNAで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項６】
請求項１または２に記載の蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞の培養物若しくは該培養物の処理物、L-Hisおよびβ-Alaを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にカルノシンを生成、蓄積させ、該媒体からカルノシンを採取することを特徴とするカルノシンの製造法。
【請求項７】
請求項１または２に記載の蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞を培地に培養し、培養物中にカルノシンを生成、蓄積せしめ、該培養物からカルノシンを採取することを特徴とする、カルノシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、N末端側がβ−ＡｌａでありＣ末端側がＬ−Ｈｉｓであるジペプチド（以下、カルノシンと略記）合成活性を有する蛋白質、カルノシン合成活性を有する蛋白質を用いたカルノシンの製造法、カルノシン合成活性を有する蛋白質を生産する微生物または形質転換体を用いたカルノシンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス属に属する微生物が、ＡＴＰと２分子のＬ−アミノ酸からα位カルボキシル基でペプチド結合したジペプチドを生成する酵素、Ｌ−アミノ酸αリガーゼを持つことが報告されている(特許文献１、非特許文献１)。Ｌ−アミノ酸リガーゼ(以下ＬＡＬと略記)はアミノ酸の修飾や特殊な補酵素を必要せずにジペプチドを合成できるので、効率的なジペプチド合成に極めて有用である。
【０００３】
ＬＡＬは比較的広い基質特異性を持ち様々なジペプチドを合成できるが、すべての種類のジペプチドを効率よく合成できるわけではない。β−ＡｌａやＬ−Ｈｉｓを基質とした場合、ジペプチド合成活性は極端に悪くなることが明らかになっている(特許文献１、非特許文献１)。従ってＬＡＬを用いたとしても、カルノシンを効率よく合成する方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第2004/058960号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Bacteriol., 187, 5195-5202 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、カルノシンを高効率に生成する蛋白質、および該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたカルノシンの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の［１］〜［９］に関する。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１１２番目および３７８番目より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質（以下、ＹｗｆＥホモログ蛋白質という。）のアミノ酸配列において、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の１１２番目および３７８番目より選ばれるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
［３］他のアミノ酸残基が、１１２番目はＶａｌおよび３７８番目はＡｒｇである［１］または［２］記載の蛋白質。
［４］１１２番目のアミノ酸残基がＶａｌであり、かつ３７８番目のアミノ酸残基がＡｒｇであるアミノ酸配列からなる［１］または［２］に記載の蛋白質。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
［６］［５］記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
［７］［６］記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
［８］［１］〜［４］のいずれか記載の蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞の培養物若しくは該培養物の処理物、1種または2種のＬ−アミノ酸またはβアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取することを特徴とするジペプチドの製造法。
［９］［１］〜［４］のいずれか記載の蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積せしめ、該培養物から該ジペプチドを採取することを特徴とする、ジペプチドの製造法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、カルノシンを高効率に生成する蛋白質、および該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたカルノシンの製造法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、以下の（１）〜（３）記載のいずれかの蛋白質をあげることができる。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１１２番目および３７８番目より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（２）ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の１１２番目および３７８番目より選ばれるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（３）他のアミノ酸残基が、１１２番目はＶａｌおよび３７８番目はＡｒｇである（１）または（２）記載の蛋白質。
【００１０】
ＹｗｆＥホモログ蛋白質とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチド合成酵素活性を有する蛋白質をいう。
配列番号１で表されるアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を有するとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列とＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列とが、少なくとも80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは98%以上の同一性を有することをいう。
【００１１】
ＹｗｆＥホモログ蛋白質の具体例としては、配列番号２で表されるBacillus subtilisのＢａｃＤ、配列番号３で表される Bacillus amyloliquefaciens FZB42のＢａｃＤ、配列番号４で表される Bacillus amyloliquefaciens のＢａｃＤ、配列番号５で表されるBacillus pumilus ATCC 7061のＢａｃＤ、配列番号６で表されるBacillus pumilus SAFR-032のＢａｃＤ等をあげることができる。
【００１２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と、ＹｗｆＥホモログ蛋白質のアミノ酸配列とのアライメントは、公知のアライメントプログラムClustalW[Nucelic Acids Research 22, 4673, (1994)]を用いて作成することができる。ClustalWは、http://www.ebi.ac.uk/clustalw/(European Bioinformatics Institute)より利用することができる。ClustalWを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いる。
【００１３】
本発明の蛋白質としてより好ましくは、上記（１）〜（３）記載の蛋白質のアミノ酸配列において、１１２番目のアミノ酸残基がＶａｌであり、かつ、３７８番目のアミノ酸残基がＡｒｇであるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、上記１に記載の本発明の蛋白質をコードするDNAをあげることができる。
３．本発明の形質転換体
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体としては、上記２のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体をあげることができる。宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物をあげることができる。
４．本発明のＤＮＡの調製
（１）ジペプチド合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
ジペプチド合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡまたはＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブを用い、Bacillus subtilis 168またはＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを有する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、または配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡもしくはＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、Bacillus subtilis 168もしくはＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを有する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
【００１４】
ＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列は、上記１のYwfEホモログ蛋白質のアミノ酸配列をもとに、またはそれらのGenBank Accession Numberをもとにデータベースを検索し、容易に取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号1で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは98%以上の同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりＹｗｆＥホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
【００１５】
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]、あるいはABI3700DNAアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００１６】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００１７】
上記において、YwfEホモログ蛋白質をコードするDNAとしては、好ましくは配列番号７で表される Bacillus amyloliquefaciens のｂａｃＤで表される塩基配列からなるDNAをあげることができる。
（２）本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該アミノ酸配列の１１２番目または３７８番目のアミノ酸残基のうち、１つ以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に、例えばモレキュラー・クローニング第３版およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換することにより取得することができる。また、同様の方法により、ＹｗｆＥのホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、ＹｗｆＥのホモログ蛋白質とを上記１の方法によってアライメントしたときに、ＹｗｆＥのホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の１１２番目または３７８番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、１つ以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に変異を導入することにより取得することができる。
【００１８】
上記のようにして取得されるＤＮＡとしては、例えば、pQE60ywfE、pQM99E11等が有するジペプチド合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
５．本発明の形質転換体の製造
本発明の形質転換体としては、本発明のＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体をあげることができる。
【００１９】
本発明のＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）、pCR-TRAP（ジーンハンター社製）、pQE-60（キアゲン社製）等をあげることができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ ATCC 12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等をあげることができる。
【００２０】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば、リプレッサー蛋白LacIを発現するプラスミドpREP4(キアゲン社製)を有するエシェリヒア・コリDH5α/pREP4をpQE60ywfE、pQM99E11等を用いて形質転換して得られる形質転換体をあげることができる。
６.本発明の蛋白質の製造法
（１）本発明の蛋白質を生産する形質転換体の製造
本発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産効率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００２１】
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００２２】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pQE-60（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）、pGHA2〔エシェリヒア・コリ IGHA2（FERM B-400）より調製、特開昭60-221091〕、pGKA2〔エシェリヒア・コリ IGKA2（FERM BP-6798）より調製、特開昭60-221091〕、pTerm2（US4686191、US4939094、US5160735）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pRI109（再表2000-44886）、pCE51、pCE52、pCE53［いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)］等をあげることができる。
【００２３】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００２４】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。組換え体ＤＮＡには、本発明のＤＮＡの発現に転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば、pQE60ywfE、pQM99E11等をあげることができる。原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Serratia）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンティコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、バチルス・サチラス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）ATCC14066、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC14067、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）ATCC15354、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.） D-0110等をあげることができるが、好ましくはエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリ XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ MM294、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ GI698、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC6872、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC21170、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC21171等をあげることができる。
【００２５】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭57-186492、特開昭57-18649）、電気穿孔法［例えば、Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993)、Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541 (1999)］、Gene, 17, 107 (1982)およびMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
【００２６】
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００２７】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオマイセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）等をあげることができる。
【００２８】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Methods Enzymol., 194, 182 (1990)）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)）、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163 (1983)）等をあげることができる。
（２）本発明の蛋白質の製造法
上記（１）の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
【００２９】
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物をあげることができる。
【００３０】
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３１】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００３２】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜11に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００３３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００３４】
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
【００３５】
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]、または特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００３６】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【００３７】
本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００３８】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該蛋白質を正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができる。
【００３９】
本発明の蛋白質、あるいは該蛋白質に糖鎖の付加された蛋白質等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいは該蛋白質の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００４０】
このようにして取得される蛋白質として、上記１に記載の蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)]、特開平5-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合蛋白質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００４１】
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
【００４２】
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、アプライドバイオシステムズ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
７．本発明のジペプチドの製造法
上記３の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記１の本発明の蛋白質と１種以上、好ましくは２種のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取することにより、ジペプチドを製造することができる。
（１）本発明の蛋白質を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質に用いられるアミノ酸としては、Ｌ-アラニン（L-Ala）、L-グルタミン（L-Gln）、L-グルタミン酸（L-Glu）、L-バリン（L-Val）、L-ロイシン(L-Leu)、L-イソロイシン(L-Ile)、L-プロリン（L-Pro）、L-フェニルアラニン(L-Phe)、L-トリプトファン（L-Trp）、L-メチオニン（L-Met）、L-セリン（L-Ser）、L-スレオニン（L-Thr）、L-システイン（L-Cys）、L-アスパラギン（L-Asn）、L-チロシン（L-Tyr）、L-リジン（L-Lys）、L-アルギニン（L-Arg）、L-ヒスチジン（L-His）、L-アスパラギン酸（L-Asp）、L-α-Aminobutyric acid、L- Azaserine、L-theanine、L-4-Hydroxyproline、L-3- Hydroxyproline、L-Ornithine、L-Citrulline、L-6-diazo-5-oxo-norleucine、グリシン（Gly）およびβ−アラニン（β-Ala）からなる群より選ばれる１種または２種のアミノ酸の組み合わせを挙げることができる。
上記製造法に用いられる、より好ましいアミノ酸としては、β-AlaとGly、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-HisおよびL-Aspからなる群より選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、特に好ましくは、β-AlaとL-Hisの組み合わせをあげることができる。
【００４３】
上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mg添加する。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源としてＡＴＰを用いることができ、ＡＴＰは、0.5mmol〜10mol/Lの濃度で用いる。
【００４４】
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。
【００４５】
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、式（Ｉ）
R1-R2  （Ｉ）
（ただしR1はL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-Aminobutyric acid、L-Azaserine、L-theanine、L-4-Hydroxyproline、L-3-Hydroxyproline、L-Ornithine、L-Citrulline、L-6-diazo-5-oxo-norleucine、Glyおよびβ-Alaからなる群より選ばれる１種であり、R2はL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-Aminobutyric acid、L-Azaserine、L-theanine、L-4-Hydroxyproline、L-3-Hydroxyproline、L-Ornithine、L-Citrulline、L-6-diazo-5-oxo-norleucine、Glyおよびβ-Alaからなる群より選ばれる１種である）で表される２つのアミノ酸が連結したジペプチド、より好ましくは、式（Ｉ）（ただしR1はβ-Alaであり、R2はL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-AspおよびGlyからなる群より選ばれる１種である）で表される２つのアミノ酸またはその誘導体が連結したジペプチドまたはその誘導体、特に好ましくは、式（Ｉ）（ただし、R1はβ-Alaであり、R2はL-Hisである）で表される２つのアミノ酸が連結したジペプチドをあげることができる。
（２）微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドの製造法
本発明の製造法において酵素源として用いられる微生物または形質転換体の培養物としては、該微生物または形質転換体を上記６の培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などをあげることができる。
【００４６】
形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸としては、上記（１）と同様のアミノ酸をあげることができる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸1mgあたり湿菌体重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。
【００４７】
基質として用いるアミノ酸は、上記（１）と同じように水性媒体中に添加することができる。上記（１）と同様、ＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
水性媒体としては、上記（１）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。
【００４８】
ジペプチドの生成反応の反応条件は、上記（１）と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、上記（１）と同様のジペプチドをあげることができる。
上記（１）および（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
（３）発酵法によるジペプチドの製造法
上記４の方法により得られる組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にジペプチドを生成、蓄積させ、該培養物からジペプチドを採取することにより、ジペプチドを製造することができる。
【００４９】
宿主細胞は、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-Aminobutyric acid、L-Azaserine、L-theanine、L-4-Hydroxyproline、L-3-Hydroxyproline、L-Ornithine、L-Citrulline、L-6-diazo-5-oxo-norleucine、Glyおよびβ-Alaからなる群より選ばれる１種または２種のアミノ酸を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物を用いてもよいが、より好ましくは、β-AlaとL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-AspおよびGlyから選ばれる１種のアミノ酸を生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物を、特に好ましくは、β-AlaとL-Hisを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物を用いることができる。
ただし、本願発明の製造法により、２種の異なるアミノ酸からなるジペプチドを製造する場合であって、用いられる形質転換体が該ジペプチドを構成するアミノ酸うちの１種のアミノ酸を生産する能力しか有していない場合、本発明で用いられる培地に、該形質転換体が生産することができない残りの１種のアミノ酸を添加してもよい。このとき添加するアミノ酸の量は、通常０．５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは２ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌである。
【００５０】
該形質転換体を培地に培養する方法は、微形質転換体の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
【００５１】
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００５２】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００５３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００５４】
上記方法で製造されるジペプチドまたはその誘導体としては、上記（１）と同様のジペプチドまたはその誘導体をあげることができる。
培養物中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００５５】
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
バチルス・サチリス168株由来のアミノ酸リガーゼをコードするＤＮＡ（ｙｗｆＥ）のクローニング
バチルス・サチリス168株(ATCC23857)をLB培地[10g/Lバクトトリプトン(ディフコ社製)、5g/Lイーストエキス（ディフコ社製）、5g/L塩化ナトリウム、20g/Lバクトアガー]に植菌し30℃で一晩静置培養した。培養後、常法に従い、該微生物の染色体ＤＮＡを単離した。
配列番号８および９で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、バチルス・サチリス168株の染色体ＤＮＡを鋳型として、PCRを行った。PCRはpyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコルに従って行った。
上記PCRにより、ｙｗｆＥに相当する約1.4kbpの断片を取得し、常法に従ってこれを発現ベクターpQE60(キアゲン社製)と連結させ、リプレッサー蛋白LacIを発現するプラスミドpREP4(キアゲン社製)を有するエシェリヒア・コリDH5α/pREP4を形質転換した。
得られた形質転換体はpQE60にywfE断片が挿入された構造を有するプラスミドを保持しており、当該プラスミドをpQE60ywfEと命名した。
【実施例２】
【００５７】
変異体酵素の調製
実施例１で得られたプラスミドpQE60ywfEを鋳型とし、配列番号１０および１１で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、エラープローンPCRを行った。
PCRは0.1μgのプラスミドDNA、0.5μmol/Lの各プライマーＤＮＡ、5.0unitのtaq ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、5μLのtaq ＤＮＡポリメラーゼ用X10緩衝液、50μMのMnCl2、200μmol/Lの各NTPを含む反応液50μLを調製し、96℃で10秒、56℃で30秒、72℃で2分の工程を30回繰り返すことにより行った。
上記ＰＣＲにより、ｙｗｆＥに相当する約1.4kbpの断片を取得し、これをpQE60と連結させ、エシェリヒア・コリDH5α/pREP4を形質転換した後、得られた形質転換体を100μg/Lのアンピシリン、および50μg/Lのカナマイシンを含む0.1mlのLB培地の入った96穴マルチウェルプレートに接種し30℃で20時間培養した。該培養液に30%グリセロール溶液を0.05mlずつ添加し、よく混合して-80℃で凍結させこれを保存菌株とした。
上記の保存菌株を解凍して100μg/Lのアンピシリン、および50μg/Lのカナマイシン、0.25mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を含む0.5mlのLB培地の入った96穴マルチウェルプレートに接種し30℃で20時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体をバグバスター（ノバジェン社製）0.15ｍｌで懸濁し10分間処理し、該処理液から遠心分離により菌体を除去し、蛋白質の漏出した上清を得た。
【００５８】
0.1 M硫酸ニッケルで前処理したキレートレジンChelating SepharoseTM Fast Flow（アマシャム・バイオサイエンス）の懸濁液を96穴フィルタープレート（MultiScreen-DV MADVN6510 ミリポア社製）に1wellあたり100μLずつ分注したものを用い、以下のような手順でHisタグ付加組換え酵素を精製した。
まず、上記で得た菌体抽出液100μLを、レジンを分注したフィルタープレートに通し、各ウェルを200μLの水で2回洗浄した。次に50mMのMOPS(pH6.2)、300mMのNaCl、100mMのイミダゾールを含む溶液を100μL×3回通し、レジンに吸着した夾雑蛋白質を除いた。最後に50mMのMOPS(pH6.2)、300mMのNaCl、350mMのイミダゾールを含む溶液を50μL×2回通してHisタグ融合蛋白質を96穴マイクロプレート上に溶出した。
得られた酵素溶液の蛋白質量はプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用い、添付の説明書の方法に従って測定した。上記の方法で0.1-0.4mg/ml程度の変異型酵素溶液を各々約100μＬずつ得ることができた。
【実施例３】
【００５９】
野生型酵素より反応性が高まった変異型酵素の取得
実施例２で調製した変異酵素ライブラリーを用い、以下のようにして基質特異性が変化した酵素を探索した。
各125mMのβ-AlaおよびL-Hisを含む溶液8μＬ、10mMのATP・２Na、100mMのMgSO4、200mMのTris-HCl（pＨ8.5）を含む溶液10μＬ、精製酵素溶液2μＬを混合して反応液を調製し、37℃で2時間ジペプチド合成反応を行った。反応後、リン酸定量試薬（ホスファC-テストワコー；和光純薬社製）150μＬを加え、37℃、20分発色反応を行い、750nmにおける吸光度をマイクロプレート・リーダーModel3550(バイオラッド社製)によって測定した。吸光度をもとに、反応によって生成したリン酸量を計算し、蛋白質量あたりのリン生成量が野生型酵素に比べ大幅に高い酵素を探索した。その結果、野生型酵素では酵素1μgあたり0.005(μmol/μg/2hr)のリン酸が生成したのに対し、3300の変異酵素の中の１つでは酵素1μgあたり0.037(μmol/μg/2hr)のリン酸が生成し、大幅なジペプチド合成活性の向上が認められた。
該変異酵素を99E11と、99E11を発現するプラスミドをpQM99E11と命名した。
【００６０】
pQM99E11を用いてエシェリヒア・コリDH5α/pREP4を形質転換して得られる、変異酵素99E11を高発現するエシェリヒア・コリDH5α/pREP4/pQM99E11をＬＢ培地に塗布し30℃で一晩生育させた後に、これを0.25ｍＭのIPTG、100μｇ/ Lのアンピシリン、50μg/Lのカナマイシンを含むＴB培地[12g/Lバクトトリプトン(ディフコ社製)、24g/Lイーストエキス（ディフコ社製）、4ｍＬ/Lグリセロール、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4]に植菌し３０℃で２０時間培養した。該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、該湿菌体から、HisTrap（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて、添付の説明書に従いHisタグ付加組換え型酵素を精製した。
精製したHisタグ付加型組換え酵素10μｇ、100mmol/LのTris-HCl(pH8.0)、30mmol/LのMgSO4、10mmol/LのATP・2ナトリウム、各30mmol/Lのβ-AlaおよびL-Hisからなる0.2ｍＬの反応液を調製し、３７℃で２時間ジペプチド合成反応を行った。反応後、生成したカルノシンの蓄積量をＢａｎｋらの方法［Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４０，１６７（１９９６）]に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を表1に示す。
【００６１】
【表１】
0005951953.tif 000002
【００６２】
上記の表１に示すとおり、変異酵素９９E１１はβ-AlaとL-Hisの組み合わせを基質とするカルノシン生成反応において、野生型酵素より高い活性を示すことがわかった。
また、ｐQM99E11が有するDNA断片について塩基配列を決定したところ、変異酵素９９E１１のアミノ酸配列には、野生型酵素のアミノ酸配列において１１２番目のIle残基がVal残基に、３７８番目のHis残基がArg残基に置換されていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明により、カルノシンを高効率に生成する蛋白質、および該蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたカルノシンの製造法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
0005951953000001.app