(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカゲル充填剤が充填されたカラムに、酸性バッファと、気体又はｐＨ６〜７の液体と、ラベル化アミノ酸を含むｐＨ９以上の試料液とをこの順で導入することを含む、液体クロマトグラフによるプレラベルアミノ酸分析法。
【請求項２】
前記酸性バッファの体積（Ｖａ）は、前記試料液の体積（Ｖｓ）に対する比（Ｖａ／Ｖｓ）で表して、０．５〜１の範囲である、請求項１のプレラベルアミノ酸分析法。
【請求項３】
前記気体の体積（Ｖｇ）は、前記酸性バッファの体積（Ｖａ）に対する比（Ｖｇ／Ｖａ）で表して、１〜２の範囲である、請求項１又は２のプレラベルアミノ酸分析法。
【請求項４】
前記ｐＨ６〜７の液体の体積（Ｖｌ）は、前記酸性バッファの体積（Ｖａ）に対する比（Ｖｌ／Ｖａ）で表して、０．５〜１の範囲である、請求項１又は２のプレラベルアミノ酸分析法。
【請求項５】
移動相は、ｐＨ６〜７のものである、請求項１〜４のいずれかのプレラベルアミノ酸分析法。
【請求項６】
前記カラムの内径は、２〜４．６ｍｍである、請求項１〜５のいずれかのプレラベルアミノ酸分析法。
【請求項７】
前記ラベル化アミノ酸は、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）によってラベル化されたアミノ酸誘導体である、請求項１〜６のいずれかのアミノ酸分析法。
【請求項８】
前記酸性バッファが、リン酸バッファである、請求項１〜７のいずれかのプレラベルアミノ酸分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＰＬＣによる自動プレラベルアミノ酸分析に関する。より具体的には、本発明は、改良された試料注入法を含むプレラベルアミノ酸分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）によるアミノ酸プレラベル分析には高い分離能が要求される。このため、分離には高性能のシリカゲルを基材とした充填剤を充填したカラムが用いられることが多い。
【０００３】
ＯＰＡによるアミノ酸のラベル化は、ｐＨの高いアルカリ条件（具体的にはｐＨ１０前後）下で効率的に進行する。このためラベル化反応が終わった試料はアルカリ性を呈している。分離に際しては、アルカリ性のまま試料をカラムに注入することがある。あるいは、アルカリ性試料が分析カラムに対して負荷が大きいため、あらかじめ酸性溶液で中性付近までｐＨ調整した後にカラムに注入することもある。
【０００４】
非特許文献１（アジレンド・テクノロジーズ、“improved Amino Acid Methods using Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 Columns for a Variety of Agilent LC Instrumentation and Separation Goals”）に記載のＯＰＡによるアミノ酸プレラベル分析方法は、カラムにリン酸水溶液及びＯＰＡラベル化アミノ酸試料をこの順番で導入するものであり、移動相にはｐＨ８．２のバッファを用いている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】アジレンド・テクノロジーズ、“improved Amino Acid Methods using Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 Columns for a Variety of Agilent LC Instrumentation and Separation Goals”、［online］、［平成２４年６月２５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5990-4547EN.pdf＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アミノ酸プレラベル分析においてアルカリ性の試料溶液をカラムに直接注入した場合、シリカゲルベースのカラムが加水分解を起こすために、カラム寿命が短くなる傾向がある。一方、アルカリ性試料溶液をあらかじめ酸性溶液を混合することにより中性付近まで下げ、その後カラムに注入した場合、ラベル化反応で生成したＯＰＡラベル化アミノ酸が不安定になって分解を起こし、定量分析での十分な信頼性を確保することができない。
【０００７】
非特許文献１に記載のアミノ酸プレラベル分析においては、最初に溶出する物質のピークが崩れやすい問題がある。
【０００８】
そこで本発明の目的は、ＯＰＡラベル化アミノ酸試料の分解を抑制しつつ、カラム寿命の短命化を抑制し、且つ良好なピークの検出も可能である、ＯＰＡアミノ酸プレラベル分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＯＰＡラベル化試料の注入に先立って酸性バッファをカラムに注入し、且つ、ＯＰＡラベル化試料と酸性バッファとを接触させないことによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  シリカゲル充填剤が充填されたカラムに、酸性バッファと、気体又はｐＨ６〜７の液体と、ラベル化アミノ酸を含むｐＨ９以上の試料液とをこの順で導入することを含む、液体クロマトグラフによるプレラベルアミノ酸分析法。
【００１１】
本発明においては、液体クロマトグラフ装置のカラムへの試料液導入に際して、アルカリ性試料液の導入に先だって酸性バッファを導入し、且つ、アルカリ性試料液と酸性バッファとを接触させないために、両液体の間に気体又は中性の液体を介在させる。
【００１２】
（２）  前記酸性バッファの体積（Ｖａ）は、前記試料液の体積（Ｖｓ）に対する比（Ｖａ／Ｖｓ）で表して、０．５〜１の範囲である、（１）のプレラベルアミノ酸分析法。
【００１３】
（３）  前記気体の体積（Ｖｇ）は、前記酸性バッファの体積（Ｖａ）に対する比（Ｖｇ／Ｖａ）で表して、１〜２の範囲である、（１）又は（２）のプレラベルアミノ酸分析法。
【００１４】
（４）  前記ｐＨ６〜７の液体の体積（Ｖｌ）は、前記酸性バッファの体積（Ｖａ）に対する比（Ｖｌ／Ｖａ）で表して、０．５〜１の範囲である、（１）又は（２）のプレラベルアミノ酸分析法。
【００１５】
（５）  移動相は、ｐＨ６〜７のものである、（１）〜（４）のいずれかのプレラベルアミノ酸分析法。
【００１６】
（６）  前記カラムの内径は、２〜４．６ｍｍである、（１）〜（５）のいずれかのプレラベルアミノ酸分析法。
【００１７】
（７）  前記ラベル化アミノ酸は、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）によってラベル化されたアミノ酸誘導体である、（１）〜（６）のいずれかのプレラベルアミノ酸分析法。
【００１８】
（８）  前記酸性バッファが、リン酸バッファである、（１）〜（７）のいずれかのプレラベルアミノ酸分析法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、ＯＰＡラベル化アミノ酸などのプレラベル化アミノ酸試料液が酸性緩衝液と接触することなくＨＰＬＣに注入されるため、ＯＰＡラベル化アミノ酸の分解が抑制される。さらに、アルカリ性であるＯＰＡラベル化アミノ酸試料液の通過前に酸性緩衝液をシリカゲル充填剤に接触させることにより、酸性緩衝液が接触した充填剤近傍のｐＨが低下する。これによって、その後通過する試料液のアルカリ性に対するシリカゲル充填剤の耐久性が向上する。また、酸性緩衝液をシリカゲル充填剤に接触させるタイミングがアルカリ性であるＯＰＡラベル化アミノ酸試料液の通過前であることにより、試料から検出されるピークの崩壊を抑制することもできる。
【００２０】
すなわち、本発明により、ＯＰＡラベル化アミノ酸などのプレラベル化アミノ酸試料の分解を抑制しつつ、カラム寿命の短命化を抑制し、且つ良好なピークの検出が可能である、プレラベルアミノ酸分析法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明を実施することができるオートサンプラーの一例の構成を液体クロマトグラフとともに概略的に示した流路構成図である。
【図２】比較例１における、カラムへの注入前にＯＰＡラベル化アミノ酸試料液に対してリン酸水溶液添加を行った場合の試料劣化の経過観察の結果である。
【図３】実施例１における連続試験の結果を示すクロマトグラムである。
【図４】比較例２における連続試験の結果を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明において分析に供される試料液は、ラベル化アミノ酸を含むアルカリ性の液体である。具体的には、試料液の具体的なｐＨは、ラベル化アミノ酸が安定的に存在することができるｐＨ９．０以上である。ラベル化アミノ酸は、このようなアルカリ性条件下でのみ溶解するアミノ酸誘導体であることが好ましい。例えば、アミノ酸分析用の代表的なプレカラム誘導体化試薬でのラベル化により得られるアミノ酸誘導体でありうる。プレカラム誘導体化試薬は、カラムクロマトグラフィ後における検出手段に応じて、当業者が適宜選択することができる。プレカラム誘導体化試薬の例としては、ｏ−フタルアルデヒド（OPA）、フェニルイソチオシアネート（PITC）、フルオレサミン、ダンシルクロライド、2,4-ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）、及びＮα（2,4-ジニトロ-5-フルオロフェニル）-L-アラニンアミド（FDAA）等が挙げられる。
【００２３】
このように本発明においては、カラムへの導入以前にアミノ酸がラベル化されている。アミノ酸ラベル化では、通常、疎水性の高い官能基が付与される。このため、逆相法による分離を行うことができる。具体的には、カラムとして、シリカゲル充填剤が充填されたものを用いることができる。
【００２４】
カラムのサイズは、内径が２．０〜４．６ｍｍであることが好ましく、３．０ｍｍであることがさらに好ましい。このような範囲の内径を有するカラムであれば、良好な分離能が得られる。カラムの長さは特に限定されるものではないが、例えば５０〜１５０ｍｍである。
【００２５】
本発明においては、試料液をカラムに導入する前に酸性バッファを導入する。酸性バッファのｐＨは、例えば２〜４、好ましくは２．１〜２．５である。この範囲のｐＨであれば、酸性緩衝液が接触したカラム充填剤近傍のｐＨを十分に低下させ、アルカリ性試料液に対するカラム充填剤の劣化を効果的に防ぐことができる。酸性バッファの例としては、リン酸バッファが挙げられる。
【００２６】
さらに、試料液と酸性バッファとを互いに接触させないために、酸性バッファの導入と試料液の導入との間に、気体又は中性液体を導入して両液体間にスペーサ的に介在させる。すなわち、カラムへは、酸性バッファ、気体又は中性液体、及び試料液をこの順で導入する。
【００２７】
気体は、不活性ガス、その他の分析系へ化学的な影響を及ぼさない純粋な気体であってもよいが、通常、空気で足りる。中性液体は、ｐＨが例えば６〜７のものである。中性液体は、バッファであることが好ましい。具体的には、本発明の分析系で移動相に用いられる液体を用いることができる。
【００２８】
本発明の移動相に用いられる液体は、ｐＨ６以上、好ましくは６〜７の中性バッファであることが好ましい。中性バッファの例としては、リン酸バッファが挙げられる。
【００２９】
試料液の導入量は、分離能の観点から例えば１〜５μＬ、好ましくは１〜２μＬである。試料液の導入量は、カラムの内径によって当業者が適宜選択することができる。より具体的には、内径が２〜３ｍｍのカラムを用いる場合の試料液の導入量は、１〜２μＬでありうる。内径が上記範囲を超えるカラムを用いる場合の試料液の導入量は、例えば５μＬとしてもよい。
【００３０】
酸性バッファの導入量（Ｖａ）は、前記試料液の体積（Ｖｓ）に対する比（Ｖａ／Ｖｓ）で表して、例えばＶａ／Ｖｓ＝０．５〜１の範囲、好ましくはＶａ／Ｖｓ＝１である。この範囲の酸性バッファの導入量によって、酸性バッファが接触した充填剤近傍のｐＨが低下させ、その後通過する試料液のアルカリ性に対するシリカゲル充填剤の耐久性が向上する。
【００３１】
気体又はｐＨ６〜７の中性液体は、試料液と酸性バッファとの接触を防ぐ目的で両液体間にスペーサ的に介在するものであるため、最低限の量があれば足りる。中性液体の導入量（Ｖｌ）は、前記酸性バッファの体積（Ｖａ）に対する比（Ｖｌ／Ｖａ）で表して、例えばＶｌ／Ｖａ-＝０．５〜１の範囲、好ましくはＶｌ／Ｖａ＝１とすることができる。気体の導入量（Ｖｇ）は、加圧条件下で流路内を輸送されることを考慮すると中性液体を用いる場合よりも多いことが好ましく、例えば前記酸性バッファの体積（Ｖａ）に対する比（Ｖｇ／Ｖａ）で表して、常圧時において、例えばＶｇ／Ｖａ＝１〜２の範囲、好ましくはＶｇ／Ｖａ＝２とすることができる。
【００３２】
本発明を実施することができる液体クロマトグラフの分析流路においては、酸性バッファと、気体又は中性液体と、試料液とは、オートサンプラによって自動的にカラムに導入されることができる。オートサンプラは、試料液を収容する容器、中性液体を収容する容器、及び酸性バッファを収容する容器内に順番にニードルを挿入し、計量ポンプによって所定量の試料液、中性液体（又は気体）及び酸性バッファ液体をこの順番で吸入し、吸入したそれら液体（又は液体及び気体）を液体クロマトグラフのカラムに注入することで導入するように構成される。
【００３３】
図１にオートサンプラの一例を液体クロマトグラフとともに示す。
このオートサンプラは、低圧バルブ１１及び高圧バルブ１２の切替えと、計量ポンプ１６の駆動と連動したニードル１３の駆動とによって、試料液等（すなわち、試料液１５ａ、気体又は中性液体１５ｂ、及び酸性バッファ１５ｃ）吸入工程、分析カラム２６への試料液等導入工程、ニードル１３の洗浄工程、洗浄ポート１４からの洗浄液排出及び洗浄液補充工程を実行するための流路が構成される。
【００３４】
計量ポンプ１６は低圧バルブ１１に流路により接続されている。低圧バルブ１１は、計量ポンプ１６の吸入口１６ａと流路により接続された中央の共通ポートＧのほか、高圧バルブ１２のポートｂと流路により接続されたポートＡ、計量ポンプ１６の吐出口１６ｂと流路により接続されたポートＢ、洗浄液を収容した容器１８ａ、１８ｂ及び１８ｃに脱気ユニット２７を介してそれぞれ流路により繋がるポートＣ、Ｄ及びＥ、及び洗浄ポート１４に流路により繋がるポートＦを備えている。低圧バルブ１１は、共通ポートＧをＡ〜Ｆのポートのうちいずれか１つのポートに接続することができ、またそれとは異なるタイミングで、Ａ〜Ｆのポートのうち任意のポート間を接続することができる。
【００３５】
計量ポンプ１６の吸入口１６ａは、マニュアルプライム用バルブ１９を介して低圧バルブ１１の共通ポートＧに流路により接続されている。計量ポンプ１６の吐出口１６ｂは、低圧バルブ１１のポートＢに流路により接続されている。
【００３６】
高圧バルブ１２は、ニードル１３に流路により繋がるポートａ、低圧バルブ１１のポートＡと流路により接続されたポートｂ、ドレイン流路２０が接続されたポートｃ、注入ポート２１に流路により繋がるポートｄ、液体クロマトグラフの分析流路を構成する流路が接続されたポートｅ及びｆを備えている。高圧バルブ１２は隣接するポート間の接続を切り替えるものである。具体的には、ポートａ−ｂ間、ｃ−ｄ間，ｅ−ｆ間を接続した状態と、ポートｂ−ｃ間、ｄ−ｅ間、ｆ−ａ間を接続した状態との間で切り替えるものである。図１ではポートｂ−ｃ間及びｄ−ｅ間を接続した状態となっている。なお、図１では、高圧移動相の各流路ＣHPを太線で強調表示している。
【００３７】
ニードル１３は、試料液を収容した容器１５ａの位置、中性液体を収容した容器１５ｂの位置、酸性バッファを収容した容器１５ｃの位置、洗浄ポート１４の位置及び注入ポート２１の位置の間で移動することができる。高圧バルブ１２のポートａとニードル１３とを繋ぐ流路上に、ニードル１３の先端から吸入した液を滞留させるサンプルループ１７が設けられている。
【００３８】
ドレイン流路２０はこのオートサンプラの流路内の液を外部へ排出するための流路であり、ドレインバルブ２２により開閉される。
【００３９】
例えば試料液の吸入時は、ニードル１３が試料液を収容した容器１５ａ内に挿入された状態で、低圧バルブ１１が、計量ポンプ１６の吸入口１６ａが接続されている共通ポートＧとポートＡとの間を接続した状態にされ、さらに高圧バルブ１２がポートａ−ｂ間を接続した状態にされる。この状態で計量ポンプ１６を吸引駆動することにより、ニードル１３の先端から試料液が吸引され、高圧バルブ１２のポートａとニードル１３とを接続する流路上に設けられたサンプルループ１７内に試料液が滞留する。
【００４０】
また、洗浄ポート１４への洗浄液の補充時は、計量ポンプ１６の吸入口１６ａが接続されている共通ポートＧと洗浄液収容容器１８ａ、１８ｂ及び１８ｃにそれぞれ繋がる各ポートＣ、Ｄ及びＥのいずれかとを接続した状態として、計量ポンプ１６の吐出口１６ｂが接続されたポートＢとポートＦとを接続した状態として、計量ポンプ１６を駆動することにより、洗浄ポート１４に洗浄液が吐出される。
【００４１】
高圧バルブ１２のポートｆには、移動相Ａ及び移動相Ｂがそれぞれ収容された容器２３ａ及び２３ｂから、脱気ユニット２８を介して脱気された移動相を、それぞれ送液ユニット２４ａ及び２４ｂによって汲み上げ、ミキサ２５で混合して送液するための流路が接続されている。高圧バルブ１２のポートｅには、分析カラム２６を備えた流路が接続されている。
【００４２】
上記の図は一例であり、種々の変更が可能である。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００４４】
［ＯＰＡラベル化アミノ酸試料液の調製］
グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、リジン、アルギニン、プロリンなどを含むアミノ酸混合標準液を、常法により、塩基性、２−メルカプトエタノール存在下において、ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）と反応させ、ＯＰＡラベル化アミノ酸試料液を得た。このＯＰＡラベル化アミノ酸試料液を、以下の実施例及び比較例で用いた。
【００４５】
［比較例１］
本比較例では、カラムへの注入前にＯＰＡラベル化アミノ酸試料液に対してリン酸水溶液添加を行った場合の試料劣化の経過観察を行った。
【００４６】
上記ＯＰＡラベル化アミノ酸試料液に、１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水溶液２０μＬを添加し、全量が１０５．５μＬの試料混合液を調製した。この試料混合液においては、著しいアミノ酸の劣化を確認した。
【００４７】
別途、上記ＯＰＡラベル化アミノ酸試料液に、１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水溶液１０μＬを添加し、全量が９０μＬの試料混合液を調製した。この試料混合液を、ＨＰＬＣ（島津製作所製、超高速液体クロマトグラフＮｅｘｅｒａ）に連続して６回注入した。１分析当たりの時間は、８．５分であった。図２に、注入回数と、グリシンピークの面積値の変化との関係を示すグラフを示す。図２に示すように、１回の分析ごとにグリシンピーク面積値は３〜４％減少した。
【００４８】
［実施例１］
図１のオートサンプラ及び液体クロマトグラフ（島津製作所製、超高速液体クロマトグラフＮｅｘｅｒａ）を用いた。ニードル１３で、まず上記ＯＰＡラベル化アミノ酸試料液１．０μＬを吸引し、次に移動相液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸バッファ（ｐＨ６．５）］を０．５μＬ吸引し、最後に酸性リン酸緩衝液（ｐＨ２．１）を１．０μＬ吸引した。その後、分析カラムにそれらの液を、酸性リン酸緩衝液（ｐＨ２．１）、リン酸バッファ（ｐＨ６．５）、ＯＰＡラベル化アミノ酸試料液の順で注入することにより導入した。ＯＰＡラベル化アミノ酸試料液と、酸性リン酸緩衝液とは混合されない。
【００４９】
上記試験を連続して行うことによって得られたクロマトグラムを図３に示す。横軸：保持時間（ｍｉｎ）、縦軸：蛍光強度（μＶ）。また、注入回数とヒスチジン理論段数との関係を表１に示す。
【００５０】
【表１】
0006040896.tif 000002
【００５１】
図３及び表１に示すように、注入５００回目であってもカラムの劣化が抑えられ、各アミノ酸に対応する良好なピークが得られた。
【００５２】
［比較例２］
酸性リン酸緩衝液の吸引及び分析カラムへの注入を行わなかったことを除いて、実施例１と同様の操作を行った。連続試験によって得られたクロマトグラムを図４に示す。また、注入回数とヒスチジン理論段数との関係を表２に示す。
【００５３】
【表２】
0006040896.tif 000003
【００５４】
図４及び表２に示すように、注入４０回を超えるとカラムの劣化が激しくなり、各アミノ酸に対応する良好なピークが得られなくなった。
【図１】
0006040896.tif 000004
【図２】
0006040896.tif 000005
【図３】
0006040896.tif 000006
【図４】
0006040896.tif 000007