(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＸＶ）：
【化１】
0005933163.tif 000176
［式中、
Ｌ１及びＬ２は共に化学結合であり、
Ｒ１及びＲ２は共に同一長さを有する無置換Ｃ１０−Ｃ１８直鎖アルキルであり、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ−、又は−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−であり、
ｍは０〜１１の整数であり、
ｎは１〜５００の整数である］
の化合物。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が共にＣ１４アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式ＸＶがラセミ混合物を表す請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式ＸＶが鏡像異性的に純粋な「Ｒ」異性体を表す請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
式ＸＶが鏡像異性的に純粋な「Ｓ」異性体を表す請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
以下の式（ＸＶ’）：
【化２】
0005933163.tif 000177
の化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘが−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ｍが１〜１０の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
ｎが１〜５００の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物が以下の式（ＸＶＩ）：
【化３】
0005933163.tif 000178
［式中、反復ＰＥＧ部位は２０００の平均分子量を有し、ｎの値は４２及び４７の間にある］
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
式ＸＶＩの前記化合物が好ましい絶対立体配置「Ｒ」を持つ立体異性体である、請求項１０に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸ベースの治療法を投与するのに有用な組成物及び方法、例えば、リポソーム及びリポプレックスのような会合複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸ベースの療法を用いる機会はかなりの有望性を有しており、現在の伝統的な医学では取り組むことができない医学的問題に対する解決を提供する。増大する数の病気関連遺伝子の位置及び配列は同定されつつあり、種々の病気についての核酸ベースの療法の臨床試験が今日進行中である。
【０００３】
核酸を細胞に導入する一つの方法は、直接的にマイクロインジェクションを用いる機械的なものである。しかしながら、この方法は、一般には、患者への全身投与では効果的でない。
【０００４】
核酸療法の全身送達は、核酸を標的細胞に分配し、次いで、標的細胞の膜を横切って、無傷、かつ治療的方法で機能することができる形態で核酸を移動させることを必要とする。
【０００５】
ウィルスベクタは、いくつかの場合において、核酸ベースの治療法を投与するために、臨床において成功裏に用いられてきた。しかしながら、ウィルスベクタは細胞膜を横切って核酸を輸送する固有の能力を有するが、それらは危険をもたらしかねない。一つのそのような危険は患者染色体へのウィルスゲノム配列のランダムな組込みを含み、潜在的に、ゲノムを損傷し、かつ恐らくは、悪性形質転換を誘導する。もう１つの危険性は、ウィルスベクタが野生型ウィルスでの突然変異又は遺伝子交換いずれかを通じて病原性遺伝子型に復帰し得ることである。
【０００６】
脂質ベースのベクタもまた、核酸療法で用いられており、二つの方法のうち一つで調製されてきた。一つの方法において、核酸は、カチオン性脂質及び中性脂質の混合物から作成された予め形成されたリポソーム又はリポプレックスに導入される。かくして形成された複合体は規定されておらず、かつ複雑な構造を有し、トランスフェクション効率は血清の存在によって著しく低下する。第二の方法は、中性脂質の存在なくしてモノ−又はポリ−カチオン性脂質とのＤＮＡ複合体の形成を含む。これらの複合体はエタノールの存在下で調製され、水中で安定ではない。加えて、これらの複合体は血清によって悪影響を受ける（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−７８（１９９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ポリアミン化合物又は本明細書中に記載された脂質部位を含む新規な製剤を特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は１つ以上の化合物を含む製剤を特徴とし、各々、式（Ｉ）：
【００１０】
【化１】
0005933163.tif 000002
［式中、
各Ｘａ及びＸｂは、各出現について、独立してＣ１−６アルキレンであり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、各Ｒは独立してＨ、
【００１１】
【化２】
0005933163.tif 000003
であり、
式中、製剤中の式（Ｉ）の化合物の分子の少なくとも約５０％におけるＲ部位の少なくともｎ＋２（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は実質的に全て）はＨではなく、
ｍは、１，２，３又は４であり、ＹはＯ、ＮＲ２、又はＳであり、
Ｒ１はアルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、その各々は、所望により１以上の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ２はＨ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、その各々は所望により置換されており、その各々は、所望により１以上の置換基で置換されていてもよく、
但し、もしｎ＝０であれば、Ｒ部位の少なくともｎ＋３はＨではない］
によって規定される構造、又はその医薬上許容される塩を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＲがＨではない場合、ＲはＲａであり、例えば、ＲがＨではない場合、Ｒは各出現についてＲａである。
いくつかの実施形態において、ＲがＨでない場合、ＲはＲｂであり、例えば、ＲがＨではない場合、Ｒは各出現についてＲｂである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＲがＨではない場合、ＲはＲｃであり、例えば、ＲがＨではない場合、Ｒは各出現についてＲｃである。
いくつかの実施形態において、ＲがＨでない場合、ＲはＲｄであり、例えば、ＲがＨでない場合、Ｒは各出現についてＲｄである。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＲがＨでない場合、ＲはＲｅであり、例えば、ＲがＨでない場合、Ｒは各出現についてＲｅである。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のＲ部位のｎ＋２はＨでなない。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のＲ部位のｎ＋３はＨではない。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のＲ部位のｎ＋４はＨではない。
【００１５】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のＲ部位のｎ＋１はＨではない。
いくつかの実施形態においてｎ＞０であり、式（Ｉ）のＮＲの少なくとも１つのＲはＨである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のＮＲ２の少なくとも１つのＲはＨである。
いくつかの実施形態において、分子の少なくとも８０％は単一の構造異性体である。例えば、式（Ｉ）のＲ部位のｎ＋２はＨではなく、あるいは式（Ｉ）のＲ部位のｎ＋３はＨではなく、あるいは式（Ｉ）のＲ部位のｎ＋４はＨではない。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ｎは２又は０である。
いくつかの実施形態において、Ｘａ及びＸｂはＣ２アルキレンである。
いくつかの実施形態において、ｎはＯであって、Ｘｂはエチレン又はプロピレンである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ｎ＞１であって、Ｘａは少なくとも１つの出現に伴って変化する。
いくつかの実施形態において、ＲがＨでない場合、Ｒは、
【００１９】
【化３】
0005933163.tif 000004
である。例えば、ＹはＯ又はＮＲ２であり得る。いくつかの実施形態においてｍは２である。いくつかの実施形態において、ＹはＯ又はＮＲ２であって、ｍは２である。いくつかの実施形態においてｍは１である。いくつかの実施形態において、ｍは１であって、ＹはＯ又はＮＲ２である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの出現についてＲ１はアルキルであり、例えば、各出現についてＲ１はアルキルである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現について、Ｒ１はアルキルであって、Ｒ２はＨである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現についてＲ１及びＲ２はアルキルである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの出現についてＲ１はアルケニルである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの出現についてＲ１はアルケニルである。
いくつかの実施形態において、ＲがＨでない場合、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現についてＲはＲａであって、ＹはＯ又はＮＨである。いくつかの実施形態において、ＹはＯである。いくつかの実施形態において、ＹはＮＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアルキル、例えば、Ｃ１０−３０アルキル又はＣ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、ｎは２である。いくつかの実施形態において、各出現についてＸａはＣ２アルキレンであって、ＸｂはＣ２アルキレンである。いくつかの実施形態において、ｍは２である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ｎは２であって、Ｒは、ＲがＨでない場合、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現についてＲａである。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアルキル、例えば、Ｃ１０−１８アルキル、又はＣ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、ＹはＯであるか、ＹはＮＨである。いくつかの実施形態において、各出現についてＸａはＣ２アルキレンであって、ＸｂはＣ２アルキレンである。いくつかの実施形態において、ｍは２である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ＮＲの少なくとも１つのＲはＨであって、Ｈでない場合、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現についてＲａであって、ＹはＯ又はＮＨである。いくつかの実施形態において、ＹはＯであるか、あるいはＹはＮＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアルキル、例えば、Ｃ１０−１８アルキル又はＣ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、ｎは２である。いくつかの実施形態において、各出現についてＸａはＣ２アルキレンであって、ＸｂはＣ２アルキレンである。いくつかの実施形態において、ｍは２である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ｎは２であって、ＮＲの少なくとも１つのＲはＨであり、ＲがＨでない場合、Ｒは、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現についてＲａであって、ＹはＯ又はＮＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアルキル、例えば、Ｃ１０−１８アルキル又はＣ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、ＹはＯであるか、あるいはＹはＮＨである。いくつかの実施形態において、各出現についてＸａはＣ２アルキレンであって、ＸｂはＣ２アルキレンである。いくつかの実施形態において、ｍは２である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＮＲ２の少なくとも１つのＲはＨであって、Ｒは少なくとも１つの出現について、例えば、各出現についてＲａであり、また、ＹはＯ又はＮＨである。いくつかの実施形態において、ＹはＯであるか、あるいはＹはＮＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアルキル、例えば、Ｃ１０−３０アルキル、Ｃ１０−１８アルキル又はＣ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、ｎは２である。いくつかの実施形態において、各出現についてＸａはＣ２アルキレンであって、ＸｂはＣ２アルキレンである。いくつかの実施形態においてｍは２である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ｎは２であって、ＮＲ２の少なくとも１つはＨであって、Ｒは、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現についてＲａであり、また、ＹはＯ又はＮＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアルキル、例えば、Ｃ１０−１８アルキル又はＣ１８アルキルである。いくつかの実施形態において、ＹはＯであるか、あるいはＹはＮＨである。いくつかの実施形態において、各出現についてＸａがＣ２アルキレンであって、ＸｂはＣ２アルキレンである。いくつかの実施形態において、ｍは２である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、製剤は以下の式の１つ又は混合物を含み、以下の式において特定されない限りＲはＨではない。
【００２９】
【化４】
0005933163.tif 000005
いくつかの実施形態において、製剤は実質的に以下の式の１つ又は混合物よりなる。
【００３０】
【化５】
0005933163.tif 000006
いくつかの実施形態において、各Ｒは
【００３１】
【化６】
0005933163.tif 000007
である。いくつかの実施形態において、各Ｒは
【００３２】
【化７】
0005933163.tif 000008
である。いくつかの実施形態において、Ｒ１はＣ１０−Ｃ１８アルキル（例えば、Ｃ１２アルキル）、又はＣ１−Ｃ３０アルケニルである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、Ｒは
【００３４】
【化８】
0005933163.tif 000009
である。いくつかの実施形態において、Ｒ１はＣ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１はＣ１２アルキルであって、Ｒ２はＨである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ｎは０であって、Ｘはプロピレンである。いくつかの実施形態において、１つのＲはＨである。いくつかの実施形態において、ＲはＨでない場合、Ｒは、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現についてＲａである。いくつかの実施形態において、Ｒ１はアルキル、例えば、Ｃ１０−３０アルキル又はＣ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、ＹはＨであるか、あるいはＹはＮＨである。いくつかの実施形態において、ｍは２である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）は
【００３７】
【化９】
0005933163.tif 000010
である。いくつかの実施形態において、Ｒは
【００３８】
【化１０】
0005933163.tif 000011
である。いくつかの実施形態において、Ｒ１はＣ１０−Ｃ１８アルキル、又はＣ１０−Ｃ３０アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒは
【００３９】
【化１１】
0005933163.tif 000012
である。いくつかの実施形態において、Ｒ１はＣ１０−Ｃ１８アルキル、又はＣ１０−Ｃ３０アルケニルであって、Ｒ２はＨである。
【００４０】
いくつかの実施形態において、
ｎは２であり、
各出現についてＸａはＣ２アルキレンであって、ＸｂはＣ２アルキレンであり、及び
各Ｒは、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現について、Ｈ又は
【００４１】
【化１２】
0005933163.tif 000013
であり、
ｍは２であり、
ＹはＮＨ又はＯであり、
Ｒ１はＣ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物の分子の少なくとも８０％は単一の構造異性体である。いくつかの実施形態において、ＹはＮＨであり、例えば、式（Ｉ）の化合物の分子の少なくとも８０％は単一の構造異性体である。いくつかの実施形態において、Ｒは５回の出現についてＲａである。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物の分子の少なくとも８０％において、Ｒは５回の出現についてＲａである。いくつかの実施形態において、ＹはＮＨである。
【００４２】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物はその無機又は有機塩、例えば、その塩酸塩のようなそのヒドロハライド塩である。いくつかの実施形態において、塩酸塩は１当量のＨＣＬからｎ＋２当量のＨＣｌの範囲内にある。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は有機酸の塩、例えば、酢酸塩であり、例えば、酢酸塩は１当量の酢酸塩からｎ＋２当量の酢酸塩又はギ酸塩であり、例えば、ギ酸塩は１当量の酢酸塩からｎ＋２当量のギ酸塩の範囲内にある。
【００４３】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は水和物の形態である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの出現について、例えば、各出現についてＲ１がアルケニル部位を含み、例えば、Ｒ１がシス二重結合を含む。
【００４４】
一つの態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物、及び核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡのようなＲＮＡ、あるいはＤＮＡ）を含む製剤を特徴とする。いくつかの実施形態において、製剤はまた、融合型脂質、又はＰＥＧ脂質のようなさらなる脂質を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、製剤は１１重量％未満の
【００４６】
【化１３】
0005933163.tif 000014
［式中、Ｘ及びｎは前記式（Ｉ）で定義した通りである］
を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、製剤は９０重量％未満の
【００４８】
【化１４】
0005933163.tif 000015
［式中、Ｙ及びＲ１は前記式（Ｉ）で定義した通りである］
を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、製剤は複数の式（Ｉ）の化合物を含む。
いくつかの実施形態において、製剤は以下の式：
【００５０】
【化１５】
0005933163.tif 000016
［式（Ｉ”）において、Ｒ部位の５つはＲａである］
の混合物を含む。いくつかの実施形態において、式（Ｉ’）及び（Ｉ”）は約１：２〜約２：１の比率で存在する。
【００５１】
一実施形態において、本発明が式（ＩＩ）：
【００５２】
【化１６】
0005933163.tif 000017
［式中、
各出現について各Ｘａ及びＸｂは、独立して、Ｃ１−６アルキレンであり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、及び
各Ｒは独立してＨ又は
【００５３】
【化１７】
0005933163.tif 000018
であり、
ｍは２であり、
ＹはＯ、ＮＲ２又はＳであり、
Ｒ１はアルキル又はアルケニルであり、
Ｒ２はＨ又はＣアルキル又はアルケニルである］
の化合物の製造方法を特徴とし、
該製造方法は、促進剤の存在下で、式（ＩＩＩ）：
【００５４】
【化１８】
0005933163.tif 000019
を、式（ＩＶ）：
【００５５】
【化１９】
0005933163.tif 000020
の化合物と反応させる段階を含む。
【００５６】
一つの態様において、本発明は、式（ＩＩ）
【００５７】
【化２０】
0005933163.tif 000021
［式中
各Ｘａ及びＸｂは、各出現について、独立してＣ１−６アルキレンであり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、及び
各Ｒは、独立して、Ｈ又は
【００５８】
【化２１】
0005933163.tif 000022
であり、
ｍは２であり、
ＹはＯ、ＮＲ２、又はＳであり、
Ｒ１はアルキル又はアルケニルであり、
Ｒ２はＨ又はＣアルキル又はアルケニルである］
の化合物の製造方法を特徴とし、
該方法は、クエンチャの存在下で、式（ＩＩＩ）：
【００５９】
【化２２】
0005933163.tif 000023
の化合物を、式（ＩＶ）：
【００６０】
【化２３】
0005933163.tif 000024
の化合物と反応させる段階を含む。
【００６１】
一つの態様において、本発明は、式（ＩＩ）：
【００６２】
【化２４】
0005933163.tif 000025
［式中、
各Ｘａ及びＸｂは、各出現について、独立してＣ１−６アルキレンであり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、及び
各Ｒは、独立して、Ｈ又は
【００６３】
【化２５】
0005933163.tif 000026
であり、
ｍは２であり、
ＹはＯ、ＮＲ２、又はＳであり、
Ｒ１はアルキル又はアルケニルであり、
Ｒ２はＨ又はアルキル又はアルケニルである］
の化合物の製造方法を特徴とし、該方法は式（ＩＩＩ）：
【００６４】
【化２６】
0005933163.tif 000027
の化合物を、式（ＩＶ）：
【００６５】
【化２７】
0005933163.tif 000028
の化合物と反応させることを含み、反応混合物は約３．８〜約６．５モル当量の式（ＩＶ）の化合物と共に約０．８〜約１．２モル当量の式（ＩＩＩ）の化合物を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、反応混合物は約５．５〜約６．５モル当量の式（ＩＶ）の化合物と共に約０．８〜約１．２モル当量の式（ＩＩＩ）の化合物を含む。いくつかの実施形態において、反応混合物は約６モル当量の式（ＩＶ）の化合物と共に、約１モル当量の式（ＩＩＩ）の化合物を含む。いくつかの実施形態において、反応混合物約５モル当量の式（ＩＶ）の化合物と共に約１モル当量の式（ＩＩＩ）の化合物を含む。
【００６７】
一つの態様において、本発明は式（ＩＩ）：
【００６８】
【化２８】
0005933163.tif 000029
［式中、
各Ｘａ及びＸｂは、各出現について独立して、Ｃ１−６アルキレンであり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、かつ
各Ｒは独立して、Ｈ又は
【００６９】
【化２９】
0005933163.tif 000030
であり、
ｍは２であり、
ＹはＯ、ＮＲ２、又はＳであり、
Ｒ１はアルキル又はアルケニルであり、
Ｒ２はＨ又はアルキル又はアルケニルである］
化合物の製造方法を特徴とし、
該方法は、ホウ酸及び水の存在下で、式（ＩＩＩ）：
【００７０】
【化３０】
0005933163.tif 000031
の化合物を、式（ＩＶ）：
【００７１】
【化３１】
0005933163.tif 000032
の化合物と反応させる２工程プロセスを含み、
反応混合物を含む第一の工程プロセスは約３．８〜約４．２モル当量の式（ＩＶ）の化合物と共に約０．８〜約１．２モル当量の式（ＩＩＩ）の化合物を含み、第二の工程は約０．８〜１．２モル当量の式（ＩＶ）の化合物を加える段階を含む。
【００７２】
一つの態様において、本発明は式（ＩＩ）：
【００７３】
【化３２】
0005933163.tif 000033
［式中、
各Ｘａ及びＸｂは、各出現について独立して、Ｃ１−６アルキレンであり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、及び
各Ｒは、独立して、Ｈ又は
【００７４】
【化３３】
0005933163.tif 000034
であり、
ｍは２であり
ＹはＯ，ＮＲ２、又はＳであり、
Ｒ１はアルキル又はアルケニルであり
Ｒ２はＨ又はアルキル又はアルケニルである］
の化合物の製造方法を特徴とし、
該方法は、式（ＩＩＩ）：
【００７５】
【化３４】
0005933163.tif 000035
の化合物を、式（ＩＶ）：
【００７６】
【化３５】
0005933163.tif 000036
の化合物と反応させ、次いで、
反応混合物から式（ＩＩ）の少なくとも１つの構造異性体を分離して、式（ＩＩ）の構造異性体を含む実質的に精製された製剤を得る段階を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の構造異性体は、クロマトグラフィ分離を用いて反応混合物から分離される。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィ分離は異性体の分離のためにフラッシュシリカゲルを用いるものである。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィ分離は、シリカゲルを用いる異性体の重力分離である。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィ分離は、異性体の分離のために移動床クロマトグラフィを用いるものである。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィ分離は異性体の分離のために液体クロマトグラフィ（ＬＣ）を用いる。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィ分離は異性体の分離のための順相ＨＰＬＣである。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィ分離は、異性体の分離のための逆相ＨＰＬＣである。
【００７８】
いくつかの実施形態において、実質的に精製された製剤は少なくとも約８０％の式（ＩＩ）の構造異性体、例えば、少なくとも約９０％の式（ＩＩ）の構造異性体、少なくとも約９５％の式（ＩＩ）の構造異性体を含む。
【００７９】
別の態様において、本発明は、式（Ｖ）：
【００８０】
【化３６】
0005933163.tif 000037
［式中、
各Ｘａ及びＸｂは各出現について、独立してＣ１−６アルキレンであり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、及び
各Ｒは、独立して、Ｈ又は
【００８１】
【化３７】
0005933163.tif 000038
であり、
ｍは１であり、
ＹはＯ、ＮＲ２、又はＳであり、
Ｒ１はアルキル又はアルケニルであり、
Ｒ２はＨ又はアルキル又はアルケニルである］
の化合物、又はその医薬上許容される塩の製造方法を特徴とし、
該方法は、式（ＩＩＩ）：
【００８２】
【化３８】
0005933163.tif 000039
の化合物を、式（ＶＩ）：
【００８３】
【化３９】
0005933163.tif 000040
の化合物と反応させて、式（Ｖ）の化合物、又はその医薬上許容される塩を得る段階を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、その医薬上許容される塩は式（Ｖ）の化合物の塩酸塩である。
一つの態様において、本発明は、式（Ｘ）：
【００８５】
【化４０】
0005933163.tif 000041
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、Ｈ、所望により１〜４のＲ５で置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、所望により１〜４のＲ５で置換されていてもよいＣ２−Ｃ６アルケニル、又はＣ（ＮＲ６）（ＮＲ６）２で置換させていてもよく、
Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、アルキル、アルケニル、アルキニルであり、その各々は所望によりフルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードで置換されていてもよく、
Ｌ１及びＬ２は、各々独立して−ＮＲ６Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−、−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）О−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、又は−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−であり、
Ｌ１−Ｒ３はＬ２−Ｒ４と共に、アセタール、ケタール、又はオルトエステルを形成することができ、Ｒ３及びＲ４は前記で定義した通りであり、Ｈ又はフェニルであってもよく、
Ｒ５はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、−ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ８）（Ｒ９）、−ＣＮ、ＳＲ１０、Ｓ（Ｏ）Ｒ１０、Ｓ（Ｏ）２Ｒ１０であり、
Ｒ６はＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ７はＨ又はＣ１−６アルキルであり、
各Ｒ８及びＲ９は、独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１０はＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
ｍは１、２、３、４、５、又は６であり、
ｎは０、１、２、３、４、５、又は６である］
の化合物及びその医薬上許容される塩であることを特徴とする。
【００８６】
いくつかの実施形態において、該化合物はその無機塩、例えば、その塩酸塩のようなそのヒドロハライド塩である。いくつかの実施形態において、該化合物はその有機塩である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、各々、独立して、Ｃ１−Ｃ３アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１はメチルである。
【００８８】
いくつかの実施形態において、Ｒ２はメチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は共にメチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１はＨ，メチル、エチル、イソプロピル、又は２−ヒドロキシエチルである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、Ｒ２はＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ２はメチル、エチル、プロピル、又はイソプロピルである。
【００９０】
いくつかの実施形態において、Ｒ１はＨ、メチル、エチル、イソプロピル、又は２−ヒドロキシエチルであって、Ｒ２はＨ、メチル、エチル、プロピル、又はイソプロピルである。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ｍは１である。
いくつかの実施形態において、ｎは１である。
いくつかの実施形態において、ｍ及びｎの双方は１である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は−ＮＲ６Ｃ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は−ＯＣ（Ｏ）−又は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、Ｌ１はＳ−Ｓ−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−又はＮ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）О−である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−又は−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、Ｌ２は−ＮＲ６Ｃ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ２は−ＯＣ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、Ｌ２はＳ−Ｓ−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ２は−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ２は−ＯＣ（Ｎ）Ｒ−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、Ｌ２は−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ２は−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−又は−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−である
いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の双方は−ＮＲ６Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の双方は−ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏ−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の双方はＳ−Ｓ−である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の双方は−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｒ６）である。
いくつかの実施形態において、Ｌ２の双方は−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−又は−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は−ＮＲ６Ｃ（Ｏ）であって、Ｌ２はＳ−Ｓ−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は−ＯＣ（Ｏ）であって、Ｌ２は−Ｓ−Ｓ−である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）又は−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｏ−であって、Ｌ２はＳ−Ｓ−である。
いくつかの実施形態において、Ｌ１はＮ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−であって、Ｌ２は−Ｓ−Ｓ−である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、Ｌ１−Ｒ３はＬ２−Ｒ４と共に、アセタール、ケタール又はオルトエステルを形成する。
いくつかの実施形態において、各Ｒ３及びＲ４は独立して、アルキルである。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４の双方はＣ６−Ｃ２８アルキルである。
いくつかの実施形態において、各Ｌ１及びＬ２は独立して−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−又は−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、Ｒ３はアルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ４はアルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ３はアルケニルである。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、Ｒ４はアルケニルである。
いくつかの実施形態において、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、アルケニルであり、例えば、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ６−Ｃ３０アルケニルであるか、各Ｒ３及びＲ４は同一のアルケニル部位である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、各Ｒ３及びＲ４は、２つの二重結合部位を含む。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合の双方はＺ立体配置を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つは以下の式（ＩＩ）：
【０１０８】
【化４１】
0005933163.tif 000042
［式中、
ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４の双方は式（ＩＩ）のものである。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＥ立体配置を有し、例えば、二重結合の双方はＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＩＩ）：
【０１０９】
【化４２】
0005933163.tif 000043
［式中、ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は３つの二重結合部位を含む。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも２つはＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合は３つとも全てＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも２つは以下の式（ＩＶ）：
【０１１１】
【化４３】
0005933163.tif 000044
［式中、ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方は式（ＩＶ）によって示される。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも２つはＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合は３つとも全てＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＶ）：
【０１１２】
【化４４】
0005933163.tif 000045
［式中、ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数であり得る］
によって示される。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方は式（Ｖ）によって示される。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、各々、Ｃ１−Ｃ６アルキル（例えばメチル）であり、Ｌ１及びＬ２は、各々、−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｒ３及びＲ４はアルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４は同一である。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４は、共に２つの二重結合を含む（例えばシス結合を有する）。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４は以下の式（ＩＩ）：
【０１１４】
【化４５】
0005933163.tif 000046
［式中、ｘは１〜８の整数、例えば５であり、
ｙは１〜１０の整数、例えば、４である］
によって示される。
【０１１５】
一つの態様において、本発明は式（Ｘ）の化合物を含む製剤を特徴とする。
一つの態様において、本発明は式（Ｘ）の化合物及び核酸（例えばｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡのようなＲＮＡ、又はＤＮＡ）を含む製剤であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、製剤はまた、融合性脂質、又はＰＥＧ脂質のようなさらなる脂質を含む。
【０１１６】
一つの態様において、本発明は、
【０１１７】
【化４６】
0005933163.tif 000047
［式中、Ｒ１及びＲ２は各々、独立して、所望により１〜４のＲ５で置換されていてもよく、
Ｒ３はアルキル、アルケニル、アルキニルであり、
Ｌ１は−ＯＣ（Ｏ）−であり、
Ｒ５は−ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ８）（Ｒ９）、−ＣＮ、ＳＲ１０、Ｓ（Ｏ）Ｒ１０、Ｓ（Ｏ）２Ｒ１０であり、
Ｒ６はＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ７はＨ、又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
各Ｒ８及びＲ９は独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１０はＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
ｍ及びｎは、各々、独立して、１、２、３、４、５、又は６である］
の化合物の製造方法を特徴とし、
該方法は、カップリング剤の存在下で式（ＶＩ）：
【０１１８】
【化４７】
0005933163.tif 000048
の化合物を、
【０１１９】
【化４８】
0005933163.tif 000049
の化合物と反応させて、それにより、（式Ｘ）の化合物を提供する段階を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、該カップリング剤はＥＤＣＩのようなカルボジイミドである。
一つの態様において、本発明は以下の式（ＸＶ）：
【０１２１】
【化４９】
0005933163.tif 000050
［式中、各Ｌ１及びＬ２は、独立して、化学結合又はＣ（Ｏ）であり、
各Ｒ１及びＲ２は、独立して、アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、
その各々は、所望により１以上の置換基で置換されていてもよく、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ−、又は−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−であり、
ｍは０〜１１の整数であり、
及び、ｎは１〜５００の整数である。］
の化合物を特徴とする。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２は共に化学結合である。
いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２は共にＣ（Ｏ）である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１３アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、又はＣ１６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は共にアルキル、例えば、同一の長さを有する直鎖アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１３アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、又はＣ１６アルキルである。いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２は共にＣ１４アルキルである。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、式ＸＶはラセミ混合物を表す。
いくつかの実施形態において、式ＸＶの化合物は、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のＲ異性体の鏡像体過剰率を有する。いくつかの実施形態において、式ＸＶは鏡像異性的に純粋な「Ｒ」異性体を表す。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、式ＸＶの化合物は、例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のＳ異性体の鏡像体過剰率を有する。いくつかの実施形態において、式ＸＶは鏡像異性的に純粋な「Ｓ」異性体を表す。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、アルケニルであり、例えば、各Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ６−Ｃ３０アルケニルであり、あるいは、各Ｒ１及びＲ２は同一のアルケニル部位である。いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は１つの二重結合、例えば、Ｅ又はＺ立体配置の二重結合を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は、２つの二重結合部位を含む。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合の双方はＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＩ）：
【０１２７】
【化５０】
0005933163.tif 000051
［式中、ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方は式（ＩＩ）のものである。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＥ立体配置を有し、例えば、両方の二重結合がＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＩＩ）：
【０１２８】
【化５１】
0005933163.tif 000052
［式中、
ｘは１〜８の正数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は３つの二重結合部位を含む。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも２つはＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合は３つとも全てＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＶ）：
【０１３０】
【化５２】
0005933163.tif 000053
［式中、ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である。］
によって示される。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方は式（ＩＶ）によって示される通りである。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも２つは、Ｅ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合は３つとも全てＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＶ）：
【０１３１】
【化５３】
0005933163.tif 000054
［式中、ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４の双方は式（Ｖ）によって示される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であり、以下の式（ＸＶ’）
【０１３３】
【化５４】
0005933163.tif 000055
の化合物を提供する。いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１３アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、又はＣ１６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は共にアルキル、例えば、同一の長さを有する直鎖アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１３アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、又はＣ１６アルキルである。いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２は共にＣ１４アルキルである。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、Ｘは−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−である。
いくつかの実施形態において、ｍは１〜１０の整数、例えば、２〜４の整数、又は整数２である。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、ｎは１〜５００の整数、例えば、４０〜４００、１００〜３５０、４０〜５０、又は４２〜４７の整数である。
いくつかの実施形態において、化合物は式（ＸＶ’）：
【０１３６】
【化５５】
0005933163.tif 000056
［式中、Ｌ１及びＬ２の双方は化学結合である］
の化合物である。いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、又はＣ１６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方はアルキル、例えば、同一長さを有する直鎖アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、又はＣ１６アルキルである。いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方はＣ１４アルキルである。いくつかの実施形態において、ｍは１〜１０の整数、例えば、２〜４の整数、又は整数２である。いくつかの実施形態において、ｎは１〜５００の整数、例えば、４０〜４００、又は４０〜５０の整数である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、化合物は式（ＸＶ’）の化合物であり、Ｌ１及びＬ２は共に化学結合であり、Ｒ１及びＲ２は共にアルキル（例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、好ましくはＣ１４アルキル）であり、ｎは約４０〜４００の整数である。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、化合物は以下の式（ＸＶＩ）：
【０１３９】
【化５６】
0005933163.tif 000057
［式中、反復するＰＥＧ部位は、４２及び４７の間のｎ値を持つ２０００の平均分子量を有する］
を有する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、式ＸＶの化合物は、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のＲ異性体の鏡像体過剰率を有する。いくつかの実施形態において、式ＸＶＩの化合物は好ましい絶対立体配置「Ｒ」を持つ立体異性体である、
一つの態様において、本発明はコレステロール部位にコンジュゲートしたＰＥＧ脂質を特徴とする。例えば、以下の式（ＸＸ）の化合物：
【０１４１】
【化５７】
0005933163.tif 000058
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ−、又は−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−であり、
ｍは０〜１１の整数であり、
ｎは１〜５００の整数である。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、式（ＸＸ）中のコレステロールに結合したＯはコレステロール部位の部分である。
いくつかの好ましい実施形態において、Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、又は−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−である。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、式（ＸＸ）の化合物は以下の式（ＸＸ’）：
【０１４４】
【化５８】
0005933163.tif 000059
に示される通りである。
【０１４５】
一つの態様において、本発明は、標的とする部位、例えば糖残基に結合したＰＥＧ脂質を特徴とする。例えば、式（ＸＶ）又は（ＸＸ）の化合物は、ＯＭｅ末端で、標的部位によって修飾される。いくつかの実施形態において、標的部位はリンカーを介してＰＥＧ部位に結合される。例示的な標的化ＰＥＧ脂質は以下の式（ＸＸＩ）及び（ＸＸＩＩ）によって示される。
【０１４６】
一実施形態において、脂質は式（ＸＸＩ）：
【０１４７】
【化５９】
0005933163.tif 000060
［式中、
各Ｌ１及びＬ２は、独立して、化学結合又はＣ（Ｏ）であり、
各Ｒ１及びＲ２は、独立して、アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、その各々は、所望により１以上の置換基で置換されていてもよく、
各Ｘ及びＸ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−；−ＮＨＣ（Ｏ）−；Ｃ（Ｓ）ＮＨ；Ｃ（Ｓ）ＮＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ−；ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−；ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−３アルキル−；又はＣ１−３アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、
ｍは０〜１１の整数であり、
ｎは１〜５００の整数であり、
ｐは１〜６、例えば、３の整数であり、
Ｔはグリコシル部位（例えば、糖残基）のような標的部位である］
の化合物である。
【０１４８】
例示的な標的部位は
【０１４９】
【化６０】
0005933163.tif 000061
を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２は共に化学結合である。
いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２は共にＣ（Ｏ）である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、又はＣ１６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方はアルキル、例えば、同一長さの直鎖アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、又はＣ１６アルキルである。いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方はＣ１４アルキルである。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、式（ＸＸＩ）はラセミ混合物を表す。
いくつかの実施形態において、式（ＸＸＩ）の化合物は、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のＲ異性体の鏡像体過剰率を有する。いくつかの実施形態において、式（ＸＸＩ）は鏡像異性的に純粋な「Ｒ」異性体を表す。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、式（ＸＸＩ）化合物は、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のＳ異性体の鏡像体過剰率を有する。いくつかの実施形態において、式（ＸＸＩ）は鏡像異性的に純粋な「Ｓ」異性体を表す。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、アルケニルであり、例えば、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ６−Ｃ３０アルケニルであり、あるいは各Ｒ１及びＲ２は同一のアルケニル部位である。いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は、１つの二重結合、例えば、Ｅ又はＺ立体配置の１つの二重結合を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は２つの二重結合部位を含む。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合の双方はＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＩ）：
【０１５５】
【化６１】
0005933163.tif 000062
［式中、ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方は式（ＩＩ）のものである。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＥ立体配置を有し、例えば、二重結合の双方はＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＩＩ）：
【０１５６】
【化６２】
0005933163.tif 000063
［式中ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、各Ｒ１及びＲ２は３つの二重結合部位を含む。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも２つはＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合は３つとも全てＺ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＶ）：
【０１５８】
【化６３】
0005933163.tif 000064
［式中、ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の双方は式（ＩＶ）によって示される通りである。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも１つはＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合の少なくとも２つはＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、二重結合は３つとも全てＥ立体配置を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは以下の式（ＩＶ）：
【０１５９】
【化６４】
0005933163.tif 000065
［式中、ｘは１〜８の整数であり、
ｙは１〜１０の整数である］
によって示される。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４の双方は式（Ｖ）によって示される。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、ｐは３である。
いくつかの実施形態において、ＬはＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル（例えば、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ３アルキル）である。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、式（ＸＸＩ）の化合物は以下の（ＸＸＩ’）：
【０１６２】
【化６５】
0005933163.tif 000066
の化合物である。
【０１６３】
一実施形態において、脂質は式（ＸＸＩＩ）：
【０１６４】
【化６６】
0005933163.tif 000067
［式中、各Ｘ及びＸ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）ＮＨ，−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ−；ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−；ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−３アルキル−；又はＣ１−３アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、
ｍは０〜１１の整数であって、
ｎは１〜５００の整数であり、
ｐは１〜６の整数、例えば、３であり、
Ｔはグリコシル部位（例えば、糖残基）のような標的部位である］
の化合物である。例示的な標的部位は
【０１６５】
【化６７】
0005933163.tif 000068
を含む。
【０１６６】
いくつかの好ましい実施形態において、式（ＸＸＩＩ）の化合物は以下に示される（ＸＸＩＩ’）の化合物である：
【０１６７】
【化６８】
0005933163.tif 000069
一つの態様において、本発明は、本明細書中に記載された化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物又は式（Ｘ）の化合物）、及びＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ又はＤＮＡ）のような核酸を含む会合複合体を特徴とする。いくつかの実施形態において、会合複合体はリポプレックス又はリポソームである。いくつかの実施形態において、会合複合体は標的部位、融合脂質、式（ＸＶ）、（ＸＶ’）又は（ＸＶＩ）を有するＰＥＧ脂質のような本明細書中に記載されたＰＥＧ脂質のようなＰＥＧ化脂質、又はその構造成分のような１つ以上のさらなる成分を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は本明細書中に記載された標的化ＰＥＧ脂質、例えば、式（ＸＸＩ）、（ＸＸＩ’）、（ＸＸＩＩ）、又は（ＸＸＩＩ’）の化合物である。
【０１６８】
一つの態様において、本発明は、本明細書中に記載された化合物（例えば、式（Ｉ）又は式（Ｘ）の化合物のような本明細書中に記載された脂質）を含む脂質製剤を緩衝液の存在下で治療剤と接触させる段階を含むリポソームの形成方法を特徴とし、該緩衝液は：
分子式Ｉの実質的に全てのアミンがプロトン化されるのに十分な強度であり、
１００及び３００ｍＭの間にあり、
２０ｍＭの同一緩衝液よりも有意に多いプロトン化を提供する濃度で存在する。
【０１６９】
一つの態様において、本発明は、本明細書中に記載された方法によって形成されたリポソームを特徴とする。
一つの態様において、本発明は、少なくとも約９０％エタノールを含む混合物中で、本明細書中に記載された脂質製剤（例えば、式（Ｉ）の化合物又は式（Ｘ）の化合物を含む脂質製剤）を治療剤と接触させ、次いで、脂質製剤を治療剤と迅速に混合して、約２００μＭ未満の直径を有する粒子を提供する段階を含むリポソームを形成する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、粒子は約５０μＭ未満の直径を有する。
【０１７０】
一つの態様において、本発明は、緩衝液の存在下で、本明細書中に記載された脂質製剤（例えば、式（Ｉ）の化合物又は式（Ｘ）の化合物を含む脂質製剤）を治療剤と接触させる段階を含むリポソームを形成する方法を特徴とし、該緩衝液は約１００〜約３００ｍＭの濃度を有する。
【０１７１】
一つの態様において、本発明は、本明細書中に記載された製剤（例えば、式（Ｉ）の化合物、又は式（Ｘ）の化合物を含む脂質製剤）及び核酸を含むリポソームを特徴とする。いくつかの実施形態において、製剤はまた、ＰＥＧ化脂質、例えば、式（ＸＶ）、（ＸＶ’）又は（ＸＶＩ）を有するＰＥＧ脂質のような本明細書中に記載されたＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は本明細書中に記載された標的化ＰＥＧ脂質、例えば、式（ＸＸＩ）、（ＸＸＩ’）、（ＸＸＩＩ）、又は（ＸＸＩＩ’）の化合物である。いくつかの実施形態において、製剤はまた、コレステロールのような構造部位を含む。いくつかの実施形態において、会合複合体の製剤は式（Ｉ）、（ＸＶ）の化合物、及びコレステロールを含む。いくつかの実施形態において、該核酸はｓｉＲＮＡであり、例えば、該核酸は分解に耐えるように修飾されているｓｉＲＮＡであり、該核酸は多糖骨格の修飾によって修飾されているｓｉＲＮＡであり、又は該ｓｉＲＮＡはＡｐｏＢ遺伝子を標的とする。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、該リポソームは、さらに、構造部位、及び本明細書中に記載されたＰＥＧ脂質のようなＰＥＧ化脂質を含み、製剤（例えば、式（Ｉ）の化合物又は式（Ｘ）の化合物を含む脂質製剤）、コレステロールのような構造部位、ＰＥＧ化脂質、及び核酸の重量比率は８〜２２：４〜１０：４〜１２：０．４〜２．２である。いくつかの実施形態において、構造部位はコレステロールである。いくつかの実施形態において、前記比率は１０〜２０：０．５〜８．０：５〜１０：０．５〜２．０、例えば、１５：０．８：７：１である。いくつかの実施形態において、平均リポソーム直径は１０ｎｍ及び７５０ｎｍの間にあり、例えば、平均リポソーム直径は３０〜２００ｎｍの間にあり、平均リポソーム直径は５０〜１００ｎｍの間にある。いくつかの実施形態において、製剤は未反応脂質の１５重量％未満である。いくつかの実施形態において、製剤（例えば、式（Ｉ）の化合物又は式（Ｘ）の化合物を含む脂質製剤）、コレステロールのような構造部位、及びＰＥＧ脂質の比率は約４２／４８／１０（モル比率）である。いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）に対する総脂質は約７．５重量％である。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された会合複合体における全賦形剤の核酸に対する重量比率は、約１５：１未満、例えば、約１０：１、７．５：１又は約５：１である。
【０１７４】
一つの態様において、本発明は、複数の脂質部位及び治療剤を含む会合複合体を形成する方法を特徴とし、該方法はエタノール中の複数の脂質部位及び水性ＮａＯＡｃ緩衝液を混合して、粒子を提供し、次いで、治療剤を該粒子に加え、それにより、会合複合体を形成する段階を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、脂質部位は１００％エタノールの溶液中で提供される。
いくつかの実施形態において、複数の脂質部位はカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は本明細書中に記載された脂質であり、例えば、カチオン性脂質は以下の脂質のいずれか一方、又はその混合物である。
【０１７６】
【化６９】
0005933163.tif 000070
又は
【０１７７】
【化７０】
0005933163.tif 000071
いくつかの好ましい実施形態において、カチオン性脂質は
【０１７８】
【化７１】
0005933163.tif 000072
である。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、複数の脂質部位はＰＥＧ脂質を含み、例えば、ＰＥＧ脂質は以下の構造：
【０１８０】
【化７２】
0005933163.tif 000073
［式中、各Ｌ１及びＬ２は、独立して、化学結合又はＣ（Ｏ）であり、
各Ｒ１及びＲ２は、独立して、アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、その各々は、所望により１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ−、又は−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−３アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−であり、
ｍは０〜１１の整数であり、
ｎは１〜５００の整数である］
を有する。
【０１８１】
いくつかの好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質は、反復するＰＥＧ部位が、例えば、４２及び４７の間のｎ値を持つ２０００の平均分子量を有する式（ＸＶＩ）のＰＥＧ脂質、又は以下に示される脂質：
【０１８２】
【化７３】
0005933163.tif 000074
である。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、複数の脂質部位は構造脂質を含み、例えば、構造脂質はコレステロールである。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は本明細書中に記載された標的化ＰＥＧ脂質、例えば、式（ＸＸＩ）、（ＸＸＩ’）、（ＳＳＩＩ）又は（ＸＸＩＩ’）の化合物である。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、例えば、治療剤の添加に先立って、脂質含有粒子を押出しする段階を含む。
いくつかの実施形態において、治療剤は核酸、例えば、分解に耐えるように修飾されているｓｉＲＮＡ、多糖骨格の修飾によって修飾されているｓｉＲＮＡ、又は親油性部位にコンジュゲートしたｓｉＲＮＡのようなｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡはＡｐｏＢ遺伝子を標的とする。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、会合複合体はカチオン性脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質及び核酸を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質及び核酸のモル比率は３６〜４８：４２〜５４：６〜１４、例えば、３８〜４６：４４〜５２：８〜１２又は約４２：４８：１０である。いくつかの実施形態において、核酸に対する総賦形剤の重量比率は約１５：１未満、例えば、約１０：１、７．５：１又は約５：１である。いくつかの好ましい実施形態において、カチオン性脂質は以下の構造：
【０１８６】
【化７４】
0005933163.tif 000075
を有し、ＰＥＧ脂質は式（ＸＶＩ）のＰＥＧ脂質であり、反復するＰＥＧ部位は、例えば、４２及び４７の間のｎの値を持つ２０００の平均分子量を有し、あるいは以下の構造：
【０１８７】
【化７５】
0005933163.tif 000076
を有し、かつ構造脂質はコレステロールであり、例えば、カチオン性脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質のモル比率は３８〜４６：４４〜５２：８〜１２、例えば、約４２：４８：１０である。いくつかの好ましい実施形態において、核酸に対する総賦形剤の重量比率は約１５：１未満、例えば、約１０：１、約７．５：１、又は約５：１である。
【０１８８】
別の態様において、本発明は、本明細書中に記載された方法から作製された会合複合体を特徴とする。
別の態様において、本発明は、カチオン性脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質、及び核酸を含む会合複合体を特徴とし、カチオン性脂質は以下の脂質のいずれか一方又はその混合物であり：
【０１８９】
【化７６】
0005933163.tif 000077
又は
【０１９０】
【化７７】
0005933163.tif 000078
ＰＥＧ脂質は式（ＸＶＩ）のＰＥＧ脂質であり、反復するＰＥＧ部位は、例えば、４２及び４７の間のｎの値を持つ２０００の平均分子量を有し、あるいは以下の構造：
【０１９１】
【化７８】
0005933163.tif 000079
を有し、及び構造脂質はコレステロールである。いくつかの好ましい実施形態において、核酸はｓｉＲＮＡである。いくつかの好ましい実施形態において、カチオン性脂質は以下の式：
【０１９２】
【化７９】
0005933163.tif 000080
を有する。いくつかの好ましい実施形態において、カチオン性脂質製剤、構造脂質（例えば、コレステロール）、ＰＥＧ脂質及び核酸のモル比率は３６〜４８：４２〜５４：６〜１４、例えば、３８〜４６：４４〜５２：８〜１２又は約４２：４８：１０である。いくつかの好ましい実施形態において、核酸に対する総賦形剤の重量比率は約１５：１未満、例えば、約１０：１、約７．５：１、又は約５：１である。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された会合複合体は約２５０００ｎｍ未満、例えば、約２０〜２００ｎｍ、約６０又は約５０ｎｍの平均直径又は粒子サイズを有する。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載された会合複合体にて投与される核酸は少なくとも約４時間、例えば、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、又は少なくとも約３週間の血清中半減期（例えば、イン・ビトロで）を示す。
【０１９５】
一つの態様において、本発明は、本明細書中に記載された製剤を含む医薬上許容される組成物を特徴とする。
一つの態様において、本発明は、本明細書中に記載されたリポソームを含む医薬上許容される組成物を特徴とする。
【０１９６】
一つの態様において、本発明は、治療量の医薬上許容される組成物、例えば、本明細書中に記載されたリポソームのような会合複合体を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物治療する方法を特徴とする。
【０１９７】
定義
用語「ハロ」又は「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素のいずれかの基をいう。
【０１９８】
用語「アルキル」とは、指定された数の炭素原子を含有し、直鎖又は分岐鎖であり得る炭化水素鎖をいう。例えば、Ｃ１−Ｃ３６アルキルは、該基がその中に１〜１３６個（包括的）の炭素原子を有し得ることを示す。用語「ハロアルキル」とは、１つ以上の水素原子がハロによって置き換えられたアルキルをいい、全ての水素がハロによって置き換えられたアルキル部位（例えば、ペルフルオロアルキル）を含む。用語「アリールアルキル」又は「アラルキル」とは、アルキル水素原子がアリール基によって置き換えられたアルキル部位をいう。アラルキルは、１つ以上の水素原子がアリール基によって置き換えられている基を含む。「アリールアルキル」又は「アラルキル」の例は、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル基を含む。
【０１９９】
用語「アルキレン」とは、二価アルキル、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−をいう。
【０２００】
用語「アルケニル」とは、２〜３６個の炭素原子を含有し、かつ１つ以上の二重結合を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖をいう。アルケニル基の例は、限定されるものではないが、アリル、プロペニル、２−ブテニル、３−ヘキセニル及び３−オクテニル基を含む。二重結合炭素の１つは、所望によりアルケニル置換基の結合点であってもよい。用語「アルキニル」とは、２〜３６個の炭素原子を含有し、１つ以上の三重結合を有することを特徴とする直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖をいう。アルキニル基の例は、限定されるものではないが、エチニル、プロパルギル、及び３−ヘキシニルを含む。三重結合炭素の１つは、所望によりアルケニル置換基の結合点であってもよい。
【０２０１】
用語「置換基」はその基のいずれかの原子において、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリール基上に「置換された」基をいう。いずれの原子も置換することができる。適切な置換基は、限定されるものではないが、アルキル（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２直鎖又は分岐鎖アルキル）、シクロアルキル、ハロアルキル（例えば、ＣＦ３のようなペルフルオロアルキル）、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、アルケニル、アルキニル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、アルコキシ、ハルアルコキシ、（例えば、ＯＣＦ３のようなペルフルオロアルコキシ）、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、カルボキシレート、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ＳＯ３Ｈ、硫酸、リン酸、メチレンジオキシ（酸素が同一の炭素（ジェミナル置換）原子に結合している−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）、エチレンジオキシ、オキソ、チオキソ（例えば、Ｃ＝Ｓ）、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（ｎは０〜２である）、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（ｎは０〜２である）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（ｎは０〜２である）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロシクリル（ｎは０〜２である）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール、及びその組合せ）、エステル（アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール、及びその組合せ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、及びその組合せ）を含む。一つの態様において、基上の置換基は、独立して、前記置換基のいずれかの１つの単一の、又はいずれかのサブセットである。別の態様において、置換基は、それ自体、前記置換基のいずれか１つで置換されていてもよい。
【０２０２】
本明細書中で用いる用語「構造異性体」とは、同一の分子式を有するが、異なる構造式を有する、プロピルアルコール及びイソプロピルアルコールのような、任意の２つ以上の化合物をいう。
【０２０３】
本明細書中で用いる用語「幾何異性体」又は「立体異性体」とは、同一数及びタイプの原子、及び化学結合（すなわち、原子の間の結合性は同一である）を含有するが、原子の異なる空間的配置を有する２つ以上の化合物、例えば、二重結合のシス及びトランス異性体、鏡像異性体及びジアステレオマーをいう。
【０２０４】
便宜的に、明細書、実施例、及び添付の請求の範囲で用いるある種の用語及び表現の意味を以下に示す。本明細書の他の部分における用語の使用と本節に示す定義との間に明らかな矛盾があれば、本節における定義が優先されるべきである。
【０２０５】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」は、各々、一般に、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを塩基として含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」とは、以下にさらに詳細に記載するような修飾されたヌクレオチド、又は代替置換部位をも意味することができると理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン及びウラシルを他の部位によって置換することができ、しかもそのような置換部位を有するオリゴヌクレオチドとの塩基対合特性は殆ど変化しないことを認識するであろう。例えば、限定されるものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン又はウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合できる。よって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含有するヌクレオチドは、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドによって本発明のヌクレオチド配列において置換することができる。そのような置換部位を含む配列が本発明の実施形態である。
【０２０６】
本明細書中で用いるように、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを含めた、対応する遺伝子の転写の間に形成されたｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続的部分をいう。標的領域は、ＲＮＡｉ剤の一部分に相補的である標的遺伝子におけるセグメントである。
【０２０７】
本明細書中で用いるように、用語「配列を含むストランド」とは、標準的なヌクレオチド命名法を用いて記載された配列によって記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【０２０８】
別段の指示のない限り、本明細書中で用い用語「相補的」は、第２のヌクレオチド配列に関連して第１のヌクレオチド配列を説明するのに用いられる場合、当業者によって理解されるように、一定の条件下で、第１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する能力をいう。そのような条件は、例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間、続いて洗浄を含むという厳密な条件とすることができる。生物内部に発生し得る生理的条件のような他の条件を適用することができる。当業者であれば、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的適用に関連して２つの配列の相補性のテストに最も適切な諸条件を設定することができよう。
【０２０９】
これは、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対する第１及び第２のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書中において相互に「十分に相補的」ということができる。しかしながら、第１の配列を本明細書中において第２の配列に関連して「実質的に相補的」という場合、２つの配列は十分に相補的であり得、あるいはそれらは、それらの最終的適用に最も関連する条件下でハイブリダイズすることができる能力を保有しつつ、ハイブリダイゼーションに際して１つ以上の、但し一般的には４つ、３つ又は２つ以下のミスマッチした塩基対を形成し得る。しかし、２つのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションに際して１つ以上の一本鎖突出部を形成するように設計する場合、そのような突出部は、相補性の決定に関してミスマッチとしてみなされるべきではない。例えば、長さが２１ヌクレオチドの一方のオリゴヌクレオチド、及び長さが２３ヌクレオチドの他方のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド薬において、長い方のオリゴヌクレオチドは短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むとき、本発明の目的においては「完全に相補的である」ということができる。
【０２１０】
「相補的」配列は、本明細書中で用いるように、ハイブリダイズするそれらの能力に関して前記要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対及び／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含み、あるいは完全にそれらから形成することができる。
【０２１１】
用語「相補的」、「完全に相補的」及び「実質的に相補的」は、本明細書中においては、それらの使用の関係から理解されるように、オリゴヌクレオチド剤のセンスストランド及びアンチセンスストランドの間の、あるいはオリゴヌクレオチド剤のアンチセンスストランドと標的配列との間の塩基マッチングに関して用いることができる。
【０２１２】
本明細書中で用いるように、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に対して実質的に相補的である」ポリヌクレオチドとは、対象とするｍＲＮＡの連続部分に対して実質的に相補的なポリヌクレオチドをいう。例えば、もし配列がＡｐｏＢをコードするｍＲＮＡの非中断部分に対して実質的に相補的であれば、ポリヌクレオチドはＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。
【０２１３】
本明細書中で用いるように、「オリゴヌクレオチド剤」とは、その標的に対してアンチセンスであるリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又は双方又はその修飾された一本鎖オリゴマー又はポリマーをいう。この用語は、天然に生じる核酸塩基、糖及び共有結合ヌクレオシド間（骨格）結合、ならびに同様に機能する天然に生じない部分を有するオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば、増強された細胞取り込み、核酸標的に対する向上した親和性、及びヌクレアーゼの存在下における増大した安定性のような望ましい特性のため天然形態よりも好ましい。
【０２１４】
オリゴヌクレオチド剤は、核酸標的（ＮＡＴ）オリゴヌクレオチド剤及び蛋白質標的（ＰＴ）オリゴヌクレオチド剤の両方を含む。ＮＡＴ及びＰＴオリゴヌクレオチド剤とは、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又は双方又はその修飾された一本鎖オリゴマー又はポリマーをいう。この用語は、天然に生じるヌクレオベース、糖、及び共有結合ヌクレオシド間（骨格）結合、ならびに同様に機能する天然に生じない部分を有するオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば、増強された細胞取り込み、核酸標的に対する向上した親和性、及び／又はヌクレアーゼの存在下における増加した安定性のような望ましい特性のため天然形態よりも好ましい。特異的ＲＮＡ又はＤＮＡ標的に結合するように設計されたＮＡＴは、標的核酸の少なくとも１０、２０又は３０以上の塩基に対して実質的相補性、例えば、少なくとも７０、８０、９０、又は１００％相補性を有し、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンタゴミール（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、及び発現を調節することができる他の非二重鎖構造を含む。他のＮＡＴオリゴヌクレオチド剤は、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、ＤＮＡザイム、及びリボザイムを含む。ＮＡＴオリゴヌクレオチド剤はいずれかの核酸、例えば、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡを標的とすることができる。これらのＮＡＴオリゴヌクレオチド剤は、それらの標的に対するワトソン−クリック相補性を介して結合してもしなくてもよい。ＰＴオリゴヌクレオチド剤は、好ましくは、三次元相互作用によって蛋白質標的に結合し、蛋白質活性を変調する。それらはデコイＲＮＡ、アプタマー等を含む。
【０２１５】
理論に束縛されることは望まないが、オリゴヌクレオチド剤は、切断依存性又は切断非依存性メカニズムを含めた、多数のメカニズムのうちの１つ以上によって作用することができる。切断ベースのメカニズムはＲＮＡｓｅ  Ｈ依存性であり得、及び／又はＲＩＳＣ複合体機能を含むことができる。切断非依存性メカニズムは、ｍｉＲＮＡによって媒介されるような占有基づく翻訳阻止、又はアプタマーが行うような、蛋白質へのオリゴヌクレオチド剤の結合を含む。オリゴヌクレオチド剤を用いて、プレｍＲＮＡにおけるスプライス部位の選択を変更することによって遺伝子の発現を変化させることもできる。スプライシングの阻害の結果、不適切にプロセッシングされたメッセージの分解をもたらすこともでき、それにより、遺伝子発現を下方制御する。
【０２１６】
本明細書中で用いるように、用語「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」とは、前記定義のような、２つの逆平行かつ実質的に相補的な核酸ストランドを含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体をいう。二重鎖構造を形成する２つのストランドは、１つのより長いＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、あるいはそれらは別々のＲＮＡ分子であってよい。別のＲＮＡ分子の場合、そのようなｄｓＲＮＡは、しばしば、文献においてはｓｉＲＮＡ（「短鎖干渉性ＲＮＡ」）という。２つのストランドが１つのより長い分子の一部であって、従って、１つのストランドの３’末端及び二重鎖構造を形成するそれぞれの他方のストランドの５’末端の間のヌクレオチドの中断されない鎖によって連結される場合、連結ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」、「ショートヘアピンＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」という。２つのストランドは、１つのストランドの３’末端、及び二重鎖構造を形成するそれぞれの他方のストランドの５’末端の間のヌクレオチドの中断されていない鎖以外の手段によって共有結合される場合、連結構造は「リンカー」という。ＲＮＡストランドは同一又は異なる数のヌクレオチドを有することができる。最大数の塩基対は、ｄｓＲＮＡの最も短いストランドから二重鎖中に存在するいずれかの突出部を差し引いたものにおけるヌクレオチドの数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１つ以上のヌクレオチド突出部を含むことができる。加えて、本明細書中で用いるように、「ｄｓＲＮＡ」は、多数のヌクレオチドにおける実質的修飾を含めた、及び本明細書中に開示された、あるいは当該分野で知られた全てのタイプの修飾を含めた、リボヌクレオチドに対する化学的修飾を含むことができる。あらゆるそのような修飾は、ｓｉＲＮＡタイプの分子で用いるように、本明細書及び請求の範囲の目的では「ｄｓＲＮＡ」に含まれる。
【０２１７】
本明細書中で用いるように、「ヌクレオチド突出部」とは、ｄｓＲＮＡの一方のストランドの３’末端が他方のストランドの５’末端を超えて延び、又はその逆である場合、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する１つ又は複数の非対合ヌクレオチドをいう。「平滑」又は「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡのその末端において不対ヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチド突出部がないことを意味する。「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、その全長にわたって二本鎖であるｄｓＲＮＡであり、すなわち、分子のいずれかの末端においてヌクレオチド突出部はない。明瞭性のために、ｓｉＲＮＡの３’末端又は５’末端にコンジュゲートした化学的キャップ又は非ヌクレオチド化学的部位は、ｓｉＲＮＡが突出部を有するか又は平滑末端であるかを決定するためには考慮されない。
【０２１８】
用語「アンチセンスストランド」とは、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡのストランドをいう。本明細書中で用いるように、用語「相補性の領域」とは、本明細書中で定義するように、配列、例えば、標的配列に実質的に相補的なアンチセンスストランド上の領域をいう。相補性の領域が標的配列に対して十分に相補的でない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、仮に存在する場合、一般的には、例えば５’及び／又は３’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド内の、末端領域又は複数末端領域にある。
【０２１９】
用語「センスストランド」は、本明細書中で用いるように、アンチセンスストランドの領域に対して実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡのストランドをいう。
用語「サイレンスとする」及び「の発現を阻害する」とは、それらが標的遺伝子に関する限り、本明細書中においては、遺伝子が転写され、かつ遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞又は細胞群から単離され得る遺伝子から転写されるｍＲＮＡ量が、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一の、但し同様には処理されていない第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較すると、低下することによって明らかになるような、少なくとも部分的な遺伝子発現の抑制をいう。抑制の程度は、通常、
【０２２０】
【数１】
0005933163.tif 000081
の各項で表される。
【０２２１】
別法として、阻害の程度は、遺伝子転写に機能的に関連するパラメータの低下、例えば、細胞によって分泌される遺伝子によってコード化される蛋白質の量、又はある種の表現型、例えば、アポトーシスを呈する細胞の数の項で与えることができる。原理的には、遺伝子サイレンシングは、構成的に、又はゲノムエンジニアリングによって、及びいずれかの適切なアッセイによって、標的を発現するいずれかの細胞において決定することができる。しかしながら、所定のｄｓＲＮＡがどの程度遺伝子の発現を阻害するか測定するために参照が必要な場合、それは本発明の範囲に含まれるところであり、下記の実施例に示されるアッセイはそのような参照を提供する。
【０２２２】
例えば、ある場合には、遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約２０％、２５％、３５％、又は５０％だけ抑制される。いくつかの実施形態において、遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、又は８０％だけ抑制される。いくつかの実施形態において、遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも少なくとも約８５％、９０％、又は９５％だけ抑制される。
【０２２３】
本明細書中で用いるように、用語「治療する」、「治療」等とは、特定の遺伝子を下方制御により調節することができる病理学的プロセスからの救済、又は緩和をいう。本発明との関係では、それが（遺伝子を下方制御により調節することができる病理学的プロセス以外の）以下に本明細書中で引用する他の条件のいずれかに関する限り、そのような疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽減し、又は緩和し、あるいはそのような疾患の進行を遅らせ、又は逆進させることを意味する。
【０２２４】
本明細書中で用いるように、表現「治療上有効量」及び「予防上有効量」とは、遺伝子を下方制御により調節することができる病理学的プロセスの、あるいは遺伝子を下方制御により調節することができる病理学的プロセスの明白な症状の治療、予防、又は管理における治療的利点を提供する量をいう。治療的に効果的な具体的な量は通常の医療実施者によって容易に決定することができ、例えば、遺伝子を下方制御により調節することができる病理学的プロセスの患者の病歴及び年齢、遺伝子発現を下方制御により調節することができる病理学的プロセスの段階、及び遺伝子発現を下方制御により調節することができる他の抗病理学的プロセスの投与のような当該分野で公知の因子によって変化し得る。患者を治療する関係での有効量は治療的利点を生じさせるのに十分である。用語「治療的利点」とは本明細書中で用いるように、患者の細胞増殖性疾患の医学的処置に関係して、患者の健康を促進し、又は高めるものをいう。この非限定的例の列挙は、ある期間の患者の生命の延長、病性新生物発生の低下又は遅延、腫瘍成長の低下、転移の遅延、癌細胞、腫瘍細胞、又はいずれかの他の過剰増殖細胞の増殖速度の低下、何らかの処理細胞あるいは処理細胞の影響を受けたいずれかの細胞におけるアポトーシスの誘導、及び／又は患者の状態に依存し得る患者への疼痛の減少を含む。
【０２２５】
本明細書中で用いるように、「医薬組成物」は、薬理学上有効量のオリゴヌクレオチド剤及び医薬上許容される担体を含む。本明細書中で用いるように、「薬理学上有効量」、「治療上有効量」又は単に「有効量」とは、意図した薬理学的、治療的、予防的結果を生じさせるのに有効なＲＮＡの量をいう。例えば、所定の臨床的処置が、病気又は障害に関連する測定可能なパラメータの少なくとの２５％の低下がある場合に有効であると考えられるとき、その病気又は障害の治療のための薬物の治療上有効量は、そのパラメータの少なくとも２５％低下を行うのに必要な量である。
【０２２６】
用語「医薬上許容される担体」とは、治療剤の投与用の担体をいう。そのような担体は限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びその組合せを含み、後により詳細に記載する。該用語は具体的には細胞培地を除く。
【０２２７】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面、及び以下の記載において説明される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は明細書及び図面、及び請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】種々のＮＤ９８組成物の効果を比較する棒グラフを示す。
【図２】種々のＮＤ９８組成物の効果を比較する棒グラフを示す。
【図３】ＮＤ９８の６−テイルド異性体の効果を示す棒グラフを示す。
【図４】２つの異なる手順を用いて調製された会合複合体の効果を比較する棒グラフを示す。
【図５】種々の鎖長を有するものを含む種々のＰＥＧ脂質部位を示す。
【図６】会合複合体の効果を比較する棒グラフを示す。
【図７】ｓｉＲＮＡに対する脂質の比率の低下に伴う種々の複合体の許容性を比較する棒グラフを示す。
【図８】核酸を負荷する会合複合体の製造方法のフローチャートである
【図９】２つの標的ＦＶＩＩ及びＡｐｏＢでのｓｉＲＮＡの効果を示す棒グラフである。
【図１０】核酸を負荷した会合複合体を作製するためのプロセスのフローチャートである。
【図１１】サイレンシングアッセイにおける核酸の効果に対する会合複合体の粒子サイズの効果を示す棒グラフである。
【図１２】ａ及びｂは、調製されていない、及び調製された形態における核酸治療剤の血清中半減期を比較する棒グラフである。
【図１３】様々な鎖長を持つＰＥＧ脂質を有する会合複合体の効果を比較する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０２２９】
ＲＮＡのような核酸ベースの治療剤を投与するのに有用な脂質製剤及び送達システムを本明細書に記載する。
カチオン性脂質化合物及び脂質製剤
ポリアミン脂質製剤
出願人らは、ある種のポリアミン脂質部位がｓｉＲＮＡのような核酸の投与のための望ましい特性を提供することを発見した。いくつかの実施形態において、脂質部位は、例えば、第ＶＩＩ分子標的化ｓｉＲＮＡと複合体化され、マウスのような動物に投与される。次いで、分泌された血清中第ＶＩＩ因子のレベルを定量し（投与後２４時間）、ここで第ＶＩＩ因子サイレンシングの程度はイン・ビボｓｉＲＮＡ送達の程度を示す。従って、ｓｉＲＮＡのような核酸の向上したイン・ビボ送達を提供する脂質が好ましい。特に出願人らは、本明細書中に記載する置換を有するポリアミンが、生物学的利用性、生物分解性、及び許容性のようなｓｉＲＮＡを送達するための望ましい特性を有し得ることを発見した。
【０２３０】
一実施形態において、脂質製剤は、それに結合したアクリルアミド置換基又は、アクリレート置換基のような複数の置換基を有するポリアミン部位を含む。例えば、脂質部位は以下に示されるポリアミン部位：
【０２３１】
【化８０】
0005933163.tif 000082
を含むことができ、１つ以上の水素原子は、例えば、いくつかの実施形態においてはさらに置換された長鎖アルキル、アルケニル、又はアルキニル部位を含む置換基で置換されている。Ｘａ及びＸｂは共にアルキレン部位である。いくつかの実施形態において、Ｘａ及びＸｂは同一の鎖長を有し、例えば、Ｘａ及びＸｂは共にエチレン部位である。他の実施形態は、Ｘａ及びＸｂは異なる鎖長のものである。いくつかの実施形態において、ポリアミンが複数のＸａ部位を含む場合、Ｘａは１以上の出現に伴って変化し得る。例えば、ポリアミンがスペルミンである場合、１つの出現におけるＸａはプロピレンであり、もう１つの出現におけるＸａはブチレンであって、Ｘｂはプロピレンである。
【０２３２】
出願人らは、いくつかの例において、ポリアミン上の比較的高い置換度を有することが望ましいことを発見した。例えば、いくつかの実施形態において、出願人らは、製剤中のポリアミンの少なくとも８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は実質的に全て）が置換基で置換された、少なくともｎ＋２の水素を有するポリアミン製剤が、例えば、ｓｉＲＮＡのような核酸の投与で用いるための望ましい特性を提供することを見出した。
【０２３３】
いくつかの場合において、ポリアミンの窒素上の置換基に存在する１つ以上のヘテロ原子を有することが望ましい（好ましい）。
いくつかの実施形態において、製剤は式（Ｉ）：
【０２３４】
【化８１】
0005933163.tif 000083
［各Ｘａ及びＸｂは、各出現について、独立してＣ１−６アルキレンであり、ｎは０、１、２、３、４、又は５であり、各Ｒは独立してＨ、
【０２３５】
【化８２】
0005933163.tif 000084
であり、製剤中の式（Ｉ）の化合物の分子の少なくとも約８０％におけるＲ部位の少なくともｎ＋２はＨではなく、ｍは１、２、３又は４であり、ＹはＯ、ＮＲ２、又はＳであり、Ｒ１はアルキル、アルケニル又はアルキニルである、その各々は所望により置換されており、かつＲ２はＨ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、その各々は所望により置換されており、但し、ｎ＝０の場合、Ｒ部位の少なくともｎ＋３はＨではない］
の化合物又はその医薬上許容される塩を含む。
【０２３６】
上述したように、製剤は対称ならびに非対称ポリアミン誘導体を含有する分子を含む。従って、Ｘａは各出現について独立しており、及びＸｂはＸａから独立している。例えば、ｎが２である場合は、Ｘａは各出現について同一であり得、あるいは各出現について異なり得、あるいはいくつかの出現について同一であり得、かつ１以上の他の出現について異なり得る。Ｘｂは、各ポリアミン誘導体におけるＸａの出現の数にかかわらず、Ｘａから独立している。各出現についての、かつＸｂから独立したＸａはメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、又はヘキシレンであり得る。例示的なポリアミン誘導該はＮ１，Ｎ１’−（エタン−１，２−ジイル）ジエタン−１，２−ジアミン、エタン−１，２−ジアミン、プロパン−１，３−ジアミン、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、及びＮ１−（２−アミノエチル）−プロパン−１，３−ジアミンをから誘導されたポリアミンを含む。好ましいポリアミン誘導体はプロパン−１，３−ジアミン及びＮ１，Ｎ１’−（エタン−１，２−ジイル）ジエタン−１，２−ジアミンを含む。
【０２３７】
式（Ｉ）のポリアミンはＨではない少なくともｎ＋２のＲ部位で置換されている。一般に、各非水素Ｒ部位は、リンカーを介してポリアミン誘導の窒素に結合され、所望により１以上の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、又はアルキニル部位を含む。適切なリンカーはアミド、エステル、チオエステル、スルホン、スルホキシド、エーテル、アミン、及びチオエテルを含む。多くの場合において、リンカー部位はアルキレン部位（例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、又はブチレン）を介してポリアミンの窒素に結合している。例えば、アミド又はエステルリンカーはメチレン又はエチレン部位を通じてポリアミンの窒素に結合している。
【０２３８】
好ましいアミン置換基の例を以下に示す：
【０２３９】
【化８３】
0005933163.tif 000085
アミンがエチレン基を介してリンカーＲ１部分に結合している場合には、１，４コンジュゲーテッド前駆体アクリレート又はアクリルアミドをポリアミンと反応させて、置換されたポリアミンを提供することができる。アミンがメチレン基を介してリンカーＲ１部分に結合する場合、アルファ−クロロ部位のようなアルファ−ハロ置換基を含めたアミド又はエステルをポリアミンと反応させ、置換されたポリアミンを提供することができる。好ましい実施形態において、Ｒ２はＨである。
【０２４０】
ＨでないＲ部位は全て、前記で提供したＲ１部位を必要とする。一般に、Ｒ１部位はＣ６−Ｃ３２アルキル、Ｃ６−Ｃ３２アルケニル又はＣ６−Ｃ３２アルキニルのような長鎖部位である。
【０２４１】
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１はアルキル部位である。例えば、Ｒ１はＣ１２アルキルのようなＣ１０−Ｃ１８アルキルである。特に好ましいＲ部位の例を以下に示す。
【０２４２】
【化８４】
0005933163.tif 000086
式（Ｉ）の化合物を含む製剤は式（Ｉ）の複数の化合物の混合物であり得る。例えば、製剤は、ポリアミン部位上の様々な置換度を有する式（Ｉ）の化合物の混合物を含むことができる。しかしながら、本明細書中に記載された製剤は、製剤中の式（Ｉ）の化合物の分子の少なくとも約８０％（例えば、なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は実質的に全て）におけるＲ部位の少なくともｎ＋２がＨではないように選択される。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、製剤は２つのアミノ基を有するポリアミン部位を含み、混合物中の式（Ｉ）の分子の少なくとも８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は実質的に全て）は、Ｈではない３つのＲ部位で置換されている。式（Ｉ）の例示的な化合物を以下に示す。
【０２４４】
【化８５】
0005933163.tif 000087
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒは
【０２４５】
【化８６】
0005933163.tif 000088
である。
【０２４６】
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１はＣ１０−Ｃ１８アルキル、又はＣ１０−Ｃ３０アルケニルである。
いくつかの実施形態において、製剤は３又は４つ（例えば、４つ）のアミノ基を有するポリアミン部位を含み、式（Ｉ）の分子の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は実質的に全て）におけるＲ部位の少なくともｎ＋２はＨではない。４つのアミノ部位を有する式（Ｉ）の例示的な化合物を以下に示す。
【０２４７】
全ての（すなわち、ｎ＋４）Ｒ部位がＨではないポリアミン部位の例は以下のものである。
【０２４８】
【化８７】
0005933163.tif 000089
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒは
【０２４９】
【化８８】
0005933163.tif 000090
である。
【０２５０】
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１はＣ１０−Ｃ１８アルキル（例えば、Ｃ１２アルキル）、又はＣ１０−Ｃ３０アルケニルである。
５つの（すなわち、ｎ＋３）Ｒ部位がＨではないポリアミン部位の例を以下に示す。
【０２５１】
【化８９】
0005933163.tif 000091
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒは
【０２５２】
【化９０】
0005933163.tif 000092
である。
【０２５３】
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１はＣ１０−Ｃ１８アルキル（例えば、Ｃ１２アルキル）又はＣ１０−Ｃ３０アルケニルである。
４つの（すなわちｎ＋２）Ｒ部位がＨではないポリアミン部位の例を以下に示す。
【０２５４】
【化９１】
0005933163.tif 000093
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒは
【０２５５】
【化９２】
0005933163.tif 000094
である。
【０２５６】
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１はＣ１０−Ｃ１８アルキル（例えば、Ｃ１２アルキル）、Ｃ１０−Ｃ３０アルケニルである。
いくつかの好ましい実施形態において、ポリアミンは以下の異性体（１）又は（２）の化合物、好ましくは異性体（１）の化合物である。
【０２５７】
【化９３】
0005933163.tif 000095
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物を含む製剤は式（Ｉ）を有する分子の混合物を含む。例えば、混合物は、Ｈではない異なる程度のＲ置換基のような、同一のポリアミンコアを有するが、異なるＲ置換基を有する分子を含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、単一のポリアミンコアを有する式（Ｉ）の化合物を含み、ポリアミンコアの各ＲはＲ又は
【０２５９】
【化９４】
0005933163.tif 000096
のような単一部位である。製剤は、従って、式（Ｉ）を有する分子の混合物を含み、該混合物はＨである様々な数のＲ部位を有する式（Ｉ）のいずれかのポリアミン化合物及び／又はＨではない単一の所定の数のＲ部位を有する式（Ｉ）のポリアミン化合物よりなり、式（Ｉ）の化合物は、先に示された構造異性体のようなポリアミンの構造異性体である。
【０２６０】
いくつかの好ましい実施形態において、製剤は、分子の少なくとも８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は実質的に全て）が単一の構造異性体であるような、式（Ｉ）の分子を含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、製剤は２つ以上の式（Ｉ）の化合物の混合物を含む。いくつかの実施形態において、製剤は同一化学式の構造異性体の混合物である。いくつかの実施形態において、製剤は式（Ｉ）の化合物の混合物であり、該化合物はＲ置換基の化学的性質が変化する。例えば、製剤は以下の化合物、
【０２６２】
【化９５】
0005933163.tif 000097
［式中、ｎは０であり、各Ｒは独立してＨ又は
【０２６３】
【化９６】
0005933163.tif 000098
である］
及び：
【０２６４】
【化９７】
0005933163.tif 000099
［式中、ｎは２であり、各Ｒは独立してＨ又は
【０２６５】
【化９８】
0005933163.tif 000100
である］
の混合物を含むことができる。
【０２６６】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は医薬上許容される塩のような塩の形態である。塩は、例えば、１つのアニオンと、本明細書中に記載された化合物上の正に荷電した置換基（例えば、アミノ基）との間に形成され得る。適切なアニオンは、フッ素、塩素、ブロマイド臭素、ヨウ素、硫酸、重硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、フマル酸、オレイン酸、吉草酸、マレイン酸、シュウ酸、イソニコチン酸、乳酸、サリチル酸、酒石酸、タンニン酸、パントテン酸、重酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、ゲンチシネート、グルコン酸、グルカロン酸、サッカレート、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸及びパモ酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物は塩酸塩のようなヒドロハライド塩である。
【０２６７】
式（Ｉ）の化合物は、水和物（例えば、（Ｈ２Ｏ）ｎ）及び溶媒和物の形態で存在させることもでき、これは本開示に含まれる。
生分解性カチオン脂質
本出願人らは１つ以上の生分解性部位を含むある種のカチオン性部位脂質を核酸治療剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）の送達用のリポソームのような会合複合体中の成分として用いることができることを発見した。例えば、本明細書中に開示されるのは、例えば、エステラーゼ、アミダーゼ、又はジスルフィド切断酵素のような酵素を介してイン・ビボにて切断に従うカチオン性脂質が本明細書中に開示される。いくつかの例において、脂質は、例えば、アセタール又はケタールのような酸不安定性部位の加水分解によって化学的に切断される。いくつかの実施形態において、脂質は、イン・ビトロ加水分解され、次いで、エステラーゼ、アミダーゼ又はジスルフィド切断酵素の１以上により、酵素切断を受ける部位を含む。これは、エンドソームのような細胞の小胞区画で起こり得る。もう１つの酸感受性切断結合はエンドソームの酸性環境で切断されるβ―チオプロピオネート結合である（ＪｅｏｎｇらＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍ．２００３，４，１４２６）。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、本発明は式（Ｘ）：
【０２６９】
【化９９】
0005933163.tif 000101
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立してＨ、所望により１〜４のＲ５で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、所望により１〜４のＲ５で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニルである、
Ｒ３及びＲ４は、各々独立してアルキル、アルケニル、アルキニルであり、その各々は所望によりフルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードで置換されており、
Ｌ１及びＬ２は、各々独立して−ＮＲ６Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−、−ＯＣ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−、Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＨであり、あるいは
Ｌ１−Ｒ３はＬ２−Ｒ４と共にアセタール又はケタールを形成することができ、
Ｒ５はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、―ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ８）（Ｒ９）、−ＣＮ、ＳＲ１０、Ｓ（Ｏ）Ｒ１０、Ｓ（Ｏ）２Ｒ１０であり、
Ｒ６はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ７はＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
各Ｒ８及びＲ９は独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１０はＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
ｍは１、２、３、４、５、又は６であり、
ｎは０、１、２、３、４、５、又は６であるその医薬上許容される塩］
の化合物、又はその医薬上許容される塩を特徴とする。
【０２７０】
いくつかの実施形態において、Ｒ１はＨ、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルのような低級アルキル、又は２−ヒドロキシエチルのような置換されたアルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ２はＨ、あるいはメチル、エチル、プロピル又はイソプロピルのような低級アルキルである。
【０２７１】
いくつかの実施形態において、Ｒ１又はＲ２は式（Ｘ）の窒素と共にクアナジン部位を形成する。
Ｌ１−Ｒ３及びＬ２−Ｒ４又はその組合せは、イン・ビボで切断される少なくとも１つの部位を提供する。いくつかの実施形態において、Ｌ１−Ｒ３及びＬ２−Ｒ４の双方は生分解性である。例えば、Ｌ１−Ｒ３及びＬ２−Ｒ４の双方は、独立して、（例えば、エステラーゼ、アミダーゼ、又はジスルフィド切断酵素による）酵素分解を受ける。いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の双方はエステル、アミド又はジスルフィドのような同一の化学的部位である。他の例において、Ｌ１及びＬ２は異なり、例えば、Ｌ１又はＬ２はエステルであり、Ｌ１又はＬ２の他方はジスルフィドである。
【０２７２】
いくつかの実施形態において、Ｌ１−Ｒ３はＬ２−Ｒ４と共にアセタール又はケタール部位を形成し、これは、イン・ビボにて加水分解される。
いくつかの実施形態において、Ｌ１−Ｒ３又はＬ２−Ｒ４の１つは酵素切断に従う。例えば、Ｌ１−Ｒ３又はＬ２−Ｒ４の一方はイン・ビボにて切断され、遊離ヒドロキシル部位又は遊離アミンを脂質上に供し、これは残りのＬ１−Ｒ３又はＬ２−Ｒ４部位と化学的に反応するのに利用できるようになる。例示的な実施形態を以下に示す：
【０２７３】
【化１００】
0005933163.tif 000102
いくつかの好ましい実施形態において、カルバミン酸又は尿素部位は、アミド、エステル、又はジスルフィド部位との組合せに含まれる。例えば、脂質はエステル部位を含み、これは、切断（例えば、酵素切断）に際して、カルバミン酸又は尿素部位と化学的に反応するのに利用できるようになる。Ｌ１及びＬ２のいくつかの好ましい組合せは、２つのアミド、２つのエステル、アミド及びエステル、２つのジスルフィド、アミド及びジスルフィド、エステル及びジスルフィド、カルバミン酸及びジスルフィド、尿素及びジスルフィドを含む。例示的な化合物を以下に示す：
Ｚ立体配置を持つアミド及びエステル結合（２つの二重結合）
【０２７４】
【化１０１】
0005933163.tif 000103
Ｚ立体配置を持つアミドエステル結合（３つの二重結合）
【０２７５】
【化１０２】
0005933163.tif 000104
Ｅ立体配置を持つアミド及びエステル結合（２つの二重結合）
【０２７６】
【化１０３】
0005933163.tif 000105
Ｅ立体配置を持つアミド及びエステル結合（３つの二重結合）
【０２７７】
【化１０４】
0005933163.tif 000106
ジスルフィド結合
【０２７８】
【化１０５】
0005933163.tif 000107
不飽和アルキル鎖、Ｅ及びＺ立体配置を持つジスルフィド結合
【０２７９】
【化１０６】
0005933163.tif 000108
飽和及び不飽和アルキル鎖を持つアミド及びジスルフィド結合
【０２８０】
【化１０７】
0005933163.tif 000109
飽和及び不飽和アルキル鎖を持つエステル及びジスルフィド結合
【０２８１】
【化１０８】
0005933163.tif 000110
アルキル鎖を持つカルバミン酸又は尿素及びジスルフィド結合
【０２８２】
【化１０９】
0005933163.tif 000111
不飽和アルキル鎖を持つカルバミン酸又は尿素及びジスルフィド結合
【０２８３】
【化１１０】
0005933163.tif 000112
不飽和アルキル鎖を持つカルバミン酸又は尿素及びジスルフィド結合
【０２８４】
【化１１１】
0005933163.tif 000113
不飽和アルキル鎖を持つカルバミン酸又は尿素結合
【０２８５】
【化１１２】
0005933163.tif 000114
いくつかの実施形態において、脂質は酸性切断を受けることができるオキシム、又はヒドラゾンを含む。
【０２８６】
Ｒ３及びＲ４は、一般に、アルキル、アルケニル、又はアルキニルのような長鎖疎水性部位である。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４はハロ部位で置換され、例えば、ペルフルオロアルキル又はペルフルオロアルケニル部位を提供する。Ｒ３及び／又はＲ４の各々は相互に独立している。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４の双方は同一である。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４は異なる。
【０２８７】
いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４はアルキルである。例えば、Ｒ３及びＲ４の一方又は双方はＣ６〜Ｃ３０アルキル、例えば、Ｃ１０〜Ｃ２６アルキル、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキル、又はＣ１２アルキルである。
【０２８８】
いくつかの実施形態において、Ｒ３及び／又はＲ４はアルケニルである。いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ３及び／又はＲ４は２又は３の二重結合を含む。例えば、Ｒ３及びＲ４は２つの二重結合を含み、あるいはＲ３及び／又はＲ４は３つの二重結合を含む。二重結合は各々独立して、Ｚ又はＥ立体配置を有する。例示的なアルケニル部位を以下に示す：
【０２８９】
【化１１３】
0005933163.tif 000115
［式中、ｘは１〜８の整数であり、かつｙは１〜１０の整数である］
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ３及び／又はＲ４は、例えば、Ｚ立体配置を有する２つの二重結合のような、２つの二重結合を有するＣ６〜Ｃ３０アルケニル、例えば、Ｃ１０〜Ｃ２６アルケニル、及びＣ１２〜Ｃ２６アルケニル、又はＣ１７アルケニルである。Ｒ３及び／又はＲ４は同一であるか、又は異なっていてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ３及びＲ４は同一である。
【０２９０】
いくつかの実施形態において、Ｒ３及び／又はＲ４はアルキニルである。例えば、Ｃ６〜Ｃ３０アルキニル、例えば、Ｃ１０〜Ｃ２６アルキニル、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキニル。Ｒ３及び／又はＲ４は１〜３つの三重結合、例えば、１、２又は３つの三重結合を有することができる。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、式（Ｘ）の化合物は医薬上許容される塩のような塩の形態である。塩は、例えば、アニオンと本明細書中に記載された化合物上の正に荷電した置換基（例えば、アミノ）との間で形成することができる。適切なアニオンは、フッ素、塩素、ブロマイド臭素、ヨウ素、硫酸、重硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、フマル酸、オレイン酸、吉草酸、マレイン酸、シュウ酸、イソニコチン酸、乳酸、サリチル酸、酒石酸、タンニン酸、パントテン酸、重酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、ゲンチシネート、グルコン酸、グルカロン酸、サッカレート、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸及びパモ酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｘ）の化合物は塩酸塩のようなヒドロハライド塩である。
【０２９２】
式（Ｘ）の化合物は水和物（例えば、（Ｈ２Ｏ）ｎ）及び溶媒和物の形態で存在させることもでき、これは本開示に含まれる。
ＰＥＧ脂質化合物
出願人らは、ある種のＰＥＧ含有脂質部位が、一本鎖、又は二本鎖、核酸、例えば、ｓｉＲＮＡのような核酸剤の投与のための望ましい特性を提供することを見出した。例えば、本明細書中に記載された脂質のようなＰＥＧ含有脂質が、ｓｉＲＮＡのような核酸部位と共に会合複合体に調製され、患者に投与される場合、脂質は核酸部位の向上した送達を提供する。この向上した送達は、例えば、ＦＶＩＩのサイレンシングのような遺伝子サイレンシングアッセイにおける評価によって決定することができる。特に出願人らは、式（ＸＶ）のＰＥＧ脂質が、改善された生物学的利用性、生分解性、及び許容性を含めた、ｓｉＲＮＡの送達のための望ましい特性を有することを見出した。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、リンカー部位を介して、長鎖アルキル部位のような２つの疎水性部位を含む構造に結合している。例示的なＰＥＧ脂質、例えば、式（ＸＶ）、（ＸＶ’）、及び（ＸＶＩ）によって含まれるものが提供される。いくつかの好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質は以下の構造：
【０２９４】
【化１１４】
0005933163.tif 000116
を有し、キラル中心の好ましい立体化学は「Ｒ」であり、反復するＰＥＧ部位は約２０００ダルトンの合計平均分子量を有する。
【０２９５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されたＰＥＧ脂質は標的部位、例えば、
【０２９６】
【化１１５】
0005933163.tif 000117
のようなグリコシル部位にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態において、標的部位はリンカー、例えば、本明細書中に記載されたリンカーを通じて、ＰＥＧ脂質に結合している。例示的な標的化ＰＥＧ脂質化合物は、本明細書中に記載された式（ＸＸＩ）、（ＸＸＩ’）、（ＸＸＩＩ）、及び（ＸＸＩＩ’）の化合物である。そのような脂質を作製する方法は、例えば、実施例４２及び４３に記載されている。
【０２９７】
カチオン性脂質化合物及びカチオン性脂質含有製剤を作製する方法
本明細書中に記載された化合物は商業的供給源（例えば、アシネックス（Ａｓｉｎｅｘ）社、ロシア、モスクワ；バイオネット（Ｂｉｏｎｅｔ）社、イギリス、カーメルフォード；ケムディヴ（ＣｈｅｍＤｉｖ）社、カリフォルニア州サンディエゴ；コムジェネックス（Ｃｏｍｇｅｎｅｘ）社、ハンガリー、ブダペスト；エナミン（Ｅｎａｍｉｎｅ）社、ウクライナ、キエフ；ＩＦラブ（ＩＦ  Ｌａｂ）社、ウクライナｒａｉｎｅ；インターバイオスクリーン（Ｉｎｔｅｒｂｉｏｓｃｒｅｅｎ）社、ロシア、モスクワ；メイブリッジ（Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ）社、イギリス、ティンタジェル；スペックス（Ｓｐｅｃｓ）社、オランダｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ティムテック（Ｔｉｍｔｅｃ）社、デラウェア州ニューヨーク；ヴィタス−Ｍラブ（Ｖｉｔａｓ−Ｍ  Ｌａｂ）社、ロシア、モスクワ）から入手することができるか、あるいは、商業的に入手可能な出発材料及び試薬を用いて、以下に示される従来法によって合成することができる。
【０２９８】
ポリアミン脂質の作製方法
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下に示される式（ＩＩＩ）：
【０２９９】
【化１１６】
0005933163.tif 000118
［式中、Ｘａ、Ｘｂ，及びｎは前記定義の通りである］
のポリアミンを式（ＩＶ）：
【０３００】
【化１１７】
0005933163.tif 000119
［式中、Ｙ及びＲ１は前記定義の通りである］
の１，４共役系と反応させて式（Ｉ）の化合物を得ることによって作製することができる。
【０３０１】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物を共に純物として（すなわち、無溶媒）反応させる。例えば、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物を高温（少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、少なくとも約８０℃、少なくとも約８５℃、少なくとも約９０℃）において、好ましくは約９０℃にて純物として共にに反応させる。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物を溶媒（例えば、アセトニトリル又はＤＭＦのような極性非プロトン性溶媒）と共に反応させる。例えば、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物を約５０℃〜約１２０℃の高温にて溶媒中で共に反応させる。
【０３０３】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物をラジカルクエンチャ又はスカベンジャー（例えば、ヒドロキノン）の存在下で共に反応させる。ラジカルクエンチャを含む反応条件は、純物、又は、例えばアセトニトリル又はＤＭＦのような極性非プロトン性溶媒中であり得る。反応は高温にて行うことができる（例えば、９０℃のような高温にて純物で、あるいは約５０℃〜約１２０℃のような高温にて溶媒と共に）。用語「ラジカルクエンチャ」又は「ラジカルスカベンジャ」とは本明細書中で用いるように、反応混合物中でフリーラジカルを吸収することができる化学的部位をいう。ラジカルクエンチャ／スカベンジャの例はヒドロキノン、アスコルビン酸、クレゾール、チアミン、３，５−Ｇ−ｔｅｒｔ−ブチル‐４−ヒドロキシトルエン、ｔｅｒｔ−ブチル‐４−ヒドロキシアニソール及びチオール含有部位を含む。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物は、反応促進剤（例えば、水、又は酢酸、ホウ酸、クエン酸、安息香酸、トシル酸、ペンタフルオロフェノール、ピクリン酸、芳香族酸、炭酸水素塩、重硫酸塩、一及び二−水素リン酸塩のような塩、フェノール、ペルハロフェノール、ニトロフェノール、スルホン酸、ＰＴＴＳ等のようなミカエル付加促進剤）、好ましくは、飽和ホウ酸水溶液のようなホウ酸の存在下で共に反応させる。反応促進剤を含めた反応条件は純物、又は溶媒、例えば、アセトニトリル又はＤＭＦのような極性非プロトン性溶媒中であり得る。反応は高温で行われ得る。（例えば、９０℃のような高温にて純物、又は約５０℃〜約１２０℃のような高温において溶媒と共に）。本明細書中で用いるように、用語「反応促進剤」とは、反応混合物中で用いた場合に、反応速度を加速し／高める化学的部位をいう。
【０３０５】
式（ＩＶ）に対する式（ＩＩＩ）の化合物の比率を変化させ、式（ＩＩＩ）のポリアミン上の置換の変動をもたらすことができる。一般に、非水素部位で置換された少なくとも約５０％の水素部位を有するポリアミンが好ましい。従って、式（ＩＩＩ）／式（ＩＶ）の化合物の比率は、遊離アミンの比較的高程度の置換を有する生成物を提供するように選択される（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、又は実質的に全て）。いくつかの好ましい実施形態において、ｎは式（ＩＩＩ）のポリアミンにおいては０であって、式（ＩＶ）の化合物に対する式（ＩＩＩ）の化合物の比率は約１：３〜約１：５、好ましくは、約１：４である。いくつかの好ましい実施形態において、ｎは式（ＩＩＩ）のポリアミンにおいては２であって、式（ＩＶ）の化合物に対する式（ＩＩＩ）の化合物の比率は約１：３〜約１：６、好ましくは約１：５である。
【０３０６】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）の化合物を２工程プロセスで反応させた。例えば、最初の工程プロセスは、式（ＩＶ）の化合物の約３．８〜約４．２モル当量と共に、式（ＩＩＩ）の化合物の約０．８〜約１．２モル当量を有する反応混合物を含み、第二の工程プロセスは、式（ＩＶ）の化合物の約０．８〜約１．２モル当量の反応混合物への付加を含む。
【０３０７】
反応の完了に際して、式（Ｉ）を有する１つ以上の生成物を反応混合物から単離することができる。例えば、式（Ｉ）の化合物は単一の生成物（例えば、単一の構造異性体）として、又は生成物の混合物（例えば、複数の構造異性体及び／又は複数の式（Ｉ）の化合物）として単離することができる。いくつかの実施形態において、フラッシュクロマトグラフィ、重力クロマトグラフィ（例えば、シリカゲルを用いる異性体の重力分離）、カラムクロマトグラフィ（例えば、順相ＨＰＬＣ又はＲＰＨＰＬＣ）、又は移動床クロマトグラフィのようなクロマトグラフィを用い、１つ以上の反応生成物を単離及び／又は精製することができる。いくつかの実施形態において、反応生成物は、単一の構造異性体のような単一化合物の少なくとも約８０％を含有する製剤を提供するように精製される（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％）。
【０３０８】
いくつかの実施形態において、遊離アミン生成物をＨＣｌのような酸で処理して、生成物のアミン塩（例えば、塩酸塩）が得られる。いくつかの実施形態において、塩生成物は、例えば、対応する遊離アミン生成物に対し、取扱い及び／又は貯蔵について改善された特性を提供する。いくつかの実施形態において、塩生成物は、対応する遊離アミンに対し、Ｎ−オキシド又はＮ−カルボネート形成のような分解生成物の形成を妨げ、又は形成速度を低下させることができる。いくつかの実施形態において、塩生成物は、対応する遊離アミンに対して、治療製剤として用いるための改善された特性を有することができる。
【０３０９】
いくつかの実施形態において、反応混合物をさらに処理して、例えば、１つ以上の生成物を精製し、又は未反応出発物質のような不純物を除去する。いくつかの実施形態において、反応混合物を、未反応アクリルアミドを捕捉することができる固定化（例えば、ポリマー結合）チオール部位と反応させる。いくつかの実施形態において、単離された生成物を処理して、さらに、不純物を除去することができ、例えば、単離された生成物を固定化されたチオール部位で処理し、未反応アクリルアミド化合物を捕捉することができる。
【０３１０】
いくつかの実施形態において、反応生成物を固定化された（例えば、ポリマー結合）イソチオシアネートと反応させることができる。例えば、第三級アミンを含めた反応生成物を固定化されたイソチオシアネートで処理して、生成物から第一級及び／又は第二級アミンを除去することができる。
【０３１１】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下に示される式（ＩＩＩ）：
【０３１２】
【化１１８】
0005933163.tif 000120
［式中、Ｘａ、Ｘｂ、及びｎは前記定義の通りである］
のポリアミンを、式（ＶＩ）：
【０３１３】
【化１１９】
0005933163.tif 000121
［式中、ＱはＣｌ、Ｂｒ、又はＩであって、Ｙ及びＲ１は前記定義の通りである］
と反応させることによって作製することができる。
【０３１４】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）及び式（ＶＩ）の化合物は純物として共に反応させる。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）及び式（ＶＩ）の化合物は、１つ以上の溶媒、例えば、アセトニトリル又はＤＭＦのような極性非プロトン性溶媒の存在下で共に反応させる。いくつかの実施形態において、反応体式（ＩＩＩ）及び式（ＶＩ）は、高温（例えば、少なくとも約５０℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約８０℃、少なくとも約９０℃、少なくとも約１００℃）において共に反応させる。
【０３１５】
いくつかの実施形態において、反応混合物は塩基、例えば、Ｋ２ＣＯ３のような炭酸塩も含む。
いくつかの実施形態において、反応混合物は触媒も含む。
【０３１６】
いくつかの実施形態において、式（ＶＩ）の化合物は、アミン部位を、酸無水物又は酸ハロゲン化物（例えば、酸塩化物）のような活性化された酸と反応させて、式（ＶＩ）の化合物を得ることによって調製される。
【０３１７】
式（ＶＩ）に対する式（ＩＩＩ）の化合物の比率は変化させることができ、式（ＩＩＩ）のポリアミン上の置換の変動を提供する。一般に、非水素部位で置換された水素部位の少なくとも約５０％を有するポリアミンが好ましい。従って、式（ＩＩＩ）／式（ＶＩ）の化合物の比率は、遊離アミンの比較的高い程度の置換を有する生成物を提供するように選択される（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、又は実質的に全て）。いくつかの好ましい実施形態において、ｎは式（ＩＩ）のポリアミンにおいては０であって、式（ＶＩ）の化合物に対する式（ＩＩＩ）の化合物の比率は約１：３〜約１：５、好ましくは約１：４である。いくつかの好ましい実施形態において、ｎは式（ＩＩＩ）のポリアミンにおいては２であって、式（ＶＩ）の化合物に対する式（ＩＩＩ）の化合物の比率は約１：３〜約１：６、好ましくは約１：５である。
【０３１８】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）及び式（ＶＩ）の化合物は２工程プロセスで反応させる。例えば、第一の工程プロセスは、式（ＶＩ）の化合物の約３．８〜約４．２モル当量と共に、式（ＩＩＩ）の化合物の約０．８〜約１．２モル当量を有する反応混合物を含み、第二の工程プロセスは式（ＶＩ）の化合物の約０．８〜約１．２モル当量の反応混合物への付加を含む。
【０３１９】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のポリアミンを式（ＩＶ）又は（ＶＩ）の化合物と反応させるに先立って保護基を用い、式（ＩＩＩ）の１以上のアミン部位を選択的に保護し、それにより、最終生成物の合成における改善された選択性を提供する。例えば、式（ＩＶ）又は（ＶＩ）の化合物との反応に先立って、式（ＩＩＩ）のポリアミンの１つ以上の第一級アミンを保護することができ、第二級アミンと反応する式（ＩＶ）又は（ＶＩ）の化合物についての選択性を提供する。選択的に除去することができる直交保護基の使用等、他の保護基方策を使用して、第一級アミンに対する選択性を提供することができる。。
【０３２０】
反応の完了に際して、式（Ｉ）を有する１以上の生成物を反応混合物から単離することができる。例えば、式（Ｉ）の化合物は単一の生成物（例えば、単一の構造異性体）として、又は生成物の混合物（例えば、複数の構造異性体及び／又は複数の式（Ｉ）の化合物）として単離することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の反応生成物は、フラッシュクロマトグラフィ、重力クロマトグラフィ（例えば、シリカゲルを用いる異性体の重力分離）、カラムクロマトグラフィ（例えば、順相ＨＰＬＣ又はＲＰＨＰＬＣ）、又は移動床クロマトグラフィのようなクロマトグラフィを用いて単離し、及び／又は精製することができる。いくつかの実施形態において、反応生成物は、単一の構造異性体のような単一化合物の少なくとも約８０％を含有する製剤を提供するように精製される（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％）。
【０３２１】
いくつかの実施形態において、遊離アミン生成物を、ＨＣｌのような酸で処理して、生成物のアミン塩を得る（例えば、塩酸塩）。いくつかの実施形態において、塩生成物は、対応する遊離アミン生成物に対して、例えば、取扱い及び／又は貯蔵のための改善された特性を提供する。いくつかの実施形態において、塩生成物は、対応する遊離アミンに対する、Ｎ−オキシド又はＮ−カルボネート形成のような分解生成物の形成を妨げ、又は形成の速度を低下させることができる。いくつかの実施形態において、塩生成物は、対応する遊離アミンに対して、治療製剤として用いるための改善された特性を有することができる。
【０３２２】
いくつかの実施形態において、ポリアミンカチオン性脂質は、位置選択的合成手法を用いて作製することができる。位置選択的合成手法は、対象とする特異的アルキル化誘導体の合成に導くポリアミン骨格の窒素上に部位特異的アルキル化を成すための便宜な方法を提供する。一般に、式（Ｉ）の化合物は、最初に、第１位のアミン又は末端アミンとの選択的な反応によりそれらの反応をブロックし、又は更なる反応を抑制する試薬と反応することで、標的化合物の合成過程における適切な段階において、これらのブロックを選択的に除去することができる。式（Ｉ）の化合物の末端アミンをブロックした後、適切なモル比率の試薬及び反応条件を用いることによって、第二位アミンの１つ以上を直交アミン保護基で選択的にブロックすることができる。選択的アルキル化、それに続くブロックされたアミンの選択的脱保護、さらに再生されたアミンのアルキル化及び記載された反応の系列の適切な反復は、対象とする特異的化合物を提供する。例えば、トリエチレンテトラミン（１）の末端アミンは、適切な反応条件下で第一級アミン特異的保護基（例えば、トリフルオロアセトアミド）によって選択的にブロックされ、引き続いて、塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミン）の存在下で過剰の直交アミン保護試薬［例えば、（Ｂｏｃ）２Ｏ］と反応させて、全ての内部アミン（例えば、Ｂｏｃ）をブロックする。末端保護基の選択的除去及び、引き続いての、例えば、アクリルアミドでの末端アミンのアルキル化は、化合物１の十分に末端アミンアルキル化された誘導体を提供する。内部アミンの保護の脱ブロック、及び、引き続いての、計算された量のアクリルアミドでのアルキル化は、例えば、部分的にアルキル化された生成物７を生じる。化合物７を作製するためのもう１つの手法は、末端部が保護された化合物１を算出された量の直交アミン保護試薬［例えば、（Ｂｏｃ）２Ｏ］と反応させて、式１の部分的に保護された誘導体を得ることである。部分的に及び選択的に保護された１つの末端アミン保護基の除去及び、引き続いてのアクリルアミドでの全ての未保護アミンのアルキル化は、対象とする化合物７を生じさせる。
【０３２３】
生物切断部位を有する脂質の製造方法
いくつかの実施形態において、式（Ｘ）の化合物は、式：
【０３２４】
【化１２０】
0005933163.tif 000122
の化合物を、式（ＸＩＩ）の化合物：
【０３２５】
【化１２１】
0005933163.tif 000123
［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は前記定義の通りである］
の化合物と反応させることによって製造することができる。
【０３２６】
いくつかの実施形態において、式（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）の化合物は、カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ１のような水溶性カルボジイミド）のようなカップリング剤の存在下で反応させる。
【０３２７】
他の化学反応及び出発材料を使用して、２つの連結基Ｌ１及びＬ２を有する式（Ｘ）の化合物を提供することができる。例えば、式（ＸＩ）のヒドロキシル部位をアミン部位で置き換えて、アミド又は尿素連結基に対する前駆体を提供することができる。
【０３２８】
反応の完了に際して、式（Ｘ）を有する１つ以上の生成物を反応混合物から単離することができる。例えば、式（Ｘ）の化合物は単一の生成物（例えば、単一の構造異性体）として、又は生成物の混合物（例えば、複数の構造異性体及び／又は複数の式（Ｘ）の化合物）として単離することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の反応生成物は、フラッシュクロマトグラフィ、重力クロマトグラフィ（例えば、シリカゲルを用いる異性体の重力分離）、カラムクロマトグラフィ（例えば、順相ＨＰＬＣ又はＲＰＨＰＬＣ）、又は移動床クロマトグラフィのようなクロマトグラフィを用いて単離及び／又は精製することができる。いくつかの実施形態において、反応生成物は、単一の構造異性体のような単一化合物の少なくとも約８０％を含有する製剤を提供するように精製される（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％）。
【０３２９】
いくつかの実施形態において、遊離アミン生成物をＨＣｌのような酸で処理して、生成物のアミン塩（例えば、塩酸塩）を得る。いくつかの実施形態において、塩生成物は、対応する遊離アミン生成物に対して、例えば、取扱い及び／又は貯蔵のための改善された特性を提供する。いくつかの実施形態において、塩生成物は、対応する遊離アミンに対して、Ｎ−オキシド又はＮ−カルボネート形成のような分解生成物の形成を妨げ、又は形成速度を低下させることができる。いくつかの実施形態において、塩生成物は、対応する遊離アミンに対する、治療的機能で用いられる改善された特性を有し得る。
【０３３０】
ＰＥＧ脂質の製造方法
ＰＥＧ脂質化合物は、例えば、適切な条件下で、グリセリド部位（例えば、ジミリスチルグリセリド、ジパルミチルグリセリド、又はジステアリルグリセリド）を活性化部位と反応させて、活性化された中間体が得られ、これを引き続いてアミン又はヒドロキシル基のような反応性部位を有するＰＥＧ成分と反応させて、ＰＥＧ脂質を得ることによって製造することができる。例えば、ダルキルグリセリド（例えば、ジミリスチルグリセリド）を、まず、塩基（例えば、トリエチルアミン）の存在下でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネートと反応させ、ピリジンのような塩基の存在下で形成された中間体とＰＥＧ−アミン（例えば、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２）との引き続いての反応により、対象とするＰＥＧ脂質が得られる。これらの条件下で、ＰＥＧ成分をカルバミン酸結合を介して脂質部位に付着させる。もう１つの例において、ＰＥＧ脂質は、例えば、グリセリド部位（例えば、ジミリスチルグリセリド、ジパルミチルグリセリド、ジステアリルグリセリド、ジミリストイルグリセリド、ジパルミトイルグリセリド又はジステアロイルグルセリド）をコハク酸無水物と反応させ、生じたカルボキシルを引き続いて活性化し、続いて、ＰＥＧ成分を有する活性化された中間体とアミン又はヒドロキシル基とを反応させて、例えば、ＰＥＧ脂質を得ることによって製造することができる。一つの例において、ＤＭＡＰのような塩基の存在下でジミリスチルグリセリドをコハク酸無水物と反応させて、ヘミコハク酸を得る。かくして得られたヘミコハク酸の遊離カルボキシル部位を、ＨＢＴＵ及びジイソプロピルエチルアミンのような標準カルボキシル活性化剤を用いて活性化し、活性化されたカルボキシルとｍＰＥＨ２０００−ＮＨ２との引き続いての反応により、例えば、ＰＥＧ脂質を得る。この手法において、ＰＥＧ成分はコハク酸ブリッジを介して脂質成分と連結される。
【０３３１】
会合複合体
本明細書中に記載された脂質化合物及び脂質製剤は、会合複合体、例えば、リポソーム又はリポプレックスにおける成分として用いることができる。そのような会合複合体を用いて、ＲＮＡのような核酸ベースの治療法、例えば、ｄｓＲＮＡのような一本鎖又は二本鎖ＲＮＡを投与することができる。
【０３３２】
本明細書中に開示された会合複合体は、核酸を標的とし、かつそれに結合することによって、遺伝子発現を修飾することができるオリゴヌクレオチド剤をパッキングするのに有用であり得る。オリゴヌクレオチド剤は一本鎖又は二本鎖とすることができ、例えば、ｄｓＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉ−ＲＮＡ前駆体（プレｍｉＲＮＡ）プラスミド又はＤＮＡを、蛋白質に含むことができる。本発明における特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、例えば、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴミール、デコイＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド及びアプタマーであり得る。
【０３３３】
会合複合体は複数の成分を含むことができる。いくつかの実施形態において、リポソームのような会合複合体は、（オリゴヌクレオチド剤、例えば、ｄｓＲＮＡのような）核酸治療剤のような有効成分、本明細書中に記載された脂質のようなカチオン性脂質を含むことができる。いくつかの実施形態において、会合複合体は複数の治療剤、例えば、１つ以上の遺伝子、又は同一遺伝子の異なる領域を標的とする２つ又は３つの一本鎖又は二本鎖核酸部位を含むことができる。また、本明細書中に記載されたＰＥＧ脂質のようなＰＥＧ脂質、又はコレステロールのような構造成分を含めた、他の成分を会合複合体に含めることもできる。いくつかの実施形態において、会合複合体は融合脂質又は成分及び／又は標的分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、会合複合体は、ｄｓＲＮＡのようなオリゴヌクレオチド剤、式（Ｉ）又は式（Ｘ）の化合物のような本明細書中に記載された脂質、本明細書中に記載されたＰＥＧ脂質のようなＰＥＧ脂質（式（ＸＶ）のＰＥＧ脂質）、及びコレステロールのような構造成分を含むリポソームである。
【０３３４】
一本鎖リボ核酸
オリゴヌクレオチド剤はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。マイクロＲＮＡは、転写の阻害によって、又は標的化ｍＲＮＡの分解等を通して、細胞中で特異的遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こすことができる小さな非コーディングＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは完全に相補的であり得るか、あるいは標的核酸との非相補性の領域を有することができ、その結果、非相補性の領域において「バルジ」をもたらす。非相補性の領域（バルジ）には、十分な相補性、好ましくは、二重鎖形成を可能とする完全な相補性の領域は、近接してそれを挟むことができる。好ましくは、相補性の領域は少なくとも８〜１０ヌクレオチド長（例えば、８、９、又は１０ヌクレオチド長）である。ｍｉＲＮＡは、マイクロＲＮＡが標的核酸に対して完全に相補性ではない場合のように、転写を抑制することによって、あるいはｍｉＲＮＡが完全な相補性をもってその標的に結合する場合にのみ起こると信じられている標的ＲＮＡ分解を引き起こすことによって、遺伝子発現を阻害することができる。本発明は、それらの標的に結合した場合にバルジを形成できる、又はできないｍｉＲＮＡの二本鎖前駆体を含むことができる。
【０３３５】
好ましい実施形態において、本発明において特徴とするオリゴヌクレオチド剤は、内因性ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡを標的とすることができる。本発明において特徴とするオリゴヌクレオチド剤は、天然に生じるヌクレオベース、糖、及びヌクレオチド間（骨格）共有結合、ならびに同様に機能する天然に生じない部分を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。そのような修飾された、又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、増強された細胞取り込み、内因性ｍｉＲＮＡ標的に対する高められた親和性、及び／又はヌクレアーゼの存在下での高められた安定性のような望ましい特性のため、しばしば、天然の形態よりも好ましい。特異的内因性ｍｉＲＮＡに結合するように設計されたオリゴヌクレオチド剤は、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１０、２０、又は２５又はそれ以上の塩基に対して、実質的相補性、例えば、少なくとも７０、８０、９０、又は１００％相補性を有する。
【０３３６】
ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡは長さが１８〜１００ヌクレオチドであり得、より好ましくは、長さが１８〜８０ヌクレオチドあり得る。成熟ｍｉＲＮＡは１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは、２１〜２５ヌクレオチド、特に２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチドの長さを有することができる。マイクロＲＮＡ前駆体は７０〜１００ヌクレオチドの長さを有することができ、かつヘアピン立体構造を有することができる。マイクロＲＮＡは、長いプレｍｉＲＮＡを機能的ｍｉＲＮＡへプロセッシングするダイサー（Ｄｉｃｅｒ）及びドロシャー（Ｄｒｏｓｈａ）と呼ばれる酵素によってプレｍｉＲＮＡからイン・ビボで生じさせることができる。本発明において特徴とするマイクロＲＮＡ又は前駆体ｍｉＲＮＡは、細胞ベースの系によってイン・ビボで合成することができるか、あるいは化学的に合成することができる。マイクロＲＮＡは、所望の特徴を付与する修飾を含むように合成することができる。例えば、修飾は、エンドサイトーシス依存性又は非依存性メカニズム等によって、安定性、特定の組織又は細胞型に標的化される標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、あるいは細胞浸透性を改善することができる。修飾は配列特異性を増加させることもでき、結果的に、オフサイト標的化を減少させることができる。合成及び化学的修飾の方法は以下により詳細に記載する。
【０３３７】
センスストランド配列（例えば、ｃＤＮＡ分子のセンスストランドの配列）を仮定すれば、ｍｉＲＮＡは、ワトソン及びクリック塩基対合の法則に従って設計することができる。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの一部に対して相補的であり得る。例えば、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡのコーディング領域又は非コーディング領域、例えば、５’ＵＴＲのような、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲う領域に対して相補的であり得る。ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約１２〜３０ヌクレオチド、好ましくは、長さが約１５〜２８ヌクレオチド（例えば、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド）であり得る。
【０３３８】
特に、本発明で特徴とするｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡは、標的核酸に対して非相補性を有する内部（すなわち、非末端）領域におけるヌクレオチド上に化学修飾を有することができる。例えば、修飾されたヌクレオチドは、バルジを形成するｍｉＲＮＡの領域に取り込むことができる。修飾は、例えば、リンカーによってｍｉＲＮＡに結合されたリガンドを含むことができる（例えば、以下のダイアグラムＯＴ−Ｉ〜ＯＴ−ＩＶ参照）。修飾は、例えば、治療ｍｉＲＮＡの薬物動態又は安定性を改善することができ、あるいはｍｉＲＮＡの標的核酸へのハイブリダイゼーション特性（例えば、ハイブリダイゼーション熱力学）を改善することができる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡのバルジ領域に取り込まれるか、又は連結された修飾又はリガンドの向きは、バルジ領域中の空間を占めるような向きとされるのが好ましい。例えば、修飾は、核酸ストランド上の修飾された塩基又は糖、あるいは挿入剤として機能するリガンドを含むことができる。これらは、好ましくは、バルジ中に置かれる。挿入剤は、芳香族、例えば、多環芳香族又は複素環芳香族化合物であり得る。多環挿入剤はスタッキング能力を有することができ、２、３、又は４の融合された環を持つ系を含むことができる。以下に記載する一般的な塩基をｍｉＲＮＡに取り込ませることができる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡのバルジ領域に取り込まれ、又は連結された修飾又はリガンドの配向は、バルジ領域中の空間を占めるように配向されることが好ましい。この配向は、改善されたハイブリダイゼーション特性、あるいはｍｉＲＮＡの他の望ましい特性を促進する。
【０３３９】
一実施形態において、ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡはアミノグリコシドリガンドを含むことができ、それにより、ｍｉＲＮＡの改善されたハイブリダイゼーション特性、又は改善された配列特異性をもたらす。例示的なアミノグリコシドはグリコシル化ポリリシン、ガラクトシル化ポリリシン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡ、及びネオ−Ｎ−アクリジン、ネオ−Ｓ−アクリジン、ネオ−Ｃ−アクリジン、トブラ−Ｎ−アクリジン、及びカナＡ−Ｎ−アクリジンのようなアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲートを含む。アクリジンアナログの使用は、配列特異性を向上させることができる。例えば、ネオマイシンＢは、ＤＮＡと比較してＲＮＡに対する高い親和性を有するが、配列特異性は低い。アクリジンアナログ、ネオ−Ｓ−アクリジンは、ＨＩＶ  Ｒｅｖ−応答エレメント（ＲＲＥ）に対する増大した親和性を有する。いくつかの実施形態において、アミノグリコシドリガンドのグアニジンアナログ（グアニジノグリコシド）は、オリゴヌクレオチド剤に連結される。グアニジノグリコシドにおいて、アミノ酸上のアミン基はグアニジン基の代わりに交換される。グアニジンアナログの結合は、オリゴヌクレオチド剤の細胞浸透性を高めることができる。
【０３４０】
一実施形態において、リガンドは、標的核酸の切断によって標的遺伝子阻害に寄与する切断基を含むことができる。好ましくは、切断基は、そこで切断基が標的ＲＮＡにアクセスし、ＲＮＡを切断できるバルジ領域に位置するようにｍｉＲＮＡに連結される。切断基は、例えば、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシン−Ａ５、ブレオマイシン−Ａ２、又はブレオマイシン−Ｂ２）、ピレン、フェナントロリン（例えば、Ｏ−フェナントロリン）、ポリアミン、トリペプチド（例えば、ｌｙｓ−ｔｙｒ−ｌｙｓトリペプチド）、又は金属イオンキレート化基であり得る。金属イオンキレート化基は、例えば、Ｌｕ（ＩＩＩ）又はＥＵ（ＩＩＩ）大環複合体、Ｚｎ（ＩＩ）２，９−ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ（ＩＩ）テルピリジン、又はアクリジンを含むことができ、これらは、Ｌｕ（ＩＩＩ）のような遊離金属イオンによるバルジの部位における標的ＲＮＡの選択的切断を促進することができる。いくつかの実施形態において、ペプチドリガンドをｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡに連結させて、例えば、バルジ領域における標的ＲＮＡの切断を促進することができる。例えば、１，８−ジメチル−１，３，６，８，１０，１３−ヘキサアザシクロテトラデカン（シクラム）を（例えば、アミノ酸誘導体によって）ペプチドにコンジュゲートして、標的ＲＮＡ切断を促進することができる。本発明において特徴とする方法及び組成物は、切断又は非切断依存性メカニズムによって標的遺伝子発現を阻害するｍｉＲＮＡを含む。
【０３４１】
ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡは、二重鎖を形成するのに十分な相補性の領域（例えば、７、８、９、１０、又は１１ヌクレオチド長である領域）によって両側から挟まれた非相補性の領域（例えば、３、４、５又は６ヌクレオチド長の領域）を含むように設計し、合成することができる。
【０３４２】
ヌクレアーゼ耐性及び／又は標的に対する結合親和性の向上のために、、ｍｉＲＮＡ配列は２’−Ｏ−メチル、２’−フッ素、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−アミノ、及び／又はホスホロチオエート結合を包含することができる。固定化された核酸（ＬＮＡ）、２−チオピリミジン（例えば、２−チオ−Ｕ）、２−アミノ−Ａ、Ｇ−クランプ修飾、及びエチレン核酸（ＥＮＡ）、例えば、２’−４’−エチレン−架橋化核酸の包含も、標的に対する結合親和性を増加させることができる。オリゴヌクレオチド骨格へのフラノン糖の包含もまた、エンドヌクレアーゼ的切断を減少させることができる。ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡは、３’カチオン基を包含することによって、あるいは３’末端におけるヌクレオシドを３’−３’結合で逆転させることによって、さらに修飾することができる。もう１つの代替法において、３’末端はアミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴでブロックすることができる。他の３’コンジュゲートは、３’−５’エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。理論に束縛されることは望まないが、ナプロキセン又はイブプロフェンのような３’コンジュゲートは、ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するのを立体的にブロックすることによってエキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。小さなアルキル鎖、アリール基、又は複素環コンジュゲート又は修飾された糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコース等）さえ、３’−５’−エキソヌクレアーゼをブロックすることができる。
【０３４３】
５’末端は、アミノアルキル基、例えば、５’−Ｏ−アルキルアミノ置換基でブロックすることができる。他の５’コンジュゲートは５’−３’エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。理論に束縛されることは望まないが、ナプロキセン又はイブプロフェンのような５’コンジュゲートは、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合するのを立体的にブロックすることによってエキソヌクレオティック切断を阻害することができる。小さなアルキル鎖、アリール基、又は複素環コンジュゲート又は修飾された糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコース等）さえ、３’−５’−エキソヌクレアーゼをブロックすることができる。
【０３４４】
一実施形態において、ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡは、標的化、例えば、本明細書中に記載された標的化修飾を改善する修飾を含む。ｍｉＲＮＡ分子を特定の細胞型に対して標的化する修飾の例は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノースのような炭水化物糖、葉酸のようなビタミン、ＲＧＤ及びＲＧＤミミックのような他のリガンド、及びナプロキセン、イブプロフェン又は他の公知の蛋白質−結合分子を含めた小分子を含む。
【０３４５】
ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡは、当該分野で公知の手法を用いる化学合成及び／又は酵素連結反応を用いて構築することができる。例えば、ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡは、天然に生じるヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増加させるように、又はｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡ及び標的核酸の間で形成された二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に使用することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを合成することができる。他の適切な核酸修飾は本明細書中に記載されている。別法として、ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡ核酸は、核酸がアンチセンスの向きにサブクローンされた発現ベクタを用いて生物学的に生産することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、対象とする標的核酸に対するアンチセンスの向きのものである）。
【０３４６】
アンチセンス−タイプのオリゴヌクレオチド剤
本発明において特徴とする一本鎖オリゴヌクレオチドはアンチセンス核酸を含む。「アンチセンス」核酸は、遺伝子発現産物をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディングストランドに相補的な、あるいは、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はプレｍｉＲＮＡ等のＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸標的と共に水素結合を形成することができる。
【０３４７】
コーディングストランド配列（例えば、ｃＤＮＡ分子のセンスストランドの配列）を仮定すれば、アンチセンス核酸はワトソン及びクリック塩基対合の法則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＲＮＡ、例えば、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡのコーディング又は非コーディング領域の部分に対して相補的であり得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの翻訳開始部位、例えば、５’ＵＴＲを囲う領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約１０〜２５ヌクレオチド（例えば、長さが１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチド）であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡに対しても相補的であり得る。
【０３４８】
アンチセンス核酸は、当該分野で公知の手法による化学合成及び／又は酵素連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチド、又は、分子の生物学的安定性を増加させ、あるいはアンチセンス及び標的核酸の間で形成された二重鎖の物理的安定性を向上させるように設計された種々の修飾ヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。他の適切な核酸修飾は本明細書中に記載されている。別法として、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス向きにサブクローンされている発現ベクタを用いて生物学的に生産することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、対象とする標的核酸に対してアンチセンス向きのものである）。
【０３４９】
アンチセンス剤はリボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド）、又はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの双方を含むことができる。例えば、リボヌクレオチドのみからなるアンチセンス剤は相補的ＲＮＡにハイブリダイズさせることができ、翻訳機構の標的ＲＮＡ転写体への到達を妨げることができ、それにより、蛋白質合成を妨げることができる。デオキシリボヌクレオチドのみ、又はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含むアンチセンス分子、例えば、アンチセンス剤の５’及び３’末端においてＲＮＡ配列によって両側から挟まれたＤＮＡ配列は相補的ＲＮＡにハイブリダイズすることができ、ＲＮＡ標的は、引き続いて、酵素、例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈによって切断することができる。標的ＲＮＡの分解は翻訳を妨げる。フランキングＲＮＡ配列は２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、及びホスホロチオエート結合を含むことができ、内部ＤＮＡ配列はホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。内部ＤＮＡ配列は、好ましくは、ＲＮＡｓｅＨ活性による標的化が望まれる場合、少なくとも５ヌクレオチド長である。
【０３５０】
増大したヌクレアーゼ耐性については、アンチセンス剤は、３’末端におけるヌクレオシドを３’−３’結合で逆転させることによってさらに修飾することができる。もう１つの別法において３’末端はアミノアルキル基でブロックすることができる。
【０３５１】
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化、例えば、本明細書中に記載された標的化修飾を改善する修飾を含む。
デコイタイプのオリゴヌクレオチド剤
本発明において特徴とするオリゴヌクレオチド剤はデコイ核酸、例えば、デコイＲＮＡであり得る。デコイ核酸は天然核酸に似ているが、天然核酸の活性を阻害し、又は中断するように修飾されている。例えば、デコイＲＮＡはリガンドについての天然結合ドメインを模倣することができる。デコイＲＮＡは、従って、特異的リガンドの結合に対して天然結合標的と競合する。天然結合標的は内因性核酸、例えば、プレｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。例えば、ＨＩＶトランス−活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現は「デコイ」として作用することができ、ＨＩＶ  ｔａｔ蛋白質に効果的に結合し、それにより、ＨＩＶ  ＲＮＡにコードされたＴＡＲ配列に結合するのを阻害可能であることが既に示されている。
【０３５２】
一実施形態において、デコイＲＮＡは、標的化、例えば、本明細書中に記載された標的化修飾を改善する修飾を含む。
ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡについての上述の化学的修飾、及び、本明細書中において他に記載された化学的修飾もまた、デコイ核酸における利用に適している。
【０３５３】
アプタマータイプのオリゴヌクレオチド剤
本発明中において特徴とするオリゴヌクレオチド剤はアプタマーであり得る。アプタマーは有機小分子又は蛋白質、例えば、転写又は翻訳因子のような非核酸リガンドに結合し、引き続いて、活性を変化させる（例えば、阻害する）。アプタマーは、非核酸リガンド上の標的結合部位の認識を示す特異的構造に折りたたまれる。アプタマーは、本明細書中に記載された修飾のいずれかを含有することができる。
【０３５４】
一実施形態において、アプタマーは、標的化、例えば、本明細書中に記載された標的化修飾を改善する修飾を含む。
ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡについて上述した化学的修飾、及び本明細書中において他に記載された化学的修飾もまた、デコイ核酸における利用に適している。
【０３５５】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の記載において説明されている。本発明の他の特徴及び利点は該記載及び図面から、及び特許請求の範囲から明らかであろう。本出願は全ての引用された文献、特許、及び特許出願について、参照によりその全体を援用する。
【０３５６】
一つの態様において、本発明はアンタゴミールを特徴とする。アンタゴミールは、マイクロＲＮＡを標的とする一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖、及びヘアピン構造の化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドである。
【０３５７】
アンタゴミールは、内因性ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的な少なくとも１２個以上の連続オリゴヌクレオチド、より具体的には、ｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の標的配列に対して実質的に相補的な１２個以上の連続ヌクレオチドを含む薬剤からなり、あるいはそれを含む。好ましくは、本発明の特徴であるアンタゴミールは、約１２〜２５ヌクレオチド、好ましくは、約１５〜２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするのに十分相補的なヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、標的配列は、表１に示される配列とは、１つ、２つ、又は３つ以下のヌクレオチドのみ異なり、一実施形態において、アンタゴミールは表２ａ〜２ｅに示される薬剤である。一実施形態において、アンタゴミールは非ヌクレオチド部位、例えば、コレステロール部位を含む。非―ヌクレオチド部位は、例えば、オリゴヌクレオチド剤の３’又は５’末端に結合させることができる。好ましい実施形態において、コレステロール部位はオリゴヌクレオチド剤の３’末端に結合されている。
【０３５８】
アンタゴミールは、修飾、例えば、ヌクレオチド修飾の取込み等により、ヌクレオチド分解に対して安定化される。別の実施形態において、アンタゴミールは、ヌクレオチド配列の５’又は３’末端における少なくとも第１、第２又は第３のヌクレオチド間結合においてホスホロチオエートを含む。さらに別の実施形態において、アンタゴミールは２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。特に好ましい実施形態において、アンタゴミールは少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態において、アンタゴミールのヌクレオチドの全ては２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【０３５９】
ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるアンタゴミールは細胞又はヒトに送達されて、異常な又は望ましくないｍｉＲＮＡ活性の場合のように、内因性ｍｉＲＮＡの活性を阻害し、又は低下させることができ、あるいは内因性ｍｉＲＮＡにハイブリダイズする標的ｍＲＮＡの不十分な活性は病気又は障害に関連する。一実施形態において、本発明において特徴とするアンタゴミールは、アルドラーゼＡ  ｍＲＮＡ、Ｎ−ｍｙｃ下流調節遺伝子（Ｎｄｒｇ３）ｍＲＮＡ、ＧＴＰａｓｅ活性タンパク質−１（Ｉｑｇａｐ１）ｍＲＮＡを含有するＩＱモチーフ、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（Ｈｍｇｃｒ）ｍＲＮＡ、及びクエン酸シンターゼｍＲＮＡ及びその他を含む多数のＲＮＡにハイブリダイズする、ｍｉＲ−１２２（表１参照）に対して実質的に相補的であるヌクレオチド配列を有する。好ましい実施形態において、ｍｉＲ−１２２に実質的に相補的なアンタゴミールは、アンタゴミール−１２２である（表２ａ〜２ｅ）。アルドラーゼＡ欠乏は、溶血性貧血、先天性多発性関節拘縮症、下垂体転位、横紋筋融解、高カリウム血症を含めた種々の障害と関連付けられることが判明した。アルドラーゼＡ欠乏症の患者は、成長及び発達遅延、顔面正中発育不全、肝腫、ならびに筋障害症候群を含む症状も発症する。かくして、これらの傷害又は症状のいずれかを有するヒト、又は有していると診断されたヒトは、ｍｉＲ−１２２にハイブリダイズするアンタゴミールでの治療を受ける候補である。
【０３６０】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
一実施形態において、本発明は、細胞又は哺乳動物における遺伝子の発現を阻害するための、リポソームのような会合複合体に封入された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、ｄｓＲＮＡは、遺伝子の発現で形成されたｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である相補性の領域を含むアンチセンスストランドを含み、かつ、相補性の該領域は長さが３０ヌクレオチド未満、一般には、長さが１９〜２４ヌクレオチドであり、かつ、該ｄｓＲＮＡは、該遺伝子を発現する細胞との接触に際して、該遺伝子の発現を少なくとも４０％だけ阻害する。ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的である２つのＲＮＡストランドを含む。ｄｓＲＮＡの一方のストランド（アンチセンスストランド）は、遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に対して実質的に相補的、一般には、十分相補的である相補性の領域を含み、他方のストランド（センスストランド）は、適切な条件下で合わせられた場合に２つのストランドはハイブリダイズし、二重鎖構造を形成するように、アンチセンスストランドに対して相補的である領域を含む。一般に、二重鎖構造は、長さが、１５及び３０の間、より一般的には１８及び２５の間、さらに一般的には１９及び２４の間、最も一般的には１９及び２１の間の塩基対である。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、長さが、１５及び３０の間、より一般的には１８及び２５の間、さらに一般的には１９及び２４の間、最も一般的には１９及び２１の間にある。本発明のｄｓＲＮＡは、さらに、１つ以上の一本鎖ヌクレオチド突出部を含むことができる。ｄｓＲＮＡは、例えば、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）社、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社から商業的に入手可能な、自動ＤＮＡシンセサイザの使用によって、さらに以下で議論するように当該分野で公知の標準的方法によって合成することができる。
【０３６１】
本明細書中で記載された会合複合体における封入に適したｄｓＲＮＡは、１８及び２５の間の塩基対（例えば、２１塩基対）の二重鎖構造を含むことができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２１ヌクレオチド長である少なくとも１つのストランドを含む。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の連続ヌクレオチドである少なくとも１つのストランドを含む。
【０３６２】
本明細書中に記載された会合複合体における封入に適したｄｓＲＮＡは、標的配列に対して１以上のミスマッチを含有することができる。好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、３以下のミスマッチを含有する。ｄｓＲＮＡのアンチセンスストランドが標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチの領域は相補性の領域の中央に位置しないのが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンスストランドが標的配列に対してミスマッチを含有する場合、ミスマッチはいずれかの末端から５ヌクレオチドに制限され、例えば、相補性の領域の５’又は３’いずれかの末端から５、４、３、２、又は１ヌクレオチドであるのが好ましい。
【０３６３】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端は、１から４、一般には１又は２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出部を有する。一般には、一本鎖突出部はアンチセンスストランドの３’末端に、あるいは別法として、センスストランドの３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、一般にはアンチセンスストランドの５’末端に位置する平滑末端を有することもできる。そのようなｄｓＲＮＡは改善された安定性及び阻害活性を有し、かくして、低用量、すなわち、１日当たり受容者の体重ｋｇ当たり５ｍｇ未満での投与を可能とする。一般には、ｄｓＲＮＡのアンチセンスストランドは、３’末端においてヌクレオチド突出部を有し、５’−末端は平滑である。別の実施形態において、突出部における１つ以上のヌクレオチドはヌクレシチドチオホスフェートで置き換えられる。
【０３６４】
さらに別の実施形態において、リポソームのような会合複合体に封入されたｄｓＲＮＡは、安定性を高めるように化学的に修飾される。このような核酸は、本明細書に引用して援用する、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（編）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）社、アメリカ合衆国、ニューヨーク州、ニューヨークに記載されているような、当該分野でよく確立された方法によって合成し、かつ／又は修飾することができる。化学的修飾は、限定されるものではないが、２’修飾、オリゴヌクレオチドの糖又は塩基の他の部位における修飾、非天然塩基のオリゴヌクレオチド鎖への導入、リガンド又は化学的部位への共有結合、及びヌクレオチド間リン酸結合の、チオリン酸のような代替結合による置換を含むことができる。１つ以上のそのような修飾を使用することができる。
【０３６５】
２つの別々のｄｓＲＮＡストランドの化学的連結は、種々のよく知られた技術のいずれかによって、例えば、共有結合、イオン結合又は水素結合を導入することによって、疎水性相互作用、ファンデルワールス、又はスタッキング相互作用によって、金属−イオン配位によって、あるいはプリンアナログの使用を介して達成することができる。そのような化学的に連結されたｄｓＲＮＡは、本明細書中に記載された会合複合体における封入に適している。一般には、ｄｓＲＮＡを修飾するのに用いることができる化学基は、限定されるものではないが、メチレンブルー、二官能性基、一般には、ビス−（２−クロロエチル）アミン、４−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシベンゾイル）シスタミン、４−チオウラシル、及びプソラレンを含む。一実施形態において、リンカーはヘキサ−エチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡは、固相合成によって生産され、ヘキサ−エチレングリコールリンカーは標準的方法に従って取り込まれる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．，及びＫ．Ｂ．Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）３５：１４６６５−１４６７０）。特別な実施形態において、アンチセンスストランドの５’−末端、及びセンスストランドの３’末端は、ヘキサ−エチレングリコールリンカーを介して化学的に連結される。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドはホスホロチオエート又はホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端における化学結合は、一般には、三重螺旋結合によって形成される。
【０３６６】
さらに別の実施形態において、２つの単一ストランドの一方又は双方におけるヌクレオチドは、例えば、限定されるものではないが、ある種のヌクレアーゼのような細胞酵素の分解活性を抑制又は阻害するように調節することができる。核酸に対する細胞酵素の分解活性を阻害するための技術は当該分野で知られており、限定されるものではないが、２’−アミノ修飾、２’−アミノ糖修飾、２’−Ｆ糖修飾、２’−Ｆ修飾、２’−アルキル糖修飾、２’−Ｏ−メトキシエチルのような２’−Ｏ−アルコキシアルキル修飾、非荷電及び荷電骨格修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、及びホスホルアミデートを含む（例えば、Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９５）１：１１１６−８）。従って、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも１つの２’−ヒドロキシル基は、化学基によって、一般には、２’−Ｆ又は２’−Ｏ−メチル基によって置き換えられる。また、少なくとも１つのヌクレオチドを、固定化されたヌクレオチドを形成するように修飾することができる。そのような固定化されたヌクレオチドは、リボースの４’−炭素でリボースの２’−酸素を連結するメチレンブリッジを含有する。固定化されたヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドはＫｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．，ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８），５４：３６０７−３６３０及びＯｂｉｋａ，Ｓ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９９８），３９：５４０１−５４０４）に記載されている。固定化されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの導入は、相補的配列に対する親和性を改善し、融解温度を数度だけ上昇させる（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．及びＤ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００１），８：１−７）。
【０３６７】
ｄｓＲＮＡへのリガンドのコンジュゲーションは、その細胞吸収、ならびに特定組織に対する標的化、あるいは肝臓細胞のような特定タイプの細胞による取り込みを高めることができる。ある例においては、疎水性リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートさせて、細胞膜の直接的浸透、及び／又は肝臓細胞を横切っての取り込みを促進する。別法として、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートされたリガンドは、受容体−媒介エンドサイトーシスに対する基質である。これらの手法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドならびにｄｓＲＮＡ剤の細胞浸透を促進するのに用いられてきた。例えば、コレステロールは種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、その結果、それらの非コンジュゲーテッドアナログと比較して、実質的により活性な化合物が得られている。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００２，１２，１０３を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他の親油性化合物は、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロール、及びメントールを含む。受容体−媒介エンドサイトーシスに対するリガンドの１つの例は葉酸である。葉酸は、葉酸−受容体−媒介エンドサイトーシスによって細胞に進入する。葉酸を有するｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸−受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に効果的に輸送され得る。Ｌｉ及び共同研究者は、オリゴヌクレオチドの３’末端への葉酸の結合の結果、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みの８倍の増加がもたらされたことを報告している。Ｌｉ，Ｓ．；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｈ．Ｍ．；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８，１５，１５４０。これまでオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてきた他のリガンドは、ポリエチレングリコール、炭水化物クラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、送達ペプチド、及びコレステロールのような脂質を含む。ｓｉＲＮＡについての他の化学的修飾はＭａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅａｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４），８（６），５７０−５７９記載されている。
【０３６８】
ある場合には、カチオン性リガンドのオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションの結果、ヌクレアーゼに対する改善された耐制がもたらされる。カチオン性リガンドの代表的な例は、プロピルアンモニウム及びジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことには、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、カチオン性リガンドがオリゴヌクレオチドを通じて分散された場合、ｍＲＮＡに対するそれらの高い結合親和性を保持すると報告された。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００２，１２，１０３及びその参考文献を参照されたい。
【０３６９】
本発明のリガンド−コンジュゲーテッドｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡへの連結分子の結合に由来するもののような、ペンダント反応官能性を担うｄｓＲＮＡの使用によって合成することができる。この反応性オリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能なリガンド、種々の保護基のいずれかを担うように合成されたリガンド、あるいはそれに結合された連結部位を有するリガンドと直接的に反応することができる。本発明の方法は、いくつかの好ましい実施形態においては、リガンドと適切にコンジュゲートされており、さらに、個体−支持体材料に結合することができるヌクレオシドモノマーの使用によって、リガンド−コンジュゲーテッドｄｓＲＮＡの合成を容易とする。所望により、固体支持体材料に結合していてもよいそのようなリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートは、選択された血清結合リガンドと、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの５’位置に置かれた連結部位との反応を介して、本発明の方法のいくつかの好ましい実施形態に従って調製される。ある場合においては、ｄｓＲＮＡの３’末端に結合したアラルキルリガンドを担うｄｓＲＮＡは、まず、長鎖アミノアルキル基を介して制御された細孔ガラス支持体にモノマー形成ブロックを共有結合させることによって調製される。次いで、標準的な固相合成技術を介して、ヌクレオチドを、固体支持体に結合したモノマー形成−ブロックに結合させる。モノマー構築ブロックはヌクレオシド、あるいは固相合成に適合する他の有機化合物であってよい。
【０３７０】
本発明のコンジュゲートに用いるｄｓＲＮＡは、固相合成のよく知られた技術を介して便宜にかつ定常的に作成することができる。そのような合成のための機器は、例えば、アプライドバイオシステムズ社（カリフォルニア州、フォスター・シティ）を含むいくつかの販売業者によって販売されている。当該分野で公知のそのような合成のためのいずれの他の手段も、加えて、又は別法として使用することができる。また、ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様な技術を用いることも知られている。
【０３７１】
特定の修飾されたオリゴヌクレオチドの合成に関する技術は以下の米国特許に見出すことができる：ポリアミンコンジュゲーテッドオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，１３８，０４５号及び第５，２１８，１０５号、キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのモノマーについては米国特許第５，２１２，２９５号、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，３７８，８２５号及び第５，５４１，３０７号、骨格−修飾オリゴヌクレオチド及び還元カップリングを介する調製については米国特許第５，３８６，０２３号、３−デアザプリン環系に基づく修飾されたヌクレオベース、及びその合成方法については米国特許第５，４５７，１９１号、Ｎ−２置換プリンに基づく修飾されたヌクレオベースについては米国特許第５，４５９，２５５号、キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するための方法については米国特許第５，５２１，３０２号、ペプチド核酸については米国特許第５，５３９，０８２号、β−ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５５４，７４６号、オリゴヌクレオチドの合成のための方法及び材料については米国特許第５，５７１，９０２号、当該基を、ヌクレオシドの種々の位置のいずれかに結合された他の部位に対するリンカーとして用いることができる、アルキルチオ基を有するヌクレオシドについては米国特許第５，５７８，７１８号、高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５８７，３６１号及び第５，５９９，７９７号、２，６−ジアミノプリン化合物を含む２’−Ｏ−アルキルグアノシン及び関連化合物の調製プロセスについては米国特許第５，５０６，３５１号、Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５８７，４６９号、３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドについては米国特許第５，５８７，４７０号、共に、コンジュゲーテッド４’−デスメチルヌクレオシドアナログについては米国特許第５，２２３，１６８号及び米国特許第５，６０８，０４６号、骨格−修飾オリゴヌクレオチドアナログについては米国特許第５，６０２，２４０号及び第５，６１０，２８９号、特に、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドを合成する方法については米国特許第６，２６２，２４１号及び第５，４５９，２５５号。
【０３７２】
本発明の配列特異的連結ヌクレオシドを担うリガンド−コンジュゲーテッドｄｓＲＮＡ及びリガンド分子において、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチド又はヌクレオシド又は前駆体、あるいは既に連結部位を担うヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、既にリガンド分子を担持しているリガンド−ヌクレオチド又はヌクレオシド−コンジュゲート前駆体、又は形成ブロックを担持する非ヌクレオシドリガンドを利用して適切なＤＮＡシンセサイザで組み立てることができる。
【０３７３】
連結部位を既に担持しているヌクレオチド−コンジュゲート前駆体を用いる場合、配列−特異的連結ヌクレオシドの合成は典型的には完了されており、次いで、リガンド分子を連結部位と反応させて、リガンド−コンジュゲーテッドオリゴヌクレオチドを形成する。ステロイド、ビタミン、脂質及びレポーター分子のような種々の分子を担うオリゴヌクレオチドコンジュゲートは従前に説明されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７８８３号参照）。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は連結されたヌクレオシドは、商業的に入手可能であって、オリゴヌクレオチド合成でルーチン的に用いられる標準ホスホルアミデート及び非標準ホスホルアミデートに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホルアミデートを用いて自動シンセサイザによって合成される。
【０３７４】
本明細書中で記載された会合複合体において封入されたｄｓＲＮＡは、１以上の修飾されたヌクレオシド、例えば、ヌクレオシド中の２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−アミノアルキル、又は２’−デオキシ−２’−フルオロ基を含むことができる。そのような修飾は高められたハイブリダイゼーション特性をオリゴヌクレオチドに付与する。さらにホスホロチオエート骨格を含有するオリゴヌクレオチドは高められたヌクレアーゼ安定性を有する。従って、官能化され、連結されたヌクレオシドはホスホロチオエート骨格、あるいは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アミノアルキル、２’−Ｏ−アリル又は２’−デオキシ−２’−フルオロ基のいずれか又は双方を含むように拡大することができる。当該分野で公知のオリゴヌクレオチド修飾のいくつかをまとめたリストは、例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００３７０９１８号に見出される。
【０３７５】
いくつかの実施形態において、５’−末端にアミノ基を保有する官能化ヌクレオシド配列はＤＮＡシンセサイザを用いて調製され、次いで、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応させる。活性エステル誘導体は当業者によく知られている。代表的な活性エステルは、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノール性エステル、ペンタフルオロフェノール性エステル及びペンタクロロフェノール性エステルを含む。アミノ基及び活性エステルの反応は、選択されたリガンドが連結基を通じて５’−位置に結合したオリゴヌクレオチドを生じる。５’−末端におけるアミノ基は、５’−アミノ−モディファイヤＣ６試薬を利用して調製することができる。一実施形態において、リガンド分子は、リガンド−ヌクレオシドホスホルアミデートの使用によって５’−位置におけるオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができ、リガンドはリンカーを介して５’−ヒドロキシ基に直接的に又は間接的に連結される。そのようなリガンド−ヌクレオシドホスホルアミデートは、典型的には、自動合成手法の最後に用いて、５’−末端にリガンドを担うリガンド−コンジュゲーテッドオリゴヌクレオチドを提供する。
【０３７６】
修飾されたヌクレオシド間結合又は骨格の例は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホン酸及びキラルホスホン酸を含めたメチル及び他のアルキルホスホン酸、ホスフィン酸、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含めたホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホン酸、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な３’−５’結合を有するボラノリン酸、これらの２’−５’−の連結アナログ、及びヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’〜５’−３’又は２’−５’〜５’−２’連結した逆転した極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
【０３７７】
上述したリン−原子−含有結合の調製に関連する代表的な米国特許は、限定されるものではないが、その各々を本明細書に引用して援用する、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、及び第５，６９７，２４８号を含む。
【０３７８】
リン原子を含まない修飾されたヌクレオシド間結合又は骨格（すなわち、オリゴヌクレオシド）の例は、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキル糖間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環糖間結合によって形成される骨格を有する。これらは（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成された）モルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものを有するものを含む。
【０３７９】
前記したオリゴヌクレオシドの調製に関連する代表的な米国特許は限定されるものではないが、その各々を本明細書に引用して援用する、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、及び第５，６７７，４３９号を含む。
【０３８０】
ある場合においては、リポソームのような会合複合体に含まれるオリゴヌクレオチドは、非リガンド基によって修飾することができる。多数の非リガンド分子が、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを増強させるためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを行うための手法は科学文献で入手可能である。そのような非リガンド部位は、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエステル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又は１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部位（Ｍｉｓｈｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部位（Ｃｒｏｏｋｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）のような脂質部位を含む。そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は前記で列記した。典型的なコンジュゲーションは、配列の１つ以上の位置においてアミノリンカーを担うオリゴヌクレオチドの合成を含む。次いで、アミノ基を、適切なカップリング又は活性化試薬を用いてコンジュゲートされている分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、依然として固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチド、あるいは液相におけるオリゴヌクレオチドの引き続いての切断のいずれかで行うことができる。ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製により、典型的には、純粋なコンジュゲートが得られる。
【０３８１】
上述した修飾は、本明細書中に記載されたオリゴヌクレオチド剤と共に用いるのに適している。
融合脂質
用語「融合性」とは、脂質又は他の薬物の送達システムの、細胞の膜と融合する能力をいう。膜は原形質膜、又は細胞小器官、例えば、エンドソーム、核等を囲む膜のいずれかであり得る。適切な融合性脂質の例は、限定されるものではないが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、又はＤＬｉｎＤＭＡを含む。いくつかの実施形態において、会合複合体は、例えば、エンドソーム放出のための脂質にコンジュゲートしたイミダゾール部位のような小分子を含む。
【０３８２】
ＰＥＧ又はＰＥＧ脂質
カチオン性及び融合性脂質に加えて、会合複合体は、ＡＴＴＡ脂質又はＰＥＧ脂質のような二層安定化成分（ＢＳＣ）を含む。例示的な脂質は以下の通りである：例えば、ＷＯ０５／０２６３７２号に記載されたジアルキルオキシプロピルにカップリングされたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、例えば、米国特許公開番号第２００３００７７８２９号及び第２００５００８６８９号に記載されたジアシルグリセロールにカップリングされたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）にカップリングされたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、又はセラミドにコンジュゲートされたＰＥＧ又はそれらの混合物（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号参照）。好ましい実施形態において、会合は本明細書中に記載されたＰＥＧ脂質、例えば、式（ＸＶ）、式（ＸＶ’）又は式（ＸＶＩ）のＰＥＧ脂質を含む。一つの好ましい実施形態において、ＢＳＣはＳＰＬＰの凝集を阻害するコンジュゲーテッド脂質である。適切なコンジュゲーテッド基質は、限定されるものではないが、ＰＥＧ脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲート、カチオン性−ポリマー−脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）又はその混合物を含む。一つの好ましい実施形態において、ＳＰＬＰはＰＥＧ脂質コンジュゲート、あるいはＣＰＬを伴うＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートのいずれかを含む。
【０３８３】
ＰＥＧはポリエチレングリコール、２つの末端ヒドロキシル基を持つエチレンＰＥＧ反復単位の直線状水溶性ポリマーである。ＰＥＧはそれらの分子量によって分類され；例えば、ＰＥＧ  ２０００は約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ  ５０００は約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧはシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社及び他の会社から商業的に入手可能であり、例えば、以下の：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネ―ト（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、及びモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）を含む。加えて、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートを含めたＰＥＧ脂質コンジュゲートを調製するのに特に有用である。
【０３８４】
好ましい実施形態において、ＰＥＧは約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトン、より好ましくは約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン、より好ましくは約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、より好ましくは約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、さらに好ましくは約２，０００ダルトン、又は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、所望により、アルキル、アルコキシ、アシル又はアリール基によって置換することができる。ＰＥＧは脂質に直接的にコンジュゲートすることができるか、あるいはリンカー部位を介して脂質に連結させてもよい。ＰＥＧを脂質にカップリングさせるのに適したいずれのリンカー部位も用いることができ、例えば、非―エステル含有リンカー部位及びエステル含有リンカー部位を含む。好ましい実施形態において、リンカー部位は非エステル含有リンカー部位である。本明細書中で用いるように、用語「非エステル含有リンカー部位」とは、カルボン酸エステル結合（−ＯＣ（Ｏ）−）を含有しないリンカー部位をいう。適切な非エステル含有リンカーは、限定されるものではないが、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、アミノ（−ＮＲ−）、カルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）、カルバミン酸（−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−）、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、スクシニル（−（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）、スクシンイミジル（−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ−）ＮＨ−）、エーテル、ジスルフィド等、ならびに（カルバミン酸リンカー部位及びアミドリンカー部位の双方を含有するリンカーのような）それらの組合せを含む。好ましい実施形態において、カルバミン酸リンカーを用いて、ＰＥＧを脂質にカップリングさせる。
【０３８５】
他の実施形態において、エステル含有リンカーを用いて、ＰＥＧを脂質にカップリングさせる。適切なエステル含有リンカー部位は、例えば、カルボネート（−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、スクシノイル、ホスフェートエステル（−Ｏ−（Ｏ）ＰＯＨ−Ｏ−）、スルホネートエステル、及びそれらの組合せを含む。
【０３８６】
標的化剤
いくつかの実施形態において、会合複合体は標的化剤を含む。例えば、標的化剤を会合複合体（例えば、リポソーム）の表面に包含させ、会合複合体が体内の標的とされた領域に向かうのを促進することができる。標的化剤の例はガラクトース、マンノース、及び葉酸である。標的化剤の他の例は、小分子受容体、ペプチド及び抗体を含む。いくつかの実施形態において、標的化剤はオリゴヌクレオチド剤のような治療部位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、標的部位を直接的に会合複合体の脂質成分に結合させる。いくつかの実施形態において、標的部位は、好ましくは平均分子量２０００ａｍｕを持つＰＥＧを介して脂質成分に直接的に結合させる。いくつかの実施形態において、標的化剤は、例えば、会合複合体の表面にはコンジュゲートされていない。
【０３８７】
構造成分
いくつかの実施形態において、会合複合体は、複合体（例えば、リポソーム）の構造を改善する１つ以上の成分を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのような治療剤をコレステロールのような親油性化合物に結合（例えば、コンジュゲート）させることができ、それにより、ｄｓＲＮＡに対する親油性アンカーを提供する。いくつかの実施形態において、コレステロールのような親油性部位へのｄｓＲＮＡのコンジュゲーションは、会合複合体のカプセル化効率を改善することができる。
【０３８８】
会合複合体の特性
リポソームのような会合複合体は、一般には、約２５ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の水力学直径を持つ粒子である。いくつかの好ましい実施形態において、会合複合体は、５００ｎｍ未満、例えば、約２５〜約４００ｎｍ、例えば、約２５ｎｍ〜約３００ｎｍ、好ましくは約１２０ｎｍ以下である。
【０３８９】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡに対する会合複合体内の総賦形剤の重量比は約２０：１未満、例えば、約１５：１である。いくつかの好ましい実施形態において、重量比率は１０：１未満、例えば、約７．５：１である。
【０３９０】
いくつかの実施形態において、会合複合体は、会合複合体がエンドゾーム条件（例えば、複合体の破壊を促進する条件）下でプロトン化されるが、生理学的条件下ではプロトン化されないようなｐＫａを有する。
【０３９１】
いくつかの実施形態において、会合複合体は、ｄｓＲＮＡのようなオリゴヌクレオチドの改善されたイン・ビボ送達を提供する。オリゴヌクレオチドのイン・ビボ送達は、遺伝子サイレンシングアッセイ、例えば、第ＶＩＩ因子のサイレンシングを測定するアッセイを用いて測定することができる。
【０３９２】
イン・ビボ第ＶＩＩ因子サイレンシング実験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、生理食塩水又は種々の脂質製剤の尾静脈注射を受けた。脂質調製ｓｉＲＮＡは、１０μＬ／ｇ動物体重の注射容量にて種々の用量で投与される。投与から２４時間後に、血清試料を眼窩後部出血によって収集する。血清第ＶＩＩ因子濃度は、発色診断キット（Ｃｏａｓｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  Ａｓｓｅｙ  Ｋｉｔ、ダイアファーマ（ＤｉａＰａｈａｒｍａ）社）を用い、製造業者のプロトコルに従って決定する。
【０３９３】
会合複合体の製造方法
いくつかの実施形態において、会合複合体は溶媒及び緩衝液の存在下で、オリゴヌクレオチドのような治療剤を脂質と接触させることによって作製される。いくつかの実施形態において、複数の脂質、例えば、１つ以上のカチオン性脂質（例えば、ポリアミン含有脂質、又は本明細書中に記載された生物切断性部位を含む脂質）、ＰＥＧ脂質、標的脂質又は融合性脂質を溶媒に包含させる。
【０３９４】
いくつかの実施形態において、緩衝液は、本明細書中に記載された基質、例えば、式（Ｉ）又は式（Ｘ）の脂質のようなアミン含有脂質の実質的に全てのアミンをプロトン化するのに十分な強度のものである。
【０３９５】
いくつかの実施形態において、緩衝液は酢酸ナトリム（ｐＨ約５）のような酢酸塩緩衝液である。いくつかの実施形態において、溶液中の緩衝液は約１００ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度である。
【０３９６】
いくつかの実施形態において、溶媒はエタノールである。例えば、いくつかの実施形態において、混合物は少なくとも約９０％エタノール、又は１００％エタノールを含む。
いくつかの実施形態において、該方法は混合物を押出しして、約５００ｎｍ未満の水力学直径を持つサイズ（例えば、約２５ｎｍ〜約３００ｎｍのサイズ、例えば、いくつかの好ましい実施形態においては、粒子サイズは約４０〜１２０ｎｍの範囲内にある）の粒子を有する会合複合体を提供する段階を含む。いくつかの実施形態において、該方法は混合物押し出しを含まない。
【０３９７】
一実施形態において、リポソームは、コレステロール、ＰＥＧ、エタノール、及び２５ｍＭ酢酸塩緩衝液を含む溶液中に混合された本明細書中に記載の脂質の溶液を提供し、ｐＨ約５の混合物を提供することによって調製される。混合物は穏やかにボルテックスされ、この混合物にスクロースが添加される。次いで、スクロースが溶解するまで、混合物を再度ボルテックスする。この混合物に酢酸塩緩衝液中ｓｉＲＮＡの溶液を加え、約２０分間軽くボルテックスする。次いで、混合物を４０℃にて少なくとも１つのフィルタ（例えば、２つの２００ｎｍフィルタ）を通して押出しし（例えば、少なくとも約１０回、例えば、１１回以上）、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して室温にて約９０分間透析する。
【０３９８】
一実施形態において、リポソームは、リポソーム混合物を押出しすることなく調製される。本明細書中に記載された脂質をコレステロール、ＰＥＧ、及びｓｉＲＮＡと、１００％エタノール、水、及び約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ（ｐＨ約５）の濃度を有する酢酸塩緩衝液中で混和する。混和したものを、９０％エタノール中で迅速に混合する。完了に際して、混合物を約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ（約５のｐＨ）の濃度を有する酢酸塩緩衝液に対して透析して（又は限外濾過で処理して）、エタノールを除去し、次いで、ＰＢＳに対して透析して（又は限外濾過で処理して）、緩衝液条件を変化させる。
【０３９９】
会合複合体は、一本鎖又は二本鎖核酸のような治療剤の不在下で形成することができ、次いで、形成に際して、１つ以上の治療上活性な一本鎖又は二本鎖核酸部位で処理して、負荷会合複合体、すなわち、治療的に活性な核酸が負荷される会合複合体を提供する。核酸は、会合複合体内に捕捉されるか、会合複合体の表面に吸収されるか、又はその両方である。例えば、前記リポソームのような会合複合体を形成する方法を用いて、核酸、例えば、ｓｉＲＮＡのような一本鎖又は二本鎖ＲＮＡのような治療剤を含まない会合複合体を形成することができる。会合複合体の形成に際して、次いで、複合体をｓｉＲＮＡのような治療剤で処理して、負荷された会合複合体を提供することができる。
【０４００】
一実施形態において、式（Ｉ）において記載された脂質のようなカチオン性脂質、好ましくは以下の式：
【０４０１】
【化１２２】
0005933163.tif 000124
のカチオン性脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質、例えば、以下のＰＥＧ脂質：
【０４０２】
【化１２３】
0005933163.tif 000125
のような本明細書中に記載されたＰＥＧ脂質を含む混合物がエタノール（例えば、１００％エタノール）中に提供され、水性ＮａＯＡｃのような水性緩衝液と組合せて、負荷されていない会合複合体を得る。次いで、会合複合体を所望により押し出しし、会合複合体のより均一なサイズ分布を提供する。次いで、会合複合体をエタノール（例えば、３５％エタノール）中のｓｉＲＮＡのような治療剤で処理し、それにより、負荷された会合複合体を得る。いくつかの実施形態において、次いで、会合複合体を、透析のようなエタノールを除去するプロセスで処理する。
【０４０３】
会合複合体の評価
前記方法のいずれかによって調製された会合複合体を同様の方法で評価する。会合複合体は、まず、目視検査によって評価される。一般に、好ましい会合複合体は凝集体又は沈澱を含まない白みがかった半透明溶液である。脂質−ナノ粒子の粒子サイズ及び粒子サイズ分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）社、アメリカ合衆国）を用いる動的光散乱によって測定される。好ましい粒子はサイズが２０〜３００ｎｍ、より好ましくは４０〜１００ｎｍである。いくつかの好ましい実施形態において、粒子サイズの分布は単峰型である。調製中の総ｓｉＲＮＡ濃度、ならびに捕捉された画分は、染料排除アッセイを用いて推定される。調製されたｓｉＲＮＡの試料を、製剤破壊界面活性剤、５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下又は不在下にてＲＮＡ−結合染料Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社）と共にインキュベートする。製剤の全ｓｉＲＮＡは、標準曲線に対して界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定される。捕捉された分率は、全ｓｉＲＮＡ含有量から（海面活性剤の不在下においてシグナルによって測定された）「遊離」ｓｉＲＮＡ含有量を差し引くことによって測定される。捕捉されたｓｉＲＮＡの割合は、典型的には＞８５％である。
【０４０４】
会合複合体及びそれを含む組成物を用いる方法
オリゴヌクレオチド剤を含む医薬組成物
会合複合体中で構築されたオリゴヌクレオチド剤は、例えば、一本鎖又は二本鎖立体配置にて、細胞又はヒトに投与することができる。二本鎖立体配置であるオリゴヌクレオチド剤は、実質的に相補的なオリゴヌクレオチドストランドに結合される。二本鎖立体配置におけるオリゴヌクレオチド剤の送達は、増大したヌクレアーゼに対する耐性のようなある種の利点をオリゴヌクレオチド剤に付与することができる。
【０４０５】
一実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されたリポソームのような会合複合体に封入されたオリゴヌクレオチド剤、及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。封入されたオリゴヌクレオチド剤を含む医薬組成物は、遺伝子発現の下方制御により調節することができる病理学的プロセスのような、標的遺伝子の発現又は活性に関連する病気又は障害を治療するのに有用である。そのような医薬組成物は、送達の様式に基づいて調製される。１つの例は、非経口送達を介する、肝臓のような特定の器官／組織への送達のために調製される組成物である。
【０４０６】
本発明の特徴である医薬組成物は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な用量で投与される。
一般に、適切な用量の封入されたオリゴヌクレオチド剤は、送達されるオリゴヌクレオチド剤が１日当たり受容者の体重キログラム当たり０．０１〜５．０ミリグラムの範囲であり、一般に、１日当たり体重キログラム当たり１マイクログラム〜１ｍｇの範囲内にある。医薬組成物は毎日一回投与でき、あるいはオリゴヌクレオチド剤は、１日を通して適切な間隔の２、３回又はそれ以上の部分用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）で、あるいは連続注入、あるいは制御された放出製剤を通じての送達を用いて投与することができる。その場合、各部分用量に含有されたオリゴヌクレオチド剤は、合計日用量を達成するために、対応して少なくしなければならない。用量単位は、例えば、封入されたオリゴヌクレオチド剤の持続放出を数日間に渡って提供する慣用的な持続放出製剤を用いて、数日間に渡り送達するために調合することもできる。持続放出製剤は当該分野でよく知られている。
【０４０７】
当業者であれば、限定されるものではないが、病気又は障害の重症度、従前の治療、患者の一般的健康及び／又は年齢、及び存在する他の病気を含むある種の因子が、患者を効果的に治療するのに必要な用量及びタイミングに影響し得ることを認識するであろう。さらに、治療上有効量の組成物での患者の治療は、１回の治療、又は一連の治療を含むことができる。会合複合体に封入された個々のオリゴヌクレオチド剤についての有効用量及びイン・ビボ半減期の推定は、慣用的な方法を用いて、あるいは本明細書中の他の箇所に記載された、適切な動物モデルを用いるイン・ビボテストに基づいて行うことができる。
【０４０８】
いくつかのマウス遺伝学における進歩は、種々のヒト病気研究のための多数のマウスモデルを作製している。そのようなモデルは、親油性組成物に封入されたオリゴヌクレオチド剤のイン・ビボテストで、ならびに治療上有効用量を決定するのに用いられる。
【０４０９】
任意の方法を用いて、リポソームのような会合複合体に封入されたオリゴヌクレオチド剤を哺乳動物に投与することもできる。例えば、投与は直接的、経口、又は非経口（例えば、皮下、心室内、筋肉内又は腹腔内注射、又は静脈内点滴）とすることができる。投与は（注射によって）迅速なものとするか、あるいは（例えば、ゆっくりとした注入、あるいは遅延放出製剤の投与により）一定期間に渡って行うことができる。
【０４１０】
会合複合体に封入されたオリゴヌクレオチド剤は、滅菌及び非滅菌水性溶液、アルコールのような通常の溶媒中の非水性溶液、又は油性の液体又は固体中の溶液のような組成物に調製することができる。そのような溶液は、緩衝液、希釈剤、及び他の適切な添加剤を含有することもできる。非経口、髄腔内又は心室内投与では、オリゴヌクレオチド剤は、滅菌水性溶液のような組成物に調製することができ、それはさらに緩衝液、希釈剤、及び他の適切な添加剤（例えば、浸透促進剤、担体化合物、及び他の医薬上許容される担体）を含有することができる。
【０４１１】
会合複合体に封入されたオリゴヌクレオチド剤は、医薬上許容される担体又は希釈剤に調製することができる。（本明細書中においては、「賦形剤」とも称される）「医薬上許容される担体」は医薬上許容される溶媒、懸濁剤、又はいずれかの他の薬理学的に不活性なビヒクルである。医薬上許容される担体は液体又は固体とすることができ、所望の体積、濃度及び他の付属する輸送及び化学的特性を提供するように意図された投与の計画様式で選択することができる。典型的な医薬上許容される担体は、その例として、限定されるものではないが：水、生理食塩水、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース及び他の糖、ゼラチン、又は硫酸カルシウム）、潤滑剤（例えば、澱粉、ポリエチレングリコール、又は酢酸ナトリウム）、分解剤（例えば、澱粉又はナトリウム澱粉グリコレート）、及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を含む。
【実施例１】
【０４１２】
化合物３、４及び４、５の合成及び精製：ミカエル付加条件下でのトリエチレンテトラミンのアルキル化−方法１（スキーム１）
【０４１３】
【化１２４】
0005933163.tif 000126
３５０ｍＬの圧力びん中に、Ｎ−ドデシルアクリルアミド１（８４ｇ，０．３５モル）［Ｓｌｅｅ，Ｄｅｂｏｒａｈ  Ｈ．；Ｒｏｍａｎｏ，Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｊ．；Ｙｕ，Ｊｉｎｇｈｕａ；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔｒｕｅ  Ｎ．；Ｊｏｈｎ，Ｊｕｄｙ  Ｋ．；Ｒａｈｅｊａ，Ｎｅｉｌ  Ｋ．；Ａｘｅ，Ｆｒａｎｋ  Ｕ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｔｏｄｄ  Ｋ．；Ｒｉｐｋａ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１），４４（１３），２０９４−２１０７］を取り、容器を穏やかに加熱することによって固体をアルゴン下で融解させた。この融解物にトリエチレンテトラミン２（１０．２ｇ，０．０７モル）を加え、混合物を９０℃にて５日間加熱した。アクリルアミド１へのトリエチレンテトラミン２のミカエル付加により、純物反応条件下で、少量の低アルキル化生成物と共に、２つの５アルキル化生成物、及び１つの６アルキル化生成物を得た。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（９０：５：５）を溶離剤として用いるＴＬＣによって、反応混合物を分析した。ＴＬＣは出発アクリルアミド１のほとんど完全な消費を示した。反応混合物をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解し、シリカゲルプレパックカラム上に装填して、混合物を溶離剤Ｈ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（４８：１：１から８：１：１）を用いて分離した。完全な分離を達成するために、同一条件を用いる多重カラムを行い、以下の純粋な生成物を得た。必要な５付加生成物３及び４が、６付加生成物５と共に単離された。反応混合物においては、低級付加生成物のいくらかもまた、粗製反応混合物のＴＬＣ及びＬＣ−ＭＳで検出された。
【０４１４】
Ｎ−ドデシル−３−（（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−｛２−［（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−２−｛（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−［２−（２−ドデシルカルバモイル−エチルアミノ）−エチル］アミノ｝−エチルアミノ）プロピオンアミド。２つの５−アルキル化誘導体の１つである化合物３（異性体Ｉ）は淡黄色発泡体（１２ｇ，１３％）として単離された。ＭＳ  ｍ／ｚ  ６７２（Ｍ＋２Ｈ／２），４４８（Ｍ＋３Ｈ／３）。１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ０．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１５Ｈ），１．２０〜１．３９（ｍ，９２Ｈ），１．４６〜１．５７（ｍ，１２Ｈ），２．２０〜２．５０（ｍ，１６Ｈ），２．６０〜２．７８（ｍ，１０Ｈ），３．１０〜３．２５（ｍ，１２Ｈ），６．９８（ｂｓ，３Ｈ），７．４１（ｂｓ，１Ｈ），７．６３（ｂｓ，１Ｈ），８．８５（ｂｓ，１Ｈ）。１３ＣＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  １４．３３，２２．９０，２７．３７，２９．５９，２９．６７，２９．８８，２９．８９，２９．９２，３２．１３，３９．７４，１７２．７７。
【０４１５】
（３−［（２−｛２−［｛２−ビス−（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−アミノ］−エチル｝−（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−アミノ］−エチルアミノ｝−エチル）−（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−アミノ］−Ｎ−ドデシル−プロピオンアミド）。第二の５−アルキル化誘導体である化合物４（異性体ＩＩ）は白色粉末（１３．７ｇ，１４％）として単離された。ＭＳ  ｍ／ｚ  ６７２（Ｍ＋２Ｈ／２），４４８（Ｍ＋３Ｈ／３）。１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ０．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１５Ｈ），１．２０〜１．３９（ｍ，９２Ｈ），１．４４〜１．５４（ｍ，１２Ｈ），２．３０〜２．４５（ｍ，８Ｈ），２．４６〜２．５４（ｍ，８Ｈ）２．５５〜２．８５（ｍ，１０Ｈ），３．１５〜３．３０（ｍ，１２Ｈ），６．９８（ｂｓ，１Ｈ），８．８５（ｂｓ，１Ｈ）。１３ＣＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  １４．３３，２２．８９，２７．２８，２７．３８，２９．５９，２９．６９，２９．８８，２９．８９，２９．９２，３２．１３，３９．６５，３９．７４，５０．８４，１７２．６３，１７２．７５，１７２．８１。
【０４１６】
これと共に、２：３（３：４）の比率の化合物３及び４の純粋な混合物（１１．６ｇ，１２％）も単離された。
３−［｛２−［｛２−［ビス−（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−アミノ］−エチル｝−（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−アミノ］−エチル｝−（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−アミノ］−エチル｝−（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−アミノ］−Ｎ−ドデシル−プロピオンアミド。６アルキル化生成物５がクリーム色粉末（１６．３ｇ，１７％）として単離された。ＭＳ  ｍ／ｚ  ７９２（Ｍ＋２Ｈ／２），５２８（Ｍ＋３Ｈ／３）。１Ｈ  ＮＭＲ  ＤＭＳＯ−ｄ６  d  ０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，１８Ｈ），１．１５〜１．４０（ｍ，１１２Ｈ），１．４５〜１．５３（ｍ，１２Ｈ），２．２０〜２．３５（ｍ，８Ｈ）２．３７〜２．５０（ｍ，１２Ｈ），２．６４〜２．７８（ｍ，１２Ｈ），３．１０〜３．２５（ｍ，１２Ｈ），７．２６，（ｂｓ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  １４．３２，２２．８９，２７．３４，２７．３８，２９．５９，２９．６９，２９．９０，２９．９２，３２．１３，３９．７７，５０．８５，１７２．８０。
【実施例２】
【０４１７】
化合物３、４及び４の合成及び精製：ミカエル付加条件下でのトリエチレンテトラミンのアルキル化−方法２（スキーム２）
別の実験において、高温での出発アクリルアミド１の重合を妨げるために、ラジカルクエンチャベンゾキノンを反応混合物に加えた。
【０４１８】
【化１２５】
0005933163.tif 000127
この方法において、ラジカルクエンチャベンゾキノンを反応混合物に加えた以外は、方法１（実施例１）のそれと同様な反応を行った。１５０ｍＬの圧力びん中で、Ｎ−ドデシルアクリルアミド１（２４ｇ，１００ミリモル）を取り、これに、１５ｍｇのベンゾキノンを加え、容器を穏やかに加熱することによって固体アクリルアミドをアルゴン下で融解させた。この融解物にトリエチレンテトラミン２（２．９ｇ，２０ミリモル）を加え、混合物を９０℃にて５日間加熱した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（９０：５：５）を溶離剤として用いるＴＬＣによって、反応混合物を分析した。ＴＬＣは出発アクリルアミド１のほとんど完全な消費を示した。反応混合物をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解させ、所望の生成物３、４及び５を実施例１に記載したように単離した。この場合、６付加生成物の量のわずかな増加が観察された。
【０４１９】
化合物３：５付加生成物、異性体Ｉは単黄色の発泡体（３．４ｇ，１３％）として単離された。この化合物についての分析及びスペクトルデータは方法１によって得られた３のそれと同一であった。
【０４２０】
化合物４：５付加生成物、異性体ＩＩは白色粉末（３．９ｇ，１４％）として単離された。この化合物についての分析及びスペクトルデータは方法１によって得られた４のそれと同一であった。異性体３及び４の純粋な混合物（１．９ｇ，７％）も単離された。
【０４２１】
化合物５：６付加生成物はクリーム色粉末（６．９ｇ，２６％）として単離された。この化合物についての分析及びスペクトルデータは方法１によって得られた５のそれと同一であった。
【実施例３】
【０４２２】
化合物３、４及び４の合成及び精製：ミカエル付加条件下でのトリエチレンテトラミンのアルキル化−方法３（スキーム３）
この方法においては、ホウ酸（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｍｉｈｉｒ  Ｋ．；Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｓａｈｉｄ；Ｋａｎｔａｍ，Ｍ．Ｌａｋｓｈｍｉ；Ｎｅｅｌｉｍａ，Ｂ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５），４６（４８），８３２９−８３３１．）のような促進剤の存在下でミカエル付加を行って、反応速度を高めた。
【０４２３】
【化１２６】
0005933163.tif 000128
この方法においては、ミカエル付加促進剤、飽和ホウ酸水溶液を反応混合物に加えた以外は方法１（実施例１）と同様な反応を行った。１５０ｍＬ圧力びん中で、容器を穏やかに加熱することによってＮ−ドデシル−アクリルアミド１（２４ｇ，１００ミリモル）をアルゴン下で融解させ、これに３ｍＬのホウ酸水溶液を加えた。この融解物にトリエチレンテトラミン２（２．９ｇ，２０ミリモル）を加え、混合物を９０℃にて２日間加熱した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（９０：５：５）を溶離剤として用いるＴＬＣによって、反応混合物を分析した。ＴＬＣは、出発アクリルアミド１のほとんど完全な消費を示した。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、溶液を固体炭酸水素ナトリウムと共に攪拌し、有機層を濾過し、ロータリーエバポレータ中で濃縮した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（４８：１：１から８：１：１）を用いるカラムクロマトグラフィ（シリカゲル）によって、この粗製生成物を精製した。完全な分離を達成するために、同一条件を用いて多重カラムを行い、以下の純粋な生成物を得た。この反応条件下では、化合物４（異性体ＩＩ）及び６付加生成物５の収率の増加が達成された。
【０４２４】
化合物３：５付加生成物３、異性体Ｉは淡黄色発泡体（３．１ｇ，１１％）として単離された。この化合物についての分析及びスペクトルデータは方法１によって得られた３のそれと同一であった。
【０４２５】
化合物４：５付加生成物４、異性体ＩＩは白色粉末（５．７ｇ，２０％）として単離されたこの化合物についての分析及びスペクトルデータは方法１によって得られた４のそれと同一であった。異性体３及び４の純粋な混合物（２．１ｇ，７％）も単離された。
【０４２６】
化合物５：６付加生成物５はクリーム色粉末（７．６ｇ，２８％）として単離された。この化合物についての分析及びスペクトルデータは方法１によって得られた５のそれと同一であった。
【実施例４】
【０４２７】
化合物３及び４の合成及び精製：ミカエル付加条件下でのトリエチレンテトラミンのアルキル化−方法４（スキーム４）
別の実験において、６付加生成物５の形成を最小化するために、溶媒の使用を試みた。
【０４２８】
【化１２７】
0005933163.tif 000129
この方法においては、攪拌しつつ９０℃の溶媒の存在下で反応を行った以外は、方法１（実施例１）及び方法２（実施例２）と同様な反応を行った。１５０ｍＬの圧力びん中で、Ｎ−ドデシル−アクリルアミド１（１０ｇ，４１．８ミリモル）を２０ｍＬのアセトニトリル又はＤＭＦいずれかに溶解させた。この溶液にトリエチレンテトラミン２（１ｇ，６．８ミリモル）を加え、混合物を、９０℃にて５日間加熱した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（９０：５：５）を溶離剤として用いるＴＬＣによって、反応混合物を分析した。ＴＬＣは、少量の所要の５付加生成物の形成を示した。この反応における主要生成物は、非常に極性の強い低級付加生成物及び４付加生成物の混合物であった。
【実施例５】
【０４２９】
反応混合物からの未反応アクリルアミドの分離及び／又は単離された生成物３、４及び５
反応混合物から未反応アクリルアミド１を除去するために、反応混合物を酢酸エチル又はＤＭＦで希釈し、ポリスチレン又はポリマー結合チオール（又はメルカプタン）と共に攪拌して、全てのアクリルアミドを捕捉した。固定化されたチオールを溶液に加え、室温にて穏やかに振盪し、固体を濾別した。固定化されたチオールのアクリルアミドへのミカエル付加により、全ての未反応アクリルアミドが捕捉される。各所望の異性体の単離後の汚染物としての痕跡量のアクリルアミドも、同一条件下で完全に除去された。単離された生成物３（又は４又は５）をＤＭＦ又は酢酸エチルに溶解させ、固定化されたアクリルアミドクエンチャ、フィルタと共に穏やかに振盪し、真空中での濾液の蒸発によりアクリルアミド汚染のない純粋な化合物３（又は４又は５）を得る。
【実施例６】
【０４３０】
化合物５からの第一級及び第二級アミン汚染物の分離
痕跡量の第一級及び第二級アミン汚染物を除去するための化合物５のカラムクロマトグラフィ分離の後に、化合物を酢酸エチル又はＤＭＦに溶解させ、固体結合又は固定化イソチオシアネートと共に室温下で一晩攪拌した。固体を濾別し、濾液の蒸発により、主要な又は二次的なアミン汚染物のいずれも含まない純粋な化合物５を得る。
【実施例７】
【０４３１】
化合物３及び４からの第一級アミンの汚染物の分離
反応の完了後に、反応混合物を室温にてジクロロメタン中のトリエチルアミンの存在下でテトラクロロフタル酸無水物によって処理し、溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルと共に攪拌し、固体を濾過し、濾液を濃縮して、第一級アミンの汚染物を含まない生成物を得た。
【０４３２】
【表１】
0005933163.tif 000130
【実施例８】
【０４３３】
生成物３、４及び５の塩酸塩の調製方法
取扱いの容易性を改善し、前記リストの化合物の安定性を増加させるために、それらを対応する塩酸塩６、７及び８に変換した。
【０４３４】
化合物３の塩酸塩（６）：アミン３（９．４ｇ）を１００ｍＬの熱無水１，４−ジオキサンに溶解させ、ジオキサン中の４Ｍ  ＨＣＩの１００ｍＬを加え、混合物を室温にて一晩攪拌した。窒素を反応混合物に１時間通気して、過剰のＨＣｌを除去し、残存する溶液を〜１０ｍＬまで濃縮した。これにＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：１）の不均一混合物１００ｍＬを加え、沈殿した生成物を濾過し、酢酸エチル（５０ｍＬ）、ヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、得られた粉末を真空下で乾燥させて、純粋な生成物６（９．９９ｇ，９６％）をクリーム色粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ０．８３（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１５Ｈ），１．２０〜１．３９（ｍ，９２Ｈ），２．６４〜２．７０（ｍ，８Ｈ），２．９０〜３．１０（ｍ，１６Ｈ），３．２５〜３．４５（ｍ，１２Ｈ），３．４６〜３．６４（ｍ，４Ｈ），５．２０〜６．０（ｂｓ，２Ｈ），８．０５〜８．１５（ｍ，５Ｈ），１０．（ｂｓ．３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  １３．８３，２２．０４，２６．４８，２８．６９，２８．７９，２８．９０，２９．０４，３１．２６，３８．７１，１６８．３８，１６８．５３。元素分析：Ｃ８１Ｈ１６３Ｎ９Ｏ５．４ＨＣｌ．３Ｈ２Ｏとして、計算値：Ｃ，６３．０５；Ｈ，１１．３０；Ｎ，８．１７；Ｃｌ，９．１９  実測値：Ｃ，６３．１３；Ｈ，１１．０６；Ｎ，８．２１；Ｃｌ，９．２１。
【０４３５】
【化１２８】
0005933163.tif 000131
化合物７
３について前記で用いたのと同様な手法を用いて、アミン４（１３．７ｇ，１０．２ミリモル）を対応するＨＣｌ塩７に変換して、６を得た。テトラヒドロクロライド塩７は白色粉末（１４．６ｇ，９６％）として単離された。１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ０．８２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１５Ｈ），１．２０〜１．４１（ｍ，９２Ｈ），２．５２〜２．７２（ｍ，８Ｈ），２．９０〜３．１０（ｍ，１６Ｈ），３．２５〜３．４５（ｍ，１２Ｈ），３．４６〜３．６４（ｍ，４Ｈ），５．２０〜６．０（ｂｓ，２Ｈ），８．０５〜８．１５（ｍ，５Ｈ），１０．（ｂｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ８．４２，１３．８４，２２．０４，２６．４８，２８．６９，２８．７９，２９．００，３１．２６，４５．４４，１６８．５３，１６８．６０。元素分析：Ｃd１Ｈ１６３Ｎ９Ｏ５．４ＨＣｌ．２Ｈ２Ｏとして、計算値：Ｃ，６３．７９；Ｈ，１１．３０；Ｎ，８．１７；Ｃｌ，９．３４  実測値：Ｃ，６３．７８；Ｈ，１１．０４；Ｎ，８．４０；Ｃｌ，９．７３。
【０４３６】
【化１２９】
0005933163.tif 000132
化合物８
塩６について前記したのと同様な手法を用いて、アミン５（１３．７ｇ，１．２ミリモル）を対応するＨＣｌ８に変換した。テトラヒドロクロライド塩８は白色粉末（１．３ｇ，９６％）として単離された。１Ｈ  ＮＭＲ  ＤＭＳＯ−ｄ６  d  ０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，１８Ｈ），１．１３〜１．３０，（ｍ，１１２Ｈ），１．３５〜１．５３（ｍ，１２Ｈ），２．１０〜２．２５（ｍ，１２Ｈ），２．３０〜２．４０（ｍ，１２Ｈ），２．６０〜２．７６（ｍ，１２Ｈ），３．１０〜３．２５（ｍ，１２Ｈ），７．２６（ｂｓ，４Ｈ），７．６４（ｂｓ，２Ｈ），１０．１（ｂｓ，４Ｈ）。
【０４３７】
【化１３０】
0005933163.tif 000133
【実施例９】
【０４３８】
化合物３及び４の直接的合成のためのトリエチレンテトラミン上のアミノ基の選択的保護
工程１：化合物１０の調製：アセトニトリル（５００ｍＬ）中のトリエチレンテトラミン２（２０．５５ｇ，１４０．５２ミリモル，シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社から購入）を攪拌しながら氷浴で冷却した。トリフルオロ酢酸エチル（３５．２０ｍＬ，２９５．０９ミリモル）を攪拌溶液に加え、２０時間攪拌した。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、高真空下で乾燥させ、９を白色固体（４４．４ｇ，９４％）として得た。かくして得られた生成物をさらに精製することなく次の反応で用いることができた（Ｗｅｎｄｅｒ  Ｐ．Ａ．らＯｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒ，２００５  ７，４８１５）。
【０４３９】
粗製化合物９（２３．７０，７０ミリモル）をアセトニトリル（４００ｍＬ）に溶解させ、氷浴上で攪拌した。Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシネ―ト（Ｚ−ＯＳｕ，４３．７３ｇ，１７５ミリモル，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入）及びトリエチルアミン（２３．４０ｍＬ，２１０ミリモル）を反応混合物に加え、一晩攪拌した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタン（ＤＣＭ）に抽出し、順次、水（２回）及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、そのように得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（グラジエント溶出、３０％〜７０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、化合物１０を白色固体（３８．２ｇ，８９％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝９．６０〜９．５０（ｍ，２Ｈ）７．４０〜７．２０（ｍ，１０Ｈ），５．０２（ｓ，４Ｈ），３．４０〜３．２０（ｍ，１２Ｈ）。ＭＳ：Ｃ２６Ｈ２８ＨＦ６Ｎ４Ｏ６として、計算値：６０６．１９，実測値：６０７．２（Ｍ４）。
【０４４０】
工程２：化合物１１の調製：化合物１０（１２．６０ｇ，２０．７８ミリモル）を室温にてメタノール（ＭｅＯＨ，１５０ｍＬ）に懸濁させ、エタノール（４０ｍｌ）中のメチルアミンの８Ｍ溶液を攪拌しながら懸濁液に加えた。全ての固体を溶液とし、室温室温で１時間攪拌した後、混合物を５０℃まで温め、８時間攪拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。全ての溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（グラジエント溶出、１０％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ〜１０：１０：８０，ＭｅＯＨ：ＴＥＡ：ＤＣＭ）によって精製して、生成物１１（７．８０ｇ，９１％）を淡黄色ガム状液体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝７．８０〜７．４０（ｍ，１０Ｈ），５．０２〜４．９４（ｍ，４Ｈ），３．４５〜３．０５（ｍ，８Ｈ），２．７０〜２．５５（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｂｓ，４Ｈ）。ＭＳ：Ｃ２２Ｈ３０Ｎ４Ｏ４として、計算値：４１４．２３，実測値：４１５．２０（Ｍ＋）。
【０４４１】
工程３：化合物１３の調製：化合物１２は、１．１モル当量のトリフルオロ酢酸エチル（８．８０ｍＬ，７７．１０ミリモル）と反応させることによって、化合物９の合成について工程１に記載したように、トリエチレンテトラミン１００（１０．２５ｇ，７０．０９ミリモル）から調製した。そのように得られた組成物１２を無水ＤＣＭ（４００ｍｌ）に溶解させ、０℃まで冷却した。（Ｂｏｃ）２Ｏ（５３．５３ミリモル，２４５．３１ミリモル）及びトリエチルアミン（４８ｍｌ，３５０ミリモル）を加え、反応混合物を一晩攪拌した。反応の進行をＴＣＬによってモニターした。溶媒を真空中で除去し、残渣をＤＣＭに抽出し、水、食塩水で洗浄し、乾燥させた。ＤＣＭを除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（グラジエント溶出５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン〜ＥｔＯＡｃ）によって精製して、所望の生成物１３（３４．２０ｇ，９２％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝９．５１〜９．３８（ｍ，１Ｈ），６．８２（ｂｓ，１Ｈ）３．３０〜３．００（ｍ，１２Ｈ），１．５８〜１．３０（ｓ，２７Ｈ）。ＭＳ：Ｃ２３Ｈ４１Ｆ３Ｎ４Ｏ７として、計算値：５４２．２９，実測値：５４３．４（Ｍ＋）。
【０４４２】
工程４：１４の調製：ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中の化合物１３（２５ｇ，４７．３２ミリモル）の溶液を水（１ｍＬ）の存在下でＫ２ＣＯ３（５０ｇ）と共に５０℃にて一晩攪拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニターした。固体Ｋ２ＣＯ３を濾別し、ＭｅＯＨで洗浄し、合わせた洗浄液及び溶媒を真空中で除去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製して、所望の生成物１４（１０．２ｇ，５０％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝６．８３（ｂｓ，１Ｈ）２．９５〜３．３０（ｍ，１２Ｈ），２．６２〜２．５０（ｍ，２Ｈ），１．２５〜１．４５（ｍ，２７Ｈ）。ＭＳ：Ｃ２１Ｈ４２Ｎ４Ｏ６として、計算値：４４６．３１，実測値：４４７．４（Ｍ＋）。
【０４４３】
【化１３１】
0005933163.tif 000134
工程５：化合物１５の調製：化合物９（２３．０ｇ，６８．０２ミリモル）をアセトニトリル／ジクロロメタン（１：１，３００ｍＬ）の混合物に溶解させ、０℃まで冷却した。Ｚ−ＯＳｕ（１７．００ｇ，６９ミリモル）を溶液に加え、１０分間攪拌した。トリエチルアミン（２３．４０ｍＬ，２１０ミリモル）を引き続いて反応混合物に加え、一晩攪拌した。溶媒及びトリエチルアミンを真空中で除去し、残渣をＤＣＭに抽出し、水（２回）、食塩水で洗浄し、乾燥させた。溶媒を除去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（まず、２０〜６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、次いで、５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）によって精製して、所望の生成物１５（１３．３ｇ）を副産物１０（８．５ｇ）と共に白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝９．６０（ｂｓ，１Ｈ），９．３０（ｂｓ，１Ｈ）７．４０〜７．２８（ｍ，５Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），３．４０〜３．１０（ｍ，８Ｈ），２．７０〜２．５０（ｍ，４Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１８Ｈ２２Ｆ６Ｎ４Ｏ４として、計算値：４７２．１５，実測値：４４７．４７３．１（Ｍ＋）。
【０４４４】
工程６：化合物１６の調製：工程２に記載したようなメチルアミン（５０ｍｌ，ＥｔＯＨ中の８Ｍ溶液）での化合物１５（１３．４ｇ，２８．３８ミリモル）の処理により、無色液体化合物１６（６．１０ｇ，７９％）を得た。そのように得られた生成物はさらに精製することなく次の反応で用いた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝７．４５〜７．２０（ｍ，６Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），３．４５〜２．９０（ｍ，８Ｈ），２．６０〜２．３０（ｍ，４Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１４Ｈ２４Ｎ４Ｏ２として、計算値：２８０．１９，実測値：２８１．２（Ｍ＋）。
【０４４５】
【化１３２】
0005933163.tif 000135
【実施例１０】
【０４４６】
５−アルキル化単一異性体４の合成−方法１
工程１：１１とＮ−ドデシルアクリルアミドとの反応：ジアミン１１（１．００ｇ，２．４１ミリモル）及びＮ−ドデシルアクリルアミド（３．４７ｇ，１４．５０ミリモル）を共に圧力チューブに取り、９０℃にて５日間加熱した。反応をＴＬＣによってモニターした。反応終了後、混合物をジクロロメタンに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィによって精製して、生成物１７、１８及び１９を得た。
【０４４７】
工程２：化合物２０の調製：化合物１９（２．００ｇ，１．４６ミリモル）を酢酸エチル及びメタノール（１：２，１５ｍｌ）の混合物に溶解させ、それに２当量の酢酸を加える。触媒としてパラジウム／炭素（０．２００ｇ，１０重量％）を用いて混合物を圧力（３４５ｋＰａ（５０ｐｓｉ））下で水素化して、所望の生成物２０を得る。
【０４４８】
工程３：単一の異性体４の調製：化合物２０（１．５０ｇ，１．３６ミリモル）及びアクリルアミド１（０．３２５ミリモル，１．３６ミリモル）をトルエン（４ｍＬ）に溶解させ、９０℃にて加熱して、化合物４を形成する。反応の進行はＴＬＣによってモニターする。反応の完了後、混合物を室温まで冷却し、ＤＣＭに溶解させ、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィにて精製して、所望の生成物４を得る。
【０４４９】
【化１３３】
0005933163.tif 000136
【実施例１１】
【０４５０】
５−アルキル化単一異性体４の合成−方法２
工程１：化合物２１の調製：化合物１６（１．０ｇ，３．５６ミリモル）及びＮ−ドデシルアクリルアミド（６．００ｇ，７当量）を共に圧力チューブに取り、加熱して、化合物２１を得る。反応の進行はＴＬＣによってモニターする。反応の完了後、混合物をＤＣＭに溶解させ、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィによって精製して、所望の化合物２１を得る。
【０４５１】
工程２：２１からの化合物４の調製：化合物２１（２．００ｇ，１．３５ミリモル）を酢酸エチル及びメタノール（１：２，１５ｍｌ）の混合物に溶解させ、それに、２当量の酢酸を加える。混合物を圧力（３４５ｋＰａ（５０ｐｓｉ））下でパラジウム−炭素（０．２００ｇ，１０重量％）上で水素化して、所望の単一の異性体４を得る。
【０４５２】
【化１３４】
0005933163.tif 000137
【実施例１２】
【０４５３】
５−アルキル化単一異性体３の合成−方法１
工程１：化合物２２の調製：化合物１４（５．０６ｇ，１１．３０ミリモル）及びＮ−ドデシルアクリルアミド（２．９４ｇ，１２．４３ミリモル）をトルエン中に取り、９０℃にて５日間加熱した。ＴＬＣをチェックし、生成物の形成を示した。反応混合物をカラムシリカゲルプレパックカラム上に直接装填し、フラッシュクロマトグラフィ（５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、化合物２２（４．８２ｇ，６２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝８．１７（ｂｓ，１Ｈ），６．６０（ｂｓ，１Ｈ），３．３０〜２．９５（ｍ，１２Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝５．８０Ｈｚ，２Ｈ），２．６０（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，２Ｈ），２．１８（ｔ，Ｊ＝６．４０Ｈｚ，２Ｈ），１．３５（ｍ，２９Ｈ），１．２６〜１．１５（ｍ，１８Ｈ），０．８３（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ３６Ｈ７１Ｎ５Ｏ７として、計算値：６８５．５４，実測値：６８６．５（Ｍ＋）。
【０４５４】
工程２：化合物２３の調製：化合物２２（４．７５ｇ，６．９２ミリモル）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却した。Ｚ−ＯＳｕ（２．５９ｇ，１．５当量）を溶液に加え、１０分間攪拌した。反応混合物を引き続いてトリエチルアミン（２．８２ｍＬ，２０．７６ミリモル）と共に一晩攪拌した。溶媒及びトリエチルアミンを真空中で除去し、残渣をジクロロメタンに抽出し、順次、水（２回）及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去した後、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５〜１０％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所望の生成物２３（５．３３ｇ，９４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝７．４９〜７．２５（ｍ，５Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），３．６０〜３．０２（ｍ，１４Ｈ），２．４５〜４５（ｍ，４Ｈ），１．５０〜１．３５（ｍ，２７Ｈ），１．２４〜１．２０（ｍ，１８Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ４４Ｈ７７Ｎ５Ｏ９として、計算値：８１９．５７，実測値：８２０．７（Ｍ＋）。
【０４５５】
工程３：化合物２４の調製：ジオキサン（５０ｍＬ）中の４Ｍ  ＨＣｌをジオキサン（１００ｍｌ）中の化合物２３（５．３０ｇ，６．５０ミリモル）の溶液に加えた。次いで、反応混合物を一晩攪拌した。反応の進行の間に、生成物が沈殿した。溶媒及びＨＣｌを真空下で除去し、白色固体を得た。残渣を、過剰のトリエチルアミンを含有するＭｅＯＨ中に取り、懸濁液を１時間攪拌して、均一な溶液を得た。溶媒を真空中で除去し、残渣をＥｔＯＡｃと共に粉砕し、トリエチルアミン塩酸塩を濾別した。合わせた濾液を真空下で蒸発させて、ガム状の液体２４（３．３０ｇ，９８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝７．３７〜７．２８（ｍ，５Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），３．６０〜３．２０（ｍ，４Ｈ），３．１０〜２．７０（ｍ，１０Ｈ），２．４０〜２．２０（ｍ，４Ｈ），１．４０〜１．３０（ｍ，２Ｈ），１．２５〜１．１７（ｍ，１８Ｈ），０．８１（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ２９Ｈ５３Ｎ５Ｏ３として、計算値：５１９．４１，実測値：５２０．４（Ｍ＋）。
【０４５６】
工程４：化合物２５の調製：化合物２４（１．００ｇ，１．９２５ミリモル）及びＮ−ドデシルアクリルアミド（３．７０ｇ，８当量）を共に圧力チューブに取り、高温にて加熱して、所望の化合物２５を得る。生成物の形成はＴＬＣによってモニターされ、引き続いて、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製して、純粋な化合物２５を得る。
【０４５７】
工程５：化合物３の調製：化合物２５（２．００ｇ，１．３５ミリモル）を酢酸エチル及びメタノール（１：２，１５ｍｌ）の混合物に溶解させ、それに、２当量の酢酸を加える。混合物を圧力（３４５ｋＰａ（５０ｐｓｉ））下でパラジウム−炭素（０．２００ｇ，１０重量％）上で水素化して、所望の生成物３を得る。
【０４５８】
【化１３５】
0005933163.tif 000138
【実施例１３】
【０４５９】
５−アルキル化単一異性体３の合成−方法２
工程１：化合物２６の調製：臭化ベンジル（１．２５ｍｌ，１．５当量）を、ＤＭＣ（１００ｍＬ）中の化合物２２（４．８０ｇ，７．００ミリモル）及びＫ２ＣＯ３（９．６７ｇ，１０当量）の懸濁液に加え、混合物を一晩攪拌した。反応の進行はＴＬＣによってモニターした。固体を濾別し、ＭｅＯＨ及び酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮し、そのようにして得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５０〜１００％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、所望の化合物２６（３．３０ｇ，６１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝７．７７（ｂｓ，２Ｈ），７．２８〜７．２３（ｍ，５Ｈ），６．８５〜６．７０（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｓ，２Ｈ），３．２０〜２．２０（ｍ，１８Ｈ），１．３５（ｓ，２７Ｈ）１．３０〜１．２３（ｍ，２Ｈ），１．２０〜１．１５（ｍ，１８Ｈ），６．８１（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ４３Ｈ７７Ｎ５Ｏ７として、計算値：７７５．５８，実測値：７７６．５（Ｍ＋）。
【０４６０】
工程２：化合物２７の調製：ジオキサン（５０ｍｌ）中の化合物２６（３．３０ｇ，４．２５ミリモル）をジオキサン中の４Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍＬ）と共に一晩攪拌した。白色沈澱の形成が反応の間に見られた。溶媒及び酸を真空下で除去し、そのようにして得られた白色残渣を過剰のトリエチルアミンを含有するメタノールに再度溶解させた。次いで、均一な溶液を減圧下で蒸発させて、白色残渣を得た。残渣をＥｔＯＡｃと共に粉砕し、トリエチルアミン塩酸塩を濾別した。濾液を減圧下で蒸発させて、所望の化合物２７
（２．３６ｇ，９９％）をガム状液体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝８．０５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４０〜７．２０（ｍ，５Ｈ），３．５８（ｓ，２Ｈ），３．１０〜２．３０（ｍ，１８Ｈ），１．４０〜１．３０（ｍ，２Ｈ），１．２５〜１．１５（ｍ，１８Ｈ），０．８２（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ２８Ｈ５３Ｎ５Ｏとして、計算値：４７５．４３，実測値：４９８．４（Ｍ＋Ｎａ）。
【０４６１】
工程３：化合物２８の調製：純物の化合物２７（１．００ｇ，２．１０ミリモル）及びＮ−ドデシルアクリルアミド（４．０ｇ，８当量）を圧力チューブ中で混合し、高温まで加熱して、化合物２８を形成させた。２８の形成をＴＬＣ及びＬＣ−ＭＳによってモニターする。反応の完了の後、生成物をクロマトグラフィ精製によって単離して、純粋な化合物２８を得る。
【０４６２】
工程４：化合物２８からの化合物３の調製：化合物２８（２．００ｇ，１．４０ミリモル）を酢酸エチル及びメタノール（１：２，１５ｍｌ）の混合物に溶解させ、それに、６当量の酢酸を加える。混合物を圧力（３４５ｋＰａ（５０ｐｓｉ））下でパラジウム−炭素（０．２００ｇ，１０重量％）上で水素化して、化合物３を得る。
【０４６３】
【化１３６】
0005933163.tif 000139
【実施例１４】
【０４６４】
異性体３の収束合成−方法１
工程１：化合物３０、３１及び３２の調製：エチレンジアミン２９（０．９７８ｍｌ，１４．６３ミリモル）、Ｎ−ドデシルアクリルアミド（７．００ｇ，２９．２６ミリモル）及びホウ酸（１００ｍｇ）を５ｍＬの水中に取り、９０℃にて４日間加熱した。アクリルアミドの完全な消失はＴＬＣ分析によって確認した。反応混合物をＤＣＭに溶解させ、水及び炭酸水素塩で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。ＤＣＭを除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（２：２：９６〜１０：１０：８０％  ＭｅＯＨ／ＴＥＡ／ＤＣＭ）によって精製して、化合物３０（１．８６ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝７．０５（ｂｓ，２Ｈ），３．２１（ｑ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，４Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，４Ｈ），２．７３（ｓ，４Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，４Ｈ），１．５７（ｂｓ，２Ｈ），１．４９〜１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２８〜１．１９（ｍ，４０Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ：Ｃ３２Ｈ６６Ｎ４Ｏ２として、計算値：５３８．５２，実測値：５３９．５０（Ｍ＋）。３１（３．５０ｇ）１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝８．２０（ｂｓ，１Ｈ），３．２０〜２．１５（ｍ，２２Ｈ），１．３６〜１．３０（ｍ，６Ｈ），１．２５〜１．１５（ｍ，３０Ｈ），０．８１（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，９Ｈ）。ＭＳ：Ｃ４７Ｈ９５Ｎ５Ｏ３として、計算値：７７７．７４，実測値：７７８．７（Ｍ＋）及び３２（１．７５ｇ）１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝３．２３〜２．１５（ｍ，２８Ｈ），１．３５〜１．４５（ｍ，８Ｈ），１．２６〜１．１５（ｍ，４０Ｈ），０．８２（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１２Ｈ）。ＭＳ：Ｃ６２Ｈ１２４Ｎ６Ｏ４として、計算値：１０１６．９７，実測値：１０１８．０（Ｍ＋）。
【０４６５】
工程２：化合物３３の調製：化合物３１（１．５５ｇ，２ミリモル）及びＫ２ＣＯ３（２．７６ｇ，２０ミリモル）をＤＭＦ中に取る。それに、クロロアセトアルデヒドジメチルアセタール（０．４５３ｍｌ，４．００ミリモル）を加え、２４時間攪拌する。反応をＴＬＣによってモニターし、Ｋ２ＣＯ３を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄する。溶媒を減圧下で除去し、残渣をクロマトグラフィ精製に付して、化合物３３を得る。
【０４６６】
工程３：化合物３４の調製：化合物３３（２．００ｇ，２．３１ミリモル）をＭｅＯＨ及びＤＣＭの混合物中に取り、それに、ＰＴＳＡ（２．０当量）を加え、反応混合物を一晩攪拌する。溶液を炭酸水素ナトリウム溶液で中和し、ＤＣＭで抽出し、乾燥させる。化合物をクロマトグラフィ分離によって精製して、所望の生成物３４を得る。
【０４６７】
工程４：３４からの単一異性体３の調製：化合物３４（２．００ｇ，２．４３ミリモル）及び３０（１．３１ｇ，２．４３ミリモル）をＤＣＭ中に取り、それに、活性化された分子篩を加え、３時間攪拌する。反応をＴＬＣによってモニターする。反応終了後、溶媒を除去する。残渣をＴＨＦに溶解させ、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５当量）及び酢酸を加え、一晩攪拌する。溶媒を除去し、ＤＣＭで抽出し、残渣のクロマトグラフィ分離により純粋な異性体３を得る。
【０４６８】
【化１３７】
0005933163.tif 000140
【実施例１５】
【０４６９】
異性体３の収束合成−方法２
所望の単一異性体３は、窒素の１つの選択的保護によって化合物３５を得ることにより化合物３０から調製される。引き続いて、化合物３５を還元条件下でアルデヒド３４と反応させて、化合物３６を得る。３６の酸処理により化合物３を得る。
【０４７０】
【化１３８】
0005933163.tif 000141
【実施例１６】
【０４７１】
異性体３の収束合成−方法３
所望の単一の異性体３はモノベンジルエチレンジアミン３７からも調製される。３７を１でアルキル化することにより、化合物３８、３９及び４０の混合物が得られる。化合物４０還元条件下でアルデヒド３４と反応させて、化合物４１が得られる。４１の水素化分解により、所望の化合物３が得られる。
【０４７２】
【化１３９】
0005933163.tif 000142
【実施例１７】
【０４７３】
異性体４の収束合成−方法１
工程１：化合物４３の調製：１５０ｍＬの圧力びん中で、容器を穏やかに加熱することによって、Ｎ−ドデシル−アクリルアミド１（１６．４ｇ，６８．８ミリモル）をアルゴン下で融解させ、これに、３ｍＬのホウ酸水溶液を加えた。この融解物に、Ｂｏｃ保護エチレンジアミン４２（５ｇ，３１．２ミリモル）を加え、混合物を９０℃にて一晩加熱した。反応混合物を、溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（９０：５：５）を用いるＴＬＣによって分析した。ＴＬＣは、出発アクリルアミド１のほとんど完全な消費を示した。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、溶液を固体炭酸水素ナトリウムと共に攪拌し、有機相を濾過し、ロータリーエバポレータ中で濃縮した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（４８：１：１から８：１：１）を用いるカラムクロマトグラフィ（シリカゲル）によって、この粗製生成物を精製した。この反応における主な生成物は二重付加生成物４３である。少量の１−付加物も観察された。
【０４７４】
工程２：化合物４４の調製：化合物４３（２．００ｇ，３．１３ミリモル）をジオキサン（５０ｍＬ）中に取り、それに、ＨＣｌ（２０ｍＬ，ジオキサン中の４Ｍ溶液）を加え、一晩攪拌する。溶媒を除去して、化合物４４を得る。
【０４７５】
工程３：３４及び４４からの単一異性体４の調製：化合物３４（２．００ｇ，２．４３ミリモル）及び４４（１．３１ｇ，２．４３ミリモル）をＤＣＭ中に取り、それに、活性化された分子篩を加え、３時間攪拌する。反応をＴＬＣによってモニターする。反応終了後、溶媒を除去する。残渣をＴＨＦに溶解させ、トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（５当量）及び酢酸を加え、一晩攪拌する。溶媒を除去し、ＤＣＭで抽出し、残渣のクロマトグラフィ分離により純粋な異性体４が得られる。
【０４７６】
【化１４０】
0005933163.tif 000143
【実施例１８】
【０４７７】
Ｎ−ドデシルアクリルアミドの１，３−ジアミノプロパンへの付加、及びアミドのアミンへの引き続いての還元
カチオン性液体中の電荷の数の効果を調べるために、アクリルアミド１の１，３−ジアミノプロパン４５でのミカエル付加物を調べた。
【０４７８】
【化１４１】
0005933163.tif 000144
工程１：４６、４７及び４８の合成：１５０ｍＬ圧力びん中で容器を穏やかに加熱することによって、Ｎ−ドデシル−アクリルアミド１（１５．４  ｇ，６４ミリモル）をアルゴン下で融解させ、これに、３ｍＬのホウ酸水溶液を加えた。この融解物に、１，３−ジアミノプロパン４４（１．５８ｇ，２１ミリモル）を加え、混合物を９０℃にて一晩加熱した。溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（９０：５：５）を用いるＴＬＣによって、反応混合物を分析した。ＴＬＣは、出発アクリルアミド１のほとんど完全な消費を示した。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、溶液を固体炭酸水素ナトリウムと共に攪拌し、有機層を濾過し、ロータリーエバポレータで濃縮した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＥｔ３（４８：１：１〜８：１：１）を用いるカラムクロマトグラフィ（シリカゲル）によって、この粗製生成物を精製した。この反応における主な生成物は三重付加生成物４６である。少量の４−付加物４７及び２−付加物４８も単離された。
【０４７９】
Ｎ−ドデシル−３−｛（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−［３−（２−ドデシルカルバモイル−メチルアミノ）―プロピル］―アミノ｝−プロピオンアミド４６。３付加生成物４６が白色固体（５．７ｇ，３５％）として単離された。ＭＳ  ｍ／ｚ  ７９３（ＭＨ＋）１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ０．８７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，９Ｈ），１．２０〜１．３０（ｍ，６０Ｈ），１．４２〜１．６６（ｍ，６Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ），２．３８〜２．４６（ｍ，４Ｈ），２．６０〜２．７０（ｍ，４Ｈ），２．８４（ｔ，２Ｈ），３．１５〜３．２８（ｍ，６Ｈ），６．６５（ｂｓ，１Ｈ），６．９９（ｂｓ，３Ｈ）。
【０４８０】
４−［｛３−［ビス−（２−ドデシルカルバモイル−エチル）−アミノ］−プロピル｝−（２−デデシルカルバモイル−エチル）アミノ］−Ｎ−ドデシル−ブチルアミド４７。４付加生成物４７も少量単離された。
【０４８１】
Ｎ−ドデシル−３−［−（２−ドデシルカルバモイル−エチルアミノ）−プロピルアミノ］−プロピオンアミド４８。ジアダクト４８はクリーム色粉末（１．６ｇ，１０％）として単離された。ＭＳ  ｍ／ｚ  ５５３（ＭＨ＋）１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ０．８９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ），１．１０〜１．２０（ｍ，４０Ｈ），１．４２〜１．６６（ｍ，６Ｈ），２．２０（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ），２．５５（ｔ，４Ｈ），２．６０（ｔ，４Ｈ），３．００（ｍ，４Ｈ），８．００（ｂｓ，２Ｈ）。
【０４８２】
工程２：アミン４，３５及び３６のそれらの対応する塩酸塩４９、５０及び５１への変換
実施例８に記載されたのと同様な手法を用い、アミン４６（５．５ｇ）を対応するＨＣｌ  ４９に変換し、二塩酸塩４９が白色粉末（５．７３ｇ，９２％）として単離された。１Ｈ  ＮＭＲ  ＤＭＳＯ−ｄ６  d  ０．８８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，９Ｈ），１．１７〜１．３０（ｍ，６６Ｈ），１．３５〜１．４５（ｍ，６Ｈ），２．１０〜２．２５（ｍ，２Ｈ），２．５５〜２．７０（ｍ，６Ｈ），２．９５〜３．１５（ｍ，１０Ｈ），３．２０〜３．３５（ｍ，６Ｈ），８．１６（ｔ，１Ｈ），８．２４（ｔ，１Ｈ），９．１５（ｂｓ，１Ｈ），１０．６５（ｂｓ，１Ｈ）。
【０４８３】
実施例８に記載されたのと同様な手順において、アミン４７を４Ｍ  ＨＣｌで処理して、二塩酸塩５０を得る。
実施例８に記載されたのと同様な手順において、アミン４８を４Ｍ  ＨＣｌで処理して、二塩酸塩５１を得る。
【０４８４】
工程３：アミド４６、４７及び４８のアミン５２、５３及び５４への還元：アミン４６を過剰のジボランと共にＴＨＦ中で一晩還流し、４Ｍ  ＨＣｌでの引き続いての処理により、ポリアミン５２の塩酸塩を得る。
【０４８５】
アミン４７及び４８の同様な処理により、それらの各塩酸塩としての対応する還元された生成物５３及び５４を得る。
【実施例１９】
【０４８６】
ポリアミド３、４及び５の対応するポリアミンデンドリマーへの還元
化合物３を大過剰のＴＨＦ中のジボランと共に還流して、対応する還元された生成物５５を得る。反応の完了後、反応混合物を仕上げ処理に先立って４Ｍ  ＨＣｌで処理し、生成物をその塩酸塩として単離する。５６及び５７の塩酸塩もまた、各々、対応する手順４及び５から得られる。
【０４８７】
【化１４２】
0005933163.tif 000145
【実施例２０】
【０４８８】
ポリアミノアルキル脂質−アミドのアミンへの還元
３２からのポリアミン６０の調製：化合物３２（１．０２ｇ，１ミリモル）をＴＨＦ（２０  ｍｌ）中に取り、それに、ＢＨ３．ＴＨＦ（６０ｍｌ，ＴＭＦ中１Ｍ）を加え、２日間還流する。反応をＴＬＣによってモニターする。ＴＨＦの除去により、白色残渣が得られ、これを１Ｍ  ＨＣｌで処理し、ＤＣＭに抽出する。粗製生成物クロマトグラフィ分離により、純粋な化合物６０が得られる。
【０４８９】
３０及び３１からのポリアミン５８及び５９の調製：調製６０について記載されたのと同様な条件下でのアミド３０及び３１の還元により、それぞれ５８及び５９が得られる。
【０４９０】
【化１４３】
0005933163.tif 000146
【実施例２１】
【０４９１】
ポリアミド−ポリアミノアルキルの合成−アルキルハライドを用いるアミンのアルキル化
工程１：化合物６２の調製：ＤＣＭ（２００ｍＬ）中の塩化クロロアセチル（１０．３１ｍＬ，１２９．３７ミリモル）の溶液を氷浴で冷却し、これに、ＴＥＡ（３６．７０ｍｌ，２６９．５ミリモル）を含有するジクロロメタン中のドデシルアミン（６１，２０．００ｇ，１０７．８１ミリモル）の溶液を１時間にわたって滴下した。反応混合物はこの時点までに茶色がかった黒色に変色し、０℃にてさらに１時間攪拌を継続した。反応混合物を焼結漏斗を通して濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、クロロホルムで希釈し、順次、水、炭酸水素ナトリウム溶液、１Ｍ  ＨＣｌ及び食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（５〜５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって残渣を精製して、化合物６２（２６．００ｇ，９２％）を茶色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝６．５９（ｂｓ，１Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），３．２５（ｑ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，２Ｈ），１．５４〜１．４９（ｍ，２Ｈ），１．４５〜１．１５（ｍ，１８Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１４Ｈ２８ＣｌＮＯとして、計算値：２６１．１９，実測値：２６２．２０（Ｍ＋）。
【０４９２】
工程２：６３、６４及び６５の調製：トリエチレンテトラミン２（１．００ｇ，６．８３ミリモル）及びクロロアセトアミド６２（１０．００ｇ，５．５当量）を共にＣＨ３ＣＮ／ＤＭＦ（１：３）の混合物中に取り、そこにＫ２ＣＯ３（９．４３ｇ，１０等量）及びＫＩ（５０ｍｇ）を加え、８５℃で３日間加熱する。反応混合物を濾過して固体を除去し、ＤＣＭで洗浄し、溶媒を真空中で除去し、粗製残渣のクロマトグラフィ分離により純粋な化合物６３、６４及び６５を得る。
【０４９３】
【化１４４】
0005933163.tif 000147
【実施例２２】
【０４９４】
ポリアミド−ポリアミノアルキルの合成−分岐アミノアルキルと共にアルキルハライドを用いるアミンのアルキル化
工程１：６７の調製：塩化クロロアセチル（４．０５ｍＬ，５１ミリモル）をＤＣＭ（１００ｍＬ）中に取り、０℃まで冷却した。これに、Ｎ，Ｎ−ジドデシルアミン（６６，１５．００ｇ，４２．４１ミリモル）及びＴＥＡ（１４．４３ｍｌ，２．５当量）のジクロロメタン溶液を１時間にわたって滴下した。反応混合物はこの時点までに茶色がかった黒色に変色し、滴下の後に、反応混合物を室温室温にて２４時間攪拌した。反応混合物を焼結漏斗を通して濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、クロロホルムで希釈し、順次、水、炭酸水素ナトリウム溶液、１Ｍ  ＨＣｌ及び食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、カラムクロマトグラフィ（５〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって残渣を精製して、必要な生成物６７（１２．５ｇ，６９％）を茶色がかった液体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝４．０４（ｓ，２Ｈ），３．３０（ｍ，４Ｈ），１．５０〜１．４５（ｍ，２Ｈ），１．４０〜１．２０（ｍ，１８Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，３Ｈ）．ＭＳ：Ｃ２６Ｈ５２ＣｌＮＯとして、計算値：４３０．１５，実測値：４３１．２（Ｍ＋）。
【０４９５】
工程２：６８、６９及び７０の調製：トリエチレンテトラミン２（０．５００ｇ，６．８３ミリモル）及びクロロアセトアミド６７（８．１０ｇ，５．５当量）を共にＣＨ３ＣＮ／ＤＭＦ（１：３）の混合物中に取り、そこにＫ２ＣＯ３（４．７２ｇ，１０当量）及びＫＩ（３０ｍｇ）を加え、８５℃で３日間加熱した。反応混合物を濾過して、不溶性固体を除去し、ＤＣＭで洗浄し、溶媒を除去し、残渣のクロマトグラフィ分離により、６８、６９及び７０を得た。
【０４９６】
【化１４５】
0005933163.tif 000148
【実施例２３】
【０４９７】
Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドのポリアミンへの付加
疎水性の鎖をカチオン性脂質により多く付加する効果を検討するために、ジドデシルアミンをアクリルアミドに対する前駆体として用いた。
【０４９８】
【化１４６】
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工程１：Ｎ，Ｎ−ジドデシルアクリルアミド７１の合成
−１０℃の無水ＣＨ２Ｃｌ２（７００ｍＬ）中のジドデシルアミン６６（２５ｇ，７０．７ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（１８ｇ，１４１ミリモル）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の塩化アクリロイル（７．６８ｇ，８５ミリモル）の溶液を２０分間にわたって滴下した。滴下完了後、反応混合物を０℃にて４時間攪拌し、その後、反応混合物のＴＬＣは反応の完了を示した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２００ｍＬ）、水（２００ｍＬ）、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥させた。有機層の濃縮により生成物７１（２８．４ｇ，１００％）が得られ、これを次の工程で用いた。１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ０．９４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ），１．０５〜１．６９（ｍ，４０Ｈ），３．１５〜３．６０（ｄｔ，４Ｈ），５．６４（ｄ，１Ｈ），６．３６（ｄ，１Ｈ），６．６３（ｍ，１Ｈ）。
【０４９９】
工程２：トリエチレンテトラミン２及び７１の反応
アクリルアミド７１をアミン２で処理し、通常の仕上げ処理及びカラム精製の後、ミカエル付加生成物７２、７３及び７４を単離する。
【０５００】
工程３：塩酸塩７５、７６及び７７の合成：得られた各単一化合物をジオキサン中に取り、ジオキサン中の４Ｍ  ＨＣｌを溶液に加え、実施例８に記載されたように攪拌して、対応する塩酸塩を得る。
【実施例２４】
【０５０１】
ミカエル付加条件下でのモノ不飽和Ｎ−アルキルアクリルアミドを用いるポリアミンのアルキル化
アルキル鎖中の二重結合の効果を検討するために、オレイルアミンをアクリルアミド７９に対する前駆体として用いた。
【０５０２】
【化１４７】
0005933163.tif 000150
工程１：化合物７９の合成：−１０℃の無水ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中のオレイルアミン７８（２６．７５ｇ，１００ミリモル）及びトリエチルアミン（２０ｇ，２００ミリモル）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の塩化アクリロイル（９．９ｇ，１１０ミリモル）の溶液を２０分間にわたって滴下した。滴下の完了後、反応混合物を０℃で４時間攪拌し、その後、反応混合物のＴＬＣは反応の完了を示した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２００ｍＬ）、水（２００ｍＬ）、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥させた。有機層の濃縮により生成物７９（３２ｇ，１００％）が得られ、これを次の工程で用いた。１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ０．９１（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），１．０５〜１．３５（ｍ，２４Ｈ），１．４２（ｔ，２Ｈ），１．９６（ｍ，４Ｈ），５．３１（ｔ，１Ｈ），５．３３〜５．３６（ｍ，１Ｈ），５．５４（ｄｄ，１Ｈ），６．０２（（ｄｄ，１Ｈ），６．１８（ｄｄ，１Ｈ），８．０３（ｂｓ，１Ｈ）。
【０５０３】
工程２：化合物７９とトリエチレンテトラミンとの反応
アクリルアミド７９をトリエチレンテトラミン２で処理し、通常の仕上げ処理及びカラム精製の後、ミカエル付加生成物は純粋な化合物８０、８１及び８２を与える。
【０５０４】
工程３：塩酸塩８３、８４及び８５の合成：得られた各単一化合物（８０，８１及び８２）をジオキサン中に取り、ジオキサン中の４Ｍ  ＨＣｌを溶液に加え、実施例８に記載したように攪拌して、対応する塩酸塩を得る。
【実施例２５】
【０５０５】
ミカエル付加条件下でのモノ不飽和Ｎ−アルキルアクリルアミドを用いるジアミンのアルケニル化
【０５０６】
【化１４８】
0005933163.tif 000151
実施例２４と同様な手順において、アクリルアミド７９をジアミン４５で処理し、通常の仕上げ処理及びカラム精製の後、ミカエル付加生成物８６、８７及び８８が単離される。そのようにして得られた遊離アミンのジオキサン中のＨＣｌでの処理により、各々、対応する塩酸塩８９、９０及び９１が得られる。
【実施例２６】
【０５０７】
ミカエル付加条件下でのポリ不飽和Ｎ−アルキルアクリルアミドを用いるポリアミンのアルケニル化
アルキル鎖におけるポリ不飽和の効果を検討するために、リノレイルアミン９２をアクリルアミド９３に対する前駆体として用いた。
【０５０８】
【化１４９】
0005933163.tif 000152
工程１：化合物９３：リノリルアミン９２を、実施例２４、工程１のそれと同様な手順により塩化アクリロイルで処理し、対応するアクリルアミド９３が単離される。
【０５０９】
工程２：化合物９３とトリエチレンテトラミンとの反応
実施例３に記載されたように、アクリルアミド９３をホウ酸の存在下でトリエチレンテトラミン２によって処理し、通常の仕上げ処理及びカラム精製の後に、ミカエル付加生成物が純粋な化合物９４、９５及び９６を得る。
【０５１０】
工程３：塩酸塩９７，９８及び９９の合成：得られた各単一化合物（９４、９５又は９６）をジオキサン中に取り、ジオキサン中の４Ｍ  ＨＣｌを溶液に加え、実施例８に記載されたように攪拌して、対応する塩酸塩を得る。
【実施例２７】
【０５１１】
ミカエル付加条件下でのポリ不飽和Ｎ−アルキルアクリルアミドを用いるジアミンのアルケニル化
【０５１２】
【化１５０】
0005933163.tif 000153
実施例３と同様な手順において、ホウ酸の存在下でアクリルアミド９３をジアミン４５で処理し、通常の仕上げ処理及びカラム精製の後、ミカエル付加生成物１００、１０１及び１０２を単離する。そのようにして得られた遊離アミンのジオキサン中のＨＣｌの処理により、各々、対応する塩酸塩１０３、１０４及び１０５を得る。
【実施例２８】
【０５１３】
ミカエル付加条件下でのアルキルアクリレートを用いるポリアミンのアルケニル化
【０５１４】
【化１５１】
0005933163.tif 000154
メタノール１：ｎ−ドデシルアクリレート（１０６）を４０℃のメタノール−水中のトリエチレンテトラミン２と共に攪拌して、化合物１０７、１０８及び１０９を得る。生成物をクロマトグラフィ反応によって単離する。
【０５１５】
方法２：４０℃のメタノール−水中のホウ酸の存在下で、ｎ−ドデシルアクリレート（１０６）をトリエチレンテトラミン２と共に攪拌して、化合物１０７、１０８及び１０９を得る。生成物をクロマトグラフィ分離によって単離する。
【実施例２９】
【０５１６】
ミカエル付加条件下におけるアルキルアクリレートを用いるジアミンのアルケニル化
【０５１７】
【化１５２】
0005933163.tif 000155
方法１：４０℃におけるメタノール−水中のトリエチレンテトラミン２と共にｎ−ドデシルアクリレート（１０６）を攪拌して、化合物１１０、１１１及び１１２を得る。生成物はクロマトグラフィ分離によって単離される。
【０５１８】
方法２：４０℃におけるメタノール−水中のホウ酸の存在下でトリエチレンテトラミン２と共にｎ−ドデシルアクリレート（１０６）を攪拌して、化合物１１０、１１１及び１１２を得る。生成物はクロマトグラフィ分離によって単離される。
【実施例３０】
【０５１９】
オクタデカ−９，１２−ジエン酸３−ジメチルアミノ−２−オクタデカ−９，１２−ジエノイルオキシ−プロピルエステル３の合成
【０５２０】
【化１５３】
0005933163.tif 000156
無水ＤＭＦ（６０ｍＬ）中のリノール酸（２５ｇ，８９．１ミリモル）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１７ｍＬ，１００ミリモル）を攪拌しつつ室温で加え、続いて、３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（４．８ｇ，４０．５ミリモル）及びＥＤＣＩ（１７．２５ｇ，８９．９ミリモル）を加え、混合物を室温にて一晩攪拌した。反応混合物のＴＬＣ（溶離剤としてのヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）は反応の完了を示した。反応混合物を氷水に注ぎ、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。有機層の濃縮により粗製生成物が得られ、これをカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、溶離剤：ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）によって精製した。純粋な生成物を含有する画分をプールし、濃縮した。純粋なエステルが透明な液体（５．７ｇ，２２％）として単離された。ＭＳ  ｍ／ｚ  ６４５（Ｍ＋Ｈ）１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  ０．８８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ），１．２０〜１．３９（ｍ，２８Ｈ），１．６１（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１２Ｈ），２．０３〜２．０８（ｍ，８Ｈ），２．２６〜２．３８（ｍ，１０Ｈ），２．４４〜２．５６（ｍ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，４Ｈ），４．０９（ｄｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ＆１１．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３６（ｄｄ，Ｊ＝３．３＆１１．９Ｈｚ，１Ｈ），５．２９〜５．３４（ｍ，１Ｈ），５．３４〜５．４１（ｍ，８Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３  d  １４．３０，２２．７９，２５．０８，２５．１０，２５．８３，２７．４０，２９．２６，２９．３０，２９．３４，２９．４２，２９．５５，２９．８３，３１．７３，３４．３２，３４．５８，４６．０１，５９．３７，６４．０２，１２８．０８，１２８．２４，１３０．２１，１３０．４２，１７３．３９，１７３．６５。
【実施例３１】
【０５２１】
押出しを用いるリポソームを製造するための例示的な手順
１００％エタノール中のＮＤ９８（１２０ｍｇ／ｍｌ）、コレステロール（２５ｍｇ／ｍｌ）、及びＣ１６−ＰＥＧ−Ｃｅｒ−２０００（１００ｍｇ／ｍｌ）のストック溶液を調製する。−２０℃で貯蔵する。製剤を調製するに先立って３７℃の水浴中で温める（３０分までが有用である。コレステロールが完全に溶解するにはもうしばらく時間がかかる）。
【０５２２】
２×２ｍｌ調製
１５ｍｌのファルコンチューブに以下のものを加える：
１）１２５μｌの脂質
２）２００μｌのコレステロール
３）７０μｌのＰＥＧ
４）５μｌの１００％エタノール
５）６００μｌの２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５
６）ボルテックス上で穏やかに混合する（設定５）
７）２０ｍｇのスクロースを加える。
【０５２３】
８）スクロースが溶解するまで再度ボルテックスする。
９）１ｍｌの新たに調製された（新しいファルコンチューブ中）、２５ｍＭ酢酸ナトリウム中のｓｉＲＮＡの１ｍｇ／ｍｌ溶液を加える（＝１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ｓｉＲＮＡ＋９００μｌの２５ｍＭ  酢酸ナトリウム）
１０）２０分間軽くボルテックスする（設定１、ファルコンチューブホールダアダプタを使用）
１１）１５分後（５分残り）、押出器を洗浄する。
【０５２４】
１２）４０℃にて２つの２００ｎｍのフィルタを通して１１回押し出す。
１３）３，５００  ＭＷＣＯ  Ｐｉｅｒｃｅカセットにおいて、室温にて９０分間、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して透析する。
【実施例３２】
【０５２５】
押出しを用いることなくリポソームを製造するための例示的な手順
１００％エタノール中のＮＤ９８（１２０ｍｇ／ｍｌ）、コレステロール（２５ｍｇ／ｍｌ）、及びＣ１６−ＰＥＧ−Ｃｅｒ−２０００（１００ｍｇ／ｍｌ）のストック溶液を調製する。−２０℃で貯蔵する。製剤を調製するに先立って３７℃の水浴中で温める（３０分までが有用である。コレステロールが完全に溶解するにはもうしばらく時間がかかる）。
【０５２６】
１５ｍｌのファルコンチューブに以下のものを加える：
１）１２５μｌの脂質
２）２００μｌのコレステロール
３）７０μｌのＰＥＧ
４）４９５μｌの１００％エタノール
５）１００μｌの水
６）１００〜３００ｍＭ酢酸ナトリウム、〜ｐＨ５中の１ｍＭの１ｍｇ／ｍｌ  ｓｉＲＮＡを調製する。
【０５２７】
７）脂質を酢酸緩衝液中のｓｉＲＮＡと共に９０％エタノール中で迅速に混合する。
８）１００〜３００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ〜５に対して透析して（又は限外濾過を用いて）エタノールを除去する。
【０５２８】
９）ＰＢＳに対して透析して（又は限外濾過を用いて）、緩衝液条件を変更する。
【実施例３３】
【０５２９】
リポソーム試料中のＲＮＡの定量のための例示的なプロトコル
以下の手順を用いて、（１）捕捉されたｓｉＲＮＡの割合及び（２）リポソーム中のｓｉＲＮＡの総量を定量することができる。
【０５３０】
材料：
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（モレキュラープローブズ社）
２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
ＴＥ緩衝液
プロトコル（９６−ウェルプレート様式）：
１．ｓｉＲＮＡ濃度が〜２μｇ／ｍＬ（０．４〜４μｇ／ｍＬ）となるようにＴＥ緩衝液中にテストすべき試料を希釈する。試料の希釈を記録する。
２．５０μＬの各試料を２ウェルにアレイする（例えば、試料はマイクロプレートの二列にアレイされる）。
３．５０μＬのＴＥ緩衝液を２つの試料（例えば、最上列試料）の各々の１つに加える。この試料を用いて「遊離」ｓｉＲＮＡを決定する。
４．５０μＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を２つの試料（例えば、最下列試料）残りに加える。この試料を用いて、「総」ｓｉＲＮＡを決定する。
５．定量すべきｓｉＲＮＡの既知量を用いることによって、標準ｓｉＲＮＡ希釈物を調製する。４μｇ／ｍＬの５０μＬから出発し、２倍ずつ希釈を行う。５０μｌの２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を希釈の標準試料の各々に加える。
６．室温にて１５分間インキュベートする。
７．１００μＬの希釈されたＲｉｂｏＧｒｅｅｎを試料の全てに加える。希釈されたＲｉｂｏＧｒｅｅｎは、１：１００希釈で用いる。
８．ＦＩＴＣ設定を用いて蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ２）にてプレートリードを行う。
計算：
ウェル中の最終容量は２００μＬである。
【０５３１】
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎの最終希釈は１：２００である。
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は０．５％である。
標準の希釈は１μｇ／ｍＬから出発する。
【０５３２】
標準曲線をプロットし、直線フィットを行う。
捕捉％＝１００×（１−「遊離」シグナル／「合計」シグナル）を測定する。
「ｓｉＲＮＡ」を測定する：まず、標準曲線を用いて「合計」シグナルを濃度に変換し、次いで、希釈倍数を掛ける。
【実施例３４】
【０５３３】
リポソームに調製された脂質部位の比較
脂質組成物の有効性は、ｓｉＲＮＡ部位を標的に送達する脂質の相対的能力を決定することによってテストすることができる。例えば、標的のサイレンシングは、ｓｉＲＮＡが細胞に送達されることを示す。出願人らは、以下の脂質部位の各々を含むリポソーム複合体を、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）をサイレンスするのに用いられるｓｉＲＮＡと比較した。
【０５３４】
最初に、精製されていない反応混合物を用いた。異なるＮＤ：９８モノマー比率：ＮＤ：９８＝１：１，２：１，３：１，４：１，５：１，及び６：１にて生成物を合成することによって、異なるＮＤ９８反応混合物を作成した。ＮＤ９８は、以下に示される構造のＮＤ：
【０５３５】
【化１５４】
0005933163.tif 000157
を、以下に示される構造のアミン９８：
【０５３６】
【化１５５】
0005933163.tif 000158
と、前記に示される比率（すなわち、ＮＤ：９８＝１：１，２：１，３：１，４：１，５：１，及び６：１）で反応させることによって生成される。
【０５３７】
リポソームはＮＤ９８：コレステロール：ＦＥＤ２０００−ＣｅｒＣ１６：ｓｉＲＮＡ＝１５：０．８：７：１（重量比率）で調製された。ＮＤ：９８＝１：１及び２：１で調製されたリポソームは、調製中に沈澱し、それ以上の評価は行われなかった。
【０５３８】
以下の表は、種々のモノマー比率（すなわち、数字は９８に対するＮＤの比率を示す）を用い、リポソームの平均粒子サイズ及びパーセント捕捉を提供する。
【０５３９】
【表２】
0005933163.tif 000159
図１は、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡの実験的投与を用いる種々のモノマー比率についてのＦＶＩＩサイレンシングアッセイの結果を提供する。結果は、ＮＤ９８  ５テイル部位及び／又はＮＤ  ９８  ６テイル部位が活性な種であることを示唆する。というのは、これらはＮＤ９８  ６：１調製で最も豊富な種類だからである。説明されたように、５テイル部位は、出発アミン９８上の水素の５つが出発アクリルアミド部位ＮＤと反応している化合物を示す。６テイル部位は、出発アミン９８上の水素の６つがアクリルアミド部位ＮＤと反応している化合物を示す。従って、「テイル」の数は、出発アミン上の反応した水素の数を示す。
【実施例３５】
【０５４０】
好ましい脂質異性体の決定
出願人らは、ＮＤ９８脂質生成物を精製した。ＮＤ９８脂質部位は、以下に示される構造のＮＤ：
【０５４１】
【化１５６】
0005933163.tif 000160
と、以下に示される構造のアミン９８：
【０５４２】
【化１５７】
0005933163.tif 000161
との反応によってもたらされる脂質部位である。
【０５４３】
出願人らは、ＮＤ９８の４−テイル混合異性体（すなわち、アミン水素の４つは前記ＮＤアクリルアミドと反応している）、５−テイルＮＤ９８の単一の構造異性体（すなわち、アミン水素の４つは前記ＮＤアクリルアミドと反応している）をテストした。２つの５テイル異性体の例を以下に示す。
【０５４４】
【化１５８】
0005933163.tif 000162
生成されたＮＤ９８生成物のリポソームを、以下の比率：ＮＤ９８：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＣｅｒＣ１６：ｓｉＲＮＡ＝１５：５：７：１（重量比率）にて以下の成分で調製した。
【０５４５】
以下の表３は、種々のモノマー比率（すなわち、数字は９８に対するＮＤの比率を示す）を用いるリポソームの平均粒子サイズ及びパーセント捕捉を提供する。
【０５４６】
【表３】
0005933163.tif 000163
表３及び図２について、ＮＤ９８  １＝５−テイルド（異性体Ｉ）、ＮＤ９８  ２＝５−テイルド（異性体Ｉ＋ＩＩ）；ＮＤ９８  ３＝５−テイルド（異性体ＩＩＩ）及びＮＤ）８４＝５−テイルド。
【０５４７】
リポソームは２．５ｍｇ／ｋｇの用量にてｓｉＲＮＡと共に投与し、ＦＶＩＩのサイレンシングについて評価した。図２は４テイルド異性体混合物、単一の５テイルド異性体（すなわち、異性体Ｉ及びＩＩ）及び５テイルド異性体の混合物（すなわち、異性体Ｉ及びＩＩの結果）を提供する。
【実施例３６】
【０５４８】
好ましいＮＤ９８異性体の決定
６テイルド９８の生成された異性体を調製し、精製した。ＮＤ９８構造は、前記実施例３４及び３５で記載されたものに対応する。６テイルは、アミン９８の水素の全てがＮＤ出発物質と反応していることを示す。この脂質出発物質に関しては、リポソームは以下の比率：ＮＤ９８：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＣｅｒＣ１６：ｓｉＲＮＡ＝１５：５：７：１（重量比率）で調製した。図３は、ＦＶＩＩを効果的にサイレントした、ｓｉＲＮＡの送達におけるＮＤ９８  ６テイル異性体の有効性を示している。
【実施例３７】
【０５４９】
種々のＮＤ９８脂質出発物質を用いるリポソーム粒子サイズ
（前記実施例３４及び３５に示された）ＮＤ９８構造を有する複数の脂質出発物質をリポソームに調製した。リポソームの粒子サイズを評価し、その結果を以下の表４に示す。
【０５５０】
【表４】
0005933163.tif 000164
【実施例３８】
【０５５１】
遊離リポソーム製剤の押出し
ＮＤ９８脂質を用い、リポソーム複合体を調製した。製剤は以下の比率：ＮＤ９８：コレステロール：ＰＥＧ２０００−ＣｅｒＣ１６：ｓｉＲＮＡ＝１５：５：７：１（重量比率）を含む。リポソームは、一般には、前記実施例３２に記載されたように、押出しすることなく調製した。２つの試料、すなわち、１００ｍＭ酢酸中での最初の透析工程において、１００ｍＭ酢酸ナトリウム中に調製された１００ｍＭｓｉＲＮＡを有する第１の試料、及び、３００ｍＭ酢酸中での最初の透析工程において、３００ｍＭ酢酸ナトリウム中に調製された３００ｍＭｓｉＲＮＡを有する第２の試料を調製した。
【０５５２】
図４は、ＦＶＩＩサイレンシングアッセイの結果を示し、これは、種々のプロセスを用いて作製された製剤の比較活性を示している。
【実施例３９】
【０５５３】
カチオン性脂質７の位置選択的合成−方策１
【０５５４】
【化１５９】
0005933163.tif 000165
工程１：化合物９の調製：無水アセトニトリル（５００ｍＬ）中のトリエチレンテトラミン１（４８．８３ｇ，０．３３４ｍｏｌ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）を一定攪拌下で氷浴冷却した。トリ酢酸エチル（７９．６ｍＬ，０．６６８ｍｏｌ）を溶液に加え、添加の後に、反応混合物を室温まで温め、２０時間攪拌した。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、残渣を最小量の温かいジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、それに、冷たいヘキサンを攪拌しつつ加えた。沈殿した生成物を氷中で冷却し、濾過して、白色固体（１１２．２ｇ，９９％）を得た。
【０５５５】
工程２：（２−｛ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−［２−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）エチル］−アミノ｝−２−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル１１３の合成
トリフルオロアセトアミド９（１１２．２ｇ，０．３３２ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＨＦ（６００ｍＬ／１００ｍＬ）に溶解させ、それに、ジイソプロピルエチルアミン（１２９．２５ｇ，１ｍｏｌ）を加え、氷浴で攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１４５ｇ，０．６６４ｍｏｌ，シグマアルドリッチ社から購入）を反応混合物に滴下し、一晩攪拌した。溶媒を除去し、残渣をＮａＨＣＯ３の飽和溶液（４００ｍＬ）と共に攪拌し、濾過し、ヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、４５℃にて真空中で一晩乾燥させて、純粋なジｂｏｃ化合物を白色固体（１６７ｇ，９４％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  ｆｏｒ  １１３（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝９．６０〜９．４０（ｍ，２Ｈ），３．３５〜３．１５（ｍ，１２Ｈ），１．３６（ｓ，１８Ｈ）ＭＳ：Ｃ１５Ｈ２４Ｆ６Ｎ４Ｏ４として、計算値：４３８．１７，実測値：４３９．２０（Ｍ＋）ＭＳ：Ｃ２０Ｈ３２Ｆ６Ｎ４Ｏ６として、計算値：５３８．２２，実測値：５３９．２０（Ｍ＋）。
【０５５６】
工程３：（２−アミノ−エチル）−｛２−［（２−アミノ−エチル）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アミノ］−エチル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
アセトアミド１１３（１６７ｇ，０．３１ｍｏｌ）をステンレス鋼圧力リアクタ中に取り、それに、エタノール（２００ｍｌ）中のメチルアミンの溶液（３３重量％）を加えた。混合物を９０℃まで温め、２４時間攪拌した。反応をマススペクトルによってモニターした。全ての溶媒を減圧下で除去し、残渣を８０℃の高真空に付して、生成物１１４（１０３ｇ，９６％）をガム状液体として得、この化合物はさらに精製することなく次の反応で用いることができた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝３．２０〜３．００（ｍ，４Ｈ），２．６２〜２．３８（ｍ，８Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ），ＭＳ：Ｃ１１Ｈ２６Ｎ４Ｏ２として、計算値：２４６．２１，実測値２４６．２０（Ｍ＋）。
【０５５７】
工程４：ミカエル付加生成物１１５の合成
ジアミン１１４（１０３ｇ，０．２９７ミリモル）、Ｎ−ドデシルアクリルアミド（３６５ｇ，１．４８７ｍｏｌ）、及び水（３０ｍＬ）中のホウ酸の飽和溶液を共に圧力リアクタ中に取り、９０℃にて４日間加熱した。反応をＴＬＣ及びマススペクトルによってモニターした。反応混合物をジクロロメタン（ＤＣＭ）に抽出し、順次、ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、そのようにして得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（グラジエント溶出−酢酸エチル）、次いで、３〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、１１５を淡黄色固体（２２８ｇ，５９％）として得た。ＭＳ：Ｃ７６Ｈ１５０Ｎ８Ｏ８として、計算値：１３０３．１６，実測値：１３０４．２０（Ｍ＋）。
【０５５８】
工程５：ジアミン１５６の調製
ジオキサン（５００ｍＬ）中の４Ｍ  ＨＣｌをメタノール（１００ｍＬ）中のｄｉｂｏｃ化合物１１５（２２８ｇ，０．１７５ｍｏｌ）の溶液に加え、混合物を室温で２日間攪拌した。残渣をマススペクトルによってモニターした。出発ｄｉｂｏｃ化合物の完全な消失後、沈殿した塩酸塩を濾過し、ＴＨＦ（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて、純粋な塩を白色粉末（１７８ｇ，９３％）として得た。前記塩を飽和ＮａＨＣＯ３（１Ｌ）で処理し、ジクロロメタン（３×６００ｍＬ）で抽出した。混和した有機抽出物を乾燥させ、濃縮して、白色固体（１６４ｇ，８５％）としてのテトラマーを単離した。ＭＳ：Ｃ６６Ｈ１３４Ｎ８Ｏ４として、計算値：１１０３．０５，実測値：１１０４．１０（Ｍ＋）。
【０５５９】
工程６：１１７の合成：化合物１１６（１６４ｇ，１４９ミリモル）、Ｎ−ドデシルアクリルアミド（３５．６ｇ，１４９ミリモル）及び水（３０ｍＬ）中のホウ酸の飽和溶液を共に圧力リアクタ中に取り、９０℃にて３日間加熱した。反応の進行は、ＴＬＣ及びマススペクトルによってモニターした。反応混合物をジクロロメタン（ＤＣＭ）に抽出し、順次、ＮａＨＣＯ３溶液及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、そのようにして得られた残渣をシリカゲル（２Ｋｇ）カラムクロマトグラフィ（グラジエント溶出−０：５：９５〜１０：１０：８０％  ＴＥＡ／ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、１１７を淡黄色固体（８３．８ｇ，４２％）として得た。ＭＳ：Ｃ７６Ｈ１５０Ｎ８Ｏ８として、計算値：１３０３．１６，実測値１３０４．２０（Ｍ＋）。物質を真正試料ＴＬＣ（定量的）、ＨＰＬＣ及びマススペクトルと比較した。ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１６３Ｎ９Ｏ５として、計算値：１３４２．２８，実測値：１３４３．３０（Ｍ＋）。
【０５６０】
工程７：塩酸塩７の合成
アミン１１７（５４ｇ，４０ミリモル）をエタノール（１００ｍＬ）に溶解させ、それに、エーテル中の２００ｍＬの２Ｍ  ＨＣｌを加え、混合物を室温で一晩攪拌した。窒素を反応混合物に通気し、排気口をドライライト（ｄｒｙｒｉｔｅ）に通し、ＫＯＨの１０％溶液まで通過させた。３０分後に、反応混合物を乾燥状態まで濃縮し、残渣を５００ｍＬの無水エタノールに再度溶解させ、混合物をロータリーエバポレータ中で濃縮した。このプロセスを再度反復し、そのようにして得られた残渣を４３℃の真空オーブン中で一晩乾燥させた。純粋な生成物をクリーム色粉末（５９．９ｇ，９９％）として単離した。
【実施例４０】
【０５６１】
カチオン性脂質７の位置選択的合成−方策２
方法１
【０５６２】
【化１６０】
0005933163.tif 000166
工程１：オーバーヘッドスターラを備えた４首５Ｌフラスコ中のアセトニトリル（２Ｌ）中のトリエチレンテトラミン１（２００ｇ，１．３７ｍｏｌ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入）を攪拌しながら氷浴で冷却した。トリフルオロ酢酸エチル（３８８．５ｇ，２．７４ｍｏｌ）を攪拌溶液に加え、２０時間攪拌した。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、残渣をＤＣＭ／ヘキサンの混合物と共に粉砕し、濾過して、１００ｇを白色固体（４２９ｇ，９３％）として得た。そのようにして得られた生成物はさらに精製することなく次の反応で用いることができた。ＭＳ：Ｃ１０Ｈ１６Ｆ６Ｎ４Ｏ２として、計算値：３３８．１２，実測値：３３９．０（Ｍ＋）。
【０５６３】
工程２：粗製化合物１０１（４２７ｇ，１．２６ｍｏｌ）を溶媒の混合物（３Ｌ，ＴＨＦ／ＤＣＭ（１：２））に溶解させ、氷−水浴で攪拌した。二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｏｃ）２Ｏ，２７０ｇ，１．２６モル，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入）及びＤＩＥＡ（５００ｍＬ，２．８６ｍｏｌ）を反応混合物に加え、一晩攪拌した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタン（ＤＣＭ，１０００ｍＬ）に抽出し、ＮａＨＣＯ３溶液（５００ｍＬ）、水（５００ｍＬ×２）及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、そのようにして得られた残渣をＤＣＭ／ヘキサン（２：１）と共に粉砕し、濾過した。溶媒を除去し、残渣を高真空下で乾燥させて、化合物１１２をガム状液体（５２３ｇ）として得た。
【０５６４】
化合物１０２の一部をシリカゲルクロマトグラフィ（グラジエント溶出、酢酸エチル、続いて３〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、化合物１０２をガム状液体（１０２．００ｇ）として得た。１０２についての１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝９．６０〜９．１０（ｍ，３Ｈ），３．３５〜３．２５（ｍ，４Ｈ），３．２５〜３．２０（２，２Ｈ），３．２０〜３．１０（ｍ，２Ｈ），２．６８〜２．５８（ｍ，４Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１５Ｈ２４Ｆ６Ｎ４Ｏ４として、計算値：４３８．１７，実測値：４３９．２０（Ｍ＋）。
【０５６５】
工程３：精製された化合物１０２（１０２．０ｇ，２３３．４０ミリモル）を圧力リアクタ中にて、室温室温でエタノール／メチルアミン（４００ｍｌ，ＥｔＯＨ中の３３重量％メチルアミン溶液）に溶解させた。混合物を９０℃まで温め、２日間攪拌した。反応をマススペクトルによってモニターした。減圧下で全ての溶媒を除去し、残渣を８０℃の高真空に付して生成物１０３（５８．００ｇ，９９％）をガム状液体として得、この化合物はさらに精製することなく次の反応で用いることができた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝３．２０〜３．００（ｍ，４Ｈ），２．６２〜２．３８（ｍ，８Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１１Ｈ２６Ｎ４Ｏ２として、計算値：２４６．２１，実測値：２４７．２０（Ｍ＋）。
【０５６６】
工程４：トリアミン１０３（５６．００ｇ，２２７．６４ミリモル）、Ｎ−ドデシルアクリルアミド（３２７．００ｇ，１３６５ミリモル）、及び水（５０ｍＬ）中のホウ酸の飽和溶液を共に圧力リアクタ中に取り、９０℃で６日間加熱した。反応をＴＬＣ及びマススペクトルによってモニターした。反応混合物をジクロロメタン（ＤＣＭ）に抽出し、順次、ＮａＨＣＯ３溶液（４００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、そのようにして得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（グラジエント溶出−酢酸エチル、次いで、３〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して１０４を淡黄色固体（１８６ｇ，５７％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝７．２０（ｂｓ，ｌＨ），７．０５（ｂｓ，１Ｈ），６．８５（ｂｓ，１Ｈ），６．７４（ｂｓ，１Ｈ），３．２５〜３．０３（ｍ，１２Ｈ），２．８０〜２．６０（ｍ，８Ｈ），２．５５〜２．２１（ｍ，１２Ｈ），１．５２〜１．４５（ｍ，１０Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．３４〜１．２０（ｍ，１００Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１５Ｈ）。ＭＳ：Ｃ８６Ｈ１７１Ｎ９Ｏ７として、計算値：１４４２．３３，実測値：１４４３．３０（Ｍ＋）。
【０５６７】
工程５：ジオキサン（４００ｍＬ）中の４Ｍ  ＨＣｌを、ジオキサン（３００ｍＬ）中の化合物１０５（１８４．００，１２７．２３ミリモル）の溶液に加えた。次いで、反応混合物を一晩攪拌した。反応をマススペクトルによってモニターした。窒素を溶液に通すことによって、過剰のＨＣｌを除去した。真空下で溶媒を除去し、残渣をエタノール（５００ｍＬ×３）で３回共蒸発させて、淡黄色ガム状固体７（１８６．００ｇ，９８％）を四塩酸塩として得た。該物質を真正試料のＴＬＣ（定量）、ＨＰＬＣ及びマススペクトルと比較した。ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１６３Ｎ９Ｏ５として、計算値：１３４２．２８，実測値：１３４３．３０（Ｍ＋）。
【０５６８】
方法２
化合物１０２を方法１：工程１及び２に記載したように調製した。メタノール１の工程２から得られた粗製生成物をさらに精製することなく次の反応を用いた。
【０５６９】
工程１：化合物１０２（１０３．４５ｇ，２３８．９０ミリモル，工程２，方法１からの粗製化合物）を、圧力リアクタ中で室温室温にてエタノール／メチルアミン（４００ｍＬ，ＥｔＯＨ中の３３  ｗｔ％メチルアミン溶液）に溶解させた。混合物を９０℃まで温め、２日間攪拌した。反応をマススペクトルによってモニターした。全ての溶媒を減圧下で除去し、残渣を水浴での８０℃の高真空に付して、生成物１０３（６３．５０ｇ）を淡黄色ガム状液体として得、この化合物は精製することなく次の反応で用いることができた。
【０５７０】
工程４：トリアミン１０３（６３．５０ｇ，２３８ミリモル）、Ｎ−ドデシルアクリルアミド（３２０．００ｇ，１３３８ミリモル）、及び水（５０ｍＬ）中のホウ酸の飽和溶液を共に圧力リアクタ中に取り、工程４、方法１に記載されたように９０℃で６日間加熱した。反応をＴＬＣ及びマススペクトルによってモニターした。反応混合物をジクロロメタン（ＤＣＭ）に抽出し、順次ＮａＨＣＯ３溶液（４００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、そのようにして得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（グラジエント溶出−酢酸エチル、次いで、３〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、１０４を淡黄色固体（６５．２ｇ，２０％）として得た。
【０５７１】
工程５：エーテル（８００ｍＬ）中の２Ｍ  ＨＣｌを化合物１０５（６５．００ｇ，４５ミリモル）に加えた。次いで、反応混合物を一晩攪拌した。反応をマススペクトルによってモニターした。窒素を溶液に通すことによって、過剰なＨＣｌを除去した。溶媒を真空下で除去し、残渣をエタノール（５００ｍＬ×３）で３回共蒸発させて、淡黄色ガム状固体７（６６ｇ，９８％）を四塩酸塩として得た。該物質を真正試料のＴＬＣ（定量）、ＨＰＬＣ及びマススペクトルと比較した。ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１６３Ｎ９Ｏ５として、計算値：１３４２．２８，実測値：１３４３．３０（Ｍ＋）。
【０５７２】
方法３
化合物１０２は方法１：工程１及び２に記載されたように調製した。方法１の工程２から得られた粗製生成物をさらに精製することなく次の反応で用いた。
【０５７３】
工程３：化合物１０２（１０５．２０ｇ，２４０ミリモル，方法Ｉからの粗製化合物）を、圧力リアクタ中で室温室温にてエタノール／メチルアミン（４００ｍｌ，ＥｔＯＨ中の３３重量％メチルアミン溶液）に溶解させた。混合物を９０℃まで温め、２日間攪拌した。反応をマススペクトルによってモニターした。全ての溶媒を減圧下で除去し、残渣を水浴上で８０℃の高真空に付して、生成物１０３（６４．７０ｇ）を淡黄色ガム状液体として得、この化合物はさらに精製することなく次の反応で用いることができた。
【０５７４】
工程４：トリアミン１０３（６４．７０ｇ，２４０ミリモル）、Ｎ−ドデシルアクリルアミド（３７０．００ｇ，１５６９ミリモル）、及び水（５０ｍＬ）中のホウ酸の飽和溶液を、共に圧力リアクタ中に取り、９０℃にて６日間加熱した。反応をＴＬＣ及びマススペクトルによってモニターした。反応混合物をジクロロメタン（ＤＣＭ）に抽出し、順次ＮａＨＣＯ３溶液（４００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去し、そのようにして得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（グラジエント溶出−酢酸エチル、次いで、３〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、１０４を淡黄色固体（１９２ｇ）として得た。
【０５７５】
工程５：所望の化合物７は実施例４０の工程５、方法１に記載されたように化合物１０４から塩酸塩として得られた。四塩酸塩としての化合物７：１９４ｇ（９８％）。該物質を真正な試料のＴＬＣ（定量）、ＨＰＬＣ及びマススペクトルと比較した。ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１６３Ｎ９Ｏ５として、計算値：１３４２．２８，実測値：１３４３．３０（Ｍ＋）。
【実施例４１】
【０５７６】
異なるＰＥＧ脂質部位を有する種々の会合複合体に調製されたｓｉＲＬＡの活性の比較
脂質組成物の有効性はｓｉＲＮＡ部位を標的に送達する脂質の相対的能力を決定することによってテストすることができる。例えば、標的のサイレンシングは、ｓｉＲＮＡが細胞に送達されることを示す。出願人は、図５に示された１３個の異なるＰＥＧ脂質部位の１つを含む会合複合体を、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）をサイレントとするのに用いられるｓｉＲＮＡと比較した。
【０５７７】
ＰＥＧ脂質１〜１３は以下の手順を用いて合成した。
【０５７８】
【化１６１】
0005933163.tif 000167
化合物５の調製：１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセリド１（３０ｇ，６１．８０ミリモル）及びＮ，Ｎ’−スクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ，２３．７６ｇ，１．５当量）をジクロロメタン（ＤＣＭ，５００ｍＬ）中に取り、氷水混合物上で攪拌した。トリエチルアミン（２５．３０ｍＬ，３当量）を攪拌溶液に加え、引き続いて反応混合物を室温室温で一晩攪拌した。反応の進行はＴＬＣによってモニターした。反応混合物をＤＣＭ（４００ｍＬ）で希釈し、有機層を水（２×５００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）で洗浄し、続いて、標準的な仕上げ処理を行った。得られた残渣を高真空下で室温にて一晩乾燥させた。乾燥させた後、そのようにして得られた粗製カルボネート３をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解させ、氷浴上で攪拌した。攪拌溶液に、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（４，１０３．００ｇ，４７．２０ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）及び無水ピリジン（８０ｍＬ，過剰）をアルゴン下で加えた。次いで、反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒及び揮発物を真空下で除去し、残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解させ、酢酸エチル中でパッキングされたシリカゲルのカラムに充填した。カラムをまず酢酸エチルで、引き続いて、ジクロロメタン中の５〜１０％メタノールのグラジエントで溶出させて、所望のＰＥＧ脂質５を白色固体（１０５．３０ｇ，８３％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．２０〜５．１２（ｍ，２Ｈ），４．１８〜４．０１（ｍ，１Ｈ），３．８０〜３．７０（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．２０（ｍ，−О―ＣＨ２−ＣＨ２−О，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．１０〜２．０１（ｍ，２Ｈ），１．７０〜１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５６〜１．４５（ｍ，４Ｈ），１．３１〜１．１５（ｍ，４８Ｈ），０．８４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２６６０〜２８３６。
【０５７９】
４ｂの調製：１，２−ジ−Ｏ―ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリド１ｂ（１．００ｇ，１．８４８ミリモル）及びＤＳＣ（０．７１０ｇ，１．５当量）を共にジクロロメタン（２０ｍＬ）中にに取り、氷水混合物中で０℃まで冷却した。トリエチルアミン（１．００ｍＬ，３当量）をそれに加え、一晩攪拌した。反応に続いてＴＬＣを行いＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下で溶媒を除去し、残渣２ｂを一晩高真空下に置いた。この化合物はさらに精製することなく、直接次の反応に用いた。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２３（１．５０ｇ，０．６８７ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）、及び先の工程２ｂからの化合物（０．７０２ｇ，１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。反応を０℃まで冷却した。ピリジン（１ｍＬ，過剰）をそれに加え、一晩攪拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。溶媒及び揮発物を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィ（最初に酢酸エチル、次いで、グラジエント溶出として５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所要の化合物４ｂを白色固体（１．４６ｇ，７６％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．１７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８２〜３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．２０（ｍ，−О―ＣＨ２−ＣＨ２−О，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．０５〜１．９０（ｍ，２Ｈ），１．８０〜１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６１〜１．４５（ｍ，６Ｈ），１．３５〜１．１７（ｍ，５６Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳの範囲：２７１６〜２８９２。
【０５８０】
４ｃの調製：１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセリド１ｃ（４．００ｇ，６．７０ミリモル）及びＤＳＣ（２．５８ｇ，１．５当量）を共にジクロロメタン（６０ｍＬ）中に取り、氷水混合物中で０℃まで冷却した。トリエチルアミン（２．７５ｍＬ，３当量）をそれに加え、一晩攪拌した。反応に続いてＴＬＣを行いＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を一晩高真空下に置いた。この化合物をさらに精製し、次の反応で直接的に用いた。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２  ３（１．５０ｇ，０．６８７ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）、及び先の工程２ｃからの化合物（０．７６０ｇ，１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。反応を０℃まで冷却した。ピリジン（１ｍＬ，過剰）をそれに加え、一晩攪拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、残渣をクロマトグラフィ（最初酢酸エチル、次いで、グラジエント溶出として５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所要の化合物４ｃを白色固体（０．９２ｇ，４８％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．２２〜５．１５（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８１〜３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．２０（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О，ＰＥＧ−ＣＨ２），１．８０〜１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６０〜１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３１〜１．１５（ｍ，６４Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２７７４〜２９４８。
【０５８１】
【化１６２】
0005933163.tif 000168
化合物６ａの調製：１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセリド１ａ（１．００ｇ，２．０６ミリモル）、コハク酸無水物（０．４１６ｇ，２当量）及びＤＭＡＰ（０．６２８ｇ，２．５当量）を共にジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取り、一晩攪拌した。反応に続いてＴＬＣを行い、ＤＣＭで希釈し、冷却した希薄クエン酸、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を一晩高真空下に置いた。この化合物をさらに精製し、次の反応で直接的に用いた。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２  ３（１．５０ｇ，０．６８７ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）、先の工程５ａからの化合物（０．６６ｇ，１．１２当量）及びＨＢＴＵ（０．４３０ｇ，１．１３ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン／ＤＭＦ（２：１，２０ｍＬ）の混合物に溶解させた。ＤＩＥＡ（０．３５８ｍＬ，３当量）をそれに加え、一晩攪拌した。反応混合物を大きなフラスコに移し、減圧下で溶媒及び揮発物を除去した。残渣を高真空下で一晩乾燥させ、クロマトグラフィ（最初は酢酸エチル、次いでグラジエント溶出としての５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所要の化合物６ａを白色固体（０．８２２ｇ，４３％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝６．３４〜６．３０（ｍ，２Ｈ），４．１６（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８２〜３．７８（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．３０（ｍ，−О―ＣＨ２−ＣＨ２−О，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．６４（ｔ，Ｊ＝７．００Ｈｚ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝６．８０Ｈｚ，２Ｈ），１．７６〜１．７２（ｍ，２Ｈ），１．５６〜１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３４〜１．１６（ｍ，４８Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳの範囲２６４４〜２８０４。
【０５８２】
化合物６ｂの調製：１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリド１ｂ（１．００ｇ，１．８４８ミリモル）、コハク酸無水物（０．０３６９ｇ，２当量）及びＤＭＡＰ（０．５６３ｇ，２．５当量）を共にジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取り、一晩攪拌した。反応に続いてＴＬＣを行い、ＤＣＭで希釈し、冷希クエン酸、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を一晩高真空下に置いた。この化合物はさらに精製して、次の反応で直接的に用いた。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２  ３（１．５０ｇ，０６８７ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）、先の工程５ｂからの化合物（０．６６ｇ，１．０３ミリモル）及びＨＢＴＵ（０．４００ｇ，１．０５ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン／ＤＭＦ（２：１，２０ｍＬ）の混合物に溶解させた。ＤＩＥＡ（０．３５８ｍＬ，３当量）をそれに加え、一晩攪拌した。反応混合物を大きなフラスコに移し、減圧下で溶媒及び揮発物を除去した。残渣を高真空下で一晩乾燥させ、クロマトグラフィ（最初に酢酸エチル、次いで、グラジエント溶出としての５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所要の化合物６ｂを白色固体（０．３００ｇ，１６％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝６．３３〜６．２８（ｍ，１Ｈ），４．１８（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８２〜３．７６（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．３０（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．６５（ｔ，Ｊ＝７．０８Ｈｚ，２Ｈ），２．４４（ｔ，Ｊ＝６．８３Ｈｚ，２Ｈ），１．７６〜１．６８（ｍ，２Ｈ），１．５７〜１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３２〜１．１７（ｍ，５６Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ：２６４０〜２８２２。
【０５８３】
化合物６ｃの調製：１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセリド１ｃ（５．００ｇ，８．３７ミリモル）、コハク酸無水物（１．７０ｇ，２当量）及びＤＭＡＰ（２．５５ｇ，２．５当量）を共にジクロロメタン（５０ｍＬ）中に取り、一晩攪拌した。反応に続いてＴＬＣを行い、ＤＣＭで希釈し、冷希クエン酸、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を一晩高真空下に置いた。この化合物はさらに精製して、次の工程で直接的に用いた。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２  ３（１．５０ｇ，０６８７ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）、先の工程５ｃからの化合物（０．７１８ｇ，１．０３ミリモル）及びＨＢＴＵ（０．４１０ｇ，１．０８ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン／ＤＭＦ（２：１，２０ｍＬ）の混合物に溶解させた。ＤＩＥＡ（０．３５０ｍＬ，３当量）をそれに加え、一晩攪拌した。反応混合物を大きなフラスコに移し、減圧下で溶媒及び揮発物を除去した。残渣を一晩高真空下で乾燥させ、クロマトグラフィ（最初に酢酸エチル、次いで、グラジエント溶出としての５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所要の化合物６ｃを白色固体（１．１ｇ，５６％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝６．３８〜６．３３（ｍ，１Ｈ），４．１９（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０７（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８１〜３．７４（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．２０（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．６３（ｔ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝６．８７Ｈｚ，２Ｈ），１．７６〜１．６８（ｍ，２Ｈ），１．５７〜１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３２〜１．１７（ｍ，６４Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２６８０〜２９２２。
【０５８４】
【化１６３】
0005933163.tif 000169
化合物８ａの調製：１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセリド１ａ（０．３００ｇ，０．６１８ミリモル）、ＭＰＥＧ−スクシネ―ト７（１．００ｇ，０．４７６ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）、ＤＣＣ（０．１２７ｇ，１．３当量）及びＤＭＡＰ（０．０５８ｇ，０．４７６ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取った。反応はＴＬＣによってモニターした。反応混合物を一晩の攪拌の後に０℃まで冷却し、沈殿した固体を濾別した。揮発物及び溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をクロマトグラフィ（最初、ＥｔＯＡｃ、続いて５〜１０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨグラジエント溶出）によって精製して、化合物８ａを白色固体（０．５９０ｇ，４８％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝４．２５〜４．１８（ｍ，２Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ，１１．５０Ｈｚ，１Ｈ），３．８０〜３．７３（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．３０（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О−，ＰＥＧ−ＣＨ２），１．５６〜１．４７（ｍ，４Ｈ），１．３０〜１．１５（ｍ，４８Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳの範囲：２４４０〜２７０８。
化合物８ｂの調製：１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリド１ｂ（０．３３４ｇ，０．６１８ミリモル）、ＭＰＥＧスクシネ−ト７（１．００ｇ，０．４７６ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）、ＤＣＣ（０．１２７ｇ，１．３当量）及びＤＭＡＰ（０．０５８ｇ，０．４７６ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取り、一晩攪拌した。反応はＴＬＣによってモニターした。反応混合物を一晩攪拌した後に０℃まで冷却し、沈殿した固体を濾過した。揮発物及び溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をクロマトグラフィ（最初はＥｔＯＡｃで溶出、続いて、５〜１０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨグラジエント溶出）によって精製して、化合物８ｂを白色固体（０．９３０ｇ，７４％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝４．２５〜４．１７（ｍ，２Ｈ），４．０９（ｄｄ，Ｊ＝５．５０Ｈｚ，１１．５０Ｈｚ，１Ｈ），３．８１〜３．７３（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．３０（ｍ，−О―ＣＨ２−ＣＨ２−О−，ＰＥＧ−ＣＨ２），１．５８〜１．４７（ｍ，４Ｈ），１．３０〜１．１７（ｍ，５６Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２４５３〜２７６０。
【０５８５】
化合物８ｃの調製：１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセリド１ｃ（０．３６９ｇ，０．６１８ミリモル）、ＭＰＥＧ−スクシネ―ト７（１．００ｇ，０．４７６ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）、ＤＣＣ（０．１２７ｇ，１．３当量）及びＤＭＡＰ（０．０５８ｇ，０．４７６ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取り、一晩攪拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。反応混合物を一晩攪拌した後、０℃まで冷却し、沈殿した固体を濾過した。揮発物及び溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をクロマトグラフィ（最初、ＥｔＯＡｃで溶出、続いて、５〜１０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨグラジエント溶出）によって精製して、化合物８ｃを白色固体（０．９６０ｇ，７５％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝４．２７〜４．２０（ｍ，２Ｈ），４．１０（ｄｄ，Ｊ＝５．８０Ｈｚ，１１．５０Ｈｚ，１Ｈ），３．８３〜３．７４（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．３５（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О−，ＰＥＧ−ＣＨ２），１．５４〜１．４６（ｍ，４Ｈ），１．３０〜１．１７（ｍ，６４Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２５０８〜２８１６。
【０５８６】
【化１６４】
0005933163.tif 000170
化合物１０ａの調製：１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール９ａ（０．３１７ｇ，０．６１８ミリモル）、ＭＰＥＧ‐スクシネ―ト７（１．００ｇ，０．４７６ミリモルＮＯＦ社、日本から購入）、ＤＣＣ（０．１２７ｇ，１．３当量）、ＤＭＡＰ（０．０５８ｇ，０．４７６ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取り、一晩攪拌した。反応はＴＬＣによってモニターした。反応混合物を一晩の攪拌の後に０℃まで冷却し、沈殿した固体を濾過した。揮発物及び溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をクロマトグラフィ（最初は、ＥｔＯＡｃ溶出、続いて、５〜１０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨグラジエント溶出）によって精製して、化合物１０ａを白色固体（０．９６０ｇ，７８％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．２６〜５．２０（ｍ，１Ｈ），４．３０〜４．０８（ｍ，６Ｈ），３．８１〜３．７３（ｍ，２Ｈ），３．７０〜３．４０（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．６５〜２．６０（ｍ，４Ｈ），２．３５〜２．２８（ｍ，４Ｈ），１．６３〜１．５２（ｍ，４Ｈ），１．３０〜１．１５（ｍ，４４Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳの範囲：２４６８〜２７３２。
【０５８７】
化合物１０ｂの調製：１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール９ｂ（０．３５２ｇ，０．６１８ミリモル）、ＭＰＥＧ−スクシネ―ト７（１．００ｇ，０．４７６ミリモル，ＮＯＦ社、日本から購入）、ＤＣＣ（０．１２７ｇ，１．３当量）及びＤＭＡＰ（０．０５８ｇ，０．４７６ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取り、一晩攪拌した。反応はＴＬＣによってモニターした。反応混合物を一晩攪拌した後に、０℃まで冷却し、沈殿した固体を濾別した。揮発物及び溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をクロマトグラフィ（最初は、ＥｔＯＡｃで溶出、続いて５〜１０％ＤＣＭ／ＭｅＯＨグラジエント溶出）によって精製して、化合物１０ｂを白色固体（１．０２ｇ，８１％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．２６〜５．１９（ｍ，１Ｈ），４．３０〜４．０５（ｍ，６Ｈ），３．８０〜３．４０（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．６５〜２．６０（ｍ，４Ｈ），２．３３〜２．２４（ｍ，４Ｈ），１．６３〜１．５０（ｍ，４Ｈ），１．３０〜１．１５（ｍ，５２Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２５２４〜２７９２。
【０５８８】
化合物１０ｃの調製：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール９ｃ（０．３８７ｇ，０．６１８ミリモル）、ＭＰＥＧ−スクシネ―ト７（１．００ｇ，０．４７６ミリモル），ＮＯＦ社、日本から購入）、ＤＣＣ（０．１２７ｇ，１．３当量）及びＤＭＡＰ（０．０５８ｇ，０．４７６ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取り、一晩攪拌した。反応はＴＬＣによってモニターした。反応混合物を一晩攪拌した後、０℃まで冷却し、沈殿した固体を濾別した。揮発物及び溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をクロマトグラフィ（最初、ＥｔＯＡｃで溶出、続いてＤＣＭ／ＭｅＯＨグラジエント溶出）によって精製して、化合物１０ｃを白色固体（１．０４ｇ，８０％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．２６〜５．１９（ｍ，１Ｈ），４．３０〜４．０５（ｍ，６Ｈ），３．８０〜３．４０（ｍ，−О―ＣＨ２−ＣＨ２−О−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．６６〜２．５９（ｍ，４Ｈ），２．３１〜２．２６（ｍ，４Ｈ），１．６３〜１．５２（ｍ，４Ｈ），１．３０〜１．１５（ｍ，５２Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２５４０〜２８４４。
【０５８９】
【化１６５】
0005933163.tif 000171
化合物１３の調製：ＭＰＥＧ２０００−ＯＨ  １１（６．００ｇ，３ミリモル，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）、コレステロールヘミスクシネート１２（１．５０ｇ，３．０８ミリモル）及びＨＢＴＵ（１．２３ｇ，３．２３ミリモル）をアルゴン下でジクロロメタン／ＤＭＦ（２：１，１００ｍＬ）の混合物に溶解させた。ＤＩＥＡ（１．６０ｍＬ，３当量）をそれに加え、一晩攪拌した。溶媒及び揮発物を減圧下で除去した。残渣を一晩高真空下で乾燥させ、クロマトグラフィ（最初は酢酸エチル、次いで、グラジエント溶出としての５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所要の化合物１３を白色固体（５．０５ｇ，６８％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．３５〜５．２５（ｍ，１Ｈ），４．６０〜４．５０（ｍ，１Ｈ），４．２２〜４．１８（ｍ，２Ｈ），３．８０〜３．７６（ｍ，２Ｈ），３．７２〜３．４０（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．６４〜２．５６（ｍ，４Ｈ），２．３１〜２．２０（ｍ，３Ｈ），２．０１〜０．８（ｍ，４４Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２３９０〜２６５４。
【実施例４２】
【０５９０】
標的化ＰＥＧ脂質
【０５９１】
【化１６６】
0005933163.tif 000172
１９の調製：
工程１：化合物１４（２．００ｇ，１．０１ミリモル）及びクロロギ酸コレステロール１５（０．４５３ｇ，１．０１ミリモル）を共にジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取った。混合物を氷水浴中で冷却した。トリエチルアミン（０．４４８ｍｌ）を加え、反応混合物を一晩攪拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。溶媒を除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル、次いで５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所望の化合物１６（１．１０ｇ，４５．４０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．３５（ｍ，１Ｈ），５．１５（ｍ，１Ｈ），３．４０〜３．８５（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О），３．１０〜３．２５（ｍ，１０Ｈ），０．８０〜２．３８（ｍ，４４Ｈ，コレステロール）。判明したＭＳ範囲：２２２０〜２４９０。
【０５９２】
工程２：化合物１６（１．００ｇ，０．４１７ミリモル）（０．２３５ｇ，０．５４２ミリモル）及びＨＢＴＵ（０．１９０ｇ，０．５ミリモル）をＤＣＭ／ＤＭＦ（２０ｍＬ，２：１）の混合物中に取った。それにＤＩＥＡを加え、一晩攪拌した。反応はＴＬＣによってモニターし、溶媒を減圧下で除去し、残渣をクロマトグラフィ（５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所望の化合物１８（１．０２ｇ，８７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）d＝７．５２（ｄ，Ｊ＝８．０６Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝７．０２Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｍ，１Ｈ），５．１８（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９２（ｄｄ，Ｊ＝３．１７，１１．２３Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｍ，１Ｈ），３．６０〜４．０２（ｍ，５Ｈ），３．２０〜３．５５（ｍ，−О−ＣＨ２−ＣＨ２−О），２．９０〜３．１０（ｍ，１０Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），１．８４（ｓ，３Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），０．８０〜２．３８（ｍ，４４Ｈ，コレステロール）。判明したＭＳの範囲：２６８０〜２９９０。
【０５９３】
工程３：化合物１８（１．０２ｇ，０．３６２ミリモル）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ）
の混合物に溶解させ、それにメタノール（過剰）中のＮａＯＭｅの０．５Ｍ溶液を加え、一晩攪拌した。反応の進行はＴＬＣによってモニターした。混合物をＡｃＯＨ中和した。溶媒を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィ（５〜１０％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、化合物１９（２８０ｍｇ，３０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．３８（ｍ，１Ｈ），４．０２〜４．０６（ｍ，７Ｈ），３．３０〜３．８０（ｍ，О−ＣＨ２−ＣＨ２−О），３．２０〜３．２９（ｍ，８Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），０．８０〜２．３８。（ｍ，４４Ｈ，コレステロール）。判明したＭＳの範囲：２６００〜２９００。
【実施例４３】
【０５９４】
標的化ＰＥＧ脂質
【０５９５】
【化１６７】
0005933163.tif 000173
２３の調製：
工程１：化合物１４（２．００ｇ，１．０１ミリモル）及び化合物２０（０．４５３ｇ，１．０１ミリモル）を共にジクロロメタン（２０ｍＬ）中に取った。混合物を氷水浴中で冷却した。ピリジン（１  ｍＬ，過剰）を加え、反応混合物を一晩攪拌した。反応はＴＬＣによってモニターした。溶媒を除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル、続いて、５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所望の化合物２１（４００ｍｇ，１５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．２０（ｍ，１Ｈ），４．０５〜４．２０（ｍ，２Ｈ），３．２０〜３．８０（ｍ，О−ＣＨ２−ＣＨ２−О），１．７０〜１．８２（ｍ，４Ｈ），１．５０〜１．６１（ｍ，２Ｈ），１．１８〜１．３８（ｍ，６０Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．３０Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２４００〜２７５０。
【０５９６】
工程２：化合物２１（０．４１５ｇ，０．１５９ミリモル）、１７（０．１００ｇ，１．３当量）及びＨＢＴＵ（０．９０ｇ，１．１５当量）をＤＣＭ／ＤＭＦ（２０ｍＬ，２：１）の混合物中に取った。それに、ＤＩＥＡ（０．２ｍＬ）を加え、一晩攪拌した。反応はＴＬＣによってモニターし、溶媒を減圧下で除去し、残渣をクロマトグラフィ（３〜１０％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、所望の化合物２２（０．４５０ｇ，９４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝６．２１（ｄ，Ｊ＝８．７０Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝２．７０Ｈｚ，１Ｈ），５．１５〜５．２０（ｍ，２Ｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝８．１５Ｈｚ，１Ｈ），４．０１〜４．２０（ｍ，４Ｈ），３．２０〜３．９０（ｍ，О−ＣＨ２−ＣＨ２−О），２．１４（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ），１．９３（ｓ，３Ｈ），１．７０〜１．８２（ｍ，４Ｈ），１．５０〜１．６１（ｍ，４Ｈ），１．１７〜１．３８（ｍ，６０Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．３２Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２８００〜３２００。
【０５９７】
工程３：化合物２２（０．４５０ｇ，０．３５９ミリモル）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（５ｍＬ）の混合物に溶解させ、それにメタノール（過剰）中のＮａＯＭｅの０．５Ｍ溶液を加え、一晩攪拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニターし、混合物をＡｃＯＨで中和した。溶媒を真空中で除去し、残渣をクロマトグラフィ（５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、化合物２３（３６５ｍｇ，８５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）d＝５．１８（ｍ，１Ｈ），４．０５〜４．２０（ｍ，４Ｈ），３．２０〜３．９０（ｍ，О―ＣＨ２−ＣＨ２−О），２．０５（ｓ，３Ｈ），１．７１〜１．８０（ｍ，４Ｈ），１．５０〜１．６１（ｍ，４Ｈ），１．１７〜１．３８（ｍ，６０Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．３２Ｈｚ，６Ｈ）。判明したＭＳ範囲：２７６０〜３０００。
【０５９８】
図６に示されたように、患者に投与された場合、製剤は種々の経路のＦＶＩＩのサイレンシングをもたらした。例えば、製剤３は、製剤５、６及び１２と同様に比較的高いレベルのＦＶＩＩのサイレンシングをもたらした。
【実施例４４】
【０５９９】
マウスに投与した製剤ＬＮＰ０１の許容性
組成物ＮＤ９８：コレステロール：ＰＥＧ−Ｃ１４＝４２：４８：１０（モル比）を含む空のリポソームを実施例４５に記載したように調製した。次いで、異なる量のｓｉＲＮＡを予め形成された押出し空リポソームに加えて３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、及び５：１（重量：重量）の初期総賦形剤：ｓｉＲＮＡ比率を有する製剤を得た。５：１の総賦形剤：ｓｉＲＮＡ比率の製剤の調製の結果、製剤中に過剰のｓｉＲＮＡがもたらされ、脂質負荷能力を飽和させる。次いで、５容量のＰＢＳに対して１００，０００  ＭＷＣＯ膜を用いる接線流濾過によって過剰のｓｉＲＮＡを除去した。次いで、得られた製剤を１０ｍｇ／ｋｇ容量の尾静脈注射を介してＣ５７ＢＬ−６マウスに投与した。製剤の許容性は、製剤の投与から２４時間及び４８時間後に動物の体重増加を測定することによって評価し、その結果を図７に示す。
【実施例４５】
【０６００】
最初に未負荷複合体を形成し、次に未負荷複合体をｓｉＲＮＡで処理することによる会合複合体の形成、及び２つの治療剤を含む会合複合体の投与
２つの異なる核酸部位を有する会合複合体を以下の通りに調製した。エタノール中のＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ−Ｃ１４のストック溶液を、各々、ＮＳ９８、コレステロール、及びＰＥＧ−Ｃ１４について以下の濃度：１３３ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、及び１００ｍｇ／ｍＬで調製した。次いで、脂質ストックを混合して、４２：４８：１０のＮＤ９８：コレステロール：ＰＥＧ−Ｃ１４モル比率を得た。次いで、この混合物を水性緩衝液に加え、その結果、３５％エタノール、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中の脂質ナノ粒子が自然に形成された。次いで、押出器（Ｌｉｐｅｘ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて未負荷脂質ナノ粒子を０．０８μｍ膜（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）を２回通して、サイズが２０〜１００ｎｍの単峰型の小胞を得た。次いで、３５％エタノール中の適量のｓｉＲＮＡを、総賦形剤：ｓｉＲＮＡ比率７．５：１（重量：重量）で、予めサイズ調整された未負荷小胞に加えた。次いで、得られた混合物を３７℃にて３０分間インキュベートして、ｓｉＲＮＡの脂質ナノ粒子への負荷を可能とした。インキュベーションの後に、透析、又はＰＢＳに対するクロスフロー濾過のいずれかによってエタノール除去及び緩衝液交換を行った。次いで、最終製剤を０．２μｍフィルタを通して滅菌濾過した。賦形剤及び治療剤の添加の順序を示すフローチャートを図８に示す。
【０６０１】
ＡｐоＢ及び第ＶＩＩ因子を標的とするｓｉＲＮＡの１：１混合物を実施例４４に記載のように調製した。これとは別に、同じＡｐｏＢ及び第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡを実施例３１に記載のようにそれぞれ調製した。次いで、３つの製剤を、１０μＬ／ｇ動物体重の注射容量にて種々の用量で投与した。投与から４８時間後に、血清試料を眼窩後出血によって収集し、動物を屠殺し、肝臓を採取した。血清中第ＶＩＩ因子濃度は製造業者のプロトコルに従い、発色診断キット（Ｃｏａｓｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ダイアファーマ社）を用いて測定した。ＡｐоＢ及び第ＶＩＩ因子の肝臓中ｍＲＮＡレベルは分岐−ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いて決定し、その結果を図９に示す。２つの治療剤の間に阻害の兆候は観察されなかった。むしろ、治療剤の双方は投与した場合に有効性を示した。
【実施例４６】
【０６０２】
予め形成された小胞を用いる会合複合体の製造方法
脂質ストック調製物
脂質性ＮＤ９８−４ＨＣｌ（分子量１４８７）、コレステロール、及びＰＥＧ−Ｃ１４のストック溶液を、ＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ−Ｃ１４を、各々１３３ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、及び１００ｍｇ／ｍＬの濃度でエタノール中に調製した。ストック溶液を５０℃まで温めて、脂質の溶液化を助けた促進した。
【０６０３】
空小胞調製物
次いで、脂質ストックを以下に列記する容量に従って混合し、ＮＤ９８：コレステロール：ＰＥＧ−Ｃ１４が４２：４８：１０のモル比を得た。また、以下の表に列記された容量に従って水性混合物も調製した。
【０６０４】
【表５】
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次いで、エタノール性脂質混合物を、磁気攪拌プレート上で迅速に攪拌しつつ、水性混合物に加えた。混合に際して、脂質性小胞が自然に形成された。次いで、得られた小胞を０．０８μ膜（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）を通して押出しして（２回）、空の小胞をサイズ調整した。全ての操作は室温で行った。
【０６０５】
空の小胞へのｓｉＲＮＡの負荷
脱塩した二重鎖ｓｉＲＮＡを１０ｍｇ／ｍＬの濃度でｐＨ５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解させることによって、ｓｉＲＮＡストック溶液を調製した。適切な容量のこのｓｉＲＮＡストックを適切な容量のエタノールと混合して、３５％（体積）エタノールで希釈されたｓｉＲＮＡ溶液を得た（以下の表参照）。
【０６０６】
【表６】
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磁気攪拌プレート上で迅速に攪拌しつつ、２７７ｍＬの希釈したｓｉＲＮＡ溶液を６２３ｍＬの空の小胞混合物に加えた。次いで、得られた混合物を３７℃にて３０分間インキュベートして、ｓｉＲＮＡの負荷を可能とした。
【０６０７】
限外濾過及び最終０．２μ濾過
インキュベーションの後、９００ｍＬ負荷ナノ粒子混合物を１．８ＬのＰＢＳに希釈して、２．７Ｌの希釈された混合物を得た。次いで、この希釈された混合物を〜１Ｌまで濃縮し、堆積された２つの１００，０００  ＭＷＣＯカートリッジを利用するザルトリウス（Ｓａｒｔоｒｉｕｓ）ＴＦＦシステムを用い、１０容量のＰＢＳに対するクロスフロー濾過によって透析濾過した。カートリッジには逆圧を適用せず、ポンプスピードは３００ｒｐｍに設定した。緩衝液交換の後、得られた溶液をほぼ２ｍｇ／ｍＬ  ｓｉＲＮＡまで濃縮した。
【０６０８】
最終濾過は、０．２μフィルタカプセル（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、Ｐｏｌｙｃａｐ  ３６  ＡＳ）に溶液を通すことによって最終濾過を行った。
このプロセスを示すフローチャートを図１０に示す。
【実施例４７】
【０６０９】
効率に対する粒子サイズの比較
実施例４６に一般的に記載された手順を用い、会合複合体を形成した。しかしながら、複合体はサイズに基づいて評価されたので、異なる押出膜を用いて、直径１５０ｎｍ、８５ｎｍ、６０ｎｍ、及び５０ｎｍを有する粒子を作製した。複合体中に負荷されたｓｉＲＮＡは第ＶＩＩ因子を標的とした。
【０６１０】
粒子は第ＶＩＩ因子サイレンシングアッセイにおいて評価し、５０ｎｍ粒子は１５０ｎｍ、８５ｎｍ、及び６０ｎｍ粒子に対して最も効果的であることを示した。アッセイの結果を図１１に示す。
【実施例４８】
【０６１１】
会合複合体に調製されていない核酸剤と調製された核酸剤との半減期の比較
会合複合体に調製されたｓｉＲＮＡの半減期はヒト血清中で３７℃でイン・ビトロにて評価した。会合複合体は実施例４６におけるように調製した。比較の目的で、調製されていないｓｉＲＮＡもヒト血清においてやはりイン・ビトロで評価した。ＨＰＬによって決定された全長産物のパーセントは、調製された及び調製されていないｓｉＲＮＡの双方について評価した。図１２に示されるように、調製されたｓｉＲＮＡはヒト血清においてイン・ビトロで半減期を有意に改善した。
【実施例４９】
【０６１２】
様々な鎖長のＰＥＧ脂質を有する会合の効果の比較
様々な長さのＰＥＧ脂質のアルキル鎖を有する会合複合体を、実施例４６のように調製した。１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６のアルキル鎖の長さを評価し、第ＶＩＩ因子サイレンシングアッセイにおける効果につき比較した。図１３に示されるように、１３、１４及び１５の鎖長は、該アッセイで測定されたように最大のサイレンシングを示した。
【０６１３】
本発明の多数の実施形態を記載した。しかしながら、本発明の主旨及び範囲を逸脱することなく、種々の変形例をなすことができることが理解されよう。従って、他の実施形態は請求の範囲の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図７】
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【図１２】
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