(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴシン１−リン酸に結合することができるＬ−核酸分子であって、前記核酸分子は５’→３’の方向にヌクレオチドの第１の末端ストレッチと、ヌクレオチドの中心ストレッチと、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチを含むか、または、５’→３’の方向にヌクレオチドの第２の末端ストレッチと、ヌクレオチドの中心ストレッチと、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチを含み、
前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが３〜６のヌクレオチドからなり、
前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが３〜６のヌクレオチドからなり、
前記ヌクレオチドの中心ストレッチが、
５’ ＡＡＵＡＧＣＣＧＵＵＧＡＡＡＣＧＣＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＵＡＧ ３’、    ５’ ＡＡＵＡＧＣＣＧＡＵＧＡＡＡＣＧＣＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＵＡＧ ３’、 および、
５’ ＡＡＵＡＧＣＣＧＡＡＵＧＡＡＡＣＧＣＣＵＵＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＵＡＧ ３’、 
からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、Ｌ−核酸分子。
【請求項２】
前記核酸がスフィンゴシン１−リン酸によって媒介される活性のアンタゴニストである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’のヌクレオチド配列からなり、および前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’のヌクレオチド配列からなり、
ここで、
Ｘ１はＡまたは不在であり、Ｘ２はＧまたは不在であり、Ｘ３はＳまたは不在であり、Ｘ４はＳまたは不在であり、Ｘ５はＣまたは不在であり、およびＸ６はＵまたは不在である、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’のヌクレオチド配列からなり、および前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’のヌクレオチド配列からなり、
ここで、
ａ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６はＵであり、または
ｂ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６はＵであり、または
ｃ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６は不在であり、または
ｄ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６は不在である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’ヌクレオチド配列からなり、および前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’のヌクレオチド配列からなり、
ここで、
ａ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６は不在であり、または
ｂ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５は不在であり、およびＸ６は不在であり、または
ｃ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５は不在であり、およびＸ６は不在である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記ヌクレオチドの第１の末端ストレッチが５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’のヌクレオチド配列からなり、および前記ヌクレオチドの第２の末端ストレッチが５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’のヌクレオチド配列からなり、
ここで、
Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳまたは不在であり、Ｘ４はＳまたは不在であり、Ｘ５は不在であり、およびＸ６は不在である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が、配列番号１２、１３、１５、１８、１９および２３〜２６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子が、配列番号１８に記載の核酸配列またはそれと相同である核酸分子からなり、その相同性が少なくとも８５％である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項９】
スフィンゴシン１−リン酸に結合することができるＬ−核酸分子であって、参照核酸分子と比較して、前記核酸分子の親和性が増加し、前記参照核酸分子が配列番号１８に記載のヌクレオチド配列からなり、および前記参照核酸分子がリボヌクレオチドからなり、前記核酸分子が配列番号１８に記載のヌクレオチド配列からなりかつ配列番号１８に記載のヌクレオチド配列の１つまたは複数のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで置換されている、Ｌ−核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が、配列番号２７〜３７、３９および４０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列からなる、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記核酸分子が、配列番号３６に記載の核酸配列またはそれと相同である核酸分子からなり、その相同性が少なくとも８５％であり、前記相同核酸がリボヌクレオチドおよび少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子が修飾基を含み、生物体由来の前記修飾基を含む前記核酸分子の排泄速度が、前記修飾基を含まない核酸と比較して低下する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸分子が修飾基を含み、前記修飾基を含む前記核酸分子が、前記修飾基を含まない核酸分子と比較して、生物体における滞留時間が増加する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
疾患の治療および／または予防のための方法で用いる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸分子と、任意にさらなる成分とを含む医薬組成物であって、前記さらなる成分が、医薬的に許容される賦形剤、医薬的に許容される担体、および医薬的に活性な薬剤を含む群から選択される、医薬組成物。
【請求項１６】
薬物の製造のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１７】
診断手段の製造のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子と、スフィンゴシン１−リン酸とを含む複合体。
【請求項１９】
スフィンゴシン１−リン酸の検出のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項２０】
スフィンゴシン１−リン酸またはスフィンゴシン１−リン酸の類似体によって媒介される活性のアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
前記スフィンゴシン１−リン酸および／または前記スフィンゴシン１−リン酸の類似体によって媒介される活性の候補アンタゴニストを提供するステップと、
請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸を提供するステップと、
前記スフィンゴシン１−リン酸および／または前記スフィンゴシン１−リン酸の類似体によって媒介される活性のアンタゴニストの存在下でシグナルを供給する試験系を提供するステップと、
前記スフィンゴシン１−リン酸によって媒介される活性の前記候補アンタゴニストが、前記スフィンゴシン１−リン酸および／または前記スフィンゴシン１−リン酸の類似体によって媒介される活性のアンタゴニストであるかどうかを決定するステップとを含む、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子を含むスフィンゴシン１−リン酸を検出するためのキット。
【請求項２２】
請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸を試料において検出する方法であって、前記方法が、
ａ）捕捉プローブが請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸分子の第１の部分と少なくとも部分的に相補的である捕捉プローブと、請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸分子の第２の部分と少なくとも部分的に相補的である検出プローブとを、またはその代わりに、請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸分子の第２の部分と少なくとも部分的に相補的である捕捉プローブと、請求項１〜１３いずれか１項に定義される核酸分子の第１の部分と少なくとも部分的に相補的である検出プローブとを提供するステップと；
ｂ）請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸分子を含有する、または請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸分子を含有すると推定される試料に、前記捕捉プローブおよび前記検出プローブを別々に、または組み合わせて添加するステップと；
ｃ）前記捕捉プローブおよび前記検出プローブが、請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸分子またはその一部と、同時にまたは任意の順番のいずれかで反応できるようにするステップと；
ｄ）前記捕捉プローブが、ステップａ)で提供される請求項１〜１３のいずれか１項に定義される核酸分子とハイブリッド形成するかどうかを任意に検出するステップと；
ｅ）請求項１〜１３のいずれか１項に定義される前記核酸分子と、前記捕捉プローブと、前記検出プローブとからなる、ステップｃ）で形成される複合体を検出するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質、好ましくはリン脂質、より好ましくはスフィンゴシン１−リン酸に結合することができる核酸分子と、薬物、診断薬、および検出薬それぞれの製造でのそのような核酸分子の使用と、そのような核酸分子を含む組成物と、そのような核酸分子を含む複合体と、そのような核酸分子を用いることにより脂質または脂質類似体が媒介する活性のアンタゴニストをスクリーニングするための方法と、そのような核酸分子を検出するための方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質および脂質誘導体は、細胞膜内の構造要素として、またはβ酸化もしくは解糖のための基質としてのそれらの機能が最もよく知られている。ごく最近では、脂質および脂質誘導体は、疾患において重要な役割を果たすシグナル分子として認識されるようになった。生理活性脂質シグナル分子の例は数多くあり、ホスファチジルイノシトール（略語ＰＩ）、ホスファチジルセリン（略語ＰＳ）、ジアシルグリセリド（略語ＤＡＧ）、ホスファチジルグリセロール（略語ＰＧ）とホスファチジン酸（略語ＰＡ）などのリン酸脂質、リゾホスファチジルコリン、血小板活性化因子およびカルジオリピンが挙げられる。他の脂質シグナル分子の例としては、カンナビノイド、プロスタグランジン、イソエイコサノイドおよびロイコトリエンを包含するエイコサノイドが挙げられる。脂質は、第２メッセンジャーとして、または自身の特定の受容体との直接的な相互作用を介して作用することができる。脂質シグナル経路は、種々の異なる刺激を介して活性化され、かつ接着、運動性、増殖、アポトーシスおよび分化を含む多様な一連の細胞内プロセスの調節に関与している。スフィンゴ脂質およびそれらの誘導体には、細胞外および細胞内のシグナル伝達機能があり、ヒト疾患において重要な役割を果たしている。脂質シグナル分子のさらなる重要な種類は、スフィンゴ脂質であり、それらにはセラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンゴミエリン、スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸、スフィンガニン、およびスフィンガニン−１−リン酸が含まれる。
【０００３】
スフィンゴシン１−リン酸（略語Ｓ１Ｐ）は、３８０ダルトンのリン脂質であり、分子式Ｃ１８Ｈ３８ＮＯ５Ｐを有する。かつては単にセラミドの分解産物と思われていたが、今やＳ１Ｐは、細胞成長、細胞増殖、血管新生、およびリンパ球輸送などの多様な生物学的プロセスにおいて重要な機能を有することが知られている。（概説は、Ｋｉｍら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００９  １７９１：６９２−６；Ｍａｃｅｙｋａら，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ２００９  ５０  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ２７２−６；Ｔａｋａｂｅら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００８  ６０（２）：１８１−９５を参照されたい）。
【０００４】
その他のＳ１Ｐの機能の中には、抗アポトーシス効果があり、かつＳ１Ｐは細胞成長および細胞増殖を促進する。その前駆体のスフィンゴシンとセラミドには、逆の機能があり、細胞周期停止と細胞死を誘発する。Ｓ１Ｐとその前駆体は、そのような反対作用を示すので、それらの絶対量（スフィンゴシンホスファターゼおよびスフィンゴシンキナーゼの相互作用によって主に制御される）よりはむしろ異なるスフィンゴシン代謝産物の相対的な均衡が、細胞運命を決定すると考えられている。この複雑な制御系は、「スフィンゴ脂質レオスタット」と呼ばれる。
【０００５】
最近の研究では、Ｓ１Ｐとその代謝産物ならびにその前駆体セラミドをＴＮＦ−α、ＩＬ１β、および他のサイトカインのための二次メッセンジャーとして関係づけている。種々の証拠は、細胞増殖と生存に関与する二次メッセンジャーとしてのＳ１Ｐの役割を裏付けている。だが同時に、Ｓ１Ｐの生物学的効果の多くは、細胞表面でＳ１Ｐ受容体（略語Ｓ１ＰＲ）に結合した５つのＧタンパク質の配位子として作用する結果である。オーファン受容体として最初に同定され、内皮分化遺伝子（略語ＥＤＧ）と命名されたＧタンパク質は、現在、ＥＤＧ１／Ｓ１Ｐ１、ＥＤＧ５／Ｓ１Ｐ２、ＥＤＧ３／Ｓ１Ｐ３、ＥＤＧ６／Ｓ１Ｐ４、ＥＤＧ８／Ｓ１Ｐ５に新たに命名され、特性が明らかにされている。各受容体は、Ｒｈｏファミリーの低分子ＧＴＰアーゼ（Ｇｑ、Ｇ１、Ｇ１２〜１３）などの下流シグナル分子を活性化するヘテロ二量体Ｇタンパク質（ＺｈｏｕとＭｕｒｔｈｙ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４，２８６：Ｃ１１３０−Ｃ１  １３８；Ｋｕｍｅら，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００７  ３２０：７６６−７７３）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（Ｇｕｏら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８  ２５７：４０３−４０８；Ｓａｔｏら，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９  ５５：１２６−１３３；Ｄｉｋｉｃら，Ｎａｔｕｒｅ．１９９６  ３８３：５４７−５５０）、ホスホリパーゼＣ／Ｄ（Ｏｋａｍｏｔｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８  ２７３：２７１０４−２７１１０；Ｇｏｎｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９９  ３３７：６７−７５；Ｂａｎｎｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  ２７４：２７３８５−２７３９１）およびその他に結合する。Ｓ１ＰＲの発現は広範囲にわたり、およびＳ１Ｐは、接着、収縮、運動性、形態形成、増殖と分化を含む広範囲の細胞応答に影響し、血管緊張の調節、創傷治癒、免疫細胞の輸送、神経細胞シグナリング、血管新生、生殖と心血管機能に関係する。応答の範囲は、細胞および組織における受容体発現のパターンと、対応するエフェクターとに依存する。このように、特定のＳ１ＰＲの活性化には、例えば、内皮細胞における別の活性化と逆の効果があり得る（Ｌｅｅら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００１  ８：６９３−７０４．；Ｋｉｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０００  ３４８：７１−７６．；Ｒｙｕら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００２  ９０：３２５−３３２）。１つのＳ１ＰＲの活性化は、ＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼを差動的に調節することができる（Ｇａｒｃｉａら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００１  １０８：６８９−７０１；Ｇｏｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００５  １０２：９２７０−９２７５；Ｌｉｕら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００  １０６：９５１−９６１）。加えて、他の成長因子シグナル経路へのクロストークがある。
【０００６】
Ｓ１Ｐは循環血液中に存在し、リンパは、血小板、活性化マスト細胞および単核食細胞によって主に作られ、分泌される。Ｓ１Ｐの濃度は、０．１〜１ｍＭの範囲で、時として最高５ｍＭが見られるが、ほとんどのＳ１Ｐはアルブミンまたは他の血漿タンパク質に結合しているので、Ｓ１ＰＲを活性化するのに利用できるのは、ごく一部にすぎない。Ｓ１Ｐの内在レベルが変化すると、炎症と自己免疫疾患、喘息、血管新生、心疾患、癌、眼疾患、および脳血管疾患を含む病態生理学的状態をもたらし得る。
【０００７】
Ｓ１Ｐ効果の多くは、Ｓ１Ｐと、１つもしくはいくつかのＳ１ＰＲとの相互作用または結合によって媒介されると思われるので、治療的なアプローチは受容体を標的とすることに集中していた。多数の異なるＳ１Ｐ受容体アンタゴニストとアゴニストが、同定され説明されてきた。それらは、種々のＳ１ＰＲに対する特異性と親和性が異なり、したがって種々の機能プロフィルを示す。最新化合物のフィンゴリモド（ＦＴＹ７２０としても知られている）は、プロドラッグであり、ｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸化される。リン酸化形態は、Ｓ１ＰＲ、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４およびＳ１Ｐ５に対するアゴニストであり、移植および自己免疫疾患のモデルにおいて非常に有効であることが示された。フィンゴリモドは、現在、多発性硬化症の治療のための第３相臨床試験中である。異なるＳ１ＰＲの拮抗作用のため、種々の受容体に対して特異的な選択性で分子を同定することに関心がもたれている。Ｓ１Ｐに依存する病態生理に干渉するもう一つのアプローチは、Ｓ１Ｐ内在レベルに影響を及ぼすことである。これは、スフィンゴシンのリン酸化を介して作られるＳ１Ｐの量を変えるＳ１Ｐキナーゼを標的にすることによって、または脱リン酸化されるＳ１Ｐの量に影響を及ぼすＳ１Ｐホスファターゼを標的にすることによって達成され得る。生理活性Ｓ１Ｐの内在レベルに影響を及ぼす別のアプローチは、分子の中和剤との相互作用によってＳ１Ｐ作用の直接抑制を介することである。本発明は、Ｓ１Ｐを中和する方法を説明する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の根本的な課題は、脂質、好ましくはリン脂質、より好ましくはＳ１Ｐと特異的に相互作用する手段を提供することである。より具体的には、本発明の根本的な課題は、脂質と、および／または脂質に、好ましくはリン脂質と、および／またはリン脂質に、より好ましくはＳ１Ｐと、および／またはＳ１Ｐに特異的に相互作用する手段に基づいた核酸を提供することである。
【０００９】
さらなる本発明の根本的な課題は、ヒト疾患または非ヒト疾患を治療するための薬物を製造する手段を提供することであり、それにより該疾患は、そのような疾患の発症機序に直接的にまたは間接的にのいずれかで関与する脂質、好ましくはリン脂質、より好ましくはＳ１Ｐによって特徴づけられる。
【００１０】
さらなる本発明の根本的な課題は、疾患を診断するための診断薬を製造する手段を提供することであり、それにより該疾患は、そのような疾患の発症機序に直接的または間接的にのいずれかで関与する脂質、好ましくはリン脂質、より好ましくはＳ１Ｐによって特徴づけられる。
【００１１】
本発明の根本的なこれらおよび他の課題は、添付の独立請求項に記載の発明の主題によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項から引き出され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
より具体的には、本発明の根本的な課題は、脂質に結合することができる核酸分子によって、第１態様において解決される。この第１の態様は、第１の実施形態でもある。
【００１３】
第１の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２の実施形態では、核酸は、脂質によって媒介される活性のアンタゴニストである。
【００１４】
第１の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある、第1の態様の第３の実施形態では、脂質はリン脂質であり、好ましくは、リン脂質はスフィンゴシン１−リン酸である。
【００１５】
第１の態様の第１、第２、および第３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第４の実施形態では、核酸分子は、ヌクレオチドの中心ストレッチを含み、該ヌクレオチドの中心ストレッチは、
５’ＷＡＵＵＧＣＣＧＡＷＵＧＵＡＡＣＧＣＣＵＵＷＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＵＡＧ３’または
５’ＷＡＵＵＧＣＣＧＷＵＧＵＡＡＣＧＣＣＵＵＷＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＵＡＧ３’
のヌクレオチド配列を含み、および
該脂質は、好ましくはスフィンゴシン１−リン酸である。
【００１６】
第１の態様の第４の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第５の実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは、
５’ＡＡＵＡＧＣＣＧＵＵＧＡＡＡＣＧＣＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＵＡＧ３’、
５’ＡＡＵＡＧＣＣＧＡＵＧＡＡＡＣＧＣＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＵＡＧ３’、
および
５’ＡＡＵＡＧＣＣＧＡＡＵＧＡＡＡＣＧＣＣＵＵＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＵＡＧ３’の群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
第１の態様の第４および第５の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第６の実施形態では、核酸分子は、５’→３’の方向に、ヌクレオチドの中心ストレッチと、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチとを含み、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、３〜６のヌクレオチドを含み、および
ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、３〜６のヌクレオチドを含む。
【００１８】
第１の態様の第４および第５の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第７の実施形態では、核酸分子は、５’→３’方向にヌクレオチドの第２の末端ストレッチと、ヌクレオチドの中心ストレッチと、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチとを含み、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは３〜６のヌクレオチドを含み、および
ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは３〜６のヌクレオチドを含む。
【００１９】
第１の態様の第６および第７の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第８の実施形態では、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’のヌクレオチド配列を含み、
ここで、
Ｘ１はＡもしくは不在であり、Ｘ２はＧもしくは不在であり、Ｘ３はＳもしくは不在であり、Ｘ４はＳもしくは不在であり、Ｘ５はＣもしくは不在であり、およびＸ６はＵもしくは不在である。
【００２０】
第１の態様の第６、第７および第８の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第９の実施形態では、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’のヌクレオチド配列を含み、
ここで、
ａ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６はＵである、または
ｂ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２は Ｇであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６はＵである、または
ｃ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６は不在である、または
ｄ）Ｘ１は、不在であり、Ｘ２は、Ｇであり、Ｘ３は、Ｓであり、Ｘ４は、Ｓであり、Ｘ５は、Ｃであり、およびＸ６は、不在である。
【００２１】
第１の態様の第６、第７、第８および第９の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１０の実施形態では、ａ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＡＧＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣＧＣＵ３’のヌクレオチド配列を含む、または
ｂ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＧＣＧＵＧ’３のヌクレオチド配列を含み、および第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣＧＣ’３のヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
第１の態様の第６、第７および第８の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１１の実施形態では、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’のヌクレオチド配列を含み、
ここで、
ａ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６は不在である、または
ｂ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５は不在であり、およびＸ６は不在である、または
ｃ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５は不在であり、およびＸ６は不在である。
【００２３】
第１の態様の第６、第７、第８および第１１の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１２の実施形態では、ａ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣＧ３’のヌクレオチド配列を含む、または
ｂ）ヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＧＣＵＧ’３のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＧＣ３’のヌクレオチド配列を含む、または
c）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＧＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣＣ３’のヌクレオチド配列を含み、好ましくは、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２のヌクレオチドストレッチは、５’ＣＡＣＧ３’のヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
第１の態様の第６、第７および第８の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１３の実施形態では、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’のヌクレオチド配列を含み、
ここで
Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳもしくは不在であり、Ｘ４はＳもしくは不在であり、Ｘ５は不在であり、およびＸ６は不在である。
【００２５】
第１の態様の第６、第７、第８および第１３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１４の実施形態では、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣ３’のヌクレオチドを含む。
【００２６】
第１の態様の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３および第１４の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１５の実施形態では、ヌクレオチドの中心ストレッチは、スフィンゴシン１−リン酸と結合するために不可欠である。
【００２７】
第１の態様の第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４および第１５の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１６の実施形態では、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチとヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、任意に互いにハイブリッド形成し、ハイブリッドすると、二本鎖構造が形成される。
【００２８】
第１の態様の第１６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１７の実施形態では、二本鎖構造は、３〜６の塩基対からなる。
【００２９】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６および第１７の一実施形態の実施形態でもある、第１の態様の第１８の実施形態では、核酸分子は、配列番号１２〜２６、４１および４２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号１２、１３、１５、１８、１９、２３〜２６、４１および４２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号１２、１８、２３、２４、４１および４２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
第１の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第１９の実施形態では、核酸分子は、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列またはそれと相同であり、その相同性が少なくとも８５％である１つの核酸分子を含む。
【００３１】
第１の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２０の実施形態では、核酸分子は、配列番号４１に記載のヌクレオチド配列またはそれと相同であり、その相同性が少なくとも８５％である１つの核酸分子を含む。
【００３２】
第１の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２１の実施形態では、核酸分子は、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列またはそれと相同であり、その相同性が少なくとも８５％である１つの核酸分子を含む。
【００３３】
第１の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２２の実施形態では、核酸分子の親和性は、参照核酸分子と比較して増加し、該参照核酸分子は、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含み、かつ該参照核酸分子はリボヌクレオチドからなり、核酸分子は、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号１８に記載のヌクレオチド配列の１つまたは複数のヌクレオチドは、リボヌクレオチドよりはむしろデオキシリボヌクレオチドである。
【００３４】
第１の態様の第２２の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２３の実施形態では、核酸分子は、配列番号２７〜３７、３９および４０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号３０、３４〜３７、３９および４０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号３６、３７、３９および４０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
第１の態様の第２３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２４の実施形態では、核酸分子は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列またはそれと相同であり、その相同性が少なくとも８５％である1つの核酸を含み、該相同核酸はリボヌクレオチドと、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドとを含む。
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３および第２４の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２５の実施形態では、核酸分子は、修飾基を含み、該修飾基を含む核酸分子の生物体からの排泄率は、該修飾基を含まない核酸と比較して、低下する。
【００３６】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３および第２４の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２６の実施形態では、核酸分子は、修飾基を含み、該修飾基を含む核酸分子は、該修飾基を含まない核酸分子と比較して、保持時間が増加する。
【００３７】
第１の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２７の実施形態では、修飾基は、生分解性および非生分解性の修飾体を含む基から選択され、好ましくは、該修飾基は、ポリエチレングリコール、直鎖型ポリエチレングリコール、分岐型ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ペプチド、タンパク質、多糖、ステロール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシアミド、およびポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンを含む群から選択される。
【００３８】
第１の態様の第２７の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２８の実施形態では、修飾基は、好ましくは、直鎖型ポリエチレングリコールまたは分岐型ポリエチレングリコールからなるポリエチレングリコールであり、該ポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは、約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、および最も好ましくは約４０，０００Ｄａである。
【００３９】
第１の態様の第２７の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２９の実施形態では、修飾基は、ヒドロキシエチルデンプンであり、該ヒドロキシエチルデンプンの分子量は、好ましくは、約５０〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは、約１００〜約７００ｋＤａ、および最も好ましくは、２００〜５００ｋＤａである。
【００４０】
第１の態様の第２５、第２６、第２７、第２８および第２９の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３０の実施形態では、修飾基はリンカーを介して核酸分子と結合し、該リンカーは、好ましくは、生分解性リンカーである。
【００４１】
第１の態様の第２５、第２６、第２７、第２８、第２９および第３０の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３１の実施形態では、修飾基は、核酸分子の５’末端ヌクレオチドおよび／もしくは３’末端ヌクレオチド、および／または核酸分子の５’末端ヌクレオチドと該核酸分子の３’末端ヌクレオチドとの間の核酸分子のヌクレオチドと結合する。
【００４２】
第１の態様の第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０および第３１の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３２の実施形態では、生物体は、動物体またはヒトの体、好ましくはヒトの体である。
【００４３】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２．第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１および第３２の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３３の実施形態では、核酸分子のヌクレオチドまたは核酸分子を形成するヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチドである。
【００４４】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２．第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２および第３３の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３４の実施形態では、核酸分子のヌクレオチドまたは核酸分子を形成するヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチドである。
【００４５】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２．第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３および第３４の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３５の実施形態では、核酸分子は、スフィンゴシン１−リン酸を結合することができる少なくとも１つの結合部分を含み、そのような結合部分は、Ｌ−ヌクレオチドからなる。
【００４６】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２．第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４および第３５の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３６の実施形態では、核酸分子は、ある疾患の治療および／または予防のための方法で用いる。
【００４７】
第１の態様の第３６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３７の実施形態では、疾患は、血管新生および／または線維症を抑制することによって治療される、または、寛解する。
【００４８】
第１の態様の第３６および第３７の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３８の実施形態では、疾患は、眼疾患であり、好ましくは、そのような眼疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫をともなう糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症または糖尿病網膜症のいずれかでの網膜色素上皮剥離、増殖性硝子体網膜症、および加齢黄斑変性症または糖尿病網膜症での網膜線維症を含む群から選択される。
【００４９】
第１の態様の第３６の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第３９の実施形態では、疾患は、血管新生および／または増殖を抑制することによって治療される、または寛解する。
【００５０】
第１の態様の第３６、第３７、第３８および第３９の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第４０の実施形態では、疾患は癌であり、好ましくは、そのような癌は、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、前立腺肥大症などの過形成を含む群から選択される。
【００５１】
第１の態様の第３６の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第４１の実施形態では、疾患は炎症性疾患であり、そのような炎症性疾患は、自己免疫疾患、肺炎、敗血症
および人工呼吸器誘発肺損傷などの外傷を含む群から選択される。
【００５２】
第１の態様の第４１の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第４２の実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、喘息および炎症性腸疾患を含む群から選択される。
【００５３】
本発明の根本的な課題は、第２の態様の第１の実施形態でもある第２の態様において、第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子と、任意にさらなる成分とを含む医薬組成物によって解決され、さらなる成分は、医薬的に許容される賦形剤、医薬的に許容される担体、および医薬的に活性な薬剤を含む群から選択される。
【００５４】
第２の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第２の態様の第２の実施形態では、医薬組成物は、第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む。
【００５５】
本発明の根本的な課題は、第３の態様の第１の実施形態でもある第３の態様において、薬物の製造のための第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１および第４２の実施形態のいずれか１つに記載の核酸分子を用いることによって解決される。
【００５６】
第３の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第２の実施形態では、薬物は人間医学、または獣医学で用いられる。
【００５７】
本発明の根本的な課題は、第４の態様の第１の実施形態でもある第４の態様において、診断手段の製造のための第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１および第４２の実施形態のいずれか１つに記載の核酸分子を用いることによって解決される。
【００５８】
第３の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第３の実施形態では、薬物は、眼疾患、癌、または炎症性疾患の治療および／または予防のためである。
【００５９】
第３の態様の第３の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第４の実施形態では、眼疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫を伴う糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症または糖尿病性網膜症のいずれかにおける網膜色素上皮剥離、加齢黄斑変性症または糖尿病性網膜症における増殖性硝子体網膜症および網膜線維症を含む群から選択される。
【００６０】
第３の態様の第３の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第５実施形態では、癌は、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、前立腺肥大症などの過形成を含む群から選択される。
【００６１】
第３の態様の第３の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第６の実施形態では、炎症性疾患は、自己免疫疾患、肺炎、敗血症および人工呼吸器誘発肺損傷などの外傷を含む群から選択される。
【００６２】
第３の態様の第６の実施形態の一実施形態でもある、第３の態様の第７の実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、喘息および炎症性腸疾患を含む群から選択される。
【００６３】
本発明の根本的な課題は、第５の態様の第１の実施形態でもある第５の態様において、第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１および第４２の実施形態のいずれか１つに記載の核酸分子と、脂質とを含む複合体によって解決され、好ましくは、該複合体は、結晶性複合体である。
【００６４】
第５の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第５の態様の第２の実施形態では、脂質は、リン脂質であり、好ましくは、リン脂質は、スフィンゴシン１−リン酸である。
【００６５】
本発明の根本的な課題は、第６の態様の第１の実施形態でもある第６の態様において、脂質を検出するための第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１および第４２の実施形態のいずれか１つに記載の核酸分子を用いることによって解決される。
【００６６】
第６の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第６の態様の第２の実施形態では、脂質は、リン脂質であり、好ましくは、リン脂質はスフィンゴシン１−リン酸である。
【００６７】
本発明の根本的な課題は、第７の態様の第１の実施形態でもある第７の態様において、脂質または脂質の類似体によって媒介される活性のアンタゴニストをスクリーニングする方法によって解決され、該方法は、
前述の脂質および／またはその脂質の類似体によって媒介される活性の候補アンタゴニストを提供するステップと、
第１の態様のいずれか１つの実施形態に定義される核酸を提供するステップと、
前述の脂質および／またはその脂質の類似体によって媒介される活性のアンタゴニストの存在下で、シグナルを供給する試験系を提供するステップと、
前述の脂質によって媒介される活性の候補アンタゴニストが、前述の脂質および／またはその脂質の類似体のアンタゴニストであるかどうかを決定するステップとを含む。
【００６８】
第７の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第２の実施形態では、脂質はリン脂質であり、好ましくは、リン脂質はスフィンゴシン１−リン酸である。
【００６９】
本発明の根本的な課題は、第８の態様の第１の実施形態でもある第８の態様において、第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、第３３、第３４、第３５、第３６、第３７、第３８、第３９、第４０、第４１および第４２の実施形態のいずれか１つに記載の核酸分子を含む脂質を検出するためのキットによって解決され、好ましくは、該脂質は、リン酸脂質であり、より好ましくは、リン酸脂質は、スフィンゴシン１−リン酸である。
【００７０】
本発明の根本的な課題は、第９の態様の第１の実施形態でもある第９の態様において、第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸を試料において検出する方法によって解決され、該方法は、
ａ）第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子の第１の部分と少なくとも部分的に相補的である捕捉プローブと、第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子の第２の部分と少なくとも部分的に相補的である検出プローブとを、またはその代わりに、第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子の第２の部分と少なくとも部分的に相補的である捕捉プローブと、第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子の第１の部分と少なくとも相補的である検出プローブとを提供するステップと；
ｂ）第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子を含有する、または含有すると推定される試料に、捕捉プローブおよび検出プローブを別々に、または組み合わせて添加するステップと；
ｃ）第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子またはその一部と、捕捉プローブおよび検出プローブが同時に、または任意の順番のいずれかで反応できるようにするステップと；
ｄ）ステップａ）で提供される第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子と、捕捉プローブがハイブリッド形成するかどうかを任意に検出するステップと；
ｅ）第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子と、捕捉プローブと、検出プローブとからなる、ステップｃ）で形成される複合体を検出するステップとを含む。
【００７１】
第９の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある、第９の態様の第２の実施形態では、検出プローブは、検出手段を含み、および／または捕捉プローブは、支持体、好ましくは固体支持体に固定化される。
【００７２】
第９の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある、第９の態様の第３の実施形態では、複合体の一部である検出プローブだけがステップｅ）で検出されるように、複合体の一部でないいずれの検出プローブも反応物から除去される。
【００７３】
第９の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある、第９の態様の第４の実施形態では、捕捉プローブおよび検出プローブが、第１の態様のいずれか１つの実施形態で定義される核酸分子またはその一部の存在下で、および前述の核酸またはその一部の非存在下でハイブリッド形成されるとき、ステップｅ）は、検出手段によって生成されるシグナルを比較するステップを含む。
【００７４】
本発明は、以下の驚くべき発見に基づいている：
ａ）脂質、好ましくはリン脂質、より好ましくは、Ｓ１Ｐに特異的に、かつ高親和性で結合する核酸分子を作ることができる；
ｂ）本発明による核酸分子であるそのような核酸分子は、ヌクレオチドの共通配列を共有し、本発明による核酸分子の共通配列は、好ましくは、本発明による核酸分子の結合特性に不可欠であり、より好ましくは、Ｓ１Ｐへの結合特性に不可欠である；
ｃ）脂質に対する、好ましくはリン脂質に対する、より好ましくはＳ１Ｐに対する本発明による核酸分子の結合親和性は、限定された数のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドと置換することによって改善される。
【００７５】
そのような核酸は、好ましくは、本明細書では、本発明による核酸分子、本発明による核酸、本発明に関する核酸、または本発明に関する核酸分子と呼ぶ。
【００７６】
それとは反対に示されない場合、核酸および核酸分子の用語は、本明細書では同義語で用いられる。
【００７７】
本明細書に記述するように、本発明による核酸の特徴は、単独で、または任意の組み合わせのいずれかで核酸が用いられる本発明のいずれの態様でも実現され得る。
【００７８】
脂質、リン脂質および特にＳ１Ｐに対して親和性が高い、短い核酸分子が同定され得るという発見は、脂質、リン脂質および特にＳ１Ｐに結合する核酸分子が同定され得ない限り驚くべきことであるが、しかしペプチド、タンパク質、核酸、小分子、抗生物質、アミノ酸、ヌクレオチドなどの標的の種類のほぼすべてに向けられている核酸分子は、’Ｔｈｅ  ａｐｔａｍｅｒ  ｈａｎｄｂｏｏｋ’（Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，Ｓ．（編集者）；Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第１版−Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００６，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）に記述されるように同定された。脂質、特にリン脂質の構造および電荷は、脂質結合核酸分子の同定が今まで成功しなかった、および／または考慮されることもなかった理由を解明する。Ｓ１Ｐなどのリン脂質は、その無電荷の脂肪族部分と、負の電荷をもつリン酸基とによって主に特徴づけられる。そのような脂質のリン酸基の電荷と負電荷を考慮に入れることで、驚くべきことに、発明者らは、脂質に、より具体的にリン脂質に結合する核酸分子を同定することができた。核酸分子の糖骨格のリン酸塩のために、核酸分子それ自体は、負の電荷をもっている。したがって、核酸分子が別の負の電荷をもつ分子または部分に結合する可能性は、きわめて低い。電荷以外に反発作用も、三次元構造をもつ核酸分子によって標的分子の送到達性に影響を握っている。小分子に結合するいくつかの核酸分子が発表されてきたが、概して、小分子に対する核酸分子の親和性は、ミクロモルの範囲であり（Ｊａｍｅｓ，２０００  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．４８４８−４８７１）、この親和性では、治療用途には不適切である。しかしながら、本発明による最良のＳ１Ｐ結合核酸分子は、ＫＤ値によって表される高結合親和性を示す。これにより、そのような核酸分子がｉｎ  ｖｉｖｏで、より具体的には、哺乳類、好ましくはヒトを治療するまたは診断する方法で用いることが可能になる。好ましくは、本発明による核酸分子のＫＤ値は、１００ｎＭ未満、より好ましくは、５０ｎＭ未満である。ある実施形態では、本発明による核酸分子値のＫＤ値は、５〜５３ｎＭの範囲で定義されるいずれの値以下である。さらなる実施形態では、本発明による核酸分子は、５〜３１ｎＭの範囲で定義されるいずれの値以下であるＩＣ５０値を有する。
【００７９】
本発明による核酸分子は、Ｓ１Ｐ（Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン１−１−リン酸とも呼ばれる）に特異的に結合するが、リン酸基が不足しているＤ−エリスロ−スフィンゴシには結合しない。
【００８０】
Ｓ１Ｐなどの脂質の効果の多くは、相互作用によって、より具体的には、いくつかの脂質受容体、好ましくはＳ１Ｐ受容体、のうちの１つと脂質が結合することによって媒介されると考えられるので、治療的なアプローチは、脂質受容体、特にＳ１Ｐ受容体を標的にすることに焦点を合わせてきた。したがって、本発明による核酸分子が、脂質によって、好ましくは、リン脂質によって、より好ましくはＳ１Ｐによって媒介される活性の好ましくはアンタゴニストであることを、当業者は認識するであろう。多数の異なるＳ１Ｐ受容体のアンタゴニストおよびアゴニストが同定され、記述されてきた。これは、前述の脂質に結合するそれらの受容体のために、これらの脂質が媒介する１活性／複数の活性に影響を及ぼす。それらのＳ１Ｐ受容体は、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４およびＳ１Ｐ５などの種々のＳ１ＰＲに対する特異性と親和性において異なり、したがって種々の機能プロフィルを示す。本発明による核酸分子の利点の一つは、本発明による核酸分子がＳ１Ｐのアンタゴニストであり、それによって単一のＳ１Ｐ受容体に対処すること、より具体的には単一のＳ１Ｐ受容体に結合することよりはむしろ、すべてのＳ１Ｐ受容体の機能を媒介するということである。
【００８１】
本発明による脂質は、好ましくは、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫなど）、モノグリセリド、ジグリセリド、リン脂質、その他を含む群から選択されるが、それに限定されるものではない。
【００８２】
脂質は、大まかに疎水性小分子または両親媒性小分子に定義され得るが、一部の脂質の両親媒性の性質によって、脂質は、水性の環境下でベシクル、リポソーム、または膜などの構造を形成することが可能になる。生体脂質は、完全に、または部分的に、２種類の異なる生化学サブユニットまたは「構成要素」、すなわち、ケトアシル基およびイソプレン基から生ずる。このアプローチを用いて、脂質は、８のカテゴリー、すなわち脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合に由来する）、ステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合に由来する）に分類し得る。
【００８３】
用語「脂質」は、時には脂肪の同義語として用いられるが、しかし脂肪は、トリグリセリドと呼ばれる脂質のサブグループである。脂質も、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリグリセリド、ジグリセリドとモノグリセリドおよびリン脂質を含む）、ならびにコレステロールなどの他のステロール含有代謝産物を包含する。
【００８４】
リン脂質は、脂質の１種類であり、リン脂質は脂質二重層を形成することができるので、すべての細胞膜の主要な成分である。大部分のリン脂質は、ジグリセリド、リン酸基、およびコリンなどの単純な有機分子を含むが、この規則に対する一例外は、グリセロールのその代わりにスフィンゴシンに由来するスフィンゴミエリンである。
【００８５】
スフィンゴ脂質は、脂肪族アミノアルコールスフィンゴシンに由来する脂質の１種類である。時には単にスフィンゴイド塩基として知られている、長鎖塩基は、酵母および哺乳類においてスフィンゴ脂質のデノボ合成の第１の非過渡生成物である。これらの化合物、具体的にはフィトスフィンゴシンおよびジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニンとしても知られている、とはいえこの用語はあまり一般的でない）は、主にＣ１８化合物であり、多少低いレベルのＣ２０塩基を有する。セラミドおよびグリコスフィンゴリピドは、これらの化合物のＮ−アシル誘導体である。スフィンゴシン骨格は、エタノールアミン、セリン、またはコリンなどの（通常）荷電頭部にＯ結合している。この骨格は、脂肪酸などのアシル基にもアミド結合している。
【００８６】
スフィンゴシン１−リン酸（略語Ｓ１Ｐ）は、分子式Ｃ１８Ｈ３８ＮＯ５Ｐを有する３８０ダルトンのリン脂質である。Ｓ１Ｐの同義語には、
Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン−１−リン酸、
４−オクタデセン−１，３−ジオール，２−アミノ−，１−（リン酸二水素），（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４−エン−１−イル  リン酸二水素、
４−オクタデセン−ｌ，３−ジオール、２−アミノ−、１−（リン酸二水素）、（Ｒ−（Ｒ＊，Ｓ＊−（Ｅ）））−、
４−オクタデセン−ｌ，３−ジオール、２−アミノ−、１−（リン酸二水素）、［Ｒ−［Ｒ＊，Ｓ＊−（Ｅ）］］−、
スフィンゴシン−４−エニン１−リン酸、
Ｃ１８−スフィンゴシン１−リン酸、
スフィンゴシン、Ｄ−エリスロ−１−リン酸、
Ｄ−エリスロ−ジヒドロスフィンゴシン１−リン酸、
（２Ｓ，３Ｒ，Ｅ）−２−アミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４−エニル  リン酸二水素、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−オクタデセン−ｌ，３−ジオール１−（リン酸二水素塩）、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アンモニオ−３−ヒドロキシオクタデカ−４−エン−１−イル  リン酸水素、
（Ｅ）−（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−１−ホスホノオキシメチル−ヘプタデカ−３−エニル−アンモニウムがある。
【００８７】
本発明のＳ１Ｐ結合核酸分子は、本明細書でボックスとも呼ばれるヌクレオチドのストレッチに関して特徴づけられることができる。異なる種類のＳ１Ｐ結合核酸は、ヌクレオチドの異なるストレッチを含む。通常は、本発明のＳ１Ｐ結合核酸分子は、それらの５’末端および３’末端にヌクレオチドのストレッチ、すなわちヌクレオチドの第１の末端ストレッチとヌクレオチドの第２の末端ストレッチを含む。ヌクレオチドの第１の末端ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、互いにハイブリッド形成することができ、それによりハイブリッドすると、二本鎖構造が形成される。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは、生理的および／または非生理的条件下で、分子中で必ずしも実現されるものではない。Ｓ１Ｐ結合核酸のヌクレオチドの３つのストレッチ（ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチ、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチ）は、５’→３’の方向に、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ−ヌクレオチドの中心ストレッチ−ヌクレオチドの第２の末端ストレッチと、互いに対して配列される。しかしながら、その代わりに、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの第１の末端ストレッチが、５’→３’の方向に互いに対して配列される。
【００８８】
異なるＳ１Ｐ結合核酸分子間の定義されたボックスまたはストレッチの配列における差異は、Ｓ１Ｐに対する結合親和性に影響する。本発明の異なるＳ１Ｐ結合核酸分子の結合分析に基づいて、中心ストレッチおよびそれらのヌクレオチド配列は、個別で、より好ましくは、それら全体で、ヒトＳ１Ｐに結合するために不可欠である。
【００８９】
本発明による核酸分子またはそのストレッチもしくはその任意の（一部分または複数の）部分は、原理的には互いにハイブリッド形成することができる。そのようにハイブリッドすると、二本鎖構造が形成される。そのようなハイブリダイゼーションは、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で起こり得ることも、または起こらないこともあると当業者は認識するであろう。また、そのようなハイブリダイゼーションの場合、塩基対形成に関する規則に少なくとも基づいた場合、ハイブリダイゼーションが、２つのストレッチの全長にわたって生じ、そのようなハブリダイゼーションおよびしたがって二本鎖構造の形成が、原理的には起こり得ることは、必ずしも当てはまるわけではない。好ましくは本明細書で用いる場合、二本鎖構造とは、２つ以上の別々の鎖または単一の鎖の空間的に分離した２つのストレッチによって形成される分子または構造の一部であり、それによって少なくとも１つの塩基対、好ましくは２つ以上の塩基対が存在し、好ましくはワトソン・クリック塩基対形成の規則に従う塩基対形成である。また、フーグスティーン塩基対形成などの他の塩基対形成が存在し得る、またはそのような二本鎖構造を形成し得ることを、当業者は認識するであろう。
【００９０】
好ましい実施形態では、本明細書で用いる場合、用語「配置」とは、本明細書で開示する核酸分子と関連して、本明細書に記述する構造的もしくは機能的な特徴または要素の順もしくは配列を意味する。
【００９１】
本発明による核酸分子が、本発明の分子をＳ１Ｐと結合させることができることを当業者は認識するであろう。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは想定していることは、Ｓ１Ｐ結合が、個々の核酸分子の三次元構造的な形質または要素の組み合わせの結果生じ、これは、そのような形質または要素を形成するヌクレオチドの配列の方向づけと折りたたみのパターンに起因し、好ましくは、そのような形質または要素は、Ｓ１Ｐ結合核酸分子のヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチ、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチによるということである。個々の形質または要素は、したがって種々の異なる個々の配列によって形成され、その変化の程度はそのような要素または形質が形成する必要がある三次元構造に依存して変わり得ることは、明らかである。核酸分子の全体の結合特性は、種々の要素および形質のそれぞれの相互作用から生じ、最終的には、その標的、すなわちＳ１Ｐによる核酸分子の相互作用、より具体的には結合をもたらす。さらに、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明のＳ１Ｐ結合核酸の特徴である中心ストレッチは、クレームの核酸のＳ１Ｐとの結合を媒介するおよび／または確立するために重要であると思われる。実質的に、本発明による核酸分子は、Ｓ１Ｐの検出に好適である。また、本発明による核酸分子がＳ１Ｐによって媒介される活性のアンタゴニストであることを、当業者は認識するであろう。このため、本発明による核酸分子が、Ｓ１Ｐが関連するか、または起因するいずれの疾患の治療および予防のそれぞれに好適である。科学的な理論的根拠は、Ｓ１Ｐが種々の疾患および状態とそれぞれ関与するかまたは関連することを確証する先行技術から取られることもあり、それを参照によって本明細書に組み込む。
【００９２】
また、本発明による核酸分子は、特定の配列と、好ましくは、本明細書に開示する本発明による核酸分子の配列と実質的に相同である核酸分子を含む。用語「実質的に相同」とは、その相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％であり、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えると理解されるものとする。
【００９３】
本発明による参照ヌクレオチド配列または参照核酸分子と関連して本発明による核酸分子中に存在する相同ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、核酸分子中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。修飾パーセントは、核酸分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づき得る。好ましくは、本発明の核酸分子の相同ヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドを含む群から選択される。
【００９４】
相同性は、当業者に周知のように決定されることができる。より具体的には、配列比較アルゴリズムは、次いで、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較して（１つまたは複数の）試験配列のための配列同一性パーセントを算出する。試験配列は、好ましくは、相同であると言われる、または相同であるかどうかを試験される配列または核酸分子であり、および相同であれば、その相同の程度、別の核酸分子に対する相同性を試験され、それによってそのような別の核酸分子も参照配列と呼ばれる。ある実施形態では、参照配列は、本明細書に記述するように核酸分子、より好ましくは配列番号１２、１８、３６、４１および４２のいずれかに記載の配列を有する核酸分子である。
【００９５】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズの実行をコンピュータで処理することによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって行うことができる。
【００９６】
配列同一性パーセントの決定に好適であるアルゴリズムの一例は、基本的局所アライメント検索ツール”basic local alignment search tool”（以下「ＢＬＡＳＴ」と呼ぶ）で使用されているアルゴリズムであり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”（以下「ＮＣＢＩ」と呼ぶ）を通して公的に入手可能である。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を用いることで配列同一性を決定する際に使用されるデフォルトパラメータは、ＭｉｃＧｉｎｎｉｓら（ＭｃＧｉｎｎｉｓら，２００４）に記述されている。本発明による核酸分子は、本明細書に開示する核酸配列の１つもしくはいくつか、またはその一部を含む核酸分子を含み、好ましくは、核酸分子または前述の一部が、ヒトＳ１Ｐへの結合に関与する程度まで含む。ある実施形態では、そのような核酸分子は、本明細書に記述する核酸分子の１つ、またはその誘導体および／もしくは代謝産物であり、そのような誘導体および／または代謝産物は、本明細書に記述する核酸分子と比較して、好ましくは、切断型核酸分子である。切断は、本明細書に開示するように核酸分子のいずれかの端または両端に関連することもある。また、切断は、核酸分子のヌクレオチドの内側配列に関連があり得る、すなわちそれぞれ、５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間の（１つまたは複数の）ヌクレオチドに関連することもある。さらに、切断は、本明細書に開示する核酸分子の配列からわずかに１つの核酸の欠失を含むこともあろう。また、切断は、本発明の（１つまたは複数の）核酸分子の１つまたは複数のストレッチに関連することもあり、それにより該ストレッチは、わずかに１ヌクレオチド長であり得る。
【００９７】
本発明による核酸分子の結合は、ルーチンの実験を用いることで、または本明細書に記述する、好ましくは本明細書の実施例の部に記述する方法を用いるまたは採用することによって当業者が決定することができる。
本発明による核酸分子は、Ｄ−核酸分子（Ｄ−核酸分子）またはＬ−核酸（Ｌ−核酸分子）のいずれかであってもよい。好ましくは、核酸はＬ−核酸分子である。加えて、核酸分子の１部分もしくはいくつかの部分がＤ−核酸として存在し、または核酸の少なくとも１部分もしくはいくつかの部分がＬ−核酸であることも可能である。用語、核酸分子の「部分」とは、わずかに１ヌクレオチドを意味するものとする。そのような核酸分子は、通常、本明細書では、それぞれＤ−核酸とＬ−核酸を指す。したがって、特に好ましい実施形態では、本発明による核酸分子は、Ｌ−ヌクレオチドからなり、および少なくとも１つのＤ−ヌクレオチドを含む。そのようなＤ−ヌクレオチドは、本発明による核酸を定義するストレッチと異なる一部に、好ましくは該核酸分子の他の部分との相互作用が関連するその部分に、好ましくは付着している。好ましくは、そのようなＤ−ヌクレオチドは、いずれのストレッチの終端に、および本発明によるいずれの核酸分子の終端にそれぞれ付着している。さらに好ましい実施形態では、そのようなＤ−ヌクレオチドは、好ましくは、修飾体またはＰＥＧおよびＨＥＳなどの修飾基を本発明による核酸に付着するスペーサーまたはリンカーとして作用することもある。
【００９８】
それらの（１つまたは複数の）核酸配列に関してそれら全体を本明細書に記述される核酸分子の各々およびいずれかが、（１つまたは複数の）特定のヌクレオチド配列を限定することも、本発明の実施形態である。言い換えれば、用語「含んでいる」または「含む」とはそのような実施形態では、含有している、またはからなるの意味で解釈されるものとする。
【００９９】
本発明による核酸分子が、より長い核酸分子の一部であり、このより長い核酸がいくつかの部分を含み、そのような部分の少なくとも１つが本発明による核酸分子またはその一部であることも本発明の範囲内である。これらのより長い核酸分子の他の（１つまたは複数の）部分は、１つもしくはいくつかのＤ−核酸、または１つもしくはいくつかのＬ−核酸のいずれかであり得る。いずれの組み合わせでも、本発明と関連して用いてもよい。より長い核酸のこれらの他の（１つまたは複数の）部分は、単独またはまとめてのいずれかで、それら全体でまたは特定の組み合わせでのいずれかで、結合、好ましくはＳ１Ｐへの結合と異なる機能を示すことができる。１つの可能な機能としては、１つの分子または他の分子との相互作用を可能にすることであり、それによりそのような１つまたは他の分子は、例えば、固定化、架橋結合、検出または増幅に関して、好ましくは、Ｓ１Ｐと異なる。本発明のさらなる実施形態では、本発明による核酸分子は、個々で、または組み合わせた部分として、本発明の核酸分子のいくつかを含む。また、本発明の核酸分子のいくつかを含むそのような核酸分子は、用語「より長い核酸分子」によって包含される。
【０１００】
明細書で用いる場合、Ｌ−核酸またはＬ−核酸分子は、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１０１】
本明細書で用いる場合、Ｄ−核酸またはＤ−核酸分子は、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１０２】
また、それとは反対を示さない場合、いかなるヌクレオチド配列も、本明細書では５’→３’方向に記載する。
【０１０３】
好ましくは本明細書で用いる場合、ヌクレオチドのいずれの位置も、配列、ストレッチまたはサブストレッチの５’末端に対して決定される、または言及される。したがって、第２のヌクレオチドは、配列、ストレッチおよびサブストレッチ、それぞれの５’末端から数えて２番目のヌクレオチドである。また、それにしたがって、最後から２番目のヌクレオチドは、配列、ストレッチおよびスブストレッチ、それぞれの３’末端から数えて２番目のヌクレオチドである。
【０１０４】
本発明の核酸分子が、Ｄ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドもしくは、例えば、ランダムな組み合わせなどの組み合わせによる両ヌクレオチドの組み合わせ、または少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドと少なくとも１つのＤ−核酸からなる定義された配列のストレッチからなるかどうかとは無関係に、核酸は（１つまたは複数の）デゾキシリボヌクレオチド、（１つまたは複数の）リボヌクレオチドまたはその組み合わせからなり得る。
【０１０５】
Ｌ−核酸分子として本発明による核酸分子を設計することは、いくつかの理由で有利である。Ｌ−核酸分子は、天然に存在する核酸分子のエナンチオマーである。しかし、Ｄ−核酸分子は、ヌクレアーゼが広く存在しているために、水溶液中で、特に生体系または生体試料中であまり安定でない。天然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞由来のヌクレアーゼは、Ｌ−核酸分子を分解する能力がない。このため、Ｌ−核酸分子の生物学的半減期は、動物およびヒトの体を含むそのような系において著しく増加する。Ｌ−核酸の分解性不足のため、ヌクレアーゼ分解産物は、そのようなＬ−核酸分子から生成されず、したがってそこから生ずる副作用は観察されない。この態様のため、Ｓ１Ｐが関わるまたは媒介する疾患および／または障害の治療で用いられるすべての他の化合物についてＬ−核酸分子は事実上、限定されている。ワトソン・クリック塩基対形成とは異なる機序を介して標的分子に特異的に結合するＬ−核酸分子、または部分的にもしくは完全にＬ−ヌクレオチドからなるアプタマー、特に、標的分子へのアプタマーの結合に関与する部分を有するアプタマーは、スピーゲマーとも呼ばれる。
【０１０６】
Ｄ−核酸、Ｌ−核酸またはＤ、Ｌ−核酸として存在するかどうか、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡであるかどうかに関係なく、本発明の本発明に関する核酸分子は、一本鎖核酸または二本鎖核酸として存在し得ることも本発明の範囲内である。典型的には、本発明による核酸分子は、一次配列のため定義された二次構造を示す一本鎖核酸であり、したがって三次構造を形成することもある。しかしながら、本発明による核酸分子は、互いに相補的である、または部分的に相補的である２本の鎖が、互いにハイブリッド形成するという意味で二本鎖であり得る。これは、核酸分子に安定性を与え、特に、核酸分子がＬ型ではなくむしろ天然に存在するＤ型に存在する場合、有利であろう。
【０１０７】
本発明の核酸分子は、修飾されることもる。そのような修飾体は、核酸の単一ヌクレオチドに関連することもあり、当技術分野では周知である。そのような修飾体の例は、特に、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ（２００３）；Ｋｕｓｓｅｒ（２０００）；Ａｕｒｕｐ（１９９４）；Ｃｕｍｍｉｎｓ（１９９５）；Ｅａｔｏｎ（１９９５）；Ｇｒｅｅｎ（１９９５）；Ｋａｗａｓａｋｉ（１９９３）；Ｌｅｓｎｉｋ（１９９３）；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９３）に記述されている。そのような修飾体は、核酸分子が含む個々のヌクレオチドの２’位でのＨ原子、Ｆ原子、またはＯ−ＣＨ３基もしくはＮＨ２基であり得る。また、本発明による核酸分子は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含むことができる。ある実施形態では、本発明による核酸分子は、ＬＮＡヌクレオチドからなる。
【０１０８】
本発明のＳ１Ｐ結合ＲＮＡ分子、すなわち、Ｌ−リボヌクレオチドからなる本発明のＬ−核酸分子において非化学修飾または置換が、本発明による親Ｓ１Ｐ結合ＲＮＡ核酸分子、すなわち、（１つまたは複数の）非化学修飾または（１つまたは複数の）置換を含まないリボヌクレオチドからなる本発明の核酸分子と比較して、本発明のＳ１Ｐ結合ＲＮＡ分子の結合親和性の改善をもたらすことを本発明者らが見いだしたことは驚くべきことである。非化学修飾または置換は、好ましくは、本発明によるＲＮＡ核酸分子、すなわちリボヌクレオチドからなる本発明の核酸分子において１つまたは複数のＬ−リボヌクレオチドを１つまたは複数のＬ−デオキシリボヌクレオチドと置換する群から選択される。
【０１０９】
好ましい実施形態では、Ｓ１Ｐ結合核酸（リボヌクレオチドだけからなるＲＮＡスピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２）の結合親和性は、最高５個までのリボヌクレオチドを最高５個までのデオキシリボヌクレオチドと置換することによって、好ましくは４個のリボヌクレオチドを４個のデオキシリボヌクレオチドと置換することによって改善した。
【０１１０】
ある実施形態では、本発明による核酸分子は、多分割の核酸であり得る。本明細書で用いる場合、多分割の核酸分子は、少なくとも２本の核酸鎖からなる核酸である。これらの少なくとも２本の核酸鎖は、機能単位を形成し、該機能単位は標的分子に対する配位子になる。この少なくとも２本の核酸鎖は、２本鎖を生成するために核酸を切断すること、または本発明の第１の部分、すなわち核酸分子全体に対応する１つの核酸と、本発明に関する核酸分子の第２の部分の核酸分子全体に対応する別の核酸とを合成することのいずれかによって、本発明に関する核酸分子のいずれかに由来し得る。上で例示したように２本以上の鎖を有する多分割の核酸を生成するために、切断および合成を適用し得ることは認識されることになる。言い換えると、少なくとも２本の核酸鎖は、典型的には、互いに相補的であり、かつハイブリッド形成する２本の鎖とは異なるのが、種々の核酸の部分の間では、ある程度の相補性が存在し得る。
【０１１１】
最終的に、本発明による核酸の完全に閉ざされた構造、すなわち環状構造が実現される、すなわち、本発明による核酸は、好ましくは、共有結合を介して閉ざされ、より好ましくは、そのような共有結合が、本明細書に開示する核酸配列の５’末端から３’末端までの間で行われることも本発明の範囲内である。
【０１１２】
本発明者らは、本発明による核酸が非常に有利なＫＤ値範囲を示すということを発見した。
【０１１３】
本発明による核酸の結合定数を決定することは、実施例４および６に記述した表面プラズモン共鳴法を用いることで可能になり、これによって本発明による核酸が有利なＫＤ値範囲を示す。個々の核酸分子間と、本発明の場合Ｓ１Ｐである標的との結合の強度を表すための適切な基準は、いわゆるＫＤ値であり、そのようなものとしてそれを決定するための方法も、当業者には周知である。
【０１１４】
本発明による核酸は、あるＫＤ値によって特徴づけられる。好ましくは、本発明による核酸が示すＫＤ値は、１μＭ未満である。約１μＭのＫＤ値は、核酸の標的との非特異的結合の特徴であると言われている。当業者が認識するように、本発明による核酸などの化合物の群のＫＤ値は、ある特定範囲内にある。約１μＭの上述のＫＤは、好ましいＫＤ値の上限である。標的結合核酸のＫＤの好ましい下限は、約１０ピコモル以上であり得る。Ｓ１Ｐに結合する個々の核酸のＫＤ値が好ましくはこの範囲内であることは、本発明の範囲内である。好ましい範囲は、この範囲内の任意の第１の数およびこの範囲内の任意の第２の数を選択することで定義されることができる。好ましい上限値は、２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好ましい下限値は、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭである。
【０１１５】
本発明による核酸分子は、標的分子に依然として結合できるという条件で任意の長さであってもよい。本発明による核酸の好ましい長さがあることは、当技術分野で認識されるであろう。典型的には、その長さは１５ヌクレオチドと１２０ヌクレオチドとの間である。本発明による核酸の可能な長さは、１５と１２０との間の任意の整数であることを、当業者は認識するであろう。本発明による核酸の長さのより好ましい範囲は、約２０〜１００のヌクレオチド、約２０〜８０のヌクレオチド、約２０〜６０のヌクレオチド、約２０〜５０のヌクレオチドおよび約３０〜５０のヌクレオチドの長さである。
【０１１６】
本明細書に開示する核酸は、好ましくは高分子量部分でありおよび／または好ましくは、特に、動物の体内、好ましくはヒトの体内における滞留時間に関して、核酸の特徴を修飾できるようにする部分を含むことは本発明の範囲内である。そのような修飾の特に好ましい実施形態は、本発明による核酸のＰＥＧ化およびＨＥＳ化である。本明細書で用いる場合、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を表し、およびＨＥＳはヒドロキシエチルデンプンを表す。好ましくは本明細書で用いる場合、ＰＥＧ化は、本発明による核酸の修飾であり、そのような修飾体は、本発明による核酸に付着するＰＥＧ部分からなる。本明細書で用いる場合、ＨＥＳ化は、本発明による核酸の修飾であり、そのような修飾体は、本発明による核酸に付着するＨＥＳ部分からなる。直鎖型ポリ（エチレン）グリコール、分岐型ポリ（エチレン）グリコール、ヒドロキシエチレンデンプン、ペプチド、タンパク質、多糖、ステロール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシアミド、ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン、およびポリエチレングリコールなどの修飾体、ならびにそのような修飾体を用いることによる核酸を修飾するプロセスは、欧州特許出願ＥＰ第１３０６３６２１号に記述されており、その開示を、その全体を参照によって本明細書に組み込む。
【０１１７】
そのように高分子量部分であるＰＥＧの場合、その分子量は、好ましくは約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである。そのように高分子量部分であるＨＥＳの場合、その分子量は、好ましくは約５０〜約１０００ｋＤａ、より好ましくは約１００〜約７００ｋＤａ、最も好ましくは２００〜５００ｋＤａである。ＨＥＳは、０．１〜１．５、より好ましくは１〜１．５のモル置換を示し、かつＣ２／Ｃ６の割合をおよそ０．１対１５、好ましくはおよそ３対１０で表す置換試料を示す。ＨＥＳ修飾のプロセスは、例えば、独国特許出願ＤＥ第１２００４００６２４９．８号に記述されており、その開示を、その全体を参照によって本明細書に組み込む。
【０１１８】
修飾は、原則として、本発明の核酸分子に対して、その任意の位置で行うことができる。好ましくは、そのような修飾は、核酸分子の５’−末端ククレオチド、３’−末端ヌクレオチドおよび／または５’ヌクレオチドと３’ヌクレオチドとの間の任意のヌクレオチドで行われる。
【０１１９】
修飾体および好ましくはＰＥＧ部分および／またはＨＥＳ部分は、直接的にまたはリンカーを介してのいずれかで本発明の核酸部分に付着され得る。本発明による核酸分子が、１つまたは複数の修飾体、好ましくは１つまたは複数のＰＥＧ部分および／またはＨＥＳ部分を含むことも、本発明の範囲内である。ある実施形態では、個々のリンカー分子は、本発明による核酸分子に、複数のＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分を付着させる。本発明と関連して用いられるリンカーは、それ自身が直鎖型または分岐型のいずれかであり得る。この種類のリンカーは、当業者にとって周知であり、国際公開ＷＯ第２００５０７４９９３号およびＷＯ第２００３０３５６６５号にさらに記述されている。
【０１２０】
好ましい実施形態では、前述のリンカーは生分解性リンカーである。生分解性リンカーは、本発明による核酸から修飾体が放出されるために、とりわけ、動物の体内、好ましくはヒトの体内における滞留時間に関して、本発明による核酸の特徴を修飾することを可能にする。生分解性リンカーを使用することで、本発明による核酸の滞留時間をより良好に制御することが可能になる。そのような生分解性リンカーの好ましい実施形態は、国際公開ＷＯ第２００６／０５２７９０号、ＷＯ第２００８／０３４１２２号、ＷＯ第２００４／０９２１９１号、およびＷＯ第２００５／０９９７６８号に記述される生分解性リンカーがあるが、これらに限定されないものとする。国際公開ＷＯ第２００４／０９２１９１号およびＷＯ第２００５／０９９７６８号において、生分解性リンカーは、本明細書に記述する１つまたは２つの修飾体、核酸分子、および介在する生分解性リンカーからなる重合体オリゴヌクレオチドプロドラッグの一部である。
【０１２１】
修飾体または修飾基が生分解性修飾体であり、生分解性修飾体が、直接的にまたはリンカーを介してのいずれかで本発明の核酸分子に付着され得ることは、本発明の範囲内である。生分解性修飾体は、本発明による核酸から修飾体が放出されるために、とりわけ、動物の体内、好ましくはヒトの体内における滞留時間に関して、本発明による核酸の特徴を修飾することを可能にする。生分解性修飾体を使用することで、本発明による核酸の滞留時間をより良好に制御することが可能になる。そのような生分解性修飾体の好ましい実施形態は、国際公開ＷＯ第２００２／０６５９６３号、ＷＯ第２００３／０７０８２３号、ＷＯ第２００４／１１３３９４号、およびＷＯ第２０００／４１６４７号、ＷＯ第２０００／４１６４７号では、好ましくは１８頁、４〜２４行目に記述されるように生分解性であるが、これらに限定されないものとする。
【０１２２】
上述の修飾体以外に、他の修飾体を用いて、本発明による核酸の特徴を修飾することができ、そのような修飾体は、タンパク質、コレステロールなどの脂質、およびアミラーゼ、デキストラン他などの糖鎖の群から選択される。
【０１２３】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明による核酸を、重合体およびより詳細には、本明細書に開示した、好ましくは生理学的に許容される重合体類などの高分子量部分で修飾することによって、排泄速度が変わると思われる。より詳細には、そのように修飾された発明に関する核酸の分子量が増加するため、および核酸が特にＬ型において代謝作用の対象でないために動物の体内から、好ましくは哺乳類の体内から、より好ましくはヒトの体内からの排泄が減少すると思われる。排泄は、典型的には腎臓を介して生じるので、本発明者らは、このように修飾された核酸の糸球体濾過速度が、この種類の高分子量修飾を施してない核酸と比較すると、著しく減少し、体内の滞留時間の増加をもたらすと考える。それと関連して、高分子量修飾にもかかわらず、本発明による核酸の特異性が有害な様式で影響を受けないことは、特に注目すべきことである。その範囲において、本発明による核酸は、驚くべき特徴があり（通常は、医薬的に活性な化合物からは期待できない）、したがって徐放をもたらす医薬製剤は、徐放を与えるために必ずしも必要とされない。むしろ、高分子量部分を含むその修飾型での本発明による核酸は、徐放製剤としてすでに用いられることができる。その範囲において、本明細書に開示する核酸分子の（１つまたは複数の）修飾体と、したがって修飾型核酸分子と、修飾体を含むいずれの組成物とは、明確な薬物動態、好ましくは制御された薬物動態およびその体内分布を与え得る。これは、循環における滞留時間および組織への分布も含む。そのような修飾体は、国際公開ＷＯ第２００３０３５６６５号にさらに記述されている。
【０１２４】
しかしながら、本明細書に開示する核酸が、いかなる修飾も含まず、特にＰＥＧ化またはＨＥＳ化などの高分子量修飾を何ら含まないことも本発明の範囲内であるそのような実施形態は、核酸が、体内における任意の標的器官または標的組織への優先的分布を示す場合、または投与後、体内からの核酸の速やかなクリアランスが望ましい場合、特に好ましい。体内における任意の標的器官または標的組織への優先的分布プロフィルを有する、本明細書に開示する核酸は、核酸の全身濃度を低く保持しながら、標的組織では有効な局所濃度を確立することを可能にするであろう。これは、低用量の使用を可能し、経済的観点から有益であるばかりでなく、核酸薬剤に対する他の組織の不必要な曝露も減少させ、したがって副作用の潜在的リスクを低下させるであろう。本明細書に開示する核酸の投与後の、体内からの速やかなクリアランスは、各本発明による核酸またはこれを含む薬物を使用するｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断または特定の治療的投与の必要性がある場合には、望ましいかも知れない。
【０１２５】
本明細書では本発明による核酸とも呼ばれる本発明に関する核酸、および／または本発明によるアンタゴニストは、薬物の生成または製造で用いてもよい。本発明によるそのような薬物または医薬組成物は、本発明に関する少なくとも１つの核酸を、任意にさらに医薬的に活性の化合物とともに含み、本発明に関する核酸は、好ましくはそれ自体が医薬的に活性な化合物として作用する。好ましい実施形態では、そのような薬物は、医薬的に許容される担体を少なくとも含む。そのような担体は、例えば、水、緩衝液、ＰＢＳ、グルコース溶液であってもよく、好ましくは、５％グルコース平衡塩液、デンプン、糖、ゼラチンまたは任意の他の許容される担体物質であってもよい。そのような担体は、一般に、当業者に知られている。本発明の任意の実施形態、用途および態様または本発明の薬物に関連する任意の実施形態、用途および態様は、本発明の医薬組成物にも適用可能であり、逆もまた同じであることを、当業者は認識するであろう。
【０１２６】
治療および／または予防のために、本発明による、または本発明にしたがって調製された核酸、医薬組成物および薬物を使用することができる兆候、疾患および障害は、それぞれの発症機序においてＳ１Ｐが直接的または間接的にのいずれかでの関与の結果生ずる。
【０１２７】
本発明は、同定によってＳ１Ｐを中和する手段と、Ｓ１Ｐ結合核酸の用途とを提供する。本発明による核酸がヒトおよび動物のＳ１Ｐと相互作用するため、本発明のＳ１Ｐ結合核酸は、本明細書に記述するヒトおよび動物のいかなる疾患の治療、予防および／または診断で用いられる得ることを当業者は理解すると思われる。それと関連して、そのような疾患、障害、および状態の根本的な作用様式に無関係に、本発明の核酸は、本明細書に開示する疾患、障害、または状態の治療および予防で用いられ得ることが認識されることになる。
【０１２８】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、以下において、種々の疾患、障害および状態と関連して、本発明による核酸分子を用いる理論的根拠を提供し、したがって主張する本発明による核酸分子の治療、予防および診断への適用を妥当なものとする。いずれの不必要な繰り返しを避けるために、それと関連して概要を述べるようにＳ１Ｐとその受容体のＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４およびＳ１Ｐ５が関与するため、前述の相互作用は、本発明による核酸分子よって対処することができ、したがって主張する治療、予防および診断の効果が達成されることを、認識すべきである。患者の疾患、障害および状態の詳細な事項、ならびにそれと関連して記述する治療レジメンのいずれの詳細も、本出願の好ましい実施形態の対象となり得ることを、さらに認識すべきである。
【０１２９】
治療および／または予防のために、本発明による、または本発明にしたがって調製された核酸分子、医薬組成物および薬物を使用することができる兆候、疾患および障害は、それぞれの発症機序においてＳ１Ｐが直接的または間接的にのいずれかでの関与の結果生ずる。Ｓ１Ｐの中和は、少なくとも部分的には、Ｓ１Ｐが調節する１つまたは複数の病理過程、例えば、過剰増殖、異常な新血管新生、血管新生、線維形成、線維症、瘢痕、異常な細胞輸送、異常な血管完全性、炎症、および自己免疫応答によって特徴づけられる疾患および状態において有益であり得る。本明細書に表す分類は、記述的な利便性のためであって、本発明を限定するものではない。
【０１３０】
Ｓ１Ｐは、細胞増殖および生存を促進することによって、細胞成長を促進する。このように、Ｓ１Ｐの有効なｉｎ  ｖｉｖｏ濃度を減少させることは、過剰増殖性障害を治療する、または予防する際に有益であると思われる。過剰増殖性障害は、細胞の制御されない激増と関連した疾患および／または障害および／または疾患状態と定義される。Ｓ１Ｐ関連の過剰増殖性障害には、過形成、組織異常増殖、内皮細胞増殖と関連した障害、および線維芽細胞増殖と関連した障害が挙げられる。ほとんどの場合、組織異常増殖は癌である。
【０１３１】
内皮細胞と関連した過剰増殖性障害は、血管新生の疾患をもたらし得る。そのような疾患および状態の例としては、固形腫瘍または血液腫瘍に起因する癌、血管腫、子宮内膜症、肥満、加齢黄斑変性症、および種々の網膜症、ならびにアテローム動脈硬化症の治療でステント留置の結果としての再狭窄に起因する内皮細胞および平滑筋細胞の増殖がある。
【０１３２】
増加している証拠は、Ｓ１Ｐを非常に強力な血管新生促進剤として関係づけている。Ｓ１Ｐは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の走化性運動性を刺激し、かつ多細胞性構造の分化［［Ｌｉｕら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００  １０６：９５１−９６１］を誘発し、かつ新血管新生部位へのＥＣ前駆体の移動［Ａｎｎａｂｉ，  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００３  Ｊｕｌ；  ３１（７）：６４０−９］を促進する。ネズミ抗Ｓ１Ｐ抗体による最近の研究では、抗体によるＳ１Ｐ中和が細胞保護効果と血管内皮細胞の移動を抑制することが種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで示された。Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、同じ抗体は、マウスでのマトリゲルプラグアッセイにおいてＶＥＧＦ誘導血管新生、ならび腫瘍細胞からのＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−６、およびＩＬ−８などの血管新生促進サイトカインの放出を抑制した。ヒト癌細胞を保有する異種移植したマウスにおいて、マウス抗Ｓ１Ｐ抗体による処置は、腫瘍増殖を著しく遅らせた［Ｖｉｓｅｎｔｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００６  Ｍａｒ；９（３）：２２５−３８］。したがって、Ｓ１Ｐに直接的に結合して中和する薬剤は、癌と、加齢黄斑変性症などの網膜および脈絡膜新生血管（Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ２００９，８８：３６７−３７７；Ｓｋｏｕｒａ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７：２５０６−２５１６；Ｘｉｅ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００９，２１８：１９２−１９８）に関連する眼疾患とを含むがこれらに限定されない病状での血管新生促進活性の治療において、Ｓ１Ｐが媒介する影響を無効にするのに有用である。
【０１３３】
線維芽細胞が関与する過剰増殖性障害には、加齢黄斑変性症などの過剰な瘢痕（例えば、線維症）の障害［Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２００９  Ｍａｒ；８８（３）：３６７−７］、心筋と関連する心臓リモデリングおよび心不全［Ｔａｋｕｗａ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｆｅｂ  ｌ；８５（３）：４８４−９３］、強皮症［Ｂｕ，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２０１０  Ｊｕｌ；６２（７）：２１１７−２６］、嚢胞性線維症［Ｕｈｌｉｇ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００８  Ｄｅｃ  １；１７８（１１）：１  １００−１４］、および例えば、手術または損傷、ケロイド、および類線維腫瘍とステント留置の結果として一般に起こる過剰な創傷治癒が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【０１３４】
Ｓ１Ｐは、線維芽細胞移動、増殖を活性化し、かつそれらのコラーゲンの産生を刺激する。したがって、細胞損傷および／または炎症が生じると、損傷した細胞によって局所的に作られたＳ１Ｐは、異常な創傷治癒、線維形成および線維症に関与し得る。したがって、Ｓ１Ｐに直接的に結合して中和する薬剤は、加齢黄斑変性症などの眼疾患、心血管疾患、および強皮症を含むがこれらに限定されない、線維芽細胞の過剰活性または過剰な数と関連する疾患および状態の治療においてＳ１Ｐが媒介する影響を無効にするのに有用である。
【０１３５】
Ｓ１Ｐは、リンパ球の運動性、癒着および輸送を調節する。リンパ組織からのリンパ球の放出は、組織中のＳ１Ｐ低濃度および血行中のＳ１Ｐ高濃度によるＳ１Ｐｎ勾配が続いて起こると思われる。この認知は、Ｓ１Ｐ分解酵素であるＳ１Ｐリアーゼを抑制するとリンパ球減少症に結果としてなることを示す複数の研究によって裏付けられている［Ｓｃｈｗａｂ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，３０９（５７４１）：１７３５−９］。薬物ＦＴＹ７２０（フィンゴリモド）は、Ｓ１Ｐ受容体上で作用することによってリンパ球減少を引き起こし、移植および自己免疫疾患での使用に成功した（ＪａｐｔｏｋおよびＫｌｅｕｓｅｒ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００９  Ｎｏｖ；１０（１１）：１  １８３−９４）。リンパ球に加えて、Ｓ１Ｐも好中球、マスト細胞および樹状細胞などの他の免疫細胞、ならびに線維芽細胞、上皮細胞、周皮細胞および他の細胞型の移動、増殖および生存を、新血管新生および血管透過性を調節するこれらの手段によって刺激する［Ａｎｎａｂｉ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００３  Ｊｕｌ；３１（７）：６４０−９；Ｐａｉｋ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００４  Ｏｃｔ  ｌ；１８（１９）：２３９２−４０３；Ｃｈａｅ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００４，１１４，１０８２−９］。したがって、例えばＳ１Ｐなどの特定のｉｎ  ｖｉｖｏ標的脂質の有効な血漿中濃度を、Ｓ１Ｐ結合核酸分子などの中和剤によって下げることを使用して、炎症部位から離れたエフェクターＴリンパ球を指示することが可能であり、それによって、加齢性黄斑変性症で見られる脈絡膜新生血管などの炎症性成分による自己免疫疾患および眼疾患を含むがこれらに限定されない疾患を治療するのに有用である。
【０１３６】
Ｓ１Ｐは、内皮および上皮のバリアの調節において重要な役割を果たしている［ＭａｒｓｏｌａｉｓおよびＲｏｓｅｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，２００９  Ａｐｒ；８（４）：２９７−３０７］。血管内皮細胞バリアは、間質から血管成分を分離する。これらのバリアが破壊すると、血管浸透性が高くなり、炎症を引き起こし、次いで器官機能に影響を及ぼす。Ｓ１Ｐは、このバリアの完全性を維持する。これは、Ｓ１ＰとＳ１Ｐ１との相互作用によって主に媒介される［Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２００５  Ｏｃｔ；１９（１２）：１６４６−５６；ＦｒｅｉｓｔｒｉｔｚｅｒおよびＲｉｅｗａｌｄ，Ｂｌｏｏｄ．２００５  Ａｐｒ  １５；１０５（８）：３１７８−８４］と考えられるが、他のＳ１ＰＲも同様に関与し得る、Ｓ１Ｐ１の拮抗作用は、血管漏出を誘発する［Ｓａｎｎａら，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００６  Ａｕｇ；２（８）：４３４−４１］ことが示されており、Ｓ１Ｐ１とＳ１Ｐ２との間の平衡が、Ｓ１Ｐが媒介する血管透過性の調節において重要であるという証拠がある。通常の状態で、内皮および上皮のバリアの完全性を維持することは重要であり得、血管透過性が上昇すると、急性肺損傷よび敗血症の一因となる［Ｗａｎｇ，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．，２００９  Ｊａｎ；７７（１）：３９−４５］。他方では、そのようなバリアの一時的な破壊が望ましいまたは有益である疾患または病的状態があり得る。腫瘍性疾患において、血管安定化は、新血管新生および腫瘍転移にとって重要である［Ｐａｉｋ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００４  Ｏｃｔ  １；１８（１９）：２３９２−４０３］。ｓｉＲＮＡによってＳ１Ｐ１の発現を減少させることで、腫瘍異種移植モデルにおいて血管安定性を抑制し、腫瘍増殖の劇的な抑制をもたらす［Ｃｈａｅ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００４，１１４，１０８２−９］。機能的Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストＦＴＹ７２０は、マウス黒色腫モデルにおいてＶＥＧＦ誘導血管透過性、腫瘍血管新生および増殖を抑制することを示した［ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｊａｎ  １；６６（１）：２２１−３１］。さらに、Ｓ１Ｐの一時的な直接中和は、内皮または上皮のバリアの破壊がある病的状態をそのままでまたは１つもしくは複数のさらなる治療薬と併用のいずれかで治療するのに有用である状態において、有益であり得。その治療薬の効果または病的状態の治療は、該バリアのそのような破壊によって増強され得る。直接Ｓ１Ｐ自体に干渉し、このように血管透過性に関しすべての細胞外Ｓ１Ｐ受容体の活性化を阻止する薬剤の効果は、まだ示されてなかった。血管透過性が増加するまたは減少するかどうかは、依然として推測の対象のままである。双方とも上記に示した疾患の治療に対して有用である。
【０１３７】
過剰増殖、新血管新生、血管新生、異所性線維形成、炎症および血管安定性を含む種々の病理過程において生理活性脂質が関与するため、Ｓ１Ｐ結合核酸分子などの中和剤との直接的な相互作用を介してＳ１Ｐの有効なｉｎ  ｖｉｖｏ濃度を下げることは、したがってＳ１Ｐがその状態を引き起こし得る、または一因となり得る。そのような疾患および状態は、全身性、または１つもしくは複数の特異的全体的である可能性があるが、１つ以上の特定の身体系、部分または器官に局在化され得る。そのような方法による治療を受け入れられる疾患または障害のクラスとしては、癌、感染症と炎症、自己免疫障害、脳血管疾患、心血管疾患、眼疾患、人工呼吸誘発肺損傷、皮膚疾患、過剰線維形成および線維症に関連する癌、病的血管新生に関連する疾患または障害、異常な新血管新生に関連する疾患または障害、異常な血管安定性に関連した疾患または障害、および以下にさらに詳細に記述する移植に関連した疾患または障害が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【０１３８】
癌細胞は、常に変異して、進化することによって治療レジメンから逃れることが多く、したがって細胞傷害性薬物または抗血管新生薬に耐性を持つようになる。癌細胞がどのように治療に耐性を持つようになるかの重要な機序は、スフィンゴシンキナーゼ１（ＳｐｈＫ１）のアップレギュレーションに次いで、今度は腫瘍微小環境へのＳ１Ｐの放出である［Ｒａｇｕｚ，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８，９９：３８７−３９１２００８；Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒ，  Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１０，３：５３−６５）。Ｓ１Ｐ媒介化学療法抵抗性の起こり得る機序は、Ｓ１Ｐと、低酸素誘導転写因子（ＨＩＦ）との間のクロストークを含み、低酸素に対する癌細胞の応答はＳ１Ｐ／ＳｐｈＫ系のアップレギュレーションを含む［Ａｄｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９，６８：８６３５−８６４２］。まとめると、Ｓ１Ｐ結合核酸分子などのＳ１Ｐ中和剤によって過剰生成されるＳ１Ｐと結びついた薬物耐性を克服することは、有望なアプローチになり得る。
【０１３９】
異常な血管新生／新血管新生、異常なリモデリング、線維形成、瘢痕および炎症などのＳ１Ｐによって調節される種々の過程は、眼疾患と関連して生じる［Ｅｉｃｈｌｅｒら，（２００６），Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ，  ｖｏｌ  １２：２６４５−６０］。
【０１４０】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、西欧諸国において６０歳以上の患者での失明の主要な原因である［ＢｙｌｓｍａおよびＧｕｙｍｅｒ（２００５），Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｔｏｍ，  ｖｏｌ  ８８：３２２−３４，Ｇｒｙｚｉｅｗｉｃｚ（２００５），Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，  ｖｏｌ  ５７：２０９２−８，ならびにＬｉｕおよびＲｅｇｉｌｌｏ（２００４），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，ｖｏｌ  １５：２２１−６］。ＡＭＤの正確な原因は完全には理解されていないにもかかわらず、脈絡膜新血管（ＣＮＶ）、網膜下線維症、浮腫および炎症などの種々のＳ１Ｐ調節プロセスは、ＡＭＤの病変形成およびＡＭＤ関連失明の一因となる［ＴｅｚｅｌおよびＫａｐｌａｎ（２００４），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，ｖｏｌ  １０：４１７−２０，ならびにＡｍｂａｔｉら，（２００３），Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，ｖｏｌ  ４８：２５７−９３］。ＶＥＧＦは、ＣＮＶ増加と、網膜内および網膜下浮腫の発生をもたらす血管浸透性増加とによるＡＭＤの病変形成の一因となる。したがって、現在の治療は、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の硝子体内注入によるＶＥＧＦの抑制に焦点を合わせている。増加する証拠タは、滲出型（湿性）ＡＭＤ関連ＣＮＶ、線維形成および炎症におけるＳ１Ｐの役割を示唆している。Ｓ１Ｐは、血管新生部位に上皮細胞の動員を誘導し、かつ初期の血管構造の生成を刺激する［Ｌｅｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９９，２６４：７４３−７５０］。またＳ１Ｐは、ＶＥＧＦ非依存的様式で、上皮細胞と壁細胞との間にＮ−カドヘリンが媒介する接合部の形成を促進する［Ｐａｉｋ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００４  Ｏｃｔ  ｌ；１８（１９）：２３９２−４０３］。Ｓ１Ｐは、さらに、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦなどの血管新生促進因子を交差活性化することによって新血管新生を補助する［Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３，１００：１０６６４−９］。Ｓ１Ｐと、ＴＧＦｂ、ＰＤＧＦなどの線維化促進因子および結合組織増殖因子およびＳ１Ｐを介する網膜色素上皮細胞によるコラーゲン発現の誘発とのクロストークは、ＡＭＤ関連線維形成におけるＳ１Ｐの役割を強く示唆している［Ｘｉｎ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４，２７９：３５２５５−３５２６２；Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９１：１８００−１８０３；Ｋａｔｓｕｍａ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２００５，５７９：２５７６−２５８２；Ｓｗａｎｅｙ，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ２００８，８７：３６７−３７５］。加えて、Ｓ１Ｐが媒介する炎症性イベントがＡＭＤの病変形成の一因となるという証拠が蓄積されている。マクロファージの全身枯渇によりレーザー誘導ＣＮＶを減弱させ［Ｓａｋｕｒａｉ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００３，４４：３５７８−３５８５］、かつ抗Ｓ１Ｐ抗体を中和することでマクロファージ浸潤を減少させた［Ｘｉｅ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００９，２１８：１９２−１９８］。さらに、Ｓ１Ｐは、Ｃ５ａ作用の主要な下流メディエーターとして意味づけられており［Ｖｌａｓｅｎｋｏ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５，１７４��６４５６−６４６１］、眼の炎症性プロセスは、例えばＡＭＤの間に生じるので、Ｃ５ａ−Ｓ１Ｐ−軸が眼の炎症性プロセスに決定的に関与し得ることを示唆している。これらのデータと一致して、滲出型ＡＭＤのモデルであるブルック膜のレーザー誘導破壊の後に、抗Ｓ１Ｐ抗体を中和する硝子体内注射によって、ＣＮＶ形成と網膜下線維症を阻止した［Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ２００９，８８：３６７−３７７；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ２００９，５０：２２４５−２２５７］。さらに、単回投与第Ｉａ相臨床試験では、抗体を中和するＳ１Ｐは、一部の患者において新血管構造の退行をもたらし、これは単回投与後の抗ＶＥＧＦ治療で見られなかった効果である［Ｓａｂｂａｄｉｎｉ，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１６２（６）：１２２５−３８］。まとめると、Ｓ１Ｐ結合核酸分子などの、Ｓ１Ｐの硝子体内濃度を下げる中和剤は、新血管新生、線維症および炎症と関連した滲出型ＡＭＤおよび他の眼疾患の治療に有望なアプローチになるであろう有力な証拠である。
【０１４１】
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、糖尿病患者においてよく見られる合併症である。ＤＲは、虚血型網膜症であり、したがって網膜血流障害によって特徴づけられる。ＤＲの病状は、最終的に眼内大量出血、小部分の網膜剥離および血管透過性の増加をもたらし得るＶＥＧＦ駆動型網膜血管新生を含む。新血管形成、血管透過性および線維症におけるＳ１Ｐの役割は、Ｓ１Ｐを拮抗することがＤＲの治療にとって有益であり得ることを示唆した。実際、ラットにおいて、ＳＰＨＫの小分子アンタゴニストによるＳ１Ｐ形成の抑制により、ＶＥＧＦ誘導血管新生およびストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症における網膜血管漏出の初期イベントが減弱した［Ｍａｉｎｅｓ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００６，４７：５０２２−５０３１］。糖尿病性網膜症患者における視力障害の主な原因の１つは、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）の発現である。ＶＥＧＦ誘導血管新生および血管漏出は、ＤＭＥ発現および進行に広く関与する［Ａｉｅｌｌｏ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９７，４６：１４７３−１４８０］。したがって、抗ＶＥＧＦ抗体（ラニビズマブ、ルセンティス）治療は、ＤＭＥにおいて成功し、［Ｍａｓｓｉｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．  ２０１０，３３（１１）：２３９９−４０５］最近、認可された。抗Ｓ１Ｐ抗体の中和のＶＥＧＦ媒介血管新生および血管漏出への効果［ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６  Ｊａｎ  １；６６（１）：２２１−３１；Ｖｉｓｅｎｔｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００６  Ｍａｒ；９（３）：２２５−３８］を考慮すると、Ｓ１Ｐ結合核酸分子などの、硝子体内および網膜の濃度を下げる中和剤は、ＤＭＥの治療にとって有望なアプローチになることが予想される。
【０１４２】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）剥離は、ＡＭＤおよびＤＲなどの新血管新生、血管浸透性の上昇、および線維形成の刺激に関連する眼疾患に二次的に生じる。Ｓ１Ｐは、レーザー誘導損傷後、ＲＰＥによって強くアップレギュレートされる［Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ２００９，８８：３６７−３７７］。ＲＰＥ剥離でのＳ１Ｐに拮抗する有益な効果の証拠は、薬効の証拠は、モノクローナル抗Ｓ１Ｐ抗体ソネプシズマブについての第Ｉ相臨床試験によって提供される。潜在性疾患の患者は、ＲＰＥ剥離の回復、すなわち抗ＶＥＧＦ治療について検討されなかった効果を経験した［Ｓａｂｂａｄｉｎｉ，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１６２（６）：１２２５−３８］。
【０１４３】
増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）は、網膜剥離の最も頻度の高い合併症である。ＰＶＲ病態生理は、最終的に網膜の過剰な瘢痕をもたらす。Ｓ１Ｐと、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−６、およびＩＬ−８などの増殖因子との間の記述したクロストーク、およびこれらの因子上で抗Ｓ１Ｐ抗体を中和する抑制効果［Ｖｉｓｅｎｔｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００６，ｖｏｌ  ９：１−１４；ＭｉｌｓｔｉｅｎおよびＳｐｉｅｇｅｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００６，ｖｏｌ  ９：１４８−１５０］を考慮し、ＰＶＲで見られる過剰な瘢痕および機能的Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストＦＴＹ７２０の、これらの同じ重要なメディエーターへの周知の効果、ならびに網膜剥離の患者においてソネプシズマブの治療効果［Ｓａｂｂａｄｉｎｉ，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１６２（６）：１２２５−３８］を最終的にもたらす病態生理を考慮すると、Ｓ１Ｐ結合核酸分子などの、Ｓ１Ｐの硝子体内濃度を下げる中和剤は、ＰＶＲの治療の有望なアプローチになると予想される。
【０１４４】
網膜線維症は、ＡＭＤおよびＤＲにおいて光受容体および失明の回復不可能な損傷をもたらす。このプロセスは、現在利用できる治療法によって、対処されない。滲出型ＡＭＤのモデルでのブルック膜のレーザー誘導破壊において、抗Ｓ１Ｐ抗体を中和すると、ＣＮＶ形成を阻止した［Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ２００９，８８：３６７−３７７］。
【０１４５】
未熟児網膜症（ＲＯＰ）のモデルにおいて、Ｓ１Ｐ２欠損マウスは、硝子体腔において病的血管新生の減少を示した［Ｓｋｏｕｒａ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７：２５０６−２５１６］。虚血誘導血管新生のＲＯＰモデルにおいて、抗Ｓ１Ｐ抗体を中和すると、網膜血管新生および血管の漏れやすさを効果的に阻止した［Ｘｉｅ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００９  ２１８：１９２−１９８］。抗Ｓ１Ｐ抗体を中和すると、ＲＯＰの間、マクロファージの浸潤をさらに制限することができた［Ｘｉｅ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００９，２１８：１９２−１９８］。
【０１４６】
眼圧の上昇は、緑内障において主要なリスク因子である。Ｓ１Ｐは、ブタおよびヒトの眼において房水流出能を低下減少させ、したがって流出抵抗および眼圧を増加させた［Ｍｅｔｔｕ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００４  Ｊｕｌ；４５（７）：２２６３−７１；Ｓｔａｍｅｒ，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２００９  Ｄｅｃ；８９（６）：９８０−８］。Ｓ１Ｐ２受容体活性化は、従来の流出抵抗を増加させる［Ｓｕｍｉｄａ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｆｅｂ  ２］。このように、異常な新血管新生（例えばS1P結合核酸分子）によってSIPの硝子体内の集中を減らすことは、緑内障の治療のための有望なアプローチである。
【０１４７】
Ｓ１Ｐの知られている多面的効果およびＶＥＧＦと、関連する増殖因子と、サイトカインとのＳ１Ｐの相互作用を考慮すると、Ｓ１Ｐの有効な眼球濃度を下げることは、病理的網膜血管新生のＶＥＧＦ駆動型増殖と関連する虚血網膜症を抑制するのに有効であることが予想される。これらには、鎌状赤血球網膜症、網膜静脈閉塞疾患、黄斑パッカ（セロハン網膜症）、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、および網膜血管新生疾患が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【０１４８】
異常新血管新生または血管新生によって特徴づけられる他の眼状態には、少なくとも１つには、コンタクトレンズ過剰装着；単純ヘルペス、帯状ヘルペスおよび原虫感染症を含む角膜感染症：翼状片；感染性ぶどう膜炎；角膜移植後のリンパ脈管新生および移植拒絶反応；慢性網膜剥離；かすみ、角膜実質瘢痕および退行などの屈折矯正手術の合併症；鎌状赤血球網膜症；静脈閉塞疾患；網膜血管腫増殖；および特発性ポリープ状脈絡膜脈管障害が挙げられる。
【０１４９】
炎症性または免疫成分による他の眼疾患には、慢性硝子体炎、自己免疫網膜ぶどう膜炎、アレルギー結膜炎、春季カタル、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、および原虫感染症［Ｃｉｕｌｌａら，（２００１），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，ｖｏｌ  １２：４４２−９］および他の眼ヒストプラスマ症が挙げられる。
【０１５０】
Ｓ１Ｐは、瘢痕の調節に関与している。前眼部の瘢痕は、外傷（空気中の破片から、例えば外科手術から生じ得る鈍的外傷、および化学薬品までの範囲の種々の危険を引き起こす原因から生じる）［Ｄａｒｔら（２００３），Ｅｙｅ，ｖｏｌ  １７：８８６−９２］、眼部瘢痕類天疱瘡（ＯＣＰ）（慢性的に瘢痕ができる（瘢痕形成）自己免疫疾患）、主に結膜に影響を及ぼす自己免疫疾患）、スティーヴンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、および中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）（薬物に対する重篤な有害反応）、翼状片（結果として失明することがあり得る眼瞼裂の間に起こる翼のような三角形膜；ＶＥＧＦは、翼状片の発現において、重要な役割を果たすことがある［Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙら（１９９６），Ｃｏｒｎｅａ，ｖｏｌ  １５：５３７−５４０，およびＬｅｅら，（２００１），Ｃｏｒｎｅａ，ｖｏｌ  ２０：２３８−４２］に関与する。
【０１５１】
Ｓ１Ｐは、過形成の間、細胞増殖を促進して、アポトーシスから保護することによって、過剰増殖を促進する。
【０１５２】
異常増殖とは、異常な、制御されない、かつ混乱した細胞成長をいう。ほとんどの場合、異常増殖は癌である。いくつかの一連の証拠は、それは、細胞運命を決定する、スフィンゴシンとセラミドに関するＳ１Ｐのバランスであることを示唆する［Ｍｏｒｉｔａら，２０００，ＭｅｌｅｎｄｅｚおよびＫｈａｗ，２００２；ＢａｕｍｒｕｋｅｒおよびＰｒｉｅｓｃｈｌ，２０００］。癌細胞は、ＳＰＨＫ１をアップレギュレートし、それによって腫瘍微小環境におけるＳ１Ｐ濃度を増加させることが示された［Ｐｙｎｅ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０，１０：４８９−５０３］。乳腺腺癌、組織球白血病、グリア芽細胞腫異種移植、およびＡＭＬ異種移植のモデルにおいて、ＳＰＨＫ１の発現が低下すると、腫瘍増殖が減少したＳＰＨＫの乳癌細胞および低分子インヒビターにおいて細胞周期停止およびアポトーシスが誘発される［Ｓａｂｂａｄｉｎｉ，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１６２（６）：１２２５−３８］。
【０１５３】
動物モデルからのこれらの結果と一致して、ＳＰＨＫは、固形腫瘍、特に、乳房、結腸、肺、卵巣、胃、子宮、腎臓、前立腺、および直腸の腫瘍の患者において過剰発現した［Ｆｒｅｎｃｈら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：５９６２−５９６９，２００３；Ｆｙｒｓｔ，  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１０，４８９−４９７］。ＳＰＨＫの発現の増加は、いくつかの癌の種類の患者において生存率の著しい低下と相関する［Ｓａｂｂａｄｉｎｉ，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１６２（６）：１２２５−３８］。Ｓ１Ｐ中和抗体は、癌細胞系、すなわち、Ａ５４９、ＨＴ−２９、ＭＣＦ−７細胞の増殖を抑制し、それらの侵襲性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのドキソルビシン誘導アポトーシスに対するそれらの抵抗性が示された［Ｖｉｓｅｎｔｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００６  Ｍａｒ；９（３）：２２５−３８］。
【０１５４】
その過剰増殖作用に加えて、Ｓ１Ｐは、新血管新生、血管新生および転移を促進する。これらは、癌病理学において重大なプロセスである。最も強力な血管新生促進剤の１つとしてＳ１Ｐを関係づける、増加している最近の証拠は、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦなどの薬剤とＳ１Ｐを直接的に比較する研究から来ている。Ｓ１Ｐは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＤＮＡ合成および走化性運動性を刺激するが、その一方で多細胞性構造の分化を誘導し、そのすべてが初期の血管形成においてＳ１Ｐの役割を示唆している（Ａｒｇｒａｖｅｓら，２００４；Ｌｅｅら，１９９９；Ｌｉｕら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００  １０６：９５１−９６１）。また、Ｓ１Ｐは、骨髄由来ＥＣ前駆体の新血管新生部位への移動を促進する（Ａｎｎａｂｉ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００３  Ｊｕｌ；３１（７）：６４０−９）。Ｓ１Ｐ１を過剰発現させる細胞は、抗血管新生剤サリドマイドおよびネオバスタットに抵抗性である（Ａｎｎａｂｉ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００３  Ｊｕｌ；３１（７）：６４０−９）。加えて、Ｓ１Ｐと、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＬ−８などの他の血管新生促進増殖因子との間に実質的なクロストークが存在することが示された。例えば、Ｓ１Ｐは、ＥＧＦ（Ｓｈｉｄａら，２００４）とＶＥＧＦ２受容体（Ｓｐｉｅｇｅｌ＆Ｍｉｌｓｔｉｅｎ，２００３）をトランス活性化し、およびＶＥＧＦは、Ｓ１Ｐ１受容体発現をアップレギュレートする（Ｉｇａｒａｓｈｉら，２００３）。また、Ｓ１Ｐ１と「ＶＥＧＦ軸」を介して作用する、Ｓ１Ｐは、後肢血管新生および新血管新生に必要とされる（Ｃｈａｅら，２００４）。抗血管新生薬であるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、化学療法との併用で大腸癌の治療のために認可された。Ｓ１Ｐは、転移に関与していることも示された［Ｔａｋｕｗａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００２，１５８２：１１２−１２０］。
【０１５５】
機能的Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストＦＴＹ７２０は、肝細胞癌、急性転化慢性骨髄性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病／リンパ腫および肺腫瘍のモデルにおいて腫瘍増殖および腫瘍関連血管新生を抑制した［Ｈｏ，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００５，４：１４３０−１４３８；Ｎｅｖｉａｎｉ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７：２４０８−２４２１；Ｌｉｕ，Ｂｌｏｏｄ  ２００８，１１１：２７５−２８４；Ｌｕｃａｓ  ｄａ  Ｓｉｌｖａ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８，７：９−１５］。これらの研究は、Ｓ１Ｐの腫瘍促進機能の腫瘍大部分が、その細胞表面受容体によって媒介されることを強く示唆しているにもかかわらず、そのＳ１Ｐは、しかも細胞内二次メッセンジャーとして作用すると考えられるべきである［Ｈａｉｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９，３２５：１２５４−１２５７；Ａｌｖａｒｅｚ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０，４６５：１０８４−１０８８］。Ｓ１Ｐは、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素の直接的な細胞内リガンドとして同定さえた。これはしかも癌の発現および進行において関係づけられる［Ｈａｉｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９，３２５：１２５４−１２５７］。
【０１５６】
中和抗Ｓ１Ｐ抗体は、腫瘍増殖および腫瘍関連血管新生を著しく阻止した。抗体は、マウスマトリゲルプラグアッセイにおいて、ｂＦＧＦ誘導血管新生およびＶＥＧＦ誘導血管新生を抑制し、および該抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞からの血管新生促進成長因子（ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−６）の放出を抑制した。それは、乳癌、卵巣癌のマウスモデルにおいて、肺腺癌異種移植モデルにおいて、およびマウス黒色腫の同種移植モデルにおいて腫瘍の進行を抑制した［Ｖｉｓｅｎｔｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００６  Ｍａｒ；９（３）：２２５−３８］。過形成は、正常な組織または器官の細胞の過剰増殖と呼ばれる。臨床的に関連する例は、良性の前立腺肥大である。Ｓ１Ｐの過剰増殖作用は、過形成と関連していた。Ｓ１Ｐ含有量減少をもたらすフェノクソディオールは、異なる種類の癌および前立腺癌で試験された［Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｅｄｗａｒｄｓ  ｐｒｅｓｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  Ｊｕｎｅ  １，２０１０］。
【０１５７】
要するに、Ｓ１Ｐの過剰増殖、血管新生および転移への関与の有力な証拠がある。病変形成への個々の過程にかかわりなく、Ｓ１Ｐ結合核酸分子などの中和剤によるＳ１Ｐの直接標的によって、ほとんどの種類の腫瘍および癌などの過剰な増殖、血管新生、転移、およびアポトーシスに対する抵抗性によって特徴づけられる疾患の有効な治療を提供すると予想される。
【０１５８】
Ｓ１Ｐは、リンパ球の運動性、接着性および輸送を調節する。Ｓ１Ｐは、リンパ器官からのリンパ球の放出および炎症部位でのそれらの保持を調節する［Ｍａｔｌｏｕｂｉａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００４，４２７，３５５−３６０；Ｌｅｄｇｅｒｗｏｏｄ，Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，９，４２−５３］。このように、血漿Ｓ１Ｐレベルが減少すると、結果としてリンパ球減少症になり、したがって病原性Ｔリンパ球を炎症部位から移動させ、それによって炎症性疾患の治療において有用になる［Ｓｃｈｗａｂ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，３０９（５７４１）：１７３５−９；ＪａｐｔｏｋおよびＫｌｅｕｓｅｒ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００９  Ｎｏｖ；１０（１１）：１１８３−９４］。さらに、Ｓ１Ｐは、プロスタグランジン、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６などの炎症促進因子の産生を誘導することが示された［Ｌａｉ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８，１８１：８０１０−１７；Ｌａｉ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９，１８３：２０９７−２１０３］。
【０１５９】
ＦＴＹ７２０は、ｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸化されて、すべてのＳ１Ｐ受容体（１、３、４、および５）に対するアゴニストとして役立つ。次に、ＦＴＹ７２０によってＳ１Ｐ受容体が活性化されると、細胞表面で利用可能な受容体がダウンレギュレートされる。これにより、非応答の細胞がＳ１Ｐに提供され、リンパ組織からのリンパ球の放出を阻止し、ＦＴＹ７２０の免疫抑制作用がもたらされる［Ｍａｎｄａｌａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９６：３４６−３４９；Ｇｒａｌｅｒ，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２００４，１８：５５１−５５３］。ＦＴＹ７２０は、種々の自己免疫モデルにおいて有効性を示し、多発性硬化症の治療のために認可されている。
【０１６０】
Ｓ１ＰおよびＳ１Ｐ１受容体の発現により、変形性関節炎の患者と比較して、滑膜関節リウマチにおいて滑膜表層細胞、血管内皮細胞、および炎症性単核細胞がアップレギュレートされることが報告されている［Ｋｉｔａｎｏ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００６  Ｍａｒ；５４（３）：７４２−５３；Ｌａｉ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８  Ｄｅｃ  ｌ；１８１（１１）：８０１０−７］。コラーゲン誘導関節炎のモデルでは、スフィンゴシンキナーゼインヒビターは、疾患重症度を著しく抑制し、関節炎症および関節破壊を減少させた［Ｌａｉ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８  Ｄｅｃ  ｌ；１８１（１１）：８０１０−７］。これと一致して、機能的Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストＦＴＹ７２０は、関節リウマチのＳＫＧマウスモデルにおいて骨破壊を抑制した［Ｔｓｕｎｅｍｉ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０  Ａｕｇ；１３６（２）：１９７−２０４］。
【０１６１】
Ｓ１Ｐ受容体機能的アンタゴニストＦＴＹ７２０の免疫抑制性作用のため、Ｓ１Ｐ結合核酸分子などの中和剤で、Ｓ１Ｐの有効なｉｎ  ｖｉｖｏ濃度を下げると、紅斑性狼蒼、乾癬、およびアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患の治療にとって有益であることが示唆される［Ｈｅｒｚｉｎｇｅｒ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００７；８（６）：３２９−３６］。
【０１６２】
Ｓ１Ｐの全身投与は、マウスにおいて気管支過感受性を増加させることが示された［Ｒｏｖｉｅｚｚｏ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｍａｙ；４２（５）：５７２−７］。吸入による機能的Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストＦＴＹ７２０0の局所投与は、喘息のアレルギー性気道炎症マウスモデルを抑制した［Ｉｄｚｋｏ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００６，１１６：２９３５−２９４４；Ｎｉｓｈｉｕｍａ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００８  Ｊｕｎ；２９４（６）：Ｌ１０８５−９３］。
【０１６３】
ＳＰＨキナーゼ欠乏マウスは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のモデルにおいて、発症した疾患を著しく寛解させた［Ｓｎｉｄｅｒ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００９  Ｊａｎ；２３（１）：１４３−５２］。これと一致して、機能的Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストＦＴＹ７２０は、マウスＩＢＤモデルにおいて、疾患の発症を効率的に抑制した［Ｄｅｇｕｃｈｉ，Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２００６  Ｏｃｔ；１６（４）：６９９−７０３］。
【０１６４】
低用量で、機能的Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストＦＴＹ７２０は、内皮バリア機能を増強し、人工呼吸器誘発肺損傷（ＶＩＬＩ）のマウスモデルにおいて肺透過性を低下させることが示された（Ｍｉｉｌｌｅｒ，Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１１  Ｍａｒ  ２３，  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）。このように、有効な肺Ｓ１Ｐ濃度を低下させると、炎症を抑制し、肺炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または肺高血圧症（ＰＡＨ）などの異なる臨床的に関連する状態において肺内皮バリア機能を増強し得る。スフィンゴシンキナーゼの抑制とそれによって有効なＳ１Ｐレベルの減少が、外傷および出血ショックの後の肺損傷を寛解させ得るというさらなる証拠がある［Ｌｅｅ，Ｊ  Ｔｒａｕｍａ．２００４，５７（５）：９５５−６０］。
【０１６５】
細菌産物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト貪食細胞において、ならびに敗血症患者においてＳｐｈＫ１発現および機能を増加させる。ＳｐｈＫ１を遮断する、ヒト貪食細胞においてＬＰＳ誘導サイトカイン産生を抑制して、敗血症マウスの生存を増加させた。重要なことに、敗血症の生存に関する抗生物質治療の治療効果は、ＳｐｈＫ１遮断によって増強された［Ｐｕｎｅｅｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１０  Ｊｕｎ  ４；３２８（５９８３）：１２９０−４］。
【０１６６】
臓器移植の動物モデルにおいて、Ｓ１Ｐ１アンタゴニストは皮膚および心臓同種移植の生存を延ばし、かつ慢性拒絶反応を減弱させた［Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５，１１１，２２２−２２９］。同様に、機能的Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストＦＴＹ７２０は、角膜移植の同所移植マウスモデルにおいて、および角膜異種移植のラット−マウスモデルにおいて移植片生着を著しく延ばした［Ｚｈａｎｇら，（２００３），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｖｏｌ  ７６：１５１１−３；Ｓｅｄｌａｋｏｖａら，（２００５），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｖｏｌ  ７９，２９７−３０３］。
【０１６７】
１型糖尿病の養子移植マウスモデルにおいて、機能的Ｓ１Ｐアンタゴニストのフィンゴリモドは、疾患進行を遅らせた［Ｍｏｒｒｉｓ，  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２０１１  Ｍａｒ；４４（２）：  １１５−２８］。
【０１６８】
フィンゴリモドによる治療は、炎症性前立腺炎のモデルにおいて、炎症性浸潤と組織破壊を著しく減少させた［Ｚｈａｎｇ，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１  Ｆｅｂ  １５］。
【０１６９】
機能的Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストＦＴＹ７２０による治療は、ストレプトゾトシン処置ラットにおいてタンパク尿および細管損傷を著しく減少させた。これは、Ｓ１Ｐ結合核酸分子などの中和剤によるＳ１Ｐの抑制が糖尿病性腎症に有益であり得ることを示す。
【０１７０】
スフィンゴシンキナーゼ−２の抑制は、ラットにおいてヨード酢酸ナトリウム誘導変形性関節炎に伴う膝関節の組織学的損傷および疼痛を減弱すると報告された［Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１１；８７（３−４）：１３５−４３］。
【０１７１】
Ｓ１Ｐ２受容体シグナル伝達は、アテローム性動脈硬化症の病変形成に関係した［Ｓｋｏｕｒａ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ．２０１１  Ｊａｎ；３１（１）：８１−５］。
【０１７２】
ＳＰＨＫ１が過剰発現しているマウスは、心筋線維症を伴う重度の心臓リモデリングを示す［Ｔａｋｕｗａ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２００９，８５：４８４−４９３］。抗Ｓ１Ｐ抗体を中和すると、原発性心臓線維芽細胞によって、コラーゲン産生を抑制する［Ｇｅｌｌｉｎｇｓ  Ｌｏｗｅ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２００９，８２：３０３−３１２］。
【０１７３】
したがって、治療および／または予防のために本発明による薬物を用いてもよい疾患および／または障害および／または疾患状態は、以下が挙げられるがこれらに限定されるものではない：
ａ）眼疾患、好ましくは、加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫を伴う糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症または糖尿病性網膜症のいずれかにおける網膜色素上皮剥離、加齢黄斑変性症または糖尿病性網膜症における増殖性硝子体網膜症および網膜線維症を含む群から選択されるような眼疾患、
ｂ）癌、好ましくは、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、前立腺肥大などの過形成を含む群から選択されるような癌、
ｃ）炎症性疾患、好ましくは、そのような炎症性疾患は、自己免疫疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、喘息、炎症性腸疾患、肺炎、敗血症、および人工呼吸器誘発肺損傷などの外傷を含む群から選択され、好ましくは、自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、喘息、および炎症性腸疾患を含む群から選択される。
【０１７４】
さらなる実施形態では、薬物は、さらなる医薬的に活性な化合物を含む。
【０１７５】
その代わりに、または加えて、そのようなさらなる医薬的に活性な化合物は、本発明によるさらなる核酸である。その代わりに、薬物は、Ｓ１Ｐと異なる標的分子に結合する、または本発明による核酸の１つと異なる機能を示す、少なくともあと１つの核酸を含む。好ましくは、そのような少なくともあと１つの核酸は、本明細書に開示するさらなる医薬的に活性な化合物のうちの１つまたはいくつかと同じような、または同一の機能を示す。
【０１７６】
該薬物は、原則として、前述の疾患の治療のための薬物の用途と関連して、開示されるいずれの疾患の予防のために、その代わりに、または加えて用いられることも本発明の範囲内である。それぞれのマーカー、したがって、それぞれの疾患のマーカーは、当業者にとって周知である。好ましくは、それぞれのマーカーは、Ｓ１Ｐである。
【０１７７】
本発明の薬物の一実施形態では、そのような薬物は、本明細書に開示する疾患、特に、本発明の薬物が用いられることになる疾患のいずれかのための他の治療と併用で用いる。
【０１７８】
本発明による組成物は、別の治療薬または治療レジメントと組み合わせて投与されることも可能である。加えて、中和剤を介してのＳ１Ｐの調節は、血管透過性の一時的な調節を誘導するのに有用であり、そのような併用治療を介して増加するまたは改善する効果のある第２の治療用薬剤による治療を可能するまたは増強する。
【０１７９】
本発明による薬物は、第２の薬物または第２の医薬的に活性な薬剤との組み合わせで癌の治療および／または予防に用いられてもよく、第２の薬物または第２の医薬的に活性な薬剤は癌細胞を損傷する、破壊するおよび／または標識する。そのような第２の薬物または第２の医薬的に活性な薬剤は、好ましくは、以下を含む群から選択されるが、これらに限定されるものではない：
ａ）リツキシマブ（標的はＣＤ２０）、セツキシマブ（標的は上皮増殖因子受容体）、イブリツモマブ−チウキセタン（標的はＣＤ２０）、トシツモマブ（標的はＣＤ２０）、トラスツズマブ（標的はＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ベバシズマブ（標的はＶＥＧＦ）などの抗体：
ｂ）アルキル化剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ドキソルビシン、メルファラン）;
ｃ）プリンアザチオプリン、メルカプトプリン、フルダラビンなどの代謝拮抗薬；
ｄ）ビンカアルカロイドなどの植物アルカロイド植物、タキサン、好ましくはドセタキセル、パクリタキセル、ポドフィロトキシン、エポチロンなどの植物テルペノイド；
ｅ）カンプトセシン、イリノテカンなどの;トポイソメラーゼインヒビター；および
ｆ）ロイコボリン、メトトレキセート、タモキシフェン、ソラフェニブ、レナリドミド、ボルテゾミブ、デキサメサゾン、フルオロウラシルなどのその他の薬剤。
【０１８０】
本発明による薬物は、第２の薬物または第２の医薬的に活性の薬剤との組み合わせで眼疾患の治療および／または予防に用いられてもよく、第２の薬物または第２の医薬的に活性な薬剤は、好ましくは、以下を含む群から選択されるが、これらに限定されるものではない：
ａ）カルシニュリンインヒビター、サイクロスポリン、メトトレキセート、アザチオプリン、タクロリムス、ラパマイシン、クロラムブシル、レフルノミド、ミコフェノール酸モフェチル、ブレキナル、ミゾリビン、サリドマイド、またはデオキシスパガリンなどの免疫系を抑制することが知られている薬剤；プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、デキサメサゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、エファーブセント、またはブデソニドのようなコルチコステロイド；
ｂ）抗炎症性または抗血管新生の生物製剤は、組み合わせて用いることができる。例えば、ＩＬ−１０、エルリズマブ（ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、トレルマブ、リツキシマブ、ゴミリキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ＨｕＭａｘ−ＴＡＣ、ビシリズマブ、ＨｕＭａｘＣＤ４、クレノリキシマブ、ＭＡＸ１６Ｈ５、ＴＮＸ１００、フォントリズマブ、Ｊ６９５（抗ＩＬ１２）、ＨｕＭａｘＩＬ−１５、メポリズマブ、エルシリモマブ、ＨｕＤＲＥＧ、アナキンラ、Ｘｏｍａ−０５２、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブ、アフェリモマブ、ＣｙｔｏＦａｂ、ＡＭＥ５２７、バパリキシマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ビタキシン、ベリムマブ、ＭＬＮ１２０２、ボロシキシマブ、Ｆ２００（抗α５β１）、エファリズマブ、ｍ６０．１１（抗ＣＤ１１ｂ）、エタナーセプト、オネルセプト、ナタリズマブ、またはシプリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ＡＢＴ−８７４、ＶＥＧＦトラップアイ。
【０１８１】
「併用療法」（または「同時療法」）は、本発明の薬物と、特定の治療レジメンの一部としての少なくとも第２の薬剤との投与を含み、これらの治療薬、すなわち、本発明の薬物と、前述の第２の薬剤との相互作用からの有益な効果を提供するように意図される。この組み合わせの有益な効果としては、治療薬の組み合わせから生じる薬物動態学的または薬力学的な相互作用が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの治療薬の組み合わせでの投与は、典型的には、定義した期間（通常、選択される組み合わせに応じて、分、時間、日または週）にわたり行われる。
【０１８２】
「併用療法」は、一般にはそうでないが、偶発的かつ任意に本発明の組み合わせを生じる別々の単独療法レジメンの一部として、これらの治療薬のうちの２つ以上の投与を包含することを意図し得る。「併用療法」は、これらの治療薬を順次、投与すること、すなわち、各治療薬を異なる時期に投与すること、ならびにこれらの治療薬、または該治療薬のうち少なくとも２つを実質的に同時に投与することを包含することを意図する。実質的な同時投与は、例えば、対象者に、各治療薬を一定の比率で含む単一のカプセル剤を投与する、または各々の治療薬のついて単一のカプセル剤を複数投与することによって達成することができる。
【０１８３】
各治療薬の順次投与または実質的な同時投与は、これらに限定されるものではないが、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を介しての直接的な吸収を含む任意の適切な経路によって達成されることができる。複数の治療薬は、同じ経路で、または異なる経路で投与されることができる。例えば、選択された組み合わせの第１の治療薬は、注射によって投与され、一方、組み合わせの他の治療薬は局所的に投与されてもよい。
【０１８４】
その代わりに、例えば、すべての治療薬は、局所的に投与されてもよく、またはすべての治療薬は、注射によって投与されてもよい。治療薬が投与される順番は、特に明記しない限り厳密な重要性はない。「併用療法」は、上述の治療薬と、さらに他の生物学的に活性な成分との組み合わせでの投与も包含し得る。併用療法が非薬物療法をさらに含む場合、治療薬と、非薬物療法の組み合わせの相互作用から有益な効果が達成される限り、該非薬物療法は、任意の適切な時期に行われてもよい。例えば、適切な場合は、非薬物療法が、該治療薬の投与から一時的、好ましくは数日または数週間の間、除かれる場合でも、有益な効果は依然として達成される。
【０１８５】
上記の一般用語で概要を述べたように、本発明による薬物は、原則として、当業者に周知のいずれの形態で投与されることができる。好ましい投与経路は、全身投与であり、より好ましくは非経口投与による、好ましくは注射による経路である。代わりとして、該薬物は、局所投与されてもよい。他の投与経路は、筋肉内、腹腔内、および皮下、経口、鼻腔内、気管内、または肺からの経路であり、優先権が与えられる投与経路は、侵襲性が最も少ないが、確実に効率の良い経路である。
【０１８６】
非経口投与は、通常、皮下、筋肉内、または静脈内への注射および注入で用いられる。さらに、非経口投与の１つのアプローチは、徐放性または持続放出性のシステムの埋め込みを使用することである。これは、一定レベルの投与量を確実に維持し、当業者にとって周知の投与経路である。
【０１８７】
さらに、本発明の好ましい薬物は、好適な鼻腔内ビヒクル、すなわち吸入剤の局所的使用を介して鼻腔内用形態で、または当業者には周知の経皮皮膚パッチの形態を用いる経皮経路を介して投与されることもできる。経皮送達系の形態で投与されるために、投与量は、もちろん、投与計画全体を通して、断続的ではなくむしろ連続的投与される。他の好ましい局所製剤としては、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアゾールスプレー剤およびゲル剤が挙げられる。
【０１８８】
本発明の薬物は、通常、これに限定されものではないが、医薬的に許容される媒剤中に溶解したまたは分散した本発明の核酸分子を含む、治療の（１つまたは複数）活性成分の有効量を含む。医薬的に許容される媒質または担体には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬活性物質のためにそのような媒剤および薬剤を用いることは、当技術分野では周知である。補助的な活性成分も、本発明の薬物に組み込むことができる。
【０１８９】
さらなる態様では、本発明は医薬組成物に関する。そのような医薬組成物は、本発明による少なくとも１つの核酸と、好ましくは医薬的に許容されるビヒクルとを含む。そのようなビヒクルは、当技術分野で使用されているおよび／または知られている任意のビヒクルまたは任意の結合剤であってもよい。より具体的には、そのような結合剤またはビヒクルは、本明細書に開示する薬物の製造と関連して記述するいずれの結合剤またはビヒクルである。さらなる実施形態では、医薬組成物は、さらなる医薬的に活性な薬剤を含む。
【０１９０】
薬物および医薬組成物の調製は、本開示を考慮すると、当業者にとって理解されるであろう。典型的には、そのような組成物は、溶液剤または懸濁液剤のいずれかで注射剤として；注射より前に、溶液中の、または懸濁液中の好適な固形剤として；経口投与のための錠剤または他の固形剤として；持続放出カプセル剤として；または点眼剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、吸入剤などを含む現在使用されるいかなる他の形態にでも調製され得る。外科医、医師またはヘルスケア従事者が手術野の特定の区域を扱うために、生理食塩水をベースにした洗浄剤などの滅菌製剤を使用することも、特に有用であり得る。また、組成物は、微小デバイス、微小粒子またはスポンジを介して送達され得る。
【０１９１】
製剤後、薬物は、投与製剤に適合した様式で、かつ薬理学的に有効である量で投与される。製剤は、上述の種類の注射剤などの種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤なども使用することができる。
【０１９２】
本発明の薬物は、持続放出型および徐放型の錠剤またはカプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤、および乳剤などの経口剤形で投与されることもできる。坐薬は、脂肪乳剤または脂肪懸濁剤から調製される。
【０１９３】
医薬組成物または薬物は、無菌化され、および／または保存剤、安定化剤、湿潤剤、または乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩類および／または緩衝剤などのアジュバントを含有してもよい。加えて、医薬組成物は、他の治療的に有益な物質を含むこともある。医薬組成物は、従来の混合方法、顆粒化、またはコーティング方法で調製され、かつ典型的には、活性成分を約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％を含有する。
【０１９４】
液体組成物、特に注射用組成物は、例えば、溶解させ、分散させることなどによって調製される。活性化合物は、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセリン、エタノールなどの医薬的純溶媒に溶解される、または該溶媒と混合され、それによって注射剤または懸濁注射剤を形成する。さらに、注射に先立つ液体に溶解させるのに好適な固形剤を、製剤化することができる。
【０１９５】
本発明の薬物および核酸分子は、それぞれ、小さな単層ベシクル、大きな単層ベシクルおよび多層状ベシクルなどのリポソーム送達系の形状で投与されることもできる。リポソームは、種々のリン脂質から形成でき、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含む。一部の実施形態では、脂質成分の被膜を、薬物の水溶液と水和させて、脂質層を形成し、薬物をカプセルに包む。これは、当業者には周知の技術である。例えば、本明細書に記述する核酸分子は、当技術分野で知られている方法を用いて構築した親油性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として提供されることができる。さらに、細胞死滅を媒介することを標的とし、かつ内部に細胞傷害性薬物を保有するためのそのような核酸分子をリポソームはその表面に有し得る。核酸関連の複合体の例は、米国特許第６，６０１１，０２０号に記載されている。
【０１９６】
また、本発明の薬物および核酸分子は、それぞれ、標的化可能な薬物担体として可溶性重合体に結合され得る。そのような重合体としては、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルーメタクリルアミドーフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンを含むことができる。さらに、本発明の薬物および核酸分子は、それぞれ、例えば、ポリ乳酸、ポリε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、および架橋結合したもしくは両親媒性ブロック共重合体のハイドロゲルなどの薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性重合体の種類に結合され得る。
【０１９７】
本発明による核酸の有効な血漿レベルは、本明細書に開示するいずれかの疾患の治療において、好ましくは、５００μＭ〜２００μＭ、好ましくは１ｎＭ〜２０μＭ、より好ましくは５ｎＭ〜２０μＭ、最も好ましくは５０ｎＭ〜２０μＭにわたる。
【０１９８】
本発明の核酸分子および薬物は、それぞれ、好ましくは毎日１回、２日もしくは３日に１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回または３カ月に１回投与されてもよい。
【０１９９】
本明細書に記述する薬物が、本明細書に開示する医薬組成物を構成することも本発明の範囲内である。
【０２００】
さらなる態様では、本発明は、そのような治療を必要とする対象者の治療のための方法に関し、該方法は、本発明による核酸のうちの少なくとも１つの医薬的に有効な量を投与することを含む。ある実施形態では、対象者は、ある疾患を患うか、またはそのような疾患を発症するリスクがあり、前述の疾患は本明細書に開示するいずれかであり、具体的には、本発明による核酸のうちのいずれかをある薬物の製造で用いることに関連して開示する疾患のいずれかである。
【０２０１】
本発明による核酸ならびにアンタゴニストは、薬物としてまたは薬物の製造で用いられるだけでなく、具体的には、炎症をおこした皮膚の局所病変においてＳ１Ｐを介入させることに関して、美容目的でも用いることができることを理解すべきである。したがって、本発明による核酸、薬物および／または医薬組成物を用いることができる治療または予防のさらなる状態または疾患は、炎症を起こした皮膚の局所病変である。
【０２０２】
好ましくは本明細書に用いる場合、診断もしくは診断薬もしくは診断手段は、直接的にまたは間接的にのいずれかでＳ１Ｐを、本明細書に記述するように好ましくはＳ１Ｐを、より好ましくは本明細書に記述する種々の障害および疾患に関連して、本明細書に記述するＳ１Ｐを検出するのに好適である。診断薬は、本明細書に記述するいずれの障害および疾患のそれぞれの検出および／または経過観察に好適である。そのような検出は、本発明による核酸のＳ１Ｐとの結合を介して可能である。そのような結合は、直接的にまたは間接的にのいずれかで検出され得る。それぞれの方法および手段は、当業者には周知である。特に、本発明による核酸は、本発明による核酸の検出、好ましくはＳ１Ｐに結合した核酸の検出を可能にする標識を含む。そのような標識は、放射性標識、酵素標識のおよび蛍光標識を含む群から、好ましは選択される。原則として、抗体のために開発されたすべての既知のアッセイを本発明による核酸のために採用することができ、他方では標的結合抗体を標的結合核酸に置き換える。非標識標的結合抗体を用いる抗体アッセイでは、検出は、好ましくは、放射性標識、酵素標識および蛍光標識で修飾され、かつそのＦｃフラグメントで標的結合抗体に結合する二次抗体によって行われる。核酸、好ましくは、本発明による核酸の場合、該核酸はそのような標識で修飾され、好ましくは、そのような標識はビオチン、Ｃｙ−３およびＣｙ−５を含む群から選択され、およびそのような標識は、そのような標識に対して作られた抗体、例えば、抗ビオチン抗体、抗Ｃｙ３抗体または抗Ｃｙ５抗体によって検出され、または該標識がビオチンの場合、該標識は、自然にビオチンに結合するストレプトアビジンまたはアビジンによって検出される。そのような抗体、ストレプトアビジンまたはアビジンは、今度は、それぞれの標識、例えば、放射性標識、酵素標識または蛍光標識によって好ましくは修飾される（ニ次抗体のように）。
【０２０３】
さらなる実施形態では、本発明による核酸分子は、第２の検出手段によって検出または分析され、該検出手段は、分子ビーコンである。分子ビーコンの方法論は、当業者には周知であり、Ｍａｉｒａｌらによって概説されている（Ｍａｉｒａｌら，２００８，Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎｌ  Ｃｈｅｍ  ３９０（４），９８９−１００７）。
【０２０４】
本発明による核酸を用いてＳ１Ｐを検出すると、具体的に、本明細書に定義したＳ１Ｐの検出が可能になることが認識されるであろう。
【０２０５】
Ｓ１Ｐの検出と関連して、好ましい方法は、以下のステップを含む：
（ａ）Ｓ１Ｐの存在を試験する試料を提供すること、 
（ｂ）本発明による核酸を提供すること、
（ｃ）好ましくは反応容器中で、該核酸と、該試料とを反応させること、
ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）より前に行われる、またはステップ（ｂ）はステップ（ａ）より前に行われることができる。
【０２０６】
好ましい実施形態では、核酸によって試料の反応を検出することを含む、さらなるステップｄ）が提供される。好ましくは、ステップｂ）の核酸は、表面に固定化される。該表面は、反応試験管、プレートのウェル、または例えばビーズなどの反応容器などに含まれるデバイスの表面であってもよい。該表面への核酸の固定化は、非共有結合または共有結合を含むがこれらに限定されるものではない、当業者に周知のいずれの手段によって行われることもできる。好ましくは、共有結合は、該表面と該核酸との間の共有化学結合を介して確立される。しかしながら、核酸が表面に間接的に固定化され、そのような間接的な固定化が、さらなる成分または一対の相互作用パートナーの使用を含むことも本発明の範囲内である。そのようなさらなる成分は、好ましくは、固定化される核酸と特異的に相互作用し、相互作用パートナーとしても呼ばれ、かつこのようにして核酸の該表面への付着を媒介する化合物である。相互作用パートナーは、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む群から、好ましくは選択される。好ましくは、相互作用パートナーは、抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。あるいは、相互作用パートナーは、核酸であり、好ましくは、機能的核酸である。より好ましくは、そのような機能的核酸は、アプタマー、スピーゲルマー、および該核酸と少なくとも部分的に相補的である核酸を含む群から選択される。さらに別の実施形態では、核酸の表面への結合は、多分割の相互作用パートナーによって媒介される。そのような多分割の相互作用パートナーは、好ましくは、一対の相互作用パートナー、または第１のメンバーと第２のメンバーとからなる相互作用パートナーであり、該第１のメンバーは、核酸に含まれるか、もしくは核酸に付着しており、および第２のメンバーは、表面に付着しているか、もしくは表面に含まれる。多分割の相互作用パートナーは、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、およびビオチンとニュートラアビジンを含む相互作用パートナーの対の群から、好ましくは選択される。好ましくは、相互作用パートナーの対の第１のメンバーは、ビオチンである。
【０２０７】
そのような方法の好ましい結果は、Ｓ１Ｐと核酸の固定化複合体を形成し、より好ましくは、前述の複合体が検出される。該複合体からＳ１Ｐが検出されることも実施形態の範囲である。
【０２０８】
この必要性に応じて各検出手段は、例えば、Ｓ１Ｐのそのパートナー／それらのパートナーに特異的である任意の検出手段である。特に好ましい検出手段は、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む群から選択される検出手段であり、その生成は、当業者には周知である。
【０２０９】
Ｓ１Ｐの検出のための方法も、好ましくはステップｃ）を行った反応容器から試料を取り出すことを含む。
【０２１０】
さらなる実施形態では、該方法は、Ｓ１Ｐの相互作用パートナーをある表面、好ましくは上記に定義した表面に固定化するステップも含み、相互作用パートナーは、本明細書で、好ましくはそれぞれの方法に関連して上記のように定義され、およびより好ましくは、それらの種々の実施形態での核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む。本実施形態では、特に好ましい検出手段は、本発明による核酸であり、そのような核酸は、好ましくは標識されても、または非標識でもよい。そのような核酸が標識される場合、該核酸は直接的、または間接的に検出される。また、そのような検出は、好ましくは、本明細書に記述する種々の実施形態での核酸、ポリペプチド、タンパク質および実施形態を含む群からも選択される第２の検出手段の使用を含み得る。そのような検出手段は、好ましくは、本発明による核酸に特異的である。より好ましい実施形態では、第２の検出手段は、分子ビーコンである。好ましい実施形態では、核酸もしくは第２の検出手段のいずれかまたは両方とも、検出標識を含み得る。該検出標識は、ビオチン、ブロモデソキシウリジン標識、ジゴキシゲニン標識、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性標識、およびキレーター分子を含む群から、好ましくは選択される。あるいは、第２の検出手段は、好ましくは、該核酸に含有される、含まれる、または該核酸に付着する検出標識と相互作用する。特に好ましい組み合わせは以下の通りである：
検出標識はビオチンであり、および第２の検出手段はビオチンに対して作られる抗体であり、または
検出標識はビオチンであり、第２の検出手段は、アビジンもしくは分子を保有するアビジンであり、または
検出標識はビオチンであり、および第２の検出手段は、ストレプトアビジンもしくは分子を保有するストレプトアビジンであり、または
検出標識はビオチンであり、および第２の検出手段は、ニュートラアビジンもしくは分子を保有するニュートラアビジンであり、または
検出標識はブロモデソキシウリジンであり、および第２の検出手段はブロモデソキシウリジンに対して作られる抗体であり、または
検出標識はジゴキシゲニンであり、および第２の検出手段はジゴキシゲニンに対して作られる抗体であり、または
検出標識はキレーターであり、および第２の検出手段は放射性核種であり、前述の検出標識が核酸に付着されることが好ましい。この種の組み合わせは、核酸が表面に付着される実施形態にも適用できることが認識されることになる。そのような実施形態では、検出標識が相互作用パートナーに付着されることが好ましい。
【０２１１】
最後に、第２の検出手段は、第３の検出手段を用いて検出され、好ましくは、第３の検出手段は酵素であり、より好ましくは第２の検出手段が検出されると、酵素反応を示し、または第３の検出手段は、放射線、より好ましくは放射性核種によって放射される放射線を検出するための手段である。好ましくは、第３の検出手段は、第２の検出手段を特異的に検出するおよび／または第２の検出手段と相互作用する。
【０２１２】
また、Ｓ１Ｐの相互作用パートナーが表面に固定化され、かつ本発明による核酸が、好ましくは該相互作用パートナーと該Ｓ１Ｐとの間に形成された複合体に添加される実施形態では、試料は、反応から、より好ましくは、ステップｃ）および／またはｄ）が行われる反応容器から取り除かれることができる。
【０２１３】
ある実施形態では、本発明による核酸は、蛍光部分を含み、および蛍光部分の蛍光は、該核酸とＳ１Ｐおよび遊離Ｓ１Ｐとの間に複合体が形成されと異なる。
【０２１４】
さらなる実施形態では、核酸は本発明による核酸の誘導体であり、核酸の誘導体は、アデノシンを置換する少なくとも１つのアデノシンの蛍光誘導体を含む。好ましい実施形態では、アデノシンの蛍光誘導体は、エテノアデノシンである。
【０２１５】
さらなる実施形態では、本発明による核酸の誘導体と、Ｓ１Ｐとからなる複合体は、蛍光を用いて検出される。
【０２１６】
方法のある実施形態では、シグナルは、ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）で生成され、好ましくは、該シグナルは試料中のＳ１Ｐの濃度と相関する。
【０２１７】
好ましい態様では、アッセイは、９６ウェルプレートで行われ得る。該プレートでは、成分は、上述のように反応容器中および反応容器として作用するウェル中で固定化される。
【０２１８】
本発明に関連する核酸は、創薬の出発物質としてさらに用いられ得る。基本的に、可能なアプローチが２つある。一アプローチは、化合物ライブラリーのスクリーニングであり、他方では、そのような化合物ライブラリーは、好ましくは低分子量化合物のライブラリーである。ある実施形態では、該スクリーニングは、高スループットスクリーニングである。好ましくは、高スループットスクリーニングは、標的ベースのアッセイにおいて化合物の高速で、効率的な試行錯誤の評価である。最高の場合、該分析は測色測定である。それと関連して用いられるライブラリーは、当業者には周知である。
【０２１９】
化合物ライブラリーのスクリーニングの場合は、当業者には周知の競合アッセイなどを用いることによって、適切なＳ１Ｐ類似体、Ｓ１ＰアゴニストまたはＳ１Ｐアンタゴニストが見つけられこともある。そのような競合アッセイは、以下のように構成されることもある。本発明に関連する核酸、好ましくは、標的結合Ｌ−核酸であるスピーゲルマーは、固相に結合する。Ｓ１Ｐを同定するために、Ｓ１Ｐ標識したＳ１Ｐ類似体をアッセイに加えてもよい。可能性のある類似体は、それぞれの標的によって得られるシグナルの減少にしたがうスピーゲルマーに結合しているＳ１Ｐ分子と競合する。アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングは、当業者に周知の細胞培養アッセイを用いることを含む。
【０２２０】
本発明によるキットは、好ましくは脂質の検出のため、より好ましくはＳ１Ｐの検出のために、少なくとも１つまたはいくつかの本発明に関する核酸を含んでもよい。さらに、該キットは、少なくとも１つまたはいくつかの陽性対照もしくは陰性対照を含んでよい。例えば、陽性対照は、Ｓ１Ｐ、具体的には、本発明に関する核酸がそれに対して選択され、または、好ましくは液体形状でそれに結合するＳ１Ｐであってもよい。陰性対照は、例えば、Ｓ１Ｐと同様の生物物理学的特性に関して定義されるが、本発明に関する核酸によって認識されないペプチドであってもよい。さらに、前述のキットは、１つまたはいくつかの緩衝剤を含んでもよい。種々の成分は、乾燥させた形状でもしくは凍結乾燥した形状でまたは液体に溶解させてキットに含まれてもよい。該キットは、１つまたは複数の容器を含んでおり、次にそれにはキットの１つまたは複数の成分が含まれ得る。さらなる実施形態では、該キットは、そのキットの使用方法および種々の成分についてのユーザ情報を記載する説明書または説明リーフレットを含む。
【０２２１】
本発明による核酸の医薬的および生物学的な決定は、基本的には、ヒト身体および非ヒト身体のいくつかの種類のホルモン、組織および器官におけるその薬物動態プロファイルおよび生体機能プロファイルのアセスメントに関する。そのような目的のために、本明細書に開示する検出方法または当業者に周知の検出方法のいずれも用いられてもよい。本発明のさらなる態様では、本発明による核酸の検出のためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを提供する。検出アッセイ内では、捕獲プローブおよび検出プローブが用いられる。該捕獲プローブは、本発明による核酸の第１の部分に対して、および検出プローブは、第２の部分に対して相補的である。捕獲プローブは表面またはマトリックスに固定化される。検出プローブは、好ましくは、本明細書の前述のように検出されることができるマーカー分子または標識を保有する。
【０２２２】
本発明による核酸の検出は、以下のように行われることができる：本発明による核酸は、捕獲プローブのその両端のうちの１端と、および他端は検出プローブとハイブリッド形成する。その後、非結合検出プローブは、例えば１ステップまたはいくつかのステップでの洗浄によって取り除かれる。好ましくは、標的またはマーカー分子を保有する検出プローブの結合量を、続いて、例えば、国際公開第ＷＯ／２００８／０５２７７号により詳細に概略を述べられているように測定することができ、これを参照によって本明細書に組み込む。
【０２２３】
好ましくは本明細書で用いる場合、好ましい実施形態では、用語「治療」は、さらに、またはその代わりに予防および／または経過観察を含む。
【０２２４】
好ましくは本明細書で用いる場合、用語「疾患」および「障害」は、それとは反対に示されない場合、互換的に使用されるものとする。
【０２２５】
本明細書で用いる場合、用語「含む」は、そのような用語に続く、または該用語によって記述される主題を限定しないことを意図する。しかしながら、代替実施形態では、用語「含む」は、「含有している」の意味で理解され、したがってそのような用語に続く、または該用語によって記述される主題を限定すると理解されるものとする。
【０２２６】
本発明による核酸分子および本明細書に用いる標的分子Ｓ１Ｐの種々の配列番号、化学的性質、その実際の配列および参照番号を、以下の表にまとめる。
【０２２７】
【表１】
0005941904.tif 000002
0005941904.tif 000003
0005941904.tif 000004
0005941904.tif 000005
【０２２８】
さらなる特徴、実施形態および利点が引き出される得る図、実施例および配列表によって、本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】Ｓ１Ｐ結合核酸の配列アライメントを示す。
【図２】Ｓ１Ｐ結合核酸２１５−Ｆ９−００１およびその誘導体の最小結合配列を示す。
【図３】Ｓ１Ｐ結合アプタマー２１５−Ｆ９−００１（Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００１とも称す）の直接および競合プルダウンアッセイによる分析の結果を示す。
【図４】スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００１−５’−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｓ９２とも称す）および２１５−Ｆ９−００２−５’−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｓ９１とも称す）のＥＤＧ３受容体によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養抑制アッセイにおけるＳ１Ｐ活性への影響を示す。
【図５】スピーゲルマーＮＯＸ−Ｓ９２（２１５−Ｆ９−００１−５’−ＰＥＧとも称す）およびＮＯＸ−Ｓ９３（２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２−５’ＰＥＧとも称す）のｉｎ  ｖｉｖｏでのＳ１Ｐ活性への影響を示し、ＮＯＸ−Ｓ９２およびＮＯＸ−Ｓ９３は、Ｓ１Ｐへの結合のためにリンパ球減少症を誘発した。
【図６】リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）および少なくとも１つの２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）からなるＳ１Ｐ結合スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００２（Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２とも称する）の誘導体を示す。
【図７】リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）および少なくとも１つの２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）からなるＳ１Ｐ結合スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００２（Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２とも称する）の誘導体内で行われた競合スピーゲルマープルダウンアッセイの結果を示す。８ｎＭのビオチン化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐに結合する０．３ｎＭの放射活性物質で標識したＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇを図のように５０ｎＭの非標識スピーゲルマーと３７℃で競合させた（３通りで）。
【図８】図８Ａはリボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）および少なくとも１つの２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）からなるＳ１Ｐ結合スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００２（Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２とも称する）の誘導体の競合スピーゲルマープルダウンアッセイの結果を示す。８ｎＭのビオチン化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐに結合する０．３ｎＭの放射活性物質で標識したＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇを図のように３６ｎＭの非標識スピーゲルマーと３７℃で競合させた（３通りで）。図８Ｂはリボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）および少なくとも１つの２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）からなるＳ１Ｐ結合スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００２（Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２とも称する）の誘導体の競合スピーゲルマープルダウンアッセイの結果を示す。７ｎＭのビオチン化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐに結合する０．５ｎＭの放射活性物質で標識したＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇを、５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（ＮＯＸ−Ｓ９１とも称する、●印）および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３とも称する、■印）の濃度を滴定することによって３７℃で２５時間競合させた。
【図９Ａ】抑制の結果を示す（３通りの培養物の平均値±標準誤差を示す）。５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（ＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）による、ＥＤＧ１を発現するリポーター細胞系における１０ｎＭのＤ−ｅ−Ｓ１Ｐ誘導βアレスチン動員を示す。
【図９Ｂ】抑制の結果を示す（３通りの培養物の平均値±標準誤差を示す）。５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３とも称する）による、ＥＤＧ１を発現するリポーター細胞系における１０ｎＭのＤ−ｅ−Ｓ１Ｐ誘導βアレスチン動員を示す。
【図９Ｃ】抑制の結果を示す（３通りの培養物の平均値±標準誤差を示す）。５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（ＮＯＣ−Ｓ９１とも称する）による、ＥＤＧ３を発現する１０ｎＭのＤ−ｅ−Ｓ１Ｐ−誘導カルシウム放出の抑制を示す。
【図９Ｄ】抑制の結果を示す（３通りの培養物の平均値±標準誤差を示す）。５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＣ−Ｓ９３とも称する）による、ＥＤＧ３を発現する１０ｎＭのＤ−ｅ−Ｓ１Ｐ−誘導カルシウム放出の抑制を示す。
【図１０】スフェロイドをベースした細胞血管新生ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるスピーゲルマーＮＯＸ−Ｓ９１およびＮＯＸ−Ｓ９３の影響を示す。該アッセイによって、ＶＥＧＦ−Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）およびＳ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）に誘導されるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の出芽を抑制するスピーゲルマーの能力を試験した。
【実施例１】
【０２３０】
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を結合する核酸
【０２３１】
標的としてビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐを用いて、いくつかのＳ１Ｐ結合核酸およびその誘導体を生成することができ得る。そのヌクレオチド配列を図１、２および６に示す。それらの核酸を、以下のように特徴づけた：
ａ）アプタマー、すなわち、直接プルダウンアッセイ（実施例３）および／または競合プルダウンアッセイ（実施例３）を用いるＤ−核酸。
ｂ）スピーゲルマー、すなわち、競合プルダウンアッセイ（実施例６）、Ｓ１Ｐ受容体ＥＤＧ−３／Ｓ１Ｐ３またはＥＤＧ−１／Ｓ１Ｐ１によるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（実施例４）を用いるＬ−核酸。さらに、スピーゲルマーをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイ（実施例７）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（実施例５）で試験した。スピーゲルマーおよびアプタマーを実施例２に記述するように合成した。
【０２３２】
このように生成した核酸分子は、わずかに異なる配列を示す。それにより主要な１種類を同定して、Ｓ１Ｐ結合核酸と定義し、図１、２および６に示す。
【０２３３】
ヌクレオチド配列モチーフの定義に関して、曖昧なヌクレオチドについてはＩＵＰＡＣ略語を用いる：
Ｓ    強い          ＧまたはＣ；
Ｗ    弱い          ＡまたはＵ；
Ｒ    プリン        ＧまたはＡ；
Ｙ    ピリミジン    ＣまたはＵ；
Ｋ    ケト          ＧまたはＵ； 
Ｍ    イミノ        ＡまたはＣ；
Ｂ    Ａではない    ＣまたはＵまたはＧ；
Ｄ    Ｃではない    ＡまたはＧまたはＵ；
Ｈ    Ｇではない    ＡまたはＣまたはＵ；
Ｖ    Ｕではない    ＡまたはＣまたはＧ；
Ｎ    すべて        ＡまたはＧまたはＣまたはＵ
【０２３４】
それとは反対の記載がなければ、いずれの核酸配列またはストレッチおよびボックスの配列は、それぞれ５’→３’の方向に示す。
１．１  Ｓ１Ｐ結合核酸
【０２３５】
図１および図２に示すように、Ｓ１Ｐ結合核酸は、潜在的なＳ１Ｐ結合モチーフを規定するヌクレオチドの１つの中心ストレッチを含む。
【０２３６】
通常は、Ｓ１Ｐ結合核酸は、それらの５’末端および３’末端にヌクレオチドの末端ストレッチ、すなわちヌクレオチドの第１の末端ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチを含む。ヌクレオチドの第１の末端ストレッチおよびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、互いにハイブリッド形成することができ、ハイブリッドすると、２本鎖構造を形成する。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは、必ずしも分子中に与えられるわけではない。
【０２３７】
Ｓ１Ｐ結合核酸のヌクレオチドの３つのストレッチ（ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチ、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチ）は、互いに５’→３’の方向に、すなわち、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ−ヌクレオチドの中心ストレッチ−ヌクレオチドの第２の末端ストレッチに配列する。しかしながら、その代わりに、ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ、ヌクレオチドの中心ストレッチおよびヌクレオチドの末端第２のストレッチは、互いに５’→３’の方向に、すなわち、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチ−ヌクレオチドの中心ストレッチ−ヌクレオチドの第１の末端ストレッチに配列する。
【０２３８】
定義したボックスまたはストレッチの配列は、Ｓ１Ｐ結合核酸間で異なることがあり、これはＳ１Ｐへの結合親和性に影響する。異なるＳ１Ｐ結合核酸の結合分析に基づいて、以下に記述するように、中心ストレッチおよびそれらのヌクレオチド配列は、個々に、より好ましくは、それら全体でヒトＳ１Ｐへの結合に不可欠である。
【０２３９】
本発明によるＳ１Ｐ結合核酸を図１および２に示す。それらすべてを、アプタマーとして、Ｓ１Ｐに、より正確にはビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐ（Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐ（ｂｉｏ）とも称する）に結合するそれらの能力を試験した。Ｓ１Ｐへのその結合親和性に関して特徴づけた第１のＳ１Ｐ結合核酸は、核酸２１５−Ｆ９−００である。平衡結合定数ＫＤを、直接および競合プルダウン結合アッセイによって決定した（ＫＤｉｒｅｃｔ＝３４ｎＭ、ＫＤｃｏｍｐ．＝４５ｎＭ；図１および３）。
【０２４０】
Ｓ１Ｐ結合核酸２１５−Ｈ１１−００１、２１５−Ｈ９−００１、２１５−Ｆ１０−００１、２２２−Ａ１０−００２および２２２−Ａ１２−００２をアプタマーとして、Ｓ１Ｐ結合核酸２１５−Ｆ９−００１と比較する競合プルダウンアッセイにおいて試験した。Ｓ１Ｐ結合核酸２１５−Ｆ１０−００１および２１５−Ｈ１１−００１は、２１５−Ｆ９−００１と同様の結合親和性を示した(図１）。Ｓ１Ｐ結合核酸２１５−Ｈ９−００１、２２２−Ａ１０−００２および２２２−Ａ１２−００２は、Ｓ１Ｐ結合核酸２１５−Ｆ９−００１と比較して結合親和性の減少を示した(図１）。
【０２４１】
Ｓ１Ｐ結合核酸２１５−Ｆ９−００１の誘導体２１５−Ｆ９−００２および２１５−Ｆ９−００３は、２１５−Ｆ９−００１と同様のＳ１Ｐへの結合を示したが、一方、誘導体２１５−Ｆ９−００４、２１５−Ｆ９−００８および２１５−Ｆ９−００９は、競合プルダウンアッセイにおいて、Ｓ１Ｐ結合核酸２１５−Ｆ９−００１と比較して、結合親和性の減少を示した(図２）。
【０２４２】
本発明によるＳ１Ｐ結合核酸は、３４または３５ｎｔ長のヌクレオチドの中心ストレッチを含む。
【０２４３】
本発明によるＳ１Ｐ結合核酸は、ヌクレオチドの中心ストレッチに関して以下の配列を共有する：
５’ＷＡＵＵＧＣＣＧＡＷＵＧＵＡＡＣＧＣＣＵＵＷＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＵＡＧ３’または
ヌクレオチドの中心ストレッチについては、５’ＷＡＵＵＧＣＣＧＷＵＧＵＡＡＣＧＣＣＵＵＷＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＣＵＡＧ３’。Ｓ１Ｐに対して最良の結合親和性を示したＳ１Ｐ結合核酸２１５−Ｆ９−００１、２１５−Ｈ１１−００１、２１５−Ｆ１０−００１および２１５−Ｆ９−００１の誘導体は、中心ストレッチについて以下の配列を含む：
ａ）２１５−Ｆ９−００１および誘導体：ＡＡＵＡＧＣＣＧＵＵＧＡＡＡＣＧＣＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＵＡＧ
ｂ）２１５−Ｈ１１−００１：ＡＡＵＡＧＣＣＧＡＵＧＡＡＡＣＧＣＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＵＡＧ
ｃ）２１５−Ｆ１０−００１：ＡＡＵＡＧＣＣＧＡＡＵＧＡＡＡＣＧＣＣＵＵＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＵＡＧ。
【０２４４】
Ｓ１Ｐ結合核酸の５’末端および３’末端のストレッチは、ヌクレオチドを３（例えば、２１５−Ｆ９−００４）、４（例えば、２１５−Ｆ９−００３）、５（例えば、２１５−Ｆ９−００２）または６（例えば、２１５−Ｆ１０−００１）を含み（図１および２）、それにより該ストレッチは任意に互いにハイブリッド形成し、ハイブリッドすると、二本鎖構造が形成される。この二本鎖構造は、３〜６の塩基対からなり得る。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは、分子中に必ずしも与えられるわけではない。
【０２４５】
試験したすべてのＳ１Ｐ結合核酸のヌクレオチドの第１の末端ストレッチと、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチとを組み合わせると、その一般式は５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’（ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ）および５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’（ヌクレオチドの第２のストレッチ）になり、ここで、
Ｘ１はＡまたは不在であり、Ｘ２はＧまたは不在であり、Ｘ３はＳまたは不在であり、Ｘ４はＳまたは不在であり、Ｘ５はＣまたは不在であり、およびＸ６はＵまたは不在である。
【０２４６】
３ヌクレオチド長の末端ストレッチと、Ｓ１Ｐ結合配列２１５−Ｆ９−００１と同一の中心ストレッチとを有するＳ１Ｐ結合配列２１５−Ｆ９−００４は、６ヌクレオチド長の末端ストレッチを有するＳ１Ｐ結合配列２１５−Ｆ９−００１と比較して、結合親和性の減少を示した(図２）。したがって、本発明によるＳ１Ｐ結合核酸の末端ストレッチの好ましい長さは、４〜６ヌクレオチドである。
【０２４７】
５〜６のヌクレオチドを有するＳ１Ｐ結合核酸のヌクレオチドの第１の末端ストレッチと、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチとを組み合わせると、その一般式は５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’’（ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ）および５’’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’’（ヌクレオチドの第２のストレッチ）になり、式中、
ａ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６はＵであり、または
ｂ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６はＵであり、または
ｃ）Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６は不在であり、または
ｄ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、およびＸ６は不在であり、
好ましくは、
ａ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＡＧＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣＧＣＵ３’のヌクレオチド配列（例えば２１５−Ｆ９−００１を参照されたい）を含み、または
ｂ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＧＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣＧＣ３’のヌクレオチド配列（例えば２１５−Ｆ９−００２を参照されたい）を含む。
【０２４８】
４〜５のヌクレオチドを有するＳ１Ｐ結合核酸のヌクレオチドの第１の末端ストレッチと、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチとを組み合わせると、その一般式は５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’（ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ）および５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’（ヌクレオチドの第２のストレッチ）になり、ここで
ａ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５はＣであり、Ｘ６は不在であり、または
ｂ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６は不在であり、または
ｃ）Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＳであり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６は不在であり、
好ましくは、
ａ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣＧ３’のヌクレオチド配列（２１５−Ｆ９−００３を参照されたい）を含み、または
ｂ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＧＣＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＧＣ３’のヌクレオチド配列（２１５−Ｆ９−００８を参照されたい）を含み、または
ｃ）ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＧＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣＣ３’のヌクレオチド配列（２１５−Ｆ９−００９を参照されたい）を含み、
より好ましくは、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＣＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣＧ３’のヌクレオチド配列を含む（２１５−Ｆ９−００３を参照されたい）。
【０２４９】
３〜４のヌクレオチドを有するＳ１Ｐ結合核酸のヌクレオチドの第１の末端ストレッチと、ヌクレオチドの第２の末端ストレッチとを組み合わせると、その一般式は５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＳＵＧ３’（ヌクレオチドの第１の末端ストレッチ）および５’ＣＡＳＸ４Ｘ５Ｘ６３’（ヌクレオチドの第２のストレッチ）になり、ここで、
Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳまたは不在であり、Ｘ４はＳまたは不在であり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６は不在であり、
好ましくは、
ヌクレオチドの第１の末端ストレッチは、５’ＧＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、およびヌクレオチドの第２の末端ストレッチは、５’ＣＡＣ３’のヌクレオチド配列を含む（２１５−Ｆ９−００９を参照されたい）。
【０２５０】
Ｓ１Ｐ結合核酸の機能性を立証するために、スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００１、２１５−Ｆ９−００２を、その５’末端にアミノ基を含むスピーゲルマーとして合成した。アミノ修飾スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００１−５’−アミノおよび２１５−Ｆ９−００２−５’−アミノに、４０ｋＤａのＰＥＧ部分を結合させ、Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００１−５’−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｓ９２とも称する）および２１５−Ｆ９−００２−５’−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）をもたらした。スピーゲルマー合成およびＰＥＧ化は、実施例２に記述する。
【０２５１】
Ｓ１Ｐのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ機能を抑制／拮抗するために、Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーを試験した。実施例４に示すように、Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーは、受容体ＥＤＧ−３／Ｓ１Ｐ３およびＥＤＧ−１／Ｓ１Ｐ１へのＳ１Ｐのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相互作用およびシグナル伝達を抑制する（図４および９）。実施例７に示すように、Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００２−５’−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管新生を抑制する。スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００１−５’−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｓ９２とも称する）の有効性をｉｎ  ｖｉｖｏで試験し、一方、２１５−Ｆ９−００１−５’−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｓ９２とも称する）は、Ｓ１Ｐへの結合のためにリンパ球減少症を誘導した（実施例５、図５）。
１．２  リボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドと置換することによるＳ１Ｐ結合核酸２１５−Ｆ９−００２の親和性の増加
【０２５２】
競合スピーゲルマープルダウンアッセイによって決定したように、スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００２（Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２とも称する）は、３１．５±３．１ｎＭ（ｎ＝４）の親和性でＳ１Ｐに結合する（プロトコル、実施例６、図６を参照されたい）。
【０２５３】
Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の結合親和性は、リボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドと置換することによって改善し、特に、Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の４つの位置でリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドと置換すると、５倍以上の親和性の改善がもたらされたことを、驚くべきことに発明者らは観察した。スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の配列において、１つのリボヌクレオチドを１つの２’−デオキシリボヌクレオチドと置換すると、ビオチン化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐ（図６を参照されたい；スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１１、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１９、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２２およびＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３２）に対する結合親和性の改善がもたらされたことを、驚くべきことに、発明者らは見出した。スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１９およびＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１の場合、ビオチン化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐに対する結合親和性における改善は、２〜３倍だけ観察された（図６および７）。１９位または２１位で、１つのリボヌクレオチドを１つの２’−デオキシリボヌクレオチドと置換すると、それぞれ、１６ｎＭ（ｎ＝２）と１１．３±２．１ｎＭ（ｎ＝３）の結合親和性の改善がもたらされた（図６）。
【０２５４】
結合親和性を増加させるために好適であることが判明した単一ヌクレオチド置換から出発し、Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の配列において複数のリボヌクレオチドを複数の２’−デオキシリボヌクレオチドと置換すると、Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐに対する結合親和性においてさらなる改善がもたらされるかどうかを評価するために、リボヌクレオチドと、２から最高５までの２’−デオキシリボヌクレオチドからなるスピーゲルマーを合成した：Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−２２、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９−２２、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２およびＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−０１−１１−１９−２１−３２（図６）。わずかに１つの２’−デオキシリボヌクレオチドまたは２つの２’−デオキシリボヌクレオチドを含むスピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の誘導体と比較して、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２スピーゲルマーの複数の位置でリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドと置換すると、前述の各位置は、それなりに結合親和性の増加に好適であると判明し、結合親和性にさらなる改善をもたらすことを競合スピーゲルマープルダウンランキングアッセイは示した（図６および７）。しかし、スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９について示したように、２つのリボヌクレオチドを２つの２’−デオキシリボヌクレオチドと置換すると、スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１と比較して、結合親和性の改善がもたらされた。この効果は、２つの２’−デオキシリボヌクレオチドも含むスピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−２２で観察されなかった（図６および８）。３つのリボヌクレオチドを３つの２’−デオキシリボヌクレオチド（スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９−２２を参照されたい）と置換すると、スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９と比較して、結合親和性のさらなる改善がもたらされなかった（図６および８）。しかし、４つの２’−デオキシリボヌクレオチドを含むスピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２の場合、２つの２’−デオキシリボヌクレオチドを有するＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９と比較して、Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐに対する結合親和性の改善が観察された(図６および８）。競合スピーゲルマープルダウンアッセイにおいて、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１は、５．４ｎＭ（ｎ＝２）の結合親和性を示した（図６）。５つのリボヌクレオチドを５つの２’−デオキシリボヌクレオチド（スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１１−１９−２１−３２、図６を参照されたい）と置換すると、Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐへの結合にさらなる改善がもたらされなかった（図６および８）。要約すると、Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の結合親和性は、リボヌクレオチドを１位、１９位、２１位および３２位で２’−デオキシリ��ヌクレオチドに置換することによって５倍以上だけ改善した（スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２、図６を参照された）ことを発明者らが観察したのは驚くべきことである。
【０２５５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイ（プロトコル、実施例４を参照されたい）で、Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐへの親和性の改善がＳ１Ｐ機能の抑制の促進に変換されることを確認した。５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（ＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３とも称する）は、ヒトＳ１Ｐ−受容体ＥＤＧ１を発現するリポーター細胞系においてＳ１Ｐ誘導アレスチン動員をそれぞれ、２２．５ｎＭおよび１０．３ｎＭのＩＣ５０値で抑制した（図９Ａ、９Ｂ）ヒトＳ１Ｐ−受容体ＥＤＧ３を発現する細胞系において、５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（ＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３とも称する）は、Ｓ１Ｐ誘導カルシウム放出をそれぞれ、１０ｎＭおよび５．５ｎＭのＩＣ５０値で抑制した（図９Ｃ、９Ｄ）。
【０２５６】
Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマー５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（ＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３とも称する）の試験をｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイで成功した（実施例７、図１０を参照されたい）。Ｓ１Ｐスピーゲルマー５’−４ｏｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００１（ＮＯＸ−Ｓ９２とも称する）および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３とも称する）の試験をｉｎ  ｖｉｖｏ研究で成功した（実施例５、図５を参照されたい）。
【実施例２】
【０２５７】
アプタマーおよびスピーゲルマーの合成と誘導体化
小規模合成
【０２５８】
アプタマー（Ｄ−ＲＮＡ核酸またはＤ−ＤＮＡ修飾型Ｄ−ＲＮＡ核酸）およびスピーゲルマー（Ｌ−ＲＮＡ核酸またはＬ−ＤＮＡ修飾型Ｌ−ＲＮＡ核酸）を、標準的環外アミン保護基とともに２’ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡおよびＤＮＡホスホラミダイト化学（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ，１９９３）を用いて、ＡＢＩ３９４シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）による固相合成によって生成した。オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分については、Ｄ−およびＬ−立体配置での、ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｒＣ（Ｎ−Ａｃ）−、ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびｒＵ−ホスホラミダイトを用いたが、ＤＮＡ部分については、Ｄ−およびＬ−立体配置でのｄＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｄＣ（Ｎ−Ａｃ）−、ｄＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびｄＴを適用した。すべてのホスホラミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ．から購入した。合成と脱保護の後、アプタマーおよびスピーゲルマーをゲル電気泳動によって精製した。
大規模合成と修飾
【０２５９】
標準環外アミン保護基（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ，１９９３）とともに２’ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡおよびＤＮＡホスホラミダイト化学を用いてＡｋｔａＰｉｌｏｔ１００シンセサイザー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｌｂｕｒｇ）による固相合成によってスピーゲルマーを生成した。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｒＣ（Ｎ−Ａｃ）−、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、Ｌ−ｒＵ−、Ｌ−ｄＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｄＣ（Ｎ−Ａｃ）−、Ｌ−ｄＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびＬ−ｄＴ−のホスホラミダイトをＣｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ．から購入した。５’−アミノ修飾因子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＡＳ）から購入した。無修飾スピーゲルマーまたは５’−アミノ修飾スピーゲルマーの合成を、Ｌ−ｒｉｂｏＡ、Ｌ−ｒｉｂｏＣ、Ｌ−ｒｉｂｏＧ、Ｌ−ｒｉｂｏＵ、Ｌ−２’デオキシＡ、Ｌ−２’デオキシＣ、Ｌ−２’デオキシＧ、またはＬ−２’デオキシＴ修飾ＣＰＧ孔径１０００Ａ（Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）の上で開始した。ＲＮＡおよびＤＮＡのホスホラミダイトの結合（１サイクルあたり１５分間）については、アセトニトリル中０．３Ｍのベンジルチオテトラゾール、およびアセトニトリル中各０．２Ｍのホスホラミダイト溶液２当量を用いた。酸化キャッピングサイクルを用いた。オリゴヌクレオチド合成のためにさらに標準溶媒と試薬をＢｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ，ＮＬ）から購入した。スピーゲルマーをＤＭＴ−ＯＮで合成し；脱保護の後、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗｉｎｃｏｔｔら，１９９５）を介して精製した。５’ＤＭＴ−基を、８０％の酢酸で除去した（室温で３０分間）。５’アミノ修飾スピーゲルマーの場合は、５’ＭＭＴ基は、８０％酢酸で除去した（室温で９０分間）。その後、２ＭのＮａＯＡｃ水溶液を加え、次いで該スピーゲルマーを、５Ｋ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いてタンジェント流濾過によって脱塩した。
スピーゲルマーのペグ化
【０２６０】
スピーゲルマーのｉｎ  ｖｉｖｏ血漿滞留時間を延ばすために、４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分をスピーゲルマーの５’末端で共有結合させた。
スピーゲルマーの５’−ペグ化
【０２６１】
ペグ化（ペグ化方法の技術的詳細については、欧州特許出願ＥＰ第１３０６３８２号を参照されたい）のために、精製した５’−アミノ修飾スピーゲルマーをＨ２Ｏ（２．５ｍＬ）、ＤＭＦ（５ｍＬ）、および緩衝液Ａ（５ｍＬ；クエン酸＋Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍＬ］、および１ＭのＮａＯＨ［３４３ｍＬ］を混合して、１Ｌの最終量になるまで水を加えて調製し；１ＭのＨＣｌでｐＨ＝８．４に調節した）の混合物中で溶解した。
【０２６２】
スピーゲルマー溶液のｐＨを、１ＭのＮａＯＨで８．４に調節した。次いで、４０ｋＤａＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｌｌｅｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を７５〜８５％の最大収率に達するまで、３７℃で、０．２５当量を３０分ごとに６回で加えた。ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを添加している間、反応混合物のｐＨを１ＭのＮａＯＨで８〜８．５に保持した。
【０２６３】
反応混合物を４ｍＬの尿素溶液（８Ｍ）および４ｍＬの緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中０１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム）と混合して、１５分間９５℃まで加熱した。次いで、ＰＥＧ化スピーゲルマーを、アセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ；緩衝液Ｃ：アセトニトリル中０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム）を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。過剰なＰＥＧを５％緩衝液Ｃで溶出し、ＰＥＧ化スピーゲルマーを１０〜１５％緩衝液Ｃで溶出した。＞９５％の純度（ＨＰＬＣによって評価した）の生成物画分を合わせて、３ＭのＮａＯＡＣ４０ｍＬと混合した。ＰＥＧ化スピーゲルマーを、タンジェント流濾過（５Ｋ再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）によって脱塩した。
【実施例３】
【０２６４】
プルダウン結合アッセイによるＳ１Ｐ結合アプタマーの分析
直接プルダウンアッセイ
【０２６５】
Ｓ１Ｐ結合核酸の親和性を、アプタマー（Ｄ−ＲＮＡ核酸）とビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐを用いて、３７℃で、プルダウンアッセイフォーマットで測定した。アプタマーは、［γ−３２Ｐ］標識ＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｔ４ポリヌレオチドキナーゼによって５’末端で放射活性物質を標識した。標識したアプタマーの放射活性は、２００，０００〜８００，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌであった。アプタマーは、選択緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１５０ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのＫＣｌ；１ｍＭのＭｇＣｌ２；１ｍＭのＣａＣｌ２；０．１％［ｗ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ−２０；ウシ血清アルブミン４ｍｇ／ｍＬ）中、３７℃、３００ｐＭ濃度での変性と再生の後に、低濃度で平衡に達するために、ビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐの量を変えて、３〜１２時間インキュベートした。使用したプラスチック製器具または固定化マトリックスの表面に結合相手が吸着されるのを防ぐために、選択緩衝液に１０μｇ／ｍＬの酵母ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）を補充した。ビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐの濃度範囲を１９２ｐＭ〜３０００ｎＭに設定した；総反応量は０．１ｍＬであった。結合反応物に添加する前に選択緩衝液で前平衡させた２μＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）上に、ビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐおよびアプタマーとビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐとの複合体を固定化した。ビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐおよびビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐと結合アプタマーとの複合体を固定化するために、ビーズは、懸濁液中、それぞれの温度で２０分間保持した。上清を取り除いて適切に洗浄した後、固定化した放射活性の量をシンチレーションカウンターで量った。結合または規準化結合のパーセンテージをチオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐの濃度に対してプロットし、および１：１のストイキオメトリを想定して、解離定数をソフトウェアアルゴリズム（ＧＲＡＦＩＴ；Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｓｕｒｒｅｙ  Ｕ．Ｋ．）を用いて得た。
合プルダウンアッセイ
【０２６６】
別のプルダウンアッセイフォーマットを用いて、Ｓ１Ｐ結合核酸の親和定数を、標識アプタマーと、種々の量の非標識アプタマーとの競合によって決定した。非標識アプタマーは、標識アプタマーとビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐとの結合において競合し、したがってＬ−ｅ−Ｓ１Ｐに対するアプタマーの親和性による結合シグナルを減少させた。一定量の選択緩衝液０．４ｍＬ中２０ｎＭのビオチン化Ｌ−ｅ−Ｓ１Ｐとともに１５０ｐＭ放射物質で標識したアプタマーを用いて、３７℃で、３〜１２時間このアッセイを行った。これらの条件は、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎアガロースまたはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ（両方ともＰｉｅｒｃｅ製）上で固定化し、洗浄した後、ビオチン化Ｌ−Ｓ１Ｐと約５〜１０％の結合をもたらした。競合のために、９６ｐＭ〜１５００ｎＭの濃度範囲で、一定量の標識アプタマーとともに非標識アプタマーを結合反応物に加えた。ビーズ上での結合、固定化、適切な洗浄、および固定化した放射性物質からの放射活性の測定の後、結合または規準化結合のパーセンテージを決定して、非標識アプタマーの濃度に対してプロットした。解離定数は、１：１のストイキオメトリを想定して、解離定数を、ソフトウェアアルゴリズム（上記を参照されたい）を用いて得た。
【０２６７】
同じアッセイフォーマットを一組の異なるアプタマーの比較ランキングで用いたが、全濃度範囲の代わりに各非標識アプタマーの３つの異なる濃度（例えば、５、５０，５００ｎＭ）のみを、参照として役立つ１つの標識アプタマーを含んだ試験管に適用した。次いで、この試験で最も活性であることが判明したアプタマーは、さらなるアプタマー変異体の比較分析のために新たな参照として役立つこともあり得る。
【実施例４】
【０２６８】
Ｓ１Ｐｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイ
４．１  Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーによるＳ１Ｐ誘導カルシウム放出の抑制
【０２６９】
ヒトＳ１Ｐ３受容体（ＥＤＧ３／Ｓ１Ｐ３）およびヒトＧ−タンパク質Ｇα１５を発現する安定に形質移入したＣＨＯ−細胞を底が透明な黒の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）の各ウェルあたり５×１０４細胞で播種し、次いで１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンをさらに含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。
【０２７０】
刺激溶液（Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐ＋種々の濃度のスピーゲルマー）を、「薄型」９６ウェルＰＣＲプレートで、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび５ｍＭのプロベネシド（ＣＨＯ−Ｕ＋）を含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地中の１０倍濃度溶液として作製する。該溶液を十分に混合して、サーモミキサー上で、３７℃で３０~６０分間イキュベートする。各（縦）列で、緩衝液対照（Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐを含まない）およびＤ−ｅ−Ｓ１Ｐ対照（スピーゲルマーを含まない）をインキュベートする。
【０２７１】
カルシウム指示色素ＦｌｕｏＦｏｒｔｅ（Ｅｎｚｏ  ＬＩｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加する前に、２００μＬのＣＨＯ−Ｕ＋で細胞を一度洗浄する。次いで、９０μＬの指示色素溶液（ＣＨＯ−Ｕ＋中、５．５６μｇ／ｍＬのＦｌｕｏＦｏｒｔｅ、０．０４４％プルロニック１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を添加して、細胞を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２７２】
蛍光シグナルの測定は、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａマルチ検出プレートリーダー（ＢＭＧ）で、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで行う。
【０２７３】
いくつかの試料を平行分析するために、９６ウェルプレートの１列（縦の列）のウェルを一緒に記録する。
【０２７４】
ベースラインの決定のために、３つの値を読み取ることによって測定を開始する。次いで、測定を中断し、プレートを測定器から移動させる。「薄型」プレートからの１列の刺激溶液１０μＬを、刺激する列のウェルに、マルチチャンネルピペットを使用して添加する。プレートを混合（プレートを静かに回しながら）して、測定器に戻し、測定を継続する（４秒間隔で、計２０回の測定）。
【０２７５】
各ウェルに対して、最大蛍光値とベースライン値の差違を決定して、スピーゲルマー濃度に対してプロットする。ほとんどの場合、スピ−ゲルマーを含まない（Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐのみ）の試料の値を１００％に設定し、スピーゲルマーを含む試料の値をこのパーセントとして算出する。用量反応曲線のために、パーセント値をスピーゲルマー濃度に対してプロットし、次いでＩＣ５０値（スピーゲルマーを含まずに５０％の活性が存在するスピーゲルマーの濃度）を、もたらされた曲線のグラフから決定する。
【０２７６】
抗Ｓ１Ｐスピーゲルマーの有効性を示すために、１０ｎＭのＤ−ｅ−Ｓ１Ｐまたは種々の量のスピーゲルマー２１５−Ｆ９−００１−５’−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｓ９２とも称する）および２１５−Ｆ９−００２−５’−ＰＥＧ（５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ２−００２およびＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）で、もしくは種々の量の２１５−Ｆ９−００２−５’−ＰＥＧ（５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２およびＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３とも称する）でプレインキュベートしたＤ−ｅ−Ｓ１Ｐで細胞を刺激した。結果は、スピーゲルマーを含まずに得られたシグナルに規準化した蛍光シグナルのパーセンテージを示す。
【０２７７】
スピーゲルマー２１５−Ｆ９−００１−５’−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｓ９２とも称する）および２１５−Ｆ９−００２−５’−ＰＥＧ（５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２およびＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）が、Ｓ１Ｐ誘導Ｃａ＋＋−放出を約１０ｎＭのＩＣ５０（独立した３実験からの平均値±標準偏差）で抑制することが判明した（図４および９Ｃ）。スピーゲルマー５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３とも称する）は、Ｓ１Ｐ誘導Ｃａ＋＋−放出を約５．５ｎＭのＩＣ５０で抑制することが判明した（図９Ｄ）。
４．２  ＥＤＧ１受容体を介してＳ１Ｐによって誘導されたアレスチン動員の、Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーによる抑制
【０２７８】
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）ｅＸｐｒｅｓｓ  ＥＤＧ−１ＣＨＯ−Ｋ１  β−アレスチンＧＰＣＲ細胞（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を、底が透明な白の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）の各ウェルあたり１×１０４細胞で播種し、１００μＬ培地（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）中、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。刺激溶液（Ｄ−ｅ−Ｓ１ｐ＋種々の濃度のスピーゲルマー）を、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で、十分に混合し、３７℃で３０分間インキュベートして、１１倍濃度溶液として作製する。１０μＬの刺激溶液を各ウェル（３組）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした。
【０２７９】
Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐによって受容体が活性化すると、活性化ＥＤＧ１とβ−アレスチンの相互作用によって、β−ガラクトシダーゼ酵素フラグメント相補性がもたらされる。
【０２８０】
β−ガラクトシダーゼ活性の定量化のために、５５μＬのＷｏｒｋｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を添加して、室温で９０分間インキュベートした。続いて、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａマルチ検出プレートリーダ（ＢＭＧ）で発光を測定した。
【０２８１】
抗Ｓ１Ｐスピーゲルマーの有効性を示すために、１０ｎＭのＤ−ｅ−Ｓ１Ｐまたは種々の量の２１５−Ｆ９−００２−５’−ＰＥＧ（５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２もしくはＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３）でプレインキュベートしたＤ−ｅ−Ｓ１Ｐで細胞を刺激した。結果は、スピーゲルマーを添加せずに得られたシグナルに規準化した発光シグナルのパーセンテージを示す。３組培養物からの平均値±標準偏差を示す。
【０２８２】
５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（２１５−Ｆ９−００２−５’−ＰＥＧおよびＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９１とも称する）は、ヒトＳ１Ｐ−受容体ＥＤＧ１を発現するリポーター細胞系において、Ｓ１Ｐ（Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐ）誘導アレスチン動員をそれぞれ２２．５ｎＭと１０．３ｎＭのＩＣ５０値で抑制した（図９Ａ、９Ｂ）。
【実施例５】
【０２８３】
Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
【０２８４】
スピーゲルマーＮＯＸ−Ｓ９２またはＮＯＸ−Ｓ９３のリンパ球の輸送を変える能力をマウスで試験するために計画した薬力学的研究を行った。１群および１時点あたり５匹の成熟雌マウス（体重（ｂｗ）２０〜２８ｇ）に、静脈内ボーラス注射（１０ｍＬ／ｋｇ  ｂｗ）を尾静脈に投与した。スピーゲルマーＮＯＸ−Ｓ９２またはＮＯＸ−Ｓ９３の注射用量は、２０ｍｇ/ｋｇｂｗであり、注射用５％グルコースをビヒクルとして使用した。表示した時点で、ＥＤＴＡ−血液試料を採取して、ｓｃｉｌ  Ｖｅｔ  ａｂｃ血液アナライザー（ｓｃｉｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ）でリンパ球数を決定した。スピーゲルマーＮＯＸ−Ｓ９２またはＮＯＸ−Ｓ９３による処置は、適用から８時間後、８．６×１０３の基底レベルから４．９×１０３リンパ球／（ＮＯＸ−Ｓ９２）への減少、または適用から２４時間後、８．７×１０３の基底レベルから４．６×１０３リンパ球／μＬ血液（ＮＯＸ−Ｓ９３）への減少が示したようにリンパ球減少症を誘発した（図５を参照されたい）。
有意性は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して決定した。
【実施例６】
【０２８５】
競合スピーゲルマープルダウンアッセイ
【０２８６】
Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーの親和定数は、競合プルダウンアッセイによって決定した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるスピーゲルマーの放射性標識を可能にするために、Ｄ−立体構造中の２つのグアノシン残基をＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２スピーゲルマーの５’末端に添加した。次いで、非標識のスピーゲルマーは、３００〜６００ｐＭ放射標識したスピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇと一定量のビオチン化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐへの結合において競合する、すなわち、非標識スピーゲルマーのＤ−ｅ−Ｓ１Ｐに対する結合親和性による結合シグナルを低下させるその能力を試験した。Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐを８ｎＭの濃度で使用し、競合するスピーゲルマーの非存在下で、放射標識スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇのおよそ１０％の最終結合をもたらした。アッセイは、２５０μＬの選択緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１５０ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのＣｌ；１ｍＭのＭｇＣｌ２；１ｍＭのＣａＣｌ２；０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０；４ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン；１０μｇ／ｍＬの酵母ＲＮＡ）中、３７℃で３〜４時間行った。ビオチン化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐおよびスピーゲルマーとビオチン化Ｓ１Ｐｎｏ複合体を、結合反応物に添加する前に選択緩衝液で前平衡させたニュートラアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓビーズ５μＬ上に固定化した。ビーズは、サーモミキサー内に３７℃で３０分間、懸濁液中で保持した。上清を取り除いて、適切に洗浄した後、固定化した放射活性の量をシンチレーションカウンターで量った。結合した放射標識スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇの結合パーセンテージまたは規準化パーセンテージを、競合するスピーゲルマーの対応する濃度に対してプロットした。解離定数は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して得た。同じアッセイフォーマットを一組の異なるスピーゲルマーの比較ランキングで用いた。この場合、表示したように競合するスピーゲルマーを単一の濃度で用いた。
【実施例７】
【０２８７】
ＮＯＸ−Ｓ９１およびＮＯＸ−Ｓ９３の血管新生のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抑制
【０２８８】
スフェロイドをベースした細胞血管新生ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｓ９１およびＮＯＸ−Ｓ９３を、ＶＥＧＦ−Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）およびＳ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）に誘導されるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の出芽を抑制するそれらの能力に関して試験した。
【０２８９】
実験は、元々公開されているプロトコル（ＫｏｒｆｆおよびＡｕｇｕｓｔｉｎ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１２：３２４９−５８，１９９９）を修飾して進めた。手短に述べると、（Ｋｏｒｆｆおよびｕｇｕｓｔｉｎ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４３：１３４１−５２，１９９８）に記述されるように５００ＨＵＶＥＣをピペットでプラスチックシャーレに懸滴してスフェロイドを調製し、一晩スフェロイドを凝集させた。次いで、５０ＨＵＶＥＣスフェロイドを、０．９ｍＬのコラーゲンゲルに播種し、２４ウェルプレートの個々のウェルにピペットで取り分けて、重合させた。
【０２９０】
１０倍濃縮した作業希釈液１００μＬをピペットで重合ゲルの表面に移してから３０分後に、血管新生刺激物質Ｓ１Ｐ［１００ｎＭの最終アッセイ濃度］またはＶＥＧＦ−Ａ［２５ｎｇ／ｍＬの最終アッセイ濃度］を添加した。同様に、Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーの投与量範囲（１０ｎＭ〜１０μＭの半対数単位刻み）を添加してＩＣ５０値を算出した。ビヒクルのみと、血管新生刺激物質単独またはスピーゲルマービヒクルを加えたもののいずれかとを対照ウェル（基底出芽および最大出芽の誘導）として使用した。ＶＥＧＦ誘導出芽アッセイでは、スニチニブを陽性対照として用いた。プレートを３７℃で２４時間インキュベートして、４％Ｒｏｔｉ−ＨＩｓｔｏｆｉｘを添加して固定させた。処置したＨＵＶＥＣスフェロイドの出芽強度を、倒立顕微鏡と、デジタル画像処理ソフトウェアＡｎａｌｙｓｉｓ３．２（Ｓｏｆｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とからなる画像解析システムを使用して、１スフェロイドあたりの累積出芽長を決定することで定量化した。ランダムに選択した１０スフェロイドの累世出芽長の平均を個々のデータポイントとして分析した。ＩＣ５０値の決定は、ＧｒａｐＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０２を用いて、変数ヒルスロープによる非線形回帰曲線適合を使用して下を０に上を１００に限定して行った。方程式は、４パラメータロジスティック方程式である。算出のために、基底出芽の中央値は、他のすべてのデータポイントから減算した。対照ＶＥＧＦ−ＡまたはＳ１Ｐ出芽の中央値を１００％に設定した。
【０２９１】
ＮＯＸ−Ｓ９１およびＮＯＸ−Ｓ９３は双方とも、Ｓ１ＰまたはＶＥＧＦ−Ａのいずれかによって誘導された出芽を抑制した。ＮＯＸ−Ｓ９３は、Ｓ１Ｐ誘導ＥＣ出芽においてＮＯＸ−Ｓ９１よりも、強い抑制を示した。Ｓ１Ｐ誘導出芽アッセイにおいて、ＮＯＸ−Ｓ９３は、ＮＯＸ−Ｓ９１（７．５×１０７Ｍ）よりも強い抑制（３．４×１０７Ｍ）を示した。両薬物は、ＶＥＧＦ−Ａ誘導出芽においてＩＣ５０値よりも低い値を示した（図１０を参照されたい）。ＮＯＸ−Ｓ９１およびＮＯＸ−Ｓ９３に対するＩＣ５０値は、ＶＥＧＦ−Ａ誘導出芽では、２．１×１０−７Ｍおよび２．４×１０−７Ｍであった。陽性対照として用いたスニチニブは、同じ範囲でＨＵＶＥＣ出芽の抑制を示し、ＩＣ５０値は２．５×１０−７Ｍであった(図１０を参照されたい）。
【０２９２】
試験したスピーゲルマーは、細胞血管新生アッセイにおいてＳ１Ｐ誘導ＥＣ出芽またはＶＥＧＦ−Ａ誘導ＥＣ出芽を抑制した。これらの結果は、Ｓ１Ｐ抗体に関して発表されているデータ（Ｖｉｓｅｎｔｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００６  ９（３）：２２５−３８）に一致している。
【０２９３】
明細書、特許請求の範囲、配列表および／または図面に開示した本発明の特徴は、別々におよびその任意の組み合わせで、本発明をその種々の形で実現するための材料になり得る。
【図１】
0005941904.tif 000006
【図２】
0005941904.tif 000007
【図３】
0005941904.tif 000008
【図４】
0005941904.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
0005941904.tif 000012
【図８】
0005941904.tif 000013
【図９Ａ】
0005941904.tif 000014
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
0005941904.tif 000016
【図９Ｄ】
0005941904.tif 000017
【図１０】
0005941904.tif 000018
【配列表】
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