【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年12月27日(2010.12.27)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  化合物であって、
（ｉ）以下の構造：
【化１】
2003505466.tif 000001
を有する化合物であって、ここで：
Ｒ１は、
【化２】
2003505466.tif 000002
から選択される基であり；
Ｒ４は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｑは、
【化３】
2003505466.tif 000003
であり；そして
Ｒ７は、Ｑの５’位でＱに結合しており、そして−Ｈ、リン酸基、ホスホジエステル基またはホスホルアミデート基である、化合物；
（ｉｉ）以下の構造：
【化４】
2003505466.tif 000004
を有する化合物であって、ここで：
ＸｄおよびＸｅは独立して、同じであるかまたは異なっており、そしてＣｌ、ＢｒおよびＩから選択される、化合物；
（ｉｉｉ）以下の構造：
【化５】
2003505466.tif 000005
を有する化合物であって、ここで各Ｘは、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択される、化合物；ならびにそれらの塩、エーテルおよびエステルから選択される、化合物。
【請求項２】  以下の構造：
【化６】
2003505466.tif 000006
を有する化合物、それらの塩、エーテルおよびエステルから選択される、請求項１に記載の化合物であって、
ここで、
Ｒ１は、
【化７】
2003505466.tif 000007
から選択され、
Ｒ４は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
Ｑは、
【化８】
2003505466.tif 000008
であり、そして
Ｒ７は、Ｑの５’位でＱに結合しており、そして−Ｈ、リン酸基、ホスホジエステル基またはホスホルアミデート基である、化合物。
【請求項３】  Ｒ７が、−Ｈである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】  Ｒ７が、アミノ酸から誘導されたホスホルアミデート基である、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】  Ｒ７が、アラニンから誘導されたホスホルアミデート基である、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】  Ｒ７が、以下：
【化９】
2003505466.tif 000009
である、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】  Ｒ７が、以下：
【化１０】
2003505466.tif 000010
である、請求項２に記載の化合物。
【請求項８】  以下の構造：
【化１１】
2003505466.tif 000011
を有する化合物、それらの塩、エーテルおよびエステルから選択される、請求項２〜請求項７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】  以下の構造：
【化１２】
2003505466.tif 000012
を有する化合物、それらの塩、エーテルおよびエステルから選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】  以下の構造：
【化１３】
2003505466.tif 000013
を有する化合物、それらの塩、エーテルおよびエステルから選択される、請求項２〜請求項７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】  以下の構造：
【化１４】
2003505466.tif 000014
を有する化合物、それらの塩、エーテルおよびエステルから選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項１２】  以下の構造：
【化１５】
2003505466.tif 000015
を有する化合物、それらの塩、エーテルおよびエステルから選択される、請求項２に記載の化合物であって、ここでＸは、ＣｌおよびＢｒから選択される、化合物。
【請求項１３】  以下の構造：
【化１６】
2003505466.tif 000016
を有する化合物、それらの塩、エーテルおよびエステルから選択される、請求項１に記載の化合物であって、ここで、ＸｄおよびＸｅが独立して、同じであるかまたは異なっており、そしてＣｌ、ＢｒおよびＩから選択される、化合物。
【請求項１４】  ＸｄがＣｌまたはＢｒであり、そしてＸｅがＨである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】  以下の構造：
【化１７】
2003505466.tif 000017
を有する化合物、それらの塩、エーテルおよびエステルから選択される、請求項１に記載の化合物であって、ここで各Ｘが、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択される、化合物。
【請求項１６】  Ｘが、ＣｌまたはＢｒである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】  ＸがＢｒである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】  請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項１９】  ヒトまたは動物の身体の処置方法において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項２０】  病理学的細胞の増殖を処置または阻害するための薬の調製のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２１】  被験体における標的細胞の増殖によって特徴付けられる病状を処置するための薬の調製のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２２】  前記病理学的細胞または標的細胞が、化学療法薬物に対して耐性である、請求項２０または請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】  前記処置または阻害が前記化学療法薬物を用いた処置をさらに含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】  前記病理学的細胞または標的細胞が、化学療法によるインビボでの選択の結果として増幅される標的酵素を発現する、請求項２０〜請求項２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】  前記標的酵素が、前記病理学的細胞または前記標的細胞において過剰発現される内因性細胞内酵素である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】  前記酵素が、チミジル酸シンターゼである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】  治療剤についてのスクリーニング方法であって、以下の工程：
（ａ）標的細胞を含むサンプルを、請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程；
（ｂ）該標的細胞の別のサンプルを、潜在的治療剤と接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルを、細胞増殖の阻害または細胞殺傷について比較する工程
を包含する、方法。
【請求項２８】  前記標的細胞が、化学療法薬物に対して耐性と特徴付けられる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】  前記標的細胞が、化学療法によるインビボでの選択の結果として増幅される標的酵素を発現すると特徴付けられる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】  前記標的酵素が、前記標的細胞において過剰発現される内因性細胞内酵素である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】  病理学的細胞の増殖を処置または阻害するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項３２】  被験体における標的細胞の増殖によって特徴付けられる病状を処置するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項３３】  前記病理学的細胞または標的細胞が、化学療法薬物に対して耐性である、請求項３１または請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】  前記化学療法薬物と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】  前記病理学的細胞または標的細胞が、化学療法によるインビボでの選択の結果として増幅される標的酵素を発現する、請求項３１〜請求項３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】  前記標的酵素が、前記病理学的細胞または前記標的細胞において過剰発現される内因性細胞内酵素である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】  前記標的酵素が、チミジル酸シンターゼである、請求項３５に記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の詳細な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、以下の米国特許仮出願、米国特許仮出願第６０／１４５，３５６号；同第６０／１４５，４３７号；および同第６０／１９１，３１５号（それぞれ１９９９年７月２２日；１９９９年７月２３日および２０００年３月２１日に出願された）に対して、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下における優先権を主張し、これらの内容は、本開示の中へ本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、薬物の発見および具体的には、病理学的細胞で過剰発現される内因性細胞内酵素に対する基質であるプロドラッグの設計の分野に関する。
【０００３】
（発明の背景）
本開示全体および本開示内で、種々の刊行物が、最初の著者および日付、特許番号または公開番号によって参照される。各々の参考文献に対する完全な図書目録的引用は、本明細書中または本出願の最後（特許請求の範囲の後）に見出され得る。これらの刊行物の開示は、本開示の中へ本明細書中に参考として援用されて、本発明が関連する分野の技術水準をより完全に記載する。
【０００４】
癌は、世界で最も一般的な致命的ヒト疾患の一つである。抗癌剤を用いる処置は、特に、手術で治療可能な状態を過ぎてしまった全身性悪性腫瘍または転移性癌に対して、重要性をどんどん増している選択肢の一つである。残念ながら、現在の治療処置を実行可能なヒト癌型のサブセットは、まだかなり小さく（Ｈａｓｋｅｌｌ，Ｃ．Ｍ．（１９９５））、毎年およそ６００，０００人が亡くなっている。Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔ＆Ｆｉｇｒｅｓ，１９９９  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙを参照のこと。ヒト癌を治療し得る薬物開発の進歩は遅く、成功は、数種の血液学的悪性腫瘍およびより少数の固形腫瘍型に限られている（ＤｏｒｒおよびＶａｎ  Ｈｏｆｆ（１９９４））。疾患機構に基づく治療法を発見する際の進歩は、今後の成功のための機会を提供する。（Ｃｏｂｌｅｉｇｈ，Ｍ．Ａ．ら（１９９９）；およびＲｏｔｈ，Ｊ．Ａ．ら（１９９９）。
【０００５】
遺伝学、生物学および生化学に関する悪性腫瘍の不均一性ならびに治療に対する原発性耐性または処置誘導性耐性は、治療処置を妨げる。さらに、多くの抗癌剤は、低い程度の選択性しか示さず、しばしば重篤なもしくは生命さえ脅かす有毒の副作用を引き起こし、それゆえ全ての癌細胞を殺傷するのに十分な高用量の適用を妨げている。従って、処置耐性病理学的悪性細胞に対して改善された選択性を有する抗腫瘍剤を探し出すことは、依然として薬物開発のための中心課題である。
【０００６】
癌細胞は、非制御増殖、脱分化および遺伝子不安定性によって特徴付けられている。不安定性は、それ自体が、異常染色体数、染色体欠失、再配列、喪失または正常二倍体数を超える複製として表れる（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１））。このゲノム不安定性は、いくつかの因子により引き起こされ得る。最も良く特徴付けられている因子のうちの１つは、腫瘍抑制遺伝子機能の喪失に対して生じる増強されたゲノム形成性である（例えば、Ａｌｍａｓａｎ，Ａら、（１９９５ａ）およびＡｌｍａｓａｎ，Ａ．ら、（１９９５ｂ））。ゲノム形成性は、環境の変化に対する腫瘍細胞の順応性に役に立ち、そしてより頻繁な変異、遺伝子の増幅、および染色体外因子の形成を可能にし得る（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ａ．ら、（１９９５）およびＷｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１））。これらの特徴は、より攻撃的な悪性腫瘍を生じる機構を提供する。なぜなら、それは、腫瘍が、天然の宿主防御機構、生物学的治療（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）およびＳｈｅｐａｒｄ，Ｈ．Ｍ．ら、（１９８８）を参照のこと）ならびに化学療法（Ａｌｍａｓａｎ，Ａ．ら、（１９９５ａ）；およびＡｌｍａｓａｎ，Ａ．ら（１９９５ｂ）を参照のこと）に対する耐性を迅速に発達させることを可能にするからである。
【０００７】
さらに、化学療法剤の臨床的有用性は、その薬剤に対する悪性細胞耐性の出現によって厳密に制限され得る。おそらく、多数の細胞性機構（例えば、薬物の変更された代謝、活性化合物に対する細胞の不浸透性もしくは細胞からの促進された薬物除去、阻害された酵素の変更された特異性、標的分子の増加した産生、細胞傷害性病変の増加した修復、または代替の生化学経路による阻害された反応のバイパス形成）が、薬物耐性に関与する。いくつかの場合において、ある薬物に対する耐性は、他の、生化学的に異なる薬物に対する耐性を与え得る。癌化学療法に対する耐性の代替機構は、腫瘍抑制遺伝子の機能的喪失を介して生じる。これらのなかで最も特徴付けられているものは、ｐ５３、ＲＢおよびｐ１６である。（Ｆｕｎｋ，Ｊ．Ｏ．１９９９；およびＴｅｈ，Ｂ．Ｔ．（１９９９））。これらの遺伝子産物の機能の喪失は、抗癌剤により一般的に標的化される酵素（例えば、５−フルオロウリジル（「５ＦＵ」）／チミジル酸シンターゼおよびメトトレキサート／ジヒドロ葉酸レダクターゼ）の抑制された発現に導く。（Ｌｅｅ，Ｖら、（１９９７）；Ｌｅｎｚ，Ｈ．Ｊ．ら、（１９９８）；およびＦａｎ，Ｊ．およびＢｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．（１９８７））。特定遺伝子の増幅は、生物学的および化学療法に対する耐性に関与する。ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子の増幅がメトトレキサートに対する耐性に関する一方で、チミジル酸シンターゼをコードする遺伝子の過剰発現／増幅が５−フルオロピリミジンを用いる処置に対する耐性に関する。（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ａ．ら、（１９９５））。表１は、生物学的および化学療法に対する耐性におけるいくつかの重要な酵素を要約している。
【０００８】
【表１】
2003505466.tif 000018
抗癌剤の乏しい選択性が長い間認識されており、そして選択性を改善し、なおかつより多くの用量が投与されることを可能にする試みが非常にたくさん存在する。一つのアプローチは、プロドラッグの開発である。プロドラッグは、毒物学上害はないが、インビボで治療的に活性な産物に転換され得る化合物である。いくつかの場合において、活性化は、抗体により標的細胞へ送達される非内因性酵素の作用（「ＡＤＥＰＴ」すなわち抗体依存性酵素プロドラッグ治療（米国特許第４，９７５，２７８号））すなわち遺伝子標的化（「ＧＤＥＰＴ」または遺伝子依存性酵素プロドラッグ治療（Ｍｅｌｔｏｎ，Ｒ．Ｇ．およびＳｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｅ．（１９９６））を介して生じる。これらの技術は、血液から出て、そして腫瘍に浸透するそれらの能力に関して厳しい制限を有する。Ｃｏｎｎｏｒｓ，Ｔ．Ａ．およびＫｎｏｘ，Ｒ．Ｊ．（１９９５）を参照のこと。
【０００９】
多数のヌクレオチドアナログおよびヌクレオシドアナログが、抗腫瘍剤および抗ウイルス剤の両方として開発および試験されてきた。例えば、５−フルオロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）（５ＦＵ）および５−フルオロデオキシウリジン（５ＦＵｄＲ）が、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）酵素のインヒビターに細胞内で転換されるその能力に基づく化学療法剤として広範に使用されてきた。多くの他の酵素阻害性化学療法剤の場合と同様に、５ＦＵを使用する癌治療は、この薬物を用いるさらなる処置に対して抵抗性のある攻撃的薬物耐性腫瘍細胞についての選択へしばしば導く。（Ａｓｃｈｅｌｅ，Ｃ．ら、（１９９４）；Ｍａｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．ら、（１９９８）；Ｌｏｎｎ，Ｕら、（１９９６）；Ｐａｒａｄｉｓｏ，Ａら、（２０００）；およびＥｄｌｅｒ，Ｄら、（２０００））。
【００１０】
また、ハロゲン化ヌクレオシドアナログ（例えば、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン（ＢＶｄＵ））に対して特別な注意が払われてきた。これらの型の化合物は、それらが、細胞傷害性応答を誘発するためにモノホスフェートヌクレオチド形態へのリン酸化を必要とし、そしてこのリン酸化が、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）酵素により優先的に達成されるという観察に基づく抗ウイルス剤として最初に開発された。ＢＶｄＵおよび関連化合物は、正常哺乳動物細胞に対する限られた毒性を一貫して示してきたが、それらの化合物は、ウイルス感染した細胞を殺傷する際に効果的である（ＤｅＣｌｅｒｑ，Ｅら、（１９９７））。
【００１１】
抗ウイルス剤および抗癌剤としてのヌクレオシドアナログ（例えば、ＢＶＤＵ）の広範な試験全体にわたって、それらのヌクレオシドアナログは、正常細胞および癌細胞の両方に対して最小毒性を有することが一貫して報告されてきた。これらの観察は、ウイルスチミジンキナーゼ酵素によるそのような化合物の優先的なリン酸化を実証する結果によって支持されており、これは、哺乳動物細胞に対するこれらの化合物の低毒性を説明する。従って、ＢＶｄＵおよび関連ヌクレオシドアナログは、抗癌治療剤としては開発されていなかった。（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｑ，Ｅら、（１９９７））。
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、病理学的細胞（例えば、生物学的薬剤および化学療法剤に対する耐性を付与する標的酵素を内因的に過剰発現する病理学的細胞）の増殖を選択的に阻害する新規な化合物を提供する。この酵素は、本発明のプロドラッグ化合物に対して作用して、１）本発明のプロドラッグ化合物を細胞毒素へと変換し、そして／または２）毒性副生成物を放出させる。本発明の別の局面では、耐性酵素との最初の反応の生成物はその後、普通の細胞酵素（例えば、アシラーゼ、ホスファターゼまたは他の「ハウスキーピング」酵素（Ｖｏｅｔら（１９９５）））または普通の細胞成分（例えば、水）によって充分に活性化されて、このプロドラッグから毒性副生成物を放出する。
【００１３】
１つの実施形態では、標的酵素の活性は、腫瘍抑制機能の喪失および／または化学療法への以前の曝露から生じた選択の結果として、標的細胞において大いに増強されている。別の実施形態では、病理学的細胞は、細胞における感染性因子の発現産物である標的酵素を含む。この発現産物は、抗生物質耐性を付与し得る。
【００１４】
本発明の別の局面は、標的酵素によって活性化され得る新たなプロドラッグについてスクリーニングするためのアッセイを含む。アッセイを完了し、そしてその結果を分析するために必要とされる試薬および使用説明書を備える、このようなアッセイを実施するためのキットもまた本発明によって提供される。
【００１５】
本発明によってさらに提供されるのは、被験体に、本明細書中に記載されるようなプロドラッグを送達することによって被験体を処置するための方法である。本発明のプロドラッグは、単独で、または他の化学療法剤もしくは代替的抗癌治療（例えば、照射）と組み合わせて用いられ得る。
【００１６】
本発明のさらなる局面は、標的酵素を発現する細胞によって特徴付けられる病状を患う被験体の処置において使用するための薬の調製である。
【００１７】
本発明のなおさらなる局面は、被験体について最適な治療を同定するための方法であり、この方法は、標的酵素を発現する細胞を単離すること、およびこの細胞を、本発明のプロドラッグの少なくとも１つと接触させること、次いで、１以上のプロドラッグのうちのどれがこの細胞の増殖を阻害するかまたはこの細胞を殺傷するかを同定し、それによってこの被験体に最適な治療を同定することによる。
【００１８】
本発明のプロドラッグは、以下の構造：
【００１９】
【化３２】
2003505466.tif 000019
を有するかまたはその互変異性体であり；
ここで、Ｒ１２またはＲ１３は、同じであっても異なっていてもよく、そしてオキソ、ＯＨまたはＮＨＮＨ２からなる群より選択され；
ここで、ａが０または１である場合、ａが０であり、かつＲ１３がオキソであるとの条件下では、二重結合が３位と４位との間に存在し、そしてＲ１２がＮＨＮＨ２であるか、
またはａが０でありＲ１２がオキソである場合、二重結合が２位と３位との間に存在し、そしてＲ１３がＮＨＮＨ２であるか；または
ａが１である場合、Ｒ１２およびＲ１３は両方ともオキソであり；
ここで、Ｒ１は、以下の式：
【００２０】
【化３３】
2003505466.tif 000020
を有する置換基であり、
ここで、Ｒ２およびＲ３は独立して、不飽和または飽和のヒドロカルビル基であり；
ここで、ｎは０または１〜１０の整数であり、そしてｍは０または１であり；そして
ここで、Ｒ４は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ３、ＳＩ（ＣＨ３）３、ＣＨＯ、ＮＯ２、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＨ＝Ｃ（Ｒ１５）２または以下の構造：
【００２１】
【化３４】
2003505466.tif 000021
を有する置換基からなる群より選択され、
ここで、ＸａおよびＸｂは独立して、同じであるかまたは異なっており、そしてＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、および強力な脱離基からなる群より選択され；
ここで、Ｙａ、ＹｂまたはＹｃは独立して、同じであるかまたは異なっており、そしてＨまたはＦであり；
ここで、Ｚ、ＺａおよびＺｂは独立して、同じであるかまたは異なっており、そしてＯおよびＳであり；そして
ここで、Ｒ１４はＨまたはＦであり、ただし、Ｒ１４がＦである場合、ａは１であり、そしてＲ１２およびＲ１３は両方ともオキソであり；そして
ここで、Ｑは、糖化合物、炭素環式化合物、および非環式化合物、またはそれらのマスクされたリン酸誘導体もしくはホスホルアミデート誘導体からなる群より選択される。
【００２２】
（発明を実施するための形態）
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の範囲内である、分子生物学、微生物学、細胞生物学、有機化学、医薬化学および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７）；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら編（１９９５）；Ｓｐｅｃｔｏｒ、Ｄ．Ｌ．ら（１９９８）ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；およびＡＮＩＭＡＬ  Ｃｅｌｌ  ＣＵＬＴＵＲＥ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７）を参照のこと。
【００２３】
本明細書および特許請求の範囲において用いる場合、単数形、「１つの（ａまたはａｎ）」、および「その、この（ｔｈｅ）」は、文脈が明白に他を示すのでない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、複数の細胞を含み、これはその混合物を含む。
【００２４】
本明細書において用いる場合、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、この組成物および方法が、言及された要素（エレメント）を含むが、他のものを除外するわけではないことを意味することを意図する。組成物および方法を規定するために用いる場合、「本質的に以下からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、この組合せに対する何らかの本質的意義の他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本明細書に規定される要素から本質的に構成される組成物は、単離および精製の方法由来の微量混入物、ならびに薬学的に受容可能なキャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、保存剤など）を除かない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、他の成分および本発明の組成物を投与するための実質的な方法のステップのわずかでない要素を除外することを意味するものとする。これらの移行部の用語のそれぞれにより規定される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００２５】
用語、「過剰発現」は、正常レベルまたは正常細胞もしくは非病理的細胞から測定されるレベルの、少なくとも２倍、好ましくは３倍、そしてより好ましくは４倍、そして最も好ましくは５倍以上の発現を意味するものとする。
【００２６】
「組成物」とは、活性な因子、および不活性（例えば、検出可能因子もしくは標識）または活性な、別の化合物または組成物（例えば、アジュバント）の組合せを意味することを意図する。
【００２７】
「薬学的組成物」とは、組成物をインビトロ、インビボ、またはエキソビボで、診断または治療用途に適切にする不活性なまたは活性なキャリアと活性因子との組合せを含むことを意図する。
【００２８】
本明細書において用いる場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、任意の標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、水、およびエマルジョン（例えば、水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョン））、ならびに種々の型の湿潤剤）を包含する。組成物は安定剤および保存剤も含み得る。キャリア、安定剤およびアジュバントの例としては、Ｍａｒｔｉｎ  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ，ＳＣＩ．，第１５版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照のこと。
【００２９】
「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、有利な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１つ以上の投与、適用または投薬量で投与され得る。
【００３０】
「標的」細胞または「病理学的（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ）」細胞としては、脱分化した、不死化された、新生物の、悪性の、転移のまたは形質転換した、高増殖性細胞が挙げられる。例としては、肉腫細胞、白血病細胞、癌腫細胞、または腺癌細胞のような癌細胞が挙げられるがこれらに限定されない。特定された癌としては、乳癌細胞、肝細胞腫細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌腫細胞、食道癌腫細胞、膀胱癌細胞、胃腸癌細胞、卵巣癌細胞、皮膚癌細胞、前立腺癌細胞、および胃癌細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
標的細胞または病理細胞は、腫瘍抑制遺伝子産物機能、薬物耐性、または遺伝子不安定性のいずれかの損失に関する細胞内酵素を過剰発現する。あるいは、１つの薬物に対する耐性は、他の生化学的に異なる薬物に対する耐性を付与し得る。内因性の、細胞内酵素のより強力なインヒビターを作製することに関する先行技術の治療と異なり、本発明は、正常な細胞および組織に対して、治療に抵抗性の疾患の細胞および組織に関連した、より高い酵素活性を開発し、そして酵素の阻害に依存しない。用語、「標的酵素」は、上記の特徴の１つ以上を有する酵素を規定するために本明細書において用いられる。
【００３２】
活性化されたかまたは過剰発現され、そして薬物耐性に関連する、遺伝子産物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）（Ｌｏｅｎｎ，Ｕら（１９９６）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈら（１９９５）；およびＪａｃｋｍａｎ，Ａ．Ｌ．ら（１９９５ｂ））、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｄ．ら（１９９５）およびＢｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．ら（１９９６））、チロシンキナーゼ（ＴＮＦ−α，Ｈｕｄｚｉａｋ，Ｒ．Ｍら（１９８８））および多剤耐性（Ｓｔｕｅｈｌｉｎｇｅｒ，Ｍら（１９９４））；Ａｋｄａｓ，Ａら（１９９６）；および（Ｔａｎｎｏｃｋ，Ｉ．Ｆ．（１９９６））；およびＡＴＰ依存性多剤耐性関連タンパク質（Ｓｉｍｏｎ，Ｓ．Ｍ．およびＳｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｍ（１９９４））ならびに、結腸癌および前立腺癌を含むいくつかの疾患では、トポイソメラーゼＩ（Ｈｕｓａｉｎら（１９９４））。
【００３３】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の増幅は、メトトレキサートに対する耐性に関するが、チミジル酸シンターゼをコードする遺伝子の増幅は、５−フルオロピリミジンでの腫瘍処置に対する耐性に関する。薬物耐性に関連する遺伝子の増幅は、Ｋａｓｈｉｎｉ−Ｓａｂｅｔら（１９８８）、米国特許第５，０８５，９８３号または本明細書に記載の方法に記載のように、改変ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で検出およびモニターされ得る。得られた薬物耐性は、細胞遺伝的異常（例えば、相同染色体染色領域および二重微小染色体（その両方が遺伝子増幅に関する））の検出によりモニターされ得る。別のアッセイとしては、直接的または間接的酵素活性アッセイが挙げられ、そしてこのそれぞれは、遺伝子増幅（例えば、ＣａｒｒｅｒａｓおよびＳａｎｔｉ（１９９５））；他の方法論（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、Ｈｏｕｚｅ，Ｔ．Ａ．ら（１９９７））または免疫組織化学（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．ら（１９９７））に関連する。
【００３４】
酵素であるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、いくつかのヒト腫瘍において時折、上昇することが示されている（Ｍｏｒｇａｎ、Ａ．Ｓ．ら（１９９８））。しかしそれにもかかわらず、本明細書において用いられる「標的酵素」からは除外される。なぜなら、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、重複する特異性を有する酵素をコードする遺伝子ファミリーのメンバーであるからである。
【００３５】
まとめると、本発明のプロドラッグは、本発明の標的酵素が、正常細胞に対して、病理学的細胞において、通常、過剰発現されるか、過剰蓄積されるか、または活性化されることに基いて、従来の治療剤とは区別され得る。本発明を他のアプローチと識別する最も重要な原理は、以下である：
（１）本発明は、チミジル酸シンターゼのような酵素についての基質の合成を記載する。過剰発現された酵素は、疾患の細胞において優先的に、プロドラッグを毒素に変換する。以前のアプローチは、これらの酵素のインヒビターにほとんど依存していた。このインヒビターは、酵素の発現の増幅および処置に対する引き続く耐性を導く（例えば、Ｌｏｅｎｎ  Ｕ．ら、（１９９６）；Ｐａｒａｄｉｓｏ、Ａら（２０００）；およびＥｄｌｅｒ、Ｄ．（２０００）を参照のこと）。
【００３６】
（２）現在のアプローチはまた、他の「基質−プロドラッグ」アプローチ（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ酵素）から識別可能である（例えば、Ｍｏｒｇａｎ、Ａ．Ｓ．ら（１９９８）を参照のこと）。ＧＳＴファミリーの酵素は、細胞に対する毒性インサルト（ｉｎｓｕｌｔ）に応答して上昇したレベルで発現される。酵素のＧＳＴファミリーは、重複する基質特性を有する。この特性は、癌細胞における発現上昇を伴う酵素のうち１種のみに反応性の基質を設計することを困難にする（Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．Ｓ．ら（１９９８））。本発明の標的酵素（例えば、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼ）は、その構造および基質特異性に関して特有であるので、特有の基質を設計することが容易である。チミジル酸シンターゼの基質のいくつかの例を、以下に提供する。
【００３７】
（３）いくつかの場合、標的酵素（例えば、チミジル酸シンターゼ）をコードする遺伝子が、変異を受け、インヒビターに対する耐性を獲得し得る（Ｂａｒｂｏｕｒ，Ｋ．Ｗ．ら（１９９２）およびＤｉｃｋｅｎ  Ａ．Ｐ．ら（１９９３））が、インヒビターでない基質プロドラッグとの反応をなお実行し得る。
【００３８】
（４）このアプローチの利点は、腫瘍抑制機能の喪失が、悪性腫瘍の発達に重要であることである。大部分の腫瘍細胞は、ｐ５３、ＲＢまたはｐ１６腫瘍抑制機能の１つを喪失している。（Ｆｕｎｋ，Ｊ．Ｏ．（１９９９）；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｄ．（１９９８）；および  Ｔｅｈ，Ｂ．Ｔ．ら（１９９９））。このような喪失は、化学療法に対する以前の曝露とは独立した、耐性酵素（例えば、チミジル酸シンターゼ）の発現上昇を生じる。本明細書に記載されるプロドラッグは、悪性腫瘍の早期段階、および化学療法で以前に処置された疾患の処置において有用である。ＧＳＴのような酵素の基質は、化学療法に関係しない多くの化合物を含む。（ＷｈａｌｅｎおよびＢｏｙｅｒ（１９９８））。
【００３９】
上記に記載の概念は、チミジル酸シンターゼ酵素および化合物ＮＢ１０１１ＴＭの例を用いて、図１Ａおよび１Ｂに図として示されている。
【００４０】
別の実施形態において、標的細胞は、癌に関係のない薬物または化合物に対するその耐性によって規定される。この場合、この細胞は、抗生物質（例えば、βラクタマーゼ）に対する耐性を付与する微生物で感染される。生物体としては、細菌、酵母および寄生生物（例えば、トリパノソーマ）が挙げられる。表２は、感染性疾患において、このアプローチにより標的される酵素のリストを提供する。
【００４１】
【表２】
2003505466.tif 000022
本発明のプロドラッグは、以下の構造：
【００４２】
【化３５】
2003505466.tif 000023
を有する化合物のＬ異性体およびＤ異性体からなる群より選択され、
ここで：
Ｒ１は、以下の式の部分であるが、ただし、化合物Ｉにおいて、ｎは０であり得る：
【００４３】
【化３６】
2003505466.tif 000024
Ｒ２は、不飽和ヒドロカルビル基；１以上の不飽和ヒドロカルビル基を含む芳香族ヒドロカルビル基；および１以上の不飽和ヒドロカルビル基を含むヘテロ芳香族基からなる群より選択される二価の電子コンジット（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃｏｎｄｕｉｔ）部分であり；
Ｒ３は、以下：
【００４４】
【化３７】
2003505466.tif 000025
からなる群より選択され；
Ｒ５は、同じであっても異なっていてもよく、そして独立して、１個〜１０個の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基、または３個〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基、またはハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；
または以下の基：
【００４５】
【化３８】
2003505466.tif 000026
または以下の基：
【００４６】
【化３９】
2003505466.tif 000027
であり；
ここで、ｎは０または１〜１０の整数であり、そしてｍは０または１であり；
ここで、Ｒ４は、以下：
【００４７】
【化４０】
2003505466.tif 000028
からなる群より選択される置換基であり得；
ここで、Ｒ８およびＲ９は、低級アルキルであり、そしてＲ１０は、ＨまたはＣＨ３であり、そして各Ｘ置換基は独立して同じであるかまたは他方と異なっており、そして−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは他の強力な脱離基であるが、但し、Ｒ７が−Ｈであり、かつｍが０である場合、Ｒ４はハロゲンではなく、また、ｍが０であり、かつｎが０である場合、Ｒ４はハロゲンではない；
ここで、各Ｙ置換基は独立して同じであるかまたは他方と異なっており、そして独立して、−Ｈまたは−Ｆであり、そして各Ｚ置換基は独立して同じであるかまたは他方と異なっており、そして−Ｏ−または−Ｓ−である。
【００４８】
１つの局面では、ｍは０であり、そしてＲ２は、以下からなる群より選択される芳香族ヒドロカルビル基である：
【００４９】
【化４１】
2003505466.tif 000029
代替的な局面では、ｍは０であり、そしてＲ２は、以下：
【００５０】
【化４２】
2003505466.tif 000030
からなる群より選択されるへテロ芳香族基であり、
ここで、Ｊは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＨ−および−ＮＲＡＬＫ−からなる群より選択され、そしてここで、ＲＡＬＫは、１個〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキルまたは３個〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基である。
【００５１】
１つの特定の局面では、Ｒ４は、以下からなる群より選択される：
【００５２】
【化４３】
2003505466.tif 000031
Ｑは、糖化合物、炭素環式化合物、非環式化合物、またはそれらのマスクされたリン酸誘導体もしくはホスホルアミデート誘導体からなる群より選択される。マスクされたリン酸誘導部（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）またはホスホルアミデート誘導部は、以下でより詳細に示すようにこの化合物の５’位でＱに結合される。例えば、Ｑは、以下：
【００５３】
【化４４】
2003505466.tif 000032
からなる群より選択される部分であり；
ここで、各Ｒ６は独立して同じであるかまたは他方と異なっており、そして−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、Ｆおよび他の保護されたヒドロキシル基からなる群より選択され；そして
Ｒ７は、５’位でＱに結合した、水素、リン酸基、ホスホジエステル基、またはホスホルアミデート基である。
【００５４】
明確（ｅｘｐｌｉｃｉｔｅｌｙ）には言及されていないが、本発明のプロドラッグのいずれもが、任意の鏡像異性体形態、ジアステレオマー（ｄｉａｓｔｅｒｉｏｍｅｒｉｃ）形態または立体異性体の形態（Ｄ体、Ｌ体、α−アノマー形態およびβ−アノマー形態を含む）であり得ることが理解されるべきである。
【００５５】
１つの実施形態では、Ｒ４は、以下からなる群より選択される化学的実体であるかまたはこの化学的実体を含む：−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリール、Ｏ−ヘテロアリール、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、−Ｓ−ヘテロアリール、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨＣＨＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＯ−アルキル、ＮＨ２ＣＯＮＨＯ−、ＮＨＮＨ２、−Ｎ３、およびシスプラチンの誘導体（例えば、以下）
【００５６】
【化４５】
2003505466.tif 000033
１つの実施形態では、Ｑは、以下：
【００５７】
【化４６】
2003505466.tif 000034
であり、ここで、Ｒ７は上記の通りであるか、またはより詳細には、以下のような構造：
【００５８】
【化４７】
2003505466.tif 000035
または以下の構造：
【００５９】
【化４８】
2003505466.tif 000036
を有する化合物であり、ここで、Ｒｄは、芳香族置換基である。
【００６０】
代替の実施形態では、Ｒ７は、アミノ酸（例えば、天然に存在する２０個のアミノ酸を含む）から誘導されたホスホルアミデート基である。１つの実施形態では、Ｒ７は、アラニンから誘導されたホスホルアミデート基である。１つの実施形態では、Ｒ７は、以下の構造を有する基であるかまたはこの基を含む：
【００６１】
【化４９】
2003505466.tif 000037
上記の基およびその調製方法は、ＭｃＧｕｉｇａｎら（１９９３）およびＭｃＧｕｉｇａｎら（１９９６）に記載される。
【００６２】
本発明はまた、以下の構造を有する化合物のＬ異性体もしくはＤ異性体またはその互変異性体を提供し：
【００６３】
【化５０】
2003505466.tif 000038
ここで、Ｒ１は、以下の式：
【００６４】
【化５１】
2003505466.tif 000039
を有する置換基であり、
ここで、Ｒ２およびＲ３は、同じであるかまたは異なっており、そして独立して、不飽和または飽和のヒドロカルビル基であり；ここで、Ｒ４は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、ＳＩ（ＣＨ３）３、ＣＨＯ、ＮＯ２、ＣＦ３、ＣＣｌ３、Ｃ（Ｒ５）２からなる群より選択され；ここで、Ｒ５は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群より選択され；ここで、ｎは０または１〜１０の整数であり、そしてｍは０または１であり；そしてＱは上記の通りである。
【００６５】
１つの局面では、ｍは０であり、そしてＲ２は、以下：
【００６６】
【化５２】
2003505466.tif 000040
からなる群より選択され、
ここで、Ｒ５は独立して、同じであるかまたは異なっており、そして１個〜１０個の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基、３個〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基、ＣＮおよびハロゲンからなる群より選択される。
【００６７】
別の局面では、一緒になったＲ２とＲ３とは、アルケニルまたはアルキニルであり、そして以下からなる群より選択される：
【００６８】
【化５３】
2003505466.tif 000041
別の局面では、ｍは０であり、そしてＲ２は、以下からなる群より選択される芳香族ヒドロカルビル基である：
【００６９】
【化５４】
2003505466.tif 000042
さらなる局面では、ｍは０であり、そしてＲ２は、以下からなる群より選択されるへテロ芳香族基であり：
【００７０】
【化５５】
2003505466.tif 000043
ここで、Ｊは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＨ−および−ＮＲＡＬＫ−からなる群より選択され、そしてここで、ＲＡＬＫは、１個〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキルまたは３個〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基である。
【００７１】
これらの実施形態について、Ｒ７は上記の通りである。
【００７２】
特定の実施形態では、Ｒ７は以下である：
【００７３】
【化５６】
2003505466.tif 000044
上記の基およびその調製方法は、Ａｂｒａｈａｍら（１９９６）に記載される。
【００７４】
１つの実施形態では、Ｒ７は、リン酸基であるか、または以下からなる群より選択される構造を有する基であるか、またはこの基を含む：
【００７５】
【化５７】
2003505466.tif 000045
２つの上記の基のうちの最初のもの、およびその調製方法は、Ｆｒｅｅｄら（１９８９）；Ｓａｓｔｒｙら（１９９２）；Ｆａｒｑｕｈａｒら（１９９４）およびＦａｒｑｕｈａｒら（１９９５）に記載される。２つの上記の基のうちの２番目のもの、およびその調製方法は、Ｖａｌｅｔｔｅら（１９９６）；およびＢｅｎｚａｒｉａら（１９９６）に記載される。
【００７６】
１つの実施形態では、Ｒ７は、以下からなる群より選択される構造を有する基であるか、またはこの基を含み：
【００７７】
【化５８】
2003505466.tif 000046
ここで、Ｒは、芳香族置換基であり、２つの上記の基のうちの最初のもの、およびその調製方法は、Ｍｅｉｅｒら（１９９７）に記載される。２つの上記の基のうちの２番目のもの、およびその調製方法は、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら（１９９７）；およびＨｏｓｔｅｔｌｅｒら、公開された国際特許出願第ＷＯ  ９６／４００８８号（１９９６）に記載される。
【００７８】
１つの実施形態では、Ｒ７は、Ｑ内に環式基を形成する。１つのこのような実施形態、およびその調製方法は、以下に示される（ここで、ＤＭＴｒは、４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニルであり、ＤＣＣは１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドであり、そして４−ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジンである）：
【００７９】
【化５９】
2003505466.tif 000047
１つの実施形態では、この化合物は、塩の形態であってもよいし、保護された形態もしくはプロドラッグの形態であってもよいし、それらの組み合わせであってもよい（例えば、塩、エーテルまたはエステルのような）。
【００８０】
別の実施形態では、上記の構造は、以下に記載される方法を用いてさらに改変されて、ホスホジアジリジン基の代わりにチオホスホジアジリジンを有する。
【００８１】
上記の５−置換ピリミジン誘導体の合成は、当該分野で周知である方法によって達成され得る。例えば、Ｌｉ２ＰｄＣｌ４の存在下でのハロアルキル化合物、ハロアセテートまたはアロアルケンでの５−クロロ水銀−２’−デオキシウリジンの処理はそれぞれ、有機パラジウム中間体を通しての、５−アルキル誘導体、５−アセチル誘導体または５−アルケン誘導体の形成をもたらす。Ｗａｔａｙａら（１９７９）およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍら（１９８１）。ピリミジンヌクレオシドおよびピリミジンヌクレオチドのＣ５−改変の別の例は、酢酸第二水銀を用いた、保護されていないヌクレオチドの処理、続いてＬｉ２ＰｄＣｌ４の存在下でのスチレンまたは環置換スチレンの添加によるＣ５−トランス−スチリル誘導体の形成である。Ｂｉｇｇｅら（１９８０）。
【００８２】
ピリミジンデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、酢酸緩衝液中の酢酸水銀（ＩＩ）で、３時間５０℃で処理することによって、ピリミジン環の５位を水銀で誘導体化した（Ｄａｌｅら（１９７３））。このような処理はまた、一リン酸の改変のために有効であると期待され；あるいは、例えば、アルカリホスファターゼで制御処理し、その後一リン酸を精製することによって、改変した三リン酸を改変した一リン酸に酵素学的に変換し得る。水銀と同様の分子特性を有するが、好ましい薬理学的な特性を有する他の部分（有機または無機）で置換し得る。置換したピリミジンの合成のための一般的な方法については、例えば、米国特許第４，２４７，５４４号；同第４，２６７，１７１号；および同第４，９４８，８８２号；ならびにＢｅｒｇｓｔｒｏｍら（１９８１）を参照のこと。上記方法はまた、リボースもしくは２’−デオキシリボース以外の糖（例えば、２’−３’−ジデオキシリボース、アラビノース、フラノース、リキソース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、およびピラノース）を含む５−置換ピリミジンヌクレオシドおよびヌクレオチドの誘導体の合成に適用され得る。５位置換基の例は、ハロビニル基（例えば、Ｅ−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジレート）である（Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ．ら（１９８３））。
【００８３】
あるいは、５−ブロモデオキシウリジン、５−ヨードデオキシウリジン、およびそれらの一リン酸誘導体は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ（ＵＳＡ），Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（ＵＳＡ），Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ（ＵＳＡ），ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ（ＵＳＡ）およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（ＵＳＡ）から市販されている。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ（ＵＳＡ）およびＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ（ＵＳＡ）から市販されている試薬を使用するキナーゼ酵素の作用を介して、化学的また酵素学的のいずれかで、市販の５−ブロモデオキシウリジンおよび５−ヨードデオキシウリジンを、それらの一リン酸に変換し得る。これらのハロゲン誘導体は、新規でかつより強力な代謝拮抗物質を生成するために、他の置換基と組み合わせられ得る。
【００８４】
ウラシルの５位の構造は、つなぎ鎖（ｔｅｔｈｅｒ）として言及される。なぜならば、つなぎ鎖は、提案された脱離基（発毒団）を複素環に接続するからである。ヒトの酵素（例えば、ＴＳ）の活性部位のＣｙｓ残基と反応することよって複素環を活性化する際に、負の電荷が、ウラシルの６位からつなぎ鎖に導かれる。Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ．ら（１９８３）による（Ｅ）−５−（ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン（ＢＶｄＵ）の５’−一リン酸化改変体およびＷａｔａｙａ，ら（１９７９），Ｓａｎｔｉ  （１９８０）；およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ，ら（１９８４）による（Ｅ）−５−（３，３，３−トリフルオロ−１−プロペニル）−２’−デオキシウリジン（ＴＦＰｅ−ｄＵｒｄ）の５’−一リン酸化改変体について、このメカニズムが記載されている。
【００８５】
ＴＳ−Ｃｙｓ−スルフヒドリルの攻撃により供給される毒素不安定化負電荷を導き得るように、毒素とｄＮＭＰとの間のつなぎ鎖「スペーサ」は不飽和でなければならない。この目的のために利用可能な多くの不飽和有機官能基の中で、ビニル、アリル、およびプロパルギルユニットが、単純で、小さく、そして容易に合成可能である。このビニルおよびアリルユニットは、２つの相互変換不可能な幾何異性体のいずれかで調製され得るとういう利点を有している。従って、これらは、酵素活性部位によるプロドラック収容のための「プローブ」として使用され得る。一方、プロパルギルユニットは、円柱状に対称である利点を有し、その結果、この型のつなぎ鎖から放出される酵素触媒毒素は、ビニル分子およびアリル分子の場合のように、ｄＵＭＰウラシル環に関する配向に依存しない。
【００８６】
２つの異なるアプローチが、本発明のヌクレオチドベースのプロドラックのいくつかの設計に用いられている。一つは、ＢＶｄＵ一リン酸の構造に基づいており、そしてｄＵＭＰのＣ５で（ポリ）ビニル置換基の末端に直接結合される脱離基／毒素の特徴を有する。これは、ビニルつなぎ鎖アプローチである。他方は、ＴＦＰｅ−ｄＵＭＰの構造に基づいており、そして一つ目と同じだが、脱離基／毒素を分離するメチレンユニットおよび不飽和ユニットを有し、従って、アリルユニットまたはプロパルギルユニットを含む。これは、アリルつなぎ鎖アプローチである。
【００８７】
アリルつなぎ鎖アプローチのプロパルギル改変体の活性化のメカニズムは、ＴＳとの５−エチニル−２’−デオキシウリジン５’−一リン酸（ＥｄＵＭＰ）および５−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−２’デオキシウリジン５’−一リン酸（ＨＯＰｄＵＭＰ）の両方の相互作用において先例を有する（Ｂａｒｒら（１９８１）；ＢａｒｒおよびＲｏｂｉｎｓ（１９８３））。ＥｄＵＭＰは、ＴＳの強力なインヒビター（Ｋｉ＝０．１  ＴＭ）であり、活性部位においてアレンベース種を形成するようである。ＨＯＰｄＵＭＰ（Ｋｉ  ＝３．０  ＴＭ）は、活性部位でカムレンベース種の形成に起因し得る異常な阻害速度論を示す。
【００８８】
ビニルおよびアリルつなぎ鎖アプローチ機構の両方に共通している中間体と構造的に類似している５−アルキリデン化（ａｌｋｙｌｉｄｅｎａｔｅｄ）５，６−ジヒドロウラシルが、最近、合成された（Ａｎｇｌａｄａら（１９９６））。これらは、高い求電子性であることが示された。エタノールとそれらが容易に反応して５−（エトキシメチル）ウラシルを生成することは、触媒的に適切なＴＳを再生する水の添加についての先例である。さらに最近になって、ＴＳによって生成されるロングエリューシブ（ｌｏｎｇ−ｅｌｕｓｉｖｅ）Ｃ５メチレン中間体の存在を、捕獲研究によって実証した（Ｂａｒｒｅｔｔら（１９９８））。
【００８９】
特定の実施形態としては、以下に示されるＬまたはＤ構造を有する化合物が挙げられる。化合物は、構造および数値による表示により同定される。
【００９０】
【化６０】
2003505466.tif 000048
好ましい実施形態を、以下に示す：
以下の構造：
【００９１】
【化６１】
2003505466.tif 000049
を有する化合物またはそれらのヌクレオシドアナログ。ここで、ＸｄおよびＸｅは、独立して、同じかまたは異なり、そして、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＮからなる群から選択される。より好ましい局面において、Ｘｄは、ＣｌまたはＢｒであり、そしてＸｅは、Ｈである。
【００９２】
以下の構造：
【００９３】
【化６２】
2003505466.tif 000050
を有する化合物またはそれらのヌクレオシドアナログ。ここで、ＸｆおよびＸｇは、独立して、同じかまたは異なり、そして、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＮからなる群から選択される。より好ましい実施形態において、ＸｆおよびＸｇは、同じであり、そして各々が、ＣｌまたはＢｒである。
【００９４】
以下の式の構造：
【００９５】
【化６３】
2003505466.tif 000051
を有する化合物またはそれらのヌクレオシドアナログ。ここで、各Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＮからなる群から選択される。好ましい実施形態において、Ｘは、ＣｌまたはＢｒであり、より好ましい実施形態において、ＸはＢｒである。
【００９６】
以下の構造：
【００９７】
【化６４】
2003505466.tif 000052
を有する化合物またはそれらのヌクレオシドアナログ。ここで、Ｒ８は、直鎖または分枝鎖の低級アルキルである。
【００９８】
以下の構造：
【００９９】
【化６５】
2003505466.tif 000053
を有する化合物またはそれらのヌクレオシドアナログ。ここで、Ｒ８およびＲ９は、直鎖または分枝鎖の低級アルキルであり、そしてＲ１０は、ＨまたはＣＨ３である。
【０１００】
以下の構造：
【０１０１】
【化６６】
2003505466.tif 000054
を有する化合物またはそれらのヌクレオシドアナログ。ここで、Ｒ１０は、ＨまたはＣＨ３である。
【０１０２】
以下の構造：
【０１０３】
【化６７】
2003505466.tif 000055
を有する化合物。
【０１０４】
以下の構造：
【０１０５】
【化６８】
2003505466.tif 000056
を有する化合物またはそのヌクレオシドアナログ。
【０１０６】
本明細書中に記載されるような化合物であって、ここで、この化合物は、以下の構造：
【０１０７】
【化６９】
2003505466.tif 000057
を有する。一つの局面において、Ｒ７＝Ｈである。別の局面において、Ｒ７は、以下の構造：
【０１０８】
【化７０】
2003505466.tif 000058
を有する置換基である。
【０１０９】
本明細書中に記載されるような化合物であって、ここで、この化合物は、以下の構造
【０１１０】
【化７１】
2003505466.tif 000059
を有する。ここで、Ｒ７＝Ｈであるか、またはＲ７は、以下の構造：
【０１１１】
【化７２】
2003505466.tif 000060
を有する置換基である。
【０１１２】
以下の構造：
【０１１３】
【化７３】
2003505466.tif 000061
を有する化合物。
【０１１４】
以下の構造：
【０１１５】
【化７４】
2003505466.tif 000062
を有する化合物またはそのヌクレオシドアナログ。ここで、各Ｘは、ＣＯ２Ｅｔ、Ｃｌ、およびＢｒからなる群から選択される。
【０１１６】
以下の構造：
【０１１７】
【化７５】
2003505466.tif 000063
を有する化合物またはそのヌクレオシドアナログ。
【０１１８】
以下の構造：
【０１１９】
【化７６】
2003505466.tif 000064
を有する化合物またはそのヌクレオシドアナログ。
【０１２０】
このプロドラックは、インビトロおよびインビボでの使用のために、キャリア（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）と組合せられ得る。
【０１２１】
本発明はまた、少なくともいくつかの所望の特性を有する新規な化合物の最初の同定を可能にする、迅速でかつ単純なスクリーニングアッセイを提供する（図２Ａおよび２Ｂを参照のこと）。このアッセイは、少なくとも２つの細胞型を必要とし、第１は、標的酵素が発現されないか、または低レベルで発現されるコントロール細胞（例ば、正常細胞）である。第２の細胞型は、標的酵素が検出可能なレベル（例えば、高レベル）で発現する試験細胞である。この細胞は、標的酵素の増強レベルについて選択される腫瘍細胞株であり得る。あるいは、標的酵素または酵素（標的酵素の適切な種を含む）を差動的に発現するために遺伝学的に改変された細胞を使用し得る。標的細胞をコードするポリヌクレオチドでの宿主細胞のトランスフェクションは、当業者に周知およびＣｈｅｎ，Ｌ．ら（１９９６）；Ｈｕｄｚｉａｋ，Ｒ．Ｍ．ら（１９８８）；またはＣａｒｔｅｒ，Ｐ．ら（１９９２）および以下の実験の部分に記載される手順を使用する一過性または持続性のいずれかである。この細胞は、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのようなバクテリア）または真核生物のものであり得る。この細胞は、哺乳動物の細胞または非哺乳動物の細胞（例えば、マウスの細胞、ラットの細胞、ヒトの細胞、真菌（例えば、酵母））または疾患を引き起こす寄生生物（例えば、ＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓまたはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ）であり得る。
【０１２２】
ｃＤＮＡの挿入のための適切なベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡおよび他の販売者から市販されている。発現の量は、細胞に導入される発現カセットのコピーの数によって、またはプロモーターの用法を変えることによって調節され得る。各トランスフェクトされた細胞株中での酵素の発現のレベルを、免疫検出用の酵素に対して先に挙げたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して、細胞溶解物中でイムノブロットおよび酵素アッセイによってモニターし得る（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら（１９９６））。発現した酵素の量を検出するための酵素アッセイをまた、Ｃａｒｒｅｒａｓ，Ｃ．Ｗ．およびＳａｎｔｉ，Ｄ．Ｖ．  （１９９５）、または以下の実験の部分に記載される方法によって総括されるように実施し得る。
【０１２３】
さらなる局面において、１種より多くの酵素を、別個の宿主細胞を別個に形質転換するために使用し得、その結果、標的酵素に対する候補薬剤の効果を、別の酵素または別の種からの対応する酵素の効果と同時に比較し得る。
【０１２４】
別の実施形態において、第３の標的細胞が、コントロールとして使用される。なぜならば、第３の標的細胞が、本発明の有効量のプロドラック化合物を受容するからである。この実施形態は、チミジル酸シンターゼによって活性化される新規な薬剤をスクリーニングするために特に有用である。なおさらなる局面において、少なくとも一つのさらなる試験細胞系を、公知の治療または薬剤と組合せた試験治療剤の相乗作用の可能性を試験するために設定する。
【０１２５】
本発明の目的のために、首尾良い候補薬剤は、この試験細胞型の増殖を遮断するか、またはこの試験細胞型を殺傷するが、このコントロール細胞型は無傷のままである。増殖アッセイを、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）；Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｂ．Ｊ．ら（１９８５）およびＳｐｅｃｔｏｒ，Ｄ．Ｌ．ら（１９９８）に記載される標準的な方法によって、または以下の実験の部分に記載される方法を用いて実施し得る。
【０１２６】
このスクリーニングを、抗生物質の発見のために広範に適用し得ることは、当業者によって理解される。例えば、酵母由来のチミジル酸シンターゼを、ヒトのチミジル酸シンターゼ酵素またはこの酵素のＥ．ｃｏｌｉ形態に置換し得る。このことは、酵母に関連する病原体を標的とする特異的な抗真菌性抗生物質の発見を可能にする。さらに、他の酵素を、この処理に供し得る。例えば、感染性因子（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｎｉｉ）のジヒドロ葉酸リダクターゼ活性を特異的に標的とするプロドラックが、選択され得た。この薬剤を、標的酵素に対する特異性について選択し、そして本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイを使用することによって、天然の宿主の酵素を活性化しないことを示すことができる。このコントロール細胞の構築物は、正常なヒトの酵素のみが存在する場合、毒性の欠如を示すために、対応する正常なヒトの酵素を含む。
【０１２７】
図２Ａおよび２Ｂは、本発明のこの局面の少なくとも１つの実施形態をどのように行い得るかを示す。外来遺伝子（例えば、ＴＳをコードするヒトの遺伝子）は、ヒトのＴＳが発現されるように宿主細胞の中に挿入される。この「コントロール細胞」は、標的酵素を発現しない。いくつかの実施形態において、標的酵素のタンパク質産物で培養培地を補充することが、必要であり得る。
【０１２８】
候補プロドラックは、細胞培養培地に直接的に添加され得、次いで、標的細胞または培養培地は、プロドラックが検出可能な標識を含有する場合、候補プロドラックから放出される標識の量についてアッセイされる。あるいは、細胞の取り込みは、Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｄ．（１９９６）に記載の方法を使用して、プロドラックをリポソームにパッケージングすることによって増強され得るか、またはＬｅｗｉｓ，Ｊ．Ｇ．ら（１９９６）に記載されるようにサイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）と組合され得る。
【０１２９】
腫瘍細胞中でのＴＳ過剰発現を利用したプロドラックについての代替の実施形態は、治療用放射性核種と結合した、デオキシウリジンホスホルアミデート、または他の改変体（本明細書中に記載される）である。治療用放射性核種の例は、レニウム１８８である。アイソトープは、Ｃａｌｌａｈａｎ，ら（１９８９）によって記載されるように、本質的に合成され得る。あるいは、これは、例えば、Ｍａｌｌｉｃｒｏｄｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＢＶ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから市販されて入手され得る。治療用放射性核種は、例えば、Ｌｉｎ，Ｗ．Ｙ．ら（１９９７）によって記載される標準的な方法によって、デオキシウリジン、もしくはデオキシウリジン５’−ホスホルアミデート、または他の誘導体と結合され得る。放射性核種を含むデオキシウリジンホスホルアミデートは、チミジル酸シンターゼを過剰発現する腫瘍細胞のＤＮＡに優先的に取り込まれ、そしてβ放射およびγ放射の集中発光を介してそれらを死なせる。代替の放射性核種は、レニウム１８６など（Ｔｒｏｕｔｎｅｒ，Ｄ．Ａ．（１９８７））を含む。
【０１３０】
処理されるべき細胞を含有するサンプルにプロドラックを送達し、そして細胞死または細胞増殖の阻害についてアッセイすることによって、本発明のプロドラックによって被験体が適切に処置されるかどうかを予想するのに、この化合物は有用である。出願人は、病理学的細胞または患者が本発明の少なくとも一つのプロドラックおよび使用のための装置を提供することによって、この治療により適切に処理されるかどうかを決定するためのキットを提供する。
【０１３１】
本発明はまた、本発明のプロドラックの有効量を細胞に送達することによって、インビトロまたはインビボで病理学的細胞または標的細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。インビボで実施される場合、本発明の有効量のプロドラックを被験体に送達することによって、被験体の標的細胞によって特徴付けされる病状を処置するのに、この方法は有用である。
【０１３２】
標的細胞が化学療法剤に対して耐性である場合、細胞が耐性を有する、有効量の薬剤を細胞または患者と接触させるか、または投与することによって、この方法は、さらに改変され得る。本発明のプロドラックは、前治療に対する耐性を取り消し得るので、本発明のプロドラックでの首尾良い処置後に、予備治療の投与により腫瘍の増殖または転移をさらに阻害し得る。このことが起こり得る例としては、標的細胞が化学療法によってインビボでの選択の結果として増殖される酵素を発現する場合、または標的酵素が標的細胞中で過剰増殖される内因性細胞内酵素である場合が挙げられるが、これらに限定されない。このような酵素の例は、前化学療法の結果として過剰発現されることが示されているチミジル酸シンターゼであり、前薬剤に対して細胞で薬剤耐性表現型を与える。
【０１３３】
本発明のプロドラックはまた、他の公知の治療と組合せて、以前の治療のいずれかもしくは両方の治療効果またはプロドラックの治療効果を増強または相乗作用を与え得る。このような前治療としては、腫瘍化学療法、放射線治療および外科手術が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
動物に送達される場合、本方法がまた、プロドラックの効果をさらに与えるために有用である。動物モデルの例として、ヌードマウスのグループ（Ｂａｌｂ／ｃ  ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕ  雌，Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）が、約１０５〜約１０９の過剰増殖の癌または標的細胞（本明細書中に記載される）で各々皮下で播種される。腫瘍が確立される場合、プロドラックは、例えば、腹腔内経路または静脈内経路によって投与される。腫瘍のサイズの減少を決定するための腫瘍の測定は、週に２度、ベニアカリパス（ｖｅｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して２次元でなされる。他の動物モデルを適切に使用し得る（Ｌｏｖｅｊｏｙら（１９９７）；Ｃｌａｒｋｅ，Ｒ．（１９９６）；およびＰｅｇｒａｍ，Ｍ．Ｄ．ら（１９９７））。
【０１３５】
インビボでの投与は、処置の過程を通じて連続的または断続的に１回の用量で達成され得る。最も有効な手段および投与用量を決定する方法は、当業者に周知であり、そして治療のために使用される組成物、治療の目的、処理される標的細胞、および処理される被験体で変化する。単一または複数の投与は、担当医によって選択される用量レベルおよびパターンで実施され得る。適切な用量処方物および薬剤の投与方法は、以下に見出され得る。
【０１３６】
プロドラック、薬剤の組合せ、またはいずれかを含む組成物は、従来の手順に従って投与することによってヒトおよび他の動物処置のための薬（例えば、薬学的組成物中の活性成分）の製造のために使用され得る。
【０１３７】
薬学的組成物は、経口的、鼻腔内、非経口的、または吸入療法によって投与され得、そして錠剤、ロゼンジ剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、アンプル、坐薬の形態またはエアロゾル形態をとり得る。これらはまた、水性または非水性の希釈剤中の活性成分の懸濁液、溶液および乳濁液、シロップ、顆粒剤または散剤の形態をとり得る。本発明の化合物に加えて、薬学的組成物はまた、他の薬学的に活性な化合物または本発明の複数の化合物を含み得る。
【０１３８】
より詳細には、本明細書中で活性成分としても言及される本発明の式の化合物が、経口、直腸、鼻腔内、局所（経皮、エアロゾル、粘膜および舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋内、静脈内および皮内を含む）ならびに肺を含む任意の適切な経路によって治療のために投与され得る。好ましい経路がレシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患とともに変化することもまた理解される。
【０１３９】
一般的に、上で挙げられた化合物のそれぞれについての適切な用量は、１日当たりレシピエントの体重１キログラムにつき約１〜約１００ｍｇの範囲、好ましくは１日当たり体重１キログラムにつき約１〜約５０ｍｇの範囲、そしてもっと好ましくは１日当たり体重１キログラムにつき約１〜約２５ｍｇの範囲である。他に示されないかぎり、全ての活性成分の重量は、塩またはエステルに対して、本発明の式の親化合物として計算され、その重量は、比例して増加する。所望の用量は、好ましくは、その日を通して適切な間隔で投与される２、３、４、５、６またはそれより多くの部分用量として提供される。これらの部分用量は、単位投薬形態で投与され得、例えば、単位投薬形態当たり約１〜約１００ｍｇ、好ましくは、約１〜約２５ｍｇより多く、そして最も好ましくは約５〜約２５ｍｇより多くの活性成分を含む。本発明の化合物および組成物の適切な投薬量は、疾患のタイプおよび重症度および段階に依存し得、患者間で異なり得ることが理解される。最適な投薬量の決定は、一般的に、本発明の処置の危険または有害な副作用に対する治療的利益のレベルのバランスをとることを含む。
【０１４０】
理想的には、プロドラッグは、疾患の部位において活性化合物のピーク濃度を達成するように投与されるべきである。これは、例えば、プロドラッグの静脈注射（必要に応じて生理食塩水中で）によって達成され得るか、あるいは例えば、活性成分を含む錠剤、カプセル剤またはシロップ剤として経口的に投与され得る。プロドラッグの所望の血液レベルは、疾患組織内に活性成分の治療的量を提供するために連続注入によって維持され得る。効力のある組み合わせの使用は、それぞれ個々の治療化合物または薬剤が単独で使用される場合に必要とされ得るよりも低い合計の投薬量のそれぞれの成分の抗ウイルス剤を必要とする治療的組み合わせを提供することが意図され、これによって有害な効果を減少する。
【０１４１】
プロドラッグ成分が単独で投与されることが可能であるが、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の治療剤とともに、上で定義されるように少なくとも１つの活性成分を含む薬学的処方物としてそのプロドラッグ成分を提供することが好ましい。それぞれのキャリアは、処方物の他の成分と適合性であり、患者に対して有害でないという意味で「受容可能」でなければならない。
【０１４２】
経口投与に適切な本発明の処方物は、カプセル剤、カシェ剤または錠剤のような（それぞれが所定の量の活性成分を含む）別個の単位として；散剤または顆粒剤として；水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液として；または水中油の液体乳濁液または油中水の液体乳濁液として提供され得る。活性成分はまた、ボーラス、舐剤またはペーストで提供され得る。
【０１４３】
錠剤は、必要に応じて一つ以上の補助成分を伴って圧縮または鋳型成形によって作製され得る。圧縮される錠剤は、必要に応じて結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈物、保存剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムデンプングリコレート、架橋ポビドン、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性剤または分散剤とともに混合されて、粉末または顆粒のような自由流動形態の活性成分を適切な機械中で圧縮することによって調製され得る。鋳型成形される錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らされた粉末状の化合物の混合物を適切な機械中で鋳型成形することによって作製され得る。錠剤は、必要に応じて、被覆され得るかまたは刻み目を付けられ得、そして所望の放出プロフィールを提供するために種々の割合で、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用してその中の活性成分のゆっくりしたまたは制御された放出を提供するように処方され得る。錠剤は、必要に応じて、胃ではなく腸の部分での放出を提供するために、腸溶性コーティングで提供され得る。
【０１４４】
口での局所投与に適切な処方物には、芳香性のベース（通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカント）中に活性成分を含むロゼンジ；不活性なベース（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシア）中に活性成分を含む香錠；ならびに適切な液体キャリア中で活性成分を含むうがい薬が挙げられる。
【０１４５】
本発明に従う局所投与のための薬学的組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、散剤、溶液、ペースト（ｐａｓｔ）、ゲル、スプレー、エアロゾルまたは油状物として処方され得る。あるいは、処方物は、活性成分および必要に応じて１つ以上の賦形剤または希釈剤で含浸される包帯（ｂａｎｄａｇｅ）または接着性硬膏のようなパッチまたは包帯（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）を含み得る。
【０１４６】
目または他の外部組織（例えば、口および皮膚）の疾患について、この処方物は、好ましくは、局所軟膏またはクリームとして適用され、例えば、約０．０７５〜約２０％ｗ／ｗ、好ましくは約０．２〜約２５％ｗ／ｗ、そして最も好ましくは約０．５〜約１０％ｗ／ｗの量で活性成分を含む。軟膏で処方される場合、プロドラッグは、パラフィン性または水混和性性の軟膏ベースのいずれかとともに使用され得る。あるいは、プロドラッグ成分は、水中油クリームベースでクリーム中で処方され得る。
【０１４７】
所望の場合、クリームベースの水性相は、例えば、少なくとも約３０％ｗ／ｗの多価アルコール（すなわち、プロピレングリコール、ブタジエン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコールならびにこれらの混合物のような２つ以上のヒドロキシル基を有するアルコール）を含み得る。局所処方物は、望ましくは、皮膚または他の冒された領域を通るプロドラッグ成分の吸収または浸透を高める化合物を含み得る。このような皮膚浸透エンハンサーの例としては、ジメチルスルホキシドおよび関連したアナログが挙げられる。
【０１４８】
本発明の乳濁液の油性相は、公知の方法で公知の成分から構成され得る。この相が乳化剤（そうでなければ、エマルジェント（ｅｍｕｌｇｅｎｔ）として知られる）のみを含み得るが、この相は、望ましくは、脂肪または油とともにかまたは脂肪と油の両方とともに少なくとも一つの乳化剤の混合物を含む。好ましくは、親水性乳化剤は、安定化剤として作用する親油性乳化剤とともに含まれる。油と脂肪の両方を含むことがまた好ましい。一緒に、安定化剤を含むかまたは含まない乳化剤は、いわゆる乳化ワックスを構成し、そして油および／または脂肪とともにワックスは、いわゆる乳化軟膏ベース（クリーム処方物の油分散相を形成する）を構成する。
【０１４９】
本発明の処方物における使用に適切なエマルジェントおよび乳化安定剤には、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｓｐａｎ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリルモノステアレートおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【０１５０】
処方物について適切な油または脂肪の選択は、所望の美容性質を達成することに基づく。なぜなら薬学的乳濁処方物中で使用されそうな大部分の油中の活性成分の溶解性は、非常に低いからである。従って、クリームは、好ましくは、脂っこくなく、非染色性で、かつチューブまたは他の容器からの漏れを避けるために適切な粘度を有する洗浄可能な製品であるべきである。ジイソアジピン酸エステル、ステアリン酸イソセチル、ココナッツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸２−エチルヘキシルまたはＣｒｏｄａｍｏｌＣＡＰとして公知の分枝鎖エステルのブレンドのような直鎖または分枝鎖の一塩基性または二塩基性アルキルエステルが使用され得、最後の３つが好ましいエステルである。これらは、必要な性質に基づいて単独でまたは組み合わせて使用され得る。あるいは、白色ワセリンおよび／または流動パラフィンのような高融点脂質あるいは他の鉱油が使用され得る。
【０１５１】
目への局所投与に適切な処方物には、点眼剤が挙げられ、ここでは活性成分が適切なキャリア中で（特にプロドラッグ成分に対して水性溶媒で）溶解させられるかまたは懸濁させられる。プロドラッグ成分は、好ましくは、約０．５〜約２０％、有利には約０．５〜約１０％、特に約１．５％ｗ／ｗの濃度でこのような処方物中で提供される。
【０１５２】
直腸投与のための処方物は、例えば、ココアバターまたはサリチレートを含む適切なベースを伴って坐薬として提供され得る。
【０１５３】
膣投与に適切な処方物は、プロドラッグ成分に加えて当該分野において適切であることが公知のようなキャリアを含む坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡状剤またはスプレー処方物として提供され得る。
【０１５４】
鼻腔内投与に適切な処方物（キャリアが固体である）には、鼻から吸う（ｓｕｆｆ）ことが行われる様式（すなわち、鼻の近くに保持された散剤の容器から鼻の経路を通って迅速に吸入されることによる）で投与される、例えば約２０〜約５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗い粉末が挙げられる。例えば、鼻腔内スプレー、鼻腔内ドロップのような投与、または噴霧器によるエアロゾル投与による投与のためにキャリアが液体である適切な処方物には、プロドラッグ成分の水性または油性溶液が挙げられる。
【０１５５】
非経口投与に適切な処方物には、水性および非水性等張性滅菌注射溶液が挙げられ、これは、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および溶質（処方物を意図するレシピエントの血液と等張性にする）；ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液（懸濁剤および増粘剤を含み得る）、ならびにリポソームまたは他の微粒子系（血液成分または一つ以上の器官に対してこの化合物を標的化するように設計される）が含まれ得る。この処方物は、単位用量または複数用量で密封された容器（例えば、アンプルおよびバイアル）で提供され得、そして使用の直前に滅菌液体キャリア（例えば注射用水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｓ））状態で保存され得る。即時注射溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。
【０１５６】
上で特に言及された成分に加えて、本発明の処方物は、問題の処方物のタイプに関して当該分野で従来の他の薬剤を含み得、例えば、経口投与に適切な薬剤は、例えば、甘味料、増粘剤および矯味矯臭剤をさらに含み得ることが理解されるべきである。
【０１５７】
本発明の式のプロドラッグおよび組成物はまた、獣医学的処方物の形態での使用のために提供され得、これは、当該分野で従来の方法によって調製され得る。
【０１５８】
以下の実施例は、本発明の例示を意図するが、本発明を限定しない。
【０１５９】
（材料および方法）
（ヌクレオシドＥＣＴＡ化合物の合成）
上記５−置換ピリミジンヌクレオシドの合成は、当該分野で周知であり、そして手短に上記された方法によって達成され得る。
【０１６０】
一つの実施形態において、本発明は、４つのクラスの化合物を含む。それぞれのクラスは、存在するウリシル（ｕｒｉｃｉｌ）塩基または改変ウリシル塩基の構造によって規定される。これらのクラスは、１）塩基が、ウラシルのフラノ−ピリミジノン誘導体である；２）塩基が、６−フルオロウラシルである；３）塩基が、４−ヒドラゾン置換ウラシル誘導体である；４）塩基がウラシルである、ＥＣＴＡ化合物である。ウラシルまたは改変ウラシル誘導体塩基を使用して、５位において毒性脱離基で置換され、この５位において電子コンジットつなぎ鎖によって接続され、そして電子コンジットつなぎ鎖と毒性脱離基との間に適切なスペーサー部分を含む化合物を合成する。ＥＣＴＡ化合物は、以下に記載されるように、非リン酸化され得、５’モノリン酸誘導体、５’ホスホジエステル誘導体、または５’保護（「マスク」）デオキシウリジンまたは代替の炭水化物部分の匹敵する誘導体であり得る。保護５−置換デオキシウリジンモノリン酸誘導体は、リン酸部分が適切な化学保護基の結合によってブロックされている誘導体である。５−置換デオキシウリジンモノリン酸誘導体の保護は、溶解性を改善し、細胞浸透を容易にし、血液脳関門を横切る通過を容易にし、そして細胞または細胞外ホスファターゼの作用を妨げ得る（これは、そうでないと、リン酸基を失い得る）。別の実施形態において、５−置換ウラシルまたはウリジン誘導体は、ヌクレオシドキナーゼ活性を含む細胞に投与され、ここで、５−置換ウラシル／ウリジン誘導体は、５−置換ウリジンモノリン酸誘導体に変換される。ウリジン誘導体はまた、それらの溶解性、細胞浸透性、および／または血液脳関門を横切る能力を増加させるために改変され得る。
【０１６１】
５−置換ウリジンモノリン酸誘導体についてのチミジル酸シンターゼの作用は、ピリミジン環の５位（「脱離基」）に結合する置換基を放出し得る。次いで、放出された置換基は、固有にまたは別の細胞成分との反応に続いてのいずれかで、毒素または細胞増殖のインヒビターとして作用し得る。
【０１６２】
（プロパルギルつなぎ鎖を有するＥＣＴＡ化合物の合成）
プロパルギルアルコールまたはアリルアルコールを有する２’−デオキシウリジンの合成は、簡単である。これらの化合物およびこれらの化合物の近縁の誘導体の多くは、文献において報告され、そしていくつかはＴＳと関連して研究されてさえきた。例えば、５−アルキニル−ｄＵＭＰ（５−（３−メトキシ−１−プロピニル）−ｄＵＭＰおよび５−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−ｄＵＭＰを含む）は、ＴＳインヒビターとして試験され（ＢａｒｒおよびＲｏｂｉｎｓ（１９８１））、そしてこれらのうちのいくつかは、ＴＳ欠乏性癌細胞のＤＮＡに組み込まれるようになることが示された（Ｂａｌｚａｒｉｎｉ，Ｊ．ら（１９８５））。
【０１６３】
５−水銀ウリジン（Ｒｕｔｈ，Ｊ．Ｌ．ら（１９７８））および５−ヨードウリジン（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら（１９８１））の両方は、パラジウム触媒の存在下で容易にアルケンおよびアルキンと縮合し、Ｃ５つなぎ鎖を有するウリジンを与える。後者の経路は、より頻繁に使用される（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら（１９８２）、Ａｓａｋｕｒａ，Ｊ．ら（１９８８）および（１９９０））。保護５−ヨード−２’−デオキシウリジンとｔ−ブチルジメチルシリルプロパルギルエーテル（Ｇｒａｈａｍら（１９９８）；Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑら（１９８３））、メチルプロパルギルエーテル（Ｔｏｌｓｔｉｋｏｖら（１９９７））との高収率の縮合が達成され、そしてプロパルギルアルコール自体（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉら（１９９５）およびＧｏｏｄｗｉｎら（１９９３））との高収率の縮合さえ達成されてきた。後者の反応によって導入される３−ヒドロキシ−１−プロピニル置換基はまた、メタクリレート基のＤＩＢＡＬ−Ｈ還元によってアクセスされ得（Ｃｈｏ，Ｙ．Ｍ．ら（１９９４））、それ自体ＢＶｄＵの合成において使用される同じＨｅｃｋ反応から生じる。これらのパラジウム触媒反応は非常に汎用性があるので、非常に長くかつ精巧に官能化されたプロパルギルに基づくつなぎ鎖を５−ヨード−２’−デオキシウリジンへ縮合するために使用され得る（Ｌｉｖａｋら（１９９２）およびＨｏｂｂｓ（１９８９））。（Ｚ）−アリルに基づくつなぎ鎖は、プロパルギル前駆体をＵｎｄｉａｒ触媒上で部分水素化することによって生成され（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら（１９８３））、一方（Ｅ）−アリルに基づくつなぎ鎖は、（Ｅ）−トリブチルスズ化エチレンのＨｅｃｋカップリングによって最も良好に調製される（Ｃｒｉｓｐ（１９８９））。
【０１６４】
文献の手順にしっかりと従って、ｔ−ブチルジメチルシリルプロパルギルエーテルを有する３’，５’−ジ−Ｏ−保護２’−デオキシウリジン（Ｇｒａｈａｍら（１９９８）およびＤｅ  Ｃｌｅｒｃｑら（１９８３））が調製され、そしてその一部（対応する（Ｚ）−アリルエーテルに変換される（ＲｏｂｉｎｓおよびＢａｒｒ（１９８３）））は、還元される。ＴＢＤＭＳ基のＴＢＡＦ−媒介除去は、インサイチュで官能化され得るオキシアニオンを生成するので、これらのＴＢＤＭＳ保護プロパルギルヌクレオシドおよび（Ｚ）−アリルつなぎ鎖を有するヌクレオシドは、トキソホア（ｔｏｘｏｐｈｏｒｅ）を有する標的のいくつかに対する簡便な前駆体として役立つ。（Ｅ）−アリルアルコールを有するヌクレオシドについては、公知のＯ−テトラヒドロピラニルエーテル誘導体は、（Ｅ）−トリブチルスズ化エチレンの文献記載のＨｅｃｋカップリングによって調製される（Ｃｒｉｓｐ（１９８９））。
【０１６５】
【化７７】
2003505466.tif 000065
２工程の文献記載のプロトコル（Ｐｈｅｌｐｓら（１９８０）ならびにＨｓｉａｏおよびＢａｒｄｏｓ（１９８１））を使用することにより、プロパルギルアルコールならびに（Ｅ）−アリルアルコールおよび（Ｚ）−アリルアルコールは、それらの対応するビス−アジリジニルホスホルアミデートまたはトリホスホルアミデートに変換され、その結果５’−モノヌクレオチドバージョンのＴＳプロセシングは、細胞増殖抑制薬ＴＥＰＡまたはＴｈｉｏＴＥＰＡの活性な代謝産物をそれぞれ放出する（Ｄｉｒｖｅｎら（１９９５））。
【０１６６】
【化７８】
2003505466.tif 000066
（フラノ−ピリミジノンの合成）
フラノ−ピリミジノンの合成は、Ｃ５プロパルギルアルコールを有する２’−デオキシウリジンの合成から始まる。次いで、フラノ−ピリミジノン化合物は、上記のＯ−テトラヒドロピラニルエーテル誘導体から形成される。合成は、プロパルギル結合の第２炭素とピリミジン環のＣ４位に結合した酸素との反応によって進み、蛍光フラノ−ピリミジノン（これは、反応混合物から容易に単離され得る）を生じる。このような化合物は、特定の電子コンジット（ｃｏｎｄｕｉｔ）、スペーサーおよび毒性脱離基の種々の組み合わせを介するＥＣＴＡ化合物の合成のためのさらなる基礎を提供する。
【０１６７】
【化７９】
2003505466.tif 000067
フロ［２，３−ｄ］ピリミジノンヌクレオシドは、２’，３’−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイルまたは２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジンを１−（テトラヒドロピラニルオキシ）−２−プロピンとこれらの蛍光化合物の形成を促進する公知の条件下（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら（１９８３））で縮合することによって調製された（「Ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  δ−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌｅｓ」Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｇ．およびＭａｎｎ，Ｍ．Ｊ．（１９５３））。炭水化物保護基の塩基触媒除去は、６−（テトラヒドロピラン−２−イルオキシメチル）置換二環式ヌクレオシドを与え、これは、標準的な酸性ＴＨＰ基加水分解（ＣＨ２Ｃｌ２中のＴＦＡ）に供されたか、またはＢＶｄＵ−ＰＡおよび５ＦＵｄＲ−ＰＡを調製するために使用される手順と同じ手順によって、位置選択的に５’−ホスホルアミデート化されたかのいずれかである。図４に示されるように、ホスホルアミデート化の後、ＴＨＰ基は、酸性加水分解によって除去され得た。
【０１６８】
（フラノ−ピリミジノンに基づくＴＳ  ＥＣＴＡ化合物）
毒性Ｒ４脱離基は、上記のＴＥＰＡおよびＴｈｉｏＴＥＰＡ誘導体の合成を用いて説明されるような、毒性脱離基をＣ５プロパルギルウリジン化合物上のヒドロキシルに結合するために使用される方法と同様の方法を用いて、フラン−２−メチルアルコールに結合され得る。当業者に明らかである種々の代替の毒性脱離基が想定される。さらに、Ｒ２電子コンジット成分の長さおよび組成、ならびにＲ３スペーサ要素の組成に対する改変がまた、想定される。
【０１６９】
フラノ−ピリミジノンに基づくＴＳ  ＥＣＴＡ化合物はまた、種々の改変された「Ｑ」部分からなり得る。多くの５−置換２’−デオキシウリジンは、ヒトＴＫのための基質ではないが、興味深いことに、５−（４−ヒドロキシ−１−ブチニル）−２’−デオキシウリジンは、例外であることが見出された（Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ．ら（１９８１））。ＥＣＴＡ化合物は、代替の炭水化物基に結合した遊離の５’ヒドロキシル基、５’モノリン酸基、または５’ホスホルアミデート基を有し得る。このようなホスホルアミデート化合物の合成のための新規な方法は、ＨＣｌスカベンジャーの存在下で、２−デオキシ３’−ヒドロキシ，５’−ヒドロキシ非保護ヌクレオチドをホスホクロリデートと反応させることによって達成される。好ましい実施形態においては、ホスホクロリデートは、アラニンのようなアミノ酸から誘導される亜リン酸置換基を含む。例えば、ホスホクロリデートは、フェニル−Ｌ−メトキシアラニンホスホロクロリデートであり得る。
【０１７０】
（Ｃ６フルオロウリジンおよびＣ４ヒドラゾン（ｈｙｄｏｚｏｎｅ）に基づく化合物）
ピリミジンＣ５−Ｃ６二重結合への中性チオール付加は、ｄＵＭＰとの通常のＴＳ反応において、発熱反応（３〜９ｋｃａｌ／ｍｏｌ；Ｌｅｓ，Ａ．ら（１９９８）による総説を参照のこと）として進む。６位におけるＴＳ反応性水素（これは、活性ヒトＴＳシステイン（Ｌ．ｃａｓｅｉのｃｙｓ−１９８を有するホモログ）を介した、酵素とのスルフィドリル結合の形成を促進し得る）に対する代替の置換基としては、フッ素が挙げられる。ピリミジン環の他の位置におけるこのような置換基はまた、基質とＴＳとの間の反応を容易にし得る。例えば、ウラシル上の４−ヒドラゾン置換（Ｌｅｓ，Ａ．ら（１９９８）によって記載されるような）は、ＴＳを用いたチオールの形成を容易にする。得られるヌクレオチド−チオール（ＴＳ）中間体が、改変されたヌクレオチドを放出するような方法（これは加水分解を介して受動的に達成され得る）で再構成することが重要である。
【０１７１】
【化８０】
2003505466.tif 000068
Ｃ６位におけるフッ素の導入は、以前に報告されていなかったが、ＫｒａｊｅｗｓｋａｓおよびＳｈｕｇａｒ（１９８２）の合成的記載（これは、多くの６置換ウラシルおよびウリジンアナログの合成を記載する）に従って合成され得る。
【０１７２】
ピリミジン塩基のＣ４位における化学的促進（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ）置換基は、当業者に周知である。文献の記載の例としては、Ｗａｌｌｉｓら（１９９９）、Ｎｅｇｉｓｈｉら（１９９６）、Ｂａｒｂａｔｏら（１９９１）、Ｂａｒｂａｔｏら（１９８９）およびＨｏｌｙら（１９９９）が挙げられる。これらの合成技術はまた、置換基の組み合わせ（例えばピリミジン環のＣ４位およびＣ５位（Ｐｌｕｔａら（１９９９））またはピリミジン環のＣ２位およびＣ４位（Ｚｅｉｄら（１９９９）））を可能にする。
【０１７３】
【化８１】
2003505466.tif 000069
本発明の別の実施形態においては、ＥＣＴＡ化合物は、代替の電子コンジット、スペーサー部分および毒性脱離基の、Ｃ６フルオロ−ウリジン塩基またはＣ４ヒドラゾン修飾ピリミジンのいずれかへの付加によって合成される。２（デオキシウリジンに基づくＥＣＴＡ化合物）の合成のための上記の方法は、このような分子の合成のために再び使用され得る。
【０１７４】
（ヌクレオシドフェニルメトキシアラニニルホスホルアミデートの合成）
ホスホルアミデートの、ヌクレオチドについてのホスフェートプロドラッグとしての使用は、ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．ら（１９９３）およびＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．ら（１９９４）によって最初に報告された。これらの著者は、抗ウイルス性２’，３’−ジデオキシヌクレオシド誘導体のホスホルアミデート誘導体（例えば、ｄ４Ｔ）が、チミジンキナーゼ欠損細胞においてそれらの抗ウイルス活性を保持することを示した。さらなる研究は、ホスホルアミデート基が細胞の内側でリン酸基へと加水分解されることを示した（ＭｃＧｕｉｇａｎ，Ｃ．ら（１９９６）；Ｂａｌｚａｒｉｎｉ，Ｊ．ら（１９９６）；およびＳａｂｏｕｌａｒｄら（１９９９））。ホスホルアミデートは、２’，３’−ジデオキシヌクレオシドをフェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデート（ＰＭＰＣ）と反応させることによって合成された。
【０１７５】
ヒドロキシル基は１つしか存在しないので、これらの反応は通常、滞りなく進行する。１より多くのヒドロキシル基が存在する化合物では、適切に保護されたヌクレオシドが必要とされ得る。２’−デオキシヌクレオシドの５’−ＯＨ基は３’−ＯＨ基よりはずっと立体障害がないので、注意深く制御された条件下ではＰＭＰＣを用いた選択的ホスホルアミド化（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｉｏｎ）が可能である。ＢＶｄＵおよび５ＦＵｄＲは両方とも無水ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ−メチルイミダゾールの存在下でＰＭＰＣと縮合して、対応するホスホルアミデートを与えた。いずれの場合も、所望の生成物は、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーを用いて出発材料から容易に分離され得た。合成スキームを以下にまとめる。
【０１７６】
【化８２】
2003505466.tif 000070
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、本発明を限定しない。
【０１７７】
（実施例１および２）
（プロパルギルつなぎ鎖を用いたＥＣＴＡ化合物の合成）
上記の一般的合成手順を用いて、ビス−アジリジン−１−イル−ホスフィン酸３−［２−デオキシウリジン−５−イル］−プロプ−２−イニルエステルを合成し、そして１Ｈ  ＮＭＲによって分析して以下の結果を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）は、ノイズに起因して複雑化した。顕著な特徴：δ８．２８（ｄ、１、Ｈ６）、６．１０（擬−ｔ、１、Ｈ１’）、５．２６（ｍ、Ｄ２Ｏに交換、１、３’−ＯＨ）、５．１３（ｍ、Ｄ２Ｏに交換、１、５’−ＯＨ）、４．８１（ｑまたはｄｄ、２、プロパルギル−ＣＨ２）、４．２４（ｍ、１、Ｈ３’）、３．５７（ｍ、２、５’−ＣＨ２）、２．１５〜２．０（ｍ、８、アジリジン−ＣＨ２）。
【０１７８】
ビス−アジリジン−１−イル−ホスフィノチオ酸３−［２−デオキシウリジン−５−イル］−プロプ−２−イニルエステルをまた合成し、そして１Ｈ  ＮＭＲによって分析して以下の結果を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）は、ノイズに起因して複雑化した。顕著な特徴：δ８．２９（ｄ、１、Ｈ６）、６．１０（擬−ｔ、１、Ｈ１’）、５．２２（ｍ、Ｄ２Ｏに交換、１、３’−ＯＨ）、５．１０（ｍ、Ｄ２Ｏに交換、１、５’−ＯＨ）、４．８８（ｑまたはｄｄ、２、プロパルギル−ＣＨ２）、４．３１（ｍ、１、Ｈ３’）、３．５２（ｍ、２、５’−ＣＨ２）、２．１５〜２．０（ｍ、８、アジリジン−ＣＨ２）。
【０１７９】
（実施例３〜８）
（フラノ−ピリミジノンの合成）
上記の一般的合成手順を用いて、以下の化合物を調製した。
【０１８０】
（実施例３）
３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−（テトラヒドロピラン−２−イルオキシメチル）フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２（３Ｈ）−オン。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ８．８０（ｓ、１、Ｈ４）、６．７４（ｓ、１、Ｈ５）、６．１６（擬−ｔ、１、Ｈ１’）、５．２７（ｄ、Ｄ２Ｏに交換、１、３’−ＯＨ）、５．１２（ｔ、Ｄ２Ｏに交換、１、５’−ＯＨ）、４．７２（ｍ、１、ＴＨＰ−Ｈ２）、４．５６（ｑ、２、ＣＨ２ＯＴＨＰ）、３．９２（ｍ、１、Ｈ４’）、３．６４（ｍ、２，５’−ＣＨ２）、２．４０（ｍ、１、Ｈ２’ａ）、２．０３（ｍ、１、Ｈ２’ｂ）、１．６８および１．５０（ｍ、８、ＴＨＰ）。ビス−ＴＭＳ誘導体について低分解能質量スペクトル（ＤＣＩ−ＮＨ３）、ｍ／ｚ  ３２３（Ｂ＋ＴＭＳ＋Ｈ＋）、５１１（ＭＨ＋）、５８３（Ｍ＋ＴＭＳ＋）。
【０１８１】
（実施例４）
３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−（ヒドロキシメチル）フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２（３Ｈ）−オン。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ１２．０（ｂｓ、１、ＯＨ）、８．２４（ｓ、１、Ｈ４）、６．５３（ｓ、１、Ｈ５）、５．５１（擬−ｔ、１、Ｈ１’）、４．４２（ｍ、２、ＣＨ２ＯＨ）。低分解能質量スペクトル（ＤＣＩ−ＮＨ３）、ｍ／ｚ  １６７（Ｂ＋２Ｈ＋）、１８４（Ｂ＋ＮＨ４＋）。
【０１８２】
（実施例５）
１−［６−（テトラヒドロピラン−２−イルオキシメチル）フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２（３Ｈ）−オン−３−イル］−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−イルフェニルメトキシ−Ｌ−アラニニルホスホルアミデート。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）は、ジアステレオマーの存在に起因して複雑化した。顕著な特徴：δ８．６２および８．５９（各ｓ、各１、Ｈ４）、７．４〜７．１（ｍ、５、ＰｈＯ）、６．６１および６．６０（各ｓ、各１、Ｈ５）、６．２５（ｍ、１、Ｈ１’）、４．５６（ｑ、２、プロパルギル−ＣＨ２）、３．５６および３．５４（各ｓ、各３、ＣＯ２Ｍｅ）、２．０（ｍ、１、Ｈ２’ｂ）、１．２２（ｍ、３、アラニニル−α−Ｍｅ）。低分解能質量スペクトル（ＤＣＩ−ＮＨ３）、ｍ／ｚ  １６７（Ｂ＋２Ｈ＋）、１８４（Ｂ＋Ｈ＋＋ＮＨ４＋−ＴＨＰ）。
【０１８３】
（実施例６）
１−［６−（ヒドロキシメチル）フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２（３Ｈ）−オン−３−イル］−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−イルフェニルメトキシ−Ｌ−アラニニルホスホルアミデート。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は、ジアステレオマーの存在に起因して複雑化した。顕著な特徴：δ８．５（ｓ、１、Ｈ４）、７．４〜７．１（ｍ、５、ＰｈＯ）、６．３６および６．３０（各ｓ、各１、Ｈ５）、６．２３（ｍ、１、Ｈ１’）、３．６７および３．６５（各ｓ、各３、ＣＯ２Ｍｅ）、２．６９（ｍ、１、Ｈ２’ａ）、２．１０（ｍ、１、Ｈ２’ｂ）、１．３５（ｍ、３、アラニニル−α−Ｍｅ）。低分解能質量スペクトル（ＤＣＩ−ＮＨ３）、ｍ／ｚ  ５２５（ＭＨ＋）、５９５（ＭＮＨ４＋）。
【０１８４】
（実施例７）
５−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジンの４−ニトロフェニルエーテル誘導体を、以下に示される通りの標準的なエーテル合成に従って調製した。
【０１８５】
【化８３】
2003505466.tif 000071
（実施例８）
５−［３−（４−ニトロフェノキシ）−１−プロピニル］−２’−デオキシウリジン。４０ｍＬの無水ＴＨＦ中の予め乾燥した５−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら（１９８３））（５６５ｍｇ、２ｍｍｏｌ）のアルゴン下の溶液を、４−ニトロフェノール（６９６ｍｇ、５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（７８７ｍｇ、３ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルアゾジカルボキシレート（５９０Ｌ、３ｍｍｏｌ）で処理し、そしてこの反応混合物を溶液が透明になるまで６０℃で加熱し、次いでさらに１時間加熱した。この混合物を２３℃まで冷まし、次いでこれをＳｉＯ２上でエバポレートし、そして溶離液としてＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いたクロマトグラフィーによって精製して１０７ｍｇ（１３％）の所望のエーテル生成物を得た：ｍｐ  １１２〜１１８℃。１Ｈ  ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ１１．６５（ｓ、Ｄ２Ｏに交換、１、ＮＨ）、８．２９（ｓ、１、Ｈ６）、８．２４（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２、ｍ−ＡｒＨ）、７．２３（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２、ｏ−ＡｒＨ）、６．０９（擬−ｔ、１、Ｈ１’）、５．１７（ｓ、２、プロパルギル−ＣＨ２）、４．２２（ｍ、１、Ｈ３’）、３．８０（ｍ、１、Ｈ４’）、３．５９（ｍ、２，５’−ＣＨ２）、２．１３（擬−ｔ、２，２’−ＣＨ２）。ペルトリメチルシリル化物質についての低分解能質量スペクトル（ＤＣＩ−ＮＨ３）、ｍ／ｚ  ５４７［Ｍ（ＴＭＳ）２Ｈ＋］、５６５［Ｍ（ＴＭＳ）２ＮＨ４＋］、６２０［Ｍ（ＴＭＳ）３Ｈ＋］。
【０１８６】
（実施例９）
（５−（４−カルベトキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（ｄｅｘｏｙｕｒｉｄｉｎｅ））
（（ａ）５−（カルボメトキシビニル）−２’−デオキシウリジン−３’，５’−ビス（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エーテル（Ｉ））
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５ｍＬ）中の５−（カルボメトキシビニル）−２’−デオキシウリジン（３．０ｇ、９．６ｍｍｏｌ）、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２２ｍＬ、２１．３ｍｍｏｌ）およびピリジニウム−ｐ−トルエンスルホネート（ＰＰＴＳ、０．２４２ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）のスラリーを、５０℃で１８時間攪拌した。得られた溶液を減圧下（浴温度４５℃）で濃縮して濃く淡黄色のオイルを得た。このオイルを、ＥｔＯＡｃ中に溶解し、そして固体を濾過した。この溶液を再度濃縮した。得られたオイルを、５０％〜７５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液として用いた、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製して、３．８１ｇ（８５％）の純粋な生成物を無色のオイルとして得た。
【０１８７】
（（ｂ）５−（３−ヒドロキシプロプ−１−エニル）−２’−デオキシウリジン−３’，５’−ビス（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エーテル（ＩＩ））
ＣＨ２Ｃｌ２（１４ｍＬ）中の（Ｉ）（３．５ｇ、７．２７ｍｍｏｌ）の溶液を、ドライアイス／アセトン浴中で−７８℃まで冷却した。トルエン（１．０Ｍ、２４ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）中の水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）を、温度を−７８℃に維持しながら、２時間かけて滴下した。この溶液を−７８℃でさらに２時間攪拌し、そしてＭｅＯＨ（２．５ｍＬ）を滴下して全ての過剰のＤＩＢＡＬ−Ｈを破壊した。この反応混合物を３０％クエン酸溶液（５０ｍＬ）、氷（２５ｇ）およびＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）の混合物中に約２０分間かけてカニューレ挿入した。相を分離し、そして水相をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬで２回）で抽出した。合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして濃縮して３．２８８ｇ（１００％）の無色のオイルを得た。
【０１８８】
（（ｃ）５−（３−オキソプロプ−１−エニル）−２’−デオキシ（ｄｅｘｏｙ）ウリジン−３’，５’−ビス（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エーテル（ＩＩＩ））
ＣＨ２Ｃｌ２（９ｍＬ）中の上記から得た粗（ＩＩ）（１．９８８ｇ、４．４ｍｍｏｌ）の溶液に、水で冷やしながら、固体ピリジニウムジクロメート（ＰＤＣ；１．８２ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を添加した。酢酸（０．４ｍＬ）を滴下しながら懸濁物を攪拌した。水浴を除去し、そして反応物を室温で１時間攪拌した。粗生成物をフロリジル（ｆｌｏｒｉｓｉｌ）のパッド（２×２．５ｃｍ）を通して濾過し、そしてフロリジルを３５ｍＬ  ＥｔＯＡｃで洗浄した。得られた褐色の溶液を別のフロリジルカラム（３．５ｃｍ直径×２．５ｃｍ高さ）を通して濾過した。濾液を濃縮して１．２７３ｇ（６４％収率）の非常に淡褐色のオイルを得た。
【０１８９】
（（ｄ）５−（４−カルベトキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン−３’，５’−ビス（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エーテル（ＩＶ））
（カルベトキシメチレン）トリフェニルホスホラン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｅ）（０．３２ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）をこの粗アルデヒド（ＩＩＩ）（０．３４４ｇ、  ０．７７ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。この溶液の色が濃くなり、錆色になった（ｄａｒｋｅｎｅｄ  ａｎｄ  ｔｕｒｎｅｄ  ｒｕｓｔ  ｃｏｌｏｒ）。１時間後、薄層クロマトグラフィーによって判断したところ、（ＩＩＩ）は完全に消費されていた。溶媒をエバポレートし、そして粗生成物を、３５％〜４５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液として用いた、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物（０．３１０ｇ、７８％収率）が無色オイルとして得られた。
【０１９０】
（（ｅ）５−（４−カルベトキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシ（ｄｅｘｏｙ）ウリジン（Ｖ））
５−（４−カルベトキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシ（ｄｅｘｏｙ）ウリジン−３’，５’−ビス（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エーテル（ＩＶ）（０．６３７ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）に溶解し、そしてＰＰＴＳ（０．０４９ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を５０℃にて７．５時間攪拌し、そして室温にて一晩放置した。白色の沈殿物が形成された。この反応混合物を０℃に冷却し、そして濾過して純粋な（Ｖ）を白色固体（０．１８８ｇ）として得た。濾液を濃縮し、そして５０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液として用いた、シリカゲルでのクロマトグラフィーにかけて、さらに０．１８０ｇの生成物を得た。この生成物の総収量は、０．３６８ｇ（８６％）であった。
【０１９１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１．２２（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、２．１７（２Ｈ、ｂｒ  ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ）、３．５５〜３．７５（２Ｈ、ｍ）、３．８１（１Ｈ、ｍ）、４．１２（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ）、４．２５〜４．２８（１Ｈ、ｍ）、５．１９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ）、５．２７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．１Ｈｚ）、５．９８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１４．５Ｈｚ）、６．１４（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ）、６．７５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１４．５Ｈｚ）、７．１８〜７．３０（２Ｈ、ｍ）、８．３０（１Ｈ、ｓ）、１１．５６（１Ｈ、ｓ）。
【０１９２】
（実施例１０）
（５−（４−カルボメトキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（Ｖａ））
ジオキサン（１２ｍＬ）中のトリエチルアミン（３．９ｍＬ、２８．２ｍｍｏｌ）の溶液を、１５分間にわたって窒素を吹き込むことによって脱アリール化（ｄｅａｒｅａｔｅ）した。酢酸パラジウム（０．６０ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．１８３ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの溶液を７０℃にて２０分間加熱して、暗褐色の溶液を得た。５−ヨード−３’−デオキシウリジン（５．０ｇ、１４．１ｍｍｏｌ）およびメチル２，４−ペンタジエノエート（２．５ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を還流下で１５時間にわたって加熱した。溶媒および揮発性成分を減圧下でエバポレートし、そして残渣を水（１５ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）との間で分配した。相を分離し、そして水相をＥｔＯＡｃ（各１０ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、そして濃縮した。残渣をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中に溶解し、そして室温まで冷ました。形成された固体を濾過によって収集し、少量のＭｅＯＨで洗浄し、そして減圧下で乾燥して０．３８ｇの褐色粉末を得た。
【０１９３】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．１７（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、３．５５〜３．７０（２Ｈ、ｍ）、３．６６（３Ｈ、ｓ）、３．８２（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．２７（１Ｈ、ｍ）、５．１８（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝４．９Ｈｚ）、５．２６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．５Ｈｚ）、５．９９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１４．４Ｈｚ）、６．１４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、６．７４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１４．８Ｈｚ）、７．２０〜７．３５（２Ｈ、ｍ）、８．３０（１Ｈ、ｓ）、１１．５６（１Ｈ、ｓ）。
【０１９４】
上記からの濾液を濃縮し、そして６０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶離液として用いた、シリカゲルでのクロマトグラフィーにかけて、さらに０．７０ｇの生成物を褐色の泡状物として得た。合わせた収量は、１．０８ｇ（２２．６％）であった。
【０１９５】
（実施例１１）
（５−（４−カルボキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシ（ｄｅｘｏｙ）ウリジン（ＶＩ））
（方法Ｉ）
５−（４−カルベトキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシ（ｄｅｘｏｙ）ウリジン（Ｖ、実施例１から）（０．４４９ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を、２Ｎ  ＮａＯＨ（３ｍＬ）に溶解し、そして２５℃にて攪拌した。２０分後、沈殿物が形成され、そしてＴＬＣは、出発物質が完全に消費されたことを示した。この混合物を０℃に冷却し、そして２Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ１まで酸性化した。得られたオフホワイトの固体を濾別し、水で洗浄し、そして減圧下で乾燥して０．２２５ｇ（５４％）の生成物を得た。
【０１９６】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．１２〜２．１９（２Ｈ、ｍ）、３．５０〜３．７０（２Ｈ、ｍ）、３．７５〜３．８５（１Ｈ、ｍ）、４．２４〜４．２９（１Ｈ、ｍ）、５．１９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ）、５．２７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ）、５．８０〜５．９５（１Ｈ、ｍ）、６．１４（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、６．６０〜６．７５（１Ｈ、ｍ）、７．１５〜７．２５（２Ｈ、ｍ）、８．２６（１Ｈ、ｓ）、１１．５６（１Ｈ、ｓ）、１２．１６（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）。
【０１９７】
濾液および洗浄液を合わせ、そして乾燥するまでエバポレートした。得られた粘性の黄色固体をＭｅＯＨに溶解し、これから、白色沈殿物が形成された。この固体を濾別してさらに０．２００ｇの生成物を得た。
【０１９８】
（方法ＩＩ）
表題化合物をまた、上記と匹敵する収率で５−（４−カルボメトキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（Ｖａ）（実施例２における方法に従って調製された）から調製し得る。
【０１９９】
（実施例１２）
（５−（４−ブロモ−１Ｅ，３Ｅ−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（ＶＩＩａ）および５−（４−ブロモ−１Ｅ，３Ｚ−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（ＶＩＩｂ））
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の５−（４−カルボキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（ＶＩ）（０．２００ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＫＨＣＯ３（０．１８５ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を２０分間、２５℃にて攪拌した。ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中のＮ−ブロモスクシンイミド（０．１１７ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。スムースガスエボリューション（ｓｍｏｏｔｈ  ｇａｓ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（ＣＯ２）を添加の間中行った。得られた褐色の懸濁物を２時間、２５℃にて攪拌し、この時点で、ＴＬＣは、（ＶＩ）が完全に消費されたことを示した。水（１０ｍＬ）をこの懸濁物に添加し、そして得られた溶液をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬで２回）で抽出した。抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、そして溶媒を減圧下でエバポレートして黄色固体（１７８ｍｇ、８０％収率）を得た。この黄色固体は、１Ｈ  ＮＭＲによって示されるように、２つの異性体の混合物からなっていた。この粗生成物を、移動相として水中の２０％アセトニトリルを用いた半分取ＨＰＬＣ（逆相Ｃ１８カラム）によって分離して、以下の異性体を得た：
５−（４−ブロモ−１Ｅ，３Ｚ−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン：保持時間１０．５分間；１Ｈ  ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．１１〜２．１８（２Ｈ、ｍ）、３．５０〜３．７０（２Ｈ、ｍ）、３．８０（１Ｈ、歪んだｑ、Ｊ＝３．５Ｈｚ）、４．２５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、５．０８（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、５．２５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、６．１５（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、６．４０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）、６．５３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ）、６．８３（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７、１０Ｈｚ）、７．３９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１０、１５．６Ｈｚ）。
【０２００】
５−（４−ブロモ−１Ｅ，３Ｅ−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン：保持時間１５．１分間；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．１２〜２．１６（２Ｈ、ｍ）、３．５０〜３．７０（２Ｈ、ｍ）、３．８０（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝３．２Ｈｚ）、４．２６（１Ｈ、ｍ）、５．１３（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、５．２５（１Ｈ、ｂｒ  ｓ）、６．１４（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、６．３６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ）、６．６７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１３．１Ｈｚ）、６．８４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１，１３．１Ｈｚ）、７．０４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１、１５．６Ｈｚ）。
【０２０１】
（実施例１３）
実施例１１、方法ＩＩに記載される手順を用いて、以下の化合物が同様の様式で入手され得る：５−（４−クロロ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（工程ＢにおけるＮ−ブロモスクシンイミドの代わりにＮ−クロロスクシンイミドを用いる）；５−（４−ヨード−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（Ｎ−ブロモスクシンイミドの代わりにヨウ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｉｄｏｄｉｄｅ）中のヨウ素を用いる）。
【０２０２】
（実施例１４）
（５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジンフェニルＮ−メトキシ−Ｌ−アラニニル  ホスホルアミデート）
（フェニルＮ−メトキシ−Ｌ−アラニニルホスホロクロリデート）
Ｌ−アラニンメチルエステルヒドロクロリド（２４５．８ｇ；１．７６ｍｏｌ）を、１２Ｌの３首丸底フラスコ（機械式スタラーおよび温度計を備えた）中に入れ、続いて４．０Ｌのジクロロメタンを入れた。この混合物を室温にて１５分間攪拌した。フェニルホスホジクロリデート（３７０．０ｇ；１．７６ｍｏｌ）をこの混合物に添加し、そして攪拌を室温にて１５分間続けた。このフラスコを、ドライアイスを有する浴の中に入れ、そして均質な懸濁物が形成されるまで、攪拌を２０分間続けた。
【０２０３】
新鮮に希釈されたトリ−ｎ−ブチルアミン（６２６．５ｇ；３．３８ｍｏｌ）を、この反応混合物に激しく攪拌しながら、フラスコの内側の温度が約０℃に保たれるようにして滴下した（約９０分間）。浴を除去し、そして攪拌を室温にて６時間続けた。この溶液を、この混合物のいくつかの部分をロータリーエバポレーターでエバポレートすることによって約２．８４Ｌになるまで濃縮し、そしてこの混合物をアルゴン化でシールし、そして−２０℃で保存した。この生成物は、リンＮＭＲによって８５％純粋であり、約０．５Ｍのフェニルメトキシアラニニルホスホクロリデートという評価濃度を与えた。
【０２０４】
（実施例１５）
（５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジンフェニルＮ−メトキシ−Ｌ−アラニニルホスホルアミデート（ＮＢ１０１１））
この反応を、アルゴン雰囲気下で行った。５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン（ＢＶｄＵ）（２０４ｇ；６１２ｍｍｏｌ）を、機械式スターラーを備えた３首３Ｌ丸底フラスコ中に入れた。このフラスコを、氷水浴中に入れ、そして滴下漏斗を用いて１５分間かけて、反応混合物を激しく混合しながら１６００ｍＬ（約８００ｍｍｏｌ）のフェニルメトキシアラニニルホスホクロリデート試薬を添加し、続いてシリンジを用いて１００ｍＬのＮ−メチルイミダゾールを５分間かけて添加した。５分後、この混合物は透明になり、そして１０分後、氷水浴を除去して混合物を、攪拌を続けながら室温まで温めた。この反応を、逆相ＨＰＬＣによってモニタリングし、そして３時間で完了した。この反応を１００ｍＬのメタノールの添加によってクエンチングし、そしてこの混合物をオイルになるまでエバポレートし、６Ｌのジクロロメタンに再度溶解し、そして８００ｇのシリカゲルに通した。ＢＶｄＵ−ＰＡの主な部分を本明細書中でＮＢ１０１１といい、これを、ローディングの間にカラムに通し、そして最終的にＮＢ１０１１の溶出を、ジクロロメタン中の５Ｌの５％メタノールに通すことによって完了した。ＮＢ１０１１を含む全ての画分を合わせ、そしてオイルになるまでエバポレートし、残渣を４Ｌの酢酸エチルに溶解し、そして混合物を水（２Ｌで２回）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして酢酸エチル（３００ｍＬで３回）で洗浄した。合わせた濾液および洗浄液をエバポレートして、淡く着色した白色泡状物を得た；総重量約５４０ｇ。
【０２０５】
粗生成物を、それぞれ溶離液として、ＣＨ２Ｃｌ２中の０％〜５％のＭｅＯＨおよびＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨを用いた２回のシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。生成物の収量は（＞９８％純度）は６４ｇであった。
【０２０６】
（実施例１６）
実施例１５に記載される方法を用いて、以下のヌクレオシドのフェニルＮ−メトキシ−Ｌ−アラニルホスホルアミデートを調製した：
１．５−（４，４−ジブロモ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン、
２．５−（２−クロロビニル）−２’−デオキシウリジン、
３．５−トリフルオロメチル−２’−デオキシウリジン、
４．５−（４−カルベトキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン、
５．５−（４−カルボメトキシ−１，３−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン、
６．５−（４−ブロモ−１Ｅ，３Ｅ−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン、
７．５−（４−ブロモ−１Ｅ，３Ｚ−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン、
８．５−（トリメチルシリルエチニル）−２’−デオキシウリジン、
９．５−（エチニル）−２’−デオキシウリジン、
１０．５−（１−デシニル）−２’−デオキシウリジン、
１１．３−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２，３−ジヒドロフロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン、
１２．３−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−オクチル−２，３−ジヒドロフロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン。
【０２０７】
（誘導体）
本明細書中に記載される上記の化合物の塩、エステルおよびエーテルもまた、本発明の範囲内にある。本発明のプロドラッグの塩は、無機または有機の酸および塩基から誘導され得る。酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール（ｇｌｙｃｏｌｌｉｃ）酸、乳酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸が挙げられる。他の酸（例えば、シュウ酸）は、それら自体は薬学的に受容可能ではないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に受容可能な酸付加塩を得る際に中間体として有用な塩の調製において用いられ得る。塩基の例としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ４＋の化合物（ここで、ＷはＣ１−４アルキルである）が挙げられる。
【０２０８】
塩の例としては、以下が挙げられる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩（ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩（ｆｌｕｃｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバレート（ｐｉｖａｌａｔｅ）、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート（ｔｏｓｙｌａｔｅ）およびウンデカン酸塩。塩の他の例としては、適切なカチオン（例えば、Ｎａ＋、ＮＨ４＋およびＮＷ４＋（ここで、ＷはＣ１−４アルキル基である））と化合した本発明の化合物のアニオンが挙げられる。
【０２０９】
治療用途のためには、本発明の化合物の塩は、薬学的に受容可能である。しかし、薬学的に受容可能でない、酸と塩基との塩もまた、例えば、薬学的に受容可能な化合物の調製または精製において用途を見出し得る。
【０２１０】
本発明の方法によって同定されたプロドラッグまたは化合物のエステルとしては、２’−、３’−および／または５’−ヒドロキシ基のエステル化によって得られたカルボン酸エステル（すなわち、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）が挙げられ、ここで、Ｒは、以下から選択される：（１）直鎖または分枝鎖のアルキル（例えば、ｎ−プロピル、ｔ−ブチル、またはｎ−ブチル）、アルコキシアルキル（例えば、メトキシメチル）、アラルキル（例えば、ベンジル）、アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシメチル）、アリール（例えば、ハロゲン、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシまたはアミノによって必要に応じて置換されたフェニル）；（２）スルホン酸エステル（例えば、アルキルスルホニル（例えば、メタンスルホニル）またはアラルキルスルホニル；（３）アミノ酸エステル（例えば、Ｌ−バリルまたはＬ−イソロイシル）；（４）ホスホン酸エステルならびに（５）モノ−、ジ−またはトリリン酸エステル。リン酸エステルは、例えば、Ｃ１−２０アルコールもしくはそれらの反応性誘導体によって、または２，３−ジ−（Ｃ６−２４）アシルグリセロールによってさらにエステル化され得る。このようなエステルにおいて、他に指定しない限り、存在する任意のアルキル部分は、１個〜１８個の炭素原子、特に１個〜６個の炭素原子、より具体的には１個〜４個の炭素原子を有利に含む。このようなエステル中に存在する任意のシクロアルキル部分は、３個〜６個の炭素原子を有利に含む。このようなエステル中に有利に存在する任意のアリール部分は、フェニル基を含む。本発明のリキソ（ｌｙｘｏ）−フラノシルプロドラッグ誘導体の例としては例えば、化学的に保護されたヒドロキシル基（例えば、Ｏ−アセチル基で）を有するもの、例えば、２’−Ｏ−アセチル−リキソ−フラノシル；３’−Ｏ−アセチル−リキソ−フラノシル；５’−Ｏ−アセチル−リキソ−フラノシル；２’，３’−ジ−Ｏ−アセチル−リキソ−フラノシルおよび２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−リキソ−フラノシルが挙げられる。
【０２１１】
本発明の化合物のエーテルとしては、メチルエーテル、エチルエーテル、プロピルエーテル、ブチルエーテル、イソブチルエーテル、およびｓｅｃ−ブチルエーテルが挙げられる。
【０２１２】
さらなる実施形態では、基質は、ピリミジンにも葉酸塩にも化学的に関連していなくてもよいが、むしろ、合理的薬物設計の公知のパラメーターに基づいて合成される。Ｄｕｎｎ，Ｗ．Ｊ．ら（１９９６）を参照のこと。
【０２１３】
（例えば、反応生成物が、ｄＵＭＰのブロモビニル誘導体の代謝拮抗物質である場合）生成物についての化学的アッセイは、以下に提供される実施例に、またはＢａｒｒ，Ｐ．Ｊ．ら（１９８３）によって記載される。
【０２１４】
（細胞におけるヌクレオシドおよび一リン酸塩の量についてのアッセイ）
このアッセイを化合物ＮＢ１０１１を用いて行った。しかし、以下の方法が、本発明のプロドラッグを用いた適用または使用のために、容易に改変されることが当業者に理解される。
【０２１５】
１０％ＦＣＳおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ培地中の細胞株ＭＣＦ７（乳癌細胞株）；ＭＣＦ７ＴＤＸ（Ｔｏｍｕｄｅｘ耐性乳癌細胞株）およびＨ６３０Ｒ１０（Ｓ．Ｃｏｐｕｒ博士、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより得た５−ＦＵ耐性結腸癌細胞株（Ｃｏｐｕｒ，Ｓ．ら（１９９５）を参照のこと））を、皿あたり７５０，０００細胞の量で、１００ｍｍのペトリ皿にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートした。１００μＭのＢＶｄＵを各皿に添加し、そして細胞を２日間３７℃で増殖させ続けた。その後、培地を吸引し、そして細胞を２度リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、皿あたり１ｍｌのＰＢＳを添加し、そして皿を−８０℃のフリーザーに置いた。細胞を凍結／解凍手順を２度繰り返すことによって破壊した。生じる懸濁液中の細胞細片をスピンダウンし（１３，０００ｒｐｍ、１０分間）、そして上清を、２０℃で、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｔ２１遠心分離機（Ｒｏｔｏｒ  ＳＬ−５０−Ｔ、１，９１２ｇ）で、５，０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離によって、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ、３０，０００カットオフ、Ａｍｉｃｏｎ）を通すことによって脱タンパク質した。通過物を１００μｌの容量まで濃縮し、そしてＨＰＬＣカラム（Ａｄｓｏｒｂｏｓｐｈｅｒｅ  ＨＳ，Ｃ１８，５μｍ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，Ａｌｌｔｅｃｈ）に注入した。サンプルを、トリフルオロ酢酸を含む水中のアセトニトリル勾配を使用して分析した。ＢＶｄＵ−誘導体の吸収の最大である３００ｎｍでピークを検出し、そして化合物の量は、３００ｎｍでのピーク面積として表現された。化合物の同定を、それらの保持時間およびスペクトルの、信頼できる標準のものとの比較によって行った。
【０２１６】
（アラマーブルー細胞増殖アッセイ）
このアッセイを、化合物ＮＢ１０１１および本発明のプロドラッグを用いて行った。指数関数的に増殖する細胞を、３８４ウェルの平底組織培養プレートに移した。全ての細胞型を、ウェルあたり５００細胞の密度（２５μＬの完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％胎児ウシ血清＋抗生物質／抗真菌剤）中）で、プレートした。２４時間後（０日目）に、１０−３〜１０−１０Ｍの用量範囲にわたる化合物を含む２５μＬの完全培地を、３連で添加した。薬剤曝露時間は１２０時間（５日）であり、その後、増殖阻害をアッセイした。５μＬのレドックス指示薬である、アラマーブルーを、各ウェルに添加した（１０％ｖ／ｖ）。３７℃での４時間のインキュベーション後、蛍光を、５３５ｎｍの励起および５９５ｎｍの発光でモニタリングした。
【０２１７】
（クリスタルバイオレット細胞増殖阻害アッセイ）
このアッセイを化合物ＮＢ１０１１および本発明のプロドラッグを用いて行った。試験化合物の細胞の増殖をブロックする能力を、クリスタルバイオレット手順により決定した。（Ｓｕｇａｒｍａｎ、Ｂ．Ｊ．ら（１９８５）；およびＡｎｔｅｌｍａｎ，Ｄ．ら（１９９５））。
【０２１８】
化合物を、１Ｍの濃度までジメチルスルホキシドに溶解した。それらをさらに、必要な場合、ＤＭＥＭ細胞培養培地中に希釈し、続いて９６ウェルマイクロタイタープレートの第１ウェルに希釈した。各濃度を標的細胞株について３連で試験した。１μＭ〜３０００μＭの化合物濃度を試験した。細胞を、化合物と共に、７２時間インキュベートし、プレートを洗浄し、そして細胞をメタノールを用いて固定し、そしてクリスタルバイオレットで染色した（Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｂ．Ｊ．ら（１９８５）；およびＡｎｔｅｌｍａｎ，Ｄら（１９９５）に記載のように）。
【０２１９】
（細胞株におけるＴＫおよびＴＳレベルのウエスタンブロット分析）
ウエスタンブロット実験を、ヒト正常結腸上皮細胞型ＣＣＤ１８ｃｏ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡより入手）、５−ＦＵに対して耐性である結腸腺癌細胞株Ｈ６３０Ｒ１０（Ｓ．Ｃｏｐｕｒ博士、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより入手、Ｃｏｐｕｒ、Ｓら（１９９５）を参照のこと）、およびＨＥＲ２をトランスフェクトされた乳癌細胞株（Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ．Ｄ．ら（１９９７））を使用して行った。細胞をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳおよび０．５％デオキシコール酸、ナトリウム塩およびプロテアーゼインヒビター）に溶解した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ−２００タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬより入手）を使用して決定した。各細胞株由来の１０μｇのタンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分離されたタンパク質を、ＰＶＤＦメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄより入手）に移し、ヒトチミジル酸シンターゼモノクローナル１次抗体および抗チューブリンモノクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡより製造）を用いてイムノブロットを続けた。西洋ワサビペルオキシダーゼに連結したヒツジ抗マウスＩｇを２次抗体といて使用した（Ａｍｅｒｓｈａｍ）。ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を免疫反応性の検出のために使用した。チミジル酸シンターゼに対応するバンドを画像分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ）によって定量し、そしてチューブリンのバンドに対して正規化した。
【０２２０】
（細胞株におけるＴＳ  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析）
異なる細胞株におけるヒトチミジル酸シンターゼ転写物の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲを使用して定量した。ヒトチミジル酸シンターゼおよびＢ−アクチンの増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下のように設計した：チミジル酸シンターゼセンスプライマー（配列番号１）５’−ＧＧＧＣＡＧＡＴＣＣＡＡＣＡＣＡＴＣＣ−３’（チミジル酸シンターゼｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ０２３０８）の塩基２０８〜２２６に対応する）、アンチセンスプライマー（配列番号２）５’−ＧＧＴＣＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＡＡ−３’（塩基５６４〜５８３に対応する）、β−アクチンセンスプライマー（配列番号３）５’−ＧＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧ−３’（β−アクチン遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１０２７７）の塩基２６４３〜２６６１に対応する）およびアンチセンスプライマー（配列番号４）５’−ＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣ−３’（塩基２９３７〜２９５５に対応する）。
【０２２１】
総ＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡより入手）を使用して、細胞から単離した。ありうるＤＮＡのコンタミネーションをモニタリングするために、β−アクチンの増幅のためのプライマーを、エキソン４／イントロン５／エキソン５接合点にわたるように設計した。ゲノムＤＮＡ鋳型は、３１３ｂｐのβ−アクチンフラグメントを生じ、そしてｃＤＮＡ鋳型は、２１０ｂｐ産物を生成する。
【０２２２】
逆転写反応をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して行った。製造者のプロトコルに従い、３μｇの総ＲＮＡを、２０μｌの容量の緩衝液にアプライし、逆転写反応を行った。
【０２２３】
ＰＣＲ反応を、逆転写反応からの３μｌのｃＤＮＡ混合物、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．４、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．４ＴＭのチミジル酸シンターゼセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、ならびに３ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手）を含む４８μｌの容量で行った。反応混合物を９４℃で３分間インキュベートし、以下の１０サイクルを続けた：９４℃で１分間のインキュベーション、５８℃で１分間のインキュベーション、次いで７２℃で１分間のインキュベーション。１０サイクル後、２μｌ中のヒトβ−アクチンプライマーを、０．２μＭの最終濃度となるように添加し、最終反応容量を５０μｌにした。ＰＣＲ反応を合計２８サイクル続け、続いて７２℃で７分間インキュベーションした。
【０２２４】
５μＬのＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルの電気泳動によって分離し、続いてＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇより入手）を用いた染色をした。チミジル酸シンターゼに対応するＤＮＡのバンドをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍによって定量し、そしてβ−アクチンのバンドに対して正規化した。
【０２２５】
（ノーザンブロット分析）
ノーザンブロットをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手し、そしてクローン化ＴＳ  ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションシグナルは、ハウスキーピング転写物としてのリボソームタンパク質Ｓ９に対して正規化した。正規化シグナルが少なくとも２倍に増強された（正常組織コントロールと比較して）場合、腫瘍はＴＳ  ｍＲＮＡを過剰発現したと考えられた。
【０２２６】
（ヒトチミジル酸シンターゼのクローニング、発現および精製）
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために、完全ヒトＴＳ  ＯＲＦを、Ｔ７プロモーター発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にサブクローニングした。生じるプラスミドベクターは、６つのヒスチジン、続いてトロンビン切断部位を有する組換え融合タンパク質としてのヒトＴＳの合成をコードする。この融合タンパク質は、合計２０のさらなるアミノ酸を、ヒトＴＳのアミノ末端に添加する。組換えタンパク質を生成するために、ヒトＴＳ発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｌａｃオペレーターの制御下で染色体に挿入されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する株）に導入した。
【０２２７】
ヒトＴＳ−ポリ−Ｈｉｓ融合タンパク質を、金属キレート化アフィニティー樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して精製した。タンパク質を精製し、その後１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して決定した。約１０ｍｇのヒトＴＳ融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉの５００ｍｌ培養から回収した。銀染色で可視化した場合、ヒトＴＳに対応するバンドのみが明確であった。ヒトＴＳバンドの同定を、抗ＴＳモノクローナル抗体ＴＳ１０６（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）を用いて、ウエスタンブロットを行うことによって確認した。
【０２２８】
（チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）酵素活性アッセイ）
ＴＳ活性を、Ｗａｈｂａら、（１９６１）の分光光度アッセイを使用して測定した。このアッセイにおいて、ＴＳ活性を、ｄＵＴＰがｄＴＴＰに転換される際に、補因子５、１０メチレンテトラヒドロ葉酸が、ジヒドロ葉酸に酸化される場合に生じる、３４０ｎｍの吸光度における増加を測定することによってモニタリングする。この方法によって調製された酵素は、０．５〜０．６５ユニット／ｍｇタンパク質の比活性を有する。１ユニットは、１分あたり１μモルのｄＴＭＰの生成として定義される。この値は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ−Ｌａｎｅ，Ｊ．ら（１９９７）によって報告された値と類似である。
【０２２９】
（ＴＳプロドラッグ代謝の細胞内産物の決定）
活性化および作用の提案された機構を実証して、そして候補治療剤である薬剤を規定するために、ＴＳプロドラッグ代謝の細胞内産物を決定することが重要である。アリールホスホジエステルアミデートの細胞内代謝の受け入れられる観点の１つは、カルボン酸への酵素的変換（ホスホモノエステルアミデートの５’−モノホスホリルヌクレオシドへの分子内再整列）を含む。Ｖａｌｅｔｔｅら（１９９６）を参照のこと。しかし、この機構は、全てのホスホルアミデートに基くプロヌクレオチドの細胞内プロセシングを描写する可能性は低い。例えば、異なる機構が、アリールホスホモノエステルアミデートプロセシングについて提唱されており、この１つは、ホスホルアミデート加水分解物による１リン酸塩種へのホスホルアミデートの単なる直接変換を含む。ＭｃＩｎｔｅｅら（１９９７）およびＦｒｉｅｓら（１９９５）を参照のこと。１リン酸ヌクレオシドをマスクしないための機構にかかわらず、このアッセイは、細胞内での、細胞内１リン酸塩の細胞傷害性化合物へのＴＳ変換の産物を検出する。
【０２３０】
高いＴＳ発現細胞株の５０％増殖阻害を誘導する量のプロドラッグ化合物とともに細胞をインキュベートする（前出の７２Ｈアッセイにおいて）。低ＴＳ発現細胞および高ＴＳ発現細胞の両方を用いる（例えば、ＣＣＤ１８ｃｏ  対．Ｈ６３０Ｒ１０）。経時的研究を実施し、ここで処理した細胞を、ＭｃＩｎｔｅｅ，Ｅ．Ｊ．ら（１９９７）に記載の方法に従って処理する。細胞を６０％メタノール含有の水で、−２０℃で溶解し、そして遠心分離によって粒子状残滓を除去する。上清を乾燥し、そして−２０℃で貯蔵する。このアリコートを、最初にＲＰ−ＨＰＬＣにより評価し、次いで、ＬＣ−ＭＳにより１リン酸塩へのホスホルアミデートの細胞内変換を実証し、そしてまたチミジル酸シンターゼによる１リン酸塩の変換を確認する。
【０２３１】
（精製したチミジル酸シンターゼを利用する基質活性の実証）
このアッセイは、将来のＴＳ酵素調製物の比活性を決定し、このような調製物の経時的な活性を保証し、そして適切な活性についてスクリーニングされた化合物がインビトロ反応条件下でＴＳ酵素を不活化するか否かを決定する。
【０２３２】
プロドラッグ化合物が精製された組換えＴＳ酵素とともにインキュベートされる場合、どの反応産物が産生されるかを決定するために、ＴＳ活性アッセイで使用された条件と同様の反応条件を用いて、インビトロで反応産物を生成する。次いで、これらの反応産物をＧＣ−質量分析法で分析し、形成された実際の分子を同定する。
【０２３３】
（結果）
（ＴＳは、いくつかの腫瘍細胞株および原発性腫瘍で高度に発現される）
正常なヒトの脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、結腸、肺、小腸、胃の筋肉、精巣、卵巣、子宮、前立腺、甲状腺、唾液腺、副腎、皮膚、末梢血リンパ球、骨髄における、そしてヒト結腸および適合するヒト正常組織由来の、チミジル酸シンターゼ発現レベルを、上記のように、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した。βアクチンのためのプライマーを、エキソン４／イントロン５／エキソン５接合部にわたるように設計し、可能性のあるＤＮＡ混入についてモニターした。従って、図３に報告された結果は、相対的ＴＳ  ｍＲＮＡレベルとして示される。図３Ａは、複数の正常ヒト組織における相対的ＴＳ  ｍＲＮＡを示す。図３Ｂは、正常ヒト結腸組織と腫瘍ヒト結腸組織との間の平均ＴＳ  ｍＲＮＡの比較である。
【０２３４】
種々の培養正常細胞株および腫瘍細胞株におけるチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）タンパク質レベルを、上記の手順に従って決定した。タンパク質レベルをウエスタンブロット分析により測定した；結果を以下に示す。
【０２３５】
【表３】
2003505466.tif 000072
（細胞中で測定したＢＶｄＵＭＰおよびＢＶｄＵの量）
細胞株ＭＣＦ７、ＭＣＦ７ＴＤＸおよびＨ６３０Ｒ１０（それぞれ、ＢＶｄＵで処理）の溶解物中に存在するＢＶｄＵＭＰまたはＢＶｄＵの量を、３００ｎｍでの対応するＨＰＬＣのピークの面積として示す。３００ｎｍでのこれらの化合物の減衰係数は同じであり、従って、ピーク面積の比較により、形成された量の直接比較が可能になることに注意のこと。
【０２３６】
以下の表４は、２日間の処理後、細胞の内側で測定されたＢＶｄＵＭＰおよびＢＶｄＵのレベルを示す。細胞を１００μｍのＢＶｄＵとともに完全培地中でインキュベートした。溶解液を調製し、そしてＢＶｄＵＭＰおよびＢＶｄＵのレベルを決定した。
【０２３７】
【表４】
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この表は、ＢＶｄＵＴＤＸが、３つ全ての細胞型に浸透し得るが、ＭＣＦ７およびＭＣＦ７ＴＤＸ細胞株においては、ＢＶｄＵＭＰが最も顕著であるようであることを示す。Ｈ６３０Ｒ１０細胞株では、わずかな変換しか生じていない。
【０２３８】
別の実験では、ＭＣＦ７およびＨ６３０Ｒ１０細胞の溶解液を用いて、リン酸ドナー法として、ＡＴＰを添加した無細胞系において、ＢＶｄＵリン酸化反応を触媒した。これにより、Ｈ６３０Ｒ１０細胞溶解液に比較して、ＭＣＦ７ＴＤＸ細胞溶解液におけるこの反応のかなり高い速度が確認された。Ｌｏｏｋ、Ｋ．Ｙ．ら（１９９７）に記載のように調製した腫瘍溶解液を調製し、そしてＢＶｄＵ（または他の候補ヌクレオシド）とともにこのアッセイで用いて、所定の患者がヌクレオシド対ホスホルアミデート治療についての候補であるか否かを決定し得る。
【０２３９】
これらの結果は、ＭＣＦ７ＴＤＸ細胞において、ＢＶｄＵがリン酸化され得、対応する１リン酸塩（引き続くＴＳ反応のための基質）を生じ得るが、一方Ｈ６３０Ｒ１０細胞では、このようなリン酸化は、ＭＣＦ７ＴＤＸよりも有意に遅く進行することを示す。ＭＣＦ７ＴＤＸが乳房腫瘍細胞株であると述べることは重要である。乳房腫瘍細胞において、他の組織由来のヒトＴＫと異なる特性を有するＴＫが見出されたことが報告されている（Ｍａｄｅｃ，Ａら（１９８８））。このＴＫは、ＢＶｄＵリン酸化の原因であり得る。上記に示された結果に基いて、ＢＶｄＵのようなヌクレオシドが、ＢＶｄＵがリン酸化され得る、特定の型の癌（乳癌を含む）の処置に特に有用であり得ることが期待される。さらに、上記の実験手順により、以下のアプローチを用いる、所定の癌型のための、ＢＶｄＵまたは他のヌクレオシドを用いることの実施可能性のインビトロ決定が可能になる。組織サンプルが利用可能な場合、細胞は、ＢＶｄＵを用いてインビトロで処理され得、そしてＢＶｄＵＭＰの可能性のある形成がモニターされ得る。ＢＶｄＵＭＰ形成が記録されれば、この腫瘍型は、ホスホルアミデート誘導体に対抗するような首尾良いヌクレオシド処置のための候補として考慮されなければならない。
【０２４０】
【表５】
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【０２４１】
【表６】
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表５および６における番号付けは、下に示す構造をいう。アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）アッセイを用いた試験の結果は、表５に示し、そしてクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）に基くアッセイの結果は、表６に示す。ＭＣＦ７−ＴＤＸを、Ｔｏｍｕｄｅｘ（ＴＳの直接のインヒビター）の存在下で、細胞培養中の選択を介してＭＣＦ７乳房腫瘍細胞から誘導した。このような選択は、しばしばＴＳの高い細胞内レベルを生じる（Ｆｒｅｅｍａｎｔｌｅ，Ｓ．Ｊ．ら（１９９５））。同様に、Ｈ６３０Ｒ１０は、Ｈ６３０結腸癌細胞から誘導された、５ＦＵ（フルオロピリミジン）耐性の結腸癌上皮細胞株である。Ｃｏｐｕｒ，Ｓら（１９９５）を参照のこと。ＨＴ１０８０、＃１２は、ＨＴ１０８０腫瘍細胞へ導入された導入遺伝子を介して高レベルのＴＳを発現する線維肉腫腫瘍細胞株である。これらのアッセイにおいて用いられる正常な細胞株としては、ＣＣＤ１８ｃｏ（正常結腸上皮）およびＤｅｔ５５１（正常皮膚）が挙げられる。
【０２４２】
表５および６の両方のデータは、ほとんどの化合物がホスホルアミデートおよびヌクレオシドとして活性であることを示す。例外の１つはＮＢ１０２６ＴＭであり、これは、ホスホルアミデートとしての検出可能な活性はほとんど有さないが、ヌクレオシド（ＮＢ１０２５ＴＭ）として活性である。この結果は、ＮＢ１０２６ＴＭがＮＢ１０１１ＴＭと同様には活性化され得ないことを示す。ヌクレオシド、特にＢＶｄＵ、ＮＢ１０２０ＴＭ（ＣｌＶｄＵ）およびＮＢ１０２４ＴＭでの細胞傷害性の結果は、驚くべきである。なぜなら、この文献は、ＢＶｄＵのような５−置換化合物は、それらがウイルス性チミジンキナーゼを発現しない限り、ヒト細胞によって効率的に一リン酸化されないことを教示するからである。Ｂａｌｚａｒｉｎｉ，Ｊら（１９８５）およびＤｅ  Ｃｌｅｒｑ、Ｅら（１９９７）を参照のこと。これらの著者は、ヘルペスウイルスがコードするＴＫにより一旦リン酸化されれば、５−置換ヌクレオチド誘導体がＴＳ酵素に結合して、それを不活性化し得ることを提示している。表４〜６の結果は、少なくともいくつかの腫瘍細胞が、ＢＶｄＵと類似の、５−置換ウリジン分子、および本明細書に示される他のヌクレオシドをリン酸化し得る、異常なチミジンキナーゼ活性を有し得ることを初めて実証する。あるいは、いくつかの腫瘍細胞は、異常に大量の、または正常型のＴＫ酵素を有し得（Ｓｕｋｉ，Ｓら（１９９５）；およびＲｏｍａｉｎ，Ｓら（１９９５））、このことは、それに対応する一リン酸塩に対して、低いが十分なヌクレオシド活性化を導く。
【０２４３】
上記で試験した化合物ＮＢ１０２４ＴＭは、以下の２つの異性体の混合物から構成される：５−（４−ブロモ−１Ｅ，３Ｅ−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（ＶＩＩａ）（異性体２）、および５−（４−ブロモ−１Ｅ，３Ｚ−ブタジエニル）−２’−デオキシウリジン（ＶＩＩｂ）（異性体１）。これらの２つの化合物を、上記（実施例１２）のように、移動相として２０％アセトニトリル含有水を用いてセミ−プレパラーティブＨＰＬＣ（逆相Ｃ１８カラム）により分離した。次いで、それぞれの単離された化合物が細胞増殖をブロックする能力を、クリスタルバイオレット手順により決定した。結果を表７に示す。２つの異性体はＺ異性体と顕著に異なる活性を示し、このことは、Ｅ異性体と比較して活性を阻害する有意に大きい増殖を示す。
【０２４４】
【表７】
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最初の２つの細胞株、ＴＳ  ＨＴ１０８０＃１２およびＭＣＦ７ＴＤＸは、高レベルのＴＳを発現するが、他の２つ、ＣＣＤ１８ｃｏおよびＤｅｔ５５１は、正常細胞である。
【０２４５】
本発明は、詳細にかつその特定の実施形態を参照して記載されてきたが、種々の変更および改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そこでなされ得ることが当業者には明白である。
【０２４６】
（参考文献）
【０２４７】
【表８】
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2003505466.tif 000079
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