(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａと、クレード３、クレード４およびクレード５からなる群より選択されるファミリー２の肺炎球菌表面タンパク質Ａを含む融合タンパク質を非経口投与する肺炎球菌ワクチンであって、
前記ファミリー１の肺炎球菌表面タンパク質Ａは、少なくともプロリンリッチ領域とα−へリックス領域を含み生体に対して肺炎球菌感染症の感染防御免疫を誘導できる部分であり、前記ファミリー２の肺炎球菌表面タンパク質Ａは、少なくともプロリンリッチ領域とα−へリックス領域を含み生体に対して肺炎球菌感染症の感染防御免疫を誘導できる部分であり、前記融合タンパク質は、前記ファミリー１の肺炎球菌表面タンパク質Ａのプロリンリッチ領域と、前記ファミリー２の肺炎球菌表面タンパク質Ａのプロリンリッチ領域の２つのプロリンリッチ領域を含むことを特徴とする肺炎球菌ワクチン。
【請求項２】
融合タンパク質が、以下の（１）〜（３）のいずれかである請求項１に記載の肺炎球菌ワクチン。
（１）ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード３の肺炎球菌表面タンパク質Ａからなる融合タンパク質
（２）ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード４の肺炎球菌表面タンパク質Ａからなる融合タンパク質
（３）ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード５の肺炎球菌表面タンパク質Ａからなる融合タンパク質
【請求項３】
ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａが、Ｄ３９、ＷＵ２、Ｅ１３４、ＥＦ１０１９７、ＥＦ６７９６、ＢＧ９１６３およびＤＢＬ５からなる群より選択される肺炎球菌株由来であることを特徴とする請求項１または２に記載の肺炎球菌ワクチン。
【請求項４】
ファミリー２クレード３の肺炎球菌表面タンパク質Ａを発現する肺炎球菌が、ＴＩＧＲ４、ＢＧ８０９０またはＡＣ１２２由来であり、ファミリー２クレード４の肺炎球菌表面タンパク質Ａが、ＥＦ５６６８、ＢＧ７５６１、ＢＧ７８１７またはＢＧ１１７０３由来であり、ファミリー２クレード５の肺炎球菌表面タンパク質Ａが、ＡＴＣＣ６３０３またはＫＫ９１０由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の肺炎球菌ワクチン。
【請求項５】
融合タンパク質が、配列番号１、３もしくは５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の肺炎球菌ワクチン。
【請求項６】
融合タンパク質が、以下の（４）〜（６）のいずれかである請求項１〜４のいずれかに記載の肺炎球菌ワクチン。
（４）Ｄ３９由来の肺炎球菌表面タンパク質Ａのα−へリックス領域およびプロリンリッチ領域と、ＥＦ５６６８由来の肺炎球菌表面タンパク質Ａのα−へリックス領域およびプロリンリッチ領域との融合タンパク質
（５）Ｄ３９由来の肺炎球菌表面タンパク質Ａのα−へリックス領域およびプロリンリッチ領域と、ＡＴＣＣ６３０３由来の肺炎球菌表面タンパク質Ａのα−へリックス領域およびプロリンリッチ領域との融合タンパク質
（６）ＷＵ２由来の肺炎球菌表面タンパク質Ａのα−へリックス領域およびプロリンリッチ領域と、ＴＩＧＲ４由来の肺炎球菌表面タンパク質Ａのα−へリックス領域およびプロリンリッチ領域との融合タンパク質
【請求項７】
融合タンパク質が前記（６）である請求項６に記載の肺炎球菌ワクチン。
【請求項８】
融合タンパク質が、配列番号５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項５に記載の肺炎球菌ワクチン。
【請求項９】
アジュバントを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の肺炎球菌ワクチン。
【請求項１０】
肺炎球菌以外の病原体に対するワクチン成分を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の肺炎球菌ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺炎球菌表面タンパク質Ａを含む肺炎球菌ワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肺炎球菌は主要な呼吸器病原性細菌であり、小児、成人に髄膜炎・敗血症を含む侵襲性感染症（Invasive pneumococcal disease：ＩＰＤ）や市中肺炎を惹起する。現行の肺炎球菌ワクチン抗原は本菌の血清型を決定する莢膜ポリサッカライドであり、現在までに少なくとも９３血清型が存在することが知られている。
２０００年に米国で小児用ワクチンとして無毒化ジフテリアトキシン（ＣＲＭ１９７）をポリサッカライド抗原に結合させた７価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ７）が導入された。ＰＣＶ７導入後にワクチン含有の７血清型の肺炎球菌による侵襲性感染症は明らかに減少したものの、小児および成人における非ワクチン含有血清型である血清型１９ＡなどによるＩＰＤ症例の増加の問題が浮上してきた。このため、２０１０年にＰＣＶ７にさらに６血清型の莢膜多糖体を抗原として追加した１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１３）が導入され、既に米国では小児、成人において承認されている。【０００３】
一方で、Ｃｒｏｎｅｙらは、ＰＣＶ１３接種前の２００２〜２０１０年の間に発症した米国アラバマ州の小児侵襲性感染症由来肺炎球菌株を集めて大規模調査を行ったところ、ＰＣＶ１３に含有される血清型は６０％しか含んでおらず、残りの４０％の菌株にはＰＣＶ１３に含まれない１７血清型が含まれていた（非特許文献１）。我が国でも２０１１年から小児に対するＰＣＶ７接種の公費助成が開始されたが、２０１２年には米国と同様に非ワクチン含有血清型によるＩＰＤの増加が報告されている（非特許文献２）。現行ワクチンに非ワクチン血清型莢膜多糖体を抗原として追加し続けることは非現実的であり、このことは莢膜多糖体をベースとする現行の肺炎球菌ワクチンの限界を示唆するものであると言える。【０００４】
以上のような現行肺炎球菌ワクチンの欠点を補う目的で、肺炎球菌表層タンパク質抗原の一つである肺炎球菌表面タンパク質Ａ（Pneumococcal surface protein A、以下「ＰｓｐＡ」と記す。）が、新規肺炎球菌ワクチン抗原として注目されている。ＰｓｐＡは図１に示す各ドメインからなる構造を有しており、ＰｓｐＡのα−へリックスおよびプロリンリッチ領域には肺炎球菌に対して感染防御作用を示す抗体が認識する抗原エピトープが存在することが知られている（非特許文献３，４）。ＰｓｐＡは、その抗原エピトープ領域の遺伝子配列により、大きく３つのファミリーに分類され、さらに６つのクレードと呼ばれる亜群に分類される。臨床より分離される肺炎球菌のＰｓｐＡファミリーは、ファミリー１および２で９８％以上を占める（非特許文献５）。ＰｓｐＡは病原因子としても働き、肺炎球菌菌体表面への補体Ｃ３の結合を阻害することが知られており（非特許文献６）、一方で、抗ＰｓｐＡ特異抗体は、ＰｓｐＡの持つ補体阻害活性に対して拮抗的に作用し、本菌に対する感染防御活性を示すことが知られている（非特許文献７，８）。この感染防御活性は、異なるＰｓｐＡファミリーを交差認識する抗体によっても起こることが報告されている（非特許文献９）。一方、異なるＰｓｐＡの交差反応性には多様性があるため（非特許文献１０，１１）、より広域な交差反応を示すファミリー１とファミリー２に属するクレードの組み合わせを選別することは、ＰｓｐＡをベースとするワクチンの開発に重要と考えられる。【０００５】
ＰｓｐＡタンパク質が、肺炎球菌感染に対するワクチンの免疫学的活性成分として有用であることは、例えば特許文献１、２に記載されている。
非特許文献１２では、ファミリー１クレード１のＰｓｐＡとファミリー２クレード４のＰｓｐＡとの融合タンパク質、およびファミリー１クレード１のＰｓｐＡとファミリー２クレード３のＰｓｐＡとの融合タンパク質のワクチン効果が検討されている。また、非特許文献１３では、ファミリー１クレード２のＰｓｐＡとファミリー２クレード４のＰｓｐＡとの融合タンパク質のワクチン効果が検討されている。しかし、これら２つの文献に記載のＰｓｐＡ融合タンパク質については、クレード５および６のＰｓｐＡを発現する肺炎球菌に対するワクチン効果や、広範囲の臨床分離肺炎球菌株に対するワクチン効果は評価されておらず、未だ実用化されたとの報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平６−５０４４４６号公報
【特許文献２】特表２０００−５０３６７６
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Croney CM, Coats MT, Nahm MH et al. 2012. PspA family distribution, unlike capsular serotype, remains unaltered following introduction of the heptavalent pneumococcal conjugate vaccine. Clin Vaccine Immunol. 19:891-896.
【非特許文献２】厚生労働科学研究費補助金  医薬品・医薬機器等レギュラトリーサイエンス総合事業．「新しく開発されたHib, 肺炎球菌、ロタウイルス、HPV等の各ワクチンの有効性、安全性並びにその投与方法に関する基礎的・臨床的研究」小児侵襲性感染症由来肺炎球菌の疫学的解析．柴山恵吾．p46-53. 平成24年3月
【非特許文献３】McDaniel LS, Ralph BA, McDaniel DO et al. 1994. Localization of protection-eliciting epitopes on PspA of Streptococcus pneumonia between amino acid residues 192 and 260. Microb Pathog. 17:323-37.
【非特許文献４】Daniels CC, Coan P, King J et al. 2010. The proline-rich region of pneumococcal surface proteins A and C contains surface-accessible epitopes common to all pneumococci and elicits antibody-mediated protection against sepsis. Infect Immun. 78:2163-2172.
【非特許文献５】Hollingshead SK, Becker R, Briles DE. 2000. Diversity of PspA: mosaic genes and evidence for past recombination in Streptococcus pneumoniae. Infect Immun. 68:5889-5900.
【非特許文献６】Tu AH, Fulgham RL, McCrory MA et al. 1999. Pneumococcal surface protein A inhibits complement activation by Streptococcus pneumoniae. Infect Immun. 67: 4720-4724.
【非特許文献７】Ezoe H, Akeda Y, Piao Z, Aoshi T, Koyama S, Tanimoto T, Ken J. Ishii KJ, Oishi K. 2011. Intranasal vaccination with pneumococcal surface protein A plus poly(I:C) protects against secondary pneumococcal pneumonia in mice. Vaccine 29:1754-1761.
【非特許文献８】Piao Z, Oma K, Ezoe H, Akeda Y, Tomono K, Oishi K. 2011. Comparative effects of toll-like receptor agonists on a low dose PspA intranasal vaccine against fatal pneumococcal pneumonia in mice. J Vaccines Vaccin 2:1, htt://dx.doi.org/10.4172/2157-7560.1000113
【非特許文献９】Ren B, Szalai AJ, Hollingshead SK et al. 2004. Effects of PspA and antibodies to PspA on activation and deposition of complement on the pneumococcal surface. Infect Immun. 72:114-122.
【非特許文献１０】Darrieux M, Moreno AT, Ferreira DM et al. 2008. Recognition of pneumococcal isolates by antisera raised against PspA fragments different clades. J Med Microbiol. 57:273-278.
【非特許文献１１】Moreno AT, Oliveira ML, Ferreira DM et al. 2010. Immunization of mice with single PspA Fragments induces Antibodies capable of mediating complement deposition on different pneumococcal strains and cross-protection. Clin Vaccine Immunol. 17:439-446.
【非特許文献１２】M. Darrieux, E. N. Miyaji, D. M. Ferreira, L. M. Lopes, A. P. Y. Lopes, B. Ren, D. E. Briles, S. K. Hollingshead, and L. C. C. Leite. 2007. Fusion Proteins Containing Family 1 and Family 2 PspA Fragments Elicit Protection against Streptococcus pneumoniae That Correlates with Antibody-Mediated Enhancement of Complement Deposition. Infect Immun. 75: 5930-5938.
【非特許文献１３】Wei Xin, Yuhua Li, Hua Mo, Kenneth L. Roland, and Roy Curtiss III. 2009. PspA Family Fusion Proteins Delivered by Attenuated Salmonella enterica Serovar Typhimurium Extend and Enhance Protection against Streptococcus pneumonia. Infect Immun. 77: 4518-4528.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、肺炎球菌表層タンパク質抗原であるＰｓｐＡの組み合わせの中から、広域な交差反応を示し、広範囲の臨床分離肺炎球菌株に対して免疫応答を誘導可能なクレードの組み合わせまたは菌株の組み合わせを見出し、ＰｓｐＡをベースとする新規な肺炎球菌ワクチンを提供することを課題とする。特に、複数のＰｓｐＡを組み合わせた融合タンパク質において、広域な交差反応を示し、広範囲の臨床分離肺炎球菌株に対して免疫応答を誘導可能な単一のタンパク質抗原を見出し、新規な肺炎球菌ワクチンを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］少なくともファミリー１の肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ただし、肺炎球菌Ｒｘ１株由来の肺炎球菌表面タンパク質Ａおよび肺炎球菌Ｓｔ４３５／９６株由来の肺炎球菌表面タンパク質Ａを除く）の全長またはそのフラグメントと、ファミリー２の肺炎球菌表面タンパク質Ａの全長またはそのフラグメントとを含む融合タンパク質を含有することを特徴とする肺炎球菌ワクチン。
［２］ファミリー１の肺炎球菌表面タンパク質Ａがクレード２であることを特徴とする前記［１］に記載の肺炎球菌ワクチン。
［３］融合タンパク質が、以下の（１）〜（３）のいずれかである前記［２］に記載の肺炎球菌ワクチン。
（１）少なくともファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード３の肺炎球菌表面タンパク質Ａとを含む融合タンパク質
（２）少なくともファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード４の肺炎球菌表面タンパク質Ａとを含む融合タンパク質
（３）少なくともファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード５の肺炎球菌表面タンパク質Ａとを含む融合タンパク質
［４］融合タンパク質が、以下の（４）〜（６）のいずれかである前記［３］に記載の肺炎球菌ワクチン。
（４）ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード３の肺炎球菌表面タンパク質Ａからなる融合タンパク質
（５）ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード４の肺炎球菌表面タンパク質Ａからなる融合タンパク質
（６）ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード５の肺炎球菌表面タンパク質Ａからなる融合タンパク質
［５］肺炎球菌表面タンパク質Ａのフラグメントが、少なくともプロリンリッチ領域の全部または一部を含むことを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の肺炎球菌ワクチン。
［６］肺炎球菌表面タンパク質Ａのフラグメントが、プロリンリッチ領域の全部または一部およびそれに隣接するα−へリックス領域の全部または一部からなることを特徴とする前記［５］に記載の肺炎球菌ワクチン。
［７］ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａが、Ｄ３９、ＷＵ２、Ｅ１３４、ＥＦ１０１９７、ＥＦ６７９６、ＢＧ９１６３およびＤＢＬ５からなる群より選択される肺炎球菌株由来であることを特徴とする前記［２］に記載の肺炎球菌ワクチン。
［８］ファミリー２クレード３の肺炎球菌表面タンパク質Ａを発現する肺炎球菌が、ＴＩＧＲ４、ＢＧ８０９０またはＡＣ１２２由来であり、ファミリー２クレード４の肺炎球菌表面タンパク質Ａが、ＥＦ５６６８、ＢＧ７５６１、ＢＧ７８１７またはＢＧ１１７０３由来であり、ファミリー２クレード５の肺炎球菌表面タンパク質Ａが、ＡＴＣＣ６３０３またはＫＫ９１０由来であることを特徴とする前記［３］に記載の肺炎球菌ワクチン。
［９］融合タンパク質が、配列番号１、３もしくは５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とする前記［１］に記載の肺炎球菌ワクチン。
［１０］少なくともファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａの全長またはそのフラグメントと、クレード３、クレード４およびクレード５からなる群より選択されるファミリー２の肺炎球菌表面タンパク質Ａの全長またはそのフラグメントとを含有することを特徴とする肺炎球菌ワクチン。
［１１］含有する肺炎球菌表面タンパク質Ａが、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかである前記［１０］に記載の肺炎球菌ワクチン。
（ｉ）ファミリー１クレード２およびファミリー２クレード３のみ
（ｉｉ）ファミリー１クレード２およびファミリー２クレード４のみ
（ｉｉｉ）ファミリー１クレード２およびファミリー２クレード５のみ
［１２］アジュバントを含むことを特徴とする前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の肺炎球菌ワクチン。
［１３］肺炎球菌以外の病原体に対するワクチン成分を含むことを特徴とする前記［１］〜［１２］のいずれかに記載の肺炎球菌ワクチン。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、広域な交差反応を示し、広範囲の臨床分離肺炎球菌株に対して免疫応答を誘導可能な肺炎球菌ワクチンを提供することができる。本発明の肺炎球菌ワクチンの接種により、小児および成人に対して肺炎球菌感染症の感染防御免疫を誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＰｓｐＡタンパク質の構造を示す図である。
【図２】実施例１で作製した３種類の融合ＰｓｐＡタンパク質の構造を示す図であり、（Ａ）はＰｓｐＡ２＋４、（Ｂ）はＰｓｐＡ２＋５、（Ｃ）はＰｓｐＡ３＋２の構造を示す図である。
【図３】（Ａ）は各融合ＰｓｐＡタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図であり、（Ｂ）は各融合ＰｓｐＡタンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図４】各融合ＰｓｐＡタンパク質を免疫したマウスから得られた免疫血清中ＩｇＧのＰｓｐＡクレードが異なる肺炎球菌表面への結合能を測定した結果を示す図である。
【図５】各融合ＰｓｐＡタンパク質を免疫したマウスにＰｓｐＡクレードが異なる肺炎球菌を感染させ、感染後２週間の生存率を観察した結果を示す図であり、（Ａ）はＢＧ９７３９を２×１０７ＣＦＵ、（Ｂ）はＷＵ２を２×１０７ＣＦＵ、（Ｃ）はＴＩＧＲ４を５×１０６ＣＦＵ、（Ｄ）はＫＫ１１６２を１×１０８ＣＦＵ、（Ｅ）はＡＴＣＣ６３０３を５×１０５ＣＦＵ感染させた結果である。
【図６】各融合ＰｓｐＡタンパク質を免疫したマウスから得られた免疫血清中ＩｇＧの臨床分離肺炎球菌株への結合能を測定した結果を示す図であり、（Ａ）はＰｓｐＡ２＋４による免疫血清、（Ｂ）はＰｓｐＡ２＋５による免疫血清、（Ｃ）はＰｓｐＡ３＋２による免疫血清の結果である。
【図７】ＰｓｐＡ２単独、ＰｓｐＡ３単独、ＰｓｐＡ２とＰｓｐＡ３、ＰｓｐＡ３＋２融合タンパク質をそれぞれ免疫したマウスから得られた免疫血清中の抗ＰｓｐＡ抗体価を測定した結果を示す図である。
【図８】アジュバントとしてＣｐＧおよびＡｌｕｍの併用またはＣｐＧの単独を使用し、３種類の融合ＰｓｐＡタンパク質（ＰｓｐＡ２＋４、ＰｓｐＡ２＋５、ＰｓｐＡ３＋２）を免疫したマウスから得られた免疫血清中の抗ＰｓｐＡ抗体価を測定した結果を示す図である。
【図９】アジュバントとしてＡｌｕｍの各濃度を単独で用い、ＰｓｐＡ３＋２融合タンパク質を免疫したマウスから得られた免疫血清中の抗ＰｓｐＡ抗体価を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
〔肺炎球菌ワクチン〕
本発明は、少なくともファミリー１のＰｓｐＡの全長またはそのフラグメントと、ファミリー２のＰｓｐＡの全長またはそのフラグメントとを含む融合タンパク質を含有する肺炎球菌ワクチンを提供する。ただし、前記非特許文献１３に記載のファミリー１クレード２のＰｓｐＡとファミリー２クレード４のＰｓｐＡとの融合タンパク質に用いられた肺炎球菌Ｒｘ１株由来のＰｓｐＡ（ファミリー１クレード２）を含む融合タンパク質は本発明から除かれる。また、前記非特許文献１２に記載の融合タンパク質において、ファミリー１クレード１のＰｓｐＡとして用いられた肺炎球菌Ｓｔ４３５／９６株（非特許文献１２およびMiyaji EN et al., Infect Immun. 70: 5086-5090, 2002.のTABLE 1参照）由来のＰｓｐＡ（ファミリー１クレード１）を含む融合タンパク質も本発明から除かれる。肺炎球菌Ｓｔ４３５／９６株のＰｓｐＡをコードする遺伝子の一部およびそのアミノ酸配列は、アクセッション番号ＡＹ０８２３８７でＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている。本明細書の以下の記載において、「ファミリー１のＰｓｐＡ」にはＲｘ１株およびＳｔ４３５／９６株由来のＰｓｐＡは含まれない。
【００１３】
本発明の肺炎球菌ワクチン（以下「本発明のワクチン」と記す）が含有する融合タンパク質（以下「本発明の融合タンパク質」と記す場合がある）は、少なくともファミリー１のＰｓｐＡおよびファミリー２のＰｓｐＡを含むものであればよい。本発明の融合タンパク質は、３種以上のＰｓｐＡを含むものでもよく、ＰｓｐＡ以外のタンパク質や莢膜ポリサッカライド（例えばキャリアータンパク質や莢膜ワクチン抗原等）を含むものでもよい。好ましくは、２種類のＰｓｐＡからなる融合タンパク質、すなわちファミリー１のＰｓｐＡとファミリー２のＰｓｐＡからなる融合タンパク質である。また、融合タンパク質は、タグ配列、ベクター由来配列、制限酵素由来配列等のＰｓｐＡ以外のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の融合タンパク質において、融合する各タンパク質の順序は限定されず、例えば、ファミリー１およびファミリー２の２種類のＰｓｐＡの融合タンパク質の場合、Ｎ末端側がファミリー１でＣ末端側がファミリー２の順でもよく、逆にＮ末端側がファミリー２でＣ末端側がファミリー１の順でもよい。３種以上のＰｓｐＡの融合タンパク質の場合やＰｓｐＡ以外のタンパク質を含む場合も同様に、順序は限定されない。
【００１５】
本発明の融合タンパク質には、ファミリーおよびクレードが既に同定されている肺炎球菌由来のＰｓｐＡを好適に用いることができる。また、ファミリーおよびクレードが未同定の肺炎球菌由来のＰｓｐＡを用いる場合は、ファミリーおよびクレードを同定した後に用いることが好ましい。ＰｓｐＡのファミリーおよびクレードは、ＰｓｐＡ遺伝子のα−ヘリックス領域およびプロリンリッチ領域を含むと予想される部分をＰＣＲで増幅し、塩基配列を決定し、得られた塩基配列中プロリンリッチ領域の上流約４００ｂｐの塩基配列を、クレードが既に同定されているＰｓｐＡ遺伝子の塩基配列と比較することにより確認することができる。具体的には、当該部分の塩基配列と表１または２に示している任意のＰｓｐＡ遺伝子の塩基配列との相同性が９７〜１００％であれば同一クレードと判断する。クレード１または２に同定されたＰｓｐＡはファミリー１、クレード３または４または５に同定されたＰｓｐＡはファミリー２、クレード６に同定されたＰｓｐＡはファミリー３と判断する（参考文献：非特許文献５、Swiatlo E, Brooks-Walter A, Briles DE, McDaniel LS. Oligonucleotides identity conserved and variable regions of pspA and pspA-like sequences of Streptococcus pneumonia. Gene 1997, 188:279-284.）。また、ファミリー１およびファミリー２に特異的なプライマーを用いてＰｓｐＡ遺伝子を増幅し、ＰＣＲ産生物のサイズが約１０００ｂｐであればファミリー１と判断し、ＰＣＲ産生物のサイズが約１２００ｂpであればファミリー２と判断することができる（参考文献：Vela Coral MC, Fonseca N, Castaneda E, Di Fabio JL, Hollingshead SK, Briles DE. Pneumococcal surface protein A of invasive Streptococcus pneumonia isolates from Colombian children. Emerg Infect Dis 2001, 7:832-6.）。
【００１６】
ファミリーおよびクレードが同定されている肺炎球菌としては、例えば表１および表２に記載の肺炎球菌が挙げられ、これらの肺炎球菌（Ｒｘ１を除く）由来のＰｓｐＡはいずれも本発明の融合タンパク質に好適に用いることができる。
【００１７】
【表１】
0005854537.tif 000002
【００１８】
【表２】
0005854537.tif 000003
【００１９】
本発明の融合タンパク質において、ファミリー１の肺炎球菌表面タンパク質Ａはクレード２であることが好ましい。より好ましくは以下の（１）〜（３）の融合タンパク質である。
（１）少なくともファミリー１クレード２のＰｓｐＡとファミリー２クレード３のＰｓｐＡとを含む融合タンパク質
（２）少なくともファミリー１クレード２のＰｓｐＡとファミリー２クレード４のＰｓｐＡとを含む融合タンパク質
（３）少なくともファミリー１クレード２のＰｓｐＡとファミリー２クレード５のＰｓｐＡとを含む融合タンパク質
さらに好ましくは以下の（４）〜（６）の融合タンパク質である。
（４）ファミリー１クレード２のＰｓｐＡとファミリー２クレード３のＰｓｐＡからなる融合タンパク質
（５）ファミリー１クレード２のＰｓｐＡとファミリー２クレード４のＰｓｐＡからなる融合タンパク質
（６）ファミリー１クレード２のＰｓｐＡとファミリー２クレード５のＰｓｐＡからなる融合タンパク質
また、ファミリー２のＰｓｐＡはクレード３であることが好ましい。したがって、本発明のワクチンとしては、上記（１）または（４）の融合タンパク質を含有することが好ましい。
【００２０】
融合タンパク質に用いるＰｓｐＡは、全長でもよくそのフラグメントでもよい。融合タンパク質を構成する２種以上のＰｓｐＡの全部が全長でもよく、全長とフラグメントの混合でもよく、全部がフラグメントでもよい。ＰｓｐＡは図１に示した通り、シグナル配列（signal sequence）、α−へリックス（α-Helix）、プロリンリッチ（Proline-rich）、コリン結合（Choline binding）およびＣ末端尾部（C-terminal tail）の各領域からなるタンパク質（前駆体）として発現し、そこからシグナル配列が切断されて成熟ＰｓｐＡになる。したがって、全長ＰｓｐＡは、図１に示したＰｓｐＡからシグナル配列の領域を除いた部分を意味する。本発明の融合タンパク質に用いるＰｓｐＡのフラグメントは、全長ＰｓｐＡの一部からなるものであって、生体に対して肺炎球菌感染症の感染防御免疫を誘導できるものであれば特に限定されないが、プロリンリッチ領域の全部または一部を含むことが好ましい。また、ＰｓｐＡのフラグメントは、プロリンリッチ領域と隣接するα−へリックス領域の全部または一部を含むものであってもよい。さらに、ＰｓｐＡのフラグメントは、Ｃ末端尾部領域を含まないことが好ましく、コリン結合領域およびＣ末端尾部領域を含まないことがより好ましい。すなわち、本発明の融合タンパク質に用いるＰｓｐＡのフラグメントは、プロリンリッチ領域の一部のみからなるもの、プロリンリッチ領域の全部のみからなるもの、プロリンリッチ領域の一部と隣接するα−へリックス領域の一部からなるもの、プロリンリッチ領域の一部と隣接するα−へリックス領域の全部からなるもの、プロリンリッチ領域の全部と隣接するα−へリックス領域の一部からなるもの、およびプロリンリッチ領域の全部とα−へリックス領域の全部からなるもののいずれかであることが好ましい。より好ましくは、プロリンリッチ領域の全部とα−へリックス領域の全部からなるフラグメントである。
【００２１】
ＰｓｐＡの各領域は、Ｙｏｔｈｅｒら（Yother J, Briles DE. 1992. Structural properties and evolutionary relationships of PspA, a surface protein of Streptococcus pneumoniae, as revealed by sequence analysis. J. Bacteriol. 174: 601-609）の報告に準じて決定することができる。具体的には、α−へリックス領域は、Ｒｘ１株由来ＰｓｐＡでは、二次構造予測プログラムを用いてα−へリックス構造を持つと予測された領域（第１位〜第２８８位）からシグナル配列（第１位〜第３１位）を除いた領域であり、このアミノ酸配列と高い相同性を示す領域と定義することができる。プロリンリッチ領域は、α−へリックス領域とコリン結合領域の間に位置し、プロリン残基が頻繁に出現する領域と定義することができる。コリン結合領域は、Ｒｘ１株由来ＰｓｐＡでは、比較的高度に保存された２０アミノ酸（TGWLQVNGSWYYLNANGAMA（配列番号２４）を基本とする）からなる繰り返し配列が１０回存在する領域であり、このアミノ酸配列と高い相同性を示す領域と定義することができる。Ｃ末端尾部領域は、コリン結合領域に存在する最終繰り返し配列の直後からＣ末端のストップコドンまでの領域と定義することができる。
【００２２】
ＰｓｐＡのフラグメントの長さは、生体に対して免疫応答を誘導可能な長さであれば特に限定されない。少なくとも２７残基以上であることが好ましく、１０８残基以上であることがより好ましく、３００残基以上であることがさらに好ましい（参考文献：Daniels CC, Coan P, King J,Hale J, Benton KA, Briles DE, Hollingshead SK. The Proline-Rich Region of Pneumococcal Surface Proteins A and C Contains Surface-Accessible Epitopes Common to All Pneumococci and Elicits Antibody-Mediated Protection against Sepsis. Infect. Immun.2010. 78: 2163-2172.）。
【００２３】
ファミリー１クレード２のＰｓｐＡとしては、例えば、肺炎球菌株Ｄ３９、ＷＵ２、Ｅ１３４、ＥＦ１０１９７、ＥＦ６７９６、ＢＧ９１６３、ＤＢＬ５などに由来するＰｓｐＡが好ましい。より好ましくはＤ３９またはＷＵ２由来のＰｓｐＡである。ファミリー２クレード３のＰｓｐＡとしては、肺炎球菌株ＴＩＧＲ４、ＢＧ８０９０、ＡＣ１２２などに由来するＰｓｐＡが好ましい。より好ましくはＴＩＧＲ４由来のＰｓｐＡである。ファミリー２クレード４のＰｓｐＡとしては、肺炎球菌株ＥＦ５６６８、ＢＧ７５６１、ＢＧ７８１７、ＢＧ１１７０３などに由来するＰｓｐＡが好ましい。より好ましくはＥＦ５６６８由来のＰｓｐＡである。ファミリー２クレード５のＰｓｐＡとしては、肺炎球菌株ＡＴＣＣ６３０３、ＫＫ９１０などに由来するＰｓｐＡが好ましい。より好ましくはＡＴＣＣ６３０３由来のＰｓｐＡである。
【００２４】
本発明の融合タンパク質は、Ｄ３９由来ＰｓｐＡとＥＦ５６６８由来ＰｓｐＡの組み合わせ、Ｄ３９由来ＰｓｐＡとＡＴＣＣ６３０３由来ＰｓｐＡの組み合わせ、またはＷＵ２由来ＰｓｐＡとＴＩＧＲ４由来ＰｓｐＡの組み合わせが好ましい。なかでもＷＵ２由来ＰｓｐＡとＴＩＧＲ４由来ＰｓｐＡの組み合わせがより好ましく、Ｎ末端側がＴＩＧＲ４由来ＰｓｐＡでＣ末端側がＷＵ２由来ＰｓｐＡの組み合わせがさらに好ましい。
さらに、本発明の融合タンパク質は、配列番号１、３もしくは５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなることが好ましい。なかでも配列番号５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる融合タンパク質がより好ましい。
【００２５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｄ３９由来ＰｓｐＡとＥＦ５６６８由来ＰｓｐＡとの融合タンパク質であり、Ｎ末端側からポリヒスチジンタグを含むベクター由来配列、Ｄ３９のＰｓｐＡのアミノ酸配列（Accession No. ABJ54172, 619aa）の第３２位〜第４０１位、ＥｃｏＲＩ認識塩基配列由来配列、ＥＦ５６６８のＰｓｐＡのアミノ酸配列（Accession No. AAC62252, 653aa）の第３２位〜第４５４位が順に連結したアミノ酸配列である。
配列番号３で表されるアミノ酸配列は、Ｄ３９由来ＰｓｐＡとＡＴＣＣ６３０３由来ＰｓｐＡとの融合タンパク質であり、Ｎ末端側からポリヒスチジンタグを含むベクター由来配列、Ｄ３９のＰｓｐＡのアミノ酸配列（Accession No. ABJ54172, 619aa）の第３２位〜第４０１位、ＥｃｏＲＩ認識塩基配列由来配列、ＡＴＣＣ６３０３のＰｓｐＡの部分アミノ酸配列（Accession No. AF071820, 461aa）の第３２位〜第４６１位が順に連結したアミノ酸配列である。
配列番号５で表されるアミノ酸配列は、ＴＩＧＲ４由来ＰｓｐＡとＷＵ２由来ＰｓｐＡとの融合タンパク質であり、Ｎ末端側からポリヒスチジンタグを含むベクター由来配列、ＴＩＧＲ４のＰｓｐＡのアミノ酸配列（Accession No. AAK74303, 744aa）の第３２位〜第５２４位、ＥｃｏＲＩ認識塩基配列由来配列、ＷＵ２のＰｓｐＡの部分アミノ酸配列（Accession No. AAF27710, 415aa）の第３２位〜第４０９位が順に連結したアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。また、実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３または５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列も同様である。
【００２７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる融合タンパク質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質と実質的に同質の活性を有する融合タンパク質が好ましい。実質的に同質の活性としては、広範囲の肺炎球菌株に対して免疫応答を誘導する活性が挙げられ、この活性が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質と同等（例えば、約０．５〜２０倍、好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましい。配列番号３または５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる融合タンパク質も同様である。
【００２８】
本発明の融合タンパク質は、公知の遺伝子工学的手法により、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に挿入した組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させ、精製することにより製造することができる。また、本発明の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子と公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽または大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系等）を用いて、製造することができる。
【００２９】
本発明のワクチンは、アジュバントを含まなくても肺炎球菌に対して免疫応答を誘導することができる点で有用性が高い。ただし本発明のワクチンは、１種以上のアジュバントを含んでいてもよい。本発明のワクチンがアジュバントを含む場合、公知のアジュバントの中から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩またはその組み合わせ）、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ＴＬＲリガンド（例えば、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４など）、ＢＡＹ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ｐｃｐｐ、モノホスホリル脂質Ａ、ＱＳ−２１、コレラ毒素、ホルミルメチオニルペプチドなどが挙げられる。好ましくは、アルミニウムアジュバント、ＴＬＲリガンドまたはこれらの組み合わせである。
本発明のワクチンがアジュバントを含む場合、アジュバントの配合量は、本発明の融合タンパク質に対する免疫応答を非特異的に高める量であれば特に限定されず、アジュバントの種類等により適宜選択すればよい。例えば、アルミニウムアジュバント（水酸化アルミニウム）およびＣｐＧを併用する場合、本発明の融合タンパク質に対して質量比でアルミニウムアジュバントが約１〜１００倍量、ＣｐＧが約１〜５０倍量を配合することが好ましい。
【００３０】
本発明のワクチンは、さらに肺炎球菌以外の病原体に対するワクチン成分を含んでいてもよい。すなわち、本発明は肺炎球菌に対するワクチン成分であるの上記本発明の融合タンパク質と肺炎球菌以外の病原体に対するワクチン成分とを含む混合ワクチンを提供する。肺炎球菌以外の病原体に対するワクチン成分は特に限定されず、例えば既に混合ワクチンとして使用実績のあるワクチン成分が挙げられる。具体的には、例えば、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、百日咳菌抗原、破傷風トキソイド、不活化ポリオウイルス、弱毒麻疹ウイルス、弱毒風疹ウイルス、弱毒ムンプスウイルス、インフルエンザ菌ｂ型ポリサッカライド抗原、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢｓ抗原、不活化Ａ型肝炎ウイルス抗原などが挙げられる。
【００３１】
現在使用されている混合ワクチンとしては、ジフテリア・百日咳・破傷風混合ワクチン（ＤＰＴワクチン）、ジフテリア・百日咳・破傷風・不活化ポリオ混合ワクチン（ＤＰＴ−ＩＰＶワクチン）、麻疹・風疹混合ワクチン（ＭＲワクチン）、麻疹・風疹・おたふく風邪ワクチン（ＭＭＲ）、インフルエンザ菌ｂ型・Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、Ａ型肝炎ウイルス・Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、ジフテリア・百日咳・破傷風・Ｂ型肝炎ウイルス・不活化ポリオワクチンなどが挙げられ、これらの混合ワクチンの成分に、本発明の肺炎球菌ワクチンの成分である融合タンパク質を追加することが好ましい。
【００３２】
本発明のワクチンは、経口投与または非経口投与より投与することができる。非経口投与としては、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、経皮投与、経粘膜投与などが挙げられる。好ましくは、非経口投与であり、より好ましくは、皮内投与、皮下投与または筋肉内投与である。
【００３３】
本発明のワクチンは、本発明の融合タンパク質と薬学的に許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口投与用製剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口投与用製剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００３４】
経口投与用の固形製剤に用いられる添加剤としては、例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の結合剤；トウモロコシデンプン等の分散剤；繊維素グリコール酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；グルタミン酸、アスパラギン酸等の溶解補助剤；安定剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子類等の水溶性高分子；白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、還元麦芽糖水アメ、粉末還元麦芽糖水アメ、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、アスパルテーム、サッカリン、サッカリンナトリウム等の甘味剤、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等のコーティング剤等が挙げられる。
経口投与用の液体製剤は、一般的に用いられる希釈剤に溶解、懸濁又は乳化されて製剤化される。希釈剤としては、例えば、精製水、エタノール、それらの混液等が挙げられる。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
【００３５】
経口投与用の注射剤に用いられる添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。注射剤等の液状製剤は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００３６】
本発明のワクチンは、免疫系を有するあらゆる動物（ヒト、非ヒト）を投与対象とすることができる。例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス等の哺乳動物；ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の鳥類が挙げられる。本発明のワクチンは、ヒトの小児および成人を対象とすることが好ましい。
本発明のワクチンの投与回数および投与間隔は特に限定されない。例えば、単回投与でもよく、約２日〜約８週間の間隔で複数回投与してもよい。
ワクチン投与量は、投与対象、投与方法などにより異なるが、１回投与量を約０．０１μｇ〜約１０ｍｇとすることが好ましく、約０．１μｇ〜約１ｍｇとすることがより好ましく、約１μｇ〜約０．１ｍｇとすることがさらに好ましい。
本発明には、本発明のワクチンの有効量を動物に投与することを含む、肺炎球菌感染症の予防または治療方法が含まれる。
【００３７】
本発明のワクチンは、従来の莢膜多糖体を抗原とするコンジュゲート肺炎球菌ワクチンと比較して、以下の点で優位性がある。
１）単一の融合タンパク質抗原のみで広範なタイプの肺炎球菌株に対して効果を示す。
２）タンパク質抗原であることから、キャリアータンパク質との融合ステップが不要であり生産コストが安価である。
３）タンパク質抗原であることから、キャリアータンパク質非存在状態で、小児および成人のどちらに対しても感染防御免疫を誘導できる。
４）単一の融合タンパク質を用いており、複数の抗原を混合する必要性がない。
５）融合タンパク質（ワクチン抗原）１種の精製を行うだけでよく、製造プロセスが容易であり、製造コストが抑制できる。
【００３８】
本発明には、少なくともファミリー１クレード２のＰｓｐＡの全長またはそのフラグメントと、クレード３、クレード４およびクレード５からなる群より選択されるファミリー２のＰｓｐＡの全長またはそのフラグメントとを含有することを特徴とする肺炎球菌ワクチンが含まれる。すなわち、少なくともクレード２のＰｓｐＡとクレード３のＰｓｐＡを含む肺炎球菌ワクチン、少なくともクレード２のＰｓｐＡとクレード４のＰｓｐＡを含む肺炎球菌ワクチン、少なくともクレード２のＰｓｐＡとクレード５のＰｓｐＡを含む肺炎球菌ワクチンである。本形態の肺炎球菌ワクチンは、上記３通りの組み合わせのＰｓｐＡを別々のタンパク質として含有してもよい。本形態の肺炎球菌ワクチンは、上記３通りの組み合わせのＰｓｐＡを別々のタンパク質として含有してもよいこと以外は、上記本発明の融合タンパク質を含有する肺炎球菌ワクチンと同様に実施することができる。
【００３９】
上記３通りの組み合わせのＰｓｐＡが別々のタンパク質である場合、肺炎球菌ワクチンが含有するＰｓｐＡは以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかであることが好ましい。
（ｉ）ファミリー１クレード２およびファミリー２クレード３のみ
（ｉｉ）ファミリー１クレード２およびファミリー２クレード４のみ
（ｉｉｉ）ファミリー１クレード２およびファミリー２クレード５のみ
【００４０】
上記３通りの組み合わせのＰｓｐＡが別々のタンパク質である場合、フラグメントに含まれる好ましい領域は、上記融合タンパク質に用いるフラグメントと同じである。好ましいＰｓｐＡを発現する肺炎球菌株の種類は、融合タンパク質の説明に記載した菌株と同じである。具体的には、クレード２のＰｓｐＡとしては、配列番号２５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。クレード３のＰｓｐＡとしては、配列番号２７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。クレード４のＰｓｐＡとしては、配列番号２８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。クレード５のＰｓｐＡとしては、配列番号２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。
【００４１】
配列番号２５で表されるアミノ酸配列は、Ｄ３９由来ＰｓｐＡ（アミノ酸配列を配列番号３０に、コードする遺伝子の塩基配列を配列番号３１にそれぞれ示す）のα−へリックス領域の全長とプロリンリッチ領域の全長からなるタンパク質であり、Ｄ３９のＰｓｐＡのアミノ酸配列（配列番号３０）の第３２位〜第４０１位に該当する。
配列番号２６で表されるアミノ酸配列は、ＷＵ２由来ＰｓｐＡ（部分アミノ酸配列を配列番号３２に、コードする遺伝子の塩基配列を配列番号３３にそれぞれ示す）のα−へリックス領域の全長とプロリンリッチ領域の全長からなるタンパク質であり、ＷＵ２のＰｓｐＡの部分アミノ酸配列（配列番号３２）の第３２位〜第４０９位に該当する。
配列番号２７で表されるアミノ酸配列は、ＴＩＧＲ４由来ＰｓｐＡ（アミノ酸配列を配列番号３４に、コードする遺伝子の塩基配列を配列番号３５にそれぞれ示す）のα−へリックス領域の全長とプロリンリッチ領域の全長からなるタンパク質であり、ＴＩＧＲ４のＰｓｐＡのアミノ酸配列（配列番号３４）の第３２位〜第５２４位に該当する。
配列番号２８で表されるアミノ酸配列は、ＥＦ５６６８由来ＰｓｐＡ（アミノ酸配列を配列番号３６に、コードする遺伝子の塩基配列を配列番号３７にそれぞれ示す）のα−へリックス領域の全長とプロリンリッチ領域の全長からなるタンパク質であり、ＥＦ５６６８のＰｓｐＡのアミノ酸配列（配列番号３６）の第３２位〜第４５４位に該当する。
配列番号２９で表されるアミノ酸配列は、ＡＴＣＣ６３０３由来ＰｓｐＡ（部分アミノ酸配列を配列番号３８に、コードする遺伝子の塩基配列を配列番号３９にそれぞれ示す）のα−へリックス領域の全長とプロリンリッチ領域の全長からなるタンパク質であり、ＡＴＣＣ６３０３のＰｓｐＡのアミノ酸配列（配列番号３８）の第３２位〜第４６１位に該当する。
【００４２】
配列番号２５〜２９のいずれかで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質は、前述の配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と同様である。
【００４３】
〔ポリヌクレオチド〕
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在することができる。ポリヌクレオチドは、二本鎖でもよく一本鎖でもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡと ＲＮＡとのハイブリッドのいずれであってもよい。一本鎖の場合は、コード鎖（センス鎖）または非コード鎖（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。さらに、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、融合タンパク質を構成する２種以上のＰｓｐＡをコードするポリヌクレオチドをそれぞれ取得して、これを結合することにより作製することができる。融合タンパク質を構成する各ＰｓｐＡをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ公知のＤＮＡ合成法やＰＣＲ法等によって、別々に取得することができる。具体的には、例えば、本発明の融合タンパク質を構成する各ＰｓｐＡのアミノ酸配列に基づいて、各アミノ酸のコドンを適宜選択して塩基配列をデザインし、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。また、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から目的のＰｓｐＡをコードする遺伝子の塩基配列情報を取得し（表１および表２のアクセッション番号参照）、所望のＰｓｐＡをコードする領域を増幅するためのプライマーを設計し、当該ＰｓｐＡを発現する肺炎球菌のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ等を行うことにより、所望のＤＮＡ断片を大量に取得できる。融合タンパク質を構成する各ＰｓｐＡをコードするポリヌクレオチドが得られたら、これを遺伝子工学的に結合することにより、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。
【００４５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、例えば配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、例えば配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、例えば配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００４６】
〔発現ベクター〕
本発明は、上記本発明の融合タンパク質を製造するために使用される発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むものであれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＳＰ６４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）が好ましい。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択することができる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。本発明の発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど）に従って、本発明の融合タンパク質を回収、精製することができる。
【００４７】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、大腸菌（Escherichia coli）および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００４８】
宿主細胞は特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などが挙げられる。上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００４９】
〔形質転換体〕
本発明は、上記本発明の発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。本発明の形質転換体は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含む。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞として例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。本発明の形質転換体は、本発明の融合タンパク質の製造に好適に使用することができる。これらの形質転換体は、本発明の融合タンパク質を安定的に発現するものであることが好ましいが、一過性に発現するものでもよい。
【００５０】
本発明には、さらに以下の各発明が含まれる。
［１］少なくともファミリー１の肺炎球菌表面タンパク質Ａの全長またはそのフラグメントと、ファミリー２の肺炎球菌表面タンパク質Ａの全長またはそのフラグメントとを含むことを特徴とする融合タンパク質。
［２］以下の（１）〜（３）のいずれかである前記［１］に記載の融合タンパク質。
（１）ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード３の肺炎球菌表面タンパク質Ａからなる融合タンパク質
（２）ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード４の肺炎球菌表面タンパク質Ａからなる融合タンパク質
（３）ファミリー１クレード２の肺炎球菌表面タンパク質Ａとファミリー２クレード５の肺炎球菌表面タンパク質Ａからなる融合タンパク質
［３］ファミリー２の肺炎球菌表面タンパク質Ａがクレード３であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の融合タンパク質。
［４］肺炎球菌表面タンパク質Ａのフラグメントが、少なくともプロリンリッチ領域の全部または一部を含むことを特徴とする前記［１］に記載の融合タンパク質。
［５］肺炎球菌表面タンパク質Ａのフラグメントが、プロリンリッチ領域の全部または一部およびそれに隣接するα−へリックス領域の全部または一部からなることを特徴とする前記［４］に記載の融合タンパク質。
［６］配列番号１、３もしくは５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とする前記［１］に記載の融合タンパク質。
［７］前記［１］〜［６］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［８］前記［７］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［９］前記［８］に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
［１０］肺炎球菌ワクチンを製造するための前記［１］〜［６］のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
［１１］前記［１］〜［６］のいずれかに記載の融合タンパク質を含むことを特徴とする肺炎球菌ワクチン。
［１２］さらにアジュバントを含むことを特徴とする前記［１１］に記載の肺炎球菌ワクチン。
［１３］前記［１］〜［６］のいずれかに記載の融合タンパク質の有効量を動物に投与することを含む、肺炎球菌感染症の予防または治療方法。
［１４］肺炎球菌感染症の予防または治療に使用するための前記［１］〜［６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５２】
〔実施例１：融合ＰｓｐＡタンパク質の作製〕
表３に示した肺炎球菌のうち、Ｄ３９、ＴＩＧＲ４、ＥＦ５６６８、ＡＴＣＣ６３０３およびＷＵ２由来のＰｓｐＡを用いて、図２（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示した３種類の融合ＰｓｐＡタンパク質を作製した。全ての遺伝子クローニング操作はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを用いて行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αはＬＢ培地（1% bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl）で培養を行い、必要時には、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるようカナマイシンをＬＢ培地に添加した。【００５３】
【表３】
0005854537.tif 000004
【００５４】
各菌株のＰｓｐＡのＮ末端側のα−へリックスおよびプロリンリッチ領域をコードするＤＮＡ断片を、表４に示したプライマーを用いて各菌株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにて増幅し、得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターに挿入して、融合ＰｓｐＡタンパク質発現ベクターを作製した。具体的には、以下のとおりである。【００５５】
【表４】
0005854537.tif 000005
【００５６】
５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ認識配列、３’末端側にＥｃｏＲＩ認識配列が付加されている肺炎球菌Ｄ３９（プライマーP1およびP2）またはＴＩＧＲ４（プライマーP7およびP8）由来のＰｓｐＡ ＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターの制限酵素切断部位ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ認識サイトに挿入した。さらに、Ｄ３９由来ＰｓｐＡが挿入されているｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターの制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ認識サイトに、５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列、３’末端側にＸｈｏＩ認識配列が付加された肺炎球菌ＥＦ５６６８（プライマーP3およびP4）あるいはＡＴＣＣ６３０３（プライマーP5およびP6）由来のＰｓｐＡ ＰＣＲ産物をそれぞれ挿入し、Ｄ３９およびＥＦ５６６８由来ＰｓｐＡ融合タンパク質ＰｓｐＡ２＋４、Ｄ３９およびＡＴＣＣ６３０３ＰｓｐＡ融合タンパク質ＰｓｐＡ２＋５を発現する２種の発現ベクターを作製した。また、ＴＩＧＲ４由来ＰｓｐＡ ＰＣＲ産物が挿入されているｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターの制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ認識サイトに、５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列、３’末端側にＸｈｏＩ認識配列が付加されたＷＵ２（プライマーP9およびP10）由来ＰｓｐＡ ＰＣＲ産物を挿入し、ＴＩＧＲ４およびＷＵ２由来ＰｓｐＡ融合タンパク質ＰｓｐＡ３＋２を発現するベクターを作製した。これら３種類の融合遺伝子（ＰｓｐＡ２＋４遺伝子、ＰｓｐＡ２＋５遺伝子およびＰｓｐＡ３＋２遺伝子）について、ＤＮＡシークエンサーによりそれぞれ塩基配列を確認し、それぞれ配列番号２、４および５で表される塩基配列であることを確認した。【００５７】
作製した各融合ＰｓｐＡタンパク質発現ベクターをＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にそれぞれ形質転換し、これをカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて３７℃で震盪培養した。吸光度ＯＤ６００ｎｍが約０．８になった培養液に、ＩＰＴＧ（終濃度０．５ｍＭ）を添加し、さらに３時間震盪培養を続け、融合ＰｓｐＡタンパク質を大量発現させた。回収した菌体から融合ＰｓｐＡタンパク質を抽出し、Ｎ末端に存在するポリヒスチジンタグを用いて、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過法により精製した。精製した融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ参照）および抗ＰｓｐＡ抗体を用いたウエスタンブロッティング（図３Ｂ参照）により、目的の融合タンパク質であることを確認した。【００５８】
〔実施例２：融合ＰｓｐＡタンパク質免疫血清中ＩｇＧの各ＰｓｐＡクレード肺炎球菌表面への結合能〕
（１）融合ＰｓｐＡタンパク質によるマウスの免疫
融合ＰｓｐＡタンパク質（ＰｓｐＡ２＋４、ＰｓｐＡ２＋５またはＰｓｐＡ３＋２）０．１μｇとアジュバント（ＣｐＧＫ３ ２．５μｇおよびＡｌｕｍ ５．０μｇ）をＬＰＳフリーのＰＢＳで調製し、６週齢の♀のＣ５７／ＢＬ６ｊマウスに皮下接種した。同じ免疫グループあたり５匹のマウスを用いた。接種は、１週間おきに合計３回行った。最終免疫（３回目の接種）から１週間後に採血し、血清を得た。【００５９】
（２）免疫血清中ＩｇＧの肺炎球菌表面への結合能の測定
肺炎球菌は、ＰｓｐＡクレード１〜６の６種類を用いた。具体的には、クレード１の菌株としてＢＧ９７３９、クレード２の菌株としてＷＵ２、クレード３の菌株としてＴＩＧＲ４、クレード４の菌株としてＫＫ１１６２、クレード５の菌株としてＡＴＣＣ６３０３、クレード６の菌株としてＢＧ６３８０を用いた（表３参照）。肺炎球菌は、ＴＨＹ培地（Todd-Hewitt broth supplemented with 0.5% yeast extract）で培養し、対数増殖期の培養液にグリセロールが終濃度２５％になるよう添加し、これを−８０℃で冷凍保存したものを使用した。
血液寒天培地で一晩培養した肺炎球菌株を、血液寒天培地で４〜５時間継代培養した後、肺炎球菌をＰＢＳにて収集した。約１０７ＣＦＵの肺炎球菌溶液９０μｌと１０μｌの免疫血清（同じ免疫グループの混合血清）を３７℃で３０分間反応させた。さらにＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体と反応させた後、洗浄遠心し、菌体に結合する蛍光強度をフローサイトメトリー法で測定した。【００６０】
（３）結果
結果を図４に示した。結合率は、菌数１００００個当たりの免疫血清中ＩｇＧ結合菌数を％で表した。ＰｓｐＡ３＋２の免疫血清は、クレード１〜５のいずれの肺炎球菌株に対しても高い結合性を示した。ＰｓｐＡ２＋４およびＰｓｐＡ２＋５の免疫血清は、クレード３のＴＩＧＲ４に対しては若干低い結合性を示したが、これ以外のクレードの肺炎球菌株に対しては、高い結合性を示した。クレード６のＢＧ６３８０に対しては、ＰｓｐＡ２＋５が高い結合性を示した。【００６１】
〔実施例３：融合ＰｓｐＡタンパク質免疫によるマウス致死的肺炎モデルでの感染防御効果〕
（１）実験方法
実施例２と同様の方法でマウスに融合ＰｓｐＡタンパク質の免疫を行った。アジュバント単独投与マウスを陰性コントロールとした。最終免疫（３回目の接種）の２週間後にマウスにＰｓｐＡのクレード１〜５を発現する以下の肺炎球菌株（表３参照）を経鼻接種し、マウス致死的肺炎モデルを作製した。マウス一匹に対して、ＢＧ９７３９（クレード１）は２×１０７ＣＦＵ、ＷＵ２（クレード２）は２×１０７ＣＦＵ、ＴＩＧＲ４（クレード３）は５×１０６ＣＦＵ、ＫＫ１１６２（クレード４）は１×１０８ＣＦＵ、ＡＴＣＣ６３０３（クレード５）は５×１０５ＣＦＵの致死的な菌量を感染させた。１群の匹数は１０匹または８匹（ＢＧ９７３９感染グループのＰｓｐＡ２＋５群、ＫＫ１１６２感染グループの陰性コントロール群およびＰｓｐＡ３＋２群、ＡＴＣＣ６３０３感染グループの陰性コントロール群）とした。
免疫マウスへの肺炎球菌感染後、２週間にわたってその生存率を観察した。生存率の違いについてはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いて解析を行った。Ｐ値が０．０５より小さい場合に有意差があるとした。【００６２】
（２）結果
結果を図５に示した。図５中の＊はワクチン投与群におけるマウスの生存率をアジュバント投与群と比較し、有意差が示され、Ｐ値が０．０５より小さい場合を表し、＊＊は同様の比較で有意差が示され、Ｐ地が０．０１より小さい場合を表す。（Ａ）はＢＧ９７３９（クレード１）、（Ｂ）はＷＵ２（クレード２）、（Ｃ）はＴＩＧＲ４（クレード３）、（Ｄ）はＫＫ１１６２（クレード４）、（Ｅ）はＡＴＣＣ６３０３（クレード５）の結果である。ＰｓｐＡ３＋２による免疫マウスでは、ＰｓｐＡクレード１〜５の肺炎球菌株のいずれを感染させた場合でも有意な生存率の改善が認められた。ＰｓｐＡ２＋４による免疫マウスおよびＰｓｐＡ２＋５による免疫マウスでは、ＰｓｐＡクレード２、４または５の肺炎球菌株を感染させた場合に有意な生存率の改善が認められた。【００６３】
〔実施例４：免疫血清中ＩｇＧの臨床分離肺炎球菌株への結合能の測定〕
（１）実験方法
実施例２で得られた各融合ＰｓｐＡタンパク質の免疫血清を用いて、免疫血清中ＩｇＧの臨床分離肺炎球菌株への結合能を測定した。対象菌株を臨床分離肺炎球菌株に変更した以外、実施例２と同様に行った。
なお、臨床分離肺炎球菌株のＰｓｐＡファミリーおよびクレードの同定方法は、以下のように行った。すなわち、下記のプライマーＬＳＭ１２およびＳＫＨ２を用いて各臨床分離肺炎球菌株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物のシークエンス解析を行った。プロリンリッチ領域の上流約４００ｂｐの塩基配列を、ファミリーおよびクレードが同定されているＰｓｐＡの塩基配列と比較し、同定を行った（参考文献：Pimenta FC, Ribeiro-Dias F, Brandileone MC et al. 2006. Genetic diversity of PspA types among nasopharyngeal isolates collected during an ongoing surveillance study of children in Brazil. J Clin Microbiol. 44:2838-43.）。
LSM12：CCGGATCCAGCGTCGCTATCTTAGGGGCTGGTT（配列番号１７）
SKH2：CCACATACCGTTTTCTTGTTTCCAGCC（配列番号１８）【００６４】
（２）評価基準および結果
前述したように、肺炎球菌菌体表層に存在するＰｓｐＡタンパク質に対する免疫血清中ＩｇＧの結合が、感染防御効果に必須であることから、肺炎球菌へのＩｇＧ結合能を基準に様々な臨床分離肺炎球菌株に対する各融合ＰｓｐＡタンパク質のカバー率を評価した。
結果を図６に示した。図６中、括弧内は使用した臨床分離肺炎球菌株の血清型およびＰｓｐＡクレードを示す。（Ａ）のＰｓｐＡ２＋４による免疫血清、（Ｂ）のＰｓｐＡ２＋５による免疫血清、（Ｃ）のＰｓｐＡ３＋２による免疫血清のいずれにおいても、ほぼ全ての臨床分離肺炎球菌株（９７．０％）に対するＩｇＧ結合能（結合率１０％以上）を示した。【００６５】
〔実施例５：ＰｓｐＡタンパク質免疫血清中の抗ＰｓｐＡ抗体価の測定〕
（１）各クレードのＰｓｐＡ抗原タンパク質の作製
クレード１〜５の各ＰｓｐＡのα−ヘリックス領域およびプロリンリッチ領域からなるタンパク質を組み換えタンパク質として作製し、抗原タンパク質とした。クレード１としてＢＧ９７３９、クレード２としてＤ３９、クレード３としてＴＩＧＲ４、クレード４としてＥＦ５６６８、クレード５としてＡＴＣＣ６３０３由来のＰｓｐＡを使用した。各クレードのＰｓｐＡ抗原タンパク質の発現ベクターを、以下のように作製した。【００６６】
すなわち、５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩ認識配列、３’末端側にＸｈｏＩ認識配列が付加されたα−へリックスおよびプロリンリッチ領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲプライマーとして、ＢＧ９７３９にはプライマーＰ１１およびＰ１２、Ｄ３９にはプライマーＰ１およびＰ１３、ＴＩＧＲ４にはプライマーＰ７およびＰ１４、ＥＦ５６６８にはプライマーＰ１５およびＰ４、ＡＴＣＣ６３０３にはプライマーＰ７およびＰ６を用いた。得られたＰＣＲ産物を、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターの制限酵素切断部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ認識サイトに挿入した。これらのベクターをＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にそれぞれ形質転換し、これをカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて３７℃で震盪培養した。吸光度ＯＤ６００ｎｍが約０．８になった培養液に、ＩＰＴＧ（終濃度０．５ｍＭ）を添加し、さらに３時間震盪培養を続け、ＰｓｐＡ抗原タンパク質を大量発現させた。回収した菌体からＰｓｐＡ抗原タンパク質を抽出し、Ｎ末端に存在するポリヒスチジンタグを用いて、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過法により精製した。精製したＰｓｐＡ抗原タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより、目的のタンパク質であることを確認した。【００６７】
（２）抗原によるマウスの免疫
抗原には、上記により得られたクレード２のＰｓｐＡ抗原タンパク質（ＰｓｐＡ２）、クレード３のＰｓｐＡ抗原タンパク質（ＰｓｐＡ３）および実施例１で作製した融合ＰｓｐＡタンパク質（ＰｓｐＡ３＋２）を使用した。６週齢の♀のＣ５７／ＢＬ６ｊマウスを１群あたり５匹ずつ以下の５群に分けた。
・ＰｓｐＡ３＋ＰｓｐＡ２投与群（ＰｓｐＡ３ ０．０５μｇ、ＰｓｐＡ２ ０．０５μｇおよびアジュバントを投与）
・ＰｓｐＡ３＋２投与群（ＰｓｐＡ３＋２ ０．１μｇおよびアジュバントを投与）
・ＰｓｐＡ２投与群（ＰｓｐＡ２ ０．１μｇおよびアジュバントを投与）
・ＰｓｐＡ３投与群（ＰｓｐＡ３ ０．１μｇおよびアジュバントを投与）
・ＰｓｐＡ３＋２投与群（ＰｓｐＡ３＋２ ４．０μｇを投与）
アジュバントにはＣｐＧＫ３ ２．５μｇおよびＡｌｕｍ ５．０μｇを用いた。ＬＰＳフリーのＰＢＳで抗原溶液を調製し、マウスに皮下接種した。接種は、１週間おきに合計３回行った。最終免疫（３回目の接種）から１週間後に採血し、血清を得た。【００６８】
（３）ＥＬＩＳＡ
各クレードの精製ＰｓｐＡ抗原タンパク質を５μｇ／ｍｌに調製し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルずつ添加した。これを一晩４℃に静置し、抗原をプレートにコーティングした。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で洗浄し、段階希釈した免疫血清サンプルを５０μｌ／ウェルずつ添加し、３７℃で３０分間静置した。続いて、各ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、２０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温、遮光下で４５分間静置した。その後、ＯＤ４０５ｎｍの吸光度を測定した。陰性コントロールの吸光度を引いた吸光度が０．１になる希釈倍率をＬｏｇ２で示し、これを血清中に含まれる抗ＰｓｐＡ抗体価とした。【００６９】
（４）結果
結果を図７に示した。ＰｓｐＡ２単独ではクレード３に対する抗体価が低く、ＰｓｐＡ３単独ではクレード１、２、４および５に対する抗体価が低くかった。ＰｓｐＡ２とＰｓｐＡ３を併用すると、クレード１〜５のいずれに対しても高い抗体価を示した。ＰｓｐＡ２とＰｓｐＡ３の融合タンパク質（ＰｓｐＡ３＋２）は、ＰｓｐＡ２とＰｓｐＡ３の併用よりいずれのクレードに対しても同等もしくは高い抗体価を示した。さらにＰｓｐＡ２とＰｓｐＡ３の融合タンパク質（ＰｓｐＡ３＋２）は、アジュバントを併用しなくても高濃度で免疫することにより、いずれのクレードに対しても高い抗体価を示すことが明らかになった。この結果から、融合ＰｓｐＡタンパク質は、別々のタンパク質としての投与と比較して同等あるいは高い抗体価が得られ、さらにアジュバントを併用しなくても高い抗体価が得られるので、肺炎球菌ワクチンの抗原として非常に有用であることが示された。【００７０】
〔実施例６：アジュバントの検討（その１）〕
アジュバントとして、ＣｐＧおよびＡｌｕｍの併用またはＣｐＧの単独使用における効果について検討した。
（１）マウスの免疫
抗原には実施例１で作製した３種類の融合ＰｓｐＡタンパク質（ＰｓｐＡ２＋４、ＰｓｐＡ２＋５、ＰｓｐＡ３＋２）を使用し、アジュバントにはＣｐＧおよびＡｌｕｍの併用またはＣｐＧの単独を使用した。以下の６群を設けた。
・ＰｓｐＡ２＋４ ０．１μｇ＋ＣｐＧＫ３ ２．５μｇ
・ＰｓｐＡ２＋４ ０．１μｇ＋ＣｐＧＫ３ ２．５μｇ＋Ａｌｕｍ ５．０μｇ
・ＰｓｐＡ２＋５ ０．１μｇ＋ＣｐＧＫ３ ２．５μｇ
・ＰｓｐＡ２＋５ ０．１μｇ＋ＣｐＧＫ３ ２．５μｇ＋Ａｌｕｍ ５．０μｇ
・ＰｓｐＡ３＋２ ０．１μｇ＋ＣｐＧＫ３ ２．５μｇ
・ＰｓｐＡ３＋２ ０．１μｇ＋ＣｐＧＫ３ ２．５μｇ＋Ａｌｕｍ ５．０μｇ
ＬＰＳフリーのＰＢＳで抗原溶液を調製し、マウスに皮下接種した。接種は、１週間おきに合計３回行った。最終免疫（３回目の接種）から１週間後に採血し、血清を得た。【００７１】
（２）ＥＬＩＳＡ
実施例５と同様の方法でＥＬＩＳＡを行い、血清中に含まれる抗ＰｓｐＡ抗体価を求めた。
（３）結果
結果を図８に示した。図８中の＊は、同じクレードのＰｓｐＡ抗原に対するＡｌｕｍ含有群の抗体価がＡｌｕｍ非含有群に比べ有意に高く、Ｐ値が０．０５より小さい場合を表し、＊＊は同様の比較で有意に高く、Ｐ値が０．０１より小さい場合を表す。ＰｓｐＡ２＋４では、Ａｌｕｍ非含有条件でクレード２，４，５に対する抗体価が高く、クレード１，３に対する抗体価が低かったが、Ａｌｕｍの添加によってクレード１，３に対する抗体価の上昇が認められた。ＰｓｐＡ２＋５ではＡｌｕｍ非含有条件で特にクレード１，３に対する抗体価が低く、Ａｌｕｍの添加によってもクレード３に対する抗体価は低値のままであった。ＰｓｐＡ３＋２ではＡｌｕｍ非含有条件でクレード１に対する抗体価が低値であったが、Ａｌｕｍの添加によって全てのクレードに対する高い抗体価が認められた。この結果から、本条件下では、Ａｌｕｍの添加によってＰｓｐＡに対する特異抗体価の上昇が確認され、また、融合型ＰｓｐＡが、全てのクレードのＰｓｐＡに対する高い特異抗体価を誘導することが明らかとなった。【００７２】
〔実施例７：アジュバントの検討（その２）〕
アジュバントとして、ＣｐＧとＡｌｕｍの併用ではなく、Ａｌｕｍを単独で用いた場合の効果について検討した。
（１）マウスの免疫
抗原には実施例１で作製した融合ＰｓｐＡタンパク質（ＰｓｐＡ３＋２）を使用し、アジュバントにはＡｌｕｍを使用した。以下の３群を設けた。
・ＰｓｐＡ３＋２ ０．１μｇ＋Ａｌｕｍ ５．０μｇ
・ＰｓｐＡ３＋２ ０．１μｇ＋Ａｌｕｍ ２５．０μｇ
・ＰｓｐＡ３＋２ ０．１μｇ＋Ａｌｕｍ ５０．０μｇ
ＬＰＳフリーのＰＢＳで抗原溶液を調製し、マウスに皮下接種した。接種は、１週間おきに合計３回行った。最終免疫（３回目の接種）から１週間後に採血し、血清を得た。【００７３】
（２）ＥＬＩＳＡ
実施例５と同様の方法でＥＬＩＳＡを行い、血清中に含まれる抗ＰｓｐＡ抗体価を求めた。
（３）結果
結果を図９に示した。Ａｌｕｍ単独の使用でも、クレード１〜５のいずれに対しても高い抗体価を示した。また、投与量を併用の場合と同じ５．０μｇにしても、併用の場合とほぼ同等の抗体価を示した。【００７４】
〔参考例１：日本における臨床分離肺炎球菌に存在するＰｓｐＡファミリーの分布〕
日本で分離された成人侵襲性肺炎球菌感染症由来の肺炎球菌７３株におけるＰｓｐＡファミリーおよびクレードの分布を調べた。ＰｓｐＡファミリーおよびクレードの同定は、実施例４に記載の方法と同様に、プロリンリッチ領域の上流約４００ｂｐの塩基配列を、ファミリーおよびクレードが同定されているＰｓｐＡの塩基配列と比較することにより行った。【００７５】
結果を表５に示した。１４５株中１４５株がＰｓｐＡファミリー１または２を保有していた。また、成人用２３価肺炎球菌ワクチンＰＰＶ２３（23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine）によってカバーされる血清型を持つ分離株は１２６株（８６．９％）、ＰＣＶ７およびＰＣＶ１３でカバーされる血清型を持つ分離株はそれぞれ５７株（３９．３％）、１０８株（７４．５％）であった。【００７６】
【表５】
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【００７７】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図９】
0005854537.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005854537.tif 000015
【配列表】
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