【手続補正書】
【提出日】平成22年3月23日(2010.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖性障害の治療のための、Ｓｙｋキナーゼ阻害化合物を含む組成物であって、該化合物は、
（ａ）Ｎ２−（２−（２−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イルアミノ）−Ｎ４−２，２−ジメチル−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−３（４Ｈ）−オン−６−イル）−５−フルオロ−２，４−ピリミジンジアミン
【化２−１】
2009534397.tif 000001
；
（ｂ）Ｎ２−（４−ベンズアミド）−Ｎ４−（３−クロロ−４−オキシアセトニトリルフェニル）−５−フルオロ−２，４−ピリミジンジアミン
【化２−２】
2009534397.tif 000002
；
（ｃ）Ｎ２−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−５−フルオロ−Ｎ４−（３−オキソ−４Ｈ−５−ピリド［１，４］オキサジン−６−イル）−２，４−ピリミジンジアミン
【化２−３】
2009534397.tif 000003
；
（ｄ）Ｎ４−（２，２−ジメチル−３−オキソ−４Ｈ−５−ピリド［１，４］オキサジン−６−イル）−５−フルオロ−Ｎ２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２，４−ピリミジンジアミン
【化２−４】
2009534397.tif 000004
；
（ｅ）（Ｎ４−（２，２−ジメチル−４−［（二水素ホスホノキシ）メチル］−３−オキソ−５−ピリド［１，４］オキサジン−６−イル）−５−フルオロ−Ｎ２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２，４−ピリミジンジアミン）
【化２−５】
2009534397.tif 000005
またはそれらの塩、水和物、溶媒和物、もしくはＮ−酸化物である、組成物。
【請求項２】
前記細胞増殖性障害が、造血新生物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記造血新生物が、リンパ系の新生物であり、必要に応じて
（ｉ）該リンパ系の新生物は、Ｔ細胞新生物であり、必要に応じて該Ｔ細胞新生物は、Ｔリンパ芽球性白血病であるか；または
（ｉｉ）該リンパ系の新生物は、Ｂ細胞新生物であり、必要に応じて該Ｂ細胞新生物は、Ｂ−リンパ芽球性白血病またはバーキットリンパ腫である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞増殖性障害が、骨髄新生物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記骨髄新生物が、
（ｉ）骨髄増殖性疾患であり、必要に応じて慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）であるか；
（ｉｉ）骨髄異形成疾患であり、必要に応じて慢性骨髄単球性白血病であるか；
（ｉｉｉ）骨髄異形成症候群であるか；または
（ｉｖ）急性骨髄性白血病であり、必要に応じてＴＥＬ／Ｓｙｋ融合タンパク質の活性と関連している、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記造血新生物が、急性骨髄性白血病、Ｂ−前駆体細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ−細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、および慢性骨髄性白血病から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記増殖性障害が、Ｓｙｋキナーゼ活性の調節から生じるウイルス媒介腫瘍である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
（ｉ）前記ウイルス媒介腫瘍が、ＩＴＡＭモチーフをコードするウイルスと関連しているか；または
（ｉｉ）前記ウイルス媒介腫瘍が、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスと関連しており、必要に応じてカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスのＫ１タンパク質の活性と関連しているか；または
（ｉｉｉ）前記ウイルス媒介腫瘍が、エプスタイン−バーウイルスと関連しており、必要に応じて該エプスタイン−バーウイルスのＬＭＰ２Ａタンパク質の活性と関連しているか；または前記ウイルス媒介腫瘍が、ＨＴＬＶ−１と関連している、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、Ｓｙｋ阻害化合物の混合物を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物を、Ａｂｌキナーゼ阻害剤とともに付加的に投与することを特徴とし、必要に応じて、
（ｉ）該Ａｂｌキナーゼ阻害剤が、２−フェニルアミノピリミジンであるか；または
（ｉｉ）該組成物と該Ａｂｌキナーゼ阻害剤とが、連続的にまたは同時に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
腫瘍転移を阻害するための、Ｓｙｋキナーゼ阻害化合物を含む組成物であって、該化合物は、
（ａ）Ｎ２−（２−（２−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イルアミノ）−Ｎ４−２，２−ジメチル−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−３（４Ｈ）−オン−６−イル）−５−フルオロ−２，４−ピリミジンジアミン
【化３−１】
2009534397.tif 000006
；
（ｂ）Ｎ２−（４−ベンズアミド）−Ｎ４−（３−クロロ−４−オキシアセトニトリルフェニル）−５−フルオロ−２，４−ピリミジンジアミン
【化３−２】
2009534397.tif 000007
；
（ｃ）Ｎ２−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−５−フルオロ−Ｎ４−（３−オキソ−４Ｈ−５−ピリド［１，４］オキサジン−６−イル）−２，４−ピリミジンジアミン
【化３−３】
2009534397.tif 000008
；
（ｄ）Ｎ４−（２，２−ジメチル−３−オキソ−４Ｈ−５−ピリド［１，４］オキサジン−６−イル）−５−フルオロ−Ｎ２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２，４−ピリミジンジアミン
【化３−４】
2009534397.tif 000009
；
（ｅ）（Ｎ４−（２，２−ジメチル−４−［（二水素ホスホノキシ）メチル］−３−オキソ−５−ピリド［１，４］オキサジン−６−イル）−５−フルオロ−Ｎ２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２，４−ピリミジンジアミン）
【化３−５】
2009534397.tif 000010
またはそれらの塩、水和物、溶媒和物、もしくはＮ−酸化物である、組成物。
【請求項１２】
前記腫瘍が、乳癌、卵巣癌、腎性癌、胃腸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、肺扁平癌、および腺癌から選択され、前記組成物は、必要に応じて腫瘍転移の診断前に予防的に投与されることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記転移が、Ｓｙｋを通るインテグリンシグナル伝達によって引き起こされ、必要に応じて該転移が、β１インテグリンによるか、β２インテグリンによるか、またはβ３インテグリンによるインテグリンシグナル伝達によって引き起こされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、Ｎ４−（２，２−ジメチル−３−オキソ−４Ｈ−５−ピリド［１，４］オキサジン−６−イル）−５−フルオロ−Ｎ２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２，４−ピリミジンジアミン；Ｎ４−（２，２−ジメチル−４−［（二水素ホスホノキシ）メチル］−３−オキソ−５−ピリド［１，４］オキサジン−６−イル）−５−フルオロ−Ｎ２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２，４−ピリミジンジアミン；またはそれらの塩、水和物、溶媒和物、もしくはＮ−酸化物である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
【図１Ａ】Ｓｙｋ阻害化合物ＶＩが増殖を妨げ、ＴＥＬ−Ｓｙｋ−形質転換細胞の分化を誘発する能力を示している。ＤＭＳＯ、Ｓｙｋ−阻害化合物ＶＩ（２μＭ）、またはＡｂｌキナーゼ阻害剤ＳＴＩ−５７１（２μＭ）のいずれかで３６時間処理されたＴＥＬ−Ｓｙｋ−またはＢＣＲＡｂｌ−形質転換細胞のＤＮＡ含有量が示されている。
【図１Ｂ】Ｓｙｋ阻害化合物ＶＩが増殖を妨げ、ＴＥＬ−Ｓｙｋ−形質転換細胞の分化を誘発する能力を示している。ＴＥＬ−Ｓｙｋがプレ−Ｂ細胞の分化を妨げる能力が示されている。
【図１Ｃ】Ｓｙｋ阻害化合物ＶＩが増殖を妨げ、ＴＥＬ−Ｓｙｋ−形質転換細胞の分化を誘発する能力を示している。細胞は、ＩＬ−７の不在下に３日間培養され、ＦＡＣＳによってκＬＣの発現について分析された。化合物ＶＩでのＴＥＬ−Ｓｙｋ活性の阻害が示されている。
【図２Ａ】Ｓｙｋ−阻害剤ＶＩが、Ｍｙｃ−形質転換されたプレ−Ｂ細胞の増殖を妨げる能力を示している。図２Ａは、Ｍｙｃ発現ベクターで形質導入され、かつＩＬ−７の不在下に１週間培養されたプレ−Ｂ細胞のＦＡＣＳプロフィールである。
【図２Ｂ】Ｓｙｋ−阻害剤ＶＩが、Ｍｙｃ−形質転換されたプレ−Ｂ細胞の増殖を妨げる能力を示している。図２Ｂの下方の図は、指示された細胞の注入の５週間後のＲＡＧ／γＣ−＋／−マウスの脾臓を示し、Ｍｙｃ−形質転換細胞が脾腫および白血病を引き起こす能力を図解している。図２Ｂは、ＤＭＳＯ、ＶＩ（２μＭ）、またはＳＴＩ−５７１（２μＭ）のいずれかで３６時間処理されたＭｙｃ−形質転換細胞のＤＮＡ含有量を示している。
【図３Ａ】Ｓｙｋ−阻害剤ＶＩが、腫瘍形成性ＳＬＰ−６５−／−プレ−Ｂ細胞系の増殖を妨げる能力を示している。図３Ａは、ＳＬＰ−６５−／−プレ−Ｂ細胞系が、指示された細胞の注入の５週間後のＲＡＧ／γＣ−−／−マウスの脾臓の状態によって証明されているように、脾腫および白血病を引き起こしうることを示している。
【図３Ｂ】Ｓｙｋ−阻害剤ＶＩが、腫瘍形成性ＳＬＰ−６５−／−プレ−Ｂ細胞系の増殖を妨げる能力を示している。図３Ｂは、ＤＭＳＯ、ＶＩ（２μＭ）、またはＳＴＩ−５７１（２μＭ）のいずれかで３６時間処理された腫瘍形成性ＳＬＰ−６５−／−プレ−Ｂ細胞系のＤＮＡ含有量を示している。
【図４】ＭＶ４−１１ヒト急性骨髄性白血病細胞が静脈内（ｉ．ｖ．）接種され、かつ腫瘍細胞接種後１７日目から調査の間中ずっと、一日２回ＰＯで４０ｍｇ／ｋｇにおいて化合物ＶＩＩで処理されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスについての生存曲線を示している。４０ｍｇ／ｋｇ  ＶＩＩグループ（１０６細胞）のＩＬＳ％についての計算は、調査終了時（８３日目）におけるこのグループの５０％超の生存率により、８３日の中央値死亡日と想定される。
【図５】個々の動物についての死亡までの日数を示している。生存率データは、ＭＶ４−１１腫瘍細胞が静脈内に注入されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスについてである。マウスは、腫瘍細胞注入後１７日目から調査の終了（８３日目）まで、一日２回ＰＯで、ビヒクルまたは様々な用量のＶＩＩで処理された。犠牲にされた動物についての死亡までの日数が、グラフ中で、青い線で表示された中央値死亡日で示されている。調査終了時の各グループにおける生存動物は、グラフの頂部に、生存動物数／総マウス数として示されている。
【図６Ａ】検死時にＭＶ４−１１腫瘍を保有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍の頻度を示している。病気の重症度は、犠牲の理由とは無関係に、終了時の検死の時に触診可能な腫瘍を有するマウスの頻度を定量化することによって評価された。
【図６Ｂ】検死時にＭＶ４−１１腫瘍を保有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍の頻度を示している。１グループあたりの腫瘍の総数が、図６Ｂに示されている。マウスは、５百万または１千万ＭＶ４−１１ヒトＡＭＬ細胞（それぞれ５Ｅ６または１０Ｅ６として示されている）でｉ．ｖ．接種された。細胞注入後１７日目に、マウスは、犠牲にされるまで、または調査の間中ずっと、生存動物については８３日目まで、ビヒクルまたは４０ｍｇ／ｋｇ  ＶＩＩ（ＰＯ．ｂｉｄ）で処理された。マウスは犠牲にされ、包括的検死が実施された。グループあたり実施された検死の総数は、８〜１３匹であった。
【図７】実験動物の腫瘍分布プロフィールを示している。様々な解剖学的位置に見られた総腫瘍のパーセントが、犠牲時の検死の時に記録された。マウスは、５百万または１千万ＭＶ４−１１細胞がｉ．ｖ，注入され、調査の間中ずっと、一日２回ビヒクルまたは４０ｍｇ／ｋｇ  ＶＩＩのどちらかが経口投与された。触診可能な腫瘍は検出されなかったが、拡張された唾液腺を示す動物がグラフに含まれている。グループあたり実施された検死の総数は、８〜１３匹であった。
【図８】ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄（ＢＭ）および末梢血（ＰＢ）におけるＭＶ４−１１腫瘍細胞の植付けプロフィールを示している。データは、腫瘍細胞ｉ．ｖ．注入後１７日目から調査の終了まで、一日２回ＰＯで、ビヒクルまたは４０ｍｇ／ｋｇ  ＶＩＩで処理されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるＭＶ４−１１ヒト腫瘍細胞の植付けからのものである。骨髄（ＢＭ）および末梢血（ＰＢ）腫瘍細胞植付けは、ＭＶ４−１１腫瘍細胞の検出のためにＣＤ３３およびＨＬＡ細胞表面染色を用いて、フローサイトメトリック分析によって検出された。データは標準化され、総細胞からのパーセントヒト腫瘍細胞が計算された。総細胞は、ヒトＣＤ３３＋ＨＬＡ＋陽性事象およびネズミＣＤ４５陽性染色事象の数として規定された。グラフはすべての試料を含む。
【図９】免疫沈降およびウェスタンブロット分析によるＭＶ４−１１異種移植片におけるＦｌｔ−３の検出を示している。図Ａは、ブロットの左側で抗ホスホチロシン抗体およびブロットの右側で抗−ホスホ−Ｆｌｔ−３特異的抗体を用いて、ＶＩＩまたはビヒクルの最終投与の約２時間後、マウスからのＭＶ４−１１腫瘍溶解物におけるリン酸化Ｆｌｔ−３の検出である。加えて、総Ｆｌｔ−３レベルについてのブロットのリプローブは、図Ｂに示されている。
【図１０】ＭＶ４−１１腫瘍異種移植片のリン酸化ヒストンＨ３分析を示している。増殖は、腫瘍細胞増殖についてのマーカーとして、ヒト特異的リン酸化ヒストンＨ３（ｐｈＨ３）の免疫組織化学染色を用いて、この調査から無作為に選択された３匹のマウスからのホルマリン固定腫瘍切片においてエキソビボで評価された。ヒトｐｈＨ３発現は、腫瘍切片において、ＶＩＩでの処理後に用量依存的に低下した。ビヒクル処理マウスからのＭＶ４−１１腫瘍異種移植片と比較したとき、２０および４０ｍｇ／ｋｇ  ＶＩＩでの処理は結果として、それぞれｐｈＨ３染色の５３％および７１％阻害を生じた。これらのデータは、ＶＩＩ媒介阻害が、インビボのＭＶ４−１１腫瘍の増殖能力を低下させ、このことは、この調査の生存中部分の間に観察された腫瘍容積の低下と相関関係があることを示している。低下した増殖は、低下した構成的Ｆｌｔ−３リン酸化によるものである可能性があるが、それは、この活性がインビトロでのＭＶ４−１１細胞の生存に必要とされることが証明されているからである。
【図１１】一日２回２６日間経口処理されたＭＶ４−１１腫瘍保有マウスからの腫瘍切片における、ｐＥｒｋ１／２およびｐＳｔａｔ５についての免疫組織化学染色を図解している代表的なデータを示している。腫瘍は、ビヒクルまたは４０ｍｇ／ｋｇ  ＶＩＩの最終投与の約２時間後にマウスから採集された。
【図１２】アネキシンＶおよびＰＩ染色によって決定された、アポトーシスの誘発における、１ｕＭ  ＶＩでのＡＭＬ細胞または３２Ｄトランスフェクタントの処理の効果を示している。