【手続補正書】
【提出日】平成23年3月18日(2011.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
敗血症を処置するために他のアプローチが提案されており、例えば抗ＩＬ-８抗体(米国特許出願第2003021783A号)、抗ＩＬ-１８抗体(米国特許第20030008822A号)、抗Ｃ５ａ抗体及びＣ末端切断Ｃ５ａペプチド(米国特許第20020165138A号)、ケモカイン類及びケモカイン断片(米国特許第20020155094A号)、プロテインＣとＢＰＩ抗体の併用(米国特許第20020044929A号)、ＣＯＸ-２インヒビター(米国特許第20020006915A号)、藻類のリポ多糖類(米国特許第6534648号)、及びＴＮＦ-αに対する抗体及び細菌性リポ多糖類(米国特許第6315999号)に対する抗体の使用等である。しかしながら、重篤な感染の処置においては、過去数十年の間にかなり進歩しているのにもかかわらず、敗血症の発生率及び敗血症による死亡率は増加し続けている。よって、感染症及びこれらの感染症に関する炎症状態を予防及び処置するための新規の方法及び組成物を提供することが所望されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
ＣＤ６生成物の定義
ＣＤ６レセプターは、胸腺細胞、成熟Ｔ細胞、及びＢ１ａ Ｂ細胞サブセットの膜で発現するリンパ系に特異的な表面糖タンパク質であるが、脳のある種の領域におけるＣＤ６発現も報告されている。ＣＤ６レセプターは、ＳＲＣＲと称されるシステインリッチ細胞外ドメインの一又はいくつかの繰り返しの存在により特徴付けられるＳＲＣＲサブファミリーに属する(M.R. Sarriasら, 「The Scavenger Receptor Cysteine-Rich (SRCR) domain: an ancient and highly conserved protein module of the innate immune system」, Crit. Rev. Immunol. 2004, vol. 24, pp. 1-37を参照)。その細胞外領域は、専ら、３つの連続したＳＲＣＲドメインからなる。機能上、それは、Ｔ(ＴＣＲ／ＣＤ３)及びＢ(ＢＣＲ)細胞に存在する抗原特異性レセプター複合体に物理的に結合し、そこでＣＤ６は、そのレセプター複合体により送達される活性化及び分化シグナルの正又は負の調節に寄与している。ＣＤ６がその天然リガンドＡＬＣＡＭに結合すること(「Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule」、CD166としても既知) (Bowenら, 「Adhesion Molecules, Their Receptors, and Their Regulation: Analysis of CD6-Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule (ALCAM/CD166) Interactions」, Transplantation Proceedings, 31, 795-796を参照)、Ｉｇスーパーファミリーの広範囲に発現する接着分子であることは十分に認められている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
【図１】図１は、グラム陽性及びグラム陰性菌へのｒｓＣＤ６の結合性を示す。Ａ)ストレプトアビジン-ＨＲＰを用いた、アフィニティー精製されビオチン標識されたタンパク質のウエスタンブロット分析。Ｂ)大腸菌及び黄色ブドウ球菌へのビオチン化タンパク質(ＢＳＡ、ｒｓＣＤ５、ｒＳｐα及びｒｓＣＤ６)の結合性。Ｃ)大腸菌又は黄色ブドウ球菌へのビオチン標識ｒｓＣＤ６及びｒＳｐαの結合のカルシウム依存性。ＴＰＡは「付加された全タンパク質」を意味する。Ｄ)増加した濃度のＬＰＳ又はＬＴＡの存在下における大腸菌及び黄色ブドウ球菌へのｒｓＣＤ６-ビオチンの競合結合アッセイ。Ｃは「競合体」を意味する。
【図２】図２は、ヒト血清からアフィニティー精製された循環ＣＤ６の特徴付けを示す。Ａ)ヒト血清からのアフィニティー精製されたｎｓＣＤ６のクーマシーブルー染色。Ｂ)ビオチン標識され精製されたｎｓＣＤ６及びｒｓＣＤ６タンパク質、及びストレプトアビジン-ＨＲＰを用いた、表面ビオチン化ＨＵＴ-７８Ｔ細胞から免疫沈降された膜ＣＤ６のウエスタンブロット分析。Ｃ)ＣＤ６の細胞外領域に対して特異的なウサギポリクローナル抗血清を用いた、Ｂ)と同様のビオチン標識タンパク質のウエスタンブロット分析。Ｄ)Ｋ６５２及びＲａｊｉ細胞と、ビオチン標識ｒｓＣＤ５、ｒｓＣＤ６、ｎｓＣＤ６又はＢＳＡとの反応性のフローサイトメトリー分析。結合したタンパク質はストレプトアビジン-トリカラーを用いて検出された。Ｆ.Ｉ.は「蛍光強度」を意味し、Ｃ.Ｎ.は「細胞数」を意味する。
【図３】図３は、ＬＰＳへのｒｓＣＤ６の結合性を示す。Ａ)ＬＰＳへのアフィニティー精製ｎｓＣＤ６及びｒｓＣＤ６の直接結合性を示すＥＬＩＳＡ。大腸菌から精製されたＬＰＳで、９６-ウェルマイクロタイタープレートをコーティングした。ついで、いくつかの濃度のビオチン標識ｒｓＣＤ６、ｎｓＣＤ６又はＢＳＡがウェルに添加され、結合したタンパク質がストレプトアビジン-ＨＲＰを用いて検出された。Ｒｅ-ＬＰＳへのｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５の結合性は、ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳ蛍光特性おける変化によりモニターされた。Ｐ.ａ.は「添加したタンパク質」を意味する。Ｂ)ｒｓＣＤ５ではなく、ｒｓＣＤ６は、ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳへの結合時、蛍光異方性(「Ａ」と称する)における大幅な増加を誘発し、それは、ｒｓＣＤ６濃度の増加を伴い増加する。Ｃ)増加した量のｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５の添加時における、５２０ｎｍでのＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳの蛍光発光強度(「Ｆ」と称する)の純変化。直角双曲線に対して適合させた飽和曲線から算出した、ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳ／ｓＣＤ６複合体に対する見かけＫｄは、２．６９±０．３２×１０−８Ｍであった。
【図４】図４は、細胞表面ＣＤ６への大腸菌由来のＬＰＳの結合性を示す。Ａ)親及びＣＤ６.ｗｔ-形質移入２Ｇ５細胞への、増加した量のＬＰＳ-ＦＩＴＣ(０、１０、２０μｇ)の直接結合性を示すフローサイトメトリー分析。Ｃ.Ｎ.は「細胞数」を意味し、Ｆ.Ｉ.は「蛍光強度」を意味する。Ｂ)比較を簡単にするために、Ａ)の平均蛍光強度は、各細胞系に添加されたＬＰＳ-ＦＩＴＣの量に対してプロットされた。Ｇ.Ｍ.は「幾何平均(Geo Mean)」を意味する。Ｃ)２Ｇ５-ＣＤ６.ｗｔ形質移入体へのＬＰＳ-ＦＩＴＣ結合性の競合実験。増加した量(０、１０、２０μｇ)のｒｓＣＤ６の存在下、１５μｇのＦＩＴＣ-ＬＰＳ(左)又は１５μｇのｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５(右)のいずれかと共に、細胞をインキュベートした。蛍光強度はフローサイトメトリーにより分析した。
【図５】図５は、ｒｓＣＤ６が細菌凝集を誘発することを示している。Ａ)ＦＩＴＣ標識された大腸菌及び黄色ブドウ球菌の懸濁液は、５ｍＭのＣａ２＋の存在下、ｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５(２μＭ)と共に、室温(ＲＴ)で一晩インキュベートされた。それぞれ正及び負のコントロールとして、等モル濃度のｒＳｐα及びＨＳＡが使用された。蛍光顕微鏡における直接調査により、凝集が観察された。Ｂ)増加した濃度のｒｓＣＤ６の不在下(●)及び存在下における、Ｃａ２＋依存性Ｒｅ-ＬＰＳ凝集の動態。Ｒｅ-ＬＰＳ、カルシウム及びＥＤＴＡの最終濃度は、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、２．５ｍＭ及び５ｍＭであった。ｒｓＣＤ６の最終濃度は、０．２５(○)、０．５０(△)、１．０(●)、２．０(□)μｇ／ｍｌであった。２つ実施したうちの一つの代表的実験を示す。時間はＴ(分)として示す。
【図６】図６は、ＬＰＳにより誘発される敗血症性ショック後のサイトカイン血清レベル、及び生存率におけるｒｓＣＤ６及びｒｓＣＤ５の効果を示す。Ａ)生存(Ｓ)グラフ。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス(８週)は、滅菌生理食塩水(「Ｓ」と称する)(ｎ＝２６)又はｒｓＣＤ５(ｎ＝１０)又はｒｓＣＤ６(ｎ＝１６)(各２５μｇ)のいずれかを腹腔投与した１時間後、大腸菌０１１１：Ｂ４からの致死量(３０ｍｇ／ｋｇ)もＬＰＳが腹腔に注射された。生存しているマウスの割合は、グラッドパス・プリズム(Gradpath prism)４．０を使用して解析され、ｌｏｇ順位ｔ検定Ｐ値が算出された。Ｂ)ＬＰＳが投与されたマウスにおけるサイトカインの循環レベル。ＴＮＦ-α、ＩＬ-１β及びＩＬ-６の血漿レベルが、ＬＰＳ注入後、異なる時間でのＥＬＩＳＡにより定量された。データは平均±ＳＥＭとして表される。結果における統計学的差異は、両側スチューデントｔ検定により評価された。★、統計学的に有意な差(Ｐ＜０．０５)。時間はＴ(min)として示す。
【図７】図７は、酵母(出芽酵母：Saccharomices cerevisae)から抽出されたザイモサンへのｒｓＣＤ６の結合性を示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果において、Ａは「吸光度」、Ｚは「ザイモサン」、Ｐは黄色ブドウ球菌から精製された「ペプチドグリカン」を意味する。大腸菌(E. coli)株Ｏ１１１：Ｂ４から精製されたＬＰＳ及びＢＳＡは、正及び負のコントロールである。
【図８】図８は、ＨＩＶ表面タンパク質ｇｐ１２０に結合する、ｒｓＣＤ６の結合性を示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果。
【図９】図９は、ヒトサイトメガロウイルス粒子に結合する、ｒｓＣＤ６の結合性を示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
実施例８：ｒｓＣＤ６はヒトサイトメガロウイルス粒子に結合する
１マイクログラムのポリクローナル抗ＣＭＶ抗体(BiosPacific, Emeryville, CA, USA)を使用し、４℃で一晩、ＰＢＳ中で、９６ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)をコーティングした。室温で１時間、３％のＢＳＡを含むＰＢＳを添加することにより、ウェルへの非特異的結合を防止した。ついで、１マイクログラムのＣＭＶ粒子の懸濁液(ABI Advanced Biotechnologies, Maryland, USA)をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ついで、種々の濃度のｒｓＣＤ６タンパク質をウェルに添加し、室温で３時間インキュベートした。室温で１時間、１：２００希釈のビオチン標識ｍＡｂ抗ＣＤ６(ＭＡＥ)、続いて１：１０００希釈のＨＲＰ標識ストレプトアビジン(DAKO, Glostrup, Denmark)を添加することにより、結合したタンパク質を検出し、これを室温で３０分インキュベートした。各インキュベート工程の間、未結合のタンパク質又はＨＲＰ-ストレプトアビジンを、０．０１％のトゥイーン-２０が添加されたＰＢＳで３回洗浄した。３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン液状基質(Sigma)を添加することにより発色させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。同様の結果のアッセイを３回繰り返した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
図９に表された結果には、ｒｓＣＤ６が、用量に依存する形で、ＣＭＶ粒子に結合したことが示されている。抗体でコーティングされたウェルに対するＣＤ６の非特異的結合のバックグラウンドは差し引いた。これらの結果には、ｒｓＣＤがヒトサイトメガロウイルスの表面に結合可能であることが示唆されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
実施例９：ｒｓＣＤ６はＨＩＶ表面タンパク質ｇｐ１２０に結合する
ｒｓＣＤ６を発現する細胞形質移入体からの１００μlの血清フリー培養上清を使用し、４℃で一晩(o/n)、９６-ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Denmark)をコーティングした。室温で１時間、３％のＢＳＡを含むＰＢＳを添加することにより、ウェルへの非特異的結合を防止した。ついで、種々の濃度の、ＨＩＶ由来の組換えｇｐ１２０タンパク質(Immunodiagnostics, through the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Germantown, Maryland, USA)をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。室温で１時間、２％の熱不活化ヒト血清に５００ｎｇの抗ｇｐ１２０ｍＡｂ(ｈｍ Ａｂ ２Ｇ１２、免疫診断)、ついで１：２００希釈のＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体(DAKO, Glostrup, Denmark)を添加することにより、結合したタンパク質を検出し、これを室温で３０分インキュベートした。各インキュベート工程の間、未結合のタンパク質又はＨＲＰ-ストレプトアビジンを、０．０１％のトゥイーン-２０が添加されたＰＢＳで３回洗浄した。３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン液状基質(Sigma)を添加することにより発色させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。同様の結果のアッセイを３回繰り返した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
図８に表された結果には、ｒｇｐ１２０が、用量に依存する形で、ｒｓＣＤ６に結合したことが示されている。ウェルにおけるブロック用バッファーへのｒｓｇｐの非特異的結合バックグラウンドは差し引いた。これらの結果には、ｒｓＣＤ６が、ヒト免疫不全ウイルスの主要な外部タンパク質のｒｇｐ１２０に結合可能であることが示唆されている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む哺乳動物における、感染症、又は感染症に関連した炎症状態、又は感染病原体からの誘導産物の存在に関連した炎症性疾患を治療的及び／又は予防的に処置するための医薬であって、ＣＤ６生成物を含有してなる医薬。
【請求項２】
感染症が微生物感染である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
微生物感染が、細菌感染、寄生虫感染、ウイルス感染、真菌感染、及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
感染症が敗血症である請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
敗血症が、菌血症、ウイルス血症、真菌血症、寄生虫血症及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
感染病原体が、細菌、寄生虫、ウイルス、真菌、及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
炎症状態が全身性炎症反応症候群である請求項１に記載の医薬。
【請求項８】
炎症状態が敗血症である請求項１に記載の医薬。
【請求項９】
敗血症が重症敗血症である請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
重症敗血症が敗血症性ショックである請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
ＣＤ６生成物が組換えＣＤ６である請求項１から１０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
ＣＤ６生成物がヒトＣＤ６生成物である請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
ＣＤ６生成物が配列番号：１のアミノ酸配列を含有する請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
ＣＤ６生成物がマウスＣＤ６生成物である請求項１１に記載の医薬。