【手続補正書】
【提出日】平成23年10月6日(2011.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
発明の要旨
一態様によると、ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；ｂ）配列番号１のアミノ酸配列の断片からなるポリペプチドであって、ここで、断片は、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含む、ポリペプチド；ならびにｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、そのポリペプチドは、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含み、かつヒトＣＤ４７に結合する、ポリペプチド；からなる群から選択される単離されたポリペプチドが提供される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【図１】図１は、ＮＯＤ系統バックグラウンドにおけるインビボおよびインビトロでのヒト造血の支援を示している。（ａ）ヒトＢＭ細胞（上パネル；細胞用量：ＲＡＧ−２ノックアウト系統４０×１０６個の単核細胞、ＳＣＩＤおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス２０×１０６個の細胞）またはヒトＣＢ細胞（下パネル、１５×１０６個の単核細胞／レシピエント）による移植後４週間のマウスのＢＭから抽出されたＤＮＡのサザンブロット解析。サンプルレーンにおける２．７ｋｂのα−サテライトバンド（矢印）の強度をコントロールヒト／マウスＤＮＡ混合物と比較することによって、ヒト細胞の生着のレベルを測定した。（ｂ、ｃ）照射マウスＢＭ間質におけるヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞のキメラＬＴＣにおいて生成されたＣＦＣの数。記載されるようなＮＯＤ、ＮＯＲ、Ｂ６、ＩＣＲ、Ｃ３ＨおよびＢＡＬＢ／ｃ雄マウス由来のＢＭ細胞を５週間にわたって培養した後、照射し、続いて１．１×１０５（ｂ）または０．６〜６．０×１０５（ｃ）個のＬｉｎ−ＣＢ細胞で接種した。培養後５週間で細胞を回収し、ＣＦＣの総数を標準的なクローン原性メチルセルロースアッセイにおいて測定した。データは、３〜６回の独立した実験の平均値として示されている。
【図２】図２は、インビトロおよびインビボにおけるヒト造血性生着の支援に対するＩｄｄ１３遺伝子座における系統特異的差異の作用を示している。（ａ）ＮＯＤコンジェニックマウス（ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ４、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ５、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ９、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３）、ＮＯＲコンジェニックマウス（ＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３）およびＢ６．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３マウス由来のマウス間質におけるヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞のキメラＬＴＣにおけるＣＦＣの生成。図１ｂに記載されているようにマウスＢＭ間質層を樹立し、０．３６〜２．０×１０５個のヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞とともに播種した。培養の５週間後、細胞を回収し、メチルセルロースアッセイにおいてプレーティングすることによってＣＦＣの数を測定した。各実験において、ＮＯＤ間質をポジティブコントロールとして使用し、Ｂ６およびＮＯＲストローマ細胞をネガティブコントロールとして使用した。データは、ＮＯＤ培養物において生成されたＣＦＣの数（＝１００％）に対して正規化され、少なくとも３回の独立した培養の平均値として示される。ＢＢ、Ｉｄｄ１３ホモ接合Ｂ６  ＢＭ間質；ＮＮ、Ｉｄｄ１３遺伝子型ホモ接合ＮＯＤ  ＢＭ間質。（ｂ）８〜９週齢のＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（ｎ＝１１）またはＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８）に３５０ｃＧｙを照射し、０．３７〜１．５×１０５個のＬｉｎ−ＣＤ３４＋細胞）を静脈内注射した。移植の６〜７週間後、マウスを屠殺し、フローサイトメトリによってヒトＣＤ４５＋細胞の生着についてレシピエントのＢＭを評価した。
【図３】図３は、ヒト造血の支援に関連するＩｄｄ１３の重大な領域の同定を示している。（ａ）ＮＯＤバックグラウンドおよびＮＯＲバックグラウンドの両方における様々なコンジェニック系統における２番染色体の図示。染色体の表示の右の縞のあるバーによって、候補間隔の遺伝的マッピングが表示されている。正式なコンジェニック系統の名称は、以下のとおりである：１．ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｍｉｔ４５２、２．ＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｊｙｈ１４９３、３．ＮＯＲ．ＢＮ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｊｙｈ１４９３、４．ＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｄ１Ｎｇｕｌ４６−Ｒａｍｐ１／Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｊｙｈ１１９２、５．ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｇｕｌ４８２、６．ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｄ２Ｊｙｈ４４３−Ｄ２Ｊｙｈ３９４１、７．ＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｄ１Ｎｇｕｌ４６−Ｒａｍｐ１／Ｄ２Ｇｕｌｌ８８−Ｄ２Ｊｙｈ１４９３、８．ＮＯＲ．ＢＮ−Ｄ２Ｊｙｈ７６７−Ｆｌｉｚ１。（ｂ）ａにおいて表されたＮＯＤまたはＮＯＲ  Ｉｄｄ１３サブコンジェニックマウス由来のマウス間質におけるヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞のキメラＬＴＣにおけるＣＦＣの生成。培養が行われ、データは、図２ａにおけるように表現される。系統の名称は、ａに記載されるとおりである。
【図４】図４は、ＳＩＲＰαのタンパク質配列アラインメントを示している。ＢＭ由来マクロファージから調製されたｃＤＮＡを、ＮＯＤおよびＮＯＲマウス由来のＳｉｒｐα転写物のＰＣＲ増幅に対する鋳型として使用した。Ｂ６マウス配列は、ＥｎｓＥＭＢＬデータベースからのものである。タンパク質ドメインは、白四角によって示されている。
【図５】図５は、ＮＯＤ、ＮＯＲおよびコンジェニックＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３マウス系統のＢＭ由来マクロファージにおけるＳＩＲＰαの免疫ブロット解析を示している。（ａ）処理されていないか、またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理された、ＢＭ由来マクロファージから調製された溶解産物を、ＳＩＲＰαの細胞質ドメイン、または充填コントロールとしてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対するポリクローナル抗体を用いる免疫ブロット解析に供した。（ｂ）ＢＭ由来マクロファージから調製された溶解産物を３７℃において、１２時間にわたってＮ−グリコシダーゼＦの非存在下（−）または存在下（＋）においてインキュベートし、次いで、ＳＩＲＰαの細胞質ドメインに対するポリクローナル抗体を用いる免疫ブロット解析に供した。Ｎ−グリコシダーゼＦで処理したサンプルおよび処理していないサンプルを同時に電気泳動した。分子サイズの規格は、キロダルトン（ｋＤ）で示されている。
【図６】図６は、ヒト造血のマウスマクロファージ媒介性抑制のＳｉｒｐα調節を示している。（ａ）ＬＴＣにおけるヒト造血のマクロファージ媒介性抑制。ＭＳ−５細胞を９６ウェル組織培養プレート上に播種した（２０００細胞／ウェル）。ＮＯＤ、ＮＯＲおよびＮＯＲ．ＮＯＤ−Ｉｄｄ１３ヘテロ接合マウスから回収された腹腔マクロファージを２００〜２０，０００細胞／ウェルの用量で播種し（５反復／用量）、翌日、２０００個のヒトＬｉｎ−ＣＢ細胞／ウェルを加えた。培養の３〜４週間後、細胞を回収し、メチルセルロースアッセイにおいてプレーティングすることによって、ヒトＣＦＣの数を測定した。エラーバーは、標準偏差を表している。（ｂ）コントロールウイルス（ＣＥＰ）またはＮＯＤ由来Ｓｉｒｐαを発現しているウイルス（ＳＩＲＰ）による感染前および感染後のＪｕｒｋａｔ細胞およびＮＯＲ  ＢＭ由来マクロファージにおけるＳＩＲＰα発現を示しているウエスタンブロット解析。タンパク質溶解産物を、ＳＩＲＰαに対するポリクローナル抗体で免疫ブロットした。レーン１：Ｊｕｒｋａｔ細胞；レーン２：ＣＥＰで感染されたＪｕｒｋａｔ細胞；レーン３：ＳＩＲＰで感染されたＪｕｒｋａｔ細胞；レーン４：ＮＯＲマクロファージ；レーン５：ＳＩＲＰで感染されたＮＯＲマクロファージ；レーン６：ＮＯＤマクロファージ。ＳＩＲＰレンチウイルスによる感染は、ＮＯＲマクロファージにおいてＮＯＤ  ＳＩＲＰαの高レベル発現をもたらした（レーン５）。（ｃ）ヒト造血のマクロファージ媒介性抑制に対するＳｉｒｐαの作用。ＮＯＲ  ＢＭ由来マクロファージにコントロールレンチウイルス（ＮＯＲ−ＣＥＰ）またはＮＯＤ由来Ｓｉｒｐα遺伝子を発現しているレンチウイルス（ＮＯＲ−ＮＯＤ  ＳＩＲＰ）を感染させた後、２０〜２０，０００細胞／ウェルの用量で（５反復／用量）、樹立されたＭＳ−５間質培養物上に播種した。翌日、２０００個のＬｉｎ−ＣＢ細胞／ウェルを加え、３．５週間後の培養物中の生成されたヒトＣＦＣを記載されるようにアッセイした。ＮＯＲ−ＮＯＤ  ＳＩＲＰウェルにおけるヒト造血の支援は、ＮＯＲ−ＣＥＰウェルよりも有意に良好だった（２０細胞／ウェルにおいてＰ＝０．０３２；２０００および２０，０００細胞／ウェルにおいてＰ＝０．００８）。エラーバーは、標準偏差を表している。
【図７】図７は、ＮＯＤ  ＳＩＲＰαによる、ヒトＣＤ４７に対する高い異種間反応性の付与を示している。（ａ〜ｄ）ＮＯＤおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３コンジェニックマウスのＢＭ由来マクロファージ上のマウスＳＩＲＰαに結合するヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）のフローサイトメトリ解析。（ａ）ＣＤ１１ｂ発現のヒストグラム；水平バーは、ＣＤ１１ｂ＋ゲートを示している。ｂ〜ｄにおけるプロットは、ＣＤ１１ｂについてゲーティングされている。（ｂ）ＳＩＲＰαおよびｈＣＤ４７−Ｆｃ染色を示す２次元等高線図。（ｃ）アイソタイプコントロール（黒色）と比較したＳＩＲＰα発現（灰色）のヒストグラム。（ｄ）ヒトＩｇＧ−Ｆｃコントロール（黒色）とオーバーレイされたｈＣＤ４７−Ｆｃ染色（灰色）のヒストグラム。（ｅ）ｈＣＤ４７−ＦｃによるマウスＳＩＲＰαの免疫沈降。ＮＯＤ、ＮＯＲおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３コンジェニックマウスのＢＭ由来マクロファージからのタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて電気泳動し、ポリクローナル抗ＳＩＲＰα抗体を用いて免疫ブロットした。各パネルは、全溶解産物、コントロールヒトＩｇＧ−Ｆｃタンパク質との免疫沈降物（ＩＰ  ｈＦｃ）およびｈＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質との免疫沈降物（ＩＰ  ｈＣＤ４７−Ｆｃ）を表している。上パネルは、ＮＯＤおよびＮＯＲ抽出物を比較しており、下パネルは、ＮＯＤおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３（Ｉｄｄ１３ｃｇ）抽出物を比較している。
【図８】図８は、マウスおよびヒトのＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインのタンパク質配列アラインメントを示している。（ａ）ＢＭマクロファージから調製されたｃＤＮＡをＮＯＤおよびＮＯＲマウス由来のＳｉｒｐα転写物のＰＣＲ増幅に対する鋳型として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）、ＢＡＬＢ／ｃおよび１２９／Ｓｖ配列をＥｎｓＥＭＢＬおよびＮＣＢＩデータベースから入手した。白四角は、ＳＩＲＰαのＸ線結晶構造において同定されたｂ−プリーツシートを表しており、Ｉｇ重鎖可変領域における類似領域に対応する。マウス系統間で異なるアミノ酸に影をつけた。Ｂ６を親配列として使用した。（ｂ）ＩｇＶドメインを含むＳＩＲＰαのエキソン３を、ヒトＨａｐＭａｌ第１期リリース（ｐｈａｓｅ  １  ｒｅｌｅａｓｅ）からの３７個体のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。白四角で囲まれた領域および影がつけられたアミノ酸は、（ａ）におけるものと同じ特徴を表しており、Ｖ１は、親配列として機能する。種間のオルソロガス位置に＊と標識された残基は、ＮＯＤと他の系統との間およびヒト間で多型である。＋と標識された残基は、ヒトにおいて多型であり、タンパク質の「上部」の溶媒に露出した表面（ＣＤ４７が結合すると予測される）上に存在する。
【図９】図９は、示されるヒトＨａｐＭａｐサンプル（表の左側）の各々からＰＣＲ増幅されたＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインの独立した配列決定による、３つのＳＮＰアッセイの識別力の確認を示している。
【図１０】図１０は、細胞外ＩｇＶ様ループ、５回膜貫通領域および短い細胞質テイルを含むＣＤ４７タンパク質を示している。
【図１１】図１１は、（ａ）ｍＣＤ４７−Ｆｃおよび異なるプラスミド骨格（ｐｃＤＮＡおよびｐＩＡＰ３６９）を用いて調製された２つのｈＣＤ４７−Ｆｃ構築物でトランスフェクトされた培養細胞の上清におけるタンパク質生成を表しているヒストグラム、および（ｂ）培養上清からの精製後の融合タンパク質を表しているＳＤＳ−ＰＡＧＥの免疫ブロットを示している。
【図１２Ａ】図１２は、（ａ）ｍＣＤ４７−Ｆｃを含むｐＩＡＰ３６９プラスミド構築物へのＫｏｚａｋ配列の導入、および（ｂ）ｐＩＡＰ３６９プラスミドに挿入された配列ｈＣＤ４７−Ｆｃを示しており、Ｋｏｚａｋコンセンサス、ｈＣＤ４７断片、リンカーおよびＦｃを示している。
【図１２Ｂ】図１２は、（ａ）ｍＣＤ４７−Ｆｃを含むｐＩＡＰ３６９プラスミド構築物へのＫｏｚａｋ配列の導入、および（ｂ）ｐＩＡＰ３６９プラスミドに挿入された配列ｈＣＤ４７−Ｆｃを示しており、Ｋｏｚａｋコンセンサス、ｈＣＤ４７断片、リンカーおよびＦｃを示している。
【図１３】図１３は、（ａ）Ｋｏｚａｋ含有プラスミドでトランスフェクトされた細胞の上清においてアッセイされたマウスおよびヒトＣＤ４７−Ｆｃの生成、ならびに（ｂ）プロテインＧ精製ＣＤ４７−Ｆｃタンパク質と反応する抗ヒトＦｃ抗体を示している免疫ブロットを示している。
【図１４】図１４は、ＳＩＲＰαのＮＯＤおよびＮＯＲマウスバージョンに対するｈＣＤ４７−ＦｃおよびｍＣＤ４７−Ｆｃ（図示せず）の結合親和性を定量化するために設計されたアッセイを示している。
【図１５Ａ】図１５は、（ａ）ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するｍＣＤ４７の結合の結果；および（ｂ）ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するｈＣＤ４７の結合の結果を示している。
【図１５Ｂ】図１５は、（ａ）ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するｍＣＤ４７の結合の結果；および（ｂ）ＮＯＤおよびＮＯＲ  ＳＩＲＰαに対するｈＣＤ４７の結合の結果を示している。
【図１６】図１６は、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７媒介性のシグナル伝達を示している模式図である。
【図１７】図１７は、ＳＩＲＰαのヒトＨＳＣ「許容性」ＮＯＤバージョンの切断型（「ＮＯＤ−Δ−ｃｙｔｏ」）（右側）の調製を示している。
【図１８】図１８は、「空の」レンチウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージ（ＮＯＲ−ＣＥＰ「菱形」）、ウイルスで感染されていないＮＯＤマクロファージ（ＮＯＤ非感染；黒三角）、「空の」レンチウイルスで感染されたＮＯＤマクロファージ（ＮＯＤ−ＣＥＰ；丸）、完全長ＮＯＤ  ＳＩＲＰαを含むレンチウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージ（ＮＯＲ−ＳＩＲＰ；四角）および切断型ＮＯＤ  ＳＩＲＰαを含むレンチウイルスで感染されたＮＯＲマクロファージ（ＮＯＤ−Δ−ｃｙｔｏ；白三角）によるヒトＨＳＣの生存を示している。
【図１９】図１９は、ＨＳＣ生着に対するＣＤ４７融合タンパク質の作用をインビボにおいて評価する研究の模式図を示している。
【図２０】図２０は、ヒトＣＤ４７−Ｆｃ融合がＮＯＤ．ＳＣＩＤ異種移植モデルにおいてヒト造血性幹細胞の高い生着をもたらすことを示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
一態様によると、ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；ｂ）配列番号１アミノ酸配列の断片からなるポリペプチドであって、ここで、断片は、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含む、ポリペプチド；ならびにｃ）ポリペプチドにおいて７アミノ酸長ごとに最大１個のアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する、ａ）およびｂ）におけるポリペプチドのうちの１つであって、ここで、そのポリペプチドは、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６のうちの少なくとも１つを含み、かつヒトＣＤ４７に結合する、ポリペプチド；からなる群から選択される単離されたポリペプチドが提供される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
ＮＯＤマウスとＮＯＲマウスとの間のＳＩＲＰα配列変異の結果を評価するために、タンパク質溶解産物をＢＭ由来マクロファージから調製し、ＮＯＤおよびＮＯＲマウスにおいて同一の配列である細胞質ドメインに対するポリクローナル抗体を用いる免疫ブロット法によって、ＳＩＲＰα発現を調べた（図５Ａ）。ＳＩＲＰα発現の定量的な系統差は、調べた条件下において検出されなかった。ＮＯＤタンパク質の電気泳動移動度は、ＮＯＲタンパク質の電気泳動移動度よりもわずかに小さかった（図５Ａ）。ＳＩＲＰαは、グリコシル化される（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｎｉｅｕｗｅｎｈｏｆ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４，１３２１−９）ので、本発明者らは、見かけの分子量の系統差が、異なるグリコシル化を反映する可能性を調べた。ＢＭ由来マクロファージからのタンパク質溶解産物をＮ−グリコシダーゼＦで処理し、免疫ブロット法によって調べた（図５Ｂ）。Ｎ結合型グリカンを除去した後、両方の系統由来のＳＩＲＰαが、さらに速く移動し、ほぼ等しい移動度だった。これらの結果から、本発明者らがＮＯＤおよびＮＯＲタンパク質の細胞外部分において検出した広範な多型が、異なるグリコシル化をもたらすことが示唆される。したがって、ＮＯＤ系統とＮＯＲ系統との間のアミノ酸配列および翻訳後修飾の相違は、Ｓｉｒｐαが、ヒト造血の支援においてＩｄｄ１３遺伝子が付与する系統特異的な差異であることと一致する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
本発明者らがマウスの系において観察した機能的なバリエーションがヒトにおいて関連性があるか否かをさらに調査するために、本発明者らは、ヒト集団においてＳＩＲＰα多型を調べた。本発明者らは、ヒトＨａｐＭａｐゲノムプロジェクトからの無関係な３７人の正常なコーカサス人（ＣＥＵ）、アフリカ人（ＹＲＩ）、中国人（ＣＨＢ）および日本人（ＪＰＴ）の個体由来のＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインを配列決定し（図９）、そして１８個のアミノ酸における組み合わせの変異を反映する１０個の異なるＳＩＲＰα  ＩｇＶ対立遺伝子を同定した（図８ｂ）。最近報告されたＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインの高分解能Ｘ線結晶構造は、ＣＤ４７結合表面に寄与する重大な残基を予測している（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ
３６，３６４−７２）。驚くべきことに、本発明者らは、予測されたＣＤ４７結合残基においてヒト対立遺伝子変異を認めた（図８ｂ）。さらに、本発明者らは、ＮＯＤ対立遺伝子をＮＯＲ対立遺伝子（ならびに他のマウス系統；図４および図８ｂ）と識別する、ＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインの同じ小領域に密集したヒト対立遺伝子変異を認めた。ヒト多型は、本発明者らがこれらのマウス系統において観察したＳＩＲＰα  Ｎ結合型炭水化物付加の異なるパターン（図５ｂおよび図８ｂ）に寄与し得るＮＯＤとＮＯＲとの間の変異のオルソロガスな位置にも見られた（アミノ酸７２のアスパラギンに対してセリン）。まとめると、これらのデータは、実験マウスにおけるようにヒトＳＩＲＰαがＩｇＶドメインにおいて高度に多型であることを示しており、そして対立遺伝子変異体が翻訳後プロセシングおよびＣＤ４７リガンド相互作用に影響することを示唆している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
実施例１４
ＨＳＣの生着に対するＳＩＲＰα媒介性シグナル伝達の役割の評価
他の研究から、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７結合がタンパク質の各々を介して双方向シグナルを誘発すること（図１６に示される模式図によって表されている）が示唆されている。本出願人は、ＣＤ４７結合によって媒介されるＳＩＲＰαを介したシグナルがＨＳＣ生着に必要であるか否かを評価した。図１７は、重大な下流のホスファターゼＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２への連結に必要な２つの免疫チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）（左側）が故意に欠失していることによってシグナルを伝達することができない、ＳＩＲＰαのヒトＨＳＣ「許容性」ＮＯＤ型の切断型（「ＮＯＤ−Δ−ｃｙｔｏ」）（右側）の調製を示している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
ヒトＨＳＣ生存におけるＳＩＲＰα−ＣＤ４７媒介性のシグナル伝達についての必要条件を判定する長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイは、Ｔａｋｅｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７  Ｄｅｃ，８（１２）：１３１３−２３に記載されている方法を用いて行った。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるための薬物を調製する際の化合物の使用であって、化合物は：
ａ）ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインに結合することができるポリペプチド；および
ｂ）ヒトＳｉｒｐαに対する抗体
を含む、使用。
【請求項２】
Ｓｉｒｐαの細胞外ドメインに結合することができるポリペプチドが、可溶性ヒトＣＤ４７またはその断片を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ポリペプチドが、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ポリペプチドが、第２のタンパク質に融合されている、請求項２および３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
第２のタンパク質が、ＩｇＧのＦｃ部分である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
さらにマクロファージを抑制するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
ＩｇＧのＦｃ部分に融合されたＣＤ４７の細胞外ドメインを含むポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号１２４、１２５および１２６によって連続してコードされる、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項７および８のいずれか１項に記載のポリペプチドならびに薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１０】
ヒトにおける造血幹細胞の生着を増加させるための請求項７および８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項７および８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項１２】
発現調節配列に作動可能に連結された請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１３】
核酸のＫｏｚａｋコンセンサス配列をさらに含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２および１３のいずれか１項に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項１５】
ポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項１４に記載の細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドを生成する方法。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
2011500005.tif 000001