(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属菌、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）属菌、及びトルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属菌からなる群より選ばれる１の酵母から抽出された酵母エキスを含有する食品保存料であって、
前記酵母エキスは、前記酵母が産生した下記一般式（１）で表される抗菌性物質を含有し、当該抗菌性物質を別途添加したものでないことを特徴とする食品保存料。
【化１】
0005907655.tif 000007
［式中、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ２は炭素数４〜９のアルキル基であり、ｎは０又は１である。但し、一般式（１）で表される抗菌性物質は、酢酸イソアミルを除く。］
【請求項２】
前記一般式（１）において、Ｒ２が炭素数７〜９のアルキル基であることを特徴とする請求項１記載の食品保存料。
【請求項３】
前記抗菌性物質が、酢酸ｎ−オクチル、２−ノナノン、２−デカノン、又は２−ウンデカノンであることを特徴とする請求項２記載の食品保存料。
【請求項４】
前記抗菌性物質を含む気相が、胞子の発芽を阻害することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の食品保存料。
【請求項５】
前記抗菌性物質を含む気相が、酵母及び／又は細菌の生育を阻害することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の食品保存料。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の食品保存料を用いることを特徴とする、カビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載の食品保存料を用いることを特徴とする、酵母及び／又は細菌の生育を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗菌性物質、該抗菌性物質を含有する防カビ剤、食品保存料、酵母エキス、殺菌剤、該抗菌性物質を用いる、カビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法、及び酵母及び／又は細菌の生育を阻害する方法に関する。また、本発明は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属菌、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）属菌、及びトルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属菌からなる群より選ばれる１の酵母が産生する、揮発性の抗菌性物質、該抗菌性物質を含有する防カビ剤、食品保存料、酵母エキス、殺菌剤、該抗菌性物質又は該酵母を用いる、カビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法、及び酵母及び／又は細菌の生育を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による腐敗や変敗を防止し、食品の保存性を高めるため、様々な抗菌性物質が、食品保存料として用いられている。食品の保存性を向上させることにより、流通過程における食品の腐敗等が効率的に防止されるため、製造コストの改善が期待でき、また、食品の安全性上も好ましい。このため、優れた抗菌性物質の開発が望まれている。ここで、抗菌性物質は、主に、化学合成物質と、微生物等から得られた天然由来の物質とに分類できるが、食品保存料として用いる場合には、安全性の点から、天然由来の物質であることが好ましい。
【０００３】
近年、天然由来の抗菌性物質として、ナイシン等の、乳酸菌由来の様々な種類のバクテリオシンが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。バクテリオシンは、通常、ペプチド若しくはタンパク質であり、消化酵素等により容易に分解されるため、非常に安全性が高い。また、主にグラム陽性菌に対し優れた抗菌活性を有することが知られている。
【０００４】
その他、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に対し優れた抗菌活性を有する抗菌性物質を含む食品保存料の製造方法として、例えば、（１）酵母の増殖に必要な栄養素、無機塩類と炭素源としてグルコースを含む培地で酵母を定常期に達するまで増殖させた後、酵母を除去した培地に必要ならば炭素源を加え、再び定常期に達するまで増殖させる繰り返し培養を２回以上行って得られた水溶液であることを特徴とする酵母が産生する抗菌性物質を含む食品保存料の製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
また、天然由来の抗菌性物質として、カビ由来の揮発性抗菌物質も開示されている（例えば、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２５４５７３９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】園元ら、食品と開発、４１巻３号、ｐ７３〜７５、２００６年
【非特許文献２】Ｓｔｒｏｂｅｌら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４７号、ｐ２９４３〜２９５０、２００１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
グラム陽性菌等のバクテリア（細菌）のみならず、カビや酵母等の真菌も、食品の腐敗等を引き起こす。特にカビは、多くの食品の腐敗の主要な要因であることから、カビの増殖を抑制することができる抗真菌活性を有する物質を、食品保存料や抗菌剤として使用できることが好ましい。
また、空気中には種々のカビ胞子が浮遊しているため、カビ胞子の付着を完全に防ぐことは困難である。そこで、特に食品では、製造段階又は食品開封後の、食品へのカビ胞子の付着を防ぐことと同時に、喫食時点まで、付着したカビ胞子の発芽を抑制できることが好ましい。
しかしながら、ナイシン等のバクテリオシンは、一般にグラム陽性菌にのみ抗菌活性を示し、カビや酵母等の真菌の増殖を抑制することができないという問題がある。また、上記（１）の方法で得られる食品保存料は、酵母由来の抗菌性物質であるため、食品に対し安全に使用することができ、また、耐熱性も有しているが、特許文献１には、カビに対する抗菌活性については一切記載がない。
一方、非特許文献２に開示された抗菌性物質は、カビ由来であるため、食品に対して安全に使用することができるかどうかは定かではない。また、上記のように胞子の発芽を抑制することは食品等の分野において非常に重要であるにも関わらず、非特許文献２には、菌糸の成長を阻害するとの記載はあるが、胞子の発芽を阻害するかどうかについては一切記載がない。
【０００８】
本発明は、安全であり、且つ、中性においてカビや酵母等の真菌の胞子の発芽及び増殖や、酵母や細菌の生育を抑制することのできる、新規な抗菌性物質を提供することを目的とする。
また、本発明は、該抗菌性物質を含有する防カビ剤、食品保存料、酵母エキス及び殺菌剤、並びに、該抗菌性物質又は該抗菌性物質を産生する微生物を用いるカビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法及び酵母及び／又は細菌の生育を阻害する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、食品由来の微生物が産生する抗真菌性物質であれば、食品保存料としても安全に用いることができると考え、様々な種類のチーズから分離した微生物の中から、ｐＨ７．０において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）又はリゾパス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）の増殖を抑制することのできる抗真菌活性を有する微生物を見出し、さらに、該微生物が産生する抗真菌性物質、及び、同様の抗真菌活性を有する該抗真菌性物質の類縁体を見出すことにより、本発明を完成させた。
さらに、本発明者らは、該抗真菌性物質が、抗真菌活性のみならず、酵母や細菌の生育を阻害する抗菌活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下（１）〜（７）の発明を提供する。
(１)キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属菌、クラビスポラ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ）属菌、及びトルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属菌からなる群より選ばれる１の酵母から抽出された酵母エキスを含有する食品保存料であって、
前記酵母エキスは、前記酵母が産生した下記一般式（１）で表される抗菌性物質を含有し、当該抗菌性物質を別途添加したものでないことを特徴とする食品保存料。
【００１１】
【化１】
0005907655.tif 000002
［式中、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ２は炭素数４〜９のアルキル基であり、ｎは０又は１である。但し、一般式（１）で表される抗菌性物質は、酢酸イソアミルを除く。］
【００１２】
（２）前記一般式（１）において、Ｒ２が炭素数７〜９のアルキル基である前記（１）の食品保存料。
（３）前記抗菌性物質が、酢酸ｎ−オクチル、２−ノナノン、２−デカノン、又は２−ウンデカノンである前記（２）の食品保存料。
（４）前記抗菌性物質を含む気相が、胞子の発芽を阻害する前記（１）〜（３）のいずれかの食品保存料。
（５）前記抗菌性物質を含む気相が、酵母及び／又は細菌の生育を阻害する（１）〜（３）のいずれかの食品保存料。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかの食品保存料を用いることを特徴とする、カビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法。
（７）前記（１）〜（５）のいずれかの食品保存料を用いることを特徴とする、酵母及び／又は細菌の生育を阻害する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の第一の態様及び第八の態様の抗菌性物質は、効果的にカビや酵母等の真菌の胞子の発芽及び増殖を抑制することができる。
本発明の第一の態様及び第八の態様の抗菌性物質により、胞子の発芽を阻害することで、食品等の保存期間を安全に延長することができるため、製造コストの改善も期待される。また、本発明の第一の態様及び第八の態様の抗菌性物質は、揮発によりカビや酵母等の真菌の活性を抑制するため、様々な用途に用いることができる。
また、本発明の第一の態様及び第八の態様の抗菌性物質により、酵母や細菌の生育を阻害することで、食品等の保存期間を安全に延長することができるため、製造コストの改善も期待される。また、本発明の第一の態様及び第八の態様の抗菌性物質は、揮発により酵母や真菌等の菌類の生育を抑制するため、様々な用途に用いることができる。
さらに、本発明の第六の態様及び第十二の態様のカビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法により、安全かつ簡便に、カビや酵母等の真菌の増殖を抑制することができる。
本発明の第七の態様及び第十三の態様の酵母及び／又は細菌の生育を阻害する方法により、安全且つ簡便に、酵母や細菌の生育を阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例２において、Ｏ９−ＮＰ９株培養シャーレ由来の気相サンプルを、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）法により分析した結果を示した図である。
【図２】実施例３において、Ｏ９−ＮＰ９株培養シャーレ由来の気相サンプルを、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）法により分析した結果を示した図である。
【図３】実施例２において、Ｏ９−ＮＰ９株培養シャーレ由来の気相サンプルを、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）法により分画して得られたリテンションタイム４．４８分のピークを、質量分析（ＭＳ）法により分析した結果を示した図である。
【図４】実施例２において、Ｏ９−ＮＰ９株培養シャーレ由来の気相サンプルを、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）法により分画して得られたリテンションタイム７．４６分のピークを、質量分析（ＭＳ）法により分析した結果を示した図である。
【図５】実施例２において、Ｏ９−ＮＰ９株培養シャーレ由来の気相サンプルを、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）法により分画して得られたリテンションタイム２９．３２分のピークを、質量分析（ＭＳ）法により分析した結果を示した図である。
【図６】実施例５における、酢酸イソアミル及び酢酸イソアミルの酸側構造の類縁体の胞子発芽阻害最小添加量(ＭＩＤ)と、酢酸イソアミル及び酢酸イソアミルの酸側構造の類縁体の揮発量と、酢酸イソアミル及び酢酸イソアミルの酸側構造の類縁体のアルキル基（Ｒ１）の長さとを示した図である。
【図７】実施例５における、酢酸イソアミル及び酢酸イソアミルのアルコール側構造の類縁体（酢酸エステル類）の胞子発芽阻害最小添加量(ＭＩＤ)と、酢酸イソアミル及び酢酸イソアミルのアルコール側構造の類縁体（酢酸エステル類）の揮発量と、酢酸イソアミル及び酢酸イソアミルのアルコール側構造の類縁体（酢酸エステル類）のアルキル基（Ｒ２）の長さとを示した図である。
【図８】実施例５における、酢酸イソアミル類縁体（２−ケトン類）の胞子発芽阻害最小添加量(ＭＩＤ)と、酢酸イソアミル類縁体（２−ケトン類）の揮発量と、酢酸イソアミル類縁体（２−ケトン類）のアルキル基（Ｒ２）の長さとを示した図である。
【図９】実施例７における、（ａ）酢酸イソアミルに曝露せずに培養したアスペルギルス・ニガー胞子、（ｂ）酢酸イソアミルに曝露した状態で培養したアスペルギルス・ニガー胞子、（ｃ）酢酸イソアミルに曝露した後、酢酸イソアミルを除去して培養したアスペルギルス・ニガー胞子の、培養開始から０時間後、５時間後、７時間後、及び４８時間後の電子顕微鏡写真である。
【図１０】実施例８における、エスケリキア・コリ又はサッカロマイセス・セレビシエの、（ａ）培養開始時点、（ｂ）４８時間通常培養を行った後、及び（ｃ）酢酸イソアミルに曝露した状態で４８時間培養を行った後の、電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明における抗真菌活性とは、カビや酵母等の真菌の増殖を抑制する活性のうち、胞子の発芽を阻害する活性を意味する。胞子の発芽を阻害することにより、効果的にカビ等の発生及び増殖を防止することができる。
本発明における抗菌活性とは、上記抗真菌活性と、酵母等の真菌や、細菌の生育を阻害し、殺菌する活性との両方を意味する。
【００１６】
本発明の第八の態様の抗菌性物質は、食品から得られた微生物が産生するものであって、ｐＨ７．０において、抗真菌活性及び抗菌活性を有するものである。このような抗菌性物質であれば、食品等に安全に使用することができ、かつ、中性の食品等に対しても効果を発揮することができるためである。
【００１７】
本発明の抗菌性物質を産生する微生物は、例えば、各種の食品から分離した微生物の中から、ｐＨ７．０において、カビ等の増殖を抑制することができる抗菌活性を有する菌株を選択することにより得ることができる。ｐＨ７．０において抗真菌活性及び抗菌活性を有する菌株は、本発明の抗菌性物質を産生していると考えられるためである。以下、本発明の第一の態様及び第八の態様の抗菌性物質、及び該第八の態様の抗菌性物質を産生する微生物を得る方法を、さらに詳細に説明する。
【００１８】
１．抗真菌性物質を産生する微生物の取得
本発明者らは、抗真菌性物質を産生する微生物を食品中から取得するにあたり、良好な発酵食品の一つであるチーズに着目し、常法により、１４種類の市販されているチーズから微生物を分離したところ、カスピアンチーズ（イラン製）由来のＯ−９菌群中に、アスペルギルス・ニガー等の増殖を抑制する抗真菌性物質を産生する菌が存在していることを見出した。そして、アスペルギルス・ニガーを用いた抗真菌活性の測定の結果、Ｏ−９菌群には、ｐＨ７．０において抗真菌活性を有する菌、すなわち、本発明の抗真菌性物質を産生する菌が存在していることがわかった。
Ｏ−９菌群から単離された、本発明の抗真菌性物質を産生する菌として、キャンディダ・マルトーサＯ９−ＮＰ９株（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−２９７）、及びクラビスポラ・スピーシーズＰ−５株（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４７４）が同定された。また、上記と同様にして、別のロットのカスピアンチーズから、本発明の抗真菌性物質を産生する菌として、サッカロマイセス・セレビシエＨ−１株（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−４７３）が同定された。上記菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された。上記菌株の遺伝学的性質及び菌学的性質は、特開２００８−２３９６０４号公報に開示された通りである。
【００１９】
２．抗真菌性物質の形体の検討
上記１で得られた菌の産生する抗真菌性物質の形体を、キャンディダ・マルトーサＯ９−ＮＰ９株を用いて、後記実施例１に記載の方法により検討した。
この結果、コントロールでは、アスペルギルス・ニガーの増殖が観察されたが、Ｏ９−ＮＰ９株の気相と接していたサンプルでは、アスペルギルス・ニガーの胞子の発芽及び増殖は観察されなかった。したがって、Ｏ９−ＮＰ９株の産生する抗真菌性物質は、該Ｏ９−ＮＰ９株と真菌とが気相を介して接触した際に抗真菌活性を有するものであり、揮発性の抗真菌性物質であることが明らかである。
【００２０】
３．抗真菌性物質候補の同定
上記２において揮発性の抗真菌性物質を産生することが判明したＯ９−ＮＰ９株を用いて、後記実施例２及び実施例３に記載の方法により、Ｏ９−ＮＰ９株の産生する揮発性物質を同定した。
この結果、Ｏ９−ＮＰ９株が産生する抗真菌性物質候補として、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、フェネチルアルコール、及びｎ−ペンタノールが同定された。
【００２１】
４．抗真菌性物質候補の抗真菌活性の測定
上記３で得られた抗真菌性物質候補の抗真菌活性を、後記実施例４に記載の方法により検討した。
この結果から、少なくとも標準品の酢酸イソアミルは、マイクロカップに添加した２０μＬが全て揮発した際に、抗真菌活性を有することが分かった。
【００２２】
５．酢酸イソアミル類縁体の抗真菌活性の測定
酢酸イソアミル類縁体が、酢酸イソアミルと同様の抗真菌活性を有するかどうかを、後記実施例５に記載の方法により検討した。
図６〜８は、酢酸イソアミル及び／又は酢酸イソアミル類縁体の、胞子発芽阻止最小添加量と、該最小添加量における揮発量と、ケト基又はエステルに結合したアルキル基の長さとを示した図である。図６は、酢酸イソアミルの酸側構造の類縁体、図７は、酢酸イソアミルのアルコール側構造の類縁体（酢酸エステル類）、図８は、酢酸イソアミル類縁体（２−ケトン類）の結果を示す。
図６〜８及び後記実施例５に示すように、酢酸イソアミルのみならず、酢酸イソアミルの類縁体である、蟻酸イソアミル、プロピオン酸イソアミル、ｎ−酪酸イソアミル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソブチル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸２−メチルブチル、酢酸ｎ−ペンチル、酢酸ｎ−ヘキシル、酢酸ｎ−ヘプチル、酢酸ｎ−オクチル、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、５−メチル−２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、２−デカノン、及び２−ウンデカノンが、本発明の抗真菌活性を有することが明らかである。また、酢酸ｎ−オクチル、２−ノナノン、２−デカノン、及び２−ウンデカノンは、添加量が少なく、揮発量が少ない場合にも真菌の胞子の発芽及び増殖を阻害するため、本発明の抗真菌活性が高いことが明らかである。
また、これら本発明の抗真菌活性を有する酢酸イソアミル及び酢酸イソアミル類縁体の構造から、下記一般式（１）で表される化合物が、本発明の抗真菌活性を有することが分かった。
【００２３】
【化２】
0005907655.tif 000003
［式中、Ｒ１は炭素数０〜３のアルキル基であり、Ｒ２は炭素数３〜９のアルキル基であり、ｎは０又は１である。］
【００２４】
６．種々の真菌及び細菌に対する抗菌性の検討
酢酸イソアミルが、アスペルギルス・ニガーと同様に、他の真菌や細菌に対して抗菌活性を有するかどうかを、後記実施例６〜８に記載の方法により検討した。
その結果、酢酸イソアミルは、検討に用いたアスペルギルス・ニガーを含む糸状菌（カビ）１５種、酵母５種、グラム陽性細菌７種、及びグラム陰性細菌２種の全てに対して、抗菌活性を有することが分かった。
【００２５】
また、酢酸イソアミルが各種菌類に与える影響を検討すべく、酢酸イソアミルに曝露したアスペルギルス・ニガー、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びサッカロマイセス・セレビシエの形態を観察した。
その結果、アスペルギルス・ニガーでは、酢酸イソアミルに曝露下において胞子の発芽が阻害されるものの、酢酸イソアミルを除去すると胞子が発芽することから、酢酸イソアミルは胞子自体を死滅させる殺菌効果ではなく、胞子の発芽のみを阻害する静菌効果を有することが分かった。一方、エスケリキア・コリ及びサッカロマイセス・セレビシエでは、酢酸イソアミルにより細胞内構造の変化や崩壊が認められたことから、酢酸イソアミルはこれらの菌に対して細胞を死滅させる殺菌効果を有することが分かった。
さらに、蛍光ディファレンスゲル二次元電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）を用いて、通常培養のエスケリキア・コリと、酢酸イソアミルに曝露したエスケリキア・コリとのタンパク質発現量解析を行ったところ、分子量２０ｋＤａ以上、且つ、酸性の領域に多くのタンパク質スポットが検出され、それらタンパク質スポットの中には、通常培養と酢酸イソアミル曝露とで発現量の異なるタンパク質スポットが複数観察された。
【００２６】
本発明の第一の態様の抗菌性物質は、上記一般式（１）で表される抗菌性物質であって、胞子の発芽を阻害し、且つ、酵母や細菌の生育を阻害し、殺菌する抗菌性物質である。
上記式（１）中、Ｒ１は炭素数０〜３のアルキル基であり、炭素数１〜３であることが好ましい。該アルキル基は直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。
上記式（１）中、Ｒ２は炭素数３〜９のアルキル基であり、炭素数４〜９であることが好ましく、炭素数５〜９であることがより好ましく、炭素数７〜９であることがさらに好ましい。該アルキル基は直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。
また、本発明者らの検討により、上記式（１）中のケト基（Ｃ（＝Ｏ））は抗真菌活性及び抗菌活性に必須であり、ケト基を有しない同様の鎖長の炭化水素基（例えば、Ｃ８〜Ｃ１２の直鎖状又は分岐鎖状の炭化水素基）は、抗菌活性を有しないことが分かった。
【００２７】
本発明の第一の態様の抗菌性物質は、酢酸イソアミル、蟻酸イソアミル、酢酸イソアミル、プロピオン酸イソアミル、ｎ−酪酸イソアミル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソブチル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸２−メチルブチル、酢酸ｎ−ペンチル、酢酸ｎ−ヘキシル、酢酸ｎ−ヘプチル、酢酸ｎ−オクチル、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、５−メチル−２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、２−デカノン、及び２−ウンデカノンからなる群から選ばれる１種以上であることが好ましく、酢酸ｎ−オクチル、２−ノナノン、２−デカノン、又は２−ウンデカノンであることがより好ましい。
本発明の第一の態様の抗菌性物質は、揮発により胞子の発芽を阻害する。抗菌性物質を揮発させる方法は特に限定されるものではなく、該抗菌性物質を含む溶液を常温下で静置する方法や、適度な熱をかけて揮発を促進する方法等の公知の方法により行うことができる。
本発明の第一の態様の抗菌性物質は、防カビ剤や食品保存料として用いることもできる。また、本発明の第一の態様の抗菌性物質は、殺菌剤として用いることもできる。
【００２８】
本発明の第六の態様のカビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法は、本発明の第一の態様の抗菌性物質を用いる方法であって、好適にカビ及び／又は酵母の増殖を阻害できる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、該抗菌性物質を揮発させ、食品等に原料として付着させる方法や、製造された食品に噴霧し揮発させる方法等がある。また、該抗菌性物質を産生する生物（菌体、植物等）を用いて、該生物の産生した揮発性物質を、食品等に原料として付着させる方法や、製造された食品に噴霧し揮発させる方法も用いることができる。また、抗菌性物質を産生する生物が食品添加物となり得るものの場合は、該生物自体や該生物の抽出エキス（例えば酵母エキス）を食品等に原料として添加し、産生された揮発性の抗菌性物質を利用してもよい。
【００２９】
本発明の第七の態様の酵母及び／又は細菌の生育を阻害する方法は、本発明の第一の態様の抗菌性物質を用いる方法であって、好適に酵母及び／又は細菌の生育を阻害し、殺菌できる方法であれば特に限定されるものではなく、上記第六の態様と同様に行うことができる。
【００３０】
本発明の第八の態様の抗菌性物質は、キャンディダ属菌、サッカロマイセス属菌、ピキア属菌、ロドトルラ属菌、クラビスポラ属菌、及びトルラスポラ属菌からなる群より選ばれる１の酵母が産生する、胞子の発芽を阻害する揮発性の抗菌性物質である。
【００３１】
本発明の第八の態様の抗菌性物質を産生するキャンディダ属菌は、キャンディダ・マルトーサ、キャンディダ・トロピカリス、又はキャンディダ・シュードインターメディアであることが好ましく、キャンディダ・マルトーサであることが特に好ましい。該キャンディダ・マルトーサには、例えば、キャンディダ・マルトーサＯ９−ＮＰ９、キャンディダ・マルトーサＩＡＭ１２２４７、及びキャンディダ・マルトーサＩＡＭ１２２４８等がある。該キャンディダ・トロピカリスには、例えば、キャンディダ・トロピカリスＩＡＭ４９６５等がある。該キャンディダ・シュードインターメディアには、例えば、キャンディダ・シュードインターメディアＩＡＭ１２５１０等がある。
【００３２】
本発明の第八の態様の抗菌性物質を産生するピキア属菌は、ピキア・フェルメンタスであることが好ましく、ピキア・フェルメンタスＪＣＭ１８２４であることが特に好ましい。また、本発明の抗菌性物質を産生するロドトルラ属菌は、ロドトルラ・アクタであることが好ましく、ロドトルラ・アクタＪＣＭ９４９４であることが特に好ましい。また、本発明の抗菌性物質を産生するサッカロマイセス属菌は、サッカロマイセス・セレビシエであることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエＨ−１であることが特に好ましい。また、本発明の抗菌性物質を産生するクラビスポラ属菌は、クラビスポラ・ルシタニエであることが好ましく、クラビスポラ・スピーシーズＰ−５又はクラビスポラ・ルシタニエＮＢＲＣ１００５９であることが特に好ましい。また、本発明の抗菌性物質を産生するトルラスポラ属菌は、トルラスポラ・デルブレッキーであることが好ましく、トルラスポラ・デルブルッキーＮＢＲＣ０９５５であることが特に好ましい。
【００３３】
本発明の酵母、すなわち、本発明の第八の態様の抗菌性物質を産生するキャンディダ属菌、サッカロマイセス属菌、ピキア属菌、ロドトルラ属菌、クラビスポラ属菌、及びトルラスポラ属菌は、常法により培養することができ、培地や温度等の培養条件は、通常、キャンディダ属菌等の酵母を培養する条件であれば、特に限定されるものではない。該培地として、例えば、ＹＰＤ培地、ＰＤ培地、ＹＭ培地、１０％（ｗ／ｗ）スキムミルク培地等がある。本発明の抗菌性物質の活性が阻害されるおそれが少ないため、ＹＰＤ培地、ＰＤ培地、又は１０％（ｗ／ｗ）スキムミルク培地であることが好ましい。また、培養温度は、２７〜３０℃が好ましい。
【００３４】
本発明の第八の態様の抗菌性物質は、本発明の酵母を培養することにより得ることができる。例えば、本発明の酵母を培養したシャーレ等の培養容器中の気相を回収することにより、得ることができる。気相を回収する方法は、該気相中の抗菌性物質を回収できる条件であれば、特に限定されるものではないが、他の物質の混入を避けるため、密閉したシャーレ等の培養容器中からシリンジ等を用いて回収する方法や、密閉容器に多数のシャーレを入れ、真空ポンプで気相を吸引し途中に設置した吸着剤に吸着させる方法が好ましい。また、公知の方法により、回収された気相から抗菌性物質のみを濃縮することもできる。このようにして回収された気相中の抗菌性物質は、防カビ剤、食品保存料、該抗菌性物質を含有する殺菌剤等として用いることもできる。
【００３５】
また、本発明の第八の態様の抗菌性物質は、該抗菌性物質を含む酵母エキスの形態で、上記防カビ剤、食品保存料、殺菌剤等として用いることもできる。
本発明において酵母エキスとは、酵母が有する様々な成分を抽出したものであり、アミノ酸やペプチド、核酸、ミネラル等が含まれている。また、酵母の種類や培養条件、抽出条件によって、各種成分の含有比を調整することができる。
酵母エキスの抽出方法は、特に限定されるものではなく、酵母等の生物原料からエキスを抽出する際に通常用いられる方法のうち、いずれの方法を用いてもよい。該抽出方法として、例えば、自己消化法、酵素分解法等がある。ここで、自己消化法とは、酵母が本来有している酵素の働きにより、酵母を可溶化し、抽出する方法であり、遊離アミノ酸含有量の多い酵母エキスを得ることができる。一方、酵素分解法とは、熱処理等により、酵母が有する酵素等を不活性化した後、分解酵素を添加して酵母を可溶化し、抽出する方法である。外部から適当な酵素を添加することにより、酵素反応を簡便に制御し得るため、遊離アミノ酸や核酸の含有量を調整することができる。酵素分解法において用いられる酵素は、通常生体成分を分解する際に用いられる酵素であれば、特に限定されるものではなく、任意の酵素を用いることができる。該酵素として、例えば、酵母の細胞壁を分解し得る酵素、タンパク質分解酵素、核酸分解酵素等があり、これらを適宜併用することにより、酵母から各種成分を効率よく抽出することができる。
【００３６】
本発明の第八の態様の抗菌性物質が、喫食可能な食品（例えば、チーズ等）由来の酵母が産生する抗菌性物質である場合、該抗菌性物質を食品に対して安全に用いることができるのみならず、化粧品や医薬品等にも用いることができる。
また、第八の態様の抗菌性物質が、中性の食品由来の酵母、又は、中性で生存可能な酵母が産生する抗菌性物質である場合、中性の食品等においても効果的に抗菌活性を示すことができる。
【００３７】
本発明の第十三の態様のカビ及び／又は酵母の増殖を阻害する方法は、本発明の抗菌性物質又は本発明の抗菌性物質を産生する酵母を用いる方法であって、本発明の抗菌性物質の抗真菌活性及び抗菌活性が得られる方法であれば、特に限定されるものではない。本発明の抗菌性物質を用いる方法として、例えば、該抗菌性物質を産生する酵母の培養液の気相を、食品等に原料として付着させる方法や、製造された食品に噴霧して揮発させる方法等がある。また、本発明の酵母を用いる方法として、例えば、発酵性食品の製造において、原料に本発明の酵母を添加した後、発酵させる方法等がある。該発酵性食品は、加熱処理を含まない発酵性食品であることが好ましい。
【００３８】
本発明の第十四の態様の酵母及び／又は細菌の生育を阻害する方法は、本発明の抗菌性物質又は本発明の抗菌性物質を産生する酵母を用いる方法であって、本発明の抗菌物質の抗真菌活性や抗菌活性が得られる方法であれば、特に限定されるものではなく、上記第十三の態様と同様に行うことができる。
【実施例】
【００３９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
［参考例１］
アスペルギルス・ニガーの胞子懸濁液を調整した。
アスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株は、ＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）平板培地に塗布した後、２８℃で３日間培養して得られた胞子を、０．０５％ｔｗｅｅｎ８０添加生理食塩水に懸濁し、懸濁液を綿濾過後、−８０℃で凍結保存したものを用いた。該凍結保存後のアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株を、生理食塩水を用いて希釈した後、サブロー培地を用いて、１．０×１０４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー胞子懸濁液を調製した。
【００４１】
［実施例１］
キャンディダ・マルトーサＯ９−ＮＰ９株の産生する抗真菌性物質の形体を検討した。
まず、キャンディダ・マルトーサＯ９−ＮＰ９株を、ＹＰＤアガー平板培地に塗布して２８℃で４８時間培養して、キャンディダ・マルトーサＯ９−ＮＰ９株が生育しているＹＰＤアガー平板培地（以下、「酵母混釈寒天培地」という。）含有シャーレを作製した。
一方、参考例１に記載の方法で調整した１．０×１０４ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬのアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ９４５５株胞子懸濁液を混釈したＰＤＡ（ポテトデキストロースアガー）平板培地（以下、「胞子混釈寒天培地」という。）含有シャーレを作製した。
次に、酵母混釈寒天培地、及び胞子混釈寒天培地の気相同士が接触するように、それぞれのシャーレのふたを開け、胞子混釈寒天培地含有シャーレを上下逆にして、酵母混釈寒天培地含有シャーレの上に重ね合わせ、パラフィルムを用いて固定及び密閉し、２８℃で２日間培養した。コントロールとして、酵母混釈寒天培地の代わりにＰＤＡ培地のみを添加したシャーレを用いた。
この結果、コントロールでは、アスペルギルス・ニガーの増殖が観察された。一方、Ｏ９−ＮＰ９株を用いたサンプルでは、アスペルギルス・ニガーの増殖は観察されなかった。
該観察の結果から、Ｏ９−ＮＰ９株の産生する抗真菌性物質は、該Ｏ９−ＮＰ９株と真菌とが気相を介して接触した際に、真菌に対して抗真菌活性を有するものであるため、該抗真菌性物質は、揮発性であることが分かった。
【００４２】
［実施例２］
Ｏ９−ＮＰ９株由来の揮発性の抗真菌性物質を同定するために、Ｏ９−ＮＰ９株の産生する揮発性物質を同定した。
まず、塗布後に２８℃で２４時間培養した以外は、上記実施例１と同様に調整した酵母混釈寒天培地含有シャーレを作製した。また、ＹＰＤ平板培地のみを含有するシャーレを作製した。その後、上記実施例１と同様に、これらのシャーレを重ね合わせて固定し、２８℃で４８時間培養した。このとき、ＹＰＤ平板培地のみ含有するシャーレを上下逆にして固定した。
次に、重ね合わせたシャーレの間から、ＳＰＭＥファイバーアセンブリー（ＰＤＭＳ膜厚１００μｍ）を挿入し、２枚のシャーレの間の気相内の揮発性物質を該ファイバーアセンブリーに１５分間吸着させた後、該ファイバーアセンブリーを用いて、ガスクロマトグラフィ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ法）による分析を行った。
ガスクロマトグラフィ、質量分析の条件はそれぞれ以下の通りである。
[ガスクロマトグラフィ]
・カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（商品名、アジレント・テクノロジー社製、長さ３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）、
・注入口温度：２２０℃
・検出器温度：２２０℃
・オーブン温度：５０℃（５分間）〜４℃／分〜２２０℃（１２．５分間）
・キャリアガス：Ｈｅ
[質量分析]
・イオン化：ＥＩ
・イオン源温度：２３０℃
・イオン化エネルギー：７０ｅＶ
ガスクロマトグラフィによる分析の結果、図１に示すように、リテンションタイム４．４８分、７．４６分、２９．３２分において主要なピークが検出され、図３〜５に示す質量分析の結果、これらのピークは、それぞれ、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、フェネチルアルコールであった。
この結果から、Ｏ９−ＮＰ９株が、揮発性物質として、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、及びフェネチルアルコールを産生していることが分かった。
【００４３】
［実施例３］
実施例２の揮発物質の回収方法を変更し、Ｏ９−ＮＰ９株由来の揮発性の抗真菌性物質の同定を再度試みた。
まず、上記実施例２と同様に調整した酵母混釈寒天培地含有シャーレ１１枚を、球形ガラス容器内に格納し、２８℃で４８時間培養した。
次に、球形ガラス容器内の気相をシリンジで５ｍＬ吸引し、ＧＳ−ＭＳ法により分析した。ガスクロマトグラフィ、質量分析の条件は上記実施例２と同様である。
ガスクロマトグラフィによる分析の結果、図２に示すように、リテンションタイム３．０８分においてピークが検出され、質量分析の結果、このピークはｎ−ペンタノールであった。
この結果から、Ｏ９−ＮＰ９株はさらに、揮発性物質として、ｎ−ペンタノールを産生していることが分かった。
【００４４】
[実施例４]
上記実施例２及び実施例３で得られた抗真菌性物質候補の、抗真菌活性を検討した。
上記実施例１と同様に、胞子混釈寒天培地を調整し、該培地を滅菌済みの型を用いてくりぬき、胞子が混釈されたアガープラグを作製した。該アガープラグは、縦、横、高さ共に３ｍｍの立方体状とした。
次に、直径９０ｍｍのガラスシャーレ内にＰＤＡ平板培地を作製し、該ＰＤＡ培地の中心点上に、滅菌済みのマイクロカップを設置して、その中に表１に示す抗真菌性物質候補の標準品を２０〜８０μＬ添加した。また、マイクロカップの周囲に、上記アガープラグを３つ設置し、ガラスシャーレを密閉して２８℃で４８時間培養した後、アガープラグ及びアガープラグ周囲のアスペルギルス・ニガーの胞子発芽及び増殖を観察した。
【００４５】
【表１】
0005907655.tif 000004
【００４６】
表１は、観察の結果に基づき、各抗真菌性物質候補において真菌（アスペルギルス・ニガー）の増殖抑制が観察されたサンプルのうち、最も少ない溶液添加量、すなわち、胞子発芽阻害最小添加量を示したものである。表中、「２０μＬ」の記載は、抗真菌性物質候補溶液を２０μＬ以上添加したサンプルにおいて、真菌の増殖抑制が観察されたことを示している。また、表中の「−」の記載は、８０μＬの抗真菌性物質候補溶液を添加した場合においても、抗真菌活性が観察されなかったことを示している。
また、上記検討において、マイクロカップ中の酢酸イソアミル２０μＬは全て揮発していることを確認した。
この結果から、標準品の酢酸イソアミルは、少なくとも、マイクロカップに添加した２０μＬが全て揮発した際に、抗真菌活性を有することが分かった。
【００４７】
[実施例５]
酢酸イソアミル類縁体が、酢酸イソアミルと同様の抗真菌活性を有するかどうかを検討した。
上記実施例４と同様に、ガラスシャーレ内のマイクロカップの中に、表２に示す酢酸イソアミル類縁体の標準品を５〜８０μＬ添加し、２８℃で４８時間培養した後、アガープラグ及びアガープラグ周囲のアスペルギルス・ニガーの胞子発芽及び増殖を観察した。表２中、「＜５μＬ」の記載は、マイクロカップに５μＬの試料を添加した場合に、十分に胞子の発芽が阻害されたことを意味する。
また、揮発量は、上記実施例４と同様のガラスシャーレ内のマイクロカップに試料を一定量添加し、２８℃で４８時間静置することにより試験を行った。試験終了後マイクロカップの重量を秤量し、試験前後の重量差から容積差を算出し、揮発量とした。表２中、「＞８０μＬ」の記載は、マイクロカップ中の８０μＬが全て揮発したことを意味する。
【００４８】
【表２】
0005907655.tif 000005
【００４９】
表２の結果から、酢酸イソアミルのみならず、酢酸イソアミルの類縁体である、蟻酸イソアミル、プロピオン酸イソアミル、ｎ−酪酸イソアミル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソブチル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸２−メチルブチル、酢酸ｎ−ペンチル、酢酸ｎ−ヘキシル、酢酸ｎ−ヘプチル、酢酸ｎ−オクチル、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、５−メチル−２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、２−デカノン、及び２−ウンデカノンが、本発明の抗真菌活性を有することが明らかである。また、酢酸ｎ−オクチル、２−ノナノン、２−デカノン、及び２−ウンデカノンは、添加量が少なく、揮発量が少ない場合にも真菌の胞子の発芽及び増殖を阻害するため、本発明の抗真菌活性が高いことが分かった。
【００５０】
[実施例６]
酢酸イソアミルの様々な真菌や細菌に対する抗菌活性について検討した。
具体的には、上記実施例４におけるアスペルギルス・ニガーに代えて表３記載の糸状菌（真菌）の胞子懸濁液、又は、酵母又は細菌の懸濁液を用い、且つ、酢酸イソアミルの標準品を表３に示す量添加した以外は実施例４と同様にして、アガープラグ及びアガープラグ周囲の糸状菌、酵母又は細菌の増殖を観察し、以下の評価条件にて評価を行った。
−:糸状菌の胞子の発芽、又は、酵母若しくは細菌の生育が全く阻害されなかった。
−／＋：糸状菌の胞子の発芽、又は、酵母若しくは細菌の生育がほぼ阻害されなかった。
＋／−：糸状菌の胞子の発芽、又は、酵母若しくは細菌の生育が僅かに阻害された。
＋：糸状菌の胞子の発芽、又は、酵母若しくは細菌の生育の一部が阻害された。
＋＋：糸状菌の胞子の発芽、又は、酵母若しくは細菌の生育の大部分が阻害された。
＋＋＋：糸状菌の胞子の発芽、又は、酵母若しくは細菌の生育が完全に阻害された。
【００５１】
【表３】
0005907655.tif 000006
【００５２】
表３の結果から、酢酸イソアミルは表３記載の糸状菌１５菌株の全てにおいて胞子の発芽を阻害し、且つ、表３記載の酵母５菌株、グラム陽性菌７菌株、及びグラム陰性菌２菌株の全てにおいてその生育を阻害した。よって、本発明の抗菌物質は、カビ、酵母、グラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌等の菌類に対して、広く抗菌活性を有することが分かった。
【００５３】
[実施例７]
酢酸イソアミルによる真菌胞子の発芽阻害に関して、その形態の経時変化を観察した。
上記実施例４と同様に、アスペルギルス・ニガーの胞子混釈アガープラグを作製し、
１６０μＬの酢酸イソアミル標準品が添加されたマイクロカップとともにガラスシャーレ内に静置した。２８℃で４８時間培養した後、一方のサンプルでは酢酸イソアミルをガラスシャーレ内から取り除き、他方のサンプルでは酢酸イソアミルをそのままシャーレ内に残し、いずれのサンプルもその後さらに４８時間培養し、培養開始から０時間後（培養開始時）、５時間後、７時間後、及び４８時間後にアガープラグ表面の胞子および菌糸の状態を電子顕微鏡で観察した。また、コントロールとして、酢酸イソアミルを用いずに培養した菌についても同様に観察を行った。
図９に、（ａ）酢酸イソアミルに曝露せずに通常培養したアスペルギルス・ニガー胞子、（ｂ）酢酸イソアミルに曝露した状態で培養したアスペルギルス・ニガー胞子、（ｃ）酢酸イソアミルに曝露した後、酢酸イソアミルを除去して培養したアスペルギルス・ニガーの、培養開始から０時間後、５時間後、７時間後、及び４８時間後の観察結果を示す。
【００５４】
図９の結果から、通常培養の（ａ）では胞子の発芽が認められたが、酢酸イソアミルに曝露した状態で培養を行った（ｂ）では、４８時間後においても胞子の発芽が見られなかった。
また、酢酸イソアミルに曝露した後、酢酸イソアミルを除去した（ｃ）では、酢酸イソアミル除去後に胞子の発芽が認められた。この結果からから、酢酸イソアミルはアスペルギルス・ニガーの殺菌効果ではなく、胞子の発芽を阻害する静菌効果を有することが分かった。
【００５５】
[実施例８]
酢酸イソアミルによる細菌及び酵母の生育阻害関して、その形態の経時変化を観察した。
具体的には、まず、エスケリキア・コリを、ＮＢアガー平板培地に塗布して２８℃で２４時間培養して、エスケリキア・コリが生育しているＮＢアガー平板培地を作製した。また、サッカロマイセス・セレビシエを、ＹＭアガー平板培地に塗布して２８℃で２４時間培養して、サッカロマイセス・セレビシエが生育しているＹＭアガー平板培地を作製した。
得られたそれぞれの培地を滅菌済みの型を用いてくりぬき、細菌又は酵母が混釈されたアガープラグを作製し、実施例４と同様にガラスシャーレ内にＮＢまたはＹＭ平板培地上に、該アガープラグと、１６０μＬ酢酸イソアミル入りのマイクロカップとを設置し、２８℃で４８時間培養した後、アガープラグ及びアガープラグ周囲のエスケリキア・コリ又はサッカロマイセス・セレビシエの生育を電子顕微鏡で観察した。
図１０に、エスケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の、（ａ）通常培養開始時点（０時間後）、（ｂ）４８時間通常培養を行った後、及び（ｃ）酢酸イソアミルに曝露した状態で４８時間培養を行った後の、観察結果を示す。
【００５６】
図１０の結果から、酢酸イソアミルに曝露したエスケリキア・コリでは、細胞内構造に変化が認められた。また、酢酸イソアミルに曝露したサッカロマイセス・セレビシエでは、細胞内小器官の崩壊が認められた。
これらの結果から、酢酸イソアミルは細菌や酵母の細胞内に影響を及ぼすことにより、その生育を阻害していることが推察された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の抗菌性物質は、特にカビ、酵母、細菌等の菌類の増殖や生育が問題となる食品分野等で利用が可能である。
【受託番号】
【００５８】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−２９７
ＮＩＴＥ  ＢＰ−４７３
ＮＩＴＥ  ＢＰ−４７４
【図１】
0005907655.tif 000008
【図２】
0005907655.tif 000009
【図３】
0005907655.tif 000010
【図４】
0005907655.tif 000011
【図５】
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【図６】
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【図７】
0005907655.tif 000014
【図８】
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【図９】
0005907655.tif 000016
【図１０】
0005907655.tif 000017