(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーロピアンコーンボーラー昆虫をＣｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質と接触させることによって前記昆虫を防除する方法であって、該Ｃｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であり、該Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
人は、食物用途およびエネルギー用途のためにトウモロコシを栽培する。人は、ダイズおよびワタを含む他の多くの作物も栽培する。昆虫は植物を食べて損害を与え、それによってこれらの人の努力を台無しにする。害虫を防除するために毎年何１０億ドルも費やされ、害虫が与える損害に対してさらに数１０億ドルが失われる。合成有機化学殺虫剤は、害虫を防除するために用いられる主な手段であったが、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）に由来する殺虫性タンパク質などの生物殺虫剤が一部の領域である重要な役割を演じている。Ｂｔ殺虫性タンパク質遺伝子による形質転換を通して昆虫抵抗性植物を作出する能力により現代農業が革新されて、殺虫性タンパク質およびその遺伝子の重要性および価値が高まっている。
【０００２】
今日までに首尾よく登録され商品化に至った昆虫抵抗性のトランスジェニック植物を作製するために、数種のＢｔタンパク質が用いられてきた。このＢｔタンパク質としては、トウモロコシのＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ３Ｂｂ、ワタのＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ、ならびにジャガイモのＣｒｙ３Ａが挙げられる。
【０００３】
これらのタンパク質を発現する市販製品は、２種のタンパク質の組合せ殺虫スペクトルが所望される場合（例えば、それぞれ鱗翅目害虫およびルートワームへの抵抗性をもたらすために組み合わされた、トウモロコシのＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ３Ｂｂ）、または２種のタンパク質のそれぞれ独立した作用により、これらのタンパク質が感受性昆虫集団での抵抗性の発達を遅らせるための手段として有用となる場合（例えば、オオタバコガのための抵抗性対応をもたらすために組み合わされた、ワタのＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ）を除いて、単一のタンパク質しか発現しない。ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）またはヘリコベルパ・アーミゲライン（Helicoverpa armigerain）の防除のためのＣｒｙ２タンパク質＋Ｖｉｐ３Ａａ、Ｃｒｙ１ＦまたはＣｒｙ１Ａに関する米国特許出願公開第２００９／０３１３７１７号も参照されたい。国際公開第２００９／１３２８５０号は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）を防除するためのＣｒｙ１ＦまたはＣｒｙ１ＡおよびＶｉｐ３Ａａに関する。米国特許出願公開第２００８／０３１１０９６号は、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性のユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｅｂｎｅｒ））を防除するためのＣｒｙ１Ａｂに一部関する。
【０００４】
すなわち、この技術の急速で広範囲な採用をもたらした昆虫抵抗性トランスジェニック植物の特質のいくつかは、これらの植物によって生成される殺虫性タンパク質に対する抵抗性を有害生物集団が発達させるという懸念も生む。高用量のタンパク質を、緩衝帯と組み合わせて利用すること、及び異なる毒素と交互にまたは同時利用で利用することを含む、Ｂｔ系昆虫抵抗性形質の有用性を維持するためのいくつかの戦略が提案されている（McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146）。
【０００５】
あるタンパク質に対して発達した抵抗性が別のタンパク質に対する抵抗性を付与しない（すなわち、これらタンパク質に対する交差抵抗性がない）ように、昆虫抵抗性管理（ＩＲＭ）スタックで用いるために選択されるタンパク質は、それらの殺虫効果を独立して発揮する必要がある。例えば、「タンパク質Ａ」に対する抵抗性について選択される有害生物集団が「タンパク質Ｂ」に感受性である場合、そこには交差抵抗性がなく、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの組合せがタンパク質Ａ単独に対する抵抗性を遅らせるのに有効であると結論付けられるであろう。
【０００６】
抵抗性の昆虫集団が存在しない場合、作用機構および交差抵抗性能力に関連すると推測される他の特性に基づいて評価を行うことができる。受容体媒介結合が交差抵抗性を示す可能性のない殺虫性タンパク質を同定することに有用であることが示唆されている（van Mellaert et al. 1999）。この手法に特有の交差抵抗性の欠如の重要な予測因子は、殺虫性タンパク質が感受性昆虫種の受容体をめぐって競合しないことである。
【０００７】
２つのＢｔ毒素が昆虫の同じ受容体をめぐって競合する場合において、その受容体がその昆虫で突然変異して毒素の１つがその受容体にもはや結合せず、よって昆虫に対してもはや殺虫性でないならば、昆虫は別の毒素（同じ受容体に競合的に結合する）にも抵抗性になる場合もあり得る。すなわち、昆虫は両方のＢｔ毒素に交差抵抗性である。しかし、２つの毒素が２つの異なる受容体に結合する場合には、これは昆虫がそれら２つの毒素に同時に抵抗性でないことを示す指標であろう。
【０００８】
例えば、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質は、ＥＣＢおよびフォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））を含む多くの鱗翅目害虫の種の防除で有用であり、シュガーケーンボーラー（ＳＣＢ；ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis））に対する活性を有する。事象ＴＣ１５０７を含むトランスジェニックトウモロコシ植物で生成されるようなＣｒｙ１Ｆａタンパク質は、ＦＡＷ防除のための業界をリードする昆虫抵抗性形質を担う。Ｃｒｙ１Ｆａは、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）、ＳｍａｒｔＳｔａｘ（商標）およびＷｉｄｅＳｔｒｉｋｅ（商標）製品でさらに利用されている。
【０００９】
受容体結合性アッセイでの検出のためのタンパク質を標識するのに利用できる一般的な技術がＣｒｙ１Ｆａタンパク質の殺虫活性を不活性化する傾向があるので、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質を用いる（競合的または相同的）受容体結合性試験を行う能力は制限されている。
【００１０】
さらなるＣｒｙ毒素は、公式なＢ．ｔ．命名委員会のウェブサイト（Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）に記載されている。ほぼ６０個の主要群の「Ｃｒｙ」毒素（Ｃｒｙ１〜Ｃｒｙ５９）が現在あり、さらなるＣｙｔ毒素およびＶＩＰ毒素などがある。数字で表した各群の多くは大文字のサブグループを有し、大文字のサブグループは小文字のサブサブグループを有する。（例えば、Ｃｒｙ１はＡ〜Ｌを有し、Ｃｒｙ１Ａはａ〜ｉを有する）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅがユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｅｂｎｅｒ））またはフォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））の腸細胞膜調製物における部位への結合のために競合しないという意外な発見に一部関する。当業者であれば本開示に鑑みて認識するであろうが、これらのタンパク質（完全長タンパク質の殺虫性部分を含む）の両方とも生成する植物は、これらの殺虫性タンパク質のいずれか単独に対する抵抗性の発達を遅らせるか阻止することができる。トウモロコシおよびダイズが一部の好ましい植物である。ＥＣＢは、対象の毒素組の好ましい標的昆虫である。
【００１２】
したがって、本発明は、Ｃｒｙ１Ｂｅタンパク質と組み合わせたＣｒｙ１Ａｂタンパク質の使用に一部関する。これらのタンパク質の両方とも生成する植物（およびそのような植物を植える土地）は、本発明の範囲内に含まれる。
【００１３】
本発明はまた、３つ（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」に一部関し、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅが基礎となる組である。一部の好ましいピラミッドの実施形態では、選択される毒素の組合せは、ＥＣＢに対して３つの作用部位を提供する。一部の好ましい「３つの作用部位」のピラミッドの組合せは、対象のタンパク質の基礎となる組に加えて、ＥＣＢを標的にするための第三タンパク質としてＣｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ１ＩおよびＤＩＧ−３を含む。本発明によるこれらの特定の三重スタックは、ＥＣＢに対して３つの作用部位を有利にかつ意外にも提供する。これは、緩衝帯地所の要件を低減または除去するのを助けることができる。
【００１４】
本発明は本明細書で、単独で、または３つ以上の毒素の「ピラミッド」で、トウモロコシのＥＣＢに対する昆虫抵抗性を提供する毒素Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅの基本的組として開示されているが、本明細書に記載されるＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅの組合せは、ダイズまたはトウモロコシの両方でＦＡＷを標的にするためのさらなるタンパク質と一緒に用いることもできることを理解すべきである。
【００１５】
本発明によってさらなる毒素／遺伝子を追加することもできる。例えば、Ｃｒｙ１Ｆａ
が対象のタンパク質の組と一緒にスタックされる場合（Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｂｅ
の両方はＦＡＷおよびＥＣＢの両方に対して活性である）、その第四の追加タンパク質は
ＥＣＢを標的にする１つの追加のタンパク質をこの三重スタックに加えることは、ＦＡＷ
に対する３つの作用部位、およびＥＣＢに対する３つの作用部位を提供するであろう。こ
の追加タンパク質（ＦＡＷを標的にする第四のタンパク質）は、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｖｉｐ３
ＡｂまたはＣｒｙ１Ｅからなる群から選択され得る。これは、２つの昆虫（ＥＣＢおよび
ＦＡＷ）に対して３つの作用部位を有する４タンパク質スタックをもたらすであろう。
本発明のさらなる具体例として、以下のものが挙げられる。
[１]  Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡおよびＣｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡを含むトランスジェニック植物。
[２]  Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ１ＩおよびＤＩＧ−３からなる群から選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、[１]に記載のトランスジェニック植物。
[３]  殺虫性Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質をコードするＤＮＡと、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｖｉｐ３Ａｂ、Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｅからなる群から選択される第四の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡとをさらに含む、[３]に記載のトランスジェニック植物。
[４]  [１]から[３]のいずれかに記載の植物の種子。
[５]  非Ｂｔ緩衝帯植物および[１]から[３]のいずれかに記載の複数の植物を備える植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の４０％未満を構成する、圃場。
[６]  前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の３０％未満を構成する、[５]に記載の植物の圃場。
[７]  前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の２０％未満を構成する、[５]に記載の植物の圃場。
[８]  前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の１０％未満を構成する、[５]に記載の植物の圃場。
[９]  前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の５％未満を構成する、[５]に記載の植物の圃場。
[１０]  前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、[５]に記載の植物の圃場。
[１１]  非Ｂｔ緩衝帯植物からの緩衝帯種子および[４]に記載の複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の４０％未満を構成する、種子混合物。
[１２]  前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の３０％未満を構成する、[１１]に記載の種子混合物。
[１３]  前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の２０％未満を構成する、[１１]に記載の種子混合物。
[１４]  前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の１０％未満を構成する、[１１]に記載の種子混合物。
[１５]  前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の５％未満を構成する、[１１]に記載の種子混合物。
[１６]  種子を播いて[５]から[１０]のいずれかに記載の植物の圃場を作製することを含む、昆虫によるＣｒｙタンパク質への抵抗性の発達を管理する方法。
[１７]  前記植物が１０エーカーよりも多くを占める、[５]から[１０]のいずれかに記載の圃場。
[１８]  トウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、[１]から[３]のいずれかに記載の植物。
[１９]  メイズ植物である、[１８]に記載の植物。
[２０]  前記植物細胞が、前記Ｃｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡおよび前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡを含み、前記Ｃｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質が配列番号１と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質が配列番号２と少なくとも９９％同一である、[１]から[３]のいずれかに記載の植物の植物細胞。
[２１]  前記Ｃｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質が配列番号１を含み、前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質が配列番号２を含む、[１]から[３]のいずれかに記載の植物。
[２２]  [２０]に記載の植物細胞を生成する方法。
[２３]  ユーロピアンコーンボーラー昆虫をＣｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質と接触させることによって前記昆虫を防除する方法。
表の簡単な説明
表１：アミノ酸の４つのクラス内のアミノ酸の例を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＥＣＢ  ＢＢＭＶに対する標識Ｃｒｙ１Ａｂ対Ｃｒｙ１Ｂｅの結合率を示すグラフである。
【図２】ＦＡＷ  ＢＢＭＶに対する標識Ｃｒｙ１Ａｂ対Ｃｒｙ１Ｂｅの結合率を示すグラフである。
【図３】ＦＡＷ  ＢＢＭＶに対する標識Ｃｒｙ１Ｂｅ対Ｃｒｙ１Ａｂの結合率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は一部、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅがユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｅｂｎｅｒ））またはフォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））の腸での結合部位に対して互いと競合しないという意外な発見に関する。したがって、これらのタンパク質のいずれか単独への抵抗性をＥＣＢが発達させることを遅らせるか阻止するために、トランスジェニックトウモロコシ（および他の植物、例えばワタおよびダイズ）においてＣｒｙ１Ａｂタンパク質をＣｒｙ１Ｂｅタンパク質と組み合わせて用いることができる。Ｃｒｙ抵抗性のＥＣＢによる損害から植物（メイズ植物など）を保護することにおいて、対象のタンパク質の組は効果を発揮することができる。すなわち、本発明の１つの用途は、Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｂｅへの抵抗性を発達させるかもしれないＥＣＢ集団に起因する損害および収量減からトウモロコシおよび他の経済的に重要な植物種を保護することである。
【００１８】
したがって、本発明は、これらのタンパク質の一方または両方へのＥＣＢによる抵抗性の発達を阻止または低減するための、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅを含む昆虫抵抗性対応（ＩＲＭ）スタックを教示する。
【００１９】
さらに、本明細書で開示される本発明は、それらのタンパク質の一方または両方へのＥＣＢによる抵抗性を阻止するためのＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅを含むＩＲＭスタックを教示するが、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅの一方または両方を単独あるいは併用で、これらのタンパク質の一方または両方へのＦＡＷによる抵抗性を阻止するように適合させることができることは、本明細書で開示される発明の範囲内である。
【００２０】
本発明は、Ｃｒｙ１Ａｂコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｂｅコア毒素含有タンパク質を生成する細胞を含む、鱗翅目害虫を防除するための組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質の両方を生成するように形質転換された、微生物または植物細胞である宿主をさらに含む。対象ポリヌクレオチド（複数可）は、好ましくは非バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）プロモーター（複数可）の制御下の遺伝子構築物中にある。対象ポリヌクレオチドは、植物での強化された発現のためのコドン使用頻度を含むことができる。
【００２２】
本発明は、鱗翅目害虫を防除する方法であって、前記鱗翅目害虫または前記鱗翅目害虫の環境を、Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質を含み、さらにＣｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質を含む組成物の有効量と接触させることを含む方法を提供することがさらに意図される。
【００２３】
本発明の実施形態は、植物による発現が可能なＣｒｙ１Ｂｅコア毒素含有タンパク質コード遺伝子および植物による発現が可能なＣｒｙ１Ａｂコア毒素含有タンパク質コード遺伝子を含むメイズ植物(maize plant)、ならびにそのような植物の種子を含む。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、植物による発現が可能なＣｒｙ１Ｂｅ殺虫性タンパク質コード遺伝子および植物による発現が可能なＣｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質コード遺伝子が移入されたメイズ植物、ならびにそのような植物の種子を含む。
【００２５】
実施例に記載されているように、放射性標識されたＣｒｙ１Ａｂタンパク質およびＣｒｙ１Ｂｅタンパク質を用いる競合的受容体結合性試験は、Ｃｒｙ１Ａｂが結合するＥＣＢ組織またはＦＡＷ組織での結合に関してＣｒｙ１Ｂｅタンパク質が競合しないことを示す。これらの結果は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質およびＣｒｙ１Ｂｅタンパク質の組合せが、これらのタンパク質のいずれかに対するＥＣＢおよびＦＡＷ集団での抵抗性の発達を低減する効果的な手段になり得ることも示す。したがって、本明細書に記載されるデータに一部基づき、Ｃｒｙ１Ｂｅタンパク質およびＣｒｙ１Ａｂタンパク質の同時生成（スタッキング）をＥＣＢに対する高用量ＩＲＭスタックを生成するために用いることができると考えられる。
【００２６】
他のタンパク質をこの組に加えることができる。例えば、本発明は、３つ（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」にも一部関し、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅが基礎となる組である。一部の好ましいピラミッドの実施形態では、選択される毒素は、ＦＡＷに対して３つの別々の作用部位を有する。一部の好ましい「３つの作用部位」のピラミッドの組合せは、対象のタンパク質の基礎となる組に加えて、ＦＡＷを標的にするための第三のタンパク質としてＣｒｙ１Ｆａ、Ｖｉｐ３Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１ＤまたはＣｒｙ１Ｅを含む。本発明によるこれらの特定の三重スタックは、ＦＡＷに対して３つの作用部位を有利に、かつ意外にも提供する。これは、緩衝帯地所の必要を軽減または除去するのを助けることができる。「別々の作用部位」は、所与のタンパク質のいずれも互いと交差抵抗性を引き起こさないことを意味する。
【００２７】
本発明によって、さらなる毒素／遺伝子を加えることもできる。例えば、Ｃｒｙ１Ｆａが対象のタンパク質の組と一緒にスタックされる場合（Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｂｅの両方はＦＡＷおよびユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ）の両方に対して活性である）、その第四の追加タンパク質はＥＣＢを標的にする１つの追加のタンパク質をこの三重スタックに加えることは、ＦＡＷに対する３つの作用部位、およびＥＣＢに対する３つの作用部位を提供する。これらの追加のタンパク質（第四のタンパク質）は、Ｃｒ２Ａ、Ｃｒｙ１Ｉ、ＤＩＧ−３（米国特許出願シリアル番号６１／２８４，２７８（２００９年１２月１６日に出願された）およびＵＳ２０１０  ００２６９２２３を参照）からなる群から選択することができる。これは、２つの昆虫（ＥＣＢおよびＦＡＷ）に対して３つの作用部位を有する４タンパク質スタックをもたらす。
【００２８】
したがって、１つの利用選択肢は、第三毒素／遺伝子と組み合わせて対象のタンパク質の組を用いること、およびこれらの毒素のいずれかに対するＥＣＢおよび／またはＦＡＷでの抵抗性の発達を低減するためにこの三重スタックを用いることである。したがって、本発明は、３つ（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」にも一部関する。一部の好ましいピラミッドの実施形態では、選択される毒素は、ＥＣＢおよび／またはＦＡＷに対して３つの別々の作用部位を有する。
【００２９】
本発明の利用選択肢には、ＥＣＢおよび／またはＦＡＷが抵抗性集団を発達させることができる作物栽培地域で、対象タンパク質の２つ、３つまたはそれ以上のタンパク質を用いることが含まれる。
【００３０】
Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｂｅの使用（ＥＣＢおよび／またはＦＡＷを防除するため）に関する手引きについては、米国特許出願第６１／２８４，２９０号（２００９年１２月１６日に出願）を参照されたい。Ｃｒｙ１ＦａはＥＣＢ（およびＦＡＷ）に対して活性であるので、Ｃｒｙ１ＡｂにＣｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｆａをプラスしたものは、本発明により、ＥＣＢに対する３つの作用部位を有利に、かつ意外にも提供するであろう。これは、緩衝帯地所の要件を軽減または除去するのを助けることができる。
【００３１】
Ｃｒｙ１Ｆａは、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）、ＳｍａｒｔＳｔａｘ（商標）およびＷｉｄｅＳｔｒｉｋｅ（商標）の製品で利用されている。対象の遺伝子の組（Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅ）は、例えばＨｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）、ＳｍａｒｔＳｔａｘ（商標）およびＷｉｄｅＳｔｒｉｋｅ（商標）などのＣｒｙ１Ｆａ製品に組み込むことができる。したがって、対象のタンパク質の組は、これらのおよび他のタンパク質への淘汰圧を軽減することにおいて有意になり得る。したがって、対象のタンパク質の組は、トウモロコシおよび他の植物（例えばワタおよびダイズ）のための３遺伝子組合せの場合のように用いることができる。
【００３２】
上記のように、さらなる毒素／遺伝子を、本発明により加えることもできる。ＥＣＢを標的にするために、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ１Ｉおよび／またはＤＩＧ−３を用いることができる。米国特許出願シリアル番号６１／２８４，２７８（２００９年１２月１６日に出願された）およびＵＳ２０１０  ００２６９２２３を参照されたい。Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｂの組合せ（ＥＣＢを防除するために）については、米国特許出願公開第２００８／０３１１０９６号を参照されたい。
【００３３】
対象のタンパク質の組合せのいずれかを生成する植物（およびそのような植物を植える土地）は、本発明の範囲内に含まれる。さらなる毒素／遺伝子を加えることもできるが、上記の特定のスタックは、ＥＣＢおよび／またはＦＡＷに対する複数の作用部位を有利に、および意外にも提供する。これは、緩衝帯地所の要件を軽減または除去するのを助けることができる。したがって、１０エーカー以上のこのように植えられる圃場は、本発明に含まれる。
【００３４】
本明細書で議論される遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得るために、ＧＥＮＢＡＮＫを用いることもできる。下の付録Ａを参照されたい。特許も使用することができる。例えば、米国特許第５，１８８，９６０号および米国特許第５，８２７，５１４号は、本発明の実施で使用するために適するＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質を記載する。米国特許第６，２１８，１８８号は、本発明で使用するために適するＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする植物最適化ＤＮＡ配列を記載する。
【００３５】
本明細書に記載されるタンパク質の組合せは、鱗翅目害虫を防除するために用いることができる。成体の鱗翅目、例えばチョウおよびガは、主に花蜜を食し、受粉の重要な実行者である。ほとんど全ての鱗翅目幼虫、すなわちイモムシは植物を食し、多くは重大な有害生物である。イモムシは、植物の葉の表面もしくは内部、または根部または茎を食し、植物から栄養を奪い、多くの場合植物の物理的支持構造物を破壊する。さらに、イモムシは果物、組織ならびに貯蔵された穀物および小麦粉を食し、売物のこれらの商品を破壊するかそれらの価値を激減させる。本明細書で用いるように、鱗翅目害虫への言及は、幼虫期を含めた、鱗翅目害虫の様々なライフステージを指す。
【００３６】
本発明の一部のキメラ毒素は、Ｂｔ毒素の完全なＮ末端コア毒素部分を含み、コア毒素部分の末端を過ぎたある場所で、タンパク質は異種プロトキシン配列への移行を有する。Ｂｔ毒素のＮ末端の殺虫活性毒素部分は、「コア」毒素と呼ばれる。コア毒素セグメントから異種プロトキシンセグメントへの移行は、ほぼ毒素／プロトキシン接合部に存在してもよいし、その代わりに、元のプロトキシンの部分（コア毒素部分を過ぎて延びる）を保持して異種プロトキシン部分への移行が下流に存在してもよい。
【００３７】
例えば、本発明の１つのキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ａｂの完全なコア毒素部分（およそアミノ酸１〜６０１）および／または異種プロトキシン（およそアミノ酸６０２からＣ末端）である。好ましい一実施形態では、プロトキシンを含むキメラ毒素の部分は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質毒素に由来する。好ましい実施形態では、プロトキシンを含むキメラ毒素の部分は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質毒素に由来する。
【００３８】
Ｂｔ毒素は、Ｃｒｙ１Ｂｅなどの特定のクラス内でさえ、長さおよびコア毒素部分からプロトキシン部分への移行の正確な位置が多少異なることを、当分野の技術者は認識する。一般的に、Ｃｒｙ１Ｂｅ毒素は、長さが約１１５０から約１２００アミノ酸である。コア毒素部分からプロトキシン部分への移行は、代表的には完全長毒素の約５０％から約６０％の間で存在する。本発明のキメラ毒素は、このＮ末端コア毒素部分の全長を含む。したがって、キメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｂｅタンパク質の完全長の少なくとも約５０％を含む。これは、一般的に少なくとも約５９０アミノ酸である。プロトキシン部分に関して、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシン部分の全長は、コア毒素部分の末端から分子のＣ末端まで伸びる。
【００３９】
遺伝子および毒素。
本発明による有用な遺伝子および毒素には、開示される完全長配列だけでなく、本明細書で具体的に例示される毒素の特徴的な殺虫活性を保持するこれらの配列の断片、変異体、突然変異体、および融合タンパク質も含まれる。本明細書で用いるように、遺伝子の「変異体」または「変形形態」という用語は、同じ毒素をコードするか、殺虫活性を有する同等毒素をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いるように、用語「同等毒素」は、標的有害生物に対して特許請求する毒素と同じか事実上同じである生物的活性を有する毒素を指す。
【００４０】
本明細書で用いるように、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」、N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813、により、境界は約９５％（Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅ）、７８％（Ｃｒｙ１ＡおよびＣｒｙ１Ｂ）および４５％（Ｃｒｙ１）の配列同一性を表す。これらのカットオフは、コア毒素だけに適用することもできる。
【００４１】
活性毒素をコードする遺伝子は、いくつかの手段を通して同定し、得ることができることは、当分野の技術者に明らかとなるはずである。本明細書で例示される具体的な遺伝子または遺伝子部分は、培養株保管所に寄託されている分離株から得ることができる。これらの遺伝子、またはその部分もしくは変異体は、合成的に、例えば遺伝子合成装置を用いて構築することもできる。遺伝子の変形形態は、点突然変異を作製する標準技術を用いて、容易に構築することができる。また、これらの遺伝子の断片は、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを標準手順に従って用いることによって作製することができる。例えば、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを体系的に切断するために、Ｂａｌ３１などの酵素または部位特異的突然変異誘発を用いることができる。活性断片をコードする遺伝子は、様々な制限酵素を用いて得ることもできる。これらのタンパク質毒素の活性断片を直接的に得るために、プロテアーゼを用いることができる。
【００４２】
例示される毒素の殺虫活性を保持する断片および同等物は、本発明の範囲内である。また、遺伝子コードの冗長性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードすることができる。同じか事実上同じである毒素をコードするこれらの代替ＤＮＡ配列を作製することは、当業者の技量の範囲内である。これらの変異体ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。本明細書で用いるように、「事実上同じ」配列への言及は、殺虫活性に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を有する配列を指す。殺虫活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子の断片も、この定義に含まれる。
【００４３】
本発明により有用な毒素をコードする遺伝子および遺伝子部分を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによるものである。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適当な標識によって検出可能であってもよいし、国際出願公開第９３／１６０９４号に記載されているように本来的に蛍光性にされてもよい。当技術分野で周知であるように、プローブ分子および核酸試料が２つの分子間で強力な結合を形成することによってハイブリダイズする場合、プローブおよび試料は実質的な相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばKeller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, StocktonPress, New York, N.Y., pp. 169- 170に記載されているような、当分野で周知の技術によってストリンジェント条件の下で行われる。塩濃度および温度の組合せの一部の例は、以下の通りである（ストリンジェンシーが上がる順序で）：室温で２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；４２℃で１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；４２℃で０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；６５℃で０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを既知の方法で判定するための手段を提供する。そのようなプローブ分析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置および標準手順を用いて合成することができる。本発明の遺伝子を増幅するＰＣＲプライマーとして、これらのヌクレオチド配列を用いることもできる。
【００４４】
変異体毒素。
本発明の特定の毒素が、本明細書で具体的に例示された。これらの毒素は本発明の毒素の例示にすぎないので、本発明が例示毒素と同じか類似した殺虫活性を有する変異体または同等毒素（および同等毒素をコードするヌクレオチド配列）を含むことは容易に明らかなはずである。同等毒素は、例示される毒素とのアミノ酸相同性を有する。このアミノ酸相同性は、一般的に７５％を超え、好ましくは９０％を超え、最も好ましくは９５％を超える。アミノ酸相同性は、生物的活性を担う毒素の重要領域、又は最終的に生物的活性を担う３次元構造の決定に関与する毒素の重要領域で最も高くなる。この点に関して、それらの置換が活性に重要でない領域にあるか、分子の３次元構造に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換であるならば、特定のアミノ酸置換が許容可能であり、期待できる。例えば、アミノ酸は以下のクラスに入れることができる：無極性、無電荷極性、塩基性および酸性。１つのクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸で置換される保存的置換は、その置換が化合物の生物的活性を実質的に変更しない限り本発明の範囲内である。下記は、各クラスに属するアミノ酸の例のリストである。
【表１】
0005907892.tif 000002
【００４５】
場合によって非保存的置換を加えることもできる。重要な要素は、これらの置換が毒素の生物的活性をあまり損なってはならないということである。
【００４６】
組換え体宿主。
本発明の毒素をコードする遺伝子は、多種類の微生物または植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子の発現は、直接または間接的に、殺虫剤の細胞内での生成および維持をもたらす。本発明の両毒素を発現するＢｔ株を作製するために、接合移入および組換え移入を用いることができる。他の宿主生物体を毒素遺伝子の一方または両方で形質転換し、次に相乗効果を達成するために用いることもできる。適する微生物宿主、例えばシュードモナス（Pseudomonas）で、微生物を有害生物の位置へ施用することができ、そこでそれらは増殖して摂取される。この結果が有害生物の防除である。あるいは、毒素遺伝子を受け入れる微生物は、毒素の活性を長引かせ、細胞を安定させる条件の下で処理することができる。毒性活性を保持する処理細胞は、次に標的有害生物の環境に施用することができる。
【００４７】
Ｂｔ毒素遺伝子が適するベクターを通して微生物宿主に導入され、前記宿主が生きた状態で環境へ施用される場合、特定の宿主微生物が用いられることが必須である。対象の１つまたは複数の作物の「植物圏」（葉面、葉圏、根圏および／または根面）を占めることが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物および他の昆虫生息地）で野生型微生物と首尾よく競合することが可能であるように、ポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の安定した維持および発現を提供するように、および、望ましくは環境中での分解および不活性化からの殺虫剤の向上した保護を提供するように選択される。
【００４８】
多数の微生物が、多種類の重要作物の葉面（植物葉の表面）および／または根圏（植物根を囲む土）に生息することが知られている。これらの微生物には、細菌、藻および真菌類が含まれる。特に興味深いものは、細菌、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）、エルウィニア属（Erwinia）、セラチア属（Serratia）、クレブシェラ属（Klebsiella）、キサントモナス属（Xanthomonas）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、根粒菌属（Rhizobium）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロバクテナム属（Agrobactenum）、アセトバクター属（Acetobacter）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、アゾトバクター属（Azotobacter）、ロイコノストック属（Leuconostoc）およびアルカリゲネス属（Alcaligenes）；真菌類、特に酵母、例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）、クリプトコックス属（Cryptococcus）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、スポロボロミセス属（Sporobolomyces）、ロドトルラ属（Rhodotorula）およびオーレオバシジウム属（Aureobasidium）などの微生物である。特に興味深いものは、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテニウム・ツメファシエンス（Agrobactenium tumefaciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオチ（Rhizobium melioti）、アルカリゲネス・エントロファス（Alcaligenes entrophus）およびアゾトバクター・ビンランジ（Azotobacter vinlandii）のような植物圏細菌種；ならびにロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルチニス（R. glutinis）、Ｒ．マリーナ（R. marina）、Ｒ．オーランチアカ（R. aurantiaca）、クリプトコックス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ジフルエンス（C. diffluens）、Ｃ．ローレンチ（C. laurentii）、サッカロミセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S. pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドルス（S. odorus）、クルイベロミセス・ベロネ（Kluyveromyces veronae）およびオーレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）などの植物圏酵母種である。色の着いた微生物が、特に興味深い。
【００４９】
遺伝子の安定した維持および発現を可能にする条件の下で、毒素をコードするＢｔ遺伝子を微生物宿主に導入するために、多種類の方法を利用できる。これらの方法は当業者に周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３５，８６７号に記載されている。
【００５０】
細胞の処理。
Ｂｔ毒素を発現するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）または組換え体の細胞は、毒素活性を長引かせ、細胞を安定させるために処理することができる。形成される殺虫剤マイクロカプセルは、安定化された細胞構造の中にＢｔ毒素（複数可）を含み、このマイクロカプセルが標的有害生物の環境へ施用されるときに毒素を保護する。適する宿主細胞には、原核生物または真核生物のいずれかが含まれてよく、通常、哺乳動物などの高等生物体に有毒である物質を生成しない細胞に限定される。しかし、毒性物質が不安定であるか、哺乳動物宿主への毒性のいかなる可能性も避けるために施用量が十分に低い場合、高等生物体にとって有毒である物質を生成する生物体が用いることもできる。宿主としては、原核生物および真菌類などの下等真核生物が特に興味深い。
【００５１】
処理時、細胞は、胞子の形態ではなく通常そのままの状態であり実質的に増殖形であるが、一部の例では胞子を利用してもよい。
【００５２】
微生物細胞、例えばＢｔ毒素遺伝子（複数可）を含む微生物の処理は、その技術が毒素の特性に悪い影響を及ぼさず、毒素を保護する細胞の能力も低下させない限り、化学的または物理的な手段により、または化学的および／または物理的な手段の組合せによることができる。化学試薬の例は、ハロゲン化剤、特に原子番号１７〜８０のハロゲン原子である。より詳しくは、穏和条件の下で、かつ所望の結果を達成するのに十分な時間、ヨウ素を用いることができる。他の適する技術には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド；塩化ゼフィランおよび塩化セチルピリジニウムなどの消毒剤；イソプロピルおよびエタノールなどのアルコール；ルゴールヨウ素、ブアン固定液、様々な酸およびヘリー固定液などの様々な組織固定剤（Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967を参照）；または細胞が宿主環境に施用されるときに細胞内で生成される毒素の活性を保存し、長引かせる物理的（熱）および化学的作用因子の組合せによる処理が含まれる。物理的手段の例は、ガンマ線放射およびＸ線放射などの短波長放射、凍結、ＵＶ照射、凍結乾燥などである。微生物細胞の処理のための方法は、米国特許第４，６９５，４５５号および４，６９５，４６２号で開示され、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
細胞は、環境条件への抵抗性を増強する強化された構造安定性を一般に有する。殺虫剤がプロ型である場合、細胞処理の方法は、標的有害生物の病原体による殺虫剤のプロ型から成熟型へのプロセッシングを妨げないように選択されるべきである。例えば、ホルムアルデヒドはタンパク質を架橋し、ポリペプチド殺虫剤のプロ型のプロセッシングを妨げることができる。処理の方法は、毒素の生物学的利用能または生物活性の少なくとも実質的な部分を保持するべきである。
【００５４】
生成のための宿主細胞の選択で特に興味深い特性には、Ｂｔ遺伝子（複数可）を宿主に導入することの容易さ、発現系の利用可能性、発現効率、宿主での殺虫剤の安定性および補助的遺伝子能力の存在が含まれる。殺虫剤マイクロカプセルとして用いるための興味深い特性には、厚い細胞壁、着色および細胞内パッケージングまたは封入体形成などの殺虫剤保護特性；水性環境での生存；人畜毒性の欠如；摂取のための有害生物への誘引効果；殺滅の容易さおよび毒素を害さずに固着させること；などが含まれる。他の考慮事項には、製剤化および取扱いの容易さ、経済性、貯蔵安定性などが含まれる。
【００５５】
細胞の増殖。
Ｂｔ殺虫性遺伝子（複数可）を含む細胞宿主は、ＤＮＡ構築物が選択有利性を提供し、細胞の実質的に全てまたは全てがＢｔ遺伝子を保持するように選択培地を提供する、任意の便利な栄養培地で増殖させることができる。これらの細胞は、従来の方法に従って次に収穫することができる。あるいは、収穫する前に細胞を処理することができる。
【００５６】
本発明の毒素を生成するＢｔ細胞は、標準技術の培地および発酵技術を用いて培養することができる。発酵サイクルの終了後、最初に当技術分野で周知である手段によってＢｔ胞子および結晶を発酵培養液から分離することによって細菌を収穫することができる。取扱いおよび特定の標的有害生物への施用を容易にするために、界面活性剤、分散剤、不活性担体および他の構成成分の添加によって、回収されたＢｔ胞子および結晶を水和剤、濃厚液剤、粒剤または他の製剤に製剤化することができる。これらの製剤および施用手法は、全て当技術分野で周知である。
【００５７】
製剤。
誘引剤ならびにＢｔ分離株の胞子、結晶および毒素、または本明細書で開示されるＢｔ分離株から入手できる遺伝子を含む組換え体微生物を含む製剤化された餌粒剤は、土壌に施用することができる。製剤化された製品は、種子コーティングまたは作物サイクルの後期段階で根部処理もしくは植物全体処理として施用することもできる。Ｂｔ細胞の植物および土壌処理は、様々な不活性の材料、例えば無機鉱物（フィロシリケート、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）または植物材料（粉末状の穂軸、籾殻、クルミ殻など）と混合することによって、水和剤、粒剤または粉剤として使用することができる。製剤は、展着助剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤または界面活性剤を含むことができる。液体製剤は水性または非水性であってよく、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤などとして使用することができる。これらの成分には、レオロジー調整剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤またはポリマーが含まれてよい。
【００５８】
当分野の技術者によって認識されるように、特定の製剤の性質、特にそれが濃厚剤であるか直接的に用いられるものであるかによって、殺虫剤濃度は広く変動する。殺虫剤は少なくとも１重量％で存在し、１００重量％であってもよい。乾燥製剤は約１〜９５重量％の殺虫剤を有するが、液体製剤は一般に液相中に約１〜６０重量％の固形分である。製剤は、１ｍｇにつき約１０２から約１０４細胞を一般に有する。これらの製剤は、１ヘクタールにつき約５０ｍｇ（液体または乾燥物）から１ｋｇ以上で投与される。
【００５９】
製剤は、噴霧、散粉、散水その他によって、鱗翅目害虫の環境、例えば葉または土へ施用することができる。
【００６０】
植物の形質転換。
本発明の殺虫性タンパク質の生成のための好ましい組換え体宿主は、形質転換された植物である。本明細書で開示されるようなＢｔ毒素タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で周知である様々な技術を用いて植物細胞に挿入することができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）の複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、高等植物への外来遺伝子の挿入のための調製のために利用できる。ベクターとしては、例えば、とりわけｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４が挙げられる。したがって、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ断片は、適する制限部位でベクターに挿入することができる。生じたプラスミドは、大腸菌（E. coli）への形質転換のために用いられる。大腸菌（E. coli）細胞は適する栄養培地で培養され、次に収穫され、溶解される。プラスミドを回収する。配列分析、制限酵素解析、電気泳動および他の生化学的分子生物学的方法が、分析方法として一般に実行される。各操作の後、用いたＤＮＡ配列を切断して次のＤＮＡ配列に連結することができる。各プラスミド配列は、同じか他のプラスミドにクローニングすることができる。植物への所望の遺伝子の挿入の方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要なこともある。例えば、植物細胞の形質転換のためにＴｉまたはＲｉプラスミドが用いられるならば、ＴｉまたはＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくともライトボーダー、しかし多くの場合はライトボーダーとレフトボーダーとが、挿入される遺伝子の隣接領域として連結されなければならない。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は集中的に研究されており、ＥＰ１２０５１６、Lee and Gelvin (2008)、Hoekema (1985)、Fraley et al., (1986)およびAn et al., (1985)で十分に記載され、当技術分野でよく確立されている。
【００６１】
挿入されたＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれると、それは比較的安定である。形質転換ベクターは、形質転換された植物細胞に、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシンなどの生物致死剤または抗生物質への抵抗性を付与する選択マーカーを通常含む。したがって、個々に使用されるマーカーは、挿入されたＤＮＡを含まない細胞ではなく形質転換された細胞の選択を可能にするはずである。
【００６２】
ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するために、多数の技術を利用できる。それらの技術には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）もしくはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いるＴ−ＤＮＡによる形質転換、融合、注射、微粒子銃（微小粒子ボンバードメント）、またはエレクトロポレーションならびに他の可能な方法が含まれる。アグロバクテリウム菌が形質転換のために用いられる場合、挿入されるＤＮＡは特別なプラスミド、すなわち中間型ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされなければならない。中間型ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列に相同性の配列のため、相同組み換えによってＴｉまたはＲｉプラスミドに組み込むことができる。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの移入のために必要なｖｉｒ領域も含む。中間型ベクターは、アグロバクテリウム菌ではそれ自身を複製することができない。中間型ベクターは、ヘルパープラスミドによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に移動させることができる（コンジュゲーション）。バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム菌の両方でそれ自身を複製することができる。それらバイナリーベクターは選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含み、左右のＴ−ＤＮＡボーダー領域によってフレーム決めされる。それらバイナリーベクターは、アグロバクテリウム菌に直接に形質転換させることができる（Holsters et al., 1978）。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウム菌は、ｖｉｒ領域を運ぶプラスミドを含むものとする。ｖｉｒ領域は、植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移入のために必要である。さらなるＴ−ＤＮＡが含まれてもよい。そのように形質転換される細菌は、植物細胞の形質転換のために用いられる。植物外植片は、植物細胞へのＤＮＡの移入のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と都合よく培養することができる。次いで、選択のための抗生物質または生物致死剤を含んでもよい適する培地で、感染植物材料（例えば、葉片、茎、根の断片だけでなく、プロトプラストまたは懸濁培養細胞も）から完全体植物を再生させることができる。次いで、そのように得られる植物は、挿入されたＤＮＡの存在について試験することができる。注射およびエレクトロポレーションの場合、プラスミドに特別に要求されるものはない。通常のプラスミド、例えばｐＵＣ派生体を用いることができる。
【００６３】
形質転換細胞は、植物内で通常の方法で増殖する。それらは胚細胞を形成することができ、形質転換形質（複数可）を後代植物へ伝えることができる。そのような植物は通常の方法で生育させること、および同じ形質転換遺伝因子または他の遺伝因子を有する植物と交配することができる。生じる雑種個体は、対応する表現型特性を有する。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態では、植物は、コドン使用頻度が植物のために最適化されている遺伝子で形質転換される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８０，８３１号を参照。一部のトランケーションされた毒素が本明細書で例示されるが、１３０ｋＤａ型（完全長）毒素がコア毒素であるＮ末端半分およびプロトキシン「尾部」であるＣ末端半分を有することは、Ｂｔ技術の分野では周知である。したがって、適当な「尾部」を、本発明のトランケーションされた／コア毒素と共に用いることができる。例えば米国特許第６，２１８，１８８号および米国特許第６，６７３，９９０号を参照。さらに、植物で使用するための合成Ｂｔ遺伝子の作製方法が当技術分野で公知である（Stewart and Burgin, 2007）。好ましい形質転換植物の１つの非限定例は、植物にて発現可能なＣｒｙ１Ａｂタンパク質コード遺伝子を含み、さらに第二の、植物にて発現可能なＣｒｙ１Ｂｅタンパク質コード遺伝子を含む稔性のメイズ植物である。
【００６５】
近交系メイズ系統へのＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｂｅ決定形質（複数可）の移入（または遺伝子移入）は、回帰性の選抜育種、例えば戻し交配によって達成することができる。この場合には、所望の反復親が、Ｃｒｙ１ＡおよびＣｒｙ１Ｂｅ決定形質のための適当な遺伝子（複数可）を運ぶドナーの近交系（一回親）と先ず交配される。この交配の後代は、次に反復親と戻し交配され、続いて生じる後代において、一回親から移される所望の形質（複数可）について選択される。所望の形質（複数可）の選択によって反復親との３世代、好ましくは４世代、より好ましくは５世代以上の戻し交配の後、後代は移入される形質（複数可）を支配する遺伝子座がヘテロ接合的になるが、他のほとんどまたはほとんど全ての遺伝子については反復親と同様である（例えば、Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175、Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376を参照）。
【００６６】
昆虫抵抗性対応（ＩＲＭ）戦略。
例えばRoush et al.は、「ピラミッド化」または「スタッキング」とも呼ばれる、殺虫性トランスジェニック作物についての対応のための２毒素戦略を概説している。（The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786）。
【００６７】
米国環境保護庁は、そのウェブサイト（epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips bt_corn_refuge_2006.htm）で、標的有害生物に対して活性である単一のＢｔタンパク質を生成するトランスジェニック作物で用いるための非トランスジェニック（すなわち、非Ｂ．ｔ．）緩衝帯（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区域）を提供するための以下の要件を公表する。
「コーンボーラー保護Ｂｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品の特定の構造化要件は、以下の通りである：
構造化緩衝帯：
コーンベルトで２０％の非鱗翅目Ｂｔトウモロコシ緩衝帯；
コットンベルトで５０％の非鱗翅目Ｂｔ緩衝帯
ブロック
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大にするためにＢｔ圃場から１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内に別個の圃場）
圃場内の帯状地
幼虫の移動の影響を低減するために、帯状地は少なくとも４条（好ましくは６条）の幅でなければならない」
【００６８】
さらに、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｎ  Ｇｒｏｗｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎも、そのウェブサイト：（ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn）で、緩衝帯要件に関して類似した指針を提供する。例えば以下である：
「コーンボーラーＩＲＭの要件：
・トウモロコシ畑地の少なくとも２０％に緩衝帯雑種を植える
・綿花生産地では、緩衝帯は５０％でなければならない
・緩衝帯雑種の１／２マイル以内に植えなければならない
・緩衝帯は、Ｂｔ圃場内に帯状地として植えることができる；緩衝帯の帯状地は少なくとも４条の幅でなければならない
・標的昆虫の経済的許容限界に到達する場合だけ、緩衝帯を従来の殺虫剤で処理することができる
・Ｂｔベースの噴霧可能な殺虫剤を緩衝帯トウモロコシで用いることはできない
・Ｂｔトウモロコシのあらゆる農場に適当な緩衝帯を設けなければならない」
【００６９】
Roush et al.（例えば、１７８０頁および１７８４頁の右欄）によって述べられているように、標的有害生物に各々有効で、ほとんど又は全く交差抵抗性のない２つの異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小さな緩衝帯の使用を可能にする。成功したスタックは、緩衝帯１０％未満の緩衝帯サイズが、単一（非ピラミッド化）形質のための約５０％の緩衝帯と同等の抵抗性対応を提供することができることをＲｏｕｓｈは示唆する。今日利用できるピラミッド化Ｂｔトウモロコシ製品については、米国環境保護庁は単一形質製品（一般に２０％）についてよりもかなり低く（一般に５％）構造化された非Ｂｔトウモロコシの緩衝帯を設けることを要求している。
【００７０】
Roush et al.（前掲）および米国特許第６，５５１，９６２号によってさらに論じられているように、圃場での様々な幾何学的栽植様式（上記のような）および袋入種子混合物を含む、緩衝帯のＩＲＭ効果を提供する様々な方法がある。
【００７１】
上記の百分率または類似した緩衝帯比率は、対象の二重または三重のスタックまたはピラミッドのために用いることができる。単一の標的有害生物に対して３つの作用部位を有する三重スタックについては、目標は緩衝帯がゼロ（または、例えば５％未満の緩衝帯）である。これは、例えば１０エーカー以上の商業用の土地に特にあてはまる。
【００７２】
本明細書で参照または引用される全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらがこの明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、参照により全体が組み込まれる。
【００７３】
具体的に示されるか含意されない限り、本明細書で用いられるように、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は「少なくとも１つ」を示す。
【００７４】
以下は、本発明を実施するための手法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきでない。特記されない限り全ての百分率は重量によるものであり、全ての溶媒混合割合は容量によるものである。全ての温度は、摂氏温度である。
【実施例１】
【００７５】
Ｃｒｙタンパク質の１２５Ｉ標識
Ｃｒｙ毒素のヨウ素化。
Ｉｏｄｏ−ＢｅａｄまたはＩｏｄｏ−ｇｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、精製されたトランケーション化Ｃｒｙ毒素をヨウ素化した。簡潔には、２つのｌｏｄｏ−Ｂｅａｄを５００μｌのリン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、鉛シールドの裏で１．５ｍｌ遠心管に入れた。これに、１００μｌのＰＢＳを加えた。フード内で、および適切な放射能取扱い技術を用いることにより、０．５ｍＣｉ  Ｎａ１２５Ｉ（１７．４Ｃｉ／ｍｇ、Ｌｏｔ０１１４、Ａｍｅｒｓｈａｍ）をＩｏｄｏ−Ｂｅａｄを有するＰＢＳ溶液に加えた。構成成分を室温で５分間反応させ、次に高度に純粋なトランケーション化Ｃｒｙタンパク質の２〜２５μｇをその溶液に加え、さらなる３〜５分間反応させた。Ｉｏｄｏ−Ｂｅａｄから溶液を取り出し、それをＰＢＳで平衡させた０．５ｍｌの脱塩Ｚｅｂａスピンカラム（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に加えることによって、反応を停止した。Ｉｏｄｏ−Ｂｅａｄを各々１０μｌのＰＢＳで２回洗浄し、洗浄溶液も脱塩カラムに加えた。放射性溶液を１，０００×ｇで２分間の遠心によって脱塩カラムを通して溶出した。Ｃｒｙ１Ｄａの場合、放射能標識法を行うためにｌｏｄｏ−ｇｅｎ法を用いた。この手法を用いて、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）中のＣｒｙ毒素を小さな０．５ｍｌポリミキシンカラムに複数回通すことによって、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を先ず除いた。Ｉｏｄｏ−ｇｅｎチューブ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）に２０μｇの無ＬＰＳのＣｒｙ１Ｄａ毒素を加え、次に０．５ｍＣｉのＮａ１２５Ｉを加えた。反応混合液を２５℃で１５分間振盪させた。溶液をチューブから取り出し、５０μｌの０．２Ｍの非放射性標識ＮａＩを加えて反応をクエンチした。緩衝液を３回交換してタンパク質をＰＢＳに対して透析し、未結合の１２５Ｉを除去した。
【００７６】
ヨウ素化されたＣｒｙタンパク質の放射純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、蛍光画像化およびガンマ計数によって測定した。簡潔には、２μｌの放射性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分離後、製造業者の説明書に従ってＢｉｏＲａｄゲル乾燥装置を用いてゲルを乾燥させた。マイラー膜（厚さ１２μｍ）で包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ保存蛍光スクリーン（３５ｃｍ×４３ｃｍ）の下でそれらを１時間露光させることによって、乾燥ゲルを画像化した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ８２０蛍光造影装置を用いてプレートを現像し、その画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアを用いて分析した。放射性バンドと一緒にバンドの直ぐ上下の領域をかみそりの刃を用いてゲルから切断し、ガンマ計数器で計数した。放射能は、Ｃｒｙタンパク質バンドおよびバンドの下の領域で検出されただけであった。放射能はバンドより上で検出されず、全ての放射性汚染物質がトランケーション化Ｃｒｙタンパク質よりも小さなタンパク質構成成分からなることを示した。これらの構成成分は、分解生成物を表す可能性が高い。
【実施例２】
【００７７】
ＢＢＭＶ調製プロトコル
可溶性ＢＢＭＶの調製および分画。
終齢スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）またはヘレオチス・ゼア（Heleothis zea）幼虫を一晩絶食させ、次いで、翌朝、氷の上で１５分間冷やしたのちに解剖した。中腸組織を体腔から取り出し、外皮に接着した後腸を残した。中腸を、仕入先の推奨通りに希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル１（ＳｉｇｍａＰ−２７１４）を補充した、９倍容量の氷冷ホモジナイゼーション緩衝液（３００ｍＭマンニトール、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１７ｍＭトリス、塩基、ｐＨ７．５）に入れた。１５ストロークのガラス組織ホモジナイザーで組織をホモジナイズした。Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒ（１９９３）のＭｇＣｌ２沈殿法によってＢＢＭＶを調製した。簡潔には、３００ｍＭマンニトール中の等量の２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液を中腸ホモジネートと混合し、５分間撹拌し、氷上で１５分間静置させた。４℃で１５分間、２，５００×ｇで溶液を遠心分離した。上清を保存し、元の容量の０．５倍希釈のホモジナイゼーション緩衝液にペレットを懸濁して再び遠心分離した。２つの上清を合わせ、４℃で３０分間、２７，０００×ｇで遠心分離してＢＢＭＶ分画を形成した。ペレットを１０ｍｌホモジナイゼーション緩衝液に懸濁し、プロテアーゼ阻害剤を追加し、４℃で３０分間、２７，０００×ｇで再び遠心分離してＢＢＭＶを洗浄した。生じたペレットをＢＢＭＶ保存緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁して、約３ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度にした。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法（１９７６）を用いることによって測定した。製造業者の説明書に従ってＳｉｇｍａアッセイを用いて、試料を凍結させる前にアルカリ性ホスファターゼの測定を行った。ＢＢＭＶ分画中のこのマーカー酵素の比活性は、中腸ホモジネート分画で見られるものと比較して一般的に７倍増加した。ＢＢＭＶを２５０μｌの試料に等分し、液体Ｎ２で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。
（１カクテル構成成分の最終濃度（μΜ）は、ＡＥＢＳＦ（５００）、ＥＤＴＡ（２５０ｍＭ）、ベスタチン（３２）、Ｅ−６４（０．３５）、ロイペプチン（０．２５）およびアプロチニン（０．０７５）である。）
【実施例３】
【００７８】
ＢＢＭＶタンパク質への１２５Ｉ  Ｃｒｙタンパク質の結合を測定する方法
ＢＢＭＶへのｌ２５Ｉ  Ｃｒｙタンパク質の結合。
結合アッセイで用いるＢＢＭＶタンパク質の最適量を決定するために、飽和曲線を作成した。１２５Ｉ放射性標識Ｃｒｙタンパク質（０．５ｎＭ）を、結合緩衝液（８ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中に０〜５００μｇ／ｍｌの様々な量のＢＢＭＶタンパク質と、２８℃で１時間インキュベートした。全容量は、０．５ｍｌであった。１．５ｍｌ遠心管から５００μｌ遠心管に反応混合液の１５０μｌを３つ組で採取し、室温で６分間、１４，０００×ｇで試料を遠心分離することによって、結合した１２５Ｉ  Ｃｒｙタンパク質を未結合のものから分離した。上清を静かに除去し、氷冷結合緩衝液でペレットを３回静かに洗浄した。ペレットを含む遠心器の底を切り取り、１３×７５ｍｍガラス培養試験管に入れた。試料をガンマ計数器でそれぞれ５分間計数した。試料に含まれる計数をバックグラウンド計数（タンパク質なしでの反応）から差し引き、ＢＢＭＶタンパク質濃度に対してプロットした。用いるタンパク質の最適量は、０．１５ｍｇ／ｍｌのＢＢＭＶタンパク質であると決定された。
【００７９】
結合動態を決定するために、飽和曲線を作成した。簡潔には、ＢＢＭＶ（１５０μｇ／ｍｌ）を、０．０１から１０ｎＭの範囲で１２５Ｉ  Ｃｒｙ毒素の濃度を増加させてと２８℃で１時間インキュベートした。各濃度の１５０μｌを３つ組で採取し、試料の遠心および計数は前記の通りに実行して、全結合を測定した。全ての非特異的受容体結合部位を飽和させるために反応混合液に、１，０００ｎＭの相同トリプシン処理非放射性Ｃｒｙ毒素を添加することにより、非特異的結合を同様に測定した。特異的結合を、全結合と非特異的結合との間の差として計算した。
【００８０】
相同的および非相同的競合結合アッセイを、１５０μｇ／ｍｌのＢＢＭＶタンパク質および０．５ｎＭの１２５Ｉ放射性標識Ｃｒｙタンパク質を用いて実施した。真の結合競合を保証するために、反応混合液に加えた競合的非放射性標識Ｃｒｙ毒素の濃度は０．０４５から１，０００ｎＭであり、放射性リガンドと同時に加えた。インキュベーションは２８℃で１時間実施し、その受容体毒素に結合した１２５Ｉ  Ｃｒｙタンパク質の量を、前記のように非特異的結合を差し引いて測定した。１００パーセントの全結合は、全ての競合リガンドの非存在下で測定した。加えた競合的リガンドの濃度に対する全特異的結合の百分率として、結果を片対数グラフにプロットした。
【実施例４】
【００８１】
結果の要約
図１は、非標識の相同的Ｃｒｙ１Ａｂ（◆）および非相同的Ｃｒｙ１Ｂｅ（●）による競合に対する、ＥＣＢ由来ＢＢＭＶにおける１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ａｂ（０．５ｎＭ）の特異的結合の百分率を示す。Ｃｒｙ１Ａｂによる相同的競合の置換曲線は、約０．５ｎＭのＣｒｙ１Ａｂで放射性リガンドの５０％の置換を示すＳ字形の曲線をもたらす。Ｃｒｙ１Ｂｅは１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｂｅをその結合部位から置換もするが、１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ａｂの５０％をその結合部位から置換するために、約４０ｎＭの濃度（Ｃｒｙ１Ａｂによって必要とされるより８０倍高い）を必要とする。
図２は、非標識の相同的Ｃｒｙ１Ａｂ（◆）および非相同的Ｃｒｙ１Ｂｅ（●）による競合に対する、ＦＡＷ由来ＢＢＭＶにおける１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ａｂ（０．５ｎＭ）の特異的結合の百分率を示す。Ｃｒｙ１Ａｂによる相同的競合の置換曲線は、約０．３ｎＭのＣｒｙ１Ａｂで放射性リガンドの５０％の置換を示すＳ字形の曲線をもたらす。Ｃｒｙ１Ｂｅは約３００ｎＭの濃度で１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ａｂを５０％置換し、すなわちＣｒｙ１Ａｂによって必要とされるよりも約１，０００倍多い。エラーバーは、２つ組の測定から得られた値域を表す。
【００８２】
図３は、非標識の相同的Ｃｒｙ１Ｂｅ（●）および非相同的Ｃｒｙ１Ａｂ（◆）による競合に対する、ＦＡＷ由来ＢＢＭＶにおける１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｂｅ（０．５ｎＭ）の特異的結合の百分率を示す。Ｃｒｙ１Ｂｅによる相同的競合の置換曲線は、約２ｎＭのＣｒｙ１Ｂｅで放射性リガンドの５０％の置換を示すＳ字形の曲線をもたらす。１，０００ｎＭの濃度のＣｒｙ１Ａｂは（置換される１２５Ｉ  Ｃｒｙ１Ｂｅより２，０００倍多い）、約５０％の置換をもたらす。Ｃｒｙ１Ｂｅの結合に対する競合するために、Ｃｒｙ１Ａｂの親和性は約５００倍低い。エラーバーは３つ組の測定から得られた値域を表す。
【００８３】
【化１】
0005907892.tif 000003
【００８４】
【表２−１】
0005907892.tif 000004
【表２−２】
0005907892.tif 000005
【表２−３】
0005907892.tif 000006
【表２−４】
0005907892.tif 000007
【表２−５】
0005907892.tif 000008
【表２−６】
0005907892.tif 000009
【表２−７】
0005907892.tif 000010
【表２−８】
0005907892.tif 000011
【表２−９】
0005907892.tif 000012
【表２−１０】
0005907892.tif 000013
【表２−１１】
0005907892.tif 000014
【表２−１２】
0005907892.tif 000015
【表２−１３】
0005907892.tif 000016
【００８５】
【表３−１】
0005907892.tif 000017
【表３−２】
0005907892.tif 000018
【表３−３】
0005907892.tif 000019
【図１】
0005907892.tif 000020
【図２】
0005907892.tif 000021
【図３】
0005907892.tif 000022
【配列表】
0005907892000001.app