【手続補正書】
【提出日】平成23年3月8日(2011.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能な遺伝子発現構築物であって、
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、該リボスイッチがスプライス部位での該ＲＮＡのスプライシングを調節し、該リボスイッチと該コード領域とが異種である、調節可能な遺伝子発現構築物。
【請求項２】
前記リボスイッチが、オルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節するか；
前記リボスイッチが、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインと該発現プラットフォームドメインとが異種であるか；または
前記リボスイッチが、オルタナティブスプライシングを調節することと、該リボスイッチが、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインと該発現プラットフォームドメインとが異種であることとの組み合わせである、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記ＲＮＡがイントロンをさらに含む、請求項１から２のいずれか１項に記載の構築物であって、そして
前記発現プラットフォームドメインが該イントロン中にオルタナティブスプライスジャンクションを含むか；
前記発現プラットフォームドメインが該イントロンの末端にスプライスジャンクションを含むか；または
前記発現プラットフォームドメインが該イントロン中にオルタナティブスプライスジャンクションを含むことと、該発現プラットフォームドメインが該イントロンの末端にスプライスジャンクションを含むこととの組み合わせである、構築物。
【請求項４】
前記オルタナティブスプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化される場合に活性であるか；または前記オルタナティブスプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化されない場合に活性である、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、請求項１から４のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項６】
前記トリガー分子がＴＰＰである、請求項５に記載の構築物。
【請求項７】
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、請求項１から６のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項８】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化するか；または前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、請求項１から７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項９】
ＲＮＡが分岐構造を有するか；
前記ＲＮＡがｐｒｅ−ｍＲＮＡであるか；または
ＲＮＡが分岐構造を有することと、該ＲＮＡがｐｒｅ−ｍＲＮＡであることとの組み合わせである、請求項１から８のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１０】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメインの領域がＰ４ステムおよびＰ５ステム中に存在する、請求項２から９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１１】
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメインの領域がループ５中にも存在するか；
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメイの領域がステムＰ２中にも存在するか；または
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメインの領域がループ５中にも存在することと、該スプライシング調節を有する前記アプタマードメイの領域がステムＰ２中にも存在することとの組み合わせである、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
前記スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在するか；または前記スプライス部位が配列ＧＵＡに続く、請求項２から１１のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１３】
ＲＮＡのスプライシングを調節するための組成物であって、リボスイッチを含む該ＲＮＡに導入されるべき構築物を含み、該リボスイッチがスプライス部位においてＲＮＡのスプライシングを調節することができる、組成物。
【請求項１４】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインと該発現プラットフォームドメインとが異種であるか；
前記リボスイッチが前記ＲＮＡのイントロンにあるか；または
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインと該発現プラットフォームドメインとが異種であることと、該リボスイッチが前記ＲＮＡのイントロンにあることとの組み合わせである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、請求項１３から１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記トリガー分子がＴＰＰである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化するか；または前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記スプライシングが天然に起こらない、請求項１３から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメインの領域がループ５中に存在するか；
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメインの領域がステムＰ２中に存在するか；または
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメインの領域がループ５中に存在することと、該スプライシング調節を有する前記アプタマードメインの領域がステムＰ２中に存在することとの組み合わせである、請求項１４から１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在するか；または前記スプライス部位が前記アプタマードメイン中の前記配列ＧＵＡに続く、請求項１４から２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
真菌増殖を阻害するための組成物であって、
ＴＰＰ応答性リボスイッチを阻害し、それにより、真菌増殖を阻害する有効量の化合物を含む、組成物。
【請求項２３】
前記真菌増殖の阻害が、真菌バイオマスを１０％以上減少させることを含む、請求項２２に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
発明の概要
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチとコード領域とが異種である、調節可能な遺伝子発現構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、ＲＮＡのオルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインと発現プラットフォームドメインとは異種である。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロン中にオルタナティブスプライスジャンクションを含む。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロンの末端にスプライスジャンクション（すなわち、５’スプライスジャンクションまたは３’スプライスジャンクション）を含む。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロン中に分岐部位を含む。オルタナティブスプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化される場合に活性であり得る。オルタナティブスプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化されない場合に活性であり得る。リボスイッチを、トリガー分子（チアミンピロリン酸（ＴＰＰ））によって活性化することができる。リボスイッチはＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。ＲＮＡは分岐構造を有することができる。ＲＮＡはｐｒｅ−ｍＲＮＡであり得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、Ｐ４ステムおよびＰ５ステム中に存在し得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中にも見出すことができる。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。したがって、例えば、発現プラットフォームドメインは、Ｐ４およびＰ５配列、ループ５配列、および／またはＰ２配列と相互作用することができる。かかるアプタマー配列は、一般に、トリガー分子がアプタマードメインに結合しない場合に限り、発現プラットフォームドメインとの相互作用のために利用可能であり得る。スプライス部位および／または分岐部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在することができる。スプライス部位は、例えば、配列ＧＵＡに続くことができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができる導入工程を含む、ＲＮＡのスプライシングを調節する方法も開示する。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインと発現プラットフォームドメインとが異種である。リボスイッチはＲＮＡのイントロンにあり得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。スプライシングは非天然に起こり得る。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在することができる。スプライス部位は、例えば、アプタマー中の配列ＧＵＡに続くことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本明細書中に組み込まれ、且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、記載と共に、開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
調節可能な遺伝子発現構築物であって、
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、該リボスイッチが該ＲＮＡのスプライシングを調節し、該リボスイッチと該コード領域とが異種である、調節可能な遺伝子発現構築物。
（項目２）
オルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節する、項目１に記載の構築物。
（項目３）
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインと該発現プラットフォームドメインとが異種である、項目１または項目２に記載の構築物。
（項目４）
前記ＲＮＡがイントロンをさらに含み、前記発現プラットフォームドメインが該イントロン中にオルタナティブスプライスジャンクションを含む、項目１から３のいずれか１項に記載の構築物。
（項目５）
前記ＲＮＡがイントロンをさらに含み、前記発現プラットフォームドメインが該イントロンの末端にスプライスジャンクションを含む、項目１から４のいずれか１項に記載の構築物。
（項目６）
前記オルタナティブスプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化される場合に活性である、項目４または項目５に記載の構築物。
（項目７）
前記オルタナティブスプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化されない場合に活性である、項目４または項目５に記載の構築物。
（項目８）
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、項目１から７のいずれか１項に記載の構築物。
（項目９）
前記トリガー分子がＴＰＰである、項目８に記載の構築物。
（項目１０）
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、項目１から９のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１１）
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化する、項目１から１０のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１２）
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、項目１から１０のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１３）
ＲＮＡが分岐構造を有する、項目１から１２のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１４）
前記ＲＮＡがｐｒｅ−ｍＲＮＡである、項目１から１３のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１５）
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がＰ４ステムおよびＰ５ステム中に存在する、項目３から１３のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１６）
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中にも存在する、項目１５に記載の構築物。
（項目１７）
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中にも存在する、項目１５または項目１６に記載の構築物。
（項目１８）
前記スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在する、項目３から１７のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１９）
前記スプライス部位が配列ＧＵＡに続く、項目３から１７のいずれか１項に記載の構築物。
（項目２０）
ＲＮＡのスプライシングを調節する方法であって、該ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程を含み、該リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができる、方法。
（項目２１）
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインと該発現プラットフォームドメインとが異種である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記リボスイッチが前期ＲＮＡのイントロンにある、項目２０または項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、項目２０から２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記トリガー分子がＴＰＰである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、項目２０から２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化する、項目２０から２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、項目２０から２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記スプライシングが天然に起こらない、項目２０から２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中に存在する、項目２１から２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中に存在する、項目２１から２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在する、項目２１から３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記スプライス部位が前記アプタマードメイン中の前記配列ＧＵＡに続く、項目２１から３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
真菌増殖を阻害する方法であって、
（ａ）真菌感染した被験体を同定する工程、
（ｂ）ＴＰＰ応答性リボスイッチを阻害する有効量の化合物を該被験体に投与し、それにより、真菌増殖を阻害する工程、
を含む、方法。
（項目３４）
前記真菌増殖の阻害が、真菌バイオマスを１０％以上減少させる工程を含む、項目３３に記載の方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
Ａ．リボスイッチ
リボスイッチは、発現するＲＮＡ分子の一部であり、トリガー分子によって結合した場合に状態が変化する発現調節エレメントである。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォームドメイン）である。遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節されるこれらの２ドメイン間の動的相互作用がもたらされる。単離および組換えリボスイッチ、かかるリボスイッチを含む組換え構築物、かかるリボスイッチに作動可能に連結された異種配列、かかるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに異種配列に作動可能に連結されたリボスイッチを開示する。異種配列は、例えば、目的のタンパク質またはペプチド（レポータータンパク質またはペプチドが含まれる）をコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチであり得るか、これに由来し得る。例えば、アプタマードメインは、天然に存在するリボスイッチのアプタマードメインであり得るか、これに由来し得る。リボスイッチは、人工アプタマーを含むか、任意選択的に排除することができる。例えば、人工アプタマーには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を介してデザインまたは選択されるアプタマーが含まれる。リボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス配列を含むことができる。種々のリボスイッチのコンセンサス配列は、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号に記載されている（図１１中など）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチとコード領域とが異種である、調節可能な遺伝子発現構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、ＲＮＡのオルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインと発現プラットフォームドメインとは異種である。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロン中またはイントロンの末端（すなわち、５’スプライスジャンクションまたは３’スプライスジャンクション）にオルタナティブスプライスジャンクションを含む。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロン中に分岐部位を含む。オルタナティブスプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化される場合、または活性化されない場合に活性であり得る。リボスイッチを、トリガー分子（チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）など）によって活性化することができる。リボスイッチはＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
異種アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチを開示する。すなわち、キメラリボスイッチは、ある供給源由来のアプタマードメインおよび別の供給源由来の発現プラットフォームドメインから構成される。異種供給源は、例えば、異なる特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。異種アプタマーは、非リボスイッチアプタマーにも由来し得る。異種発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源にも由来し得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
異種リボスイッチおよびコード領域を含むＲＮＡ分子を開示する。すなわち、かかるＲＮＡ分子は、ある供給源由来のリボスイッチおよび別の供給源由来のコード領域から構成される。異種供給源は、例えば、異なるＲＮＡ分子、異なる転写物、異なる遺伝子由来のＲＮＡまたは転写物、異なる細胞由来のＲＮＡまたは転写物、異なる生物由来のＲＮＡまたは転写物、異なる種由来のＲＮＡまたは転写物、天然の配列および人工または操作された配列、特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
２．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源（例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノム）、または異種哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：  １１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：  ３５５−３６０（１９８２））。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
方法
ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができる、導入工程を含む、ＲＮＡのスプライシングを調節する方法を本明細書中に開示する。リボスイッチは、例えば、オルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインが異種である。リボスイッチはＲＮＡのイントロンにあり得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを抑制することができる。スプライシングは非天然で起こり得る。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在することができる。スプライス部位は、例えば、アプタマー中の配列ＧＵＡに続くことができる。