(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌特異遺伝子であるテロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）ｍＲＮＡ（配列番号１）に作用する、トランススプライシングリボザイム−単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）複合体をコードするポリヌクレオチド及び可溶性プログラムされた細胞死１（ｓＰＤ−１）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノウィルス。
【請求項２】
前記複合体をコードするポリヌクレオチドは、トランススプライシングリボザイムをコードする配列番号２の塩基配列と、ＨＳＶｔｋをコードする配列番号３のポリヌクレオチドを含むものである請求項１に記載の組換えアデノウィルス。
【請求項３】
前記可溶性プログラムされた細胞死１（ｓＰＤ−１）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４の塩基配列を含むポリヌクレオチドである請求項１に記載の組換えアデノウィルス。
【請求項４】
請求項１から請求項３のうちのいずれか一項に記載の組換えアデノウィルスを有効成分として含む癌予防または治療用薬学組成物。
【請求項５】
薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランススプライシングリボザイム及び癌治療遺伝子を含む組換えアデノウィルス及びこの用途に係り、さらに詳しくは、本発明は、癌特異遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム−ＨＳＶｔｋ複合体をコードするポリヌクレオチド及び癌治療遺伝子を含む組換えアデノウィルス、前記組換えアデノウィルスを有効成分として含む癌予防または治療用薬学組成物及び前記組換えアデノウィルスまたは薬学組成物を治療を必要とする個体に投与するステップを含む癌を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は韓国内で死亡原因の１位を占める重大疾患であり、癌を克服するための数多くの研究がなされてきているが、未だに克服されていない難治病である。癌に対する既存の治療法としては、手術、化学療法及び放射線治療などが挙げられるが、それぞれの方法に限界が多いため、最近ではこれらの治療法とは概念が異なる治療法が研究されているが、中でも、遺伝子治療法に関する研究が盛んになされている。
【０００３】
遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）とは、通常の方法では治療し難い先天的または後天的な遺伝子異常を遺伝工学的な方法により治療する方法のことをいう。具体的には、遺伝子治療は、先天的または後天的な遺伝子欠陥、ウィルス性疾病、癌または心血管系疾患などの慢性疾患の治療と予防のために、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの遺伝物質を人体内に投与して治療タンパク質を発現させたり、特定のタンパク質の発現を抑制したりする治療方法であり、疾病の原因を遺伝子次元で解析して根本的に治療することができることから、難治病の克服はもとより、既存の医療方式の代替手段として期待されている方法である。
【０００４】
癌に対する遺伝子治療は、人体内の免疫反応を誘導する免疫学的遺伝子治療法と、用いられた遺伝子が直接的に癌細胞を破壊したり死滅を誘導したりする遺伝子治療法とに大別できる。後者の場合には、遺伝子を細胞内に運んで発現させるベクターの役割が非常に重要であるが、アデノウィルスベクターは、遺伝子伝達の高い効率、未分化細胞への遺伝子伝達能及び高い力価のウィルス貯蔵物の製造しやすを有することから、最も有望な遺伝子治療用ベクターのうちの一つとして認められている。
【０００５】
一般的に用いられる遺伝子治療用アデノウィルスベクターは、複製に欠かせない一連の遺伝子を削除し、プロモータ活性のレベルが高いサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）またはラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモータを入れて治療目的タンパク質を生体内に高い効率で発現させる。
【０００６】
最近では、遺伝子治療に活用可能な標的遺伝子の多くが、活発な細胞分裂をする一般細胞にも発現することに起因して発生する副作用を低減するための努力の一環として、癌細胞に特異的な治療（ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）が試みられている（Ｆｕｋｕｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：  ３６３−３６９，  ２００４）。このために、ＣＭＶやＲＳＶの代わりに組織特異的なプロモータを用いる方法が考えられているが、特異性が高まる代わりに治療効能が低下するという欠点があるため、未だ実用レベルに至っていないのが現状である。
【０００７】
上記の欠点を解決するために、最近、組織特異的プロモータ以外の因子を用いて組織特異的な癌治療用アデノウィルスを開発しようとする研究が行われているが、代表的なものとして、トランススプライシングリボザイムなどを用いる方法が開発されている。
【０００８】
前記トランススプライシングリボザイムを用いた組織特異的な癌治療用アデノウィルスの開発に関する研究は、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からのグループＩイントロンリボザイムが実験管内だけではなく、バクテリア、さらには、人体細胞内でトランススプライシング反応を行うことにより別々に存在する二つの転写体を互いに連結することができるということが判明されて始めて注目を集めることになった。
【０００９】
具体的には、このようなグループＩイントロンに基づくトランススプライシングリボザイムは、疾患と関連する遺伝子転写体または疾病細胞でのみ特異的に発現される特定のＲＮＡを標的として、これらを正常なＲＮＡに修正したり新たな治療用遺伝子転写体に置換するように再プログラムを誘発したりすることができて、疾患特異的であり、且つ、安全な遺伝子治療技術になり得る見込みである。なお、トランススプライシングリボザイムは、疾患特異ＲＮＡを除去するとともに、我々が希望する治療用遺伝子産物の発現を誘導することができるので、治療効果を倍加させることができる。
【００１０】
とりわけ、最近の研究において、癌組織において特異的に作用し得るヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ：ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を標的とするトランススプライシングリボザイムが知られるに伴い、これを用いた癌治療剤を開発しようとする試みが盛んに行われているが、未だにこれといった結果は知られていない。
【００１１】
遺伝子治療方法に用いられる治療用遺伝子としては、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（以下、ＨＳＶｔｋと略称する）、大腸菌のシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）及び大腸菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下、ＰＮＰと略称する）遺伝子などが知られている。これらを用いた遺伝子治療は、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ｇｅｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ；ＧＤＥＰＴ）と呼ばれ、いずれもプロドラッグを用いるという共通点がある。ＧＤＥＰＴに用いられるプロドラッグとしては、ガンシクロビル（ＧＣＶ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及び６−メチルフリン−２−デオキシリボシド（６−ＭｅＰ−ｄＲ）がそれぞれＨＳＶ−ＴＫ、ＣＤ及びＰＮＰと併用されている。細胞毒性がないプロドラッグは、導入された遺伝子によって細胞に毒性がある薬物に変換されるが、主としてリン酸化によって活性が生じる。自殺遺伝子を用いた遺伝子療法のメリットは、これらの遺伝子が導入された細胞で活性化された薬物によって隣の細胞も死滅させるいわゆる傍観者効果が大きいということであるが、これは、遺伝子の導入効率が低い状態で取り得る最善の戦略といわれる技術である。
【００１２】
このような遺伝子治療戦略においてＨＳＶｔｋを用いることはかなり普遍化されている。具体的には、ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶシステムは、自殺遺伝子療法のうち最も広く用いられる方法の一つであり、ＷＯ９０／０７９３６、ＵＳ５，８３７，５１０、ＵＳ５，８６１，２９０、ＷＯ９８／０４２９０、ＷＯ９７／３７５４２及びＵＳ５，６３１，２３６などに開示されている。ＨＳＶｔｋ遺伝子を発現する細胞はガンシクロビル（ＧＣＶ）をリン酸化させることができ、その結果、ＤＮＡを複製する作用を妨げて、細胞死滅を誘導することができる。この方法は、現在、様々なヒト癌の遺伝子治療時に、３０種類以上の臨床試験に用いられている。しかしながら、これもまた増殖する細胞しか死滅させることができず、卓越した傍観者効果を有しておらず、多量使用時に細胞毒性問題も引き起こすことが懸念されるという問題点を有しているため、現在は、細胞死滅効果と傍観者効果を向上させるために２種類以上のプロドラッグを用いて癌を克服しようとする研究が盛んに行われている。
【００１３】
一方、プログラムされた細胞死１（ＰＤ−１：ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１）は、５５ｋＤａの第Ｉ型硬膜タンパク質であって、Ｉｇ相関遺伝子の一部を構成しており、免疫グロブリン分子群に属するＴ細胞の補助阻害分子としてよく知られている。すなわち、ＰＤ−１は、活性化したＢ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞上に発現される受容体のＣＤ２８群（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡを含む）に属する抑制因子の一員である。ＰＤ−１に対するリガンドとしてはＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２があり、これらはＰＤ−１と結合するときにＴ細胞の活性化を下向き調節することが知られている。ＰＤ−１は、通常のＴ細胞では正常状態であるときに発現されておらず、前記細胞が活性化すると初めて発現が増大することが知られている。また、ＰＤ−Ｌ１は、多数のヒト癌で多量に発見され、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用は、Ｔ細胞に刺激または抑制信号を伝達する。すなわち、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用によって、腫瘍侵襲性リンパ球が減り、Ｔ細胞受容体媒介増殖が減少し、癌細胞による免疫回避現象が発生する。したがって、最近の研究において、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の信号伝達を遮断することにより、抗癌免疫反応を効果的に誘導して、癌を治療しようとする研究が行われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、組織特異性と治療効能が同時に向上した癌治療遺伝子治療方案を開発するために鋭意研究を重ねた結果、癌組織特異的トランススプライシングリボザイム−ＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）複合体をコードするポリヌクレオチド及び癌治療遺伝子であるｓＰＤ−１遺伝子を含むようにデザインした組換えアデノウィルスが、癌組織に特異的な優れた治療効果を示すだけではなく、遺伝子治療による副作用を顕著に低減することができるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一つの目的は、癌特異遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイム−ＨＳＶｔｋ複合体をコードするポリヌクレオチド及び癌治療遺伝子を含む組換えアデノウィルスを提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記組換えアデノウィルスを有効成分として含む癌予防または治療用薬学組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記組換えアデノウィルスまたは薬学組成物を治療を必要とする個体に投与するステップを含む、ヒトを除く動物の癌を治療する方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の組換えアデノウィルスは、癌特異遺伝子に作用するトランススプライシングリボザイムによって、癌細胞に対する選択性を示すだけではなく、癌治療遺伝子による抗癌活性の向上を示すことから、癌の効果的な予防及び治療に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、マウスＴＥＲＴを標的とするトランススプライシングリボザイム（ｍＴＥＲＴ−ＴＲ）−ＨＳＶｔｋを示す概略図である。マウスＴＥＲＴ（ｍＴＥＲＴ）転写物の標的部位は、スプライシング部位辺りの配列で表示した。トランススプライシングリボザイムは、アンチセンスｍＴＥＲＴ  ＲＮＡ配列を用いてｍＴＥＲＴ  ＲＮＡを特異的に認識し、内部案内塩基配列（ＩＧＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｇｕｉｄｅｄ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の３’末端でｍＴＥＲＴ  ＲＮＡを切断する。トランススプライシングリボザイムのＨＳＶｔｋコーディングＲＮＡ部分の５’末端は、ｍＴＥＲＴ  ＲＮＡの切断された末端に連結される。ｍＴＥＲＴ標的ｍＲＮＡ及びリボザイム間の可能性ある塩基結合は、縦線で表示した。
【図２ａ】図２ａは、マウスＴＥＲＴ−ＴＲによるアデノウィルスＨＳＶｔｋ遺伝子発現の調節効果を示す。（ａ）Ｅ１／Ｅ３−欠乏性アデノウィルスであるＡｄ５ｍＴＲがマウスのＴＥＲＴ−ＴＲ調節下で、ＨＳＶｔｋを発現させた結果を示す。Ａｄ５ＭＯＣＫは、Ｅ１／Ｅ３−欠乏性アデノウィルスの対照群である。
【図２ｂ】図２ｂは、マウスＴＥＲＴ−ＴＲによるアデノウィルスＨＳＶｔｋ遺伝子発現の調節効果を示す。（ｂ）ＣＴ２６細胞（３×１０３）を９６ウェルプレートに接種した後、１００μＭのＧＣＶの存在下で様々なＭＯＩのＡｄ５ＭＯＣＫまたはＡｄ５ｍＴＲに露出させた結果を示す。細胞増殖分析キットを用いて感染３日目に細胞毒性を測定した結果を示す。資料は、３回分析実験に対する平均±標準偏差値で表示した。
【図２ｃ】図２ｃは、マウスＴＥＲＴ−ＴＲによるアデノウィルスＨＳＶｔｋ遺伝子発現の調節効果を示す。（ｃ）５×１０８ＰＦＵのＡｄ５ＭＯＣＫまたはＡｄ５ｍＴＲを注射し、ＧＣＶ（７５ｍｇ／ｋｇ）を一日につき２回ずつ腹腔注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの両側面にＣＴ２６細胞（１×１０６）を皮下接種させた結果を示す。資料は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）で表示した。
【図３ａ】図３ａは、ＨＳＶｔｋによって誘導された向上したＤＣ−媒介性抗原提示効果を示す。（ａ）Ｃ５７／ＢＬ６マウスのＥ．Ｇ７腫瘍にＡｄ５ＭＯＣＫまたはＡｄ５ｍＴＲを注射した。４日後に腫瘍を回収し、Ｈ＆Ｅ染色によって組織学的な分析を行った。
【図３ｂ】図３ｂは、ＨＳＶｔｋによって誘導された向上したＤＣ−媒介性抗原提示効果を示す。（ｂ）アデノウィルスを注射してから２日が経過した後、抗−ＣＤ１１ｃマイクロビードを用いたＭＡＣＳクロマトグラフィによってＥ．Ｇ７腫瘍周りの吸収性リンパノードからＤＣｓ（５×１０４）を回収した後、ＯＴ−１形質転換マウスからＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞と共同培養した。７２時間後に、培養上澄み液を回収し、ＩＦＮ−γの量を測定した。ＤＣ−Ａｄ５ＭＯＣＫは、Ａｄ５ＭＯＣＫが注射されたマウスから得たＤＣｓを示し、ＣＤ−Ａｄ５ｍＴＲは、Ａｄ５ｍＴＲが注射されたマウスから得たＤＣｓを示す。資料は、平均±標準偏差値で表示した。
【図４ａ】図４ａは、ｍＴＥＲＴ−ＴＲ−調節性ＨＳＶｔｋ及びｓＰＤ１−Ｉｇを発現させる二重−モジュールアデノウィルスの製造方法を示す。（ａ）Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１は、Ｅ１領域のＣＭＶプロモータの調節下でｍＴＥＲＴ−ＴＲ−ＨＳＶｔｋをコードし、Ｅ３領域のＥＦ１αプロモータの調節下でｓＰＤ１−Ｉｇをコードする。
【図４ｂ】図４ｂは、ｍＴＥＲＴ−ＴＲ−調節性ＨＳＶｔｋ及びｓＰＤ１−Ｉｇを発現させる二重−モジュールアデノウィルスの製造方法を示す。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞（４×１０５）に４８時間かけて２ＭＯＩのアデノウィルスを感染させ、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて破砕した後、免疫ブロット分析を行った。Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１（１レーン当たりにタンパク質８０μｇ）によるｓＰＤ１−Ｉｇ発現は、抗−ＰＤ１抗体を用いて確認した。
【図４ｃ】図４ｃは、ｍＴＥＲＴ−ＴＲ−調節性ＨＳＶｔｋ及びｓＰＤ１−Ｉｇを発現させる二重−モジュールアデノウィルスの製造方法を示す。（ｃ）リン酸化ＧＣＶにおけるＨＳＶｔｋ酵素活性は、放射性同位元素で標識されたＰＣＶ（１μＣｉ／ｍｌ）の蓄積量を測定することによってＣＴ２６細胞で評価した。資料は、３回分析実験に対する平均±標準偏差値で表示した。
【図４ｄ】図４ｄは、ｍＴＥＲＴ−ＴＲ−調節性ＨＳＶｔｋ及びｓＰＤ１−Ｉｇを発現させる二重−モジュールアデノウィルスの製造方法を示す。（ｄ）１０ＭＯＩのアデノウィルスで感染された細胞から回収された培養上澄み液にＯＴ−１マウスで精製されたＯＶＡ−特異的ＣＤ８Ｔ細胞（１×１０６）とＭＣ３８／ＯＶＡ細胞（１×１０４）の共同培養物を混合した。７２時間後に、培養上澄み液を回収し、ＩＦＮ−γレベルを測定した。資料は、平均±標準偏差値で表示した。
【図５ａ】図５ａは、マウスのＣＴ２６大腸癌細胞の表面でＰＤ−Ｌ１が発現されることを示す。ａ．総ＲＮＡは各細胞で製造され、ＰＤ−Ｌ１転写体はＲＴ−ＰＣＲによって検出された。マウスの肝癌細胞（Ｈｅｐａ−１）を比較群として用いて分析した。
【図５ｂ】図５ｂは、マウスのＣＴ２６大腸癌細胞の表面でＰＤ−Ｌ１が発現されることを示す。ｂ．柔細胞分析によって各細胞の表面でＰＤ−Ｌ１タンパク質を分析した。
【図６ａ】図６ａは、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１の生体外及び生体内抗−腫瘍活性を示す。（ａ）１００μＭＧＣＶとともに、様々なＭＯＩのＡｄ５ＭＯＣＫ、Ａｄ５ｍＴＲまたはＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１でＣＴ２６細胞を感染させた。３日後、細胞毒性を図１ｄの方法により測定した。資料は、３回分析実験に対する平均±標準偏差値で表示した。
【図６ｂ】図６ｂは、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１の生体外及び生体内抗−腫瘍活性を示す。（ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇にＣＴ２６細胞（１×１０６）を皮下接種した。前記腫瘍に５×１０８ＰＦＵのＡｄ５ＭＯＣＫ、Ａｄ５ＥＦ１α．ｓＰＤ１、Ａｄ５ｍＴＲまたはＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１を処理した。ＧＣＶ（７５ｍｇ／ｋｇ）を一日につき２回ずつ腹腔注射した。腫瘍の体積は指定された時間に測定し且つ表示した。資料は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０）で表示した。
【図７ａ】図７ａは、ｓＰＤ１−Ｉｇによる腫瘍成長抑制がＣＤ８Ｔ細胞によって媒介されることを示す。（ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下ＣＴ２６腫瘍にＡｄ５ＭＯＣＫ、Ａｄ５ｍＴＲまたはＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１（左側パネル）を注射した。ｓＰＤ１−Ｉｇの抗−腫瘍活性でＣＤ８Ｔ細胞の関連性を決定するために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスの皮下ＣＴ２６腫瘍にＡｄ５ＭＯＣＫ、Ａｄ５ｍＴＲまたはＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１（右側パネル）を注射した。ウィルスを処理する２日前及び処理後５日おきにマウスに２．４３α抗−ＣＤ８抗体（５００μｇ）を静脈注射してＣＤ８Ｔ細胞を枯渇させた（右側パネル）。矢印は、抗体を注射した時間を示す。腫瘍の体積は、指定された時間に測定し且つ表示した。
【図７ｂ】図７ｂは、ｓＰＤ１−Ｉｇによる腫瘍成長抑制がＣＤ８Ｔ細胞によって媒介されることを示す。（ｂ）２．４３α抗−ＣＤ８抗体の存在または不在時に、腫瘍成長の抑制を１２日目頃にＡｄ５ＭＯＣＫに対する相対値として算出した。資料は、平均±ＳＥＭで表示した。
【図８ａ】図８ａは、Ｔ及びＢ細胞欠乏Ｒａｇ１−／−マウスにおけるｓＰＤ１−Ｉｇによる腫瘍増殖の抑制効果を示す。（ａ）Ｃ５７／ＢＬ６に皮下注射されたＥ．Ｇ７腫瘍にＡｄ５ＭＯＣＫ、Ａｄ５ｍＴＲまたはＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１（左側パネル）を注射した。ｓＰＤ１−Ｉｇの抗−腫瘍活性でリンパ球の関連性を測定するために、Ｒａｇ１−／−マウスに皮下注射されたＥ．Ｇ７腫瘍にＡｄ５ＭＯＣＫ、Ａｄ５ｍＴＲ、またはＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１（右側パネル）を注射した。腫瘍成長は、指定された時間に算出し且つ表示した。
【図８ｂ】図８ｂは、Ｔ及びＢ細胞欠乏Ｒａｇ１−／−マウスにおけるｓＰＤ１−Ｉｇによる腫瘍増殖の抑制効果を示す。（ｂ）Ｒａｇ１−／−マウスまたは野生型マウスにおける腫瘍成長の調節は、１２日目のＡｄ５ＭＯＣＫ値に対して相対的に算出した。
【図８ｃ】図８ｃは、Ｔ及びＢ細胞欠乏Ｒａｇ１−／−マウスにおけるｓＰＤ１−Ｉｇによる腫瘍増殖の抑制効果を示す。（ｃ）Ｒａｇ１−／−マウスのＥ．Ｇ７腫瘍（１×１０６細胞）を５×１０８ＰＦＵのＡｄ５ＭＯＣＫ、Ａｄ５ｍＴＲまたはＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１で７日置きに２回注射した。ＯＴ−１マウスのＣＤ８Ｔ細胞（５×１０４）を最初のアデノウィルス注射と同時に注射した。腫瘍成長は、指定された時間に算出し且つ表示した。資料は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）で表示した。
【図８ｄ】図８ｄは、Ｔ及びＢ細胞欠乏Ｒａｇ１−／−マウスにおけるｓＰＤ１−Ｉｇによる腫瘍増殖の抑制効果を示す。（ｄ）免疫細胞の生体外分析を行うために、Ｒａｇ１−／−マウスのＥ．Ｇ７腫瘍をＯＴ−１マウス由来ＣＤ８Ｔ細胞及び適切なアデノウィルスと共同培養した。最初のアデノウィルス注射後８日目頃に、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）をマウス眼球静脈から回収した。柔細胞分析を通じて全体の生存細胞からＯＴ−１ＣＤ８Ｔ細胞の数を算出し、ＴＣＲＶα２＋、Ｖβ５＋、Ｔ細胞（ＯＴ−１細胞）の割合を算出した。
【図９ａ】図９ａは、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１処理による２次腫瘍の抑制効果を示す。（ａ）ＣＴ２６腫瘍をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下移植し、３日置きに３回５×１０８ＰＦＵのＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１を注射した。最初に処理してから２週後に、向こう側に１×１０６個の腫瘍細胞を導入した。最初にウィルスを注射してから１日後にＧＣＶ（７５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注射し始め、１２日間注射した。腫瘍の大きさは３日置きに測定した。
【図９ｂ】図９ｂは、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１処理による２次腫瘍の抑制効果を示す。（ｂ）Ｅ．Ｇ７腫瘍をＣ５７／ＢＬ６マウスに皮下移植し、上述した（ａ）と同じ方法を行った。
【図９ｃ】図９ｃは、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１処理による２次腫瘍の抑制効果を示す。（ｃ）２次腫瘍が接種されてから７日後に、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１で事前処理されたマウスと未処理マウスにおける接種部位の腫瘍の大きさを測定した。資料は、平均±標準偏差値で表示した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
上記の目的を達成するための本発明の一実施形態によれば、本発明は、癌特異遺伝子であるテロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ：Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ（配列番号１）に作用する、トランススプライシングリボザイム−単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）複合体をコードするポリヌクレオチド及び癌治療遺伝子を含む組換えアデノウィルスを提供する。
【００２１】
本発明の用語「癌特異遺伝子」とは、癌細胞でのみ特異的に発現されるか、あるいは、顕著に過発現される遺伝子を意味する。前記癌特異遺伝子は、本発明によるリボザイムが癌特異的に作用し得る特徴を付加することができる。このような癌特異遺伝子としては、テロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のｍＲＮＡ、ＡＦＰ（α-フェトプロテイン）ｍＲＮＡ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ｍＲＮＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）ｍＲＮＡ、または細胞骨格関連のプロテイン２（ＣＫＡＰ２）ｍＲＮＡなどになり得るが、特にこれらに制限されない。
【００２２】
本発明の用語「テロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）」とは、癌細胞の永続性（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）能力を調節する最も重要な酵素のうちの一つであり、染色体に末端小粒構造を形成して染色体の末端を保護する役割を果たすことにより細胞の老化を抑制する酵素を意味する。正常的な細胞では細胞が分裂する度に末端小粒の長さが少しずつ短くなって結果的に遺伝物質が損失され、細胞が死滅するような機序を有する。しかしながら、癌細胞ではこの酵素が末端小粒を継続的に延長させるため細胞が死滅せず、癌細胞の不滅性に直接的に寄与することにより癌を治療するのに重大な障害要素であることが知られている。かようなテロメラーゼは無限に複製される生殖細胞、造血細胞及び癌細胞で８０〜９０％のテロメラーゼ活性を有しているが、癌細胞の周りの正常細胞はその活性を有さないという特徴を有する。本発明の目的からみて、前記ＴＥＲＴは本発明で提供する癌治療遺伝子の直接的な標的として使用可能であるが、特にこれに制限されない。
【００２３】
本発明の用語「リボザイム」とは、トランススプライシング活性及びセルフ−スプライシング活性を示す酵素活性があるＲＮＡ分子を意味する。本発明の目的からみて、前記リボザイムは、トランススプライシング反応を通じて癌特異的遺伝子の活性を阻害して、結果的に選択的な抗癌効果を示すだけではなく、癌治療遺伝子と接合された形で発現されて癌治療遺伝子を活性化させる役割を行うための手段として使用可能であるため、癌特異遺伝子を不活性化させ、癌治療遺伝子を活性化させ得る活性を示す限り、いかなる形のものでも使用可能である。好ましくは、癌に特異的なＴＥＲＴのｍＲＮＡを認知してトランススプライシングする能力が検証されたｈＴＥＲＴ標的トランススプライシンググループＩリボザイムであるＲｉｂ６７リボザイムまたは配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるリボザイムになり得るが、特にこれに制限されない。
【００２４】
本発明の用語「ＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）」とは、単純ヘルペスウィルス由来のチミジンリン酸化酵素を意味する。この酵素は、毒性のない前駆体を毒性物質に転換することにより、その遺伝子が移入された細胞を死滅させる薬剤感受性遺伝子の代表例である。本発明の目的からみて、前記ＨＳＶｔｋ遺伝子は、リボザイムに接合された形で発現されて抗癌活性を示す癌治療遺伝子として使用可能である。このようなＨＳＶｔｋ遺伝子は、好ましくは、配列番号３で表わされる塩基配列を有することができ、ジェンバンク（ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号ＡＡＰ１３９４３、Ｐ０３１７６、ＡＡＡ４５８１１、Ｐ０４４０７、Ｑ９ＱＮＦ７、ＫＩＢＥＴ３、Ｐ１７４０２、Ｐ０６４７８、Ｐ０６４７９、ＡＡＢ３０９１７、Ｐ０８３３３、ＢＡＢ８４１０７、ＡＡＰ１３８８５、ＡＡＬ７３９９０、ＡＡＧ４０８４２、ＢＡＢ１１９４２、ＮＰ＿０４４６２４、ＮＰ＿０４４４９２、ＣＡＢ０６７４７などに記載のものになり得るが、特にこれらに制限されない。
【００２５】
本発明の用語「癌治療遺伝子（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ）」とは、癌細胞内で発現時に治療学的な効果を示すポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を意味する。本発明において、前記癌治療遺伝子は、前記リボザイムと接合された形で発現されるか、または、独立して発現されて抗癌活性を示す。本発明の目的からみて、前記癌治療遺伝子としては、薬剤感受性遺伝子、細胞死滅遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子、抗新生血管生成遺伝子などが挙げられるが、これらに制限されないだけではなく、本発明では、前記癌治療遺伝子を単独的にまたは２以上を複合的に用いることができる。
【００２６】
本発明の用語「薬剤感受性遺伝子（ｄｒｕｇ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇｇｅｎｅ）」とは、毒性のない前駆体を毒性物質に転換する酵素に対する遺伝子を意味するが、遺伝子の移入された細胞が死滅するため自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ）とも呼ばれる。すなわち、正常細胞には毒性のない前駆体を全身的に投与したときに癌細胞にのみ前駆体が毒性代謝体（ｔｏｘｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）に転換されて薬剤に対する感受性を変化させることにより癌細胞を破壊する方法に用いられる遺伝子である。本発明の目的からみて、前記薬剤感受性遺伝子としては、ＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）遺伝子とガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、大腸菌のシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＣＤ）遺伝子、５−フルオロシトシン（５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ、５−ＦＣ）などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００２７】
本発明の用語「細胞死滅遺伝子（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ）」とは、発現されてプログラムされた細胞死滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。本発明の目的からみて、前記細胞死滅遺伝子としては、ｐ５３、アデノウィルスＥ３−１１．６Ｋ（Ａｄ２及びＡｄ５由来）またはアデノウィルスＥ３−１０．５Ｋ（Ａｄ由来）、アデノウィルスＥ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子、カスパーゼをコードする遺伝子などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００２８】
本発明の用語「細胞増殖抑制遺伝子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ｇｅｎｅ）」とは、細胞内で発現されて細胞周期の途中に細胞周期を停止するヌクレオチド配列を意味する。本発明の目的からみて、前記細胞増殖抑制遺伝子としては、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン従属性キナーゼ抑制因子をコードする遺伝子（例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８及びｐ１９）、成長中止特異性ホメオボックス（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ、ＧＡＸ）遺伝子などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００２９】
本発明の用語「細胞毒性遺伝子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｇｅｎｅ）」とは、細胞内で発現されて毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。本発明の目的からみて、前記細胞毒性遺伝子としては、シュードモナス外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコードするヌクレオチド配列などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００３０】
本発明の用語「腫瘍抑制因子遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）」とは、標的細胞内で発現されて腫瘍表現型を抑制できるか、あるいは、細胞死滅を誘導できるヌクレオチド配列を意味する。本発明の目的からみて、前記腫瘍抑制因子遺伝子としては、腫瘍塊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子、ＭＭＡＣ−１遺伝子、腺腫様ポリープ症コイル蛋白質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｉｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、欠損された結腸腫瘍（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、染色体３ｐ２１．３に位置する鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ−２遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ｓＰＤ−１（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１）などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００３１】
本発明の用語「ｓＰＤ−１（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１）」とは、免疫グロブリン分子群に属するＴ細胞の補助阻害分子としてよく知られている５５ｋＤａの第Ｉ型硬膜タンパク質であるＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１）の細胞外ドメインを意味する。一般的に、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用によって腫瘍侵襲性リンパ球が減り、Ｔ細胞受容体媒介増殖が減少し、癌細胞による免疫回避現象が発生するが、最近の研究においてＰＤ−１の遊離された態様であるｓＰＤ−１がＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用による免疫回避現象を抑制して抗癌免疫反応を効果的に誘導することができるということが報告されている。従って、本発明の目的からみて、前記ｓＰＤ−１遺伝子は、本発明によるリボザイムのトランススプライシング活性によって癌特異遺伝子に接合されて癌細胞に治療遺伝子として使用可能であり、好ましくは、配列番号４で表わされる塩基配列を有することができるが、特にこれに制限されない。
【００３２】
本発明の用語「抗原性遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）」とは、標的細胞内で発現されて免疫システムで認識可能な細胞表面抗原性タンパク質を産生するヌクレオチド配列を意味する。本発明の目的からみて、前記抗原性遺伝子としては、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、ｐ５３などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００３３】
本発明の用語「サイトカイン遺伝子（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ）」とは、細胞内で発現されてサイトカインを生成するヌクレオチド配列を意味する。本発明の目的からみて、前記サイトカイン遺伝子としては、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、インターフェロンα、β、γ（インターフェロンα−２ｂ）、インターフェロンα−２α−１などの融合体が挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００３４】
本発明の用語「抗新生血管生成遺伝子（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）」とは、発現されて抗−新生血管生成因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列を意味する。本発明の目的からみて、前記抗新生血管生成遺伝子としては、アンギオスタチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の抑制因子、エンドスタチンなどが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００３５】
本発明の用語「アデノウィルス」とは、アデノウィルスベクターと同じ意味を有し、アデノビリダエ属に属するウィルスを意味する。前記アデノビリダエは、マストアデノウィルス属の動物性アデノウィルスをいずれも含む。特に、ヒトのアデノウィルスとしては、Ａ−Ｆ亜属（ｓｕｂｇｅｎｅｒａ）及びこの個々の血清型が挙げられ、Ａ−Ｆ亜属は、ヒトのアデノウィルス第１型、第２型、第３型、第４型、第４ａ型、第５型、第６型、第７型、第８型、第９型、第１０型、第１１型（Ａｄ１１Ａ及びＡｄ１１Ｐ）、第１２型、第１３型、第１４型、第１５型、第１６型、第１７型、第１８型、第１９型、第１９ａ型、第２０型、第２１型、第２２型、第２３型、第２４型、第２５型、第２６型、第２７型、第２８型、第２９型、第３０型、第３１型、第３２型、第３３型、第３４型、第３４ａ型、第３５型、第３５ｐ型、第３６型、第３７型、第３８型、第３９型、第４０型、第４１型、第４２型、第４３型、第４４型、第４５型、第４６型、第４７型、第４８型、第９１型などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００３６】
本発明の他の実施態様として、本発明は、前記組換えアデノウィルスを有効成分として含む癌予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００３７】
本発明で提供する前記組換えアデノウィルスは、癌特異遺伝子であるＴＥＲＴに作用する、トランススプライシングリボザイム−ＨＳＶｔｋ複合体をコードするポリヌクレオチド及び癌治療遺伝子を含んでおり、ＴＥＲＴが発現される癌細胞に投与される場合にＴＥＲＴによってトランススプライシングリボザイム−ＨＳＶｔｋ複合体からＨＳＶｔｋが解離され、解離されたＨＳＶｔｋは細胞毒性を示すだけではなく、癌治療遺伝子によって免疫細胞に対する攻撃を誘導することができるので、癌治療剤としての役割を果たす。これに対し、ＴＥＲＴが発現されない正常細胞に投与される場合には、トランススプライシングリボザイム−ＨＳＶｔｋ複合体からＨＳＶｔｋが解離されないため、細胞毒性を示さない結果、本発明の前記組換えアデノウィルスは癌細胞に対する優れた選択性を示すので、より安全な癌治療に使用可能である。
【００３８】
本発明の用語「癌」とは、細胞の正常的な分裂、分化及び死滅の調節機能に問題が発生して非正常的に過多増殖して、周りの組織及び臓器に浸潤して塊を形成し、既存の構造を破壊したり変形した状態の細胞または組織を意味するが、その例として、膵臓癌、乳房癌、前立腺癌、脳腫瘍、頭頸部癌腫、黒色腫、骨髓腫、白血病、リンパ腫、肝癌、胃癌、結腸癌、骨癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門付近癌、結腸癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頚部癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫及び中枢神経系腫瘍などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００３９】
本発明の用語「予防」とは、本発明による組換えアデノウィルスまたは組成物の投与で癌を抑制させたり発病を遅延させたりするあらゆる行為を意味する。
【００４０】
本発明の用語「治療」とは、本発明による組換えアデノウィルスまたは組成物の投与で癌を好転したり利したりするあらゆる行為を意味する。
【００４１】
さらに、本発明の癌予防または治療用薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでいてもよい。
【００４２】
本発明の薬学組成物に使用可能な薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスファート、カルシウムシリケート、カルシウムカーボネート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、鉱物油などが挙げられる。
【００４３】
本発明の薬学組成物は、通常の方法に従って、散剤、顆粒剤、精製、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口型剤形、外用剤、座剤及び滅菌注射溶液の形に剤形化して使用可能である。剤形化する場合には、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、精製、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記キョウオウまたはウコン抽出物、これから分離されたリナロール化合物またはこの薬学的に許容可能な塩に少なくとも１以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混合して調製される。また、単純な賦形剤に加えて、マグネシウムステアレート、タルクなどの潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられるが、頻用される単純希釈剤である水、液状パラフィンに加えて、種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、エチルオレアートなどの注射可能なエステルなどが使用可能である。座剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用可能である。
【００４４】
本発明のさらに他の態様として、本発明は、前記組換えアデノウィルスまたは薬学組成物を治療を必要とする個体に薬学的に有効な量で投与するステップを含む、癌を治療する方法を提供する。
【００４５】
本発明の用語「薬学的に有効な量」とは、医学的な治療に適用可能な合理的な受恵／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、患者の性別、年齢、疾病の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素に応じて決定され得る。本発明の薬学組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与したりしてもよく、従来の治療剤と順次的にまたは同時に投与されてもよい。また、本発明の薬学組成物は、単一投与または多重投与されてもよい。前記要素をいずれも考慮に入れて副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定可能である。具体的に、本発明の薬学組成物としては、経口投与または静脈投与が好適に用いられる。
【００４６】
本発明の用語「投与」とは、ある適切な方法により動物に所定の物質を導入することを意味し、本発明による治療用組成物は、目的組織に達し得る限り、ある一般的な経路を介して経口または非経口で投与可能である。なお、本発明による治療用組成物は、有効成分が標的細胞に移動可能な任意の装置によって投与可能である。
本発明による治療用組成物の好適な投与量は、患者の状態及び体重、疾病の度合い、薬物の剤形、投与経路及び期間によるが、当業者によって適切に選択可能である。しかしながら、好適な効果を得るために、本発明の薬学組成物は、１日につき１〜１０ｍｇ／ｋｇで、好ましくは、１〜５ｍｇ／ｋｇで投与することが好ましい。投与は、一日につき一回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。
【００４７】
本発明の治療用組成物は、単独で、または、外科的手術療法などの補助治療方法と並行して使用可能である。本発明の組成物と併用可能な化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。なお、発明の組成物と併用可能な放射療法は、Ｘ線照射及びγ線照射などが挙げられるが、特にこれらに制限されない。
【００４８】
本発明の一態様によれば、本発明者らは、ヒトのＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）を認識し且つ切断するリボザイムがＨＳＶｔｋｍＲＮＡと連結され、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの３’末端で切断されるように設計されたトランススプライシングリボザイムを設計し（図１）、マウスで前記トランススプライシングリボザイムの効果を確認できるようにマウスのＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ（ｍＴＥＲＴ−ＴＲ）を標的とするトランススプライシングリボザイムを用いた類似のシステムを考案し、これをＥ１／Ｅ３−欠乏アデノウィルスゲノムに挿入してｍＴＥＲＴ−ＴＲ−調節性ＨＳＶｔｋ（ｍＴＥＲＴ−ＴＲ−ＨＳＶｔｋ）を含むアデノウィルス（Ａｄ５ｍＴＲ）を製作し（図２ａ）、これをＢＡＬＢ／ｃマウス由来の大腸癌細胞株であるＣＴ２６細胞株に感染させた結果、２．５ＭＯＩで感染させたときに、ほとんどの細胞を死滅させることができ（図２ｂ）、体外環境での細胞毒性とほとんど同様に、ＢＡＬＢ／ｃマウスで皮下ＣＴ２６腫瘍にＡｄ５ｍＴＲを注射する場合に、腫瘍の成長が有意に抑制されることを確認した（図２ｃ）。なお、本発明者らは、同系のＢ６マウスに皮下注射されたＥ．Ｇ７腫瘍で細胞死滅を誘導するＡｄ５ｍＴＲの能力を試験した結果、ウィルス感染後に腫瘍抗原が放出されることを確認し（図３ａ）、Ａｄ５ｍＴＲで処理されたマウス由来のＤＣｓが、ＯＶＡ抗原を十分なレベルで提供して、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を刺激することができるということを確認した（図３ｂ）。
【００４９】
一方、本発明者らは、アデノウィルスゲノムのＥ１領域で、ｍＴＥＲＴ−ＴＲによって調節されるＨＳＶｔｋとＥ３領域にあるｓＰＤ１−Ｉｇを含む二重−モジュールアデノウィルス（Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１）を製作し（図４ａ）、その活性を試験した結果、腫瘍細胞攻撃に反応して抗原−特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌が、ｓＰＤ１−Ｉｇを含む上澄み液によって向上することを確認し（図４ｄ）、腫瘍細胞の表面でのＰＤ−Ｌ１の発現を柔細胞分析によって確認した（図５）。また、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１で感染されたＣＴ２６細胞は、Ａｄ５ｍＴＲで感染されたものとほとんど同じレベルの生体外細胞毒性を示し（図６ａ）、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１は、Ａｄ５ｍＴＲと比較して有意的に腫瘍退行を促し、実際にほとんど完全な腫瘍退行が発生することを確認した（図６ｂ）。本発明において予想した通り、ＨＳＶｔｋはＤＣｓによる抗原−特異的ＣＤ８Ｔ細胞反応を促し（図３ｂ）、ｓＰＤ１−Ｉｇは細胞外で抗−腫瘍ＣＤ８Ｔ細胞反応性を促す（図４ｄ）。
【００５０】
このような二重−モジュールＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１による向上した腫瘍成長抑制効果は、ＣＤ８Ｔ細胞が枯渇したマウスではほとんど消失し（図７ａ）、抗−腫瘍活性に影響するＣＤ８の枯渇は、Ａｄ５ｍＴＲよりもＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１に対して一層高い効果を示し（１．９倍対４．７６倍）（図７ｂ）、ＣＴ２６モデルでＡｄ５ｍＴＲよりもＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１に対して一層強い効果を示した（１．６１倍対６．５８倍）（図８ｂ）。Ｅ．Ｇ７を含むＲａｇ１−／−マウスに静脈注射されたＯＴ−ＩＴ細胞によって抗原−特異的Ｔ細胞反応が形成されるとき、アデノウィルス投与の前記抗−腫瘍効果が修復され、前記効果は、Ａｄ５ｍＴＲを投与した後よりもＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１を投与するときに一層顕著になり（図８ｃ）、血中ＯＴ−ＩＴ細胞の数は、Ａｄ５ｍＴＲと比較して、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１を投与したときに一層大幅に増大した（図８ｄ）。
【００５１】
このようなアデノウィルスの効果を生体内で確認した結果、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１が投与されたマウスでは１次腫瘍が最小限に増殖され、２次腫瘍が成長せず（図９ａ及び９ｃ）、同じ結果をＥ．Ｇ７腫瘍モデルを含むＢ６マウスで確認した（図９ｂ及び９ｃ）。
【００５２】
このような本発明の組換えアデノウィルスの効果は、マウスを対象として確認したが、前記アデノウィルスの効果を引き起こすＴＥＲＴはマウスだけではなく、ヒトの腫瘍でも発現されるので、本発明で提供する組換えアデノウィルスはヒトの癌治療のために使用可能である。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明の理解への一助となるために好適な実施例を例示する。下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が制限されることはない。
【００５４】
実施例１：材料及び方法
実施例１−１：細胞及びマウス
全ての細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地で培養した。６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７／ＢＬ６マウスをＳＬＣ（日本国）から購入した。ＯＴ−１マウス（Ｂ６  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）及びＲａｇ１−／−マウス（Ｂ６  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）はジャクソンラボラトリーから入手した。全ての動物実験は大韓民国の国立癌センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｋｏｒｅａ）の実験動物の使用と管理に関する管理規定（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に基づいて行った。
【００５５】
実施例１−２：アデノウィルスの製作
ＣＭＶプロモータの調節下でマウスのＴＥＲＴ−ＴＲ−ＨＳＶｔｋ遺伝子を含むＡｄ５ｍＴＲを生成するためにＡｄｅｎｏＺＡＰＴＭとＡｄｅｎｏＱｕｉｃｋＴＭシステムを用いた。ｐＡＶＱ−ＣＭＶ−ｍＴＥＲＴ  ＡＳ１００  Ｒｉｂ（＋６７）ＴＫにＳｐｅＩ／ＳａｃＩＩを処理してＣＭＶ．ｍＴＲ．ＨＳＶｔｋを含むＤＮＡ断片を得、前記断片をｐＺＡＰ１．１のＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶ切断部位に挿入して、ｐＺＡＰ１．１．ＣＭＶ．ｍＴＲ．ＨＳＶｔｋを製作した。ｐＺＡＰ１．１．ＣＭＶ．ｍＴＲ．ＨＳＶｔｋをＰａｃＩ／ＤｒａＩＩＩで切断し、ＲｉｇｈｔＺＡＰ１．２に連結した後、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。ｓＰＤ１−Ｉｇを製作するために、ＰＤ−１の細胞外ドメインを下記のプライマーを用いたＰＣＲ方法により増幅した。
【００５６】
正方向プライマー：５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号５）
【００５７】
逆方向プライマー：  ５’−ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ−３’（配列番号６）
【００５８】
前記増幅産物をｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２Ａ．Ｆｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩ座位に挿入して、ｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２Ａ．Ｆｃ１．ＥＦ１．ｓＰＤ−１を製作した。ｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２Ａ．Ｆｃ１．ＥＦ１．ｓＰＤ１−Ｉｇ由来のＥＦ１．ｓＰＤ１−ＩｇをｐＥ３．１ベクター（ＯＤ２６０）のＥｃｏＲＩ／ＳｗａＩ座位に挿入して、ｐＥ３．１．ＥＦ１．ｓＰＤ１−Ｉｇを製作した。ｐＺＡＰ１．１．ＣＭＶ．ｍＴＲ．ＨＳＶｔｋのＣＭＶ．ｍＴＲ．ＨＳＶｔｋ断片をｐＥ１．２ベクター（ＯＤ２６０）のＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ座位に挿入して、ｐＥ１．２．ＣＭＶ．ｍＴＲ．ＨＳＶｔｋを製作した。Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１を製作するために、ｐＥ１．２．ＣＭＶ．ｍＴＲ．ＨＳＶｔｋとｐＥ３．１．ＥＦ１．ｓＰＤ１−Ｉｇを制限酵素であるＤｒａＩＩＩ／ＰｆｌＭＩで切断し、ＡｄｅｎｏＱｕｉｃｋ１３．１に連結した後、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。Ａｄ５ＥＦ１．ｓＰＤ１を製作するために、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１と同じ方式で、ｐＥ３．１．ＥＦ１．ｓＰＤ１−ＩｇとｐＥ１．２空きベクターを制限酵素であるＤｒａＩＩＩ／ＰｆｌＭＩで切断し、ＡｄｅｎｏＱｕｉｃｋ１３．１に連結した後、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。
【００５９】
実施例１−３：細胞外環境におけるＧＣＶ吸収及び細胞毒性の分析
ＨＳＶｔｋ酵素活性は、細胞でリン酸化されたＧＣＶの蓄積量を測定して決定した。細胞増殖分析（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）は、標準方法を用いてアデノウィルスの細胞毒性を評価する方式により行った。要するに、細胞（３×１０３）を９６ウェルプレートに接種し、３７℃で１晩中培養した。前記培養された細胞に様々な感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のアデノウィルスを感染させた。１日後、ＧＣＶを最終濃度２００μＭになるように添加した後、３日間細胞増殖を測定した。全ての実験は３回繰り返し行った。
【００６０】
実施例１−４：抗体及び試薬
Ａｄ５ＣＭＶ．ｍＴＲ．ｓＰＤ１からｓＰＤ１−Ｉｇタンパク質発現を確認するために、ＨＥＫ２９３細胞（４×１０５）に２ＭＯＩのアデノウィルスを感染させた。感染後２４時間が経過した時点で、培養上澄み液と細胞残留物（８０μｇ）を抗−Ｐｄｃｄ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いた免疫ブロット方法により分析した。ＣＤ８Ｔ細胞を枯渇させるために、５００μｇの２．４３α抗−ＣＤ８抗体を、アデノウィルスを感染させる２日前に腹腔注射し、その後に１５日間５日置きに腹腔注射した。
【００６１】
実施例１−５：ＩＦＮ−γ産生量を分析するためのＣＤ８Ｔ細胞／ＤＣ共同培養分析
吸収性リンパノード由来のＤＣｓ（ＤＬＮ−ＤＣｓ）を１７．５％のニコデンズ勾配を用いて増幅させ、抗−ＣＤ１１ｃマイクロビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いたＭＡＣＳカラムで精製した。ＯＴ−１マウス由来の純粋なＣＤ８Ｔ細胞を抗−ＣＤ８マイクロビードを用いて分離した。９６ウェルプレートで７２時間かけてＤＬＮ−ＤＣｓ（５×１０４）を純粋なＣＤ８Ｔ細胞（１×１０５）とともに培養した。７２時間後に培養上澄み液を得、ＩＦＮ−γの含量をＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で測定した。
【００６２】
実施例１−６：細胞外環境ＯＴ−１Ｔ細胞活性化分析
安定的にオブアルブミン（ＯＶＡ）を発現させるマウスの大腸癌細胞ＭＣ３８、Ｂ６ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）であるＭＣ３８／ＯＶＡ細胞を６ウェルプレートで培養した。２４時間かけて１０ＭＯＩのアデノウィルスで感染させたＨＥＫ２９３の培養上澄み液からｓＰＤ１−Ｉｇを得た後、ＯＴ−１ＣＤ８Ｔリンパ球（１×１０６）が付加されたＭＣ３８／ＯＶＡ細胞（１×１０４）に加えて７２時間培養した。ＯＴ−１マウス由来の純粋なＣＤ８＋Ｔリンパ球を上述したＭＡＣＳカラムを用いて分離した。ＣＤ８Ｔリンパ球から産生されたＩＦＮ−γの生成量は、マウスＩＦＮ−γＣＢＡアッセイキット（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて測定した。
【００６３】
実施例１−７：生体内動物研究及び生体外分析
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に１×１０６個のＣＴ２６細胞を接種した。腫瘍が感知されるとき（７日経過）、５×１０８ＰＦＵのアデノウィルスを腫瘍内に注射し、ＧＣＶ（７５ｍｇ／ｋｇ）を１４日間１日につき２回ずつ静脈注射した。アデノウィルスを７日置きに２回投与した。腫瘍の体積は、下記の公式を用いて決定した。
【００６４】
長さ×幅２×０．５２３６
皮下腫瘍の形成とウィルス注射のための類似する過程をＣＤ８Ｔ細胞枯渇実験で行った。Ｅ．Ｇ７細胞（Ｃ５７／ＢＬ６  ｂａｃｋｇｏｕｎｄ；１×１０６）をＲａｇ１−／−マウスまたはＣ５７／ＢＬ６マウスに注射し、アデノウィルスとＧＣＶを上述した方法により処理した。生体外分析を行うために、Ｒａｇ１−／−マウスのＥ．Ｇ７腫瘍に、ＯＴ−１マウスから分離されたＣＤ８Ｔ細胞の静脈投入方法によりＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１を処理した。感染後８日が経過した時点で、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）を血液から得、柔細胞分析を行った。
【００６５】
実施例２：結果
実施例２−１：マウスのＴＥＲＴ−ＴＲ−ＨＳＶｔｋを含むアデノウィルスの製作
本発明者らは、公知の腫瘍マーカーであるＴＥＲＴを用いて腫瘍特異的アデノウィルスを用いた新規なＨＳＶｔｋ発現戦略を開発した。前記戦略において、ヒトのＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）を認識し且つ切断するリボザイムを組換えアデノウィルスを用いて腫瘍細胞に伝達した。さらに、前記リボザイムはＨＳＶｔｋｍＲＮＡと連結され、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの３’末端で切断されるように設計したが、これは、腫瘍細胞でＨＳＶｔｋｍＲＮＡの新規な解読を誘導した。この種のリボザイムは、トランススプライシングリボザイムと定義される（図１）。理論的に、トランススプライシングリボザイムによって調節されるＨＳＶｔｋの発現は、腫瘍細胞を含むｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを高いレベルで発現させる細胞に制限される。このため、このようなシステムは、ｈＴＥＲＴが低いレベルで発現される周りの正常組織の細胞に影響せずに、腫瘍細胞にＨＳＶｔｋを伝達する効果的な方法により提案された。実際に、このような戦略は、異種移植マウスモデルに移植されたヒトの大腸癌細胞に高い効果を示す。免疫学的分析時におけるこのようなシステムの一つの問題点は、ヒトの腫瘍細胞を用いた実験が異種移植拒否反応の抑制された免疫欠乏マウスで行われたということである。このため、このようなシステムは、抗−腫瘍免疫化に対するＨＳＶｔｋの効果を評価するには不向きである。このような制限点を解消するために、本発明者らは、マウスのＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ（ｍＴＥＲＴ−ＴＲ）を標的とするトランススプライシングリボザイムを用いた類似のシステムを考案し、同系のマウス腫瘍モデルを用いてＴＥＲＴ−ＴＲ−調節されたＨＳＶｔｋの免疫学的効果を評価した。前記ＴＥＲＴ認識配列は、ＨＳＶｔｋコーディング配列の近くに位置し、ＨＳＶｔｋの発現は、ｍＴＥＲＴ転写体の存在に依存的である（図１）。ＣＭＶプロモータによって調節されるこのような全体的な発現カセットは、Ｅ１／Ｅ３−欠乏アデノウィルスゲノムに挿入され、ｍＴＥＲＴ−ＴＲ−調節性ＨＳＶｔｋ（ｍＴＥＲＴ−ＴＲ−ＨＳＶｔｋ）を含むアデノウィルス（Ａｄ５ｍＴＲ）を製作した（図２ａ）。
【００６６】
また、対照群として、前記発現カセットを除くアデノウィルス（Ａｄ５ＭＯＣＫ）を製作した。Ａｄ５ｍＴＲによるＨＳＶｔｋの発現が、マウスの腫瘍細胞に細胞毒性を示すか否かを確認するために、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の大腸癌細胞株であるＣＴ２６細胞を用いたが、前記細胞株は、ｍＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを高いレベルで発現させる。ＣＴ２６細胞をＧＣＶの存在下で様々なＭＯＩのＡｄ５ｍＴＲに露出させた。２．５ＭＯＩがほとんどの細胞を死滅するのに十分であるのに対し、Ａｄ５ＭＯＣＫは５０ＭＯＩでも細胞毒性を全く示さなかった（図２ｂ）。体外環境での細胞毒性と同様に、ＢＡＬＢ／ｃマウスで皮下ＣＴ２６腫瘍にＡｄ５ｍＴＲを注射する場合に、腫瘍の成長が有意に抑制された（図２ｃ）。
【００６７】
このため、Ａｄ５ｍＴＲは、ヒトのＴＥＲＴ−ＴＲ−ＨＳＶｔｋを含むアデノウィルスの抗−腫瘍効果とほとんど同じ効果を示し、これは、マウスで抗−腫瘍免疫性の研究に好適に使用可能であることが分かる。
【００６８】
実施例２−２：ＨＳＶｔｋによる向上したＤＣ−媒介性腫瘍抗原の提示
ＤＮＡ導入またはアデノウィルス感染による腫瘍細胞におけるＨＳＶｔｋの発現は、細胞毒性ＣＤ８Ｔ細胞の抗原反応を増進させることが知られている。生体ＧＣＶの存在下でのＨＳＶｔｋの発現は、たとえ腫瘍体積の全部ではないが、有意な部分で細胞死滅を誘導することができるため、死滅した細胞から誘導された腫瘍抗原は、ＤＣｓなどのＡＰＣｓによって検出可能であり、これらの細胞は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞に反応するリンパノードに移動する。このようなモデルが文献に提示されたが、本発明者らは、定義された抗原特異的Ｔ細胞を用いて、このような可能性を試験することにした。このような実験のために、本発明者らは、モデル腫瘍抗原としてマウスの腫瘍細胞株Ｅ．Ｇ７（オブアルブミンを安定的に発現するＥＬ４細胞の誘導体）を用い、Ｔ細胞をモデル腫瘍−抗原（ＯＶＡ）−特異的ＣＤ８Ｔ細胞群集として用いられたＯＶＡ特異的Ｔ細胞受容体形質転換マウスから精製した。ＯＴ−１マウスから精製された全てのＣＤ８Ｔ細胞は、ＯＶＡ特異的細胞毒性Ｔ細胞である。先ず、本発明者らは、同系のＢ６マウスに皮下注射されたＥ．Ｇ７腫瘍で、細胞死滅を誘導するＡｄ５ｍＴＲの能力を試験した。腫瘍を分離し、Ａｄ５ｍＴＲの投与後、組織学的に評価するときに、有意レベルの細胞死滅が観察され、これは、ウィルス感染後に腫瘍抗原が放出されることを意味する（図３ａ）。次いで、本発明者らは、腫瘍−吸収リンパノードからＤＣｓを精製し、ＤＣ／ＣＤ８Ｔ細胞共同培養分析を用いて、ＩＦＮ−γ生成のためにＯＶＡがロードされたものであるか否かを評価した。Ａｄ５ｍＴＲで処理された腫瘍含有マウス由来のＤＣｓを用いて培養及び精製されたＯＴ−ＩＴ細胞は、対照群ウィルスで処理された、腫瘍含有マウス由来のＤＣｓを用いて培養されたＯＴ−ＩＴ細胞よりも多量にＩＦＮ−γを産生した。このような結果は、Ａｄ５ｍＴＲで処理されたマウス由来のＤＣｓが、ＯＶＡ抗原を十分なレベルで提供して、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を刺激することができるということを示す（図３ｂ）。このため、腫瘍でのＨＳＶｔｋの発現と、これによるＧＣＶ誘導性細胞死滅は、腫瘍抗原の放出結果であり、これらの抗原は、腫瘍抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞を刺激可能なＤＣｓによって効率的に捕獲された。
これより、ＨＳＶｔｋの腫瘍特異的発現は、ＤＣｓを通じて抗−腫瘍Ｔ細胞活性を効果的に刺激することができるだけではなく、腫瘍細胞の細胞毒性を直接的に誘導することができるということが分かる。
【００６９】
実施例２−３：ｍＴＥＲＴ−ＴＲ−ＨＳＶｔｋ及びｓＰＤ１−Ｉｇを両方とも含むアデノウィルスの製作
Ａｄ５ｍＴＲは、興味深い可能性が増大する抗−腫瘍ＣＤ８Ｔ細胞反応性を刺激した。腫瘍が誘導された免疫抵抗性を不活性化させるための別の戦略を有するこれらの提案の組み合わせは、抗−腫瘍Ｔ細胞反応性をさらに向上させた。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍細胞の表面で発現される公知の免疫抑制剤である。本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１を中和させる前記ＰＤ−Ｌ１受容体の受容性形態であるｓＰＤ１を製作し、ＰＤ−Ｌ１媒介性Ｔ細胞抑制を除去した。生体内でｓＰＤ１の安定性を増大させるために、ｓＰＤ１をＩｇＧ２ａのＦｃ領域と融合させてｓＰＤ１−Ｉｇを製作した。本発明者らは、アデノウィルスゲノムのＥ１領域で、ｍＴＥＲＴ−ＴＲによって調節されるＨＳＶｔｋとＥ３領域にあるｓＰＤ１−Ｉｇを含む二重−モジュールアデノウィルス（Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１）を製作した（図４ａ）。前記Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１でＨＥＫ２９３細胞を感染させ、細胞外環境でｓＰＤ１−Ｉｇを発現させて分泌させ、免疫ブロット分析法により確認した（図４ｂ）。Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１感染細胞でのＨＳＶｔｋの発現レベルは、酵素活性によって測定された方式によりＡｄ５ｍＴＲ感染細胞のそれと比較した（図４ｃ）。なお、本発明者らは、生体外環境で分泌されたｓＰＤ１−Ｉｇが、腫瘍細胞表面のＰＤ−Ｌ１を中和させることにより、抗−腫瘍Ｔ細胞反応性を向上させることができるか否かを試験した。Ａｄ５ＥＦ１α．ｓＰＤ１感染された２９３ＨＥＫ細胞の培養上澄み液に、ＯＶＡを発現する腫瘍細胞とＯＶＡ特異的ＯＴ−ＩＴ細胞の共同培養物を加え、Ｔ細胞反応性をＩＦＮ−γ分泌量に基づいて測定した。期待の通り、腫瘍細胞攻撃に反応して、抗原−特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌は、ｓＰＤ１−Ｉｇを含む上澄み液によって向上した（図４ｄ）。腫瘍細胞の表面でのＰＤ−Ｌ１の発現は、柔細胞分析によって確認された（図５）。これらの結果は、前記二重−モジュールアデノウィルスが、生体内の腫瘍微細環境で抗−腫瘍Ｔ細胞の反応性を向上させることができるということを意味する。
【００７０】
実施例２−４：Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１による腫瘍成長の効果的な抑制
ｓＰＤ１−Ｉｇが、生体内でＨＳＶｔｋの抗−腫瘍活性を増進させることができるか否かを確認するために、ＣＴ２６大腸癌モデルを用いた（図２ｃ）。ＣＴ２６細胞は、それらの細胞表面にＰＤ−Ｌ１を高いレベルで発現させるため、前記モデルを選択した（図５）。Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１で感染されたＣＴ２６細胞は、Ａｄ５ｍＴＲで感染された細胞とほとんど同じレベルの生体外細胞毒性を示し、これは、ｓＰＤ１−ＩｇがＨＳＶｔｋによる細胞毒性の直接的な原因にならないことを予想させた（図６ａ）。これに比べて、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１はＡｄ５ｍＴＲと比較して有意的に腫瘍退行を促し、実際にほとんど完全な腫瘍退行が観察された（図６ｂ）。ｓＰＤ１−Ｉｇを単独で含む対照群アデノウィルス（Ａｄ５ＥＦ１α．ｓＰＤ１）は、これらのモデルでいかなる抗−腫瘍効果も示さないが、これは、腫瘍組織でｓＰＤ１−Ｉｇ発現が腫瘍退行を誘導するには不十分であり、このようなｓＰＤ１−Ｉｇの効果のために生体内でＨＳＶｔｋによる抗原反応が必要であることを意味する。
【００７１】
実施例２−５：ｓＰＤ１−Ｉｇの腫瘍成長抑制効果はＣＤ８Ｔ細胞によって媒介される
ＨＳＶｔｋは、ＤＣｓによる抗原−特異的ＣＤ８Ｔ細胞反応を促し（図３ｂ）、ｓＰＤ１−Ｉｇは、細胞外で抗−腫瘍ＣＤ８Ｔ細胞反応性を促す（図４ｄ）。このような結果は、生体内で向上したＣＤ８Ｔ細胞反応性が、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１の向上した抗−腫瘍効果の原因であることを提示した。これらの可能性を確認するために、ＣＴ２６腫瘍保有マウスに抗−ＣＤ８抗体を投与して、ＣＤ８Ｔ細胞を枯渇させた。二重−モジュールＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１による向上した腫瘍成長抑制効果が、ＣＤ８Ｔ細胞の枯渇したマウスではほとんど消失した（図７ａ）。興味深いことに、Ａｄ５ｍＴＲの抗−腫瘍活性もまた減少したが、これは、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおけるＡｄ５ｍＴＲの効果が、ＣＤ８Ｔ細胞によって媒介された抗−腫瘍免疫反応に依存的であることを示す。しかしながら、抗−腫瘍活性に影響するＣＤ８の枯渇は、Ａｄ５ｍＴＲよりもＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１に対して一層高い効果を示す（１．９倍対４．７６倍）（図７ｂ）。腫瘍−特異的ＣＤ８Ｔ細胞の役割をより直接的に評価するために、Ｅ．Ｇ７腫瘍モデルとＯＶＡ−特異的ＯＴ−ＩＴ細胞を用いた。Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１が投与された同系のＢ６マウスへのＥ．Ｇ７腫瘍の皮下注射は、ＣＴ２６モデルで観察されたのと同様に、向上した腫瘍退行結果を示す。これに比べて、同じ実験が同系のリンパ球−欠乏Ｒａｇ１−／−マウスで行われる場合には、２種類のウィルスの抗−腫瘍効果が顕著に減少した（図８ａ）。ＣＴ２６モデルでＣＤ８Ｔ細胞枯渇の効果と一致するように、減少の度合いはＡｄ５ｍＴＲよりもＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１に対して一層強い効果を示す（１．６１倍対６．５８倍）（図８ｂ）。Ｅ．Ｇ７を含むＲａｇ１−／−マウスに静脈注射されたＯＴ−ＩＴ細胞によって抗原−特異的Ｔ細胞反応が形成されるとき、アデノウィルス投与の前記抗−腫瘍効果が修復され、前記効果は、Ａｄ５ｍＴＲを投与した後よりもＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１を投与するときに一層顕著になった（図８ｃ）。特に、血中ＯＴ−ＩＴ細胞の数は、Ａｄ５ｍＴＲと比較して、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１を投与したときにさらに大幅に増大した（図８ｄ）。このような結果は、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１が腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞の機能を直接的に向上させることによって腫瘍退行を促すということを示す。
【００７２】
実施例２−６：Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１処理の抗癌効果
１次腫瘍部位へのウィルスの注射によってマウスの遠位部で２次腫瘍の成長を抑制する可能性が増大したＡｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１が投与されたマウスの血液内で、癌特異的Ｔ細胞が増大した。ＢＡＬＢ／ｃマウスで発生したＣＴ２６腫瘍に、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１を３日置きに３回投与した。最初の投与日から１４日後に、同じマウスの向こう側の部位で２次ＣＴ２６腫瘍の発生が試みられた。このとき、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１が投与されたマウスでは、１次腫瘍が最小限に増殖されたのに対し、Ａｄ５ＭＯＣＫが投与されたマウスでは、大きなサイズ（＞６００ｍｍ３）の１次腫瘍が発生した。このため、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの新たな集団が、２次腫瘍発生のための対照群として用いられた。対照群では２次腫瘍が順調に成長したが、Ａｄ５ｍＴＲ．ｓＰＤ１が投与されたマウスでは成長しなかった（図９ａ及び９ｃ）。同じ結果がＥ．Ｇ７腫瘍モデルを含むＢ６マウスで確認された（図９ｂ及び９ｃ）。したがって、二重モジュールアデノウィルスの注射は、抗癌免疫性を向上させて抗癌効果を導き出した。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
0005872042.tif 000008
【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９ａ】
0005872042.tif 000022
【図９ｂ】
0005872042.tif 000023
【図９ｃ】
0005872042.tif 000024
【配列表】
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