【手続補正書】
【提出日】平成23年6月30日(2011.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
上記のクローニングおよび発現スキームを、ＩＢＴ１８３、ＩＢＴ１８４、ＩＢＴ１８５、ＩＢＴ１８６、ＩＢＴ１８７ａ、およびＩＢＴ１８７ｂに対して繰り返した。ＩＢＴ１８７ｂをＩＢＴ１８７ａ由来のクローニング人工産物として生成した。封入体の形態における融合ペプチドの存在または不在について判定した。様々な封入体タグの配列ならびに通常は可溶性の目的のペプチド（ＨＣ７７６４３）の封入体形成を駆動するそれらの能力について判定したものを表５に報告する。
【表６】
2010534477.tif 000001
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．一般構造：Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｘａａ２−Ｔｒｐ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｇｌｎ−スペーサー−［［Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｘａａ２−Ｔｒｐ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｇｌｎ］−［スペーサー］ｍ］ｎ
（式中、
Ｘａａ１＝Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ；
Ｘａａ２＝Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ；
Ｘａａ３＝Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ；
Ｘａａ４＝ＧｌｕまたはＧｌｎ；
Ｘａａ５＝ＧｌｎまたはＬｙｓ；
ｎ＝１〜１０；
ｍ＝ｎ−１；かつ
スペーサーはプロリン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、およびシステインからなる群から選択されるアミノ酸を含むペプチドである）
を含む封入体タグ。
２．配列番号３３を含む少なくとも１つの架橋可能なシステイン部分をさらに含む、上記１に記載の封入体タグ。
３．封入体タグのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに位置する少なくとも１つの架橋可能なシステイン部分をさらに含む、上記１に記載の封入体タグ。
４．配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、および配列番号２６５からなる群から選択される、上記１に記載の封入体タグ。
５．少なくとも１つの関心あるペプチドに作動可能に連結された、上記１または２に記載の封入体タグを含む融合ペプチド。
６．封入体タグを少なくとも１つの関心あるペプチドから分離する少なくとも１つの切断部位をさらに含む、上記５に記載の融合ペプチド。
７．関心あるペプチドが、ポリマー結合ペプチド、毛髪結合ペプチド、爪結合ペプチド、皮膚結合ペプチド、歯結合ペプチド、抗菌ペプチド、クレー結合ペプチド、色素結合ペプチド、およびセルロース結合ペプチドからなる群から選択される、上記６に記載の融合ペプチド。
８．少なくとも１つの関心あるペプチドに作動可能に連結された、上記１または２に記載の封入体タグを含む融合ペプチドをコードする核酸分子。
９．上記８に記載の核酸分子を含む発現カセット。
１０．上記９に記載の発現カセットを含むベクター。
１１．上記１０に記載のベクターを含む微生物宿主細胞。
１２．宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、緑色硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミキソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される、上記１１に記載の微生物宿主細胞。
１３．不溶性形態でのペプチドを発現するための方法であって、
ａ）関心あるペプチドをコードする第２の部分に作動可能に連結された、上記１または２に記載の封入体タグをコードする第１の部分を含む、融合ペプチドをコードする発現可能な遺伝子コンストラクトを合成するステップと、
ｂ）発現宿主細胞を（ａ）の遺伝子コンストラクトで形質転換するステップと、
ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を、発現可能な遺伝子コンストラクトを発現させかつコードされた融合ペプチドを不溶性形態で産生する条件下で増殖させるステップと、
ｄ）上記不溶性形態での上記融合ペプチドを回収するステップと、
を含む、方法。
１４．関心あるペプチドを生産するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの関心あるペプチドをコードする第２の部分に作動可能に連結された、上記１または２に記載の封入体タグをコードする第１の部分を含む、融合ペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを合成するステップであって、ここで上記第１の部分および上記第２の部分を少なくとも１つの切断可能なペプチドリンカーにより分離するステップと、
ｂ）発現宿主細胞を（ａ）の遺伝子コンストラクトで形質転換するステップと、
ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を、遺伝子コンストラクトを発現させかつコードされた融合ペプチドを不溶性形態で産生させる条件下で増殖させるステップと、
ｄ）上記不溶性形態での融合ペプチドを回収するステップと、
ｅ）上記融合ペプチドの上記第１の部分がもはや上記第２の部分に融合されないように、上記融合ペプチドから上記少なくとも１つの切断可能なペプチドリンカーを切断するステップと、
ｆ）上記関心あるペプチドを回収するステップと、
を含む、方法。
１５．関心あるペプチドが、ポリマー結合ペプチド、毛髪結合ペプチド、爪結合ペプチド、皮膚結合ペプチド、歯結合ペプチド、クレー結合ペプチド、色素結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、および抗菌ペプチドからなる群から選択される、上記１３または１４に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造：Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｘａａ２−Ｔｒｐ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｇｌｎ−スペーサー−［［Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘａａ１−Ｐｈｅ−Ｘａａ２−Ｔｒｐ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｇｌｎ］−［スペーサー］ｍ］ｎ
（式中、
Ｘａａ１＝Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ；
Ｘａａ２＝Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ；
Ｘａａ３＝Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ；
Ｘａａ４＝ＧｌｕまたはＧｌｎ；
Ｘａａ５＝ＧｌｎまたはＬｙｓ；
ｎ＝１〜１０；
ｍ＝ｎ−１；かつ
スペーサーはプロリン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、およびシステインからなる群から選択されるアミノ酸を含むペプチドである）
を含む封入体タグ。
【請求項２】
配列番号３３を含む少なくとも１つの架橋可能なシステイン部分をさらに含む、請求項１に記載の封入体タグ。
【請求項３】
封入体タグのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに位置する少なくとも１つの架橋可能なシステイン部分をさらに含む、請求項１に記載の封入体タグ。
【請求項４】
少なくとも１つの関心あるペプチドに作動可能に連結された、請求項１または２に記載の封入体タグを含む融合ペプチド。
【請求項５】
封入体タグを少なくとも１つの関心あるペプチドから分離する少なくとも１つの切断部位をさらに含む、請求項４に記載の融合ペプチド。
【請求項６】
少なくとも１つの関心あるペプチドに作動可能に連結された、請求項１または２に記載の封入体タグを含む融合ペプチドをコードする核酸分子。
【請求項７】
不溶性形態でのペプチドを発現するための方法であって、
ａ）関心あるペプチドをコードする第２の部分に作動可能に連結された、請求項１または２に記載の封入体タグをコードする第１の部分を含む、融合ペプチドをコードする発現可能な遺伝子コンストラクトを合成するステップと、
ｂ）発現宿主細胞を（ａ）の遺伝子コンストラクトで形質転換するステップと、
ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を、発現可能な遺伝子コンストラクトを発現させかつコードされた融合ペプチドを不溶性形態で産生する条件下で増殖させるステップと、
ｄ）上記不溶性形態での上記融合ペプチドを回収するステップと、
を含む、方法。
【請求項８】
関心あるペプチドを生産するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの関心あるペプチドをコードする第２の部分に作動可能に連結された、請求項１または２に記載の封入体タグをコードする第１の部分を含む、融合ペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを合成するステップであって、ここで上記第１の部分および上記第２の部分を少なくとも１つの切断可能なペプチドリンカーにより分離するステップと、
ｂ）発現宿主細胞を（ａ）の遺伝子コンストラクトで形質転換するステップと、
ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を、遺伝子コンストラクトを発現させかつコードされた融合ペプチドを不溶性形態で産生させる条件下で増殖させるステップと、
ｄ）上記不溶性形態での融合ペプチドを回収するステップと、
ｅ）上記融合ペプチドの上記第１の部分がもはや上記第２の部分に融合されないように、上記融合ペプチドから上記少なくとも１つの切断可能なペプチドリンカーを切断するステップと、
ｆ）上記関心あるペプチドを回収するステップと、
を含む、方法。