【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年8月25日(2011.8.25)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のワクチン接種治療用の薬剤を用意するための単離された核酸発現構築体組成物の使用法であって、単離された核酸発現構築体組成物は成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)をコード化する核酸発現構築体を含み、ワクチン接種治療は、
(a) 被験者の組織に、成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)をコード化する核酸発現構築体を有する組成物を搬送する工程と、
(b) 被験者に抗ワクチン抗体を誘発するのに有効な量のワクチンを被験者に供給する工程とを有し、
ＧＨＲＨは被験者の生体内で発現し、ワクチン接種反応はＧＨＲＨ発現構築体が搬送されないコントロール被験者に比して高められ、
核酸発現構築体は、SEQID#14のＧＨＲＨと少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する配列を具える使用法。
【請求項２】
核酸発現構築体を有する組成物の搬送は、被験者にワクチンを供給するのと同時に生じる、請求項１に記載の使用法。
【請求項３】
更に、ＧＨＲＨをコード化する核酸発現構築体を有する組成物を被験者内に搬送した後であるが、ワクチンを供給する前に、一定時間待機する工程を有する、請求項１に記載の使用法。
【請求項４】
一定時間は、１年以下である、請求項３に記載の使用法。
【請求項５】
一定時間は、７日から１４日の範囲である、請求項４に記載の使用法。
【請求項６】
被験者の組織に核酸発現構築体を有する組成物を搬送する工程は、組織の電気穿孔を含む、請求項１に記載の使用法。
【請求項７】
組織の電気穿孔は、
被験者の組織に複数の針電極を刺す工程であって、複数の針電極は離れて配列され、被験者の組織は筋肉細胞を有する工程と、
０.０１−５ｍｇ量の核酸発現構築体を有する組成物を複数の針電極間の組織内へ導入する工程と、
複数の針電極に電気的パルスを加える工程を有し、
電気的パルスにより核酸発現構築体は筋肉細胞膜を越えることができる、請求項６に記載の使用法。
【請求項８】
組織の電気穿孔は更に、被験者内でワクチンに対する抗体を誘発するのに有効な量のワクチンを被験者に供給する工程を有し、
ワクチンは、牛の疱疹ウイルス-1(“IBR”)、牛のウイルス性下痢症(“BVD”)、パラインフルエンザ3、呼吸器合胞体ウイルス、レプトスピラカニコラ、レプトスピラグリッポタイフォーサ、レプトスピラハードジョ、レプトスピライクテロハエモーハージェ、レプトスピラ・ポーモーナ・バクテリンマイコプラズマ、ハイポニューモニア、マイコプラズマ・ハイポニューモニア或いはそれらの組み合わせの少なくとも一部を含む、請求項７に記載の使用法。
【請求項９】
核酸発現構築体を有する組成物は更に、トランスフェクション促進ポリペプチド、又は帯電したポリペプチドを含む、請求項７又は８に記載の使用法。
【請求項１０】
トランスフェクション促進ポリペプチド、又は帯電したポリペプチドは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸を含む、請求項９に記載の使用法。
【請求項１１】
核酸発現構築体は、マウスpAV0202(SEQID#23); ネズミpAV0203(SEQID#24);HV-GHRH pAV0224(SEQID#25);ブタ-wt-GHRH pAV0225(SEQID#26);犬-pAV0235(SEQID#27);牛のpAV0236(SEQID#28);猫pAV0238(SEQID#29);TI-GHRH pAV0239(SEQID#30);羊のpAV0240(SEQID#31);鶏pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33)、或いはヒトのpAV0226(SEQID#34)と少なくとも９７％が同一の配列を含む、請求項１に記載の使用法。
【請求項１２】
ワクチンは、微生物、病原菌、又は蛋白毒素の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の使用法。
【請求項１３】
微生物は、ウイルス、バクテリア、マイコプラズマ、又は寄生動物を含む、請求項１２に記載の使用法。
【請求項１４】
微生物は、牛の疱疹ウイルス-1(“IBR”)、牛のウイルス性下痢症(“BVD”)、パラインフルエンザ3、呼吸器合胞体ウイルス、レプトスピラカニコラ、レプトスピラグリッポタイフォーサ、レプトスピラハードジョ、レプトスピライクテロハエモーハージェ、レプトスピラ・ポーモーナ・バクテリンマイコプラズマ、ハイポニューモニア、マイコプラズマ・ハイポニューモニア或いはそれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の使用法。
【請求項１５】
被験者は、ヒト、反芻動物、食用動物又は仕事用動物を含む、請求項１に記載の使用法。
【請求項１６】
(a) 成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)をコード化する核酸発現構築体と、
(b) ワクチンとを具え、
ＧＨＲＨは被験者の生体内で発現する組成物。
【請求項１７】
ワクチンは、微生物、病原菌、又は蛋白毒素の少なくとも一部を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
微生物は、ウイルス、バクテリア、マイコプラズマ、又は寄生動物を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
微生物は、牛の疱疹ウイルス-1(“IBR”)、牛のウイルス性下痢症(“BVD”)、パラインフルエンザ3、呼吸器合胞体ウイルス、レプトスピラカニコラ、レプトスピラグリッポタイフォーサ、レプトスピラハードジョ、レプトスピライクテロハエモーハージェ、レプトスピラ・ポーモーナ・バクテリンマイコプラズマ、ハイポニューモニア、マイコプラズマ・ハイポニューモニア或いはそれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ワクチン接種レスポンスを増強する成長ホルモン放出ホルモン
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、２００４年７月２３日に出願された発明者がルクサンドラ  ドラギラ−アクリ、パトリシア  エ−ブラウン、アミール  エス  カハン、ウィリアム  シー  デービスであって、発明の名称が“ワクチン接種レスポンスを増強する成長ホルモン放出ホルモン”である米国仮特許出願第６０／５９０，７３９号に基づく優先権を要求し、該仮出願の全ての内容は引用を持って本願への記載加入とする。
【背景技術】
【０００２】
本発明は被験者にワクチン接種をする工程;ワクチン接種効率を増強する工程;ワクチン接種の前に被験者を用意する工程;ワクチン接種を受けた被験者の感染症を検査した後に、臨床結果を改善する工程を有する構成及び方法に関する。
特に、被験者にワクチンを供給する前、又はワクチンの供給と共に、成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)をコード化する核酸発現構築体を被験者の組織へ供給することに関し、ＧＨＲＨは被験者の生体内で発現され、被験者はワクチンを受けるヒト、ブタ、雌牛、鳥又は他のあらゆる動物類を含む。
【０００３】
感染症は、人間と動物の両方に重要な問題として残っている。従って、年齢に応じた抗生物質の選択、及び特定ワクチンの臨床有効性の評価は、必要である。疾病の治療ではなく、予防に可成りの努力が払われてきた。ワクチンの年間市場は２００億ドル以上である。多数の報告書は、神経内分泌系システムと免疫系システムの相互依存の関係を示してい
る。
視床下部のＧＨＲＨは、脳下垂体前葉からの成長ホルモン(“ＧＨ”)分泌を刺激する、しかし、最近の研究は、このペプチドの免疫修飾物質の特性をさらに実証した(シエジャカ他、２００４年）。生理学・病理学の条件（マーシャル、２００１年ら）の下の免疫状態変調中のＧＨＲＨの重要性は、ＧＨ／インスリンの様な成長因子−Ｉ（“ＩＧＦ  −Ｉ”）軸芯の刺激を介して記載され、及び免疫変調器（ディアライナス他、１９９９年；  コラム他、２００１年）として直接記述された。ＧＨＲＨは免疫系の開発及び調整に於いて不可欠である。しかしながら、ＧＨＲＨがそれらの効果、又はワクチン及び病原体の挑戦へのＧＨＲＨ治療の影響をどのように調節するかについての正確な詳細は、まだ不明である
【０００４】
成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)及び成長ホルモン(“ＧＨ”)軸芯;
特定のワクチン応答を増強し、且つ感染症を調べた後の臨床結果を改善する方法としてのＧＨＲＨプラスミド媒介補足の利用をよりよく理解するために、ＧＨＲＨ／ＧＨ軸芯のメカニズム及び現在の理解に取り組まれるだろう。理論によって拘束されたくないが、ＧＨの中心的な役割は、ヒト及び他の脊椎動物の身体の成長の制御である。
脳下垂体からのＧＨ分泌を規制する生理学上適切な経路は、よく知られている。
ＧＨ経路遺伝子は次のものを含んでいる：
（１）ＧＨ及びＩＧＦ−Ｉのようなリガンド;
（２）ピット1、即ちプロップ1の予言のような転写調節因子及びピット１:
（３）夫々ＧＨＲＨ及びソマトスタチン（“ＳＳ”）のような、主動筋及び拮抗筋敵；そ
して
（４）ＧＨＲＨレセプタ（“ＧＨＲＨ−Ｒ”）及びＧＨレセプタ（“ＧＨ−Ｒ”)のようなレセプタ。これらの遺伝子は、視床下部、脳下垂体、肝臓及び骨を含む、異なる器官及び組織で発現する。
ＧＨ経路が有効に規制されて発現することは、炭水化物、タンパク質及び脂肪代謝の恒常性と同様に最適な線形増加にとって不可欠である。下垂体前葉製剤からのＧＨ合成及び分泌はＧＨＲＨによって刺激され、ソマトスタチン、両視床下部ホルモンによって禁じられる。
ＧＨは、主として肝臓及び他の標的とする器官の中で、ＩＧＦ−Ｉの生産を増加させる。
ＩＧＦ−Ｉ及びＧＨも同様に、視床下部及び脳下垂体上にフィードバックして、ＧＨＲＨ
及びＧＨの放出を禁じる。ＧＨは、末梢組織に直接的及び間接的作用の両方を誘発し、間
接的な効果は主としてＩＧＦ−Ｉによって媒介される。
【０００５】
ＧＨＲＨ及び免疫機能；
プラスミドを媒介としたＧＨＲＨ補足は、病気又は様々な処理摂生法により圧迫された免疫系を有する動物に、様々な免疫活性化効果があると示された（ドーシュカインド及びホースマン、２００１年）。
研究は、免疫系の細胞が、ＧＨＲＨ、ＧＨ及びＩＧＦ−Ｉ（バージェス、１９９９年ら)を生産することを示し、免疫機能が自己分泌及び傍分泌メカニズムの両方によって規制されるかもしれないことを示唆する。
呼吸器疾患のように、高齢者の中で増えた病的状態が、老化で生じる変化、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ生産の減少、ＩＧＦ−Ｉの利用の減少、及び免疫監視、特にＴ細胞媒介の減少の原因となるように関係することが、更に示唆された（ジェラート、１９９６年；  クリスシュナラジェイ他、１９９８年）。
逆に、高齢者のＧＨＲＨ又はその類似体の投与は、治療の後の短い期間及び長い期間の両方に、深遠な免疫増強効果に帰着する。これらの結果は、T細胞レセプターαβ及びT細胞レセプターγδ(コーラム他、1997年)を発現する細胞と同様に、数の増加したリンパ細胞、単球、Ｂ細胞を含む。
例えば骨髄移植の後である免疫無防備の患者では、ＩＧＦ−Ｉ投与はリンパ・脊髄性の再構成を増強することができる(アルプドガン他、２００３年）。
更に、疾病とワクチン接種の動物モデルの研究は、ＧＨの生体内の投与が有効にマクロファージを準備することができ、病原体に対する抵抗を増加させることができることを示す（サカイ他、１９９７年)。
【０００６】
異なる動物モデル及び人間の幾つかの研究は、ＧＨＲＨが、ＧＨ軸芯の刺激を介して、及び免疫変調器として直接に、免疫の刺激的な効果があることを示した(ディアライナス他、１９９９年；コーラム他、２００１年)。ＧＨは、直接又はＩＧＦ−Ｉを介しての何れかにてＧＨによって引き起こされた免疫反応を増強すると知られている。
最近、ＧＨ分泌促進物質（“ＧＨＳ”）は、脳下垂体によるＧＨの生産を引き起こすことが分かっただけでなく、年を取ったハツカネズミ中の胸腺細胞質及び分化を統計的に著しく増加させることが決定された。
移植できるリンパ腫細胞ラインＥＬ４で接種を受けた時、治療された年を取ったハツカネズミは腫物の開始及び後の転移に対する統計的に著しい抵抗を示した。
ＥＬ４細胞へのＣＴＬの生成も治療されたハツカネズミの中で増強され、ＧＨＳが相当な免疫の増強効果を持っていることを示唆する(クー、2001年)。
免疫機能もＩＧＦ−Ｉによって調整され、Ｂ細胞開発に２つの主な効果である強化及び成熟があり、そしてインターロイキン-７と一緒に働くＢ細胞増殖共同因子として調整される。
これらの活動は、反ＩＧＦ−Ｉ抗体、ＩＧＦ−Ｉへのアンチセンス手順の使用、及び活動の代わりに用いるべき組み換えのＩＧＦ−Ｉの使用を通じて識別された。
組み換えのＩＧＦ−Ｉを用いたハツカネズミの治療は、骨髄(Jardieu他、1994年)中の予備のＢ細胞及び成熟したＢ細胞の数を増加させるとして、これらの観察を確認した(ジャーディウ、1994年)。免疫グロブリンの生成物としてＩＧＦ−Ｉに敏感なままだったＢ細胞も、生体外及び生体内のＩＧＦ−Ｉによって刺激された(ロビンズ他、1994年)。
【０００７】
年取った哺乳動物にて、ＧＨＲＨ−ＧＨ−ＩＧＦ−Ｉ軸芯は、骨格筋多量（sarcopenia）、骨粗鬆症、関節炎の損失に関連したＧＨ分泌及びＩＧＦ−Ｉ生成が減少し、脂肪堆積物が増加し、除脂肪体重が減少した可成りの減少を経る(カロニ及びシュナイダー、１９９４年；  ヴェルドハイス他、１９９７年)。組み換えＧＨ治療によってこれらの変化の発生を相殺することができることが実証された。感染の危険の増加及び消耗の両方に取り組む治療は、患者の安寧及び生活の質で大きな前進になるだろう。
【０００８】
最近の２０年間の組換え型タンパク質の生産は、多くの種々の条件の治療用の有用なツールを提供した。例えば身長の低い子供のＧＨ欠乏、やけどの同化剤、敗血症及びＡＤＤＳ患者である。しかしながら、ＧＨ動作に対する抵抗が、栄養失調と伝染中で報告された。
しかしながら、頻繁な皮下注射、即ち静脈注射、インスリン抵抗性及び耐糖能異常を含めて、現在のＧＨ治療にはいくつかの欠点がある（ラビノフスキー他、１９９２年）；更に、子どもは、主要な大腿部の骨端の時期尚早の骨端の閉鎖及び滑りに弱い（リウ及びレロイス、１９９９年）。
単に１４日ごとに注入が必要なＧＨの”持続放出の”形式(ジェネンテックからの)が開発されている。しかし、このＧＨ製品は、正常な生理学上の拍動性のＧＨプロフィールを乱すように見えて、しばしば副作用に関係している。
【０００９】
成長ホルモン放出ホルモン対成長ホルモン、或いはペプチド(“ＧＨＲＰ”)をリリースする成長ホルモン
ＧＨとＧＨＲＨは、組換え型タンパク質として現在治療上投与される。
ＧＨとそのレセプタの間の相互作用に関する現在の知識は、ＧＨを循環させる分子の異成分が重要な恒常的な意味合いを持つことを示唆する。
インスリン抵抗性を含む悪影響が、外生のＧＨが根本的なＧＨ血中濃度を上げて、生来のＧＨの偶発的なパルスを廃止するという事実に起因することが示唆された。
研究は、ＧＨＲＨの持続注入がＧＨＲＨレセプタの減感なしで、又はヒト、羊或いはブタのＧＨ供給の減損なしで正常なＧＨの拍動性のパターンを回復することを示した（デブルイル他、１９９０年；  ヴァンス他、１９８９年；  ヴァンス他、１９８５年)。
同時に、このシステムはフィードバックができ、それはＧＨ治療中で完全に廃止される。実質的には、副作用はＧＨＲＨ治療についてに報告されていない（トーナー他、１９８６年）。従って、ＧＨＲＨ治療はＧＨ治療よりも生理学的かもしれない。
【００１０】
ヒトの短期のＧＨ及びＩＧＦ−Ｉを刺激するために、ＧＨＲＰは診療所で使用される。ヘキサリン(有力で、よく研究されたＧＨＲＰ)は、正常な個人の深遠なＧＨ放出を引き起こすことができる。
ヒトのヘキサリンに対するＧＨ反応は、かなり希釈されて、以降の長期的な投与となる。
この希薄は部分的で可逆的であるが、それは可成りヘキサリン及び同様の薬剤(ラヒム及びシャレット、１９９８年)の長期的な治療的な使用の可能性を制限した。ヘキサリンを用いた長期療法は、ワクチンに関連して、免疫機能を刺激するのに必要である。
ＧＨ放出薬剤の開発及びヒトの被験者へのそれらの使用に関して、これらの薬剤はＧＨ放出に特定されないことが明らかである。ヒトについてのより最近の研究は、副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)(ジゴ、１９９９年)、コルチゾール及びプロラクチン(ＰＲＬ)の急激な増加は、ＧＨＲＰ(ヘキサリン、ＭＫ−０６７７)の投与の後に生じたことを示している(シュライム他、１９９９年)。
ＧＨＲＰ及び類似の薬剤を用いた長期間の治療中、一時的な(更に些細な)高プロラクチン血症及び副腎皮質機能亢進の繰り返しの発作の悪影響の可能性は、懸念を生じ、さらなる研究を要求し、感染症の疑いに直面している患者に理解され得る(ラヒム他、１９９９年)。
【００１１】
対照的に、組み換えのＧＨＲＨ治療について、副作用は本質的に報告されていない。
頭蓋外に分泌したＧＨＲＨは、成熟したペプチド又は先を切られた分子のように(膵島細胞腫物及び種々に位置する類癌腫で見られたように)、しばしば生物学上、活発で、さらに先端肥大症を生産することができる(エッシュ他、１９８２年；  トーナー他、１９８４年)。
ＧＨが不十分な子供或いは成人の人間への組み換えのＧＨＲＨの投与は、ＩＧＦ−Ｉレベルを増大させ、ＧＨＲＨ服用量に比例してＧＨ分泌を増加させ、まだ組み換えのＧＨＲＨの大型服用量に対する反応を起動する(ベルク及びウォーカ、１９９７年)。
このようにして、ＧＨＲＨ投与は、正常以下のＧＨ及びＩＧＦ−Ｉレベルの増加に代えて、一層生理学的である(コーパス他、１９９３年)。
【００１２】
組み換えＧＨＲＨタンパク質の治療は、殆ど副作用のない正常な周期的ＧＨ分泌を巻き込んで(entrain)刺激するが、生体内のＧＨＲＨは半減期が短く、頻繁な(１日当たり１〜３回)静脈内、皮下、又は鼻腔内(３００倍の高い服用量が必要)投与が必要となる。
したがって、慢性的な治療として、ＧＨＲＨ投与は実際的ではない。
【００１３】
野生体ＧＨＲＨは、人間(フローマン他、１９８４年)及び家畜の両方の循環系に、比較的短い半減期を持っている。
ＧＨＲＨ(１−４４)ＮＨ２のプラズマ９５％の６０分間の培養が低下した後に、より短い(１−４Ｏ)ＯＨ形式のホルモンの培養が、同様の条件の下で、６０分間の培養の後にペプチドの７７%だけの低下を示す(フローマン他、１９８９年)。
治療の核酸ベクトル中の特定の耐プロテアーゼ性のＧＨＲＨ類似体に対するｃＤＮＡコード化の編入は、血清中のより長い半減期を持つ分子に帰着し、効能を増加させて、プラスミド注入された動物に、一層大量のＧＨを放出し(ドラギア-アクリ他、１９９９年)、この内容は引用を持って、本願に組込まれる。
アミノ酸に敏感なプロテアーゼのアミノ酸置換による突然変異生成は、ＧＨＲＨ分子の血清半減期を延長する。
更に、ＧＨＲＨの生物学的活動は、その特定のレセプタへの結合親和力を増加させる、非常に活発な類似体の使用により増強される(ドラギア−アクリ他、1999年)。
【００１４】
家畜中の成長ホルモン(“ＧＨ”）及び成長ホルモン放出ホルモン（“ＧＨＲＨ”):
組換えＧＨ又は組換えＧＨの投与が長年被験者に使用されたが、それはワクチン接種の後に反応を刺激する、或いは感染症の検査後に臨床の結果を改善する方法としてではない。特に、家畜の組み換えＧＨ治療は、細い組織沈着及び／又はミルク生産を増強し、その一方、飼料効率を高めると示された(エサートン他、1986年; クリンド他、1998年)。
多数の研究は、組み換えのＧＨが著しく死骸脂肪の量を減らし、従って生成物の質が向上することを示した。しかしながら、長期のＧＨ投与は実際的な制限、経済的制限及び生理学の制限を有し、その有用性及び有効性を弱くする可能性がある(チョン他、1985年;ゴピナス及びエサートン、1989年b)。
実験的に、組み換えのＧＨ放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)はより生理学的な代替物として使用された。大きな動物類(例えばブタまたは牛)へのＧＨＲＨの使用が、成長実現及びミルク生産を増強するだけではなく、より重要なことには、実際的且つ代謝的な観点から生産効率を高めることである(デュブロイル他、1990年; ファーマー他、1992年)。
例えば、乳を分泌する雌ブタへ組み換えＧＨＲＨの使用は、離乳したてのブタの成長に有益な効果があり、更に最適な栄養上・ホルモンの条件がＧＨＲＨがその全潜在能力を発揮するのに必要である(ファーマー他、1996年)。ＧＨＲＨ及びＧＨの投与はミルク生産を刺激し、ミルクになる飼料摂取を増加させる。
この治療は、主として細い身体重量を増加させ、飼料摂取効率を全面的に改良することにより、成長を増強する(ラピエール他、1991年; ヴァンルージ他、2000年)。
熱く及び冷蔵された屠殺重量は増加し、死骸脂質(軟繊維質量のパーセント)は、ＧＨＲＨ及びＧＨの投与により減少する(エサートン他、1986年)。
【００１５】
生体内の遺伝子組み換え搬送及び発現:
理論によって拘束されたくないが、先特定の遺伝子組み換えを体細胞組織へ搬送して、天的又は後天的な欠陥、及び不均衡を修正することは可能である。
そのような遺伝子組み換えに基づいた搬送には、組換え型タンパク質の投与についての多くの長所がある。これらの利点は次のものを含んでいる:
天然蛋白構造の保存;生物学的活動の改善;全身毒性の回避;及び感染症及び有毒不純物の回避である。
タンパク質が循環へ連続的に合成され分泌されるので、プラスミド調節された治療により、治療域中のタンパク質の生産を長く延ばすことができる。対照的に、組換え型タンパク質を使用することの主たる制約は、各投与の後にタンパク質の生物学的利用性が制限されることである。
【００１６】
プラスミドに基づいた発現システムにて、非ウイルスベクターは、治療の遺伝生成物をコード化する核酸に加えて、合成の遺伝子組み換え運搬システムから構成されてもよい。
このように、殆どのウイルスベクターの使用に関する危険は、目標組織或いはウイルスベクターに対する免疫反応を引き起こし、ＤＮＡ変化或いは癌遺伝子の活性化の可能性を引き起こすことができるウイルス蛋白の発現を含めて回避されることができる。
非ウイルスの発現ベクター生成品は、一般に遺伝子搬送のための“種特異の”要素を使用することにより毒性が低く、それは、プラスミドに目標とされる免疫性の危険及び発現の損失を最小化する。
更に、宿主染色体内への偶発的な突然変異の割合を越える一連のプラスミドの著しい統合は、生体内で現在まで報告されていない。その結果、この種の治療は癌遺伝子を活性化するべきでないし、がん抑制遺伝子を不活性化するべきでない。
染色体の外部で存在するエピゾームのシステムとして、プラスミドは、目標組織内で遺伝子発現が有限に持続することに繋がって、薬物動態学と解毒(elimination)の特徴を規定した。
プラスミドベクターは、良好な生産実行技術を使用して製造するのが簡単である。
それらは、生物学評価及び研究(FDA/CBER)(フレデリクソン他、2003年)のための全米遺伝子治療(ASGT)及び食品医薬品投与センタによって支持されたワークショップ中で2003年3月13-14日に述べられたように、ウイルスベクターと比較して利益率へのリスクは低い。
【００１７】
直接のプラスミドＤＮＡ遺伝子導入は現在多くの最新核酸治療戦略の基礎で、ウイルス要素や、脂質粒子を必要としない(アイハラ及びミヤザキ、1998年; ムラマツ他、2001年)。
骨格筋は目標組織である、なぜなら筋繊維が長命期間を有し、免疫適格の宿主の中で発現される環状ＤＮＡプラスミドによって変換することができるからである(デイビスら他、1993年; トリパシイ他、1996年)。
プラスミドＤＮＡ構築体は被験者の骨格筋内への直接の治療に対する魅力的な候補である、なぜなら構築体が生化学的に安定している実体であり、長年成功裡に使用されているからである(アクサディ他、1991年; ヴォルフ他、1990年)。
直接のプラスミドＤＮＡ注入の後に達成されるコード化された生成物の比較的低い発現レベルは、分泌されたペプチドの対生物作用を示すのに時々十分である(ダンコ及びヴォルフ、1994年;ツルミ他、1996年)。
以前のレポートは、ヒトのＧＨＲＨ  ｃＤＮＡがハツカネズミ中のプラスミドによって筋肉に搬送され、そこで２週の期間に亘って適当な程度にまで、一時的にＧＨ分泌を刺激することを示した(ドラギア−アクリ他、1997年)。
【００１８】
プラスミドを媒介としたＧＨＲＨ補足は免疫機能を刺激する
健康な犬の予備的研究により、骨格筋内へのＧＨＲＨプラスミドだけの投与が、数ヶ月に亘って、生理学的なＧＨＲＨ発現を保証することが示唆された(ドラギア−アクリ他、2003a)。
最初の研究は、プラスミドベースのＧＨＲＨ治療を評価して、老人病又は癌に苦しめられた家畜犬に有益な効果を生成し、及び治療摂生法の長期的な安全性を評価するように設計された。癌で苦しんだ１６匹の犬へ、筋肉に特有のＧＨＲＨを発現するプラスミドが投与された。
最初の５６日間の評価は、ＧＨＲＨの生物活性の表示である血清ＩＧＦ−Ｉ濃度が増加したことを実証した(ドラギア−アクリ他、2002a)。循環するリンパ細胞レベルの著しい増加は治療された動物で見つかった。
更なるパイロット研究が、自然に生じる腫瘍を備えた厳しく衰弱した老人病の家畜犬で実施された。この場合、ＩＧＦ−Ｉレベルは３６５日の後処理以上に上げられると分かった。この長い研究継続に於いて、少なくとも１８０日の後処理について分析することができる犬が含まれていた。血液のパラメーターの改良及びメンテナンスに加えて、重量、活動レベル及び運動負荷の増加が観察された。
治療された犬の長期的な全体評価は、研究期間を通して維持された生命の品質が改善されたことを示した。これらの結果は、老化し癌貧血及び／又は悪液質に関連した分解的なプロセスを逆にする際に、プラスミドを媒介とするＧＨＲＨ治療の役割を示唆し、改善された安寧状態が免疫機能の刺激に関係しているかもしれないことを示唆する。
【００１９】
プラスミド搬送及び電気穿孔法:
電気穿孔、ソノポレーション(sonoporation)及び圧力を含む物理的手段によって、細胞へのプラスミドＤＮＡの搬送を高める努力がなされた。
理論によって拘束されたくないが、電気穿孔によって構築される核酸の投与は、細胞へ永久的な損害をもたらさずに、細胞の細胞膜の中に一時的な孔を生成すべく、パルス状の電場の応用を含み、それによって外生の分子が細胞に入ることができる(スミス及びノードストローム、2000年)。電気穿孔的なシステムによって生成された電気的なパルスを調節することによって、核酸分子は、手順の間に作られる細胞の通路か孔を通って移動することができる。
ホフマン他が発明者としてリストされ、1998年1月6日に発行された、タイトルが“多孔性の気球を具えた電気穿孔及びイオン導入カテーテル”である米国特許第5,704,908号は、患者の身体の穴内の選択された位置の細胞に、分子を搬送する電気穿孔装置について記述する。同様のパルス電圧注射装置に以下のものがある。ホフマン他が発明者としてリストされ、1997年12月30日に発行された、タイトルが“薬剤及び遺伝子を調停して搬送する針電極”である米国特許5,702,359号；ホフマンが発明者としてリストされ、1995年8月8日に発行された、タイトルが“臨床応用用の電圧制御フィードバックを有する電気穿孔システム”である米国特許5,439,440号；ホフマン他が発明者としてリストされ、1996年5月5日に公開された、タイトルが“誘発された電場による電気穿孔的遺伝子及び薬物治療」であるPCT出願WO/96/12520号;ホフマン他が発明者としてリストされ、1996年4月25日に公開された、タイトルが“電気穿孔的装置及び方法によるフロー”であるPCT出願WO/96/12006号;ホフマンが発明者としてリストされ、1995年7月27日に公開された、タイトルが“薬剤及び遺伝子を細胞に挿入する電気穿孔的且つイオン導入装置及び方法”であるPCT出願WO/95/19805号；そしてニコラウ他が発明者としてリストされ、1997年3月6日に公開された、
タイトルが“細胞の生体内の電気穿孔”であるPCT出願WO/97/07826であり、上記のリストされた参考例の各々の全内容は、引用を持って、本願への記載加入とする。
【００２０】
近年、生体内のプラスミド搬送を高め、その後、分泌されたタンパク質の生理学的レベルを達成する著しく進歩が、電気穿孔技術を使用して得られた。
電気穿孔は、プラスミドの注入の後に腫瘍細胞に核酸を入れるか(ルーカス他、2002年; マツバラ他、2001年)、或いはヒトの中の皮膚・皮下の腫物に抗腫瘍薬ブレオマイシンを搬送するのに(ゲール他、1998年; ヘラー他、1996年)非常に成功裡に使用された。
電気穿孔は、さらにハツカネズミ(レスボーデス他、2002年; ルーカス他、2001年; ヴィルクィン他、2001年)、ネズミ(テラダ他、2001年; ヤスイ他、2001年)及び犬(フェウェル他、2001年)に広範囲に使用されて、様々なホルモン、サイトカイニン或いは酵素をコード化する治療用の遺伝子を運ぶ。
ＧＨＲＨを使用する従来の研究は、電気穿孔を有するプラスミド治療が、計量可能であって、
大きな動物及び人間のタンパク質を生成し、分泌を規制することを引き起こすのに、有望なアプローチを表わすことを示した(ドラギア−アクリ他、1999年; ドラギア−アクリ他、2002年c)。電気穿孔は、さらに囓歯動物及び他の小さな動物に広範囲に使用された(ベッタン他、2000年;イン及びタン、2001年)。
電気穿孔に続くプラスミドの筋肉注射は、反芻動物にワクチン接種目的で成功裡に使用された(バビウク他、2003年; トレフセン他、2003年)。
電極配置が電場分布及びその後の結果に影響することが観察された(ゲール他、1999年; ミクラビクック他、1998年)。理論によって拘束されたくないが、針電極は大規模な動物モデルにて、外部キャリパ電極より一貫してよい結果を与えて、ヒトに使用することができる。
【００２１】
骨格筋肉内へのプラスミド摂取を高める電気穿孔の能力も、よく立証されている。
同様に、ポリ-L-グルタミン酸塩(“ＰＬＧ”）又はポリビニルピロリドン（“ＰＶＰ”)で形成(formulate)されたプラスミドは、プラスミドトランスフェクションを増加させることが観察された。従って、それによって所望の遺伝子組み換えの発現が増加した。
例えば、ＰＬＧ又はＰＶＰで形成されたプラスミドは、ハツカネズミ、ネズミ及び犬の骨格筋内の、遺伝子発現を10層まで増加させることが観察された(フェウェル他、2001年; ムンパー他、1998年)。
理論によって拘束されたくないが、陰イオンのポリマーナトリウムＰＬＧは、低いプラスミド濃度にて、プラスミド摂取を増強し、手順によって引き起こされた可能性のあるあらゆる組織損傷も減らす。ＰＬＧは安定した化合物であり、比較的高温にも抵抗力がある(ドルニック他、1993年)。
ＰＬＧは抗癌剤の安定を増加させ(リー他、2000年)、及び傷を閉じるか、或いは損傷及び組織修理時に組織から出血を防ぐ“接着剤”として用いられてきた(オータニ他、1996年; オータニ他、1998年)。ＰＬＧはまた、抗原吸入又はオゾンへの露出の後に、抗毒素体として使用されてきた(フライヤ及びジャコビィ、1993年)。
【００２２】
理論によって拘束されたくないが、ＰＬＧは、プラスミドＤＮＡを安定させ及び薄膜の孔を通って細胞内輸送を促進することによるだけでなく、活発なメカニズムによっても、電気穿孔工程時に、プラスミドのトランスフェクションを増加させる。
例えば、細胞上にて正電荷を持つ表面蛋白は、蛋白質間相互作用を通じて、プラスミドＤＮＡに繋がった負電荷を有するＰＬＧと複合することができた。
電場が加えられる場合、表面蛋白は向きを逆にし、また確実にＤＮＡ分子を吸収し、トランスフェクション効率を十分に増加させる工程となる。
更に、ＰＬＧは、生体内のプラスミド搬送に関連した筋肉損傷を防ぎ(ドラギア−アクリ他、2002年b)、注入に先立って生体外のプラスミド安定を増加させるだろう。
線形のＤＮＡを有する真核細胞の電気穿孔を指向した研究がある(マクナリ他、1988年; ノイマン他、1982年)(トネグッゾ他、1988年)(アラタニ他、1992年;ナイリン他、1993年;キエ及びソン、1993年;ヨリフジ及びミカワ、1990年)、しかし、これらの例は細胞浮遊、細胞培養などへのトランスフェクションを示し、そのようなトランスフェクトされた細胞は、体細胞組織の中に存在しない。
【００２３】
米国特許第4,956,288号は、外部のＤＮＡがある状態で細胞の集団を電気穿孔することにより、外部のＤＮＡの大量のコピー数を含む組み換えの宿主細胞を準備し、細胞を培養し、外部のＤＮＡの少量のコピー数を有する細胞を殺す方法を導く。
【００２４】
理論によって拘束されたくないが、ＧＨＲＨ  ｃＤＮＡはハツカネズミに筋肉に搬送されて、筋原性の発現ベクターを注入可能であり、２週間に亘って、一時的にＧＨ分泌を刺激することができる(ドラギア−アクリ他、1997年)。
この注入可能なベクターシステムは、強い合成筋肉プロモータ(リー他、1999年)を組込むことにより最適化され、該プロモータは十分に長い半減期と大きなＧＨ分泌活動性を有する新規性のある耐プロテアーゼ性のＧＨＲＨ分子(ｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨ)と結び付けられた(ドラギア−アクリ他、1999年ら)。
非常に効率的な電気穿孔技術は、動物の骨格筋に核酸構築体を搬送すべく最適化された(ドラギア−アクリ他、2002年b)。
ベクター設計及び電気パルス・プラスミド搬送方法のこの組み合わせを使用して、発明者は、ブタの中の増加した成長ホルモン及び有利に修正された身体構造を示すことができた(ドラギア−アクリ他、1999年; ドラギア−アクリ他、2003年b)。
修正されたＧＨＲＨ核酸は、癌及び癌治療に関連する貧血症を有する家畜動物に、赤血球生成を増加させる(ドラギア−アクリ他、2002年a)。
ブタに於いて、利用可能なデータは、修正されたブタのＨＶ−ＧＨＲＨ類似体(SEQID#1)は、野生タイプのブタＧＨＲＨよりも、成長及び陽性の身体構成変化を促進するのに効能があることを示唆した(ドラギア−アクリ他、1999年)。
【００２５】
成長ホルモンの放出を増加させる目的から、ＧＨＲＨ類似タンパク質の投与レベル(米国特許第5,847,066号、第5,846,936号、第5,792,747号、第5,776,901号、第5,696,089号、第5,486,505号、第5,137,872号、第5,084,442号、第5,036,045号、第5,023,322号、第4,839,344号、第4,410,512号、RE33,699号)、又は人造の又は自然に発生するＧＨＲＨのペプチド断片(米国特許第4,833,166号、第4,228,158号、第4,228,156号、第4,226,857号、第4,224,316号、第4,223,021号、第4,223,020号、第4,223,019号)が報告されてきた。以下の突然変異を含むＧＨＲＨ類似体も報告されている(米国特許第5,846,936号)。ポジション１に於けるTyrがHisへ、ポジション２に於けるAlaがVal,Leu又は他の物へ、ポジション８に於けるAsnがGln,Ser又はThrへ、ポジション１５に於けるGlyがAla又はLeuへ、ポジション２７に於けるMetがNle又はLeuへ、ポジション２８に於けるSerがAsnへ変異する。
ＧＨＲＨ類似体は、シュワルツ他が発明者としてリストされ、2003年4月22日に発行された、タイトルが“ブタの超活発な成長ホルモン放出ホルモンの類似体”である米国特許第6,551,996号(“996号特許”)の主題であり、該996号特許は、成長ホルモンの放出を引き起こす能力を改善した突然変異を含むＧＨＲＨ類似体の応用を開示する。
更に、996号特許の応用は、成長欠陥の治療、成長性能の改善、普通の成長についてのレベルよりも大きなレベルでの動物の成長ホルモンの生成の刺激、及び成長ホルモン放出ホルモンの類似体の投与を用いた成長の向上に関し、引用を持って、本願への記載加入とする。
【００２６】
要するに、感染症の検査後に、ワクチン接種のレスポンス及び有効性の増強、及び被験者の臨床的結果を改善することは、以前は非経済的で、範囲が制限された。
関連する技術は、組換え型タンパク質技術を利用して、制限された許容範囲内のこれらの異なる条件を改善することが可能なことを示した。しかし、これらの治療にはいくつかの重大な欠点がある。
組換え型タンパク質をコード化する核酸発現構成が、従来の組換えの治療の頻繁な注入及びコストが高い問題に対する実行可能な解決策であることが開示された。
当該技術分野にて、被験者に搬送されて生体内で安定したタンパク質を発現する核酸表現構成を利用することによって、疾病を抱えた被験者に拡張した治療法を求めるニーズがある。
【発明の開示】
【００２７】
発明の要約
本発明は、被験者にワクチン接種する構成及び方法、ワクチン接種の前に被験者を準備する方法、及びワクチン接種された被験者に、感染症の検査後の臨床的結果を改善する方法に関する。本発明の幾つかの実施例は、ワクチン接種が必要な被験者にワクチンを搬送する前、又は搬送すると同時に、成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)をコード化する核酸発現構成を被験者の細胞組織に搬送することに関し、ＧＨＲＨは被験者の生体内で発現され、被験者はヒト、ブタ、雌牛、鳥又はワクチンを受けるあらゆる他の動物種を含む。
【００２８】
本発明の一態様は、ワクチン接種の必要な被験者を用意する工程を有する。本方法は、生体内で発現したＧＨＲＨをコード化する核酸発現構築体を被験者の組織に搬送する工程を有する。本発明の好ましいＧＨＲＨは、少なくとも９０％がSEQID#14のコード化されたＧＨＲＨと同一であり、好ましい核酸発現構築体は、マウスpAV0202(SEQID#23); ネズミpAV0203(SEQID#24);HV-GHRH pAV0224(SEQID#25);ブタ-wt-GHRH pAV0225(SEQID#26);犬-pAV0235(SEQID#27);牛のpAV0236(SEQID#28);猫pAV0238(SEQID#29);TI-GHRH pAV0239(SEQID#30);羊のpAV0240(SEQID#31);鶏pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33)、或いはヒトのpAV0226(SEQID#34)と少なくとも９７％が同一の配列を含む。
本発明は、ワクチンを含み、該ワクチンは、被験者の体内に導入されたときに、免疫系、抗体形成及び／又はＴ細胞及び／又はＢ細胞反応の作成の活性化を引き起こすことにより、特異的疾患への免疫を生成する死んだ微生物、生きた弱毒化有機体、サブユニット抗原、トキソイド抗原、結合した抗原、或いは他のタイプのワクチンを指す。
しかし、本発明の好ましい実施例は、ワクチン接種を含み、該ワクチン接種は、牛の疱疹ウイルス-1(“IBR”)、牛のウイルス性下痢症(“BVD”)、パラインフルエンザ3、呼吸器合胞体ウイルス、レプトスピラカニコラ、レプトスピラグリッポタイフォーサ、レプトスピラハードジョ、レプトスピライクテロハエモーハージェ、レプトスピラ・ポーモーナ・バクテリンマイコプラズマ、ハイポニューモニア、マイコプラズマ・ハイポニューモニア或いはそれらの組み合わせを含む。
【００２９】
一般に、核酸発現構築体は、被験者がワクチン接種を受ける前の１年以下の期間に被験者に搬送される、しかし、この期間は変わり得る。例えば、好ましい実施例に於いて、核酸発現構築体は、被験者がワクチン接種を受ける０日から約１４日前に搬送される。
被験者の組織へ核酸発現構築体を搬送する好ましい方法の１つは、組織電気穿孔を含む。多くの組織電気穿孔の方法が以前に記述された。しかし、好ましい組織電気穿孔方法は次の工程を含む:
被験者の組織へ複数の針電極を刺す工程であって、複数の針電極は離れて配列され、被験者の組織は筋細胞を含む工程;約０.０１―５mgの量の核酸発現構築体を複数の針電極間の組織に導入する工程;及び複数の針電極に電気的なパルスを印加する工程であって、電気的なパルスによって核酸発現構築体が筋細胞細胞膜を横断することができる工程である。
更に、核酸発現構築体はさらにトランスフェクションを促進するポリペプチドあるいは帯電したポリペプチド(例えばポリＬ-グルタミン酸塩)を含んてもよい。
【００３０】
本発明の第２の態様は被験者にワクチン接種をする方法である。
この方法は次の工程を含む:被験者の組織へ成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)をコード化する核酸発現構築体を搬送する工程;その後、被験者内に反ワクチン抗体を誘発するのに有効な量のワクチンを被験者に供給する工程である。
好ましいＧＨＲＨ発現構築体は上記される。ワクチンは、被験者にＧＨＲＨ発現構築体を搬送するのと同時に、或いはＧＨＲＨ発現構築体を搬送してから期間経過後に提供することができる。好ましい実施例では、ワクチンはＧＨＲＨ核酸発現構築体の搬送後、１年以内に搬送される。
本発明は、次のものを含むワクチンを包含する:
被験者の体内に導入されたときに、免疫系、抗体形成及び／又はＴ細胞及び／又はＢ細胞反応の作成の活性化を引き起こすことにより、特異的疾患への免疫を生成する死んだ微生物、生きた弱毒化有機体、サブユニット抗原、トキソイド抗原、結合した抗原、或いは他のタイプのワクチンである。しかし、発明の好ましい実施例は、上記のワクチン接種を含む。
更に好ましい実施例に於いて、ワクチンはＧＨＲＨ核酸発現構築体を搬送してから、約７日から１４日後に搬送される。
別の好ましい実施例では、ＧＨＲＨ核酸発現構築体はトランスフェクションを促進するポリペプチドと共に、組織電気穿孔を使用して搬送される。
【００３１】
本発明の３番目の態様は、関節炎を持っているワクチン接種の被験者の、感染症の検査の後に、臨床的結果を改善する方法を含む。方法は次の工程を含む:
被験者の組織へ複数の針電極を刺す工程であって、複数の針電極は離れて配列されている工程；被験者の組織へ成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)をコード化する核酸発現構築体を、発現ＧＨＲＨがワクチン接種反応を高めるのに有効なように、搬送する工程；及び複数の針電極に電気的なパルスを印加する工程であって、電気的なパルスによって核酸発現構築体が筋細胞細胞膜を横断することができる工程である。ポリＬ-グルタミン酸塩の所定の濃度を有する０.０１−５ｍｇの好ましい範囲の核酸発現構築体が、被験者の筋組織へ搬送され、核酸発現構築体は少なくとも９０％がSEQID#14のコード化されたＧＨＲＨと同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する配列を含む。
好ましい核酸発現構築体は、少なくとも９７％がマウスpAV0202(SEQID#23);ネズミpAV0203(SEQID#24);HV-GHRH PAV0224(SEQID#25);ブタ-wt-GHRH pAV0225(SEQID#26);犬pAV0235(SEQID#27);牛のpAV0236(SEQID#28);猫pAV0238(SEQID#29);TI-GHRHpAV0239(SEQID#30);羊のpAV0240(SEQID#31);鶏pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33)或いはヒトのpAV0226(SEQID#34)と同一の配列を含む。
好ましいワクチンは、次のものを含む:
被験者の体内に導入されたときに、免疫系、抗体形成及び／又はＴ細胞及び／又はＢ細胞反応の作成の活性化を引き起こすことにより、特異的疾患への免疫を生成する死んだ微生物、生きた弱毒化有機体、サブユニット抗原、トキソイド抗原、結合した抗原、或いは他のタイプのワクチンである。
【００３２】
本発明の４番目の態様は、成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)をコード化する核酸発現構築体及びワクチンの両方を有する組成物を具える。好ましい核酸発現構築体は、少なくとも９７％がマウスpAV0202(SEQID#23);ネズミpAV0203(SEQID#24);HV-GHRH PAV0224(SEQID#25);ブタ-wt-GHRH pAV0225(SEQID#26);犬pAV0235(SEQID#27);牛のpAV0236(SEQID#28);猫pAV0238(SEQID#29);TI-GHRHpAV0239(SEQID#30);羊のpAV0240(SEQID#31);鶏pAV0241(SEQID#32);馬pAV0249(SEQID#33)或いはヒトのpAV0226(SEQID#34)と同一の配列を含む。
好ましいワクチンは、被験者の体内に導入されたときに、免疫系、抗体形成及び／又はＴ細胞及び／又はＢ細胞反応の作成の活性化を引き起こすことにより、特異的疾患への免疫を生成する死んだ微生物、生きた弱毒化有機体、サブユニット抗原、トキソイド抗原、結合した抗原、或いは他のタイプのワクチンを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
好ましい実施例の詳細な記載
当業者であれば、ここで開示された発明内にて種々の代替及び修正が、本発明の範囲及び精神から離れることなく、成され得ることは容易に明白であろう。
【００３４】
明細書内で用いられる“a”又は“an”は、１つ又はそれ以上を意味する。請求の範囲で用いられるように、単語“comprising”と組みあわせて用いられると、“a”又は“an”は１又は２以上を意味する。ここで用いられる“another”は少なくとも２番目又はそれ以上を意味する。
【００３５】
ここに使用される用語“類似体”は、ＧＨＲＨのあらゆる突然変異体、又はＨＶ−ＧＨＲＨ(SEQID#1)、ブタ-ＧＨＲＨ(SEQID#2)、牛-ＧＨＲＨ(SEQED#3)、犬-ＧＨＲＨ(SEQID#4)、猫-ＧＨＲＨ(SEQID#5)、ＴＩ−ＧＨＲＨ(SEQID#6)、羊のＧＨＲＨ(SEQID#7)、鶏-ＧＨＲＨ(SEQID#8)、馬-ＧＨＲＨ(SEQID#9)、ＴＶ-ＧＨＲＨ(SEQID#11)、１５／２７／２８−ＧＨＲＨ(SEQID#12)、ヒトのＧＨＲＨ(１−４４)ＮＨ２(SEQID#13)、ヒトのＧＨＲＨ(１−４０)ＯＨ(SEQID#10)形式のようなＧＨＲＨの合成ペプチド断片、或いは自然に発生するペプチド断片も含み、又は(１−２９)アミノ酸と同等のあらゆる短い形式を含む。
【００３６】
ここに使用される用語“身体の太った割合”は、総体重の合計で除した身体脂肪重量として定義される。
【００３７】
ここに使用される用語“身体条件スコア”(BCS)は、馬或いは他の家畜の全体的な栄養及び管理を評価する方法として定義される。
【００３８】
ここに使用される用語“カセット”は１つ又は２つ以上の遺伝子組み換え発現ベクターとして定義される。
【００３９】
ここに使用される用語“細胞をトランスフェクトするパルス”は、線形ＤＮＡ断片のようなベクターのトランスフェクションに帰着する、細胞への力の伝達として定義される。いくつかの実施例では、電気穿孔でのように、力は電気からであり、又は、力は血管の圧力からである。
【００４０】
ここに使用される用語“コード化領域”は、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)へ転写され、次に特定のポリペプチドのアミノ酸特性の配列(sequence)に翻訳されるＤＮＡ塩基配列の任意の部分を指す
【００４１】
ここに使用される用語“搬送”又は“搬送する”は、圧力下で又は圧力無しで、化学的又は生物学的プロセス、注入、混合、電気穿孔、ソノポレーション又はそれらの組み合わせによって、組織、被験者、細胞又は任意の受容体へ物質を導入する手段として定義される。
【００４２】
ここに使用される用語“慢性病”は、慢性閉塞性肺疾患、慢性心不全、脳卒中、痴呆、股間接骨折後のリハビリテーション、慢性腎不全、関節炎、慢性関節リウマチのような条件、及び多くの障害を有する高齢者であって、少なくとも２年間、月に一度は往診及び／又は入院する患者として定義される。
【００４３】
ここに使用される用語“ドナー被験者”は、細胞が除去され、被験者の外側で任意の時間、細胞が生存能力のある状態で維持される動物界の任意の種を指す。
【００４４】
ここに使用される用語“ドナー細胞”は、除去され、被験者の外側で任意の時間、生存能力のある状態で維持されるあらゆる細胞を指す。
【００４５】
ここに使用される“電気穿孔”は、電気的なパルスを利用して、細胞内へ核酸配列を伝える方法を指す。
【００４６】
ここに使用される用語“電気的なパルス”及び“電気穿孔”は、核酸分子を細胞へ持っていく目的から、電流を組織か細胞へ投与することを指す。当業者であれば、“パルス化した電界”、“パルス化した電流装置”及び“パルス電圧装置”の用語に関連することが理解される。当業者であれば、電気的なパルスの量及び持続時間が、受容体である被験者の組織、サイズ及び全体的な健康に依存することを認識し、そのようなパラメーターを経験的に決定する方法を更に知っている。
【００４７】
ここに使用される用語“コード化されたＧＨＲＨ”は成長ホルモン放出ホルモンの生物学上活発なポリペプチドである。
【００４８】
ここに使用される用語“増強されたワクチン接種反応”は、免疫系のより速い活性化、より速い抗体形成、より多い免疫体滴定量、Ｔ細胞反応及び／又はＢ細胞反応の増強を許すことにより、特定の疾患に対して増強された免疫を含む。
【００４９】
ここに使用される用語であるＧＨＲＨの“生物学的な機能の均等物”は、野生体のＧＨＲＨポリペプチドとは識別可能なアミノ酸配列を有し、その一方、ＧＨＲＨポリペプチドと比較された時、同様か改善された生物的活性を同時に有するポリペプチドである。
生物学的な機能の均等物は、自然に発生していても、又は個別に修正されてもよい。
当業者は、ここに使用される同様か、改善された生物活動が、成長ホルモン或いは他の下垂体ホルモンを促進する及び／又は放出することを指すことを認識する。
当業者は、いくつかの実施例では、ＧＨＲＨのコード化された生物学的な機能の均等物が、別個のアミノ酸配列を含むように企てられ、その一方、ＧＨＲＨポリペプチドと比較された時、同様か改善された生物的活性を同時に有するポリペプチドであることを認識する。
そのような配列を企てる公知の方法は、特定部位の突然変異誘発を含んでいる。
【００５０】
ここに使用される用語“成長ホルモン”(“ＧＨ”)は、成長に関係があり、標的細胞に作用する化学的なメッセンジャーとして働くホルモンとして定義される。
特定の実施例では、成長ホルモンは、成長ホルモン放出ホルモンの作用によって放出される。
【００５１】
ここに使用される用語“成長ホルモン放出ホルモン”(“ＧＨＲＨ”)は、成長ホルモンの放出を促進するか刺激するホルモンとして定義され、及びより狭い範囲では、プロラクチンのような他の下垂体ホルモンとして定義される。
【００５２】
ここに使用される用語“異種構造の核酸配列”は、異なる調節及び発現要素を含むＤＮＡ塩基配列として定義される。
【００５３】
ここに使用されるような用語“免疫療法”は、身体の免疫系を促進する、又は増強して、
病状の徴候を減じ、被験者の伝染性状態の進展を防ぎ、及び／又は薬物治療の必要を減じる防御抗体を構築するあらゆる治療を指す。
【００５４】
ここに使用される用語“修正された細胞”は、細胞へ更なる核酸配列が導入された被験者からの細胞として定義される。
【００５５】
ここに使用される用語“修正されたドナー細胞”は、ＧＨＲＨコード化した核酸配列が搬送された、あらゆるドナー細胞を指す。
【００５６】
ここに使用される用語“分子スイッチ”は、遺伝子の転写を調節することができる被験者へ搬送される分子を指す。
【００５７】
ここに使用される用語“核酸発現構築体(nucleic acid expression construct)”は、転写されることができるＲＮＡの核酸コード化を含む、あらゆるタイプの単離された遺伝子構築体を指す。用語“発現ベクター”も代わりに、ここで使用され得る。
特定の実施例では、単離された核酸発現構築体は次のものを含む:
プロモータ;所定のヌクレオチド配列;及び３'の未翻訳の領域;ここで、プロモータ、所定のヌクレオチド配列及び３'の未翻訳の領域は、効果的にリンクされ、所定のヌクレオチド配列の生体内発現はプロモータによって調節される。
ここに使用される用語“ＤＮＡ断片”は、実質的には、二重鎖のＤＮＡ分子を指す。断片は公知のあらゆる標準的な分子生物学的手段によって生成され得るが、いくつかの実施例では、ＤＮＡ断片、即ち発現構築体は、親ＤＮＡ分子の制限消化によって生成される。
用語“発現ベクター”、“発現カセット”或いは“発現プラスミド”も、代わりに使用され得る。親分子は任意の標準的な分子生物学的ＤＮＡ試薬であり得るが、いくつかの実施例では、親ＤＮＡ分子はプラスミドである。
【００５８】
ここで使用される用語“有効にリンクした”は、物理的な位置ではなく作用する能力によってリンクされる、核酸配列の要素又は構造を指す。
要素又は構造は、所望の動作の達成が可能で、又は所望の動作によって特徴づけられる。当業者には、核酸配列内の要素又は構造は、効果的にリンクされる為に、縦並びか隣接することは必要でないことが理解されるだろう。
【００５９】
ここに使用される用語“ポリL-グルタミン酸塩(“ＰＬＧ”)”は、ベクターとして使用にふさわしく、或いは電気穿孔で、又は電気穿孔無しでＤＮＡ転送の助けとなるL-グルタミン酸の生分解性高分子を指す。
【００６０】
ここに使用される用語“注射後”は、核酸カセットの導入に続く期間を指し、カセットは、異種起源の核酸配列コード化ＧＨＲＨ、及びその生物学的な等価物を被験者の細胞内に含み、修正された細胞が生きている有機体内にある間に、コード化された遺伝子の発現が生じることを許す。
【００６１】
ここに使用される用語“プラスミド”は、一般に染色体外の遺伝物質で構成された構築体を指し、通常染色体ＤＮＡと独立して複製することができる環状の二重ＤＮＡで構成される。プラスミド、又はその破片はベクターとして使用され得る。プラスミドは、発生するか、バクテリア及び(例外的に)他の微生物から得られる二重らせん構造のＤＮＡ分子である。しかし、ミトコンドリア及び葉緑体ＤＮＡ、キラー酵母及び他の場合は一般に除外される。
【００６２】
ここで使用される用語“プラスミドを媒介とした遺伝子補足”は、生体内で核酸発現を利用することにより、被験者が治療タンパク質の治療域に対して長期の露出をすることができる方法を指す。
【００６３】
ここで使用される用語“パルス電圧装置”或いは“パルス電圧注入装置”は、細胞への電気的な局所パルスを放射することにより、生物の細胞の中への核酸分子の摂取を引き起こすことができ、又は引き起こす装置に関する。その後、細胞膜は不安定になり、通路又は孔を形成する。このタイプの従来の装置は、所望の電圧振幅及びパルス電圧の期間を選択するか調節することができるように、較正される。
パルス電圧装置の最も重要な点は、発明の構成、特に線形のＤＮＡ断片を生物の細胞へ搬送することを促進する装置の能力である。、
【００６４】
ここに使用される用語”プラスミドバックボーン”は、典型的にはバクテリアの複製起点を含んでいるＤＮＡの配列、及びバクテリアの抗生物質選択遺伝子を指し、それは適切なプラスミドで変形されるバクテリアだけの特定の成長に必要である。しかし、抗生物質抵抗性遺伝子及び複製起点の両方を欠くミニサークルと呼ばれるプラスミドがある(ダークエット他、1997年; ダークエット他、1999年; ソウブリエール他、1999年)。
生体外で増幅された発現プラスミドＤＮＡ(即ち、非ウイルスの発現システム)の使用により、ウイルスベクターに関連した危険を回避する。
非ウイルスの発現システム生成品は、一般に遺伝子搬送に“種特異の”コンポーネントの使用により低い毒性を有し、それは、ウイルスベクターに一般に関する免疫性の危険を最小化する。本発明の１つの態様は、プラスミドバックボーンがウイルスのヌクレオチド配列を含まないということである。
【００６５】
ここに使用される用語“プロモータ”は、遺伝子の転写を指図するＤＮＡの配列を指す。
プロモータは、原核生物又は真核生物の遺伝子の転写を指図する。
プロモータは、誘発剤に反応して転写の開始を“誘発可能”であり、又は対照的に“構成的であり”それによって、プロモータは誘発剤が転写の速度を調節しない。
プロモータは組織に特有か、組織に好ましい方法で調節されてもよく、それは、特定タイプの組織内の操作可能にリンクしたコーディング領域の転写においてのみ活性的である。
【００６６】
ここに使用される用語である被験者の“生活の質”又は“生活の質に関する健康”は、患者及びそのオーナーに評価される属性を指し、次のものを含む；
合理的な物理的、情緒的・知的機能を維持することができる範囲、及び家族内、仕事場、及び一般社会の価値のある活動に参加する能力を保持する程度の心地よさと福祉の組み合わせ。
【００６７】
ここに使用される用語である被験者の“福祉”は、機能レベルの仕事及び活動、健康状態、幸福、心地よさ、福祉、繁栄を実行する状態又は上手に実行することを指す。
【００６８】
ここに使用される用語“複製応答要素”は、指定された宿主の中でプラスミドの複製に結びつく核酸配列を含む。
分子生物学の技術の当業者は、複製要素が選択可能な標識遺伝子プロモータ、リボソームの結合部位、選択可能な標識遺伝子配列及び複製起点を含むことが判るだろうが、これらに限定されない。
【００６９】
ここに使用される用語“残りの線形のプラスミドバックボーン”は、核酸発現プラスミドを線形にするプロセスの終わりに残されるプラスミドバックボーンのあらゆる破片をも含む。
【００７０】
ここに使用される用語“受容体である被験者”は、修正されたドナー細胞が、ドナーである被験者から導入され得る動物界のあらゆる種を指す。
【００７１】
ここに使用される用語“調節タンパク質”は、遺伝子の発現を調節するのに使用され得て、誘発剤に反応して転写速度を増加させるあらゆるタンパク質を指す。
【００７２】
ここに使用される用語“分泌促進物質”は、分泌を刺激する薬剤を指す。例えば、成長ホルモン分泌促進物質は、動物へ搬送された時に、脳下垂体からの成長ホルモンの放出を刺激するあらゆる分子である。成長ホルモン放出ホルモンは成長ホルモン分泌促進物質である。
【００７３】
ここに使用される用語“被験者”又は“動物”は、動物界のあらゆる種を指す。好ましい実施例では、それはヒト、及びペット(例えば猫、犬など);仕事(例えば馬など);食用(雌牛、鶏、魚、子羊、ブタなど)、に用いられる飼育動物、及び当該技術分野で公知の全てをより明確に指す。
【００７４】
ここに使用される用語“組織”は、同様の細胞の集まり、及びそれらを囲む細胞間質を指す。当業者は、組織が特定の機能を実行すべく、同様に特別化された細胞の集合体であることが判る。本発明の範囲について、用語である組織は細胞系、細胞の停止、細胞の培養を指さない。特定の実施例に於いて、組織は生体内で電気穿孔される。他の実施例では、組織は植物組織ではない。当業者は、４つの基礎的な組織が身体にあることが判る:
1) 皮膜組織;
2)血液、骨及び軟骨を含む結合組織;
3) 筋組織;
そして4)神経組織である。特定の実施例に於いて、方法及び構成は、線形のＤＮＡが電気穿孔によって筋組織の中に転写されることを開示している(direct)。
【００７５】
ここに使用される用語“治療の要素”は、コード化された遺伝子生成物の生体内発現に結びつく核酸配列を含む。分子生物学の当業者は、治療の要素がプロモータ配列、遺伝子組み換え、ポリA配列即ち３’又は５’UTRを含むことが判るだろうが、これらに限定されない。
【００７６】
ここに使用される用語“トランスフェクトする”は、真核細胞の中へ核酸を導入することを指す。幾つかの実施例では、細胞は植物組織又は酵母菌ではない。
【００７７】
ここに使用される用語“ベクター”は細胞又は有機体へ核酸を伝えるあらゆる媒体(vehicle)を指す。その例は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、リポソーム或いはカチオンの脂質を含んでいる。
用語“ベクター”は、更にその細胞内へ核酸配列を搬送することにより、標的細胞の転換を指向するように設計された遺伝物質で構成された構築を指す。
ベクターは、含まれる核酸カセットを転写することができ、必要な場合は、核酸を入れられた細胞に翻訳されるように、位置的に連続して他の必要な要素に適応させられた多数の遺伝要素を含み得る。これらの要素は効果的にリンクされる。
用語“発現ベクター”は、異種細胞にて組換え型タンパク質を生産するのに必要な全ての情報を含んでいるＤＮＡプラスミドを指す。
【００７８】
ここに使用される用語“ウイルスバックボーン”は、プロモータ、遺伝子及び3'ポリA信号即ち翻訳されていない地域を含まない核酸配列を指すが、部位特異的なゲノムの統合Rep及び逆方向末端反復(“ＩＴＲ”)、或いは逆転写用のｔＲＮＡプライマの結合部位、或いは生体内に挿入された時、ウイルスの免疫性反応を引き起こし、統合を許し、組織の特定のプロモータの特異性及び活動に影響を与え、転写の沈黙を引き起こし、被験者に安全リスクをもたらす核酸配列要素に限定されない。
【００７９】
用語“血管の圧力パルス”は、細胞内へのベクターの摂取を促進すべく、大量の流体のパルスを指す。当業者は、血管の圧力パルスの量及び持続が、受容体である動物の組織、サイズ及び全面的な健康に依存することが判り、更にそのようなパラメーターを如何に決定するかを経験的に知っている。
【００８０】
ここに使用される用語“ワクチン”は、被験者の体内に導入されたときに、免疫系、抗体形成及び／又はＴ細胞及び／又はＢ細胞反応の作成の活性化を引き起こすことにより、特異的疾患への免疫を生産する死んだ微生物、生きた弱毒化有機体、サブユニット抗原、トキソイド抗原、結合した抗原あるいは他のタイプの抗原分子を指す。
一般に、微生物に対するワクチンは、少なくともウィルス、バクテリア、寄生動物、マイコプラズマ、又は他の病原菌の一部に向けられる。
【００８１】
特定の病原体へのワクチン接種又は免疫の効能及び感染症の検査後の臨床結果は、ヒトと獣医学の両方に異常に重要である。本発明の１つの実施例は、ワクチン接種に対する反応を増強する方法である。
方法は次の工程を含む:
複数の針電極を有する被験者の筋組織へ浸透する工程であって、複数の針電極は一定間隔で配置される;被験者の筋組織へ成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)をコード化する核酸発現構築体を、発現ＧＨＲＨの量が特定のワクチン接種に対する反応を増強するのに有効であるように搬送する工程、及び複数の針電極に電気的なパルスを加え、該電気的なパルスは、核酸発現構築体が筋細胞細胞膜を横切ることを可能にする工程を有する。
ポリL-グルタミン酸塩ポリペプチドの濃度が規定された0.01-5mgの範囲の核酸発現構築体は、被験者の筋組織に搬送され、核酸発現構築体は、SEQID#14のコード化されたＧＨＲＨと少なくとも９０％が同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する配列を含む。好ましい被験者は、ヒト、反芻動物、食用動物、馬又は仕事用動物を含む。
ワクチン接種に対して増強された反応の多くの指標がある一方、少数の例が次のものを含む:増加した特定の抗体の滴定量、感染症の検査後のより迅速な反応、臨床の改善された結果或いはそれらの組み合わせである。
本発明の他の特定の実施例は、被験者の組織へ核酸発現構築体を搬送する様々な方法を包含する(例えば電気穿孔方法、腸管外のルートによってキャリアと協働するウイルスベクター、或いはそれらの組み合わせのそばのキャリアーと協力するウイルスベクターあるいはそれのコンビネーション)。
【００８２】
第２の好ましい実施例は、１回の投与で搬送される核酸発現構築体を含み、１回の投与は総量で約０．０１−５ｍｇの核酸発現構築体を含む。一般に、核酸発現構築体は、２倍体細胞(例えば筋細胞)を有する被験者の組織に搬送される。
【００８３】
第３の実施例では、核酸導入に用いられる核酸発現構築体は、wt豚のGHRHプラスミド(SEOJD#26)を含む。他の特定の実施例は他の核酸発現構築体を利用する(例えば最適化された牛のGHRHプラスミド、pAV0236(SEQID#28); TI-GHRHプラスミド、pAV0239(SEQE)#30)；HV-GHRHプラスミド、pAV0224(SEQID#25);羊のGHRHプラスミド、pAV0240(SEQID#31);鶏のGHRHプラスミド、pAV0241(SEQID#32);犬のGHRHプラスミド、pAV0235(SEQID#27);猫のGHRHプラスミド、pAV0238(SEQID#29);馬のGHRHプラスミド、pAV0249(SEQID#33)、ヒトのGHRHプラスミド、pAV0226(SEQID#34)。
【００８４】
第４の特定の実施例に於いて、核酸発現構築体は更に、核酸導入を促進するポリペプチドを含む(例えば、帯電したポリペプチド、あるいはポリL-グルタミン酸塩)。被験者の組織へ核酸発現構築体を搬送した後に、コード化されたＧＨＲＨ、又はその機能的な生物学上の等価物の発現が開始する。コード化されたＧＨＲＨは生物学上活発なポリペプチドを含み、GＨＲＨのコード化された機能的な生物学上の等価物は、識別可能なアミノ酸配列を含むよう設計され、同時にその一方、ＧＨＲＨポリペプチドと比較した時に同様の又は改善された生物学的な活性を有するポリペプチドである。
特定のコード化されたＧＨＲＨ又はその機能的な生物学上の等価物の一実施例は、定式(SEQID#14)である。動物はヒト、食用動物、仕事用動物(例えばブタ、雌牛、羊、ヤギ或いは鶏)又はペット(例えば犬、猫、馬)を含む。
【００８５】
本発明はまた、感染症の検査後に、患者の臨床結果を改善するのに役立つ方法に関係する。本発明の一般的な方法はプラスミドを媒介とした遺伝子の追加で被験者を治療する工程を含む。
方法は成長ホルモン放出ホルモン(“ＧＨＲＨ”)又はその機能的な生物学上の等価物をコード化する核酸発現構築体を、被験者の筋肉のような組織の中へ伝える工程を含む。
本発明の特定の実施例はプラスミドが調節されたＧＨＲＨ追加により、治療された被験者のワクチン接種応答の改善を指向する。プラスミド注入は特定のワクチン接種に先立つか、又は同時にすることができる。それに続く、被験者のＧＨＲＨ又は生物学上の等価物の生体内の発現は、ワクチン接種の応答を改善するのに十分である。このようにして、感染症の問題が後日に生じる場合、臨床の結果は著しく改善される。
さらに、選択された組織に複数の電極を置き、その後、核酸発現構築体を複数の電極を挟む領域内の選択された組織に搬送し、細胞に核酸を導入するパルス(例えば、電気的)を核酸発現構築体が搬送された選択された組織領域内の選択された組織に加えることにより、この方法を増強することは可能である。
しかし、細胞に核酸を導入するパルスは電気的なパルスである必要がなく、血管圧力パルスのような異なる方法も利用することができる。
電気穿孔、直接噴射、遺伝子銃又は金の粒子衝撃も、特定の実施例の中で、被験者内へＧＨＲＨをコード化する核酸発現構築体又は生物学上の等価物を搬送するために使用される。本発明での被験者は動物を含む(例えばヒト、ブタ、馬、雌牛、マウス、ネズミ、猿、羊、ヤギ、犬又は猫)。
【００８６】
組み換えのＧＨ代償治療法は、有益な効果と共に、農業及び臨床に広く使用される。しかし、一般に、服用量は生理学的な量以上である。
組み換えＧＨのそのような多い服用量は、有害な副作用に関係する、例えば３０％以下の組み換えＧＨで治療された被験者は、高い頻度インスリン抵抗性を生じ(ゴピナス及びエサートン、1989年a; ゴピナス及びエサートン、1989年b; バーヘルスト他、1997年)、又は小児科の患者に加速された骨骨端成長及び成長停止を生じる(ブレセン及びランドル、1996年)。
更に、ＧＨを循環させる分子の異成分は、成長及び平衡状態(homeostasis)に重要な意味合いを持つ(サトザワ他、2000年; ツネカワ他、1999年; ワダ他、1998年)。
望まれない副作用は、組み換えの外生のＧＨタンパク質を用いた治療がＧＨの基底レベルを上げて、ＧＨの自然で偶発的なパルスを除去する(abolish)という事実に起因する。
対照的に、副作用は組み換えのＧＨＲＨ治療については、報告されていない。
脳下垂体の門脈循環範囲中のＧＨＲＨの正常なレベルは、約１５０から８００ｐｇ／ｍｌの範囲であり、その一方、ホルモン系統の循環する値は約１００−５００ｐｇ／ｍｌである。
頭蓋外の腫物によって引き起こされた先端肥大症の患者の中には、ほぼ１００倍のレベルを有する者がいる(例えば、５０ｎｇ／ｍｌの免疫反応性のＧＨＲＨ)(トーナー他、1984年)。
子ども及び老人にて、組み換えのＧＨＲＨ治療(1-5年)を使用する長期的な研究は、断食時のグルコース濃度の変化、又は小児科の患者の加速された骨端の成長及び成長停止、又は主要な大腿部の骨端のスリップのような古典的なＧＨ副作用がないことを示した(シェヴァリエ他、2000年ら)(ダック他、1992年; ビットーネ他、1997年)。
【００８７】
ヒト、羊又はブタの研究は、組み換えのＧＨＲＨタンパク質を有する連続的な注入がＧＨＲＨ受容体の感度を減じず、又はＧＨ供給を消耗せずに、正常なＧＨパターンを回復することを示した(ダブロイル他、1990年)。
このシステムがＧＨ治療で除去されるある程度のフィード・バックができるので、ＧＨＲＨ組換え型タンパク質治療はＧＨ治療より生理学的かもしれない。
しかし、生体内でのＧＨＲＨの短い半減期により、頻繁な(１日当たり１〜３回)静脈内投与、皮下投与又は鼻腔内投与(３００倍の高い用量を要求する)は必要である(エヴァンス他、1985年; トーナー他、1986年b)。
このように、慢性の治療として、組み換えのＧＨＲＨタンパク質投与は実際的ではない。
しかし、プラスミドを媒介とした補足アプローチは、ＧＨＲＨ使用に対するこの制限を克服することができた。
遺伝子治療用途へのＧＨＲＨの選択は、遺伝子、ｃＤＮＡ及び自然の及び幾つかの変化させられた分子が、ヒト、ブタ、牛及び他の種について特徴づけられたという事実によって支持される(ボーレン他、1983年; ギルマン他、1982年);
猫、犬及び馬に特有のＧＨＲＨのｃＤＮＡが単離された。治療の効能の測定は簡単で明白である。
【００８８】
生体内に遺伝子を導入する非ウイルス技術の中では、筋肉内へのプラスミドＤＮＡの直接注入が単純で、安く、安全である。
単純な直接注入の後の筋繊維の中への非能率的なＤＮＡ摂取は、比較的低い発現レベルとなった(プレンティス他、1994年; ウェルズ他、1997年)。更に、導入遺伝子の発現期間は短かった(ヴォルフ他、1990年)。最も成功した従前の臨床的用途は、ワクチンに限定された(ダンコ及びヴォルフ、1994年; ツルミ他、1996年)。
最近、生体内のプラスミド搬送を増強し、かつ続いて、生理学的レベルの分泌されたタンパク質を達成する著しい進化は、電気穿孔技術を使用して得られた。
電気穿孔は、プラスミドの注入の後に腫瘍細胞に核酸を入れる(ルーカス他、2002年; マツバラ他、2001年)、又はヒトの中の皮膚及び皮下の腫物に抗腫瘍薬ブレオマイシンを搬送するのに、非常に成功裡に使用された(ゲール他、1998年; ヘラー他、1996年)。
電気穿孔が、またハツカネズミ(レスボーデス他、2002年; ルーカス他、2001年; ビルクイン他、2001年)、ネズミ(テラダ他、2001年; ヤスイ他、2001年)及び犬(フェウェル他、2001年)に広範囲に使用されて、様々なホルモン、サイトカイニン又は酵素をコード化する治療遺伝子を搬送する。
成長ホルモン放出ホルモン(ＧＨＲＨ)を使用する我々の従来の研究は、電気穿孔を用いるプラスミド治療が計量可能で、大きな動物及びヒト中のタンパク質の生成と調整された分泌を引き起こすのに有望なアプローチを表わすことを示した(ドラギア−アクリ他、1999年; ドラギア−アクリ他、2002年c)。電気穿孔はまた、げっ歯動物及び他の小さな動物に広範囲に使用された(ベッタン他、2000年;イン及びタン、2001年)。
電極配置が電場分配及びその後の結果に影響することが観察された(ゲール他、1999年; ミクラビキック他、1998年)。
予備試験は、大きな動物又はヒトについては、針電極が外部キャリパ電極より一貫して良好な複製可能な結果を与えることを示した。
【００８９】
プラスミドの骨格筋肉への摂取を高める電気穿孔の能力は、上記の如く、良く記載されてきた。更に、ＰＬＧ又はポリビニールピロドニン(“ＰＶＰ”)で処方されたプラスミドが、遺伝子トランスフェクションを増加させ、それ故にハツカネズミ、ネズミ、犬の骨格筋肉内にて、遺伝子発現を１０倍に増加させることが観察されてきた(フェウェル他、２００１年、ムンパー他、１９９８年)。
理論によって拘束されたくないが、ＰＬＧはプラスミドＤＮＡを安定させ、細胞膜孔を通って細胞膜内搬送を容易にすることによるだけでなく、動的メカニズムによっても、電気穿孔工程時にプラスミドのトランスフェクションを増加させる。
例えば、細胞上の正に帯電した表面タンパク質は、タンパク質−タンパク質の相互作用により、プラスミドＤＮＡに繋がった負に帯電したＰＬＧと複合化する。電界が加えられると、表面タンパク質は方向を逆にし、ＤＮＡ分子を動的に吸収し、トランスフェクション効率を実質的に増加させるように処理する。
【００９０】
理論によって拘束されたくないが、ワクチン接種反応を高め、且つここに記載された感染症の検査の後の被験者の結果を改善するプラスミドの補足アプローチは、組み換えのＧＨ又はＧＨＲＨタンパク質を直接注入することの制限に対する長所がある。
ＧＨＲＨの発現又は新規性のあるＧＨＲＨの生物学上の均等物は、合成筋肉に特有のプロモータによって調節された発現プラスミドによって導かれる。そのようなＧＨＲＨ又は生物学上の均等物の発現は、被験者に高いレベルのＧＨ及びＩＧＦ−Ｉを誘発させ、それは筋肉注射及び生体内の電気穿孔によって、被験者の細胞へコード化配列を搬送した。
生体内の電気穿孔は被験者の細胞へ異種起源の核酸符号化システムを導入する好ましい方法であるが、他の方法は存在し、これは当業者には知られているべきである(例えば電気穿孔、リポフェクタミン、リン酸カルシウム、生体外変形、直接注入、ＤＥＡＥデキストラン、超音波分解のローディング、核酸導入が調節された受容体、微粒子銃等)。
例えば、被験者、即ちドナーの身体から最初に細胞を撤去することにより、被験者の細胞へ、ＧＨＲＨ又はその機能的な生物学上の均等物をコード化する核酸配列を直接導入して、培養液中で細胞を維持して、その後、様々な方法により核酸コード化システムを導入し(例えば電気穿孔、リポフェクタミン、リン酸カルシウム、生体外変形、直接注入、DEAEデキストラン、超音波分解のローディング、核酸導入が調節された受容体、微粒子銃等)、最後に、元の被験者又は他の宿主被験者(生体外の方法)へ修正された細胞を再導入することも可能である。ＧＨＲＨ配列は、アデノウイルス・ベクター又はアデノウィルスに関連するベクターへクローンを作り、１回の筋肉注射によって、静脈内に、或いは動脈内に搬送される。
ＧＨＲＨ配列を運ぶプラスミドＤＮＡは、カチオン脂質又はリポソームと複合化されて、筋肉内、静脈内、又は皮下に搬送される。
【００９１】
ここで使用される投与は、ベクター又はＤＮＡのキャリアを体内に導入する経路を指す。
投与は、目標組織に直接され、或いは全身の投与の後に目標組織を目掛けて搬送される。
特に、本発明は、身体へベクターを投与することで、被験者のワクチン接種反応の改善に使用され、プラスミドを媒介とした追加に役立つ、組織内のある特定の核酸配列が、あるレベルに調節されて発現することを確立する。
ベクターの投与、及び搬送用に計画された使用の為の好ましい手段は、上記されている。
【００９２】
筋細胞は、溶液、検査液、又は筋肉の中へのコロイドとして、ＤＮＡ粒子を１回注入した後に、細胞外のスペースからＤＮＡを取り上げるユニークな能力を持っている。この方法によるＤＮＡの発現は、数か月の間保持される。筋細胞中のＤＮＡ摂取は、生体内の電気穿孔を利用して、さらに高められる。
【００９３】
策定されたＤＮＡベクター搬送は、巨大分子の複合体にＤＮＡを組み入れることに伴って生じ、目標細胞によってエンドサイトーシスを経る。そのような複合体は脂質、タンパク質、炭水化物、合成有機化合物、或いは無機化合物を含む。ベクターを用いて作られた複合体の特性(サイズ、電荷、表面特性、組成)は、身体内のベクターの生物学的利用能力を決定する。策定された他の要素は、細胞の表面又は細胞内部の特定の受容体と相互に作用するリガンドとして機能する。策定された他の要素は、細胞に入り、核内体から放出され、核内に入ることを高めるように機能する。
【００９４】
搬送はまた、ＤＮＡ運搬体の使用を通じる場合がある。ＤＮＡ運搬体はＤＮＡベクターと結合し、表皮の細胞によって摂取されることができる分子を指す。ＤＮＡ運搬体はＤＮＡと非共有結合する分子錯体を含み、細胞膜を通って効率的にＤＮＡを搬送する。運搬体がまた、核細胞膜を通ってＤＮＡを搬送することも好ましい。
例えば、以下の出願を参照されたく、全て(図面を含む)は引用を持って、本願への記載加入とする。
(1) ウー他、米国特許第6,150,168号、発明の名称が“ＤＮＡ運搬体システム及び使用方法;”
(2) ウー他、1993年3月19日に出願されたPCT/US93/02725、発明の名称が“ＤＮＡ運搬体システム及び使用方法”;
(3) ウー他、米国特許第6,177,554号“核酸運搬体システム及び使用方法”;
(4) ゾカ他、米国特許第5,955,365号、発明の名称が“自己組立するポリヌクレオチド運搬システム”；及び
(5) ゾカ他、1993年4月5日に出願されたPCT/US93/03406、“自己組立するポリヌクレオチド運搬システム”。
【００９５】
搬送の別の方法はＤＮＡ運搬体システムを含む。ＤＮＡ運搬体システムは、ＤＮＡとは独立して非共有結合する幾つかの要素を含む粒子から構成される。各要素は、特定の受容体を認識するリガンド、又はＤＮＡと結びつく陽性基と複合したタンパク質のような他の官能基から構成される。使用され得る陽イオンの例は、スペルミン、スペルミン派生語、ヒストン、カチオンのペプチド及び／又はポリリシンである；１つの要素は、ＤＮＡベクター及び目標細胞上の細胞表面の受容体の両方に結び付けることができる。
そのような要素の例は、アシアロ糖蛋白受容体、葉酸受容体、マンノース-６-リン酸塩受容体、或いはカルニチン受容体と相互に作用する有機化合物である。
第２の要素は、ＤＮＡベクター及び核膜上の受容体の両方に結び付くことができる。核リガンドは核膜を通って、運搬体システムを認識し輸送することができる。そのようなリガンドの一例は、シミアンウイルス４０大きなＴ抗原、又はヒストンからの核目標配列である。
第３の要素はＤＮＡベクター、及びエピゾームの溶解を引き起こす要素の両方に結びつくとができる。その例は、アデノウイルス、インフルエンザ・ウイルス赤血球凝集素と関係するペプチド或いは上記に引用したスコカ特許に記載されたＧＡＬＡペプチドのような不活性化されたウイルス粒子を含む。
【００９６】
投与はまた、脂質を含む。脂質は、単層か、両層状か、多重層状に整えられた脂質から成る球状の小胞の穴であるリポソーム、及びＤＮＡのような水溶の化合物を取り込み、直径サイズが０．０５から数ミクロンまで変動する内部の水スペースを形成する。リポソームを形成しなくとも、脂質は有用であり得る。
特定の例は、カチオンの脂質、及びＤＯＰＥを含む複合体の使用を含み、ＤＮＡ及び標的細胞の細胞膜と相互に作用し、細胞内へのＤＮＡの挿入を促進する。
【００９７】
遺伝子の搬送はまた、遺伝子的に操作された細胞の移植により行なうことができる。
例えば、筋芽細胞と呼ばれる未熟な筋細胞が、筋繊維へ遺伝子を運ぶのに使用されてもよい。組換え型ヒト成長ホルモンを発現するために遺伝子的に操作された筋芽細胞は、動物の血液へ成長ホルモンを分泌する場合がある。組み込まれた遺伝子の分泌は、３ケ月までの期間の間、持続することができる。
【００９８】
筋芽細胞は最終的には、既存の筋組織に分化し融合する。筋芽細胞が現存の構造に組み入れられるので、それは許容されるだけでなく養育される。筋芽細胞は、プラスミドを媒介とした追加を必要とする個人から筋組織を取ることにより容易に得ることができ、遺伝子的に操作された細胞は、患者の筋肉に損害をもたらすことなく、容易に戻すことができる。
同様に、角化細胞は組織へ遺伝子を搬送するのに用いられてもよい。多くの角化細胞は、小さな生体検査組織を培養することによって生成することができる。培養は、階層化されたシートとして準備することができ、ヒトに移植された時、長年にわたって組織親和性の質を改善し続ける表皮を生成する。
適切なベクターを用いて角化細胞をトランスフェクトすることにより培養している間、角化細胞は遺伝子的に操作される。角化細胞は真皮から表皮を区別する基底膜によって血液循環から分けられるが、ヒトの角化細胞は血液循環へ生産されたタンパク質を分泌する。
【００９９】
搬送はさらに、ウイルスベクターを使用してもよい。例えば、アデノウイルスのベクターは、ウィルスゲノムのElとE3の領域を、本発明ではプロモータ、5'UTR、3'UTR及び核酸カセットを含むと記載されたベクター要素と置換し、この組換えゲノムを、２９３個の細胞へ導入することにより構成され、該細胞はこの遺伝子を伝染性のウイルス粒子へ包み込む。
その後、この細胞からのウィルスは、生体外又は生体内の組織に感染するにに使用されて、核酸カセットの中で遺伝子の発現に結びつく組織へベクターを導入する。
【０１００】
ベクター
用語“ベクター”がキャリアー核酸分子を指すのに用いられて、該分子内に核酸配列が挿入されて細胞内に導入され、幾つかの実施例に於いて、複製される。
核酸配列は動物に固有であり、又は“外因性”であり、“外因性”とはベクターが導入される細胞にとって異質であり、又は配列が普通は見付からない宿主細胞核酸内の位置を除き、配列が細胞内の配列と同種であることを意味する。
好ましい実施例では、ベクターはウイルスの配列を本質的に含んでいないが、ベクターはプラスミド、コスミド、ウィルス(バクテリオファージ、動物ウイルス及び植物ウイルス)、線形のＤＮＡ断片及び人工染色体(例えばＹＡＣ、ＢＡＣ)を含んでいる。
当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築するために、上手に用意するだろう。
【０１０１】
用語“発現ベクター”は、転写され得るＲＮＡの核酸コード化を含む、あらゆるタイプの遺伝子構築体を指す。ある場合には、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド或いはペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は例えば翻訳されず、アンチセンス分子、即ちリボザイムを生産する。
発現ベクターは様々な“調節配列”を含むことができる。それは特定の宿主細胞内にて、
効果的にリンクしたコード配列の転写及び恐らく翻訳に必要な核酸配列を指す。
転写と翻訳を管理する調節配列に加えて、ベクターと発現ベクターは、同様に他の機能に役立ち、以下に記載される核酸配列を含み得る。
【０１０２】
プラスミドベクター
ある実施例では、プラスミドベクターからの線形のＤＮＡ断片が、真核細胞、特に哺乳類の細胞にトランスフェクトするのに使用することが考えられる。
一般に、宿主細胞と互換性をもつ種に由来するレプリコンと調節配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主に関して使用される。ベクターは通常、形質転換細胞の発現を選択することができるマーキング配列と同様に、複製部位を運ぶ。
この例に限定されないが、大腸菌は、大腸菌種に由来したプラスミドであるpBR322又はpUCの派生語を使用して、しばしば変形される。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン抵抗用遺伝子を含んでおり、このように、形質転換細胞を識別する容易な手段を提供する。
他のプラスミドは、カナマイシン又はネオマイシン用遺伝子を含んでいるか、あるいは非抗生物質選択メカニズムを有する。
pBRプラスミド、或いは他の微生物のプラスミドか、ファージは更に例えば、プロモータを含み、又は含むように修正され、該プロモータは微生物の有機体によってそれ自身のタンパク質を発現させるのに使用され得る。
当業者は、本発明の方法で使用すべく、当該技術分野のあらゆるプラスミドも修正され得ることが判る。特定の実施例では、例えば、治療用に用いられＧＨＲＨベクターは合成的に生産され、カナマイシン耐性遺伝子を有する。
【０１０３】
更に、宿主微生物と互換性をもつレプリコンと調節配列を含むファージベクターは、これらの宿主に関して、ベクターを変形して使用することができる。
例えば、ファージラムダＧＥＭ(商標)−１１は、組み換えのファージベクターを作る際に利用され、該ファージベクターは例えば大腸菌LE392のような宿主細胞を形質転換するために使用される。
【０１０４】
更に有用なプラスミドベクターはpINベクター(イノウエ他、1985年)及びpGEXベクターを含み、後での浄化、分離或いは劈開に備えて、グルタチオンＳ-転移酵素可溶の融合タンパク質の生成で使用される。他の適切な融合タンパク質はβ-ガラクトシダーゼ、ユビキチン等を具えたものである。
【０１０５】
発現ベクターを含むバクテリアの宿主細胞(例えば大腸菌)は、多くの適切なメディア(例えばLB)内の何れかに於いて成長する。当業者には理解されるように、あるプロモータについて、宿主細胞を特定の薬剤に接触させる、例えば媒体にIPTGを加え、又は孵化をより高温に切り替えることによって、あるベクター内の組換え型タンパク質の発現が誘発されてもよい。
一層長い時間の間、略２−２４時間の間、バクテリアを培養した後に、細胞は遠心分離によって集められ、残った媒体を取り除くために洗われる。
【０１０６】
プロモータ及びエンハンサ
プロモータは、核酸配列の一部領域である調節配列であり、そこで遺伝子産物の転写の開始及び速度が調節される。それは、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写調節因子のような、調節蛋白質と分子が結びつく遺伝子要素を含み、核酸配列の特定の転写を開始する。
語句“効果的に位置した”、“効果的に繋がった”“調節下で”及び“転写調節の下で”は、プロモータが核酸配列に関する、正確な機能的な位置及び／又は方向にいて、転写開始及び／又は配列の発現を調節することを意味する。
【０１０７】
プロモータは、一般にＲＮＡ合成のための開始位置を位置決めするのに機能する配列を含む。この最もよく知られている例はＴＡＴＡボックスである、しかし幾つかのプロモータは、ＴＡＴＡボックスがなく、例えば、哺乳類ターミナルデオキシヌクレオチヂル転移酵素遺伝子用のプロモータ、シミアンウイルス４０後期遺伝子用のプロモータであり、開始位置に横たわる個別の要素は、開始の場所を固定するのに役立つ。追加のプロモータ要素は、転写開始の頻度を規制する。
典型的には、これらは開始位置の上流に地域３０−１１０ｂｐに位置するが、多くのプロモータは開始位置の下流に同様に機能要素を含むことが示された。プロモータの“調節下に”コード配列をもたらすために、選ばれたプロモータの(即ち、3'の)転写リーディング・フレームの“下流”の転写開始位置の5'終了を位置決めする。
“上流の”プロモータは、ＤＮＡの転写を刺激し、コード化されたＲＮＡの発現を促進する。
【０１０８】
プロモータ要素間の間隔はしばしば柔軟であり、要素が互いに逆にされ、移動する場合、プロモータ機能が保存されている。ティミディン(timidine)キナーゼ(tk)プロモータでは、活動が低下し始める前に、プロモータ要素間の間隔は50 bpに増加されて離れ得る。
プロモータによって、個々の要素が転写を活性化するために協動して又は独立して機能することができるように見える。プロモータは“エンハンサ”と共に使用されてもよいし、使用されなくてもよい。“エンハンサ”は、核酸配列の転写活性化に含まれるシス作用の調節配列(転写、複製に必要とされる塩基配列)を指す。
【０１０９】
プロモータは、生来、核酸配列に関連し、コード化断片及び／又はエクソンの上流に位置する5'の非コードの配列を単離することにより得られる。そのようなプロモータは“内生的な”と呼ぶことができる。
同様に、エンハンサは、生来、核酸配列に関連し、配列の下流又は上流の何れかに位置する。或いは、組み換えか、合成か、異種起源のプロモータの管理の下でコード化核酸断片の位置を決めることにより利点が得られだろう。そのプロモータは、その生来の環境の中で通常核酸配列に関係していないプロモータを指す。
組み換えか、合成か、異種起源のエンハンサは、さらにその生来の環境の中で核酸配列に通常関連しなかったエンハンサを指す。
そのようなプロモータ又はエンハンサは、他の遺伝子のプロモータ又はエンハンサ、及び他のウィルス、即ち原核生物か真核細胞から単離させられたプロモータ又はエンハンサ、  “自然には生じない”即ち、異なる転写調節領域の異なる要素及び／又は発現の後の突然変異を含むプロモータ又はエンハンサを含んてもよい。
例えば、組み換えＤＮＡ構成の中で最も一般に使用されるプロモータは、含めるβ-ラクタマーセ(ペニシリナーゼ)、ラクトーゼ及びトリプトファン(trp)のプロモータシステムを含む。
プロモータとエンハンサの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、組み換えのクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して生成され、核酸増幅技術はここに示された構成に関するＰＣＲ(商標)を含む(参照によって各々ここに組込まれて、米国特許第4,683,202号及び第5,928,906号を参照し、これらの内容は引用を持って本願への記載加入とする)。
更に、ミトコンドリア、葉緑体などのような非核の細胞器官内の転写及び配列の発現を指向した調節配列が同様に用いられることが考えられる。
【０１１０】
当然、発現用に選択された細胞器官、細胞タイプ、組織、器官、有機体内のＤＮＡ断片の発現を有効に指図するプロモータ及び／又はエンハンサを用いることは重要だろう。
分子生物学の当業者は、一般にタンパク質を発現するのに、プロモータ、エンハンサ及び細胞タイプの組み合わせを使用することを知っている。
使用されるプロモータは、組換え型タンパク質及び／又はペプチドの大規模生産に有利なように、適切な条件の下で構成的で、組織に特有で、誘致可能で及び／又は有用で、導入されたＤＮＡ断片の高レベルの発現を指図する。プロモータは異種起源かもしれないし又は内部成長的かもしれない。
【０１１１】
更に、発現を駆り立てるのに、あらゆるプロモータ/エンハンサの組み合わせ(例えば真核生物のプロモータデータ・ベースEPDB、http://www.epd.isb-sib.ch/のように)も使用することができるかもしれない。
T3、T7又はSP6の細胞質の発現システムの使用は、別の可能な実施例である。
搬送複合体の一部、又は付加的な遺伝発現構築体として、適切なバクテリアのポリメラーゼが提供される場合、真核細胞は、所定のバクテリアのプロモータから細胞質が転写することを支援することができる。
【０１１２】
表１及び２は、本発明の文脈に用いられ得て、ＲＮＡの発現を規制する要素/プロモータの例を列挙しており、これに限定されない。表２は、誘致可能な要素であって、特定の刺激に応じて活性化することができる核酸配列の領域の例を提供し、これらに限定されない。
【表１】
2008507537.tif 000001
【表２】
2008507537.tif 000002
【０１１３】
組織特異プロモータ又は要素の同一性は、それらの活動を特徴づける分析と同様に、当業者に周知である。それらの領域の例は、ヒトのＬＩＭＫ２遺伝子(ノモト他、1999年)、ソマトスタチン受容体２遺伝子(クラウス他、1998年)、ネズミ科の副睾丸のレチノイン酸結合力のある遺伝子(ラライ他、1999年)、ヒトのＣＤ４(チャオ−エモネット他、1998年)、マウスアルファ２(ＸＩ)コラーゲン(リウ他、2000年)；ツナミ他、1998年)、ＤｌＡドーパミン受容体遺伝子(リー他、1997年)、インスリンと同類の成長因子II(ダイ他、2001年; ウー他、1997年)、及びヒトの血小板内皮細胞接着分子- 1．(アルメンドロ他、1996年)を含んでおり、これらに限定されない。
【０１１４】
好ましい実施例に於いて、合成筋肉プロモータはSPc5-12(リー他、1999年)のように利用されて、それは骨格αアクチン、複合のＭＥＦ−２サイト、ＭＥＦ−Ｉサイト、そしてＴＥＦ−Ｉ結合部位から基部に近い血清レスポンス要素(“SRE”)を含んでおり、自然の筋原性のプロモータの転写の性能を大きく超過する。
そのような合成プロモータの独自性は、筋原性のプロモータ及びその使用(例えば米国特許第5,374,544号)、又は核酸配列の筋原性発現のシステム(例えば米国特許第5,298,422号)に関する権利化された特許の著しい改良である。
好ましい実施例では、発明で利用されたプロモータは止められず、内部成長的な細胞の機構又は要因によって活動が著しく縮小されない。
トランス作用因子部位及びエンハンサを含む他の要素は、本発明の本実施例に従って使用されてもよい。
他の実施例では、自然な筋原性のプロモータが利用されて、当業者は、全米バイオテクノロジー情報センター(“NCBI”)GenBankデータベースあるいはNCBI PubMedサイトを含むデータベースからどのようにそのようなプロモータ配列を得るかを知っている。
当業者は、本発明と関係する配列又は関係する文献を得るために、これらのデータベースが利用されてもよいことに気付いている。
【０１１５】
開始信号及び内部リボソーム結合部位
特定の開始信号がまた、コード化配列の有効な翻訳に要求される。これらの信号は、ＡＴＧ開始コドン、又は隣接した配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳調節信号が供給される必要がある。当業者は容易にこれを決定し、必要な信号を供給する。
開始コドンは全挿入物の翻訳を保証する所望のコード化配列の読み出しフレームを備えた“フレーム単位”であることは周知である。
外生の翻訳調節信号及び開始コドンは自然物、又は合成物の何れかである。発現効率は適切な転写増強要素の包含によって増強されてもよい。
【０１１６】
本発明の或る実施例に於いて、内部リボソーム内部認識部位(“ＩＲＥＳ”)要素が使用されて、多重遺伝子性、又は多シストロン性のメッセージを作成する。
ＩＲＥＳ要素は、5'のメチル化されたキャップに依存した翻訳のリボソーム走査モデルを回避することができ、また内部部位で翻訳を始める(ペルティエ及びソネンバーグ、1988年)。ピコルナウイルスファミリー(ポリオと脳心筋炎)の2つの構成からのＩＲＥＳ要素が、哺乳類メッセージからのＩＲＥＳ(メースジャック及びサーノウ、1991年)と同様に記述された(ペルティエ及びソネンバーグ、1988年)。
ＩＲＥＳ要素は異種起源の読み枠(open reading frame)に繋がれることができる。
多数の読み枠は一緒に転写されて、各々はＩＲＥＳによって各々分離されて、多シストロン性のメッセージを作成する。ＩＲＥＳ要素によって、各読み枠はリボソームにアクセス可能であって、効率的に翻訳される。
同義遺伝子は１つのメッセージを転写するために、１つのプロモータ/エンハンサを使用して、効率的に発現されることができる(参照によってここに組込まれて、米国特許第5,925,565号及び第5,935,819号を参照し、これらの内容は引用を持って本願への記載加入とする)。
【０１１７】
多数クローニング部位
ベクターは多数の制限酵素部位を含む核酸領域であるＭＣＳを含むことができ、それらの何れかは、標準の組み換えの技術と共に使用されて、ベクターを消化することができる(例えば(カーボネリ他、1999年; コセア、1997年; レベンソン他、1998年)を参照し、これらの内容は引用を持って本願への記載加入とする)。
“酵素消化制限”は、核酸分子中の特定位置でのみ機能する酵素を備えた核酸分子の触媒の劈開を指す。これらの制限酵素の多くは市販で入手可能である。そのような酵素の使用は、当業者によって広く理解される。
ベクターはしばしば、ＭＣＳ内にて切断する制限酵素を使用して、線形化されるか断片化されて、外生の配列がベクターに結紮されることを可能にする。“結紮”とは、２個の核酸断片間のリン酸ジエステル結合を形成する過程を指す。それは互いに連続しているかもしれないし、連続していないかもしれない。
制限酵素及び結紮反応に関する技術は、組換えの技術の当業者に周知である。
【０１１８】
部位の結合
転写された真核生物のＲＮＡ分子の大部分は、ＲＮＡスプライシングを経て、一次転写産物からイントロンを取り除く。ゲノムの真核生物の配列を含んでいるベクターは、ドナー及び／又は受容体スプライシング部位に、適切な発現の為に、転写の適切な処理を確実にすることを要求する(例えば(チャンドラー他、1997年)参照)。
【０１１９】
終止コドン
本発明のベクターか構築体は、一般に少なくとも１つの終止コドンを含む。
“終止コドン”又は“ターミネーター”は、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ転写の特定の終止に含まれるＤＮＡ塩基配列で構成される。従って、ある実施例では、ＲＮＡ転写の生産を終了する終止コドンを検討する。ターミネーターは生体内で望ましいメッセージレベルを達成するのに必要かもしれない。
【０１２０】
真核生物のシステムに於いて、ターミネーター領域は更に、新しい転写の部位特異的な劈開を許す特定のＤＮＡ塩基配列を含み、ポリアデニル酸部位を露出する。
これは、専門の内部成長的なポリメラーゼに転写の3'終了へ約200Aの残留物(“ポリA”)の伸張を加えるように信号を送る。
このポリA後部で修正されたＲＮＡ分子が、一層安定性があり、一層効率的に翻訳されるように見える。従って、真核生物に関する他の実施例では、そのターミネーターがＲＮＡの劈開の信号を含むのが好ましい。また、ターミネーター信号がメッセージのポリアデニル酸化を促進することはもっと好ましい。
ターミネーター及び／又はポリアデニル酸部位要素は、メッセージレベルを増強し、且つカセットから他の配列の中への読みを最小化するのに役立つ。
【０１２１】
本発明で使用することを考慮したターミネーターは、ここで記載した、或いは当業者に公知の転写のあらゆる既知のターミネーターも含んでおり、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーターかシミアンウイルス４０ターミネーターのようなウイルスの終始配列のような遺伝子の終始配列を含むが、これらに限定されない。
或る実施例では、終止コドンは、配列切断等により、転写できない、即ち翻訳できない配列であるかも知れない。
ポリアデニル酸化信号
【０１２２】
発現、特に真核生物の発現では、転写の適切なポリアデニル酸化を発効させるには、一般的にポリアデニル酸化信号を含む。ポリアデニル酸化信号の性質は、発明を成功裡に実行するのに重要とは考えられない、及びそのようなあらゆる配列が用いられ得る。
好ましい実施例はシミアンウイルス４０ポリアデニル酸化信号、骨格のアルファアクチン3'UTR或いはヒトかウシ成長ホルモンのポリアデニル酸化信号を含んでおり、様々な標的細胞において便利で、良好に機能することが知られている。ポリアデニル酸化は、転写の安定性を増加させてもよいし、あるいは細胞質の搬送を促進してもよい。
複製起点
【０１２３】
宿主細胞中のベクターを繁殖させるために、それは１つ又は２以上の複製部位の起点を含んでいてもよい(しばしば“オリ”と名付けられる)、それは応答が開始する特定の核酸配列である。或いは、宿主細胞がイースト菌である場合、自己複製配列(“ARS”)を用いることができる。
選択可能で選別可能なマーカー
【０１２４】
本発明のある実施例に於いて、本発明の核酸構築体を含んでいる細胞は、発現ベクターにマーカーを含むことにより生体外かあるいは生体内が識別され得る。
そのようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞との容易に識別できる細胞へ識別可能な変更を与えるだろう。一般に、選択可能なマーカーは選択できる特性を与えるものである。
肯定的な選択可能なマーカーは、マーカーの存在がその選択を許容するものであり、その一方、否定的な選択可能なマーカーはその存在がその選択を防ぐものである。
肯定的な選択可能なマーカーの一例は薬物耐性マーカー、例えばカナマイシンである。
【０１２５】
通常、薬剤選択マーカーの封入は、形質転換体のクローニング及び識別に役立ち、例えばネオマイシンに対する抵抗を与える遺伝子、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールは有用な選択マーカーである。
条件の実行に基づく形質転換体の識別ができる表現型を与えるマーカーに加えて、比色分析に基づくＧＦＰのような識別可能なマーカーもまた考えられる。
或いは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(“tk”)又はクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(“CAT”)のような選別可能な酵素が利用されてもよい。
当業者はまた、おそらくＦＡＣＳ分析に関連して、如何に免疫学のマーカーを使用するかをを知るだろう。
遺伝子産物をコード化する核酸と同時に発現されることができる限り、使用されるマーカーは重要であると考えられない。選択可能で選別可能なマーカーの更なる例は、当業者に周知である。
突然変異生成
【０１２６】
用いられた箇所にて、突然変異生成は様々な標準的、突然変異を起こし得る手順によって遂行された。突然変異は、それによって変化が有機体の量か構造に生じる工程である。
突然変異は、単一の遺伝子、遺伝子のブロック又は染色体全体のヌクレオチド配列の修正を含む。
１つの遺伝子の変化は、点突発変異の結果であり、ＤＮＡ塩基配列内の１つのヌクレオチド塩基の除去、追加あるいは代用を含んでおり、又は多数のヌクレオチドの挿入か削除に関する変化の結果である。
【０１２７】
突然変異は、ＤＮＡ複製の厳守、又はゲノム内の転位遺伝要素(トランスポゾン)の移動時の誤りのような出来事の結果、自然に発生し得る。
それらはまた、化学的又は物理的な突然変異原に晒された後に、誘発される。
そのような変化誘発剤は電離放射線、紫外線光、及びアルキル化剤及び多環式芳香族炭化水素のような化学薬品の種々の群を含み、その全てが核酸と直接又は間接的に(一般に幾つかの代謝の生体内変化に続いて)相互作用することができる。
影響を受けたＤＮＡが模写されるか修理される場合、そのような環境要因によって引き起こされたＤＮＡ障害は、塩基配列の修正に結びつき、突然変化する。
突然変化はまた、特別の目標方法の使用により、特定部位であり得る。
特定部位の突然変異誘発
【０１２８】
構造に案内された部位特異的突然変異は、タンパク質−リガンドの相互作用の解剖及び設計の強力なツールを意味する(represent)(ウェルズ、1996年、ブレイステッド他、1996年)。本発明の技術は、選択されたＤＮＡへ１又は２以上のヌクレオチド配列変更を導入することにより、配列変形の準備及び試験を提供する。
【０１２９】
部位特異的突然変異は、十分な数の隣接した未修正のヌクレオチドと同様に、所望の突然変異のＤＮＡ塩基配列をコード化する特定のオリゴヌクレオチド配列を使用する。
このように、横断されている欠失結合の両側で安定した二本鎖を形成するために、プライマ配列は十分なサイズ及び複雑さを備えている。
長さが約１７から２５のヌクレオチドのプライマが好ましく、配列の結合の両側上の約５から１０の残基が変更される。
【０１３０】
本発明の技術は一般的に、単鎖及び二重らせん構造の形式の両方に存在するバクテリオファージ・ベクターを用いる。特定部位の突然変異誘発に役立つベクトルは、Ｍ１３ファージのようなベクトルを含む。これらのファージ・ベクターは市販で入手可能であり、それらの使用は当業者に一般に周知である。
二重らせん構造のプラスミドもまた、特定部位の突然変異誘発に普通に使用され、それは、ファージからプラスミドまで対象である遺伝子を搬送する工程を除去する。
【０１３１】
一般に、最初に単鎖のベクターを得るか、二重らせん構造のベクターの２つのストランドを溶かし、それは、その配列内に所望のタンパク質か遺伝要素をコード化するＤＮＡ塩基配列を含んでいる。
その後、合成的に準備された、所望の突然変異した配列を生むオリゴヌクレオチドプライマーは、１つのストランドのＤＮＡ調整品でアニーリング(再結合)され、交雑条件を選択する場合の誤った組合せの程度を考慮に入れる、。
交配された生成物は、大腸菌ポリメラーゼI(クレノウ断片)のようなＤＮＡ重合酵素にさらされて、突然変異を生むストランドの合成を終える。
従って、ヘテロ二本鎖が形成されて、そこで１本のストランドは元の突然変異していない配列をコード化し、２本目のストランドは所望の突然変異を生む。
その後、このヘテロ二本鎖ベクターは大腸菌細胞のような適切な宿主細胞を形質転換するために使用され、及び突然変化配列の配置を生む組み換えのベクターを含むクローンが選択されている。
【０１３２】
タンパク質の所定の残留物の機能的な重要性及び情報内容についての包括的な情報が、飽和突然変異生成によって最も良く得られ、該飽和突然変異生成内にて１９のアミノ酸置換が全て検査される。
このアプローチの欠点は、飽和突然変異生成の多重残留物の事業計画が、圧倒されるほど多いことである(ウォレン他、1996年、ブラウン他、1996年;ゼング他、1996年;バートン、及びバーバス、1994年;イエルトン他、1995年;ジャクソン他、1995年;ショート他、1995年;ウォン他、1996年;ヒルトン他、1996年)。
何百、おそらく何千もの特定部位の突然変異が、研究されるべきである。
しかしながら、改善された技術は、突然変異体の生産及び迅速な選別をより一層簡単にする。また、米国特許第5,798,208号及び第5,830,65号の“ウォークスルー”突然変異体の記載を参照されたい。
特定部位の突然変異誘発の他の方法は米国特許第5,220,007号;第5,284,760号;第5,354,670号;第5,366,878号;第5,389,514号;第5,635,377号;及び第5,789,166号に開示されている。
電気穿孔
【０１３３】
本発明のある実施例に於いて、核酸は、電気穿孔によって細胞小器官、細胞、組織或いは有機体へ導入される。電気穿孔は、細胞及びＤＮＡの懸架を高電圧電気放電に晒すことを含む。
この方法の幾つかの変形では、ペクチン分解酵素のようなある植物細胞壁分解酵素が用いられて、目標受容体細胞を治療していない細胞よりも電気穿孔による形質転換を受けやすくする(米国特許第5,384,253号、引用を持って本願への記載加入とする)。
或いは、受容体細胞は、機械的な外傷及び当該技術分野で公知の他の方法により変形を受けやすく作られる。
【０１３４】
電気穿孔を使用する真核細胞のトランスフェクションは完全に成功した。
マウスの予備Bリンパ細胞は、ヒトのκ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ(ポッター他、1984年)、また、ネズミ肝細胞はこの方法でクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた(ツアー−カスパ他、1986年)。
【０１３５】
電気穿孔の根本的な現象は、全ての場合について、同じであると考えられる。しかし、観察された結果の原因である正確なメカニズムは解明されていない。
理論によって拘束されたくないが、電気穿孔の結果は、細胞が電気的なパルスに晒された後、細胞膜が大きな分子に対して一時的に浸透性があるようになることを明白に具現する。
細胞壁を通る経路があり、それは、正常な状況の下で、双方向にイオンが移動することができることにより、約９０ｍｖの膜間静止電圧を維持する。
【０１３６】
理論によって拘束されたくないが、電気穿孔は、これらの構造及び開口を通って高イオン流出を強いて行い又は経路を広げることにより、同じ構造を利用する。
先行技術では、金属の電極は組織に接して設置され、電極間の距離に比例した所定の電圧がそれらに課される。
電気穿孔に使用されたプロトコルは、定式Ｅ＝Ｖ／ｄに従って、生じる電界強度の点から定義され、ここで(“Ｅ”)は電界であり、(“Ｖ”)は課された電圧で、(“ｄ”)は電極間の距離である。
【０１３７】
電界強度Ｅは、被験者の細胞の中への薬剤か巨大分子を搬送する電気穿孔プロトコルを公式化する場合、先行技術に於いて非常に重要な値である。従って、電極間の距離に比例する、所定電圧のパルスを印加することにより、様々なプロトコル用のあらゆる電界強度も計算することは可能である。
しかし、注意すべきことは、電界は、絶縁された電極を持った組織で生成されることができることである(即ち、イオン流れは電界を作成するのには必要ではない)。
理論によって拘束されたくないが、成功した電気穿孔を成功させるのに必要なのは、電流であって、電界自体は必要ではない。
【０１３８】
電気穿孔中に、生成された熱は、電極間のインピーダンス、電流の二乗、及び脈拍時間の積である。熱は組織の電気穿孔中に生成され、電極間の電流、電圧及び脈拍時間の積として引き出すことができる。
電気穿孔用に現在記載されたプロトコルは、生じる電界強度Ｅに関して定義されており、それは未知の電流の短い電圧パルスに依存する。
従って、組織で生成される抵抗や熱を決定することができず、所定の電圧を備えた異なる電気穿孔プロトコルパルス電圧を用いて様々な成功に結びつく。電極を横切る細胞の熱を制限する能力は、所定の電気穿孔電圧パルスプロトコルの有効性を高める場合がある。
例えば、先行技術は、対向する一対の電極を横切って所定電圧のパルスを利用する６つの針電極配列の利用を開示する。この状況は、一致し交差する重なり点が構築する領域内で、電気穿孔時に集中したパターンを設定する。電気穿孔経路に沿った、細胞及び組織の過度の熱は細胞を殺し、プロトコルの有効性を制限する。
しかし、対向する一対の電極以外に(without)、対称的に配備された針電極は、一致する電気穿孔重なり点が構築されない領域内で、電気穿孔時に分散したパターンを生成することができる。
【０１３９】
電極間の電流流れを制御することにより、細胞の相対熱を決定することができる。従って、所定のパルシング・プロトコルの後の有効性を決定するのは電流であって、電極を横切る電圧ではない。所定の電圧は、所定の電流を生じず、先行技術は、電流の正確な投与を決定する手段を提供せず、技術の有用性を制限する。
このようにして、２つの電極間の組織中の電流をしきい値以下に維持する制御により、パルス条件を変え、細胞熱を減らし、細胞の死を少なくし、所定の電圧パルスと比較した時、巨大分子を細胞内により効率的に組み込むことができるだろう。
【０１４０】
細胞膜中の経路に影響を与えるイオンの流出を、正確にコントロールすることにより、電極間スペースの細胞に搬送された電気の投与を有効に制御する手段を提供して、上記の問題を克服する。組織への電気の正確な投薬は、電流レベル、パルス長及びパルス数の積として計算される。
従って、本発明の特定の実施例は、どの箇所にも過度の電流の蓄積濃度を生じることなく、複数の経路に沿った多くの組織に電気穿孔電流を配達することができ、それによって、組織の過熱に起因する細胞死を回避する。
【０１４１】
理論によって拘束されたくないが、生成される電圧パルスの性質は、組織の性質、選択された組織のサイズ及び電極間距離によって決定される。電圧パルスは、できるだけ均質で、正確な振幅であることが望ましい。
過度に強い電界は、細胞の溶解に帰着する。しかし、電界強さが弱いと、電気穿孔の効果が減退することとなる。電気穿孔装置の中には、電極間距離を利用して、電気穿孔用の電界強度及び所定の電圧パルスを計算するものがある。
電極間距離を知ることに頼ることは、電極のデザインを制限する。プログラム可能な電流のパルス・コントローラーが２つの電極間の多くの組織中のインピーダンスを決定するので、電極間距離は適切な電流パルスを決定する重大な要因ではない。従って、針電極配列設計の他の実施例は非対称的なものになるだろう。
更に、当業者は、発明の趣旨及び範囲に外れない、幾つもの適切な対称的・非対称的な針電極配列を想像することができる。配列内及び所望の組織内の個々の電極の深さは、比較可能な結果を伴って変えることができる。
更に、針電極配列に巨大分子のための多数の注入部位が加えられる。
【０１４２】
被験者の選択された組織の細胞内への巨大分子の導入を有効に促進するために使用される電気穿孔装置の１つの例は、２００３年８月９日に出願された、発明の名称が“一定電流の電気穿孔装置及び使用方法”である発明者がスミス他である米国特許出願第10/657,725号に記載されており、その全体内容は引用を持って、本願への記載加入とする。
電気穿孔装置は、電気運動装置(“ＥＫＤ”)を含み、その動作はソフトウェア又はファームウェアによって特定される。ＥＫＤは、ユーザ制御及びパルスパラメータの入力に基づいた配列中の電極間の一連のプログラム可能な定電流パルス・パターンを生み、現在の波形データの格納及び獲得を許可する。電気穿孔装置は、さらに針電極の配列、注入針用の中央注入チャンネル及び除去可能なガイド・ディスクを有する代替可能な電極ディスクを含む。
制限酵素
【０１４３】
本発明のいくつかの実施例では、線形のＤＮＡ断片は親ＤＮＡ分子の制限酵素の消化によって生成される。制限酵素の例は以下に提供される。
名前            認識配列
【表３−１】
2008507537.tif 000003
【表３−２】
2008507537.tif 000004
【表３−３】
2008507537.tif 000005
【０１４４】
ここに使用される用語であるＤＮＡの“制限酵素の消化”は、ＤＮＡ内の或る位置でのみ作用する酵素を用いたＤＮＡの触媒の分裂を指す。
そのような酵素は制限酵素と呼ばれ、そして各々の部位は、制限部位と呼ばれる。
ここに使用される様々な制限酵素は市販で入手可能であり、それらの反応条件、共同因子及び酵素供給者によって確立される他の必要条件が使用される。
制限酵素は一般に、大文字からできている略語、その後に続く各制限酵素が最初得られた微生物を表わす他の文字、次に特定の酵素を指定する数で示される。
一般に、１μｇのプラスミド、即ちＤＮＡ断片が、一般に、約２０μｌの緩衝液内の約１−２ユニットの酵素に対して使用される。特別の制限酵素用の適切なバッファー及び基質量はメーカー毎に特定される。制限酵素はプラスミドの完全さ及び正確さを確実にすべく使用される。
複数例
【０１４５】
次の複数例は、本発明の好ましい実施例を実証するために開示されている。
以下の例に開示された技術は、本発明の実行を良好に機能させる為に、発明者によって発見された技術を表し、このようにその実行に対する好ましいモードを構成すると考えられることが当業者によって理解されるだろう。
しかし、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施例の中で多くの変更が為され、本発明の趣旨及び範囲から外れずに、同様なものか同様の結果を得ることを理解すべきである。
例１
被験動物に於けるＤＮＡベクターの構築及び方法
【０１４６】
ＤＮＡ構築体:
ワクチン接種反応を高め、且つ感染症の検査の後に、被験者の臨床結果を改善するために、いくつかのＧＨＲＨ構築体を設計することが最初に必要だった。
手短に述べれば、プラスミドベクターは、種特異の野生体又はＧＨＲＨ類似物に付けられた筋肉特定型の合成プロモータSPc5-12(SEQID#15)(リー他、1999年)を含んでいた。
幾つかの野生型のＧＨＲＨ配列は我々の研究所(犬、猫及び馬)でクローンを作られた;
他のもの(鶏、羊、牛、豚、ヒト)は専門の文献に従って合成された。
ＧＨＲＨ類似物配列は、前記の如く、部位指向型突然変異生成によって生成された(ドラギア-アクリ他、1999年)。
手短に述べれば、哺乳類ＧＨＲＨ類似物ｃＤＮＡは、部位指向型突然変異生成ＧＨＲＨｃＤＮＡ(SEQID#18)(変更された部位II生体外突然変異誘発システム、プロメガ、マディソン(WI))によって生成され、pSPc5-12のBamHI/雄ジカIII部位へクローンを作り、特定のＧＨＲＨ構築体を生成した。成長ホルモンの3'の翻訳されていない領域(3'UTR)は、ＧＨＲＨ  ｃＤＮＡの下流にクローンを作られた。
合成プラスミドは、ＧＨＲＨ用の哺乳類のアナログ・コード化領域を含んでいた。また、合成のアミノ酸配列は哺乳動物の中に当然なかった。
理論によって拘束されたくないが、ワクチン接種反応の増強、及び感染症の検査後の被験者の臨床結果の改良は、最終的には、ＧＨＲＨホルモンの循環するレベルによって決定される。
幾つかの異なるプラスミドは、異なる突然変異、即ち野生型のＧＨＲＨアミノ酸配列、又はそれらの機能的な生物学上の等価物をコード化した。例えば、
【表４】
2008507537.tif 000006
【０１４７】
一般に、コード化されたＧＨＲＨ又は又はそれらの機能的な生物学上の等価物は、公式化される。
-Ｘ1-Ｘ2-ＤＡＩＦＴＮＳＹＲＫＶＬ-Ｘ3-ＱＬＳＡＲＫＬＬＱＤＩ-Ｘ4-Ｘ5-ＲＱＱＧＥ-Ｘ6-Ｎ-Ｘ7-Ｅ-Ｘ8-ＧＡ-ＯＨ(SEQID#14)
【０１４８】
ここで、Ｘ1は、チロシン(“Y”)、又はヒスチジン(“H”)から成るグループから選ばれたアミノ酸のＤ又はＬ-異性体である。Ｘ2は、アラニン(“A”)、バリン(“V”)或いはイソロイシン(“I”)から成るグループから選ばれたアミノ酸のＤ又はＬ-異性体である。
Ｘ3は、アラニン(“A”)又はグリシン(“G”)から成るグループから選ばれたアミノ酸のＤ又はＬ-異性体である。
Ｘ4は、メチオニン(“M”)又はロイシン(“L”)から成るグループから選ばれたアミノ酸のＤ又はＬ-異性体である。Ｘ5は、セリン(“S”)又はアスパラギン(“N”)から成るグループから選ばれたアミノ酸のＤ又はＬ-異性体である。Ｘ6は、アルギニン(“R”)又はセリン(“S”)から成るグループから選ばれたアミノ酸のＤ又はＬ-異性体である。
Ｘ7は、アルギニン(“R”)又はグルタミン(“Q”)から成るグループから選ばれたアミノ酸のＤ又はＬ-異性体である。及びＸ8は、アルギニン(“R”)又はグルタミン(“Q”)から成るグループから選ばれたアミノ酸のＤ又はＬ-異性体である。
【０１４９】
上記のプラスミドは、ポリリンカー、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子、骨格のアルファ・アクチンプロモータ、又は骨格のアルファ・アクチン'3、UTR/NCRを含んでいない。更に、これらのプラスミドは後記するように、筋肉注入で導入され、その後生体内の電気穿孔が続く。
【０１５０】
“機能的な生物学上の等価物”に関して、“機能的な生物学上の等価な”タンパク質及び／又はポリヌクレオチドの定義に固有のものは、分子が等価物の生物学的な活動の容認可能なレベルを保持しつつ、分子の所定部分内に成される変更の数には制限があるとの概念である。
機能的な生物学上の等価物は、ここでは、それらのタンパク質(及びポリ・ヌクレオチド)として定義され、選択されたアミノ酸(即ちコドン)が代用されてもよい。
ＧＨＲＨの機能的な生物学上の均等物を含むペプチドは、ＧＨＲＨと比較した時、同様又は改善された生物学的な活動を有すると同時に、別個のアミノ酸配列を含むように企画されてきたポリペプチドである。例えば、ＧＨＲＨの１つの生物学的活動は、被験者のＧＨ分泌を容易にすることである。
【０１５１】
最適化されたプラスミドバックボーン
本発明の１つの態様は、最適化されたプラスミドバックボーンである。以下に示された合成プラスミドは、種特異哺乳類転写に合成的に最適化される真核生物の配列を含んでいる。既存のpSP-HV-GHRHプラスミド(“pAV0125”)(SEQID#22)は新しいプラスミド(SEQID#25)を形成するように、合成的に最適化された。
プラスミドpAV0125は、２００３年４月２２日に発行された、発明の名称が“非常に活発な豚の成長ホルモン放出ホルモン類似体”で発明者がシュワルツ他である米国特許第6,551,996号(シュワルツ'996特許)に記載され、成長ホルモンの放出を誘発する能力を改善する突然変異を含むＧＨＲＨ類似体の応用を開示する。
この3,534bpのプラスミドpAV0125(SEQID#22)は、別の市販のプラスミド、例えば合成プロモータsPc5- 12(SEQID#15)、修正された豚のGHRH配列(SEQID#18)、及びヒト成長ホルモン(SEQID#38)の3'末端からの、様々な要素を備えたプラスミドバックボーンを含んでいる。
最適化された合成プラスミドの他の特定例は、最適化されたwt-豚のGHRHプラスミド(pAV0225(SEQID#26)図８)；犬GHRHプラスミド(pAV0235(SEQID#27)図９);牛のGHRHプラスミド(pAV0236(SEQID#28)図１０);猫GHRHプラスミド(pAV0238(SEQID#29)図１１);TI - GHRHプラスミド(pAV0239(SEQID#30)図１２);羊のGHRHプラスミド(pAV0240(SEQID#31)図１３);鶏GHRHプラスミド(pAV0241(SEQID#32)図１４);馬GHRHプラスミド(pAV0249(SEQID#33)図１５);ヒトのGHRHプラスミド(SEQID#34)を含んでいる。
そのように最適化されたプラスミド用に治療コード化された遺伝子は更に、修正されたＧＨＲＨ分子又はその機能的な生物学上の等価物をコード化する最適化された核酸配列を含んでいてもよい。
例２
プラスミド注入及び電気穿孔は大きな動物に抗原を搬送するために使用することができる
【０１５２】
３〜６週間の年齢で、１５〜４０kgの間の重量の混合ジェンダーの若いハイブリッドブタが使用された(ｎ＝６から７/グループ/実験毎に)。
動物は囲いに収容されたグループで、任意に、２４％の蛋白食(生産者協同組合、ブライアン、テキサス州)及び水へアクセスできた。プラスミドは、市販のキット(キアジェン社、チャッツワース、カリフォルニア州、アメリカ)を使用して得られた。菌体内毒素レベルは、動的な色素形成性のＬＡＬ(エンドサフェ、チャールストン、サウスカロライナ州)によって測定されたように、０.０１EU/μg以下であった。
プラスミド調合は、滅菌水で薄められて、ポリＬグルタミン酸塩ナトリウム塩で１％の重量/重量に策定された(ＭＷ＝１０.５kDa平均)(シグマ、セントルイス、ミズーリ州)。
実験０日目においては、動物は手で抑えられて、プラスミド溶解を発現する、分泌されたアルカリフォスファターゼ(SEAP)は、２１−ゲージ針を使用して、５つのピン電極配列の中心に、無傷の皮膚を通って半膜様筋に直接注入された。
適切な注入部位を見つける際に、主な表面血管は全て回避された。プラスミド注入の後の所定の時間間隔では、我々の場合は８０ミリ秒で、電気穿孔が５２ミリ秒の５つのパルス、０.４−１アンペアの電界強度、パルス間隔１秒で開始された。
動物は、ＮＩＨ、ＵＳＤＡ及び動物保護法ガイドラインに従って維持された。
【０１５３】
血液収集:
各実験の０日、３日、７日、１０日目に於いては、動物の体重は午前８：３０に量られた。また、血液は頚静脈に穴を開けることによって、マイクロテインナー血清セパレーター・チューブの中へ集められた。
室温で１０〜１５分で血液を凝結させ、続いて３０００xgで１０分間、遠心分離機にかけられ、詳しい分析まで、−８０℃で血清保存された。
【０１５４】
分泌した胚のアルカリホスファターゼ分析
血清サンプルは溶かされ、メーカー指示につき、５０μＬが、ホスファ光の化学発光の記録検査キットを用いて、SEAP活動のために分析された(アプライドバイオシステム、ベッドフォード、マサチューセッツ州)。分析のための検知の下限値は３ｐｇ／ｍＬである。
より多くの濃縮血清サンプルが、SEAP活動のために分析する前に、マウス血清の中で1:10に薄められた。サンプルは全てルミスターギャラクシー照度計(BMG ラボテクノロギーズ、オッフェンブルク、ドイツ)を使用して読まれた。
【０１５５】
SEAPタンパク質はブタに於いて免疫原性である。また、直接の筋肉注入の後に電気穿孔が使用される場合、タンパク質の免疫調節されたクリアランスが、プラスミド搬送(図１)の後に１０〜１４日以内に生じる。
従って、SEAP発現のレベルは２週間の期間の間のみ研究し、筋肉内のプラスミド・トランスファーに続く遺伝子発現の信頼できる尺度として解釈することができる。
それにもかかわらず、被験者の免疫機能を特に増強する他のタイプの分子を搬送するのに技術が使用される。
測定可能なワクチン接種反応が通常ワクチン接種の約１４日後に生じると、ワクチン接種の前に、又はワクチン接種手順と同時に、ＧＨＲＨとして免疫変調器での処理が生じることは合理的である。
例３
雌牛内へのＧＨＲＨ投与
【０１５６】
１８〜２０か月の年齢で、５４７±４３ｋｇの３２頭の初産のホルスタイン雌牛が、懐妊の最後の３ケ月間に２.５mgのpSP-HV-GHRHで一旦、治療され、治療されたグループとして指定した。同様に、同じ出所からの、同じ種類及び同じ年齢の２０頭の妊娠している若い雌牛が、プラスミド治療を受けず、コントロールとして扱われた。動物は、２３ケ月±２４日で生まれた。
雌牛は、ファンが取り付けられた仕切のない小屋に収容され、蒸発冷却のために水蒸気器を装備し、自然な日光にさらされた。群れは生牧草ベースの全混合物の定量を任意に２度毎日与えられた。各雌牛には、仕切りに入ることを自動的に識別することができるトランスポンダ/万歩計(登録商標)が取り付けられた。
この実験の終わりでは、それらの組織が食物連鎖に入らないように、プラスミドで治療された動物はすべて処分された。治療された動物によって生産されたミルク及び組織は全て破壊され、人間の食物連鎖に入らなかった。動物プロトコルは、米国学術研究会議の実験動物の注意及び使用のためのガイドに従って導かれた。
【０１５７】
プラスミドＤＮＡの筋肉注射
pSPc5-12-HV-GHRHの菌体内毒素のないプラスミド(キアゲン社、チャッツワース、カリフォルニア州、アメリカ)製剤は、水の中で５ｍｇ／ｍＬまで薄められ、ポリL-グルタミン酸塩1%重量/重量で策定された。雌牛は、２１Ｇ針(ベクトン・ディキンソン、フランクリンラックス、ニュージャージー州)を使用して、僧帽筋の中で２.５ｍｇのpSP-HV-GHRHの合計量が筋肉注射で与えられた。
注入後の２分間、注入された筋肉はアドバイシーズのＥＫＤ装置を使用して、下記条件を使用して電気穿孔されされた:上記の如く、５つのパルス、１アンペア、５２ミリセカンド/パルス(ドラギア−アクリ他、2002年b)。
電圧は電気穿孔中に組織の抵抗の変化とともに変化し(定電流を維持する為)、それは８０〜１２０Ｖ/ｃｍであると記録された。全ての注入について、２ｃｍの針が皮膚を通って筋肉に挿入された。動物は注入直後に観察され、そして２４時間後に電気穿孔の部位にてあらゆる悪影響について観察された。
【０１５８】
体重、身体状態、及び蹄スコア
治療前に、雌牛は同じ目盛で体重測定され(ウエイトトロニックス915A表示器及びWP233プリンタに接続されたプリエフェート牛圧搾シュート、セントラルシティスケール、セントラルシティ、ネブラスカ州)、ランダムにグループに割り当てられた。
治療グループを知らされていなかった2人の別々の乳牛科学者(テキサスA&M大学)が、治療に先立って、60〜80のDIM、及び100〜120のDIMの間で身体条件スコアを評価した。
雌牛は、背骨、腰及び臀部エリアの観察及び取り扱いにより記録され、(ローデンブルク、1996年)、可能性があるBCSは１(非常に薄い雌牛)〜５(厳しく過剰条件つきの雌牛)の範囲をとる。
蹄スコアはプラスミド-ＧＨＲＨ治療に先立って測定され、60のDIMで測定された。蹄スコアは、０(蹄に問題はない)〜４(蹄に重大な問題がある)の各足の評価を含んでいた。
蹄は夫々、最終的に２ポイントを割り当てられ、それは現在の腫瘍(１ポイント)及び所定時間での必要な治療(１ポイント)に対してである。
可能性のある蹄スコアは、０(蹄に問題はない)〜２４(４本全ての足、腫物に重大な蹄問題があり、及び各蹄に極度の治療が必要とされる)の範囲をとる。
【０１５９】
血球算定及び免疫のマーカーの完了
全ての若い雌牛からの全ての血液は、EDTAに集められ、治療前、及び治療後１８日び３００日後、及びワクチン接種の検査後に、完璧な血球算定分析をするために、提出された(テキサス獣医診断研究所、カレッジステーション、テキサス州))。
血液学的パラメーターは、:赤血球計算、ヘマトクリット、ヘモグロビン、全ての白血球の数、及び白血球の数の差(好中球、リンパ細胞、単球、エオシン好性細胞及び好塩基性細胞)、血小板数、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度及びフィブリノーゲンを含んでいた。
【０１６０】
免疫のマーカーは、０日、１８日に全ての治療された牛及びコントロールに、並びに治療後３００日であってBiocor-9のワクチン接種の検査後の２０頭の治療された牛及び１０頭のコントロール牛について検査された。
分析は、デイビス博士の研究所(獣医微生物学/病理学、CVM、ワシントン州立大学、プルマン、ワシントン州)で開発された単クローン抗体(mAb)を使用して、流れ血球計算器(FC)によって行なわれた。
mAbsの組み合わせは、３色FCの中で使用され、末梢血中の末梢血単核球(PBMC)の異なる母集団の構成及び頻度、及びＣＤ４とＣＤ８のアルファ・ベータ(αβ)Ｔ細胞及びガンマ・デルタ(γδ)Ｔ細胞の機能的な状態を決定した。
同じ特異性の２つのmAbsが幾つかの組み合わせの中で使用されて、ＣＤ４とＣＤ８のT細胞上の蛍光性の信号の強度を増加させた。
１０ｍＬの血液が、示された時に得られ、ＦＣ用に処理された(デイビス他、1995年)。
血液は３倍に緩衝されたＮＨ4Ｃｌの中で溶解され、酸性のクエン酸塩ブドウ糖(PBS/ACD)を含んでいるリン酸緩衝生理食塩水の中で洗われ、次に、mAbsの異なる組み合わせを含んでいる、９６枚のきれいな円錐形の底組織培養プレートの中で分配された。
細胞は氷の上で１５分間培養され、ＰＢＳ／ＡＣＤで３Ｘを洗われて、フルオレスセイン、フィコエリトリンあるいはフィコエリトリン-Cy5で結合したアイソタイプが特定されたヤギ反マウス抗体の異なる組み合わせで更に１５分間培養した(サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ、アラバマ州、バーミンガム、カルタゴ研究所、バーリンゲーム、カリフォルニア州)。
細胞は次に２Ｘを洗われて、PBSで緩衝された２％のホルムアルデヒドに固定された。検査されるまで、細胞は冷蔵庫の中で維持された。
細胞は、細胞探究ソフトウェアを装備したベクトン・ディキンソンFACSort上で検査された。データは、フロー・ジョウ(トリー・スター社、サンカルロス、カリフォルニア州)及びFCSエクスプレス(デノボソフトウェア、ソーントン、オンタリオ、ｋナダ)ソフトウェア上で分析された。
もし他で述べられなかったならば、データは、それの特定の単クローン抗体又はそれらの組み合わせで分析された全ての母集団の割合として示される(例えば、全てのＣＤ４+及びＣＤ４―細胞は、分析された細胞の１００％を示す；全てのＣＤ２-ＣＤ３-、ＣＤ２-ＣＤ３+、ＣＤ２+ＣＤ３―又はＣＤ２+ＣＤ３+は、ＣＤ２及びＣＤ３抗体の両方で分析された１００％の細胞を表す)。
【０１６１】
生化学及びインシュリン測定
血清サンプルは６０及び１００のDEMで集められた。血清はRIAと生化学分析のために等分され、分析に先立って−８０℃で格納された。生化学分析が、血清収集の後、４８時間以内に生じた(テキサスの獣医学の診断研究所、カレッジステーション、テキサス)。
血清の生化学の終了時には、アラニン・アミノトランスフェラーゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、クレアチン・ホスホキナーゼ、総ビリルビン、総タンパク質、アルブミン、グロブリン、血中尿素窒素、クレアチニン、燐、カルシウム及びグルコースの合計を含んでいた。
インシュリン及びIGF-I分析は血清収集の後に９０日以内に行なわれた。サンプルは、独立した研究所によってグルコースとインシュリンのレベルについて分析された(テキサスの獣医学の診断研究所、カレッジステーション、テキサス)。全てのサンプルは同じ評価で分析された。分析の変動性はグルコース分析について、３.６％であり、インシュリン分析について４.４％であった。
全てのタンパク質は、血清サンプルに対して、バイオラッドタンパク質分析キットを使用して測定された(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、ヘラクレス、カリフォルニア)。
【０１６２】
IGF-Iのについての放射免疫検定
血清IGF-Iは、メーカーのプロトコル(ダイアグノスチックシステムラボラトリィ、ウェブスター、テキサス州)に従う異種のヒトの免疫放射定量測定法キットを使用して測定された。キットは、結合蛋白質妨害を除去する抽出工程を使用する。サンプルはすべて同じ分析の中で実行された。分析内変動性は４％だった。牛のIGF-Iに対するヒトのIGF-I抗体の交差反応性は、１００％である。
【０１６３】
サラウンド９(商標)ワクチン接種:
研究で記録された動物(ＧＨＲＨ治療されたもの、及びコントロール)は全て、サラウンド９(商標)(バイオコー社)と呼ばれる９方式のワクチンを使用して、研究開始の後に３００日目にワクチン接種を受けた。
サラウンド９(商標)は、不活性化され補助的なＩＢＲ(牛の疱疹ウイルス-1)の高抗原性歪み、BVD(牛のウイルス性下痢症)、パラインフルエンザ3、呼吸器合胞体ウイルス(死んだウィルスとして)及びレプトスピラカニコーラの抗原菌種、レプトスピラグリッポタイフォーサ、レプトスピラハードジョ、レプトスピラ黄疸性ハモハージエ及びレプトスピラ・ポーモーナの細菌ワクチンを含む多価のワクチンである。
全ての断片は、最大のウィルス抗原性を維持すべく、不活性化され補助される。
レプトスピラ血液型亜型は、最大の成長及び抗原性を保証するように設計された媒体の中で生産される。このワクチン接種は、下痢、及び乳腺炎の病因に含まれる病原体から呼吸器疾患に、雌牛の病原性条件の大きな配列を向けた。
ワクチンは、５ｍｌの溶液で、１回の注入で皮下に又は筋肉内に投与される。
【０１６４】
統計分析
データは、異なる時間ポイントで繰り返された測定から構成され、治療グループ(治療されたｎ＝３２、コントロールｎ＝２０)へは実験ユニットは、不均一に割り当てられた。
重大な(Ｐ＜０．０５)治療ｘデイ相互作用が検知された時、更なる比較が行なわれた。ＳＡＳ(１つの主たる効果の分析)を使用する混合モデルが用いられて、異なる時間点に各変数のグループ中に何らかの著しい違いがあることを検査した。
疾病率と死亡率、選別割合及び蹄の問題のようなカテゴリーデータは、ANOVAによって分析された。データは、ANOVAが実行され得る数値でコード化された。各動物の合計の蹄スコアはこのパラメーターの分析にて使用された。
死亡率については、等価スコアシステム:生きている＝１、死んでいる=＝０が使用された。
血清IGF-Iは繰返される測定用に、ANOVAによって分析された。
学生のt-テスト、ANOVA即ち線形回帰と比較される値は、結果の中で現れ、統計的有意水準としてＰ＜０.０５Pが得られた。
例４
ＧＨＲＨプラスミド治療で治療され、多価ワクチンでワクチン接種を受けた雌牛の臨床反応
【０１６５】
生化学とＣＢＣの価値:
白血球数の合計はグループ間で同様であった。しかし、３００日目の循環するリンパ細胞の割合は、ＧＨＲＨ治療された動物にて増加した(４７．４±３．３％、これに対し、コントロール３７.８±５.３％、Ｐ＜０．０６)。ヘモグロビン内の生理学的な増加(ＧＨＲＨ治療された動物にて１１．５５±０．１５ｇ／ｄＬ、これに対し、コントロール１０．９±０．１５ｇ／ｄＬ、Ｐ＜０.０２)及び赤血球内の生理学的な増加(７．６５±０．１ミリオン／ｍＬ、これに対し、７．３±０．２ミリオン／ｍＬ、Ｐ＜０．０７)も、この時間ポイントで観察された。
テストされた時間ポイントで、他のＣＢＣ又は血清の生化学的パネルでのグループ間で、違いは見付からなかった。これらは牛についての値の正常範囲内であった。
グルコースとインシュリンのレベルはグループ(図２)間で異なっていなかった。
【０１６６】
免疫のマーカー:
白血球、差異、及び流れ血球計算(FC)プロフィールの総数は、０日のグループ間では同様であった。治療後１８日目に、ＣＤ２+の値は、１４％で治療された動物では増加した、しかし、基線価値と比較したとき、コントロールでは変化がなかった：Ｐ＜０.００４、ＧＨＲＨ治療された牛で、４３.４±１.７％対３７.９±１.４％、コントロールで３７.３±２.１％対３８.８±１.８％であった(図３Ａ)。
ＣＤ４+／ＣＤ８+比率は、ほとんどＣＤ４+細胞の増加により(０日目で、２９.７±０.７％対２４.５±０.８％)、治療された動物の中で増加した(１８日目−０日目＝８±０．６％、Ｐ＜０.０４)。
同じ期間内で、ＣＤ４+ＣＤ４５Ｒ+未投薬リンパ細胞はＧＨＲＨ治療とともに、５３％だけ増加した：Ｐ＜０.０１６、ＧＨＲＨ治療された動物中で１８日目、11.1±0.4%、これに対し、０日目、７.４±０.４％、及びコントロール動物で１８日目、８±０.７％、これに対し、０日目、７.２±０.８％であった(図３Ｂ)。
ＣＤ２５+／ＣＤ４+細胞はまた、治療とともに著しく増加した：Ｐ＜０.００１、ＧＨＲＨ治療された動物中で、１８日目、４.３±０.３％、これに対し、０日目、１±０.１％、、及びコントロールで１８日目、３.８±０.２％、これに対し、０日目、１.７±０.２％であった。
【０１６７】
治療後、３００日目に於いて、より包括的なパネルが実行された時、ＣＤ４Ｒ+ＣＤ４５Ｒ０+未投薬リンパ細胞は、Ｐ＜０.０５、治療された動物で０.９８±０.０８と、コントロールの０.９１±０.０８よりも著しく大きかった(図３Ｃ)。
ＣＤ２+ＣＤ３+γδ細胞は、治療された動物で、全てのＣＤ２+細胞がＰ＜０.０２、６８.５±１.４％と、コントロールの６０±５.６％よりも多数であった。
【０１６８】
サラウンド(商標)９方式ワクチン接種(バイオコー社)の２週間後に、より包括的なパネルが実行された時、ＣＤ４+／ＣＤ８+比率がＧＨＲＨ治療された動物では著しく増加し、一方、コントロールでは減少した。：ＧＨＲＨ治療された動物でＰ＜０.０５、０.２３±０.０７、これに対し、コントロールで、−０.０９±０.０１であった(図４)。
【０１６９】
サラウンド(商標)９方式ワクチン接種(バイオコー社)の2週間後に、より包括的なパネルが実行された時、ＣＤ２５-ＣＤ４+ＣＤ４５Ｒ０未投薬Ｔ−リンパ細胞は、Ｐ＜０.０５で、コントロールに比してＧＨＲＨ治療された動物で著しく増加した(図５)。
【０１７０】
治療された動物中の死亡率:
若い雌牛の死亡率(不本意な処分割合)は、ＧＨＲＨ治療された動物とコントロールとの間で異なっていた。３６０日間の研究中に、治療された若い雌牛のどれも死なず、その一方、コントロールは２０％を処分しなければならなかった(Ｐ＜０．００３)。
死因は下記だった:
１頭はヨーネ病、１頭は蹄条件及び感染した断片からの全身感染症、１頭は後脚麻痺によって悪化した重い蹄問題、及び１頭は重大な乳腺炎であった。１頭の治療された動物は、事故により処分された。
ミルク生産(ＤＩＭ)に於ける、１２０日前の全部の不本意な処分割合は、治療で４０％だけ減少した。環境上の病原体に対するワクチン接種後の保護は、ＧＨＲＨプラスミドを仲介とした治療によって増加した。
【０１７１】
体重及び身体条件スコア:
若い雌牛の身体条件スコア(ＢＣＳ)は、６０〜８０のＤＩＭでストレス及び陰性のエネルギーバランスの時に、グループ間に異なった。
pSP-HV-GHRHで治療された若い雌牛は、６０〜８０のＤＩＭの間で、ＢＣＳが改善したこと(Ｐ＜０.０００１、図６)を示した。
最初の１００のＤＩＭ中、治療された動物は平均３．５ｋｇ(体重の合計の０．０６％)(Ｐ＜０.０２、図７)の体重が減り、一方、コントロール雌牛は平均で２６.４ｋｇ(６０のＤＩＭに於いて体重の４.６％)の体重が減った。
良好なＢＣＳは、血清ＩＧＦ−Ｉレベルの増加と関連がある。:ＧＨＲＨ治療された若い雌牛では、１００日目−６０日目＝２２.４ｎｇ／ｍＬ(１００日目で１１９.７±６.９ｎｇ／ｍＬであったのに対し、６０日目で９７.３±６.６ｎｇ／ｍＬであった)であったのに対し、コントロールでは、８±７.４ｎｇ／ｍＬ(１００日目で９９.８±３.９ｎｇ／ｍＬであったのに対し、６０日目で９１.８±６.８ｎｇ／ｍＬであった)(Ｐ＜０.０４)であった。
【０１７２】
病的状態:
プラスミド投与に先立って、研究の当初に於いて、動物の群は、重要な蹄の病状を持っていた。足問題は、バクテリアを起源とする(マレー他、1996年)の中で恐らく大部分であり、研究全体に亘ってこれらの動物中の病的状態の主要な原因のうちの１つだった。
主な蹄の病状を構成したデジタル皮膚炎病変はＧＨＲＨ治療によって減じられた。
研究は、乳牛の２９％及び肉牛の４％もが肉眼的に、デジタル皮膚炎の病変をしており、スピロヘータが、事例(ブラウン他、2000年)の６０％以上に関係することを示した。
スピロヘータへの免疫反応は、このように短期間(トロット他、2003年)であり、伝染負担を縮小し、安定した長期療法が望ましいだろう。
ワクチン接種及びＧＨＲＨ治療の組み合わせは、治療された動物には有益であることが判った
。治療された動物とコントロールを比較した時、研究の経過の至る所で悪化する足問題を持っていた動物の割合は、コントロールは４０％高かった:ＧＨＲＨ治療された動物では３２頭中７頭であるのに対し、コントロールは２０頭中７頭であった。
全面的な蹄スコア改良は、コントロール群中の高い動物間変動性により統計的有意性(Ｐ＜０.４)に達しなかった。
【０１７３】
望まれない副作用(例えば、出血潰瘍、肝臓と腎臓の空胞形成、又は動物の死(スミス他、1991年))を生じる豚の組み換えのソマトトロピン(rpST)又はbSTとは対照的に、ＧＨＲＨプラスミドを仲介としたＧＨＲＨ遺伝子追加は、動物に副作用が観察されず、良好に許容される。
安定した組織/繊維状に特有のhGHを含むプラスミドは以前に、家畜及びＧＨが不足している宿主の中で、ＧＨの搬送及び安定した生産のために使用された。
hGHを含むプラスミドを搬送するのに使用される方法は、トランスジェネシス、筋芽細胞転写又はリポソームを媒介とした静脈注射を含む(バー及びライデン、1991年; デーラー他、1994年; Pursel他、1990年)。
しかし、これらの技術には大規模手術の中で、及び／又は次のものを含む食用動物に使用されることを妨げる、著しい不利な点がある:
1)リポソーム搬送に関連した可能性のある毒性又は免疫反応;
2)トランスフェクトされた筋芽細胞アプローチの際の、広範囲な生体外の操作の必要性;及び／又は3)トランスジェネシスの際の重大な副作用又は非能率の危険(ドハワン他、1991年; ミラー他、1989年)。
これらの技術と比較して、プラスミドを媒介とする遺伝子追加及びＤＮＡ注入は、単純で有効であり、搬送システム又は過度の発現に関連する併発症が無い。
【０１７４】
ここに提供される実施例は、高められたワクチン接種反応及び改善された臨床の結果が、ＧＨＲＨプラスミドを注入された哺乳動物に生じることを例証する。
治療された被験者は、感染症の検査への反応に対する被験者の能力が著しく改善されたことを示す。
治療された被験者は、関連する病状又は死を含む治療からの副作用を経験しなかった。理論によって拘束されたくないが、ワクチン接種反応で増強すれば、筋原性のＧＨＲＨベクターの異所的発現が、生理学上より適切な方法で、おそらくＧＨ軸芯を刺激するだろうということを示す。
【０１７５】
当業者は、目的を実行し、かつ固有の結果及び利点と同様に言及された結果及び利点を得るのに、本発明がよく適していることを容易に認識する。
ここに記載された成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、類似物、プラスミド、ベクター、医薬組成物、治療、方法、手順及び技術は、現在好ましい実施例の代表であって、模範的であることを意図しており、発明の範囲を制限するものとして意図されない。
更に、牛の疱疹ウイルス-1(“ＩＢＲ”)、牛のウイルス性下痢症(“ＢＶＤ”)、パラインフルエンザ3、呼吸器合胞体ウイルス、レプトスピラカニコラ、レプトスピラグリッポタイフォーサ、レプトスピラハードジョ、レプトスピライクテロハエモーハージェ、レプトスピラ・ポーモーナ・バクテリンマイコプラズマ、ハイポニューモニア、マイコプラズマ・ハイポニューモニア或いはそれらの組み合わせを含むワクチンは、模範的であることを意図しており、発明の範囲を制限するものとして意図されない。
従って、発明の範囲内の変更及び他の用途が、当業者に思い浮かぶであろうし、それらは発明の精神内に包含されるか、係属中の請求の範囲によって定義される。
【０１７６】
引用された参考文献
以下の各米国特許及び発行された参照例の全内容は、引用を持って本願への記載加入とする。
米国特許
コイ他が発明者として挙げられる１９９８年１２月８日発行の米国特許第5,847,066号。
フェリックス他が発明者として挙げられる１９９８年１２月８日発行の米国特許第5,846,936号。
シャリー他が発明者として挙げられる１９９８年８月１１日発行の米国特許第5,792,747号。
ボウワー他が発明者として挙げられる１９９８年７月７日発行の米国特許第5,776,901号。
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ボイド他が発明者として挙げられる１９９４年３月８日発行の米国特許第5,292,721号。
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トーナーが発明者として挙げられる１９９１年７月３０日発行の米国特許第5,036,045号。
コバックス他が発明者として挙げられる１９９１年６月１１日発行の米国特許第5,023,332号。
ボウワー他が発明者として挙げられる１９８９年６月１３日発行の米国特許第4,839,344号。
ボウワー他が発明者として挙げられる１９８３年１０月１８日発行の米国特許第4,410,2,512号。
トレングラーが発明者として挙げられる１９９１年９月２４日発行の米国特許RE33,699号。
グロスベナー他が発明者として挙げられる１９８９年５月２３日発行の米国特許第4,833,166号。
モマニー他が発明者として挙げられる１９８０年１０月１４日発行の米国特許第4,228,158号。
モマニー他が発明者として挙げられる１９８０年１０月１４日発行の米国特許第4,228,156号。
モマニー他が発明者として挙げられる１９８０年１０月７日発行の米国特許第4,226,857号。
モマニー他が発明者として挙げられる１９８０年９月２３日発行の米国特許第4,224,316号。
モマニー他が発明者として挙げられる１９８０年９月１６日発行の米国特許第4,223,021号。
モマニー他が発明者として挙げられる１９８０年９月１６日発行の米国特許第4,223,020号。
モマニー他が発明者として挙げられる１９８０年９月１６日発行の米国特許第4,223,019号。
ホフマン他が発明者として挙げられる１９９７年９月３０日発行の、発明の名称が“薬剤及び遺伝子を調節搬送する針電極”である米国特許第5,702,359号。
ホフマン他が発明者として挙げられる１９９５年８月８日発行の、発明の名称が“医療的用途の電圧制御フィードバックを具えた電気穿孔システム”である米国特許第5,439,440号。
ホフマン他が発明者として挙げられる１９９６年５月５日発行の、発明の名称が“電界を減じることによる電気穿孔的な遺伝子及び薬剤治療”である国際公開公報第WO/96/12520号。
ホフマン他が発明者として挙げられる１９９６年４月２５日発行の、発明の名称が“電気穿孔装置及び方法によるフロー”である国際公開公報WO/96/12006号。
ホフマンが発明者として挙げられる１９９５年７月２７日発行の、発明の名称が“細胞内に薬剤と遺伝子を挿入する電気穿孔的及びイオン導入装置及び方法”である国際公開公報WO/95/19805号。
ニコラウ他が発明者として挙げられる１９９７年３月６日発行の、発明の名称が“生体内の細胞の電気穿孔”である国際公開公報WO/97/07826号。
【０１７７】
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【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、プラスミドを発現する異なる濃度のＳＥＡＰをブタに注入した後に、分泌されたアルカリフォスファターゼＳＥＡＰタンパク質のプラズマ・レベルを示す。
【図２】図２は、コントロール動物及びｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨで治療された動物のグルコースとインシュリンのレベルを示す。
【図３】図３のパネルＡ及びパネルＢは、治療後０日後及び１８日後のＣＤ２+細胞及びＣＤ４+ＣＤ４５Ｒ+未投薬のＴ細胞の割合を示し、パネルＣは、３００日の治療後のＣＤ４５Ｒ+/ＣＤ４５Ｒ-未投薬のＴ細胞の比率を示し、値は手段±ＳＥＭ、*Ｐ＜０．００１として表される。
【図４】図４は、ＧＨＲＨプラスミドを受け取った雌牛中のサラウンド９方法のワクチン(バイオコア)を有するワクチン接種の１４日後に、同じ期間Ｐ＜０．０５にＣＤ４+/ＣＤ８+比率の減少があったコントロール動物と比較して、ＣＤ４+/ＣＤ８+比率は著しく増加したことを示す。
【図５】図５は、ＧＨＲＨプラスミドを受け取った動物中のサラウンド９方法のワクチン(バイオコア)を有するワクチン接種の１４日後に、Ｐ＜０．０５のコントロール動物と比較して、未投薬のＴ細胞の相対的な割合が増加することを示す。
【図６】図６は、６０〜８０のＤＩＭでコントロールと比べてｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨ治療された若い雌牛の身体条件スコアを示す。身体条件スコアは治療グループ間Ｐ＜０.０００１で異なった。
【図７】図７は、注入後の異なる時点で、コントロールと比較して、ｐＳＰ−ＨＶ−ＧＨＲＨ発現プラスミドで治療された動物の重量を示す。
【図８】図８は、ｐＡＶ０２２４発現プラスミドの制限マップを示す。
【図９】図９は、ｐＡＶ０２２５発現プラスミドの制限マップを示す。
【図１０】図１０は、ｐＡＶ０２３５発現プラスミドの制限マップを示す。
【図１１】図１１は、ｐＡＶ０２３６発現プラスミドの制限マップを示す。
【図１２】図１２は、ｐＡＶ０２３８発現プラスミドの制限マップを示す。
【図１３】図１３は、ｐＡＶ０２３９発現プラスミドの制限マップを示す。
【図１４】図１４は、ｐＡＶ０２４０発現プラスミドの制限マップを示す。
【図１５】図１５は、ｐＡＶ０２４１発現プラスミドの制限マップを示す。
【図１６】図１６は、ｐＡＶ０２４９発現プラスミドの制限マップを示す。
【図１７】図１７は、ｐＡＶ０２２６発現プラスミドの制限マップを示す。