【事件の表示】
　上記当事者間の特許第３２２５４６８号発明「抗体測定用試薬」の特許無効審判事件について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
　審判費用は、請求人の負担とする。
【理　由】
第１　手続の経緯の概要
　本件特許第３２２５４６８号についての手続の経緯の概要は以下のとおりである。
　平成　４年８月２８日　：出願
　平成１３年８月３１日　：特許権の設定登録
　平成２２年２月２２日　：審判請求
　　　　　　　　　　　　　甲第１号証ないし甲第２０号証提出
　平成２２年５月１７日　：答弁書提出
　　　　　　　　　　　　　乙第１号証ないし乙第５号証提出
　平成２２年６月２５日　：審理事項通知書
　平成２２年８月２０日　：被請求人口頭審理陳述要領書提出
　平成２２年８月２０日　：請求人口頭審理陳述要領書提出
　　　　　　　　　　　　　甲第２１号証ないし甲第３６号証提出
　
第２　請求人の主張の概要
　請求人は，本件の請求項１ないし９に係る発明について特許を無効とする，審判費用は被請求人の負担とするとの審決を求め，審判請求書と共に甲第１号証ないし甲第２０号証を提出し，また，口頭審理陳述要領書と共に甲第２１号ないし甲第３６号証を提出し，本件請求項１ないし９に係る特許発明は，甲第１号証に記載された発明と同一であるから，特許法第２９条第１項第３号の規定により特許を受けることができない（無効理由１），本件請求項５及び６に係る発明は，甲第１号証に記載された発明と技術常識及び周知技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない（無効理由２），本件請求項１ないし９に係る発明は，甲第２号証に記載された発明と同一であるから，特許法第２９条の２の規定により特許を受けることができない（無効理由３），本件請求項１ないし９に係る発明は，甲第３号証に記載された発明と同一であるから，特許法第２９条の２の規定により特許を受けることができない（無効理由４），本件請求項１ないし９に係る発明は，甲第１，４及び１１号証に記載された先行技術並びに技術常識及び周知技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない（無効理由５）から，本件特許は同法第１２３条第１項第２号に該当し，無効とすべきものであると主張している
　証拠方法は以下のとおりである。
　
甲第１号証：国際公開第９１／１７４４２号
甲第１号証−２：特表平６−５０６７６８号公報
甲第２号証：国際公開第９３／２０４４５号
甲第２号証−２：特表平７−５０４４９２号公報
甲第３号証：国際公開第９３／０９２５３号
甲第３号証−２：特表平６−５０５１６４号公報
甲第４号証：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
　Ｖｏｌ．８８，１９９１，ｐ．４６４１−４６４５
甲第５号証：Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４４，１９８９，
　ｐ．３６２−３６４
甲第６号証：Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５１，１９９１，　ｐ．２８４２−２８４７
甲第７号証：Ｔｈｅ　Ｋｏｒｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１，１９９２年１月，
　ｐ．９−１２
甲第８号証：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
　Ｖｏｌ．８８，１９９１，ｐ．３６４７−３６５１
甲第９号証：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
　Ｖｏｌ．８９，１９９２年５月，ｐ．４４８６−４４８９
甲第１０号証：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
　Ｖｏｌ．８９，１９９２年４月，ｐ．３１９０−３１９４
甲第１１号証：国際公開第９１／１５７７１号
甲第１１号証−２：特表平５−５０８２１９号公報
甲第１２号証：山本重雄編「バイオ検査薬開発マニュアル」，(株）シーエムシー出版，１９９２年４月２８日第１刷，ｐ．９０−９８
甲第１３号証：Ｒｅｖｉｗｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．１，１９８２，ｐ．３５−６８
甲第１４号証：米国特許第４５１５８９０号明細書
甲第１５号証：欧州特許公開第４５１６８７号明細書
甲第１６号証：鑑定書（写し）
甲第１７号証：欧州特許公開第２９１４７９号明細書
甲第１８号証：米国特許第５２７９９３５号明細書
甲第１９号証：米国特許第４５１０２４０号明細書
甲第２０号証：米国特許第４２３７２１９号明細書
甲第２１号証：鑑定書
甲第２２号証：鑑定書
甲第２３号証：米国特許第４４９７８９９号明細書
甲第２４号証：石黒正恒著「生物化学実験法８　ＳＨ基の化学修飾」，学会出版センター，１９８９年第４版，ｐ．４，ｐ．８１−８２
甲第２５号証：志村憲助ら著「生物化学実験法１１　ゲル濾過法　第２版」，学会出版センター，１９９０年，ｐ．１５９−１６５
甲第２６号証：特許庁企画「特許ワークブック」，（社）発明協会，
　２００４年初版第４刷，ｐ．１１４，１５６
甲第２７号証：鑑定書
甲第２８号証：鑑定書（写し）
甲第２９号証：ルミパルスオーソＨＣＶ抗原キット添付文書，
２００８年１２月改訂（第３版）
甲第３０号証：特開昭６０−１２６３００号公報
甲第３１号証：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．７，
　１９８４，ｐ．３２９−３３３
甲第３２号証：国際公開第９２／１３８９２号
甲第３２号証−２：特表平６−５０５３８９号公報
甲第３３号証：米国特許第５０７５２２１号明細書
甲第３４号証：米国特許第４７６９３２０号明細書
甲第３５号証：米国特許第４７０２９０９号明細書
甲第３６号証：Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，
　Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．２，１９９０，ｐ．４２３−４４１
　
第３　被請求人の主張の概要
　被請求人は，本件審判請求は成り立たない，審判の費用は請求人の負担とするとの審決を求め，答弁書と共に乙第１ないし５号証を提出し，本件請求項１ないし９に係る発明は，甲第１号証，甲第２号証及び甲第３号証に記載された発明と同一でなく，甲第１，４，及び１１号証に記載された先行技術と周知技術から容易に発明し得たものではなく，また，本件請求項５及び６に係る発明は，甲第１号証に記載された発明及び周知技術から容易ではないと主張している。
　証拠方法は以下のとおりである。
　
乙第１号証：特表平５−５０３４２２号公報
乙第２号証：Ｂａｎｇａｌｏｒｅ　ＧｅＮｅｉ社カタログ，「Ｔ７ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」，２００８
乙第３号証：ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ社のインターネットホームページ，「Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＦＡＱ」，２０１０年５月１２日検索
乙第４号証：見解書（写し）
乙第５号証：見解書（写し）
　
第４　当審の判断
１　本件発明
　本件の請求項１ないし９に係る発明（以下，それぞれ「本件発明１」ないし「本件発明９」という。）は，以下のとおりのものと認める。
　
「【請求項１】検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するための感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原含有試薬において，該試薬に還元剤を含有せしめるか又は固相化された該抗原含有試薬を還元剤で処理せしめることを特徴とするＨＣＶ抗体測定用試薬。
【請求項２】還元剤が反応溶媒中に存在する請求項１記載の試薬。
【請求項３】試薬が感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原を担体に固相化した抗原であり，該抗原試薬が還元剤で処理されている請求項１記載の試薬。
【請求項４】感受性チオール基をもつ抗原がＨＣＶゲノムの非構造領域のＮＳ３領域である請求項３記載の試薬。
【請求項５】感受性チオール基をもつ抗原が遺伝子組換え技術による発現産物である請求項４記載の試薬。
【請求項６】感受性チオール基をもつ抗原が合成ペプチドである請求項４記載の試薬。
【請求項７】試薬が担体を含み，該担体がビーズ，チューブ，プレート，赤血球，又はラテックス粒子である請求項１記載の試薬。
【請求項８】還元剤がチオール基の酸化防止剤である請求項１〜７のいずれか１項記載の試薬。
【請求項９】還元剤がジチオスレイトール，ジチオエリスリトール，チオグリコール酸，システイン，グルタチオン，２−メルカプトエタノール，２−メルカプトエチルアミン及びこれらの混合物から成る群より選ばれる少なくとも一つである請求項１〜７のいずれか１項記載の試薬。」
　
２　本件発明１の「ＨＣＶ抗体測定用試薬」の技術的範囲について
　本件発明１は，検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するために用いるＨＣＶ抗体測定用の試薬であるから，ＨＣＶ抗体測定のために検体と混合する前に，還元剤を含有せしめ又は還元剤で処理せしめられて試薬として完成したものであるといえ，当該試薬中に検体，つまり，ＨＣＶ抗体を測定する対象である検体が含有された反応中の試薬が含まれるとは，測定用の試薬の使用や流通形態を考えれば，通常は考えられない。
　しかしながら，広義の「試薬」には，反応中の試薬も含まれること，また，本件発明１が「還元剤を含有せしめる」及び「還元剤で処理せしめる」とされ，現在形で表現されているため，既に「含有された」又は「処理された」状態であることが，必ずしも明確とはいえないため，以下に，「ＨＣＶ抗体測定用試薬」の技術的範囲について検討する。
　本件明細書には，本件発明１の「ＨＣＶ抗体測定用試薬」の特徴である「該試薬に還元剤を含有せしめる」又は「固相化された該抗原含有試薬を還元剤で処理せしめる」こと，つまり試薬の製造過程について，
　段落【０００５】に「試薬を製造するに際し，担体にＨＣＶ抗原を感作した後，得られた感作担体を還元剤を含有する緩衝液に分散させ，上記感作担体を含有する緩衝液を凍結乾燥することからなる。」，
　段落【０００６】に「試薬を製造するに際し，不溶性担体にＨＣＶ抗原を固相化した後，得られた抗原結合固相を前記の還元剤あるいはこれらの混合物を含有する緩衝液に浸漬した後，上記固相を乾燥することにより達成することが出来る」と記載されている。
　また，試薬の製造方法及びその使用方法の具体例として，
　段落【０００９】の実施例１には，凍結乾燥ＨＣＶ抗原感作赤血球をＤＴＴ含有トリス塩酸緩衝液に再懸濁し，感度を比較したこと，感度の比較は，ＨＣＶ抗体陽性ヒト血清を段階希釈した感度管理用血清を分注したマイクロタイタープレートのウエルに感作血球を分注して行ったことが記載され，段落【００１０】の実施例２には，凍結乾燥ＨＣＶ抗原感作赤血球を２−ＭＥ含有トリス塩酸緩衝液に再懸濁し，実施例１に準じて感作血球の感度比較を行ったことが記載されており，これらの実施例では，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬である，凍結乾燥ＨＣＶ抗原感作赤血球を，還元剤含有緩衝液に再懸濁して試薬とし，この試薬は検体と混合して使用するものである。
　また，段落【００１１】の実施例３には，ＨＣＶ抗原感作赤血球をグルタチオン添加凍結乾燥用緩衝液中で凍結乾燥し，これを緩衝液中に懸濁し，実施例１に準じて感作血球の感度比較を行ったことが記載されており，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬である，ＨＣＶ抗原感作赤血球を，還元剤を添加した緩衝液中で凍結乾燥して試薬としている。そして，使用時に緩衝液中に再懸濁して液体の試薬とし，この試薬は検体と混合して使用するものである。
　また，段落【００１２】の実施例４には，ＨＣＶ抗原固定化ポリスチレンビーズを，反応用緩衝液として，２−ＭＥ含有トリス塩酸緩衝液を入れたウエルに入れ，１時間放置後，感度管理用血清を添加することが記載されており，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬である，ＨＣＶ抗原固定化ポリスチレンビーズを，還元剤を添加した反応用緩衝液に入れることにより，還元剤で処理して試薬とし，この試薬は検体と混合して使用するものである。
　また，段落【００１３】の実施例５には，凍結乾燥ＨＣＶ抗原感作赤血球をトリス塩酸緩衝液に懸濁し，２週間放置後のこの懸濁液に２−ＭＥを添加し，実施例１と同様に感度を検討したことが記載されており，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬である，凍結乾燥ＨＣＶ抗原感作赤血球を，緩衝液に再懸濁して放置した後，還元剤を添加して試薬とし，この試薬は検体と混合して使用するものである。
　上記のとおり，本件明細書の記載から，本件発明１の「ＨＣＶ抗体測定用試薬」は，その製造過程で還元剤が添加或いは還元剤で処理されて製造され，その試薬は使用時に検体と混合されて測定が行われるものである。
　ところで，請求項２に「還元剤が反応溶媒中に存在する請求項１記載の試薬」と記載されているが，「溶媒」とは，一般に，固体が液体と混ざって溶液をつくる場合，その液体を溶媒といい，固体は溶質という（岩波　理化学辞典　第４版及び第５版の「溶媒」の欄参照）ことから，請求項２の「反応溶媒」は，上記実施例４に記載の２−ＭＥを含有するトリス塩酸緩衝液である「反応用緩衝液」に相当するものであるといえ，請求項２発明では，「反応溶媒」に還元剤を存在させたものを，抗原試薬に含有せしめ又は，これで固相化抗原試薬を処理でしめるものといえ，請求項２の「反応溶媒」には，溶質である抗原や抗体が含まれないとするのが相当である。
　以上のことから，請求項１の「ＨＣＶ抗体測定用試薬」は，その製造時に還元剤が添加され又は還元剤で処理されるものであり，当該試薬には，検体である抗体を添加した状態のものは含まれないとするのが相当といえる。
　一方，段落【０００６】に「本発明に従えば，凝集反応時に感作担体を懸濁させる際の使用緩衝液中に上記還元剤を添加してもよい。」，段落【０００７】に「本発明に従えば，抗原結合固相に検体中の特異抗体を反応させる際に使用する反応液中に上記の還元剤あるいはこれらの混合物を添加してもよい。」と記載されているが，「凝集反応時に感作担体を懸濁させる際の使用緩衝液」及び「抗原結合固相に検体中の特異抗体を反応させる際に使用する反応液」はいずれも，反応の『際に使用』するとされており，現に抗原や抗体が混合され反応が行われている溶液を意味するものではなく，反応に使用されることになる緩衝液を意味するとするのが適当であり，この解釈は，実施例等の明細書全体の記載と整合するものである。
　さらに，段落【０００２】の従来技術中に「このようにある種の抗原を用いた試薬の場合，試薬の保存中に抗原の活性が反応溶液中で急激に低下し，抗原抗体反応が十分に進行できず測定感度が十分に上がらない」と記載されているが，試薬の活性の低下は「試薬の保存中」に生じるとされており，試薬の使用中ではないことから，ここでいう「反応溶液」は，抗原と緩衝液からなるものであり，実施例中で対照実験に用いられた，還元剤を含まない試薬を意味するとするのが相当といえる。
　さらに，段落【０００３】に「本発明者等は，これらの知見に基づきＨＣＶ抗体測定系に還元剤，特にチオール保護剤を添加することにより，そのＨＣＶ抗体測定系の感度の低下の問題を防止でき，しかもその還元剤処理は該測定系に悪影響を与えないことを明らかにし，本発明を完成したものである。」と記載され，「ＨＣＶ抗体測定系」に還元剤が添加されることが記載されているが，この記載は，本件発明１の「ＨＣＶ抗体測定用試薬」を使用した測定系のことを言っているのであって，試薬そのものについての記載とはいえない。
　そうすると，上記各記載をもっても，本件発明１の「ＨＣＶ抗体測定用試薬」が，検体である抗体を添加した状態のものも含むとすることはできない。
　したがって，ＨＣＶ抗体測定のために検体と混合する前に，還元剤を含有せしめ又は還元剤で処理せしめられ試薬として完成したものであるするのが相当である。
　
３　証拠の記載事項
（１）甲第１号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項が記載されている。訳文は，対応日本語公報である特表平６−５０６７６８号公報（甲第１号証−２）による。
（1a）「ポリメラーゼプローブのＢおよびＣドメインは，クローニング，酵素的構築，化学的架橋技術，直接的化学合成またはそれらの組み合わせによって調製され得る。」（第１４頁１７〜２０行）
（1b）「本発明の別の局面では，免疫学的な分析物の存在および濃度を検出および定量するためのイムノアッセイに，アンプリファイアプローブを使用する。」（第２５頁５〜７行）
（1c）「分析物は，例えば生物学的流動体あるいは組織，食物，環境物質等のさまざまな種に存在し得，あるいはインビトロで合成し得る。」（第２５頁１８〜２１行）
（1d）「固相を利用するイムノアッセイにおいては，分析物（抗原でも抗体でも有り得る）は固相に直接的に固定されるか，最初に固相に結合された第１抗原に分析物が結合することにより間接的に固定化されるか，あるいは第２抗原が分析物を認識し，次に分析物が固相に結合された第１抗原によって認識されるサンドイッチアッセイ（図２Ａ）によって固定化される。」（第２６頁３〜１０行）
（1e）「抗原／抗体複合体の安定性を維持するように核酸ハイブリダイゼーンコンの条件を調節することが重要である。」（第２９頁１２〜１４行）
（1f）「実施例１−ヒト血清におけるＨＣＶ抗原の存在についてのイムノイムアッセイ
　このアッセイは，Ｃ型肝炎ウィルスのＣ−１００抗原の存在を直接に検査するために設計される。このイムノアッセイのための一般的なプロトコールは，前述されたとおりである。第１抗体としてヤギ抗マウス抗体を使用するマイクロタイタープレートを用意する。この抗体を９６ウエルのマイクロタイタープレートのウェル中に固定化する。第２抗体は，ＨＣＶ　Ｃ−１００のエピトープに特異的なマウスモノクローナル抗体である。ＨＣＶについてスクリーニングしようとする個体からの血清の同一の２つの希釈物をブロッキングバッファー中で調製し，適切な非感染コントロールと並列してマイクロタイターのウェル中でインキュベートする。第３抗体は，各ＨＣＶ抗原を認識するポリクローナルウサギ抗体の組み合わせである。最後の抗体は，ハイブリッドＴ７ポリメラーゼアンプリファイアプローブである。ドメインＡのポリペプチド部分は，ヤギ抗ウサギ抗体として機能し，「サンドイッチ」イムノアッセイを完成させる。
　Ｔ７ポリメラーゼプローブを添加した後，ドメインＣの転写は，この複合体を，４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ８），２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭスペルミジン，１０ｍＭジチオスレイトール，０．１５ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン，ｒＡＴＰ，ｒＣＴＰ，ｒＧＴＰ，ｒＵＴＰがそれぞれ１．２５ｍＭ，１６００単位／ｍｌ　ＲＮアシン，および２０００単位／ｍｌ　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼからなる溶液２０μｌ中でインキユベートすることにより実施する。この混合物を３７℃で１時間インキュベートする。８×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳを含有する溶液２０μｌを添加して転写を停止させ，混合物全体を，Ｃ１’配列を有する固定化キャプチャープローブを含む新しいウェルに移し変える。ドメインＣの転写物の捕捉（図３）は，５５°Ｃで１時間インキュベートし，その後０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで２回洗浄することによって実行される。
　次に，ドメインＣの転写物を，４０μｌの４×ＳＳＣ，１００μｇ／ｌのポリＡ中の酵素標識プローブ（ｃ２’）５０ｆｍｏ１を５５℃で１５分間添加することにより標識する。最後に，この複合体を０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで洗浄し，続いて０．１×ＳＳＣで２回洗浄する。
　ＡＰ検出のために，Ｌｕｍｉｇｅｎ　Ｉｎｃ，から得られる，酵素が引き金となって起こるジオキセタン反応（Ｓｃｈａｐｐ（１９８７）ら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２８：１１５９−１１６２および米国特許第４，８５７，６５２号）を行う。検出方法は，以下のように行う。標識工程では，ＡＰプローブを有する）ＨＭバッファ−２０μｍを各ウェルに添加し，それらのウェルを５５°Ｃで１５分間インキュベートする。上清を除去して，各ウェルを３８０μｌの０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで２回洗浄する。次に，それらのウェルを３８０μｌの０．１×ＳＳＣで２回洗浄して，残存する全てのＳＤＳを取り除く。ＣＴＡＢバッファー中の３．３×１０−４Ｍジオキセタン２０μｍを各ウェルに添加する。これらのウェルを軽くたたいて試薬が底に沈むようにし，この試薬が底金体に均一に分布するようゆっくりと回す。ウェルをマイクロタイタープレートのシールで覆い，３７℃のオーブンで１時間インキコベートする。次にウェルをルミノメータ−で読み，既知量の抗原について作成された標準曲線と比較して定量する。」（第３５頁２０行〜第３７頁６行）
（1g）「実施例２−ヒト血清におけるＨＣＶに対する抗体の存在についてのイムノアツセイ
　マイクロタイタープレートをまず，Ｃ型肝炎ウィルスからのＨＣＶ　Ｃ−１００抗原でコートする。コーティングバッファー（５０ｍＭホウ酸ナトリウム，ｐＨ９．０），２１ｍｌ／プレート，ＢＳＡ（２５μｇ／ｍｌ），ＨＣＶ　Ｃ−１００（２．５０μｇ／ｍｌ）を含む溶液を添加の直前に調製する。この溶液を０．２ｍｌ／ウェルでプレートに添加し，５分間混合した後，それらを覆って３７℃で２時間インキュベートし，その後この溶液を吸引によって取り除く。これらのウェルを０．４ｍｌの洗浄バッファー（１００ｍＭ　リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４，１４０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％カゼイン，１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，０１％（ｗ／ｖ）ヒビテン）で１回洗浄する。洗浄溶液を除去した後，２００μｌ／ウエルのコート後溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０．１％（ｖ／ｖ）カゼイン，３％ショ糖，および２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））を添加し，プレートをゆったりと覆って気化するのを防ぎ，そして室温に３０分間放置する。次にこれらのウェルを吸引して溶液を取り除き，棚の加温なしに，１晩凍結乾燥する。
　イムノアッセイを遂行するために，血清サンプルまたはコントロールの同一の２つの希釈液２０μｌをサンプル希釈物（１００ｍＭ　リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４，５００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１％（ｗ／ｖ）カゼイン，０．０１％（ｗ／ｖ）Ｈｉｂｉｔａｎｅ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１００μｇ／ｍｌ酵母抽出液）２００μｌを含むウェルに添加する。これらのプレートをシールし，３７℃で２時間インキュベートし，その後この溶液を吸引により除去して，そしてこれらのウェルを４００μｌの洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄する。
　血清サンプルの添加に引き続いて，これらのウェルを，ウサギ抗ヒト血清を第３抗体（ウサギ抗分析物抗体）で置き換えたこと以外，上記実施例１と同様にして処理する。」（第３７頁７行〜第３８頁６行）
　
（２）甲第２号証
　本件出願日前の国際特許出願であって，本件出願後に国際公開されたものであり，国際出願日における明細書及び図面には，以下の事項が記載されている。なお，記載箇所の表示は，国際公開パンフレットの頁と行による。また，訳文は，対応日本語公報である特表平７−５０４４９２号公報（甲第２号証−２）による。
（2a）「我々はまた，検査試料中の抗ＨＣＶ　ＩｇＭ抗体の存在を高感度且つ特異的に検出することができ，従ってＨＣＶ感染の有用敏感なマーカーを提供する新規のイムノアッセイを発見した。
発明の概要
　本発明は，検査試料中に存在し得るＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に対するＩｇＭの存在及び／又は量を決定するためのアッセイを提供する。抗ＨＣＶ　ＣＯＲＥ　ＩｇＭ抗体は，感染の敏感なマーカーとして有用であることが示される。該アッセイは，検査試料中に存在し得るリューマチ性因子様物質（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ｆａｃｔｏｒ−１ｉｋｅ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ）の作用（影響）が存在した場合に，その作用を阻止するのに十分な条件に検査試料をかけ，ＨＣＶ　ＣＯＲＥ，ＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶ　ｃ−１００から選択した１種類以上のＨＣＶ抗原に検査試料を接触させ，得られた混合物を抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートする操作を含む。」（第３頁下から８行〜第４頁７行）
（2b）「本明細書に記載のアッセイは，ＨＣＶ抗原を結合するための固相を含み得る。固相としては，ポリマーもしくはガラスのビーズ，ニトロセルロース，微小粒子（ｍｉｃｒｏ　ｐａｒｔｉｃｌｅ），反応トレーのウェル，試験管及び磁気ビーズを選択し得る。」（第６頁１１行〜１４行）
（2c）「本明細書に記載の本発明の方法で検査できる検査試料としては，ヒト及び動物の体液，例えば全血，血清，血漿，脳を髄液，尿，生物学的液体，例えば細胞培養上清，組織試料及び細胞試料挙げられる。」（第８頁下から１３〜９行）
（2d）「該アッセイ形態では，本発明の実施に固相を使用し得る。この場合の「固相（ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ）」とは，不溶性であるか又は後続の反応によって不溶性にし得る任意の材料を意味する。固相としては，捕捉試薬を引き付けて固定する能力を本来的に備えているものを選択し得る。あるいは，捕捉試薬を引き付けて固定する能力を有する別のレセプターを保持できるものを使用し得る。別のレセプターとしては，捕捉試薬に対して，又は捕捉試薬に結合した帯電物質に対して，逆の電荷を有する帯電物質が挙げられる。更に別の変形例として，レセプター分子は，固相上に固定され，特異的結合反応を介して捕捉試薬を固定する能力を有する任意の特異的結合メンバーであってもよい。レセプター分子は，アッセイの実施前又はアッセイの実施中に捕捉試薬を固相材料に間接的に結合することができる。本発明のアッセイの実施にアッセイデバイスを使用する場合，該アッセイデバイスは多（の形態を有し得，そのうちの幾つかは固相として選択した材料に依存する。例えば，固相としては任意の適当な多孔質材料を使用し得る。「多孔質（ｐｏｒｏｕｓ）」とは，検査試料を容易に透過させることができる材料を意味し，これには吸水性（ｂｉｂｕｌｏｕｓ）及び非吸水性の両方の固相材料が含まれる。本発明で使用し得る固相としては，１種類以上のアッセイ試薬を含む１つ以上の層を有する注入及び流出型（ｐｏｕｒａｎｄ　ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）アッセイデバイスで使用されるファイバーグラス，セルロースもしくはナイロンパッド，浸漬読取り型（ｄｉｐ　ａｎｄ　ｒｅａｄ）アッセイで使用されるディップスティック，ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）用の試験片（例えば紙），あるいは薄層クロマトグラフィーもしくは毛細管作用技術用の試験片（例えばニトロセルロース），又は当業者に良く知られている別の多孔質もしくは開孔材料（例えばポリエチレンシート材料）が挙げられる。しかしながら固相は多孔質材料には限定されない。固相としては，ポリマーもしくはガラスのビーズ，微粒子，管，シート，プレート，スライド，ウェル，テープ，試験管等，又は本来電荷を有するか，あるいは帯電物質を保持することができる他の任意の材料も使用し得る。」（第１０頁１７行〜第１１頁１４行）
（2e）「固体支持体は当業者に公知であり，具体例としては，反応トレーのウェルの壁，試験管，ポリスチレンビーズ，磁気ビーズ，ニトロセルロースストリップ，メンプラン，ラテックス粒子のような微粒子，ガラス，プラスチック，誘導体化プラスチック，金属及びケイ素のチップ等が挙げられる。」（第１２頁１４〜１７行）
（2f）「本明細書に記載のアッセイでＨＣＶ抗原を捕捉試薬として使用する場合は，１種類以上のＨＣＶ抗原を固相に結合した状態で，又は溶液形態で使用する。該抗原としては，ＨＣＶ　ＣＯＲＥ，ＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶ　ｃ−１００を使用し得る。我々は，ＨＣＶ　ＣＯＲＥが本発明のアッセイの実施で使用するのに最も好ましい抗原であると確認したが，ＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶ　ｃ−１００も単独で又は任意に組み合わせて使用し得る。例えば，ＨＣＶ　ＣＯＲＥ抗原をＨＣＶ　３３ｃ及び／又はｃ−１００又は別のＨＣＶ抗原と組み合わせ，本明細書に記載の方法で捕捉抗原として使用し得る。」（第１４頁下から９〜１行）
（2g）「実施例１
　　　　　半自動化ドツトプロットイムノアッセイ
　半自動ドツトプロットイムノアッセイで，ＡＢＢＯＴＴＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アナライザー（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ．ＩＬから市販）を用いて，ニトロセルロースからなるテストカード上にコーティングした精製組換えＨＣＶ抗原を検出した。・・・要約すれば，テストカードを後述のように用意し，用意したテストカードを本明細書に記載のアッセイに使用した。各テストカードは陰性対照を含んでいた。陰性対照は，自己ブランキング（ｓｅｌｆ−ｂｌａｎｋｉｎｇ）及びバリディティチェックを考慮したものである。
　酵母中に発現されたＨＣＶクローンｃ１００−３（ＫｕｏらによりSｃｉｅｎｃｅ　２４４：３６２−３６４［１９８９］に記載されている）キメラポリペプチドと，大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に発現された組換えＨＣＶポリペプチド，例えばｐＨＣＶ−２３（最初の１０７個のＮ末端アミノ酸を欠失しているｃ１００フラグメント）　，ｐＨＣＶ−２９（ＣＫＳ−３３ｃ），ｐＨＣＶ−３４（ＣＫＳ−ＣＯＲＥ）及ｐＨＣＶ−３５（λｐＬ　ＣＯＲＥ）及びｐＨＣＶ−４５（ＮＳ４／ＮＳ５結合体）に由来するものとからなるＨＣＶテストカードを開発した。第１図は，本明細書に記載のＨＣＶのｒＤＮＡ発現領域の地図である。」（第１５頁下から８行〜第１６頁１５行）
（2h）「実施例２
　　　ＩｇＭを測定するためのＨＣＶアッセイ手順
　１０μｌの検査試料を，１ｍｌの試料希釈物（１．５％ｖ／ｖＢｒｉｊ−３５（登録商標）と０．１％ｗ／ｖＥＤＴＡと０．１％ＮａＮ２，とを含む２０ｍＭ　ＴＢＳ中の，１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］と，０．５％ｗ／ｖ脱脂粉乳と，０．０３％酵母抽出物と，ＣＫＳタンパク質を含む５％ｗ／ｖ大腸菌溶解物とからなる）と混合した。希釈物がリューマチ性因子様妨害を抑制するための哺乳動物抗ヒトＩｇＧを含んでいる場合は，試料／希釈物混合物を室温で約１５分間インキュベートした。該インキュベーションの後に，試料／希釈物混合物を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ，沈殿したＩｇＧ凝集体を除去した。上清を該アッセイで希釈検査試料として使用した。該希釈検査試料１ｍｌを前述のように用意した検査セルに移した。該検査セルを検査試料と共に３５℃で約６０分間インキュベートした。
　次いで，検査セルをＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アナライザーで約１５分間ＴＢＳで洗浄した。洗浄は，検査セルを少なくとも３回洗浄し濯ぐ一連の洗浄ステップを含んでいた。次いで，１ｍｌの抗ヒトＩｇＭ：ビオチンプローブを２００ｎｇ／ｍｌでプローブ希釈液（ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）プローブ希釈液，Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬから市販）で希釈した。最も好ましい抗ヒトＩｇＭはヤギ抗ヒトＩｇＭ（ヤギ抗ヒトＩｇＭ，Ｆ（ａｂ′）２：ビオチン結合体，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕ　ｉｓ，ＭＯから市販）であったが，全ヤギ抗ヒトＩｇＭ：ビオチン結合体プローブも使用し得ると確認された。該混合物を３５℃で３０分間インキュベートした。該インキュベーション後，更に１５分間の洗浄を前述のように行った。次いで，１ｍｌの抗ビオチン：アルカリホスファターゼ結合体を反応セルに加え，３５℃で３０分間インキュベートした。使用した抗ビオチン抗体はウサギポリクローナル抗体である。酵素は仔牛腸由来のアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）又は大腸菌組換えアルカリホスファターゼ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）であった。前記インキュベーション後，更に１５分間の洗浄を前述のように行った。次いで，１ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールホスフェート（ＢＣ
ＩＰ）を反応セルに加え，該混合物を３５℃で３０分間インキュベートした。該インキュベーションの後に，１５分間の最終洗浄を前述のように実施した。　最終洗浄した後，ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アナライザーで反応セルを乾燥しく３５℃で２５分間），反応セルのアレイ内の所定位置での反射率を測定して，個々の反応の程度を客観的に測定した。結果はＤＲ（反射密度，ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ）又はΔＤＲ（陰性対照スポットのＤＲ値を検査スポットＤＲから差し引いた自己ブランク化（ｓｅｌｆ−ｂｌａｎｋｅｄ）結果）として現れた。後述のように，選択集団（ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）に基づいて各抗原の反応性カットオフ値を計算した。」（第１７頁下から１５行〜第１８頁下から５行）
（2i）「２．高ＡＬＴ試料
　ＨＣＶ　ＩｇＭ反応性試料を同定するために，高ＡＬＴ値を有する９１個の試料血漿ユニットからなる集団を供給し，本発明のＨＣＶ　ＩｇＭアッセイで検査した。これらの試料は，複数のＨＣＶアッセイ，即ちプロトタイプアッセイＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶアッセイ，プロトタイプアッセイＡＢＢＯＴＴ　ＩＭｘ（登録商標）ＨＣＶアッセイ，市販のライセンスアッセイでありＨＣＶ　ｃ１００を捕捉抗原として使用するＡＢＢＯＴＴ“１．０”アッセイ，及び更に２つの組換えＨＣＶタンパク質（３３ｃ及びＣＯＲＥ）を使用するプロトタイプアッセイＡＢＢＯＴＴ　”２．０ＥＩＡ”（これらのテストはいずれもＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）により，抗ＨＣＶ（ＩｇＧ）活性について予めスクリーニングした。アッセイした９１個の試料のうち，３つの試料（試料Ｎｏ．１０１０，１０３４及び１０８９）は，前述の種々のＨＣＶアッセイ（ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶアッセイ，ＡＢＢＯＴＴ“１．０”アツセイ及びプロトタイプＡＢＢＯＴＴ”２．０ＥＩＡ”）でＨＣＶ　ＩｇＧ反応性を示した。」（第２０頁１８行〜３２行）
（2j）「実施例６
　　　　　ＩｇＭアッセイに対する還元剤の効果
　Ａｂｂｏｔｔ抗ＨＣＶアッセイ（前述のＨＣＶ　ＩｇＧアッセイ，ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標））及び本発明のＩｇＭアッセイで抗ＨＣＶに対して強く反応した５つの試料を，還元剤での処理後に，ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アッセイで，ＨＣＶ抗原に対するＩｇＧ及びＩｇＭ特異的反応性について検査した。ＩｇＭアッセイは実施例１及び２に記載の方法に従って，但し下記のように実施した。特定的には，試料希釈物の添加の前に，試料をジチオトレイトール（ＤＴＴ）と共に酢酸ナトリウム緩衝液中で，最終ＤＴＴ濃度１８ｍＭで，１５分間インキュベートした。該ＩｇＭアッセイでは，５つの試料の総てが抗ＨＣＶ　ＣＯＲＥについて還元敏感反応性（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を示した。ＩｇＧ抗ＨＣＶアッセイでは，ＨＣＶ　ＣＯＲＥ，ＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶ　ｃ−１００に対する反応性は試料への還元剤の添加によって左右されなかった。また，患者１０１０に由来する分別ＩｇＭ反応性又は極めて低い阻害はＤＴＴでの前処理によって破壊された。しかしながら該検査試料のＩｇＧフラクションは，ＤＴＴの存在下又は不在下で処理した時には，ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アッセイで同様の反応性又は極めて低い阻害を示した。これらのデータは表１０及び１１に示す。」（第３３頁１５行〜最終行）
（2k）図１には，ＨＣＶ　ＡＡ＃が，「ＣＯＲＥ　１−１５０」，「３３Ｃ　１１９２−１４５７」，「Ｃ１００　１６７７−１９３１」，「Ｃ１００−３　１５６９−１９３１」と記載され，また，Ｃ１００−３がＳＯＤとＣ１００から構成されることが図示されている。（図面１／４　ＦＩＧ．１）
　
（３）甲第３号証
　本件出願日前の国際特許出願であって，本件出願後に国際公開されたものであり，国際出願日における明細書及び図面には，以下の事項が記載されている。なお，記載箇所の表示は，国際公開パンフレットの頁と行による。また，訳文は，対応日本語公報である特表平６−５０５１６４号公報（甲第３号証−２）による。
（3a）「ｃ３３ｃの誘導体を利用する改良されたイムノアッセイを開発するため，ｃ３３ｃ配列のタンパクの種々の構造がつくられ，テストされた。驚くべきことに，ｃ３３ｃ全領域中に発見された免疫優性エピトープはすべて１０２個カルボキシ末端アミノ酸中に含まれていることが発見された。
　本発明においては，ＮＳ３遺伝子産物のｃ３３ｃ領域のこの１０２個カルボキシ末端部分中に含まれる抗原決定子を有する組換えタンパクが提供される。代替具体例においては，組換え融合タンパクを実質的に同じ配列を含む合成ペプチドで置換する。
　前記アミノ酸配列，または実質的に同じ抗原性を示すＭ換えタンパクまたは合成ペプチドは，患者血清標本中に含まれるＨＣＶに対する抗体と，固相支持体上に被覆された，ＮＳ３遺伝子産物のｃ３３Ｃフラグメントの末端カルボキシ１０２アミノ酸中に含まれる組換えタンパクまたは合成ペプチドさ，またはＨＣＶ　ＮＳ３遺伝子産物のｃ３３ｃフラグメントのカルボキシ末端１０２アミノ酸の抗原決定子を実質的に持っている組換えタンパクまたは合成ペプチドと接触させるステップと，ｃ３３ｃフラグメントに対し，さらに詳しくはそのカルボキシ末端１０２アミノ酸フラグメントもしくはその抗原的均等物に対し特異性の患者血清標本中に含まれる抗体と結合することを許容するのに充分な時間インキュベートするステップと，結合した抗体を未結合抗体から分離するステップと，そして結合した抗体を検出するステップよりなる，イムノアツセイに利用される。」（第２頁１２行〜第３頁１０行）
（3b）「実施例５
ｃ３３ｃ制限フラグメントの免疫スクリーニング
　λｇｔｌｌに発現されたｃ３３ｃの制限フラグメントは，実施例２に記載した操作を使用する免疫スクリーニングにより，血清学的活性について分析された。正しいＤＮＡ配列のインサートを含んでいた図１のクローンは，３種のＨＣＶ反応性標本のプールを使用して免疫スクリーニングされた。これらの結果は表３に呈示されている。これらクローンは１０種の抗ＨＣＶｃ３３ｃ反応性血清および７種のｃ３３ｃ／非反応性血清よりなる個々の血清でさらに免疫スクリーニングされた。このパネルの血清学的プロフィルは図４に示されている。この結果は，Ｂａｎ　II／ＥｃｏＲＩフラグメントは全長ｃ３３ｃ抗原と反応するパネルのすべてのメンバーによって認識される１以上のエピトープを含んでいることを指示する。ｃ３３Ｃ全長に対するパネル
メンバーの免疫反応性は，ｃ３３ｃＲＩＢＡテスト（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ．ＮＪ）により決定した同様な相対的免疫反応性を表わす。ＢａｎII／ＥｃｏＲＩフラグメントの完全な配列は図２に提示しである。」（第１５頁１４行〜最終行）
（3c）「実施例７
　ＢＡＮII／ＥｃｏＲＩｃ３３ｃフラグメントのタンパク発現用ｐＧＥＸベクターへのクローニングおよびタンパク精製
　ＢＡＮ　II／ＥｃｏＲＩ　ｃ３３ｃ　ＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化によって対応するｐＵＣ１９クローンから除去し，２％ＴＡＢアガロースゲル上にサイズ分画し，ジーンクリーンによって精製した。このフラグメントを発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘａ，Ｓｍｉｔｈ　＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ，６７：３１（１９８８）のＥｃｏＲＩ部位にクローンした。このベクターはＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６ＫＤグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端融合物として，フレーム内インサートを発現するであろう。この組換えプラスミドは，製造者のプロトコールに従って，Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中へ形質転換された。ＧＳＴ−ｃ３３ｃ　ＢａｎII／ＲｃｏＲＩ融合遺伝子が発現され，そしてタンパクはＳｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ，６７：３１　（１９８８）によって記載された方法の以下の修正によって精製された。アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢプロス中で生育させた一夜培養物を新鮮な培地中に１：１０希釈し，ＯＤ６００　０．４へ３７℃で生育させた。この時点でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの濃度へ加えた。培養物を３７℃でさらに２時間生育させ，細胞を遠心によりペレット化し，ＭＴＰＢＳ（ＮａＣｌ　１５０ｍＭ，Ｎａ２ＨＰＯ４　１６ｍＭ，ＮａＨ２ＰＯ４　４ｍＭ，Ｐｈ７．３）の１／５０または１／１００培養物体積中に再懸濁した。細胞を氷上で超音波処理によって溶解し，ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１％へ加えた。溶解物を１０，０００×ｇで４℃において５分間遠心した。遠心の上清をあらかじめ洗浄し，そしてＭＴＰＢＳ中に希釈した５０％グルタチオンアガロースビーズ（イオウ結合，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ９の１／１０容積と室温でローター上で混合した。２〜３分吸着の後，アガロースビーズを５００×ｇにおける２分間遠心によって集め，ペレットをＭＴＰＢＳで３回洗った。融合タンパクを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０中の還元型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５ｍＭとの競合により，ビーズ体積に対して２×２分洗液を使用して溶出した。」（第１９頁８〜第２１頁１４行）
（3d）「実施例９
常磁性微粒子酵素イムノアッセイを使用するＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩの免疫反応性
　ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩ融合タンパクを全長ｃ３３ｃタンパクの免疫反応性を常磁性微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＰアッセイ）によって比較した。このアッセイは，表面にＨＣＶ抗原を被覆した常磁性固相を使用することによって抗ＨＣＶを検出した。常磁性微粒子（ＭＰ）はＢａｘｔｅｒ　Ｄｔａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ．，Ｐａｎｄｅｘ，Ｍａｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬから得た。これらは螢光性ポリスチレン常磁性コアとポリスチレン表面からなっていた。すべての粒子製剤は狭い粒度分布（平均直径は４．５μｍ）によって特徴化されていた。ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩおよびＣ３３ｃウイルス遺伝子産物を実施例７のように精製した。全長Ｃ３３ＣタンパクはｐＥＴ５ａシステム中の１６アミノ酸リーダー，Sｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３（１９８２）によって発現された。０．１ＭアセテートバッファーｐＨ５．０中４００μｇタンパク／ｍｌのウィルス抗原をＭＰ（２．５％ｗ／ｖ）上へ，抗原とＭＰを室温で一夜ゆっくり混合することによって受動的に被覆した。ＭＰは次にＰＢＳ　（２０ｍＭリン酸ナトリウム，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で遠心（５０００ｒｐｍ，５分）を使用して良く洗った。抗原被覆ＭＰをＰＢＳ中０．０２５％（ｗ／ｖ）の作業濃度へ希釈した。
　標本を１：１００へ希釈しく希釈バッファー：１５％ウシ新生児血清，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．３％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０，ｐＨ７．４），そして５０μｌを黒色プラスチックマイクロタイタープレートの各ウェルへ入れた。ＭＰ（０．０２５％ｗ／ｖ）２０μｌを各ウェルへ加え，４２℃で３０分間インキュベートした。各ウェル中の粒子を洗浄ステップの間各ウェルの底へとどめておくため磁場を使用し，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳで５回洗った。コンジュゲート希釈液（８％ウシ新生児血清，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＳＯ４，ｐＨ７．４）中へ１：８００希釈したヤギ抗ヒトＩｇ（Ｈ＋Ｌ）β−ガラクトシダーゼコンジュゲート（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ，Ｌａ　Ｍｉｒａｄａ，ＣＡ）５０μｌを各ウェルへ加え，４２℃で１５分間インキュベートした。プレートを前記のように洗った。基質（４−メチルウンベリフェリルβ−ガラクトシド，ＭＵＧ：０．５ｍＭ　ＭＵＧ，２０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ，０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ８．５）５０μｌを各ウェルへ加え，生成物螢光を時間間隔（２分および１４分）で測定した（３６５ｎｍ励起および４５０ｎｍ放出）。標準曲線としてクマリンの希釈液を使用して，螢光値をｎＭクマリン値へ変換した。基質転換の動力学値（１２分間に生成したｎＭで表したクマリンの量）をＱｕａｔｔｒｏ　Ｐｒｏ（Ｂｏｒｌａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｃｏｔｔ　Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡ）スプレッドシートソフトウェアプログラムを使用して測定した。動力学値の動力学的範囲は０ないし５．０００μＭクマリンであった。ランダムボランティア−血液ドナーサンプルおよび血清変換の間モニターされた患者からの系統的血清サンプルのパネルをテストすることにより，カットオフ計算のための予備アルゴリズムが確立された。このアルゴリズム（陽性キャリブレータ−のμＭクマリン×０．１７５）は約２００〜３００μＭクマリンのカットオフを与えた。
　表７中の結果は，ＭＰアッセイを使用し，全長ｃ３３ｃ抗原に免疫反応性のすべての血清はＢａｎII／ＥｃｏＲＩ産物にも反応性であることを示す，一部の血清との全長ｃ３３ｃのより強い反応性は，ＭＰアッセイがＢａｎII／ＥｃｏＲＩウィルス産物のために最適化されなかった事実を表す。
　ＢａｎII／ＥｃｏＲＩ産物をＭＰアッセイへ最適化するアプローチは，因子Ｘ開裂，Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ，６７：３１（１９８）によりＧＳＴ融合をＢａｎII／ＥｃｏＲＩから除去し，ＢａｎII／ＥｃｏＲＩをｐＥＴ５ａ，Sｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，１８９：１１３（１９８６）へクローニングするか，またはウィルス産物を他の態様で固相へ被覆することを含む。」（第２２頁１５行〜第２４頁最終行）
（3e）図２には，ＢａｎII／ＥｃｏＲＩフラグメントの完全な配列が提示され，アミノ酸数が１０２であることが示されている。
　
（４）甲第４号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（4a）「要約　　酵素免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を，Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染の血清診断用に，組換えバキュロウイルスにより合成されたＨＣＶコアタンパク質（ｐ２２）を用いて開発した。」（第４６４１頁左欄１行〜４行）
（4b）「動物細胞内で発現され，正しくプロセッシングされたＨＣＶコアタンパク質に対する抗体を検出するＥＬＩＳＡは，提供血液の大規模なスクリーニングおよびＣ型肝炎の早期の診断に有用であろう。」（第４６４１頁左欄１６行〜２０行）
（4c）「HCV感染の早期の診断に用いることができる，感度がより高いＨＣＶ抗体アッセイを確立する。」（第４６４１頁右欄３行〜５行）
（4d）「このタンパク質を用いることにより，抗体検出系を確立して，ＨＣＶ感染を診断するための特異的で高感度な方法を開発した(12)」（第４６４１頁右欄９行〜１２行）
（4e）「ＥＬＩＳＡの確立。　Ａｃ３１６に感染させたＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒ細胞（１０７細胞）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し，２ｍｌの５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／０．１ｍＭジチオスレイトール（１ｍｌあたり１００μｌのフェニルメチルスルフォニルクロリドを含む）で超音波処理して溶解させた。１０，０００×ｇでの遠心分離の後，その上清に対して硫酸アンモニウムを加えることにより上清を分画して，３３％の飽和溶液を作製した。沈殿を遠心分離により回収し，超音波処理により２ｍｌのＰＢＳに溶解して，部分精製ＨＣＶコアタンパク質を調製した。次いで，ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９０）のウエルを，ＰＢＳにより１：５０に希釈した上記の溶液１００μｌで被覆した。２５％Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅ（大日本製薬，大阪）を含むＰＢＳによりブロッキングした後に，血清１００μを各々のウエルに加え，プレートを室温にて２時間インキュベートした。アルカリフォスファターゼとヤギ抗ヒト免疫グロブリンのＦ（ａｂ’）２断片との結合物（Ｔａｇｏ４６０３）との２回目のインキュベーションを室温で１時間行うことにより，結合した抗体を検出した。酵素活性は，ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として用いて測定した。各ウエルの吸光度は，４１０ｎｍで測定した。患者の血清の最適希釈は通常１：４００〜１：８００であり，これは特異ｔきシグナル対非特異的シグナルの最高の比率をもたらした。抗Ｃ１００−３をＨＣＶ抗体ＥＬＩＳＡ試験（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，東京）により測定した。」（第４６４１頁右欄下から４行〜第４６４２頁左欄２１行）
　
（５）甲第５号証の記載事項
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（5a）「特異的なアッセイを，血液感染性の非−Ａ，非−Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）ウイルスについて開発した。当該アッセイにおいては，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の組換え酵母クローン中で合成したポリペプチドを，循環ウイルス抗体を捕捉するために使用した。」（第３６２頁要約欄１〜３行）
  
（６）甲第６号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（6a）「Ｏｒｔｈｏ−ＨＣＶ　ＥＬＩＳＡ（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）を，抗−ＨＣＶを検出するために使用した。この間接的なアッセイは，Ｃｈｏｏ　ｅｔ　ａｌ．（１３）によって詳細が記載された組換えあＨＣＶ抗原ポリペプチド（Ｃ１００−３）を使用する。・・・さらにその上，ＥＬＩＳＡ陽性血清を，Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓによって卸されたＣｈｉｒｏｎ　ＨＣＶ　ＲＩＢＡ（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）によって再試験した。このアッセイは，ニトロセルロースストリップにアプライした，３つの組換え抗原，すなわち，ＳＯＤ−ＨＣＶ融合ポリペプチド５−１−１（大腸菌において合成），Ｃ１００−３（酵母において合成）及びＳＯＤのみ（酵母において合成）を含む。」（第２８４３頁右欄２４〜４４行）
　
（７）甲第７号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（7a）「このアッセイは，酵母において合成した組換えＨＣＶ抗原（Ｃ１００−３）を使用する。」（第９頁要約欄６〜７行）
（7b）「抗−ＨＣＶは，ＡＢＢＯＴＴ　ＨＣＶ　ＥＩＡ　Ｔｅｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＢＯＴ　ＣＯ．，Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して，製造者の取扱説明書に従って検出した。このアッセイは，酵母において合成した組換えＨＣＶ抗原（Ｃ１００−３）を使用する。」（第１０頁右欄１１〜１５行）
　
（８）甲第８号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（8a）「本報告においては，セロコンバージョンパネルによって，キャプシド及び非構造タンパク質の両方の免疫優勢領域に由来する合成ペプチドに基づくアッセイが，４〜１０週まで，Ｃ型肝炎ウイルス抗体の検出を促進することが示された。」（第３６４７頁要約欄６〜１０行）
（8b）「注意深く選択された特徴的抗原性ペプチドにより，ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びヒトリンパ球向性ウイルスＩ／ＩＩ診断における有用性が以前から示されているので(14-19)，我々は，組換えＨＣＶ（ｒＨＣＶ）Ｃ１００−３タンパク質に基づくイムノアッセイの欠点を克服するために，構造タンパク質(13)及び非構造タンパク質(20)に両方をコードする既知のＨＣＶゲノム配列に由来する合成ペプチドを使用した。」（第３６４７頁左欄下から４行〜右欄５行）
　
（９）甲第９号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（9a）「酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の構造領域に由来する配列を有する合成ペプチド（ＳＰ）を使用することによって開発した。・・・要約すると，我々は，構造ＨＣＶ合成ポリペプチドであるＨＣＶ−ＳＰに基づいて，高い特異性及び感度を有し，ＨＣＶ感染の急性期における特異的な抗体を検出することができるＥＬＩＳＡを開発した。」（第４４８６頁要約欄１〜２３行）
　
（１０）甲第１０号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（10a）「一連の重複するデカペプチドを，ＨＣＶ−Ｈ（アミノ酸１〜５１３），ＨＣ−Ｊ４（アミノ酸１８１〜５１３）及び配列の変異を示す他の３つの単離物に由来する領域からの配列に従って，固相（ピン）手法によって合成した。」（第３１９０頁要約欄１０〜１４行）
　
（１１）甲第１１号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項が記載されている。訳文は，対応日本語公報である特表平５−５０８２１９号公報（甲第１１号証−２）による。
（11a）「これらの５つのポリペプチドのうち，５−１−１は，推定されるＮＳ４ドメインに存在し，Ｃ１００は，推定されるＮＳ３およびＮＳ４ドメインに広がっており，Ｃ３３ｃは，推定されるＮＳ３ドメインに存在し，ＣＡ２７９ａおよびＣＡ２９０ａは，推定されるＣドメインに存在する。」（第２頁２９行〜３３行）
（11b）「これらのさらなる研究により，いずれのシングルＨＣＶポリペプチドよりもより効果的な，ＨＣＶ抗体の検出を提供するＨＣＶ抗原の組合せの同定が可能になった。
　従って，本発明の１つの局面は，ＨＣＶ抗原の組合せであって，
（ａ）Ｃドメインからの第１ＨＣＶ抗原，および
（ｂ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの別のＨＣＶ抗原，
　（ｉ）ＮＳ３ドメインからのＨＣＶ抗原，　
　（ｉｉ）ＮＳ４ドメインからのＨＣＶ抗原，
　（ｉｉｉ）ＳドメインからのＨＣＶ抗原，および
　（ｉｖ）ＮＳ５ドメインからのＨＣＶ抗原
を含む，ＨＣＶ抗原の組合せ。
　１つの実施態様では，ＨＣＶ抗原の組合せは，複数の抗原を含む融合タンパク質の形態である。他の実施態様では，抗原の組合せは，共通の固体マトリックスに結合した複数の個体抗原の形態である。さらに他の実施態様では，抗原の組合せは，個体抗原の混合物の形態である。
　本発明の他の局面は，ＨＣＶに対する抗体を含むと思われる哺乳類体成分中に，該抗体を検出する方法である。この方法では，抗原抗体反応を起こさせる条件下で，該哺乳類体成分を上記のＨＣＶ抗原の組合せに接触させる工程；および該抗体および該抗原の免疫複合体の存在を検出する工程とを包含する。」（第３頁１５行〜第４頁７行）
（11c）「「ドメイン」は，図２に示すＨＣＶポリタンパク質のセグメントを指し，これらは，通常，ＨＣＶの推定される構造および非構造タンパク質に対応する。ドメインの記号は，一般に，フラビウイルスタンパク質を名付けるのに使用される従来の方法に従う。図２に示すドメインの位置は，およそのものである。記号「ＮＳ」は，「非構造」ドメインを指し，「Ｓ」は，エンベロープドメインを指し，「Ｃ」は，ヌクレオカプシドまたはコアドメインを指す。」（第５頁１８〜２６行，対応公報第３頁左下欄１０行〜１７行）
（11d）「抗原の組合せを使用するアッセイフォーマット
　ＨＣＶ抗原は，抗体を検出するための既知の抗原を用いる，実質的にすべてのアッセイフォーマットにおいて使用され得る。これらのアッセイのすべてに共通の特性は，抗原と，ＨＣＶ抗体を含むと思われる体成分とを，成分中に存在する任意のこのような抗体と抗原とが結合する条件下で，接触させることである。このような条件とは，通常，過剰の抗原を用いた生理的温度，ｐＨおよびイオン強度である。抗原と試料とをインキュベートさせ，次に抗原を含む免疫複合体が検出される。
　免疫アッセイの設計は，非常に多様であり，多くのフォーマットが当該技術分野において公知である。プロトコルは，例えば，固体支持体または免疫沈降を用い得る。はとんどのアッセイでは，標識された抗体またはポリペプチドを使用し，その標識は，例えば，酵素分子，蛍光分子，化学発光分子，放射性分子，または染料分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅させるアッセイもまた知られている。その例としては，ビオチンおよびアビジンを用いるアッセイ，ならびにＥＬＩＳＡアッセイのような，酵素で標識され媒介された免疫アッセイが挙げられる。
　免疫アッセイは，限定されるわけではないが，異種または同種フォーマットであり，標準型または競合型であり得る。異種フォーマットの場合，通常，インキュベーション後，試料をポリペプチドから容易に分離するために，ポリペプチドは固体マトリックスまたは支持体に結合される。使用され得る固体支持体の例としては，ニトロセルロース（例えば，膜またはミクロタイターウェルの形態ン，ポリ塩化ビニル（例えば，シートまたはミクロタイターウェルの形態），ポリスチレンラテックス（例えば，ビーズまたはミクロタイタープレートの形態），ポリフッ化ビニリデン（イムロン（ＩｍｍｕｌｏｎＴＭ）として知られる），ジアゾ化紙，ナイロン膜，活性化ビーズ，およびプロテインＡビーズがある。」（第１０頁１〜最終行）
（11e）「実施例１：ＨＣＶ抗原Ｃ３３ｃの合成
　ＨＣＶ抗原Ｃ３３ｃはＮＳ３ドメイン由来の配列を含有する。特に図１のアミノ酸１１９２位から１４５７位を含有する。この抗原はヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）との融合タンパク質としてバクテリア内で以下のように生産された。ベクターｐＳＯＤｃｆｌ（Ｓｔｅｉｎｅｒら（１９８６），Ｊ，Ｖｉｒｏｌ，５８：９）は，ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで完全消化され，得られたＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ断片は，以下のリンカ−に連結されて，ｐｃｆｌＥＦが形成された。
・・・
　アミノ酸１１９２から１４５７をコードし，ＥｃｏＲＩ末端を有するｃＤＮＡクローンがｐｃｆｌＥＦに挿入され，ｐｃｆｌＥＦ／Ｃ３３ｃが形成される。この発現構築物をＤ１２１０　Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。
　この形質転換細胞を用いて，Ｎ末端にＳＯＤを有し，Ｃ末端Ｃ３３ｃ　ＨＣＶ抗原をインフレームで有する融合タンパク質を発現させる。発現は，１５ｍｌの形質転換細胞の一晩培養物をアンピシリン（１００μｓ／ｍｌ）含有する１５００ｍｌのルリアブイヨンに接種することにより行われる。細胞をＯ．Ｄ．０．３なるまで増殖させ，ＩＰＴＧを最終濃度２ｍＭになるように添加して，細胞の濃度がＯ．Ｄ．１に達するまで増殖を続行した。その時点で３，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離機にかけて採取した。パックした細胞は−８０℃で数カ月保存可能である。
　ＳＯＤ−Ｃ３３ｃのポリペプチドを精製するために，ポリペプチドが発現される細菌細胞を浸透圧衝撃および機械的破砕に供し，ＳＯＤ−Ｃ３３ｃを含む不溶性画分を単離して，ＮａＣｌアルカリ溶液で分画抽出にかけ，そして抽出物中の融合ポリペプチドをＳ−セファロースおよびＱ−セファロースのカラムでクロマトグラフィーにより精製した。
　浸透圧衝撃および機械的破砕により得た粗抽出物を以下の手順により調製した。１グラムのパックした細胞を０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，２０％のスクロースを含有する１０ｍ１の溶液中に懸濁して，水上で１０分間インキュベートした。次に細胞を４，０００×ｇで１５分間４℃にて遠心分離機にかけてペレット状にした。上清を除去後，細胞ペレットを１０ｍ１の緩衝液Ａ１（０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ，ｐＨ７．５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１４ｍＭβメルカプトエタノール［ＢＭＥ］）に再懸濁して，氷上で１０分間インキューベートした。細胞を再び４，０００×ｇで１５分間４℃でペレット状にした。透明な上清（ペリプラズム画分Ｉ）を除去後，細胞ペレットを緩衝液Ａ１に再懸濁して，氷上で１０分間インキュベートして，再び４，０００×ｇで１５分間４℃で遠心分離機にかけた。透明の上清（ペリプラズム画分ＩＩ）を除去後，細胞ペレットを５ｍｌの緩衝液Ａ２（０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１４ｍＭ　ＢＭＥ，１ｎＭ　ＥＤＴＡ，１ｍＭ　ＰＭＳＦ）に再懸濁した。細胞を破砕させるため，懸濁液（５ｍｌ）および７．５ｍｌのダイノミル型の無鉛酸洗浄ガラスビーズ（直径０．１０−０．１５ｍｍ）（Ｇｌｅｎ−Ｍｉｌｌｓ（株）から入手）をファルコンチューブに入れて，２分間最高速度でボルテックスにかけ，続いて少なくとも２分間氷上で冷した。ボルテックス−冷却工程をさらに４回繰り返した。ボルテックス後，スラリーを低い吸引力でガラス漏斗を用いて濾過した。ガラスビーズを２回，緩衝液Ａ２で洗浄し，そして濾液と洗浄液を混ぜ合わせた。
　粗抽出物の不溶性画分を２０，０００×ｇで１５分間４℃で遠心分離機にかけて回収し，１０ｍ１の緩衝液Ａ２で２回洗浄し，５ｍｌのＭＩＬＬＩ−Ｑ水に再懸濁した。
　最終濃度が各々２０ｍＭになるようにＮａＯＨ（２Ｍ）およびＮａＣｌ（２Ｍ）を懸濁液に添加し，混合物を１分間ボルテックスにかけ，２０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離機にかけ，そして上清を維持することにより，ＳＯＤ−Ｃ３３ｃ含有画分を，不溶性物質から単離した。
　Ｓ−セファロースでＳＯＤ−Ｃ３３ｃを精製するために，上清画分を最終濃度が６Ｍ尿素，０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１４ｍＭ　ＢＭＥ，１ｍＭ　ＥＤＴＡになるように調整した。この画分を，緩衝液Ｂ（０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１４ｍＭ　ＢＭＥ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で平衡化したＳ−セファロース速流動（１．５×１０ｃｍ）のカラムにかけた。カラムにかけた後，カラムをカラムの２倍容の緩衝液Ｂで洗浄した。通過および洗浄画分を回収した。アプライおよび洗浄の流速は１ｍｌ／分であり，回収された画分は１ｍｌであった。
　ＳＯＤ−Ｃ３３ｃ含有画分を同定するため，画分の部分標本をＳＤＳを含有する１０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析して，クーマシーブルーで染色した。画分をさらにＳＯＤに対する抗体を用いてウェスタン法によっても分析した。ＳＯＤ−Ｃ３３ｃ含有画分をプールした。
　ＳＯＤ−Ｃ３３ｃを緩衝液Ｂで平衡化したＱ−セファロースカラム（１．５ｃｍ×５ｃｍ）でさらに精製した。Ｓ−セファロース上でのクロマトグラフィーから得たＳＯＤ−Ｃ３３ｃを含有するプールされた画分を，カラムにかけた。カラムを緩衝液Ｂで洗浄して，６０ｍ１の緩衝液Ｂ中のＮａＣｌ０．０から０．４Ｍのグラジェントで溶出させた。アプライ，洗浄，および溶出の流速は１ｍｌ／分であり，回収された画分は１ｍｌであった。Ｑ−セファロースカラムからの全画分をＳ−セファロースカラムの時と同様に分析した。カラムから溶出されたＳＯＤ−Ｃ３３ｃのピークは約０．２Ｍ　ＮａＣｌの時点であった。
　Ｑ−セファロースカラムから得たＳＯＤ−Ｃ３３ｃは，ポリアクリルアミドＳＤＳゲルおよびヒトＳＯＤに対するモノクローナル抗体を用いたイムノブロットでの分析によると，約９０％以上の純度であった。」（第１２頁１７行〜第１５頁１５行，対応公報第５頁右下欄１行〜第６頁左下欄１４行）
（11f）「実施例６：ＨＣＶにに対する抗体のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　ＨＣＶ（非Ａ，非Ｂ）を有すると臨床的に診断された個体の血清中，および供給血液から採取した血清中のＨＣＶに対する抗体を検出する実施例１から５のＨＣＶ抗原の能力を，ＲＩＡフォーマットで試験した。
　ＲＩＡは，ＳＥＬＥＣＴＥＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬＵＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．），ｐｐ．３７３−３９１に記載のＴｓｕおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（１９８０）の手順に基づき行った。一般には，マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ　２．Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ　ｓｔｒｉｐｓ）を精製したＨＣＶ抗原で被覆した。被覆したプレートを血清試料または適切な対照と共にインキュベートした。インキュベーションの間，抗体は，もし存在するなら，固相抗原に免疫学的に結合する。結合しなかった物質を除去して，マイクロタイタープレートを洗浄後，ヒト抗体−ＮＡＮＢＶ抗原の複合体は，１２５Ｉ標識ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンと共にインキュベートすることにより検出される。結合していない標識抗体を吸引により除去して，プレートを洗浄する。個々のウェルの放射活性を測定する。結合ヒト抗ＨＣＶ抗体の量はウェルの放射活性に比例する。
　詳細には，０．１２５Ｍ　Ｎａホウ酸緩衝液，ｐＨ８．３，０．０７５Ｍ　ＮａＣ１（ＢＢＳ）中に０．１から０．５μｇのＨＣＶ抗原を含有する１００μｌの部分標本を，マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｍｍｕｌｏｎ　２　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ　ｓｔｒｉｐｓ）の各ウェルに添加した。プレートを４℃にて一晩湿気のあるチャンバーでインキュベートした。その後，抗原液を除去し，ウェルを０．０２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ＢＢＳＴ）を含有するＢＢＳで３回洗浄した。非特異的結合を阻害するため，ＢＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を１００μｍ添加し，続いて室温で１時間インキュベートして，このインキュベーションの後ＢＳＡ溶液を除去することにより，ウェルをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で被覆した。１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する０．０１Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２，０．１５Ｍ　ＮａＣｌ（ＰＢＳ）で１：１００に希釈した血清試料を１００μｌ添加し，そして血清含有ウェルを３７℃で１時間インキュベートすることにより，被覆されたウェル中の抗原を血清と反応させた。インキュベーション後，血清試料を吸引により除去して，ウェルをＢＢＳＴで５回洗浄した。抗原に結合した抗体を１２５Ｉ標識Ｆ’（ａｂ）２ヒツジ抗ヒトＩｇＧを被覆ウェルに結合することにより定量した。１００μｌの標識プローブの部分標本（比放射能５−２０μＣｉ／μｇ）を各ウェルに添加し，プレートを１時間３７℃でインキュベートし，次いで過剰のプローブを吸引により除去して，ＢＢＳＴで５回洗浄した。各ウェルに結合した放射活性をガンマ放射線を検出するカウンターにより測定した。」（第２１頁２８行〜第２３頁５行，対応公報第８頁左下欄４行〜右下欄２０行）
　
（１２）甲第１２号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項が記載されている。
（12a）「1.5.3　第一世代のHCV診断薬
　カイロン社ではこのウイルス遺伝子の非構造領域（Non Structural Region;NS）の一部(NS3〜NS4領域）とひとスーパーオキシドジムスターゼ（Superoxide dismutase［SOD]遺伝子の一部を融合タンパク質として遺伝子工学的に発現させることに成功した。これを抗原として用いHCV抗体(c100-3抗体）をELISAもしくはRIAにて測定する系が開発された。この測定系はわが国にもいち早く導入され，Ｃ型肝炎の臨床的研究に多大な貢献をもたらした。」（第９１頁１６行〜２１行）
（12b）「1.5.4　第二世代のHCV診断薬
　c100-3抗体の測定系を始めとするいわゆる第一世代のHCV診断薬のみでの診断では不十分であることが指摘されている。即ち，HCV感染者のすべてを検出できないこと，および急性期の抗体出現まで時間を要すること等である。Ｃ型肝炎をより早期に，より特異的に診断するために第二世代のHCV診断薬開発が行われている。ダイナボット社ではHCVの３種のリコンビナント抗原（ｐHCV-34，c100-3，ｐHCV-31）を用いた第二世代のHCV関連抗体測定系を開発した。抗原としてはHCV遺伝子のNS-3〜NS-4領域に相当するc100-3に加えて新たに２種類の抗原を用いる。ｐHCV-34抗原はHCVのコア領域に相当し，ｐHCV-31抗原はNC-3の33cおよびNS-4のc100-3の一部であるBCDに相当する。同様のHCV関連抗体測定系の開発がオーソ社からも報告されている。オーソ社の用いている抗原領域もダイナボット社のそれとほぼ同様のものを用いており，遺伝子工学的に生産されている。また，東燃，国際試薬は共同で日本人の非A非B型肝炎患者の血漿からHCV遺伝子RNAを抽出し，新たなHCV遺伝子のクローニングを行い，得られた遺伝子より２種のリコンビナント抗原，c11とc17，を作成した。c11抗原はHCV遺伝子のコア領域の一部に相当し，c7抗原はNS-3領域に相当する。そしてこれら２種類の抗原(c7，c11）を用いてHCV関連抗体測定用ELISAキット（イムチェックHCVAb）を開発している。これら第二世代のHCV診断薬は慢性肝炎，肝硬変，肝癌での陽性率が高く，輸血後および散発性非A非B肝炎においては早期に抗体が検出でき，急性肝炎に診断に有用であることが示されている。即ち，従来法に比較して，臨床的感度，特異性に優れたHCV関連抗体の検出試薬であると考えられる。」（第９２頁１２行〜３１行）
　
（１３）甲第１３号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（13a）「それ故，細胞内因子のためのＥＩＡ系の感度は，抗原をＥＩＡ抗体により接近しやすくなるような操作により改善することが可能である。抗原を暴露する１つの可能性のある方法は，粘膜および細胞膜におけるジスルフィド結合を還元できる試薬を用いた試料の処理である。例えば，穏やかな還元剤Ｎ−アセチルシステインを用いた鼻洗浄試料の処理は，呼吸器系ウイルスおよびインフルエンザウイルスのヘマグルチンの測定の為のＥＩＡ系の効率を改善する。」（第５３頁右欄３行〜１５行）
　
（１４）甲第１４号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（14a）「本開示は，ヒト血液抽出物，骨髄抽出物及びリンパ球抽出物における，末端デオキシヌクレオチジル転移酵素のin vitro定量的測定方法に関し，末端デオキシヌクレオチジル転移酵素は，ノニオン界面活性剤，抗凝固剤及び還元剤を含む抽出液を用いて抽出する。」（フロントページ要約欄）
（14b）「ここでいう「還元剤」なる用語は，末端デオキシヌクレオチジル転移酵素（ＴｄＴ）の分子間ジスルフィド結合形成を防ぎ，ＴｄＴの酸化防止をすることによって，ＴｄＴを安定化する組成物をいう。このような還元剤は当業者にとって容易に認識しうるものであって，グルタチオンなどのようなチオール類が包含される。本発明の抽出組成物中の還元剤としてグルタチオンを使用するのが好ましい。」（第３欄５３行〜６１行）
　
（１５）甲第１５号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（15a）「試験試料，例えば，感染したヒト細胞を含む臨床検体中のクラミジア・トラコマティスの存在を検出する方法であって，該方法においては，試験試料を処理して，試料中に存在するクラミジア・トラコマティスに由来する多価クラミジア抗原を露出し，標識した抗体試薬を加えて，標識抗体と遊離した抗原との免疫複合体を含む混合物を形成させる方法。」（第１頁要約欄１行〜４行）
（15b）「このようなタンパク質抗原を露出させるのにさらに有用なのは，一つ又は複数の次に示すいずれかの物質である：アセチルシステイン（例えば２００ｍM以下の濃度で）のような還元剤」（第４頁１１〜１２行）
（15c）「さらなる例として，露出される抗原がＬＰＳである場合，有用な試料処理液は，約６．５〜約９で，好ましくはリン酸緩衝液（例えば０．１Ｍ）を用いて緩衝する。このようなリポポリサッカライド（ＬＰＳ）抗原を露出させるのにさらに有用なのは，一つ又は複数の次に示すいずれかの物質である：ＤＴＴ（例えば５０ｍＭより低い濃度）及びアセチルシステイン（例えば１００ｍＭより低い濃度）のような還元剤」（第４頁１８〜２１行）
　
（１６）甲第１６号証
　平成２２年２月１９日付けで知的財産高等裁判所に提出した松浦善治氏による鑑定書の写しであって，甲第１号証，本件では甲第４号証で使用したＨＣＶコア抗原に「感受性チオール基」が存在するとの見解が実験データと共に示され，また，甲第１号証，本件では甲第４号証で使用したＤＴＴが，硫酸アンモニア沈殿工程で精製した後も残存しているとする見解が示されている。
　
（１７）甲第１７号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（17a）「哺乳類及び鳥類のクラミジア感染を免疫化学的に検出するアッセイ方法であって，サンプル中に存在する可能性があるクラミジア属の細菌を溶菌溶液中で溶菌させる方法。」（第１頁要約欄３〜４行）
（17b）「主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）はジスルフィド架橋によって互いに結合しているので，ＭＯＭＰが検出すべき標的タンパク質である場合には，ジチオスレイトールのような還元剤を使用することが有利である。」（第４頁３〜４行）
　
（１８）甲第１８号証の記載事項
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（18a）「抗原ストックは，A型インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ−Ａ）（ＷＳＮ種）を感染させたメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞であって，・・・に希釈した細胞を用いて調製した。・・・２５０μｌアリコートのこの抗原（又は対照）を上記装置にアプライし，制流インサートを介してメンブレン上層上に排液させ，次いで３００μｌの０．１５Mクエン酸水溶液を通過させた。・・・アルカリホスファターゼであるウシ腸ＡＰにコンジュゲートした抗−Ｆｌｕ−Ａ抗体（Ｂｕｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）を２７μｇ／ｍｌ含む溶液を１００ｍＭトリスＨｃｌ，１５０ｍＭのＮａCｌ，２００ｍＭのリン酸ナトリウム，１％カゼイン，1ｍＭの塩化マグネシウム，０．１ｍＭの塩化亜鉛，１ｍＭの２−メルカプトエタノール及び０．２％のＮａＮ３を含む緩衝液（ｐＨ７．２）中に調製した。この混合物の１５０μｌアリコートを上記装置に添加し，メンブレンスタックに吸収させた。短時間（２分）のインキュベーションの後，装置を３００μｌのＴＢＳ（ＩｇＧ不含）で洗浄した。」（第６欄３〜３１行）
　
（１９）甲第１９号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（19a）「実施例１：チロキシン（Ｔ４）の測定　緩衝液：１０ｍＭのリン酸カルシウム（ｐＨ７．０），０．１４Ｍ塩化のトリウム，０．５ｍＭの塩化マグネシウム，１ｍＭの１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　反応混合物：１０μｌのＴ４誘導化β−ガラクトシダーゼ（１μｇ／ｍｌ）（ヨードアセチル−Ｔ４とβ−ガラクトシダーゼとの１：２のモル比での反応により調製），１０μｌの抗−Ｔ４ヒツジ全血清（１０−１希釈）（免疫原：Ｔ４−エデスチンコンジュゲート），２０μｌのＬ−チロキシン（１．２５〜２５ｎｇ／ｌ）　上記混合物を，３０分間３７℃でインキュベートし，その後，５分間６２℃で加熱する。」（第５欄１０〜２５行）
　
（２０）甲第２０号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（20a）「二連で行ったすべての測定は，１．６Mトリス緩衝液，ｐＨ７．６（２００μｌ），２％ウシ血清アルブミン（１００μｌ），０．０２０Ｍメルカプトエタノール（１０μｌ），５ピコグラムのウサギγグロブリン（５０μｌ）を含有する１２×７５ｍｍガラス管内で行った。・・・高濃度のトリスおよび２−メルカプトエタノールは，アイソザイムのスルフヒドリル基を保護し，モノマーの解離を防止すると考えられている。この混合物に，１００μｌ〜５μｌの範囲の容積で，抗血清の適切な希釈液を添加した（希釈は正常ウサギ血清で行った）。１２５Ｉが標識されたＭＭ（０．１ｍｃｇ），ＭＢ（０．１ｍｃｇ），およびＢＢ　ＣＫ（０．２ｍｃｇ）を，各管内に約２５０００ｃｐｍが存在するように添加した。」（第６欄４１行〜第７欄４２行）
　
（２１）甲第２１号証
　２０１０年８月１９日付けの，マイケル・ホートン氏の鑑定書であって，甲第２号証は，ＨＣＶ抗体測定用免疫アッセイを開示している，ＨＣＶ抗体含有試料に添加したＤＴＴは抗原抗体反応開始時点で還元剤としてまだ機能している，還元剤は抗原のジスルフィド結合の形成防止を促進する，当業者は，ｃ３３ｃ抗原等のＨＣＶ抗原の安定化のための還元剤の使用を知っていた，との鑑定が示されている。
　
（２２）甲第２２号証
　平成２２年８月２０日付けの，松浦善治氏の鑑定書であって，甲第２号証は，ＨＣＶ抗体測定用免疫アッセイを開示している，ＨＣＶ抗体含有試料に添加したＤＴＴは，抗原抗体反応が行われる際に還元剤としての機能を有し存在していた，ｃ３３ｃ抗原等のＨＣＶ抗原のジスルフィド結合の形成を防ぐために還元剤を添加することは周知であるとの鑑定，及び甲第３号証について，実施例９のグルタチオンの一部はコーティング工程で存在し，洗浄工程を経ても抗原に結合し続け，抗原のジスルフィド結合が形成されるのを防ぐ，との鑑定が示されている。
　
（２３）甲第２３号証の記載事項の日本語訳
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（23a）「本発明は，臨床試料中のクラミジア・トラコマティス抗原の検出のためのイムノアッセイ手法に関する。具体的には，測定すべきクラミジア・トラコマティス抗原を直接固相にコーティングした固相イムノアッセイに関する。」（第１欄７〜１２行）
（23b）「予期せぬことに，界面活性剤，例えばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，Ｔｗｅｅｎ−８０，ドデシル硫酸塩，デオキシコール酸または他の胆汁酸塩を溶菌培地に添加することにより，本発明の方法の感度が増すことが見出された。デオキシコール酸塩，好ましくはケノデオキシコール酸塩を溶菌培地へ添加することにより，本発明の方法を使用して得られた結果に関して優れた感度及び特異性をもたらすことが見出された。界面活性剤に加えて，還元剤，例えばジチオスレイトール，２−メルカプトエタノール，Ｎ−アセチル−システインなどが，好ましくは溶菌培地に添加される。」（第２欄２９〜４１行）
　
（２４）甲第２４号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項が記載されている。
（24a）「ＳＨ基は酸化剤の添加によって酸化を受けるのはもちろん，空気中の酸素によって自発的に酸化−いわゆる自動酸化−される。この分子状酸素によるチオール基の酸化速度は，微量の金属イオン（とくに鉄と銅）の存在で非常に加速される。したがって，これら金属イオンと複合体をつくることができるキレート剤を添加したり，β−メルカプトエタノールやＤＤＴなどの添加によって，遊離ＳＨ基が活性の発現に必要な酵素タンパク質のＳＨ基を保持，安定化できる。」（第８１頁下から４行〜第８２頁３行）
　
（２５）甲第２５号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項が記載されている。
（25a）「使用する溶出液としては，目的とする蛋白質や酵素を安定に保つのに必要なｐＨを保ち，しかも蛋白質や酵素活性の測定を阻害しない緩衝液を使用する。酵素の安定化のために，必要に応じて種々の塩類，ジチオスレイトールなどの還元試薬，ＥＤＴＡ，グリセロール，ショ糖などを加える。」（第１６２頁７〜１０行）
　
（２６）甲第２６号証
　２００４年６月３０日（初版４刷）に発行された，特許ワークブックであって，新規性の判断について記載されている。
　
（２７）甲第２７号証
　２０１０年８月１８日付けの，リチャード．Ａ．ラーナー氏の鑑定書であって，甲第３号証において，実施例７で使用されたグルタチオンの一部が，実施例９においては，グルタチオンを溶液から除去する工程については述べられておらず，実施例７で使用されたグルタチオンの一部が，実施例９のコーテイング工程及び洗浄工程の間にわたって，抗原に結合し続けるとの鑑定が示されている。
　
（２８）甲第２８号証
　２０１０年７月１５日付けの，マイケル・ホートン氏の鑑定書の写しであって，本件出願時点で科学者は「感受性チオール基」という概念を理解しており，還元剤が感受性チオール基に及ぼす安定化効果も理解していた，甲第２号証，本件では甲第１１号証において，実施例１において精製した際に，１４ｍＭ　ＢＭＥバッファー中の抗原が最終的な形態であり，実施例６のコーテイングバッファー中に，約０．１ｍＭのＢＭＥが含まれていた，甲第２号証は，複数の抗原を使用することで感度が向上することを教示しており，単一のＨＣＶ抗原を複数のＨＣＶ抗原で置き換えることは困難ではないとの鑑定を示している。
　
（２９）甲第２９号証
　本件出願後の２００８年１２月（改訂（第３版））に頒布された刊行物であり，以下の事項が記載されている。
（29a）「Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質キット
　ルミパルスオーソＨＣＶ抗原」
（29b）「＜反応プロトコール；２ステップモード＞
検体の前処理　　検体を，界面活性剤を主成分とするＨＣＶ抗原用検体処理液で処理し，ＨＣＶコア蛋白質を露出させ，共存するＨＣＶコア蛋白に対する抗体を失活させます。」（第1頁目右欄１行〜４行）
（29c）「２．試料の調製法
　プラスチックチューブに検体２００μＬを分注し，これにＨＣＶ抗原用検体処理液１００μＬを加えて撹拌した後，６０±４℃，３０分間反応させます（前処理）。前処理の終了した検体は，室温に５分程度静置することで室温に戻し，これを測定用検体とします。」（第２頁目左欄９〜１３行）
　
（３０）甲第３０号証の記載事項
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項が記載されている。
（30a）「１）(a)特異結合性タンパクを
　(1)アルデヒド化合物，および
　(2)還元剤
　と反応させ，
　（b）不溶性支持体の表面をその反応させた特異結合性タンパクと接触させ，そして該表面に特異結合性タンパクを結合させ，そして
　（c）前記不溶性支持体から未結合タンパクを除去する
ことからなる固相イムノアッセイの製造方法。
２）特異結合性タンパクが抗体，抗原およびハプテンからなる群より選択される特許請求の範囲第１項記載の方法」（特許請求の範囲請求項１，２）
（30b）「更に詳細には，本発明は不溶化された安定な特異結合性タンパクおよび，アルデヒドと反応させそして還元剤の存在下にインキュベートした特異結合性タンパクを用いる固相イムノアッセイの調製方法を包含する。このアルデヒド／還元剤を特異結合性タンパクと組合せるとコーテイング溶液の免疫反応安定性の顕著な増大および／または標識被分析物の結合割合（％）の向上がみられる。
　本明細書に用いる用語「特異結合性タンパク」とは抗体，抗原またはハプテンと特異的に反応するガンマグロブリンまたは免疫グロブリンとも呼ばれる一群の血清タンパクを意味する。」（第４頁左上欄５行〜最終行）
（30c）「適切なイムノアッセイまでうまく開発できなかつた特異結合性タンパクが，本発明に従つてアルデヒド活性化段階の完了前または完了後に還元剤をコーテイング溶液に添加することにより使用可能となることを見出した。特異結合性タンパクに対してアルデヒド化合物か還元剤のいずれかを他方の非存在下に用いた場合には，得られる結合効率がこれら物質の双方を用いた場合に達成される効率よりも低い，抗体抑制活性のロスを防ぐことによる相乗効果を得るには，これらの試剤の双方の存在が不可欠である。」（第4頁左下欄３行〜１３行）
（30d）「この効果のメカニズムは知られていないが，還元剤の存在により特異結合性タンパクの酸化が防止されることによるものと思われる。中性又はアルカリ性ｐＨにあるタンパクが溶存酸素との試験管内反応によりジスルフイド架橋を形成し得ることは知られている。Haschemeyer　R.H.およびA.E.V.Haschemeyer，1973「Primary structure of proteins」Proteins.　Ed. John Wiley and Sons,Inc. p.66参照。これらの結合はタンパク／抗体の三次構造を変える効果を有し，それ故に分子の酵素活性または免疫活性を変えることができる。還元剤は硫黄基を還元させたスルフヒドリル型，すなわち−ＳＨにすることにより分子内スルフイド結合の形成を防ぐ化学的能力を有するものと思われる。それで特異的結合性タンパク／抗体は各コーテイング溶液中での免疫反応性が安定化される。
　不溶性プラスチック支持体上にコーテイングした場合，特異結合性タンパクは一般に，還元剤が取込まれない場合よりも大きな大きな標識被分析物の結合を示す。特異結合性タンパクの免疫反応安定性は，一旦固相表面に結合されると，長時間にわたつて，２５℃では数ヶ月間にまでわたつてさえも極めて良好であることを見い出した。」（第５頁左上欄９行〜右上欄１５行）
（30e）「実施例１
本願発明１および比較用実験Ａ
Ｌ−３，５，３−トリヨード−チロニン（Ｔ３）に対する精製ウサギ抗血清を・・・グルタールアルデヒドを最終濃度が５ミリモル濃度（ｍＭ）となるように添加しそして室温で２０分間反応させる。その反応終了時に，本発明実験１には，１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度が０．６ｍＭとなるように添加するが，比較用実験Ａには添加しない。その溶液を混合させ１ｍｌをポリプロピレン管中に分散させ，２４℃で一夜インキュベートし，傾瀉し，ｐＨ７．４を有するトリス−ゼラチン緩衝液で１回洗浄しそして２５℃で空気乾燥させる。
　ＤＴＴの存在下または非存在下に製造した管の比較分析を第１図に示す。それらの結果は，コーテイングの処理の際に還元剤が存在する場合にはコーテイング効率が増大することを示す。それらの結果は，ＤＴＴを取り込ませて製造した管によりＴ３の取り込みを測定するための優れた固相イムノアッセイが得られることを示す。」（第８頁左上欄６行〜右上欄１１行）
（30f）「実施例２
本願発明２および比較用実験Ｂ
　ウサギ・ジゴキシン抗血清を・・・精製して・・・その精製抗血清を・・・グルタールアルデヒドと反応させる。次いで１，４−ジチオスレイトールを０．６ｍＭの濃度となるまで本発明実験は添加するが，比較用実験Ｂは添加しない。次にその溶液を混合しそして１．０ｍｌをポリプロピレン管に添加しそして２５℃で一夜インキュベートする。管を傾瀉し，ｐＨ７．４で緩衝されたトリス−ゼラチンで１回洗浄し次いで空気乾燥する。第２図はジゴキシン抗血清の結合が１，４−ジチオスレイトールを使用せずに製造した管に比べ著しく増大することを示している。」（第８頁右上欄１２〜左下欄１２行）
　
（３１）甲第３１号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（31a）「要約
　従来の間接的な赤血球凝集試験は，２−メルカプトーエタノール（２−ＭＥ)を用いた事前の血清の処理を行った場合や行わなかった場合に，（二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｋｎｏｗｌｅｓｉ）に感染した動物から収集された）アカゲザルの血清において行われた。驚くべきことに，多くの血清サンプルは，２−ＭＥによる最終的なタイターの顕著な増加を示した。」（第３２９頁左欄１行〜７行）
（31b）「前試験は，２−メルカプトエタノール（２−ME)を用いた事前の血清の処理を行った場合行わなかった場合について，マラリア抗原をコーティングしたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を2倍希釈した（二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｋｎｏｗｌｅｓｉ）に感染した動物から収集された）アカゲザルの血清に添加した従来の間接的な赤血球凝集試験を含んでいた。・・・２−ＭＥ処理を用いた場合に最終的なタイターの顕著な増加を示した，予期しなかった第三のカテゴリーが存在した。」（第３２９頁右欄１０〜２０行）
（31c）「一週間間隔で動物から採取した血清を，脱補体(decomplement)し，ＳＲＢＣを用いて吸収させ，ＩＨＡ試験に供した。血清は，２−ＭＥを添加し，１時間３７℃でインキュベートし，その後，二倍希釈液を調製した。（第３３０頁左欄１９行〜２５行）」
（31d）「ＩＨＡ試験は，最初に収集した血清中に行い，２−ＭＥで処理した血清試料中のタイターの増加，すなわち３つの収集物の平均値を計算した。」（第３３１頁左欄６行〜９行）
（31e）「ＩＨＡタイターの２−ＭＥによる増加は，活発な感染期のマラリア流行地域から収集されたヒト血清の日常的なスクリーニングにより，早くから気付かれていた。実験Ｉの根拠は，生きた寄生虫を注入した高度免疫アカゲザル血清において，このような２−ＭＥによる増加を求めることであった。図１は，これらのサル血清中のΔ２−ＭＥ値を示す。実験動物，特に生きた寄生虫を注入した動物は，２−ＭＥを用いた処理により，タイターの顕著な増加を示した。」（第３３１頁左欄１４行〜右欄１行）
（31f）「実験IIは，初期薬物抑制二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｋｎｏｗｌｅｓｉ）の感染の間に収集した血清におけるＩＨＡタイターの２−ＭＥによる増加を求め，その免疫学的重要性を評価するために，デザインした。感染初期の発作の間に収集した血清におけるＩＨＡタイターの２−ＭＥによる増加は，二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｋｎｏｗｌｅｓｉ）を用いた攻撃感染に対する同じ動物の機能免疫と相関関係があった。」（第３３１頁右欄７行〜１４行）
（31g）「２−MEによる増加は，未処理血清中の凝集タイターを遮蔽する，血清中の何らかの阻害物質を除去することに起因すると思われる。」（第３３２頁左欄１６行〜１８行）
　
（３２）甲第３２号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。訳文は対応日本語公報である特表平６−５０５３８９号公報（甲第３２号証−２）による。
（32a）「さらに，試料を界面活性剤または還元剤またはその両方で処理することにより，「隠れた」抗原または抗原決定基を暴露することができる。たとえば，コア抗原はウィルスエンベロープで覆われたカプシド形態中に存在する。界面活性剤でエンベロープを剥ぎ取ることによりコア抗原が暴露される。モノクローナル抗体はまた，アッセイに一層高い感度を与え，一層短いインキュベーション時間を可能とする点で高力価のポリクローナル抗体に比べて実際的な利点をも提供する。」（第１６頁２〜６行）
　
（３３）甲第３３号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（33a）「本発明は，安定化スルフヒドリル基含有還元剤を含んでなる組成物，抽出組成物および診断測定のためのクラミジア生菌体または淋菌生菌体からの抗原抽出に対するその使用に関する。」（第1欄９〜１３行）
（33b）「ジチオスレイトールまたは他のスルフヒドリル基含有還元剤は，外生の蛋白質を可溶化するためのクラミジア抗原の抽出に有用であることが知られているが，これらの試薬は一般に不安定であり，迅速に使用しない限りはそれらの活性を急速に失う。従って，長期間貯蔵することができる抽出組成物および診断試験キットを入手することが望まれるであろう。」（第１欄６５行〜第２欄）
（33c）「既知の抽出組成物および分析方法に伴う前述の課題は，スルフヒドリル基含有還元剤および１種以上の親水性ポリマーを含んでなる組成物によって解決される。」（第２欄８行〜１１行）
　
（３４）甲第３４号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（34a）「抗−プロトロンビンの固相酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
　マイクロタイタープレート（９６穴；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ　２，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を，０．０５Ｍホウ酸，ｐＨ８．５中の２０μｇ／ｍｌの濃度のヒトプロトロンビンを用いて，16時間４℃でコーティングした。プレートを，ウエルに加えた同じバッファー中の０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，０．１４Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．０５％　ＮａＮ３及び２％ウシ血清アルブミンで，３０分間２４℃で徹底的に洗浄した。０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，１４Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．０５％　ＮａＮ３を用いた徹底的な洗浄後に，５０μｌの培養液上清またはマウスポリクローナル抗−プロトロンビン抗血清を，プレートに加えて，３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．１５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，０．１４Ｍ　ＮａＣｌ，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，２ｍＭ　β−メルカプトエタノール，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．０５％ＮａＮ３を用いて徹底的に洗浄した。前記バッファー中のβ−ガラクトシダーゼがコンジュゲートしたヒツジ抗−マウスＩｇＧのＦａｂ断片（５０μｌ）を添加した。プレートを２４℃で２時間インキュベートした後，同じバッファーで３回洗浄した。ｐ−ニトロフェニルＤ−ガラクトシド（５０μｌ，０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２），１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，２ｍＭ　β−メルカプトエタノール中）を各ウエルに加え，反応を３０〜６０分間２３℃で行った。４０５ｎｍの吸光度を，Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＭＲ　５８０　Ｍｉｃｒｏ−ＥＬＩＳＡオートリーダーを用いてモニターした。固定化したプロトロンビンに結合した抗−プロトロンビン抗体を検出した。」（第２８欄４１行〜６７行）
　
（３５）甲第３５号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（35a）「非−Ａ，非−Ｂ肝炎抗原又は抗体の検出のために本願明細書において使用した免疫粘着アッセイは，Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出についてのＭａｙｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ（Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ．２０；１７８，１９７１）によって記載された方法に基づく」（第８欄４３行〜４７行）
（35b）「アッセイ
　前記二つの血清を４５分間５６℃で加熱し，補体を不活性化する。抗原についての力価を求める場合：
１．０．０５ｍｌの加熱した試料を，二列のウエル＃１に添加し，ブランクであるゼラチンベロナール緩衝液，ＧＶＢを０．２５ｍｌ使用して，連続して希釈する。
２．既知の抗体ポジティブ血清を，適切な希釈（４−８ＩＡ単位）で１列に添加し，ＧＶＢを対照としてもう一つの列に添加する。プレートを振動ミキサー上で混合し（１０秒間），３７℃で１時間インキュベートする。
３．適切な希釈の補体（１：５０から１：１００）を，全てのウエルに加える（０．０２５ｍｌ）。プレートを再度１０秒間混合し，３７℃で４０分間インキュベートする。
４．マイクロプレートをインキュベーターから取り出し，０．０２５ｍｌのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を全てのウエルに加える。プレートを再度混合する。
５．即座に，０．０２５ｍｌの０．５％ＲＢＣを全てのウエルに加え，混合した後，凝集パターンを発達させるために，プレートを室温で少なくとも２時間静置する。本方法は，可逆的ではないので，一晩静置させることが時には現実的である。蓋又はカバーを完全にプレート上で使用し，試料の蒸発を防ぐ。各実験により，対照抗原及び抗体をアッセイに供し，それぞれの力価を報告する。」（第８欄６５行〜第９欄２４行）
　
（３６）甲第３６号証
　本件出願前に頒布された刊行物であり，以下の事項（日本語訳）が記載されている。
（36a）「Ｃ１００は，ＨＣＶポリプロテインの推定上の非構造領域内に位置する（図２参照）。Ｃ１００は，その後，ＨＣＶ１００フラグメントを，ヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードするヒト遺伝子に融合させることによって，リコンビナント酵母内で発現させた。ヒトＳＯＤへの融合により，リコンビナント細菌及び酵母内での異種蛋白質の発現が容易になった。得られた融合ポリペプチド（Ｃ１００−３）の相対組成を図３に示す。」（第４３０頁２０行〜２７行）
（36b）「図３　循環抗体を捕捉するための，酵母リコンビナントＨＣＶ抗原（Ｃ１００−３）の組成。この抗原は，ヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の１５４アミノ酸及びＨＣＶポリプロテインの非構造部分に由来する３６３アミノ酸（Ｃ１００）を含む。クローニング手順が原因で，隣接するリンカー（Ｌ）ＤＮＡに由来する追加の１０アミノ酸が存在する。」（第４３０頁下から５行〜１行）
 
（３７）乙第１号証
　本件出願後に頒布された刊行物であり，甲第１号証中で先行技術として引用された刊行物の対応日本語公報であり，以下の事項が記載されている。
（37a）「１．ハイブリダイゼーションアッセイで信号増幅用に使用するためのポリデオキシヌクレオチド構築物であって，以下の３つのドメイン：
（ａ）一本鎖であり，標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有する，第一ドメイン（Ａ）；
（ｂ）二本鎖であり，ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素活性のためのプロモーターとして機能することができる，第二ドメイン（Ｂ）；および
（ｃ）一本鎖または二本鎖のいずれかであり，第三のドメインが該第二のドメインのプロモーター活性のための鋳型として機能することができるように，該第二のドメインに隣接している，第三のドメイン（Ｃ）：
を包含する，ポリデオキシヌクレオチド構築物。」（請求の範囲請求項１）
（37b）「様々な量で合成ＨＩＶ標的配列を含む正常ヒト血漿の試料を，実施例２に記載のように調製した。１０μｌの血漿を１２．５μｌの抽出用緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８．０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ，４０μｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および２ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）に添加し，マイクロタイターディッシュのウェル中で６５℃で３０分間インキュベートした。ウェルはまず初めに，実施例２に記載のように，所定配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを固相基質に結合させることにより準備した。１２．５ｆｍｏｌのＨＩＶ捕捉およびリンカ−プローブを含む５μｌのｌＮ　ＮａＯＨをウェル当り添加し（前記），混合物をさらに６５℃で３０分間インキュベートした。その後１３μｌのＭＯＰＳ−ＳＳＣ（０．７７Ｍ　３−［Ｎ−モルホリノ］プロバンスルホン酸，１．８４５Ｍ　ＮａＣ１，０．１８５Ｍクエン酸Ｎａ）を添加し，混合物をさらに６５℃で２時間インキュベートした。
　ウェルを次に，洗浄用緩衝液Ａ（０．ｌ×ＳＳＣ．０．１％ＳＤＳ）で２回洗浄した。洗浄の後，４０μｌのウマｈｙｂ　ｍｉｘ（５０％ウマ血清，０．６Ｍ　ＮａＣｌ，０．０６Ｍクエン酸Ｎａ，０．１％ＳＤＳ）中の３０ｆｍｏｌのＴ７鋳型プローブを添加し，混合物を５５℃で１時間インキュベートした。（ウマハイブリダイゼーションｍｉｘは以下のように調製した：１０ｍ１の場合−−−５０４μｌ水（ジエチルピロカーボネートＤＥＰＣ処理済み），３３６μｌ　１０％ＳＤＳ，６０μｌ　１ＭトリスＨＣＩ（ｐＨ８），１００μｌ　２５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ，５ｍｌウマ血清，を６５℃で２時間インキュベートし，１ｍｌ水（ＤＥＰＣ処理済）および２ｍｌ　２０×ＳＳＣを添加。）
　ウェルを次に，洗浄用緩衝液Ａで２回および洗浄用緩衝液Ｂ（０．ｌ×ＳＳＣ）で２回洗浄した。その後４０μｌの転写用ｍｉｘ（４０ｍＭ　トリスＨＣｌ　ｐＨ８，２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，８０単位Ｔ７ポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ），１０ｍＭ　ＤＴＴ，０．１５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ，それぞれ１．２５ｍＭのＡＴＰ，ＵＴＰ，ＧＴＰおよびＣＴＰ，１６００単位／ｍｌ　ＲＮＡｓｉｎ）を添加し，混合物を３７℃のオーブンで１．５時間インキュベートした。」（第２１頁左下欄下から１３行〜右下欄下から９行）
　
（３８）乙第２号証
　２００８年のＢａｎｇａｌｏｒｅ　ＧｅＮｅｉ社のカタログであって，ＤＴＴが，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性のために要求されることが記載されている。
　
（３９）乙第３号証
　２０１０年５月１２日に検索された，ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ社のインターネットホームページであって，ＤＴＴが，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性のために要求されることが記載されている。
　
（４０）乙第４号証
　平成２２年５月１２日付けの，奥村康氏による見解書の写しであって，甲第１号証（本件では甲第４号証）であるＣｈｉｂａ論文は，ＨＣＶコア抗原を用いて抗体を捕捉する診断が臨床的に有用であることを明らかにしたものであり，同抗原へのＤＤＴの影響の有無を論じた内容ではない，ＤＴＴは夾雑タンパク質との会合を外すために，細胞溶解物の部分精製に際して前処理のために添加したものである，松浦鑑定書（甲第１６号証）は，実験の設計に欠陥が多く，ＨＣＶコア抗原がＤＴＴの影響を受けて抗体との反応性に変化を生じるかは全く分からない，ラーナー鑑定書（甲第２７号証）は，ＤＴＴがＥＬＩＳＡプレートに還元剤として残留したかどうかは証明できていない，との見解が示されている。
　
（４１）乙第５号証
　２０１０年５月１４日付けの，アントニー　スコット　ミアホフ氏による鑑定書であって，ＨＣＶコアタンパク質（アミノ酸１−１５０）及びＨＣＶ−ＮＳ３タンパク質（アミノ酸１１９２−１４５７）を使用し，ＤＴＴの影響をＥＬＩＳＡ法により測定し，ＨＣＶコアタンパク質は，ＤＴＴの存在下，不存在下でのコーテイングで顕著な変化を示さず，ＮＳ３タンパク質は，ＤＴＴの存在下では，不存在下に比べ免疫学的反応性が増大しチオール基の感受性がはっきりと示される，との鑑定が実験結果と共に示されている。
　
４　本件明細書及び甲各号証で用いられているＨＣＶ抗原の略称について
　ＨＣＶ抗原について，本件明細書及び甲各号証で「Ｃ１００」，「Ｃ−１００」，「ｃ−１００」，「Ｃ１００−３」及び「ｃ１００−３」と表記されたＨＣＶ抗原は，同じ抗原を意味し，また，「３３ｃ」，「ｃ３３ｃ」，「Ｃ３３ｃ」と表記されたＨＣＶ抗原は，同じ抗原を意味する。
　
５　無効理由１について
（１）甲第１号証記載の発明
　甲第1号証には，上記記載事項（特に(1g)(1f)）から，
「Ｃ−１００抗原でコートしたマイクロタイタープレートであって，コーティングバッファー（５０ｍＭホウ酸ナトリウム，ｐＨ９．０），２１ｍｌ／プレート，ＢＳＡ（２５μｇ／ｍｌ），ＨＣＶ　Ｃ−１００（２．５０μｇ／ｍｌ）を含む溶液を添加直前に調製し，この溶液を０．２ｍｌ／ウェルでマイクロタイタープレートに添加し，５分間混合した後，３７℃で２時間インキュベートし，その後この溶液を吸引によって取り除き，ウェルを０．４ｍｌの洗浄バッファー（１００ｍＭ　リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４，１４０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％カゼイン，１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，０１％（ｗ／ｖ）ヒビテン）で１回洗浄し，洗浄溶液を除去した後，２００μｌ／ウエルのコート後溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０．１％（ｖ／ｖ）カゼイン，３％ショ糖，および２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））を添加し，室温に３０分間放置し，ウェルを吸引して溶液を取り除き，１晩凍結乾燥して得られたものであり，
　イムノアッセイを遂行するために，血清サンプルの希釈液２０μｌを，サンプル希釈物（１００ｍＭ　リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４，５００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１％（ｗ／ｖ）カゼイン，０．０１％（ｗ／ｖ）ヒビテン，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１００μｇ／ｍｌ酵母抽出液）２００μｌを含むウェルに添加し，マイクロタイタープレートを３７℃で２時間インキュベートし，溶液を吸引により除去して，ウェルを４００μｌの洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し，ウェルに，ハイブリッドＴ７ポリメラーゼアンプリファイアプローブであるウサギ抗分析物抗体を添加しイムノアッセイを完成させ，Ｔ７ポリメラーゼプローブを添加した後，この複合体を，４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ８），２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭスペルミジン，１０ｍＭジチオスレイトール，０．１５ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン，ｒＡＴＰ，ｒＣＴＰ，ｒＧＴＰ，ｒＵＴＰがそれぞれ１．２５ｍＭ，１６００単位／ｍｌ　ＲＮアシン，および２０００単位／ｍｌ　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼからなる溶液２０μｌ中でインキュベートしてドメインＣの転写を実施して，ヒト血清におけるＨＣＶに対する抗体の存在についてのイムノアッセイに用いるＣ−１００抗原でコートしたマイクロタイタープレート。」の発明（以下，「甲１発明」という。）が記載されていると認められる。
　
（２）対比・判断
　ア　本件発明１について
　本件発明１と甲１発明とを比較する。
　（ア）甲１発明の「Ｃ−１００抗原」は，ＨＣＶ抗原の一種であるから，本件発明１の「感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原」とは，ＨＣＶ抗原である点で共通する。
　（イ）甲１発明の「Ｃ−１００抗原でコートしたマイクロタイタープレート」と，本件発明１の「固相化された該抗原含有試薬」とは，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬である点で共通する。
　（ウ）甲１発明の「ヒト血清における」，「ＨＣＶに対する抗体」，「イムノアツセイ」は，本件発明１の「検体中」，「ＨＣＶ抗体」，「免疫学的方法により測定」することに，それぞれ相当する。
　したがって，両者の間には，以下の一致点及び相違点がある。
　
（一致点）
　検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するためのＨＣＶ抗原含有試薬において，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬であるＨＣＶ抗体測定用試薬である点。
　
（相違点ア）
　ＨＣＶ抗原が，本件発明１では，感受性チオール基をもつものであるのに対して，甲１発明では，「Ｃ−１００抗原」であり，感受性チオール基をもつかどうか明らかでない点。
　
（相違点イ）
　本件発明１が，ＨＣＶ抗原含有試薬に還元剤を含有せしめるか又は固相化された該抗原含有試薬を還元剤で処理せしめるのに対して，甲１発明では，マイクロタイタープレートに抗原をコートするための溶液「コーティングバッファー（５０ｍＭホウ酸ナトリウム，ｐＨ９．０），２１ｍｌ／プレート，ＢＳＡ（２５μｇ／ｍｌ），ＨＣＶ　Ｃ−１００（２．５０μｇ／ｍｌ）を含む溶液」，コートした後の洗浄液「洗浄バッファー（１００ｍＭ　リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４，１４０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％カゼイン，１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，０１％（ｗ／ｖ）ヒビテン）」，及びコート後溶液「コート後溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０．１％（ｖ／ｖ）カゼイン，３％ショ糖，および２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））」には還元剤は含有されず，コート後溶液を吸引して取り除いた後凍結乾燥して得た，Ｃ−１００抗原でコートしたマイクロタイタープレートに，サンプル希釈物として添加される溶液「サンプル希釈物（１００ｍＭ　リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４，５００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１％（ｗ／ｖ）カゼイン，０．０１％（ｗ／ｖ）ヒビテン，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１００μｇ／ｍｌ酵母抽出液）」にも還元剤は含有されず，このサンプル希釈物を含むウエルに血清サンプルを添加した後に用いる洗浄液「洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）」にも還元剤は含有されず，ハイブリッドＴ７ポリメラーゼアンプリファイアプローブであるウサギ抗分析物抗体を添加しイムノアッセイを完成させ，Ｔ７ポリメラーゼプローブを添加した後，還元剤を含有した溶液を添加して転写を行う点。
　
　そこで，上記各相違点について検討する。
（相違点アについて）
　Ｃ−１００抗原は，アミノ酸配列１６７７−１９３１を有し，３３Ｃ抗原と重複しないＮＳ３領域〜ＮＳ４領域にコードされるものであることは，本件明細書段落【０００２】に「ＨＣＶゲノム上の非構造領域であるＮＳ３およびＮＳ４領域にコードされるＣ１００−３抗原を使用したＨＣＶ抗体測定系が開発された。１９９１年には，ＨＣＶゲノム上の構造領域であるコア領域およびＣ１００−３抗原とは重複しないＮＳ３領域にコードされるコア抗原およひ３３Ｃ抗原」と記載され，さらに，甲第２号証の図１に３３Ｃがアミノ酸配列１１９２−１４５７でありＮＳ３領域にコードされ，Ｃ１００がアミノ酸配列１６７７−１９３１であり，ＮＳ３領域の一部〜ＮＳ４領域にコードされることが図示されているとおりである。
　そして，３３Ｃ抗原については，本件明細書段落【０００３】に「感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原，特にＨＣＶゲノム上のＮＳ３領域にコードされているタンパク質」と記載され，実施例５で，抗３３Ｃ抗体を検体とした場合，還元剤非添加の感作血球を２週間放置したものに，還元剤である２−ＭＥをに添加して測定した場合，添加しない場合に比べて感度が回復していることが【表５】に示されていること，及び乙第５号証でアミノ酸配列１１９２−１４５７のＨＣＶ−ＮＳ３抗原，つまり３３Ｃ抗原を用いてＮＳ３抗体を検出した実験で，ＤＴＴを添加して抗原をコーテイングした固相を使用した場合，添加しないでコーテイングした固相を使用した場合に比べて感度が向上することが，表１Ｂ，表２Ｂ（第５頁）に示されていることから，ＮＳ３領域にコードされる３３Ｃ抗原は「感受性チオール基」をもつということができる。
　以上のとおり，ＮＳ３領域にコードされる３３Ｃ抗原は，「感受性チオール基」をもつといえるが，同じＮＳ３領域の一部をコード領域に含むことのみを理由として，Ｃ−１００抗原が「感受性チオール基」をもつということはできないから，この抗原が，「感受性チオール基」をもつかどうかは明らかでなく，甲１発明が感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原を有するものであるとすることはできない。
　
（相違点イについて）
　前記「第４　２」で記載したとおり，本件発明１の「ＨＣＶ抗体測定用試薬」は，検体と混合する前に還元剤を含有せしめるか又は還元剤で処理せしめることにより得られたものである。
　これに対して，甲１発明は，マイクロタイタープレートに抗原をコートするための溶液，コートした後の洗浄液，及びコート後溶液には還元剤は含有されず，コート後溶液を吸引して取り除いた後凍結乾燥して得た，Ｃ−１００抗原でコートしたマイクロタイタープレートは，還元剤で処理されたたものではなく，Ｃ−１００抗原でコートしたマイクロタイタープレートに，サンプル希釈物として添加される溶液にも還元剤は含有されていない。
　そして，還元剤が添加されるのは，Ｃ−１００抗原と血清サンプル中の抗体との反応後に，Ｔ７ポリメラーゼプローブを添加した後であり，還元剤を含有した溶液を添加して転写を行うものであるから，検体と試薬とを混合する前に，試薬を製造する過程で還元剤を添加することは記載されていないし示唆もされていない。
　
　以上のとおり，本件発明１は，甲１発明であるとすることはできない。
　
　イ　本件発明２ないし９について
　本件発明２は，本件発明１の還元剤が，反応溶媒中に存在することを限定するものである。
　本件発明３は，本件発明１の感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原試薬が，感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原を担体に固相化した抗原であることを限定するものである。
　本件発明４は，本件発明３の感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原が，ＨＣＶゲノムの非構造領域のＮＳ３領域であることを限定するものである。
　本件発明５は，本件発明４の感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原が，遺伝子組換え技術による発現産物であることを限定するものである。
　本件発明６は，本件発明４の感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原が，合成ペプチドであることを限定するものである。
　本件発明７は，本件発明１の試薬が，担体を含み，該担体がビーズ，チューブ，プレート，赤血球，又はラテックス粒子であることを限定するものである。
　本件発明８は，本件発明１〜７の還元剤が，チオール基の酸化防止剤であることを特定するものである。
　本件発明９は，本件発明１〜７の還元剤がジチオスレイトール，ジチオエリスリトール，チオグリコール酸，システイン，グルタチオン，２−メルカプトエタノール，２−メルカプトエチルアミン及びこれらの混合物から成る群より選ばれる少なくとも一つであることを限定するものである。
　そして，上記限定を省いた，本件発明１が，前記「ア」に記載したとおり甲１発明と同一でない以上，本件発明２ないし９は，前記「ア」と同様の理由により，甲１発明であるとすることはできない。
　
（３）まとめ
　以上のとおり，本件発明１ないし９は，甲第１号証に記載された発明であるから特許法第２９条第１項第３号の規定により特許を受けることができないとすることはできない。
　
６　無効理由２について
　本件発明５は，本件発明４の感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原が，遺伝子組換え技術による発現産物であることを限定するものであり，本件発明６は，本件発明４の感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原が，合成ペプチドであることを限定するものである。
　そして，請求人の主張する無効理由２は，本件発明１ないし４が甲１発明と同一であるとした上で，上記限定事項は，甲第４ないし１０号証に記載されるように本件出願前の周知技術であったので，上記限定事項は容易に想到しうるとするものである。
　そうすると，上記「４」で記載したとおり，本件発明１ないし４が甲１発明と同一であるとすることができない以上，上記限定事項が周知技術であったとしても，本件発明５及び６が，甲１発明と甲第４ないし１０号証に記載される本件出願前の周知技術から容易になし得たものとすることはできない。
　
７　無効理由３について
（１）甲第２号証記載の先願発明
　甲第２号証の記載事項（特に(2j)(2g)(2h)）から，先願の明細書及び図面には，
「ニトロセルロース上にＨＣＶのＣＯＲＥ，３３ｃ，ｃ−１００をコーテイングしたテストカードであって，
　ＩｇＭアッセイで抗ＨＣＶに対して強く反応した５つの試料を，ジチオトレイトール（ＤＴＴ）と共に酢酸ナトリウム緩衝液中で，最終ＤＴＴ濃度１８ｍＭで，１５分間インキュベートすることにより還元剤処理し，ＨＣＶ抗原に対するＩｇＧ及びＩｇＭ特異的反応性について検査するのに使用する上記テストカード。」の発明（以下，「甲２発明」という。）が記載されていると認められる。　
　
（２）対比・判断
　ア　本件発明１について
　本件発明１と甲２発明とを比較する。
　（ア）甲２発明の「ＨＣＶのＣＯＲＥ，３３ｃ，ｃ−１００」をコーテイングしたテストカードであるから，「３３ｃ」をコーテイングしたテストカードを含んでいる。そして，本件明細書の記載から，本件発明１の「感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原」には，「３３Ｃ抗原」が含まれているといえることは，前記「４（２）（相違点アについて）」で記載したとおりである。
　（イ）甲２発明の「ニトロセルロース上にＨＣＶの」「３３ｃ」「をコーテイングしたテストカード」は，本件発明１の「固相化された該抗原含有試薬」に相当する。
　（ウ）甲２発明の「試料」，「ＨＣＶ抗原に対するＩｇＧ及びＩｇＭ」及び「特異的反応性について検査する」が，本件発明１の「検体」，「ＨＣＶ抗体」及び「免疫学的方法により測定する」に相当する。
　
　そうすると，両者の間には，以下の一致点及び相違点がある。
（一致点）
　検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するための３３Ｃ抗原含有試薬において，固相化された３３Ｃ抗原含有試薬であるＨＣＶ抗体測定用試薬である点。
　
（相違点ウ）
　本件発明１が，３３Ｃ抗原含有試薬に還元剤を含有せしめるか又は固相化された該抗原含有試薬を還元剤で処理せしめるのに対して，甲１発明は，ニトロセルロース上にＨＣＶの３３ｃをコーテイングする際に還元剤を含有させるものではなく，試料を最終ＤＴＴ濃度１８ｍＭ含有緩衝液中で，１５分間インキュベートすることにより還元剤処理し，これを検査するのに使用するテストカードである点。
　
　上記相違点について検討する。
　前記「第４　２」で記載したとおり，本件発明１の「ＨＣＶ抗体測定用試薬」は，検体と混合する前に還元剤を含有せしめるか又は還元剤で処理せしめることにより得られたものである。
　これに対して，甲第２号証には，ニトロセルロース上に抗原をコーティングする際に還元剤が用いられることは記載も示唆もない。そして，還元剤が添加されるのは，試料に対してであり，ニトロセルロース上にコーテイングされた抗体に還元剤が含有された試料が添加されるが，試薬と試料とを混合する前に還元剤を添加することは，記載されていないし示唆もされていない。
　したがって，本件発明１は甲２発明と同一であるとすることはできない。
　
　イ　本件発明２ないし９について
　本件発明２ないし９は，前記「４（２）イ」に記載したとおりの限定事項を有するものである。
　したがって，上記限定を省いた，本件発明１が，甲２発明と同一でない以上，本件発明２ないし９は，前記「７（２）ア」と同様の理由により，甲２発明と同一であるとすることはできない。
　
（３）まとめ
　以上のとおり，本件発明１ないし９は，甲２発明と同一であるから，特許法第１８４条の１３で読み替えて準用する特許法第２９条の２の規定により特許を受けることができないとすることはできない。
　
８　無効理由４について
（１）甲第３号証記載の先願発明
　甲第３号証の実施例９（上記(3d)）には「ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩおよびｃ３３ｃ遺伝子産物を実施例７のように精製した」と記載されており，ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩ同様にＣ３３ｃも遺伝子産物である以上，遺伝子産物の発現細胞から精製する必要があることは明らかであるところ，甲第３号証には，実施例７以外に，微粒子を被覆するために用いる抗原の精製法は記載されていないことから，ｃ３３ｃ遺伝子産物もＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩと同様にＧＳＴと融合された形で遺伝子産物を発現させ，その精製はグルタチオンアガロースビーズと還元型グルタチオンを用いて行うとするのが相当である。
　したがって，甲第３号証の記載事項（特に(3c)(3d)）から，先願の明細書及び図面には，
「ＨＣＶのＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩおよびｃ３３ｃ遺伝子産物を精製するために，遺伝子産物発現細胞を遠心によりペレット化し，ＭＴＰＢＳ（ＮａＣ１　１５０ｍＭ，Ｎａ２ＨＰＯ４　１６ｍＭ，ＮａＨ２ＰＯ４　４ｍＭ，Ｐｈ７．３）の１／５０または１／１００培養物体積中に再懸濁し，細胞を氷上で超音波処理によって溶解し，ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１％へ加え，溶解物を１０，０００×ｇで４℃において５分間遠心し，遠心の上清を洗浄し，ＭＴＰＢＳ中に希釈した５０％グルタチオンアガロースビーズと室温でローター上で混合し，吸着後，グルタチオンアガロースビーズを５００×ｇで２分間遠心によって集め，ペレットをＭＴＰＢＳで３回洗い，融合タンパクを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０中の還元型グルタチオン５ｍＭとの競合により，ビーズ体積に対して２×２分洗液を使用して溶出して精製した，ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩおよびＣ３３ｃウイルス遺伝子産物を，それぞれ常磁性微粒子と室温で一夜ゆっくり混合することによって被覆し，ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７．４）で遠心（５０００ｒｐｍ，５分）を使用して良く洗い，この抗原被覆常磁性粒子をＰＢＳ中０．０２５％（ｗ／ｖ）の濃度へ希釈して得られた，抗原被覆常磁性微粒子であって，前記ＰＢＳ中に希釈した抗原被覆常磁性微粒子と血清とをマイクロタータープレートのウエル中で混合して行う常磁性微粒子イムノアッセイに用いるＰＢＳ中に希釈した抗原被覆常磁性微粒子。」の発明（以下，「甲３発明」という。）が記載されていると認められる。
　
（２）対比・判断
　ア　本件発明１について
　本件発明１と甲３発明とを比較する。
　（ア）甲３発明の「精製した，ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩおよびＣ３３ｃウイルス遺伝子産物」のうち，「ｃ３３ｃウイルス遺伝子産物」は，甲第３号証の実施例９（上記(3d)）の冒頭に「ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩ融合タンパクを全長ｃ３３ｃタンパクの免疫感応性を常磁性微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＰイムノアッセイ）によって比較した。」と記載され，「全長ｃ３３ｃタンパクはｐＥＴ５ａシステム中の１６アミノ酸リーダー，Sｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３（１９８２）によって発現された。」と記載されていることから，全長「ｃ３３ｃ」抗原であることは，明らかといえる。
　そして，前記「５（２）ア（相違点アについて）」で記載したとおり，本件明細書の記載から，本件発明１の「感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原」には，「３３Ｃ抗原」が含まれているといえる。
　（イ）甲第３号証には，「ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩ」は，ｃ３３ｃフラグメントであり，１０２個のアミノ酸で構成され，ｃ３３ｃ抗原の免疫優性エピトープが全て含まれていることが記載されている（上記(3a)）。そして，本件明細書に記載されるように「感受性チオール基」は，抗原の活性に大きく影響するチオール基であることから，「ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩ」が「感受性チオール基」をもっている可能性は高といえるが，還元剤を処理した場合の感度が，処理しない場合に比べて有意に向上するか明らかでないため，「ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩ」が「感受性チオール基」をもっているかどうかは明らかでない。
　（ウ）甲３発明の「抗原被覆常磁性微粒子」は，抗原である「ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩ」又は「Ｃ３３ｃ」を被覆したものであるから，本件発明１の「固相化された該抗原含有試薬」に相当する。
　（エ）甲３発明の「血清」及び「常磁性微粒子イムノアッセイ」は，それぞれ本件発明１の「検体」及び「免疫学的方法により測定する」ことに相当する。また，甲３発明の「常磁性微粒子イムノアッセイ」は，ＨＣＶ抗体を測定するためのものであることは，血清と反応させる抗原がＨＣＶ抗原であることから明らかである。
　
　したがって，両者の間には，以下の一致点及び相違点がある。
（一致点）
　検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するための３３Ｃ抗原含有試薬において，固相化された３３Ｃ抗原含有試薬であるＨＣＶ抗体測定用試薬である点。
　
（相違点エ）
　本件発明１が，３３Ｃ抗原含有試薬に還元剤を含有せしめるか又は固相化された該抗原含有試薬を還元剤で処理せしめるのに対して，甲３発明はＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩおよびＣ３３ｃ遺伝子産物を精製する工程で還元型グルタチオンが添加されることから，精製されたＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩおよびＣ３３ｃ遺伝子産物溶液中に還元型グルタチオンが含有されているといえ，常磁性微粒はこの溶液中に混合されることから，常磁性微粒を抗原で被覆する際に還元型グルタチオンが溶液中に存在していることになるが，被覆後，還元剤を含有しないＰＢＳで良く洗い，還元剤を含有しないＰＢＳ中に希釈したものである点。
　
　そこで，上記相違点について検討する。
　甲３発明は，常磁性微粒，つまり固相を，Ｃ３３ｃ抗原，ＧＳＴ−ＢａｎII／ＥｃｏＲＩ抗原でそれぞれ被覆する際に還元型グルタチオンが溶液中に存在しているといえ，被覆の際は抗原のチオール基は還元剤で保護されていると考えられる。しかしながら，甲３発明は，常磁性粒子を抗原で被覆した後，還元剤を含有しないＰＢＳ中で良く洗っている。そして，還元型グルタチオンは，グルタミン酸，システイン，グリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり，水に良く溶ける性質であるから（「化学大辞典」東京化学同人　１９９８年第１版第５刷，「化学大辞典」共立出版　１９９３年縮刷版第３４刷，グルタチオンの欄参照）ＰＢＳ中で良く洗うことにより抗原被覆常磁性粒子から還元型グルタチオンは除去されるといえる。なお，通常，ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンアガロースビーズを用いて精製する場合，溶出されたＧＳＴ融合タンパク質含有液中の還元型グルタチオンを除去するために透析等の処理を行うが，甲３発明では，ＧＣＴ融合抗原が常磁微粒子に被覆されていることから，透析膜を用いることなく，洗浄により抗原を失うことなく還元型グルタチオンを除去できるといえる。
　このように，常磁性微粒子を被覆する際には，溶液中に還元剤が含有されているものの，その後還元剤は除去され，還元剤を含有しないＰＢＳ中に希釈し試薬となっていることから，甲３発明は，本件発明１の「固相化された該抗原含有試薬を還元剤で処理せしめる」構成を有しているとすることはできない。
　したがって，本件発明１は，甲３発明と同一であるとすることはできない。
　
　イ　本件発明２ないし９について
　　本件発明２ないし９は，前記「４（２）イ」に記載したとおりの限定事項を有するものである。
　したがって，上記限定を省いた，本件発明１が，甲１発明と同一でない以上，本件発明２ないし９は，前記「８（２）ア」と同様の理由により，甲１発明と同一であるとすることはできない。
　
（３）まとめ
　以上のとおり，本件発明１ないし９は，甲３発明と同一であるから特許法第１８４条の１３で読み替えて準用する特許法第２９条の２の規定により特許を受けることができないとすることはできない。
　
９　無効理由５について
（１）甲第１号証記載の発明
　上記「４（１）」に記載したとおりのものである。
　
（２）甲第４号証記載の発明
「Ａｃ３１６に感染させたＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒ細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し，５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）／０．１ｍＭジチオスレイトール（１ｍｌあたり１００μｌのフェニルメチルスルフォニルクロリドを含む）で超音波処理を施しな溶解し，１０，０００×ｇで遠心分離した後，その上清に対して硫酸アンモニウムを３３％飽和溶液となるように添加することで分画し，遠心分離により沈殿を回収し，超音波処理を施しながら２ｍｌのＰＢＳに溶解して，部分精製されたＨＣＶコアタンパク質を調製し，次いで，ＥＬＩＳＡプレートのウエルを，ＰＢＳにより１：５０に希釈した，上記精製されたＨＣＶコアタンパク質含有ＰＢＳ溶液１００μｌにより被覆し，２５％ブロックエースを含むＰＢＳによりブロッキングした，ＨＣＶ感染の血清診断用ＥＬＩＳＡプレート」（以下，「甲４発明」という。）
　
（３）甲第１１号証記載の発明
「Ｓ−セファロース上でのクロマトグラフィーから得たＳＯＤ−Ｃ３３ｃを含有するプールされた画分を，緩衝液Ｂ（０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１４ｍＭ　ＢＭＥ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で平衡化したＱ−セファロースカラムを，緩衝液Ｂ中のＮａＣｌ０．０から０．４Ｍのグラジェントで溶出させ精製したＳＯＤ−Ｃ３３ｃを得，０．１２５Ｍ　Ｎａホウ酸緩衝液，ｐＨ８．３，０．０７５Ｍ　ＮａＣ１（ＢＢＳ）中に０．１から０．５μｇの前記精製したＳＯＤ−Ｃ３３ｃを含有する標本を，マイクロタイタープレートの各ウェルに添加し，プレートを一晩インキュベートし，その後，ＨＣＶ抗原液を除去し，ウェルを０．０２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ＢＢＳＴ）を含有するＢＢＳで３回洗浄し，非特異的結合を阻害するため，ＢＢＳ中のＢＳＡ溶液を１００μｍ添加し，続いて室温でインキュベートして，このインキュベーションの後ＢＳＡ溶液を除去することにより，ウェルをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で被覆して得られたマイクロタイタープレートであり，被覆されたウェル中の抗原を供給血液から採取した血清と反応させ，血清中のＨＣＶに対する抗体を検出するためのマイクロタイタープレート」
　
（４）甲１発明，甲４発明及び甲１１発明から把握できる発明
　甲１，甲４及び甲１１発明で固相化する抗原はいずれもＨＣＶ抗原である。そして，ＨＣＶ抗原を固相化したいずれのプレートも，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬であり，ＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するのに用いるものである。
　したがって，甲１，甲４及び甲１１発明を総合すると以下の発明は本件出願前の周知技術であったといえる。
「検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するためのＨＣＶ抗原含有試薬において，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬であるＨＣＶ抗体測定用試薬」（以下，「周知発明」という。）
　
（５）対比・判断
　ア　本件発明１について
　本件発明１と周知発明とを比較すると，両者は，検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するためのＨＣＶ抗原含有試薬において，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬であるＨＣＶ抗体測定用試薬である点で一致し，以下の点で相違する。
　
（相違点オ）
　ＨＣＶ抗原が，本件発明１では，感受性チオール基をもつものであるのに対して，周知発明は，ＨＣＶ抗原全般を意味するものである点。
　
（相違点カ）
　本件発明１は，ＨＣＶ抗原含有試薬に還元剤を含有せしめるか又は固相化された該抗原含有試薬を還元剤で処理せしめるのに対して，周知発明は，固相化されたＨＣＶ抗原含有試薬を還元剤で処理せしめるものではない点。
　
　そこで，上記各相違点について検討する。
（相違点オについて）
　本件明細書段落【０００２】に「【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染を診断する方法としては，１９８８年に米国カイロン社よりＨＣＶゲノム上の非構造領域であるＮＳ３およびＮＳ４領域にコードされるＣ１００−３抗原を使用したＨＣＶ抗体測定系が開発された。１９９１年には，ＨＣＶゲノム上の構造領域であるコア領域およびＣ１００ー３抗原とは重複しないＮＳ３領域にコードされるコア抗原およひ３３Ｃ抗原の使用により更に感度および検出率の優れたＨＣＶ抗体測定系が開発された。」と記載され，また，３３Ｃ抗原は，甲第１１号証で検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するために用いられ，さらに，甲第１２号証には，「ダイナボット社ではHCVの３種のリコンビナント抗原（ｐHCV-34，c100-3，ｐHCV-31）を用いた第二世代のHCV関連抗体測定系を開発した。」，「ｐHCV-31抗原はNC-3の33cおよびNS-4のc100-3の一部であるBCDに相当する。」と記載されていることから，３３Ｃ抗原は，検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法により測定するために用いられる抗原として，本件出願前に周知のものであったといえる。
　そして，前記「５（２）ア（相違点アについて）」で記載したとおり，本件明細書の記載から，本件発明１の「感受性チオール基をもつＨＣＶ抗原」には，「３３Ｃ抗原」が含まれているといえる。
　そうすると，周知発明において，ＨＣＶ抗原として，３３Ｃ抗原を採用することに格別の困難性があるとすることはできない。
　
（相違点カについて）
（ア）まず，甲各号証の還元剤の使用について検討する。
　ａ　甲第１号証には，抗原抗体反応後に標識となるプローブ部分に対して作用させるために反応系に還元剤を添加することが記載され，甲第４号証及び甲第１１号証には，抗原の精製工程で還元剤が用いられることが記載されているが，いずれも抗原試薬に還元剤を含有させ又は固相化抗原試薬を還元剤で処理するものではなく，このような還元剤の使用については記載も示唆もされていない。
　ｂ　甲第１３号証に，鼻洗浄試料中の抗原を暴露するために粘膜及び細胞膜のジスルフィド結合を還元できる還元剤で試料を処理することにより，インフルエンザウイルスの測定のＥＩＡの効率が改善することが記載され，
　甲第１４号証には，ヒト血液抽出物等から末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を抽出する際に還元剤を含有した抽出液を用いることが記載され，
　甲第１５号証には，試料中に存在するクラミジア・トラコマティスの抗原を露出させるために還元剤を用いることが記載され，
　甲第１７号証には，クラミジア属の細菌の主要外膜タンパク質がジスルフィド結合により互いに結合しているので，これを検出する場合は，還元剤で処理することが有利であること記載され，
　甲第２３号証には，クラミジア・トラコマティス抗原の検出のために，当菌培地に還元剤を添加することで感度が向上することが記載され，
　甲第３２号証には，試料を還元剤で処理してＨＣＶのコア抗原の抗原決定基を暴露することが記載され，
　甲第３３号証には，外生のタンパク質を可溶化し，クラミジア菌または淋菌から抗原を抽出するのに，還元剤を用いることが記載され，
　上記甲各号証の記載から，細菌や細胞試料を還元剤で処理して抗原を露出させ，抗体との反応を促進することは，本件出願前の周知技術といえる。
　ｃ　甲第２０号証には，クレアチンキナーゼのアイソザイムの測定において，還元剤を含有する緩衝液を用いてアイソザイムのスルフヒドリル基，つまりチオール基を保護することが記載され，
　甲第２４号証には，還元剤が，遊離ＳＨ基が活性の発現に必要な酵素タンパク質のＳＨ基を保護，安定化することが記載され，
　甲第２５号証には，ゲル濾過において，酵素の安定化のために還元剤を添加することが記載され，
　上記甲各号証に記載から，遊離ＳＨ基が活性の発現に必要な酵素の安定化のために還元剤を添加することは，本検出前の周知技術といえる。
　ｄ　甲第１８号証には，抗Ａ型インフルエンザ抗体を含む溶液を還元剤含有緩衝液で調製し，メンブレン上に固相化したＡ型インフルエンザ抗原と反応させることが記載され，
　甲第１９号証には，標識チロキシン抗チロキシン抗体を用いてたチロキシン測定用の緩衝液中であって，還元剤が含有されたものが記載され，
　甲第３１号証には，マラリア原虫感染動物血清をマラリア抗原コーテイングヒツジ赤血球で検出する場合，マラリア原虫感染動物血清を還元剤で処理すると，タイターの増加つまり，感度が向上することが記載され，
　甲第３４号証には，プロトロンビンで被覆したマイクロタイタープレートを用いて抗プロトロンビンを測定する際に，抗体添加後，還元剤含有緩衝液で洗浄し，また標識酵素の基質溶液中に還元剤を含有させることが記載され，
　甲第３５号証には，非Ａ非Ｂ肝炎抗原に，抗体含有血清と補体を添加しインキュベート後，還元剤を添加し，赤血球を加えて凝集パターンから抗原の力価を求めることが記載され，
　上記甲各号証の記載から，免疫測定系において，還元剤が添加される系があることも周知である。しかしながら，還元剤を添加せずに分析を行う場合が多いことにも注意を向ける必要がある。例えば，Ｃ型肝炎ウイルスの免疫アッセイについてみても，国際公開第９２／１３２７５号，特開平４−２３２４６５号公報，特開平４−９９７９９号公報，特開平４−１２１１９２号公報（いずれも実施例を参照）に記載されるとおり，還元剤を用いることなく分析を行うことも通常行われているのであり，免疫測定系一般において還元剤を添加することが周知技術であったということはできない。
　ｅ　甲第３０号証には，アルデヒド化合物を用いて不溶性支持体を抗原，抗体等の特異的結合性タンパク質でコーティングする際，還元剤を添加することにより，コーテイング溶液の免疫反応性が増大することが記載され，効果のメカニズムは知られていないとした上で，特異結合性タンパク質の酸化が防止されることによるものと思われると記載されている。一方で，実施例は，いずれも，抗血清，つまり抗体を不溶性支持体にコーテイングすることが記載され，コーテイング効率が増大すること，抗原との結合率が増大することが記載されているから，還元剤の添加目的は，アルデヒドを用いた固相への抗体の結合における抗体の安定化であり，還元剤が作用するものは抗体といえる。
（イ）一方，３３Ｃ抗原は周知の抗原といえるものの，この抗原がもつチオール基が抗原の活性に大きく影響を与える「感受性のチオール基」であることは，本件明細書と鑑定書である乙第５号証で示された実験結果によって確認して知り得たことであり，「感受性のチオール基をもつＨＣＶ抗原」について記載或いは示唆した，本件出願前に頒布された証拠はない。
　さらに，上記ｄに記載したとおり，チオール基が酸化されない状態でいることで安定性を保持する酵素に対して還元剤を添加して安定化することは周知であり，また，上記ｅに記載したとおり，アルデヒドを用いた抗原，抗体等の特異結合性タンパク質の固相化において，還元剤の添加により免疫反応性が増大することが知られていたとしても，一般に，抗原がチオール基をもっていても，そのチオール基が抗原活性に大きく影響するものであるかどうかは，抗原の種類により異なるというべきであり，３３Ｃ抗原のチオール基が「感受性チオール基」であることが，上記周知技術から，本件出願前に自明であるということもできない。
　また，甲第３号証にも記載されるように，３３Ｃ抗原は遺伝子組換えで作製され精製されたものであるから，上記ｃに記載した周知技術のように抗原の露出が必要なものではない。
　そうすると，上記甲各号証に記載された周知技術を考慮しても，３３Ｃ抗原含有試薬に還元剤を添加せしめ又は固相化された３３Ｃ抗原含有試薬を還元剤で処理する動機付けを見出すことはできず，周知発明において，ＨＣＶ抗原として周知の３３Ｃ抗原を選択することは，上記のとおり困難性があるとはいえないものの，固相化された３３Ｃ抗原を還元剤で処理することは，当業者が容易になし得たことであるとすることはできない。
　
　イ　本件発明２ないし９について
　　本件発明２ないし９は，前記「４（２）イ」に記載したとおりの限定事項を有するものである。
　したがって，上記限定を省いた，本件発明１が，前記「９（５）ア」に記載したとおり，甲１，４，１１発明から把握できる周知発明，及び周知技術から，当業者が容易に発明できたものでない以上，本件発明２ないし９は，前記「９（５）ア」と同様の理由により，甲１，４，１１発明から把握できる周知発明，及び周知技術から，当業者が容易に発明できたものとすることはできない。
　
（６）まとめ
　したがって，本件請求項１ないし９に係る発明は，甲第１，４及び１１号証に記載された先行技術並及び周知技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないとすることはできない。
　
第５　むすび
　以上のとおり，本件請求項１ないし９に係る発明についての特許は，特許法第２９条第１項，同第２項の規定，または特許法第２９条の２の規定に違反してなされたものであるから，特許法第１２３条第１項第２号に該当し無効とすべきものであるとすることはできない。
　また，審判に関する費用については，特許法第１６９条第２項で準用する民事訴訟法第６１条の規定により，請求人が負担すべきものとする。
　よって，結論のとおり審決する。