(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキアミの水または熱水による抽出物を有効成分とする、レプチン分泌の促進作用に基づく摂食抑制作用によるものではない体重増加抑制剤（但し食品用途を除く）。
【請求項２】
オキアミの水または熱水による抽出物を有効成分とする、レプチン分泌の促進作用に基づく摂食抑制作用によるものではない抗肥満剤（但し食品用途を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキアミの水溶性抽出物の薬理用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
オキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａｃｅａ）は、養殖魚のエサや釣りのエサなどとして利用されている海洋生物であることは周知の通りである。その食用資源としての価値は今のところそれほど注目されてはいないが、オキアミの一種であるツノナシオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ）は、三陸地方ではイサダと呼ばれ、食用として馴染み深い。
【０００３】
近年、海洋生物に含まれる成分が持つ薬理作用についての関心が高まっている。オキアミについても、特許文献１において、そのエタノール抽出物が、摂食抑制に関わる因子の一つであるレプチンの脂肪細胞からの分泌促進作用に基づいて肥満の予防や治療に有効であると提案されている。しかしながら、特許文献１においては、オキアミのエタノール抽出物がインビボ実験において体重増加抑制作用などを持つことは確認されておらず、その有用性は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２３９５００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、オキアミに含まれる新規な成分が有する薬理用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、オキアミの水溶性抽出物が、脂肪細胞の分化に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子の発現抑制作用、脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用、体重増加抑制作用を持ち、肥満の予防や治療に有効であることを見出した。
【０００７】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、オキアミの水または熱水による抽出物を有効成分とする、レプチン分泌の促進作用に基づく摂食抑制作用によるものではない体重増加抑制剤である（但し食品用途を除く）。
また、本発明は、請求項２記載の通り、オキアミの水または熱水による抽出物を有効成分とする、レプチン分泌の促進作用に基づく摂食抑制作用によるものではない抗肥満剤である（但し食品用途を除く）。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、オキアミに含まれる新規な成分が有する薬理用途として、オキアミの水溶性抽出物を有効成分とする抗肥満剤を提供することができる。本発明のオキアミの水溶性抽出物と特許文献１に記載のオキアミのエタノール抽出物は、肥満の予防や治療を目的とする有効成分である点において共通する。しかしながら、特許文献１に記載のオキアミのエタノール抽出物は、レプチンが持つ摂食抑制作用などによって効果を期待するものであるのに対し、本発明のオキアミの水溶性抽出物は、後述する実施例から明らかなようにレプチン分泌促進作用を持たないことから、その効果はレプチンが持つ摂食抑制作用などによるものではない。従って、本発明のオキアミの水溶性抽出物と特許文献１に記載のオキアミのエタノール抽出物は、成分的にも作用的にも全く異なるものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１におけるオキアミの水溶性抽出物のＰＰＡＲγ遺伝子の発現抑制作用を示すグラフである。
【図２】同、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現抑制作用を示すグラフである。
【図３】同、脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用を示す写真である。
【図４】同、マウスの体重増加抑制作用を示すグラフである。
【図５】実施例１における各群のマウスの１８週間における１日あたりの平均摂餌量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、ＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）は、核内受容体型の転写調節因子として機能するタンパク質であって、脂肪細胞の分化において中心的役割を果たしていることが知られており、Ｃ／ＥＢＰαは、ロイシンジッパー型転写因子として機能するタンパク質であって、ＰＰＡＲγとともに脂肪細胞の分化のマスターレギュレーターであることが知られている（ＰＰＡＲγとＣ／ＥＢＰαについては必要であれば例えばＳｔｅｐｈａｎｅ  Ｇｅｓｔａ，Ｙｕ−Ｈｕａ  Ｔｅｓｎｇ，Ｃ．Ｒｏｎａｌｄ  Ｋａｈｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  Ｆａｔ：Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｔｏ  Ｉｔｓ  Ｓｏｕｒｃｅ．Ｃｅｌｌ  １３１：２４２−２５６（２００７）を参照のこと）。オキアミの水溶性抽出物は、これらのタンパク質をコードする遺伝子の発現抑制作用を持つので、脂肪細胞の分化を抑制することによる抗肥満効果を期待することができる。また、オキアミの水溶性抽出物は、脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用や体重増加抑制作用を持つ。
【００１１】
オキアミの水溶性抽出物は、例えば、オキアミに水や湯を加えてホモジナイズし、得られたペースト状物を遠心分離することで得られる上清や、上清をろ過することで得られるろ液として得ることができる。こうして得られた液状の水溶性抽出物は、そのまま液状物として用いてもよいし、乾燥や濃縮を行って固形物や半固形物や粉末などにして用いてもよい。また、上記のようにして得られた液状の水溶性抽出物をさらにゲルろ過やイオンクロマトグラフィーなどによって精製し、得られた画分を水溶性抽出物として用いてもよい。なお、原料として用いるオキアミは特に限定されるものではなく、三陸地方でイサダと呼ばれているツノナシオキアミの他、ナンキョクオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ  ｓｕｐｅｒｂａ）などであってもよい。オキアミは生のものを用いてもよいし、凍結したものを用いてもよい。また、オキアミの乾物や塩蔵物を用いてもよい。
【００１２】
本発明におけるオキアミの水溶性抽出物は、例えば、健康食品やサプリメントなどを含む飲食品や医薬品などの形態で人体に対して経口的に投与することができる。これらの形態における製剤組成は特に限定されるものではなく、自体公知の一般的なものを採用することができる。その投与量は、適用対象者の年齢や性別、症状の程度などに基づいて適宜決定することができ、適切な投与量を投与することにより、ヒトに対して抗肥満効果をもたらすことができる。また、オキアミの水溶性抽出物は、ウシやブタなどの家畜やニワトリなどの家禽の飼料、イヌやネコなどのペットフードといった動物用餌に添加し、これらの動物に対する肥満の予防や治療のための有効成分として用いてもよい。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１４】
実施例１：
（１）オキアミの水溶性抽出物の調製
三陸地方で漁獲されたイサダ（ツノナシオキアミ）の真空冷凍パック（−２５℃凍結保存）１３ｋｇ分を、パックのままボイル加熱して解凍した後、解凍されたイサダに蒸留水を添加し（重量比でイサダ３に対して１の割合）、カッターミキサーを用いて５分間ホモジナイズしてペースト状物を得た。得られたペースト状物を８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた上清をろ紙（５Ａ）を用いてろ過することで、約９Ｌの薄黄色のろ液をオキアミの水溶性抽出物として得た。また、このろ液に対して凍結乾燥を行った後、得られた凍結乾燥物を粉砕することで、オキアミの水溶性抽出物の薄赤色の粉末を得た。
【００１５】
（２）オキアミの水溶性抽出物のＰＰＡＲγ遺伝子およびＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現抑制作用
（実験方法）
タイプＩコラーゲンコートされた２４穴培養プレート（コーニング社）に、１穴あたり１×１０５個のマウス脂肪前駆細胞：３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ（ＤＳファーマバイオメディカル社）を加え、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン社）および１０μｇ／ｍＬウシインスリン（シグマ社）を含むダルベッコ変法イーグル培地（インビトロジェン社）で９日間培養し、脂肪細胞へ分化誘導した。培養開始７日後の細胞よりＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡを鋳型にしてＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（タカラ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。４ｎｇのｃＤＮＡに、フォワードプライマーとリバースプライマーをそれぞれ２μＭずつとＦａｓｔ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を加え、ＳｔｅｐＯｎｅ  ｐｌｕｓ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ＰＰＡＲγ遺伝子の定量的ＰＣＲを行った。また、同様にして、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の定量的ＰＣＲを行った。得られたデータはＲＰＬＰ０遺伝子の定量的ＰＣＲのデータでノーマライズを行い、分化誘導前の３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞に対するｍＲＮＡの相対的発現量をΔΔＣＴ法にて算出し、遺伝子発現の指標とした。なお、ＲＮＡ精製、ｃＤＮＡ合成、定量的ＰＣＲはキット付属の使用説明書の記載に従って行った。ＰＰＡＲγ遺伝子の定量的ＰＣＲは、配列番号１で示されるフォワードプライマー：５’−ＴＧＣＣＴＴＣＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＣＣ−３’と配列番号２で示されるリバースプライマー：５’−ＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡ−３’を用いて行った。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の定量的ＰＣＲは、配列番号３で示されるフォワードプライマー：５’−ＣＣＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＣＧＧＣ−３’と配列番号４で示されるリバースプライマー：５’−ＧＡＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣ−３’を用いて行った。ＲＰＬＰ０遺伝子の定量的ＰＣＲは、配列番号５で示されるフォワードプライマー：５’−ＴＴＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＡＡＡ−３’と配列番号６で示されるリバースプライマー：５’−ＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡ−３’を用いて行った。
【００１６】
（実験結果）
培地に、（１）で得たオキアミの水溶性抽出物の粉末を５００μｇ／ｍＬの濃度で加えて培養を行った場合と、コントロールとして同容量のリン酸緩衝生理食塩水を加えて培養を行った場合のそれぞれにおけるＰＰＡＲγ遺伝子の発現結果を図１に、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現結果を図２にそれぞれ示す（縦軸は脂肪細胞への分化誘導前（ｄａｙ０）の細胞における発現量を１とした時の相対値）。図１と図２から明らかなように、培地にオキアミの水溶性抽出物を加えて培養を行った場合（インスリン＋イサダ）、リン酸緩衝生理食塩水を加えて培養を行った場合（インスリン）に比較して、ＰＰＡＲγ遺伝子およびＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現が顕著に抑制されたことから、オキアミの水溶性抽出物は、脂肪細胞の分化を抑制することによる抗肥満効果が期待できることがわかった。
【００１７】
（３）オキアミの水溶性抽出物の脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用
（実験方法）
（２）と同様の方法で３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞を９日間培養し、脂肪細胞へ分化誘導した。培養開始９日後の細胞をリン酸緩衝液で１度洗浄した後、１０％ホルマリン溶液（シグマ社）を加え室温で１０分間固定した。固定した細胞をリン酸緩衝液で２度洗浄した後、蒸留水で６０％に希釈したイソプロパノールを加え、１度洗浄した。その後、１８０ｍｇ／ｍＬのＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（シグマ社）染色液を加え、室温で４０分間染色した。染色後の細胞を６０％イソプロパノールで１度、リン酸緩衝液で２度洗浄し、倒立顕微鏡（ニコン社）を用い、４００倍の倍率で観察した。
【００１８】
（実験結果）
培地に、（１）で得たオキアミの水溶性抽出物の粉末を５００μｇ／ｍＬの濃度で加えて培養を行った場合と、コントロールとして同容量のリン酸緩衝生理食塩水を加えて培養を行った場合のそれぞれにおける脂肪細胞のＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色像を図３に示す。図３から明らかなように、培地にオキアミの水溶性抽出物を加えて培養を行った場合（Ｂ）、リン酸緩衝生理食塩水を加えて培養を行った場合（Ａ）に比較して、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏによって染色されるトリグリセリドを蓄積した脂肪細胞の数は顕著に少ないことから、オキアミの水溶性抽出物は、脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用を持つことがわかった。
【００１９】
（４）オキアミの水溶性抽出物の体重増加抑制作用
（実験方法）
４週齢のＣ５７ＢＬ／６系統雄性マウス（日本チャールズリバー社）を実験動物として用いた。マウスを、（ａ）通常餌であるＲｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔｓ  ｗｉｔｈ  １０ｋｃａｌ％  Ｆａｔ（リサーチダイエット社）を摂取させる群：１０％ｆａｔ、（ｂ）通常餌に（１）で得たオキアミの水溶性抽出物の粉末を１％添加した餌を摂取させる群：１０％ｆａｔ＋１％イサダ、（ｃ）高脂肪餌であるＲｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ４５ｋｃａｌ％  Ｆａｔ（リサーチダイエット社）を摂取させる群：４５％ｆａｔ、（ｄ）高脂肪餌に（１）で得たオキアミの水溶性抽出物の粉末を１％添加した餌を摂取させる群：４５％ｆａｔ＋１％イサダ、に分けて飼育を行い（各群５匹）、３日ごとにマウスの体重と餌の摂取量を測定した。また、実験開始から１８週後の各群のマウスの心臓から採血を行い、４℃において１２００ｇで１０分間遠心分離を行うことで得た上清（血清）中のレプチン濃度を、森永生科学研究所社のレプチン測定キットを用いて測定した。
【００２０】
（実験結果）
実験開始から１８週間における、各群のマウスの体重増加率（縦軸は実験開始時の体重を１とした時の相対値）を図４に、各群のマウスの１日あたりの平均摂餌量（摂取カロリー）を図５にそれぞれ示す。また、実験開始から１８週後の各群のマウスの血清中のレプチン濃度を表１に示す。図４から明らかなように、通常餌を摂取させた場合でも高脂肪餌を摂取させた場合でも、オキアミの水溶性抽出物を添加することで、体重増加が抑制されたが（ａ群対ｂ群、ｃ群対ｄ群）、体重増加の抑制効果は、通常餌を摂取させた場合よりも高脂肪餌を摂取させた場合の方が優れていたことから、オキアミの水溶性抽出物は、とりわけ高脂肪食摂取下での体重増加の抑制に有効であることがわかった。また、図５から明らかなように、通常餌を摂取させた場合でも高脂肪餌を摂取させた場合でも、オキアミの水溶性抽出物を添加したことによる摂餌量の顕著な低下は認められなかった。さらに、表１から明らかなように、通常餌を摂取させた場合に対して高脂肪餌を摂取させた場合において有意に上昇した血清中のレプチン濃度は、高脂肪餌にオキアミの水溶性抽出物を添加することによって有意に低下した。また、通常餌にオキアミの水溶性抽出物を添加することによって、血清中のレプチン濃度は低下する傾向にあった。以上の結果から、オキアミの水溶性抽出物が持つ体重増加抑制作用は、レプチン分泌の促進作用に基づく摂食抑制作用などによるものではないことがわかった。
【００２１】
【表１】
0005998312.tif 000002
【００２２】
実施例２：
実施例１の（１）と同様にして得たナンキョクオキアミの水溶性抽出物も、程度の違いはあるが、実施例１の（２）と（３）の作用を持っていた。
【００２３】
比較例１：
クロロホルムとメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ１：２）を用いて得たオキアミの脂溶性抽出物は、実施例１の（２）と（３）の作用を持っていなかった。
【００２４】
製剤例１：錠剤
以下の成分組成からなる肥満の予防や治療のための錠剤を自体公知の方法で製造した。
実施例１で得たオキアミの水溶性抽出物の粉末    １
乳糖                                        ８０
ステアリン酸マグネシウム                    １９（単位：重量％）
【００２５】
製剤例２：ビスケット
以下の成分組成からなる肥満の予防や治療のためのビスケットを自体公知の方法で製造した。
実施例１で得たオキアミの水溶性抽出物の粉末    １
薄力粉                                      ３２
全卵                                        １６
バター                                      １６
砂糖                                        ２４
水                                          １０
ベーキングパウダー                            １（単位：重量％）
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は、オキアミに含まれる新規な成分が有する薬理用途として、オキアミの水溶性抽出物を有効成分とする抗肥満剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
0005998312.tif 000003
【図２】
0005998312.tif 000004
【図３】
0005998312.tif 000005
【図４】
0005998312.tif 000006
【図５】
0005998312.tif 000007
【配列表】
0005998312000001.app