(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性の皮膚性状を治療するための局所用薬剤であって、
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＰＢＭＣ増殖性物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない細胞培養培地または血清中で少なくとも１時間培養することによって得られる細胞培養培地または血清の上清を包含し、かつ、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を包含しない薬剤。
【請求項２】
上記性状が、虚血に関連する性状であることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
上記性状が、創傷、組織の虚血、慢性の創傷、糖尿病性の創傷、皮膚潰瘍、皮膚の熱傷、および形成手術における皮膚の皮弁からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
上記細胞培養培地が、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｘ−ｖｉｖｏ（商標）、およびウルトラカルチャー（商標）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
上記ＰＢＭＣが、ストレスを誘発する条件の下で培養されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
上記ストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧、ｐＨの変化、またはこれらの組み合わせが含まれることを特徴とする、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
上記ＰＢＭＣが、培養中に少なくとも１０Ｇｙの放射線、オゾン、高温、またはＵＶ線によってストレスを与えられることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項８】
上記ＰＢＭＣが、培養中に少なくとも２０Ｇｙの放射線、オゾン、高温、またはＵＶ線によってストレスを与えられることを特徴とする、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
上記ＰＢＭＣが、培養中に少なくとも４０Ｇｙの放射線、オゾン、高温、またはＵＶ線によってストレスを与えられることを特徴とする、請求項７または８に記載の薬剤。
【請求項１０】
上記薬剤が、ゲル、軟膏、皮膚パッチ、薬学的に許容可能なマトリクス、ペースト、クリーム、粉末、リニメント剤、またはローションとして提供されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１１】
上記ゲルが、ハイドロゲルであることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
上記薬学的に許容可能なマトリクスが、コラーゲン／エラスチンのマトリクスの上であることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１３】
上記上清が凍結乾燥されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１４】
上記ＰＢＭＣが、上記細胞培養培地または血清中で少なくとも４時間培養されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１５】
上記ＰＢＭＣが、上記細胞培養培地または血清中で少なくとも６時間培養されることを特徴とする、請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
上記ＰＢＭＣが、上記細胞培養培地または血清中で少なくとも１２時間培養されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の薬剤。
【請求項１７】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＰＢＭＣ増殖性物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない細胞培養培地または血清中で少なくとも１時間培養することによって得られる細胞培養培地または血清の上清を包含し、かつ、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を包含しない、炎症性の皮膚性状を治療するための局所用薬剤を、炎症性の皮膚性状を治療するための薬物の製造の用途に用いる使用方法。
【請求項１８】
上記性状が、虚血に関連する性状であることを特徴とする、請求項１７に記載の使用方法。
【請求項１９】
炎症性の皮膚性状を治療するための、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を包含しない局所用薬剤を調製する方法であって、
ａ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を準備するステップと、
ｂ）ステップａ）のＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ増殖性物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない細胞培養培地または血清中で少なくとも１時間培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）の上清を単離するステップと、
ｄ）ステップｃ）の上清を用いて上記薬剤を調製するステップとを含む、方法。
【請求項２０】
ステップｂ）の前またはステップｂ）の途中で、上記ＰＢＭＣがストレスを誘発する条件に曝され、
このストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧、ｐＨの変化、またはこれらの組み合わせが含まれることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｂ）の前またはステップｂ）の途中で、上記ＰＢＭＣが、少なくとも１０Ｇｙの放射線、オゾン、高温、またはＵＶ線に曝露されることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップｂ）の前またはステップｂ）の途中で、上記ＰＢＭＣが、少なくとも２０Ｇｙの放射線、オゾン、高温、またはＵＶ線に曝露されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップｂ）の前またはステップｂ）の途中で、上記ＰＢＭＣが、少なくとも４０Ｇｙの放射線、オゾン、高温、またはＵＶ線に曝露されることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１９、２１、２２または２３に記載の方法によって得られる薬剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、内部炎症性の皮膚性状、好ましくは虚血に関連する内部性皮膚性状を治療するための薬剤に関する。
【０００２】
低酸素症、つまり酸素が減少した状態は、肺が易感染性になると、または血流が低下すると発生し得る。虚血、つまり血流の減少は、血餅（血栓）もしくは任意の外来性の循環物質による動脈もしくは静脈の閉塞（塞栓）によって、または血管障害（例えば粥状動脈硬化）によって引き起こされる可能性がある。血流の減少は、突然発症して持続期間が短い（急性の虚血）こともあれば、発症が遅く持続期間が長いまたは頻繁に再発（慢性の虚血）することもある。急性の虚血は、局所的で不可逆的な組織の壊死（梗塞）に関係していることが多い。一方で、慢性の虚血は通常一過性の低酸素性の組織傷害に関係する。ただし灌流の減少が長引く、あるいは重篤であると、慢性の虚血は梗塞にも関係する。梗塞は脾臓、腎臓、肺、脳、および心臓においてよく発生し、例えば腸梗塞、肺梗塞、虚血発作、心筋梗塞などの障害を引き起こす。
【０００３】
虚血性障害における病理的な変化は、虚血の持続期間および重症度ならびに患者の生存期間に依存する。壊死は梗塞内部で最初の２４時間以内に確認できる。また、急性の炎症反応は梗塞に隣接する生存組織中で発達し、白血球は死組織の領域に移動する。これに続く数日の間に、細胞が、梗塞内で貪食およびコラーゲンの瘢痕または神経膠瘢痕との置換によって、徐々に分解および除去される。
【０００４】
１つの器官における低灌流または梗塞が、他の器官に影響を及ぼすことが多い。一例として、例えば肺塞栓症によって引き起こされる肺の虚血は、肺に影響するだけではなく、心臓やその他の器官（例えば脳）をも低酸素性ストレス下におく。心筋梗塞は、血栓症、動脈壁痙攣、または心臓のウイルス感染症に起因する冠動脈の閉塞をともなうことが多く、うっ血性心不全および全身的低血圧症を引き起こす可能性がある。心拍停止が長引いて低灌流が継続すると、二次的な各種合併症（例えば全身的な虚血性脳症）が発症する可能性がある。脳虚血は、もっとも一般的には粥状動脈硬化が原因となって血管閉塞によって引き起こされ、その重症度は、各種一過性脳虚血発作（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｔｔａｃｋ；  ＴＩＡ）から大脳梗塞または脳卒中にまでわたり得る。ＴＩＡの症状は一時的かつ可逆的であるが、ＴＩＡは再発する傾向があり、ＴＩＡに続いて脳卒中を起こすことが多い。
【０００５】
閉塞性動脈疾患の例としては、心筋梗塞につながるおそれのある冠動脈疾患、ならびに腹部大動脈、腹部大動脈の主要な支脈、および脚の動脈に影響しかねない末梢動脈疾患などがあげられる。末梢動脈疾患とは、例えばバージャー病、レイノー病、および先端チアノーゼなどである。末梢動脈疾患は一般に粥状動脈硬化によって引き起こされるが、その他の主要な原因の一例としては糖尿病があげられる。末梢動脈疾患に関連する合併症の例としては、重症下肢痙攣、急性扁桃炎、異常な心拍、心不全、心発作、脳卒中、腎不全などがあげられる。
【０００６】
虚血性障害および低酸素性障害は罹患および死亡の主要な原因である。循環器疾患は、世界中の死亡原因の３０％を占める。各種の循環器疾患の中では、虚血性心疾患および脳血管疾患が死亡原因の約１７％である。
【０００７】
現在、虚血性障害および低酸素性障害の治療では、症状の緩和および原因となる疾患の治療に焦点が合わせられている。例えば、心筋梗塞の治療にはニトログリセリンおよび鎮痛薬が用いられ、痛みを制御し心臓の作業負荷を軽減する。ジゴキシン、利尿薬、アムリノン、β遮断薬、高脂血症治療薬、およびアンジオテンシン変換酵素阻害薬を含めた、他の薬物療法が性状の安定化のために使用されるが、これらの治療法はいずれも、虚血および低酸素症によって生じた組織の損傷を直接治療対象とするものではない。
【０００８】
現在の治療法には短所があるために、低酸素症に関連する性状の治療に効果的な方法に対する必要性が依然として存在する。例えば粥状動脈硬化、糖尿病、および肺障害に起因して起きる虚血によって引き起こされる組織の損傷の、効果的な予防法に対する必要性も存在する。
【０００９】
虚血および低酸素症に関連する性状には、通常炎症が併発する。したがって、炎症も緩和する手段および方法が必要とされている。
【００１０】
本発明の目的は、炎症性状、好ましくは虚血に関連する性状を効率的に治療することを可能にする手段を提供することである。
【００１１】
本発明は、炎症性の皮膚性状、好ましくは虚血に関連する皮膚性状を治療するための局所用薬剤であって、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；  ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを、ＰＢＭＣ増殖性物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中で少なくとも１時間培養することによって得られる生理的溶液の上清を包含する薬剤に関する。
【００１２】
上記において規定した薬剤を炎症性の皮膚性状、好ましくは虚血に関連する皮膚性状を患う患者に投与することによって、各症状が軽減され、治癒過程が実現されることがわかった。
【００１３】
本発明の薬剤は、培養ＰＢＭＣまたはそのサブセットの上清を包含する。ＰＢＭＣの培養過程において、これらのＰＢＭＣは、活性化ＰＢＭＣにおいて発現および分泌される物質とは異なる、サイトカインなどの物質を発現および分泌する。このことは、本発明のＰＢＭＣのセクレトームが、活性化ＰＢＭＣのセクレトームとは異なることを意味している。本発明のＰＢＭＣは、細胞の表面以外の部分でトリガーされるセクレトーム生成を行う。したがって、ＰＨＡまたはＬＰＳなどのＰＢＭＣを活性化する物質と接触していないＰＢＭＣの上清が、炎症性の皮膚性状の治療に使用可能であることは驚くべきことである。これは、これらのＰＢＭＣのセクレトームが、該性状の治療を支援する物質を含有することを示している。この上清は、虚血性の皮膚性状の治療に特に適している。
【００１４】
本発明に係るＰＢＭＣの上清は、ＰＢＭＣ増殖性物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中でＰＢＭＣを培養することによって得られる。ただし、このＰＢＭＣは、生理的溶液中で少なくとも１時間インキュベーションされる。この最短培養時間は、ＰＢＭＣにサイトカインおよびその他の有益な物質を分泌させるために必要である。
【００１５】
本発明に係る薬剤のうちＰＢＭＣの部分は、例えばフィコール勾配、低浸透圧性溶解などの当該技術分野において公知の方法を用いて、全血から得ることもできる。これらの方法は当該技術分野において周知である。
【００１６】
上記薬剤のＰＢＭＣを、薬剤が投与されるドナー集団または同じ個体から得てもよい。
【００１７】
上清を得るもととなる生理的溶液は、溶液１ｍｌあたり、または単位服用量あたり、少なくとも５００個、好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０５個、さらにより好ましくは少なくとも１０６個のＰＢＭＣを包含する。
【００１８】
ここで使用する「生理的溶液」とは、ＰＢＭＣを使用に先立って本発明に係る薬剤中で培養するための溶液を指す。
【００１９】
「生理的溶液」とは、さらに、１時間以内、好ましくは３０分以内にＰＢＭＣの死を引き起こさない溶液も指す。生存ＰＢＭＣの個数が、ある溶液中で１時間以内、好ましくは３０分以内に７５％、より好ましくは９０％減少すれば、この溶液はここで規定する「生理的溶液」であるとは見なさない。「生理的溶液」は、ＰＢＭＣがこの溶液に接触しても、ＰＢＭＣの自発的な溶解を引き起こさない。
【００２０】
本文脈において、「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」または「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」ステップは、「インキュベーション」ステップを含む、または「インキュベーション」ステップからなる。なお、この「インキュベーション」ステップは、ＰＢＭＣが、ＰＢＭＣを培養するために通常使用される条件の下で、規定の時間（少なくとも１時間、好ましくは少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも８時間、さらにより好ましくは少なくとも１２時間）溶液に接触するステップである。
【００２１】
本発明の文脈において、「虚血に関連する皮膚性状」という用語は「虚血性の皮膚性状」という用語と互換的に使用可能であって、ヒトまたは動物の体の一部の領域に十分な酸素が供給されず、その結果組織の損傷または機能障害を発生させる、任意の性状、疾患、または障害を表す。病態は、血管の狭窄または閉塞によって引き起こされる可能性がある、皮膚または皮膚の一部の内部における血液供給の減少または消滅という特徴を有していてもよい。このような性状を、ここではまとめて、「虚血」または「虚血関連皮膚性状」または「虚血に関連する皮膚性状」という用語によって称する。例えば心疾患では、虚血という用語を使って、狭窄または閉塞した冠動脈が原因となって酸素に富む血液が十分な量だけ得られていない心筋に言及することが多い。虚血の症状は「虚血」状態にある器官によって異なる。心臓の場合、虚血の結果、狭心症が起こることが多い。脳では、虚血の結果、脳卒中が起こり得る。虚血性状の場合には炎症が併発する。
【００２２】
炎症（特に虚血）に関連する病理学的な皮膚性状の例としては、創傷、慢性の創傷、糖尿病性の創傷、皮膚潰瘍、乾癬などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。
【００２３】
ただし、本発明の文脈における病態とは、内皮細胞の損傷または機能障害、つまり創傷を特徴とするものであってもよい。本発明に係る薬剤を使用することによって治療してもよい創傷の例としては、慢性の創傷、糖尿病性の創傷、潰瘍、熱傷、炎症性皮膚疾患、腸疾患などがあげられるが、これらの例に限定されるものではない。
【００２４】
ここで使用する「生理的溶液」とは、好ましくはＰＢＭＣまたはそのサブセットの破壊を引き起こさない浸透圧を示す溶液であって、個体に直接投与可能である。
【００２５】
「ＰＢＭＣ増殖性物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない」という用語は、ＰＢＭＣを活性化し、ＰＢＭＣまたはそのサブセットの増殖を誘発する物質を含有しない生理的溶液を指す。このような物質の例としては、ＰＨＡ、ＬＰＳなどがある。
【００２６】
本発明の好適な実施形態によれば、上記炎症性皮膚疾患は、炎症、低酸素症によって誘発される炎症および自己免疫疾患（好ましくは乾癬、ざ瘡、酒さ、壊疽性膿皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚疾患、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、結節性紅斑、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫の侵襲、刺傷、咬傷によって引き起こされる感染性皮膚疾患、および蕁麻疹）、および虚血に関連する皮膚性状からなる群より選択される。特に好ましい皮膚性状は、虚血に関連する皮膚性状である。
【００２７】
本発明の特に好適な実施形態によれば、上記の虚血に関連する皮膚性状は、創傷、組織の虚血、慢性の創傷、糖尿病性の創傷、皮膚潰瘍、皮膚の熱傷、および形成手術における皮膚の皮弁からなる群より選択される。
【００２８】
末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；  ＰＢＭＣ）のサブセットは、好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である。言うまでもなく、これらの細胞の組み合わせ、具体的にはＴ細胞とＢ細胞との組み合わせ、Ｔ細胞とＮＫ細胞との組み合わせ、Ｂ細胞とＮＫ細胞との組み合わせ、Ｔ細胞とＢ細胞とＮＫ細胞との組み合わせを使用することも可能である。これらの細胞を準備および単離する方法は公知である。
【００２９】
驚くべきことに、本発明のＰＢＭＣは、溶液が薬学的に許容不可能な物質を含有せず、（先に規定したように）ＰＢＭＣの突然死を引き起こさず、ＰＢＭＣを活性化せず、かつ、ＰＢＭＣの増殖を刺激しない限り、任意の種類の溶液中で培養可能であることがわかった。したがって、使用される溶液は、少なくともＰＢＭＣの溶解を引き起こさない浸透圧性を示す。生理的溶液は、好ましくは生理食塩水（好ましくは生理的ＮａＣｌ溶液）、全血、血液分画物（好ましくは血清）、または細胞培養培地である。
【００３０】
上記細胞培養培地は、好ましくはＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｘ−ｖｉｖｏ、およびウルトラカルチャー（Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群より選択される。
【００３１】
本発明の特に好適な実施形態によれば、本発明のＰＢＭＣはストレスを誘発する条件の下で培養される。
【００３２】
ここで使用する「ストレスを誘発する条件の下で」という用語は、ストレス細胞を引き起こす培養条件を指す。細胞においてストレスを引き起こす条件としては、例えば熱、化学物質、放射線、低酸素症、浸透圧などがある。
【００３３】
本発明のＰＢＭＣにさらにストレスを加えると、炎症性の皮膚性状、特に虚血に関連する皮膚性状の治療にとって有益な物質の発現および分泌が一層増加する。
【００３４】
本発明の好適な実施形態によれば、ストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱（例えば、ＰＢＭＣの最適な培養温度、つまり３７℃より２℃、好ましくは５℃、より好ましくは１０℃を超えて高い温度）、放射線（例えばＵＶ線やγ線）、化学物質、浸透圧（つまり、体液中で、特に血液中で通常発生する浸透圧条件に比べて少なくとも１０％高い浸透圧条件）、またはこれらの組み合わせか含まれる。
【００３５】
放射線を利用して本発明のＰＢＭＣにストレスを与えるのであれば、好ましくは、ＰＢＭＣは少なくとも１０Ｇｙ、好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙで曝露される。ここで、供給源として、好ましくは、Ｃｓ−１３７セシウムが使用される。
【００３６】
本発明の好適な実施形態によれば、非活性化ＰＢＭＣまたはそのサブセットは、培地中で少なくとも４時間、好ましくは少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間培養される。
【００３７】
本発明に係る薬剤は、局所的に投与される。したがって、好ましくは、この薬剤はゲル（好ましくはハイドロゲル）、軟膏、皮膚パッチ、薬学的に許容可能なマトリクス（好ましくはコラーゲン／エラスチンのマトリクスの上）（例えば、Haslik W et al. J Plast Reconst Aesth Surg (2008): “Management of full-thickness skin defects in the hand and wrist region: first long-term experiences with the dermal matrix Matriderm"を参照）、さらに、ペースト、クリーム、粉末、リニメント剤、またはローションとして提供される。
【００３８】
本発明に係る薬剤は、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば希釈剤、安定剤、担体などを包含してもよい。剤形に応じて、本発明に係る薬剤はこれらの成分を包含する。これらの成分を調製する方法は、当業者にとって周知である。
【００３９】
本発明に係る薬剤の有効期間を伸ばすために、溶液ａ）または上清ｂ）は凍結乾燥される。このような調製物を凍結乾燥する方法は、当業者にとって周知である。
【００４０】
上記凍結乾燥された調製物を、使用前にバッファ、安定剤、塩などを含む水または水溶液と接触させてもよい。
【００４１】
本発明の別の態様は、上記において規定された薬剤を、炎症性の皮膚性状（特に虚血に関連する皮膚性状）を治療するための薬物の製造の用途に用いる使用方法に関する。
【００４２】
本発明のさらにもう１つの態様は、ここに開示する局所用薬剤を調製する方法であって、ａ）末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；  ＰＢＭＣ）またはそのサブセットを準備するステップと、ｂ）ステップａ）のＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ増殖性物質およびＰＢＭＣ活性化物質を含有しない生理的溶液中で少なくとも１時間培養するステップと、ｃ）ステップｂ）の上清を単離するステップと、ｄ）ステップｃ）の上清を用いて上記薬剤を調製するステップとを含む、方法に関する。
【００４３】
本発明に係る薬剤は、ＰＢＭＣを生理的溶液中で少なくとも１時間、好ましくは少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも８時間、さらにより好ましくは少なくとも１２時間インキュベーションまたは培養することによって得ることができる。このステップにおいて、ＰＢＭＣは、炎症性状の治療において有用な物質の合成および分泌を開始する。上記培養ステップの前、同ステップの後、および同ステップの途中で、ＰＢＭＣは、ＰＨＡまたはＬＰＳなどのＰＢＭＣを活性化する物質を添加することによって活性化されることがない。培養ステップの後に、培養物のＰＢＭＣおよび／または上清は単離され、最終的な薬剤の調製においてさらに使用される。上述のように、上記薬剤は、培養ＰＢＭＣ、上記細胞がインキュベーションされた培養物の上清、または培養ＰＢＭＣと培地との両方を包含してもよい。
【００４４】
本発明の好適な実施形態によれば、上記細胞は、ステップｂ）の前または同ステップの途中で、ストレスを誘発する条件に曝され、このストレスを誘発する条件には、低酸素症、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧（例えば、塩、特にＮａＣｌを添加して、浸透圧を血液中より高くすることによって誘発される）、ｐＨの変化（つまり、酸または水酸化物を添加してｐＨ値を６．５〜７．２または７．５〜８．０とすることによるｐＨ値の変化）、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００４５】
本発明の好適な実施形態によれば、上記細胞は、ステップｂ）の前または同ステップの途中で、少なくとも１０Ｇｙ（好ましくは少なくとも２０Ｇｙ、より好ましくは少なくとも４０Ｇｙ）、オゾン、高温、またはＵＶ線に曝露される。
【００４６】
本発明の別の態様は、上述の方法によって得られる薬剤に関する。
【００４７】
本発明のさらに別の態様は、本発明に係る薬剤を適切な量で、必要とする個体に投与することによって、炎症性の皮膚性状（特に虚血に関連する皮膚性状）を治療する方法に関する。
【００４８】
本発明を、以下の図面および例によってさらに説明する。ただし本発明はこれらに制限されるものではない。
【００４９】
図１ａおよび図１ｂは、ヒトの一次ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；  ＫＣ）および皮膚線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；  ＦＢ）における、細胞遊走に対する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来する培養物の上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；  ＳＮ）の効果を示している。
【００５０】
ＫＣおよびＦＢは、それぞれ、ＫＣ増殖培地およびＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを補充）中で成長させた。培養密度に到達した後、細胞の単層をピペットの先端を用いて掻き取り、さらに、ＰＢＭＣに由来するＳＮを用いて１６時間培養した。生存ＰＢＭＣ（ＬＬ）から得られたＳＮの、ＫＣに対する効果はほとんど検出できなかった。一方で、アポトーシス性ＰＢＭＣ（ＡＰＯ）から得られたＳＮはＫＣの遊走を強く誘発した。これとは対照的に、ＳＮ（ＬＬおよびＡＰＯ）は、どちらも皮膚のＦＢにおいて細胞遊走を強く誘発した。
【００５１】
図２は、ＫＣおよびＦＢの細胞周期進行に対する、ＰＢＭＣに由来するＳＮの効果を示している。
【００５２】
増殖性のＫＣおよびＦＢを、ＰＢＭＣに由来するＳＮ中で培養した。２４時間後に、細胞をブロモデオキシウリジンで２時間インキュベーションし、さらに、ユーザマニュアル（ＢｒｄＵ−ＦＡＣＳ  ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｋｉｔ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の指示に従って処理した。図２に示すように、ＰＢＭＣに由来するＳＮでＦＢを刺激すると、増殖性の細胞集団が減少し、続いてＧ２／Ｍ相において細胞が増加した。一方、ＬＬ−ＳＮおよびＡＰＯ−ＳＮではどちらにおいても、増殖性ＫＣの有意な増加が見られた。ただし、アポトーシス細胞に由来するＳＮの効果は、ＫＣにおいてより顕著であった。
【００５３】
図３ａおよび図３ｂは、ＰＢＭＣに由来するＳＮが、インビボにおける創傷の治癒を大幅に強化することを示している。
【００５４】
Ｂ６／１２９マウスの背中にパンチバイオプシー法で形成した６ｍｍの創傷に、ＬＬ（図３ａ、図３ｂ）のＰＢＭＣ−ＳＮまたはＡＰＯ（図３ｂ）のＰＢＭＣ−ＳＮのいずれかを含有するクリームを、創傷を形成した直後に適用した。創傷を形成してから８日後にマウスを屠殺し、Ｈ＆Ｅ染色法によって創傷を分析した。図３ａおよび図３ｂに示すように、どちらのＳＮも、皮膚の真皮部および上皮部の双方において創傷治癒を大幅に強化した。
【００５５】
図４は、ＰＢＭＣに由来するＳＮが、インビボにおける創傷の治癒を大幅に強化することを示している。
【００５６】
創傷を形成した後、痂皮が形成されるまでの最初の５日間の創傷のサイズを測定した。図４に示すように、ＰＢＭＣに由来する上清を含有するクリームを用いて治療を行った後の創傷の閉鎖は、クリームを単独で用いた場合に比べて、５日間を通じて非常に速いことがわかった。また、創傷のサイズは、クリームを単独で用いた場合には最初の２日間にいくぶん増加したが、ＰＢＭＣに由来する上清を用いて治療した創傷は、創傷を形成しクリームを適用してから最初の２４時間の間に閉鎖を開始した。
【００５７】
図５ａおよび図５ｂは、ＰＢＭＣに由来するＳＮを用いて治療した後に、インビボのマウスの創傷において血管新生が増加したことを示している。
【００５８】
第ＶＩＩＩ因子（図５ａ）およびＣＤ３１（図５ｂ）（どちらも血管に対するマーカー）を検出する免疫組織化学法によって、コントロールに比べると、ＳＮを用いて治療した創傷においてＣＤ３１陽性細胞の大幅な増加が見られた。このことは、血管新生が増加したことを示唆し、創傷の治癒の促進に寄与する。その一方で、Ｋｉ６７染色による分析では、このタイミングにおける増殖性の細胞の増加が検出されなかった（図５ａ）。
【００５９】
図６ａは、無刺激の生存ＰＢＭＣも、ＩＡ−ＰＢＭＣも、どちらも主に単球に由来する炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αを分泌しないことを示している（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【００６０】
図６ｂは、無刺激のＰＢＭＣに比べると、炎症促進性のインターフェロンγの分泌が、活性化後に強く誘発されることを示している（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【００６１】
図７ａは、フローサイメトリー法を用いた分析の結果を統合して示している。ＰＢＭＣをＴ細胞についてゲートし（ｇａｔｅｄ）、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を評価した（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝４）。
【００６２】
図７ｂは、いずれか（ＰＨＡ、ＣＤ３  ｍＡｂ）で活性化されたＰＢＭＣの代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す。ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）は陽性細胞の百分率を表す。
【００６３】
図８は、刺激ＰＢＭＣを対象とした３［Ｈ］チミジン取り込み法によって測定した増殖速度が、ＲＰＭＩ中で無刺激で培養される生存ＰＢＭＣに比べて高いことを示している。
【００６４】
図９は、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ＰＢＭＣセクレトームに対するＴ細胞の応答が阻害されることを示している。
【００６５】
図１０は、ＰＢＭＣを用いて実施した抗ＣＤ３およびＰＨＡ刺激実験を示している。
【００６６】
図１１ａないし図１１ｃは、抗ＣＤ３、ＰＨＡ、および混合リンパ球を用いて刺激をした際のＰＢＭＣの増殖を示している。
【００６７】
図１２ａおよび図１２ｂは、ＰＢＭＣの上清を用いてイノキュベーションした（ｉｎｏｃｕｂａｔｅｄ）ＣＤ４＋細胞の上清のアネキシンＶのレベルおよびＰＩの陽性度を示している。
【００６８】
図１３ａおよび図１３ｂは、ＰＢＭＣの上清によってＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ６９の上方制御が阻害されることを示している。
【００６９】
図１４は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βをディマネタイズ（ｄｅｍｏｎｅｔｉｚｉｎｇ）しても、ＣＤ４＋細胞の増殖速度が上昇しなかったことを示している。
【００７０】
〔実施例〕
〔実施例１：末梢血単核球の培養物の上清による、創傷治癒の大幅な強化〕
非治癒性の皮膚潰瘍は、ほとんどの一般的な治療法に対して耐性を有することが多い。従来の研究では、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；  ＰＢＭＣ）を塩基性線維芽細胞増殖因子とともに適用することは、糖尿病性壊疽に対する有用な治療法であると考えられることが示された。本実施例では、ＰＢＭＣ（放射線の照射を受けたＰＢＭＣか、放射線の照射を受けていないＰＢＭＣかのいずれか）の培養物の上清が、マウスモデルにおいて創傷治癒の強化を誘発するために十分であるかどうかを調べた。さらに、これらの上清の、ヒトの一次線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；  ＦＢ）、ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；  ＫＣ）、および内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ；  ＥＣ）に対する効果を分析した。
【００７１】
ＰＢＭＣに由来する上清を用いてＦＢおよびＫＣをインキュベーションすることによって、放射線の照射を受けていない細胞の上清も、放射線の照射を受けた細胞の上清も、ともにＦＢの遊走を強く誘発し、一方で、ＦＢの増殖に対しては全く効果がないことがわかった。これとは対照的に、どちらの上清もＫＣについてはその遊走能および増殖能に対して効果的であることが示された。なお、放射線の照射を受けた細胞に由来する上清の効果のほうが、より顕著であった。ＰＢＭＣに由来する上清は、インビトロで遊走機構および増殖機構を誘発したので、これらの上清が、インビボにおいても創傷の治癒を誘発可能かどうかをさらに調べた。したがって、クリームを含有するＰＢＭＣの上清を調整し、Ｂ６／１２９マウスの背中にパンチバイオプシー法で形成した６ｍｍの創傷に対して、創傷を形成した直後に適用した。これに続く４日〜５日間、痂皮が形成されるまで、創傷のサイズを測定した。驚くべきことに、ＰＢＭＣに由来する上清を含有するクリームを用いた治療後の創傷の閉鎖のほうが、クリームを単独で用いた場合に比べて、この５日間を通じて非常に速いことがわかった。興味深いのは、創傷のサイズは、クリームを単独で用いた場合には最初の２日間にいくぶん増加したが、ＰＢＭＣに由来する上清を用いて治療した創傷は、創傷を形成しクリームを適用してから最初の２４時間の間に閉鎖を開始したことである。創傷を形成してから８日〜１０日後に、マウスを屠殺し、Ｈ＆Ｅ染色法、および血管に対するマーカーであるＣＤ３１を検出する免疫組織化学法によって、創傷を分析した。Ｈ＆Ｅ染色によって、ＰＢＭＣに由来する上清から得られるクリームの存在下のほうが、皮膚の真皮部および上皮部のどちらにおいても創傷治癒は、よく進行することがわかった。さらに、このような創傷では、ＣＤ３１陽性細胞が大幅に増加した。このことは、血管新生が増加したことを示唆し、創傷の治癒の促進に寄与する。
【００７２】
まとめると、ＰＢＭＣに由来する上清によってインビボのマウスにおける創傷の治癒が促進され、これらの上清よってインビトロのヒト細胞における増殖および遊走も誘発されることが示された。ＰＢＭＣの上清を含有するクリームの処方物によって、非治癒性の皮膚潰瘍の治療にとって大きな効果が実現されるかもしれない（図１ａ〜図５ｂを参照）。
【００７３】
〔実施例２：静止末梢血単核球（ｒｅｓｔｉｎｇ  ＰＢＭＣ）による、低活性マーカーおよび炎症性サイトカイン産生の減少の証明〕
活性化された末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；  ＰＢＭＣ）およびその上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；  ＳＮ）は、創傷の再生において有益であると考えられている（Holzinger C et al. Eur J Vasc Surg. 1994 May; 8(3): 351-6.）。非活性化ＰＢＭＣおよび非活性化ＰＢＭＣに由来するＳＮには、実験的な急性心筋梗塞（ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉｃａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ；  ＡＭＩ）および創傷を形成したモデルにおいて薬効があることが、実施例１および実施例２において示された。ＰＢＭＣの非活性化は実験的に検証されなければならないので、ＰＢＭＣの培養が、Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ２５）の強化または炎症性サイトカインの分泌（単球の活性化＝ＴＮＦα、Ｔ細胞活性化＝ＩＮＦγ）の強化につながるかどうかを調べた。対照実験では、培養されたＴ細胞が、ＣＤ３  ｍＡｂ刺激または植物性血球凝集素（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；  ＰＨＡ）によってトリガーされる。
【００７４】
〔方法および結果〕
静脈血を健常人からＥＤＴＡ管に収集した。フィコール・ハイパック密度グレード分離（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を実施した後に、ＰＢＭＣを収集し、生存細胞と放射線の照射を受けたアポトーシス細胞（ＩＡ−ＰＢＭＣ）とに分けた。アポトーシス細胞を得るために、ＰＢＭＣを６０Ｇｙ（セシウム１３７）に曝露した。フローサイメトリー法による分析を実施するために、５００，０００個のＰＢＭＣを２００μｌの無血清培地中で培養した。細胞に対してＰＨＡ（７μｇ／ｍｌ）もしくはＣＤ３−ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）で刺激を与えるか、または刺激を全く与えなかった。２４時間のインキュベーションの後に、細胞を洗浄し、ＣＤ３、ＣＤ６９、およびＣＤ２５について染色（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）し、ＦＣ５００（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で表面活性化マーカーについて評価した。ＥＬＩＳＡアッセイを実施するために、ＰＢＭＣを、ＰＨＡ刺激またはＣＤ３刺激を与えるものと与えないものとに分けて、２．５×１０６個／ｍｌの密度で一晩培養した。２４時間後に、上清を回収し、−２０℃で凍結させた。ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ社）用およびＩＮＦ−γ（Ｂｅｎｄｅｒ社）用の市販のＥＬＩＳＡキットを購入した。手短に説明すると、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートをＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γに対する抗体でコーティングし、一晩保存した。２４時間後に、プレートを洗浄し、試料を各ウェルに２個ずつ添加した。インキュベーションならびに検出用抗体およびＳｔｒｅｐ−ｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰの添加の後、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加した。発色後、スルヒック酸（ｓｕｌｐｈｉｃ  ａｃｉｄ）を添加することによって、酵素反応を停止させた。光学濃度値を、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３プレート読み取り装置で読み取った。
【００７５】
〔結果〕
ＦＡＣＳ分析
ＣＤ３で刺激されたＴ細胞およびＰＨＡで刺激されたＴ細胞は、２４時間のインキュベーション後に、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の上方制御を示した。無刺激の細胞およびアポトーシス細胞は、ほんのわずかな量のＣＤ６９およびＣＤ２５を発現させるだけであった（図６ａ（代表的な試料、図６ｂ、ヒストグラム、ｎ＝４））。統計的有意性は星印で表す（＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５）。
【００７６】
ＥＬＩＳＡ分析
無刺激のＰＢＭＣに由来する上清においてはＴＮＦ−αもＩＮＦ−γもいずれも検出されなかったが、ＰＨＡまたはＣＤ３で刺激を与えたＰＢＭＣから得られた上清は、ＥＬＩＳＡ分析が示唆するように、これらのサイトカインが高い値であることを示した（＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、ｎ＝８）。この結果は、無刺激のＰＢＭＣとは炎症性サイトカインの分泌パターンが異なることを明確に示している。
【００７７】
〔結論〕
以上のデータは、「無刺激ＰＢＭＣ」が、刺激ＰＢＭＣ（ＰＨＡおよびＣＤ３  ｍＡｂ）とは異なる別の表現型（活性化マーカー、サイトカインの分泌）であることを示唆している。
【００７８】
図６ａは、無刺激の生存ＰＢＭＣも、ＩＡ−ＰＢＭＣも、どちらも主に単球に由来する炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αを分泌しないことを示している（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【００７９】
図６ｂは、無刺激のＰＢＭＣに比べると、炎症促進性のインターフェロンγの分泌が、活性化後に強く誘発されることを示している（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝８）。
【００８０】
図７ａは、フローサイメトリー法を用いた分析の結果を統合して示している。ＰＢＭＣをＴ細胞についてゲートし（ｇａｔｅｄ）、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を評価した（有意性は次のとおりである：＊ｐ＝０．０５、＊＊ｐ＝０．００１；ｎ＝４）。
【００８１】
図７ｂは、いずれか（ＰＨＡ、ＣＤ３  ｍＡｂ）で活性化されたＰＢＭＣの代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す。ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）は陽性細胞の百分率を表す。
【００８２】
〔実施例３：生理的溶液中で培養されるＰＢＭＣの増殖活性〕
本実施例の目的は、特異的（ＣＤ３）、非特異的（レクチン、ＰＨＡ）、および同種のＴ細胞の誘発（混合リンパ球反応、ＭＬＲ）を２日（ＣＤ３、ＰＨＡ）および５日（ＭＬＲ）間の刺激アッセイにおいて利用する免疫アッセイに比べると、ＰＢＭＣは増殖活性を有しないことを証明することである。
【００８３】
〔物質および方法〕
ＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心法によって若い健常人から分離し、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、アメリカ）および１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、アメリカ）を含有するＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社、アメリカ）中で、２００μＬにつき細胞が１×１０５個の割合で再懸濁した。レスポンダー細胞に、ＣＤ３に対するＭｏＡｂ（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ社、ＮＪ、アメリカ）によって、または、ＰＨＡ（７μＬ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、アメリカ）によって、刺激を与えるか、あるいは、放射線の照射を受けた同種のＰＢＭＣを１：１の比（ＭＬＲの場合）で用いることによって刺激を与えた。プレートを４８時間または５日間インキュベーションし、その後、３［Ｈ］チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン）を用いて１８時間パルスを与えた。細胞を回収し、３［Ｈ］チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器において測定した。
【００８４】
〔結果〕
刺激ＰＢＭＣは、３［Ｈ］チミジン取り込み法によって測定した増殖速度が、ＲＰＭＩ中で無刺激で培養される生存ＰＢＭＣに比べて高いことを示した（図８）。この効果は、増殖が抗原提示細胞（ＭＬＲ）によってトリガーされるアッセイ同様、Ｔ細胞に特異的な刺激（ＰＨＡ、ＣＤ３）を付加することによっても観察された。
【００８５】
〔結論〕
この一連の実験は、培養液中で最長５日間まで保持される生存ＰＢＭＣが増殖しない一方で、異なる方法で刺激を与えられたＰＢＭＣは顕著な増殖応答を示したことを示唆している。以上のデータから、無刺激でＰＢＭＣを培養すると増殖応答を引き起こさないと結論できる。
【００８６】
〔実施例４：無菌培養条件の下で保管された分離ＰＢＭＣのセクレトームは、血管新生能を有する〕
血管新生と炎症とはインビボにおいて強く関連しているので、これらのＰＢＭＣのセクレトームがＴ細胞に対して抗増殖効果をも示し、その結果、炎症性の免疫応答に干渉するかどうかを調べた。
【００８７】
〔物質および方法〕
フィコール密度勾配遠心法によって若い健常人から分離したＰＢＭＣ（２．５×１０６個／ｍｌ）を、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、アメリカ）および１％のＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、アメリカ）を含有するＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社、ＣＡ、アメリカ）中で２４時間インキュベーションすることによって、セクレトームを得た。上清を細胞分画から分離し、−８０℃で保存した。増殖アッセイを実施するために、分離後に、同種のＰＢＭＣを２００μＬのＲＰＭＩにつき細胞が１×１０５個の割合で再懸濁した。レスポンダー細胞に、ＣＤ３に対するＭｏＡｂ（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ社、アメリカ）によって、または、ＰＨＡ（７μＬ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、アメリカ）によって、刺激を与えた。上清の異なる希釈物を添加した。プレートを４８時間インキュベーションし、その後、３［Ｈ］−チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン）を用いて１８時間パルスを与えた。細胞を回収し、３［Ｈ］−チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器において測定した。
【００８８】
〔結果〕
同種のＰＢＭＣのセクレトームが、３［Ｈ］−チミジン取り込み法によって測定する増殖速度は、正のコントロールに比べて有意に低減することを示した（図９）。この効果は用量に依存し、ＰＨＡ刺激時とともに、抗ＣＤ３刺激時にも観察された。
【００８９】
〔結果が示唆すること〕
この一連の実験は、生存ＰＢＭＣから得られるセクレトームを２４時間培養液中に保持すると、有意な抗増殖効果をインビトロで示すことを示唆している。以上のデータは、ＰＢＭＣに由来する上清または凍結乾燥された状態にある上清は、低酸素症によって誘発される炎症またはその他の高炎症性疾患（例えば自己免疫疾患、炎症性皮膚疾患など）に関連するヒトの疾患を治療するための、潜在的な治療用処方物として作用する可能性があることを示唆している。
【００９０】
〔実施例５：末梢血単核球が分泌するパラクリン因子は、免疫を抑制する特性を有する〕
実施例１では、急性心筋梗塞（ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉｃａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ；  ＡＭＩ）の動物モデルにおける、ＰＢＭＣセクレトームの抗炎症効果が示された。本実施例では、ＡＭＩを誘発後のＰＢＭＣセクレトームの適用が、免疫応答を大きく下方制御することによって心筋の炎症性損傷を阻害することを示す。
【００９１】
これらの知見に基づいて、試験管内実験におけるセクレトームの考え得る免疫抑制効果について調べた。ＣＤ４＋細胞は、免疫過程において、他の白血球（例えばマクロファージ、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞など）の補助にとって重要であって、免疫反応の統合において鍵となる役割を果たす。
【００９２】
〔物質および方法〕
〔ＰＢＭＣセクレトームの生成〕
健常人から得られるＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心法によって分離した。細胞を、ウルトラカルチャー（Ｕｌｔｒａ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）の培地（Ｌｏｎｚａ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）中で１×１０６個／ｍｌ（ｓｕｐ  ｌｉｖ）の濃度で再懸濁した。アポトーシス性ＰＢＭＣからセクレトームを生成するために、６０Ｇｙ（ｓｕｐ  ＡＰＡ）を照射することによって、アポトーシスを誘発した。細胞を、加湿雰囲気（５％  ＣＯ２、３７℃、相対湿度９５％）中で２４時間インキュベーションした。上清を除去し、５０ｍＭの酢酸アンモニウムに対して３．５ｋＤａのカットオフ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オランダ）で４℃で一晩透析した。その後、上清を無菌濾過し、凍結乾燥した。凍結乾燥したセクレトームを−８０℃で保存し、実験を行うたびに新たに再懸濁した。セクレトームを無作為抽出して、そのｐＨ値を計測した。
【００９３】
〔ＣＤ４細胞の分離〕
ＭＡＣＳビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用してＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞を枯渇させることによって、ＣＤ４＋細胞を分離した。細胞は新鮮なものを準備し、ただちに各実験に使用した。
【００９４】
〔アポトーシスの測定〕
アポトーシスを、市販のアネキシンＶ／ＰＩキット（ＢＤ社、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、アメリカ）を用いてフローサイトメトリーによって検出した。アポトーシスをアネキシン陽性染色法によって規定し、後期アポトーシスをＰＩの陽性度によって規定した。
【００９５】
〔増殖実験〕
ＰＢＭＣまたは精製済みＣＤ４＋細胞を、９６個の丸底ウェルを有するプレートにおいて、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、アメリカ）、０．５％のβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、アメリカ）、および１％のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（インビトロゲン社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、アメリカ）を補充したウルトラカルチャー（Ｕｌｔｒａ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）中で、１×１０５個／ウェルの濃度にまで希釈した。ＰＨＡ（７μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、アメリカ）、ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ、ＢＤ社、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、アメリカ）、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、ＢＤ社、アメリカ）を用いて、または放射線の照射を受けた（６０Ｇｙ）同種のＰＢＭＣを１：１の比で用いて、ＭＬＲを得るために、細胞に刺激を与えた。細胞を、複数の濃度のＰＢＭＣセクレトーム、ＩＬ−１０、またはＴＧＦ−βを用いて４８時間または５日間（ＭＬＲ）インキュベーションした。その後、３［Ｈ］チミジン（３．７×１０４Ｂｑ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて、細胞に１８時間パルスを与えた。細胞を回収し、３［Ｈ］チミジンの取り込み量を液体シンチレーション計数器において測定した。
【００９６】
〔活性化マーカー〕
精製済みＣＤ４＋細胞を、抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激し、複数の濃度のＰＢＭＣセクレトームでコインキュベーションした。細胞を、標準的なフローサイメトリー法の染色プロトコールにしたがって、ＣＤ６９およびＣＤ２５について染色し、フローサイトメーターＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、アメリカ）で分析した。
【００９７】
〔結果〕
予備試実験において、生細胞（ｓｕｐ  ｌｉｖ）から得られるＰＢＭＣの上清の抗増殖性特性について試験を行った。抗ＣＤ３刺激実験およびＰＨＡ刺激実験では、増殖速度が、セクレトーム（ｎ＝１０）を添加することによって大幅に低下した。
【００９８】
これらの細胞は、免疫応答を始動および継続させる際に中心的役割を果たすので、これらの知見に基づいて、Ｔヘルパー細胞の区画に対するＰＢＭＣセクレトームの効果を評価した。図１０と同様に、非常に高度に精製されたＣＤ４＋細胞は、セクレトームを添加することによって増殖能を喪失した。この現象は、放射線の照射を受けたアポトーシス性ＰＢＭＣ（図１１ａないし図１１ｃ、ｎ＝５）の上清の場合にも、生存ＰＢＭＣの上清の場合にも観察された。
【００９９】
次のステップは、細胞生存率に対するセレクトームの考え得る効果を決定することである。したがって、静止ＣＤ４＋細胞を、上清およびアネキシンＶを用いてイノキュベーションし（ｉｎｏｃｕｂａｔｅｄ）、ＰＩの陽性度を評価した。生存ＰＢＭＣから得られる上清も、アポトーシス性ＰＢＭＣから得られる上清も、どちらも顕著なアポトーシス促進効果を示した（図１２ａおよび図１２ｂ、ｎ＝５）。
【０１００】
ＰＢＭＣセクレトームがＣＤ４＋細胞活性化を阻害することができるかどうかを試してみるために、ＣＤ４＋細胞の抗ＣＤ３刺激に続いて、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９を評価した。どちらのマーカーの上方制御も、ＰＢＭＣセクレトームによって大幅にかつ用量に応じて阻害された（図１３ａおよび図１３ｂ、ｎ＝５）。
【０１０１】
最後の一連の実験では、これらの実験において中和抗体を添加することによる、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの効果について検討した。ＩＬ−１０も、ＴＧＦ−βも、これらのサイトカインをディマネタイズ（ｄｅｍｏｎｅｔｉｚｉｎｇ）しても増殖速度は上昇しなかったので（図１４、ｎ＝５）、本発明のＰＢＭＣセクレトームの抗増殖効果の原因ではなかった。
【０１０２】
〔結論〕
これらの実験によって、ＰＢＭＣのセレクトームがインビトロで免疫抑制特性を有することが初めて示された。上清は、ａ）抗ＣＤ３刺激実験、ＰＨＡ刺激実験、およびＭＬＲ刺激実験において増殖速度を低下させ、ｂ）Ｔ細胞の誘発時にＣＤ４＋細胞のアポトーシスを誘発し活性化を阻害する効力を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１ａ】ヒトの一次ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；  ＫＣ）における、細胞遊走に対する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来する培養物の上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；  ＳＮ）の効果を示す図である。
【図１ｂ】ヒトの皮膚線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；  ＦＢ）における、細胞遊走に対する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来する培養物の上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；  ＳＮ）の効果を示す図である。
【図２】ＫＣおよびＦＢの細胞周期進行に対する、ＰＢＭＣに由来するＳＮの効果を示す図である。
【図３ａ】ＰＢＭＣに由来するＳＮが、インビボにおける創傷の治癒を大幅に強化することを示す図である。
【図３ｂ】ＰＢＭＣに由来するＳＮが、インビボにおける創傷の治癒を大幅に強化することを示す図である。
【図４】ＰＢＭＣに由来するＳＮが、インビボにおける創傷の治癒を大幅に強化することを示す図である。
【図５ａ】ＰＢＭＣに由来するＳＮを用いて治療した後に、インビボのマウスの創傷において血管新生が増加したことを示す図である。
【図５ｂ】ＰＢＭＣに由来するＳＮを用いて治療した後に、インビボのマウスの創傷において血管新生が増加したことを示す図である。
【図６ａ】無刺激の生存ＰＢＭＣも、ＩＡ−ＰＢＭＣも、どちらも主に単球に由来する炎症促進性のサイトカインＴＮＦ−αを分泌しないことを示す図である。
【図６ｂ】無刺激のＰＢＭＣに比べると、炎症促進性のインターフェロンγの分泌が、活性化後に強く誘発されることを示す図である。
【図７ａ】フローサイメトリー法を用いた分析の結果を統合して示す図であり、ＰＢＭＣをＴ細胞についてゲートし（ｇａｔｅｄ）、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を評価した結果を示す図である。
【図７ｂ】いずれか（ＰＨＡ、ＣＤ３  ｍＡｂ）で活性化されたＰＢＭＣの代表的なＦＡＣＳ分析結果を示す図である。
【図８】刺激ＰＢＭＣを対象とした３［Ｈ］チミジン取り込み法によって測定した増殖速度が、ＲＰＭＩ中で無刺激で培養される生存ＰＢＭＣに比べて高いことを示す図である。
【図９】Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ＰＢＭＣセクレトームに対するＴ細胞の応答が阻害されることを示す図である。
【図１０】ＰＢＭＣを用いて実施した抗ＣＤ３およびＰＨＡ刺激実験を示す図である。
【図１１ａ】抗ＣＤ３を用いて刺激をした際のＰＢＭＣの増殖を示す図である。
【図１１ｂ】ＰＨＡを用いて刺激をした際のＰＢＭＣの増殖を示す図である。
【図１１ｃ】混合リンパ球を用いて刺激をした際のＰＢＭＣの増殖を示す図である。
【図１２ａ】ＰＢＭＣの上清を用いてイノキュベーションした（ｉｎｏｃｕｂａｔｅｄ）ＣＤ４＋細胞の上清のアネキシンＶのレベルを示す図である。
【図１２ｂ】ＰＢＭＣの上清を用いてイノキュベーションした（ｉｎｏｃｕｂａｔｅｄ）ＣＤ４＋細胞の上清のＰＩの陽性度を示す図である。
【図１３ａ】ＰＢＭＣの上清によってＣＤ４＋細胞におけるＣＤ２５の上方制御が阻害されることを示す図である。
【図１３ｂ】ＰＢＭＣの上清によってＣＤ４＋細胞におけるＣＤ６９の上方制御が阻害されることを示す図である。
【図１４】ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βをディマネタイズ（ｄｅｍｏｎｅｔｉｚｉｎｇ）しても、ＣＤ４＋細胞の増殖速度が上昇しなかったことを示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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