【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年12月8日(2010.12.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  サンプル中の核酸フラグメント中の変異を検出するための方法および装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】  サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異または多形性を検出する方法であって、
(ａ)上記サンプル中に存在する核酸フラグメントをＰＣＲにより増幅するステップ、
(ｂ)ステップ(ａ)で形成された二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的な融解を生ずる勾配の存在下でゲル電気泳動により上記核酸フラグメントを分離し、上記部分的に融解した核酸フラグメントを電気泳動ゲル中の特定位置に固定するステップ、および
(ｃ)上記分離された核酸フラグメントを検出するステップ、
を含み、ステップ(ａ)は電気泳動ゲル中または電気泳動ゲル上において行うことを特徴とする方法。
【請求項２】  上記方法が更に、
(ｄ)ステップ(ｂ)の前に、上記サンプル中に存在する二本鎖核酸フラグメントを一本鎖核酸フラグメントへ完全に融解させることと、上記一本鎖核酸フラグメントから二本鎖フラグメントを再形成することとを含み、ここで、ホモ二量体二本鎖核酸フラグメントに加えてヘテロ二量体二本鎖核酸フラグメントを形成することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】  上記ゲル電気泳動が、キャピラリーゲル電気泳動であることを特徴とする、請求項１または２の方法。
【請求項４】  上記方法が更に：
(ｅ)上記少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントを再び二本鎖とするように、ステップ(ｂ)後に電気泳動条件を変え、それにより、上記分離された核酸フラグメントを、事実上は等速で上記電気泳動ゲル中の特定位置からさらに移動させること、
を含むことを特徴とする、請求項１、２または３の方法。
【請求項５】  上記分離された核酸フラグメントを、キャピラリーから排出される時に検出することを特徴とする、請求項３または４の何れかの方法。
【請求項６】  上記方法が、上記分離された核酸フラグメントを上記電気泳動ゲルから単離することを更に含むことを特徴とする、請求項１〜５の何れかの方法。
【請求項７】  上記二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的な融解を生ずる電気泳動ゲル中の勾配が温度勾配であることを特徴とする、請求項１〜６の何れかの方法。
【請求項８】  上記二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的な融解を生ずる勾配が化学勾配であることを特徴とする、請求項１〜６の何れかの方法。
【請求項９】  上記化学勾配が尿素およびホルムアミドにより形成されることを特徴とする、請求項８の方法。
【請求項１０】  上記勾配が、温度勾配および化学勾配の組合せからなることを特徴とする、請求項７、８または９の方法。
【請求項１１】  上記少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントが再び二本鎖核酸フラグメントを形成するように電気泳動条件を変えることは、上記電気泳動ゲルの温度を低下させることを含むことを特徴とする、請求項２〜１０の何れかの方法。
【請求項１２】  上記サンプルが、個体由来の遺伝子材料を含み、ここで、上記遺伝子材料は核酸の形態で存在し、血液、精液、唾液および／または組織細胞のいずれかを含むことを特徴とする、請求項１〜１１の何れかの方法。
【請求項１３】  サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出するための装置であって、上記装置は、
電気泳動ゲルを配置した多数のキャピラリーであり、当該キャピラリー中の電気泳動ゲルの上側部および下側部は両方とも、電極を配置した液体バスと接触しているキャピラリー、
上記電気泳動ゲルにわたって電圧をかけるための電圧源、
電気泳動を行う間に電気泳動条件を変えるための手段、および、
分離されたＤＮＡフラグメントを検出するための手段、
を含み、
上記装置はさらに、ＰＣＲのＤＮＡ増幅を行う間に上記キャピラリー中の温度を調節するように設計された手段を含み、上記ＰＣＲのＤＮＡ増幅は、電気泳動ゲル中または電気泳動ゲル上において行うことを特徴とする装置。
【請求項１４】  上記キャピラリー中のゲルの上側部が、実質的に全キャピラリー用の１つの一体化された液体バスに接触し、上記一体化された液体バス中に１つの電極が配置され、上記キャピラリー中の各電気泳動ゲルの下側部が、互いに別個の液体バスと接触し、上記各別個の液体バス中にそれぞれ１つの電極が配置されていることを特徴とする、請求項１３の装置。
【請求項１５】  上記キャピラリー中の電気泳動条件を変えるための手段が、上記キャピラリー中の温度を変えるための手段であることを特徴とする、請求項１３または１４の装置。
【請求項１６】  上記キャピラリーが、上記サンプル中の核酸フラグメントを上記電気泳動ゲル中で増幅するために、プライマーおよびｄＮＴＰで被覆されていることを特徴とする、請求項１３〜１５の何れかの装置。
【請求項１７】  上記キャピラリーが更に、上記サンプル中の核酸フラグメントを上記電気泳動ゲル中で増幅するために、ポリメラーゼで被覆されていることを特徴とする、請求項１３〜１６の装置。
【請求項１８】  上記キャピラリーがプライマーおよびｄＮＴＰで被覆されていることを特徴とする、請求項１〜１２の何れかの方法および／または請求項１３〜１７の何れかの装置において使用するためのキャピラリー。
【請求項１９】  上記キャピラリーがポリメラーゼで更に被覆されていることを特徴とする、請求項１８のキャピラリー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出するための方法および装置に関連し、ここで、本方法は、適当な順序において行う以下のステップ：
(ａ)サンプル中に存在する核酸フラグメントを増幅すること、
(ｂ)ステップ(ａ)で形成した二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的な融解を生ずる勾配の存在下でゲル電気泳動により核酸フラグメントを分離し、部分的に融解した核酸フラグメントをゲル中の特定位置に固定すること、および
(ｃ)分離された核酸フラグメントを検出すること、
を含む。
【０００２】
例えば、核酸フラグメントにおいて、特にＤＮＡフラグメントにおいて、特定の変異をスクリーニングするための方法が知られている。ＤＮＡ中の変異は、遺伝性疾患および／または特定の癌を生じ得ることが知られている。従って、患者のサンプルにおけるこのようなＤＮＡ変異を明らかにすることは、患者が特定の遺伝性疾患をもたらす異常遺伝子の保持者であるかどうかを確認する際に、または信頼性のある診断を行う際に重要となり得る。ＤＮＡ変異の研究はまた、例えば、特定の形態の癌の進行の危険性を決定する際に、腫瘍の場合の処置計画を行う際に、疾患と特定遺伝子欠損との関連の科学的研究を行う際に、および組織分類を行う際に重要となり得る。
【０００３】
サンプル中の核酸フラグメントにおける、例えばＤＮＡ等における変異の検出を可能とするため、サンプル中に存在する核酸フラグメント、通常は非常に少数のコピーとして、またはより大きな核酸フラグメントの一部としてサンプル中に存在する核酸フラグメントを最初に増幅し、十分な材料を得なければならない。この目的の為に、例えばＰＣＲのような従来技術の増幅技術が一般に用いられる。増幅ステップの後、増幅された二本鎖ＤＮＡフラグメントは、検出できるようにする前に、互いに分離されなければならない。この目的の為に、ゲル電気泳動に基づく技術が一般的に用いられる。しかし、本方法の欠点は、増幅ステップと分離ステップの両方が時間がかかる工程であり、そのため、本方法を行うためには長い処理時間を必要とすることである。しばしば、非常に多数のサンプルをスクリーニングしなければならないので、非常に多数のサンプルにおいて、サンプル中に存在する核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異の存在を迅速かつ単純な方法で試験し得る方法の開発が望まれる。
【０００４】
そのため、本発明の目的は、サンプル中の核酸フラグメント中の１つまたはそれより多い変異を検出するための方法であって、非常に多数のサンプルにおいて変異の有無を短時間で試験できる方法を提供することである。
【０００５】
この目的は、本発明によれば、増幅ステップ(ａ)をゲル中またはゲル上で行うことで達成される。
【０００６】
ゲル中またはゲル上で増幅ステップを行うことより、本方法は、より短時間で実行可能になる。増幅ステップ直後、増幅後のゲルにわたって電圧をかけて電気泳動を開始することにより、増幅された核酸フラグメントを互いに分離する。そのため、増幅ステップを行った後、後続の電気泳動ステップのためにサンプルをゲル上に配置することはもはや必要ではない。ゲル上で増幅する間、ＰＣＲ混合物(一般に、酵素、プライマー、ヌクレオチドなどからなる)をゲル上に配置する。この場合、ＰＣＲ混合物は、例えば、ゲルのアクリルアミドと、境界表面においてのみ接触する。ゲル中での増幅の場合、ＰＣＲ混合物はゲル中に位置する。この場合、ＰＣＲ混合物はアクリルアミドと完全接触している。
【０００７】
変異を有する核酸フラグメントと変異を有さない核酸フラグメントの大きさには全く相違がないか殆ど相違がないので、本発明によれば、異なるフラグメントは、結合エネルギーの相違に基づき互いに分離される。結合エネルギーはフラグメントの核酸組成に依存する。核酸フラグメント中に変異、例えばヌクレオチドの置換が存在するとき、その結合エネルギーは、変異のないフラグメントの結合エネルギーと相違する。
【０００８】
変異のない核酸フラグメントから変異のある核酸フラグメントを分離するため、二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的な融解を生ずる勾配、例えば温度が増加する勾配(increasing temperature gradient)を適用する。変異のある二本鎖核酸フラグメントは、変異のない二本鎖核酸フラグメントの結合エネルギーとは異なる結合エネルギーを有するので、それらフラグメントは、異なる温度で少なくとも部分的に一本鎖となる(融解する)。少なくとも部分的な融解により、フラグメントはゲル中の特定位置で固定される。結合エネルギーの相違により、変異のない二本鎖核酸フラグメントは、変異のあるフラグメントとは異なるゲル中の位置で固定される。そのため、この方法により、変異のある核酸フラグメントは、ゲル中で、変異のない核酸フラグメントから分離され得る(図１)。
【０００９】
フラグメントをゲル中の特定位置に確実に固定するため、二本鎖フラグメントは、少なくとも部分的な融解を生ずる勾配の影響の下で完全には融解してはならない。この目的のため、例えば、ＧＣリッチテール(「ＧＣクランプ」；約１５から６０のＧＣ対)を、増幅プライマーのうちの１つに付加してもよい。ＧＣクランプは、少なくとも部分的な融解を生ずる勾配中で二本鎖を維持する。
【００１０】
次いで、相互に分離したフラグメントを従来技術の方法によりゲル中で検出することができる。この目的の為に、例えば、核酸フラグメントに結合するエチジウムブロミドを、電気泳動ステップ前またはその実行中にサンプルに添加し、それにより当該フラグメントはＵＶ光を用いて見えるようになる。しかし、本発明では、他の既知の検出方法もまた使用可能である。
【００１１】
本発明による、特に適当な好ましい態様の方法では、本方法は、以下のステップを含む。
(ｄ)ステップ(ｂ)の前に、サンプル中に存在する二本鎖核酸フラグメントを一本鎖核酸フラグメントへ完全に融解させるステップ、およびこれらの一本鎖核酸フラグメントから二本鎖フラグメントを再形成するステップ。ここで、ホモ二量体二本鎖核酸フラグメントに加えてヘテロ二量体二本鎖核酸フラグメントを形成する。
【００１２】
ホモ二量体二本鎖核酸フラグメント(以下、ホモ二量体フラグメントと称する)は、「通常の」(すなわち、変異のない)２つの一本鎖核酸フラグメントまたは変異を有する２つの一本鎖核酸フラグメントが対となり二本鎖核酸フラグメントを形成するときに生ずる。ヘテロ二量体二本鎖核酸フラグメント(以下、ヘテロ二量体フラグメントと称する)は、通常の一本鎖核酸フラグメントが変異を有する一本鎖核酸フラグメントと対となるときに、形成される(図２)。対になる２つの一本鎖核酸フラグメントが厳密には相補的でないので、ヘテロ二量体フラグメントはホモ二量体フラグメントよりも低い結合エネルギーを有する。
【００１３】
二本鎖核酸フラグメントを一本鎖フラグメントに完全に融解すること、およびこれらの一本鎖フラグメントから二本鎖核酸フラグメントを再形成することは、例えば、サンプルを加熱して二本鎖フラグメントを融解させ、次いでサンプルを再び冷却して一本鎖フラグメントから再び二本鎖核酸フラグメントを形成させ、次いで、ゲル電気泳動を用いて二本鎖核酸フラグメント互いに分離することにより、行われ得る。
【００１４】
次いで、異なる核酸フラグメントは、上記のように、当該フラグメントの部分的融解を生ずる勾配中で結合エネルギーの相違に基づき相互に分離される。ヘテロ二量体フラグメントは、ホモ二量体フラグメントより低い結合エネルギーを有し、そのため、より短い時間で部分的な融解と固定が行われる。
【００１５】
ヘテロ接合性変異が存在するとき、図２に示すように、２つのホモ二量体フラグメントおよび２つのヘテロ二量体フラグメントを含む、４種の二本鎖核酸フラグメントが形成される。ヘテロ二量体フラグメントは、少なくとも１塩基が対とならない、すなわち、向かい合う塩基と結合できないという事実により特徴付けられる。２つのヘテロ二量体フラグメントはより低い結合エネルギーを有し、そのため、ホモ二量体フラグメントよりも短い時間で部分的に融解し、ゲル中の異なる特定位置で固定される。塩基対は隣接塩基対の結合エネルギーに影響するので(すぐに隣接する塩基対にはより強く影響し、それより離れた塩基対にはより弱く影響する)、２種のヘテロ二量体フラグメントは異なる結合エネルギーを有する。２つのヘテロ二量体フラグメントの結合エネルギーの相対的な相違により、これらは、ゲル中の異なる位置(すなわち、例えば、異なる温度)で融解し、そのため、異なる位置で固定される。この手法で、例えば、異なる対立遺伝子を互いに分離することができる。
【００１６】
本発明の方法で使用される電気泳動は、好ましくはキャピラリー電気泳動である。この技術は、キャピラリー中にポリアクリルアミド等のゲルを配置することに基づく。キャピラリー中にサンプルが配置され、次いで、キャピラリーにわたって電圧がかけられる。サンプル中に存在する分子は、特にその大きさおよび／または電荷に基づき異なるスピードでキャピラリー中のゲルを通って移動し、こうして、互いに分離される。キャピラリー電気泳動の利点は、核酸フラグメントの場合、キャピラリー中のゲルにわたってより高い電圧をかけることが出来るので、分子がキャピラリー中をより速く移動し得るという事実にある。そのため、電気泳動ステップは、ずっと短い時間で行うことができる。これは、キャピラリーが非常に細く、そのため、キャピラリー中のゲルの抵抗が高いという事実の結果である。ゲルにわたって高い電圧がかかるとき、電流、およびそれより生ずる熱は、低いままである。発生した熱をより容易かつより迅速に放出できるように、キャピラリーの体積に対する表面積の割合は、より高くされる。ずっと低い粘度(実質的には液体)を有するゲルをキャピラリー中に配置することも可能である。ずっと低い密度を有する固体のゲルマトリクスを選択することも可能である。更なる利点は、非常に少量のサンプルを分析し得ることであり、それは、僅かな材料のみが利用可能であるときに特に重要となる。
【００１７】
キャピラリーの壁が非常に薄いことと、体積に対する面積の割合が大きいこととに起因して、さらに、迅速な熱転移を生じさせることが可能になり、急な温度勾配を適用し得る。そのため、非常に速い増幅ステップが可能であり、本発明による方法は相当速く行うことができる。
【００１８】
更に利点のある態様では、本方法は更に以下のステップを含む。
(ｅ)少なくとも部分的に融解した核酸フラグメントを再び二本鎖とするように、ステップ(ｂ)後に電気泳動条件を変え、それにより、分離された核酸フラグメントを、事実上は等速で、電気泳動ゲル中の特定位置からさらに移動させる。
【００１９】
分離された核酸フラグメントは、好ましくは、それらがキャピラリーから排出されるときに検出される。分離された核酸フラグメントをさらに電気泳動させることにより、異なるフラグメントが、特定の順序でキャピラリーから排出される。フラグメントは、例えば、分離前の核酸フラグメントに例えば蛍光標識を付与し、フラグメントがキャピラリーから排出される直前または排出されるときに適正な波長のレーザーでフラグメントを励起することにより、自動的に検出し得る。その後、感光セルを用いて蛍光を検出することができる。ＤＮＡフラグメントの標識の場合、蛍光物質が使用し得るが、他の形態の標識もまた可能である。フラグメントを標識することにより、本方法の感度は向上し、材料は少なくて済む。
【００２０】
しかし、例えば、キャピラリー中でフラグメントが移動する間、他の既知の検出方法もまた使用可能である。例えば、異なる時間にわたってＵＶ光をキャピラリーに照射し、カメラを用いて記録することも可能である。この方法では、例えば、ゲル中のフラグメントの特定位置を決定することもできる。
【００２１】
本発明による方法の特に適当な好ましい実施態様には更に、分離された核酸フラグメントをゲルから単離することが含まれる。その後、単離されたフラグメントを、例えば配列決定のような更なる分析に用い得る。
【００２２】
分離された核酸フラグメントは、例えば、それらがキャピラリーから排出されるときに単離され得る。他の単離方法として、キャピラリー中の特定位置を決定した後(例えば、上記のようにカメラを用いる)に、ゲルからフラグメントを単離してもよい。この目的の場合、(使い捨ての)キャピラリーを、例えば、正しい位置で切断することができ、その後、核酸フラグメントをキャピラリー片のゲル残留物(gel remnants)から単離することができる。分離された対立遺伝子は、例えば、この方法で分類し得る。
【００２３】
本発明において、二本鎖核酸フラグメントの少なくとも部分的な融解を生ずる勾配は、好ましくは温度勾配である。温度の漸進的または段階的増加により、二本鎖核酸フラグメントがそれらの結合エネルギーを得て融解し、ゲル中の特定位置に固定されるということを、単純な方法で達成可能である。温度勾配は、例えば、キャピラリーの上側部からその下側部へ適用されるが、例えば、時間的に適用される、すなわち実験の始めから終わりまでの時間にわたって適用されてもよい。
【００２４】
本発明の方法による、特に適当な他の態様では、少なくとも部分的な融解を生ずる勾配は、化学勾配である。
【００２５】
化学勾配は、好ましくは、尿素およびホルムアミドにより形成される。濃度が次第に増加する尿素およびホルムアミドの中では、核酸フラグメントは、より低い結合エネルギーを有するものからより迅速に融解して、ゲル中に固定される。
【００２６】
本発明では、上記勾配に加えて、二本鎖フラグメントの融解を生ずる他の勾配を適用することもできる。本発明の他の好ましい態様では、部分的な融解を生ずる勾配が、温度勾配および化学勾配の組合せからなる。
【００２７】
本発明による方法の特に好ましい態様では、いったん核酸フラグメントが互いに分離されてゲル中の特定位置で固定されると、電気泳動条件は、部分的に融解された核酸フラグメントが再び二本鎖となりそれにより分離フラグメントがキャピラリー中の特定位置から同じ速度でさらに移動するように、上記のように変更される。ここで、電気泳動条件の変更は、好ましくは、温度を下げることからなる。キャピラリー中の温度を低下させることにより、部分的に融解されたフラグメントは、再び二本鎖となり、更にゲル中の特定位置から、同じ相対的速度で移動し、特定の順序でキャピラリーから排出される。変異を有する二本鎖核酸フラグメントの大きさは、変異を有しない核酸フラグメントの大きさとは相違しないか殆ど相違しないので、それらの相対的速度は同じである。
【００２８】
ゲル中の核酸フラグメントの分離を、化学勾配または他の勾配を適用することにより行うとき、温度は分離後も同様に低下されてもよく、これにより、少なくとも部分的に融解したフラグメントは再び二本鎖となる。
【００２９】
核酸中の１つまたはそれより多い変異を検出することが望まれるサンプルは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのように核酸の形態で遺伝子材料が存在する、個体由来の任意の適当な材料、例えば、血液、精液、唾液および／または多様な組織細胞からなり得る。サンプルは最初に、核酸を単離するように処理され得る。核酸の抽出および精製は、当業者に既知の標準的プロトコールにより行う。例えば、ＲＮＡの場合のように、サンプル中に存在する核酸が一本鎖フラグメントからなるとき、最初に二本鎖核酸フラグメントが既知技術を用いて作成される。ＲＮＡの場合、例えば、この目的のために既知のＰＴ−ＰＣＲ技術を使用し得る。
【００３０】
本願明細書では、「変異」なる語句は、「通常」(野生型)の遺伝子材料に対する核酸フラグメント中の任意の変化をいう。ここで、変異核酸のヌクレオチド配列は、相当する非変異核酸のヌクレオチド配列とは、１つのまたはそれより多い相違を示す。その変異は、例えば、点変異(一般的には単一塩基対が相違するものであり、通常は他の塩基対で置換されている)である可能性があり、または１つもしくはそれより多いヌクレオチドの挿入もしくは欠失である可能性がある。本発明では、「変異」なる用語は更にまた、いわゆる多型性、すなわち、ある所与の遺伝子の自然集団中で生ずる対立遺伝子の相違をいう。
【００３１】
本発明は更に、上記方法を実行可能な装置に関連し、その装置を提供する。
【００３２】
本発明の装置は、ゲルを配置した多数のキャピラリーと、ゲルにわたって電圧をかけるための電圧源と、電気泳動を行う間に電気泳動条件を変えるための手段と、分離されたＤＮＡフラグメントを検出するための手段とを含む。キャピラリー中のゲルの上側部および下側部は両方とも、電極を配置した液体バスと接触している。本装置を用いて、本発明の方法を簡単かつ非常に迅速に実行することができる。
【００３３】
本発明の装置の好ましい態様では、当該装置は、非常に多数のキャピラリーを含むが、ここで、当該キャピラリー中のゲルの上側部が、実質的に全キャピラリー用の１つの一体化された液体バスに接触し、一体化された液体バス中に１つの電極が配置され、そして当該キャピラリー中の各電気泳動ゲルの下側部が、互いに別個の液体バスと接触し、別個の液体バス中にそれぞれ電極が配置されている。
【００３４】
適当な組み込み型電圧源により、キャピラリー中のゲルにわたる電極間に電圧をかけることができる。ゲルにわたってかけられる電圧は、可変にすることができるが、可変でなければならないということはない。
【００３５】
本発明の装置で使用し得る検出手段は、例えばクロマトグラフィーで通常使用される従来技術の検出手段であり、例えば、ＵＶ／可視光スペクトロホトメーターのようなものである。好ましくは、蛍光検出手段が、その良好な感度のために使用される。ただし、サンプル中の核酸フラグメントは、この目的のため、最初に標識されていなければならない。
【００３６】
本発明では、キャピラリー中の電気泳動条件を変更する手段は、好ましくは、電気泳動を行う間にキャピラリー中の温度を変更する手段からなる。
【００３７】
本発明の装置において、温度を変更する手段は、好ましくは、キャピラリーをクランプするいわゆるペルティエ素子、またはキャピラリーの周りに巻かれたペルティエコイルを含む。ペルティエ素子は、２種の異なる金属のストリップからなる。ペルティエ素子を流れる電流の強さおよび／または方向を変えることにより、ペルティエ素子は、冷却すると同時に加熱することができる(いわゆるペルティエ効果)。キャピラリー中の温度を電気泳動を行う間に変える際に使用可能な他の手段もあり、例えば、キャピラリーを取り囲む領域を加熱する加熱手段、例えば(ハロゲン)ランプを使用可能であり、例えば、冷風をキャピラリーに吹きつけてキャピラリーの温度を下げる冷却手段、例えばファンを使用可能である。
【００３８】
キャピラリー中の各ゲルの下側部が互いに別個の液体バスと接触しているので、分離された核酸フラグメントは、特定フラグメントがキャピラリーから排出された後、液体バスを交換することにより簡単に単離することが出来る。液体バスは、通常の既知の電気泳動緩衝液を含み、単離された核酸フラグメントは、沈殿または濃縮のような既知の技術を用いて緩衝液から回収され、更なる分析のために使用される。
【００３９】
特に適当な好ましい態様では、温度を測定する装置手段が少なくとも１つのキャピラリー中に配置される。増幅ステップを行う間、キャピラリー中の温度は、迅速に、できる限り正確に調節されなければならない。キャピラリー中の温度を測定する手段を配置することにより、増幅ステップを行う間におけるキャピラリー中の温度について、非常に信頼性のある示度が得られる。
【００４０】
ここで、温度を測定するための手段が、この目的のための適当な任意の手法で実現され得る。温度を測定する手段は、好ましくは、少なくとも１つのキャピラリー中に配置した白金抵抗ワイヤを含む。ここで、各キャピラリーが実質的に互いに同じ熱容量を有するように、キャピラリーは、例えば、水で充填されて密閉されることが可能である。
【００４１】
更に特に好ましい装置の態様では、キャピラリーは、サンプル中に存在する核酸フラグメントをキャピラリー中、ゲル中、またはゲル上で増幅するために、プライマーおよびｄＮＴＰで被覆されている。この手法では、変異を検出しようとしているサンプルと、ポリメラーゼとのみを、キャピラリー上に配置しなければならない。より好ましくは、キャピラリーは、プライマー、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼで被覆されている。
【００４２】
本発明はまた、上記の方法および装置において使用するキャピラリーに関係し、そのキャピラリーを提供し、ここで、当該キャピラリーは、プライマーおよびｄＮＴＰで被覆され、より好ましくはプライマー、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼで被覆されている。この目的のため、例えば、内側を被覆した使い捨てキャピラリーを使用し得る。
【００４３】
本発明は更に、添付の図を参照することにより説明され、ここで、
図１は、部分的に融解したＤＮＡフラグメントの概要図を示しており(本発明の方法のステップｂ)、
図２は、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成を概略的に示しており(本発明の方法のステップｄ)、
図３は、本発明の装置の好ましい態様の概要図(部分断面図)を示しており、
図４は、図３の詳細を示しており、そして
図５は、本発明の装置の他の適当な好ましい態様の概要図(部分断面図)を示している。
【００４４】
図３に示すように、装置１は、コンテナー３中に非常に多数のキャピラリー２を含み、ここで、ゲルは、キャピラリー中に配置される。キャピラリー２中のゲルの上側部４と下側部５の両方が、カソード８およびアノード９がそれぞれ配置されている液体バス６、７と接触している。キャピラリー２中のゲルの上側部４は、各キャピラリーのための一体化された液体バス６と接触し、各キャピラリー２のゲルの下側部５は、互いに別個の液体バス７と接触している。ここで、一体化された液体バス６の内部にはカソード８が配置され、各別個の液体バス７の内部にはそれぞれアノード９が配置されている。図４に、これをより詳細に示す。装置１は更に、電圧源１０を含み、さらに、キャピラリーを固定的にクランプしているいわゆるペルティエブロックからなる温度を変えるための手段１１(図４に概略を示す)を含む。
【００４５】
図４中に示す好ましい態様では、さらに、分離された核酸フラグメントを検出するための検出手段１２が存在し、この検出手段は、核酸フラグメントがキャピラリー２から排出されるとき当該核酸フラグメントを検出する。この検出手段は、例えば、標識された核酸フラグメントを励起するダイオードレーザー１３を含み、ここでフラグメントにより放出される蛍光は蛍光の検出手段１２により検出される。
【００４６】
図５は、本発明の装置の利点のある他の態様を示す。同様に、装置１は、ゲルを配置した多くのキャピラリー２を含み、キャピラリー２の上側部４は、全キャピラリー用の１つの一体化された液体バス６と接触しており、キャピラリー２の下側部５は、互いに別個の液体バス７と接触している。一体化された液体バス６の内部にはカソード８が配置され、各別個の液体バス７の内部にはそれぞれ別個のアノード９が配置されている。本態様では、キャピラリー中の温度を増加させる加熱手段およびキャピラリーに冷風を吹きつける冷却手段（図示せず）による、温度を変えるための手段１１が形成される。
【００４７】
本発明の方法における検出方法では、例えば、ＵＶ露光および高解像度ＣＣＤカメラを使用し得る。例えば、ＥｔＢｒまたはＳｙＢｒ−ｇｏｌｄにより標識されたフラグメントが検出され得る。例えば、蛍光標識したフラグメントがカラーＣＣＤカメラを用いて検出可能であり、ＵＶ光を遮断するフィルターを使用する。この目的に適当なソフトウェアを用いることにより、異なる色を後に可視化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、部分的に融解したＤＮＡフラグメントの概要図を示す。
【図２】  図２は、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成を概略的に示す。
【図３】  図３は、本発明の装置の好ましい態様の概要図を示す。
【図４】  図４は、図３の詳細を示す。
【図５】  図５は、本発明の装置の他の適当な好ましい態様の概要図を示す。