【手続補正書】
【提出日】平成23年9月1日(2011.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性高分子をサンプルから選択的に単離するための、またはサンプルに含まれる機能性高分子を精製するための方法であって、
ａ）機能性高分子を含有するサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相抽出（ＳＰＥ）装置に、機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程；および
ｂ）吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出し、それにより機能性高分子をサンプルから選択的に単離する、または機能性高分子を精製する工程、
を含む方法。
【請求項２】
複数の機能性高分子をサンプルから選択的に単離するための方法であって、
ａ）複数の機能性高分子を含むサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む第１固相抽出（ＳＰＥ）装置に、複数の機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程；
ｂ）吸着した機能性高分子をアルミナ吸着剤から溶出する工程；
ｃ）少なくとも１つの画分を収集する工程；
ｄ）少なくとも１つの画分を、充填アルミナ吸着剤を含む第２固相抽出（ＳＰＥ）装置に、少なくとも２つの機能性高分子がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程；および
ｅ）少なくとも２つの吸着した機能性高分子を第２固相抽出（ＳＰＥ）装置のアルミナ吸着剤から溶出し、それにより複数の機能性高分子をサンプルから選択的に単離する工程、
を含む方法。
【請求項３】
サンプル中の機能性高分子を検出するための方法であって、
請求項１に記載の方法に従って機能性高分子を精製する工程；および
ｃ）機能性高分子を検出する工程、
を含む方法。
【請求項４】
機能性高分子がペプチド、ポリペプチド、リン酸化ペプチド、糖ペプチド、好ましくはシアル化糖ペプチド、タンパク質、リンタンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、リン脂質、合成または天然ポリマー、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
機能性高分子がペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびリン脂質からなる群より選択され、並びに高酸性側鎖を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
機能性高分子がリン酸基、スルホン酸基もしくはシアリレート基を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり、好ましくは機能性高分子がリン酸化ペプチド、シアル化糖ペプチド、スルホン化ペプチドまたはスルホン化糖ペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ペプチドが、好ましくはＴ１８＿Ｐ、Ｔ１９＿１Ｐ、Ｔ４３＿１ＰおよびＴ４３＿２Ｐからなる群より選択されるリン酸化ペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
機能性高分子が酸性ペプチド、中性ペプチドまたは塩基性ペプチドを上回って選択的に単離される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
機能性高分子が酸性ペプチドを上回って選択的に単離される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＰＥ装置が微量溶出プレート、クロマトグラフィーカラム、薄層プレート、サンプル浄化装置、注入カートリッジ、マイクロタイタープレートおよびクロマトグラフィー準備装置からなる群より選択され、好ましくはＳＰＥ装置は微量溶出プレートまたはクロマトグラフィーカラムであり、より好ましくはＳＰＥ装置はＨＰＬＣ級アルミナ吸着剤で好ましくは充填された９６−ウェル微量溶出プレート、またはクロマトグラフィーカラム、好ましくはマイクロボアカラム、キャピラリーカラムもしくはナノカラムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アルミナ吸着剤がアルミナＡ、好ましくは約４．５のｐＨを有するアルミナＡ、アルミナＮ、好ましくは約７のｐＨを有するアルミナＮ、およびアルミナＢ、好ましくは約１０のｐＨを有するアルミナＢからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アルミナ吸着剤がＨＰＬＣ級であり、好ましくはアルミナＢであり、並びにＳＰＥ装置が微量溶出プレート、好ましくは９６−ウェル微量溶出プレートである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
アルミナ吸着剤粒子のサイズが約１８〜約３２μｍの範囲をとる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）サンプルが血液、尿、脊髄液、滑液、痰、精液、唾液、涙、胃液、およびこれらの抽出物並びに／又は希釈液／溶液からなる群より選択される生体液であるか、またはこれらから誘導され、或いは（ｂ）サンプルが反応混合物、調製用ＨＰＬＣ、クロマトグラフィー溶離液もしくは画分または環境サンプルであるか、またはこれらから誘導される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルを、ローディングに先立ち、酸溶液／有機溶液の混合液に溶解する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
酸溶液が約０〜約４の範囲、好ましくは約１〜約３の範囲のｐＨを有し、酸溶液がトリフルオロ酢酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルホン酸、リン酸、パラ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、重酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、ギ酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、シュウ酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸もしくは酢酸の水溶液から選択され、有機溶媒が有機溶液または有機溶媒と非有機溶媒の混合液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
有機溶媒がアセトニトリル、アセトン、エタノール、メタノール、２−プロパノール、エーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ベンゼン、トルエン、クメン、塩化メチレン、トリクロロメタン、四塩化炭素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジン−２−オンおよびジメチルスルホキシドから選択され、非有機溶媒が水である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
吸着した機能性高分子を、好ましくは水酸化アンモニウム溶液、トリエチルアミンもしくはリン酸ジアンモニウムから選択される塩基性移動相溶液でアルミナ吸着剤から溶出する、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
サンプルを第１ｐＨを有する溶液に溶解し、固相抽出（ＳＰＥ）装置にロードし、第２ｐＨを有する移動相溶液で機能性高分子をアルミナから溶出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ローディング工程で置換剤を添加することをさらに含み、置換剤が好ましくは置換カルボン酸誘導体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
機能性高分子を検出する工程をさらに含み、検出工程が好ましくは質量分析もしくは液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的混合物を含むサンプルからリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質を選択的に単離するための方法であって、
ａ）酸および有機溶媒を含む溶液中にサンプルを溶解する工程；
ｂ）溶解したサンプルを、充填アルミナ吸着剤を含む固相溶出プレートまたはカラムに、リン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質がアルミナ吸着剤に選択的に吸着するような条件下でロードする工程、ここで溶出プレートは好ましくは微量溶出プレートであり、カラムは好ましくはマイクロボアカラム、キャピラリーカラムまたはナノカラムである；
ｃ）塩基性移動相を用いてリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質をアルミナから溶出する工程；および
ｄ）単離されたリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはリン脂質を収集し、それによりリン酸化ペプチド、オリゴヌクレオチドもしくはリン脂質を選択的に単離する工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
微量溶出プレートが９６のウェルを含み、ＨＰＬＣ級アルミナ吸着剤で充填されており、アルミナが好ましくはアルミナＢであり、アルミナ吸着剤粒子のサイズが好ましくは約１８〜約３２μｍの範囲をとる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
充填アルミナ吸着剤を含む固相抽出（ＳＰＥ）装置および請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法に従って用いるための取扱説明書を含むキット。