【手続補正書】
【提出日】平成23年3月16日(2011.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
ｐＺＵＦｍＥａＤ８Ｓを含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体の機能解析
一般方法で述べられるようにして、プラスミドｐＺＵＦｍＥａＤ８Ｓ（配列番号５１、図８Ｂ）をＹ４００１Ｕ株に形質転換した。形質転換体をＭＭＬｅｕプレート上で選択した。３０℃で２日間の生育後、形質転換体を拾って新鮮なＭＭＬｅｕプレート上に再度画線培養した。ひとたび成長したら、これらの株を個々に３ｍＬの液体ＭＭＬｅｕに３０℃で接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は７つの形質転換体の全てで、総脂質の約６．５％のＤＧＬＡおよび９．４％のＥＤＡが生成されたことを示し、これらの７つ株のＥＤＡからＤＧＬＡへの変換効率は約４１％と判定された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４０】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較すると、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）Δ８デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較すると、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）Δ８デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、前記相補体および前記ヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、相補体
を含む、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる微生物宿主細胞。
２．単離されたポリヌクレオチドが、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、上記１に記載の微生物宿主細胞。
３．微生物宿主細胞が、酵母、藻類、細菌、ユーグレナ属、ストラメノパイル、および真菌からなる群から選択される、上記１に記載の微生物宿主細胞。
４．細胞がモルティエレラ属の真菌である、上記３に記載の微生物宿主細胞。
５．細胞が、スラウストキトリウム種、およびシゾキトリウム種からなる群から選択されるストラメノパイルである、上記３に記載の微生物宿主細胞。
６．酵母が油性酵母である、上記３に記載の微生物宿主細胞。
７．油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される、上記６に記載の微生物宿主細胞。
８．ａ）（ｉ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）エイコサジエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサジエン酸がジホモ−γ−リノール酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のジホモ−γ−リノール酸を回収するステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。
９．ａ）（ｉ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる
群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するΔ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）エイコサトリエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサトリエン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を生成する方法。
１０．微生物宿主細胞が配列番号３９に記載のΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子を含んでなるヤロウィア種であり、組み換えヌクレオチド分子がヤロウィア中での発現について最適化された少なくとも２０８個のコドンを含んでなる、上記８または９に記載の方法。
１１．ａ．）組み換え核酸分子が、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号３９からなる群から選択される核酸配列を有し、
ｂ．）宿主細胞がヤロウィア・リポリティカである、上記８または９に記載の方法。
１２．配列番号３９に記載のΔ８デサチュラーゼをコードして、少なくとも２０８個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較すると、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）Δ８デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と比較すると、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）Δ８デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、前記相補体および前記ヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、相補体
を含む、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる微生物宿主細胞。
【請求項２】
ａ）（ｉ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）エイコサジエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサジエン酸がジホモ−γ−リノール酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のジホモ−γ−リノール酸を回収するステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。
【請求項３】
ａ）（ｉ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するΔ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）エイコサトリエン酸源
を含んでなる微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、エイコサトリエン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を生成する方法。
【請求項４】
配列番号３９に記載のΔ８デサチュラーゼをコードして、少なくとも２０８個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。