【手続補正書】
【提出日】平成23年11月1日(2011.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における、TRA、TRB、TRG、TRD、IgH、IgK及びIgL遺伝子座から選択される少なくとも１つの遺伝子座のV(D)J再構成の組み合わせ多様性を、前記個体からの生体試料に由来するゲノムDNAから、インビトロ分析する方法であって、以下の：
A) 前記ゲノムDNAの複数のフラグメントを複数回のマルチプレックスPCRにより増幅する工程であって、その少なくとも1回は、以下の特徴：
(i) それぞれのプライマー対は、ある特定のV若しくはD遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するプライマーと、ある特定のJ遺伝子の下流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するプライマーとで構成されているので、2つの別々のV(D)J又はD-J再構成の特徴である少なくとも2つのフラグメントの増幅が可能になり；
(ii) 前記プライマーは熱力学的に併用でき；
(iii) 前記プライマーは、第1プライマー対を用いて増幅されるフラグメントが第2プライマー対を用いて増幅されるフラグメントと区別できるような様式で選択される；
を有する少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて行われるマルチ-n-プレックスPCR (n≧2)である工程と；
B) 工程Aで得られた増幅産物を検出する工程と；
C) 結果を解釈する工程と
を含む方法。
【請求項２】
工程B)が、DNAフラグメントの増幅のリアルタイム測定の工程を含み、工程C)が、以下：
(i) １つ、又は複数の曲線の半分未満の数であるいくつかの曲線が、他の曲線が第１曲線の変曲点の少なくとも２サイクル後、好ましくは第１曲線の変曲点の少なくとも３又は４サイクル後で変曲点を示すという、他の曲線と比較したシフトを示すか、或いは増幅を示さない場合に、結果は、クローン性又はオリゴクローン性のリンパ球増殖の存在を示し；
(ii) 逆に、全ての曲線が同じサイクルにて変曲点を示すか、又は2若しくは3増幅サイクルの最大シフトを示す場合、結果は、増幅されたフラグメントに相当する再構成の1つに起因するクローンのリンパ球増殖の仮定を棄却することを可能にする、
のようにして行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
40℃と95℃の間の温度上昇の間にそれぞれのチューブ中の蛍光を連続的に測定することによりリンパ球増殖を確認する工程をさらに含み、優勢なピークを観察することが、優勢なアンプリコン、すなわちリンパ球増殖の存在を示すが、よく似たサイズのいくつかのピークを観察することが、逆に、リンパ球多様性を示す請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR (n≧2)が、ある特定のV遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通センスプライマーを含む少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて行われ、それぞれのプライマー対が、ある特定のJ遺伝子の下流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するアンチセンスプライマーも含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、ある特定のJ遺伝子の下流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通アンチセンスプライマーを含む少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて行われ、それぞれのプライマー対が、ある特定のV遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するセンスプライマーも含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、TRB遺伝子座のある再構成を分析するために、以下の特徴を有する少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせ：
(i) 前記2つのプライマー対は、ある特定のV遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通センスプライマーを含み、それぞれは、ある特定のJ遺伝子の下流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するアンチセンスプライマーを含む；
(ii) 前記2つのアンチセンスプライマーは、TRB遺伝子座のJ遺伝子の2つの別々の群に属する2つの遺伝子Jy及びJzの下流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する；
(iii) 前記Jy遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jy遺伝子の始点との間の距離は、前記Jz遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jz遺伝子の遺伝子群のうちの最初のJ遺伝子の始点との間の距離よりも大きい
を用いて行われる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１回のマルチ-n-プレックスPCR 反応(n≧2)が、配列番号１の配列のhTRBJ1.6プライマー及び配列番号２の配列のhTRBJ2.7プライマーと、ある特定のV遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するセンスプライマーとを含む少なくとも３つのプライマーの組み合わせを用いて、ヒトTRB遺伝子座のある再構成を分析するために行われる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
24回のマルチ-n-プレックスPCR (n≧2)が、少なくとも３つのプライマーの組み合わせを用いて行われることによりヒトTRB遺伝子座のV(D)J再構成を分析するための請求項６又は７に記載の方法であって、プライマーのそれぞれの組み合わせは、請求項７で規定されるhTRBJ1.6プライマー及びhTRBJ2.7プライマーと、配列番号３〜２５の配列で規定されるプライマーから選択される少なくとも１つのhTRBVプライマーとを含む、方法。
【請求項９】
少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、ヒトTRB遺伝子座の不完全DJ再構成を分析するために、以下の特徴を有する少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせ：
(i) 前記2つのプライマー対は、ある特定のD遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通センスプライマーを含み、それぞれは、ある特定のJ遺伝子の下流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するアンチセンスプライマーを含む；
(ii) 前記2つのアンチセンスプライマーは、TRB遺伝子座のJ遺伝子の2つの別々の群に属する2つの遺伝子Jy及びJzの下流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する；
(iii) 前記Jy遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jy遺伝子の始点との間の距離は、前記Jz遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jz遺伝子の遺伝子群のうちの最初のJ遺伝子の始点との間の距離よりも大きい
を用いて行われる、TRB遺伝子座の不完全D-J再構成のインビトロ検出のための請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、TRB遺伝子座の不完全再構成を分析するために、ある特定のD遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するセンスプライマーと、請求項７で規定されるhTRBJ1.6プライマー及びhTRBJ2.7プライマーとを含む少なくとも３つのプライマーの組み合わせを用いて行われる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
(i) 配列番号１の配列のhTRBJ1.6プライマー及び配列番号２の配列のhTRBJ2.7プライマーと、配列番号２６および２７の配列で規定されるプライマーから選択されるhTRBD1プライマーとで構成される3つ組のプライマーを用いるマルチ-2-プレックスPCRと、(ii) hTRBJ2.7プライマーと、配列番号２８および２９の配列で規定されるプライマーから選択されるhTRBD2プライマーとで構成されるプライマー対を用いる単純マルチプレックスPCRとを行うことにより、ヒトTRB遺伝子座の全ての不完全再構成を分析するための請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒトTRA遺伝子のJ遺伝子の95%と、同じ遺伝子のある特定のV遺伝子との再構成を分析するための請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、工程A)において、6回のマルチ-2-プレックスPCR又は3回のマルチ-4-プレックスPCRが、V遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中とハイブリッド形成するプライマーと、対(配列番号３０、配列番号３１)、(配列番号３２、配列番号３３)、(配列番号３４、配列番号３５)、(配列番号３６、配列番号３７)、(配列番号３８、配列番号３９)及び(配列番号４０、配列番号４１)から選択される1つ又は2つのアンチセンスプライマー対とからそれぞれが構成されるプライマーの組み合わせを用いて行われる方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法が、TRA遺伝子座のV遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する、配列番号４２〜６１の配列から選択される少なくとも１つのプライマーを用いて行われる、TRA遺伝子座のVJ再構成の多様性を分析するための方法。
【請求項１４】
ヒトTRG遺伝子座の全てのJ遺伝子と、同じ遺伝子座の少なくとも２つのある特定の遺伝子Vx及びVyとの再構成を分析するための請求項１〜３及び５のいずれか１項に記載の方法であって、工程A)において、少なくとも1回のマルチ-2-プレックスPCRが、前記Vx及びVy遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する2つのセンスプライマーと、ヒトTRG遺伝子座のJ2遺伝子中とハイブリッド形成する配列番号６２の配列のhTRGJdo2アンチセンスプライマーとで構成される3つ組のプライマーを用いて行われる方法。
【請求項１５】
ヒトTRG遺伝子座のV遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する少なくとも１つのプライマーが、配列番号６３〜６６の配列で規定されるプライマーから選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトTRD遺伝子座の全てのJ遺伝子と、同じ遺伝子座のある特定のV遺伝子との再構成を分析するための請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、工程A)において、マルチ-2-プレックスPCRが、前記V遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中とハイブリッド形成するプライマーと、配列番号６７の配列のhTRDJ1do5アンチセンスプライマー及び配列番号６８の配列のhTRDJ3do2アンチセンスプライマーとで構成される３つ組のプライマーを用いて行われる方法。
【請求項１７】
24回のマルチ-n-プレックスPCR (n≧2)が、少なくとも３つのプライマーの組み合わせであって、プライマーのそれぞれの組み合わせがhTRDJ1do5アンチセンスプライマー及びhTRDJ3do2アンチセンスプライマーと、配列番号６９〜８４の配列で規定されるプライマーから選択される少なくとも１つのプライマーとを含む組み合わせを用いて行われることにより、TRD遺伝子座のVJ再構成を分析するための請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトIgH遺伝子座の全てのJ遺伝子と、同じ遺伝子座の少なくとも２つのある特定の遺伝子Vx及びVyとの再構成を分析するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、工程A)において、少なくとも１回のマルチ-2-プレックスPCRが、前記Vx及びVy遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する２つのセンスプライマーと、IgHJ6遺伝子の下流及び／又は該遺伝子の中とハイブリッド形成するアンチセンスプライマーとで構成される３つ組のプライマーを用いて行われる方法。
【請求項１９】
前記アンチセンスプライマーが、配列番号８５の配列のhIgHJ6do2プライマーである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトIgH遺伝子座のV遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する少なくとも１つのプライマーが、配列番号８６〜９１の配列で規定されるプライマーから選択される請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、ヒトIgH遺伝子座のある不完全再構成を分析するために、ある特定のJ遺伝子の下流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通アンチセンスプライマーを含む少なくとも２つのプライマー対を構成する少なくとも３つのプライマーの組み合わせを用いて行われ、それぞれが、ある特定のD遺伝子の上流及び／又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するセンスプライマーを含む、IgH遺伝子座の不完全D-J再構成のインビトロ検出のための請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記共通アンチセンスプライマーが、請求項１９で規定されるhIgHJ6do2プライマーであり、且つ／又は、ヒトIgH遺伝子座のD遺伝子の上流及び／若しくは該遺伝子の中とハイブリッド形成する少なくとも１つのプライマーが、配列番号９２〜９８の配列で規定されるプライマーから選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
増幅産物を検出する工程B)が、前記産物をそれらのサイズによって分ける工程を含み、且つ工程C)が、アンプリコンをそれらのサイズにより分けることにより得られるデータを処理する工程を含み、前記処理が、コンピュータにより行われ、観察されたそれぞれのアンプリコンに、対応するV(D)J再構成の名称を割り当てることを可能にする請求項４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
データ処理が、対応するV(D)J再構成の相対的頻度を定量するために、観察されたそれぞれのアンプリコンのシグナル強度も統合する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
以下の：
A) 個体からの生体試料を用いてリンパ球計数を行う工程と；
B) 同じ試料又は同じ個体から同時に採取された別の試料を用いて、前記個体のリンパ球のレパートリーの組み合わせ多様性の程度を、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法を行うことにより決定する工程と；
C) 工程A)及びB)で得られたデータを組み合わせる工程と
を含む個体の免疫不全の程度をインビトロで決定する方法。
【請求項２６】
危険性のレベルを、少なくとも以下の４つのゾーン：
(i) 低い計数(＜1000 Ly/μL)及び低いV-J組み合わせ多様性(＜40%)：高い感染の危険性及び感染による高い死亡の危険性；
(ii) 低い計数(＜1000 Ly/μL)、しかし正常なV-J組み合わせ多様性(＞65%)：低い感染の危険性；
(iii) 正常の計数(1000〜3200 Ly/μL)及び低いV-J組み合わせ多様性(＜40%)：中程度の感染の危険性；
(iv) 正常の計数(1000〜3200 Ly/μL)及び正常なV-J組み合わせ多様性(＞65%)：免疫レパートリーは健常である、
に割り当てるグラフの観点から、工程C)で得られた組み合わせを解釈する工程も含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程B)が、前記個体のTリンパ球及びBリンパ球のレパートリーの組み合わせ多様性の程度を決定することを含み、工程C)において、データが、第1軸に免疫グロブリン多様性の程度、第2軸にTCR多様性の程度、第3軸にリンパ球計数を示す3次元グラフにより調べられる請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項で規定されるプライマーの組み合わせと、PCRを行うための試薬とを含む請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項２９】
それぞれのウェルが異なる組み合わせのプライマーを含むマルチウェルプレートを含み、前記マルチウェルプレートが、TRA、TRB、TRG、TRD及びIgH遺伝子座から選択される少なくとも１つの遺伝子座のV-J再構成の少なくとも50%を増幅するために必要なプライマーの組み合わせを全て含む請求項２８に記載のキット。