【手続補正書】
【提出日】平成23年3月16日(2011.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
精製ＫＡＲＩにおける活性アッセイ
本実施例で用いられるアッセイ条件は、２０％（ｖ／ｖ）精製試料５μＬを細胞抽出物の代わりに用いたこと以外では実施例２の場合と同じであった。精製試料のタンパク質濃度およびその比活性を表７に示す。試験対象の最速の成長者（ｇｒｏｗｅｒ）である精製ＰＦ５−ＫＡＲＩの比活性は、Ｋ１２−ＫＡＲＩの比活性の２倍であった。これらの結果が実施例２におけるこれら２種の酵素の粗製剤を用いて得られたデータと一致することから、最少培地中での成長の間での倍加時間が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酵素よりも高い比活性を有するＫＡＲＩ酵素を同定するための手段として用いられうるという仮説に対してさらなる支持が得られる。
【表８】
2010524470.tif 000001
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．アセトラクテートをジヒドロキシ−イソバレレートに変換するための方法であって、
ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性よりも高い比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを含む微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をアセトラクテートと接触させるステップであって、２，３−ジヒドロキシイソバレレートが生成されるステップと、
を含む方法。
２．遺伝子コンストラクトが、以下の条件：
ａ）約７．５のｐＨ、
ｂ）約２２．５℃の温度、および
ｃ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする、上記１に記載の方法。
３．イソブタノールを生成するための方法であって、
ａ）以下の遺伝子コンストラクト：
１）ピルベートをアセトラクテートに変換する（経路ステップａ）アセトラクテートシンターゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
２）（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（経路ステップｂ）において、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ii）約２２．５℃の温度、および
iii）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
３）２，３−ジヒドロキシイソバレレートをα−ケトイソバレレートに変換する（経路ステップｃ）ためのアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
４）α−ケトイソバレレートをイソブチルアルデヒドに変換する（経路ステップｄ）分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
５）イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換する（経路ステップｅ）ための分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をイソブタノールが生成される条件下で成長させるステップと、
を含む方法。
４．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトがシュードモナスから単離される、上記１〜３のいずれか一つに記載の方法。
５．宿主細胞が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、上記１〜３のいずれか一つに記載の方法。
６．宿主細胞が、クロストリジウム、ザイモモナス、エシェリキア、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、乳酸桿菌、腸球菌、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ピキア、カンジダ、ハンセヌラ、ビブリオおよびサッカロミセスからなる群から選択される属のメンバーである、上記４に記載の方法。
７．宿主細胞が大腸菌である、上記６に記載の方法。
８．細胞がラクトバチルス・プランタルムである、上記６に記載の方法。
９．細胞がサッカロミセス・セレビシェである、上記６に記載の方法。
１０．アセトラクテートシンターゼが配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する、上記３に記載の方法。
１１．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記１〜３のいずれか一つに記載の方法。
１２．アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する、上記３に記載の方法。
１３．分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼが配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する、上記３に記載の方法。
１４．分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼが配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する、上記３に記載の方法。
１５．大腸菌ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性を超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を含む組換え宿主細胞。
１６．ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素が、以下の条件：
ａ）約７．５のｐＨ、
ｂ）約２２．５℃の温度、および
ｃ）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有する、上記１５に記載の組換え宿主細胞。１７．以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ii）約２２．５℃の温度、および
iii）約１０ｍＭ超のカリウム；
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする遺伝子コンストラクトの同定および単離のための方法であって、
ａ）Ｍ９最少培地中で成長させる場合、大腸菌の倍加時間よりも短い倍加時間を有する細菌種を同定するステップと、
ｂ）（ａ）の細菌種をケトール酸レダクトイソメラーゼ活性についてスクリーニングし、活性細菌種を同定するステップと、
ｃ）（ｂ）の活性細菌種のゲノムＤＮＡを、ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードすることで知られる遺伝子コンストラクトに対して相同性を有する核酸配列でプローブし、前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子コンストラクトを同定し、単離するステップと、
ｄ）前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする前記遺伝子コンストラクトを増幅し、発現するステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の前記発現された遺伝子コンストラクトを、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ii）約２２．５℃の温度、および
iii）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するものについてスクリーニングするステップと、
を含む、方法。
１８．活性細菌種が、クロストリジウム、ザイモモナス、エシェリキア、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、ビブリオ、乳酸桿菌、腸球菌、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、およびブレビバクテリウムからなる群から選択される、上記１７に記載の方法。
１９．ステップ（ａ）の倍加時間が、Ｍ９最少培地中で成長させる場合、大腸菌の倍加時間の８０％以下である、上記１７に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトラクテートをジヒドロキシ−イソバレレートに変換するための方法であって、
ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性よりも高い比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼを有するポリペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを含む微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をアセトラクテートと接触させるステップであって、２，３−ジヒドロキシイソバレレートが生成されるステップと、
を含む方法。
【請求項２】
イソブタノールを生成するための方法であって、
ａ）以下の遺伝子コンストラクト：
１）ピルベートをアセトラクテートに変換する（経路ステップａ）アセトラクテートシンターゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
２）（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（経路ステップｂ）において、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ii）約２２．５℃の温度、および
iii）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
３）２，３−ジヒドロキシイソバレレートをα−ケトイソバレレートに変換する（経路ステップｃ）ためのアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
４）α−ケトイソバレレートをイソブチルアルデヒドに変換する（経路ステップｄ）分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
５）イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換する（経路ステップｅ）ための分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクト；
を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をイソブタノールが生成される条件下で成長させるステップと、
を含む方法。
【請求項３】
大腸菌ケトール酸レダクトイソメラーゼの比活性を超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を含む組換え宿主細胞。
【請求項４】
以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ii）約２２．５℃の温度、および
iii）約１０ｍＭ超のカリウム；
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素をコードする遺伝子コンストラクトの同定および単離のための方法であって、
ａ）Ｍ９最少培地中で成長させる場合、大腸菌の倍加時間よりも短い倍加時間を有する細菌種を同定するステップと、
ｂ）（ａ）の細菌種をケトール酸レダクトイソメラーゼ活性についてスクリーニングし、活性細菌種を同定するステップと、
ｃ）（ｂ）の活性細菌種のゲノムＤＮＡを、ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードすることで知られる遺伝子コンストラクトに対して相同性を有する核酸配列でプローブし、前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子コンストラクトを同定し、単離するステップと、
ｄ）前記活性細菌種由来のケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする前記遺伝子コンストラクトを増幅し、発現するステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）の前記発現された遺伝子コンストラクトを、以下の条件：
ｉ）約７．５のｐＨ、
ii）約２２．５℃の温度、および
iii）約１０ｍＭ超のカリウム
のもとで行われるＮＡＤＰＨ消費アッセイによって測定される際、精製タンパク質に基づく１．１μモル／分／ｍｇを超える比活性を有するものについてスクリーニングするステップと、
を含む、方法。