【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年10月17日(2011.10.17)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】バイオセンサーに用いる新しい化学
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、2007年10月17日付け出願番号第60/980,733号および2008年8月7日付け出願番号第61/087,094号および第61/087,102号の米国仮特許出願の利益、およびそれらに対する優先権を請求し、そのすべての開示を、参照することによってそのまま全体として本明細書に組み込む。
【０００２】
技術分野
本発明は、新規な組成物および標的被分析物のE0の変化を用いる被分析物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
電子移動反応は、光合成から酸素呼吸まで、多種多様な生物学的変換における重要な工程である。化学的、および生物学的な系における電子移動反応の研究は、大規模な知識および強い理論的な基礎の開発を導き、それは少数のパラメータに関して電子移動速度（率）を記述する。
【０００４】
タンパク質および他の生物学的分子における電子トンネル効果(electronic tunneling)は、酸化還元（redox）中心の電子相互作用が比較的弱い場合の反応において起こる。半古典論の反応は、電子移動の反応速度が、原動力（driving force）（-ΔG°）、核の再配置パラメータ（λ）、および遷移状態（HAB）での反応体および生成物の間での電子結合強度（electronic-coupling strength）に依存し、次の方程式によると予測する。すなわち
【数１】
2011501161.tif 000001
【０００５】
上記の方程式において、核の再配置エネルギー（reorganization energy）、λは、生成物の平衡核立体配置（equilibrium nuclear configuration）での反応体のエネルギーとして規定される。極性溶媒中の電子移動反応では、λへの主要な貢献は、反応体の電荷分布における変化に応じた溶媒分子の再配向（reorientatioan）から生じる。λの第2の構成要素は、ドナーおよびアクセプターの酸化状態における変化による、結合の長さ、および角度における変化に由来する。
【０００６】
以前の研究では、再配置エネルギー、λにおける変化を新規センサーの基礎として用いることが記述される。たとえば、特許文献１〜４を参照し、すべてを、参照することによってそのまま全体について本明細書に組み込む。これらの方法は、一般に酸化還元活性複合体に、またはそれの近くで被分析物を結合することを含む。酸化還元活性複合体は標的被分析物を結合する少なくとも1つの電気活性（electroactive）分子および捕獲（capture）リガンドを含み、そして複合体は電極に結合する。被分析物の結合により、酸化還元活性分子の再配置エネルギーが変えられ、このようにして、E0が変わり、そして検出が許される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第6,013,459号明細書
【特許文献２】米国特許第6,013,170号明細書
【特許文献３】米国特許第6,248,229号明細書
【特許文献４】米国特許第7,267,939号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、酸化還元活性分子のE0における変化と対応する、溶媒再配置エネルギーにおける変動を用いた（例えば、バイオセンサーの遷移金属とシアノリガンドを利用する）、標的被分析物の検出のための組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、標的被分析物の検出において使用するための、バイオセンサーに関する方法および組成物を提供する。
【００１０】
一つの側面において、本発明は特定のE0を有する共有結合的に付着した電気活性複合体（EAM）含有の電極を含む固形支持体（しばしば、本明細書において「基材（substrate）」と称する）が含まれる組成物を提供する。基材は任意に、電極のアレイ（array）を含むことができる。電極（群）は各々、任意にReAMCの一部分であることができるEAMを含有する。適切な遷移金属には、鉄、ルテニウムおよびオスミウム、ならびに本明細書で概説される他のものが含まれる。いくつかの実施態様において、EAMsは、少なくとも1つのシアノリガンドを含み、また、2、3、4および5つでも本発明における使用が見出された。EAMs（ならびにReAMCsおよび希釈剤SAM形成性種）は、付着（attachment）リンカー（アルキル基（置換されたアルキル基が含まれる）を含む）を用いて電極に連結されることができる。
【００１１】
更なる側面では、電極は任意に自己組織化単分子層（self assembled monolayer, SAM）種を含む。
【００１２】
追加の側面では、本発明のEAM/ReAMCsは、アンカーリガンドを用いる電極に付着し、それは「単足性（unipodal）」または「多足性（multipodal）」であることができ、たとえば、2つの硫黄原子または環状ジスルフィドアンカー基のような二足性付着の使用が含まれる。
【００１３】
更なる側面では、EAMは、前記EAMおよび捕獲リガンドを含む酸化還元活性捕獲複合体（REAMC）の一部分である。一つの側面において、捕獲リガンドは、配位（coordination）原子を遷移金属に提供する。追加の側面では、電極が、EAMを含む第1の種および捕獲リガンドを含む第2の種が含むよう、捕獲リガンドはEAMとは分かれている。
【００１４】
一つの側面において、捕獲リガンドは、ペプチドを含むタンパク質、または炭水化物（carbohydrate）である。
【００１５】
追加の側面では、本明細書に概説されるように、本発明は、試料を、電極が含まれる組成物と接触させることを含む、標的被分析物を検出する方法を提供する。標的分析物を捕獲リガンドと結合させることは、EAMのE0を変え、たとえば、第2のE0を作り出し、それは標的分析物の存在、または不存在を決定するために測定される。
【００１６】
更なる側面では、本発明は、第1の官能基を含む第1の種（通常はSAM形成性種（SAM forming species））が含有される電極を提供することを含む、バイオセンサーを作成する方法を提供する。電極は、第1の種と生体分子の間で共有結合を形成するために第2の官能基を含む生体分子（それは、捕獲リガンドになる）と接触される。電極はまた、本発明のバイオチップを形成するための、電気活性複合体（EAM）を含有する。いくつかの側面では、各々の分子上の官能基は、マレイミド、イミドエステル、N-ヒドロキシサクシニミジル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アルファ-ハロアシルおよびピリジル（pryidyl）ジスルフィドおよびシステインを含む部分からなる群から選ばれる（例えば、第1の官能基はマレイミドを含み、そして生体分子は、システインアミノ酸を含むタンパク質（例えば、ペプチド）である。
【００１７】
追加的な側面では、本発明には、次の式
アンカー-スペーサー1-EAM-（スペーサー2）n-CL
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
EAMは電気活性部分であり、溶媒接触可能（solvent accessible）酸化還元化合物を含有し、
CLは捕獲リガンドであり、
スペーサー1はSAM形成性種であり、および
n=0または1である）
を有する化合物が包含される。
【００１８】
更なる側面では、本発明には、次の式
アンカー-スペーサー1-EAM-（スペーサー2）n-CL      （I）
（式中、EAMは遷移金属および少なくとも1種の電荷中和性（charge-neutralizing）リガンドを含む電気活性部分である）
を有する化合物が包含される。電荷中和性リガンドは、次の、ジチオカルバメート、ベンゼンジチオレート、シッフ塩基、EDTA、DTPA、カルボン酸塩、アミン、チオレート、ホスフィン、イミダゾール、ピリジン、ビピリジン、テルピリジン、tacn（タクン）、サレン（salen）、acacen（アカセン）、Cp、ピンサー（pincer）、スコルピオネート（scorpionates）およびペンタアンミン（pentaammine）からなる群より選ぶことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1A-1Cはいくつかの本発明の化合物を描く。図1Aはここで、スペーサーを通して酸化還元（ここでは、ルテニウムの例を含むことが示される）に連結される捕獲リガンドを一端部に含む化合物を示す。化合物はまたアンカーを含み、それを通して、化合物は電極の表面に付着される。また、同様に電極の表面に付着される絶縁体（110）が示される。図1Bおよび1Cは、化合物が複数金属を含有することを描く。CLが「捕獲リガンド」であるような、示されるようなジオメトリー（geometry）は、単一のタンパク質を引き付け、そしてそれが2つの金属中心と同時に相互作用させ、より一層大きな電位（potential）の変化を与える。
【図２】図2はBPAlアンカーを有する[BIM-Ru(NH3)4L]2+複合体およびBPAアンカーを有する[Ru(NH3)5L]2+複合体を描く。
【図３】図3はBIPODベースの化合物を描く。
【図４Ａ】図4Aはアルキルチオールアンカーを有する[BIM-Ru(NH3)4L]2+複合体を描く。
【図４Ｂ】図4Bは共役チオールアンカーを有する[Ru(NH3)5L]2+複合体を描く。
【図５Ａ】図5AはRu-Nベースの複合体の新しいアーキテクチャーを描く。
【図５Ｂ】図5BはRu-Nベースの複合体の例を描く。
【図６Ａ】図6Aは、増幅を伴う検出のための、修飾されたプルシアンブルー表面を図式的に描く。
【図６Ｂ】図6Bは、電位シフトを高めるための、クラウンエーテル配位の使用を描く。
【図７】図7は、第2の球状配位、Ru(NH3)5Lおよび18-C-6の間の付加物形成の効果を描く。
【図８Ａ】図8Aおよび8Bは、複数金属が用いられるとき、「単一」および「隣り合う」アレンジメントにおいて用いるリガンドを描く。
【図８Ｂ−１】上記と同様の図である。
【図８Ｂ−２】上記と同様の図である。
【図９Ａ】図9は、被分析物の検出のために化合物を生じさせるためのビルディングブロックのいくつかを描く。
【図９Ｂ】上記と同様の図である。
【図１０】図10Aおよび10Bはいくつかの例示的な化合物を描く。
【図１１】図11はいくつかの例示的な化合物を描く。
【図１２】図12および13は、本発明の適切なジオメトリーのいくつかの概略図を描く。図12AおよびCは、リンカーが電極に対して一端部にて付着し、そして他の端部が配位原子を遷移金属(TM)のために提供するリガンド(L)で終わる状況を描く。捕獲基材（CS）は追加のリガンド（描いていない）を提供し、そして複数の他のリガンドは残留する配位原子を提供する。酵素による作用の際、捕獲基材は、脱離基(X)を生じる。これらの図は、遷移金属が6つの配位原子を利用する状況を描くが、金属に応じて他の数の配位原子を用いることができることに留意する必要がある。同様に、これらの図は、単一の配位原子を提供するリガンドの使用を描くが、多重の（複数の）配位原子（例えば、多座の）リガンドが提供される少数のリガンドのを同様に用いることができる。図12Bは、捕獲基材およびEAMが別々に電極に付着される状況を描く。図12Cは、捕獲基材が配位原子を遷移金属に提供しないこと以外は、図3Aに似た状況を描く。、溶液におけるEAMの電気化学ポテンシャルが標的酵素の酵素活性の結果として変えられることができるという点で、溶液相系（solution phase system）が図12および14と似ていることができることを理解すべきである。
【図１３】上記と同様の図である。
【図１４】図14は本発明でのバイオチップを生産するための一般的なスキームを描く。
【図１５】図15は図14の生産の特定の例を示す。
【図１６】図16A、B、CおよびDは、いくつかの例示的な化合物を描く。
【図１７】図17A、B、CおよびDは、いくつかの例示的な化合物を描く。類似の化合物は、例えばジスルフィド環状アンカー基のような異なるアンカーまたは異なるスペーサーとともに構築することができる。
【図１８】図18AおよびBは、いくつかの例示的な化合物を描く。類似の化合物は、例えばジスルフィド環状アンカー基のような異なるアンカーまたは異なるスペーサーとともに構築することができる。
【図１９】図19は合成の一般的なスキームを描く。
【図２０】図20は一般的な検出スキームを描く。
【図２１Ａ−Ｂ】図21A、B、C、DおよびEは、いくつかの例示的な化合物を描く。類似の化合物は、例えばジスルフィド環状アンカー基のような異なるアンカー、または異なるスペーサーとともに構築することができる。
【図２１Ｃ−Ｅ】上記と同様の図である。
【図２２】図22は合成の一般的なスキームを描く。
【図２３】図23はアッセイのために合成の一般的なスキームを描き、これは、「Novel Chemistry used in Biosensors（バイオセンサーにおいて用いる新規な化学）と題され、参照することによって本明細書中にはっきりとその全体において組み込まれる、2008年10月17日にファイルされたUSSN ______にも記述される。
【図２４】FIG 24は捕獲リガンドを描く。
【図２５Ａ−Ｂ】図25A、B、CおよびDは、いくつかの例示的な化合物を描く。類似の化合物は、例えばジスルフィド環状アンカー基のような異なるアンカー、または異なるスペーサーとともに構築することができる。
【図２５Ｃ−Ｄ】上記と同様の図である。
【図２６Ａ−Ｂ】図26A、B、CおよびDは、EAMとしてフェロセンを用いるいくつかの例示的な化合物を描く。似た化合物は、例えばジスルフィド環状アンカー基のような異なるアンカー、または異なるスペーサーとともに構築することができる。
【図２６Ｃ−Ｄ】上記と同様の図である。
【図２７】図27AおよびBは、いくつかの例示的な化合物を描く。似た化合物は、例えばジスルフィド環状アンカー基のような異なるアンカー、または異なるスペーサーとともに構築することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳しい説明
本発明は、標的被分析物およびバイオセンサーの相互作用の際、観察されたE0における改変によって証明されるような、再配置エネルギー、λにおける変化に依存する電気化学的バイオセンサーの改善に向けられる。以前に示すように、再配置エネルギーにおける変化に依存するバイオセンサーが記述された。本発明は、シアノリガンドを電気活性部分（EAMs）の遷移金属のために利用することなどの驚くべき改善を示した。シアノリガンドは、E0の変化における驚くべき増加を提供し、例えば、E0のデルタは、他の荷電されたリガンドについて見られるものよりも高い。
【００２１】
I.  再配置エネルギーの概説
本発明は、酸化還元活性分子および電極の間で電子移動（electron transfer）を容易にするか、または妨げるような被分析物の結合の際の、酸化還元活性分子の再配置エネルギーにおける変化を用いる標的被分析物の検出のための方法および組成物を提供する。この発明は、遷移金属イオンのような酸化還元活性分子が酸化される（電子を失う）か、または還元される（電子を得る）とき、変化が、分子構造において、ならびにその直近の溶媒（immediate solvent）の環境において生じるという事実に基づく。分子構造（結合長さおよび角度）での、そして分子を取り巻く溶媒分子の組織（化）でのこれらの変化は、新規な酸化状態を力強く安定させるのにはたらく。これらの変化の合計は、酸化還元反応の再配置エネルギー、λを構成する。分子内変化は内圏（inner-sphere）再配置エネルギー、λiと称され、そして溶媒および環境における変化は、外圏（outer-sphere）または溶媒再配置エネルギー、λoと称される。
【００２２】
この発明の目的のために、第１の焦点（primary focus）は溶媒の再配置エネルギーにおける変化上にあるが、内圏再配置における変化は本発明のいくつかの実施態様において考慮される。この発明の意図は、電気活性分子（EAM）が、対象の被分析物（例えば、タンパク質（proteint）または細菌）に選択的に結合することができる捕獲リガンド（CL）に付着されるとき、酸化還元反応の再配置エネルギーにおける変化を十分に利用する（capitalize on）ことである。EAM-CLを被分析物に対し結合させることは、EAMの溶媒環境における変化を招き、これにより、EAMに関与する酸化還元反応のための再配置エネルギーが変化する。酸化還元反応が電極およびEAMの間で電子移動に関与する場合について、標準電位（E0）は変化する。このように、EAM-CL複合体（錯体）のE0における変化は、それが被分析物（anlyte）に結合することの表れである。結合の指標としてのE0における変化、そして結果として、被分析物の存在または不存在を検出することが、この発明の意図である。
【００２３】
電子移動を使う、被分析物の検出のための慣習的な方法論において、通常、結合対の1つのメンバー（例えば、抗体および抗原）に付着したラベルまたはタグとして、EAMを採用する。これらの方法では、酸化または還元の際、最小の溶媒再配置を有する電気活性分子を用いることによって、外圏溶媒効果が最小であるようにEAMが選ばれる。そのようなEAMは一般に、水とほとんど相互作用をもたない大きな疎水性リガンドを含む。このように、伝統的に用いられる遷移金属イオンのためのリガンドは無（非）極性であり、そして概して、疎水性であり、しばしば有機環（例は、ビピリジルおよびテルピリジル）を含む。全電子移動反応の大きさが、予め定められた電極電位にて測定される（電流（curent））ので、慣習上そのようなEAMが選ばれる。
【００２４】
理論に束縛されるものではないが、この発明に最も適切な酸化還元分子は、酸化還元反応が水性環境において、大きな溶媒再配置エネルギーをもつものであると予想される。増加を安定させるか、または変化を減少させるための再配置は、いくつかの現象に起因することができる。水のような極性溶媒において、酸化還元分子の電荷は、酸化還元分子の近くの環境において極性溶媒の分子の方向性によって安定化される。極性分子が分子の異なる原子上でわずかな電荷変動（バリエーション）しかもたないので、酸化還元分子の周りのそれらの方向性はそれを安定化させるのを助けることができる。さらに、CN-のようないくつかのリガンドはそれら自体で、極性であり、そして原子上の部分的な電荷をもつ。これらの極性のリガンドはそれら自体で、溶媒分子を囲むことでの方向性を誘導することができる。荷電された酸化還元分子の安定化（または不安定化）はまた、酸化還元分子中の遷移金属のリガンドに対する溶媒および/または他の水素結合によっても起こることができる。溶媒分子、ならびに酸化還元分子を囲む溶媒における他の分子は、それらのドナー数またはアクセプター数に基づいて特徴付け、そして比較することができる（Neyhart et al.（ネイハートら）, J. Am. Chem. Soc（ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ）118 (1996年) 3724-29頁、参照することによって本明細書に組み込む）。特定の溶媒の使用、または好ましいドナー数またはアクセプター数をもつ分子の溶媒への特定の添加剤の使用は、酸化還元反応の溶媒再配置エネルギーに影響を及ぼす。さらに、酸化還元分子の電荷における変化は、溶媒中の荷電されたイオンによって安定化される。このように、被分析物の結合の際の溶媒再配置変化における変化は、電解質の適した選定によって最大化することができ、イオン上の電荷、イオンの濃度、イオンのサイズおよびイオンの疎水性が考慮される。
【００２５】
理論に束縛されるものではないが、酸化還元分子の安定化を、選択した溶媒系中で最大にすること（すなわち、その溶媒再配置エネルギーを最大にすること）が好ましく、それは酸化還元分子を安定化させる現象が、酸化還元分子/捕獲リガンド複合体であるEAM-CLの被分析物に対する結合の際に妨げられるためである。そのような状況の下で、E0での変化によって証明される再配置エネルギーにおける変化が最適であると予想される。CLが被分析物に結合することは、被分析物（例は、タンパク質）の表面上、あるいは裂け目またはポケット中の環境中に、EAMを「強制する」と予想され、これは溶媒環境の最適な組織化にはより一層有利でない。1つの実施態様において、結合は立体障害のため、EAMの近くで水分子の脱落を引き起こすと予想される。
【００２６】
溶媒再配置エネルギーが、結合の際に増加するか、または減少するかどうか（およびE0がより一層多くの正の電位またはより一層多くの負の電位になるか（nives to）どうかは、EAMの特定の電荷に依存することに注目するべきであるが、理論によって拘束されるものではない。モニターされているEAMの酸化還元反応が、EAM3+へのEAM2+の酸化のようなEAMの増加した電荷を招く場合、EAM-CLの結合された環境は、結合されてないEAM-CLよりも、再配置によって安定化されない。それゆえに、E0がより一層多くの正電位へ移ることが予想される。あるいはまた、モニターされているEAM酸化還元反応が、EAM-へのEAM2-の酸化のようなEAMの減少した電荷を招く場合、結合されてないEAM-CLは、結合されたEAM-CLよりも、再配置によって少なくしか安定化されない。それゆえに、あるものはE0がより一層少ない正電位へ移ると予想される。
【００２７】
理論に束縛されるものではないが、本発明において活用されうる2つの一般的なメカニズムがある。第1のものは、酸化還元ラベルによる内圏変化に関する。この実施態様では、標的被分析物を、立体的にEAMの近くにある捕獲リガンドに結合することは、EAMの、小さな極性のリガンドの1つまたは複数を、標的被分析物によって供給される1つまたは複数の配位原子によって置き換えられるようにし、少なくとも2つの理由のために、内圏再配置エネルギーにおける変化が引き起こされる。まず、推定的により一層大きなリガンドのための、小さな極性のリガンドの交換は、概して、より一層多くの水を金属から除外し、要求される溶媒再配置エネルギー（すなわち内圏λi効果）を下げる。第2に、比較的小さな酸化還元活性分子への概して大きな標的被分析物の接近は、金属イオンの第1または第2の配位圏（coordination sphere）内で水を立体的に除外し、また、溶媒再配置エネルギーが変化する。
【００２８】
あるいはまた、本発明は、置換的に（substitutionally）不活性なリガンド、加えて外圏効果に依存する。この実施態様において、金属イオンの上で、標的分析物の配位原子による極性リガンドの交換がある。むしろ、この実施態様において、極性のリガンドは、金属イオンに効果的に不可逆的に結合し、そして、標的被分析物の結合の結果としての金属イオンの第1または第2の配位圏における水の排除の結果、溶媒再配置エネルギーにおける変化が得られ、本質的に、水は排除される（すなわち、外圏λo効果）。
【００２９】
本発明は、新規なアーキテクチャーを有する化合物および標的被分析物の検出のためにこれらの化合物を用いる方法を提供する。
【００３０】
いくつかの実施態様において、標的被分析物は捕獲リガンドと結合する。いくつかの実施態様において、標的被分析物は酵素であることができ、そして酵素的事象（米国特許出願第61/087094号に記述されるようなものであり、参照することによって、その全体において本明細書に組み込む）。の結果としてE0が変化する。
【００３１】
本発明の実施態様において、おそらく、標的被分析物の導入の際の再配置エネルギーの変化により、E0において変化がある。より一層十分に下記で議論するように、様々な因子に従って、変化はE0における正または負のシフトのいずれかでありうる。概して、シアノリガンドを用いるとき、E0における変化はE0における負のシフトであることができるが、用いられる系と他のリガンド（あるとすれば）に応じて、標的被分析物と捕獲リガンドとの相互作用の効果はE0における正のシフトを招くことができる。驚くべきことに、約50mV、100mV、150mV、200mV、250mVおよび300mVよりも大きなシフトがシアノリガンドを用いて確認することができる。
【００３２】
CN-は良好な求核試薬であり、そしてある例において、鉄-シアノ(-2)複合体は、シアノのN上に-0.8767の部分的な電荷をもち、そしてシアノのC上に0.5549の部分的な電荷をもつ。窒素上のその電荷数は非常に大きいため、孤立の1対の電子があるように作用すると考えることができる。したがって、N上の部分的な負電荷は、水の陽子がNへと向かうよう、水分子を並べる（その反対は、NH3リガンドにあてはまる）。窒素上の部分的な電荷が高いので、この局所配向効果は強く、そして従って、近くの水（標的捕獲の前に）および排除された水（標的捕獲の後）の間のデルタは高く、・・・すなわち、2つの状態の間のラムダにおける違いは、量的により一層高い。
【００３３】
単座CN-は常に、炭素を通して結合し、したがって、大きな部分的な負電荷がN上に備わる。溶媒（水）へと向かう部分的な負電荷がより一層大きいほど、観察可能な効果はより一層大きくなる。そのように、リガンド上の部分的な負電荷を有するリガンドは、高い酸化状態の金属を安定化させ、そして水の方向性に対する強い影響をもつ。
【００３４】
CNは最良であり、それは、それがN上の最も高い正味電荷、およびしたがって、水の陽子との最も強い相互作用をもつからである。すなわち
CN->NO2->SO32->NCS->NO
NCS-はSCN-とに等しい。
【００３５】
概して、金属中心がより一層正になるほど、金属の電位はより一層高い。したがって、すべての負電荷とまではいかないが、そのほとんどが水との相互作用によって中和されるとき、金属はより一層正になる。
【００３６】
II.  センサーのジオメトリー
本発明は、電極の表面上、またはいくつかの場合において、溶液においてのいずれかでの、酸化還元活性分子の、電気化学的電位、E0の変化に基づく、標的被分析物の検出のための方法および組成物に向けられる（本明細書中での大部分の説明は、固形相アッセイに向けられる一方で、当業者に理解されるように、本発明が同様に溶液において用いることができ、そして本明細書中で、そのような説明は、溶液相のアッセイに対して同様に適用可能なように適用されることを意図される）。
【００３７】
概して、本発明は次のように記述することができる。酸化還元活性分子は、通例、遷移金属および少なくとも1種のリガンドを含み（例えば、1つ（または本明細書に記述されるように複数の）のシアノリガンドなど）、それらは、配位原子を遷移金属に提供し、本明細書に記述するようにリンカーを通して、概して電極の表面に付着される。さらに、本明細書に記述するように、電極はまた、自己組織化単分子層（SAM）を任意に含むことができる。酸化還元活性分子の空間付近（spatial vicinity）では、本明細書に記述するように、概して3つの方向のうちの1つに捕獲リガンドが付着される。標的被分析物の導入および/または結合は、酸化還元活性分子の電気化学的電位の変化を招き、次にそれが本明細書に記述されるように、様々なやり方で検出される。
【００３８】
図12-14において描くように、3つの基本的なジオメトリーがセンサーのために存在するが、本明細書中での説明はそのように制限されるのを意図しない。1つの実施態様において、図12Aで示すように、電気活性部分（EAM）は、遷移金属イオンおよびリガンドを含み、それらのリガンドは配位原子を遷移金属のために提供し（いくつかの実施態様において、少なくとも1種はシアノリガンドであり）、電極に付着される。さらに、特異的に標的被分析物を結合する捕獲リガンド（しばしば、「結合性リガンド」とも称される）も電極に付着する。双方の種は概して、本明細書に記述するような付着リンカーを用いて電極に付着される。標的被分析物の結合の際、EAMのE0が変化するように、2つの種はそれらが空間的に近くにあるようにして電極に付着される。以下に記載される、単分子層形成性種を含む第3の種が、電極の上で任意に存在することもできることに留意する必要がある。この実施態様では、EAMの種は式（Ia）を有することができ、捕獲リガンドの種は式（Ib）を有することができ、そして希釈剤の種は式（Ic）を有することができる。
AG−スペーサー1−EAM        （Ia）
AG−スペーサー1−CL        （Ib）
AG−スペーサー1−TGn        （Ic）
式中、AGはアンカー基であり、EAMは、電気活性部分であり、溶媒接触可能酸化還元複合体を含み、スペーサー1は本明細書に記述するSAM形成性種であり、CLは捕獲リガンドであり、そしてTGは末端基であり、nは0または1である。
【００３９】
第2の実施態様において、図*XBにおいて描かれるように、EAMの遷移金属のための配位原子のうちの1つは捕獲リガンドによって提供され、「酸化還元活性部分複合体」、すなわちReAMCが形成される。この実施態様では、配位原子は、実際は、捕獲リガンドの一部分であり（例えば、捕獲リガンドがペプチドである場合、アミノ基は配位原子を提供することができる）、または捕獲リガンドに付着するのに用いるリンカーの一部分（例えば、ピリジンリンカー等）であることができる。ReAMCは単一の種として付着され、そして上記のように、以下に記述される単分子層形成性種を含む追加的な種もまた、電極上に任意に存在することができる。この実施態様では、本発明は、式(II)を有する化合物を提供する。
AG−スペーサー1−EAM−（スペーサー2）n−CL        （II）
式中、AGはアンカー基であり、EAMは電気活性部分であり、溶媒接触性酸化還元複合体を含み、CLは捕獲リガンドであり、スペーサー1は本明細書に記述するSAM形成性種であり、そしてスペーサー2はリンカーであり、n=0または1を有する。
【００４０】
第3の実施態様において、図12Cにおいて描かれるように、そこで、ReAMCは単一の種であり、しかし、捕獲リガンドは配位原子を提供しない。むしろ、それは空間的に近いが、ReAMCのEAMとは区別される。この場合も同様に、以下に記述される単分子層形成性種を含む第3の種もまた、電極上で任意に存在することができる。この実施態様では、本発明は、式（III）を有する化合物を提供する。
【化１】
2011501161.tif 000002
式中、AGはアンカー基であり、EAMは電気活性部分であり、溶媒接触可能酸化還元複合体を含み、CLは捕獲リガンドであり、スペーサー1は本明細書に記述するSAM形成性種であり、そしてS2およびS3は、EAMおよびCLを一緒にAGと連結して分枝した構造を形成する2つのリンケージ（連関）である。S2およびS3は、異なるか、または同じであることができる。
【００４１】
この立体配置の1種の例を、下に示す。
【化２】
2011501161.tif 000003
式中、M=遷移性金属、Ln=アンカーおよび捕獲リガンドに共有結合的に接続する配位リガンド（coordinating ligand）、n=0または1、およびL=配位リガンドである。
【００４２】
III.  電極
1つの側面において、本発明は、電極に付着されるこれらのリガンドのアーキテクチャーを提供する。本明細書中での「電極」は組成物を意味し、そしてそれは、電子装置につなげられるとき、電流または電荷を感知し、そして信号に変換することができる。好適な電極は技術分野で既知であり、そして制限されないが、一定の金属およびそれらの酸化物でを含み、金、白金、パラジウム、シリコン、アルミニウム；酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、酸化インジウムスズ、酸化パラジウム、シリコン酸化物、酸化アルミニウム、モリブデン酸化物（Mo2O6）、タングステン酸化物（WO3）およびルテニウム酸化物を含む金属酸化物電極；そして炭素（ガラス状炭素電極、黒鉛およびカーボンペーストが含まれる］が含まれる。好適な電極は、金、シリコン、炭素および金属酸化物の電極を含み、特に好ましくは金である。
【００４３】
本明細書に記述する電極は平面として描かれ、それは電極のとりうる立体配置のうちのわずか1種であり、概略的目的のためだけである。電極の立体配置は、用いる検出方法とともに変動する。例えば、平らな平坦電極は、光学的検出方法のために好適でありえ、または核酸のアレイが作成されるとき、このようにして、合成および検出の双方のためのアドレス可能なロケーションが要求される。あるいはまた、単一のプローブ分析のために、電極は、SAMs、EAMsおよび内側表面に結合する捕獲リガンドのような系の構成要素を伴うチューブの形態であってよい。これは、小容量の試料に曝される、核酸を含む表面積の最大化を許容する。
【００４４】
本発明での電極は、概して、バイオチップカートリッジ中に組み込まれ、そして多種多様な立体配置を採ることができ、そして作用（working）および参照の電極、相互接続（「基板を通しての（through board）」相互接続を含む）、およびマイクロ（微小）流体の構成要素（microfluidic components）を含むことができる。例えば、参照することによってその全体としてそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第7,312,087号を参照されたい。
【００４５】
バイオチップカートリッジは、生体分子のアレイが含まれる基材を含み、そして様々なやり方において構成することができる。例えば、チップは、試薬の導入および除去のために入口および出口を有する反応チャンバー（室）を含むことができる。さらに、カートリッジは、試料を導入し、試薬を加え、反応を行うことができるような、そして次いで試料が、検出のためにアレイを含む反応室に加えられるような、マイクロ流体の構成要素をもつキャップまたはふたを含むことができる。
【００４６】
好適な実施態様において、バイオチップは複数のアレイロケーションを有する基材が含まれる。「基材」または「固形支持体」または他の文法上の同等物によって、本明細書において、捕獲リガンドの付着または関連（association）で適当な別個の個々の部位を含むために修飾することができる任意の材料をも意味する。適切な基材は、金のような金属表面、以下に規定する電極、ガラス、および修飾されたガラスまたは官能基化されたガラス、ファイバーグラス、テフロン（登録商標）、セラミックス、マイカ、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、およびスチレンおよび他の物質の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（商標）およびそれらの誘導体等を含む）、GETEK（ポリプロピレンオキシドおよびファイバーグラスのブレンド）等、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカ、またはシリコンおよび修飾されたシリコンを含むシリカベースの物質、炭素、金属、無機ガラスおよび様々なポリマーが含まれ、プリント回路基板（PCB）材料が特に好まれる。
【００４７】
本発明の系は、アレイ形式において特に有用性が見出され、すなわちそこで、アドレス可能な検出電極のマトリクスが存在する（本明細書中では概して、「パッド」、「アドレス」または「マイクロロケーション」と称する）。本明細書において、「アレイ」によって、アレイ形式の複数の捕獲リガンドが意味され、アレイのサイズは、アレイの組成および最終用途に依存する。約2から何千までもの異なる捕獲基材が含まれるアレイを作成することができる。
【００４８】
好適な実施態様において、検出電極は基材上で形成される。さらに、本明細書での議論は概して、金の電極の使用に向けられるが、当業者によって理解されるように、他の電極を同様に用いることができる。本明細書中、および引用する参考文献において概説されるように、基材は多種多様な物質を含むことができる。
【００４９】
概して、好適な物質には、プリント回路基板材料が含まれる。回路基板材料は、導電層で被覆された絶縁性基材であって、リソグラフィー（石版印刷）技術、特にフォトリソグラフィー技術を用いて加工されるものを含むものであり、電極および相互接続（しばしば、当技術分野において、相互接続またはリードとして言及される）のパターンを形成する。絶縁性基材は概して、常にではないが、重合体である。技術分野において既知であるように、1つまたは複数の層は、「二次元の」（例えば、すべての電極および相互接続が平面）または「三次元の」（ここで、電極は1つの表面にあり、相互接続は基板（board）を他の側に通り抜けることができるか、またはそこでは電極が複数の表面上にある）いずれかの基板を形成するために用いられうる。三次元系はしばしば、ドリル（drilling）またはエッチングの使用に頼り、そして「基板を通しての」相互接続が作成されるように、次いで銅のような金属での電気めっきが続く。回路基板材料は、しばしば、すでに基材に付着したホイル（例えば銅箔）を、必要に応じて添加された追加の銅とともに（例えば相互接続のために）、例えば、電気めっきによって備えて、提供される。銅の表面は、次いで、例えば、接着層の付着を許容するために、例えば、エッチングを通して、粗化される必要がありうる。
【００５０】
したがって、好適な実施態様において、本発明は、複数の電極、好ましくは、金の電極が含まれる基材を含むバイオチップ（時々「チップ」と称する）を提供する。電極の数は、アレイについて概説されるのと同様である。本明細書に概説されるように、各々の電極は好ましくは自己組織化単分子層を含む。好適な実施態様において、本明細書に概説されるように、単分子層形成性種のうちの1種には、捕獲リガンドが含まれる。さらに、各々の電極は、相互接続を有し、それは、一端部にて電極に付着され、そして電極を制御することができる装置に最終的に付着される。つまり、各々の電極は、独立してアドレス可能である。
【００５１】
最後に、本発明での組成物は、マイクロ流体の構成要素およびロボットの構成要素（例えば、米国特許第6,942,771号および第7,312,087号明細書および関連したケースを参照し、その双方を参照することによって本明細書に全体としてそのまま組み込む）を含む多種多様な追加的構成要素、およびコンピュータを利用する（computers utilizing）信号処理技術を含む検出システム（例えば、米国特許第6,740,518号明細書を参照し、参照することによって本明細書にその全体としてそのまま組み込む）を含むことができる。
A.  自己組織化単分子層スペーサー
【００５２】
いくつかの実施態様において、電極は任意にさらにSAMを含む。「単分子層（monolayer）」または「自己組織化単分子層」または「SAM」によって、本明細書中では、表面上で自発的に化学吸着される（chemisorbed）分子の比較的整列した（ordered）アセンブリが意味され、ここで、分子は互いにおよそ平行して、そして表面に対して大体直角に方向付けられる。分子の各々は、表面に接着する官能基を含み、そしてそのある部分は比較的整列したアレイを形成するために単分子層において隣接分子と相互作用する。つまり、「混合された」単分子層は異種の単分子層を含み、すなわち、少なくとも2つの異なる分子が単分子層を作り上げる。本明細書に概説されるように、単分子層の使用は、その表面に対する生体分子の非特異的結合の量を減らし、そして核酸の場合には、電極からのオリゴヌクレオチドの距離の結果としてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの効率を上昇させる。このように、単分子層は、電極面から離れて標的酵素の維持を容易にする。さらに、単分子層は、電荷担体を電極の表面から遠ざけて保つのに役立つ。このように、この層は、電極とReAMの間、または電極と溶媒中の荷電種の間で電気的接触を防止するのを助ける。そのような接触は、試料において存在しうる荷電種を介した、直接的な「短絡（short circuit）」または間接的な短絡を招くことがある。したがって、単分子層は好ましくは電極表面上の均一な層において、最低限の「ホール」が存在するように、きつく詰められる（tightly packed）。単分子層は、このように、電極への溶媒接触可能性を妨げる物理的なバリアとしてはたらく。
【００５３】
いくつかの実施態様において、単分子層は導電性のオリゴマーを含む。本明細書において、「導電性のオリゴマー」によって、実質導電性オリゴマー（、好ましくは、直線状）を意味し、そのいくつかの実施態様は「分子ワイヤー」として文献に言及される。本明細書において、「実質導電性」によって、オリゴマーが100Hzにて電子を移動（transfering）することができることを意味する。概して、導電性のオリゴマーは、実質重なり合うπ-軌道、すなわち、導電性のオリゴマーのモノマー単位の間でのように共役したπ-軌道をもつけれども、導電性オリゴマーはまた、1種または複数のシグマ（σ）結合も含みうる。加えて、導電性のオリゴマーは、関係するEAM中にか、またはそれから電子を注入し、または受け取るためのその能力によって機能的に規定されうる。さらにまた導電性のオリゴマーは、本明細書に規定されるように、絶縁体よりも導電性である。加えて、本発明での導電性のオリゴマーは、電気活性ポリマーから区別され、それらは自身で電子を供与するか、または受け入れうる。
【００５４】
導電性のオリゴマーのより一層詳細な説明は、国際公開（WO）第/1999/57317号において見出され、参照することによって本明細書に全体としてそのまま組み込む。とりわけ、WO/1999/57317の第14から21頁までの構造1から9までで示す導電性のオリゴマーは、本発明においての使用が見出される。いくつかの実施態様において、導電性のオリゴマーは、以下の構造を有する。
【化３】
2011501161.tif 000004
【００５５】
さらに、単分子層での導電性オリゴマーの少なくともいくつかの末端は、電子的に露出する。「電子的に露出する」によって、本明細書において、末端に近接近するEAMの設置（placement）に際して、および適した信号による開始の後、EAMの存在に依存する信号が検出されうることが意味される。導電性のオリゴマーは、末端基をもつか、またはそうでなくてよい。このように、好適な実施態様において、追加の末端基はなく、そして導電性のオリゴマーは、例えば、アセチレン結合のような末端基を伴って終る。あるいはまた、いくつかの実施態様において、しばしば本明細書中で「Q」として描かれる末端基が加えられる。末端基は、種々の理由のため：例えば、EAMsの検出のために導電性オリゴマーの電子的利用可能性に貢献するため；または例えば、非特異的な結合を防ぐために、SAMの表面を変えるために用いることができる。例えば、負に荷電された基は、標的被分析物がDNAまたはRNAのような核酸であるとき、核酸が表面上で横になるのを、反発するか（repelled）または防止し、ハイブリダゼーションを容易にするように、負に荷電された表面を形成するために末端上に存在しうる。好適な末端基は、-NH、-OH、-COOH、および-CH3のようなアルキル基、および（ポリ）エチレングリコールのような（ポリ）アルキルオキサイドを含み、−OCH2CH2OH、-(OCH2CH2O)2H、-(OCH2CH2O)3H、および-(OCH2CH2O)4Hが好ましい。
【００５６】
1つの実施態様において、異なる種類の末端基とともに導電性のオリゴマーの混合物を用いることが可能である。このように、例えば、末端基のいくつかは検出を容易にしえ、そしていくつかは非特異的な結合を防ぎうる。
【００５７】
いくつかの実施態様において、電極は不動態化剤（passivating agent）を、好ましくは、電極表面上の単分子層の形態でさらに含む。いくつかの被分析物について、結合性リガンドが電極から少し離れているとき、被分析物の結合性（すなわち、ハイブリダイゼーション）の効率は増加しうる。さらに、単分子層の存在は、表面への非特異的な結合を減少させることができる（それは末端基の使用によって、本明細書に概説されるように、さらに容易にすることができる。不動態化剤の層は、電極の表面から離れた結合性リガンドおよび/または被分析物の維持を容易にする。さらに、不動態化剤は、電荷担体を電極の表面から遠ざけて保つのに役立つ。このように、この層は、電極と電子移動部分の間、または電極と溶媒内の荷電種の間での電気的接触を防止するのを助ける。そのような接触は、試料において存在することがある荷電された種を介して、直接的な「短絡」または間接的な短絡を招くことがある。したがって、不動態化剤の単分子層は、電極表面上の均一な層において、最低限の「穴」が存在するように、好ましくはきつく詰められる。あるいはまた、不動態化剤は単分子層の形態でなくてよいが、導電性のオリゴマーの詰め込みまたは他の特徴を助けるために存在してよい。
【００５８】
不動態化剤は、このように、電極に対する溶媒接触性をブロックする物理的なバリアとしてはたらく。よって、不動態化剤はそれ自身、実際に(1)導電性、または(2)非導電性、すなわち絶縁性の、分子のいずれかでありうる。このように、1つの実施態様において、不動態化剤は、本明細書に記述されるような導電性のオリゴマーであり、電極に対する電荷の移動を阻止し、または減少させるための末端基を伴うかまたは伴わない。導電性でありうる他の不動態化剤には、-(CF2)n--(CHF)n--および--(CFR)n--が含まれうる。好適な実施態様において、不動態化剤は絶縁体部分である。
【００５９】
いくつかの実施態様において、単分子層は絶縁体を含む。「絶縁体」は、実質非導電性のオリゴマー、好ましくは、直線状である。「実質非導電性の」によって、本明細書では、絶縁体を通しての電子移動の速度が、導電性のオリゴマーを通しての電子移動の速度よりも遅いことが意味される。換言すると、絶縁体の電気抵抗は、導電性のオリゴマーの電気抵抗よりも高い。しかし、--(CH2)16分子のように、概して絶縁体であると考えられるオリゴマーさえ、遅い速度であるが、まだ電子を移動させうることに注目すべきである。
【００６０】
いくつかの実施態様において、絶縁体は約10-7 Ω-1 cm-1またはそれよりも低い導電性、Sを持ち、約10-8 Ω-1 cm-1未満が好ましい。Gardner（ガードナー）ら、Sensors and Actuators（センサー・アンド・アクチュエーター）A 51 (1995) 57-66を、参照することによって本明細書に組み込む。
【００６１】
概して、絶縁体は、アルキルまたはヘテロアルキルオリゴマーまたはシグマ結合を有する部分であるが、任意の特定の絶縁体分子は芳香族基または1つまたは複数の共役された結合を含みうる。本明細書において、「ヘテロアルキル」によって、少なくとも1つのヘテロ原子、すなわち、鎖に含まれる窒素、酸素、硫黄、リン、シリコンまたはホウ素を有するアルキル基が意味される。あるいはまた、絶縁体は、1つまたは複数のヘテロ原子の付加を有する導電性のオリゴマーと全く類似してよく、それは、電子移動を、好ましくは大幅に抑制するか、または遅くするのにはたらく。好ましくは、アルキルまたはヘテロアルキルの鎖は長さで約4から約18個の原子まであり、そしてより一層好ましくは、長さで約6から約16個までの原子である/
【００６２】
絶縁体を含む不動態化剤は、、電極上の、部分または導電性のオリゴマーの詰め込み、絶縁体の親水性または疎水性、および可とう性（flexibility）を変えるため、すなわち、絶縁体の、回転方向、ねじれ方向または長さ方向の可とう性を変えるために、本明細書中で規定するなR基で置換されうる。例えば、分枝したアルキル基を用いうる。さらに、絶縁体を含む不動態化剤の末端は、単分子層の露出された表面に影響を与えるために、追加の基を含むことができ、しばしば本明細書中で末端基（「TG」）と称する。例えば、荷電されたか、中性の、または疎水性の基の付加は、試料からの非特異的結合を抑制するか、または被分析物、その他の結合の動力学に影響を及ぼすために行ってよい。例えば、荷電された表面を形成し、一定の標的被分析物の結合を促す（encourage）か、または妨げる（discourage）か、表面上で横たわるのに反発し、または防止するために、末端上に荷電された基があってよい。
【００６３】
不動態化剤の長さは、必要に応じて変動する。概して、上記で概説するように、不動態化剤の長さは導電性のオリゴマーの長さと似ている。さらに、導電性のオリゴマーは基本的に不動態化剤と同じ長さ、またはそれらよりも長い長さであることができ、結合性リガンドを溶媒に対してより一層接触可能にする。
【００６４】
単分子層は、絶縁体を含む不動態化剤の単一の種類、または異なる種類を含みうる。
【００６５】
適切な絶縁体は、技術分野で既知であり、そして制限されないが、--(CH2)n--、--(CRH)n--、および--(CR2)n--、エチレングリコールまたは酸素の代わりに他のヘテロ原子、すなわち、窒素またはイオウを用いる誘導体が含まれる（イオウ誘導体は電極が金であるとき、好まれない）。好ましくは、絶縁体は、金への付着のためのチオールまたはジスルフィド末端を有する形態--(CH2)n--である。また好ましくは、絶縁体の他の端部（alternate end）は、親水性（hydrophylic）基で、オリゴエチレングリコール、--OH、または--COOHで終わる。
【００６６】
いくつかの実施態様において、電極は金属表面であり、かつ相互接続または電気化学を行う能力をもつことは必ずしも必要でない。
B.  アンカー基
【００６７】
本発明は、アンカー基を含む化合物を提供する。「アンカー」または「アンカー基」によって、本明細書において、本発明の化合物を電極に付着する化学基が意味される。
【００６８】
当業者によって理解されるように、アンカー基の組成は、それが付着する表面の組成に依存して異なる。金電極の場合、ピリジニルアンカー基およびチオールベースのアンカー基は、特定の用途を見出される。
【００６９】
導電性のオリゴマーの共有結合的な付着は様々なやり方で成し遂げることができ、電極および使われる導電性のオリゴマーに依存する。概して、以下に「A」として構造1において描かれるようないくつかのリンカーの種類が用いられ、ここで、Xは導電性のオリゴマーであり、そして斜線の表面は電極である。
【化４】
2011501161.tif 000005
【００７０】
この実施態様において、Aはリンカーまたは原子である。「A」の選択はある程度で電極の特徴に依存する。よって、例えば、Aは、金電極を用いるとき、イオウ部分でありうる。あるいはまた、金属酸化物電極を用いるとき、Aは、酸化物の酸素に付着されたシリコン（シラン）部分でありうる（例えば、Chen（チェン）ら、Langmuir（ラングミュア）10:3332-3337 (1994年); Lenhard（レーンハード）ら、J. Electroanal. Chem.（ジャーナル・オブ・エレクトロアナリティカル・ケミストリー）78:195-201(1977年)を参照し、参照することによってそれらの双方を明示的に組み込む）。カーボンベースの電極を用いるとき、Aはアミノ部分であることができる（好ましくは、1級アミン、例えば、Deinhammer（ダインハンマー）ら、Langmuir 10:1306-1313 (1994)を参照）。このように、好ましいA部分には、制限されないが、シラン部分、イオウ部分（アルキルイオウ部分を含む）、およびアミノ部分が含まれる。
【００７１】
いくつかの実施態様において、電極はカーボン電極、すなわち、ガラス状のカーボン電極であり、そして付着は、アミン基の窒素を介してである。代表的な構造は米国特許出願公開第20080248592号の構造15で描かれ、本明細書に参照することによってその全体についてそのまま組み込むが、しかし、特にそこで記述されるような構造および異なるアンカー基の記載および付随するテキストについては別である。ここでも、追加的な原子は存在しうる（すなわち、リンカーおよび/または末端基）。
【００７２】
米国特許出願公開第20080248592号の構造16は、上記のように参照によって本明細書に組み込まれ、酸素原子は、金属酸化物電極の酸化物からのものである。Si原子はまた、他の原子も含んでよい（すなわち、置換基を含むシリコン部分）。他の電極へのSAMの、他の付着は、この技術分野において既知である。例えば、インジウムスズ酸化物電極に対する付着について、Napier（ネイピア）ら、Langmuir、1997を参照し、またインジウムスズ酸化物電極へのリン酸塩の化学吸着（CHI conference（CHIコンフェレンス）、1998年5月4〜5日でのH. Holden Thorpe（ホールデン・ソープ）の話）を参照されたい。
【００７３】
1つの好適な実施態様において、インジウムスズ酸化物（ITO）が電極として用いられ、そしてアンカー基はホスホン酸塩含有種である。
【００７４】
1).  ピリジニルアンカー基
1つの側面において、本発明は、本発明での化合物を表面に付着させるための、ピリジンおよびその誘導体の使用を提供する。
【００７５】
いくつかの実施態様において、アンカーはピリジル基を含み、式(II)の構造を有する。
【化５】
2011501161.tif 000006
式中、環上の炭素は、本明細書に規定されるようなR基を用いて任意に、そして独立して置換することができる。ピリジンは、ベンゼンに構造的に関連する複素環芳香族の有機化合物であり、ここで、6員環における1種のCH基が窒素原子と置き換えられる。ピリジンは、錯体化学におけるリガンドとして用いることができる。リガンドとして、それは通常「py」と略される。本発明はピリジンの窒素原子の上で、金属表面と結合する孤立電子対の能力を利用する。ピリジンベース化合物の1種の利益は、それらが空気安定性（air stable）なことである。Curtis（カーティス）ら、Inorg. Chem.（インオルガニック・ケミストリー）24:385-397(1985年); Callahan（キャラハン）ら、Inorg. Chem. 14:1443-1453 (1975); Lavallee（ラヴァリイ）およびFleischer（フライシャー）、J. Am. Chem. Soc.（ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー）94:2583-2599 (1972年);およびJwo（ジウー）ら、J. Am. Chem. Soc. 101:6189-6197 (1979)を、参照することによってそのすべてを組み込む。
【００７６】
いくつかの実施態様において、ピリジル基は、下で示す、アセチレン基によって分けられた2つのピリジル基を含む、ビピリジル基（ビスピリジルアセチレン、BPA）を含む。
【化６】
2011501161.tif 000007
この実施態様では、どちらの環上の炭素も、任意におよび独立して、本明細書に規定されるようなR基を用いて置換することができる。環のうちの1種は、本明細書に規定されるようなスペーサーへの連結を含み、または、いくつかの図において示すように、ピリジル基に対して付着する1種よりも多くのスペーサーがありうる（例えば、n=1またはそれよりも多く、2であるときいくつかの実施態様において特定の使用が見出される）。
【００７７】
2).  イオウアンカー基
構造1において単一部分として描く、導電性のオリゴマーは、1種よりも多くの「A」部分で電極に付着されることができ、「A」部分は同じか、または異なることができる。したがって、例えば、電極が金電極であり、そして「A」がイオウ原子または部分であるとき、複数のイオウ原子は、導電性のオリゴマーを電極に付着するのに、概して、構造2、3および4で下に描くように用いることができる。当業者によって理解されるように、他のそのような構造を作成することができる。構造2、3および4において、A部分はまさにイオウ原子であるが、置換されたイオウ部分もまた用いうる。
【００７８】
したがって、例えば、電極が金電極であり、そして「A」が概して、構造6で下に描かれるように、イオウ原子、または部分であるとき、複数のイオウ原子は、導電性のオリゴマーを電極に付着するのに、概して、構造2、3および4において下に描くように用いうる。当業者によって理解されるように、他のそのような構造を作成することができる。構造2、3および4において、A部分はまさにイオウ原子であるが、置換されたイオウ部分も用いうる。
【化７】
2011501161.tif 000008
【００７９】
また、構造4と同様、電極に付着された3つのイオウ部分を有する単一の炭素原子において終結する導電性のオリゴマーを持つことが可能でありうることに注目すべきである。
【００８０】
別の側面では、本発明は、共役されたチオールを含むアンカーを提供する。共役されたチオールアンカーを有するいくつかの例示的な複合体を、図4において示す。いくつかの実施態様において、アンカーは、アルキルチオール基を含む。いくつかの例は、図4Aおよび4Bに示される。図4Bにおいて描く2つの化合物は、それぞれ、カルベンおよび4-ピリジルアラニンをベースとする。
【００８１】
別の側面では、本発明は、金電極のような電極上での被分析物検出のための電気活性部分の構築においてアンカー性基としてはたらく、共役された多足性のチオ含有性の化合物を提供する。つまり、スペーサー基（これは、EAMs、ReAMCs、または「空の」単分子層形成性種に付着することができる）は、2つまたはそれよりも多くのイオウ原子を用いて付着される。本明細書に記載するように、これらの多足性のアンカー基は線状または環状であることができる。
【００８２】
いくつかの実施態様において、アンカー基は「二足性」であり、金の表面に付着する2つのイオウ原子を含み、そして線状であるが、いくつかの場合には、他の多足性を有する系を含むことは可能でありうる（例えば「三足性（tripodal）」）。そのような多足性のアンカー基は増加した安定性を示し、および/または立体的に要求の厳しい（demanding）頭部基を有するチオール含有アンカーからSAMを調製するためのより一層大きなフットプリント（footprint）を許容する。
【００８３】
いくつかの実施態様において、アンカーは環状ジスルフィド（「二足（bipod）」）を含む。いくつかの場合において、他の多足性を有する環系のアンカー基を含むことが可能でありうる（例えば「三足性」）。以下に議論するように、環の原子の数は、例えば、5から10まで変動することができ、そしてまた多環式アンカー基を含む。
【００８４】
いくつかの実施態様において、アンカー基は、以下に示すような、頂点窒素原子（apex nitrogen atom）および分子内ジスルフィド結合を有する7員環である[1,2,5]-ジチアゼパン（dithiazepane）単位を含む。
【化８】
2011501161.tif 000009
【００８５】
構造（IIIa）において、また、リングの炭素原子を追加的に置換することができることは注目すべきである。当業者によって理解されるように、他の員環もまた含まれる。さらに、多環式環構造を用いることができ、それは他の環状アルカン（環状ヘテロアルカン類を含む）または芳香環構造で置換された上記に示す[1,2,5]-ジチアゼパンのような環状ヘテロアルカンを含むことができる。
【００８６】
いくつかの実施態様において、アンカー基およびスペーサーの一部分は、以下に示す構造を有する。
【化９】
2011501161.tif 000010
【００８７】
ここでの「R」基は、EAMの遷移金属構成要素のための末端調整性リガンドを伴う共役されたオリゴフェニルエチニレン単位を含む、任意の置換基であることができる。
【００８８】
アンカーは、二足性の中間体（I）（式中R=Iである式IIIとしての化合物）から合成され、それはLi（リー）ら、Org. Lett.（オルガニック・レターズ）4：3631-3634(2002年)において記述され、参照することによって本明細書に組み込む。また、Wei（ウェイ）ら、J. Org, Chem.（ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー）69：1461-1469(2004年)を参照し、本明細書中で参照することによって組み込む。
【００８９】
イオウ原子の数は、本明細書に概説されるように、スペーサーあたり、1つ、2つ、および3つを利用する特定の実施態様と共に変動することができる。
【００９０】
C.  電気活性部分
アンカー基に加え、本発明は、電気活性部分を含む化合物を提供する。「電気活性部分（EAM）」または「遷移金属複合体」または「酸化還元活性分子」または「電子移動部分（ETM）」によって、本明細書では、可逆的に、または半可逆的に1つまたは複数の電子を移動させることが可能な金属含有の化合物が意味される。電子のドナーおよびアクセプターの能力が関連することを理解すべきであり、つまり、一定の実験的な状況の下で電子を失うことができる分子は、異なる実験的な状況の下で電子を受け入れることができる。
【００９１】
可能性がある遷移金属複合体の数が非常に多いこと、および電子移動化合物の技術における熟練した当業者は本発明において多数の化合物を利用することができることを理解すべきである。ここで、「遷移性金属」によって、金属の原子が電子の一部分または完成されたシェルをもつ金属が意味される。本発明において用いるための適切な遷移金属には、制限されないが、カドミウム（Cd）、銅（Cu）、コバルト（Co）、パラジウム（Pd）、亜鉛（Zn）、鉄（Fe）、ルテニウム（Ru）、ロジウム（Rh）、オスミウム（Os）、レニウム（Re）、白金（Pt）、スカンジウム（Sc）、チタン（Ti）、バナジウム(V)、クロミウム（Cr）、マンガン（Mn）、ニッケル（Ni）、モリブデン(Mo)、テクネチウム（Tc）、タングステン(W)、およびイリジウム（Ir）が含まれる。つまり、第1の一連の遷移金属、白金族の金属（Ru、Rh、Pd、Os、IrおよびPt））は、Fe、Re、W、MoおよびTcと同様に、特定の使用を本発明において見出す。特に好ましいものは、ルテニウム、オスミウム、鉄、白金およびパラジウムが含まれ、酸化状態における変化による配位部位の数を変化させない金属であり、オスミウム、ルテニウムおよび鉄が特に好ましく、そしてオスミウムは、多くの実施態様において特定の使用が見出される。いくつかの実施態様において、鉄は好ましくない。概して、遷移金属はTMまたはMとして本明細書に描かれる。
【００９２】
遷移性金属および配位性リガンドは金属複合体を形成する。「リガンド」または「配位性リガンド」（「L」としてここで図において描かれる）によって、本明細書において、原子、イオン、分子または官能基であって、概して、1つまたは複数の中心原子またはイオンに対して、その電子の1つまたは複数を、配位共有結合を通して、または共有結合を通して、付与するものが意味される。
【００９３】
金属の他の配位部位を、捕獲リガンドに対し（直接またはリンカーを使って間接的に）、あるいは、電極に（より一層十分に以下に記載するように、しばしばスペーサーを用いて）対し、あるいは双方に対し、遷移金属複合体を付着するために用いる。したがって、例えば、遷移金属複合体が結合性リガンドに直接的に取り付けられる（joined）とき、金属イオンの配位部位の1つ、2つまたはそれよりも多くが、結合性リガンドによって（または間接的に取り付けられる場合、リンカーによって）供給される配位原子によって占められうる。加えて、または代わりに、金属イオンの配位部位の1つまたは複数は、遷移金属複合体を電極に付着させるのに用いるスペーサーによって占められうる。例えば、より一層十分に以下に記載するように、遷移金属複合体が結合性リガンドとは別の電極に付着されるとき、1（n-1）以外の金属(n)の配位部位のすべては、極性のリガンドを含みうる。
【００９４】
適切な小さな極性リガンドは、概して、本明細書で「L」として描かれ、より一層十分に本明細書に記述されるように、2つの一般的なカテゴリーに分類される。1種の実施態様において、小さな極性リガンドは、概して、乏しい脱離基としての特徴、または良好なシグマドナーとしての特徴、および金属の同一性のために、金属イオンと効果的に不可逆的に結合する。これらのリガンドは、「置換的に（substitutionally）不活性」と称されうる。あるいは、より一層十分に以下に記述するように、小さな極性リガンドは、それらの良好な脱離基の特性または乏しいシグマドナー特性のために可逆的に金属イオンに結合することができ、これにより、標的被分析物の結合の際、被分析物が1種または複数の配位原子を金属のために提供することができ、小さな極性リガンドが効果的に置き換えられる。これらのリガンドは、「置換的に不安定」と称されうる。リガンドは好ましくは双極子を形成し、それはこれが高い溶媒再配置エネルギーに寄与するからである。
【００９５】
遷移性金属複合体の構造のいくつかを以下に示す。
【化１０】
2011501161.tif 000011
【００９６】
Lは、配位原子を金属イオンの結合のために提供する共（co）リガンドである。当業者によって理解されるように、共リガンドの数および性質は金属イオンの配位数に依存する。単-、二-または多座の共リガンドを、任意の位置ででも用いうる。このように、例えば、金属が六の配位数をもつとき、導電性のオリゴマーの末端からのL、核酸からの寄与されるL、およびrは、六まで増加する。このように、金属が六の配位数をもつとき、rはゼロ（すべての配位原子が他の二つのリガンドによって提供されるとき）から四までに及ぶことができ、それはすべての共リガンドが単座であるときである。このようにして、概して、rは0から8まであり、金属イオンの配位数および他のリガンドの選定に依存する。
【００９７】
1つの実施態様において、金属イオンは六の配位数をもち、および双方の導電性のオリゴマーに付着するリガンドおよび核酸に付着するリガンドは少なくとも二座であり、つまり、rは、好ましくはゼロ、一（すなわち、残りの共リガンドは二座である）または二である（二つの単座の共リガンドが使われる）。
【００９８】
技術分野において理解されるように、共リガンドは同じか、または異なることができる。適切なリガンドは、二つのカテゴリーに分類される：すなわち、配位原子（概して、シグマ（σ）ドナーとして出版物に言及される）としての窒素、酸素、イオウ、炭素またはリンの原子（金属イオンに依存する）を用いるリガンド；およびメタロセンリガンド（概して、パイ（π）ドナーとして出版物において言及され、そしてLmとして本明細書に描かれる）のような有機金属のリガンドである。適切な窒素を提供するリガンドは技術分野においてよく知られ、そしてそれには、制限されないが、シアノ（C≡N）、NH2；NHR；NRR′；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換された誘導体；テルピリジンおよび置換された誘導体；フェナントロリン、特に1,10-フェナントロリン（phenと省略）、および4,7-ジメチルフェナントロリンおよびジピリドール[3,2-a：2',3'-c]フェナジン（dppzと省略）のようなフェナントロリンの置換された誘導体；ジピリドフェナジン；1,4,5,8,9,12-ヘキサアザトリフェニレン（hatと省略）；9,10-フェナントレンキノンジイミン（phiと省略）；1,4,5,8-テトラアザフェナントレン（tapと省略）；1,4,8,11-テトラ-アザシクロテトラデカン（cyclamと省略）およびイソシアン化物が含まれる。置換された誘導体は、融合した誘導体を含めて、用いうる。いくつかの実施態様において、ポルフィリンおよびポルフィリンファミリーの置換された誘導体が用いられうる。例えば、Comprehensive Coordination Chemistry（コンプリヘンシブ・コーディネーション・ケミストリー）, Ed. Wilkinson et al.（ウィルキンソンら編）, Pergammon Press（ペルガモン・プレス社）, 1987年, Chapters（チャプター）13.2 (pp 73-98), 21.1 (pp. 813-898)および21.3 (pp 915-957)を参照し、それらのすべてを参照することによって明示的に本明細書に組み込む。
【００９９】
技術分野において理解されるように、ドナー(1)が金属と結合し、ドナー(2)が周囲の媒体（溶媒、タンパク質、その他）と相互作用するのに使用可能である任意のリガンドであるドナー(1)-ブリッジ-ドナー(2)を本発明において用いることができる（特にシアノのように、ドナー(1)およびドナー(2)がパイ系を通してカップリングする（coupled）場合（Cはドナー(1)、Nはドナー(2)、パイ系はCN三重結合である））。1種の例はビピリミジンであり、それはビピリジンとそっくりに見えるが、媒体との相互作用のために「裏面（バックサイド）」上にNドナーを有する。追加の共リガンドには、制限されないが、シアン酸塩、イソシアン酸塩（-N=C=O）、チオシアン酸塩、イソニトリル、N2、O2、カルボニル、ハロゲン化物、アルコキシド（alkoxyide）、チオラート、アミド、リン化物、およびスルフィノ、スルホニル、スルホアミノ、およびスルファモイルのようなイオウ含有化合物が含まれる。
【０１００】
いくつかの実施態様において、複数のシアノが、異なる金属との複合体の共リガンドとして用いられる。例えば、7つのシアノが、Re(III)に結合し、8つは、Mo(IV)およびW(IV)を結合する。このようにして、6つまたはそれよりも少ないシアノおよび1つまたは複数のLを有するRe(III)、または7つまたはそれよりも少ないシアノおよび1つまたは複数のLを有するMo(IV)またはW(IV)を、本発明において用いることができる。W(IV)を有するEAM系は、それがより一層不活性で、調製するのがより一層簡単で、より一層好都合な還元電位であるため、他に勝る特定の利点をもつ。概して、より一層大きなCN/L比率がより一層大きなシフトを与える。
【０１０１】
炭素、酸素、イオウおよびリンを用いる適切なシグマ供与性（sigma donating）リガンドは、技術分野において既知である。例えば、適切なシグマカーボンドナーは、Cotton（コットン）およびWilkenson（ウィルケンソン）、Advanced Organic Chemistry（アドバンスド・オルガニック・ケミストリー）、第5版、John Wiley & Sons（ジョン・ワイリー・サンズ社）、1988年において見出され、参照することによって本明細書に組み込みまれる（例えば、第38頁を参照）。同様に、適切な酸素リガンドには、クラウンエーテル、水および技術分野において既知の他のものが含まれる。ホスフィン類および置換されたホスフィン類も適切である（CottonおよびWilkensonの第38頁を参照）。
【０１０２】
酸素、イオウ、リンおよび窒素の供与性リガンドは、ヘテロ原子を配位原子としてはたらかせるのを可能にするような方法で付着される。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、有機金属化合物リガンドが用いられる。酸化還元部分、そして、複素環式または環外の置換基のようなドナー原子を伴うδ結合された有機リガンドを有する種々の遷移金属配位化合物としての使用のための純粋な有機化合物に加えて、パイ結合された有機リガンドを有する多種多様な遷移金属有機金属化合物合成物が利用可能である（Advanced Inorganic Chemistry（アドバンスド・インオルガニック・ケミストリー）、第5版、CottonおよびWilkinson、John Wiley & Sons、1988、第26章；Organometallics, A Concise Introduction（オルガノメタリックス、ア・コンサイス・イントロダクション）、Elschenbroich（エルシェンブロイヒ）ら、第2版、1992、VCH；およびComprehensive Organometallic Chemistry（コンプリヘンシブ・オルガノメタリック・ケミストリー）II、A Review of the Literature（ア・レビュー・オブ・ザ・リテラチャー）1982-1994、Abel（アベル）ら編、第7巻、章7、8、10および11、Pergamon Press（ペルガモン・プレス）を参照し、参照することによって本明細書に明示的に組み込む）。そのような有機金属化合物リガンドには、シクロペンタジエニドイオン[C5H5(-1)]のような環式芳香族化合物、および種々の環置換され、そして環融合された誘導体（インデニリド（indenylide）（-1）イオンのようなもの）が含まれ、それらは、ビス（シクロペンタジエイル（cyclopentadieyl））金属化合物、（すなわちメタロセン）のクラス（部類）を与える（例えば、Robins（ロビンス）ら、J. Am. Chem. Soc. 104: 1882-1893 (1982)；およびGassman（ガスマン）ら、J. Am. Chem. Soc. 108: 4228-4229 (1986)を参照し、参照することによって組み込む）。これらのうち、フェロセン［(C5H5)2Fe］およびその誘導体は、多種多様な化学（Connelly（コネリー）ら、Chem. Rev. 96: 877-910（1996）、参照することによって組み込む）および電気化学（Geiger（ガイガー）ら、Advances in Organometallic Chemistry （アドバンシーズ・イン・オルガノメタリック・ケミストリー）23: 1-93；および、Geiger（ガイガー）ら、Advances in Organometallic Chemistry 24: 87、参照することによって組み込む）電子移動または「酸化還元」反応において用いられる典型例である。様々な第1、第2および第3の周期の遷移金属のメタロセン誘導体は、リボース環または核酸のヌクレオシド塩基に共有結合して付着される酸化還元部分としての潜在的な候補である。他の潜在的に適切な有機金属化合物リガンドはベンゼンのような環状アレーンを含み、ビス（アレーン）金属化合物、およびそれらの、環置換され、そして環融合された誘導体が産生され、ビス（ベンゼン）クロミウムはそれらの典型例である。アリル（-1）イオン、またはブタジエンのような他の非環式のπ結合されたリガンドは、潜在的に適切な有機金属化合物を産生し、そしてすべてのそのようなリガンドは、他のパイ結合され、そしてデルタ結合されたリガンドを伴う導電において、有機金属化合物の一般的な部類を構成し、そこでは炭素結合に対する金属がある。架橋性有機リガンド、および追加の非架橋リガンドを有し、ならびに金属-金属の結合を伴う、および伴わないそのような化合物の種々の二量体およびオリゴマーの電気化学的研究は、核酸分析において潜在的な候補酸化還元部分である。
【０１０４】
共リガンドの1種または複数が有機金属化合物リガンドであるとき、リガンドは概して、有機金属リガンドの炭素原子の1種を介して付着されるが、複素環リガンドについては付着は他の原子を介してでありうる。好ましい有機金属リガンドは、メタロセンリガンドを含み、置換された誘導体およびメタロセネオファンが含まれる（上記、CottonおよびWilkensonの第1174頁を参照）。例えば、メチルシクロペンタジエニルのようなメタロセンリガンドの誘導体は（ペンタメチルシクロペンタジエニルのような多重メチル基が好ましい）、メタロセンの安定性を増加させるのに用いることができる。好適な実施態様において、メタロセンの2つのメタロセンリガンドのわずか1つが誘導体化される。
【０１０５】
本明細書に記述するように、リガンドの任意のな組合せを用いうる。好適な組合せは以下を含む：a)すべてのリガンドは、窒素供与性リガンドである；b)すべてのリガンドは有機金属リガンドである；およびc)導電性オリゴマーの末端でのリガンドはメタロセンリガンドであり、そして核酸により提供されるリガンドは窒素供与性リガンドである。必要ならば、窒素供与性リガンドまたはメタロセンリガンド、または混合物のいずれでもある他のリガンドを有する。
【０１０６】
通例、金属の存在は、複数のプロリガンドが一緒に結合して複数の酸化状態を提供することを許容するため、非大環状（non-macrocyclic）キレート化剤を含むEAMは、金属イオンと結合して非大環状キレート化合物を形成する。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、窒素供与性プロリガンドが使われる。適切な窒素供与性プロリガンドは、技術分野においてよく知られ、およびそれには、制限されないが、NH2；NHR；NRR′；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換された誘導体；テルピリジンおよび置換された誘導体；フェナントロリン類、特に1,10-フェナントロリン（phenと省略）、および4,7-ジメチルフェナントロリンおよびジピリドール[3,2-a：2',3'-c]フェナジン（dppzと省略）のようなフェナントロリンの置換された誘導体；ジピリドフェナジン；1,4,5,8,9,12-ヘキサアザトリフェニレン（hatと省略）；9,10-フェナントレンキノンジイミン（phiと省略）；1,4,5,8-テトラアザフェナントレン（tapと省略）；1,4,8,11-テトラ-アザシクロテトラデカン（cyclamと省略）およびイソシアン化物が含まれる。また、置換された誘導体は、融合された誘導体を含めて、用いうる。金属イオンを配位的に飽和させず、そして別のプロリガンドの追加を必要とする大環状リガンドは、この目的では非大環状であると考えられる点に留意する必要がある。当業者によって理解されるように、配位的に飽和された化合物を形成するために、多数の「非大環状」リガンドを共有結合で付着することが可能であるが、それは環状骨格を欠く。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、単座（例えば、少なくとも1種のシアノリガンド）、二座、三座、多座のリガンド（飽和させるまで）の混合物は、EAMsの構築物において使用することができる。
【０１０９】
概して、遷移金属複合体が溶媒接触可能であるかどうかについて決定するのは、リガンドの組成物または特徴である。「溶媒接触可能な遷移金属複合体」または文法上の等価物によって、本明細書では少なくとも1つ、好ましくは2つ、およびより一層好ましくは3つ、4つまたはそれよりも多くの小さな極性リガンドを持つ遷移金属複合体を意味する。極性リガンドの実際の数は、金属イオンの配位数(n)に依存する。極性リガンドの好ましい数は、（n-1）および（n-2）である。例えば、六座配位（hexacoordinate）金属（Fe、Ru、およびOsのようなもの）について、溶媒接触可能な遷移金属複合体は、好ましくは1つから5つまでの小さな極性リガンドをもち、2から5までが好ましく、そして3から5までが特に好ましい（下記により一層十分に記述するように、他の部位の要件に依存する）。PtおよびPdのような四座配位金属は、好ましくは1つ、2つまたは3つの小さな極性リガンドをもつ。
【０１１０】
「溶媒接触可能（solvent accessible）」および「妨げられた溶媒（solvent inhibited）」が相対語であることを理解すべきである。つまり、適用されるエネルギーが高い場合、溶媒接触可能な遷移金属複合体さえ、電子を移動するように誘導されうる。
【０１１１】
EAMsのいくつかの例を、本明細書に記述する。
【０１１２】
1).  シアノベースの複合体
1側面において、本発明は、遷移金属および少なくとも1種のシアノ（-C≡N）リガンドを有するEAMsを提供する。金属の価数および系の立体配置（コンフィギュレーション）（例えば、配位原子に寄与する捕獲リガンド、その他）に従い、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのシアノリガンドを用いることができる。概して、ほとんどのシアノリガンドを使う実施態様が好適であり、また、これは系の立体配置に依存する。例えば、図15において描くように、オスミウムのような六座金属を用いるEAMは、別途捕獲リガンドから付着され、5つのシアノリガンドを許容し、第6の配位サイトが付着リンカーの末端によって占められる。六座金属が付着リンカーおよび捕獲リガンドを提供する配位原子の双方をもつとき、4つのシアノリガンドがあることができる。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、図において描かれるように、付着リンカーおよび/または捕獲リガンドは、単一の配位原子よりも多くを提供することができる。このようにして、例えば、図17において、付着リンカーは、2つの配位原子に寄与するビピリジンを含む。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、シアノリガンド以外のリガンドを、少なくとも1種のシアノリガンドとの組合せにおいて用いる。
【０１１５】
2）  Ru-Nベースの複合体
1側面において、本発明は新規なアーキテクチャーをRu-Nベースの複合体のために提供し、ここで、配位は単座、二座、三座、または多座であることができた。このように、配位リガンドL（それは、共有結合的にアンカーおよび捕獲リガンドに接続する）の数は、1、2、3、または4であることができる。例のいくつかのものは、図5Aに示される。
【０１１６】
電荷中性性リガンドは、技術分野において既知の任意の適切なリガンド（例えば、ジチオカルバマート、ベンゼンジチオレート、または本明細書に記述されるようなシッフ塩基など）であることができる。捕獲リガンドおよびアンカーは、同じフレームワーク上か、または別個であることができる。
【０１１７】
本発明の別の側面では、EAMリガンドのアーキテクチャーの各々の構成要素は、Ru錯体化学よりもむしろ、共有結合を通して接続される。アーキテクチャーの構築は、本明細書中で提供され、現代の合成有機化学方法論に頼ることができる。重要な設計的配慮には、アンカーおよび捕獲リガンドの構成要素対配位性リガンド構成要素において存在する官能基の直交反応性（orthogonal reactivity）の必要性が含まれる。好ましくは、化合物全体を合成することができ、そして酸化還元活性遷移性金属が合成の最後の工程近くでリガンドに対して配位される。本明細書に提供される配位性リガンドは、ルテニウムペンタアミン前駆体のための十分に確立された無機の方法論に頼る。Gerhardt（ゲールハルト）およびWeck（ベック）、J. Org. Chem. 71: 6336-6341 (2006)；Sizova（シゾバ）ら、Inorg. Chim. Acta.（インオルガニカ・キミカ・アクタ）、357：354-360 (2004)；およびScott（スコット）およびNolan（ノラン）、Eur. J. Inorg. Chem. 1815-1828 (2005)を参照し、参照することによってここですべてを組み込む。Ru-ペンタアミン複合体を有するEAMのアーキテクチャーのいくつかの例を、以下の図5Bにおいて示す。
【０１１８】
当業者によって理解することができるように、本明細書に提供する化合物のアンカー構成要素はアルキルおよび多足性ベースのチオールの間で交換することができる。
【０１１９】
3)  フェロセンベースのEAMs
いくつかの実施態様において、EAMsは置換されたフェロセンを含む。フェロセンは空気安定性である。それは、捕獲リガンドおよびアンカー性基の双方で、簡単に置換することができる。標的タンパク質をフェロセン上の捕獲リガンドに結合する際、それはフェロセンのまわりで環境を変えるだけでなく、また、シクロペンタジエニル環が回転（spinning）するのを防ぎ、それはおよそ4kJ/モルだけエネルギーを変える。国際公開WO/1998/57159；Heinze（エインセ）およびSchlenker（シュレンカー）、Eur. J. Inorg. Chem. 2974-2988 (2004)；HeinzeおよびSchlenker、Eur. J. Inorg. Chem. 66-71 (2005)；およびHolleman（ホールマン）-Wiberg（ウィーベリ）、Inorganic Chemistry、Academic Press（アカデミック・プレス社）、第34版、1620でのものを、参照することによって組み込む。
【化１１】
2011501161.tif 000012
【０１２０】
いくつかの実施態様において、アンカーおよび捕獲リガンドを、より一層簡単な合成のために同じリガンドに付着する。いくつかの実施態様において、アンカーおよび捕獲リガンドは異なるリガンドに付着される。
【０１２１】
本明細書に開示する新規なアーキテクチャーを構築するのに用いることができる多くのリガンドがある。それらには、制限されないが、カルボン酸塩、アミン、チオレート、ホスフィン、イミダゾール、ピリジン、ビピリジン、テルピリジン、tacn（1,4,7-トリアザシクロノナン）、salen（N,N′-ビス（サリチリデン）エチレンジアミン）、acacen（N,N′-エチレンビス（アセチルアセトンイミネート（acetylacetoniminate）(-)）、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、DTPA（ジエチレントリアミン五酢酸）、Cp（シクロペンタジエニル）、ピンサー（はさみ）リガンド類、およびスコルピオネート類（scorpionates）が含まれる。いくつかの実施態様において、好ましいリガンドはペンタアミンである。
【０１２２】
ピンサーリガンドは、キレート性リガンドの特定の種類である。ピンサーリガンドは、金属の反対側ならびにその間に結合を造り出すために、それ自体で金属中心の周りをラップする。金属コア電子に及ぼす効果のピンサーリガンド化学は、アミン、ホスフィン、および混合ドナーリガンドと似ている。これは、金属の活性を調整する（tailor）ことができる独特の化学的状況を造る。例えば、ピンサーリガンドを適応するための複合体の立体構造（sterics）について高い要求があるので、金属が中で参加することができる反応は制限され、そして選択的である。
【０１２３】
スコルピオネートリガンドは、facの様式において金属と結合する三座リガンドを言う。スコルピオネート類の最もよく知られる部類は、トリス（ピラゾリル）ハイドロホウ酸塩またはTpリガンドである。CpリガンドはTpに対してイソロバル（isolobal）である。
【０１２４】
いくつかの実施態様では、以下の制限が望ましい：すなわち、金属複合体は、溶媒と近くで接触が許される小さな極性リガンドをもつべきである。
【０１２５】
4)  電荷中和性リガンド
別の局面において、本発明は、荷電されたリガンドを含む金属複合体をもつ組成物を提供する。中性から荷電されたものまで、または荷電されたものから中性にまで変化する系の再配置エネルギー（例えば、M(L)n+<-> M(L)n0;M(L)n-<-> M(L)n0）は、水分子および周囲のイオンが、未荷電の状態、またはそれからの変化に適応するためにより一層「再配置」されなければならないので、電荷が単純に変化する系（例えば、M(L)n2+<-> M(L)n3+）のためのものより大きくなりうる。
【０１２６】
いくつかの実施態様において、荷電されたリガンドの陰イオン化合物は、アンカーおよび捕獲リガンドを金属中心に付着するのに用いることができる。金属複合体で、内側の複合体スフィアにハロゲン化物イオンXを含むものは、荷電されたリガンド（制限されないが、チオール（R-SH）、チオラート類（thiolates）（RS-E；E=脱離基、すなわち、トリメチルシリル-基）、炭酸、ジチオール、炭酸塩、アセチルアセトネート、サリチル酸塩、システイン、3-メルカプト-2-（メルカプトメチル）プロパン酸が含まれる）と反応する。この反応のための駆動力はHXまたはEXの形成である。陰イオンリガンドが、双方の捕獲リガンドおよびアンカーを含む場合、1種の置換反応が必要とされ、そして従って、それと反応する金属複合体は、内圏において1つのハロゲン化物リガンドをもつ必要がある。アンカーおよび捕獲リガンドが別々に導入される場合、出発物質は概して、配位内圏において2つのハロゲン化物を含む必要がある。Seidel （サイデル）ら、Inorg. Chem 37: 6587-6596 (1998)；Kathari（キャサリ）およびBusch（ブッシュ）、Inorg. Chem. 8: 2276-2280 (1978)；Isied（イシイド）およびKuehn（キューン）、J. Am. Chem. Soc. 100: 6752-6754；およびVolkers（フェルカーズ）ら、Eur. J. Inorg. Chem. 4793-4799 (2006)を、参照することによってすべてを本明細書に組み込む。
【０１２７】
適切な金属複合体の例は、次のものである（以下に描く構造が複数の単座のリガンドを示し、そして多座のリガンドはシアノリガンドのような単座のリガンドの代わり、またはそれとの組合せであることができることに注目すべきである）。すなわち
【化１２】
2011501161.tif 000013
【０１２８】
いくつかの実施態様において、ジチオカルバマートが、以下の例のもののように、電荷中和性リガンドとして用いられる。
【化１３】
2011501161.tif 000014
【０１２９】
いくつかの実施態様において、ベンゼンジチオレートが、次の例のもののような、電荷中和性リガンドとして用いられる。
【化１４】
2011501161.tif 000015
【０１３０】
上記に描く構造では、Lnは配位リガンド（coordinate ligand）であり、そしてn=0または1である。
【０１３１】
いくつかの実施態様において、EAMはシッフ塩基のタイプの複合体を含む。「シッフ塩基」または「アゾメチン」によって、本明細書では、アリールまたはアルキル基に接続するが水素には接続しない窒素原子を有する炭素-窒素の二重結合が含まれる官能基が意味される。シッフ塩基は一般式R1R2C=N-R3を有する（式中、R3はシッフ塩基を安定なイミンにさせるフェニルまたはアルキルの基である）。シッフ塩基は、ヘミアミナールを形成する求核付加によって芳香族アミンおよびカルボニル化合物から合成することができ、次いでイミンを生成するために脱水が続く。
【０１３２】
Acacenは小さな平坦四座リガンドであり、その窒素および酸素の原子を通した周辺水分子に対する水素結合を形成することができ、それは再配置エネルギー効果を高める。それは多くの官能基（functionalities）で修飾することができ、制限されないが、カルボン酸およびハロゲン化物が含まれ、acacen-リガンドを捕獲リガンドに、およびアンカー基にカップリングするのに用いることができる。この系は、各種の異なる金属中心がEAMsにおいて利用させるのを許す。リガンドがその2つの酸素および2つの窒素の原子と結合するので、4つの配位部位だけが占められる。これにより、金属中心に応じて、2つの追加の配位部位を開放する。これらの配位部位は、各種の有機および無機のリガンドによって占められることができる。これらの追加の開放した部位は、捕獲リガンドを標的に結合する際に、電位シフトが最適化されるよう、内圏の置換（例えば、不安定なH2OまたはNH3は、タンパク質結合によって置き換えることができる）または外圏の影響（例えば、CO、CNはH結合に影響することができる）のために用いることができる。WO/1998/057158、WO/1997/21431、Louie（ルーイ）ら、PNAS 95: 6663-6668 (1999)、およびBottcher（ベッチャー）ら、Inorg. Chem. 36: 2498-2504 (1997)を、参照することによって本明細書にすべてを組み込む。
【０１３３】
いくつかの実施態様において、salen-複合体を同様に用いる。Syamal（シヤマル）ら、Reactive and Functional Polymers（リアクティブ・アンド・ファンクショナル・ポリマー）39: 27-35 (1999)。
【０１３４】
いくつかのacacenベースの複合体およびsalenベースの複合体の構造を以下で示し、ここで、捕獲リガンドでの官能化のために適切なリガンド上の位置および/またはアンカーをアスタリスクでマークする。
【化１５】
2011501161.tif 000016
【０１３５】
コバルトの複合体を形成するために、リガンドとしてacacenを用いることの1種の例は次のものである。
【化１６】
2011501161.tif 000017
式中、AおよびBは置換基であり、Lnは配位性リガンドであり、n=0または1であり、そしてYは対イオンである。
【０１３６】
5)  スルファト（Sulfato）リガンド類
いくつかの実施態様で、EAMはスルファトの複合体を含み、制限されないが、[L-Ru(III)(NH3)4SO4]+および[L-Ru(III)(NH3)4SO22]2+が含まれる。SO4−Ru(III)-複合体は空気安定性である。リガンドLは、捕獲リガンドおよびアンカーを含む。硫酸塩リガンドは、アミンよりも極性で、そして負に荷電される。表面の複合体は、従って周囲水分子からの寄与により、 [L-Ru(NH3)4-L′]および[L-Ru(NH3)5]2+の双方よりも大きな再配置エネルギーをもつ。IsiedおよびTaube、Inorg. Chem. 13: 1545-1551 (1974)を、本明細書中に参照することによって組み込む。
【化１７】
2011501161.tif 000018
【０１３７】
6)  多重の金属を有するEAM
本発明の1つの側面では、複数の金属中心が単一のリガンド複合体に組み込まれ、そしてそれによって信号が増える。この配置（arangement）は、標的あたりの金属の比率を上昇させ、より一層高い感度を招く。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、複数の金属中心は興味のある被分析物（標的）との大きな相互作用を可能にするためにアンカー性部分の捕獲リガンドの近くに存在する。被分析物あたり1つよりも多くのリポーター金属をもつことで、信号−雑音比を押し上げることができ、装置の感度を増加させることができる。そのような例の1種は図19において示される。
【０１３９】
いくつかの実施態様において、プルシアンブルー（Prussian blue、PB）が用いられる。プルシアンブルーは、化学的または電気化学的に、単純な鉄のシアン化物の前駆体から形成することができる、無機の、3次元ポリマー（下記参照）である。MnおよびVおよびRuのような他の金属はまた、PB様のフィルム（薄膜）中に組み込まれた。50-100nmの厚さのフィルムは迅速に形成される。捕獲リガンドを有する鉄（または他の似た金属）の複合体は、フィルムの形成の間、この複合体を前駆体と組み合わせることによって、フィルムの表面上に組み込むことができる。
Fe(H2O)63+ + Fe(CL)(H2O)53+ + Fe(CN)64- −＞ 表面上のFe-CLを有するPB 
【０１４０】
標的被分析物（タンパク質のようなもの）が結合するとき、シアノ基および表面の上の他の水分子への水の水素結合は、崩壊され、そして捕獲リガンドによるのみのものよりも多くの金属に影響を及ぼす。電気化学的信号は、この増幅のために急激に変化する。図6Aを参照。いくつかの実施態様において、タンパク質結合前の信号のバックグラウンド除去は、有利でありうる。
【化１８】
2011501161.tif 000019
【０１４１】
上記に示す例において、鉄の金属上の軸方向位（axial position）は、表面に対して直角に配置される捕獲リガンドで官能化される。単一の標的を官能基化された表面に結合させることは、直接付着した金属だけでなく隣接した金属中心にも影響を与える。
【０１４２】
Fe-CL複合体は、それが表面上だけに組み込まれ、そして過度の欠陥を引き起こさないように、フィルムの初期の形成後に加えられうる。フィルム厚は、化学反応の進行する時間によって、または、電気化学的に形成される場合にどれだけ多くの電流が溶液に適用されるかによって、制御することができる。
【０１４３】
あるいは、PBのアイランドは、捕獲リガンドを伴うか、または伴わないアルカンまたは共役されたSAMのエリア（領域）の間で成長することができる。これは、ナノパターニングを必要とし、そして試料溶液において、外来の種からの電気化学的信号を防止するのを助ける。
【０１４４】
用いることができる金属には、制限されないが、ルテニウム、鉄、レニウム、およびオスミウムが含まれ、各々に関連した適切なリガンド構造を有する。
【０１４５】
複数の金属が同じ複合体において存在するとき、複数の金属中心の間の連結性は概して金属の間で一般に「クロストーク」を可能にしてはならず、むしろ絶縁するべきである。
【０１４６】
7)  クラウンエーテルリガンド
1つの側面において、本発明は極性基（クラウンエーテル（CEs）のようなもの）を、金属中心に近接して導入した組成物を提供する。これは、標的被分析物（例は、タンパク質）をEAMに結合する際、電位シフトを増やすことができ、そして従ってプローブの感度を増すことができる。
【０１４７】
クラウンエーテルは、複素環の化学的化合物であり、それは、それらの最も単純な形態において、エチレンオキサイドの環状オリゴマーである。任意の単純なクラウンエーテルの重要な繰り返し単位は、エチレンオキシ、すなわち、-CH2CH2O-であり、それは、ジオキサンにおいて二回、および18-クラウン-6において六回繰り返される。概して、n≧4である（-CH2CH2O-）nタイプの大員環が、「クラウン」エーテルとして、それらのより一層長い体系的名称によるよりもむしろそのように称される。例えば、18-クラウン-6の体系的名称は、「1,4,7,10,13,16-ヘキサオキサシクロオクタデカン」である。クラウンエーテルの名称における最初の数は環における原子の数に言及し、そして第2の数は酸素である原子の数に言及する。
【０１４８】
また、本発明によって想定されるのはクラウンエーテルの誘導体である。
【０１４９】
この実施態様は、タンパク質結合性事象に先立って、第2のスフィア部分をEAMのルテニウム中心に結合させることに基づく。クラウンエーテル水素をペンタアンミンルテニウム複合体に結合させると、アセトニトリルにおいて著しく負（〜100 mVまで）に酸化還元電位をシフトすることが示された。Ando（アンドウ）、Coordination Chemistry Reviews、248: 185-203 (2004)、およびその中での引用；Andoら、Polyhedron（ポリヘドロン）、11: 2335-2340 (1992)）；Zang（ツアン）ら、Inorg. Chem., 4738-4743 (1994)；Todd（トッド）ら、Inorg. Chem.、32: 2001-2001 (1993)；Dong（ドン）ら、J. Am. Chem. Soc.、115、4379-4380 (1993)、すべてを本明細書中に参照することによって組み込む。
【０１５０】
本出願人は本明細書に提供されるEAMへのタンパク質結合による酸化還元電位の正のシフトを観察し、このようにして、クラウンエーテルの使用はこの効果を増幅する。タンパク質結合に先立って、金属中心に結合したいくつかの電子供与性（donating）部分（すなわち、クラウンエーテル）を有することによって、我々の初期のポテンシャルをより一層負（ネガティブ）に動かすことによる「不正工作をし（stacks the deck）」、タンパク質結合の際、クラウンエーテルが置き換えられ（第2のスフィアの配位を変化させ）、より一層大きな正の電位シフトを与える。
【０１５１】
理論に束縛されることなく、増加された電位シフトの理由はおそらく、つぎのようである。すなわち、CEは、周囲水分子に対して水素結合を形成する。CEはCEの酸素原子と結合するアルカリ金属イオン（例えば、電解質におけるNa+、K+）と結合することが知られている。水中で、CE、イオンおよび対イオン（例えば、Cl-）は、周囲水分子で水和する。標的を捕獲リガンドに結合した際、遷移金属複合体を囲んでいる水分子は、CE、アルカリ金属イオンおよびアルカリ金属イオンの対イオンを水和させる水分子と同様に置き替えられる（replaced）。図6Aおよび6Bを参照。ずっと多くの(many more)水分子が置き替えられるという事実は、結合事象において観察される、電位のシフトを増加させる。いくつかの場合に、親水性からより一層の疎水性までの環境の変化は、実際にCEからアルカリ金属塩（K+およびNa+イオンのようなもの）ならびに水分子を追い出し、そして1.0Vもの電位シフトを予想することができる。Electrochimic acta（エレクトロキミカ・アクタ）、2001、2733を、本明細書に参照することによって組み込む。図7を参照。いくつかの例は次のようである。
【化１９】
2011501161.tif 000020
式中、S1およびS2はスペーサーであり、CL=捕獲リガンドであり、そして、AG=アンカー基である。
【０１５２】
8)  ピリジン-チオエーテル/エーテル-リガンド類
いくつかの実施態様において、ピリジンチオエーテル/エーテル-リガンド類が、EAMの合成において用いられる。これらのリガンド系は、ピリジン窒素およびチオエーテル/エーテルの官能性を介して種々の金属中心と結合することができる。理論に束縛されることなく、EAMを標的に結合させる際、金属-チオエーテル/エーテルの結合が開裂されて、そして例えば、ハロゲン化物が金属中心と結合する可能性があり、それは内圏効果であり、電気化学ポテンシャルにおける大きなシフトが導かれる。
【０１５３】
そのような複合体の例の1種は、以下に示される。
【化２０】
2011501161.tif 000021
式中、Ln=金属中心の配位リガンド、L=0または1、およびX=OまたはS。
【０１５４】
いくつかの実施態様において、ビピリジンおよび他の多座の窒素ベースのリガンドで、1,10 フェナントロリンまたはテルピリジンのようなものが用いられる。これらの種類のリガンドの例を以下に示す。
【化２１】
2011501161.tif 000022
【０１５５】
D.  スペーサー基類 
いくつかの実施態様において、EAMまたはReAMCは、付着リンカーまたはスペーサー（「スペーサー1」）を介してアンカー基（それは、電極に付着する）に共有結合的に付着され、それはさらに、概して、電極への付着リンカーの関連（association）を許す機能的な部分を含む。例えば、米国特許第7,384,749号を参照し、本明細書に参照することによってその全体をそのまま、そして特に付着リンカーに関する議論のために組み込む。金電極の場合には、イオウ原子が官能基として用いることができることに注目する必要がある（この付着は、この発明の目的のために共有結合（covalent）であると考えられる）。「スペーサー」または「付着リンカー」によって、本明細書において、電極の表面を離れて酸化還元活性複合体を保持する部分が意味される。いくつかの実施態様において、本明細書に概説されるように、スペーサーは導電性のオリゴマーであるが、しかし、以下に概説されるように、適切なスペーサー部分は不動態化剤および絶縁体を含む。いくつかの場合においては、スペーサー分子は、SAM形成性種である。スペーサー部分は、実質的に非導電性であってよいが、好ましくは（しかし、必要ではない）、酸化還元活性分子および電極（HAB）の間での電子カップリングは電子移動の速度を制限しない。
【０１５６】
さらに、ReAMCsが利用される場合には、付着リンカーを、捕獲リガンドの配位原子と捕獲リガンド自体の間で用いることができる。同様に、付着リンカーを、図12-14において示されるように、分枝することができる。加えて、付着リンカーは、それらがReAMCにおいて関連しないとき、捕獲リガンドを電極に付着するのに用いることができる。
【０１５７】
付着リンカーの1端部は、EAM/ReAMC/捕獲リガンドに連結され、そして他端部（当業者によって理解されるが、それはどちらについても正確な末端である必要はない）は電極に付着される。
【０１５８】
酸化還元活性分子を含んでいる導電性のオリゴマーの共有結合的付着（および他のスペーサー分子の付着）は、用いられる電極および導電性のオリゴマーに依存して、様々なやり方において成し遂げることができる。例えば、構造12-19および米国特許出願公開第20020009810における添付のテキストを参照し、本明細書に参照することによってその全体をそのまま組み込む。
【０１５９】
概して、スペーサーの長さは、米国特許第6,013,459、6,013,170および6,248,229、ならびに7,384,749号明細書において導電性のポリマーおよび不動態化剤について概説され、そのすべてを参照することによって全体としてそのまま本明細書に組み込む。当業者によって理解されるように、スペーサーがあまりに長くなる場合、酸化還元活性分子および電極の間の電子カップリングは迅速に減少する。
【０１６０】
E.  捕獲リガンド類
様々な分子は、捕獲リガンドとして本発明において用いることができる。「捕獲リガンド」または「結合性リガンド」または「捕獲結合性リガンド」または「捕獲結合性種」または「捕獲プローブ（探針）」によって、個々で標的被分析物と結合する標的被分析物の存在について探るのに用いる化合物が意味される。概して、捕獲リガンドは、検出の目的のために、電極への標的被分析物の付着を許す。より一層十分に以下で概説されるように、捕獲プローブへの標的被分析物の付着は直接（すなわち、標的被分析物が捕獲リガンドに結合する）または間接的（1つまたは複数の捕獲エキステンダーリガンドが用いられる）でありうる。「共有結合的に付着した」によって、本明細書中で、2つの部分が、少なくとも1つの結合によって、シグマ結合、パイ結合および配位結合を含めて、付着されることが意味される。
【０１６１】
いくつかの実施態様において、結合は特異的であり、そして捕獲リガンドは結合対の一部である。「特異的に結合」によって、ここでリガンドが被分析物を、試験試料の被分析物および他の構成要素または汚染物質を区別するのに十分な特異性で結合することが意味される。しかし、当業者によって理解されるように、被分析物を、高度に特異的でない結合を用いて検出することは可能であり、例えば、それらの系は異なる捕獲リガンド（例えば異なるリガンドのアレイ）を用いることができ、そして任意の特定の被分析物の検出は、結合性リガンドのパネルに対する結合のその「サイン」を介してであり、「電子鼻」が働く様式と似ている。これは、特定の有用性を化学的被分析物の検出において見出す。結合は、非特異的な結合を取り除くための洗浄工程を含む、アッセイの条件下で結合を維持するのに十分でなければならない。この結合は、非特異性の結合を取り除くための洗浄工程を含む、アッセイの条件下で結合を維持するのに十分でなければならない。概して、結合性リガンドに対する被分析物の分離定数は、少なくとも10-4-10-6M-1の範囲にあり、好ましい範囲は10-5から10-9 M-1で、そして特に好ましい範囲は10-7-10-9M-1である。
【０１６２】
当業者によって理解されるように、捕獲リガンドの組成は標的被分析物の組成に依存する。多種多様な被分析物に対する捕獲リガンドは、既知であり、または既知の技術を用いて簡単に見出すことができる。例えば、被分析物が一本鎖核酸であるとき、捕獲リガンドは相補的核酸でありうる。同様に、被分析物は核酸結合性タンパク質であることができ、そして捕獲結合性リガンドは一本鎖または二重鎖核酸である。あるいはまた、被分析物が一本鎖または二重鎖核酸であるとき、結合性リガンドは核酸-結合性タンパク質でありうる。被分析物がタンパク質であるとき、結合性リガンドはタンパク質または小分子を含む。好適な結合性リガンドタンパク質には、ペプチドが含まれる。例えば、被分析物が酵素であるとき、適切な結合性リガンドは基材およびインヒビターを含む。当業者に理解されるように、被分析物として、または結合性リガンドとしてのいずれでも、関係する任意の2つの分子を用いうる。適切な被分析物/結合性リガンドの対には、制限されないが、抗体/抗原、レセプター/リガンド、タンパク質/核酸、酵素/基質および/またはインヒビター、そして炭水化物（糖タンパク質および糖脂質が含まれる）/レクチン、タンパク質/タンパク質、タンパク質/小分子が含まれ、そして炭水化物およびそれらの結合性パートナーはまた、適切な被分析物−結合性リガンド対でもある。これらは、野生型または誘導体シーケンスでよい。好適な実施態様において、結合性リガンドは、細胞表面レセプターの一部分（特に細胞外一部分）であって、多量体を形成することで知られる、成長ホルモン受容体、ブドウ糖輸送体（特にGLUT 4レセプター）、トランスフェリン受容体、上皮細胞増殖因子受容体、低密度リポタンパク質受容体、高密度リポタンパク質受容体、上皮細胞増殖因子受容体、レプチン受容体、インターロイキン受容体（IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15およびIL-17レセプターのようなものを含む）、ヒト成長ホルモン受容体、VEGF受容体、PDGF受容体、EPO受容体、TPO受容体、毛様体神経栄養因子受容体、プロラクチン受容体およびT-細胞受容体などである。
【０１６３】
本明細書に記述するように、捕獲リガンドは共有結合を介して配位性リガンドおよび/またはアンカーに付着することができる。捕獲結合性リガンドの付着の方法は概して、技術分野において知られていているように行われ、そして付着リンカーおよび捕獲結合性リガンドの組成に依存すする。概して、捕獲結合性リガンドは各々の上の官能基であって、次いで付着のために用いることができる官能基の使用を通して付着リンカーに付着される。付着のための好ましい官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基である。これらの官能基は次いで、直接または、リンカー（「Z」として本明細書にしばしば描かれる）の使用を通して付着することができる。リンカーは、技術分野において既知であり、例えば、ホモ-またはヘテロ-二官能性リンカーとしてよく知られている（1994 Pierce Chemical Company catalog（ピアス・ケミカル社、カタログ）, technical section on cross−linkers（クロスリンカーのテクニカルセクション）, 第155-200頁を参照し、本明細書に参照することによって組み込む）。好ましいZリンカーには、制限されないが、アルキル基（ヘテロ原子部分を含む置換されたアルキル基およびアルキル基を含む）が含まれ、短いアルキル基、エステル類、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコールおよび誘導体が好ましい。Zはまたスルホン基でよく、スルホンアミドを形成する。
【０１６４】
このように、タンパク質、レクチン、核酸、小さな有機分子、炭水化物、その他を含む捕獲結合性リガンドを加えることができる。
【０１６５】
いくつかの実施態様において、抗体またはその断片が、捕獲リガンドとして用いられる。ここで「抗体」によって、特異的に抗原と結合することができる免疫グロブリンと呼ばれるグリコシル化されたタンパク質のファミリーのメンバーが意味される。用語「抗体」は全長のものを含み、同様に技術分野において既知の抗体断片（例えば、てFab、Fab2、単鎖抗体（例えばFv）、キメラ抗体、ヒト化した抗体およびヒト抗体、その他）を含み、抗体全体の修飾または組換えDNA技術を使って新たに合成されたもの、およびその誘導体のいずれによっても生産される。
【０１６６】
しかし、いくつかの実施態様において、抗体全体は好ましくない。これは、抗体があまりに嵩高いく、トランスデューサーとの干渉が導かれるからである。したがって、いくつかの実施態様において、抗体断片およびミニトープ類が捕獲リガンドとして用いられる。
【０１６７】
本明細書において「エピトープ」によって、抗原の抗体認識の実際の部位が意味される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定基部位」と取り換えて用いられる。
【０１６８】
「ミニトープ類」または「ミモトープ（mimotope）」によって、本明細書において、生物学的に重要な部位（例えば、エピトープ、または酵素活性部位、または受容体結合部位）の空間的構造をもつペプチドが意味される。
【０１６９】
いくつかの実施態様において、捕獲リガンドは、抗体代替物（antibody alternatives）を含み、アビマー（avimer）を含むが、これに限られない。本明細書において「avimer」によって、インビトロエキソンシャッフリングおよびファージ提示によってヒト細胞外受容体ドメインの大きなファミリーから発展する（evolved from）タンパク質が意味される。それは、概して、結合性および抑制性の特性を有する多ドメインタンパク質である。Silverman（シルヴァーマン）ら、Nature Biotechnology（ネイチャー・バイオテクノロジー）23: 1556-1561 (2005)を、本明細書に参照することによって組み込む。
【０１７０】
いくつかの実施態様において、捕獲リガンドは、オリゴマーペプチドを含む。これらのペプチドは技術分野において既知の技術を用いて得ることができ、制限されないが、ファージ提示、Sidhu（シドゥ）ら、Methods Enzymol.、328、333−363（2000）、および1ビーズ1ペプチドが含まれる。例えば、ペプチドはバイオパニング（Biopanning）を用いて得ることができる。Giodano（ジオダノ）ら、Nat Med. 7: 1249-53 (2001)を、本明細書に、参照することによって組み込む。
【０１７１】
標的被分析物が核酸または核酸結合性タンパク質であるとき、捕獲リガンドは核酸でありえ、あるいはまた、概して本明細書に参照することによって組み込む米国特許第5,270,163、5,475,096、5,567,588、5,595,877、5,637,459、5,683,867、5,705,337号および関連した特許において記述されているように、核酸「アプタマー」を実質的に任意の標的被分析物に対しての結合のために開発することができる。同様に、ワイドボディの出版物が、コンビナトリアルケミストリーの方法に基づく結合性パートナーの開発に関して存在する。この実施態様では、捕獲リガンドが核酸であるとき、好ましい組成物および技術は国際出願PCT US97/20014において概説され、本明細書に参照することによって組み込む。
【０１７２】
いくつかの実施態様において、捕獲リガンドはアプタマーを含む。ここで「アプタマー」によって、一本鎖、部分的一本鎖、部分的二重鎖または、二重鎖ヌクレオチド配列であって、有利には複製可能（replicatable）なヌクレオチド配列であり、特に、Watson（ワトソン）-Crick（クリック）の塩基対形成または三重鎖形成以外のメカニズムによって選ばれた非オリゴヌクレオチド分子または分子の群を認識することができるものが意味される。本明細書に明らかにされるアプタマー類には、制限がなく、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似物、修飾されたヌクレオチド、および骨格の修飾、枝分れ部位および非ヌクレオチド残基、グループまたはブリッジを含むヌクレオチドが含まれる、規定された配列セグメントおよび配列が包含される。本発明でのアプタマー類には、部分的に、そして完全に一本鎖および二重鎖のヌクレオチド分子および配列、合成RNA、DNAおよびキメラのヌクレオチド、ハイブリッド、デュプレックス、ヘテロデュプレックス、および任意のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそのキメラのカウンターパートおよび/または対応する相補的な配列、プロモーターまたは、アプタマー分子または配列のすべてまたは一部を増幅、転写または複製するのに必要なプライマー-アニーリング配列が含まれる。アプタマーは、特に、可溶性、不溶性、または固定化された選ばれた分子（例は、リガンド、受容体およびエフェクター分子）と特異的に結合することができる。あるいはまた、用語「アプタマー」は、特定の結合と明確に異なるメカニズムによって、化学的に穏やかな（chemically bland）表面の、形状に特有の認識ができるヌクレオチドを含む。本発明でのアプタマー類は、特に、選ばれた標的分子（例は、リガンドまたは受容体）の化学的アイデンティティよりもむしろ化学的に穏やかな表面（例は、シリコンチップまたはカーボンナノ構造）を含む構造的形状または表面上の特長を認識するように選定されうる。アプタマーは、それ自体が分子であるか、またはヌクレオチド分子または分子の群が含まれる配列セグメント（例は、合成ヘテロポリマー、多価ヘテロポリマーのハイブリッド構造またはアプタマーの多分子装置を含む規定された配列セグメントまたはアプタマーの配列）でありうる。
【０１７３】
IV.  本発明の組成物を作成する方法 
当業者によって理解されるように、組成物は技術分野において既知の様々な技術を用いて作成することができる。例えば、米国特許第6,013,459号、6,248,229、7,018,523、7,267,939号明細書、米国特許出願番号第09/096593および60/980,733、米国仮出願で、本出願と並行して出願される「Electrochemical Assay for the Detection of Enzymes（酵素の検出のための電気化学的アッセイ）」と題される出願（特に合成と関係した教示のため）の開示を参照。
【０１７４】
1つの実施態様において、図3に描くように、本発明の組成物を作成する。この実施態様で、捕獲リガンドの付着のために官能基を含む種が備わる電極が用いられ、そしてその組成物が作成された後、相補的官能基を有する捕獲リガンドが添加され、捕獲リガンドの表面への基本的に自然発生的な付加がもたらされる。当業者によって理解されるように、用いることができる多種多様な官能基/相補的官能基がある。適切な官能基には、制限されないが、マレイミド、イミドエステル、N-ヒドロキシサクシニミジル、ハロゲン化アルキル、アリールハロゲン化物、アルファ-ハロ・アシルおよびピリジル（pryidyl）ジスルフィドが含まれる。概して、対応する/相補的な官能基は、スルフヒドリル、アミン、アミン、スルフヒドリル、スルフヒドリル、スルフヒドリルおよびスルフヒドリルのそれぞれである。当業者によって理解されるように、これらの官能基の方向性を切替えることが可能であり、例えば、スルフヒドリルが、付着リンカー上で存在し、そしてマレイミドは捕獲リガンドとして用いる生体分子に加えられる。
【０１７５】
本明細書で注目されるように、付着の方法は、2つの構成要素上で存在する反応基に依存する。例示的な実施態様において、本発明でのハプテンの反応性官能基および反応性部分の官能基は、求電子剤および求核剤（それらは、その間の共有結合のつながりを生じさせることができる）を含む。あるいはまた、反応性官能基は、光活性化することができる基を含み、それは適切な波長の光を伴うイルミネーションの後でだけ化学的に反応性になる。典型的に、反応性官能基と反応性パートナーの間の共役反応は、反応性官能基の1種または複数の原子を招くか、または反応性パートナーは、2つの構成要素を付着する新規な連結に組み込まれる。官能基と連結の選ばれた例を表1に示し、ここで、求電子基と求核基の反応は共有結合連結を産生する。
【表１】
2011501161.tif 000023
【０１７６】
*  活性化されたエステル類は技術分野において理解されるように、概して、式-COΩを有し、式中、Ωは良好な脱離基（例えば、オキシサクシニミジル（-OC4H4O2）オキシスルホサクシニミジル（-OC4H3O2-SO3H）、-1-オキシベンゾトリアゾリル（-OC6H4N3）；あるいは、ニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、またはトリフルオロメチル、またはその組合せのような電子求引性置換基によって、1または複数回置換されたアリールオキシ基またはアリールオキシであって、活性化されたアリールエステル類を形成するのに用いられるもの；あるいは、カルボジイミドによって活性化されたカルボン酸で、無水物または混合された無水物-OCORaまたは-OCNRaNHRbを形成するもの（式中、RaおよびRbは、それらが同じか、または異なってよく、それはC1-C6アルキル、C1-C6ペルフルオロアルキル、またはC1-C6アルコキシである）；またはシクロヘキシル、3-ジメチルアミノプロピル、またはN-モルホリノエチルである）。
**  アシルアジドはまたイソシアン酸塩に再配置することができる。
【０１７７】
官能基および相補的官能基はまた、柔軟性または立体的な堅さのために（場合によってはまたは他の理由のためでありうる）、リンカーを含むこともできる。
【０１７８】
図は官能基および相補的な官能基の存在を描くが、場合によっては、付加が、これらの基からの原子の損失を招き、よって、図が、官能基全体および相補的な官能基が最終的な組成において存在する状況を描くことは意味されない。
【０１７９】
加えて、図は「単官能基」のリンカー（例えば、マレイミド）の使用を描く。ホモ-またはヘテロの二官能性基のいずれかを利用する追加的な工程を含むことも可能である（1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross linkers, pages 155-200を参照し、本明細書に参照することによって組み込む）。例えば、1つの末端にイオウ原子を、他の端部にアミノ基を含む付着リンカーは、アミンと反応する二官能性基のリンカーと反応することができ、そしてその後、アミノ基を含む捕獲リガンドを加えることができる。
【０１８０】
別の実施態様において、本発明の組成物は、各々の構成要素を合成し、そして（通常、同時に）それらを電極に添加することによって作成される。つまり、図12Aの実施態様において、例えば、付着リンカー（イオウ原子のような付着の機能的な部分を有するもの）、リガンド、遷移金属および結合性リガンドを含むREAMCが作成され、そして（任意にSAM形成性種を伴って）電極に加えられる。同様に、2つまたは3つの構成要素の系が、図1Bにあり、付着リンカーおよび付着官能基を有するEAMを含む第1の種、捕獲リガンドを有する付着リンカーを含む第2の種、およびSAM形成性種の任意の第3の種が、電極に対して、通常、同時に、加えられる。場合によっては、構成要素は順に加えることができ、そして場合によっては、さらなるSAM形成性種（および/または他の構成要素）を任意の加熱とともに加えることで行われるポスト合成工程を、電極上で良好なパッキングを確実にするために行うことができる。
【０１８１】
いくつかの実施態様において、リガンドは金属複合体が形成されたあとで、それはアンカーおよび捕獲リガンドを加えることを許容する、官能性をもつことができる。
【０１８２】
いくつかの実施態様において、化合物は段階を追って合成される。したがって、捕獲リガンドおよびアンカーは、順にEAMのリガンドに加えられる。
【０１８３】
いくつかの実施態様において、捕獲リガンドおよびアンカーは、付随してEAMに加えられる。
【０１８４】
いくつかの実施態様において、「クリップ」は、最初にEAMに加えられ、そして捕獲リガンドおよびアンカー基は後に「クリップ」に加えられる。本明細書において「クリップ」によって、共有結合的にEAMに付着することができる基または部分であって、それに対して捕獲リガンドおよび/またはアンカー基を加えることができるものを意味する。
【０１８５】
クリップの1種を以下で示す。
【化２２】
2011501161.tif 000024
式中、PG=保護基である。
【０１８６】
そこではペンタアンミンを配位性リガンドとして用いるいくつかの実施態様において、捕獲リガンドを最初に加えることができ、そしてアンカー基を捕獲リガンドに加える。
【０１８７】
本発明の組成物は、様々な研究、臨床的、品質管理、実地試験セッティングにおいて用いうる。
【０１８８】
本明細書に提供される例は、説明目的だけのためであり、そして本発明の範囲を制限する意味ではない。さらに、本明細書で引くすべての参考文献は、その中のすべての関連した内容のために、参照することによって組み込む。
【０１８９】
V.  本発明の組成物を用いる方法
A.  標的被分析物および試料
1側面において、本発明は、標的被分析物の検出において有用な方法および組成物を提供する。「標的被分析物」または「被分析物」または文法上の等価物は、本明細書中で、検出される任意の分子または化合物を意味し、そしてそれは結合性の種（例は、以下に規定する捕獲リガンド）と結合することができる。適切な被分析物には、制限されないが、環境上、または臨床上の化学物質または汚染物質または生体分子のような小さい化学的分子が含まれ、制限されないが、農薬、殺虫剤、毒素、治療上のおよび乱用される薬物、ホルモン類、抗生物質、抗体、有機物質、等が含まれる。適切な生体分子には、制限されないが、タンパク質（酵素、免疫グロブリンおよびグリコプロテインを含む）、核酸、脂質、レクチン、炭水化物、ホルモン類、細胞全体（原核生物（例えば病原性細菌）および真核生物の細胞を含み、哺乳類の腫瘍細胞を含む）、ウイルス、胞子、その他が含まれる。特に好ましい被分析物は、タンパク質であり、酵素；薬物、細胞；抗体；抗原；細胞膜抗原および受容体（神経、ホルモン、栄養、および細胞表面レセプター）またはそれらのリガンドを含む。
【０１９０】
いくつかの実施態様において、標的被分析物はシトクロムP450、アビジン/ストレプトアビジン、SEB、PSA-（プロテアーゼ）、トリプシン/キモトリプシン（プロテアーゼ）、炭疽菌の胞子およびE. coli（エシェリキア・コリ）0157：H7である。
【０１９１】
いくつかの実施態様において、標的被分析物はタンパク質である。当業者によって理解されるように、本発明を用いて検出しうる多数の可能性があるタンパク性標的被分析物がある。ここでは「タンパク質」または文法上の等価物によって、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチド、誘導体および類似物で、非自然に発生するアミノ酸およびアミノ酸類似物を含有するタンパク質を含むもの、およびペプチド模倣物の構造が意味される。側鎖は、(R)または(S)の立体配置のいずれでもよい。好適な実施態様において、アミノ酸は(S)またはL-立体配置である。以下に議論するように、タンパク質が捕獲リガンドとして用いられるとき、試料の汚染物質による劣化を遅らせるためにタンパク質の類似物を利用することは望ましい場合がある。
【０１９２】
適切なタンパク質標的被分析物には、制限されないが、(1)免疫グロブリン、特にIgE、IgGsおよびIgMs、ならびに特に治療上または診断上関連した抗体で、制限されないが、例えば、ヒトアルブミン、アポリポタンパク質（アポリポタンパク質Eを含む）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、α-フェトプロテイン、チロキシン、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、アンチトロンビン、製薬に対する抗体（抗てんかん作用薬（フェニトイン、プリミドン、カルバリエゼピン（carbariezepin）、エトサクシミド、バルプロ酸、およびフェノバルビトール）、心臓作用薬（強心剤）（ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミド、およびジソピラミド）、気管支拡張薬（テオフィリン）、抗生物質（クロラムフェニコール、スルフォンアミド）、抗うつ薬、免疫抑制剤、乱用される薬物（アンフェタミン、メタンフェタミン、カンナビノイド、コカインおよびアヘン剤）および任意の多くのウイルスに対する抗体（オルソミクソウイルス（例は、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例は、呼吸器合胞体（RS）ウイルス、ムンプス（耳下腺炎）ウイルス、はしかウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例は、風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例は、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例は、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（A、BおよびCを含む）、ヘルペスウイルス（例は、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例は、狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（HIV、HTLV-Iおよび-IIを含む）、パポーバウイルス（例は、乳頭腫ウイルス）、ポリオーマウイルス、およびピコルナウイルス、などを含む）、および細菌（関心のある多種多様な病原性の、および非病原性の原核生物がまれ、それには；バチルス属；ビブリオ属、例は、V. cholerae（コレラ菌）；エシェリキア（大腸菌類）、例は、Enterotoxigenic E. coli（毒素原性大腸菌）、赤痢菌、例は、S. dysenteriae（志賀赤痢菌）；サルモネラ属、例は、S
. typhi（チフス菌）；マイコバクテリウム、例は、M. tuberculosis（結核菌）、M. leprae（ライ菌）；クロストリジウム属、例は、C. botulinum（ボツリヌス菌）、C. tetani（破傷風菌）、C. difficile（クロストリジウム・ディフィシル）、C.perfringens（ウェルシュ菌）；コリネバクテリウム属（Cornyebacterium）、例は、C. diphtheriae（ジフテリア菌）；連鎖球菌属、S. pyogenes（化膿性連鎖球菌）、S. pneumoniae（肺炎球菌）；ブドウ球菌属、例は、S. aureus（黄色ブドウ球菌）；ヘモフィルス属、例は、H. influenzae（インフルエンザ菌）；ナイセリア属、例は、N. meningitidis（髄膜炎菌）、N. gonorrhoeae（淋菌）；エルシニア属、例は、G. lamblia（ランブル鞭毛虫）、Y. pestis（ペスト菌）、シュードモナス属、例は、P. aeruginosa（緑膿菌）、P. putida（プチダ菌）；クラミジア属、例は、C. trachomatis（トラコーマクラミジア）；ボルデテラ属、例は、B. pertussis（百日咳）；トレポネーマ属、例は、Treponema palladium（梅毒トレポネーマ）；およびその他）に対する抗体が含まれる；(2)酵素（および他のタンパク質）で、制限されないが、心臓病の指標またはその処置として使われる酵素で、クレアチンキナーゼ、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノ転移酵素、トロポニンＴ、ミオグロビン、フィブリノゲン、コレステロール、トリグリセリド、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）を含む；膵臓疾患の指標で、アミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシンおよびトリプシンを含む；肝機能酵素およびタンパク質で、コリンエステラーゼ、ビリルビンおよびアルカリ性ホスファターゼを含む；アルドラーゼ、前立腺酸性ホスファターゼ、末端デオキシヌクレオチド転移酵素およびHIVプロテアーゼのような細菌およびウイルスの酵素；(3)ホルモン類およびサイトカイン（その多くは、細胞レセプターのためのリガンドとしてはたらく）で、エリトロポイエチン（EPO）、トロンボポエチン（TPO）、インターロイキン（IL-1からIL-17までを含む）、インシュリン、インシュリン様増殖因子（IGF-1および-2を含む）、上皮細胞増殖因子（EGF）、形質転換増殖因子（TGF-αおよびTGF-βを含む）、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、上皮細胞増殖因子（EGF）、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、レプチン、VEGF、PDGF、毛様体神経栄養因子、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、カルシトニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、黄体（leutinzing）ホルモン（LH）、プロゲステロン、テストステロン；および(4)他のタンパク質（α-フェトプロテイン、癌胎児抗原CEAを含む）が含まれる。
【０１９３】
加えて、抗体が検出しうる任意の生体分子は、同様に直接検出することができ、つまり、ウイルスまたは細菌細胞、治療上のおよび乱用される薬物の検出、その他が直接行われうる。
【０１９４】
適切な標的被分析物は、炭水化物を含み、制限されないが、乳がん（CA15-3、CA 549、CA 27.29）、ムチン様癌腫関連の抗原（MCA）、卵巣がん（CA125）、膵がん（DE-PAN-2）、および結腸直腸および膵性がん（CA 19、CA 50、CA242）のマーカーが含まれる。
【０１９５】
当業者によって理解されるように、多数の被分析物を本方法を用いて検出することができ、基本的に、以下に記述された結合性リガンドを作成しうる任意の標的被分析物も、本発明の方法を用いて検出しうる。
【０１９６】
いくつかの実施態様で、標的被分析物は、MRSAに関連したタンパク質である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）（また、多重抵抗性（multiple-resistant）Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）またはオキサシリン耐性黄色ブドウ球菌（ORSA）とも称する）は、ヒトにおいて処置するのが難しい感染の原因である。MRSAはβラクタムと呼ばれる抗生物質の大きな集団に耐性がある黄色ブドウ球菌の種であり、それには、ペニシリンおよびセファロスポリンが含まれる。
【０１９７】
有機体(organisum)は地域関連MRSA（CA-MRSA）または健康管理関連MRSA（HA-MRSA）としてサブカテゴライズされることが多いが、この区別は複雑である。他の著者がバクテリア自体の遺伝子の特徴によってCA-MRSAを決定する一方、MRSA感染を患っている患者に関連した基準によってCA-MRSAが規定する者もある。CA-MRSA株は、1990年代後期に最初に報告され、これらのケースは、健康管理セッティングへの曝露の欠如によって規定された。次の数年で、CA-MRSA感染症が、高齢の、およびより一層良好に調査されたヘルスケア関連の株と異なったMRSAの株によって引き起こされたことが明白になった。新規なCA-MRSA株は、アメリカ合衆国において迅速に広がり、都市の緊急治療室でこれらの感染のために治療を求める個体の間で培養された皮膚感染の最も一般的な原因になった。これらの菌株は、アスリート、刑務所および刑務所抑留者、兵士、ネイティブアラスカン（アラスカ先住民）およびネイティブアメリカンで普通に、そして都心で子供たちに皮膚感染を起こす。
【０１９８】
MRSAは、普通の細菌の黄色ブドウ球菌の抵抗性変種である。それは、ベータラクタマーゼ耐性ベータラクタム抗生物質（メチシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、およびオキサシリンを含む）での処置を生き残るための能力を発展させた。MRSAは、特に病院関連の（院内で起こる）感染症において厄介である。病院で、開いた創傷、侵襲性装置、および弱められた免疫系を有する患者は、感染のために、一般市民より一層大きな危険性がある。適切な衛生上の手法に従わない病院スタッフは、患者から患者へ細菌を移すかもしれない。指示される場合、MRSA感染症またはMRSAコロニー形成を有する患者への訪問客は提供された手袋、ガウン、およびマスクを用いて病院隔離プロトコルに従うように勧められる。そのようなプロトコルに従わない訪問客は、細菌をカフェテリア、バスルーム、およびエレベーターに広めることになる。
【０１９９】
いくつかの実施態様で、MRSA関連のタンパク質は、ペニシリン結合タンパク質2a（PBP2a）である。PBP2′はmecA遺伝子によってコードされたタンパク質であり、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびコアグラーゼ（凝固促進酵素）陰性ブドウ球菌（coagulase-negative staphylococci）の膜において存在する。PBP2′の調製は、技術分野において既知の方法で、Hardy Diagnostics（ハーディ・ダイアグノスティック社）（Santa Maria（サンタマリア）、CA（米国カリフォルニア州））によって配布されるPBP2′キットのMRSA Latex Test（ラッテックス・テスト）において記述されるプロトコルのようなものを用いて遂行することができる。
【０２００】
いくつかの実施態様で、標的はMRSAのPBP2aタンパク質であり、そして捕獲リガンドはPBP2aと結合することができる部分である。
【０２０１】
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法上の等価物は、本明細書中で、共有結合的に一緒に連結される少なくとも2つのヌクレオチドが意味される。本発明での核酸は概して、リン酸ジエステル結合を含むが、場合によっては、以下で概説されるように、核酸の類似体は、代わりのバックボーン（骨格）をもつことがあり、例えば、ホスホラミド（Beaucage（ボーケージ）ら、Tetrahedron（テトラヘドロン）49（10）: 1925 (1993)およびその中での言及；Letsinger（レットシンガー）、J. Org. Chem. 35: 3800 (1970)；Sprinzl（スプリンツェル）ら、Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977)；Letsingerら、Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1986)；Sawai（サワイ）ら、Chem. Lett. 805 (1984)、Letsingerら、J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988)；およびPauwels（ポーウェル）ら、Chemica Scripta 26: 141 91986））、ホスホロチオネート（Mag（マグ）ら、Nucleic Acids Res.、19: 1437 (1991)；および米国特許第5,644,048号明細書）、ジチオリン酸（Briu（ブリウ）ら、J. Am. Chem. 111: 2321 (1989)（O-メチルホスホロアミダイト（methylphophoroamidite）リンケージ）（Eckstein（エクスタイン）、Oligonucleotides and Analogues（オリゴヌクレオチドおよび類似体）：A Practical Approach（実際的なアプローチ）、Oxford University Press（オックスフォード大学出版部）参照）、およびペプチド核酸骨格およびリンケージ（Egholm（エゴルム）、J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992) ；Meier（マイアー）ら、Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992)；Nielsen（ニールセン）, Nature, 365:566 (1993); Carlsson（カールソーン）ら, Nature 380:207 (1996)参照、それらのすべてを参照することによって組み込む)が含まれうる。他の類似体の核酸は、正の骨格（positive backbone）(Denpcy（デンプシィ）ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995)；非イオン性骨格(米国特許第5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141および4,469,863号明細書；Kiedrowshi（キードロウシ）ら, Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991)；Letsinger ら, J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；Letsingerら, Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994)；Chapters 2および3, ASC Symposium Series 580, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research（アンチセンス研究における炭水化物修飾）”, Y.S. Sanghui（サングイ）およびP. Dan Cook（P.ダン・クック）；Mesmaeker（メスマエカー）ら, Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994)；Jeffs（ジェフス）ら, J. Biomolecular NMR 34:17 (1994)；Tetrahedron Lett. 37:743 (1996))および非リボース骨格、米国特許第5,235,033および5,034,506号明細書に記載されているものを含み、およびChapters 6および7, ASC Symposium Series 580, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, Ed. Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cook.  Nucleic acids containing one or more carbocyclic sugars are also included within the definition of nucleic acids（1または複数の炭素環式糖を含む核酸はまた核酸の定義内に含まれる）(Jenkins（ジェンキンス）ら, Chem. Soc. Rev. (1995) pp169-176参照)を有するそれらを含む。いくつかの核酸の類似体は、Rawls（ラウルズ）, C & E News June 2, 1997年第35頁に記述される。これらの参考文献のすべては、参照することによって本明細書に明示的に組み込む。リボース-リン酸塩骨格のこれらの修飾は、ETMの付加を容易にし、または生理的環境でのそのような分子の安定性および半減期を増加するために行われうる。
【０２０２】
当業者によって理解されるように、これらの核酸の類似体のすべては本発明での使用が見出されうる。さらに、自然に発生する核酸および類似体の混合物を作成することができ、例えば、導電性のオリゴマーまたはEAM付着の部位で、類似体構造を用いうる。あるいはまた、異なる核酸の類似体の混合物、および自然に発生する核酸および類似体の混合物を作成しうる。
【０２０３】
核酸は、指定されるように、一本鎖または二重鎖であるか、または二重鎖または一本鎖の双方の配列の部分を含みうる。核酸は、DNA（ゲノムおよびcDNAのいずれも）、RNAまたはハイブリッドでよく、本明細書中で、、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン（xathanine）ヒポキサンチン（hypoxathanine）、イソシトシン、イソグアニン、その他の塩基の任意の組合せを含む。概して、米国特許第5,681,702号明細書に記述されているように、好ましい実施態様は、標的配列よりもむしろ、他のプローブに対して相補的に設計された核酸中のイソシトシンおよびイソグアニンを利用し、これが非特異的ハイブリダイゼーションを減らす。本明細書に用いるように、「ヌクレオシド」という語はヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体だけでなくヌクレオチド、そしてアミノ修飾されたヌクレオシドのような修飾されたヌクレオシドを含む。さらに、「ヌクレオシド」は、非自然に発生する類似体構造を含む。したがって、例えば各々が塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、本明細書中ではヌクレオシドと称する。
【０２０４】
いくつかの実施態様で、核酸標的被分析物は好ましくない。
【０２０５】
概して、試料は本発明の組成物に加えられる。１局面において、本発明は、試料中の標的酵素を検出する方法を提供する。「試料」または「試験試料」によって、本明細書中で、検出される被分析物または被分析物を含む組成物が意味される。試料は異種であることができ、いろいろな構成要素、すなわち異なるタンパク質を含むことができる。あるいはまた、試料は同種でありえ、1種の構成要素を含む。試料は、自然発生性、生物学的物質、または人工物質であることができる。物質は、天然または変性した形態であることができる。試料は、単細胞または複数の細胞、血液試料、組織試料、皮膚試料、尿試料、水試料、または土壌試料でありうる。いくつかの実施態様において、試料は単細胞の内容物、または複数の細胞の内容物を包含する。試料は生きている有機体で、真核生物、原核生物、哺乳類、ヒト、酵母（イースト）、または細菌のようなもの由来でありえ、または試料はウイルス由来であることができる。試料は任意の処置を伴わず、または必要に応じて伴って用いることができる。
【０２０６】
いくつかの実施態様において、標的被分析物は、試験試料中に含まれ、存在する場合、標的被分析物が捕獲結合性リガンドと結合する状況下で、本発明の組成物が加えられる。これらの状況は、概して、生理的状況である。概して、複数のアッセイ混合物は、種々の濃度に対する異なった反応を得るために、異なる濃度と共に平行して運転する。典型的に、これらの濃度のうちの1種は、ネガティブコントロールとして用いられ、すなわち、0濃度、または検出レベルよりも低い。さらに、任意のいろいろな他の試薬も、スクリーニング（ふるい分け）アッセイに含まれうる。これらには、塩類、中性タンパク質のような試薬（例えば、アルブミン、洗剤）等で、最適な結合を容易にするもの、および/または非特異的な、または背景相互作用を減らすのに用いられるものを含む。また、さもなければ、アッセイの効率を改善する試薬で、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤、その他のようなものが用いられうる。構成要素の混合物は、任意の順序で加えることができ、必要な結合を提供する。
【０２０７】
当業者によって理解されるように、多数の被分析物は本方法を用いて検出される。基本的に、作成されうる以下に記載の捕獲リガンドのための任意の被分析物が、本発明の方法を用いて検出されうる。
【０２０８】
加えて、当業者は、信号の損失に頼るアッセイにおいて本発明の組成物を用いることも可能であることを認める。例えば、酸化還元活性分子が抑制されるとき、最初の測定がされ、そして次いで、系は標的被分析物の導入の結果として変化し、溶媒抑制された分子が溶媒接触可能にされ、信号の損失がもたらされる。これはいくつかのやり方において行われ、それは当業者によって理解される。
【０２０９】
いくつかの実施態様において、標的被分析物が存在するとき、第1の測定が採られる。例えば、高い塩濃度または熱の状況を用いて、標的被分析物をその後除去し、そして次いで、第2の測定をする。信号の損失の定量化はアッセイの基礎として役立つことができる。
【０２１０】
あるいはまた、標的被分析物は酵素でありうる。この実施態様では、好ましくは、しかし要求されないが、酸化還元活性分子に好ましくは、1つまたは複数のリガンドとして共有結合的に付着されるよう、酸化還元活性分子は、酵素基材または類似体の存在によって溶媒抑制される。、。標的酵素の導入の際に、酸化還元活性分子が溶媒を接触可能にするように、開裂されるか、またはさもなければ基材が立体的に変化するよう、酵素は基材と関係する。この変化は次いで検出することができる。これは、単一の酵素分子が複数の溶媒接触可能な分子を招くことができるため、信号の増幅をもたらすという点で有利である。これは、酵素（特にスカベンジャープロテアーゼまたはカルボヒドラーゼ）を分泌する細菌または他の病原体の検出において特定の使用を見出される。
【０２１１】
いくつかの実施態様で、標的被分析物はプロテアーゼである。プロテアーゼは6つの群に分類され、すなわち、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸プロテアーゼである。概して、プロテアーゼは、タンパク質のアミノ酸配列に従い、特定のペプチド結合を壊すこと（例は、限られたタンパク質分解のための特定のセグメント）ができ、またはアミノ酸に完全なタンパク質を分解すること（無制限のタンパク質分解）のいずれもできる。活性は破壊的な変化であり、タンパク質の機能をだめにするか、その主要な構成要素にまでそれを消化し、それは機能の活性化でありえ、またはそれはシグナリング経路の信号であることができる。
【０２１２】
いくつかの実施態様で、標的酵素はエンドペプチターゼである。本明細書中で、「エンドペプチターゼ」によって、タンパク質基板の範囲内でペプチド結合を壊すペプチダーゼが意味され、それは、タンパク質基材の一方または双方の末端からのペプチド結合を壊すエキソペプチダーゼと対照的である。エンドペプチターゼは、触媒メカニズムに基づいてサブクラスに分けられ、すなわち、セリンエンドペプチターゼ、システインエンドペプチターゼ、アスパラギン酸エンドペプチターゼ、メタロエンドペプチダーゼ、および他のエンドペプチターゼである。
【０２１３】
(1).  セリンエンドペプチダーゼ
【０２１４】
このクラスは、2つの異なったファミリーを含む。哺乳類の酵素で、キモトリプシン、トリプシンまたはエラスターゼまたはカリクレインのようなものを含むキモトリプシンファミリー、およびサブチリシンのような細菌の酵素を含むサブスチリシン（substilisin）ファミリーがある。一般的な三次元（3D）構造は2つのファミリーで異なり、しかし、それらは、同じ活性部位の幾何学をもち、そして触媒作用は同じメカニズムによって進行する。セリンエンドペプチターゼは、基質残基と相互作用する種々の酵素サブサイトにおけるアミノ酸置換に関連して、異なる基質特異性を示す。いくつかの酵素は基質との延長した相互作用部位をもつ一方、他は、P1基質残基に制限される特異性をもつ。
【０２１５】
(2).  システインエンドペプチダーゼ
【０２１６】
このファミリーはパパイン、アクチニジンまたはブロメラインのような植物プロテアーゼ、いくつかの哺乳類のカテプシンを含み、リソソームカテプシンおよびカテプシン類B、L、S、H、J、NおよびOが含まれ；細胞質性カルパイン（カルシウム活性化された）ならびに、いくつかの寄生的なプロテアーゼ（例は、トリパノソーマ属、住血吸虫属）およびカスパーゼを含み、インターロイキン変換酵素（ICE）が含まれる。
【０２１７】
(3).  アスパラギン酸エンドペプチターゼ
【０２１８】
ほとんどのアスパラギン酸エンドペプチターゼはペプシンファミリーに属する。ペプシンファミリーは、ペプシンおよびキモシンならびにリソソームカテプシンDおよび処理酵素で、レニン、および一定の菌類プロテアーゼ（ペニシロペプシン（penicillopepsin）、リゾプスペプシン（rhizopuspepsin）、エンドチアペプシン（endothiapepsin））のような消化酵素を含む。第2のファミリーは、レトロペプシンとも呼ばれるエイズウイルス（HIV）からのプロテアーゼのようなウイルスエンドペプチターゼを含む。
【０２１９】
セリンおよびシステインプロテアーゼと対照的に、アスパラギン酸エンドペプチターゼによる触媒作用には四面体の中間体の存在を介する、共有結合中間体が関与しない。求核攻撃は、2つの同時陽子移動によって達成される。１つは水分子から、2つのカルボキシル基の二分子まで、および第2のものは、二分子からの1つから基質のカルボニル酸素までであり、同時にCO-NH結合開裂を伴う。
【０２２０】
(4).  メタロエンドペプチターゼ
【０２２１】
メタロエンドペプチターゼは、細菌、真菌、ならびにより一層高等な有機体において見出される。それらはそれらの配列およびそれらの構造において大いに異なるが、大多数の酵素は触媒的に活性な亜鉛原子を含む。場合によっては、亜鉛は活性を失わずにコバルトまたはニッケルのような別の金属と取り替えられうる。細菌性サーモリシンはよく特徴づけられ、そしてその結晶学的な構造は亜鉛が2つのヒスチジンおよび1つのグルタミン酸によって結合されることを示す。多くの酵素は配列HEXXHを含み、それは2つのヒスチジンリガンドを亜鉛に提供し、その一方、第3のリガンドは、グルタミン酸（サーモリシン、ネプライシン、アラニルアミノペプチダーゼ）またはヒスチジン（アスタシン）のいずれでもある。他のファミリーは、Zn原子の結合の異なったモードを示す。触媒メカニズムは、切れやすい結合のカルボニル基の上での亜鉛結合水分子の攻撃の後、非共有結合四面体の中間体の形成を導く。この中間体はさらに、脱離基へのグルタミン酸陽子の移動によって分解される。
【０２２２】
特定の関心は、アデノシンデアミナーゼ、アンジオテンシン変換酵素、カルシニュリン、メタロベータラクタマーゼ、PDE3、PDE4、PDE5、腎臓ジペプチダーゼ、およびウレアーゼを含むメタロ（金属）酵素である。
【０２２３】
1つの実施態様で、メタロエンドペプチターゼは、MMP-1からMMP-17まで、特にMMP-1、MMP-2、MMP-7およびMMP-9を含むマトリクスメタロプロテイナーゼである。
【０２２４】
(5).  細菌/毒素エンドペプチダーゼ
【０２２５】
通常、細菌の起源の毒素エンドペプチターゼは、宿主有機体において破壊的で、しばしば致死的な影響をもつことがある。より一層よく知られた細菌のエンドペプチターゼ毒素のいくつかを、表1において下に挙げる。
【０２２６】
【表２】
2011501161.tif 000025
【０２２７】
ボツリヌス菌のニューロトキシン（BoNT、血清型A-G）および破傷風菌の破傷風ニューロトキシン（TeNT）は細菌の毒素の2つの例であり、それらはエンドペプチターゼである。BoNTは最も一般的には乳児および食物性ボツリヌス症と関係し、腸にある間、神経毒と、毒素分子に保護と安定性を提供すると思われている1つまたは複数の関係するタンパク質とから構成される大きな複合体として自然に存在する。TeNTは、創傷中の植物性破傷風菌から合成され、他の任意のタンパク質成分と複合体を形成しないようにみえる。
【０２２８】
BoNTは、特に神経シナプス膜でシナプス小嚢のドッキングをコントロールする小さなタンパク質を開裂させる、非常に特異的な亜鉛依存的なエンドプロテアーゼである。BoNT AおよびBoNT Eは、特異的に25kDのシナプトソームの関係するタンパク質（SNAP-25（スナップ）-25）を開裂させ、BoNT Aで残基Q197およびR198の間で開裂させる。SNAP-25は、神経伝達物質放出の規制に関与するシナプス前プラズマ膜タンパク質である。異なるタンパク質アイソフォームをコードする2つの代わりの転写物変異体が、ヒトにおけるこの遺伝子のために記述され、SNAP25A（GenBank受入番号NP_003072）およびSNAP25B（GenBank受入番号NP_570824）である。BoNT Cは、膜タンパク質シンタキシンおよびSNAP-25を開裂させる。BoNT B、D、FおよびGは、細胞内小嚢関係の膜関連タンパク質（VAMP、またシナプトブレビンと称される）に特有である。Schiavo（スキアボ）ら、JBC 266：23784-87 (1995);Schiavoら、FEBS Letters 335：99-103 (1993)を参照し、本明細書に、それらを全体としてそのまま参照することによって組み込む。
【０２２９】
いくつかの試験管内のアッセイは、固定化された合成ペプチド基材の開裂に基づいて展開された。Hall（ホール）ら、J Clin Microbiol 34: 1934-8 (1996)； Witcome（ウィットカム）ら、Appl Environ Microbiol 65: 3787-92 (1999)、およびAnne（アン）ら、Ana. Biochem 291: 253-61 (2001)。 
【０２３０】
BoNTおよびTeNTはコード化されるプラスミド（TeNT、BoNTs/A、G、およびおそらくB）またはコード化されるバクテリオファージ（BoNTs/C、D、E、F）のいずれでもあり、そして神経毒は150kDaの不活性ポリペプチドとして合成される。BoNTおよびTeNTは、溶解した細菌の細胞から放出され、それから神経毒ポリペプチドにおいて露出されたループのタンパク質分解の開裂によって活性化される。各々の活性神経毒分子は、1つの重鎖（100kDa）および軽鎖（50kDa）からなり、ジスルフィド結合によって単一の鎖間によって連結される。BoNTおよびTeNTの双方の重鎖は、2つのドメイン、すなわち、分子のN末端半分に位置付けされる毒素の移動のために必要な領域、および重鎖のC末端の範囲内で位置付けされる細胞結合性ドメイン、を含む。BoNTおよびTeNTの双方の軽鎖は、分子の亜鉛依存的なプロテアーゼ活性のために必要とされる亜鉛結合性モチーフを含む。
【０２３１】
BoNTおよびTeNTの細胞標的は、シナプス前原形質膜へのシナプス小嚢、および従って神経伝達物質の放出のために必須なものにドッキングし、および融合するために必要とされる一群のタンパク質である。BoNTは、末梢神経系と関係した運動ニューロンのシナプス前膜の上の受容体と結合する。これらのニューロンにおいて標的タンパク質のタンパク質分解はアセチルコリンの放出を抑制し、それによって筋収縮を防止する。BoNT/B、D、FおよびGは、小嚢関係の膜タンパク質を開裂させ、そしてシナプトブレビン、BoNT/AおよびEはシナプトソームの関係タンパク質SNAP-25を標的にし、そしてBoNT/CはシンタキシンおよびSNAP-25を加水分解する。TeNTは、2種類のニューロンに入ることによって中枢神経系に影響を及ぼす。TeNTは初期に運動ニューロンのシナプス前膜上の受容体と結合するが、それから脊髄への逆行する小胞輸送によって移動され、そこで神経毒は抑制性介在ニューロンに入ることができる。これらのニューロンにおいての小嚢関係の膜タンパク質およびシナプトブレビンの開裂は、グリシンおよびガンマ-アミノ酪酸の放出を中断させ、それは次に、筋収縮を誘発する。BoNTまたはTeNTの中毒（弛緩性の、および痙攣性麻痺のそれぞれ）の対照的な臨床症状は、影響を受ける特定のニューロンおよびブロックされた神経伝達物質のタイプの直接的な結果である。
【０２３２】
特定の関心は、BoNT/LC（血清型C）、および特にBoNTC/LC（他のLC血清型と比較して）である。最初に、BoNTC/LCは特に重要なバイオテロリズムの脅威をもたらし、それはそれがヒト神経細胞中に長い半減期をもつからである。第2に、おそらくこのLCプロテアーゼが機能することを膜に要求するように見えるので、BoNTC/LCのための試験管内のアッセイが目下存在しない。神経細胞環境では、BoNTC/LCは、シンタキシンを開裂させ、膜タンパク質がシナプス前膜にシナプス小嚢融合のために必要とされる。
【０２３３】
他の例には、エルシニア属病原性因子YopJおよびYopT、ならびにサルモネラ菌AvrAが含まれる。
【０２３４】
他の標的被分析物には、制限されないが、凝固因子レベル（出血性または血栓症の状況）、糞便のエラスターゼ（すい臓の外分泌性の活性、例は、嚢胞性線維症または慢性膵炎）、PSA、VEGFおよびEGFR（直腸癌での腫瘍反応）、MMP-9（食道癌および初期の脳卒中マーカーの腫瘍マーカー）、MMP-13（初期の脳卒中マーカー）、カテプシンB（癌）、カテプシンG（気腫、慢性関節リウマチ、炎症）、プラスミノゲンアクチベーター（活性剤）（血栓症、慢性炎症、癌）、ウロキナーゼ（癌）が含まれる。
【０２３５】
いくつかの実施態様で、標的被分析物は、トロポニン（心臓トロポニンＩおよびT）である。トロポニンは、平滑筋でなく、骨格および心筋において筋収縮に不可欠な3つの調節タンパク質の複合体である。トロポニンは骨格の筋肉および心筋の双方で見出され、しかし、トロポニンの特定のバージョンは筋肉のタイプの間で異なる。トロポニン（心臓トロポニンＩおよびT）の2つのサブタイプは、非常に感受性で、心臓筋肉（心筋）への損傷の特異的な指標である。それらは、胸の痛みを伴う患者において不安定な狭心症および心筋梗塞（心臓発作）の間を区別するために、血液において測定される。心筋梗塞を患った患者は、損傷を受けた心筋の領域をもち、そして血液において心臓トロポニンレベルを上げた。
【０２３６】
同様に、別の実施態様は、競合タイプのアッセイを利用する。この実施態様では、結合性リガンドは、検出が望まれる実際の分子と同じであり、つまり、結合性リガンドは、実は標的被分析物または類似体である。酸化還元活性分子が溶媒抑制となるように、結合性リガンドの結合性パートナーは表面に加えられ、電子移動が起こり、そして信号を発生させる。それから、電極に結合するのと同じかまたは似た標的被分析物を含む実際の試験試料が、加えられる。試験試料被分析物は、パートナーへの結合を争い、信号において表面の結合性パートナーの損失を起こし、そして結果として減少させる。
【０２３７】
似た実施態様は標的被分析物（または類似体）を利用し、好ましくはより一層大きな部分（「ブロッキング部分」）に共有結合的に付着する。被分析物−ブロッキング部分の複合体は、標的被分析物を結合する結合性リガンドに結合し、酸化還元活性分子を溶媒抑制するのに役立つ。試験試料標的被分析物の導入は、被分析物−ブロッキング部分の複合体を争うのに役立ち、より一層大きな複合体を放出させ、そしてより一層溶媒接触可能な分子をもたらす。
【０２３８】
本発明は、さらに、AC検出方法を用いて、被分析物を検出するための機器を提供する。機器は、少なくとも最初の測定または試料電極、および２番目の測定または対電極を有する試験チャンバーを含む。3つの電極系も役に立つ。第1および第2の測定電極は、試験試料の受け取り領域で接触し、液体試験試料の存在下、2つの電極が電気的に接触することができる。
【０２３９】
さらに別の実施態様で、最初の測定電極は、スペーサーを介して（好ましくは本明細書に記述するように、導電性のオリゴマーを介して）共有結合した酸化還元活性複合体を含む。あるいはまた、最初の測定電極は、共有結合的に付着された酸化還元活性分子および結合性リガンドを含む。
【０２４０】
機器は、試験チャンバーに、つまり、測定電極に電気的に接続された電源を更に含む。好ましくは、電源は、必要ならば、ACおよびDCの電圧を送ることができる。
【０２４１】
実施態様で、機器は入力された信号および出力信号を比較することができるプロセッサーを更に含む。プロセッサーは電極にカップリングし、そして出力信号を受け取るために立体配置され、そしてこのようにして標的被分析物の存在を検出する。
【０２４２】
B.  イニシエーション（開始）
1局面において、本発明は、標的被分析物を検出する方法を提供する。
【０２４３】
存在するならば、標的被分析物が捕獲リガンドと結合するという状況の下で、標的被分析物は、試験試料内に含まれ、溶媒接触可能な酸化還元活性複合体または溶媒接触可能な酸化還元活性分子と捕獲リガンドの混合物のいずれかを含む電極に加えられる。これらの状況は、概して生理的状況である。通常、複数のアッセイ混合物は、種々の濃度に対する差異的な反応を得るために、異なる濃度を伴って平行して運転される。典型的に、これらの濃度のうちの1つ（すなわち、0濃度、または検出のレベルより低い）は、ネガティブコントロールとして用いられる。さらに、任意の種類の他の試薬も、スクリーニングアッセイに含まれうる。これらは、塩類、中性のタンパク質のような試薬（例は、アルブミン、洗剤）などで、最適な結合を容易にし、および/または非特異的な、または背景の相互作用を減らすのに用いられうるものを含む。また、さもなければ、アッセイの効率を改善する、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤、その他を用いうる。構成要素の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で加えることができる。
【０２４４】
いくつかの実施態様で、標的被分析物は、可逆的に捕獲リガンドと結合する。すなわち、非共有結合的に（抗体-抗原のタンパク質−タンパク質相互作用、酵素-基質（またはいくつかのインヒビター）または受容体-リガンド相互作用においてのように）結合する。
【０２４５】
好ましい実施態様で、標的被分析物は、不可逆的に、例えば、共有結合的に、結合性リガンドを結合する。例えば、いくつかの酵素-インヒビターの相互作用は、不可逆と考えられる。代わりに、共有結合をもたらす系の以降の操作で、被分析物はまず最初に可逆的に結合する。例えば、結合後の化学的な架橋結合を、当業者に理解されるように行うことができる。例えば、ペプチドは、様々な二官能性薬剤で、マレイミド安息香酸、メチルジチオ酢酸、メルカプト安息香酸、S-ピリジルジチオプロピオン酸塩、その他のようなものを用いて架橋結合することができる。あるいはまた、標的被分析物上の機能的に反応性の基および結合性リガンドは共有結合の付着を形成するために誘導されうる。
【０２４６】
結合性部分への被分析物の結合の際、溶媒接触可能な酸化還元活性分子は、溶媒抑制されたものになる。本明細書中で、「溶媒抑制された酸化還元活性分子」によって、溶媒抑制された酸化還元活性分子の溶媒の再配置エネルギーが、溶媒接触可能な酸化還元活性分子の溶媒再配置エネルギーより少ないことが意味される。上記したように、これがいくつかのやり方で起こりうる。いくつかの実施態様において、標的被分析物は、その小さな極性のリガンドの配位原子を、溶媒接触可能な酸化還元活性分子が少なくとも1種の、および好ましくはいくつかを失うように提供する。あるいはまた、いくつかの実施態様において、酸化還元活性分子に対する標的被分析物の近くは、リガンド交換がもたらされないで、むしろ溶媒を、金属イオン（すなわち、第1または第2の配位圏）の周りのエリアから排除し、そのようにして、必要な溶媒再配置エネルギーを効果的に下げる。
【０２４７】
いくつかの実施態様で、必要な溶媒再配置エネルギーは、酸化還元活性分子のE0において減少が、約100mVだけ（好ましくは少なくとも約200mV、および少なくとも約300-500mVが特に好ましい）もたらされるのに十分に減少する。
【０２４８】
いくつかの実施態様で、必要な溶媒再配置エネルギーは、少なくとも100mVだけ（好ましくは少なくとも約200mV、および特に好ましくは、少なくとも約300-500mV）である。
【０２４９】
いくつかの実施態様において、必要な溶媒再配置エネルギーは、溶媒接触可能な酸化還元活性分子と電極の間での電子移動（kET）の率と比較し、溶媒抑制された酸化還元活性分子と電極の間での電子移動の率の変化をもたらすのに十分に減少する。実施態様において、この率の変化は、約3のファクターについてよりも大きく、好ましくは、少なくとも約10のファクターで、および特に好ましくは少なくとも約100または複数のファクターである。
【０２５０】
溶媒再配置エネルギーの決定は、当業者によって理解されるように行う。手短に言うと、Marcus theory（マーカス論）で概説されるように、電子移動率（kET）を多数の異なる推進力（または自由エネルギー、−ΔG°）で定める。率が自由エネルギーに等しい点はλである。これは、ほとんどの場合、溶媒再配置エネルギーに相当すると扱うことができ、Gray（グレイ）ら、Ann. Rev. Biochem. 65: 537 (1996)を参照し、本明細書中に参照することによって組み込む。
【０２５１】
標的被分析物の存在を示す、溶媒抑制された酸化還元活性分子は、電子移動の開始、および溶媒抑制された酸化還元活性分子および電極の間で電子移動の信号の特徴を検出することによって検知される。
【０２５２】
電子移動は通常、電子的に開始され、電圧が好まれる。電位（potential）は、修飾された核酸プローブを含む試料に適用される。正確なコントロールおよび適用された電位における変動は定電位電解装置を介することができ、そして3つの電極系（1つの参照、1つの試料および1つの対電極）または2つの電極系（1つの試料および1つの対電極）のいずれかである。これは、一部で酸化還元活性分子の選択に、そして一部で用いられる導電性オリゴマーに依存する、系のピークの電子移動電位に、適用された電位をマッチングすることを許容する。
【０２５３】
好ましくは、開始および検出は、溶媒接触可能な、および溶媒抑制された酸化還元活性分子の溶媒再配置エネルギーの相対的な違いを最大にするために選ばれる。
【０２５４】
C.  検出
酸化還元活性分子および電極の間の電子移動は、様々なやり方で、電子的検出で検知することができ、制限されないが、好ましくは、電流測定法（amperommetry）、ボルタンメトリー、静電容量およびインピーダンスが含まれる。これらの方法には、ACまたはDC電流、パルス化した方法、ロックイン技術、およびフィルタリング（ハイパス、ローパス、バンドパス（帯域通過））に基づく時間または周波数依存的な方法が含まれる。いくつかの実施態様において、必要とされるすべてのものは、電子移動の検出であり、他において、電子移動の率が定められうる。
【０２５５】
いくつかの実施態様で、電子的検出用いられ、電流測定法、ボルタンメトリー、静電容量、およびインピーダンスが含まれる。適切な技術には、制限されないが、電子重量測定、電量分析（制御された電位電量分析および一定の電流の電量分析を含む）；ボルタンメトリー（周期的ボルタ分析法、パルスボルタ分析法（通常のパルスボルタ分析法、方形波ボルタ分析法、示差パルスボルタ分析法、オスターヤング（Osteryoung）方形波ボルタ分析法およびクーロンスタティックパルス（coulostatic pulse）技術）；除去分析（アニオディック（aniodic）除去分析、カソーディック（cathiodic）除去分析、方形波除去ボルタ分析法）；コンダクタンス測定（電解コンダクタンス、直接の分析）；時間-依存電気化学的分析（クロノアンペロメトリー（chronoamperometry）、クロノポテンシオメトリー、サイクリッククロノポテンシオメトリーおよびアンペロメトリー、ACポログラフィー、クロノグラバメトリー（chronogalvametry）およびクロノ（時）電量分析）；ACインピーダンス測定；静電容量測定；ACボルタ分析法、およびフォト電気化学が含まれる。
【０２５６】
いくつかの実施態様で、電子移動の監視は、電流測定の検出を介する。検出のこの方法は、本発明の組成物を含む電極および試験試料において補助（対）電極の間で電位（別々の基準電極と比較して）を適用することが含まれる。異なった効率の電子移動は、標的被分析物の存在、または不存在で、試料において誘導される。
【０２５７】
電流測定による電子移動を測るための装置は、感受性電流検出を含み、そして電位をコントロールする手段（通常、定電位電解装置）を含む。この電圧は、酸化還元活性分子の電位に関して最適化される。
【０２５８】
いくつかの実施態様において、代わりの電子検出モードが利用される。例えば、電位差測定（またはボルタンメトリー）の測定値は、非誘導電流の（non-faradaic）（正味電流の流れがない）プロセスを含み、そして伝統的にpHおよび他のイオンは探知器が利用される。似たセンサーは、酸化還元活性分子および電極の間で電子移動を監視するのに用いられる。さらに、絶縁体（抵抗のようなもの）の、およびコンダクター（伝導率、インピーダンスおよび静電容量（capicitance）のようなもの）の他の特性は、酸化還元活性分子と電極の間で電子移動を監視するのに用いることができる。最後に、電流（電子移動のようなもの）も発生させる任意の系も小さな磁場を生み出し、それはいくつかの実施態様において監視しうる。
【０２５９】
いくつかの実施態様で、系は標的の添加の前に有機溶媒での系を運転することによって電極上で溶媒接触可能な酸化還元活性分子の量を決定するために測定されうる。これは、センサーまたは系の内部の制御として役に立つのに、全く重要である。これは、似ているが、むしろ、異なるコントロール系に依存する、検出のために用いる同じ分子への予備的測定を、標的の追加前に許容する。このように、検出のために用いる実際の分子は、任意の実験の前に定量化することができる。水が不存在である場合、すなわち、アセトニトリルのような有機溶媒において、系を実行することは水を除外し、そして実質的に任意の溶媒再配置も否定する。これは、電極の表面にある分子の実際の数の定量化を許容する。試料は次いで加えることができ、出力信号が定められ、そして、結合された分子/結合を解かれた分子の比率が測定される。これは、先の方法に勝る重要な利点である。
【０２６０】
本発明の組成物において観察された電子移動の速い速度の1つの利益が、時間分解能により、電流に基づくモニターの信号対雑音の結果を大いに高めることができることであると理解されなければならない。本発明での電子移転の迅速な速度により、電子移動開始および完成の間で高い信号およびステレオタイプ遅延の双方がもたらされる。特定の遅れの信号を増幅することによって、電子移動のパルス化された開始の使用および検出の「ロックイン」増幅を通じてのように、信号対騒音での大規模な改善が達成されうる。
【０２６１】
理論によって拘束されないが、標的被分析物が、電極に結合し、直列にレジスターおよびコンデンサーに類似した方法で反応しうるように見える。また、酸化還元活性分子のE0は、標的被分析物結合の結果としてシフトすることができる。さらにまた、電子移動の速度に基づいて溶媒接触可能な、および溶媒抑制された酸化還元活性分子を区別することが可能である場合があり、それは標的被分析物の検出のために多数のやり方で順に利用することができる。このようにして、当業者によって理解されるように、任意の数の開始検出系を、本発明において用いることができる。
【０２６２】
いくつかの実施態様で、電子移動は開始され、そして直流（DC）技術を用いて検出する。上記したように、酸化還元活性分子のE0は、標的被分析物の結合の際、溶媒際組織化エネルギーにおける変化の結果としてシフトすることができる。このようにして、溶媒接触可能な酸化還元活性分子のE0で、そして溶媒抑制された分子のE0で採取された測定は、被分析物の検出を許容する。当業者によって理解されるように、多数の適切な方法は電子移動を検出するのに用いられうる。
【０２６３】
いくつかの実施態様で、電子移動が交流（AC）方法を用いて開始される。電極および第2の電子移動部分の間で電子移動を開始するために、最初の入力電気信号は、系に適用され、好ましくは少なくとも試料電極（本発明の複合体を含む）および対電極を介する。電圧を参照および作用電極に印加し、3つの電極系も用いうる。この実施態様では、最初の入力された信号は、少なくともAC構成要素を含む。AC構成要素は、可変的な振幅と周波数でありうる。概して、本方法において用いるために、AC振幅は、約1mVから約1.1Vまでであり、好ましくは約10mVか約800mVまで、そして特に好ましくは約10mVから約500mVまでに及ぶ。AC周波数は約0.01Hzから約10MHzに及び、そして好ましくは、約1Hzからおよそ1MHzまで、および約1Hzから約100kHzである。
【０２６４】
いくつかの実施態様で、最初の入力信号はDC構成要素およびAC構成要素を含む。つまり、試料および対電極の間の直流オフセット電圧は、第2の電子移動部分の電気化学電位を通してスイープされる。スイープは、系の最大の反応が見られる直流電圧を確認するのに用いられる。これは、概して、酸化還元活性分子の電気化学電位またはそれに近いものである。一旦この電圧が定められるなら、スイープあるいは1種または複数の均一な直流オフセット電圧が用いられうる。直流オフセット電圧は、約-1Vから約+1.1Vまでが好ましく、約500mVから約+800mVまでが特に好ましく、そして約-300mVから約500mVまでがとりわけ好ましい。直流オフセット電圧の上部で、可変的な振幅および周波数のAC信号構成要素を適用する。酸化還元活性分子が、ACの動揺に反応するのに十分に低い溶媒再配置エネルギーをもつ場合、AC電流は電極および酸化還元活性分子の間で電子移動のために生成される。
【０２６５】
いくつかの実施態様において、AC振幅は変動する。理論に束縛されることなく、振幅を増やすことが推進力を増やすように見える。このように、より高い振幅は、より高い過電圧をもたらし、電子移動のより速い速度を与える。このように、概して、同じ系は、その周波数でより高い過電圧を用いることにより、任意の周波数ででも改善された反応（すなわち、より高い出力信号）を与える。このように、振幅は高周波で増加し、系中で電子移動の速度を上昇させ、より大きな感度をもたらす。そのうえ、上記したように、電子移動の速度に基づいて、溶媒接触可能および溶媒抑制酸化還元活性分子の間を区別することは可能でありえ、それは次に、周波数または過電圧のいずれかに基づいて2つを区別するのにも用いることができる。
【０２６６】
いくつかの実施態様で、系の測定は、少なくとも2つの別々の振幅または過電圧で行い、複数の振幅での測定が好ましい。上記したように、振幅での変化の結果としての反応での変化が、系の識別、較正および定量化の基礎を形成しうる。
【０２６７】
いくつかの実施態様で、AC周波数は変動する。異なる周波数にて、異なる分子は異なるやり方で反応する。当業者によって理解されるように、概して、周波数の増加は出力電流を増やす。しかし、電子が電極および酸化還元活性分子の間で伝わる速度より周波数が大きいとき、より一層高い周波数は、出力信号の損失または減少を招く。いくつかのポイントでは、周波数は溶媒抑制された酸化還元活性分子を通してでさえ電子移動の速度より大きく、そして次いで出力信号も落下する。
【０２６８】
加えて、AC技術の使用は共有結合的に付着した核酸以外の実体のために任意の単一の周波数での背景信号の有意な現象（すなわち、不必要な信号の「ロッキングアウト」または「フィルタリング」）を許容する。つまり、電荷担体の周波数反応または溶液における酸化還元活性分子は、その拡散係数によって制限される。したがって、高周波で、電荷担体はその電荷を電極へ移すのに十分速く拡散しないかもしれず、および/または電荷移動動力学は十分に速くない場合がある。これは特に不動態化層単分子層を利用しないか、あるいは部分的または不十分な単分子層しかもたない実施態様（すなわち、溶媒が電極に接触可能である場合）において特に重要である。概説した上記の、DC技術での、電極が溶媒に接触可能である場合の「孔」の存在は、溶媒電荷担体の「短絡」の系を招くことがある。しかし、本AC技術を用いて、1種または複数の溶液における電荷担体の周波数反応を防ぎ、1種または複数の周波数を選び、単分子層が存在するか、または存在しないかを選ぶことができる。これは、血液のような多くの生物学的流体が、電流測定に関する検出方法に干渉することがある酸化還元活性分子をかなりの量を含むため、特に重要である。
【０２６９】
いくつかの実施態様で、系の測定は、少なくとも2つの別の周波数で行い、複数の周波数での測定値が好ましい。複数の周波数はスキャンを含む。好適な実施態様において、周波数反応は少なくとも2つ、好ましくは少なくとも約5つ、およびより一層好ましくは少なくとも約10の周波数にて定められる。
【０２７０】
D.  信号処理
電子移動を開始させるために入力信号を送った後、出力信号は受け取られ、または検出される。出力信号の存在および大きさは、以下のものに依存する：入力信号の過電圧/振幅；入力AC信号の周波数；電子移動部分の間の、介在媒体、すなわち、インピーダンスの組成；DCオフセット；系の環境；および溶媒である。所定の入力信号において、出力信号の存在および大きさは、概して、金属イオンの酸化状態における変化をもたらすことを要求される溶媒再配置エネルギーに依存する。したがって、AC構成要素およびDCオフセットを含む入力信号を送る際、、溶媒再配置エネルギーが十分に低く、周波数は範囲内にあり、そして振幅は十分であるとき、電子は電極および酸化還元活性分子の間に移され、出力信号がもたらされる。
【０２７１】
いくつかの実施態様で、出力信号はAC電流を含む。上記で概説するように、出力電流の大きさは多数のパラメータに依存する。これらのパラメータを変動させることによって、系はいくつかのやり方で最適化されうる。
【０２７２】
概して、本発明において発生するAC電流は、約1フェムトアンペア（femptoamp）から約1ミリアンペアまで、約50フェムトアンペアから約100マイクロアンペアまでの電流が好ましく、および約1ピコアンペアから約1マイクロアンペアまでが特に好ましい。
【実施例】
【０２７３】
実施例1．化合物の合成
化合物200
【化２３】
2011501161.tif 000026
【０２７４】
100mLの丸底フラスコに、1-ウンデカネチオール（1.4973g、7.95mmol）および乾燥メタノール（30mL）を加えた。乾燥ジクロロメタン（5mL）を、溶解を援助するために加えた。2,2-ジチオジピリジン（1.7547g、7.96mmol）を粉体として加え、次いでトリエチルアミン（1.15mL、8.27mmol）を加えた。反応混合物を、アルゴンを用いて酸素を除去し、次いで24時間アルゴンの陽圧力の下に室温で撹拌するためにセットした。反応内容物を、ロータリーエバポレーター上で乾燥させ、溶離剤として、酢酸エチル/ヘキサン（1:1）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物200（1.8494g、78%）を得た。
【０２７５】
化合物201
【化２４】
2011501161.tif 000027
【０２７６】
100mLのSchlenk（シュレンク）フラスコに、化合物200（1.8528g、6.23mmol）を乾燥テトラヒドロフラン（30mL）とともに加えた。1-メルカプトウンデカン酸（1.5108g、6.92mmol）および4-ジメチルアミノピリジン（0.7710g、6.31mmol）を、固体として、反応フラスコに、次いで追加のテトラヒドロフラン（20mL）を加えた。反応内容物をアルゴンで酸素を除去し、それから、16時間アルゴンの陽圧力の下に室温で撹拌するためにセットした。反応内容物を、ロータリーエバポレーターで乾燥させ、溶離剤として、メタノール/ジクロロメタン（1:9）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物201（1.0207g、40%）を得た。
【０２７７】
化合物202
【化２５】
2011501161.tif 000028
【０２７８】
250mLの丸底フラスコに、N-ヒドロキシスクシンイミド（0.1435g、1.25mmol）を、乾燥ジクロロメタン（100mL）とともに添加した。内容物を、溶解を援助するために超音波処理浴室に短く置き、次いで化合物201（0.5078g、1.25mmol）をジクロロメタン溶液（10mL）として一気に加えた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（0.2876g、1.39mmol）のジクロロメタン溶液（10mL）を、23分間にわたり滴下により加え、そして次いで、30分間、泡立たせたアルゴンで脱酸素化を続け、内容物を、17時間アルゴンのポジティブ圧力の下に室温で撹拌するために設定した。反応内容物を、ジシクロヘキシル尿素沈殿物を除去するためにフィルターに通し、20-25mLにまでロータリーエバポレーター上で濃縮し、それから次いで、溶離剤としてジクロロメタンにおいてメタノール（2.5%）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物202（0.3892g、62%）を得た。
【０２７９】
化合物203
【化２６】
2011501161.tif 000029
【０２８０】
25mLの丸底フラスコに、Boc-D-2,4-ジアミノ酪酸（0.3080g、1.41mmol）および無水マレイン酸（0.1415g、1.44mmol）を氷酢酸（8mL）とともに加えた。反応内容物を、4.5時間アルゴンの陽圧力の下に室温で撹拌させるためにセットした。反応内容物を、すべての揮発性物質を除去し、減圧のライン上で乾燥させ、化合物203（0.4490g）を得た。材料を、更に精製することなく、現状のままで用い；推定純度は、1HNMRデータに基づき65%である。
【０２８１】
化合物204
【化２７】
2011501161.tif 000030
【０２８２】
100mLのSchlenkフラスコに、化合物203（0.2919g、0.92mmol）を、乾燥トルエン（40mL）およびトリエチルアミン（400μL、2.89mmol）とともに加えた。フラスコにDean-Stark（ディーン-スターク）機器を付け、そして横の腕には乾燥トルエンを満たした。全体のセットアップをアルゴンでフラッシュし、そしてフラスコを、4.5時間の間、活発に還流させた。反応内容物を、ロータリーエバポレーター上で乾燥させ、黄褐色の/褐色がかった油を得た。この油を、水（20mL）に溶かし、そしてクエン酸（50mL水溶液）で酸性化した。粗生成物の抽出を、ジクロロメタン/メタノール（9:1）で達成した。有機溶液を、ロータリーエバポレーター上で濃縮し、そして次いで、溶離剤として酢酸エチル/メタノール（4:1）、+微量の酢酸を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物204（0.2647g、96%）を得た。
【０２８３】
化合物205
【化２８】
2011501161.tif 000031
【０２８４】
25mLの丸底フラスコに、HCl（ジオキサン中の4Mの10mL;40mmol）をアルゴンの下で加えた。内容物を、次いで化合物204が含まれる予め冷やされた25ｍLの丸底フラスコに移し、氷水浴において冷やした。内容物を、45分の間、アルゴンの下で0℃で撹拌し、次いで室温に暖め、さらに追加の2時間撹拌した。すべての溶媒および過剰なHClを減圧ラインで除去し、そして粗残分を、溶離剤として水を用いDowex（ダウエックス）1X2-100陰イオン交換樹脂を通過させ、化合物205（0.2004g、98%）を得た。
【０２８５】
化合物206
【化２９】
2011501161.tif 000032
【０２８６】
50mLのSchlenkフラスコに、化合物202（0.0220g、0.044mmol）および乾燥アセトニトリル（6mL）を加えた。化合物203（0.0105g、0.045mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（8.5のμL、0.049mmol）を、順に加え、そして異成分からなる内容物を室温でアルゴンの下に撹拌するためにセットした。30分後、追加のジイソプロピルエチルアミン（8.5μL、0.049mmol）を、化合物203の溶解を援助するために反応混合物に加えた。ジメチルアセトアミド（1.5mL）を、均一な溶液を提供するために滴下により加え；内容物をアルゴンでフラッシュし、そして17時間室温で撹拌するためにセットした。反応内容物を、減圧ライン上で乾燥するためにポンプ圧送し、次いでジクロロメタン中に溶解し、そしてクエン酸水溶液で洗浄した。ジクロロメタン（4×20mL）による抽出に次いで、メタノール/ジクロロメタン（1:9）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、化合物206（0.0114g、45%）を得た。
【０２８７】
化合物207
【化３０】
2011501161.tif 000033
【０２８８】
15mLの石英（クウォーツ）Schlenk管（チューブ）に、均一な溶液を与えるため、カリウムヘキサシアノオスメート（hexacyanoosmate）（0.3052g、0.61mmol）および亜硝酸ナトリウム（0.8138g、11.8mmol）を水とともに加えた（10mL;pH=4、酢酸）。反応内容物を、次いでテフロン（登録商標）スクリューキャップで封をし、20分の間、アルゴンで酸素を除去した。石英管は、(14)254nmのバルブを備えるライオネット（Rayonet）フォト反応機に置き、そして17時間照射した。反応内容物を50mLの丸底フラスコへ移し、黄色の固体を産生するために、ロータリーエバポレーター上で濃縮した。粗反応混合物を、溶離剤として水を用い、Sephadex（セファデックス）G-15カラム上で精製し、化合物207（0.1567g、65%）を得た。
【０２８９】
化合物208
【化３１】
2011501161.tif 000034
【０２９０】
50mLの丸底フラスコに、化合物207（0.1567、0.40mmol）および水（2mL）を、均一な溶液を与えるために添加した。4-アミノメチルピリジン（0.4320g、4.0mmol）を液体として加え、それから水酸化ナトリウム水溶液（3Mの7mL、21mmol）を加えた。反応混合物はアルゴンで酸素を除去され、72時間65℃にまで加熱した。反応内容物を室温にまで冷やし、それから1MのHClを緩徐に添加することによって中和した。溶媒は、ロータリーエバポレーター上で除去し、および粗物質を、溶離剤として水を用いるSephadex G-15のカラム上で精製し、化合物208（0.0922g、47%）を得た。
【０２９１】
化合物209
【化３２】
2011501161.tif 000035
【０２９２】
50mLのSchlenkフラスコに、化合物206（0.0114g、0.044mmol）、2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム（tetramethyluronium）四フルオロホウ酸塩（0.0140g、0.047mmol）、およびN,N-ジメチルホルムアミド（5mL）を加えた。内容物はアルゴンの下で撹拌する。そして、追加のジイソプロピルエチルアミン（7.8のμL、0.045mmol）を加える。1時間室温で撹拌した後に、溶媒をロータリーエバポレーター上で除去し、次いで残留物を、乾燥メタノール（5mL）に溶解する。化合物208（0.0219g、0.044mmol）を固体として加え、内容物を18時間室温で撹拌する。溶媒をロータリーエバポレーター上で除去し、残りを、溶離剤としてメタノールを用いるLH-20カラム上でクロマトグラフィーによって精製し、化合物209を得る。
【０２９３】
実施例2.  ペンタシアノオスメート  分枝した分子ワイヤー複合体
一般的考察。
すべての合成操作（スキームS1）は、特に明記しない限り、標準的なSchlenk技術を使用し、乾いたアルゴン空気の下で実行された。反応媒体について、溶媒をガラスコントウアー（Glass Contours）（Laguna Beach（ラグーナビーチ）、CA（米国カリフォルニア州））から取得するダウ-グラブス（Dow-Grubbs）溶媒系1を介して、中性のアルミナ上で乾燥した。これらの溶媒は、使用の前にアルゴンでガスを除去した。
【０２９４】
材料。以前に記述されたように2,3,4,5、化合物101、1-エチニル-4-（トリメチルシリルエチニル）ベンゼン、5-（4-ヨードフェニルエチニル）-［1,2,5］ジチアゼパン、および化合物208を合成した。すべての他の試薬を、商業上の供給者から購入し、そして特に明記しない限り、更なる精製なしで用いた。反応はTLCによってモニターし（アルミニウムに支持されたシリカゲルシート60F254、EMD Chemicals（EMDケミカル社）、Gibbstown（ギブスタウン）、NJ（米国ニュージャージ州））、スポットをUV光への曝露の際の蛍光消失によって視覚化した。
【０２９５】
実験法：
スキームS1.  化合物107の合成。
【化３３】
2011501161.tif 000036
【０２９６】
反応条件：(a) 1-エチニル-4-（トリエチルシリルエチニル）ベンゼン、Pd（PPh3）2Cl2、CuI、TEA; (b) TBAF; (c) 5-（4-ヨードフェニルエチニル）-［1,2,5］ジチアゼパン、Pd（PPh3）2Cl2、CuI、TEA; (d) HCl、MP; (e) LiI; (f) EDC、HOBt、208。
【０２９７】
化合物102。化合物101（1.44g、3.55mmol）、1-エチニル-4-（トリメチルシリルエチニル）ベンゼン（0.705g、3.55mmol）、Pd（PPh3）2Cl2（0.062g、0.089mmol）およびCuI（0.017g、0.089mmol）を、THF（15mL）中で混合した。TEA（2.5mL）を加え、そして反応をArの空気の下に2.5h 室温で撹拌するためにセットした。反応混合物を真空内で濃縮し、そして粗残分を、シリカゲル（1:1:5、EtOAC：DCM：ヘキサン）上でカラムクロマトグラフィーによって精製し、フレーク状の黄色の固体（1.51g、3.17mmol、89%）として純粋な生成物を得た。ESI-MS（ポジティブ、MeOH：DCM）m/z：498.10（M+Na）+。1H NMRは化合物102の構造と一致していた。
【０２９８】
化合物103。THF（50mL）中の化合物102（1.44g、3.03mmol）をアセトニトリル/N2(l)浴で、およそ-15℃に冷やした。TBAF（THFの1.0M、4.5mL、4.5mmol）を、注射器によって滴下で加えた。20分後、水（2mL）を、反応が消えるように加え、そして揮発性物質を真空内で除去した。粗製のオレンジの油を、EtOAc（200mL）に溶解し、そして水（3×100mL）で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、ろ過し、粗残分に濃縮し、それを、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（1:1:3、EtOAc：DCM：ヘキサン）によって精製し、オフホワイトの固体（1.22g、3.02mmol、99%）として、純粋な生成物を得た。1H NMRは化合物103の構造と一致していた。
【０２９９】
化合物104。化合物103（0.533g、1.32mmol）、5-（4-ヨードフェニルエチニル）-［1,2,5］ジチアゼパン（0.445g、1.32mmol）、Pd（PPh3）2Cl2（0.046g、0.066mmol）、およびCuI（0.006g、0.033mmol）を、THF（5mL）中で混合した。TEA（1.0mL）を加え、そして反応をArの空気の下で50℃にまで加熱した。22時間の後、揮発性物質を真空内で除去し、そして粗残分を、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィー（0.2：0.8：4、EtOAc：ヘキサン：DCM）によって精製し、緑がかった黄色の固体（0.285g、0.470mmol、36%）として純粋な生成物を得た。1H NMRは化合物104の構造と一致していた。
【０３００】
化合物105。化合物104（0.072g、0.12mmol）を、ジオキサン（3mL）およびアニソール（0.5mL）に溶解した。HCl（ジオキサン中の4.0M、3mL）を滴下し、そして、反応を1時間室温で撹拌した。揮発性物質は真空内で除去し、そして粗製の黄色の固体を更なる精製なしで用いた。NHS-3-マレイミドプロピオネート（MPS）（0.034g、0.13mmol）、N,N-ジメチルアセトアミド（4mL）、およびTEA（50μL）を加え、そして反応を一昼夜室温で撹拌させた。15時間後、反応混合物を、水（75mL）に注ぎ、そしてDCM（4×50mL）で抽出した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、ろ過し、粗製残分にまで濃縮し、それをシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー（1:2:2、ジエチルエーテル：EtOAc：DCM）によって精製し、黄色の固体（0.040g、0.060mmol、50%）として、純粋な生成物を得た。1H NMRは化合物105の構造と一致していた。
【０３０１】
化合物106。化合物105（0.031g、0.047mmol）および超乾燥したLiI（0.045g、0.34mmol）を、暗所で24時間、乾いたEtOAc（3mL）中で還流した。反応混合物を、EtOAc（100mL）とともにHCl（aq）（0.1M、10mL）に注いだ。有機相をHCl（aq）（0.1M、2×50mL）で洗浄して、Na2SO4上で乾燥させ、ろ過し、粗製残分にまで濃縮し、それを、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィー（0.1：0.5：9.4、酢酸：MeOH：DCM）によって精製し、黄色の固体（0.020g、0.031mmol、66%）として純粋な生成物を得た。ESI-MS（ネガティブ、MeOH）m/z：684.39（M+Cl）。1H NMRは化合物106の構造と一致していた。
【０３０２】
化合物107。化合物106（0.007g、0.011mmol）および化合物208（0.006g、0.013mmol）を、MeOH（2.5mL）およびTHF（0.5mL）の中に懸濁させる。フラスコを超音波処理し、そして混合物を氷浴で4℃に冷却する。THF（0.5mL）中の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（106に対して0.1当量（equiv））を添加し、次いでN-（3-ジメチルアミノプロピル）-N-エチルカルボジイミド・HCl（0.002g、0.011mmol）およびTEA（3μL）を添加し、そして反応物を撹拌して一昼夜室温で暖かくするのを許容する。溶媒を真空内で除去し、そして残分を、溶離剤としてメタノールを用いてLH-20カラム上でのクロマトグラフィーによって精製し、化合物107を得る。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合的に付着された電気活性複合体（ＥＡＭ）を含有する電極を含む組成物であって、前記ＥＡＭは遷移金属および少なくとも１つのシアノリガンドを含む、組成物。
【請求項２】
前記ＥＡＭが少なくとも２つのシアノリガンドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＥＡＭが少なくとも３つのシアノリガンドを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＥＡＭが少なくとも４つのシアノリガンドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＥＡＭが少なくとも５つのシアノリガンドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記遷移金属がオスミウムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
電極が金であり、および前記ＥＡＭが前記電極と、１つのイオウ原子を介して共有結合的に付着する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
電極が金であり、および前記ＥＡＭが前記電極と２つのイオウ原子を介して共有結合的に付着する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＥＡＭが、前記電極と、前記イオウ原子（群）を含む第１の末端を伴う付着リンカーを用いて付着する、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記付着リンカーが、前記遷移金属のために配位原子を提供する第２の末端を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記付着リンカーがアルキル鎖である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アルキル鎖が置換される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記電極が、前記ＥＡＭおよび捕獲リガンドを含む酸化還元活性捕獲複合体（ＲＥＡＭＣ）を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。 
【請求項１４】
前記捕獲リガンドが配位原子を前記遷移金属のために提供する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
電極が金であり、および前記ＲＥＡＭＣが前記電極と、１つのイオウ原子を介して共有結合的に付着する、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
電極が金であり、および前記ＲＥＡＭＣが前記電極と、２つのイオウ原子を介して共有結合的に付着する、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＲＥＡＭＣが、前記電極と、前記イオウ原子（群）を含む第１の末端を伴う付着リンカーを用いて付着する、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記付着リンカーが、前記遷移金属のために配位原子を提供する第２の末端を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記付着リンカーがアルキル鎖である、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アルキル鎖が置換される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記電極が、前記ＥＡＭを含有する第１の種および捕獲リガンドを含有する第２の種を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記捕獲リガンドがペプチドである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記捕獲リガンドが炭水化物である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、電極のアレイを含み、その各々は、遷移金属および少なくとも１つのシアノリガンドを含む共有結合的に付着された遷移金属複合体を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
標的酵素を検出する方法であって、
ａ）試料を、
ｉ）遷移金属、および第１のＥ０を有する少なくとも１つのシアノリガンドを含む電気活性部分（ＥＡＭ）、
ｉｉ）捕獲リガンド
を含む電極が含まれる組成物と、前記標的酵素が、存在するならば、前記捕獲リガンドを変え、前記ＥＡＭが第２のＥ０をもつような条件の下で接触させる工程、および
ｂ）前記第２のＥ０を測定する工程
を含む、方法。
【請求項２６】
各々が
ｉ）遷移金属、および第１のＥ０を有する少なくとも１つのシアノリガンドを含む電気活性部分（ＥＡＭ）、
ｉｉ）捕獲リガンド
を含む複数の電極が含まれる支持体を、前記組成物が含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
標的酵素を検出する方法であって、
ａ）試料を、
ｉ）遷移金属、および第１のＥ０を有する少なくとも１つのシアノリガンドを含む電気活性部分（ＥＡＭ）、
ｉｉ）捕獲リガンド
を含むＲＥＡＭＣが含まれる組成物と、前記標的酵素が、存在するならば、前記捕獲リガンドを変え、前記ＥＡＭが第２のＥ０をもつような条件の下で接触させる工程、および
ｂ）前記第２のＥ０を測定する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
ａ）官能基を含む第１の種、および
ｂ）電気活性複合体（ＥＡＭ）であって、遷移金属および少なくとも１種のシアノリガンドを含むＥＡＭ
を含む電極が含まれる組成物。
【請求項２９】
前記官能基はマレイミド基である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
バイオセンサーを作成する方法であって、
ａ）次の
ｉ）第１の官能基を含む第１の種、および
ｉｉ）電気活性複合体（ＥＡＭ）であって、遷移金属および少なくとも１種のシアノリガンドを含むＥＡＭ
が含まれる電極を提供する工程、
ｃ）前記電極を、第２の官能基を含む生体分子と、前記第１の種および前記生体分子の間で共有結合を形成するために接触させる工程
を含む、方法。
【請求項３１】
第１の官能基が、マレイミド、イミドエステル、N-ヒドロキシスクシンイミジル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アルファ-ハロアシルおよびピリジルジスルフィドを含む部分からなる群より選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の官能基がマレイミドを含み、前記生体分子がシステインアミノ酸を含むタンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質がペプチドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
次の式
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ      （Ｉ）
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
ＥＡＭは電気活性部分であり、溶媒接触可能酸化還元化合物を含有し、
ＣＬは捕獲リガンドであり、
スペーサー１はＳＡＭ形成性種であり、
ｎ＝０または１である）
を有する化合物。
【請求項３５】
前記ＥＡＭが、マンガン、テクネチウム、レニウム、鉄、ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、イリジウム、ニッケル、パラジウム、白金、銅、銀、および金からなる群より選ばれる遷移性金属を含有する、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
前記遷移性金属がルテニウムである、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
前記環状ジスルフィド基が、ピリジル−オリゴフェニルエチルニル−［１，２，５］−ジチアゼパンを含む、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３８】
次の式
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ      （Ｉ）
（式中、前記アンカーはピリジル基を含み、
ＥＡＭは電気活性部分であり、
ｉ）溶媒接触可能酸化還元化合物、および
ｉｉ）電荷中和性リガンド
を含み、
ＣＬは捕獲リガンドであり、
スペーサー１はＳＡＭ形成性種であり、
ｎ＝０または１である）
を有する化合物。
【請求項３９】
前記電荷中和性リガンドが、ジチオカルバマート、ベンゼンジチオレート、シッフ塩基、ＥＤＴＡ、およびＤＴＰＡからなる群より選ばれる、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
前記電荷中和性リガンドが、カルボン酸塩、アミン、チオレート、ホスフィン、イミダゾール、ピリジン、ビピリジン、テルピリジン、tacn、サレン、acacen、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、Ｃｐ、ピンサー、およびスコルピオネートからなる群より選ばれる、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
前記電荷中和性リガンドがペンタアンミンである、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
前記ＥＡＭが、単座、二座、三座、または多座である、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
ａ）第１のアンカー、
ｂ）前記第１のアンカーに連結する電荷中和性リガンド、
ｃ）前記電荷中和性リガンドと共有結合的に付着する電気活性部分（ＥＡＭ）、および
ｄ）捕獲リガンド
を含む、組成物。
【請求項４４】
前記捕獲リガンドが前記第１のアンカーと連結する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
さらに、第２のアンカーを含み、前記捕獲リガンドは前記第２のアンカーと連結する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を含む電極が含まれる組成物であって、前記ＳＡＭは次の式
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−スペーサー２−ＣＬ      （ＩＩ）
（式中、前記アンカーは、前記電極と、ジスルフィド基を通して連結され、
ＥＡＭは電気活性部分であり、溶媒接触可能酸化還元化合物を含有し、
ＣＬは捕獲リガンドであり、
スペーサー１は絶縁性または導電性のいずれかであり、
スペーサー２は任意である）
を有する化合物を含有する、組成物。
【請求項４７】
ａ）次の式
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ      （Ｉ）
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
ＥＡＭは電気活性部分であり、溶媒接触可能酸化還元化合物を含有し、
ＣＬは捕獲リガンドであり、
スペーサー１は絶縁性または電導性のいずれかであり、
ｎ＝０または１である）
を有する化合物を提供する工程、および
ｂ）前記電極への前記アンカーの付着を形成するために、前記環状ジスルフィドを開くことによって、前記化合物を電極と接触させる工程
を含む、方法。
【請求項４８】
前記電極がさらに、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
電極のアッセイを含む組成物であって、各電極は、次の式
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ      （Ｉ）
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
ＥＡＭは電気活性部分であり、溶媒接触可能酸化還元化合物を含み、
ＣＬは捕獲リガンドであり、
スペーサー１は絶縁性または導電性のいずれかであり、
ｎ＝０または１である）
を有する化合物を含有する、組成物。
【請求項５０】
試験試料において標的被分析物を検出する方法であって、
ａ）次の式
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ      （Ｉ）
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
ＥＡＭは電気活性部分であり、溶媒接触可能酸化還元化合物を含有し、
ＣＬは捕獲リガンドであり、
スペーサー１は絶縁性または導電性のいずれかであり、
ｎ＝０または１である）
を有する化合物を含む電極を提供する工程、
ｂ）前記電極を前記試験試料と接触させる工程、および
ｃ）前記ＥＡＭの再配置エネルギーを測ることによって前記標的被分析物の存在を決定する工程
を含む、方法。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図５Ａ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図５Ａ】
2011501161.tif 000037
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図９Ａ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９Ａ】
2011501161.tif 000038
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２３】
2011501161.tif 000039