【事件の表示】
　特願２００２−１７３４６９「ポリペプチドの細胞表面局在化方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年　１月２２日出願公開、特開２００４−　１６０５４〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯
　本願は，平成１４年６月１３日を出願日とする特許出願であって，平成２０年２月２６日付で拒絶査定がなされ，同年３月２７日に拒絶査定不服審判が請求され，同年４月２５日に特許請求の範囲について手続補正がなされたものである。
　
２．本願発明
　本願の請求項１に係る発明（以下，「本願発明」という。）は，平成２０年４月２５日付手続補正書によって補正された特許請求の範囲に記載された以下のとおりのものと認める。
「【請求項１】　配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなる，異種ポリペプチドを細
胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチド。」
　
３．引用例
（１）引用例１
　原査定の拒絶の理由で引用例１として引用された本願出願日前に頒布された刊行物である，J.Biol.Chem., 2001, Vol.276, No.28, p.26249-26259（以下，「引用例１」という。）には，以下の事項が記載されている。
　
ア．「ラット腎臓の中性セラミダーゼの精製，特徴づけ，分子クローニング及び細胞内分布」（第２６２４９頁，標題）
　
イ．「以前に，我々はマウスにおいて，一つは凍結−解凍により可溶化し，一つは可溶化しない，２つのタイプの中性セラミダーゼを報告した。前者はマウス肝臓から９４ｋＤａタンパク質として精製され，クローン化された（Tani, M., Okino, N., Mori, K., Tanigawa, T., Izu, H., Ito, M.(2000) J. Biol. Chem. 275, 11229-11234）。本稿では，凍結−解凍により完全に不溶性のラット腎臓の１１２ｋＤａの膜結合中性セラミダーゼの精製，分子クローニング及び細胞内分布を記述する。この酵素の読み取り枠は９つの推定Ｎ−グリコシル化部位と一つの可能な膜貫通ドメインを有する７６１のアミノ酸からなるポリペプチドをコードした。セラミダーゼを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において，１３３−ｋＤａ（ゴルジ型）及び１１３−ｋＤａ（小胞体型）のＭｙｃ−タグをつけたセラミダーゼが検出され，これら２つのタンパク質は，ツニカマイシンの存在下で発現させると，活性を失うと同時に８７ｋＤａのタンパク質に変換され，Ｎ−グリコシル化プロセスが酵素活性の発現のために不可欠であることを示した。免疫組織学的分析は，セラミダーゼがラット腎臓で主に近位尿細管，遠位尿細管及び集合尿細管のアピカル膜に位置し，肝臓ではこの酵素は肝実質細胞のエンドソーム様細胞小器官に分布することを明確に示した。興味深いことに，腎臓セラミダーゼはコレステロール及びＧＭ１ガングリオシドを伴うラフトマイクロドメインに濃縮されていることが判った。」（第２６２４９頁，左欄第１〜２７行）
　
ウ．「過去数年において，中性／アルカリ性セラミダーゼ，スフィンゴ脂質シグナリングの欠損する連鎖の一つ，の分子クローニングが，マウス（２１），ヒト（２２），細菌（２３）及び酵母（２４）で行われた。マウスでは，我々は２タイプの中性セラミダーゼを発見し，一つは凍結−解凍により可溶化され，もう一つは可溶化されなかった。前者はマウス肝臓から９４ｋＤａタンパク質として精製され（２５），その酵素をコードするｃＤＮＡがクローン化された（２１）。本稿では，我々はラット腎臓の１１２ｋＤａの膜結合セラミダーゼの精製，特徴付け及びｃＤＮＡクローニングを報告するが，それは凍結−溶解での抽出に完全に抵抗性であり，６−７の至適ｐＨを持っていた。注目されるのは，ヒト脳の中性／アルカリ性セラミダーゼはミトコンドリアに特異的に位置し，この細胞小器官にセラミドプールの存在を示唆すること（２２）である。」（第２６２４９頁右欄下から１１行〜第２６２５０頁左欄第３行）
　
エ．「
図５　ラット，マウス，ヒト及び細菌由来の中性／アルカリ性セラミダーゼの推定アミノ酸配列のアライメント。　中性／アルカリ性セラミダーゼのアライメントは，ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（４８）を使用して実行した。Ｂｏｘ１，ラット及びマウスのセラミダーゼの小胞体移行シグナル配列；Ｂｏｘ２，ヒト脳セラミダーゼのミトコンドリア−ターゲッティング配列。Ｂｏｘ３及び４，セラミダーゼのジ−Ｌｅｕ配列。」（第２６２５５頁）
　
オ．「なぜこの酵素は組織−特異的様式で分布するのか？　一つの可能な説明は，ジ−Ｌｅｕシグナルに対するレセプターの組織−特異的発現であり，ジ−Ｌｅｕシグナルは細胞膜からエンドソーム／リソソームへの小胞輸送のため（３７）又は側底膜にターゲッティングするため（４２）の局在化シグナルであり，機能性ジ−Ｌｅｕモチーフがラット及びマウスセラミダーゼの推定アミノ酸配列中に見出されたが，ヒトには見出されなかったからである。ジ−Ｌｅｕレセプターはクラスリン−被覆小胞に結合するアダプタータンパク質（ＡＰ）の構成成分であり，ＡＰの器官−特異的発現が報告されている（４３）。ジ−Ｌｅｕレセプターはラット肝実質細胞において発現されているが，ラット尿細管細胞では発現されていないようである。従って，ラット肝実質細胞において，セラミダーゼはジ−Ｌｅｕモチーフを用いた小胞輸送によって，細胞形質膜から後期エンドソーム／リソソームに局在化され，ラット尿細管細胞では，おそらくジ−Ｌｅｕシグナルのためのレセプターを欠くために細胞形質膜のアピカル膜に保持されたのだろう。Ｔｙｒシグナルも標準的な局在化シグナルと考えれているが（４４），ラット及びマウスセラミダーゼの推定アミノ酸配列には存在しない。
　近年，Ｂａｗａｂら（２２）がヒト中性セラミダーゼの推定アミノ酸配列中のミトコンドリア−ターゲッティングシグナル（図５）の存在を報告し，過剰発現する緑色蛍光タンパク質−タグを付けたセラミダーゼが，ＨＥＫ２９３及びＭＣＦ７細胞のミトコンドリアに排他的に位置することを示した。しかし，ラットセラミダーゼは，推定配列はミトコンドリア−ターゲッティングシグナルを欠き，この酵素はミトコンドリアの酵素には通常存在しないＮ−グリカンで高度にグリコシル化されているため（４５），ミトコンドリアには存在していないようである。本研究では，ツニカマイシン処理が完全な活性を有する成熟セラミダーゼの生成を阻害することも明らかになり，Ｎ−グリコシル化プロセスが酵素活性の発現のために不可欠であることを示した。」（第２６２５８頁右欄下から１８行〜第２６２５９頁左欄第１５行）
　
　上記記載事項ア〜オによれば，引用例１には，ラット腎臓の中性セラミダーゼの７６１残基からなる推定アミノ酸配列が記載され，中性セラミダーゼが近位／遠位尿細管，集合管の細胞の形質膜のアピカル膜に局在化することが記載されている。
　
（２）引用例２
　原査定の拒絶の理由で引用例２として引用された本願出願日前の平成１４年４月２７日に，弘前大学医学部コミュニケーションセンターで開催された「 遠藤正彦教授退官記念シンポジウム　２１世紀を切り開く糖質科学（http://www.glycoforum.gr.jp/square/020427/index.htmlを参照。）」において，「エンドグリコセラミダーゼとセラミダーゼの分子進化」と題して，九州大学大学院・農学研究院・生物機能科学部門　伊藤信氏によって発表された事項（以下，「引用例２」という。）は，その発表内容が掲載されるインターネットの電子的技術情報　＜ＵＲＬhttp://www.glycoforum.gr.jp/square/020427/pdf/3.pdf＞に記載された以下の事項が含まれるものと認める。
　
ア．「セラミダーゼは，細胞内のセラミド／スフィンゴシン／スフィンゴシン-1-リン酸量を制御する重要なシグナル変換酵素である。私たちは，中性セラミダーゼの一次構造はバクテリアからほ乳動物まで保存されており，１つの遺伝子ファミリーを形成していることを見いだした。また，ほ乳動物由来の本酵素は，シグナル配列の直後にセリン，スレオニンに富んだ領域（ムチンボックス）が存在し，ＰＮＡレクチンを用いた解析から高度にO-グリコシル化されていることが示された。このムチンボックスは，本酵素を細胞表面にリクルートする上で必須であることをムチンボックス欠損変異体の解析等から明らかにした。ムチンボックスはバクテリアや無脊椎動物のセラミダーゼには存在せず，脊椎動物への進化の過程で獲得されたものと考えられ，その生物学的意義に興味が持たれる。」（第１８〜２６行）
　
４．対比
　本願発明における「配列番号：２に示されるアミノ酸配列」は，本願明細書の【００１３】に説明されるように，引用例１に記載されるラット腎臓由来セラミダーゼのＮ末端部分より見出されたムチンボックスであり，配列番号５に示されるラット腎臓由来セラミダーゼのアミノ酸配列中の第４３番目のＡｓｐ〜第７８番目のＧｌｎ（以下，「４３Ａｓｐ」のように，アミノ酸残基の配列中の位置を左肩に表記する。）に相当する配列である。
　また，引用例に記載されたラット腎臓由来中性セラミダーゼが「細胞形質膜のアピカル膜へ局在化」する活性は，本願発明における「ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性」に相当する。
　よって，本願発明と引用例１に記載された発明を対比すると，両発明は，「ラット腎臓由来中性セラミダーゼの細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチド」に関するものである点で一致し，以下の点で相違する。
　相違点１
　本願発明が配列番号：２で示される４３Ａｓｐ〜７８Ｇｌｎの３６のアミノ酸残基からなるポリペプチドであるのに対し，引用例１に記載された発明は，配列番号：２で示される３６のアミノ酸残基をその一部として含む７６１のアミノ酸残基からなるポリペプチドである点。
　相違点２
　本願発明は異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するぺポリペプチドであるのに対し，引用例１には，異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングすることについては記載がない点。
　
５．判断
　上記相違点について検討する。
（１）相違点１について
　引用例２では，中性セラミダーゼは，シグナル配列の直後にセリン，スレオニンに富んだ領域（ムチンボックス）が存在し，ムチンボックス欠損変異体の解析等を用いて，ムチンボックスが細胞表面へリクルートする上で必須であることを明らかにしたこと，ムチンボックスはバクテリアや無脊椎動物のセラミダーゼには存在しないものであることが開示されている。
　ここで，引用例１の図５に記載された中性セラミダーゼのアライメントを参照すると，ラット，マウス，ヒト及び細菌であるP. aeruginasaの４種類の配列が比較されており，ラット及びマウスには，Box1として囲まれて示されるシグナル配列が存在し，当該シグナル配列直後のＴＩＥＮＨＫＤという配列の後の，ラットの配列の４４Ｓ残基から８２Ｇ残基に当たる３９残基のアミノ酸配列には，細菌由来の中性セラミダーゼに対応する配列が存在しないこと，ヒトではこの部位にBox2として囲まれて示されるミトコンドリア−ターゲッティング配列が含まれること，さらに，ラット，マウス及びヒトの中性セラミダーゼでは，この部位にセリン（Ｓ），スレオニン（Ｔ）が多く含まれており，ラットの配列では上記３９残基中１７残基がＳ又はＴとなっていることが判る。
　そして，引用例１の記載事項オにあるように，引用例１には，ラット尿細管細胞では，中性セラミダーゼが細胞形質膜，すなわち細胞表面に保持されることが記載されているのであるから，引用例２におけるほ乳類中性セラミダーゼを細胞表面へリクルートするムチンボックスの存在の開示に基づき，ラット腎臓由来中性セラミダーゼにおいて，細胞形質膜表面へターゲッティングするムチンボックスの配列を特定することは，当業者が容易に想到し得るものである。
　その際に，引用例２における「シグナル配列の直後のセリン，スレオニンに富んだ領域」及び「バクテリアや無脊椎動物のセラミダーゼには存在しない」という説明に該当するラット腎臓由来中性セラミダーゼのアミノ酸配列は，概ね上述の４４Ｓ残基〜８２Ｇ残基の３９残基となることは明らかであるから，その前後数残基を適宜延長又は欠失したムチンボックス欠失変異体を作成し，細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有する本願発明の配列番号２に示される４３Ａｓｐ〜７８Ｇｌｎの３６のアミノ酸配列のポリペプチドを得ることは，当業者が適宜なし得ることに過ぎない。
　
（２）相違点２について
　本願発明における「異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有する」という特定事項は，配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが本来有する性質又は効果を記述するものであり，本願発明のポリペプチドにさらに物としての限定を付加するものではないから，この点はポリペプチドという物質の発明としての相違点とはいえない。
　しかも，引用例１に記載されたラット腎臓由来セラミダーゼもその一部に配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものであるから，本願発明のポリペプチドと同様に上記性質又は効果を有するものともいえるから，その性質又は効果においても，両ポリペプチドに相違はない。
　したがって，相違点２については，実質的な発明の構成上の相違点ではない。
　そして，本願発明の効果については，以下（３）で検討する。
　
（３）本願発明の効果
　本願発明における「異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有する」という効果については，４．対比の相違点２に記載したように，引用例１及び２には記載されていない。
　しかしながら，引用例１には，ラット腎臓由来中性セラミダーゼが細胞形質膜表面へ局在化されていることが記載され（記載事項オ），引用例２では，ムチンボックスが細胞表面へポリペプチドをリクルートするために必須であることをムチンボックス欠損変異体の解析等から明らかにしたことが開示されていることから，ラット腎臓由来中性セラミダーゼのムチンボックスが同定されれば，それが細胞形質膜表面への局在化シグナルとして機能することは当業者が当然予測するものである。
　
　そして，引用例１の記載事項オには，ＢawabらがＧＦＰタグを付けたヒト中性セラミダーゼ，すなわちヒト中性セラミダーゼとＧＦＰとの融合タンパク質がミトコンドリアに局在化し，ヒト中性セラミダーゼの局在化シグナルが融合タンパク質とした場合も機能したことを報告したことが記載されている。
　また，上記ヒト中性セラミダーゼ以外にも，細胞形質膜の他，核，小胞体等の様々な細胞内小器官に局在するポリペプチドとＧＦＰとの融合タンパク質を作成し，細胞内の各部位へターゲッティングされたことを確認したという数多くの報告がなされており（必要であれば，Annu. Rev. Biochem., 1998, Vol.67, p.509-544, 特に第５３２頁１９〜２４行，第５３３頁下から７行〜第５３４頁第１８行，J.Biol.Chem., 2001, Vol.276, No.48, p.45009-45014,　特表平１１−５１１１１７号等を参照。），局在化シグナルを含むペプチドとＧＦＰとの融合タンパク質により，細胞内の特異的部位へターゲッティングすることは周知技術である。
　さらに，本願発明のムチンボックスと同様の，ムチン型糖鎖修飾を受けるペプチドを用いた融合タンパク質についても，以下のような報告がなされている。
　本願明細書の【０００４】において，従来技術として引用されたJ.Biol.Chem.,1998, Vol.273, p.30263-30270には，「われわれは，腸細胞における細胞内輸送及び細胞内局在化シグナルを研究するためのモデルとして，ヒトニューロトロフィンレセプターｐ７５（ｐ７５ＮＴＲ）を腸上皮細胞系Ｃａｃｏ−２で発現した。・・・アピカル局在化，細胞内経路及び基底面からアピカル面への経細胞輸送は，細胞内ドメインの切り詰め又は膜貫通ドメインのグリコシルイノシトールリン脂質アンカーによる置換によって影響されなかった。・・・」（第３０２６３頁　要約を参照）と記載され，ｐ７５ＮＴＲのＯ−グリコシル化部位（本願発明の「ムチンボックス」に相当する。）を含む細胞外ドメインと胎盤性アルカリホスファターゼとの融合タンパク質（第３０２６４頁左欄下から２６〜１７行を参照。）が細胞表面へターゲッティングされたことが記載されている。　
　本願出願日前に頒布された刊行物であるJ. Biol. Chem, 2002.March.1., Vol.277, No.9, p.6858-6863には，エンテロペプチダーゼのムチン様ドメインとＧＦＰとの融合タンパク質を作成し，腎臓細胞のアピカル面へターゲティングすることができたことが報告されている（第６８５８頁　要約を参照）。
　同様に，本願出願前に頒布された刊行物であるバイオサイエンスとインダストリー，2000，Vol.58, No.6, p409-412にも，ムチンボックスを融合したタンパク質を発現させると，ムチンボックスが正しく認識され，ムチン型糖鎖が結合した糖タンパク質が生産できることが報告されている（第３１頁左欄第３行〜第３２頁左欄第２７行）。
　これらの論文は，本願発明のムチンボックスと同様な，細胞内局在化に関与するペプチドと異種タンパク質との融合タンパク質が，当該ペプチドの本来有する，細胞内局在化シグナル，Ｏ−グリコシル化修飾を受けるといった機能，及び異種タンパク質の機能を失うことなく発現されることを示す報告である。
　
　このような，本願出願日当時の技術水準を考慮すれば，本願発明のムチンボックスと異種タンパク質との融合タンパク質を作成した場合に，ムチンボックス及び異種タンパク質のそれぞれが本来有する機能を失わずに発現されることは，当業者が予測することができたものである。
　したがって，本願発明の「異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有する」という効果は，引用例１及び２から予測し得るものである。
　
（４）請求人の主張について
　請求人は審判請求書において以下の主張をしている。
ア．引用例２では，単に「ほ乳動物由来」の中性セラミダーゼと記載されているだけであり，それが，ラット由来か否かは不明である。また，引用例２には，一次構造がバクテリアからほ乳動物まで保存されているとの記載からみて，ムチンボックスがバクテリアには存在しないとしても，ほ乳動物間では保存されているとみるのが相当であり，引用例１のFig. 5.に記載のアライメントに接した当業者が，ラット，マウス，ヒトの配列を対比した場合，配列番号：２に示されるアミノ酸配列がムチンボックスであろうと予測することは極めて困難なことである。
　
イ．引用例２に開示されているのは，「本酵素を細胞表面にリクルートする上で必須であることをムチンボックス欠損変異体の解析等から明らかにした」との記載であり，セラミダーゼ自体を細胞表面にリクルートするのに必要であると記載しているのに過ぎない。ここで，原審の審査官殿は，「・・・それを融合させたタンパク質もまた細胞表面へリクルートされるであろうことも，本願出願時の技術常識を勘案すれば，当業者が予測し得ることである。」と述べているが，請求人はそのような技術常識が本願の出願時当時（平成１４年６月）に存在していたという事実を知らない。本願の段落０００２〜０００４において，従来技術について記載したように，タンパク質の細胞膜表面へのターゲティングの研究はなされていたものの，いずれも未だ明らかではなく，ある酵素に見出されるムチンボックスが，そのまま他のタンパク質に対しても細胞膜表面へのターゲティングが可能であるという技術常識は，本願出願当時には決して存在していない。
　
ウ．セラミダーゼ以外の特定の機能を有するポリペプチドに前記のムチンボックスが付加された場合に，ムチンボックスが前記のポリペプチドの正しい折りたたみ（フォールディング）や活性の発現を阻害せず，かつそれを細胞表面に局在化されることが可能であるかどうかは，引用例２の記載からは決して予測できるものではなく，異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へ局在化及びターゲティングさせようとすることが容易との判断は，何らの根拠もないことであり，本願で開示したことに基づく後知恵に過ぎない。
　
　請求人の主張について以下，検討する。
主張アについて
　引用例１に記載されるラット腎臓由来の中性セラミダーゼは，「ほ乳類由来」の中性セラミダーゼに該当し，しかも細胞形質膜に局在化することも引用例１に記載されているのであるから，引用例２に「ラット由来」の記載がなくても，ラット腎臓由来の中性セラミダーゼにおいても細胞形質膜局在化シグナルとなるムチンボックスが存在することを予測させるものとえいる。
　また，請求人は，ムチンボックスがほ乳動物間では保存されているとみるのが相当であると主張しているが，引用例２では，ムチンボックスが，ラット，マウス及びヒトのセラミダーゼで保存されているとは説明していない。
　しかも，引用例１には，ヒト脳由来中性セラミダーゼが細胞膜ではなく，ミトコンドリアに特異的に位置することが記載されているから（記載事項ウ及びオ），引用例１及び２の開示に接した当業者は，ヒト脳由来中性セラミダーゼには「細胞表面にリクルートする上で必須」のムチンボックスが保存されていないと予測する方が自然である。
　ゆえに，（１）で検討したように，引用例２の「シグナル配列の直後のセリン，スレオニンに富んだ領域」，「バクテリアや無脊椎動物には存在しない」といった説明に基づけば，ラット中性セラミダーゼの４４Ｓ〜８２Ｇの配列が特定され，ラットのこの部位の配列に相当するヒト脳由来中性セラミダーゼの配列には，ラットに保存されていないミトコンドリア−ターゲッティング配列（記載事項エのBox2）が存在するとしても，本願発明の配列番号：２に示されるアミノ酸配列がラット中性セラミダーゼのムチンボックスであると予測することを妨げるものではない。
　よって，「配列番号：２に示されるアミノ酸配列がムチンボックスであろうと予測することは極めて困難なことである」という請求人の主張アは採用できない。
　
　主張イ及びウについて
　請求人は，異種ポリペプチドにムチンボックスが付加された場合に，ムチンボックスが異種ポリペプチドの正しい折りたたみ等を阻害せず，それを細胞表面に局在化させることができることは予測できない旨を主張している。
　しかしながら，ムチンボックスが異種ポリペプチドの正しい折りたたみを阻害することが予測されるという具体的な根拠は示しておらず，融合タンパク質が細胞表面へリクルートされないことが予測されるとする具体的理由はない。
　そして，上記（３）で検討したとおり，本願出願日当時の技術水準を考慮すれば，ムチンボックスと異種タンパク質との融合タンパク質を作成した場合に，ムチンボックス及び異種タンパク質のそれぞれが本来有する機能を失わずに発現されることは，当業者が予測することができたものであるから，請求人の主張イ及びウを採用することはできない。
　
６．むすび
　したがって，本願の請求項１に係る発明は，引用例１及び２に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであり，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから，その他の請求項に係る発明について検討するまでもなく，本願は拒絶すべきものである。
　よって，結論のとおり審決する。