【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年8月12日(2010.8.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ヘマグルチニンポリペプチド、ならびにヘマグルチニンポリペプチドに関連する試薬および方法
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、２００６年８月１４日に出願された同時継続中の米国仮特許出願第６０／８３７，８６８号、および２００６年８月１４日に出願された同時継続中の米国仮特許出願第６０／８３７，８６９号に対する優先権を米国特許法のもとに主張する。米国仮特許出願第６０／８３７，８６８号および同第６０／８３７，８６９号のそれぞれの全ての内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府による支援
本発明は、契約番号第Ｕ５４  ＧＭ６２１１６のもと国立一般医科学研究所により、そして契約番号ＧＭ５７０７３のもと国立衛生研究所により与えられた米国政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザには、世界的流行、一時的流行、再流行、および突発の長い歴史がある。Ｈ５Ｎ１株を含むトリインフルエンザは接触感染性が高く、命にかかわる可能性がある病原体であるが、現在のところは、ヒトに感染する能力は限られている。しかし、トリインフルエンザウイルスは、その宿主特異性を変化させ、そしてそれがヒトに容易に感染することを可能にする変異を蓄積していることが歴史的に観察されている。実際、前世紀の主要なインフルエンザウイルスの世界的流行のうちの２つは、ヒトへの感染を可能にするようにそれらの遺伝的構造が変化したトリインフルエンザウイルスから始まった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在のＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、およびＨ２Ｎ２トリインフルエンザ株が、それらの宿主特異性を変化させ、そしてそれらがヒトに容易に感染することを可能にする変異を蓄積している可能性があることは、重要な懸案事項である。したがって、これらの株のＨＡタンパク質が実際に、ヒトに容易に感染できる形態に換わり得るかどうかを評価することが必要であり、さらに、そのような能力を有しているＨＡ変異体を同定することが必要である。さらに、一般的には、様々な対象（特に、ヒト）への感染を可能にするか、または予防する、ＨＡタンパク質の特徴を理解することも必要である。また、インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患の有効な処置またはそのような疾患の発症を遅延させるためのワクチンおよび治療ストラテジーも必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明により、特定のグリカン結合特性を有しているヘマグルチニンポリペプチドが提供される。具体的には、本発明により、アンブレラ様トポロジーを有しているシアリル化されたグリカンに結合するヘマグルチニンポリペプチドが提供される。特定の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、アンブレラグリカンに対して、高い親和性および／または特異性で結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、コーントポロジーの（ｃｏｎｅ−ｔｏｐｏｌｏｇｙ）グリカンと比較すると、アンブレラグリカンに対して優先的な結合を示す。
【０００６】
本発明によってはまた、提供されたヘマグルチニンポリペプチドを伴う診断用および治療用の試薬と方法（ワクチンを含む）も提供される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下のＨＡポリペプチドなどが提供される：
（項目１）
アンブレラトポロジーグリカンに結合する、操作されたＨＡポリペプチド。
（項目２）
前記アンブレラトポロジーグリカンにα２−６シアリル化グリカンが含まれる、項目１に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目３）
前記ＨＡポリペプチドがアンブレラトポロジーグリカンに対して高い親和性で結合する、項目１または項目２に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目４）
前記ＨＡポリペプチドが、アンブレラトポロジーグリカンに対して、ヒトの感染を媒介する野生型のヒトに適応したＨＡの親和性と匹敵する親和性で結合する、項目３に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目５）
前記ＨＡポリペプチドが、アンブレラトポロジーグリカンに対して、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡの親和性の少なくとも５０％の親和性で結合する、項目３に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目６）
前記ＨＡポリペプチドが、アンブレラトポロジーグリカンに対して、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡの親和性の少なくとも７０％の親和性で結合する、項目３に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目７）
前記ＨＡポリペプチドが、アンブレラトポロジーグリカンに対して、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡの親和性の少なくとも８０％の親和性で結合する、項目３に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目８）
前記ＨＡポリペプチドが、アンブレラトポロジーグリカンに対して、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡの親和性の少なくとも９０％の親和性で結合する、項目３に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目９）
前記ＨＡポリペプチドが、アンブレラトポロジーグリカンに対して、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡの親和性の少なくとも１００％の親和性で結合する、項目３に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目１０）
前記ＨＡポリペプチドが、コーントポロジーグリカンと比較して、アンブレラトポロジーグリカンに対して優先的に結合する、項目１または項目２に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目１１）
前記ＨＡポリペプチドが、コーントポロジーグリカン対アンブレラトポロジーグリカンについての少なくとも２の相対的親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する、項目１０に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目１２）
前記ＨＡポリペプチドが、コーントポロジーグリカン対アンブレラトポロジーグリカンについての少なくとも３の相対的親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する、項目１０に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目１３）
前記ＨＡポリペプチドが、コーントポロジーグリカン対アンブレラトポロジーグリカンについての少なくとも４の相対的親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する、項目１０に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目１４）
前記ＨＡポリペプチドが、コーントポロジーグリカン対アンブレラトポロジーグリカンについての少なくとも５の相対的親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する、項目１０に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目１５）
前記ＨＡポリペプチドが、コーントポロジーグリカン対アンブレラトポロジーグリカンについての少なくとも１０の相対的親和性でアンブレラトポロジーグリカンに結合する、項目１０に記載の操作されたＨＡポリペプチド。
（項目１６）
アンブレラトポロジーグリカン以外に結合する単離されたＨＡポリペプチドであって、ＨＡポリペプチドは、以下の株のいずれに由来するＨ１タンパク質でもなく：Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９８６；Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／１９９５；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９２／１９９６；Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６、または、以下の株のいずれに由来するＨ２タンパク質でもなく：Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５＋／１９５７；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６７、または、以下の株のいずれに由来するＨ３タンパク質でもない：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８；Ａ／Ｐｈｉｌｌｉｐｉｎｅｓ／２／１９８２；Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１／１９８５；Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／３６０／１９８６；Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／２／１９８７；Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／１９８７；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／１９８９；Ａ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／９／１９９３；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／１９９４；Ａ／Ｎａｎｃｈａｎｇ／８１３／１９９５；Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／１９９７；Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９；Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９；Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３；Ａ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／３２３／２００３；Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４；Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６５／２００５、単離されたＨＡポリペプチド。
（項目１７）
アンブレラトポロジーグリカンに結合する操作されたＨＡポリペプチドの特徴的な部分。
（項目１８）
ＨＡポリペプチドの特徴的な部分であって、ＨＡポリペプチドは、以下の株のいずれに由来するＨ１タンパク質でもなく：Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９８６；Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／１９９５；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９２／１９９６；Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６、または、以下の株のいずれに由来するＨ２タンパク質でもなく：Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５＋／１９５７；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６７、または、以下の株のいずれに由来するＨ３タンパク質でもなく：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８；Ａ／Ｐｈｉｌｌｉｐｉｎｅｓ／２／１９８２；Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１／１９８５；Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／３６０／１９８６；Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／２／１９８７；Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／１９８７；Ａ／Ｂｅｉｇｉｎｇ／３５３／１９８９；Ａ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／９／１９９３；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／１９９４；Ａ／Ｎａｎｃｈａｎｇ／８１３／１９９５；Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／１９９７；Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９；Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９；Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２；Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３；Ａ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／３２３／２００３；Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４；Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６５／２００５、前記特徴的な部分がアンブレラトポロジーグリカンに結合する、特徴的な部分。
（項目１９）
項目１７または項目１８に記載の特徴的な部分が含まれているポリペプチド。
（項目２０）
項目１７または項目１８に記載の特徴的な部分をコードする核酸。
（項目２１）
項目１９に記載のポリペプチドをコードする核酸。
（項目２２）
項目２０に記載の核酸が含まれているベクター。
（項目２３）
項目２１に記載の核酸が含まれているベクター。
（項目２４）
項目２０に記載の核酸が含まれている宿主細胞。
（項目２５）
項目２１に記載の核酸が含まれている宿主細胞。
（項目２６）
項目２２に記載のベクターが含まれている宿主細胞。
（項目２７）
項目２３に記載のベクターが含まれている宿主細胞。
（項目２８）
アンブレラトポロジーグリカンに結合する操作されたＨＡポリペプチドに結合する抗体。
（項目２９）
ＨＡポリペプチドに結合する抗体であって、ＨＡポリペプチドは、以下の株のいずれに由来するＨ１タンパク質でもなく：Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９８６；Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／１９９５；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９２／１９９６；Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６、または、以下の株のいずれに由来するＨ２タンパク質でもなく：Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５＋／１９５７；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６７、または、以下の株のいずれに由来するＨ３タンパク質でもなく：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８；Ａ／Ｐｈｉｌｌｉｐｉｎｅｓ／２／１９８２；Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１／１９８５；Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／３６０／１９８６；Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／２／１９８７；Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／１９８７；Ａ／Ｂｅｉｇｉｎｇ／３５３／１９８９；Ａ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／９／１９９３；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／１９９４；Ａ／Ｎａｎｃｈａｎｇ／８１３／１９９５；Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／１９９７；Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９；Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９；Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２；Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３；Ａ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／３２３／２００３；Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４；Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６５／２００５、前記ＨＡポリペプチドがアンブレラトポロジーグリカンに結合する、抗体。
（項目３０）
抗体がポリクローナルである、項目２８または項目２９に記載の抗体。
（項目３１）
抗体がモノクローナルである、項目２８または項目２９に記載の抗体。
（項目３２）
アンブレラトポロジーグリカンに結合する操作されたＨＡポリペプチドが含まれているウイルス粒子。
（項目３３）
インフルエンザ感染を処置する方法であって、アンブレラトポロジーグリカンに結合する操作されたＨＡポリペプチド、アンブレラトポロジーグリカンに結合する操作されたＨＡポリペプチドの特徴的な断片が含まれているポリペプチド、アンブレラトポロジーグリカンに結合する操作されたＨＡポリペプチドに結合する抗体、またはその特徴的な部分、アンブレラトポロジーグリカンに結合する操作されたＨＡポリペプチドをコードする核酸、またはその特徴的な部分、あるいはそれらの組み合わせが含まれている組成物を投与することによる、方法。
（項目３４）
ヒトの上気道組織の中のＨＡ受容体上に見られるグリカンのうち、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のグリカン構造が含まれている、グリカンアレイ。
（項目３５）
ＨＡポリペプチドを同定または特性決定するための方法であって、以下の工程：
ＨＡタンパク質が含まれている試料を提供する工程；
前記試料を項目２６に記載のグリカンアレイと接触させる工程；および
前記アレイ上の１つ以上のグリカンに対するＨＡの結合を検出する工程、
が含まれる、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１ａ】図１ａは表１である。
【図１ｂ】図１ｂは表１続きである。
【図１ｃ】図１ｃは表２である。
【図１ｄ】図１ｄは表３である。
【図１ｅ】図１ｅは表３続きである。
【図１ｆ】図１ｆは表３続きである。
【図１】野生型ＨＡの例示的な配列のアラインメント。配列は、ＮＣＢＩのインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）から入手した。
【図１Ａ】野生型ＨＡの例示的な配列のアラインメント。配列は、ＮＣＢＩのインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）から入手した。
【図１Ｂ】野生型ＨＡの例示的な配列のアラインメント。配列は、ＮＣＢＩのインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）から入手した。
【図１Ｃ】野生型ＨＡの例示的な配列のアラインメント。配列は、ＮＣＢＩのインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）から入手した。
【図２】ＨＡグリカン結合ドメインの配列アラインメント。灰色：シアル酸への結合に関与している保存されているアミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与している特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の位置に影響を与えるアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他の単糖（または修飾されたもの）への結合に関与しているアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４についての配列は、それらのそれぞれの結晶構造から得た。他の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得た。省略形：ＡＤＡ７６、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／３５／７６（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＩ３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／３０（Ｈ１Ｎ１）；ＡＰＲ３４、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＣ１８、Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴ９１、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；ＡＮＹ１８、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）；ＡＤＵ６３、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｕｋｒａｉｎｅ／１／６３（Ｈ３Ｎ８）；ＡＡＩ６８、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）；ＡＭ９９、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）；ＡＤＳ９７、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７（Ｈ５Ｎ３）；Ｖｉｅｔ０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）。
【図２Ａ】ＨＡグリカン結合ドメインの配列アラインメント。灰色：シアル酸への結合に関与している保存されているアミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与している特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の位置に影響を与えるアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他の単糖（または修飾されたもの）への結合に関与しているアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４についての配列は、それらのそれぞれの結晶構造から得た。他の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得た。省略形：ＡＤＡ７６、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／３５／７６（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＩ３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／３０（Ｈ１Ｎ１）；ＡＰＲ３４、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＣ１８、Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴ９１、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；ＡＮＹ１８、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）；ＡＤＵ６３、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｕｋｒａｉｎｅ／１／６３（Ｈ３Ｎ８）；ＡＡＩ６８、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）；ＡＭ９９、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）；ＡＤＳ９７、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７（Ｈ５Ｎ３）；Ｖｉｅｔ０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）。
【図２Ｂ】ＨＡグリカン結合ドメインの配列アラインメント。灰色：シアル酸への結合に関与している保存されているアミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与している特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の位置に影響を与えるアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他の単糖（または修飾されたもの）への結合に関与しているアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４についての配列は、それらのそれぞれの結晶構造から得た。他の配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得た。省略形：ＡＤＡ７６、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／３５／７６（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＩ３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／３０（Ｈ１Ｎ１）；ＡＰＲ３４、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＣ１８、Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴ９１、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；ＡＮＹ１８、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１／１８（Ｈ１Ｎ１）；ＡＤＵ６３、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｕｋｒａｉｎｅ／１／６３（Ｈ３Ｎ８）；ＡＡＩ６８、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）；ＡＭ９９、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）；ＡＤＳ９７、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７（Ｈ５Ｎ３）；Ｖｉｅｔ０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）。
【図３】Ｈ１  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図３Ａ】Ｈ１  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図３Ｂ】Ｈ１  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図４】Ｈ３  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図４Ａ】Ｈ３  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図４Ｂ】Ｈ３  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ａ】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ａ−１】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ａ−２】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ｂ】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ｂ−１】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ｂ−２】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ｂ−３】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ｂ−４】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ｂ−５】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図５Ｂ−６】Ｈ５  ＨＡに特徴的な保存されているサブ配列を示している配列アラインメント。
【図６】グリカン受容体特異性を理解するための構想。α２−３−および／またはα２−６−結合グリカンは、様々なトポロジーを採用することができる。本発明にしたがって、特定のこれらのトポロジーに対して結合するＨＡポリペプチドの能力は、様々な宿主、例えば、ヒトの感染を媒介する能力をこれに付与する。この図において示されるように、本発明では、２つの特に関連のあるトポロジー（「コーン」トポロジーと「アンブレラ」トポロジー）が定義される。コーントポロジーは、α２−３−および／またはα２−６−結合グリカンによって採用され得、そして、コアに結合した短いオリゴ糖または分岐したオリゴ糖の典型である（しかし、このトポロジーは、特定の長いオリゴ糖によっても採用され得る）。アンブレラトポロジーは、α２−６−結合グリカンだけによって採用され得（おそらく、α２−６結合の中に存在する余分なＣ５−Ｃ６結合によってもたらされる立体構造の数の増大が原因である）、そして長いオリゴ糖分岐（特に、モチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含むもの）を有している長いオリゴ糖または分岐したグリカンによって主に採用される。本明細書中に記載されるように、アンブレラグリカントポロジーに結合するＨＡポリペプチドの能力により、ヒト受容体への結合、および／またはヒトの感染を媒介する能力が付与される。
【図７】コーングリカントポロジー対アンブレラグリカントポロジーを有しているＨＡ残基の相互作用。ＨＡ−グリカンの共晶の分析により、ＨＡ結合部位に対するＮｅｕ５Ａｃの位置がほぼ不変であることが明らかにされている。Ｎｅｕ５Ａｃとの接触には、Ｆ９８、Ｓ／Ｔ１３６、Ｗ１５３、Ｈ１８３、およびＬ／Ｉ１９４のような高度に保存されている残基が関与している。他の糖との接触には、糖結合がα２−３であるか、またはα２−６であるか、そしてグリカントポロジーがコーンであるか、またはアンブレラであるかに応じて、様々な残基が関与する。例えば、コーントポロジーにおいては、主要な接触は、Ｎｅｕ５Ａｃと、およびＧａｌ糖とである。Ｅ１９０およびＱ２２６は、この結合において特に重要な役割を担っている。この図はまた、コーン構造に対する結合に関与し得る他の位置（例えば、１３７、１４５、１８６、１８７、１９３、２２２）も示している。いくつかの場合には、様々な残基が様々なグリカン構造と様々な接触を形成し得る。これらの位置にあるアミノ酸のタイプは、グリカン構造の中に様々な修飾および／または分岐パターンを有している受容体に結合するＨＡポリペプチドの能力に影響を与え得る。アンブレラトポロジーにおいては、接触は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの域を超えて、複数の糖と形成される。この図では、アンブレラ構造への結合に関与し得る残基（例えば、１３７、１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９６、２２２、２２５、２２６）を示している。いくつかの場合には、様々な残基が、様々なグリカン構造と様々な接触を形成し得る。これらの位置にあるアミノ酸のタイプは、グリカン構造の中に様々な修飾および／または分岐パターンを有している受容体に結合するＨＡポリペプチドの能力に影響を与え得る。いくつかの実施形態においては、１９０位のＤ残基、および／または２２５位のＤ残基が、アンブレラトポロジーへの結合に寄与する。
【図８】例示的なコーントポロジー。この図は、コーントポロジーを採用する特定の例示的な（しかし、包括的ではない）グリカン構造を説明している。
【図９】例示的なアンブレラトポロジー。この図は、アンブレラトポロジーを採用する特定の例示的な（しかし、包括的ではない）グリカン構造を説明している。
【図１０Ａ】ヒトの気管支上皮細胞およびヒト結腸上皮細胞のグリカンプロフィール。上気道組織の中でのグリカンの多様性をさらに調べるために、Ｎ結合グリカンをＨＢＥ（代表的な上気道細胞株）から単離し、そしてＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して分析した。ＨＢＥ中でのａ２−６の顕著な発現を、シアリダーゼＳ（ａ２−３特異的）とシアリダーゼＡ（切断およびＳＡ）での試料の事前処理によって確認した。長い分岐トポロジーを有しているグリカンの顕著な発現は、典型的な質量ピーク（シアンで強調）のＴＯＦ−ＴＯＦフラグメンテーション解析によってサポートされる。上気道組織におけるグリカンの多様性についての基準を得るために、ヒトの結腸上皮細胞（ＨＴ２９；典型的な腸細胞株）のＮ結合グリカンプロフィールを得た。この細胞株は、現在のＨ５Ｎ１ウイルスが腸細胞に感染することが示されていることから選択した。シアリダーゼＡとＳでの事前処理の対照は、ＨＴ−２９細胞において、ａ２−３グリカン（赤で強調）の顕著な発現を示した。さらに、長い分岐したグリカントポロジーは、ＨＢＥについて観察されたほどには観察されなかった。したがって、Ｈ５Ｎ１  ＨＡのヒトでの採用には、ヒトの上気道組織で発現された多様なグリカン（例えば、アンブレラグリカン）に対する高い親和性での結合を可能にするＨＡ変異が含まれるであろう。
【図１０Ｂ】ヒトの気管支上皮細胞およびヒト結腸上皮細胞のグリカンプロフィール。上気道組織の中でのグリカンの多様性をさらに調べるために、Ｎ結合グリカンをＨＢＥ（代表的な上気道細胞株）から単離し、そしてＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して分析した。ＨＢＥ中でのａ２−６の顕著な発現を、シアリダーゼＳ（ａ２−３特異的）とシアリダーゼＡ（切断およびＳＡ）での試料の事前処理によって確認した。長い分岐トポロジーを有しているグリカンの顕著な発現は、典型的な質量ピーク（シアンで強調）のＴＯＦ−ＴＯＦフラグメンテーション解析によってサポートされる。上気道組織におけるグリカンの多様性についての基準を得るために、ヒトの結腸上皮細胞（ＨＴ２９；典型的な腸細胞株）のＮ結合グリカンプロフィールを得た。この細胞株は、現在のＨ５Ｎ１ウイルスが腸細胞に感染することが示されていることから選択した。シアリダーゼＡとＳでの事前処理の対照は、ＨＴ−２９細胞において、ａ２−３グリカン（赤で強調）の顕著な発現を示した。さらに、長い分岐したグリカントポロジーは、ＨＢＥについて観察されたほどには観察されなかった。したがって、Ｈ５Ｎ１  ＨＡのヒトでの採用には、ヒトの上気道組織で発現された多様なグリカン（例えば、アンブレラグリカン）に対する高い親和性での結合を可能にするＨＡ変異が含まれるであろう。
【図１１Ａ】データ検索プラットフォーム（図１１Ａ）には、データ検索プラットフォームの主要な要素が示されている。データベースから抽出されるデータオブジェクトから特徴が導かれる。特徴は、パターンまたは規則を導くための分類方法によって使用されるデータセットになるように準備される。（図１１Ｂ）は、使用者がグリカンアレイデータにデータ検索プロセスを適用できる重要なソフトウェアモジュールを示す。
【図１１Ｂ】データ検索プラットフォーム（図１１Ａ）には、データ検索プラットフォームの主要な要素が示されている。データベースから抽出されるデータオブジェクトから特徴が導かれる。特徴は、パターンまたは規則を導くための分類方法によって使用されるデータセットになるように準備される。（図１１Ｂ）は、使用者がグリカンアレイデータにデータ検索プロセスを適用できる重要なソフトウェアモジュールを示す。
【図１２Ａ】データ検索分析で使用した特徴。この図は、グリカンマイクロアレイ上のグリカンからまとめた様々なタイプのペア、トリプレット、およびクアドロプレットを説明している典型的なモチーフとして、本明細書中で定義される特徴を示す。これらの特徴の選択の論理的根拠は、ＨＡのグリカン結合部位に対するジ−四糖の結合に基づく。最終的なデータセットには、グリカンに由来する特徴と、さらに、アレイ上でスクリーニングしたＨＡのそれぞれについての結合シグナルが含まれる。様々な分類方法のうち、ルールインダクション分類法（ｒｕｌｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用した。この方法の主要な利点のうちの１つは、これにより、他の統計学的方法または数学的方法と比較した場合に、より簡単に解釈できるＩＦ−ＴＨＥＮ規則が生じることである。分類の２つの主要な目的は以下である：（１）高親和性のグリカンリガンド（これは結合を促進する）のセットについて存在する特徴を特定すること、および（２）結合に好ましくない低親和性のグリカンリガンドに存在する特徴を特定すること。
【図１２Ｂ】データ検索分析で使用した特徴。この図は、グリカンマイクロアレイ上のグリカンからまとめた様々なタイプのペア、３つ、および４つを説明している典型的なモチーフとして、本明細書中で定義される特徴を示す。これらの特徴の選択の論理的根拠は、ＨＡのグリカン結合部位に対するジ−四糖の結合に基づく。最終的なデータセットには、グリカンに由来する特徴と、さらに、アレイ上でスクリーニングしたＨＡのそれぞれについての結合シグナルが含まれる。様々な分類方法のうち、ルールインダクション分類法（ｒｕｌｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用した。この方法の主要な利点のうちの１つは、これにより、他の統計学的方法または数学的方法と比較した場合に、より簡単に解釈できるＩＦ−ＴＨＥＮ規則が生じることである。分類の２つの主要な目的は以下である：（１）高親和性のグリカンリガンド（これは結合を促進する）のセットについて存在する特徴を特定すること、および（２）結合に好ましくない低親和性のグリカンリガンドに存在する特徴を特定すること。
【図１３】データ検索分析で使用した分類子。この図は、分類子ｉｄｓと規則の表を示す。
【図１４】Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌモチーフとＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの立体構造のマップと溶媒露出度。パネルＡは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体構造のマップを示す。富化領域２は、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２３共晶構造において観察されたトランス立体構造である。富化領域１は、ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共晶構造において観察された立体構造である。パネルＢは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌの立体構造のマップを示し、ここで、シス立体構造（富化領域３）が、ＨＡ−α２−６シアリル化グリカン共晶構造の全てにおいて観察される。パネルＣは、それぞれのＨＡ−グリカン共晶構造中のＮｅｕ５Ａｃ  α２−３とα２−６シアリル化オリゴ糖の溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）の差を示す。赤とシアンの棒は、それぞれ、α２−６（ポジティブな値）またはα２−３（ネガティブな値）シアリル化グリカンの中のＮｅｕ５Ａｃが、グリカン結合部位とさらに接触することを示している。パネルＤは、ブタとヒトのＨ１（Ｈ１α２−３）、トリおよびヒトのＨ３（Ｈ３α２−３）に結合したα２−３シアリル化グリカンのＮｅｕＡｃのＳＡＳＡと、ブタおよびヒトのＨ１（Ｈ１α２−６）に結合したα２−６シアリル化グリカンのＮｅｕＡｃのＳＡＳＡとの差を示す。Ｈ３α２−３についてのシアンのネガティブな棒は、トリのＨ３と比較して、ヒトＨ３  ＨＡのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌとのより少ない接触を示している。ねじれ角−φ：Ｃ２−Ｃ１−Ｏ−Ｃ３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６結合について）；ψ：Ｃ１−Ｏ−Ｃ３−Ｈ３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合について）、またはＣ１−Ｏ−Ｃ６−Ｃ５（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合について）；ω：Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合について）。φ、ψマップは、Ｍａｒｔｉｎ  Ｆｒａｎｋ博士とＣｌａｕｓ−Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｅｔｈ博士（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって開発されたＧｌｙｃｏＭａｐｓ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得た。高エネルギーから低エネルギーまでの着色図解は、それぞれ、明るい赤から明るい緑である。
【図１５Ａ】α２−３／６シアリル化グリカンに対するＨ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの結合に関与している残基。パネルＡ−Ｄは、ＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共晶構造において、それぞれ、α２−３およびα２−６シアリル化グリカンと相互作用している残基の溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標のΔ）を示す。緑色の棒はグリカンと直接相互作用する残基に対応し、そして明るいオレンジ色の棒は、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０とＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近接している残基に対応する。緑色の棒についてのポジティブなΔの値は、その残基がα２−６シアリル化グリカンとより接触することを示しており、一方、ネガティブなΔの値は、α２−３シアリル化グリカンとより接触することを示している。パネルＥには、表の形式で、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの中のα２−３／６シアリル化グリカンへの結合に関与している残基をまとめる。α２−３シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基は青で色をつけ、α２−６シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基には赤で色をつけた。
【図１５Ｂ】α２−３／６シアリル化グリカンに対するＨ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの結合に関与している残基。パネルＡ−Ｄは、ＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共晶構造において、それぞれ、α２−３およびα２−６シアリル化グリカンと相互作用している残基の溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標のΔ）を示す。緑色の棒はグリカンと直接相互作用する残基に対応し、そして明るいオレンジ色の棒は、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０とＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近接している残基に対応する。緑色の棒についてのポジティブなΔの値は、その残基がα２−６シアリル化グリカンとより接触することを示しており、一方、ネガティブなΔの値は、α２−３シアリル化グリカンとより接触することを示している。パネルＥには、表の形式で、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの中のα２−３／６シアリル化グリカンへの結合に関与している残基をまとめる。α２−３シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基は青で色をつけ、α２−６シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基には赤で色をつけた。
【図１５Ｃ】α２−３／６シアリル化グリカンに対するＨ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの結合に関与している残基。パネルＡ−Ｄは、ＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共晶構造において、それぞれ、α２−３およびα２−６シアリル化グリカンと相互作用している残基の溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標のΔ）を示す。緑色の棒はグリカンと直接相互作用する残基に対応し、そして明るいオレンジ色の棒は、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０とＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近接している残基に対応する。緑色の棒についてのポジティブなΔの値は、その残基がα２−６シアリル化グリカンとより接触することを示しており、一方、ネガティブなΔの値は、α２−３シアリル化グリカンとより接触することを示している。パネルＥには、表の形式で、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの中のα２−３／６シアリル化グリカンへの結合に関与している残基をまとめる。α２−３シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基は青で色をつけ、α２−６シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基には赤で色をつけた。
【図１５Ｄ】α２−３／６シアリル化グリカンに対するＨ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの結合に関与している残基。パネルＡ−Ｄは、ＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共晶構造において、それぞれ、α２−３およびα２−６シアリル化グリカンと相互作用している残基の溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標のΔ）を示す。緑色の棒はグリカンと直接相互作用する残基に対応し、そして明るいオレンジ色の棒は、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０とＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近接している残基に対応する。緑色の棒についてのポジティブなΔの値は、その残基がα２−６シアリル化グリカンとより接触することを示しており、一方、ネガティブなΔの値は、α２−３シアリル化グリカンとより接触することを示している。パネルＥには、表の形式で、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの中のα２−３／６シアリル化グリカンへの結合に関与している残基をまとめる。α２−３シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基は青で色をつけ、α２−６シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基には赤で色をつけた。
【図１５Ｅ】α２−３／６シアリル化グリカンに対するＨ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの結合に関与している残基。パネルＡ−Ｄは、ＡＳＩ３０＿Ｈ１、ＡＰＲ３４＿Ｈ１、ＡＤＵ６３＿Ｈ３、およびＡＤＳ９７＿Ｈ５共晶構造において、それぞれ、α２−３およびα２−６シアリル化グリカンと相互作用している残基の溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）の差（横座標のΔ）を示す。緑色の棒はグリカンと直接相互作用する残基に対応し、そして明るいオレンジ色の棒は、Ｇｌｕ／Ａｓｐ１９０とＧｌｎ／Ｌｅｕ２２６に近接している残基に対応する。緑色の棒についてのポジティブなΔの値は、その残基がα２−６シアリル化グリカンとより接触することを示しており、一方、ネガティブなΔの値は、α２−３シアリル化グリカンとより接触することを示している。パネルＥには、表の形式で、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの中のα２−３／６シアリル化グリカンへの結合に関与している残基をまとめる。α２−３シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基は青で色をつけ、α２−６シアリル化グリカンへの結合に関与している特定の重要な残基には赤で色をつけた。
【図１６】二分岐のα２−６シアリル化グリカン（コーントポロジー）に対するＶｉｅｔ０４＿Ｈ５  ＨＡの結合。伸張配座（百日咳毒素の共晶構造から得られた；ＰＤＢ  ＩＤ：１ＰＴＯ）での、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合を有している表面に露出しているＶｉｅｔ０４＿Ｈ５グリカン結合部位の立体視。Ｌｙｓ１９３（オレンジ色）は、この立体構造においてはグリカンと全く接触していない。この立体構造においてグリカンへの結合に関与している可能性があるさらに別のアミノ酸は、Ａｓｎ１８６、Ｌｙｓ２２２、およびＳｅｒ２２７である。しかし、シス立体構造のα２−６シアリル化オリゴ糖へのＨＡの結合において観察された特定の接触は、伸張配座においては存在しない。いずれの特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明者らは、これが、伸張配座が（シス−立体構造ほど最適に）ＨＡに結合しない場合があることを示唆していることに注目する。分岐したＮ結合グリカン（この場合、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ分岐が、Ｍａｎα１−３Ｍａｎ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＬＧＣ）とＭａｎα１−６Ｍａｎ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＺＡＧ）に結合させられている）の構造は、この結合のシス立体構造と伸張配座のいずれについても、Ｖｉｅｔ０４＿Ｈ５  ＨＡ結合部位のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合に対して重なりあった。この重なり合うことは、コアのＭａｎα１−６Ｍａｎに結合させられたＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ分岐を有している構造が、（いずれの立体構造においても）結合部位との好ましくない立体的重複を有していることを示している。一方、コアのＭａｎα１−３Ｍａｎに結合させられたこの分岐を有している構造（トリマンノースコアが紫色に着色されている図に示される）は、シス立体構造においては、Ｌｙｓ１９３と立体的な重複を有するが、伸張配座においてはＬｙｓ１９３と接触することなく結合することができるが、好ましくない。
【図１７】ＷＴ  Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡの生産。パネルＡは、４〜１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに上で泳動させ、ニトロセルロース膜上にブロットした、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８）、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９）、およびＨ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）に由来するＨＡタンパク質の可溶性形態を示す。Ｈ１Ｎ１  ＨＡは、ヤギ抗インフルエンザＡ抗体と抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰを使用してプローブした。Ｈ３Ｎ２は、フェレット抗Ｈ３Ｎ２  ＨＡ抗血清と抗フェレットＨＲＰを使用してプローブした。Ｈ５Ｎ１は、抗トリＨ５Ｎ１  ＨＡ抗体と抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを使用してプローブした。Ｈ１Ｎ１  ＨＡとＨ３Ｎ２  ＨＡはＨＡ０として存在し、一方、Ｈ５Ｎ１  ＨＡはＨＡ０およびＨＡ１の両方として存在する。パネルＢは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜の上にブロットした、全長のＨ５Ｎ１  ＨＡと２つの変異体（Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、“ＤＳＤＬ”、およびＧＬｕ１９０Ａｓｐ  Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ  Ｇｌｎ２２３Ｌｅｕ  Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ、“ＤＳＬＳ”）を示す。ＨＡは、抗トリＨ５Ｎ１抗体と抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰでプローブした。
【図１８】上気道組織の切片のレクチン染色。Ｊａｃａｌｉｎ（緑色）とＣｏｎＡ（赤色）での気管組織の同時染色により、気管の先端面上の杯細胞に対するＪａｃａｌｉｎ（Ｏ結合グリカンに特異的に結合する）の優先的な結合と、絨毛のある気管上皮細胞に対するｃｏｎＡ（Ｎ結合グリカンに特異的に結合する）の優先的な結合が明らかとなった。いずれの特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明者らは、この知見が、杯細胞がＯ結合グリカンを主に発現し、一方、絨毛を有している上皮細胞はＮ結合グリカンを主に発現することを示唆していることに注目する。ＪａｃａｌｉｎとＳＮＡ（赤色；α２−６に特異的に結合する）での気管の同時染色は、杯細胞と絨毛細胞の両方に対するＳＮＡの結合を示す。一方、Ｊａｃａｌｉｎ（緑色）とＭＡＬ（赤色）（これは、α２−３シアリル化グリカンに特異的に結合する）での同時染色は、多列気管上皮に対するＭＡＬの結合が、最弱から結合がないことを示したが、組織の基部領域に対しては多数の結合を示した。まとめると、レクチンの染色データは、気管上皮の先端面上にある絨毛細胞と杯細胞の中の、それぞれ、Ｎ結合グリカンとＯ結合グリカンの両方の一部としての、α２−６シアリル化グリカンの優勢な発現と広範囲の分布を示している。
【図１９】上気道組織切片および下気道組織切片に対する組み換え体Ｈ１、Ｈ３  ＷＴ  ＨＡの用量応答結合。ＨＡの結合は、ヨウ化プロピジウム染色（赤色）に対して緑色で示される。気管組織の先端面は、長い分岐トポロジーを有しているα２−６グリカンを主に発現する。他方、肺胞組織は、ａ２−３グリカンを主に発現する。Ｈ１  ＨＡは気管の先端面に有意に結合し、その結合は、４０から１０ｕｇ／ｍｌまでの稀釈で、段階的に減少する。Ｈ１  ＨＡもまた、最大濃度でのみ、肺胞組織に対して、いくらかの弱い結合を示す。Ｈ３  ＨＡの結合パターンはＨ１  ＨＡの結合パターンとは異なる。例えば、Ｈ３  ＨＡは、４０および２０ｕｇ／ｍｌで、気管組織切片と肺胞組織切片の両方に対して有意な結合を示す。しかし、１０ｕｇ／ｍｌの濃度では、Ｈ３  ＨＡは、気管組織の先端面に対して主な結合を示し、肺胞組織に対してはわずかな結合を示すかまたは結合を示さない。まとめると、これらの組織結合データは、気管組織の先端面に対する高親和性結合の重要性を強調している。さらに、これらのデータは、α２−６シアリル化グリカンに対する高い特異性（Ｈ１  ＨＡによって明らかにされたもののような）は、ヒトの感染を媒介するためには絶対的に必要なものではないことを明らかにしている。なぜなら、Ｈ３  ＨＡは、α２−３シアリル化グリカンに対していくらかの親和性を示すからである。
【図２０】Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５  ＷＴ  ＨＡの直接的な結合用量応答。上部から下部に向かって、様々な濃度での野生型Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５  ＨＡについて、それぞれ、結合シグナル（およそ８０００００の飽和レベルに対して正規化した）を示す。グリカンについての説明を差し込み図として示す。ここで、ＬＮは、Ｇａｌｂ１０４ＧｌｃＮＡｃに対応し、３’ＳＬＮと６’ＳＬＮは、それぞれ、ＬＮでα２−３とα２−６結合したシアル酸に対応する。Ｈ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの特徴的な結合パターン（これは、ヒトに感染するために採用される）は、４０ｕｇ／ｍｌから５ｕｇ／ｍｌに減少するまでの稀釈範囲全体にわたる長いα２−６（６’ＳＬＮ−ＬＮ）グリカンに対する飽和濃度でのそれらの結合である。Ｈ１  ＨＡは、長いα２−６シアリル化グリカンに対する結合については高度に特異的であるが、Ｈ３  ＨＡは、短いα２−６シアリル化グリカン（６’ＳＬＮ）に対して高い親和性で、そして長いα２−３に対して、α２−６と比較して、低い親和性で結合する。Ｈ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡのこの直接的な結合用量応答は、組織結合パターンと一致する。さらに、長いα２−６シアリル化グリカンに対するＨ１  ＨＡとＨ３  ＨＡの高親和性の結合は、気管組織の先端面（これは、長い分岐トポロジーを有しているα２−６シアリル化グリカンを発現する）に対するそれらの広域結合と相関関係がある。この相関関係により、ヒトに適応したＨ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの上気道組織の向性についての有用な知見がもたらされる。一方、Ｈ５  ＨＡは、α２−６シアリル化グリカンに対するその比較的低い親和性（有意なシグナルは、２０〜４０ｕｇ／ｍｌでしか見られない）と比較して、α２−３シアリル化グリカンに対して高い親和性（４０ｕｇ／ｍｌから２．５ｕｇ／ｍｌの濃度に減少するまでの飽和シグナル）で結合する、反対のグリカン結合傾向を示す。したがって、いずれの特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明は、ＨＡポリペプチド（例えば、トリＨ５  ＨＡ）のヒトへの適応の必要条件が、ヒトの気道上部で主に発現される長いα２−６シアリル化グリカン（例えば、アンブレラトポロジーグリカン）に対して高い親和性で結合する能力を獲得することであると提起する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＨＡ配列エレメントについての記載
ＨＡ配列エレメント１
ＨＡ配列エレメント１は、自然界に存在しているインフルエンザ単離物において見られる多くのＨＡタンパク質のおおよそ９７位〜１８５位の残基（ここで、残基位置は、Ｈ３
ＨＡを参考として使用して割り当てられる）に対応する配列エレメントである。この配列エレメントは、以下の基本構造を有する：
Ｃ（Ｙ／Ｆ）ＰＸ１ＣＸ２ＷＸ３ＷＸ４ＨＨＰ、ここで：
Ｘ１は、およそ３０〜４５アミノ酸長である；
Ｘ２は、およそ５〜２０アミノ酸長である；
Ｘ３は、およそ２５〜３０アミノ酸長である；そして、
Ｘ４は、およそ２アミノ酸長である。
【０００９】
いくつかの実施形態においては、Ｘ１は、約３５〜４５、または約３５〜４３、または約３５、３６、３７、３８、３８、４０、４１、４２、もしくは４３アミノ酸長である。いくつかの実施形態においては、Ｘ２は、約９〜１５、または約９〜１４、または約９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４アミノ酸長である。いくつかの実施形態においては、Ｘ３は、約２６〜２８、または約２６、２７、もしくは２８アミノ酸長である。いくつかの実施形態においては、Ｘ４は、配列（Ｇ／Ａ）（Ｉ／Ｖ）を有する。いくつかの実施形態においては、Ｘ４は、配列ＧＩを有する；いくつかの実施形態においては、Ｘ４は、配列ＧＶを有する；いくつかの実施形態においては、Ｘ４は、配列ＡＩを有する；いくつかの実施形態においては、Ｘ４は、配列ＡＶを有する。いくつかの実施形態においては、ＨＡ配列エレメント１にはジスルフィド結合が含まれる。いくつかの実施形態においては、このジスルフィド結合は、９７位および１３９位（本明細書中で利用した標準的なＨ３ナンバリングシステムに基づく）に相当する残基を架橋する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、特にＨ１ポリペプチドにおいては、Ｘ１は、約４３アミノ酸長であり、そして／またはＸ２は、約１３アミノ酸長であり、そして／またはＸ３は、約２６アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、特にＨ１ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
ＣＹＰＸ１ＡＴ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｓ）ＣＸ２ＷＸ３ＷＸ４ＨＨＰ、ここで：
Ｘ１Ａは、およそ２７〜４２、またはおよそ３２〜４２、またはおよそ３２〜４０、またはおよそ２６〜４１、またはおよそ３１〜４１、またはおよそ３１−３９、またはおよそ３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長であり、Ｘ２からＸ４は上記のとおりである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、特にＨ１ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
ＣＹＰＸ１ＡＴ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｓ）ＣＸ２Ｗ（Ｉ／Ｌ）（Ｔ／Ｖ）Ｘ３ＡＷＸ４ＨＨＰ、ここで：
Ｘ１Ａは、およそ２７〜４２、またはおよそ３２〜４２、またはおよそ３２〜４０、またはおよそ３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長であり、
Ｘ３Ａは、およそ２３〜２８、またはおよそ２４〜２６、またはおよそ２４、２５、もしくは２６アミノ酸長であり、そして、Ｘ２とＸ４は上記のとおりである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、特にＨ１ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１には配列：
ＱＬＳＳＩＳＳＦＥＫ
が、通常は、Ｘ１（Ｘ１Ａの中を含む）の中に、特にＸ１の約１２位の残基で始まるように、（例えば、図１〜３に示すように）含まれる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、特にＨ３ポリペプチドにおいては、Ｘ１は、約３９アミノ酸長であり、そして／またはＸ２は、約１３アミノ酸長であり、そして／またはＸ３は、約２６アミノ酸長である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、特にＨ３ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
ＣＹＰＸ１ＡＳ（Ｓ／Ｎ）（Ａ／Ｓ）ＣＸ２ＷＸ３ＷＸ４ＨＨＰ、ここで：
Ｘ１Ａは、およそ２７〜４２、またはおよそ３２〜４２、またはおよそ３２〜４０、またはおよそ２３〜３８、またはおよそ２８〜３８、またはおよそ２８〜３６、またはおよそ２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長であり、Ｘ２からＸ４は、上記のとおりである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、特にＨ３ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
ＣＹＰＸ１ＡＳ（Ｓ／Ｎ）（Ａ／Ｓ）ＣＸ２ＷＬ（Ｔ／Ｈ）Ｘ３ＡＷＸ４ＨＨＰ、ここで：
Ｘ１Ａは、およそ２７〜４２、またはおよそ３２〜４２、またはおよそ３２〜４０、またはおよそ３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長であり、
Ｘ３Ａは、およそ２３〜２８、またはおよそ２４〜２６、またはおよそ２４、２５、もしくは２６アミノ酸長であり、Ｘ２とＸ４は上記のとおりである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、特にＨ３ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１には、配列：
（Ｌ／Ｉ）（Ｖ／Ｉ）ＡＳＳＧＴＬＥＦ
が、通常は、Ｘ１（Ｘ１Ａの中を含む）の中に、特に、Ｘ１の約１２位の残基で始まるように、（例えば、図１、２、および４に示すように）含まれる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、特にＨ５ポリペプチドにおいては、Ｘ１は、約４２アミノ酸長であり、そして／またはＸ２は、約１３アミノ酸長であり、そして／またはＸ３は、約２６アミノ酸長である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、特にＨ５ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
ＣＹＰＸ１ＡＳＳＡＣＸ２ＷＸ３ＷＸ４ＨＨＰ、ここで：
Ｘ１Ａは、およそ２７〜４２、またはおよそ３２〜４２、またはおよそ３２〜４０、またはおよそ２３〜３８、またはおよそ２８〜３８、またはおよそ２８〜３６、またはおよそ２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長であり、Ｘ２からＸ４は上記のとおりである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、特にＨ５ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
ＣＹＰＸ１ＡＳＳＡＣＸ２ＷＬＩＸ３ＡＷＸ４ＨＨＰ、ここで：
Ｘ１Ａは、およそ２７〜４２、またはおよそ３２〜４２、またはおよそ３２〜４０、またはおよそ３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０アミノ酸長であり、
Ｘ３Ａは、およそ２３〜２８、またはおよそ２４〜２６、またはおよそ２４、２５、もしくは２６アミノ酸長であり、Ｘ２とＸ４は上記のとおりである。
【００２０】
いくつかの実施形態において、特にＨ５ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１は、以下の配列によって伸張される（すなわち、１８６位〜１９３位に対応する位置で）：
ＮＤＡＡＥＸＸ（Ｋ／Ｒ）。
【００２１】
いくつかの実施形態において、特にＨ５ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント１には、配列：
ＹＥＥＬＫＨＬＸＳＸＸＮＨＦＥＫ
が、通常は、Ｘ１の中に、特に、Ｘ１の６位の残基で始まるように、（例えば、図１、２、および５に示されるように）含まれる。
【００２２】
ＨＡ配列エレメント２
ＨＡ配列エレメント２は、自然界に存在しているインフルエンザ単離物において見られる多くのＨＡタンパク質のおよそ３２４位〜３４０位の残基（ここでも、Ｈ３  ＨＡに基づくナンバリングシステムを使用する）に対応する配列エレメントである。この配列エレメントは以下の基本構造を有する：
ＧＡＩＡＧＦＩＥ
いくつかの実施形態において、ＨＡ配列エレメント２は、以下の配列を有する：
ＰＸ１ＧＡＩＡＧＦＩＥ、ここで：
Ｘ１は、およそ４−１４アミノ酸長、または約８−１２アミノ酸長、または約１２、１１、１０、９、もしくは８アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、この配列エレメントは、ＨＡ０切断部位を提供し、それによりＨＡ１とＨＡ２の生産を可能にする。
【００２３】
いくつかの実施形態において、特にＨ１ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント２は以下の構造を有する：
ＰＳ（Ｉ／Ｖ）ＱＳＲＸ１ＡＧＡＩＡＧＦＩＥ、ここで：
Ｘ１Ａは、およそ３アミノ酸長である；いくつかの実施形態においては、Ｘ１Ａは、Ｇ（Ｌ／Ｉ）Ｆである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、特にＨ３ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント２は以下の構造を有する：
ＰＸＫＸＴＲＸ１ＡＧＡＩＡＧＦＩＥ、ここで：
Ｘ１Ａは、およそ３アミノ酸長である；いくつかの実施形態においては、Ｘ１Ａは、Ｇ（Ｌ／Ｉ）Ｆである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、特にＨ５ポリペプチドにおいては、ＨＡ配列エレメント２は以下の構造を有する：
ＰＱＲＸＸＸＲＸＸＲＸ１ＡＧＡＩＡＧＦＩＥ、ここで：
Ｘ１Ａは、およそ３アミノ酸長である；いくつかの実施形態においては、Ｘ１Ａは、Ｇ（Ｌ／Ｉ）Ｆである。
【００２６】
定義
親和性：当該分野で公知であるように、「親和性」は、そのパートナー（例えば、ＨＡ受容体）に対する特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）の結合の緊密度の尺度である。親和性は、様々な方法で測定することができる。
【００２７】
生物学的活性：本明細書中で使用される場合は、表現「生物学的に活性」は、生体系において、特に、有機体の中で活性を有している、任意の物質の特徴をいう。例えば、有機体に投与されると、その有機体に対して生物学的作用を有する物質は、生物学的に活性であると見なされる。特定の実施形態においては、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合には、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有しているそのタンパク質またはポリペプチドの一部分が、通常は、「生物学的に活性な」部分と呼ばれる。
【００２８】
広域ヒト結合（ＢＳＨＢ）Ｈ５  ＨＡポリペプチド：本明細書中で使用される場合は、表現「広域ヒト結合Ｈ５  ＨＡ」は、ヒトの上皮組織において見られるＨＡ受容体に対して、特に、α２−６シアリル化グリカンを有しているヒトＨＡ受容体に対して結合する、Ｈ５  ＨＡポリペプチドのバージョンをいう。さらに、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡは
、複数の様々なα２−６シアリル化グリカンに結合する。いくつかの実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡは、ヒトの試料中に見られる十分な数の様々なα２−６シアリル化グリカン（それらを含むそのウイルスは、ヒトの集団に感染する幅広い能力を有している）に対して結合し、特に、それらの集団中の上気道受容体に対して結合する。いくつかの実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡは、本明細書中に記載されるように、アンブレラグリカン（例えば、長いα２−６シアリル化グリカン）に結合する。
【００２９】
特徴的な部分：本明細書中で使用される場合は、タンパク質またはポリペプチドの「特徴的な部分」という表現は、いずれもタンパク質またはポリペプチドの特徴である、アミノ酸の連続するストレッチ、またはアミノ酸の連続するストレッチのコレクションを含むものである。個々のそのような連続するストレッチには、一般的には、少なくとも２つのアミノ酸が含まれるであろう。さらに、当業者は、タンパク質にとって特徴的であるためには、通常は、少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上のアミノ酸が必要であることを理解するであろう。一般的には、特徴的な部分は、上記で特定された配列同一性に加えて、関連する完全なタンパク質と、少なくとも１つの機能的特徴を共有するものである。
【００３０】
特徴的な配列：「特徴的な配列」は、ポリペプチドまたは核酸のファミリーの全てのメンバーにおいて見られ、したがって、そのファミリーのメンバーを定義するために当業者によって使用され得る配列である。
【００３１】
コーントポロジー：表現「コーントポロジー」は、本明細書中で、特定のグリカンによって、特にＨＡ受容体上のグリカンによって採用される３次元配置を指して使用される。図６に示されるように、コーントポロジーは、α２−３シアリル化グリカンによって、またはα２−６シアリル化グリカンによって採用され得、これは通常は短いオリゴヌクレオチド鎖であるが、いくつかの長いオリゴヌクレオチドもまたこの立体構造を採用することができる。コーントポロジーは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合のグリコシドのねじれ角によって特性決定される。これは、およそ−６０、６０、または１８０のφ（Ｃ１−Ｃ２−Ｏ−Ｃ３／Ｃ６）値と、−６０から６０のψ（Ｃ２−Ｏ−Ｃ３／Ｃ６−Ｈ３／Ｃ５）試料によって与えられる最小エネルギーの立体構造の３つの領域の見本をとる（図１４）。図８は、コーントポロジーを採用するグリカンの特定の代表的な（包括的ではない）例を示す。
【００３２】
対応する：本明細書中で使用される場合は、用語「〜に対応する」は、ＨＡポリペプチド中のアミノ酸残基の位置／同一性を指す際に、頻繁に使用される。当業者は、便宜上、標準的なナンバリングシステム（野生型Ｈ３  ＨＡに基づく）が本明細書中で利用され（例えば、図１〜５に説明されるように）、その結果、例えば、１９０位の残基に「対応する」アミノ酸が実際に特定のアミノ酸鎖中の１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ、野生型Ｈ３  ＨＡの１９０位に見られる残基に対応することを理解するであろう；当業者は、対応するアミノ酸を特定するための方法を容易に理解するであろう。
【００３３】
分離度で取り出された：本明細書中で使用される場合は、「分離度で取り出された」アミノ酸は、グリカン結合に対して間接的な作用を有しているＨＡアミノ酸である。例えば、１分離度で取り出されたアミノ酸は：（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；および／または（２）あるいは直接結合するアミノ酸の宿主細胞のＨＡ受容体と会合するグリカンと相互作用する能力に影響を与えるかのいずれかである；そのような１分離度で取り出されたアミノ酸は、グリカン自体に結合する場合も、また、グリカン自体には直接は結合しない場合もある。２分離度で取り出されたアミノ酸は、（１）１分離度で取り出されたアミノ酸と相互作用する；および／または（２）あるいは１分離度で取り出されたアミノ酸の能力に影響を与えて直接結合するアミノ酸と相互作用するなどのいずれかである
。
【００３４】
直接結合するアミノ酸：本明細書中で使用される場合は、表現「直接結合するアミノ酸」は、宿主細胞のＨＡ受容体と会合した１つ以上のグリカンと直接相互作用するＨＡポリペプチドのアミノ酸をいう。
【００３５】
操作された：用語「操作された」は、本明細書中で使用される場合は、そのアミノ酸配列がヒトによって選択されたポリペプチドを表す。例えば、操作されたＨＡポリペプチドは、自然界に存在しているインフルエンザ単離物において見られるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態においては、操作されたＨＡポリペプチドは、ＮＣＢＩデータベースに含まれるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
【００３６】
Ｈ１ポリペプチド：「Ｈ１ポリペプチド」は、この用語が本明細書中で使用される場合は、そのアミノ酸配列に、Ｈ１の特徴であり、そして他のＨＡサブタイプからＨ１を区別する少なくとも１つの配列エレメントが含まれている、ＨＡポリペプチドである。代表的なそのような配列エレメントは、例えば、図１〜３に示されるもののようなアラインメントによって決定することができ、これには例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ１特異的実施形態に関して本明細書中に記載されるものが含まれる。
【００３７】
Ｈ３ポリペプチド：「Ｈ３ポリペプチド」は、この用語が本明細書中で使用される場合は、そのアミノ酸配列に、Ｈ３の特徴であり、そして他のＨＡサブタイプからＨ３を区別する少なくとも１つの配列エレメントが含まれている、ＨＡポリペプチドである。代表的なそのような配列エレメントは、例えば、図１、２、および４に示されるようなアラインメントによって決定することができ、これには例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ３特異的実施形態に関して本明細書中に記載されるものが含まれる。
【００３８】
Ｈ５ポリペプチド：「Ｈ５ポリペプチド」は、この用語が本明細書中で使用される場合は、そのアミノ酸配列に、Ｈ５の特徴であり、そして他のＨＡサブタイプからＨ５を区別する少なくとも１つの配列エレメントが含まれている、ＨＡポリペプチドである。代表的なそのような配列エレメントは、例えば、図１、２、および５に示されるようなアラインメントによって決定することができ、これには例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ５特異的実施形態に関して本明細書中に記載されるものが含まれる。
【００３９】
ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド：本明細書中で使用される場合は、用語「ヘマグルチニンポリペプチド」（または「ＨＡポリペプチド」）は、そのアミノ酸配列に、ＨＡの少なくとも１つの特徴的な配列が含まれているポリペプチドをいう。インフルエンザ単離物に由来する多種多様なＨＡ配列が当該分野で公知である；実際、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）は、本願の出願時点で、９７９６のＨＡ配列を含むデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ｆｌｕ．ｈｔｍｌ）を保持している。当業者は、このデータベースを参照して、ＨＡポリペプチドの一般的に特徴的な配列、および／または特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６ポリペプチド）に特徴的な配列：あるいは、特定の宿主（例えば、トリ、ラクダ、イヌ、ネコ、ジャコウネコ、環境、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、ストーンマーチン、ブタ、トラ、クジラなど）の感染を媒介するＨＡに特徴的な配列を容易に同定することができる。例えば、いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチドには、インフルエンザウイルスの自然界に存在している単離物において見られるＨＡタンパク質の、約９７位と１８５位、３２４位と３４０位、９６位と１００位、および／または１
３０位〜２３０位の残基の間に見られる１つ以上の特徴的な配列エレメントが含まれる。いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチドは、本明細書中で定義されるＨＡ配列エレメント１および２のうちの少なくとも１つが含まれているアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチドは、ＨＡ配列エレメント１および２が含まれているアミノ酸配列を有しており、いくつかの実施形態においては、互いに、約１００〜２００、または約１２５〜１７５、または約１２５〜１６０、または約１２５〜１５０、または約１２９〜１３９、または約１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、もしくは１３９アミノ酸の間隔を隔てて有している。いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチドは、グリカンの結合に関与している９６位〜１００位、および／または１３０位〜２３０位の領域の中の位置に残基が含まれているアミノ酸配列を有する。例えば、多くのＨＡポリペプチドには、以下の残基のうちの１つ以上が含まれる：Ｔｙｒ９８、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３、およびＬｅｕ／Ｉｌｅ１９４。いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチドには、これらの残基のうちの少なくとも２個、３個、４個、または５個全てが含まれる。
【００４０】
単離された：用語「単離された」は、本明細書中で使用される場合は、（ｉ）最初に生産された（自然界において、または実験の設定においてかは問わない）際にそれが会合している成分のうちの少なくともいくつかから分離されているか；あるいは、（ｉｉ）人の手によって生産されたかのいずれかである薬剤または物質をいう。単離された薬剤または物質は、それらが最初に会合していた他の成分のうちの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上を分離することができる。いくつかの実施形態においては、単離された薬剤は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて純粋である。
【００４１】
長いオリゴ糖：本開示の目的のために、オリゴ糖は、通常、これが少なくとも４個の糖残基を有している少なくとも１つの直鎖を含む場合に「長い」と見なされる。
【００４２】
自然界には存在しないアミノ酸：表現「自然界には存在しないアミノ酸」は、アミノ酸の化学構造（すなわち：
【００４３】
【化１】
2010500880.tif 000001
を有しており、したがって、少なくとも２つのペプチド結合に関与することができるが、自然界において見られるものとは異なるＲ基を有している物質をいう。いくつかの実施形態においては、自然界には存在しないアミノ酸はまた、水素ではない第２のＲ基を有する場合もあり、そして／また、アミノ酸部分またはカルボン酸部分の上に１つ以上の他の置換を有する場合もある。
【００４４】
ポリペプチド：「ポリペプチド」は、一般的に言うと、ペプチド結合によって互いに結合させられた少なくとも２個のアミノ酸の並びである。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、少なくとも３〜５個のアミノ酸が含まれ得、これらのアミノ酸はそれぞれ、少なくとも１つのペプチド結合によって互いに結合される。当業者は、ポリペプチドに、それでもなおポリペプチド鎖に組み込むことができる「自然界には存在しない」アミノ酸または他の物質が任意に含まれる場合がしばしばあることを理解するであろう。
【００４５】
純粋：本明細書中で使用される場合は、薬剤または物質は、それに他の成分が実質的に
含まれていない場合には「純粋」である。例えば、特定の薬剤または物質が９０％より多くを占めている調製物は、通常、純粋な調製物とみなされる。いくつかの実施形態においては、薬剤または物質は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋である。
【００４６】
短いオリゴ糖：本開示の目的のために、オリゴ糖は、通常、任意の直鎖の中に４個未満、または確実には、３個未満の残基を有している場合には、「短い」と見なされる。
【００４７】
特異性：当該分野で公知であるように、「特異性」は、その結合パートナー（例えば、ヒトＨＡ受容体、および具体的には、ヒト上気道ＨＡ受容体）を他の可能性のある結合パートナー（例えば、トリＨＡ受容体）から区別する、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）の能力の尺度である。
【００４８】
治療薬：本明細書中で使用される場合は、表現「治療薬」は、所望される生物学的または薬理学的作用を誘発する任意の薬剤をいう。
【００４９】
処置：本明細書中で使用される場合は、用語「処置」は、疾患、障害、もしくは症状の１つ以上の症候または状況を緩和する、その発症を遅らせる、その重篤度または発生を軽減する、あるいはその予防を行うために使用される任意の方法をいう。本発明の目的のために、処置は、症候の発症の前、発症の間、および／または発症後に投与することができる。
【００５０】
アンブレラトポロジー：表現「アンブレラトポロジー」は、本明細書中では、特定のグリカンによって、特にＨＡ受容体上のグリカンによって採用される３次元配置をいうために使用される。本発明には、アンブレラトポロジーグリカンに対する結合が、ヒト宿主の感染を媒介するＨＡタンパク質の特徴であることの認識が含まれる。図６に示されるように、アンブレラトポロジーは、通常、α２−６シアリル化グリカンだけによって採用され、そして通常は長い（例えば、４糖よりも長い）オリゴ糖である。アンブレラトポロジーの一例は、およそ−６０の、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のφ角によって与えられる（例えば、図１４を参照のこと）。図９は、アンブレラトポロジーを採用するグリカンの特定の代表的な（包括的ではない）例を示す。
【００５１】
ワクチン接種：本明細書中で使用される場合は、用語「ワクチン接種」は、（例えば、疾患の原因となる物質に対する）免疫応答を生じさせることが意図される組成物の投与をいう。本発明の目的のために、ワクチン接種は、疾患の原因となる物質への暴露の前に、その間に、および／またはその後に投与することができ、特定の実施形態においては、物質への暴露の前、間、および／または直後に投与することができる。いくつかの実施形態においては、ワクチン接種には、適切な時間の間隔をあけた、ワクチン組成物の複数回の投与が含まれる。
【００５２】
変異体：本明細書中で使用される場合は、用語「変異体」は、その配列が比較される特定の目的のＨＡポリペプチドと「もとの」ＨＡポリペプチドとの間での関係を表す相対的な用語である。目的のＨＡポリペプチドは、目的のＨＡポリペプチドが、もとのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有しているが、特定の位置に少数の配列変化を有している場合に、もとのＨＡポリペプチドの「変異体」であると見なされる。通常は、変異体の残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満が、もとの残基と比較して置換される。いくつかの実施形態においては、変異体は、もとの残基と比較して、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個の置換された残基を有する。多くの場合は、変異体は、極めて少ない数（例えば、５個、４個、３個、２個、または１個未満）の置換された機能的残基（すなわち、特定の生
物学的活性に関与している残基）を有する。さらに、変異体は、通常、もとの残基と比較して、５個、４個、３個、２個、もしくは１個以下の付加または欠失を有し、そして多くの場合には、付加または欠失は有さない。さらに、任意の付加または欠失は、通常、約２５個、２０個、１９個、１８１個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１０個、９個、８個、７個、６個未満であり、そして一般的には、約５個、４個、３個、または２個未満の残基である。いくつかの実施形態においては、もとのＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの自然界に存在している単離物（例えば、野生型ＨＡ）において見られるものである。
【００５３】
ベクター：本明細書中で使用される場合は、「ベクター」は、それに対して連結させられた別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。いくつかの実施形態においては、ベクターは、それに連結させられた核酸を、宿主細胞（例えば、真核生物細胞または原核生物細胞）の中で染色体外で複製および／または発現させることができる。動作可能に連結させられた遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書中では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００５４】
野生型：当該分野で理解されているように、表現「野生型」は、一般的には、自然界において見られるタンパク質または核酸の通常の形態をいう。例えば、野生型ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの自然界に存在している単離物において見られる。多種多様な野生型ＨＡ配列を、ＮＣＢＩのインフルエンザウイルス配列のデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ．において見ることができる。
【００５５】
本発明により、アンブレラトポロジーグリカンに結合するＨＡポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態においては、本発明により、特定の標的種のＨＡ受容体上に見られるアンブレラトポロジーグリカンに結合するＨＡポリペプチドが提供される。例えば、いくつかの実施形態においては、本発明により、ヒトＨＡ受容体（例えば、ヒト上皮細胞上に見られるＨＡ受容体）上に見られるアンブレラトポロジーグリカンに結合するＨＡポリペプチドが提供され、具体的には、上気道の中のヒトＨＡ受容体上に見られるアンブレラトポロジーグリカンに結合するＨＡポリペプチドが提供される。
【００５６】
本発明により、ヒトの上気道の中の細胞上で見られるＨＡ受容体に結合するＨＡポリペプチドが提供され、具体的には、指定された親和性および／または特異性でそのような受容体（および／またはそれらのグリカン、特に、それらのアンブレラグリカン）に結合するＨＡポリペプチドが提供される。
【００５７】
本発明には、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、長いａ２−６シアリル化グリカン）に結合する能力、特に、高い親和性で結合する能力の獲得が、ヒトに感染する能力をＨＡポリペプチド変異体に付与することができる（そのもとのＨＡポリペプチドがヒトに感染できない場合）ことの認識が含まれる。いずれの特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明者らは、アンブレラトポロジーグリカンへの結合が最重要であり得ること、特に、他のタイプのグリカンへの結合の消滅は必要ない可能性があることを提起した。
【００５８】
本発明によってはさらに、本発明のＨＡポリペプチドを伴う様々な試薬と方法が提供され、これには例えば、それらを同定するためのシステム、それらを調製するためのストラテジー、それらに結合する抗体、ならびに、それらに関連する様々な診断および治療方法が含まれる。本発明のこれらの態様および他の態様の特定の実施形態についてのさらなる説明を以下に示す。
【００５９】
ヘマグルチニン（ＨＡ）
インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスであり、これは、ウイルス粒子の膜の中に埋め込まれている２つの糖タンパク質（ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む、脂質膜エンベロープを特徴とする。１６種類の公知のＨＡサブタイプと、９種類のＮＡサブタイプが存在しており、様々なインフルエンザ株は、その株のＨＡとＮＡサブタイプの番号に基づいて命名される。アミノ酸の配列同一性と結晶構造の比較に基づいて、ＨＡサブタイプは２つの主要なグループと、４つのさらに小さいクレードに分類されている。様々なＨＡサブタイプは、必ずしも強いアミノ酸配列同一性を共有していないが、様々なＨＡサブタイプの全体的な３Ｄ構造は互いに類似しており、分類の目的のために使用することができるいくつかのわずかな差を有する。例えば、中心のα−ヘリックスに関して膜の遠位サブドメインの特定の方向が、ＨＡサブタイプを決定するために一般的に使用される１つの構造上の特徴である（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：２８７，２００４）。
【００６０】
ＨＡは、Ｈ１〜Ｈ１６と呼ばれる、１６種類のサブタイプのうちの１つのホモ３量体として膜の中に存在する。これまでのところ、これらのサブタイプのうちの３種類（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）だけが、ヒトへの感染に適応できた。ヒトに感染するように適応したＨＡ（例えば、世界的大流行となったＨ１Ｎ１（１９１８）およびＨ３Ｎ２（１９６７〜６８）インフルエンザサブタイプに由来するＨＡ）について報告されている１つの特徴は、α２−３シアリル化グリカンに優先的に結合するそれらのトリの先祖と比較した、α２−６シアリル化グリカンに優先的に結合するそれらの能力である（Ｓｋｅｈｅｌ  ＆  Ｗｉｌｅｙ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，６９：５３１，２０００；Ｒｏｇｅｒｓ，＆  Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１２７：３６１，１９８３；Ｒｏｇｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３０４：７６，１９８３；Ｓａｕｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：９６０９，１９９２；Ｃｏｎｎｏｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０５：１７，１９９４；Ｔｕｍｐｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０：７７，２００５）。しかし、本発明には、ヒト宿主に感染する能力が、特定の結合のグリカンに対する結合とより少なく、特定のトポロジーのグリカンに対する結合とより多く相関関係にあるとの認識が含まれる。したがって、本発明は、ヒトへの感染を媒介するＨＡがアンブレラトポロジーグリカンに対して結合し、多くの場合には、コーントポロジーグリカンを上回ってアンブレラトポロジーグリカンに対して優先性を示すことを明らかに示す（コーントポロジーグリカンはα２−６シアリル化グリカンであり得るにもかかわらず）。
【００６１】
（α２−３とα２−６結合の両方の）シアリル化オリゴ糖に結合した、Ｈ１（ヒトおよびブタ）、Ｈ３（トリ）、およびＨ５（トリ）サブタイプに由来するＨＡのいくつかの結晶構造を利用することができ、これらは、これらのグリカンとのＨＡの異なる相互作用に関与している特異的なアミノ酸についての分子的洞察を提供する（Ｅｉｓｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２３２：１９，１９９７；Ｈａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ，９８：１１１８１，２００１；Ｈａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３０９：２０９，２００３；Ｇａｍｂｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１８３８，２００４；Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１８６６，２００４；Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  ２３：８５，２００６；Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１２：４０４，２００６）。
【００６２】
例えば、Ｈ５（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／３／９７）単独、あるいは、α２−３またはα２−６シアリル化オリゴ糖に結合したＨ５の結晶構造により、結合したグリカンと直接相互作用する特定のアミノ酸が同定され、また、１以上の分離度で取り出されたアミノ酸も同定された（Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１１１８１，２００１）。いくつかの場合には、これらの残基の立体構造は、結合した状態と結合していない状態で異なる。例えば、Ｇｌｕ１９０、Ｌｙｓ１９３
、およびＧｌｎ２２６は全て、直接結合相互作用に関与しており、結合した状態と結合していない状態で異なる立体構造を有する。Ａｓｎ１８６の立体構造（これは、Ｇｌｕ１９０に対して近位にある）もまた、結合した状態と結合していない状態で有意に異なる。
【００６３】
本発明のＨＡポリペプチドの結合特性
上記のように、本発明には、アンブレラトポロジーグリカンに対する結合が、特定の宿主（例えば、ヒトを含む）の感染を媒介する能力と相関関係があるとの知見が含まれる。したがって、本発明により、アンブレラグリカンに結合するＨＡポリペプチドが提供される。特定の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、アンブレラグリカンに対して高い親和性で結合する。特定の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、複数の様々なアンブレラトポロジーグリカンに対して、多くの場合には、高い親和性および／または特異性で結合する。
【００６４】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、アンブレラトポロジーグリカン（例えば、長いα２−６シアリル化グリカン、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−）に対して高い親和性で結合する。例えば、いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、アンブレラトポロジーグリカンに対して、ヒトへの感染を媒介する野生型ＨＡ（例えば、Ｈ１Ｎ１  ＨＡまたはＨ３Ｎ２  ＨＡ）について観察された親和性に匹敵する親和性で結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、アンブレラグリカンに対して、ヒトへの感染を媒介する野生型ＨＡについて比較できる条件下で観察された親和性の、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の親和性で結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、アンブレラグリカンに対して、ヒトへの感染を媒介する野生型ＨＡについて比較できる条件下で観察された親和性よりも大きい親和性で結合する。
【００６５】
特定の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドの結合親和性は、濃度の範囲にわたって評価される。そのようなストラテジーにより、特に、多価結合アッセイにおいて、１つの濃度での分析よりも有意なさらなる情報が提供される。いくつかの実施形態においては、例えば、本発明のＨＡポリペプチドの結合親和性は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の倍率の濃度範囲にわたって評価される。
【００６６】
特定の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、それらが、本明細書中に記載されるアッセイのような多価グリカンアレイ結合アッセイにおいて飽和シグナルを示す場合には、高い親和性を示す。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、これらが、そのような実験において約４０００００を上回る、またはそれ以上（例えば、約５０００００、６０００００、７０００００、８０００００を上回るなど）のシグナルを示す場合には、高い親和性を示す。いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチドは、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上の濃度範囲にわたり、アンブレラグリカンに対して飽和結合を示し、そしていくつかの実施形態においては、１０倍またはそれ以上の規模の濃度範囲でアンブレラグリカンに対して飽和結合を示す。
【００６７】
さらに、いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、アンブレラトポロジーグリカンに対して、それらがコーントポロジーグリカンに対して結合するよりも強く結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、アンブレラグリカン対コーングリカンについて約１０、９、８、７、６、５、４、３、または２である相対的親和性を示す。
【００６８】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、α２−６シアリル化グ
リカンに結合する；いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、α２−６シアリル化グリカンに優先的に結合する。特定の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、複数の様々なα２−６シアリル化グリカンに結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、α２−３シアリル化グリカンには結合できず、他の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、α２−３シアリル化グリカンに結合できる。
【００６９】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、ヒトの上気道上皮細胞上に見られる受容体に結合する。特定の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、気管支および／または気管の中のＨＡ受容体に結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、肺深部の受容体には結合できず、他の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、肺深部の受容体に結合できる。
【００７０】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、ヒトの上気道組織（例えば、上皮細胞）の中のＨＡ受容体上に見られるグリカンのうち、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上に結合する。
【００７１】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、図９に示されるグリカンのうちの１つ以上に結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、図９に示される複数のグリカンに結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、図９に示されるグリカンに対して、高い親和性および／または特異性で結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、図９に示されるグリカンに対して、図８に示されるグリカンに対するそれらの結合と比較して、優先的に結合する。
【００７２】
本発明により、指定された結合特異性を有している単離されたＨＡポリペプチドが提供され、アンブレラグリカンに関して指定された結合特性を有している操作されたＨＡポリペプチドもまた提供される。
【００７３】
いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ１ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ２ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ３ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ４ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ５ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ６ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ７ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ８ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ１０ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ１１ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ１２ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ１３ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有し
ている本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ１４ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ１５ポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ１６ポリペプチドである。
【００７４】
いくつかの実施形態においては、指定された結合特性を有している本発明のＨＡポリペプチドは、Ｈ１ポリペプチドではなく、Ｈ２ポリペプチドではなく、そして／またはＨ３ポリペプチドではない。
【００７５】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドには、以下の株のいずれに由来するＨ１タンパク質も含まれない：Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９８６；Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／１９９５；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／９２／１９９６；Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６。
【００７６】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、１９５７〜５８のアジアで大流行したインフルエンザウイルスの株のいずれに由来するＨ２タンパク質でもない。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドには、以下の株のいずれに由来するＨ２タンパク質も含まれない：Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５＋／１９５７；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６４；Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／１９６７。
【００７７】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドには、以下の株のいずれに由来するＨ３タンパク質も含まれない：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８；Ａ／Ｐｈｉｌｌｉｐｉｎｅｓ／２／１９８２；Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１／１９８５；Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／３６０／１９８６；Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／２／１９８７；Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／１９８７；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／１９８９；Ａ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／９／１９９３；Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／１９９４；Ａ／Ｎａｎｃｈａｎｇ／８１３／１９９５；Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／１９９７；Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９；Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９；Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３；Ａ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／３２３／２００３；Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４；Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６５／２００５。
【００７８】
変異体ＨＡポリペプチド
特定の実施形態においては、ＨＡポリペプチドは、そのアミノ酸配列はもとのＨＡのアミノ酸配列と同一であるが、少数の特定の配列変化を有している、もとのＨＡポリペプチドの変異体である。いくつかの実施形態においては、もとのＨＡは、インフルエンザウイルスの自然界に存在している単離物（例えば、野生型ＨＡポリペプチド）の中に見られるＨＡポリペプチドである。
【００７９】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体は、それらの対応するもとのＨＡポリペプチドとは異なるグリカン結合特性を有する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡ変異体ポリペプチドは、それらの同種のもとのＨＡポリペプチドよりも、（例えば、コーングリカンに対する親和性および／または特異性と比較して）アンブレラグリカンに対して大きな親和性および／または特異性を有する。特定の実施形態においては、そのようなＨＡポリペプチド変異体は操作された変異体である。
【００８０】
いくつかの実施形態においては、グリカン結合特性が変化したＨＡポリペプチド変異体は、グリカン結合部位の中の残基に、またはグリカン結合部位に影響を与える残基に配列
変化を有する。いくつかの実施形態においては、そのような置換は、結合したグリカンと直接相互作用するアミノ酸の置換である；他の実施形態においては、そのような置換は、結合したグリカンと相互作用するものから１分離度で取り出されたアミノ酸の置換である。ここで、１分離度で取り出されたアミノ酸は：（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；（２）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、グリカン自体とは直接は相互作用しない；または、（３）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与え、また、グリカン自体とも直接相互作用するかのいずれかである。本発明のＨＡポリペプチド変異体には、１つ以上の直接結合するアミノ酸の置換、１つ以上の１分離度のアミノ酸（ｆｉｒｓｔ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）の置換、１つ以上の２分離度のアミノ酸（ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）の置換、あるいは、これらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体には、なおさらに高い分離度を有している１つ以上のアミノ酸の置換が含まれる場合がある。
【００８１】
いくつかの実施形態においては、グリカン結合特性が変化したＨＡポリペプチド変異体は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの域を超えて糖と接触する残基に配列変化を有する（例えば、図７を参照のこと）。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。特定の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体は、同種の野生型のもとのＨＡと比較して、少なくとも２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸置換を有する；いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体は、２個、３個、または４個のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態においては、全てのそのようなアミノ酸置換は、グリカン結合部位の中に配置される。
【００８３】
いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体は、１３７位、１４５位、１５６位、１５９位、１８６位、１８７位、１８９位、１９０位、１９２位、１９３位、１９６位、２２２位、２２５位、２２６位、および２２８位の残基のうちの１つ以上に対応する位置に配列置換を有する。いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体は、１５６位、１５９位、１８９位、１９２位、１９３位、および１９６位の残基のうちの１つ以上に対応する位置；ならびに／または、１８６位、１８７位、１８９位、および１９０位の残基のうちの１つ以上に対応する位置；ならびに／または、１９０位、２２２位、２２５位、および２２６位の残基のうちの１つ以上に対応する位置；ならびに／または、１３７位、１４５位、１９０位、２２６位、および２２８位の残基のうちの１つ以上に対応する位置に、配列置換を有する。いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体は、１９０位、２２５位、２２６位、および２２８位の残基のうちの１つ以上に対応する位置に配列置換を有する。
【００８４】
特定の実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡ（例えば、Ｈ５）と比較して、９８位、１３６位、１３８位、１５３位、１５５位、１５９位、１８３位、１８６位、１８７位、１９０位、１９３位、１９４位、１９５位、２２２位、２２５位、２２６位、２２７位、および２２８位の残基からなる群より選択される残基に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。他の実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域の中に配置されたアミノ酸から選択される残基（９８位、１３６位、１５３位、１５５位、１８３位、１９０位、１９３位、１９４位、２２２位、２２５位、２２６位、２２７位、および２２８位の残基を含むがこれらに限定されない）に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態においては、Ｈ
Ａポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して配置されているアミノ酸から選択される残基（９８位、１３８位、１８６位、１８７位、１９５位、および２２８位の残基を含むがこれらに限定されない）に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【００８５】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、１３８位、１８６位、１８７位、１９０位、１９３位、２２２位、２２５位、２２６位、２２７位、および２２８位の残基からなる群より選択される残基に１つ以上のアミノ酸置換を有する。他の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域の中に配置されたアミノ酸から選択される残基（１９０位、１９３位、２２２位、２２５位、２２６位、２２７位、および２２８位の残基を含むがこれらに限定されない）に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して配置されているアミノ酸から選択される残基（１３８位、１８６位、１８７位、および２２８位の残基を含むがこれらに限定されない）に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【００８６】
さらなる実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、９８位、１３６位、１５３位、１５５位、１８３位、１９４位、および１９５位の残基からなる群より選択される残基に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。他の実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に配置されているアミノ酸から選択される残基（９８位、１３６位、１５３位、１５５位、１８３位、および１９４位の残基を含むがこれらに限定されない）に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して配置されているアミノ酸から選択される残基（９８位および１９５位の残基を含むがこれらに限定されない）に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【００８７】
特定の実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、結合したグリカンと相互作用するものから１分離度で取り出されたアミノ酸から選択される残基（９８位、１３８位、１８６位、１８７位、１９５位、および２２８位の残基を含むがこれらに限定されない）に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。ここで、１分離度で取り出されたアミノ酸は、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；（２）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、グリカン自体とは直接は相互作用しない；または、（３）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与え、またグリカン自体とも直接相互作用するかのいずれかである。
【００８８】
さらなる実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、結合したグリカンと相互作用するものから１分離度で取り出されたアミノ酸から選択される残基（１３８位、１８６位、１８７位、および２２８位の残基を含むがこれらに限定されない）に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。ここで、１分離度で取り出されたアミノ酸は、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；（２）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、グリカン自体とは直接は相互作用しない；または、（３）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与え、またグリカン自体とも直接相互作用するかのいずれかである。
【００８９】
さらなる実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、結合したグリカンと相互作用するものから１分離度で取り出されたアミノ酸から選択される残基（９８位および１９５位の残基を含むがこれらに限定されない）に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。ここで、１分離度で取り出されたアミノ酸は、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；（２）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、グリカン自体とは直接は相互作用しない；または、（３）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与え、またグリカン自体とも直接相互作用するかのいずれかである。
【００９０】
特定の実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、１５９位の残基にアミノ酸置換を有する。
【００９１】
他の実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、１９０位、１９３位、２２５位、および２２６位から選択される残基に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５ポリペプチド変異体は、野生型のもとのＨＡと比較して、１９０位、１９３位、２２６位、および２２８位から選択される残基に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【００９２】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５変異体は、以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を有する：Ｓｅｒ１３７Ａｌａ、Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９０Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｇｌｎ２２６Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｎ２２６Ｖａｌ、Ｓｅｒ２２７Ａｌａ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ。
【００９３】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５変異体は、以下のアミノ酸置換のセットのうちの１つ以上を有する：
Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、およびＧｌｎ２２６Ｌｅｕ；
Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、およびＧｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１３７Ａｌａ、Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ｇｌｕ１９０Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｓｅｒ２２７Ａｌａ。いくつかのそのような実施形態においては、ＨＡポリペプチドは、野生型ＨＡと比較して少なくとも１つのさらなる置換を有しており、その結果、アンブレラグリカンに対する変異体の親和性および／または特異性が高まる。
【００９４】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド（ＨＡポリペプチド変異体を含む）は、Ｄ１９０、Ｄ２２５、Ｌ２２６、および／またはＳ２２８を含む配列を有する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、Ｄ１９０とＤ２２５を含む配列を有する；いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、Ｌ２２６とＳ２２８を含む配列を有する。
【００９５】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体は、もとのＨＡと、特にもとの野生型ＨＡと比較して、開いた結合部位を有する。
【００９６】
ＨＡポリペプチドの一部または断片
本発明によりさらに、本発明のＨＡポリペプチドの特徴的な部分と、それらをコードする核酸が提供される。一般的には、特徴的な部分は、いずれもＨＡポリペプチドの特徴である、アミノ酸の連続するストレッチ、またはアミノ酸の連続するストレッチのコレクションを含むものである。それぞれのそのような連続するストレッチには、一般的には、少なくとも２つのアミノ酸が含まれるであろう。さらに、通常、少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上のアミノ酸が、Ｈ５  ＨＡポリペプチドの特徴であるために必要であることは、当業者に明らかであろう。一般的には、特徴的な部分は、上記の配列同一性に加えて、関連する完全なＨＡポリペプチドと少なくとも１つの機能的特長を共有するものである。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドの特徴的な部分は、関連する全長のＨＡポリペプチドとグリカン結合特性を共有する。
【００９７】
ＨＡポリペプチドの生産
本発明のＨＡポリペプチド、および／またはその特徴的な部分、あるいはそれらをコードする核酸は、任意の利用可能な手段によって生産することができる。
【００９８】
本発明のＨＡポリペプチド（または、特徴的な部分）は、例えば、本発明のＨＡ−ポリペプチドをコードする核酸を発現するように操作された宿主細胞システムを利用することによって生産することができる。
【００９９】
卵、バキュロウイルス、植物、酵母、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ（ＭＤＣＫ））、またはＶｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）細胞のような任意のシステムを、ＨＡポリペプチド（または特徴的な部分）を生産するために使用することができる。あるいは、または加えて、ＨＡポリペプチド（または特徴的な部分）は、組み換え技術を使用して、例えば、発現ベクターの使用を通じて、細胞の中で発現させることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
【０１００】
あるいは、または加えて、本発明のＨＡポリペプチド（またはその特徴的な部分）は、合成手段によって生産することができる。
【０１０１】
あるいは、または加えて、本発明のＨＡポリペプチド（またはその特徴的な部分）は、完全なウイルスの（そうでなければ、野生型であるか、弱毒化されているか、死滅させられたかなどは問わず）状況において生産され得る。本発明のＨＡポリペプチド、またはその特徴的な部分はまた、ウイルス様粒子の状況においても生産される場合がある。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、ＨＡポリペプチド（またはその特徴的な部分）は、インフルエンザウイルスから単離され得、そして／または精製され得る。例えば、ウイルスは、卵（例えば、孵化鶏卵）の中で増殖させることができる。この場合、回収された材料は、通常は、尿膜腔液である。あるいは、または加えて、インフルエンザウイルスは、ウイルスを増殖させるために組織培養を使用する任意の方法によって導くことができる。ウイルスを増殖させるための適切な細胞基質としては、例えば、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、またはＭＤＣＫのクローン由来の細胞、ＭＤＣＫ様細胞）、サル腎臓細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞を含むＡＧＭＫ細胞）、無限継代細胞株としての培養された上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、あるいは、商用供給業者（例えば、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）から容易に入手することができる、ワクチン目的のためのインフルエンザの生産に適している任意の他の哺乳動物細胞のタイプが挙げられる。適切な細胞基質にはまた、ＭＲＣ−５細胞のようなヒト細胞も含まれる。適切な細胞基質は細胞株に限定されない；例えば、ニワトリの胚線維芽細胞のような初代細胞もまた含まれる。
【０１０３】
また、本明細書中に記載されるＨＡポリペプチド、特に変異体ＨＡポリペプチドを、アンブレラトポロジーグリカンに結合することができるＨＡポリペプチドのスクリーニングおよび／または選択を容易にすることができる条件下で、ＨＡ（単独であるか、または複合体の一部としてであるかは問わず、ウイルス粒子もしくはウイルスの一部としてを含む）を生産する細胞または有機体を培養することによって、作成、同定、単離、および／または生産することができることも、当業者に明らかであろう。一例ではあるが例を挙げると、いくつかの実施形態において、アンブレラトポロジーグリカンに対して（例えば、特定の特異性および／または親和性で）結合するそのような変異体を明らかにする、そして／またはそのような変異体に好ましい条件下で、ＨＡ変異体のコレクションを生産および／または実験することが、有用であり得る。いくつかの実施形態においては、そのようなＨＡ変異体のコレクションは、自然界での進化によって生じる。いくつかの実施形態においては、そのようなＨＡ変異体のコレクションは操作によって生じる。いくつかの実施形態においては、ＨＡ変異体のそのようなコレクションは、操作と自然界での進化の組み合わせによって生じる。
【０１０４】
ＨＡ受容体
ＨＡは、糖タンパク質受容体に結合することによって細胞の表面と相互作用する。ＨＡ受容体に対するＨＡの結合は、ＨＡ受容体上のＮ結合グリカンによって主に媒介される。具体的には、インフルエンザウイルス粒子の表面上のＨＡが、細胞性宿主の表面上のＨＡ受容体と会合するシアリル化グリカンを認識する。認識および結合の後、宿主細胞は、ウイルス細胞を包み込み、ウイルスは複製して、近隣の細胞に対して分配されるさらに多くのウイルス粒子を生産することができる。
【０１０５】
ＨＡ受容体は、受容体のＨＡ結合部位の近くにある、α２−３またはα２−６シアリル化グリカンのいずれかによって修飾され、受容体に結合したグリカンの結合のタイプは、受容体のＨＡ結合部位の立体構造に影響を与え、それにより、様々なＨＡに対する受容体
の特異性に影響を与える。
【０１０６】
例えば、トリＨＡのグリカン結合ポケットは狭い。本発明にしたがうと、このポケットはα２−３シアリル化グリカンのトランス立体構造に対して、および／またはコーントポロジーグリカンに対しては、α２−３結合しているか、またはα２−６結合しているかを問わず、結合する。
【０１０７】
トリ組織の中のＨＡ受容体、そして、ヒト深部肺および消化管（ＧＩ）組織の中のＨＡ受容体も、α２−３シアリル化グリカン結合を特徴とし、さらに、（本発明にしたがって）コーントポロジーを主に採用するグリカン（α２−３シアリル化グリカン、および／またはα２−６シアリル化グリカンを含む）を特徴とする。
【０１０８】
対照的に、上気道の気管支および気管の中のヒトＨＡ受容体は、α２−６シアリル化グリカンによって修飾される。α２−３モチーフとは異なり、α２−６モチーフは、Ｃ６〜Ｃ５結合が原因で、さらなる立体構造の自由度を有する（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  ２３：８５，２００６）。そのようなα２−６シアリル化グリカンに結合するＨＡは、この立体構造の自由度によって生じる構造の多様性に順応するための、さらなる開いた結合ポケットを有する。さらに、本発明にしたがうと、ＨＡは、アンブレラトポロジー中のグリカン（例えば、α２−６シアリル化グリカン）に結合する必要があり得、特に、ヒトの上気道組織の感染を効率的に媒介するためには、強い親和性および／または特異性で、そのようなアンブレラトポロジーグリカンに結合する必要があり得る。
【０１０９】
これらの空間的拘束にされたグリコシル化プロフィールの結果として、ヒトは、通常は、多くの野生型のトリＨＡ（例えば、トリＨ５）を含むウイルスには感染しない。具体的には、ウイルスに遭遇する可能性がもっとも高いヒトの呼吸管の部分（すなわち、気管および気管支）には、コーングリカン（例えば、α２−３シアリル化グリカン、および／または短いグリカン）を有している受容体はなく、そして野生型のトリＨＡは、通常は、コーングリカン（例えば、α２−３シアリル化グリカン、および／または短いグリカン）と会合した受容体に対して主に、またはそれだけに結合するので、ヒトは、トリウイルスには滅多に感染しなくなっている。アンブレラグリカン（例えば、長いα２−６シアリル化グリカン）を有しているウイルスと深部肺および／または消化管受容体に接近することができるほど十分に近く接触した場合にのみ、ヒトの感染が起こる。
【０１１０】
グリカンアレイ
既知の特異的なグリカン−グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）相互作用についての現在の知識を迅速に拡大するために、国際的な共同研究を主導しているＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ
ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ；ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ）は、新しいグリカンリガンド特異性についてのＧＢＰの高スループットのスクリーニングを可能にするいくつかのグリカン構造が含まれているグリカンアレイを開発した。これらのグリカンアレイには、１価のグリカンモチーフと多価のグリカンモチーフの両方が含まれ（すなわち、ポリアクリルアミド骨格に結合させられ）、そしてそれぞれのアレイには、低濃度（１０ｕＭ）と高濃度（１００ｕＭ）で２６４種類のグリカンが、それぞれの濃度について６スポット含まれる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ５．ｓｈｔｍｌを参照のこと）。
【０１１１】
アレイには、Ｎ結合グリカンとＯ結合グリカンの生理的多様性をとらえる合成のグリカンが主に含まれる。合成のグリカンに加えて、様々な哺乳動物の糖タンパク質に由来するＮ結合グリカン混合物もまた、アレイ上に提示される。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合は、グリカン「アレイ」は、任意に固体支持体上に固定された、１つ以上のグリカンのセットをいう。いくつかの実施形態においては、「アレイ」は、空間において物理的に分けられた２つ以上の位置に、整理された配置またはパターンとして存在するグリカンのコレクションである。通常、グリカンアレイは、少なくとも４、８、１６、２４、４８、９６、または数百もしくは数千の分離された位置を有するであろう。一般的には、本発明のグリカンアレイは、任意のさまざまな形式を有し得る。生体分子に適応することができる様々な異なるアレイ形式は当該分野で公知である。例えば、膨大な数のタンパク質および／または核酸アレイが周知である。当業者は、本発明のグリカンアレイに適している標準的なアレイ形式をすぐに理解するであろう。
【０１１３】
いくつかの実施形態においては、本発明のグリカンアレイは、「マイクロアレイ」形式で存在する。マイクロアレイは、通常、５０〜２００ミクロン、またはそれ未満の距離で隔てられている試料位置を有し得、ナノからマイクロモルの範囲、もしくはナノからピコグラムの範囲の試料が固定される。当該分野で公知のアレイ形式としては、例えば、それぞれの分離された試料位置が例えば１０ミクロンの大きさを有しているアレイ形式が挙げられる。
【０１１４】
いくつかの実施形態においては、本発明のグリカンアレイには、支持体上に間隔をあけて固定された複数のグリカンが含まれる。本発明により、支持体上に整列させられたグリカン分子が提供される。本明細書中で使用される場合は、「支持体」は、グリカン分子を整列させるために使用されるに適している任意の材料をいう。当業者に明らかであろうように、任意の多種多様な材料が使用され得る。いくつかではあるが例を挙げると、本発明において使用され得る支持体材料としては、疎水性膜、例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロン膜が挙げられる。そのような膜は当該分野で周知であり、そして、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫから入手することができる。
【０１１５】
さらなる実施形態においては、その上にグリカンが整列させられる支持体には金属酸化物が含まれ得る。適切な金属酸化物としては、酸化チタン、酸化タンタル、および酸化アルミニウムが挙げられるがこれらに限定されない。そのような材料の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ，Ｆａｎｃｙ  Ｒｏａｄ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ．ＢＨ１２  ４ＱＨ  ＵＫから入手することができる。
【０１１６】
なおさらなる実施形態においては、そのような支持体は金属酸化物ゲルであるか、またはそのような支持体に金属酸化物ゲルが含まれる。金属酸化物ゲルは、炭水化物が含まれている分子の固定を助けるために、所定の巨視的な領域の中に大きな表面積を提供すると考えられる。
【０１１７】
本発明にしたがって使用され得るさらに別の、または代わりの支持体材料としては、ゲル、例えば、シリカゲルまたは酸化アルミニウムゲルが挙げられる。そのような材料の例は、例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手することができる。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態においては、グリカンアレイは、通常の使用の間の大きさまたは形状の変化に耐えられる支持体上に固定される。例えば、支持体は、グリカンを整列させるために使用されるに適している成分材料でコーティングされたガラススライドであり得る。また、一部の複合材料は、支持体に所望される硬さをもたらすことができる。
【０１１９】
本明細書中に示されるように、本発明のアレイは、様々なＨＡポリペプチドとそれらの
結合特性の同定および／または特性決定に有用である。特定の実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチドは、アンブレラトポロジーグリカンに対して（例えば、α２−６シアリル化グリカンに対して、特にアンブレラトポロジーで配置された長いα２−６シアリル化グリカンに対して）結合するそれらの能力を評価するために、そのようなアレイ上で試験される。
【０１２０】
実際、本発明により、α２−６シアリル化グリカン、そして任意に、α２−３シアリル化グリカンのアレイが提供される。これは、ＨＡポリペプチドの結合能力を特性決定するために、そして／または、例えば、ヒトに結合するＨＡポリペプチドを検出するための診断薬として使用することができる。いくつかの実施形態においては、本発明のアレイには、アンブレラトポロジーのグリカン（例えば、α２−６シアリル化グリカン、特に長いα２−６シアリル化グリカン）が含まれる。当業者に明らかであろうように、そのようなアレイは、任意のＨＡポリペプチド（例えば、研究者によって設計されたそして／または調製されたものに加えて、自然界に存在しているインフルエンザ単離物において見られるものを含む）を特性決定する、あるいは検出するために有用である。
【０１２１】
いくつかの実施形態においては、そのようなアレイには、ヒトＨＡ受容体、特にヒト上気道ＨＡ受容体上に見られるグリカン（例えば、アンブレラグリカンであり、これは多くの場合は、α２−６シアリル化グリカン、特に、長いα２−６シアリル化グリカンであろう）のうちの、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上を示すグリカンが含まれる。いくつかの実施形態においては、本発明のアレイには、図１０に示されるグリカン構造のうちのいくつか、または全てが含まれる。いくつかの実施形態においては、アレイには、これらの示されたグリカンのうちの、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上が含まれる。
【０１２２】
本発明により、グリカンアレイを使用してＨＡタンパク質を同定または特性決定するための方法が提供される。いくつかの実施形態においては、例えば、そのような方法には、（１）ＨＡポリペプチドが含まれている試料を提供する工程、（２）上記試料をグリカンアレイと接触させる工程、および（３）アレイ上の１つ以上のグリカンに対するＨＡポリペプチドの結合を検出する工程が含まれる。
【０１２３】
本発明にしたがって、グリカンアレイと接触させられるＨＡポリペプチドが含まれている試料についての適切な供給源としては、病理学的試料（例えば、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変のスワブ、脳脊髄液、頸管スミア、膿試料、フードマトリックス、ならびに、脳、脾臓、および肝臓のような体の様々な部分に由来する組織）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、または加えて、ＨＡポリペプチドが含まれている試料についての他の適切な供給源としては、土壌、水、および微生物叢のような環境試料が挙げられるが、これらに限定されない。なお他の試料としては、研究室試料（例えば、研究者によって設計され、そして／または調製された操作されたＨＡポリペプチド）が挙げられる。列挙されていない他の試料もまた適切である場合がある。
【０１２４】
本発明のグリカンアレイに対するＨＡポリペプチドの結合を評価するために適している多種多様な検出システムは当該分野で公知である。例えば、ＨＡポリペプチドは、アレイとの接触の前、または後に、検出可能であるように（直接または間接的に）標識することができる；その後、結合が、局在化させられた標識の検出によって検出され得る。いくつかの実施形態においては、スキャンデバイスを、アレイ上の特定の位置を試験するために
使用することができる。
【０１２５】
あるいは、または加えて、整列させられたグリカンに対する結合は、例えば、比色、蛍光、または放射活性検出システム、あるいは、他の標識方法、あるいは、標識が必要ではない他の方法を使用して測定することができる。一般的には、蛍光の検出には、通常、蛍光分子でアレイを直接プローブすること、そして蛍光シグナルをモニターすることが含まれる。あるいは、または加えて、アレイは、間接的な蛍光の検出のために（例えば、ビオチンで）タグを付けられた分子で（この場合、蛍光標識されたストレプトアビジンの結合について試験することによって）プローブすることができる。あるいは、または加えて、蛍光の消光方法を利用することができ、ここで、整列させられたグリカンが蛍光標識され、そして試験分子（これは、別の蛍光色素分子で標識される場合も、標識されない場合もある）でプローブされる。そのような実施形態においては、アレイに対する結合は、整列させられたグリカンから放たれる蛍光を抑えるように作用し、したがって、結合は蛍光の放射の消滅によって検出される。あるいは、または加えて、整列させられたグリカンは、放射活性物質の存在下で増殖させられた生存している組織試料でプローブすることができ、放射活性で標識されたプローブを得ることができる。そのような実施形態における結合は、放射活性の放射を測定することによって検出することができる。
【０１２６】
そのような方法は、本発明のグリカンアレイに対するＨＡポリペプチドの結合の事実、および／または結合の程度を決定するために有用である。本発明のいくつかの実施形態においては、そのような方法はさらに、グリカン−ＨＡポリペプチドの相互作用を妨害するか、あるいは変化させる物質を同定および／または特性決定するために使用することができる。
【０１２７】
以下に記載される方法は、例えば、炭水化物と相互作用できると考えられる分子が実際にそうであり得るかどうかを同定することにおいて、または、分子が炭水化物と相互作用する能力を予想以上に有しているかどうかを同定するために、特に有用であり得る。
【０１２８】
本発明によってはまた、例えば、試験試料の中の特定の物質を検出するために、本発明のアレイを使用する方法も提供される。例えば、そのような方法には、（１）グリカンアレイを試験試料（例えば、ＨＡポリペプチドを含むと考えられる試料）と接触させる工程；および、（２）アレイに対する試験試料中の任意の物質の結合を検出する工程が含まれ得る。
【０１２９】
なおさらに、本発明のアレイに対する結合は、例えば、結合物質とグリカンとの間での相互作用の速度論を決定するために利用することができる。例えば、相互作用の速度論を決定するための本発明の方法には、（１）グリカンアレイを試験される分子と接触させる工程；および（２）結合物質と整列させられたグリカン（単数または複数）との間での相互作用の速度論を測定する工程が含まれ得る。
【０１３０】
結合物質の、本発明のアレイの中の任意のグリカンとの相互作用の速度論は、上記に詳述したように、例えば、比色または蛍光シグナルの実時間変化によって測定することができる。そのような方法は、例えば、特定の結合物質が、特異的な炭水化物と相互作用する異なる結合物質よりも、高い結合の程度で同じ炭水化物と相互作用することができるかどうかを決定することにおいて、特に有用であり得る。
【０１３１】
もちろん、本発明のＨＡポリペプチドによるグリカンの結合を、アレイ形式自体の中には存在しないグリカン試料または供給源について評価することができることは、明らかであろう。例えば、本発明のＨＡポリペプチドは、それらのグリカン結合特性を評価するために組織試料および／または細胞株に対して結合させることができる。適切な細胞株とし
ては、例えば、任意の様々な哺乳動物細胞株、特に、アンブレラトポロジーグリカンを含む（例えば、そのうちの少なくともいくつかが、α２−６シアリル化グリカン、特に長いα２−６シアリル化グリカンであり得る）ＨＡ受容体を発現する細胞株が挙げられる。いくつかの実施形態においては、利用される細胞株は、アンブレラトポロジーを有している個々のグリカンを発現する。いくつかの実施形態においては、利用される細胞株は、多様なグリカンを発現する。いくつかの実施形態においては、細胞株は、臨床分離株から得られる；場合によっては、これらは、所望されるグリカンの分布および／または罹患率を有するように維持されるか、または操作される。いくつかの実施形態においては、組織試料および／または細胞株は、哺乳動物の上気道上皮細胞に特徴的なグリカンを発現する。
【０１３２】
データ検索プラットフォーム
本明細書中で議論されるように、本発明にしたがって、ＨＡポリペプチドは、グリカン結合実験、構造についての情報（例えば、ＨＡの結晶構造）、および／またはタンパク質構造の予想プログラムによるデータを検索することにより、同定および／または特性決定することができる。
【０１３３】
本発明者らによって利用される（そして、本明細書中で説明される）特定のデータ検索プロセスに含まれる主要な工程は、図１１に説明される。これらの工程には、以下の３つのエレメントについての操作が含まれる：「データオブジェクト（ｄａｔａ  ｏｂｊｅｃｔｓ）」、特徴、および分類子。「データオブジェクト」は、データベースの中で保存されている生のデータである。グリカンアレイデータの場合には、単糖および結合に関するグリカン構造についての化学的な記述と、スクリーニングした様々なＧＢＰを有するそれらの結合シグナルが、データオブジェクトを構成していた。データオブジェクトの性質は「特徴」であった。特徴に基づいて得られた規則またはパターンを、データオブジェクトを記載するために選択した。「分類子」は、データオブジェクトを特異的なクラスに集めるため、あるいは、複数の特徴の間で、またはそれらの中での関係性を決定するためのいずれかに使用した規則またはパターンである。分類子は、ＧＢＰに対して高い親和性で結合するグリカンによって満たされる特異的な特徴を提供する。これらの規則には２つの種類がある：（１）結合を促進すると考えることができる、高親和性グリカンリガンドのセットについて存在する特徴、および（２）結合には好ましくないと考えることができる、高親和性グリカンリガンドの中には存在するべきではない特徴。
【０１３４】
本明細書中で利用されるデータ検索プラットフォームには、上記の操作を実行するための、互いに相互作用するソフトウェアモジュールを含めた（図１１）。特徴抽出装置（ｆｅａｔｕｒｅ  ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）は、特徴を抽出するためにＣＦＧデータベースにインターフェースで接続され、ＣＦＧによって使用されるオブジェクトベースの関係性（ｏｂｊｅｃｔ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ）データベースは、柔軟性のある特徴の定義を容易にする。
【０１３５】
特徴の抽出とデータの準備
グリカンアレイ上のグリカンから抽出された代表的な特徴が表１に列挙される。
【０１３６】
【表１Ａ】
2010500880.tif 000002
【０１３７】
【表１Ｂ】
2010500880.tif 000003
示されたこれらの特定の特徴の選択の背後にある論理的根拠は、ＧＢＰ上のグリカン結合部位が、通常は、ジ−４糖を提供することである。系図（ｔｒｅｅ）をベースとする表現を、グリカン構造中の単糖および結合（還元末端にある系図の根元）についての情報を得るために使用した。この表現により、単糖のトリプレットなどの連結されたセットのようなさらに高次の特徴を含む様々な特徴の抽出が容易になった（図１２）。データの準備には、それぞれのグリカンについて抽出された特徴（表１）とともに、グリカンアレイの中の全てのグリカンの列方向のリストを作成することを含めた。グリカンとそれらの特徴についてのこの基本の表から、サブセットを、特異的なＧＢＰ、またはＧＢＰのセットに対する結合を支配する特異的なパターンを決定するための、規則に基づく分類（以下を参照のこと）のために選択した。
【０１３８】
分類子
様々なタイプの分類子が開発されており、多くの用途において使用されている。これらは、主に以下の３つの主要なカテゴリーに分類される：数学的方法、距離的方法、および論理的方法。これらの様々な方法、およびそれらの利点と欠点は、Ｗｅｉｓｓ  ＆  Ｉｎｄｒｕｋｈｙａ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｄａｔａ  ｍｉｎｉｎｇ−Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓａｎｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９８）において詳細に議論されている。この特異的な用途のために、本発明者らは、論理的方法に含まれる、規則誘導（Ｒｕｌｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）と呼ばれる方法を選択した。規則誘導の分類子は、ＩＦ−ＴＨＥＮ規則の形態でパターンを作成する。
【０１３９】
論理的方法、具体的には、ＩＦ−ＴＨＥＮ規則を作成する規則誘導法のような分類子についての主要な利点の１つは、分類子の結果が、他の統計学的方法または数学的方法と比較した場合に、より簡単に説明できることである。これにより、発見された規則またはパターンの構造的および生物学的有意性を研究することが可能となる。先に記載された特徴（表１）を使用して作成された例示的な規則は以下である：もし（ＩＦ）Ａグリカンに、「Ｇａｌｂ４ＧｌｃＮＡｃｂ３Ｇａｌ［Ｂ］」が含まれ、「Ｆｕｃａ３ＧｌｃＮＡｃ［Ｂ］」は含まれない場合は、そのとき(THEN)グリカンはガレクチン３に対してより高い親和性で結合するであろう。この場合に使用される特異的な規則誘導アルゴリズムは、Ｗｅｉｓｓ  ＆  Ｉｎｄｕｒｋｙａ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｄａｔａ  ｍｉｎｉｎｇ−Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓａｎｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９８）によって開発されたアルゴリズムである。
【０１４０】
結合レベル
低親和性の結合と高親和性の結合を識別する閾値が、グリカンアレイスクリーニングデータセットのそれぞれについて定義された。
【０１４１】
核酸
特定の実施形態においては、本発明により、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的なもしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸が提供される。他の実施形態においては、本発明により、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的なもしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸に対して相補的である核酸が提供される。
【０１４２】
他の実施形態においては、本発明により、ＨＡポリペプチド、またはＨＡポリペプチドの特徴的なもしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸に対してハイブリダイズする核酸分子が提供される。そのような核酸は、例えば、プライマーとして、またはプローブとして使用することができる。いくつかではあるが例を挙げると、そのような核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして、ハイブリダイゼーション（インサイチュハイブリダイゼーションを含む）のためのプローブとして、そして／または、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのプライマーとして使用することができる。
【０１４３】
特定の実施形態においては、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得、一本鎖でも、また二本鎖でもあり得る。いくつかの実施形態においては、本発明の核酸には、１つ以上の自然界には存在しないヌクレオチドが含まれる場合がある；他の実施形態においては、本発明の核酸には、自然界に存在しているヌクレオチドだけが含まれる。
【０１４４】
抗体
本発明により、本発明のＨＡポリペプチドに対する抗体が提供される。これらは、モノクローナル抗体でも、また、ポリクローナル抗体であり得、当業者に公知の任意の様々な技術によって調製することができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと）。例えば、抗体は、組み換え体抗体の生産を可能にするための、細胞培養技術（モノクローナル抗体の作成を含む）によって、または、適切な細菌もしくは哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションにより生産することができる。
【０１４５】
薬学的組成物
いくつかの実施形態においては、本発明により、ＨＡポリペプチド（単数または複数）、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドもしくは核酸の特徴的なまたは生物学的に活性な断片、そのようなポリペプチドもしくは断片に結合する抗体、そのようなポリペプチドと、もしくはそれらに結合するグリカンと相互作用する低分子などが含まれている薬学的組成物が提供される。
【０１４６】
本発明には、そのような本発明の薬学的組成物の投与によるインフルエンザ感染の処置が含まれる。いくつかの実施形態においては、処置はワクチンの投与によって行われる。今日までに、インフルエンザワクチンの開発においては有意な成果が得られているが、さらなる改良の余地がある。本発明により、本発明のＨＡポリペプチドが含まれているワクチン、特にアンブレラグリカン（例えば、α２−６結合アンブレラグリカン、例えば、長いα２−６シアリル化グリカン）に結合するＨＡポリペプチドが含まれているワクチンが提供される。
【０１４７】
一例ではあるが例を挙げると、ヒトにおいて、Ｈ５Ｎ１株に特異的なワクチンを作成する試みは、一般的には、Ｈ５  ＨＡの低い免疫原性が少なくとも一部の原因であって、成功していない。１つの実験においては、Ｈ５Ｎ１株に特異的なワクチンが、１：４０の抗体力価を生じることが示されているが、これは、感染からの防御を保障するために十分に高い力価ではない。さらに、なおさらに適度な１：４０の抗体力価を生じさせるために必要な投与量（精製された死滅ウイルスまたは抗原の９０μｇの２用量）は、一般的な季節的なインフルエンザウイルスワクチンに通常使用される投与量の１２倍であった（Ｔｒｅａｎｏｒら、Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５４：１３４３，２００６）。他の実験も同様に、現在のＨ５ワクチンはそれほど免疫原性が高くないことを示していた（Ｂｒｅｓｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ，３６７：１６５７，２００６）。いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンは、低用量のＨ５  ＨＡタンパク質の使用を可能にし、そして／または高い免疫原性を得るように意図される１つ以上のストラテジー（例えば、Ｅｎｓｅｒｉｎｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：９９６，２００５を参照のこと）を利用して処方される。例えば、いくつかの実施形態においては、多価の程度が（例えば、デンドリマーの使用を通じて）改善される；いくつかの実施形態においては、１つ以上のアジュバントが利用されるなどである。
【０１４８】
いくつかの実施形態においては、本発明により、ワクチンと、ヒト対象へのこれらのワクチンの投与が提供される。特定の実施形態においては、ワクチンは、以下の１つ以上が
含まれている組成物である：（１）不活化ウイルス、（２）生の弱毒化インフルエンザウイルス、例えば、複製欠損ウイルス、（３）本発明のＨＡポリペプチド、またはその特徴的なもしくは生物学的活性な部分、（４）ＨＡポリペプチド、またはその特徴的なもしくは生物学的活性な部分をコードする核酸、（５）ＨＡポリペプチド、またはその特徴的なもしくは生物学的活性な部分をコードするＤＮＡベクター、ならびに／あるいは（６）発現システム、例えば、抗原として使用される１つ以上のインフルエンザタンパク質を発現する細胞。
【０１４９】
したがって、いくつかの実施形態においては、本発明により、不活化インフルエンザワクチンが提供される。特定の実施形態においては、不活化インフルエンザワクチンには、以下３つのタイプの抗原調製物のうちの１つが含まれる；不活化された完全なウイルス、サブビリオン（精製されたウイルス粒子が脂質エンベロープを可溶化させるための界面活性剤または他の試薬で破壊される（「分割」ワクチン））、または精製されたＨＡポリペプチド（「サブユニット」ワクチン）。特定の実施形態においては、ウイルスは、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エーテル、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０）を含むエーテル、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、デオキシコール酸ナトリウム、およびトリ（ｎ−ブチル）リン酸塩での処理によって不活化させることができる。不活化は、尿膜腔液（卵の中で生産されたウイルスに由来する）の浄化の後、または前に行うことができる；ビリオンは遠心分離によって単離し、そして精製される（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ，１９９８）。ウイルスの効力を評価するためには、一元放射免疫拡散法（ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）（ＳＲＤ）の試験を使用することができる（Ｓｃｈｉｌｄら、Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．，５２：４３−５０  ＆  ２２３−３１，１９７５；Ｍｏｓｔｏｗら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：５３１，１９７５）。
【０１５０】
本発明によってはまた、生の弱毒化インフルエンザウイルスが提供され、弱毒化のための方法は当該分野で周知である。特定の実施形態においては、弱毒化は、逆遺伝学、例えば、部位特異的突然変異誘発法の使用によって行われる。
【０１５１】
いくつかの実施形態においては、ワクチンに使用されるインフルエンザウイルスは、卵、例えば、孵化鶏卵の中で増殖させられる。この場合、回収される材料は尿膜腔液である。あるいは、または加えて、インフルエンザウイルスは、ウイルスを増殖させるために組織培養を使用する任意の方法によって誘導することができる。ウイルスを増殖させるための適切な細胞基質としては、例えば、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、またはＭＤＣＫのクローン由来の細胞、ＭＤＣＫ様細胞）、サル腎臓細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞を含むＡＧＭＫ細胞）、無限継代細胞株としての培養された上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、あるいは、商用供給業者（例えば、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）から容易に入手することができる、ワクチンの目的のためのインフルエンザの生産に適している任意の他の哺乳動物細胞のタイプ（上気道上皮細胞を含む）が挙げられる。適切な細胞基質にはまた、ＭＲＣ−５細胞のようなヒト細胞も含まれる。適切な細胞基質は細胞株に限定されない；例えば、ニワトリの胚線維芽細胞のような初代細胞もまた含まれる。
【０１５２】
いくつかの実施形態においては、本発明のワクチンには、さらに、１つ以上のアジュバントが含まれる。例えば、アルミニウム塩（Ｂａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２０：Ｓ１８，２００２）、およびモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ；Ｒｉｂｉら、（１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，
ｐ．４０７，１９８６）を、ヒトのワクチンにおいてアジュバントとして使用することができる。あるいは、または加えて、以下のような新しい化合物が、ヒトのワクチンにおいてアジュバントとして現在試験されている：ＭＦ５９（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｒｏｎ．ｃｏｍ／ｉｎｖｅｓｔｏｒｓ／ｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅｓ／２００５／０５１０２８．ｈｔｍｌ）、ＣＰＧ７９０９（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２２：３１３６，２００４）、およびサポニン、例えば、ＱＳ２１（Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２４：２２７５，２００６）。
【０１５３】
加えて、以下のようないくつかのアジュバントが、インフルエンザワクチンの免疫原性を増強させることが当該分野で公知である：ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ））ホスファゼン］（ＰＣＣＰ；Ｐａｙｎｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１６：９２，１９９８）、インターフェロン−γ（Ｃａｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１０：２３８，１９９２）、ブロックコポリマーＰ１２０５（ＣＲＬ１００５；Ｋａｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：２１７７，２０００）、インターロイキン−２（ＩＬ−２；Ｍｂｗｕｉｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ，８：３４７，１９９０）、およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ；Ｋｒｅｕｔｅｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７０：３６７，１９８１）。
【０１５４】
ワクチンに加えて、本発明により、ウイルス感染の処置に有用な他の治療用組成物が提供される。例えば、いくつかの実施形態において、処置は、本発明のＨＡポリペプチドの発現または活性を妨害する物質の投与によって行われる。例えば、処置は、抗体（例えば、特定のＨＡポリペプチド（例えば、アンブレラグリカンに結合するＨＡポリペプチド）、核酸（例えば、ＲＮＡｉに使用することができる、ＨＡ配列に相補的な核酸配列）、ＨＡ受容体に対する結合に競合するグリカン、グリカン−ＨＡポリペプチド相互作用に競合する低分子もしくは糖模倣物、またはそれらの組み合わせが含まれているウイルス粒子を認識する抗体）が含まれている組成物を用いて行うことができる。いくつかの実施形態においては、多様な構造を有している様々な薬剤のコレクションが利用される。いくつかの実施形態においては、治療用組成物には、１つ以上の多価の薬剤が含まれる。いくつかの実施形態においては、処置には、暴露または暴露の疑いの直後の緊急投与が含まれる。
【０１５５】
一般的には、薬学的組成物には、滅菌の生体適合性の担体（滅菌水、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、またはデキストロース溶液が含まれるがこれらに限定されない）のような１つ以上の不活性な物質に加えて、治療薬が含まれるであろう。あるいは、または加えて、組成物には、任意の様々な添加剤（例えば、安定剤、緩衝剤、賦形剤、または保存剤）が含まれ得る。特定の実施形態においては、薬学的組成物には、脂質小胞、生体利用可能なおよび／または生体適合性のおよび／または生体分解性のマトリックス、あるいは他の微粒子の中にカプセル化させられた、捕捉された、または結合させられた治療薬が含まれるであろう。
【０１５６】
本発明の薬学的組成物は単独で、あるいは、１つ以上の他の治療薬（ワクチンおよび／または抗体を含むがこれらに限定されない）と組み合わせて投与され得る。「と組み合わせて」によっては、複数の薬剤が同時に投与されなければならないこと、または複数の薬剤が一緒に送達されるように処方されなければならないことを暗に意味するようには意図しないが、これらの送達方法は本発明の範囲に含まれる。一般的には、それぞれの薬剤は、その薬剤について決定された投与量、および時間的スケジュールで投与されるであろう。加えて、本発明には、本発明の薬学的組成物の、それらの生体利用性を改善することができる、それらの代謝を減少させるかもしくは変化させることができる、それらの排出を阻害することができる、またはそれらの体内での分布を変化させることができる薬剤と組み合わせた送達が含まれる。本発明の薬学的組成物は、その必要がある任意の対象（例えば、任意の動物）の処置に使用できるが、これらは、ヒトの処置において使用されること
が最も好ましい。
【０１５７】
本発明の薬学的組成物は様々な経路によって投与することができ、これには、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、心室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所（粉末剤、軟膏、クリーム剤、またはドロップ剤によって）、粘膜、口腔、あるいは、経口もしくは鼻腔用のスプレーまたはエアゾールとしての投与が含まれる。一般的には、最も適切な投与経路は、薬剤の性質（例えば、消化管の環境でのその安定性）、患者の状態（例えば、患者が経口投与に耐えられるかどうか）などを含む様々な要因に応じて変化するであろう。現在は、経口もしくは鼻腔用のスプレーまたはエアゾールの経路が、肺または呼吸系に治療薬を直接送達するために最も一般的に使用される。しかし、本発明には、薬物送達技術の進歩の可能性を考慮して、任意の適切な経路による本発明の薬学的組成物の送達が含まれる。
【０１５８】
皮内への本明細書中に記載される薬学的組成物の送達に使用される適切なデバイスとしては、例えば、米国特許第４，８８６，４９９号、同第５，１９０，５２１号、同第５，３２８，４８３号、同第５，５２７，２８８号、同第４，２７０，５３７号、同第５，０１５，２３５号、同第５，１４１，４９６号、同第５，４１７，６６２号に記載されているもののような、短い針のデバイスが挙げられる。皮内用の組成物はまた、皮膚への針の有効な貫通長さを制限するデバイス（例えば、引用により本明細書中に組み入れられるＷＯ９９／３４８５０に記載されているもの）、およびその機能的等価物によって投与される場合もある。ジェット式注射デバイスもまた適切である。これは、液体用のジェット式注射器を通じて、または針（これは、角質層の孔をあけて、真皮に達する噴流を生じさせる）を通じて真皮に液体ワクチンを送達する。ジェット式注射デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、同第５，５９９，３０２号、同第５，３３４，１４４号、同第５，９９３，４１２号、同第５，６４９，９１２号、同第５，５６９，１８９号、同第５，７０４，９１１号、同第５，３８３，８５１号、同第５，８９３，３９７号、同第５，４６６，２２０号、同第５，３３９，１６３号、同第５，３１２，３３５号、同第５，５０３，６２７号、同第５，０６４，４１３号、同第５，５２０，６３９号、同第４，５９６，５５６号、同第４，７９０，８２４号、同第４，９４１，８８０号、同第４，９４０，４６０、ＷＯ９７／３７７０５、およびＷＯ９７／１３５３７に記載されている。皮膚の外層を貫通させて真皮に対して粉末形態のワクチンを加速させるために圧縮ガスを使用する、バリスティックパウダー／粒子送達デバイスもまた適している。加えて、従来の注射器が、伝統的な皮内投与のマントゥー方法において使用され得る。
【０１５９】
薬学的な物質の処方および製造における一般的な考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見ることができる。
【０１６０】
診断法／キット
本発明により、病理学的試料（血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変のスワブ、脳脊髄液、頸管スミア、膿試料、フードマトリックス、ならびに、脳、脾臓、および肝臓のような体の様々な部分に由来する組織を含むがこれらに限定されない）中のＨＡポリペプチドを検出するため、特に、特定のグリカン結合特性（例えば、アンブレラグリカンに対して、α２−６シアリル化グリカンに対して、長いα２−６シアリル化グリカンに対して結合するなど）を有しているＨＡポリペプチドを検出するためのキットが提供される。本発明によってはまた、土壌、水、および微生物叢を含むがこれらに限定されない環境試料中の目的のＨＡポリペプチドを検出するためのキットも提供される。列挙されていない他の試料もまた適切である場合がある。
【０１６１】
特定の実施形態においては、本発明のキットには、特定のグリカン結合特性を有しているＨＡポリペプチドを特異的に検出する１つ以上の試薬が含まれ得る。そのような試薬としては、例えば、特定のＨＡポリペプチド（例えば、アンブレラグリカンおよび／またはα２−６シアリル化グリカンおよび／または長いα２−６シアリル化グリカンに結合するＨＡポリペプチド）を特異的に認識する抗体を挙げることができる。これは、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、および／または免疫ブロッティングによってそのようなＨＡポリペプチドを特異的に検出するために使用することができる。これらの抗体はまた、ウイルス中和試験においても使用することができ、ここで試料は、目的のＨＡポリペプチドに特異的な抗体で処理され、未処理の試料と比較して、培養細胞に感染するその能力について試験される。この試料中のウイルスにそのようなＨＡポリペプチドが含まれている場合には、抗体はウイルスを中和し、それが培養細胞に感染することを防ぐであろう。あるいは、または加えて、そのような抗体はまた、ＨＡ阻害試験においても使用することができる。ここで、ＨＡタンパク質が所定の試料から単離され、特定のＨＡポリペプチドまたはＨＡポリペプチドのセットに特異的な抗体で処理され、赤血球を凝集させるその能力について、未処理の試料と比較して試験される。試料中のウイルスにそのようなＨＡポリペプチドが含まれている場合には、抗体はＨＡポリペプチドの活性を中和して、それが赤血球を凝集させることを防ぐであろう（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ＷＨＯ＿ＣＤＳ＿ＣＳＲ＿ＮＣＳ＿２００２＿５／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｉｓｅａｓｅ／ａｖｉａｎ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｌａｂｔｅｓｔｓ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。他の実施形態においては、そのような薬剤として、特定のＨＡポリペプチドをコードするヌクレオチドに特異的に結合する核酸を挙げることができ、これは、ＲＴ−ＰＣＲまたはインサイチュハイブリダイゼーションによってそのようなＨＡポリペプチドを特異的に検出するために使用することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ＷＨＯ＿ＣＤＳ＿ＣＳＲ＿ＮＣＳ＿２００２＿５／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｉｓｅａｓｅ／ａｖｉａｎ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｌａｂｔｅｓｔｓ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。特定の実施形態においては、試料から単離された核酸は、検出の前に増幅させられる。特定の実施形態においては、診断試薬は検出できるように標識することができる。
【０１６２】
本発明によってはまた、インフルエンザウイルスおよびワクチンの作成のための、本発明の試薬が含まれているキットも提供される。キットの内容物としては、目的のＨＡポリペプチド（または特徴的なもしくは生物学的に活性な部分）をコードするＨＡヌクレオチド（または特徴的なもしくは生物学的に活性な部分）が含まれている発現プラスミドが挙げられるが、これに限定されない。あるいは、または加えて、キットには、目的のＨＡポリペプチド（または特徴的なもしくは生物学的に活性な部分）を発現する発現プラスミドが含まれ得る。ウイルス遺伝子を含まない発現プラスミドもまた、使用者が任意の目的のインフルエンザウイルスに由来するＨＡヌクレオチドを取り込ませることができるように、含められる場合がある。ＶｅｒｏおよびＭＤＣＫ細胞株を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞株もまた、キットとともに含められる場合がある。特定の実施形態においては、診断試薬は、検出できるように標識することができる。
【０１６３】
特定の実施形態においては、本発明にしたがって使用されるキットには、参照試料、試料の処理、試験の実施についての説明書、結果の解釈のための説明書、試験を実施するために必要な緩衝剤および／または他の試薬が含まれ得る。特定の実施形態においては、キットには抗体のパネルが含まれ得る。
【０１６４】
本発明のいくつかの実施形態においては、上記で議論されたグリカンアレイが、診断法および／またはキットとして利用され得る。
【０１６５】
特定の実施形態においては、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットは、多用量でアンブレラグリカンに対するＨＡポリペプチドの結合を評価するための用量応答実験（例えば、上記）を行うために使用される。そのような実験によっては、試験したＨＡポリペプチドの結合特性についての特に有用な知見が得られ、これらは、特異的な結合を評価するために特に有用である。このタイプの用量応答結合実験については、多くの有用な用途が見出されている。一例ではあるが例を挙げると、これらは、ＨＡポリペプチド変異体の関連するシリーズにおける結合特性の進化の追跡を助けることができる。これは、シリーズが自然な進化、意図的な操作、または２つの組み合わせによって生じたかどうかは問わない。
【０１６６】
特定の実施形態においては、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットは、所望される結合特性を有しているＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡポリペプチド変異体を誘導する、同定する、そして／あるいは選択するために使用される。例えば、いくつかの実施形態においては、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットは、ＨＡポリペプチドの集団に対して進化的（例えば、スクリーニングおよび／または選択）圧力を働かせるために使用される。
【実施例】
【０１６７】
（実施例１）
α２−３およびα２−６シアリル化グリカンに対するＨ１  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、およびＨ５  ＨＡの結合特異性についての枠組み
Ｈ１（ＰＤＢ  ＩＤＳ：１ＲＤ８、１ＲＵ７、１ＲＵＹ、１ＲＶ０、１ＲＶＴ、１ＲＶＸ、１ＲＶＺ）、Ｈ３（ＰＤＢ  ＩＤｓ：１ＭＱＬ、１ＭＱＭ、１ＭＱＮ）、およびＨ５（１ＪＳＮ、１ＪＳＯ、２ＦＫ０）に由来するＨＡ、ならびに、α２−３および／またはα２−６シアリル化オリゴ糖を含むそれらの複合体の結晶構造により、特異的なＨＡ−グリカン相互作用に関与している残基についての分子的洞察が得られた。さらに最近、トリおよびヒトのＨ１およびＨ３サブタイプのグリカン受容体特異性が、様々なα２−３およびα２−６シアリル化グリカンを含むグリカンアレイ上の野生型および変異体をスクリーニングすることによって、詳しく調べられた。
【０１６８】
１９１８年にヒトで大流行したウイルスのＨＡの中のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ変異は、α２−６からα２−３シアリル化グリカンへとその特異性を反転させた（Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５５：１１４３，２００６；Ｇｌａｓｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１１５３３，２００５）。一方、トリＨ１の二重変異Ｇｌｕ１９０ＡｓｐとＧｌｙ２２５Ａｓｐ（Ａ／Ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／３５／１９７６）は、α２−３からα２−６シアリル化グリカンへとその特異性を反転させた。Ｈ３サブタイプの場合には、１９６３年のトリＨ３Ｎ８株と１９６７〜６８年にヒトで大流行したＨ３Ｎ２株との間での、Ｇｌｎ２２６からＬｅｕ、およびＧｌｙ２２８からＳｅｒへのアミノ酸の変化が、α２−３からα２−６シアリル化グリカンへのそれらの優先性の変化と関係があった（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３０４：７６，１９８３）。ＨＡグリカンの結合特異性と感染効率との間の関係は、高病原性の毒性のある１９１８  Ｈ１Ｎ１ウイルスを使用したフェレットモデルにおいて明らかにされていた（Ｔｕｍｐｅｙ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５：６５５，２００７）。
【０１６９】
もとのヒトα２−６シアリル化グリカン（ＳＣ１８）受容体に対する優先性から、トリα２−３シアリル化受容体に対する優先性（ＡＶ１８）への受容体結合特異性の切り替え
により、感染できないウイルスが生じた。一方、α２−３／α２−６シアリル化グリカン特異性が混ざっているウイルス（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１／１８（ＮＹ１８））のうちの１つは感染性を示さず、驚くべきことに、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｔｘ９１）ウイルス（これもまた、α２−３／α２−６シアリル化グリカン特異性が混ざっている）は、効率よく感染することができた。さらに、上記のように、高病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスの様々な株についてもまた、α２−３／α２−６シアリル化グリカン特異性の混合が示されており（Ｙａｍａｄａ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：３７８，２００６）、まだヒトからヒトに感染することはできなかった。ＨＡのシアリル化グリカン特異性と感染に関する交絡する結果は、以下の疑問を投じた。第１に、ヒトの上気道の中で見られるシアリル化グリカンに多様性が存在し、ウイルスの特異性と組織向性の原因となり得るかどうか。第２に、α２−３および／またはα２−６シアリル化グリカンの両方がＨＡグリカン結合ポケットに結合する方法において役割を担い得るグリカン立体構造の相違があるかどうか。まとめると、ヒトへの適応のためのインフルエンザＡウイルスＨＡのグリカン結合要件は何であるか。
【０１７０】
α２−３シアリル化グリカンに対するＨ１  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、およびＨ５  ＨＡの結合についてのグリカントポロジーおよび置換によって付与される構造的拘束
全てのＨＡ−グリカン共晶構造の分析は、Ｎｅｕ５Ａｃ糖（ＳＡ）の方向がＨＡグリカン結合部位に対して固定されていることを示す。様々なＨＡサブタイプにわたってアミノ酸Ｐｈｅ９５、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ１９４の高度に保存されているセットは、ＳＡの固定に関与している。したがって、α２−３またはα２−６に対するＨＡの特異性は、グリコシド酸素原子およびＳＡ以外の糖とのＨＡグリカン結合部位の相互作用によって支配される。
【０１７１】
Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合の立体構造は、α２−３の中のＧａｌおよびＧａｌ以外の糖の位置が、この結合のグリコシドねじれ角によって支配されるコーン様領域の中に入るようになっている（図６）。最小エネルギーの立体構造の典型的な領域は、およそ−６０または６０または１８０のφ値によって表され、この場合、ψは、−６０から６０の見本をとる（図１４）。これらの最小エネルギーの領域においては、α２−３の中のＧａｌ以外の糖は、ＨＡグリカン結合部位の外側に飛び出している。これは、α２−３モチーフ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−）を有しているＨＡの共晶構造からも明らかであり、ここで、φ値は、通常はおよそ１８０である（トランス立体構造と呼ばれる）。このトランス立体構造は、ポケットの外側の突起に対してα２−３モチーフを生じる。これは、３つの糖（または３糖）のα２−３モチーフ上の中心にあるＧａｌおよび／またはＧｌｃＮＡｃ（またはＧａｌＮＡｃ）糖の位置で分岐している構造上のバリエーション（硫酸化およびフコシル化）が、ＨＡ結合に対して最も大きな影響を有しているであろうことを暗に意味している（図７）。この構造の暗示は、データ検索分析によって得られたα２−３シアリル化グリカンに対するＨＡの結合についての３つの異なる分類子と一致する（表３）。これらの３つのクラスの全てにおいて共通している特徴は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌが、ＧａｌＮＡｃα／β１−４Ｇａｌと一緒には存在しないはずであることである。結晶構造の分析は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＧａｌのＧａｌに対して結合したＧａｌＮＡｃが、分類子と一致して、タンパク質と好ましくない立体接触を形成することを示した。
【０１７２】
シアル酸結合についての保存されている固定点に加えて、２つの重要な残基であるＧｌｎ２２６とＧｌｕ１９０が、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌモチーフに対する結合に関与している。結合部位の基部に存在するＧｌｎ２２６は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合のグリコシド酸素原子と相互作用する（図１５、パネルＣ、Ｄ）。Ｇｌｎ２２６の反対側に存在するＧｌｕ１９０は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ単糖と相互作用する（図１５、パネルＣ、Ｄ）。さらに、残基Ａｌａ１３８（Ｇｌｎ２２６に対して近位にある）とＧｌｙ２
２８（Ｇｌｕ１９０に対して近位にある）（これらは、トリＨＡの中で高度に保存されている）は、α２−３シアリル化グリカンとの最適な相互作用のためのＧｌｎ２２６とＧｌｕ１９０の正確な立体構造を促進することに関与することができる（図１５）。ヒトＨ１サブタイプであるＡＰＲ３４には、４つのアミノ酸Ａｌａ１３８、Ｇｌｕ１９０、Ｇｌｎ２２６、およびＧｌｙ２２８が全て含まれており、その結晶構造において観察されるように、α２−３シアリル化グリカンに結合する（図１４、パネルＢ）。
【０１７３】
ＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３、ＡＤＵ６７＿Ｈ３＿２３、およびＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２３の結晶構造においてグリカン結合部位が重なり合うことにより、Ｇｌｕ１９０側鎖の位置と、α２−３シアリル化グリカンに対するＨＡの結合に対するその影響についてのさらなる知見が得られた。Ｈ１  ＨＡの中のＧｌｕ１９０の側鎖は、Ｈ３  ＨＡの中のＧｌｕ１９０の側鎖と比較して、さらに（およそ１Å）結合部位の内側にある。この原因は、Ｇｌｕ１９０残基の近位に存在する、Ｈ３  ＨＡの中のＳｅｒ１８６と比べた、Ｈ１  ＨＡの中のアミノ酸の相違Ｐｒｏ１８６である可能性がある。Ｇｌｕ１９０の側鎖立体構造のこの変化は、グリカンマイクロアレイデータのデータ検索分析によって示されるように、α２−６シアリル化グリカンのいくつかに対する適度な親和性でのトリＨ１（そして、トリＨ３ではない）の結合と相関関係があり得る（表３）。さらに、Ｇｌｙ２２８からＳｅｒへの置換（トリのＨ３サブタイプとヒトのＨ３サブタイプの間での特徴的な変化）は、Ｇｌｕ１９０の立体構造を変化させて、トランス立体構造のＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌに対するヒトＨ３  ＨＡの相互作用を妨害する。これはさらに、ヒトＡＡＩ６８＿Ｈ３＿２３共晶構造において観察されるＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌモチーフの異なる立体構造（トランスではない）によっても詳しく述べられる。この立体構造のＮｅｕ５Ａｃα２−３  Ｇａｌモチーフは、トリＨ３  ＨＡを有しているトランス立体構造の中のこのモチーフによってもたらされるものと比較して、ヒトＨ３  ＨＡ結合部位との最適ではない接触を提供する（図１４）。この接触が少なくなることの結果として、ヒトＨ３  ＨＡの中のＧｌｙ２２８Ｓｅｒ変異は、そのグリカン結合部位を、α２−３シアリル化グリカンとの相互作用について好ましくないようにする。この構造的観察は、ヒトＨ３  ＨＡがα２−３シアリル化グリカンのいくつかに対しては適度な親和性しか有していないことを示すデータ検索分析による結果（表３）と一致する。
【０１７４】
Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌの周囲の構造のバリエーションは、ＨＡ−グリカン相互作用に対してどのような影響を与えるのであろうか。Ｌｙｓ１９３（これは、トリＨ５において高度に保存されている（図５））は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの中の６−Ｏ硫酸化Ｇａｌおよび／または６−Ｏ硫酸化ＧｌｃＮＡｃと相互作用するように配置されている。この観察は、データ検索分析によって確認される。ここで、トリＨ５だけが、ＧａｌまたはＧｌｃＮＡｃで硫酸化されたα２−３シアリル化グリカンに対して高い親和性で結合する（表３）。同様の様式で、２２２位の塩基性アミノ酸は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃモチーフの中の４−Ｏ硫酸化ＧｌｃＮＡｃ、またはＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃモチーフの中の６−Ｏ硫酸化ＧｌｃＮＡｃと相互作用することができる。一方、かさの大きい側鎖（例えば、Ｈ１およびＨ５の中のＬｙｓ２２２、およびＨ３の中のＴｒｐ２２２）は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃモチーフの中のフコシル化ＧｌｃＮＡｃを妨害する可能性がある。この構造的観察は、トリＨ３およびＨ５株について観察された分類子規則α２−３タイプＣを裏づけ（表３）、ＧｌｃＮＡｃでのフコシル化が結合にとって有害であることを示す。α２−３シアリル化グリカンに対するＶｉｅｔ０４＿Ｈ５  ＨＡの結合は、それらのそれぞれのグリカン結合部位がほとんど同じであるアミノ酸と仮定すると、ＡＤＳ９７＿Ｈ５  ＨＡの結合と類似している（表３）。
【０１７５】
したがって、α２−３シアリル化グリカンに対する結合については、Ｎｅｕ５Ａｃを固定する残基とは異なり、全てのトリＨ１、Ｈ３、およびＨ５サブタイプにおいて高度に保
存されているＧｌｕ１９０とＧｌｎ２２６が、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌモチーフに対する結合に重要である。ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃとの接触、ならびに、α２−３モチーフの中での硫酸化およびフコシル化のような置換には、１３７位、１８６位、１８７位、１９３位、および２２２位のアミノ酸が含まれる。Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５由来のＨＡは、グリカンマイクロアレイの中に存在する多様なα２−３シアリル化グリカンに対して差別的な結合特異性を示す。これらの位置にあるアミノ酸残基は、異なるＨＡの間では保存されておらず、これは、異なる結合特異性の原因となる。
【０１７６】
α２−６シアリル化グリカンへのＨ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの結合についてのグリカントポロジーと置換によって付与される構造的拘束
Ｎｅｕ５Ａｃａ２−６Ｇａｌ結合の場合には、さらに別のＣ６−Ｃ５結合の存在によってさらに大きな立体構造上の柔軟性が提供される。α２−６の中のＧａｌおよびその後の糖の位置は、α２−３の場合のコーン様領域と比較して、はるかに大きなアンブレラ様領域に広がる（図６）。α２−６に対する結合には、そのようなアンブレラトポロジーの基部にあるＮｅｕ５ＡｃとＧａｌ糖、またそれに続く糖との、オリゴ糖の長さに応じた最適な接触が含まれる。短いα２−６オリゴ糖（例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３／４Ｇｌｃは、コーン様トポロジーを採用する可能性がある。一方、α２−６モチーフＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−の中のＧｌｃの換わりにＧｌｃＮＡｃが存在することにより、アンブレラトポロジー（これは、ＧｌｃＮＡｃとＮｅｕ５Ａｃの両方のアセチル炭素の間での最適なファンデルワールス接触によって安定化させられる）を好む可能性がある。しかし、α２−６モチーフはまた、コーントポロジーをも採用することができ、その結果、分岐およびＨＡの結合のようなさらなる要素が、アンブレラトポロジーによってもたらされる安定性を補うことができる。Ｎ結合グリカンの中の複数の短いオリゴ糖分岐の一部として存在するα２−６モチーフのコーントポロジーは、糖内相互作用によって安定化させられ得る。一方、アンブレラトポロジーは、長いオリゴ糖分岐（少なくも４糖）の中のα２−６モチーフによって好まれる。α２−６モチーフ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−モチーフ）を有しているＨ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの共晶構造は、上記の概念をサポートする。ここで、約−６０のφ（シス立体構造と呼ばれる）によって、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ以外の糖のＨＡタンパク質方向への湾曲が生じて結合部位との最適な接触が形成される（図７）。
【０１７７】
Ｈ１  ＨＡにおいては、ＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６およびＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２６に由来するＨＡのグリカン結合ドメインと、ヒトＨ１Ｎ１（Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８）サブタイプに由来するＨＡのグリカン結合ドメインとが重なり合うことにより、α２−６シアリル化グリカンに対する特異性を提供することに関与しているアミノ酸についての知見が得られた。Ｌｙｓ２２２とＡｓｐ２２５は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの中のＧａｌの酸素原子と相互作用するように配置されている。Ａｓｐ１９０とＳｅｒ／Ａｓｎ１９３は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌα１−４ＧｌｃＮＡｃα１−３Ｇａｌモチーフのさらなる単糖であるＧｌｃＮＡｃα１−３Ｇａｌと相互作用するように配置されている（図１５、パネルＡ、Ｂ）。
【０１７８】
Ａｓｐ１９０、Ｌｙｓ２２２、およびＡｓｐ２２５は、１９１８年にヒトで大流行した複数の株に由来するＨ１  ＨＡの間で高度に保存されている。アミノ酸Ｇｌｎ２２６は、全てのトリおよびヒトのＨ１サブタイプにおいて高度に保存されているが、α２−３シアリル化グリカン（トリＨ１サブタイプの中の）に対する結合におけるその役割と比較して、α２−６シアリル化グリカン（ヒトＨ１サブタイプの中の）に対する結合に関与していることは明らかになっていない。トリとヒトのＨ１  ＨＡの野生型および変異体形態についてのグリカンアレイ結果のデータ検索分析は、α２−６シアリル化グリカンに対する結合における上記のアミノ酸の役割をさらに実証している（表３）。トリＨ１  ＨＡのＧｌｕ１９０Ａｓｐ／Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ二重変異は、その結合をα２−６シアリル化グリカ
ンに対して反転させる（表３）。さらに、ヒトＡＮＹ１８＿Ｈ１のＬｙｓ２２２Ｌｅｕ変異体は、グリカンの結合におけるＬｙｓ２２２の不可欠な役割と一致して、アレイ上の全てのシアリル化グリカンに対するその結合を排除する。
【０１７９】
α２−６シアリル化グリカンに対するＨ３Ｎ２  ＨＡ結合の特異性を提供するアミノ酸を同定するために、ヒトＨ３Ｎ２（ＡＡＩ６８＿Ｈ３）、ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２６、およびＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６に由来するＨＡのグリカン結合ドメインを重ね合わせた。これらの重ね合わせた構造の分析は、Ｌｅｕ２２６が、Ｎｅｕ５α２−６ＧａｌモチーフのＣ６原子との最適なファンデルワールス接触を提供するように配置されており、Ｓｅｒ２２８は、シアル酸のＯ９と相互作用するように配置されていることを示した。ヒトＨ３の中のＳｅｒ２２８もまたＧｌｕ１９０と相互作用し（Ｇｌｕ１９０と相互作用しないトリＡＤＵ６３＿Ｈ３の中のＧｌｙ２２８とは異なる）、それにより、その側鎖の立体構造に影響を与える。ヒトＨ３  ＨＡの中のＧｌｕ１９０の側鎖は、トリＨ３  ＨＡの中のＧｌｕ１９０の側鎖と比較して、約０．７Å、わずかに結合部位の内側に移動させられる。これらの相違は、α２−３シアリル化グリカンに対して結合するヒトＨ３  ＨＡの能力を制限し、α２−６シアリル化グリカンに対するその優先的な結合と相関関係がある。したがって、Ｇｌｎ２２６ＬｅｕおよびＧｌｙ２２８Ｓｅｒ変異は、１９６７年に大流行したヒトＨ３サブタイプへの、トリＨ３のグリカン受容体特異性の反転を引き起こす。
【０１８０】
１９６７〜６８に大流行したＨ３Ｎ２に由来するＨＡと、より最近のＨ３サブタイプ（１９９０年以降）に由来するＨＡとの比較は、Ｇｌｕ１９０が、最近のサブタイプにおいては、Ａｓｐに変異していることを示している。この変異は、α２−６シアリル化グリカンに対するヒトＨ３の結合をさらに促進する。なぜなら、ヒトＨ３の中のＡｓｐ１９０は、これらのグリカンと好ましく相互作用するように配置されているからである。この構造の予測は、ヒトＨ３サブタイプ（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／１９９９）についてのグリカンアレイデータのデータ検索分析によってさらに裏付けられる。このＨＡには、Ａｓｐ１９０、Ｌｅｕ２２６、およびＳｅｒ２２８が含まれており（図２）、α２−６シアリル化グリカンに対する強い優先性を示す（表３）。
【０１８１】
上記の観察は、α２−６シアリル化グリカンに対するＨ１  ＨＡの結合とＨ３  ＨＡの結合との間での類似性、さらには相違の両方を際立たせる。Ｈ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡのいずれにおいても、Ａｓｐ１９０およびＳｅｒ／Ａｓｎ１９３は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフ以外の単糖と好ましい接触を形成するように配置されている（図１５、パネルＡ、Ｂ）。アミノ酸の相違と、Ｈ１  ＨＡとＨ３  ＨＡとの間でのα２−６シアリル化グリカンとのそれらの接触は、これらのグリカンへの結合について、異なる表面およびイオン相補性を提供する。Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌよりもさらに大きな立体構造上の自由度を有している。したがって、α２−６シアリル化グリカンに対するＨＡの結合は、この立体構造の自由度に順応するための、さらなる開いた結合ポケットを有している。ヒトＨ３  ＨＡの中のＬｅｕ２２６は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌとの最適なファンデルワールス接触を提供するように配置されているが、このモチーフに対してＨ１  ＨＡの中のＧｌｎ２２６によって提供されるイオン性の接触は最適ではない。一方、Ｈ１においては、アミノ酸Ｌｙｓ２２２とＡｓｐ２２５が、Ｈ３の中のＴｒｐ２２２およびＧｌｙ２２５と比較して、α２−６シアリル化グリカンとのより適しているイオン性の接触を提供する。
【０１８２】
α２−６シアリル化グリカンに対する野生型および変異体Ｈ５  ＨＡの結合についての構造的拘束
Ｈ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの中の様々なアミノ酸によって提供されるα２−６シアリル化グリカンとの相互作用は、現在のトリＨ５Ｎ１  ＨＡが、そのグリカン受容体特異性を反転させるために、Ｈ１様またはＨ３様のグリカン結合部位を変異させることができる
ことを示唆していた。上記の枠組みに基づいて、Ｈ５  ＨＡについて仮定されるＨ１様およびＨ３様の変異をさらに精密に作り上げ、以下に議論するように試験した。
【０１８３】
重ねあわせたＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６、ＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２６、ＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２６、およびＶｉｅｔ０４＿Ｈ５構造の分析から、α２−６シアリル化グリカンに対するＨ５  ＨＡのＨ１様結合についての知見が得られた。Ｈ１  ＨＡおよびＨ５  ＨＡは、同じ構造のクレードに属するので、それらのグリカン結合部位は、類似するアミノ酸のトポロジーと分布を共有する（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：２８７，２００４）。Ｌｙｓ２２２（これは、トリＨ５  ＨＡにおいて高度に保存されている）は、Ｈ１  ＨＡの中の類似のＬｙｓと類似する、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌモチーフのＧａｌとの最適な接触を提供するように配置される。Ｖｉｅｔ０４＿Ｈ５の中のＧｌｕ１９０およびＧｌｙ２２５は、（Ｈ１の中のＡｓｐ１９０およびＡｓｐ２２５の代わりに）、Ｈ１と類似するＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃモチーフとの不可欠な接触は提供しない。したがって、Ｈ５  ＨＡの中のＧｌｕ１９０ＡｓｐおよびＧｌｙ２２５Ａｓｐ変異によって、α２−６シアリル化グリカンとの接触を改善できる可能性がある。
【０１８４】
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃオリゴ糖の中のＧｌｃＮＡｃ以外の相互作用と、Ｈ１  ＨＡおよびＨ５  ＨＡのグリカン結合ポケットの分析は、Ｈ１  ＨＡの中のＳｅｒ／Ａｓｎ１９３が、最後から２番目のＧａｌとの好ましい接触を提供するが、Ｈ５の中の類似のＬｙｓ１９３は、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌモチーフと好ましくない立体的重複を有することを示した。したがって、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ変異によっては、α２−６シアリル化グリカンとのさらなる好ましい接触（Ｇｌｕ１９０ＡｓｐおよびＧｌｙ２２５Ａｓｐ変異を伴う）を提供することができる。
【０１８５】
Ｈ１  ＨＡの中の高度に保存されているＧｌｎ２２６はまた、トリＨ５  ＨＡにおいても保存されている。Ｇｌｎ２２６がα２−６シアリル化グリカンに対するＨ１  ＨＡの結合においてあまり活発ではない役割を担うと仮定すると（上記で議論したように）、Ｌｅｕのような疎水性アミノ酸に対するこのアミノ酸の変異により、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフの中のＧａｌのＣ６原子とのそのファンデルワールス接触を増強させることができる可能性があり得る。
【０１８６】
ＡＤＵ６３＿Ｈ３＿２６、ＡＡＩ６８＿Ｈ３、ＡＤＳ９７＿Ｈ５＿２６、およびＶｉｅｔ０４＿Ｈ５が重なり合うことにより、α２−６シアリル化グリカンに対するＨ５  ＨＡのＨ３様結合についての知見が得られた。この重なり合わせは、Ｈ５  ＨＡおよびＨ３  ＨＡのグリカン結合部位と構造的に並ぶが、これは、Ｈ５とＨ１との間での構造的アラインメントほど良好ではなかった。Ｈ３  ＨＡの中のＬｅｕ２２６とＳｅｒ２２８によってそれぞれ提供されるＮｅｕ５α２−６Ｇａｌモチーフとの好ましいファンデルワールス接触とイオン的接触は、（Ｇｌｎ２２６とＧｌｙ２２８を有している）Ｈ５  ＨＡの中には存在しなかった。Ｌｅｕ２２６およびＳｅｒ２２８がヒトＨ３  ＨＡの中のα２−６シアリル化グリカンに対する結合にとって重要であると仮定すると、Ｈ５  ＨＡの中のＧｌｎ２２６ＬｅｕおよびＧｌｙ２２８Ｓｅｒ変異によって、α２−６シアリル化グリカンとの最適な接触を提供できる可能性があり得る。さらに、Ｈ３とＨ５との間での比較においてもなお、Ｌｙｓ１９３は、好ましい接触を提供するように配置されているヒトＨ３  ＨＡの中のＳｅｒ１９３と比較して、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフ以外の単糖と好ましくない立体的接触を有するように配置される。１９６７〜６８年に大流行したＨ３Ｎ２に由来するＨＡにはＧｌｕ１９０が含まれているが、Ｈ５  ＨＡの中のＡｓｐ１９０は、より長いオリゴ糖の中のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌモチーフとより良好なイオン的接触を提供するように配置されている。
【０１８７】
上記の残基の役割は、Ｖｉｅｔ０４＿Ｈ５の野生型および変異体形態についてのグリカ
ンアレイデータのデータ検索分析によって、さらに裏付けられた（表３）。二重変異体Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ／Ｇｌｙ２２５Ａｓｐは、いずれのグリカン構造にも結合しない。なぜなら、これは、α２−３シアリル化グリカンに対する結合についてはアミノ酸Ｇｌｕ１９０を失っており、α２−６シアリル化グリカンに対する結合についてはＬｙｓ１９３による立体障害を有しているからである。同様に、二重変異体Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒは、α２−３シアリル化グリカン（α２−３タイプＢ分類子）のうちのいくつかに結合するが、１つの二分岐を有しているα２−６シアリル化グリカン（α２−６タイプＡ分類子）だけにしか結合しない。
【０１８８】
二分岐のα２−６シアリル化グリカンに対するこの結合の分析は、このグリカンの中のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合が、より接触は少ないが、二重変異に対して伸張配座の中で潜在的に結合できることを示した（図１６）。さらに、Ｍａｌα１−３Ｍａｎ分岐上のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌは、Ｈ５  ＨＡのグリカン結合部位と好ましくない立体的接触を有している、Ｍａｎα１−６Ｍａｎ分岐上の同じモチーフと比較して、さらに好ましく結合する（図１６）。α２−６シアリル化グリカンに対するＧｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ二重変異体の狭い特異性は、結合を妨害するＬｙｓ１９３と一致する。
【０１８９】
いずれの特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明者らは、インフルエンザＡウイルスＨＡのヒトへの適応のための必要条件は、高い親和性で長いα２−６（主に、ヒトの上気道で発現される）に結合する能力を獲得することであると提起する。例えば、グリカンの多様性の１つの特徴は、シアル酸で捕捉されるラクトサミンの分岐の長さである。これは、データ検索分析によって導かれたα２−６シアリル化グリカンの２つの異なる特徴によって捕捉される（表３）。１つの特徴は、Ｎ結合したコアのＭａｎに連結させられたＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを特徴とし、他方は、より長い分岐（これは、通常はアンブレラトポロジーを採用する）を形成している別のラクトースアミン単位に連結させられたこのモチーフを特徴とする。したがって、上気道に対する変異体Ｈ５  ＨＡの広域結合は、これらの変異体がアンブレラトポロジーを採用している長いα２−６を有しているグリカンに対して高い親和性で結合する場合に限り、可能であり得る。例えば、本発明に従うと、所望される結合パターンとしては、図９に示されるアンブレラグリカンに対する結合が挙げられる。
【０１９０】
対照的に、本発明者らは、グリカンアレイ上の１つの二分岐のａ２−６  シアリル（ｓｕａｌｙｌ）−ラクトサミングリカン構造だけに対して結合を示した修飾されたＨ５  ＨＡタンパク質（Ｇｌｙ２２８ＳｅｒとＧｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ置換を含む）についての最近の報告に注目した（Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：４０４，２００６）。したがって、そのような修飾されたＨ５  ＨＡタンパク質は、本明細書中に記載されるＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡではない。
【０１９１】
（実施例２）
ＨＡのクローニング、バキュロウイルスによる合成、発現、および精製
ウイルスの中のヘマグルチニンは３量体として存在し、膜に固定される。ＨＡの全長の構築物は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端の膜貫通配列を有する。ＨＡの組み換えによる発現のためには、多くの場合は、タンパク質の分泌が可能であるＨＡの短縮型の構築物が使用される。この短縮型の可溶性構築物は、ＨＡのＮ末端シグナルペプチドをＧｐ６７シグナルペプチド配列で置き換えることによって作成され、Ｃ末端の膜貫通領域は、「ｆｏｌｄｏｎ」配列、続いてトリプシン切断部位、および６×−Ｈｉｓタグによって置き換えられる（Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５５：１１４３，２００６）。ＨＡの全長および可溶性形態の両方を昆虫細胞の中で発現させた。Ｓｆ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中のＳｆ−９細胞の懸濁培養物を、全長のＨＡまたは可溶性形態のＨＡのいずれかが含まれているバキュロウイルスに感染させた。細胞を
、感染の７２〜９６時間後に回収した。
【０１９２】
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４由来のヘマグルチニン（ＨＡ）は、Ａｄｏｌｆｏ  Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅから懇意により譲り受けた。この「野生型」（ＷＴ）ＨＡを鋳型として使用して、２つの異なる変異体構築物、ＤＳＬＳとＤＳＤＬを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して作成した。突然変異誘発のために使用したプライマーは、ウェブに基づくプログラムＰｒｉｍｅｒＸ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｐｒｉｍｅｒｘ／）を使用して設計し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって合成された。ＷＴ遺伝子と変異体ＨＡ遺伝子を、エントリーベクターｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に、ＴＯＰＯ連結を使用してサブクローニングした。ＷＴ遺伝子を含むエントリーベクターと、変異体遺伝子を含むエントリーベクターを、ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ  ｌｉｎｅａｒ  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、Ｇａｔｅｗａｙクローニング技術を使用して組換えた。ＤＮＡ配列決定をそれぞれのサブクローニング工程で行って、配列の精度を確認した。生産された組み換え体バキュロウイルスＤＮＡを使用してＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ−９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクトして、ウイルスの一次ストックを得た。
【０１９３】
全長のＨＡを、Ｗａｎｇら、（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ，２４：２１７６によって改良された方法により、感染させた細胞の膜画分から精製した。簡単に説明すると、１５０ｍｌの培養物から細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットを、３０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１．０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ−ＮＰ９、５％のグリセロール、ｐＨ５．９３）中の１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−９で、４℃で３０分間抽出した。その後、抽出物を６，０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を０．４５ミクロンのフィルターを使用して濾過し、緩衝液Ａで先に平衡化させておいたＱ／ＳＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上にロードした。ロードした後、カラムを２０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。その後、陰イオン交換カラムＱを外し、ＳＰカラムを、タンパク質の溶出のために、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．０３％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、５％のグリセロール、ｐＨ  ８．２）の５つ５ｍｌの画分と、緩衝液Ｃ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、５％のグリセロール、ｐＨ８．２）の２つの５ｍｌの画分を用いて使用した。目的のタンパク質が含まれている画分をまとめてプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００Ｋ  ＮＭＷＬ膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して限外濾過を行った。タンパク質を濃縮し、ＰＢＳの中に再構成させた。
【０１９４】
可溶性形態のＨＡを、Ｓｔｅｖｅｎｓら、（２００４）に記載されているプロトコルを使用して、感染させた細胞の上清から精製した。簡単に説明すると、上清を濃縮し、可溶性のＨＡを、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアフィニティークロマトグラフィーを行うことによって、濃縮した細胞上清から回収した。ＨＡが含まれている溶離画分をプールし、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析した。イオン交換クロマトグラフィーを、Ｍｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ１０／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して透析した試料について行った。ＨＡが含まれている画分をまとめてプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００Ｋ  ＮＭＷＬ膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して限外濾過を行った。タンパク質を濃縮して、ＰＢＳの中に再構成した。
【０１９５】
試料中のタンパク質の存在は、抗トリＨ５Ｎ１  ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロット分析を行うことによって確認した。ドットブロット免疫アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃから入手した野生型Ｈ５  ＨＡを対照として使用した）により、ＷＴと変異体のタンパク質濃度を決定した。行った様々な実験において、Ｈ５  ＨＡ（ＷＴおよび変異体）のタンパク質濃度は、通常は、２０〜５０μグラム／ｍｌの範囲にあることが明らかになった。所定のロットについてのタンパク質濃度に基づいて、１：１０〜１：１００の範囲の適切な段階希釈を使用した（図１７を参照のこと）。
【０１９６】
（実施例３）
ＨＡのグリカン結合特異性を調べるためのデータ検索プラットフォームの適用
α２−３／６シアリル化グリカンに対するＨ５Ｎ１サブタイプの結合についての枠組みを開発した（図７）。この枠組みには、２つの相補性分析を含めた。第１の分析には、ＨＡグリカン結合部位、ならびに、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、およびＨ５  ＨＡ−グリカン共晶構造を使用した、α２−３シアリル化グリカンとα２−６シアリル化グリカンとのその相互作用の体系的分析を含めた（表２）。
【０１９７】
この分析により、アンブレラトポロジーまたはコーントポロジーのいずれかのグリカンを含む様々なα２−３／６シアリル化グリカンとのＨＡグリカン結合部位の相互作用についての重要な知見が得られた。第２の分析には、様々なＨ１  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、およびＨ５  ＨＡについてのグリカンアレイデータを分析するためのデータ検索アプローチを含めた。このデータ検索分析は、マイクロアレイ中のグリカンの構造的特徴に対する、様々な野生型および変異体ＨＡの強いバインダー、弱いバインダー、そして非バインダーと相関関係がある（表３）。
【０１９８】
重要なことは、これらの相関関係（分類子）が、様々なＨＡへの結合に対する、α２−３／６シアリル化結合および／または様々なトポロジーの微妙な構造的バリエーションの影響を捉えることである。データ検索分析によって得られたグリカンの特徴の相関関係を、ＨＡグリカン結合部位上にマップし、これにより、以下に議論するような、α２−３およびα２−６シアリル化グリカン（様々なトポロジーのグリカンを含む）に対するＨ１  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、およびＨ５  ＨＡの結合を体系的に研究するための枠組みを得た。
【０１９９】
一例ではあるが例を挙げると、本発明のＨ５  ＨＡに対するこの枠組みの適用により、α２−６  オリゴ糖鎖の長さが、特に、分岐の程度の状況において、グリカンについての構造的バリエーションのニュアンスよりも重要となる理由が説明される。例えば、より長いα２−６モチーフを有している二分岐構造に対して１つのα２−６モチーフを有している三分岐構造は、個々のα２−６モチーフについての構造的バリエーションと比較して、ＨＡ−グリカン結合に影響を与えるであろう。これは、データ検索によって本明細書中で得られたα２−６モチーフについての、長さに依存する異なる分類子によって確認される（表３）。
【０２００】
（実施例４）
広域ヒト結合Ｈ５  ＨＡポリペプチド
本発明のいくつかの特定の実施形態においては、ＨＡポリペプチドはＨ５ポリペプチドである。いくつかのそのような実施形態においては、本発明のＨ５ポリペプチドは、アンブレラグリカンに対する結合（例えば、高親和性の結合および／または高特異性の結合）を示す。いくつかの実施形態においては、本発明のＨ５ポリペプチドは、「広域ヒト結合」（ＢＳＨＢ）Ｈ５ポリペプチドと呼ばれる。
【０２０１】
表現「広域ヒト結合」（ＢＳＨＢ）は、最初は、ヒトの上皮組織の中に見られるＨＡ受容体、特にα２−６シアリル化グリカンを特徴とするヒトＨＡ受容体に対して結合するＨ５ポリペプチドをいうように作られた。上記で議論したように、一般的には、ＨＡポリペプチドに関して、いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  
ＨＡポリペプチドは、ヒトの上気道上皮細胞上に見られる受容体に結合する。さらに、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、複数の様々なα２−６シアリル化グリカンに結合する。特定の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドはアンブレラグリカンに結合する。
【０２０２】
特定の実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、気管支および／または気管の中のＨＡ受容体に結合する。いくつかの実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、深部肺の受容体には結合できず、他の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、深部肺の中の受容体に結合できる。さらなる実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、α２−３シアリル化グリカンには結合できず、他の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、α２−３シアリル化グリカンに結合できる。
【０２０３】
特定の実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、もとのＨ５  ＨＡ（例えば、自然界に存在しているインフルエンザ単離物の中で見られるＨ５  ＨＡ）の変異体である。例えば、いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５
ＨＡポリペプチドは、野生型Ｈ５  ＨＡと比較して、グリカン結合部位の中に、またはグリカン結合部位に影響を与える、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態においては、そのような置換は、結合したグリカンと直接相互作用するアミノ酸の置換である；他の実施形態においては、そのような置換は、結合したグリカンと相互作用するものから１分離度で取り出されたアミノ酸の置換である。ここで、１分離度で取り出されたアミノ酸は：（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；（２）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、グリカン自体とは直接は相互作用しない；または、（３）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与え、また、グリカン自体とも直接相互作用するかのいずれかである。本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドには、１つ以上の直接結合するアミノ酸の置換、１つ以上の１分離度のアミノ酸の置換、１つ以上の２分離度のアミノ酸の置換、あるいは、これらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドには、なおさらに高い分離度を有している１つ以上のアミノ酸の置換が含まれる場合がある。
【０２０４】
特定の実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、少なくとも２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸の置換を有する；いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、２個、３個、または４個のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態においては、全てのそのようなアミノ酸置換は、グリカン結合部位の中に配置されている。
【０２０５】
特定の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型Ｈ５  ＨＡと比較して、９８位、１３６位、１３８位、１５３位、１５５位、１５９位、１８３位、１８６位、１８７位、１９０位、１９３位、１９４位、１９５位、２２２位、２２５位、２２６位、２２７位、および２２８位の残基からなる群より選択される残基に、１つ以上のアミノ酸置換を有する。他の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に配置されているアミノ酸から選択される残基（９８位、１３６位、１５３位、１５５位、１８３位、１９０位、１９３位、１９４位、２２２位、２２５位、２２６位、２２７位、および２２８位の残基が含まれるがこれらに限定されない）に１つ以上のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して配置されているアミノ酸から選択される残基（９８位、１３８位、１８６位、１８７位、１９５位、および２２８位の残基が含まれるがこれらに限定されない）に１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【０２０６】
さらなる実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、１３８位、１８６位、１８７位、１９０位、１９３位、２２２位、２２５位、２２６位、２２７位、および２２８位の残基からなる群より選択される残基に１つ以上のアミノ酸置換を有する。他の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に配置されているアミノ酸から選択される残基（１９０位、１９３位、２２２位、２２５位、２２６位、２２７位、および２２８位の残基が含まれるがこれらに限定されない）に１つ以上のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して配置されているアミノ酸から選択される残基（１３８位、１８６位、１８７位、および２２８位の残基が含まれるがこれらに限定されない）に１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【０２０７】
さらなる実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、９８位、１３６位、１５３位、１５５位、１８３位、１９４位、および１９５位の残基からなる群より選択される残基に１つ以上のアミノ酸置換を有する。他の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に配置されているアミノ酸から選択される残基（９８位、１３６位、１５３位、１５５位、１８３位、および１９４位の残基が含まれるがこれらに限定されない）に１つ以上のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、グリカンに直接結合する受容体の領域に隣接して配置されているアミノ酸から選択される残基（９８位および１９５位の残基が含まれるがこれらに限定されない）に１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【０２０８】
特定の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、結合したグリカンと相互作用するものから１分離度で取り出されたアミノ酸から選択される残基（９８位、１３８位、１８６位、１８７位、１９５位、および２２８位の残基が含まれるがこれらに限定されない）に１つ以上のアミノ酸置換を有する。ここで、１分離度で取り出されたアミノ酸は、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；（２）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、グリカン自体とは直接は相互作用しない；または、（３）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与え、また、グリカン自体とも直接相互作用するかのいずれかである。
【０２０９】
さらなる実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、結合したグリカンと相互作用するものから１分離度で取り出されたアミノ酸から選択される残基（１３８位、１８６位、１８７位、および２２８位の残基が含まれるがこれらに限定されない）に１つ以上のアミノ酸置換を有する。ここで、１分離度で取り出されたアミノ酸は、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；（２）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、グリカン自体とは直接は相互作用しない；または、（３）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与え、また、グリカン自体とも直接相互作用するかのいずれかである。
【０２１０】
さらなる実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、結合したグリカンと相互作用するものから１分離度で取り出されたアミノ酸から選択される残基（９８位および１９５位の残基が含まれるがこれらに限定されない）に１つ以上のアミノ酸置換を有する。ここで、１分離度で取り出されたアミノ酸は、
（１）直接結合するアミノ酸と相互作用する；（２）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、グリカン自体とは直接は相互作用しない；または、（３）あるいは直接結合するアミノ酸のグリカンと相互作用する能力に影響を与え、また、グリカン自体とも直接相互作用するかのいずれかである。
【０２１１】
特定の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、１５９位の残基にアミノ酸置換を有する。
【０２１２】
他の実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、１９０位、１９３位、２２５位、および２２６位から選択される残基に１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態においては、ＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型のＨ５  ＨＡと比較して、１９０位、１９３位、２２６位、および２２８位から選択される残基に１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５変異体は、以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を有する：Ｓｅｒ１３７Ａｌａ、Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９０Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｇｌｎ２２６Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｎ２２６Ｖａｌ、Ｓｅｒ２２７Ａｌａ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ。
【０２１３】
いくつかの実施形態においては、本発明のＨＡポリペプチド変異体、特にＨ５変異体は、以下のアミノ酸置換のセットのうちの１つ以上を有する：
Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、およびＧｌｎ２２６Ｌｅｕ；
Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、およびＧｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１３７Ａｌａ、Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ｇｌｕ１９０Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ
、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｓｅｒ２２７Ａｌａ。
【０２１４】
いくつかのそのような実施形態においては、ＨＡポリペプチドは、野生型ＨＡと比較して、少なくとも１つのさらなる置換を有しており、その結果、アンブレラグリカンに対する変異体の親和性および／または特異性が増大する。
【０２１５】
特定の実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、Ｈ１  ＨＡに特徴的なアミノ酸配列を有する。例えば、いくつかの実施形態においては、そのようなＨ１様のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、置換Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、およびＧｌｎ２２６Ｌｅｕを有する。
【０２１６】
特定の実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、Ｈ１  ＨＡに特徴的なアミノ酸配列を有する。例えば、いくつかの実施形態においては、そのようなＨ３様のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡは、置換Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、およびＧｌｙ２２８Ｓｅｒを含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、野生型Ｈ５  ＨＡと比較して、１つの開いた結合部位を有する。いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、以下のα２−６シアリル化グリカンに結合する：
【０２１８】
【化２】
2010500880.tif 000004
およびそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、構造：
【０２１９】
【化３】
2010500880.tif 000005
およびそれらの組み合わせ；ならびに／あるいは、
【０２２０】
【化４】
2010500880.tif 000006
およびそれらの組み合わせのグリカンに結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、
【０２２１】
【化５】
2010500880.tif 000007
に結合する；いくつかの実施形態においては、
【０２２２】
【化６】
2010500880.tif 000008
に結合する；いくつかの実施形態においては、
【０２２３】
【化７】
2010500880.tif 000009
に結合する；そしていくつかの実施形態においては
【０２２４】
【化８】
2010500880.tif 000010
に結合する。
【０２２５】
いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、アンブレラトポロジーグリカンに結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、図９に示されるグリカン（例えば、α２−６シアリル化グリカン）のうちの少なくともいくつかに結合する。いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは図９に示される複数のグリカンに結合する。
【０２２６】
いくつかの実施形態においては、本発明のＢＳＨＢ  Ｈ５  ＨＡポリペプチドは、ヒトの上気道組織（例えば、上皮細胞）の中のＨＡ受容体上に見られるグリカンのうちの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上に結合する。
【０２２７】
（実施例５）
ヒトの上気道組織の中でのグリカンの多様性
レクチン結合実験は、上気道組織の中のα２−３とα２−６の分布において多様性を示した。染色実験は、気道上皮の先端面上のＮ結合グリカン（繊毛細胞）とＯ結合グリカン（杯細胞の中）の両方の一部として、α２−６シアリル化グリカンの優勢な分布を示した（図１８）。一方、気道組織の内部領域には、主に、Ｎ結合グリカン上に分配されたα２−３が含まれていた。長年にわたる疑問は、どのα２−６シアリル化グリカン受容体がヒトの肺に存在するかどうかである。
【０２２８】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  グリカンプロファイリング分析は、実質的な多様性（図１０）を示し、さらに、ヒトの上気道上でのα２−６シアリル化グリカンの優勢な発現を示した。有意なことは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦを使用した代表的な質量ピークのフラグメンテーションが、複数のラクトサミン反復を有しているより長いオリゴ糖分岐が、短いオリゴ糖分岐と比較して広範囲に分布しているグリカントポロジーをサポートすることである（図１０）。上気道の中でのグリカンの分布とトポロジーにおける多様性についての参照を提供するために、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を、ヒトの結腸上皮細胞（ＨＴ２９）に由来する
Ｎ結合グリカンについて行った。現在のＨ５Ｎ１ウイルスは主に腸に感染することが公知であり、したがってこれらの細胞を代表的な腸細胞として選択した。ＨＴ２９細胞のグリカンプロフィールはＨＢＥのグリカンプロフィールとは有意に異なり、ここで、α２−３の優勢な分布が存在し、そして長いオリゴ糖分岐のグリカントポロジーは観察されたとおりではなかった（図１０）。
【０２２９】
図１８のデータは、以下の方法にしたがって作成した。ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋したヒトの気管組織切片は、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。組織切片についてパラフィン除去を行い、再水和させ、内因性のビオチンをストレプトアビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用してブロックした。その後、切片を、ＦＩＴＣで標識したＪａｃａｌｉｎ（Ｏ結合グリカンに特異的）、ビオチニル化コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、Ｎ結合グリカンを構成するコアオリゴ糖構造の一部であるα結合マンノース残基に特異的）、ビオチニル化されたイヌエンジェ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）のレクチン（ＭＡＬ、ＳＡα２，３−ｇａｌに特異的）、およびビオチニル化されたセイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）のアグルチニン（ＳＮＡ、ＳＡα２，６−ｇａｌに特異的）（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ；０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中に１０μｇ／ｍｌ）とともに３時間インキュベートした。ＴＢＳＴ（１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）での洗浄の後、切片を、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５４６ストレプトアビジン（０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。スライドをＴＢＳＴで洗浄し、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザースキャン共焦点顕微鏡）下で観察した。全てのインキュベーションは室温（ＲＴ）で行った。
【０２３０】
図１０のデータは、以下の方法を使用して作成した。細胞（約７０×１０６）を、それらが１００ｍＭのクエン酸塩生理食塩を用いて＞９０％のコンフルエントになった時点で回収し、細胞膜をプロテアーゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）での処理とホモジナイザーションの後に単離した。細胞膜画分をＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、反応混合物を３７℃で一晩インキュベートした。反応混合物を１０分間沸騰させて酵素を失活させ、脱グリコシル化されたペプチドとタンパク質をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して取り出した。グリカンをさらに脱塩し、黒鉛化炭素固相抽出カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を使用して、中性の画分（２５％アセトニトリルの画分）と酸性画分（０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルの画分）に精製した。酸性画分を、ソフトイオン化条件（加速電圧２２ｋＶ、格子電圧９３％、ガイドワイヤ０．３％、および１５０ｎｓの抽出遅延時間）を用いて、それぞれポジティブモードとネガティブモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。ピークを固化していない種として較正した。α２−６シアリル化グリカンの優勢な発現が、シアリダーゼＡおよびＳを使用した試料の事前の処理によって確認された。単離されたグリカンを、その後、最終容量１００ｍＬの５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）の中の０．１ＵのＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓのシアリダーゼ（シアリダーゼＡ、非特異的）または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のシアリダーゼ（シアリダーゼＳ、α２−３シアリル化グリカンに特異的）とともに、３７℃で２４時間インキュベートした。中性画分と酸性画分を、それぞれ、ポジティブモードとネガティブモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。
【０２３１】
（実施例６）
ヒトの肺組織に対するＨ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの用量応答結合
気管組織のアピカル側は、長い分岐トポロジーを有しているα２−６グリカンを主に発現する。一方、肺胞組織はα２−３グリカンを主に発現する。Ｈ１  ＨＡは、気管のアピカル面に対して有意に結合し、その結合は、４０から１０μｇ／ｍｌまでの稀釈にともなって徐々
に減少する（図１９）。Ｈ１  ＨＡはまた、最も高い濃度でのみ、肺胞組織に対していくらかの弱い結合を示す。Ｈ３  ＨＡの結合パターンは、Ｈ３  ＨＡが、４０および２０μｇ／ｍｌで気管と肺胞の組織切片の両方に対して有意な結合を示すという点で、Ｈ１  ＨＡとは異なる（図１９）。しかし、１０μｇ／ｍｌの濃度では、ＨＡは、主に気管組織のアピカル側に対する結合を示し、肺胞組織に対しては結合をほとんどから全く示さない。まとめると、組織結合データは、１）気管組織のアピカル側に対するＨ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの高親和性での結合、ならびに、２）Ｈ３  ＨＡはα２−３に対する親和性（α２−６よりも相対的に低い）を示すが、Ｈ１  ＨＡはα２−６に対して特異性が高いことを指摘している。
【０２３２】
図１９のデータは、以下の方法を使用して作成した。ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋したヒトの組織肺と気管の切片は、それぞれ、ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃから、そしてＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。組織切片についてパラフィン除去を行い、再水和させ、非特異的結合を防ぐために、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡとともに３０分間インキュベートした。Ｈ１Ｎ１  ＨＡおよびＨ３Ｎ２  ＨＡを一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ、Ａｂｃａｍ）、および二次抗体（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、それぞれ４：２：１の割合で、氷上で２０分間かけて予め複合体化させた。形成した複合体を４０、２０、または１０μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度になるように、１％のＢＳＡ−ＰＢＳの中に希釈した。その後、組織切片を、ＨＡ抗体複合体とともに、ＲＴで３時間インキュベートした。切片をヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＢＳＴ中の１：１００）で対比染色し、十分に洗浄し、その後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザースキャン共焦点顕微鏡）下で観察した。
【０２３３】
（実施例７）
様々なトポロジーのグリカンに対する野生型ＨＡポリペプチドの用量応答直接結合
本明細書中に記載したように、本発明には、本明細書中で「アンブレラ」トポロジーと呼ばれる特定のトポロジーを有しているグリカンに対するＨＡポリペプチドによる結合が、ヒト宿主の感染を媒介するＨＡポリペプチドの能力と相関関係があることの認識が含まれる。本実施例には、様々な宿主の感染を媒介する様々なＨＡポリペプチドを用いた直接結合実験の結果を記載し、ヒトの感染とアンブレラグリカンへの結合との間の相関関係を説明する。
【０２３４】
直接結合アッセイでは、通常は、定義されたグリカン構造（例えば、１価または多価）が、多くの場合にはポリマー骨格を使用して支持体（例えば、硝子スライドまたはウェルプレート）上に提示されるグリカンアレイを利用する。いわゆる「連続」アッセイにおいては、三量体ＨＡポリペプチドがアレイに結合させられ、その後、例えば、標識された（例えば、ＦＩＴＣまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された）一次および二次抗体を使用して検出される。「多価」アッセイにおいては、三量体ＨＡが、最初に、一次抗体および二次抗体（通常は、４：２：１のＨＡ：一次抗体：二次抗体の割合で）と複合体を形成させられ、その結果、１つの予め複合体化させられたＨＡあたり１２のグリカン結合部位が存在し、その後、これがアレイと接触させられる。結合アッセイは、通常は、ＨＡ濃度の範囲全体にわたって行われ、その結果、アレイの中の様々なグリカンについての相対的な親和性に関する情報が得られる。
【０２３５】
例えば、直接結合実験を、３’ＳＬＮ、６’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、６’ＳＬＮ−ＬＮ、および３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮのような様々なグリカンを有しているアレイを用いて行った。ここで、ＬＮはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを示し、３’はＮｅｕ５Ａｃα２−３を示し、そして６’はＮｅｕ５Ａｃα２−６を示す。具体的には、ビオチニル化されたグリカン（５０μｌの１２０ｐｍｏｌ／ｍｌ）を、事前にＰＢＳで３回リンスした、ストレプトアビジンでコーティングしたＨｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ３
８４−ウェルプレートとともに一晩（ＰＢＳ中、４℃）インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで３回洗浄して過剰なグリカンを除去し、さらに処理することなく使用した。
【０２３６】
適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ）を、４：２：１のＨＡ：一次抗体：二次抗体の割合で、氷上で１５分間インキュベートした。その後、混合物（すなわち、事前に複合体を形成させたＨＡ）を、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡで２５０μｌの最終容量とした。５０ｕｌの事前に複合体を形成させたＨＡを、次いで、３８４ウェルプレートの中のグリカンでコーティングしたウェルに添加し、これを室温で２時間インキュベートした。続いて、ウェルを、０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＰＢＳで３回洗浄した。ＨＲＰ活性を、製造業者の説明書にしたがってＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して評価した。ＨＡプレ複合体の段階稀釈物について実験を行った。適切なネガティブ（非シアリル化グリカン）対照とバックグラウンド（グリカンを含まない、またはＨＡを含まない）対照を含め、全てのアッセイを３連で行った。結果を図２０に示す。
【０２３７】
既知のヒトに適応したＨ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの結合パターンの１つの特徴は、４０μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまで減少する稀釈範囲全体にわたる、長いα２−６（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に対する飽和レベルでのそれらの結合である（図２０）。Ｈ１  ＨＡは、長いα２−６に対する結合について特異性が高いが、Ｈ３  ＨＡはまた、短いα２−６（６’ＳＬＮ）に対しても高い親和性で、そして長いα２−３に対しては、α２−６と比較してより低い親和性で結合する（図２０）。Ｈ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの直接的な結合の用量応答は、組織結合パターンと一致する。さらに、長いα２−６に対するＨ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの高親和性の結合は、長い分岐トポロジーを有しているα２−６グリカンを発現する気管組織の先端面に対するそれらの広範囲の結合と相関関係がある。この相関関係により、ヒトに適応したＨ１  ＨＡおよびＨ３  ＨＡの上気道組織向性についての有用な知見が得られた。一方、試験したＨ５  ＨＡは、これが、α２−６に対するその比較的低い親和性（有意なシグナルは、２０〜４０μｇ／ｍｌでしか見られない）と比較して、α２−３に対して高い親和性（４０から２．５μｇ／ｍｌに低下するまでの飽和シグナル）で結合するという、反対のグリカン結合傾向を示した（図２０）。
【０２３８】
等価物
当業者は、本明細書中に記載された本発明の特異的な実施形態についての多くの等価物を、日常的に行われる実験以上の実験を使用することなく、理解するか、または確認できるであろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されるようには意図されるのではなく、以下の特許請求の範囲に示されるとおりである。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンブレラトポロジーグリカンとＨＡポリペプチドとの間でのグリカン−ＨＡポリペプチド相互作用と競合する薬剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＨＡポリペプチドがウイルス粒子の表面にある、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ＨＡポリペプチドのうちの前記相互作用に関与する残基が、残基１３７、１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９６、２２２、２２５、２２６、２２８およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるものを含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記アンブレラトポロジーグリカンが、長いα２−６シアリル化グリカンを含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記長いα２−６シアリル化グリカンが、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα２−６Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−６ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌα２−３Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−３／６ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６Ｇａｌα２−３／６Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃからなる群より選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記薬剤がグリカン、低分子および糖模倣物からなる群より選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記薬剤がポリペプチドである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記薬剤がＨＡポリペプチドである、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記薬剤が、ＨＡポリペプチド変異体である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記薬剤が、アンブレラトポロジーグリカンに対して、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡについて匹敵する条件下で観察される親和性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％の親和性で結合する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記薬剤が、アンブレラトポロジーグリカンに対して、それらがコーントポロジーグリカンに対して結合するよりも強く結合する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記薬剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも１０、少なくとも９、少なくとも８、少なくとも７、少なくとも６、少なくとも５、少なくとも４、少なくとも３または少なくとも２の相対的親和性を示す、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記相互作用が、前記ＨＡポリペプチドとヒトの上気道上皮細胞、気管支および／または気管、および／または肺深部上に見られる受容体との間で起こる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
グリカン−ＨＡポリペプチド相互作用と競合する薬剤を同定する方法であって、該方法は：
試験薬剤のコレクションを提供する工程；
該試験薬剤を少なくとも１つのアンブレラトポロジーグリカンおよび該アンブレラトポロジーグリカンに結合する少なくとも１つのＨＡポリペプチドと接触させる工程；ならびに
該薬剤が存在しない場合と比較して、該薬剤が存在する場合に、該少なくとも１つのアンブレラトポロジーグリカンと該少なくとも１つのＨＡポリペプチドとの間で観察された結合が減少することを決定する工程
による、方法。
【請求項１５】
アンブレラトポロジーグリカンについて高親和性を有する薬剤を同定する方法であって：
試験薬剤のコレクションを提供する工程；
該試験薬剤を少なくとも１つのアンブレラトポロジーグリカンと接触させる工程；および
該少なくとも１つのアンブレラトポロジーグリカンと該試験薬物との間の観察される結合が高親和性で起こることを決定する工程
による、方法。
【請求項１６】
前記ＨＡポリペプチドのうちの前記相互作用に関与する残基が、残基１３７、１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９６、２２２、２２５、２２６および２２８、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される残基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンブレラトポロジーグリカンが、長いα２−６シアリル化グリカンを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記長いα２−６シアリル化グリカンが、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα２−６Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−６ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌα２−３Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−３／６ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６Ｇａｌα２−３／６Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃからなる群より選択される。請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験薬剤が、グリカン、低分子および糖模倣物からなる群より選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験薬剤がポリペプチドである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記試験薬剤がＨＡポリペプチドである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記試験薬剤がＨＡポリペプチド変異体である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記試験薬剤がアンブレラトポロジーグリカンに対して、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡについて匹敵する条件下で観察される親和性の少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％の親和性で結合する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記試験薬剤が、アンブレラトポロジーグリカンに対して、それらがコーントポロジーグリカンに対して結合するよりも強く結合する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記試験薬剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも１０、少なくとも９、少なくとも８、少なくとも７、少なくとも６、少なくとも５、少なくとも４、少なくとも３または少なくとも２の相対的親和性を示す、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２６】
試料中のＨＡポリペプチドを検出する方法であって、ここで該ＨＡポリペプチドは、アンブレラトポロジーグリカンに結合する、方法。
【請求項２７】
前記試料は、病理学的試料である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記病理学的試料は、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変のスワブ、脳脊髄液、頸管スミア、膿試料、フードマトリックス、ならびに、脳、脾臓、および肝臓に由来する組織、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料は環境試料である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記環境試料は、土壌、水、および微生物叢からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料は、研究室試料である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記研究室試料は、研究者によって設計および／または調製された、操作されたＨＡポリペプチドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アンブレラトポロジーグリカンが長いα２−６シアリル化グリカンを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
アンブレラトポロジーグリカンに対して高親和性を有する試験薬剤を評価する方法であって、
アンブレラトポロジーグリカンを有するＨＡに対する該薬剤の結合能力を決定し、それによって該薬剤を評価する工程
を包含する、方法。
【請求項３５】
アンブレラトポロジーグリカンに対して高親和性を有する薬剤を含むデバイスであって、薬剤の用量を被験体の気道に投与するように構成されている、デバイス。
【請求項３６】
ヒト上気道組織におけるＨＡ受容体に見られるグリカンのうちの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより高いグリカン構造を含むグリカンアレイ。
【請求項３７】
アンブレラトポロジーグリカンに結合する抗体。