【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年1月4日(2011.1.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
第一の側面において、本発明は、実質的に同じ条件下で培養した場合に、PTS宿主細胞内の対応する同じ代謝経路と比較して、形質転換宿主細胞の代謝経路への炭素流量が増えることを特徴とし、a)プロモーター及びグルコース同化タンパク質の上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含むDNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、宿主細胞内のグルコース同化タンパク質をエンコードする核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾；b)Glu+表現型を復元するためのDNA構築物の組込み、及びc)形質転換された宿主細胞の適切な条件下の培養を含む、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を本来有するPTS-/Glu-宿主細胞の代謝経路への炭素流量を増やす方法に関係する。本方法のある態様においては、プロモーターは非宿主細胞プロモーター、又は、修飾された内生プロモーターである。第2の態様では、グルコース同化タンパク質はグルコーストランスポーター、好ましくは、大腸菌由来ガラクトパーミアーゼ、又はこれらと少なくとも80％配列が相同であるグルコーストランスポーターである。第3の態様では、グルコース同化タンパク質は、リン酸タンパク質、好ましくは、大腸菌由来グルコキナーゼ又はこれと少なくとも80％配列が相同であるグルコキナーゼである。第4の態様では、細菌宿主細胞は、大腸菌細胞、バシルス細胞及びパンテア細胞の群より選択される。第5の態様では、PTS-/Glu-宿主細胞は、ptsl、ptsH及びcrrよりなる群から選択される1以上の遺伝子が欠失されたPTS細胞から得られる。第6の態様では、PTS-/Glu-宿主細胞は、トランスアルドラーゼ、フォスフォエノールピリビン酸シンターゼ、DAHPシンターゼ、DHQシンターゼ、DHQデデハイドラターゼ、シキメイトデハイドロゲナーゼ、シキメイトキナーゼEPSPシンターゼ及びコリスメイトシンターゼからなる群より選択されるタンパク質をエンコードしているポリヌクレオチドにより形質転換される。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
第二の側面では、本発明は、第一の側面で述べた方法及び、さらに、プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードする核酸配列と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾を含む方法に関係する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
第三の側面では、本発明は、目的とするタンパク質が、ピルビン酸、PEP、乳酸塩、酢酸、グリセロール、スクシニル、エタノール及びコリスミ酸からなる群より選択され、a) DNA構築物が、グルコース同化タンパク質をエンコードしている核酸と作動可能に連結している内生プロモータと置換され、 PTS-/Glu-宿主細胞の染色体上に組み込まれることを特徴とする、プロモーターを含むDNA構築物を用いるPTS-/Glu-表現型細菌宿主細胞の形質転換、b)該形質転換された宿主細胞の適切な条件下での培養 c)PTS-/Glu+表現型を得るためのグルコース同化タンパク質の発現をさせること、及びd) 実質的に同じ培養条件で培養された対応するPTS宿主細胞内で生産される目的生成物の量と比較して、増量された目的生成物の量を形質転換された宿主細胞内で得ることを含む、糖質輸送に対する、本来PTSを利用する能力を有しているPTS-/Glu-細菌宿主細胞内で目的生成物の生産を増やす方法に関係する。ある態様では、宿主細胞は、大腸菌細胞、バシルス細胞及びパンテア細胞からなる群より選択される。第2の態様では、グルコース同化タンパク質は、大腸菌由来のガラクトースパーミアーゼ又はそれらと少なくとも80％配列相同性を有するグルコーストランスポーターである。第3の態様では、グルコース同化タンパク質は大腸菌由来グルコキナーゼ又は少なくともそれらと70％の配列相同性を有するグルコキナーゼである。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
第四の側面では、本発明は、a)プロモーター及び、ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第一DNA構築物を有するPTS-/Glu-宿主細胞形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトパーミアーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾、b)プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第二DNA構築物を有するPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾、c)第一DNA構築物が、ガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの両者が、宿主細胞内で発現し、両発現が、形質転換された宿主細胞内への炭素流量が、組換えが起こっていないPTS-/Glu-細菌細胞に対応する同じ代謝経路内への炭素流量と比較して、増えることを特徴とする、第一DNA及び第二DNAの組換えを含む、本来糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を有するPTS-/Glu-細菌宿主細胞の代謝経路内への炭素流量を増やす方法に関係する。ある態様では、この代謝経路は、芳香環経路である。第二の態様では、この方法は、さらにトランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びフォスフォエノールピルビン酸シンターゼから選択されるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを有する形質転換PTS-/Glu-宿主細胞を含む。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
第五の側面では、本発明は、a)プロモーター及びグルコーストランスポーターの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコーストランスポーターをエンコードしている核酸と、作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾、b)グルコーストランスポーターをエンコードしている核酸の内生のプロモーターを置換するDNA構築物の組換え及び、c)PTS-/Glu-宿主細胞へGlu+表現型を復元させる、グルコーストランスポーターの発現を含む、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を本来有するPTS-/Glu-細菌宿主細胞へGlu+表現型を復元させる方法に関係する。好ましい態様では、この方法は、第五の側面に応じた方法に、プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、このPTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸に作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾；第二DNAグルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換される第二DNA構築物の組換えをさせること；及びグルコキナーゼを発現させることを、さらに含む。ある態様では、Glu+表現型を復元した細胞は少なくとも約0.4hr-1の特定の成長速度を有する。他の態様では、グルコーストランスポーターは、ガラクトースパーミアーゼである。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
第六の側面においては、本発明は、a)糖質輸送に関するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を有する、PTS-/Glu-表現型を有する細菌宿主細胞の選択；b) DAN構築物が、グルコース同化タンパク質をエンコードする核酸と作動可能に結合している内生プロモーターと置き換わるように宿主細胞内へ組み込まれることを特徴とする、プロモーターを含む、DNA構築物を用いた、前記細菌宿主細胞の形質転換を含む、選択された細菌宿主細胞の内生染色体調節領域の修飾；c)適切な環境下における形質転換された細菌宿主細胞の培養；及びd) PEPの利用度が、実質的に同じ培養条件で培養された非形質転換PTS宿主細胞に対応するPEP利用度と比較して、増加していることを特徴とする、PTS-/Glu+表現型を有する形質転換された宿主細胞を得るための、グルコース同化タンパク質の発現をさせること、を含む、細菌宿主細胞内のフォスフォエノールピルビン酸(PEP)利用能を増加させる方法に関係する。一の態様では、グルコース同化タンパク質は、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコースパーミアーゼの内生プロモーターと置き換わる外来プロモーターを含むDNA構築物である。他の態様では、グルコース同化タンパク質は、グルコキナーゼ及びグルコキナーゼの内生プロモーターと置き換わる外来プロモーターを含むDNA構築物である。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
第八の側面では、a)外来プロモーター及びガラクトースパーミアーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合する内生染色体調節領域の修飾、b)外来プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合する内生染色体調節領域の修飾、c)第一DNA構築物がガラクトパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置き換わり、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置き換わる、第一及び第二DNA構築物の組込み、d)適切な環境下における形質転換宿主細胞の培養及びe)実質的に同じ培養条件で培養された対応する非形質転換PTS細菌宿主細胞の成長速度と比較して、速い特定の成長速度を有する形質転換された細菌細胞を得るために、修飾された調節領域から、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの発現をさせること、を含む、糖質輸送に対する、フォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を本来有している、PTS-/Glu-宿主細胞の成長速度を増加させる方法に関係す
る。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
第九の側面は、本発明は、a)外来プロモーター及びガラクトースパーミアーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む、第一DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換によって、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードする核酸と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾；b)外来プロモーター及びグルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域を含む、第二DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードする核酸と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾；c)ガラクトースパーミアーゼの発現及びグルコキナーゼの発現をさせるための、形質転換された大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の適切な環境下における培養；及びd)目的生成物がエタノール、コリスミ酸又はコハク酸であり、実質的に同じ培養条件において培養された対応する大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内の目的物質の量と比較して、増量された、形質転換された大腸菌内の目的生成物を得ることを含む、糖質輸送に対する、PTSを利用する能力を本来有するPTS-/Glu-大腸菌宿主細胞内の目的生成物の生産を増やす方法に関係する。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６７】
KLpts7/pMCGG内のグルコース輸送システムをエンコードしているプラスミドは、この系統に高い細胞密度(図10A)とグリセロール及び1,3-プロパンジオールの生産(図10B)をさせた。しかしながら、細胞質量に対するグリセロール及び1,3-プロパンジオールの量は、OD600が194のときに、1,3-プロパンジオールが約7g/Lと、低かった。対照的に図11に示すように、KLgaIP-ptrcは、発酵における細胞質量は少なかったが、生成物は、OD600が70（図１１Ａ）であるときに、約61g/Lの1,3-プロパンジオール及び36g/Lのグリセロール（図１１Ｂ）を生産した。