【手続補正書】
【提出日】平成22年10月18日(2010.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モナチンを生成するための経路におけるある反応の生成物を、モナチンを生成するための経路における他の反応の反応物として再生するための方法であって、
Ｌ−トリプトファンが反応してＩ３Ｐを生成する場合に、アルファ−ケト基質からＬ−アミノ酸を生成し、
アミノ酸ラセマーゼを用いてＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換し、
Ｉ３ＰからＭＰを生成し、
ＭＰを反応させてモナチンを形成し、次いで
ＭＰが反応してモナチンを形成する場合に、Ｄ−アミノ酸からアルファ−ケト基質を再生成することを含み、
アルファ−ケト基質は、アルファ−ケトグルタル酸、オキサロ酢酸、ピルビン酸、およびその組合せから選ばれ、
アミノ酸ラセマーゼは、アルファ−ケト基質がピルビン酸である場合、アラニンラセマーゼであり、アルファ−ケト基質がアルファ−ケトグルタル酸である場合、グルタミン酸ラセマーゼであり、アルファ−ケト基質がオキサロ酢酸である場合、アスパラギン酸ラセマーゼであることを特徴とする該方法。
【請求項２】
該アラニンラセマーゼが、バチルス・ステアロサーモフィルスからのアラニンラセマーゼおよびゲオバチルス・ステアロテルモフィルスからのアラニンラセマーゼの熱安定性相同体から選ばれ、該グルタミン酸ラセマーゼが、Ｌ．ブレビスグルタミン酸ラセマーゼおよびＰ．ペントサセウスグルタミン酸ラセマーゼから選ばれ、該アスパラギン酸ラセマーゼはＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社のＡＳＰＲ−１０１であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｉ３ＰからのＭＰの生成が、Ｒ−ＭＰをＳ−ＭＰに対して約１：１よりも大きな比で優先的に生成する１つまたは複数のアルドラーゼ酵素によって促進されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つまたは複数のアルドラーゼ酵素が、Ｒ特異的アルドラーゼ酵素であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｌ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成し、
Ｄ−トリプトファンからＩ３Ｐを生成し、
Ｉ３ＰからＲ−ＭＰを生成し、次いで
Ｒ−ＭＰからモナチンを生成することを含む経路を介してＲ，Ｒモナチンまたはその塩を生成することを含むことを特徴とする方法であって、
Ｌ−トリプトファンからのＤ−トリプトファンの生成は、トリプトファンラセマーゼ、トリプトファンラセマーゼの活性を有するラセマーゼ、広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有するラセマーゼ、およびその組合せから選ばれる１つまたは複数の酵素によって促進され、
トリプトファンラセマーゼの活性を有するラセマーゼは、配列番号４１に対応し、Ｙ３５４Ｃ突然変異、Ｙ３５４Ｔ突然変異、Ｙ３５４Ｇ突然変異、Ｙ３５４Ｌ突然変異、Ｙ３５４Ｎ突然変異、Ｙ３５４Ｓ突然変異、Ｙ３５４Ｉ突然変異、Ｙ３５４Ｍ突然変異、Ｙ３５４Ｐ突然変異、ならびにＹ３５４Ａ、Ｍ３５Ｖ、およびＲ１９５Ｈの突然変異の組合せから選ばれる突然変異を有するアラニンラセマーゼ、配列番号４３のアラニンラセマーゼ、配列番号４１に対応し、Ｍ３５Ｃ突然変異、Ｆ６６Ｅ突然変異、Ｙ３５４Ａ突然変異、およびＰ１９７Ｌ突然変異ならびにその組合せから選ばれる突然変異を有するアラニンラセマーゼから選ばれ、
広域特異性アミノ酸ラセマーゼは、
ａ）配列番号１２０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｙ３９６Ｃ突然変異を有する、配列番号１２０に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２８の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号１２８に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ビブリオ・フィシェリからのアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＷ８５２３０．１のアラニンラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿２０４１１８のアラニンラセマーゼ、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス・プチダ（シュードモナス・ストリアタとしても知られている）から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１６の配列を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＺＰ＿００８９８３３２．１  ＧＩ：８２７３５４７０の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ４６８３からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｉ３８４Ｍ突然変異を有する、配列番号２０４に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＫＴ２４４０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＮＢＲＣ１２９９６から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＡＴＣＣ７９６６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、シュードモナス株２１５０から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オレオボランスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．オーレオファシエンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダ１２６３３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．フルオレッセンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．プチダＳＣＲＣ７４４から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．グラベオレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、Ｐ．ストリアタＡＫＵ０８３から単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する、シュードモナス・タエトロレンスから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０４のアミノ酸２４〜４０９を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ジャンデイから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ４９５７２からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９４の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ソブリアから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、ＡＴＣＣ３５９９４からの広域特異性ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９２の広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｌ３８３Ｍ突然変異を有する、ＡＴＣＣ１４４８６からの広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９５を含む遺伝子によってコードさ���た広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号１９６を含む遺伝子によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０１を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、配列番号２０２を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、エロモナス・キャビエからのアミノ酸ラセマーゼに対応する酵素、Ｄ７６Ｎ突然変異を有する、配列番号１７９に対応する広域特異性アミノ酸ラセマーゼの活性を有する酵素、エロモナス・ハイドロフィラから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７７のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４６を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、エロモナス・キャビエから単離された広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１７９のアミノ酸２２〜４０８を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５５の部分配列を含有する広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１の広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、およびその活性断片、
ｂ）ａ）の広域特異性アミノ酸ラセマーゼのいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列およびその活性断片を含む酵素、
ｃ）Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０９６１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１１９によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１２７によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＣＰ  ００００２０．１  ＧＩ：５９４７８７０８の領域８００８４２．．８０２０５３によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＣ＿００６８４０によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＫＴ２４４０  Ｂａｒ  ＤＮＡによってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＹ３９６Ｃ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１１９に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１２７に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５１を含む広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１５４を含む配列によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、ＮＺ＿ＡＡＬＭ０１０００００２ヌクレオチド５３１７３．．５４４０２によってコードされた広域特異性アミノ酸ラセマーゼ、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＩ３８４Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１４０に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ラセマーゼがＬ３８３Ｍ突然変異を含むような置換を有する、配列番号１７８に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１９３に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、配列番号１７６に対応する核酸配列によってコードされた広域特異性ラセマーゼ、ならびに
ｄ）ｃ）の広域特異性アミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む酵素
から選ばれ、
Ｒ−ＭＰからのＲ，Ｒモナチンの生成は、広域特異性を有するＤ−アミノトランスフェラーゼによって促進される該方法。
【請求項６】
Ｄ−トリプトファンからのインドール−３−ピルビン酸の生成が１つまたは複数の酵素によって促進され、Ｒ−モナチン前駆体からのＲ，Ｒモナチンの生成がＤ−トリプトファンからのインドール−３−ピルビン酸の生成を促進する酵素と同じ１つまたは複数の酵素によって促進されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ−ＭＰからのＲ，Ｒモナチンの生成が、
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼのうちの１つまたは複数から選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼの活性を有する酵素、
ｂ）ａ）の酵素のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有する配列を含む酵素、
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼとバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼのハイブリッドであるハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、または
ｄ）ａ〜ｃの組合せ
から選ばれる広域特異性Ｄ−アミノトランスフェラーゼによって促進されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ｉ３ＰからのＲ−ＭＰの生成が、Ｒ−ＭＰをＳ−ＭＰに対して１：１よりも大きな比で優先的に生成するアルドラーゼ酵素によって促進されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
アルドラーゼ酵素がＲ特異的アルドラーゼ酵素であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異の組合せ、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異の組合せから選ばれる突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼ、
ｂ）ａ）のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有し、突然変異を有する配列を含む酵素、
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、およびバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼから選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼ、ならびに
ｄ）ａ）〜ｃ）の組合せ
から選ばれるＤ−アミノトランスフェラーゼを用いてＤ−トリプトファンをアミノ基転移することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
モナチンを生成することをさらに含み、少なくとも１つの精製工程をさらに含み、該Ｒ，Ｒモナチンが、全有機化合物の少なくとも約６０重量％の純度の程度まで精製されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生成されたモナチンの少なくとも約７５重量％が、Ｒ，Ｒモナチンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
生成されたモナチンの少なくとも約８０重量％が、Ｒ，Ｒモナチンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼの存在下でモナチン前駆体を反応させて、モナチンを生成することを含み、１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼは、
ａ）Ｔ２４３Ｓ突然変異、Ｔ２４３Ｎ突然変異、Ｎ１００Ａ突然変異、Ｔ２４３Ｑ突然変異、Ｔ２４３ＮおよびＮ１００Ａの突然変異の組合せ、Ｆ２００Ｍ突然変異、Ｆ２００Ｙ突然変異、ならびにＦ２００ＭおよびＴ２４３Ｎの突然変異の組合せまたはその組合せから選ばれる突然変異を有する、配列番号８６に対応するＤ−アミノトランスフェラーゼ、
ｂ）ａ）の酵素のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性パーセントを有し、突然変異を含むＤ−アミノトランスフェラーゼ酵素、ならびに
ｃ）バチルス・ハロデュランスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼとバチルス・スファエリクスＤ−アミノトランスフェラーゼのハイブリッドであるハイブリッドＤ−アミノトランスフェラーゼ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルスＤ−アミノトランスフェラーゼ、バチルス・リケニホルミスＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ４９７８からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣＣ７０６３からのＤ−アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するバチルス・リケニホルミス分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、またはその組合せから選ばれる１つまたは複数のＤ−アミノトランスフェラーゼ
から選ばれることを特徴とする方法。