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　特願２００２−１３８１４１「ニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１５年１１月１８日出願公開、特開２００３−３２５１７２〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯
　本願は平成１４年５月１４日を出願日とする特許出願であって，平成１９年１２月２１日付で拒絶査定がなされ，平成２０年２月７日に拒絶査定不服審判が請求され，平成２２年１２月２７日付で当審による拒絶理由が通知され，平成２３年３月７日に特許請求の範囲について手続補正がなされたものである。
　
２．本願発明
　本願の請求項１に係る発明(以下，「本願発明」という。）は，平成２３年３月７日付手続補正書によって補正された特許請求の範囲に記載された以下のとおりのものである。
「【請求項１】ニトリルヒドラターゼ凍結体を解凍する際に，解凍浴槽水温を５〜２５℃とするニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法であって，ニトリルヒドラターゼ凍結体が，酵素を含む遺伝子組換え大腸菌菌体，酵素を含む遺伝子組換え大腸菌の固定化物，および酵素を含む遺伝子組換え大腸菌を含む培養液からなる群から選ばれる少なくとも１種の凍結体であることを特徴とするニトリルヒドラターゼ凍結体の解凍方法。」
　
３．引用例
（１）引用例１
　当審による拒絶の理由で引用された，本願出願日前に頒布された刊行物である，FEMS, Microbiology Letters, 1995, Vol.129, p.57-61には，以下の事項が記載されている。
　
ア．「Rhodococcus AJ270由来のニトリルヒドラターゼによる位置−及び立体−特異的ニトリル加水分解」（第５７頁標題）
　
イ．「アセトニトリルを利用する細菌AJ270が土壌から単離され，Rhodococcus菌種として同定され，その属の全ての認識された種と異なるものであることが示された。それは試験された３６の脂肪族，芳香族及び複素環芳香族のニトリルのうち３２のニトリルでよく成長し，高濃度（0.25−0.38Ｍ）のアセトニトリル，ベンゾニトリル及び３−シアノピリジンで急成長することができる。Rhodococcus AJ270のニトリルヒドラターゼは−２０℃で１８ヶ月間の貯蔵において安定であり，非常に広範な範囲のニトリル及びジニトリルに対して活性を持ち，位置特異的及び立体特異的なニトリル生体内分解を触媒することができる。AJ270の頑強な多用途の生体触媒としての適合性が議論される。」（第５７頁要約）
　
ウ．「ニトリルヒドラターゼ解析のための細菌は，３０℃で０．２５Ｍアセトニトリルを補充された５００ｍｌのミネラル培地を含む２リットル振盪フラスコで生育された。培養物は対数期後期（約２０時間後）に遠心分離により回収され，０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．２（緩衝液Ａ）で２度洗浄し，同じ緩衝液に再懸濁された。」（第５８頁左欄第１８〜２４行）
　
エ．「ｐＨ７での割合の＞６５％はｐＨ５〜９の範囲にわたって観察されたが，最も高い割合のアセトニトリル加水分解は，３０℃，ｐＨ７．０で観察された。−２０℃で貯蔵された細胞ペレットは，１８ヶ月後に最初の活性の８０％を保持していた。」（第６０頁左欄第９〜１３行）
　
　上記記載事項ア〜エによれば，引用例１には，ニトリルヒドラターゼを含むRhodococcus AJ270菌体のペレットを−２０℃で保存した後，活性を測定したことが記載されている。
　
（２）引用例２
　当審による拒絶の理由で引用された，本願出願日前に頒布された刊行物である，特開平９−２７５９７８号公報には，以下の事項が記載されている。
　
ア．「本発明は，シュードノカルディア・サーモフィラ（
Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ
　
イ．「ニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に製造するためには，アミド化合物の製造コストに占める該酵素の製造コストを下げることが重要であり，より具体的には単位微生物重量・単位時間あたりのアミド化合物の生成速度（以下，菌体活性と呼ぶ）を高くする必要がある。そこで，該酵素の遺伝子を用いて遺伝子工学の手法により該酵素を大量に発現させることを目的として，該酵素の遺伝子をクローニングする試みが検討されている。例えば，コリネバクテリウム属（特開平２−１１９７７８），シュードモナス属（特開平３−２５１１８４），ロドコッカス属ロドクロウス種（特開平４−２１１３７９），リゾビウム属（特開平６−２５２９６），クレビシエラ属（特開平６−３０３９７１）を挙げることができる。」（段落【０００３】）
　
ウ．「［実施例３］形質転換菌株の造成
　ｐＰＴ−Ｂ１上のｌａｃプロモーターの転写方向とＯＲＦ１及びＯＲＦ２の転写方向は完全に一致していた。そこで，ｐＰＴ−Ｂ１上のニトリルヒドラターゼ遺伝子の５’末端側上流に位置し，かつ，ｐＰＴ−Ｂ１上の唯一の制限酵素サイトであるＸｂａＩおよびＮｓｐＶによりｐＰＴ−Ｂ１を切断し，アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い，アガロースゲルから約４．６ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後，５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させ，この融解液に対して実施例２と同様のフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行ってＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）により平滑末端化処理を行った後，ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）により自己連結させてプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１［図−２（図２）］を構築した。東洋紡績社製の大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセルを用いてｐＰＴ−ＤＢ１をＨＢ１０１株に導入し，形質転換菌株ＭＴ−１０８２２株を得た。これにより，本菌株においてニトリルヒドラターゼ遺伝子がｐＵＣ１８上のｌａｃプロモーターにより転写・翻訳されるようになった。ＭＴ−１０８２２株は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５として茨城県つくば市東１丁目１番３号にある工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。」（段落【００３５】）
　
（３）周知文献１
　当審による拒絶の理由で周知技術を示す文献として例示された，本願出願日前に頒布された刊行物である，特表平４−５００１５５号公報（以下，「周知文献１」という。）には，以下の事項が記載されている。
「冷凍した細胞を，好ましくは３０℃水浴中でのインキュベーションにより解凍し，室温で遠心分離により集める。」（第５頁左下欄第３〜４行）
　
（４）周知文献２
　当審による拒絶の理由で周知技術を示す文献として例示された，本願出願日前に頒布された刊行物である，特表平６−５０５９１３号公報（以下，「周知文献２」という。）には，以下の事項が記載されている。
　「混合物は，チューブをドライアイス／エタノール浴（約−７５℃），または液体窒素の中に１０分間浸すことによって，凍結し，２５℃の水浴中で解凍した。チューブは，１０分間水浴中に保った。」（第４頁左上欄第１３〜１７行）
　
（５）周知文献３
　当審による拒絶の理由で周知技術を示す文献として例示された，本願出願日前に頒布された刊行物である，特表２００１−５０９６７５号公報（以下，「周知文献３」という。）には，以下の事項が記載されている。
　「バイオリアクター培養物を，６日目にウイルスで接種した。ウイルス接種物を，−８０℃で凍結保存した。４５ｍｌの容量のウイルス接種物２−２を，２０〜２５℃の水浴中で解凍した。」（第３９頁第２〜４行）
　
（６）周知文献４
　当審による拒絶の理由で周知事項を示す文献として例示された，本願出願日前に頒布された刊行物である，特開昭６２−２５９５８６号公報（以下，「周知文献４」という。）には，以下の事項が記載されている。
「・・・ニトリルラーゼのニトリル水和活性は不安定で，温度や精製度を上げるにしたがい活性が低下することが判明した。」(第２頁左上欄第１３〜１５行）
　
（７）周知文献５
　当審による拒絶の理由で周知事項を示す文献として例示された，本願出願日前に頒布された刊行物である，J.Chem.Tech.Biotechnol., 1990, Vol.48, p.217-226（以下，「周知文献５」という。）には，以下の事項が記載されている。
　
ア．「Rhodococcus属菌株が生産する新規なニトリルヒドラターゼが発見された。・・・本酵素は，室温でさえやや不安定である。本酵素はアクリルアミドの生産に利用できるであろう。本酵素のこの利用のための至適温度は，酵素が十分な活性と安定性を示す約４℃である。」（第２１７頁，要約の第１〜１２行）
　
イ．「図３は異なる温度でのヒドラターゼ活性を示す。酵素は１０℃以下で活性かつ安定であるが，一方，短い反応時間（５分）で使用されても，不活性化は２５℃を超える温度で顕著になる。」（第２２１頁第１８〜２０行）
　
（８）周知文献６
　当審による拒絶の理由で周知事項を示す文献として例示された，本願出願日前に頒布された刊行物である，J. Industrial Microbiology, 1990, Vol.5, p.71-78（以下，「周知文献６」という。）には，以下の事項が記載されている。
　
ア．「３−シアノピリジンはニトリルヒドラターゼを含むBrevibacterium R-312の全細胞によってニコチンアミドに水和される。動態学的研究に使用された細胞は，０．３０mgニコチンアミド／mg細胞（乾物）-分の初期活性を持ち，４℃，１０℃，２５℃及び３０℃での貯蔵半減期（pH8)は，それぞれ約１００日，１０日，５日及び１日未満である。」（第７１頁，要約第１〜４行）
　　
イ．「２５℃より高温でのルーチンアッセイ試験は行わなかった。というのは，高温でのヒドラターゼの半減期が短すぎる（例えば，３０℃で１日未満）ためである。：そのような限られた安定性を有する細胞を使用することは実用的であるとは思われない。」（第７４頁左欄第１５〜１９行）　
　
（９）周知文献７
　当審による拒絶の理由で周知事項を示す文献として例示された，本願出願日前に頒布された刊行物である，Enzyme Microb.Technol., 1993, Vol.15, p.979-984（以下，「周知文献７」という。）には，以下の事項が記載されている。
　
「ｎ−酪酸を２０ｍＭより高濃度で加えると，ニトリルヒドラターゼは３０℃で３時間完全に安定化することができた。・・・遊離細胞を用いたニトリルヒドラターゼの相対活性が様々な溶液に貯蔵中に測定された。図２に示すように，２０ｍＭのn-酪酸を含む0.1Ｍ　NaH2PO4/Na2HPO4緩衝液（pH7.1)中では，遊離細胞は５℃で４８０時間以上酵素活性の損失なく貯蔵することができた。n-酪酸を含まない0.1Ｍ　NaH2PO4/Na2HPO4緩衝液（pH7.1)中に懸濁された遊離細胞の半減期は，２５℃で３５時間，及び５℃で２５０時間であった。さらに，２０ｍＭのn-酪酸を含む0.1Ｍ　NaH2PO4/Na2HPO4緩衝液（pH7.1)中に懸濁された遊離細胞の半減期は２５℃で１２５時間であった。」（第９８１頁左欄第６行〜右欄第１０行）
　
（１０）周知文献８
　当審による拒絶の理由で周知事項を示す文献として例示された，本願出願日前に頒布された刊行物である，J.Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, Vol.11, p.687-697（以下，「周知文献８」という。）には，以下の事項が記載されている。
　
ア．「休止全細胞のニトリルヒドラターゼの操作上の安定性が，継続的な攪拌ＵＦ−膜反応器におけるアクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換に続いてモニターされた。・・・しかしニトリルヒドラターゼの半減期は温度が４℃から１０℃に変わると，３３時間からおよそ７時間に落ち込んだ。」（第６８７頁要約第５〜９行）
　
イ．「２．２休止細胞の調整
　ニトリルヒドラターゼは全ての発酵条件での培養培地上清に活性がないことで確認されるように，細胞内酵素である。細胞は発酵の異なる時間で採取された。ブロスが１５分間，11,400rpmで遠心分離され，細胞は５０mMのNa2HPO4/NaH2PO4緩衝液，pH7.0の１００ml／洗浄で３回洗浄された。細胞ペーストはその後同じ緩衝液で稀釈され，反応の生体触媒の供給源として使用されるまで，冷蔵庫（−１８℃）で保管された。」（第６８８頁右欄下から４行〜第６８９頁左欄第７行）
　
４．対比
　引用例１の記載事項エによれば，１８ヶ月間凍結保存した後に酵素活性を測定していることから，凍結した微生物菌体を解凍して使用していることは明らかである。
　よって，本願発明と引用例１に記載された発明とは，酵素を含む菌体からなるニトリルヒドラターゼ凍結体を解凍して使用する点で一致し，以下の点で相違する。
相違点１：本願発明は，解凍する際に解凍浴槽を使用し，その水温を５〜２５℃とするのに対し，引用例１に記載された発明では，具体的な解凍方法が記載されていない点。
相違点２：本願発明は菌体が遺伝子組換え大腸菌であるのに対し，引用例1に記載された発明では，Rhodococcus AJ270である点。
　
５．判断
　上記相違点について検討する。
（１）相違点１について
　凍結した菌体等を水浴により温度を管理しながら解凍することは周知文献１〜３に記載されるように周知技術である。 
 　そして，ニトリルヒドラターゼが，温度が高い程不安定であり，酵素活性が低下することも，周知文献４〜８に記載されるように周知の事項であり，引用例1に記載された凍結保存した微生物菌体を解凍する際にも，ニトリルヒドラターゼの活性低下を防止することは，自明の課題である。
　してみると，引用例1に記載された凍結保存したニトリルヒドラターゼを含む微生物菌体を解凍して使用するに際し，水浴により酵素の活性を低下させない温度に管理しながら解凍を行うことは，当業者が容易に想到し得たものである。
　そして，解凍する水温が高過ぎれば酵素活性が低下し，また，水温が低過ぎれば解凍に時間がかかることになるから，それらを考慮して効率よく解凍できる水温の範囲を設定することには，当業者が適宜なし得ることに過ぎない。
　
（２）相違点２について
　引用例２には，アミド化合物の工業的製造に使用するために，遺伝子組換えによりニトリルヒドラターゼを大量生産することが従来から検討されてきたこと（記載事項イ），及び，ニトリルヒドラターゼを産生する遺伝子組換え大腸菌（記載事項ウ）が記載されており，このような遺伝子組換え大腸菌によって大量生産された酵素についても，アミド化合物の製造に使用するまでの間，その活性を低下せさずに保存する必要があるのは自明である。
　そして，引用例１に記載されたRhodococcus属菌と引用例２に記載された大腸菌とは，微生物の種類は異なるものではあるが，菌体内で生産される酵素は，同じニトリルヒドラターゼであり，上述のとおり，いずれも工業的に使用するまで安定に保存する必要性があるものであるから，引用例１に記載されたニトリルヒドラターゼを含む微生物菌体と同様に，引用例２に記載されたニトリルヒドラターゼを含む遺伝子組換え大腸菌菌体を凍結保存し，使用時において解凍して使用することは，当業者が容易に想到し得たものである。
　
（３）本願発明の効果について
　本願発明の実施例では，解凍温度が5〜25℃の範囲では，活性残存率が82〜95％と高いレベルの酵素活性を維持していたのに対して，解凍温度を30℃まで上昇させると，その活性残存率は15％にまで低下することが確認されている（段落【００３１】）。
　しかしながら，周知文献４〜８の各記載事項にあるように，ニトリルヒドラターゼは，低温であるほど安定性が高く，２５℃より高温になると不安定であることは周知事項であるから，２５℃までは活性残存率が高く，３０℃を超えると活性残存率が低下することは，上記周知事項から予測し得るものである。
　したがって，本願発明は，引用例１，２及び周知事項から予測し得ない顕著な効果を奏するものではない。
　
（４）請求人の主張について
　請求人は，平成２３年３月７日付意見書において，以下の点を挙げ，本願発明の進歩性を主張をしている。
ア．引用文献１,２のいずれにも，本願発明のように，温度を５〜２５℃に管理しながら遺伝子組換え大腸菌を解凍するという構成は，記載も示唆もない。
イ．周知文献１〜３には，二種類の真核生物の解凍温度が記載されているのみであるから，周知文献１〜３の記載から，原核生物である大腸菌の解凍温度，さらにはその好適な範囲について，少なくとも周知技術であると認識する程度まで決して読み取れるものでない。
ウ．周知文献４〜８それぞれにおいて，「（※どのような条件で解凍したか不明な）ニトリルヒドラターゼが，温度が高い程不安定であり，酵素活性が低下すること」が記載されているに過ぎない。この“温度”とは，ニトリルヒドラターゼがその酵素活性を発揮する際の“温度”であって，凍結保存したニトリルヒドラターゼを含む遺伝子組換え大腸菌を解凍する際の“温度”とは一切関係がない。すなわち，周知文献４〜８のいずれにも，凍結保存した遺伝子組換え大腸菌を解凍する際の温度について，記載も示唆もない。
　
　しかしながら，請求人も認めるとおり，周知文献４〜８には，「ニトリルヒドラターゼが，温度が高い程不安定であり，酵素活性が低下すること」が記載されている。
　そして，高温による酵素活性の低下は，タンパク質の立体構造が変化するためであり，このようなタンパク質の変性を防ぐために，タンパク質を常時低温に保つように取り扱うことは技術常識である（必要であれば，実験医学別冊　バイオマニュアルＵＰシリーズ　改訂版　分子生物学研究のためのタンパク実験法　1998年10月30日，（株）羊土社，第１８頁第１２行〜第１９頁第４行を参照。）。
　したがって，ニトリルヒドラターゼが高温で不安定であることが知られていれば，それを含む遺伝子組換え大腸菌の凍結体を解凍する際の適切な解凍温度について，周知文献４〜８に具体的な記載がなくとも，ニトリルヒドラターゼの変性の起きにくい温度範囲に管理することは，当業者が当然行うことに過ぎない。
　よって，請求人の主張を採用することはできない。
　
６．まとめ
　以上により，本願の請求項１に係る発明は，引用例１及び２並びに周知技術に基づき，当業者が容易に発明をすることができたものであり，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから，本願は拒絶すべきものである。
　よって，結論のとおり審決する。