【手続補正書】
【提出日】平成23年1月25日(2011.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
鋳型源として第一鎖反応物を使用し、DRB*1501およびDRA*0101 DNA配列の所望の領域を、Taq DNAポリメラーゼ(Gibco BRL、ニューヨーク州グランドアイランド)を用いてアニーリング温度55℃でPCRにより増幅した。β1を作製するために使用したプライマーは、
2008537736.tif 000001
および
2008537736.tif 000002
であった。α1を作製するために使用したプライマーは、
2008537736.tif 000003
および
2008537736.tif 000004
であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１９】
RNAの単離およびRT-PCR
RNeasyミニキットプロトコル(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を用いて脊髄から全RNAを単離し、次いでオリゴdT、ランダムヘキサマー、およびSuperscript RT II酵素(Invitrogen、ニューヨーク州グランドアイランド)を用いてcDNAに変換した。Quantitect SYBR Green PCRマスターミックス(Qiagen)およびプライマー(ABIにより合成)を用いて、リアルタイムPCRを行った。反応は、L32ハウスキーピング遺伝子を対照として含め、以下の遺伝子を検出するための従来の市販のプライマーを用いて、ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)で行った。
2008537736.tif 000005
媒体群と処置群の間の統計的有意差は、マン・ホイットニー検定により決定した。サイトカインレベルの差は、スチューデントのt検定により評価した。P値≦0.05を有意とみなした。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５３】
【図１】図1A（SEQ ID NO：1および2）は、抗原コード領域を持たない典型的β1∝1カセットの配列を示す図である。独特のNcoI、PstIおよびXhoI制限酵素切断部位を太字で示す。β1ドメインの終わりとα1ドメインの始まりを示している。図1B（SEQ ID NO：3および4）は、図1Aに示した挿入部位で発現カセット中に取り込むことができるインフレーム抗原ペプチド/リンカー挿入配列の配列を示す図である。この配列は、ラットMBP-72-89抗原、埋め込まれたトロンビン切断部位を持つ柔軟なリンカー、および抗原コード領域を容易に交換するために用いることができる独特のSpeI制限酵素切断部位を含む。前述の実施例2は、MBP-72-89配列のスレオニン残基の代わりにセリンを有するモルモットからの等価のペプチド利用法について記述している。図1C（SEQ ID NO：5および6）および1D（SEQ ID NO：7および8）は、MBP-72-89抗原コード領域の代わりに発現カセット中に挿入することができる例示的なNcoI/SpeI断片を示す図である。図1CはMBP-55-69抗原を含み、図1DはCM-2抗原を含む。
【図２】図2Aおよび2Bは、β1α1分子の構造に基づくデザインを表す図である。図2Aは、脳炎誘発性MBP-69-89ペプチドをのせた(非共有結合)ラットクラスII RT1.Bを示す。図2Bは、MBP-69-89をのせた一本鎖β1α1分子を示す。
【図３】図3Aおよび3Bは、ラットT細胞に結合している抗原特異的β1α1/ポリペプチド分子の直接検出を示す図である。A1 T細胞ハイブリドーマ(BV8S2 TCR+)およびCM-2細胞系統(BV8S2 TCR-)を様々なβ1α1構成物と共に4℃で17時間インキュべートし、洗浄し、OX6-PE(α-RT1.B)または対照PE-アイソタイプにより15分間染色し、次いでFACSで分析した。CM-2系統におけるI-Aのバックグラウンド発現を標識していないOX-6でブロックした。図3Aは、A1ハイブリドーマの染色を示すヒストグラムである。図3Bは、CM-2細胞系統の染色を示すヒストグラムである。
【図４】A488を結合したβ1α1/ポリペプチド分子のラットBV8S2 TCRへの結合を表すグラフである。β1α1分子にAlexa-488色素を結合し、MBP-69-89をのせ、A1 T細胞ハイブリドーマ(BV8S2 TCR+)と4℃で3時間インキュベートし、次いでFACSにより分析した。A488-β1α1(空)およびA488-β1α1/MBP-69-89を示す。
【図５】β1α1/MBP-69-89複合体が抗原特異的増殖をIL-2可逆的に阻害することを表す棒グラフである。Gp-MBP/CFAで12日前に免疫化したラットのリンパ節細胞から得たMBP-69-89ペプチドにより選択した短期T細胞系統を、β1α1構成物で24時間前処置し、洗浄し、次いで細胞を20ユニット/mlのIL-2存在下および不在下で培養する増殖解析に用いた。細胞を3日間、最後の18時間は[3H]チミジン(0.5μCi/10μl/ウェル)存在下でインキュベートした。示した値は平均CPM±SEMである。バックグラウンドは210CPMであった。カラムa．IL-2不在の対照増殖解析。カラムb．20μMのβ1α1/MBP-55-69前処置。カラムc．10nMのβ1α1/MBP-69-89前処置。カラムd．10nMのβ1α1/MBP-69-89＋IL-2増殖解析。実験は2回行ったが、1回の代表的実験の結果を示す。*は対照培養に対してβ1α1/MBP-69-89による有意(p＜0.001)な阻害を示す。
【図６】図6A〜6Dは、実験的自己免疫脳脊髄炎からのβ1α1/MBP-69-89複合体による臨床的防御を示すグラフである。ルイスラットのグループ(n＝6)に25μgのGp-MBP/CFAを注入して臨床的EAEを活動的に誘発した。疾病誘発後、第3、7、9、11および14日に、図に示すとおりラットにβ1α1/ペプチド複合体もしくはペプチド単独を投与、または未処置で放置した。図に示すとおり、(6A)未処置または2μgのMBP-69-89ペプチド単独。(6B)食塩水中300μgのβ1α1/(空)複合体。(6C)食塩水中300μgのβ1α1/CM-2複合体。(6D)食塩水中30μgのβ1α1/MBP-69-89複合体。300μgのβ1α1/ペプチド複合体処置に対して毎日の体重(グラム、右側のy軸)をプロットしている。実験は3回行ったが、1回の代表的実験の結果を示す。値は臨床疾病の各日における平均臨床スコア±SEMを示す。30μgの複合体は2μgの遊離ペプチドと等価である。
【図７】定着したEAEのβ1α1/MBP-69-89複合体による処置を表すグラフである。ルイスラットのグループ(n＝6)に25μgのGp-MBP/CFAを注入して臨床的EAEを活動的に誘発した。臨床徴候の発症日(第11日)、第13日および第15日に、ラットに300μgのβ1α1/MBP-69-89複合体(矢印で示す)を投与、または未処置で放置した。実験は2回行ったが、1回の代表的実験の結果を示す。値は臨床疾病の各日における平均臨床スコア±SEMを示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、β1α1/MBP-69-89複合体がMBP69-89に対するDTH反応を特異的に阻害することを示すグラフである。(8A)PPDによる攻撃後24時間における耳の厚みの変化。(8B)MPB-69-89による攻撃後24時間における耳の厚みの変化。値は平均スコア±SEMを示す。*は対照群と処置群の間の有意差を示す(p＝0.01)。実験は2回行ったが、1回の代表的実験の結果を示す。
【図９】300μgのβ1α1/MBP-69-89複合体で処置したルイスラットにおいて、MBP-69-89に対するT細胞の反応が阻害されたことを示すグラフである。対照群がEAEから回復した(第17日)後、リンパ節細胞を対照群および処置群から採取し、最適濃度のGp-MBP、Gp-MBP-69-89ペプチド、またはPPDで刺激した。*は対照群と処置群の間の有意差を示す(*p＜0.05、**P＜0.001)。処置群で、Gp MBPおよびMBP-69-89ペプチドでは阻害が認められたが、PPDに対しては見られなかったことに留意されたい。
【図１０】図10A（SEQ ID NO：24および86）、10B（SEQ ID NO：87および88）、および10C（SEQ ID NO：89および90）は、例示的なヒト(DRAおよびDRB1 0101)(10A)、マウス(I-Ek)(10B)およびラット(RT1.B)(10C)β1およびα1ドメインのアミノ酸配列を示す図である(ラットの配列の開始メチオニンおよびグリシン配列は翻訳開始の理由により構成物に含まれた)。
【図１１】（SEQ ID NO：91および92）ヒトMHCクラスI B*5301由来の例示的なα1およびα2ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１２】ヒトHLA-DR2由来組換えT細胞受容体リガンド(RTL)の概略モデルを示す。図12(A)は、APC表面上のMHCクラスII分子の概略縮尺モデルである。ポリペプチド骨格細胞外ドメインは、HLA-DR2の公知の結晶座標(PDBアクセッションコード1BX2)に基づく。膜貫通ドメインは、ポリグリシンαヘリックスのおよその直径である0.5nmの円柱として模式的に示される。α1、α2、β1、およびβ2ドメイン、加えてMHCクラスIIヘテロ二量体のカルボキシル末端を表示してある。図12(B)は、HLA-DR2由来の共有結合されたβ1およびα1ドメイン、ならびに共有結合されたMBP85-99ペプチドを含むRTL303分子の概略図である。RTLの図は、結合しているペプチドの長軸周囲の〜45°(y軸)および〜45°(z軸)の回転により、パネル(a)のMHCクラスII分子と対称関係にある。上図、主要なT細胞受容体(TCR)接触残基H11、F12、K14、およびN15を表示した、パネル(a)と同様の陰影づけをした略図。中図、静電ポテンシャル(EP)による陰影づけ。EPの陰影勾配は、濃い(最も正)〜薄い(最も負)の範囲である。下図、親油性ポテンシャル(LP)による陰影づけ。LPの陰影勾配は、濃い(分子の最も親油性の高い領域)〜薄い(最も疎水性の高い領域)の範囲である。
【図１３】（SEQ ID NO：93および94）ヒトHLA-DR2由来RTL303のヌクレオチドおよびタンパク質配列である。RTL303は、HLA-DR2(ヒトDRB1*1501/DRA*0101)のβ-1およびα-1ドメインをコードする配列、ならびにヒトMBP85-99ペプチドをコードする配列から得られた。唯一のNcoI、SpeI、およびXhoI制限部位を太字で示す。β-1ドメインの終点およびα-1ドメインの始点を矢印で示す。RTL303は、ヒトMBP85-99ペプチドをコードするインフレームのペプチド/リンカー挿入物(太字)、トロンビン切断部位が組み込まれた可動性リンカー、およびコードされたアミノ末端ペプチドを迅速に交換するために使用できる唯一のSpeI制限部位を含む。RTL301は、F150L置換を生じる単一の点突然変異以外はRTL303と同一である。本研究で使用した2つのさらなるタンパク質、RTL300およびRTL302は、それぞれRTL301およびRTL303の「空」型である。これらの分子はペプチド/リンカー挿入物(残基16〜115)を欠いている。グリシン32および51のコドン使用は、大腸菌でのタンパク質発現レベルを増加させるために、天然配列から変更してある。
【図１４】ヒトHLA-DR2由来RTL303の精製を示す。図14(A)は、RTL303のイオン交換FPLCである。挿入図左：Mr、分子量標準物質；U、非誘導細胞；I、RTL303の高レベル発現を示す誘導細胞。挿入図右：画分25〜28は部分精製RTL303を含む。図14(B)は、RTL303のサイズ排除クロマトグラフィーである。挿入図：画分41〜44、精製RTL303を含む；Mr、分子量標準物質；Red、還元RTL303；NR、非還元RTL303。
【図１５】天然のジスルフィド結合を有する、精製および再度折り畳まれたDR2由来RTLを示すウェスタンブロットのデジタル画像である。RTL試料は、還元剤β-メルカプトエタノール(β-ME)有りまたは無しでLaemmli試料緩衝液中で5分間煮沸し、その後SDS-PAGE(12%)により解析した。非還元RTL(-レーン)は還元RTL(+レーン)よりも見かけの分子量が小さく、ジスルフィド結合の存在が示される。最初および最後のレーンは、分子量標準物質である炭酸脱水酵素(31kD)およびダイズトリプシンインヒビター(21.5kD)を示す。RTL(+/-β-ME)は表示の通りである。
【図１６】DR2由来RTLが非常に規則正しい構造を有することを示す円二色性のデジタル画像である。CD測定は、0.1mmセルを使用しJasco J-500装置において、260〜180nmの範囲で20℃で行った。各タンパク質溶液の濃度値は、アミノ酸解析により決定した。緩衝液、50mMリン酸カリウム、50mMフッ化ナトリウム、pH7.8。二次構造の解析は変数選択法を用いて行った。
【図１７】熱変性に供したDR2由来RTLの高度の協同性および安定性を実証する実験のグラフである。CDスペクトルを温度の関数として222nmでモニターした。加熱速度は10℃/時間であった。グラフは、変性の割合を温度の関数として作図してある。1.0は、完全にほどけた構造に相当する。
【図１８】残基F150の4Å内の原子の相互作用の概略図である。距離は1BX2による座標を用いて計算した。挿入図：RTL303分子内の残基F150の位置。
【図１９】図19A、19B、および19Cは、ヒトHLA-DR2由来RTLの構造に基づく設計を図示する。(A)は、APC表面上のMHCクラスII分子の概略縮尺モデルである。ポリペプチド骨格細胞外ドメインは、HLA-DR1の結晶座標(PDBアクセッションコード1AQD)に基づく。膜貫通ドメインは、ポリグリシンαヘリックスのおよその直径である0.5nmの円柱として模式的に示される。MHCクラスIIヘテロ二量体のカルボキシル末端を表示してある。(B)は、共有結合したMBP85-99ペプチドを含むHLA-DR2β1α1由来RTL303分子の図である。(C)は、共有結合したC-ABLペプチドを含むHLA-DR2β1α1由来RTL311分子の図である。RTLの図は、結合しているペプチドの長軸周囲の〜45°(y軸)および〜45°(z軸)の回転により、パネル(a)のMHCクラスII分子と対称関係にある。左図、主要なTCR接触残基を表示した、パネル(A)と同様の陰影づけをした略図。中図、静電ポテンシャル(EP)による陰影づけ。EPの陰影勾配は、濃い(最も正)〜薄い(最も負)の範囲である。右図、親油性ポテンシャル(LP)による陰影づけ。LPの陰影勾配は、濃い(分子の最も親油性の高い領域)〜薄い(最も疎水性の高い領域)の範囲である。O2ワークステーション(Silicon Graphics、カリフォルニア州マウンテンビュー)およびBrookhaven Protein Data Bank(Brookhaven National Laboratories、ニューヨーク州アプトン)に寄託されている座標を用いて、プログラムSybyl(Tripos Associates、ミズーリ州セントルイス)によりグラフィック画像を作成した。RTLの構造に基づく相同性モデリングは、MBPペプチドと複合体形成したHLA-DR2(DRA*0101、DRB1*1501；例えば、Smith et al., J. Exp. Med. 188：1511, (1998)を参照されたい)の公知の結晶座標に基づいた。HLA-DR2 MBPペプチド複合体(PDBアクセッション番号1BX2)中のアミノ酸残基をCABL側鎖と置換し、構造の緻密化の過程で局所エネルギー最小化を用いてHLA-DR2のペプチド骨格を剛体としてモデル化した。
【図２０】T細胞クローンの応答を図示した一連の棒グラフである。DR2拘束性T細胞クローンである、MBP-85-99ペプチドに特異的なMR#3-1およびCABL-b3a2ペプチドに特異的なMR#2-87、ならびにMBP85-99ペプチドに特異的なDR7拘束性T細胞クローンCP#1-15を50,000個細胞/ウェルで、培地のみ、または照射した(2500ラド)凍結自己PBMC(150,000個/ウェル)およびペプチド-Ag(MBP-85-99またはCABL、10μg/ml)と共に3つ組ウェルで72時間培養し、最後の18時間は3H-チミジンを取り込ませた。示した各実験は、少なくとも2回の独立した実験の代表的なものである。バーはCPM±SEMを表す。
【図２１】RTL処置により誘導されるζ鎖リン酸化がAg特異的であることを示すグラフである。DR2拘束性T細胞クローンである、MBP-85-99ペプチドに特異的なMR#3-1またはCABL-b3a2ペプチドに特異的なMR#2-87を、培地のみで(対照)または20μM RTL303もしくはRTL311と共に37℃でインキュベートした。リン酸化ζ(ゼータ)のウェスタンブロット解析により、それぞれp21およびp23と称される21kDおよび23kDの一対のリン酸化タンパク質種が示される。バンドの定量化により、10分の時点でピークに達するp21/p23比の異なる変化が示された。示した各実験は、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。点は平均値±SEMを表す。
【図２２】RTLで刺激したT細胞の蛍光発光比を示す。RTLは、T細胞において持続した高いカルシウムシグナルを誘導する。MBP-85-99ペプチドに特異的なDR2拘束性T細胞クローンMR#3-1におけるカルシウムレベルを、単一細胞解析によりモニターした。RTL303処置が持続した高いカルシウムシグナルを誘導したのに対し、RTL301(単一の点変異、F150L以外はRTL303と同一である)による処置は、同じ期間にカルシウムシグナルの増加を誘導しなかった。データは、各実験において少なくとも14個の個々の細胞をモニターした2回の別個の実験の代表的なものである。
【図２３】ERK活性がRTL処置T細胞において減少することを実証する一連の棒グラフである。DR2拘束性T細胞クローンである、MBP-85-99ペプチドに特異的なMR#3-1またはCABL b3a2ペプチドに特異的なMR#2-87を、添加なしで(対照)、および20μMまたは8μMのRTL303またはRTL311と共に37℃で15分間インキュベートした。15分のインキュベーション期間の終了時に、細胞を活性化リン酸化ERK(P-ERK)および全ERK(T-ERK)についてアッセイした。活性化P-ERKの定量化は、対照(未処置)細胞中の全体に対する割合として表す。示した各実験は、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。バーは平均値±SEMを表す。
【図２４】T細胞クローンにおけるIL-10サイトカイン産生の直接的抗原特異的調節がRTL処置により誘導されたことを示す一連のグラフである。DR2拘束性T細胞クローンMR#3-1およびMR#2-87を、培地のみ(-対照)、抗CD3 mAb、20μM RTL303、またはRTL311中で72時間培養した。増殖は3H-チミジンの取り込みにより評価した。サイトカイン(pg/ml)プロファイルは、上清の免疫アッセイ(ELISA)によりモニターした。示した各実験は、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。バーは平均値±SEMを表す。クローンMR#3-1は抗CD3に対して初期増殖を示したが、RTLに対しては示さなかった。
【図２５】RTL前処置により誘導されたIL-10サイトカイン産生がAPC/ペプチドによる刺激後に維持されたことを示す一連のグラフである。T細胞は、抗CD3またはRTL処置後に増殖するおよびサイトカインを産生する能力が減少し、このRTL効果は抗原およびMHC特異的であった。IL-10は特異的RTLによってのみ誘導され、IL-10産生はAPC/抗原による再刺激後でさえも維持された。T細胞クローンは50,000個細胞/ウェルで、培地、抗CD3、または20μM RTLと共に3つ組で48時間培養し、RPMIで一度洗浄した。洗浄後、照射した(2500ラド)凍結自己PBMC(150,000個/ウェル)およびペプチド-Ag(MBP-85-99、10μg/ml)を添加して細胞を72時間インキュベートし、最後の18時間は3H-チミジンを添加した。示した各実験は、少なくとも2回の独立した実験の代表的なものである。バーは平均値±SEMを表す。サイトカインアッセイについては、クローンを10μg/ml抗CD3または20μM RTL303もしくはRTL311と共に48時間培養し、その後RPMIで洗浄して、照射自己PBMC(2500ラド、T：APC＝1：4)およびペプチド-Ag(10∝g/ml)で72時間再刺激した。サイトカイン(pg/ml)プロファイルは、上清の免疫アッセイ(ELISA)によりモニターした。示した各実験は、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。バーは平均値±SEMを表す。
【図２６】改変RTLのサイズ排除クロマトグラフィーデータを示す。精製および再度折り畳まれた改変RTL400およびRTL401を、サイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。Superdex 75(16/60)サイズ排除カラムを一連の公知の分子量タンパク質で較正し、検量線の勾配からY＝-0.029X＋6.351(r＝0.095)が算出され、次にこれを用いて改変RTL400およびRTL401の大きさを推定した。
【図２７】RTL401の静脈内または皮下投与がSJLマウスにおいてどのようにEAEを改善するのかを示す。SJL雌マウスをPLP139-151(ser)で免疫化した。疾患発症時(12日目)に、マウスを、媒体、RTL401 0.8mgの静脈内注射、またはRTL401 0.8mgの皮下注射で8日間毎日処置した。マウスは、上記の実施例に概説した通りにスコア化した。表示したデータは、マウス12〜14匹/群の各群につき2回実験した平均値である。
【図２８】RTL処置が、MHCおよび神経抗原ペプチドの同族の組み合わせに対してどの程度特異的であるかを示す。B6XSJLマウス(I-As/I-Eb MHCクラスII分子)をPLP139-151またはMOG35-55で免疫化した。発症時に、マウス群を媒体またはRTL401 0.8mgの静脈内連日注射で8日間処置し、疾患経過をモニターした。MOG35-55免疫化マウスはRTL処置に対して応答しなかったのに対し、PLP139-151免疫化マウスは、RTL401による静脈内処置後にEAEの有意な改善を示した。表示したデータは、群当たり全部で11〜16匹のマウスを使用した2回の実験の平均値である。
【図２９】T細胞増殖応答パターンを示す。免疫化後42日目に、媒体、RTL401静脈内、およびRTL401皮下処置マウスからリンパ節および脾臓を単離した。代表的マウス3匹に由来する細胞をプールし、刺激培地中で72時間インキュベートして[3H]チミジンの存在下で最後の18時間インキュベートした後の免疫化Ag、PLP139-151に対する増殖によりT細胞応答を測定した。データは、培地のみの対象に対する正味のcpmとして表示してある。対照群と実験群との有意差は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３０】T細胞サイトカイン応答パターンを示す。SJLマウスを、RTL401処置後の様々な時点で屠殺した。脾臓を摘出し、PLP139-151ペプチド10μgと共にインビトロで設定した。48時間後に上清を回収し、上記の通りにサイトメトリービーズアレイによりサイトカイン産生についてアッセイした。対照群と実験群との有意差は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。データは、各群各時点につきマウス2匹の平均値およびSDとして表示してある。
【図３１】RTL処置の付加的なCNS効果を示す。RTL401処置後の様々な時点のマウスより摘出した脳および脊髄から、単核細胞を単離した。トリパンブルー排除法により細胞を計数した。表示した結果は、プールした脳または脊髄2〜3個による数である。
【図３２】RTL処置により、CNS中のT細胞上の接着分子発現が有意に減少することを示す。RTL401処置後の様々な時点の代表的なマウス2匹より摘出した脳および脊髄から、MNCを単離した。次いで、細胞を抗マウスCD3および抗マウスVLA-4または抗マウスLFA-1で染色し、CNSに浸潤しているT細胞上のこれらの接着分子の発現を同定した。表示したデータは、CD3およびVLA-4またはLFA-1について二重陽性であった、ゲートをかけた細胞全体に占める割合である。対照群と実験群との間の有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３３】リアルタイムPCRによって決定されるサイトカインおよびケモカイン遺伝子発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。様々な時点における対照マウス2匹およびRTL処置マウス2匹より摘出した全凍結脊髄から、mRNAを単離した。cDNAを合成し、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β3、RANTES、MIP-2、およびIP-10に特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。各遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子、L32の発現と比較して算出した。対照群と実験群との間の有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３４】媒体およびRTL処置マウスの脊髄からの、ケモカイン受容体遺伝子の相対的発現のリアルタイムPCR定量化を提供する。様々な時点における対照マウス2匹およびRTL処置マウス2匹より摘出した全凍結脊髄から、mRNAを単離した。cDNAを合成し、CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR6、CCR7、およびCCR8に特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。各遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子、L32の発現と比較して算出した。対照群と実験群との間の有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３５】図35Aおよび35Bは、SJLマウスにおいて受動的に誘発されたEAEに及ぼすRTL401処置の効果を示す。疾患発症時(およそ6日目)に、マウスを媒体(35A)またはRTL401 100μgの5日間の静脈内注射もしくは8日間の皮下注射、またはRTL401 100μgの5日間の静脈内注射(35B)で処置した。マウスは、実施例15に概説した通りにスコア化した。対照群と実験群との有意差は、マン・ホイットニー検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３６】脾臓、血液、および脳におけるTh1サイトカイン発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。
【図３７】脾臓、血液、および脳におけるTh2サイトカイン発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。
【図３８】リアルタイムPCRによって決定される脾臓におけるサイトカイン遺伝子発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。
【図３９】リアルタイムPCRによって決定される脊髄におけるサイトカイン遺伝子発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。
【図４０】図40Aおよび40Bは、EAEの受動的誘発19日後の対照(媒体処置)(A)またはRTL処置(B)SJLマウスに由来する、固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン-エオシンで染色した脊髄切片の顕微鏡写真である。媒体処置脊髄の頸部切片では炎症が軽度〜中程度であるのに対し(A)、RTL処置脊髄では細胞性単核細胞浸潤がほとんど検出されない(B)ことに留意されたい。倍率は12.5xであった。矢印は、媒体処置脊髄における炎症部位を示す。表示したデータは、平均EAEスコア3.5(対照) 対 1.0(RTL401処置)を有する各群由来のマウス2匹から検査した全部で20枚の頸部切片の代表的なものである。
【図４１】図41A、41B、41C、および41Dは、RTL401処置が、受動的に誘発された(41A)および能動的に誘発された(41C)EAEを有するSJLマウスのCNSにおける、軸索損傷のマーカーである非リン酸化神経フィラメント(NPNFL)の量の減少によって示されるように、EAEを有するSJLマウスにおける軸索消失を改善することを実証する。図41Aおよび41Cは、異なった処置をしたまたは異なった時点で安楽死させたマウスに由来する全腰髄ホモジネートの代表的な免疫ブロット解析を示す。図41A中の各バンドは群ごとのマウス2匹を表し、図41C中の各バンドは各群のマウス4匹に由来する試料を表す。図41Bおよび41Dは、先行するのブロットの濃度測定解析を提供する。GAPDH＋グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素。
【図４２】図42Aおよび42Bは、100μg/ml RTL401(原液)、10μg/ml RTL401(1：10)、10μg/ml PLP-139-151ペプチド、または培地と共に24時間インキュベートした後に洗浄して、PLPペプチドを添加せずにAPCと共に48時間インキュベートした、PLP-139-151ペプチドに特異的なT細胞において、RTL401がインビトロでIL-13およびその他のサイトカインの発現増加を誘導することを実証するグラフである。(*)は、培地前処置T細胞と比較した有意差(p＜0.05)を示す。(&)は、PLP-139-151ペプチド前処置T細胞と比較した有意差(p＜0.05)を示す。データは、3回の別個の実験からプールしている。
【図４３】図43Aおよび43Bは、媒体処置EAEマウス、または20日目に開始する連続5回のRTL401静脈内処置および32日目に開始する連続3回の皮下処置を施したRTL401処置EAEマウスで60日目に屠殺したマウスの胸髄の背側(43A)および腹側/外側白質(43B)におけるミエリン損傷の形態計測解析の図表である。EAEの発症は11日目であると考えられ、EAEのピークは20日であった。各点は個々のマウスを表す。
【図４４】疾患ピーク後のRTL401の投与により、SJLマウスにおけるEAEの臨床評価が改善されることを示す図表である。
【図４５】図45Aは、免疫化60日後の、媒体(左画像)またはRTL401(右画像)で処置したEAEマウスに由来する代表的な胸髄切片の写真を提供する。組織切片はトルイジンブルーで染色し(白黒で表示)、損傷領域を手作業で赤線で囲んだ。スケールバーは、25mM(低倍率視野)または100mM(高倍率視野)である。
【図４６】図46Aは、免疫化60日後の、媒体(左画像)またはRTL401(右画像)で処置したEAEマウスに由来する胸髄切片の軸索染色の写真を提供する。正常な軸索は神経フィラメントの抗体混合物で茶褐色に染色され、浸潤免疫細胞の核はヘマトキシリンで青色に染色された。図46B〜Dは、表示のようなおよび上記実施例でさらに記載したような、RTL処置したおよびしなかったマウスの脊髄で観察された、細胞浸潤、軸索損傷、神経炎症、およびその他の病理組織学的徴候に及ぼすRTL効果に関する図示データを提供する。
【図４７】図47Aは、免疫化60日後の、媒体(左画像)またはRTL401(右画像)で処置したEAEマウスに由来する胸髄のNPNFL抗体による代表的な損傷軸索染色、および浸潤免疫細胞上のヘマトキシリンの写真を提供する。図47Bは、表示のようなおよび上記実施例でさらに記載したような、RTL処置したおよびしなかったマウスの脊髄で観察された細胞軸索損傷およびその他の病理組織学的徴候に及ぼすRTL効果に関する図示データを提供する。
【図４８】図48A〜Fは、20日目の疾患ピーク時のEAEマウスに由来する脊髄における病変領域を示す代表的な電子顕微鏡写真である。
【図４９】媒体(図49A〜C)またはRTL401(図49D〜E)による処置開始後40日である60日目に評価したEAEマウス由来の脊髄における病変領域を示す代表的な電子顕微鏡写真である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2008537736.tif 000006
【図１Ｂ】
2008537736.tif 000007
【図１Ｃ】
2008537736.tif 000008
【図１Ｄ】
2008537736.tif 000009
【図２】
2008537736.tif 000010
【図３】
2008537736.tif 000011
【図４】
2008537736.tif 000012
【図５】
2008537736.tif 000013
【図６Ａ】
2008537736.tif 000014
【図６Ｂ】
2008537736.tif 000015
【図６Ｃ】
2008537736.tif 000016
【図６Ｄ】
2008537736.tif 000017
【図７】
2008537736.tif 000018
【図８】
2008537736.tif 000019
【図９】
2008537736.tif 000020
【図１０Ａ】
2008537736.tif 000021
【図１０Ｂ】
2008537736.tif 000022
【図１０Ｃ】
2008537736.tif 000023
【図１１】
2008537736.tif 000024
【図１２】
2008537736.tif 000025
【図１３】
2008537736.tif 000026
【図１４Ａ】
2008537736.tif 000027
【図１４Ｂ】
2008537736.tif 000028
【図１５】
2008537736.tif 000029
【図１６】
2008537736.tif 000030
【図１７】
2008537736.tif 000031
【図１８】
2008537736.tif 000032
【図１９】
2008537736.tif 000033
【図２０】
2008537736.tif 000034
【図２１】
2008537736.tif 000035
【図２２】
2008537736.tif 000036
【図２３】
2008537736.tif 000037
【図２４】
2008537736.tif 000038
【図２５】
2008537736.tif 000039
【図２６】
2008537736.tif 000040
【図２７】
2008537736.tif 000041
【図２８】
2008537736.tif 000042
【図２９】
2008537736.tif 000043
【図３０】
2008537736.tif 000044
【図３１】
2008537736.tif 000045
【図３２】
2008537736.tif 000046
【図３３】
2008537736.tif 000047
【図３４】
2008537736.tif 000048
【図３５】
2008537736.tif 000049
【図３６】
2008537736.tif 000050
【図３７】
2008537736.tif 000051
【図３８】
2008537736.tif 000052
【図３９】
2008537736.tif 000053
【図４０】
2008537736.tif 000054
【図４１】
2008537736.tif 000055
【図４２】
2008537736.tif 000056
【図４３】
2008537736.tif 000057
【図４４】
2008537736.tif 000058
【図４５】
2008537736.tif 000059
【図４６】
2008537736.tif 000060
【図４７】
2008537736.tif 000061
【図４８】
2008537736.tif 000062
【図４９】
2008537736.tif 000063
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008537736000001.app