【手続補正書】
【提出日】平成23年6月13日(2011.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳におけるｍＲＮＡ編集（該ｍＲＮＡ編集はＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集である）の病理的変化を評価するための方法であって、細胞を含有する末梢組織からなる生体サンプルの群から選択される単一の生体サンプルまたは２種類の異なる生体サンプルが用いられ、
前記の細胞を含有する末梢組織が、白血球(blood white cells)を含有する血液サンプルおよび、任意で、皮膚サンプル、からなる群から選択される哺乳類生体組織であり、
脳におけるｍＲＮＡ編集の病理学的変更の評価が、
−白血球を含有する血液サンプルで発現されるＡＤＡＲの性質または／および量、ならびに、任意で
−皮膚サンプルにおける該ｍＲＮＡの編集率またはその編集形態のプロフィール
により決定される、方法。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡ編集を有する該ｍＲＮＡが５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡであり、
前記方法が、患者が５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または該病状を発症するリスクがあるかどうかをin vitroにおいて特定するための方法であり、
ａ）被験患者から、血液細胞を含有する生体サンプルおよび、任意で、皮膚細胞を含有する生体サンプル、を得る工程；
ｂ）前記血液細胞サンプルで発現されたＡＤＡＲの性質または／および量を決定し、任意で、さらに、前記皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の編集率を決定する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた前記血液細胞サンプルで発現されたＡＤＡＲの性質または／および量、ならびに、任意で、前記皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのこの編集形態または非編集形態に関して工程ｂ）で得られた編集率を、正常患者もしくはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を示す患者から得られた特徴的な発現ＡＤＡＲプロフィールおよび、任意で、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの対照編集率と比較することにより、患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該病状が、精神病、統合失調症、鬱病、鬱性自殺または異常な摂食挙動からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
in vitroにおいて、患者により示される病状が５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連するかどうかを決定するための請求項１に記載の方法であって、
ａ）該病状を示す患者から、血液細胞および、任意で皮膚細胞、を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）前記血液細胞サンプルで発現されたＡＤＡＲの性質または／および量を決定し、任意で、さらに、前記皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の編集率を決定する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた前記血液細胞サンプルで発現されたＡＤＡＲの性質または／および量、ならびに、任意で、前記皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのこの編集形態または非編集形態に関して工程ｂ）で得られた編集率を、正常患者もしくはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連しないことが知られている病状を示す患者から得られた特徴的な発現ＡＤＡＲプロフィールおよび、任意で、５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの対照編集率と比較することにより、患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定する工程
を含む、方法。
【請求項５】
哺乳類においてin vivoで５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集を調節する薬剤をin vitroで特定するための、請求項１に記載の方法であって、
ａ）該哺乳類に５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の候補モジュレーターを投与する工程；
ｂ）該哺乳類から、血液細胞および、任意で皮膚細胞、を含有する生体サンプルを得る工程；
あるいは
ａ）哺乳類血液細胞および、任意で皮膚細胞（これらの細胞は組換え細胞であり得る）を含有する生体サンプルを得る工程；
ｂ）前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集の候補モジュレーターの存在下で該生体サンプルを接触させる工程；
および
ｃ）該モジュレーターの、
−前記血液細胞で発現されたＡＤＡＲの性質または／および量に対する効果；および、任意で
−前記皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の編集率に対する効果
を、
工程ｂ）において生体サンプルから得られた発現ＡＤＡＲの性質または／および量、ならびに、任意で、この編集形態または非編集形態の編集率を、該哺乳類の対照血液細胞サンプルおよび、任意で皮膚細胞サンプル、から得られた発現ＡＤＡＲの性質または／および量、ならびに、任意で編集率、と比較することにより決定する工程
を含む、方法。
【請求項６】
５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状の予防または治療のために用いられる薬剤の有効性を患者においてin vitroで決定するための、請求項１に記載の方法であって、
ａ）−被験患者から、血液細胞を含有する生体サンプルおよび、任意で、皮膚細胞を含有する生体サンプル、を得る工程、および
−前記血液細胞サンプルで発現されたＡＤＡＲの性質または／および量を決定し、任意で、さらに、前記皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の編集率を決定する工程；
ｂ）該患者に病状の予防または治療を意図した薬剤を投与する工程；
ｃ）処置中または／および処置後に該患者から血液細胞および、任意で皮膚細胞、を含有する新たな生体サンプルを得、血液細胞サンプルで発現されたＡＤＡＲの性質または／および量を決定し、任意で、さらに、皮膚細胞サンプルにおける前記５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの少なくとも１つの編集形態または非編集形態の編集率を決定する工程；および
ｄ）該薬剤の有効性を、工程ａ）の生体サンプルから得られた発現ＡＤＡＲの性質または／および量、ならびに、任意で編集率、を、工程ｃ）で得られたものと比較することにより決定する工程（正常患者で見られるものに近いまたは等しい発現ＡＤＡＲの性質または／および量、ならびに、任意で編集率、をもたらす発現ＡＤＡＲの性質または／および量、ならびに、任意で編集率、の調節が処置の有効性に重要である）
を含む、方法。
【請求項７】
患者または哺乳類がヒト、マウスまたはラット、好ましくはヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
皮膚細胞がケラチノサイト、メラノサイト、繊維芽細胞、ランゲルハンス細胞およびメルケル細胞からなる群から選択され、皮膚組織が表皮および真皮からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ケラチノサイトがＨａＣａＴ細胞などのヒト不死化細胞に由来し、あるいはメラノサイトがヒト不死化細胞または黒色腫に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ケラチノサイトが新生児の皮膚、真皮または毛包に由来し、メラノサイトが表皮または毛包に由来し、繊維芽細胞が真皮または乳頭毛包に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
皮膚細胞、培養皮膚由来細胞または皮膚組織がまぶたまたは耳の皮膚に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
編集率が該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの編集および非編集形態総てに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの各編集および非編集形態の編集率が、
Ａ）皮膚細胞系統、培養皮膚由来細胞または皮膚組織の全ＲＮＡを抽出し、その後、適当であればそのｍＲＮＡを生成する工程；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写する工程；および
Ｃ）工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡを、編集され得る編集部位を含有する５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡフラグメントに特異的な少なくとも１対のプライマー（このプライマー対はＲＮＡ抽出物中に存在する可能性のある総ての編集形態および非編集形態を増幅し得るように選択される）を用いてＰＣＲ増幅する工程
を含む方法により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの各編集および非編集形態の編集率が、
Ａ）皮膚細胞系統、培養皮膚由来細胞または皮膚組織の全ＲＮＡを抽出し、その後、適当であればそのｍＲＮＡを生成する工程；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写する工程；および
Ｃ）工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡを、編集され得る編集部位を含有する５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡフラグメントに特異的な少なくとも１対のプライマー（このプライマー対はＲＮＡ抽出物中に存在する可能性のある総ての編集形態および非編集形態を増幅し得るように選択される）を用いてＰＣＲ増幅する工程
（ここで、工程Ｂの逆転写は５ＨＴＲ２Ｃ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで行われる）
を含む方法により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程Ｂ）において、５ＨＴＲ２Ｃ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが配列5’-TTCGTCCCTCAGTCCAATCAC-3’（配列番号３４）を有する、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程Ｃ）において、ＰＣＲ増幅工程が２回のＰＣＲを含むネステッドＰＣＲであり、ここで、１回目のＰＣＲが２００ｂｐ〜３００ｂｐの間の長さを有するＰＣＲ核酸産物をもたらすプライマーセットにより行われ、２回目のＰＣＲが９０ｂｐ〜１６０ｂｐの間の長さを有する最終ＰＣＲ核酸産物をもたらすプライマーセットにより行われる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
工程Ｃ）において、ＰＣＲ増幅工程が２回のＰＣＲを含むネステッドＰＣＲであり、１回目のＰＣＲが次のプライマーセット：
マウスまたはラットでは、
フォワード：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’、配列番号３５；
リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’、配列番号３６；
ヒトでは、
フォワード：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’、配列番号３５；
リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’、配列番号３６、
により行われ、および
２回目のＰＣＲが以下のプライマーセット：
マウスまたはラットでは、
フォワード：5’-TTTGTGCCCCGTCTGGAT-3’、配列番号３９；
リバース：5’-GCCTTAGTCCGCGAATTG-3’、配列番号４０；および
ヒトでは、
フォワード：5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’、配列番号３７；
リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’、配列番号３８
により行われる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
該５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの各編集および非編集形態の編集率が、該ｍＲＮＡの編集および非編集型の個々の形態それぞれの編集プロフィールを提供し得るＳＳＣＰ法により決定され、該ＳＳＣＰ法が工程Ａ）、Ｂ）およびＣ）の後に
Ｄ）適当であれば、工程Ｃ）で得られたＰＣＲ産物を精製する工程；
Ｅ）適当であれば、工程Ｄ）で得られたＰＣＲ産物を定量する工程；
Ｆ）特に加熱した後に急冷することにより、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ解離させる工程；
Ｇ）キャピラリー電気泳動により一本鎖ＤＮＡを分離する工程；および
Ｈ）蛍光を読み取り、適当であれば、蛍光リーダーに関連づけた取り込み系の手段によりプロフィールデータを取得することにより編集プロフィールを得る工程
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
患者が脳におけるｍＲＮＡ編集（該ｍＲＮＡ編集はＡ−ｔｏ−Ｉ編集ＡＤＡＲに依存する）の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかをin vitroで特定するための、請求項１に記載の方法であって、
ａ）被験患者から細胞を含有する血液サンプルを得る工程；
ｂ）血液サンプル細胞に含まれるＲＮＡ発現産物に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を決定する工程；および
ｃ）該患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを、被験患者で得られた発現ＡＤＡＲの量および／または質を、正常患者またはこのｍＲＮＡ編集の機構の変更に関連する病状を示す患者の血液サンプルで得られた発現ＡＤＡＲの量および／または質と比較することにより特定する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
該編集ｍＲＮＡが、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体、Ｇタンパク質共役セロトニン受容体およびＰＤＥＡ８をコードするｍＲＮＡからなる群から選択されるｍＲＮＡである、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項２１】
該編集ｍＲＮＡが５ＨＴＲ２Ｃ、好ましくは、ヒト５ＨＴＲ２ＣをコードするｍＲＮＡである、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＤＡＲを発現する血液サンプル細胞が白血球(blood white cells)、白血球(leucocytes)またはバッフィーコート由来細胞である、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項２３】
ＡＤＡＲ発現産物がＡＤＡＲ１、イソ型１５０および／または１１０であり、ＡＤＡＲ２遺伝子発現産物が好ましくは、ＤＡＲ１、イソ型１５０ｋＤおよび／または１１０ｋＤタンパク質、およびＡＤＡＲ２タンパク質をコードするヒト遺伝子の発現産物である、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＤＡＲ発現産物がＡＤＡＲ  ｍＲＮＡである、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡの決定が、
Ａ）該血液サンプル細胞の全ＲＮＡを抽出し、その後、適当であれば、ｍＲＮＡを精製する工程；
Ｂ）工程Ａ）で抽出されたＲＮＡを逆転写させる工程；および
Ｃ）工程Ｂ）で得られたｃＤＮＡを、定量および／または定性分析される各ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡに特異的な、少なくとも１対のプライマーを用いてＰＣＲ増幅する工程
を含む方法により行われる、請求項１または２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程Ｃ）において、ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡ  ＰＣＲ増幅に特異的なプライマー対が、
ヒトＡＤＡＲ１−１５０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ａ  ３４ｐフォワード：5’-GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC-3’（配列番号４１）、
ＥＸ２  ５７８ｍリバース：5’-CTTGCCCTTCTTTGCCAGGGAG-3’（配列番号４２）；
ヒトＡＤＡＲ１−１１０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ｂ  ５３４ｐフォワード：5’-CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC-3’（配列番号４３）、ＥＸ２  ８０４ｍリバース：5’-CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC-3’（配列番号４４）；
ヒトＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡの増幅には：
ＡＤＡＲ２  １２７４ｐフォワード：5’-GCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGC-3’（配列番号４５）、
ＡＤＡＲ２  １４８６ｍリバース：5’-GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC-3’（配列番号４６）；
マウスＡＤＡＲ１−１５０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ａ  １９ｐフォワード：5’-GTCTCAAGGGTTCAGGGGACCC-3’（配列番号４７）、
ＥＸ２  ６４６ｍリバース：5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’（配列番号４８）；
マウスＡＤＡＲ１−１１０イソ型ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ１Ｂ  ７２ｐフォワード：5’-TCACGAGTGGGCAGCGTCCGAGG-3’（配列番号４９）、
ＥＸ２  ６４６ｍリバース：5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’（配列番号４８）；および
マウスＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡの増幅には：
ＥＸ７  １２８１ｐフォワード：5’-GCTGCACAGTCTGCCTTGGCTAC-3’（配列番号５０）、ＥＸ９  １６２２ｍリバース：5’-GCATAAAGAAACCTGAGCAGGGAC-3’（配列番号５１）
からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＡＤＡＲ発現産物がＡＤＡＲタンパク質である、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項２８】
工程ｂ）において、ＡＤＡＲタンパク質の決定が、
Ａ）所望により、血液サンプル細胞に含まれる全タンパク質を抽出した後、適当であれば、タンパク質の精製工程を行う工程；および
Ｂ）血液サンプル細胞に含まれる各ＡＤＡＲタンパク質の存在および／または濃度を、該ＡＤＡＲタンパク質を特異的に認識することができる抗体、好ましくは標識された抗体の実現により決定する工程
を含む方法により行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
配列ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC（配列番号３７）を含む、もしくは有するか；または
配列番号３７のフラグメントｎｔ５〜ｎｔ１４を含む、
単離された核酸。
【請求項３０】
プライマーまたはプローブとしての請求項２９に記載の核酸の使用。
【請求項３１】
ヒト編集および非編集５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡのイソ型を増幅するための２回目のネステッドＰＣＲプライマーセット：
フォワード：5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’（配列番号３７）、
リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’（配列番号３８）。
【請求項３２】
ネステッドＰＣＲによりヒト編集および非編集ヒト５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡの総てのイソ型を増幅するためのプライマーセット：
１回目：
フォワード：5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’（配列番号３５）；
リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’（配列番号３６）；
および２回目：
フォワード：5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’（配列番号３７）；
リバース：5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’（配列番号３８）。
【請求項３３】
請求項２９に記載の核酸、または請求項３１もしくは３２に記載のプライマーセットを含む、哺乳類５ＨＴＲ２Ｃ  ｍＲＮＡ編集率またはプロフィールの決定のためのキット。