(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリペプチド配列を含むことを特徴とするインフルエンザＡウイルスに対する中和活性を持つ抗体または抗体断片：
カバット方法によって、配列番号１で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号４で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
カバット方法によって、配列番号７で表されるＣＤＲ１領域、配列番号８で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号９で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号１０で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１１で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１２で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
カバット方法によって、配列番号１３で表されるＣＤＲ１領域、配列番号８で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号９で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号１０で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１４で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
カバット方法によって、配列番号１５で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１６で表されるＣＤＲ２領域、及び配列番号９で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号１０で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１７で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１２で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片。
【請求項２】
前記抗体または抗体断片は、配列番号３７で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号３８で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項３】
前記抗体または抗体断片は、配列番号３９で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号４０で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項４】
前記抗体または抗体断片は、配列番号４１で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号４２で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項５】
前記抗体または抗体断片は、配列番号４３で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖及び配列番号４４で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項６】
前記抗体または抗体断片は、インフルエンザＡウイルスＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つに対して中和活性を持つことを特徴とする、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項７】
下記ポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含むことを特徴とするインフルエンザＡウイルスに対する中和活性を持つ抗体または抗体断片：
カバット方法によって、配列番号１８で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１９で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２０で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号２１で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
カバット方法によって、配列番号２４で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号２７で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２８で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２９で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
カバット方法によって、配列番号３０で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号３１で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片と、
カバット方法によって、配列番号３４で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号３１で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３６で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２９で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される抗体または抗体断片。
【請求項８】
前記抗体または抗体断片は、配列番号４５で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む軽鎖及び配列番号４６で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項９】
前記抗体または抗体断片は、配列番号４７で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む軽鎖及び配列番号４８で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１０】
前記抗体または抗体断片は、配列番号４９で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む軽鎖及び配列番号５０で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
前記抗体または抗体断片は、配列番号５１で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む軽鎖及び配列番号５２で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含む重鎖で構成されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１２】
前記抗体または抗体断片は、インフルエンザＡウイルスＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つに対して中和活性を持つことを特徴とする、請求項７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１３】
前記抗体または抗体断片は、Ｆａｂ切片、Ｆｖ切片、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする、請求項１または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１４】
請求項１または７に記載のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離された核酸分子が挿入された発現ベクター。
【請求項１６】
宿主細胞に、請求項１５に記載の発現ベクターが形質感染されたインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片生産細胞株。
【請求項１７】
宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞及びＨＥＫ２９３細胞からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１６に記載のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片生産細胞株。
【請求項１８】
請求項１または７に記載のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片を含む組成物。
【請求項１９】
請求項１または７に記載のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片を含むインフルエンザＡウイルス由来の疾患の予防及び治療用組成物。
【請求項２０】
請求項１または７に記載のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片に標識物質を接合したコンジュゲートを含むインフルエンザＡウイルス診断用組成物。
【請求項２１】
前記標識物質は、酵素、ルシフェラーゼ及び放射性同位元素、毒素からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする、請求項２０に記載のインフルエンザＡウイルス診断用組成物。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物の製造における、請求項１または７に記載のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片の使用。
【請求項２３】
前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９サブタイプであることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
１）請求項１または７に記載のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ抗体または抗体断片と、
２）容器と、を含むインフルエンザＡウイルス診断用キット。
【請求項２５】
１）請求項２０に記載のインフルエンザＡウイルス診断用組成物と、
２）容器と、を含むインフルエンザＡウイルス診断用キット。
【請求項２６】
前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９サブタイプであることを特徴とする、請求項２４または２５に記載のインフルエンザＡウイルス診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザＡウイルスに感染された後で回復した患者の血液から選別されたヒトＢ細胞が生産する、インフルエンザＡウイルスに対して中和活性を持つヒト単一クローン抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウイルス（Influenza virus）に呼吸器が感染されて現われる病気であり、冬に多く現われ、感染性が非常に高くて全年令層を対象として容易に伝播されるが、特に老弱者層が脆弱であると知られている（Treanor J,2004,N Engl J Med.350(3):218-20）。オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）に属するエンベロープウイルス（enveloped virus）であり、８個の分節からなるマイナスセンス１本鎖（Negative-sense、single-strand）のＲＮＡ（ribonucleic acid）を遺伝体として持つインフルエンザウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃグループに分類され、インフルエンザＡウイルス（influenza A virus）の場合、主要表面タンパク質であるＨＡ（hemaggutinin）とＮＡ（neuraminidase）とによって再びいろいろなサブタイプ（subtype）に分けられる。現在まで１６種のＨＡ及び９種のＮＡが知られている（Cheung TK and Poon LL 2007,Ann NY Acad Sci.1102:1-25）。インフルエンザウイルスは、種類によって鳥類、豚及び人に感染されるという特性と、ＲＮＡ分節になっている遺伝体とによって、多様な遺伝子の組み合わせ及び突然変異で変種ウイルスが発生し続ける（Treanor J,2004.N Engl J Med.350(3):218-20）。このような持続的な変異によって永久的な免疫力を得難いため、現在最も効果的にあると思われる予防法は、毎年流行すると予測されるインフルエンザウイルスに対するワクチンを接種し、特定タイプに合う免疫力を毎年形成させることである。
【０００３】
インフルエンザウイルスに対するワクチンは、一般的に卵を用いて生産されるが、これは長時間がかかる非効率的方法である。したがって、だいたい毎年短時間に十分量のワクチンを生産するのに問題点がある。このような問題を解決するために、細胞培養（cell culture）を用いたワクチン生産方法がいろいろな製薬会社（GSK，Baxter）で活発に進んでいる実情である。また、インフルエンザウイルスの流行性感染（pandemic infection）が引き起こされる場合、これに対する迅速なワクチンの開発は、時間のため極めて困難な実情である。抗ウイルス剤（antiviral drug）も、突然変異で抵抗性を持つウイルスの出現問題のため１００％信頼できない。
【０００４】
このような問題点を解決するために、インフルエンザウイルスに対する抗体の使用及び開発が行われ、最近に活発に進んでいる（Throsby et al.,2008,PloS One 3(e3942)；Sui et al.,2009,Nature structural&molecular biology.16(265-273)；Simmons et al.,2007,PloS Medicine 4(e178)；Wrammert et al.,2011,J Exp Med.208(181-193)；Corti et al.,2011,Science 333(850-856)）。
【０００５】
回復した患者の血液生産物は、多様なウイルスに感染された患者の治療に用いられ、流感感染（pandemic flu infection）の治療にも使われてきた。例えば、スペイン・インフルエンザ・ウイルス（Spanish influenza virus）に感染された患者が肺炎症状を伴う場合、前記インフルエンザに感染された後で回復した患者から採取した血液生産物（blood product）を治療に使った（Luke et al.,2006.Annals of internal medicine.145:599）。このようにハイパー免疫グロブリン（Hyper immune globulin：ＩｇＩｖ）は、ヒト血漿で精製されて多様なウイルスに感染された患者の治療に用いられるが、前記のように製造された生産物は暫定的感染源に対して安全ではなく、量産に非効率的である。
【０００６】
ヒトＢ細胞は、特異的ヒト単一クローン抗体の選別に用いられる。しかし、エプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus）によるヒトＢ細胞の不死化（immortalization）は、不死化の効率が低くて長時間がかかるなど非効率的にある。これを補うために新たな技術が開発及び用いられている。それらのうち一つは、ＲＴ−ＰＣＲ方法を用いてＢ細胞で直接抗体の遺伝子情報を獲得することである。例ば、特定抗原に応じる抗体を発現するＢ細胞を染色した後、ＦＡＣＳ分析機（FACS-sorter）を用いて分離し、これら単一Ｂ細胞から抗体の遺伝情報をＲＴ−ＰＣＲ方法によって獲得して発現ベクターに挿入した後、再び動物細胞で形質感染して量産する方法がある。これをさらに容易かつ迅速に進めるために、下記のような技術を用いられる。新技術であるＩＳＡＡＣ（immunospot Array Assay on a Chip）は、特異的単一クローン抗体を分泌する単一Ｂ細胞を数週以内にスクリーニングして抗体遺伝子を獲得する（Jin et al.,2009 Nat Med.15,1088-1092）。このように獲得された抗体は自然的なヒト抗体であり、免疫源性問題でさらに効果的にある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、インフルエンザＡウイルスに対して中和活性を持つ結合分子を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記結合分子を暗号化する、単離された核酸分子を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供することである。
また本発明の他の目的は、前記発現ベクターが形質感染された結合分子生産細胞株を提供することである。
また本発明の他の目的は、結合分子の選別方法を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記結合分子を含む組成物を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記結合分子を用いたインフルエンザＡウイルス来由の疾患治療方法を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記ヒト結合分子を用いたインフルエンザＡウイルス来由の疾患予防方法を提供することである。
また本発明の他の目的は、前記ヒト結合分子を用いたインフルエンザＡウイルス感染有無の診断方法を提供することである。
さらに本発明の他の目的は、前記ヒト結合分子を含むインフルエンザＡウイルス診断用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明は、インフルエンザＡウイルスに対して中和活性を持つ結合分子を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を暗号化する、単離された核酸分子を提供する。
また、本発明は、前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。
また、本発明は、前記発現ベクターが形質感染された結合分子生産細胞株を提供する。
また、本発明は、結合分子の選別方法を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を含む組成物を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を含むインフルエンザＡウイルス来由の疾患の予防及び治療用組成物を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を含むインフルエンザＡウイルス診断用組成物を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を用いたインフルエンザＡウイルス来由の疾患治療方法を提供する。
また、本発明は前記結合分子を用いたインフルエンザＡウイルス来由の疾患予防方法を提供する。
また、本発明は、前記結合分子を用いたインフルエンザＡウイルス感染有無の診断方法を提供する。
さらに本発明は、前記結合分子を含むインフルエンザＡウイルス診断用キットを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の結合分子は、インフルエンザＡウイルスに対して結合及び中和活性を持つので、前記インフルエンザＡウイルスによる疾患の予防及び治療に有用であり、インフルエンザＡウイルスの感染有無の診断方法にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｈ３ヘマグルチニン（Hemaglutinin；以下、“ＨＡ”と称する）に対して結合することで一次選別された結合分子の結合力を、ＥＬＩＳＡ方法で検証したグラフである。
【図２】ｐＣＴ１４５（Ａ）及びｐＣＴ１４７（Ｂ）のベクター地図であり、Ａ：ｐＣＴ１４５ベクター、Ｂ；ｐＣＴ１４７ベクター、ｐａｃ：Puromycin N-acetyl-tranferaseをコードする遺伝子（ＰＡＣ）、ＤＳ：dyad symmetry sequence（ＥＢＮＡ１はoriP内のdyad symmetry（ＤＳ）エレメントと結合する）である。
【図３】本発明の結合分子を発現する発現ベクター地図である。
【図４】本発明の結合分子を用いたマウス動物実験結果である。
【図５】本発明の結合分子を用いたフェレット動物実験中で、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８）インフルエンザウイルス接種後の鼻腔洗浄液及び肺組織でのウイルス力価変化結果である。
【図６】本発明の結合分子を用いたフェレット動物実験中で、Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）インフルエンザウイルス接種後の鼻腔洗浄液及び肺組織でのウイルス力価変化の結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の単語を、次のように定義する。
本発明で使われる“インフルエンザＡウイルス（influenza A virus）”は、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）に属するエンベロープウイルス（enveloped virus）であり、８個の分節からなるマイナスセンス１本鎖（Negative-sense、single-strand）のＲＮＡ（ribonucleic acid）を遺伝体として持ち、Ａ、Ｂ及びＣグループに分類され、主要表面タンパク質であるＨＡ（hemaggutinin）及びＮＡ（neuraminidase）によって再び様々なサブタイプ（subtype）に分けられる。現在まで１６種のＨＡ及び９種のＮＡが知られている。
【００１２】
本発明で使われる“Ｈ３サブタイプのウイルス”と表記されたものは、Ｈ３サブタイプのＨＡを持っているウイルスを称するので、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ７、Ｈ３Ｎ８及びＨ３Ｎ９ウイルスが含まれる。
【００１３】
本発明で使われる“ヘマグルチニン（hemaggutinin、以下“ＨＡ”と称する）”は、インフルエンザウイルスの外被（envelope）糖蛋白質を示す。ＨＡは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に吸着して貫通することを媒介する。現在まで１６種のサブタイプが報告されている。
【００１４】
本発明で使われる“回復した患者または完治患者”は、インフルエンザＡウイルスに感染されてインフルエンザＡウイルスに陽性反応を示したが、治されて血液内でインフルエンザＡウイルスが陰性反応を示す患者である。
【００１５】
本発明で使われる“結合分子”は、キメラ、ヒト化またはヒト単一クローン抗体のような単一クローン抗体を含む完全な（intact）免疫グロブリン（immunoglobulin）、または抗原に結合する免疫グロブリン、例えば、インフルエンザＡウイルスの単量体ＨＡまたは三量体ＨＡとの結合のために、完全な免疫グロブリンと競争する免疫グロブリン断片を含む可変性ドメインを意味する。構造とは構わずに抗原−結合断片は、完全な免疫グロブリンによって認識された同じ抗原と結合される。抗原−結合断片は、結合分子のアミノ酸配列の２個以上の連続基、２０個以上の連続アミノ酸残基、２５個以上の連続アミノ酸残基、３０個以上の連続アミノ酸残基、３５個以上の連続アミノ酸残基、４０個以上の連続アミノ酸残基、５０個以上の連続アミノ酸残基、６０個以上の連続アミノ酸残基、７０個以上の連続アミノ酸残基、８０個以上の連続アミノ酸残基、９０個以上の連続アミノ酸残基、１００個以上の連続アミノ酸残基、１２５個以上の連続アミノ酸残基、１５０個以上の連続アミノ酸残基、１７５個以上連続アミノ酸残基、２００個以上の連続アミノ酸残基、または２５０個以上の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含む。“抗原−結合断片”は、特にＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、２価の（ｂｉｖａｌｅｎｔ）単鎖抗体、単鎖把持抗体、ディアボディ、トリアバデ−、テトラボディ、ポリペプチドへの特定抗原に結合するのに十分な免疫グロブリンの一つ以上の断片を含むポリペプチドなどを含む。前記断片は合成によって、または完全な免疫グロブリンの酵素的または化学的分解によって生成されるか、または、再組み合わせＤＮＡ技術によって遺伝工学的に生成される。生成方法は、当業界で周知のものである。
【００１６】
本発明で使われる“薬剤学的に許容可能な賦形剤”という用語は、容認可能な、または便利な投薬形態を製造するための薬物、製剤または結合分子のような活性分子で組み合わせられる不活性物質を意味する。薬剤学的に許容可能な賦形剤は、非毒性であるか、または、少なくとも毒性が使われた用量及び濃度において、収容者にその意図された用途のために許容される賦形剤であり、薬物、製剤または結合粉剤を含む剤形化の異なる成分と両立する。
【００１７】
本発明で使われる“治療学的に有効な量”という用語は、インフルエンザＡウイルスの被曝前または被曝後の予防または治療に有効な本発明の結合分子の量を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の発明者らは、インフルエンザＡウイルスに感染された後で回復した患者の採血された血液からＰＢＭＣ（peripheral blood mononuclear cell）を分離し、前記分離されたＰＢＭＣを対象としてＨ１サブタイプのＨＡに対する単一クローン抗体を生産するＢ細胞を、ＩＳＡＡＣ方法を用いて選別した。前記選別されたＢ細胞から、ＨＡに対する単一クローン抗体を生産する遺伝子情報をＲＴ−ＰＣＲ方法によって収得し、これをｐｃＤＮＡベクターに挿入してＣＨＯ細胞株に形質感染した後、抗体を生産して１次に８２個の抗体を選別した。ＨＡとの反応性をさらに綿密に測定するために、ｐｃＤＮＡベクターに挿入されたすべての抗体をヒト細胞であるＦ２Ｎ細胞に形質感染し、これより生産された抗体を、Ｈ３サブタイプの単量体ＨＡ一部及び三量体ＨＡを抗原として用いたＨＡ−ＥＬＩＳＡを通じて比較分析を行い、三量体ＨＡと高い割合で反応する６個（ＣＴ１２９、ＣＴ１３５、ＣＴ１４７、ＣＴ１４９、ＣＴ１６３及びＣＴ１６６抗体）の抗体を２次選別した。前記２次選別された抗体でいろいろな種類のインフルエンザウイルスに対する中和活性を確認するために、マイクロ中和試験法（microneutralization test：以下、“ＭＮテスト”と称する）及び血球凝集抑制試験法（hemagglutination inhibition test：以下、“ＨＩテスト”と称する）を行った。様々な抗体が様々なインフルエンザウイルスに高い、または低い中和活性を示した、すべての抗体がＨＩテストで不応反応を示した。ＭＮテストを通じて様々なウイルスに複合的な中和活性を示すＣＴ１４９抗体を選別し、遺伝子を抗体発現効率の高いＭａｒＥｘ発現ベクターに挿入した後でＦ２Ｎ細胞に形質感染して生産された抗体により、さらに多様なインフルエンザウイルスについてのＭＮテストを施した。その結果、ＣＴ１４９抗体は、Ｈ１、Ｈ３サブタイプのウイルスだけではなくＨ５、Ｈ７、Ｈ９サブタイプのウイルスに対しても中和活性を持つということが分かった（表４を参照）。また、Ｈ３サブタイプのインフルエンザウイルスを用いた動物実験で、ＣＴ１４９抗体は、Ｈ３Ｎ２感染の予防及び治療に優れた効果を示した（図４を参照）。前記結果を通じて本発明者らは、インフルエンザＡウイルス感染に対処する抗インフルエンザＡウイルス単一クローン抗体の発明を完成した。
【００１９】
よって、本発明は、インフルエンザＡウイルスに対して中和活性を持つ結合分子を提供する。
【００２０】
前記結合分子は、抗体であることを特徴とし、前記抗体は、Ｆａｂ切片、Ｆｖ切片、ディアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが望ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明において、前記結合分子は、インフルエンザＡウイルス表面のＨＡに結合することを特徴とする。また前記結合分子は、インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１サブタイプに感染された後で回復した患者の血液に存在するＢ細胞で生産されることを特徴とする。
特にＣＴ１４９抗体は、Ｇｒｏｕｐ１（Ｈ１，Ｈ５，Ｈ９）のみならずＧｒｏｕｐ２（Ｈ３，Ｈ７）インフルエンザウイルスに対しても中和活性を持っている。
【００２２】
本発明において、前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１Ｎ１サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１サブタイプは、Ａ／Ｏｈｉｏ／０７／２００９である。また、前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ５Ｎ１サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１サブタイプは、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４×ＰＲ８である。合わせて、前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ７Ｎ２サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザＡウイルスＨ７Ｎ２サブタイプは、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｖｉｒｇｉｎｉａ／０２×ＰＲ８である。前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ９Ｎ２サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザＡウイルスＨ９Ｎ２サブタイプは、Ａ／Ｇｒｅｅｎ−ｗｉｎｇｅｄ ｔｅａｌ／２０９／ＴＸ／２００９及びＡ／ｃｋ／ＨＫ／Ｇ９／９７×ＰＲ８からなる群から選択されるいずれか一つ以上である。また本発明において、前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ３Ｎ２サブタイプであることを特徴とし、前記インフルエンザＡウイルスＨ３Ｎ２サブタイプは、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎ／３／０３．ｒｇ、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９−Ｘ１０９、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／９２−Ｒ−Ｈ３、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／９４Ｒ−Ｈ３、Ａ／Ｎａｎｃｈａｎｇ／９３３／９５、Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９からなる群から選択されるいずれか一つ以上である。
【００２３】
本発明において、可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムによって通常的な方法で定められた（文献［Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th),National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)］参照）。本発明に使われたＣＤＲナンバリングはカバット方法（Ｋａｂａｔ ｍｅｔｈｏｄ）を使ったが、それ以外にＩＭＧＴ方法、Ｃｈｏｔｈｉａ方法、ＡｂＭ方法など他の方法によって定められたＣＤＲを含む結合分子も本発明に含まれる。
【００２４】
また、本発明は、下記軽鎖ポリペプチド配列を含むインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号１、配列番号７、配列番号１３及び配列番号１５で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ１領域と、配列番号２、配列番号８及び配列番号１６で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ２領域と、配列番号３または配列番号９で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのＣＤＲ３領域と、を含むことを特徴とする軽鎖。
【００２５】
また、本発明は、下記重鎖ポリペプチド配列を含むインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号４または配列番号１０で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのＣＤＲ１領域と、配列番号５、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１７で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ２領域と、配列番号６または配列番号１２で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのＣＤＲ３領域と、を含むことを特徴とする重鎖。
【００２６】
また、本発明は、下記軽鎖及び重鎖ポリペプチド配列を含むインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号１、配列番号７、配列番号１３及び配列番号１５で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ１領域と、配列番号２、配列番号８及び配列番号１６で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ２領域と、配列番号３または配列番号９で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのＣＤＲ３領域と、を含むことを特徴とする軽鎖、及びカバット方法によって、配列番号４または配列番号１０で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのＣＤＲ１領域と、配列番号５、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１７で表されるポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ２領域と、配列番号６または配列番号１２で表されるポリペプチド配列のうちいずれか一つのＣＤＲ３領域と、を含むことを特徴とする重鎖。
【００２７】
また、本発明は、下記ポリペプチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリペプチド配列で構成されることを特徴とするインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号１で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖、及び配列番号４で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号７で表されるＣＤＲ１領域、配列番号８で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号９で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖、及び配列番号１０で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１１で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１２で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号１３で表されるＣＤＲ１領域、配列番号８で表されるＣＤＲ２領域、及び配列番号９で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖、及び配列番号１０で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１４で表されるＣＤＲ２領域、及び配列番号６で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される結合分子と、カバッ方法によって、配列番号１５で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１６で表されるＣＤＲ２領域、及び配列番号９で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖、及び配列番号１０で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１７で表されるＣＤＲ２領域、及び配列番号１２で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される結合分子。
【００２８】
本発明において、前記結合分子は、配列番号３７で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号３８で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
また、前記結合分子は、配列番号３９で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号４０で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
また、前記結合分子は、配列番号４１で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号４２で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
同時に、前記結合分子は、配列番号４３で表されるポリペプチド配列を含む軽鎖、及び配列番号４４で表されるポリペプチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
【００２９】
前記結合分子は、インフルエンザＡウイルスＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つの中和活性を持つことを特徴とする。また前記インフルエンザＡウイルスＨ３サブタイプは、Ｈ３Ｎ２であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【００３０】
また、本発明は、下記軽鎖ポリヌクレオチド配列を含むインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３０及び配列番号３４で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ１領域と、配列番号１９、配列番号２５及び配列番号３５で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ２領域と、配列番号２０または配列番号２６で表されるポリヌクレオチド配列のうちいずれか一つのＣＤＲ３領域と、を含むことを特徴とする軽鎖。
【００３１】
また、本発明は、下記重鎖ポリヌクレオチド配列を含むインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号２１、配列番号２７及び配列番号３１で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ１領域と、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３２及び配列番号３６で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ２領域と、配列番号２３、配列番号２９及び配列番号３３で記載したポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ３領域と、を含むことを特徴とする重鎖。
【００３２】
また、本発明は、下記軽鎖及び重鎖ポリヌクレオチド配列を含むインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３０及び配列番号３４で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ１領域と、配列番号１９、配列番号２５及び配列番号３５で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ２領域と、配列番号２０または配列番号２６で表されるポリヌクレオチド配列のうちいずれか一つのＣＤＲ３領域と、を含むことを特徴とする軽鎖、及びカバット方法によって、配列番号２１、配列番号２７及び配列番号３１で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ１領域と、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３２及び配列番号３６で表されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ２領域と、配列番号２３、配列番号２９及び配列番号３３で記載したポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのＣＤＲ３領域と、を含むことを特徴とする重鎖。
【００３３】
また、本発明は、下記ポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とするインフルエンザＡウイルスに対する中和活性を持つ結合分子を提供する。カバット方法によって、配列番号１８で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１９で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２０で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号２１で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号２４で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号２７で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２８で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２９で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号３０で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号３１で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される結合分子、及びカバット方法によって、配列番号３４で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖及び配列番号３１で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３６で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２９で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖で構成される結合分子。
【００３４】
本発明において、前記結合分子は、配列番号４５で表されるポリヌクレオチド配列を含む軽鎖及び配列番号４６で表されるポリヌクレオチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
また、前記結合分子は、配列番号４７で表されるポリヌクレオチド配列を含む軽鎖及び配列番号４８で表されるポリヌクレオチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
また、前記結合分子は、配列番号４９で表されるポリヌクレオチド配列を含む軽鎖及び配列番号５０で表されるポリヌクレオチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
さらに、前記結合分子は、配列番号５１で表されるポリヌクレオチド配列を含む軽鎖及び配列番号５２で表されるポリヌクレオチド配列を含む重鎖で構成されることを特徴とする。
前記結合分子は、インフルエンザＡウイルスＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つに対して中和活性を持つことを特徴とする。また、前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ３サブタイプはＨ３Ｎ２であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【００３５】
本発明の結合分子は、抗体であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。前記抗体は、Ｆａｂ切片、Ｆｖ切片、ディアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが望ましく、抗体の一部分としてインフルエンザＡウイルスＨＡに結合する能力を持ち、本発明の結合分子と競争的にＨＡに結合する全ての断片を含む。さらに、本発明は、前記結合分子の機能的変異体を含む。変異体がインフルエンザＡウイルスＨ３サブタイプまたはその断片に特異的に結合するために、本発明の結合分子と競争できるならば、本発明の結合分子の機能的変異体と見なされる。詳細には、機能的変異体がインフルエンザＡウイルスＨＡまたはその断片に結合でき、これに対して中和活性を持つならば、本発明の機能的変異体として見なされる。機能的変異体は、１次構造的配列が実質的に類似した誘導体を含むが、これに制限されるものではなく、例えば、生体外（in vitro）または生体内（in vivo）変形、化学薬品及び／または生化学薬品を含み、これらは、本院発明の親結合分子では見つけられない。このような変形としては、例えば、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、地質または地質誘導体の共有結合、架橋、二硫化結合形成、グリコシル化、水酸化、メチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解及び燐酸化などが含まれる。機能的変異体は、選択的に、親結合分子のアミノ酸配列と比べて一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を含む結合分子である。さらに機能的変異体は、アミノ末端またはカルボキシ末端のうち一つまたは全てにおいてアミノ酸配列の切断体（truncated form）を含む。
【００３６】
本発明の機能的変異体は、本発明の親結合分子と比べて同一または異なり、または、さらに高いまたは低い結合親和力を持つが、依然としてインフルエンザＡウイルスのＨＡまたはその断片に結合する。例えば、本発明の機能的変異体は、本発明の親結合分子と比べてインフルエンザＡウイルスＨＡまたはその断片に対して増加または減少した結合親和力を持つ。望ましくは、骨格構造、超可変（Hypervariable）領域、特に、ＣＤＲ３領域を含むが、これらに限定されるものではなく、可変領域のアミノ酸配列が変形される。一般的に軽鎖または重鎖領域は、３個のＣＤＲ領域を含む３個の超可変領域及びさらに保存された領域、すなわち、骨格領域（ＦＲ）を含む。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基及び超可変ループからのアミノ酸残基を含む。本発明の範囲に属するための機能的変異体は、本明細書の親結合分子と少なくとも約５０％〜９９％、望ましくは、少なくとも約６０％〜９９％、さらに望ましくは、少なくとも約８０％〜９９％、さらに望ましくは、約９０％〜９９％、特に少なくとも約９５％〜９９％、及び特に少なくとも約９７％〜９９％アミノ酸配列同質性を持つ。比較されるアミノ酸配列を最適に配列し、類似または同じアミノ酸残基を定義するために、コンピュータアルゴリズムのうち当業者に周知のＧａｐまたはＢｅｓｔ ｆｉｔを使える。機能的変異体は、親結合分子またはその一部をＰＣＲ方法、オリゴマーヌクレオチドを用いた突然変異生成及び部分突然変異生成を含む公知の一般分子生物学的方法によって変化させるか、または有機合成方法で得られるが、これらに制限されるものではない。
【００３７】
また、本発明は、前記結合分子を暗号化する、単離された核酸分子を提供する。
本発明の核酸分子は、本発明で提供する抗体のアミノ酸配列が、周知の如く、ポリヌクレオチド配列にて翻訳された核酸分子をいずれも含む。したがって、ＯＲＦ（open reading frame）による多様なポリヌクレオチド配列が製造され、これもいずれも本発明の核酸分子に含まれる。
【００３８】
また、本発明は、前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。前記発現ベクターとしては、セルトリオン固有の発現ベクターであるＭａｒＥｘベクター及び商業的に広く使われるｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター；コスミド；ラムダ、ラムダ状（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１ Ｐ２２、Ｑμ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスからなる群から選択されたいずれか一つから選択された発現ベクターを用いることが望ましいが、これらに限定されるものではなく、当業者に発現ベクターと知られた全ての発現ベクターは本発明に使用でき、発現ベクターを選択する時には目的とする宿主細胞の性質による。宿主細胞へのベクター導入時、燐酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクションまたは電気穿孔法によって行われるが、これらに限定されるものではなく、当業者ならば、使用する発現ベクター及び宿主細胞に好適な導入方法を選択して用いる。望ましくは、ベクターは一つ以上の選別マーカーを含むが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いて生産物生産如何によって選別できる。選別マーカーの選択は、目的とする宿主細胞によって選別され、これは公知の方法を用いるので、本発明はこれに制限されない。
【００３９】
本発明の核酸分子の精製を容易にするために、タグ配列を発現ベクター上に挿入して融合させる。前記タグは、ヘキサ−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグまたはｆｌａｇタグを含むが、これらに限定されるものではなく、当業者に周知の精製を容易にするタグならば、いずれも本発明で利用できる。
また、本発明は、前記発現ベクターが形質感染されたインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子生産細胞株を提供する。
【００４０】
本発明において、前記細胞株は、哺乳動物、植物、昆虫、菌類または細胞性起源の細胞を含むが、これらに限定されるものではない。前記哺乳動物細胞としては、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ボウズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなる群から選択されたいずれか一つを宿主細胞として使用することが望ましいが、これらに限定されず、当業者に周知の哺乳動物宿主細胞として使用可能な細胞はいずれも利用できる。
【００４１】
また、本発明は、下記のような段階を含むインフルエンザＡウイルスに感染された患者からの、抗インフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子の選別方法を提供する。１）インフルエンザＡウイルスに感染された患者を対象として血液内インフルエンザＡウイルス陰性患者を選別する段階と、２）前記段階１）で選別された患者から血液を採取して収集する段階と、３）前記段階２）で収集された患者の血液からＢ細胞を分離する段階と、４）前記段階３）でＨＡと結合する結合分子を生産するＢ細胞を選別する段階と、５）前記段階４）で選別されたＢ細胞からＲＮＡを抽出する段階と、６）前記段階５）の抽出されたＲＮＡを対象として結合分子遺伝子を増幅する段階と、７）前記段階６）で増幅された遺伝子を発現ベクターにクローニングする段階と、８）前記段階７）の発現ベクターを宿主細胞に形質感染させる段階と、９）前記段階８）で製作された形質感染された細胞で生産する結合分子から、ＨＡと結合する結合分子を選別する段階と、１０）選別された結合分子に対する細胞株を製作して培養する段階と、１１）前記段階１０）の宿主細胞の培養液で、インフルエンザＡウイルスのＨＡに結合する結合分子を精製する段階と、１２）前記段階１１）で精製された結合分子を対象としてインフルエンザＡウイルス中和活性を再確認する段階と、１３）前記段階１２）の中和活性実験で、インフルエンザＡウイルス中和活性を持つ結合分子を再選別する段階。
【００４２】
前記選別方法の結合分子は、抗体であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。前記抗体は、Ｆａｂ切片、Ｆｖ切片、ディアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが望ましく、抗体の一部分として、インフルエンザＡウイルスＨＡに結合する能力を持ち、かつ本発明の結合分子と競争的にＨＡに結合する断片をいずれも含む。
【００４３】
さらに、本発明は、前記結合分子の機能的変異体を含む。変異体がインフルエンザＡウイルスまたはその断片に特異的に結合するために本発明の結合分子と競争できるならば、本発明の結合分子の機能的変異体と見なされる。詳細には、機能的変異体がインフルエンザＡウイルスＨＡまたはその断片に結合でき、これに対して中和活性を持つならば、本発明の結合分子の機能的変異体と見なされる。機能的変異体は、１次構造的配列が実質的に類似した誘導体を含むが、これに制限されるものではなく、例えば、生体外または生体内変形、化学薬品及び／または生化学薬品を含み、これらは本発明の親結合分子では見つけられない。このような変形は、例えば、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、地質または地質誘導体の共有結合、架橋、二硫化結合形成、グリコシル化、水酸化、メチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解及び燐酸化などが含まれる。機能的変異体は、選択的に親結合分子のアミノ酸配列と比べて一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を含む結合分子である。
【００４４】
さらに、機能的変異体は、アミノ末端またはカルボキシ末端のうち一つまたは全てにおいて、アミノ酸配列の切断体を含む。本発明の機能的変異体は、本発明の親結合分子と比べて同一または異なり、または、さらに高いまたは低い結合親和力を持つが、依然としてインフルエンザＡウイルスのＨＡまたはその断片に結合できる。例えば、本発明の機能的変異体は、本発明の親結合分子と比べてインフルエンザＡウイルスＨＡまたはその断片に対して増加または減少した結合親和力を持つ。望ましくは、骨格構造、超可変領域、特にＣＤＲ３領域を含むが、これらに限定されるものではなく、可変領域のアミノ酸配列が変形される。一般的に軽鎖または重鎖領域は、３個のＣＤＲ領域を含む３個の超可変領域及びさらに保存された領域、すなわち、骨格領域（ＦＲ）を含む。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基及び超可変ループからのアミノ酸残基を含む。本発明の範囲に属するための機能的変異体は、本明細書の親結合分子と少なくとも約５０％〜９９％、望ましくは、少なくとも約６０％〜９９％、さらに望ましくは、少なくとも約８０％〜９９％、さらに望ましくは約９０％〜９９％、特に少なくとも約９５％〜９９％、及び特に少なくとも約９７％〜９９％アミノ酸配列同質性を持つ。比較されるアミノ酸配列を最適に配列し、類似または同じアミノ酸残基を定義するために、コンピュータアルゴリズムのうち当業者に周知のＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使える。機能的変異体は、親結合分子またはその一部を、ＰＣＲ方法、オリゴマーヌクレオチドを用いた突然変異生成及び部分突然変異生成を含む公知の一般分子生物学的方法によって変化させるか、または有機合成方法で得られるが、これらに制限されるものではない。
【００４５】
また、本発明は、前記結合分子を含む組成物を提供する。
本発明の組成物は、本発明のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子以外に、薬剤学的に許容可能な賦形剤を含む。薬剤学的に許容可能な賦形剤は、公知のものである。
また、本発明は、前記結合分子を含むインフルエンザＡウイルス来由の疾患予防及び治療用組成物を提供する。
【００４６】
本発明の組成物は、本発明のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子以外に、薬剤学的に許容可能な賦形剤を含む。薬剤学的に許容可能な賦形剤は、公知のものである。
また本発明の予防及び治療用組成物は、少なくとも５個の異なる治療剤を含む。本発明の予防及び治療用組成物は、インフルエンザＡウイルスＨＡ及びその断片に結合する数種の単一クローン抗体を含み、これを通じて中和活性に相乗作用を示す。
【００４７】
さらに、本発明の予防及び治療用組成物は、少なくとも一つの他の治療剤または診断制を含む。前記治療剤としては、抗ウイルス薬剤を含むが、これに限定されるものではない。このような薬剤としては、抗体、小分子、有機または無機化合物、酵素、ポリヌクレオチド配列、抗ウイルス性ペプチドなどである。
【００４８】
本発明の予防及び治療用組成物は、製造及び保存条件下で無菌かつ安定しており、伝達時または伝達前に好適な薬剤学的に許容可能な賦形剤中に、再構成のために粉末状に存在する。殺菌性注射溶液の製造のための殺菌粉末の場合、望ましい製造方法は、活性構成成分の粉末及びそれより予め殺菌−ろ過された溶液から、さらなる所望の構成成分を生産する真空乾燥及び凍結乾燥である。本発明の組成物は溶液状態であり、好適な薬剤学的に許容可能な賦形剤が、単位投与量注射型を提供するために伝達される前または伝達する時に添加及び／または混合される。望ましくは、本発明で使われる薬剤学的に許容可能な賦形剤は、高薬物濃度に好適であり、適当なフロー性を保持し、必要に応じて吸収が遅延される。
【００４９】
本発明の予防及び治療用組成物投与の最適の経路選択は、組成物内の活性分子の物理−化学的特性、臨床的状況の緊急性及び所望の治療用効果に対する活性分子のプラズマ濃度の関係を含むいろいろな因子によって影響される。例えば、本発明の結合分子は、インプラント及びマイクロカプセル化伝達システムを含む、調節された放出剤形の迅速な放出を防止した担体と共に製造される。エチレンビニルアセテート、多価無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーが本発明に使われる。また本発明の結合分子は、抗体の不活性化を防止した物質または化合物でコーティングされるか、または共に投与される。例えば、本発明の結合分子は、好適な担体−リポソームまたは希釈剤−と共に投与される。
【００５０】
本発明の予防及び治療用組成物の投与方法は、経口及び非経口に分けられ、望ましい投与経路は、静脈内皮下または鼻腔が望ましいが、これらに限定されるものではない。
前記経口形態は、錠剤、トローチ剤、薬用ドロップス剤、水性または油性懸濁液剤、酸剤または分散顆粒剤、エマルジョン剤、剛性カプセル剤、軟性ゼラチンカプセル剤、シロップ剤またはエリクサー剤、ピール剤、糖衣錠、液剤、ゲル剤またはスラリー剤として製剤化される。これら剤形は、不活性希釈剤、顆粒化または崩解剤、結合剤、光沢剤、保存剤、着色剤、風味剤または甘味剤、植物性油またはミネラル油、湿潤剤及び増粘剤を含む薬剤学的賦形剤を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
前記非経口形態は、水性または非水性の等張性殺菌非毒性注射または注入溶液または懸濁液の形態である。溶液または懸濁液は、適用された投与量及び濃度で、受容体に非毒性の１，３−ブタンジオール、リンガー溶液、ハンクス溶液、等張性塩化ナトリウム溶液のような薬剤、オイル、脂肪酸、局所痲酔剤、保存剤、緩衝液、粘度または溶解度増加剤、水溶性抗酸化剤、油溶性抗酸化剤及び金属キレート化剤を含む。
また、本発明は、インフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子に標識物質を接合したコンジュゲートを含むインフルエンザＡウイルス診断用組成物を提供する。
【００５２】
本発明の診断用組成物は、検出可能なモイエティ／薬剤のような少なくとも一つの検出可能な標識物質を含む。本発明の標識物質は、本発明のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子に非共有的に連結され、また共有結合で前記結合分子に直接的に連結される。選択的に一つ以上の連結化合物によって前記結合分子に連結されてもよい。このような技術は、公知のものである。このような標識物質は、検出可能なモイエティ／薬剤としては、酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、毒素及び非放射性パラマグネチック金属イオンからなる群から選択されたいずれか一つであることが望ましいが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、下記のような段階を含むインフルエンザＡウイルス来由の疾患治療方法を提供する。インフルエンザＡウイルスによって発生する疾患を持つ対象に、本発明のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子を治療学的に有効な量に投与する段階。
【００５３】
本発明の治療方法において、インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９サブタイプからなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とし、前記インフルエンザＡウイルスＨ３サブタイプは、Ｈ３Ｎ２であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
本発明の治療方法において、当業者に周知の治療剤を共に投与する。
本発明の治療方法において、インフルエンザＡウイルス来由の疾患は、新種インフルエンザ、大流行性インフルエンザ及び季節性インフルエンザからなる群から選択されたいずれか一つであるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
本発明の治療方法において、インフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子投与量は、最適の反応を提供するように調節される。投与量の範囲は、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇであり、望ましくは０．１〜１５０ｍｇ／ｋｇであり、さらに望ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇであるが、これらに限定されるものではない。投与回数は、様々な時間にかけて分けて投与され、投与量は、治療的状況の緊急事態によって示されるところによって比例的に減少または増加し、これは、本発明で限定するものではなく、担当医者の権限によって変化する。
【００５５】
本発明の治療方法において、インフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子投与方法は、経口及び非経口に分けられ、望ましい投与経路は静脈内であるが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、下記のような段階を含むインフルエンザＡウイルス来由の疾患予防方法を提供する。対象に、本発明のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子を治療学的に有効な量に投与する段階。
【００５６】
本発明の予防方法において、当業者に周知の予防剤を共に投与する。
本発明の予防方法において、インフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子投与量は、最適の反応を提供するように調節される。投与量の範囲は、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇであり、望ましくは０．１〜１５０ｍｇ／ｋｇであり、さらに望ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇであるが、これらに限定されるものではない。投与回数は、様々な時間にかけて分けて投与され、投与量は、治療的状況の緊急事態によって示されるところによって比例的に減少または増加し、これは、本発明で限定するものではなく、担当医者の権限によって変化する。
【００５７】
本発明の予防方法において、インフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子の投与方法は、経口及び非経口に分けられ、望ましい投与経路は静脈内であるが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、下記のような段階を含む患者のインフルエンザＡウイルス感染有無の診断方法を提供する。１）サンプルと、本発明のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子とを接触させる段階と、２）前記結合分子とサンプルとの反応を検出する段階、または１）サンプルと本発明の診断用組成物とを接触させる段階と、２）前記診断用組成物とサンプルとの反応を検出する段階。
【００５８】
本発明の診断方法において、前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９サブタイプからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とし、前記インフルエンザＡウイルスＨ３サブタイプは、Ｈ３Ｎ２であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
本発明の診断方法において、本発明の結合分子は、診断検出のために必要に応じて標識物質を接合させ、これは公知のものである。
本発明の診断方法において、前記サンプルは、対象の痰、唾、血液、汗、肺細胞、肺組織の粘液、呼吸器組織及び唾液からなる群から選択されたいずれか一つであることが望ましいが、これらに限定されず、当業者に周知の通常的な方法でサンプル準備が可能である。
【００５９】
本発明の診断方法において、前記反応検出方法は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収分析法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光法、免疫細胞化学、ＦＡＣＳ、ＢＩＡＣＯＲＥ及びウエスタンブルロッ分析のような均質及び異種性結合免疫分析からなる群から選択されたいずれか一つであるが、これらに限定されず、当業者に周知の検出方法ならば、本発明に使用できる。
また、本発明は、１）本発明のインフルエンザＡウイルスに中和活性を持つ結合分子と、２）容器を含むインフルエンザＡウイルス診断用キットとを提供する。
さらに本発明は、１）本発明のインフルエンザＡウイルス診断用組成物と、２）容器を含むインフルエンザＡウイルス診断用キットとを提供する。
【００６０】
本発明の診断キットにおいて、前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９サブタイプからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とし、前記インフルエンザＡウイルスＨ３サブタイプは、Ｈ３Ｎ２であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
本発明の診断用キットにおいて、前記２）の容器には、固体担体が含まれる。本発明の結合分子は、固体担体に取り付けられ、このような固体担体は、多孔性または非多孔性、平面または非平面である。
【００６１】
＜実施例＞
＜実施例１：インフルエンザ回復患者の血液からのＰＢＭＣ分離準備＞
回復患者群は、新種インフルエンザ確診後２〜４週となった患者であり、血液内に新種インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）が存在していないと確認され、かつ新種インフルエンザウイルスに対する抗体を保有している志願者で構成され、これは、臨床試験審査委員会（ＩＲＢ）の承認をもらって行われた。これら患者群の特徴は、次の通りである。（１）季節インフルエンザを対するワクチンを接種されていない。（２）他の伝染性ウイルス、すなわち、ＨＢｓＡｇに対して陰性反応を、ａｎｔｉ−ＨＣＶ抗体及びａｎｔｉ−ＨＩＶ抗体に対して陰性反応を示す。（３）血漿（plasma）で、インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１サブタイプのＲＴ−ＰＣＲに陰性反応を示す。（４）血清で、インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１サブタイプの単量体（monomeric）ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）に対するＥＬＩＳＡで１：１６０以上の力価（titer）を示す。志願者から約１００ｍｌの全血を収得し、ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Axis-Shield,Norway,1114545）方法を使ってＰＢＭＣ（peripheral blood mononuclear cell）を分離した。分離されたＰＢＭＣは、燐酸緩衝溶液で３回洗浄した後、ＫＭ ｂａｎｋｅｒ II（Cosmobio,Japan,KOJ-16092010）冷凍培地（freezing medium）で２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度に合わせ、液体窒素タンク（Liquid Nitrogen Tank）に保管された。
【００６２】
＜実施例２：単一クローン抗体の１次選別＞
抗原特異抗体を分泌するＢ細胞の選別方法は、Ｊｉｎら（Jin A.et al.,2009.Nat Med.15,1088-1092）によって説明された方法を用いた。簡略に、前記実施例１で分離されたＰＢＭＣを、用意されたマイクロアレイチップ上のそれぞれのウェルに１つずつ添加した。単一細胞から分泌された抗体は、予めコーティングされた抗ヒトＩｇＧ抗体によって確認された。これを通じて選別された抗体分泌細胞（antibody secreting cell）を対象として標識されたＨＡ抗原を用いて、ＨＡに結合する抗体の分泌有無を確認した。確認された個別抗体分泌細胞から、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）方法を用いて、抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子の全体配列を確保した。確保された重鎖及び軽鎖ＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（in vitrogen,USA,V790-20）に挿入し、抗体の軽鎖及び重鎖をそれぞれ生産する発現ベクターを製造した後、前記製造された軽鎖及び重鎖生産発現ベクターをＣＨＯ細胞に形質感染させた。次いで、形質感染されたＣＨＯ細胞で生産された抗体を用いて、下記の実施例３に記載のＨＡ−ＥＬＩＳＡ方法を通じてＨＡに結合される抗体８２個を１次的に選別した。この時には、抗体サンプルを連続して希釈せず、ＨＡとの反応を示すすべての抗体を１次的に選別した。
【００６３】
＜実施例３：単一クローン抗体のＨＡ結合能の検証＞
１次的に選別された８２個の抗体から、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＨＡへの結合力が高い単一クローン抗体を２次的に選別するために、単量体ＨＡのサブユニット（ＨＡ１）及び三量体ＨＡを確保してＨＡ−ＥＬＩＳＡを進めた。インフルエンザＡウイルスの再組み合わせＨＡ１サブユニット（１１０５６−Ｖ０８Ｈ１）は、Sino Biological Inc.（China）から購入した。購入されたＨＡ１サブユニットは、Ｃ−末端にヒスチジン（polyhistidine）残基を含むＨＡのＮ−末端分節（Ｍｅｔ１−Ａｒｇ３４５）で構成されており、形質感染されたヒト細胞から生産された。再組み合わせ三量体ＨＡ（ＦＲ−６１）は、ＩＲＲ（Influenza Reagent Resource,USA）から提供した。前記三量体ＨＡは、Ｃ−末端ペプチドにトロンビン切断部位、三量体形成誘導ドメイン（trimerizing domain;foldon）及び６個のヒスチジン残基を含む構造であり、バキュロウイルスシステムを用いて生産された。
【００６４】
抗体の抗原（ＨＡ）との反応性は、抗原（ＨＡ）及び抗体を用いた酵素結合免疫吸収分析法（ＥＬＩＳＡ）によって測定された。詳細な方法は、下記の通りである。先ず、５０ｕｌの三量体ＨＡ抗原（２５０ｎｇ／ｍｌ）を、それぞれ９６−ウェルマイクロタイタープレート（Nunc,Denmark,449824）のウェルに吸着させた。前記プレートを、１％ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin，ＢＳＡ）が含有された燐酸緩衝溶液（Teknova,USA,D5120）で処理してブロッキングした後、３倍ずつ連続して希釈した抗体サンプル（starting concentration：１ｕｇ／ｍｌ）をプレートの各ウェルに加えた。次いで、室温で１時間反応（incubation）させた後、過酸化酵素の標識された塩素の抗ヒトガンマ抗体（Zymed,USA,62.8420）で感知した。室温で１時間反応後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Sigma-Aldrich,USA,T0440）と反応させ、本反応を１Ｎ ＨＣｌで中止させた。プレートリーダ（Spectramax plus 384,Molecular Device）を使って４５０／５７０ｎｍで吸光度を測定し、グラフパッドプリズムプログラム（GraphPad Software Inc.USA）を用いて、抗原−抗体間反応性をグラフで示した。
【００６５】
大多数の抗体がＨ３Ｎ２のＨＡに対して結合していないが、図１に示されたようにＣＴ１２９、ＣＴ１３５、ＣＴ１４７、ＣＴ１４９、ＣＴ１６４及びＣＴ１６６抗体は高い反応性を示した。特にこれらは、三量体ＨＡにはよく結合したが、ＨＡ１サブユニットには結合していない。これは、選別された抗体が、既知のＨＡ１部分にあるエピトープではなく、ＨＡ１とＨＡ２分節の境界面やＨＡ２に結合する可能性と、正常組織（conformation）とを持っているＨＡのみに結合する可能性を示唆している。
【００６６】
これに前記図１の結果に基づいて、１次的に選別された８２個の抗体のうち、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスの三量体ＨＡに高い反応性を示す抗体６個（ＣＴ１２９、ＣＴ１３５、ＣＴ１４７、ＣＴ１４９、ＣＴ１６４及びＣＴ１６６抗体）を２次的に選別し、これら抗体の発現量を高めるためにこれら抗体遺伝子を、ｐｃＤＮＡベクターからセルトリオン固有の発現ベクターであるＭａｒＥｘ発現ベクターに、次のように再クローニングを進めた。再クローニング後、これら抗体遺伝子を含むＭａｒＥｘ発現ベクターを用いて、マイクロ中和試験法（Microneutralization test；ＭＮ ｔｅｓｔ）及び血球凝集抑制試験（Hemagglutination inhibition test：ＨＩ ｔｅｓｔ）に必要な抗体を生産した。
【００６７】
２次的に選定された６個抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をそれぞれ含むオリジナルのｐｃＤＮＡベクターに、制限酵素Ｎｈｅ Ｉ及びＰｍｅ Ｉを処理して重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を確保した後、確保された重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を、それぞれ同じ制限酵素で処理されたｐＣＴ１４５ベクター及びｐＣＴ１４７ベクターに挿入した。ｐＣＴ１４５及びｐＣＴ１４７ベクターは、それぞれ抗体の重鎖及び軽鎖をクローニングするために製作されたセルトリオン固有のベクターである（図２）。次いで、重鎖転写単位（プロモータ−重鎖遺伝子−ポリエー）と軽鎖転写単位（プロモータ−軽鎖遺伝子−ポリエー）とを共に含む発現ベクターを製作するために、重鎖遺伝子を含むｐＣＴ１４５ベクターに制限酵素Ｐａｃ Ｉ及びＡｓｃ Ｉを処理して重鎖転写単位を確保した後、軽鎖遺伝子を含むｐＣＴ１４７ベクターに同じ制限酵素を処理して重鎖転写単位を挿入した。次いで、制限酵素を用いて、重鎖転写単位と軽鎖転写単位とを同時に含むベクターを選別した（図３）。選別されたベクターは、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｍａｘｉ ｋｉｔ（QIAGEN,Germany,12362）を用いて抽出され、抽出されたＤＮＡのうち一部を用いて塩基配列分析を行い、最終的に抗体の塩基配列を確認した。
【００６８】
次いで、抽出された抗体のＤＮＡを用いて、浮遊培養中のセルトリオンで製作したＦ２Ｎ細胞株に形質感染して単一クローン抗体を生産する一時的細胞株を製造し、方法は下記の通りである。細胞内の一時的形質感染のために陽イオン性ポリマー（cationic polymer）であるＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ（In vitrogen,USA,16447-100）を使い、製造社の使用マニュアルによって形質感染を行った。形質感染の前日、ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３ Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ（SAFC,LIK,14571C，以下“ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地”と称する）で培養されたＦ２Ｎ細胞を遠心分離し、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地（SAFC,LIK,65237，オーダーメイド）を用いて、ｍｌ当り１×１０６個の細胞濃度で２５０ｍｌの三角フラスコに８０ｍｌ、または１ｌの三角フラスコに２００ｍｌを接種した。形質感染の当日に８０ｍｌ接種した場合、単一クローン抗体をコーディングするＤＮＡ １００μｇ及びＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） Ｍａｘ試薬１００μlを、それぞれＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ II（In vitrogen,USA,12309）培地を用いて１．６ｍｌのｖｏｌｕｍｅに希釈した後、軽く混合した。２００ｍｌを接種した場合、ＤＮＡ ２５０μｇ及びＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） Ｍａｘ試薬２５０μlを、それぞれＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ II培地を用いて４ｍｌの容積に希釈した後、軽く混合した。それぞれ混合した直後、希釈されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） Ｍａｘ試薬溶液をＤＮＡが希釈されている溶液と混合した後、常温で１９分反応させた。常温で１９分反応させる間に、前日接種されたＦ２Ｎ細胞を、新鮮なＭｏｄｉｆｉｅｄ ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地を用いて０．８×１０６個の細胞濃度に希釈し、１９分反応後、ＤＮＡとＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） Ｍａｘ試薬との混合溶液をＦ２Ｎ細胞に処理することで形質感染を進めた。形質感染の翌日、同量のＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３培地を形質感染された細胞に添加して７〜８日間培養することで、単一クローン抗体を生産した。
【００６９】
＜実施例４：ウイルスに対する生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）中和活性の調査＞
ＨＡ−ＥＬＩＳＡを進めた６個の抗体を用いて多様なインフルエンザウイルスに対する生体の外中和活性を確認するために、ＭＮ（microneutralization）分析を行った。
＜実施例４−１：ＭＤＣＫ細胞株培養及びウイルス濃度の決定＞
ＭＤＣＫ（Madin-Darby canine kidney）は、Ｌｏｎｄｏｎ ｌｉｎｅ（ＭＤＣＫ−Ｌ）を使った。ＭＤＣＫ細胞株は、１０％のＦＢＳ（Atlas Biologicals,USA,F0500A）、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco,USA,15140）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Gibco,USA,15630）及び２ｍＭＬのグルタミン（Gibco,USA,25030）が含まれたＤＭＥＭ（Gibco,USA,11965）培地を用いて、３７℃の５％ＣＯ２湿潤（humidified）細胞培養器で培養された。
【００７０】
ウイルス濃度は、細胞基盤ＥＬＩＳＡ方法で定量し、ＴＣＩＤ５０（Median tissue culture infective dose）を求めた。前記方法は、下記のように進められた。先ず、ウイルス保存液（Virus stock）を、ウイルス希釈剤（virus diluent）［ＤＭＥＭ（Gibco,USA）、３％のＢＳＡ（Gibco,USA,15260）、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco,USA）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Gibco,USA）］で１０倍ずつ連続希釈し、９６ウェルプレートのウェルに１００μlずつ添加した。陰性対照群（Negative control）としては、ウイルスが含まれていないウイルス希釈剤（virus diluent）を添加した。次いで、培養中のＭＤＣＫ細胞株にトリプシンを処理して培養容器から分離した後、ＭＤＣＫ培養培地を処理してトリプシンを中和した。燐酸緩衝溶液を用いて２回洗浄した後、ウイルス希釈剤で細胞ペレットを希釈して５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度に合わせた。ウイルスが入っている９６ウェルプレートに３〜４μｇ／ｍｌ ＴＰＣＫ−トリプシン（Sigma,USA）を入れた直後、前記ＭＤＣＫ細胞株１００μlずつ添加して３７℃の５％ ＣＯ２湿潤細胞培養器で２０時間反応させた。反応させたプレートを燐酸緩衝溶液で１回洗浄した後で冷凍させたアセトン：燐酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（８０：２０）混合液を各ウェルに２００μlずつ添加して８分間固定させた後、常温で２０分間乾燥した。各プレートに燐酸緩衝溶液をウェル当り２００μl添加して２回洗浄し、ビオチン化されたａｎｔｉ−ＮＰ（nuclear protein）単一クローン抗体（Milipore,USA,MAB8257B）を、１％のＢＳＡが含まれた燐酸緩衝溶液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２，０００倍希釈してウェル当り１００μlを添加し、常温で１時間反応させた。ウェル当り２００μlの燐酸緩衝溶液で３回洗浄した後、１％のＢＳＡが含まれた燐酸緩衝溶液に２０，０００倍希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰ接合抗体をウェル当り１００μlずつ添加し、常温で１時間反応させた。燐酸緩衝溶液で４回洗浄した後、ＯＰＤ（Sigma,USA,P8287）溶液をウェル当り１００μl添加して常温で１０分間発色させ、３Ｍ ＨＣｌをウェル当り５０μl処理して反応を終了させた後、ＯＤ４９０を測定した。Ｒｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ（The American 1938）による方法を用いて測定されたＯＤ４９０でＴＣＩＤ５０を計算した。
【００７１】
＜実施例４−２：ＭＮ分析法＞
各抗体は、ウイルス希釈剤を用いて１次的に１０μｇ／ｍｌ濃度で合わせた。この濃度を初期濃度とし、再びウイルス希釈剤を用いて連続して２倍ずつ希釈し、９６ウェルプレートのウェル当り５０μlずつ添加し、１００ ＴＣＩＤ５０に該当する濃度のウイルスをウェル当り５０μlずつ添加して、３７℃の５％ ＣＯ２湿潤細胞培養器で１時間反応させた。次いで、３〜４μｇ／ｍｌ濃度のＴＰＣＫ−トリプシン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ，Ｔ１４２６）を各ウェルに入れ、かつ１００μlずつの処理されたＭＤＣＫ細胞株を入れた後、３７℃の５％ ＣＯ２湿潤細胞培養器で２０時間反応させた。２０時間反応させた後の過程は、実施例４−１に言及されたウイルス定量化に使われた方法と同じ方法でＭＮ分析を進め、ＯＤ４９０数値を測定した。細胞のみ入れたウェルのＯＤ４９０数値より高い数値を示すウェルは、ウイルスに感染されたと判断した。各抗体別にウイルス抗原が検出されていない様々なＯＤ４９０数値のうち抗体の最も低い濃度（μｇ／ｍｌ）を表１に示し、この抗体の濃度が低ければ低いほど、ウイルスの中和活性が高いことを意味する。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
Ｈ３サブタイプのインフルエンザウイルスに対する６個候補抗体のＭＮ分析結果、ＣＴ１２９抗体は、ＨＡ−ＥＬＩＳＡ結果として高い結合力を示したが、実験に使った３種のウイルスに対して中和活性を示していない。ＣＴ１３５抗体は、２種のＨ３Ｎ２ウイルス（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８及びＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７）に対して中和活性を示し、ＣＴ１４７、ＣＴ１４９、ＣＴ１６４及びＣＴ１６６抗体は、実験した３種のＨ３Ｎ２ウイルス（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８及びＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７）に対して中和活性を示した。
【００７４】
前記抗体のうちＣＴ１４９抗体を任意に選択して多様なインフルエンザウイルスに対する中和活性を、ＭＮ分析法を用いて検証した（表２）。
【表２】
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【００７５】
ＣＴ１４９抗体は、実験に使った多様なＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、及びＨ３Ｎ２サブタイプのインフルエンザウイルスに対して中和活性を示した。
【００７６】
＜実施例５：ウイルスによる赤血球凝集反応に対する抗体の抑制能力の調査＞
ｖ−ｂｏｔｔｏｍ ９６−ウェルプレート上で抗体を２倍ずつ連続して希釈し、４倍のＨＡユニットのウイルスを添加して混合させた。混合したプレートを常温で３０分間反応させた後、それぞれのウェルに１％ ａｖｉａｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌを添加した。血球凝集抑制エンドポイント（end point）は、凝集反応が観察されない最も低い抗体濃度と定めた。
【００７７】
その結果、実験したすべての抗体が、試験に使ったＨ３Ｎ２サブタイプのウイルス（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７）に対して、血球凝集を高濃度（＞２０μｇ／ｍｌ）でも抑制できなかった（表３）。
【表３】
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【００７８】
＜実施例６：動物実験を通じた抗体のインフルエンザインフルエンザウイルスの予防及び治療効果の調査＞
＜実施例６−１：マウスを通じる抗体のインフルエンザインフルエンザウイルスの予防及び治療効果の調査＞
ＣＴ１４９抗体がマウスにおいて、Ｈ３Ｎ２ウイルスの予防及び治療効果を持つかどうかを調べるために、次のように実験を進めた。５匹で構成されたマウスの各グループに、鼻腔を通じて１０ＬＤ５０のＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８ウイルスを感染させた。ＣＴ１４９抗体は、ｋｇ当たり１０または２０ｍｇの量をウイルス感染２４時間前、またはウイルス感染後２４時間や４８時間後に腹腔内注射を通じてマウスに投与された。
【００７９】
実験結果、図４のように、陰性対照群の場合にウイルス感染１１日目に全てのマウスが死亡したことに比べて、ＣＴ１４９抗体をウイルス感染２４時間前に１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ注射する場合、全てのマウスが生存してＣＴ１４９抗体がウイルス感染において予防効果があるということが分かった。ＣＴ１４９抗体の治療効果を確認するためにウイルス感染後に抗体を注射する場合、４８時間後に１０ｍｇ／ｋｇの抗体を投与した時に２０％のマウスが死亡したこと以外に、２４時間後に１０ｍｇ／ｋｇや２０ｍｇ／ｋｇ投与、または４８時間後に２０ｍｇ／ｋｇ投与した時には全てのマウスが生存して、ＣＴ１４９抗体がウイルス感染に対する治療効果があるということが分かった。
【００８０】
＜実施例６−２：フェレットを通じる抗体のインフルエンザインフルエンザウイルスの治療効果の調査＞
ヒトと類似した感受性及び症状を示してインフルエンザ研究に多く使われているフェレットを用いて、ＣＴ１４９抗体がＨ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１ウイルスに対して治療効果を持つかどうかを調査するために、次のように実験を進めた。
各試験群は、９匹で構成され、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８）インフルエンザウイルスの場合に１×１０６ ＥＩＤ５０／ｍｌを、Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）インフルエンザウイルスの場合に１×１０２ ＥＩＤ５０／ｍｌを鼻腔及び機関に接種した。ウイルス接種１日後にインフルエンザと関係ない陰性対照群ＣＴ−Ｐ６抗体３０ｍｇ／ｋｇあるいはＣＴ１４９抗体１５ｍｇ／ｋｇや３０ｍｇ／ｋｇを単回単独静脈注射するか、またはＣＴ１４９抗体３０ｍｇ／ｋｇを毎日３日間単独静脈注射した。
【００８１】
ウイルス接種後１、３、５、７、９日目に各試験群から抗生剤を含むＰＢＳ溶液１ｍｌを用いてフェレットの鼻腔洗浄液を採取し、３、５、９日目には鼻腔洗浄液を採取した後、各群当たり３匹ずつのフェレットを犠牲させて肺組織を確保し、ウイルス濃度を有精卵を用いて測定した。有精卵を用いたウイルス滴定試験のために鼻腔洗浄液は遠心分離し、肺組織は、抗生剤を含むＰＢＳ溶液１ｍｌにフェレットの肺組織１ｇを入れて粉砕機を用いて破砕、遠心分離して上澄液を確保した後、抗生剤を含む溶液で１０倍ずつ段階別に希釈した。希釈された上澄液を１０〜１３日齢の有精卵に接種及び４８時間培養後、有精卵の尿膜液５０μlを取って同量の０．５％ニワトリの赤血球と混合後、３０分間反応させた後で血球凝集反応如何によってウイルスを滴定した。
【００８２】
Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８）インフルエンザウイルス接種２４時間後に陰性対照群（ＣＴ−Ｐ６）と、ＣＴ１４９を投与した実験動物フェレットとのウイルス力価を測定した結果、陰性対照群の場合にウイルス接種１日後に約ｌｏｇ４ ＥＩＤ５０／ｍｌ以上のウイルス力価が観察され、接種５日後まで鼻腔洗浄液及び肺組織でウイルス力価が維持または増加したが、７日以後にはウイルスが検出されていない。ＣＴ１４９を投与した群では、ウイルス接種１日後に陰性対照群を投与した群と類似したウイルス力価を示したが、３日以後にはウイルスが減少していて９日にはウイルスが全く検出されず、ウイルスの除去が早く起きることが分かった。特に肺組織でウイルスの力価減少が、投与抗体量の増加によってさらに早く起きる傾向を示した（図５）。
【００８３】
Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）インフルエンザウイルス接種２４時間後に陰性対照群（ＣＴ−Ｐ６）と、ＣＴ１４９を投与した実験動物フェレットとのウイルス力価を測定した結果、陰性対照群の場合にウイルス接種１日後に約ｌｏｇ２．４ＥＩＤ５０／ｍｌ以上のウイルス力価が観察され、接種５日後まで鼻腔洗浄液及び肺組織でウイルス力価が増加することが観察された。接種後５日目に対照群内の６匹のフェレットのうち１匹のみ生き残り、５日目に鼻腔洗浄液内のウイルス力価は一匹のみで測定され、９日目には既に全てのフェレットが死亡してウイルス力価を測定できなかった。ＣＴ１４９を投与した群では、３日目からウイルス力価が減少し始め、９日目にはウイルスが全く検出されず、ウイルスの除去が早く起きることが分かり、抗体の投与量によってさらに早く減少する傾向を示した。ＣＴ１４９投与群では１５ｍｇ／ｋｇの単回投与群で１匹のフェレットのみ接種７日目に死亡し、ＣＴ１４９がインフルエンザウイルスに対して治療効果があるということが分かった（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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