(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されたボツリヌス毒素Ａ型製剤を、ｐＨは４．５ないし６．５の範囲、
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度を０．０２ないし０．２Ｍに調節して添加した陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーを遂行して亜分画を分離する段階；及び、
上記亜分画のうちＡ２６０／Ａ２８０の値が０．４ないし０．６の水準を維持する非拡散性ボツリヌス毒素分画を収得する段階を含む非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法によって分離精製されたものであって、
毒素１００Ｕ／ｍｌ当りＺｎイオンが少なくとも１５０ｐｐｂ、Ｆｅイオンが少なくとも８０ｐｐｂ、Ｍｇイオンが少なくとも１４０ｐｐｂで含まれることを特徴とする非拡散型ボツリヌス毒素を、拡散型ボツリヌス毒素であればその半数致死量に相当する単位の１．５ないし３倍の投与量でマウスの右下肢に注射し、右下肢の筋肉と呼吸筋の麻痺有無と致死有無を観察し、呼吸筋の麻痺と致死が認められない場合、そのボツリヌス毒素が非拡散型であると確認することを特徴とする非拡散型ボツリヌス毒素を判別する方法。
【請求項２】
上記半数致死量を１Ｕとし、少なくとも４０μｌの量の２Ｕの上記毒素を注射後９６時間における生存率の低下が認められない場合、そのボツリヌス毒素が非拡散型であると確認することを特徴とする請求項１に記載の非拡散型ボツリヌス毒素を判別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法とそれによって得られた局所筋麻痺効果を有する非拡散型ボツリヌス毒素に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は、しわ取り等の美容治療に使われる「ボトックス」（Ｂｏｔｏｘ）が、ひどい場合には死亡等の深刻な副作用を起こし得ると警告した。
【０００３】
「ボトックスを注射した部位ではない他の部位に筋肉麻痺反応が起きる副作用が報告された」、「ボトックス注射を打って病院に入院したり、死亡することもあった」ということであった。深刻なボトックスの副作用が発生した患者の大部分は、脳性マヒによる筋肉硬直を治療するために脚の筋肉にボトックス注射を打った子供の患者達であるとＦＤＡは明らかにした。
【０００４】
韓国内でもボトックスは脳性マヒ患者の筋肉治療はもちろん、硬直した首の筋肉の治療や顔面筋肉の硬直による痛みの治療及び声帯麻痺の治療等に広範囲に使われている。美容治療分野ではシワ取り・皮膚の老化防止治療等に使われており、最近老化防止医療が流行しながらボトックスの使用量は毎年増加している。
【０００５】
ボトックスを筋肉に注射すれば、筋肉神経が麻痺する効果がある。これにより脚の筋肉が過度に硬直した脳性麻痺の子供にボトックスを注射して歩き方を自然にする治療が施行されてきた。ＦＤＡは、ボトックス毒素が脚以外に体内の他の部位に広がっていき、呼吸筋肉の機能に影響を及ぼして副作用が発生したものとみている［ＦＤＡ  ＮＥＷＳ  ＲＥＬＥＡＳＥ  ＦＯＲ  ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ  ＲＥＬＥＡＳＥ  Ａｐｒｉｌ  ３０、２００９、ＦＤＡ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｎｅｗｓ：  Ｓｈｏｗ  ＃７４、Ａｐｒｉｌ  ２００８］。  ＦＤＡはこれと関連して「ボトックスを打ってから呼吸が遅くなったり飲み込みにくくなったりする症状が出るかを患者と医者らは注意する必要がある」といっている［ＦＤＡ−ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ７／３１／０９  ＡＰＰＥＮＤＩＸ  １：  ＭＥＤＩＣＡＴＩＯＮ  ＧＵＩＤＥ  ＢＯＴＯＸ、ＢＯＴＯＸ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ（Ｂｏｅ−ｔｏｘ）（ｏｎ  ａ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ  Ａ）  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ］］。
【０００６】
しかしＦＤＡは、「シワ取り等の美容目的で使われたボトックス注射では、いまだ深刻な副作用事例が報告されていない」といっている。ＦＤＡは、これと関して医者らにボトックス処方を中断させるという措置を取らなかった。
【０００７】
アメリカの消費者団体らは最近、「１９９７年から２００６年までＦＤＡに報告されたボトックス関連の副作用事例が１８０件であり、そのうち１６件の死亡事例もある」とボトックス使用時に異常反応が生じ得るという警告を強化するようにという請願をＦＤＡに出している。
【０００８】
従来の発明では、酸沈殿（ＵＳＰ  ７，３５４，７４０．  Ａｎｉｍａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ａ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ、Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｉｎｃ．）、又は酸沈殿後にクロマトグラフィーを追加的に施行（ＵＳＰ  ７，４５２，６９７．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ａ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ、Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｉｎｃ．  韓国特許出願第１０−２００８−００１６８００号  クロストリジウム・ボツリヌムからボツリヌス毒素を精製する方法、メデックスゼン；  韓国特許出願第１０−２００２−００００６８５号  クロストリジウム・ボツリヌムＡ型毒素を精製する方法、メディトックス）してボツリヌス毒素を精製してきた。
【０００９】
しかし、上記の方法で精製されたボツリヌス毒素は、相当量が治療部位以外の体内に広がって周辺臓器や呼吸筋肉が麻痺する症状が現われており、深刻な場合には死亡に至る深刻な副作用を有するものと知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国特許出願第１０−２００８−００１６８００号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記の問題点を解決するために提案されるものであり、酸沈殿又は酸沈殿後のクロマトグラフィーによって精製された既存のボツリヌス毒素Ａ型製剤を塩化ナトリウムを使用して陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーして３つの異質な亜分画が存在することを確認し、そのうちの一つの亜分画が筋麻痺活性を有しながらも体内非拡散型であることを確認した。
【００１２】
すなわち、本発明は、体内非拡散型でありながら局所制限的に筋麻痺活性を有する非拡散型ボツリヌス毒素とこれを分離する方法を提供するところにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記した目的を達成するための一例として、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法は、精製されたボツリヌス毒素Ａ型製剤を、ｐＨは４．５ないし６．５の範囲、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度を０．０２ないし０．２Ｍに調節して添加した陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーを遂行して亜分画を分離する段階；及び上記亜分画のうちＡ２６０／Ａ２８０の値が０．４ないし０．６の水準を維持する非拡散性ボツリヌス毒素分画を収得する段階を含んでなることを特徴とする。
【００１４】
上記した目的を達成するための一例として、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素は、上記した方法によって分離精製されたものであって、毒素１００Ｕ／ｍｌ当りＺｎイオンが少なくとも１５０ｐｐｂ、Ｆｅイオンが少なくとも８０ｐｐｂ、Ｍｇイオンが少なくとも１４０ｐｐｂで含まれることを特徴とする。
【００１５】
上記した目的を達成するための一例として、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素を判別する方法は、上記非拡散型ボツリヌス毒素をその半数致死量の１．５ないし３倍の量でマウスの右下肢に注射し、右下肢の筋肉と呼吸筋の麻痺有無と致死有無を判断することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
上記した本発明によれば、目的とする部分に筋麻痺効果が発生し、それ以外の部分には毒素が拡散せず、筋麻痺効果が早く持続的に発生する局所筋麻痺効果を有する非拡散型ボツリヌス毒素を得ることができる。
【００１７】
また本発明によれば、既存と異なって各生産配置別にタンパク質対比毒素力価が高い非拡散型ボツリヌス毒素を得ることができる。
【００１８】
また本発明によれば、陰イオンクロマトグラフィー条件を調節して拡散性毒素と混合しない非拡散型ボツリヌス毒素を多量に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例１によって亜分画を分離した結果を示したイオン樹脂クロマトグラフィーの結果である。
【図２】図２は、バッファーのｐＨ変化による亜分画ピーク％の変化を示したグラフである。
【図３】図３は、試料量に伴う各亜分画のピーク％の変化を示したグラフである。
【図４】図４は、実施例１によって分離された亜分画のうち、活性分画（ｐＩ及びｐＩＩ）の投与量（Ａ）及び投与後の時間変化（Ｂ）に伴う生存率を示したものである［Ｍｏｕｓｅ：  ＩＣＲ、ｆｅｍａｌｅ、４ｗｅｅｋ、１８〜２２ｇ  ｎ＝１０、ＩＭ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｒｉｇｈｔ  ｈｉｎｄ  ｌｅｇ］。
【図５】図５は、実施例１によって分離された亜分画のうち、体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）と既存の市販製品をマウスの右下肢に投与後１２時間の体内拡散性を比較した写真である。
【図６】図６は、実施例１によって分離された亜分画のうち、体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）と既存市販製品をマウスの右下肢に投与後、投与量（Ａ）及び投与後の時間（Ｂ）に伴う生存率を示したグラフである。
【図７】図７は、実施例１によって分離された亜分画のうち、体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）と既存の市販製品を１Ｕずつマウスの右下肢に投与後、筋麻痺の効果開始時間を比較したグラフである。
【図８】図８は、実施例１によって分離された亜分画のうち、体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）と既存市販製品を０．５Ｕずつマウスの右下肢に投与後、筋麻痺効果の持続時間を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法を段階別に具体的に説明する。
【００２１】
本発明は、精製されたボツリヌス毒素Ａ型製剤を塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度を調節して添加した陰イオンクロマトグラフィーを遂行して亜分画を分離する段階と、上記亜分画のうちＡ２６０／Ａ２８０の値が０．４ないし０．６の水準を維持する非拡散性ボツリヌス毒素分画を収得する段階を含んでなることを特徴とする。
【００２２】
本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法は、既存の酸沈殿法や酸沈殿後にイオン樹脂クロマトグラフィーを利用して得られたボツリヌス毒素を再び本発明の発明者によって提案された新しい陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィー法を適用して非拡散型ボツリヌス毒素の分画を獲得する方法である。
【００２３】
したがって、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法には、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ａ型菌株培養液からボツリヌス毒素Ａ型製剤を酸沈殿させるか、酸沈殿後にクロマトグラフィーによって分離し精製して得られたボツリヌス毒素Ａ型製剤を使用する。
【００２４】
上記した精製されたボツリヌス毒素Ａ型製剤を塩化ナトリウムを使用して陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーを遂行する場合、イオン交換樹脂から  ３つの亜分画を得ることができる。上記陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーを遂行するために使用される緩衝液は酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）緩衝液であり、ここに亜分画を得るために添加される塩化ナトリウム濃度を順次に高めて分離される各分画を取る。塩化ナトリウムを使用しない場合（濃図０Ｍ  ＮａＣｌ）に分離される分画は、体内拡散型活性分画（ｐｅａｋ  Ｉ、ｐＩ）であることが確認され、塩化ナトリウムの濃度を０．０２ないし０．２Ｍにした場合に分離される分画は、体内非拡散型活性分画（ｐｅａｋ  ＩＩ、ＰＩＩ）  であることが確認されており、塩化ナトリウムの濃度を１Ｍにした場合に分離される分画は、体内拡散型非活性分画（ｐｅａｋ  ＩＩＩ、ｐＩＩＩ）であることが確認された。
【００２５】
すなわち、上記したｐＩＩを得るために使用される塩化ナトリウムの濃度は０．０２ないし０．２Ｍの範囲であり、塩化ナトリウムを使用しないか、塩化ナトリウムの濃度が上記範囲より高いか低い場合には、収得される亜分画にｐＩ  又はｐＩＩＩ分画が混合することがあり得るため、本発明で目的とする局所的筋麻痺効果を有する非拡散型活性分画を得ることが困難である。
【００２６】
一方、上記の通り塩化ナトリウムを使用した陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーの場合、緩衝液のｐＨが４．５ないし５．５の範囲で遂行される場合、分離する亜分画のうちｐＩ又はｐＩＩＩ分画の混合程度が少なくなりｐＩＩ分画の純度が高くなる。これはＡ２６０／Ａ２８０を比較するかマウスの右下肢筋肉注射時の麻痺部位の程度で確認することができる。
【００２７】
また、上記の通り塩化ナトリウムを使用した陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーの場合、精製されたボツリヌス毒素Ａ型製剤の試料量が、使用される陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーカラム体積対比１／５ないし１倍の範囲で遂行される場合、ｐＩＩの分画量が大きくなる。すなわち、カラムの体積が１ｍｌで、精製されたボツリヌス毒素Ａ型製剤の試料量が０．２ないし１ｍｌの場合に得られるｐＩＩの分画量は２０％ないし５０％の範囲で現われる。
【００２８】
一方、上記した本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法によって得られた  ｐＩＩ分画は、マウスを使用して確認した半数致死量（ｔｏｔａｌ  ＬＤ５０）が１×１０５ないし５×１０５Ｕ／ｍｌで現われる等、安定しているものと確認された。また、処置対象に投与時に目的部位以外に拡散する現象がなく、市販製品と比較する場合、筋麻痺効果の開始が有意的に早く、筋麻痺持続時間が長いということを確認することができる。
【００２９】
また、上記した本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法によって得られた非拡散型ボツリヌス毒素（ｐＩＩ分画）は、毒素１００Ｕ／ｍｌ当りＺｎイオンが少なくとも１５０ｐｐｂ、Ｆｅイオンが少なくとも８０ｐｐｂ、Ｍｇイオンが少なくとも１４０ｐｐｂで含まれる。本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法は、既存の方法によって精製されたボツリヌス毒素Ａ型よりＭｇ、Ｆｅ及びＺｎの含量が有意的に高く現われる特徴があることを確認した。
【００３０】
このような本発明の精製方法によって得られた非拡散型ボツリヌス毒素は、その半数致死量の１．５ないし３倍の量でマウスの右下肢に注射時、右下肢の筋肉は麻痺する反面、呼吸筋の麻痺や致死活性がないものと確認され、これにより本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の拡散有無を判別することができる。
【００３１】
以下本発明を実施例及び図面等に基づいて具体的に説明するところ、本発明が次の実施例及び図面等によって限定されるものではない。
【００３２】
以下、本発明の実施例等で使われた市販製品は、ＵＳＰ  ７，３５４，７４０［Ａｎｉｍａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ａ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ］に開示された方法によって製造されたアラガン社（Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｉｎｃ）のボトックス製剤（Ｌｏｔ＃：  Ｃ２０６６  Ｃ２、Ｃ２４８１  Ｃ２）であるが、本発明がここに提示された市販製品や方法によって精製されたボツリヌス毒素Ａ型製剤にのみ適用されるのではなく、その他の酸沈殿等によって精製されたボツリヌス毒素Ａ型製剤として使用可能なものなら充分に適用することができるものである。
【実施例１】
【００３３】
実施例１．  陰イオンイオン樹脂クロマトグラフィー分離分画
【００３４】
ボツリヌス毒素培養液を既存の酸沈殿法で精製した精製物を試料として陰イオンクロマトグラフィーを実施して３つの亜分画を分離し、分離結果は図１に示した［ｐＩ、Ｐｅａｋ  Ｉ（体内拡散型活性分画）；  ｐＩＩ、Ｐｅａｋ  ＩＩ（体内非拡散型活性分画）；  ｐＩＩＩ、ＰｅａｋＩＩＩ（非活性分画）］。
【００３５】
陰イオンイオン交換クロマトグラフィー時の使用器機はＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、使用カラム（ｃｏｌｕｍｎ）はＨｉｔｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ  １ｍｌ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃  １７−５０５５−０１）、使用緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）はランニング緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）として酢酸ナトリウム緩衝液（Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ５．５）、エルーション緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）だった。
【００３６】
酢酸ナトリウムに１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５．５）、エリューション（Ｅｌｕｔｉｏｎ）条件０Ｍ  ＮａＣｌでｕｎｂｏｕｎｄ  ｗａｓｈ（ｐＩ、体内拡散型活性分画）した後、０．０５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＩＩ、体内非拡散型活性分画）を利用してピーク（ｐｅａｋ）を分離し、１Ｍ  ＮａＣｌでエリューション（ｅｌｕｔｉｏｎ）（ｐＩＩＩ、非活性分画）、流速（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）１ｍｌ／ｍｉｎ、試料前処理として酸沈殿後に脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）して使用した。
【実施例２】
【００３７】
実施例２．  バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）のｐＨ変化によるピーク（Ｐｅａｋ）  変化及び特性
【００３８】
上記陰イオンイオン交換クロマトグラフィー時に使用したバッファーのｐＨの変化に伴う亜分画のピーク％は、図２に示した。図２に図示したように、バッファーのｐＨが４．５ないし５．５の範囲の場合、ｐＩＩのピーク％が大きくなることを確認することができる。バッファーのｐＨに伴う亜分画のＡ２６０／Ａ２８０は次表１に示し、半数致死量（Ｔｏｔａｌ  ＬＤ５０（Ｕｎｉｔ））を次表２に示した。
【００３９】
【表１】
0005998419.tif 000002
【００４０】
上記表１に示されたように、バッファーのｐＨが４．５ないし５．５の範囲の場合、Ａ２６０／Ａ２８０が０．４５ないし０．６と示されて投与試料として適するものと判断することができる。
【００４１】
したがって、精製された体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）を得るためには、バッファーのｐＨを４．５ないし５．５に調節するのが望ましいのである。
【００４２】
【表２】
0005998419.tif 000003
【００４３】
上記表２に示されたように、バッファーのｐＨが５．０ないし５．５の範囲の場合、半数致死量が０．８×１０５ないし３．５×１０５Ｕ／ｍｌと示されてｐＩＩの回収率が高いものと判断することができる。
【００４４】
したがって、安定した体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）を得るためには、バッファーのｐＨを５．０ないし５．５に調節するのが望ましいのである。
【実施例３】
【００４５】
実施例３．  試料量（ｓａｍｐｌｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）の変化によるピーク変化及び特性
【００４６】
実施例１と同一の方法で亜分画を得るが、このための試料の量変化による各亜分画（ｐＩ、ｐＩＩ及びｐＩＩＩ）のピーク特性変化を図３に示し、各亜分画別Ａ２６０／Ａ２８０の変化を次表３に示し、半数致死量（Ｔｏｔａｌ  ＬＤ５０（Ｕｎｉｔ））を次表４に示した。
【００４７】
【表３】
0005998419.tif 000004
【００４８】
上記表３に示されたように、試料量が０．２５ないし２ｍｌの範囲の場合、Ａ２６０／Ａ２８０が０．４ないし０．６と示され、投与試料として適するものと判断することができる。
【００４９】
したがって、体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）を多量に得るためには、試料量をカラム体積対比１／５ないし２倍の範囲で調節するのが望ましいのである。
【００５０】
【表４】
0005998419.tif 000005
【００５１】
上記表４に示されたように、試料量が０．２５ないし１ｍｌの範囲の場合、半数致死量が０．８×１０５ないし３．５×１０５Ｕ／ｍｌと示され、ｐＩＩの回収率が高いものと判断することができる。
【００５２】
したがって、安定した体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）を得るためには、試料量をカラム体積対比１／５ないし１倍の範囲に調節するのが望ましいのである。
【００５３】
実験例１．  筋麻痺効果の比較試験方法
【００５４】
１）  右下肢筋肉注射方法
【００５５】
上記実施例１によって分離された亜分画の筋麻痺効果を確認するために、マウスを使用して右下肢筋肉注射法を遂行した。
【００５６】
使用したマウス（ＩＣＲＭｏｕｓｅ、ｆｅｍａｌｅ、４ｗｅｅｋ、１８〜２２ｇ）は実験群当り１０匹であり、マウスの重さを正確に測定して記録した。５０μｌハミルトン注射器に上記亜分画を１Ｕ／２０μｌ濃度で単位に合うように空気なく満たしてからＩＣＲマウスの右側後脚の足首部位で針を３ｃｍほど入れて筋肉内に注射した。筋肉内注射後、時間帯別に次表５に提示された麻痺指数及び測定基準に準して麻痺指数及び死亡有無を観察してその結果を図４  に示した。
【００５７】
【表５】
0005998419.tif 000006
【００５８】
【表６】
0005998419.tif 000007
【００５９】
図４に図示されたように、上記実施例１で分離した亜分画のうち体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）は拡散型活性分画（ｐＩ）に比べて投与用量対比有意な生存率増加をにせ（Ａ）、投与用量２Ｕで時間経過に伴う生存率はｐＩＩ  １００％対比ｐＩ  ０％の極端的な差を示したこと（Ｂ）を確認することができる。
【００６０】
実験例２．  市販製品と体内非拡散型活性分画（ｐＩＩ）間の体内拡散性比較
【００６１】
市販製品（アラガン社ボトックス（Ｌｏｔ＃：  Ｃ２０６６  Ｃ２、Ｃ２４８１  Ｃ２））と上記実施例１によって分離された亜分画ｐＩＩの筋麻痺効果を確認するために、マウスを使用して右下肢筋肉注射法を遂行した。
【００６２】
使用したマウス（ＩＣＲＭｏｕｓｅ、ｆｅｍａｌｅ、４ｗｅｅｋ、１８〜２２ｇ）は実験群当り１０匹であり、マウスの重さを正確に測定して記録した。５０μｌハミルトン注射器に精製前試料と亜分画ｐＩＩを１Ｕ／２０μｌ濃度で単位に合うように空気なく満たしてからＩＣＲマウスの右側後脚の足首部位で針を３ｃｍほど入れて筋肉内に注射した。筋肉内注射後、体内拡散性を観察するために、マウスの麻痺程度を肉眼で確認し、注射後１２時間が経過したマウスの状態を写真図５に示し、投与時間及び投与量に伴う死亡有無を観察した結果を図６に示した。また、筋麻痺効果の開始時間は図７に示し、筋麻痺効果の持続時間を図８に示した。
【００６３】
図５に図示されたように、ｐＩＩは筋肉内注射した右下肢が麻痺するが、既存市販製品は腰及び反対側の脚まで拡散して麻痺したことを示している。
【００６４】
図６に図示されたように、ｐＩＩは市販製品に比べて投与用量対比有意な生存率増加をみせ（Ａ）、投与用量２Ｕで時間経過に伴う生存率はｐＩＩ  １００％  対比既存技術製造品０％の極端的な差を示すことを確認することができる（Ｂ）。
【００６５】
図７に図示されたように、ｐＩＩは市販製品に比べて投与用量１Ｕで筋麻痺効果の開始が有意的に早く現われることを確認することができる。
【００６６】
図８に図示されたように、ｐＩＩは市販製品に比べて投与用量０．５Ｕで筋麻痺効果の持続期間が８０日以上長かった。
【００６７】
実験例３．  ボツリヌス毒素凍結乾燥物のイオン含量分析
【００６８】
市販製品（アラガン社ボトックス（Ｌｏｔ＃：  Ｃ２０６６  Ｃ２、Ｃ２４８１  Ｃ２））と上記実施例１によって分離された亜分画ｐＩＩの凍結乾燥物間のイオン含量についての分析を遂行した。
【００６９】
市販製品と比較するためにｐＩＩ分画を希釈して同じ量のボツリヌス毒素（１００Ｕ）と付随添加物を瓶に入れて凍結乾燥を遂行し、マウス半数致死試験法を利用して市販製品とｐＩＩ凍結乾燥物間の活性が同一であることを確認した後イオン含量分析を進行した。二つの凍結乾燥物を蒸溜水１０ｍｌを用いて溶かした後、誘導結合プラズマ質量分析機を利用してイオン含量を測定し、その結果を次表７に示した。
【００７０】
【表７】
0005998419.tif 000008
【００７１】
上記表７に示されたように、本発明によって精製された非拡散型ボツリヌス毒素（ｐＩＩ分画）の凍結乾燥物が市販製品に比べてＭｇ、Ｆｅ、Ｚｎイオンの含量が有意的に高いことを確認することができた。
【００７２】
以上で説明した本発明は、前述の実施例及び添付された図面によって限定されるものではなく、本発明の技術的思想を脱しない範囲内でさまざまな置換、変形及び変更が可能なことは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に明白なことである。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、目的とする部分に筋麻痺効果が発生し、それ以外の部分には毒素が拡散せず、筋麻痺効果が早く持続的に発生する局所筋麻痺効果を有する非拡散型ボツリヌス毒素を多量に得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図５】
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