【手続補正書】
【提出日】平成23年3月24日(2011.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、二重特異性抗体を作製するためのエクスビボ方法：
a) 第1の結合特異性を有する第1の抗体を提供する段階であって、該第1の抗体がIgG4様CH3領域を含む段階、
b) 該第1の結合特異性と異なる、第2の結合特異性を有する第2の抗体を提供する段階であって、該第2の抗体がIgG4様CH3領域を含む段階、
c) コアヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1の抗体および該第2の抗体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 二重特異性抗体を得る段階。
【請求項２】
第1の抗体、または第1の抗体および第2の抗体のそれぞれがコアヒンジ領域内にCPPC配列を含む、請求項1記載のエクスビボ方法。
【請求項３】
第1の抗体、または第1の抗体および第2の抗体のそれぞれがIgG4様コアヒンジ領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項４】
第1の抗体、または第1の抗体および第2の抗体のそれぞれが、コアヒンジ領域内に、X1およびX2の両方がプロリンではないという条件で、X1およびX2が任意のアミノ酸であってよい、CX1X2C配列を含む抗体である、請求項1または3のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項５】
第1の抗体、または第1の抗体および第2の抗体のそれぞれが、コアヒンジ領域内に、X3がプロリンを除く任意のアミノ酸であってよい、CX3PCまたはCPX3C配列を含む抗体である、請求項4記載のエクスビボ方法。
【請求項６】
第1の抗体、または第1の抗体および第2の抗体のそれぞれが、コアヒンジ領域内にCSPC、CPSC、CRPC、CPRC、CGHC、またはCPHC配列を含む抗体である、請求項5記載のエクスビボ方法。
【請求項７】
第1の抗体、または第1の抗体および第2の抗体のそれぞれがIgG4 CH3領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項８】
第1の抗体、または第1の抗体および第2の抗体のそれぞれが非IgG4アイソタイプのCH3領域を含み、このCH3配列が、ジスルフィド結合または共有結合性のもしくは安定した非共有結合性の重鎖間結合の形成に関与するいかなるアミノ酸残基も含まないが他のペプチドはCH3領域の同一のアミノ酸配列を含む配列であるか、またはそのように改変されている、請求項1〜6のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項９】
CH3領域がSEQ ID NO: 19に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項8記載のエクスビボ方法：
238位のArg(R)がGln(Q)によって置換；239位のAsp(D)がGlu(E)によって置換；292位のLys(K)がArg(R)によって置換；302位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；および328位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
【請求項１０】
292位のLys(K)がArg(R)によって置換されている、請求項9記載のエクスビボ方法。
【請求項１１】
CH3領域がSEQ ID NO: 19に示す配列を有するが、292位のLys(K)がTyr(W)またはPhe(F)によって置換されている、請求項1〜6または8のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項１２】
CH3領域がSEQ ID NO: 20に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項8記載のエクスビボ方法：
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換；276位のMet(M)がVal(V)によって置換；288位のLys(K)がArg(R)によって置換；298位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；および324位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
【請求項１３】
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換されている、請求項12記載のエクスビボ方法。
【請求項１４】
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換されており；かつ324位のPro(P)がLeu(L)によって置換されている、請求項12記載のエクスビボ方法。
【請求項１５】
5つすべての置換がなされている、請求項12記載のエクスビボ方法。
【請求項１６】
CH3領域がSEQ ID NO: 21に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項8記載のエクスビボ方法：
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換；314位のSer(S)がAsn(N)によって置換；322位のAsn(N)がLys(K)によって置換；327位のMet(M)がVal(V)によって置換；339位のLys(K)がArg(R)によって置換；349位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；352位のIle(I)がVal(V)によって置換；365位のArg(R)がHis(H)によって置換；366位のPhe(F)がTyr(Y)によって置換；および375位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
【請求項１７】
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換されている、請求項16記載のエクスビボ方法。
【請求項１８】
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換されており；かつ375位のPro(P)がLeu(L)によって置換されている、請求項16記載のエクスビボ方法。
【請求項１９】
10個すべての置換がなされている、請求項16記載のエクスビボ方法。
【請求項２０】
第1の抗体、または第1の抗体および第2の抗体のそれぞれがIgG4抗体である、請求項1、3〜7のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項２１】
第1の抗体がコアヒンジ領域内にCPPCを含み、かつIgG4様CH3領域を含み、および、第2抗体がコアヒンジ領域内にCPPCを含み、かつIgG4様CH3領域を含む、請求項1または2記載のエクスビボ方法。
【請求項２２】
第1の抗体および/または第2の抗体がヒト抗体である、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項２３】
段階c)における条件が、コアヒンジ領域外のジスルフィド架橋の有意な還元または異性化が起こらないように選択される、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項２４】
段階c)が還元剤の添加を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項２５】
段階c)が、グルタチオン、L-システイン、ジチオスレイトール、β-メルカプト-エタノール、およびシステアミンからなる群より選択される作用物質の添加を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項２６】
作用物質の濃度が、段階c)で生じる溶液の酸化還元電位が実施例31に記載する条件下で、1μMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば10μMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば50μMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば0.1 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である濃度である、請求項24または25記載のエクスビボ方法。
【請求項２７】
作用物質の濃度が、段階c)で生じる溶液の酸化還元電位が実施例35に記載する条件下で、1 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば2 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば4 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば6 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば8 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば10 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である濃度である、請求項24または25記載のエクスビボ方法。
【請求項２８】
作用物質の濃度が、段階c)で生じる溶液の酸化還元電位が1 Mのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性が低い、例えば100 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性が低い、15 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかもしくはより還元性が低い濃度である、請求項26または27記載のエクスビボ方法。
【請求項２９】
段階c)が、還元型グルタチオンの存在下での、20℃またはそれ以上、例えば37℃の温度における、少なくとも1時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも10時間の、抗体のインキュベーションを含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項３０】
結果として得られた組成物中の抗体分子の10%未満、例えば5%未満、例えば2%未満、例えば1%未満が凝集状態である、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項３１】
半分子のさらなる交換を停止させるために、段階c)において得られた組成物を非還元条件に導くさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項３２】
好ましくは以下から選択される方法を用いて、二重特異性抗体を安定化するさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法：
a) ヒンジ領域内のシステインを化学的に架橋する、
b) 半分子上の炭水化物側鎖を化学的に架橋する、および
c) CH3領域内に非対称的に導入されたシステインを架橋する。
【請求項３３】
好ましくは非還元条件下で、二重特異性抗体を精製するさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項３４】
治療用途のために、結果として得られた二重特異性抗体を薬学的組成物に製剤化するさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項３５】
第1の抗体が、腫瘍細胞、またはerbB1、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD38、CD4、もしくはCXCR5などの腫瘍細胞タンパク質に対する、またはCD79aもしくはCD79bに対する結合特異性を有する、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項３６】
第2の抗体が、腫瘍細胞、またはerbB1、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、もしくはCXCR5などの腫瘍細胞タンパク質に対する結合特異性を有する、請求項35記載のエクスビボ方法。
【請求項３７】
(i)第1の抗体がerbB1に対する結合特異性を有し、かつ第2の抗体がerbB2に対する結合特異性を有するか、
(ii)第1の抗体がCD19に対する結合特異性を有し、かつ第2の抗体がCD20に対する結合特異性を有するか、
(iii)第1の抗体がCD4に対する結合特異性を有し、かつ第2の抗体がCXCR5に対する結合特異性を有するか、または
(iv)第1の抗体がCD38に対する結合特異性を有し、かつ第2の抗体がCD34に対する結合特異性を有する、
請求項36記載のエクスビボ方法。
【請求項３８】
第1の抗体が病原微生物に対する結合特異性を有する、請求項1〜34のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項３９】
第2の抗体が、CD3、CD25、CD28、CD16、CD89、CD32、またはCD1などのエフェクター細胞タンパク質に対する結合特異性を有する、請求項35または38記載のエクスビボ方法。
【請求項４０】
第2の抗体が化学療法薬に対する結合特異性を有する、請求項35記載のエクスビボ方法。
【請求項４１】
第2の抗体が、血清アルブミンなどの血液タンパク質、またはトランスフェリンなどの脳タンパク質、または肝臓タンパク質に対する結合特異性を有する、請求項35記載のエクスビボ方法。
【請求項４２】
第2の抗体が組織因子などの血液凝固に関与するタンパク質に対する結合特異性を有する、請求項35記載のエクスビボ方法。
【請求項４３】
第1および/または第2の抗体が、細胞毒性剤；放射性同位体；プロドラッグまたは薬物、例えばタキサンなど；サイトカイン；ケモカイン、および補体、例えばC1qなどからなる群より選択される化合物に連結されている、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
【請求項４４】
以下の段階を含む、二重特異性抗体を作製するためのエクスビボ方法：
a) 第1の結合特異性を有する第1の抗体を提供する段階であって、該第1の抗体がコアヒンジ領域内のCPPC配列およびIgG4 CH3領域を含む段階、
b) 該第1の結合特異性と異なる、第2の結合特異性を有する第2の抗体を提供する段階であって、該第2の抗体がコアヒンジ領域内のCPPC配列およびIgG4 CH3領域を含む段階、
c) コアヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1の抗体および該第2の抗体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 二重特異性抗体を得る段階。
【請求項４５】
段階c)において還元剤が添加され、該剤の濃度が、段階c)で生じる溶液の酸化還元電位が実施例35に記載する条件下で、1 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば2 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば4 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば6 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば8 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば10 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である濃度である、請求項44記載のエクスビボ方法。
【請求項４６】
前記請求項のいずれか一項記載の方法によって得られるか、または得られ得る、単離された二重特異性抗体。
【請求項４７】
2つのIgG4様CH3領域を含む、単離された二重特異性抗体。
【請求項４８】
請求項2、4〜14、または16〜18のいずれか一項において規定された特徴を含む、請求項47記載の二重特異性抗体。
【請求項４９】
第1および/または第2のCH3領域がIgG4 CH3領域である、請求項47または48記載の二重特異性抗体。
【請求項５０】
コアヒンジ領域外およびCH3領域外の配列が、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものである、請求項46〜49のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項５１】
請求項47〜50のいずれか一項記載の二重特異性抗体を含む薬学的組成物。
【請求項５２】
薬として使用するための、請求項51記載の組成物。
【請求項５３】
癌の治療用の薬として使用するための、請求項51記載の組成物。
【請求項５４】
癌の治療用の薬を調製するための、請求項1〜45のいずれか一項記載の方法によって得られるかもしくは得られ得る二重特異性抗体かまたは請求項46〜50のいずれか一項記載の二重特異性抗体の、使用。
【請求項５５】
以下の段階を含む、所望の特性を有する二重特異性抗体を選択する方法：
a) 一組の抗体を提供する段階であって、各抗体が異なる標的特異性を有し、かつ各抗体がIgG4様CH3領域を含む段階、
b) 還元条件下で、該一組の抗体の各抗体を該一組の別の抗体と共にインキュベートし、それによって一組の抗体混合物を作製する段階であって、各混合物が異なる二重特異性抗体を含む段階、
c) 結果として得られた一組の抗体混合物を所与の所望の特性についてアッセイする段階、および
d) 所望の特性を有する二重特異性抗体混合物を選択する段階。
【請求項５６】
段階b)が、請求項2〜45における段階c)について規定されるさらなる特性の1つまたは複数を有する、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
所望の特性が腫瘍細胞殺傷である、請求項55または56記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
なおさらなる局面において、本発明は、以下の段階を含む、所望の特性を有する二重特異性抗体を選択する方法に関する：
a) 一組の抗体を提供する段階であって、各抗体が異なる標的特異性を有し、かつ各抗体がIgG4様CH3領域を含む段階、
b) 還元条件下で、該一組の抗体の各抗体を、該一組の別の抗体と共にインキュベートし、それによって一組の抗体混合物を作製する段階であって、各混合物が異なる二重特異性抗体を含む段階、
c) 結果として得られた一組の抗体混合物を所与の所望の特性についてアッセイする段階、および
d) 所望の特性を有する二重特異性抗体混合物を選択する段階。
[請求項1001]
以下の段階を含む、二重特異性抗体を作製するためのエクスビボ方法：
a) 第1の結合特異性を有する第1の抗体を提供する段階であって、該第1の抗体がIgG4様CH3領域を含む段階、
b) 該第1の結合特異性と異なる、第2の結合特異性を有する第2の抗体を提供する段階であって、該第2の抗体がIgG4様CH3領域を含む段階、
c) コアヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1の抗体および該第2の抗体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 二重特異性抗体を得る段階。
[請求項1002]
第1の抗体がコアヒンジ領域内にCPPC配列を含む、請求項1001記載のエクスビボ方法。
[請求項1003]
第1の抗体がIgG4様コアヒンジ領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1004]
第1の抗体が、コアヒンジ領域内に、X1およびX2の両方がプロリンではないという条件で、X1およびX2が任意のアミノ酸であってよい、CX1X2C配列を含む抗体である、請求項1001または1003のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1005]
第1の抗体が、コアヒンジ領域内に、X3がプロリンを除く任意のアミノ酸であってよい、CX3PCまたはCPX3C配列を含む抗体である、請求項1004記載のエクスビボ方法。
[請求項1006]
第1の抗体が、コアヒンジ領域内にCSPC、CPSC、CRPC、CPRC、CGHC、またはCPHC配列を含む抗体である、請求項1005記載のエクスビボ方法。
[請求項1007]
第1の抗体がIgG4 CH3領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1008]
第1の抗体が非IgG4アイソタイプのCH3領域を含み、このCH3配列が、ジスルフィド結合または共有結合性のもしくは安定した非共有結合性の重鎖間結合の形成に関与するいかなるアミノ酸残基も含まないが他のペプチドはCH3領域の同一のアミノ酸配列を含む配列であるか、またはそのように改変されている、請求項1001〜1006のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1009]
CH3領域がSEQ ID NO: 19に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1008記載のエクスビボ方法：
238位のArg(R)がGln(Q)によって置換；239位のAsp(D)がGlu(E)によって置換；292位のLys(K)がArg(R)によって置換；302位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；および328位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
[請求項1010]
292位のLys(K)がArg(R)によって置換されている、請求項1009記載のエクスビボ方法。
[請求項1011]
CH3領域がSEQ ID NO: 19に示す配列を有するが、292位のLys(K)がTyr(W)またはPhe(F)によって置換されている、請求項1001〜1006または1008のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1012]
CH3領域がSEQ ID NO: 20に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1008記載のエクスビボ方法：
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換；276位のMet(M)がVal(V)によって置換；288位のLys(K)がArg(R)によって置換；298位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；および324位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
[請求項1013]
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換されている、請求項1012記載のエクスビボ方法。
[請求項1014]
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換されており；かつ324位のPro(P)がLeu(L)によって置換されている、請求項1012記載のエクスビボ方法。
[請求項1015]
5つすべての置換がなされている、請求項1012記載のエクスビボ方法。
[請求項1016]
CH3領域がSEQ ID NO: 21に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1008記載のエクスビボ方法：
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換；314位のSer(S)がAsn(N)によって置換；322位のAsn(N)がLys(K)によって置換；327位のMet(M)がVal(V)によって置換；339位のLys(K)がArg(R)によって置換；349位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；352位のIle(I)がVal(V)によって置換；365位のArg(R)がHis(H)によって置換；366位のPhe(F)がTyr(Y)によって置換；および375位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
[請求項1017]
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換されている、請求項1016記載のエクスビボ方法。
[請求項1018]
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換されており；かつ375位のPro(P)がLeu(L)によって置換されている、請求項1016記載のエクスビボ方法。
[請求項1019]
10個すべての置換がなされている、請求項1016記載のエクスビボ方法。
[請求項1020]
第1の抗体がIgG4抗体である、請求項1001、1003〜1007のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1021]
第2の抗体がコアヒンジ領域内にCPPC配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1022]
第2の抗体がIgG4様コアヒンジ領域を含む、請求項1001〜1020のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1023]
第2の抗体が、コアヒンジ領域内に、X1およびX2の両方がプロリンではないという条件で、X1およびX2が任意のアミノ酸であってよい、CX1X2C配列を含む抗体である、請求項1001〜1020または1022のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1024]
第2の抗体が、コアヒンジ領域内に、X3がプロリンを除く任意のアミノ酸であってよい、CX3PCまたはCPX3C配列を含む抗体である、請求項1023記載のエクスビボ方法。
[請求項1025]
第2の抗体が、コアヒンジ領域内にCSPC、CPSC、CRPC、またはCPRC配列を含む抗体である、請求項1023記載のエクスビボ方法。
[請求項1026]
第2の抗体がIgG4 CH3領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1027]
第2の抗体が非IgG4アイソタイプのCH3領域を含み、このCH3配列が、ジスルフィド結合または共有結合性のもしくは安定した非共有結合性の重鎖間結合の形成に関与するいかなるアミノ酸残基も含まないが他のペプチドはCH3領域の同一のアミノ酸配列を含む配列であるか、またはそのように改変されている、請求項1001〜1025のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1028]
CH3領域がSEQ ID NO: 19に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1027記載のエクスビボ方法：
238位のArg(R)がGln(Q)によって置換；239位のAsp(D)がGlu(E)によって置換；292位のLys(K)がArg(R)によって置換；302位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；および328位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
[請求項1029]
292位のLys(K)がArg(R)によって置換されている、請求項1028記載のエクスビボ方法。
[請求項1030]
CH3領域がSEQ ID NO: 19に示す配列を有するが、292位のLys(K)がTyr(W)またはPhe(F)によって置換されている、請求項1021〜1027のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1031]
CH3領域がSEQ ID NO: 20に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1027記載のエクスビボ方法：
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換；276位のMet(M)がVal(V)によって置換；288位のLys(K)がArg(R)によって置換；298位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；および324位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
[請求項1032]
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換されている、請求項1031記載のエクスビボ方法。
[請求項1033]
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換されており；かつ324位のPro(P)がLeu(L)によって置換されている、請求項1031記載のエクスビボ方法。
[請求項1034]
5つすべての置換がなされている、請求項1031記載のエクスビボ方法。
[請求項1035]
CH3領域がSEQ ID NO: 21に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1027記載のエクスビボ方法：
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換；314位のSer(S)がAsn(N)によって置換；322位のAsn(N)がLys(K)によって置換；327位のMet(M)がVal(V)によって置換；339位のLys(K)がArg(R)によって置換；349位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；352位のIle(I)がVal(V)によって置換；365位のArg(R)がHis(H)によって置換；366位のPhe(F)がTyr(Y)によって置換；および375位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
[請求項1036]
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換されている、請求項1035記載のエクスビボ方法。
[請求項1037]
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換されており；かつ375位のPro(P)がLeu(L)によって置換されている、請求項1035記載のエクスビボ方法。
[請求項1038]
10個すべての置換がなされている、請求項1035記載のエクスビボ方法。
[請求項1039]
第2の抗体がIgG4抗体である、請求項1001〜1020または1022〜1026のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1040]
第1の抗体がコアヒンジ領域内にCPPCを含み、かつIgG4様CH3領域を含み、および、第2抗体がコアヒンジ領域内にCPPCを含み、かつIgG4様CH3領域を含む、請求項1001または1002記載のエクスビボ方法。
[請求項1041]
第1の抗体および/または第2の抗体がヒト抗体である、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1042]
段階c)における条件が、コアヒンジ領域外のジスルフィド架橋の有意な還元または異性化が起こらないように選択される、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1043]
段階c)が還元剤の添加を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1044]
段階c)が、グルタチオン、L-システイン、ジチオスレイトール、β-メルカプト-エタノール、およびシステアミンからなる群より選択される作用物質の添加を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1045]
作用物質の濃度が、段階c)で生じる溶液の酸化還元電位が実施例31に記載する条件下で、1μMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば10μMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば50μMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば0.1 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である濃度である、請求項1043または1044記載のエクスビボ方法。
[請求項1046]
作用物質の濃度が、段階c)で生じる溶液の酸化還元電位が実施例35に記載する条件下で、1 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば2 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば4 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば6 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば8 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば10 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である濃度である、請求項1043または1044記載のエクスビボ方法。
[請求項1047]
作用物質の濃度が、段階c)で生じる溶液の酸化還元電位が1 Mのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性が低い、例えば100 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性が低い、15 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかもしくはより還元性が低い濃度である、請求項1045または1046記載のエクスビボ方法。
[請求項1048]
段階c)が、還元型グルタチオンの存在下での、20℃またはそれ以上、例えば37℃の温度における、少なくとも1時間、例えば少なくとも2時間、例えば少なくとも5時間、例えば少なくとも10時間の、抗体のインキュベーションを含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1049]
結果として得られた組成物中の抗体分子の10%未満、例えば5%未満、例えば2%未満、例えば1%未満が凝集状態である、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1050]
半分子のさらなる交換を停止させるために、段階c)において得られた組成物を非還元条件に導くさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1051]
好ましくは以下から選択される方法を用いて、二重特異性抗体を安定化するさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法：
a) ヒンジ領域内のシステインを化学的に架橋する、
b) 半分子上の炭水化物側鎖を化学的に架橋する、および
c) CH3領域内に非対称的に導入されたシステインを架橋する。
[請求項1052]
好ましくは非還元条件下で、二重特異性抗体を精製するさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1053]
治療用途のために、結果として得られた二重特異性抗体を薬学的組成物に製剤化するさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1054]
第1の抗体が、腫瘍細胞、またはerbB1、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD38、CD4、もしくはCXCR5などの腫瘍細胞タンパク質に対する、またはCD79aもしくはCD79bに対する結合特異性を有する、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1055]
第2の抗体が、腫瘍細胞、またはerbB1、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、もしくはCXCR5などの腫瘍細胞タンパク質に対する結合特異性を有する、請求項1054記載のエクスビボ方法。
[請求項1056]
第1の抗体がerbB1に対する結合特異性を有し、かつ第2の抗体がerbB2に対する結合特異性を有する、請求項1054記載のエクスビボ方法。
[請求項1057]
第1の抗体がCD19に対する結合特異性を有し、かつ第2の抗体がCD20に対する結合特異性を有する、請求項1054記載のエクスビボ方法。
[請求項1058]
第1の抗体がCD4に対する結合特異性を有し、かつ第2の抗体がCXCR5に対する結合特異性を有する、請求項1054記載のエクスビボ方法。
[請求項1059]
第1の抗体がCD38に対する結合特異性を有し、かつ第2の抗体がCD34に対する結合特異性を有する、請求項1054記載のエクスビボ方法。
[請求項1060]
第1の抗体が病原微生物に対する結合特異性を有する、請求項1001〜1053のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1061]
第2の抗体が、CD3、CD25、CD28、CD16、CD89、CD32、またはCD1などのエフェクター細胞タンパク質に対する結合特異性を有する、請求項1054または1060記載のエクスビボ方法。
[請求項1062]
第2の抗体が化学療法薬に対する結合特異性を有する、請求項1054記載のエクスビボ方法。
[請求項1063]
第2の抗体が、血清アルブミンなどの血液タンパク質、またはトランスフェリンなどの脳タンパク質、または肝臓タンパク質に対する結合特異性を有する、請求項1054記載のエクスビボ方法。
[請求項1064]
第2の抗体が組織因子などの血液凝固に関与するタンパク質に対する結合特異性を有する、請求項1054記載のエクスビボ方法。
[請求項1065]
第1および/または第2の抗体が、細胞毒性剤；放射性同位体；プロドラッグまたは薬物、例えばタキサンなど；サイトカイン；ケモカイン、および補体、例えばC1qなどからなる群より選択される化合物に連結されている、前記請求項のいずれか一項記載のエクスビボ方法。
[請求項1066]
以下の段階を含む、二重特異性抗体を作製するためのエクスビボ方法：
a) 第1の結合特異性を有する第1の抗体を提供する段階であって、該第1の抗体がコアヒンジ領域内のCPPC配列およびIgG4 CH3領域を含む段階、
b) 該第1の結合特異性と異なる、第2の結合特異性を有する第2の抗体を提供する段階であって、該第2の抗体がコアヒンジ領域内のCPPC配列およびIgG4 CH3領域を含む段階、
c) コアヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1の抗体および該第2の抗体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 二重特異性抗体を得る段階。
[請求項1067]
段階c)において還元剤が添加され、該剤の濃度が、段階c)で生じる溶液の酸化還元電位が実施例35に記載する条件下で、1 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば2 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば4 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば6 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば8 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である、例えば10 mMのグルタチオンによって生じる酸化還元電位と等しいかまたはより還元性である濃度である、請求項1066記載のエクスビボ方法。
[請求項1068]
前記請求項のいずれか一項記載の方法によって得られるか、または得られ得る、単離された二重特異性抗体。
[請求項1069]
2つのIgG4様CH3領域を含む、単離された二重特異性抗体。
[請求項1070]
コアヒンジ領域内に1つまたは2つのCPPC配列を含む、請求項1069記載の二重特異性抗体。
[請求項1071]
コアヒンジ領域内に、X1およびX2の両方がプロリンではないという条件で、X1およびX2が任意のアミノ酸であってよい、1つまたは2つのCX1X2C配列を含む、請求項1069記載の二重特異性抗体。
[請求項1072]
コアヒンジ領域内に、X3がプロリンを除く任意のアミノ酸であってよい、1つまたは2つのCX3PCまたはCPX3C配列を含む、請求項1069記載の二重特異性抗体。
[請求項1073]
コアヒンジ領域内に1つまたは2つのCSPC、CPSC、CRPC、またはCPRC配列を含む、請求項1069記載の二重特異性抗体。
[請求項1074]
第1および/または第2のCH3領域が非IgG4アイソタイプのものであって、このCH3配列が、ジスルフィド結合または共有結合性のもしくは安定した非共有結合性の重鎖間結合の形成に関与するいかなるアミノ酸残基も含まないが他のペプチドはCH3領域の同一のアミノ酸配列を含む配列であるか、またはそのように改変されている、請求項1069〜1073のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
[請求項1075]
第1および/または第2のCH3領域がSEQ ID NO: 19に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1074記載の二重特異性抗体：
238位のArg(R)がGln(Q)によって置換；239位のAsp(D)がGlu(E)によって置換；292位のLys(K)がArg(R)によって置換；302位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；および328位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
[請求項1076]
第1および/または第2のCH3領域がSEQ ID NO: 19に示す配列を有するが、292位のLys(K)がArg(R)によって置換されている、請求項1075記載の二重特異性抗体。
[請求項1077]
第1および/または第2のCH3領域がSEQ ID NO: 19に示す配列を有するが、292位のLys(K)がTyr(W)またはPhe(F)によって置換されている、請求項1074記載の二重特異性抗体。
[請求項1078]
第1および/または第2のCH3領域がSEQ ID NO: 20に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1074記載の二重特異性抗体：
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換；276位のMet(M)がVal(V)によって置換；288位のLys(K)がArg(R)によって置換；298位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；および324位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
[請求項1079]
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換されている、請求項1074記載の二重特異性抗体。
[請求項1080]
234位のArg(R)がGln(Q)によって置換されており；かつ324位のPro(P)がLeu(L)によって置換されている、請求項1074記載の二重特異性抗体。
[請求項1081]
第1および/または第2のCH3領域がSEQ ID NO: 21に示す配列を有し、このCH3領域が、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1074記載の二重特異性抗体：
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換；314位のSer(S)がAsn(N)によって置換；322位のAsn(N)がLys(K)によって置換；327位のMet(M)がVal(V)によって置換；339位のLys(K)がArg(R)によって置換；349位のGln(Q)がGlu(E)によって置換；352位のIle(I)がVal(V)によって置換；365位のArg(R)がHis(H)によって置換；366位のPhe(F)がTyr(Y)によって置換；および375位のPro(P)がLeu(L)によって置換。
[請求項1082]
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換されている、請求項1081記載の二重特異性抗体。
[請求項1083]
285位のArg(R)がGln(Q)によって置換されており；かつ375位のPro(P)がLeu(L)によって置換されている、請求項1081記載の二重特異性抗体。
[請求項1084]
第1および/または第2のCH3領域がIgG4 CH3領域である、請求項1069〜1073のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
[請求項1085]
コアヒンジ領域外およびCH3領域外の配列が、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものである、請求項1068〜1084のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
[請求項1086]
請求項1069〜1085のいずれか一項記載の二重特異性抗体を含む薬学的組成物。
[請求項1087]
薬として使用するための、請求項1086記載の組成物。
[請求項1088]
癌の治療用の薬として使用するための、請求項1086記載の組成物。
[請求項1089]
癌の治療用の薬を調製するための、請求項1001〜1067のいずれか一項記載の方法によって得られるかもしくは得られ得る二重特異性抗体かまたは請求項1068〜1085のいずれか一項記載の二重特異性抗体の、使用。
[請求項1090]
以下の段階を含む、所望の特性を有する二重特異性抗体を選択する方法：
a) 一組の抗体を提供する段階であって、各抗体が異なる標的特異性を有し、かつ各抗体がIgG4様CH3領域を含む段階、
b) 還元条件下で、該一組の抗体の各抗体を該一組の別の抗体と共にインキュベートし、それによって一組の抗体混合物を作製する段階であって、各混合物が異なる二重特異性抗体を含む段階、
c) 結果として得られた一組の抗体混合物を所与の所望の特性についてアッセイする段階、および
d) 所望の特性を有する二重特異性抗体混合物を選択する段階。
[請求項1091]
段階b)が、請求項1002〜1067における段階c)について規定されるさらなる特性の1つまたは複数を有する、請求項1090記載の方法。
[請求項1092]
所望の特性が腫瘍細胞殺傷である、請求項1090または1091記載の方法。