【手続補正書】
【提出日】平成23年8月11日(2011.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子の配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列および受容体に対するリガンドを含む、標的核酸分子に対するプローブであって、該プローブに結合する標的核酸分子の非存在下において第１の三次元構造を有し、該プローブに結合する標的核酸の存在下において第２の三次元構造を有し、第１の三次元構造が、受容体がリガンドと結合するのを抑制または阻止し、第２の三次元構造が、受容体がリガンドと特異的に結合するのを許容する、プローブ。
【請求項２】
受容体が、検出可能な標識を含む、請求項１のプローブ。
【請求項３】
検出可能な標識からの検出シグナルが増幅される、請求項２のプローブ。
【請求項４】
第１の三次元構造が、受容体がリガンドと結合するのを立体的に妨げる、請求項１〜３いずれかに記載のプローブ。
【請求項５】
プローブが、基体上に固定化されている、請求項１〜４いずれかに記載のプローブ。
【請求項６】
受容体がリガンドと結合するのを抑制または阻止されるよう、第１の三次元構造がリガンドを基体に近い位置へ配置する、請求項５のプローブ。
【請求項７】
受容体が、リガンドと特異的に結合する抗体である、請求項１〜６いずれかに記載のプローブ。
【請求項８】
検出可能な標識が、フルオレセイン、ストレプトアビジンまたはビオチンである、請求項２〜７いずれかに記載のプローブ。
【請求項９】
検出シグナルが、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼまたはウレアーゼによって増幅される、請求項３〜８いずれかに記載のプローブ。
【請求項１０】
プローブが、ヘアピンプローブまたは四重鎖プローブである、請求項１〜９いずれかに記載のプローブ。
【請求項１１】
標的核酸分子が、IL-8 の核酸である、請求項１〜１０いずれかに記載のプローブ。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド配列が、配列番号５〜１４および２３〜２５の配列からなる群より選択される、請求項１〜１１いずれかに記載のプローブ。
【請求項１３】
以下を含む、サンプル中における標的核酸分子をアッセイするための方法:
請求項１〜１２のいずれかに記載のプローブをサンプルおよび受容体と接触させること、および
リガンドと受容体との間の複合体の存在または不存在を検出すること、
ここで、複合体の存在は、サンプル中における標的核酸分子の存在を示し、複合体の不存在は、サンプル中における標的核酸分子の不存在を示す。
【請求項１４】
受容体が、検出可能な標識を含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
検出可能な標識からの検出シグナルを増幅することをさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
第１の三次元構造が、受容体がリガンドと結合するのを立体的に妨げる、請求項１３〜１５いずれかに記載の方法。
【請求項１７】
プローブが、基体上に固定化されている、請求項１３〜１６いずれかに記載の方法。
【請求項１８】
受容体がリガンドと結合するのを抑制または阻止されるよう、第１の三次元構造がリガンドを基体に近い位置へ配置する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
受容体が、リガンドと特異的に結合する抗体である、請求項１３〜１８いずれかに記載の方法。
【請求項２０】
検出可能な標識が、フルオレセイン、ストレプトアビジンまたはビオチンである、請求項１４〜１９いずれかに記載の方法。
【請求項２１】
検出可能な標識からの検出シグナルが、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼまたはウレアーゼによって増幅される、請求項１５〜２０いずれかに記載の方法。
【請求項２２】
プローブが、ヘアピンプローブまたは四重鎖プローブである、請求項１３〜２１いずれかに記載の方法。
【請求項２３】
複合体を検出する前に、リガンドに結合していないあらゆる受容体を除去することをさらに含む、請求項１３〜２２いずれかに記載の方法。
【請求項２４】
標的核酸分子が、IL-8 の核酸である、請求項１３〜２３いずれかに記載の方法。
【請求項２５】
プローブのポリヌクレオチド配列が、配列番号５〜１４および２３〜２５の配列からなる群より選択される、請求項１３〜２４いずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【図１】図 1 は、本発明のアッセイ方法の態様を概略的に示す。
【図２】図 2 は、本発明のヘアピンプローブに関するプローブ構造の影響を示す。
【図３】図 3 は、直線状プローブおよびヘアピンプローブによる mRNA の検出限界を示す。
【図４】図 4 は、ヘアピンプローブを用いる電気化学的検出における特異的シグナル増幅を模式的に示す。ヘアピンプローブに対して標的が全く結合していない場合、ヘアピンは閉じており、HRP が表面上で有効な複合体を形成できず、その結果、シグナルは観察されない。標的とハイブリダイズした後は、ヘアピンが開き、HRP 複合体が形成される。その後、TMB が還元型 HRP を再生し続け、それが電流シグナルを増幅する。
【図５】図 5 は、ヘアピンプローブを適用する、２組の唾液の RNA: IL-8 および S100A8 の交差検出を示すグラフである。RNA 標的のレベルは、IL-8 については 5 nM、S100A8 については 7 nM である。空(blank)のシグナルは、6×SSC および 10 mM MgCl2 である。4 回実施した実験の平均および標準偏差を示す。
【図６】図 6 は、様々なリンカーを有する IL-8 ヘアピンプローブを用いる検出を図によって比較する。ヘアピンは、空対照(blank control)においては閉じており、RNA サンプルを伴うと開く。IL-8 RNA の濃度は 50 nM である。空対照は、6×SSC および 10 mM MgCl2 である。4 回実施した実験の平均および標準偏差を示す。異なるリンカー長を有するヘアピンプローブの立体配置を、模式的に示す。
【図７】図 7 は、異なるステムループ構造を有する IL-8 ヘアピンプローブを用いる検出を、図によって比較する。ヘアピンは、空対照において閉じており、RNA サンプルを伴うと開く。下線を伴う配列（配列番号２〜４）は、標的 RNA（配列番号１）と相補的である。イタリック体の配列は、ステム部分である。太字の配列は、ループ部分である。HP1: 10 bp がステム、41 bp が二重鎖。 HP2: 8 bp がステム、34 bp が二重鎖。 HP3: 6 bp がステム、27 bp が二重鎖。IL-8 RNA の濃度は 50 nM である。空対照は、6×SSC および 10 mM MgCl2 である。4 回実施した実験の平均および標準偏差を示す。
【図８】図 8 は、直鎖状プローブとヘアピンプローブの間で比較された、唾液の RNA の検出を示す。(a): IL-8。表 2 に示す通り、直鎖状プローブは IL-8 CP および IL-8 DP であり、ヘアピンプローブは IL-8 HP である; (b): S100A8。表 2 に示す通り、直鎖状プローブは S100A8 CP および S100A8 DP であり、ヘアピンプローブは S100A8 HP である。
【図９】図 9 は、IVT RNA を用いる、スパイクされた(spiked)唾液の電気化学的検出を示す。円: (a) IL8; (b) S100A8。唾液サンプルは、何の処理も伴わない同一人の同一バッチ(batch)からの全唾液(whole saliva)である。
【図１０】図 10 は、標識分子とオリゴヌクレオチドの間の結合の構造を示す。
【図１１】図 11 は、HP を適用する、２組の IVT RNA: IL-8 および S100A8 を用いた交差検出。(a)８つのサンプルについての電流測定シグナル。(1)-(4) は、HP を S100A8 について適用し、標的化する RNA は、それぞれ (1) 7 nM S100A8、(2) 500 nM IL-8、(3) 5 nM IL-8、および (4) バッファーのみ、であった。(5)-(8) は、HP を IL-8 について使用し、標的化する RNA は、それぞれ (5) 5 nM IL-8、(6) 700 nM S100A8、(7) 7 nM S100A8、および (8) バッファーのみ、であった。(b) (a)における同じ８つのサンプルの棒グラフ。HP の配列は、表 3 に IL-8 HP および S100A8 HP として記載する。４つの独立した実験の平均および標準偏差を示す。
【図１２】図 12、直鎖状プローブ(LP) および HP による唾液の IL-8 RNA の検出。表 3 に記載される通り、LP は IL-8 CP および IL-8 DP であり、HP は IL-8 HP であった。測定されたシグナルから、空対照のシグナルを減算した。４つの実験の平均および標準偏差を示す。LP についての 4 fM の標的のデータ点は、その値が空対照の値よりも下だったため、示されていない。
【図１３】図 13、同じセットの臨床唾液サンプルについての、HP を用いる電流測定シグナルと、IL-8 mRNA の qPCR によって検出される濃度との間の相関。線形回帰についての R2 は、0.99 であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
【表２】
2010528618.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
方法を確立する目的で、IL-8 および S100A8 のインビトロで転写された(IVT) RNA を、本研究における検出のための標的として用いた。IVT RNA を、２つの工程において生成した: 一つ目は、常套の RT-PCR を用いてインビトロ転写のための鋳型を生成することであり、ここで、プライマーはフォワードプライマーの 5'末端において 20 塩基のコア(core) T7 プロモーター配列を有する。IL-8 については、フォワードプライマーが 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGaaggaaaactgggtgcagag-3'（配列番号１５）であり、リバースプライマーが 5'-attgcatctggcaaccctac-3'（配列番号１６）である。S100A8 については、フォワードプライマーが 5' CTAATACGACTCACTATAGGGatcatgttgaccgagctgga-3'（配列番号１７）であり、リバースプライマーが 5'-gtctgcaccctttttcctga-3'（配列番号１８）である。生産物は、それぞれ 177 bp および 159 bp の二本鎖 DNA であった。常套の RT-PCR を、口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞株の全 RNA を鋳型として用いて行い、50 U の MuLV 逆転写酵素 (Applied Biosystems)、20 U の RNAse 阻害剤 (Applied Biosystems)、10 mM の dNTP および 5 nmol のランダムヘキサマー(random hexamer)を有する 20 μl の逆転写反応混合物中において cDNA を合成した。混合物を、最初に 25℃で 10 分間インキュベートし、次いで 42℃で 45 分間逆転写を行い、その後、RT の最終の不活性化を 95℃で 5 分間行い、そして 4℃で 5 分間冷却した。１マイクロリットルの cDNA を、400 nM のプライマーを有する 20 μl の PCR 反応において用いた。PCR 反応を、以下のプロトコールによって行った: 95℃で 3 分、その後、95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒 を 40 サイクル、そして最終の伸長を 72℃で 7 分間。RT-PCR 産物を、エチジウムブロマイドで染色された 2% のアガロースゲル上で確認した。第２の工程は、IVT RNA を生成することであった。T7 MEGAshort transcribe kit (Invitrogen) を用い、製造者の説明書に従って、インビトロ転写を行った。簡潔には、第１の工程からの 8 μl の PCR 産物を、37℃において 3 時間、インビトロで転写し、その後さらに 20 分間、2 μl の rDNase1 (Invitrogen) で処理した。その結果得られた一本鎖 RNA 転写産物を、cleaned up (Arcturus、Mountain View、CA) を用いて精製した。組換え RNA を、Nanodrop 分光測定を用いて、量および A260/A280 比について定量化した。得られた RNA を、キャリアー(carrier)としてパン酵母の tRNA (30 μg/ml、Roche) を有する、RNase を含まない(RNase-free)蒸留水(Invitrogen)中に溶解した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
プライマー設計
IL8 についての、60 ℃付近の融解温度を有する、イントロンにまたがる(intron-spanning)プライマーのペアを、primer3 プログラムを用いて設計した。OF および OR は、RT-PCR のためのプライマーであり、IF および IR は、qPCR のために設計した。
IL8_IF      IL8    IF            CCAAGGAAAACTGGGTGCAG  （配列番号１９）
IL8_IR      IL8    OR            CTTGGATACCACAGAGAATGAATTTTT  （配列番号２０）
IL8_OF      IL8    OF            TTTCTGATGGAAGAGAGCTCTGTCT  （配列番号２１）
IL8_OR      IL8    IR            ATCTTCACTGATTCTTGGATACCACA  （配列番号２２）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
【表３】
2010528618.tif 000002
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
【表４】
2010528618.tif 000003