【手続補正書】
【提出日】平成23年1月18日(2011.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞調製物の状態を評価する方法であって、前記調製物中の伸長グリカン構造、または、少なくとも２つの、グリカン構造の群の存在を検出する工程を含み、前記グリカン構造またはグリカン構造の群は、式Ｔ１
2010516240.tif 000001
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ６はＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基シアル酸、好ましくはＮｅｕ５Ａｃα２またはＮｅｕ５Ｇｃα２、最も好ましくはＮｅｕ５Ａｃα２であり；
Ｒ３、はＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基Ｆｕｃα１（Ｌ‐フコース）またはＮ‐アセチル（Ｎ‐アセトアミド、ＮＣＯＣＨ３）であり；
Ｒ４、はＨ、ＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基Ｆｕｃα１（Ｌ‐フコース）であり、
Ｒ４がＨである場合、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ４がＨではない場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ７はＮ‐アセチルまたはＯＨであり；
Ｘは前記細胞由来の天然オリゴ糖主鎖構造、好ましくはＮ‐グリカン、Ｏ‐グリカンもしくは糖脂質構造であり；またはｎが０である場合、Ｘは無であり、
Ｙはリンカー基、好ましくはＯ‐グリカンおよびＯ‐結合末端オリゴ糖および糖脂質のための酸素、ならびにＮ‐グリカンのためのＮ、またはｎが０である場合、無であり；そして
Ｚは担体構造、好ましくは細胞により産生された天然担体であり、例えばタンパク質または脂質であって、好ましくは担体上のセラミドもしくは分岐グリカンコア構造、またはＨであり；
アーチはガラクトピラノシルからの結合が左側の残基の３位または４位いずれかに対するものであること、およびＲ４構造が他の４または３位にあることを表し；
ｎは０または１の整数であり、ｍは１〜１０００、好ましくは１〜１００、および最も好ましくは１〜１０の整数（担体上のグリカンの数）であり、
ただしＲ２およびＲ３のうち１つはＯＨまたはＲ３はＮ‐アセチルであり、
左側の第１の残基が右側の残基の４位に結合する場合、Ｒ６はＯＨである］によるものであり：
ならびに、
前記グリカン構造は伸長構造であって、ここで、前記結合剤は前記構造およびさらに少なくとも１つの還元末端伸長エピトープに結合し、これは式Ｔ１のＸおよび／またはＹを置換する単糖エピトープであり、前記単糖エピトープは、前記式Ｅ１：
ＡｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎ、［式中、Ａはアノマー構造アルファまたはベータであり、ｘは結合位置２、３または６であり；およびＨｅｘはヘキソピラノシル残基Ｇａｌ、またはＭａｎであり、ｎは０または１の整数であり、
ただし
ｎが１である場合、ＡｘＨｅｘＮＡｃはβ４ＧａｌＮＡｃまたはβ６ＧａｌＮＡｃであり、
ＨｅｘがＭａｎである場合、ＡｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、および、
ＨｅｘがＧａｌである場合、ＡｘＨｅｘはβ３Ｇａｌまたはβ６Ｇａｌまたはα３Ｇａｌまたはα４Ｇａｌである］；
によるものであり、
または
前記結合剤エピトープはさらに還元末端伸長エピトープ
還元末端ＧａｌＮＡｃα含有構造に結合するＳｅｒ／Ｔｈｒもしくは
Ｇａｌβ４Ｇｌｃ含有構造に結合するβＣｅｒに結合し、および前記グリカン構造は関連するまたは混入した細胞集団から決定される幹細胞集団である方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、造血幹細胞の試料から伸長グリカン構造を検出する工程を含み、ここで前記伸長構造は、
式Ｅ１：
ＡｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎ
［式中、Ａはアノマー構造アルファまたはベータであり、ｘは結合位置２、３、または６であり；およびＨｅｘはヘキソピラノシル残基Ｇａｌ、またはＭａｎであり、およびｎは０または１の整数であり、
ただし、
ｎが１である場合、ＡｘＨｅｘＮＡｃはβ４ＧａｌＮＡｃまたはβ６ＧａｌＮＡｃであり、
ＨｅｘがＭａｎである場合、ＡｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、そして
ＨｅｘがＧａｌである場合、ＡｘＨｅｘはβ３Ｇａｌまたはβ６Ｇａｌまたはα３Ｇａｌまたはα４Ｇａｌである］
の少なくとも１つの還元末端伸長単糖エピトープにさらに結合し、
ただし
ｉ）造血幹細胞は癌細胞株の細胞ではなく、そして
ｉｉ）細胞が造血ＣＤ３４＋細胞であり、前記構造がＮ‐アセチルラクトサミンを含む場合は、前記構造はフコシル化された特異的な伸長構造であるか、またはＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ構造ではない方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα３／６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、およびＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃの群より選択される末端エピトープが、
式Ｅ１：
ＡｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎ
［式中、Ａはアノマー構造アルファまたはベータであり、Ｘは結合位置２、３、または６であり；およびＨｅｘはヘキソピラノシル残基Ｇａｌ、またはＭａｎであり、およびｎは０または１の整数であり、
ただし、
ｎが１である場合、ＡｘＨｅｘＮＡｃはβ６ＧａｌＮＡｃであり、
ＨｅｘがＭａｎである場合、ＡｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、そして
ＨｅｘがＧａｌである場合、ＡｘＨｅｘはβ３Ｇａｌまたはβ６Ｇａｌであり、ただし、ＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃはβ３Ｇａｌと結合しない］
の伸長構造に結合する方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、ここで前記結合物質が式Ｔ８Ｅベータ
［Ｍα］ｍＧａｌβ１‐３／４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｐ
［式中
式中、ｘは結合位置２、３、または６であり
式中、ｍ、ｎおよびｐは独立に０または１の整数であり
ＭおよびＮは単糖残基であって
ｉ）独立に無（その位置における遊離水酸基）
および／または
ｉｉ）Ｇａｌの３位または／およびＧｌｃＮＡｃの６位に結合するシアル酸であるＳＡ
および／または
ｉｉｉ）Ｇａｌの２位および／またはＧｌｃＮＡｃの３もしくは４位に結合するＦｕｃ（Ｌ‐フコース）残基（ＧａｌがＧｌｃＮＡｃの他の位置（４または３）に結合する場合）
であり、
ただしｍ、ｎおよびｐは独立に０または１であり、
Ｈｅｘはヘキソピラノシル残基ＧａｌまたはＭａｎであり、
ただしｐが１の場合、βｘＨｅｘＮＡｃはβ６ＧａｌＮＡｃであり、
ｐが０の場合
ＨｅｘはＭａｎであり、かつβｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、またはＨｅｘはＧａｌであり、かつβｘＨｅｘはβ３Ｇａｌもしくはβ６Ｇａｌである］
の構造を認識する方法。
【請求項５】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法であって、前記結合物質が
式Ｔ１０Ｅ
［Ｍα］ｍＧａｌβ１‐４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｐ
［ただしｐが１である場合、βｘＨｅｘＮＡｃはβ６ＧａｌＮＡｃであり、
ｐが０である場合、ＨｅｘはＭａｎであり、かつβｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、または、ＨｅｘはＧａｌであり、かつβｘＨｅｘはβ６Ｇａｌである］
のＩＩ型ラクトサミンを基盤とする構造を認識する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記結合物質が式Ｔ１０ＥＭａｎ：
［Ｍα］ｍＧａｌβ１‐４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎ、
［式中、変数は請求項２の式Ｔ８Ｅベータに対して記載されるものと同様である］
のＩＩ型ラクトサミンを基盤とする構造を認識する方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記結合物質が
式Ｔ１０ＥＧａｌ（ＮＡｃ）：
［Ｍα］ｍＧａｌβ１‐４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβ６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｐ
［式中、変数は請求項２の式Ｔ８Ｅベータに対して記載される通りである］
のＩＩ型ラクトサミンを認識する方法。
【請求項８】
前記構造が、Ｏ‐グリカンコアＩＩシアリル‐Ｌｅｗｉｓ  ｘ構造ＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ６（ＲＧａｌβ３）ＧａｌＮＡｃであり、それが抗体ＣＨＯ１３１によって認識される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が造血幹細胞の５０％超を認識した、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合物質が式Ｔ９Ｅ
［Ｍα］ｍＧａｌβ１‐３［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ
のＩ型ラクトサミンを基盤とする構造を認識する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法であって、結合試薬の以下の組み合わせの１つが用いられ、前記試薬はＩ型およびＩＩ型アセチルラクトサミンならびにそのフコシル化バリアントもしくはその非シアル化フコシル化バリアント；または好ましくはＦｕｃα２末端および／もしくはＦｕｃα３／４分岐構造を有するフコシル化Ｉ型およびＩＩ型Ｎ‐アセチルラクトサミン構造；または好ましくはＦｕｃα２末端を含むフコシル化Ｉ型およびＩＩ型Ｎ‐アセチルラクトサミン構造を認識する、方法。
【請求項１２】
前記結合物質が、
式
［Ｍα］ｍＧａｌβ１‐４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ
［ただし、構造がＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌではない］
のＩ型ラクトサミンを基盤とする構造を認識する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記の伸長オリゴ糖構造がＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、およびＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出がモノクローナル抗体、グリコシダーゼ、グリコシル転移酵素、植物レクチン、動物レクチンおよびそれらのペプチド模倣物からなる群より選択される組み替えタンパク質である結合剤により行われる、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合剤が、生体材料または他の細胞型を含む細胞材料等の試料からヒト幹細胞を選別または選択するために用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合剤が、異なるヒト幹細胞型間の選別または選択のために用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法により得られた細胞集団。
【請求項１８】
前記グリカン構造がＮ‐グリカンコア構造を有するＮ‐グリカンを含むＮ‐グリカンサブグライコーム中に存在し、前記Ｎ‐グリカンがＮ‐グリコシダーゼにより細胞から遊離され得る、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１９】
請求項２または３に記載の方法であって、前記グリカン構造が、Ｏ‐グリカンコア構造を有するＯ‐グリカンを含むＯ‐グリカンサブグライコーム中に存在し、または前記グリカン構造が、糖脂質コア構造を有する糖脂質を含む糖脂質サブグライコーム中に存在し、前記グリカンがグリコシルセラミダーゼにより遊離され得る方法。
【請求項２０】
前記細胞調製物の細胞表面グライコームの存在または非存在が検出される、請求項２乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞調製物が、前記細胞調製物の細胞集団内の混入する構造、時間依存的変化または細胞集団の状態の変化に関して、前記細胞調製物内のグリカンの質量分析を用いたグリコシル化分析により、評価／検出される、請求項２乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
幹細胞由来の請求項１に記載のグリカン構造と、当該グリカン構造と結合する結合剤を有する組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれかに記載のグリカン構造を検出するための結合剤を含む少なくとも１つの試薬；および前記試薬を用いて幹細胞の濃縮を行うための説明書を含み、任意に幹細胞の濃縮を行うための手段を含む、試料内の幹細胞の濃縮および検出のためのキット。