【手続補正書】
【提出日】平成23年8月1日(2011.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
［式中、Ａｒは上記定義のとおりであり、好ましくは置換されてもよいＣ６Ｈ４基であり；ＴはＣ１−Ｃ３アルキル基を表わす］
の誘導体を反応させる工程と、
ｃ２）式（Ｘ）ないし（XVII）の誘導体の１種を用いて反応工程ａ２）を行う工程と、
ｃ３）反応生成物をＮＢＳ、ＡＩＢＮで処理して、Ｔ’−Ｂｒ（Ｔ’＝ＣＨ２）によって置換されたＡｒをもつブロモ誘導体とする工程と、
ｃ４）このように得られたブロモ誘導体を有機溶媒中、（ＣＨ）６Ｎ４と反応させ、次いでＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏと反応させて、−Ｃ＝Ｏによって置換されたＡｒを有するセトン誘導体を得る工程と、
ｃ５）該セトン誘導体をＫＣＮ、ＮＨ４ＣｌおよびＮＨ４ＯＨで処理し、−Ｃ（ＣＮ，ＮＨ２）によって置換されたＡｒを有するアミノシアノ誘導体を得る工程と、
ｃ６）Ｐ＝Ｏ部分をＰ＝Ｓに置換する工程であって、ヒドロキシメチル基（存在する場合）およびホスフィン（ホスホン）酸を保護した後に、ローソン試薬またはＰＳＣｌ３の使用により硫黄原子を導入することによる、工程と、
ｃ７）２工程での加水分解、すなわち、１）エステルのＬｉＯＨまたはＫＯＨによる加水分解；２）酸性条件下、６０〜８０℃で脱保護することを含む加水分解を行う工程と、
ｃ８）酸性条件下に処理して、−Ｃ（ＣＯＯＲ，ＮＨ２）によって置換されたＡｒを有する誘導体を得る工程と、
ｃ９）触媒で処理して、最終所望の生成物を得る工程と
を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
［式中、ＱはＤ−Ｃ（Ｒ，Ｒ’）−またはＤ−である］
のチオホスホネートの調製のために使用され：
ｄ１）式（IX）の誘導体をＮ，Ｏ−（ビス−トリエチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）および硫黄粉末と処理する工程と、
ｄ２）１Ｎ−ＨＣｌにより加水分解して、チオホスホネート（Ｉｘ）を得る工程と、
ｄ３）ＤＭＦ中、チオホスホネート（Ｉｘ）をＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）、アルコールＱＯＨと反応させるか、またはチオホスホネート（Ｉｘ）をＳＯＣｌ２と０℃で反応させ、次いで１当量のアルコールＱＯＨと反応させる工程と、
ｄ４）該反応生成物を酸性条件下、または触媒と、またはＣ７として処理し、最終所望生成物（Ｉｙ）を得る工程と
を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
のチオホスホネートの調製のために使用され、
ｅ１）Ｚ−保護セリンメチルエステル Ｏ−ホスフェート（Ｚ−Ｓｅｒ−（ＯＭｅ）−Ｏ−ホスフェート）または同族体（例えば、ホモセリン）を（Ｉｘ）としてのｄ３）（ジエステル化）で、次いで、ａ３）およびａ４）に記載したように処理する工程、または
ｅ２）次亜リン酸Ｈ３ＰＯ２をｂ１）のように処理し、次いで、その縮合生成物をｄ１）のように反応させ、Ｍ’＝Ｈの（Ｉｚ）を得ること；次いで、これをＺ−保護セリンメチルエステル（Ｚ−Ｓｅｒ−（ＯＭｅ）−ＯＨ）または同族体とｄ３）およびｄ４）のように反応させる工程
を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
Ｈ−ホスフィン酸誘導体の合成は、Ｐ−Ｃ結合の形成が通常、亜リン酸III部分の不飽和系または活性化ハロゲン化物への付加から生じる多くの研究の対象であった。これらの反応は塩基−触媒もしくは金属−触媒条件またはラジカル条件下で起こる。次亜リン酸（Ｈ３ＰＯ２）から出発する場合、この挑戦はモノ置換ホスフィン酸を得るために付加を１当量の置換基に制限することである。この問題は、ビス（トリメチルシリルオキシ）ホスホナイト（bis(trimethylsilyloxy)phosphonite：ＢＴＳＰ）を使用した場合に直面するが、この場合は、Ｈ−ホスフィン酸誘導体のみを生成させるために、大過剰のＢＴＳＰ（５当量）を必要とする。Froestl et al（文献１）によって、ＧＡＢＡホスフィン酸類似体の合成に、別のルートが示唆された。一時的な保護がモノアルキル化を保証したが、後に、収率が低く、再現性のないことが報告された。最適な反応はラジカル条件下で起こると思われる。Ｈ−アルキルホスホネートは、それらのラジカルが第二のアルキル化工程の間に形成され得ないために、問題なく得られる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
Ｌ−ＡＰ４（１）周辺の結合残基に注目すると、５つの塩基性残基が末端ホスホネート基とイオン相互作用していることが分かる。それらはローブ１からのＫ７４、Ｒ７８およびＫ４０５並びにローブ２からのＲ２５８およびＫ３１７である（図４）。それらの内、これら塩基性残基の３つ（Ｒ７８、Ｋ４０５およびＲ２５８）は同時に酸性残基（Ｅ４０３、Ｄ３１２、Ｅ２８７、Ｄ２８８）に結合し、その結果、それらの正の電荷が中和される。残りの２つの塩基性残基（Ｋ７４およびＫ３１７）は、ホスホネート基の負の電荷により中和される。唯一の負の末端電荷を保持するグルタメートにより、静電気的安定化が弱まり、結果としてアゴニスト効力が低下する。Ｌ−ＡＰ４（１）についての同様の結合パターンが、ｍＧｌｕ４受容体に結合したＬ−チオＡＰ４（４）で見出される。さらに、チオホスホネート基の総電荷がＬ−ＡＰ４（１）ホスホネート基によるよりもより２に接近するため（上記参照）、ＬＢＤの両方のローブに対する（４）の静電的相互作用は、（１）に比べて増強される。Ｌ−チオＡＰ４（４）に結合したＬＢＤの閉鎖コンフォメーションの安定化増加は、ｍＧｌｕ４受容体結合部位でのそのより高い効力を説明し得る。ｍＧｌｕ８受容体での（４）の同様に高い効力についても同様の解釈を示唆し得る；その理由は、結合パターンがｍＧｌｕ４およびｍＧｌｕ８結合部位で同じであるからである。興味深いのは、（１）と（４）のｍＧｌｕ６およびｍＧｌｕ７受容体でのＥＣ５０の増加（表１）が、その閉鎖コンフォメーションにおけるＬＢＤの非最適安定化と相関することである。事実、Ｋ７４はｍＧｌｕ６中でグルタミン（Ｑ５８）によって置換され、ｍＧｌｕ７中でアスパラギン（Ｎ７４）によって置換され（図１１）、その結果、ｍＧｌｕ４／８に結合する（１）／（４）と比較して、イオン性相互作用の１つが失われている。さらに、ｍＧｌｕ４受容体においてＲ２５８に類似する別の塩基性残基がｍＧｌｕ７受容体（Ｑ２５８）において失われており、（１）または（４）に結合したＬＢＤの活性コンフォメーションの安定性をさらにより低下させる。それにも拘らず、第III群ｍＧｌｕ受容体のすべてにおいて、（１）および（４）と強力に静電気的に相互作用するローブ２のリジン（ｍＧｌｕ４のＫ３１７、ｍＧｌｕ６のＫ３０６、ｍＧｌｕ７のＫ３１９、ｍＧｌｕ８ＲのＫ３１４）は保存される。この相互作用は、（４）とにおいてより強いため、（４）の効力が第III群受容体のすべてについて（１）よりも高い。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
（考察）
Ｌ−ＡＰ４の数々の標品が過去１０年間に公にされたが、その幾つかでは出発原料として天然のアミノ酸を使用している。本明細書に提示された合成は、ビニルグリシンと次亜リン酸との間のラジカル縮合の緩和な条件を利用する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
Ｌ−チオＡＰ４（４）は、水溶液中、２種の互変異性体、すなわちチオーロ（thiolo）体（Ｐ−ＳＨ）またはチオノ（thiono）体（Ｐ＝Ｓ）として存在し得る。研究により、ホスホノチオ酸においては、チオノ−チオーロ平衡が圧倒的にチオノ側にあることが示される。硫黄の水素結合は酸素よりも相当に弱いので、Ｌ−チオＡＰ４の効力の上昇は、かかる相互作用から生じるものではない可能性がある。ホスホリル基の酸素原子に置き換わる硫黄の特殊性（Ｐ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）は、それがホスホネートの第二酸性度に対し主たる作用を示すことである。（１）の末端基についてＳＰＡＲＣオンライン計算機を用いて計算されたｐＫａ値（ｐＫａ１、ｐＫａ３）は、２．８および７．４であるのに対し、（４）のｐＫａ値（ｐＫａ１、ｐＫａ３）は、２．１および３．４であった。対照的に、４，４’−ジフルオロ置換Ｌ−ＡＰ４におけるように、Ｌ−ＡＰ４の４位に電子吸引性置換基を導入すると、予測されるｐＫａが１．１５および５．８０と、両方の酸性度に影響する。第二の（チオ）ホスホン酸基の解離（ｐＫａ３）は、中性のｐＨにおいて、この部分の電荷にとって臨界である。実験値は３１Ｐ  ＮＭＲ滴定により測定され、（１）および（４）について、それぞれ６．８８および５．５６であった。このように、生理学的ｐＨにおいて、Ｌ−ＰＡ４（１）は部分的にのみイオン化されているのに対し、Ｌ−チオＡＰ４（４）のチオホスホネート基は略完全に脱プロトン化されて、ｍＧｌｕ４受容体結合部位でドッキングしたＬ−ＡＰ４の３Ｄモデルにて同定された結合部位の５つの塩基性残基とのより強力な静電気的相互作用を可能とする（図４）。これらの相互作用は結合ドメインの活性コンフォメーションを安定化し、それがその結果として受容体活性化の引き金を引く。ｍＧｌｕ７Ｒのローブ１残基（Ｘ線構造ＰＤＢコード：２ｅ４ｚ）のＣα原子と、Ｌ−ＡＰ４（１）とドッキングしたｍＧｌｕ４Ｒ（相同性モデル）のＣα原子との重ね合わせを図３に示す。Ｇｌｕ４Ｒからの残基４１〜１２４、１５０〜２０２、３３９〜３７１、およびｍＧｌｕ７からの残基４１〜１２４、１５０〜２０２、３４１〜３７３が、１．０５Åのｒｍｓｄで重ね合わされた。図３に示された塩基性残基の殆どは第III群ｍＧｌｕ受容体の４つのサブタイプの中に保存され、その結果として、Ｌ−チオＡＰ４（４）はサブタイプ選択性ではない。しかし、Ｌ−ＡＰ４（１）と同様に、Ｌ−チオＡＰ４（４）は第III群選択的アゴニストであり、他の群のｍＧｌｕ受容体に対してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示さない。Ｌ−ＡＰ４（１）およびＬ−チオＡＰ４（４）の効力と選択性は、Ｘ線構造と相同性モデルを分析する分子レベルで説明され得る。一方、それらの末端（チオ）ホスホネート基の負電荷は、ｍＧｌｕ４／８受容体の高塩基性末端ポケットとの強力なイオン性相互作用を可能とするが、それらは結合したグルタメートと比較して、第I／II群受容体結合部位でのさらなる相互作用を可能にしない。対照的に、これら後者の受容体の場合、余分の電荷が、リガンド周辺の極性結合ネットワークを不安定にし得るので、それが有害となり、ＬＢＤの活性コンフォメーションに到達するのを妨げ得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２７】
1H NMR(D2O): δ 1.70(m, 2H), 2.12(m, 2H), 3.99(t, J=6.02Hz, 1H)。31P NMR(D2O): δ 35.42。13C NMR(D2O): δ 23.61(d, J=135.42Hz), 24.68, 53.91(d, J=13.37Hz), 172.49。MS(ESI-)m/z 182.2(M-1)。[a]D20 +13.2(c 1.0, H2O,文献55 +10.3, c 2.0, H20)。
（２Ｓ）−２−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−４−チオホスホノブタン酸メチル（７）：
（５）（２９６ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）および硫黄粉末（９６ｍｇ、３ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２ｍＬ）中の混合物に、アルゴン雰囲気下、０℃で、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）（８１４ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を滴下した。この混合物を室温に加温し、１時間にわたり攪拌して、次いで０℃に冷却し、１５ｍＬの１Ｎ−ＨＣｌを加え、酢酸エチルで抽出した（２×１００ｍＬ）。合わせた有機溶液を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧濃縮した（３０２ｍｇ、９３％）。