【手続補正書】
【提出日】平成23年6月9日(2011.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i) 対象者又は動物からの試料を、考慮される対象者又は動物の種のIg分子の特定のクラスに対して指向されたIg結合タンパク質で感作された固体担体と接触させ、免疫複合体を形成し、
(ii) (i)で形成された免疫複合体を、アルボウイルスED3ドメインとアルカリホスファターゼ(PhoA)とを少なくとも含むハイブリッドタンパク質からなる検知分子とインキュベートする
ことを含み、
該免疫複合体の検出が、前記試料中のアルボウイルスの存在の指標である、
ことを特徴とする、対象者又は動物宿主におけるアルボウイルスの検出又はスクリーニングのための方法。
【請求項２】
前記Ig結合タンパク質が、抗IgM、抗IgG及び抗IgA抗体からなる群より選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記アルボウイルスが、フラビウイルスであることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記アルカリホスファターゼが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、酵母及び細菌のアルカリホスファターゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記アルカリホスファターゼが、大腸菌のアルカリホスファターゼであり、配列番号25を含むことを特徴とする請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイブリッドタンパク質が、ポリペプチドタグをさらに含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドタグが、HIS (ヘキサヒスチジン)、c-MYC、HA、VSV-G、HSV、V5及びFLAGからなる群より選択されることを特徴とする請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記ハイブリッドタンパク質が、ヘキサヒスチジン又はフラビウイルスED3ドメインと、大腸菌のアルカリホスファターゼとを含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記大腸菌のアルカリホスファターゼが、改変されていることを特徴とする請求項5又は8に記載の方法。
【請求項１０】
前記大腸菌のアルカリホスファターゼが、その活性部位に2つの変異D153G及びD330Nを含み、配列番号24を含む請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記ED3ドメインのポリペプチドが、黄熱病ウイルスED3ドメインポリペプチド、西ナイルウイルスED3ドメインポリペプチド、デングウイルスED3ドメインポリペプチド、セントルイス脳炎ウイルスED3ドメインポリペプチド、マリーバレー脳炎ウイルスED3ドメインポリペプチド、及び日本脳炎ウイルスED3ドメインポリペプチドからなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドタグと、アルボウイルスED3ドメインと、アルカリホスファターゼとを含むことを特徴とするハイブリッドタンパク質。
【請求項１３】
ヘキサヒスチジンと、
黄熱病ウイルスED3ドメインポリペプチド、西ナイルウイルスED3ドメインポリペプチド、デングウイルスED3ドメインポリペプチド、セントルイス脳炎ウイルスED3ドメインポリペプチド、マリーバレー脳炎ウイルスED3ドメインポリペプチド、及び日本脳炎ウイルスED3ドメインポリペプチドを含む群より選択されるフラビウイルスED3ドメインと、
大腸菌のアルカリホスファターゼと
を含むことを特徴とする請求項12に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１４】
多量体の形態にあることを特徴とする請求項12又は13に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１５】
前記多量体が、二量体の形態にあることを特徴とする請求項１４に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１６】
配列番号2の配列からなる(H6-ED3.DEN1-PhoA)2、配列番号4の配列からなる(H6-ED3.DEN2-PhoA)2、配列番号6の配列からなる(H6-ED3.DEN3-PhoA)2、配列番号8の配列からなる(H6-ED3.DEN4-PhoA)2、配列番号10の配列からなる(H6-ED3.WN-PhoA)2、及び配列番号12の配列からなる(H6-ED3.YF-PhoA)2からなる群より選択されることを特徴とする請求項12〜15のいずれか1項に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１７】
請求項12〜16のいずれか1項に記載のハイブリッドタンパク質をコードする核酸。
【請求項１８】
H6-ED3.DEN1-PhoAハイブリッドタンパク質をコードする配列番号1、H6-ED3.DEN2-PhoAハイブリッドタンパク質をコードする配列番号3、H6-ED3.DEN3-PhoAハイブリッドタンパク質をコードする配列番号5、H6-ED3.DEN4-PhoAハイブリッドタンパク質をコードする配列番号7、H6-ED3.WN-PhoAハイブリッドタンパク質をコードする配列番号9、及びH6-ED3.YF-PhoAハイブリッドタンパク質をコードする配列番号11からなる群より選択されることを特徴とする請求項17に記載の核酸。
【請求項１９】
(a) 請求項12〜16のいずれか1項に記載のハイブリッドタンパク質をコードする配列を含む発現ベクターを、アルボウイルスED3ポリペプチドをコードする配列をベクターpEBL1 (配列番号13)に挿入することにより得て、
(b) XL1-blue大腸菌株を、(a)で得られた発現ベクターで形質転換し、
(c) 改変された前記株を、適切な培地中で培養し、
(d) タグ-ED3-PhoAハイブリッドタンパク質を、ペリプラスム抽出物から精製する
ことを含むことを特徴とする、請求項12〜16のいずれか1項に記載のハイブリッドタンパク質を作製する方法。
【請求項２０】
前記アルボウイルスED3ポリペプチドが、フラビウイルスED3ポリペプチドである請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
工程(a)の発現ベクターが、請求項12〜16のいずれか1項で定義されるハイブリッドタンパク質の発現ベクターからなる群より選択されることを特徴とする請求項19又は20に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現ベクターが、ハイブリッドタンパク質H6-ED3.DEN1-PhoAをコードする配列を含む(pEBL11、CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes、75015 パリ、リュ  デュ  ドクトール  ル  28)に、2007年4月23日に、アクセッション番号I-3748で寄託された)ことを特徴とする請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現ベクターが、ハイブリッドタンパク質H6-ED3.WN-PhoAをコードする配列を含む(pEBL15、CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes、75015 パリ、リュ  デュ  ドクトール  ル  28)に、2007年4月23日に、アクセッション番号I-3749で寄託された)ことを特徴とする請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes、75015 パリ、リュ  デュ  ドクトール  ル  28)に、2007年4月23日に、アクセッション番号I-3747で寄託された発現ベクターpEBL1。
【請求項２５】
CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes、75015 パリ、リュ  デュ  ドクトール  ル  28)に、2007年4月23日に、アクセッション番号I-3748で寄託された発現ベクターpEBL11。
【請求項２６】
CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes、75015 パリ、リュ  デュ  ドクトール  ル  28)に、2007年4月23日に、アクセッション番号I-3749で寄託された発現ベクターpEBL15。
【請求項２７】
(i) 対象者又は動物からの試料を、考慮される対象者又は動物の種のIg分子の特定のクラスに対して指向されたIg結合タンパク質で感作された固体担体と接触させ、免疫複合体を形成し、
(ii) (i)で形成された免疫複合体を、アルボウイルスED3ドメインとアルカリホスファターゼとを少なくとも含むハイブリッドタンパク質からなる検知分子とインキュベートし、
(iii) 前記アルボウイルス抗体の存在を検出する
ことを含む、対象者又は動物におけるアルボウイルス抗体をスクリーニングする方法。
【請求項２８】
前記アルボウイルスが、フラビウイルスである請求項２７に記載のアルボウイルス抗体をスクリーニングする方法。
【請求項２９】
- 考慮される動物種のIg分子の特定のクラスに対して指向されたIg結合タンパク質で感作された固体担体と、
- 少なくとも、請求項12〜16のいずれか1項で定義されるアルボウイルスED3ドメインとアルカリホスファターゼとを少なくとも含むハイブリッドタンパク質と、
- 感染した個体からの参照血清を含む少なくとも1つの陽性対照と、
- 感染していない個体からの参照血清を含む少なくとも1つの陰性対照と
を含む、対象者におけるアルボウイルス抗体について検出及び／又はスクリーニングするためのキット。
【請求項３０】
前記アルボウイルスが、フラビウイルスである請求項２９に記載のアルボウイルス抗体について検出及び／又はスクリーニングするためのキット。
【請求項３１】
前記Ig結合タンパク質が、抗IgM、抗IgG及び抗IgAからなる群より選択され、前記ハイブリッドタンパク質が、ヘキサヒスチジンと、適切なフラビウイルスのウイルスED3ドメインと、大腸菌のアルカリホスファターゼとを含むことを特徴とする請求項29又は30に記載のキット。
【請求項３２】
前記アルカリホスファターゼが、その活性部位に2つの変異D153G及びD330Nを含む改変アルカリホスファターゼであり、配列番号24を含むことを特徴とする請求項31に記載のキット。
【請求項３３】
病原体の適切な抗原とアルカリホスファターゼとを含むハイブリッドタンパク質の、前記病原体による感染のインビトロ検出又は前記病原体の疫学の研究のための使用。
【請求項３４】
病原体の適切な抗原とアルカリホスファターゼとを含むハイブリッドタンパク質の、前記病原体又はその免疫原に対するワクチン接種の有効性をインビトロで確認するための使用。
【請求項３５】
タンパク質又はそのフラグメントとアルカリホスファターゼとを含むハイブリッドタンパク質の、PhoAと融合した前記タンパク質又はそのフラグメントと分子、タンパク質又は細胞との相互作用を研究するための使用。
【請求項３６】
(i) 対象者又は動物からの試料を、考慮される動物の種のIg分子の特定のクラスに対して指向されたIg結合タンパク質で感作された固体担体と接触させ、免疫複合体を形成し、
(ii) (i)で形成された免疫複合体を、病原体の適切な抗原とアルカリホスファターゼとを含むハイブリッドタンパク質からなる検知分子とインキュベートすることを含み、
該免疫複合体の存在が感染の指標である
ことを特徴とする、病原体による感染を検出するか、病原体又はその免疫原によるワクチン接種の有効性を確認するか、又は病原体の疫学を研究するための方法。
【請求項３７】
(i) 分子、タンパク質又は細胞を、PhoAと融合したタンパク質又はそのフラグメントを含むハイブリッドタンパク質と接触させ、
(ii) PhoAと融合したタンパク質又はそのフラグメントと前記分子、タンパク質又は細胞との間で結局は形成された複合体を検出する
ことを含むことを特徴とする、PhoAと融合したタンパク質又はそのフラグメントと、分子、タンパク質又は細胞との相互作用を研究する方法。
【請求項３８】
(i)固体担体と結局は結合させた抗アルボウイルス抗体又はアルボウイルスの表面分子の受容体を、PhoAと融合したアルボウイルスのエピトープを含むハイブリッドタンパク質と接触させ、
(ii)前記抗アルボウイルス抗体又は前記受容体と前記エピトープとの間で形成された複合体を、適切なシグナルの形成を測定することにより検出し、
(iii)試験する化合物を加え、
(iv)前記抗アルボウイルス抗体又は前記受容体と前記エピトープとの間で形成された複合体の量が、工程(ii)で検出された複合体の量に関して低減したかを、適切なシグナルを測定し、(ii)で得られたシグナルと得られたシグナルとを比較することにより検出することを含む、抗アルボウイルス化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３９】
工程（ii）及び工程（iv）において測定されるシグナルが、パラニトロフェノールの形成である請求項３８に記載の方法。