【手続補正書】
【提出日】平成23年10月3日(2011.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の膵臓の状態を評価し、該患者に由来する膵臓細胞を含む試料におけるhsa-miR-196a発現レベルを決定する段階を含む、膵炎と膵臓癌とを区別する方法であって、正常試料または膵炎の試料と比べたhsa-miR-196a発現の上昇が、膵臓癌の指標である、前記方法。
【請求項２】
hsa-miR-217発現レベルを決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法であって、正常試料または膵炎の試料と比べたhsa-miR-217発現の低下が、膵臓癌の指標である、前記方法。
【請求項３】
以下からなる群より選択される一つまたは複数のmiRNAの発現レベルを決定する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法：
hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d, hsa-let-7f, hsa-let-7g, hsa-let-7i, hsa-miR-100, hsa-miR-101, hsa-miR-103, hsa-miR-106b, hsa-miR-107, hsa-iR-10a, hsa-miR-125a, hsa-miR-125b, hsa-miR-130a, hsa-miR-130b, hsa-miR-134, hsa-miR-140, hsa-miR-141, hsa-miR-143, hsa-miR-145, hsa-miR-146a, hsa-miR-148a, hsa-miR-148b, hsa-miR-150, hsa-miR-154, hsa-miR-155, hsa-miR-18a, hsa-miR-181b, hsa-miR-182, hsa-miR-186, hsa-miR-196a, hsa-miR-196b, hsa-miR-199a, hsa-miR-199a-AS, hsa-miR-19a, hsa-miR-19b, hsa-miR-200a, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-203, hsa-miR-21, hsa-miR-210, hsa-miR-214, hsa-miR-216, hsa-miR-217, hsa-miR-221, hsa-miR-222, hsa-miR-223, hsa-miR-224, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-27a, hsa-miR-27b, hsa-miR-29c, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b, hsa-miR-30c, hsa-miR-30d, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31, hsa-miR-331, hsa-miR-335, hsa-miR-365, hsa-miR-368, hsa-miR-374, hsa-miR-375, hsa-miR-376a, hsa-miR-377, hsa-miR-379, hsa-miR-429, hsa-miR-93, hsa-miR-95, hsa-miR-96, hsa-miR-99b, hsa-miR-452, hsa-miR-494, hsa-miR-497, miR-205, またはambi-miR-7105。
【請求項４】
試料が、組織、血液、血清、血漿、または膵液の試料である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
試料が、新鮮であるか、凍結されているか、固定されているか、または包埋されている、請求項4記載の方法。
【請求項６】
膵臓癌が膵管腺癌（PDAC）である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
hsa-miR-196aの発現が、増幅またはハイブリダイゼーションを伴うアッセイ法によって判定される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
増幅を伴うアッセイ法が定量的増幅アッセイ法である、およびハイブリダイゼーションを伴うアッセイ法が、アレイハイブリダイゼーションアッセイ法または溶液ハイブリダイゼーションアッセイ法である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
miRNAを標識し、該標識したmiRNAを1種または複数種のmiRNAプローブにハイブリダイズさせる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
miRNAプローブが支持体に結合されている、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
支持体が、ガラス、プラスチック、金属、またはラテックスである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
支持体が平面状である、またはビーズである、請求項10記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
本発明の他の目的、特性、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内のさまざまな変更および修飾が、この詳細な説明から当業者に明らかになることから、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の態様を意味する一方で、説明目的のみで与えられると理解されるべきである。
［図面の説明］
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、かつ本発明のある局面をさらに示すために含まれる。これらの1つもしくは複数の図面を、本明細書に記載する特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することで、本発明はよりよく理解されるであろう。
図１：膵臓組織に由来する全RNAの全体像。24の個別の膵臓組織試料のそれぞれから単離された約1 μgの全RNAを、臭化エチジウムで染色した1％変性ホルムアルデヒドアガロースゲルで解析した。
図２：正常膵臓組織で発現されたmiRNomeの解析。38の試料に由来する生のアレイデータの大規模な標準化の後に、5つの正常膵臓組織（N）におけるmiRNAの平均的な発現を、33の組織標準セット（Ref）におけるmiRNAの平均的な発現と比較した。
図３：正常組織とPDAC組織間の発現されたmiRNomeの比較。生のアレイデータを標準化した後に、5つの正常膵臓組織（N）におけるmiRNAの平均的な発現を、8つのPDAC試料（Ca）におけるmiRNAの平均的な発現と比較した。
図４：4Aおよび4Bは、正常試料（N）、慢性膵炎試料（Ch）、およびPDAC試料（Ca）において差次的に発現されるmiRNAを示す。（図4A）一群の差次的に発現されるmiRNA間の関係を示すベン図。円は、図に示す直接的なペアワイズ比較において差次的に発現されるmiRNAの総数を含む。交差領域は、各比較で共通する差次的に発現されるmiRNAの数に対応する。（図4B）表6に記載の94種類の差次的に発現されるmiRNAを対象とした主成分解析。
図５：正常組織と疾患膵臓組織で差次的に発現される上位20種類のmiRNA。miRNA候補は、3つの主要組織タイプのうち少なくとも2つの間の、|Δh|>1.6、およびp値<0.0001のものが選択された。このグラフは、正常（N）、慢性膵炎（Ch）、PDAC（Ca）の3つの試料タイプにおける示された20種類のmiRNAに対する標準化発現値の平均および標準偏差を示す。
図６：正常（N）試料、慢性膵炎（Ch）試料、PDAC（Ca）試料、および細胞株（CL）試料で差次的に発現されるmiRNAの主成分解析。
図７：PDAC試料および細胞株試料で過剰発現されたmiRNA。5つの正常（N）試料、6つの慢性膵炎（Ch）試料、8つのPDAC（Ca）試料、および6つの細胞株（CL）試料における、個々の標準化されたmiRNAの発現レベルと、および関連するp値。
図８：アレイデータとqRT-PCRデータの比較。プロファイルが既に得られている19の組織試料に加えて、2つの正常（N）試料、2つのPDAC（Ca）試料、および1つの慢性膵炎（Ch）試料に由来する25 ngの全RNAインプットを使用して、リアルタイムRT-PCRを実施した。記載のmiRNAに特異的なプライマーセットによって得られたmiRNAの発現データを、各試料の5S rRNAの発現レベルに対して標準化した（miRNAのCt−5SのCt）。グラフは、アレイによって決定した（19試料）、またはqRT-PCR法で決定した（24試料）、個々の標準化されたmiRNAの発現レベルをp値とともに示す。
図９：miR-196aおよびmiR-217の発現は、正常組織と疾患膵臓組織に分類される。（図9A）1つの正常試料（N5）、1つのPDAC試料（Ca3）、または1つの慢性膵炎試料（Ch1）に由来する、記載の全RNAインプット量を使用して、miR-196aおよびmiR-217に特異的なプライマーセットによってリアルタイムRT-PCRを実施した。miR-217の発現に対するmiR-196aの発現の比の計算には、生Ct値を直接使用した（すなわち、対数空間におけるmiR-196aのCt−miR-217のCt）。（図9B）記載の24の個々の組織試料を対象に、および25 ngの全RNAインプットを使用した、図9Aと同様の試験。
図１０：miR-196aおよびmiR-217の発現を、正常組織と疾患膵臓組織に分類する。20のサブセットの凍結膵臓組織試料（6つのN、6つのCh、および8つのCa、実施例1）を対象に、TaqMan（登録商標） MicroRNA Assays（Applied Biosystems；Foster City, CA, USA）を実施した。qRT-PCR反応には、10 ngのRNAインプットを使用した。RT反応はランダムプライマーを使用して実施し、PCR反応では遺伝子特異的なプライミングを使用した。グラフは、個々の試料中のmiR-196aとmiR-217の間の生Ctの差をp値（ANOVA）とともに示す。
図１１：（図11A）正常膵臓、慢性膵炎、および膵臓腺癌の間で差次的に発現されると文献に報告された4つの遺伝子のqRT-PCRの発現データ。図10と同じ試料セット（20の凍結膵臓組織試料；6つのN、6つのCh、および8つのCa）を、TaqMan（登録商標） Gene Expression Assays（Applied Biosystems）を使用して調べた。qRT-PCR反応を、RT反応についてはランダムプライミングを使用して、およびPCR反応については遺伝子特異的なプライミングを使用して、5 ngの全RNAインプットを用いて実施した。各試料に関して、mRNAの発現データを、GAPDHの発現に対して標準化した（mRNA-XのCt−GAPDHのCt）。グラフは、qRT-PCRによって決定した、個々の標準化されたmRNA発現レベルをp値（ANOVA）とともに示す。（図11B）miR-196a、miR-217、およびmRNA遺伝子の発現指標（expression signature）の組み合わせは、正常膵臓、慢性膵炎、および膵臓癌の分離を改善する。これらのグラフは、miR-24（miRNA）またはGAPDH（mRNA）に対して標準化したマーカーに関する個々のCt値の組み合わせによって達成された実験群間の分離をp値（ANOVA）とともに示す。
図１２：凍結膵臓組織試料（6つのN、6つのCh、および8つのCa）、ならびに膵臓穿刺吸引物（FNA, n=13）の間の6種類のmiRNAおよび2種類のmRNA遺伝子の発現データの差の比較。10のFNA試料は、病理学的にPDACと報告された（Ca FNA、◆）。残る3つの試料（FNA）のうち、2つには非確定的な病理学的な報告（FNA-8-●およびFNA-13-★）がなされ、1つについては内分泌膵臓と一致した（FNA-12、▲）。リアルタイムRT-PCR反応を実施し、図10および図11と同様に標準化した。
図１３：凍結した正常膵臓、慢性膵炎、膵臓癌、膵臓癌のFNA（Ca FNA、◆）、および他のFNA（FNA、FNA-8-●、FNA-12-▲およびFNA-13-★）の間の、miR-196a、miR-217、およびmRNAの遺伝子発現指標の組み合わせの性能比較。グラフは、miR-24（miRNA）またはGAPDH（mRNA）に対して標準化された個々のmiRNA/mRNA発現指標の組み合わせを使用して達成された実験群間の分離を示す。
[請求項101]
患者に由来する試料における1種または複数種のmiRNAの発現プロファイルを測定する段階を含む、患者の状態を診断する方法であって、患者に由来する試料における発現プロファイルと正常試料の発現プロファイルの差が病理学的状態の指標であり、miRNAが
2010504102.tif 000001
である、方法。
[請求項102]
miRNAが
2010504102.tif 000002
の1つまたは複数である、請求項101記載の方法。
[請求項103]
miRNAが、miR-196a、miR-217、またはmiR-196aとmiR-217の両方である、請求項102記載の方法。
[請求項104]
miRNAが
2010504102.tif 000003
であり、1種または複数種のmiRNAの発現の差が膵炎の指標である、請求項101記載の方法。
[請求項105]
患者試料中の1種または複数種のmiRNAの発現の上昇が膵炎の指標であり、miRNAが
2010504102.tif 000004
である、請求項101記載の方法。
[請求項106]
患者試料中の1種または複数種のmiRNAの発現の低下が膵炎の指標であり、miRNAが
2010504102.tif 000005
である、請求項101記載の方法。
[請求項107]
1種または複数種のmiRNAの発現の差が膵臓癌の指標であり、miRNAが
2010504102.tif 000006
である、請求項101記載の方法。
[請求項108]
1種または複数種のmiRNAの発現の上昇が膵臓癌の指標であり、miRNAが
2010504102.tif 000007
である、請求項101記載の方法。
[請求項109]
1種または複数種のmiRNAの発現の低下が膵臓癌の指標であり、miRNAが
2010504102.tif 000008
である、請求項101記載の方法。
[請求項110]
膵炎が、
2010504102.tif 000009
の1つまたは複数の発現の差によって、膵臓癌と区別される、請求項101記載の方法。
[請求項111]
発現レベルが膵臓の疾患状態と相関する、1種または複数種のmRNAの発現プロファイルを測定する段階をさらに含む、請求項101記載の方法。
[請求項112]
測定されるmRNAが、癌胎児性抗原関連細胞接着分子6のmRNA、サバイビンのmRNA、ムチン4のmRNA、およびウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体のmRNAからなる群より選択される、請求項111記載の方法。
[請求項113]
1種または複数種のmRNAの発現プロファイルを測定する段階が、定量的逆転写PCR(qRT-PCR)による、請求項111記載の方法。
[請求項114]
試料が、組織、血液、血清、血漿、または膵液の試料である、請求項101記載の方法。
[請求項115]
試料が、新鮮であるか、凍結されているか、固定されているか、または包埋されている、請求項114記載の方法。
[請求項116]
患者に由来する試料および正常試料が膵臓試料である、請求項101記載の方法。
[請求項117]
病理学的状態が非癌性状態である、請求項101記載の方法。
[請求項118]
非癌性状態が慢性膵炎である、請求項117記載の方法。
[請求項119]
病理学的状態が癌性状態である、請求項101記載の方法。
[請求項120]
病理学的状態が膵臓癌である、請求項119記載の方法。
[請求項121]
膵臓癌が膵管腺癌(PDAC)である、請求項120記載の方法。
[請求項122]
患者から試料を得る段階をさらに含む、請求項101記載の方法。
[請求項123]
試料由来のmiRNAを標識する段階をさらに含む、請求項122記載の方法。
[請求項124]
標識したmiRNAを1種または複数種のmiRNAプローブにハイブリダイズさせる段階をさらに含む、請求項123記載の方法。
[請求項125]
miRNAプローブが支持体に結合されている、請求項124記載の方法。
[請求項126]
支持体が、ガラス、プラスチック、金属、またはラテックスである、請求項125記載の方法。
[請求項127]
支持体が平面状である、請求項126記載の方法。
[請求項128]
支持体がビーズである、請求項126記載の方法。
[請求項129]
miRNAの発現が、増幅アッセイ法またはハイブリダイゼーションアッセイ法によって判定される、請求項101記載の方法。
[請求項130]
増幅アッセイ法が定量的増幅アッセイ法である、請求項129記載の方法。
[請求項131]
定量的増幅アッセイ法が定量的RT-PCRである、請求項130記載の方法。
[請求項132]
ハイブリダイゼーションアッセイ法が、アレイハイブリダイゼーションアッセイ法または溶液ハイブリダイゼーションアッセイ法である、請求項129記載の方法。
[請求項133]
診断する段階が、病理学的状態についてスクリーニングする段階、病理学的状態の予後を評価する段階、病理学的状態の病期を決定する段階、または処置に対する病理学的状態の反応を評価する段階である、請求項101記載の方法。
[請求項134]
miRNAの配列を含む1種または複数種の核酸を膵臓細胞に接触させることによって、膵臓状態を処置する方法であって、内因性のmiRNAの発現が膵臓細胞で調節され、miRNAの配列が、
2010504102.tif 000010
の1つまたは複数と少なくとも85%同一である、方法。
[請求項135]
miRNA配列が、修飾された核酸配列を含む、請求項134記載の方法。
[請求項136]
膵臓細胞が膵臓癌細胞である、請求項134記載の方法。
[請求項137]
第2の処置を実施する段階をさらに含む、請求項134記載の方法。
[請求項138]
第2の処置が、化学療法、放射線療法、手術、または免疫療法である、請求項137記載の方法。
[請求項139]
miRNAが核酸ベクターから転写される、請求項134記載の方法。
[請求項140]
ベクターがプラスミドベクターである、請求項139記載の方法。
[請求項141]
ベクターがウイルスベクターである、請求項139記載の方法。
[請求項142]
2010504102.tif 000011
に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有する核酸セグメントを有する、有効量の1種または複数種の合成miRNA分子またはmiRNA阻害因子を対象に投与する段階を含む、対象の膵管腺癌を処置する方法。
[請求項143]
対象に、
(a)
2010504102.tif 000012
に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有する核酸セグメントを有する1種もしくは複数種のmiRNA阻害因子;および/または
(b)
2010504102.tif 000013
に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有する核酸セグメントを有する1種もしくは複数種のmiRNA
が投与される、請求項142記載の方法。
[請求項144]
2010504102.tif 000014
に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有する核酸セグメントを含む、有効量の1種または複数種の合成miRNA分子またはmiRNA阻害因子を対象に投与する段階を含む、対象の慢性膵炎を処置する方法。
[請求項145]
対象に、
(a)
2010504102.tif 000015
に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有する核酸セグメントを有する1種もしくは複数種のmiRNA阻害因子;および/または
(b)
2010504102.tif 000016
に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有する核酸セグメントを有する1種もしくは複数種のmiRNA
が投与される、請求項144記載の方法。
[請求項146]
適切な容器手段中に、
2010504102.tif 000017
の1つまたは複数を含む、2種類または2種類以上のmiRNAハイブリダイゼーション用試薬または増幅用試薬を含む、試料についてmiRNAプロファイルを評価することによる病理学的試料の解析用のキット。
[請求項147]
試料中のmiRNAを標識するための試薬をさらに含む、請求項146記載のキット。
[請求項148]
標識用試薬が、少なくとも1種類のアミン修飾されたヌクレオチド、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびポリ(A)ポリメラーゼ緩衝液を含む、請求項147記載のキット。
[請求項149]
標識用試薬がアミン反応性色素を含む、請求項148記載のキット。
[請求項150]
miRNAハイブリダイゼーション用試薬がハイブリダイゼーション用プローブを含む、請求項146記載のキット。
[請求項151]
miRNA増幅用試薬が増幅用プライマーを含む、請求項146記載のキット。