【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年7月26日(2011.7.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】    感染性疾患を治療する方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】  感染性病原体を含む生物学的液体または生物学的産物と、生物学的液体または生物学的産物の血液学的および／または生化学的構成要素が実質的に安定である溶媒系であって、感染性病原体の脂質が可溶である少なくとも１つの溶媒を含む溶媒系とを、感染性病原体の脂質を溶解するために十分な時間接触させ、それにより感染性病原体の活性を低減するステップと、
生物学的液体または生物学的産物と溶媒系とを分離し、それにより、溶解した脂質が、生物学的液体または生物学的産物から分離され、感染性病原体の脂質が可溶である少なくとも１つの溶媒中に残るステップ
とを包含し、
少なくとも１つの溶媒が、Ｃ２−６エーテルもしくはＣ４−８アルコール、またはこれらの組合わせである、
脂質外被または脂質膜を有する感染性病原体の活性を低減させる方法。
【請求項２】  前記生物学的液体または生物学的産物が、血液、血漿、血漿分画、血液細胞派生物、ヘモグロビン、アルファインターフェロン、成長因子、Ｔ−細胞成長因子、血小板由来成長因子、プラスミノーゲンアクチベーター、血漿沈降物、血漿寒冷沈降物、血漿エタノール沈降物、血漿ポリエチレングリコール沈降物、血漿上清、血漿寒冷上清、血漿エタノール上清、血漿ポリレチレングリコール上清、哺乳類精液、哺乳類血清、または牛胎児血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記生物学的液体または生物学的産物が、哺乳類血漿、鳥類血漿、またはヒト血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  前記生物学的液体または生物学的産物が水溶性分画を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】  感染性病原体の脂質が可溶である溶媒が、生物学的液体または生物学的産物と実質的に不混和性である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】  溶媒系と生物学的液体または生物学的産物との分離が、接触させた後に溶媒系と生物学的液体または生物学的産物とを落ち着かせて、溶解した脂質を含む少なくとも１つの溶媒の層を形成すること、および、溶解した脂質を含む少なくとも１つの溶媒の層を除去することを可能にする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】  感染性病原体が脂質外被を有するウイルスである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】  Ｃ２−６エーテルが、プロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、もしくはジエチルエーテル、またはこれらの混合物である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】  溶媒系が、０〜６０％のＣ４−８アルコール、および４０〜１００％のＣ２−６エーテルを包含する、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】  感染性病原体の脂質が可溶である少なくとも１つの溶媒が、０〜６０％のＣ４−８アルコール、および４０〜１００％のＣ２−６エーテルを包含する、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】  溶媒系が、０〜５０％のＣ４−８アルコール、および５０〜１００％のＣ２−６エーテルを包含する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】  感染性病原体の脂質が可溶である少なくとも１つの溶媒が、０〜５０％のＣ４−８アルコール、および５０〜１００％のＣ２−６エーテルを包含する、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】  分離が遠心分離をさらに含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】  分離するステップの後に、生物学的液体または生物学的産物を第二のエーテルで洗浄して、残留溶媒の除去および／または水層の脱乳化を行うステップを含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】  感染性病原体による感染症に罹患した患者を治療するための組成物の調製のための、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法によって処理された生物学的液体または生物学的産物の使用。
【請求項１６】  溶媒系が、感染性病原体の脂質が可溶である少なくとも１つの溶媒を含み、溶解した脂質が、生物学的液体または生物学的産物から少なくとも１つの溶媒を分離する際に前記少なくとも１つの溶媒中に残り、生物学的液体または生物学的産物の血液学的および生化学的構成要素が、前記少なくとも１つの溶媒中で実質的に安定である、
生物学的液体または生物学的産物中の脂質外被または脂質膜を有する感染性病原体の活性を低減させるための溶媒系の使用。
【請求項１７】  凝固因子欠乏症に罹患した患者の治療、またはワルファリン効果の逆転、または血小板減少性紫斑病の治療に用いる組成物の調製のための、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法によって処理された生物学的液体または生物学的産物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、微生物またはウイルスのような感染性病原体によって引起された感染性疾患に罹っている患者を治療する方法に関する。本発明は、血漿のような血液または血液産物を含む生物学的液体に存在しうる脂質外被を有する感染性病原体の活性を減少させる方法に関する。一般に、本発明は、ＨＩＶ、Ｂ型またはＣ型肝炎に罹っている患者を治療する方法に向けられる。
【０００２】
本発明は、ＨＩＶウイルスに特に参照して記述されが、しかし、ここに記述される方法が、脂質外被または膜を有する他の感染性病原体の治療および不活性化のためにも使用できると考えられ、そしてそれにより制限されないことが意図される。
【０００３】
（発明の背景）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）として知られる疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と称されるウイルスによって引起されると思われる。
【０００４】
ＨＩＶは、ＲＮＡウイルスである。血中に循環する遊離ＨＩＶウイルスまたはバイロンは、保護的脂質外被によって囲まれる各タンパク質コアを包含する。簡潔には、ＨＩＶウイルスの生命サイクルは、典型的にヒトＴ４リンパ球またはマクロファージである標的細胞の膜に結合するＨＩＶウイルスで始まる。
【０００５】
脂質外被は、標的細胞表面でＣＤ４レセプターを認識し、そしてそれに結合するウイルス性外被糖タンパクを有する。結合に続いて、ウイルスは、その脂質外被を落とし、そして宿主細胞に潜入する。逆転写は、ウイルス性ＲＮＡゲノムの線形ＤＮＡコピーを生じる。その後、ウイルス性ＤＮＡは、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組込まれる。組込まれたＤＮＡの発現は、調節および構造的ウイルスタンパク質をコードするウイルス性ｍＲＮＡを生じる。これらのウイルスタンパク質は、宿主細胞表面で会合する。それらが、宿主細胞膜を破壊するとき、ウイルス粒子は、未感染細胞に対する認識および結合のために必要な外被糖タンパクを含むその宿主から脂質外被を獲得する。
【０００６】
血液中で循環するＨＩＶの量は、ウイルス負荷として知られている。ウイルス負荷は、患者がどのようにその疾患に反応し、そしてＡＩＤＳに対する進行の危険を評価するかについての指標を提供する。ウイルス負荷が、その疾患の段階との直接的関係を示し、そしてウイルス負荷が減少すると、疾患進行の速度を減じることを示した。最近の治療計画は、細胞媒介ウイルスの生殖サイクルを標的にすることによってウイルス負荷を減少させることをねらう。これらの療法は、血液中の成熟ウイルス循環に対して有効でない。
【０００７】
ＨＩＶの治療で使用するための抗ウイルス薬剤は、ウイルス複製を防止または阻害し、そして一般に、Ｔ−４リンパ球またはマクロファージに対するウイルスの最初の付着、ウイルス性ＤＮＡへのウイルスＲＮＡの転写、および生殖中の新たなウイルスの会合を標的にするように設計されてきた。
【０００８】
現存するＨＩＶ治療での主要な困難さは、ウイルスの突然変異率が高いことである。個々のものが、多数の様々のＨＩＶ株を担持する可能性があり、そのいくつかは、抗ウイルス薬剤のいくつかに耐性である可能性がある。治療中、耐性株が進化しうる。ＨＩＶウイルスの様々の突然変異に関連した困難さは、有効であるために、厳密なプロトコールによって摂取されなければならない薬剤の組合せを用いることによって取り組まれることが試みられた。これは、適合性および遵守に困難さを導入く。さらに、多くの薬剤が、望ましくない副作用を示す。
【０００９】
化学薬品での治療による脂質外被を有するウイルスの不活性化は、知られている。これらのウイルスの有機溶媒に対する感受性は、ウイルス分類についての条件として使用された。クロロホルムは、脂質で被覆されたウイルスを不活性化するために特に有効な剤であると観察された。しかし、クロロホルムは血漿タンパク質も変性させ、そのため動物に投与されるための液体として使用するには全く不適切である。血漿タンパク質は、凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、プラスミン、フィブリノーゲン（因子Ｉ）、ＩｇＭ、ヘモグロビンおよびインターフェロンを包含する。これらのタンパク質の損失は患者の健康に有害な影響を示し、そして患者を死に至らせる可能性さえある。β−プロピオラクトンは別の溶媒であり、そしてそれは脂質で被覆されたウイルスを不活性化させるが、さらに凝固のために重要なタンパク質である血液タンパク質因子ＶＩＩＩを７５％まで不活性化する。
【００１０】
したがって、動物に投与されるべきである生物学的液体中のウイルスの不活性化は、単に液体および表面を滅菌することとは全く異なる。これは、生物学的液体での所望なタンパク質様構成要素の存在による。血漿の重要な用途は、凝固因子の欠損を示す患者の治療にある。因子ＶＩＩＩが低レベルの血漿は、このような治療的処理に適切でない。さらに、多量の変性タンパク質の患者への投与は順次、自己免疫疾患または変性因子ＶＩＩ自体に対する抗体につながりうる、免疫反応を開始する可能性がある。ジエチルエーテルも、脂質外被を有するウイルスの不活性化のために適切な溶媒として提唱されてきた。ジエチルエーテルを選択する１つの理由は、一般的麻酔薬としてのそれの初期使用から、一般に毒性がないことが知られていることである。しかし、ジエチルエーテルは、特にウイルス脂質外被の一部を形成するリン脂質のような両親媒性分子にとっては、比較的不十分な脂肪族溶媒である。ポックスウイルスのようなある種のウイルスは、ジエチルエーテルに強力に耐性であることが分かった。さらにジエチルエーテルは、ヒト血液の温度より低い３４℃の沸点を示す。このため、ジエチルエーテルを新たに抜取った血液産物と接触させることは、エーテルの好ましくない蒸散を生じる。
【００１１】
ジエチルエーテルの液体可溶化特性を改善を図って、ジエチルエーテルを非イオン性界面活性剤と合わせることが提唱された。商品名ツイーン８０で入手可能な界面活性剤が特に好まれた。この界面活性剤はエーテルと脂質の間の接触を増加させる。
【００１２】
リン酸ジおよびトリアルキルもウイルス不活性化剤として提唱され、この点でジエチルエーテルより優れていることが観測された。このリン酸塩の欠点は、水溶性が低いことである（０．４％未満）。したがって、これらの剤を有効に操作するために、前述のツイーン８０のような非イオン性界面活性剤を使用することが必要である。しかし、界面活性剤の使用は、その除去のために冗漫な手段を必要とする。
【００１３】
非イオン性界面活性剤を除去するため提唱された手段としては、血漿タンパク質を保有する多孔性膜を用いたダイアフィルトレーション、クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー支持体上での所望の血漿成分の吸収、および血漿タンパク質の沈降が挙げられる。
【００１４】
リン酸アルキル／界面活性剤溶媒系（ＳＤ）は、１９８０年代の中ごろのその開発以来、広範な支持を得、そしてＨＩＶ、Ｂ型およびＣ型肝炎の不活性化するための血漿の処理用に、米国赤十字により使用されている。
【００１５】
ＳＤ法によって処理された血漿の使用についての指標は制限され、そしてそのために利用可能な濃縮製剤のない、多重凝固因子欠乏症、ワルファリン効果の逆転、および血栓性血小板減少症紫斑病の患者の治療のある、凝固因子欠乏症の患者の治療が挙げられる。
【００１６】
ＳＤ処理法では、新鮮な凍結血漿（ＦＦＰ）を解凍し、そして濾過を、貯蔵および３０℃で４時間の１％リン酸トリ（ｎ−ブチル）および１％トリトンＸ−１００界面活性剤を用いた処理の前に行う。溶媒／界面活性剤系は、大豆油抽出およびＣ１８樹脂での逆相クロマトグラフィーによって除去する。水を超遠心分離によって除去し、そして血漿は最終的に滅菌濾過する。
【００１７】
溶媒／界面活性剤除去は、長くて冗漫なバッチ処理であり、そして商用規模で有効に操作できるため、それは比較的多量の貯蔵血漿で大規模に行われなければならない。ＳＤ法は、同じ患者に対する最終的な回復のための、単独の患者から得られる継続的な血漿の処理のためには使用できない。さらに、単独の患者における小単位の血漿の処理は、経済的にひどく高くつくだろう。
【００１８】
ＳＤ処理は、１９８０年代中ごろに開発されたが、本発明者は、感染性疾患に罹っている患者の治療方法としての、その使用法に関するいかなる示唆にも気付いていない。さらにこの系では血液凝集因子の変性がほとんどないという事実を支持するデータがあるが、他のタンパク質の活性におけるＳＤ処理の効果に関し、本発明者が気付いているデータはない。
【００１９】
上に明記されるとおり、ＳＤで処理された血漿の主要な使用法は、他の形態で投与され得ない種々の凝固因子の欠乏症を示す患者の治療のためである。したがって、凝集因子の変性が最小限であることは重要であるが、他の血液タンパク質の変性は許容できる。しかし、これらの他の血液タンパク質の変性は、患者における血漿の大規模置換においては受容されない。
【００２０】
上に検討されるとおり、血漿タンパク質が変性された血漿の再導入は、患者に対して毒性がある可能性があり、そしてある種の症例では、患者が死に至る可能性さえある。これらの理由のため、血漿のような液体のウイルス不活性化による感染患者の治療は、提案された場合でもおそらく被験者への健康上のリスクの観点から、採用されなかった。
【００２１】
ウイルスで不活性化された血漿を患者に再導入する１つの提案が、米国特許番号第５４８４３９６号に記載されている。この方法では、血液を患者から抜き取り、そして赤血球および血小板を含む第一の成分と、血漿、白血球および細胞不含ウイルスを含む第二の感染成分とに分離する。その後、感染成分を５または１０分間、ジエチルエーテルに曝す。エーテルを５０〜５２℃での蒸留により除去し、そして死滅した細胞不含ウイルスおよび死滅した感染細胞を含む処理済み血漿を患者に戻す。
【００２２】
この特許は、クロロホルムを含む他の溶媒の使用をも示唆する。しかし上に明記されるとおり、クロロホルムは血漿タンパク質を変性させるため受容されない。
【００２３】
米国特許番号第５４８４３９６号に記載の方法に関しては、多数の困難がある。第一に、該方法は、除去された全白血球を死滅させ、そして死滅細胞を患者に戻すことに関与する。これらの死滅細胞断片は毒性でありうる。任意の毒性は、疾病の進行段階で患者にとって特に危険である可能性がある。第二に、エーテルが蒸留によって除去される。これは、エーテルに溶解したあらゆる脂質が血漿内に残ることを意味する。血漿脂質はタンパク質と正常に会合する。有機溶媒との接触は、この会合を分裂させる。いったん分裂すると、脂質およびタンパク質は再会合しない。したがってこの方法では、会合されなかった脂質も患者に戻される。さらに、会合されなかった血漿脂質の強力な毒性に関する懸念がある。
【００２４】
またさらに、エーテルが約５０−５２℃での蒸留により除去され、該特許にはその時間の長さを記載していないが、血漿は加熱にかけられる。ＨＩＶウイルスは、熱感受性であることが知られている。このように、観察されるウイルス不活性化の原因が、エーテルか加熱か、またはその組合せのいずれであるかどうかに関して不明確である。またさらに、一般に血液および血漿が曝され得る最高温度は、約４０℃であると認められている。高温では血漿タンパク質の変性が起りうる。
【００２５】
加熱処理による血液中のＨＩＶを不活性化は提案されてきた。しかしこの方法は、血液構成要素における高温の有害な影響に関する問題のため、採用されなかった。
【００２６】
先に明記されるとおり、エーテルは、血漿中の脂質で被覆されたウイルスを不活性化する薬剤として既に提案された。しかしこの溶媒は、ウイルス不活性化速度はリン酸トリ（ｎ−ブチル）（ＴＮＢＰ）が優れていることが示されたため、採用されなかった。米国特許番号第４５４０５７３号は、ジエチルエーテルとＴＮＢＰによるウイルス不活性化について、いくつかの比較データを提供する。研究されたウイルスは、典型的な脂質含有ウイルスであるシンビス、センダイおよびＶＳＶウイルスであった。これらの結果は、４℃でのジエチルエーテルを用いた処理が、これらのウイルスを不活性化するのに多くの時間がかかることを示す。米国特許番号第４４８１１８９号には、４℃で１６時間、血漿をジエチルエーテルと接触させることによるＢ型肝炎ウイルスの不活性化が記載されている。米国特許番号第４５４０５７３号にも、室温でのＴＮＢＰによるウイルス不活性化の研究がある。ウイルスの不活性化のための最小限の時間は２時間である。ＴＮＢＰを用いた商用の血漿滅菌手段は、４時間以上かけて行われることも注目に値する。
【００２７】
初期のエーテルの研究は４℃で行われたことが知られているが、それに対し米国特許番号第５４８４３９６号の研究は室温で行われた。とは言え、ジエチルエーテル実験の間の直接的比較はできないが、ジエチルエーテルとの接触の５分後にＨＩＶウイルスの不活性化を完了するという米国特許番号第５４８４３９６号の請求項は注目すべきである。この観察から導きうる２つの可能な結論がある。第一に、ＨＩＶウイルスは他のウイルスに比べ、ジエチルエーテルに対し顕著により感受性である。この場合には、米国特許番号第５４８４３９６号で記述されるとおりの方法は、ＢまたはＣ型肝炎のような他の脂質含有ウイルスに感染した患者の処理には適切でない。これは、患者がＣ型肝炎とＨＩＶウイルスに同時に感染することがしばしば起こり、そして両方の症状について患者を治療できることが望ましいために、不十分である。さらに、米国特許番号第５４８４３９６号の方法は、非ＨＩＶウイルスに対して有効でないため、血液製剤の滅菌には全く適さない。
【００２８】
あるいは、ジエチルエーテルはウイルス活性化の原因ではなく、そしてウイルスは血漿が約５０−５２℃に加熱される蒸留段階の間に不活性化される可能性がある。この場合、加熱がその方法の基本的特性であることは明らかである。しかし、４０℃より高い温度での血液製剤の曝露を長引かせると、血液成分に不利に影響しうる。
【００２９】
患者に血漿を処理および導入する別の方法は、患者の血漿が、ドナー血漿、またはさらに通常には血漿タンパク質分画と交換させる血漿瀉血（血漿交換療法）である。この治療は、起こり得る、外来タンパク質の導入および感染性疾患の伝達により、可能性のある合併症を生じうる。これは、ＨＩＶを有する患者のような構成免疫系を有する患者に全く顕著であろう。またさらに別の血漿瀉血はまた、患者の抗体を含む血漿中の所望の要素、および血漿中を循環する任意の抗ウイルス薬を除去する。
【００３０】
（発明の要約）
したがって、脂質外被または膜を有する感染性病原体による感染に関連した症状を、治療または制御する方法、または上記欠点を少なくとも部分的に克服しうる、このような感染性病原体を不活性化する方法を提供するか、または有益な選択を公衆にもたらすことが、本発明の目的である。
【００３１】
本発明の第一の広範な形態によって、動物から血液を抜き取り、血液細胞を血漿から分離し、そして血漿中の感染性病原体の活性レベルを低減するために十分な時間、脂質が可溶性であり血液学的および生化学的構築要素が実質的に安定である溶媒を含む溶媒系と血漿を接触させ、血漿を溶媒系から分離し、そしてその血漿を動物に再導入し、それにより、溶解した脂質が溶媒系で分離され、そして溶媒系に残ることを包含する、脂質外被または膜を有する感染性病原体に感染した動物を治療する方法の提供がある。
【００３２】
典型的には、処理された血漿は動物への再導入の前に血液細胞と再混合されるが、ある種の場合に、これは好ましくないかまたは不要かもしれない。
【００３３】
上述の系によって不活性化できるウイルス性の感染性病原体としては、以下の属の脂質でコードされるウイルスが挙げられる。
【００３４】
アルファウイルス（アルファウイルス類）、ルビブルス（ルベラウイルス）、フラビウイルス（フラビウイルス類）、ペスチウイルス（粘膜疾患ウイルス類）、（命名されていないもの、Ｃ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（コロナウイルス類）、トロウイルス（トロウイルス類）、アルテイウイルス（アルテリウイルス類）、パラミキソウイルス（パラミキソウイルス類）、ルブラウイルス（ルブラブリウス類）、モービリウイルス（モービリウイルス類）、ニューモビリナエ（ニューモウイルス類）、ニューモウイルス（ニューモウイルス類）、ベシキュロウイルス（ベシキュロウイルス類）、リッサウイルス（リッサウイルス類）、エフェメロウイルス（エフェメロウイルス類）、シトラブドウイルス（植物ラブドウイルスＡ群）、ヌクレオラブドウイルス（植物ラブドウイルスＢ群）、フィロウイルス（フィロウイルス類）、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ（インフルエンザＡおよびＢウイルス類）、インフルエンザウイルスＣ（インフルエンザＣウイルス）、（命名されていないもの、ソゴト様ウイルス）、ブンヤウイルス（ブンヤウイルス類）、フレボウイルス（フレボウイルス類）、ナイロウイルス（ナイロウイルス類）、ハンタウイルス（ハンタウイルス類）、トスポウイルス（トスポウイルス類）、アレナウイルス（アレナウイルス類）、（命名されていない哺乳類Ｂ型レトロウイルス類、命名されていないもの、哺乳類および爬虫類Ｃ型レトロウイルス類、命名されていないもの、Ｄ型レトロウイルス、レンチウイルス（レンチウイルス類）、スプマウイルス（スプマウイルス類）、オルトヘパドナウイルス（哺乳類のヘパドナウイルス類）、アビヘパドナウイルス（鳥類のヘパドナウイルス）、シンプレックスウイルス（シンプレックスウイルス類）、バリセロウイルス（バリセロウイルス類）、ベータヘルペスビリナエ（サイトメガロウイルス類）、サイトメガロウイルス（サイトメガロウイルス類）、ムロメガロウイルス（マウスサイトメガロウイルス類）、ロゼオロウイルス（ヒトヘルペスウイルス６）、ガンマヘルペスビリナエ（リンパ球関連ヘルペスウイルス類）、リンホクリプトウイルス（イプスタイン−バー様ウイルス類）、ラジノウイルス（サイミリ−アテレス−様ヘルペスウイルス類）、オルトポックスウイルス（オルトポックスウイルス類）、パラポックスウイルス（パラポックスウイルス類）、アビポックスウイルス（鶏痘ウイルス類）、カプリポックスウイルス（羊痘様ウイルス類）、レポリポックスウイルス（粘液腫ウイルス類）、スイポックスウイルス（豚痘ウイルス類）、モルスシポックスウイルス（伝染性軟属腫ウイルス）、ヤタポックスウイルス（ヤバポックスおよびタナポックスウイルス類）、命名されていないもの、アルリカ豚コレラ様ウイルス類、イリドウイルス（小型イリデッセント昆虫ウイルス類）、ラナウイルス（フロントイリドウイルス類）、リンフォシスチウイルス（魚類のリンパ嚢腫ウイルス類）。
【００３５】
これらのウイルス類としては、以下のヒトおよび動物病原体が挙げられる：
ロス川ウイルス、熱ウイルス、デング熱ウイルス類、マリーバレー脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス類（欧州および極東ダニ媒介脳炎ウイルス類、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトコロナウイルス２２９−ＥおよびＯＣ４３およびその他（風邪、上部呼吸管感染、おそらく肺炎、および、ことによると胃腸炎を引き起す）、ヒトパラインフルエンザウイルス１および３、おたふく風邪ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス２、４ａおよび４ｂ、麻疹ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザＡウイルス類およびインフルエンザＢウイルス類、アレナウイルス：リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）ウイルス；ラッサウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１および２、Ｂ型肝炎ウイルス、亜族：ヒトヘルペスウイルス１および２、ヘルペスウイルスＢ、イプスタイン−バーウイルス）、（痘瘡）ウイルス、牛痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス。
【００３６】
上記治療方法は、ＨＩＶ、Ｂ型またはＣ型肝炎に感染した患者のウイルス負荷を減少させるために特に適する。該方法は、従来の抗ウイルス薬剤療法と共同して使用でき、そして賞賛しうる。従来の療法を越えた本発明の利点は、本発明の方法が非特異的であり、そして薬物耐性株を含めた任意の脂質で被覆されたウイルスを除去または不活性化しうることである。本発明の方法は、大比率の耐性ＨＩＶ株を保有し、およびほとんどの利用可能な抗ウイルス薬剤を試し尽くした可能性のある個人のために、特定の用途を見出しうる。本発明の方法は、患者に要求される薬剤プロトコールを遵守しないといった理由により該ウイルス負荷が増加した患者において、ウイルス負荷を減少させるためにも使用できる。
【００３７】
適切な溶媒系は、炭化水素、エーテルおよびアルコールまたはそれの２つまたはそれ以上の混合物を包含する。好ましい溶媒は、エーテル、またはエーテルとアルコールの混合物である。アルコールとしては、適切には、血漿または他の生物学的液体とあまり混和性でないものが挙げられ、そしてこれらとして、Ｃ４からＣ８までのアルコールを含めた低級アルコールが挙げられる。好ましくは、ブタノール（ブタン−１−オール）および（ブタン−２−オール）である。Ｃ２−６エーテルも好ましく、そしてこれらとしては、プロピルエーテル（ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）、エチルプロピルエーテル）、ジエチルエーテルまたはその混合物が挙げられうる。利用できうる他の溶媒としては、アミン、エステル、ヘキサンのような炭化水素および混合物が挙げられうる。特に好ましい溶媒は、（１）ウイルス脂質外被を迅速に崩壊させるか、または他のウイルス構成要素を不可逆に変性でき、（２）血漿または他の生物学的液体と実質的に不混和性で、（３）（必要であれば）血漿または他の生物学的液体から迅速に除去でき、そして（４）血漿の血液学的または生化学的構成要素を、その血漿が導入できる動物に毒性である可能性のある範囲まで変性させないものである。好ましい溶媒系としては、ブタノール、ジイソプロピルエーテル、ジエチルエーテルまたはその混合物が挙げられ、そしてこれらは、０％から約６０％までのアルコールと、約４０％から約１００％までのエーテルとの比でありうる。好ましくは、溶媒系は、０から約５０％までの間のアルコールおよび約５０から約１００％までのエーテルを包含する。
【００３８】
血漿が溶媒系と接触している期間は、溶媒系の効力に依存する同範囲である。
一般に接触時間は約５秒から約２時間の間、好ましくは約３０秒から１時間までの間、そして最も好ましくは、約５または約１０分から約３０分までの間である。
【００３９】
本発明の別の好ましい形態によって、脂質外被または脂質膜を有する感染性病原体を不活性化するためのウイルス不活性化溶媒系の提供があり、そしてその溶媒系は、約４０から約１００％までのジイソプロピルエーテルまたはジエチルエーテル、および約０から約６０％までの間のブタノールを包含する。
【００４０】
本発明の別の広範な形態により、感染性病原体の活性レベルを減少させるために十分な時間、液体または血液産物を、脂質が可溶性であり、そして血液学的および生化学的構成要素が実質的に安定である溶媒を含む溶媒系と接触させること、そしてその溶媒系から液体を分離し、それにより溶解した脂質が溶媒系と分離され、そして溶媒系に残ることを特徴とする、液体または血液産物中の脂質外被または脂質膜を有する感染性病原体の活性を減少させる方法の提供がある。
【００４１】
この方法で処理される液体は、血漿に制限されないことが理解される。その方法は、脂質外被または脂質膜を有する活性な感染性病原体を担持する任意の液体または組成物中の活性ウイルスレベルを減じさせるために使用できる。典型的な液体としては、哺乳類血漿、貯蔵血漿、アヴァール血漿、血漿分画；ヘモグロビン、アルファインターフェロン、Ｔ細胞成長因子、血小板由来の成長因子および同等物のような血液細胞派生物、プラスミノーゲンアクチベーター、寒冷沈降物、エタノール沈降物およびポリエチレングリコール沈降物を含めた血漿沈降物、または寒冷上清、エタノール上清およびポリレチレングリコール上清のような上清、哺乳類精液および血清が挙げられる。
【００４２】
好ましい溶媒系は、上に記述されるものである。したがってその方法は、貯蔵血液、血漿および血漿分画中の活性な感染性病原体のレベルを減じるのに適し、そして上に記述されるとおりＳＤ血漿処理に対する代替法を提供できる。
【００４３】
他の用途としては、牛胎児血清のような組織培養中に使用される液体の滅菌が挙げられる。牛胎児血清（ＦＣＳ）は、研究およびワクチン製造のための細胞を培養するために使用される。反芻動物のためのワクチン製造のために使用される場合、家畜ペストウイルスで汚染されたＦＣＳは、現場に実際の疾病を引起しうる。現時点でその問題に取り組む唯一の方法は、ペストウイルス不含の群を維持すること、または各胎児を個々に試験することである。どちらの方法も非常に高価である。ペストウイルス不含のＦＣＳを生成する、経済的でかつ有効な方法が当業界に必要である。
【００４４】
上記方法による処理のための適切な液体も、癌細胞または正常な細胞から得られる産物、または遺伝子挿入に続く発酵処理から得られる産物が挙げられる。
【００４５】
両方の上記方法では、溶媒系は、任意の適切な方法によって処理されるべき液体から分離でき、そして該分離が液体の任意の生化学的または血液学的構成要素に有害な影響を及ぼさないことが望ましい。溶媒が水性液体中で実質的に不混和性の場合、該分離は一般に、２つの層を分け、そして溶媒系が水性相より多少とも高密度であるかどうかにより、該層を除去することによって達成される。この方法における分離の利点は、溶媒層に溶解された脂質も除去できることである。この方法では、毒性でありうる脂質断片は、液体から実質的に除去できる。２つの層の分離は、遠心分離によって促進できる。代わりに、溶媒の少なくとも一部は、好ましくは減圧下で、蒸留によって除去できる。
【００４６】
分離の後のその液体は、いくらかの混入した溶媒をなお含みうるものであり、通常は乳液の形態である。したがって液体は脱乳化剤で処理できる。脱乳化剤は、エーテルまたは他の剤を包含し得、そして好ましいエーテルはジエチルエーテルである。エーテルは液体に添加できるか、または代わりに液体がエーテル中に分散される。エーテルは、溶媒の分離に関して、上に記述されるとおり類似の方法によって除去できる。
【００４７】
本発明の治療の方法では、血漿は、連続または不連続ベースで処理できる。典型的には、治療の連続法では、動物から得られる血液を、抜取針を介して抜き取り、抗−凝固剤溶液と混合し、そして血液細胞を分離するために遠心分離できる。血漿を、ブタノール−ＤＩＰＥ（４０％−６０％）Ｖ／Ｖ）または１００％ＤＩＰＥ溶液でありうる本発明による溶媒系と混合させる。血漿および溶媒は、混合された後、血漿溶媒分離装置に通され、ここでほとんどの溶媒（有機層）が、血漿（水相）から除去される。分離装置は、それを通って、高密度の水相が通過しうる下部流出口を有する簡単な装置でありうる。血漿中の任意の乳液を破壊するエーテルは、一般的に、分離装置から得た血漿に添加される。その後、血漿は、溶媒の平衡、およびエーテルが除去される二次遠心分離装置を通してポンプで回収され得る。処理血漿は、要求される場合、液体交換ポンプによって引き抜かれて、血液細胞と混合される（置換液は必要な場合血漿に添加され、処理および分離段階中での血漿容積のあらゆる損失を克服する。）。
【００４８】
患者自身の血液が、この方法の間に使用され、そして薬剤または外来組織が導入されない場合、体による処理血液の拒絶および有害な副作用はないだろう。
【００４９】
治療の不連続法では、血漿は、一般に、不連続法で、患者から離れた位置で処理され、エーテルを用いた複数洗浄が実行できる。
【００５０】
種々の修飾は、上に記述されるとおり処理および分離段階に対して行われうることが理解される。例えば、溶媒を用いた血漿の処理は、その血漿または溶媒の他のものに、その溶媒または血漿を分散させることによって促進できる。このような分散は、回転チャンバーの手段によって達成できる。適切な配列の例は、米国特許番号第５７４４０３８号に記述される。
【００５１】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（実施例１）
生化学的および血液学的構成要素での血漿の処理の影響が、動物で研究された。
【００５２】
動物の血液容量のおよそ４分の１が除去された。血液細胞を遠心分離により血漿から除去した。血漿を処理し、その後血液細胞と再混合し、そして静脈内注入により元の動物に再導入した。生化学的、血液学的および脂質分析のためのこの手段の前後で、血液サンプルを収集した。
【００５３】
実験期間の間に、以下の生化学的および血液学的パラメーターで変化はなかった。
【００５４】
【表１】
2003522740.tif 000001
【００５５】
血清ｐＨ、ブタノール−ＤＩＰＥ（４０％−６０％Ｖ／Ｖ）で処理したときのヒト血清中のタンパク質および酵素活性についての比較も行った。結果は、以下の表に示される。
【００５６】
【表２】
2003522740.tif 000002
【００５７】
本発明の溶媒系を用いた処理は、上記血液構成要素に有害に影響しないことが分かるだろう。重要なことには、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼおよびコレステロールエステル移行タンパク質のような脂質関連酵素の活性を含めた、血漿タンパク質の変性および酵素活性においては変化がないように見える。
【００５８】
（実施例２）
およそ１００の感染用量を含む血清を伴う細胞不含培養上清を、１：２比でブタノール：ジイソプロピルエーテル（４０：６０）と混合し、そして１時間、３０ｒｐｍで、軌道振蘯装置で混合した。
【００５９】
混合物を４００×ｇで１０分間遠心分離し、そして水相を除去した。その後ジエチルエーテルと混合し、そして以前と同様に２回遠心分離した。残留ジエチルエーテルを、真空で除去した。Ｔ−リンパ球細胞株を２時間、処理、未処理ウイルスと、またはウイルスなしでインキュベートし、その後細胞を洗浄してウイルスを除去し、２週間培養した。ウイルスｐ２４抗原を検出するＥＬＩＳＡアッセイは、ウイルス複製が処理血清で感染した細胞では起こらなかったのに対し、感染したが未処理である血清で処理された細胞ではウイルス複製が起こることを示した。
【００６０】
これらの結果は、本発明の方法および溶媒系による血清の処理が、ＨＩＶウイルスの感染性を脱活性化および排除できることを示す。なおさらに、この脱活性化は他の血清成分になんら有害な影響を及ぼすことなしに達成できる。
【００６１】
（実施例３）
目的
血清の脱脂が、アヒルＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）の不活性化を生じるかどうかを試験すること。
【００６２】
１０６ＩＤ５０用量のＤＨＢＶを含む標準血清貯蔵液（カムデン）を使用した。
【００６３】
２１の仔アヒルは、孵化の日にＤＨＢＶ陰性集団から得た。これらの仔アヒルは購入時に試験し、そしてドットブロットハイブリダイゼーションによって、ＤＨＢＶ・ＤＮＡ陰性であることが示された。
【００６４】
試験手段
有機溶媒系を、４０％ブタノール対６０％ジイソプロピルエーテルの比率で混合した。４ｍｌの混合有機溶媒系を、２ｍｌの標準血清貯蔵液と混合し、そして１時間穏やかに回転させた。混合物を、４００×ｇで、１０分間遠心分離し、そして水相を除去した。その後、それを、等量のジエチルエーテルと混合し、そして以前のとおり遠心分離した。その後、水相を除去し、そして等量のジエチルエーテルと混合し、そして再遠心分離した。水相を除去し、そして残留ジエチルエーテルを、フュームキャビネットで通気することによって除去した。
【００６５】
陽性対照および陰性対照
陽性および陰性対照血清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。
【００６６】
陽性対照：１０６ＩＤ５０用量のＤＨＢＶを含む２ｍｌの貯蔵血清を、４ｍｌのＰＢＳと混合した。陰性対照：２ｍｌの貯蔵ＤＨＢＶ陰性血清を、４ｍｌのＰＢＳと混合した。
【００６７】
残存する感染性を、１日齢アヒルの腹膜腔への１００μｌの試験サンプル（ｎ＝７）、陰性（ｎ＝７）または陽性（ｎ＝７）対照のいずれかの接種によって試験した。
【００６８】
結果
陽性対照アヒルの１羽は、４および６日齢の間で死滅し、そしてさらなる分析から除外した。別の３羽の陽性対照アヒルは、病原体接種の９および１０日目の間で死滅し、そして２羽の処理および１羽の陰性対照は、１１日目で死滅した。実験を終了することが決定された。残りの仔アヒルを、１２日目に安楽死させ、そしてそれらの肝臓を、Ｄｅｖａら（１９９５年）によって記述されるとおりＤＨＢＶ・ＤＮＡ分析のために取り出した。
【００６９】
陰性対照
全ての７羽の陰性対照のアヒルは、ＤＨＢＶ陰性のままであった。
【００７０】
陽性対照
全ての６羽の陽性対照のアヒルは、その肝臓でＤＨＢＶ陽性であることが分かった。
【００７１】
試験アヒル
全ての７羽の試験アヒルは、それらの肝臓でＤＨＢＶ・ＤＮＡについて陰性のままであった。
【００７２】
結論  上記溶媒系を用いた血清の脱脂は、ＤＨＢＶの不活性化を生じ、処理血清を接種された仔アヒルのいずれもが感染しなかった。実験は、１４日目の代わりに１２日目に終了されなければならなかったが、陽性対照アヒルの全ては、ＤＨＢＶについて陽性であった（３／３が、１０日目までにＤＨＢＶ陽性であった）。これは、処理アヒルについて肝臓でＤＨＢＶ陽性になるのに十分な時間が経過したこと、そして実験の早めの終了は結果とは無関係であったことを示唆する。
【００７３】
（実施例４）
Ｃ型肝炎についてのモデルとして、畜牛ペストウイルス（ウシウイルス性下痢ウイルス、ＢＶＤＶ）の不活性化。
【００７４】
１．ウイルス
標準畜牛ペストウイルス単離物（ＢＶＤＶ）を、これらの実験で使用した。この単離物「ヌメレラ」ＢＶＤウイルスは、１９８７年に、ＮＳＷのベガ区域にある農家での「粘膜病」の典型的事例から提出された診断試験片から単離された。このウイルスは、３０年の期間を超えて我々の実験室で試験された９５％のＢＶＤＶ単離物のように非細胞変性であり、そして型を決定する試薬としてＥＭＡＩで生じたモノクローナル抗体の１２個全てのパネルと反応する。したがって、このウイルスは、オーストラリアのＢＶＤウイルスの「標準株」を表す。
【００７５】
ヌメレラウイルスを、ＢＶＤＶを含めた外来性ウイルス因子を含まない試験されたウシＭＤＢＫ細胞で培養した。ウイルス培養のために使用される培地は、ＥＭＡＩ畜牛に由来し、１０％成体ウシ血清を含有し、そして試験された全ては、ＢＶＤＶウイルスおよび抗体を含まない。この血清補助物を、３０年間我々の実験室で使用して、試験系の外来性ＢＶＤＶ汚染の可能性を排除したが、これは、試験ウイルスが培養系で唯一のものであることを保証するために注意を払わない世界じゅうの実験室に欠けている常識である。これらの試験培養系を用いることで、ウイルスの高いレベルの複製、および感染ウイルスの高い収量を確保した。ＭＤＢＫ細胞で５日培養の後の最終ウイルス収量の滴定は、１ｍｌの清澄化（遠心分離）された培養用培地当たり１０６．８感染ウイルス粒子の力価を示した。
【００７６】
２．感染ＢＶＤＶの不活性化
１０６．８感染ウイルス粒子／ｍｌを含む１００ｍｌの組織培養上清を、１５０ｃｍ２組織培養フラスコから収獲した。上清は、遠心分離（３０００ｒｐｍで、１０分間、４℃でペレット化された細胞残骸）により清澄化され、そして１０ｍｌを、動物接種（非不活性化ウイルス）についての陽性対照として別に取った。残りの９０ｍｌ（１０７．７５感染ウイルスを含む）を、以下のプロトコールを用いて不活性化させた。簡潔には、１８０ｍｌブタノール：ジイソプロピルエーテル（２：１）を添加し、そして旋回攪拌によって混合させた。その後、５００ｍｌコニカルフラスコ中の混合物を、３０分間、３０ｒｐｍで、室温で、軌道振蘯装置で振蘯させた。その後それを１０分間、４００×ｇで遠心分離し、そして有機溶媒相を除去し、廃棄した。連続段階で、底部層（水相）を有機相の底から取り出し、相当に収量を改善できる。
【００７７】
ブタノール：ジイソプロピルエーテル処理の後に、水相を、４回、等量の新鮮なジエチルエーテルで洗浄して、ブタノールの全ての汚染痕跡を除去した。各回、フラスコを渦巻き回転させて、上のとおり遠心分離（４００×ｇ、１０分、４℃）前に水相および溶媒相の混合さえも確保した。４回洗浄後、水相を一夜（１６時間）、フュームフード内の滅菌ビーカーに置き、滅菌組織で覆って汚染を防止した。フュームフードを稼動させたままにし、不活性化ウイルス標品から全ての残りの揮発性エーテル残留物を除去した。その後、４℃滅菌条件下で保存した後、それを組織培養物または動物に接種し、任意の残りの感染ウイルスについて試験した。
【００７８】
３．不活性化ＢＶＤＶ標品の試験
３．１組織培養接種
２ｍｌの溶媒不活性化ウイルス標品（１０７．１ウイルス等価物）を、８ｍｌ組織−培養物培地と混合し、そして６０分間、２５ｃｍ２組織−培養物フラスコ中で単層のＭＤＢＫ細胞に吸着させた。陽性対照として、２ｍｌの非不活性化ウイルス（同じ量の生きた感染ウイルスを含む）を、２５ｃｍ２組織−培養物フラスコ中でＭＤＢＫ細胞に吸着させた。６０分後、上清を、両方のフラスコから除去し、そして通常の培養培地（＋１０％ＡＢＳ）と交換した。その後、フラスコを、５日間、標準条件下で培養した後、ＭＤＢＫ細胞を固定し、そして標準免疫ペロキシダーゼプロトコールを用いて、６つのＢＶＤＶ特異的モノクローナル抗体の混合物で染色した（ＥＭＡＩパネル、２つの異なるＢＶＤウイルスタンパク質と反応性がある）。
【００７９】
有機溶媒で処理された（不活性化）ウイルスを接種した単層のＭＤＢＫ細胞中に感染細胞はない。対照的に、対照フラスコ中のおよそ９０％の細胞（非不活性化ＢＶＤウイルスを接種された）は、強く特異的な免疫ペロキシダーゼ染色によって示されるとおりウイルスについて陽性であった。これらの結果は、インビトロ試験条件下で、感染ウイルスで、不活性化ＢＶＤＶ標品中に残るものはなかったことを示した。
【００８０】
３．２動物接種
さらにいっそう敏感なインビボ試験は、生来（抗体−陰性）の家畜に、不活性化ウイルス標品を接種することである。このような動物で皮下に注射される１つの感染性ウイルス粒子と同じぐらい小さいのは、細胞内への侵入およびウイルスの複製がＢＶＤＶに極度に有効であると仮定すると、感染性−ウシ用量であると考えられる。
【００８１】
１０頭の抗体−陰性の雄の仔牛の群（１０−１２ヶ月齢）を、３つの群に任意に割当てた。６頭の雄の仔牛の第一群を、ＢＶＤウイルスが十分に不活性化されたかどうかを試験するのに使用した。２頭の雄の仔牛に、陽性対照として作用する非不活性化ウイルスを接種するのに対して、２頭の残りの雄の仔牛は、接種された群の動物内で天然に生じる天然のペストウイルス伝達がないことを保証する陰性「監視」動物として作用した。陽性対照動物（生きた感染ウイルスを接種された）を、それらが、感染後一過性ウイルス血症を発生した時（通常は、生きたＢＶＤＶウイルスを受けた４−７日後に）に、ウイルスが任意の他の動物を感染させるのを止める別個の隔離条件下で行われた。抗体レベルは、ＥＭＡＩで開発された、立証された競合ＥＬＩＳＡを用いて１０頭の動物で測定された。この試験は、シーエスエル・リミテッド（ＣＳＬ  Ｌｔｄ）によって独立に立証され、そして欧州で、ＩＤＥＸＸスカンジナビアによって市販されている。
【００８２】
第一の群にある６頭の動物は、各々、市販のアジュバントに組込まれた４．５ｍｌの不活性化ＢＶＤＶ標品の皮下注射を受けた。各ｍｌの不活性化標品は、１０６．８ウイルス等価物を含み、不活性化の前の総ウイルス負荷は、１０７．４ＴＣＩＤ５０であった。陽性対照動物は、各々、５ｍｌの非活性化標品、すなわち、第一の群についてと同じ方法で皮下に注射された１０７．５ＴＣＩＤ５０を受けた。残りの２頭の「監視」動物は、なんらウイルス抗原を与えられず、治験が行われる間、その群で起る天然のペストウイルス活性はないことを保証するために、治験の間中、第一の群の動物と一緒に生草を与えられた。
【００８３】
不活性化ＢＶＤウイルス標品を受ける雄の仔牛のいずれかで抗体発生はなかった。単回用量投与の２および４週後に、総量２７ｍｌの不活性化ウイルス標品中に残される感染ウイルスはなかったことを示す６頭の雄の仔牛のうち、血清変換されたものはなかった。これは、１０８．２ＴＣＩＤ５０の総不活性化と同等である。対照的に、不活性化の前に、５ｍｌのウイルス標品の各々を受けている２頭の動物での接種の２および４週間後の両方で、抗−Ｅ２抗体（中和抗体）および抗−ＮＳ３抗体は両方とも高レベルであった。これは、不活性化の前におけるウイルスの感染特性を確認した。これらのインビボ結果は、インビトロ組織−培養試験の知見を確認する。２頭の「監視」動物は、天然のペストウイルス感染のないままの群を示している間中、血清反応陰性のままであった。
【００８４】
（実施例５）
電子顕微鏡(Election Microscope)研究は、不活性化の前後に、ウイルス粒子を見る目的で行われた。
【００８５】
不活性化は、ＤＩＰＥ／ブタノールおよびＤＩＰＥ単独で、６０分、１分および３０秒間、行われた。３０秒間の処理の後でさえ、ＥＭによって検出される感染性または見ることができるウイルス粒子がなかった。ウイルス粒子で、不活性化サンプルについて観察されるものはまったくなかった。ウイルス液体外被の破壊は、観察するには早く起りすぎると思われる。
【００８６】
本発明の方法および溶媒系は、生物学的液体でのＨＩＶバイロンを含む感染性病原体を迅速に、そして有効に不活性化しうる。
【００８７】
さらに、このような不活性化は、ヒトの健康で有害な影響を示し得るタンパク質の認識可能な破壊なしに起る。さらに、溶解した脂質は除去され、そして患者には導入されない。
【００８８】
本発明はまた、生物学的液体および血液産物での感染性病原体を迅速に、そして有効に不活性化させうる。その方法は比較的簡単で、そして先に記述されるとおり、例えば最近使用されたＳＤ血漿処理法と比較された場合に、溶媒系の除去についての複雑な手段および装置を必要としない。ウイルスを不活性化させる比較的簡単な方法は経済的レベルで望ましく、そしてまた、発展途上国、特にＨＩＶが流行している国で広範な可能性を有する。
【００８９】
本明細書および請求項では、語句「包含する」および「含む」は、述べられた整数（単数または複数）に限定されず、そして１つまたはそれ以上の他の整数を排除しないことが理解されるだろう。
【００９０】
種々の修飾および改善は、その概念および範囲から逸脱することなしに、ここに記述される通り本発明になされる。