【手続補正書】
【提出日】平成23年3月2日(2011.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
前記の方法によって、各々配列番号：１〜１９３で表示されるアミノ酸配列を有し、細胞膜を横切る生物活性分子の横断を容易にできる新規の１９３個のＭＴＤペプチドが同定された。前記１９３個のＭＴＤは各々ＪＯ−０１〜ＪＯ−１９３と命名され、これらの構造的特性および配列は図１ａ〜１ｏに示した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
各々の新規のＭＴＤに融合されたＥＧＦＰタンパク質（Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ：ＨＭＥ）の発現ベクターを構築するために（図２）、プライマー対として表１および２に記載したオリゴヌクレオチド（ＭＴＤ  ＪＯ−０１〜ＪＯ−１９３各々に対して順方向プライマーとして、配列番号：３９３〜５８５；ＭＴＤ  ＪＯ−０１〜ＪＯ−１９３に対して逆方向プライマーとして、配列番号：５８６）、およびテンプレートとしてｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ条件は９５℃で５分間の初期変性後に、９５℃で４５秒、６８℃で４５秒、および７２℃で１分を３０回行い、７２℃で５分間の最終延長を行った。増幅されたＰＣＲ生成物を制限酵素ＮｄｅＩで切断してアガロースゲル電気泳動を行った。ｋＦＧＦ−４由来ＭＴＤ  １６ｍｅｒ
2010516758.tif 000001
ｋＦＧＦ−４由来ＭＴＤ  １２ｍｅｒ
2010516758.tif 000002
ＨＩＶ−Ｔａｔ由来タンパク質伝達ドメイン
2010516758.tif 000003
およびＨＩＶ−Ｔａｔ相同体
2010516758.tif 000004
を陽性対照として用い、スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）ペプチド（配列番号：３８７）を陰性対照として用いた。図３ａ〜３ｃに示したように、ＭＴＤ−ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ断片が成功的に増幅されたことを確認した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
ＦＩＴＣ結合Ｈｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、ＵＳＡ）に供した。各々の試料に対して、細胞（１×１０４）を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏサイトメトリー分析ソフトウェアを用いて分析した。各々の実験は少なくとも２回行った。新規のＭＴＤ（ＪＯ−０１〜ＪＯ−１９３）に融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ−ＥＧＦＰ組換えタンパク質のそれぞれの細胞透過性効能を、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤに溶合された陽性対照タンパク質の細胞透過性と視覚的に比較した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010516758000001.app
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１ａ−１】
2010516758.tif 000005
【図１ａ−２】
2010516758.tif 000006
【図１ａ−３】
2010516758.tif 000007
【図１ａ−４】
2010516758.tif 000008
【図１ｂ−１】
2010516758.tif 000009
【図１ｂ−２】
2010516758.tif 000010
【図１ｂ−３】
2010516758.tif 000011
【図１ｂ−４】
2010516758.tif 000012
【図１ｃ−１】
2010516758.tif 000013
【図１ｃ−２】
2010516758.tif 000014
【図１ｃ−３】
2010516758.tif 000015
【図１ｃ−４】
2010516758.tif 000016
【図１ｄ−１】
2010516758.tif 000017
【図１ｄ−２】
2010516758.tif 000018
【図１ｄ−３】
2010516758.tif 000019
【図１ｄ−４】
2010516758.tif 000020
【図１ｅ−１】
2010516758.tif 000021
【図１ｅ−２】
2010516758.tif 000022
【図１ｅ−３】
2010516758.tif 000023
【図１ｅ−４】
2010516758.tif 000024
【図１ｆ−１】
2010516758.tif 000025
【図１ｆ−２】
2010516758.tif 000026
【図１ｆ−３】
2010516758.tif 000027
【図１ｆ−４】
2010516758.tif 000028
【図１ｇ−１】
2010516758.tif 000029
【図１ｇ−２】
2010516758.tif 000030
【図１ｇ−３】
2010516758.tif 000031
【図１ｇ−４】
2010516758.tif 000032
【図１ｈ−１】
2010516758.tif 000033
【図１ｈ−２】
2010516758.tif 000034
【図１ｈ−３】
2010516758.tif 000035
【図１ｈ−４】
2010516758.tif 000036
【図１ｉ−１】
2010516758.tif 000037
【図１ｉ−２】
2010516758.tif 000038
【図１ｉ−３】
2010516758.tif 000039
【図１ｉ−４】
2010516758.tif 000040
【図１ｊ−１】
2010516758.tif 000041
【図１ｊ−２】
2010516758.tif 000042
【図１ｊ−３】
2010516758.tif 000043
【図１ｊ−４】
2010516758.tif 000044
【図１ｋ−１】
2010516758.tif 000045
【図１ｋ−２】
2010516758.tif 000046
【図１ｋ−３】
2010516758.tif 000047
【図１ｋ−４】
2010516758.tif 000048
【図１ｌ−１】
2010516758.tif 000049
【図１ｌ−２】
2010516758.tif 000050
【図１ｌ−３】
2010516758.tif 000051
【図１ｌ−４】
2010516758.tif 000052
【図１ｍ−１】
2010516758.tif 000053
【図１ｍ−２】
2010516758.tif 000054
【図１ｍ−３】
2010516758.tif 000055
【図１ｍ−４】
2010516758.tif 000056
【図１ｎ−１】
2010516758.tif 000057
【図１ｎ−２】
2010516758.tif 000058
【図１ｎ−３】
2010516758.tif 000059
【図１ｎ−４】
2010516758.tif 000060
【図１ｏ−１】
2010516758.tif 000061
【図１ｏ−２】
2010516758.tif 000062
【図１ｏ−３】
2010516758.tif 000063
【図１ｏ−４】
2010516758.tif 000064
【図２】
2010516758.tif 000065
【図３ａ】
2010516758.tif 000066
【図３ｂ】
2010516758.tif 000067
【図３ｃ】
2010516758.tif 000068
【図４ａ】
2010516758.tif 000069
【図４ｂ】
2010516758.tif 000070
【図４ｃ】
2010516758.tif 000071
【図４ｄ】
2010516758.tif 000072
【図５ａ】
2010516758.tif 000073
【図５ｂ】
2010516758.tif 000074
【図５ｃ】
2010516758.tif 000075
【図６ａ】
2010516758.tif 000076
【図６ｂ】
2010516758.tif 000077
【図７ａ】
2010516758.tif 000078
【図７ｂ】
2010516758.tif 000079
【図８】
2010516758.tif 000080
【図９ａ】
2010516758.tif 000081
【図９ｂ】
2010516758.tif 000082
【図９ｃ】
2010516758.tif 000083
【図９ｄ】
2010516758.tif 000084
【図９ｅ】
2010516758.tif 000085
【図９ｆ】
2010516758.tif 000086
【図９ｇ】
2010516758.tif 000087
【図１０ａ】
2010516758.tif 000088
【図１０ｂ】
2010516758.tif 000089
【図１０ｃ】
2010516758.tif 000090
【図１０ｄ】
2010516758.tif 000091
【図１０ｅ】
2010516758.tif 000092
【図１０ｆ】
2010516758.tif 000093
【図１０ｇ】
2010516758.tif 000094
【図１０ｈ】
2010516758.tif 000095
【図１０ｉ】
2010516758.tif 000096
【図１１ａ】
2010516758.tif 000097
【図１１ｂ】
2010516758.tif 000098
【図１２ａ】
2010516758.tif 000099
【図１２ｂ】
2010516758.tif 000100
【図１２ｃ】
2010516758.tif 000101
【図１２ｄ】
2010516758.tif 000102
【図１２ｅ】
2010516758.tif 000103
【図１２ｆ】
2010516758.tif 000104
【図１２ｇ】
2010516758.tif 000105
【図１２ｈ】
2010516758.tif 000106
【図１２ｉ】
2010516758.tif 000107
【図１３ａ−１】
2010516758.tif 000108
【図１３ａ−２】
2010516758.tif 000109
【図１３ａ−３】
2010516758.tif 000110
【図１３ｂ−１】
2010516758.tif 000111
【図１３ｂ−２】
2010516758.tif 000112
【図１３ｂ−３】
2010516758.tif 000113
【図１３ｃ−１】
2010516758.tif 000114
【図１３ｃ−２】
2010516758.tif 000115
【図１３ｃ−３】
2010516758.tif 000116
【図１３ｄ−１】
2010516758.tif 000117
【図１３ｄ−２】
2010516758.tif 000118
【図１３ｄ−３】
2010516758.tif 000119
【図１３ｅ−１】
2010516758.tif 000120
【図１３ｅ−２】
2010516758.tif 000121
【図１３ｅ−３】
2010516758.tif 000122
【図１３ｆ−１】
2010516758.tif 000123
【図１３ｆ−２】
2010516758.tif 000124
【図１３ｆ−３】
2010516758.tif 000125
【図１３ｇ−１】
2010516758.tif 000126
【図１３ｇ−２】
2010516758.tif 000127
【図１３ｇ−３】
2010516758.tif 000128
【図１３ｈ−１】
2010516758.tif 000129
【図１３ｈ−２】
2010516758.tif 000130
【図１３ｈ−３】
2010516758.tif 000131
【図１３ｉ−１】
2010516758.tif 000132
【図１３ｉ−２】
2010516758.tif 000133
【図１３ｉ−３】
2010516758.tif 000134
【図１３ｊ−１】
2010516758.tif 000135
【図１３ｊ−２】
2010516758.tif 000136
【図１３ｊ−３】
2010516758.tif 000137
【図１３ｋ】
2010516758.tif 000138
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明は、細胞内への生物活性分子の輸送を容易にすることができ、それによって、薬物送達、ワクチンの投与、ペプチド療法、および遺伝子療法に効果的に用いられる細胞透過性を有するＭＴＤペプチドを提供する。
[請求項101]
生物活性分子の細胞内への輸送を媒介することができるペプチドであって、配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離された巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチド。
[請求項102]
請求項101記載の巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
[請求項103]
配列番号:194〜386からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項102記載の単離されたポリヌクレオチド。
[請求項104]
多数のアミノ酸配列データベースからシグナル配列様ドメインを有する分泌タンパク質を同定する段階と、
前記同定された分泌タンパク質から、それらのN末端に単一の疎水性領域を有しかつヘリックス構造を形成する疎水性ペプチドを選択する段階と、
MTDペプチドとしての使用に適したペプチドを生成するのに効果的な条件下で、前記選択された疎水性ペプチドを最適化および最小化する段階と
を含む、生物活性分子の細胞内への輸送を媒介することができる巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドを同定する方法。
[請求項105]
前記シグナル配列様ドメインが、
2010516758.tif 000139
からなる群より選択される、請求項104記載の方法。
[請求項106]
前記アミノ酸配列データベースが、PubMed Entrez Protein Databaseからなる群より選択される、請求項104記載の方法。
[請求項107]
選択された疎水性ペプチドの左側または右側で非疎水性アミノ酸を除去して、この疎水性領域は維持しながらペプチド長さを最小化する段階と、
選択された疎水性ペプチドの中間または右側で非疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸であるプロリンで置き換えて柔軟性を与える段階と、
繰り返される疎水性アミノ酸の数を最小化してペプチドの長さを減少させる段階と
によって、前記最適化および最小化段階が行われる、請求項104記載の方法。
[請求項108]
前記最適化および最小化の結果として生成されたMTDペプチドが、細胞透過性、疎水性、および柔軟性を示し、約7〜約17アミノ酸長を有し、かつヘリックス構造を形成する、請求項104記載の方法。
[請求項109]
前記MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項108記載の方法。
[請求項110]
配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドと、生物活性分子とを含む、細胞透過性を有する単離された組換えタンパク質。
[請求項111]
前記生物活性分子が、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドからなる群より選択される、請求項110記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項112]
前記生物活性分子が、成長因子、酵素、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項110記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項113]
前記生物活性分子が、酵素、ホルモン、輸送タンパク質、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、シグナル伝達タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜貫通タンパク質、内部タンパク質、外部タンパク質、分泌タンパク質、ウィルスタンパク質、ネイティブタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、ジスルフィド結合を有するタンパク質、タンパク質複合体、化学的に修飾されたタンパク質、およびプリオンからなる群より選択される、請求項112記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項114]
前記生物活性分子が、核酸、コード核酸配列、mRNA、アンチセンスRNA分子、糖質、脂質、および糖脂質からなる群より選択される、請求項110記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項115]
前記生物活性分子が治療剤である、請求項110記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項116]
前記生物活性分子が治療薬物および毒性化合物からなる群より選択される、請求項115記載の単離された組換えタンパク質。
[請求項117]
細胞透過性を有する生物活性分子を生成するのに効果的な条件下で巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドを生物活性分子に付着させる段階を含む、細胞透過性を有する生物活性分子を遺伝的に操作する方法であって、前記MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
[請求項118]
前記付着させる段階が、生物活性分子のN末端、C末端、その両方、またはその中間にMTDペプチドを付着させることを含む、請求項117記載の方法。
[請求項119]
前記付着させる段階が、ペプチド結合によってMTDペプチドを生物活性分子に付着させることを含む、請求項117記載の方法。
[請求項120]
前記付着させる段階が、共有結合によってMTDペプチドを生物活性分子に付着させることを含む、請求項117記載の方法。
[請求項121]
生物活性分子に付着された巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドを含む細胞透過性組換えタンパク質を対象に投与する段階を含む、対象において細胞内に生物活性分子を輸送する方法であって、前記MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、方法。
[請求項122]
MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、薬物送達のための巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドの使用。
[請求項123]
MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ワクチン投与のための巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドの使用。
[請求項124]
MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、タンパク質療法のための巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドの使用。
[請求項125]
MTDペプチドが配列番号:1〜193からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、遺伝子療法のための巨大分子伝達ドメイン(MTD)ペプチドの使用。