【手続補正書】
【提出日】平成22年7月23日(2010.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性ｐＨセンサーとして使用するための化合物であって、
以下の式Ａを有し、Ｒ１およびＲ２がヒドロキシでもなく、チオールでもなく、かつそれらのいずれの脱プロトン化形態でもないことを特徴とする、化合物：
2010508295.tif 000001
式中、
Ｒ１−Ｒ６は、水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつ
Ｘはフルオロフォアであるか、あるいは
Ｒ１およびＲ３−Ｒ６は、水素であるか、または電子吸引性基以外の置換基であり、かつＸおよびＲ２は一緒になって、位置ＸとＲ２との間で式Ａのベンゼン環に縮合した５員もしくは６員の複素環式環を含む部分を形成する。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のいずれも、ヒドロキシルでもなく、チオールでもなく、かつそれらのいずれの脱プロトン化形態でもない、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１−Ｒ６が、
水素、
ヒドロカルビル、または−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲｂ−から選択される１つまたは複数の結合によって遮られたヒドロカルビル；またはＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６について言えば、−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲｂ−結合を介して式Ａのベンゼン環に結合され、かつ−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＲｂ−から選択される１つまたは複数の結合によって任意で遮られたヒドロカルビル
から選択され、このヒドロカルビルが非置換であるかまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されており、かつ
ヒドロカルビルが１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、
Ｒｂが、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６ヒドロカルビル、または−Ｏ−結合を介して隣接するＮに結合されかつ／または１つまたは複数の−Ｏ−結合によって遮られたＣ１−Ｃ６ヒドロカルビルであり、このヒドロカルビルが非置換であるかまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されており、
−Ｌが、共有単結合であるリンカー、または一連の安定な共有結合を含みかつＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから選択される多価の原子を組み込む部分であり、
−Ｒｘが反応基であり、
−ＬＲが、−ＬをＳｃに結合している反応基の残基を任意でさらに含むリンカー−Ｌであり、
−Ｓｃが結合された物質であり、
任意でＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のうちの少なくとも１つ（例えばそれらのうちの２つ）がＨではない、
請求項１または請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つがアルコキシまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−ＬＲ−Ｓｃによって置換されたアルコキシであり、アルコキシが１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、他の記号が請求項３で定義されたとおりである、請求項１または請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１、ならびにＲ２、Ｒ３およびＲ６のうちの１つ、２つまたは３つが、−Ｏ−もしくは−ＮＲｂ−結合を介して前記ベンゼンに結合されたヒドロカルビルであり、
前記ヒドロカルビルが、前記結合の１つまたは複数によって遮られていないかまたは遮られており、かつ非置換であるかまたは−Ｌ−Ｒｘもしくは−Ｌ−Ｓｃによって置換されており、
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６のうちの１つ、２つまたは３つが、互いに同じであるかまたは異なる、
請求項３または請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１およびＲ３が請求項５で定義されたとおりであるが、Ｒ２およびＲ６が、請求項５で定義されたものではなく、かつ任意でともに水素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘがキサンテン、インドールまたはボラポリアザインダシンである、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
以下の式Ｉを有する、請求項１に記載の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩：
2010508295.tif 000002
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６は、各々独立に、Ｈ、Ｚ、または電子供与性基（ＥＤＧ）であるが、ただし、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシルでもなく、かつチオールでもなく、かつそれらの脱プロトン化形態でもなく、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ５は、独立にＹ、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アシル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、反応基、担体分子、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｘはフルオロフォアであり、
Ｙは＝ＣＲｂＲｃまたは＝ＣＲｂＲｄであり、
Ｚは−ＯＲｃ、−ＳＲｃ、−ＮＲｂＲｃであり、
ＲｂはＨ、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒｃはアルキルまたは置換されたアルキルであり、かつ
Ｒｄはアミノまたは置換されたアミノである。
【請求項９】
Ｘがキサンテン、インドールまたはボラポリアザインダシンである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘが、
2010508295.tif 000003
である、請求項８に記載の化合物：
式中、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、各々独立に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択されるか、あるいは
Ｒ１１およびＲ１４はＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、かつＲ１２およびＲ１３はＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成する。
【請求項１１】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０がアルキルである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０がメチルである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４がＨである、請求項１０から請求項１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１１およびＲ１４がＲ７およびＲ８と一緒になって縮合環を形成し、Ｒ１２およびＲ１３がＲ９およびＲ１０と一緒になって縮合環を形成し、各縮合環が以下の構造を有する、請求項１０に記載の化合物：
2010508295.tif 000004
式中、
Ｒ２７およびＲ２８は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３−、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される。
【請求項１５】
Ｘが、
2010508295.tif 000005
であり、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０が、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、
請求項８に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１６およびＲ１９がＨである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ２０がメチルである、請求項１５または請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｘが、
2010508295.tif 000006
であり、
Ｒ２１が、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ
Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６が、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換されたスルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換されたアルキルチオ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルからなる群から選択される、
請求項８に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６がＨである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ２３がカルボキシルエステルである、請求項１８または請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ２３が−ＣＯ２ＣＨ３である、請求項１８または請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
前記ＥＤＧが、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、チオール、アルキルチオ、ヒドロキシ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシからなる群から選択される、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
前記ＥＤＧが、アルコキシ、置換されたアルコキシ、アミノ、置換されたアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、および（カルボキシルエステル）オキシからなる群から選択される、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｚ部分が存在する、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｙ部分が存在する、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ１にＺを含み、少なくとも１つのさらなるＥＤＧを含む、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ１がアルコキシである、請求項２４または請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１が−ＯＣＨ３である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ１およびＲ３が−ＯＣＨ３または−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項８から請求項２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ２およびＲ６がＨである、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
前記ＥＤＧが、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アリール、置換されたアリール、シクロアルキル、置換されたアルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールからなる群から選択される、請求項８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ４およびＲ５がアルキルまたは置換されたアルキルである、請求項８から請求項３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ５が、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２（ＣＨ２）ｍＨであり、
式中、ｎが０、１、２、３、４または５であり、かつｍが０、１、２または３である、
請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ５が＝ＣＨ（置換されたアミノ）である、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ４がエチルである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３６】
前記化合物のｐＫａが約５〜約８である、請求項１から請求項３５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３７】
以下の式ＩＩＩの化合物：
2010508295.tif 000007
式中、
Ｒ３は電子供与性基（ＥＤＧ）であり、かつ
Ｒ４およびＲ５は、各々独立に、Ｈ、アルキル、置換されたアルキル、アシル、＝ＣＨ（アミノ）、＝ＣＨ（置換されたアミノ）、＝ＣＨ（アルキル）、および＝ＣＨ（置換されたアルキル）からなる群から選択される。
【請求項３８】
Ｒ４およびＲ５が、各々独立にＨ、アルキルおよび置換されたアルキルから選択される、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
（ａ）試料を請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物と接触させ、接触させた試料を形成する段階と、
（ｂ）前記接触させた試料をインキュベーションし、インキュベーションされた試料を形成する段階と、
（ｃ）前記インキュベーションされた試料を照射し、照射された試料を形成する段階と、
（ｄ）前記照射された試料からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、試料のｐＨを測定する方法であって、
前記蛍光性発光が前記試料のｐＨを測定するために使用される方法。
【請求項４０】
前記試料が細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料が、生細胞、細胞内液、細胞外液、血清、生体液、生物学的発酵培地、環境試料、工業試料、タンパク質、ペプチド、緩衝液、生体液もしくは化学反応器、血液細胞、免疫細胞、培養細胞、筋肉組織、ニューロン、細胞外小胞、脈管組織、血液、唾液、尿、水、土壌、廃水、海水、薬剤、食品または飲料を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記試料が、ポリマー膜上、ポリマーゲル内、微小粒子上、マイクロアレイ上、シリコンチップ上、スライドガラス上、マイクロウェルプレート上、および微小流体チップ上に固定化されている、請求項３９、請求項４０および請求項４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記接触させる段階が、前記試料を第２の色素と接触させることをさらに含む、請求項３９から請求項４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２の色素が、前記色素とまたは化合物と異なる蛍光性発光スペクトルを有しかつ前記化合物のｐＫａと異なるｐＫａを有するｐＨ感受性色素である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
生細胞内部のｐＨをモニターするための方法であって、
（ａ）前記細胞を請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｂ）前記接触させた細胞を、前記化合物が前記細胞に侵入するためにインキュベーションし、標識された細胞を形成する段階と、
（ｃ）前記標識された細胞を、蛍光が測定される適切な波長を用いて照射し、それによって前記細胞内部のｐＨをモニターする段階と
を含む、方法。
【請求項４６】
前記細胞内部のｐＨの変化が細胞プロセスに対応する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物がタンパク質、核酸または脂質に結合されている、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞がニューロンである、請求項４５、請求項４６および請求項４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）担体分子を蛍光性ｐＨ感受性色素に結合し、担体結合体を形成する段階と、
（ｂ）前記担体結合体を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｃ）前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
（ｄ）前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
（ｅ）前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、溶液中の担体分子の食作用を検出するための方法であって、
蛍光性発光が前記担体分子の食作用を示す方法。
【請求項５０】
前記担体分子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生体粒子である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記色素が、請求項１から請求項３８のいずれか一項で特許請求される色素である、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）請求項１から請求項３８にいずれか一項に記載の化合物を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、
（ｂ）前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、
（ｃ）前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、
（ｄ）前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階と
を含む、ｐＨに関連する細胞プロセスを検出する方法であって、
蛍光性発光の増加が前記細胞プロセスの活性化を示す方法。
【請求項５３】
前記細胞プロセスがイオンチャネルの開口である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記イオンチャネルがカルシウムチャネルである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物を細胞の集団と接触させ、接触させた細胞集団を形成する段階と、
前記接触させた細胞集団を、前記化合物が標的細胞に侵入するのに十分な時間インキュベーションし、それによってインキュベーションされた細胞集団を形成する段階と、
前記インキュベーションされた細胞集団を照射する段階と
を含む、前記標的細胞が集団内の隣接する細胞とは異なって標識される、前記細胞の集団内の標的細胞を同定する方法であって、
前記標的細胞が、前記集団内の隣接する細胞と異なる標識によって同定される、方法。
【請求項５６】
前記標的細胞が神経細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記異なる標識が蛍光の増加を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１０から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、
（ａ）式ＩＩＡ：
2010508295.tif 000008
の化合物を、式ＩＩＣ：
2010508295.tif 000009
の化合物と接触させ、前記標的化合物を形成する段階を含む方法。
【請求項５９】
式ＩＩＡの化合物を合成する段階をさらに含む、請求項５８に記載の方法であって、該方法が、
（ｂ）式ＩＩＢ：
2010508295.tif 000010
の化合物を塩素化剤、例えば塩化オキサリルと接触させ、式ＩＩＡの化合物を形成する段階を含む、方法。
【請求項６０】
請求項１５から請求項１７のいずれか一項に記載の化合物または請求項１５に直接的もしくは間接的に従属する場合には請求項２２から請求項３６のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、
（ａ）式ＩＶＡ：
2010508295.tif 000011
の化合物を、式ＩＶＢ：
2010508295.tif 000012
および／またはＩＶＣ：
2010508295.tif 000013
の化合物、ならびに２，３，５，６−テトラクロロシクロヘキサ−２，５−ジエン−１，４−ジオン（クロラニル）、およびＢＦ３・Ｅｔ２Ｏと接触させ、前記標的化合物を形成する段階を含む方法。
【請求項６１】
請求項１８から請求項２１のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１８に直接的もしくは間接的に従属する場合には請求項２２から請求項３６のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法であって、
（ａ）式ＶＡ：
2010508295.tif 000014
の化合物をＰ（ＯＥｔ）３と接触させ、前記標的化合物を形成する段階を含む方法。
【請求項６２】
式ＶＡの化合物を合成する段階をさらに含む、請求項６１に記載の方法であって、該方法が、
（ａ）式ＩＶＡ：
2010508295.tif 000015
の化合物を式ＶＢ：
2010508295.tif 000016
の化合物と接触させ、式ＶＡの化合物を形成する段階を含む、方法。
【請求項６３】
（ａ）請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物と、
（ｂ）検体と
を含む、組成物。
【請求項６４】
前記検体が細胞であり、前記化合物が前記細胞内部に位置する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記検体がタンパク質、脂質または核酸である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６６】
前記化合物が担体分子に結合されている、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
試料のｐＨを測定するためのキットであって、
（ａ）請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物と、
（ｂ）前記試料のｐＨを測定するための指示書と
を含むキット。
【請求項６８】
緩衝剤、精製培地、前記試料を含むバイアル、または有機溶媒のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
任意で、生細胞に関する、または生物学的実体もしくは物質、例えば生細胞、細胞内液、細胞外液、体液、血清、発酵培地、細胞培養液、もしくは組織を含むかまたは含むと思われる試料における、請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物のｐＨセンサーとしての使用。
【請求項７０】
バイオアッセイ法における、請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の化合物の使用。