【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年8月30日(2011.8.30)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポジティブに形質転換された細胞を選択する方法であって：
（ａ）内因性細胞生存タンパク質の活性を欠く真核細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞生存タンパク質または少なくともその機能的部分をコードする核酸構築物で該真核細胞を形質転換する工程；および
（ｃ）細胞の生存度が該細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような条件下で、該核酸構築物で形質転換した該真核細胞を培養し、それによって、ポジティブに形質転換された細胞を選択する工程
を包含し、該細胞生存タンパク質がガラクトキナーゼ１であり、該真核細胞が哺乳動物細胞であり、該核酸構築物がさらに目的のタンパク質をコードしており、かつ該細胞生存タンパク質をコードする核酸と該目的のタンパク質をコードする核酸とがバイ−シストロン性配置にある方法。
【請求項２】
前記目的のタンパク質が、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、細胞外タンパク質、細胞接着タンパク質および細胞シグナル伝達タンパク質からなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記増殖因子が、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インターフェロンγおよび血小板由来増殖因子からなる群より選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ホルモンが、プロラクチン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、レプチン、成長ホルモン、インスリンおよびＣＧ−βからなる群より選択される請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記サイトカインが、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０およびＩＬ−１９からなる群より選択される請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記細胞外タンパク質が、フィブリノーゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビメンチン、微小管結合タンパク質１ｂ、神経突起伸長因子（ＮＯＦ）、細菌セルロース（ＢＣ）およびラミニンからなる群より選択される請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記細胞接着タンパク質が、インテグリン、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）１、Ｎ−ＣＡＭ、カドヘリン、テネイシン、ギセリンおよび神経損傷誘導タンパク質２（ニンジュリン２）を含む細胞接着タンパク質からなる群より選択される請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記細胞シグナル伝達タンパク質が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、核因子κＢ、Ｒａｆキナーゼインヒビタータンパク質（ＲＫＩＰ）、Ｒａｆ−１、ＭＥＫ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ホスホイノシチド−３−キナーゼγ、チロシンキナーゼ受容体、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質、カベオリン−３、および１４−３−３タンパク質からなる群より選択される請求項２記載の方法。
【請求項９】
前記核酸構築物が配列番号３に示される核酸配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞生存タンパク質がガラクトキナーゼ１であるのに対して、前記培養する工程がＤ−ガラクトースの存在下で達成される請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｄ−ガラクトースの濃度が０．０１〜１０ｍＭの範囲から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｄ−ガラクトースの濃度が０．２５ｍＭである請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
細胞の生存度が細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような培養条件下で、該細胞生存タンパク質および目的のタンパク質を発現するように遺伝的に改変された細胞を含む細胞毒性のない真核細胞培養物であって、該細胞生存タンパク質がガラクトキナーゼ１であり、該真核細胞が哺乳動物細胞であり、かつ該細胞生存タンパク質をコードする核酸と該目的のタンパク質をコードする核酸とがバイ−シストロン性配置にある細胞培養物。
【請求項１４】
前記目的のタンパク質が、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、細胞外タンパク質、細胞接着タンパク質および細胞シグナル伝達タンパク質からなる群より選択される請求項１３記載の細胞培養物。
【請求項１５】
前記増殖因子が、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インターフェロンγおよび血小板由来増殖因子からなる群より選択される請求項１４記載の細胞培養物。
【請求項１６】
前記ホルモンが、プロラクチン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、レプチン、成長ホルモン、インスリンおよびＣＧ−βからなる群より選択される請求項１４記載の細胞培養物。
【請求項１７】
前記サイトカインが、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０およびＩＬ−１９からなる群より選択される請求項１４記載の細胞培養物。
【請求項１８】
前記細胞外タンパク質が、フィブリノーゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビメンチン、微小管結合タンパク質１ｂ、神経突起伸長因子（ＮＯＦ）、細菌セルロース（ＢＣ）およびラミニンからなる群より選択される請求項１４記載の細胞培養物。
【請求項１９】
前記細胞接着タンパク質が、インテグリン、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）１、Ｎ−ＣＡＭ、カドヘリン、テネイシン、ギセリンおよび神経損傷誘導タンパク質２（ニンジュリン２）を含む細胞接着タンパク質からなる群より選択される請求項１４記載の細胞培養物。
【請求項２０】
前記細胞シグナル伝達タンパク質が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、核因子κＢ、Ｒａｆキナーゼインヒビタータンパク質（ＲＫＩＰ）、Ｒａｆ−１、ＭＥＫ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ホスホイノシチド−３−キナーゼγ、チロシンキナーゼ受容体、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質、カベオリン−３および１４−３−３タンパク質からなる群より選択される請求項１４記載の細胞培養物。
【請求項２１】
前記培養条件がＤ−ガラクトースを含む請求項１３記載の細胞培養物。
【請求項２２】
前記Ｄ−ガラクトースの濃度が０．０１〜１０ｍＭの範囲から選択される請求項２１記載の細胞培養物。
【請求項２３】
前記Ｄ−ガラクトースの濃度が０．２５ｍＭである請求項２１記載の細胞培養物。
【請求項２４】
目的のタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）目的のタンパク質および細胞生存タンパク質または少なくともその機能的部分をコードする核酸構築物で、内因性細胞生存タンパク質の活性を欠く真核細胞を形質転換する工程；
（ｂ）細胞の生存度が該細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような条件下で、該核酸構築物で形質転換された該真核細胞を培養し、それによって、ポジティブに形質転換された真核細胞を選択する工程；および
（ｃ）該ポジティブに形質転換された真核細胞またはその培養培地から、目的のタンパク質を精製する工程
を包含し、該細胞生存タンパク質がガラクトキナーゼ１であり、該真核細胞が哺乳動物細胞であり、かつ該細胞生存タンパク質をコードする核酸と該目的のタンパク質をコードする核酸とがバイ−シストロン性配置にある方法。
【請求項２５】
前記目的のタンパク質が、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、細胞外タンパク質、細胞接着タンパク質および細胞シグナル伝達タンパク質からなる群より選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記増殖因子が、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インターフェロンγおよび血小板由来増殖因子からなる群より選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ホルモンが、プロラクチン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、レプチン、成長ホルモン、インスリンおよびＣＧ−βからなる群より選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記サイトカインが、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０およびＩＬ−１９からなる群より選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞外タンパク質が、フィブリノーゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビメンチン、微小管結合タンパク質１ｂ、神経突起伸長因子（ＮＯＦ）、細菌セルロース（ＢＣ）およびラミニンからなる群より選択される請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞接着タンパク質が、インテグリン、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）１、Ｎ−ＣＡＭ、カドヘリン、テネイシン、ギセリンおよび神経損傷誘導タンパク質２（ニンジュリン２）を含む細胞接着タンパク質からなる群より選択される請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞シグナル伝達タンパク質が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、核因子κＢ、Ｒａｆキナーゼインヒビタータンパク質（ＲＫＩＰ）、Ｒａｆ−１、ＭＥＫ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ホスホイノシチド−３−キナーゼγ、チロシンキナーゼ受容体、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質、カベオリン−３および１４−３−３タンパク質からなる群より選択される請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸構築物が配列番号３に示される核酸配列を含む請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
前記培養する工程がＤ−ガラクトースの存在下で達成される請求項２４記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｄ−ガラクトースの濃度が０．０１〜１０ｍＭの範囲から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｄ−ガラクトースの濃度が０．２５ｍＭである請求項３３記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
以下の実施例の節の実施例１〜３において示されるように、ＲＦＣ遺伝子およびレポーター遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰ）を含むバイ−シストロン性発現ベクターを用いる、還元型葉酸塩キャリア（ＲＦＣ）−欠損細胞の同時トランスフェクション、続いて、ロイコボリン（還元型葉酸）の濃度の段階的減少は、ＲＦＣ遺伝子の過剰発現、およびいかなる細胞毒性薬物も含まない培地中でのレポーター遺伝子の有意な発現を生じた。さらに、以下の実施例の節の実施例１、２、および４に示されるように、ＧａｌＫ１遺伝子およびレポーター遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰ）を含むバイ−シストロン性発現ベクターを用いる、ＧａｌＫ１−欠損細胞の同時トランスフェクション、続いて、単独のヘキソース源として、５ｍＭ  Ｄ−ガラクトースを含む増殖培地中での選択は、いかなる細胞毒性薬物も非存在下でのＧａｌＫ１タンパク質およびＥＧＦＰタンパク質の過剰発現を生じた。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９１】
細胞生存タンパク質および目的のタンパク質をコードする核酸配列が、本明細書の核酸構築物中で同じ転写調節下に配置される場合（たとえば、バイ−シストロン性ベクターを使用して）、同様のレベルの発現が、トランスフェクトされた細胞中の両方の核酸配列から予測されることが認められる。従って、高レベルの細胞生存タンパク質を発現する細胞は、同様のレベルの目的のタンパク質を発現するようである。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３５】
ＲＦＣ遺伝子を使用する永続的選択の実験設計−ＲＦＣ永続的選択アプローチの最初の段階は、ＲＦＣ欠損ＣＨＯ細胞の樹立を必要とする。細胞は、葉酸を輸送する能力を欠くことが判明した後で、これらは、バイ−シストロン性配置においてヒトＲＦＣ遺伝子に連結されたレポーター遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰ）を有する発現ベクターでトランスフェクトする（図６におけるフローチャートを参照のこと）。トランスフェクト細胞は、ＲＦＣ発現細胞を選択するために、選択葉酸濃度下で（単独の葉酸源としての還元型ロイコボリン）Ｇ４１８中で増殖させる。トランスフェクト細胞が、十分な量の還元型葉酸を内在化すること、および葉酸欠乏条件下で生存することを可能にするために、ｈＲＦＣの発現レベルは高くあるべきである。一旦、安定なトランスフェクト細胞プールが樹立されると、ロイコボリン濃度は次第に減少し、ＧＦＰの発現は、毒性選択の非存在下で、発現の安定性を評価するためにＧ４１８の除去の際に続く。これらの条件下で、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現は、時間の経過とともに安定して維持されるはずであることが予測される。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３６】
ＧａｌＫ１遺伝子を使用する永続的選択の実験設計−ガラクトキナーゼ欠損細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５７）は、バイ−シストロン性配置においてヒトＧａｌＫ１遺伝子（Stambolianら、1995）に連結されたレポーター遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰ）を有する発現ベクターでトランスフェクトする（図７におけるフローチャートを参照のこと）。トランスフェクト細胞は、ＧａｌＫ１発現細胞を選択するために、選択ガラクトース濃度下で（単独のヘキソース源としての５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース）Ｇ４１８中で増殖させる。一旦、安定なトランスフェクト細胞プールが樹立されると、Ｄ−ガラクトース濃度は次第に減少し、次いで、ＧＦＰの発現は、毒性選択の非存在下で、発現の安定性を評価するためにＧ４１８の除去の際に続く。これらの条件下で、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現は、時間の経過とともに安定して維持されるはずであることが予測される。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４３】
安定な形質転換体の樹立
ｈＲＦＣ−ＥＧＦＰ−対数増殖期の単層Ｃ５Ｒ０．１５細胞（２×１０7細胞）は、標準的なトリプシン処理プロトコールによって脱着させたのに対して、懸濁液中で増殖させたＣＨＯ−Ｓ細胞は、遠心分離によって収集した。次いで、細胞を、ｈＲＦＣ遺伝子またはｈＲＦＣ−ＨＡ遺伝子をコードする、ＥＧＦＰベースの１０μｇのバイ−シストロン性発現ベクターを使用して、エレクトロポレーション（１０００マイクロファラド、２３４Ｖ、Rothemら、2003）によってトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、１０％透析ＦＣＳで補充し、単独の葉酸源として２ｎＭロイコボリンを含む、葉酸を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に移し、３７℃で４８時間増殖させた。次いで、細胞を、葉酸を欠き、１０％透析ウシ胎仔血清を補充し、４５０μｇ／ｍｌまたは６００μｇ／ｍｌのいずれかのＧ−４１８（カルビオケム−ノババイオケム、サンディエゴ、ＣＡ）および単独の葉酸源としての２ｎＭ  ロイコボリンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に移した。６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８＋２ｎＭ  ＬＣＶの存在下で５週間後、細胞をよりストリンジェントな選択に供し、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８の定常濃度の存在下で、１、０．５、および０．２５ｎＭロイコボリンに並行して移した。細胞を、これらの選択条件下で少なくとも１ヶ月間増殖させ、その時点で、細胞を、Ｇ−４１８の非存在下または存在下でさらに増殖させた。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４４】
ｈＧＡＬＫｌ−ＥＧＦＰ−対数増殖期のＧａｌＫ１欠損単層細胞（２×１０7細胞）を、標準的なトリプシン処理プロトコールによって脱着させた。次いで、細胞を、ＧａｌＫ１遺伝子をコードする、ＥＧＦＰベースの１０μｇのバイ−シストロン性発現ベクターを使用して、エレクトロポレーション（１０００マイクロファラド、２３４Ｖ）（Rothemら、2003）によってトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、１０％透析ウシ胎仔血清で補充し、５ｍＭまたは２ｍＭのいずれかのＤ−ガラクトースを含む、グルコースを含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に移し、３７℃で２４時間増殖させた。次いで、細胞を、グルコースを欠き、１０％透析ウシ胎仔血清を補充した、３００、４５０または６００μｇ／ｍｌのいずれかのＧ−４１８を含み、５ｍＭまたは２ｍＭのいずれかのＤ−ガラクトースを有するＲＰＭＩ−１６４０培地（６つの独立したプール）に移した。３日後、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８＋５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース中で増殖している培養物を分割し、よりストリンジェントなＤ−ガラクトースおよび／またはＧ−４１８選択に、以下のように移した：１ｍＭ  Ｄ−ガラクトース＋６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８；  ０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース＋３００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８；  ０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ａｌｏｎｇ）＋７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８。ストリンジェントな条件で４０日後、０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース＋７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８で増殖している培養物を、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８の存在下または非存在下で、０．２５ｍＭまたは０．１ｍＭ  Ｄ−ガラクトースを含む培地中にさらに配置した。これらの培養物は、分析の前に、少なくとも５週間増殖させた。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６３】
レポーター遺伝子発現に対するロイコボリンの効果−ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現に対する減少するロイコボリン濃度の効果。減少濃度のロイコボリン（０．２５〜２ｎＭ）の存在下でのＧ−４１８（６００μｇ／ｍｌ）において増殖したＣ５  Ｒ０．１５  ＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体のフローサイトメトリー分析は、非トランスフェクトコントロール細胞と比較して、ＥＧＦＰ蛍光の１００倍の増加を示した（図１２）。同様に、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８および２ｎＭまたは１０ｎＭロイコボリンの存在下で増殖したｈＲＦＣ  ＣＨＯ−Ｓ  Ｒ０．１５は、選択マーカーとしてのＲＦＣまたはＲＦＣ−ＨＡ、および第２のシストロンとしてのＥＧＦＰをコードするバイ−シストロン性ベクターを用いるトランスフェクション後に、ＥＧＦＰ蛍光の〜１０倍増加を示した（図１３）。これらの結果は、ロイコボリン選択の有効性を示し、上流の遺伝子、ＲＦＣまたはＲＦＣ−ＨＡが、これらの形質転換細胞において高いレベルで発現されることを示唆する。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８０】
【図１】還元型葉酸塩の代謝を示す概略図である。ＰＲＰＰ：５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸；ＧＡＲ−ＴＦａｓｅ：グリシンアミドリボヌクレオチドトランスフォーミラーゼ；ＡＩＣＡＲ−ＴＦａｓｅ：５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドトランスフォーミラーゼ；ＭＲＰ−１：多剤耐性タンパク質１；ＴＳ：チミジル酸シンターゼ；ＩＭＰ：イノシン一リン酸；ＴＳ−チミジル酸シンターゼ；ＤＨＦＲ：ジヒドロ葉酸還元酵素；ＲＦＣ：還元型葉酸塩キャリア。
【図２】葉酸代謝の代謝拮抗阻害を示す概略図である。ＲＦＣを介して細胞に入る葉酸代謝阻害剤は、緑色で印を付けている；細胞膜を介して拡散によって細胞に入る葉酸代謝阻害剤は、茶色で印を付けている；阻害されるタンパク質には赤色で印を付けている。ＭＴＸ−メソトレキサート；ＭＴＡ：複数を標的とする抗葉酸剤；ＥＤＸ：エダトレキサート；ＡＭＴ：アミノペトリン；ＴＭＱ：トリメトレキサート；ＤＤＡＴＨＦ：５，１０−ジデアザ−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸。
【図３】葉酸（ａ）およびＭＴＸ（ｂ）の化学式を示す概略図である。
【図４】ｈＲＦＣについてのトポロジーモデルを示す概略図である。ｈＲＦＣについてのこのトポロジーモデルは、１２個の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、内側に配向しているＮ末端およびＣ末端、ならびにＡｓｎ５８で外側に配向しているＮグリコシル化部位を示す。ｈＲＦＣ一次配列における１１個のシステイン残基の位置もまた示す。Ｃ末端の５６個のアミノ酸は、４個のシステイン残基を含む（CaoおよびMatherly, 2003から採用）。
【図５】グルコース−６−リン酸へのグルコースの代謝的変換を示す概略図である。
【図６】ＲＦＣ遺伝子を用いる永続的選択ストラテジーを示す概略図である。（１）ＲＦＣ−細胞の単離のためのＭＴＸを用いる処理；（２）バイ−シストロン性配置でｈＲＦＣ遺伝子に連結されたＥＧＦＰ（レポーター遺伝子）を有する発現ベクターを用いるトランスフェクション；（３）還元型葉酸塩（ロイコボリン）およびＧ４１８の選択濃度での増殖；（４）Ｇ４１８の非存在下でのロイコボリンの選択濃度での高発現レベルの維持−非毒性永続的選択；本研究においてはＧＦＰを目的遺伝子として使用した。
【図７】Ｇａｌｋ１遺伝子を用いる永続的選択ストラテジーを示す概略図である。（１）バイ−シストロン性配置でヒトＧａｌＫ１遺伝子に連結されたＥＧＦＧ（レポーター遺伝子）を有する発現ベクターを用いるトランスフェクション；（２）グルコースの非存在下かつ選択ガラクトース濃度およびＧ４１８の選択濃度での増殖；（３）Ｇ４１８の非存在下での選択ガラクトース濃度での高発現レベルの維持；非毒性永続的選択；本研究においてはＧＦＰを目的遺伝子として使用した。
【図８】ＲＦＣ機能を喪失したＣＨＯ−Ｓ細胞における、Ｆ−ＭＩＸ蛍光の抗葉酸剤による置き換えを示すＦＡＣＳ分析である。ＣＨＯ−ＳおよびＲＦＣ欠損ＣＨＯ−Ｓ細胞（１５０ｎＭ  ＭＴＸへの曝露によって樹立したＣＨＯ−ＳＲ０．１５）を、Ｆ−ＭＴＸ（蛍光性ＭＴＸアナログ）で染色し、その後、細胞を種々の濃度のＭＴＸまたはＴＭＱ（トリメトレキサート、その実体についてはＲＦＣ非依存性である脂溶性抗葉酸剤）とともにインキュベートした。Ｆ−ＭＴＸの置き換えは、機能的に活性なＲＦＣを示す。ＣＨＯ−ＳＲ０．１５の１００ｎＭ  ＭＴＸ濃度を用いる競合後のＦ−ＭＩＸ蛍光の保持は、ＭＴＸ輸送の欠損、すなわち、ＲＦＣ機能の喪失を示唆する。
【図９】ＲＦＣ機能を喪失したＣＨＯ  ＡＡ８細胞における、Ｆ−ＭＩＸ蛍光の抗葉酸剤による置き換えを示すＦＡＣＳ分析である。野生型ＣＨＯ  ＡＡ８細胞およびＲＦＣ欠損クローンＣ４およびＣ５を、Ｆ−ＭＴＸ（蛍光性ＭＴＸアナログ）で染色し、その後、細胞を種々の濃度のＭＴＸまたはＴＭＱ（その実体についてはＲＦＣ非依存性である脂溶性抗葉酸剤）に供した。Ｆ−ＭＴＸの置き換えは、機能的に活性なＲＦＣを示す。高濃度ＭＴＸを用いる競合後のＦ−ＭＩＸ蛍光の保持は、ＭＴＸ輸送の欠損、すなわち、ＲＦＣ機能の喪失を示す。
【図１０】親の細胞またはＣＨＯ−ＳＲ０．１５細胞のＴＭＱ過敏性を図示する棒グラフである。細胞は、増殖培地および種々の濃度のＴＭＱの存在下で３日間インキュベートし、細胞の生存およびＴＭＱの５０％阻害濃度を決定した。親のＣＨＯ細胞と比較した場合のＣＨＯ−ＳＲ０．１５細胞の８倍の過敏性に注目のこと。
【図１１】抗葉酸剤耐性亜系統におけるＭＴＸ輸送の喪失を示す棒グラフである。［3Ｈ］ＭＴＸ輸送速度は、親の細胞および抗葉酸剤耐性細胞において決定した。細胞は、２μＭ  ＭＴＸとともに３分間インキュベートし、その後、放射性標識されたＭＴＸの取り込みのレベルをシンチレーション計数によって決定した。ＣＨＯ−Ｓ−Ｒ０．０４およびＣＨＯ−Ｓ−Ｒ０．１２は、それぞれ、４０ｎＭおよび１２０ｎＭまでのＭＴＸに対する細胞の段階的曝露によって得られたＣＨＯ−Ｓ  ＲＦＣ欠損細胞である。Ｃ４およびＣ５は、１５０ｎＭ  ＭＴＸを用いる処理によって得られたＣＨＯ  ＡＡ８クローンである。ＣＨＯ  Ｓ  ＭＴＸＲ細胞ならびにＣＨＯ  Ｃ４細胞およびＣ５細胞における［3Ｈ］ＭＴＸの乏しい輸送は、ＲＦＣ機能の喪失を示すことに注目のこと。
【図１２】ＲＦＣ−ＨＡでトランスフェクトされたＣＨＯ  Ｃ５細胞におけるＥＧＦＰ発現を示すＦＡＣＳ分析である。非トランスフェクトＣＨＯ  Ｃ５細胞およびそれらのＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体のフローサイトメトリー分析は、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および０．２５〜２μＭ  ロイコボリン（ＬＣＶ）を含む培地中で６週間、二重に選択した。トランスフェクトされた細胞は、すべてのロイコボリン濃度において、均質にＥＧＦＰを発現するように見えた。
【図１３】ＲＦＣおよびＲＦＣ−ＨＡでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞におけるＥＧＦＰ発現を示すＦＡＣＳ分析である。非トランスフェクトＣＨＯ−ＳＲ０．１５細胞ならびにそれらのＲＦＣまたはＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体のＥＧＦＰ蛍光の代表的なフローサイトメトリー分析は、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および２〜１０ｎＭ  ロイコボリンを含む培地中で２週間、二重に選択した。ＣＨＯ−ＳＲ０．１５トランスフェクト集団は均質であり、非トランスフェクト細胞と比較して５〜１０倍のＥＧＦＰ蛍光の増加を示した。
【図１４】トランスフェクトされたＣＨＯ  Ｃ５細胞におけるＲＦＣ−ＨＡの発現を示すウェスタンブロット分析である。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００可溶性タンパク質を、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８および２ｎＭロイコボリンを含む増殖培地中で４週間増殖したＣＨＯ  Ｃ５（−）細胞およびそれらのＲＦＣ−ＨＡ形質転換体（＋）から最初に抽出した。次いで、タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ナイロンメンブレンに転写し、そしてＨＡタグに対するモノクローナル抗体とともに反応させた。メンブレンを、標準増強化学発光（standard enhanced chemiluminescence）  （ＥＣＬ）手順を使用して発色させた。ＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト細胞におけるＨＡタグの特異的発現に注目のこと。
【図１５】ＲＦＣトランスフェクション細胞におけるＭＴＸ増殖阻害を示すグラフである。Ｃ５Ｒ０．１５細胞（ＲＦＣ欠損）およびそれらのＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体に対するＭＴＸの細胞毒性を示す。細胞は、種々の濃度のＭＴＸで３日間インキュベートし、その後、細胞の生存をトリパンブルー排除を使用して測定し、そして５０％阻害濃度を決定した（矢印によって示す）。ＲＦＣとＲＦＣ−ＨＡの両方のトランスフェクト体においてＭＴＸ感度が１００倍増加することに注目のこと。
【図１６】は、ＲＦＣの免疫蛍光染色を示す蛍光画像である。Ｃ５の親の細胞またはＣ５  ＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト細胞は１ｎＭロイコボリンの存在下で培養し、６００ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を免疫蛍光染色に供した。細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、溶解緩衝液で処理し、そしてヘマグルチニン（ＨＡ）タグに対するＭＡｂで染色し、続いてフルオレセイン結合体化二次抗体で染色した。Ｄａｐｉ核酸染色は細胞核を示す。ａ〜ｃ−トランスフェクトしていないＣ５細胞（ＲＦＣ−、ネガティブコントロール）；ｄ〜ｇ−ＲＦＣ−ＨＡ  Ｃ５細胞。グリーン蛍光染色は、トランスフェクトしていないＣ５細胞（ｃ）と比較して、ＲＦＣ−ＨＡ  Ｃ５トランスフェクト細胞（ｆおよびｇ）において、ＨＡ免疫染色後に観察されたことに注目のこと。ｇは、ｆの染色された細胞の拡大を示す。
【図１７】は、選択増殖条件下でのｈＲＦＣトランスフェクト細胞の増殖を示すグラフである。２×１０５細胞を３０ｍｍペトリディッシュ中で播種した（５ｍｌ培地／ディッシュ）。培地の交換なしで、全体で４日間、細胞濃度を毎日測定した。ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体は、０．６ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で、またはＧ４１８が３週間の間除去された後で、透析ＦＢＳ、１または２ｎＭロイコボリン（ＬＣＶ）を含む選択培地中で増殖させた。選択培地中では増殖することができなかった、親のＲＦＣ−ＡＡ８細胞およびＣ５細胞は、２．３μＭ葉酸を含み、かつ１０％  ＦＢＳを補充した非選択培地（ＲＰＭＩ）中で増殖させた。ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体の倍加時間は〜２８時間であった。
【図１８】ＲＦＣを用いる永続的選択条件下でのＥＧＦＰ発現の安定性を示すＦＡＣＳ分析である。ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクトＣ５細胞における増強したグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のフローサイトメトリー分析を示す。ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体は、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で、またはＧ４１８の除去後に、透析ＦＢＳ、１または２ｎＭロイコボリン（ＬＣＶ）を含む選択培地中で増殖させた。選択培地中では増殖することができなかった、親のＲＦＣ−Ｃ５細胞（ネガティブコントロール）は、２．３μＭ葉酸を含み、かつ１０％  ＦＢＳを補充した非選択培地中で増殖させた。
【図１９】Ｇａｌｋ１を用いる永続的な選択条件下でのＥＧＦＰ発現の安定性を示すＦＡＣＳ分析である。ｈＧａｌ−Ｋ１−ＥＧＦＰバイ−シストロン性ベクターでトランスフェクトし、Ｇ−４１８の非存在下または存在下、ミリモル濃度以下のガラクトース濃度での選択下で、３週間（ａ）または２ヶ月間（ｂ）増殖させた、ガラクトキナーゼ欠損チャイニーズハムスター細胞におけるＥＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を示す。ガラクトキナーゼ欠損細胞は、非選択培地中で増殖させた。
【図２０】選択増殖条件下でＧａｌＫ１トランスフェクト細胞の増殖を示すグラフである。２×１０5細胞を３０ｍｍペトリディッシュ中で播種した（５ｍｌ培地／ディッシュ）。培地の交換なしで、全体で４日間、細胞濃度を毎日測定した。ＧａｌＫ１トランスフェクト体は、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で、またはＧ４１８が３週間の間除去された後で、選択培地（１０％透析ＦＢＳ、０．２５〜０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトースで補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で増殖させた。親のガラクトキナーゼ欠損チャイニーズハムスター細胞は、非選択培地（５ｍＭ  Ｄ−グルコースを含み、かつ１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で増殖させた。選択培地中でのＧａｌＫ１トランスフェクト体の倍加時間は〜２８時間であった。