(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株。
【請求項２】
第１項に記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株の培養物。
【請求項３】
第１項に記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株、又は第２項に記載の前記菌株の培養物を含む、プロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）製剤。
【請求項４】
第１項に記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株、第２項に記載の前記菌株の培養物、又は第３項に記載のプロバイオティクス製剤を含む、飼料添加剤。
【請求項５】
第１項に記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株、第２項に記載の前記菌株の培養物、第３項に記載のプロバイオティクス製剤、又は第４項に記載の飼料添加剤を含む飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たなバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株及びこれを含むプロバイオティクス製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、バイオ燃料の生産と新興国の経済成長による穀物需要の増加、農地の減少、原油価格の急騰などにより国際穀物価格が上昇の一途をたどっている。国際穀物価格の上昇は国内の配合飼料価格の上昇をもたらし、畜産農家の経営に大きく打撃を与えている。このような理由により家畜の生長促進と飼料穀物の効率的利用を図るため、プロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）、プリバイオティンクス（Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）、酵素剤などに関する研究が盛んに行われている。
【０００３】
一般的に飼料穀物には、難消化性炭水化物、即ち、セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ヘミセルロース（Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅｓ）、リグニン（Ｌｉｇｎｉｎ）が多く含まれている。難消化性炭水化物は消化器官の機能を変形させて、家畜に消化抑制や軟便・赤痢をもたらす。このような問題を解決するため、難消化性炭水化物の分解を目的とする様々な飼料用の酵素剤が多く用いられている。
【０００４】
セルロースを加水分解できるセルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、ヘミセルロースの主要構成成分であるキシラン（Ｘｙｌａｎ）とこれと結合されたリグニンを分解するキシラナーゼ（Ｘｙｌａｎａｓｅ）は飼料添加用の酵素として多く用いられて、穀物飼料の家畜の腸内利用性を高めることにより飼料効率を向上することと（Ｂｅｇｕｉｎ ａｎｄ Ａｕｂｅｒｔ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １３：２５−５８， １９９４）、畜産糞尿の堆肥化を促進することが知られている（キムテイル外、韓国微生物学会誌 ３５（４）：２７７−２８２， １９９９）。
【０００５】
マンナナーゼ（Ｍａｎｎａｎａｓｅ）は、ヘミセルロースを構成する主要成分であるマンナン（Ｍａｎｎａｎ）含有物質を分解する酵素である。大豆タンパク質は、豚、鶏などの家畜飼料として用いられるが、マンナーゼは大豆粕のエネルギー源となる炭水化物の中でガラクタン（Ｇａｌａｃｔａｎ）を分解し単胃動物の代謝を容易にする。
【０００６】
最近上述のような酵素を生産する菌株を活用しプロバイオティクスとして利用しようとする努力がなされている。
【０００７】
プロバイオティクスは、腸内微生物の均衡に役立つ微生物、抗菌活性、及び／又は、酵素活性を有する微生物とこれらが生産する生産物を含む概念である（Ｆｕｌｌｅｒ， Ｒ． Ｊ Ａｐｐｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ６６（５）：３６５−３７８， １９８９）。
【０００８】
前記のプロバイオティクスに関する先行技術には、下記のものがある。
韓国登録特許第１０−０３１８５５４号は中性セルラーゼを生産するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．Ｓｐ）７９−２３菌株、韓国登録特許第１０−１０６２３０９号はセルラーゼとキシラナーゼを分泌するバチルス・リケニフォルミスＤＫ４２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＫ４２）菌株ＫＡＣＣ９１４１０Ｐを開示している。また、韓国登録特許第１０−０４２６９３０号はアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼの酵素活性を有するバチルス・アミロリケファシエンスＢ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｂ４）菌株ＫＣＴＣ１８０８３Ｐを開示している。
【０００９】
しかしながら、このような先行技術には、セルラーゼ、及び／又は、キシラナーゼを分泌するバチルス種が開示されているだけで、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼの３つ全てを複合的に分泌する菌株及びこれを活用したプロバイオティクス製剤に関する技術は報告されてない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、複合消化酵素の生産能、耐酸性、耐胆汁性の優秀な、バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株の培養物を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株、又はその培養物を含む、プロバイオティクス製剤、飼料添加剤、飼料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のある実施様態において、複合消化酵素の生産能、耐酸性、耐胆汁性が優秀である新たなバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株が提供される。
【００１４】
本発明のさらなる実施様態において、前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株の培養物が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる実施様態において、前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株、又は前記菌株の培養物を含む、プロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）製剤が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる実施様態において、記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株、記載の前記菌株の培養物、又は前記プロバイオティクス製剤を含む、飼料添加剤が提供される。
本発明のさらなる実施様態において、記載の前記バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株、記載の前記菌株の培養物、前記プロバイオティクス製剤、又は前記飼料添加剤を含む飼料が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、複合消化酵素の生産能、耐酸性、耐胆汁性に優れた、新たなバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株又はその培養物を含むプロバイオティクス、飼料添加剤、飼料の提供により、家畜の消化力を向上させ家畜用飼料の効率を高めることと、腸内微生物の均衡と維持、及び／又は、抗菌活性を向上させ畜産業発展に寄与する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明のバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）菌株の電子顕微鏡写真である。
【図２】図２は、実施例１の候補菌株２種の時間により生長性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）の消化酵素活性を示す写真である。
【図４】図４は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）を人工胃液、又は人工胆汁により処理したときの生存率を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例６による飼料の消化率を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）の溶血性有無を示す写真である。
【図７】図７は、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）の１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
下記で、本発明に関してより詳しく説明する。本明細書に記載のない内容は、本発明の技術分野、又は類似分野の熟練者なら十分に認識と類推できるものであり、その説明を省略する。
【００２０】
本発明のある実施様態において、新たに分離したバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ１５０（ＫＣＣＭ１１２６８Ｐ）（以下、‘ＣＪＭＰＢ１５０’）菌株が提供される。
【００２１】
前記ＣＪＭＰＢ１５０、形態学的にグラム陽性桿菌し（図１参照）、１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１、図７）の分析結果、バチルス・サブチルスと９９％の相同性を有する菌株である。
【００２２】
前記ＣＪＭＰＢ１５０は、２０１２年３月２２日に、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘濟１洞３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ１１２６８Ｐとして寄託された。
【００２３】
前記ＣＪＭＰＢ１５０は、複合消化酵素の生産能力がある。
前記ＣＪＭＰＢ１５０が生産能を持つ消化酵素は、セルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、キシラナーゼ（Ｘｙｌａｎａｓｅ）、マンナナーゼ（Ｍａｎｎａｎａｓｅ）を含み、プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）、アミラーゼ（Ａｍｙｌａｓｅ）、リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ）からなる群より選ばれる少なくとも一つをさらに含むことができる。
【００２４】
前記ＣＪＭＰＢ１５０は、より好ましくはセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼを全て生産することができる。
【００２５】
前記ＣＪＭＰＢ１５０は、耐熱性に優れている。
より具体的に、前記ＣＪＭＰＢ１５０は、３７℃、２００ｒｐｍの条件で、２４時間培養して、９５℃で１０分間熱処理した後の内生胞子形成率が、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上である。
【００２６】
また、３７℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間培養して、９５℃で１０分間熱処理した後の内生胞子形成率が、好ましくは１００％である。
【００２７】
前記内生胞子は高温条件の環境だけではなく、紫外線、低温、乾燥、及び／又は、高圧などの極限環境に抵抗性を有し、内生胞子形成率が高くなるほど菌株の生存率が高くなる。
【００２８】
前記ＣＪＭＰＢ１５０は、耐酸性に優れている。
より具体的には、前記ＣＪＭＰＢ１５０はｐＨ２．５に調整した溶液にペプシン（Ｐｅｐｓｉｎ）を１％（ｗ／ｖ）で添加して製造された人工胃液を含む培地に３時間培養した後の生存率が、好ましくは８０％以上である。
【００２９】
前記ＣＪＭＰＢ１５０は、耐胆汁性に優れている。
より具体的には、前記ＣＪＭＰＢ１５０は１％（ｗ／ｖ）のパンクレアチン（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ）が含まれた人工胆汁を含有する培地に、３時間培養した後の生存率が、好ましくは８０％以上である。
【００３０】
本発明の新たに分離した菌株ＣＪＭＰＢ１５０は、通常的バチルス菌株の培養方法により培養することができる。前記ＣＪＭＰＢ１５０は、好ましくは２０ないし４０℃範囲の培養温度で１２時間ないし４日間培養して得ることができる。
【００３１】
本発明のさらなる実施様態において、前記ＣＪＭＰＢ１５０の培養物が提供される。
前記培養物は、前記ＣＪＭＰＢ１５０菌株を培養した培養培地、又は培養液、及び前記培養培地、又は培養液で培養したその結果物を含む概念であり、前記培養物は前記ＣＪＭＰＢ１５０菌株を含むことと含まないこともできる。
【００３２】
前記培養物は、その剤形が限定されなく、当該技術分野で通常的に利用される剤形であり得る。例えば、前記培養物は、液体又は固体であり得るし、培養物の原形状態、またはそれの濃縮や乾燥状態であり得る。
【００３３】
培養培地
本発明のＣＪＭＰＢ１５０を培養する培地として、天然培地、又は合成培地を用いることができる。
【００３４】
前記培地の炭素原は、特に限りはなく、当該技術分野で知られたものを利用することができる。前記炭素原の非制限的例として、グルコース、スクロース、デキストリン、グリセロール、又はデンプンなどを挙げることができる。これらは一つ、又は二つ以上を混合して使用できる。
【００３５】
前記培地の窒素原は、特に限りはなく、当該技術分野で知られているものを用いることができる。前記窒素原の非制限的として、ペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥された酵母、大豆、アンモニウム塩、硝酸塩及びその他の有機又は無機窒素を含む化合物などがある。これらは、一つ又は二つ以上を混合して用いることができる。
【００３６】
前記培地に含まれる無機塩は、特に限りはなく、当該技術分野で知られているものを用いることができる。前記無機塩の非制限的例として、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カルシウムなどがある。これらは、一つ又は二つ以上を混合して用いることができる。
【００３７】
本発明のＣＪＭＰＢ１５０の培養培地には、前記炭素原、窒素原、無機塩成分以外にも、アミノ酸、ビタミン、核酸、及び／又は、その他の一般的に培養培地に含まれる成分が添加できる。
【００３８】
培養液
本発明のＣＪＭＰＢ１５０菌株の培養液は、培養原液、または、前記培養原液から培養上澄液を除去した液、及び／又は、これらの濃縮液であり得る。前記培養液は前記ＣＪＭＰＢ１５０菌株を含むことができる。
【００３９】
前記培養液の組成は、特に限りはなく、通常的にバチルス菌株の培養に必要であると知られている成分だけでなく、バチルスの生長に上昇的に作用する成分をさらに含むこともでき、それによる組成は当該技術分野で通常の知識を有する者により容易に選択できる。
【００４０】
前記培養液は液状状態、又は乾燥状態であり得る。
前記培養液の乾燥方法は、特に限りはなく、当該技術分野の通常的方法が用いられる。前記乾燥方法の非制限的例として、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、又は凍結乾燥などがある。これらは一つ、又は二つ以上の方法を合わせて用いることもできる。
【００４１】
本発明のさらなる実施様態において、前記ＣＪＭＰＢ１５０菌株、又は前記菌株の培養物を含む、プロバイオティクス製剤が提供される。
【００４２】
前記プロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）は、人間や動物などの宿主の健康に有益な効果をもたらす微生物、又はその成分を意味するものであり、宿主の腸内の消化管の壁に定着し他の有害菌の定着と病原菌の増殖を抑制して、プロバイオティクスが生産する有益な消化酵素は栄養素の吸収と利用を容易にすると知られている。
【００４３】
本発明のプロバイオティクス製剤は、前記ＣＪＭＰＢ１５０菌株、及び／又は、前記菌株の培養物を含むものであり得る。
【００４４】
本発明のプロバイオティクスには、好ましくは前記ＣＪＭＰＢ１５０菌株が５×１０４ないし５×１０１０ＣＦＵ／ｍｌで含まれ、より好ましくは１×１０６ないし１×１０９ＣＦＵ／ｍｌで含まれる。
【００４５】
前記プロバイオティクス製剤は薬学的に許容される担体をさらに含むことができ、前記担体と共に製剤化して提供することができる。
【００４６】
前記薬学的に許容される担体は、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性・特性を阻害しない担体、又は希釈剤を意味する。
【００４７】
前記担体において、液状溶液として製剤化されるプロバイオティクス製剤に利用できる担体として、滅菌と生体に適合するものは、食塩水、滅菌水、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、又はグリセロールなどがある。これらは一つ、または二つ以上を混合して用いることもできるし、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、及び／又は、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することもできる。
【００４８】
また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び／又は、潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、又は錠剤に製剤化することができる。
【００４９】
本発明のプロバイオティクス製剤を有効成分として含む経口投与用の剤形は、特に限りはなく、当該技術分野で知られている剤形を用いることができる。前記経口投与用剤形の非制限的例として、錠剤、トローチ、ローゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性・油性懸濁液、調剤粉末、又は顆粒、エマルション、ハード・ソフトカプセル、シロップ、又はエリキシル剤などを挙げることができる。
【００５０】
前記錠剤又はカプセルなどの剤形に製剤化するため、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロース、又はゼラチンなどの結合剤、ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉、又はサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ナトリウムステアリルフマラート、又はポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油などを含むことができる。カプセル剤形の場合は上述の物質以外に脂肪油などの液体担体をさらに含むこともできる。
【００５１】
本発明のさらなる実施様態において、前記プロバイオティクス製剤を含む飼料添加剤が提供される。
【００５２】
本発明のＣＪＭＰＢ１５０菌株、及び／又は、その培養物が含まれたプロバイオティクス製剤は、飼料添加剤の形態で別途製造され家畜飼料に混合されることや、又は飼料製造のときに前記プロバイオティクス製剤を直接添加する方式により混合されることもできる。
【００５３】
前記飼料添加剤の形態は、特に限りはなく、好ましくは液状、又は乾燥状態であり、より好ましくは乾燥粉末の形態である。
【００５４】
前記乾燥粉末形のプロバイオティクス製剤の乾燥方法は、特に限りはなく、当該技術分野で知られた方法を用いることができる。前記乾燥方法の非制限的例として、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などを挙げることができる。これらは一つ、又は二つ以上の方法を合わせて用いることができる。
【００５５】
前記飼料添加剤は、本発明のＣＪＭＰＢ１５０、及び／又は、その培養物を含むプロバイオティクス製剤以外にも、飼料の保存性を高める他の添加剤をさらに含むことができる。
【００５６】
本発明の飼料添加剤にさらに含められる添加剤は、特に限りはなく、当該技術分野で知られたもとを用いることができる。前記添加剤の非制限的例として、飼料添加剤の品質低下を防止する決着剤、乳化剤、保存剤など；効用を増大させるアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、抽出剤、オリゴ糖などがあり、その他飼料混合剤などをさらに含むこともできる。これらは一つ、または二つ以上を混合して用いることができる。
【００５７】
本発明のプロバイオティクス製剤、又は飼料添加剤は、動物に単独で投与されることもできるし、食用担体の中に他の飼料添加剤を組み合わせて投与されることもできる。また、トップ・ドレス、家畜飼料への直接混合、飼料とは別に経口剤形での投与、又は他成分と組合わせて投与することもできる。
【００５８】
本発明のさらなる実施様態において、前記飼料添加剤を含む飼料が提供される。
本発明の前記飼料において、前記飼料添加剤が、好ましくは飼料１００重量部に対して０．０５ないし１０重量部、より好ましくは０．１ないし１重量部である。前記の範囲内で家畜の消化力が効果的に増進されることにより、飼料の効率を高めることができる。
【００５９】
本発明の前記飼料の成分は、特に限りはなく、当該技術分野で知られているものを用いることができる。前記飼料成分の非制限的例として、植物性として、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、油脂類、澱粉類、フクベ類、穀物副産物類など；動物性として、タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、魚粉などがある。これらは一つ、または二つ以上を混合して用いることができる。
【００６０】
本発明のプロバイオティクス製剤、飼料添加剤、又は前記飼料添加剤が含まれた飼料が使用できる家畜は、例えば、食用牛、乳牛、子牛、豚、子豚、羊、ヤギ、馬、ウサギ、犬、猫などの家畜、及びヒヨコ、卵鶏、家庭用ニワトリ、雄鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ウズラなどの家禽類があるが、これらに限らない。
【００６１】
下記で、実施例を記述することにより、本発明をより詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明の一つの例示に過ぎず、本発明の内容はこれらに限定して解釈されることではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１
バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ１５０菌株の分離
（１）試料の用意と菌株分離
韓国の伝統発酵食品であるメジュと各種醤類の試料を用意して、用意した試料を段階的に希釈し、３％塩化ナトリウムが添加されたＢＨＩ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に塗抹した後、３７℃の条件で２４時間培養した。
【００６３】
前記各試料から分離された菌株はコロニー観察によりグループ化し、菌株を分離した。選別されたコロニーは、３回にわたって新しい培地に移して培養する方法で純粋分離し、純粋培養された菌を２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）が添加された培地に入れて−７０℃以下で保存した。
【００６４】
（２）酵素活性の優秀な菌株を選抜
複合消化酵素の活性がある菌株を選別するため、分離された醤類由来菌に対し、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼの３つに対する酵素活性評価を行った。酵素活性評価は、各酵素に対する基質の入った培地を用いて、透明環（ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）の形成程度により酵素活性能力を測定した。
【００６５】
培養液状態で醤類由来菌に対する消化酵素活性の結果に基づいて、活性の優秀な菌株を約２００種を１次選抜し、２次的に培養液と時間帯別の培養上澄液に対する消化酵素の分泌活性を分析した。
【００６６】
１）助酵素液の採取
１次的に選抜された菌株をＢＨＩ液体培地で、２４時間、４８時間、培養した培養上澄液を採取し、４℃、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、最終上層液を酵素活性分析用の助酵素液として、下記の通り、各酵素別各々の基質が含まれている培地を用いて、基質分解の程度を判定した。
【００６７】
２）プロテアーゼ活性
脱脂粉乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を２％添加したＹＭ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ／ｌ、Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ／ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ５ｇ／ｌ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ １０ｇ／ｌ、Ａｇａｒ ２０ｇ／ｌ； Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ、以下、’ＹＭ培地’）培地を製造した。上記で採取した助酵素液を１．５μｌずつ基質培地板に分株した後、３０℃で１５時間反応した後、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
【００６８】
３）セルラーゼ活性
１％ＣＭＣ（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）基質が添加されたＹＭ培地を製造した。上記で採取した助酵素液を１．５μｌずつ基質培地板に分株し、３７℃で１５時間反応した後、０．２％のコンゴーレッド（Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ）水溶液で３０分間染色し、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液で脱色した。助酵素液周囲の基質が分解されて生じる透明環の形成程度により酵素の活性能力を測定した。
【００６９】
４）アミラーゼ活性
１％の可溶性デンプン（ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ）基質が添加されたＹＭ培地を製造した。上記で採取した助酵素液を１．５μｌずつ基質培地板に分株した後、３７℃で１５時間反応した。Ｉ２とＫＩが各々０．１％、２％添加された水溶液で染色した後、助酵素液周囲の基質が分解されて生じる透明環の形成程度により酵素の活性能力を測定した。
【００７０】
前記２次評価の結果に基づいて、下表１に示した消化酵素活性の優秀な菌株１９種を選抜した。その中で、培養液と上澄液において複合消化酵素の活性が優秀な１５０、４７０を候補菌株として最終選抜した。
【００７１】
下表１は、次選抜菌株の消化酵素生産性を示す。
【表１】
0005872104.tif 000002
【００７２】
（３）生長性の評価
複合消化酵素の生産性が優秀な上記候補菌株に対して、生長性評価を行った。ＢＨＩ液体培地で各菌株を３７℃、２００ｒｐｍで１５時間培養した。前記培養液を１００ｍｌのＢＨＩ液体培地に０．１％接種し、３７℃で１０時間、２４時間培養して、各液をＢＨＩ寒天培地に塗抹し、菌数を測定した。
【００７３】
前記結果は図２に示し、２４時間培養した場合、候補菌株２種の中で１５０の生長性がもっと優秀であることを確認した。
よって、複合消化酵素の生産能と生長性が優秀である１５０菌株を最終選抜し、これをＣＪＭＰＢ１５０と命名した。
【００７４】
実施例２
選抜菌株ＣＪＭＰＢ１５０の消化酵素活性
消化酵素活性の優秀な菌株として選抜されたＣＪＭＰＢ１５０の消化酵素の分泌活性を調べるため、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼの他に、キシラナーゼ、マンナナーゼ、リパーゼの活性を評価した。
【００７５】
１）助酵素液の採取
ＣＪＭＰＢ１５０菌株をＢＨＩ液体培地で２４時間培養した培養上澄液を採取し、４℃、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、最終上層液を酵素活性分析のための助酵素液として、下記の通り各酵素別に各々の基質が含まれている培地を用いて、基質分解程度を判定した。
【００７６】
２）キシラナーゼ活性
１％キシラン（ｘｙｌａｎ）が添加されたＹＭ培地を製造した。前記助酵素液１．５μｌを基質培地板に分株して、３７℃で１５時間反応した後、０．２％のコンゴーレッド水溶液により３０分間染色し、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液により脱色した。その後、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
【００７７】
３）リパーゼ活性
１％のトリカプリリン（ｔｒｉｃａｐｒｙｌｉｎ）が添加されたＹＭ培地を製造した。上記助酵素液１．５μｌを基質培地板に分株して、３７℃で１５時間反応した後、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
【００７８】
４）マンナナーゼ活性
１％マンナン（ｌｏｃｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ、ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）が添加された基質培地（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ／ｌ、Ｐｅｐｔｏｎｅ ５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／ｌ、Ａｇａｒ ２０ｇ／ｌ、ｐＨ５）を製造した。上記助酵素液１．５μｌを基質培地板に分株し、３７℃で２４時間反応した後、透明環の形成程度により酵素活性能力を測定した。
【００７９】
前記ＣＪＭＰＢ１５０の消化酵素活性は、下表２及び図３に示した。
【表２】
0005872104.tif 000003
表２と図３に示したとおり、ＣＪＭＰＢ１５０はプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼの他、キシラナーゼ、マンナナーゼ、リパーゼの６種の消化酵素を全て優秀な水準で分泌した。
【００８０】
実施例３
ＣＪＭＰＢ１５０菌株の形態学的、生化学的特性の調査と同定
（１）形態学的、生化学的特性の調査
複合消化酵素活性の優秀な菌株として最終選抜されたＣＪＭＰＢ１５０菌株の同定をするため、１次的に形態学的、生化学的調査を行った。形態的特徴によりグラム陽性桿菌であることを確認し（図１）、生化学的特性を分析するためＡＰＩ ５０ ＣＨＢシステム（ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、フランス）によりＣＪＭＰＢ１５０菌株の糖発酵パターンを分析した。
【００８１】
下表３は、ＣＪＭＰＢ１５０菌株の糖発酵パターンを分析した結果を示す。
【表３】
0005872104.tif 000004
【００８２】
上記表３において、‘＋’は陽性、‘−’は陰性を表し、対照区は基質のない試験群である。
【００８３】
（２）ＣＪＭＰＢ１５０菌株の同定
ＣＪＭＰＢ１５０菌株のより正確な同定のため、ＤＮＡ塩基配列による分子系統分類学的方法を行った。
【００８４】
塩基配列分析はＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（バイオニア、韓国）とユニバーサルプライマー２７Ｆ（５‘ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３’：配列番号２）、及び１４９２Ｒ（５‘ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ ３’：配列番号３）を用いて、１６ｓ ｒＤＮＡの遺伝子を増幅した。遺伝子増幅時、総反応液は２０μｌに合わせて、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分を３０回繰り返し、増幅されたＤＮＡ塩基配列を分析した。ＣＪＭＰＢ１５０菌株の分析された１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は配列番号１（図７）に示した。
【００８５】
前記の分析結果、バチルス・サブチルスと９９．９％の相同性を有する微生物として同定された。
上述した方法により同定された本発明の新たな微生物であるバチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＣＪＭＰＢ１５０は、２０１２年３月２２日、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘濟１洞３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ１１２６８Ｐとして寄託された。
【００８６】
実施例４
ＣＪＭＰＢ１５０菌株の内生胞子形成能
バチルスは、必須栄養源の中で一つ以上の栄養源が枯渇するなどのストレスを受けると生存のため内生胞子を形成する。内生胞子は、紫外線、高温、低温、乾燥、高圧などの極限環境に抵抗性を有するため、内生胞子の形成はバチルスの生存率を維持することにおいて非常に重要である。このようなことで、バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０を長時間培養し、内生胞子の形成能を確認した。
【００８７】
ＢＨＩ液体培地に菌を０．１％接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間、４８時間培養した。各時間帯別に培養液をＢＨＩ寒天培地に塗抹して総菌数を測定し、９５℃で１０分間熱処理した培養液をＢＨＩアガー（Ａｇａｒ）培地に塗抹して、内生胞子の数を測定した。
【００８８】
下表４は、前記内生胞子数の測定結果を示す。
【表４】
0005872104.tif 000005
上記表４に示した通り、ＣＪＭＰＢ１５０を２４時間培養したとき、約８８％が内生胞子を形成し、４８時間培養したときには１００％が内生胞子を形成することを確認した。
【００８９】
従って、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０は２４時間以上培養したとき、高い内生胞子形成能を有し、プロバイオティクスとして利用したら動物の消化器官内で高い生存率の維持が可能であると判断される。
【００９０】
実施例５
ＣＪＭＰＢ１５０菌株の耐酸性と耐胆汁性
プロバイオティクス菌株は、口腔から摂取され最終目的部位である腸まで生きたまま到達するためには強酸性の胃液と胆汁液に対する抵抗性が必要である。よって、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０がプロバイオティクス菌株としての応用できるかを確認するため、耐酸性及び耐胆汁性を確認した。
【００９１】
（１）耐酸性及び人工胃液に対する抵抗性
人工胃液は、ＨＣｌを用いてｐＨ２．５に調整した０．０５Ｍのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液にペプシン（Ｐｅｐｓｉｎ； Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）１％（ｗ／ｖ）を添加して製造した。
ＣＪＭＰＢ１５０菌株をＢＨＩ液体培地に、３７℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した後、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し上澄液は捨てて菌体を回収し、人工胃液を上澄液の同量に添加し、３７℃で３時間培養した。培養後、ＢＨＩ培地に塗抹して菌数を測定し、耐酸性及び人工胃液に対する抵抗性を確認した。
【００９２】
（２）人工胆汁に対する抵抗性
人工胆汁は０．０５Ｍリン酸ナトリウム溶液に１％（ｗ／ｖ）のパンクレアチン（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を添加し滅菌した後、滅菌１０％（ｗ／ｖ）ｏｘａｇａｌｌ（Ｄｉｆｃｏ Ｃｏ．）溶液を培地の１％（ｖ／ｖ）になるように添加し、ｐＨを６．８に調整して製造した。
【００９３】
前記（１）の人工胃液で３時間培養したＣＪＭＰＢ１５０菌株を、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し上澄液は捨てて菌体を回収し前記人工胆汁を上澄液と同量に添加し、３７℃で２４時間培養した。培養後、ＢＨＩ培地に塗抹して菌数を測定し耐酸性及び人工胆汁に対する抵抗性を確認した。
前記耐酸性及び人工胃液と人工胆汁に対する抵抗性測定の結果は、図４に示した。
【００９４】
図４に示したとおり、ＣＪＭＰＢ１５０をｐＨ２．５の人工胃液で２時間処理したとき、約８３％の生存率、人工胃液処理後に人工胆汁を２４時間処理したときにも８３％生存率が維持された。
したがって、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０は人工胃液と人工胆汁の連続処理後においても、高い生存率を示し、プロバイオティクス菌株として有用に利用できることが確認された。
【００９５】
実施例６
ＣＪＭＰＢ１５０の生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での飼料消化率
バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０が実際腸のような条件で消化率を高めるかどうかを調べるために、飼料の消化率を調査した。
【００９６】
標準飼料（トウモロコシ５０％、大豆粕３０％、小麦１０％、米糠５％、酒粕５％を混合して製造した飼料）１０ｇにバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０を０．１％混合して、ｐＨ６．０の１２５ｍｌの燐酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）に添加し、３ＭのＨＣｌを用いてｐＨ２に滴定した。これに、２ｍｌのペプシン（２０ｍｇ／ｍｌ）溶液を添加し２００ｒｐｍ、３８℃で２時間反応した。
【００９７】
２時間反応した後に、燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）５０ｍｌを添加して、３Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ６．８まで滴定した。その後、２ｍｌのパンクレアチン（５０ｍｇ／ｍｌ）溶液を添加し、２００ｒｐｍ、３８℃で１８時間培養した。
【００９８】
培養した後、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．５４１）を用いて、消化後に残った飼料を濾した後、１３５℃のオーブンで乾燥した。これの乾燥重さを測定し下記の式１により飼料の消化率を計算した。
【００９９】
0005872104.tif 000006
【０１００】
測定された飼料消化率は、表５と図５に示した。
【表５】
0005872104.tif 000007
上記表５と図５に示したとおり、ＣＪＭＰＢ１５０を飼料に添加したとき、対照区（上記標準飼料にＣＪＭＰＢ１５０、又は酵素剤などを添加しなかった試験群）に比べて約２．２％の消化率が増加し、飼料添加剤として用いられている市販の酵素剤（Ｍａｎｎａｎａｓｅ）を１％添加したときには、対照区に比べ約１．６％消化率が増加した。したがって、本発明のバチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０が飼料の消化率を高めることができ、飼料添加剤の酵素剤を代替できることを確認した。
【０１０１】
実施例７
ＣＪＭＰＢ１５０菌株の安全性
ＣＪＭＰＢ１５０の安全性を調べるために、溶血性（β−ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）を調査した。β−溶血は、有害菌の中でリン脂質酵素を生産し赤血球により供給されるリン脂質を加水分解して赤血球を溶血させる作用である。
【０１０２】
バチルス・サブチルスＣＪＭＰＢ１５０の溶血性を調べるため５％の羊血液（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ、ギサンバイオテック、韓国）が含まれているＴＳＡ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）を製造した。製造された前記血液寒天培地に画線接種（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）した後、３７℃で２４時間培養し、図６に示したとおり、溶血性が表れないことを確認した。
【図１】
0005872104.tif 000008
【図５】
0005872104.tif 000009
【図６】
0005872104.tif 000010
【図２】
0005872104.tif 000011
【図３】
0005872104.tif 000012
【図４】
0005872104.tif 000013
【図７】
0005872104.tif 000014
【配列表】
0005872104000001.app