(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の一本鎖Fc領域により隔てられた2つのドメイン抗体（dAb）を含む抗原結合性構築物であって、各dAbがVEGFに結合することが可能であり、更に一方のdAbが一本鎖Fc領域のN末端につなげられかつ配列番号114、115および116のCDR配列を含み、他方のdAbが一本鎖Fc領域のC末端につなげられかつ配列番号117、118および119のCDR配列を含む、上記抗原結合性構築物。
【請求項２】
一本鎖Fc領域のN末端につなげられたdAbが配列番号104のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗原結合性構築物。
【請求項３】
一本鎖Fc領域のC末端につなげられたdAbが配列番号105のアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の抗原結合性構築物。
【請求項４】
前記Fc領域が、CH1、CH2およびCH3定常領域抗体ドメインのうち1つ以上、ならびに任意によりヒンジ領域（すなわち、CH1とCH2との間）を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗原結合性構築物。
【請求項５】
前記Fc領域が、配列番号110のIgG1配列である、請求項4に記載の抗原結合性構築物。
【請求項６】
dAbの一方または両方が、リンカーを介してFc領域につなげられている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗原結合性構築物。
【請求項７】
それを介してdAbがFc領域のN末端につながるリンカーが、配列番号77または配列番号79のアミノ酸配列を有する、請求項6に記載の抗原結合性構築物。
【請求項８】
それを介してdAbがFc領域のC末端につながるリンカーが、配列番号87のアミノ酸配列を有する、請求項6または7に記載の抗原結合性構築物。
【請求項９】
(a) 配列番号104 - 配列番号77- 配列番号110 - 配列番号87 - 配列番号105；または
(b) 配列番号104 - 配列番号79 - 配列番号110 - 配列番号87-配列番号105；または
(c) 配列全体にわたって少なくとも97％のアミノ酸同一性を有する(a)もしくは(b)の変異体；または
(d) N末端につなげられたdAbが配列番号104の配列に対して少なくとも97％の配列同一性を有し、C末端につなげられたdAbが配列番号105の配列に対して少なくとも97％の配列同一性を有する(a)もしくは(b)の変異体
である、請求項1に記載の抗原結合性構築物。
【請求項１０】
配列番号180のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗原結合性構築物。
【請求項１１】
配列番号188のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗原結合性構築物。
【請求項１２】
1つ以上のdAbが、
(a) 配列VTVS(S)nX [VH dAbに関して]またはVEIKpRqX [VL dAbに関して]からなるC末端配列；およびまた任意により
(b) ヒト生殖系列フレームワーク配列と比較して14、41、108、110、または112位での1箇所以上のアミノ酸置換
（ここで、
nは、0または1から独立に選択される整数であり；
pおよびqは、pが1を表す場合にqは0または1であり得、かつpが0を表す場合にqもまた0を表すように、それぞれが0または1を表し；
Xは、存在するかまたは不存在であり得、存在する場合は1〜8アミノ酸残基のアミノ酸伸長を表す）
を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の抗原結合性構築物。
【請求項１３】
VL dAbに関して、C末端配列がVEIKpRqXであり、pは1であり、qは1であり、かつXはA、AAAまたはTである、請求項12に記載の抗原結合性構築物。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか1項に記載の2つの抗原結合性構築物を含む二量体であって、ヘテロ二量体またはホモ二量体である、上記二量体。
【請求項１５】
請求項14に記載の二量体、および1種以上の製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
医薬における使用のための、請求項14に記載の二量体。
【請求項１７】
糖尿病性黄斑浮腫（DME）、Wet AMD、糖尿病性網膜症、RVO、および角膜血管新生などの癌および/または眼疾患などのVEGFシグナル伝達に関連する疾患の治療での使用のための、請求項14に記載の二量体。
【請求項１８】
請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗原結合性構築物をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗原結合性構築物をコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列を含む、組み換え形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２０】
請求項19に記載の宿主細胞を培養し、前記抗原結合性構築物を単離するステップを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗原結合性構築物の製造方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法により製造される抗原結合性構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の一本鎖Fc領域により隔てられた1つまたは2つのエピトープ結合ドメインを含む抗原結合性構築物であって、各エピトープ結合ドメインがVEGFに結合することが可能である構築物、本発明の2つの抗原結合性構築物を含む二量体、該二量体を含む医薬組成物およびVEGFシグナル伝達に関連する疾患（糖尿病性黄斑浮腫（DME）、滲出型加齢黄斑変性（Wet AMD）、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞（RVO）、および角膜血管新生など）の治療でのそれらの使用、ならびに該抗原結合性構築物をコードするポリヌクレオチド配列を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮増殖因子（VEGF）ファミリーの増殖因子およびそれらの受容体は、血管新生および血管透過性の必須の調節因子である。VEGFファミリーは、VEGF-A、PlGF（胎盤増殖因子）、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-Eおよびヘビ毒VEGF（snake venom VEGF）を含み、それぞれが、血管パターン形成および血管発達での異なる役割を有すると考えられている。単一の8エキソン遺伝子から転写されるmRNAの選択的スプライシングによって、VEGF-Aは、シグナルペプチド切断後に残るアミノ酸の数により識別される少なくとも9種類のサブタイプ（アイソフォーム）を有する。例えば、ヒトでは、最もよく知られるアイソフォームはVEGF165であり、これは、可溶性型と細胞結合型との平衡状態で存在する。より長いアイソフォーム（VEGF183、VEGF189、およびVEGF206）は、高度に正に荷電したC末端領域を有し、このC末端領域は、それらのバイオアベイラビリティを変化させる細胞表面グリカンおよびヘパリンとの結合を媒介する。すべてのVEGF-Aアイソフォームは、受容体結合性VEGF断片を構成する約110個のN末端残基のコアを介して生じる結合を用いてホモ二量体を形成する。正常な環境下で、および固形腫瘍の中心部では、VEGFの発現は、主に、血管の供給の不足を表す低酸素状態により媒介される。低酸素状態は、低酸素誘導性因子であるHIF-1αと構成的に発現されているHIF-1αとの二量体化を引き起こし、これはVEGF遺伝子のプロモーター領域中の低酸素応答性エレメントに結合する転写因子を形成する。正常酸素状態下では、HIF-1αタンパク質は、複数のプロリンヒドロキシル化イベントの結果として、ユビキチン媒介分解を受ける。他の腫瘍関連VEGFアップレギュレーションは、炎症性サイトカインおよび増殖因子を介する癌遺伝子経路（すなわち、ras）を通した活性化、ならびに機械力による活性化により起きる。
【０００３】
活性型VEGFホモ二量体は、VEGFRファミリーの受容体により、細胞表面にて結合される。VEGF-Aに対する主要な血管内皮関連受容体は、VEGFR1（Flt1）およびVEGFR2（Flk-2；KDR）である。両方の受容体がチロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、活性化のためにはリガンド媒介二量体化を必要とする。二量体化するときには、キナーゼドメインは自己リン酸化を受けるが、VEGFR2でのキナーゼ活性の程度は、VEGFR1でのものよりも大きい。VEGFの親和性はVEGFR1に対して約3倍大きい（VEGFR2に対するKD 100pMと比較して、KD約30pM）が、VEGFの血管新生シグナル伝達は大部分がVEGFR2を通して媒介されることが実証されている。このことは、VEGFR1は主に、VEGFを隔離し、VEGFR2活性化の程度を変化させるためのおとり受容体（decoy receptor）として機能するという提案につながる。VEGFR1発現は一部の腫瘍と関連しているが、その主要な役割は、胎児発生および器官形成の間のものであると思われる。VEGF-A165は、ニューロピリン（neuropilin）受容体NRP1およびNRP2によっても結合される。これらの受容体はTKドメインを欠いているが、これらの受容体は、VEGFR2に対する共受容体（co-receptor）として機能し、VEGFをVEGFR2に移動させることによりシグナル伝達を増大させると考えられている。
【０００４】
多数の研究が、腫瘍血管新生での主要因子としてVEGF-Aを確認することを手助けしてきた。例えば、VEGF-Aは大多数の腫瘍および腫瘍関連間質で発現される。増殖を支援する、よく発達しかつ拡大する脈管系の不在下では、腫瘍細胞は、壊死性およびアポトーシス性になり、それにより、連続的な細胞増殖の結果として生じ得る腫瘍体積（1mm3の単位での）の増加に対する制限を強いる。VEGF-Aの発現は、壊死領域に隣り合う低酸素腫瘍細胞で最も高く、このことは、増殖中の腫瘍での低酸素状態によるVEGF-Aの誘導が血管新生の活性化因子と抑制因子とのバランスを変化させる場合があり、これが腫瘍中での新規血管の増殖につながることを示唆する。この仮説に一致して、低分子量チロシンキナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド等（VEGF-Aを阻害もしくは捕捉するかまたはそのシグナル伝達受容体であるVEGFR-2をブロックする）をはじめとする多数のアプローチが、治療剤として開発されてきた。
【０００５】
VEGF-Aはまた、多数の眼疾患（加齢黄斑変性（AMD）、滲出型AMD、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、糖尿病性黄斑浮腫（diabetic macular oedema）および角膜血管新生など）にも関連づけられてきた。VEGF-Aは、低酸素状態に応答して種々の眼細胞タイプにより産生され、血管透過性の増進および内皮細胞増殖の刺激をはじめとする多数の機能を有する。
【０００６】
AMDは、網膜色素上皮の異常として定義され、これは、黄斑での上層の光受容体の変性につながり、中心視力の欠失を引き起こす。AMDは、主要な公衆衛生の負荷を代表し、米国内の900万人を超える人々が中間型または進行型のAMDを有すると見積もられている。早期AMDは、ドルーゼンおよび視力喪失を伴わない網膜色素上皮の色素過剰または色素減少により特徴づけられる。視力喪失が生じる進行型AMDは、地図状萎縮または脈絡膜血管新生（choriodal neovascularisation；CNV）として現れ得る。滲出型AMDとも称されるCNVは、血管の異常増殖の結果である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ラニビズマブ（ルセンティス）、ベバシズマブ（アバスチン）およびアフリベルセプト（アイリーア）は、抗VEGF治療薬の例であり、新生血管AMDに対して一般的に投与されている。それらの治療薬の存在にもかかわらず、AMDおよび他の眼疾患の治療のためのさらなる治療薬に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗体の一本鎖Fc領域により隔てられた1つまたは2つのエピトープ結合ドメインを含む抗原結合性構築物であって、各エピトープ結合ドメインがVEGFに結合することが可能である構築物に関する。
【０００９】
一態様では、本発明の抗原結合性構築物の各エピトープ結合ドメインは、ドメイン抗体（dAbとも称される）である。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、以下の抗原結合性構築物に関する：
(a) DOM 15-26-597 - AS - Fc（配列番号110） - フィブロネクチン×4 - DT02-K-044-085；または
(b) DOM 15-26-597 - IgG1ヒンジ - Fc（配列番号110） - フィブロネクチン×4- DT02-K-044-085；または
(c) 配列全体にわたって少なくとも97％のアミノ酸同一性を有する(a)もしくは(b)の変異体；または
(d) 各dAb配列が特定のdAbの配列に対して少なくとも97％の配列同一性を有する(a)もしくは(b)の変異体。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の2つの抗原結合性構築物を含む二量体、該二量体を含む医薬組成物およびVEGFシグナル伝達と関連する疾患（糖尿病性黄斑浮腫（DME）、滲出型加齢黄斑変性（Wet AMD）、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞（RVO）、および角膜血管新生など）の治療でのそれらの使用、ならびに該抗原結合性構築物をコードするポリヌクレオチド配列に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトVEGF165に結合するDMS1529、DMS1576およびベバシズマブ（アバスチン）の比較を示すELISA（EC50値を含む）を表す図である。
【図２Ａ】MSDによる、Vk Fc-dAb DMS30000 3μg/mLを用いた予備飽和後のVEGFに対するVh dAb-Fc DMS1576の結合性を表す図である。
【図２Ｂ】MSDによる、Vh dAb-Fc DMS1576 3μg/mLを用いた予備飽和後のVEGFに対するVk Fc-dAb DMS30000の結合性を表す図である。
【図３】ベバシズマブ（アバスチン）と比較した抗VEGF Vh dAb-Fc、Vk Fc-dAbおよびdAb-Fc-dAb分子から生じるVEGF誘導性ヒト臍帯内皮細胞（HUVEC）増殖アッセイの最大阻害についての分散の重み付け解析を表す図である。
【図４】MSDによる、マウスVEGF164に対するDMS1529およびDMS30000の結合性を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、抗体の一本鎖Fc領域により隔てられた2つのエピトープ結合ドメインを含む抗原結合性構築物であって、各エピトープ結合ドメインがVEGFに結合することが可能である構築物を対象とする。
【００１４】
一態様では、本発明の抗原結合性構築物の各エピトープ結合ドメインは、ドメイン抗体（dAbとも称される）である。
【００１５】
本明細書中で用いる場合、用語「エピトープ結合ドメイン」とは、異なる可変領域またはドメインとは独立に抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを意味する。これはドメイン抗体（dAb）であり得、または以下のものからなる群より選択される足場（スキャホールド）の誘導体：CTLA-4（エビボディ（Evibody））；リポカリン；プロテインAのZドメインなどのプロテインA由来分子（アフィボディ（Affibody）、SpA）、Aドメイン（アビマー（Avimer）/マキシボディ（Maxibody））；熱ショックタンパク質（GroElおよびGroESなど）；トランスフェリン（トランスボディ(trans-body)）；アンキリンリピートタンパク質（DARPin）；ペプチドアプタマー；C型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ-クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）；PDZドメイン；サソリ毒（カリブドトキシン（charybdotoxin））；ヒトプロテアーゼ阻害剤のkunitz型ドメイン；Ras結合性タンパク質AF-6のPDZドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）；であって、天然のリガンド以外のリガンドに対する結合性を得るためにタンパク質工学操作に供してあるドメインであり得る。
【００１６】
本明細書中で用いる場合、用語「ドメイン」とは、タンパク質の残りの部分とは独立した三次構造を有するフォールディングされたタンパク質構造を意味する。一般的に、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性を担い、多くの場合、タンパク質の残りの部分および/またはそのドメインの機能損失を伴わずに、追加し、除去し、または他のタンパク質に移動させることができる。
【００１７】
本明細書中で用いる場合、用語「ドメイン抗体」とは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含むフォールディングされたポリペプチドドメインを意味する。したがってこれは、完全な抗体可変領域（VH、VHHおよびVLなど）および改変型抗体可変ドメイン（例えば、1つ以上のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列により置き換えられているもの）、あるいは切断されているかまたはN末端もしくはC末端伸長部を含む抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの結合活性および特異性を少なくとも残している可変ドメインのフォールディングされた断片を含む。単一可変ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに結合することが可能である。「ドメイン抗体」または「dAb(TM)」もまた、「単一可変ドメイン」（single variable domain）とも称される。ドメイン抗体は、ヒトドメイン抗体であり得るが、他の動物種由来の単一ドメイン抗体（げっ歯類（例えば、WO00/29004に開示されているもの）、テンジクザメおよびラクダ科動物のVHH dAbなど）も含む。ラクダ科動物VHHは、ラクダ（camel）、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコをはじめとする動物種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これらは、軽鎖を天然に欠いた重鎖抗体を生成する。そのようなVHHドメインは、当技術分野で利用可能な標準的技術に従ってヒト化することができ、そのようなドメインは、「ドメイン抗体」であるとみなされる。本明細書中で用いる場合、VHは、ラクダ科動物VHHドメインを含む。NARVは別のタイプの免疫グロブリンドメイン抗体であり、テンジクザメをはじめとする軟骨魚類で同定された（Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)）。これらのドメインはまた、新規抗原受容体可変領域（Novel Antigen Receptor variable region）（通常、V(NAR)またはNARVと略される）としても知られる。
【００１８】
本明細書中で用いる場合、用語「抗体の一本鎖Fc領域」とは、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、iGG4もしくはIgG4PEなど）、またはIgA抗体の単一重鎖Fc領域を意味する。単一重鎖Fc領域は、CH1、CH2およびCH3定常領域抗体ドメインのうち1つ以上、例えば、3つ全部の定常領域抗体ドメインまたはCH2ドメインおよびCH3ドメインのみを含むことができる。CH1、CH2およびCH3定常領域抗体ドメインのうち1つ以上を含むことに加えて、抗体の単一重鎖FC領域は、抗体のヒンジ領域（CH1およびCH2ドメインの間に通常見出される領域など）をさらに含むことができる。
【００１９】
一態様では、抗体の一本鎖Fc領域は、単一のIgG1重鎖、例えば、CH2およびCH3抗体定常ドメインを含む単一IgG1重鎖である。
【００２０】
さらなる態様では、抗体の一本鎖Fc領域は、配列番号110のIgG1配列である。
【００２１】
さらなる態様では、抗体の一本鎖Fc領域は、以下の配列である：
QASSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
【００２２】
一態様では、Fc配列のN末端は、Fcの開始点にて「AS」で始まるか、またはN末端アミノ酸を含まずに始まる（Fc配列がASTHTCPPCまたはTHTCPPCで始まる）。
【００２３】
別の態様では、Fc領域は、FcのN末端内に突然変異を含む（例えば、THTCPPCがTATCPPCにより置き換えられる）。例えば、THTCPPCがTHPCPPCにより置き換えられる（例えば、配列番号83および84）。そのような突然変異は、本明細書中に開示されるいずれの配列中にも存在することができ、本明細書中に開示される特定の配列の変異体配列である。
【００２４】
抗体のFc領域は、そのエフェクター機能の程度について選択することができる。
【００２５】
本明細書中で用いる場合の用語「エフェクター機能」とは、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ADCC）、補体依存性細胞毒性（CDC）媒介応答、Fc媒介食作用およびFcRn受容体を介した抗体再利用のうちの1つ以上を指すことを意味する。IgG抗体に関して、ADCCおよびADCPをはじめとするエフェクター機能性は、重鎖定常領域と免疫細胞の表面上に存在するFcγ受容体のファミリーとの相互作用により媒介される。ヒトでは、これらは、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）およびFcγRIII（CD16）を含む。抗原に結合した抗原結合性タンパク質との相互作用およびFc/Fcγ複合体の形成は、細胞毒性、免疫細胞活性化、食作用および炎症性サイトカインの放出をはじめとする広範な作用を誘導する。
【００２６】
抗原結合性タンパク質の定常領域と種々のFc受容体（FcR）との相互作用は、抗原結合性タンパク質のエフェクター機能を媒介すると考えられる。かなりの生物学的作用が、エフェクター機能性、特に、抗体依存性細胞性細胞毒性（ADCC）、補体の固定化（補体依存性細胞毒性またはCDC）、および抗原結合性タンパク質の半減期/クリアランスの結果であり得る。通常、エフェクター機能を媒介する能力は、抗原に対する抗原結合性タンパク質の結合を必要とし、すべての抗原結合性タンパク質があらゆるエフェクター機能を媒介するわけではないであろう。
【００２７】
エフェクター機能は、例えば、FcγRIIIとナチュラルキラー細胞との結合を介して、またはFcγRIと単球/マクロファージとの結合を介してADCCエフェクター機能について測定することをはじめとする多数の方式で測定することができる。例えば、本発明の抗原結合性タンパク質は、ナチュラルキラー細胞アッセイでADCCエフェクター機能について評価することができる。そのようなアッセイの例は、Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604；Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131；Lazar et al, 2006 PNAS USA, 103; 4005-4010に見出すことができる。CDC機能を測定するためのアッセイの例としては、1995 J Imm Meth 184:29-38に記載されているものが挙げられる。
【００２８】
ヒト定常領域の一部のアイソタイプ、特にIgG4およびIgG2アイソタイプは、元来、(a)古典的経路による補体の活性化；および(b)抗体依存性細胞性細胞毒性の機能を有しない。抗原結合性タンパク質の重鎖定常領域に対する種々の改変は、所望のエフェクター特性に応じて行なうことができる。特定の突然変異を含むIgG1定常領域は、Fc受容体に対する結合を減少させ、したがってADCCおよびCDCを低下させることが別々に記載されている（Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564；Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662；Chappel et al. PNAS USA 1991, 88; 9036-9040；Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84；Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324；Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168）。
【００２９】
特定の突然変異または残基Asn297への変化したグリコシル化を含むヒトIgG1定常領域はまた、Fc受容体に対する結合を増強させるとして記載されてきた。一部の場合には、これらの突然変異はまた、ADCCおよびCDCを増強させることも示されてきた（Lazar et al. PNAS USA 2006, 103; 4005-4010；Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604；Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817）。
【００３０】
本発明の一実施形態では、そのような突然変異は、239位、332位および330位（IgG1）から選択される1箇所以上の位置、または他のIgGアイソタイプの同等の位置でのものである。好適な突然変異の例は、S239DおよびI332EおよびA330Lである。一実施形態では、本明細書中に記載される本発明の抗原結合性タンパク質は、239位または332位で突然変異されているか（例えば、S239DおよびI332E）、またはさらなる実施形態では、239位および332位および330位から選択される3箇所以上の位置で突然変異されている（例えば、S239DおよびI332EおよびA330L、EUインデックス番号付け）。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、変化したグリコシル化プロフィールを有する重鎖定常領域を含むことにより、抗原結合性タンパク質が増強されたエフェクター機能を有する抗原結合性タンパク質が提供される。例えば、ここで、抗原結合性タンパク質が増強されたADCCもしくは増強されたCDCを有するか、または増強されたADCCエフェクター機能およびCDCエフェクター機能の両方を有する。変化したグリコシル化プロフィールを有する抗原結合性タンパク質を作製するために好適な方法論の例は、WO2003011878、WO2006014679およびEP1229125に記載されており、これらのすべてを、本発明の抗原結合性タンパク質に適用することができる。
【００３２】
本発明の抗原結合性構築物は、VEGFに結合することが可能なエピトープ結合ドメインを含む。本明細書中で用いる場合、用語「VEGF」は、いずれかのVEGF分子、特にVEGF-A、例えばヒトVEGF-A（VEGF-Aのいずれかのアイソフォームを含む、VEGF165など）に対する参照である。
【００３３】
本発明の抗原結合性構築物は、一態様では、抗体の一本鎖Fc領域により隔てられた2つのエピトープ結合ドメインを含む。隔てられているとは、エピトープ結合ドメインが互いに直接的につながっていないことを意味する。一態様では、エピトープ結合ドメインは、Fc領域の反対の端部に位置する。一方のエピトープ結合ドメインはN末端につなげられ、他方はC末端につなげられている。それぞれのエピトープ結合ドメインは独立に選択され、そのようなドメインは、VEGF上の同じエピトープまたは異なるエピトープに結合することができる。
【００３４】
一態様では、本発明の抗原結合性構築物で、抗体のFc領域のN末端端部につなげられたエピトープ結合ドメインは、重鎖または軽鎖dAbであり、ここで、軽鎖dAbはκまたはλ軽鎖であり得る。
【００３５】
本発明の抗原結合性構築物がC末端につなげられたエピトープ結合ドメインを有するさらなる態様では、エピトープ結合ドメインは軽鎖dAbであり、ここで、軽鎖dAbはκまたはλ軽鎖であり得る。
【００３６】
本発明の抗原結合性構築物が2つのエピトープ結合ドメインを含むまたさらなる態様では、Fc領域のN末端につなげられたドメインは重鎖dAbであり、Fc領域のC末端につなげられたドメインは軽鎖dAbである。
【００３７】
本発明の抗原結合性構築物が2つのエピトープ結合ドメインを含むまたさらなる態様では、Fc領域のN末端につなげられたドメインは軽鎖dAbであり、Fc領域のC末端につなげられたドメインは軽鎖dAbである。
【００３８】
本発明の抗原結合性構築物は、融合タンパク質として発現させることができ、またはエピトープ結合ドメインを別個に発現させて、かつ当技術分野で周知の方法を用いた化学的コンジュゲーションなどの別の手段により連結させることができる。
【００３９】
エピトープ結合ドメインは、抗体のFc領域に直接的につなげるか、またはリンカーを介して間接的につなげることができる。dAbのN末端が抗体のFc領域のC末端に融合されている構築物では、ペプチドリンカーがdAbの抗原結合性を増強させる場合がある。実際に、dAbのN末端端部は、抗原結合活性に関与する相補性決定領域（CDR）に近接して位置する。つまり、ペプチドリンカーは、エピトープ結合ドメインとタンパク質足場の定常ドメインとの間のスペーサーとして機能する場合があり、これは、dAb CDRがより容易に抗原に到達すること、および一部の状況では、より高い親和性で結合することを可能にし得る。さらに、一部のペプチドリンカー（例えば、7アミノ酸長より長いもの）は、本明細書中に記載される通りのヘテロ二量体およびホモ二量体での、抗体のFc領域のC末端につながっている軽鎖dAbへの抗体のFc領域のN末端につながっている重鎖dAbの会合を促進しかつ可能にし得る。そのような会合は、本発明の抗原結合性構築物および二量体の抗原結合性および/または他の特性を増強させることができる。
【００４０】
抗体のFc領域のC末端に融合された場合、各dAbは、Fc部分のCH3ドメインの近傍に位置する場合がある。このことは、これらの受容体がCH2ドメイン（FcγRI、IIおよびIIIクラスの受容体に関して）またはCH2ドメインとCH3ドメインとの間のヒンジ（例えば、FcRn受容体）とかみ合うため、Fc受容体（例えば、FcγRI、II、IIIおよびFcRn）に対するFc結合特性に影響するとは予測されない。そのような抗原結合性構築物の別の特徴は、両方のdAbが互いに空間的に近接していることが予測され、適切なリンカーの提供により柔軟性がもたらされているならば、これらのdAbが、ホモ二量体分子種を形成することさえあり、したがって、構築物の安定性を増強させ得るFc部分の「ジッパーで閉じられた」（zipped）四つ組（quaternary）構造を広める場合があることである。
【００４１】
好適なリンカーの例としては、1アミノ酸〜150アミノ酸長、もしくは1アミノ酸〜140アミノ酸長、例えば、1アミノ酸〜130アミノ酸長、もしくは1アミノ酸〜120アミノ酸長、もしくは1アミノ酸〜80アミノ酸長、もしくは1アミノ酸〜50アミノ酸長、もしくは1アミノ酸〜20アミノ酸長、もしくは1アミノ酸〜10アミノ酸長、もしくは5アミノ酸〜18アミノ酸長、または7アミノ酸より長いが10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140もしくは150アミノ酸以下であり得るアミノ酸配列が挙げられる。そのような配列は、それら自体の三次構造を有することができ、例えば、本発明のリンカーが単一可変ドメインを含む場合がある。一実施形態でのリンカーのサイズは、単一可変ドメインと同等である。好適なリンカーは、1〜100オングストロームのサイズのものであり得、例えば20〜80オングストロームのサイズのものであり得、または例えば20〜60オングストロームのサイズのものであり得、または例えば40オングストローム未満、または20オングストローム未満、または5オングストローム未満の長さであり得る。
【００４２】
一態様では、リンカーは7アミノ酸より長く、かつ150アミノ酸長以下である。
【００４３】
リンカーの例としては、限定するものではないが、配列番号57〜63および66〜82に概要が示されているものが挙げられる。一態様では、リンカーは、配列番号58、60、62、63および75から選択される。
【００４４】
本発明の抗原結合性構築物が2つのエピトープ結合ドメインを含む場合、エピトープ結合ドメインは、同じかまたは異なるリンカーによって抗体のFc領域につなげることができる。
【００４５】
エピトープ結合ドメインを抗体のFc領域のN末端につなげるためにリンカーが用いられる一態様では、リンカーは、配列番号58、60および62からなる群より選択される。さらなる態様では、N末端リンカーは配列番号58または配列番号60である。
【００４６】
エピトープ結合ドメインを抗体のFc領域のC末端につなげるためにリンカーが用いられる一態様では、リンカーは、配列番号63および配列番号75からなる群より選択される。特に好ましいリンカーは、配列番号63である。
【００４７】
一態様では、本発明の抗原結合性構築物で使用されるリンカーは、単独でまたは他のリンカーに加えて、1つ以上のGS残基のセットを含むことができる（例えば、「GSTVAAPS」または「TVAAPSGS」または「GSTVAAPSGS」）。
【００４８】
一実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカー「(PAS)n(GS)m」、「(GGGGS)n(GS)m」、「(TVAAPS)n(GS)m」、「(GS)m(TVAAPSGS)n」、「(PAVPPP)n(GS)m」、「(TVSDVP)n(GS)m」、「(TGLDSP)n(GS)m」（式中、n＝1〜10、かつm＝0〜4）によって、抗体のFc領域に連結される。
【００４９】
そのようなリンカーの例としては、(PAS)n(GS)m（式中、n＝1かつm＝1）、(PAS)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝1）、(PAS)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝1）、(PAS)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝1）、(PAS)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝0）、(PAS)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝0）、(PAS)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝0）が挙げられる。
【００５０】
そのようなリンカーの例としては、(GGGGS)n(GS)m（式中、n＝1かつm＝1）、(GGGGS)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝1）、(GGGGS)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝1）、(GGGGS)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝1）、(GGGGS)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝0（配列番号49））、(GGGGS)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝0（配列番号50））、(GGGGS)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝0）が挙げられる。
【００５１】
そのようなリンカーの例としては、(TVAAPS)n(GS)m（式中、n＝1かつm＝1）、(TVAAPS)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝1）、(TVAAPS)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝1）、(TVAAPS)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝1）、(TVAAPS)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝0）、(TVAAPS)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝0）、(TVAAPS)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝0）が挙げられる。
【００５２】
そのようなリンカーの例としては、(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝1かつm＝1）、(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝2かつm＝1）、(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝3かつm＝1）、または(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝4かつm＝1）、(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝5かつm＝1）、(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝6かつm＝1）、(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝1かつm＝0）、(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝2かつm＝10）、(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝3かつm＝0）、または(GS)m(TVAAPSGS)n（式中、n＝0）が挙げられる。
【００５３】
そのようなリンカーの例としては、(PAVPPP)n(GS)m（式中、n＝1かつm＝1）、(PAVPPP)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝1）、(PAVPPP)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝1）、(PAVPPP)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝1）、(PAVPPP)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝0）、(PAVPPP)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝0）、(PAVPPP)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝0）が挙げられる。
【００５４】
そのようなリンカーの例としては、(TVSDVP)n(GS)m（式中、n＝1かつm＝1）、(TVSDVP)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝1）、(TVSDVP)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝1）、(TVSDVP)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝1）、(TVSDVP)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝0）、(TVSDVP)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝0）、(TVSDVP)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝0）が挙げられる。
【００５５】
そのようなリンカーの例としては、(TGLDSP)n(GS)m（式中、n＝1かつm＝1）、(TGLDSP)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝1）、(TGLDSP)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝1）、(TGLDSP)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝1）、(TGLDSP)n(GS)m（式中、n＝2かつm＝0）、(TGLDSP)n(GS)m（式中、n＝3かつm＝0）、(TGLDSP)n(GS)m（式中、n＝4かつm＝0）が挙げられる。
【００５６】
用いることができるさらなるリンカーは、WO 2009068649に開示されている。
【００５７】
抗原結合性構築物は、さらに、リンカーとして、かつヒト血清アルブミンに由来するアルブミン、またはその断片を含むことができ、これは、DETYVPKEFNAETFGS、DETYVPKEFNAETF、EVDETYVPKEFNAETFTFHADGS、EVDETYVPKEFNAETFTFHAD、DDNPNLPRLVRPE、DEMPADLPSLAADF、HKDDNPNLPRLVRPEVDVM、およびENDEMPADLPSLAADFVESKDなどである。リンカーはさらに、いくつかの追加の残基を含むことができ（例えば、追加のグリシンおよびセリン残基を含むことができる）、またはリンカーのいずれかの端部からアミノ酸が除去されていることができる（例えば、一態様では、5個のアミノ酸が除去されている）。これらの追加の残基は、アルブミン由来配列の最初もしくは終点にあることができ、またはアルブミン由来配列の内部にあることができる。
【００５８】
一態様では、本発明は、2つのエピトープ結合ドメインを含む抗原結合性構築物であって、各エピトープ結合ドメインは独立に選択されるdAbであり、DOM 15-26-593、DOM 15-26-597、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236またはDT02-K-044-255の配列に少なくとも97％同一なアミノ酸配列を含む、抗原結合性構築物を対象とする。
【００５９】
さらなる態様では、各エピトープ結合ドメインは、DOM 15-26-593、DOM 15-26-597、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236およびDT02-K-044-255からなる群より独立に選択されるdAbである。
【００６０】
さらなる態様では、一本鎖Fc領域のN末端につなげられたdAbが、DOM 15-26-597またはDT02-K-044-085の配列に少なくとも97％同一なアミノ酸配列を含む。
【００６１】
さらなる態様では、一本鎖Fc領域のN末端につなげられたdAbは、DOM 15-26-597またはDT02-K-044-085である。
【００６２】
さらなる態様では、一本鎖Fc領域のC末端につなげられたdAbが、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236またはDT02-K-044-255の配列に少なくとも97％同一なアミノ酸配列を含む。
【００６３】
さらなる態様では、一本鎖Fc領域のC末端につなげられたdAbは、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236またはDT02-K-044-255である。
【００６４】
さらなる態様では、本発明の抗原結合性構築物は、
(a) DOM 15-26-597 - AS- Fc（配列番号110） - フィブロネクチン×4 - DT02-K-044-085；または
e)  (b) DOM 15-26-597 - IgG1ヒンジ - Fc（配列番号110） - フィブロネクチン×4- DT02-K-044-085；または
f)  (c) 配列全体にわたって少なくとも97％のアミノ酸同一性を有する(a)もしくは(b)の変異体；または
g)  (d) 各dAb配列が特定のdAbの配列に対して少なくとも97％の配列同一性を有する(a)もしくは(b)の変異体
である。
【００６５】
本発明はさらに、抗体の一本鎖Fc領域につなげられた1つのエピトープ結合ドメインを含む抗原結合性構築物であって、該エピトープ結合ドメインが、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236またはDT02-K-044-255の配列に少なくとも97％同一なアミノ酸配列を含むdAbであり、かつさらに、該エピトープ結合ドメインはVEGFに結合することが可能である、抗原結合性構築物を対象とする。
【００６６】
またさらなる態様では、本発明は、抗体の一本鎖Fc領域につなげられた1つのエピトープ結合ドメインを含む抗原結合性構築物であって、該エピトープ結合ドメインが、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236またはDT02-K-044-255から選択されるdAbである、抗原結合性構築物を対象とする。
【００６７】
一態様では、抗原結合性構築物は、以下の構造（N末端からC末端）を有する：
a. Fc - リンカーC- DT02-K-044-085 dAb；
b. DOM 15-26-593 dAb - リンカーN - Fc - リンカーC - DT02-K-044-085 dAb；
c. DOM 15-26-597 dAb - リンカーN - Fc - リンカーC - DT02-K-044-085 dAb；
d. DT02-K-044-085 dAb-リンカーN - Fc - リンカーC - DT02-K-044-085 dAb；
e. Fc - リンカーC - DT02-K-044-251 dAb；
f. DOM15-26-597 dAb - リンカーN - Fc - リンカーC - DT02-K-044-251 dAb；
g. DT02-K-044-251 dAb - リンカーN - Fc - リンカーC - DT02-K-044-251 dAb；
h. a〜gに関して、リンカーNは、配列番号57〜63および配列番号76〜82に記載されたもののいずれかであり得る；
i. a〜gに関して、リンカーCは、配列番号66〜75および配列番号85〜94に記載されたもののいずれかであり得る；
j. a〜gに関して、Fcは、配列番号64、65、102および配列番号83、84、110に記載されたもののいずれかであり得る；
k. 少なくとも97％のアミノ酸同一性を有する、a〜jのいずれかの変異体；
l. dAb配列が特定のdAbの配列に少なくとも97％の同一性を有する、a〜jのいずれかの変異体。
【００６８】
さらなる態様では、本発明の抗原結合性構築物は、以下の構造を有する：
dAb1-リンカーN-Fc-リンカーC-dAb2
【００６９】
ここで、dAb1は、下記から定義することができる：
【表１】
0005987057.tif 000002
【００７０】
ここで、リンカーNは、下記から定義することができる：
【表２】
0005987057.tif 000003
【００７１】
ここで、Fcは、下記から定義することができる：
【表３】
0005987057.tif 000004
【００７２】
ここで、リンカーCは、下記から定義することができる：
【表４】
0005987057.tif 000005
【００７３】
ここで、dAb2は、下記から定義することができる：
【表５】
0005987057.tif 000006
【００７４】
タンパク質に結合することができる、天然に存在する自己抗体が、ヒトで存在する。つまり、自己抗体は、内在性タンパク質（投薬を受けていない被験体で存在する）ならびに治療のために被験体に投与されるタンパク質またはペプチドに結合することができる。治療用タンパク質に結合する自己抗体および薬物治療に対する応答で新規に形成される抗体は、抗薬物抗体（ADA）と総称される。被験体に投与される治療用タンパク質またはペプチドなどの分子に対する既存の抗体は、それら分子の有効性に影響を与えることができ、治療対象の患者での投与反応、過敏性、臨床応答の変化、および分子を持続させること、排除することまたは中和することによるバイオアベイラビリティの変化をもたらし得るであろう。低下した免疫原性（すなわち、被験体、特にヒト被験体に投与した場合の既存ADAに結合する能力の低下）を有するヒト免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインまたはdAbを含む、療法のための分子を提供することが有利であり得る。
【００７５】
つまり、本発明の一態様では、同等な非改変型分子と比較して、既存抗体（ADA）に結合する能力が低下した、改変型dAbまたは抗原結合性構築物またはそのような改変型dAbを含む二量体が提供される。低下した結合能とは、改変型分子が、既存ADAに対して低下した親和性（a reduced affinity or reduced avidity）で結合することを意味する。該改変型dAbは、(a) C末端付加、伸長、欠失もしくはタグ、および/または(b) 1箇所以上のアミノ酸フレームワーク置換から選択される1箇所以上の改変を含む。
【００７６】
一態様では、改変型dAbまたは抗原結合性構築物またはそのような改変型dAbを含む二量体は、以下のものを含む：
a) 配列VTVS(S)nX（VH dAbに関して）もしくはVEIKpRqX（VL dAbに関して）からなるC末端配列；およびまた任意により
b) ヒト生殖系列フレームワーク配列と比較して14、41、108、110、または112位での1箇所以上のアミノ酸置換
（ここで、
nは、0または1から独立に選択される整数であり；
pおよびqは、pが1を表す場合にqは0または1であり得、かつpが0を表す場合にqもまた0を表すように、それぞれが0または1を表し；
Xは、存在するかまたは不存在であり得、存在する場合は1〜8アミノ酸残基のアミノ酸伸長を表す）。
【００７７】
一態様では、dAbのC末端配列は、VEIKpRqX（ここで、pは1であり、qは0であり、Xは不存在である）である。
【００７８】
さらなる態様では、既存ADAに対する低下した結合性を有する該改変型dAbは、1箇所以上のアミノ酸置換を有し、該1箇所以上のアミノ酸置換は、P14A置換、P41A置換、L108A置換、T110A置換、S112A置換、P14K置換、P14Q置換、およびP14T置換からなる群より選択される。
【００７９】
さらなる態様では、Xが存在し、かつ1〜8アミノ酸の伸長であり、特にアラニン残基を含む1〜8アミノ酸の伸長（例えば、一残基アラニン伸長、またはAS、AST、ASTK、ASTKG、ASTKGP伸長）である。
【００８０】
さらなる態様では、Xが存在し、かつ1〜8アミノ酸の伸長であり、特にA、AAAまたはT伸長を含む1〜8アミノ酸の伸長である。
【００８１】
一態様では、改変型dAbは、C末端に存在するタグを含むことができる。タグは、当技術分野で公知のいずれかのタグ、例えば、アフィニティタグ（mycタグ、FLAGタグ、hisタグなど）、化学的修飾（PEGなど）、またはタンパク質ドメイン（抗体Fcドメインなど）であり得る。
【００８２】
C末端付加または伸長またはタグは、分子のC末端との直接的融合またはコンジュゲートとして存在し得る。
【００８３】
当業者に周知の免疫アッセイを用いて、改変型dAbがADAに対して所望の低下した結合性を有することを確認することができる。
【００８４】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に開示される抗原結合性構築物の二量体を対象とする。本明細書中で用いる場合、用語「二量体」とは、2つの抗原結合性構築物、すなわち、互いに会合して二量体を形成する2本の鎖を含むポリペプチド複合体を意味する。二量体は、本発明の2つの同じ抗原結合性構築物を含むホモ二量体または本発明の2つの異なる抗原結合性構築物を含むヘテロ二量体であり得る。本発明のホモ二量体またはヘテロ二量体は、標的VEGF分子に対する改善された特性（親和性など）を有することができる。
【００８５】
一態様では、本発明のホモ二量体およびヘテロ二量体は、BiacoreTM（本明細書中の方法に記載された通りのBiacoreTM法など）により測定した場合に、抗原に対して少なくとも1mMのKd、例えば、少なくとも10nM、1nM、500pM、200pM、100pM、＜100pM、10pM、5pM、1pMのKdを有してVEGFに結合することができる。
【００８６】
本発明の抗原結合性構築物および二量体のin vivo半減期は、免疫グロブリン定常ドメインまたはFcRn（新生児Fc受容体）結合性ドメインの改変により増加させることができる。
【００８７】
成体哺乳動物では、FcRn（新生児Fc受容体としても知られる）は、IgGアイソタイプの受容体に結合し、これを分解から救出する保護的受容体として機能することにより、血清抗体レベルの維持に重要な役割を果たす。IgG分子は内皮細胞によりエンドサイトーシスされ、それらがFcRnに結合する場合、循環中に出されて再利用される。対照的に、FcRnに結合していないIgG分子は細胞に入り、リソソーム経路の標的とされて、ここで分解される。
【００８８】
新生児FcRn受容体は、抗体クリアランスおよび組織間のトランスサイトーシスに関与していると考えられている（Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57およびGhetie et al (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766を参照されたい）。ヒトFcRnと直接的に相互作用すると断定されているヒトIgG1残基は、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434およびHis435である。本節に記載されたこれらの位置のいずれかでのスイッチは、本発明の抗原結合性タンパク質の血清半減期の増大および/またはエフェクター特性の変化を可能にすることができる。
【００８９】
本発明の抗原結合性タンパク質は、FcRnに対する定常ドメインまたはその断片の親和性を増大させるアミノ酸改変を有することができる。治療用および診断用IgGならびに他の生物活性分子の半減期を増大させることは、これらの分子の投与量および/または投与頻度を低下させることをはじめとする多数の利益を有する。したがって、一実施形態では、1箇所以上のこれらのアミノ酸改変を有するIgG定常ドメインの全体もしくは一部分を含む本明細書中に提供される本発明の抗原結合性タンパク質または融合タンパク質およびそのような改変型IgG定常ドメインにコンジュゲートされた非IgGタンパク質または非タンパク質分子が提供され、ここで、改変型IgG定常ドメインの存在が、抗原結合性タンパク質のin vivo半減期を増加させる。
【００９０】
PCT公報WO 00/42072号は、変化したFcRn結合親和性を有する変異型Fc領域を含むポリペプチドを開示し、このポリペプチドは、Fc領域の238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位、および447位アミノ酸のうちいずれかの1箇所以上にアミノ酸改変を含み、ここで、Fc領域の残基の番号付けは、EUインデックス（Kabat et al）のものである。
【００９１】
PCT公報WO 02/060919号A2には、野生型IgG定常ドメインと比較して1箇所以上のアミノ酸改変を含むIgG定常ドメインを含む改変型IgGが開示され、該改変型IgGは、野生型IgG定常ドメインを有するIgGの半減期と比較して増大した半減期を有し、1箇所以上のアミノ酸改変は、251位、253位、255位、285〜290位、308〜314位、385〜389位、および428〜435位でのものである。Shieldsら（2001, J Biol Chem ; 276:6591-604）は、ヒトIgG1抗体のFc領域中の残基を変化させるためにアラニンスキャン突然変異誘発（alanine scanning mutagenesis）を用い、続いてヒトFcRnに対する結合性を評価した。アラニンに変化させた場合にFcRnに対する結合を効果的に無効にする位置は、I253、S254、H435、およびY436を含む。以下の通りの他の位置は、結合での比較的顕著でない低下を示した：E233〜G236、R255、K288、L309、S415、およびH433。いくつかのアミノ酸位置が、アラニンに変化させた場合にFcRn結合性の改善を示した。そのうちの注目に値するものは、P238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424、およびN434である。多数の他のアミノ酸位置が、FcRn結合性での若干の改善を示すか（D265、N286、V303、K360、Q362、およびA378)または変化を示さなかった（S239、K246、K248、D249、M252、E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280、V282、E283、H285、T289、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E388、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430、T437、K439、S440、S442、S444、およびK447）。
【００９２】
最も著明な効果は、FcRnに対する改善された結合性を有する組み合わせ変異体について見出された。pH6.0にて、E380A/N434A変異体は、天然のIgG1と比較してFcRnに対して8倍超高い結合性を示し、それと比較して、E380Aでは2倍、およびN434Aでは3.5倍であった。これにT307Aを追加することで、天然のIgG1と比較して結合性での12倍の改善をもたらした。一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、E380A/N434A突然変異を含み、FcRnに対して増大した結合性を有する。
【００９３】
Dall'Acquaら（2002, J Immunol.169: 5171-80）は、マウスFcRnに対するヒトIgG1ヒンジ-Fc断片ファージディスプレイライブラリーのランダム突然変異誘発およびスクリーニングを記載した。筆者らは、251位、252位、254〜256位、308位、309位、311位、312位、314位、385〜387位、389位、428位、433位、434位、および436位のランダム突然変異誘発を開示した。IgG1-ヒトFcRn複合体安定性での主要な改善は、Fc-FcRn接触面を通るバンドに位置する残基（M252、S254、T256、H433、N434、およびY436）の置換で生じ、より低い程度で、V308、L309、Q311、G385、Q386、P387、およびN389などの周辺の残基の置換で生じる。ヒトFcRnに対する最高の親和性を有する変異体は、M252Y/S254T/T256EおよびH433K/N434F/Y436H突然変異を組み合わせることにより得られ、野生型IgG1と比較して親和性の57倍の増大を示した。そのような突然変異型ヒトIgG1のin vivo挙動は、野生型IgG1と比較してカニクイザルでの血清半減期の4倍近い増大を示した。
【００９４】
したがって、本発明は、FcRnに対する最適化された結合性を有する抗原結合性タンパク質の変異体を提供する。好ましい実施形態では、抗原結合性タンパク質の該変異体は、該抗原結合性タンパク質のFc領域での少なくとも1箇所のアミノ酸改変を含み、ここで、該改変は、該親ポリペプチドと比較してFc領域の以下のアミノ酸からなる群より選択され：226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401 403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447、ここで、Fc領域中のアミノ酸の番号付けは、KabatのEUインデックスのものである。
【００９５】
本発明のさらなる態様では、改変はM252Y/S254T/T256Eである。
【００９６】
さらに、種々の刊行物が、分子へとFcRn結合性ポリペプチドを導入することにより（WO 97/43316；米国特許第5,869,046号；同第5,747,035号；WO 96/32478；WO 91/14438）、またはFcRn結合親和性は保存されているが他のFc受容体に対する親和性は大幅に減少している抗体と分子とを融合させることにより（WO 99/43713）または抗体のFcRn結合性ドメインと融合させることにより（WO 00/09560；米国特許第4,703,039号）、その半減期が改変されている、生理学的に活性な分子を得るための方法を記載している。
【００９７】
さらに、減少した生物学的半減期を有する抗原結合性タンパク質を作製する方法もまた提供される。His435がアラニンに突然変異されている変異体IgGは、FcRn結合性の選択的低下および顕著に減少した血清半減期をもたらす（Firan et al. 2001, International immunology 13:993）。米国特許第6,165,745号には、抗原結合性タンパク質をコードするDNAセグメントに突然変異を導入することにより、減少した生物学的半減期を有する抗原結合性タンパク質を作製する方法が開示されている。突然変異としては、Fc-ヒンジドメインの253位、310位、311位、433位、または434位でのアミノ酸置換が挙げられる。
【００９８】
本発明はまた、本明細書中に開示されるいずれかの特定の抗原結合性構築物配列（エピトープ結合ドメイン配列など、例えば、dAb配列または抗原結合性構築物全体の配列）の変異体にも関する。好適には、変異体は、好適には親配列の結合特性を実質的に保持しているか、または親が多特異的である場合には少なくとも1種の結合特性（VEGF Aなどの1つのVEGFに対するいくぶんかの結合親和性など）を実質的に保持しながら、特定された配列に対して少なくとも70％、または少なくとも75％、または少なくとも80％、または少なくとも85％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一般的に、いずれの変異体も、親の結合親和性の少なくとも30％、好適には少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上、好適には親配列の100％（またはそれ以上）の結合親和性を有するであろう。
【００９９】
一態様では、抗原結合性構築物は、抗原結合性構築物がVEGF（VEGF Aなど）に結合することが可能である限り、1、2、3、または4個のアミノ酸を変化させることができる。
【０１００】
一態様では、エピトープ結合ドメイン配列は、ドメイン抗体（dAb）由来のCDR（1つまたは複数）を含む。本明細書中で特定または参照されるいずれかの配列のCDRは、抗原結合性構築物がVEGF（VEGF-Aなど）に結合することが可能である限り、1、2、3、または4個のアミノ酸を変化させることができる。
【０１０１】
CDRは、抗原結合性タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。
【０１０２】
本明細書中を通して、可変ドメイン配列のアミノ酸残基は、特に記載しない限り、Kabatナンバリング慣例（Kabat numbering convention）に従って番号付けされる。さらなる情報に関しては、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。
【０１０３】
以下の表（表1）は、各CDRまたは結合単位についてのそれぞれのナンバリング慣例を用いた1つの定義を示す。表1では、Kabatナンバリングスキームを用いて、可変ドメインアミノ酸配列を番号付けしている。CDR定義の一部は、用いられる個々の刊行物によって変わり得ることに留意すべきである。
【表６】
0005987057.tif 000007
【０１０４】
一態様では、本発明は、2つのdAbを含む抗原結合性構築物であって、各dAbが独立に選択され、以下のものを含む、抗原結合性構築物を提供する：
(i) CDR配列である配列番号111、112および113のうち1つ以上；
(ii) CDR配列である配列番号114、115および116のうち1つ以上；
(iii) CDR配列である配列番号117、118および119のうち1つ以上；
(iv) CDR配列である配列番号120、121および122のうち1つ以上；
(v) CDR配列である配列番号123、124および125のうち1つ以上；
(vi) CDR配列である配列番号126、127および128のうち1つ以上；または
(vii) CDR配列である配列番号129、130および131のうち1つ以上。
【０１０５】
さらなる態様では、本発明は、2つのdAbを含む抗原結合性構築物であって、抗体のFc領域のN末端につなげられたdAbが1つ以上のCDR配列：配列番号114、115および116を含み、抗体のFc領域のC末端につなげられたdAbが1つ以上のCDR配列：配列番号117、118および119を含む、抗原結合性構築物を提供する。
【０１０６】
またさらなる態様では、本発明は、1つのdAbを含む抗原結合性構築物を提供し、該抗原結合性構築物は以下のものを含む：
(i) CDR配列である配列番号117、118および119のうち1つ以上；
(ii) CDR配列である配列番号120、121および122のうち1つ以上；
(iii) CDR配列である配列番号123、124および125のうち1つ以上；
(iv) CDR配列である配列番号126、127および128のうち1つ以上；または
(v) CDR配列である配列番号129、130および131のうち1つ以上。
【０１０７】
一態様では、例えば、VEGF（VEGF Aなど）に対する結合に関して、本明細書中に記載される抗原結合性構築物または二量体と競合する抗原結合性構築物または二量体が提供される。
【０１０８】
一態様では、本明細書中に記載される抗原結合性構築物および二量体は、VEGF-Aに対する結合に関してアバスチンと競合することができる。
【０１０９】
本明細書中に記載される抗原結合性構築物および二量体のいずれもが、1種以上の抗原を中和することが可能であろうことが理解されるであろう。
【０１１０】
本発明の抗原結合性構築物との関連で本明細書を通して用いられる、用語「中和する」およびその文法的な変形は、本発明の抗原結合性構築物の存在下で、そのような抗原結合性構築物の不在下での標的の活性と比較して、標的の生物学的活性が、完全にまたは部分的に、減少することを意味する。中和は、限定するものではないが、リガンド結合をブロックすること、リガンドが受容体を活性化するのを防止すること、受容体をダウンレギュレーションすることまたはエフェクター機能性に影響を与えることのうち1つ以上によるものであり得る。
【０１１１】
例えば、中和性抗原結合性構築物の存在下でのリガンドとその受容体との結合の減少を評価することにより、中和を評価する方法は当技術分野で公知であり、受容体結合アッセイ（本明細書中の実施例7、17、26、41および50を参照されたい）およびウサギ網膜漏出モデル（rabbit retinal leakage model）（本明細書中の実施例9および42を参照されたい）を含む。
【０１１２】
本発明はまた、本発明の抗原結合性構築物をコードするか、またはそのような構築物の一部分（エピトープ結合ドメイン配列など）をコードするポリヌクレオチド配列にも関する。好適には、ポリヌクレオチドは、VEGF（VEGF-Aなど）に結合することができるポリペプチドをコードする。本発明はまた、抗原結合性構築物またはその一部分に対して少なくとも70％の配列同一性（少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％など）を有する抗原をコードするポリヌクレオチド配列にも関する。一態様では、抗原結合性構築物またはその一部分は、VEGF（VEGF-Aなど）に結合することができ、かつVEGF（VEGF-Aなど）シグナル伝達に関連する疾患を完全にもしくは部分的に予防または治療することができる。
【０１１３】
本発明はまた、本明細書中に開示される特定のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70％の配列同一性（少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の同一性など）を有するポリヌクレオチド配列にも関する。
【０１１４】
本発明の抗原結合性構築物は、本発明の抗原結合性構築物に対するコード配列を含む発現ベクターを用いる宿主細胞のトランスフェクションにより、製造することができる。発現ベクターまたは組み換えプラスミドは、抗原結合性構築物についてのこれらのコード配列を、宿主細胞での複製および発現、および/または宿主細胞からの分泌を制御することが可能な慣用の調節制御配列と機能的につなげて配置することによって製造される。調節配列としては、プロモーター配列（例えば、CMVプロモーター）、および他の既知の抗体に由来することができるシグナル配列が挙げられる。同様にして、相補的抗原結合性構築物をコードするDNA配列を有する第2の発現ベクターを製造することができる。特定の実施形態では、この第2の発現ベクターは、コード配列および選択マーカーが関与し、それにより各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることを可能な限り確実にすることを条件にすることを除いて、第1のベクターと同一である。あるいは、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する2つの抗原結合性構築物に対するコード配列は、単一のベクター上に（例えば、同じベクターの2つの発現カセットに）存在し得る。
【０１１５】
一態様では、本発明は、本明細書中に記載される抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体をコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列を含む、組み換え形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞に関する。
【０１１６】
選択された宿主細胞を、第1のベクターと第2のベクターの両方を用いて慣用の技術により共トランスフェクションして（または単に単一のベクターによりトランスフェクションして）、本発明のトランスフェクションされた宿主細胞を作製することができる。トランスフェクションされた細胞を、次に慣用の技術により培養して、遺伝子操作された本発明の抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体を生成させる。抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体は、適切なアッセイ（ELISAまたはRIAなど）により培養物からスクリーニングする。本明細書中に開示される他の抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体を構築するために、同様の慣用の技術を用いることができる。
【０１１７】
本発明の方法および組成物の構築で用いるクローニングステップおよびサブクローニングステップのための好適なベクターは、当業者が選択することができる。例えば、慣用のpUCシリーズのクローニングベクター（pUC19など）を用いることができる。さらに、容易に複製可能であり、多数のクローニング部位および選択遺伝子（例えば、抗生剤耐性遺伝子）を有し、かつ操作が容易ないずれのベクターでも、クローニングのために用いることができる。つまり、クローニングベクターの選択は、本発明の限定要因ではない。
【０１１８】
発現ベクターはまた、異種DNA配列の発現を増幅するのに好適な遺伝子（例えば、哺乳動物ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（DHFR））を特徴とする場合もある。他の好適なベクター配列としては、ウシ成長ホルモン（BGH）由来のものなどのポリAシグナル配列およびβ-グロビンプロモーター配列（betaglopro）が挙げられる。本明細書中で有用な発現ベクターは、当業者に周知の技術を用いて合成することができる。
【０１１９】
そのようなベクターの構成要素（例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列など）は、商業的供給源もしくは天然供給源から取得するか、または選択された宿主での組み換えDNAの生成物の発現および/もしくは分泌を指令することに用いるための公知の手順により合成することができる。多数のタイプが哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、および真菌発現のために当技術分野で公知である他の適切な発現ベクターもまた、この目的のために選択することができる。
【０１２０】
本発明はまた、本発明の抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体のコード配列を含有する組み換えプラスミドを用いてトランスフェクションされた細胞株も包含する。クローニングおよびこれらのクローニングベクターの他の操作のために有用な宿主細胞もまた慣用である、しかしながら、大腸菌の種々の株由来の細胞を、クローニングベクターの複製および本発明の抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体の構築での他のステップのために用いることができる。
【０１２１】
本発明の抗原結合性構築物、ヘテロ二量体またはホモ二量体の発現のための好適な宿主細胞または細胞株としては、哺乳動物細胞、例えばNS0、Sp2/0、CHO（例えば、DG44）、COS、HEK、線維芽細胞（例えば、3T3）、および骨髄腫細胞などが挙げられ、例えば、CHOまたは骨髄腫細胞で発現させることができる。ヒト細胞を用いることができ、従って、分子をヒトグリコシル化パターンで修飾することが可能になる。あるいは、他の真核生物細胞株を用いることができる。好適な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増殖、スクリーニングおよび生成物産生および精製のための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. 1989: Cold Spring harbour Press, Molecular Cloning: Laboratory Manualを参照されたい。
【０１２２】
当業者に公知の細菌細胞および所望の場合には酵母細胞の株、ならびに昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Drosophila）および鱗翅目（Lepidoptera））およびウイルス発現系も宿主細胞として利用可能である。例えば、Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)およびその中で引用されている参照文献を参照されたい。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載される抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体の製造方法であって、宿主細胞を培養し、そして抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体を単離するステップを含む方法に関する。
【０１２４】
本発明はまた、本明細書中に記載される抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体の製造方法であって、以下のステップ：
(a) 本明細書中に記載される単離された核酸を含む発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を培養するステップであって、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が組み換え宿主細胞中で不活性化されている、上記ステップ；および
(b) 抗原結合性タンパク質を回収するステップ
を含む方法も提供する。
【０１２５】
抗原結合性構築物、ヘテロ二量体およびホモ二量体の製造のためのそのような方法は、例えば、BioWa社（Princeton, NJ）から入手可能なPOTELLIGENTTM技術システムを用いて行なうことができ、これは、機能的FUT8遺伝子を有する細胞で産生される同一のタンパク質と比較して増大した、強化された抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ADCC）活性を有する抗原結合性構築物、ホモ二量体およびヘテロ二量体を製造することができる。POTELLIGENTTM技術システムの態様は、US7214775、US6946292、WO0061739およびWO0231240に記載されている（これらのすべてが参照により本明細書中に組み入れられる）。当業者はまた、他の適切な系も認識するであろう。
【０１２６】
本発明はまた、本明細書中に記載される抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体を製造する方法であって、以下のステップ：
(a) 本明細書中に記載される単離された核酸を含む発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を培養するステップであって、該発現ベクターがIgG1およびIgG3両方のFcドメインアミノ酸残基を有するFcドメインをコードする核酸配列を含む、上記ステップ；および
(b) 抗原結合性タンパク質を回収するステップ
を含む方法も提供する。
【０１２７】
抗原結合性構築物、ヘテロ二量体およびホモ二量体の製造のためのそのような方法は、例えば、BioWa社（Princeton, NJ）および協和発酵工業株式会社（現在は協和発酵キリン株式会社）から入手可能なCOMPLEGENTTM技術システムを用いて行なうことができ、このシステムでは、IgG1およびIgG3両方のFcドメインアミノ酸残基を有するキメラ型Fcドメインをコードする核酸配列を発現させ、これによりそのようなキメラ型Fcドメインを有しないこと以外は同一のタンパク質と比較して増大した、強化された補体依存性細胞毒性（CDC）活性を有する抗原結合性構築物、ヘテロ二量体またはホモ二量体を製造させる。COMPLEGENTTM技術システムの態様は、WO2007011041およびUS20070148165に記載されている（これらのそれぞれが参照により本明細書中に組み入れられる）。別の実施形態では、IgG鎖のFc領域に配列特異的突然変異を導入することにより、CDC活性を増大させることができる。当業者はまた、他の適切な系も認識するであろう。
【０１２８】
そのような改変は単独で用いるだけでなく、エフェクター機能をさらに強化させるために互いに組み合わせて用いることができることは、当業者には明らかであろう。
【０１２９】
本発明の一態様では、少なくともIgG3由来の1つのCH2ドメインおよびIgG1由来の1つのCH2ドメインを含む突然変異型およびキメラ型重鎖定常領域を含む重鎖定常領域を含む抗原結合性構築物、ヘテロ二量体またはホモ二量体が提供され、IgG1 CH2ドメインは、239位および332位および330位から選択される位置での1箇所以上の突然変異（例えば、突然変異はS239DおよびI332EおよびA330Lから選択することができる）を有し、それにより抗原結合性構築物は強化されたエフェクター機能を有し、例えば、以下の機能のうち1つ以上を有する：強化されたADCCまたは強化されたCDC、例えば、強化されたADCCおよび強化されたCDC。一態様では、IgG1 CH2ドメインは、突然変異S239DおよびI332Eを有する。
【０１３０】
本発明の別の態様では、キメラ型重鎖定常領域を含み、変化したグリコシル化プロフィールを有する抗原結合性構築物、ヘテロ二量体またはホモ二量体が提供される。そのような一態様では、重鎖定常領域は、少なくともIgG3由来の1つのCH2ドメインおよびIgG1由来の1つのCH2ドメインを含み、フコース：マンノースの比が0.8：3以下となる変化したグリコシル化プロフィールを有し、例えば、抗原結合性タンパク質が脱フコシル化され、それにより該抗原結合性タンパク質が、そのような突然変異および変化したグリコシル化プロフィールを有しない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同等な抗原結合性タンパク質と比較して強化されたエフェクター機能を有し、例えば、以下の機能のうち1つ以上を有する：強化されたADCCまたは強化されたCDC、例えば、強化されたADCCおよび強化されたCDC。
【０１３１】
本発明の一態様では、BioWa社（Princeton, NJ）から入手可能なACCRETAMABTM技術システム（POTELLIGENTTM技術システムおよびCOMPLEGENTTM技術システムを組み合わせている）を用いて、キメラ型Fcドメインを有さず、オリゴ糖にフコースを有する以外は同一のモノクローナル抗体と比較して増大した、強化されたADCC活性およびCDC活性の両方を有する抗原結合性タンパク質を生成する、本明細書中に記載される抗原結合性構築物、ヘテロ二量体またはホモ二量体を製造する方法を提供する。
【０１３２】
抗原結合性構築物の発現の別の方法は、米国特許第4,873,316号に記載されているものなどのトランスジェニック動物での発現を用いることができる。これは、動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関し、哺乳動物にトランスジェニックにより組み込まれた場合に、メスがその母乳中に所望の組み換えタンパク質を産生することを可能にする。
【０１３３】
本発明はまた、抗原結合性構築物のアミノ酸配列またはそれをコードする核酸、あるいはそれらの一部分をコンピュータを用いて設計し、構築物がコンピューター上でin silicoで存在する、本明細書中に開示される抗原結合性構築物の製造方法にも関する。
【０１３４】
本発明はまた、医学での使用のための、例えば、癌および眼疾患（糖尿病性黄斑浮腫（DME）、Wet AMD（加齢黄斑変性）、糖尿病性網膜症、RVO（網膜静脈閉塞）、および角膜血管新生など）などのVEGFシグナル伝達（VEGF-Aシグナル伝達など）に関連する疾患を治療するための医薬の製造における使用のための、本明細書中に開示される抗原結合性構築物も提供する。
【０１３５】
本発明はまた、治療的な量の本発明の抗原結合性構築物を投与するステップを含む、癌および眼疾患（糖尿病性黄斑浮腫（DME）、Wet AMD、糖尿病性網膜症、RVO、および角膜血管新生など）などのVEGFシグナル伝達（VEGF-Aなど）により引き起こされる眼血管疾患に罹患した患者を治療する方法にも関する。
【０１３６】
本発明はまた、癌および眼疾患（糖尿病性黄斑浮腫（DME）、Wet AMD、糖尿病性網膜症、RVO、および角膜血管新生など）の治療のための本発明の抗原結合性構築物にも関する。
【０１３７】
投与量および治療の継続期間は、ヒト循環中での本発明の分子の相対的持続期間に関連し、治療対象の状態および患者の全般的な健康状態に応じて当業者が調整することができる。長期間（例えば、4〜6ヵ月）にわたる繰り返し投与（例えば、1週間に1回または2週間に1回）が、最大の治療的有効性を達成するために必要である場合がある。
【０１３８】
本発明の治療剤の投与様式は、宿主に薬剤を送達するいずれかの好適な経路であり得る。本発明の抗原結合性構築物、および医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下投与（s.c.）、髄腔内投与、腹腔内投与、筋内投与（i.m.）、静脈内投与（i.v.）、または鼻内投与に特に有用である。
【０１３９】
一態様では、投与は眼に適応のものであり、投与は、硝子体内投与（眼の硝子体液への直接注入）などの局所眼部送達によるか、または眼周囲投与（例えば、経強膜投与、結膜下、テノン嚢下（sub-tenon）、球周囲投与、局所投与、球後投与など）であるか、または下直筋、上直筋または外直筋に送達される。一態様では、投与は、経強膜投与または局所眼送達である。
【０１４０】
例えば硝子体内注射による眼への局所性投与のために、医薬調製物を、25〜30gの針ゲージを用いる標準的な注射器による単回注射により投与される100μLの総量で（例えば、50〜100μL）投与することができる（30g針を用いて投与される50μL量など）。不定期投与のために調製する場合、そのような製剤は、液量内に15％までの固体懸濁物を含有することができる。そのような製剤中の活性薬剤の用量は様々であるが、好ましい態様では、25〜30％までの固体懸濁物を含むことができるであろう。好ましい態様では、0.5〜2.5mgの活性薬剤を、眼投与を介して投与する。
【０１４１】
一態様では、投与は、持続送達系もしくは徐放送達系（微粒子もしくはゲルベースの系、またはリポソームベースの系など）または好適には月1回注射の投薬レジメンと比較した場合に減少した頻度での眼への局所的投与を可能にするであろう当業者に公知のいずれかの他の系を用いる。そのようなレジメンは、1週間に1回または2週間に1回未満の頻度での送達を可能にし、例えば、4週間に1回、2ヵ月もしくは8週間に1回、3ヵ月もしくは12週間に1回、4ヵ月もしくは16週間に1回、5ヵ月もしくは20週間に1回、6ヵ月もしくは24週間に1回、9ヵ月もしくは36週間に1回、または12ヵ月もしくは52週間に1回であり得るであろう。本発明の抗原結合性構築物、ヘテロ二量体およびホモ二量体のための好ましい送達頻度は、6ヵ月または24週間に1回である。
【０１４２】
本発明の治療剤は、製薬上許容される担体中の活性成分として、有効量の本発明の抗原結合性構築物、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含有する医薬組成物として調製することができる。本発明の予防剤では、即時注射形態での、好ましくは生理的pHに緩衝された、抗原結合性構築物を含有する水性懸濁液または水溶液が好ましい。非経口投与用の組成物は、一般的に、製薬上許容される担体（好ましくは水性担体）中に溶解された本発明の抗原結合性構築物またはそのカクテルの溶液を含む。種々の水性担体を用いることができ、これは例えば、0.9％生理食塩液、0.3％グリシンなどである。これらの溶液は、無菌かつ一般的に粒子状物質を含まないようにすることができる。これらの溶液は、慣用の周知の滅菌技術（例えば、ろ過）により滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要な場合、製薬上許容される補助物質を含有することができる（pH調整剤および緩衝剤など）。そのような医薬製剤中の本発明の抗原結合性構築物の濃度は、広い範囲で異なることができ、すなわち、約0.5重量％未満から、通常は約1重量％または少なくとも1重量％から15または20重量％ほどであり、選択された特定の投与様式にしたがって、第一に流体の体積、粘度などに基づいて選択されるであろう。
【０１４３】
つまり、筋内注射用の本発明の医薬組成物は、1mLの滅菌緩衝水、および約1ng〜約100mg、例えば、約50ng〜約30mgまたはより好ましくは約5mg〜約25mgの本発明の抗原結合性構築物を含有させて調製することができる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約250mLの無菌リンゲル液、およびリンゲル液1mL当たり約1〜約30、好ましくは5mg〜約25mgの本発明の抗原結合性構築物を含有させて作製することができる。非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は周知であり、当業者に明白であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにさらに詳細に記載されている。本発明の静脈内投与可能な抗原結合性構築物製剤の調製に関して、以下の文献を参照されたい：Lasmar U and Parkins D “The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000)、Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals”, Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992)、Akers,M.J. “Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations”, J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300、Imamura, K et al “Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274、Izutsu, Kkojima, S. “Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”, J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039、Johnson, R, “Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization”, J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922、Ha,E Wang W, Wang Y.j. “Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability”, J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)（これらの全内容は、参照により本明細書中に組み入れられ、かつ読者が具体的に参照する。
【０１４４】
医薬調製物である場合、本発明の治療剤が単位投与剤形で存在することが好ましい。適切な治療上有効用量は、当業者が容易に決定するであろう。好適な用量は、体重に従って患者に対して算出することができ、例えば、好適な用量は、0.01〜20mg/kg、例えば0.1〜20mg/kg、例えば1〜20mg/kg、例えば10〜20mg/kgまたは例えば1〜15mg/kg、例えば10〜15mg/kgの範囲であり得る。ヒトで本発明で用いる状態を有効に治療するために、好適な用量は、0.01〜1000mg、例えば0.1〜1000mg、例えば0.1〜500mg、例えば500mg、例えば0.1〜100mg、または0.1〜80mg、または0.1〜60mg、または0.1〜40mg、または例えば1〜100mg、または1〜50mgの範囲内の本発明の抗原結合性構築物であり得、これを非経口的に、例えば皮下、静脈内または筋内に投与することができる。そのような投与は、必要な場合、医師により適切に選択された適切な時間間隔で繰り返される。
【０１４５】
本明細書中に記載される抗原結合性構築物は、保存のために凍結乾燥して、使用前に好適な担体中に再構成することができる。この技術は、慣用の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥・再構成技術を用いることができる。
【０１４６】
本発明で用いるエピトープ結合ドメインを作製するために用いることができる、当技術分野で公知のいくつかの方法がある。
【０１４７】
一例では、方法は、核酸のコード機能と、該核酸によりコードされるポリペプチドの物理的、化学的および/または機能的特性とを関連付けるディスプレイシステムを利用する。そのようなディスプレイシステムは、複数の複製可能な遺伝的パッケージ（バクテリオファージまたは細胞（細菌）など）を含むことができる。ディスプレイシステムは、ライブラリ（バクテリオファージディスプレイライブラリなど）を含むことができる。バクテリオファージディスプレイは、ディスプレイシステムの一例である。
【０１４８】
用語「ライブラリ」とは、不均一なポリペプチドまたは核酸の混合物を意味する。ライブラリは、それぞれが単一のポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成される。この範囲で、「ライブラリ」は「レパートリ」と同義である。ライブラリメンバー間の配列の差異は、ライブラリ中に存在する多様性を担う。ライブラリは、ポリペプチドもしくは核酸の単純な混合物の形態を採ることができ、または核酸のライブラリで形質転換された生命体もしくは細胞（例えば、細菌、ウイルス、動物または植物細胞など）の形態であり得る。一例では、個々の生命体または細胞は、ただ1つのまたは限定された数のライブラリメンバーを含有する。有利には、核酸は、該核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、発現ベクターに組み込まれる。従って一態様では、ライブラリは、宿主生命体の集団の形態を採ることができ、それぞれの生命体は、核酸の形態でライブラリの単一のメンバーを含有する発現ベクターの1個以上のコピーを含み、該核酸が発現されて、その対応するポリペプチドメンバーを生成することができる。つまり、宿主生命体の集団は、様々なポリペプチドの大きなレパートリをコードする能力を有する。
【０１４９】
多数の好適なバクテリオファージディスプレイシステム（例えば、一価ディスプレイおよび多価ディスプレイシステム）が記載されている（例えば、以下の刊行物を参照されたい：Griffiths et al., 米国特許第6,555,313号B1（参照により本明細書中に組み入れられる）；Johnson et al., 米国特許第5,733,743号（参照により本明細書中に組み入れられる）；McCafferty et al., 米国特許第5,969,108号（参照により本明細書中に組み入れられる）；Mulligan-Kehoe, 米国特許第5,702,892号（参照により本明細書中に組み入れられる）；Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)；Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994)；Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)）。バクテリオファージディスプレイシステムでディスプレイされるペプチドまたはポリペプチドは、例えば、線状ファージ（例えば、fd、M13、F1）、溶菌性ファージ（例えば、T4、T7、λ）またはRNAファージ（例えば、MS2）などのいずれかの好適なバクテリオファージ上にディスプレイすることができる。
【０１５０】
ファージディスプレイなどのディスプレイシステム（例えば、核酸のコード機能と、該核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの機能的特性とを関連付けるシステム）を本明細書中に記載される方法で用いる場合（例えば、dAbまたは他のエピトープ結合ドメインの選択で用いる場合）、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅するかまたはそのコピー数を増やすことが多くの場合に有利である。これは、本明細書中に記載される方法または他の好適な方法を用いる選択の追加ラウンドのための、またはさらなるレパートリ（例えば、親和性成熟レパートリ）を調製するために、十分な量の核酸および/またはペプチドもしくはポリペプチドを取得する効率的な方法を提供する。核酸は、ファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応などのいずれかの好適な方法を用いて増幅することができる。
【０１５１】
一般的に、好適なファージコートタンパク質（例えば、fd pIIIタンパク質）との融合タンパク質としてペプチドまたなファージポリペプチドのレパートリをディスプレイするファージのライブラリが、作製または供給される。融合タンパク質は、ファージコートタンパク質の先端に（または所望の場合には内部の位置で）、ペプチドまたはポリペプチドをディスプレイすることができる。例えば、ディスプレイされるペプチドまたはポリペプチドは、pIIIのドメイン1に対するアミノ末端の位置に存在することができる。（pIIIのドメイン1は、N1とも称される。）ディスプレイされるポリペプチドは、pIIIに直接融合させることができ（例えば、pIIIのドメイン1のN末端）またはリンカーを用いてpIIIに融合させることができる。所望であれば、融合体は、タグ（例えば、mycエピトープ、Hisタグ）をさらに含むことができる。ファージコートタンパク質との融合タンパク質としてディスプレイされるペプチドまたはポリペプチドのレパートリを含むライブラリは、ディスプレイされるペプチドもしくはポリペプチドをコードするファージベクターまたはファージミドベクターのライブラリを好適な宿主細菌に導入し、得られた細菌を培養してファージを生成させる（例えば、好適なヘルパーファージまたは所望の場合には補完プラスミドを用いて）ことによるなどして、いずれかの好適な方法を用いて生成することができる。ファージのライブラリは、沈殿および遠心分離などのいずれかの好適な方法を用いて、培養物から回収することができる。
【０１５２】
ディスプレイシステムは、いずれかの所望の量の多様性を含むペプチドまたはポリペプチドのレパートリを含むことができる。例えば、レパートリは、生命体、生命体群、所望の組織もしくは所望の細胞タイプにより発現される天然に存在するポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むか、あるいはランダムな、もしくはランダム化されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むことができる。所望であれば、ポリペプチドは、共通コアまたは足場を共有することができる。例えば、レパートリまたはライブラリ中のすべてのポリペプチドが、プロテインA、プロテインL、プロテインG、フィブロネクチンドメイン、アンチカリン（anticalin）、CTLA4、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ、セルラーゼ）、または抗体もしくは抗体断片などの免疫グロブリンスーパーファミリー由来のポリペプチド（例えば、抗体可変ドメイン）から選択される足場に基づくことができる。そのようなレパートリまたはライブラリ中のポリペプチドは、ランダムなまたはランダム化されたアミノ酸配列の所定の領域および共通アミノ酸配列の領域を含むことができる。特定の実施形態では、レパートリ中のすべてまたは実質的にすべてのポリペプチドは、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ）または抗体の所望の抗原結合性断片（例えば、ヒトVHまたはヒトVL）などの所望のタイプのものである。一部の実施形態では、ポリペプチドディスプレイシステムは、各ポリペプチドが抗体可変ドメインを含むポリペプチドのレパートリを含む。例えば、レパートリ中の各ポリペプチドは、VH、VLまたはFv（例えば、一本鎖Fv）を含むことができる。
【０１５３】
アミノ酸配列多様性は、いずれかの好適な方法を用いてペプチドもしくはポリペプチドまたは足場のいずれかの所望の領域に導入することができる。例えば、アミノ酸配列多様性は、いずれかの好適な突然変異誘発法（例えば、低フィデリティPCR、オリゴヌクレオチド媒介または部位特異的突然変異誘発、NNKコドンを用いた多様化）またはいずれかの他の好適な方法を用いて多様化されたポリペプチドをコードする核酸のライブラリを調製することにより、抗体可変ドメインの相補性決定領域または疎水性ドメインなどの標的領域に導入することができる。所望であれば、多様化する対象のポリペプチドの領域をランダム化することができる。
【０１５４】
レパートリを構成するポリペプチドのサイズは、大部分が選択の問題であり、均一なポリペプチドサイズは必要とされない。レパートリ中のポリペプチドは、少なくとも三次構造を有する（少なくとも1つのドメインを形成する）ことができる。
【０１５５】
エピトープ結合ドメインまたはドメインの集合は、いずれかの好適な方法を用いて、レパートリまたはライブラリ（例えば、ディスプレイシステム中）から選択し、単離しかつ/または回収することができる。例えば、ドメインは、選択可能な特性（例えば、物理的特性、化学的特性、機能的特性）に基づいて選択または単離することができる。好適な選択可能な機能的特性としては、レパートリ中のペプチドまたはポリペプチドの生物学的活性、例えば、一般的リガンド（例えば、スーパー抗原）に対する結合性、標的リガンド（例えば、抗原、エピトープ、基質）に対する結合性、抗体に対する結合性（例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現されるエピトープを通して）、および触媒活性が挙げられる（例えば、Tomlinson et al., WO 99/20749；WO 01/57065；WO 99/58655を参照されたい）。
【０１５６】
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーはすべて、それらのポリペプチド鎖に関して類似のフォールディングを共有する。例えば、抗体はその一次配列において非常に多様であるが、配列および結晶学的構造の比較から、予想とは異なり、抗体の6個の抗原結合性ループのうち5個（H1、H2、L1、L2、L3）が、限られた数の主鎖コンホメーション、または古典的構造を採用していることが明らかになっている（Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901；Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877）。したがって、ループ長および重要な残基の解析によって、ヒト抗体の大多数で見出されるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖コンホメーションの予測が可能となってきた（Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799；Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628；Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220）。H3領域は、配列、長さおよび構造においてはるかに多様であるが（Dセグメントの使用による）、H3領域もまた、短いループ長について限られた数の主鎖コンホメーションを形成し、主鎖コンホメーションは、ループおよび抗体フレームワーク中の重要な位置での特定の残基の長さおよび存在、または残基の種類に依存する（Martin et al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800；Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1）。
【０１５７】
有利には、dAbは、ドメインのライブラリ（VHドメインのライブラリおよび/またはVLドメインのライブラリなど）から組み立てられる。一態様では、一定のループ長および重要な残基を選択して、メンバーの主鎖コンホメーションがわかることを確実にして、ドメインのライブラリを設計する。有利には、これらは、天然に見出される免疫グロブリンスーパーファミリー分子の本当のコンホメーションであり、それにより、上記のようにこれらが機能しない可能性を最小限にする。機能的メンバーのうち少数が、その機能に影響しない変化した主鎖コンホメーションを有することができるように、変異は低頻度で存在し得る。
【０１５８】
数種類の既知の主鎖コンホメーションまたは単一の既知の主鎖コンホメーションを選択した場合、構造的および/または機能的多様性を有するレパートリを作製するために、分子の結合部位を変えることにより、dAbを構築することができる。このことは、変異体がその構造および/またはその機能に十分な多様性を有して、一定範囲の活性をもたらすことが可能であるように、変異体を作製することを意味する。
【０１５９】
一態様では、本発明は、本明細書中に記載される配列に対して実質的に同一な配列、例えば少なくとも90％同一の配列、例えば少なくとも91％、または少なくとも92％、または少なくとも93％、または少なくとも94％、または少なくとも95％、または少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、または少なくとも99％同一の配列を含む。
【０１６０】
核酸に関して、用語「実質的に同一」とは、2つの核酸、またはその指定された配列が、適切なヌクレオチド挿入または欠失を含んで最適にアラインして比較した場合に、少なくとも約80％のヌクレオチドで、通常は少なくとも約90％〜95％、より好ましくは少なくとも約98％〜99.5％のヌクレオチドで同一であることを示す。あるいは、実質的な同一性は、セグメントが、ストランドの相補体に対して選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に、存在する。
【０１６１】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関して、用語「同一な」とは、適切な挿入または欠失を含んで最適にアラインして比較した場合の、2つの核酸またはアミノ酸配列の間の同一性の程度を示す。あるいは、実質的な同一性は、DNAセグメントが、ストランドの相補体に対して選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に、存在する。
【０１６２】
2つの配列の間の同一性パーセントは、配列同士により共有される同一な位置の数の関数であり（すなわち、同一性％＝同一な位置の数/位置の総数 ×100）、2つの配列を最適にアラインするために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較および2つの配列の間の同一性パーセントの決定は、以下の非限定的な例に記載される通り、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
【０１６３】
2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリックスならびに40、50、60、70、または80のギャップ重み付けおよび1、2、3、4、5、または6の長さ重み付けを用いて、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて決定することができる。2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、PAM120重み付け残基表、12のギャップ長さペナルティおよび4のギャップペナルティを用いて、E. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）（ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられている）を用いても決定することができる。さらに、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、ならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップ重み付けおよび1、2、3、4、5、または6の長さ重み付けを用いて、NeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）アルゴリズム（GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み入れられている）を用いて決定することができる。
【０１６４】
例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、参照配列と同一、つまり100％同一であることができ、または参照配列と比較して特定の整数までのヌクレオチド変化を含むことができる。そのような変化は、少なくとも1箇所のヌクレオチド欠失、置換（転位およびトランスバージョンを含む）、または挿入からなる群より選択され、該変化は、参照ヌクレオチド配列の5’または3’末端位置で、またはそれらの末端位置の間のどこかで、参照配列中のヌクレオチドの中で個々に散在して、もしくは参照配列内で1つ以上の連続的な群で、生じることができる。ヌクレオチド変化の数は、参照配列中のヌクレオチドの総数と、それぞれの同一性パーセントのパーセント数（100で除算する）とを乗算し、参照配列のヌクレオチドの該総数からその積を減算することにより決定され、または：
nn ≦ xn − (xn ・ y)
であり、式中、nnはヌクレオチド変化の数であり、xnは参照配列中のヌクレオチドの総数であり、yは50％同一性について0.50であり、60％同一性について0.60であり、70％同一性について0.70であり、80％同一性について0.80であり、85％同一性について0.85であり、90％同一性について0.90であり、95％同一性について0.95であり、97％同一性について0.97であり、または100％同一性について1.00であり、xnとyとの整数でない積は、xnから減算する前に最も近い整数へと端数を切り捨てられる。参照配列のポリヌクレオチド配列の変化は、このコード配列中にナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異またはフレームシフト突然変異をつくり出し、それにより、そのような変化後のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを変化させる場合がある。
【０１６５】
同様に、別の例では、本発明のポリペプチド配列は、参照配列に同一、つまり100％同一であり得、または同一性％が100％未満になるように、参照配列と比較して特定の整数までのアミノ酸変化を含み得る。そのような変化は、少なくとも1箇所のアミノ酸欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）、または挿入からなる群より選択され、該変化は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端またはカルボキシ末端位置で、またはこれらの末端位置の間のどこかで、参照配列中のアミノ酸の中で個々に散在して、もしくは参照配列内で1つ以上の連続的な群で、生じることができる。所与の同一性％に対するアミノ酸変化の数は、参照配列によりコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数と、それぞれの同一性パーセントのパーセント数（100で除算する）とを乗算し、ポリペプチド参照配列のアミノ酸の該総数からその積を減算することにより決定され、または：
na ≦ xa − (xa ・ y)
であり、式中、naはアミノ酸変化の数であり、xaはポリペプチド配列中のアミノ酸の総数であり、yは、例えば、70％同一性について0.70であり、80％同一性について0.80であり、85％同一性について0.85等であり、xaとyとの整数でない積は、xaから減算する前に最も近い整数へと端数を切り捨てられる。
【０１６６】
本発明の基本的な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の実施形態で利用することができる。当業者は、本明細書中に記載される具体的な手順の多数の等価物を、通常の研究を超えるものを用いずに、認識するか、または解明することができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、かつ特許請求の範囲に含まれる。本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されているのと同程度まで、参照により本明細書中に組み入れられる。特許請求の範囲および/または明細書中で用語「含むこと」（comprising）と組み合わせて用いられる場合の単語「a」または「an」の使用は、「1」を意味する場合があるが、「1以上」、「少なくとも1」および「1または2以上」とも一致する。特許請求の範囲での用語「または」の使用は、開示が選択肢および「および/または」のみを意味するとの定義を指示するが、選択肢のみを意味することが明白に示されているか、または選択肢が相互排他的でない限り、「および/または」を意味するために用いられる。本明細書を通して、用語「約」は、値が、デバイス、値を測定するために利用する方法についての誤差の固有の変動、または被験体間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【０１６７】
本明細書中で用いる場合、用語「またはその組み合わせ」とは、この用語に先立って列挙される項目のすべての置換（permutation）および組み合わせを意味する。例えば、「A、B、C、またはその組み合わせ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABC（および特定の文脈で順番が重要である場合には、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABも）のうち少なくとも1つを含むことが意図される。
【実施例】
【０１６８】
本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示の目的で示され、本発明の限定として示されるのではないことが理解されるであろう。
【０１６９】
実施例を通じて、dAb-Fc、Fc-dAbおよびdAb-Fc-dAb分子が参照される。用語「dAb-Fc」および「Fc-dAb」は、各抗原結合性構築物が、直接的またはリンカーを介して間接的に、N末端（dAb-Fc）またはC末端（Fc-dAb）のいずれかでつながっているdAbを有する、2つの抗原結合性構築物を含む二量体に対する単純な参照である。
【０１７０】
同様に、用語「dAb-Fc-dAb」とは、各抗原結合性構築物が、直接的またはリンカーを介して間接的に、N末端につながっているdAbおよびC末端につながっているdAbを有する、2つの抗原結合性構築物を含む二量体を意味する。
【０１７１】
実施例1−Vh dAb-Fc分子の発現
DMS1529（配列番号1および29）は、W02008/149150/A20に記載されている。DMS1576（配列番号2および30）は、アミノ酸56をYからNに変換する、DMS1529からの部位特異的突然変異誘発により作製した。DMS1529およびDMS1576は、振盪フラスコおよび撹拌タンク懸濁培養の組み合わせを用いるグラクソスミスクラインの一般的モノクローナル抗体製造法プラットフォームを用いて、CHROMOSプール（またはバルク）トランスフェクションまたは安定的ポリクローナルもしくはモノクローナルCHO細胞株のいずれかから製造した。バイオリアクターをモニタリングし、撹拌速度、溶存酸素濃度、pHおよび温度に関する制御された条件に維持する。溶存酸素はN2中40％O2の添加を通して維持し、pHは炭酸ナトリウムおよびCO2の自動添加を介して制御する。産生培養時間は、細胞生存率および最小抗体力価の組み合わせから決定される。産生期間の終了時には、バイオリアクター中の培養物を、深層ろ過および滅菌ろ過により清澄化して、清澄化未処理バルク（CUB）のバッチを生成させる。
【０１７２】
実施例2−Vh dAb-Fc分子の精製
アフィニティクロマトグラフィおよび自動化FPLC精製システムを用いて、清澄化細胞培養上清（CUB、実施例1）からDMS1529およびDMS1576を捕捉した。ロードした後、結合した生成物をpH中性水性バッファーの組み合わせを用いて洗浄し、非特異的に結合した不純物を除去し、続いて、低pH溶出した。結合した生成物の90％超が回収され、続いて、溶出プールのpHをpH3.5に30分間調整し、ウイルス中和を行ない、その後、pHをpH4.5に調整した。さらなる精製が必要な場合、第2のカラムに対する結合を達成するために、さらなるpH調整を行なった。結合に続いて、同等のpHで低伝導度バッファー中で生成物を洗浄し、非特異的に結合した不純物をさらに除去した。精製されたdAb-Fcを次いでpHおよび塩シフトを用いて溶出し、プールとして収集し、その後に0.2μmろ過および保存した。特に記載しない限り、第1のアフィニティカラムのみを用いて調製したタンパク質を以下の実施例に記載するin vitroアッセイでVEGF結合性について解析したが、試験物質をさらに精製した（すなわち、第2のカラムを用いた）場合には言及されるであろう。
【０１７３】
実施例3−SDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）による分子分析
DMS1529およびDMS1576の分子の完全性、均一性および純度(％)を、還元条件下および非還元条件下の両方でのSDS-PAGE、および分析的サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）により分析した。SDS-PAGE分析は、Novex社の「NuPAGE」システムを用いて製造業者の取扱説明書に従って行ない、ゲルはInstant Blue Protein Stain Solution（Triple Red Ltd）を用いて染色した。ゲルは、モノマー鎖当たりの予測されるグリカン鎖の存在を許容する無傷の成熟タンパク質の予測される分子質量（約76〜79kDa）と一致するバンドサイズを示した。SECは、TSKゲルG2000SWXLカラム（TOSOH、BioScience）を用いて行なった。中性pHでのリン酸ナトリウム/塩化ナトリウムベースの移動相を、0.5mL/分の流速で用いた。精製タンパク質（約1mg/mL）の標準的サンプル注入体積は10μLであった。カラム溶出液のUV吸光度は、214nmおよび280nmでモニタリングした。すべてのタンパク質関連ピークの面積を積分して、分子に関連したピークの純度を測定した。生物学的アッセイでのさらなる分析の前に、SDS-PAGEおよびSECにより、タンパク質が95％超の純度の標的タンパク質であることを確認した（データは示していない）。
【０１７４】
実施例4−VEGF結合性ELISA
ELISAにより、VEGF165に特異的に結合するDMS1529およびDMS1576の能力を測定し、ベバシズマブ（アバスチン、Phillip Chapper & Co. Ltd., UKから入手される臨床薬製品）と比較した。F96 Maxisorp 96ウェル平底免疫プレート（Nunc社、カタログ番号439454）を、100μLの25μg/mL hVEGF165（HEK293哺乳動物細胞から作製されるVEGFのGSK「社内」供給物）を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。0.05％のTween-20を含有するPBSを用いてプレートを6回洗浄し、200μLのブロッキング溶液（PBS中1％BSA）を各ウェルに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。続いて、プレートを0.05％Tween-20/PBSを用いて洗浄した。90μLのアッセイ希釈液（PBS中0.1％BSA、0.05％Tween-20）を各ウェルに添加し、次に10μLのサンプルまたは対照（80〜0.08ng/mLの濃度範囲で2倍の連続希釈）をプレート全体にわたってブロッキング溶液中に加え、室温で1時間インキュベートした。続いて、プレートを0.05％Tween-20/PBSで洗浄した。PBS 中0.1％BSA、0.05％Tween-20の中で1：10,000に希釈した100μLの抗ヒトIgG（Fc特異的）HRP（Sigma社、カタログ番号：A0170）を、適切なウェルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートし、0.05％Tween-20/PBSで洗浄した。100μLの3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（TMB）液体基質システム（Sigma T0440）を各ウェルに添加した。十分な青色が発色したら（＞2.0のOD450が予想される）、100μLの0.25M硫酸（Fisher Scientific J/8410/17）の添加により、15分後に反応を停止させた。吸光度を、基本的なエンドポイントプロトコールを用いて、SpectraMax Plus384マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて450nmで読み取った。
【０１７５】
DMS1529およびDMS1576の両方が、VEGF165に同様の様式で特異的に結合することが見出され、両方の分子が、低下したIC50値により示される通り、ベバシズマブ（アバスチン）よりも強力であることが示された（図1）。
【０１７６】
実施例5−VEGF結合性MSD
VEGF165に特異的に結合するDMS1529およびDMS1576の能力を、メソスケールディスカバリー（Meso Scale Discovery；MSD）アッセイにより測定した。MSDデータは、抗Vhまたは抗Fc試薬を用いる検出後に、hVEGF165に対するDMS1529およびDMS1576の同等な結合性を示す。
【０１７７】
実施例6−表面プラズモン共鳴によるDMS1529およびDMS1576のVEGFに対する結合性
VEGF165に対するDMS1529およびDMS1576分子の結合親和性を、Biacore T100（GE Healthcare）（実施例6A）およびProteOn XPR36タンパク質相互作用アレイシステム（BioRad）（データは示していない）を用いて表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。
【０１７８】
実施例6A−Biacoreを用いたDMS1529およびDMS1576のVEGFに対する結合性
第一級アミンカップリングによりC1チップにプロテインAを固定化し、次にこの表面を、抗VEGF構築物を捕捉するために用いた。ヒト組み換えVEGF（HEK293細胞の一時的トランスフェクションから「社内で」供給した）を、256nM、64nM、16nM、4nM、1nM、0.25nMおよび0.0625nMでアナライトとして用いた。すべての結合曲線を、バッファー注入（すなわち、0nM）と二重参照し、データを、T100に固有の1：1モデルおよび二価モデルの両方にフィッティングした。100mM H3PO4を用いて再生を行なった。ランは、ランニングバッファーとしてHBS-EPを用いて室温で行なった。DMS1529およびDMS1576に関して、実験データに対する解析モデルのフィッティングがうまく行かないため、信頼性のあるキネティクスは得られなかったが、会合定数および解離定数が推定できたので、これらを表2Aにまとめる。
【０１７９】
BiacoreデータおよびProteOnデータの両方が、DMS1529およびDMS1576が表面プラズモン共鳴を用いたVEGF165に対する同等の結合キネティクスを有することを示す。
【表７】
0005987057.tif 000008
【０１８０】
実施例7−VEGF R1およびR2受容体結合アッセイ
DMS1529およびDMS1576の有効性を、ベバシズマブ（アバスチン）と比較してVEGF受容体結合アッセイで分析した。このアッセイは、VEGF R1またはVEGF R2に対するVEGF165の結合性および試験物質がこの相互作用をブロックする能力を測定する。MSD標準結合96ウェルプレート（L11XA-3）を、重炭酸塩バッファー（50μL/ウェル）中の0.25μg/mL VEGF R1（R&D Systems 321-FL）またはVEGF R2（R&D 357-KD）を用いてコーティングし、プレートシーラーで覆って、4℃で一晩インキュベートした。次の日、MSDプレートをTris洗浄バッファーを用いて300μL/ウェルで3回洗浄し、ティッシュペーパーのパッドで吸い取って余分な洗浄バッファーをウェルから除去した。次にMSDプレートをPBS中の3％BSA（250μL/ウェル）を用いてブロッキングし、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。MSDプレートを再度洗浄し、次に2倍濃度の抗VEGF分子（25μL/ウェル）を添加し、振盪（750RPM）しながら室温で10分間インキュベートし、その後、2倍濃度のrhVEGF 25μL/ウェル（R&D Systems、293-VE/CF（バキュロウイルスを用いて昆虫細胞で製造した）またはVEGFのGSK「社内」供給物（HEK293哺乳動物細胞から製造した）、後者は表3A以外はデータを示していない）を添加した。抗VEGF分子およびVEGFは、PBS中0.1％BSAを用いて調製した。最初のアッセイは、抗VEGF分子をVEGFと一緒にプレインキュベートするステップを含んで行なった。プレインキュベーションは、等量の2倍濃度の抗VEGF分子を、等量の2倍濃度のVEGF（R&D、293-VE/CF）に室温で30分間添加することにより調製した。用いたVEGFの最終濃度は、10ng/mLであった。VEGFなしおよびVEGFのみの対照も含めた。MSDプレートを、振盪（750RPM）しながら室温で2時間インキュベートした後、再度洗浄し、続いてPBS中1％BSAの中で0.25μg/mLの検出試薬（50μL/ウェル、ヤギ抗ヒトVEGFビオチン化抗体、R&D Systems BAF293）を添加し、振盪（750RPM）しながら室温で1時間イ
ンキュベートした。MSDプレートを再度洗浄し、次にPBS中1％BSAの中で2μg/mLのストレプトアビジンスルホ-TAG（50μL/ウェル、MSD R32AD-1）を添加し、振盪（750RPM）しながら室温で30分間インキュベートした。MSD Sector Imager 6000での電気化学発光の測定前に、MSDプレートを洗浄し、150μL/ウェルの2×リードバッファーT（MSD R92TC-1）を加えた。曲線フィッティングおよびEC50算出は、GraphPad Prismを用いて行なった。VEGFR1およびVEGFR2に対するVEGFの結合を阻害するDMS1529、DMS1576およびベバシズマブ（アバスチン）の能力を、記載した通りに測定した。EC50値を、表3Aに列挙する。
【０１８１】
第2のアッセイは、VEGF受容体コーティングMSDプレートへの添加前に、抗VEGF物質とVEGFをプレインキュベートしないで行なった。このアッセイは、DMS1576とベバシズマブ（アバスチン）の比較のみを行ない、R&D Systems社から供給されたVEGF（293-VE/CF）のみを用いた。VEGFR1およびVEGFR2に対するVEGFの結合を阻害するDMS1576およびベバシズマブ（アバスチン）の能力を、プレインキュベーションステップを除いて上記の通りに測定した。EC50値を、表3Bに列挙する。
【０１８２】
表3Aのデータから、DMS1529およびDMS1576の両方が同様のEC50値を有するものと思われ、これらは、VEGFR1およびVEGFR2の両方へのVEGFの結合に対して、ベバシズマブ（アバスチン）のEC50値よりもほぼ10倍低かった（すなわち、より大きな有効性）。すべての抗VEGF分子が、VEGFR1およびVEGFR2結合アッセイの両方に関して、「社内の」HEK293生成VEGFと比較して、R&D SystemsのVEGFへの結合の方がより強力であり、VEGFとのプレインキュベーションを行なうアッセイでの方がより強力であった。VEGFとのプレインキュベーションなしで、VEGFR1およびVEGFR2の両方に対して、DMS1576はベバシズマブ（アバスチン）についてのものと比較した相対的EC50値を維持したので、この簡略化されたアッセイタイプを新規分子の以後の分析に用いた。すべてのRBAアッセイで、DMS1529およびDMS1576の両方がベバシズマブ（アバスチン）よりも強力に見えるが、ベバシズマブ（アバスチン）と異なり、DMS1529およびDMS1576のいずれも、これらのアッセイで100％阻害に到達していないようである（データは示していない）。
【表８】
0005987057.tif 000009
【０１８３】
実施例8−ヒト臍帯内皮細胞（HUVEC）増殖アッセイ
DMS1529およびDMS1576を、ベバシズマブ（アバスチン）のものと比較して、ヒト臍静脈内皮細胞の増殖を抑制するその能力についてアッセイした。アッセイは、所定濃度のVEGF165により誘導される内皮細胞増殖の程度およびVEGFアンタゴニストがこの作用をブロックする能力を測定する。HUVECを、96ウェルゼラチンコーティングプレートに5000細胞/ウェルで播種し（外側のウェルは空けた）、数時間インキュベートして接着させた。試験分子は、それぞれ三重で、2倍の連続希釈を用いて等モル濃度（最大3.33×10-08M）でアッセイした。VEGF165は、75ng/mLの最終濃度となるように、基礎培地中に調製した。細胞単層から培地を手作業で除去し、50μLの基礎培地を加えて、細胞が乾燥するのを防いだ。25μLのVEGF165含有培地および25μL基礎培地または試験抗体含有培地を適切に加えた。細胞を72時間インキュベートし、その後、Cell Titre Gloを用いて細胞の総数を測定した。VEGF165を用いたHUVECの処理は、VEGF165処理していない細胞と比較して、72時間後に細胞の総数の期待された増加をもたらした（データは示していない）。このVEGFに媒介される増加は、HUVEC増殖およびHUVEC細胞死の防止の両方に対するVEGFの累積的作用を表すと解釈される。試験化合物は、競合体分子（comparator molecule）であるベバシズマブ（アバスチン）に対して個々のプレートに対して独立に評価した。
【０１８４】
DMS1529を、2つの別個のアッセイで評価した。データは、DMS1529は、約50％までしかHUVEC増殖を阻害できないことを示唆し（比較として、ベバシズマブ（アバスチン）については約100％）、最良フィット曲線は、DMS1529がこのアッセイでベバシズマブ（アバスチン）よりも高いIC50を有する（すなわち、有効性が低い）ことを示唆する。DMS1576は、HUVECアッセイで何度か評価した。1つのサンプルデータセットでは、データは、DMS1529と同様に、DMS1576は約50％までしかHUVEC増殖を阻害できないことを示唆し（比較として、ベバシズマブ（アバスチン）については約100％）；最良フィット曲線は、DMS1576がこのアッセイでベバシズマブ（アバスチン）よりも高いIC50を有する（すなわち、有効性が低い）ことを示唆する。しかしながら、2つの他のデータセットは、ベバシズマブ（アバスチン）と比較して、DMS1576の最大阻害％およびIC50での不足がより小さいことを示唆する（データは示していない）。
【０１８５】
実施例9−VEGF誘導性血液網膜関門崩壊でのパフォーマンス：ウサギ網膜漏出モデル
DMS1529およびDMS1576を、ウサギ眼でのヒトVEGF165（R&D Systems）誘導性血管網膜関門崩壊（BRB）モデルで試験し、ベバシズマブ（アバスチン）、ラニビズマブ（ルセンティス）、およびケナコルト（トリアムシナロン（Tramcinalone））と比較した。ベバシズマブ、ラニビズマブおよびケナコルトのすべての供給元は、既に記載された臨床的供給元であるPhillip Chapper & Co. Ltd, UKから入手した。モデルは、詳細に文献に記載されており、「エデルマンモデル」としても知られる（Edelman JL, Lutz D, Castro MR, Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown, Exp Eye Res. 2005 Feb; 80(2):249-58）。
【０１８６】
本研究の目的は、ウサギでの組み換えヒトVEGF165誘導性血液網膜関門崩壊モデルでの網膜血管漏出の低下での、2種類の用量：高用量（H）および低用量（L）でのDMS1529およびDMS1576の有効性を評価することであった。高用量（H）および低用量（L）は、ラニビズマブ（ルセンティス）に対するモル当量投与に基づいた。低用量（L）は、高用量の3分の1であった。ベバシズマブ（アバスチン）もまた、眼への適応に対して病院で用いられる用量からスケールダウンさせた用量で投与した。投与および注射スケジュールを、表4Aに示す。
【０１８７】
簡潔には、すべての分子を、10mMヒスチジンHCl、10％α-αトレハロース二水和物（trehalose dehydrate）、0.01％ポリソルベート80、pH 5.5へと、PD-10脱塩カラム（GE Healthcare）を用いてバッファー交換し、Vivaspin 20（分子量カットオフ5000Da）スピン濃縮（Sartorius Stedim Biotech）を用いて所望の濃度に濃縮し、両方とも製造業者の取扱説明書に従って用いた。サンプルを-80℃で凍結させ、上記の実施例に記載された通りに、このプロセス後の安定性、機能的活性および均一性を確認する試験の後に、ドライアイス上で発送した（データは示していない）。
【０１８８】
98頭のGD79B有色ウサギを、10頭の9群および8頭の1群（ケナコルト対照のために用いた）にランダムに分けた。各群を、2つの実験セットに対応する2群にさらに分けた。試験品目、参照品目または対照品目を、第-7日に右眼への硝子体内注射（IVT、50μL）により投与した。左眼は未処置のまま残し、陰性対照として機能した。第0日に、500ng rhVEGF165（血管透過性誘導剤）の単回硝子体内注射を用いて血液網膜関門（BRB）崩壊について、右眼を誘導した。フルオレセインナトリウムを、VEGFチャレンジの47時間後にすべての群に静脈内注入した（第2日）。トレーサーの注入後10分以内に、右眼で網膜血管造影を行ない、写真を撮影した。硝子体網膜区画中の眼内フルオレセイン含有量を、非侵襲的スキャン眼蛍光測定を用いて1時間後に測定した。右眼/左眼フルオレセイン含有量（AUC）Rt比を、網膜透過性評価のために決定した。評価期間の終わり（第2日）に、動物を安楽死させ、すべての動物の右眼を摘出した。急速凍結した眼球および水性体液サンプルを、出資者であるGSKへの発送まで-80℃で保存した。定性的評価のために、フルオレセイン血管造影図を収集した。化合物は、GSKの要求によりマスクされたままとした。これについての投与スケジュールを、表4Aにまとめる。
【０１８９】
硝子体内注射したVEGFはBRBの崩壊を誘導し、これは、注射の9日後に、E：ベバシズマブ（アバスチン）、H：ラニビズマブ（ルセンティス、高用量）およびI：ラニビズマブ（ルセンティス、低用量）と標識されたマスクされた化合物を用いた処置により、市販の参照（ケナコルト(登録商標)）のものと同様の有効性でブロックされた。誘導された右眼と左眼との間の硝子体網膜フルオレセイン含有量のRt比の低い値が観察された（化合物EについてRt＝1.39±0.77（n＝9）、化合物HについてRt＝1.05±0.52（n＝10）および化合物IについてRt＝1.81±1.76（n＝10））。ケナコルト処置群は、非誘導動物のものと近い平均Rt比を示した（Rt＝1.15±0.61）。
【０１９０】
覆面試験では、重大な網膜血管漏出が、化合物A：DMS1576（高用量）、B：DMS1576（高用量）、C：ビヒクル（陰性対照群）、D：DMS1576（低用量）、F：DMS1529（低用量）およびG：DMS1529（高用量）を用いた処置後に誘導された右眼で報告された。化合物のマスクを外すこと（unmasking）およびビヒクル対照との比較なしに、化合物A、B、C、D、FおよびGは、化合物E、HおよびIよりも明らかに有効性が低かった。
【０１９１】
VEGF誘導性ウサギ網膜漏出の阻害を実証する、マスクを外したデータおよび統計解析を、表4Bに示す。この解析のために、同じ分子および用量に対応するマスクされた群をまとめた。表4Bのデータに関して、P値は、多重比較調整を行なうかまたは行わずに示され、それぞれ、「Dunnett」p値および「未調整」p値と標識されている。信頼区間は、未調整p値に対応する（CIはp＞0.05での1の比を含む）。表4Bのデータ解析から、高用量のDMS1529（46％）およびDMS1576（41％）は部分的にしかVEGF誘導性網膜漏出の程度を減少させず、低用量では減少はさらに小さかった：DMS1529（19％）およびDMS1576（25％）。同じ条件で、化合物E：ベバシズマブ（アバスチン、75％）、H：ラニビズマブ（ルセンティス、高用量、82％）およびI：ラニビズマブ（ルセンティス、低用量、78％）は、市販のコルチコイド参照（ケナコルト(登録商標)遅延型（Kenacort Retard）、85％）と同様の効果でVEGF誘導性網膜血管漏出を抑制した。
【表９】
0005987057.tif 000010
【表１０】
0005987057.tif 000011
【０１９２】
実施例10−抗VEGF Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子のクローニング
dAb配列（配列番号97〜101、105〜109）を、哺乳動物発現ベクター中でヒトIgG1アイソタイプの一般的なFcのN末端またはC末端にクローニングした。dAbはリンカー配列を用いてFcに連結した：N末端リンカーは、AAAS（配列番号57および76）、またはTVAAPS（配列番号59および78）のいずれかであり、C末端リンカーは（(GS(TVAAPSGS）×3）（配列番号66および85）、またはアルブミンドメイン3（配列番号71および90）のいずれかであった。
【０１９３】
実施例11−抗VEGF Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子の発現
関連するVk抗VEGF dAb-FcおよびFc-dAb分子（配列番号3〜9、16〜24、31〜37および44〜52、表19に列挙する）をコードする発現プラスミドをHEK293 6E細胞に一時的にトランスフェクションし、500mL規模で発現させて、抗体断片分子を生成させた。500μgのプラスミドDNAを18mLのOptiMEM（Invitrogen）に添加し、別に、666μLの293fectinを18mLのOptiMEMに添加した。両方のチューブを室温で5分間インキュベートした。DNA/OptiMEM溶液を、穏やかに回しながら、293fectin/OptiMEMチューブにゆっくりと加えた。次に、室温で25分間、DNA/293fectinトランスフェクション複合体を形成させた。HEK293E懸濁細胞培養物を0.5×106細胞/mLとなるように希釈し、上記のトランスフェクション複合体を、培養フラスコを穏やかに回しながら500mLの希釈した細胞培養物にゆっくりと加えた。続いてフラスコを、135rpmで振盪している37℃、5％CO2インキュベーターに戻した。トランスフェクションの24時間後、12.5mLの20％w/vカゼイン-トリプトンを細胞培養物に添加し、インキュベーションを上記の通りに継続した。トランスフェクション6日後に、培養物を5,500×gで20分間遠心分離して細胞をペレットにし；上清をろ過（0.22μm）し、分泌されたタンパク質発現について分析した。50〜100mg/L上清の発現レベルが日常的に達成された。
【０１９４】
実施例12−Vk抗VEGF dAb-FcおよびFc-dAb分子の精製
Vk抗VEGF dAb-FcおよびFc-dAb分子を、上清（実施例11を参照されたい）からアフィニティ精製した。リン酸ナトリウムバッファー中に懸濁されたアフィニティ樹脂20mL（50：50スラリー）を500mLのろ過した上清に加え；上清/アフィニティ樹脂混合物を4℃で一晩、室温で約3時間回転させて、結合が行なわれるのを可能にした。その後、樹脂を沈殿させて、上清を注意深く注ぎ出した。樹脂を残りの上清に再懸濁し、空のドリップカラムに注ぎ入れた。上清にカラムを通り抜けさせ、続いて樹脂をPBSの3×10倍カラム容量洗浄で洗浄し、次にTrisバッファーの4×カラム洗浄で洗浄した。4×カラム容量の低pHバッファーを用いて溶出を行ない、溶出液を1×カラム容量の1M Tris pH8.0を含むチューブに集めて、溶出されたタンパク質を中和した。
【０１９５】
実施例13−Vk抗VEGF dAb-FcおよびFc-dAb分子のSDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）による分子解析
実施例12に記載された通りに精製された抗VEGF dAb-FcおよびFc-dAb分子の分子完全性、均一性および純度％を、実施例3に従ってSDS-PAGEにより分析した。ゲルは、モノマー鎖当たりの予測されるグリカン鎖の存在を許容する無傷の成熟タンパク質の予測される分子質量（dAb-FcおよびFc-dAb分子についてそれぞれ約76〜約85kDa）と一致するバンドサイズを示した。生物学的アッセイでのさらなる分析の前に、SDS-PAGEおよびSECにより、タンパク質が95％超の純度の標的タンパク質であることを確認した。dAb-FcまたはFc-dAb分子が95％未満の純度であった場合、さらなるSEC精製を行なった（実施例14を参照されたい）。
【０１９６】
実施例14−Vk抗VEGF dAb-FcおよびFc-dAb分子のサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）による精製
必要であれば、HiLoad 16/600 Superdex 200カラム（GE Healthcare）を用いて、Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子に対して調製的サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）を行なった。用いた移動相は0.5mL/分の流速のリン酸緩衝生理食塩水であり、0.5〜2mLの画分を収集した。カラム廃液のUV吸光度を、214nmおよび280nmでモニタリングした。dAb-FcまたはFc-dAb分子の溶出に対応するピークに対して収集された画分をプールした。分子完全性、均一性および純度％を、実施例13に記載されたSDS-PAGEおよび分析的SECにより再度分析した。生物学的アッセイでのさらなる分析の前に、SDS-PAGEおよびSECにより、タンパク質が95％超の純度の標的タンパク質であることを確認した。
【０１９７】
実施例15−Vk抗VEGF dAb-FcおよびFc-dAb分子のVEGF結合ELISA
VEGF165に特異的に結合するVk抗VEGF dAb-FcおよびFc-dAb分子の能力を、ELISAにより測定した。これは、実施例4と同様の様式で行なった。試験した抗VEGF化合物のすべてが、VEGF165に特異的に結合することが見出された（データは示していない）。
【０１９８】
実施例16−Biacoreでの抗VEGF Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子のVEGFに対する結合
VEGF165に対する抗VEGF Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子の結合親和性を、軽微な改変を含むが実施例6と類似の様式で、Biacore T100を用いて表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。第一級アミンカップリングによりC1チップにプロテインAを固定化し、次にこの表面を、抗VEGF構築物を捕捉するために用いた。ヒト組み換えVEGF165（HEK293細胞の一時的トランスフェクションから「社内で」供給した）を、64nM、16nM、4nM、2nM、1nM、0.5nMおよび0.25nMでアナライトとして用いた。すべての結合曲線を、バッファー注入（すなわち、0nM）と二重参照し、データを、T100に固有の1：1モデルにフィッティングした。50mM NaOHを用いて再生を行なった。ランは、ランニングバッファーとしてHBS-EPを用いて37℃で行なった。
【０１９９】
Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子を、DMS1576およびベバシズマブ（アバスチン）と比較した。データは、Biacoreにより測定した場合に、VEGFに対する結合に関して、DMS1576およびVk dAb-Fcと比較してVk Fc-dAb分子（DMS30000、DMS30001、DMS30002、DMS30003およびDMS30004）がすべて改善されていることを示す（表5を参照されたい）。
【表１１】
0005987057.tif 000012
【０２００】
実施例17−抗VEGF Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子のVEGF R1およびR2受容体結合アッセイ
抗VEGF Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子の有効性を、改変法（すなわち、実施例7に記載されたプレインキュベーションなし）を用いてVEGF受容体（R1およびR2）結合アッセイで分析し、Vh dAb-FcであるDMS1576およびベバシズマブ（アバスチン）と比較した。Vk Fc-dAb分子（DMS30000、DMS30003およびDMS30004）は、VEGFR1およびVEGFR2の両方に対して、DMS1576およびベバシズマブ（アバスチン）よりも強力であることが観察され（すなわち、より低いEC50値、表6Aおよび6Bを参照されたい）；Vk dAb-Fc分子（DMS30005）は、VEGFR1に対してDMS1576よりも有効性が低く、ベバシズマブ（アバスチン）とは同様であり、かつVEGFR2に対してはベバシズマブ（アバスチン）よりも強力であった。VEGFR1に対して、データは、Vk Fc-dAb分子（DMS30000、DMS30003およびDMS30004）により達成される阻害が、両者とも90％以上であるVh dAb-Fc分子（DMS1576）およびベバシズマブ（アバスチン）と比較して、87〜89％で若干低下していることを示す。Vk dAb-Fc分子（DMS30005）はさらに低下して、82％である。VEGFR2に対しては、データは、Vk Fc-dAb分子（DMS30000、DMS30003およびDMS30004）により達成される阻害が、Vh dAb-Fc分子（DMS1576）およびベバシズマブ（アバスチン）のものに匹敵し、すべて90％以上であることを示す。Vk dAb-Fc分子（DMS30005）は若干低下して、86％である。
【表１２】
0005987057.tif 000013
【表１３】
0005987057.tif 000014
【０２０１】
実施例18−ヒト臍帯内皮細胞（HUVEC）増殖アッセイ：抗VEGF dAb-FcおよびFc-dAb分子を用いた阻害
ヒト臍静脈内皮細胞のVEGFにより駆動される増殖を抑制するVk dAb-FcおよびFc-dAb分子の能力を、実施例8に記載されたVh dAb-Fc（DMS1576）およびベバシズマブ（アバスチン）からのこのアッセイでの阻害のものと比較した。Vk dAb-Fc分子（DMS30005およびDMS30006）は、単回アッセイでアッセイした（データは示していない）。データは、これらの分子が、ベバシズマブ（アバスチン）における約100％と比較して、有効性が低く（より低いIC50）かつ完全に増殖を阻害することができない（約70〜80％、DMS30005）ことを示した。実施例8で既に見られたように、データは、Vh dAb-Fc分子（DMS1576）がベバシズマブ（アバスチン）よりも高いIC50を有する（すなわち、有効性が低い）ことを示唆する。Vk Fc-dAb分子（DMS30000、DMS30003およびDMS30004）は、数回アッセイした。データセットは、Vk Fc-dAb分子を用いた処置により達成される阻害が、ベバシズマブ（アバスチン）を用いて達成されるもの（すなわち、約100％）に匹敵するVEGF媒介阻害のレベルを与えたことを示す。実際に、すべてのVk Fc-dAb分子が、同様のベバシズマブ（アバスチン）曲線と重なるか、または左に若干シフトする最良フィット曲線をもたらし、したがって、本アッセイではより強力な分子である可能性があった（データは示していない）。
【０２０２】
実施例19−ヒトVEGFに対する抗VEGF Vh dAb-FcおよびVk Fc-dAb分子の結合性の示差性および非干渉性の実証
VkベースのFc-dAb分子で既に予め飽和されたVEGFに結合するVhベースのdAb-Fc分子の能力、および逆に、VhベースのdAb-Fc分子で既に予め飽和されたVEGFに結合するVkベースのFc-dAb分子の能力を、VkベースのFc-dAb分子としてDMS30000を用い、VhベースのdAb-Fc分子としてDMS1576を用いる改変型MSDアッセイで実証した。
【０２０３】
19.A−Vk Fc-dAb DMS30000を用いて予め飽和させた後のVEGFに対するVh dAb-Fc DMS1576の結合性
MSDハイバンド96ウェルプレート（MSD L11XB-3）を、PBS（25μL/ウェル）中の3μg/mL rhVEGF165（HEK293細胞の一時的トランスフェクションから「社内で」供給した）を用いてコーティングし、プレートシーラーで覆って、4℃で一晩インキュベートした。次の日、MSDプレートをTris洗浄バッファーを用いて300μL/ウェルで3回洗浄し、ティッシュペーパーのパッドで吸い取って余分な洗浄バッファーをウェルから除去した。次にMSDプレートをPBS中の3％BSA（250μL/ウェル）を用いてブロッキングし、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。MSDプレートを洗浄し、その後、飽和濃度のDMS30000（≧3μg/mL）を添加し（25μL/ウェル）、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。MSDプレートを再度洗浄し、その後、DMS1576（25μL/ウェル、0〜100ng/mL)を添加し、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。DMS30000およびDMS1576はPBS中0.1％BSAの中に調製した。MSDプレートを再度洗浄し、続いてPBS中1％BSAの中で1μg/mLの、DMS1576に含まれるVh dAbに特異的な検出試薬（25μL/ウェル、社内スルホ-TAG標識抗Vh mAb）を添加し、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。MSD Sector Imager 6000での電気化学発光の測定前に、MSDプレートを洗浄し、150μL/ウェルの2×リードバッファーT（MSD R92TC-1）を加えた。
【０２０４】
図2Aのデータは、VhベースのdAb-Fc分子であるDMS1576が、VkベースのFc-dAb分子であるDMS30000を用いて予め飽和させたVEGF165に結合できることを示す。
【０２０５】
19.B−Vh dAb-Fc DMS1576を用いて予め飽和させた後のVEGFに対するVk Fc-dAb DMS30000の結合性
MSDハイバンド96ウェルプレート（MSD L11XB-3）を、PBS（25μL/ウェル）中の3μg/mL VEGF（HEK293細胞の一時的トランスフェクションから「社内で」供給した）を用いてコーティングし、プレートシーラーで覆って、4℃で一晩インキュベートした。次の日、MSDプレートをTris洗浄バッファーを用いて300μL/ウェルで3回洗浄し、ティッシュペーパーのパッドで吸い取って余分な洗浄バッファーをウェルから除去した。次にMSDプレートをPBS中の3％BSA（250μL/ウェル）を用いてブロッキングし、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。MSDプレートを洗浄し、その後、飽和濃度のDMS1576（≧3μg/mL）を添加し（25μL/ウェル）、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。MSDプレートを再度洗浄し、その後、DMS30000（25μL/ウェル、0〜100ng/mL)を添加し、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。DMS30000およびDMS1576はPBS中0.1％BSAの中に調製した。MSDプレートを再度洗浄し、続いてPBS中1％BSAの中で1μg/mLの、DMS30000に含まれるVk dAbに特異的な検出試薬（25μL/ウェル、社内スルホ-TAG標識抗Vk mAb）を添加し、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。MSD Sector Imager 6000での電気化学発光の測定前に、MSDプレートを洗浄し、150μL/ウェルの2×リードバッファーT（MSD R92TC-1）を加えた。
【０２０６】
図2Bのデータは、VkベースのFc-dAb分子であるDMS30000が、VhベースのdAb-Fc分子であるDMS1576を用いて予め飽和させたVEGF165に結合できることを実証する。
【０２０７】
実施例19の両方のデータのセットは、Vk Fc-dAb（DMS30000）およびVh dAb-Fc（DMS1576）の両方が、もう一方の分子の存在下でVEGF165に結合できることを示す。実施例19に記載される実験は、VkおよびVh由来のdAbの2つの系統が、VEGFホモ二量体の異なるエピトープに結合することができることを示唆する。
【０２０８】
実施例20−抗VEGF dAb-Fc-dAb分子のクローニング
哺乳動物発現ベクター中でVh dAb-Fc（DMS1576、配列番号2および30）のC末端にVk dAb配列（DT02-K-044-085（配列番号97および105）またはDT02-K-044-251（配列番号100および108））をクローニングすることにより、Vh-Vk dAb-Fc-dAb（配列番号10〜11、25、38〜39および53）を遺伝子操作した。C末端dAbは、（(GS(TVAAPSGS）×3）（配列番号66および85）またはアルブミンドメイン3（配列番号71および90）リンカー配列のいずれかを用いてFcのC末端に連結した。哺乳動物発現ベクター中で対応するVk dAb-Fc（すなわち、DMS30000（配列番号3および31）またはDMS30003（配列番号6および34）またはDMS30013（配列番号16および44）のいずれか）のC末端にVk dAb 配列（DT02-K-044-085（配列番号97および105）またはDT02-K-044-251（配列番号100および108）をクローニングすることにより、Vk-Vk dAb-Fc-dAb（配列番号12〜15、26〜28、40〜43および54〜56）を遺伝子操作した。N末端dAbは、AS（配列番号58および77）、またはヒンジIgG1（配列番号60および79）のいずれかを用いて、FcのN末端に連結した。Fc領域内で例えば以下の変化：His 2 AlaまたはThr 3 Proを有する部位特異的突然変異誘発を行なうことにより、配列番号27および28をそれぞれ作製した。
【０２０９】
実施例21−抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の発現
実施例11に記載された方法を用いて、関連する抗VEGF dAb-Fc-dAb分子をコードする発現プラスミド（配列番号10〜15、25〜28、38〜43および53〜56に列挙されている）をHEK293 6E細胞に一時的にトランスフェクションし、500mL規模で発現させて、抗体断片分子を生成させた。50〜100mg/L上清の発現レベルが日常的に達成された。
【０２１０】
実施例22−抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の精製
dAb-Fc-dAb分子を、上清（実施例21）からアフィニティ精製した。リン酸緩衝生理食塩水中に懸濁されたアフィニティ樹脂2mL（50：50スラリー）を500mLのろ過した上清に加え；上清/アフィニティ樹脂混合物を4℃で一晩、穏やかに回転させて、結合が行なわれるのを可能にした。その後、樹脂を沈殿させて、上清を注意深く注ぎ出した。樹脂を残りの上清に再懸濁し、空のドリップカラムに注ぎ入れ、上清にカラムを通過させた。pH中性水性バッファーの組み合わせを用いて、結合した生成物を洗浄して、非特異的に結合した不純物を除去し、続いて、低pH溶出した。結合した生成物の90％超が回収され、続いて、溶出プールのpHをpH3.5に30分間調整し、ウイルス中和を行ない、その後、pHをpH4.5に調整した。
【０２１１】
実施例23−抗VEGF dAb-Fc-dAb分子のサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）による分子分析
実施例22に記載された通りに精製された抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の完全性、均一性および純度(％)を、実施例3に記載された通りにSDS-PAGE、および分析的サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）により分析した。生物学的アッセイでのさらなる分析の前に、SDS-PAGEおよびSECにより、タンパク質が95％超の純度の標的タンパク質であることを確認した。
【０２１２】
実施例24−抗VEGF dAb-Fc-dAb分子のVEGF結合ELISA
VEGF165に特異的に結合する抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の能力を、実施例4および15に記載された通りにELISAにより測定した。試験した抗VEGF dAb-Fc-dAbのすべてが、VEGF165に特異的に結合することが見出された（データは示していない）。
【０２１３】
実施例25−BiacoreでのVEGFに対する抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の結合性
VEGF165に対する抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の結合親和性を、軽微な改変を含むが実施例6と類似の様式で、Biacore T100を用いて表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。第一級アミンカップリングによりC1チップにプロテインAを固定化し、次にこの表面を、抗VEGF構築物を捕捉するために用いた。ヒト組み換えVEGF165（HEK293細胞の一時的トランスフェクションから「社内で」供給した）を、75nM、15nM、3nMおよび0.6nMでアナライトとして用いた。すべての結合曲線を、バッファー注入（すなわち、0nM）と二重参照し、データを、T100に固有の1：1モデルにフィッティングした。50mM NaOHを用いて再生を行なった。ランは、ランニングバッファーとしてHBS-EPを用いて37℃で行なった。
【０２１４】
dAb-Fc-dAb分子を、それらの対応するVk Fc-dAbおよびVh dAb-Fc分子と比較した。本アッセイフォーマットについてのデータは、dAb-Fc-dAb分子が対応するVk Fc-dAbよりもよいとは考えられないことを示唆する可能性がある。Vk Fc-dAbは、対応するdAb-Fc-dAbと比較して優れた解離速度（off-rate）を有すると考えられる。しかしながら、dAb-Fc-dAbの「親和性」はVEGFに対する2つの異なる結合イベントの混合（すなわち、N末端dAbおよびC末端Vk dAbの結合）であるので、トレース（データは示していない）は全容を示さない可能性がある。dAb-Fc-dAb中の（すなわち、C末端Vk Fc-dAbと同じ方向にある）Vk dAbが同じ親和性を有するであろうことが予測され、このデータは、実施例16に既に記載されたことを確認する。FcのN末端のVhまたはVk dAbのいずれかの配置は、乏しい親和性をもたらし（実施例16を参照されたい）、したがって組み合わされた分子の全体的な親和性が悪く見えるようにする。見かけの親和性（表7を参照されたい）は、これらの分子についてのBiacoreでの以下の有効性を示す：Vh-Vk dAb-Fc-dAb（DMS30007およびDMS30008）は最も乏しい親和性を有し、Vk-Vk dAb-Fc-dAb（DMS30009、DMS30010、DMS30011およびDMS30012）はdAb-Fc-dAb親和性のうち最良のものを有し、互いに非常に似通っているように見える。
【表１４】
0005987057.tif 000015
【０２１５】
実施例26−抗VEGF dAb-Fc-dAb分子のVEGF R1およびR2受容体結合アッセイ
抗VEGF Vh-VkおよびVk-Vk dAb-Fc-dAb分子の有効性を、VEGF受容体（R1およびR2）結合アッセイで分析した。dAb-Fc-dAbのVEGFR1およびVEGFR2の両方に対する有効性（EC50）は、Vk Fc-dAb分子（DMS30000）のものに匹敵するようであり、Vh dAb-Fc分子（DMS1576）およびベバシズマブ（アバスチン）の両方よりも強力（すなわち、低いEC50値）であるようであった（表8AおよびBを参照されたい）。VEGFR1に対して、データは、Vh-Vk dAb-Fc-dAb（DMS30007およびDMS30008）およびVk-Vk dAb-Fc-dAb（DMS30009）の両者により達成される阻害が、すべて90％以上であるVh dAb-Fc分子（DMS1576）、Vk Fc-dAb分子（DMS30000）およびベバシズマブ（アバスチン）を用いて達成されるものに匹敵したことを示す（表8A）。VEGFR2に対しては、データは、Vh-Vk（DMS30022）dAb-Fc-dAbにより達成される阻害が、すべて90％以上を達成したVh dAb-Fc分子（DMS1576）、Vk Fc-dAb分子（DMS30000およびDMS30003）およびベバシズマブ（アバスチン）を用いて達成されるものに匹敵したことを示し、Vh-Vk dAb-Fc-dAb（DMS30007およびDMS30008）およびVk-Vk dAb-Fc-dAb分子（DMS30009、DMS30023およびDMS30025）により達成される阻害は、約75〜87％で、より低かった（表8B）。
【表１５】
0005987057.tif 000016
【表１６】
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【０２１６】
実施例27−抗VEGF dAb-Fc-dAb分子のヒト臍帯内皮細胞（HUVEC）増殖アッセイ
以下の変更を含んで実施例8および18に記載された方法を用いて、ヒト臍静脈内皮細胞の増殖を抑制するVh-Vk（DMS30022）およびVk-Vk（DMS30023およびDMS30025）dAb-Fc-dAb分子の能力を、Vh dAb-Fc分子（DMS1576）、Vk Fc-dAb分子（DMS30000）およびベバシズマブ（アバスチン）と比較した：(i)外側のウェルを細胞を入れないままにするのではなく、96ウェルプレート全体を用いた、および(ii)非線形回帰（可変勾配）と比較してS字形曲線（Sigmodial curve）フィッティング、可変勾配を用い、GraphPad Prismを用いてデータを解析した。データは、実施例8および18で既に見られたように、Vh dAb-Fc分子（DMS1576）がベバシズマブ（アバスチン）よりも高いEC50を有する（すなわち、有効性が高くない）ことを示唆し；平均して、Vk Fc-dAb分子（DMS30000）がEC50に関してベバシズマブ（アバスチン）に類似することが観察され；他方、Vh-VkおよびVk-Vk dAb-Fc-dAb分子（DMS300022、DMS300023、DMS300024およびDMS300025）はすべて、EC50に関してベバシズマブ（アバスチン）よりも改善されていることが観察された。
【０２１７】
実施例28−等温熱量法（ITC）による溶液中で測定するVEGF結合アッセイでのdAb-Fc-dAbならびにdAb-FcおよびFc-dAbフォーマットのパフォーマンス
VEGF165に対する抗VEGF dAb-Fc-dAb、dAb-FcおよびFc-dAb結合性の溶液平衡結合親和性（KD）、化学量論（N）および熱力学（ΔH（エンタルピー）およびΔS（エントロピー））を、Microcal VP-ITCを用いて等温滴定熱量法（ITC）により測定し、モノクローナル抗体ベバシズマブ（アバスチン）と比較した。本実験の主な目的は、異なる分子フォーマットのVEGFに対する結合性の相対的な化学量論を比較することであった。VEGF165を、VEGF165が3倍濃度過剰を超え、飽和が達成されるまで、25℃で抗体溶液に滴定した。すべての滴定は、一貫性を担保するために、VEGF165の同じバッチを用いた。積分した結合等温線を、多相性挙動の徴候がないため、標準的な1：1結合モデルを用いて、Originソフトウェア（Microcalバージョン）内でフィッティングした。結果を表10にまとめる。
【表１７】
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【０２１８】
すべての抗体が、25℃でエンタルピー的に好ましくエントロピー的に好ましくない結合性を有する。dAb-Fc、Fc-dAbおよびdAb-Fc-dAb dAbフォーマットの間には化学量論に明白な差異があり、二重dAbフォーマットでより大きな能力（capacity）がある。dAb-Fc-dAbフォーマットはまた、VEGF165が過剰量存在する場合には、アバスチンよりも高能力を示す。測定された親和性は同じ順位（rank order）であり、他の方法により測定されたものと一致する。
【０２１９】
実施例29−種々のリンカー改変を伴う抗VEGF Vh dAb-Fc、Vk dAb-FcおよびVk Fc-dAb分子のクローニング
dAb配列（配列番号96〜97、104〜105、表19を参照されたい）を、哺乳動物発現ベクター中でヒトIgG1アイソタイプの一般的FcのN末端またはC末端にクローニングした。dAbを、様々なリンカー配列（表19を参照されたい、配列番号57〜75および76〜94）を用いてFcに連結した：Vh dAb-Fcに関して、dAbはDOM15-26-597であり；N末端リンカーはAS（配列番号58および77）、またはTVAAPS（配列番号59および78）、またはヒンジIgG1リンカー（配列番号60および79）、またはヒンジIgG3リンカー（配列番号61および80）またはフィブロネクチン×3リンカー（配列番号62および81）またはフィブロネクチン×4リンカー（配列番号63および82）のいずれかであり；Vk dAb-Fcに関して、dAbはDT02-K-044-085であり；N末端リンカーはH2A IgG1Fc点突然変異を有するAS（配列番号64および83）、T3P IgG1Fc点突然変異を有するAS（配列番号65および84）、またはTVAAPS（配列番号59および78）、またはヒンジIgG1リンカー（配列番号60および79）、またはヒンジIgG3リンカー（配列番号61および80）またはフィブロネクチン×3リンカー（配列番号62および81）またはフィブロネクチン×4リンカー（配列番号63および82）のいずれかであり；Vk Fc-dAbはDT02-K-044-085であり；C末端リンカーは（GS(TVAAPSGS)×3（配列番号66および85）、またはフィブロネクチン×3リンカー（配列番号67および86）またはフィブロネクチン×4リンカー（配列番号68および87）またはアルブミンドメイン1（配列番号69および88）、アルブミンドメイン2（配列番号70および89）、切断型アルブミンドメイン3リンカー、（Alb Dom 3-TFHAD、配列番号72および91）またはGly4Ser 3×リンカー(配列番号73および92）、Gly4Ser 4×リンカー(配列番号74および93）またはヘリックスリンカー(配列番号75および94）のいずれかであった。
【０２２０】
実施例30−種々のリンカー改変を伴う抗VEGF Vh dAb-Fc、Vk dAb-FcおよびVk Fc-dAb分子の発現
関連するVh抗VEGF dAb-Fc、Vk抗VEGF dAb-FcおよびVk抗VEGF Fc-dAb分子をコードする発現プラスミド（実施例29、配列番号132〜134および155〜176、表19に記載されている）をHEK293 6E細胞に一時的にトランスフェクションし、500mL規模で発現させて、実施例11に記載されている通りに抗体断片分子を生成させた。
【０２２１】
実施例31−種々のリンカー改変を伴う抗VEGF Vh dAb-Fc、Vk dAb-FcおよびVk Fc-dAb分子の精製
実施例30に記載されたVh抗VEGF dAb-Fc、Vk抗VEGF dAb-FcおよびVk抗VEGF Fc-dAb分子を、上清からアフィニティ精製した（実施例12を参照されたい）。
【０２２２】
実施例32−種々のリンカー改変を伴う抗VEGF Vh dAb-Fc、Vk dAb-FcおよびVk Fc-dAb分子のSDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）による分子分析
実施例31に記載された通りに精製された抗VEGF Vh dAb-Fc、抗VEGF Vk dAb-Fcおよび抗VEGF Vk Fc-dAb分子の完全性、均一性および純度(％)を、実施例3に記載された通りにSDS-PAGEにより分析した。ゲルは、モノマー鎖当たりの予測されるグリカン鎖の存在を許容する無傷の成熟タンパク質の予測される分子質量（dAb-FcおよびFc-dAb分子に対して約76kDa〜約85kDa）と一致するバンドサイズを示した。生物学的アッセイでのさらなる分析の前に、SDS-PAGEおよびSECにより、タンパク質が95％超の純度の標的タンパク質であることを確認した。dAb-FcまたはFc-dAb分子が95％未満の純度であった場合、さらなるSEC精製を行なった（実施例14および33を参照されたい）。
【０２２３】
実施例33−種々のリンカー改変を伴う抗VEGF Vh dAb-Fc、Vk dAb-FcおよびVk Fc-dAb分子のサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）による精製
必要であれば、Vh dAb-Fc、Vk dAb-FcおよびVk Fc-dAb分子に対して、調製的サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）を行なった。
【０２２４】
実施例34−種々のリンカー改変を伴う抗VEGF Vh dAb-Fc、Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子のVEGFに対するBiacoreでの結合性
VEGF165に対する抗VEGF Vh dAb-Fc、Vk dAb-FcおよびFc-dAb分子の結合親和性を、軽微な改変を含むが実施例16と類似の様式で、Biacore T100を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。第一級アミンカップリングによりC1チップにプロテインAを固定化し、次にこの表面を、抗VEGF構築物を捕捉するために用いた。ヒト組み換えVEGF165（HEK293細胞の一時的トランスフェクションから「社内で」供給した）を、以下に詳述する様々な範囲の希釈系列でアナライトとして用いた。すべての結合曲線を、バッファー注入（すなわち、0nM）と二重参照し、データを、T100に固有の1：1モデルにフィッティングした。50mM NaOHを用いて再生を行なった。ランは、ランニングバッファーとしてHBS-EPを用いて37℃で行なった。
【０２２５】
Vk Fc-dAb分子は、16nM、4nM、2nM、1nM、0.5nMおよび0.25nMの濃度範囲にわたって、DMS30000およびベバシズマブ（アバスチン）と比較した。データから、C末端リンカーであるアルブミンドメイン2およびフィブロネクチン×4によりIgG1Fcに連結されたDT02-K-085 dAbを有するVk Fc-dAb 分子が、BiacoreでDMS30000と同様の挙動を示したことが、結論付けられた（表11A）。アルブミン2リンカーの使用は生物物理学的研究から好ましくなかったので（データは示していない）、フィブロネクチン×4（fib4）が、DMS3000の（GS(TVAAPSGS)×3リンカーを置き換えるための好ましいC末端リンカーであった（（GS(TVAAPSGS)×3リンカーは、分子の発達を問題あるものにする多数のグリコシル化アイソフォームの原因となる（データは示していない））。同様のBiacore実験により、4倍希釈系列で128nM〜0.03125nMの濃度範囲にわたってさらなる抗VEGF Vk Fc-dAbデータセットを作成し、これを表11Bに示す。データは、DT02-K-085 dAbをIgG1FcにつなげるためのC末端リンカーとして、fib4リンカー（DMS30026）をヘリックスリンカー（DMS30027）と比較する。fib4リンカーが好ましい。
【表１８】
0005987057.tif 000019
【表１９】
0005987057.tif 000020
【０２２６】
16nM、4nM、2nM、1nM、0.5nMおよび0.25nMの濃度範囲にわたって、Vk dAb-Fc分子をDMS1576およびベバシズマブ（アバスチン）と比較し、ここで、N末端リンカーであるN085フィブロネクチン4および1×TVAAAPSによりIgG1Fcに連結されたDT02-K-085 dAbを有するVk dAbFc分子を比較した。データは、IgG1FcのN末端にDT02-K-085 dAbをつなげるために、2つのリンカーのうち1×TVAPPSが好ましいことを示唆する。Vk dAb-Fc分子のさらなる例は、表11Bおよび11Cに示されている。4倍希釈系列で128nM〜0.03125nMの濃度範囲にわたってデータを作成し、N085 T113P（T2P）またはASTHPリンカー（DMS30029）、N085 extg1またはIgG1ヒンジリンカー（DMS30028）によりIgG1FcのN末端につなげられたDT02-K-085 dAbを有するVk dAb-Fcタンパク質を、DMS1576と比較した。表11Bのデータから、IgG1ヒンジリンカー（N085extg1）が、1×TVAAPSより優れて、IgG1FcのN末端へのDT02-K-085 dAbの連結のための好ましいリンカーとしみなされた。
【０２２７】
4倍希釈系列で128nM〜0.03125nMの濃度範囲にわたって、Vh dAb-Fc分子をDMS1576およびベバシズマブ（アバスチン）と比較した。表11Bからのデータは、dAb-FcのN末端への15-26-597 Vh dAbの連結のための好ましいリンカーは、3コピーのフィブロネクチンリピートに基づくものであることを示唆する。表11Cに示されるさらなるデータは、15-26-597 dAbをFcにN末端連結するために他のリンカーを用いる場合、得られる生成されたdAb-Fcタンパク質は、抗VEGF Biacoreで二相性の性質であることを示唆する。Biacore曲線の形状から、N597extg1（IgG1ヒンジ）リンカーが本データセットからの2番目によいリンカーとみなされた。
【表２０】
0005987057.tif 000021
【０２２８】
Fcに対する15-26-597 dAbのN末端カップリングのためにリンカーFib3またはFib4を含むVh dAb-Fc分子の抗VEGF Biacoreでの挙動を、DMS1576と、4倍希釈系列で32nM〜0.03125nMのVEGFの濃度範囲にわたって比較した。データを表11Dに示す。データは、Fib3リンカーに対してFib4リンカーを用いる利点はないが、Fib3またはFib4リンカーの配列を用いてFcに15-26-597 dAbをN末端連結するために、DMS1576中に存在する「AS」からリンカーを長くする場合に、Vh dAb-Fcは抗VEGF Biacoreによるさらに最適な結合キネティクスを示すことを示唆する。
【０２２９】
全体的なデータセットは、以下のことを示唆した：有効性を改善するがグリコシル化アイソフォームの数も減らすために新規なリンカーを用いて最も最適な抗VEGF dAb-Fc-dAbを構築するために、
(i)    FcへのDT-02-K44-085 Vk dAbのC末端付加のためには；フィブロネクチン×4およびヘリックスリンカーが好ましく；
(ii)    FcへのDT-02-K44-085 Vk dAbのN末端付加のためには；IgG1ヒンジ、ASTHPおよび1×TVAAPリンカーが好ましく；
(iii)    Fcへの15-26-597 Vh dAbのN末端付加のためには；フィブロネクチン3リンカーが好ましかったが、IgG1ヒンジおよびASリンカーをさらに次に進めた。
【表２１】
0005987057.tif 000022
【０２３０】
実施例35−改変リンカーを有する抗VEGF Vh/VkおよびVk/Vk dAb-Fc-dAb分子のクローニング
Vk-Vk dAb-Fc-dAb：DMS30034およびDMS30035（配列番号135〜136、177〜178、表19）ならびにVh-Vk dAb-Fc-dAb：DMS30036〜DMS30041（配列番号137〜142、179〜184、表19）を、Fc IgG1配列のN末端またはC末端（配列番号: 102および110）にVh-dAb-Fc融合ベクター（DMS1576、配列番号2および30）からVk dAb配列（DT02-K-044-085（配列番号97および105）またはVh dAb配列DOM15-26-597（配列番号96および104）をクローニングすることにより、遺伝子操作した。哺乳動物発現ベクター中で、フィブロネクチン×4リンカー（配列番号63および82、表19を参照されたい）によりVk dAb（DT02-K-044-085（配列番号97および105））のN末端にFc IgG1をC末端で連結させた。N末端Vh dAbは、AS（配列番号58および77、表19）：DMS30038（配列番号139、181、表19）、またはヒンジIgG1（配列番号60および79、表19）：DMS30037（配列番号138、180、表19）またはフィブロネクチン3（配列番号67および86、表19）：DMS30036（配列番号137、179、表19）およびDMS30040（配列番号141、183、表19）またはフィブロネクチン4（配列番号60および79、表19）：DMS30039（配列番号140、182、表19）およびDMS30041（配列番号142、184、表19〜）のいずれかを用いてFcのN末端に連結した。N末端Vk dAbは、ヒンジIgG1（配列番号60および79、表19）：DMS30034（配列番号135、177、表19）またはASTHP(H2A IgG1Fc、配列番号58および65；77および84、表19）：DMS30035（配列番号136、178、表19）またはヒンジIgG1（配列番号60および79、表19〜）：DMS30043（配列番号143、177、表19）のいずれかを用いてFcのN末端に連結した。DMS30035、30040および30041（それぞれ、配列番号136および178；141および183；ならびに142および148）の配列中では、Fcは、Fcの3位でトレオニンではなくプロリンを含有する。
【０２３１】
フィブロネクチン×4リンカー配列およびC末端Vk dAbは、哺乳動物細胞での安定的発現のために、全体的なdAb-Fc-dAbコドン最適化指数（ヒト）が0.95超となるように、コドン最適化した。この断片は、オリゴヌクレオチドアセンブリにより製造し、DMS30034（配列番号135および177）、DMS30036（配列番号137および179）、DMS30037（配列番号138および180）およびDMS30038（配列番号139および181）へとクローニングして、それぞれ、DMS30043（配列番号143および177）、DMS30044（配列番号144および179）、DMS30045（配列番号145および180）およびDMS30046（配列番号146および181）を製造した。明瞭にするために、アミノ酸配列は同じままにし、DNA配列のみを変化させた。
【０２３２】
実施例36−改変リンカーを有する抗VEGF Vh/VkおよびVk/Vk dAb-Fc-dAb分子の発現
実施例10および21に記載された方法を用いて、関連する抗VEGF dAb-Fc-dAb分子をコードする発現プラスミド（配列番号135、137〜139および177、179〜181に列挙されている）をHEK293 6E細胞に一時的にトランスフェクションし、500mL規模で発現させて、抗体断片分子を生成させた。30mg/L上清超の発現レベルが日常的に達成された。
【０２３３】
実施例37−改変リンカーを有する抗VEGF Vh/VkおよびVk/Vk dAb-Fc-dAb分子の精製
dAb-Fc-dAb分子を、上清（実施例36）からアフィニティ精製した。リン酸緩衝生理食塩水中に懸濁されたアフィニティ樹脂2mL（50：50スラリー）を500mLのろ過した上清に加え；上清/アフィニティ樹脂混合物を4℃で一晩、穏やかに回転させて、結合が行なわれるのを可能にした。その後、樹脂を沈殿させて、上清を注意深く注ぎ出した。樹脂を残りの上清に再懸濁し、空のドリップカラムに注ぎ入れ、上清にカラムを通り抜けさせた。pH中性水性バッファーの組み合わせを用いて、結合した生成物を洗浄して、非特異的に結合した不純物を除去し、続いて、低pH溶出した。結合した生成物の90％超が回収され、続いて、溶出プールのpHをpH3.5に30分間調整し、ウイルス中和を行ない、その後、pHをpH4.5に調整した。
【０２３４】
実施例38−改変リンカーを有する抗VEGF Vh/VkおよびVk/Vk dAb-Fc-dAb分子のサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）による分子分析
実施例38に記載された通りに精製された抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の完全性、均一性および純度(％)を、実施例3、13および24に記載された通りにSDS-PAGEおよび分析的サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）により分析した。生物学的アッセイでのさらなる分析の前に、SDS-PAGEおよびSECにより、タンパク質が95％超の純度の標的タンパク質であることを確認した。
【０２３５】
実施例39−Biacoreでの改変リンカーを有する抗VEGF Vh/VkおよびVk/Vk dAb-Fc-dAb分子のVEGFに対する結合性ならびにVhおよびVk dAb-FcおよびVk Fc-dAbとの比較
VEGF165に対する抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の結合親和性を、軽微な改変を含むが実施例25および34と類似の様式で、Biacore T100を用いて表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。第一級アミンカップリングによりC1チップにプロテインAを固定化し、次にこの表面を、抗VEGF構築物を捕捉するために用いた。ヒト組み換えVEGF165（HEK293細胞の一時的トランスフェクションから「社内で」供給した）を、4倍希釈系列で32nM〜0.03125nMでアナライトとして用いた。すべての結合曲線を、バッファー注入（すなわち、0nM）と二重参照し、データを、T100に固有の1：1モデルにフィッティングした。50mM NaOHを用いて再生を行なった。ランは、ランニングバッファーとしてHBS-EPを用いて37℃で行なった。
【０２３６】
dAb-Fc-dAb分子をその対応するVk Fc-dAbおよびVk dAb-FcおよびVh dAb-Fc分子と比較し、データを表12Aに示す。これらのVh/Vk dAb-Fc-dAbのうちの一部：DMS30037およびDMS30022（表12Aを参照されたい）は、Biacoreで予想外に優れた働きを見せ、良好な会合および解離速度を有し、非常に強力な分子であることを示唆した。
【表２２】
0005987057.tif 000023
【０２３７】
最も強力に見えるdAb-Fc-dAbとDMS1576およびアバスチンとを比較するさらなるBiacoreデータセットを取得し、この例を表12Bに示す。データセットは、Vh/Vk dAb-Fc-dAb：DMS30022、DMS30036、DMS30037およびDMS30038が、有効性についてアバスチンと同様であるように見えること、および総合的なKDではDMS1576から改善されているが、Vk/Vk dAb-Fc-dAb DMS30034は全体的に有効性があまり高くない（解離定数に関して、Kd s-1 1.04E-04、表12Bを参照されたい）ことを再確認する（表12Bを参照されたい）。
【０２３８】
実施例25とは対照的に、これらの結果から見て取れるVEGFに対するdAb-Fc-dAb分子の結合データは、Biacoreが、両方のVEGF結合部位が同様の有効性のものである場合に（例えば、DMS30036、DMS30037およびDMS30038）、二価の抗VEGF dAb-Fc-dAb分子を分析するための非常に情報量の多いアッセイ形式であり得、かつ1方が強力な結合部位であり1方があまり強力でない結合部位を有する分子（例えば、DMS30034）と区別するために用いることができることを示唆する。
【表２３】
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【０２３９】
実施例40−最も強力なVh dAb-Fcおよびアバスチンと比較した改変リンカーを有する抗VEGF Vh/VkおよびVk/Vk dAb-Fc-dAb分子のVEGF R2受容体結合アッセイ
改変リンカーを有するいくつかの抗VEGF Vh/VkおよびVk/Vk dAb-Fc-dAb分子の有効性を、実施例7、17および26に記載の改変法（すなわち、プレインキュベーションなし）を用いたVEGF受容体2（R2）結合アッセイで分析し、Vh dAb-Fc、DMS30030およびベバシズマブ（アバスチン）と比較した。データを表13Aおよび13Bに示す。表13Aのデータから、試験したすべてのdAb-Fc-dAb分子：DMS30022、DMS30023、DMS30034、DMS30036およびDMS30037が、DMS30030よりも低いEC50値から、より強力であること、およびベバシズマブ（アバスチン）よりも目に見えて強力であると考えられた。しかしながら、本アッセイで分子により達成される最大阻害％にはいくぶんかのばらつきがあり、アバスチン、DMS30022およびDMS30030は94％超の最大阻害を達成し、DMS30023、DMS30034、DMS30036およびDMS30037は78〜84％の最大阻害を達成した（データは示していない）。
【０２４０】
dAb-Fc-dAb：DMS30022およびDMS30038とVh dAb-Fc、DMS30030およびベバシズマブ（アバスチン）とを比較するさらなるデータを生成し、これを表13Bに示す。
【０２４１】
まとめると、DMS30022およびDMS30038は同等であり、DMS30030よりも低いEC50値から、より強力であること、およびベバシズマブ（アバスチン）よりも目に見えて強力であると考えられた（表13B）。また、本アッセイで分子により達成される最大阻害％にはいくぶんかのばらつきがあり、アバスチン、DMS30022およびDMS30030は95％超の最大阻害を達成し、DMS30038は91％の最大阻害を達成した（データは示していない）。
【表２４】
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【表２５】
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【０２４２】
実施例41−ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）増殖アッセイ：改変リンカーを含む抗VEGF Vh/VkおよびVk/Vk dAb-Fc-dAb分子を用いた阻害
以下の変更を含んで実施例8および18および27に記載された方法を用いて、ヒト臍静脈内皮細胞の増殖を抑制する、改変リンカーを有するdAb-Fc-dAb 分子：Vh-Vk（DMS30022、DMS30036、DMS30037）およびVk-Vk（DMS30023、DMS30034）の能力を、Vh dAb-Fc分子（DMS30030）、Vk Fc-dAb分子（DMS30026）およびベバシズマブ（アバスチン）と比較した：(i)外側のウェルを細胞を入れないままにするのではなく、96ウェルプレート全体を用いた、および(ii)非線形回帰（可変勾配）と比較してS字形曲線（Sigmodial curve）フィッティング、可変勾配を用い、GraphPad Prismを用いてデータを解析した。試験化合物は、比較化合物（comparator molecule）であるベバシズマブ（アバスチン）に対して個々のプレートで独立に評価し、アッセイは少なくとも別々に4回行ない、分子当たりの合計データセットは、ベバシズマブ（アバスチン）：20；DMS30030：8；DMS30036：8；DMS30022：4；DMS30037：8；DMS30026：4；DMS30023：4；DMS30034：4であった（データは示していない）。ベバシズマブ（アバスチン）のものと比較して、特定の分子によりもたらされるアッセイでの最大阻害の程度および相対的EC50値の両方を解析することに焦点を当てた。
【０２４３】
データは、非線形回帰（可変勾配）と比較してS字形曲線フィッティング、可変勾配を用い、GraphPad Prismを用いて解析した。個々の曲線フィットは、各分子および各日に対してフィッティングした。一部のフィッティングがうまくいかなかったため、低濃度でプラトーが観察されなかった場合には、曲線に制約を導入することが決定された。この制約は、最低濃度での点の平均と同じであった。最小値が制約されるかされないかについてデータを手動で選択し、曲線フィットおよびパラメータをこの基準選択に基づいて自動で更新した。曲線最大値および標準誤差の推定値を、重み付けとして1/(標準誤差)2、[SE]2を用いて、分散の重み付け混合モデル解析を用いて解析した。解析は、ランダム効果条件（random effects terms）を用いて、プレート間および日間のばらつきについて調整した。この解析から、予測される平均が推定され、アバスチン（対照）に戻って比較を行なった（表14A）。次に、IC50についてlog10スケールで同じ解析を行ない、結果を元に変換した。これにより、幾何平均の推定値がもたらされ、アバスチン（対照）との比の形態でアバスチンに戻って比較を行なった（すなわち、0.5の比はアバスチンからの50％の低下を示す）（表14B）。
【表２６】
0005987057.tif 000027
【０２４４】
本解析から、分子DMS30022、DMS30034、DMS30036およびDMS30037は、HUVECアッセイでの最も高い最大阻害をもたらすようであり、それらは明らかにアバスチン群より高い能力を示した（out-performed）が、信頼区間はゼロ参照と重なり合っており、それにより、アバスチンとの統計学的に有意な差異はなかった（データは示していない）（表14A）。
【表２７】
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【０２４５】
95％信頼区間（CI）を含むIC50値の幾何平均の同様の解析は、分子DMS30022、DMS30023、DMS30036およびDMS30037が、アバスチンよりも統計学的に有意に低いIC50を有することを示した（データは示していない）（表14B）。
【０２４６】
別個のデータのセットを、別の操作者から同様の形式でのHUVECアッセイにより生成した。データは、HUVECアッセイで2種類のdAb-Fc-dAb：DMS30022およびDMS30037の挙動をベバシズマブ（アバスチン）のものと比較することに焦点を当て、四重で行なった。データは、両方のdAb-Fc-dAbがHUVECアッセイで非常に似通ったIC50値および最大阻害のレベルを有し、この特定のデータセットではさほど統計学的ではないが、ベバシズマブ（アバスチン）よりも強力であると思われることを示唆する（データは示していない）。
【０２４７】
実施例42−VEGF誘導性血液網膜関門崩壊での改変リンカーを含む抗VEGF Vh/VkおよびVk/Vk dAb-Fc-dAb分子のパフォーマンス：ウサギ網膜漏出モデル
実施例9に記載された通りに、DMS30022、DMS30030、DMS30034、DMS30036およびDMS30037を、ウサギ眼でヒトVEGF165（R&D Systems）誘導性血管網膜関門崩壊（BRB）モデルで試験し、ベバシズマブ（アバスチン）、およびケナコルト（トリアムシナロン（Tramcinalone））に対して比較した。
【０２４８】
本研究の目的および方法は、上記の実施例9に関して概説されているのと同様である。投与および注射スケジュールを、表15Aに示す。
【０２４９】
上記の実施例9の方法に従って、すべての分子を、50mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.5、104mM NaCl、0.02mM EDTAへとバッファー交換した。
【０２５０】
140頭のHY79B有色ウサギを、12頭の11群および8頭の1群にランダムに分け、各群を、ケナコルト処置群（2頭の4セット）を除いて、3頭の動物の4つの実験セットにさらに分けた（表15Aを参照されたい）。
【０２５１】
投与した分子の一部（DMS30036、DMS30037およびDMS30022）の平均硝子体内レベルを、MSD（メソスケールディスカバリー）ベースの機能的VEGF結合アッセイにより測定した（データは示していない）。測定した分子について、レベルは、注入レベルおよびウサギ硝子体液中での分子に対して期待される半減期の範囲から予測されるものと同様であった（データは示していない）。フルオレセイン血管造影図を、定性的評価のために収集した。
【表２８】
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【０２５２】
硝子体内注射したVEGFはBRBの崩壊を誘導し、これは、注射9日後に、マスクを外した場合の以下の化合物を用いた処置により、市販の参照（ケナコルト(登録商標)）のものと同様の有効性でブロックされた：ベバシズマブ（アバスチン）（3種類の用量すべてで）；DMS30030（LおよびL/3用量）：DMS30022（L/3用量）、DMS30034（L/3用量）、DMS30036（L用量）、およびDMS30037（LおよびL/3用量）。覆面試験では、分類は、1つの目立った範囲外（outling）データ点の存在により影響されたが、ビヒクル、陰性対照、およびDMS30036（L/3用量）を用いた処置後に誘導された右眼で重大な網膜血管漏出が報告された（データは示していない）。蛍光に関する異常なスコアのために、1つのデータ点（ウサギ134）はDMS30037 L/3用量投与群からのさらなる分析から除外したことに留意されたい。
【０２５３】
生データをさらなる統計学的解析に供した：同じ分子および用量に対応するマスクされた群をまとめ、幾何平均値を95％信頼区間（CI）を伴って決定した。幾何平均データを表15B(i)に示し、95％CIを伴うビヒクル値に対する比および分散を表15B(ii)に示す。表15B(i)および(ii)のデータ解析から、市販のコルチコイド参照（ケナコルト(登録商標)遅延型）がVEGF誘導性網膜漏出の程度を80％低下させ、3種類の異なる用量のベバシズマブ（アバスチン）は71.4〜76.4％有効であったが、用量応答の徴候はなく、DMS30022（L/3）は74.6％、DMS30037（L）は74.2％および（L/3）は67.4％；DMS30036（L/3）は63.7％；DMS30034（L/3）は59.5％およびDMS30030（L）は65.5％および（L/3）は70.5％有効であった。DMS30022およびDMS30037などのVh/Vk dAb-Fc-dAbは、このモデルで最も強力なフォーマットであったことが結論付けられた。
【表２９】
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【０２５４】
実施例43−チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞からのVh/Vk dAb-Fc-dAb分子の大規模精製
例えば、DMS30037を、アフィニティクロマトグラフィおよび自動化FPLC精製システムを用いて、清澄化細胞培養上清から捕捉した。ロードしたら、pH中性水性バッファーの組み合わせを用いて結合した生成物を洗浄して、非特異的に結合した不純物を除去し、続いて低pH溶出を行ない、これにより、結合した生成物の90％超が回収された。-40℃での保存後、溶出プールを解凍し、次にpH3.6に30分間調整して、ウイルス中和を行ない、その後、pHをpH6.0に調整した。pH調整済みプールを、生成物を、プロセス不純物の除去を促進する非生成物結合条件下でロードする第2のカラムでさらに精製した。。精製されたDMS30037を、次に1つのプールとして収集し、その後、0.2μmろ過し、保存した。さらに、DMS30037アフィニティカラム溶出液を、低塩バッファー中でpH7.5に調整し、ろ過し、濃縮して、タンジェンシャルフローろ過システムを用いて好適な製剤化バッファーへと透析した。回収された生成物を、0.2μm滅菌ろ過し、保存した。
【０２５５】
実施例44−改変されたC末端を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子のクローニング
Vk dAbのC末端に改変を有するVh-Vk dAb-Fc-dAb：DMS30047〜30054（配列番号147〜154および185〜192、表19）を、PCRならびにそれぞれDMS30045およびDMS30046への再クローニングにより変異型Vk dAb配列を作製することによって遺伝子操作し、改変型哺乳動物発現ベクターを製造した。DMS30045から、(i) C末端アルギニン残基を除去してDMS30047（DMS30037-R）を作製し、(ii) C末端アラニンを付加してDMS30048（DMS30037+A）を作製し、(iii) 3つのC末端アラニンを付加してDMS30049（DMS30037+AAA）を作製し、C末端トレオニンを付加してDMS30050（DMS30037+T）を作製した。DMS30046から、(i) C末端アルギニン残基を除去してDMS30051（DMS30038-R）を作製し、(ii) C末端アラニンを付加してDMS30052（DMS30038+A）を作製し、(iii) 3つのC末端アラニンを付加してDMS30053（DMS30038+AAA）を作製し、C末端トレオニンを付加してDMS30054（DMS30038+T）を作製した。
【０２５６】
実施例45−改変されたC末端を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子（DMS30047〜30054）の発現
実施例10、21および36に記載された方法を用いて、関連する抗VEGF dAb-Fc-dAb分子をコードする発現プラスミド（配列番号147〜154、および185〜192、表19に列挙されている）をHEK293 6E細胞に一時的にトランスフェクションし、500mL規模で発現させて、抗体断片分子を生成させた。30mg/L上清超の発現レベルが日常的に達成された。
【０２５７】
実施例46−改変されたC末端を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子の精製
上記の実施例37に関して記載された通りに、上清（実施例45）からdAb-Fc-dAb分子をアフィニティ精製した。
【０２５８】
実施例47−改変されたC末端を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子のサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）による分子分析
実施例46に記載された通りに精製された抗VEGF dAb-Fc-dAb分子の完全性、均一性および純度(％)を、実施例3および13に記載された通りにSDS-PAGEおよび分析的サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）により分析した。生物学的アッセイでのさらなる分析の前に、SDS-PAGEおよびSECにより、タンパク質が95％超の純度の標的タンパク質であることを確認した。
【０２５９】
実施例48−Biacoreでの改変されたC末端を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子のVEGFに対する結合性
VEGF165に対する一部の抗VEGF dAb-Fc-dAb分子（小さなC末端改変を含む）の結合親和性を、軽微な改変を含むが実施例34および40と類似の様式で、Biacore T100を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。第一級アミンカップリングによりC1チップにプロテインAを固定化し、次にこの表面を、抗VEGF構築物を捕捉するために用いた。ヒト組み換えVEGF165（HEK293細胞の一時的トランスフェクションから「社内で」供給した）を、4倍希釈系列で32nM〜0.03125nMにてアナライトとして用いた。すべての結合曲線を、バッファー注入（すなわち、0nM）と二重参照し、データを、T100に固有の1：1モデルにフィッティングした。50mM NaOHを用いて再生を行なった。ランは、ランニングバッファーとしてHBS-EPを用いて37℃で行なった。得られたデータを、表16A、16Bおよび16Cに示す。表16Aのデータから、DMS30037と、C末端で改変された数種類の変異体：DMS30037+A（DMS30048）、DMS30037+AAA（DMS30049）、およびDMS30037+T（DMS30050）の挙動、Biacoreで同等であるようであり、C末端改変が親に比べて有効性を低下させるとは考えられない。
【０２６０】
さらなるデータセットを表16Bに示し、この表では、DMS30037およびDMS30038の両方の特性を、Biacoreで、以下のC末端で改変された変異体：DMS30037-R（+R（DMS30047）と標識される）、DMS30037+T（DMS30050）およびDMS30038-R（+R（DMS30051）と標識される）ならびにベバシズマブ（アバスチン）と比較した。このデータセットでは再び、すべての分子の挙動がBiacore上で同等であるようであり、C末端改変が親に比べて有効性を低下させるとは考えられない。アバスチンについての曲線を見る以外に、有用なデータを得ることはできなかった。さらなるデータセットを表16Cに示し、この表では、分子DMS30037およびDMS30038を、以下のC末端で改変された変異体：DMS30037-R（DMS30047）、DMS30037+T（DMS30050）、DMS30038-R（DMS30051）およびDMS30038+T（DMS30054）ならびにベバシズマブ（アバスチン）と比較した。ここでも、すべてのdAb-Fc-dAb 分子の挙動がBiacore上で同等であるようであり、C末端改変が親に比べて有効性を低下させるとは考えられない。このデータセット（表16Cを参照されたい）では、解離速度が強固すぎる（too tight）ため、ベバシズマブ（アバスチン）データは適正に測定できなかった。
【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【０２６１】
実施例49−改変されたC末端を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子のVEGF R2受容体結合アッセイ
DMS30037およびDMS30038に基づくが、C末端改変を有する抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子の有効性を、実施例7、17および26および40に記載される改変法（すなわち、プレインキュベーションなし）を用いるVEGF受容体2（R2）結合アッセイで、野生型分子およびベバシズマブ（アバスチン）の両方と比較した。データを表17Aに示し、すべての被験dAb-Fc-dAb分子：DMS30037、DMS30037+T（DMS30050）、DMS30037-R（DMS30047）、DMS30038、DMS30038-R（DMS30051）が、同等の有効性のものであり、ベバシズマブ（アバスチン）よりも顕著に強力であると考えられた（表17A）。このアッセイで分子により達成された最大阻害％には、ほとんど変動がなく、すべての分子が93〜98％超の最大阻害を有した（データは示していない）。
【０２６２】
同じアッセイ形式でdAb-Fc-dAb：DMS30038、DMS30038+T（DMS30050）およびDMS30038-R（DMS30051）とベバシズマブ（アバスチン）とを比較する、さらなるデータを作成し、データを表17Bに示す。データから、DMS30038およびそのC末端変異体（表17B）はRBAアッセイでのEC50値により判断して同様の有効性を有し、この基準ではベバシズマブ（アバスチン）より顕著に強力であると考えられる。このアッセイで分子により達成された最大阻害％には、ほとんど変動がなく、すべての分子が94％超の最大阻害を達成した（データは示していない）。
【表３３】
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【表３４】
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【０２６３】
実施例49−ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）増殖アッセイ：C末端改変を含む抗VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb分子を用いた阻害
以下の変更を含んで実施例8、18、27および41に記載された方法を用いて、ヒト臍静脈内皮細胞の増殖を抑制する、DMS30037およびDMS30038に基づくがC末端改変を有するdAb-Fc-dAb 分子：DMS30037-R（DMS30047）およびDMS30037+T（DMS30050）、DMS30038-R（DMS30051）およびDMS30038+T（DMS30054）の能力を、ベバシズマブ（アバスチン）と比較した：(i)外側のウェルを細胞を入れないままにするのではなく、96ウェルプレート全体を用いた、および(ii)非線形回帰（可変勾配）と比較してS字形曲線（Sigmodial curve）フィッティング、可変勾配を用い、GraphPad Prismを用いてデータを解析した。試験化合物は、比較化合物（comparator molecule）であるベバシズマブ（アバスチン）に対して個々のプレートで独立に評価し；アッセイは少なくとも別々に3回行ない、分子当たりの合計データセットは、ベバシズマブ（アバスチン）：15；DMS30037：7；DMS30038：8；DMS30037-R（DMS30047）：3；DMS30037+T（DMS30050）：4；DMS30038-R（DMS30051）：4およびDMS30038+T（DMS30054）：4であった（データは示していない）。ベバシズマブ（アバスチン）のものと比較して、特定の分子によりもたらされるアッセイでの最大阻害の程度および相対的EC50値の両方を解析することに焦点を当てた。
【０２６４】
データは、非線形回帰（可変勾配）と比較してS字形曲線フィッティング、可変勾配を用い、GraphPad Prismを用いて解析した。個々の曲線フィットは、各分子および各日に対してフィッティングした。一部のフィッティングがうまくいかなかったため、低濃度でプラトーが観察されなかった場合には、曲線に制約を導入することが決定された。1つのプレートが、制約にもかかわらず曲線フィッティングがうまくいかなかったために、解析から除外した。この制約は、最低濃度での点の平均と同じであった。最小値が制約されるかされないかについてデータを手動で選択し、曲線フィットおよびパラメータをこの基準選択に基づいて自動で更新した。曲線最大値および標準誤差の推定値を、重み付けとして1/(標準誤差)2、[SE]2を用いて、分散の重み付け混合モデル解析を用いて解析した。解析は、ランダム効果条件（random effects terms）を用いて、プレート間および日間のばらつきについて調整した。この解析から、予測される平均が推定され、ベバシズマブ（アバスチン、対照）に戻って比較を行なった（表18Aを参照されたい）。次に、IC50についてlog10スケールで同じ解析を行ない、結果を元に変換した。これにより、幾何平均の推定値がもたらされ、ベバシズマブ（アバスチン対照）との比の形態でベバシズマブ（アバスチン）に戻って比較を行なった（すなわち、0.5の比はベバシズマブ（アバスチン）からの50％の低下を示す）（表18Bを参照されたい）。
【表３５】
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【０２６５】
本解析から、分子DMS30037、DMS30037+TおよびDMS30037-Rは、HUVECアッセイでの最も高い最大阻害をもたらすようであり、それらはアバスチン群より高い能力を示した（out-performed）。信頼区間はゼロ参照と重ならず、したがって、データはアバスチンのものから統計学的に有意であった（データは示していない）（表18Aを参照されたい）。
【表３６】
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【０２６６】
95％信頼区間（CI）を含むIC50値の幾何平均の同様の解析は、ほとんどすべてのdAb-Fc-dAb分子DMS30037、DMS30037+T、DMS30038、DMS30038+TおよびDMS30038-Rが、ベバシズマブ（アバスチン）よりも統計学的に有意に低いIC50値を有することを示した（データは示していない）（表18Bを参照されたい）。DMS30037-Rからのデータセットは、n数が低い（3）ために非常に変動した。
【０２６７】
データ全体は、両方のdAb-Fc-dAb：DMS30037およびDMS30038に対するC末端改変が、親分子に非常に類似したHUVECアッセイでのIC50値および最大阻害レベルを有し、最大阻害％および低いIC50の両方に関して、ベバシズマブ（アバスチン）よりも強力であると考えられることを示唆する（表18Aおよび18Bを参照されたい）。
【０２６８】
実施例50−マウスVEGF164に対するVh dAb-Fc（DMS1529）およびVk Fc-dAb（DMS30000）の交差反応性
MSD（メソスケールディスカバリー）ハイバンド96ウェルプレート（MSD L11XB-3）を、1または2μg/mL mVEGF164（R&D 493-MV/CF）（25μL/ウェル）を用いてコーティングし、シールして、4℃で一晩インキュベートした。次の日、MSDプレートをTris洗浄バッファーを用いて300μL/ウェルで3回洗浄し、PBS中の3％BSA（250μL/ウェル）を用いてブロッキングし、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。MSDプレートを再度洗浄し、その後、DMS1529、DMS30000またはmVEGF R2 Fc（R&D 443-KD/CF）標準曲線を添加し（25μL/ウェル）、振盪（750RPM）しながら室温で2時間インキュベートした。標準はPBS中0.1％BSAを用いて希釈した。MSDプレートを再度洗浄し、続いてPBS中1％BSAの中で1μg/mLの検出試薬（25μL/ウェル、社内スルホ-TAG標識ヤギ抗ヒトIgG、Fc特異的、Sigma I2136）を添加し、振盪（750RPM）しながら室温で1時間インキュベートした。MSD Sector Imager 6000での電気化学発光の測定前に、MSDプレートを再度洗浄し、150μL/ウェルの2×リードバッファーT（MSD R92TC-1）を加えた。Excelを、データ解析およびグラフプロットに用いた。
【０２６９】
図4に例となるデータセットを示し、この図では、DMS1529、DMS3000およびマウスVEGF R2 Fc対照タンパク質について、抗体濃度に対してMSDシグナルをプロットする。
【０２７０】
3種類すべてのタンパク質がマウスVEGF164に対して濃度依存的に明らかに結合し、dAbがマウスVEGF164と交差反応することを示す。
【表３７】
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【表３８】
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【０２７１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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