(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１〜４に示すタンパク質からなる、歯周病発症判定用マーカー。
【表１】
0005869323.tif 000013
【表２】
0005869323.tif 000014
【表３】
0005869323.tif 000015
【表４】
0005869323.tif 000016
【請求項２】
表１〜４に示すタンパク質からなる、歯周病の進行度判定用マーカー。
【表１】
0005869323.tif 000017
【表２】
0005869323.tif 000018
【表３】
0005869323.tif 000019
【表４】
0005869323.tif 000020
【請求項３】
歯周病発症の有無を判定するために、被験体の口腔内から検体を採取し、採取した検体に含まれる表１〜４に示すタンパク質を定量する方法。
【表１】
0005869323.tif 000021
【表２】
0005869323.tif 000022
【表３】
0005869323.tif 000023
【表４】
0005869323.tif 000024
【請求項４】
歯周病の進行度を判定するために、被験体の口腔内から検体を採取し、採取した検体に含まれる表１〜４に示すタンパク質を定量する方法。
【表１】
0005869323.tif 000025
【表２】
0005869323.tif 000026
【表３】
0005869323.tif 000027
【表４】
0005869323.tif 000028
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周組織とは、歯の周囲にあって、歯を支持する役割を担っている組織をいい、歯肉、歯根膜、セメント質、歯槽骨から構成されている。その歯周組織の炎症のうち、炎症が歯肉に限局したものを「歯肉炎」といい、炎症部位が歯肉を超えて広がり歯根膜や歯槽骨が損傷、破壊した場合を「歯周炎」という。これらを総称して「歯周病」という。
【０００３】
歯肉炎及び歯周炎の歯周病は、ともに、歯垢（口腔内の食物残渣等に細菌などが付着して繁殖した塊）の中の細菌が増殖し、他の要因も影響して、歯周組織が炎症を起こすことによって生じる内因性感染症である。歯周病は虫歯と異なりほとんど痛みがなく、気づかないうちに進行することが多い。しかし、歯周病を放置すると症状は進行し、やがて歯が抜けることとなる恐れが大きく、循環器系疾患へのリスク増加も懸念される。さらに、歯周病は口臭の原因ともなる。
【０００４】
歯周病対策としては、正しい歯磨きや、定期検診によるプラークコントロール、食生活の改善等の予防行為が挙げられる。しかし、現実的には、歯周病診断により、進行しつつある歯周病をいかに的確に発見し、その症状に適した治療を行うか、というところが非常に重要である。
歯周病の診断は、一般には、歯周ポケットの測定、アタッチメントレベル、Ｘ線画像診断等によって行われている。しかし、これらの診断方法は被験体への負担が大きい。さらに、これらの歯周病診断方法は操作手順が複雑であり、歯科医師の経験や技能に基づくため判定基準に個人差があるなどの問題がある。
【０００５】
これまでに、歯周病マーカーを用いた歯周病の診断方法が提案されている。例えば、特許文献１には、歯肉溝滲出液に含まれ、親水性で陰性荷電の強い酸性タンパク質であって等電点が２．５以下であり且つ分子量が約９，０７０〜９，１００のタンパク質を歯周病疾患マーカーとして利用した歯周病診断方法が記載されている。しかし、この方法では、歯肉溝滲出液を採取しなければならず、簡便性に欠ける。また、特許文献２には、唾液又は歯肉浸出液中のβ−デフェンシンを免疫学的測定法により検出又は測定する、歯周病診断方法が記載されている。しかし、この方法において、β−デフェンシンの検出は、β−デフェンシンに対する抗体がβ−デフェンシンと反応して発色する化学物質により行っており、色の濃淡に基づいてβ−デフェンシン量を測定するものであるため、客観性、定量性に欠ける。また、特許文献３には、歯肉溝滲出液に含まれるγ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性を測定する歯周病の検査方法が記載されている。しかし、この方法では、歯肉溝滲出液を採取しなければならず、簡便性に欠ける。さらに、これらの診断方法において、歯周病マーカーとするタンパク質は１種類のみである。口腔内のタンパク質量は個人差や日内変動も大きく、１種類のタンパク質のみを歯周病マーカーとしたのでは、正確性に欠ける場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−５１５３６号公報
【特許文献２】特開２００９−１４５２２０号公報
【特許文献３】特開２００４−１２９５８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便にかつ正確に歯周病の発症の有無を判定することができる歯周病発症判定用マーカーを提供することを課題とする。
また、本発明は、簡便にかつ正確に歯周病の進行の程度を判定することができる歯周病の進行度判定用マーカーを提供することを課題とする。
また、本発明は、簡便にかつ正確に歯周病の発症の有無を判定することができる歯周病発症判定方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、簡便にかつ正確に歯周病の進行の程度を判定することができる歯周病進行度判定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一般的に、加齢に伴い、齲蝕や歯肉炎を発症したり、口臭が強くなる等、口腔状態は悪化する。そのため、健康を保つには、口腔内の状態を正確に把握するのが重要である。
本発明者は、加齢に伴う唾液成分の変化について鋭意検討を行った。その結果、口腔内に存在するタンパク質を、若年者の口腔内に特異的に多く存在するタンパク質、高齢者の口腔内に特異的に多く存在するタンパク質、若年者及び高齢者のいずれの口腔内にも存在するタンパク質、に分類できることを見出した。そして、これら口腔内に含まれるタンパク質のうち、特定のタンパク質を指標とすることにより、歯周病発症の有無や歯周病の進行度を判定することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成させたものである。
【０００９】
本発明は、表１〜４に示すタンパク質からなる、歯周病発症判定用マーカーに関する。
【００１０】
【表１】
0005869323.tif 000002
【００１１】
【表２】
0005869323.tif 000003
【００１２】
【表３】
0005869323.tif 000004
【００１３】
【表４】
0005869323.tif 000005
【００１４】
また、本発明は、前記表１〜４に示すタンパク質からなる、歯周病の進行度判定用マーカーに関する。
また、本発明は、被験体の口腔内から検体を採取し、採取した検体に含まれる前記表１〜４に示すタンパク質を定量し、タンパク質の定量値に基づいて歯周病発症の有無を判定する、歯周病発症判定方法に関する。
さらに、本発明は、被験体の口腔内から検体を採取し、採取した検体に含まれる前記表１〜４に示すタンパク質を定量し、タンパク質の定量値に基づいて歯周病の進行度を判定する、歯周病進行度判定方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の歯周病発症判定用マーカーによれば、簡便にかつ正確に歯周病の発症の有無を判定することができる。
また、本発明の歯周病進行度判定用マーカーによれば、簡便にかつ正確に歯周病の進行の程度を判定することができる。
また、本発明の歯周病発症判定方法によれば、簡便にかつ正確に歯周病の発症の有無を判定することができる。
また、本発明の歯周病進行度判定方法によれば、簡便にかつ正確に歯周病の進行の程度を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、被験者の口腔内から採取した検体に含まれる前記表１〜４に示すタンパク質の定量値に基づく歯周ポケットの深さ（ＰＤ）の予測値と、実際に測定したＰＤの実測値との相関関係を示す図である。
【図２】図２は、被験者の口腔内から採取した検体に含まれる前記表１〜４に示すタンパク質の定量値に基づく歯肉炎症指数（ＧＩ（Gingival  Index））の予測値と、実際に測定したＧＩの実測値との相関関係を示す図である。
【図３】図３は、被験者の口腔内から採取した検体に含まれる前記表１〜４に示すタンパク質の定量値に基づく歯肉出血指数（ＢＯＰ（Bleeding  on  Probing））の予測値と、実際に測定したＢＯＰの実測値との相関関係を示す図である。
【図４】図４は、被験者の口腔内から採取した検体に含まれる前記表１〜４に示すタンパク質の定量値に基づく歯垢量（ＰＩ（Plaque  Index））の予測値と、実際に測定したＰＩの実測値との相関関係を示す図である。
【図５】図５は、被験者の口腔内から採取した検体に含まれる前記表１〜４に示すタンパク質の定量値に基づく齲蝕指数（ＤＭＦ（Decayed  teeth，Missing  teeth  because  of  caries，Filled  teeth）歯数）の予測値と、実際に測定したＤＭＦ歯数の実測値との相関関係を示す図である。
【図６】図６は、被験者の口腔内から採取した検体に含まれる前記表１〜４に示すタンパク質の定量値に基づく呼気中メチルメルカプタン濃度（CH3SH)の予測値と、実際に測定したCH3SHの実測値との相関関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明する。
本発明の歯周病発症判定用マーカー（単に、歯周病判定用マーカーともいう）及び歯周病進行度判定用マーカーは、前記表１〜４に示すタンパク質からなる。
本明細書に記載の各タンパク質の名称、アミノ酸配列、分子量、及び機能等は、UniProt（Universal  Protein  Resource，URL：http://www.uniprot.org/）に記載されており、このデータベースに基づいて各タンパク質を記載している。
【００１８】
本発明の歯周病発症判定方法及び歯周病進行度判定方法において、ヒト等の被験体の口腔内から採取した検体を使用する。検体は口腔内から採取したものであれば特に制限はなく、口腔内から採取した唾液、歯垢、舌苔、歯肉溝滲出液などを用いることができる。簡便性の観点からは、検体を唾液から採取することが好ましい。検体は、安静時、非安静時を問わず、そのまま吐出したもの、又は水などで含嗽したものとして得ることができるが、刺激時の唾液は主に食事中などの特定の行動中にのみ出てくる唾液であり、一日の大部分の時間においては安静時に唾液が分泌される。歯周病を含む加齢に伴う口腔内の症状は、特定の時間帯に見られる症状と言うよりは、常にその状態であると考えられる。そのため、安静時唾液の方が口腔内の症状とより関連が強いことから、安静時に検体を採取することが好ましい。ここで、被験体としては、ヒト、サル、チンパンジー、犬、猫、牛、豚、ラット及びマウス等の哺乳動物を挙げることができる。
【００１９】
採取した検体に含まれる前記タンパク質の定量方法としては特に制限はなく、通常の方法により行うことができる。本発明においては、多数のタンパク質の同時定量が可能な分析装置を用いる方法が好ましい。このような分析装置としては、高速液体クロマトグラフ質量分析装置（例えば、Orbitrap質量分析計、TSQ  Vantage等、いずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等を挙げることができる。
前記タンパク質を定量するための被験試料は、口腔内から採取した検体を破砕／抽出処理後にカットオフ分子量が３０００以下のフィルターで限外ろ過し、夾雑物を除去することが好ましい。
【００２０】
採取した検体に含まれる前記タンパク質の定量値に基づいて、歯周病発症の有無や歯周病の進行度（重篤度）を判定する。具体的には、前記タンパク質のうち、歯周病患者や高齢者から採取した検体に特異的に多く見出されるタンパク質の定量値が高い場合、及び／又は健常人や若年者から採取した検体に特異的に多く見出されるタンパク質の定量値が低い場合、歯周病を発症し、その症状が進行していると判定することができる。これに対して、歯周病患者や高齢者から採取した検体に特異的に多く見出されるタンパク質の定量値が低い場合、及び／又は健常人や若年者から採取した検体に特異的に多く見出されるタンパク質の定量値が高い場合、歯周病は発症していないと判定することができる。また、歯周病治療前後の前記タンパク質量を比較することにより治療効果の判定を行うことができる。
あるいは、後述の実施例でも示すように、歯周ポケットの深さ、歯肉炎症指数、歯肉出血指数、歯垢量、齲蝕指数、呼気中メチルメルカプタン濃度等の歯周病の症状の指標についてＰＬＳ回帰分析を行い、タンパク質の定量値に対する係数を各タンパク質に与え、口腔内の検体に含まれる前記各タンパク質の定量値から、歯周病発症の有無や歯周病の進行度を判定することができる。
先天的又は後天的に、口腔内に存在するある１種のタンパク質の量などが著しく変化する場合がある。しかし、１種類のみのタンパク質の変化では、口腔内の状態に大きな影響を与えることが難しい。そのため、このような１種類のタンパク質のみを歯周病マーカーとする方法では、実際の測定値と大きなズレを生じる可能性がある。そこで、本発明のように、多数のタンパク質を歯周病マーカーとすることで、そのようなリスクを減少させ、より正確な口腔状態の判定が可能となる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
試験例１  歯周病マーカータンパク質のスクリーニング
被験者（若年者層（20歳代の被験者）19名、高齢者層（60歳代〜70歳代の被験者）20名）に水で含嗽してもらい、座位安静時にて１０分間、口腔内の全唾液を採取した。
採取した唾液について、15000rpm、４℃で１０分間遠心分離を行った。得られた上清について、限外濾過膜（ミリポア社製、カットオフ値：3000）を用いて脱塩濃縮処理を行った。濃縮サンプル２５μＬに、還元液（３３３ｍＭ尿素（シグマ社製）、６．７ｍＭジチオトレイトール（シグマ社製）、２５ｍＭ炭酸アンモニウム（シグマ社製））７５μＬを加え、５６℃で４５分間インキュベートを行った。さらに、アルキル化液（１％ヨードアセトアミド（和光純薬社製）、２５ｍＭ炭酸アンモニウム（シグマ社製））２５μＬ加え、遮光条件で室温下、３０分間インキュベートした。さらに、トリプシン液（５％トリプシン（プロメガ社製）、２５０ｍＭ炭酸アンモニウム（シグマ社製））１２５μＬ加え、３７℃で１５．５時間消化を行い、２．５μＬの１０％トリフルオロ酢酸（和光純薬社製）を加えて反応を停止させた。このようにして、サンプルを調製した。なお、ここで用いた試薬は、全てHPLCグレードのものである。
【００２３】
各年齢層から被験者１０名ずつを選別し（各年齢層において、歯周ポケット深さがより深い被験者５名、歯周ポケット深さがより浅い被験者５名を選別）、前記サンプルを１０ｎｇ／μＬとなるように０．１％ギ酸で希釈し、Orbitrap  Velosにより、サンプルに含まれるタンパク質の解析を行った。なお、分析条件は以下の通りである。また、タンパク質の同定は、Proteome  Discoverer（商品名、サーモサイエンティフィック社製）により、FDR<5%、Rank1のペプチドのみを反映させた条件で、SEQUESTを用いて行った。
【００２４】
【数１】
0005869323.tif 000006
【００２５】
その結果、若年者層のサンプルからは４６１種類、高齢者層のサンプルからは５１２種類、合計６８５種類のタンパク質（うち、若年者層及び高齢者層に共通するタンパク質は、２８８種）を同定した。
続いて、前記６８５種類のタンパク質について、TSQ  Vantage（サーモサイエンティフィック社）のMRMモードで測定し、定量的な比較を行った。TSQ  Vantageの分析条件は下記の通りである。なお、各タンパク質について、標的ペプチドのピーク面積をタンパク質の相対定量値として算出した。
【００２６】
【数２】
0005869323.tif 000007
【００２７】
その結果、若年者層と高齢者層とで、タンパク質の定量値に有意な差（p<0.05）の見られたタンパク質は、前記表１〜４に示す、１４７種類のタンパク質であった。そのうち、高齢者層で低値を示したタンパク質が、表１で示す２９種類のタンパク質、高齢者層で高値を示したタンパク質が、表２〜４示す１１８種類のタンパク質であった。
【００２８】
試験例２  歯周病マーカータンパク質量と、歯周病の症状との相関関係
前記39名の被験者に対して、歯周ポケットの深さ（ＰＤ）、歯肉炎症指数（ＧＩ）、歯肉出血指数（ＢＯＰ）、歯垢量（ＰＩ）、齲蝕指数（ＤＭＦ歯数）、呼気中メチルメルカプタン濃度（CH3SH)の測定を行った。その詳細を下記に示す。
【００２９】
（１）歯周ポケットの深さ（ＰＤ）
上顎右側の中切歯、側切歯、第一大臼歯及び第二大臼歯、上顎左側の第一小臼歯、第一大臼歯及び第二大臼歯、下顎右側の第一小臼歯、第一大臼歯及び第二大臼歯、並びに下顎左側の中切歯、側切歯、第一大臼歯及び第二大臼歯の１４本の歯の表裏、合計２８部位の被験者の歯周ポケットに歯科用プローブを挿入した。前記測定部位のうち、最も歯周ポケットの深い部位の歯周ポケットの深さ（ＰＤ）を１ｍｍごとに測定した。
【００３０】
（２）歯肉炎症指数（ＧＩ）
上顎右側の中切歯、側切歯、第一大臼歯及び第二大臼歯、上顎左側の第一小臼歯、第一大臼歯及び第二大臼歯、下顎右側の第一小臼歯、第一大臼歯及び第二大臼歯、並びに下顎左側の中切歯、側切歯、第一大臼歯及び第二大臼歯の１４本の歯の表裏、合計２８部位の被験者の歯周ポケットに歯科用プローブを挿入し、歯肉の炎症度合いを４段階で評価し、全２８部位の歯肉炎症指数スコアの平均値を算出した。歯肉炎症指数スコアの判定は、以下の通りとした。
（ＧＩ）
０：  正常歯肉。
１：  歯肉に炎症あり。プロービングで出血なし。
２：  歯肉に炎症あり。プロービングで出血あり。
３：  自然出血・腫瘍形成。
【００３１】
（３）歯肉出血指数（ＢＯＰ）
上顎右側の中切歯、側切歯、第一大臼歯及び第二大臼歯、上顎左側の第一小臼歯、第一大臼歯及び第二大臼歯、下顎右側の第一小臼歯、第一大臼歯及び第二大臼歯、並びに下顎左側の中切歯、側切歯、第一大臼歯及び第二大臼歯の１４本の歯の表裏、合計２８部位の被験者の歯周ポケットに歯科用プローブを挿入し、歯周ポケットからの出血の有無を４段階で評価し、全２８部位の歯肉出血指数スコアの平均値を算出した。歯肉出血指数スコアの判定は、以下の通りとした。
（ＢＯＰ）
０：  出血なし。
１：  点状出血あり。
２：  線状出血あり。
３：  自然出血あり。
【００３２】
（４）歯垢量（ＰＩ）
上顎右側の側切歯及び第一大臼歯、上顎左側の第一小臼歯、下顎右側の第一小臼歯、並びに下顎左側の側切歯及び第一大臼歯の６本の歯の表裏、合計１２部位の歯垢量をSilness，LoeのPlaque  Indexの測定方法に従って測定した（Silness，Loe，1964)。歯垢量を４段階で評価し、全１２部位の歯垢量スコアの平均値を算出した。歯垢量スコアの判定は、以下の通りとした。
（ＰＩ）
０：  歯垢なし。
１：  歯肉縁部に薄模様の歯垢あり（探針で検知）。
２：  中程度の歯垢あり（肉眼で認知）。
３：  多量（厚さ１〜２ｍｍ）の歯垢あり（肉眼で認知）。
【００３３】
（５）齲蝕指数（ＤＭＦ歯数）
肉眼で、齲蝕履歴のある永久歯の数を計測した。
【００３４】
（６）呼気中メチルメルカプタン濃度（CH3SH)
ディスポシリンジにより採取した呼気中のメチルメルカプタン濃度を、オーラルクロマ（商品名、アビメディカル社製）を用いて測定した。
【００３５】
このようにして測定した口腔内状態指標（ＰＤ、ＧＩ、ＢＯＰ、ＰＩ、ＤＭＦ、CH3SH）と、各被験者のサンプルに含まれる歯周病マーカータンパク質量とに基づいて、PLS回帰分析を行い、口腔内状態指標を目的変数、各タンパク質の相対定量値を説明変数としたときの、各タンパク質の回帰係数をそれぞれ算出した。なお、各タンパク質の相対定量値はそれぞれ標準化（前記39名の被験者の平均値を0とし、標準偏差を1とする)した値を使用した。さらに、解析には”The  R  Project  for  Statistical  Computing”（http://www.r-project.org/）を用い、plsパッケージ中のplsr関数を使用した。その結果を表５〜９に示す。
【００３６】
【表５】
0005869323.tif 000008
【００３７】
【表６】
0005869323.tif 000009
【００３８】
【表７】
0005869323.tif 000010
【００３９】
【表８】
0005869323.tif 000011
【００４０】
【表９】
0005869323.tif 000012
【００４１】
上記のように算出した、各口腔内状態指標における、各タンパク質の回帰係数に基づき、各被験者のサンプルに含まれる歯周病マーカータンパク質量から算出した口腔内状態指標の予測値と、実際に測定した口腔内状態との関係を図１〜６に示す。なお、図１〜６において、サンプル中の各歯周病マーカータンパク質量と、各歯周病マーカータンパク質の回帰係数から予測した口腔内状態指標の値を縦軸に、実際に測定した値を横軸に示す。
【００４２】
図１〜６から明らかなように、表１〜４に示すタンパク質量と、歯周病との症状とに相関関係があることがわかる。したがって、被験体の口腔内のタンパク質のうち、表１〜４に示すマーカータンパク質量を定量することにより、歯周病発症の有無や、歯周病の進行度を簡便にかつ正確に判定することができる。
以上の結果から、表１〜４に示すタンパク質の質量と歯周病との間に相関関係を有することが臨床的に示された。したがって、表１〜４に示す歯周病マーカータンパク質は、歯周病発症判定用マーカー及び歯周病の進行度判定用マーカーに用いることができる。
【図１】
0005869323.tif 000029
【図２】
0005869323.tif 000030
【図３】
0005869323.tif 000031
【図４】
0005869323.tif 000032
【図５】
0005869323.tif 000033
【図６】
0005869323.tif 000034