【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年3月14日(2011.3.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスであって、
（ａ）選択されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型の細菌細胞を溶解薬で溶解し、遠心分離または濾過を用いて細胞溶解物を清澄化することによって生産された清澄化された細胞溶解物を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより保持物質を生産するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記保持物質のｐＨを４．５未満に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された前記酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするのに十分な時間保持し、続いて前記酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された莢膜多糖溶液を生産するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記清澄化された莢膜多糖溶液を、活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）により生産された前記濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製莢膜多糖溶液を生産するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）により生産された前記濃縮された精製莢膜多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより、溶液の形態の実質的に精製された莢膜多糖が生産される、
プロセス。
【請求項２】
前記選択されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型が、１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群より選ばれる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の前記ｐＨが、約３．５に低下される、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
ステップ（ｅ）の前記ダイアフィルトレーションが、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、請求項１、２または３に記載のプロセス。
【請求項５】
ステップ（ｅ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．０〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、請求項１、２または３に記載のプロセス。
【請求項６】
ステップ（ｅ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．４へのｐＨ調節を含む、請求項１、２または３に記載のプロセス。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前記保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
ステップ（ｄ）が、ステップ（ｃ）の前記清澄化された莢膜多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
ステップ（ｄ）の前記活性炭フィルタが、ウッドベースのリン酸−活性炭を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）において形成された前記酸性化された保持物質溶液を少なくとも２時間保持することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
ステップ（ａ）の前記溶解薬が、デオキシコール酸ナトリウムである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
ステップ（ａ）の前記溶解薬が、非動物由来溶解薬である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記非動物由来溶解薬が、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオネート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸塩、ヒオデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、およびコール酸塩からなる群より選ばれる、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記非動物由来溶解薬が、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウムである、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスであって、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆの細菌細胞を溶解薬で溶解し、遠心分離または濾過を用いて細胞溶解物を清澄化することによって生産された清澄化された細胞溶解物を、室温で中性ｐＨにて、無塩の媒質中で限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより無塩の保持物質を生産するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記無塩の保持物質のｐＨを４．５未満に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された前記酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするために少なくとも２時間、室温にて保持し、続いて前記酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された莢膜多糖溶液を生産するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記清澄化された莢膜多糖溶液を、活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）により生産された前記濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製莢膜多糖溶液を生産するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）により生産された前記濃縮された精製莢膜多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより溶液の形態の血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを含む実質的に精製された莢膜多糖が生産される、
プロセス。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）の前記ｐＨが、約３．５に低下される、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
ステップ（ｅ）の前記ダイアフィルトレーションが、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、請求項１５または１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
ステップ（ｅ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．０〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、請求項１５または１６に記載のプロセス。
【請求項１９】
ステップ（ｅ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．４へのｐＨ調節を含む、請求項１５または１６に記載のプロセス。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前記無塩の保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）が、ステップ（ｃ）の前記清澄化された莢膜多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２２】
ステップ（ｄ）の前記活性炭フィルタが、ウッドベースのリン酸−活性炭を含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２３】
ステップ（ａ）の前記溶解薬が、デオキシコール酸ナトリウムである、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２４】
ステップ（ａ）の前記溶解薬が、非動物由来溶解薬である、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記非動物由来溶解薬が、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオネート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸塩、ヒオデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、およびコール酸塩からなる群より選ばれる、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記非動物由来溶解薬が、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウムである、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａの細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスであって、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａの細菌細胞を溶解薬で溶解し、遠心分離または濾過を用いて細胞溶解物を清澄化することによって生産された清澄化された細胞溶解物を、約４℃でｐＨ約６にて、リン酸ナトリウム緩衝液中で限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより保持物質を生産するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記保持物質のｐＨを４．５未満に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）において形成された前記酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするために少なくとも２時間、約４℃で保持し、続いて前記酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された莢膜多糖溶液を生産するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）の前記清澄化された莢膜多糖溶液のｐＨを約６に調節し、それによりｐＨ調節された清澄化された莢膜多糖溶液を生産するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記ｐＨ調節された清澄化された莢膜多糖溶液を、活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）により生産された前記濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製莢膜多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）により生産された前記濃縮された精製莢膜多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより溶液の形態の血清型１９Ａを含む実質的に精製された莢膜多糖が生産される、
プロセス。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）の前記ｐＨが、約３．５に低下される、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
ステップ（ｆ）の前記ダイアフィルトレーションが、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、請求項２７または２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
ステップ（ｆ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．０〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、請求項２７または２８に記載のプロセス。
【請求項３１】
ステップ（ｆ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．４へのｐＨ調節を含む、請求項２７または２８に記載のプロセス。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前記保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３３】
ステップ（ｅ）が、ステップ（ｄ）の前記ｐＨ調節された清澄化された莢膜多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３４】
ステップ（ｅ）の前記活性炭フィルタが、ウッドベースのリン酸−活性炭を含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３５】
ステップ（ａ）の前記リン酸ナトリウム緩衝液が、２５ｍＭリン酸ナトリウムである、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載プロセス。
【請求項３６】
ステップ（ａ）の前記溶解薬が、デオキシコール酸ナトリウムである、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載プロセス。
【請求項３７】
ステップ（ａ）の前記溶解薬が、非動物由来溶解薬である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３８】
前記非動物由来溶解薬が、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオネート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸塩、ヒオデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、およびコール酸塩からなる群より選ばれる、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項３９】
前記非動物由来溶解薬が、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウムである、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項４０】
肺炎球菌ワクチンの製造のためのプロセスであって、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のプロセスによりＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するステップと、肺炎球菌ワクチンの前記製造において前記実質的に精製された莢膜多糖を用いるステップと、を含む、プロセス。
【請求項４１】
前記肺炎球菌ワクチンが、タンパク質キャリアと結合された莢膜多糖を含む、請求項４０に記載のプロセス。
【請求項４２】
１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群より選ばれる選択されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型の細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を含む溶液であって、前記溶液は請求項１に記載のプロセスによって生産される、溶液。
【請求項４３】
１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆからなる群より選ばれる選択されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型の細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を含む溶液であって、前記溶液は請求項１５に記載のプロセスによって生産される、溶液。
【請求項４４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａの細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を含む溶液であって、前記溶液は請求項２７に記載のプロセスによって生産される、溶液。
【請求項４５】
ｐＨが４．５未満の清澄化され、酸性化された保持物質溶液であって、１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群より選ばれるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型の細胞溶解物からの莢膜多糖を含む、保持物質溶液。
【請求項４６】
前記細胞溶解物と比較して、９８％より多くのタンパク質が前記溶液から除去されている、請求項４５に記載の保持物質溶液。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】莢膜Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖の生産のための短縮された精製プロセス
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製された肺炎球菌多糖の生産において用いられるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：肺炎連鎖球菌）血清型の細胞溶解物から過剰な可溶性タンパク質および他の不純物を除去するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、グラム陽性の槍形球菌であり、通常は、対（双球菌）の状態だけでなく、短鎖または単細胞としても見られる。これらの菌は、それらがベータ溶血を示す嫌気性的成長の場合を除き、血液寒天プレート上で光輝性のコロニーを伴って容易に成長してアルファ溶血を示す。これらの菌は、細胞自体の酵素である自己溶解素の存在下で、細胞壁を分解できる胆汁塩に対し感受性である。この生物は、耐気性嫌気性菌であり、複雑な栄養要件を有するという点で選好性である。
【０００３】
大部分の肺炎球菌血清型の細胞は、各細胞を囲む多糖被覆である莢膜を有する。この莢膜は、ヒトにおける毒性の決定因子である。なぜならば、莢膜は、抗体が細菌細胞に付着することを阻止することにより食作用を妨げるからである。現在９０の莢膜血清型が同定されており、２３の血清型が侵襲性疾患の約９０％の原因である。ワクチンとして、多糖は、発達したまたは損なわれていない免疫系を有する個体においてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する適度な免疫を付与できる。しかしながら、多糖がＣＲＭ１９７のような高分子量タンパク質と結合され、複数の血清型の結合体を含有するワクチンに処方される場合、そのような結合体ワクチンは、肺炎球菌感染のリスクもまた最も高い乳幼児および高齢者における免疫応答を可能にする。
【０００４】
ワクチン製品に利用される各Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型についての莢膜多糖は、生物を液体培地中で成長させることにより生産される。この生物の集団は、多くの場合、種培養バイアルから種培養ボトルにスケールアップされ、生産規模の発酵容量に達するまで、漸増する容量の１つまたは複数の種発酵槽を経て継代される。成長周期の終止は、いくつかの手段の１つにより判定することができ、その時点で、細胞壁破壊と、細胞が定常期に達すると細胞溶解を引き起こす自己溶解素の放出とを助ける洗浄剤または他の試薬の添加により、細胞が溶解される。次に、下流の（精製）処理のためにブロスが採集される。主要な夾雑物は、細胞タンパク質、核酸、およびＣ−多糖および培地成分である。
【０００５】
現在市販されている７−価肺炎球菌結合体（７ｖＰｎＣ）ワクチン（Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標））、および新しく開発された１３−価肺炎球菌結合体（１３ｖＰｎＣ）ワクチンについての血清型の大部分について、現在の精製プロセスは、クロマトグラフィーおよび多重膜分離のような、多くの高価で労働集約的で技術的要求の厳しい操作を伴う１６のステップを必要とする。Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖のための精製プロセスを改善しようとする以前の試みとしては、例えば、発酵および回収の間のｐＨ操作（特許文献１参照）ならびに溶媒および洗浄剤沈降が含まれた。しかしながら、これらのプロセスにおける不純物の除去は依然として、多くの労働集約的かつ高価なステップにわたっている。タンパク質レベルは、可溶性タンパク質の物理的および化学的特性のため、満たすのが最も問題となる規格である。
【０００６】
従って、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ溶解物中の可溶性タンパク質レベルを低減し、現行の精製プロセスの無効力を排除して肺炎球菌結合体ワクチンに組み込むのに適した実質的に精製された莢膜多糖を生産する、単純化された精製プロセスが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０２２８３８１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスに関する。このプロセスは、
（ａ）選択されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型を生産する細菌細胞を含む発酵ブロスを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における細菌細胞を溶解薬で溶解し、それにより細胞片、可溶性タンパク質、核酸、および多糖を含む細胞溶解物を生産するステップと、
（ｃ）細胞片を除去するために遠心分離または濾過を用いてステップ（ｂ）の細胞溶解物を清澄化し、それにより清澄化された細胞溶解物を生産するステップと、
（ｄ）低分子量不純物を除去し多糖濃度を増大させるためにステップ（ｃ）の清澄化された細胞溶解物を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより保持物質を生産するステップと、
（ｅ）タンパク質および核酸を沈降させるためにステップ（ｄ）の保持物質のｐＨを４．５未満に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成された酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするのに十分な時間保持し、続いて酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液を、活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）により生産された濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製多糖溶液を生産するステップと、
（ｉ）ステップ（ｈ）により生産された濃縮された精製多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより、溶液の形の実質的に精製された莢膜多糖が生産される。本発明のこの実施形態のために選択された代表的な非限定的なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型は、１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆである。特定の実施形態において、ステップ（ｅ）のｐＨは、約３．５に低下される。別の実施形態において、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む。別の実施形態において、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約７．０〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む。別の実施形態において、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約７．４へのｐＨ調節を含む。さらに別の実施形態において、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）の保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｇ）の活性炭フィルタは、ウッドベースのリン酸−活性炭を含む。別の実施形態において、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｅ）において形成された酸性化された保持物質溶液を少なくとも２時間保持するステップを含む。さらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）の溶解薬は、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）である。別の実施形態において、ステップ（ｂ）の溶解薬は、非動物由来溶解薬である。さらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）の溶解薬は、非動物由来溶解薬Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）である。
【０００９】
本発明のプロセスによってＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から生産される実質的に精製された莢膜多糖は、肺炎球菌ワクチン、好ましくはタンパク質キャリアと結合された多糖を含有する肺炎球菌ワクチンの製造において用いられ得る。
【００１０】
本発明はまた、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスに関する。このプロセスは、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを生産する細菌細胞を含む発酵ブロスを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における細菌細胞を溶解薬で溶解し、それにより細胞片、可溶性タンパク質、核酸、および多糖を含む細胞溶解物を生産するステップと、
（ｃ）細胞片を除去するために遠心分離または濾過を用いてステップ（ｂ）の細胞溶解物を清澄化し、それにより清澄化された細胞溶解物を生産するステップと、
（ｄ）低分子量不純物を除去し多糖濃度を増大させるためにステップ（ｃ）の清澄化された細胞溶解物を、室温で中性ｐＨにて、無塩の媒質中で限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより無塩の保持物質を生産するステップと、
（ｅ）タンパク質および核酸を沈降させるためにステップ（ｄ）の無塩の保持物質のｐＨを４．５未満に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成された酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするために少なくとも２時間、室温にて保持し、続いて酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液を、活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）により生産された濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製多糖溶液を生産するステップと、
（ｉ）ステップ（ｈ）により生産された濃縮された精製多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより溶液の形の血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを含む実質的に精製された莢膜多糖が生産される。特定の実施形態において、ステップ（ｅ）のｐＨは、約３．５に低下される。別の実施形態において、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む。別の実施形態において、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約７．０〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む。別の実施形態において、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約７．４へのｐＨ調節を含む。さらに別の実施形態において、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）の無塩の保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｇ）の活性炭フィルタは、ウッドベースのリン酸−活性炭を含む。さらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）の溶解薬は、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）である。別の実施形態において、ステップ（ｂ）の溶解薬は、非動物由来溶解薬である。さらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）の溶解薬は、非動物由来溶解薬Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）である。
【００１１】
本発明はまた、血清型１９Ａを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスに関する。このプロセスは、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａを生産する細菌細胞を含む発酵ブロスを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における細菌細胞を溶解薬で溶解し、それにより細胞片、可溶性タンパク質、核酸、および多糖を含む細胞溶解物を生産するステップと、
（ｃ）細胞片を除去するために遠心分離または濾過を用いてステップ（ｂ）の細胞溶解物を清澄化し、それにより清澄化された細胞溶解物を生産するステップと、
（ｄ）低分子量不純物を除去し多糖濃度を増大させるためにステップ（ｃ）の清澄化された細胞溶解物を、約４℃でｐＨ約６にて、リン酸ナトリウム緩衝液中で限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより保持物質を生産するステップと、
（ｅ）タンパク質および核酸を沈降させるためにステップ（ｄ）の保持物質のｐＨを４．５未満に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成された酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするため少なくとも２時間、約４℃で保持し、続いて酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液のｐＨを約６に調節し、それによりｐＨ調節された清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）のｐＨ調節された清澄化された多糖溶液を、活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｉ）ステップ（ｈ）により生産された濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製多糖溶液を生産するステップと、
（ｊ）ステップ（ｉ）により生産された濃縮された精製多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより溶液の形の血清型１９Ａを含む実質的に精製された莢膜多糖が生産される。特定の実施形態において、ステップ（ｅ）のｐＨは、約３．５に低下される。別の実施形態において、ステップ（ｉ）のダイアフィルトレーションは、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む。別の実施形態において、ステップ（ｉ）のダイアフィルトレーションは、約７．０〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む。別の実施形態において、ステップ（ｉ）のダイアフィルトレーションは、約７．４へのｐＨ調節を含む。さらに別の実施形態において、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）の保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｈ）は、ステップ（ｇ）のｐＨ調節された清澄化された多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｈ）の活性炭フィルタは、ウッドベースのリン酸−活性炭を含む。別の実施形態において、ステップ（ｄ）のリン酸ナトリウム緩衝液は、２５ｍＭリン酸ナトリウムである。さらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）の溶解薬は、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）である。別の実施形態において、ステップ（ｂ）の溶解薬は、非動物由来溶解薬である。さらに別の実施形態において、ステップ（ｂ）の溶解薬は、非動物由来溶解薬Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）である。
例えば、本発明の好ましい実施形態では以下が提供される： 
（項目１）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスであって、
（ａ）選択されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型を生産する細菌細胞を含む発酵ブロスを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における前記細菌細胞を溶解薬で溶解し、それにより細胞片、可溶性タンパク質、核酸、および多糖を含む細胞溶解物を生産するステップと、
（ｃ）細胞片を除去するために遠心分離または濾過を用いてステップ（ｂ）の前記細胞溶解物を清澄化し、それにより清澄化された細胞溶解物を生産するステップと、
（ｄ）低分子量不純物を除去し多糖濃度を増大させるためにステップ（ｃ）の前記清澄化された細胞溶解物を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより保持物質を生産するステップと、
（ｅ）タンパク質および核酸を沈降させるためにステップ（ｄ）の前記保持物質のｐＨを４．５未満に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成された前記酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするのに十分な時間保持し、続いて前記酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の前記清澄化された多糖溶液を、活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）により生産された前記濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製多糖溶液を生産するステップと、
（ｉ）ステップ（ｈ）により生産された前記濃縮された精製多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより、溶液の形態の実質的に精製された莢膜多糖が生産される、
プロセス。
（項目２）
前記選択されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型が、１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群より選ばれる、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
ステップ（ｅ）の前記ｐＨが、約３．５に低下される、項目１または２に記載のプロセス。
（項目４）
ステップ（ｈ）の前記ダイアフィルトレーションが、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、項目１、２または３に記載のプロセス。
（項目５）
ステップ（ｈ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．０〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、項目１、２または３に記載のプロセス。
（項目６）
ステップ（ｈ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．４へのｐＨ調節を含む、項目１、２または３に記載のプロセス。
（項目７）
ステップ（ｅ）が、ステップ（ｄ）の前記保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する、項目１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目８）
ステップ（ｇ）が、ステップ（ｆ）の前記清澄化された多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する、項目１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目９）
ステップ（ｇ）の前記活性炭フィルタが、ウッドベースのリン酸−活性炭を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１０）
ステップ（ｆ）が、ステップ（ｅ）において形成された前記酸性化された保持物質溶液を少なくとも２時間保持することを含む、項目１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１１）
ステップ（ｂ）の前記溶解薬が、デオキシコール酸ナトリウムである、項目１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１２）
ステップ（ｂ）の前記溶解薬が、非動物由来溶解薬である、項目１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目１３）
前記非動物由来溶解薬が、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオネート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸塩（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、ヒオデオキシコール酸塩（ｈｙｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、グリコデオキシコール酸塩（ｇｌｙｃｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、タウロデオキシコール酸塩（ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、タウロケノデオキシコール酸塩（ｔａｕｒｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、およびコール酸塩（ｃｈｏｌａｔｅ）からなる群より選ばれる、項目１２に記載のプロセス。
（項目１４）
前記非動物由来溶解薬が、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウムである、項目１２に記載のプロセス。
（項目１５）
血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスであって、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを生産する細菌細胞を含む発酵ブロスを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における前記細菌細胞を溶解薬で溶解し、それにより細胞片、可溶性タンパク質、核酸、および多糖を含む細胞溶解物を生産するステップと、
（ｃ）細胞片を除去するために遠心分離または濾過を用いてステップ（ｂ）の前記細胞溶解物を清澄化し、それにより清澄化された細胞溶解物を生産するステップと、
（ｄ）低分子量不純物を除去し多糖濃度を増大させるためにステップ（ｃ）の前記清澄化された細胞溶解物を、室温で中性ｐＨにて、無塩の媒質中で限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより無塩の保持物質を生産するステップと、
（ｅ）タンパク質および核酸を沈降させるためにステップ（ｄ）の前記無塩の保持物質の前記ｐＨを４．５未満に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成された前記酸性化された保持物質溶液を、前記沈降物の沈降を可能にするために少なくとも２時間、室温にて保持し、続いて前記酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の前記清澄化された多糖溶液を、活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）により生産された前記濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製多糖溶液を生産するステップと、
（ｉ）ステップ（ｈ）により生産された前記濃縮された精製多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより溶液の形態の血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを含む実質的に精製された莢膜多糖が生産される、
プロセス。
（項目１６）
ステップ（ｅ）の前記ｐＨが、約３．５に低下される、項目１５に記載のプロセス。
（項目１７）
ステップ（ｈ）の前記ダイアフィルトレーションが、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、項目１５または１６に記載のプロセス。
（項目１８）
ステップ（ｈ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．０〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、項目１５または１６に記載のプロセス。
（項目１９）
ステップ（ｈ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．４へのｐＨ調節を含む、項目１５または１６に記載のプロセス。
（項目２０）
ステップ（ｅ）が、ステップ（ｄ）の前記無塩の保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する、項目１５〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２１）
ステップ（ｇ）が、ステップ（ｆ）の前記清澄化された多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する、項目１５〜２０のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２２）
ステップ（ｇ）の前記活性炭フィルタが、ウッドベースのリン酸−活性炭を含む、項目１５〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２３）
ステップ（ｂ）の前記溶解薬が、デオキシコール酸ナトリウムである、項目１５〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２４）
ステップ（ｂ）の前記溶解薬が、非動物由来溶解薬である、項目１５〜２２のいずれか１項に記載のプロセス
（項目２５）
前記非動物由来溶解薬が、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオネート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸塩、ヒオデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、およびコール酸塩からなる群より選ばれる、項目２４に記載のプロセス。
（項目２６）
前記非動物由来溶解薬が、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウムである、項目２４に記載のプロセス。
（項目２７）
血清型１９Ａを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスであって、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａを生産する細菌細胞を含む発酵ブロスを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における前記細菌細胞を溶解薬で溶解し、それにより細胞片、可溶性タンパク質、核酸、および多糖を含む細胞溶解物を生産するステップと、
（ｃ）細胞片を除去するために遠心分離または濾過を用いてステップ（ｂ）の前記細胞溶解物を清澄化し、それにより清澄化された細胞溶解物を生産するステップと、
（ｄ）低分子量不純物を除去し多糖濃度を増大させるためにステップ（ｃ）の前記清澄化された細胞溶解物を、約４℃でｐＨ約６にて、リン酸ナトリウム緩衝液中で限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより保持物質を生産するステップと、
（ｅ）タンパク質および核酸を沈降させるためにステップ（ｄ）の前記保持物質の前記ｐＨを４．５未満に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成された前記酸性化された保持物質溶液を、前記沈降物の沈降を可能にするために少なくとも２時間、約４℃で保持し、続いて前記酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の前記清澄化された多糖溶液の前記ｐＨを約６に調節し、それによりｐＨ調節された清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）の前記ｐＨ調節された清澄化された多糖溶液を、活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｉ）ステップ（ｈ）により生産された前記濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製多糖溶液を生産するステップと、
（ｊ）ステップ（ｉ）により生産された前記濃縮された精製多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより溶液の形態の血清型１９Ａを含む実質的に精製された莢膜多糖が生産される、
プロセス。
（項目２８）
ステップ（ｅ）の前記ｐＨが、約３．５に低下される、項目２７に記載のプロセス。
（項目２９）
ステップ（ｉ）の前記ダイアフィルトレーションが、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、項目２７または２８に記載のプロセス。
（項目３０）
ステップ（ｉ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．０〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む、項目２７または２８に記載のプロセス。
（項目３１）
ステップ（ｉ）の前記ダイアフィルトレーションが、約７．４へのｐＨ調節を含む、項目２７または２８に記載のプロセス。
（項目３２）
ステップ（ｅ）が、ステップ（ｄ）の前記保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する、項目２７〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３３）
ステップ（ｈ）が、ステップ（ｇ）の前記ｐＨ調節された清澄化された多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する、項目２７〜３２のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３４）
ステップ（ｈ）の前記活性炭フィルタが、ウッドベースのリン酸−活性炭を含む、項目２７〜３３のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３５）
ステップ（ｄ）の前記リン酸ナトリウム緩衝液が、２５ｍＭリン酸ナトリウムである、項目２７〜３４のいずれか１項に記載プロセス。
（項目３６）
ステップ（ｂ）の前記溶解薬が、デオキシコール酸ナトリウムである、項目２７〜３５のいずれか１項に記載プロセス。
（項目３７）
ステップ（ｂ）の前記溶解薬が、非動物由来溶解薬である、項目２７〜３５のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３８）
前記非動物由来溶解薬が、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオネート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸塩、ヒオデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、およびコール酸塩からなる群より選ばれる、項目３７に記載のプロセス。
（項目３９）
前記非動物由来溶解薬が、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウムである、項目３７に記載のプロセス。
（項目４０）
肺炎球菌ワクチンの製造のためのプロセスであって、項目１〜３９のいずれか１項に記載のプロセスによりＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するステップと、肺炎球菌ワクチンの前記製造において前記実質的に精製された莢膜多糖を用いるステップと、を含む、プロセス。
（項目４１）
前記肺炎球菌ワクチンが、タンパク質キャリアと結合された多糖を含む、項目４０に記載のプロセス。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の短縮された精製プロセスを用いた血清型５についての平均インプロセス多糖（ＰＳ）収率、タンパク質／ＰＳ比率、および核酸（ＮＡ）／ＰＳ比率を示す。結果は、各精製ステップについて示してある。
【図２】現行の精製プロセス（Ａ）からの血清型４ＰＳについてのＮＭＲスペクトルが短縮された精製プロセス（Ｂ）からの血清型４ＰＳと比較して示してある。これら２つのスペクトル間には、著しい違いは全く観察されなかった。両方のスペクトルにおける右から２番目のピークは、ピルベートであり、ピルベート基ピーク高さは、両方のスペクトルにおいて同等であった。
【図３】本発明の短縮された精製プロセスを用いた血清型４についての平均インプロセスＰＳ収率、タンパク質／ＰＳ比率、およびＮＡ／ＰＳ比率を示す。結果は、各精製ステップについて示してある。
【図４】本発明の短縮された精製プロセスを用いた血清型１９Ａについての平均インプロセスＰＳ収率、タンパク質／ＰＳ比率、およびＮＡ／ＰＳ比率を示す。結果は、各精製ステップについて示してある。
【図５】本発明の短縮された精製プロセスを用いた血清型７Ｆについての平均インプロセスＰＳ収率、タンパク質／ＰＳ比率、およびＮＡ／ＰＳ比率を示す。結果は、各精製ステップについて示してある。
【図６】本発明の短縮された精製プロセスを用いた血清型６Ｂについての平均インプロセスＰＳ収率、タンパク質／ＰＳ比率、およびＮＡ／ＰＳ比率を示す。結果は、各精製ステップについて示してある。
【図７】本発明の短縮された精製プロセスを用いた血清型６Ａについての平均インプロセスＰＳ収率、タンパク質／ＰＳ比率、およびＮＡ／ＰＳ比率を示す。結果は、各精製ステップについて示してある。
【図８】本発明の短縮された精製プロセスを用いた血清型１についての平均インプロセスＰＳ収率、タンパク質／ＰＳ比率、およびＮＡ／ＰＳ比率を示す。結果は、各精製ステップについて示してある。
【図９】本発明の短縮された精製プロセスを用いた血清型１４についての平均インプロセスＰＳ収率、タンパク質／ＰＳ比率、およびＮＡ／ＰＳ比率を示す。結果は、各精製ステップについて示してある。
【図１０】本発明の短縮された精製プロセスを用いて精製された血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、および１９ＦについてのＰＳインプロセス収率の比較を示す。
【図１１】本発明の短縮された精製プロセスを用いて精製された血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、および１９Ｆについてのタンパク質／ＰＳ比率の比較を示す。結果は、各精製ステップについて比較してある。
【図１２】本発明の短縮された精製プロセスを用いて精製された血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、および１９ＦについてのＮＡ／ＰＳ比率の比較を示す。結果は、各精製ステップについて比較してある。
【図１３】本発明の短縮された精製プロセスの酸性化ステップに起因するタンパク質除去効率を示す。酸性化前後のタンパク質濃度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の差は、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、および１９Ｆのバッチについての酸性化前の初期タンパク質濃度に対してプロットしてある。初期タンパク質濃度で割ったタンパク質濃度差は、酸性化ステップによるタンパク質除去率を反映した。
【図１４】本発明の短縮された精製プロセスの炭素吸着ステップに起因するタンパク質除去効率を示す。除去された（炭素上に吸着された）タンパク質の量を、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、および１９Ｆのバッチについての初期タンパク質負荷量に対してプロットした。初期タンパク質負荷量で割った除去されたタンパク質の量は、炭素吸着ステップによるタンパク質除去率を反映した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、肺炎球菌結合体ワクチンへの組み込みに適した実質的に精製された莢膜多糖を生産するための細胞Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ溶解物中の可溶性タンパク質レベルを低減する短縮された精製プロセスに関する。現在市販されている７−価肺炎球菌結合体（７ｖＰｎＣ）ワクチン（Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標））、ならびに新しく開発された１３−価肺炎球菌結合体（１３ｖＰｎＣ）ワクチンについての血清型の大部分について、現在の多糖精製プロセスは、最高１６のステップを必要とする。これらのステップは、クロマトグラフィーおよび多重膜分離のような、多くの高価で労働集約的で技術的要求の厳しい操作を伴う。本発明のプロセスは、同じ精製を達成しながらもこれらのステップのうち最高８つを省き、クロマトグラフィーの必要を無くす。従って、本発明は、より安価で、所要時間がより少なく、より少ないステップを伴うより効率的な精製プロセスに関する。
【００１４】
本発明の短縮された精製プロセスは、清澄化された細胞Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ溶解物ブロスを限外濾過およびダイアフィルトレーションし、続いて濃縮した溶解物ブロスを４．５未満、好ましくは約３．５のｐＨへ酸性化することにより、多糖収率に重大な影響を及ぼすことなく溶液中タンパク質の少なくとも９８％が沈降させられるという発見に関する。ｐＨ４．５未満、好ましくはｐＨ約３．５への酸性化の前に、溶解および清澄化された発酵ブロスを限外濾過およびダイアフィルトレーションすることにより、タンパク質の「塩溶」効果が省かれ、「塩析される」タンパク質のフラクションが増大される。「塩溶」がタンパク質の増大した溶解度を指すのに対し、「塩析」は、溶液中のタンパク質がそれらの等電点に達する時のそれらのタンパク質の沈降を指す。限外濾過およびダイアフィルトレーションステップはまた、炭酸ナトリウム処理したブロスが、ｐＨ５．０への酸性化を受ける場合に観察される発泡を防止する（米国特許出願公開第２００６／０２２８３８１号参照）。従って、清澄化された溶解物ブロスの限外濾過およびダイアフィルトレーションにより、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型発酵時に炭酸ナトリウムのような任意の低分子量ｐＨ滴定剤を用いることが可能になり、ｐＨ４．５未満へ酸性化される場合の清澄化された溶解物ブロスの発泡が防止される。
【００１５】
「清澄化された溶解物ブロス」は、細胞片を除去するために遠心分離または濾過を受けた溶解物ブロスを指す。
【００１６】
「ダイアフィルトレーションする」、「ダイアフィルトレーション」、「ＤＦ」、および同様な用語は、例えば、溶液から小さい分子を除去するために適切な物理的および化学的特性を有する半透膜を用いることを指す。
【００１７】
「限外濾過する」、「限外濾過」、「ＵＦ」、および同様な用語は、例えば、溶液中の分子を区別し、同様な分子をより小さい容量の溶液へ濃縮するために適切な物理的および化学的特性を有する半透膜を用いることを指す。
【００１８】
本発明の方法の範囲内で、限外濾過およびダイアフィルトレーションは一般に、フィルタ膜の目詰まりを回避するために、「クロスフロー」または「接線フロー」濾過を含む。「クロスフロー」濾過において、濾過される溶液は、膜の表面を通過させられる。膜を通過する物質は、透過物と呼ばれる。膜を通過しない物質は、保持物質と呼ばれる。保持物質は、供給リザーバへリサイクルされて再濾過される。
【００１９】
本明細書中で用いられるように、ｐＨ４．５未満、特にｐＨ約３．５が達成される限り、限外濾過およびダイアフィルトレーションされた溶解物ブロスのｐＨを低下するために、任意の酸を用い得る。従って、有機酸および鉱酸双方を本発明の方法の範囲内で用い得る。本明細書中で用いられるように、用語「鉱酸」は、有機酸とは対照的に、化学反応により無機鉱物から誘導された酸を指す。本発明の方法の範囲内で用いられ得る鉱酸の代表的な非限定的な例としては、塩酸、硝酸、リン酸、および硫酸が含まれる。特定の実施形態において、濃縮された溶解物ブロスのｐＨは、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、または３．０未満に低下される。他の実施形態において、濃縮された溶解物ブロスのｐＨは、約４．４、約４．３、約４．２、約４．１、約４．０、約３．９、約３．８、約３．７、約３．６、約３．５、約３．４、約３．３、約３．２、約３．１、約３．０、約２．９、約２．８、約２．７、約２．６、約２．５、約２．４、約２．３、約２．２、約２．１、または約２．０に低下される。
【００２０】
本発明の短縮された精製プロセスはまた、上述の濃縮および低ｐＨステップと組み合わせることにより、活性炭を用いた濾過により、多糖収率に重大な影響を及ぼすことなく残留タンパク質の少なくとも９０％が沈降させられるという発見に関する。特定の実施形態において、おがくずまたは他の木材製品から誘導されリン酸により活性化された炭素を用いた炭素濾過は、現行の炭素濾過方法の範囲内で用いられる炭素よりも、タンパク質不純物の低減または除去に効果的であることが見出された。
【００２１】
従って、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスに関し、このプロセスは、
（ａ）選択されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型を生産する細菌細胞を含む発酵ブロスを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における細菌細胞を溶解薬で溶解し、それにより細胞片、可溶性タンパク質、核酸、および多糖を含む細胞溶解物を生産するステップと、
（ｃ）細胞片を除去するために遠心分離または濾過を用いてステップ（ｂ）の細胞溶解物を清澄化し、それにより清澄化された細胞溶解物を生産するステップと、
（ｄ）低分子量不純物を除去し多糖濃度を増大させるためにステップ（ｃ）の清澄化された細胞溶解物を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより保持物質を生産するステップと、
（ｅ）タンパク質および核酸を沈降させるためにステップ（ｄ）の保持物質のｐＨを４．５未満、特に３．５に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成された酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするのに十分な時間、特に少なくとも２時間、撹拌ありまたはなしで保持し、続いて酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液を活性炭フィルタ、特にウッドベースのリン酸−活性炭を含む活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）により生産された濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製多糖溶液を生産するステップと、
（ｉ）ステップ（ｈ）により生産された濃縮された精製多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより、溶液の形の実質的に精製された莢膜多糖が生産される。ステップ（ｉ）の無菌濾過は、濃縮された精製多糖溶液から細菌および粒子を除去するために有用である。本発明のこの実施形態のために選択された代表的な非限定的なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型は、１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆである。特定の実施形態において、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）の保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む。しかしながら、長期保存中の実質的に精製された莢膜多糖の改善された安定性のために、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約７．０〜約７．５の間への、より具体的には約７．４へのｐＨ調節を含む。
【００２２】
本明細書中で用いられるように、用語「実質的に精製された莢膜多糖含有溶解物」または「実質的に精製された莢膜多糖を含有する溶液」は、タンパク質と多糖とのパーセント比率（タンパク質／ＰＳ）が、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満および核酸と多糖とのパーセント比率（ＮＡ／ＰＳ）が、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満であるようにタンパク質が除去された細胞Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ溶解物または溶液を指す。特定の実施形態において、実質的に精製された莢膜多糖含有溶解物または特定の血清型を含む溶液についてのタンパク質／ＰＳおよびＮＡ／ＰＳのパーセント比率は、以下の通りである：血清型１については、タンパク質／ＰＳの比率は２％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％未満であり、血清型４については、タンパク質／ＰＳの比率は３％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％未満であり、血清型５については、タンパク質／ＰＳの比率は７．５％以下であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％以下であり、血清型６Ａについては、タンパク質／ＰＳの比率は２％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％未満であり、血清型６Ｂについては、タンパク質／ＰＳの比率は４％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は１％未満であり、血清型７Ｆについては、タンパク質／ＰＳの比率は５％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％未満であり、血清型９Ｖについては、タンパク質／ＰＳの比率は２％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は１％未満であり、血清型１４については、タンパク質／ＰＳの比率は３％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％未満であり、血清型１８Ｃについては、タンパク質／ＰＳの比率は２％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％未満であり、血清型１９Ａについては、タンパク質／ＰＳの比率は２％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％未満であり、血清型１９Ｆについては、タンパク質／ＰＳの比率は３％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％未満であり、血清型２３Ｆについては、タンパク質／ＰＳの比率は２％未満であり、ＮＡ／ＰＳの比率は２％未満である。細胞溶解物または溶液中のタンパク質、多糖、および核酸濃度の定量のための方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）およびＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、修正ローリーアッセイ、分光光度法、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー／多角度レーザー光散乱）、ならびにＮＭＲ（核磁気共鳴）が含まれる。
【００２３】
本発明の方法の範囲内で、細菌細胞は、任意の溶解薬を用いて溶解され得る。「溶解薬」は、細胞壁破壊と、細胞溶解を引き起こす自己溶解素の放出とを助ける任意の薬剤であり、例えば、洗浄剤が含まれる。本明細書中で用いられるように、用語「洗浄剤」は、細菌細胞の溶解を引き起こすことができる任意の陰イオンまたは陽イオン洗浄剤を指す。本発明の方法の範囲内で使用するためのそのような洗浄剤の代表的な例としては、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、Ｎ−ラウリルサルコシン（ＮＬＳ）、ケノデオキシコール酸ナトリウム、およびサポニンが含まれる。
【００２４】
本発明の１つの実施形態において、細菌細胞を溶解するために用いられる溶解薬は、ＤＯＣである。ＤＯＣは、胆汁酸デオキシコール酸のナトリウム塩であり、これは、雌ウシまたは雄ウシのような生物学的供給源から一般的に導かれる。ＤＯＣは、ＬｙｔＡタンパク質を活性化し、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおける細胞壁成長および分裂に関与する自己溶解素である。ＬｙｔＡタンパク質は、そのＣ−末端部分にコリン結合領域を有し、ｌｙｔＡ遺伝子の変異は、ＤＯＣによる溶解に対し抵抗力があるＬｙｔＡ変異体を生み出すことが知られている。
【００２５】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖精製時のＤＯＣの使用が健康上のリスクを招くという証拠は皆無であるが、そのような生物学的に誘導された試薬の使用は、潜在的な規制問題を引き起こすかもしれない。従って、本発明の１つの実施形態において、細菌細胞を溶解するために用いられる溶解薬は、非動物由来溶解薬である。本発明の方法の範囲内で使用するための非動物由来溶解薬としては、ＤＯＣの作用様式（すなわち、ＬｙｔＡ機能に影響を及ぼし、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の溶解という結果になる）と同様な作用様式を有する非動物供給源からの薬剤が含まれる。そのような非動物由来溶解薬としては、ＤＯＣの類似体、界面活性剤、洗浄剤、およびコリンの構造的類似体が含まれるが、それらに限定されず、以下の実験セクションにおいて記載されるような手順を用いて決定され得る。１つの実施形態において、非動物由来溶解薬は、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール（例えば、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０、ＣＡＳ＃：９００２−９３−１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手可能）、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手可能）、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオネート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸塩、ヒオデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、およびコール酸塩からなる群より選ばれる。別の実施形態において、非動物由来溶解薬は、ＮＬＳである。
【００２６】
本発明はまた、上記で記載されたプロセスに対する血清型特異的な修正にも関する。例えば、血清型１９Ａ多糖は不安定であり、精製の間にその分子量が変化するため、記載されたプロセスに対する修正が、１９Ａ多糖を安定化するのに有用であることが見出された。これらの修正としては、限外濾過およびダイアフィルトレーションステップを、酸性化の前に、約４℃で、約６のｐＨにてリン酸ナトリウム緩衝液中で実行すること、沈降物の沈降を可能にするために、酸性化された保持物質溶液を約４℃で、少なくとも２時間保持すること、および、活性炭濾過ステップの前に、清澄化された多糖溶液のｐＨを６に調節することが含まれた。これとは対照的に、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆについて、酸性化に先立つ限外濾過およびダイアフィルトレーションステップが、水のような無塩の媒質中で実行された場合に、より少ない多糖損失およびより多くのタンパク質除去が達成されることが発見され、このステップは、室温で、中性ｐＨにて実行できたかもしれない。
【００２７】
従って、本発明はまた、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から、実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスに関し、このプロセスは、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを生産する細菌細胞を含む発酵ブロスを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における細菌細胞を洗浄剤で溶解し、それにより細胞片、可溶性タンパク質、核酸、および多糖を含む細胞溶解物を生産するステップと、
（ｃ）細胞片を除去するために遠心分離または濾過を用いてステップ（ｂ）の細胞溶解物を清澄化し、それにより清澄化された細胞溶解物を生産するステップと、
（ｄ）低分子量不純物を除去し多糖濃度を増大させるためにステップ（ｃ）の清澄化された細胞溶解物を、室温で中性ｐＨにて、無塩の媒質中で限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより無塩の保持物質を生産するステップと、
（ｅ）タンパク質および核酸を沈降させるためにステップ（ｄ）の無塩の保持物質のｐＨを４．５未満、好ましくは約３．５に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成された酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするために少なくとも２時間、室温にて、撹拌ありまたはなしで保持し、続いて酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液を活性炭フィルタ、特にウッドベースのリン酸−活性炭を含む活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）により生産された濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製多糖溶液を生産するステップと、
（ｉ）ステップ（ｈ）により生産された濃縮された精製多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより溶液の形の血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆを含む実質的に精製された莢膜多糖が生産される。特定の実施形態において、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）の無塩の保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｇ）は、ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む。しかしながら、長期保存中の実質的に精製された莢膜多糖の改善された安定性のために、ステップ（ｈ）のダイアフィルトレーションは、約７．０〜約７．５の間への、より具体的には約７．４へのｐＨ調節を含む。
【００２８】
本発明はまた、血清型１９Ａを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞溶解物から実質的に精製された莢膜多糖を生産するためのプロセスにも関し、このプロセスは、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａを生産する細菌細胞を含む発酵ブロスを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）における細菌細胞を洗浄剤で溶解し、それにより細胞片、可溶性タンパク質、核酸、および多糖を含む細胞溶解物を生産するステップと、
（ｃ）細胞片を除去するために遠心分離または濾過を用いてステップ（ｂ）の細胞溶解物を清澄化し、それにより清澄化された細胞溶解物を生産するステップと、
（ｄ）低分子量不純物を除去し多糖濃度を増大させるためにステップ（ｃ）の清澄化された細胞溶解物を、約４℃でｐＨ約６にて、２５ｍＭリン酸ナトリウムのリン酸ナトリウム緩衝液中で限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより保持物質を生産するステップと、
（ｅ）タンパク質および核酸を沈降させるためにステップ（ｄ）の保持物質のｐＨを４．５未満、特に約３．５に低下させ、それにより酸性化された保持物質溶液を形成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成された酸性化された保持物質溶液を、沈降物の沈降を可能にするために少なくとも２時間、約４℃で撹拌ありまたはなしで保持し、続いて酸性化された保持物質溶液を濾過または遠心分離し、それにより清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の清澄化された多糖溶液のｐＨを約６に調節し、それによりｐＨ調節された清澄化された多糖溶液を生産するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）のｐＨ調節された清澄化された多糖溶液を活性炭フィルタ、特にウッドベースのリン酸−活性炭を含む活性炭フィルタを通して濾過するステップと、
（ｉ）ステップ（ｈ）により生産された濾過溶液を限外濾過およびダイアフィルトレーションし、それにより濃縮された精製多糖溶液を生産するステップと、
（ｊ）ステップ（ｉ）により生産された濃縮された精製多糖溶液を、無菌フィルタを用いて濾過するステップと、
を含み、それにより溶液の形の血清型１９Ａを含む実質的に精製された莢膜多糖が生産される。特定の実施形態において、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｄ）の保持物質から少なくとも９８％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｈ）は、ステップ（ｇ）のｐＨ調節された清澄化された多糖溶液から少なくとも９０％のタンパク質を除去する。別の実施形態において、ステップ（ｉ）のダイアフィルトレーションは、約５．５〜約７．５の間へのｐＨ調節を含む。しかしながら、長期保存中の実質的に精製された１９Ａ多糖の改善された安定性のために、ステップ（ｉ）のダイアフィルトレーションは、約７．０〜約７．５の間への、より具体的には約７．４へのｐＨ調節を含む。
【００２９】
以下の実施例は、例示のために提示されており、限定のためではない。
【実施例】
【００３０】
実験
以下の実施例は、本発明の改善されたプロセスを用いて１０Ｌスケールで精製したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、および１９Ｆについての結果を提示し、結果を現行の精製プロセスの結果と比較する。
【００３１】
（実施例１）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１４、および１９Ａのための短縮された精製プロセス
デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）により溶解したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ発酵ブロスを、それらの採取後２日間以内に得るか、４℃で保存して翌週のうちに処理した。以下に記載されるように、本発明の精製プロセスは、現行の精製プロセスと比較して以下の変更を含んでいた：１）酸性化ステップを、冒頭から最初の限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）ステップ後に移動し、ｐＨを、５ではなく３．５に調節した；２）ダイアフィルトレーション緩衝液を、０．０２５Ｍリン酸塩から脱イオン（ＤＩ）水に変更し；３）炭素吸着を、ウッドベースのリン酸活性炭を用いる２  ＣＵＮＯ  Ｒ３２ＳＰカーボンディスク（ＣＵＮＯ  Ｉｎｃ．，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）に変更し、吸着時間を４ターンオーバーから１２ターンオーバーへ延長した（各ターンオーバーは２２分間であった）、４）約５回ダイアフィルトレーションする場合、最後の３０Ｋダイアフィルトレーションステップの間、ｐＨを７．４に調節した。同じ精製手順を、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、または７Ｆに適用した。血清型１９Ａについては、ステップをさらに修正し、精製は、以下に記載されるように冷気室中で実施した。
【００３２】
精製ステップ
プロセスを冷気室中で４℃にて実施した型１９Ａを除き、すべてのステップは室温で実施した。
【００３３】
溶解物の清澄化：このステップの目的は、細胞片を除去し、ブロスを清澄化することであった。これは、遠心分離か、濾過によって達成された。ブロスを、１０，０００ｇで３０分間またはブロスが清澄になるまで２０℃（型１９Ａについては４℃）で遠心分離するか、Ｃｅｌｐｕｒｅ（登録商標）濾過助剤（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を添加してＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて濾過した。清澄化された溶解物をさらなる処理のために収集し、ペレットを廃棄した。
【００３４】
第１のＵＦ／ＤＦ（限外濾過／ダイアフィルトレーション）：このステップにより、容積減少および緩衝液交換が提供され、また低分子量不純物が除去された。清澄化された溶解物を、元の容積の約１／８に濃縮した。ダイアフィルトレーションは、約１０容量のＤＩ水（１９Ａについては、ｐＨ６、２５ｍＭリン酸塩）を用いて実行した。
【００３５】
酸性化：９８％より多くのタンパク質がこのステップにおいて除去された。撹拌している間、濃縮リン酸を保持物質に慎重に添加した。保持物質のｐＨを、ｐＨ３．５の目標値に調節した。酸性化された保持物質を３０分間撹拌し、熟成のために室温で一晩（１９Ａについては４℃で２時間）熟成させ、タンパク質および核酸の沈降という結果になった。
【００３６】
酸性化された保持物質の清澄化：これは、酸性化後に沈澱物を除去する清澄化ステップであった。酸性化された溶液のスラリーを、ローター中で１０，０００ｒｐｍで（１７，０００相対遠心力またはＲＣＦ）２０℃で１時間遠心分離した（６Ｂを除く。この場合、遠心分離は、３７℃で６時間であった）。上清を収集し、ペレットを廃棄した。Ｃｅｌｐｕｒｅ（登録商標）濾過助剤（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を添加したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によるデプスフィルトレーションもこのステップ用に用いることができる。
【００３７】
炭素吸着：ほとんどの場合、酸性化された１００Ｋ保持物質の遠心分離後にわずかな黄色が見られた。色の除去は、ウッドベースのリン酸−活性炭を用いた炭素吸着により達成された。このステップにより、酸性化後に残る残留タンパク質も除去された。清澄化された多糖溶液を、炭素フィルタを通して５〜６時間または一晩再循環した（１９Ａについては、ｐＨは、炭素吸着前に６に調節した）。
【００３８】
最終３０Ｋ  ＵＦ／ＤＦ：これは、溶液を＞２ｇ／Ｌの最終多糖（ＰＳ）濃度に濃縮するための別の濃縮および緩衝液交換ステップであり、これを脱イオン（ＤＩ）水へダイアフィルトレーションした。炭素濾過したＰＳ溶液を濃縮した。次に、濃縮物を、ＤＩ水で１０×ダイアフィルトレーションした。ｐＨは、ダイアフィルトレーションの間、７．４に調節した。
【００３９】
最終０．２μｍ無菌濾過：最終ＰＳ溶液は、０．２２μｍフィルタまたは無菌使い捨てフィルタユニットにより無菌濾過し、４℃冷蔵庫中で保存した。
【００４０】
分析方法
タンパク質、ＰＳ、および核酸濃度の定量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）およびＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、修正ローリーアッセイ、分光光度法、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー／多角度レーザー光散乱）、ならびにＮＭＲ（核磁気共鳴）を含む、当該技術分野においてよく知られた方法を用いて実行した。
【００４１】
結果および考察
型５短縮精製バッチ：型５についての、短縮されたプロセスを用いた３つの精製バッチの最終ＰＳ収率、ＰＳ分子量および主要不純物レベルと現行のプロセスを用いたそれらとの比較が表１に示してある。すべての開始ブロスは、ＤＯＣ溶解高細胞密度発酵バッチであり、これらの多糖濃度（約０．５ｇ／Ｌ）は、標準ＳＯＰ発酵ブロスの多糖濃度（約０．３ｇ／Ｌ）よりも高かった。３０Ｋまたは５０Ｋ膜を、第１のＵＦ／ＤＦステップに用いた。不純物レベルは、不純物／ＰＳ比率を用いて計算した。同じアプローチを、本明細書中に記載されるすべての他の血清型について用いた。
【００４２】
【表１】
2010521972.tif 000001
表１のデータが示すように、短縮精製プロセスを用いる３つのバッチ全てのタンパク質比率は、≦７．５％の規格を満たし、また、現行プロセスのタンパク質比率に匹敵した。核酸（ＮＡ）ならびにＣ−多糖（Ｃ−ＰＳ）比率も、それぞれ≦２．０％および≦３５％の規格を十分下回るものであり、現行プロセスのそれらの比率に匹敵した。表１に示される３つのバッチの最終ＰＳ収率および不純物レベルの結果は、短縮プロセスの再現性および堅牢性を実証している。
【００４３】
多糖が３．５のより低いｐＨにおいて加水分解され得るかどうかについて若干の懸念があった。従って、精製プロセス時のＰＳ保持時間変化を監視し、最終精製ＰＳの分子量を測定した。ＨＰＬＣクロマトグラムからは、血清型５ＰＳ保持時間の著しい変化は全く観察されなかった。短縮プロセスによる精製ＰＳの分子量および現行プロセスによる精製ＰＳの分子量（２８４ｋｇ／ｍｏｌ）にも、ＭＡＬＬＳ測定に基づき、著しい違いは全くなかった。従って、精製ＰＳの分子量は、短縮精製プロセスにより悪影響を受けなかったと結論づけられた。
【００４４】
３つの短縮プロセスバッチについて処理ステップの各々におけるインプロセス多糖収率、タンパク質／多糖比率および核酸／多糖比率が表２にまとめてある。
【００４５】
【表２】
2010521972.tif 000002
どのような精製プロセスの各ステップの間にも、生成物の損失が常にある。これらの３つの短縮プロセスバッチについて、ＰＳ損失はほとんど、第１のＵＦ／ＤＦステップおよび酸性化ステップにおいて生じた。第１のＵＦ／ＤＦステップにおけるＰＳの損失は、膜表面へのＰＳまたはＰＳ−タンパク質複合体の吸着に起因するものであった。この損失は、ダイアフィルトレーション後にＤＩ水で膜の保持物質側をすすぎ、そのすすぎ液を元の保持物質と合わせることにより最小限になった。酸性化ステップにおけるＰＳの損失は、２つの理由に起因している可能性がある。すなわち、沈降固体へのＰＳの物理的吸着、および酸性化時の共沈に伴うタンパク質への多糖結合である。この第２の可能性をさらに調べたところ、結果はＰＳ／タンパク質結合の証拠を示した。
【００４６】
図１は、各精製ステップにおけるタンパク質／ＰＳ比率の減少を示す。遠心分離ステップによりタンパク質がわずかに除去されたが、大部分のタンパク質は、酸性化ステップで除去された。タンパク質力価が最も高いバッチについてさえ、ｐＨ３．５処置後には、痕跡量のタンパク質しか検出されなかった。
【００４７】
タンパク質／ＰＳ比率と同様、核酸／ＰＳ比率は、バッチ間の不純物レベルのばらつきを示した。３０／５０ＫＵＦ／ＤＦステップは、同じ処理ステップにおけるタンパク質除去と比較して、著しい量の核酸を除去した。理論によって拘束されていないが、これは、核酸の分子サイズがタンパク質のサイズよりも小さく、それによって核酸が３０／５０ＫＵＦ／ＤＦステップを介して比較的容易に除去されることに起因していたのかもしれない。第１の遠心分離および酸性化ステップも、かなりの量の核酸を除去した。
【００４８】
表２は、活性炭吸着ステップもタンパク質／ＰＳおよびＮＡ／ＰＳレベルを低減することを示している。百分率減少は、最初の２つのステップほど著しくはなかったが、このステップは、溶液の色を除去するために重要であり、不純物レベルが規格を満たすことを確実にした。
【００４９】
型４短縮精製バッチ：型４についての３つの短縮精製バッチの概略が表３に示してある。３つのバッチすべてについての供給ブロスは、ＤＯＣ−溶解した。
【００５０】
【表３】
2010521972.tif 000003
型４ＰＳ収率も５０〜６０％の間であった。タンパク質／ＰＳ比率および核酸／ＰＳ比率は、十分それらの規格内であった。Ｃ−ＰＳ比率はまた、十分規格内であった。３つのバッチすべての分子量は、約３００ｋｇ／モル近辺であった。同様な発酵ブロスを用いる現行の精製プロセスによって精製された血清型４ＰＳも、より低い分子量２８５ｋｇ／モルをもたらした。発酵ブロスおよび最終精製溶液からのＰＳのＨＰＬＣクロマトグラフの比較により、ＰＳ保持時間に差が全くないことが示された。このことは、分子量の差は、プロセス変更によって引き起こされたのではなく、むしろ発酵プロセスの固有の性質に起因することを示唆した。
【００５１】
型４ＰＳは、精製された分子中にピルベート基を含んでおり、このピルベートは、肺炎球菌結合体ワクチンにおいて使用するための結合に重要であった。ピルベート量が酸処理により悪影響を受けないことを保証するため、ＮＭＲ分析を実施した。図２は、標準の型４ＰＳおよびバッチＬ２９２７６−４７から型４ＰＳについてのＮＭＲスペクトルを示す。２つのスペクトルの間に著しい違いは全く観察されなかった。両方のスペクトルにおいて右から２番目のピークはピルベートであり、ピルベート基ピーク高さは、両方のスペクトルにおいて同等であった。３つの短縮されたプロセスバッチすべてについてのピルベート比率は、０．８モル／モルであり、＞０．７モル／モルの規格を満たした。
【００５２】
３つの型４バッチについてのインプロセスＰＳ収率、タンパク質／ＰＳおよびＮＡ／ＰＳ比率の概要が表４に示してある。ＰＳ損失はほとんど、第１の遠心分離、酸性化および活性炭吸着ステップで生じ、それぞれ平均が１０％、８％および２０％であった。全体のＰＳ収率は、型５のＰＳ収率、約５５％に近かった。
【００５３】
【表４】
2010521972.tif 000004
図３は、表４の３つのバッチについての精製ステップの各々における平均ＰＳ収率、タンパク質／ＰＳおよびＮＡ／ＰＳ比率変化を示す。タンパク質除去は、予想されるように大部分が酸性化ステップにおいて生じた。第１の遠心分離およびＵＦ／ＤＦステップも、ある一定量のタンパク質を集合的に除去したが、タンパク質減少は、酸性化ステップよりも少なかった。
【００５４】
型５と同様に、大部分の核酸／ＰＳ比率減少は、５０／１００Ｋ  ＵＦ／ＤＦ、第１の遠心分離、および酸性化ステップにおいて生じ、第１のＵＦ／ＤＦステップにおけるＮＡ減少は、タンパク質の減少よりも著しかった。また、図３に示されるように、活性炭ステップは、ある一定量のタンパク質およびＮＡを除去し、不純物レベルを規格以下にした。活性炭ステップは、溶液の色も除去した。
【００５５】
型１９Ａ短縮精製バッチ：型１９Ａ多糖は不安定であり、分子量は精製の間に変化する。短縮された精製プロセスは、１９Ａ多糖を安定化するために若干修正された。これらの修正は以下の通り要約される：１）精製ステップは、大部分を冷気室中で４℃にて実施し；２）第１の１００Ｋダイアフィルトレーションを、室温水を用いる代わりにｐＨ６の２５ｍＭリン酸塩緩衝液（４℃）を用いて冷却し；３）酸性化保持時間を、一晩から２時間に低減し；４）酸性化された１００Ｋ保持物質を清澄化した後、ｐＨを６に調節し、活性炭吸着をｐＨ３．５ではなくｐＨ６で実施した。
【００５６】
短縮された精製プロセスによって精製された２つの１９Ａバッチの結果が、表５に示してある。
【００５７】
【表５】
2010521972.tif 000005
２つの短縮された精製バッチのＰＳ収率は、それぞれ６２および７６％であった。最終タンパク質／ＰＳ比率、核酸比率、およびＣ−ＰＳ比率はすべて、それらのそれぞれの規格を満たした。２つのバッチからの多糖の最終の分子量は、それぞれ５２５ｋｇ／モルおよび４８８ｋｇ／モルであり、フェーズＩＩＩ臨床試験において用いられる１９ＡのＰＳの分子量（４８６ｋｇ／モル）に近かった。
【００５８】
２つのバッチについてのタンパク質／ＰＳ比率は両方とも＜２％の規格を満たした。２つのバッチのＮＡおよびＣ−ＰＳ比率は両方とも、十分それらの規格内であった。
【００５９】
精製ステップの各々におけるＰＳ収率、タンパク質およびＮＡ減少が、表６および図４に示してある。結果は、第１の遠心分離ステップを除き、精製ステップの各々におけるＰＳ損失を示した。血清型５および４のように、タンパク質およびＮＡ除去は、ほとんど最初の３つのステップにおいて起こり、酸性化後には、どのような検出可能なタンパク質およびＮＡもほとんど残っていなかった。ことによると酸性化後の非常に低いタンパク質およびＮＡ濃度のため、活性炭吸着ステップは著しい量のタンパク質およびＮＡを除去しなかったが、このステップは、色除去のために依然として必要とされた。
【００６０】
【表６】
2010521972.tif 000006
型７Ｆ短縮精製バッチ：型７Ｆは、非イオン多糖であり、上記の血清型と比較して、現行のプロセスを用いた精製の間に段階的変化を一般に必要とする。しかしながら、本発明の短縮された精製プロセスは、プロセス変更を必要することなく血清型７Ｆにうまく適用された。型７Ｆブロスの２つのバッチは、短縮されたプロセスを用いて精製された。１つは標準発酵ブロス（Ｌ２９２７６−１０７）であり、１つは高細胞密度ブロス（Ｌ２９２７６−１５７）であった。２つのバッチの結果の概要が表７に示してある。
【００６１】
【表７】
2010521972.tif 000007
型７ＦのＰＳ収率は実際には、ことによると帯電したタンパク質分子への非イオンポリマーの結合がより少ないため、他の血清型よりも高かった。最終タンパク質、ＮＡおよびＣ−ＰＳ比率はすべて、十分それらの規格内であった。型７Ｆの分子量は、標準バッチの分子量と同等であり、たとえ７Ｆ分子量が相当高かったとしても、非イオンポリマーの排除体積がより少ないため、ＰＳ溶液はあまり粘性を帯びていなかった。
【００６２】
精製ステップの各々における型７  ＦＰＳ収率、タンパク質およびＮＡ比率が表８に示してあり、２つのバッチの平均が図５においてプロットしてある。
【００６３】
【表８】
2010521972.tif 000008
各精製ステップにおいていくらかの型７  ＦＰＳ損失があった。全体的に、ＰＳ損失は、血清型５および４のＰＳ損失より小さかった。タンパク質およびＮＡ比率減少は大部分が、第１の遠心分離、１００Ｋ  ＵＦ／ＤＦ、および酸性化ステップによるものであった。他の血清型と同様、１００Ｋ  ＵＦ／ＤＦは、ＮＡの除去においてタンパク質よりも効率的であった。活性炭吸着ステップは、酸性化後の非常に低い不純物レベルのため、著しい量のタンパク質およびＮＡを除去しなかったが、このステップは色除去のために依然として必要であった。
【００６４】
型６Ｂ短縮精製バッチ：６Ｂの２つのバッチを、短縮精製プロセスを用いて精製した。酸性化した１００Ｋ保持物質の清澄化が、他の血清型よりも長い時間（１時間の代わりに６時間）を必要とすることが判明した。この差を除いて、精製プロセスは、血清型のそれと同様であった。２つのバッチの結果の概要が表９に示してある。
【００６５】
【表９】
2010521972.tif 000009
すべての不純物レベル（タンパク質、ＮＡ、およびＣ−ＰＳ）は、十分それらの規格内であった。ＰＳ収率は比較的高く、他の血清型と比較して、タンパク質およびＮＡ比率も同じであった。
【００６６】
精製ステップの各々におけるインプロセスＰＳ収率、タンパク質およびＮＡ比率が、表１０および図６に示してある。
【００６７】
【表１０】
2010521972.tif 000010
１９Ａと同様、ＰＳ損失は、ＰＳの若干の増加があった第１の遠心分離ステップを除き、精製ステップの各々において生じた。タンパク質およびＮＡの除去は大部分、第１の遠心分離、第１の１００Ｋ  ＵＦ／ＤＦおよび酸性化ステップにより達成された。しかしながら、活性炭吸着ステップにおいてタンパク質およびＮＡ比率のいくらかの減少があった。
【００６８】
型６Ａ短縮精製バッチ：型６Ａの２つのバッチを、短縮精製プロセスを用いて精製した。最終溶液のＰＳ収率、不純物レベルおよび分子量の概要が表１１に示してある。
【００６９】
【表１１】
2010521972.tif 000011
２つの６Ａバッチの最終ＰＳ収率は、両方とも＞７０％であり、これは、短縮プロセスを用いて処理した血清型の間で最も高かった。タンパク質、ＮＡ、およびＣ−ＰＳ比率はすべて、規格内であった。
【００７０】
表１２および図７は、精製ステップの各々におけるインプロセスＰＳ収率、タンパク質およびＮＡ比率変化を示す。第１の遠心分離および１００Ｋ  ＵＦ／ＤＦステップにおいてＰＳのどのような損失もほとんどなかった。約１０−１５％ＰＳ損失が、酸性化および活性炭吸着ステップにおいて生じ、これは他の血清型のＰＳ損失と近かった。大部分のタンパク質およびＮＡ比率減少は、第１の遠心分離、１００Ｋ  ＵＦ／ＤＦ、および酸性化によるものであった。酸性化後、タンパク質およびＮＡ比率は両方とも、すでにそれらの規格より下にあった。タンパク質については、酸性化が最も効率的なステップであったのに対し、ＮＡについては、１００Ｋ  ＵＦ／ＤＦが大部分のＮＡ／ＰＳ比率を低減した。活性炭吸着ステップは、酸性化後の非常に低い不純物レベルのため、著しい量のタンパク質およびＮＡを除去しなかったが、このステップは色除去のために依然として必要であった。
【００７１】
【表１２】
2010521972.tif 000012
型１短縮精製バッチ：短縮プロセスによって精製された型１の２つのバッチの概要が表１３に示してある。バッチＬ２９２７６−１７０は、高細胞密度発酵ブロスから精製し、Ｌ２９２７６−１７３は、標準発酵ブロスから精製した。
【００７２】
【表１３】
2010521972.tif 000013
両方のバッチのＰＳ収率は約５０％であり、タンパク質、ＮＡおよびＣ−ＰＳについての不純物レベルはすべて、それらの規格内にあった。
【００７３】
精製ステップの各々の後におけるインプロセスＰＳ収率、タンパク質およびＮＡ比率が、表１４および図８に示してある。傾向は、精製された他の血清型と同様であった。ＰＳ損失は大部分、酸性化および活性炭吸着ステップにおいて生じ、大部分のタンパク質およびＮＡ除去は、最初の３つのステップにおいて生じた。タンパク質よりも多くのＮＡが１００Ｋ  ＵＦ／ＤＦステップにおいて除去された。活性炭吸着ステップは、酸性化後の非常に低い不純物レベルのため、著しい量のタンパクおよびＮＡを除去しなかったが、このステップは、色除去のために依然として必要であった。
【００７４】
【表１４】
2010521972.tif 000014
型１４短縮精製バッチ：血清型１４の２つバッチを、プロセス変更なしで、短縮精製プロセスを用いて精製した。最終ＰＳ収率および不純物レベルの概要が表１５に示してある。
【００７５】
【表１５】
2010521972.tif 000015
血清型７Ｆと同様、血清型１４は非イオン多糖であり、その現行の精製プロセスは、他の血清型と若干異なる。しかしながら、本発明の短縮精製プロセスは、そのような付加的ステップの必要なしで、血清型１４にうまく適用された。２つの短縮精製プロセスバッチのＰＳ収率は、５０〜６０％であり、タンパク質およびＮＡ比率は、それらの規格内にあった。精製されたＰＳの分子量も、規格を満たした。
【００７６】
インプロセスＰＳ収率、タンパク質およびＮＡ比率の概要が、表１６および図９に示してある。上述の他の試験された血清型についてと同様なＰＳ損失、タンパク質およびＮＡ除去の傾向が観察された。
【００７７】
【表１６】
2010521972.tif 000016
（実施例２）
種々の血清型の比較（血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、および１９Ｆ）
本発明の短縮精製プロセスを用いた種々の血清型の精製を比較するために、実施例１において記載されたすべての血清型に加え血清型９Ｖ、１８Ｃ、および１９ＦについてのＰＳ除去を、図１０の１つのグラフにおいてプロットした。大部分の血清型は、精製ステップの各々においてＰＳ損失についてと同様な傾向をたどった。第１の遠心分離ステップにおける型６Ｂおよび酸性化ステップにおける型１４について、ＰＳ収率の増大があった。ＰＳ百分率損失は、血清型ごとに変化した。型５は、酸性化ステップにおいてほとんどのＰＳを失い、型４は、活性炭吸着ステップにおいてほとんどのＰＳを失ったようであった。
【００７８】
血清型の各々についての各精製ステップについてのタンパク質／ＰＳ比率が、図１１に示してある。この図は、種々の血清型についての初期タンパク質／ＰＳ比率に差があったことを示しており、型１、４、５、９Ｖ、１９Ｆ、および１８Ｃは、最も高い初期タンパク質／ＰＳ比率を有する。たとえタンパク質／ＰＳ比率が型１、４、５、９Ｖ、１９Ｆ、および１８Ｃについて、第１のＵＦ／ＤＦステップの後でさえも他の血清型と比較してずっと高くても、酸性化ステップは、タンパク質／ＰＳ比率を大きく低減し、タンパク質はこのステップ後にあまり残らなかった。
【００７９】
図１２に示されるように、ＮＡ／ＰＳ比率も、血清型ごとに変わった。型１および５が最も高いＮＡ／ＰＳ比率を有しており、続いて型１８Ｃおよび４であった。第１の遠心分離およびＵＦ／ＤＦステップは、これらの血清型について著しい量のＮＡを除去し、型１が最も効率的であるように思われた。酸性化ステップ後には、ＮＡはほとんど残っていなかった。
【００８０】
（実施例３）
酸性化および活性炭吸着ステップ効率分析（血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、および１９Ｆ）
ＰｎＣ多糖の精製にとり、最も重要かつ除去が困難な不純物はタンパク質である。短縮プロセスの不純物除去効率をより理解するために、２つの主要な精製ステップである酸性化および活性炭吸着をタンパク質除去について分析した。酸性化ステップについて、酸性化の前および後におけるタンパク質濃度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の差を、本発明の短縮精製プロセスを用いた血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、および１９Ｆについての酸性化前の初期タンパク質濃度に対してプロットした（図１３）。
【００８１】
酸性化ステップの前および後の溶液体積の比較的小さい変化のため、初期タンパク質濃度で割ったタンパク質濃度差は、酸性化ステップによるタンパク質除去レートを反映した。図１３は、初期タンパク質濃度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイによる）に対するタンパク質濃度差の直線的適合度の勾配を示す。非常に良好な直線関係が、タンパク質濃度変化と初期濃度の間に観察され、Ｒ２は１に近かった。勾配は０．９８７６であり、これは９８．７６％タンパク質除去に相当する（溶液体積変化は無視できるものと想定する）。従って、調べたすべての血清型について、酸性化ステップは非常に効率的であり、平均して酸性化ステップは、９８％より多くのタンパク質を除去した。
【００８２】
酸性化ステップと同様、活性炭吸着ステップの効率も、除去された（炭素に吸着された）タンパク質の量を初期タンパク質負荷に対してプロットすることにより評価した（図１４）。Ｒ２（０．９７２３）は、酸性化ステップの場合ほど高くはなかったが、除去されたタンパク質と初期タンパク質負荷との間に良好な直線関係が観察された。この直線的適合度の勾配は、タンパク質除去レートに対応するので、活性炭吸着ステップは、９３．８７％タンパク質除去をもたらした。
【００８３】
酸性化および活性炭吸着ステップの分析に基づき、これら２つのステップ後には、約０．１％のタンパク質しか溶液中に残されなかった。
【００８４】
実施例１〜３についての結論
短縮精製プロセスは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの莢膜多糖のための現行の精製プロセスに取って代わるために開発された。この短縮精製プロセスは、わずかな変更を行って、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および１９Ａに直接適用された。プロセスは、ＤＯＣ−溶解した発酵ブロスを用いて、１０Ｌスケールで実施した。タンパク質／ＰＳ、ＮＡ／ＰＳおよびＣ−ＰＳ／ＰＳ比率を含む不純物レベルはすべて、それらの規格を満たした。ＰＳ収率は５０％より高く、現行の精製プロセスのＰＳ収率に匹敵した。インプロセスＰＳ収率、タンパク質／ＰＳおよびＮＡ／ＰＳ比率は、種々の血清型の挙動を比較するためにプロットした。血清型１、５、９Ｖ、１９Ｆ、および１８Ｃは、１００Ｋ  ＵＦ／ＤＦステップの前および後のタンパク質／ＰＳ比率に基づいて、精製が最も困難であることが判明した。
【００８５】
ステップ分析は、酸性化および活性炭吸着ステップが、それぞれ９８％より多くの、および９０％より多くのタンパク質を除去した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）ことを示した。
【００８６】
（実施例４）
多糖生産におけるデオキシコール酸ナトリウムの非動物由来溶解薬による代替
この実施例は、実質的に精製された莢膜Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖の生産について上述されたプロセス内において、非動物由来溶解薬がデオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）の代替物として使用できるかどうかを調べた。上記のように、ＤＯＣは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおける細胞壁成長および分割に関与する自己溶解素であるＬｙｔＡタンパク質を活性化する。ＬｙｔＡタンパク質は、そのＣ末端部分にコリン結合ドメインを有し、ｌｙｔＡ遺伝子の変異は、ＤＯＣによる溶解に対し抵抗性のあるＬｙｔＡ変異体を生み出すことが知られている。
【００８７】
ＤＯＣの機序と同様な機序により細胞溶解を引き起こす化合物を同定するために、ラピッドマイクロタイタープレートアッセイが開発された。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の死滅および多糖の放出においてＤＯＣと同等に効果的な、ＤＯＣに対するいくつかの非動物由来代替物が同定された。標準条件を用いた処理後、非動物由来化合物で生産された多糖のサイズおよび純度は、ＤＯＣで生産された多糖のサイズおよび純度と同一であった。
【００８８】
方法
細胞溶解：試験される化合物を、０．１〜０．０１％（ｖ／ｖ）の最終濃度で発酵ブロスに添加し、溶液を、３７℃で１時間インキュベートさせた。次に溶液を、２〜８℃で一晩保存した。翌朝、溶液を遠心分離してすべての細胞片を除去した。細胞を含まないブロスをＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析し、放出された多糖の濃度を決定した。溶解は、２〜３７℃の間の任意の温度で、好ましくは６．０〜７．５のｐＨ範囲で実行できた。洗浄剤の濃度は一般に、個別の洗浄剤によって０．０５〜０．２％の間であった。
【００８９】
マイクロタイターアッセイ：種々の洗浄剤または界面活性剤による肺炎球菌のｌｙｔＡ−依存溶解を試験するために、ラピッドマイクロタイタープレートアッセイが考案された。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの同質遺伝子型株の２つの対をこのアッセイにおいて用いた；各対の一方がｌｙｔＡ遺伝子の野生型であるのに対し、他方の株は、ｌｙｔＡ遺伝子中に欠失を有していた  従って、もし溶解が活性ｌｙｔＡ機能に依存すれば、その洗浄剤は、変異株を溶解しないであろう。４つの株、すなわちＲ６Ｘ、Ｒ６Ｘ  ΔｌｙｔＡ、Ｄ３９、およびＤ３９  ΔｌｙｔＡを、ＨｙＳｏｙ培地中でほぼ対数増殖中期（ＯＤ６００約０．２〜０．８；ＯＤ６００＝６００ｎｍにおける光学密度）まで培養した。次に細胞を遠心分離し、細胞ペレットをＨｙＳｏｙ培地中に再懸濁させた。マイクロタイタープレートの各ウェルに、１００μＬの細胞懸濁液を、１０μＬの洗浄剤保存液または対照としての水と共に、添加した。３６℃で約１５分後、試料のＯＤ６００をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で測定した。以下の結果は、新たに調製された細胞または凍結および解凍された細胞について観察された：ＤＯＣ、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００およびＮ−ラウリルサルコシンにさらされた野生型細胞はすべて、培地ブランクと同等のＯＤ値を持っていた。これは溶解が生じていたことを示す。他方で、ΔｌｙｔＡ細胞は、これらの洗浄剤の存在下では溶解しなかった。これは、これらの洗浄剤が細胞を溶解するためにＬｙｔＡ機能が必要とされることを示す。
【００９０】
比較分析研究に用いられるＰＳの単離：培養物を、１０Ｌバイオリアクター中のＨｙ−Ｓｏｙ培地中で成長させた。ｐＨは、ＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３を用いて約７．０に制御した。成長の終わりに（光学密度のさらなる増加がないことによって示されるとおり）、培養物を０．１２％ＤＯＣかまたは０．１％ＮＬＳで処理した。培養物を、１２〜１６時間インキュベートした。細胞死滅の有効性は、処理したブロスの試料をＴＳＡ−血液寒天プレートに塗布することによって確認した。多糖は、（上記のように）清澄化された溶解物から標準手順を用いて精製した。精製多糖を、物質の純度および正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定するのに適した各種の標準分析手法を用いて検査した。
【００９１】
溶解物のＰＳ含有量を、屈折率（ＲＩ）検出器に結合されたＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて決定した。
【００９２】
血清型１および６Ｂを用いた非動物由来溶解薬のスクリーニング
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１および６Ｂを、Ｈｙ−Ｓｏｙベースの培地中で別個に成長させた。培養物を、別個に収集し、試験管中に別個に分配した。ＤＯＣに匹敵する溶解活性についてスクリーニングされる非動物由来化合物をストック溶液として（適切な溶媒中に）調製し、培養物に添加した。一晩インキュベートした後、試験管を遠心分離し、各血清型について溶解物のＰＳ含有量をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定し、ＤＯＣと比較した。
【００９３】
ｌｙｔＡ変異体を用いた非動物由来溶解薬のスクリーニング
ｌｙｔＡ変異を含有する株の同質遺伝子的対を、Ｈｙ−Ｓｏｙベースの培地中で成長させた。細胞を収集し、マイクロタイタープレートのウェル中に分配した。試験化合物を添加し、培養物をインキュベートした。３６℃で１５分間の後、各ウェルの光学密度（ＯＤ６００）を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて決定した（表１７および１８を参照されたい。これらの表は、代表的化合物についての２つの別個な試験の結果の概要を示す）。
【００９４】
【表１７】
2010521972.tif 000017
【００９５】
【表１８】
2010521972.tif 000018
上記のスクリーニング研究に基づき、ＤＯＣに取って代わる以下の非動物由来溶解薬が同定された：デカンスルホン酸、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０（ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール；ＣＡＳ＃：９００２−９３−１；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手可能）、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオネート、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ケノデオキシコール酸塩、ヒオデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、およびコール酸塩。
【００９６】
ＮＬＳ−溶解ＰＳとＤＯＣ−溶解ＰＳとの比較
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、および７Ｆを、実施例１および２において上述されたように１０Ｌスケールで、本発明の改善されたプロセスを用いて精製した。しかしながら、一方のグループではＮＬＳ（０．１％）を溶解薬として用いたのに対し、他方のグループでは、ＤＯＣ（０．１２％）を溶解薬として用いた。
【００９７】
ＰＳ収率、タンパク質／ＰＳ比率、ＮＡ／ＰＳ比率、およびＰＳ分子量を、上記のように測定した。結果の概要を表１９に示す。これらの結果は、本発明の精製方法における溶解薬としてのＮＬＳの使用が、比較的高いＰＳ収率を、比較的低いタンパク質および核酸レベルと共にもたらすことを示した。実際、試験した血清型の大多数について、溶解薬としてのＮＬＳの使用は、ＤＯＣの使用と比較して、より高いＰＳ収率をもたらした。
【００９８】
【表１９】
2010521972.tif 000019
本明細書中で言及されたすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者の水準を示すものである。すべての刊行物および特許出願は、あたかも各個別の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別的に参照により組み込まれるように、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００９９】
上記の発明は、理解を明瞭にする目的のため、例示および実施例によりある程度詳細に説明されてきたが、一定の変更および修正が、特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図７】
2010521972.tif 000020