【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年12月21日(2010.12.21)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗体または抗体の抗原結合抗体断片であって、該抗体または抗体の抗原結合抗体断片は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、該抗体または抗体の抗原結合抗体断片は、Ｔｉｅ１外部ドメインおよび内皮細胞に結合するが、血小板には実質的に結合せず、該重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、以下：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１：
（ＡＧＳＲ）−Ｙ−（ＧＶＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＦ）（配列番号１１７）
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）；
ｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１２１）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）または
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）；
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３：
Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号１１４のアミノ酸９９〜１０９）、
Ｖ−（４残基または５残基）−Ｆ−Ｄ−（Ｉ／Ｙ）（配列番号１２４）、
Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２５）、
（ＧＶ）−Ｎ−Ｙ−Ｙ−（ＧＹＤ）−Ｓ−（ＳＤ）−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２６）、
（ＧＶＤ）−（ＡＧＬＮ）−（ＬＹＲ）−（ＧＳＴＬＹＨ）−（ＧＹＤ）−（ＡＧＳＹＦＰ）−（ＳＦＤ）−（ＡＧＹＤ）−（ＩＹ）−（ＧＦＤ）−（ＹＤＰ）−（ＩＰ）−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２７）または
Ｖ−Ｎ−Ｙ−Ｙ−Ｄ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２８）、
を含み、そして、該軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、以下：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−Ｘ１−Ｙ−Ｌ−（ＡＮ）（配列番号１２９）（式中、Ｘ１はセリンであるか、または、存在しなくてもよい）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｌ（配列番号１３０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−（ＳＹ）−（ＬＹ）−（ＡＬＮ）（配列番号１３１）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）（式中、Ｘ１はセリンであるか、または、存在しなくてもよい）；
Ｓ−Ｘ−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１４２）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、そして、Ｘ３は任意のアミノ酸である）、あるいは、
Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ４は任意のアミノ酸であり、そして、Ｘ５は任意のアミノ酸である）；
ｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３３）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３４）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３５）、
（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）、
（ＤＥ）−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４４）、あるいは
（ＤＥ）−（ＶＤ）−（ＳＴＤＮ）−（ＹＲＤＮ）−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４５）；ならびに、
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３７）、
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）、
（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３８）、
Ｑ−Ｑ−（ＹＲ）−（ＧＳ）−Ｓ−（ＳＷ）−Ｐ−Ｒ−Ｘ１−Ｔ（配列番号１３９）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であるか、または存在しない）、
（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＴＩ）（配列番号１４０）、
（ＬＱ）−（ＬＲＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＡＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＳＶＲＰ）−（ＳＴＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＳＴＩ）（配列番号１４１）、あるいは、
（ＳＱ）−Ｓ−（ＳＹ）−（ＡＳＩＤ）−（ＧＳＲ）−（ＳＴ）−（ＳＴＲＮ）−（ＳＴＹＲ）−（ＡＴＬＹ）−（ＳＶＷＱ）（配列番号１４６）
を含む、単離された抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片であって、ここで、前記ＬＣ  ＣＤＲ１は、アミノ酸配列  Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）
（式中、Ｘ１は、ＧまたはＲである）を含む、抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片であって、ここで、前記ＬＣ  ＣＤＲ１は、アミノ酸配列  Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）
（式中、Ｘ２は、ＹまたはＮである）を含む、抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片であって、ここで、前記ＬＣ  ＣＤＲ１は、アミノ酸配列  Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）
（式中、Ｘ３は、Ｆ、Ｎ、または、Ｋである）を含む、抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片であって、ここで、前記ＬＣ  ＣＤＲ１は、アミノ酸配列  Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）
（式中、Ｘ４は、脂肪族アミノ酸である）を含む、抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項６】
請求項５に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片であって、ここで、前記脂肪族アミノ酸は、ＶまたはＡである、抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項７】
前記ＨＣ可変ドメイン配列が、配列番号１１８および配列番号１６０を含む、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項８】
前記ＬＣ可変ドメイン配列が配列番号１３２、配列番号１３６および配列番号１６１を含む、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項９】
前記ＨＣ可変ドメイン配列の前記アミノ酸配列が、クローンＥ３（配列番号１１４）、クローンＧ２（配列番号１１０）、クローンｐ−Ａ１（配列番号４）、クローンｐ−Ａ１０（配列番号１６）、クローンｐ−Ｂ１（配列番号２０）、クローンｐ−Ｂ３（配列番号２４）、クローンｐ−Ｃ６（配列番号２８）、クローンｐ−Ｄ１２（配列番号４０）、クローンｐ−Ｆ３（配列番号４４）、クローンｐ−Ｆ４（配列番号４８）、クローンｐ−Ｇ３（配列番号５２）、クローンｓ−Ａ１０（配列番号６０）、クローンｓ−Ｈ１（配列番号１０２）、クローンｓ−Ａ２（配列番号５６）、クローンｓ−Ｂ２（配列番号６４）、クローンｓ−Ｂ９（配列番号６８）、クローンｓ−Ｃ１０（配列番号８０）、クローンｓ−Ｃ２（配列番号７２）、クローンｓ−Ｃ７（配列番号７６）、クローンｓ−Ｄ１１（配列番号８４）、クローンｓ−Ｅ１１（配列番号８８）、クローンｓ−Ｇ１０（配列番号９８）またはクローンｓ−Ｈ４（配列番号１０６）のＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列である、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１０】
前記ＬＣ可変ドメイン配列の前記アミノ酸配列が、クローンＥ３（配列番号１１６）、クローンＧ２（配列番号１１２）、クローンｐ−Ａ１（配列番号６）、クローンｐ−Ａ１０（配列番号１８）、クローンｐ−Ｂ１（配列番号２２）、クローンｐ−Ｂ３（配列番号２６）、クローンｐ−Ｃ６（配列番号３０）、クローンｐ−Ｄ１２（配列番号４２）、クローンｐ−Ｆ３（配列番号４６）、クローンｐ−Ｆ４（配列番号５０）、クローンｐ−Ｇ３（配列番号５４）、クローンｓ−Ａ１０（配列番号６２）、クローンｓ−Ｈ１（配列番号１０４）、クローンｓ−Ａ２（配列番号５８）、クローンｓ−Ｂ２（配列番号６６）、クローンｓ−Ｂ９（配列番号７０）、クローンｓ−Ｃ１０（配列番号８２）、クローンｓ−Ｃ２（配列番号７４）、クローンｓ−Ｃ７（配列番号７８）、クローンｓ−Ｄ１１（配列番号８６）、クローンｓ−Ｅ１１（配列番号９０）、クローンｓ−Ｇ１０（配列番号１００）またはクローンｓ−Ｈ４（配列番号１０８）のＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列である、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１１】
前記ＨＣ可変ドメイン配列の前記アミノ酸配列が、Ｅ３クローン（配列番号１１４）からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含み、前記ＬＣ可変ドメイン配列が、Ｅ３クローン（配列番号１１６）からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１２】
前記ＬＣ可変ドメイン配列が配列番号１５９を含む、請求項１１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１３】
前記ＨＣ可変ドメイン配列が配列番号１１４を含む、請求項１１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１４】
前記ＨＣフレームワーク領域およびＬＣフレームワーク領域がヒトのものである、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１５】
さらにＦｃドメインを含む、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１６】
ヒトＩｇＧ１の定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２の定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３の定常ドメインまたはヒトＩｇＧ４の定常ドメインを含む、請求項１５に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１７】
単離された抗体または抗体の抗原結合抗体断片であって、該抗体または抗体の抗原結合抗体断片は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、該抗体または抗体の抗原結合抗体断片は、Ｔｉｅ１外部ドメインおよび内皮細胞に結合するが、血小板には実質的に結合しない、単離された抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１８】
Ｔｉｅ１に５ｎＭ未満のＫｄで結合する、請求項１７に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項１９】
Ｅ３抗体（配列番号１１４および１１６）のＨＣ免疫グロブリン可変ドメインおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインを含むか、または該Ｅ３抗体（配列番号１１４および１１６）の該ＨＣ免疫グロブリン可変ドメインおよび該ＬＣ免疫グロブリン可変ドメインのそれぞれに少なくとも８５％同一であるドメインを含む、請求項１７に記載の単離された抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項２０】
ＨＵＶＥＣ細胞による管形成をインビトロで阻害する、請求項１７に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項２１】
組織学的切片中のメラノーマ関連構造物を認識する、請求項１７に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項２２】
単離された抗体または抗体の抗原結合抗体断片であって、該抗体または抗体の抗原結合抗体断片は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、
該抗体または抗体の抗原結合抗体断片は、Ｔｉｅ１外部ドメインおよび内皮細胞に結合するが、血小板には実質的に結合せず、
Ｔｉｅ１への結合に対してＥ３と競合するか、あるいは
Ｅ３により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープにか、またはＥ３により認識されるエピトープと共通する少なくとも一つ、二つまたは三つの残基を有するエピトープに結合する、
単離されたタンパク質。
【請求項２３】
単離された核酸であって、該核酸は、免疫グロブリンＨＣ可変ドメイン配列を含むポリペプチドをコードするコード配列を含み、ここで、該コード配列は、クローンＥ３（配列番号１１４）、クローンＧ２（配列番号１１０）、クローンｐ−Ａ１（配列番号４）、クローンｐ−Ａ１０（配列番号１６）、クローンｐ−Ｂ１（配列番号２０）、クローンｐ−Ｂ３（配列番号２４）、クローンｐ−Ｃ６（配列番号２８）、クローンｐ−Ｄ１２（配列番号４０）、クローンｐ−Ｆ３（配列番号４４）、クローンｐ−Ｆ４（配列番号４８）、クローンｐ−Ｇ３（配列番号５２）、クローンｓ−Ａ１０（配列番号６０）、クローンｓ−Ｈ１（配列番号１０２）、クローンｓ−Ａ２（配列番号５６）、クローンｓ−Ｂ２（配列番号６４）、クローンｓ−Ｂ９（配列番号６８）、クローンｓ−Ｃ１０（配列番号８０）、クローンｓ−Ｃ２（配列番号７２）、クローンｓ−Ｃ７（配列番号７６）、クローンｓ−Ｄ１１（配列番号８４）、クローンｓ−Ｅ１１（配列番号８８）、クローンｓ−Ｇ１０（配列番号９８）またはクローンｓ−Ｈ４（配列番号１０６）のＨＣ可変ドメインをコードする参照配列と少なくとも８５％同一であるか、または該コード配列は、該参照配列またはその相補体にハイブリダイズする、単離された核酸。
【請求項２４】
免疫グロブリンＬＣ可変ドメインを含むポリペプチドをコードする第二のコード配列をさらに含む、請求項２３に記載の核酸であって、ここで、該コード配列は、クローンＥ３（配列番号１１６）、クローンＧ２（配列番号１１２）、クローンｐ−Ａ１（配列番号６）、クローンｐ−Ａ１０（配列番号１８）、クローンｐ−Ｂ１（配列番号２２）、クローンｐ−Ｂ３（配列番号２６）、クローンｐ−Ｃ６（配列番号３０）、クローンｐ−Ｄ１２（配列番号４２）、クローンｐ−Ｆ３（配列番号４６）、クローンｐ−Ｆ４（配列番号５０）、クローンｐ−Ｇ３（配列番号５４）、クローンｓ−Ａ１０（配列番号６２）、クローンｓ−Ｈ１（配列番号１０４）、クローンｓ−Ａ２（配列番号５８）、クローンｓ−Ｂ２（配列番号６６）、クローンｓ−Ｂ９（配列番号７０）、クローンｓ−Ｃ１０（配列番号８２）、クローンｓ−Ｃ２（配列番号７４）、クローンｓ−Ｃ７（配列番号７８）、クローンｓ−Ｄ１１（配列番号８６）、クローンｓ−Ｅ１１（配列番号９０）、クローンｓ−Ｇ１０（配列番号１００）またはクローンｓ−Ｈ４（配列番号１０８）のＬＣ可変ドメインをコードする参照配列に対して８５％同一であるか、あるいは、該コード配列は、該参照配列またはその相補体に対してハイブリダイズする、核酸。
【請求項２５】
単離された核酸であって、該核酸は、免疫グロブリンＬＣ可変ドメイン配列を含むポリペプチドをコードするコード配列を含み、ここで、該コード配列は、クローンＥ３（配列番号１１６）、クローンＧ２（配列番号１１２）、クローンｐ−Ａ１（配列番号６）、クローンｐ−Ａ１０（配列番号１８）、クローンｐ−Ｂ１（配列番号２２）、クローンｐ−Ｂ３（配列番号２６）、クローンｐ−Ｃ６（配列番号３０）、クローンｐ−Ｄ１２（配列番号４２）、クローンｐ−Ｆ３（配列番号４６）、クローンｐ−Ｆ４（配列番号５０）、クローンｐ−Ｇ３（配列番号５４）、クローンｓ−Ａ１０（配列番号６２）、クローンｓ−Ｈ１（配列番号１０４）、クローンｓ−Ａ２（配列番号５８）、クローンｓ−Ｂ２（配列番号６６）、クローンｓ−Ｂ９（配列番号７０）、クローンｓ−Ｃ１０（配列番号８２）、クローンｓ−Ｃ２（配列番号７４）、クローンｓ−Ｃ７（配列番号７８）、クローンｓ−Ｄ１１（配列番号８６）、クローンｓ−Ｅ１１（配列番号９０）、クローンｓ−Ｇ１０（配列番号１００）またはクローンｓ−Ｈ４（配列番号１０８）のＬＣ可変ドメインをコードする参照配列と少なくとも８５％同一であるか、または該コード配列は、該参照配列またはその相補体にハイブリダイズする、単離された核酸。
【請求項２６】
免疫グロブリンＨＣ可変ドメインを含むポリペプチドをコードする第二のコード配列をさらに含む、請求項２５に記載の核酸であって、ここで、該コード配列は、クローンＥ３（配列番号１１４）、クローンＧ２（配列番号１１０）、クローンｐ−Ａ１（配列番号４）、クローンｐ−Ａ１０（配列番号１６）、クローンｐ−Ｂ１（配列番号２０）、クローンｐ−Ｂ３（配列番号２４）、クローンｐ−Ｃ６（配列番号２８）、クローンｐ−Ｄ１２（配列番号４０）、クローンｐ−Ｆ３（配列番号４４）、クローンｐ−Ｆ４（配列番号４８）、クローンｐ−Ｇ３（配列番号５２）、クローンｓ−Ａ１０（配列番号６０）、クローンｓ−Ｈ１（配列番号１０２）、クローンｓ−Ａ２（配列番号５６）、クローンｓ−Ｂ２（配列番号６４）、クローンｓ−Ｂ９（配列番号６８）、クローンｓ−Ｃ１０（配列番号８０）、クローンｓ−Ｃ２（配列番号７２）、クローンｓ−Ｃ７（配列番号７６）、クローンｓ−Ｄ１１（配列番号８４）、クローンｓ−Ｅ１１（配列番号８８）、クローンｓ−Ｇ１０（配列番号９８）またはクローンｓ−Ｈ４（配列番号１０６）のＨＣ可変ドメインをコードする参照配列と少なくとも８５％同一であるか、または該コード配列は、該参照配列またはその相補体にハイブリダイズする、単離された核酸。
【請求項２７】
宿主細胞であって、該細胞は、抗体のＨＣ可変ドメインを含むポリペプチドをコードする第一の核酸配列、および該抗体のＬＣ可変ドメインを含むポリペプチドをコードする第二の核酸配列を含み、ここで、該抗体は、請求項１または１７に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片である、宿主細胞。
【請求項２８】
宿主細胞であって、該細胞は、ＨＣ可変領域を含むポリペプチドをコードする第一の核酸配列、およびＬＣ可変領域を含むポリペプチドをコードする第二の核酸配列を含み、ここで、該ＨＣ可変領域および該ＬＣ可変領域はそれぞれ、Ｅ３（配列番号１１４および１１６）、Ｇ２（配列番号１１０および１１２）、ｐ−Ａ１（配列番号４および６）、ｐ−Ａ１０（配列番号１６および１８）、ｐ−Ｂ１（配列番号２０および２２）、ｐ−Ｂ３（配列番号２４および２６）、ｐ−Ｃ６（配列番号２８および３０）、ｐ−Ｄ１２（配列番号４０および４２）、ｐ−Ｆ３（配列番号４４および４６）、ｐ−Ｆ４（配列番号４８および５０）、ｐ−Ｇ３（配列番号５２および５４）、ｓ−Ａ１０（配列番号６０および６２）、ｓ−Ｈ１（配列番号１０２および１０４）、ｓ−Ａ２（配列番号５６および５８）、ｓ−Ｂ２（配列番号６４および６６）、ｓ−Ｂ９（配列番号６８および７０）、ｓ−Ｃ１０（配列番号８０および８２）、ｓ−Ｃ２（配列番号７２および７４）、ｓ−Ｃ７（配列番号７６および７８）、ｓ−Ｄ１１（配列番号８４および８６）、ｓ−Ｅ１１（配列番号８８および９０）、ｓ−Ｇ１０（配列番号９８および１００）およびｓ−Ｈ４（配列番号１０６および１０８）からなる群から選択されるクローンのＨＣ可変ドメインおよびＬＣ可変ドメインのそれぞれのアミノ酸配列に、少なくとも８５％同一である配列を含む、宿主細胞。
【請求項２９】
単離された抗体であって、該抗体は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、該抗体は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合し、該重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および該軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、
ｉ）式：
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）に従うアミノ酸配列を含む、ＨＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）式：
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）
に従うアミノ酸配列を含む、ＨＣ  ＣＤＲ２；
ｉｉｉ）アミノ酸配列Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号１１４のアミノ酸９９〜１０９）を含む、ＨＣ  ＣＤＲ３；
ｉｖ）式：
Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）（式中、Ｘ１はセリンであってもまたは存在しなくてもよい）
に従うアミノ酸配列を含む、ＬＣ  ＣＤＲ１；
ｖ）式：
（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）
に従うアミノ酸配列を含む、ＬＣ  ＣＤＲ２；および
ｖｉ）式：
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）、
に従うアミノ酸配列を含む、ＬＣ  ＣＤＲ３；
を含む、単離された抗体。
【請求項３０】
５ｎＭ未満のＫｄでＴｉｅｌ１に結合する、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項３１】
ＨＵＶＥＣ細胞による管形成をインビトロで阻害する、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項３２】
組織学的切片中のメラノーマ関連構造物を認識する、請求項１に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片。
【請求項３３】
請求項１〜２２、または、２９〜３２のいずれか１項に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３４】
被験体における血管形成の調節のための組成物であって、該組成物は、請求項１〜１７、または、２９〜３２に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片を含む、組成物。
【請求項３５】
前記抗体または抗体の抗原結合抗体断片がＴｉｅ１活性をアンタゴナイズする、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記被験体が血管形成関連疾患を有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記被験体が腫瘍疾患を有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記被験体が転移性癌を有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３９】
前記被験体が血管形成に依存する癌または腫瘍を有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４０】
前記被験体が炎症性疾患を有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４１】
前記被験体が慢性関節リウマチを有する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記被験体が乾癬を有する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記抗体または抗体の抗原結合抗体断片が全身送達のために適している、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４４】
前記抗体または抗体の抗原結合抗体断片が、血管の発芽、分裂および再構築のうちの一つ以上の活性を減少するのに有効な量である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４５】
前記抗体または抗体の抗原結合抗体断片が、脈管形成または細管形成を減少するのに有効な量である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４６】
被験体において内皮細胞活性を調節するための組成物であって、該組成物は、
請求項１、１７、または、２２に記載の抗体または抗体の抗原結合抗体断片を含む、組成物。
【請求項４７】
インビトロでサンプル中のＴｉｅ１タンパク質の存在を検出する方法であって、該方法は、
ｉ）該サンプルを、請求項１、１７、または、２２に記載のＴｉｅ１に結合する抗体または抗体の抗原結合抗体断片に、該Ｔｉｅ１に結合する抗体または抗体の抗原結合抗体断片と該Ｔｉｅ１タンパク質との相互作用が起こる条件下で接触させる工程；および
（ｉｉ）該Ｔｉｅ１に結合する抗体または抗体の抗原結合抗体断片と該サンプルとの間の複合体の形成を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
インビボでＴｉｅ１の存在を検出するための組成物であって、該組成物は、請求項１、１７、または、２２に記載のＴｉｅ１に結合する抗体または抗体の抗原結合抗体断片を含む、組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ＴＩＥ１結合リガンド
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願番号第６０／４９４，７１３号（２００３年８月１２日出願）（その全体が参照として本明細書中に援用される）に対し優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
血管により供給される酸素と栄養素は組織の発達と機能にとって重要である。実際、心臓血管系は胚で発達する最初の器官系である。器官生成中と組織または腫瘍の発達中、成長細胞の循環系への近接は、血管と器官実質の調和した成長によって確保される。血管の発達と血管生成を調節することにより病気を予防または治療することは可能であろう。
【０００３】
血管は内皮細胞の内層とペリサイトまたは軟筋肉細胞の外層から構成される。最初の管状形成物は内皮細胞により形成され、続いてそれら内皮細胞はペリサイトと軟筋肉細胞を補充して該内皮細胞を外筒でおおう。中胚葉に由来する内皮前駆細胞の分散した集団から血管のｄｅ  ｎｏｖｏ形成を脈管形成と呼ぶ。この初生のネットワークは、発芽、分裂および再構築等の連続的な形態形成の事象を受けて、大きいものから分岐した小さな血管までの階層血管ネットワークを作る。これらの連続的な形態形成の事象をまとめて血管形成と呼ぶ。以前の研究は、血管の管生成と血管生成の発達を仲介する多くの内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）とそれらの同起源のリガンドを同定している。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーとそれらのレセプターは初期の胚血管網状組織の形成中に機能する一方で、アンギオポイエチン（Ａｎｇ）とそれらのレセプターＴｉｅ２、ならびにエフリンとそれらのＥｐｈレセプターがその後の再構築プロセスに関与する。血管生成およびリンパ管生成応答に関与するレセプターの概説については、例えば、非特許文献１を参照されたい。
【０００４】
Ｔｉｅ１とＴｉｅ２は、ほとんど内皮細胞と造血前駆細胞のみに発現するＲＴＫである。これらの二つのレセプターは、胚形成中に血管構造の正常な発達に必要とされる。これらの二つのＴｉｅレセプターは、他のＲＫＴファミリーメンバーとは異なり、細胞外ＥＧＦ相同ドメインを含むためにＲＴＫサブファミリーを形成する。例えば、非特許文献２および特許文献１を参照。マウスにおけるＴｉｅ１の標的化破壊は、広範な出血および欠陥のある微小血管完全性により特徴付けられる致死的表現型をもたらす。例えば、非特許文献３を参照されたい。Ｔｉｅ２のない胚は、周囲内皮支持細胞の不適切な動員からおこる血管再構築と成熟の欠陥を有する。アンギオポイエチン（Ａｎｇ）と呼ばれる少なくとも三つのリガンドがＴｉｅ２に関して同定されたが、Ｔｉｅ１のリガンドはまだ知られていない。Ａｎｇ１を欠如するマウスは血管発達の欠陥を示し、この欠陥はＴｉｅ２を欠如するマウスの欠陥を思い起こさせるが、それはＴｉｅ２を欠如するマウスの欠点よりも僅かに重篤ではない。Ａｎｇ１の結合はＴｉｅ２のチロシンリン酸化とそのシグナル経路の活性化を誘導するが、Ａｎｇ２は内皮細胞においてこれらの効果を中和することが報告されている。したがって、Ａｎｇ２のトランスジーンの過多発現はマウス胚の血管形成を破壊する。これまで、四種類のアンギオポイエチンと多くの関連タンパク質が発見されたが、それらのどれもがＴｉｅ１に結合するように思われない。
【特許文献１】国際公開第９３／１４１２４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  「Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」  （２００１）２：２５７
【非特許文献２】Ｐａｒｔａｎｅｎ  「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」  （１９９２）１２：１６９８
【非特許文献３】Ｐｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  「ＥＭＢＯ  Ｊ」  （１９９５）１４：５８８４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
一つの特徴において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列と軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。タンパク質はＴｉｅ１外部ドメインに結合する。例えば、タンパク質は、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和性ＫＤで結合する。
【０００６】
一実施態様において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のＣＤＲはヒト、霊長類、非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）または合成のものである。一実施態様において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のフレームワーク領域はヒト、霊長類または非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）のものである。
【０００７】
一実施態様において、重鎖は一つ以上の下記性質を含む：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１：
（ＡＧＳＲ）−Ｙ−（ＧＶＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＦ）（配列番号１１７）
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）；
ｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１２１）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）または
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）；
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３：
Ｖ−（４または５残基）−Ｆ−Ｄ−（Ｉ／Ｙ）（配列番号１２４）、
Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２５）、
（ＧＶ）−Ｎ−Ｙ−Ｙ−（ＧＹＤ）−Ｓ−（ＳＤ）−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２６）、
（ＧＶＤ）−（ＡＧＬＮ）−（ＬＹＲ）−（ＧＳＴＬＹＨ）−（ＧＹＤ）−（ＡＧＳＹＦＰ）−（ＳＦＤ）−（ＡＧＹＤ）−（ＩＹ）−（ＧＦＤ）−（ＹＤＰ）−（ＩＰ）−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２７）または
ＶＮＹＹＤＳＳＧＹＧＰＩＡＰＧＬＤＹ（配列番号１２８）。
【０００８】
一実施態様において、軽鎖は一つ以上の下記性質を含む：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−Ｘ１−Ｙ−Ｌ−（ＡＮ）（配列番号１２９）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｌ（配列番号１３０）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−（ＳＹ）−（ＬＹ）−（ＡＬＮ）（配列番号１３１）または
Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）（式中、Ｘ１はセリンであるか、または存在しなくてもよい）
ｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３３）（式中、Ｘはどのアミノ酸であってもよい）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３４）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３５）または
（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）；および
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）、
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３７）、
（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３８）、
Ｑ−Ｑ−（ＹＲ）−（ＧＳ）−Ｓ−（ＳＷ）−Ｐ−Ｒ−Ｘ１−Ｔ（配列番号１３９）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸でもよく、または存在しない）、
（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＴＩ）（配列番号１４０）または
（ＬＱ）−（ＬＲＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＡＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＳＶＲＰ）−（ＳＴＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＳＴＩ）（配列番号１４１）。
【０００９】
一実施態様において、軽鎖が一つ以上の下記性質を有する：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：
Ｓ−Ｘ−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１４２）または
Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸（例えば、ＧまたはＲ）であってよく、Ｘ２はどのアミノ酸（例えば、ＹまたはＮ）でもよく、Ｘ３はどのアミノ酸（例えば、Ｆ、ＮまたはＫ）でもよく、Ｘ４はどのアミノ酸（例えば、脂肪族、例えばＶまたはＡ）でもよい）；
ｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：
（ＤＥ）−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４４）、
（ＤＥ）−（ＶＤ）−（ＳＴＤＮ）−（ＹＲＤＮ）−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４５）；
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
（ＳＱ）−Ｓ−（ＳＹ）−（ＡＳＩＤ）−（ＧＳＲ）−（ＳＴ）−（ＳＴＲＮ）−（ＳＴＹＲ）−（ＡＴＬＹ）−（ＳＶＷＱ）（配列番号１４６）。
【００１０】
一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ２は下記のアミノ酸配列を含む：
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４７）または（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４８）。
【００１１】
一実施態様において、タンパク質は、ｐ−Ｆ３とＥ３の対応するＣＤＲ配列に関連するＨＣ  ＣＤＲ１とＨＣ  ＣＤＲ２配列を含む。例えば、タンパク質は、配列ＭＹＧＭ（配列番号１４９）をＨＣ  ＣＤＲ１に対応する位置に含む。この配列の後に小さいアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリンまたはセリンが続くことができる。別の例において、タンパク質は、配列ＶＩＳＰＳＧＧＸ１ＴＸ２ＹＡＤＳＡＶＫＧ（配列番号１５０）をＨＣ  ＣＤＲ２に対応する位置に含む。例えば、Ｘ１は親水性アミノ酸、例えばグルタミンまたはアスパラギンであってよい。例えば、Ｘ２は小さいアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリンまたはセリンであってよい。
【００１２】
一実施態様において、ＨＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲはここに記載の抗体のＨＣ可変ドメインにもマッチするモチーフにマッチする。同様に、一実施態様において、ＬＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲはここに記載の抗体のＬＣ可変ドメインにもマッチするモチーフにマッチする。さらに別の実施態様において、ＣＤＲのマッチしたモチーフは、ここに記載の抗体で対とされるＨＣとＬＣに基づく。
【００１３】
一実施態様において、Ｈ１とＨ２の超可変ループは、ここに記載の抗体と同じ基準構造を有する。一実施態様において、Ｌ１とＬ２の超可変ループはここに記載の抗体と同じ基準構造を有する。
【００１４】
一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列は少なくとも５個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも３、４または５個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１５、１６または１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１０、１２、１４、１５、１６または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１４、１５、１６または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも７または８個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５、６、７または８個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ３配列と同一である。
【００１５】
一実施態様において、ＨＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲはここに記載のモチーフにマッチして、該モチーフはここに記載のクローン、例えばＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣ可変ドメインにマッチするモチーフの組となる。例えば、タンパク質は配列番号１１８および配列番号１６０、例えばＥ３  ＨＣ可変ドメインにマッチするモチーフを含んでよい。
【００１６】
一実施態様において、ＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列は、少なくとも１０、１１または１２個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９、１０または１１個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施態様において、ＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも６または７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５、６または７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施態様において、ＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも８、９または１０個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９または１０個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣのＣＤＲ３配列と同一である。
【００１７】
一実施態様において、ＬＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲはここに記載のモチーフにマッチして、該モチーフが、ここに記載のクローン、例えばＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣ可変ドメインにマッチするモチーフの組となる。例えば、タンパク質は配列番号１３２、配列番号１３６および配列番号１６１、例えばＥ３  ＬＣ可変ドメインにマッチするモチーフを含んでよい。
【００１８】
一実施態様において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００１９】
一実施態様において、ＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００２０】
一実施態様において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０およびｓ−Ｈ４からなる群から選択されたクローンのＨＣおよびＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００２１】
一実施態様において、ＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメインの一つ以上のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４）のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメインの対応するフレームワーク領域に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００２２】
一実施態様において、軽鎖可変ドメイン配列はヒトのもの、またはヒトにおいて非免疫原性である。一実施態様において、重鎖可変ドメイン配列はヒトのもの、またはヒトにおいて非免疫原性である。
【００２３】
タンパク質は、Ｔｉｅ１を発現する細胞、例えば内皮細胞に結合することができる。一実施態様において、タンパク質は血小板（例えば、休止および／または活性化血小板）に実質的に結合しない（例えば検出可能に結合しない）。
【００２４】
一実施態様において、タンパク質はＨＵＶＥＣによる管形成をインビトロで阻害する。
【００２５】
一実施態様において、タンパク質は組織学的切片中のメラノーマ関連構造物、例えばメラノーマ組織のみならず、周囲構造物の抗原を認識する。一実施態様において、タンパク質は組織学的切片中の正常な皮膚の血管を染色しない。
【００２６】
一実施態様において、タンパク質はＴｉｅ１に特異的に結合し、例えば、該タンパク質は別のヒトタンパク質（例えば、Ｔｉｅ２、Ｉｇ様ドメイン、ＥＧＦ様ドメインまたはフィブロネクチンタイプＩＩＩリピートを有するＴｉｅ１以外の天然タンパク質、またはヒト血清アルブミン）に比較して、少なくとも１０、５０、１００、１０３または１０４倍優先的にＴｉｅ１に結合する。一実施態様において、タンパク質はここに記載のＴｉｅ１ドメインに結合する。
【００２７】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１の活性を調節するタンパク質（例えば、単離タンパク質）、例えばＴｉｅ１レセプターにより特徴付けられる。例えば、タンパク質は天然のものではない。一実施態様において、タンパク質はＨＣとＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。一実施態様において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のＣＤＲはヒト、霊長類、非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）または合成のものである。一実施態様において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のフレームワーク領域はヒト、霊長類または非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）のものである。別の実施態様において、タンパク質は免疫グロブリン可変ドメインを実質的に含まず、例えばタンパク質はＴｉｅ１に独立して相互作用するペプチドを含む。
【００２８】
一実施態様において、タンパク質はＴｉｅ１タンパク質の活性を活性化する。
【００２９】
一実施態様において、タンパク質は、Ｅ３抗体のＨＣとＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域において少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるドメインを含む。一実施態様において、タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合するか、またはＥ３により認識されるエピトープとオーバーラップするか、またはＥ３により認識されるエピトープと共通する少なくとも一つ、二つまたは三つの残基を有するエピトープに結合する。
【００３０】
一実施態様において、活性化タンパク質は、Ｔｉｅ１細胞外部ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメインを含むキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存性細胞がＩＬ−３の不在下において生存することを可能とする。
【００３１】
一実施態様において、タンパク質はＴｉｅ１の二量体化を引き起こすことができる。一実施態様において、タンパク質はＴｉｅ１のＲＴＫドメインの自己リン酸化を引き起こすことができる。
【００３２】
一実施態様において、タンパク質はＥ３抗体と共働して、Ｔｉｅの活性を活性化する。一実施態様において、タンパク質は、Ｇ２またはＣ７抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域において少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるドメインを含む。一実施態様において、タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＧ２またはＣ７と競合するか、またはＧ２またはＣ７により認識されるエピトープとオーバーラップするか、またはＧ２またはＣ７により認識されるエピトープと共通する少なくとも一つ、二つまたは三つの残基を有するエピトープに結合する。
【００３３】
別の実施態様において、タンパク質はＴｉｅ１タンパク質の活性を中和する。例えば、タンパク質は、Ｔｉｅタンパク質を刺激するＥ３抗体の能力を少なくとも部分的に阻害することができる。一実施態様において、タンパク質は、Ｔｉｅ１細胞外部ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメインを含むキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存性細胞がＩＬ−３の不在下において生存することを可能とするＥ３抗体の能力を少なくとも部分的に阻害することができる。
【００３４】
一実施態様において、タンパク質のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインは、Ｂ２またはＤ１１の各免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列に少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸ドメインを含む
一実施態様において、Ｔｉｅ１モジュレータータンパク質は、Ｂ２、Ｄ１１、Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３およびＰ−Ｃ６からなる群から選択される抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域において各抗体のＣＤＲ領域に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一である免疫グロブリンドメインを含む。例えば、タンパク質は、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和性ＫＤで結合する。
【００３５】
一実施態様において、タンパク質は、天然のＴｉｅ１結合タンパク質の能力がＴｉｅタンパク質と相互作用することを少なくとも部分的に阻害することができる。
【００３６】
タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００３７】
別の特徴において、本発明は、例えば、蛍光活性化細胞選別により検出されるように、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合するが、血小板には実質的に結合しない抗体（例えば、単離された抗体）により特徴付けられる。例えば、抗体は活性化血小板および／または休止血小板には実質的に結合しない。一実施態様において、抗体は内皮細胞に結合する。一実施態様において、タンパク質はモノクローナル抗体である。抗体は、他の特異性を有する他のＴｉｅ１結合抗体を含まない（例えば、血小板と結合するＴｉｅ１結合タンパク質を含まない）調製物中に提供することができる。抗体はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００３８】
別の特徴において、本発明は、Ｅ３抗体により安定化された立体配座のＴｉｅ１タンパク質に対して、未刺激状態の内因性Ｔｉｅ１タンパク質に対するよりも優先的に結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施態様において、タンパク質は免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施態様において、タンパク質は、Ｔｉｅ１に独立して結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのもの）を含む。例えば、ペプチドは一つ、二つまたは三つのジスルヒド結合を含むことができる。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００３９】
別の特徴において、本発明は、単量体Ｔｉｅ１タンパク質よりも優先的に二量体立体配座のＴｉｅ１タンパク質に結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施態様において、タンパク質は免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施態様において、タンパク質は、Ｔｉｅ１に独立して結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのもの）を含む。例えば、ペプチドは一つ、二つまたは三つのジスルヒド結合を含むことができる。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００４０】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインのエピトープに対して２×１０−７Ｍ未満のＫＤで結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。エピトープは、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４が結合したエピトープ、または少なくとも一つ、二つまたは三つの残基を共通して含むエピトープとオーバーラップするか、またはその中にあるか、またはそれを含む。例えば、タンパク質は１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和性ＫＤで結合する。一実施態様において、タンパク質は免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施態様において、タンパク質は、Ｔｉｅ１に独立して結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのもの）を含む。例えば、ペプチドは一つ、二つまたは三つのジスルヒド結合を含むことができる。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００４１】
別の特徴において、本発明は、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＴｉｅ１外部ドメインへの結合を競合的に阻害するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施態様において、タンパク質は免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施態様において、タンパク質は、Ｔｉｅ１に独立して結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのもの）を含む。例えば、ペプチドは一つ、二つまたは三つのジスルヒド結合を含むことができる。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００４２】
別の特徴において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列と軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつＴｉｅ１外部ドメインの活性を中和するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施態様において、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１は、Ｑ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｓ（配列番号１５１）またはＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ａ（配列番号１５２）（式中、Ｘはどのアミノ酸であってもよく、または任意に脂肪族、例えばイソロイシンまたはバリンである）を含む。一実施態様において、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ２は、Ａ−Ｓ−Ｘ１−Ｒ−Ｘ２−Ｔ（配列番号１５３）またはＤ−Ａ−Ｓ−Ｘ１−Ｒ−Ｘ２−Ｔ（配列番号１５４）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸であってもよく、または任意に親水性アミノ酸、例えばセリンまたはアスパラギンであり、Ｘ２はどのアミノ酸であってもよく、または任意に脂肪族または小さい脂肪族の例えばアラニンまたはバリンである）を含む。一実施態様において、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３は、Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２−Ｗ−Ｐ−Ｒ（配列番号１５５）またはＸ１−Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２−Ｗ−Ｐ−Ｒ−Ｔ（配列番号１５６）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸であってもよく、または任意にロイシンまたはグルタミンであり、Ｘ２はどのアミノ酸であってもよく、または任意にリジンまたはセリンである）を含む。
【００４３】
一実施態様において、Ｔｉｅ１に対する結合に関してＢ２および／Ｄ１１抗体と競合するか、またはＢ２および／またはＤ１１のＴｉｅ１に対する結合を競合的に阻害する。
【００４４】
一実施態様において、タンパク質はＥ３抗体により刺激されたＴｉｅ１活性を中和する。一実施態様において、タンパク質はＴｉｅ１の二量体化を阻害する。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００４５】
別の特徴において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列と軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離された単一特異的タンパク質により特徴付けられ、該タンパク質がＴｉｅ１外部ドメインに結合し、かつヒトまたは非マウス定常ドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１、２、３または４の定常ドメイン）を含む。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００４６】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合する単離されたヒト抗体により特徴付けられる。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００４７】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合し、かつ起源が非ヒトであって５、４、３または２未満のペプチド（長さが６〜９アミノ酸のもの）または潜在的なヒトＴ細胞エピトープである５、４、３または２未満のペプチドを含む単離された抗体（例えば、単離された抗体）により特徴付けられる。一実施態様において、抗体は、起源が非ヒトであるか、または潜在的なヒトＴ細胞エピトープであるペプチド（長さが６〜９アミノ酸のもの）は含まない。
【００４８】
一実施態様において、抗体は脱免疫化を含む方法により得られる。例えば、抗体は脱免疫化、例えば完全に脱免疫化されている。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００４９】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合し、かつ修飾Ｆｃドメイン、例えば修飾ヒトＦｃドメインを含む単離された抗体により特徴付けられる。例えば、抗体は、例えばＦｃ機能を変える修飾を含んでよい。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を一つ以上の残基、例えば米国第５，６４８，２６０号の番号に従う、例えば残基２３４と２３７の一つ以上において変異できる。他の例示的な修飾は米国第５，６４８，２６０号に記載されたものを含む。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００５０】
別の特徴において、本発明は、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和性ＫＤでＴｉｅ１レセプターに結合する単離されたタンパク質により特徴付けられる。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００５１】
別の特徴において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列と軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質により特徴付けられ、該タンパク質がＴｉｅ１外部ドメインに結合し、かつ例えば、非霊長類ＣＤＲ（例えば、非マウスまたは非ウサギＣＤＲ）または合成ＣＤＲである少なくとも一つ以上のＣＤＲを含む。タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００５２】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１に結合する抗原結合タンパク質の免疫グロブリンＨＣ可変ドメインを含むポリペプチドをコードするコード配列を含む単離された核酸により特徴付けられる。一実施態様において、ＨＣ可変ドメインは一つ以上の下記の特徴を有する。
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１：
（ＡＧＳＲ）−Ｙ−（ＧＶＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＦ）（配列番号１１７）、
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）；
ｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１２１）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）；
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３：
Ｖ−（４または５残基）−Ｆ−Ｄ−（Ｉ／Ｙ）（配列番号１２４）、
Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２５）、
（ＧＶ）−Ｎ−Ｙ−Ｙ−（ＧＹＤ）−Ｓ−（ＳＤ）−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２６）、
（ＧＶＤ）−（ＡＧＬＮ）−（ＬＹＲ）−（ＧＳＴＬＹＨ）−（ＧＹＤ）−（ＡＧＳＹＦＰ）−（ＳＦＤ）−（ＡＧＹＤ）−（ＩＹ）−（ＧＦＤ）−（ＹＤＰ）−（ＩＰ）−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２７）または
ＶＮＹＹＤＳＳＧＹＧＰＩＡＰＧＬＤＹ（配列番号１２８）。
【００５３】
一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列は少なくとも５個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも３、４または５個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１５、１６または１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１０、１２、１４、１５、１６または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１４、１５、１６または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも７または８個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５、６、７または８個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ３配列と同一である。
【００５４】
一実施態様において、ＨＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲはここに記載のモチーフにマッチして、該モチーフは、ここに記載のクローン、例えばＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣ可変ドメインにマッチするモチーフの組となる。
【００５５】
一実施態様において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００５６】
一実施態様において、核酸は、免疫グロブリンＬＣ可変ドメイン、例えば、ここに記載のＬＣドメイン等のポリペプチドをコードする第二コード配列をさらに含む。一実施態様において、核酸はさらにコード配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。
【００５７】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１に結合する抗原結合タンパク質の免疫グロブリンＬＣ可変ドメイン等のポリペプチドをコードするコード配列等の単離された核酸により特徴付けられる。一実施態様において、ＬＣ可変ドメインとしては、下記の一つ以上の特徴を有する：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−Ｘ１−Ｙ−Ｌ−（ＡＮ）（配列番号１２９）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｌ（配列番号１３０）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−（ＳＹ）−（ＬＹ）−（ＡＬＮ）（配列番号１３１）または
Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）（式中、Ｘ１はセリンであるか、または存在しなくてもよい）；
ｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３３）（式中、Ｘはどのアミノ酸であってもよい）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３４）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３５）または
（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）；および
ｉｉｉ）以下のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３７）、
（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３８）、
Ｑ−Ｑ−（ＹＲ）−（ＧＳ）−Ｓ−（ＳＷ）−Ｐ−Ｒ−Ｘ１−Ｔ（配列番号１３９）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸でもよく、または存在しない）、
（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＴＩ）（配列番号１４０）または
（ＬＱ）−（ＬＲＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＡＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＳＶＲＰ）−（ＳＴＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＳＴＩ）（配列番号１４１）。
【００５８】
一実施態様において、軽鎖は下記の一つ以上の特徴を有する：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：
Ｓ−Ｘ−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列場号１４２）または
Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸（例えばＧまたはＲ）であってもよく、Ｘ２はどのアミノ酸（例えば、ＹまたはＮ）であってもよく、Ｘ３はどのアミノ酸（例えば、Ｆ、ＮまたはＫ）であってもよく、Ｘ４はどのアミノ酸（例えば、脂肪族、例えば、ＶまたはＡ）であってもよい）；
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：
（ＤＥ）−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４４）
（ＤＥ）−（ＶＤ）−（ＳＴＤＮ）−（ＹＲＤＮ）−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４５）；
ｖ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
（ＳＱ）−Ｓ−（ＳＹ）−（ＡＳＩＤ）−（ＧＳＲ）−（ＳＴ）−（ＳＴＲＮ）−（ＳＴＹＲ）−（ＡＴＬＹ）−（ＳＶＷＱ）（配列番号１４６）。
【００５９】
一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ２は下記のアミノ酸配列を含む：
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４７）または（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４８）。
【００６０】
一実施態様において、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１は、Ｑ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｓ（配列番号１５１）またはＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ａ（配列番号１５２）（式中、Ｘはどのアミノ酸であってもよく、または任意に脂肪族、例えばイソロイシンまたはバリンである）を含む。一実施態様において、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ２は、Ａ−Ｓ−Ｘ１−Ｒ−Ｘ２−Ｔ（配列番号１５３）またはＤ−Ａ−Ｓ−Ｘ１−Ｒ−Ｘ２−Ｔ（配列番号１５４）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸であってもよく、または任意に親水性アミノ酸、例えばセリンまたはアスパラギンであり、Ｘ２はどのアミノ酸であってもよく、または任意に脂肪族または小さい脂肪族の例えばアラニンまたはバリンである）を含む。一実施態様において、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３は、Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２−Ｗ−Ｐ−Ｒ（配列番号１５５）またはＸ１−Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２−Ｗ−Ｐ−Ｒ−Ｔ（配列番号１５６）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸であってもよく、または任意にロイシンまたはグルタミンであり、Ｘ２はどのアミノ酸であってもよく、または任意にリジンまたはセリンである）を含む。
【００６１】
一実施態様において、ＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列は、少なくとも１０、１１または１２個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９、１０または１１個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施態様において、ＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも６または７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５、６または７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施態様において、ＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも８、９または１０個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９または１０個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣのＣＤＲ３配列と同一である。
【００６２】
一実施態様において、ＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００６３】
一実施態様において、さらに核酸は、免疫グロブリンＨＣ可変ドメイン、例えばここに記載のＨＣドメイン等のポリペプチドをコードする第二のコード配列を含む。一実施態様において、核酸はさらにコード配列に作動可能に連結させたプロモーターを含む。
【００６４】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１に結合する抗原結合タンパク質の免疫グロブリンＨＣまたはＬＣ可変ドメインを集合的に含む一つ以上のポリペプチド鎖をコードする一つ以上のコード配列を含む核酸により特徴付けられる。一実施態様において、少なくとも一つの可変ドメインをコードする核酸セグメントは、ここに記載の核酸に対して、例えばストリンジェントな条件（例えば、高ストリンジェンシー条件）下でハイブリダイズする。核酸はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００６５】
別の特徴において、本発明は、抗原結合タンパク質のＨＣ可変ドメイン等のポリペプチドをコードする第一核酸配列と抗原結合タンパク質のＬＣ可変ドメイン等のポリペプチドをコードする第二核酸配列を有する宿主細胞を特徴とし、該抗原結合タンパク質がＴｉｅ１に対して２×１０−７Ｍ未満のＫＤで結合する。一実施態様において、ＨＣまたはＬＣ可変ドメインは少なくとも一つのヒトＣＤＲを含む。抗原結合タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００６６】
別の特徴において、本発明は、ＨＣ可変ドメイン等のポリペプチドをコードする第一核酸配列とＬＣ可変ドメイン等のポリペプチドをコードする第二核酸配列を有する宿主細胞を特徴とし、ＨＣ可変ドメインとＬＣ可変ドメインのそれぞれが、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０およびｓ−Ｈ４からなる群から選択されたクローンのＨＣ可変ドメインとＬＣ可変ドメインの各アミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である配列を有する。抗原結合タンパク質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００６７】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１と相互作用するここに記載のタンパク質と薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物により特徴付けられる。
【００６８】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１と相互作用するここに記載のタンパク質を含む、無菌かつ被験体への投与に適する薬学的組成物により特徴付けられる。
【００６９】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１細胞外部ドメインおよびシグナルを作ることのできる異種の細胞内配列を含むキメラレセプターを発現するシグナル依存またはシグナル応答細胞を提供する工程；候補化合物を該細胞に接触させる工程；シグナルに依存する細胞の性質を評価する工程を含む方法により特徴付けられる。一実施態様において、細胞内配列はＥｐｏＲタンパク質の細胞内配列の少なくとも一領域を含む。該方法は、例えば候補化合物の活性または複数の化合物を評価するために用いることができる。
【００７０】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１細胞外部ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメインを含むキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存細胞を提供する工程；候補化合物を該細胞に、ＩＬ−３の濃度が細胞の生存度を保持するのに十分ではない条件下に接触させる工程；細胞の性質を評価する工程を含む方法により特徴付けられる。該方法は、例えば候補化合物の活性または複数の化合物を評価するために用いることができる。一実施態様において、該性質は生存度である。一実施態様において、評価はＭＴＴアッセイを含む。一実施態様において、該方法はさらに候補化合物を被験体に投与することを含む。例えば、候補化合物として、タンパク質、例えば免疫グロブリン可変ドメインを含むタンパク質が挙げられる。
【００７１】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１活性を調節する化合物を同定する方法により特徴付けられる。該方法は、複数の候補化合物を提供する工程、ここに記載の方法を用いて複数の候補化合物をそれぞれ評価する工程を含む。
【００７２】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１細胞外部ドメインの一領域および異種の細胞内配列を含むキメラ膜貫通タンパク質を発現する培養細胞により特徴付けられる。一実施態様において、細胞内配列はＥｐｏＲ細胞内ドメインの一領域を含む。一実施態様において、細胞は生存のためにＩＬ−３またはＴｉｅ１を必要とする。例えば、細胞はキメラ膜貫通タンパク質の不存在下にＩＬ−３依存性であるが、Ｅ３抗体の存在下とＩＬ−３の不存在下に生存できる。
【００７３】
別の特徴において、本発明は、単離哺乳類細胞（例えば、Ｔｉｅ１細胞外部ドメインの一領域および異種の細胞内配列を含むキメラ膜貫通タンパク質を発現する細胞）とＴｉｅ１結合リガンドを含む調製物において、該Ｔｉｅ１結合リガンドが細胞の生存度を保持するのに必要であることを特徴とする調製物により特徴付けられる。
【００７４】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１結合リガンドと、Ｔｉｅ１細胞外部ドメインの一領域および異種の細胞内配列を含むキメラ膜貫通タンパク質を発現する培養細胞とを含むキットにより特徴付けられる。
【００７５】
別の特徴において、本発明は候補化合物の評価方法により特徴付けられる。本方法は、（ｉ）（ａ）Ｔｉｅ１細胞外部ドメインの一領域とキナーゼドメインとを含む不溶性タンパク質と（ｂ）ＡＴＰとを含む細胞または膜画分；（ｉｉ）キナーゼドメインの活性を変えるリガンド；および（ｉｉｉ）候補化合物を含む調製物を提供する工程、ならびに該不溶性タンパク質のリン酸化状態を評価する工程を含む。
【００７６】
別の特徴において、本発明は候補化合物の評価方法により特徴付けられる。本方法は、（ｉ）Ｔｉｅ１細胞外部ドメインの少なくとも一領域を含むＴｉｅ１タンパク質または膜貫通タンパク質とＡＴＰとを含む細胞または膜画分；（ｉｉ）Ｔｉｅ１または膜貫通タンパク質の自己リン酸化を引き起こすリガンド；および（ｉｉｉ）候補化合物を含む調製物を提供する工程、ならびにＴｉｅ１タンパク質のリン酸化状態を評価する工程を含む。
【００７７】
一実施態様において、リガンドは抗体である。一実施態様において、リガンドは、Ｅ３抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲ領域において少なくとも９０％同一であるドメインを含む。一実施態様において、該方法はさらに候補化合物を被験体に投与することからなる。
【００７８】
別の特徴において、本発明は、（ｉ）Ｔｉｅ１細胞外部ドメインの少なくとも一領域を含む膜貫通タンパク質とＡＴＰを含む細胞または膜分画；および（ｉｉ）Ｔｉｅ１または膜貫通タンパク質の自己リン酸化を引き起こすリガンドを含む調製物を提供する工程；および膜貫通タンパク質のリン酸化状態を評価する工程を含む方法により特徴付けられる。
【００７９】
別の特徴において、本発明は、（ｉ）Ｔｉｅ１自己リン酸化を刺激することができ、および／または（ｉｉ）Ｔｉｅ１細胞外部ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメインを含むキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存細胞が、ＩＬ−３の濃度が該細胞の生存度を保持するのに不十分な条件で生存可能とさせることのできるリガンドを哺乳類細胞に接触させる工程；そして哺乳類細胞を評価する工程を含む方法により特徴付けられる。一実施態様において、細胞は内因性Ｔｉｅ１タンパク質を発現する。一実施態様において、細胞は内皮細胞である。一実施態様において、本方法はさらに、哺乳類細胞をリガンド以外の試験化合物に接触させる工程を含む。例えば、リガンドは抗体である。例えば、リガンドは、Ｅ３抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲ領域において少なくとも９０％同一であるドメインを含む。
【００８０】
別の特徴において、本発明は、哺乳類細胞またはその画分を、Ｔｉｅ１の活性を調節することのできる作用物質に接触させる工程；そして哺乳類細胞またはその画分を評価する工程を含む方法により特徴付けられる。一実施態様において、該作用物質を、細胞が生きている間に細胞に接触させ、その評価は細胞の画分を単離する工程を含む。一実施態様において、該作用物質はタンパク質、例えば抗体またはペプチドである。一実施態様において、該作用物質は、Ｅ３抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域中でＥ３抗体に対して少なくとも９０％同一であるドメインを含む。一実施態様において、該作用物質は、Ｂ２またはＤ１１抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域中でＢ２またはＤ１１抗体に対して少なくとも９０％同一であるドメインを含む。一実施態様において、該作用物質は、Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３またはＰ−Ｃ６抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域中でＡ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３またはＰ−Ｃ６抗体に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるドメインを含む。一実施態様において、該作用物質は、Ｇ２またはＣ７抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域中でＧ２またはＣ７抗体に対して少なくとも９０％同一であるドメインを含む。該作用物質はここに記載の他の特徴を有することができる。
【００８１】
別の特徴において、本発明は試験化合物の評価方法により特徴付けられる。本方法は、Ｔｉｅ１の活性を調節することのできる作用物質と、試験化合物の存在下にＴｉｅ１細胞外部ドメインの少なくとも一領域を含むタンパク質との相互作用を評価する工程を含む。一実施態様において、該作用物質は、８０００、７０００、６０００、５０００または３０００ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物である。例えば、その評価は、Ｔｉｅ１細胞外部ドメインの少なくとも一領域を含むタンパク質を含む細胞を、試験化合物の存在下に該作用物質と接触させる工程を含む。別の例において、その評価は、Ｔｉｅ１細胞外部ドメインの少なくとも一領域を含むタンパク質、該作用物質および試験化合物を含む無細胞調製物を形成することを含む。
【００８２】
別の特徴において、本発明は、（ｉ）Ｔｉｅ１細胞外部ドメインを含むタンパク質および（ｉｉ）Ｔｉｅ１の活性に対して刺激または中和することのできるリガンドを含む人工タンパク質複合体により特徴付けられる。一実施態様において、リガンドは抗体（例えばここに記載の抗体）である。例えば、リガンドとして、Ｅ３、Ｂ２、Ｄ１１、Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３、Ｐ−Ｃ６、Ｇ２およびＣ７からなる群から選択される抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域において各抗体のＣＤＲ領域に対して少なくとも９０％同一である免疫グロブリンドメインが挙げられる。一実施態様において、複合体は膜分画中または哺乳類細胞上に存在する。
【００８３】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１と相互作用するタンパク質（例えば、ここに記載のタンパク質）を含む組成物を、被験体の血管形成を調節（例えば、減少または増加）するのに有効な量で被験体に投与する工程を含む方法により特徴付けられる。
【００８４】
例えば、タンパク質は、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和性ＫＤで結合する。
【００８５】
一実施態様において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のＣＤＲはヒト、霊長類、非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）または合成のものである。一実施態様において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のフレームワーク領域はヒト、霊長類または非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）のものである。
【００８６】
一実施態様において、重鎖は一つ以上の下記性質を含む：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１：
（ＡＧＳＲ）−Ｙ−（ＧＶＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＦ）（配列番号１１７）
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）；
ｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１２１）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）または
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）；
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３：
Ｖ−（４または５残基）−Ｆ−Ｄ−（Ｉ／Ｙ）（配列番号１２４）、
Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２５）、
（ＧＶ）−Ｎ−Ｙ−Ｙ−（ＧＹＤ）−Ｓ−（ＳＤ）−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２６）、
（ＧＶＤ）−（ＡＧＬＮ）−（ＬＹＲ）−（ＧＳＴＬＹＨ）−（ＧＹＤ）−（ＡＧＳＹＦＰ）−（ＳＦＤ）−（ＡＧＹＤ）−（ＩＹ）−（ＧＦＤ）−（ＹＤＰ）−（ＩＰ）−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２７）または
ＶＮＹＹＤＳＳＧＹＧＰＩＡＰＧＬＤＹ（配列番号１２８）。
【００８７】
一実施態様において、軽鎖は一つ以上の下記性質を含む：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−Ｘ１−Ｙ−Ｌ−（ＡＮ）（配列番号１２９）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｌ（配列番号１３０）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−（ＳＹ）−（ＬＹ）−（ＡＬＮ）（配列番号１３１）または
Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）（式中、Ｘ１はセリンであるか、または存在しなくてもよい）；
ｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３３）（式中、Ｘはどのアミノ酸であってもよい）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３４）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３５）または
（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）；および
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３７）、
（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３８）、
Ｑ−Ｑ−（ＹＲ）−（ＧＳ）−Ｓ−（ＳＷ）−Ｐ−Ｒ−Ｘ１−Ｔ（配列番号１３９）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸でもよく、または存在しない）、
（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＴＩ）（配列番号１４０）または
（ＬＱ）−（ＬＲＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＡＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＳＶＲＰ）−（ＳＴＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＳＴＩ）（配列番号１４１）。
【００８８】
一実施態様において、軽鎖は一つ以上の下記性質を含む：
ｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：
Ｓ−Ｘ−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１４２）または
Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）（式中、Ｘ１はどのアミノ酸（例えば、ＧまたはＲ）であってよく、Ｘ２はどのアミノ酸（例えば、ＹまたはＮ）でもよく、Ｘ３はどのアミノ酸（例えば、Ｆ、ＮまたはＫ）でもよく、Ｘ４はどのアミノ酸（例えば、脂肪族、例えばＶまたはＡ）でもよい）；
ｉｉｉ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：
（ＤＥ）−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４４）、
（ＤＥ）−（ＶＤ）−（ＳＴＤＮ）−（ＹＲＤＮ）−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４５）；
ｖ）下記のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
（ＳＱ）−Ｓ−（ＳＹ）−（ＡＳＩＤ）−（ＧＳＲ）−（ＳＴ）−（ＳＴＲＮ）−（ＳＴＹＲ）−（ＡＴＬＹ）−（ＳＶＷＱ）（配列番号１４６）
一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ２は下記のアミノ酸配列を含む：
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４７）または（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４８）。
【００８９】
一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列は、少なくとも５個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも３、４または５個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１５、１６または１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１０、１２、１４、１５、１６または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１４、１５、１６または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも７または８個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５、６、７または８個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣのＣＤＲ３配列と同一である。
【００９０】
一実施態様において、ＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列は、少なくとも１０、１１または１２個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９、１０または１１個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施態様において、ＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも６または７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５、６または７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施態様において、ＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも８、９または１０個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９または１０個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣのＣＤＲ３配列と同一である。
【００９１】
一実施態様において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００９２】
一実施態様において、ＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００９３】
一実施態様において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０およびｓ−Ｈ４からなる群から選択されたクローンのＨＣおよびＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００９４】
一実施態様において、ＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメインの一つ以上のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４）のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のＨＣおよびＬＣ可変ドメインの対応するフレームワーク領域に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一である。
【００９５】
一実施態様において、軽鎖可変ドメイン配列はヒトのもの、またはヒトにおいて非免疫原性である。一実施態様において、重鎖可変ドメイン配列はヒトのもの、またはヒトにおいて非免疫原性である。
【００９６】
タンパク質はＴｉｅ１を発現する細胞、例えば内皮細胞に結合することができる。一実施態様において、タンパク質は血小板に実質的に結合しない（例えば検出可能に結合しない）。
【００９７】
一実施態様において、タンパク質はＴｉｅ１に特異的に結合し、例えば、該タンパク質は別のヒトタンパク質（例えば、Ｔｉｅ２、Ｉｇ様ドメイン、ＥＧＦ様ドメインまたはフィブロネクチンタイプＩＩＩリピートを有するＴｉｅ１以外の天然タンパク質、またはヒト血清アルブミン）に対してよりもＴｉｅ１に対して少なくとも１０、５０、１００、１０３または１０４倍優先的に結合する。一実施態様において、タンパク質はここに記載のＴｉｅ１ドメインに結合する。
【００９８】
一実施態様において、タンパク質は局所的に運ばれる。一実施態様において、タンパク質は全身に運ばれる。
【００９９】
一実施態様において、被験体は、低減した血管形成を必要とするか、またはそのように同定されている。例えば、被験体は血管形成関連疾患を有する。別の例において、被験体は腫瘍疾患、例えば、転移性癌を有する。例えば、被験体は血管形成に依存する癌または腫瘍を有する。
【０１００】
別の実施態様において、被験体は炎症性疾患、例えばリュウマチ性関節炎または乾癬を有する。
【０１０１】
一実施態様において、タンパク質を、血管の発芽、分裂および再構築の活性の一つ以上を低減するのに有効な量で投与する。一実施態様において、タンパク質は脈管形成または細管形成を低減させるのに有効な量で投与する。
【０１０２】
一実施態様において、該方法は、投与前に、被験体を、低減血管形成を必要とする被験体として同定することを含む。一実施態様において、さらに該方法はタンパク質を連続的または別々のボーラスにて投与することを含む。一実施態様において、さらに該方法は被験体を投与期間中モニターすることを含む。例えば、モニターすることは被験体において血管を（全体にわたるか部分的に）画像化することを含む。例えば、画像化は、前記タンパク質を被験体に投与するか、または異なるＴｉｅ１結合リガンドを投与することを含む。
【０１０３】
別の特徴において、本発明は、ここに記載のタンパク質（例えば、Ｔｉｅ１活性を減少させるタンパク質）を含む組成物を、被験体のＴｉｅ１活性を減少させるのに有効な量で被験体に投与することを含む方法により特徴付けられる。該方法はここに記載の他の特徴を有することができる。
【０１０４】
別の特徴において、本発明は、ここに記載のタンパク質（例えば、Ｔｉｅ１活性を増加させるタンパク質）を含む組成物を、被験体のＴｉｅ１活性を増加させるのに有効な量で被験体に投与することを含む方法により特徴付けられる。該方法はここに記載の他の特徴を有することができる。
【０１０５】
一実施態様において、組成物は、例えば創傷に局所的に投与する。例えば、被験体は創傷治癒（例えば、火傷、裂傷または手術）の処置を必要とする。
【０１０６】
一実施態様において、該方法は、Ｅ３抗体の一つ以上のＣＤＲを含む第一抗体とＧ２またはＣ７抗体の一つ以上のＣＤＲを含む第二抗体を投与することを含む。
【０１０７】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１活性を調節するここに記載のタンパク質を含む組成物を、被験体のＴｉｅ１活性を調節させるのに有効な量で被験体に投与することを含む方法により特徴付けられる。一実施態様において、該方法は共にＴｉｅ１に相互作用する第一および第二タンパク質を投与することを含む。例えば、Ｔｉｅ１活性を刺激する第一タンパク質とＴｉｅ１活性を中和する第二タンパク質を投与して、例えば活性を正確に滴定する。例えば、第一と第二タンパク質を異なる場所に投与して、別の領域に影響を与えることなく一つの領域の血管形成を阻害することができる。
【０１０８】
一実施態様において、第一タンパク質と第二タンパク質を別々に投与する。別の実施態様において、第一タンパク質と第二タンパク質を組み合わせて投与する。該方法はここに記載の他の特徴を有することができる。
【０１０９】
別の特徴において、本発明は、ここに記載のタンパク質（例えば、Ｔｉｅ１の活性を調節できるタンパク質）を含む組成物を、被験体の内皮細胞の活性を調節するのに有効な量で被験体に投与することを含む方法により特徴付けられる。一実施態様において、タンパク質は循環中に供給される。
【０１１０】
一実施態様において、本組成物は、内皮細胞を治療に対して感作させ、感作させた内皮細胞を阻害、死滅、剥離またはその他の方法で停止する被験体に治療を提供するのに有効である。
【０１１１】
別の特徴において、本発明は、（ｉ）サンプル（および任意に、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）を、Ｔｉｅ１に結合するタンパク質、例えばここに記載のタンパク質を、Ｔｉｅ１結合リガンドとＴｉｅ１タンパク質の相互作用が起こる条件下に接触させる工程；そして（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合リガンドとサンプル（および任意に、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）との間の複合体の形成を検出する工程を含む方法により特徴付けられる。
【０１１２】
別の特徴において、本発明は、（ｉ）被験体（および任意に、コントロール被験体）にＴｉｅ１結合リガンド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を、Ｔｉｅ１結合リガンドとＴｉｅ１タンパク質の相互作用が起こる条件下に投与する工程；そして（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合リガンドと被験体のＴｉｅ１分子との間の複合体の形成を検出するか、または被験体中のＴｉｅ１結合リガンドの分布またはＴｉｅ１結合リガンドの少なくとも一つの位置を検出する工程を含む方法により特徴付けられる。一実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドはＴｉｅ１の活性を調節しない。Ｔｉｅ１結合リガンドはここに記載のタンパク質であることができる。一実施態様において、リガンドは活性化Ｔｉｅ１を検出する。
【０１１３】
Ｔｉｅ１に結合する抗体は好ましくは単一特異的、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である。例えば、抗体は生細胞上のＴｉｅ１、例えば内因性Ｔｉｅ１分子または異種核酸から発現するＴｉｅ１分子を認識することができる。一実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドは主要な内皮細胞と相互作用する。「単一特異的抗体」との用語は、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性と親和性を示す抗体をいう。この用語は、単一の分子種として、例えば均一な単離細胞の集団から作られる抗体をいう「モノクローナル抗体」を含む。「モノクローナル抗体組成物」とは抗体の単一分子種を含む組成物中の抗体またはその断片の調製物をいう。一実施態様において、モノクローナル抗体は哺乳類細胞により作られる。一種類以上のモノクローナル抗体種を組み合わせてよい。
【０１１４】
Ｔｉｅ１結合抗体は全長（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤおよびＩｇＥ）であってよく、または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでよく、例えばＦｃドメインまたはＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４配列を含まない。抗体は二つの重鎖免疫グロブリンと二つの軽鎖免疫グロブリンを含むことができ、または単一鎖抗体であってよい。抗体は、任意にカッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロンまたはミュー定常領域遺伝子から選択される定常領域を含むことができる。Ｔｉｅ１結合抗体は、実質的にヒト抗体からの重鎖および軽鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域またはその一部を含むことができる。ここで用いる「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。
【０１１５】
一実施態様において、抗体（またはその断片）は組換え抗体または修飾抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫化またはインビトロ生成抗体である。ここに用いる「組換え」または「修飾」ヒト抗体は、組換え手段により調製、発現、作成または単離したすべての抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組換えのコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離した抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他ＤＮＡ配列へのスプライシングをともなう他の手段により調製、発現、作成または単離した抗体を含むことが意図される。そのような組換え抗体は、ヒト化、ＣＤＲグラフト化、キメラ、脱免疫化、インビトロ生成抗体を含み、任意にヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含んでよい。
【０１１６】
一実施態様において、該抗体は、Ｔｉｅ１に結合する公知のモノクローナル抗体、例えばＷＯ９５／２６３６４に記載された抗体、例えば３Ｃ４Ｃ７Ｇ６および１０Ｆ１１Ｇ６が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。別の実施態様において、抗体は、Ｔｉｅ１に結合する公知のモノクローナル抗体、例えば、３Ｃ４Ｃ７Ｇ６および１０Ｆ１１Ｇ６とは競合しない。さらに別の実施態様において、抗体はここに記載のリガンドとは競合しない。
【０１１７】
ここに開示されたリガンドのオーバーラップするエピトープに結合するか、または該リガンドのＴｉｅ１への結合を競合的に阻害する抗体または他のリガンドは本発明の範囲内にある。例えば、抗体または他のリガンドは、単一特異的な抗体、例えば、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４のオーバーラップするエピトープに結合するか、または該抗体のＴｉｅ１への結合を競合的に阻害するか、またはその逆である（例えば、リガンドの結合を競合的に阻害する単一特異的な抗体）。オーバーラップするエピトープは共通する少なくとも一つのアミノ酸を含む。互いの結合を競合的に阻害するリガンドはオーバーラップするエピトープに必ずしも結合しない。例えば、それらは立体的な干渉により、またはＴｉｅ１の立体配座を変えることにより結合を阻害するだろう。
【０１１８】
Ｔｉｅ１結合リガンドの任意の組合せ、例えば、Ｔｉｅ１の異なる領域に結合する二つ以上の抗体、例えば、Ｔｉｅ１の細胞外部ドメイン上の二つの異なるエピトープに結合する抗体、例えば、二重特異性抗体の組み合わせは本発明の範囲内にある。
【０１１９】
一実施態様において、Ｔｉｅ１結合抗体またはその抗原結合断片は少なくとも一つの軽鎖または重鎖の免疫グロブリン（または好ましくは少なくとも一つの軽鎖免疫グロブリンおよび少なくとも一つの重鎖免疫グロブリン）を含む。好ましくは、各免疫グロブリンは、抗Ｔｉｅ１軽鎖または重鎖の可変領域のそれぞれ、すなわち、ここに記載の抗体、例えばＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４の可変領域由来のＣＤＲに実質的に同一である少なくとも一つ、二つ、および好ましくは三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖または重鎖の可変領域を含む。
【０１２０】
ここに記載のＴｉｅ１結合リガンドは単独で用いることができ、例えば、被験体に投与でき、または非誘導体化または非複合型でインビトロに用いることができる。他の実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドは、誘導体化、修飾または別の官能性分子、例えば別のポリペプチド、タンパク質、同位体、細胞または不溶性支持体に結合させることができる。例えば、Ｔｉｅ１結合リガンドは１つ以上の他の分子の実体、とりわけ例えば抗体（例えば、リガンドが二特異的または多特異的抗体を形成する抗体である場合）、毒素、放射性同位元素、治療（例えば、細胞毒性または細胞増殖抑制）剤または部分に機能的に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有的会合またはそれ以外によって）連結することができる。例えば、Ｔｉｅ１結合リガンドは放射性イオン（例えば、α−、γ−またはβ−エミッター）、例えばヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、レニウム（１８６Ｒｅ）またはビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）に連結できる。
【０１２１】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメイン、例えばここに記載の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインを含むポリペプチドをコードするコード配列を含む核酸により特徴付けられる。例えば、核酸として、ここに記載の特定の核酸配列、またはここに記載の核酸配列に少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である核酸、またはここに記載の核酸配列（例えば、特定の核酸配列）に特異的にハイブリダイズする（例えば、ここに記載の条件下で）核酸、またはその断片（例えば、ＣＤＲをコードする断片）を挙げることができる。
【０１２２】
ここに記載の核酸はさらにコード配列に作動可能に連結させたプロモーターを含むことができる。核酸は第一および第二のコード配列を含むことができ、例えば、ここで第一のコード配列は免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードし、第二のコード配列は免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。
【０１２３】
別の特徴において、本発明は、重鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第一核酸と軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第二核酸を有する宿主細胞により特徴付けられる。重鎖可変領域と軽鎖可変領域は会合してＴｉｅ１結合タンパク質を形成することができる。これらの可変領域はここに記載の一つ以上の性質、例えばここに記載の配列に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有することができる。また、本発明はＴｉｅ１結合抗体を提供する方法を含む。本方法は、ここに記載の宿主細胞を提供する工程；そして第一と第二の核酸を、軽鎖と重鎖の可変領域の集合物がＴｉｅ１と相互作用する抗原結合タンパク質を形成する条件下で宿主細胞中に発現させる工程を含み得る。
【０１２４】
別の特徴において、本発明は組成物、例えば、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤およびここに記載の少なくとも一つのＴｉｅ１結合リガンド（例えば、抗体またはその断片）を含む薬学的組成物を提供する。一実施態様において、組成物、例えば薬学的組成物は二つ以上の上記Ｔｉｅ１結合リガンドの組合せを含む。
【０１２５】
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１結合抗体（またはその断片）、例えばここに記載のＴｉｅ１結合抗体（またはその断片）を単独で使用するため、または他の治療モダリティーと組み合わせて、例えば細胞毒性剤または標識剤、例えば、ここに記載の細胞毒性剤または標識剤と組み合わせて使用するための、Ｔｉｅ１関連疾患、例えば内皮細胞関連疾患、例えばリューマチ性関節炎または転移性癌の治療、予防または検出のための、Ｔｉｅ１抗体またはそのような作用物質の組合せの使用説明書とともに含むキットにより特徴付けられる。
【０１２６】
別の特徴において、Ｔｉｅ１に結合するタンパク質リガンドは、免疫グロブリンではないポリペプチドである。例えば、ポリペプチドは多様な長さ、例えば４〜１００アミノ酸残基の長さ、好ましくは５〜７５、６〜５０または７〜４０アミノ酸残基の長さ、さらに好ましくは８〜３０または１０〜２５アミノ酸残基の長さを有することができる。一部実施態様において、ポリペプチドは非標準的または合成アミノ酸残基、例えば、ノルロイシン、セレノシステイン、ピロリジン等を含む。一部実施態様において、ポリペプチドは架橋基、例えばジスルヒド結合を形成することのできる二つのシステイン残基、またはペプチドを環状化するために用いることのできる他の種類の化学架橋部分を含む。他の好ましい実施態様において、ポリペプチドは例えばポリエチレングリコールを用いるか、または可溶性タンパク質への融合を用いて修飾し、例えばポリペプチドの可溶性または循環半減期を高めることができる。
【０１２７】
別の特徴において、本発明はＴｉｅ１に特異的に結合するタンパク質を同定する方法により特徴付けられる。好ましい実施態様において、本発明は、Ｔｉｅ１抗原を提供する工程；ディスプレーライブラリー（例えば、ファージディスプレーライブラリーのメンバー）を提供する工程；ライブラリーに存在するメンバーを同定する工程を含み、該メンバーはＴｉｅ１抗原に特異的に結合するタンパク質を発現する。「Ｔｉｅ１抗原」との用語は少なくとも８アミノ酸の長さを有するＴｉｅ１の任意の抗原性断片をいう。例えば、Ｔｉｅ１抗原として、Ｔｉｅ１外部ドメインの断片、例えば、ここに記載の断片等の折り畳まれたタンパク質ドメインを含む断片が挙げられる。一部実施態様において、Ｔｉｅ１抗原はヒト起源であり、例えばヒトＴｉｅ１の細胞外部ドメインまたはその断片（例えば、ここに記載の断片）を含む。Ｔｉｅ１抗原は別のポリペプチド、例えばＦｃドメインに任意に融合させた組換えポリペプチドであってよく、またはＴｉｅ１をその表面に発現する細胞（例えば、内皮細胞）であってよい。他の好ましい実施態様において、Ｔｉｅ１抗原は活性化立体配座を有し、例えばＴｉｅ１抗原は、二量体立体配座またはここに記載のＥ３抗体により安定化させた立体配座である。
【０１２８】
ここに記載した方法は、例えば実質的に完全なゲノム（例えば修飾遺伝子ＩＩＩを含む）を有するバクテリオファージに基づくライブラリーおよびファージミド核酸を含むバクテリオファージ粒子に基づくライブラリーに適用可能である。「バクテリオファージライブラリーのメンバー」および「ファージ」との用語は両方の種類のライブラリーのメンバーを包含する。「バクテリオファージ粒子」の用語は、核酸をパッケージするバクテリオファージコートタンパク質から形成される粒子をいう。パッケージした核酸は修飾バクテリオファージゲノムまたはファージミド、例えば、バクテリオファージの複製開始点を含むが、必須のファージ遺伝子を欠如し、「ヘルパーファージ」またはｉｎ  ｔｒａｎｓで供給されるファージ遺伝子の助けなくしては大腸菌で増殖できない核酸であってよい。
【０１２９】
他の実施態様において、本発明はＴｉｅ１に特異的に結合するタンパク質の同定方法により特徴付けられる。該方法は、Ｔｉｅ１抗原（例えば、Ｔｉｅ１外部ドメインの領域）を提供する工程；非ヒト動物をＴｉｅ１抗原により免疫する工程；そしてＴｉｅ１と相互作用する免疫グロブリンを産生する細胞を単離する工程を含む。例えば、該方法は動物（例えば、免疫マウス）の脾臓からハイブリドーマ細胞を作り；そしてＴｉｅ１抗原に特異的に結合する抗体を発現する個々のハイブリドーマ細胞系を同定することを含む。例えば、該
好ましい実施態様において、Ｔｉｅ１抗原はヒト起源であり、例えばヒトＴｉｅ１の細胞外部ドメインまたはその一部断片、例えばＴｉｅ１のＨＡ結合ドメインを含む。Ｔｉｅ１抗原は、別のポリペプチド、例えば精製ハンドルに任意に融合させた組換えポリペプチドであってよく、またはＴｉｅ１をその表面に発現する細胞（例えば、内皮細胞）であってよい。別の好ましい実施態様において、Ｔｉｅ１抗原は活性化立体配座を有し、例えば二量体化している。
【０１３０】
好ましい実施態様において、該方法は同定されたファージまたはハイブリドーマから核酸分子を単離することを含み、該核酸分子はＴｉｅ１抗原に特異的に結合するポリペプチドまたは抗体をコードする。単離された核酸分子はここに記載のように治療剤を作るために用いることができる。
【０１３１】
別の特徴において、本発明は、ここに記載の方法により同定したタンパク質をコードする核酸により特徴付けられる。好ましい実施態様において、核酸は重鎖および軽鎖の免疫グロブリンまたはここに記載の免疫グロブリン断片をコードする配列を含む。例えば、本発明は、ここに記載のＴｉｅ１結合抗体分子の重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれコードする第一と第二の核酸により特徴付けられる。ともに機能する重鎖と軽鎖をコードする配列は別々の核酸分子上または同一の核酸分子上に存在しうる。別の特徴において、本発明は、ここに記載の核酸を有する宿主細胞およびベクターにより特徴付けられる。
【０１３２】
さらに別の特徴において、本発明はＴｉｅ１結合抗体、またはその抗原結合断片を作る方法により特徴付けられる。該方法は、重鎖可変領域、例えば、ここに記載の重鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第一核酸を有する宿主細胞を提供する工程；軽鎖可変領域、例えばここに記載の軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第二核酸を提供する工程；第一と第二の核酸を、軽鎖と重鎖の可変領域の集合物がＴｉｅ１と相互作用する抗原結合タンパク質を形成する条件下で宿主細胞中に発現させる工程を含む。第一と第二の核酸を連結されていても連結されていなくてもよく、例えば同一または異なるベクター上に発現させることができる。第一と第二の核酸は同一分子の成分であってよく、または異なる分子（例えば、異なる染色体またはプラスミド）上に存在することができる。
【０１３３】
宿主細胞は真核細胞、例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞または原核細胞、例えば大腸菌であってよい。例えば、哺乳類細胞は培養細胞または細胞系であってよい。例示的な哺乳動物細胞として、リンパ球細胞系（例えば、ＮＳＯ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、卵母細胞およびトランスジェニック動物の細胞、例えば、哺乳類上皮細胞が挙げられる。例えば、ここに記載の抗体をコードする核酸はトランスジェニック動物で発現できる。一実施態様において、核酸は組織特異的プロモーター（例えば、哺乳類の特異的プロモーター）の制御下に置き、抗体をトランスジェニック動物中に作る。例えば、抗体分子は、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニックウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたはげっ歯類の乳中に分泌させる。単鎖抗体を作るために、重鎖と軽鎖の可変ドメインの両方を含む単一ポリペプチドをコードするように核酸を構成する。
【０１３４】
Ｔｉｅ１は広い範囲の癌に関連して過多発現することがわかった。Ｔｉｅ１結合リガンドを有する腫瘍脈管構造上のＴｉｅ１の標的化（例えば、抗体）を用いて、腫瘍成長または転移が低減するように脈管構造を阻害、破壊、さもなければ中和することができる。リガンドは、例えば毒性ペイロードに関連させるか、または直接的な機能的阻害を仲介することができる。
【０１３５】
別の特徴において、本発明は、細胞の活性、例えば内皮細胞の活性、細胞、例えば内皮細胞、例えば、癌、例えば腫瘍周囲の内皮細胞の増殖、付着、成長または生存等の細胞活性の阻害方法により特徴付けられる。本発明の方法は、細胞を、Ｔｉｅ１結合リガンドに、細胞の付着、移動、成長または増殖を阻害するのに十分な量で接触させることを含む。本発明の方法は、例えば疾患、例えば炎症性疾患（例えば、リュウマチ性関節炎、狼瘡、再狭窄、乾癬、移植片対宿主反応または多発性硬化症）または癌疾患（例えば、悪性または転移性疾患）を、被験体（例えば、実験動物またはヒト患者）に、該疾患を治療または予防するのに有効な量のＴｉｅ１結合リガンドを投与することにより治療または予防するために用いることができる。Ｔｉｅ１結合リガンドは、卒中、心臓病、潰瘍、硬皮症、不妊症、および不十分な血管形成に関連する他の病気を治療または予防するために用いることもできる。
【０１３６】
Ｔｉｅ１結合リガンドを用いて、血管形成関連疾患、特に血管形成依存性癌および腫瘍を治療および予防することができる。
【０１３７】
血管形成関連疾患として、固形腫瘍；白血病等の血液系腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍（例えば、血管腫、聴覚経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫、リュウマチ性関節炎）；乾癬；視覚血管形成疾病、例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄班変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス；Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群；心筋血管形成；プラーク新血管形成；末梢血管拡張；血友病関節；血管線維腫；および傷の肉芽化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
「血管形成依存性癌および腫瘍」は、成長（容積および／または質量の膨張）のために、血液を供給する血管の数と密度の増加を必要とする癌腫瘍である。一実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドはそのような癌と腫瘍の後退を引き起こす。「後退」とは腫瘍の質量と大きさの減少、例えば少なくとも２、５、１０または２５％の減少をいう。
【０１３９】
別の特徴において、本発明は、細胞（インビトロ、エクスビボまたはインビボで）、例えば内皮細胞、例えば癌、例えば腫瘍の周囲の内皮細胞を接触する方法により特徴付けられる。該方法は、Ｔｉｅ１と相互作用するリガンド、例えばここに記載のリガンドを提供する工程、細胞を、少なくとも一つの検出可能なリガンド／細胞複合体を形成するのに十分な量のリガンドに接触させる工程を含むことができる。リガンドとして、例えば標識または細胞毒性実体、例えば免疫グロブリンＦｃドメインまたは細胞毒性薬を挙げることができる。
【０１４０】
別の特徴において、本発明は、細胞を治療、例えば阻害、剥離または死滅するか、または細胞の少なくとも一つの活性を損じる方法により特徴付けられる。該方法は、Ｔｉｅ１結合リガンド、例えばここに記載のリガンドを提供する工程、細胞をリガンドと、細胞の少なくとも一つの活性を損じるか、または細胞を阻害、剥離または死滅させるのに十分な量で接触させる工程を含む。この接触は、インビトロまたはインビボであってよい。例えば、細胞は、例えば内皮細胞、例えば癌、例えば腫瘍の周囲の内皮細胞であってよい。リガンドとして細胞毒性実体を挙げることができる。本発明の方法を用いて、例えば疾患、例えば内皮細胞系疾患、血管疾患、創傷治癒または癌性疾患（例えば、悪性または転移性疾患）を治療または予防するのに有効な量のＴｉｅ１結合リガンドを被験体（例えば実験動物またはヒト患者）に投与することによりそれら病気を治療または予防することができる。
【０１４１】
主題の方法は、例えばインビトロまたはイクスビボで培養中の細胞に用いることができる。例えば、内皮細胞、例えば癌生検サンプルの内皮細胞をインビトロで、培養培地中で培養でき、接触工程はＴｉｅ１結合リガンドを培養培地に加えることにより行うことができる。本方法は、被験体に存在する細胞（例えば、癌性または転移性細胞）に対して、インビボ（例えば、治療または予防）プロトコールの一部として実施できる。インビボ実施態様のために、接触工程は被験体中で行われ、該工程は、リガンドの細胞への結合と細胞の付着、移動、成長または増殖の阻害とを可能とする効果的な条件下にＴｉｅ１結合リガンドを被験体に投与することを含む。
【０１４２】
本発明の方法は、例えば、固形腫瘍、軟組織腫瘍および転移病巣、特に、血液供給または血管形成を必要とする腫瘍等の、しかしこれらに限定されない癌性疾患の治療または予防に用いることができる。固形腫瘍の例として、例えば、多様な器官系、例えば肺、乳房、リンパ系、胃腸管（例えば、結腸）および尿性器管（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、咽頭等の肉腫、腺癌および癌腫ならびに例えばほとんどの結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌腫、肝臓癌、肺の非小細胞癌腫、小腸癌および食道癌等の悪性疾患を含む腺癌等の悪性疾患が挙げられる。被験体は、哺乳類、例えば霊長類、好ましくは高等霊長類、例えばヒト（例えば、ここに記載の疾患、例えば内皮細胞系疾患、例えば癌を有するかまたはその危険性のある患者）でよい。
【０１４３】
Ｔｉｅ１結合抗体またはその断片、例えばここに記載のＴｉｅ１結合抗体またはその断片を、被験体に対して、全身的に（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、鼻内、経皮膚、または吸入により）、局所的に、または鼻、喉および気管支等の粘膜への適用により投与できる。
【０１４４】
さらに、該方法は、例えば、腫瘍サイズの減少；癌マーカー、例えば癌特異的抗原レベルの減少；例えば骨スキャンにおける新しい病巣出現の低減；新しい病気関連症状の出現の減少；または軟組織塊の大きさの減少または安定化等のこれら一つ以上の減少のために、または臨床的な成果の向上に関連する任意のパラメーターのために被験体をモニターする工程をさらに含むことができる。被験体は、治療の開始前；治療中；または治療のひとつ以上の要素を投与した後等、これらの一つ以上の期間でモニターすることができる。モニタリングは、同じＴｉｅ１結合リガンドによるさらなる治療の必要性またはさらなる作用物質によるさらなる治療の必要性を評価するために用いることができる。一般的に、上記パラメーターの一つ以上の減少は被験体の改善された状態を示す。モニタリングに関する情報は、例えば電子的またはデジタルの形で記録することができる。
【０１４５】
Ｔｉｅ１結合リガンドは、非複合の形にて単独で用いることによって、Ｔｉｅ１発現細胞の付着、移動または溢出を阻害するか、またはＴｉｅ１発現細胞を剥離または死滅させることができる。リガンドが抗体である場合、剥離または死滅は、例えば、補体仲介細胞溶解および／またはエフェクター細胞仲介細胞死滅等の抗体依存性細胞死滅機構によって仲介できる。他の実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドは、Ｔｉｅ１発現細胞を死滅または剥離するのに効果的な物質、例えば、細胞毒性剤または細胞毒性部分に結合（例えば、直接または間接的な物理的会合、共有または非共有結合）させることができる。例えば、Ｔｉｅ１結合リガンドは放射性イオン（例えば、α−、γ−またはβ−エミッター）、例えば、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）またはビスマス（２１３Ｂｉ）に結合させることができる。本発明の方法および組成物を他の治療モダリティーと組合せて用いることができる。一実施態様において、本発明の方法は、Ｔｉｅ１結合リガンド、例えば、Ｔｉｅ１結合抗体またはその断片を、細胞毒性剤に、前記疾患の治療または予防に有効な量で組み合わせて被験体に投与することを含む。リガンドと細胞毒性剤は同時または逐次投与することができる。他の実施態様において、本発明の方法と組成物は外科的および／または放射線手順と組み合わせて用いる。
【０１４６】
別の特徴において、本発明は、サンプル中、インビトロ（例えば、生物学的サンプル、組織生検サンプル、例えば癌性病巣）で、Ｔｉｅ１タンパク質またはＴｉｅ１タンパク質を発現する細胞（例えば内皮細胞）の存在を検出する方法により特徴付けられる。この主題の方法を用いて、ここに記載の疾患、例えば癌性疾患を評価、例えば診断または段階付けることができる。当方法は（ｉ）サンプル（および任意に、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）に、ここに記載のＴｉｅ１結合リガンドを、Ｔｉｅ１結合リガンドとＴｉｅ１タンパク質の相互作用が起こる条件下に接触させる工程；そして（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合リガンドとサンプル（および任意に、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）との間の複合体の形成を検出する工程を含む。複合体の形成はＴｉｅ１タンパク質（例えば、活性化Ｔｉｅ１タンパク質）の存在を示すものであり、ここに記載の治療の適合性または必要性を示すことができる。例えば、参照サンプル、例えばコントロールサンプルに比較した場合のサンプル中の複合体の形成の統計的に有意な変化は、サンプル中のＴｉｅ１（例えば活性化Ｔｉｅ１）の存在を示す。
【０１４７】
さらに別の特徴において、本発明はＴｉｅ１（例えば、活性化Ｔｉｅ１）の存在をインビボ（例えば、被験体中のインビボ画像化）で検出する方法を提供する。この主題の方法を用いて、ここに記載の疾患、例えば癌性疾患を評価、例えばその診断、場所の特定または段階付けを行うことができる。当方法は（ｉ）被験体（および任意にコントロール被験体）にＴｉｅ１結合リガンド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を、Ｔｉｅ１結合リガンドとＴｉｅ１タンパク質の相互作用が起こる条件下に接触させる工程；そして（ｉｉ）該リガンドとＴｉｅ１との間の複合体の形成を検出する工程を含み、参照、例えば、コントロール被験体または被験体のベースラインに比較して被験体中の複合体形成の統計的に有意な変化がＴｉｅ１の存在を示すものであることを特徴とする。被験体内の特定の位置での活性化Ｔｉｅ１の存在は、内皮細胞関連疾患、例えば血管形成関連疾患、例えば癌、例えば転移性癌、またはここに記載の他の血管形成関連疾患を示すことができる。
【０１４８】
他の実施態様において、ここに記載の疾患（例えば、炎症または癌性疾患）の診断または段階付けの方法が提供される。該方法は、（ｉ）該疾患を有するか、またはその危険性のある被験体を同定する工程；（ｉｉ）該疾患に侵された組織または細胞のサンプルを得る工程；（ｉｉｉ）該サンプルまたはコントロールサンプルをＴｉｅ１結合リガンドに、結合物質とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こる条件下で接触させる工程、そして（ｉｖ）複合体の形成を検出する工程を含む。参照サンプル、例えばコントロールサンプルに比較してリガンドとの複合体の形成の統計的に有意な増加は疾患または疾患の段階を示す。例えば、固形腫瘍に位置する腫瘍細胞上の活性化Ｔｉｅ１の発見は、腫瘍が転移性癌に進展していることを示すことができる。
【０１４９】
好ましくは、インビボおよびインビトロ診断法に用いられるＴｉｅ１結合リガンドは、結合または未結合の結合物質の検出を容易にする検出可能な物質で直接または間接に標識する。適当な検出可能な物質として、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。一実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドは、放射性イオン、例えば、インジウム（１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、ビスマス（２１３Ｂｉ）、イオウ（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）またはリン（３２Ｐ）に結合させる。別の実施態様において、リガンドはＮＭＲ造影剤で標識する。
【０１５０】
また、本発明は、多様なアミノ酸および核酸配列、例えばここに記載の配列またはここに記載の配列に関連する配列を含むポリペプチドおよび核酸を提供する。例えば、本発明は、ここに記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸により特徴付けられる。核酸は、同系コドン、または各ポリペプチドを作るように翻訳されうるいかなる組のコドンも含むことができる。そのようなポリペプチドは多鎖タンパク質の個々のサブユニット、例えば、複数の異なるポリペプチド鎖を有する抗体を含む。核酸は、発現されない核酸断片またはベクターであってよいが、免疫グロブリン可変領域（例えば、ここに記載のＣＤＲ等）の少なくとも一部またはその相補体をコードする配列を含む。そのような核酸を用いて、有用な構築物、細胞およびタンパク質を調製することができる。さらに、本発明はここに記載の核酸を有する宿主細胞により特徴付けられる。細胞はここに記載のタンパク質を、例えばその表面に発現できる。
【０１５１】
ここで用いられる「抗体」との用語は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質をいう。例えば、抗体は重（Ｈ）鎖可変領域（ここではＶＨと略す）と軽（Ｌ）鎖可変領域（ここではＶＬと略す）を含むことができる。別の例において、抗体は二つの重（Ｈ）鎖可変領域と二つの軽（Ｌ）鎖可変領域とを含む。「抗体」との用語は抗体の抗原結合断片（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片およびｄＡｂ断片）ならびに完全抗体を包含する。
【０１５２】
ＶＨとＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるさらに保存された領域が点在する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割できる。フレームワーク領域とＣＤＲの程度は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７を参照）。Ｋａｂａｔの定義をここでは用いる。ＶＨとＶＬのそれぞれは典型的には三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置される。
【０１５３】
「免疫グロブリンドメイン」は免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインをいう。免疫グロブリンドメインは典型的には約７つのβストランドから形成される二つのβシートと保存されたジスルヒド結合とを含む（例えば、Ａ．Ｆ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．  Ｂａｒｃｌａｙ  １９８８  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：３８１−４０５を参照）。免疫グロブリン可変領域の超可変ループの基準構造は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７９９−８１７；  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４（１８）：４６２８−３８に記載のようにその配列から推測することができる。
【０１５４】
ここに用いられる「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成できるアミノ酸配列をいう。例えば、該配列は天然の可変ドメインのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでよい。例えば、該配列は一つ、二つまたはそれ以上のＮまたはＣ末端アミノ酸、内部アミノ酸を除外してもよいし、一つ以上の挿入または付加的な末端アミノ酸を含んでよいし、または他の変更物を含んでもよい。一実施態様において、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と会合して、標的結合構造物（または「抗原結合部位」）、例えばＴｉｅ１との相互作用する（例えばＴｉｅ１へ結合するか、またはそれを阻害する）構造物を形成することができる。
【０１５５】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は重鎖または軽鎖定常領域のすべてまたは一部をさらに含むことで、それぞれ重鎖または軽鎖免疫グロブリン鎖を形成することができる。一実施態様において、抗体は二つの重鎖免疫グロブリン鎖と二つの軽鎖免疫グロブリン鎖からなる四量体であり、該重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖は例えばジスルヒド鎖によりそれらの間で結合している。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の三ドメインを含む。軽鎖定常領域はＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は典型的には、免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および伝統的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）等の宿主組織または因子に対する抗体の結合を仲介する。「抗体」との用語はタイプＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそのサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンの軽鎖はカッパまたはラムダタイプであってよい。一実施態様において、抗体はグリコシル化している。抗体は、抗体依存性細胞毒性および／または補体仲介細胞毒性に対して機能しうる。
【０１５６】
抗体の一つ以上の領域はヒトのものであってよく、効果的にはヒトのものである。例えば、一つ以上の可変領域はヒトのものであってよく、効果的にはヒトのものである。例えば、一つ以上のＣＤＲがヒトのもの、例えばＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３のものであってよい。各軽鎖ＣＤＲはヒトものであってよい。ＨＣ  ＣＤＲ３はヒトものであってよい。一つ以上のフレームワーク領域はヒトのものであってよく、例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４である。一実施態様において、すべてのフレームワーク領域はヒトのもの、例えばヒトの体細胞、例えば免疫グロブリンを作る造血細胞、または非造血細胞に由来する。一実施態様において、ヒト配列は、例えば生殖系核酸によりコードされる生殖系配列である。一つ以上の定常領域はヒトのものであってよく、効果的にはヒトのものである。別の実施態様において、フレームワーク領域（例えば、集団的にＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、または集団的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）または完全な抗体の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５または９８％がヒトのものであってよく、効果的にはヒトのものである。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は、集団的に、軽鎖または重鎖配列をコードする座のヒト生殖系Ｖセグメントによりコードされるヒト配列に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８または９９％同一であってよい。
【０１５７】
抗体のすべてまたは一部は免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによりコードされてよい。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１とＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、エプシロンおよびミュー定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）で可変領域遺伝子によりコードされ、ＣＯＯＨ末端でカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によりコードされている。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は同様に可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上記の定常領域遺伝子の一つ、例えば（約３３０アミノ酸をコードする）ガンマによりコードされている。
【０１５８】
ここで用いる全長抗体の「抗原結合断片」（または単に「抗体部分」または「断片」）との用語は、興味ある標的に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の一つ以上の断片をいう。全長抗体の「抗原結合断片」との用語に包含される結合断片の例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわちヒンジ部でジスルヒド架橋によって連結した二つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬとＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）官能性を保持する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の二つのドメインであるＶＬとＶＨは別個の遺伝子によりコードされているが、それらは組換え法を用いて、それらに、ＶＬとＶＨドメインが対となって単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成する単一タンパク質の鎖を作らせることを可能にする合成リンカーにより結合させることができる。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。
【０１５９】
抗体断片は、当業者に公知の慣用の技術を含む適当な技術を用いて得ることができる。「単一特異的抗体」との用語は、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性と親和性を示す抗体をいう。この用語は、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含み、これらはここで用いられるように、単一の分子組成を有する抗体またはその断片調製物をいう。ここで用いる「イソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。
【０１６０】
一実施態様において、抗体のＨＣまたはＬＣは、ヒト生殖系配列によりコードされるアミノ酸配列に対応する配列、例えばフレームワーク領域および／またはＣＤＲ中のものを含む。例えば、抗体はヒトＤＰ４７抗体由来の配列を含むことができる。一実施態様において、抗体の一つ以上のコドンは生殖系核酸配列に対して変えられるが、同一のアミノ酸配列をコードするように選択される。コドンは、例えば特定の系において発現を最適化し、制限酵素部位を作り、サイレントフィンガープリント等を作るよう選択することができる。
【０１６１】
一実施態様において、抗体ＨＣのＣＤＲ２は、ＤＰ４７のＣＤＲ２に見られるアミノ酸に同一である少なくとも１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸位置を含む。
【０１６２】
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域とは、免疫グロブリン可変領域が、正常なヒトにおいて免疫原性応答を引き出さないように十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「ヒト化」免疫グロブリンの説明は、例えば、米国６，４０７，２１３号と米国５，６９３，７６２号を含む。
【０１６３】
「効果にはヒトの」免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が、正常なヒトにおいて免疫原性応答を引き出さないように十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「効果的にはヒトの」抗体は、抗体が正常なヒトにおいて免疫原性応答を引き出さない十分な数のヒトアミノ酸位置を含む抗体である。
【０１６４】
「Ｔｉｅ１外部ドメイン」との用語はＴｉｅ１タンパク質の任意の細胞外部領域、例えば、配列番号２のおおよそアミノ酸２５〜７５９を含む領域をいう。他の例示領域は、一つ以上のＥＧＦドメイン（例えば、配列番号２の２１４〜２５６、２５８〜３０３、３０３〜３４５、２１４〜３０３、２５８〜３４５または２１４〜３４５）；一つ以上のＩＧ様Ｃ２ドメイン（例えば、４３〜１０５、４３〜４２６、３７２〜４２６）；一つ以上のフィブロネクチンタイプＩＩＩリピート（例えば、配列番号２の４４６〜５４０、５４３〜６３９、６４３〜７４４、４４６〜６３９、５４３〜７４４または４４６〜７４４）；およびその組合せを含む領域である。
【０１６５】
ここで用いる「結合親和性」とは見掛け会合定数すなわちＫａをいう。Ｋａは解離定数（Ｋｄ）の逆数である。リガンドは例えば特定の標的分子に対して少なくとも１０５、１０６、１０７または１０８Ｍ−１の結合親和性を有する。第二標的に対して第一標的に対するリガンドの高い親和性結合は、第二標的への結合に関するＫａ（またはＫｄの数値）よりも、第一標的への結合に関するより大きなＫａ（またはより小さいＫｄの数値）により示すことができる。そのような場合、リガンドは第二標的よりも第一標的に特異性を有する。（例えば、特異性または他の比較に関する）結合親和性の違いは少なくとも１．５、２、５、１０、５０、１００または１０００倍であってよい。例えば、Ｔｉｅ１結合リガンドはＴｉｅに対して、他の抗原、例えばＴｉｅ２、ＥＧＦ、フィブロネクチンまたはヒト血清アルブミンよりも少なくとも１．５、２、５、１０、５０、１００または１０００倍優先的に結合するだろう。Ｔｉｅ１結合リガンドは種特異的でもよいし、種一般的（例えば、二種類以上の種に由来するＴｉｅ１タンパク質に結合することができる）でもよい。
【０１６６】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲルろ過、ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴または分光法（例えば、蛍光アッセイを用いる）等の多様な方法により決定できる。これらの技術を用いて、結合または遊離のリガンドの濃度をリガンド（または標的）濃度の関数として測定できる。結合リガンド（［結合］）の濃度は遊離リガンド（［遊離］）の濃度および標的上のリガンドの結合部位の濃度に関連付けられ、ここで（Ｎ）は下記式による１標的分子あたりの結合部位の数である。
【０１６７】
［結合］＝Ｎ・［遊離］／（（１／Ｋａ）＋［遊離］）
Ｋａの定量的測定はルーチンではあるが、Ｋａの正確な測定を行うことは必ずしも必要ではなく、しばしば親和性の定性的測定値を得れば十分であり、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析等の方法を用いて決定したものはＫａに比例するので、より高い親和性が参照よりも例えば２、５、１０、２０または５０倍高いかどうかの決定等の比較に用いることができる。結合親和性は、典型的には０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０中で評価する。
【０１６８】
「単離された組成物」は、単離された組成物を得ることのできる天然サンプルの少なくとも一つの成分の少なくとも９０％から取り出される組成物をいう。人工的または天然に作られる組成物は、種または興味のある種の集団が重量／重量で少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９５、９８または９９％純粋である場合に「少なくとも」ある程度の純度を有する「組成物」となりうる。
【０１６９】
「エピトープ」は、リガンド、例えばポリペプチドまたは抗原結合リガンド（例えばＦａｂまたは抗体）が結合する標的化合物の部位をいう。標的化合物がタンパク質である場合、例えばエピトープは、リガンドが結合するアミノ酸をいうことがある。オーバーラップするエピトープは少なくとも一つの共通アミノ酸残基を含む。
【０１７０】
ここで用いる「実質的に同一」（または「実質的に相同」）との用語は、第一または第二のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が類似の活性を有するように、第二アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に同一または等価な（例えば、類似の側鎖、例えば保存アミノ酸置換を有する）十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第一のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を言うためにここで用いる。抗体の場合、第二の抗体は同じ特異性を有し、同上のものの少なくとも５０％の親和性を有する。
【０１７１】
ここに開示された配列に類似または相同（例えば少なくとも約８５％の配列同一性）である配列も本出願の一部である。一実施態様において、配列同一性は約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であってよい。もしくは、核酸セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェント条件）下に該ストランドの相補体にハイブリダイズする場合、実質的な同一性が存在する。核酸は全細胞中、細胞溶解物中、または部分的に精製されるか、実質的に純粋な形で存在してよい。
【０１７２】
二つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（これらの用語はここで相互交換可能に用いる）の計算は下記の通り実施される。それら配列は最適な比較の目的のために配列する（例えば、最適配列のためにギャップを第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一つまたは両方に導入でき、非相同配列は比較の目的のために無視することができる）。好ましい実施態様において、比較の目的のために並べられる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、よりさらに好ましくは少なくとも６０％、よりさらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを次に比較する。第一配列での位置が、第二配列の対応する位置で同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合、それらの分子はその位置において同一である（ここで用いるように、アミノ酸または核酸「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」と等しい）。二つの配列間の同一性パーセントは、二つの配列の最適配列のために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一位置の数の関数である。
【０１７３】
配列の比較と二配列間の同一性パーセントの決定は、数学的なアルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施態様において、二アミノ酸配列の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、そして１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６の長さウエイトを用いて、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムに導入されたＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４−４５３）アルゴリズムを用いて決定する。さらに好ましい実施態様において、二つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６の長さウエイトを用いて、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて決定する。特に好ましいパラメーターの組（および分子が本発明の配列同一性または相同性制限の範囲にあるかどうかを決定するのにどのパラメーターを使うべきか不確かな場合に用いられるべきパラメーター組）はギャップペナルティー１２、キャップ伸長ペナルティー４およびフレームシフトギャップペナルティー５を用いるＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。
【０１７４】
ここで用いる「相同」との用語は「類似性」と同義であり、興味ある配列が一つ以上のアミノ酸置換物の存在により参照配列と異なることを意味する（但し、適度のアミノ酸挿入または欠損は存在してもよい）。参照配列に対する相同性または類似性の程度を計算するための現在好ましい手段は、それぞれの場合で、計算配列関連性の有意性を決定するためのアルゴリズムデフォルトまたは推薦パラメーターを用いたＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤから利用可能）を使用することによる。二つのアミノ酸配列間または二つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、ギャップ長さペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されたＥ．  ＭｅｙｅｒｓとＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，  ４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて決定することもできる。
【０１７５】
ここで用いる「低ストリンジェンシー、中間ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー下でハイブリダイズする」との言葉はハイブリダイゼーションと洗浄の条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を行うための指針はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９），  ６．３．１−６．３．６に見ることができる。水性法および非水性法がこの引用文献に説明されており、何れかの方法を用いることができる。ここでいう具体的なハイブリダイゼーション条件は下記の通りである：１）約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件およびその後の少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの二回の洗浄（洗浄の温度は低ストリンジェンシー条件では５５℃まで増加させることができる）；２）約４５℃での６×ＳＳＣでの中間ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件およびその後の６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄；３）約４５℃での６×ＳＳＣの高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件およびその後の６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄；および４）非常に高いストリンジェンシー条件は０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、６５℃であり、その後の６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄。
【０１７６】
ここに記載のリガンドは、ここに記載のあるリガンドに対して、ポリペプチド機能に対して実質的な効果を持たない変異（例えば、保存アミノ酸置換または非必須アミノ酸置換）を有してもよい。特定の置換が寛容されるかどうか、つまり、結合活性等の所望の生物学的性質に悪影響を与えるかどうかはＢｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０に記載されているように決定することができる。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されている場合である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。フレームワークとＣＤＲアミノ酸残基が一つ以上の保存置換を含むことは可能である。
【０１７７】
「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を無効にすることなく、さらに好ましくは生物学的活性を実質的に変えることなく、結合物質、例えば抗体の野生型配列から変更させることのできる残基であるが、「必須」アミノ酸残基はそのような変化をもたらす。
【０１７８】
一般的に、「Ｘ」がアミノ酸残基を示すために用いられる場合、どのアミノ酸（例えば２０種類の天然アミノ酸のいずれか）もその箇所または少なくともその部分集合（例えば、１９種類の非システインアミノ酸のいずれか）で用いることができる。
【０１７９】
「ポリペプチド」または「ペプチド」（これらは相互交換可能に用いてよい）との用語は、例えば、ペプチド結合により連結された３個以上のアミノ酸、例えば３〜３０、１２〜６０、または３０〜３００、または３００アミノ酸を超える長さのポリマーをいう。ポリペプチドは一つ以上の非天然アミノ酸を含んでよい。典型的には、ポリペプチドは天然アミノ酸のみを含む。「タンパク質」は一つ以上のポリペプチド鎖を含むことができる。したがって、「タンパク質」との用語はポリペプチドを包含する。また、タンパク質またはポリペプチドは一つ以上の修飾、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化等を含むことができる。「小さいペプチド」との用語は、長さが３〜３０アミノ酸、例えば長さが８〜２４アミノ酸のポリペプチドを記載するために用いることができる。
【０１８０】
統計的な有意性は任意の公知の方法により決定することができる。例示的な統計的試験はスチューデントＴ試験、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ非パラメーター試験およびＷｉｌｃｏｘｏｎ非パラメーター統計的試験を含む。いくつかの統計的に有意の関係は０．０５または０．０２未満のＰ値を有する。特定のリガンドは、統計的に有意（例えば、Ｐ値＜０．０５または０．０２）である、例えば特異性または結合の差を示すだろう。
【０１８１】
本発明の他の特徴および利点は下記の詳細な説明および請求の範囲から明らかとなるであろう。本発明の実施態様はここに記載の特徴のいかなる組合せも含むことができる。本出願で引用されたすべての参考文献、特許出願および公開された特許の内容は文献の援用により本文に編入する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１８２】
（詳細な説明）
この開示は、とりわけ、Ｔｉｅ１に結合するタンパク質およびＴｉｅ１結合タンパク質を同定する方法を提供する。同定されたタンパク質は、例えば小さいペプチド（例えば環状または直鎖ペプチド、例えば約７〜２５アミノ酸のペプチド）、ポリペプチド（例えば、少なくとも２０アミノ酸のポリペプチド）または多鎖タンパク質（例えば、少なくとも二つのペプチドまたはポリペプチドを含むもの）であってよい。多鎖タンパク質の具体例は別個の重鎖と軽鎖を有する抗体である。ポリペプチドの具体例は単鎖抗体である。
【０１８３】
Ｔｉｅ１は、膜貫通ドメインを含むレセプターチロシンキナーゼタンパク質である。Ｔｉｅ１はほとんど内皮細胞だけに存在する。したがって、Ｔｉｅ１結合リガンドを用いて、例えば内皮細胞を特異的に認識し、または標的とすることができる。一部のＴｉｅ１結合リガンドは、内皮細胞を刺激または中和させるために用いることもできる。一部実施態様において、これらのＴｉｅ１結合リガンドは、特定の構造的特徴（例えば下記の特徴）、下記の特徴の組み合わせ、および／または下記の構造的特徴に少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに対して親和性を有する。
【０１８４】
【表１】
2007528720.tif 000001
配列は、配列番号２（下記の実施例１）に示されるアミノ酸配列を基準とする。
【０１８５】
Ｔｉｅ１に結合するタンパク質を同定する一つの方法は、ライブラリーを提供する工程、Ｔｉｅ１抗原またはその断片（例えば、細胞外部ドメイン、ＥＧＦドメイン、フィブロネクチンリピート、またはＩｇスーパーファミリードメイン（例えばＩｇ様Ｃ２タイプ２ドメイン）に結合するタンパク質をコードする一つ以上のメンバーをライブラリーから選択する工程を含む。選択は多くの方法により実施することができる。例えば、ライブラリーはディスプレーライブラリーであってよい。
【０１８６】
Ｔｉｅ１は、タグを付けて組換え発現させることができる。Ｔｉｅ１は精製し、支持体、例えばアフィニティービーズまたは常磁気ビーズまたは他の磁気応答粒子に結合させる。
【０１８７】
Ｔｉｅ１は細胞の表面に発現させることもできる。例えば、Ｔｉｅ１が活性化される場合のみに、細胞に特異的に結合するディスプレーライブラリーのメンバーを選択することができる。
【０１８８】
（Ｔｉｅ１アゴニストおよびアンタゴニスト）
一実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドはＴｉｅ１活性を調節することができる。例えば、Ｔｉｅ１結合リガンドはＴｉｅ１アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１８９】
Ｔｉｅ１アゴニストは、例えば内皮細胞の活性を刺激するために用いることができる。例えば、Ｔｉｅ１アゴニストは、内皮細胞中のホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）活性および／またはＡｋｔキナーゼ活性を高めるために用いることができる。Ｋｏｎｔｏｓらは、Ｔｉｅ１の細胞質ドメインがＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットと会合することができ、ＰＩ３キナーゼ活性を活性化することができることを示唆する。Ｋｏｎｔｏｓ（２００２）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２：１７０４−１７１３。Ｔｉｅ細胞質ドメインはタンパク質チロシンホスファターゼＳｈｐ２とも会合するかもしれない。例えば、Ｍａｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ４７６：３５−４６を参照されたい。また、Ｔｉｅ１アゴニストは二量体化および／またはＴｉｅ１細胞質ドメイン、例えばモチーフＹＶＮのおよそアミノ酸の１１１７のチロシンのチロシンリン酸化（例えば自己リン酸化の結果として）を増加させるだろう。
【０１９０】
Ｔｉｅ１結合リガンドは、細胞アッセイにおいて（例えば、下記の実施例２に記載のＢａＦ３細胞アッセイにおいて）、アゴニスト活性に関して評価できる。例示的な細胞アッセイは、成長因子レセプターの細胞内ドメインに融合させたＴｉｅ１外部ドメインを含むキメラレセプターが発現している成長因子依存細胞を用いる。細胞は必須成長因子の不存在下で、しかし試験化合物、例えばＴｉｅ１結合リガンドの存在下で成長能力に関して評価する。Ｔｉｅ１結合リガンドはＴｉｅ１を刺激する場合、Ｔｉｅ１キメラのシグナル活性は、必要とされる成長因子によるその同系レセプターを経た刺激の代用となりうる。よって、必要とされる成長因子の不存在下の細胞の生存は、Ｔｉｅ１結合リガンドがＴｉｅ１を刺激することの証拠として用いることができる。
【０１９１】
Ｔｉｅ１アンタゴニストは、例えば内皮細胞の活性を減少させるために用いることができる。例えば、Ｔｉｅ１アンタゴニストは、内皮細胞中のホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）活性、Ｓｈｐ２活性、および／またはＡｋｔキナーゼ活性を低下させるために用いることができる。Ｔｉｅ１アンタゴニストも、二量体化および／またはＴｉｅ１細胞質ドメイン、例えばモチーフＹＶＮのおよそアミノ酸の１１１７のチロシンのチロシンリン酸化（例えば自己リン酸化の結果として）を低下させるだろう。
【０１９２】
Ｔｉｅ１結合リガンドは細胞アッセイでアンタゴニスト活性について評価できる。例えば、アンタゴニストは、Ｔｉｅ１を刺激するＴｉｅ１アゴニスト（Ｅ３抗体等）を阻害する能力についてここに記載の細胞アッセイで検定できる。（例えば、下記の実施例２に記載されるＢａＦ３細胞アッセイ）。
【０１９３】
（ディスプレーライブラリー）
多くの方法が、Ｔｉｅ１に結合するタンパク質を同定するために用いることができる。一実施態様において、ディスプレーライブラリーはＴｉｅ１に結合するタンパク質を同定するために用いられる。ディスプレーライブラリーは物質の集合であり、各物質は、接近可能なタンパク質成分、および該タンパク質成分をコードまたは同定する回収可能な成分を含む。タンパク質成分は、例えば３アミノ酸〜３００を超えるアミノ酸のいかなる長さであってよい。選択において、ライブラリーの各メンバーのタンパク質成分はＴｉｅ１タンパク質でプローブされ、該タンパク質成分がＴｉｅ１に結合する場合、ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば支持体上の保持により同定する。
【０１９４】
保持されるディスプレーライブラリーメンバーを支持体から回収し、分析する。この分析は類似または異なる条件で増幅およびその後の選択を含み得る。例えば、陽性および陰性選択を交互に行うことができる。分析は、タンパク質成分のアミノ酸配列の決定と詳細な特性付けのためのタンパク質成分の精製を含み得る。
【０１９５】
多様なフォーマットをディスプレーライブラリーのために用いることができる。具体例は下記の通りである。
【０１９６】
（ファージディスプレー）
一つのフォーマットはウイルス、特にバクテリオファージを利用する。このフォーマットは「ファージディスプレー」と呼ばれる。タンパク質成分は典型的にはバクテリオファージコートタンパク質に共有結合させる。この結合は、コートタンパク質に融合させたタンパク質成分をコードする核酸の翻訳から生じる。この結合は、柔軟性のあるペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、またはストップコドンの抑制の結果として導入されるアミノ酸を含むことができる。ファージディスプレーは、例えばＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９；  Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７；  ＷＯ９２／１８６１９；  ＷＯ９１／１７２７１；  ＷＯ９２／２０７９１；  ＷＯ９２／１５６７９；  ＷＯ９３／０１２８８；  ＷＯ９２／０１０４７；  ＷＯ９２／０９６９０；  ＷＯ９０／０２８０９；  ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２：３７１−８；  Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；  Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；  Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；  Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；  Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；  Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；  Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６７：１２９−４９；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２に記載されている。
【０１９７】
ファージディスプレーシステムは線維状ファージ（ファージｆ１、ｆｄおよびＭ１３）ならびに他のバクテリオファージ（例えば、Ｔ７バクテリオファージおよびラムドイドファージ；  例えばＳａｎｔｉｎｉ（１９９８）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８２：１２５−１３５；  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ６：１−６；  Ｈｏｕｓｈｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６８：３６３−３７０を参照）に関して開発された。線維状ファージディスプレーシステムは典型的には、遺伝子ＩＩＩタンパク質等のマイナーコートタンパク質および遺伝子ＶＩＩＩタンパク質、メージャーコートタンパク質への融合物を使うが、遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、遺伝子ＩＸタンパク質またはそのドメイン等、他のコートタンパク質への融合物も用いることができる（例えば、ＷＯ００／７１６９４を参照）。一実施態様において、該融合は遺伝子ＩＩＩタンパク質のドメイン、例えばアンカードメインまたは「断端」への融合である（例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質アンカードメインの説明については、米国特許第５，６５８，７２７号を参照）。該コートに示されるタンパク質は、非ペプチド結合、例えば非共有結合または非ペプチド共有結合を用いて物理的に会合させることもできる。例えば、ジスルヒド結合および／またはｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎコイルドコイルを物理的会合のために用いることができる（例えば、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：６９およびＷＯ０１／０５９５０）。
【０１９８】
タンパク質成分の原子価も調節できる。遺伝子ＩＩＩタンパク質のすべての複製物はタンパク質成分に融合するので、タンパク質成分をコードする配列の完全なファージゲノムへのクローニングは多価ディスプレーをもたらす。減少原子価のために、ファージミド系が利用できる。この系において、遺伝子ＩＩＩに融合させたタンパク質成分をコードする核酸は典型的には７０００ヌクレオチド未満の長さを有し、プラスミド上に提供される。プラスミドはファージの複製開始点を含むので、プラスミドを有する細菌細胞がヘルパーファージ、例えばＭ１３Ｋ０１に感染すると該プラスミドはバクテリオファージ粒子に取り込まれる。ヘルパーファージは遺伝子ＩＩＩのインタクトなコピーおよびファージ複製と構築に必要とされる他のファージ遺伝子を提供する。ヘルパーファージは欠陥開始点を有するために、ヘルパーファージゲノムは野生型開始点を有するプラスミドと比較して、ファージ粒子に効率的に取り込まれない。
【０１９９】
タンパク質成分を示すバクテリオファージは生育でき、標準的なファージ調製法、例えば成長培地からのＰＥＧ析出を用いて集めることができる。
【０２００】
個々のディスプレーファージの選択後に、選択されたファージを用いて細胞を感染させることにより、選択されたタンパク質成分をコードする核酸が得られる。個々のコロニーまたはプラークを集め、核酸を単離し、配列決定する。
【０２０１】
（細胞系ディスプレー）
さらに別のフォーマットにおいて、ライブラリーは細胞ディスプレーライブラリーである。タンパク質は、細胞、例えば真核または原核細胞の表面に示される。例示的な原核細胞としては、大腸菌細胞、古草菌細胞および胞子（例えばＬｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３６６）が挙げられる。例示的な真核細胞としては酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、ＨａｎｓｅｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。酵母表面ディスプレーが、例えば、Ｆａｂ断片等の免疫グロブリンタンパク質を示すために用いることのできる酵母ディスプレーシステムと重鎖および軽鎖の組合せを作るための接合の使用を記載するＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：５５３−５５７およびＷＯ０３／０２９４５６に記載されている。
【０２０２】
一実施態様において、多様な核酸配列を酵母ディスプレー用ベクターにクローニングする。このクローニングは多様な配列をドメイン（または完全な）酵母細胞表面タンパク質、例えばＡｇａ２、Ａｇａ１、Ｆｌｏ１またはＧａｓ１に結合させる。これらのタンパク質のドメインは、膜貫通ドメイン（例えば、Ｆｌｏ１）によって、またはリン脂質二重層（例えば、Ｇａｓ１）への共有結合によって、多様な核酸配列によりコードされるポリペプチドを固定できる。ベクターは二つのポリペプチド鎖が細胞表面に発現するように構成することで、それらの鎖の一つを酵母細胞表面タンパク質に結合できる。例えば、二つの鎖は免疫グロブリン鎖であってよい。
【０２０３】
一実施態様において、初期Ｔｉｅ１結合免疫グロブリンに基づいて変異させた免疫グロブリン重鎖をコードする核酸を一つの細胞タイプの酵母細胞に導入し、初期Ｔｉｅ１結合免疫グロブリンに基づいて変異させた免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸を他の細胞タイプの酵母細胞に導入する。これらの細胞の二集団を組み合わせて、免疫グロブリン重鎖と軽鎖をそれぞれ発現する二倍体酵母を形成することができる。例えば向上した親和性でＴｉｅ１に結合する細胞のために、これら酵母細胞を選択および／またはスクリーニングできる。
【０２０４】
（リボソームディスプレー）
ＲＮＡおよび該ＲＮＡにコードされるポリペプチドは、該ＲＮＡを翻訳し、初期ポリペプチドを依然として付着させたリボソームを安定化することによって物理的に会合させることができる。典型的には、高い二価Ｍｇ２＋濃度と低い温度が用いられる。例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ  ９１：９０２２およびＨａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：１２８７−９２；  Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３２８：４０４−３０；およびＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２３１（１−２）：１１９−３５を参照されたい。
【０２０５】
（ポリペプチド−核酸融合物）
別のフォーマットは、ポリペプチド−核酸融合物を利用する。共有結合させたピュロマイシン基を含むポリペプチド−核酸融合物は、例えばＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２および米国特許第６，２０７，４４６号に記載のようにｍＲＮＡのインビトロ翻訳により作ることができる。次に、ｍＲＮＡをＤＮＡへと逆転写し、ポリペプチドに架橋させることができる。
【０２０６】
（他のディスプレーフォーマット）
さらに他のディスプレーフォーマットは、タンパク質成分が、ポリペプチドを識別する非核酸タグに結合した非生物学的ディスプレーである。例えば、該タグはポリペプチドを示すビーズに結合させた化学タグまたは高周波タグであってよい（例えば、米国特許第５，８７４，２１４号を参照）。
【０２０７】
ディスプレー技術は、リガンド、例えば抗体リガンド、標的の特定のエピトープを得るために用いることもできる。これは、例えば、特定のエピトープを欠如するか、またはエピトープ内で例えばアラニンにより変異させた競合非標的分子を用いることにより行うことができる。そのような非標的分子は、ディスプレーライブラリーを標的に結合させたときに競合分子として、または例えば標的に対して特異的ではないディスプレーライブラリーメンバーを解離させる洗浄液中に捕捉する前溶出剤として、下記の陰性選択法に用いることができる。
【０２０８】
（反復選択）
一つの好ましい実施態様において、ディスプレーライブラリー技術を反復態様に用いる。最初のディスプレーライブラリーを用いて標的に対する一つ以上のリガンドを同定する。次に、これらの同定されたリガンドを、例えば変異誘発法を用いて改変し第二のディスプレーライブラリーを形成する。次に、より高い親和性のリガンドを、例えばさらに高いストリンジェンシーまたはさらに競合的な結合および洗浄条件を用いることにより第二ライブラリーから選択する。
【０２０９】
一部実施において、変異誘発は、結合界面で知られている領域または結合界面である可能性の高い領域を標的とする。例えば、同定されたリガンドが抗体である場合、変異誘発を、ここに記載のように重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域に向けさせることができる。さらに、変異誘発を、ＣＤＲの近くまたは隣接するフレームワーク領域、例えば、ＣＤＲ結合部の特に１０、５または３アミノ酸内のフレームワーク領域に向けさせることができる。抗体の場合、変異誘発を、正確な段階的な向上のために１つまたは２〜３のＣＤＲに限定することもできる。
【０２１０】
いくつかの例示的な変異誘発技術として、エラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５）、組換え（例えばＵＳＳＮ  １０／２７９，６３３）、ランダム切断を用いるＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９−３９１；  「核酸シャッフリング」と呼ばれる）、ＲＡＣＨＩＴＴＴＭ（Ｃｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １９：３５４）、部位特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：６４８７−６５０４）、カセット変異誘発（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０８：５６４−５８６）および縮重オリゴヌクレオチドの取り込み（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：３２４５）が挙げられる。
【０２１１】
反復選択の一例において、ここに用いられる方法を用いて、標的に対する少なくとも最少結合特異性または最少活性、例えば１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭを超える結合の平衡解離定数でＴｉｅ１に結合するタンパク質リガンドをディスプレーライブラリーから最初に同定する。最初の同定タンパク質リガンドをコードする核酸配列を変異の導入のための鋳型核酸として用いて、例えば、最初のタンパク質リガンドに比べて向上した性質（例えば、結合親和性、動力学または安定性）を有する第二タンパク質リガンドを同定する。
【０２１２】
（オフ−レート選択）
遅い解離速度は、特にポリペプチドとそれらの標的との相互作用に関して高い親和性を予測しうるので、ここに記載の方法を用いて、標的に対する結合相互作用に関して所望の（すなわち低下した）動力学的解離速度を有するリガンドを単離できる。
【０２１３】
遅く解離するリガンドをディスプレーライブラリーから選択するために、ライブラリーを固定化された標的に接触させる。次に、固定化標的を、非特異的または弱く結合する生物分子を除去する第一溶液で洗浄する。次に、固定化標的を、飽和量の遊離標的、すなわち粒子に結合しない標的の複製物を含む第二溶液で溶出する。遊離標的は、標的から解離する生物分子に結合する。再結合は、固定化標識のさらに低い濃度に対して遊離標的の飽和量により効果的に妨げられる。
【０２１４】
第二溶液は、実質的に生理学的またはストリンジェントである溶液条件を有することができる。典型的には、第二溶液の溶液条件は第一溶液の溶液条件と同じである。第二溶液の画分は、後の画分から前のものを区別するために時間の順序で集める。後の画分は前の画分の生物分子よりも標的から遅い速度で解離する生物分子を含む。
【０２１５】
さらに、延長インキュベーション後でさえも標的に結合し続けるディスプレーライブラリーメンバーを回収することもできる。これらはカオトロピック条件を用いて解離させるか、もしくは標的に結合させながら増幅することが可能である。例えば、標的に結合したファージは細菌細胞に接触させることができる。
【０２１６】
（特異性のための選択とスクリーニング）
「選択」とは、ディスプレーライブラリーの多くのメンバーを標的に接触させ、結合したものを回収、増殖させるプロセスをいう。この選択は、例えば１０１０メンバーを超える多くのメンバーを有するライブラリーからの選択であってよい。「スクリーニング」とは、単離されたライブラリーメンバーを標的への結合に関してそれぞれ単独に調べるプロセスをいう。自動化により、数千の候補物質を高度な平行プロセスでスクリーニングしてよい。ここに記載のディスプレーライブラリー選択法は、非標的分子に結合するディスプレーライブラリーメンバーを捨てる選択プロセスを含んでよい。非標的分子の具体例として、免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含む分子の細胞外部ドメインまたはＥＧＦドメイン、およびＴｉｅ１以外のレセプターチロシンキナーゼ、例えばＴｉｅ２が挙げられる。一実施において、いわゆる「陰性選択」工程が、標的と、関連する非標的分子と、関連するが異なる非標的分子とを区別するために用いられる。ディスプレーライブラリーまたはそのプールを非標的分子に接触させる。非標的に結合しないサンプルのメンバーを集め、その後の標的分子への結合のための選択またはその後の陰性選択のために用いる。陰性選択工程は、標的分子に結合するライブラリーメンバーの選択前でも選択後でもよい。
【０２１７】
別の実施において、スクリーニング工程を用いる。ディスプレーライブラリーメンバーを標的分子の結合のために単離した後に、各単離ライブラリーメンバーの非標的分子（例えば、上記の非標的）への結合能力を調べる。例えば、高処理ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いてこのデータが得られる。また、ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて標的に対する各ライブラリーメンバーの結合に関する定量的なデータを得ることもできる。非標的結合データと標的結合データを比較して（例えば、コンピュータとソフトウエアを用いて）、Ｔｉｅ１に特異的に結合するライブラリーメンバーを同定する。
【０２１８】
ここに記載のディスプレーライブラリーの選択とスクリーニング法は、標的分子上の特定の部位に結合するディスプレーライブラリーメンバーを選択する選択またはスクリーニングプロセスを含むことができる。例えば、高濃度のここに記載の抗体による溶出を用いて、溶出に用いた該抗体が結合したエピトープに近いか、またはそれにオーバーラップするエピトープに結合するファージを選択できる。したがって、緩衝液中にＥ３抗体を用いるか、または用いずにＥＬＩＳＡを実施することにより、Ｔｉｅ１のＥ３結合部位に結合するファージがスクリーニングできる。
【０２１９】
（Ｔｉｅ１結合抗体の選択とスクリーニング：）
下記は、ファージミドＦａｂライブラリーを用いて、Ｔｉｅ１に結合する抗体を同定する一つの例示的方法を提供する。例えば、三回の選択を、減少量（例えば、一回目、二回目および三回目でそれぞれ１００、５０および５０μｇ）の標的タンパク質を用いて行うことができる。標的はストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に固定化する。ライブラリーを、各回の選択前のストレプトアビジン被覆磁気ビーズに対して、および任意に、共通する精製ハンドルを含んでよい無関係のタンパク質に対して枯渇させる。例えば、標的がＦｃドメインとの融合物として作られる場合、ライブラリーは可溶性Ｔｒａｉｌ−Ｆｃ（市販のＦｃ融合タンパク質）に対して枯渇させることができる。この枯渇プロセスはＦｃバインダーを除去する。
【０２２０】
各回の選択は、例えば、２サイクルのストレプトアビジンビーズ枯渇、１サイクルのファージのＴｉｅ１被覆ビーズへの結合、１０サイクルの洗浄、結合ファージの溶出、および次回のために富化されたファージの増殖を含み得る。１０回の洗浄後、Ｔｉｅ１被覆ビーズに結合したファージは直接に増幅でき、または増幅前に溶出することができる。三回の選択後、個々のクローンを９６ウエルマイクロタイタープレートで生育させ、ファージＥＬＩＳＡによりＴｉｅ１結合活性について個々にスクリーニングできる。ＥＬＩＳＡは、Ｔｉｅ１、特異性コントロールおよび関連のないコントロールへの結合の評価を含むことができる。単離物は選択プロセスから生じる多様性を決定するためにＤＮＡフィンガープリントしてよい。例えば、陽性単離物はオリゴヌクレオチドプライマーＭ１３リバースおよび遺伝子ＩＩＩフォーワードによりＰＣＲ増幅してよい（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１）。生成物はＢｓｔＮＩフィンガープリンティングにより分析できる。
【０２２１】
リガンドを示すファージによるＥＬＩＳＡを実施する例示的な方法は下記の通りである。個々のクローンを生育させ、既に記載のように（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１）回収できる。ＥＬＩＳＡのために、９６ウエルＩｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ中ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅＴＭストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を１μｇ／ウエルで被覆し、一晩４℃でインキュベートする。ＰＢＳで３回洗浄後、１００μＬのビオチン化Ｔｉｅ１タンパク質を固定化ストレプトアビジンに３０〜６０分間室温で結合させる。次に、Ｔｉｅ１被覆ウエルを３００μＬの２％乳／１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（２％ＭＰＢＳＴ）で２時間３７℃にてブロックする。ウエルを、２％ＭＰＢＳＴで一時間室温にてブロックしておいた１００μＬのファージ培養上清とともにインキュベートする。ウエルを１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０．１％（ＰＢＳＴ）で５回洗浄し、抗Ｍ１３−ＨＲＰ二次抗体の１：５，０００希釈物の１００μＬとともに１時間室温でインキュベートする。ウエルを、ＴＭＢ溶液による展開前にＰＢＳＴで５回洗浄し、６３０ｎｍで読む。
【０２２２】
細胞ＥＬＩＳＡのために、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳ中１×１０６〜２×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させる。９６ウエル組織培養皿（Ｆａｌｃｏｎ，  ＶＷＲ）の１ウエルあたり１〜２×１０５細胞の最終密度を用いることができる。細胞は、等量の０．２％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、３７℃で１２分間インキュベートすることにより固定する。次に、それらを、自動化プレート洗浄器（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いてＰＢＳで三回洗浄し、２００μＬの２％ＭＰＢＳＴで一時間室温でブロックする。ＥＬＩＳＡの残りの操作は、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０．０５％を洗浄とインキュベーションに用いる以外は上記のように実施できる。
【０２２３】
（生殖系抗体）
抗体の可変領域を一つ以上の生殖系配列にさらに類似させるために、Ｔｉｅ１に結合する抗体、例えばここに記載の抗体を修飾できる。例えば、抗体は、一つ、二つ、三つまたはそれ以上のアミノ酸置換を、例えばフレームワークまたはＣＤＲ領域に含むことで、それを参照生殖系配列にさらに類似させることができる。一つの例示的な生殖系列化方法は、単離された抗体の配列に類似する（例えば、特定のデータベースで最も類似する）一つ以上の生殖系配列を同定することを含むことができる。次に（アミノ酸レベルでの）変異を増加および／またはくみ合わせて、単離された抗体に作ることができる。例えば、いくつかまたはすべての可能な生殖系変異をコードする配列を含む核酸ライブラリーを作る。次に、変異抗体を評価して、例えば、単離抗体に対して一つ以上のさらなる生殖系残基を有し、かつなおも有用である（例えば、機能的な活性を有する）抗体を同定する。一実施態様において、できるだけ多くの生殖系残基を単離抗体に導入する。
【０２２４】
一実施態様において、変異誘発を用いて、一つ以上の生殖系残基を置換またはそれらをＣＤＲ領域に挿入する。例えば、生殖系ＣＤＲ残基は、修飾される可変領域に対して類似（例えば、最も類似）する生殖系配列からのものであってよい。変異誘発後、生殖系残基が寛容されるかどうかを決定するために、抗体の活性（例えば、結合または他の機能的活性）を評価することができる。類似の変異誘発をフレームワーク領域内で実施できる。
【０２２５】
生殖系配列の選択は異なる方法で実施することができる。例えば、生殖系配列が、選択性または類似性のあらかじめ決めた基準、例えば、少なくともある程度の同一性パーセント、例えば少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％の同一性を満たす場合、該生殖系配列が選択できる。選択は、少なくとも２、３、５または１０の生殖系配列を用いて実施できる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合、類似の生殖系配列の同定は、そのような一つの配列を選択することを含んでよい。ＣＤＲ３の場合、類似の生殖系配列の同定は、そのような一つの配列を選択することを含んでよいが、アミノ末端部分およびカルボシキシ末端部分に別々に寄与する二つの生殖系配列の使用を含んでもよい。他の実施において、二つまたは三つ以上の生殖系配列を、例えばコンセンサス配列を形成するために用いる。
【０２２６】
一実施態様において、特定の参照可変ドメイン配列、例えばここに記載の配列に関して、関連可変ドメイン配列が、参照ＣＤＲ配列中の残基（ヒト生殖系配列（すなわち、ヒト生殖系核酸によりコードされるアミノ酸配列）で対応する位置の残基と同一である残基）と同一でないＣＤＲアミノ酸位置の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５または１００％を有する。
【０２２７】
一実施態様において、特定の参照可変ドメイン配列、例えばここに記載の配列に関して、関連可変ドメインが、ヒト生殖系配列、例えば、参照可変ドメイン配列に関連した生殖系配列からのＦＲ配列に同一のＦＲ領域の少なくとも３０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％を有する。
【０２２８】
したがって、興味ある所与の抗体に類似の活性を有するが、一つ以上の生殖系配列、特に一つ以上のヒト生殖系配列にさらに類似する抗体を単離することができる。例えば、抗体はＣＤＲ（例えばフレームワーク領域）以外の領域中の生殖系配列に少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％同一であってよい。さらに、抗体は、修飾される可変領域に類似する（例えば、最も類似する）生殖系配列からの生殖系残基である、ＣＤＲ領域中の少なくとも１、２、３、４または５個の生殖系残基を含んでよい。主要な興味のある生殖系配列はヒト生殖系配列である。抗体の活性（例えば、結合活性）は元の抗体の１００、１０、５、２、０．５、０．１および０．００１のファクター内であることができる。
【０２２９】
Ｖカッパの例示的生殖系参照配列として、Ｏ１２／Ｏ２、Ｏ１８／Ｏ８、Ａ２０、Ａ３０、Ｌ１４、Ｌ１、Ｌ１５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５／Ｌ１９、Ｌ８、Ｌ２３、Ｌ９、Ｌ２４、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｏ１１／Ｏ１、Ａ１７、Ａ１、Ａ１８、Ａ２、Ａ１９／Ａ３、Ａ２３、Ａ２７、Ａ１１、Ｌ２／Ｌ１６、Ｌ６、Ｌ２０、Ｌ２５、Ｂ３、Ｂ２、Ａ２６／Ａ１０およびＡ１４が挙げられる。例えばＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４（１８）：４６２８−３を参照されたい。
【０２３０】
ＨＣ可変ドメインの生殖系参照配列は、特定の基準構造、例えば、Ｈ１とＨ２超可変ループ中の１〜３構造物を有する配列に基づくことができる。免疫グロブリン可変ドメインの超可変ループの基準構造は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７９９−８１７；  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４（１８）：４６２８−３８に記載のようにその配列から推測することができる。１〜３構造を有する例示的配列として、ＤＰ−１、ＤＰ−８、ＤＰ−１２、ＤＰ−２、ＤＰ−２５、ＤＰ−１５、ＤＰ−７、ＤＰ−４、ＤＰ−３１、ＤＰ−３２、ＤＰ−３３、ＤＰ−３５、ＤＰ−４０、７−２、ｈｖ３００５、ｈｖ３００５ｆ３、ＤＰ−４６、ＤＰ−４７、ＤＰ−５８、ＤＰ−４９、ＤＰ−５０、ＤＰ−５１、ＤＰ−５３およびＤＰ−５４が挙げられる。
【０２３１】
（多様性）
ディスプレーライブラリーおよび他のライブラリーは、示されたポリペプチドの一つ以上の位置で変異を含む。所与の位置での変異は合成または天然のものであってもよい。一部ライブラリーには、合成および天然の多様性が含まれる。
【０２３２】
（合成的多様性）
ライブラリーは、人工的に合成された配列を起源とする多様な核酸配列の領域を含むことができる。典型的には、これらは、各所与の位置でのヌクレオチドの分布を含む縮重オリゴヌクレオチド集団から形成される。所与の配列の包含は分布に関してランダムである。合成的多様性の縮重源の一例は、ＮＮＮ（ここで、Ｎは等しい比率で４ヌクレオチドのいずれかである）を含むオリゴヌクレオチドである。
【０２３３】
合成的多様性は、例えば、所与のトリヌクレオチドでの核酸配列のコドンの数をＮＮＮよりも小さい分布に限定するようにさらに抑制することができる。例えば、そのような分布は、コドンの幾つかの位置の４個未満のヌクレオチドを用いて作ることができる。さらに、トリヌクレオチド付加技術を用いて分布をさらに抑制することができる。
【０２３４】
いわゆる「トリヌクレオチド付加技術」は、例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３および米国４，７６０，０２５および米国５，８６９，６４４に記載される。オリゴヌクレオチドを、一コドン（すなわち、トリヌクレオチド）を一度に、固体相支持体上に合成する。支持体は、多くのオリゴヌクレオチドが平行して合成されるように合成用の多くの官能基を含む。この支持体は、最初に、第一の位置のコドンセットの混合物を含む溶液に曝される。そのユニットは、さらなるユニットが付加されないように保護される。第一の混合物を含む溶液を洗浄除去し、固体支持体は、第二の位置のコドンセットを含む第二混合物が、結合第一ユニットに付加できるように脱保護する。この工程は反復して複数のコドンを逐次構築する。トリヌクレオチド付加技術は、所与の位置で多くのアミノ酸をコードすることのできる核酸の合成を可能とする。これらのアミノ酸の頻度は混合物中のコドンの比率により調節することができる。さらに、所与の位置でのアミノ酸の選択は、単一ヌクレオチドの混合物が合成中に付加される場合のように、コドン表の象限に制限されない。ランダム化コドンまたはスパイクコドンを含む合成オリゴヌクレオチドを親和成熟選択用ライブラリーを作るために用いることもできる。
【０２３５】
（天然の多様性）
ライブラリーは、異なる天然配列を起源とする（またはそれに基づいて合成された）多様な核酸配列の領域を含むことができる。ディスプレーライブラリーに含めることのできる天然の多様性の例は免疫細胞に存在する配列の多様性である（下記も参照）。核酸はこれらの免疫細胞から調製され、ポリペプチドディスプレーのフォーマットに取り入れられる。
【０２３６】
（抗体ディスプレーライブラリー）
一実施態様において、ディスプレーライブラリーは、免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン可変ドメインを各々含むタンパク質の多様なプールを表わす。ディスプレーライブラリーは、例えば、ヒト抗原を認識するヒトまたは「ヒト化」抗体を同定するために特に有用である。そのような抗体は、内皮関連疾患、例えば、転移性癌等のヒト疾患を治療する治療剤として用いることができる。抗体の定常領域とフレームワーク領域はヒトのものであるために、これらの治療抗体は抗原として認識されて標的とされることはないであろう。また、定常領域はヒト免疫系のエフェクター機能を動員するために最適化される。インビトロのディスプレー選択プロセスは、正常なヒト免疫系が自己抗原に対する抗体を作ることができないことを克服する。
【０２３７】
典型的な抗体ディスプレーライブラリーは、ＶＨドメインとＶＬドメインを含むポリペプチドを示す。「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインをいう。免疫グロブリンドメインは典型的には約７つのβストランドから構成される二つのβシートと、保存されたジスルヒド結合とを含む（例えば、Ａ．Ｆ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．  Ｂａｒｃｌａｙ  １９８８  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：３８１−４０５を参照）。免疫グロブリン可変領域の超可変ループの基準構造は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７９９−８１７；  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４（１８）：４６２８−３８に記載のようにその配列から推測することができる。ディスプレーライブラリーは抗体をＦａｂ断片（例えば、二つのポリペプチド鎖を用いるもの）または単鎖Ｆｖ（例えば、単一のポリペプチド鎖を用いるもの）として示すことができる。他のフォーマットも用いることができる。
【０２３８】
Ｆａｂと他のフォーマットの場合のように、示された抗体は、重鎖または軽鎖の一部として定常領域を含むことができる。一実施態様において、各鎖は、例えばＦａｂの場合と同じように、一つの定常領域を含む。他の実施態様において、さらなる定常領域が示される。
【０２３９】
抗体ライブラリーは多くの方法により構築することができきる（例えば、ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−８を参照）。さらに、各方法の要素は他の方法の要素と組み合わせることができる。変異が単一の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）または複数の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬ）中に導入されるようにプロセスを用いることができる。変異は、例えば、重鎖および軽鎖可変ドメインの片方または両方の領域を言及するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の一つ以上の領域において、免疫グロブリン可変ドメイン中に導入することができる。一実施態様において、変異を所与の可変ドメインのすべての三つのＣＤＲ中に導入する。別の好ましい実施態様において、変異を例えば重鎖可変ドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ２に導入する。どの組合せも可能である。一つの方法において、抗体ライブラリーは、ＣＤＲをコードする多様なオリゴヌクレオチドを、核酸の対応する領域に挿入することにより構築する。オリゴヌクレオチドはモノマーヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを用いて合成することができる。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら（（２０００）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９６：５７−８６）はトリヌクレオチド合成と、オリゴヌクレオチドを受容する設計制限部位を用いた鋳型とを用いてＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドを構築する方法を記載する。
【０２４０】
別の方法において、動物、例えば、非ヒト動物、例えばげっ歯類をＴｉｅ１で免疫する。動物は任意に抗原で追加免疫して、応答をさらに刺激する。次に、脾臓細胞を動物から単離し、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸を増幅し、ディスプレーライブラリーでの発現のためにクローニングする。非ヒト動物は一つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列を有することができる。例えば、動物は完全なヒト免疫グロブリン座を有することができる。また、動物は不活性化内因性免疫グロブリン座を有してもよい。
【０２４１】
さらに別の方法において、抗体ライブラリーは、ナイーブな生殖系免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト遺伝子）から増幅された核酸から構築される。増幅された核酸はＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸を含む。免疫グロブリンをコードする核酸の供給源は以下に記載する。増幅は、例えば保存された定常領域にアニールするプライマーを用いるＰＣＲ、または他の増幅方法を含むことができる。
【０２４２】
免疫グロブリンドメインまたはその断片をコードする核酸は、例えばヒト、霊長類、マウス、ウサギ、ラクダまたはげっ歯動物の免疫細胞から得ることができる。一例において、細胞は特定の性質に関して選択される。成熟の多様な段階のＢ細胞を選択することができる。別の例において、Ｂ細胞はナイーブである。
【０２４３】
一実施態様において、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、表面結合ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＧ分子を発現するＢ細胞を選別する。さらに、異なるイソタイプのＩｇＧを発現するＢ細胞を単離することができる。別の好ましい実施態様において、ＢまたはＴ細胞をインビトロで培養する。細胞を、例えばフィーダー細胞とともに培養するか、またはマイトジェンまたは他の調節剤、例えばＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ２０、フォルボールミリステートアセテート、細菌のリポ多糖、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニンまたはアメリカヤマゴボウマイトジェンを加えることによりインビトロで刺激することができる。
【０２４４】
さらに別の実施態様において、細胞を、免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リューマチ性関節炎、脈管炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症または抗リン脂質症候群を有する被験体から単離する。被験体はヒトまたは動物、例えばヒト病気用の動物モデルまたは類似の疾患を有する動物であってよい。さらに別の実施態様において、細胞を、ヒト免疫グロブリン座を有するトランスジェニック非ヒト動物から単離する。
【０２４５】
一つの好ましい実施態様において、細胞は体細胞過多変異のプログラムを活性化している。例えば、抗免疫グロブリン、抗ＣＤ４０および抗ＣＤ３８抗体による処理によって、細胞が免疫グロブリン遺伝子の体細胞変異誘発を受けるように刺激することができる（例えば、Ｂｅｒｇｔｈｏｒｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：２２２８を参照）。別の実施態様において、細胞はナイーブである。
【０２４６】
免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸は、下記の例示的な方法により天然のレパートリーより単離することができる。最初に、ＲＮＡを免疫細胞から単離する。全長（すなわち、キャップされた）ｍＲＮＡを（例えば、キャップされていないＲＮＡをウシ小腸ホスファターゼにより脱リン酸化することにより）分離する。次に、キャップをタバコ酸ピロホスファターゼで除去し、逆転写を用いてｃＤＮＡを作る。
【０２４７】
第一（アンチセンス）鎖の逆転写は任意の適当なプライマーを用いる任意の様式で行うことができる。例えば、ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０を参照されたい。プライマー結合領域は、例えば異なるイソタイプの免疫グロブリンを逆転写するために、異なる免疫グロブリン間で一定であってよい。プライマー結合領域は特定のイソタイプの免疫グロブリンに特異的であってもよい。典型的には、プライマーは少なくとも一つのＣＤＲをコードする配列に対して３’である領域に特異的である。別の実施態様において、ポリ−ｄＴプライマーが用いられてもよい（および重鎖遺伝子のために好ましいであろう）。
【０２４８】
合成配列を逆転写鎖の３’末端に連結することができる。合成配列を、逆転写後のＰＣＲ増幅中のフォーワードプライマー結合用のプライマー結合部位として用いることができる。合成配列の使用は、利用可能な多様性を完全に捕捉する異なるフォーワードプライマーのプールを用いる必要性をなくすことができる。
【０２４９】
次に、例えば、一回以上の回数で可変ドメインをコードする遺伝子を増幅する。複数の回数を用いる場合、ネステドプライマーを、高められた忠実度のために用いることができる。次に、増幅核酸を、ディスプレーライブラリーベクターにクローニングする。
【０２５０】
核酸配列を増幅するための任意の方法を増幅のために用いてよい。多様性を最大化し、多様性を偏らせない方法が好ましい。多様な技術が核酸増幅のために用いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；  米国特許第第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号、Ｓａｉｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，  １３５０−１３５４）は、核酸合成のラウンドを駆動する多様な温度のサイクルを利用する。転写に基づく方法は、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ合成を利用して核酸を増幅する（米国特許第６，０６６，４５７号、米国特許第６，１３２，９９７号、米国特許第５，７１６，７８５号、Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３３１−３４；  Ｓｔｏｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４９１）。ＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号、５，４０９，８１８号および５，５５４，５１７号）は転写、逆転写、およびＲＮａｓｅＨに基づく分解のサイクルを利用してＤＮＡサンプルを増幅する。さらに別の増幅方法は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ；  米国特許第５，８５４，０３３号および同第６，１４３，４９５号）および鎖置換増幅（ＳＤＡ；  米国特許第５，４５５，１６６号および同第５，６２４，８２５号）を含む。
【０２５１】
（二次スクリーニング法）
標的に結合する候補ディスプレーライブラリーメンバーの選択後、各候補ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば標的に対するその結合性をさらに特性付けるためにさらに分析することができる。同様に、他の方法により得られる候補リガンド（例えば免疫化等による）も分析できる。各候補リガンドは一種類以上の二次スクリーニングアッセイに供することができる。アッセイは結合的性質、触媒的性質、生理学的性質（例えば、細胞毒性、腎臓クリアランス、免疫原性）、構造的性質（例えば、安定性、立体配座、オリゴマー化状態）または別の機能的性質に関するものでありうる。同じアッセイは繰返して、しかし例えばｐＨ、イオンまたは熱感受性を決定するために異なる条件で用いることができる。
【０２５２】
適切であれば、アッセイは、ディスプレーライブラリーメンバーを直接に、または示されたポリペプチドをコードする核酸から作られた組換えポリペプチド、または示されたポリペプチドの配列に基づいて合成された合成ペプチドを使用することができる。結合的性質のための例示的なアッセイは下記のものがある。
【０２５３】
（ＥＬＩＳＡ）
ディスプレーライブラリーによりコードされるタンパク質は結合的性質に関してＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、各タンパク質を、底表面が標的、例えば限定量の標的で被覆されたマイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄して非特異的に結合したポリペプチドを除去する。次に、プレートに結合したタンパク質の量を、ポリペプチド、例えばポリペプチドのタグまたは定常領域を認識することのできる抗体を用いてプレートを調べることにより決定する。抗体は、適当な基質が提供される場合に発色生成物を作るアルカリホスファターゼ等の酵素に結合させる。タンパク質は、細胞から精製でき、または例えば線維状バクテリオファージコートとの融合物としてディスプレーライブラリーフォーマットでアッセイできる。もしくは、ディスプレーライブラリーに存在するか、選択によりディスプレーライブラリーから得られたペプチド／抗体の親和性を調べるために、標的分子、例えばＴｉｅ１を発現する細胞（例えば生存または固定されたもの）をマイクロタイタープレートに平板培養して用いることができる。
【０２５４】
ＥＬＩＳＡアッセイの別のものでは、多様性ストランドライブラリーの各ポリペプチドを用いてマイクロタイタープレートの異なるウエルを被覆する。次に、一定の標的分子を用いてＥＬＩＳＡを続けて各ウエルを調べる。
【０２５５】
（細胞結合アッセイ）
Ｔｉｅ１結合タンパク質を、一つ以上の細胞タイプ、例えば内皮細胞または血小板と相互作用する能力について評価することができる。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）はタンパク質と細胞との相互作用を調べる一つの例示的な方法である。Ｔｉｅ１結合タンパク質は、細胞への結合前またはその後にフルオロフォアにより直接または間接的に標識され、次に細胞をＦＡＣＳソーターでカウントする。
【０２５６】
例えば、下記の方法を用いて、Ｔｉｅ１結合タンパク質が血小板または他の細胞タイプと相互作用するかどうか評価することができる。
【０２５７】
血小板の単離。ヒト血液は、告知された健康なボランティアから得ることができる。例えば、静脈血を１／６容量のＡＣＤ（１００ｍｌのｄＨ２Ｏ中の２．５ｇのクエン酸ナトリウム、１．５ｇのクエン酸および２．５ｇのグルコース）に集める。血液を８００×ｇで１５分間室温で遠心し、血小板に富む血漿を取り出し、６０分間３７℃で、１ｍＭアセチルサリチル酸の存在下にインキュベートした後に、１０００×ｇで１０分間室温にて遠心する。血小板のペレットをＨＥＰＥＳ緩衝性Ｔｙｒｏｄｅの溶液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．２％ウシ血清アルブミンおよび０．０５Ｕ／ｍＬアピラーゼ）で２・１０８細胞／ｍｌの密度で再懸濁することができる。例えば、Ｋｏｒｎｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６５：１０，０４２−１０，０４８およびＮａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３１０：１５５−１６２）を参照されたい。
【０２５８】
ＦＡＣＳ。血小板のＦＡＣＳ分析に関して。細胞を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（４×１０５細胞／サンプル）中、ＰＧＥ１（１ｍｇ／ｍＬ）の存在下に再懸濁し、Ｔｉｅ１リガンド（例えば、約５μｇ／ｍＬ）またはコントロールとともにインキュベートすることができる。２２℃での１時間のインキュベーション後に、細胞を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、５０μＬの１／１００希釈ＦＩＴＣ標識二次抗体で処理し、３０分間氷上でインキュベートし、洗浄し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁する。サンプルをイムノサイトメトリーシステムフローサイトメーター（ＦＡＣ  Ｓｏｒｔ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を用いて分析する。例えば、Ｍａｌｇｏｒｚａｔａら（２０００）Ｂｌｏｏｄ，  Ｖｏｌ．９５  Ｎｏ．  ８（４月１５日、２６００〜２６０９ページ）も参照されたい。
【０２５９】
さらに、単離血小板からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離タンパク質のウエスタンブロッティングと免疫沈降により血小板を評価することができる。さらに他の方法は、Ｔｉｅ１結合リガンドが結合している（例えば被覆されている）表面に細胞を結合することを含む。
【０２６０】
他の細胞タイプは当分野で公知の方法によってＦＡＣＳのために調製することができる。
【０２６１】
（均一結合アッセイ）
候補ポリペプチドの標的との結合相互作用は、均一アッセイを用いて分析することができ、すなわちアッセイのすべての成分を加えた後、さらなる流体操作は必要とされない。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を均一アッセイとして用いることができる（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照）。第一分子（例えば、画分中に同定された分子）上のフルオロフォア標識を、その発光蛍光エネルギーが、第二分子（例えば標識）が第一分子に接近している場合に第二分子上の蛍光標識により吸収されうるように選択する。第二分子上の蛍光標識はそれが転移エネルギーを吸収する場合に蛍光を発する。標識間のエネルギー転移の効率はそれらの分子を分けている距離に関連するので、それら分子間の空間的関係を評価することができる。結合が分子間に起こる状況で、アッセイでの「受容体」分子標識の蛍光発生を最大とすべきである。ＦＲＥＴによるモニターに適するように構成される結合事象は当技術でよく知られた標準的な蛍光検出手段（例えば、蛍光定量計を用いて）都合よく測定することができる。第一または第二の結合分子の量を滴定することにより、結合曲線を作成して平衡結合定数を予測することができる。
【０２６２】
均一アッセイの別の例はアルファスクリーン（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍｅｒｉｄｅｎ  ＣＴ）である。アルファスクリーンは二つの標識ビーズを用いる。一つのビーズはレーザーで励起されたときに一重項酸素を発生する。別のビーズは一重項酸素が第一のビーズから拡散し、それと衝突する場合に光のシグナルを発生する。このシグナルは二つのビーズが接近している場合のみ発生する。一つのビーズはディスプレーライブラリーメンバーに結合させ、他のものは標的に結合させることができる。シグナルを測定して結合の程度を決定する。
【０２６３】
均一アッセイは、候補ポリペプチドをディスプレーライブラリーベヒクル、例えばバクテリオファージに結合させた状態で行うことができる。
【０２６４】
（表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ））
ディスプレーライブラリーから単離された分子と標的との結合相互作用はＳＰＲを用いて分析することができる。ＳＰＲまたは生物分子相互作用分析（ＢＩＡ）は何ら相互作用物質を標識することなしにリアルタイムで生物特異的相互作用を検出する。ＢＩＡチップの結合表面の質量変化（結合の事象を示す）は、表面に近い光の屈折率の変化をもたらす（表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）。屈折度の変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応を示すものとして測定される検出可能なシグナルを生じる。ＳＰＲを用いる方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；  Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；  Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１）Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６３：２３３８−２３４５；  Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５：６９９−７０５およびＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されるオンラインリソース）に記載されている。
【０２６５】
ＳＰＲからの情報を用いて、平衡解離定数（Ｋｄ）、および生物分子の標的への結合に関するＫｏｎとＫｏｆｆ等の動力学パラメーターの正確で定量的な測定を提供することができる。そのようなデータは異なる生物分子を比較するために用いることができる。例えば、多様性ストランドのライブラリーから選択される核酸によりコードされるタンパク質を比較して、標的に対する高い親和性を有するか、または遅いＫｏｆｆを有する個体を同定することができる。この情報は構造／活性の関係（ＳＡＲ）を進展させるために用いることもできる。例えば、親タンパク質の成熟したバージョンの動力学および平衡結合パラメーターを親タンパク質のパラメーターと比較することができる。特定の結合パラメーター、例えば高い親和性と遅いＫｏｆｆに関係する所与の位置の変異アミノ酸を同定することができる。この情報は、構造的なモデル化（例えば、相同性モデル化、エネルギー最少化、または結晶学またはＮＭＲによる構造決定を用いる）と組み合わせることができる。その結果、タンパク質とその標的との物理的相互作用の理解を公式化し、他の設計プロセスの指針として用いることができる。
【０２６６】
（タンパク質アレイ）
ディスプレーライブラリーから同定されたタンパク質は、固体支持体、例えばビーズまたはアレイに固定化することができる。タンパク質アレイのために、各ポリペプチドを支持体上の独自のアドレスに固定化する。典型的には、アドレスは二次元アドレスである。タンパク質アレイを以下に説明する（例えば、診断を参照）。タンパク質アレイを用いて、複数のタンパク質を、例えばＴｉｅ１との相互作用に関して評価することも可能である。
【０２６７】
（細胞アッセイ）
ライブラリーで宿主細胞を形質転換することにより候補タンパク質をライブラリーから選択することができる；ライブラリーはディスプレーライブラリーから前もって同定しておくことができる。例えば、ライブラリーは、ポリペプチドをコードし、かつタンパク質が細胞内に産生、細胞から分泌、または細胞表面に結合するように発現を支配するセグメントを含むベクター核酸配列を含むことができる。細胞はＴｉｅ１に結合するタンパク質に関してスクリーニングまたは選択することができ、例えば細胞の表現型または細胞仲介活性の変化により検出される。例えば、Ｔｉｅ１に結合する抗体の場合、活性は自己リン酸化、ＰＩ３キナーゼの活性化、ＡＫＴの活性化、または内皮細胞活性の変化（例えば、増殖）であってよい。
【０２６８】
別の実施態様において、細胞のライブラリーは細胞アレイの形を有する。細胞アレイは任意の適当な検出可能な活性に関して同様にスクリーニングすることができる。
【０２６９】
他の実施態様において、競合結合アッセイを用いて、Ｔｉｅ１への結合に関して参照リガンドと競合するタンパク質を同定する。同様に、エピトープマッピングを用いて、Ｔｉｅの特定のエピトープに結合するタンパク質を同定することができる。Ｔｉｅ１の断片と変異体をリガンド／同定プロセス、例えば特性付け、スクリーニングまたは免疫化の一つ以上に用いることもできる。
【０２７０】
（Ｔｉｅ１結合抗体を得る方法）
ディスプレーライブラリーの使用に加えて、Ｔｉｅ１結合抗体を得るため、またはディスプレーライブラリーの使用に組み合わせて他の方法を用いることができる。例えば、Ｔｉｅ１外部ドメインまたはその領域を非ヒト動物、例えばげっ歯動物中の抗原として用いることができる。
【０２７１】
一実施態様において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を有する。例えば、ヒトＩｇ座の大きな断片を用いてマウス抗体産生を欠如するマウス系統を設計することができる。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的Ｍａｂを作成、選択してもよい。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭ，  Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４），米国２００３００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号（１９９６日４月２９日出願）を参照されたい。
【０２７２】
別の実施態様において、モノクローナル抗体は非ヒト動物から得られ、次に修飾、例えばヒト化または脱免疫化する。Ｗｉｎｔｅｒは本発明のヒト化抗体を調製するために使用してよいＣＤＲグラフト化法を記載する（英国特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ（１９８７年３月２６日出願）；Ｗｉｎｔｅｒ米国５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のすべてのＣＤＲが非ヒトＣＤＲの少なくとも一部によって置換されるか、もしくはＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲにより置換されてよい。ヒト化抗体をあらかじめ決めた抗原に結合させるために必要なＣＤＲの数を取りかえることが必要なだけである。
【０２７３】
ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域からの等価な配列に置換することにより作ることができる。ヒト化抗体を作る一般的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７，  Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４およびＱｕｅｅｎら米国５，５８５，０８９号、米国５，６９３，７６１号および米国５，６９３，７６２号により提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも一つからの免疫グロブリンＦｖ可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列を単離、操作および発現することを伴う。そのような核酸の供給源は当業者によく知られており、例えば上記のようにあらかじめ決めた標的に対して抗体を産生するハイブリドーマから得てよい。ヒト化抗体またはその断片をコードする組換えＤＮＡを次に適当な発現ベクターにクローニングする。
【０２７４】
Ｔｉｅ１結合抗体は、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７（これらの内容は文献の援用により本文に具体的に導入される）に開示の方法によりヒトＴ細胞エピトープの特異的な欠失または「脱免疫化」により修飾してもよい。簡単に説明すれば、抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドに関して分析することができる；これらのペプチドは（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に定義される）潜在的なＴ細胞エピトープを表わす。潜在的なＴ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレディング」（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）と呼ばれるコンピュータモデル化アプローチを適用することができ、さらにヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを調べて、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載のようにＶＨとＶＬ配列に存在するモチーフを探すことができる。これらのモチーフは１８種類の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれにも結合するために、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変領域中の少数のアミノ酸残基を、好ましくは単一アミノ酸置換によって置換することで除去することができる。可能な保存的置換が行なわれる限り、ヒト生殖系抗体配列中のこの位置に共通するアミノ酸をしばしば、しかし排他的ではなく使ってよい。ヒト生殖系配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｌ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７７６−７９８；  Ｃｏｏｋ，  Ｇ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ２２７：７９９−８１７に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｌ．Ａ．ら編集。ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）。脱免疫変化を同定した後、ＶＨとＶＬをコードする核酸を変異誘発または他の合成方法（例えば、デノボ合成、カセット置換等）により構築することができる。変異誘発された可変配列は、任意にヒト定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１またはκ定常領域に融合させることができる。
【０２７５】
ある場合では、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体機能に重要であると知られているか、予測されている残基を含むであろう。例えば、潜在的なＴ細胞エピトープは通常ＣＤＲに向かって偏る。さらに、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体の構造と結合にとって重要なフレームワーク残基に存在しうる。これらの潜在的なエピトープを除去する変化はある場合では、例えば、変化あり、変化なしで鎖を作り試験することによるさらに厳密な検査を必要とするだろう。可能であれば、ＣＤＲにオーバーラップする潜在的なＴ細胞エピトープをＣＤＲ外の置換により除去した。ある場合では、ＣＤＲ内の変更は単なるオプションなので、この置換のある、またはない変異体を調べなければならない。他の場合、潜在的なＴ細胞エピトープを除去するために必要な置換は、抗体結合に決定的であろうフレームワーク内の残基位置にある。これらの場合、この置換のある、またはない変異体を調べなければならない。よって、ある場合では、いくつかの変異体脱免疫化重鎖および軽鎖可変領域を設計し、多様な重鎖／軽鎖組合せを、最適な脱免疫化抗体を同定するために調べてよい。次に、異なる変異体の結合親和性を、脱免疫化の程度、すなわち可変領域に残る潜在的なＴ細胞エピトープの数と関連させて考慮することにより最終的な脱免疫化抗体の選択を行うことができる。脱免疫化は、非ヒト配列を含む抗体、例えば、ネズミの抗体または他の非ヒトモノクローナル抗体を修飾するために用いることができる。脱免疫化は、ディスプレーライブラリーから単離された抗体を修飾するために用いることができる。
【０２７６】
（内皮細胞アッセイ）
Ｔｉｅ１結合リガンドまたは候補リガンドを、細胞アッセイを用いて特性付けて、例えば、リガンドが細胞に接触した場合の細胞表現型または他の活性の変化を評価することができる。典型的には、細胞はＴｉｅの外部ドメインの少なくとも一部を含むタンパク質を発現する。一部実施態様において、細胞は全長の成熟Ｔｉｅ１タンパク質を発現する。
【０２７７】
内皮細胞増殖。候補Ｔｉｅ１結合リガンドの内皮増殖阻害活性は、ウシ毛管内皮細胞増殖アッセイ、ニワトリＣＡＭアッセイ、マウス角膜アッセイ等の生物学的活性アッセイを用いて、移植腫瘍に対するリガンドの効果を評価することにより調べることができる。ニワトリＣＡＭアッセイは、例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙらの「Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ」、Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．７９（２）、１９９４年１０月２１日、３１５〜３２８ページに記載されている。簡単に説明すると、インタクトな卵黄を有する３日齢のニワトリ胚を卵から分離して、ペトリ皿に置く。三日間のインキュベーション後、試験すべきタンパク質を含むメチルセルロースディスクを個々の胚のＣＡＭに適用する。４８時間のインキュベーション後、胚とＣＡＭを観察して、内皮の成長が阻害されるかどうかを決定する。マウス角膜アッセイは、成長因子含有ペレットを、疑われる内皮成長阻害剤を含む別のペレットとともに、マウスの角膜に移植し、角膜で作られた毛細管のパターンを観察することを含む。
【０２７８】
血管形成。血管形成は、例えば、臍静脈、冠状動脈または皮膚細胞等の多様なヒト内皮細胞系を用いてアッセイしてよい。適当なアッセイとして、増殖を測定するアラマーブルー系アッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから利用可能）；血管形成増強剤または阻害剤の存在または不存在下に細胞の膜を通る移動を測定するＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｌｃｏｎ  ＨＴＳ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋ細胞培養挿入物の使用等の、蛍光分子を用いる移動アッセイ；およびマトリゲルＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上の内皮細胞による管状構造物の形成に基づく細管形成アッセイが挙げられる。
【０２７９】
細胞付着。細胞付着アッセイは、候補Ｔｉｅ１結合リガンドの存在または不存在下に、細胞の精製付着タンパク質への付着または細胞同士の付着を測定する。細胞／タンパク質付着アッセイは、細胞の精製タンパク質への付着を調節する作用物質の能力を測定する。例えば、組換えタンパク質を作り、ＰＢＳで２．５ｇ／ｍＬに希釈し、マイクロタイタープレートのウエルを被覆するために用いる。陰性コントロールに用いられるウエルは被覆しない。次に被覆ウエルを洗浄し、１％ＢＳＡでブロックし、再び洗浄する。化合物を最終試験濃度の２倍まで希釈し、ブロックされ被覆されたウエルに加える。次に、細胞をウエルに加え、未結合の細胞を洗浄除去する。保持された細胞を、カルセインＡＭ等の膜浸透性蛍光染料を加えることによりプレート上で直接標識し、そのシグナルを蛍光マイクロプレートリーダーで定量する。
【０２８０】
細胞／細胞付着アッセイは、細胞同士の結合を調節する候補Ｔｉｅ１結合リガンドの能力を測定するために用いることができる。このアッセイは、選択された付着タンパク質を天然に、または組換えにより発現する細胞を使用することができる。例示的なアッセイにおいて、細胞付着タンパク質を発現する細胞を、他の細胞（むしろ同じ細胞タイプか、または細胞が付着する別のタイプの細胞のいずれか）とともにマルチウエルプレートのウエルで平板培養する。付着することのできる細胞は、ＢＣＥＣＦ等の膜浸透性蛍光染料で標識し、候補リガンドの存在下に単層に付着させる。未結合細胞を洗浄除去し、結合細胞を蛍光プレートリーダーを用いて検出する。高処理細胞付着アッセイも記載されている。例えば、Ｆａｌｓｅｙ  Ｊ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ  ２００１；１２（３）：３４６−５３を参照されたい。
【０２８１】
管形成。管形成アッセイは、通常、細胞外マトリックスの環境を刺激するマトリックス基質上に管構造物を形成する培養細胞（一般的に、内皮細胞）の能力をモニターするために用いることができる。例示的な基質として、４℃で液体で、３７℃で固体ゲルを形成するマトリゲルＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（ラミニン、コラーゲンＩＶおよび硫酸へパリンプロテオグリカンを含む基底膜タンパク質の抽出物）が挙げられる。他の適当なマトリックスはコラーゲン、フィブロネクチンおよび／またはフィブリン等の細胞外成分を含む。細胞は血管生成促進刺激物質により刺激し、それらの細管形成能力を画像化により検出する。細管は、刺激とともに一晩インキュベーションした後に一般的に検出できるが、それよりも長いか短い時間枠を用いてもよい。管形成アッセイは当分野でよく知られている（例えば、Ｊｏｎｅｓ  Ｍ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：１４１８−１４２３）。これらのアッセイは伝統的に血清によるか、または成長因子ＦＧＦまたはＶＥＧＦによる刺激を伴う。一実施態様において、アッセイは無血清培地で培養された細胞を用いて実施する。一実施態様において、アッセイを、一つ以上の血管形成促進因子、例えばＴＮＦ−αのような炎症性血管形成因子またはＦＧＦ、ＶＥＧＦ、フォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ＴＮＦ−アルファ、エフリン等の存在下で行われる。
【０２８２】
細胞移動。内皮細胞移動の例示的アッセイは、ヒト微小血管内皮（ＨＭＶＥＣ）移動アッセイである。例えば、Ｔｏｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２２，  ４９７−５１１を参照。移動アッセイは当分野で知られている（例えば、Ｐａｉｋ  Ｊ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１１８３０−１１８３７を参照）。一例において、培養内皮細胞を、典型的な細胞サイズよりも一般的に小さい孔サイズのマトリックス被覆多孔性薄膜上にまく。薄膜は典型的にはトランスウエルポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．）等の膜であり、一般的に血管形成促進刺激を含む下部チャンバーと液体接触した上部チャンバーの一部である。移動は一般的に刺激との一晩のインキュベーション後にアッセイするが、それよりも長いか、短い時間枠を用いてもよい。移動は薄膜を横断した細胞の数として評価し、ヘモトキシリン溶液（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による細胞の染色によるか、または細胞数の決定のための任意の他の方法により検出してよい。別の例示的な設定では、細胞を蛍光標識し、移動を蛍光の読み、例えばＦａｌｃｏｎ  ＨＴＳ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて検出する。一部の移動が刺激の不存在下に観察される一方で、移動は血管形成促進因子に対する応答で大きく増加する。アッセイを用いて、Ｔｉｅ１結合リガンドの内皮細胞移動に対する効果を調べることができる。
【０２８３】
発芽アッセイ。例示的な発芽アッセイは、コラーゲンゲル系マトリックスに埋め込まれた内皮細胞の細胞数で定義される球状集合体（「スフェロイド」）を用いる三次元のインビトロ血管生成アッセイである。スフェロイドは、細胞外マトリックス中への侵入による毛細管様構造物の発芽（「細胞発芽」という）とその後の複雑な吻合ネットワーク形成の出発点として働くことができる（Ｋｏｒｆｆ  ａｎｄ  Ａｕｇｕｓｔｉｎ，  １９９９，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１２：３２４９−５８）。例示的な実験設定において、スフェロイドは４００個のヒト臍静脈内皮細胞を、非吸着性の９６ウエルプレートの個々のウエルにピペットで移し、一晩球状に凝集させることにより調製される（Ｋｏｒｆｆ  ａｎｄ  Ａｕｇｕｓｔｉｎ：  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４３：１３４１−５２，  １９９８）。スフェロイドを採取し、９００μｌのメトセル−コラーゲン溶液にまき、２４ウエルプレートの各ウエルにピペットで移し、コラーゲンゲル重合を行う。試験物質を３０分後に、試験物質の１０倍濃縮した作業用希釈物の１００μｌをゲル頂部にピペットで移すことによって加える。プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。実験インキュベーション時間の最後にパラホルムアルデヒドを加えることにより皿を固定する。内皮細胞の発芽強度は自動化イメージ分析システムにより定量して、１スフェロイドあたりの累積発芽長さを決定することができる。
【０２８４】
一部実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドはここに記載のアッセイ、例えばここに記載の細胞アッセイに対して統計的に有意な効果を有する。
【０２８５】
（リガンド産生）
標準的な組換え核酸法を用いてＴｉｅ１に結合するタンパク質リガンドを発現することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照されたい。一般的に、タンパク質リガンドをコードする核酸配列は核酸発現ベクターにクローニングする。タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、各鎖を発現ベクター、例えば同一または異なる細胞で発現する同一または異なるベクターにクローニングすることができる。抗体の生産方法も下記に提供する。
【０２８６】
（抗体生産）
いくつかの抗体、例えば、Ｆａｂを細菌細胞、例えば大腸菌細胞に作ることができる。例えば、Ｆａｂが、ディスプレー実体とバクテリオファージタンパク質（またはその断片）との間の抑圧可能なストップコドンを含むファージディスプレーベクター中の配列によりコードされている場合、ベクター核酸は、ストップコドンを抑制できない細菌細胞中に移し替えることができる。この場合、Ｆａｂは遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合せず、培地中に分泌する。
【０２８７】
抗体は真核細胞中に作ることもできる。一実施態様において、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は酵母細胞、例えばＰｉｃｈｉａ（例えば、Ｐｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２５１：１２３−３５を参照）、ＨａｎｓｅｕｌａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに発現させる。
【０２８８】
一実施態様において、抗体は哺乳類細胞で作られる。クローン抗体またはその抗原結合断片を発現する好ましい哺乳類宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞等、例えばＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９：６０２−６２１に記載のようにＤＨＦＲ選択マーカーとともに用いる）、リンパ球細胞系、例えば、ＮＳ０ミエローマ細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞およびトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳類からの細胞が挙げられる。例えば、細胞は乳腺の上皮細胞である。
【０２８９】
免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）や選択マーカー遺伝子等の付加的な配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易とする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号および米国特許第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート等の薬品に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子として、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅によるｄｈｆｒ−宿主細胞での使用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０２９０】
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組換え発現の例示的な系において、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム仲介トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖と軽鎖の遺伝子はそれぞれエンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルス等に由来するもの、例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント）に作動可能に連結させて遺伝子の高レベルの転写を行う。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も有し、これは該ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のメトトレキセート選択／増幅を用いる選択を可能とする。選択された形質転換宿主細胞を培養して抗体重鎖と軽鎖を発現させ、インタクトな抗体を培養培地から回収する。標準的な分子生物学技術を用いて、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、抗体を培養培地から回収する。例えば、一部の抗体はプロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。
【０２９１】
Ｆｃドメインを含む抗体のために、抗体産生システムは好ましくはＦｃドメインがグリコシル化されている抗体を合成する。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインはＣＨ２ドメイン中のアスパラギン２９７でグリコシル化している。このアスパラギンは二分枝タイプのオリゴ糖による修飾部位である。このグリコシル化はＦｃγレセプターと補体Ｃ１ｑにより仲介されるエフェクター機能に必要とされることが示されている（Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｏｆ（１９９２）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５１：１−８４；  Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １６３：５９−７６）。好ましい実施態様において、Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳類発現系で作られる。Ｆｃドメインは他の真核生物での翻訳後修飾を有してもよい。
【０２９２】
抗体はトランスジェニック動物によって作ることもできる。例えば、米国５，８４９，９９２号はトランスジェニック哺乳類の乳腺に抗体を発現する方法を記載する。乳特異的プロモーターおよび興味ある抗体と分泌のためのシグナル配列とをコードする核酸を含むトランスジーンが構築される。そのようなトランスジェニック哺乳類の雌により作られる乳は、分泌された興味のある抗体を含む。抗体は乳から精製でき、または一部の利用では直接に用いることができる。
【０２９３】
例えば天然、ヒトまたは部分的にヒトの免疫グロブリン座を有する例えば動物を用いて、Ｔｉｅ１に結合する抗体を免疫化により作ることもできる。非ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列、例えば特定の位置で、例えば下記の位置の一つ以上（好ましくは少なくとも５、１０、１２またはすべて）でコンセンサスヒトアミノ酸残基の置換を含むように修飾することもできる：（軽鎖の可変ドメインのＦＲにおいて）、４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３８Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、５８Ｌ、４６Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７３Ｌ、８５Ｌ、８７Ｌ、９８Ｌおよび／または（重鎖の可変ドメインのＦＲにおいて）２Ｈ、４Ｈ、２４Ｈ、３６Ｈ、３７Ｈ、３９Ｈ、４３Ｈ、４５Ｈ、４９Ｈ、５８Ｈ、６０Ｈ、６７Ｈ、６８Ｈ、６９Ｈ、７０Ｈ、７３Ｈ、７４Ｈ、７５Ｈ、７８Ｈ、９１Ｈ、９２Ｈ、９３Ｈおよび／または１０３Ｈ（Ｋａｂａｔのナンバリングによる）。例えば、米国６，４０７，２１３号を参照されたい。
【０２９４】
（Ｔｉｅ１生産）
Ｔｉｅ１外部ドメインタンパク質、Ｔｉｅ１タンパク質またはＴｉｅ１リポソームの製造方法は当分野で知られている。例えば、ＷＯ９３／１４１２４を参照されたい。
【０２９５】
（ビオチン化法）
多様な方法がタンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質または標的タンパク質をビオチン化するために利用できる。例えば、タンパク質を５倍モル過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンとともに、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、一晩４℃でインキュベートすることができる。遊離ビオチンは、例えば１０ｋＤａ分子量カットオフメンブレンを有するＢｉｏｍａｘ装置を用いて、ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０へのバッファー交換または透析により除去する。タンパク質１モルあたりに導入されるビオチン分子の数は製造者（Ｐｉｅｒｃｅ）により記載されるようにＨＡＢＡアッセイを用いて決定することができる。
【０２９６】
（薬学的組成物）
別の特徴において、本発明は、Ｔｉｅ１結合リガンド、例えばＴｉｅ１に結合すると同定された抗体分子、他のポリペプチドまたはペプチド、またはここに記載されたものを含み、薬学的に受容可能なキャリアとともに処方された組成物、例えば薬学的に受容可能な組成物を提供する。ここで用いる「薬学的組成物」は標識リガンド（例えば、インビボ画像化用）ならびに治療組成物を包含する。
【０２９７】
ここで用いる「薬学的に受容可能なキャリア」とは、生理学的に適合性のあるいかなるおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗カビ剤、等張性剤および吸収遅延剤等を含む。好ましくは、キャリアは（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊椎または表皮投与に適する。投与経路にしたがって、活性化合物、すなわち、タンパク質リガンドは、化合物を不活性化する可能性のある酸の作用または他の自然条件から該化合物を保護する物質で被覆してもよい。
【０２９８】
「薬学的に受容可能な塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒物学的効果を付与しない塩をいう（例えば、Ｂｅｒｇｅ，  Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６：１−１９）。そのような塩の具体例として、酸付加塩と塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等に由来する塩および非毒性の有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等に由来する塩が挙げられる。塩基付加塩として、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等に由来する塩および非毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等に由来する塩が挙げられる。
【０２９９】
本発明の組成物は多様な形を有してよい。これらのものとして、例えば、液体、半固体および固体投与形、例えば液体溶液（例えば、注射可能で注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉剤、リポソームおよび座薬が挙げられる。好ましい形は投与および治療的利用の意図する態様に依存する。典型的な好ましい組成物は、例えばヒトに抗体を投与するために用いられる組成物と類似するもの等、注射可能または注入可能な溶液の形にある。投与の好ましい態様は非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。好ましい実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドは静脈内注入または注射により投与される。別の好ましい実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドは筋内注射か皮下注射により投与される。
【０３００】
ここに用いる「非経口投与」および「非経口に投与される」との語句は、腸または局所投与以外の通常注射による投与様式を意味し、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮膚内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射または注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０１】
薬学的組成物は典型的には、製造および保存の条件下で無菌および安定でなければならない。薬学的組成物を試験して、それが投与の規制上および産業上の標準を満たすことを保証することもできる。例えば、調製物中のエンドトキシン量は、ＵＳＰ２４／ＮＦ１９法にしたがって（例えば、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒロット＃７Ｌ３７９０から利用できるキット、感受性０．１２５ＥＵ／ｍｌを用いる）リムルスアメボサイトライセートアッセイを用いて調べることができる。薬学的組成物の無菌性はＵＳＰ２４／ＮＦ１９法にしたがってチオグリコレート培地を用いて決定することができる。例えば、調製物を用いてチオグリコレート培地に接種し、３５℃で１４日以上インキュベートする。培地は微生物の生育を検出するために定期的に調べる。
【０３０２】
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高医薬濃度に適する他の秩序だった構造物として処方することができる。無菌の注射可能な溶液は、有効化合物（例えばリガンド）を、必要とされる上記成分の一つまたはその組合せとともに適当な溶媒中に必要とされる量で配合した後にろ過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上記からの必要とされる他の成分を含む無菌ベヒクルに有効化合物を配合することにより調製する。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、すでに無菌ろ過した溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分の粉末を与える真空乾燥と凍結乾燥である。溶液の適当な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを用いることにより、分散液の場合必要とされる粒度の保持により、および界面活性剤の使用により保持することができる。注射可能な組成物の延長した吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアレート塩とゼラチンを組成物に含ませることにより達成することができる。
【０３０３】
本発明の抗Ｔｉｅ１タンパク質リガンドは当分野で知られている多様な方法により投与することができるが、多くの使用のために好ましい投与経路／態様は静脈注射または注入である。例えば、治療の使用のためには、Ｔｉｅ１結合リガンドが、３０、２０、１０、５または１ｍｇ／分よりも低い速度での静脈内注入により投与して、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量を達成することができる。投与経路および／態様は所望の結果に基づき変えられよう。ある実施態様において、有効化合物は、移植物等の調節放出処方物およびマイクロカプセル化送達システム等、該化合物を急速な放出に対して保護するキャリアとともに調製してよい。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解可能で生物適合性のポリマーを用いることができる。そのような処方物の多くの調製方法が特許されているか、一般的に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８を参照されたい。
【０３０４】
ある実施態様において、リガンドは、例えば不活性希釈剤または同化可能な食用キャリアとともに経口投与してよい。化合物（および所望であれば、他の成分）を硬質または軟質の外殻ゼラチンカプセルに封入するか、錠剤へと圧縮するか、または被験体の食事に直接配合してもよい。経口治療投与のために、化合物は賦形剤とともに配合し、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤等の形で用いてよい。本発明の化合物を非経口投与以外で投与するために、化合物の不活化を防止する物質で化合物を被覆するか、または化合物を該物質とともに投与することが必要であろう。
【０３０５】
薬学的組成物は当分野で公知の医学装置により投与することができる。例えば、好ましい実施態様において、本発明の薬学的組成物を、米国特許第５，３９９，１６３号、同上５，３８３，８５１号、同上５，３１２，３３５号、同上５，０６４，４１３号、同上４，９４１，８８０号、同上４，７９０，８２４号または同上４，５９６，５５６号等に開示される装置等の注射針なしの皮下注射装置により投与することができる。本発明に有用なよく知られた移植物とモジュールの具体例として、医薬を調節速度で分配する移植可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、薬物を皮膚を通って投与する治療装置を開示する米国特許第４，４８６，１９４号、医薬を正確な注入速度で送達する医薬注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な医薬送達用の可変流の移植可能注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、マルチチャンバー区画を有する浸透医薬送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号および浸透医薬送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。勿論、多くの他のそのような移植物、送達システムおよびモジュールも知られている。
【０３０６】
ある実施態様において、本発明の化合物はインビボでの適当な分布を保証するように処方することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物が（所望なら）ＢＢＢを確実に通過するために、それらを、例えばリポソーム中に処方することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号および同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは特定の細胞または器官に選択的に運ばれて、標的化された医薬送達を向上させる一つ以上の部分を含んでよい（例えば、Ｖ．Ｖ．  Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２９：６８５を参照）。
【０３０７】
投薬計画は最適な所望とされる応答（例えば、治療的応答）を提供するように調節する。例えば、単一のボーラスを投与してもよいし、いくつかに分けた用量を経時的に投与してもよいし、用量を治療状況の必要性によって示されるように比例させて増減してもよい。非経口組成物を、投与の容易さと投与量の均一性のための投与量単位で処方することは特に有利である。ここで用いる投与量単位形は、治療を受ける被験体のために単位投与量として適する物理的に別々の単位をいい、各単位は、必要とされる医薬キャリアと組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算されたあらかじめ決めた量の有効化合物を含む。本発明の投与量単位形の規格は、（ａ）有効化合物の独自の特性と達成すべき特定の治療効果および（ｂ）個人における治療の感受性のためにこのような有効化合物の配合技術に内在する制限により指示され、およびこれらに直接左右される。
【０３０８】
本発明の抗体の治療または予防に効果のある量の例示的な限定するものではない範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。Ｔｉｅ１結合抗体は３０、２０、１０、５または１ｍｇ／分を下回る速度で静脈内注入により投与して約１〜１００ｍｇ／ｍ２または約５〜３０ｍｇ／ｍ２の用量を達成することができる。抗体よりも分子量の小さいリガンドについては、適当な量は比例して少なくすることができる。投与量の値は、緩和すべき症状のタイプと重篤度とともに変えてもよいことに注意されたい。任意の特定の被験体に対しては、特定の投薬計画は、個人の必要性と、組成物を投与するか、組成物投与を監督する者の専門的な判断とに基づいて経時的に調整させる必要があり、ここで示す投与量の範囲は例示的なものにすぎず、請求された組成物の範囲や実施を制限するものではないことを理解されたい。
【０３０９】
本発明の薬学的組成物は、「治療効果のある量」または「予防効果のある量」の本発明Ｔｉｅ１結合リガンドを含んでよい。「治療効果のある量」とは、所望の治療成果を達成するために必要な投与量と時間において有効な量をいう。組成物の治療効果のある量とは、個人の病状、年齢、性および体重等の因子および個人において所望の応答を引き出すタンパク質リガンドの能力にしたがって変えてもよい。治療効果のある量は、治療的に有益な効果が組成物のあらゆる毒性または有害な効果に上回る量でもある。「治療効果のある投与量」とは好ましくは測定可能なパラメーター、例えば炎症または腫瘍の成長速度を、未処置の被験体に対して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％抑制する。化合物の測定可能なパラメーター（例えば、癌）の抑制能力はヒト腫瘍の効能を予測する動物モデルシステムで評価することができる。もしくは、組成物のこの性質は、熟練実施者に公知のアッセイによってインビトロでの抑制等の化合物の抑制能力を調べることにより評価することができる。
【０３１０】
「予防効果のある量」とは、所望の予防成果を達成するために必要な投与量と時間において有効な量をいう。典型的には、予防的な用量は疾患前または疾患の初期段階で被験体に用いられるために、予防効果のある量は治療効果のある量よりも少ないであろう。
【０３１１】
Ｔｉｅ１に結合するタンパク質リガンドおよび使用、例えば治療、予防または診断利用の使用説明書を含むキットも本発明の範囲内にある。一実施態様において、診断利用の使用説明書は、Ｔｉｅ１をインビトロで、例えばサンプル、例えば炎症疾患または癌または腫瘍疾患を有する患者の生検サンプルまたは細胞中、またはインビボで検出するＴｉｅ１結合リガンド（例えば、抗体またはその抗原結合断片、または他のポリペプチドまたはペプチド）の利用を含む。別の実施態様において、治療的利用の使用説明書は、癌または腫瘍疾患を有する患者における示唆された投与量および／または投与様式を含む。さらに、キットは、診断剤または治療剤、例えばここに記載の診断剤または治療剤等の少なくとも一つの付加的試薬および／または一つ以上の付加的Ｔｉｅ１結合リガンドを必要に応じて一つ以上の分離した医薬品として処方して含む。
【０３１２】
（安定化および保持）
一実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンド（例えば、ここに記載のＴｉｅ１結合抗体）は、循環中、例えば血液、血清、リンパ液または他の組織中でその安定化および／または保持を向上させる部分と物理的に会合させる。
【０３１３】
例えば、Ｔｉｅ１結合リガンドはポリマー、例えば実質的に非抗原性のポリマー、例えばポリオキシアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドと会合させることができる。適当なポリマーは重量により実質的に変わるであろう。約２００〜約３５，０００の範囲の数平均分子量を有するポリマーが本発明の目的のために通常選択される。約１，０００〜約１５，０００の分子量が好ましく、２，０００〜約１２，５０００が特に好ましい。
【０３１４】
例えば、Ｔｉｅ１結合リガンドは水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンと複合化することができる。そのようなポリマーの限定するものではないリストは、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、その共重合体およびそのブロック共重合体（但し、ブロック共重合体の水溶性は保持されている）を含む。さらなる有用なポリマーとして、ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロック共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）；ポリメタクリレート；カルボマー；糖モノマーＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸からなる分鎖または未分鎖の多糖、例えばホモ多糖またはヘテロ多糖、例えばラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸ムコ多糖の多糖サブユニット、例えばヒアルロン酸等；糖アルコールのポリマー、例えばポリソルビトールおよびポリマンニトール等；ヘパリンまたはヘパロンが挙げられる。
【０３１５】
他の化合物、例えば細胞毒、標識、または他の標的作用物質、例えば別のＴｉｅ１結合リガンドまたは無関係のリガンドを同じポリマーに連結することもできる。モノ活性化アルコキシ末端ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、モノメトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）；Ｃ１−４アルキル末端ポリマー；およびビス活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）を架橋のために用いることができる。例えば、米国第５，９５１，９７４号を参照されたい。
【０３１６】
その最も共通する形において、ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧは下記の一般構造を持つ、ヒドロキシル基の末端を有する直鎖または分鎖のポリエーテルである：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ＰＥＧは、エポキシ環上のヒドロキシドイオンの求核攻撃により開始されるエチレンオキシドのアニオン性開環重合により合成することができる。ポリペプチド修飾に特に有用なのは下記の一般構造を有するモノメトキシＰＥＧ、ｍＰＥＧである。
【０３１７】
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
さらなる説明については、例えばＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５９−４７６を参照されたい。
【０３１８】
一実施態様において、架橋前のポリマーは水溶性である必要はないが、水溶性であるのが好ましい。一般的に、架橋後、生成物は水溶性であり、例えば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。さらに、ポリマーは複合体形において高い免疫原性を有すべきではなく、複合体が静脈内注射または注入による投与を意図するのであれば、そのような経路に適合しない粘度を持つべきでもない。
【０３１９】
一実施態様において、ポリマーは反応性のある単一基のみを含む。これはタンパク質分子の架橋を避けるのに役立つ。しかし、架橋を低減するために反応条件を最大化することや、実質的に均一な誘導体を回収するために反応生成物をゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィーで精製することはここでの範囲内にある。他の実施態様において、ポリマーは、複数のリガンドをポリマー骨格に連結する目的のために二つ以上の反応基を含有する。再び、ゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィーを用いて、所望の誘導体を実質的に均一な形で回収することができる。
【０３２０】
ポリマーの分子量は約５００，０００Ｄ以下であり得、好ましくは少なくとも約２０，０００Ｄ、または少なくとも約３０，０００Ｄ、または少なくとも約４０，０００Ｄである。選択される分子量は、達成される複合体の効果的な大きさ、ポリマーの性質（例えば、直鎖または分鎖等の構造）および誘導化の程度に依存しうる。
【０３２１】
共有架橋は、例えばＮ末端アミノ基およびリジン残基に見られるエプシロンアミノ基、ならびに他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルヒドリル、ヒドロキシルまたは他の親水基への架橋によってＴｉｅ１結合リガンドをポリマーへ連結するために用いることができる。ポリマーは、多官能性（普通は二官能性）架橋剤を使用することなくＴｉｅ１結合リガンドに直接共有結合させてもよい。アミノ基への共有結合は、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド活性基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび無水酢酸、または塩化ＰＥＧ＋４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性化スクシンイミジルエステル、活性化ジチオカルボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に基づく既知の化学反応により達成する。カルボキシル基はカルボジイミドを用いてＰＥＧ−アミンを結合させることにより誘導体化できる。スルヒドリル基は、マレイミド置換ＰＥＧ（例えば、アルコキシ−ＰＥＧアミン＋スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）ＷＯ９７／１０８４７またはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  Ａｌａから市販されているＰＥＧ−マレイミド）に結合させることにより誘導体化できる。もしくは、例えばＰｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ７０：１１２６−１１３０（１９９４）に記載されているように、リガンド上の遊離アミノ基（例えばリジン残基上のエプシロンアミノ基）を２−イミノ−チオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）によりチオール化し、次にマレイミドを含有するＰＥＧの誘導体に結合させることができる。
【０３２２】
Ｔｉｅ１結合リガンドへ結合させることのできる官能化ＰＥＧポリマーは、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  Ａｌａ．）から入手できる。そのような市販されているＰＥＧ誘導体として、例えば、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−スクシネート、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジルカルボネート、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカルボネート、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルヒド、ヘテロ官能性ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシランおよびＰＥＧホスホリドが挙げられる。これらのＰＥＧ誘導体を結合させる反応条件はＴｉｅ１結合リガンド、ＰＥＧ化の所望の程度、および利用されるＰＥＧ誘導体に依存しながら変えてもよい。ＰＥＧ誘導体の選択に伴う幾つかの因子として、所望の結合点（例えばリジンまたはシステインＲ基）、誘導体の加水分解安定性と反応性、結合の安定性、毒性および抗原性、分析の適切性等が挙げられる。任意の特定の誘導体の使用の具体的な説明は製造者から入手できる。
【０３２３】
Ｔｉｅ１結合リガンドとポリマーの複合体は、例えばゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣにより未反応の出発材料から分離することができる。複合物の異種の種は同じ方法で互いに精製する。異なる種（例えば、一つまたは二つのＰＥＧ残基を有するもの）の分離は、未反応のアミノ酸のイオン的性質の違いのために可能である。例えば、ＷＯ９６／３４０１５を参照されたい。
【０３２４】
（治療）
Ｔｉｅ１に結合するタンパク質リガンド（例えば、ここに記載のもの）は治療的および予防的有用性を有する。例えば、これらのリガンドは培養中の細胞、例えばインビトロまたはイクスビボまたは被験体に例えばインビボで投与して、内皮細胞疾患、血管発達疾患、傷の治癒、炎症疾患および癌、特に転移性癌等の多様な疾患の治療、予防および／または診断を行うことができる。
【０３２５】
ここに用いる「治療する」または「治療」との用語は、Ｔｉｅ１結合抗体を単独または一つ以上の他の作用物質（例えば第二の作用物質）と組み合わせて被験体、例えば患者に適用または投与すること、または該作用物質を、被験体、例えば、疾患（例えば、ここに記載の疾患）、疾患の症状または疾患に対する素因を有する患者から単離された組織または細胞、例えば細胞系に、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、変化、矯正、改善、向上または作用する目的で適用または投与することと定義される。細胞の治療とは、細胞のインビトロまたはインビボでの成長または活性、剥離または死滅の阻害、さもなければ細胞、例えば異常な細胞の疾患、例えばここに記載の疾患（例えば、癌性疾患）を仲介する能力の低減をいう。
【０３２６】
一実施態様において、「細胞の治療」とは細胞、例えば過多増殖細胞の活性および／または増殖の減少をいう。そのような減少は細胞の全体的な除去を必ずしも示さず、細胞の活性または数の減少、例えば統計的に有意な減少を示す。活性の減少の例は細胞移動の減少または細胞分化の減少である。
【０３２７】
ここで用いられるように、疾患を治療するのに効果的なＴｉｅ１結合リガンドの量、または「治療効果のある量」とは、被験体に対する一回または複数の投与の際に、細胞、例えば内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ１発現内皮細胞）または癌細胞（特にその転移細胞）を治療するために、またはここに記載の疾患を有する被験体を、そのような治療のない場合に予想される場合に比べて治癒、緩和、低減または向上を持続させるために効果的なリガンドの量をいう。ここに用いる腫瘍の「成長の阻害」はその成長および転移を遅延、中断、阻害または停止をいい、必ずしも腫瘍成長の全体的な除去を示すものではない。
【０３２８】
ここで用いられるように、疾患を予防するのに効果的なＴｉｅ１結合リガンドの量、またはリガンドの「予防効果のある量」は、被験体に対する一回または複数の投与の際に、疾患、例えば内皮細胞関連疾患、血管発達疾患、炎症性病気または癌の発生または再発を防止または遅延するのに効果的であるＴｉｅ１結合リガンド、例えば、ここに記載のＴｉｅ１結合抗体の量を意味する。
【０３２９】
例えば、二つの状態間の定量的違いを示す「誘導する」、「阻害する」、「高める」、「上昇する」、「増加する」、「低下する」等の用語は、二つの状態間の違い、例えば統計的に有意な違いをいう。例えば、「Ｔｉｅ１発現過多増殖細胞の増殖を阻害するのに有効な量」は、細胞の成長速度が、例えば未処置細胞とは異なる、例えば統計的に有意に異なるであろうことを意味する。
【０３３０】
ここで用いる「被験体」との用語はヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。好ましいヒト動物は異常な細胞増殖または細胞分化により特徴付けられる疾患を有するヒト患者を含む。本発明の「非ヒト動物」との用語はすべての脊椎動物、例えば非哺乳類（例えば、ニワトリ、両生類、爬虫類）および哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ等を含む。
【０３３１】
一実施態様において、被験体はヒト被験体である。もしくは、被験体は、本発明の抗体が交差反応するＴｉｅ１様抗原を発現する哺乳類であってよい。本発明のタンパク質リガンドは治療目的（以下さらに議論する）のためにヒト被験体に投与することができる。さらに、Ｔｉｅ１結合リガンドは、獣医学の目的のため、またはヒト病気の動物モデルとして、リガンドが結合するＴｉｅ１様抗原を発現する非ヒト哺乳類（例えば、霊長類、ブタまたはマウス）に投与することができる。後者に関して、そのような動物モデルはリガンドの治療的効能の評価（例えば、投与量および投与時間の試験）に有用であろう。
【０３３２】
一実施態様において、本発明は、細胞（例えば、非癌性細胞、例えば、正常、良性または過形成細胞、または癌性細胞、例えば悪性細胞、例えば固形腫瘍に見られる細胞、軟組織腫瘍、または転移病巣（例えば、腎臓、尿路上皮、結腸、直腸、肺、胸または肝臓の癌および／または転移に見られる細胞））を治療（例えば、阻害、剥離または死滅）する方法提供する。本発明の方法は、細胞をＴｉｅ１結合リガンド、例えばここに記載のＴｉｅ１結合抗体に、細胞を治療、例えば阻害、剥離または死滅させるのに十分な量で接触させる工程を含む。
【０３３３】
主題の方法は培養中の細胞に対して例えばインビトロまたはイクスビボで用いることができる。例えば、癌性または転移性細胞（例えば、腎臓、尿路上皮、結腸、直腸、肺、胸、卵巣、前立腺または肝臓の癌性または転移性細胞）を、培養培地中でインビトロで、例えば、内皮細胞とともに培養することができ、接触工程はＴｉｅ１結合リガンドを培養培地に加えることにより達成できる。この方法は、インビボ（例えば、治療または予防）プロトコールの一部として被験体中に存在する細胞（例えば、癌性または転移性細胞）に対して実施することができる。インビボ実施態様において、接触工程は被験体中で行われ、かつリガンドの細胞への結合と、治療、例えば細胞の死滅または剥離とを行うのに効果的な条件下で、Ｔｉｅ１結合リガンドを被験体に投与することを含む。
【０３３４】
該方法は癌を治療するために用いることができる。ここに用いる「癌」、「過多増殖」、「悪性」および「腫瘍性」との用語は互換可能で、迅速な増殖または腫瘍により特徴付けられる異常な状態または条件にある細胞を言及する。これらの用語は、侵入の組織病理学的種類または段階にかかわらず、すべての種類の癌成長または癌遺伝子プロセス、転移組織または悪性転換細胞、組織または器官を包含する。「病理学的過多増殖」細胞は悪性腫瘍成長により特徴付けられる病状に存在する。
【０３３５】
「腫瘍新生」の用語の通常の医学的な意味は、正常な成長調節、例えば腫瘍性細胞成長に対する応答性の損失としてもたらされる「新しい細胞成長」をいう。「過形成」とは異常に高い成長速度を受ける細胞をいう。しかし、ここで用いるように、腫瘍新生と過形成との用語はそれらの文脈が明らかにするように互換可能に用いることができ、一般的に異常な細胞成長速度を経験する細胞を言及する。腫瘍新生と過形成は、良性、前悪性または悪性であってよい「腫瘍」を含む。一実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドによるＴｉｅ１活性の減少は腫瘍の近くおよび周囲の血管生成を減少または妨げることで、腫瘍成長を減少または妨げることができる。別の実施態様において、過形成は、異常に増殖している内皮細胞を含む。Ｔｉｅ１結合リガンドは過形成の細胞自体を調節するために用いることができる。
【０３３６】
癌疾患の具体例として、固形腫瘍、軟組織腫瘍および転移病巣が挙げられるが、これらに限定されない。固形腫瘍の具体例として、多様な器官系の悪性腫瘍、例えば肉腫、腺癌および癌腫、例えば肺、胸、リンパ節、胃腸（例えば結腸）および尿性器管（例えば、腎臓細胞、尿路上皮細胞）、咽頭、前立腺、卵巣に影響を与える腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えばほとんどの結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌腫、肝臓癌、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌等を含む腺癌を含む。上記癌の転移病巣は、本発明の方法および組成物を用いて治療または予防することもできる。
【０３３７】
主題の方法は、多様な器官系の悪性腫瘍、例えば肺、胸、リンパ節、胃腸（例えば結腸）および尿性器管、前立腺、卵巣、咽頭に影響を与える悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えばほとんどの結腸癌、腎臓細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣癌、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌等を含む腺癌を治療するために有用でありうる。治療可能な例示的な固形腫瘍として、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、コルドーマ、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、Ｅｒｗｉｎｇ腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌腫、腎臓細胞癌腫、肝癌、胆管癌腫、絨毛癌、精上皮腫、胚癌腫、Ｗｉｌｍｓ腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、グリオーマ、アストロサイトーマ、メジュロブラストーマ、頭蓋咽頭腫、上衣腫、ピネアローマ、血管芽細胞腫、聴覚経腫、オリゴデンドログリオーマ、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽腫が挙げられる。
【０３３８】
「癌腫」との用語は当業者により認識され、呼吸系癌腫、胃腸系癌腫、尿性器系癌腫、精巣癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌癌腫およびメラノーマ等の上皮または内分泌組織の悪性腫瘍をいう。例示的な癌腫は、頸部、肺、前立腺、胸、頭および首、結腸および卵巣の組織から形成される癌腫を含む。この用語は、例えば癌腫と肉腫の組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。「腺癌」は、腺組織に由来するか、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成している癌腫をいう。
【０３３９】
「肉腫」との用語は当業者により認識され、間葉組織由来の悪性腫瘍をいう。
【０３４０】
主題の方法は、造血組織起源の過多増殖／腫瘍性細胞、例えば骨髄、リンパまたは赤血球由来、またはその前駆細胞からの細胞の増殖を阻害するために用いることもできる。例えば、本発明は、急性前骨髄白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，  Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．  １１：２６７−９７に概説）等の、しかしこれらに限定されない多様な骨髄疾患の治療を意図する。主題の方法により治療してよいリンパ悪性腫瘍として、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、例えば、Ｂ由来ＡＬＬとＴ由来ＡＬＬ、慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍのマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の治療方法の意図する悪性リンパ腫のさらなる形として、非ホジキンリンパ腫とその変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＦ）およびホジキン病が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔｉｅ１は急性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群（Ｖｅｒｓｔｏｖｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｌｅｕｋ，  Ｌｍｐｈｏｍａ）、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病（Ａｇｕａｙｏ  ｅｔ  ａｌ，２００１．
Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において上方調節を受けることが示されたため、Ｔｉｅ１と相互作用するリガンドはこれら疾病の検出、治療または予防に用いることができる。
【０３４１】
Ｔｉｅ１結合リガンドの投与方法は、「薬学的組成物」で説明する。使用される分子の適当な投与量は被験体の年齢および体重および使用される特定の医薬に基づくであろう。リガンドは、例えば天然性または病理学的な因子とＴｉｅ１との間の望まれない相互作用を阻害、減少させる競合剤として用いることができる。
【０３４２】
一実施態様において、Ｔｉｅ１結合リガンドを用いて、細胞、例えば、内皮細胞をインビボで阻害する（例えば、細胞の少なくとも一つの活性を阻害し、増殖、移動、成長または生存度を低下する）。リガンドはそれ自体で用いるか、または作用物質、例えば細胞毒性剤、放射性同位元素と複合体化して用いることができる。この方法は、リガンドをそれのみ、または細胞毒性剤に結合させて治療を必要とする被験体に投与することを含む。
【０３４３】
「細胞毒性剤」および「細胞増殖抑制剤」および「抗腫瘍剤」との用語はここでは互換可能で用いられ、成長または増殖を阻害する性質を有する作用物質（例えば、細胞増殖抑制剤）または過多増殖細胞、例えば異常癌細胞の死滅を誘導する性質を有する作用物質をいう。癌の治療実施態様において、「細胞毒性剤」との用語は、「抗癌」または「抗腫瘍」との用語と互換可能に用いられ、新生物、特に固形腫瘍、軟組織腫瘍または転移病巣の発達または進展を阻害する作用物質を意味する。
【０３４４】
抗癌剤の限定するものではない具体例として、例えば、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、インターカレート剤、シグナル伝達経路に干渉できる作用物質、細胞死を促進する作用物質、放射線、および他の腫瘍関連抗原に対する抗体（ネイキッド（ｎａｋｅｄ）抗体、免疫毒素および放射性複合体を含む）が挙げられる。特定のクラスの抗癌剤の具体例を以下詳細に示す：抗チュブリン／抗微小管、例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アンサクリン、エピルビシン、メルバロン、塩化ピロキサントロン；代謝拮抗物質、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキサート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパレート＝ＰＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ２’−デオキシシチジン、アラ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−[５−[Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ]−２−テノイル]−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ミトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール；他の作用機構により作用する作用物質、例えば、ジヒドロレンペロン、スピロムスチンおよびデシペプチド；インターフェロン等の例えば抗腫瘍応答を増強する生物学的応答修飾剤；アクチノマイシンＤ等の細胞死作用物質；および抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン等の抗エストロゲン剤または例えば４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリドなどの抗アンドロゲン剤。
【０３４５】
Ｔｉｅ１結合リガンドはＴｉｅ１発現内皮細胞を認識し、癌細胞、例えば癌性肺、肝臓、結腸、胸、卵巣、表皮、喉頭および軟骨細胞、特にそれらの転移細胞に関連した（例えば該細胞に近接するか、または混合した）内皮細胞に結合することができるので、Ｔｉｅ１結合リガンドは、リガンドが結合する該細胞を阻害（例えば、少なくとも一つの活性の阻害、成長および増殖の減少または死滅）するために用いることができる。癌の近くの内皮細胞活性を減少させることは、栄養、成長シグナル等のために内皮細胞に依存するであろう癌細胞を間接的に阻害（例えば、少なくとも一つの活性の阻害、成長および増殖の減少または死滅）することができる。
【０３４６】
もしくは、リガンドは癌細胞付近の細胞に結合するが、癌細胞を直接または間接的に阻害（例えば、少なくとも一つの活性の阻害、成長および増殖の減少または死滅）するのに十分に癌細胞に近い。よって、（例えば毒素、例えば細胞毒素により修飾された）Ｔｉｅ１結合リガンドを用いて癌組織（癌細胞自体および癌に関連するか、癌に侵入する内皮細胞等）中の細胞を選択的に阻害（例えば、死滅または剥離）するために用いることができる。
【０３４７】
リガンドは、治療薬、放射線を放出する化合物、植物、真菌または細菌起源の分子、生物学的タンパク質およびそれらの混合物等の多様な細胞毒性剤を供給するために用いてよい。細胞毒性剤は、例えば、ここに記載のようにショートレンジで高エネルギーのαエミッター等、ショートレンジの放射線エミッター等、細胞内で作用する細胞毒性剤であってよい。
【０３４８】
酵素的に活性のある毒素およびその断片はジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、エキソトキシンＡ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｂｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サクリン、ある種のＡｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ある種のＤｉａｎｔｈｉｎタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｒｏｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシンにより例示される。免疫毒素の酵素学的に活性のあるポリペプチドの調製方法はＷＯ８４／０３５０８およびＷＯ８５／０３５０８、および下記に添付の実施例で説明されている。抗体と複合体化することのできる細胞毒部分の具体例として、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキセート、ネオカルジノスタチンおよびプラチナが挙げられる。
【０３４９】
ポリペプチド毒素の場合、組換え核酸技術を用いて、リガンド（またはそのタンパク質成分）および細胞毒（またはそのタンパク質成分）を翻訳融合物としてコードする核酸を構築することができる。組換え核酸を次に例えば細胞中に発現し、コードされた融合ポリペプチドを単離する。
【０３５０】
タンパク質リガンド（例えば、抗体）を細胞毒性剤に複合化する方法は既に記載されている。クロラムブシルを抗体と複合化する方法は、Ｆｌｅｃｈｎｅｒ（１９７３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  ９：７４１−７４５；  Ｇｈｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３：４９５−４９９；およびＳｚｅｋｅｒｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ，  １９：２１１−２１５に記載されている。ダウノマイシンおよびアドリアマイシンを抗体に複合化する方法は、Ｈｕｒｗｉｔｚ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３５：１１７５−１１８１およびＡｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙｓ，  １：４２９−４４９に記載されている。抗体／リシン複合体の調製方法は米国特許第４，４１４，１４８号とＯｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙｓ，  １：３７３−３８８およびそこで挙げられた参考文献に記載されている。カップリング技術はＥＰ８６３０９５１６．２にも記載されている。
【０３５１】
正常で、良性の過多形成性または癌性細胞を死滅または剥離するために、第一タンパク質リガンドを、前医薬活性剤のすぐ近くにあるときにのみ活性化される前医薬と複合化する。前医薬活性化剤を、第二タンパク質リガンド、好ましくは標的分子上の非競合部位に結合するものと複合化する。二つのタンパク質リガンドが競合または非競合の結合部位に結合するかどうかは慣用の競合結合アッセイにより決定することができる。本発明の実施に使用するための適当な医薬／前医薬のペアはＢｌａｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５６：３２８７−３２９２に記載されている。
【０３５２】
もしくは、Ｔｉｅ１結合リガンドは、腫瘍部位に局在させると、幾つかの細胞直径物の死滅をもたらす高エネルギー放射線エミッター、例えば、１３１Ｉ、γ−エミッター等の放射性同位元素と複合化することができる。例えば、Ｓ．Ｅ．  Ｏｒｄｅｒ，  “Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｌｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒ．Ｗ．  Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ  ３０３−３１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照されたい。他の適当な放射性同位元素として、α−エミッター、例えば２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉおよび２１１Ａｔおよびβ−エミッター、例えば１８６Ｒｅおよび９０Ｙが挙げられる。さらに、Ｌｕ１１７を画像化用剤と細胞毒性剤の両方として用いてもよい。
【０３５３】
１３１Ｉ、９０Ｙおよび１７７Ｌｕで標識した抗体を用いる放射線免疫治療（ＲＩＴ）は現在、精力的に臨床的研究がなされている。これらの三つの核種の物理的特性には顕著な違いがあり、その結果、放射性核種の選択は、最大放射線量を腫瘍に供給するために非常に重大である。９０Ｙの高いベータエネルギー粒子は嵩の大きい腫瘍には良好であろう。１３１Ｉの比較的低いエネルギーのベータ粒子は理想的であるが、放射性ヨウ素化した分子のインビボ脱ハロゲン化は抗体を細胞に取り込むためには大きな欠点である。対照的に、１７７Ｌｕは、わずかに０．２〜０．３ｍｍ範囲の低エネルギーのベータ粒子を有し、９０Ｙに比較して、はるかに低い放射線量を骨髄に供給する。さらに、（９０Ｙに比較して）長い物理的半減期のために、腫瘍残留時間は長い。その結果、１７７Ｌｕで標識された作用物質のさらに高い活性（さらに高いｍＣｉ量）を、骨髄に対する比較的に低い放射線量で投与することができる。多様な癌の治療における１７７Ｌｕ標識抗体の使用を調べる幾つかの臨床的な研究が存在する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １：１４４７−１４５４；  Ｍｅｒｅｄｉｔｈ  ＲＦ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ３７：１４９１−１４９６；  Ａｌｖａｒｅｚ  ＲＤ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６５：９４−１０１）。
【０３５４】
Ｔｉｅ１結合リガンドはインビボで直接に用いて、天然の補体依存細胞毒（ＣＤＣ）または抗体依存細胞性細胞毒（ＡＤＣＣ）により抗原発現細胞を除去することができる。本発明のタンパク質リガンドとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３由来のＦｃ部分、または補体に結合するＩｇＭの対応する部分等、補体結合エフェクタードメインを挙げることができる。一実施態様において、標的細胞の集団を本発明の結合剤と適当なエフェクター細胞によってイクスビボ処置する。この処置は補体または補体含有血清を加えることにより補われ得る。さらに、本発明のタンパク質リガンドを被覆した標的細胞の食作用は補体タンパク質の結合により向上させることができる。別の実施態様の標的において、補体結合エフェクタードメインを含むタンパク質リガンドで被覆された細胞は補体によって溶解する。
【０３５５】
予防のために抗Ｔｉｅ１リガンドを用いることによる死滅または剥離方法も本発明に含まれる。例えば、これらの物質は癌の発達または進行を防止または遅延するために用いることができる。
【０３５６】
癌を治療するための本発明の治療方法の使用は、多くの有益性を有する。タンパク質はＴｉｅ１を特異的に認識するので、他の組織は害さずに、高レベルの該作用物質が、治療を必要とする箇所に直接供給される。本発明による治療は臨床的パラメーターにより効果的にモニターすることができる。もしくは、これらのパラメーターを用いて、そのような治療を使用しなければならないときを示すことができる。
【０３５７】
本発明のＴｉｅ１結合リガンドは、手術、放射線治療および化学療法等の、しかしこれらに限定されない癌を治療するための現在存在する１つまたは複数の療法と組み合わせて投与することができる。
【０３５８】
（診断利用）
Ｔｉｅ１に結合するタンパク質リガンド（例えば、抗体、例えばここに記載の抗体）は、インビトロおよびインビボの診断、治療および予防の有用性を有する。
【０３５９】
一つの特徴において、本発明はＴｉｅ１の存在を、インビトロ（例えば、組織、生検サンプル、例えば癌性組織等の生物学的サンプル）またはインビボ（例えば、被験体のインビボ画像化）で検出する診断方法を提供する。
【０３６０】
本方法は、（ｉ）サンプルをＴｉｅ１結合リガンドに接触させ；そして（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合リガンドとサンプルとの複合体の形成を検出することからなる。該方法は、参照サンプル（例えば、コントロールサンプル）をリガンドに接触させ、参照サンプルに対する複合体形成の程度と比較した場合のリガンドとサンプルとの複合体形成の程度を決定することからなってもよい。コントロールサンプルまたは被験体に比較した場合のサンプル中または被験体中の複合体の形成の変化、例えば統計的に有意な変化はサンプル中のＴｉｅ１の存在を示しうる。
【０３６１】
別の方法は、（ｉ）Ｔｉｅ１結合リガンドを被験体に投与し；そして（ｉｉｉ）Ｔｉｅ１結合リガンドと被験体との複合体の形成を検出することからなる。検出は複合体形成の位置または時間を検出することからなってもよい。
【０３６２】
Ｔｉｅ１結合リガンドは結合または未結合の抗体の検出を容易とする検出可能な物質で直接または間接に標識することができる。適当な検出可能な物質として、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射活性物質が挙げられる。
【０３６３】
Ｔｉｅ１結合リガンドとＴｉｅ１との複合体形成は、Ｔｉｅ１結合リガンドまたは未結合リガンドのいずれかを測定または可視化により検出することができる。慣用の検出アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学を使用することができる。Ｔｉｅ１結合リガンドの標識に加えて、サンプル中のＴｉｅ１の存在を、検出可能な物質で標識したスタンダードと未標識Ｔｉｅ１結合リガンドを利用する競合免疫アッセイによって検定することができる。このアッセイの一例において、生物学的サンプル、標識スタンダードおよびＴｉｅ１結合作用物質を一緒にし、未標識リガンドに結合した標識スタンダードの量を決定する。サンプル中のＴｉｅ１の量は、Ｔｉｅ１結合作用物質に結合した標識スタンダードの量に逆比例する。
【０３６４】
フルオロフォアとクロモフォア標識タンパク質リガンドを調製することができる。抗体と他のタンパク質は約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、蛍光部分は３１０ｎｍを超える、好ましくは４００ｎｍを超える波長で実質的な吸収を有するように選択する必要がある。多様な適当なフルオレサーおよびクロモフォアが、Ｓｔｒｙｅｒ（１９６８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １６２：５２６およびＢｒａｎｄ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４１：８４３−８６８に記載されている。タンパク質リガンドは、慣用的な操作、例えば米国特許第３，９４０，４７５号、同上４，２８９，７４７号および同上４，３７６，１１０号に記載された操作により蛍光クロモフォア類によって標識することができる。上記の所望の多くの性質を有するフルオレサーのもう一集団は、フルオレセインとローダミンを含むキサンテン染料である。蛍光化合物のもう一つの集団はナフチルアミンである。フルオロフォアまたはクロモフォアでいったん標識したら、タンパク質リガンドは、例えば蛍光顕微鏡（共焦点または脱回旋顕微鏡等）を用いて、サンプル中のＴｉｅ１の存在または局在化を検出するために用いることができる。
【０３６５】
（組織学的分析）
ここに記載のタンパク質リガンドを用いて、免疫組織化学を実施することができる。例えば、抗体の場合、抗体を標識（例えば精製タグまたはエピトープタグ）を用いて合成するか、または標識または標識結合基を複合化することにより検出可能に標識できる。例えば、キレーターを抗体に連結することができる。次に、抗体を、例えば顕微鏡スライドグラス上の組織の固定片である組織学的調製物に接触させる。結合のためのインキュベーション後に、調製物を洗浄して未結合抗体を除去する。次に、調製物を例えば顕微鏡を用いて分析して、抗体が調製物に結合したかどうかを同定する。該方法は、内皮細胞または内皮細胞により形成された組織、例えば血管を評価するために用いることができる。
【０３６６】
抗体（または他のポリペプチドまたはペプチド）は結合時に未標識であってよい。結合と洗浄の後、抗体を標識して検出可能とする。
【０３６７】
（タンパク質アレイ）
Ｔｉｅ１結合リガンドはタンパク質アレイに固定化することもできる。タンパク質アレイは診断道具として用いて、例えば医学サンプル（例えば、単離された細胞、血液、血清、生検サンプル等）をスクリーニングすることができる。勿論、タンパク質アレイは、例えばＴｉｅ１や他の標的分子に結合する他のリガンド、例えばヒアルロン酸を含んでもよい。
【０３６８】
ポリペプチドアレイの製造方法は、例えば、Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：９８９−９９４；  Ｌｕｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７０：１０３−１１１；  Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８，  ｅ３，  Ｉ−ＶＩＩ；  ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３；  ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１に記載されている。アレイ用ポリペプチドは、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓから例えば市販のロボット装置を用いて高速でスポットすることができる。アレイ基板は、例えばニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば表面修飾ガラスであってよい。アレイは多孔性マトリックス、例えばアクリルアミド、アガロースまたは他のポリマーを含むこともできる。
【０３６９】
例えば、アレイは例えば上記のＤｅ  Ｗｉｌｄｔに記載されたように抗体のアレイであってよい。タンパク質リガンドを作る細胞は配列されたフォーマットでフィルター上に生育することができる。ポリペプチド生産を誘導し、発現されたポリペプチドをフィルターに細胞位置で固定化する。
【０３７０】
タンパク質アレイを、標識標的に接触させて、多様性ストランドライブラリーの各固定化ポリペプチドに対する標的の結合程度を決定することができる。標的が未標識の場合、例えば、標識プローブを用いるサンドイッチ法を用いて未標識標的の結合を検出することができる。
【０３７１】
アレイの各アドレスでの結合の程度に関する情報は、プロフィールとして、例えばコンピュータデータベースに保存することができる。タンパク質アレイを複製して作って、これを用いて例えば標的および非標的の結合プロフィールを比較することができる。例えば、タンパク質アレイを用いて、一つ以上の分子に関して所望の結合的性質を有する多様性ストランドライブラリーの個々のメンバーを同定することができる。
【０３７２】
（ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別））
Ｔｉｅ１結合リガンドを用いて、細胞、例えばサンプル（例えば、患者サンプル）中の細胞を標識することができる。また、該リガンドは蛍光化合物に連結している（または連結可能である）。次に、細胞を蛍光活性化細胞選別（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡから入手可能なソーターを使用する；米国５，６２７，０３７号、５，０３０，００２号および５，１３７，８０９号も参照）を用いて選別することができる。細胞がソーターを通過するにしたがって、レーザービームが蛍光化合物を励起しながら、検出器は通過する細胞の数を計測し、蛍光化合物が細胞に連結しているかどうかを蛍光を検出することにより決定する。各細胞に結合した標識の量を定量し、分析してサンプルを特性付けこることができる。
【０３７３】
ソーターは細胞を片寄らせ、リガンドに結合した細胞を、リガンドに結合しない細胞から分離することもできる。分離された細胞を培養および／または特性付けることができる。
【０３７４】
（インビボ画像化）
さらに別の実施態様において、本発明はＴｉｅ１発現する癌性組織の存在をインビボで検出する方法を提供する。本方法は、（ｉ）被験体（例えば、癌または腫瘍性疾患を有する患者）に検出可能なマーカーと複合化したＴｉｅ１結合抗体を投与し；（ｉｉ）被験体を、Ｔｉｅ１発現組織または細胞に対する検出可能なマーカーを検出する手段にさらすことからなる。例えば、該方法を用いて、血管または内皮細胞、例えばＴｉｅ１発現内皮細胞の場所を可視化することができる。被験体は、例えばＮＭＲまたは他の断層写真撮影手段により画像化することができる。
【０３７５】
本発明による診断画像化に有用な標識の具体例として、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃおよび１８８Ｒｈ等の放射性標識、フルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン射出断層写真法（「ＰＥＴ」）スキャナーにより検出可能なポジトロン放射同位元素、ルシフェリン等の化学発光体、およびパーオキシダーゼまたはホスファターゼ等の酵素マーカーが挙げられる。ショートレンジ検出器プローブにより検出可能な放射性同位元素等のショートレンジの放射線エミッターを用いることもできる。タンパク質リガンドは公知の技術を用いてそれらの試薬により標識することができる。例えば、抗体の放射能標識に関する技術として、Ｗｅｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＤ．  Ｃｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １２１：８０２−８１６を参照されたい。
【０３７６】
本発明の放射能標識リガンドをインビトロ診断試験のために用いることもできる。放射性同位元素で標識されたリガンドの比活性は半減期、放射活性標識の同位体の純度、および該標識がどのように抗体に導入するかに依存する。
【０３７７】
ポリペプチドの放射活性同位元素（例えば、１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、１３１Ｉ）による標識操作は一般に知られている。例えば、トリチウム標識操作は米国特許第４，３０２，４３８号に記載されている。例えばネズミのモノクローナル抗体に適合させたヨウ素化、トリチウム標識および３５Ｓ標識操作は、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ：  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｌｏｎｄｏｎ；  Ｏｒｌａｎｄｏ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６．  ｐｐ  １２４−１２６）およびそこで引用された参考文献に記載されている。抗体等のポリペプチドをヨウ素化する他の操作は、Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５，  Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４−１０２１および米国特許第３，８６７，５１７と同上４，３７６，１１０号に記載されている。画像化に有用な放射能標識元素としては、例えば１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃが挙げられる。抗体をヨウ素化する操作は、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ８９：１１４−１２３；  Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，  Ｊ．（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １１３：２９９−３０５；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８９−２９７に記載されている。９９ｍＴｃ標識の操作は、Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：  Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｍａｓｓｏｎ  １１１−１２３（１９８２）およびそこで引用された参考文献に記載されている。１１１Ｉｎ標識抗体に適した操作は、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．  Ｉｍｍｕｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６５：１４７−１５７，  Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ，  ３５：５５４−５５７およびＢｕｃｋｌｅｙ，  Ｒ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．  １６６：２０２−２０４に記載されている。
【０３７８】
放射能標識リガンドの場合、リガンドは患者に投与され、リガンドが反応する抗原を有する腫瘍に局在化され、例えばガンマカメラまたは射出断層写真法を用いて、放射性核スキャンニング等の公知の技術を用いてインビボで検出または「画像化」される。例えば、Ａ．Ｒ．  Ｂｒａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒ．Ｗ．  Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），  ｐｐ  ６５−８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照されたい。もしくは、ポシトロン射出トランスアキシャル断層写真スキャナー、例えばＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに位置するＰｅｔ  ＶＩと呼ばれるもの等が、放射性標識（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎ）がポシトロンを放射する場合に用いることができる。
【０３７９】
（ＭＲＩ造影剤）
核磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）は、生きている被験体の内部特徴を可視化するためにＮＭＲを用いるもので、予後、診断、治療および手術に有用である。ＭＲＩは明らかな有益性のために放射活性トレーサー化合物なしに用いることができる。いつくかのＭＲＩ技術がＥＰ−Ａ−０  ５０２  ８１４に要約されている。一般的に、異なる環境下の水プロトンの緩和時間定数Ｔ１とＴ２に関連付けられる違いを用いて像を作る。しかし、これらの違いはシャープな高分解像を提供するには不十分なこともある。
【０３８０】
これらの緩和時間定数の違いは造影剤により増強できる。そのような造影剤の具体例として、多くの磁性剤、例えば（主にＴ１を変える）常磁性造影剤および（主にＴ２応答を変える）強磁性または超常磁性剤が挙げられる。キレート（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡおよびＮＴＡキレート）は幾つかの常磁性物質（例えば、Ｆｅ３＋、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３）を連結（およびその毒性を低下）するために用いることができる。他の作用物質は、例えば、直径が１０μｍ未満で約１０ｎＭまでの粒子の形を有してよい。粒子は強磁性、反強磁性または超常磁性を有することができる。粒子は、例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−Ｆｅ２Ｏ３、フェライトおよび遷移元素の他の磁性無機化合物を含むことができる。磁性粒子は非磁性物質を有するか、有さない一つ以上の磁性結晶を含んでよい。非磁性物質として、合成または天然ポリマー（例えば、セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプン等）を挙げることができる。
【０３８１】
（ｉ）実質的にすべての天然の豊富なフッ素原子が１９Ｆ同位元素であり、よって実質的にすべてのフッ素含有化合物がＮＭＲ活性であり、（ｉｉ）多くの化学活性のある多フッ素化化合物、例えば無水トリフルオロ酢酸が比較的低い費用で市販されており、かつ（ｉｉｉ）ヘモグロブリン代用品として酸素を運ぶために利用されている過フッ素化ポリエーテル等の多くのフッ素化化合物がヒトの利用で医学的に許容されている限り、Ｔｉｅ１結合リガンドは、ＮＭＲ活性１９Ｆ原子または複数のそのような原子を含む指示基により標識することもできる。インキュベーションのためにそのような時間を許した後、全身ＭＲＩを、Ｐｙｋｅｔｔ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，  ２４６：７８−８８に記載された装置の１つ等を用いて実施し癌組織をつきとめ、画像化する。
【０３８２】
Ｔｉｅ１結合リガンド、例えばここに記載のリガンドを評価することから得られた情報を装置に適合する媒体、例えばコンピュータ読み取り可能またはコンピュータアクセス可能な媒体上に記録することができる。この情報はコンピュータ表示として、例えばデータベース（例えば、リガンドを用いる画像化の場合、一つか複数の被験体の画像のデータベース）中に保存することができる。「コンピュータ表示」との用語はコンピュータが取り扱うことのできる形にある情報を意味する。コンピュータ表示を保存する行為は、情報を、コンピュータによる操作に適する形に置く行為をいう。
【０３８３】
Ｔｉｅ１に結合するタンパク質リガンド、および診断使用のための説明書、例えばサンプル、例えば癌または腫瘍性疾患を有する患者からの生検サンプルまたは細胞中のＴｉｅ１をインビトロで検出するか、または例えば被験体を画像化することによりＴｉｅ１をインビボで検出するためのＴｉｅ１結合リガンド（例えば、抗体またはその抗原結合断片、または他のポリペプチドまたはペプチド）の使用のための説明書を含むキットも本発明の範囲にある。さらに本キットは、標識または付加的な診断剤等の少なくとも一つの付加的な試薬を含むことができる。インビボ使用のために、リガンドは薬学的組成物として処方することができる。
【０３８４】
下記の発明は、下記の実施例（次のページから始まる）によりさらに詳細に説明するが、下記実施例は制限するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【０３８５】
（実施例）
（実施例１：）
【０３８６】
【表２】
2007528720.tif 000002
【０３８７】
【表３】
2007528720.tif 000003
（実施例２：  選択と主要なスクリーニング）
本発明者らは、免疫グロブリンをＦａｂ断片として示す非常に大きなファージライブラリーからＴｉｅ１特異的抗体を選択するためにファージディスプレーを使用した。Ｔｉｅ１に特異的な抗体を単離するために、ファージ表示Ｆａｂ抗体ライブラリーを、ヒトＦｃまたはヒスチジン精製タグに対して融合させたＴｉｅ１細胞外部ドメインに対して選択した。
【０３８８】
溶液中の選択は、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｍ−２８０−ＤＹＮＡＬ）上に捕捉されたビオチン標識抗原を用いて行った。Ｔｉｅ１を発現する細胞上での選択はＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ自動化磁気ビーズ捕捉装置を用いて実施した。固定化抗原上での選択はイムノチューブ上に被覆したＴｉｅ１−Ｆｃを用いて行った。
【０３８９】
幾つかの選択法が用いられた。
方法１：  ラウンド１（５００ｍＭビオチン標識Ｔｉｅ１／磁気ビーズ）、ラウンド２（１×１０７Ｔｉｅ１発現細胞／Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ）、ラウンド３（１×１０７Ｔｉｅ１発現細胞／Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ）
方法２：  ラウンド１（５００ｍＭビオチン標識Ｔｉｅ１／磁気ビーズ）、ラウンド２（１×１０７Ｔｉｅ１発現細胞／Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ）、（３００ｍＭビオチン標識Ｔｉｅ１／磁気ビーズ）
方法３：  ラウンド１（５μｇ／ｍｌのＴｉｅ１  Ｆｃ被覆イムノチューブ）、ラウンド２（Ｔｉｅ１−Ｆｃ被覆イムノチューブ）、ラウンド３（Ｔｉｅ１  Ｆｃ被覆イムノチューブ＋ヒトＩｇＧの減少）
選択法から回収したライブラリーメンバーは、ファージＥＬＩＳＡでの抗原結合について調べた。各単離物を被覆Ｔｉｅ１  Ｆｃに対する結合について調べた。方法１はどの結合クローンも同定しなかったが、方法２は１３個の陽性クローンを同定した（ｎ＝９５）。方法３は８６個の結合クローンを同定した（ｎ＝９５）。
【０３９０】
選択されたクローンの配列分析は重鎖の選択ＣＤＲ３に基づきグループ分けし、独自のＶＨ−ＣＤＲ３配列を有する２３個の異なる抗体をもたらした。
【０３９１】
本発明者らは、ディスプレーライブラリーベクターからのＶＨとＶＬコード配列を哺乳類の発現ベクターシステムの二つのベクターに再クローニングすることにより、選択されたＦａｂを完全にヒトの抗体として再フォーマットした。これらのベクターは、ヒトカッパ定常ドメインとヒトガンマ−１重鎖定常領域を含む。両ベクターは、対応する完全ＩｇＧの発現と生産のために哺乳類ＣＨＯ−Ｋ１細胞に共移入した。これらの抗体は下記のものを含む幾つかのアッセイを用いて特性付けた：
１．Ｔｉｅ１移入細胞と主要ヒト内皮細胞のウエスタンブロッテフィングと免疫沈降；
２．Ｔｉｅ１移入細胞と主要ヒト内皮細胞の免疫蛍光；
３．Ｂａ／Ｆ３細胞および主要ヒト内皮細胞中のＴｉｅ１の刺激と阻害；および
４．ヒト組織の免疫染色。
【０３９２】
本発明者らは、Ｔｉｅ１と相互作用する２３個の抗体を同定した。下記の表１も参照。
【０３９３】
再フォーマットされたクローンの配列確認後、それらをＨｅｋ２９３Ｔ細胞の過渡的トランスフェクションに用いた。成長後、ＩｇＧを、プロテインＡカラムを用いて培養上清から精製した。精製ＩｇＧ１の量はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて決定した。
【０３９４】
Ｔｉｅ１特異的ＩｇＧの特異性は、マウス肺微小血管内皮細胞（ＬＥＩＩ）およびＴｉｅ１発現構築物を移入したＬＥＩＩ−Ｔｉｅ１細胞で全細胞ＥＬＩＳＡにより決定することができる。細胞を１０，０００細胞／ウエルの密度で９６ウエルプレートにまき、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。ＩｇＧ１のＬＥ１１細胞への結合の染色と検出は、ＨＲＰ複合ウサギ抗ヒトＨＲＰによる標準的な標識とＴＭＢ染色により検出する。精製ＩｇＧ１のＬＥＩＩ−Ｔｉｅ１移入細胞への結合は、内因的に発現するＴｉｅ１タンパク質に対して補正することができる。もしくは、内因性Ｔｉｅ１をほとんど持たないか全くもたない細胞を分析のために用いることもできる。
【０３９５】
結合抗体の少なくとも一つ（Ｅ３）は、ＢａＦ３細胞バイオアッセイでＴｉｅ１活性化抗体として機能する。本発明者らは、過渡的にトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞とヒト主要内皮細胞におけるＥ３  ＩｇＧ治療に応答するＴｉｅ１リン酸化を研究した。本発明者らの結果は、Ｅ３  ＩｇＧがＴｉｅ１レセプターを活性化することを示す。起こりうる天然のリガンドのかわりに、Ｅ３を用いてＴｉｅ１の幾つかの機能をインビトロまたはインビボで特性付けることができる。Ｅ３と相互作用するＴｉｅ１の領域はＴｉｅ１活性化または阻害のための小分子量化合物の標的となりうる。Ｅ３は一つの特定のＴｉｅ１活性化アッセイで機能するが、このアッセイでのＥ３と他の陽性物は他の機能に関して、および他の文脈において阻害効果も有し得る。例えば、Ｅ３はＨＵＶＥＣ細胞による管形成を阻害しうる。下記を参照されたい。
【０３９６】
さらに、本発明者らは、ＢａＦ３細胞生検においてＥ３により付与された生存効果を阻害する二つの抗体を見出した。これらの二つの抗体はＢａＦ３アッセイにおいてＥ３により誘導されたＴｉｅ１の二量体化を阻害し得る。Ｂ２とＤ１１の二つの抗体は、Ｅ３と組み合わせて用いられると、Ｔｉｅ１／ＥｐｏＲ細胞の生存性を完全にブロックした。よって、Ｂ２とＤ１１抗体はＴｉｅ１をインビボで阻害するために用いることができる。
【０３９７】
（方法）
（細胞培養）
ＣＯＳ１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ネズミのＢａ／Ｆ３前Ｂリンパ球を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、抗生物質および２ｎｇ／ｍｌインターロキン−３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で補ったＤＭＥＭで培養した。ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られたヒト皮膚微小管内皮細胞（ＨＤＭＶＥＣ）を、供給者により提供された内皮細胞培地で培養し、４〜７継代で使用した。
【０３９８】
（ウエスタンブロッティングと免疫沈降）
ＣＯＳ１細胞に、ＦＵＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って用いることでｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５（１０ｃｍ細胞培養プレートあたり１μｇのＤＮＡ）を移入し、刺激前の４８時間インキュベートした。免疫沈降のために、Ｔｉｅ１移入細胞およびＨＭＶＥＣ細胞を、アプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦおよびバナジン酸ナトリウムを補ったＤＯＣ−ＲＩＰＡ溶解緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１％ＳＤＳ、１％ＤＯＣ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で溶解した。等量の細胞溶解物からの免疫沈降は、ポリクローナル抗ヒトＴｉｅ１抗体（Ｒ＆Ｄ）、モノクローナル抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、または２３種類の抗Ｔｉｅ１抗体（１μｇ／ｍｌ）と一緒に１〜２時間インキュベートし、その後にプロテインＧ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）とともに１時間インキュベートすることにより実施した。免疫沈降物はＰＢＳ−Ｔで二回およびＰＢＳで二回洗浄した後に、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液による溶出と８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を行った。ブロットは前記の２３種類の抗Ｔｉｅ１抗体（５μｇ／ｍｌ）により、次にＨＲＰ複合化抗ヒトＦｃ抗体により調べた。
【０３９９】
（免疫蛍光染色）
ガラスカバースリップ上のＣＯＳ１細胞に、ＦＵＧＥＮＥＴＭ６（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って用いて、ｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５（Ｖ５−エピトープはｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１の３’末端に付加した）（１０ｃｍの細胞培養皿あたり１μｇ  ＤＮＡ）を過渡的に移入し、染色前の４８時間インキュベートした。細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間４℃で固定した。必要であれば、細胞にＰＢＳ中の０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を５分間浸透させた。非特異的な結合部位はＰＢＳ中の１％ＢＳＡで３０分間インキュベートすることによりブロックした。次に、細胞を抗Ｔｉｅ１抗体（５μｇ／ｍｌ）および抗Ｖ５抗体により１時間室温で染色した後、ＦＩＴＣ複合抗ヒト抗体（ＤＡＫＯ、４０μｇ／ｍｌ）およびＴＲＩＴＣ複合抗マウス抗体（ＤＡＫＯ、１５μｇ／ｍｌ）とともに３０分間インキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８フルオロクローム（Ｓｉｇｍａ、０．５μｌ／ｍｌ）を核の染色のために用いた。
【０４００】
（Ｂａ／Ｆ３バイオアッセイ）
バイオアッセイ用にＴｉｅ１−ＥｐｏＲ発現Ｂａ／Ｆ３細胞を作るために、Ｂａ／Ｆ３前Ｂ細胞に、マウスエリスロポイエチンレセプターの膜貫通および細胞質ドメインに融合させたヒトＴｉｅ１の細胞外部ドメインを含むキメラレセプターを発現する核酸を安定的に移入した。使用した核酸はｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクター中のＴｉｅ１−ＥｐｏＲキメラｃＤＮＡであった。キメラレセプターをコードする核酸は、ヒトＴｉｅ１のＰＣＲ増幅細胞外部分（Ｘ６０９７５のｂｐ  ３７〜２３１６）をＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてｍＥｐｏＲ−ｐｃＤＮＡベクターにクローニングすることにより構築した。ＥｐｏＲの膜貫通および細胞内ドメインに融合させたＴｉｅ１の細胞外部分からなるキメラレセプターをコードするｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクターにサブクローニングした。ベクターは直鎖とし、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにＢａ／Ｆ３細胞へ共移入した。安定な細胞のプールは２５０μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎによる選択により作った。幾つかのクローンでのＴｉｅ１／ＥｐｏＲ融合タンパク質の発現はＥｐｏＲに対する抗体によるウエスタンブロッティングにより分析した。
【０４０１】
アッセイを実施するために、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲキメラを発現するＢａ／Ｆ３細胞を、９６ウエルマイクロタイタープレートに、示された濃度の抗Ｔｉｅ１抗体の存在下に５００００細胞／ウエルへと分割した。コントロールとして、Ｔｉｅ１−ＥｃｏＲを発現しないＺｅｏｃｉｎ耐性プールを用いた。４８時間後、細胞の生存度は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリムブロミド（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ）を加えた後、さらに２時間培養し、等しい容量の細胞溶解溶液（１０％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＨＣｌ）を加え、一晩３７℃でインキュベートすることにより決定した。吸光度は５４０ｎｍで測定した。
【０４０２】
（Ｔｉｅ１リン酸化アッセイ）
ＣＯＳ１細胞にｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５を移入した。移入の２４時間後、細胞に血清を８時間枯渇させ、次にＥ３  ＩｇＧで処理した。Ｔｉｅ１リン酸化アッセイのために、ＨＤＭＶＥＣを１０ｃｍの皿でコンフルエンス近くまで培養し、無血清培地で枯渇させ（８〜１６時間）、示されたように刺激した。刺激後、細胞を溶解緩衝液（ＲＩＰＡ−ＤＯＣ：  ５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＤＯＣ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、およびアプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦおよびバナジン酸ナトリウムを補ったもの）で溶解した。移入を受けたＣＯＳ１細胞またはＨＤＭＶＥＣからの明澄な溶解産物を抗Ｖ５または抗Ｔｉｅ１  Ｂ９でそれぞれ免疫沈降させた。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、抗ホスホチロシンと抗Ｔｉｅ１（Ｒ＆Ｄシステム）抗体を用いてイムノブロットした。
【０４０３】
（ヒト組織の免疫染色）
免疫組織化学により抗Ｔｉｅ１抗体の反応性を評価するために、ヒト腎臓と肺の５μｍの低温切片を室温で３０分間乾燥し、冷アセトンで１０分間固定した。スライドをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．０３％Ｈ２Ｏ２で１５分間処理して、内因性パーオキシダーゼ活性を低下させた。ＴＮＢ（室温で３０分）を用いて非特異的結合をブロックし、切片をＴｉｅ１抗体とともに１０μｇ／ｍｌの濃度で一晩＋４℃でインキュベートした。ＰＢＳによる数回の洗浄後、ビオチン化抗ヒト抗体（１：３００、Ｚｙｍｅｄ）を組織に加えた。シグナルはＴＳＡキットで増幅し、ＡＥＣ染色で検出した。
【０４０４】
（結果）
Ｔｉｅ１移入細胞と主要ヒト内皮細胞のウエスタンブロッティング、免疫沈降および免疫蛍光（表１を参照）。
【０４０５】
【表４】
2007528720.tif 000004
２３種類の選択された抗Ｔｉｅ１抗体の結合能力を確認するために、本発明者らは最初にｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５（Ｖ５タグ付き）を移入したＣＯＳ１細胞、および主要内皮細胞を用いて、ウエスタンブロッティングと免疫沈降を実施した。次に、抗Ｔｉｅ１抗体が生細胞内でＴｉｅ１を認識するかどうかを調べるために、これらの細胞を免疫蛍光染色により研究した。分析されたすべての抗体は移入したＴｉｅ１と内因性Ｔｉｅ１の両方を認識したが、表１に示されているように結合親和性の差が検出された。
【０４０６】
（Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ移入Ｂａ／Ｆ３細胞とヒト主要内皮細胞におけるＴｉｅ１の刺激と阻害）
Ｔｉｅ１に対するリガンドは同定されなかったが、本発明者らはＴｉｅ１結合リガンドの下記の効率的なスクリーニング法を用いた。インターロイキン−３依存前Ｂリンパ球（Ｂａ／Ｆ３）細胞に、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ融合タンパク質を発現する構築物を移入した。Ｂａ／Ｆ３細胞はＩＬ−３依存性であるために、それらはＩＬ−３が提供されないと死滅する。しかし、Ｔｉｅ−ＥｐｏＲレセプターを発現するＢａ／Ｆ３細胞は、培地が、天然リガンドか人工類似物のいずれかであるＴｉｅ１結合リガンドを含む場合、生存および増殖することができる。細胞生存は、例えばミトコンドリアの活性を測定する比色ＭＴＴアッセイにより定量することができる。
【０４０７】
ＢａＦ３細胞アッセイからの結果は、調べられた２３種類の異なるモノクローナル抗体のうち、わずかにＥ３  ＩｇＧのみがＴｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞の生存を促進できた一方で、コントロールとして用いられたＥｐｏＲ  Ｂａ／Ｆ３細胞の生存度はＥ３  ＩｇＧにより影響を受けなかった。Ｅ３  Ｆａｂ断片はＴｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞の生存度に効果を持たなかったので、免疫グロブリン分子のＩｇＧ部分はＥ３  ＩｇＧの生存効果のために必要であった。５０ｎｇ／ｍｌのＥ３  ＩｇＧの濃度はＴｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞生存アッセイにおいてほとんど最大の生存度を与えた。
【０４０８】
Ｔｉｅ１の細胞外部領域に結合するＥ３  ＩｇＧがＴｉｅ１の自己リン酸化を誘導するかどうかを調べるために、Ｅ３  ＩｇＧ処理に応答するＴｉｅ１レセプターリン酸化レベルを過渡的に移入を受けたＣＯＳ１細胞とヒト主要内皮細胞において調べた。ＣＯＳ１細胞に、Ｖ５タグ付きの全長Ｔｉｅ１  ｃＤＮＡを含む発現ベクターを移入し、血清枯渇の後に、細胞をＥ３  ＩｇＧ（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。細胞溶解物を幾つかの時間点で抽出し、Ｔｉｅ１を抗Ｖ５で免疫沈降した後、抗ホスホチロシンおよび抗Ｔｉｅ１抗体を用いるウエスタンブロッティングを行った。その結果は、Ｔｉｅ１は１０〜３０分間のＥ３  ＩｇＧ刺激後にチロシンがリン酸化されることを示した。Ｅ３  ＩｇＧが主要内皮細胞中のＴｉｅ１リン酸化を誘導するかどうかを決定するために、ＨＤＭＶＥＣ細胞を血清枯渇させ、幾つかの濃度のＥ３で６０分間刺激した。次に、Ｔｉｅ１を細胞溶解物から免疫沈降させ、抗ホスホチロシンブロッティング分析に供したところ、５０〜２００ｎｇ／ｍｌでのＥ３  ＩｇＧ刺激後にレセプターリン酸化を示した。さらに高いＥ３濃度（５００〜１０００ｎｇ／ｍｌ）はＴｉｅ１リン酸化を誘導したが、その応答はさらに速く、刺激の５分後で最も卓越した。
【０４０９】
Ｅ３  ＩｇＧ誘導Ｔｉｅ１活性化の動力学を調べるために、細胞をＥ３  ＩｇＧ（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、レセプターリン酸化を多様な時間点で調べた。Ｔｉｅ１リン酸化はＥ３  ＩｇＧ処理の１５〜３０分後に最も高かったが、リン酸化は最大１時間持続した。
【０４１０】
調べられた任意の他のモノクローナル抗体がＴｉｅ１−ＥｐｏＲ  Ｂａ／Ｆ３アッセイにおいてＥ３  ＩｇＧの生存効果を阻害するかどうかを決定するために、抗体をＥ３  ＩｇＧと組み合わせて研究した。１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＥ３  ＩｇＧを、１００（１：１）または５００（１：５）ｎｇ／ｍｌの他の抗体とともに用いて、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞の生存度を測定した。Ｅ３  ＩｇＧと試験抗体（１：１および１：５の比率にある）との両組合せからの結果は類似しており、２３抗体のうち２抗体（Ｂ２とＤ１１）はＥ３  ＩｇＧの生存効果を完全にブロックしたことを示した（表２）。幾つかの抗体（Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３およびＰ−Ｃ６）はＥ３  ＩｇＧの生存度効果をある程度阻害し、抗体のうち２つのもの（Ｇ２とＣ７）が、Ｅ３  ＩｇＧと組合せにおいてＴｉｅ１／ＥｐｏＲ  Ｂａ／Ｆ３細胞の生存を促進した。
【０４１１】
【表５】
2007528720.tif 000005
（ヒト組織の免疫染色）
抗Ｔｉｅ１抗体は培養細胞中のヒトＴｉｅ１に反応する。ビオチン化抗Ｔｉｅ１抗体を用い、標識ストレプトアビジンまたはアビジンを用いて結合抗体を検出することにより、抗体が肺および腎臓および腫瘍からのヒト組織サンプルを染色することができるかどうかを決定することもできる。
【０４１２】
一実施態様において、Ｔｉｅリガンド（例えばここに記載のＴｉｅ１抗体）をトランスジーン等またはアデノウイルス供給を経て遺伝子系ベクターから作ることができる。
【０４１３】
（実施例３：  例示配列）
例示的な免疫グロブリン可変ドメインの配列を以下に示す：
【０４１４】
【表６】
2007528720.tif 000006
【０４１５】
【表７】
2007528720.tif 000007
【０４１６】
【表８】
2007528720.tif 000008
【０４１７】
【表９】
2007528720.tif 000009
【０４１８】
【表１０】
2007528720.tif 000010
【０４１９】
【表１１】
2007528720.tif 000011
【０４２０】
【表１２】
2007528720.tif 000012
【０４２１】
【表１３】
2007528720.tif 000013
【０４２２】
【表１４】
2007528720.tif 000014
【０４２３】
【表１５】
2007528720.tif 000015
【０４２４】
【表１６】
2007528720.tif 000016
【０４２５】
【表１７】
2007528720.tif 000017
【０４２６】
【表１８】
2007528720.tif 000018
【０４２７】
【表１９】
2007528720.tif 000019
【０４２８】
【表２０】
2007528720.tif 000020
【０４２９】
【表２１】
2007528720.tif 000021
【０４３０】
【表２２】
2007528720.tif 000022
【０４３１】
【表２３】
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【０４３２】
【表２４】
2007528720.tif 000024
【０４３３】
【表２５】
2007528720.tif 000025
【０４３４】
【表２６】
2007528720.tif 000026
【０４３５】
【表２７】
2007528720.tif 000027
【０４３６】
【表２８】
2007528720.tif 000028
【０４３７】
【表２９】
2007528720.tif 000029
【０４３８】
【表３０】
2007528720.tif 000030
【０４３９】
【表３１】
2007528720.tif 000031
【０４４０】
【表３２】
2007528720.tif 000032
【０４４１】
【表３３】
2007528720.tif 000033
【０４４２】
【表３４】
2007528720.tif 000034
【０４４３】
【表３５】
2007528720.tif 000035
（実施例４：  アライメント）
表３と表４は例示的な抗体のＣＤＲとＦＲ領域の表であり、それらの配列をここで挙げる。
【０４４４】
【表３６】
2007528720.tif 000036
【０４４５】
【表３７】
2007528720.tif 000037
（実施例５：）
（Ｂ２とＤ１１の配列アライメント）
Ｂ２とＤ１１はＢａＦ３活性化アッセイにおいてＥ３のアゴニスト活性を消すために、両者ともにＴｉｅ１のアンタゴニストである。Ｂ２とＤ１１はともにカッパ軽鎖を有し、配列が類似する（８アミノ酸の違い）：
【０４４６】
【表３８】
2007528720.tif 000038
（実施例６：  抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧを用いたＨＵＶＥＣ細胞による管形成の阻害）
血管形成のＥ３のインビトロ阻害能を示すために、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）による管形成の精製Ｅ３の阻害能を調べた。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、新鮮なヒト臍帯静脈をトリプシン−ＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２０〜２５分間、３７℃で処理することにより得た。細胞を、接着因子（ＡＦ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で被覆したＴ−２５フラスコ中、１０％ＦＣＳ、０．４％ＢＢＥ、１％  １−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−ＥＤＴＡで離して、二回または三回の継代でコンフルエントになったときに使用した。これら細胞を１：２の分離比で、単層の約６０〜８０％のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。細胞を解離するために、ＨＵＶＥＣ単層をトリプシン／ＥＤＴＡ（５００リットル／皿）で３７℃、３分間処理した。トリプシン活性は３体積分の完全ＲＰＭＩ培地を加えることにより停止した。細胞を注意してかきとり、繰返しのピペッティングにより分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。
【０４４７】
二継代後、ＨＵＶＥＣを、７．５体積分の２ｍｇ／ｍｌコラーゲン（コラーゲンＲ；  Ｓｅｒｖａ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、１体積分の１０×ＭＥＭ、１．５体積分のＮａＨＣＯ３（１５．６ｍｇ／ｍｌ）を混合し約１体積分のＮａＯＨによりｐＨを７．４に調節することにより調製されたコラーゲンゲル（１．５ｍｇ／ｍｌの５０μｌコラーゲンＩ）上のそれらの培養培地（９６ウエルプレートで４０．１０３／５０μｌ／ウエル）にまいた。１時間３０分後、培養培地を次に捨て、細胞をコラーゲンの新しい層（１．５ｍｇ／ｍｌ、新しい調製物、５０μｌ／ウエル）で被覆した。ゲルの重合後、培養培地を、Ｅ３抗体（１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下に各ウエルに加えた。アッセイは、コントロール（１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）として用いられるストレプトアビジン抗体を用いて実施した。培養表面上の管ネットワークの全体長さを、ＭＥＴＡＶＵＥＴＭソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により×４０倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を視野±ＳＥＭ（相対単位）あたりの平均血管範囲として示した。各アッセイを少なくとも３回実施した。
【０４４８】
Ｅ３は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でさえもＨＵＶＥＣＳによる管形成の有力な阻害剤である。コントロール抗ストレプトアビジンは、ＨＵＶＥＣＳの管を形成する能力に対して効果を持たない。この結果は、Ｅ３が血管形成の一面を阻害しうることを示している。
【０４４９】
（実施例７：  マッチした腫瘍と正常組織切片に結合するＥ３の免疫組織化学的分析）
主要な腫瘍と正常組織におけるＥ３のＴｉｅ１への結合を評価するために、抗体をＩｇＧとして作り、ビオチン標識した。Ｅ３抗体と二つの他の抗Ｔｉｅ１抗体であるＢ２とＤ１１を全長ＩｇＧ分子として再フォーマットした。これらのＩｇＧをコードする核酸をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に過渡的にトランスフェクト（移入）した。過渡的細胞トランスフェクション用のプラスミド調製物は、ＨＰ−ＧＥＮＥＬＵＴＥＴＭＭＩＤＩ調製キット（Ｓｉｇｍａ、カタログナンバーＮＡ０２００）を用いて実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社、カタログナンバーＱ４０１）をトランスフェクションの２４時間前にまいた；１０ｃｍ培養皿一枚あたり６×１０６細胞をまいた。トランスフェクションは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログナンバー１１６６８０１９）を製造者の指示に基づいて用いることにより実施した。１０ｃｍ皿一枚あたり５マイクログラムのプラスミドＤＮＡを用いた。細胞を、１０％「超低ＩｇＧ」ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログナンバー１６２５００７８）を補ったＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログナンバー３１９６６０２１）中、３７℃、５％ＣＯ２で、水飽和雰囲気下で培養した。順化培地をトランスフェクションの７２時間と１４４時間後に集め、プールし、滅菌ろ過した。
【０４５０】
ＰＢＳで平衡化した１００ｍｌのプロテインＡビーズ（ｒプロテインＡセファロース４ファストフロー、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログナンバー１７−１２７９−０１）を細胞培養上清に加え、これらを一晩、４℃で、例えば５０ｍｌチューブ中で回転した。ビーズを遠心で集め、９６ウエルろ過プレート（ＵＮＩ−ＦＩＬＴＥＲ  ８００ＧＦ／Ｂ、Ｗｈａｔｍａｎ、カタログナンバー７７００−２８０３）に移し、真空マニホールド（ＭａｃｈｅｒｅｙＮａｇｅｌ、カタログ番号７６０６８１）を用いてＰＢＳで広範囲に洗浄した。抗体の溶出はビーズを４００μｌの１２．５ｍＭのクエン酸に再懸濁することにより達成された。３０〜６０秒のインキュベーション後、真空マニホールドを用いて、ビーズ溶出液を９６ウエルコレクションプレート（ＵＮＩＰＬＡＴＥ７５０、Ｗｈａｔｍａｎ、カタログナンバー７７０１−５７５０）のウエルに集めた。コレクションプレートの各ウエルは６０μｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）緩衝液を含み、溶出分画を迅速に中和した。溶出工程は抗体回収を最大化するために二回実施した。次に、溶出サンプルを、透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ、ＭＷＣＯ１０，０００、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログナンバー６６３８０）を用いて、ＰＢＳに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌ溶液が１．３５の吸光度を有するとみなして、タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度から決定した。調製物の品質は還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０４５１】
Ｔｉｅ１抗体はＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ―ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．２１３３１）を用いてビオチン化した。Ｔｉｅ−１／ＦｃおよびＴｉｅ−１−Ｈｉｓのために、反応を２時間、氷上で、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中、５倍モル過剰量のビオチン化剤の存在下に実施した。抗体のために、反応を２時間、ＰＢＳ中の氷上で、１５倍モル過剰量のＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンの存在下に行った。反応はＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（５０ｍＭの最終濃度）を加えることにより停止した後、氷上で１時間インキュベートした。次に、サンプルをＰＢＳに対して透析した。
【０４５２】
多様な正常および腫瘍組織切片をビオチン化抗体で染色した。マウスモノクローナル抗Ｔｉｅ１抗体（７ｅ８）（Ａｌｉｔａｌｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ）を陽性コントロールとして使用した。一次抗体なしの切片は陰性コントロールとして用いた。すべてのサンプルは新鮮な凍結組織であり、染色をＴＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。アセトン固定（１０〜２０分、−２０℃）後、スライドを０．７３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理して内因性パーオキシダーゼ活性を減少させた後、ＴＮＢ緩衝液で３０分間ブロックした。切片（５〜１０ｍｍ厚）を一次抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに一晩、４℃でインキュベートした。マウスモノクローナル抗ｔｉｅ１抗体（７ｅ８）を有する切片を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを加える前にビオチン化抗マウス抗体（ＶｅｃｔａＳｔａｉｎ）で処理した。シグナルをＴＳＡキットを用いて増幅し、次にＡＥＣ（２３５ｍｌ  ＮａＡｃ、１５ｍｌ  ＡＥＣ（保存溶液：  １６００ｍｇの３−アミノ−９−エチル−カルバゾールおよび４８０ｍｌのＮ−ジメチルホルムアミド）、２５０μｌのＨ２Ｏ２）により可視化した。
【０４５３】
一般的に、Ｔｉｅ−１発現は、マッチする正常な組織に比較したときに腫瘍組織中で上方調節を受けた。しかし、腫瘍組織において、抗Ｔｉｅ１抗体は血管に加えて他の構造物を染色した。さらに、あるエピトープの発現で若干の組織特異性が見られた。例えば、Ｅ３抗原は肺および腎臓の血管を染色したが、皮膚では染色せず、一方、Ｂ２抗体は胸よりも他の正常な組織で血管を非常に弱く染色した。Ｔｉｅ−１の外部ドメインの腫瘍組織への脱落は観察された違いを説明することができる。
【０４５４】
皮膚組織において、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体は血管を非常に弱く染色したが、ネズミ７ｅ８コントロール抗体は正常な皮膚で明らかな染色を与えた。メラノーマ組織において、７ｅ８抗体は血管のみを染色したが、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体も他の周囲構造物を染色した。染色パターンは、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体のすべての３抗体について類似であった。
【０４５５】
肺組織において、本発明者らは、Ｅ３抗体が肺の大静脈を特に明らかに染色することを観察したが、Ｄ１１と７ｅ８はわずかな染色を示した。Ｂ２は同じ静脈を染色しなかった。Ｔｉｅ−１の発現は肺癌腫において劇的に上方調節したが、すべての抗体は、正常の肺からのサンプルよりも肺癌腫を有するサンプル中でより強く血管を染色した。肺腫瘍において、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体は血管以外の構造物を染色した。
【０４５６】
腎臓において、Ｅ３とＤ１１抗体は血管に加えた腎臓細管を染色した。Ｂ２は細管または血管の非常に弱い染色のみを与えたが、７ｅ８は血管のみを染色した。ハイパーネフローマ組織において、Ｅ３抗体のみが明らかな染色を与えた。
【０４５７】
胸において、Ｅ３は乳房組織の静脈と毛細管で最も明るい染色を与え、Ｂ２と７ｅ８は類似の染色を与えたが、Ｄ１１はこれらの構造物をかなり弱く染色した。乳癌腫において、Ｔｉｅ−１発現は実質的に上方調節され、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体は血管に加えて他の構造物も染色した。
【０４５８】
（実施例８：  フローサイトメトリーを用いる抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧのマウス内皮細胞系への結合）
本発明者らは、Ｅ３がマウスＴｉｅ１とｉｎ  ｓｉｔｕで交差反応するかどうかを評価し、よって、本発明者らが評価できるのであれば、マウス内皮細胞に結合するマウス腫瘍異種移植モデルにおけるＥ３活性を試験し、ヒト細胞系とトランスフェクトした細胞系と比較した。
【０４５９】
Ｔｉｅ−１抗体およびコントロールＭａｂのマウス内皮細胞への特異的な結合をフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳｓｃａｎ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｏｘｎａｒｄ，  Ｅｐｉｃｓ，  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により測定した。マウス内皮細胞系であるＭＳ１、Ｌｅ−２（Ａｌｉｔａｌｏ）Ｂｅｎｄ３、ＳＶＥＣ（ＡＴＣＣ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）およびＴｉｅ−１移入Ｌｅ−２細胞（Ａｌｉｔａｌｏ）を染色した。細胞染色は存在するプロトコールから改良した。約２００，０００細胞を各実験に用いた：  トリプシン処理後、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳ、１０％熱不活性化ヒト血清（インキュベーション緩衝液）に再懸濁した。特異性を試験するために、抗体を異なる希釈度で１時間、室温でインキュベートした。細胞を遠心により３分間６１１ｇで回転させた。インキュベーションとインキュベーションの間に細胞をＰＢＳで二回洗浄した。次に、関連するビオチン化抗体（ストレプトアビジンに対するＡ２、Ｔｉｅ−１に対するＥ３）を加え、１時間室温でインキュベートした。この後に、インキュベーション緩衝液中で、１時間室温でトレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン（Ｄａｋｏ，  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）とともにインキュベートした。最終インキュベーション工程後、結合抗体は、ＦＡＣＳＣａｎおよびＥｐｉｃｓ  Ａｌｔｒａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｏｘｎａｒｄ，  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によるフローサイトメトリーを用いることにより検出し、結果を分析した。
【０４６０】
インキュベーション中０．１％の最終濃度でサポニンをインキュベーション緩衝液に加える以外は、細胞内Ｔｉｅ−１を上記のように測定した。抗Ｔｉｅ−１抗体Ｅ３は、ｉｎ  ｓｉｔｕでＥ３のマウスおよびヒトＴｉｅ１への交差反応を示すマウス内皮細胞系に結合する。フローサイトメトリーによって検出されるマウス細胞系中の結合パターンは、マウス細胞において、主要ヒト内皮細胞系に比較して高い細胞表面染色が存在する点において、ＨＵＶＥＣでの結合パターンとは異なる。
【０４６１】
（実施例９：  フローサイトメトリーを用いるヒト血小板に結合する抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧの決定）
Ｔｉｅ−１に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清（Ｒ＆Ｄシステム）を用いる結合実験は以前の研究でヒト血小板への結合を示した（Ｔｓｉａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。この研究からの結論は、血小板が、Ｔｉｅ１の発達の問題を示しうるＴｉｅ−１免疫反応性の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体Ｅ３が血小板に結合するかどうかを調べるために、本発明者らは、活性化および不活化の両方の血小板に対するフローサイトメトリー分析を実施し、染色パターンを精製抗Ｔｉｅ１ポリクローナル血清と比較した。
【０４６２】
血小板活性化をさけるために、血小板ＧｅｌＳｅｐキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）キットを製造者の指標に基づいて用いることで、健康なドナーの血漿からヒト血小板を単離した。血小板は、トロンビンを０．８Ｕ／ｍｌの最終濃度で加えることにより活性化した。活性化血小板を非活性化血小板から区別するために、二重染色をＴｉｅ−１抗体／コントロール抗体と抗体ＣＤ４２（全血小板）またはＣＤ６２（活性化血小板）を用いて実施した。
【０４６３】
調製後、血小板をＧｅｌＳｅｐキット、１０％熱不活性化ヒト血清（インキュベーション緩衝液）の緩衝液２に再懸濁し、１時間インキュベートした。特異性を試験するために、ビオチン化抗体であるヒト抗Ｔｉｅ１（Ｅ３）、ヒト抗ストレプトアビジン（Ａ２）、ヒト抗ＦＩＴＣおよびヤギ抗Ｔｉｅ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１試験あたり５０００００血小板とともに、異なる希釈度（２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）で一時間、室温でインキュベートした。血小板を遠心により１０分間６１１ｇで回転させた。インキュベーションとインキュベーションの間に血小板をＧｅｌＳｅｐキットの緩衝液１で二回洗浄した。次に、抗ＣＤ４２−ＰｅｒｃＰまたは抗ＣＤ６２−ＰｅｒｃＰとともにストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリンを３０分間室温でインキュベーション緩衝液中でインキュベートした。最後のインキュベーションと洗浄後に、結合抗体の検出をＦＡＣＳｓｃａｎおよびＥｐｉｃｓ  Ａｌｔｒａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｏｘｎａｒｄ，  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によるフローサイトメトリーにより実施し、結果を分析した。細胞は、非活性化血小板を用いた場合、全血小板のためにＳＳＣと抗ＣＤ４２−ＰｅｒｃＰ上にゲートを付け、活性化血小板のためにＳＳＣおよび抗ＣＤ６２−ＰｅｒｃＰ上にゲートを付けた。
【０４６４】
ポリクローナルヤギ抗Ｔｉｅ−１抗体は試験された条件下に血小板に実際に結合する。この結合は血小板が活性化されているときに低い。対照的に、ヒト抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３は全血小板に対しても、活性化血小板に対しても顕著な結合を示さない。
【０４６５】
（実施例１０：  抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧによる免疫沈降を用いるヒト血小板におけるＴｉｅ１免疫反応性の評価（Ｐａｕｌａ  Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ，  Ｌａｅｔｉｔｉａ  Ｄｅｖｙ））
Ｔｉｅ−１に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる以前の研究は、ヒト血小板への結合を示した（Ｔｓｉａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。この研究からの結論は、血小板が、Ｔｉｅ１の発達の問題を示しうるＴｉｅ−１免疫反応の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体Ｅ３が血小板に結合する可能性を排除するために、血小板とＨＵＶＥＣＳから調製された溶解物の免疫沈降を実施した。活性化と不活性化の両方の血小板を試験した。抗Ｔｉｅ−１抗体であるＢ２、Ｄ１１、Ｅ３、ヤギポリクローナル抗体ＡＦ６１９（Ｒ＆Ｄ）および陰性コントロール抗体抗ＦＩＴＣと抗ストレプトアビジンを用いた。ＨＵＶＥＣＳをトリプシン処理により培養皿から回収し、血小板を血小板ＧｅｌＳｅｐキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ，  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）を製造者の指標にしたがって用いることにより調製した。一回の免疫析出実験につき、３〜５ｅ１０６と３ｅ１０８細胞血小板を、試験した各抗体のために用いた。血小板と細胞をＰＢＳで洗浄し、１４００ｒｐｍで４分間回転させ、上清を除去した。次に、細胞を、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸（ＤＯＣ）および０．５％ＮＰ−４０を含む１ｍｌ溶解緩衝液中で５分間溶解した。溶解した細胞を１０分間、１４．０００ｒｐｍで回転させ、５μｇ／ｍｌ抗体を上清に加え、４℃でロテーター上でインキュベートした。１００μｌ／サンプルプロテインＡビーズ（Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を溶解緩衝液で３回洗浄し（遠心速度：  １５秒、２０００ｒｐｍ）、次に抗体とともにインキュベートした細胞溶解物を３０分間、４℃で加えた。次に、ビーズを、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＤＯＣ、０．５％ＮＰ−４０を含有する洗浄緩衝液で３回洗浄した。最後に、ビーズを回転させ、ペレットを等量のサンプル緩衝液に再懸濁してＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングを実施した。ウエスタンブロッティングにおいて、Ｔｉｅ−１をポリクローナルヤギ抗Ｔｉｅ−１抗体で検出した。この研究の結論は、Ｅ３は、血小板においてではなく、ＨＵＶＥＣにおいてＴｉｅ−１を免疫沈降できるということである。
【０４６６】
（実施例１１：  抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧによる染色によって決定されたＨＵＶＥＣＳ中のＴｉｅ１の分布）
本発明者らは、ＨＵＶＥＣＳ中のＥ３の染色パターンを共焦点顕微鏡を用いて分析した。ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、６００００細胞の密度でゼラチン被覆顕微鏡スライド上にスポットし、２４時間加湿インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。細胞を風乾し、４％パラホルムアルデヒドで２０分間室温で固定した。スライドをＰＢＳで洗浄した。スライドを１０％熱不活性化ヒト血清（インキュベーション緩衝液）とともにインキュベートした。
【０４６７】
Ｔｉｅ−１への特異的な結合を測定するために、ビオチン化抗体Ｅ３およびビオチン化陰性コントロール抗体Ａ２を１０μｇ／ｍｌの濃度で用い、室温で一時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで二回洗浄した。次に、ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン（Ｄａｋｏ，  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、  Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、室温で一時間インキュベートした。最後のインキュベーションと洗浄後、結合抗体の検出は共焦点顕微鏡を用いて実施した。
【０４６８】
Ｅ３は共焦点顕微鏡により検出されたように特異的にＨＵＶＥＣに結合する。染色は細胞内に主に位置し、細胞表面局在Ｔｉｅ１の小さいプールに比べてＴｉｅ１の大きい細胞内プールを示唆する。Ｅ３の局在化は細胞骨格タンパク質とともにＴｉｅ１の共局在化に一致した。
【０４６９】
（実施例１２：  抗Ｔｉｅ１  Ｅ３のフレームワーク領域に置かれた体細胞変異の生殖系列残基への変換）
ヒトにおけるＥ３の潜在的な免疫原性を減少させるために、ＬＣフレームワーク領域中のすべての非生殖系列アミノ酸残基を訂正して生殖系列に戻した。Ｅ３のＬＣを、すべてのカッパおよびラムダ軽鎖生殖系列遺伝子を含むデータベースにアライメントさせた最初の分析を実施した。Ｅ３のＬＣは、ＤＰＫ４に最も近い相同性を有することが示され、生殖系列フレームワーク領域に対してＥ３に三つの置換が同定された。
【０４７０】
本発明者らは、ＤＰＫ４生殖系列フレームワーク領域に同一な配列を含むようにＬＣフレームワーク領域が変更されたＥ３の生殖系列抗体を構築した。生殖系列Ｅ３抗体は、所望の配列をコードする核酸を設計することにより構築した。Ｅ３  ＬＣ可変ドメインをコードする核酸に対する変更は、ＰＣＲと他の標準的な分子生物学的技術により行い、核酸配列決定により実証した。
【０４７１】
生殖系列Ｅ３配列は以下の通りである：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＨＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＨＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号１５９）
変更位置に下線が付けてある。
【０４７２】
本発明者らは、Ｅ３抗体の生殖系列版を可溶性ＦａｂとＩｇＧの両方として作った。陽性ｓＦＡＢを発現するクローンのＦａｂカセットをオリゴヌクレオチドでＰＣＲ増幅し、ヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインを含む哺乳類発現ベクター中に連結し、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細胞中にエレクトロポレートした。原核生物リボソーム結合配列と遺伝子の三リーダー配列を哺乳類の内部リボソーム侵入および重鎖リーダー配列によって置換した。再フォーマットした抗体クローンを配列決定してクローニング操作後に正確性を確認した。エンドトキシンのないＤＮＡを調製し、過渡的トランスフェクションの研究に用いた。
【０４７３】
（実施例１３：  組換えＴｉｅ１−Ｆｃへの結合のための生殖系抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−Ｆａｂの生産とＥＬＩＳＡによるその試験）
Ｅ３フレームワークの体細胞変異の生殖系列残基への変換が可溶性Ｆａｂの結合活性に効果を有するかどうかを評価するために、可溶性Ｆａｂを作った。親Ｅ３  Ｆａｂを含む可溶性発現ベクターと生殖系列系Ｅ３  Ｆａｂ構築物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと２％グルコースを含む２×ＴＹブロスで３０℃で一晩生育し、この一晩の培養物の４ｍｌを用いて、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％グルコースを含む４００ｍｌの２×ＴＹブロスに接種した。細胞を３７℃で０．８〜１．０のＯＤ６００まで生育し、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物を３０℃で４時間維持した。培養物を４，０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心した。上清を捨て、ペレットを、プロテアーゼインヒビター（プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤［Ｒｏｃｈｅ］：  １錠剤を１ｍｌの水に溶解し、ＴＥＳ緩衝液で５０倍に希釈する）を含む４．８ｍｌの氷冷ＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍトリス塩酸、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース、ｐＨ８．０）に再懸濁した。５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、氷上に５〜１０分間置く。このインキュベーション中、遠心管を、プロテアーゼインヒビターを含む５．２５ｍｌのＴＥＳ：Ｈ２Ｏ（１：３）で洗浄し、これを細胞に加える。２０分間以上氷上でインキュベートする。３０００ｇで１５分間４℃で遠心し、上清を新しい遠心チューブに移す。細胞ペレットを、１５ｍＭのＭｇＳＯ４とプロテアーゼインヒビターを含む６ｍｌのＴＥＳに再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートする。３０００ｇで１５分間、４℃で遠心する。上清を遠心チューブに移し、８０００ｇで２０分間、４℃で遠心する。上清を集め、ＰＢＳに対して透析する。Ｆａｂを金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。透析した周縁細胞質抽出物を１ｍｌのＴＡＬＯＮＴＭ金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともにインキュベートし、室温で２時間回転する。ビーズを空の重力カラム（Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｔ．７３１−１５５０）に移す。ビーズをＰＢＳ中の５ｍＭイミダゾールで洗浄し、ＦａｂをＰＢＳ中の１５０ｍＭイミダゾールにより溶出する。透析カセット（ＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＳＥＲＴＭ透析カセット、ＭＷＣＯ  １０，０００、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログナンバー６６３８０）を用いてＰＢＳに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌ溶液が０．８６の吸光度を有するとみなして２８０ｎｍでの吸光度からタンパク質濃度を決定する。調製物の品質は還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができる。
【０４７４】
０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１００マイクロリットルあたり、５００ｎｇまたは５０ｎｇの精製組換えヒトＴｉｅ−１−Ｆｃ標的抗原でＩＭＭＵＬＯＮＴＭ２ＨＢプレートのウエルを一晩被覆した。親のＥ３、Ｅ３生殖系列（Ｅ３ｇ）または陰性コントロール可溶性Ｆａｂを、ＰＢＳＴの１００マイクロリットルあたり５マイクログラムまたは１マイクログラムでウエルに負荷した。組換えヒトＴｉｅ−１−Ｆｃ標的抗原を適当な量の酢酸に溶解し、次に０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）緩衝液中に１００マイクロリットルあたり５００ｎｇおよび５０ｎｇの最終濃度に希釈する。標的抗原をウエルに加えた後、マイクロタイタープレートを一晩４℃でインキュベートする。次に、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、３７℃で２時間、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックする。このプレートを再び洗浄緩衝液、ＰＢＳＴでプレートを回洗浄し、ＰＢＳＴ１００マイクロリットルあたり、５または１マイクログラムの精製Ｆａｂの１ウエルあたり１００マイクロリットルを加えた後、室温で１時間インキュベートした。プレートを７回ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ中の抗ｓＦａｂ−ＨＲＰの１００マイクロリットルの１：５０００希釈物を加えた（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ＃３１４１４）。ウエルを７回洗浄した後、１００マイクロリットルのＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を各ウエルに加え、プレートをＥＬＩＳＡで６３０ｎｍにて読んだ。Ｅ３および生殖系列Ｅ３が、このアッセイで組換えヒトＴｉｅ−１−Ｆｃ標的抗原に結合した。
【０４７５】
（実施例１４：  ＢＩＡｃｏｒｅにおける組換えヒトＴｉｅ１への結合のための生殖系列抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−Ｆａｂの生産とその試験）
組換え精製ヒトＴｉｅ−Ｆｃ抗原（原液２．４５ｍｇ／ｍｌ）を、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｃａｔ．２１３３１）を用いてビオチン化した。反応は、２時間、氷上で、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中で、５倍モル過剰量のビオチン化剤の存在下で実施し、トリス塩酸、ｐＨ７．５（５０ｍＭ最終濃度）を加えて停止した後、氷上で１時間のインキュベーションを行った。次に、サンプルをＰＢＳに対して透析した。次に抗原をＨＢＳ中で１／１００倍に希釈し、次にストレプトアビジンチップ上に捕捉した。これを８３０ＲＵ（共鳴単位）の密度に被覆した。すべての分析をＨＢＳ緩衝液中で行った。親Ｆａｂ  Ｅ３と生殖系列系Ｅ３  Ｆａｂを上記のように調製した。０．５８７ｍｇ／ｍｌ（１１７４０ｎＭ）の原液をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／５８７に希釈し、２０ｎＭの原液を得て、生殖系列Ｆａｂ  Ｅ３  ０．０２５ｍｇ／ｍｌ（５００ｎＭ）をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／２５に希釈して２０ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を各Ｆａｂ調製物から作り、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭおよび１．２５ｎＭ溶液を得た。会合相のために、サンプルは３０μｌ／分で４分間、注入プログラムを用いて注入した。この後は１０分間の解離相であり、残っているサンプルを、１８秒間の５ｍＭ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  ＮａＣｌの一回の注入によりＴｉｅ−１  Ｆｃ表面から５０μｌ／分の流速で取り除いた。すべてのサンプルを実験し、デュプリケートで分析した。
【０４７６】
センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮＴＭソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを用いて分析した。分析から、Ｅ３抗体の生殖系列化は抗体の結合活性に対して最少の効果を有したことがわかる。
【０４７７】
【表３９】
2007528720.tif 000039
（実施例１５：  ＢＩＡｃｏｒｅを用いる組換えヒトＴｉｅ１への結合に対する生殖系列抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧと親抗Ｔｉｅ１  Ｅ３との親和性比較）
結合挙動が、体細胞変異の生殖系列残基への戻り変換により影響を受けるかどうかを評価するために、生殖系列抗体を作り、ＩｇＧとして調べた。生殖系列Ｅ３−ＩｇＧ構築物を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に過渡的にトランスフェクトし、該構築物を精製した。
【０４７８】
生殖系列Ｅ３  ＩｇＧ１保存溶液０．６３ｍｇ／ｍｌをｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈し、親Ｅ３  ＩｇＧ１保存溶液０．５６ｍｇ／ｍｌ（２１４３−００１）をｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈した。ＩｇＧを直接にＣＭ５チップに被覆した。チップの表面を０．０５Ｍ  ＮＨＳ／０．２Ｍ  ＥＤＣの７分間のパルスで活性化させ、７８０ＲＵ生殖系列Ｅ３−ＩｇＧおよび７２８非生殖系列Ｅ３  ＩｇＧが表面に被覆されるまでＩｇＧを流した。すべての流れる細胞を次に１Ｍエタノールアミン塩酸塩、ｐＨ８．５の７分間のパルスで非活性化した。すべての分析はＨＢＳ緩衝液で実施した。精製組換えヒトＴｉｅ−１  ＦｃをＨＢＳで１／２８．７に希釈して、４００ｎＭの保存溶液を得た。連続的な希釈物を作って、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭおよび２５ｎＭのＴｉｅ−１  Ｆｃ原液を得た。会合相の分析ために、サンプルは３０μｌ／分で８．３分間、注入プログラムを用いて注入した。この後は４０分間の解離相であった。表面に会合して残っている抗原を、３０秒間の１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の二回の注入によりＩｇＧ表面から５０μｌ／分の流速で取り除いた。すべてのサンプルを実験し、デュプリケートで分析した。
【０４７９】
センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮＴＭソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを用いて分析した。生殖系列化はヒトＴｉｅ１  Ｆｃに関してＥ３  ＩｇＧの結合活性に対して最少の衝撃を有した。
【０４８０】
【表４０】
2007528720.tif 000040
（実施例１６：  ＢＩＡｃｏｒｅ中の組換えマウスＴｉｅ１への結合に対する生殖系列抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−Ｆａｂの生産と試験）
マウスＴｉｅ１−Ｆｃ抗原（原液０．５ｍｇ／ｍｌ）を確立された方法を用いてビオチン化し、ＨＢＳで１／１００倍の希釈後、これをストレプトアビジンチップへの捕捉に用いた。これを７４０ＲＵの共鳴値に被覆した。すべての分析をＨＢＳ緩衝液中で行った。親Ｆａｂ  Ｅ３  ０．５８７ｍｇ／ｍｌ（１１７４０ｎＭ）をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／５８７に希釈し、２０ｎＭの原液を得て、生殖系列Ｆａｂ  Ｅ３  ０．０２５ｍｇ／ｍｌ（５００ｎＭ）をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／２５に希釈して２０ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を各Ｆａｂ調製物から作り、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭおよび１．２５ｎＭ溶液を得た。会合相のために、サンプルは３０μｌ／分で４分間、注入プログラムを用いて注入した。この後は１０分間の解離相であり、残っているサンプルを、１８秒間の５０ｍＭ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  ＮａＣｌの一回の注入によりＴｉｅ−１  Ｆｃ表面から５０μｌ／分の流速で取り除いた。すべてのサンプルを実験し、デュプリケートで分析した。
【０４８１】
センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮＴＭソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを用いて分析した。Ｅ３抗体の生殖系列化は抗体の結合活性に対して最少の効果を有した。
【０４８２】
【表４１】
2007528720.tif 000041
（実施例１７：  ＢＩＡｃｏｒｅを用いる組換えマウスＴｉｅ１への結合に対する生殖系列抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧと親抗Ｔｉｅ１  Ｅ３との親和性比較）
結合挙動が、体細胞変異の生殖系列への戻り変換により影響を受けるかどうかを評価するために、生殖系列抗体を作り、ＩｇＧとして調べた。生殖系列Ｅ３を記載されたようにＩｇＧに再フォーマットした。次に、これを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に確立された方法を用いて過渡的にトランスフェクトした。ＩｇＧを、確立された方法を用いるプロテインＡカラムクロマトグラフィーを用いて培養上清から精製し、以降のＩｇＧを次に表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて結合活性について調べた。生殖系列Ｅ３  ＩｇＧ１保存溶液０．６３ｍｇ／ｍｌ（２１４６−００２）をｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈し、親Ｅ３  ＩｇＧ１保存溶液０．５６ｍｇ／ｍｌ（２１４３−００１）をｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈した。ＩｇＧを直接にＣＭ５チップに被覆した。チップの表面を０．０５Ｍ  ＮＨＳ／０．２Ｍ  ＥＤＣの７分間のパルスで活性化させ、７８０ＲＵ生殖系列Ｅ３−ＩｇＧおよび７２８非生殖系列Ｅ３  ＩｇＧが表面に被覆されるまでＩｇＧを流した。すべての流れる細胞を次に１Ｍエタノールアミン塩酸塩、ｐＨ８．５の７分間のパルスで非活性化した。すべての分析はＨＢＳ緩衝液で実施した。精製組換えマウスＴｉｅ−１  ＦｃをＨＢＳで１／６．５に希釈して、４００ｎＭの保存溶液を得た。連続的な希釈物を作って、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭおよび２５ｎＭのＴｉｅ−１  Ｆｃ原液を得た。会合相の分析ために、サンプルは３０μｌ／分で８．３分間、注入プログラムを用いて注入した。この後は４０分間の解離相であった。表面に会合して残っている抗原を、３０秒間の１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の二回の注入によりＩｇＧ表面から５０μｌ／分の流速で取り除いた。すべてのサンプルを実験し、デュプリケートで分析した。
【０４８３】
センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮＴＭソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを用いて分析した。生殖系列化法はマウスＴｉｅ１  Ｆｃに関してＥ３  ＩｇＧの結合活性に対して最少の衝撃を有した。
【０４８４】
【表４２】
2007528720.tif 000042
（実施例１８：  ＨＵＶＥＣＳを用いる管形成アッセイにおける生殖系列抗Ｔｉｅ１−Ｅ３および親抗Ｔｉｅ１−Ｅ３のＩＣ５０の比較）
生殖系列Ｅ３とその親抗体を、コラーゲンタイプＩマトリックス中の管形成アッセイで評価した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（新しく単離したもの）を、ヒト臍帯静脈をトリプシン−ＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２０〜２５分間、３７℃で処理することにより得た。次に、細胞を、接着因子（ＡＦ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で被覆したＴ−２５フラスコ中、１０％ＦＣＳ、０．４％ＢＢＥ、１％  １−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−ＥＤＴＡで離し、二回または三回の継代でコンフルエントになったときに使用した。培養中これら細胞を１：２の分離比で、単層の約６０〜８０％のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。ＨＵＶＥＣ単層をトリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で３７℃、３分間処理した。トリプシン活性は３体積分の完全ＰＲＭＩ培地を加えることにより停止した。細胞を注意してかきとり、繰返しのピペッティングにより分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。ＨＵＶＥＣ（継代２）を、７．５体積分の２ｍｇ／ｍｌコラーゲン（コラーゲンＲ；  Ｓｅｒｖａ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、１体積分の１０×ＭＥＭ、１．５体積分のＮａＨＣＯ３（１５．６ｍｇ／ｍｌ）を混合し約１体積分のＮａＯＨによりｐＨを７．４に調節することにより調製されたコラーゲンゲル（１．５ｍｇ／ｍｌの５０μｌ  ｃｏｌｌ  Ｉ）上のそれらの培養培地（４０．１０３／５０μｌ／９６ウェルプレートのウエル）にまいた。１時間３０分後、培養培地を次に捨て、細胞をコラーゲンの新しい層（１．５ｍｇ／ｍｌ、新しい調製物、５０μｌ／ウエル）で被覆した。ゲルの重合後、培養培地を、Ｅ３抗体または生殖系Ｅ３抗体（０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下に各ウエルに加えた。培養表面上の管ネットワークの全体長さを、Ｍｅｔａｖｕｅソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により×４０倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を視野±ＳＥＭ（相対単位）あたりの平均血管範囲として示した。各アッセイを少なくとも３回実施した（図１６、図１７）。その結論は、３体細胞変異のＥ３中の生殖系列アミノ酸への変換はＥ３の効能にほとんど効果を持たなかったということである。親Ｅ３および生殖系列Ｅ３は、基本的に同じＩＣ５０＝１０ｎｇ／ｍｌ、すなわち６６ｐＭでインビトロでチューブ形成を阻害する。
【０４８５】
（実施例１９：  マウス内皮細胞を用いた管形成アッセイにおける生殖系列抗Ｔｉｅ１−Ｅ３の分析）
マウスＴｉｅ−１交差反応とマウスＴｉｅ１に対する生物活性を評価するために、Ｅ３と生殖系列Ｅ３の両方を、マウス内皮細胞系（ＬＥＩＩ）を用いてインビトロでの管形成を阻害する能力について評価した。
【０４８６】
ＬＥＩＩ肺マウス内皮細胞系（ＡＴＣＣ）を、Ｔ−２５フラスコで、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＧＬＵＴＡＭＡＸＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を有するＭＥＭ培地中で培養した。培養中、細胞を１：５の分離比で、単層の約８０％のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。ＬＥＩＩ単層をトリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で３７℃、３分間処理した。トリプシン活性は３体積分の完全ＭＥＭ培地を加えることにより停止した。細胞を注意してかきとり、繰返しのピペッティングにより分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。ＬＥＩＩを基底膜（ＢＩＯＣＯＡＴＴＭ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のそれらの培養培地（２０〜４０×１０３／５０μｌ／９６ウエルプレートのウエル）にまいた。ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ（３０分間、３７℃、５％ＣＯ２環境）の重合後、所望の分子（４．１０５細胞／ｍｌ；  ５０μｌ／ウエル）存在下に完全培養培地に再懸濁した内皮細胞懸濁液を各ウエルに加えた。次に、血管形成アッセイプレートを１６〜１８時間、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベートした。管ネットワークの全体長さを、ＭＥＴＡＶＵＥＴＭソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により×４０倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を視野±ＳＥＭ（相対単位）あたりの平均血管範囲として示した。各アッセイを少なくとも２回実施した。生殖系列Ｅ３はマウス内皮細胞における管形成の強力な阻害剤である。
【０４８７】
（実施例２０：  抗Ｔｉｅ１−Ｅ３を用いるマウス腫瘍組織切片の免疫組織化学分析）
本発明者らは、抗体Ｅ３がマウス異種移植片におけるマウス内皮細胞に結合するかどうかを調べた。免疫組織化学は、ビオチン化抗体Ｅ３およびコントロール抗体である抗ＣＤ３１（内皮細胞特異的マーカー）および抗ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）を用いて実施した。ＳＷ４８０細胞（ＡＴＣＣ）を含むマウス異種移植片からのホルマリン固定腫瘍組織を、ヒト抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３の結合パターンについて調べた。パラフィン包埋組織の５μｍ切片を脱パラフィンし、再水和し、温かいクエン酸緩衝液（０．０１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ６、９５℃）で４５分間で前処理した。スライドを新しいクエン酸緩衝液で２０分間冷却し、蒸留水ですすいだ。スライドを過酸化水素処理し（ＰＢＳ中０．３％Ｈ２Ｏ２）、５％ＦＣＳ、５％熱不活性化ヒト血清（ＨＳ）を含むＰＢＳととともに１時間プレインキュベートした。抗体のインキュベーションとインキュベーションとの間に、スライドを３回５分間、ＰＢＳで洗浄した。ビオチン化抗体Ｅ３とＡ２をＰＢＳ、１０％ＨＳで１０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、１時間室温でインキュベートした。次に、スライドをアビジン−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ）とともに３０分間、室温でインキュベートした。染色をＡＥＣ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）とＨ２Ｏ２により検出した。パーオキシダーゼ反応を水を加えて停止し、スライドをヘマトキシリンで向流染色した。組織の結合反応性を評価した。染色パターンはマウス内皮細胞Ｔｉｅ１の染色に一致し、Ｅ３はマウス異種移植中でＳＷ４８０腫瘍細胞により発現されたＴｉｅ−１に結合する。
【図面の簡単な説明】
【０４８８】
【図１】図１はＴｉｅ１による血小板特異的マーカーＣＤ４２の標識およびＥ３抗体による標識を示す二変数ＦＡＣＳプロットを示す。バックグランド数のＣＤ４２陽性細胞のみがＥ３抗体により標識されている。
【図２】図２Ａ、２Ｂ、２Ａおよび２Ｂは、生殖系Ｅ３（３Ａおよび３Ｂ）を親Ｅ３（２Ａおよび２Ｂ）と比較した抗体濃度に対する分岐点の数のプロットである。
【図３】図２Ａ、２Ｂ、３Ａおよび３Ｂは、生殖系Ｅ３（３Ａおよび３Ｂ）を親Ｅ３（２Ａおよび２Ｂ）と比較した抗体濃度に対する分岐点の数のプロットである。