【手続補正書】
【提出日】平成23年8月16日(2011.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューレグリン−１(ＮＲＧ１)と同族受容体間の相互作用を調節して杯細胞過形成を阻害する、ＮＲＧ１の調節剤。
【請求項２】
ＮＲＧ１がＮＲＧ１αまたはＮＲＧ１βファミリーのメンバーである、請求項１記載の調節剤。
【請求項３】
ＮＲＧ１βがＮＲＧ１β１である、請求項２記載の調節剤。
【請求項４】
ＮＲＧ１がＮＲＧ１の膜結合および／または可溶形態である、請求項１〜３のいずれか記載の調節剤。
【請求項５】
調節剤が低分子量化合物である、請求項１〜４のいずれか記載の調節剤。
【請求項６】
調節剤が抗体である、請求項１〜４のいずれか記載の調節剤。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項６記載の調節剤。
【請求項８】
抗体がヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項７記載の調節剤。
【請求項９】
抗体がＮＲＧ１αと比較して優先的にＮＲＧ１β１と結合するものである、請求項６〜８のいずれか記載の調節剤。
【請求項１０】
抗体がＮＲＧ１αと比較してＮＲＧ１β１と特異的に結合するものである、請求項９記載の調節剤。
【請求項１１】
抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ４のヒト定常領域を含むものである、請求項６〜１０のいずれか記載の調節剤。
【請求項１２】
異常な粘液生産を特徴とする疾患または障害の処置用医薬の製造における、請求項１〜１１のいずれか記載の調節剤の使用。
【請求項１３】
疾患または障害が呼吸器のものである、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
疾患または障害がＣＯＰＤ、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性気管支炎または喘息である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
疾患または障害がヒトのものである、請求項１２〜１４のいずれか記載の使用。
【請求項１６】
異常な粘液生産を特徴とする疾患の予防または進行の遅延および／または症状の改善用医薬の製造における、請求項１〜１１のいずれか記載の調節剤の使用。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか記載の調節剤を同定する方法であって；
候補調節剤とＮＲＧ１とを接触させて；そして
該候補調節剤がＮＲＧ１とその同族受容体間の相互作用を調節するかを決定する
ことを含む方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか記載の調節剤と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
ＣＯＰＤ、ＣＦ、喘息、慢性気管支炎、下気道の疾患、肺気腫、肺炎の処置のための、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
異常な粘液生産によって特徴付けられる呼吸器疾患または障害を有するヒト患者を処置する薬剤であって、ヒトＮＲＧ１と結合し、ＮＲＧ１とＥＲＢ２／ＥＲＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する阻害剤、ならびにヒトＩＬ−１３とその同族ヒト受容体間の相互作用を阻害する抗ヒトＩＬ−１３薬物および／またはヒトＩＬ−４５とそのヒトＩＬ−４受容体間の相互作用を阻害する抗ヒトＩＬ−４薬物および／またはヒトＩＬ−５とその同族受容体間の相互作用を阻害する抗ヒトＩＬ−５薬物および／またはヒトＩｇＥとその同族受容体間の相互作用を阻害する抗ＩｇＥ薬物の組み合わせを有効成分として含む、薬剤。
【請求項２１】
抗ヒトＮＲＧ１β１抗体を抗ヒトＩＬ−１３抗体、抗ヒトＩＬ−４抗体、抗ヒトＩＬ−５抗体および抗ヒトＩｇＥ抗体から選択される１種またはそれ以上の薬物と組み合わせて含む、請求項２０記載の薬剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ムチンＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂは喘息、ＣＯＰＤおよびＣＦのような呼吸器疾患における気道粘液分泌物の主要成分である［Williams et al, 2006; Rose and Voynow, 2006; Rogers, 2003］。粘液過分泌は喘息の特徴であり、重度の急性喘息発作で死亡した患者由来の肺の形態学的分析によって、気道内腔の杯細胞数および粘液の増加が示された［Aikawa et al, 1992］。気道内腔における粘液栓は、ほとんどの患者において致命的な喘息の主たる寄与原因として報告されている。［Kuyper et al, 2003; Hays and Fahay, 2003］。ＭＵＣ５ＡＣ発現は、正常個体と比較して、喘息重積状態において増加し、表層上皮、内腔および杯細胞に局在化する［Gronenberg et al, 2002a］。健常人と比較して軽度乃至中等度の喘息を有する対象における肺細胞数の増加も報告されており、分泌されるムチンの濃度が中等度の喘息を有する患者の気道においてより高いことが報告されている［Ordonez et al, 2001］。さらに、健常人と比較して喘息を有する対象の杯細胞のＭＵＣ５ＡＣムチン着色（staining）の増加が報告されている［Ordonez et al, 2001］。ムチンＭＵＣ５Ｂは喘息患者の気道表層杯細胞によっても生産される［Gronenberg et al, 2002a］。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
４．  発明の詳細な説明
下記セクション４の説明において、多様なタンパク質、そのアイソフォームおよび疾患／障害の処置に関する記載は、ヒトタンパク質、そのアイソフォームおよびヒト疾患および障害に関連する。したがって「ＮＲＧ−１」、「ＮＲＧ１α」および「ＮＲＧ１β１」は、ヒトＮＲＧ−１等について言及しているものと解釈される。下記の態様において、「ＮＲＧ１」および「ＮＲＧ１β１」についての記載は、それぞれのタンパク質のあらゆる形態ならびに付加的および個別に、可溶形態および膜結合形態を意味していると理解することができ、本明細書に触れた者はそれぞれの態様がそのようなものと解釈されることを意図していると推測することができる。したがって、特に定めのない限り、下記それぞれの態様において、３つの態様、第１にそれぞれのタンパク質のあらゆる形態、第２に何れかの膜結合形態そして第３にそれぞれのタンパク質の可溶形態に言及する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
マウス免疫グロブリン座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置換されている多様なトランスジェニックマウス種が現在では利用可能である（Tomizuka K, (2000) PNAS 97, 722-727; Fishwild DM (1996) Nature Biotechnol. 14, 845-851. Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15, 146-156参照）。抗原負荷によってかかるマウスは、興味のある抗体を選択することができるヒト抗体のレパートリーを作製することができる。特に注目すべきなのは、ヒトリンパ球が照射マウスに移植されているTrimera（商標）系（Eren R et al, (1988) Immunology 93:154-161参照）、ヒト（または他の種）リンパ球を大規模に蓄えられたインビトロ抗体生産方法に効果的に通し、次いで不要物を除去し（deconvulated）、希釈および選択方法を限定するSelected Lymphocyte Antibody System（ＳＬＡＭ、Babcook et al, PNAS (1996) 93: 7843-7848参照）ならびにXenomouse（商標）（Abgenix Inc）である。別のアプローチはMorphotek Incから入手可能なMorphodoma（商標）技術を用いる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
親和性成熟の技術（Marks; Bio/technol 10, 779-783 (1992)）を用いて、ＨおよびＬ鎖Ｖ領域を天然に生じる変異で順次置換し、改善された結合親和性に基づいて選択して１次ヒト抗体の親和性が改善されている結合親和性を得ることができる。この技術の変形、例えば「エピトープインプリンティング」も現在では利用可能である（WO 93/06213参照）。Waterhouse; Nucl Acids Res 21, 2265-2266 (1993)も参照されたい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
４．１．１．１．２  キメラおよびヒト化抗体
ヒト疾患または障害の処置におけるインタクトな非ヒト抗体の使用は、現在では十分に確立された免疫原性の問題（すなわち、患者の免疫系が非自己として非ヒトインタクトな抗体が認識して中和応答を開始することがある）の可能性がある。これは特にヒト患者に非ヒト抗体を多回投与したときに顕著である。長年にわたってこれらの問題を克服する多様な技術が開発されており、一般に免疫化動物、例えばマウス、ラットまたはウサギから非ヒト抗体を得ること比較的に容易にしたままに、インタクトな抗体の非ヒトアミノ酸配列の組成を減少させることを含む。これを得るため、広くは２つのアプローチが用いられている。第１のものは、一般にヒト定常領域と融合した非ヒト（例えばマウスのようなげっ歯類）可変ドメインを含む、キメラ抗体である。抗体の抗原結合部位が可変領域に局在しているため、キメラ抗体は抗原に対する結合親和性を保持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得し、したがって上記のもののようなエフェクター機能を発揮することができる。キメラ抗体は典型的に、組換えＤＮＡ法を用いて作製する。抗体をコードするＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）を単離し、常套の方法を用いて（例えば本発明の抗体のＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブ、例えば上記配列番号１、２、３、４、５および６をコードするＤＮＡを用いて）配列決定する。ハイブリドーマ細胞はかかるＤＮＡの典型源として使用する。単離すると、該ＤＮＡは発現ベクターに入れて、次いでこれを大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトする。これはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を生産して抗体を合成しない。ＤＮＡは、ヒトＬおよびＨ鎖のコーディング領域を対応する非ヒト（例えばマウス）ＨおよびＬ定常領域で置換して修飾してもよい（例えばMorrison; PNAS 81, 6851 (1984)参照）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
４．３  アンキリン  −  Molecular Partners
この技術は、多様な標的と結合するために使用することができる可変領域を有する骨格としてのアンキリン由来反復モジュールを用いることに基づく。アンキリン反復モジュールは２個の逆平行α−ヘリックスおよびβ−ターンから成る３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソーム・ディスプレイを用いてほとんど最適化される。したがって、ある態様において、ＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１と結合してその生物学的活性を中和するアンキリン化合物が提供される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
４．６  アンチカリン  −  Pieris
アンチカリン（登録商標）はPieris ProteoLab AG社が開発した製品である。これは化学的に感受性な化合物または不溶性化合物の生理的輸送または貯蔵に通常関与する小さなロバストタンパク質の広範な群であるリポカリンに由来する。多様な天然リポカリンがヒト組織または体液中に生じる。
このタンパク質構造は、強固なフレームワークの頭頂部に超可変ループを有しており、免疫グロブリンと類似している。しかし、抗体またはその組換えフラグメントと対照的に、リポカリンは免疫グロブリンドメインよりもごくわずかに大きな１６０〜１８０アミノ酸残基を含む一本鎖ポリペプチドから成る。
結合ポケットを形成する４個のループのセットは、顕著な構造柔軟性を示し、多様な側鎖を受容する。したがって、異なる形態の上記標的化合物を高い親和性および特異性で認識するため、結合部位は独自の方法で再形成され得る。
リポカインファミリーの一つのタンパク質である、オオモンシロチョウのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）は、４ループのセットに突然変異を起こさせてアンチカリンを開発するために使用されている。「アンチカリン」について記載している特許出願の一例は、PCT WO 199916873である。
したがって、ある態様において、ＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１と結合してその生物学的活性を中和するアンチカリン化合物が提供される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
４．７  アフィリン  −  Scil Proteins
アフィリン（商標）化合物は、タンパク質と低分子化合物に対する特異的親和性について設計された低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン（商標）化合物は、それぞれ異なるヒト由来足場タンパク質に基づく２種のライブラリーから極めて速やかに選択することができる。アフィリン（商標）化合物は免疫グロブリンタンパク質と全く構造的相同性を示さない。Scil Proteinsは２種のアフィリン（商標）骨格を用い、その一方はヒト構造的眼レンズ体タンパク質であるガンマ・クリスタリンであり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。ヒト骨格はいずれも極めて小さく、高い温度安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほぼ耐性である。この高い安定性は、主に該タンパク質の広いベータシート構造に由来する。ガンマ・クリスタリン由来タンパク質の例はWO200104144に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例はWO2004106368に記載されている。したがって、ある態様において、ＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１と結合してその生物学的活性を中和するアフィリン化合物が提供される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
４．８．７  細胞培養方法
本発明の治療用抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に既知の方法の何れかで培養することができる。宿主細胞はスピナーフラスコ、回転ボトルまたは中空繊維系で培養することができるが、大規模生産には特に懸濁培養のための撹拌タンク反応槽を用いるのが好ましい。好ましくは撹拌タンクは例えばスパージャー、バッフルまたは低剪断翼を用いた通気のために採用される。バブルカラムおよびエアリフトリアクターについて、空気または酸素バブルによる直接通気を用いてもよい。宿主細胞が無血清培地で培養されるとき、通気プロセスの結果としての細胞損傷を防止するのを補助するため、該培地は細胞保護剤、例えばプルロニックＦ−６８を補うのが好ましい。宿主細胞の特徴に依存して、足場依存性細胞系については増殖基質としてマイクロ担体を用いることができ、あるいは細胞は懸濁培養を採用してもよい（これが典型的である）。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養は、流加培養法、反復回分法（Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109参照）、拡張型回分法または灌流培養のような多様な運用モードを用いることができる。組換え形質転換された哺乳類宿主細胞は、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）のような血清含有培地中で培養することができるが、かかる宿主細胞は合成無血清培地、例えばKeen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163に記載のもの、または商業的に入手可能な培地、例えばProCHO-CDMまたはUltraCHO（商標）（Cambrex NJ, USA）中で培養することが好ましく、所望によりグルコースのようなエネルギー源および組換えインスリンのような合成増殖因子を補ってもよい。宿主細胞の無血清培養は、該細胞が無血清条件下での増殖に適合することが必要であり得る。一つの適合アプローチは、宿主細胞が無血清条件に適合するのを学習するように、かかる宿主細胞を血清含有培地中で培養して８０％の培養培地を無血清培地で反復して交換することである（例えばScharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E. G. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers参照）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
４．１０  医薬組成物
本発明は、治療用タンパク質または低分子量化合物を含み、薬学的に許容される担体と共に製剤されている医薬組成物を提供する。該組成物はさらに、下記ヒトの疾患または障害の処置または予防に好適な他の治療物質を含んでいてもよい。薬学的担体は該組成物を向上しまたは安定化し、あるいは組成物の製造を容易にする。薬学的に許容される担体は、生理的に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において既知の多様な方法で投与することができる。投与経路および／または形態は望まれる結果に従って変化する。静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下投与、あるいは標的部位の近くへの投与が好ましい。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与（例えば注射または輸液による）に好適であるべきである。投与経路に依存して、活性化合物（特に低分子量化合物）は、該化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から該化合物を保護するための物質でコーティングされていてもよい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
本発明は主としてヒト疾患または障害の処置について説明しているが、当業者は本明細書の教示が非ヒト哺乳類の同様の疾患または障害の処置にも適用され得ると容易に理解する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
５．２  略語一覧
【表１】
2010536830.tif 000001
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
５．３  方法
５．３．１  ＨＢＥＣの培養
本質的に［Atherton et al, 2003］に記載のとおり得られたシングルコート（singlequot）を補った気管支上皮細胞増殖培地（ＢＥＧＭ；Cambrex）でヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ； Cambrex）を培養した。分化のため、孔サイズ０．４μｍ、１２ｍｍのTranswellインサート（Costar）で細胞密度８．２５×１０４細胞／インサートで、分化培地中で細胞を増殖した。分化培地は５０％のＢＥＧＭおよび５０％のダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含み、５２μｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物、５μｇ／ｍｌのインスリン、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、０．５μｇ／ｍｌのエピネフリン、０．５ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび５０ｎＭのレチノイン酸を補った。細胞を７日間液体中に維持し、次いで気相液相界面（ＡＬＩ）で７〜１４日間増殖し、培地を２〜３日ごとに補充した。ＡＬＩ培養期間の間、細胞をＮＲＧ１αまたはＮＲＧ１β１（R&D systems）で処理し、Transwellインサートの基底チャンバーに加えた。全段階で細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の存在下、気流インキュベーター中で維持した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
５．３．３  ＲＮＡの作製およびファーストストランドｃＤＮＡ合成
既報のとおり初代細胞から全ＲＮＡを単離した［Jones et al, 2003］。RNeasy mini RNA単離キット（Qiagen）を用い、製造業者の指示に従って細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡはアレルゲン誘導性杯細胞形成のマウスオボアルブミン（ＯＶＡ）モデル由来肺組織からも単離した。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＯＶＡで２週間にわたって感作し、［Trifilieff et al, 2000］に記載のとおり、オボアルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ）の１日用量で２連続日投与した。Qiagen RNeasy miniprepキットの試薬およびプロトコルを用いてＲＮＡをマウス肺組織から作製した。ポリトロンホモジナイザー（Kinematica AG）を用いて、６００μＬのＲＬＴバッファーに凍結肺組織（２０ｍｇ）をホモジナイズした。Qiashredderカラム（Qiagen）を用い、製造業者の指示に従って溶解物をさらに処理した。
１μｇの全ＲＮＡならびにファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Roche Diagnostics Ltd.）の試薬およびプロトコルを用いて、ファーストストランドｃＤＮＡ合成を実施した。