【手続補正書】
【提出日】平成23年3月15日(2011.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）酢酸キナーゼ、ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ、ｃ）アルコールデヒドロゲナーゼ、ｄ）ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ｅ）メチルグリオキサールシンターゼ、ｆ）ピルビン酸オキシダーゼ、ｇ）クエン酸リアーゼ、ｈ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ｉ）ギ酸輸送体、ｊ）リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ｋ）リンゴ酸酵素、およびｌ）プロピオン酸キナーゼ／α−ケト酪酸ギ酸リアーゼをコードする標的遺伝子に対する遺伝的改変（該遺伝的改変は該標的遺伝子により生産されるポリペプチドの酵素活性を不活性化する）を含む、遺伝的に改変された細菌株。
【請求項２】
大腸菌、Gluconobacter oxydans、Gluconobacter asaii、Achromobacter delmarvae、Achromobacter viscosus、Achromobacter lacticum、Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium radiobacter、Alcaligenes faecalis、Arthrobacter citreus、Arthrobacter tumescens、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter oxydans、Aureobacterium saperdae、Azotobacter indicus、Brevibacterium ammoniagenes、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium globosum、Brevibacterium fuscum、Brevibacterium ketoglutamicum、Brevibacterium helcolum、Brevibacterium pusillum、Brevibacterium testaceum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium immariophilium、Brevibacterium linens、Brevibacterium protopharmiae、Corynebacterium acetophilum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamium、Enterobacter aerogenes、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Erwinia herbicola、Erwinia chrysanthemi、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、Flavobacterium rhenanum、Flavobacterium sewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、ミクロコッカス種ＣＣＭ８２５、Morganella morganii、Nocardia opaca、Nocardia rugosa、Planococcus eucinatus、Proteus rettgeri、Propionibacterium shermanii、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas ovalis、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas acidovolans、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas testosteroni、Pseudomonas aeruginosa、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１５５９２、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１９０７０、Sporosarcina ureae、Staphylococcus aureus、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、Actinomadura madurae、Actionomyces violaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、Streptomyces coelicolor、Streptomyces flavelus、Streptomyces griseolus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivaceus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces virginiae、Streptomyces antibioticus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces lavendulae、Streptomyces viridochromogenes、Aeromonas salmonicida、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、Bacillus thiaminolyticus、Escherichia freundii、Microbacterium ammoniaphilum、Serratia marcescens、Salmonella typhimurium、Salmonella schottmulleriまたはXanthomonas citriである、請求項１に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項３】
大腸菌である、請求項２に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項４】
（ａ）クエン酸リアーゼ遺伝子と、以下のａ）酢酸キナーゼ、ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ、ｃ）アルコールデヒドロゲナーゼ、ｄ）ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ｅ）メチルグリオキサールシンターゼ、ｆ）ピルビン酸オキシダーゼ、ｇ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ｈ）ギ酸輸送体、ｉ）リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ｊ）リンゴ酸酵素、および／またはｋ）プロピオン酸キナーゼ／α−ケト酪酸ギ酸リアーゼをコードする標的遺伝子の１以上に対する遺伝的改変；または
（ｂ）クエン酸リアーゼ遺伝子、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酢酸キナーゼ遺伝子、ギ酸輸送体遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子と、以下の標的遺伝子：ａ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ｂ）リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ｃ）リンゴ酸酵素、および／またはｄ）プロピオン酸キナーゼ／α−ケト酪酸ギ酸リアーゼの１以上に対する遺伝的改変（該遺伝的改変は該遺伝子または該標的遺伝子により生産されるポリペプチドの酵素活性を不活性化する）
を含む、遺伝的に改変された細菌株。
【請求項５】
大腸菌、Gluconobacter oxydans、Gluconobacter asaii、Achromobacter delmarvae、Achromobacter viscosus、Achromobacter lacticum、Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium radiobacter、Alcaligenes faecalis、Arthrobacter citreus、Arthrobacter tumescens、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter oxydans、Aureobacterium saperdae、Azotobacter indicus、Brevibacterium ammoniagenes、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium globosum、Brevibacterium fuscum、Brevibacterium ketoglutamicum、Brevibacterium helcolum、Brevibacterium pusillum、Brevibacterium testaceum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium immariophilium、Brevibacterium linens、Brevibacterium protopharmiae、Corynebacterium acetophilum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamium、Enterobacter aerogenes、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Erwinia herbicola、Erwinia chrysanthemi、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、Flavobacterium rhenanum、Flavobacterium sewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、ミクロコッカス種ＣＣＭ８２５、Morganella morganii、Nocardia opaca、Nocardia rugosa、Planococcus eucinatus、Proteus rettgeri、Propionibacterium shermanii、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas ovalis、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas acidovolans、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas testosteroni、Pseudomonas aeruginosa、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１５５９２、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１９０７０、Sporosarcina ureae、Staphylococcus aureus、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、Actinomadura madurae、Actionomyces violaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、Streptomyces coelicolor、Streptomyces flavelus、Streptomyces griseolus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivaceus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces virginiae、Streptomyces antibioticus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces lavendulae、Streptomyces viridochromogenes、Aeromonas salmonicida、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、Bacillus thiaminolyticus、Escherichia freundii、Microbacterium ammoniaphilum、Serratia marcescens、Salmonella typhimurium、Salmonella schottmulleriまたはXanthomonas citriである、請求項４に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項６】
大腸菌である、請求項５に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項７】
代謝的に進化されている、請求項１、２、３、４、５または６に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項８】
前記標的遺伝子もしくはその一部、または前記の複数の標的遺伝子もしくはそれらの一部が欠失、フレームシフト突然変異、点突然変異、停止コドンの挿入またはそれらの組合せにより不活性化されている、請求項１ に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項９】
外因性の遺伝子もしくはそのフラグメントを含まない、または天然の遺伝子のみを含む、請求項１ に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項１０】
１）遺伝的に改変された細菌株が不活性化された以下の遺伝子：ａ）フマル酸レダクターゼ；ｂ）ＡＴＰシンターゼ；ｃ）２−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ；ｄ）コハク酸デヒドロゲナーゼ；ｅ）グルコース輸送体；ｆ）イソクエン酸リアーゼレプレッサーの１以上を有していなくともよく；かつ／または２）遺伝的に改変された株がリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼおよび／またはクエン酸シンターゼをコードし、かつ／または過剰発現するプラスミドまたは多重コピープラスミドを含まない、請求項１ に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項１１】
代謝的に進化されている、請求項 ８、９または１０ に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項１２】
ａ）少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭまたは７００ｍＭ濃度のコハク酸；
ｂ）少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭまたは７００ｍＭ濃度のフマル酸；
ｃ）少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭ    濃度のマレイン酸
を生産する、請求項１〜６または８〜１０のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項１３】
ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０３２、ＫＪ０４４、ＫＪ０５９、ＫＪ０６０、ＫＪ０７０、ＫＪ０７１、ＫＪ０７２、ＫＪ０７３、ＫＪ０７６、ＫＪ０７９、ＫＪ０９１、ＫＪ０９８、ＫＪ１０４、ＫＪ１１０、ＫＪ１１９、ＫＪ１２２またはＫＪ１３４である、遺伝的に改変された細菌株。
【請求項１４】
遺伝的に改変された細菌株を培養するまたは増殖させる方法であって、請求項１ に記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株を培養培地に接種すること、および該遺伝的に改変された細菌株を培養するまたは増殖させることを含む、方法。
【請求項１５】
コハク酸、フマル酸またはマレイン酸を生産する方法であって、請求項１ に記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株を、コハク酸またはマレイン酸またはフマル酸の生産を可能とする条件下で培養することを含む、方法。
【請求項１６】
前記の１以上の遺伝的に改変された細菌株がＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０３２、ＫＪ０４４、ＫＪ０５９、ＫＪ０６０、ＫＪ０７０、ＫＪ０７１、ＫＪ０７２、ＫＪ０７３、ＫＪ０７６、ＫＪ０７９、ＫＪ０９１、ＫＪ０９８、ＫＪ１０４、ＫＪ１１０、ＫＪ１１９、ＫＪ１２２またはＫＪ１３４である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記の遺伝的に改変された細菌株が無機塩培地で培養される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
無機塩培地が２％〜２０％（ｗ／ｖ）の間の炭水化物を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
無機塩培地が２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％または２０％（ｗ／ｖ）の糖を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
炭水化物がグルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロースまたは組合せである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
コハク酸またはマレイン酸の収率が９０％以上である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
収率が少なくとも９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％または９９％である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記の遺伝的に改変された細菌株が少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭまたは７００ｍＭの濃度のコハク酸を生産する、請求項１５ に記載の方法。
【請求項２４】
前記の遺伝的に改変された細菌株が少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭ濃度のマレイン酸を生産する、請求項１５ に記載の方法。
【請求項２５】
前記の遺伝的に改変された細菌株が少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭまたは７００ｍＭ濃度のフマル酸を生産する、請求項１５ に記載の方法。
【請求項２６】
増殖培地がコハク酸、マレイン酸またはフマル酸のための基質としてグリセロールを含む、請求項１４ または１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地がコハク酸、マレイン酸またはフマル酸の生産のための基質としてグリセロールをさらに含む、請求項１８ に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１ に記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株と培地を含む組成物。