【手続補正書】
【提出日】平成23年7月7日(2011.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
【図１Ａ】ＦＧＦ２１短縮突然変異体７−１８１及び８−１８１（図１Ａ）及びＦＧＦ２１短縮突然変異体１−１７２、１−１７１、１−１６９及び１−１６４（図１Ｂ）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図１Ｂ】ＦＧＦ２１短縮突然変異体７−１８１及び８−１８１（図１Ａ）及びＦＧＦ２１短縮突然変異体１−１７２、１−１７１、１−１６９及び１−１６４（図１Ｂ）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２】ヒトＦＧＦ２１対照及びＦＧＦ２１短縮突然変異体３−１８１、４−１８１、５−１８１、７−１８１、８−１８１、１−１８０、１−１７８、１−１７７、１−１７６、１−１７５、１−１７４、１−１７３、１−１７２、９−１８１及び１−１４９において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。
【図３】ＰＢＳ（黒いバー）、ヒトＦＧＦ２１対照（白色のバー）又はＦＧＦ２１短縮突然変異体８−１８１（灰色のバー）及び９−１８１（点描付きのバー）を注射したマウスで測定した血糖値を示す。
【図４】ＰＢＳ（黒丸）、Ｆｃ−ＦＧＦ２１対照（ＷＴ）（白丸）又はアミノ酸残基５−１８１（黒三角）もしくは７−１８１（白三角）を含む短縮型Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。
【図５】ＰＢＳ（黒丸）、ＦＧＦ２１−Ｆｃ対照（ＷＴ）（白丸）、残基１−１７５を含む短縮型ＦＧＦ２１−Ｆｃ融合タンパク質（黒三角）又はアミノ酸残基１−１７１を含む短縮型Ｆｃ−ＦＧＦ２１タンパク質（白三角）を注射したマウスで測定した血糖値の％変化を示す。
【図６Ａ】ヒトＦｃ（５）ＦＧＦ２１対照試料（図６Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（５）ＦＧＦ２１の試料の、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）の結果を示す。
【図６Ｂ】ヒトＦｃ（５）ＦＧＦ２１対照試料（図６Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（５）ＦＧＦ２１の試料の、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）の結果を示す。
【図６Ｃ】ヒトＦｃ（５）ＦＧＦ２１対照試料（図６Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（５）ＦＧＦ２１の試料の、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）の結果を示す。
【図６Ｄ】ヒトＦｃ（５）ＦＧＦ２１対照試料（図６Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（５）ＦＧＦ２１の試料の、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）の結果を示す。
【図７Ａ】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１（３）Ｆｃ対照試料（図７Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（３）ＦｃのＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図７Ｂ】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１（３）Ｆｃ対照試料（図７Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（３）ＦｃのＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図７Ｃ】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１（３）Ｆｃ対照試料（図７Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（３）ＦｃのＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図７Ｄ】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１（３）Ｆｃ対照試料（図７Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（３）ＦｃのＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図８Ａ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図８Ａ）及び、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（１５）ＦＧＦ２１の試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図８Ｂ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図８Ａ）及び、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（１５）ＦＧＦ２１の試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図８Ｃ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図８Ａ）及び、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（１５）ＦＧＦ２１の試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図８Ｄ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図８Ａ）及び、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（１５）ＦＧＦ２１の試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図９Ａ】ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ対照試料（図９Ａ）及び、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図９Ｂ】ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ対照試料（図９Ａ）及び、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図９Ｃ】ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ対照試料（図９Ａ）及び、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図９Ｄ】ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ対照試料（図９Ａ）及び、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図１０Ａ】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図１０Ａ、配列番号３８）及びＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ（図１０Ｂ、配列番号２５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により同定される切断部位を示す。
【図１０Ｂ】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図１０Ａ、配列番号３８）及びＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ（図１０Ｂ、配列番号２５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により同定される切断部位を示す。
【図１１】ＰＢＳ（黒色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白色のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（灰色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（点描付きのバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（白地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ／Ｓ１７２Ｌ（黒地の水平線模様のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１５１Ａ（白地の斜線模様のバー）を注射したマウスで測定した血糖値を示す。
【図１２】ＰＢＳ（黒丸）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（白三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ／Ｓ１７２Ｌ（白菱型）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１５１Ａ（黒四角）を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。
【図１３】ＰＢＳ（黒色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白色のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１５０Ａ／Ｇ１５１Ａ／Ｉ１５２Ｖ（灰色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（白地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ（灰色地の斜線模様のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ／Ｓ１７２Ｌ（白地の斜線模様のバー）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。
【図１４】ＰＢＳ（黒四角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白四角）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１５０Ａ／Ｇ１５１Ａ／Ｉ１５２Ｖ（黒逆三角形）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（白逆三角形）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ（黒丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ／Ｓ１７２Ｌ（白丸）を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。
【図１５】ＰＢＳ（黒色のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（白色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ａ（灰色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｃ（白地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｄ（灰色及び白色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｎ（黒地の斜線模様のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｓ（白地の斜線模様のバー）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。
【図１６】ＰＢＳ（黒丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（白丸）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ａ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｃ（白三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｄ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｎ（白菱型）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｓ（黒逆三角）を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。
【図１７】ＰＢＳ（黒色のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（白色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（灰色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｈ（黒地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｑ（白地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（点描付きのバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（灰色地の斜線模様のバー）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。
【図１８】ＰＢＳ（黒丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（白丸）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｈ（白三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｑ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（白菱型）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（黒四角）を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。
【図１９Ａ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ）及び、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図１９Ｂ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ）及び、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図１９Ｃ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ）及び、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図１９Ｄ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ）及び、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２０Ａ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ）及び、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２０Ｂ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ）及び、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２０Ｃ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ）及び、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２０Ｄ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ）及び、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２１Ａ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ）及び、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２１Ｂ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ）及び、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２１Ｃ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ）及び、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２１Ｄ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ）及び、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２２Ａ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ）及び、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２２Ｂ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ）及び、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２２Ｃ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ）及び、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２２Ｄ】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ）及び、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌの試料の、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図２３Ａ】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号３８）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号３９）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号４０）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により同定された切断部位を示す。
【図２３Ｂ】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号３８）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号３９）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号４０）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により同定された切断部位を示す。
【図２３Ｃ】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号３８）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号３９）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号４０）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により同定された切断部位を示す。
【図２３Ｄ】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号３８）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号３９）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号４０）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により同定された切断部位を示す。
【図２４Ａ】ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ及びＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ及びＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（図２４Ｂ）；及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ及びＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（図２４Ｃ）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２４Ｂ】ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ及びＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ及びＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（図２４Ｂ）；及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ及びＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（図２４Ｃ）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２４Ｃ】ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ及びＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ及びＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（図２４Ｂ）；及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ及びＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（図２４Ｃ）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２５Ａ】Ｆｃ−ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ及びＦｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ−ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ及びＦｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（図２５Ｄ）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２５Ｂ】Ｆｃ−ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ及びＦｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ−ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ及びＦｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（図２５Ｄ）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２５Ｃ】Ｆｃ−ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ及びＦｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ−ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ及びＦｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（図２５Ｄ）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２５Ｄ】Ｆｃ−ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ及びＦｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ−ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ及びＦｃ−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（図２５Ｄ）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２６Ａ】野生型成熟ＦＧＦ２１及び様々なＦＧＦ２１突然変異体に対する時間の関数としての凝集を表し；図２６Ａは、１、２及び４日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質を温置した後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ、黒菱型）及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（黒丸）に対する％凝集の変化を示し、図２６Ｂは、１、６及び１０日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質を温置した後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ）及びＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｃ、Ｐ７８Ｒ、Ｌ８６Ｔ、Ｌ８６Ｒ、Ｌ９８Ｃ、Ｌ９８Ｒ、Ａ１１１Ｔ、Ａ１２９Ｄ、Ａ１２９Ｑ、Ａ１２９Ｋ、Ａ１３４Ｋ、Ａ１３４Ｙ及びＡ１３４Ｅ（全てプロット上で標識）に対する％凝集の変化を示す。
【図２６Ｂ】野生型成熟ＦＧＦ２１及び様々なＦＧＦ２１突然変異体に対する時間の関数としての凝集を表し；図２６Ａは、１、２及び４日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質を温置した後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ、黒菱型）及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（黒丸）に対する％凝集の変化を示し、図２６Ｂは、１、６及び１０日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質を温置した後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ）及びＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｃ、Ｐ７８Ｒ、Ｌ８６Ｔ、Ｌ８６Ｒ、Ｌ９８Ｃ、Ｌ９８Ｒ、Ａ１１１Ｔ、Ａ１２９Ｄ、Ａ１２９Ｑ、Ａ１２９Ｋ、Ａ１３４Ｋ、Ａ１３４Ｙ及びＡ１３４Ｅ（全てプロット上で標識）に対する％凝集の変化を示す。
【図２７】ヒトＦＧＦ２１対照及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ、ＦＧＦ２１  Ｌ５２Ｔ及びＦＧＦ２１  Ｌ５８Ｅにおいて行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。
【図２８Ａ】１、４及び８日間にわたり４℃で温置した後の、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  ６−１８１／Ｇ１７０Ｅ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（白四角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（ｘ印）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（白三角）及びＦＧＦ２１対照（黒丸）に対する凝集レベルの変化を示すプロットであり、図２８Ｂは、温置の結果も示す棒グラフである。
【図２８Ｂ】１、４及び８日間にわたり４℃で温置した後の、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  ６−１８１／Ｇ１７０Ｅ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（白四角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（ｘ印）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（白三角）及びＦＧＦ２１対照（黒丸）に対する凝集レベルの変化を示すプロットであり、図２８Ｂは、温置の結果も示す棒グラフである。
【図２９】ＰＢＳ（ビヒクル）（黒丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（白丸）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ／Ｐ１７１Ｇ（黒三角）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ（白三角）を注射したマウスで測定した血糖値を示す。
【図３０】ヒトＦＧＦ２１（黒丸、黒線）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白丸、黒線）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ（黒三角、点線）において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示すプロットである。
【図３１Ａ】ＦＧＦ２１（黒丸、黒線）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白丸、黒線）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ（黒三角、点線）に対して、室温（図３１Ａ）及び４℃（図３１Ｂ）で９日後に観察される％高分子量凝集体を示すプロットである。
【図３１Ｂ】ＦＧＦ２１（黒丸、黒線）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白丸、黒線）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ（黒三角、点線）に対して、室温（図３１Ａ）及び４℃（図３１Ｂ）で９日後に観察される％高分子量凝集体を示すプロットである。
【図３２】１６８時間にわたる様々な点でのＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇにおける、観察される変化を示す一連のＭＡＬＤＩ質量分析トレースである。
【図３３】ＰＢＳビヒクル対照（白丸）、野生型成熟ＦＧＦ２１（黒四角）及びＦＧＦ２１突然変異体Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ（黒逆三角）；Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ（白菱型）及びＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ（黒丸）のそれぞれに対する、ｄｂ／ｄｂマウスでの血糖値の％変化を示すプロットである。
【図３４】ＰＢＳビヒクル対照（黒丸）及びＦＧＦ２１突然変異体Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ（黒三角）；Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ、１８３Ｇ（白三角）、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ（黒菱型）及びＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ（白菱型）のそれぞれに対する、ｏｂ／ｏｂマウスでの血糖値の％変化を示すプロットである。
【図３５】ＰＢＳビヒクル対照（白丸）及びＦＧＦ２１突然変異体Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ（黒四角）；Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｓ（白三角）、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ａ（黒逆三角）、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８０Ｓ（白菱型）及びＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｇ（黒丸）のそれぞれに対する、ｄｂ／ｄｂマウスでの血糖値の％変化を示すプロットである。
【図３６】ＰＢＳビヒクル対照（黒丸）及びＦＧＦ２１突然変異体Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ（白四角）；Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ（黒三角）及びＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ（白菱型）のそれぞれに対する、ｄｂ／ｄｂマウスでの血糖値の％変化を示すプロットである。
【図３７】アカゲザルで行われた６週間の用量漸増実験に対する研究計画を図示するダイアグラムであり、この図面において、網掛けの印は、絶食状態での採血を示し、点描のある印は給餌状態での採血を示した。
【図３８Ａ】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットであり、図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、点線は群Ｃに相当し、図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、黒線は群Ｃに相当し、図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当し、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当する。
【図３８Ｂ】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットであり、図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、点線は群Ｃに相当し、図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、黒線は群Ｃに相当し、図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当し、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当する。
【図３８Ｃ】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットであり、図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、点線は群Ｃに相当し、図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、黒線は群Ｃに相当し、図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当し、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当する。
【図３８Ｄ】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットであり、図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、点線は群Ｃに相当し、図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、黒線は群Ｃに相当し、図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当し、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当する。
【図３９】アカゲザルでの体重における、ビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）の影響を示すプロットであり；網掛けのバー１及び２は、低用量での第１及び２週に相当し、白色のバー３及び４は、中程度の用量での第３及び４週に相当し、黒色のバー５及び６は、高用量での第５及び６週に相当し、点描付きのバー７、８及び９は、休薬期間中の第７−９週に相当する。
【図４０】アカゲザルでの空腹時インスリン値における、ビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）のベースラインに対する空腹時インスリンの％変化を示すプロットであり、網掛けのバー１及び２は低用量での第１及び２週に相当し、白色のバー３及び４は、中程度の用量での第３及び４週に相当し、黒色のバー５及び６は高用量での第５及び６週に相当し、点描付きのバー７及び８は薬期間中の第７及び８週に相当する。
【図４１】この試験の第５及び６週の間に得られたアカゲザルの給餌状態でのインスリン値における、高用量でもたらされる、ビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）の影響を示すプロットであり、黒色のバーは第５週に相当し、網掛けのバーは第６週に相当する。
【図４２】Ｆｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）での２週間の高用量治療の終了時に行ったＯＧＴＴ５のグルコースプロファイルを示すプロットであり、黒丸、黒線は、ビヒクルに相当し、白四角、点線は、ＦＧＦ２１に相当し、黒三角、黒線は、Ｆｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）に相当する。
【図４３】Ｆｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）での２週間の高用量治療の終了時に行ったＯＧＴＴ５のインスリンプロファイルを示すプロットであり、黒丸、黒線は、ビヒクルに相当し、白四角、点線は、ＦＧＦ２１に相当し、黒三角、黒線は、Ｆｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）に相当する。
【図４４】アカゲザルの各投与期間（低、中及び高用量）の終了時に測定した、グルコースＯＧＴＴ  ＡＵＣ１−３を示すプロットであり、白色のバーは、ＯＧＴＴ３中のグルコース測定値から計算したＡＵＣ３に相当し、黒色のバーは、ＯＧＴＴ４中のグルコース測定値から計算したＡＵＣ４に相当し、網掛けのバーは、ＯＧＴＴ５中のグルコース測定値から計算したＡＵＣ５に相当する。
【図４５】アカゲザルの各群からの空腹時血漿トリグリセリド値のベースラインからの％変化におけるビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）の影響を示すグラフであり；網掛けのバー１及び２は、低用量での第１及び２週に相当し、白色のバー３及び４は、中程度の用量での第３及び４週に相当し、黒色のバー５及び６は、高用量での第５及び６週に相当し、点描付きのバー７、８及び９は、薬期間中の第７−９週に相当する。
【図４６】ビヒクル、高用量のＦＧＦ２１又はＦｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）での治療の第５及び６週の間に測定した場合の、アカゲザルの各群からの給餌状態での血漿トリグリセリド値を示すグラフであり、網掛けのバーは第５週に相当し、黒色のバーは第６週に相当する。
【図４７】各注射からおよそ２１時間後に得た試料による、投与前及び５、１２、１９及び２６日に測定した、個々のサルのＦＧＦ２１レベルを示すプロットである。
【図４８】各注射からおよそ５日後に得た試料による、投与前及び５、１２、１９及び２６日に測定した、個々のサルのＦｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）レベルを示すプロットである。
【図４９】低、中及び高用量のそれぞれの投与後に行われた３回のＯＧＴＴから測定されたＦＧＦ２１及びＦｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）レベルの平均濃度を示すプロットであり；網掛けのバーは低用量でのＯＧＴＴ３に相当し、黒色のバーは中程度の用量でのＯＧＴＴ４に相当し、白色のバーは高用量でのＯＧＴＴ５に相当する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
【表１７】
2011523561.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
別の実験において、ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇを野生型成熟ＦＧＦ２１及びＦｃ−ＦＧＦ２１と並行して試験した。ある実験において、６時間にわたり、ＦＧＦ２１、Ｆｃ−ＦＧＦ２１又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇの様々な濃度の存在下で、組み換え２９３Ｔ細胞株を培養した。次に、ルシフェラーゼ活性について細胞溶解液をアッセイした。図３０で示されるように、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇは、Ｆｃ−ＦＧＦ２１と同様の活性を有し、このことから、２つの点突然変異の導入によって、分子のインビトロ活性が変化しなかったことが示唆された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
さらに別の実験において、ＦＧＦ２１及びＦｃ−ＦＧＦ２１と並行して、２種類の異なる温度、即ち室温及び４℃で、９日間にわたり、６５ｍｇ／ｍＬのＦｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇの安定性を評価した。温置時間後、次に、様々な温度での時間プロファイルに対する凝集性を調べるために、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで細胞溶解液を分析した。図３１Ａ及び３１Ｂで示されるデータから、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇにおいて、室温（図３１Ａの、黒三角、点線）及び４℃（図３１Ｂの、黒三角、点線）で、凝集形成速度が顕著に低下したことが示された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
Ｃ末端突然変異を含むタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１突然変異体
組み合わせ突然変異体のインビボ安定性も試験した。具体的には、マウス及びカニクイザルにおいて、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇのインビボ安定性をＦｃ（１５）ＦＧＦ２１の安定性と比較した。その結果は、両種において同様であることが分かった。カニクイザルの実験において、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１を２３．５ｍｇ／ｋｇでＩＶ注射し、投与後８４０時間までの時間点で血清及び血漿の一定分量を回収した。１６８時間までの時間点を分析した。抗Ｆｃ試薬を用いて時間点試料をアフィニティー精製し、次いでＭＡＬＤＩ質量分析を用いて分析した。この結果は、この２つの分析間でよく相関した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４５】
免疫親和性ＭＡＬＤＩを用いて生成されたデータを分析して、Ｐ１７１部位での切断は、Ｐ１７１からＰ１７１Ｇの突然変異の結果として、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ分子において解消されると思われた。しかし、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇに対して、３個以下のＣ末端残基の喪失の結果として生じる小さくゆっくりとした分解が観察された（図３２）。アミノ酸残基１７１と１７２との間のより切断が起こりやすい切断部位を図２０及び２１で示されるように妨害した後、その他のＦＧＦ２１突然変異体によっても、この３個のＣ末端残基での小さな切断が観察された。この３個のＣ末端残基切断は、連続した残基ごとのカルボキシペプチダーゼによるか又はアミノ酸残基１７９−１８０及び１８０−１８１で非特異的切断を伴うアミノ酸残基１７８及び１７９での特異的プロテアーゼ攻撃による分子のＣ末端からの切断の停止に相当し得る。Ｃ末端での２−３個のアミノ酸の喪失により、β−ｋｌｏｔｈｏ結合が減少し得、最終的にはその分子の効能及びインビボ活性が低下し得る。例えば、Ｙｉｅら、２００９、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８３：１９−２４参照。Ｃ末端のカルボキシペプチダーゼ分解（と思われるもの）に対処するために、様々なＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドにアミノ酸残基「キャップ」を付加する影響を試験した。表１９で与えられるものを含む様々なコンストラクトを作製し、本明細書中に記載の技術を用いてアッセイした。表１９は、インビトロＥＬＫルシフェラーゼアッセイの結果をまとめる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４９】
図３３は、ＰＢＳ対照、野生型ネイティブＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）及び、プロリン又はグリシン残基の何れかがＣ末端に付加された２種類のキャップ付き分子、即ちＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）を注射した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の％変化を示す。本実施例において、野生型又は突然変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ末端に残基を付加した場合、この残基は、得られたタンパク質におけるその位置で言及する。従って、「１８２Ｇ」は、成熟１８１残基野生型又は突然変異タンパク質のＣ末端にグリシン残基が付加されたことを指す。図３３は、ネイティブＦＧＦ２１が６時間にわたり血糖値を低下させ、一方で、試験した全ての３種類のＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体が、少なくとも１２０時間にわたり、持続性の血糖低下活性を示したことを示す。融合分子のＦＧＦ２１成分のＣ末端にプロリン残基の付加を含む分子であるＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）は、最も効能が大きいと思われ、その結果、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）と比較して、最低血糖値が得られた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５０】
続く実験において、（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）のインビボ活性を試験し、Ｃ末端に２個のグリシン付加を含むキャップ付き分子、即ちＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ  １８３Ｇ）のインビボ活性と比較した。図３４は、その実験の結果を示す。図３４は、ＰＢＳ対照、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ  １８３Ｇ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）を注射したｏｂ／ｏｂマウスで観察された血糖値の％変化を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５１】
図３４で示されるように、試験した分子は全て、ＰＢＳ対照と比較して、持続性のグルコース低下活性を示した。この実験により、Ｃ末端にプロリン付加のあるＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）のグルコース低下効力が、プロリンキャップなしの分子、例えばＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、若干向上したという以前の結果（図３３）が確認された。しかし、Ｃ末端での２個のグリシン残基の付加、例えばＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ  １８３Ｇ）は、分子のインビボ効能を低下させ、インビボでのグルコース低下効果の持続時間を短縮するようであった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５２】
図３５は、ＰＢＳ対照又はＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｓ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ａ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｓ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｇ）を注射した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の％変化を示す。全ての突然変異体が、同様の作用持続時間で同様のグルコース低下活性を示した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５３】
図３６は、ビヒクル対照、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を注射した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の％変化を示す。Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）は、血糖低下において効力が低かった。しかし、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（位置１８０のアミノ酸のアラニンがグルタミン酸に変異）は、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）よりも効力が高く、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、血糖値をさらに２０％低下させた。これらのデータから、Ａ１８０Ｅ突然変異により、インビボでのＣ末端分解が減少し得、それにより、その分子のインビボ効能及び効力が向上することが示唆される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５４】
アカゲザルの試験
本明細書中に記載の方法を用いて、Ｆｃ−リンカー−ＦＧＦ２１コンストラクトを作製した。このコンストラクトは、（Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒリンカー配列（配列番号２３）にＣ末端で融合されたＩｇＧ１  Ｆｃ配列（配列番号１３）を含み、次にこれを成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端にＣ末端で融合させ、これに２つの突然変異Ｌ９８Ｒ及びＰ１７１Ｇを導入した。次に、本明細書中に記載のとおり、このコンストラクトを発現させ、精製し、タンパク質の二量体形態として単離した（この各単量体は、各単量体のＦｃ領域間の分子間ジスルフィド結合を介して連結された。）。この分子は、本実施例で「Ｆｃ−ＦＧＦ２１（ＲＧ）」と呼び、配列番号３７によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を有する。この実施例において、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１の成熟型、即ち配列番号４を指す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３０】
2011523561.tif 000002
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３２】
2011523561.tif 000003