【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年9月5日(2011.9.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託されたＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．Ｐ１−２９株から得られるポリペプチド；
配列番号２、または、受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託されたＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．Ｐ１−２９株から得られるヌクレオチド配列、または、これらに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の発現によって得られる、ポリペプチド；および
受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託されたＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．Ｐ１−２９株から得られるポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２、または、これに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託されたＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．Ｐ１−２９株から得られるヌクレオチド配列の発現によって得られる、ポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドであって、該ポリペプチドはフィターゼ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも１００Ｕ／ｍｇという比活性を有するという点で特徴付けられ、該比活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５中に、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で３７℃の温度で該ポリペプチドをインキュベートすることによって決定される、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも２００Ｕ／ｍｇという比活性を有するという点で特徴付けられ、該比活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５中に、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で３７℃の温度で該ポリペプチドをインキュベートすることによって決定される、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも３００Ｕ／ｍｇという比活性を有するという点で特徴付けられ、該比活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５中に、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で３７℃の温度で該ポリペプチドをインキュベートすることによって決定される、ポリペプチド。
【請求項５】
単離および／または精製されている、請求項１〜４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ｐＨ３〜６において最大活性を有するという点で特徴付けられ、該活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中に、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で該ポリペプチドを３７℃の温度でインキュベートすることによって決定される、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜５に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ｐＨ４〜５において最大活性を有するという点で特徴付けられ、該活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中に、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で該ポリペプチドを３７℃の温度でインキュベートすることによって決定される、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜５に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ｐＨ４．５において最大活性を有するという点で特徴付けられ、該活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中に、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で該ポリペプチドを３７℃の温度でインキュベートすることによって決定される、ポリペプチド。
【請求項９】
５９位、７０位、１２２位、１２５位、１６７位、１９３位、１９７位、２０４位、２０９位、２１１位、２２１位、２２３位、２２５位、２４０位、２４２位、２４４位、２６８位、２８１位、２８９位、２９４位、３０３位、３３６位または３５１位（配列番号３におけるナンバリングに従って番号付けしている）のうちの少なくとも１つにおいて変異を含む、請求項１〜８のうちのいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、
【化１−１】
2008516597.tif 000001
【化１−２】
2008516597.tif 000002
という変異のうちの１つ以上を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｋ５９Ｅ；Ｔ１６７Ｖ；Ｋ２４０Ｔ；Ｔ１６７Ｉ；Ｋ２４０Ｅ；Ｄ２４４Ｃ；Ｑ２８９Ｙ；Ｔ２０９ＫまたはＦ１９７Ｓからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項９または請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
【化２】
2008516597.tif 000003
からなる群より選択される変異の組み合わせを含む、請求項９〜１１のうちのいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記単離されたポリペプチドが、フィターゼ酵素改変体であり、該フィターゼ酵素改変体は、該フィターゼ酵素改変体が由来する親フィターゼ酵素と比較して、より高い熱安定性および／またはより高い比活性および／またはより高いタンパク質分解安定性を有する、請求項１１および１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
単離された核酸分子であって、
ｉ）請求項１〜１３のうちのいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子、
ｉｉ）配列番号２に示される配列を含む単離された核酸分子、
から選択される、単離された核酸分子。
【請求項１５】
単離された核酸分子であって、
ｉ）配列番号３のポリペプチドをコードする核酸に対して、５０℃かつ０．２×ＳＳＣでのストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸、
ｉｉ）配列番号２からなる核酸に対して、５０℃かつ０．２×ＳＳＣでのストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸、
から選択される、単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、請求項１４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１４または１５または１６に記載の単離された核酸分子であって、
配列番号２と同じヌクレオチド配列、
配列番号２と相補的なヌクレオチド配列、または
配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列、
を含む、単離された核酸分子。
【請求項１８】
請求項９〜１３のポリペプチドをコードする、請求項１４〜１７のうちのいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項１４または１６〜１８のうちのいずれか１項に記載の核酸分子を含む、プラスミドまたはベクター系。
【請求項２０】
請求項１〜１３に記載のポリペプチドのうちのいずれかを発現するための発現ベクターであり、かつ／または、
微生物中において、請求項１４〜１８のうちのいずれか１項に記載の核酸分子を含む、
請求項１９に記載のプラスミドまたはベクター系。
【請求項２１】
請求項１９または２０のうちのいずれかに記載のプラスミドまたはベクター系を用いて形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１３のうちのいずれかに記載のポリペプチドを含む、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、微生物に由来し、該微生物は、
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌と、
Ｈ．ｐｏｌｙｍｐｒｐｈａ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母、ならびにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．およびＡ．ｏｒｙｚａｅなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．などの糸状菌を包含する真菌と
を包含する、宿主細胞。
【請求項２４】
前記微生物が原核生物細菌である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記微生物がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８として寄託された、細菌細胞株Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．Ｐ１−２９。
【請求項２７】
ポリペプチドを産生する方法であって、
宿主細胞中において、請求項１〜１３のうちのいずれかに記載のポリペプチドを発現させ、かつ／または請求項１４または１６〜１８のうちのいずれかに記載の核酸分子を発現させる工程と、
該宿主細胞培養培地から該ポリペプチドを分離する工程と
を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項１〜１３のうちのいずれかに記載されるポリペプチドを、食物または動物飼料に対して液体形態で噴霧する工程
を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
【請求項２９】
請求項１〜１３のうちのいずれかに記載のポリペプチドを乾燥生成物として、食物または動物飼料と混合する工程
を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
【請求項３０】
食物または動物飼料の製造における請求項１〜１３のうちのいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項３１】
ｉ）請求項１〜１３のうちのいずれかに記載のポリペプチド、および／または
ｉｉ）請求項２８もしくは２９に記載の方法によって生成された動物飼料、
のいずれかを含む、食物または動物飼料組成物。
【請求項３２】
フィターゼ酵素改変体を調製するための方法であって、該方法は、以下の連続的工程：
ａ）少なくとも１つの親フィターゼ酵素を選択する工程であって、該少なくとも１つの親フィターゼ酵素は、請求項１〜１３のうちのいずれか１項に記載のポリペプチドから選択される、工程、
ｂ）該親フィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換またはそれらの組み合わせである該親フィターゼ酵素の少なくとも１つの変更を導入することによって、少なくとも１つのフィターゼ改変体を作製して、少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体を得る工程、
ｃ）該少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体をスクリーニングして、該親フィターゼ酵素と比較して、
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．より高い比活性および／または
ｉｉｉ．より高いタンパク質分解安定性
から選択される改良された特性（単数または複数）を有する改良されたフィターゼ酵素改変体を同定する工程、および
ｄ）該改良されたフィターゼ酵素改変体を調製する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
工程ｄ）が、単離されかつ／または精製されたフィターゼ酵素改変体を生成する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程ｂ）の間にフィターゼ酵素改変体の集団が生成され、かつ工程ｃ）において、該フィターゼ酵素改変体の集団の少なくとも一部がスクリーニングされる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程ａ）が、親フィターゼ酵素をコードする請求項１４または１６〜１８のうちのいずれかに記載の核酸分子を変異誘発に供する工程を包含し、かつ
工程ｂ）が、工程（ａ）で得られた変異された核酸分子を宿主細胞において発現させる工程を包含し、かつ
工程ｃ）が、宿主細胞またはその抽出物を、前記改良された特性（単数または複数）を有する改良されたフィターゼ酵素改変体についてスクリーニングする工程を包含する、
請求項３２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
工程ｃ）の後に、反復工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１回の引き続くラウンドをさらに含み、好ましくは該引き続くラウンド（単数または複数）において、工程ａ）の少なくとも１つの親フィターゼ酵素が、請求項３２〜３５のうちのいずれかに記載の方法に従って調製された、前記少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体および／または改良されたフィターゼ改変体から選択される、請求項３２〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
工程ｄ）の後に、反復工程ａ）〜ｄ）の少なくとも１回の引き続くラウンドをさらに含み、好ましくは該引き続くラウンド（単数または複数）において、工程ａ）の少なくとも１つの親フィターゼ酵素が、請求項３２〜３５のうちのいずれかに記載の方法に従って調製された、前記少なくとも１つのフィターゼ酵素改変体および／または改良されたフィターゼ改変体から選択される、請求項３２〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
工程ｃ）が、ｉ）前記親フィターゼ酵素、および／またはｉｉ）配列番号３を含むポリペプチドのいずれかと比較して、少なくとも２．５という熱安定性の差を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する、請求項３２〜３７に記載の方法。
【請求項３９】
工程ｃ）が、前記親フィターゼ酵素または配列番号３のフィターゼと比較した場合に、少なくとも３０という改良されたペプシン安定性を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する、請求項３２〜３８に記載の方法。
【請求項４０】
工程ｃ）が、前記親フィターゼ酵素または配列番号３のフィターゼと比較した場合に、少なくとも１１０という改良された比活性比を有する、改良されたフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞についてスクリーニングする工程を包含する、請求項３２〜３９に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
（技術的な背景および先行技術）
フィチン酸は、穀類およびマメ類におけるリンの主要な貯蔵形態である。しかし、ブタ、家禽および魚類のような単胃動物は、フィチン酸（またはフィチン酸）を代謝も吸収もできず、従ってこれは排出されて、集中的な家畜生産の地方ではリン汚染がもたらされる。さらに、フィチン酸はまた、カルシウム、銅および亜鉛のような金属因子をキレートすることによって、単胃動物における抗栄養剤として機能する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
酵素が広範な基質特異性を有しており、フィチン酸を加水分解するだけでなく、イノシトール五リン酸、四リン酸および三リン酸のようなフィチン酸分解の中間産物も分解することを可能にすることがまた重要である。ブタでのフィチン酸分解の研究によって、これらのイノシトール五リン酸は、そうでなければ小腸および大腸においてかなり不溶性のままであり、従って、動物および腸のミクロフローラによって生成されるアルカリホスファターゼに対して近づきがたいことが示される（Ｓｃｈｌｅｍｍｅｒ  Ｕら、Ａｒｃｈ．Ａｎｉｍ．Ｎｕｔｒ．５５，２５５〜２８０（２００１））。異なる酵素の基質特異性プロフィールにおける変動は同定されている。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のフィターゼによって生成されたイノシトール−三リン酸は、この酵素によるさらなる加水分解に対して本質的に耐性である（Ｋｅｒｏｖｕｏ  Ｊら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５２，６２３〜６２８（２０００））。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
詳細には、フィターゼの特徴における改善は、飼料補充物としての使用に特に適切である改善された改変体を作製する、食物および飼料の処理条件下での酵素安定性に、胃の通過の間の酵素安定性に、そしてヒトまたは動物の胃および／または腸管における酵素活性および安定性に関する。従って、このような改善は、パラメーターのなかでもとりわけ、上昇した温度、好ましくは６５℃を上回る温度での安定性の増大、タンパク質分解性の消化、好ましくはペプシンのような消化管のプロテアーゼに対する安定性の増大、低いｐＨでの触媒活性、好ましくはｐＨ５．５未満での触媒活性の増大、およびフィチン酸からのリン酸塩遊離、そして好ましくはさらにイノシトールリン酸塩の遊離の一般的な効率を含む。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４８】
適切には、本発明のフィターゼまたは機能的な等価物は、このフィターゼが少なくとも１００Ｕ／ｍｇまたは２００Ｕ／ｍｇ、好ましくは少なくとも３００Ｕ／ｍｇの比活性を有し、この比活性が、実施例１に詳細であるように、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５に含有される、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられる。本発明のフィターゼまたはその機能的な等価物はまた適切には、このフィターゼが約ｐＨ４〜４．５で最大活性を有し、この活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に含有される、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられ得  る。本発明のフィターゼはまた適切には、このフィターゼがｐＨ２．５〜５．５で観察される最大活性の４０％以上を有し、ｐＨ２．５での活性は塩酸グリシン緩衝液を用いて決定するという点で特徴付けられ得る。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
適切には、一実施形態では、本発明のフィターゼまたは機能的な等価物は、このフィターゼが３３０Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、この比活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５に含有される、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられる。別の実施形態では、本発明のフィターゼまたはその機能的な等価物はまた適切には、このフィターゼが約ｐＨ３およびｐＨ４〜４．５で２つの最大活性を有し、この活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に含有される、２ｍＭのフィチン酸、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられ得る。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
本発明によるフィターゼ特徴の改善は、食物および飼料の処理における使用に、そして食物および飼料製品への添加物としての使用に関する。詳細には、改善は、食物および飼料の処理条件下での安定性に、胃の通過の間の安定性に、そしてヒトまたは動物の胃および／または腸管における活性および安定性に関する。このような改善は、パラメーターのなかでもとりわけ、上昇した温度、好ましくは６５℃を上回る温度での安定性の増大、タンパク質分解性の消化、好ましくは消化管のプロテアーゼに対する安定性の増大、低いｐＨでの触媒活性、好ましくはｐＨ５．５未満での触媒活性の増大、およびフィチン酸からのリン酸塩遊離の一般的な効率を含む。