【手続補正書】
【提出日】平成23年2月28日(2011.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の核酸集団から少なくとも１つの変異ヌクレオチドを有する標的核酸を濃縮するための方法であって、
（ａ）前記試料を前記標的核酸配列の第１の鎖についての濃縮プライマーおよび増幅プライマーで処理して、二本鎖の混合物を作製する工程であって、
前記二本鎖の混合物は、ハイブリダイズ条件下で前記標的核酸鋳型にアニールされた前記濃縮プライマーを含み、
前記濃縮プライマーのヌクレオチド配列は、変異被疑ヌクレオチドが位置する診断領域に実質的に相補的であるが、
３’末端のヌクレオチド、または３’末端の１、２もしくは３ヌクレオチド以内のヌクレオチドは変異被疑ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドのいずれかに相補的であり、
前記増幅プライマーは、前記標的核酸にアニールすることができ、それによって、前記増幅プライマーの３’末端は、前記濃縮プライマーの５’末端に隣接するか、または前記濃縮プライマーの５’末端の上流にある、工程と、
（ｂ）適切なヌクレオシド三リン酸および任意に熱安定性である核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下で工程（ａ）の前記混合物を維持して、前記アニールされたプライマーを伸長し、伸長可能な場合、プライマー伸長産物を合成する工程であって、
前記濃縮プライマーが前記正常ヌクレオチドを有する前記標的核酸の診断領域にアニールすると、前記濃縮プライマーの伸長が起こり、前記濃縮プライマーの伸長は前記正常ヌクレオチドを有する標的核酸にアニールされた前記増幅プライマーから開始される伸長を阻止するので、それによって前記変異ヌクレオチドを有する前記標的核酸の優先的増幅を可能にする工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記濃縮プライマーの３’末端ヌクレオチドは対応する前記正常ヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）において、第１の濃縮プライマーおよび第１の増幅プライマーが存在し、前記二本鎖が、前記濃縮プライマーおよび前記増幅プライマーにアニールされた前記標的核酸を含み、それによって、前記増幅プライマーの３’末端が前記濃縮プライマーの５’末端の上流にあり；そして、工程（ｂ）において、アニールされた濃縮プライマーが、前記変異被疑ヌクレオチドを含む前記診断領域にアニールする場合、前記アニールされた濃縮プライマーは伸長できず、
それによって、前記濃縮プライマーが、前記伸長条件下で前記標的配列から解離され、それによって、前記増幅プライマーの伸長が、前記変異被疑ヌクレオチドを含む前記診断領域を通過することを可能にし、前記アニールされた濃縮プライマーが、対応する前記正常ヌクレオチドを含む前記診断領域にアニールする場合、前記アニールされた濃縮プライマーが伸長されて、前記濃縮プライマー伸長産物を合成し、それによって、前記増幅プライマーの伸長が、前記濃縮プライマーの伸長産物によって阻止される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記濃縮プライマーは、前記濃縮プライマーの前記伸長産物を指数関数的増幅に適さないようにする部分を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記部分は、核酸ポリメラーゼについての鋳型として適切でない阻止部分であり、前記濃縮プライマーの全てまたは一部の複製が阻止され、前記阻止部分は、
（ｉ）炭化水素の腕、非ヌクレオチド結合、ペプチド核酸、ヌクレオチド誘導体、脱塩基リボースまたは染料であるか、
（ｉｉ）前記濃縮プライマーの３’末端から３ヌクレオチド未満、離間して位置するか、
（ｉｉｉ）前記濃縮プライマーの３’末端から６ヌクレオチド未満、離間して位置するか、または
（ｉｖ）前記濃縮プライマーの３’末端から１８ヌクレオチド未満、離間して位置する、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記濃縮プライマーは、前記濃縮プライマーの全てまたは一部をヌクレアーゼ切断に対して耐性となるようにする修飾されたヌクレオチドまたは結合を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記３’末端および／または５’末端における最後の５ヌクレオチドまたは結合は、前記濃縮プライマーがヌクレアーゼ切断に対して耐性となるように修飾され、かつ／または前記３’末端および／または５’末端における最後のヌクレオチドまたは結合は、前記濃縮プライマーがヌクレアーゼ切断に対して耐性となるように修飾される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）および工程（ｂ）は増幅反応において繰り返される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅反応はＰＣＲである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）において、前記反応混合物は、前記標的配列の第１の鎖に相補的である前記標的配列の第２の鎖についてのさらなる濃縮プライマーおよび／または増幅プライマーを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記濃縮された標的核酸を検出する工程を含み、前記検出は、ブリッジプローブにより媒介され、前記ブリッジプローブは、ブリッジ部分によって連結された少なくとも２つの結合部分を含み、第１の結合部分は、核酸鋳型の第１の領域にハイブリダイズでき、
第２の結合部分は、前記核酸鋳型の前記第１の領域に隣接または実質的に隣接する前記核酸鋳型の第２の領域にハイブリダイズでき、
前記標的核酸鋳型の前記第１の領域は、前記変異被疑ヌクレオチドを含み、
前記ブリッジ部分は、前記核酸鋳型にハイブリダイズできない少なくとも１つのヌクレオチド化学部分または少なくとも１つの非ヌクレオチド化学部分を有する配列を含み、
前記ブリッジ部分の長さおよび／または組成は、個々の結合部分の融点（Ｔｍ）および／または前記ブリッジプローブのＴｍを決定するのに適応される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）前記核酸鋳型の前記第１の領域は、プライマーの伸長産物の伸長された部分上の領域であり、前記第２の領域は、前記プライマーまたはプローブの一部であるか、または
（ｉｉ）前記核酸鋳型の前記第１の領域および前記第２の領域は、増幅プライマーまたはプローブの両方の部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブリッジプローブの結合部分は、異なる融点にてマッチしたヌクレオチドまたはミスマッチしたヌクレオチドを有する前記標的核酸にハイブリダイズし、前記異なる融点が測定され、変異被疑ヌクレオチドの有無の指標となる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）前記ブリッジ部分の一端は、前記第１の結合部分の５’末端に結合され、前記ブリッジ部分の他端は、前記第２の結合部分の３’末端に結合されるか、または、
（ｉｉ）前記ブリッジ部分の一端は、前記第１の結合部分の５’末端に結合され、前記ブリッジ部分の他端は、前記第２の結合部分の５’末端に結合されるか、
または、前記ブリッジ部分の一端は、前記第１の結合部分の３’末端に結合され、前記ブリッジ部分の他端は、前記第２の結合部分の３’末端に結合される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）前記ブリッジプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、前記ブリッジプローブの末端は互いの方向を向くか、または
（ｉｉ）前記ブリッジプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、前記ブリッジプローブの末端は反対の方向を向くか、または、
（ｉｉｉ）前記ブリッジプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、前記ブリッジプローブの末端は同じ方向を向く、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブおよび／または前記プライマーは、検出ラベルを含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の結合部分は第１のラベルに結合され、前記第２の結合部分は第２のラベルに結合され、
（ｉ）前記第１のラベルおよび前記第２のラベルは、接触クエンチング対となり、前記ラベルの１つはクエンチャーであり、
前記プローブと前記標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、前記第１のラベルおよび前記第２のラベルは、接触クエンチング関係となるか、または
（ｉｉ）前記第１のラベルおよび前記第２のラベルは、蛍光エネルギー移動対となり、
前記プローブと前記標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、前記第１のラベルおよび前記第２のラベルは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）関係となる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の結合部分および前記ブリッジプローブの前記第２の結合部分とハイブリダイズできる前記プライマーの一部は、各々、フルオロフォアおよびクエンチャー結合対の１つのメンバーに結合され、
それにより、前記ブリッジプローブと前記プライマー伸長鎖とのハイブリダイゼーションの際に、前記フルオロフォアおよびクエンチャーは、接触クエンチング関係となる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記クエンチャーは、
（ｉ）非蛍光性実体、または
（ｉｉ）ナノ粒子、または
（ｉｉｉ）Ｇ残基または複数のＧ残基
である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記濃縮された標的核酸を検出する工程を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。