【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年11月16日(2010.11.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  ルシフェラーゼ発現カセットおよび使用法
【特許請求の範囲】
【請求項１】  発現カセットであって、
以下の相対順序：
５’−ｌｕｘＡ−ｌｕｘＢ−ｌｕｘＣ−ｌｕｘＤ−ｌｕｘＥ−３’
で配置された、ルシフェラーゼｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、
（ａ）該ポリヌクレオチドの転写は、全ての該遺伝子産物をコードするポリシストロン性ＲＮＡを生じ；
（ｂ）該ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥの遺伝子産物の各々が、個々のポリペプチドとして発現され；そして
（ｃ）グラム陽性リボソーム結合部位配列を含むポリヌクレオチド配列が、全ての該ｌｕｘコード配列に対して５’側に配置される、発現カセット。
【請求項２】  前記ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥコード配列に対して５’側に配置される複数挿入部位をさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】  少なくとも１つのグラム陽性リボゾーム結合部位が、配列番号１として示される配列を含む、請求項１または請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】  前記ｌｕｘ遺伝子産物のコード配列が、Ｐｈｏｔｏｒｈａｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓに由来する、請求項１〜３のいずれかに記載の発現カセット。
【請求項５】  前記ポリヌクレオチドがさらに、全ての前記ｌｕｘコード配列に対して５’側に位置するプロモーターを含み、該ポリヌクレオチドの転写が、全ての前記ｌｕｘ遺伝子産物をコードするポリシストロン性ＲＮＡを生じる、請求項１〜４のいずれかに記載の発現カセット。
【請求項６】  請求項５に記載の発現カセットであって、ここで、前記プロモーターが、Ｓａ１（配列番号１５）、Ｓａ２（配列番号１６）、Ｓａ３（配列番号１７）、Ｓａ４（配列番号１８）、Ｓａ５（配列番号１９）、およびＳａ６（配列番号２０）からなる群から選択される、発現増強配列に含まれる、発現カセット。
【請求項７】  請求項５に記載の発現カセットであって、ここで、前記プロモーターが、Ｓｐ１（配列番号２１）、Ｓｐ５（配列番号２２）、Ｓｐ６（配列番号２３）、Ｓｐ９（配列番号２４）、Ｓｐ１６（配列番号２５）、およびＳｐ１７（配列番号２６）からなる群から選択される、発現増強配列に含まれる、発現カセット。
【請求項８】  前記プロモーターが、発現増強配列Ｓｐ１６（配列番号２５）に含まれる、請求項６に記載の発現カセット。
【請求項９】  前記発現カセットが、細菌トランスポゾン内に含まれる、請求項１〜８のいずれかに記載の発現カセット。
【請求項１０】  前記発現カセットが、細菌ミニトランスポゾン内に含まれる、請求項１〜８のいずれかに記載の発現カセット。
【請求項１１】  前記遺伝子産物のコード配列が、前記発現カセットが導入される宿主系における該遺伝子産物の発現に最適であるコドンを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の発現カセット。
【請求項１２】  シャトルベクターであって、以下：
請求項１〜１１のいずれかに記載の発現カセット；
選択可能なマーカーをコードするポリヌクレオチド；
グラム陽性の複製起点；および
グラム陰性の複製起点、
を含む、シャトルベクター。
【請求項１３】  光を生成するようにグラム陽性細菌を改変する方法であって、該方法は、請求項１〜１１のいずれかに記載の発現カセットを用いて該グラム陽性細菌を形質転換する工程を包含する、方法。
【請求項１４】  レポーターマーカーの発現に影響する分析物の能力について、該分析物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
請求項１〜１１のいずれかに記載のルシフェラーゼ発現カセットを含むグラム陽性細菌に該分析物を提供する工程であって、ここで、該レポーターマーカーがルシフェラーゼを含む、工程；および
該グラム陽性細菌の光を生成する能力に対する該分析物の効果をモニタリングして、それにより、該分析物が、グラム陽性菌における該レポーターの発現に影響するか否かを確認する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】  前記分析物の効果をモニタリングする工程の前に、ルシフェラーゼの光生成に必要とされる基質を提供する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】  前記基質が、アルデヒドを含み、そして該アルデヒドが、蒸気として提供される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】  請求項１〜１１のいずれかに記載の発現カセットを含む、グラム陽性細菌。
【請求項１８】  請求項１２に記載のシャトルベクターを含む、細菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ルシフェラーゼ発現ベクター、それを作製する方法およびその使用の方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
生物発光細菌は、海洋および陸上環境の両方で広く見出される。興味深いことに、天然に存在する海洋および陸上生物発光細菌のすべての同定された種はグラム陰性である。現在まで、以下の４つのグラム陰性の属で少なくとも１１種が記載されている：Ｖｉｂｒｉｏ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ（Ａｌｔｅｒｍｏｎａｓ）、およびＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）。これら種のすべてにおいて、生物発光に対応する５つの遺伝子がｌｕｘオペロンでクラスターとなっている（ｌｕｘＣＤＡＢＥ）。
【０００３】
生物発光（約４９０ｎｍの波長を有する青緑光を発する）は、還元フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ2）および長鎖脂肪アルデヒドのルシフェラーゼが触媒する酸化の結果であると考えられている。このルシフェラーゼ酵素は、２つのサブユニット（ｌｕｘＡＢ）によりコードされ、その一方、発光反応のためのアルデヒド基質の生合成を行う脂肪酸レダクターゼポリペプチドは、３つの遺伝子ｌｕｘＣＤＥによりコードされている。ルシフェラーゼおよび脂肪酸レダクターゼポリペプチドをコードするこれらの遺伝子は、Ｖｉｂｒｉｏ、ＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓのｌｕｘオペロンからクローン化され、そして配列決定されている。各事例において、ｌｕｘＣＤＥ遺伝子は、ｌｕｘＡＢ遺伝子に隣接し、転写はｌｕｘＣＤＡＢＥの順序である。これら３つの細菌の各々で多くのさらなるｌｕｘ遺伝子が同定されているが、ｌｕｘＡ〜Ｅのみが、光の生合成に必須である（Ｍｅｉｇｈｅｎ、Ｅ．による総説（１９９３）、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：１０１６〜１０２２、およびＵｌｉｔｚｕｒ，Ｓ．（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ  １２：１７９〜１９２）。
【０００４】
米国特許第５，６５０，１３５号に記載の方法は、動物を解剖またはそうでなければ切開することなく生存動物中の生物発光細菌の検出を可能にする（「インビボモニタリング」）−光は、高感度カメラを用いて、筋肉、皮膚、毛皮およびその他の従来の「不透明」組織を通じて検出される。このおよびその他の意味において、それ故、選択された細菌に生物発光性質を付与することが所望され、その結果、この細菌は、種々の感染モデルにおいてインビボモニタリングで追跡され得る。特に、グラム陽性細菌にこのような生物発光性質を付与することが所望され得る。なぜなら、哺乳動物に病原性である多くの細菌は実際グラム陽性であるからである。例えば、グラム陽性球菌であるＳｔａｐｈｏｌｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる感染症は偏在し、そして例えば、膿瘍、乳腺炎、肺炎、菌血症、骨髄炎、全腸炎およびトキシックショック症候群（ＴＳＳ）を含む。別のグラム陽性球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓは、咽頭感染（「ｓｔｒｅｐ」喉）症の主要原因である。ＡｎｔｈｒａｘおよびＬｉｓｔｅｒｉａ（髄膜炎を引き起こす）のようなグラム陽性桿菌は、ヒトおよびその他の哺乳動物で重篤、および致命的感染症を引き起こし得る。
【０００５】
非生物発光グラム陰性細菌は、代表的には、その中に生物発光種からのｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンをクローニング（適切なプロモーターの制御下）することにより生物発光性質を有するように操作され得る（例えば、Ｃｏｎｔａｇら、米国特許第５，６５０，１３５号を参照のこと）が、生物発光グラム陽性細菌を作成する先の試みは限られた成功に遭遇した。例えば、１つのアプローチは、機能的ＬｕｘＡＢ融合タンパク質をコードする発現カセットを採用した（Ｊａｃｏｂｓ，Ｍら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：２５１〜２５６）。このカセットでは、グラム陽性リボソーム結合部位（ＲＢＳ）がｌｕｘＡの上流に挿入され、ｌｕｘＢ遺伝子がｌｕｘＡの下流のフレーム中にクローン化された。このアプローチは、特定の環境および食品安全研究に有用である生物発光グラム陽性細菌の多くの新規な属を生成するのに成功したが（例えば、このような細菌による汚染に対する食品産物の評価）、これらの細菌は、病原性を研究するためには有用ではない。この制限の主要な理由は、先行技術に記載のＬｕｘＡＢ融合タンパク質が哺乳動物の体温では安定ではなく、そしてそれ故、３７℃で細菌において最小の光生成のみを触媒し得ることである。
【０００６】
事実、現在まで公開された生物発光グラム陽性細菌のいずれもが、上記のようなインビボのモニタリング適用のためにそれらを有用にするに十分な光をインビボで生成しない。それ故、グラム陽性細菌が、哺乳動物宿主細胞で見出される温度で、しかも生存動物においてモニタリングするに適切な明るさのレベルで生物発光を作成し得る方法を有することが所望される。本発明は、特に、感染および／または病原性に関する研究に適切な生物発光グラム陽性細菌を生成するために有用である、このような方法、発現カセット、およびその他のツールを提供する。
【０００７】
（発明の要旨）
１つの局面で、本発明は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含み、ここで、（ａ）これら遺伝子産物のコード配列の配置は以下の相対的順序５’−ｌｕｘＡ−ｌｕｘＢ−ｌｕｘＣ−ｌｕｘＤ−ｌｕｘＥ−３’であり；（ｂ）このポリヌクレオチドの転写はすべての遺伝子産物をコードするポリシストロン性ＲＮＡを生じ；そして（ｃ）ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥ遺伝子産物の各々は、個々のポリペプチドとして発現される。１つの実施形態では、この発現カセットは、ｌｕｘＡコード配列の５’末端に隣接して位置する複数挿入部位を含む。別の実施形態では、この発現カセットは、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥ遺伝子産物の各々をコードするこのポリヌクレオチド配列の各々の上流に少なくとも１つのグラム陽性リボソーム結合部位配列（配列番号１）をさらに含む。これら遺伝子産物のコード配列は、好ましくは、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのルシフェラーゼのような、３７℃で安定であるルシフェラーゼをコードする。従って、好ましくは、ルシフェラーゼのヌクレオチドコード配列は、このような生物由来である。実施形態の１つのシリーズでは、このポリヌクレオチドの転写は、Ｓａ２またはＳａ４のようなＳａ１〜Ｓａ６からなる群から選択される発現増強配列（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中に含まれるプロモーターにより媒介される。実施形態の関連するシリーズでは、このポリヌクレオチドの転写は、Ｓｐ１、Ｓｐ５、Ｓｐ６、Ｓｐ９、Ｓｐ１６およびＳｐ１７からなる群から選択される発現増強配列（例えばＳｐ１６）中に含まれるプロモーターにより媒介される。
【０００８】
別の局面では、本発明は、ｌｕｘＡ、およびｌｕｘＢ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含み、ここで（ａ）このポリヌクレオチドの転写は、両方の遺伝子産物をコードするポリシストロン性ＲＮＡを生じ、そして（ｂ）グラム陽性リボソーム結合部位配列を含むポリヌクレオチド配列が、ｌｕｘＡコード配列の５’末端に隣接し、そしてｌｕｘＢコード配列の５’末端に隣接して位置している。１つの実施形態では、この発現カセットは、ｌｕｘＡまたはｌｕｘＢコード配列の少なくともいずれか１つの５’側に挿入部位をさらに含む。この挿入部位は、例えば、複数挿入部位をさらに含む。１つの実施形態では、この複数挿入部位は、ｌｕｘＡコード配列の５’側に位置する。関連する実施形態では、この複数挿入部位は、ｌｕｘＢコード配列の５’側に位置する。別の実施形態では、このポリヌクレオチドは、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥ遺伝子産物をさらにコードする。これらｌｕｘ遺伝子産物のコード配列の配置は、例えば、以下の相対的順序５’−ｌｕｘＡ−ｌｕｘＢ−ｌｕｘＣ−ｌｕｘＤ−ｌｕｘＥ−３’であり得る。好ましくは、グラム陽性細菌Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列がすべてのｌｕｘコード配列の５’側にある。実施形態の１つの群では、このポリヌクレオチドの転写は、Ｓａ２またはＳａ４のようなＳａ１〜Ｓａ６からなる群から選択される発現増強配列中に含まれるプロモーターにより媒介される。実施形態の別の群では、このポリヌクレオチドの転写は、Ｓｐ１、Ｓｐ５、Ｓｐ６、Ｓｐ９、Ｓｐ１６およびＳｐ１７からなる群から選択される発現増強配列（例えばＳｐ１６）中に含まれるプロモーターにより媒介される。上記のように、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのコード配列は、好ましくは、Ｐｈｏｔｏｒｈａｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのような、３７℃で安定であるルシフェラーゼをもつ生物から得られる。
【０００９】
なお別の局面において、本発明は、ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢおよびｌｕｃの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。ここで、（ａ）このポリヌクレオチドの転写は、３つ全ての遺伝子産物をコードするポリシストロン性ＲＮＡを生じ、そして（ｂ）グラム陽性細菌Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含むポリヌクレオチド配列は、ｌｕｘＡコード配列の５’末端、ｌｕｘＢコード配列の５’末端、およびｌｕｃコード配列の５’末端に隣接して位置する。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドはさらに、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥの遺伝子産物をコードする。別の実施形態において、グラム陽性細菌Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、全てのｌｕｘコード配列の５’側かまたはｌｕｘＡおよびｌｕｘＣのみの５’側に位置する。１つのセットの実施形態において、ポリヌクレオチドの転写は、Ｓａｌ−Ｓａ６からなる群より選択される発現増強配列（例えば、Ｓａ２またはＳａ４）に含まれるプロモーターによって媒介される。関連のセットにおいて、ポリヌクレオチドの転写は、Ｓｐ１、Ｓｐ５、Ｓｐ６、Ｓｐ９、Ｓｐ１６およびＳｐ１７からなる群より選択される発現増強配列（例えば、Ｓｐ１６）に含まれるプロモーターによって媒介される。発現カセットはさらに、ｌｕｘＡコード配列の５’末端に隣接して位置する複数挿入部位を含む。好ましい実施形態において、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢについてのコード配列は、Ｐｈｏｔｏｒｈａｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓから得られる。
【００１０】
ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの遺伝子産物のインフレームでの融合物をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットもまた、本発明に含まれる。ここで、（ａ）グラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含むポリヌクレオチド配列は、ｌｕｘＡコード配列の５’末端に隣接して位置し、そして（ｂ）挿入部位は、ｌｕｘＡのコード配列とｌｕｘＢのコード配列との間に位置する。挿入部位はさらに、複数挿入部位を含み得る。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドはさらに、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥの遺伝子産物をコードする。これらの遺伝子産物についてのコード配列の配置は、相対的順序（５’−ｌｕｘＡ−ｌｕｘＢ−ｌｕｘＣ−ｌｕｘＤ−ｌｕｘＥ−３’）に従うことが好ましいが必ずしもそうではない。好ましい実施形態において、グラム陽性細菌Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、ｌｕｘＡ−ｌｕｘＢ融合物コード配列およびｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥのコード配列全ての５’側である。
【００１１】
上記の全ての発現カセットが細菌性トランスポゾンまたは細菌性ミニトランスポゾン内に含まれ得ることが明白である。さらに、これらのカセットの全てにおいて、これらの遺伝子産物のコード配列は、発現カセットが導入される宿主系における遺伝子産物の発現に最適であるコドンを含み得る。
【００１２】
本発明はまた、選択された細胞型における使用のための光生成発現カセットを選択する方法を含む。この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）選択された細胞型から単離されたゲノムＤＮＡのフラグメントを調製する工程、および（ｉｉ）ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢの遺伝子産物のインフレームでの融合物をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットの挿入部位にこのフラグメントを挿入する工程。ここで、（ａ）グラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含むポリヌクレオチド配列は、ｌｕｘＡコード配列の５’末端に隣接して位置し、そして（ｂ）挿入部位は、ｌｕｘＡのコード配列とｌｕｘＢのコード配列との間に位置する。発現カセットは、好ましくは、選択された細胞型において遺伝子産物を発現し得る。この方法の工程（ｉｉｉ）は、選択された細胞型の細胞内にこれらのフラグメントを保有する発現カセットを導入する工程であり、そして工程（ｉｖ）は、光を生成する細胞についてのスクリーニング工程である。ここで、光の生成は、発現カセットによって媒介される。これらのフラグメントは、例えば、ゲノムＤＮＡの酵素的消化（選択された制限エンドヌクレアーゼを使用する部分的消化）によってか、またはゲノムＤＮＡの機械的フラグメント化によって産生され得る。ｌｕｘ遺伝子の転写は、好ましくは、選択された細胞型（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ）から得られるプロモーターによって媒介される。１つの実施形態において、スクリーニングは、約３７℃より高い温度で実施される。
【００１３】
本発明はさらに、以下を含むルシフェラーゼ発現カセットを含む：ａ）ｌｕｃをコードするポリヌクレオチド；およびｂ）グラム陽性細菌より得られる発現増強配列（例えば、グラム陽性プロモーターおよび／またはグラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）を、ｌｕｃコードポリヌクレオチドの５’側に含むポリヌクレオチド配列。発現増強配列を含む低分子ＤＮＡフラグメントは、好ましくは、ｌｕｃとプロモーターとの間にある。
【００１４】
本発明はさらに、以下を含むルシフェラーゼ発現カセットを含む：ａ）ｌｕｘＹをコードするポリヌクレオチド；およびｂ）グラム陽性細菌より得られる発現増強配列（例えば、グラム陽性プロモーターおよび／またはグラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）を、ｌｕｘＹコードポリヌクレオチドの５’側に含むポリヌクレオチド配列。発現増強配列を含む低分子ＤＮＡフラグメントは、好ましくは、ｌｕｘＹとプロモーターとの間にある。
【００１５】
本発明はさらに、ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａｌ−６ならびにｐＣＭＯＲ  Ｇ＋２  Ｓｐ１、Ｓｐ５、Ｓｐ６、Ｓｐ９、Ｓｐ１６およびＳｐ１７として称されるプラスミドを含む。
【００１６】
別の局面において、本発明は、以下を含むシャトルベクターを含む：ａ）上記の任意の発現カセットに従う発現カセット；ｂ）選択マーカーをコードするポリヌクレオチド；ｃ）グラム陽性複製起点；およびｄ）グラム陰性複製起点。
【００１７】
本発明のなお別の局面は、グラム陽性細菌におけるルシフェラーゼの発現を得るに有用である発現増強配列についてのスクリーニング方法を含む。この方法は、以下の工程を包含する：ａ）グラム陽性細菌ゲノムからのＤＮＡフラグメントを、以下を含む発現カセットに導入する工程：（ｉ）ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、このポリヌクレオチドは、以下の５’−ｌｕｘＡＢＣＤＥの相対的順序であるポリヌクレオチド、（ｉｉ）少なくとも１つのｌｕｘコードポリヌクレオチドの５’側にグラム陽性細菌から得られた発現増強配列を含むポリヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）少なくとも１つのｌｕｘコードポリヌクレオチドの５’側の挿入部位；ｂ）工程（ａ）の発現カセットをグラム陽性細菌宿主細胞に形質導入する工程；ならびにｃ）宿主細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルを決定し、それによりグラム陽性細菌におけるルシフェラーゼの発現を得るに有用なグラム陽性発現増強ＤＮＡ配列を同定する工程。
【００１８】
本発明のさらに別の局面は、グラム陽性細菌におけるルシフェラーゼの発現を得るに有用な発現増強配列についてのスクリーニング方法を含む。この方法は、以下の工程を包含する：ａ）グラム陽性細菌ゲノムからのＤＮＡフラグメントを以下を含む発現カセットに導入する工程：（ｉ）ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢの遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）少なくとも１つのｌｕｘコードポリヌクレオチドの５’側にグラム陽性細菌から得られた発現増強配列を含むポリヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）少なくとも１つのｌｕｘコードポリヌクレオチドの５’側の挿入部位；ｂ）工程（ａ）の発現カセットをグラム陽性細菌宿主細胞に形質導入する工程；ならびにｃ）宿主細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルを決定し、それによりグラム陽性細菌におけるルシフェラーゼの発現を得るに有用なグラム陽性発現増強ＤＮＡ配列を同定する工程。
【００１９】
本発明の一部はまた、グラム陽性細菌におけるルシフェラーゼの発現を得るに有用な発現増強配列についてのスクリーニング方法である。この方法は、以下の工程を包含する：ａ）グラム陽性細菌ゲノムからのＤＮＡフラグメントを以下を含む発現カセットに導入する工程：（ｉ）ｌｕｃをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）ｌｕｃコードポリヌクレオチドの５’側にグラム陽性細菌から得られた発現増強配列を含むポリヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）少なくとも１つのｌｕｃコードポリヌクレオチドの５’側の挿入部位；ｂ）工程（ａ）の発現カセットをグラム陽性細菌宿主細胞に形質導入する工程；ならびにｃ）宿主細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルを決定し、それによりグラム陽性細菌におけるルシフェラーゼの発現を得るに有用なグラム陽性発現増強ＤＮＡ配列を同定する工程。
【００２０】
別の局面において、本発明は、ルシフェラーゼ発現カセットを作製する方法を包含する。この方法は、以下の工程：（ａ）５’−３’の方向にｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；および１つ以上のｌｕｘコードポリヌクレオチドに作動可能に連結された、グラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏヌクレオチド配列を調製する工程；ならびに（ｂ）ｌｕｘ遺伝子産物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの間に核酸の小さな配列を挿入する工程、を包含する。
【００２１】
本発明は、ルシフェラーゼ発現カセットを作製する方法を包含する。この方法は、以下の工程：（ａ）ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；および１つ以上のｌｕｘコードポリヌクレオチドに作動可能に連結された、グラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏヌクレオチド配列を調製する工程；ならびに（ｂ）ｌｕｘ遺伝子産物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの間に核酸の小さな配列を挿入する工程、を包含する。
【００２２】
本発明はまた、ルシフェラーゼ発現カセットを作製する方法を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ｌｕｃ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；およびこのｌｕｃコードポリヌクレオチドに作動可能に連結された、グラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏヌクレオチド配列を調製する工程；ならびに（ｂ）このｌｕｃをコードするポリヌクレオチドの５’側に核酸の小さな配列を挿入する工程、を包含する。
【００２３】
本発明はまた、ルシフェラーゼ発現カセットを作製する方法を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ｌｕｘＹ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；およびこのｌｕｘＹコードポリヌクレオチドに作動可能に連結された、グラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏヌクレオチド配列を調製する工程；ならびに（ｂ）このｌｕｘＹをコードするポリヌクレオチドの５’側に核酸の小さな配列を挿入する工程、を包含する。
【００２４】
本発明の部分はまた、光を生成するようにグラム陽性生物を改変する方法である。この方法は、上記に記載される発現カセットのいずれかでそのグラム陽性生物を形質転換する工程を包含する。
【００２５】
別の局面において本発明は、分析物がレポーターマーカーの発現に影響を与える能力について、その分析物をスクリーニングする方法を包含する。この方法は以下：（ａ）上記のルシフェラーゼ発現カセットのいずれかでグラム陽性細菌を形質転換する工程；（ｂ）その細菌にその分析物を提供する工程；（ｃ）必要である場合、ルシフェラーゼ光生成のために必要な基質を提供する工程；および（ｄ）そのグラム陽性細菌が光を生成する能力についてその分析物の効果をモニターして、それによりその分析物が、グラム陽性細菌においてそのレポーターの発現にその分析物が影響を与えるかどうかを同定する工程、を包含する。１つの実施形態において、この基質はアルデヒドであり、そして蒸気として提供される。
【００２６】
本発明において含まれるのはまた、動物全体においてレポーターマーカーの発現に分析物が影響を与える能力について、その分析物をスクリーニングする方法である。この方法は、以下の工程：（ａ）上記ルシフェラーゼ発現カセットのいずれかでグラム陽性細菌を形質転換する工程；（ｂ）動物全体にその細菌を導入する工程；（ｃ）その動物にその分析物を提供する工程；（ｄ）必要である場合、ルシフェラーゼ光生成のために必要な基質を提供する工程；および（ｅ）そのグラム陽性細菌が光を生成する能力についてその分析物の効果をモニターして、それによりその分析物が、グラム陽性細菌においてそのレポーターの発現にその分析物が影響を与えるかどうかを同定する工程、を包含する。１つの実施形態において、この基質はアルデヒドであり、そして注射により提供される。
【００２７】
別の局面において、本発明は、光を生成し得るグラム陽性細菌を包含する。ここで、（ａ）この細菌は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードする配列を含み、（ｂ）約１×１０6細菌細胞が約３７℃で少なくとも約１×１０4相対光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）を生成し得る。他の実施形態において、１秒、１細胞あたり、少なくとも約１０光子を放射する細胞が開示される。１秒、１細胞あたり少なくとも約２５光子を放射する細胞もまた包含される。１秒、１細胞あたり少なくとも約５０光子を放射する細胞が開示される。１秒、１細胞あたり少なくとも約７５光子を放射する細胞が開示される。少なくとも約１００光子を放射する細胞もまた開示される。
【００２８】
さらに別の局面において、本発明は、上記発現カセットのいずれかを含む、トランスジェニック非ヒト動物を包含する。
【００２９】
本発明に含まれるのはまた、発現増強配列Ｓａ１−Ｓａ６またはＳｐ配列（以下に開示される）のいずれかにおいて含まれるプロモーター配列である。好ましい実施形態において、このプロモーター配列は、配列番号１５〜２６からなる群より選択される発現増強配列（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から選択される。
【００３０】
一般的な実施形態において、本発明は、光生成タンパク質（ＬＧＰ）をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された、上記のパラグラフにおいて定義されるようなプロモーター配列を含む発現カセットを包含する。１つの実施形態において、このＬＧＰは、蛍光タンパク質（例えば、グリーン蛍光タンパク質）である。別の実施形態において、このＬＧＰは、発光タンパク質または生物発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）である。具体的な実施形態において、このルシフェラーゼは、原核生物ルシフェラーゼ（ｌｕｘをコードするルシフェラーゼ）または真核生物（ｌｕｃをコードする）ルシフェラーゼのいずれかであり得る。
【００３１】
さらに別の局面において、本発明は、非ヒト哺乳動物被験体においてある存在物を局在化させるための方法を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）その存在物と、αサブユニットおよびβサブユニットを含む原核生物ルシフェラーゼとの結合体を、その被験体に投与する工程；（ｂ）その被験体にアルデヒドを送達する工程；（ｃ）その結合体がその被験体における局在化を達成し得る時間の後、不透明な組織を通じて、その被験体において局在化されたそのルシフェラーゼからの光子放射を、光検出器デバイスで、光子放射の画像が構築され得るまで測定する工程；ならびに（ｄ）光子放射の画像を構築する工程であって、その画像は、その哺乳動物被験体におけるその存在物の局在化を示す、工程。
【００３２】
本発明はまた、細菌細胞宿主（例えば、グラム陽性細菌）を包含する。この細菌は、本明細書に記載される、１つ以上の発現ベクター、プラスミド、トランスポゾンなどを含む。
【００３３】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書における開示に鑑み、当業者には容易に行われる。さらに、本明細書において記載される異なる実施形態の種々の形態が組合され得る。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、そうではないと示さない限り、当該分野における技術内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献において充分に説明されている。例えば、以下を参照のこと：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ  （１９９５）．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９））。
【００３５】
（定義）
本発明を記載するにあたり、以下の用語を使用し、そして以下に示されるように定義されることを意図する。そうではないと指示しない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、本発明の分野における当業者にとってそれらがそうであるのと同じ意味を有する。
【００３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうではないと示さない限り、複数形の言及も包含する。従って、例えば、「１つの抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」への言及は、そのような因子の２つ以上の混合物を包含する。
【００３７】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」とは、互換的に用いられ、そしてデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであるか、あるいはそれらのアナログの任意長のヌクレオチドの重合体形態をいう。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、そして公知であれ未知であれ任意の機能を発揮し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ，リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。
【００３８】
ポリヌクレオチドは、代表的に、アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；およびチミン（Ｔ）（そのポリヌクレオチドがＲＮＡであるときは、チミン（Ｔ）に替えてウラシル（Ｕ））の特定の配列からなる。従って、用語ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記は、中央演算装置を有するコンピュータにおけるデータベースに入力され得、そして機能的ゲノム学および相同性検索のようなバイオインフォーマティクスアプリケーションとして使用される。
【００３９】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレエメント」）の制御下におかれた場合、インビボで（ＤＮＡの場合）転写され、そして（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドに翻訳される核酸分子である。コード配列の協会は、５’（アミノ）末端において開始コドン、および３’（カルボキシ）末端において翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列でさえ、挙げられ得るが、それらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に配置され得る。
【００４０】
代表的な「制御エレメント」とは、以下が挙げられるがそれらに限定されない：転写レギュレーター（例えば、プロモーター、転写増強エレメント、転写終結シグナルおよびポリアデニル化配列）；ならびに翻訳レギュレーター（例えば、翻訳開始の最適化のための配列（例えば、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（リボソーム結合部位）配列、および翻訳終止配列）。プロモーターとしては、誘導性プロモーター（ここで、そのプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（ここで、そのプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、および構成的プロモーターが挙げられ得る。
【００４１】
「発現増強配列」とは、代表的に、そのような制御エレメント（例えば、プロモーター、プロモーターエンハンサー、エンハンサーエレメントおよび翻訳エンハンサー（例えば、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列））の非存在下での発現レベルに比較してポリヌクレオチドの転写または翻訳を改善する制御エレメントをいう。
【００４２】
「単離されたポリヌクレオチド」分子は、その分子が天然において見出される生物全体から分離されそして別個である核酸分子であるか；またはそれが天然に通常付随する配列の全体または部分がない核酸分子であるか；またはそれが天然に存在するような配列であるが、それとともに異種配列（以下に定義される）を有する配列である。
【００４３】
「ポリペプチド」とは、その最も広義で用いられ、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、または他のペプチド模倣物からなる化合物をいう。このサブユニットは、ペプチド結合または他の結合（例えば、エステル結合、エーテル結合など）によって連結され得る。本明細書において使用されるように、用語「アミノ酸」とは、天然および／または非天然あるいは合成のアミノ酸（グリシンおよびＤ光学異性体またはＬ光学異性体の両方を含む）、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物のいずれかをいう。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、そのペプチド鎖が短い場合通常オリゴペプチドと呼ばれる。そのペプチド鎖が長い場合、そのペプチドは、代表的に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００４４】
「作動可能に連結された」とは、要素の配置をいい、ここで、そのように記載された成分は、その通常の機能を実施するように構成される。従って、コード配列（例えば、レポーター遺伝子）に作動可能に連結された所定のプロモーターは、その適切な酵素が存在する場合、そのコード配列の発現を行い得る。そのプロモーターまたは他の制御エレメントは、それらがその発現を誘導するように機能する限り、そのコード配列とは近接する必要はない。例えば、介入するまだ翻訳されないが転写される配列は、そのプロモーター配列とそのコード配列との間に存在し得、そしてそのプロモーター配列は、なおも、そのコード配列に作動可能に連結されているとみなされ得る。
【００４５】
核酸分子を記載するための本明細書において使用される「組換え体」とは、ゲノムの、ｃＤＮＡの、半合成のまたは合成の起源のポリヌクレオチドを意味し、その起源または操作により、（１）それが天然に付随するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と付随しない；および／または（２）天然に連結されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されているポリヌクレオチドを意味する。用語「組換え体」とは、タンパク質またはポリペプチドに関して使用されるとき、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」および他のそのような用語であって、単細胞存在物として培養される原核生物微生物または真核生物細胞株を意味する用語は、互換的に用いられ、そして組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡについてレシピエントとして用いられ得るかまたは用いられた細胞をいい、そして形質転換されたもとの細胞の子孫を包含する。単一の親の細胞の子孫は、必ずしも、もとの親の細胞とは、形態またはゲノムもしく総ＤＮＡ相補体において、偶然または意図的な変異に起因して、完全に同一でなくてもよいことが理解される。関連する特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴付けられるべき親に充分類似する親の細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫において包含され、そして上記用語によって包含される。
【００４６】
核酸およびアミノ酸の「配列同一性」を決定するための技術は、当該分野において公知である。代表的にはそのような技術は、遺伝子についてのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによりコードされるアミノ酸を決定すること、ならびにこれらの配列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列と比較することを包含する。一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列のそれぞれヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の正確な対応をいう。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、その「％同一性」を決定することによって比較され得る。２つの配列の％同一性は、それが核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、２つの整列された配列の間の正確な適合の数を、より短い配列の長さで除し、そして１００を乗じた数値である。核酸配列のおよその整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３  ３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発されたスコア付け行列を用いてアミノ酸配列に適用することができ、およびＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化することができる。配列の％同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的なインプリメンテーションは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションにおいて提供される。この方法のためのこのデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能である）において記載される。本発明の状況において％同一性を確立する好ましい方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配布されている、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有するＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。この一連のパッケージからＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムパッケージは、デフォルトパラメータがスコア付け表（例えば、ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１、およびギャップ（ｇａｐ）＝６）について使用されるときに用いられ得る。生成したデータから、「Ｍａｔｃｈ」値は、「配列同一性」を反映する。配列の間の％同一性または類似性を算出するた��の他の適切なプログラムは、一般に当該分野において公知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメータとともに用いたＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて用いられ得る：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４７】
あるいは、相同性は、相同性領域の間に安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズさせること、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼにより消化し、そして消化したフラグメントのサイズを決定することによって判定され得る。２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチド配列は、以下である場合に、互いに「実質的に相同」である：上記の方法を用いて判定される場合、それらの配列が、少なくとも約８０−８５％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５−９８％の配列同一性を、その分子の所定の長さに対して示すとき。本明細書において使用される場合、実質的に相同とはまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチドの配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。実質的に相同なＤＮＡ配列は、サザンハイブリダイゼーション実験において、例えば、その特定の系について規定されるようなストリンジェントな条件下で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術範囲内である。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出。
【００４８】
「遺伝子」とは、転写または翻訳された後、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードし得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドをいう。本明細書において記載される任意のポリヌクレオチド配列は、それらが付随する遺伝子のより大きなフラグメントまたは全長コード配列を同定するために使用され得る。より大きなフラグメント配列を単離する方法は、当業者に公知である。
【００４９】
２つの核酸フラグメントは、本明細書において記載されるように「選択的にハイブリダイズ」することが考慮される。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、そのような分子の間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を与える。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列が標的分子に対してハイブリダイズすることを少なくとも部分的に妨害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの妨害は、当該分野において周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価され得る（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。そのようなアッセイは、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーへと変動する条件を用いて選択性の程度を変動させることを用いて行われ得る。低ストリンジェンシーの条件が使用される場合、非特異的結合の非存在は、部分的な程度の配列同一性でさえ欠如する二次プローブ（例えば、その標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて評価され得、その結果、非特異的な結合事象の非存在下で、その二次プローブは、その標的にはハイブリダイズしない。
【００５０】
ハイブリダイゼーションベースの検出系を利用するとき、核酸プローブは、標的核酸配列に相補的であるよう選択され、次いで、そのプローブおよびその標的配列が互いに「選択的にハイブリダイズ」するかまたは結合してハイブリッド分子を形成する適切な条件の洗濯によって選択される。「中程度のストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０−１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、代表的に、選択された核酸プローブの配列と約９０−９５％より大きな配列同一性を有する、少なくとも約１０−１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。そのプローブおよび標的が特定の程度の配列同一性を有する、プローブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野において知られるとおりに決定され得る（例えば、以下を参照のこと：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００５１】
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件に関して、多くの等価な条件が、例えば、以下の要因：プローブ配列および標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、およびポリエチレングリコール）の有無、ハイブリダイゼーション反応の温度および時間のパラメータを変化させること、ならびに洗浄条件を変化させることによって特定のストリンジェンシーを確立するために用いられ得ることは、当該分野において周知である。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野における標準的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）に従って選択される。
【００５２】
「〜によってコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいう。ここで、ポリペプチド配列またはその部分は、その核酸配列によってコードされるポリペプチドからの少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。その配列によってコードされるポリペプチドと免疫学的に同定可能なポリペプチド配列もまた包含する。
【００５３】
「精製されたポリヌクレオチド」とは、そのポリヌクレオチドが天然に結合しているタンパク質を本質的に含まない（例えば、約５０％未満、好ましくは約７０％未満、そしてより好ましくは約９０％未満を含む）、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製する技術は当該分野において周知であり、例えば、カオトロピック剤でのポリヌクレオチドを含む細胞の破壊、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度に従った沈殿によるポリヌクレオチドとタンパク質との分離を含む。
【００５４】
「ベクター」は標的細胞に遺伝子配列を移入し得る（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、微粒子キャリア、およびリポソーム）。代表的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を導き得、そして標的細胞に遺伝子配列を移入し得る、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクルならびにウイルスベクターを含む。
【００５５】
「核酸発現ベクター」は、目的の配列または遺伝子の発現を導き得るアセンブリをいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含む。他の制御エレメントもまた存在し得る。例えば、発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物は、１または複数の細菌の複製起点、１または複数の選択マーカー、そのプラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、マルチクローニング部位、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）も含み得る。
【００５６】
「発現カセット」は、細胞において発現し得るポリヌクレオチド遺伝子または配列を含む任意の核酸構築物を包含する。発現カセットは、目的のポリヌクレオチド遺伝子または配列に加えて、さらなる転写、翻訳、または他の調節または制御エレメントを含み得る。このようなカセットは、代表的には、標的細胞中に発現カセットを移入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」（すなわち、「核酸発現ベクター」）または「遺伝子移入ベクター」に構築される。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００５７】
「グラム陽性」は、任意の標準的なグラム染色色素での脱色に抵抗する細菌をいう分類学上の特徴である。対照的に、グラム陰性細菌は、特定の有機溶媒（例えば、エタノールまたはアセトン）で容易に脱色される。染色を保持するかまたは染色に抵抗する細菌の能力は、一般に、細胞壁の構造を反映する。グラム陰性細菌は、そのグラム陰性細菌対応物より、広範なペプチドグリカン架橋しそしてより透過性のない細胞壁を有することが示唆されている。グラム陽性細菌の限定されない例には、Ｓｔａｐｈｏｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、特定のＢａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどが含まれる。
【００５８】
「光生成」は、化学反応によりまたは放射の吸収により光を生成し得ると定義される。
【００５９】
「光」は、そうではないと断らない限り、本明細書中では、約３００ｎｍと約１１００ｎｍとの間の波長を有する電磁放射と定義される。
【００６０】
「可視光」は、そうではないと断らない限り、本明細書中では、約４００ｎｍと約７５０ｎｍとの間の波長を有する電磁放射と定義される。
【００６１】
「光生成タンパク質」は、化学反応により（例えば、ルシフェラーゼにより生成されるような生物発光）または放射の吸収により（例えば、グリーン蛍光タンパク質により生成されるような、蛍光）光を生成し得るタンパク質またはポリペプチドと定義される。
【００６２】
「ルシフェラーゼ」は、そうではないと断らない限り、原核生物および真核生物のルシフェラーゼ、ならびに改変または変化した光学特性を有する改変体（例えば、異なる色の光を産生するルシフェラーゼ（例えば、Ｋａｊｉｙａｍａ，ＮおよびＮａｋａｎｏ，Ｅ．（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４（６）：６９１−６９３））を含む。「Ｌｕｘ」は、ルシフェラーゼおよび光子放出に関連する原核生物の遺伝子をいう。「Ｌｕｃ」は、ルシフェラーゼおよび光子放出に関連する真核生物の遺伝子をいう。
【００６３】
本明細書中で使用する「動物」は、代表的には、非ヒト哺乳動物をいい、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；ペット哺乳動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｍａｍｍａｌ）（例えば、イヌおよびネコ）；研究動物（マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む）；トリ（ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽トリ、アヒル、ガチョウなどのような家畜のトリ、野生のトリ、および狩猟のトリを含む）を包含するがこれらに限定されない。この用語は、特定の年齢を示さない。したがって、成体および新生仔の個体の両方を含むと意図される。
【００６４】
本明細書中で使用する「分析物」は、その効果（例えば、特定のプロモーターの誘導または抑制）が試験動物および本発明の方法を使用して評価され得る任意の化合物または物質をいう。このような分析物には、化学化合物、薬学的化合物、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドアナログが包含されるが、それらに限定されない。多くの機関（例えば、国立衛生研究所、製薬会社、および化学会社）が、天然プロセスもしくは合成プロセスまたは発酵ブロスもしくは抽出物に由来する化学化合物または生物学的化合物の大きなライブラリーを有する。このような化合物／分析物は本発明の実施に用いられ得る。
（発明の実施の形態）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、処方またはプロセスパラメータが当然に変化し得るので、特定の処方またはプロセスパラメータに限定されないことを理解すべきである。本明細書中で使用する用語法は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、限定する意図のないこともまた理解すべきである。
【００６５】
本明細書に記載するものと同様であるかまたは等価である多くの方法および材料が本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料および方法を本明細書中に記載する。
【００６６】
（本発明の一般的概説）
上記で議論されたように、天然に存在する生物発光性細菌における光の合成は、５つの必須遺伝子によりコードされる。これらの遺伝子は、生物発光性表現型を生じる非生物発光性細菌へと移動し得るオペロン（ｌｕｘＣＤＡＢＥ）においてクラスター化される。天然に存在する海生および陸生の生物発光性細菌の全ての同定した種はグラム陰性であるので、他方でグラム陽性細菌の生物発光性表現型への形質転換は制限されている（一部、これら２つの細菌グループの遺伝子が異なることに起因する）。本発明は、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｌｕｘオペロン全体を再操作して、グラム陽性制御エレメントに導入することにより、１つの局面においてこの問題を解決する。この新規なｌｕｘＡＢＣＤＥカセットをいくつかの異なるグラム陽性／グラム陰性シャトルベクター（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋シリーズ）に挿入し、そしてこれらの構築物を、宿主細菌による強い光の生産を生じるグラム陽性プロモーターを選択するために、プロモーター−プローブビヒクルとして使用した。このアプローチを用いると、グラム陽性細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのいくつかの株を含む）のいくつかの異なる属が、明るく生物発光性になった。後者の細菌両方において、１００コロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）程度が生物発光を用いて３７℃で検出され得た。
【００６７】
ルシフェラーゼ酵素は、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢによりコードされるのに対し、アルデヒド生合成を担う酵素は、３つの遺伝子ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤおよびｌｕｘＥによりコードされる。しかし、アルデヒドは、細胞膜を横切って急激に拡散し得、そして市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ）ので、この基質の合成をコードする遺伝子（ｌｕｘＣＤＥ）は生物発光には絶対必須であるわけではなく、そしてこの化合物を外因的に添加することにより置換され得る。従って、生物発光性グラム陽性細菌を生成するために、細胞が機能的ルシフェラーゼを確実に合成し得ることのみが必要である。
【００６８】
「発明の背景」において議論したように、このことは、再操作したｌｕｘＡＢカセットを導入することにより多くのグラム陽性細菌において達成された。このカセットにおいて、グラム陽性リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、ｌｕｘＡの上流に挿入され、そしてこの遺伝子は、インフレームでｌｕｘＢに融合され、そのために、機能的ＬｕｘＡＢ融合タンパク質の合成が可能になった（Ｊａｃｏｂｓ，Ｍ．ら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：２５１−２５６）。このアプローチは、環境研究（例えば、このような細菌による汚染に関する食品の評価）のために有用な生物発光性グラム陽性細菌の多くの新規な属を生成することに成功したが、既存のｌｕｘＡＢ構築物は、病原性を研究するための使用が限定されていた。なぜなら、今日までに公開された株または構築物のいずれも、インビボで十分な光を生産せず、上記で議論したインビボモニタリング適用には有用にならないからである。
【００６９】
本発明は、ルシフェラーゼ発現カセットに関する。次いで、これらの発現カセットは適切な骨格（例えば、シャトルベクター）に挿入され得、それによって細胞または動物に光を生産する能力を付与する。本明細書中に記載される発現カセットは、グラム陽性細菌が最小量を超える光を生理学的温度で発することを初めて可能にするものである。
【００７０】
１つの実施形態において、この発現カセットは、例えば、細菌ｌｕｘ遺伝子をｌｕｘＡＢＣＤＥの順番に配置することにより、ｌｕｘの機能的発現を促進するように組換え操作された細菌ｌｕｘ遺伝子を含む。従って、この発現カセットは、これらの遺伝子の改変されていない順番、すなわち、ｌｕｘＣＡＢＤＥの順番を再配置する。構造遺伝子（ｌｕｘＡＢ）および基質をコードする遺伝子（ｌｕｘＣＤＥ）の両方を含むことにより、この発現カセットは、外因性基質の添加を必要としない。さらに、グラム陽性（Ｇｒａｍ＋）シャイン−ダルガーノ配列の導入とともに、遺伝子の再配置は、改変されていない順番より、より高い光生産能力を付与する。グラム陽性シャイン−ダルガーノ配列を、好ましくは、再配置された複数のまたは全部のｌｕｘ遺伝子より前に（代表的には、５’に）挿入した。必要に応じて、プロモーターまたは他の転写レギュレーターもしくは翻訳レギュレーターを含む短いＤＮＡ配列は、ｌｕｘカセットの前に挿入される。
【００７１】
本発明により提供される別の発現カセットは、ｌｕｘＡＢをコードするポリヌクレオチドを含むが、基質をコードする遺伝子を含まない。このようなｌｕｘＡＢ発現カセットを使用すると、外因性基質（例えば、アルデヒド）は、光を生産する能力をモニタリングするために提供される。ｌｕｘＡＢ発現カセットは、代表的には、ｌｕｘＡをコードする遺伝子と、ｌｕｘＢをコードする遺伝子との間の翻訳を増強するＤＮＡ配列（例えば、シャイン−ダルガーノ配列）を含む。
【００７２】
さらに、別の細菌遺伝子（ｌｕｘＹ）は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ株Ｙ−１から単離された。このｌｕｘＹは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）（ルシフェラーゼ酵素により活性化された場合に、５４５ｎｍのλｍａｘで黄色蛍光を発する基質）をコードする。Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｔ．Ｏ．ら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：５５０９−５５１５を参照のこと。従って、本発明の別の発現カセットは、機能的ｌｕｘＹをコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、この発現カセットは、例えば、グラム陽性細菌由来のｌｕｘＹおよび制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはシャイン−ダルガーノ配列）をコードするポリヌクレオチドを含む。このｌｕｘＹ発現カセットはまた、ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。ここで、このポリペプチドコード配列は、代表的には、プロモーターとｌｕｘＹコード配列との間に配置される。本発明のさらなる局面において、ｌｕｘＡＢＣＤＥＹ、ｌｕｘＡＢＹなどのカセットが提供される。ｌｕｘＹ遺伝子を、例えば、ｌｕｘＡＢＣＤＥ遺伝子カセットに付加することにより、可視光スペクトルの赤色端（ｒｅｄ  ｅｎｄ）に向かって生物発光の間に発した光の波長の範囲が広がる。より長い波長の光が、より短い波長の光と比較した場合、生組織を容易に透過することを考慮すると、本発明のｌｕｘＡＢＣＤＥ遺伝子カセットの選択された実施形態（例えば、上記に記載の）は、従って、レポーター手段として生物発光を用いる用途の感度を増大させる手段として、ｌｕｘＹコード配列をさらに含む。
【００７３】
本発明のなお別の発現カセットは、機能的ｌｕｃ、真核生物ルシフェラーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、この発現カセットは、例えば、グラム陽性細菌由来のｌｕｃおよび制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはシャイン−ダルガーノ配列）をコードするポリヌクレオチドを含む。このｌｕｃ発現カセットはまた、ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。ここで、このポリペプチドコード配列は、代表的には、プロモーターとｌｕｃコード配列との間に配置される。
【００７４】
種々のルシフェラーゼコード遺伝子が同定され、これらの遺伝子としては、以下があげられるが、これらに限定されない：Ｂ．Ａ．ＳｈｅｒｆおよびＫ．Ｖ．Ｗｏｏｄ、米国特許第５，６７０，３５６号、Ｋａｚａｍｉ，Ｊ．ら、米国特許第５，６０４，１２３号、Ｓ．Ｚｅｕｎｏら、米国特許第５，６１８，７２２号；Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ、米国特許第５，６５０，２８９号、Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ、米国特許第５，６４１，６４１号、Ｎ．ＫａｊｉｙａｍａおよびＥ．Ｎａｋａｎｏ、米国特許第５，２２９，２８５号、Ｍ．Ｊ．ＣｏｒｍｉｅｒおよびＷ．Ｗ．Ｌｏｒｅｎｚ、米国特許第５，２９２，６５８号、Ｍ．Ｊ．ＣｏｒｍｉｅｒおよびＷ．Ｗ．Ｌｏｒｅｎｚ、米国特許第５，４１８，１１５号、ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．ら（１９８７）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７；Ｔａｔｓｕｍｉ，Ｈ．Ｎ．ら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３１：１６１−１６５ならびにＷｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７００−７０２（全て本明細書中に参考として援用される）。このようなルシフェラーゼをコードする遺伝子は、本明細書中に記載の方法により改変されて、例えば、グラム陽性微生物において有用なポリペプチド配列および／または発現カセットが生成され得る。
【００７５】
本明細書中に記載される発現カセットを使用して、ルシフェラーゼ発現を増強する、配列をスクリーニングするための方法もまた、提供される。上記のように、種々の配列が、これらの発現カセット内に（例えば、ｌｕｘＡコードヌクレオチドとｌｕｘＢコードヌクレオチドとの間に、またはｌｕｃとそのプロモーター配列との間に）挿入され得る。このような配列の挿入前または挿入後のいずれかにおいて、この発現カセットは、適切なベクター骨格（例えば、シャトルベクター）内に導入され得る。続いて、発現カセットおよび、特定の細胞型（例えば、関連微生物または哺乳動物細胞）に挿入された配列によって付与された光生成能力が、評価され得る。
【００７６】
別の局面において、発現カセットは、培養系において細胞（例えば、原核生物細胞および真核生物細胞）をモニターする方法に有用である。１つの実施形態において、本明細書中に記載されるルシフェラーゼ発現カセットは、グラム陽性細菌内に導入され、分析物のこれらの細胞に及ぼす効果は、光を生成するそれらの能力によってモニターされる。この様式で、例えば、抗生物質は、細胞の増殖を殺すかまたは抑制するそれらの能力について、細胞内で容易にスクリーニングされ得る。上記のように、特定の発現カセット（例えば，ｌｕｘＡＢおよびｌｕｃ）は、外因性基質の添加を必要とする。従って、本発明はまた、例えば、本発明の発現カセットを保有する細胞を含有する培養培地と接触した雰囲気に、アルデヒド蒸気を添加することによって、基質（例えば、アルデヒド）を投与する方法を含む。
【００７７】
あるいは、本発明の発現カセット（例えば、適切な骨格を含む）は、動物全体に導入され得る。１実施形態において、発現カセットは、最初に、細胞（例えば、グラム陽性細菌）内に導入される。次いで、動物全体におけるグラム陽性細菌に及ぼす分析物の効果が評価され得る。外因性基質（例えば、アルデヒド）が必要とされる場合、それは、例えば、注射によってもしくは動物にアルデヒド蒸気を吸入させることによって、動物に提供され得、これらの方法もまた、提供される。
【００７８】
さらに、本発明の発現カセットは、トランスジェニック動物を産生するために使用され得る。
【００７９】
本発明の利点として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）細菌（特に、グラム陽性細菌）の毒性株における高レベルのルシフェラーゼ（ｌｕｘまたはｌｕｃ）発現を得ることであり、これは、例えば、細胞内の感染のモニターを可能にする；（ｉｉ）細菌（特に、グラム陽性細菌）の毒性株において高レベルのルシフェラーゼ（ｌｕｘまたはｌｕｃ）発現を得ることであって、これは、例えば、細胞系または動物系におけるレポーター遺伝子としてのルシフェラーゼを使用する際の感染のモニターを可能にする；（ｉｉｉ）ｌｕｘの基質コード遺伝子の発現が、外因性基質の添加の必要性を排除する；（ｉｖ）ＣＤＡＢＥからＡＢＣＤＥへのｌｕｘオペロンの再配列が、オペロンの機能性成分の分離を可能にする（例えば、別々に、ｌｕｘ  ＡＢおよび／またはｌｕｘ  ＣＤＥ成分で形質転換する）。
【００８０】
（ルシフェラーゼ）
生物発光は、細菌感染を研究するための強力なレポーター系を提供する（例えば、米国特許第５，６５０，１３５号）。ルシフェラーゼは、基質（例えば、ルシフェリン、長鎖アルデヒドまたはコレントラジン（ｃｏｌｅｎｔｒａｚｉｎｅ））、エネルギー供給源（例えば、ＡＴＰまたはＦＭＮＨ2）および酸素が提供される場合、光を生成する特性を共有する多様な酵素のファミリーのメンバーに適用される用語である。ルシフェラーゼは、広く真核生物ルシフェラーゼおよび原核生物ルシフェラーゼに分類され得る。真核生物ルシフェラーゼ（「ｌｕｃ」）は、代表的に、単一遺伝子によってコードされる（例えば、ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．ら、（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：７８７０−７８７３；ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．ら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７を参照のこと）。ルシフェラーゼ系を含む例示的な真核生物は、北米ホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓである。ホタルルシフェラーゼは、大規模に研究されてきており、ＡＴＰアッセイに広く使用される。コメツキムシの別の種であるＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈａｌａｍｕｓ由来のルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが、クローン化されかつ発現されてきた（Ｗｏｏｄら）。このコメツキムシは、この種の異なるメンバーが異なる色の生物発光を放射するという点で、珍しい。互いに９５〜９９％相同性を有するクローンの４クラスを、単離した。それらは、５４６ｎｍ（緑色）、５６０ｎｍ（黄緑色）、５７８ｎｍ（黄色）および５９３ｎｍ（橙色）で光を放射する。最後のクラス（５９３ｎｍ）は、本発明の光生成部分としての使用に特に有利であり得る。なぜなら、放射された光は、より短い波長の光より容易に組織を貫通する波長を有する。
【００８１】
細菌性ルシフェラーゼ（「ｌｕｘ」）は、代表的に、ｌｕｘオペロンの２個の異なる遺伝子（ｌｕｘ  Ａおよびｌｕｘ  Ｂ）によってコードされる２個のサブユニット（αおよびβ）から構成される。オペロンの３つの他の遺伝子（ｌｕｘ  Ｃ、ｌｕｘ  Ｄおよびｌｕｘ  Ｅ）は、アルデヒド基質の生合成に必要とされる酵素をコードする。細菌性ｌｕｘは、特定の生物発光グラム陰性細菌（例えば、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）内に存在し、順序ＣＤＡＢＥである。
【００８２】
（ルシフェラーゼ発現カセット）
種々のルシフェラーゼコード遺伝子が同定されており、これには以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｂ．Ａ．ＳｈｅｒｆおよびＫ．Ｖ．Ｗｏｏｄ，米国特許第５，６７０，３５６号、Ｋａｚａｍｉ、Ｊら、米国特許第５，６０４，１２３号、Ｓ．Ｚｅｎｎｏら、米国特許第５，６１８，７２２号；Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ、米国特許第５，６５０，２８９号、Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ、米国特許第５，６４１，６４１号、Ｎ．ＫａｊｉｙａｍａおよびＥ．Ｎａｋａｎｏ、米国特許第５，２２９，２８５号、Ｍ．Ｊ．ＣｏｒｍｉｅｒおよびＷ．Ｗ．Ｌｏｒｅｎｚ、米国特許第５，２９２，６５８号、Ｍ．Ｊ．ＣｏｒｍｉｅｒおよびＷ．Ｗ．Ｌｏｒｅｎｚ、米国特許第５，４１８，１５５号、ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．ら（１９８７）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５〜７３７；Ｔａｔｓｕｍｉ，Ｈ．Ｎ．ら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３１：１６１〜１６５、ならびにＷｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７００〜７０２（全て参考として本明細書において援用される）。
【００８３】
（Ｌｕｘコード発現カセット）
本発明の１つの局面において、構造ｌｕｘ遺伝子産物および基質コードｌｕｘ遺伝子産物の両方をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットが提供される。本発明者らは、例えば、ＣＡＢＤＥからＡＢＣＤＥにｌｕｘ遺伝子を再整列すること、および１つ以上のｌｕｘ遺伝子の前にグラム陽性シャインダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ）配列を挿入することが、得られたルシフェラーゼに光を生成する能力の増強を付与することを実証した。適切なグラム陽性シャインダルガーノ配列（例えば、配列番号１）は、本明細書の教示に照らして当業者に公知であり、そしてまた以下の実施例に記載されている。ｌｕｘＡＢＣＤＥ発現カセットはルシフェラーゼを発現するだけでなく、ｌｕｘルシフェラーゼ基質（アルデヒド）の合成に必要な生合成酵素も発現する。従って、酸素は、この発現カセットを用いる場合に、生物発光に必要な唯一の外因性の必要とされるものである。
【００８４】
別の局面において、ｌｕｘＡＢ発現カセットが提供される。ｌｕｘＡＢカセットは、代表的に、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢをコードするポリヌクレオチドの各々の上流に作動可能に連結されたグラム陽性リボソーム結合部位（「シャインダルガーノ配列」とも呼ばれる）を含む。本明細書において記載されるように、これらのカセットは、ＳｔａｐｈｏｌｏｃｃｏｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのようなグラム陽性細菌において発現される場合特に、公知の構築物に見出された活性よりも高いレベルのルシフェラーゼ活性を付与する。
【００８５】
本明細書中に記載されるｌｕｘＡＢＣＤＥ発現カセットおよびｌｕｘＡＢ発現カセットの両方は、必要に応じて、既知または未知の配列の挿入のための部位を含む。両カセットにおいて、この挿入部位は、代表的に、ｌｕｘＢ遺伝子の５’側  （すなわち、ｌｕｘＡとｌｕｘＢとの間）に位置する。この挿入部位を使用して、例えば、実施例に記載されるような、ランダムフラグメント発現増強配列スクリーニング（ＲＦＥＥＳＳ）を、（１）目的のＤＮＡ（例えば、グラム陽性細菌から得られたＤＮＡ）の部分酵素消化（例えば、ＳａｕＩＩＩａを使用して）；（２）ｌｕｘＢ遺伝子の５’側へのこれらのフラグメントの挿入；（３）このｌｕｘ発現カセットを含む適切なベクターへのこれらのポリヌクレオチドフラグメントのクローニング；（４）細胞（例えば、グラム陽性細菌）へのこれらのベクターの形質転換および（５）これらの細胞が発光する能力についてのこれらの細胞の評価を行うことによって、実施され得る。
【００８６】
（Ｌｕｃコード発現カセット）
本発明はまた、真核生物ルシフェラーゼの発現を可能にする発現カセットを含む。１つの実施形態において、このｌｕｃ発現カセットは、構成的に発現されるプロモーターに作動可能に連結された、ｌｕｃ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、このプロモーターは、グラム陽性細菌から得られる。次いで、この発現カセットを、適切なベクター骨格（例えば、シャトルベクター）に導入し得る。１つの実施形態において、このシャトルベクターは、選択マーカーおよび２つの複製起点を含み、この複製起点の一方は、グラム陰性生物における複製のための複製起点であり、もう一方は、グラム陽性生物における複製のための複製起点である。
【００８７】
適切なプロモーターは、本明細書の教示を考慮して、当該分野で公知の任意の方法によって同定され得る。上記および以下の実施例に記載される、１つのこのような方法において、ランダムフラグメント発現増強配列スクリーニング（ＲＦＥＥＳＳ）を、グラム陽性細菌から得られた部分消化した（例えば、ＳａｕＩＩＩａを使用して）ＤＮＡを使用して行う。次いで、このランダムフラグメントを、ｌｕｃを含むベクターにクローニングし、細菌（好ましくは、グラム陽性細菌）に形質転換し、そしてそれらが発光を生じる能力について評価する。
【００８８】
（ルシフェラーゼ発現ベクターを作製する方法）
本発明の好ましい実施形態において、このルシフェラーゼ発現カセットを、ベクター骨格、例えば、シャトルベクター（例えば、ｐＭＫ４（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍら（１９８４）Ｇｅｎｅ  ２９：２１−２６）、ｐＤＬ２８９（Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｎ．ら（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７：５０２８−５０３４）およびｐＳＵＭシリーズ（Ａｉｎｓａ，Ｊ．Ａ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅ  １７６：２３−２６））に挿入する。代表的には、これらのシャトルベクターは、以下を含む：（１）グラム陽性複製起点；（２）グラム陰性複製起点（３）ポリリンカー；および（４）選択マーカー（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール）をコードするポリヌクレオチド。
【００８９】
本明細書中に記載される発現カセットは、本明細書の教示を考慮して、分子生物学の技術分野で公知の方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ（１９９５）またはＳａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）を利用して構築され得る。代表的には、発現カセットは、ｌｕｘ遺伝子またはｌｕｃ遺伝子をコードするポリヌクレオチドから、これらのポリヌクレオチドを適切な転写調節エレメント（例えば、プロモーター）および翻訳調節エレメント（例えば、グラム陽性シャイン−ダルガーノ配列）に作動可能に連結することによって構築される。短いランダムヌクレオチド配列、選択マーカーなどもまた、適切な位置でこの発現カセットに導入され得る。
【００９０】
ポリヌクレオチド、適切な調節配列および短いランダムヌクレオチド配列を得る好ましい方法は、ＰＣＲである。ＰＣＲの一般的な手段は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））に教示される。各増幅反応のためのＰＣＲ条件は、経験的に決定され得る。多くのパラメータが、反応の達成に影響する。これらのパラメータとしては、とりわけ、アニーリングの温度および時間、伸長時間、Ｍｇ2+濃度およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、テンプレートおよびデオキシリボヌクレオチドの相対的濃度である。例示的なプライマーを、以下の実施例１に記載する。増幅後、得られたフラグメントを、アガロースゲル電気泳動、その後のエチジウムブロミド染色および紫外線照射での可視化によって検出し得る。
【００９１】
ポリヌクレオチド（例えば、短いランダムヌクレオチド配列）を得るための別の方法は、酵素消化による。以下の実施例に記載のように、平滑切断する４ヌクレオチド認識制限酵素（例えば、ＡｌｕＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＳａｕ３ＡＩ）での適切な細菌由来のＤＮＡの消化によって生成された短いＤＮＡ配列を、改変型ｌｕｘカセットと連結させた。
【００９２】
ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を使用して、ベクターゲノムに挿入される。例えば、挿入ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを、適切な条件下で制限酵素と接触させ、各分子に相補末端または平滑末端を作製し、これらの分子は互いは互いに対合し得、リガーゼを用いて結合し得る。あるいは、合成核酸リンカーを、ポリヌクレオチドの末端に連結させ得る。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含むことができる。他の手段も同様に、当該分野で公知でありかつ利用可能である。
【００９３】
（細胞培養物中のルシフェラーゼ発現カセットの評価）
ルシフェラーゼベクター構築物（例えば、上記および実施例に記載の構築物）を、種々の宿主細胞の形質転換における使用に適応させ得る。これらの宿主細胞としては、ほとんどの細菌（例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌）および多くの真核生物細胞（微生物、植物細胞、哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない）が挙げられる。さらに、特定のウイルス（例えば、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルス）が、ルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作され得る。例えば、Ｋｏｖａｃｓらは、ヘルペスウイルスにおけるホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子の安定な発現を教示する。Ｂｒａｓｉｅｒらは、哺乳動物細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子構築物の使用を教示する。培養物中の哺乳動物細胞からのルシフェラーゼ発現は、巨視的（Ｉｓｒａｅｌ，Ｈ．（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０４：１３９−１４５）および微視的（Ｈｏｏｐｅｒ，Ｃら（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ５：１２３−１３０）の両方でのＣＣＤ画像化を使用して研究されている。
【００９４】
従って、原核生物および真核生物の両方の細胞が、本発明の発現カセットの有用な標的である。細胞は、例えば、その細胞を形質転換するために使用される異種遺伝子構築物によって提供される、比較的高濃度の発現カセットでロードされ得る。さらに、その細胞の所望の位置に「標的部分」または分子を標的するのに効果的な、その「標的部分」または分子を発現する細胞を選択し得る。あるいは、これらの細胞を、適切な標的部分を発現するベクター構築物で形質転換し得る。
【００９５】
原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての形質転換方法は、当該分野で周知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら）、これらとしては、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。適切な調節エレメントおよび複数のクローニング部位を含むベクターは、広範に市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）。
【００９６】
（細胞培養におけるレポーターとしてのルシフェラーゼベクターの使用）
本明細書中に記載される発現カセットは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方において有用なレポーター系である。ルミネセンスをモニタリングすることによって、プロモーターおよび分析物は、細胞培養系において評価され得る。例えば、誘導が薬物耐性と関連する遺伝子から得られたプロモーターは、本明細書中に記載されるルシフェラーゼ発現カセット（例えば、ｌｕｘＡＢまたはｌｕｘＡＢＣＤＥ）に作動可能に連結され得る。これらの発現カセットは、細胞中に（例えば、シャトルベクターによって）導入され、そして分析物の有効性がルミネセンスをモニタリングすることによって評価される。
【００９７】
腫瘍形成性もまた、本明細書中に記載されるルシフェラーゼ発現カセットを用いて評価され得る。例えば、真核生物細胞（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｇｉａｒｄｉａおよび腫瘍細胞）は、特定の条件下で（例えば、細胞がウイルスに感染した際またはサイトカインによる刺激の際に）発現される、調節可能なプロモーターを含むルシフェラーゼ発現カセットで形質転換され得る。これらおよび他の刺激物に関連した因子に応答するプロモーターは、当該分野で公知である。関連した局面では、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ系（Ｇｏｓｓｅｎら））を用いて、光生成タンパク質の発現を一過的に活性化し得る。例えば、ｌｕｘＡＢＣＤＥ発現カセットは、腫瘍関連プロモーターに作動可能に連結され、そしてこのカセットで形質転換された細胞を用いて抗腫瘍化合物についてスクリーニングされ得る。
【００９８】
（動物におけるルシフェラーゼ発現ベクターの評価）
本明細書中に記載される発現カセットは、動物全体の非侵襲性画像化に特に有用である。動物全体の非侵襲性画像化は、Ｃｏｎｔａｇらによる共有にかかる米国特許第５，６５０，１３５号に記載され、そして本明細書中に参考として援用される。（また、Ｃｏｎｔａｇら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（２）：２４５−２４７；Ｃｏｎｔａｇら（１９９６）ＯＳＡ  Ｔｏｐｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ３：２２０−２２４；Ｃｏｎｔａｇら（１９９７）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，６６（４）：５２３−５３１；およびＣｏｎｔａｇら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３を参照のこと）。
【００９９】
画像化方法では、結合体は、生体適合性実体（例えば、形質転換された細菌）および光生成部分（例えば、ルシフェラーゼ酵素）を含む。光放出結合体は代表的に、種々の方法のいずれかによって被験体に投与され、被験体内で局在させられ、そして画像化される。画像化（すなわち、被験体からの光子放出の測定）は数十分間まで持続し得るので、被験体は代表的に、画像化プロセスの間固定されるが、必ずしもそうではない。
【０１００】
光放射実体の画像化は、極めて低いレベル（代表的には１光子事象）の光を検出し得、そして画像が構築され得るまで光子放出を積分し得る光検出器の使用を含む。このような高感度の光検出器の例としては、１光子事象がカメラによって検出される前にこの事象を増感するデバイス、および検出システムに固有のバックグラウンドノイズに対して１光子を検出し得る、（例えば、液体窒素で冷却された）カメラが挙げられる。
【０１０１】
一旦光子放出画像が作製されると、これは代表的に、被験体の「写真的な」反射光画像上に重ねられた偽色（ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｏｒ）画像として表されて、放出光子源についての参考のフレームを提供する（すなわち、被験体に関して光放射結合体を局在させる）。次いで、このような「複合」画像は分析されて、被験体におけるレポーター遺伝子の発現の局在および／またはレベルが決定される。
【０１０２】
（動物の感染）
本明細書中に記載されるルシフェラーゼ発現カセットは、動物において原核生物細胞および真核生物細胞の両方を評価する際に有用である。病原性細菌（例えば、グラム陽性細菌）が、本明細書中に記載のルシフェラーゼ発現カセットと結合体化され得、そして／またはこの発現カセットで形質転換され得、その後、動物全体に導入され得る。次いで、この動物が、インビボでの感染プロセスを追跡ため、そして感染を阻害する際のその効力について潜在的抗感染薬物（例えば、新規な抗生物質）を評価するために、使用され得る。従って、１つの局面において、本明細書中に記載の発現カセットは、ルシフェラーゼ発現カセットを保有する細菌に感染した哺乳動物被験体における光放出結合体の非侵襲的画像化および／または検出において有用である。例として、このルシフェラーゼ発現カセットは、病原性細菌の成長および／または増殖を阻害する際に有用な薬剤をスクリーニングするために使用され得る。
【０１０３】
さらに、選択された抗原に対する抗体を発現するコロニーを同定するためにスクリーニングされ得る、表面結合抗体を発現する細菌を含むＥ．ｃｏｌｉライブラリーを得ることが可能である（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）。次いで、このコロニー由来の細菌は、本発明のルシフェラーゼ発現カセットで形質転換され得、そして形質転換体は、上記のような、本発明の方法において利用され得、哺乳動物宿主におけるその抗原を局在化させ得る。
【０１０４】
あるいは、形質転換された細胞は、それらが試験被験体中で均一に分布するように、試験被験体に投与され得る。さらに、調節可能なプロモーターが、光生成タンパク質が特定の条件下で（例えば、ウイルスによる感染もしくはサイトカインによる刺激の際に）発現されるように、発現カセットにて使用され得る。これらの刺激および他の刺激に関する因子に応答するプロモーターが、当該分野で公知である。関連する局面において、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ系（Ｇｏｓｓｅｎら））が、その光生成タンパク質の発現を一過的に活性化するために使用され得る。
【０１０５】
例えば、ＣＤ４＋リンパ球が、ｔａｔ応答性ＨＩＶ  ＬＴＲエレメントを含む構築物で形質転換され得、そしてＨＩＶによる感染についてのアッセイとして使用され得る（Ｉｓｒａｅｌ，Ｈ．（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０４：１３９〜１４５）。このような構築物で形質転換された細胞は、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス（ＭｃＣｕｎｅら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２１４１〜２）に導入され得、そしてヒトＨＩＶ感染およびＡＩＤＳについてのモデルとして使用され得る。
【０１０６】
上記のように、例えば、構成的に活性なプロモーターで形質転換された腫瘍細胞株が、腫瘍の増殖および転移をモニターするために使用され得る。形質転換された腫瘍細胞は、動物モデルに注入され得、腫瘍塊を形成させられ得、そしてその腫瘍塊のサイズおよび転移が、想定の増殖インヒビターまたは想定の転移インヒビターでの処置の間にモニターされ得る。
【０１０７】
腫瘍細胞はまた、その活性が種々の感染性病原体に対して感受性であるかまたは治療化合物に対して感受性である、調節可能プロモーターを含む構築物で形質転換された細胞から生成され得る。
【０１０８】
（トランスジェニック動物）
本明細書中に記載される発現カセットを使用して、トランスジェニック動物を産生し得る。トランスジェニック非ヒト動物を産生する方法は、当該分野において公知である（Ｌｅｄｅｒ，Ｐ．ら、米国特許第４，７３６，８６６号；Ｍｅｌｍｅｄ，Ｓ．ら、米国特許第５，８２４，８３８号；Ｂｏｓｃｈ，Ｆ．ら、米国特許第５，８３７，８７５号；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．ら、米国特許第５，４８７，９９２号；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．ら、米国特許第５，６１４，３９６号；Ｒｕｌｅｙ，Ｈ．Ｅ．，米国特許第５，６２７，０５８号、全て、本明細書中に参考として援用される）。
【０１０９】
（基質投与）
上記のように、本明細書中に記載される特定の発現カセットは、光の生成のために、外因性基質の添加を必要とする（例えば、ｌｕｃおよびｌｕｘＡＢ発現カセット）。本発明の好ましい実施形態において、基質は、アルデヒドである。細胞に投与される場合に、アルデヒドは、蒸気として、培養培地を囲む雰囲気に適用され得るか、または液体もしくは固体として培養培地に直接適用され得る。
【０１１０】
さらに、基質はまた、動物全体に投与され得る。基質に関する適切な濃度は、構築される試験動物の各系列に関して、実験的に決定され得る。基質（代表的には、ルシフェリンまたはアルデヒド）は、目的の分析物の投与の前か、その投与と同時か、またはその投与の後に、投与され得る。基質の投与経路は、分析物に関して記載されるとおりであり得る。基質に関する好ましい投与経路としては、静脈内もしくは局所投与、または基質を雰囲気に（例えば、蒸気として）提供することによる投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
以下の実施例は、例示を意図されるが、本発明を限定しない。
【０１１２】
（材料および方法）
他に示されない限り、細胞、タンパク質および核酸（例えば、ＤＮＡ）の操作を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ（１９９５）に記載されるような、標準的な方法を使用して実施した。他に示されない限り、制限酵素を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手し、改変酵素を、ＰｒｏｍｅｇａまたはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手し、そして他の実験室用化学物質を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１１３】
（外因性アルデヒドの存在下でのインビトロスクリーニング）
（アルデヒドを使用するスクリーニング）  外因性アルデヒド基質を添加し、その後、ｌｕｘＣＤＥ遺伝子を含まない細菌のプレートまたは培養物を画像化した。プレートを画像化するために、ｎ−デシルアルデヒド（デカナール；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を、画像化されるべき細菌を含むプレートを覆う蓋の表面の内側表面に散布し（「アルデヒド蒸気画像化」）次いで、このプレートを、増感したＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ｍｏｄｅｌ  ２４００−３２）を使用して、本質的に米国特許第５，６５０，１３５号に記載されるように、画像化した。液体培養物を画像化するために、１μｌのデカナールを、培養物の約１０倍の希釈物１ｍｌに添加した。
【０１１４】
（Ｂ．  ＤＮＡの調製およびクローニング）
他に示されない限り、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼでの消化に続いて、ＤＮＡサンプルを、８５℃に１５分間加熱して、この制限酵素を不活化した。連結を、１６℃で一晩実施した。
【０１１５】
（Ｃ．細菌細胞の形質転換）
（コンピテント細胞の調製）他に記載しない限り、細菌細胞は、以下のように形質転換された。細菌培養物をＬＢ中で一晩増殖させた。５ｍｌのそれぞれの培養物を使用して新鮮な５００ｍｌ容積のＬＢを播種した。これらの培養物を、約０．６のＯ．Ｄ（６００ｎｍ）に到達するまで３７℃で振盪した。次いで、これらの細胞を氷上で３０分間冷却し、その後、３０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離によって収集した。細胞を、５０ｍｌの冷０．５Ｍスクロース（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）中またはｄｄＨ2Ｏ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のいずれかに再懸濁させ、その後、再遠心分離し、そして５ｍｌの冷０．５Ｍスクロース（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）中またはｄｄＨ2Ｏ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のいずれかに再懸濁させた。この段階で、細胞を氷上で３０分間維持し、次いで、再遠心分離しそして５ｍｌの冷１０％グリセロール中で再懸濁させた。各細胞型のアリコートを凍結しそして−８０℃で保存した。
【０１１６】
（エレクトロポレーション）プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎカラムを使用して精製し、透析してそして「ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ」（ＢｉｏＲａｄ）を使用してコンピテント細胞にエレクトロポレートした。セッティングは、２５μＦ、２．５ｋＶ、および１００オームの抵抗（Ｓ．ａｕｒｅｕｓについて）または４００オームの抵抗（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて）のいずれかであった。細胞を放置して１ｍｌの培養培地中２時間３７℃で回収し、その後、要求性の選択抗生物質を含む適切な寒天で平板培養した。
【０１１７】
（Ｄ．イメージングサンプル）
サンプルを、以下に記載されるように少し改変をして、基本的にＣｏｎｔａｇら、米国特許第５，６５０，１３５号に記載されるように画像化した。本発明のサポートで実施される実験（以下に詳述される）において、サンプルによって発生される光の量は、増感光子計数カメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２４００−３２）または冷却一体化（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）カメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ＬＮ／ＣＣＤ  １３４０−１３００−ＥＢ／１）のいずれかを使用して定量化した。他に示さない限り、光子計数カメラは、カメラＸＥＮ−３であり、そして一体化カメラは、カメラＸＥＮ−５であり、両方とも、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにあった。両方のタイプのカメラは、電荷結合素子アレイ（ＣＣＤアレイ）を使用して、選択された単位面積当たりの光子の数に比例するシグナルを生成する。選択される単位面積は、単一のＣＣＤピクセルによって検出されるか、またはビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）が使用される場合、任意の選択されたグループのピクセルによって検出されるほど小さくあり得る。このシグナルは、必要に応じてイメージプロセッサ（例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓから入手可能なＡｒｇｕｓ）を介してルートを決められ得、次いで、コンピュータ（イメージプロセシングソフトウエアアプリケーション（例えば、「ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ」（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｔｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を実行するＷｉｎｄｏｗｓ  ＮＴを実行するＰＣ（Ｄｅｌｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）またはＭａｃｉｎｔｏｓｈ（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）のいずれか）に伝送される。ソフトウェアおよび／またはイメージプロセッサを使用して画像を獲得し、コンピュータデータファイルとして保存する。データは、一般的に（ｘ、ｙ、ｚ）の値の形態をとり、ここで、ｘおよびｙは、シグナルが集められる点または領域の空間座標を表し、そしてｚは、その点または領域におけるシグナルの量を表し、「相対光単位」（ＲＬＵ）として表現された。
【０１１８】
解釈を容易にするために、データは、代表的には、「偽色」イメージとして示され、ここで、色スペクトルを使用して、特定の点におけるｚ値（シグナルの量）を示す。さらに、偽色シグナルイメージは、代表的に、反射光または「写真的」イメージの上に重ねられて参照のフレームを提供する。
【０１１９】
シグナルが安定な光電子放出標準（例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）を使用して較正されているカメラ上で得られる場合、任意のカメラからのＲＬＵシグナル値は、同じ光電子放出標準を使用して較正された任意の他のカメラからのＲＬＵと比較され得ることが理解される。さらに、絶対的なフォトン束（単位時間において単位面積から放出される光子）についての光電子放出標準を較正した後に、当業者は、このような任意のカメラからのＲＬＵ値をフォトン束値に変換し得、次いでこのフォトン束値によって単位時間あたりにサンプルにおいて形質転換された細胞によって放出された光子の数を推定し得る。
【０１２０】
（Ｅ．９６ウェルマイクロタイタープレートを使用する光出力の定量化）
溶液中の細胞によって生成された光の量を、溶液の希釈液を９６ウェルプレートのウェルにプレートし、そしてＸｅｎ−３カメラで上記のようにプレートを画像化することによって定量化した。次いで、このＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを使用して、特定のウェルからの光に対応するシグナルを示す画像の各領域の周りで、規定された輪郭を重ね合わせた。次いで、これらの領域の各々からのシグナルを定量化して、そして各ウェルの単一ＲＬＵ値として表現した。これらのＲＬＵを、以下で詳細に記載されるいくつかの研究（実施例１３、１４および１５を含む）において使用した。
【０１２１】
（実施例１）
（ＬＵＸＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの上流にグラム陽性ＲＢＳの取り込み）
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｌｕｘオペロンの５つの遺伝子（ｌｕｘＡ−Ｅ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｍｕｌｌｉｎｓ；Ｍｕｌｌｉｎｓら）を使用してＰＣＲ増幅し、グラム陽性リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）ＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）の配列を取り込んだ。この部位は、各開始コドンの少なくとも７個のヌクレオチドの上流であった。ｌｕｘ遺伝子の各々を、以下の表１に示されたプライマーセットを使用して個々に増幅した。各々の場合、太字で強調したヌクレオチドは、クローニングを容易にするために取り込まれた、異なる制限エンドヌクレオチド（一番右の欄に示される）の位置および配列を示す。グラム陽性ＲＢＳおよび開始コドンは、それぞれ実線および破線によって下線が引かれている。
【０１２２】
【表１】
2003509029.tif 000001
ＰＣＲを、２００μｌの薄壁のＰＣＲチューブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を備える自動サーモサイクラー（Ｔｅｃｈｎｅ  Ｐｒｏｇｅｎｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）を用いて実施した。反応を、以下を含む５０μｌ中で実施した：５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から市販されるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとともに供給される）、２．０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー（オペロン；表１の配列を参照のこと）、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｌｕｘＣＤＡＢＥカセット（ｐＳＢ４１７またはｐＳＢ３８４のいずれか；Ｗｉｎｓｏｎら（１９９８）ＦＥＭＳ，１６３：１８５−２０２）。各遺伝子の増幅を、９５℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で１分間の３０サイクル、続いて７２℃で２分間の最終伸長工程を使用して達成した。
【０１２３】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓと以前は呼ばれていた）のｌｕｘＣＤＡＢＥカセットの配列は、受託番号Ｍ９０００９２．１（ＧＩ：１５５４１１；ＸＥＮＬＡＢＣＤＥＢ）（Ｍｅｉｇｈｅｎ，Ｅ．Ａ．およびＳｚｅｔｔｎｅｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５３７１−５３８１（１９９２））のＧｅｎＢａｎｋから利用可能である。
【０１２４】
（実施例２）
（ｐＳＫ-Ｇ＋ＬＵＸＡＧ＋ＬＵＸＢの構築（ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴにおけるＬＵＸＡＢカセット））
上記実施例１において増幅された遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ-ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）において個々に構築した。このｌｕｘＡ  ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉで消化し、そしてそのＢａｍＨ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉ部位でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ-に連結し（ＩＰＴＧ誘導可能ｌａｃ  Ｚプロモーターの指向的に特定の方向を向けられた下流）、プラスミドｐＳＫ-Ｇ＋ｌｕｘＡを生成した。次いで、プラスミドｐＳＫ-Ｇ＋ｌｕｘＡを、ＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にエレクトロポレートし、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢアガー（ａｇａｒ）プレート上にプレートした。選択されたコロニーを、プラスミドプレップのために増殖し、そしてこのプラスミドＤＮＡを単離し、そしてＳａｌ  Ｉで切断した。得られたフラグメントを、Ｓａｌ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉで切断されたｌｕｘＢ  ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ（実施例１）と連結し、ｐＳＫ-Ｇ＋ｌｕｘＡＧ＋ｌｕｘＢを生成した。
【０１２５】
ｐＳＫ-Ｇ＋ｌｕｘＡＧ＋ｌｕｘＢを、ＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞にエレクトロポレートし、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢアガー上にプレートし、そして得られた形質転換体を、光子計測ＣＣＤカメラを使用して（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ  Ｐｒｅｆ．，Ｊａｐａｎ；ｍｏｄｅｌ  ２４００−３２）、外因性アルデヒドの存在下（材料および方法を参照のこと）で光に関してスクリーニングした。生物発光コロニーを精製し、そしてそれらの光の強度に関してモニターした。生物発光の極端に高いレベルを、記録した（２．０に到達するだけのカメラの感度）。外因性アルデヒドの非存在下でさえ、光のバックグラウンドレベルを、溶液中およびプレートからの両方で検出し得た（後者の場合、１分で０〜５にビット範囲を変えた）。驚くべきことに、ｐＳＫ-Ｇ＋ｌｕｘＡＧ＋ｌｕｘＢを含むグラム陰性Ｅ．ｃｏｌｉコロニーからの光のレベルは、ネイティブなＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｌｕｘオペロンで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉコロニー由来の光のレベルより有意に大きかった（外因性アルデヒドの存在下で）。
【０１２６】
これらの結果は、機能的なＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓルシフェラーゼαおよびβサブユニットが、ｌａｃＺプロモーターにより駆動されるＤＮＡ発現カセットから、グラム陰性細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において個々に発現され得、ここでこのＤＮＡ発現カセットは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢコード配列の各々の上流にグラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含むことを示す。
【０１２７】
（実施例３）
（ｐＳＫ-  ＬＵＸＡＢＣＤＥの構築（ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴにおけるＬＵＸＡＢＣＤＥカセット））
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ-における別個のｌｕｘＣＤＥカセットの構築を、ｌｕｘＡＢカセットの生成に関して実施例２において本質的に記載されるように、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ、およびｌｕｘＥの連続したクローニングにより達成した。ｌｕｘＣ〜Ｅ  ＰＣＲ増幅産物を、互換性のある酵素Ｓａｌ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉを用いて、個々に消化し、そしてこのクローニング手順の各工程を、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体のＰＣＲにより、確認した。最終的なｌｕｘＣＤＥカセットの忠実度を、ｐＳＫ-Ｇ＋ｌｕｘＡＧ＋ｌｕｘＢにおけるｌｕｘＡＢ遺伝子のＳａｌ  Ｉ部位下流でＳａｌ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉを用いて切断されたこの配列を挿入し、ｐＳＫ-  ｌｕｘＡＢＣＤＥを生成することにより確認した。スクリーニングを、アルデヒド処理を行わなかった以外は、上記のように実施した。なぜなら、この物質は、ｌｕｘＣＤＥ遺伝子によりコードされたからである。上記のように、ｐＳＫ-ｌｕｘＡＢＣＤＥを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αは、ネイティブなＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｌｕｘオペロンを含む細菌よりかなり明るかった。
【０１２８】
（実施例４  ｐＭＫ４ｌｕｘＡＢおよびｐＭＫ４ｌｕｘＡＢＣＤＥシャトルベクターの構築、ならびにＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ  ＡＵＲＥＵＳにおけるそれらの生物発光特性の評価）
（Ａ．ｐＭＫ４ｌｕｘＡＢシャトルベクターの構築）
上記の実施例２において記載した通りに作成されたｌｕｘＡＢカッセトを、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化を介してｐＳＫ-Ｇ＋ｌｕｘＡＧ＋ｌｕｘＢから単離し、そしてグラム陽性／陰性シャトルベクターｐＭＫ４（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．ら、（１９８４）、「Ｎｅｗ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｈｉｃｈ  ａｌｌｏｗ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｇｅｎｅ  ２９：２１−２６（本明細書中で参考として援用される））のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングした。ｐＭＫ４は、ＡＴＣＣ番号３７３１５の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；マナサス、ＶＡ）から入手可能である。このクローニングを、以下のように行った：（ｉ）ｌｕｘＡＢカッセトをＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＺプロモーターと逆方向に配向し、そして（ｉｉ）ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を、ｌｕｘＡコード領域の上流に維持した。得られたベクター（ｐＭＫ４ｌｕｘＡＢ）構築物を、ＤＨ５αにエレクトロポレーションし、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ上にプレートした。
【０１２９】
（Ｂ．ｐＭＫ４ｌｕｘＡＢプラスミドおよび外因性アルデヒド気体を用いたランダムフラグメント発現増強配列スクリーニング（ＲＦＥＥＳＳ））
適切な発現増強配列（ＥＥＳ）（例えば、プロモーター配列）についてスクリーニングするために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを、部分的消化においてＳａｕ３Ａで切断し（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ（１９９５）を参照のこと）、そしてＢａｍＨＩで切断しておいたｐＭＫ４ｌｕｘＡＢプラスミドに連結した。５つの異なるＤＮＡ濃度を、４×０．６  ｌｏｇ酵素希釈（４ＵのＳａｕ３Ａから開始して２０μｌにＤＮＡを希釈した）のセットにおいて消化した（１μｇ／μｌ、５００ｎｇ／μｌ、２００ｎｇ／μｌ、１００ｎｇ／μｌおよび５０ｎｇ／μｌ）。次いで、２０個の別個の連結物を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０にエレクトロポレーションし、プールし、２時間インキュベートし、そして５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＢＨＩ上にプレートした。およそ２０，０００コロニー（２００コロニーを含むプレートを１００枚）を、外因性アルデヒドの存在下で光についてスクリーニングした。これは、７３個の非常に生物発光する形質転換体（ｐＭＫ４ｌｕｘＡＢＳａ１−Ｓａ７３（以下の表２では、Ｓａ１−Ｓａ７３と略した））の単離を生じた。
【０１３０】
これらの単離物を、コロニー精製し、そしてアルデヒド気体の存在下でＬＢプレート上で生物発光に従って階級付けした。各々のプレートを、ＣＣＤカメラの下に置き、そして連続的なモニタリング（すなわち、データを収集しないで）の間に階級付けした。階級付けは、Ｏｆｆ  Ｓｃａｌｅ−ＯＳ（カメラ感度は、示された数に至るまで自動的にスイッチが下がっている）、Ｖｅｒｙ  Ｈｉｇｈ−ＶＨ（正常なカメラ検出の上限（感度１０））、Ｈｉｇｈ−Ｈ（いくつかの領域に連続的に赤の閃光）、Ｍｅｄｉｕｍ−Ｍ（高頻度のヒット）、Ｌｏｗ−Ｌ（低頻度のヒット）の順番であった。
【０１３１】
【表２】
2003509029.tif 000002
（Ｃ．ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１（ｐＭＲＫ４）シャトルベクターを作製するためのｐＭＫ４ｌｕｘＡＢへのｌｕｘＣＤＥ遺伝子の付加）
ｌｕｘＣＤＥ遺伝子を、プラスミドファミリーｐＭＫ４ｌｕｘＡＢＣＤＥＳａ１〜Ｓａ６（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａ１〜Ｓａ６またはｐＭＫ４ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｐ１〜Ｐ６と再命名された）を作製するために、ｐＭＫ４ｌｕｘＡＢＳａ１〜Ｓａ６へ、以下のように導入した：プラスミドＳａ１〜Ｓａ６をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α中で再増殖させて、そしてＳａｌＩで切断した。次いで、これらの消化物を（ｌｕｘＣＤＥカセットの、５’末端においてはＸｈｏＩを用いて、そして３’末端においてはＳａｌＩを用いて）ＸｈｏＩ／ＳａｌＩで切断したｌｕｘＣＤＥと個々に連結した。これを、Ｍ１３（−２０）およびＭ１３逆方向プライマー（例えば、配列については、１９９９  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ、３２０ページを参照のこと）を使用して、ｐＳＫ  ｌｕｘＣＤＥからＰＣＲ増幅した（９５℃３０秒、５０℃１分および７２℃３分の３５サイクル）。得られたプラスミドを示すマップ（Ｓａ１〜６配列の代わりにＢａｍＨ  Ｉ挿入部位を有する、ＥＥＳを有さないＳａ１〜Ｓａ６を、代わりに示す）を図１に示す。
【０１３２】
６の連結物をＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０へエレクトロポレーションし、そして５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレートにプレーティングし、そして得られたコロニーを、外因性アルデヒドの非存在下で光についてスクリーニングした。興味深いことに、Ｓａ１〜Ｓａ６  ｌｕｘＡＢＣＤＥ形質転換体から記録された生物発光のレベルは、対応するｌｕｘＡＢ形質転換体とは異なった。ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢ構築物（Ｓａ２）における最も低い生物発光のレベルを生じるＥＥＳが、ｌｕｘＡＢＣＤＥ構築物において使用された場合に、最も明るいシグナルを生成した。
【０１３３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０、ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ２（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａ２）およびｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ４（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａ４）におけるほとんどの光を生じるプラスミドを、ミニプレップ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）し、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓの病原性単離物８３２５−４へエレクトロポレートした。得られた形質転換体は、非常に生物発光性（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）であった（操作されたグラム陰性細菌を用いて達成されたレベルと比較できる光レベル）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株８３２５−４（ＳｔａｐｈＡ−ＸＧＮ−１と称される形質転換された株（ｓｔｒａｉｎｅｄ））中のプラスミドｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ２（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａ２；ａ．ｋ．ａ．ｐＸＧＮ−ｌｕｘ−１）を、ブダペスト条約の下で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−２２２の下で寄託した（１９９９年６月１５日）。
【０１３４】
（Ｄ．選択され同定されたＳ．ａｕｒｅｕｓ発現促進配列の配列）
ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａ１〜Ｓａ６におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＥＥＳ（実施例４Ｂ）を、ｌｕｘＡバックプライマー（ＬＵＸＡ−ＲＥＶ；配列番号１２：ＣＣＡ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＣＧ）を使用する標準方法を用いて配列決定し、そしてこれを以下に示す。各配列は、図１（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１）に示されるＢａｍＨ１プロモーター挿入部位のすぐ上流で終端し、各配列における最後のヌクレオチドは、ＢａｍＨＩ認識配列における最初の位置
【０１３５】
【化１】
2003509029.tif 000003
に対応する。ＥＥＳ（Ｓａ１）の一つのみが「Ｇ」で終端し、これにより最終的なｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ１（ａ．ｋ．ａ．  ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｐ１）構築物におけるＢａｍＨ  Ｉの完全性を保有することに注意。
【０１３６】
ｌｕｘＡＢＣＤＥ  カセットのＢａｍＨ  Ｉプロモーター挿入部位とＡＴＧ開始コドン（包括的）との間のベクター配列は、以下の通りである（配列番号１４）：
【０１３７】
【化２】
2003509029.tif 000004
。ＢａｍＨ  Ｉ部位を太字で示し、そしてグラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列およびＡＴＧ開始コドンに下線を付している。
【０１３８】
ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａｌ（配列番号１５）
【０１３９】
【化３】
2003509029.tif 000005
Ｓａｌ配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＬｙｔＥ／ｐａｐｃｅ細胞壁ヒドロラーゼ（Ｍａｒｇｏｔら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：７６９，（１９９８））と関連する配列に対して類似性を有する。
【０１４０】
ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ２（配列番号１６）
【０１４１】
【化４】
2003509029.tif 000006
Ｓａ２配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（受託番号ｅｍｂ  ＣＡＡ７４２４７；Ｙ１３９３７；ｇｉ  ２６３３９６０）由来のＹＩｐＣタンパク質と関連する配列、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（受託番号ｅｍｂ  ＣＡＡ７４２４８；Ｙ１３９３７）の推定ＰｌｓＸタンパク質と関連する配列に限定された類似性を有する。
【０１４２】
ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ３（配列番号１７）
【０１４３】
【化５】
2003509029.tif 000007
Ｓａ３配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓチオレドキシン（受託番号ｅｍｂ  ＣＡＡ１１４０４；ＡＪ２２３４８０）と関連する配列に類似性を有する。
【０１４４】
ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ４（配列番号１８）
【０１４５】
【化６】
2003509029.tif 000008
Ｓａ４配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＭｎｈＧ（受託番号ｄｂｊ  ＢＡＡ３５１０１；ＡＢ０１５９８１）と関連する配列に類似性を有する。
【０１４６】
ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ５（配列番号１９）
【０１４７】
【化７】
2003509029.tif 000009
ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ６（配列番号２０）
【０１４８】
【化８】
2003509029.tif 000010
Ｓａ６配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤｎａＩ  Ｂａｃｓｕプライモソームタンパク質（受託番号ｓｐ  Ｐ０６５６７；ｇｉ  ２７９７０８）と関連する配列に類似性を有する。
【０１４９】
上記に議論された結果は、ＥＥＳがルシフェラーゼ遺伝子に作動可能に連結される場合に、ＲＦＥＥＳＳが、生物発光を引き起こすのに効果的なＥＥＳの単離のための有用な方法であることを示す。さらに、このデータは、このような生物発光を生成するのに効果的な特定のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＥＥＳの例を提供する。
【０１５０】
（実施例５）
（動物におけるアルデヒド毒性の評価）
４匹のマウスに、０、２、４および６時間で、ｎ−デシルアルデヒドを０．１％および０．０１％の濃度で５００μｌの量でＩＰ注射した。アルデヒド溶液を、以下のように調製した：１００μｌのアルデヒドを、９００μｌのエタノール中に希釈した。次いで、この１０％溶液の１０μｌを、ｐＨ７．４の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の９９０μｌ中に希釈して、０．１％の最終容量のアルデヒド溶液を得た。この動物を、２４時間の期間にわたって観察した。２４時間後に、どのマウスも、何らかの病気の明らかな症状または異常な挙動を示さなかった。
【０１５１】
（実施例６）
（Ｓ．ＡＵＲＥＵＳにおけるｐＭＫ４  ＬＵＸＡＢ  ＳＡ３の、マウスにおける生物発光についての評価）
最初の注射の２４時間後、実施例５に記載されるように試験した４匹のマウスに、病原性菌株（８３２５−４）、およびｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢ  Ｓａ３を含むＳ．ａｕｒｅｕｓの臨床的メチシリン耐性（ｍｅｔｈａｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）（ＭＲＳＡ）菌株を注射した。このＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株を、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１０ｍｌの容量のＬＢにおいて、約０．５のＯ．Ｄ（６００ｎｍ）まで増殖させた。この細菌をペレット化し、そして各サンプルを１０ｍｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁した。このサンプルのＯ．Ｄを再測定し、そして以下の変換：細胞の＃＝（Ａ６００）（１１．１×１０８）を使用して、１ｍｌ当たり１×１０5、１×１０6、および１×１０7個の細胞となるように調整した。この希釈物を、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むチョコレートプレート上にプレーティングすることによって、確認した。
【０１５２】
用量は、腹膜内２５０μｌ（ＩＰ；１ｍｌ当たり１×１０5および１×１０6個）、または筋肉内１００μｌ（ＩＭ；太腿に１ｍｌ当たり１×１０6および１×１０7個）のいずれかであった。次いで、この４匹のマウスに、０．１％のｎ−デシルアルデヒド５００μｌをＩＰ注射した。アルデヒドのこの投与を、生物発光の画像処理のちょうど２、４および６時間前に繰り返した。画像処理の直前に、このマウスを、体重１０ｇ当たり１５μｌの用量で、１００ｍｇ／ｍｌの「Ｋｅｔａｓｅｔ」（ケタミン［Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ］）および２０ｍｇ／ｍｌの「Ｒｏｍｐｕｍｎ」（キシラジン小動物［Ｄａｒｂｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ］）の４：１混合物を、筋肉内（ＩＭ）注射することによって麻酔した。従って、２０ｇのマウスは３０μｌを受けた。麻酔は、典型的には２〜３分で効果を生じ、そしてこの動物は、代表的には２０〜３０分間落ち着いたままであった。必要な場合、１０ｇの体重当たり７μｌの第２用量を投与した。一般に、この動物は、１回の用量の投与の６０〜９０分後に回復した。しかし、２回投薬された動物は、回復するのに４時間もの長さを要し得た。
【０１５３】
このマウスを、本質的にはＣｏｎｔａｇら、米国特許第５，６５０，１３５号に記載されるように画像化した。生物発光を、０時間および２時間で観察し、これは外因的に投与したアルデヒドが、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのみを用いて形質転換された細胞を画像化するためにインビボで使用され得ることを示す。これらの結果は、外因的に投与されたアルデヒドが、身体全体に拡散し得ることを実証する。なぜなら、アルデヒドのＩＰ注射は、大腿筋に位置するｌｕｘＡＢ細菌からの光の発生を可能にするためである。
【０１５４】
（実施例７）
（マウスにおける生物発光についての、Ｓ．ＡＵＲＥＵＳ中のｐＭＫ４  ＬＵＸＡＢＣＤ  ＳＡ２（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  ＳＡ２）の評価）
ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋ｌ  ＳＡ２（ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ２；ｐＸＥＮ−ｌｕｘ−１）を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株８３２５−４およびＭＲＳＡを実施例６に記載されるように調製し、そしてマウスにおける生物発光について試験した。これらの株を、１００μｌ  ＩＰ（１ｍｌあたり４×１０6）および１００μｌ  ＩＭ（右大腿において、１ｍｌあたり４ｘ１０6、左大腿において１ｍｌあたり４×１０7）でマウスに接種し、そして０時間、４時間、６時間および２４時間でモニターした。次いで、これらのマウスを、０時間、４時間、６時間および２４時間で、上記のように画像化した。両方の株を、インビボで動物中で容易に可視化した。
【０１５５】
（実施例８）
（ｐＤＬ２８９  ＬＵＸＡＢＣＤＥ（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋２）シャトルベクターの構築およびＳＴＲＥＰＴＯＣＯＣＣＵＳ  ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥにおけるその生物発光特性の評価）
（Ａ．ｐＤＬ２８９  ｌｕｘＡＢＣＤＥシャトルベクターの構築）
実施例３に記載されるように生成されたｌｕｘＡＢＣＤＥカセットを、ＢａｍＨ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉ消化を介して、ｐＳＫ−ｌｕｘＡＢＣＤＥから単離し、そしてグラム陽性／陰性シャトルベクターｐＤＬ２８９のＢａｍＨ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉ部位にクローニングし（Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｎ．，ら，（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７：５０２８−５０３４，本明細書中で参考として援用される）、ｐＤＬ２８９  ｌｕｘＡＢＣＤＥ（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋２）を生成した。実施例３の場合と同様に、クローニングを、ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位が、ｌｕｘＡ  コード領域の上流に維持されるように実施したが、この場合、ｌｕｘＡＢＣＤＥカセットは、ｌａｃＺプロモーターと同じ方向であり、そしてｌａｃＺプロモーターの下流にあった。次いで、ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋２を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αにエレクトロポレートした。得られた陽性クローンを極端に明るく（なぜなら、このカセットは、ｌａｃＺプロモーターの下流であるからである）、純粋な培養物は、カメラが４．０の感度に達することを可能にした。
【０１５６】
（Ｂ．ｐＤＬ２８９  ｌｕｘＡＢＣＤＥ（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋２）を使用するランダムフラグメント発現増強配列スクリーニング（ＲＦＥＥＳＳ））
上記パート（Ａ）に同定される陽性クローンの１つを、プラスミド調製し、そして得られたＤＮＡを使用して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについてスクリーニングされ得るプロモーターライブラリーを構築した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｅ  Ｒ６由来のゲノムＤＮＡを、部分的な消化で、Ｓａｕ３Ａを用いて切断し（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ（１９９５））、そしてＢａｍＨＩで切断されたｐＣＭＯＲ  Ｇ＋２プラスミドを用いて連結した。次いで、これらの連結物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αにエレクトロポレートした。得られた形質転換体を、プレートから直接プールし、それらのプラスミドＤＮＡを抽出し、そしてこのＤＮＡを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの病原性の被包性株のコンピテント細胞にエレクトロポレートした。
【０１５７】
次いで、２５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むチョコレートプレート上の約２０，０００のグラム陽性形質転換体を、光子計数ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，モデル２４００−３２）を使用して、上記のように、生物発光についてスクリーニングした。８０の中程度〜高い光度コロニーを取り上げ、これらの２１の最も明るいものを、単一のコロニーについて線条化した。これらの２１の単離物を、４００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むチョコレートプレート上で２４時間および７２時間の両方で光度の読みについてモニターした。２４時間において、個々のコロニーは、約０．５ｍｍ未満の直径であり、光は、線条全体から放射された。しかし、７２時間まで、単一コロニーは、１６時間のＥ．ｃｏｌｉ．増殖によって達成されるぐらいのサイズに増殖し、そして強力に生物発光性であり、固体線条からは、ほとんどから全く放射されなかった。光度をまた、２５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＢＨＩの１６時間液体培養物から測定した（Ｏ．Ｄ．  ０．５−０．８）。ビットレンジ光単位（Ｂｉｔ  Ｒａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）（ＢＲＬＵ）は、「０」のゲインに設定されたＡｒｇｕｓ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒに連結されたＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓモデル２４００−３２増感ＣＣＤカメラ上でのビットレンジ変化の割合（ビットレンジ／秒として表現される）に等しい。この情報の要約を以下の表３に示す：
【０１５８】
【表３】
2003509029.tif 000011
*単離体Ｓｐ３は、２５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するチョコレートプレート上に溶血のゾーンを与えなかった。
【０１５９】
（Ｃ．選択され同定されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ発現増強配列の配列）
ｐＤＬ２８９  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓｐ１、５、６、９、１６および１７中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＥＥＳを、ｌｕｘＡバックプライマー（ＬＵＸＡ−ＲＥＶ；配列番号１２）を使用する標準的な方法を用いて配列決定し、そして以下に示す。各配列は、ＢａｍＨ  Ｉプロモーター挿入部位のすぐ上流で終結し、各配列の最後のヌクレオチドは、ＢａｍＨ  Ｉ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ；配列番号１３）中の最初の位置に対応する。ＥＥＳのうちただ２つ（Ｓｐ９およびＳｐ１６）のみが、「Ｇ」で終わり、それにより、最後のｐＤＬ２８９  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓｐ９およびｐＤＬ２８９  ｌｕｘ  ＡＢＣＤＥ  Ｓｐ１６構築物中のＢａｍＨ  Ｉ部位の完全性を保有することに注意のこと。
【０１６０】
ＢａｍＨ  Ｉプロモーター挿入部位とｌｕｘＡＢＣＤＥカセットのＡＴＧ開始コドン（包括的）との間のベクター配列は、以下のとおりである（配列番号１４）：
【０１６１】
【化９】
2003509029.tif 000012
ＢａｍＨ  Ｉ部位は、太字で示し、そしてグラム陽性Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列およびＡＴＧ開始コドンは下線を引いて示す。
【０１６２】
【化１０】
2003509029.tif 000013
Ｓｐ１配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｄ−グルタミン酸付加酵素、ＭｕｒＤ（ｍｕｒ  Ｄ）、ウンデカプレニル−ＰＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド−ＵＤＰＧｌｃＮＡｃ  ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ｍｕｒＧ）、細胞分裂タンパク質ＤｉｖＩＢ（ｄｉｖＩＢ）、オロチジン−５’−デカルボキシラーゼＰｙｒＦ（ｐｙｒＦ）に関連する配列に対して類似性を有する（Ｍａｓｓｉｄｄａ，Ｏ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４（１１）：３０６９〜３０７８（１９９８）；受託番号  ｇｂ│ＡＦ０６８９０２）。
【０１６３】
【化１１】
2003509029.tif 000014
Ｓｐ５配列は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル（ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ）アラニン−Ｄ−グルタメートリガーゼ（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラノイル（ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｎｏｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタメートシンセターゼ；Ｄ−グルタミン酸付加酵素）（受託番号ｓｐ│Ｏ０６２２２；ＭＵＲＤ ＭＹＣＴＵ）に関連する配列に対して類似性を有する。
【０１６４】
【化１２】
2003509029.tif 000015
Ｓｐ９配列は、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉコバルト輸送ＡＴＰ結合タンパク質Ｏホモログ（受託番号ｇｉ│１５９１７３２およびＵ６７５５１）に関連する配列に対して類似性を有する。
【０１６５】
【化１３】
2003509029.tif 000016
Ｓｐ１６配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩα鎖（受託番号ｇｉ│１５９１７３２およびＵ６７５５１）、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（受託番号ｄｂｊ│ＢＡＡ１３１６０；Ｄ８６７２７）に関連する配列に対して類似性を有する。
【０１６６】
【化１４】
2003509029.tif 000017
（実施例９）
（ｐＤＬ２８９  ＬｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓｐ１、５、６、９および１６で形質転換したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのマウスにおける生物発光についての評価）
ｐＤＬ２８９  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓｐ１、５、６、９および１６を含むＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６時間液体培養物を、マウスにおいて試験した。各培養物の１ｍｌからの細菌をペレット化し、１ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁し、そしてこれの１００μｌおよび１／１０希釈物の１００μｌを、それぞれマウスの左大腿筋および右大腿筋に接種した。各希釈物のより低い方を、２５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するチョコレート寒天にプレートし、コロニー形成単位（接種におけるｃ．ｆ．ｕ．；上記の表３を参照のこと）を評価した。マウスの各々を、時間０、４時間、７時間および２４時間において、ＣＣＤカメラで５分間モニターした。
【０１６７】
表３におけるデータから明らかであるように、ｐＤＬ２８９  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓｐ１、５および６を含むＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、＞８０％プラスミド保持で１×１０4ｃ．ｆ．ｕ．と６×１０4ｃ．ｆ．ｕとの間を与えた。Ｓｐ９からは、ｃ．ｆ．ｕ．は回収されなかった（おそらく、非効率的な粉砕のため）。一方、Ｓｐ１６は、＞９０％プラスミド保持で２．５×１０5ｃ．ｆ．ｕ．を与えた。
【０１６８】
上記のデータに基づいて、ｐＤＬ２８９  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓｐ１６を含むＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを、さらなる研究のための最良の候補菌株として選択した。
【０１６９】
（実施例１０）
（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋３シャトルベクターを用いる生物発光性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの構築）
実施例２に記載されるように生成したｌｕｘＡＢＣＤＥカセットを、ＢａｍＨ  １／Ｋｐｎ  Ｉ消化によりｐＳＫ-ｌｕｘＡＢＣＤＥから単離し、そしてグラム陽性／陰性シャトルベクターｐＳＵＭ３９（Ａｉｎｓａら、（１９９６）Ｇｅｎｅ  １７６：２３−２６（本明細書中に参考として援用される））のＢａｍＨ  I／Ｋｐｎ  Ｉ部位にクローン化し、ｐＳＵＭ３９  ｌｕｘＡＢＣＤＥ（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋３）を生成する。上記のように、クローニングを行い、その結果ＢａｍＨ  I制限酵素認識部位をｌｕｘＡコード領域の上流に維持する。当業者は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとともに使用するために適切な他のグラム陽性／陰性シャトルベクター（例えば、ｐＳＵＭ４０またはｐＳＵＭ４１（Ａｉｎｓａ，Ｊ．Ａ．ら、（１９９６）Ｇｅｎｅ １７６：２３−２６））をｐＳＵＭ３９の代わりに使用し得ることを理解する。
【０１７０】
潜在的に有用なプロモーター配列を同定するために、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のゲノムＤＮＡを、上記のように部分的な消化においてＳａｕ３Ａで切断し（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ（１９９５））、そしてＢａｍＨ  １で切断したｐＣＭＯＲ  Ｇ＋３プラスミドと連結する。次いで、これらの連結物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αにエレクトロポレーションする。次いで、得られた形質転換体をプールし、それらのプラスミドＤＮＡを抽出し、次いでこのＤＮＡを、コンピテントなＭ．ｓｍｅｇｍａｒｔｉｓ宿主細胞にエレクトロポレーションする。次いで、ベクターを組み込んだ形質転換体を選び、拡げ、そしてそれらのプラスミドＤＮＡをコンピテントなＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞にエレクトロポレーションする。
【０１７１】
グラム陽性形質転換体を、上記のように光子計数ＣＣＤカメラを用いて、生物発光についてスクリーニングする。
【０１７２】
（実施例１１）
（ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１シャトルベクターを用いる生物発光性Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｅの構築）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のゲノムＤＮＡを、部分的消化においてＳａｕ３  Ａで切断し（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ（１９９５）を参照のこと）、ＢａｍＨ  Iで切断したｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１プラスミド（実施例４）と連結する。次いで、これらの連結物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αにエレクトロポレーションする。得られた形質転換体を、プレートから直接プールし、それらのプラスミドＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをコンピテントなＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ宿主細胞にエレクトロポレーションする。
【０１７３】
グラム陽性形質転換体を、上記のように光子計数ＣＣＤカメラを用いて、生物発光についてスクリーニングする。
【０１７４】
（実施例１２）
（異種間のグラム陽性プロモーター配列の同定）
ｐＭＫ４の広い宿主範囲に起因して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＥＥＳ（Ｓａ１−６）を含む１セットのｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１構築物を、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ２３０７４）の病原性株中にエレクトロポレートし、任意のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＥＥＳが、Ｌｉｓｔｅｒｉａにおいて光を誘導したか否かを試験した。全ての６つのプラスミドは、このＬｉｓｔｅｒｉａ株に首尾良く移動したが、ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａ４のみが、有意な光レベルを与えることが見い出され、構築物の残部は、低レベルの生物発光を誘導するのみであった。ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａ４は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＬ．  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの両方で高レベルの光を誘導し得たので、この構築物は、グラム陽性細菌の他の属を光表現型に形質変換するために使用し得る。
【０１７５】
（実施例１３）
（改変ｌｕｘＡＢＣＤＥを含むＳ．ａｕｒｅｕｓからの生物発光とネイティブｌｕｘＣＤＡＢＥを含むＳ．ａｕｒｅｕｓからの生物発光の比較）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ構築物ｐＣＭＯＲ  Ｓａ１（これは、プロモーターとｌｕｘＡＢＣＤＥカセットとの間に、ＢａｍＨ  Ｉ部位を保持した；実施例４を参照）を、操作されたｌｕｘＡＢＣＤＥカセットを使用して発生させた生物発光のレベルをネイティブｌｕｘＣＤＡＢＥカセットを使用して発生させた生物発光のレベルと比較するための、開始ベクターとして選択した（ここで、２つのカセットは、それぞれ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｓａ１プロモーターの制御下にあった）。ｌｕｘＣＤＡＢＥ構築物を、以下のように生成した：まず、ネイティブｌｕｘＣＤＡＢＥカセットを、ＢａｍＨＩ／Ｓａ１Ｉフラグメントとして、ｐＳＢ４１７（Ｗｉｎｓｏｎら、１９９８、ＦＥＭＳ、１６３、１８５−２０２）から単離し、そして次いで、このフラグメントを使用して、ｐＣＭＯＲ  Ｓａ１から脱落された、対応するｌｕｘＡＢＣＤＥ  ＢａｍＨＩ／Ｓａ１Ｉフラグメントと置き換え、ｐＭＫ４  ｌｕｘＣＤＡＢＥ  Ｓａ１を生成した。このクローニングを、Ｅ．ｃｏｌｉ．ＤＨ５αにおいて実行し、そして完了したプラスミドを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０に移した。
【０１７６】
２つの異なるカセットによって生成された生物発光を、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αおよび形質転換されたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０細胞（各々は、ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａ１（ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｓａ１）もしくは、ｐＭＫ４  ｌｕｘＣＤＡＢＥ  Ｓａ１のいずれかを含む）を用いて比較した。４つの細菌株の各々の指数培養物を、２倍希釈（−０．３ｌｏｇ）で、黒の９６ウェルマイクロタイタープレートの全体に渡って希釈し、そして、光子計数ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、モデル２４００−３２）を用いて、３７℃で３０分の期間にわたって、光をモニターした。次いで、各ウェルの内容物をプレートし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を、生物発光レベル（相対光単位；ＲＬＵ）と比較した。
【０１７７】
結果を図２に示す。ｌｕｘＣＤＡＢＥとｌｕｘＡＢＣＤＥの両方のカセットは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて比較可能によく機能するが、ｌｕｘＡＢＣＤＥのみは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいて有意な生物発光を引き起こした。Ｓａ１：ｌｕｘＡＢＣＤＥは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｓａ１：ｌｕｘＣＤＡＢＥの約１／４の少ない光を発した。この現象に対する、１つの可能な説明は、高い転写および高い翻訳効率は、エネルギー的にコストがかかり得、従って、細胞にとって有害で、生物発光の減少を引き起こし得るということである。
【０１７８】
Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓモデル２４００−３２ＣＣＤカメラを用いて、３７℃で検出可能なＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０  ｐＣＭＯＲ  Ｓａ１の最小数は、約４００ｃ．ｆ．ｕ．であった。しかし、この最小数は、より高感度な、液体窒素冷却積分形ＣＣＤカメラを用いることによって、有意に改善された（以下の実施例１４を参照のこと）。ＭＲＳＡ株は、試験されたプラスミド（ｐＣＭＯＲ  Ｓａ１−２０）に関係なく、ＲＮ４２２０または８３２５−４のいずれかより、有意により多くの光（約４倍）を発した。
【０１７９】
この結果は、本発明の方法を使用して、（ＸＥＮ−３  Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓモデル２４００−３２光子計数ＣＣＤカメラによって測定する場合）１×１０6の生物当り１×１０4ＲＬＵを超えて発し得るグラム陽性の生物を生成し得ることを示す。
【０１８０】
（実施例１４）
（液体培養物中で検出された最小数の生物発光性Ｓ．ＡＵＲＥＵＳおよびＳ．ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥおよびＬ．ＭＯＮＯＣＹＴＯＧＥＮＥＳＥ）
光Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０  ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａｌ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓｐ１６およびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２３０７４  ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａ４の指数培養物を、高感度液体窒素冷却積分ＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｒｅｎｔｏｎ，ＮＪ；ｍｏｄｅｌ  ＬＮ／ＣＣＤ  １３４０−１３００−ＥＢ／１）を使用してモニターし、細菌株のそれぞれの検出可能なｃ．ｆ．ｕ．の最小数を測定した。培養物を、黒９６ウェルマイクロタイタープレート全体に渡って、約１０3／ウェル〜約１０1／ウェルの細菌濃度に２倍希釈（−０．３  ｌｏｇ）で希釈し、１０分間を超えて光についてモニターした。わずか８０ｃ．ｆ．ｕのＳ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの両者を、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｃａｍｅｒａを使用して３７℃で検出し得、約４００ｃ．ｆ．ｕのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが、この同じ方法によって検出可能であった。
【０１８１】
（実施例１５）
（Ｓ．ＡＵＲＥＵＳにおける生物発光の温度安定性）
生物発光を使用して動物中からの病原性細菌をモニターする（Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．ら、（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３）ために、ｌｕｘ遺伝子とＬｕｘタンパク質の両者が、体温（すなわち、３７℃周辺）で十分に機能することが重要である。改変ｌｕｘ遺伝子が、生物発光が最適に細菌細胞内で起こる温度範囲を変えたかどうかを測定するために、改変されたｌｕｘＡＢＣＤＥカセットから発生する光を、３１℃と４７℃の間でグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両者における天然のｌｕｘＣＤＡＢＥから発生する光と比較した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０  ｐＭＫ４  ｌｕｘＣＤＡＢＥ  Ｓａｌは、以先には暗く示された（図２）ので、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０  ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  ＳａｌおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｐＭＫ４  ｌｕｘＣＤＡＢＥ  Ｓａｌのみを、実験のこのセットにおいて試験した。後者の３細菌株の指数培養物は、３０℃で約１０7ｃ．ｆ．ｕ／ｍｌに増え、そして３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７℃でセットした加熱ブロックに各１ｍｌ容量を配置した。細菌を１時間の間各上昇させた温度で順応させ、そして増殖し得た後、９加熱ブロックを、逐次、光子計数ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，ｍｏｄｅｌ  ２４００−３２）のチャンバ内に配置し、そして３培養物のそれぞれからの光を１分間の間記録した。バクテリアの数の変動から生じる相対光単位数におけるエラーを除去するために、各培養物を、ｃ．ｆ．ｕが記録され得るようにプレートし、そして光データは、それに応じて調整された。
【０１８２】
図５から示され得るように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０  ｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１  Ｓａｌの培養物から記録された最大の光は、３７℃であった。さらに、３１℃と４１℃の間で、この株からの光放射は、２時間および４時間でさえ、この最大値の６０％を超えて維持し、Ｌｕｘ酵素が、このより狭い温度範囲内では安定であることを示した。対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｐＣＭＯＲ  ＳａｌおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｐＭＫ４  ｌｕｘＣＤＡＢＥ  Ｓａｌの両者は、４１℃で最大光を与え、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｐＣＭＯＲ  Ｓａｌについては、この温度で実際にわずかにより輝いていた。
【０１８３】
（実施例１６）
（改変されたＬＵＸＡＢＣＤＥオペロンを用いたＬＩＳＴＥＲＩＡ  ＭＯＮＯＣＹＴＯＧＥＮＥＳの形質転換および評価）
改変されたｌｕｘＡＢＣＤＥプラスミドを使用して、実施例１４に上述したようにグラム陽性Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを首尾良く形質転換した。改変されたｌｕｘＡＢＣＤＥオペロンを所有するグラム陽性細菌は、高い生物発光性であり、そしてさらに、動物においてインビボでモニターし得た。抗生物質選択の非存在下でのプラスミド喪失は、観察できる構造的な不安定性を有さず、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来ではインビボで２４時間〜４８時間の期間を超えて最小である（＞８０％プラスミド保持）ことが示された。
【０１８４】
記載される全てのプラスミドは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，８６０  Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ａｖｅｎｕｅ，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４５０１で保管されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、プラスミドｐＣＭＯＲ  Ｇ＋１の模式図である。プラスミド骨格はｐＭＫ４（９）である。ｌｕｘ遺伝子のヌクレオチド配列は、示された順番で、表１に示される関連配列が隣接するＧｅｎＢａｎｋ（受託番号Ｍ９００９３）において与えられるとおりである。プラスミドは、ゲノムＤＮＡ（４塩基切断因子により部分消化される）を、特有のＢａｍＨＩまたはＳｍａＩ部位において連結すること、およびそのＤＮＡが由来するグラム陽性細菌において光について選択することにより、プロモータープローブビヒクルとして使用され得る。
【図２】
図２は、ネイティブｌｕｘＣＤＡＢＥ対改変されたｌｕｘＡＢＣＤＥを含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉからの光発光の比較である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０  ｐＣＭＯＲ  Ｓａ１（−黒四角−）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０  ｐＭＫ４  ｌｕｘＣＤＡＢＥ  Ｓａ１（−黒三角−）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｐＣＭＯＲ  Ｓａ１（．．黒四角．．）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｐＭＫ４  ｌｕｘＣＤＡＢＥ  Ｓａ１（．．黒三角．．）の指数増殖期培養物を、黒の９６ウェルマイクロタイタープレート全体に渡って、二倍希釈（−０．３ｌｏｇ）で稀釈し、そして光子計数ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、モデル２４００−３２）を用いて３０分間に亘って光についてモニターした。次いで、各ウェルの内容物を平板培養して、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数値を生物発光（ＲＬＵ）のレベルと比較させた。ｐＣＭＯＲ  Ｓａ１はまた、ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｐ１としても知られる。
【図３】
図３は、改変されたｌｕｘＡＢＣＤＥの温度安定性を示すプロットである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０  ｐＣＭＯＲ  Ｓａ１（−黒四角−）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｐＣＭＯＲ  Ｓａ１（．．黒四角．．）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｐＭＫ４  ｌｕｘＣＤＡＢＥ  Ｓａ１（．．黒三角．．）の指数増殖期培養物を、３０℃で約１０7ｃｆｕ／ｍｌにまで増殖させ、そして各々１ｍｌの容量を、３１℃、３３℃、３５℃、３７℃、３９℃、４１℃、４３℃、４５℃および４７℃に設定した加熱ブロックに配置した。これらの上昇した温度の各々において、１時間後、９つのこの加熱ブロックを、光子計数ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、モデル２４００−３２）のチャンバの内側に連続的に配置し、そして３つの培養物の各々のからの光を１分間にわたって記録した。示されるのは、これらの温度の各々におけるＲＬＵであり、このデータは、保持される最大の生物発光の百分率として表現され、そしてＣＦＵの数値における変動について調整されている。
【図４】
図４は、パネルＡおよびパネルＢは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ８３２５−２ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｐ１−（パネルＡ）およびＳ．ａｕｒｅｕｓ  ８３２５−４  ｐＭＫ４  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｐ２−（パネルＢ）を感染させたマウスから記録された生物発光データを示すグラフである。各々のデータセットは、アモキシシリン（１０ｍｇ／ｋｇ）での未処置（黒四角）または処置（黒三角）のいずれかの６匹のマウスからのＲＬＵの平均数をあらわす。これらは、背側および腹側の両方で、ＩＣＣＤカメラをもちいて感染後０、４、８および２４時間後において、５分間に亘って画像をとった。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
［配列表］
【表４】
2003509029.tif 000018
2003509029.tif 000019
2003509029.tif 000020
2003509029.tif 000021
2003509029.tif 000022
2003509029.tif 000023
2003509029.tif 000024