(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンボスポンジン１型モチーフ１３を有する組換えジスインテグリン様およびメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質および非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を含む試料から精製するための方法であって、前記方法は：
前記非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物をヒドロキシアパタイトに保持しながら、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が、前記ヒドロキシアパタイトに結合しないことにより、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が前記ヒドロキシアパタイトからのフロースルー分画に現れることを可能にする条件下で、前記試料を前記ヒドロキシアパタイトとクロマトグラフィにより接触させること；
その後、前記フロースルー分画を、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂と、クロマトグラフィにより接触させること；および、
溶出緩衝液を用いて前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を前記陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂から溶出させること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、前記試料を、陰イオン交換樹脂とクロマトグラフィにより接触させることと、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、前記陰イオン交換樹脂から溶出することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を限外濾過によって濃縮することと、前記ヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、ダイアフィルトレーション交換によって、カルシウムイオンおよび亜鉛イオンを含む緩衝液中に安定化することと、をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドロキシアパタイトまたは前記混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂との接触に続いて、緩衝液伝導率を減少させることによって、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を陽イオン交換のために調製するための、調製するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記調製するステップは、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記調製するステップは、透析によって行われ、前記透析は、一回または二回行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記調製するステップは、ゲル濾過によって行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、少なくとも１つのウイルス不活性化ステップまたはウイルス除去ステップに供することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス不活性化ステップは、非イオン性界面活性剤および有機溶媒を含む溶媒−界面活性剤混合物を、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に添加することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、前記ウイルス不活性化ステップ中に固定化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、陽イオン交換樹脂上に固定化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶媒−界面活性剤混合物は、１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、０．３％のリン酸トリ‐Ｎ‐ブチル、および０．３％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルス除去ステップは、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をナノフィルタで濾過して、ウイルスおよび／またはウイルス粒子を除去することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、少なくとも１つのウイルス不活性化ステップまたはウイルス除去ステップに供することをさらに含み、前記ウイルス不活性化ステップまたはウイルス除去ステップは、前記調製するステップの後に行われる、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、勾配溶出を用いて前記陽イオン交換樹脂から溶出することをさらに含み、前記勾配溶出は、低塩含有量を有する第１の緩衝液およびより高い塩含有量を有する第２の緩衝液を用いることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、ステップ溶出を用いて前記陽イオン交換樹脂から溶出することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップ溶出は、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、保存緩衝液により前記陽イオン交換樹脂から溶出することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記保存緩衝液は、７．０超のｐＨを有し、１０ｍＭ未満のカルシウムイオン、緩衝化合物、０．０５％の非イオン性界面活性剤、および塩を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記保存緩衝液を用いた前記陽イオン交換樹脂からの前記溶出のステップに後続の限外濾過もダイアフィルトレーションも緩衝液交換ステップも存在しない、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年７月３１日に出願された米国特許仮出願第６１／２３０，３０８号の利益を主張するものであり、この仮出願は参照によりその全体がこれによって組み込まれ、また我々はこの出願に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、概して、トロンボスポンジン１型モチーフ１３を有する組換えジスインテグリン様およびメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）および他のタンパク質を精製する方法、ならびにかかる精製されたタンパク質を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
メタロプロテイナーゼ遺伝子ファミリー、ＡＤＡＭ（ジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）は、多様な機能を有する膜結合型プロテアーゼであるメンバーを含む。ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーは、Ｃ末端における１つ以上のトロンボスポンジン１様（ＴＳＰ１）ドメイン（複数可）の存在、ならびに典型的にＡＤＡＭメタロプロテイナーゼにおいて観察される、ＥＧＦリピート、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部の非存在によってＡＤＡＭから識別される。
【０００４】
トロンボスポンジン１型モチーフ１３を有するジスインテグリン様およびメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）は、ＡＤＡＭＴＳファミリーのメンバーである。ＡＤＡＭＴＳ１３は、８つのトロンボスポンジンドメインを有し、疎水性膜貫通ドメインを有さない。したがって、それが分泌される。ＡＤＡＭＴＳ１３は、Ｔｙｒ１６０５−Ｍｅｔ１６０６結合においてフォンヴィレブランド因子を開裂し、機能するためにカルシウムおよび亜鉛イオンの両方を必要とする。また、ＡＤＡＭＴＳ１３は、「フォンヴィレブランド因子開裂プロテアーゼ」および「ＶＷＦＣＰ」としても知られる。
【０００５】
不十分なＡＤＡＭＴＳ１３発現は、いくつかの疾患の病変形成、例えば、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）等の血栓性障害に関与している（例えば、米国特許公開第２００７００１５７０３号を参照されたい）。ＴＴＰにおいて、ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損および／または阻害は、身体全体にわたる小血管中に形成される広範な顕微鏡レベルの血栓症をもたらす（血栓性微小血管症）。顕微鏡レベルの血塊を通過する赤血球は、せん断応力を経験し、それが赤血球膜に対する損傷を引き起こし、次に血管内溶血および分裂赤血球形成に至る。また、血栓症も血流減少を引き起こし、それは終末器官損傷をもたらし得る。症状は典型的に、幻覚、奇異な行動、精神状態の変化、脳卒中、または頭痛等の神経学的問題；腎不全；発熱；および打撲傷もしくは紫斑病をもたらす血小板減少症（血小板数減少）；ならびに貧血症および黄疸を伴う微小血管症性溶血性貧血を含む。現在の療法は、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する循環抗体を減少させるための血漿交換療法、および／または酵素の血中濃度を補充することを伴う。
【０００６】
したがって、治療剤として使用することができる、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を、特に商業生産規模で精製する方法を提供することに対する強い必要性が存在する。ＡＤＡＭＴＳ１３の精製は、困難であることが判明しており、クロマトグラフィを含む、種々のアプローチが試みられている。ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が溶出液または上清中に現れることを可能にする、非ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合するクロマトグラフ用物質は、精製のための有用なアプローチを提供するであろう。また、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物が溶液中に残るか、または遥かにより強力に結合する一方で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合するクロマトグラフィ物質は、魅力的なアプローチを提示し、他のアプローチと平行して使用されてもよい。本開示は、かかるアプローチを提供する。
【０００７】
さらに、ウイルス汚染物質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、ならびに他のタンパク質および組換えタンパク質の精製における追加的な課題を提起している。１つの従来のアプローチは、溶液中の溶媒−界面活性剤混合物で精製されるように、試料を処理することを伴っていた。溶媒−界面活性剤化学物質による試料のインキュベーションは、脂質被覆ウイルスの非活性化に至った。しかしながら、この溶液中処理は、例えば、処理後の溶媒−界面活性剤化学物質の除去を促進するために、非効率的に、試料を少なくとも１つの他の槽に移動することを必要とした。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３を含むいくつかのタンパク質は、溶媒−界面活性剤化学物質に感受性が高く、凝集体形成をもたらす。本開示は、ウイルス不活性化のかかる問題に取り組むための、溶媒−界面活性剤処理中のタンパク質の固定化を伴うアプローチを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、トロンボスポンジン１型モチーフ１３を有する組換えジスインテグリン様およびメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質（特に、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３）を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質および非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を含む試料から精製するための方法に関する。驚くべきことに、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物から精製するのに好適な条件下で、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィを使用できることが見出された。本方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質がヒドロキシアパタイトからの溶出液中に現れることを可能にする条件下で、試料を、ヒドロキシアパタイトとクロマトグラフィにより接触させることによって、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を富化することを含む。つまり、不純物を保持しながら、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、好ましくはＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的部分が、ヒドロキシアパタイトに結合しないことを可能にする条件下で、試料がヒドロキシアパタイトによるクロマトグラフィに供される。いくつかの好ましい実施形態では、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、組換えＡＤＡＭＴＳ１３核酸を含むＣＨＯ細胞の培養から収集された上清から精製される。いくつかの好ましい実施形態では、上清または溶出液中のパーセント収率は、驚くべきことに５０％〜１００％である。本方法は、ヒドロキシアパタイトからの溶出液を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂と、クロマトグラフィにより接触させることを含むタンデムクロマトグラフィをさらに含んでもよい。いくつかの好ましい実施形態では、タンデムクロマトグラフィによる富化後のＡＤＡＭＴＳ１３パーセント収率は、驚くべきことに少なくとも６０％である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本方法は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３を濃縮するおよび／またはＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を陰イオン交換樹脂に結合させる、任意の事前富化調製ステップをさらに含む。例えば、本方法は、ヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、試料を、陰イオン交換樹脂とクロマトグラフィにより接触させること、およびＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を陰イオン交換樹脂から溶出すること、ならびに／またはヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を限外濾過によって濃縮すること、ならびに／またはヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、ダイアフィルトレーション交換によって、カルシウムイオンおよび亜鉛イオンを含む緩衝液中に安定化すること、をさらに含んでもよい。いくつかの好ましい実施形態では、タンデムクロマトグラフィの前に、試料は、１０倍〜２０倍の限外濾過によって濃縮され、緩衝液は、３０ｋＤａの分画分子量によるダイアフィルトレーションによって、カルシウムおよび亜鉛イオンを含有する低伝導率緩衝液に交換され、ＡＤＡＭＴＳ１３は、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＰＯＲＯＳ  ５０Ｄ、またはＰＯＲＯＳ  ５０ＰＩ等の陰イオン交換樹脂に結合され、そこから溶出される。いくつかの好ましい実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィステップからの溶出液プールが、伝導率を６ｍＳ／ｃｍに減少させるためにヒドロキシアパタイト−希釈緩衝液で１：４に希釈された後、ヒドロキシアパタイトによるクロマトグラフィ、続いてヒドロキシアパタイトからの溶出液を用いる、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂によるクロマトグラフィを含む、ヒドロキシアパタイトによるタンデムクロマトグラフィが行われる。いくつかの好ましい実施形態では、事前富化ステップ（複数可）からの溶出液は、驚くべきことに少なくとも７５％のパーセント収率を提供し得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒドロキシアパタイトまたは混合モード樹脂とのクロマトグラフィによる接触に続いて、陽イオン交換クロマトグラフィによる任意の仕上げステップをさらに含む。かかる実施形態では、ヒドロキシアパタイトまたは陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂との接触に続いて、本方法は、緩衝液伝導率を減少させることによって、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を陽イオン交換のために調製するステップをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、この調製ステップは、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって、透析によって、および／またはゲル濾過によって行われる。限外濾過／ダイアフィルトレーションが使用されるいくつかの実施形態では、分画は、１０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、緩衝液交換は、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＦＦ  ｌｏｗ  ｓｕｂ上での陰イオン交換クロマトグラフィによって行われる。透析が使用されるいくつかの実施形態では、透析は、単一の透析モジュールへの２回以下の通過からなってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィは、Ｓｏｕｒｃｅ  ＳカラムまたはＰＯＲＯＳ  Ｓカラム上で行われる。いくつかの好ましい実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３パーセント収率は、緩衝液伝導率を減少させた後に、驚くべきことに少なくとも９０％であり、陽イオン交換クロマトグラフィによる仕上げ後には、驚くべきことに少なくとも７０％である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、ウイルスを不活性化するためならびに／またはウイルスおよびウイルス粒子を除去するために、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、任意のウイルス不活性化ステップに供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化ステップは、非イオン性界面活性剤および有機溶媒を含む溶媒−界面活性剤混合物を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に添加することを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、固定化、例えば、陽イオン交換樹脂上に固定化される。いくつかの実施形態では、溶媒−界面活性剤混合物は、１％のＴＲＩＴＯＮＸ−１００、０．３％のリン酸トリ‐Ｎ‐ブチル、および０．３％のＴＷＥＥＮ８０を含み、ならびに／または溶媒−界面活性剤処理は、１２℃〜１６℃で３０分間持続する。代替的にまたは加えて、ウイルス不活性化ステップは、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、ナノフィルタで濾過して、ウイルスおよび／またはウイルス粒子を除去することを含んでもよい。いくつかのかかる実施形態では、ナノ濾過は、溶媒−界面活性剤処理前および／または後に、２０Ｎまたは３５Ｎフィルタを通して行われる。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化ステップは、上述の調製ステップの後に、および／またはタンデムクロマトグラフィステップの後に、および／または上述の陽イオン交換クロマトグラフィの仕上げ後に行われる。いくつかの好ましい実施形態では、ウイルス不活性化後のＡＤＡＭＴＳ１３パーセント収率は、驚くべきことに少なくとも９５％である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、陽イオン交換樹脂から溶出することをさらに含む。いくつかの好ましい実施形態では、勾配溶出、例えば、低塩濃度を有する第１の緩衝液および高塩濃度を有する第２の緩衝液を含む勾配溶出が使用される。いくつかのより好ましい実施形態では、ステップ溶出が使用され、さらにより好ましくは、ステップ溶出は、保存緩衝液による樹脂からのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質溶出を伴う。例えば、保存緩衝液は、７．０超のｐＨを有してもよく、１０ｍＭ未満のカルシウムイオン、緩衝化合物、０．０５％の非イオン性界面活性剤、および塩を含む。いくつかのより好ましい実施形態では、本方法は、保存緩衝液による樹脂からの溶出に続く、後続の濃縮または緩衝液交換ステップを含まない。
【００１３】
特に好ましい実施形態では、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質および非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を含む試料から精製するための方法が提供され、本方法は、試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質がヒドロキシアパタイトからの溶出液または上清中に現れることを可能にする条件下で、ヒドロキシアパタイトとクロマトグラフィにより接触させること、次いで、好ましくはタンデムクロマトグラフィとして、該溶出液を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂と、クロマトグラフィにより接触させることを含む。
【００１４】
別の特に好ましい実施形態では、上述のクロマトグラフィステップに先立って、ヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、試料を、陰イオン交換樹脂とクロマトグラフィにより接触させること、およびＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を陰イオン交換樹脂から溶出すること；ならびに／または試料中のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を限外濾過によって濃縮すること、およびＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、ダイアフィルトレーション交換によって、カルシウムイオンおよび亜鉛イオンを含む緩衝液中に安定化することが行われる。
【００１５】
別の特に好ましい実施形態では、ヒドロキシアパタイトまたは陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂との接触に続いて、本方法は、緩衝液伝導率を減少させることによって、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を陽イオン交換のために調製するステップをさらに含み、ここで調製ステップは、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって、および／または単一の透析モジュールへの２回以下の通過からなる透析によって、および／またはゲル濾過によって行われる。
【００１６】
さらに別の特に好ましい実施形態では、本方法は、試料を、組換えＡＤＡＭＴＳ１３核酸を含むＣＨＯ細胞の培養から収集された上清から得ること；ヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、試料を、陰イオン交換樹脂とクロマトグラフィにより接触させること、およびＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を陰イオン交換樹脂から溶出すること；ならびに／または試料中のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を限外濾過によって濃縮すること；およびヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、ダイアフィルトレーション交換によって、カルシウムイオンおよび亜鉛イオンを含む緩衝液中に安定化すること；続いて試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質がヒドロキシアパタイトからの溶出液または上清中に現れることを可能にする条件下で、ヒドロキシアパタイトとクロマトグラフィにより接触させること；次いで溶出液を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂と、クロマトグラフィにより接触させること；続いて緩衝液伝導率を減少させることによって、例えば、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって；および／または単一の透析モジュールへの２回以下の通過からなる透析によって；および／またはゲル濾過によって、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を陽イオン交換のために調製すること、を含み、任意に、１つ以上のウイルス不活性化ステップをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、ウイルス不活性化ステップは、非イオン性界面活性剤および有機溶媒を含む溶媒−界面活性剤混合物を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に添加することを含み、ここでＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、陽イオン交換樹脂上に固定化され、溶媒−界面活性剤混合物は、１％のＴＲＩＴＯＮＸ−１００、０．３％のリン酸トリ‐Ｎ‐ブチル、および０．３％のＴＷＥＥＮ８０を含む。さらに別の実施形態では、ウイルス不活性化ステップは、溶媒−界面活性剤処理と共に、または溶媒−界面活性剤処理の代わりに、ナノフィルタを使用して、ウイルスおよび／またはウイルス粒子を除去する。いくつかの好ましい実施形態では、上記に概説される全体的な手順のＡＤＡＭＴＳ１３パーセント収率は、驚くべきことに２２〜２４％以上であり、さらにより好ましい実施形態では、凝集体は、驚くべきことに５０％減少させられる。
【００１７】
ＡＤＡＭＴＳ１３が陽イオン交換樹脂上に固定化されているいくつかの実施形態では、本方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、７．０超のｐＨを有し、１０ｍＭ未満のカルシウムイオン、緩衝化合物、０．０５％の非イオン性界面活性剤、および塩を含む保存緩衝液によるステップ溶出を用いて、または低塩含有量を有する第１の緩衝液およびより高い塩含有量を有する第２の緩衝液を含む勾配溶出を用いて、樹脂から溶出することをさらに含む。
【００１８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態に従って調製される、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的組成物、例えば、精製されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質および薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００１９】
本発明のまたさらなる態様は、タンパク質試料中のウイルス汚染物質を不活性化するための方法に関し、ここでタンパク質は、ウイルス汚染物質を有し得る源からの任意のタンパク質であり得る。好ましい実施形態では、タンパク質は、組換えタンパク質、特に、有機溶媒および界面活性剤に曝露されたとき、凝集に感受性が高いタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、特に組換えＡＤＡＭＴＳ１３、または異なるタンパク質（特に、異なる組換えタンパク質）であってもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、血液凝固因子である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、トロンビン、フォンヴィレブランド因子、抗ＭＩＦ抗体、またはクロマトグラフィによって精製されている別のタンパク質のうちの１つ以上である。ウイルス不活性化は、タンパク質精製と併せて、または併せずに行われてもよい。いくつかの実施形態では、本方法は、タンパク質を支持体上に固定化すること、ならびに固定化されたタンパク質を、非イオン性界面活性剤および有機溶媒を含む界面活性剤−溶媒混合物で処理すること含む。いくつかの好ましい実施形態では、支持体は、クロマトグラフ用樹脂である。さらにより好ましい実施形態では、界面活性剤−溶媒混合物は、１％のＴＲＩＴＯＮＸ−１００、０．３％のリン酸トリ‐Ｎ‐ブチル、および０．３％のポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０）を含む。溶媒−界面活性剤混合物処理は、タンパク質がクロマトグラフ用樹脂上、例えば、陽イオン交換樹脂上に固定化されたままである間、長時間、例えば、３０分間〜１時間継続することができ、および／または溶媒−界面活性剤処理は、２℃〜１０℃で生じてもよい。このウイルス不活性化へのアプローチは、驚くべきことに、タンパク質が溶媒中に固定化されない間の溶媒−界面活性剤混合物での処理と比較して、界面活性剤−溶媒混合物での処理中のタンパク質凝集体の形成を、有意な量、例えば、５０％超減少させることができる。いくつかの好ましい実施形態では、この手順に続いて、タンパク質を、形成された少量の凝集体が後の溶出画分中でさらに除去される勾配溶出等の緩衝液により、支持体から溶出することが行われる。いくつかの好ましい実施形態では、この手順に続いて、タンパク質を保存緩衝液により溶出することが行われる。いくつかのより好ましい実施形態では、溶出緩衝液は、０．１％のＴＷＥＥＮ８０の濃縮物を含む。いくつかのさらにより好ましい実施形態では、本方法は、保存緩衝液による樹脂からの溶出に続く、後続の濃縮または緩衝液交換ステップを含まない。いくつかの好ましい実施形態では、凝集体は、驚くべきことに５０％減少させられる。
【００２０】
なおもさらに別の特に好ましい実施形態では、タンパク質試料中のウイルス汚染物質を不活性化するための方法が提供され、本方法は、タンパク質をクロマトグラフ用樹脂上に固定化することと、固定化されたタンパク質を、１％のＴＲＩＴＯＮＸ−１００、０．３％のリン酸トリ‐Ｎ‐ブチル、および０．３％のポリソルベート８０を含む溶媒−界面活性剤混合物で３０分間〜１時間処理することと、を含む。いくつかのかかる実施形態では、本方法は、タンパク質を、７．０超のｐＨを有し、１０ｍＭ未満のカルシウムイオン、緩衝化合物、０．０５％の非イオン性界面活性剤、および塩を含む保存緩衝液により溶出することをさらに含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
トロンボスポンジン１型モチーフ１３を有する組換えジスインテグリン様およびメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質および非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を含む試料から精製するための方法であって、前記方法は、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質がヒドロキシアパタイトからの溶出液または上清中に現れることを可能にする条件下で、前記試料を前記ヒドロキシアパタイトとクロマトグラフィにより接触させることを含む、方法。
（項目２）
前記溶出液を、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂と、クロマトグラフィにより接触させることをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、前記試料を、陰イオン交換樹脂とクロマトグラフィにより接触させることと、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、前記陰イオン交換樹脂から溶出することと、をさらに含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記試料中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を限外濾過によって濃縮することと、前記ヒドロキシアパタイトとのクロマトグラフィによる接触の前に、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、ダイアフィルトレーション交換によって、カルシウムイオンおよび亜鉛イオンを含む緩衝液中に安定化することと、をさらに含む、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記ヒドロキシアパタイトまたは前記陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂との接触に続いて、緩衝液伝導率を減少させることによって、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を陽イオン交換のために調製するステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記調製するステップは、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって行われる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記調製するステップは、透析によって行われ、前記透析は、単一の透析モジュールへの２回以下の通過からなる、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記調製するステップは、ゲル濾過によって行われる、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、少なくとも１つのウイルス不活性化ステップに供することをさらに含む、項目１、２、または５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記ウイルス不活性化ステップは、非イオン性界面活性剤および有機溶媒を含む溶媒−界面活性剤混合物を、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に添加することを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、固定化される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、陽イオン交換樹脂上に固定化される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記溶媒−界面活性剤混合物は、１％のＴＲＩＴＯＮＸ−１００、０．３％のリン酸トリ‐Ｎ‐ブチル、および０．３％のＴＷＥＥＮ８０を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記ウイルス不活性化ステップは、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をナノフィルタで濾過して、ウイルスおよび／またはウイルス粒子を除去することを含む、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記ウイルス不活性化ステップは、前記調製するステップの後に行われる、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、勾配溶出を用いて前記樹脂から溶出することをさらに含み、前記勾配溶出は、低塩含有量を有する第１の緩衝液およびより高い塩含有量を有する第２の緩衝液を用いる、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、ステップ溶出を用いて前記樹脂から溶出することをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記ステップ溶出は、前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、保存緩衝液により前記樹脂から溶出することを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記保存緩衝液は、７．０超のｐＨを有し、１０ｍＭ未満のカルシウムイオン、緩衝化合物、０．０５％の非イオン性界面活性剤、および塩を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
後続の濃縮または緩衝液交換ステップが存在しない、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
項目１、２、または５のいずれか１項に記載の方法に従って調製される組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む、組成物。
（項目２２）
項目１２に記載の方法に従って調製される組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む、組成物。
（項目２３）
タンパク質試料中のウイルス汚染物質を不活性化するための方法であって、前記方法は、
前記タンパク質を支持体上に固定化することと、
前記固定化されたタンパク質を、非イオン性界面活性剤および有機溶媒を含む溶媒−界面活性剤混合物で処理することと、を含む、方法。
（項目２４）
前記タンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３、Ａｄｖａｔｅ、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、フォンヴィレブランド因子、および抗ＭＩＦ抗体から選択される少なくとも１つである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記支持体は、クロマトグラフ用樹脂である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記溶媒−界面活性剤混合物は、１％のＴＲＩＴＯＮＸ−１００、０．３％のリン酸トリ‐Ｎ‐ブチル、および０．３％のポリソルベート８０を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記溶媒−界面活性剤混合物処理は、３０分間〜１時間継続する、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記タンパク質を、保存緩衝液により前記支持体から溶出することをさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記保存緩衝液は、７．０超のｐＨを有し、１０ｍＭ未満のカルシウムイオン、緩衝化合物、０．０５％の非イオン性界面活性剤、および塩を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
後続の濃縮または緩衝液交換ステップが存在しない、項目２８に記載の方法。
【００２１】
本発明のこれらの態様および他の態様は、下記により詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に従って、トロンボスポンジン１型モチーフ１３を有する組換えジスインテグリン様およびメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）を、ＡＤＡＭＴＳ１３および非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を含む試料から精製するための方法の例示的ステップのフロー図を示す。図１に示されるステップの順序は、本明細書に開示される通り、および当業者によって理解される通り、変えられてもよく、および／または１つ以上のステップが省略されてもよい。
【図２】陽イオン交換カラム上での精製実施における変形を示す。図２Ａは、ウイルス不活性化に続く、ステップ溶出による陽イオン交換クロマトグラフィを伴う手順を示し、図２Ｂは、先行するウイルス不活性化が行われない、ステップ溶出による陽イオン交換クロマトグラフィを伴う手順を示し、図２Ｃは、クロマトグラフ用カラム上でのウイルス不活性化が後に続く、勾配溶出による陽イオン交換クロマトグラフィを伴う手順を示し、図２Ｄは、先行するウイルス不活性化が行われない、勾配溶出による陽イオン交換クロマトグラフィを伴う手順を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の一態様は、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物も含み得る、試料からのトロンボスポンジン１型モチーフ１３を有する組換えジスインテグリン様およびメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質の精製のための方法に関する。タンパク質試料はまた、ウイルス汚染物質を含む場合があり、それは、１つ以上のウイルス不活性化ステップにより除去および／または不活性化されてもよい。
【００２４】
本明細書で使用される「トロンボスポンジン１型モチーフ１３を有するジスインテグリン様およびメタロペプチダーゼ」、「ＡＤＡＭＴＳ１３」、「ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質」、「ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド」、および「組換えＡＤＡＭＴＳ１３」は、置き換え可能であり（別段の定めがない限り）、完全長ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の生物活性誘導体または断片であってもよい、組換え哺乳動物ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を指す。完全長ヒトおよびマウスＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質のアミノ酸配列は、Ｑ７６ＬＸ８およびＱ７６９Ｊ６のそれぞれのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（登録商標）受入番号を有する。ヒトＡＤＡＭＴＳ１３に関する構造の詳細および配列情報は、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４１０５９−６３）において見出すことができる。
【００２５】
本明細書で使用される「その生物活性誘導体または断片」という用語は、ＡＤＡＭＴＳ１３のものと同様の、または実質的に同様の生物学的機能を有する、任意のポリペプチドを意味する。その生物活性誘導体または断片のポリペプチド配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失、添加、および／または置換を含んでもよく、その非存在、存在、および／または置換はそれぞれ、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の１つ以上の生物活性に対するいかなる実質的な悪影響をも有しない。例えば、選択的スプライシングは、完全長タンパク質の生物活性断片である１３０ｋＤａ種を生じさせる。上記のポリペプチドの生物活性は、よく知られている方法、例えば、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）に対するＡＤＡＭＴＳ１３のタンパク質分解活性、ならびに／または後続の下流効果の減少および／もしくは遅延を試験する方法によって測定することができる。「下流効果」とは、その効果がＡＤＡＭＴＳ１３機能の直接的な原因であるか、またはその間接的な原因、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３活性後に次々と起こる事象によって生じる効果であるかにかかわらず、その天然基質（複数可）に対するＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の作用の１つ以上の生物学的、生化学的、または生理学的発現を意味する。アッセイとしては、内皮への血小板粘着の減少および／もしくは遅延、血小板凝集の減少および／もしくは遅延、血小板糸状物（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｓｔｒｉｎｇ）の形成の減少および／もしくは遅延、血栓形成の減少および／もしくは遅延、血栓成長の減少および／もしくは遅延、血管閉塞の減少および／もしくは遅延、ｖＷＦ（例えば、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ））のタンパク質分解開裂、ならびに／または血栓の崩壊を試験する方法が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ＡＤＡＭＴＳ１３  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ」と題する米国特許第７，２７０，９７６号の第６欄の５５行目〜第１０欄の３４行目および第１２欄の１行目〜第１８欄の２５行目、ならびに「Ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｈｏｍｏｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」と題する米国特許第７，４６８，２５８号の第１１欄の２６行目〜第１６欄の５０行目を参照されたく、また、「ＡＤＡＭＴＳ１３−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」と題する米国特許公開第２００７００１５７０３号の段落［００３６］、［００４３］〜［００４５］、および［００５３］、ならびに「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ｖｏｎ  ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｓｓａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」と題する米国特許公開第２００７００６５８９５号、ならびに「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｎｅｓｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  Ｐａｔｉｅ��ｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」と題する欧州出願第１９９０４２１Ａ１号を参照されたく、これらは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチドおよびその誘導体および／または断片に対するアッセイに関して、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２６】
組換えＡＤＡＭＴＳ１３、例えば、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３は、当該技術分野で知られる任意の方法によって発現させることができる。１つの具体的な実施例が、組換えＡＤＡＭＴＳ１３ヌクレオチド配列を調製する方法に関して、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０２／４２４４１号に開示される（１４頁の６行目〜１８頁の４行目を参照されたい）。いくつかの実施形態では、組換えＡＤＡＭＴＳ１３は、以下のプロセスに従って産生される：（ｉ）例えば、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅を介した遺伝子工学によって、組換えＡＤＡＭＴＳ１３ヌクレオチド配列を調製すること、（ｉｉ）例えば、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを介する等のトランスフェクションによって、組換えＡＤＡＭＴＳ１３ヌクレオチド配列を真核細胞に導入すること、（ｉｉｉ）例えば、連続的な方法またはバッチ式で、形質転換細胞を培養すること、（ｉｖ）例えば、構成的に、または誘導によって、組換えＡＤＡＭＴＳ１３の発現を可能にすること、（ｖ）例えば、培養培地から、または形質転換細胞を採取することによって、発現された組換えＡＤＡＭＴＳ１３を含む試料を単離すること、および（ｖｉ）本明細書に開示する方法に従って、試料からＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製すること。
【００２７】
組換えＡＤＡＭＴＳ１３は、好適な宿主系、好ましくは、真核生物宿主系、およびより好ましくは、薬理学的に有効なＡＤＡＭＴＳ１３分子を産生することができることを特徴とする系における発現によって産生することができる。真核細胞の例としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ  ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２等の哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞が使用され、この細胞は、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を培養培地中に分泌する。ＡＤＡＭＴＳ１３を組換え技術によって発現するために使用される試薬または条件に具体的な制限はなく、当該技術分野で知られる、または市販のいかなる系が採用されてもよい。
【００２８】
本明細書で使用される「試料」は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質および非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を含む任意の組成物を指す。当業者は、本明細書で使用される試料が、上記のような組換えＡＤＡＭＴＳ１３を産生する結果であり得ることを認識するであろう。したがって、試料は、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を発現する形質転換細胞の培養から回収される上清、培養培地から組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製するプロセスの１つ以上のステップにおいてＡＤＡＭＴＳ１３を含む緩衝液、および／または細胞培養から採取される形質転換細胞を含んでもよい。あるいは、試料は、血液、血漿、または血液もしくは血漿の分画であってもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、１００Ｌの細胞培養上清を含む試料から精製される。しかしながら、当業者は、本発明の方法が、例えば、大規模生産のために必要に応じて拡大されてもよいことを認識するであろう。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、少なくとも約２５０Ｌの試料、少なくとも約５００Ｌの試料、または少なくとも約１，０００Ｌの試料から商業生産の規模でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製することを含む。
【００３０】
本明細書で使用される「非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物」は、概して、プロセス関連不純物を指す。不純物としては、例えば、宿主細胞不純物（宿主細胞抗原とも称される、汚染宿主細胞タンパク質等）、ならびにＤＮＡ、ＲＮＡ、および細胞残屑等の他の生体分子不純物；培地成分（複数可）；溶媒；界面活性剤等を挙げることができる。さらに、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物としてはまた、生成物関連不純物、例えば、生物活性ではないＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の誘導体もしくは断片、またはＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の凝集体が挙げられる。血液または血漿の場合、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物としては、例えば、アルブミン、免疫グロブリン等の、血液または血漿中に通常見出される他のタンパク質を挙げることができる。本明細書で使用される「凝集体」は、巨大分子の二量体、三量体、および他の多量体等の、高分子量構造またはオリゴマー構造に対応する、２つ以上のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド分子、または任意の他のタンパク質分子のうちの２つ以上を含む構造を指す。「非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物」としてはまた、ウイルス汚染物質を挙げることができる。「ウイルス汚染物質」は、例えば、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、またはその断片を含む、ウイルスから生じる、および／またはウイルス由来の任意の不純物を指す。
【００３１】
「精製する」、「精製される」、「精製すること」等の用語は、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物からＡＤＡＭＴＳ１３を除去、単離、または分離することを指す。例えば、植物、細菌、酵母、または哺乳動物宿主細胞中に発現された組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、例えば、宿主細胞タンパク質を含む非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の除去によって精製されてもよい。純度の割合は、宿主細胞タンパク質（例えば、ＣＨＯタンパク質）に対するＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の割合を指してもよい。「実質的に精製された」組換えＡＤＡＭＴＳ１３は、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を少なくとも約６０％、好ましくは、少なくとも約７５％、およびより好ましくは、少なくとも約９０％（または約９５％、約９９％、もしくは約９９．９％）含まない。具体的には、「実質的に精製された」組換えＡＤＡＭＴＳ１３は、宿主細胞タンパク質を少なくとも約６０％、好ましくは、少なくとも約７５％、およびより好ましくは、少なくとも約９０％（または約９５％、約９９％、もしくは約９９．９％）含まない。宿主細胞タンパク質は、例えば、以下により詳細に考察するように、ポリクローナル抗血清を使用した免疫化学的方法によって検出することができる。
【００３２】
汚染物質の除去はまた、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の富化をもたらし得る。本明細書で使用される「富化」、「富化する」、および「富化すること」は、試料中の組換えＡＤＡＭＴＳ１３の割合の増加を指す。したがって、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の富化は、試料の何らかの操作後、例えば、試料を１つ以上のクロマトグラフィステップに供した後、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の割合が増加した時に生じる。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物、特に、宿主細胞タンパク質の少なくとも約１０倍の減少〜約１１５倍の減少がある時に、十分に富化される。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の少なくとも約２０倍（例えば、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍等）の減少がある時に、十分に富化され、特に、この減少は、宿主細胞タンパク質に対して生じる。
【００３３】
当業者は、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物、特に、宿主細胞タンパク質の倍数減少を決定するために、当該技術分野で利用可能な方法を使用することができるだろう。例えば、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物に対するアッセイが利用されてもよい。一実施形態では、試料は、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を発現する形質転換細胞の培養から回収される馴化上清であり、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の倍数減少を決定するためのアッセイは、宿主細胞タンパク質レベルを測定する。１つの特定の実施形態では、形質転換細胞は、形質転換ＣＨＯ細胞であり、アッセイは、ＣＨＯタンパク質を測定する酵素免疫吸着血清アッセイである。非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の倍数減少は、例えば、溶出される非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の量に対する試料中の非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の量として、溶出液中の不純物レベル（例えば、ｐｐｍで）によって割られる装填量中の不純物レベル（例えば、ｐｐｍで）として計算されてもよい。
【００３４】
宿主細胞タンパク質は、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３を製造するために使用される宿主細胞および／または組換えベクター系のタンパク質成分に対してポリクローナル抗血清を使用した免疫化学的方法によって検出されてもよい。概して、抗血清は、宿主細胞由来の抗原に対して上昇させられてもよく、ここで、宿主細胞は、製造プロセスで使用されるがＡＤＡＭＴＳ１３に対する遺伝子コード化を欠く、発現ベクターを含む。宿主細胞不純物は、本明細書に記載するものと同一および／または実質的に同様の方法（複数可）を使用して抽出されてもよい。本明細書に記載するものと同一および／または実質的に同様の方法（複数可）を使用して得られる、精製された（または部分的に精製された）宿主細胞抗原は、次いで、ＡＤＡＭＴＳ１３を製造するために使用される宿主細胞および組換えベクター系のタンパク質成分に対する抗血清の調製のために使用されてもよい。宿主細胞タンパク質は、免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析で、抗血清を使用して検出することができる。宿主細胞タンパク質不純物はまた、存在するタンパク質を検出するために、二次元ゲル電気泳動ならびに銀染色法および／またはコロイド金染色法によって分析されるように、試料を分離することによって検出されてもよい。また、宿主細胞不純物のレベルを定量化するために、ＨＰＬＣが使用されてもよい。しかしながら、ＨＰＬＣ法は、免疫測定法または銀染色法ほど精度が高くない。好ましくは、宿主細胞不純物は、例えば、これらの分析法のうちの１つ以上を使用して、検出可能なレベル未満まで減少させられる。
【００３５】
本明細書で使用される「約」という用語は、指定された値から±１０％の近似範囲を示す。
【００３６】
ＡＤＡＭＴＳ１３の富化
【００３７】
概して、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質および非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を含む試料から、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質（好ましくは、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質）を精製する方法を提供し、本方法は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３の量を富化するために、試料を（ｉ）ヒドロキシアパタイトまたは（ｉｉ）ヒドロキシアパタイトおよび混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂（タンデムで）とクロマトグラフィにより接触させることを含む。本明細書で使用される「クロマトグラフィにより接触させること」は、本明細書に記載する、および／または当該技術分野で知られるクロマトグラフィの任意のモードを使用して、分離される試料または他の混合物をクロマトグラフ用樹脂と接触させることを指す。モードとしては、バッチモードおよびカラムクロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。接触は、樹脂上、樹脂中、または樹脂内に試料を曝露および／またはインキュベートし、樹脂を通して試料を濾過することによって、あるいは任意の他の手段によって達成される。クロマトグラフィのためにしばしば使用される緩衝液は、リン酸緩衝液である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、試料は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質がヒドロキシアパタイトからの溶出液中に生じることを可能にする条件下で、ヒドロキシアパタイトと接触させられる。「条件下」とは、例えば、カラムの高さ、充填、緩衝液（ｐＨ、塩濃度、イオン強度等）、温度、圧力等を含む、クロマトグラフィが実施される１つ以上のパラメータまたは変数を指す。すなわち、試料は、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、好ましくは、ＡＤＭＡＴＳ１３タンパク質の実質的な部分がヒドロキシアパタイトに結合しないことを可能にする条件下で、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供される。カラムクロマトグラフィが使用される場合、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、好ましくは、その実質的な部分は、カラムを通って流動し、それにより、フロースルー分画または溶出液として、カラムから落ちる緩衝液中のＡＤＡＭＴＳ１３に対して富化し、一方で、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物は、保持される。バッチクロマトグラフィが使用される場合、上清または上清分画は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質またはその実質的な部分を含む。「溶出液」は、本明細書において、「フロースルー」、「フロースルー分画」、「上清」、または「上清分画」とほとんど同じ意味で使用される。溶出液（または上清）は、回収することができる。そのような回収は、例えば、試料が樹脂に曝露され、インキュベーションが完了した後に、クロマトグラフ用樹脂の遠心分離、沈降、濾過等によって生じる。ヒドロキシアパタイトから回収される溶出液（または上清）はさらに、本発明に従った１つ以上のステップに供されてもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態では、例えば、本方法はさらに、ヒドロキシアパタイトからの溶出液を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂等の混合モード樹脂とクロマトグラフィにより接触させることを含む。すなわち、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質試料は、最初に、好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分がヒドロキシアパタイトに結合しない条件下で、ヒドロキシアパタイトを用いたタンデムクロマトグラフィに、続いて、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたクロマトグラフィに供されてもよい。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィステップ、および陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を使用した混合モードクロマトグラフィの任意のタンデムステップに関するさらなる詳細を以下に提供する。
【００４０】
（ａ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
【００４１】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィステップは、特に本明細書の開示を踏まえて、本明細書に記載するような、当該技術分野で知られるような、または当業者によって理解され得るような、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィの任意の方法を伴う。ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィの方法は、当該技術分野でよく知られている。ヒドロキシアパタイトは、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の化学式を有し、骨および歯のミネラル、ならびに他の生物学的構造の主成分である。ヒドロキシアパタイトは、そのような天然源から得られてもよく、またはよく知られている方法によって合成されてもよい。ヒドロキシアパタイトは、特に、タンパク質のクロマトグラフィ分離のためのクロマトグラフ媒体または支持体として広く使用される。粒径は、概して重要ではなく、大きく異なってもよい。典型的な粒径は、直径で約１μｍ〜約１，０００μｍ、好ましくは、直径で約１０μｍ〜約１００μｍに及ぶ。多孔率もまた、大きく異なってもよい。好ましい実施形態では、平均孔径は、約１００Å〜約１０，０００Å、より好ましくは、約５００Å〜約３，０００Å、さらにより好ましくは、５００Å〜３，０００Åに及ぶ。
【００４２】
種々のヒドロキシアパタイトクロマトグラフ媒体が市販されており、本明細書に開示する方法の実践において、任意の利用可能な形態の材料を使用することができる。使用され得る市販のセラミックヒドロキシアパタイト材料の限定されない例としては、ＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ（登録商標）、ヒドロキシアパタイトＩおよびＩＩ型（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、およびＨＡ  ＵＬＴＲＯＧＥＬ（登録商標）（ＰＡＬＬ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）が挙げられる。一実施形態では、試料は、ヒドロキシアパタイトＩＩ型（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いたクロマトグラフィに供される。
【００４３】
驚いたことに、試料をヒドロキシアパタイトとクロマトグラフィにより接触させることによって、試料中の非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の有意または実質的な部分がヒドロキシアパタイトに結合する一方で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の有意または実質的な部分は、溶液中に残ることが発見された。したがって、上記に考察するように、ヒドロキシアパタイトによる試料の処理は、よく知られている方法に従って、バッチモードで、またはカラムクロマトグラフィモードで実施されてもよく、十分に富化されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、上清中または溶出中のそれぞれに回収される。
【００４４】
本明細書で使用される「実質的な部分」は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィステップの前のものと比較して、試料からの組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の約３０％〜約１００％（例えば、約４０％〜約９０％、例えば、約５０％〜約８０％、例えば、約６０％〜約７０％）の上清または溶出液における回収収率を指す。例えば、約５０％〜約１００％の上清または溶出液における回収収率は、試料が、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分が流動することを可能にする条件下で、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供されたことを示す。
【００４５】
好ましい実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィに供される試料は、例えば、室温で約３ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍの間、好ましくは、室温で約１０ｍＳ／ｃｍ未満の低い伝導率を有する。一実施形態では、試料は、室温で６ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。別の実施形態では、試料は、室温で７ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。当業者は、試料の伝導率が、中性塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等を含む食塩水で調整されてもよく、約２０ｍＭのリン酸緩衝液で好適に緩衝され得ることを容易に理解するであろう。試料は、好ましくは、約６．５〜約９．０の間のｐＨを有し、好ましくは、７〜８の間のｐＨを有する。試料は、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の十分な結合を可能にする任意の時間の長さにわたって、例えば、約５分〜約２４時間にわたって、ヒドロキシアパタイトと接触したままであってもよい。富化されたＡＤＡＭＴＳ１３は、上清分画またはフロースルー分画中に回収されてもよく、それは、後続の洗浄、特に第１の洗浄からの溶出液を含んでもよい。
【００４６】
一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分が上清または溶出液中に残ることを可能にする条件下で、試料を、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供することによって、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィの前の試料と比較して、富化されたＡＤＡＭＴＳ１３、例えば、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物、特に、宿主細胞タンパク質の約１０倍の減少〜約１１５倍の減少がもたらされる。一実施形態では、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィは、試料中の宿主細胞タンパク質を少なくとも約２０倍（例えば、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、例えば、約１００倍等）減少させる。
【００４７】
好ましい実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分が上清または溶出液中に残ることを可能にする条件下で、試料を、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供することによって、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物、特に、宿主細胞タンパク質の約９０％〜約９９％の除去がもたらされる。一実施形態では、試料を、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供することによって、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の少なくとも約９０％（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％等）の除去、特に、宿主細胞タンパク質の除去がもたらされる。したがって、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分が上清または溶出液中に残ることを可能にする条件下で、試料を、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供することによって、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に対して富化することを含む、本明細書に開示する方法はまた、実質的に精製されているＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む、緩衝液を提供してもよい。
【００４８】
ＡＤＡＭＴＳ１３の実質的な部分がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィカラムを通って流動することを可能にする例示的なカラム条件を、以下の実施例に提供する。概して、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィ中にＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分が流動することを可能にするために、クロマトグラフィカラムは、好ましくは、約５ｃｍ〜約３０ｃｍ、例えば、２０ｃｍ〜３０ｃｍの間のベッド高さを有する。さらに、試料を、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供する前に、例えば、試料をヒドロキシアパタイトカラムに装填する前に、カラムは、最初に、よく知られている洗浄緩衝液、活性化緩衝液、および／または平衡化緩衝液、特に、ヒドロキシアパタイトの製造業者によって推奨されるものを用いて、それぞれ、洗浄され、活性化され、および／または平衡化されてもよい。一実施形態では、カラムは、同一の緩衝液、例えば、２０ｍＭのＮａ／Ｋ  ＰＯ４を含み、７．０のｐＨを有し、室温で５．５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する緩衝液を用いて、活性化および平衡化される。
【００４９】
（ｂ）混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用クロマトグラフィ
【００５０】
一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ヒドロキシアパタイト、続いて、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたタンデムクロマトグラフィによって富化される。驚いたことに、ＡＤＡＭＴＳ１３が混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に結合する一方で、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物は、溶液中に残るか、あるいは混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂にはるかに強固に結合することが発見された。したがって、ヒドロキシアパタイトによる試料の処理、続いて、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂による処理は、よく知られている方法に従って、連続的バッチモードで、または連続的カラムクロマトグラフィモードで実施されてもよく、十分に富化されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、試料を、タンデムバッチモードクロマトグラフィまたはタンデムカラムクロマトグラフィのそれぞれに供した後、最終上清分画または最終溶出液プール中に回収されてもよい。したがって、本明細書に記載するように、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分が上清中に残ること、または溶出液として、ヒドロキシアパタイトを含むカラムを通って流動することを可能にする条件下で、試料を、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供することによって富化される。ヒドロキシアパタイトによる処理後、富化されたＡＤＡＭＴＳ１３を含む回収された上清または溶出液は、随意に、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたバッチモードまたはカラムクロマトグラフィに供される。一実施形態では、ヒドロキシアパタイトステップからの上清または溶出液は、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を含むクロマトグラフィカラム送り込まれる。混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたバッチモードまたはカラムクロマトグラフィは、特に本明細書の開示を踏まえて、本明細書に記載するような、当該技術分野で知られるような、または当業者によって理解され得るような、任意の方法によって実施することができる。ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィの後の使用に好適な、好ましい混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂は、親水性リンカーを含むセファロースベースのマトリクスである。親水性リンカーは、例えば、チオエーテル基を介して、機能的リガンドを含んでもよい。親水性リガンドは、負に帯電していてもよく、さらに、疎水性基、例えば、炭化水素を含んでもよい。さらに疎水性基を含む親水性リガンドは、混合モードリガンド、すなわち、本明細書に記載するような混合モードクロマトグラフィを実施するのに好適な、マルチモーダル機能性を有するリガンドを作成することができる。いくつかの実施形態では、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂のイオン容量は、約０．０７ｍＭ／ｍＬ〜約０．０９ｍＭ／ｍＬの間であってもよく、約２〜約１４の間のｐＨ安定性を有してもよい。概して、ＡＤＡＭＴＳ１３は、イオン結合、水素結合、および／または疎水結合を介して、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に結合する。
【００５１】
本明細書に記載する方法に従って使用され得る、市販の混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂の例としては、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣ培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＳａｍｐｌｉＱ  ＳＡＸ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂は、ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣである。ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣは、約７５μｍの平均粒径を有する硬質の高度に架橋されたビーズアガロースに基づく、マルチモーダル弱陽イオン交換体である。それは、高い塩濃度でタンパク質に結合する、マルチモーダル機能性を有するリガンドを含む。それは、約３バール（約０．３ＭＰａ）における水とほぼ同一の粘度を有する処理緩衝液を使用して、約２０℃で、約１０ｃｍ〜約２０ｃｍのベッド高さを有する約１ｍの直径のカラムに対して、約６００ｃｍ／時間の典型的な流速を有する。
【００５２】
混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたクロマトグラフィ中、ＡＤＡＭＴＳ１３は、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に結合し、さらに、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物（例えば、富化前の試料中に存在する宿主細胞タンパク質）から単離される。」混合モードクロマトグラフィステップがカラム上で実施される場合、陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を吸収し、一方で、汚染非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物は、プロセス流れから除去され、クロマトグラフィカラムを通って流動することによって、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質から分離される。
【００５３】
ＡＤＡＭＴＳ１３が吸収される混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂は、次いで、例えば、緩く結合した汚染物質もしくは不純物を除去するために、および／または樹脂からのＡＤＡＭＴＳ１３の溶出のために調製物中の緩衝液伝導率を調節するために洗浄される。すなわち、試料がヒドロキシアパタイトとクロマトグラフィにより接触させられ、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む回収された上清または溶出液が、混合モード陽イオン／疎水性相互作用樹脂とクロマトグラフィにより接触させられ、それに吸収された後、混合モード陽イオン／疎水性相互作用樹脂は、洗浄緩衝液で洗浄される。概して、洗浄緩衝液は、緩衝リン酸イオンおよび中性塩を含み、緩衝液の関連パラメータが増加させられるにつれて、例えば、緩衝液の塩濃度および／またはｐＨの増加と共に、混合モード陽イオン／疎水性相互作用樹脂へのＡＤＡＭＴＳ１３の結合が弱められるように、高いｐＨを有する。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３に結合した混合モード陽イオン／疎水性相互作用樹脂は、最初に、平衡化緩衝液、例えば、約２０ｍＭのリン酸塩および約２５ｍＭのＮａＣｌを含み、室温で約７．０のｐＨを有する平衡化緩衝液で洗浄される。後続の洗浄は、例えば、約２０ｍＭのリン酸塩、約８０ｍＭのＮａＣｌを含み、室温で約８．０のｐＨを有する洗浄緩衝液で実施されてもよい。ＡＤＡＭＴＳ１３に結合した混合モード陽イオン／疎水性相互作用樹脂は、例えば、５０ｍＭのＮａ／Ｋ  ＰＯ４および１６０ｍＭのＮａＣｌを含み、室温で８．０のｐＨおよび１６．５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する緩衝液を用いた、最終洗浄に供されてもよい。
【００５４】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、続く、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いた混合モードクロマトグラフィ、および任意の洗浄後に、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、溶出緩衝液で混合モードクロマトグラフ用樹脂から溶出される。概して、溶出緩衝液は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの緩衝イオン、例えば、２０ｍＭ〜５０ｍＭの緩衝イオンを含む。例示的な緩衝液としては、リン酸塩、トリス、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ヒスチジン、ＭＥＳ、クエン酸塩、グリシルグリシン、トリス／酢酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。溶出緩衝液はまた、概して、好ましくは、塩形態で高濃度の、ナトリウム、カリウム、またはカルシウムイオン等であるが、これらに限定されない、一価または二価陽イオンを含む（例えば、Ｃｌ、ＰＯ４、ＳＯ４、またはＯＡｃ陰イオン等を有する）。好ましい実施形態では、溶出緩衝液は、高濃度のナトリウムイオン、例えば、約７００ｍＭを超えるＮａ＋を含む。溶出緩衝液は、約７〜約１１に及ぶｐＨを有してもよい。一実施形態では、溶出緩衝液は、５０ｍＭのＮａ／Ｋ  ＰＯ４、１，０００ｍＭのＮａＣｌを含み、室温で８．０のｐＨおよび９３ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。
【００５５】
ヒドロキシアパタイトカラムから得られる富化されたＡＤＡＭＴＳ１３がカラム中で混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に結合し、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物から単離されることを可能にする例示的な条件を、以下の実施例に提供する。概して、混合モード陽イオン交換／疎水性クロマトグラフィカラムのベッド高さは、試料の量に応じて、約１ｃｍ〜約１００ｃｍ、またはさらに高くてもよい。さらに、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用クロマトグラフィカラムのカラム容積に対するヒドロキシアパタイトクロマトグラフィカラム容積の比は、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３量と比較した、試料中の非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物の量に応じて、約１０：１であってもよい。
【００５６】
さらに、当業者は、タンデムヒドロキシアパタイトおよび混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたクロマトグラフィを含む実施形態に対して、洗浄、活性化、および／または平衡化のために使用される樹脂および緩衝液は、ある特定の実施形態において、両方のカラムに適合するように選択されることを認識するであろう。一実施形態では、カラムは、別々に活性化される。別の実施形態では、カラムは、タンデムで１回平衡化され、装填され、洗浄され、続いて、１つ以上の第２または後続の洗浄（複数可）および溶出（複数可）が混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に対してのみ適用される。一実施形態では、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用クロマトグラフィカラムを活性化および平衡化するための緩衝液は、ヒドロキシアパタイトカラムを活性化および平衡化するために使用されるものと同一である。一実施形態では、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用クロマトグラフィカラムを活性化および平衡化するための緩衝液は、２０ｍＭのＮａ／Ｋ  ＰＯ４を含み、室温で７．０のｐＨおよび５．５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する緩衝液である。
【００５７】
好ましい実施形態では、試料は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分がヒドロキシアパタイト樹脂を通って流動し、続いて、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に結合し、次いで、そこから溶出されることを可能にする条件下で、タンデムヒドロキシアパタイトおよび混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたクロマトグラフィに供される。より好ましい実施形態では、このタンデムクロマトグラフィは、十分に富化されたＡＤＡＭＴＳ１３をもたらす。いくつかの実施形態では、試料、例えば、予め富化されてもよい、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を発現する形質転換宿主細胞の培養から回収される馴化上清を、本明細書に記載するタンデムクロマトグラフィに供することによって、約４０％〜約８０％のＡＤＡＭＴＳ１３（例えば、約４５％〜約７５％の間、例えば、約５０％〜約７０％の間、例えば、約５５％〜約６５％）、および／または約４０％〜約９０％の活性（例えば、約４５％〜約８５％の間、例えば、約５０％〜約８０％の間、例えば、約５５％〜約７５％）を得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、タンデムクロマトグラフィは、約９０％〜約９９％の宿主細胞不純物を除去する。一実施形態では、本明細書に記載するようなタンデムクロマトグラフィは、試料をタンデムクロマトグラフィに供する前のＡＤＡＭＴＳ１３の純度と比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３の純度を少なくとも約６００倍、例えば、少なくとも約６５０倍、例えば、少なくとも約７００倍、例えば、少なくとも約８００倍、例えば、少なくとも約９００倍、例えば、少なくとも約１，０００倍、例えば、少なくとも約１，１００倍、例えば、少なくとも約１，２００倍、例えば、少なくとも約１，３００倍、例えば、少なくとも約１，４００倍、または少なくとも約１，５００倍増加させる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、試料、例えば、好ましくは、ＵＦ／ＤＦおよび／または陰イオン交換によって予め富化されてもよい、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を発現する形質転換宿主細胞の培養から回収される馴化上清を、本明細書に記載するタンデムクロマトグラフィに供することによって、約６００〜約１，５００ｐｐｍの非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物（例えば、宿主細胞抗原）を有する試料がもたらされる。例えば、タンデムクロマトグラフィは、約７５０〜約１２５０ｐｐｍの非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を有する試料、好ましくは、約１，０００ｐｐｍ未満の非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を有する試料をもたらし得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、タンデムクロマトグラフィは、タンデムクロマトグラフィ前の試料と比較して、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物（特に、宿主細胞抗原）の約１，０００倍の減少〜約３，０００倍の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、予め富化されてもよい、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を発現する形質転換宿主細胞の培養から回収される馴化上清を、本明細書に記載するタンデムクロマトグラフィに供することによって、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物（例えば、宿主細胞抗原）は、少なくとも約１，０００倍、例えば、少なくとも約１，３００倍、例えば、少なくとも約１，５００倍、例えば、少なくとも約２，０００倍、例えば、少なくとも約２，５００倍、例えば、少なくとも約３，０００倍等減少する。
【００６１】
したがって、好ましい実施形態では、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を含む、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂からの溶出緩衝液は、実質的に精製されているＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む組成物を提供する。
【００６２】
試料の富化前調製
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法はさらに、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィ、またはヒドロキシアパタイトおよび混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたタンデムクロマトグラフィによる富化のために、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む試料を調製することを含む。この任意の富化前ステップでは、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３は、（ａ）限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮される、および／または（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ１３が結合し、続いて、そこから溶出されるイオン交換樹脂と、クロマトグラフィにより接触させられる、のいずれかまたは両方であってもよい。
【００６４】
（ａ）富化前限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）
【００６５】
任意の富化前ステップでは、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３は、富化前限外濾過によって濃縮され、試料の緩衝液は、ダイアフィルトレーションによって交換される。富化前限外濾過／ダイアフィルトレーションステップは、典型的には、上記のようなヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィ、またはヒドロキシアパタイト、続いて、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたタンデムクロマトグラフィによって、ＡＤＡＭＴＳ１３の富化前に実施される。富化前限外濾過／ダイアフィルトレーションステップは、典型的には、任意の富化前陰イオン交換クロマトグラフィの前（実施される場合）に実施される。この富化前限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）ステップは、低分子量成分、例えば、細胞培養培地の低分子量成分を除去するのに有効であり得る。そのような成分は、後続のクロマトグラフィカラムに結合し、ＡＤＡＭＴＳ１３のカラムの容量を減少させ得る。したがって、富化前ＵＦ／ＤＦは、後のクロマトグラフィステップに対する装填を最適化することができる。一実施形態では、約３０ｋＤａ未満の低分子量成分、または少なくともその実質的な部分は除去される。いくつかの実施形態では、除去される（または実質的に除去される）低分子成分は、約６０ｋＤａ未満、約５５ｋＤａ未満、約５０ｋＤａ未満、約４５ｋＤａ未満、約４０ｋＤａ未満、約３５ｋＤａ未満、約３０ｋＤａ未満、約２５ｋＤａ未満、約２０ｋＤａ未満等の成分である。
【００６６】
富化前限外濾過／ダイアフィルトレーションステップはまた、ある特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を後続の処理のための適切な緩衝溶液に変換するために、および／または試料をさらに濃縮するために使用される。一実施形態では、適切な緩衝溶液は、富化前陰イオン交換クロマトグラフィに適した低伝導率緩衝液である（そのような陰イオン交換クロマトグラフィが実施される場合）。例えば、低伝導率緩衝液は、室温で約１０ｍＳ／ｃｍ未満、例えば、約７ｍＳ／ｃｍ〜約８ｍＳ／ｃｍ、例えば、７ｍＳ／ｃｍの伝導率を有し、約７．０以上のｐＨを有してもよい。
【００６７】
別の実施形態では、適切な緩衝溶液は、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂上のクロマトグラフィが続いてもよい、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィによる富化に適した、富化緩衝液である。例えば、富化緩衝液は、２０ｍＭのＮａ／Ｋ  ＰＯ４を含み、室温で約７のｐＨを有してもよい。別の実施形態では、適切な緩衝溶液はまた、カルシウムおよび／または亜鉛イオンを含み、それらのいずれかまたは両方は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を安定させる。一実施形態では、適切な緩衝溶液は、約１０ｍＭ未満、例えば、２ｍＭの濃度のカルシウムイオンを含む。別の実施形態では、適切な緩衝溶液は、約５０μｍ未満、例えば、５μｍの濃度の亜鉛イオンが添加される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、適切な緩衝溶液は、約７．０以上のｐＨを有する溶液中で緩衝能力を有する緩衝剤を含む。一実施形態では、緩衝剤は、リン酸塩、トリス、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ヒスチジン、ＭＥＳ、クエン酸塩、グリシルグリシン、トリス／酢酸塩等から成る群より選択される。
【００６９】
この富化前ＵＦ／ＤＦステップ後に得られる試料は、後続の精製ステップで使用されてもよく、例えば、試料は、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィ、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、続いて、陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂上の混合モードクロマトグラフィによって除去される宿主細胞タンパク質を含む、ＵＦ／ＤＦ濃縮プールであってもよい。いくつかの実施形態では、富化前ＵＦ／ＤＦステップ後の試料は、富化前ＵＦ／ＤＦステップ前の試料と比較して、約１０倍〜約２０倍、例えば、約１５倍濃縮されている。
【００７０】
（ｂ）富化前陰イオン交換クロマトグラフィ
【００７１】
別の任意の富化前ステップは、富化前クロマトグラフィを含み、これは、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィ、またはヒドロキシアパタイト、続いて、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたタンデムクロマトグラフィによるＡＤＡＭＴＳ１３の富化前に実施されてもよい。当業者は、富化前クロマトグラフィが任意の富化前限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ後に実施されてもよいことを認識するであろう。あるいは、富化前クロマトグラフィは単独で、すなわち、任意の富化前限外濾過／ダイアフィルトレーションステップなしで実施されてもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、富化前クロマトグラフィステップは、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む試料を、陰イオン交換樹脂とクロマトグラフィにより接触させること、および陰イオン交換樹脂からＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を溶出することを含む。すなわち、ＡＤＡＭＴＳ１３は、陰イオン交換樹脂に結合され、続いて、そこから溶出される。本明細書で使用される「陰イオン交換樹脂」という用語は、陰イオン交換クロマトグラフィに好適であり、例えば、正電荷基によって正味の正電荷を有する（中性ｐＨで）、任意の樹脂を指す。例としては、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）、ジメチルエタノールアミン（ＤＭＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、第４級アミノエタン（ＱＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、第４級アンモニウム（Ｑ）等、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
一実施形態では、陰イオン交換樹脂はまた、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：大きな孔、潅流挙動、および対流挙動。本明細書に開示する富化前ステップで使用され得る市販の陰イオン交換樹脂の限定されない例としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＡＮＸ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｌｏｗ  ｓｕｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ，Ｇｒｏｖｅ  Ｃｉｔｙ，ＯＨ）、ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＣＩＭ（登録商標）；ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ−ＤＭＡＥ（Ｃａｐｉｔｏｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ−ＴＭＡＥ（Ｃａｐｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｍａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＤＥＡＥ（Ｃｈｉｓｓｏ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｙｅ，ＮＹ）等が挙げられる。
【００７４】
富化前陰イオン交換クロマトグラフィの間、ＡＤＡＭＴＳ１３は、陰イオン交換樹脂に結合し、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物（例えば、富化前ＵＦ／ＤＦ濃縮プール中の存在し得る宿主細胞成分）から単離される。概して、陰イオン交換樹脂がＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を吸収する一方で、作用ｐＨよりも大きい等電点を有する非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物は、陰イオン交換カラムを通って流動することによって、プロセス流れから除去される。作用ｐＨ未満の等電点を有する非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物は、それらが、好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質と共溶出しないように、樹脂により強固に、好ましくは、はるかに強固に結合する。ＡＤＡＭＴＳ１３が吸収されるカラムは、次いで、例えば、緩く結合した不純物もしくは汚染物質を除去するために、および／または溶出のために調製物中の緩衝液の伝導率を調節するために、溶出前に洗浄される。典型的には、結合したＡＤＡＭＴＳ１３は、緩衝液のイオン強度を増加させることによって、陰イオン交換樹脂から溶出される。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は、段階溶出によって溶出される。概して、装填された試料および洗浄緩衝液は、室温で、約７〜約９の間、例えば、７．７のｐＨ、および約１０ｍＳ／ｃｍ未満（例えば、６．５ｍＳ／ｃｍ）の伝導率を有する。溶出緩衝液（複数可）は、室温で、約６〜約９（例えば、７）のｐＨ、および約１０ｍＳ／ｃｍよりも大きい（例えば、１６．５ｍＳ／ｃｍ）伝導率を有してもよい。
【００７５】
典型的には、陰イオン交換クロマトグラフィステップからの溶出液は、約６０％〜約１２０％のＡＤＡＭＴＳ１３活性をもたらし（例えば、約７０％、または約８０％〜約１０７％のＡＤＡＭＴＳ活性をもたらし）、および／または約２０％〜約７０％の純度（例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％等の純度）を有する組換えＡＤＡＭＴＳ１３を含む。一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィは、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を約２倍〜約５倍減少させる。好ましい実施形態では、富化前調製後のパーセント収率は、約７５％であり得る。
【００７６】
溶出されたＡＤＡＭＴＳ１３は、次いで、上記のように、試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分が流動することを可能にするヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供すること、または試料を、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分が流動することを可能にする条件下でのヒドロキシアパタイトを用いたタンデムクロマトグラフィ、続いて、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたクロマトグラフィに供することによって、富化されてもよい。
【００７７】
ウイルス不活性化
【００７８】
当業者は、ウイルス不活性化の方法が、ウイルス汚染物質（例えば、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、およびその断片を含む、ウイルスから生じる、および／またはウイルス由来の不純物）を含む、または潜在的に含む試料から、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を精製するのに特に有用であり得ることを認識するであろう。したがって、一実施形態では、本明細書に開示する方法はさらに、少なくとも１つのウイルス不活性化ステップを含む。「ウイルス不活性化」という用語は、ウイルスが溶液中に維持されるが、非活性化または不活性化される（例えば、脂質エンベロープウイルスの脂質被覆を溶解することによって、生存不能の状態にされる）状態、ならびに試料からのウイルスおよび／またはウイルス汚染物質の物理的除去（例えば、サイズ排除によって）のいずれかまたは両方を指す。したがって、本明細書の開示に関連して、「ウイルス不活性化」は、ウイルス非活性化およびウイルス除去のいずれかまたは両方を指す。
【００７９】
実施される場合、ウイルス不活性化は、全精製プロセスを通して１回、または２回以上生じてもよい。さらに、それは、試料を、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィに供する前または後に生じてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化は、以下により詳細に記載する陽イオン交換クロマトグラフィによる任意の仕上げステップの前および後に生じる。しかしながら、当業者は、もしある場合、ウイルス不活性化が随意に、精製プロセス中の任意のステップにおいて生じてもよいことを認識するであろう。さらに、当業者は、ウイルス不活性化の適切なタイミングを認識することができる。
【００８０】
脂質エンベロープウイルスを生存不能の状態する方法は、当該技術分野でよく知られている。概して、試料中の脂質エンベロープウイルスを非活性化（または不活性化）する方法は、試料に溶媒／界面活性剤混合物を添加することを含む（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）“Ｔｒｉ（ｎ−ｂｕｔｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｃｅｎｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ５２：５３−５９（特に、５４〜５５頁を参照されたい）、ならびに米国特許第４，５４０，５７３号（第７欄の９行目〜１２欄の４２行目）、第４，７６４，３６９号（第７欄の１７行目〜１２欄の４７行目）、第４，９３９，１７６号（第３欄の５９行目〜１０欄の１４行目）、第５，１５１，４９９号（第２欄の５９行目〜１１欄の３８行目）、第６，０９０，５９９号（第４欄の２０行目〜８欄の６７行目）、第６，４６８，７３３号（第５欄の１２行目〜９欄の３６行目）、および第６，８８１，５７３号（第５欄の６３行目〜１４欄の９行目）を参照されたく、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。脂質被覆ウイルスを非活性化するために使用される溶媒／界面活性剤の組み合わせは、当該技術分野で知られる任意の溶媒／界面活性剤の組み合わせであってもよく、好ましくは、非イオン性界面活性剤および有機溶媒を含む。限定されない例としては、リン酸トリ−Ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）およびＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、ならびにＴＷＥＥＮ  ８０（登録商標）（ＣＡＳ  ９００５−６５−６）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、コール酸ナトリウム等が挙げられる。溶媒（複数可）および／または界面活性剤（複数可）の濃度は、当該技術分野で一般的に使用される濃度、例えば、約０．１％を超えるＴｎＢＰおよび約０．１％を超えるＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）であってもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、溶媒／界面活性剤混合物がウイルスを不活性化する条件は、約３０分〜約２４時間、好ましくは、約３０分〜約１時間、約５〜約８に及ぶｐＨレベル、および約２℃〜約３７℃、好ましくは、約１２℃〜約２５℃に及ぶ温度で、約１０〜約１００ｍｇ／ｍＬの溶媒／界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、混合物は、処理中にわずかに振動させられるか、または撹拌される。一実施形態では、ウイルス不活性化ステップは、少なくとも１時間にわたって、１５℃〜２５℃で、試料に溶媒／界面活性剤混合物（例えば、０．３％のＴｎＢＰ、１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、および０．３％のＴＷＥＥＮ  ８０（登録商標）を含む、溶媒／界面活性剤混合物として）を添加することを含む。別の実施形態では、試料は、３０分にわたって、１２℃〜１６℃で、０．３％のＴｎＢＰ、１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、および０．３％のＴＷＥＥＮ  ８０（登録商標）を含む溶媒／界面活性剤混合物で処理される。ポリソルベートまたはコール酸塩およびリン酸トリ−ｎ−ブチルの組み合わせ等の、当業者に明らかとなるように、他の溶媒／界面活性剤の組み合わせおよび／または好適な条件が使用されてもよい。そのような組み合わせは、例えば、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、またはそれ以上のより長い処理時間を必要とする場合がある。
【００８２】
不活性化は、当該技術分野で知られる任意の手段によってもたらされ得る。例えば、不活性化は、希釈によって、好ましくは、冷たい希釈緩衝液を用いた希釈によって停止することができる。例えば、いくつかの実施形態では、不活性化は、約２０ｍＭのＭＥＳを含み、室温で約６のｐＨを有する、ある容積の冷たい希釈緩衝液を用いた希釈によって停止される。
【００８３】
溶媒／界面活性剤の組み合わせを用いて脂質被覆ウイルスを非活性化した後、溶媒／界面活性剤混合物は、除去されてもよい。例えば、溶媒／界面活性剤混合物は、クロマトグラフィまたは他の好適な手段を用いて除去されてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）樹脂（Ｂｉｏｓｅｐｒａ  Ｉｎｃ．，ＭＡ）等の溶媒／界面活性剤除去（ＳＤＲ）樹脂を用いたクロマトグラフィが使用される（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４６８，７３３号（第５欄の１２行目〜９欄の３６行目）を参照されたい）。
【００８４】
固定化タンパク質を用いたウイルス汚染物質の不活性化
【００８５】
いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化は、タンパク質が固定化されると同時の、溶媒／界面活性剤を用いたウイルス非活性化を含む。そのような手順は、本明細書に記載するＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチドのウイルス不活性化で、ならびに他のタンパク質に対して使用されてもよい。他のタンパク質としては、免疫系タンパク質（抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、Ｆｃ融合、主要組織適合抗原、Ｔ細胞受容体）、酵素（酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ）、構造タンパク質、線維性タンパク質（アクチン、Ａｒｐ２／３、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、スペクトリン、タウタンパク質、チューブリン等の細胞骨格タンパク質、およびコラーゲン、エラスチン、Ｆ−スポンジン等の細胞外マトリクスタンパク質）、球状タンパク質、血漿タンパク質（血清アルブミンおよび血清アミロイドＰ成分）、凝固因子（補体タンパク質、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブリン、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、タンパク質Ｚ−関連プロテアーゼ阻害剤、トロンビン、フォンヴィレブランド因子等）、Ｃ反応性タンパク質、ヘムタンパク質、細胞接着タンパク質（カドヘリン、エペンジミン、インテグリン、ＮＣＡＭ、セレクチン）、膜貫通輸送タンパク質（ＣＦＴＲ、グリコホリンＤ、スクランブラーゼ）、イオンチャネル（アセチルコリン受容体カリウムチャネル）、シンポート／アンチポートタンパク質（グルコース輸送体）、ホルモンおよび成長因子（上皮成長因子インスリン、インスリン様成長因子、オキシトシン）、受容体（膜貫通受容体、Ｇ−タンパク質共役受容体、ロドプシン、エストロゲン受容体等の細胞内受容体）、ＤＮＡ結合タンパク質（ヒストン）、転写調節タンパク質（ｃ−ｍｙｃ  ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＰ３、ＭｙｏＤ、ｐ５３）、栄養貯蔵／輸送タンパク質（フェリチン）、シャペロンタンパク質、高分子複合体（ヌクレオソーム、リボ核タンパク質、シグナル認識粒子、スプライセオソーム）等を含む、任意のタンパク質、またはウイルス汚染物質を有し得る源からの生物学的製剤を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、タンパク質は、組換えタンパク質、特に、有機溶および界面活性剤に曝露されたとき、凝集に感受性が高いタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、特に、組換えＡＤＡＭＴＳ１３、または異なるタンパク質（特に、異なる組換えタンパク質）である。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、血液凝固因子である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＩ因子、トロンビン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、トロンビン、フォンヴィレブランド因子、抗ＭＩＦ抗体、ならびに特に、クロマトグラフィ精製を受けやすいタンパク質、および／または溶媒／界面活性剤を用いた処理に感受性が高いタンパク質のうちの１つ以上である。したがって、本発明の別の態様は、固定化タンパク質のウイルス不活性化に向けられる。好ましくは、ウイルス不活性化は、手順が、精製されているタンパク質を固定化することによる、タンパク質調製物のウイルス不���性化を伴うように、タンパク質精製手順と併せて実施される。
【００８６】
上記のような種々のタンパク質を精製するための下流プロセスに適用される、従来の溶媒／界面活性剤のウイルス不活性化ステップは、概して、例えば、バッチ方法で、精製されている試料に、溶液中の溶媒／界面活性剤混合物を添加することを伴う。バッチ方法において、タンパク質を含む試料は、撹拌槽（例えば、大規模精製用のタンク）中で、溶媒／界面活性剤混合物（例えば、約１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、約０．３％のリン酸トリ−Ｎ−ブチル、および約０．３％のポリソルベート８０を含む混合物）で処理される。溶媒／界面活性剤化学物質の溶解後、処理された試料溶液は、第２の撹拌槽に送り込むことができ、そこで、本質的に、実際のウイルス不活性化が行われ、この場合、タンパク質溶液は、そのような非活性化が行われることを可能にするようにインキュベートされる（例えば、約３０分〜約１時間）。
【００８７】
対照的に、本発明のいくつかの実施形態は、タンパク質、例えば、精製されているタンパク質を含む、組成物のウイルス不活性化を伴い、ここで、タンパク質は、固定化される。このプロセスは、標的タンパク質が溶液中にあるよりもむしろ、タンパク質が固定化される一方で、対象となるタンパク質を含む組成物を、溶媒／界面活性剤混合物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、タンパク質は、クロマトグラフ用樹脂上で固定化される。タンパク質がクロマトグラフ用樹脂上、例えば、クロマトグラフ用カラム上で固定化されるウイルス不活性化は、本明細書において「カラム上」ウイルス不活性化と称される。以下の実施例に記載するＰｏｒｏｓ  Ｓ上のＡＤＡＭＴＳ１３の精製は、ウイルス不活性化がカラム上で実施される、このプロセスの一実施形態を提供する。当業者は、タンパク質が種々の手段によって、種々の支持体上で固定化されてもよいことを認識するであろう。例えば、タンパク質は、スライドガラス、ビーズ、マトリクス、または膜を含む、任意の固体または半固体支持体に結合されてもよい。固定化は、任意のプロセスから生じてもよく、それにより、タンパク質は、タンパク質溶液の他の成分に対して、支持体に固定される。固定化は、支持体の群とタンパク質の群との間の１つ以上の種類の結合によって、例えば、共有結合、水素結合、静電相互作用、ファンデルワールス力等、またはそれらの組み合わせによって生じてもよい。
【００８８】
クロマトグラフ用カラム上の固定化タンパク質のウイルス不活性化は、精製を単純化することができる。例えば、２つ以上の槽（大規模精製で使用される２つのタンクシステム）を必要とするよりもむしろ、クロマトグラフィ精製およびウイルス不活性化は、同一槽中で、例えば、同一クロマトグラフ用カラム上で実施されてもよい。これは、例えば、時間を減らす、試薬を節約する、および／または効率を高める等、タンパク質精製の下流プロセスを単純化する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフ用カラムは、陽イオン交換樹脂である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフ用カラムは、陰イオン交換樹脂である。
【００８９】
固定化タンパク質のウイルス不活性化のある特定の実施形態のさらなる、かつ驚くべき利点は、凝集体形成の減少である。いくつかのタンパク質は、溶媒／界面活性剤混合物に感受性を示し、例えば、溶液中の溶媒／界面活性剤試薬と接触させられる時に凝集体を形成する。特定の理論または仮説に限定されるものではないが、感受性タンパク質が固定化されている間、例えば、タンパク質がクロマトグラフ用樹脂に結合されている間に、溶媒／界面活性剤混合物と接触させることは、単純に、固定化タンパク質分子が物理的に相互に接触することができないことに基づき、凝集体の形成を防止することができる。いくつかの実施形態では、不活性化は、約２０％未満の凝集体、約１８％未満の凝集体、約１５％未満の凝集体、約１２％未満の凝集体、約１０％未満の凝集体、または約５％未満の凝集体の形成をもたらす。また、ある特定の実施形態では、凝集レベルは、タンパク質調製物が、タンパク質が固定化されないウイルス不活性化に供される時の凝集レベルと比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約５０％、または約１００％低減される。
【００９０】
１つの好ましい実施形態では、タンパク質は、クロマトグラフ用樹脂上に装填され、溶媒／界面活性剤処理が、洗浄ステップ、好ましくは、脂質エンベロープウイルスの不活性化を可能にするのに十分長いインキュベーション期間にわたって継続する、洗浄ステップとして使用される。例えば、洗浄ステップは、好ましくは、約３０分〜約１時間にわたって継続する。溶媒／界面活性剤混合物は、上記のように、そのようなウイルス不活性化をもたらすのに好適な濃度で、非イオン性界面活性剤および有機溶媒を含む。例えば、いくつかの実施形態では、溶媒／界面活性剤混合物は、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．３％のリン酸トリ−Ｎ−ブチル、および０．３％のポリソルベート８０を含む。いくつかの特定の実施形態に関するさらなる詳細を、ＡＤＡＭＴＳ１３精製に関して以下に提供する。
【００９１】
ウイルス不活性化はまた、例えば、ナノフィルタを使用したナノ濾過等の濾過による、ウイルス除去を含んでもよい。そのようなウイルス除去は、単独で、またはウイルス非活性化（不活性化）、例えば、上記のような溶媒／界面活性剤混合物を用いた処理を含む、ウイルス非活性化ステップと組み合わせて生じてもよい。ウイルス不活性化がウイルス非活性化およびウイルス除去の両方を含む時、ウイルス除去は、溶媒／界面活性剤処理によるウイルス非活性化の前および／または後に生じてもよい。概して、試料からのウイルス除去は、試料を濾過すること、例えば、ウイルスおよびウイルス汚染物質が流動することを可能にする一方で、試料中のＡＤＡＭＴＳ１３を維持する細孔径を有するフィルタに、試料を通すことを伴う。一実施形態では、フィルタの細孔径は、約１５ｎｍ〜約５０ｎｍの間である。濾過はまた、２０Ｎまたは３５Ｎのフィルタ（Ｐｌａｎｏｖａ，Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ）を使用したナノ濾過によって実施することができる。いくつかの実施形態では、ナノフィルタの汚染を防止するために、前置フィルタが使用され、例えば、約２μＭのフィルタ、または０．２μＰＶＤＦもしくはＰＥＳ膜が使用されてもよい。
【００９２】
陽イオン交換クロマトグラフィによる仕上げ
【００９３】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィ（またはヒドロキシアパタイト、続いて、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたタンデムクロマトグラフィ）の後に、陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィによる、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む試料を仕上げる任意のステップを含む。本ステップでは、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む緩衝液の伝導率は、陽イオン交換クロマトグラフィに対する適切な伝導率を達成するために必要に応じて、仕上げ前に低減されてもよい。
【００９４】
（ａ）緩衝液伝導率の低減
【００９５】
ヒドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィ、またはヒドロキシアパタイト、続いて、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂を用いたタンデムクロマトグラフィの後、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む緩衝液は、例えば、イオン成分（例えば、塩化ナトリウム）を除去することにより緩衝液の伝導率を低減することによって、陽イオン交換のために調製されてもよい。いくつかの実施形態では、緩衝液伝導率は、約５ｍＳ／ｃｍ未満に低減され、および／またはｐＨは、約６．０に低減される。緩衝液の伝導率は、特に本明細書の開示を踏まえて、当該技術分野で知られる、本明細書に記載する、または当業者によって理解され得るような任意の方法によって低減されてもよい。限定されない例としては、限外濾過／ダイアフィルトレーション（例えば、クロスフローカセットまたは中空糸モジュール）、ゲル濾過、透析等が挙げられる。
【００９６】
一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、陽イオン交換平衡化緩衝液（例えば、２０ｍＭのＭＥＳを含む緩衝液、室温でｐＨ６．０）に対して、約１０ｋＤａのカットオフを有する膜を用いた限外濾過／ダイアフィルトレーションによって、陽イオン交換のために調製される。いくつかの実施形態では、限外濾過／ダイアフィルトレーション膜は、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａのカットオフ、例えば、約２０ｋＤａのカットオフ、約３０ｋＤａのカットオフ、約４０ｋＤａのカットオフ等を有する、ＰＥＳ膜である。そのような方法を使用して、緩衝液のｐＨは、約８．０〜約６．０に低減されてもよく、および／または緩衝液の伝導率は、室温で約２ｍＳ／ｃｍ未満に低減されてもよい。いくつかのそのような実施形態では、ダイアフィルトレーション用の緩衝液は、２０ｍＭのＭＥＳを含んでもよく、室温で６．０のｐＨ、および／または室温で０．６ｍＳ／ｃｍの伝導率を有してもよい。いくつかの実施形態では、ダイアフィルトレーションに対する緩衝液の伝導率は、使用される陽イオン交換平衡化緩衝液と同一、または実質的に同一であってもよい。
【００９７】
一実施形態では、陽イオン交換のためのＡＤＡＭＴＳ１３を含む緩衝液の調製は、透析によって、例えば、中空糸血液透析モジュール（Ａｑｕａｍａｘ  ｓｅｒｉｅｓ，ＰＥＳ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｏｌｌｏｗｆｉｂｅｒｓ，Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等の血液透析モジュールを含む、ダイアライザ機械を使用して実施される。概して、約５Ｌの試料に対して、約２ｍ２のフィルタ面積が使用され、試料緩衝液および透析緩衝液は、相互に対して逆流で流される。いくつかの実施形態では、透析は、単一の透析モジュールへの２回以下の通過からなる。「単一の透析モジュール」とは、透析が実施される１つのユニットまたは構造を意味する。透析モジュールは、概して、それぞれが入口および出口ポートアクセスを有する、管腔および毛細管外の２つの別々の流動チャンバを形成するように管状筐体中に入れられた、端部が開口した中空糸膜の束を備える。半透過性中空糸膜は、２つのチャンバを分離し、溶質のサイズおよび濃度勾配に基づき、通過を選択的に可能にする一方で、他の溶質が２つのチャンバ間を通過することを制限する。逆流モードでモジュールを操作することによって、膜を通過する溶質は、素早く流され、大量の透析液中へと希釈され（「スイープ」）、可能な限り最大の濃度勾配を維持する。したがって、透析は、単一の透析モジュールへの単回通過のスイープで実施されてもよい。
【００９８】
いくつかの実施形態では、これらの方法の組み合わせが使用され、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィによる仕上げのための調製物中の試料の濃縮および緩衝液交換をもたらすために、透析によるＵＦ／ＤＦが使用されてもよい。さらに他の実施形態では、緩衝液交換は、陰イオン交換クロマトグラフィによって実施されてもよい。
【００９９】
（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィ
【０１００】
上記に示すように、本明細書に開示する方法は、随意に、陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィによって、試料を仕上げることを含んでもよい。本明細書で使用される「陽イオン交換樹脂」という用語は、陽イオン交換クロマトグラフィに好適な、かつ例えば、負電荷基によって正味の負電荷を有する（中性ｐＨで）、任意の樹脂を指す。例としては、カルボキシル基、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホアルキル基（ＳＰ、ＳＥ）、メチルスルホネート（複数可）基、セルロースの硫酸化エステル、ヘパリン等、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。このステップは、概して、ＡＤＡＭＴＳ１３生成物を濃縮し、予備処方緩衝液中に生成物を配置し、プロセス関連不純物（例えば、ＣＨＯタンパク質等の宿主細胞タンパク質、ＣＨＯ  ＤＮＡ等の宿主細胞ＤＮＡ、溶媒／界面活性剤混合物の試薬等）、ならびに生成物関連不純物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３の凝集体および非生物活性断片）を含む、非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物をさらに減少させるように設計される。
【０１０１】
一実施形態では、陽イオン交換樹脂はまた、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：大きな孔、潅流挙動、および対流挙動。本明細書に開示する仕上げステップで使用され得る市販の陽イオン交換樹脂の限定されない例としては、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＣＩＭ（登録商標）；ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｓ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａｃａｐ  ＣＭ（Ｔｏｓｏｈ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ（Ｔｏｓｏｈａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ（Ｔｏｓｏｈ）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｓ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ＭａｃｒｏｐｒｅｐＣＭ（（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３（Ｍｅｒｃｋ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＣＯＯ（Ｍｅｒｃｋ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍｅｒｃｋ），Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｃｈｉｓｓｏ）、ＣＭ  ａｎｄ  ＳＰ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（Ｐａｌｌ）、ＣＭ  ａｎｄ  Ｓ  ＨｙｐｅｒＤ（Ｐａｌｌ）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Ｐａｌｌ）、Ｓ  ａｎｄ  ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓ  ａｎｄ  ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓ  ａｎｄ  ＣＭ  ＣＡＰＴＯ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＭｏｎｏＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等が挙げられる。
【０１０２】
陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィは、当該技術分野でよく知られている方法である。いくつかの実施形態では、陽イオン交換カラムは、約０．２〜約０．５ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３／ｍＬの最大装填量を有する。好ましい実施形態では、カラムは、少なくとも０．３ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３／ｍＬが装填される。概して、陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィの間、ＡＤＡＭＴＳ１３は、陽イオン交換樹脂および緩衝液に結合し、ある特定の不純物は通過して流れる。ＡＤＡＭＴＳ１３が吸収されるカラムは、次いで、緩く結合した汚染物質もしくは不純物を除去するために、および／または陽イオン交換樹脂からのＡＤＡＭＴＳ１３の溶出のために調製物中の緩衝液を調節するために、洗浄することができる。次いで、ＡＤＡＭＴＳ１３は、溶出液中に溶出することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィステップから得られる溶出液は、所望よりも大量のＡＤＡＭＴＳ１３の凝集体を含有する。いくつかの実施形態では、例えば、溶出液は、約１５％を超える凝集体を含み、それは、ダイアライザステップおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィステップを用いた濃縮および緩衝液交換後に導入されると考えられる。
【０１０４】
凝集体の割合が有意に低いＡＤＡＭＴＳ１３の生成を可能にするために、陽イオン交換樹脂Ｐｏｒｏｓ  Ｓに関して図２においてさらに詳述するように、ある特定の条件を陽イオン交換樹脂と共に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、例えば上記により詳細に記載するように、陽イオン交換クロマトグラフィによる精製、続いて、カラム上溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化を含む組み合わせが使用される。この組み合わせは、好ましくは、溶出液中にＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチドを伴う少量の凝集体をもたらす。より好ましい実施形態では、溶出手順は、勾配溶出（段階溶出よりもむしろ）を含み、それは、例えば、溶出ピークの下降部において、ＡＤＡＭＴＳ１３の凝集体をさらに除去することができる。さらにより好ましい実施形態では、溶出緩衝液中のＴｗｅｅｎ  ８０の濃度は、約０．０５％超、例えば、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、好ましくは、約０．１％、約０．１１％、約０．１２％、約０．１３％、約０．１４％、または約０．１５％である。濃度の増加は、ＡＤＡＭＴＳ１３へのさらなる安定効果を有し、さらに、樹脂からのＡＤＡＭＴＳ１３の溶出中の、高分子量構造の形成を防止すると考えられる。「ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を安定化させること」または「ＡＤＡＭＴＳ１３への安定効果」とは、特に、断片化もしくは凝集形態よりもむしろ、無傷および／もしくは単量体の形態、または実質的に無傷および／もしくは単量体の形態での、ＡＤＡＭＴＳ１３の天然構造を促進する傾向があることを意味する。安定化はまた、得られたＡＤＡＭＴＳ１３が、変動温度、変動ｐＨ、イオン強度等のそうでなければ不安定な条件の中における断片化、天然構造の損失、および／または凝集に抵抗する傾向を意味し得る。
ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質はまた、採取中に使用されるマトリクスによって安定化されてもよく、例えば、溶媒／界面活性剤処理によるウイルス不活性化は、濃縮採取に実施される。さらに、実際に形成する凝集体は、陰イオン交換クロマトグラフィカラム（本明細書に記載するようなＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等）上での捕獲、および／またはクロマトグラフィ（本明細書に記載するようなヒドロキシアパタイトを用いたタンデムクロマトグラフィ／Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ等）による仕上げ等、後の精製ステップによって除去することができる。
【０１０５】
上記に記載する１つ以上の修正形を使用することによって、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチドの少量の凝集体を含む溶出液をもたらすことができる。例えば、好ましい実施形態では、陽イオン交換カラムからの溶出液は、約２０％未満、約１８％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、または約５％未満の凝集体を含み得る。
【０１０６】
陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィの最終ステップは、溶出緩衝液を用いてＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を溶出することを含む。いくつかの実施形態では、結合したＡＤＡＭＴＳ１３は、緩衝液のイオン強度を増加することによって、陽イオン交換樹脂から溶出される。陽イオン交換樹脂にクロマトグラフィにより接触するために使用されるＡＤＡＭＴＳ１３を含む緩衝液は、概して、室温で約１０ｍＳ／ｃｍ未満、例えば、５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。さらに、陽イオン交換樹脂にクロマトグラフィにより接触するために使用されるＡＤＡＭＴＳ１３を含む緩衝液は、概して、室温で約７．０未満、例えば、６．０のｐＨを有する。陽イオン交換樹脂からＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を溶出するために使用される溶出緩衝液は、そのような緩衝液よりも低いイオン強度を有することができる。樹脂はまた、目的とする貯蔵緩衝液のｐＨに等しい、または実質的にに等しいｐＨを有する緩衝液で洗浄されてもよい。
【０１０７】
好ましい実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、貯蔵緩衝液を用いて、陽イオン交換樹脂から溶出される。概して、貯蔵緩衝液とは、室温で約５〜約９のｐＨを有し、カルシウム、緩衝化合物、および塩を含む緩衝液を意味する。貯蔵緩衝液のｐＨは、室温で約７．０よりも大きくてもよい（例えば、約７．５）。貯蔵緩衝液は、約１０ｍＭ未満のＣａ＋＋（例えば、２ｍＭのＣａ＋＋）を含んでもよく、緩衝化合物は、リン酸塩、トリス、ＨＥＰＥＳ、ヒスチジン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、トリシン、酢酸塩等からなる群より選択されてもよく、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２等からなる群より選択されてもよい。好ましい実施形態では、貯蔵緩衝液は、７．０を超えるｐＨを有し、１０ｍＭ未満のカルシウムイオン、緩衝化合物、および塩を含む。より好ましい実施形態では、貯蔵緩衝液はさらに、非イオン性界面活性剤、例えば、約０．０１〜約０．５％の非イオン性界面活性剤、例えば、０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。さらにより好ましい実施形態では、溶出液は、貯蔵緩衝液を用いた陽イオン交換樹脂からの溶出後に、後続の濃縮または緩衝液交換ステップのどちらにも供されない。
【０１０８】
１つの特定の実施形態では、例えば、約２０ｃｍのベッド高さを有するＳｏｕｒｃｅ  Ｓカラム等、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が仕上げステップの陽イオン交換樹脂として使用される。そのような実施形態では、カラムは、約２カラム容積の約２ＭのＮａＣｌで活性化され、約２０ｍＭのＭＥＳ、約１０ｍＭのＮａＣｌ、および約２ｍＭのＣａＣｌ２を含み、室温で約６のｐＨを有する、約６カラム容積の緩衝液で平衡化されてもよい。ＡＤＡＭＴＳ１３を含む緩衝液は、室温で約５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率で、カラムと接触させられてもよく、カラムは、続いて、平衡化緩衝液で洗浄され、最終的に、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む溶出液が回収される。回収後、溶出液は濃縮され、緩衝液は、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィ、ダイアフィルトレーション、限外濾過、透析等によって交換されてもよい。
【０１０９】
別の特定の実施形態では、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓが、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む試料の仕上げにおける陽イオン交換樹脂として使用される。本実施形態では、陽イオン交換樹脂にクロマトグラフィにより接触するために使用されるＡＤＡＭＴＳ１３を含む緩衝液は、約５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率、および約６．１〜約６．４の間のｐＨを有してもよい。ＡＤＡＭＴＳ１３は、段階溶出が、好ましくは、より濃縮された生成物を提供し得るが、勾配溶出を使用して溶出されてもよい。勾配溶出が実施される場合、２つの緩衝液が使用されてもよく、例えば、溶出液プールが約２００ｍＭの塩濃度を有し得るように、第１の緩衝液は、低い塩含有量を有し（例えば、塩をほとんどまたは全く有しない）、第２の緩衝液は、より高い塩含有量（例えば、約５００ｍＭ）を有する。段階溶出が実施される場合、溶出緩衝液は、貯蔵緩衝液、例えば、約３００ｍＭのＮａＣｌ、約２ｍＭのＣａＣｌ２、約２０ｍＭのヒスチジン、約０．０５％のＴｗｅｅｎ  ８０を有する貯蔵緩衝液を含んでもよく、室温で約７．５のｐＨを有してもよい。いくつかのそのような実施形態では、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓステップ後に、緩衝液交換の必要がなく、すなわち、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓから得られるＡＤＡＭＴＳ１３分画は、すでに緩衝液中にあり、貯蔵に好適な濃度である。さらに他の実施形態では、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓカラムから得られるＡＤＡＭＴＳ１３分画は、さらなる濃縮および／または緩衝液交換ステップに供されてもよい。
【０１１０】
概して、本明細書に開示する方法のいくつかの実施形態に従って、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製することによって、純粋ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の組成物が得られる。一実施形態では、開示した方法に従って、組換えタンパク質を精製することによって、少なくとも約９０％純粋、例えば、少なくとも約９５％純粋、例えば、少なくとも約９８％純粋、例えば、または少なくとも約９９％純粋であるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が得られる。開示した方法のいくつかの実施形態に従って、少なくとも約２０％の収率が得られる。一実施形態では、本方法は、少なくとも約５％、例えば、約３０％、例えば、約１０％、例えば、約２０％、例えば、約４０％、例えば、約５０％、例えば、約６０％、例えば、約７０％、例えば、約８０％、例えば、約９０％、または例えば、約９５％の収率を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、約５００単位／ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３〜約１，０００単位／ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３に及ぶ比活性度を有する、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を提供する。別の実施形態では、本方法は、約１，２００単位／ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３  ＵＶ２８０タンパク質〜約２，４００単位／ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３  ＵＶ２８０タンパク質に及ぶ比活性度を有する、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を提供する。別の実施形態では、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が組換えＡＤＡＭＴＳ１３核酸で形質転換されるＣＨＯ細胞によって産生される場合、開示した方法に従って組換えＡＤＡＭＴＳ１３を精製することによって、約１，０００ｐｐｍ未満の宿主細胞不純物を有する組成物が産生される。いくつかの実施形態では、本方法は、貯蔵緩衝液中に少なくとも約２ｍｇ／ｍＬのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を提供する。
【０１１１】
組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む組成物
【０１１２】
本発明はさらに、本明細書に開示する方法に従って精製される組換えＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物を提供する。本明細書に開示する組成物は、精製された組換えＡＤＡＭＴＳ１３の貯蔵に有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、精製されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、冷凍で、例えば、−６０℃未満で貯蔵される。本明細書に開示する組成物はまた、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の治療的投与のために、および／または治療的投与、特に、非経口投与のために組成物を調製するために有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法に従って得られる、精製されたＡＤＡＭＴＳ１３は、バルク薬物物質の形態、すなわち、治療的投与用の組成物への処方の準備ができている形態である。
【０１１３】
したがって、本発明の別の態様は、精製された組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が賦形剤（複数可）または他の薬学的に許容される担体と混合される、薬学的組成物に関する。好ましい実施形態では、薬学的に許容される担体は、薬学的に不活性である。薬学的に不活性な担体は、活性薬剤と反応しない、もしくは実質的に反応しない、および／または、特に、活性薬剤の所望の薬学的特性に影響を与えない、もしくは実質的に影響を与えない担体である。薬学的組成物は、当該技術分野で知られる任意の方法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥等によって調製されてもよい。
【０１１４】
治療される状態に応じて、これらの薬学的組成物は、全身的または局所的に処方および投与されてもよい。処方および投与のための技術は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．）の最新版において見出すことができる。好適な経路としては、例えば、経口または経粘膜投与、ならびに筋肉内投与、皮下投与、髄内投与、髄腔内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与等を含む、非経口送達を挙げることができる。
【０１１５】
本発明での使用に好適な薬学的組成物としては、使用目的を達成するために、有効量の活性成分としてＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物が挙げられる。本明細書で使用される「有効量」のＡＤＡＭＴＳ１３は、天然ＡＤＡＭＴＳ１３の生物学的効果を増大、富化、改善、増加、または生成する量を指すことができる。天然ＡＤＡＭＴＳ１３の生物学的効果としては、血液凝固に関与する巨大タンパク質である、フォンヴィレブランド因子を開裂するＡＤＡＭＴＳ１３の作用に基づく、ｖＷＦ開裂プロテアーゼ活性が挙げられる。「有効量」は、血小板凝集レベルの低下をもたらす、例えば、血液凝固障害を患う個人におけるレベルを、血液凝固障害を患っていない個人により相当するレベルまで低下させる、ＡＤＡＭＴＳ１３の量を含む。血液凝固障害としては、モシコウィック症候群としても知られている血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、アップショー・シュールマン症候群（ＴＴＰの家族性形態）、および脳卒中が挙げられるが、これらに限定されない。「有効量」はまた、１つ以上の血液凝固障害および関連状態の治療における予防的および／または治療的有用性を達成するための量を含む。ある特定の有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１１６】
本発明は、動物対象における血液凝固障害および関連状態を治療および／または予防するための方法、薬学的組成物、およびキットを提供する。本明細書で使用される「動物対象」という用語は、ヒトならびに他の哺乳動物を含む。
【０１１７】
本明細書で使用される「治療することおよび／または予防すること」は、治療的有用性および／または予防的有用性のそれぞれを達成することを含む。治療的有用性とは、治療されている基礎にある血液凝固障害の好転または改善を意味する。例えば、ＴＴＰ患者において、治療的有用性は、患者がなお基礎疾患に悩む可能性があるという事実にもかかわらず、改善が患者において観察されるように、ＴＴＰと関連する状態および／または症状のうちの１つ以上を根絶または改善することを含む。例えば、治療は、血栓症の形成が低減または根絶された時だけではなく、頭痛の減少、熱の低下、および／または腎不全の遅延等、ＴＴＰに伴う症状に対する改善が、患者において観察された時も、治療的有用性を提供することができる。
【０１１８】
予防的有用性のために、本発明の薬学的組成物は、診断がまだ行われていない場合でさえ、血液凝固障害を発症する危険性がある患者、例えば、ＴＴＰのような血液凝固障害と一般的に関連付けられる症状または状態のうちの１つ以上を報告する患者に投与されてもよい。
【０１１９】
活性成分に加えて、薬学的組成物は、活性化合物の、薬学的に使用され得る調製物への処理を促進する、賦形剤および助剤等の好適な薬学的に許容される担体を含んでもよい。
【０１２０】
非経口投与用の薬学的処方は、概して、水溶性形態の活性成分の水溶液を含む。いくつかの実施形態では、活性薬剤の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製されてもよい。好適な脂溶性溶媒または媒体としては、ゴマ油等の油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。随意に、懸濁液はまた、例えば、高濃度溶液の調製を可能にするために、活性薬剤の溶解性を増加させる好適な安定化剤または薬剤を含有してもよい。
【０１２１】
注入のために、本発明の薬学的組成物は、水溶液中、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理緩衝食塩水等の生理学的に適合性のある緩衝液中で処方されてもよい。組織または細胞投与のために、浸透させられる特定のバリアに対して適切な浸透剤が処方物中に使用される。そのような浸透剤は、概して、当該技術分野で知られている。
【０１２２】
経口使用のための薬学的調製は、活性薬剤を固体賦形剤と混合し、随意に、得られた混合物を粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望に応じて、好適な助剤を添加した後に、顆粒の混合物を処理することによって得ることができる。好適な賦形剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの炭水化物またはタンパク質充填剤；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ等からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース；アラビアおよびトラガカントを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲン等のタンパク質が挙げられる。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウム等のその塩等の崩壊剤または可溶化剤が添加されてもよい。治療される患者による経口および／または経鼻摂取のために、薬学的組成物が錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、溶液、懸濁液、糖衣錠等として処方されることを可能にする担体もまた、使用されてもよい。
【０１２３】
経口使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチン製の押し込み式カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトール等のコーティングで作られる軟質シールカプセルが挙げられる。押し込み式カプセルは、ラクトースまたはデンプン等の充填剤または結合剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；および随意に安定化剤と混合される活性薬剤を含有することができる。軟カプセルにおいて、活性化合物は、安定化剤と一緒に、または安定化剤なしで、油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール等の好適な液体中に溶解または懸濁されてもよい。
【０１２４】
本明細書に記載する方法に従って調製されるＡＤＡＭＴＳ１３または他のタンパク質を含む組成物は、薬学的に許容される担体と共に処方され、適切な容器（またはキット）に配置され、示された状態の治療に関してラベルが付けられてもよい。
【実施例】
【０１２５】
以下の実施例は、例示目的で提供され、本発明の範囲を制限することを目的としない。
【０１２６】
実施例１
【０１２７】
図１は、本明細書に開示するような本発明のある特定の実施形態に従って、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製するための例示的な方法を提供する。提供される実施例では、組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、組換えＡＤＡＭＴＳ１３ヌクレオチド配列を含むＣＨＯ細胞の培養から回収される上清から精製される。本実施例では、試料は、約２単位／ｍＬ（約２μｇ／ｍＬ）のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む細胞培養上清である。
【０１２８】
図１に示すように、ＡＤＡＭＴＳ１３および非ＡＤＡＭＴＳ１３不純物を含む試料は、最初に、任意の富化前調製に供されてもよい：（ａ）ステップ１０１に示すように、試料は、限外濾過によって濃縮されてもよく（約１０倍〜約２０倍）、緩衝液は、ダイアフィルトレーションによって交換されてもよい（約３０ｋＤａの分子量カットオフ）、および（ｂ）ステップ１０２に示すように、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、さらなる富化前に、陰イオン交換樹脂に結合され、そこから溶出され得る。
【０１２９】
試料の富化前調製
【０１３０】
（ａ）富化前限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）
【０１３１】
図１、ステップ１０１に示すように、富化前陰イオン交換クロマトグラフィのための装填を最適化するために、細胞培養上清は、約１０倍〜約２０倍に濃縮され、ＰＥＳ膜（約３０ｋＤａ〜約５０ｋＤａのカットオフ；Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ）を使用して、ＡＤＡＭＴＳ１３を安定させると考えられる、カルシウムおよび亜鉛イオンを含有する低伝導率緩衝液に透析濾過される。細胞培養上清ダイアフィルトレーション用の緩衝液は、室温で７．７のｐＨを有する、２０ｍＭのトリス、０．１％のポリソルベート８０、８５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５μＭのＺｎＣｌ２である。
【０１３２】
（ｂ）富化前陰イオン交換クロマトグラフィ
【０１３３】
図１、ステップ１０２に示すように、富化前陰イオン交換クロマトグラフィは、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ低サブを使用して実施されてもよい。この陰イオン交換樹脂は、以下の条件（表１〜２）に従って使用されてもよい。
【０１３４】
カラム装填：最大０．５ｍｇのＡＤＡＭＴＴＳ１３  Ａｇ／ｍＬ樹脂；ベッド高さ：２０ｃｍ
【表１】
0005907869.tif 000002
【０１３５】
あるいは、段階溶出は、表２に詳述するように、４８％のＡＮＸ−ＥｌｕＢおよび５２％のＡＮＸ−ＥｌｕＡを含む、２．８カラム容積の緩衝液と共に使用することができる。他の潜在的に好適な緩衝液も示される。
【表２】
0005907869.tif 000003
【０１３６】
図１、ステップ１０２中に示されるものとは異なる樹脂が使用されてもよい。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡからのＰＯＲＯＳ  ５０ＤおよびＰＯＲＯＳ  ５０ＰＩを使用することができる。この樹脂を使用した富化前陰イオン交換クロマトグラフィからの溶出液は、約２０％〜約７０％の純度を有する組換えＡＤＡＭＴＳ１３を提供することができ、試料のこの富化前調製後のパーセント収率は、少なくとも約７５％であり得る。
【０１３７】
ＡＤＡＭＴＳ１３の富化
【０１３８】
図１、ステップ１０３および１０４のそれぞれに示すように、ＡＤＡＭＴＳ１３は、次いで、仕上げステップ（ａ）および（ｂ）によって富化されてもよい。ＡＤＡＭＴＳ１３を含む試料は、最初に、ヒドロキシアパタイトＩＩ型カラム（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上のヒドロキシアパタイトを用いたタンデムクロマトグラフィ（ステップ１０３）、続いて、陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂ＣＡＰＴＯ（登録商標）ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の混合モードクロマトグラフィ（ステップ１０４）に供される。より具体的には、ステップ１０２の富化前陰イオン交換クロマトグラフィからの溶出液プールは、伝導率を約６ｍＳ／ｃｍに低下させるために、ヒドロキシアパタイト−希釈緩衝液で１：４に希釈される。希釈された溶出液プールは、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の実質的な部分が流動することを可能にする条件下での、ヒドロキシアパタイト（ステップ１０３）、続いて、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に結合する、混合モード陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂（ステップ１０４）を用いたタンデムクロマトグラフィに供される。タンデムクロマトグラフィの条件を以下および表３〜４に提供する。
【０１３９】
カラム１：樹脂：ヒドロキシアパタイトＩＩ型（Ｂｉｏｒａｄ）（ＨＡ）；装填：最大２ｍｇの総タンパク質／ｍＬ樹脂；ベッド高さ：２０〜３０ｃｍ。
【０１４０】
カラム  ２：樹脂：Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；装填：３〜６ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３／ｍＬ樹脂；ベッド高さ：１０ｃｍ。
【０１４１】
カラム容積比  ＨＡ：ＭＭＣ＝１０：１。
【表３】
0005907869.tif 000004
【表４】
0005907869.tif 000005
【０１４２】
タンデムクロマトグラフィによる富化後のＡＤＡＭＴＳ１３のパーセント収率は、少なくとも６０％であり得る。
【０１４３】
ウイルス不活性化
【０１４４】
図１、ステップ１０５に示すように、試料は、汚染ウイルスもしくはウイルス粒子を不活性化するために溶媒／界面活性剤処理に供することができ、および／または試料は、そのようなウイルスもしくはウイルス粒子を除去するために濾過される。また、図１に示すように、ウイルス不活性化ステップ１０５は、手順の種々の時点において、例えば、タンデムクロマトグラフィステップ１０３および１０４の前、または以下に記載する濃縮および緩衝液交換を伴うステップ（ステップ１０６）の後に実施することができる。
【０１４５】
溶媒／界面活性剤処理によるウイルス不活性化のために、試料は、約１２℃〜約１６℃で３０分間、１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、０．３％のリン酸トリ−Ｎ−ブチル、および０．３％のポリソルベート８０を含む溶媒／界面活性剤混合物で処理される（特に、脂質エンベロープウイルスを不活性化するために）。さらなる詳細を以下の実施例２に提供する。
【０１４６】
あるいは、または加えて、試料は、濾過、例えば、０．２μｍの粒子フィルタを通したナノ濾過に供される。例えば、溶媒／界面活性剤処理後の混合物は、以下に記載する１容積の仕上げ平衡化緩衝液で希釈され、０．２μｍのＰＶＤＦまたはＰＥＳ膜を通して濾過される。濾過は、溶媒／界面活性剤処理の前および／または後に実施することができる。処理後の濾過は、処理中に形成された可能性がある粒子状物質を除去するために使用されてもよい。濾過はまた、図１にも示すような２０Ｎのフィルタ（Ｐｌａｎｏｖａ，  Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ）を使用したナノ濾過によって実施することができ、ここで、ウイルス不活性化ステップ１０５は、タンデムクロマトグラフィステップ１０３および１０５の前に実施される。さらなるウイルス不活性化ステップ１０５は、以下に記載するように、試料が陽イオン交換クロマトグラフィによって仕上げられた後に実施することができる。
【０１４７】
このウイルス不活性化からのＡＤＡＭＴＳ１３のパーセント収率は、少なくとも９５％であり得る。
【０１４８】
陽イオン交換クロマトグラフィによる仕上げ
【０１４９】
富化後、ＡＤＡＭＴＳ１３は、陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィによって仕上げられてもよく、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む緩衝液の伝導率は、陽イオン交換クロマトグラフィに対する適切な伝導率を達成するために、仕上げ前に低下させられてもよい。したがって、富化後ステップは、（ａ）緩衝液伝導率を低下させること、続いて、（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィを伴ってもよい。
【０１５０】
（ａ）緩衝液伝導率の低下
【０１５１】
図１、ステップ１０６に示すように、陽イオン交換クロマトグラフィのための調製は、１０ｋＤａのカットオフを有するＵＦ／ＤＦ、およびダイアライザ機械を使用した濃縮および緩衝液交換を伴ってもよい。図示された実施形態では、緩衝液交換のために使用されるダイアライザ機械は、０．３〜１．９ｍ２のフィルタ面積を有する中空糸血液透析モジュール（Ａｑｕａｍａｘ  ｓｅｒｉｅｓ，ＰＥＳ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｏｌｌｏｗｆｉｂｅｒｓ，Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を伴う。操作中、以下のパラメータがオンラインで監視される：圧力（モジュール前、モジュール後、および膜間圧）、伝導率、ならびに温度。ダイアライザカートリッジは、２つのポンプと接続され、１つは、試料を供給し（中空糸を通して）、１つは、透析緩衝液を供給する（逆流方向で、中空糸を包囲して）。約２ｍ２のフィルタ面積が約５Ｌの試料に対して使用され、流量は、以下の方法で固定される：４０ｍＬ／分（試料流量、または２０ｍＬ／分／ｍ２のフィルタ面積）、６０ｍＬ／分（透析緩衝液流量、逆流）。透析の前および後に、中空糸モジュールは、透析緩衝液ですすがれ、回収された生成物に、透析後のすすぎが追加される。透析後、試料は、透析前とほぼ同じ容積を有するが、わずかに濃縮されている。
【０１５２】
この方法で緩衝液伝導率を低下させた後のＡＤＡＭＴＳ１３のパーセント収率は、約９０％であり得る。
【０１５３】
他の実施形態では、緩衝液交換は、ステップ１０２にあるように、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＦＦ低サブ上の陰イオン交換クロマトグラフィによって実施されてもよい。
【０１５４】
陽イオン交換クロマトグラフィ
【０１５５】
図１、ステップ１０７に示すように、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の富化（ならびに任意の濃縮および緩衝液交換ステップ１０６、および／またはウイルス不活性化ステップ１０５）後、試料は、陽イオン交換クロマトグラフィによって仕上げられてもよい。ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む緩衝液は、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、またはＰＯＲＯＳ（登録商標）５０  ＨＳカラム等のＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかで仕上げられる。
【０１５６】
Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓカラム上での仕上げのための条件を表５に提供し、仕上げステップのための緩衝液を表６に提供する。
【０１５７】
樹脂：Ｓｏｕｒｃｅ  ３０  Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；カラム装填：最大０．２（０．５）ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３／ｍＬ樹脂；ベッド高さ：２０ｃｍ。
【表５】
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【表６】
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【０１５８】
Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓカラムからの溶出液プールは、濃縮され、貯蔵緩衝液に対して透析濾過される。
【０１５９】
ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓカラム上での仕上げのための条件を表７に提供し、仕上げステップのための緩衝液を表８に提供する。
【０１６０】
樹脂：ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；カラム装填：最大１２ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３／ｍＬ樹脂；ベッド高さ：２０ｃｍ。
【表７】
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【表８】
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【０１６１】
ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓカラムからの溶出液プールは、濃縮され、貯蔵緩衝液に対して透析濾過される。
【０１６２】
このさらなる仕上げステップ後のＡＤＡＭＴＳ１３のパーセント収率は、少なくとも約７０％、および緩衝液交換後、少なくとも約９０％であり得る。
【０１６３】
図１、ステップ１０８に示すように、精製されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、上記の方法に従って得られる。ＡＤＡＭＴＳは、例えば、約−６０℃未満で冷凍および保存される。全プロセスの収率は、約２２％〜約２４％、またはそれ以上であり得る。
【０１６４】
実施例２
【０１６５】
図２は、図１の陽イオン交換クロマトグラフィステップ１０７で使用され得る種々の条件の要約を提供する。具体的に、種々の実行から得られるＡＤＡＭＴＳ１３生成物の比較は、図２Ｃの条件が汚染凝集体を低減することを示す。
【０１６６】
図２Ａに示すように、変化形Ａは、以下により詳細に考察するような、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理を使用したウイルス不活性化、続いて、段階溶出を適用するＰｏｒｏｓ  Ｓ上の陽イオン交換クロマトグラフィの組み合わせである。図２Ｂに示すように、変化形Ｂは、段階希釈を用いるが、ウイルス不活性化が先行しない、Ｐｏｒｏｓ  ５０Ｓ上の陽イオン交換クロマトグラフィを伴う。変化形ＡおよびＢの両方を、表９に概説する手順に従って実施することができる。
【表９】
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【０１６７】
変化形Ａにおいて、ステップ１０６からの調整された（透析された）溶出液は、溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化ステップ１０５に供される。溶出液は、最初に、特定の物質を除去するために、０．２μの細孔径のフィルタを通して濾過される。次いで、濾液は、ストック溶液から、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．３％のリン酸トリ−ｎ−ブチル、および０．３％のポリソルベート  ８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）の最終濃度まで、溶媒／界面活性剤混合物が補充される。不活性化は、わずかな撹拌または振動下で、約３０分〜約１時間の時間枠で、約１２℃〜約２５℃に及ぶ温度で実施される。不活性化は、１容積の冷たい希釈緩衝液（２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、室温）で溶液を希釈することによって停止される。カラムを保護するために、溶媒／界面活性剤で処理および希釈された溶液は、例えば、ウイルス不活性化処理中に形成された可能性がある粒子状物質を除去するために、再び０．２μのフィルタを通して濾過される。
【０１６８】
溶媒／界面活性剤で不活性化および希釈された生成物溶液は、次いで、段階希釈を使用したＰｏｒｏｓ  ５０ＨＳ上の陽イオン交換クロマトグラフィステップ１０７に供される。クロマトグラフィの詳細を上記の表９に概説する。得られた溶出液プールは、−６０℃未満で冷凍保存され得る、バルク薬物物質の形態のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を提供する。
【０１６９】
変化形Ｂにおいて、陽イオン交換クロマトグラフィステップ１０７は、溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化ステップ１０５なしで、ステップ１０６からの調整された（透析された）溶出液に対して実施される。陽イオン交換クロマトグラフィの詳細は、上記に詳述される通りである。
【０１７０】
図２Ｃに示すように、変化形Ｃは、勾配溶出を使用したＰｏｒｏｓ  ５０ＨＳ上の陽イオン交換クロマトグラフィによる精製、続いて、カラム上溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化を伴う組み合わせである。この変化形は、驚いたことに、そうでなければ精製されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパクに見出される凝集体を低減する。変化形Ｃで使用され得るクロマトグラフィの詳細を以下の表１０に概説する。
【表１０】
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【０１７１】
変化形Ｃにおいて、装填材料は、陽イオン交換仕上げステップ１０４の溶出液プールであり、好ましくは、ゲル濾過による透析または緩衝液交換によって達成される、４．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。特に、Ｐｏｒｏｓ  Ｓ上の陽イオン交換クロマトグラフィは、上記に考察するように、クロマトグラフ用カラム上に固定化されるウイルスのウイルス不活性化を伴う、カラム上溶媒／界面活性剤処理を含むように適合される。カラム上ウイルス不活性化は、２℃〜１０℃の溶媒／界面活性剤混合物を用いた１時間の洗浄を含む。カラム上処理後、洗浄緩衝液は、溶出前に溶媒／界面活性剤化学物質を効率的に洗い落とすように交換される。
【０１７２】
溶出は、２００ｍＭのＮａＣｌを用いた段階溶出から勾配溶出に変更され、それは、特に、溶出ピークの下降部において、ＡＤＡＭＴＳ１３のモノマーまたはオリゴマー種の分離を促進すると考えられる。凝集体は、後の溶出分画中に除去され、それにより、そうでなければ精製されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に見出される凝集体をさらに除去する。モノマーＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を安定化させるためのさらなる適合として、溶出緩衝液中のＴｗｅｅｎ  ８０の濃度は、洗浄および溶出緩衝液中で０．０５％〜０．１％に増加させられる。これは、Ｐｏｒｏｓ  Ｓ樹脂からのＡＤＡＭＴＳ１３の溶出中の凝集体の形成をさらに防止すると考えられる。カラム上溶媒／界面活性剤処理によるウイルス不活性化を含む、Ｐｏｒｏｓ  Ｓ上のクロマトグラフィの手順の詳細を、上記の表１０に概説する。
【０１７３】
図２Ｄに示すように、変化形Ｄは、対照としての役割を果たす。変化形Ｄにおいて、陽イオン交換クロマトグラフィを介したステップ１０７の仕上げは、勾配溶出および溶出緩衝液中の増加したＴｗｅｅｎ  ８０を再び用いるが、溶媒／界面活性剤処理によるカラム上ウイルス不活性化を用いない、Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ上で実施される。ウイルス不活性化溶媒／界面活性剤処理ステップ１０５は、代わりに、陽イオン交換前に濃縮採取に実施される。クロマトグラフィの詳細を以下の表１１に提供する。
【表１１】
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【０１７４】
変化形Ｄにおいて、装填材料は、陽イオン交換仕上げステップ１０４の溶出液プールであり、好ましくは、ゲル濾過による透析または緩衝液交換によって達成される、４．５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。Ｐｏｒｏｓ  Ｓ上の陽イオン交換クロマトグラフィステップ１０７は、上記のように、段階溶出の代わりに勾配溶出、ならびに洗浄および溶出緩衝液中の０．１％のＴｗｅｅｎ  ８０を再び使用する。勾配溶出を用いたＰｏｒｏｓ  Ｓ上のクロマトグラフィの手順の詳細を、上記の表１１に概説する。
【０１７５】
実施例３
【０１７６】
１００Ｌの発酵槽規模を使用した実験室規模における実験を、カラム上溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化で実施し、陽イオン交換クロマトグラフィステップ１０７の性能に対するこの手順の潜在的な影響を決定した。データを表１２に示す。
【表１２】
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【０１７７】
表１２に示すように、Ｐｏｒｏｓ  Ｓ上の陽イオン交換クロマトグラフィ前に、溶液中の溶媒／界面活性剤処理を介して、ウイルス不活性化を実施することによって、大量の凝集体の形成がもたらされ得る（図２Ａの変化形Ａおよび試料１）。溶媒／界面活性剤処理が省略され、同一の手順が実施される場合、凝集体形成は、有意に低減される（図２Ｂの変化形Ｂおよび試料２）。
【０１７８】
また、カラム上で溶媒／界面活性剤処理を実施すること、すなわち、ＡＤＡＭＴＳ１３を、それが樹脂の表面上で固定化されている一方で、溶媒／界面活性剤混合物と接触させることによって、凝集体の形成を防止することができる。さらに、実際に形成される少量の凝集体は、後の溶出分画中の勾配溶出によってさらに除去することができる（図２Ｃの変化形Ｃ、試料３および４）。
【０１７９】
比較のために、溶液中の基準溶媒／界面活性剤処理、精製プロセス、続いて、直前にもカラム上でも溶媒／界面活性剤処理を用いないＰｏｒｏｓ  Ｓ上の陽イオン交換クロマトグラフィが実施される（図２Ｄの変化形Ｄ、試料５、６、および７）。この手順もまた、低含有量の凝集体を有するＡＤＡＭＴＳ１３を産生することができる。
【０１８０】
本明細書において参照される全ての特許および特許公開は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
上記の説明を読むことにより、ある特定の修正および改良が当業者に想到されるであろう。全てのそのような修正および改良は、簡潔さおよび読みやすさの目的で本明細書では削除されているが、適切に、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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