(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト野生型シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を共有し、核酸に基づく病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に対する結合親和性を、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）の前記ＰＡＭＰに対する結合親和性に比べて増大させている、単離Ｃｐｎ１０変異ポリペプチドであって、配列番号９、１２、１５、２４、２６、２９、３２、３８、４１、４４、４９、５２、６０、８１、８４、８７、９０、９３もしくは９６のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、単離Ｃｐｎ１０変異ポリペプチド。
【請求項２】
前記変異ポリペプチドの前記Ｎ末端は、メチオニン残基から開始する、請求項１に記載の単離Ｃｐｎ１０変異ポリペプチド。
【請求項３】
前記メチオニン残基は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に先行する、請求項２に記載の単離Ｃｐｎ１０変異ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号９、１２、１５、２４、２６、２９、３２、３８、４１、４４、４９、９０、もしくは９３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離Ｃｐｎ１０変異ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項６】
配列番号１０、１３、１４、１６、１７、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３９、４０、４２、４３、４５、４６、５０、５１、９１、９２、９４、もしくは９５のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の単離核酸。
【請求項７】
配列番号５２、６０、８１、８４、８７、もしくは９６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離Ｃｐｎ１０変異ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項９】
配列番号５３、５４、６１、６２、８２、８３、８５、８６、８８、８９、９７、もしくは９８のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の単離核酸。
【請求項１０】
ヒト野生型シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を共有し、かつ、前記野生型ポリペプチドに比べて１つの追加的なアミノ酸残基によって伸長されたＮ末端を含む単離Ｃｐｎ１０変異ポリペプチドであって、ここで、前記追加的なアミノ酸残基は、セリンまたはプロリン残基であり、またここで、前記変異ポリペプチドは、核酸に基づく病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に対する結合親和性を、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）の前記ＰＡＭＰに対する結合親和性に比べて増強している、単離Ｃｐｎ１０変異ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２１または３５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離Ｃｐｎ１０変異ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項１３】
配列番号２２、２３、３６、もしくは３７のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の単離核酸。
【請求項１４】
（ａ）請求項１から４、７、１０または１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、あるいは
（ｂ）請求項５、６、８、９、１２または１３のいずれか一項に記載の核酸
の任意の１つもしくは複数を含む組成物。
【請求項１５】
医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
対象における免疫活性化を抑制するための医薬を調製するための方法であって、前記医薬が、
（ａ）請求項１から４、７、１０または１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、
（ｂ）請求項５、６、８、９、１２または１３のいずれか一項に記載の核酸、あるいは
（ｃ）請求項１４または請求項１５に記載の組成物
を治療有効量で含む、方法。
【請求項１７】
対象における炎症性疾患を処置するための医薬を調製するための方法であって、前記医薬が、
（ａ）請求項１から４、７、１０または１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、
（ｂ）請求項５、６、８、９、１２または１３のいずれか一項に記載の核酸、あるいは
（ｃ）請求項１４または請求項１５に記載の組成物
を治療有効量で含む、方法。
【請求項１８】
前記炎症性疾患は、
（ａ）関節リウマチ、
（ｂ）クローン病、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される炎症性腸疾患、
（ｃ）インスリン依存性糖尿病、および若年型糖尿病からなる群より選択されるＩ型糖尿病、
（ｄ）慢性疲労症候群、
（ｅ）アルツハイマー病、
（ｆ）グレーブス病、
（ｇ）変形性関節症、
（ｈ）コラーゲンＩＩ関節炎、
（ｉ）多発性硬化症、
（ｊ）全身性エリテマトーデス、
（ｋ）自己免疫性心筋炎、
（ｌ）自己免疫性卵巣疾患、
（ｍ）自己免疫性甲状腺疾患、
（ｎ）自己免疫性神経炎、
（ｏ）自己免疫性肝炎、
（ｐ）自己免疫性ぶどう膜網膜炎、
（ｑ）自己免疫性ぶどう膜炎、
（ｒ）乾癬、
（ｓ）シェーグレン病、
（ｔ）サルコイドーシス、
（ｕ）皮膚筋炎、
（ｖ）白血球破砕性血管炎、
（ｗ）重症筋無力症、
（ｘ）アレルギー性脳脊髄炎、
（ｙ）甲状腺機能亢進症、
（ｚ）悪性貧血、
（ａａ）リウマチ性多発筋痛および多発性筋炎
（ａｂ）多発性筋炎慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、
（ａｃ）感染性疾患、
（ａｄ）リーキーガット症候群、
（ａｅ）鬱血性心疾患、
（ａｆ）アナフィラキシー、薬剤反応、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、じんましん、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触アレルギー、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、および昆虫毒アレルギーからなる群より選択されるアレルギー、
（ａｇ）喘息、
（ａｈ）急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および
（ａｉ）アテローム硬化症
からなる群から選択される方法であって、
（ａ）請求項５、６、８、９、１２または１３のいずれか一項に記載の核酸を候補作用剤と、前記候補作用剤と前記核酸との間で結合が生じるのに適した条件下で接触させるステップと、
（ｂ）前記核酸によってコードされるポリペプチドの生成を測定するステップと、
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
免疫抑制剤についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）パターン認識受容体（ＰＲＲ）を発現する免疫細胞、
（ｂ）前記ＰＲＲに対するリガンド、および
（ｃ）請求項１から４、７、１０または１１のいずれか一項に記載のポリペプチド
を含む混合物を候補作用剤と、前記候補作用剤と前記ポリペプチドとの間で結合が生じるのに適した条件下で接触させるステップと、前記免疫細胞内での前記ポリペプチドによって誘発されるＰＲＲ媒介性の細胞シグナル伝達のレベルを検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項２０】
前記検出するステップは、
（ａ）前記免疫細胞によるサイトカインおよび／またはケモカインの産生および／または分泌を測定するステップ、
（ｂ）前記免疫細胞による活性化マーカーの発現を測定するステップ、
（ｃ）前記免疫細胞内でのｔｏｌｌ様受容体媒介性のＮＦ−κＢ活性化を検出するステップ
のうちの任意の１つもしくは複数によって実施される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照による援用
本願は、２００９年１０月９日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２００９９０４９５６号明細書からの優先権を主張し、その内容全体は、相互参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、一般に、シャペロニン１０Ｎ末端変異体に関する。より詳細には、本発明は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）および／または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に対する増強された免疫調節能および／または増大した結合親和性を有するシャペロニン１０Ｎ末端変異体に関する。
【背景技術】
【０００３】
シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）は、初期妊娠因子（ＥＰＦ）および熱ショックタンパク質１０（Ｈｓｐ１０；ＨＳＰＥ１）としても既知であり、細胞タンパク質のフォールディングを促進する分子シャペロンとして機能する。特に、Ｃｐｎ１０は、多様な細胞種のミトコンドリア内でシャペロニン６０（Ｃｐｎ６０）と複合体を形成することが示されている。この複合体は、ミトコンドリア内に輸入されるポリペプチドのフォールディングに関与し、ペプチド凝集を阻止し、変性タンパク質を再活性化する。
【０００４】
Ｃｐｎ１０は、タンパク質フォールディングにおけるその役割に加え、多数の他の細胞プロセスに関与すると考えられる。例えば、Ｃｐｎ１０がパターン認識受容体（ＰＲＲ）に関連した生物学的活性を調節することが示唆されている。ＰＲＲは、「ＰＡＭＰ」（病原体関連分子パターン）として既知の病原性微生物に由来する特定のリガンド（例えば、リポペプチド、糖脂質、核酸）および／または「ＤＡＭＰ」（損傷関連分子パターン）と称される宿主由来リガンド（例えば、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、タンパク質）の認識時に、免疫応答を開始させ、駆動することに関与する。例えば、ＰＡＭＰの、食細胞（例えばマクロファージ）によって発現されるＰＲＲへの結合は、細胞によるエンドサイトーシスおよび病原体の破壊を促進することが示されている。ＰＡＭＰ／ＤＡＭＰのＰＲＲへの結合はまた、様々な免疫細胞（例えば、マクロファージ、Ｂリンパ球および樹状細胞）内での細胞シグナルカスケードを開始させ、炎症性メディエーター（例えば、サイトカイン、ケモカイン、反応性酸素種など）の産生および分泌に至る。
最近のデータによると、Ｃｐｎ１０が、ＰＲＲシグナル伝達によって誘発される炎症性分子の産生および分泌を下方制御することが示唆される。Ｃｐｎ１０はまた、抗炎症性分子のＰＲＲ媒介性の産生および分泌の正の調節に関与している。Ｃｐｎ１０のＰＲＲシグナル伝達に対する調節能は、免疫系の活性化に関連した種々の疾患および障害（例えば炎症性疾患）を処置する手段を提供する。例えば、Ｃｐｎ１０の投与を用い、ＰＲＲシグナル伝達を開始させることに関与するリガンドを封鎖することが可能である。次いで、これは、炎症性メディエーターの産生および放出を抑制し、それ故、免疫活性化および炎症を阻害する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】オーストラリア仮特許出願第２００９９０４９５６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｃｐｎ１０の、免疫活性化のサプレッサーとしての同定にもかかわらず、炎症性疾患および症状を予防および／または処置するための改善された作用剤に対する需要がある。望ましくは、かかる作用剤は、ＰＲＲリガンドに増大した親和性で結合でき、それにより、ＰＲＲシグナル伝達によって媒介される炎症性分子の産生および分泌を阻害することになる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書中で示されるように、Ｃｐｎ１０ポリペプチドのＮ末端ドメインに対する特定の変化は、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰへの結合を促進することが見出されている。次いで、これは、Ｃｐｎ１０変異体の免疫抑制能と、特にＰＲＲシグナル伝達によって誘発される炎症性メディエーターの産生および放出に対するその効果を促進するものと考えられる。
【０００８】
第１の態様では、本発明は、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を共有し、かつ前記野生型ポリペプチドに比べて、少なくとも２つの追加的なアミノ酸残基によって伸長されたＮ末端を含む、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドを提供する。
【０００９】
第１の態様の一実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を共有する。
【００１０】
第１の態様の別の実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【００１１】
第１の態様の別の実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を共有する。第１の態様の一実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドに比べて、免疫調節機能が増強している。
【００１２】
第１の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に対する結合親和性が、野生型Ｃｐｎ１０のＰＡＭＰに対する結合親和性に比べて増大している。
【００１３】
第１の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に対する結合親和性が、野生型Ｃｐｎ１０のＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて増大している。
【００１４】
第１の態様の別の実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）に比べて、免疫調節機能が増強している。
【００１５】
第１の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に対する結合親和性が、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）のＰＡＭＰに対する結合親和性に比べて増大している。
【００１６】
第１の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に対する結合親和性が、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）のＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて増大している。
【００１７】
第１の態様の一実施形態では、ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含む。
【００１８】
第１の態様の一実施形態では、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡである。
【００１９】
第１の態様の一実施形態では、細菌ＤＮＡは、ＣｐＧモチーフを含む。
【００２０】
第１の態様の一実施形態では、ＰＡＭＰは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドモチーフ（ＣｐＧ  ＯＤＮ）を含むオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
第１の態様の一実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮモチーフは、ＣｐＧＡ、ＣｐＧＢおよび／またはＣｐＧＣの任意の１つもしくは複数である。
【００２２】
第１の態様の一実施形態では、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒト野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドである。
【００２３】
第１の態様の一実施形態では、単離ポリペプチドのＮ末端は、メチオニン残基から開始する。メチオニン残基は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基に先行しうる。
【００２４】
第１の態様の一実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号９、１２、１５、１８、２４、２６、２９、３２、３８、４１、４４、４７、４９、７８、９０、もしくは９３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
第１の態様の別の実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号５２、５５、５８、６０、８１、８４、８７、もしくは９６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
第１の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、ＧＳＭ−Ｃｐｎ１０（配列番号５７）ではない。
【００２７】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の単離ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
【００２８】
第２の態様の一実施形態では、単離核酸は、配列番号１０、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３９、４０、４２、４３、４５、４６、４８、５０、５１、９１、９２、９４、もしくは９５のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
第２の態様の一実施形態では、単離核酸は、配列番号５３、５４、５６、５７、５９、６１、６２、８２、８３、８５、８６、８８、８９、９７、もしくは９８のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
第３の態様では、本発明は、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を共有し、かつ前記野生型ポリペプチドに比べて、１つの追加的なアミノ酸残基によって伸長されたＮ末端を含む、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドを提供する。
【００３１】
第３の態様の一実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を共有する。
【００３２】
第３の態様の別の実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【００３３】
第３の態様の別の実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を共有する。
【００３４】
第３の態様の一実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドに比べて、免疫調節機能が増強している。
【００３５】
第３の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に対する結合親和性が、野生型Ｃｐｎ１０のＰＡＭＰに対する結合親和性に比べて増大している。
【００３６】
第３の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に対する結合親和性が、野生型Ｃｐｎ１０のＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて増大している。
【００３７】
第３の態様の別の実施形態では、単離シャペロニン１０（Ｃｐｎ１０）変異ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）に比べて、免疫調節機能が増強している。
【００３８】
第３の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に対する結合親和性が、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）のＰＡＭＰに対する結合親和性に比べて増大している。
【００３９】
第３の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に対する結合親和性が、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）のＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて増大している。
【００４０】
第３の態様の一実施形態では、ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含む。
【００４１】
第３の態様の一実施形態では、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡである。
【００４２】
第３の態様の一実施形態では、細菌ＤＮＡは、ＣｐＧモチーフを含む。
【００４３】
第３の態様の一実施形態では、ＰＡＭＰは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドモチーフ（ＣｐＧ  ＯＤＮ）を含むオリゴヌクレオチドである。
【００４４】
第３の態様の一実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮモチーフは、ＣｐＧＡ、ＣｐＧＢおよび／またはＣｐＧＣの任意の１つもしくは複数である。
【００４５】
第３の態様の一実施形態では、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒト野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドである。
【００４６】
第３の態様の一実施形態では、追加的なアミノ酸残基は、セリンまたはプロリン残基である。
【００４７】
第３の態様の別の実施形態では、追加的なアミノ酸残基は、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸またはグルタミン残基である。
【００４８】
第３の態様の一実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号２１または３５で示されるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
第３の態様の別の実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、もしくは７５で示されるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
第３の態様の一実施形態では、変異ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）またはＧｌｙ−Ｃｐｎ１０（配列番号６）ではない。
【００５１】
第４の態様では、本発明は、第３の態様の単離ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
【００５２】
第４の態様の一実施形態では、単離核酸は、配列番号７、８、２２、２３、３６、もしくは３７のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む。
【００５３】
第５の態様では、本発明は、第２または第４の態様の単離核酸を含むベクターを提供する。
【００５４】
第６の態様では、本発明は、第５の態様のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００５５】
第７の態様では、本発明は、
（ａ）第１または第３の態様の単離ポリペプチド、
（ｂ）第２または第４の態様の単離核酸、
（ｃ）第５の態様のベクター
の任意の１つもしくは複数を含む組成物を提供する。
【００５６】
第７の態様の一実施形態では、組成物は、医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体をさらに含む。
【００５７】
第８の態様では、本発明は、対象における免疫活性化を抑制するための方法であって、
（ａ）第１または第３の態様の単離ポリペプチド、
（ｂ）第２または第４の態様の単離核酸、
（ｃ）第５の態様のベクター、
（ｄ）第７の態様の組成物
を治療有効量で対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００５８】
第９の態様では、本発明は、対象における炎症性疾患を予防または処置するための方法であって、
（ａ）第１または第３の態様の単離ポリペプチド、
（ｂ）第２または第４の態様の単離核酸、
（ｃ）第５の態様のベクター、
（ｄ）第７の態様の組成物
を治療有効量で対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００５９】
第９の態様の一実施形態では、炎症性疾患は、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、若年型糖尿病）、慢性疲労症候群、アルツハイマー、グレーブス病、変形性関節症、コラーゲンＩＩ関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣疾患、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性神経炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、自己免疫性ぶどう膜炎、乾癬、シェーグレン病、サルコイドーシス、皮膚筋炎、白血球破砕性血管炎、重症筋無力症、アレルギー性脳脊髄炎、甲状腺機能亢進症、悪性貧血、リウマチ性多発筋痛および多発性筋炎慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感染性疾患、リーキーガット症候群、心血管疾患（例えば、鬱血性心疾患）、アレルギー（例えば、アナフィラキシー、薬剤反応、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、じんましん、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触アレルギー、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー）、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）およびアテローム硬化症、ならびに感染性疾患からなる群から選択される。
【００６０】
第１０の態様では、本発明は、免疫抑制剤についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）第２または第４の態様の単離核酸を候補作用剤と、前記候補作用剤と前記核酸との間で結合が生じるのに適した条件下で接触させるステップと、
（ｂ）前記核酸によってコードされるポリペプチドの生成を測定するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００６１】
第１１の態様では、本発明は、免疫抑制剤についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）パターン認識受容体（ＰＲＲ）を発現する免疫細胞
（ｂ）前記ＰＲＲに対するリガンド、および
（ｃ）第１または第３の態様の単離ポリペプチド、
を含む混合物を候補作用剤と、前記候補作用剤と前記ポリペプチドとの間で結合が生じるのに適した条件下で接触させるステップと、前記免疫細胞内での前記ポリペプチドによって誘発されるＰＲＲ媒介性の細胞シグナル伝達のレベルを検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００６２】
第１１の態様の一実施形態では、検出ステップは、
（ａ）前記免疫細胞によるサイトカインおよび／またはケモカインの産生および／または分泌を測定するステップ、
（ｂ）前記免疫細胞による活性化マーカーの発現を測定するステップ、
（ｃ）前記免疫細胞内でのｔｏｌｌ様受容体媒介性のＮＦ−κＢ活性化を検出するステップ
のうちの任意の１つもしくは複数によって実施される。
【００６３】
第１２の態様では、本発明は、対象における免疫活性化を抑制するための薬剤の調製における、
（ａ）第１または第３の態様の単離ポリペプチド、
（ｂ）第２または第４の態様の単離核酸、
（ｃ）第５の態様のベクター、
（ｄ）第７の態様の組成物、
のうちの任意の１つもしくは複数の使用を提供する。
【００６４】
第１３の態様では、本発明は、対象における炎症性疾患を予防または処置するための薬剤の調製における、
（ａ）第１または第３の態様の単離ポリペプチド、
（ｂ）第２または第４の態様の単離核酸、
（ｃ）第５の態様のベクター、
（ｄ）第７の態様の組成物、
のうちの任意の１つもしくは複数の使用を提供する。
【００６５】
第１４の態様では、本発明は、対象における炎症性疾患を予防または処置する場合の使用における、
（ａ）第１または第３の態様の単離ポリペプチド、
（ｂ）第２または第４の態様の単離核酸、
（ｃ）第５の態様のベクター、
（ｄ）第７の態様の組成物、
のうちの任意の１つもしくは複数を提供する。
【００６６】
第１３の態様または第１４の態様の一実施形態では、炎症性疾患は、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、若年型糖尿病）、慢性疲労症候群、アルツハイマー、グレーブス病、変形性関節症、コラーゲンＩＩ関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣疾患、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性神経炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、自己免疫性ぶどう膜炎、乾癬、シェーグレン病、サルコイドーシス、皮膚筋炎、白血球破砕性血管炎、重症筋無力症、アレルギー性脳脊髄炎、甲状腺機能亢進症、悪性貧血、リウマチ性多発筋痛および多発性筋炎慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感染性疾患、リーキーガット症候群、心血管疾患（例えば、鬱血性心疾患）、アレルギー（例えば、アナフィラキシー、薬剤反応、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、じんましん、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触アレルギー、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー）、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）およびアテローム硬化症、ならびに感染性疾患、からなる群から選択される。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態は、ここではあくまで例として、添付の図面との関連で述べられることになる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ヒトＣｐｎ１０および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｒｏＥＳアミノ酸配列および対応する構造ドメインの境界のアラインメントを示す。
【図２Ａ】様々なＣｐｎ１０Ｎ末端変異体のＣｐＧ  ＯＤＮリガンドへの結合の度合いを示すグラフである。結果は、所与のＣｐＧ  ＯＤＮリガンド（すなわちＣｐＧ−Ａ、ＣｐＧ−ＢまたはＣｐＧ−Ｃ）に結合するアラニン−Ｃｐｎ１０（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０）のパーセントとして表される。
【図２Ｂ】様々なＣｐｎ１０Ｎ末端変異体のＣｐＧ  ＯＤＮリガンドへの結合の度合いを示すグラフである。結果は、所与のＣｐＧ  ＯＤＮリガンド（すなわちＣｐＧ−Ａ、ＣｐＧ−ＢまたはＣｐＧ−Ｃ）に結合するアラニン−Ｃｐｎ１０（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０）のパーセントとして表される。
【図２Ｃ】様々なＣｐｎ１０Ｎ末端変異体のＣｐＧ  ＯＤＮリガンドへの結合の度合いを示すグラフである。結果は、所与のＣｐＧ  ＯＤＮリガンド（すなわちＣｐＧ−Ａ、ＣｐＧ−ＢまたはＣｐＧ−Ｃ）に結合するアラニン−Ｃｐｎ１０（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０）のパーセントとして表される。
【図３】生成される組換えＣｐｎ１０タンパク質の純度を示す、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
定義
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本願中で使用される場合、文脈によって他に明示されない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」はまた、複数の細胞を含む。
【００７０】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書中で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、それに対応して多様な意味を有する。したがって、例えば、タンパク質をコードする配列を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ポリヌクレオチドは、排他的にその配列からなるかまたは１つもしくは複数の追加的な配列を含んでもよい。
【００７１】
「作用剤」は、本明細書中で使用される場合、その範囲内に、任意の天然または作製された成分または化合物を含む。したがって、同用語は、限定はされないが、任意の化学成分および化合物、核酸、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体および抗体の断片、ならびに本発明との関連で適切でありうる他の物質を含む。
【００７２】
用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」ならびに「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」および「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」を含むその用語の変形は、本明細書中で使用される場合、任意の適切な手段により、化合物（例えば、核酸、ポリペプチドまたは抗体）または本発明の組成物を生物に、接触させるか、適用するか、送達するか、または提供することを含む。
【００７３】
用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、本明細書中で使用される場合、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹ、全抗体（一本鎖全抗体を含む）、ならびにそれらの抗原結合断片、を含む。抗原結合抗体断片は、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含む断片を含む。抗体は、任意の動物に由来してもよい。一本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変領域を、単独で、または、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体もしくは一部と併せて含んでもよい。また、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせが含まれる。抗体は、生物学的分子に特異的に結合する、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、多重特異性、ヒト化、ならびにヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体であってもよい。
【００７４】
用語「核酸」は、本明細書中で使用される場合、一本鎖または二本鎖形態のいずれかでのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを示し、かつ、他に限定されない限り、天然ヌクレオチドと同様に核酸にハイブリダイズする、天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。
【００７５】
用語「ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、ペプチド結合によって互いに結合されるアミノ酸で構成されるポリマーを意味する。本発明の目的のため、「ポリペプチド」は、完全長タンパク質または完全長タンパク質の一部を構成しうる。
【００７６】
用語「処置」は、本明細書中で使用される場合、病状または症候を治療するか、またはそうでなければ、疾患または他の望ましくない症候の進行を、どのような方法であれ、予防するか、阻害するか、遅延させるか、または食い止める、ありとあらゆる使用を示す。
【００７７】
用語「有効量」および「治療有効量」は、本明細書中で使用される場合、無毒であるが、所望される治療効果をもたらすのに十分な量の作用剤または化合物をそれらの意味の範囲内に含む。必要とされる正確な量は、処置されている種、年齢および対象の全身状態、処置されている症状の重症度、投与されている特定の作用剤および投与方法などの要素に依存し、対象間で変化することになる。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかし、任意の所与の場合においては、適切な「有効量」は、単なる型通りの実験を用いて、当業者によって決定されうる。
【００７８】
ヒト「野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列」は、本明細書中で使用される場合、メチオニン残基から開始されず、配列番号１で示されるアミノ酸配列によって規定されうる。
【００７９】
用語「アラニン−Ｃｐｎ１０」および「Ａｌａ−Ｃｐｎ１０」は、本明細書中で使用される場合、同じ意味を有し、単一の追加的なＮ末端アラニン残基から開始する任意のポリペプチド（これは他の同一の野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドまたはその断片と比較される）を包含する。例えば、本明細書中に記載のヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０は、Ｎ末端でアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａから開始し、配列番号３で示される配列を有しうる。
【００８０】
本明細書で使用される用語「実質的に」は、本明細書中で使用される場合、大部分であるが必ずしも全部でないことを意味する。
【００８１】
本明細書中の先行技術文書に関する任意の説明、あるいはそれら文書に由来するかまたは基づく本明細書中の記述は、文書またはそれから派生する記述が関連技術の周知の一般的知識の一部であるということを認めるものではない。
【００８２】
説明目的で、本明細書中で言及されるすべての文書は、特に明記しない限り、参照により援用される。
【００８３】
詳細な説明
発明者は、追加的なＮ末端アラニン残基を有し（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０；配列番号３）、かつ柔軟な可動ループが欠如したヒトＣｐｎ１０変異体の（２Åの解像度での）Ｘ線結晶構造を解明している。これらの試験により、Ｃｐｎ１０単量体が、βヘアピン「ルーフループ」領域および「可動ループ」領域によって隣接されたコアの逆平行βバレル領域からなることが示された。ヒトＣｐｎ１０のＮ末端ドメインは、β−バレルから生じ、まずβヘアピンターンを受けた後、ルーフループの特定の領域に極めて接近したＣｐｎ１０ドーム様構造の上部を横切って配置される直線状に伸展した規則性が高い配座を形成する。一部の結晶構造では、Ｃｐｎ１０七量体内部の特定のサブユニットのＮ末端ドメインは、大規模な構造変化を受け（それは付属物（ａｐｐｅｎｄａｇｅ）がかなり柔軟であることを示し）、例えば核酸への結合を調節するという重要な生物学的機能を果たす可能性が高いことが認められた。
【００８４】
発明者によって行われた分子モデリングは、特定の機構または作用機序に縛られることなく、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の柔軟なＮ末端がルーフループ上に、Ｎ末端アラニン残基（Ａｌａ−１）とルーフループ上の小規模構造ポケットとの相互作用によってドッキングしうることを示した。構造ポケットは、残基Ｓｅｒ５２〜Ｇｌｙ５７によって形成されると考えられる。ルーフループの開始点における２つの重要な残基Ｌｙｓ５３およびＬｙｓ５５は、より小さい残基（Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５４、Ｇｌｙ５６およびＧｌｙ５７）によって囲まれ、それらの伸長された側鎖ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２のおかげで、Ｇｌｙ５４によって隔てられたポケットを形成すると考えられる。Ａｌａ−１のＣＨ３側鎖は、これらのＬｙｓ側鎖と相互作用し、それらと１つの大きい有意な集団（および第２のより小さいもの）を形成すると考えられる。Ａｌａ−１の、Ｌｙｓ５３〜Ｌｙｓ５５のルーフループ構造ポケットへのこの結合は、柔軟なＮ末端に有効に固定し、核酸に基づくＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子へのより強力な結合をもたらすと考えられる。ここで、このより強力な結合は、タンパク質の免疫抑制能を増強すると考えられる。
【００８５】
本発明は、Ｎ末端ドメイン内の残基に対する修飾を含むＣｐｎ１０変異体を提供する。一般に、本発明のＣｐｎ１０Ｎ末端ドメイン変異体は、野生型Ｃｐｎ１０に比べて、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む分子および／または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を含む宿主分子に対する増大した結合親和性を有する。故に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドとＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子との間の結合相互作用は、一般に、野生型Ｃｐｎ１０とそれら分子との間の結合相互作用より強力である。好ましくは、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドとＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子との間の結合相互作用は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０とそれら分子との間の結合相互作用より強力である。
【００８６】
ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含むリガンドのパターン認識受容体（ＰＲＲ）への結合は、有効な固有の免疫応答を確立する上で中核となる一連の事象を開始させる。特定の機構または作用機序に限定させることなく、本発明のＣｐｎ１０Ｎ末端ドメイン変異体によるこれらのリガンドの強力な結合が、それらリガンドとそれらの標的ＰＲＲとの間の相互作用を修飾または阻止すると仮定される。次いで、これは、ＰＲＲシグナル伝達によって引き起こされる免疫応答、例えば炎症性分子の産生および分泌によって誘発されるものなどの開始を阻害すると考えられる。
【００８７】
したがって、ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子への結合は、免疫応答の性質および／または強さに影響を与えうる。本発明のＣｐｎ１０Ｎ末端ドメイン変異体は、ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子に、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０がそれら分子に結合する場合より強力に結合するおかげで、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて増強された免疫調節機能を果たしうる。
【００８８】
本発明のＣｐｎ１０Ｎ末端ドメイン変異体は、投与することで、免疫応答を抑制することが可能である。したがって、変異体は、投与することで、免疫活性化に関連した種々の疾患（例えば慢性炎症性疾患）を予防および／または処置することが可能である。
【００８９】
本発明のＣｐｎ１０Ｎ末端ドメイン変異体はまた、スクリーニングアッセイにおいて使用し、それらの活性のアゴニストを同定することが可能である。これらのアゴニストは、一般に、本発明の変異体によって媒介されるＰＲＲシグナル伝達に対する抑制効果を促進することから、ＰＲＲシグナル伝達のアンタゴニストとなる。
【００９０】
Ｃｐｎ１０Ｎ末端ドメイン変異体
本発明は、Ｎ末端ドメインでの残基に対する修飾を含むＣｐｎ１０変異体（「本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド」）を提供する。また、Ｃｐｎ１０変異体をコードする核酸（「本発明のＣｐｎ１０核酸」）が提供される。
【００９１】
典型的には、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、単離ポリペプチドである。これに関連する用語「単離された」は、ポリペプチドが、その天然状態で見出されることになる場合に伴う他の成分の一部もしくは全部から除去されているかまたはそれらに関連しないことを意味することは理解されるであろう。例えば、「単離された」ポリペプチドは、より大きなポリペプチド配列内の他のアミノ酸配列から除去されうるか、または関連のないタンパク質などの天然成分から除去されうる。理解を容易にするため、「単離された」ポリペプチドはまた、自然から得られていないばかりか、新たに調製され、例えば、化学合成され、および／または組換え方法によって調製されているポリペプチドを含む。本明細書中に記載のように、本発明の単離Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、より長いポリペプチドまたは融合タンパク質の一成分として含めてもよい。
【００９２】
典型的には、本発明のＣｐｎ１０核酸は、単離核酸である。これに関連する用語「単離された」は、核酸が、その天然状態で見出されることになる場合に伴う他の成分の一部もしくは全部から除去されているかまたはそれらに関連しないことを意味することは理解されるであろう。例えば、「単離された」核酸は、より大きな核酸配列内の他の核酸配列から除去されうるか、または関連のない核酸などの天然成分から除去されうる。理解を容易にするため、「単離された」核酸はまた、自然から得られていないばかりか、新たに調製され、例えば、化学合成され、および／または組換え方法によって調製されている核酸を含む。
【００９３】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列と、Ｎ末端ドメイン内の１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入の分だけ異なりうる。
【００９４】
当業者は、生物学的条件下で、多数の哺乳類野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド（例えばヒト野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド）の開始メチオニンが、一般に２番目の残基であるアラニンを踏まえて切断される（すなわち「Ｎ末端ルール」）ことを理解するであろう。したがって、ヒト「野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列」は、本明細書中で検討される場合、メチオニン残基から開始することなく、配列番号１で示されるアミノ酸配列によって規定されうる。
【００９５】
Ｃｐｎ１０の「Ｎ末端ドメイン」は、本明細書中で検討される場合、Ｃｐｎ１０単量体におけるβバレルの第１のβ鎖を形成する残基に先行する、ポリペプチド配列内のすべてのアミノ酸残基を包含する。したがって、ヒト野生型Ｃｐｎ１０配列の「Ｎ末端ドメイン」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基１〜７によって規定されうる。
【００９６】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、Ｎ末端ドメイン内での修飾を別にして、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの変異体、または野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドの断片と同一または実質的に同一でありうることは理解されるであろう。
【００９７】
野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、任意の供給源に由来してもよく、その非限定例として、植物（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））、細菌（例えば、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、線虫（例えば、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ））、ならびに動物、例えば、哺乳類、カエル（例えば、ニシツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、ミバエ（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、ニワトリ、魚（例えば、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｔｅｒｉｏ））および他の海洋動物（例えば、ユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｓａｖｉｇｎｙｉ）などのホヤ）が挙げられる。あるいは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、古細菌（ａｒｃｈａｅｌ）（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ））であってもよい。
【００９８】
好ましくは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、哺乳動物に由来する。例えば、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、霊長動物、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、またはマウスＣｐｎ１０ポリペプチドであってもよい。
【００９９】
より好ましくは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、ヒト野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドである。ヒト野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１００】
したがって、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列またはそのポリペプチド配列の変異体もしくは断片（すなわちその変異体もしくは断片）のＮ末端ドメイン内の任意のアミノ酸残基を置換または欠失させることにより、生成してもよい。Ｎ末端ドメイン内の任意の数のアミノ酸を置換または欠失させ、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドを生成してもよく、ここで欠失または置換される特定のアミノ酸については限定されない。
【０１０１】
それに加え、またはその代わりに、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、１つもしくは複数の追加的なアミノ酸残基を野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）のＮ末端ドメインに組み込むことによって生成してもよい。１つもしくは複数の追加的なアミノ酸残基をＮ末端ドメインに「組み込む」ことが、アミノ酸残基または２つ以上のアミノ酸残基を含む配列をＮ末端ドメインのいずれかの場所に挿入することを包含することは理解されるであろう。任意の数の追加的なアミノ酸を、Ｎ末端ドメインに組み込んでもよく、ここで組み込まれるアミノ酸の同一性については限定されない。
【０１０２】
したがって、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）のＮ末端残基（すなわち第１の残基）に付加される１つもしくは複数の追加的なアミノ酸残基を含んでもよい。付加残基は、正に帯電した残基、負に帯電した残基、または中性の残基であってもよい。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）、および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）、増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、増大したＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１０３】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、１つもしくは複数の中性アミノ酸残基を、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）の最初のＮ末端残基に付加することによって生成してもよい。追加的な中性アミノ酸は、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択してもよい。
【０１０４】
特定の実施形態では、特定のシャペロニン１０Ｎ末端変異体Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）およびＧｌｙ−Ｃｐｎ１０（配列番号６）は、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）の最初のＮ末端残基に付加された単一の中性アミノ酸残基を有するＮ末端変異体であり、本発明の範囲から除外される。
【０１０５】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、１つもしくは複数の正に帯電したアミノ酸残基を、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）の最初のＮ末端残基に付加することによって生成してもよい。正に帯電したアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンからなる群から選択してもよい。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）、および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）、増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のそれらＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１０６】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号６６で示されるアミノ酸配列またはその断片を含んでもよい。断片は、配列番号６６によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初のアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１０７】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号６６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、配列番号６６によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初のアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１０８】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、１つもしくは複数の負に帯電したアミノ酸残基を、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）の最初のＮ末端残基に付加することによって生成してもよい。負に帯電した１種または複数種アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択してもよい。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）、および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）、増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のそれらＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１０９】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号７２または７４で示されるアミノ酸配列またはその断片を含んでもよい。断片は、配列番号７２または７４によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初のアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１１０】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号７２または７４で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、配列番号７２または７４によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初のアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸残基を含む配列を、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）の最初のＮ末端残基に付加することによって生成される。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のそれらＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１１２】
アミノ酸残基の付加された配列は、異なるように帯電したアミノ酸の組み合わせを含んでもよい。例えば、配列は、中性アミノ酸残基と正に帯電した残基の組み合わせ、または中性アミノ酸残基と負に帯電した残基の組み合わせを含んでもよい。
【０１１３】
当業者は、タンパク質翻訳における生体系では、メチオニン残基を生成するＡＴＧ開始コドンの翻訳から開始されることを理解するであろう。Ｃｐｎ１０の場合、開始メチオニンが、隣接残基の同一性に依存し、最終（野生型）ポリペプチドから切断されうることが判定されている。より詳細には、隣接アミノ酸が、アラニン、グリシン、プロリン、またはセリンである場合、開始メチオニンが野生型Ｃｐｎ１０から切断されることが判定されている。例えば、上記のように、ヒト野生型Ｃｐｎ１０は、一般に、生物学的条件下で、アラニン残基から開始する（すなわち開始メチオニンは切断される）一方、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）相同体ＧｒｏＥＳは、メチオニンから開始し、アスパラギンが後続する（すなわち開始メチオニンは切断されない）。
【０１１４】
場合により、生体系ではＣｐｎ１０ポリペプチドの開始メチオニンを切断する傾向があるにもかかわらず、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドを、代替手段（例えば化学合成）を用いて合成し、および／または、修飾し、開始メチオニンを維持または除去することが可能であることは理解されるであろう。したがって、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、開始メチオニン残基から開始してもまたは開始しなくてもよい。
【０１１５】
発明者は、メチオニン残基のＣｐｎ１０のＮ末端への付加が、ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子への結合力増大を促進することを判定している。特定の機構または作用機序に限定されないが、メチオニンの大きい側鎖（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３）が、発明者によって同定された推定上の結合ポケットの外部に位置する、Ｃｐｎ１０分子のルーフループ内の残基（例えば配列番号１のイソロイシン５９（Ｉｌｅ５９）および／またはバリン６２（Ｖａｌ６２））との複数の相互作用を受けることが提起されている。
【０１１６】
したがって、特定の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸残基を含む配列を、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）の最初のＮ末端残基に付加することによって生成され、ここで付加される配列の１つもしくは複数の残基は、メチオニンである。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のそれらＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１１７】
一部の実施形態では、配列は、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）のＮ末端残基に付加されたメチオニン残基を含む。
【０１１８】
特定の実施形態では、特定のシャペロニン１０Ｎ末端変異体ＧＳＭ−Ｃｐｎ１０（配列番号５７）は、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）の１番目のＮ末端残基に付加された３つの中性アミノ酸残基を有するＮ末端変異体であり、本発明の範囲から除外される。
【０１１９】
他の実施形態では、配列は、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）のＮ末端残基に付加された他の残基（すなわちメチオニン以外の残基）を含む。Ｎ末端残基に付加された配列の付加されたアミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンからなる群から選択してもよい。
【０１２０】
好ましくは、付加された配列は、１つもしくは複数の追加的なアミノ酸残基に先行する少なくとも１つのメチオニン残基を含む。配列の最後のアミノ酸残基は、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）のＮ末端残基に付加される。最後のアミノ酸残基は、中性アミノ酸残基または帯電したアミノ酸残基であってもよい。１つもしくは複数の追加的な残基は、メチオニン残基とＮ末端に付加された残基を分離しうる。
【０１２１】
好ましくは、付加された配列は、２番目のアミノ酸残基に先行する１番目のメチオニン残基を含む。配列の２番目のアミノ酸残基は、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）のＮ末端残基に付加される。２番目のアミノ酸残基は、中性アミノ酸残基または帯電したアミノ酸残基であってもよい。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、１つの中性アミノ酸残基を、ヒト野生型ポリペプチド配列の最初のＮ末端残基に付加することによって生成される。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のそれらＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１２３】
特定の実施形態では、特定のシャペロニン１０Ｎ末端変異体Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）およびＧｌｙ−Ｃｐｎ１０（配列番号６）は、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）の最初のＮ末端残基に付加された単一の中性アミノ酸残基を有するＮ末端変異体であり、本発明の範囲から除外される。本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号６、２１、３５、６３、６４、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７３、もしくは７５で示されるアミノ酸配列またはその断片を含んでもよい。断片は、配列番号６、２１、もしくは３５によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初のアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１２４】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号６、２１、３５、６３、６４、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７３、もしくは７５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、配列番号６、２１、もしくは３５によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初のアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１２５】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号７、８、２２、２３、３６もしくは３７のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはその断片を含んでもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初のアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１２６】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号７、８、２２、２３、３６もしくは３７のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む核酸またはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初のアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１２７】
他の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、２つの中性アミノ酸残基を含む配列を、ヒト野生型ポリペプチド配列の最初のＮ末端残基に付加することによって生成される。付加される配列の最初のアミノ酸残基は、メチオニンであってもよい。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のそれらＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１２８】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号９、１２、１５、２４、２６、２９、３２、３８、４４、４９、５２、５５、７６、７８、８４、もしくは９６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列またはその断片を含んでもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１２９】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号９、１２、１５、２４、２６、２９、３２、３８、４４、４９、５２、５５、７６、７８、８４、もしくは９６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１３０】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号１０、１３、１４、１６、１７、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３９、４０、４５、４６、５０、５１、５３、５４、５６、５７、８５、８６、９７、もしくは９８のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはその断片を含んでもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１３１】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号１０、１３、１４、１６、１７、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３９、４０、４５、４６、５０、５１、５３、５４、５６、５７、８５、８６、９７、もしくは９８のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む核酸またはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１３２】
他の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、３つ以上の中性アミノ酸残基を含む配列を、ヒト野生型ポリペプチド配列の最初のＮ末端残基に付加することによって生成される。付加される配列は、１つもしくは複数のメチオニン残基を含んでもよい。付加される配列の最初のアミノ酸残基は、メチオニンであってもよい。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のそれらＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１３３】
したがって、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号５８、６０、７７、８１、８７、９０、もしくは９３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列またはその断片を含んでもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初の３つのアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１３４】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号５８、６０、７７、８１、８７、９０、もしくは９３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初の３つのアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１３５】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号５９、６１、６２、８２、８３、８８、８９、９１、９２、９４、もしくは９５のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列またはその断片を含んでもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初の３つのアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１３６】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号５９、６１、６２、８２、８３、８８、８９、９１、９２、９４、もしくは９５のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む核酸またはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、上記の配列番号のいずれか１つによってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初の３つのアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１３７】
さらなる実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、中性アミノ酸残基と正に帯電した残基の組み合わせを含む配列を、ヒト野生型ポリペプチド配列の最初のＮ末端残基に付加することによって生成される。付加される配列の最初のアミノ酸残基は、メチオニンであってもよい。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）、および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）、増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のそれらＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１３８】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号１８で示されるアミノ酸配列またはその断片を含んでもよい。断片は、配列番号１８によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１３９】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、配列番号１８によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１４０】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号１９または配列番号２０で示されるヌクレオチド配列を含んでもよい。断片は、配列番号１９または配列番号２０によってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１４１】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号１９または配列番号２０で示されるヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、配列番号１９または配列番号２０によってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１４２】
他の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、中性アミノ酸残基と負に帯電した残基の組み合わせを含む配列を、ヒト野生型ポリペプチド配列の最初のＮ末端残基に付加することによって生成される。付加される配列の最初のアミノ酸残基は、メチオニンであってもよい。ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）、および／または野生型Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号１で示されるヒト野生型Ｃｐｎ１０に比べて）、増強された免疫調節機能を有してもよい。ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０のそれらＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。
【０１４３】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号４１または配列番号４７で示されるアミノ酸配列またはその断片を含んでもよい。断片は、配列番号４１または配列番号４７によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１４４】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号４１または配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、配列番号４１または配列番号４７によって規定されるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくとも含む。
【０１４５】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号４２、４３もしくは４８のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含んでもよい。断片は、配列番号４２、４３もしくは４８のいずれか１つによってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１４６】
本発明のＣｐｎ１０核酸配列は、配列番号４２、４３もしくは４８のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。断片は、配列番号４２、４３もしくは４８のいずれか１つによってコードされるＮ末端ドメイン配列の最初の２つのアミノ酸残基を少なくともコードする。
【０１４７】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、Ｎ末端ドメインの外部に位置する領域内で、（野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列に比べて）追加的なアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入をさらに含んでもよい。
【０１４８】
例えば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ルーフβヘアピンドメイン、βバレルドメインおよび／または可動ループドメイン内で、１つもしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換をさらに含んでもよい。したがって、あくまで例として、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の位置７〜１０１の任意の１つもしくは複数において、追加的な置換、欠失および／または挿入をさらに含んでもよい。
【０１４９】
特定の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ヒト野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチド配列（またはその変異体もしくは断片）と、Ｎ末端ドメイン内での１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入、また、（配列番号１の残基５２〜６２によって規定される）ルーフβヘアピンドメイン内での１つもしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換の分だけ異なる。
【０１５０】
２つの配列間の配列同一性のパーセントは、比較ウインドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって判定されうる。２つの配列を最適に整列するため、比較ウインドウにおける配列（例えば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドまたはＣｐｎ１０核酸）の一部は、例えば、欠失または付加を含まない参照配列（例えば別種に由来するもの）と比較し、欠失または付加（すなわちギャップ）を含んでもよく、その逆もいえる。次いで、配列同一性のパーセントは、同一のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が両配列内に存在する位置の数を測定し、一致した位置の数を生成し、一致した位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で除し、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセントを生成することにより、計算することが可能である。
【０１５１】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連では、配列同一性のパーセントは、次の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用するかまたはマニュアルでのアラインメントおよび目視検査によって測定される際、比較ウインドウまたは指定領域にわたって最大一致（ｍａｘｉｍｕｍ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）になるように比較および整列される場合、特定の領域（または特定化されない場合には全配列）にわたって同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセントを示す。
【０１５２】
配列比較においては、典型的には、一方の配列は、試験配列の比較対象の参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要ならば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用するか、または代替パラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、参照配列に対して、試験配列における配列同一性のパーセントをプログラムパラメータに基づいて計算する。
【０１５３】
比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野で既知である。配列同一性の判定のための配列の最適なアラインメントは、限定はされないが、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）におけるＣＬＵＳＴＡＬ、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（バージョン１０）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）を含む既知のコンピュータプログラムを用いて従来のように行ってもよい。
【０１５４】
本明細書中で例示される本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、１つもしくは複数の追加的なアミノ酸をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、追加的なアミノ酸は、例示されるポリペプチドの由来元でありうるタンパク質またはより大きなポリペプチドのすぐ上流および／または下流のアミノ酸に対応しうる。当業者は、本明細書中で例示される本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの１つもしくは複数のアミノ酸が、活性の低下を伴わずに欠失しうることを理解するであろう。
【０１５５】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドを、例えば、アセチル基、脂質、炭水化物および／またはリン酸基で修飾することで、免疫原性、安定性および／または溶解度が改善されうる。ポリペプチド末端のキャッピングを用いることで、細胞性プロテアーゼに対する安定性が促進されうる。
【０１５６】
本明細書中で例示される本発明のＣｐｎ１０核酸は、１つもしくは複数の追加的なヌクレオチドをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、追加的なヌクレオチドは、核酸の由来元であるゲノム配列内のすぐ上流および／または下流のヌクレオチドに対応しうる。当業者は、本明細書中で例示される本発明のＣｐｎ１０核酸の１つもしくは複数のヌクレオチドが、活性の低下を伴わずに欠失しうることを理解するであろう。
【０１５７】
「本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド」がそれらポリペプチドの変異体を包含することは理解されるであろう。同様に、「本発明のＣｐｎ１０核酸」がそれら核酸の変異体を包含することは理解されるであろう。
【０１５８】
用語「変異体」は、本明細書で使用される場合、実質的に類似の配列を示す。一般に、２つの配列は、その２つの配列が、特定の領域全体または特定されない場合に全配列にわたって同じ（「配列同一性」のパーセント）である、特定のパーセントのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合、「実質的に類似する」。したがって、本発明のＣｐｎ１０核酸または本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの「変異体」は、参照配列と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を共有しうる。
【０１５９】
一般に、ポリペプチド変異体は、それらの由来元であるポリペプチドと定性的な生物学的活性を共有する。核酸変異体は、一般に、由来元であるポリペプチドと定性的な生物学的活性を一般に共有するポリペプチドをコードする。また、本発明のＣｐｎ１０核酸および本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの相同体は、用語「変異体」の意味の範囲内に含まれる。核酸相同体は、典型的には、異なる種に由来するが、対応する本発明のＣｐｎ１０核酸と実質的に同一の生物学的機能または活性を共有している。ポリペプチド相同体は、典型的には、異なる種に由来するが、対応する本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を共有している。
【０１６０】
さらに、用語「変異体」はまた、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの類似体を含む。ポリペプチド「類似体」は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの誘導体であるポリペプチドであり、ここで誘導体は、ポリペプチドが実質的に同一の機能を保持する程度に、１つもしくは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換を含む。用語「保存的アミノ酸置換」は、ポリペプチド鎖（タンパク質の一次配列）内で同様の特性を有する、一方のアミノ酸ともう一方のアミノ酸との置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を示す。例えば、帯電したアミノ酸のグルタミン酸（Ｇｌｕ）と同様に帯電したアミノ酸のアスパラギン酸（Ａｓｐ）との置換の場合、保存的アミノ酸置換となる。
【０１６１】
「本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド」がそれらポリペプチドの断片を包含することは理解されるであろう。同様に、「本発明のＣｐｎ１０核酸」がそれら核酸の断片を包含することは理解されるであろう。
【０１６２】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの「断片」は、成分をコードするポリペプチドであるか、あるいは本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドまたはその変異体の成分である。典型的には、断片は、それが成分であるポリペプチドと定性的な生物学的活性を共有する。典型的には、ポリペプチド断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００もしくは１００を超えるアミノ酸残基長であってもよい。
【０１６３】
本発明のＣｐｎ１０核酸の「断片」は、成分をコードする核酸であるか、あるいは本発明のＣｐｎ１０核酸またはその変異体の成分である。核酸の断片は、必ずしも生物学的活性を保持するポリペプチドをコードする必要がない。断片は、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用でありうる。典型的には、核酸断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０もしくは３４００ヌクレオチド長であってもよい。
【０１６４】
一般に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む分子および／または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を含む宿主分子に対する増大した結合親和性を有する。故に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドとＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子との間の結合相互作用は、一般に、野生型Ｃｐｎ１０とそれらの分子との間の結合相互作用より強力である。好ましくは、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドとＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子との間の結合相互作用は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０とそれらの分子との間の結合相互作用より強力である。
【０１６５】
ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子との結合は、免疫応答の性質および／または強さに影響を与えうる。本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子との結合が、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０がそれらの分子に結合する場合より強力であることから、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて、増強された免疫調節機能を発揮しうる。
【０１６６】
したがって、特定の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて（例えば配列番号３で示されるヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて）、増強された免疫調節機能を有しうる。
【０１６７】
ポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅｓ）のＮ末端は、野生型ポリペプチドに比べて、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの追加的なアミノ酸残基によって伸長されうる。Ｎ末端は、メチオニン残基から開始されうる。
【０１６８】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて増強された免疫調節機能を有する本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、例えば、配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、５２、５５、５８、６０、８１、８４、８７、９０もしくは９３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列またはその断片（その配列のＮ末端ドメインを含む）を含んでもよい。
【０１６９】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に比べて増強された免疫調節機能を有する本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、５２、５５、５８、６０、８１、８４、８７、９０もしくは９３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片（その配列のＮ末端ドメインを含む）と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を共有してもよい。
【０１７０】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節機能（すなわち免疫調節能）のレベルは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を用いて測定してもよい。例えば、免疫調節機能のレベルは、ポリペプチドとＰＡＭＰおよびＤＡＭＰ（例えば細菌ＣｐＧ）との結合相互作用の性質および／または強さによって測定し、ひいては本明細書の実施例中に記載の方法を用いて測定してもよい。それに加え、またはその代わりに、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節機能は、ポリペプチドによって引き起こされるパターン認識受容体（ＰＲＲ）シグナル伝達の程度を測定することによって評価してもよい。例えば、ポリペプチドの、ＰＲＲ（例えばＴｏｌｌ様受容体）を介するポリ（Ｉ：Ｃ）誘発性のＮＦκＢ生成に対する阻害能は、米国特許出願第１２／９３４９８０号明細書（２００９年１２月３０日公開）中に記載の技術を用いて測定してもよく、その内容全体は、相互参照によって本明細書中に援用される。それに加え、またはその代わりに、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節機能は、ＰＲＲを発現する細胞によるポリペプチドおよびそれらＰＲＲに対するリガンドの存在下でのサイトカイン生成および／またはサイトカイン分泌のレベルを測定することによって評価してもよい（下記の表題「免疫抑制」の項も参照）。当業者は、上記の技術が例示的なものであり、かつ、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの免疫調節機能（すなわち免疫調節能）のレベルを測定するのに使用される特定の方法に関する特定の制限が全く存在しないことを理解するであろう。
【０１７１】
特定の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、野生型Ｃｐｎ１０および／またはＡｌａ−Ｃｐｎ１０とＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰとの結合親和性に比べて、ＰＡＭＰおよび／またはＤＡＭＰに対する増大した結合親和性を有してもよい。
【０１７２】
ＰＡＭＰは、ＣｐＧモチーフを含んでもよい。例えば、ＰＡＭＰは、細菌ＤＮＡであってもよい。ＰＡＭＰは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドモチーフ（ＣｐＧ  ＯＤＮ）を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。特定の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮモチーフは、ＣｐＧＡ、ＣｐＧＢおよびＣｐＧＣのうちの任意の１つもしくは複数である。
【０１７３】
一部の実施形態では、特定のＣｐｎ１０Ｎ末端変異体は、本発明の範囲から除外してもよい。例えば、特定の実施形態では、特定のヒトＣｐｎ１０Ｎ末端変異体Ａｌａ−Ｃｐｎ１０（配列番号３）、ＧＳＭ−Ｃｐｎ１０（配列番号５７）、およびＧｌｙ−Ｃｐｎ１０（配列番号６）は、本発明の範囲から除外してもよい。
【０１７４】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、当該技術分野で既知の方法を用いて作製してもよい。例えば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ペプチド化学合成、例えば固相ペプチド合成、液相ペプチド合成および組換え遺伝子技術において使用される従来の方法によって作製してもよい。本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドのアミノ酸残基は、ありとあらゆるそれらの異性体（例えば、Ｄ体、Ｌ体およびＤＬ体）およびアイソフォームを含むことは理解されるであろう。
【０１７５】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、固相化学技術（例えば、Ｓｔｅｗａｒｄら、（１９６３年）、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（１９７３年）、「Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第２巻、４６頁を参照）または古典的溶液合成（例えば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、（１９６５年）、「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第１巻、７２−７５頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照）によって合成してもよい。一般に、かかる方法は、１つもしくは複数のアミノ酸または好適に保護されたアミノ酸の、ポリマー上の成長する連続ポリペプチド鎖への付加を含む。典型的には、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかは、好適な保護基によって保護される。次いで、保護および／または誘導体化されたアミノ酸は、不活性固体支持体に付加されるか、または好適に保護された相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列における次のアミノ酸を、アミド結合を形成するのに適した条件下で付加することにより、溶液中で使用される。次いで、保護基は、新たに付加されたアミノ酸残基から除去される場合があり、次いで（好適に保護された）次のアミノ酸が付加され、成長するポリペプチド鎖が形成される。
【０１７６】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、例えば、タンパク質またはより大きなポリペプチドの、ｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ−Ｃおよびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）Ｖ８−プロテアーゼなどの１つもしくは複数のプロテイナーゼによる消化により、生成してもよい。消化されたペプチド断片は、例えば高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）技術により、精製してもよい。
【０１７７】
それに加え、またはその代わりに、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、組換えポリペプチド生成技術を用いて生成してもよい。組換えポリペプチド生成技術は、典型的には、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドをコードする核酸のプラスミドへのクローニングを、後続する好適な微生物における過剰発現のため、含むことになる。発現ベクターまたはプラスミドの作成に適した方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；および、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）、（２００７年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．などの標準のテキスト中で詳述されている。
【０１７８】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの生成に適した組換え方法は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、（編）（２００７年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、（第５章）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．；およびＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、（１９９４年）、「Ｔｈｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈなどの標準のテキスト中で詳述されている。
【０１７９】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの生成用に使用可能な一般に使用される発現系は、例えば、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓｉｓ））、ウイルス（例えば、バキュロウイルスおよび痘疹）、細胞（例えば哺乳類および昆虫）および無細胞系、を含む。使用可能な好適な無細胞系は、限定はされないが、真核生物としてのウサギ網状赤血球（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｔｙｅ）、小麦胚芽抽出系、および原核生物としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）無細胞系を含む（例えば、Ｍａｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：５５９−５６４頁（２０００年）、ＰｅｌｈａｍおよびＪａｃｋｓｏｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７：２４７−２５６頁（１９７６年）；ＲｏｂｅｒｔｓおよびＰａｔｅｒｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７０：２３３０−２３３４頁（１９７３年）；Ｚｕｂａｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、７：２６７頁（１９７３年）；ＧｏｌｄおよびＳｃｈｗｅｉｇｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０：５３７頁（１９７１年）；Ｌｅｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６（４）：２６３２−２６３８頁（１９９１年）；Ｂａｒａｎｏｖら、Ｇｅｎｅ、８４：４６３−４６６頁（１９８９年）；ならびにＫｕｄｌｉｃｋｉら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０６：３８９−３９３頁（１９９２年）を参照。
【０１８０】
（例えば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドと特定のパーセントの配列同一性を有するポリペプチドを生成するための）本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドのアミノ酸配列への変化は、当該技術分野で標準の技術を用いて行ってもよい。例えば、アミノ酸変化は、ヌクレオチドの付加、欠失または置換を含むヌクレオチド置換技術（保存的および／または非保存的）を、適切なリーディングフレームが維持されるという条件下で使用することによって行ってもよい。典型的な技術は、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、オリゴヌクレオチド媒介性またはポリヌクレオチド媒介性突然変異誘発、既存もしくは改変された制限酵素部位の使用を介した選択領域の欠失、ならびにポリメラーゼ連鎖反応、を含む。本発明の目的に合うように修飾されたポリペプチドの活性の試験は、当業者に既知の多数の技術のいずれかの技術を介して行ってもよい。
【０１８１】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの精製は、当該技術分野における標準的技術、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、（２００７年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ    ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、（第６章）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．に記載のものを用いて行ってもよい。例えば、ポリペプチドが溶解状態である場合、それは、カラムクロマトグラフィーなどの標準的方法を用いて単離してもよい。本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、精製を補助する様々な親和性タグまたは担体タンパク質を有するように遺伝子操作してもよい。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸を有する発現ベクターに操作されるヒスチジンおよびタンパク質タグの使用は、例えば、天然または変性条件下での金属−キレートアフィニティークロマトグラフィー（ＭＣＡＣ）により、精製を促進しうる。精製は、大規模生成を目的として、スケールアップしてもよい。
【０１８２】
本発明のＣｐｎ１０核酸は、当該技術分野で既知の標準的技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔａｋｕｒａ  Ｋ．ら、（１９８４年）、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３頁；Ｉｎｎｉｓら、（編）、（１９９０年）、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、（編）、（１９９５年）、「ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびにＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、（編）、（１９９９年）、「ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載のものを用いて作製してもよい。
【０１８３】
本発明のＣｐｎ１０核酸は、例えば、リン酸ジエステルおよびリン酸トリエステル法（例えば、Ｎａｒａｎｇら、（１９７９年）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０頁；Ｂｒｏｗｎら、（１９７９年）、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｔＲＮＡ  Ｇｅｎｅ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１頁；および米国特許第４３５６２７０号明細書を参照）またはジエチルホスホロアミダイト法（ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、（１９８１年）、「Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−１８６２頁を参照）を含む化学合成技術により、作製してもよい。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、米国特許第４４５８０６６号明細書中に記載されている。
【０１８４】
本発明のＣｐｎ１０核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）または相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）であってもよい。ＲＮＡは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から誘導してもよい。ＲＮＡは、対応するＤＮＡ配列の転写から誘導される一次転写産物であってもよい。ＲＮＡはまた、転写後プロセシングを受けることがある。例えば、一次ＲＮＡ転写産物は、転写後プロセシングを受け、成熟ＲＮＡを形成しうる。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、細胞によってタンパク質に翻訳されうる対応するオープンリーディングフレームから誘導されるＲＮＡを示す。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡに相補的でありかつそれから誘導される二本鎖ＤＮＡを示す。センスＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むことから、細胞によってタンパク質に翻訳されうるＲＮＡ転写産物を示す。アンチセンスＲＮＡは、標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を遮断するために使用されうるＲＮＡ転写産物を示す。
【０１８５】
当業者は、所与のＣｐｎ１０ＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列が、遺伝子コードを使用して誘導しうることを理解するであろう。ＲＮＡ配列は、特定のＤＮＡ配列に相補的な配列を生成することにより、所与のＤＮＡ配列から誘導してもよい。相補配列は、ＤＮＡ配列内の各シトシン（「Ｃ」）塩基をグアニン（「Ｇ」）塩基に、ＤＮＡ配列内の各グアニン（「Ｇ」）塩基をシトシン（「Ｃ」）塩基に、ＤＮＡ配列内の各チミジン（「Ｔ」）塩基をアデニン（「Ａ」）塩基に、またＤＮＡ配列内の各アデニン（「Ａ」）塩基をウラシル（「Ｕ」）塩基に変換することにより、生成してもよい。
【０１８６】
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列は、ＲＮＡ配列を上記のようにＤＮＡ配列から誘導し、次いでＲＮＡ配列をｃＤＮＡ配列に変換することにより、ＤＮＡ配列から誘導してもよい。ＲＮＡ配列は、ＲＮＡ配列内の各シトシン（「Ｃ」）塩基をグアニン（「Ｇ」）塩基に、ＲＮＡ配列内の各グアニン（「Ｇ」）塩基をシトシン（「Ｃ」）塩基に、ＲＮＡ配列内の各ウラシル（「Ｕ」）塩基をアデニン（「Ａ」）塩基に、またＲＮＡ配列内の各アデニン（「Ａ」）塩基をチミジン（「Ｔ」）塩基に変換することにより、ｃＤＮＡ配列に変換してもよい。
【０１８７】
特定の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０核酸は、ベクターにクローン化してもよい。ベクターは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含んでもよい。ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または外来配列の挿入、細胞へのそれらの導入および導入配列の発現に適した任意の他の好適な媒体であってもよい。典型的には、ベクターは、発現ベクターであり、また、発現制御およびプロセシング配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含んでもよい。
【０１８８】
本発明では、かかるベクターによって形質転換された宿主細胞についても検討される。例えば、本発明のＣｐｎ１０核酸は、細菌宿主細胞に形質転換されるベクターにクローン化してもよく、それは、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主細胞に形質転換される。ベクターの作成およびその宿主細胞への形質転換のための方法は、一般に当該技術分野で既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）（２００７年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【０１８９】
抗体
本発明はまた、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに「特異的に結合する」抗体（「本発明の抗体」）を提供する。
【０１９０】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに「特異的に結合する」抗体は、ポリペプチドに、それが無関連分子（例えば非標的ポリペプチド）に結合する場合より有意に高い親和性で結合できるものである。したがって、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、そのポリペプチドと他の任意の数の有望な代替的な結合パートナーとを識別する能力を有する抗体である。故に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに特異的な抗体は、有望な結合パートナーとして複数の異なっても等しく接近可能な分子に暴露される場合、そのポリペプチドに選択的に結合し、他の代替的な有望な結合パートナーは、抗体によって実質的に未結合のまま残ることになる。一般に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに特異的な抗体は、そのポリペプチドに、標的ポリペプチドでない他の有望な結合パートナーより、少なくとも１０倍、好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、および最も好ましくは１００倍を超えるほど頻繁に、優先的に結合することになる。本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに特異的な抗体は、他の非標的分子に、弱くても検出可能なレベルで結合できる場合がある。これは、バックグラウンド結合として周知であり、例えば適切な対照の使用により、ポリペプチドに特異的な結合と容易に識別可能である。
【０１９１】
抗体の本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドへの結合を促進するための反応条件（例えば、抗体の濃度、インキュベーション時間、ｐＨ、温度など）は、主に使用される抗体および特異的な標的ポリペプチドに依存することになり、当該技術分野で既知の方法を用いて容易に決定されうる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９４年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｏｌｉｇａｎら、（編）、（２００８年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；およびＢｏｎｉｆａｃｉｎｏら、（編）（２００７年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）。
【０１９２】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、当該技術分野で既知の方法を用いて生成してもよい。
【０１９３】
例えば、典型的にはＦａｂ部分を有する、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、（１９８８年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．に記載のハイブリドーマ技術を用いて調製してもよい。
【０１９４】
本質的には、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の調製においては、培養物中の連続細胞系によって抗体の産生をもたらす任意の技術を用いてもよい。これらは、Ｋｏｈｌｅｒおよび同僚によって最初に開発されたハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５年）、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７頁を参照）、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、（１９８３年）、「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２−７９頁を参照）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５年）、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、７７−９６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．を参照）、を含む。不死の抗体産生細胞系は、融合以外の技術、例えば発癌性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−バーウイルスの形質移入によって作製してもよい（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、（１９８０年）、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、（１９８１年）、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；およびＫｅｎｎｅｔｔら、（１９８０年）、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【０１９５】
要するに、モノクローナル抗体が産生される元となるハイブリドーマの作製は、典型的には、骨髄腫または他の自己増殖性細胞系を、哺乳動物の脾臓（その認識因子結合部分、または認識因子、またはその起点（ｏｒｉｇｉｎ）に特異的なＤＮＡ結合部分で超免疫されたもの）から得られるリンパ球と融合することを含む。本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、そのポリペプチド中に存在する抗原とのその免疫反応能によって同定される。
【０１９６】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性のある抗体を分泌するハイブリドーマを有する栄養素培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することによって産生してもよい。培養物は、ハイブリドーマが抗体分子を培地中に分泌するのに十分な条件下で、またその期間、維持される。次いで、抗体含有培地は回収される。次いで、抗体分子は、既知の技術を用いてさらに単離してもよい。
【０１９７】
同様に、ポリクローナル抗体の産生のために使用可能な、当該技術分野で既知の様々な手順がある。本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに対するポリクローナル抗体の産生においては、限定はされないが、ウサギ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含む様々な宿主動物は、ポリペプチドの注射によって免疫してもよい。さらに、ポリペプチドは、免疫原性担体（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ））に複合してもよい。また、限定はされないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの天然ゲル、界面活性物質、例えば、リソレシチン、プルロニック・ポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェニル、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウム・パルヴムを含む、様々なアジュバントを使用し、免疫応答を増強してもよい。
【０１９８】
所望される抗体に対するスクリーニングはまた、当該技術分野で既知の種々の技術によって行ってもよい。抗体の免疫特異的結合に適したアッセイは、限定はされないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイなどを含む（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９４年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。抗体結合は、一次抗体に対する検出可能な標識によって検出してもよい。あるいは、抗体は、適切に標識された二次抗体または試薬とのその結合によって検出してもよい。イムノアッセイにおける結合事象を検出するための種々の方法は、当該技術分野で既知であり、本発明の範囲内に含まれる。
【０１９９】
適量の本発明の抗体を得るという観点では、抗体を無血清培地でのバッチ発酵を使用して作製してもよい。発酵後、抗体は、クロマトグラフィーおよびウイルス不活化／除去ステップを組み込んだ多段階手順を介して精製してもよい。例えば、抗体は、まずプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって分離し、次いで溶媒／洗剤で処理し、任意の脂質で包まれたウイルスを不活化してもよい。典型的にはアニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製を用い、残留するタンパク質、溶媒／洗剤および核酸を除去してもよい。精製抗体は、ゲル濾過カラムを使用し、さらに精製し、０．９％生理食塩水に調合してもよい。次いで、調合されたバルク調製物を、滅菌し、ウイルス濾過を行い、調剤してもよい。
【０２００】
免疫抑制
本発明は、対象における免疫活性化を抑制するための方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド（またはそれを含む組成物）を対象に投与するステップを含む。他の実施形態では、本方法は、本発明のＣｐｎ１０核酸（またはそれを含む組成物）を対象に投与するステップを含む。また、対象における免疫活性化を抑制するための薬剤の調製における本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドまたは本発明のＣｐｎ１０核酸の使用が提供される。
【０２０１】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび本発明のＣｐｎ１０核酸は、限定はされないが、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下または筋肉内）、粘膜（例えば、経口または鼻腔内）、または局所経路を含む任意の好適な経路により、対象（例えばヒト対象）に投与してもよい。
【０２０２】
特定の機構または作用機序に限定されないが、野生型Ｃｐｎ１０ポリペプチドのＮ末端ドメイン内の残基に対する修飾が、野生型Ｃｐｎ１０に比べて、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む分子および／または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を含む宿主分子に対する結合親和性の増大をもたらすものと考えられる。故に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドとＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子との間の結合相互作用は、一般に、野生型Ｃｐｎ１０とそれらの分子との間の結合相互作用より強力である。好ましくは、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドとＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含む分子との間の結合相互作用は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０とそれらの分子との間の結合相互作用より強力である。ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰを含むリガンドのパターン認識受容体（ＰＲＲ）への結合は、有効な固有の免疫応答を確立する上で中核となる一連の事象を開始させる。本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドによるこれらのリガンドの強力な結合が、それらリガンドとそれらの標的ＰＲＲとの間の相互作用を修飾または阻止すると仮定される。次いで、これは、ＰＲＲシグナル伝達によって誘発される免疫活性化（例えば炎症性分子の産生および分泌）の開始を阻害すると考えられる。
【０２０３】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、任意の微生物に由来するＰＡＭＰに結合しうる。かかる微生物の非限定例として、細菌、ウイルス、真菌、線虫、マイコバクテリアおよび原虫が挙げられる。
【０２０４】
好ましくは、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、核酸に基づくＰＡＭＰに高親和性に結合する。
【０２０５】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドが結合しうる核酸に基づくＰＡＭＰの非限定例として、非メチル化シトシンリン酸グアニン（ＣｇＧ）モチーフを有する細菌ＤＮＡ、ならびに、二本鎖ＲＮＡ、５'三リン酸ｓｓＲＮＡおよび他の複製中間体を含むウイルス由来のＰＡＭＰが挙げられる。
【０２０６】
好ましい実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ  ＯＤＮ）を有するオリゴヌクレオチドに高親和性に結合する。
【０２０７】
一般に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ＣｐＧ  ＯＤＮに、野生型Ｃｐｎ１０がＣｐＧ  ＯＤＮに結合する場合より高い親和性で結合する。好ましくは、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ＣｐＧ  ＯＤＮに、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０がＣｐＧ  ＯＤＮに結合する場合より高い親和性で結合する。
【０２０８】
特定の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、微生物に由来する１つもしくは複数のＰＡＭＰと、構造、立体配座および／または配列相同性を共有する宿主分子（例えば、宿主タンパク質、核酸または脂質）に結合する。
【０２０９】
したがって、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドｂｉｎｄは、ＤＡＭＰに結合しうる。
【０２１０】
好ましくは、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、核酸に基づくＤＡＭＰに高親和性に結合し、その非限定例として、細胞ＤＮＡおよびＲＮＡならびに免疫複合体が挙げられる。それに加え、またはその代わりに、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドＤＡＭＰに高親和性に結合する。
【０２１１】
好ましい実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ＤＮＡ  ＤＡＭＰに高親和性に結合する。
【０２１２】
一般に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ＤＮＡ  ＤＡＭＰに、野生型Ｃｐｎ１０がＤＮＡ  ＤＡＭＰに結合する場合より高い親和性で結合する。好ましくは、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、ＤＮＡ  ＤＡＭＰに、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０がＤＮＡ  ＤＡＭＰに結合する場合より高い親和性で結合する。
【０２１３】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドによって結合されるＰＡＭＰまたはＤＡＭＰは、一般に、パターン認識受容体（ＰＲＲ）に対するリガンドとなる。かかるリガンドによって結合されるＰＲＲの非限定例として、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン様受容体（ＮＬＲ）、およびＩＦＮ調節因子のＤＮＡ依存性活性化因子（ＤＡＩ）が挙げられる。
【０２１４】
ＰＲＲは、１つもしくは複数の免疫細胞タイプ上で発現される場合があり、その非限定例として、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞（例えば、骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞）が挙げられる。
【０２１５】
特定の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドによって結合されるＰＡＭＰまたはＤＡＭＰは、ＲＬＲ受容体に対するリガンドであり、その非限定例として、ＲＩＧ−１およびＭＤＡ５が挙げられる。
【０２１６】
他の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドによって結合されるＰＡＭＰまたはＤＡＭＰは、ＮＬＲに対するリガンドであり、その非限定例として、ＮＡＬＰ３−インフラマソームおよびＡＩＭ２−インフラマソームが挙げられる。
【０２１７】
さらなる実施形態では、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドによって結合されるＰＡＭＰまたはＤＡＭＰは、ｔｏｌｌ様受容体に対するリガンドである。ｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９からなる群から選択されうる。一実施形態では、ＴＬＲ受容体は、ＴＬＲ９である。
【０２１８】
本明細書中に提供される方法に従い、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび本発明のＣｐｎ１０核酸は、対象における免疫活性化を抑制するために投与される。
【０２１９】
対象は、限定はされないが、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）属（例えば、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ））、ウシ属、ウマ属、ブタ属、ネコ属、イヌ属、霊長類（例えばヒト）、および齧歯類のメンバを含む任意の哺乳動物種の個体であってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。
【０２２０】
特定の実施形態では、本方法は、免疫抑制剤を対象に投与するステップをさらに含む。免疫抑制剤の非限定例として、抗炎症性化合物、気管支拡張化合物、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、クロモグリケート、テオフィリン、ロイコトリエンアンタゴニスト、および抗ヒスタミン、ならびにそれらの組み合わせ、が挙げられる。免疫抑制剤はまた、免疫抑制薬またはＢもしくはＴリンパ球に特異的な特異抗体、またはその活性化を媒介する表面受容体であってもよい。例えば、免疫抑制薬は、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、クロモグリケート、テオフィリン、ロイコトリエンアンタゴニスト、および抗ヒスタミン、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０２２１】
上で考察したように、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの、ＰＲＲのＰＡＭＰおよびＤＡＭＰ（すなわちリガンド）への結合が、リガンドと受容体との相互作用を改変すると考えられる。
【０２２２】
したがって、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの、ＰＲＲのアゴニストであるリガンドへの結合は、アゴニストのＰＲＲに対する結合能を低下させ、それにより、免疫活性化に関与する細胞シグナルカスケードの開始を阻害しうる。
【０２２３】
リガンドの、食細胞（例えばマクロファージ）上の細胞ＰＲＲへの結合によって開始される細胞シグナルカスケードは、エンドサイトーシスおよび病原体の破壊を誘発しうる。
【０２２４】
リガンドの、細胞ＰＲＲへの結合によって開始される細胞シグナルカスケードは、炎症性メディエーターまたは抗炎症性メディエーター（例えば、サイトカインおよびケモカイン）の産生および分泌を誘発しうる。次いで、これらのメディエーターは、様々な免疫細胞の活性化および機能を調節する。
【０２２５】
一般に、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド（および／またはそれをコードする本発明のＣｐｎ１０核酸）は、それらが投与される対象における免疫活性化を抑制する。
【０２２６】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド（および／またはそれをコードする本発明のＣｐｎ１０核酸）の所与の対象における免疫活性化に対する抑制能は、当該技術分野で既知の標準的技術を用いて測定可能である。
【０２２７】
例えば、ＰＲＲを発現する対象に由来する免疫細胞を、生体外で所与のＰＲＲリガンドと併せてＣｐｎ１０ポリペプチドに暴露し、次いで炎症性メディエーター（例えば、サイトカインおよびケモカイン）の産生および／または分泌を標準的アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて測定してもよい。炎症性メディエーターは、炎症性サイトカインまたはケモカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳなど）、化学メディエーター（例えば、ロイコトリエン、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジン、ＣＧＲＰ、酸化窒素、ブラジキニン、リソソーム酵素、トロンボキサン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、反応性酸素種、酸化窒素）、神経ペプチド、成長因子または神経伝達物質、であってもよい。炎症性メディエーターは、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ４、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ）であってもよい。
【０２２８】
それに加え、またはその代わりに、炎症性メディエーターに対する細胞表面受容体および／または活性化細胞表面マーカーの発現は、免疫細胞の、所与のＰＲＲリガンドと併せた本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドへの暴露後に、生体外で（例えばフローサイトメトリーにより）測定してもよい。
【０２２９】
細胞活性化の度合いもまた、細胞シグナル（例えば、ＴＬＲ媒介性ＮＦ−κＢ活性化、１型インターフェロン産生、チロシンまたはセリン／トレオニンのリン酸化、ＡＤＰリボシル化など）または補体の活性化を、当該技術分野で既知の標準的アッセイを用いて検出することによって測定してもよい。
【０２３０】
当業者は、上で言及された免疫活性化を検出するための方法があくまで例示を目的として提供され、かつ当該技術分野で既知の他の好適な手段が本発明の範囲内に含まれることを理解するであろう。
【０２３１】
処置の方法
本発明は、免疫活性化に関連した疾患および症状、特に過剰および／または慢性炎症の処置および／または予防のための方法を提供する。本方法は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび／または本発明のＣｐｎ１０核酸を投与するステップを含む。ポリペプチドおよび／または核酸は、組成物（例えば、適切な担体、希釈剤および／または担体を含む医薬組成物）の形態で投与してもよい。
【０２３２】
特定の機構または作用機序に限定されないが、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび／または本発明のＣｐｎ１０核酸（またはそれらを含む組成物）の投与は、ＰＲＲ媒介性のシグナル伝達を阻害する手段を提供すると考えられることから、それを用い、対象における炎症性メディエーターの産生／分泌を抑制することが可能である。多数の疾患および症状は、免疫系の慢性炎症に関連し、それ故、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび／または本発明のＣｐｎ１０核酸の投与は、かかる疾患を予防および／または処置する手段を提供する。
【０２３３】
特定の実施形態では、本方法は、免疫抑制剤を対象に投与するステップをさらに含む。免疫抑制剤の非限定例として、抗炎症性化合物、気管支拡張化合物、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、クロモグリケート、テオフィリン、ロイコトリエンアンタゴニスト、および抗ヒスタミン、ならびにそれらの組み合わせ、が挙げられる。免疫抑制剤はまた、免疫抑制薬またはＢもしくはＴリンパ球に対する特異抗体、またはその活性化を媒介する表面受容体であってもよい。例えば、免疫抑制薬は、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、クロモグリケート、テオフィリン、ロイコトリエンアンタゴニスト、および抗ヒスタミン、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０２３４】
本発明の方法に従って処置される疾患は、自己免疫炎症性疾患であってもよい。かかる疾患の非限定例として、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、若年型糖尿病）、慢性疲労症候群、アルツハイマー、グレーブス病、変形性関節症、コラーゲンＩＩ関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣疾患、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性神経炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、自己免疫性ぶどう膜炎、乾癬、シェーグレン病、サルコイドーシス、皮膚筋炎、白血球破砕性血管炎、重症筋無力症、アレルギー性脳脊髄炎、甲状腺機能亢進症、悪性貧血、リウマチ性多発筋痛、および多発性筋炎、が挙げられる。
【０２３５】
本発明の方法に従って処置される疾患は、非自己免疫性炎症性疾患であってもよい。かかる疾患の非限定例として、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、リーキーガット症候群、心血管疾患（例えば鬱血性心疾患）、アレルギー（例えば、アナフィラキシー、薬剤反応、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、じんましん、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触アレルギー、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー）、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アテローム硬化症、および感染性疾患、が挙げられる。
【０２３６】
それに加え、またはその代わりに、本発明の方法に従って処置される疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であってもよい。
【０２３７】
本発明の方法に従って処置される対象は、限定はされないが、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）属（例えば、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ））、ウシ属、ウマ属、ブタ属、ネコ属、イヌ属、霊長類（例えばヒト）、および齧歯類のメンバを含む任意の哺乳動物種の個体であってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。
【０２３８】
対象は、疾患（例えば炎症性疾患）を患っているかまたは患っているのではないかと思われうる。あるいは、対象は、疾患（例えば炎症性疾患）を発症しやすい傾向を有するかまたは有するのではないかと思われうる。
【０２３９】
ポリペプチドまたは核酸は、限定はされないが、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下または筋肉内）、粘膜（例えば、経口または鼻腔内）、または局所経路を含む任意の好適な経路により、対象（例えばヒト対象）に投与してもよい。
【０２４０】
特定の実施形態では、本発明は、疾患を処置するための薬剤の調製における本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび／または本発明のＣｐｎ１０核酸の使用を提供する。
【０２４１】
疾患は、自己免疫炎症性疾患であってもよい。かかる疾患の非限定例として、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、若年型糖尿病）、慢性疲労症候群、アルツハイマー、グレーブス病、変形性関節症、コラーゲンＩＩ関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣疾患、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性神経炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、自己免疫性ぶどう膜炎、乾癬、シェーグレン病、サルコイドーシス、皮膚筋炎、白血球破砕性血管炎、重症筋無力症、アレルギー性脳脊髄炎、甲状腺機能亢進症、悪性貧血、リウマチ性多発筋痛、および多発性筋炎、が挙げられる。
【０２４２】
疾患は、非自己免疫性炎症性疾患であってもよい。かかる疾患の非限定例として、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感染性疾患、リーキーガット症候群、心血管疾患（例えば鬱血性心疾患）、アレルギー（例えば、アナフィラキシー、薬剤反応、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、じんましん、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触アレルギー、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー）、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アテローム硬化症、および感染性疾患、が挙げられる。
【０２４３】
それに加え、またはその代わりに、本発明の方法に従って処置される疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であってもよい。
【０２４４】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、組成物の形態で対象に投与してもよい。一般に、本発明の方法に準じた使用に適した組成物は、当業者に既知の方法に従って調製してもよく、また医薬的に許容できる担体、希釈剤および／またはアジュバントを含んでもよい。本発明の組成物は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドまたは本発明の２つ以上の異なるＣｐｎ１０ポリペプチドの組み合わせを含むように調製してもよい。かかる組成物は、医薬的に許容できる担体、アジュバントおよび／または希釈剤を含む医薬組成物中に含めてもよい。本発明の組成物は、免疫抑制剤を含んでもよい。
【０２４５】
本発明の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０核酸の投与についても検討される。かかる状況では、本発明のＣｐｎ１０核酸（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）は、核酸の対象への投与後に適切なポリペプチド配列が生成されるように、典型的にはプロモーターに作動可能に連結される。核酸は、ベクターで対象に投与してもよい。ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または外来配列の挿入、真核細胞へのそれらの導入および導入配列の発現に適した任意の他の好適な媒体であってもよい。投与されるべき核酸コンストラクトは、裸ＤＮＡを含むか、または１つもしくは複数の医薬的に許容できる担体とともに組成物の形態であってもよい。
【０２４６】
典型的には、ベクターは、真核発現ベクターであり、また、発現制御およびプロセシング配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含んでもよい。本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドをコードする核酸の発現は、当該技術分野で既知の様々な遺伝子送達方法を用い、対象の免疫細胞内で増大しうる。例えば、誘導性プロモーターなどの発現制御配列に作動可能に連結された、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターは、ポリペプチドの生成を増大させるため、対象に投与してもよい。あるいは、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドをコードする核酸配列を有するウイルスベクター（例えばレトロウイルスおよびアデノウイルスベクター）は、前記タンパク質の生成を誘発するため、対象に投与してもよい。本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドをコードする核酸の送達はまた、細胞を対象から抽出し、目的の核酸を有するベクターを投与し、次いで細胞を対象に再導入することによって行ってもよい。
【０２４７】
本明細書中に提供される疾患を予防または処置するための方法の有効性は、標準的技術を用いて判定してもよい。
【０２４８】
治療用途においては、かかる判定は、一般に、疾患が、処置された対象において治癒されるかまたは少なくとも部分的に抑制されるかを確定することに依存することになる。
【０２４９】
予防用途においては、かかる判定は、一般に、対象が、処置後の関連期間にわたって疾患を発病するか否かを確定することに依存することになる。
【０２５０】
これらの要素は、対象の問題の疾患の症候および兆候についての臨床試験によって確定することが可能である。それに加え、またはその代わりに、診断アッセイを行い、疾患の指標または問題の疾患を発病する可能性を検出することが可能である。
【０２５１】
免疫抑制剤についてのスクリーニング
本発明のＣｐｎ１０Ｎ末端ドメイン変異体はまた、スクリーニングアッセイにおいて使用し、それらの活性のアゴニストを同定することが可能である。これらのアゴニストは、一般に、本発明の変異体によって媒介されるＰＲＲシグナル伝達に対する抑制効果を促進することから、ＰＲＲシグナル伝達のアンタゴニストとなる。
【０２５２】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに結合する化合物は、それらの活性を促進する能力を有しうる。
【０２５３】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに結合する作用剤についてスクリーニングする方法を提供する。本方法は、ポリペプチドを候補作用剤と、候補作用剤とポリペプチドとの間で結合が生じるのに適した条件下で接触させるステップと、作用剤がポリペプチドに結合するか否かを判定するステップと、を含む。
【０２５４】
本発明のＣｐｎ１０核酸に結合する化合物は、それらの活性を促進する能力を有しうる。
【０２５５】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、本発明のＣｐｎ１０核酸に結合する作用剤についてスクリーニングする方法を提供する。本方法は、核酸を候補作用剤と、候補作用剤と核酸との間で結合が生じるのに適した条件下で接触させるステップと、作用剤が核酸に結合するか否かを判定するステップと、を含む。
【０２５６】
候補作用剤の本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドまたは本発明のＣｐｎ１０核酸への「結合」が、直接結合、間接結合（例えば１つもしくは複数の中間分子を介する）、部分結合、完全結合、一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）／一時的（ｔｅｍｐｏｒａｒｙ）結合および安定的／持続的（ｅｎｄｕｒｉｎｇ）結合、を包含することは理解されるであろう。
【０２５７】
特に、望ましい作用剤は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび／または本発明のＣｐｎ１０核酸に結合し、それらの活性を促進する能力を有する候補作用剤である。
【０２５８】
本発明のスクリーニング方法において使用される候補作用剤は、任意の供給源に由来してもよい。
【０２５９】
例えば、候補作用剤は、天然起源または合成であってもよい。
【０２６０】
有望な候補作用剤は、本発明の方法におけるスクリーニングのため、当業者に既知の多数の技術によって生成してもよい。例えば、Ｘ線結晶学および核磁気共鳴分光学などの方法を用い、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび本発明のＣｐｎ１０核酸の構造をモデル化することにより、コンピュータに基づくモデリングを用いて有望な免疫抑制剤の設計を容易化できる。また、様々な形態のコンビナトリアル化学を用い、推定上の候補作用剤を生成することが可能である。
【０２６１】
候補作用剤は、任意の分子量、例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、７０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、もしくは１０００００ダルトンであってもよい。
【０２６２】
候補作用剤は、任意の化合物であってもよく、その非限定例として、アミノ酸、核酸、ペプチド核酸、脂質、ポリペプチド、炭水化物、およびヌクレオシドが挙げられる。他の非限定例として、ペプチドミメティクス（例えば、ペプトイド）、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、代謝産物、代謝類似体、および有機もしくは無機化合物（ヘテロ有機および有機金属化合物を含む）が挙げられる。
【０２６３】
特定の実施形態では、ハイスループット方法を用い、化学物質の大規模ライブラリがスクリーニングされる。候補化合物のかかるライブラリは、作成するかまたは商業的供給源から購入してもよい。例えば、ライブラリは、１０，０００、５０，０００、もしくは１００，０００もしくはそれより多くの固有化合物を含んでもよい。あくまで一例として、ライブラリは、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、フラン、イミダゾール、インドール、モルホリン、ナフタレン、ピペリジン、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピロリジン、ピロール、キノリン、チアゾール、チオフェン（ｔｈｉｐｈｅｎｅｓ）、およびトリアジンを含む複素環から作成してもよい。ライブラリは、化学物質、例えば、Ｃａｒｒｅｌｌら、（１９９４年）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９頁；Ｃａｒｅｌｌら、（１９９４年）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１頁；Ｃｈｏら、（１９９３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３−１３０５頁；ＤｅＷｉｔｔら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９−６９１３頁；Ｅｒｂら、（１９９４年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６頁；Ｇａｌｌｏｐら、（１９９４年）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１頁；およびＺｕｃｋｅｒｍａｎｎら、（１９９４年）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−２６８５頁において記載のものの１つもしくは複数のクラスを含んでもよい。
【０２６４】
本発明のスクリーニング方法は、候補作用剤を本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドまたは本発明のＣｐｎ１０核酸と接触させるステップを含む。
【０２６５】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび／または本発明のＣｐｎ１０核酸と結合するかまたはそうでなければ相互作用する作用剤、および詳細にはそれらの活性を促進する作用剤は、種々の好適な方法によって同定してもよい。非限定的方法として、ツーハイブリッド法、共免疫沈降、親和性精製、質量分析、タンデム親和性精製、ファージディスプレイ、ラベル転移、ＤＮＡマイクロアレイ／遺伝子共発現およびタンパク質マイクロアレイ、が挙げられる。
【０２６６】
例えば、ツーハイブリッドアッセイを用い、候補作用剤が本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドと相互作用または結合するかを判定してもよい。酵母ツーハイブリッドアッセイシステムは、典型的にはタンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに使用される酵母に基づく遺伝子アッセイである（例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４０：２４５−２４６頁を参照）。同アッセイは、転写活性化因子のマルチドメイン性を利用する。例えば、既知の転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインは、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに融合され、また転写活性化因子の活性化ドメインは、候補作用剤に融合されうる。候補作用剤とポリペプチドとの間の相互作用は、転写活性化因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近接化することになる。それに続く、転写活性化因子によって活性化される特定のレポーター遺伝子の転写は、相互作用の検出を可能にする。
【０２６７】
上記技術の改良においては、融合タンパク質は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドを検出可能なタグ（例えばアルカリホスファターゼ）に融合し、ＦｌａｎａｇａｎおよびＬｅｄｅｒによって記載の免疫沈降の改良形態（ＦｌａｎａｇａｎおよびＬｅｄｅｒ、（１９９０年）、Ｃｅｌｌ、６３：１８５−１９４頁）を用いることによって作成することが可能である。
【０２６８】
それに加え、またはその代わりに、共免疫沈降を用い、候補作用剤が本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドと相互作用または結合するかを判定してもよい。この技術を用い、末梢血単核球の試料は、タンパク質−タンパク質相互作用の保護に適した非変性条件下で溶解されうる。次いで、得られた溶液は、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに特異的な抗体とともにインキュベートされ、例えば固体支持体に付着された抗体結合タンパク質による捕捉により、バルク溶液から免疫沈降されうる。この方法によるポリペプチドの免疫沈降は、ポリペプチドに関連の作用剤の共免疫沈降を容易にする。関連の作用剤の同定は、限定はされないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、および質量分析を含む、当該技術分野で多くの既知の方法を用いて確立してもよい。
【０２６９】
それに加え、またはその代わりに、ファージディスプレイ法を用い、候補作用剤が本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドと相互作用または結合するかを判定してもよい。ファージディスプレイは、遺伝子バンク由来の複数の遺伝子をファージに組み込むことによる、タンパク質相互作用についてスクリーニングするための試験である。この方法下で、組換えＤＮＡ技術を用い、極めて多数の遺伝子が、各遺伝子のポリペプチド生成物がウイルス粒子の表面上に提示されるように、バクテリオファージのコートタンパク質と融合されて、発現される。目的のファージディスプレイされたポリペプチド生成物の全ライブラリは、このようにして作成されうる。次いで、ファージディスプレイされたポリペプチド生成物の得られたライブラリに対し、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに対する結合能についてスクリーニングしてもよい。ファージと相互作用することから抽出されたＤＮＡは、ポリペプチドと相互作用する配列を有する。
【０２７０】
それに加え、またはその代わりに、アフィニティークロマトグラフィーを用い、候補作用剤が本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドと相互作用または結合するかを判定してもよい。例えば、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドは、支持体（セファロースなど）上に固定され、また細胞溶解液がカラム上を通過されうる。次いで、固定された本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドに結合するタンパク質が、カラムから溶出され、例えばＮ末端アミノ酸の配列決定によって同定されうる。  
【０２７１】
本発明のＣｐｎ１０核酸と結合するかまたはそうでなければ相互作用する作用剤、また詳細にはそれらの活性を調節する作用剤は、当該技術分野で既知の種々の方法によって同定してもよく、その非限定例として、電気泳動、ゲルシフトアッセイ、表面プラズモン共鳴ＡＴＰアーゼアッセイ、円偏光二色性、質量分析、および核磁気共鳴、が挙げられる。ＤＮＡ結合分子の検出のためのスクリーニングアッセイの具体例が、米国特許第５７２６０１４号明細書中に記載されている。
【０２７２】
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび本発明のＣｐｎ１０核酸は、ハイスループットスクリーニングにおいて使用し、候補作用剤の、それらと結合するかまたはそうでなければ相互作用する能力についてアッセイしてもよい。これらの候補化合物は、機能的なポリペプチドおよび核酸に対してさらにスクリーニングし、作用剤の活性に対する効果を判定してもよい。
【０２７３】
本発明ではまた、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの活性を、ポリペプチドの発現を改変することによって促進しうる化合物の同定について検討される。この場合、かかる化合物は、候補化合物の存在下でのポリペプチドの発現レベルを候補化合物の不在下での発現レベルと比較することによって同定することが可能である。
【０２７４】
特定の候補作用剤によって結合されることが同定された本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの活性は、例えば、免疫細胞（例えば末梢血単核球）の試料を、ＰＲＲリガンドの存在下で、ポリペプチドおよび作用剤と接触させることにより、評価してもよい。次いで、細胞内で誘発されるＰＲＲ媒介性のシグナル伝達の度合いは、当該技術分野で既知の方法を用いて評価してもよい。好適な方法は、限定はされないが、上記の表題「免疫抑制」の項に記載のものを含む。例えば、細胞内で誘発されるＰＲＲ媒介性のシグナル伝達の度合いは、炎症性メディエーター（例えばサイトカインおよびケモカイン）の産生および／または分泌を測定し、炎症性メディエーターに対する細胞表面受容体または他の活性化細胞表面マーカーの発現を測定し、活性化（例えば、ＴＬＲ媒介性のＮＦ−κＢ活性化、１型インターフェロン産生、チロシンまたはセリン／トレオニンリン酸化、ＡＤＰリボシル化など）を示す細胞シグナルを検出し、および／または補体系の活性化を検出することによって評価してもよい。
【０２７５】
特定の候補作用剤によって結合されることが同定された本発明のＣｐｎ１０核酸の活性は、例えば、候補作用剤への暴露時に、コードされたポリペプチドの生成を測定することにより、評価してもよい。これは、例えば、タンパク質を検出し、および／または定量することが可能な任意の技術を用いて行ってもよい。好適な方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、免疫組織化学、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノアッセイ、プロテオミクスなどを含む。それに加え、またはその代わりに、同定された作用剤の存在下での核酸の転写レベルは、例えば定量的転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む技術を用いて測定してもよい。
【０２７６】
上記の技術が、あくまで、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび／または本発明のＣｐｎ１０核酸と相互作用するか、あるいはそれらの活性を促進する能力を有する作用剤を同定するために利用可能な方法のタイプの例であることは理解されるであろう。他の好適な方法は、当業者によって既知となり、本発明の範囲内である。
【０２７７】
上記の方法を用い、本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドまたは本発明のＣｐｎ１０核酸のアゴニストである作用剤は、同定可能である。アゴニストである作用剤は、ポリペプチドまたは核酸の１つもしくは複数の生物学的活性を促進する。好ましくは、アゴニストによって促進される生物学的活性は、ポリペプチドのＰＲＲリガンドへの結合である。
【０２７８】
抗体を産生するための方法は、当該技術分野で既知であり、上記の表題「抗体」の項に記載されている。
【０２７９】
組成物
本発明は、本発明の１つもしくは複数のＣｐｎ１０ポリペプチドおよび／または本発明の１つもしくは複数のＣｐｎ１０核酸を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の１つもしくは複数の抗体を含んでもよい。
【０２８０】
本発明の組成物は、医薬的に許容できる担体、アジュバントおよび／または希釈剤を含んでもよい。担体、希釈剤およびアジュバントは、組成物の他の成分に適合可能であり、かつそのレシピエントに対して有害でないという点で「許容できる」必要がある。医薬的に許容できる担体または希釈剤の非限定例として、脱塩水または蒸留水；生理食塩水溶液；植物に基づく油、例えば、ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油；ゴマ油、例えば、ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油またはヤシ油；ポリシロキサン、例えばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリシロキサン（ｐｏｌｙｓｏｌｐｏｘａｎｅ）を含むシリコーン油；揮発性シリコーン；液体パラフィン、ソフトパラフィンまたはスクアランなどの鉱油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；低級アルカノール、例えばエタノールまたはイソプロパノール；低級ａｒａｌｋａｎｏｌｓ；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールまたはグリセリン；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチルなどの脂肪酸エステル；ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）；寒天；ガムトラガカントまたはアカシアゴム、ならびにワセリン、が挙げられる。典型的には、１つもしくは複数の担体は、組成物の１０重量％〜９９．９重量％を形成することになる。
【０２８１】
それに加え、またはその代わりに、本発明の組成物は、免疫抑制剤を含んでもよく、その非限定例として、抗炎症性化合物、気管支拡張化合物、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、クロモグリケート、テオフィリン、ロイコトリエンアンタゴニスト、および抗ヒスタミン、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。免疫抑制剤はまた、免疫抑制薬またはＢもしくはＴリンパ球に対する特異抗体、またはその活性化を媒介する表面受容体であってもよい。例えば、免疫抑制薬は、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、クロモグリケート、テオフィリン、ロイコトリエンアンタゴニスト、および抗ヒスタミン、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０２８２】
それに加え、またはその代わりに、本発明の組成物は、アジュバントを含んでもよい。任意の好適なアジュバントは、本発明のワクチン中に含めてもよい。例えば、アルミニウムに基づくアジュバントを使用してもよい。好適なアルミニウムに基づくアジュバントは、限定はされないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびそれらの組み合わせを含む。使用可能なアルミニウムに基づくアジュバントの他の具体例が、欧州特許第１２１６０５３号明細書および米国特許第６３７２２２３号明細書中に記載されている。
【０２８３】
水中油エマルジョンは、本発明の組成物およびワクチン中のアジュバントとして使用してもよい。水中油エマルジョンは、当該技術分野で周知である。一般に、水中油組成物は、代謝可能な油、例えば、魚油、植物油、または合成油を含むことになる。好適な水中油エマルジョンの例として、欧州特許第０３９９８４３号明細書、米国特許第７０２９６７８号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２００７／００６９３９号パンフレット中に記載のものが挙げられる。水中油エマルジョンは、他のアジュバントおよび／または免疫刺激剤と併用してもよい。
【０２８４】
他の好適なアジュバントの非限定例として、免疫刺激剤、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、コレラ毒素（ＣＴ）またはその成分サブユニット、易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）またはその成分サブユニット、ｔｏｌｌ様受容体リガンドアジュバント、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）、およびそれらの誘導体（例えば、モノホスホリル脂質Ａおよび３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ）、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）、および呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質、が挙げられる。
【０２８５】
それに加え、またはその代わりに、本発明の組成物は、ステロイド、例えばコルチコステロイドを含んでもよい。
【０２８６】
本発明の組成物は、注射による投与に適した形態、経口摂取に適した製剤の形態（例えば、カプセル、タブレット、カプレット、エリキシルなど）、局所投与に適した軟膏、クリームまたはローションの形態、点眼剤としての送達に適した形態、吸入、例えば鼻腔内吸入または経口吸入による投与に適したエアロゾル形態、あるいは非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内または静脈内注射に適した形態であってもよい。
【０２８７】
注射可能溶液または懸濁液としての投与においては、無毒な非経口的に許容できる希釈剤または担体は、リンガー液、等張生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、エタノールおよび１，２プロピレングリコールを含んでもよい。
【０２８８】
経口使用に適した数例の担体、希釈剤、賦形剤およびアジュバントは、ピーナッツ油、液体パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンを含む。さらにこれらの経口製剤は、好適な香料および着色剤を含有してもよい。カプセルは、カプセル形態で使用される場合、崩壊を遅延させるモノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルなどの化合物でコーティングしてもよい。
【０２８９】
アジュバントは、典型的には、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、防腐剤、殺菌薬および緩衝剤を含む。
【０２９０】
経口投与用の固体形態は、ヒトおよび動物（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）対象の薬務において許容できる結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香料、コーティング剤、防腐剤、潤滑剤および／または時間遅延剤（ｔｉｍｅ  ｄｅｌａｙ  ａｇｅｎｔ）を含有してもよい。好適な結合剤は、アカシアゴム、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールを含む。好適な甘味料は、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンを含む。好適な崩壊剤は、トウモロコシデンプン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、ザンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天を含む。好適な希釈剤は、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、けい酸カルシウムまたはリン酸ニカルシウムを含む。好適な香料は、ペパーミント油、冬緑油、サクランボ油、オレンジ油またはラズベリー香料、を含む。好適なコーティング剤は、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはそれらのエステルのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、セラックまたはグルテン、を含む。好適な防腐剤は、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは重亜硫酸ナトリウム、を含む。好適な潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルク、を含む。好適な時間遅延剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを含む。
【０２９１】
経口投与用の液体形態は、上記作用剤に加え、液体担体を含有してもよい。好適な液体担体は、水、油、例えば、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ラッカセイ油、ヤシ油、液体パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリドまたはそれらの混合物を含む。
【０２９２】
経口投与用の懸濁液は、分散剤および／または懸濁化剤をさらに含んでもよい。好適な懸濁化剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、またはアセチルアルコール、を含む。好適な分散剤は、レシチン、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、例えば、ステアリン酸、ポリオキシエチレンソルビトールモノ−もしくはジ−オレエート、−ステアレートまたは−ラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノ−もしくはジ−オレエート、−ステアレートまたは−ラウレートなど、を含む。
【０２９３】
経口投与用のエマルジョンは、１つもしくは複数の乳化剤をさらに含んでもよい。好適な乳化剤は、上で例示された分散剤、またはグアーガム、アカシアゴムもしくはトラガカントゴムなどの天然ゴムを含む。
【０２９４】
非経口に投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者にとって自明であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ中により詳述されている。
【０２９５】
本発明の局所製剤は、１つもしくは複数の許容できる担体と、場合によって任意の他の治療成分とともに活性成分を含んでもよい。局所投与に適した製剤は、処置が必要とされる部位に向けての皮膚の貫通に適した液体または半液体製剤、例えば、眼、耳または鼻への投与に適した塗布剤、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、およびドロップを含む。
【０２９６】
本発明に従うドロップは、無菌の水性もしくは油性の溶液または懸濁液を含んでもよい。これらは、活性成分を、殺菌剤および／または抗真菌剤および／または任意の他の好適な防腐剤（場合によって表面活性剤を含む）の水溶液に溶解させることによって調製してもよい。次いで、得られた溶液は、濾過によって浄化し、好適な容器に移し、滅菌してもよい。滅菌は、９０℃〜１００℃で３０分間オートクレーブまたは維持するかあるいは濾過し、その後、無菌技術によって容器に移すことにより、行ってもよい。ドロップ中への封入に適した殺菌剤および抗真菌剤の例として、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）、が挙げられる。油性溶液の調製にとって好適な溶媒は、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールを含む。
【０２９７】
本発明に従うローションは、皮膚または眼への適用に適したものを含む。点眼薬は、場合によって殺菌薬を含有する無菌水溶液を含んでもよく、ドロップの調製に関する上記の方法と同様の方法で調製してもよい。皮膚に適用するためのローションまたは塗布剤はまた、乾燥を速め、皮膚を冷やすための作用剤、例えばアルコールまたはアセトン、および／またはグリセロールなどの保湿剤、あるいはヒマシ油またはラッカセイ油などの油、を含んでもよい。
【０２９８】
本発明に従うクリーム、軟膏またはペーストは、外用の活性成分の半固体製剤である。それらは、微粉または粉末形態の活性成分を、単独であるいは水性または非水性流体中の溶液または懸濁液中で、脂肪性または非脂肪性基剤と混合することによって作製してもよい。基剤は、炭化水素、例えば、硬質、軟質または液体パラフィン、グリセロール、蜜ろう、金属石鹸；粘液；天然由来の油、例えば、アーモンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ヒマシ油またはオリーブ油、羊毛脂またはその誘導体、あるいはプロピレングリコールまたはマクロゴールなどのアルコールを伴うステアリン酸またはオレイン酸などの脂肪酸、を含んでもよい。
【０２９９】
本発明の組成物は、アニオン性、カチオン性もしくは非イオン性界面活性剤などの任意の好適な界面活性剤、例えばソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を組み込んでもよい。天然ゴム、セルロース誘導体または無機材料などの懸濁化剤、例えばケイ素シリカ（ｓｉｌｉｃａｃｅｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａ）、およびラノリンなどの他の成分もまた、含めてもよい。
【０３００】
本発明の組成物は、リポソームの形態で投与してもよい。リポソームは、一般にリン脂質または他の脂質物質に由来し、水性培地中に分散されたモノまたはマルチラメラ水和液晶によって形成される。リポソームを形成可能な、任意の無毒の生理学的に許容できる代謝可能な脂質を使用してもよい。リポソーム形態の組成物は、安定剤、防腐剤、賦形剤などを含有してもよい。好ましい脂質は、天然および合成の双方での、リン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成するための方法は、当該技術分野で既知であり、これに関しては、特に、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ（編）、（１９７６年）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第ＸＩＶ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．３３頁（以下参照）を参照のこと。
【０３０１】
本組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体のアレイに複合してもよい。ＰＥＧのタンパク質への付加（ペグ化）は、タンパク質の血漿クリアランス速度を減少させ、それによりその有効性を増大させるための十分に確立された方法である（Ｎｕｃｃｉら、１９９１年、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．６：１３３頁）。ペグ化のさらなる利点は、タンパク質の安定性の増大、免疫原性の低下、溶解度の促進およびタンパク質加水分解に対する感受性の低下を含みうる（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｗ．２００１年、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ．１：１−２２頁）。ＰＥＧ分子は、−（ＯＣＨ３ＣＨ２）ｎ−ＯＨの基本的な反復構造を有し、その分子量に従うグループに分類される。ＰＥＧ誘導体は、タンパク質に複合されることで、その流体力学的半径が増加し、一般に、その半減期の増加は、付加されるＰＥＧ鎖のサイズに直接関連する（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｗ．２００１年、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ．１：１−２２頁）。
【０３０２】
本組成物はまた、微粒子の形態で投与してもよい。ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、およびイプシロン−カプロラクトン（ε−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）から形成される生分解性微粒子は、血漿半減期を増加させ、それによって有効性を延長する薬剤担体として広く使用されている（Ｒ．Ｋｕｍａｒ、Ｍ．、２０００年、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ  Ｓｃｉ．３（２）２３４−２５８頁）。微粒子は、ワクチン、抗生物質、およびＤＮＡを含む、ある範囲の薬剤候補を送達するために調合されている。さらに、これらの製剤は、非経口的な皮下注射、静脈内注射および吸入を含む様々な送達経路に対して開発されている。
【０３０３】
本組成物は、イソ酪酸酢酸スクロース（ＳＡＩＢ）および有機溶媒または有機溶媒混合物からなる放出制御マトリックスを組み込んでもよい。ポリマー添加剤は、さらに粘度を増大させかつ放出速度を低下させるための放出調節剤として媒体に添加してもよい。ＳＡＩＢは、周知の食品添加物である。それは、イソ酪酸基６対酢酸基２の名目比の、非常に疎水性の高い、完全エステル化スクロース誘導体である。混合エステルとして、ＳＡＩＢは、結晶化しないが、透明な粘液として存在する。ＳＡＩＢをエタノールまたはベンジルアルコールなどの医薬的に許容できる有機溶媒と混合すると、混合物の粘度が十分に低下し、注射が可能になる。活性薬剤成分をＳＡＩＢ送達媒体に添加し、ＳＡＩＢ溶液または懸濁製剤を形成することが可能である。製剤が皮下注射される場合、溶媒がマトリックスから拡散し、それにより、ＳＡＩＢ薬剤またはＳＡＩＢ−薬剤−ポリマー混合物がインサイチュで形成するデポーとして構成されうる。
【０３０４】
本発明の目的のため、分子および作用剤は、治療用または予防用のいずれかの組成物として対象に投与してもよい。例えば、本発明の組成物は、ワクチン（例えば予防用ワクチンまたは治療用ワクチン）として投与してもよい。治療用途においては、組成物は、既に疾患に罹患している患者に、疾患およびその合併症を治療するかまたは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。組成物は、患者を有効に処置するのに十分な量の分子または作用剤を提供する必要がある。
【０３０５】
本発明の実施形態では、本発明のＣｐｎ１０核酸の投与についても検討される。かかる状況では、核酸は、核酸の対象への投与後に適切なポリペプチド配列が生成されるように、典型的にはプロモーターに作動可能に連結される。核酸は、ベクターで対象に投与してもよい。ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または外来配列の挿入、真核細胞へのそれらの導入および導入配列の発現に適した任意の他の好適な媒体であってもよい。典型的には、ベクターは、真核発現ベクターであり、また、発現制御およびプロセシング配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含んでもよい。投与されるべき核酸コンストラクトは、裸ＤＮＡを含むか、または１つもしくは複数の医薬的に許容できる担体とともに組成物の形態であってもよい。
【０３０６】
投与の経路
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチド、本発明のＣｐｎ１０核酸、本発明の組成物、または本発明の抗体の対象への投与は、限定はされないが、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下または筋肉内）、粘膜（例えば、経口または鼻腔内）または局所経路を含む、任意の好適な経路によって行ってもよい。
【０３０７】
したがって、ポリペプチド、核酸、抗体または組成物は、注射による投与に適した形態、経口摂取（例えば、カプセル、タブレット、カプレット、エリキシルなど）に適した製剤の形態、局所投与に適した軟膏、クリームまたはローションの形態、点眼剤としての送達に適した形態、吸入、例えば鼻腔内吸入または経口吸入による投与に適したエアロゾル形態、あるいは非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内または静脈内注射に適した形態で投与してもよい。
【０３０８】
鼻腔内投与用の製剤は、凍結乾燥粉末形態、点鼻剤、スプレーのような液体形態、または、粉末、クリーム、もしくはエマルジョンのような吸入に適した形態で提供してもよい。
【０３０９】
一実施形態では、ポリペプチド、核酸、抗体または組成物は、本発明の方法に従い、対象への投与用に経口形態で提供される。経口投与は、自己タンパク質中に存在する抗原（病原性細菌タンパク質の場合と配列相同性を共有する）に対する耐性を再誘発するように設計された処置方法に役立ちうる。
【０３１０】
ポリペプチド、核酸、抗体または組成物は、治療的または予防的に対象に投与してもよい。
【０３１１】
治療用途においては、ポリペプチド、核酸、抗体または組成物は、既に疾患（例えば炎症性疾患）に罹患している患者に、疾患およびその合併症を治療するかまたは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。典型的には、治療用途の場合、処置は、病状または症状の期間中に行われることになる。
【０３１２】
予防用途においては、ポリペプチド、核酸、抗体または組成物は、投与時に疾患に罹患していない対象に投与される。
【０３１３】
任意の特定の対象における治療有効量レベルは、処置されている疾患および疾患の重症度；使用される化合物または作用剤の活性；使用される組成物；対象の年齢、体重、全身状態、性別および食生活；投与の時間；投与の経路；ポリペプチド、核酸、抗体または組成物の封鎖の速度；治療の期間；処置と併用または同時使用される薬剤、を含む種々の要素とともに、当該技術分野で既知の他の関連する要素に依存することになる。
【０３１４】
さらに、最適量および個別用量の間隔が、処置されている疾患の性質および範囲、投与の形態、経路および部位、ならびに処置されている特定の対象の性質によって決定されることは、当業者にとって明らかであろう。
【０３１５】
当業者であれば、型通りの実験により、該当する自己免疫疾患を有効に予防または処置するのに必要となる、ポリペプチド、核酸、抗体または組成物の無毒な有効量を決定できるであろう。
【０３１６】
例えば、最適用量は、好適な試験手順と相まって、ポリペプチド、核酸、抗体または組成物を含む希釈製剤を連続的に投与することから得られうる。それに加え、またはその代わりに、様々な異なる用量および投与頻度を含むマトリックスを、設計し、実験対象の１つもしくは複数の群に適用することで、最適用量を決定することが可能である。
【０３１７】
一般に、有効用量は、約０．０００１ｍｇ〜約１０００ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；典型的には、約０．００１ｍｇ〜約７５０ｍｇの活性物質の活性物質／ｋｇ体重／２４時間；約０．０ｌｍｇ〜約５００ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；約０．ｌｍｇ〜約５００ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；約０．ｌｍｇ〜約２５０ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；または約１．０ｍｇ〜約２５０ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間の範囲内であると想定される。
【０３１８】
より典型的には、有効用量範囲は、約１．０ｍｇ〜約２００ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；約１．０ｍｇ〜約１００ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；約ｌ．０ｍｇ〜約２５ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；約５．０ｍｇ〜約５０ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；約５．０ｍｇ〜約２０ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間；または約５．０ｍｇ〜約１５ｍｇの活性物質／ｋｇ体重／２４時間の範囲内であると想定される。
【０３１９】
あるいは、有効用量は、週２回で約０．１ｍｇの活性成分／ｋｇ体重〜約２ｍｇの活性成分／ｋｇ体重の範囲内であってもよい。
【０３２０】
あるいは、有効用量は、最大で約５００ｍｇ／ｍ２であってもよい。一般に、有効用量は、約２５〜約５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約２５〜約３５０ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約２５〜約３００ｍｇ／ｍ２、さらにより好ましくは約２５〜約２５０ｍｇ／ｍ２、さらにより好ましくは約５０〜約２５０ｍｇ／ｍ２、およびさらにより好ましくは約７５〜約１５０ｍｇ／ｍ２の範囲内であると想定される。
【０３２１】
特定の実施形態において示されるように、極めて多くの変形および／または改良が、広範に記載される、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされうることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、本実施形態は、例示的であって限定的でないものとして、あらゆる観点で考慮されるべきである。
【実施例】
【０３２２】
本発明は、ここで具体例との関連で説明されることになり、それらは、決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【０３２３】
実施例１：Ｃｐｎ１０ポリペプチドの生成
本発明のＣｐｎ１０ポリペプチドの生成プロセスをさらに明らかにするため、以下の非限定例を提供する。
【０３２４】
（修飾を伴うかまたは伴わない）ヒトＣｐｎ１０の発現を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換された熱誘発性（ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）発現プラスミドまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換されたＩＰＴＧ誘発性発現プラスミドｐＥＴ３０  ＫａｎＲおよびｐＥＴ２３  ＡｍｐＲ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のいずれかを用いて行った。
【０３２５】
本質的にＲｙａｎらによって記載（１９９５年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：２２０３７−２２０４３頁）のように、熱誘発性発現プラスミドを使用し、Ｃｐｎ１０を生成し、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ（ＢｉｏＲａｄ）カラム上への単一通過によって９０％超の純度に精製し、ｐＨ８で平衡化した。次いで、Ｃｐｎ１０を含有する未結合材料を、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、次いでゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）クロマトグラフィーによってさらに精製した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の精製Ｃｐｎ１０を、製造業者の使用説明書に従い、０．２ｍｍのＭｕｓｔａｎｇ  Ｅ膜を有するＡｃｒｏｄｉｓｃを通して濾過し（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ．カタログ番号ＭＳＴＧ５Ｅ３）、残留エンドトキシンを除去し、−８０℃で保存した。
【０３２６】
ＩＰＴＧ誘発性発現プラスミドを使用し、細胞を、適切な抗生物質（１００μｇ／ｍｌ  Ａｍｐおよび５０μｇ／ｍｌ  Ｋａｎ）を含有するＬＢ中で、ＯＤ６００ｎｍが０．５になるまで成長させ、次いでＣｐｎ１０の生成を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで５時間誘発した。細胞を、遠心分離（６，０００×ｇ）によって４℃で１０分間ペレット化し、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）に再懸濁し、８，０００ｐｓｉで４回均質化した。不溶性材料を、４℃、１５，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって除去した。Ｃｐｎ１０を含有する上清を、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＥＩでボルテックスし、氷上で５分間インキュベートし、次いで４℃、１５，０００×ｇで３０分間遠心分離し、核酸および極めて多量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質を除去した。Ｃｐｎ１０が豊富に存在する上清を、０．４５μｍのフィルターシリンジを通過させ、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で予備平衡化したＢｉｇ  Ｂｅａｄ  Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカチオン交換カラム上に負荷し、０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配で溶出を行った。Ｃｐｎ１０を含有する画分をプールし、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）＋２Ｍ硫酸アンモニウムで１／１０に希釈し、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム上に負荷し、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）の０〜６０％の勾配で溶出を行った。Ｃｐｎ１０を含有する画分を、２５ｍＭトリス（ｐＨ８）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡに透析し、約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。残留エンドトキシンおよび核酸を除去するため、Ｃｐｎ１０を、最終的に２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡで予備平衡化したＣａｐｔｏ−Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上を通過させた。精製Ｃｐｎ１０を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌに透析し、−８０℃で保存するため、約５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。
【０３２７】
Ｃｐｎ１０、例えば図２中に示される様々なＣｐｎ１０変異ポリペプチドの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのクマシーブリリアント染色によって測定し、９９％超であった。一定分量を、使用前に１回解凍した。
【０３２８】
実施例２：Ｃｐｎ１０のＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）への結合の定量分析
Ｃｐｎ１０突然変異体のＯＤＮへの結合量を測定するため、突然変異体を、１０μｇ／μｌでＰＢＳ（ｐＨ７．２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で調合し、５０μｇを、９６ウェルプレートの３通りのウェルに４℃で１６時間吸着させた。非結合タンパク質のデキャンティング後、プレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、１％ＢＳＡおよび５％スクロースで、２３℃で２時間ブロッキングした。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、０．０１μｇ／μｌで調合した、５０μｌの３’もしくは５’−ビオチン標識ヒトＯＤＮ−２２１６クラス−Ａ、ヒトＯＤＮ−２００６クラス−Ｂ、またはヒトＯＤＮ−Ｍ３６２クラス−Ｃ（ＴＬＲ９アゴニスト）（Ｐｒｏｌｉｇｏ／Ｓｉｇｍａ）を、各ウェルに添加し、２３℃で２時間インキュベートした。未結合リガンドを、５ＰＢＳ（ｐＨ７．２）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０での洗浄により、除去した。結合ＣｐＧ−ＯＤＮを、Ａ４５０ｎｍでのストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ検出システムで分析した。
【０３２９】
図１では、生理的塩濃度（約１５０ｍＭ）での定量分析による、ＣｐＧ−ＯＤＮと多数のＣｐｎ１０Ｎ末端変異体との、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０よりも強力な相互作用を強調する。
【０３３０】
例えば、変異体ＭＶ−Ｃｐｎ１０、ＭＬ−Ｃｐｎ１０、ＭＩ−Ｃｐｎ１０、ＭＨ−Ｃｐｎ１０、Ｐｒｏ−Ｃｐｎ１０、ＭＦ−Ｃｐｎ１０、ＭＹ−Ｃｐｎ１０、ＭＷ−Ｃｐｎ１０、ＭＣ−Ｃｐｎ１０、Ｓｅｒ−Ｃｐｎ１０、ＭＴ−Ｃｐｎ１０、ＭＤ−Ｃｐｎ１０、ＭＮ−Ｃｐｎ１０、ＭＱ−Ｃｐｎ１０、ＡＡ−Ｃｐｎ１０、ＡＡＡ−Ｃｐｎ１０、ＳＧ−Ｃｐｎ１０、ＳＴＧ−Ｃｐｎ１０、ＰＧ−Ｃｐｎ１０、ＰＴＧ−Ｃｐｎ１０、ＭＱＳ−Ｃｐｎ１０およびＭＱＳＮ−Ｃｐｎ１０の各々は、少なくとも１つのＣｐＧ−クラス（すなわち、ＣｐＧ−クラスＡ、Ｂおよび／またはＣ）と、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０よりも強力な相互作用を示した。
【０３３１】
実施例３：分子モデリング
生物活性タンパク質であるには、特定の折り畳まれた三次元構造をとる必要があり、この構造は、タンパク質のアミノ酸配列によって決定される。アミノ酸側鎖に特有の構造および特性は、タンパク質の特定の生物学的機能を決定づける。水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス力および疎水性パッキングなどの極めて多数の非共有相互作用は、タンパク質フォールディングの安定性および柔軟性に寄与する。
【０３３２】
２Åの解像度での（柔軟な可動ループが欠如した）ヒトＡｌａ−Ｃｐｎ１０のＸ線結晶構造が得られた。Ｃｐｎ１０単量体は、βヘアピン「ルーフループ」領域および「可動ループ」領域によって隣接されたコアの逆平行βバレル領域からなる。結晶構造によると、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０のＮ末端が、βヘアピンを形成し、ルーフループの特定の領域に極めて接近したＣｐｎ１０ドーム様構造の上部を横切る直線状に伸展した規則性が高い配座で存在することが示される。一部のＸ線結晶構造においては、Ｃｐｎ１０七量体内部の特定のサブユニットのＮ末端は、大規模な構造変化を受け（それは付属物がかなり柔軟であることを示し）、例えば核酸への結合を調節するという重要な生物学的機能を果たすことが認められた。分子モデリングによると、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の柔軟なＮ末端が、ルーフループ上に、（アミノ酸位置−１（以後Ａｌａ−１と称される）での）アラニンの、残基Ｓｅｒ５２〜Ｇｌｙ５７によって形成されるルーフループ上の小さい構造ポケットへの相互作用（鍵と鍵穴に類する）によってドッキングしうるという示唆が得られる。ルーフループの開始点における２つの重要な残基Ｌｙｓ５３およびＬｙｓ５５は、より小さい残基（Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ５４、Ｇｌｙ５６およびＧｌｙ５７）によって囲まれ、それらの伸長された側鎖ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２のおかげで、Ｇｌｙ５４によって隔てられたこのポケットを形成できると考えられる。アミノ酸側鎖相互作用およびパッキング形状の分析（ＴｈｏｒｎｔｏｎおよびＳｉｎｇｈのＡｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｄｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓを使用；Ｓｉｎｇｈ  Ｊ．およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  Ｊ．Ｍ．（１９９２年）．「Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｄｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、第ＩおよびＩＩ巻、ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）によると、Ａｌａ−１のＣＨ３側鎖が、これらのＬｙｓ側鎖と相互作用し、それらと１つの大きい有意な集団（および第２のより小さいもの）を形成できることが示される。Ａｌａ−１の、Ｌｙｓ５３〜Ｌｙｓ５５のルーフループ構造ポケットへのこの結合は、柔軟なＮ末端に有効に固定し、強力な核酸結合をもたらす場合がある。
【０３３３】
Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｄｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（ＴｈｏｒｎｔｏｎおよびＳｉｎｇｈ）は、２０の異なる種類のアミノ酸側鎖間に全部で４００の考えられるペアワイズ相互作用が存在することを説明し、アミノ酸側鎖がいかにして相互作用し、互いに対してパック（集団化）するかを判定するための重要な参考文献であると考えられる。側鎖の接触における任意の集団化の有意性は、パッキング形状およびファンデルワールス力に関連して評価される。有意性は、ランダム分布に対するＣｈｉ２試験によって評価される。これらの相互作用を分析するためのデータベースおよびソフトウェアは、ＥＭＢＬ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの一部としてのＴｈｏｒｎｔｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  ＤａｔａｂａｓｅｓのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎによって主催される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｓｉｄｅｃｈａｉｎｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。このデータベースを使用し、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０のＮ末端変異の、核酸リガンドへの結合および免疫調節機能に対する効果をモデル化した。
【０３３４】
Ａｌａ−１のＬｙｓ５３Ｌｙｓ５５への結合の摂動により、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の立体構造が改変され、核酸（例えばＣｐＧ−ＯＤＮ）に対する結合能が損なわれる場合がある。分子の完全なＮ末端（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ΔＮｔｅｒｍ）またはルーフループ（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０−ΔＲｏｏｆ）の除去により、Ａｌａ−１のこのポケットへの結合が阻止され、Ｃｐｎ１０のＣｐＧ−ＯＤＮに対する結合能が著しく損なわれる（図１参照）。同様に、Ｌｙｓ５３およびＬｙｓ５５の異なるアミノ酸への突然変異が、結合ポケットを破壊し、ＣｐＧ−ＯＤＮへの結合を著しく損なわせることが認められた（図１参照）。
【０３３５】
突然変異体Ｘ−Ｃｐｎ１０によって示されるように、位置−１（Ａｌａ−１）でのＡｌａの除去によるＮ末端の短縮がまた、ＣｐＧ−ＯＤＮへの結合を損なわせることが認められた（図１参照）。
【０３３６】
グリシンは、大きさおよび構造の双方においてアラニンに類似したアミノ酸であり、グリシンが、アラニンの−ＣＨ３側鎖に比べて、−Ｈ側鎖のみを有する点が異なる。また、Ａｌａ−１とグリシンとの置換の結果、おそらくはそれがポケットに正確に適合できない（酷似しても不正確な鍵の鍵穴への挿入に類する）ことが理由で、免疫調節機能が損なわれた。グリシンとＬｙｓ５３Ｌｙｓ５５側鎖との相互作用のモデリングは、６つの大規模かつ有意な集団が側鎖間に形成されうるという示唆を提供した。これらの集団は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０によって形成されるものと異なることから、分子の異なる立体構造をもたらし、それにより、ＣｐＧ−ＯＤＮへの結合が損なわれた。
【０３３７】
故に、Ｎ末端Ａｌａ−１の、ルーフループの構造ポケットへの正確な結合は、ＣｐＧ−ＯＤＮの結合およびＰＲＲシグナル伝達のモジュレータとしてのＡｌａ−Ｃｐｎ１０の機能にとって必要であると考えられる。
【０３３８】
タンパク質翻訳は、開始メチオニンから開始される。「Ｎ末端ルール」によると、一部のタンパク質では、開始メチオニンが、以下のアミノ酸の同一性に応じて除去される。質量分析を用いて、隣接アミノ酸が、アラニン（Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の場合）、グリシン（Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０の場合）プロリンまたはセリンである場合、開始メチオニンがＣｐｎ１０から切断されることが測定された。他のすべてのアミノ酸においては、メチオニンは、無傷のままであった。プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）およびメチオニン（Ｍｅｔ）はすべて、アラニンより大きいアミノ酸である。
【０３３９】
Ａｌａ−Ｃｐｎ１０の立体構造がＣｐＧ−ＯＤＮへの結合にとっていかに必要であるかについて仮説を立てると、Ａｌａ−１アミノ酸がより大きくより大規模な（ｂｕｌｋｉｅｒ）アミノ酸によって置換される場合、それはルーフループのポケットに正確に適合できない可能性があり、その場合、Ｃｐｎ１０−Δ−ＮｔｅｒｍまたはＡｌａ−Ｃｐｎ１０−ΔＲｏｏｆ、Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０またはＸ−Ｃｐｎ１０と同様、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０に対して機能が悪化していると仮定された（図１参照）。驚くべきことに、これは事実と異なった。事実、より大きくより大規模なアミノ酸のＰｒｏ、ＳｅｒまたはＭｅｔのＮ末端での置換は、実際にはＣｐＧ−ＯＤＮの改善された結合をもたらしたことから、ＰＲＲシグナル伝達の抑制を促進することが想定されたことになる。
【０３４０】
セリンは、アラニンと、（−ＣＨ３の代わりに）側鎖ＣＨ２−ＯＨにおける単一の酸素分子の分だけ異なる小さいアミノ酸である。Ｎ末端でのセリンの配置は、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０と最も構造的に類似し、その場合、ポケットに正確に適合せず、Ｇｌｙ−Ｃｐｎ１０と同様、ＣｐＧ−ＯＤＮへの結合を損なわれるのに適したサイズであると想定することができる。しかし、これは事実でないとは限らず、Ｔｈｏｒｎｔｏｎデータベースによると、Ｓｅｒは、Ｌｙｓ５３Ｌｙｓ５５側鎖に結合できず、有意な集団を全く形成できないことが予測された。しかし、それは、Ｌｙｓ５３Ｌｙｓ５５に対してルーフループの他方の末端で、Ｇｌｙ５７、Ｇｌｕ５８、Ｉｌｅ５９、Ｇｌｎ６０、Ｐｒｏ６１およびＶａｌ６２のいずれかと結合し、有意な集団形状（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｅｓ）を形成することができると予測される。
【０３４１】
プロリンは、それがアミノ酸骨格の最初のＮと環を形成する側鎖ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２を有する点で独特である。したがって、その側鎖は大規模であり、その場合、ポケットを遮断すると考えることができる。しかし、Ｔｈｏｒｎｔｏｎデータベースによると、ＰｒｏがＬｙｓ５３Ｌｙｓ５５側鎖に結合できないことが予測されることから、これは事実であるとは限らない。しかし、それは、Ｌｙｓ５３Ｌｙｓ５５に対してルーフループの他方の末端で、Ｇｌｙ５７、Ｇｌｕ５８、Ｉｌｅ５９、Ｐｒｏ６１およびＶａｌ６２のいずれかと結合し、有意な集団形状を形成することができると予測される。
【０３４２】
メチオニンは、大きい側鎖ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３を有し、側鎖相互作用の試験（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ）によると、Ｎ末端メチオニンがＬｙｓ５３Ｌｙｓ５５と集団を全く形成できないと予測されることが示された。しかし、メチオニンは、ルーフループ内に位置するイソロイシン５９（Ｉｌｅ５９）またはバリン６２（Ｖａｌ６２）と複数の相互作用を形成すると予測される。
【０３４３】
Ｎ末端位置にメチオニンを有する突然変異体のＣｐＧ−ＯＤＮに対する結合能においては、いずれのアミノ酸がそれに後続するかによって違いがあることに注目することは興味深い。この違いは、Ｍｅｔに後続するこれらのアミノ酸と、Ｉｌｅ５９またはＶａｌ６２のいずれかを囲むルーフループ内のそれらとの追加的な側鎖相互作用に起因すると仮定される。
【０３４４】
これらのアミノ酸は、Ｌｙｓ５３Ｌｙｓ５５の側鎖に結合し、ポケットに適合することができない可能性があることから、実際にはポケット外部のルーフループに結合することが提起されている。次いで、この結合は、ルーフループに対して異なる構造変化を起こす可能性があり、それにより、分子は、全体として、ＣｐＧ−ＯＤＮとのより強力な結合を可能にし、Ａｌａ−Ｃｐｎ１０全体にわたる免疫修飾を促進する。
【図３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【配列表】
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