【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年9月7日(2011.9.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
【図１】高い基本レベルのＩｎｓＰ７が膵β細胞中に存在し、ＩＰ６Ｋが膵β細胞中で発現している。（Ａ）初代膵島またはインシュリン分泌ＭＩＮ６ｍ９細胞での［３Ｈ］標識ＩｎｓＰ６の百分率としての［３Ｈ］標識ＩｎｓＰ７の比較。データは３つの別個の実験から得たものである。（Ｂ）（Ａ）の膵島データを正常島（６０％）対ｏｂ／ｏｂ（９０％）の種々のβ細胞組成を考慮するために変換した。（Ｃ）全体ＲＮＡを島およびＭＩＮ６ｍ９細胞から抽出し、逆転写した。伝令ＲＮＡの相対発現を、適切なプライマーおよびプローブを使用して定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。１８ＳリボソームＲＮＡ（ＴａｑＭａｎ（商標）リボソームＲＮＡコントロール試薬、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を内在性対照として使用した。
【図２】ＩＰ６Ｋの発現は、膵β細胞におけるエキソサイトーシスを促進する。ＩＰ６Ｋ１はＣａ2+依存性エキソサイトーシスを刺激する。（Ａ）個々のマウスβ細胞をＥＧＦＰ（ｍｏｃｋ）で、またはＥＧＦＰと野生型（ＩＰ６Ｋ１）またはＩＰ６Ｋのキナーゼ不活性（ＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）変異型のいずれかとの組み合わせでトランスフェクトし、穿孔パッチ構成を用いて一連の４回の５００ミリ秒の脱分極を受けた。細胞キャパシタンス（ΔＣｍ）の増大が細胞外培地中の３ｍＭグルコースで測定した。（Ｂ）個々の脱分極に対してプロットした細胞やパシタンスの平均増大およびｍｏｃｋ（偽の）トランスフェクトをしたか野生型（ＩＰ６Ｋ１）またはキナーゼ不活性（ＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）ＩＰ６Ｋのいずれかを過剰発現している細胞での一連の脱分極の最後における細胞キャパシタンスの増大の合計を表すヒストグラム（Ｃ）ｍｏｃｋトランスフェクトしたか野生型またはＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）のいずれかを過剰発現している細胞における個々の脱分極に対してプロットした統合Ｃａ2+電流（ＱＣａ）を示すヒストグラム。値は８−１２回の実験から得たものである。＊Ｐ＜０．０５。（Ｄ）ｍｏｃｋトランスフェクト細胞または野生型（ＩＰ６Ｋｎ）またはキナーゼ不活性（ＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）１，２，および３型キナーゼのいずれかを過剰発現している細胞における一連の脱分極の最後における細胞キャパシタンスの平均合計増大を表すヒストグラム。値は７−１２回の実験から得たものである。＊Ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＩＮＳ−１Ｅ細胞を、ｐＣＭＶ５−ｈＧＨおよび空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）（ｍｏｃｋ）と平行して同時トランスフェクトするか、ｐＣＭＶ５−ｈＧＨと野生型（ＩＰ６Ｋｎ）またはキナーゼ不活性（ＩＰ６Ｋ１−Ｋ／Ａ）１，２および３型キナーゼとで同時トランスフェクトした。ｈＧＨ分泌を３ｍＭグルコースのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩ＨＥＰＥＳ緩衝液で比較した。ｈＧＨ放出は、分泌されたｈＧＨとして合計ｈＧＨの百分率で示している。値は３つの実験（各々三連とする）から得たものである。＊Ｐ＜０．０５。
【図３】ＩｎｓＰ７は、用量依存的にＣａ2+依存性エキソサイトーシスを促進する個々のマウスβ細胞を、標準の全細胞のパッチ構成を使用して、一連４回、５００ミリ秒で脱分極させた。（Ａ）エキソサイトーシスは、対照条件下でおよびピペット充填溶液中の３μＭ  ５−ＩｎｓＰ７の存在下で観察された。５−ＩｎｓＰ７を２分間細胞へ拡散させてから、実験を開始した。（Ｂ）３μＭ  ５−ＩｎｓＰ７  ピペット充填溶液の不在下または存在下での個々の脱分極に対してプロットした細胞キャパシタンスの平均増加と、一連の脱分極の最後における細胞キャパシタンスの合計増加とを表すヒストグラム。（Ｃ）３μＭ  ＩｎｓＰ７  ピペット充填溶液の不在下または存在下での個々の脱分極に対してプロットした統合Ｃａ2+流れ（ＱＣａ）を示すヒストグラム。（Ｄ）−７０ｍＶから０までの一回の膜脱分極により引き起こされるエキソサイトーシスに対する５−ＩｎｓＰ７の刺激作用の濃度依存性。曲線はヒル方程式に対する平均データポイントの最小二乗法を表わす。値は５−７回の実験から得たものである。＊Ｐ＜０．０５。（Ｅ）上記の（Ａ）と同じプロトコルを使用したエキソサイトーシスに対する１０μＭ濃度のＩｎｓＰ７のいくつかの異性体の比較。
【図４】ＩＰ６Ｋ２ではなくＩＰ６Ｋ１のＲＮＡサイレンシングは、ＲＲＰからの顆粒の放出を阻害する。（Ａ）  個々のマウスβ−細胞を、２５ｎＭのＩＰ６Ｋ１（番号１）に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトするかまたは同じ濃度の陰性対照でトランスフェクトし、穿孔パッチ構成を使用して一連で４回、５００ミリ秒で脱分極させた。細胞キャパシタンス（ΔＣｍ）の増加を、細胞外培地中の３ｍＭグルコースで測定した。（Ｂ）ｍｏｃｋトランスフェクトさせるかＩＰ６Ｋ１に対するｓｉＲＮＡまたは陰性対照のいずれかを過剰発現した細胞における、個々の脱分極に対してプロットした細胞キャパシタンスの平均増大および一連の脱分極の最後における細胞キャパシタンスの合計増大を示すヒストグラム。（Ｃ）ＩＰ６Ｋ１とＩＰ６Ｋ２のＲＮＡサイレンシング後のキャパシタンス増加の合計に対する影響。（Ｄ）対照条件下およびＩＰ６Ｋ１の発現レベルが低減された細胞でのエキソサイトーシスに対する５−ＩｎｓＰ７の影響。
【図５】エキソサイトーシスに対する５−ＩｎｓＰ７の影響はＩｎｓＰ６とは異なる。個々のマウスβ細胞を、標準の全細胞のパッチ構成を使用して、一連４回、５００ミリ秒で脱分極させた。エキソサイトーシスは、対照条件下でおよびピペット充填溶液中の３μＭ  ５−ＩｎｓＰ７または１０μＭ  ＩｎｓＰの存在下で観察された。リン酸イノシトールを、２分間細胞へ拡散させてから、実験を開始した。
【図６】ＭＩＮ６ｍ９細胞でのｓｉＲＮＡのスクリーニング。各ＩＰ６Ｋに対して６つのｓｉＲＮＡを、１００ｍＮでＭＩＮ６ｍ９細胞をサイレンシングするその能力についてスクリーニングした。そして、ＩＰ６Ｋ１またはＩＰ６Ｋ２をサイレンシングするために、各ケースで２つ、ＩＰ６Ｋ１（１と４）およびＩＰ６Ｋ２（３と５）を個別にまたは組み合わせて用いた。これを２つの陰性対照と比較した。ｍＲＮＡを抽出し、遺伝子の発現量をＴａｑｍａｎ（商標）ＲＴ−ＰＣＲで測定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図７】ＩＰ６Ｋ１またはＩＰ６Ｋ２のＲＮＡサイレンシングは細胞ＩｎｓＰ７レベルを低下させる。ＭＩＮ６ｍ９細胞を、陰性対照かＩＰ６Ｋ１および2のいずれかに対して選択したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＩＰ６Ｋ１（１と４）に対するｓｉＲＮＡを、２５ｎＭで各々加えた。ＩＰ６Ｋ２（３と５）に対するｓｉＲＮＡを同様の濃度で加えた。これを５０ｎＭの陰性対照の添加により対照比較した。４つのｓｉＲＮＡはすべて同時に適用し、１００ｎＭ陰性対照ｓｉＲＮＡにより対照比較した。ｓｉＲＮＡでのトランスフェクトの２時間後、培地を５０μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］イノシトール含有培地に変更し、細胞を４８時間から７２時間培養した。細胞を抽出し、ＨＰＬＣにかけた。データはイノシトール脂質の合計に対して表され、３つの個別の実験からの平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図８】ＭＩＮ６ｍ９細胞における単一Ｌ型Ｃａ2+チャンネル活性に対するＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡの効果。ＭＩＮ６ｍ９細胞を、５０ｎＭの陰性対照に対して選択されたｓｉＲＮＡで、またはＩＰ６Ｋ１に対するｓｉＲＮＡ（１および４）それぞれ２５ｎＭでトランスフェクトした。（Ａ）対照細胞（陰性対照ｓｉＲＮＡトランスフェクション、左）およびＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡを受けた細胞（右）に対する細胞に取り付けたパッチから記録された単一Ｃａ2+チャンネル電流の例。いずれのパッチも１つのＬ型Ｃａ2+チャンネルを含んでいる。（Ｂ）対照ＭＩＮ６ｍ９細胞（ｎ＝３０）およびＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡを受けた細胞（ｎ＝３０）における単一Ｌ型Ｃａ2+チャンネルの電流パラメータ。対照ＭＩＮ６ｍ９細胞とＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡを受けた細胞との間で、１つのパッチ当たりのチャンネル数、開確率、平均閉時間、平均開時間に有意差はない（Ｐ＞０．０５）。データは平均±ＳＥＭとして示す。統計学的有意差は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験またはｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ試験のいずれかにより評価した。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
細胞培養とトランスフェクション。
ＨＩＴ  Ｔ１５細胞およびマウス膵島を、以前に記載されたように（２９）ＲＰＭＩ−１６４０培地に維持した。特定のＲＰＭＩ−１６４０培地にそれぞれ存在するインスリン分泌ＨＩＴ  Ｔ１５細胞およびマウス膵島に対して、［３Ｈ］ミオイノシトール（ＧＥヘルスケア、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン、ウプサラ）１０または５０μＣｉ／ｍｌで、以前に記載されたように（２９）標識化を行った。細胞を７２時間で標識したが、４８−１６８時間の標識化ではＩｎｓＰ６対ＩｎｓＰ７の比が変化しなかった。実験のため、膵島または細胞を洗浄してＫｒｅｂｓ緩衝液に移し、基本グルコース条件（細胞株は０．１ｍＭおよび膵島は３ｍＭ）下で３０分インキュベートした。ポリリン酸イノシトールを以前に記載されたように（２９）ＨＰＬＣで抽出および分離した。他に記載されたように（３０）ＩＮＳ−１Ｅ細胞を培養した。マウス膵島を雌ＮＭＲＩマウス（Ｂｏｍｈｏｌｔｇａａｒｄ社、デンマーク、ライ）または正常血糖性ｏｂ／ｏｂマウスから、以前に記載されたように（３１，３２）分離した。細胞を１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）でインキュベートした。単一マウスの膵島細胞を、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（ｍｏｃｋ）またはｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰと対照構築物との組み合わせを２μｇ／ｍｌで上記ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地にプレーティングした後日、製造業者の取扱説明書に従ってリポフェクトアミン（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて付着させてトランスフェクトした。リポフェクトアミン（商標）をＤＮＡに対して４：１の比で使用した。細胞をトランスフェクションの４８時間後に使用した。ＧＦＰ蛍光に基づくと、マウス膵島細胞中のトランスフェクション効率は８＋／−１％に及んだ（ｎ＝１２４細胞；４つの異なる細胞調製物およびトランスフェクション）。ＳｉＲＮＡをリポフェクトアミン（商標）２０００および最適ＭＥＭ（商標）培地を使用して、ＭＩＮ６ｍ９細胞および初代膵島細胞にトランスフェクトした。翌日培地をＭＩＮ６ｍ９細胞または初代膵島細胞のいずれかの通常の培地に変更し、細胞をさらに４日間培養した。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
キャパシタンス測定。
キャパシタンス測定のために、ＥＧＦＰを発現している細胞を選択した。穿孔パッチまたはパッチクランプ技術の標準全細胞構成と、ＥＰＣ９パッチクランプアンプ（Ｈｅｋａ
Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ社、ドイツ、ランブレヒト／プファルツ）とを使用して、エキソサイトーシスを細胞キャパシタンスの変化としてモニタした。穿孔パッチ構成のピペット溶液は、（単位ｍＭで）７６  Ｃｓ２ＳＯ４、１０  ＮａＣＩ、１０  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、５ＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨを使用してｐＨ７．３５）および０．２４ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢから構成された。穿孔には数分間が必要であり、Ｇｓｅｒｉｅｓ（一連のコンダクタンス）が安定し、＞３５ｎＳである場合に電圧クランプは満足であると考えられた。標準的な全細胞記録のために使用されるピペット溶液は、（単位ｍＭで）１２５  Ｃｓグルタミン酸塩、１０  ＣｓＣｌ、１０  ＮａＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、５ＨＥＰＥＳ、０．０５  ＥＧＴＡ、０．０１  ＧＴＰ、および３  ＭｇＡＴＰ（ＣｓＯＨを使用してｐＨ７．１５）を含んでいた。ＩｎｓＰ７アイソフォームを、本文書に示した最終濃度になるようにピペット充填溶液に溶解させ、使用まで凍結した。細胞外培地は、（単位ｍＭで）１１８  ＮａＣＩ、２０  テトラエチルアンモニウム−Ｃｌ、５．６  ＫＣｌ、１．２  ＭｇＣｌ２、２．６  ＣａＣｌ２、５ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４０）および３  グルコースから構成した。刺激プロトコルは、１Ｈｚで適用される一連の４回の５００ミリ秒の脱分極から成り、−７０ｍＶから０ｍＶまでに及んだ。キャパシタンス測定は３３°Ｃで行ない、記録チャンバを１．５ｍｌ／分の速度で潅流した。
単一Ｌ型Ｃａ2+チャンネル活性の測定
細胞付着パッチの記録を、以前に記載されたように（３２）対照ＭＩＮ６ｍ９細胞およびＩＰ６Ｋ１−ｓｉＲＮＡを受けたＭＩＮ６ｍ９細胞に対して行なった。簡単に説明すると、一般に電極抵抗は２−４ＭΩとした。細胞付着シングルチャネル記録を、電荷担体としてＢａ2+を用いて行い：（単位はｍＭ）１１０  ＢａＣｌ２、１０  ＴＥＡ−Ｃｌ、５
ＨＥＰＥＳ−Ｂａ（ＯＨ）２およびｐＨ７．４、また、（単位はｍＭ）１２５  ＫＣｌ、３０  ＫＯＨ、１０  ＥＧＴＡ、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、５  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨおよびｐＨ７．１５を含む脱分極用外部記録溶液を使用して、細胞内電位を約０ｍＶとする。記録はＡｘｏｐａｔｃｈ（商標）２００アンプ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ）で作成した。保持電位の−７０ｍＶから膜電位の０ｍＶに細胞を脱分極させるために、周波数０．５Ｈｚで電圧パルス（２００ミリ秒）を加える。生じた電流を１ｋＨｚでフィルタし、５ｋＨｚでデジタル化し、ソフトウェアプログラムｐＣＬＡＭＰ（商標）６（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ）で分析した。
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）放出分析
ｐＣＭＶ５−ｈＧＨと、空ベクターｐｃＤＮＡ３または対象プラスミドとによるトランスフェクション後、ＩＮＳ−１Ｅ細胞を４８−マルチウェルプレート（１つのウェル当たりの２×１０5細胞）に播き、４８時間培養した。インキュベーションと分泌実験は以前
に記載されたように（３３）、上述と同じ細胞外培地を使用し、３ｍＭグルコースを補給して行なった。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
結果
［３Ｈ］ミオイノシトール標識プロトコルを使用して、本願発明者らは、インシュリン分泌細胞および膵島をイノシトールピロリン酸種の存在の有無について調べた。ＩｎｓＰ７は、ＩｎｓＰ６キナーゼを用いて生成された正規ＩｎｓＰ７標準との同時溶出により同定された（データは図示しない）。ＩｎｓＰ８はほとんど検知されなかった。図１Ａは、
インシュリン分泌または初代β細胞に対する細胞ＩｎｓＰ６レベルの割合として発現されたＩｎｓＰ７レベルを示す。正常マウスの膵島（６０％がβ細胞）では、ＩｎｓＰ７の相対レベルはＩｎｓＰβレベルの約５％である。対照的に、約９０％を超えるβ細胞を有するｏｂ／ｏｂマウスの膵島のＩｎｓＰ７の割合は約８％である。これは、ＩｎｓＰ７レベルの上昇がβ細胞に限定されることを示唆している。１００％のβ細胞へ初代マウスデータを正規化する（図１Ｂ）と、β細胞はＩｎｓＰ６濃度の約９％でＩｎｓＰ７レベルを維持していることをすること示唆している。インシュリン分泌細胞株のうち、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞だけが同様のレベルのＩｎｓＰ７（１０％のＩｎｓＰ６）を有している。成長している培養細胞のみに高い信頼で適用できる平衡標識技術（１３）を用いて、発明者らはＨＩＴ−Ｔ１５細胞におけるＩｎｓＰ７の基本濃度が５．８＋／−０．１４μＭ（±ＳＥＭ、ｎ＝３）であると推測できたが、これは他の哺乳動物細胞または酵母で推算した範囲（１〜５μＭ）（４）の上限の濃度を反映している。ＩｎｓＰ７は他の哺乳動物細胞（４）と共通してβ細胞でも細胞ＩｎｓＰ６プールと迅速に交換する状態にあり（データは図示しない）、β細胞におけるＩｎｓＰ６の細胞濃度も高いため（１３）、高レベルのＩｎｓＰ７がβ細胞に存在するのは驚くべきことではない。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
高いＩｎｓＰ７濃度がβ細胞を反応性のある状態に維持するための原因であるかどうかを調べるために、本願発明者らは基本条件下で初代β細胞にて３つの報告されたすべての哺乳動物ＩＰ６Ｋを過剰発現させ、刺激されたエキソサイトーシスが続いて増強されるかどうか調べた。本願発明者らは、エキソサイトーシスの基準として細胞キャパシタンスの増加を使用した。この技術は、インシュリン含有下流が原形質膜（１７）と融合した場合に起こるβ細胞表面積の増大を検出する。代謝上インタクトな細胞での測定を可能にするために穿孔パッチ全細胞技術を使用し、エキソサイトーシスは−７０ｍＶから０ｍＶまでの一連の４回の５００ミリ秒の脱分極化パルスにより誘発した。ｍｏｃｋ（偽の）トランスフェクト細胞では、一連のパルスによって誘発されるキャパシタンスの増大は７９＋／−１１ｆＦ（ｎ＝８；図２Ａ、Ｂ）に達した。ＩＰ６Ｋ１を過剰発現している細胞では、キャパシタンス増加の振幅が１５３％刺激され、平均１９８＋／−１２ｆＦ（Ｐ＜０．０５；ｎ＝１０）だったが、ＩＰ６Ｋ１のキナーゼ不活化型を過剰発現している細胞ではエキソサイトーシスに対する影響は観察されなかった（図２Ａ、Ｂ）。興味深いことに、最初の脱分極により引き起こされるキャパシタンス増大は、野生型ＩＰ６Ｋ１を過剰発現する細胞では２９３％だけ増大した。最初の脱分極中のエキソサイトーシスは、大半が、容易に放出されるプール（ＲＲＰ）の内容を表わすと考えられる（７８）。ＲＲＰ（単位ｆＦ）のサイズは方程式：ＲＲＰ＝Ｓ／（１−Ｒ２）を使用して推定することができ、Ｓは第１（ΔＣ１）パルスと第２（ΔＣ２）パルスに対する応答の合計であり、Ｒｈａ比ΔＣ２／ΔＣ１である（１８）。本願発明者らは、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞および野生型ＩＰ６Ｋ１細胞におけるＲＲの平均が９６＋／−９ｆＦ（ｎ＝８）および２２５＋／−２１ｆＦ（ｎ＝１０）であると推算する。したがって、ＩＰ６Ｋ１は、ＲＲＰのサイズを１３４％増加させた。１顆粒当たり３ｆＦの換算係数を使用する（１９）と、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞および野生型ＩＰ６Ｋ１細胞におけるＲＲＰはそれぞれ３０および７５の粒子を含むと推算される。ＩＰ６Ｋ１の刺激作用は最初の脱分極に限定され、最後の３回のパルスでは増強はほとんど見られなかった（図２Ｂ）。一連の脱分極におけるエキソサイトーシスのレスポンスの消耗は、Ｃａ2+誘導エキソサイトーシスの抑制を生じさせるＣａ2+電流の不活性化を反映しない（図２Ｃ）。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
この点の本願発明者らのデータはすべて、エキソサイトーシスの制御におけるＩｎｓＰ７のための役割を示しているが、本願発明者らの結果は酵素またはＩｎｓＰ７のいずれかの外因性の添加に基づいている。内因性ＩｎｓＰ７が生理学的に関連した方法でエキソサイトーシスのキャパシティに寄与しているか否かを試験するために、本願発明者らは、ｓｉＲＮＡを用いてβ細胞中のＩＰ６Ｋ１およびＩＰ６Ｋ２をサイレンシングした。マウス特異的ｓｉＲＮＡをマウス細胞株ＭＩＮ６と、Ｔａｑｍａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲ遺伝子発現分析とを使用してスクリーニングした（図６参照）。ＩＰ６Ｋ１またはＩＰ６Ｋ２のいずれかを除去すると、細胞内ＩｎｓＰ７レベルが著しく減少した（図７参照）。適切なｓｉＲＮＡ候補を蛍光タグ化し、初代β細胞にトランスフェクトした。上述の穿孔パッチ技術を用いて、蛍光細胞について細胞キャパシタンス測定を行なった。興味深いことに、ＩＰ６Ｋ２ではなくＩＰ６Ｋ１のサイレンシングだけが（図４Ｃ）がエキソサイトーシス能を阻害し、顆粒のＲＲＰの消耗を反映する最初のパルスでサイレンシングの効果がやはり最も顕著だった（図４Ａ、Ｂ）。さらに、ＩＰ６Ｋ１をサイレンシングしたときに全細胞モードに５−ＩｎｓＰ７を添加すると、正常なエキソサイトーシス応答を回復することができた（図４Ｄ）。したがって、ＩＰ６Ｋ２ではなくＩＰ６Ｋ１により生成された内因性ＩｎｓＰ７が、膵臓のβ細胞のエキソサイトーシス能の増大の原因である。本願発明者らの内因性の系と外因性の系との間の矛盾は、インビボで２つのキナーゼが異なる分布をしているか、細胞内結合しているかの反映であり得る。実際、ＩＰ６Ｋ１はエキソサイトーシスに関与するタンパク質と結合してよいが、これはＩＰ６Ｋ２にはできない（２０）。興味深いことに、アポトーシスにおけるＩＰ６Ｋ２の役割を見た他の研究で同様のパターンが示されている（２１）。すなわち、ＩＰ６Ｋ１−３が実質的に過剰発現すると、アポトーシスの増加につながるが、ＩＰ６Ｋ２のサイレンシングのみがこれを防ぐ。いずれの場合も、ＩｎｓＰ７の上方への生理学的増加は、異なるキナーゼにより示されるコンパートメント化の一部を明らかに克服する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
II型糖尿病の治療用の化合物を識別する方法であって、
（ａ）膵β細胞を、１または複数の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）ＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現レベルおよびＩｎｓＰ７のレベルのうちの少なくとも一方を決定すること、からなり、
前記ＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現の増加およびＩｎｓＰ７の増加のうちの少なくとも一方が、該試験化合物がII型糖尿病を治療するのに適していることを示す方法。
【請求項２】
前記接触させることが、基本グルコース条件下で起こる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膵β細胞は、膵組織、膵臓の単離されたランゲルハンス膵島、単離された膵β膵島細胞、およびインスリン分泌細胞株から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記膵β細胞は、膵臓の単離されたランゲルハンス膵島である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
膵β細胞で前記試験化合物により誘発されるインスリン放出を測定すること、および該
測定値を対照と比較することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試験化合物により誘発される膵β細胞キャパシタンスを測定すること、および該測定値を対照と比較することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記決定することは、膵β細胞におけるＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現レベルを決定することからなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記決定することは、膵β細胞におけるＩｎｓＰ７のレベルを決定することからなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
膵β細胞を用いた試験における、II型糖尿病の治療用の化合物を識別するためのＩＰ６Ｋ１キナーゼおよびＩｎｓＰ７のうちの少なくとも一方の使用方法。
【請求項１０】
患者におけるII型糖尿病を治療するための医薬組成物であって、
有効量のＩＰ６Ｋ１キナーゼの発現を増加させることが可能な治療薬
を含み、該治療薬が、ＩＰ６Ｋ１またはその活性断片を含む遺伝子治療ベクター、もしくはＩＰ６Ｋ１またはその活性断片である、医薬組成物。
【請求項１１】
患者におけるII型糖尿病を治療するための医薬組成物であって、
有効量のＩｎｓＰ７の生産を増加させることが可能な治療薬
を含み、該治療薬が、ＩＰ６Ｋ１またはその活性断片を含む遺伝子治療ベクター、ＩＰ６Ｋ１またはその活性断片、もしくはＩｎｓＰ７である、医薬組成物。