【手続補正書】
【提出日】平成22年11月11日(2010.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非治療目的でのHPRT遺伝子における部位特異的改変の誘発のためのI-CreI変異型又はその単鎖誘導体の使用であって、該I-CreI変異型又は単鎖誘導体が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの２つの機能的サブドメインの一方に少なくとも１つの置換を有し、かつ配列番号１〜14の配列からなる群より選択されるHPRT遺伝子のDNA標的配列を切断でき、かつ少なくとも以下の工程：
(ａ)I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第１機能的サブドメイン中に、好ましくは26位、28位、30位、32位、33位、38位及び/又は40位に、少なくとも１つの置換を有するI-CreI変異型の第１シリーズを構築し、
(ｂ)I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第２機能的サブドメイン中に、好ましくは44位、68位、70位、75位及び/又は77位に、少なくとも１つの置換を有するI-CreI変異型の第２シリーズを構築し、
(ｃ)(ｉ)I-CreI部位の−10位〜−８位のヌクレオチドトリプレットがcag、att、cct、ttg、gac、atg、ttt、ttc、tgg、gtc、aag、gagからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii)＋８位〜＋10位のヌクレオチドトリプレットが、前記I-CreI部位の−10位〜−８位を置換する前記ヌクレオチドトリプレットの逆相補配列(すなわち、それぞれctg、aat、agg、caa、gtc、cat、aaa、gaa、cca、gac、ctt及びctc)で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる工程(ａ)の第１シリーズからの変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(ｄ)(ｉ)I-CreI部位の−５位〜−３位のヌクレオチドトリプレットが、gac、taa、tca、gtg、gct、tgt、tgg、ctg、ttg、tag及びgagからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii)＋３位〜＋５位のヌクレオチドトリプレットが、前記I-CreI部位の−５位〜−３位を置換する前記ヌクレオチドトリプレットの逆相補配列(すなわち、それぞれgtc、tta、tga、cac、agc、aca、cca、cag、caa、cta及びctc)で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる工程(ｂ)の第２シリーズからの変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(ｅ)(ｉ)I-CreI部位の＋８位〜＋１０位のヌクレオチドトリプレットが、cat、cga、tat、ggg、tac、taa、cag、gca、aca、gaa、tga、atgからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii)−10位〜−８位のヌクレオチドトリプレットが、前記I-CreI部位の＋８位〜＋10位を置換する前記ヌクレオチドトリプレットの逆相補配列(すなわち、それぞれatg、tcg、ata、ccc、gta、tta、ctg、tgc、tgt、ttc、tca及びcat)で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる工程(ａ)の第１シリーズからの変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(ｆ)(ｉ)I-CreI部位の＋３位〜＋５位のヌクレオチドトリプレットが、tcc、tat、gtg、gaa、tgg、tac、ttt、aca、agc、gcg、tcc、act、caa及びaagからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii)−５位〜−３位のヌクレオチドトリプレットが、前記I-CreI部位の＋３位〜＋５位を置換する逆相補配列(すなわち、それぞれgga、ata、cac、ttc、cca、gta、aaa、tgt、gct、cgc、gga、agt、ttg及びctt)で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる工程(ｂ)の第２シリーズからの変異型を選択及び/又はスクリーニングし、
(g1)配列番号１〜14の配列のDNA標的を切断できる工程(ｃ)〜(ｆ)からの変異型を選択及び／又はスクリーニングする
を含む方法により得ることができる使用。
【請求項２】
前記HPRT遺伝子が、チャイニーズハムスター(Criteculus sp.)のHPRT遺伝子、マウス(Mus musculus)のHPRT遺伝子及びヒト(Homo sapiens)のHPRT遺伝子からなる群より選択される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記I-CreI変異型又は単鎖誘導体が、前記I-CreI変異型又は単鎖誘導体のゲノムDNA切断を取り囲むHPRT遺伝子の領域と相同性を有する配列で挟まれた、導入される配列を含むターゲティングDNA構築物と組み合わされる請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記I-CreI変異型又は単鎖誘導体が、発現ベクターに挿入されているポリヌクレオチド断片によりコードされる請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記ベクターが、請求項３で定義されるターゲティングDNA構築物を含む請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記HPRT遺伝子の部位特異的改変が、前記I-CreI変異型によるHPRT遺伝子の切断と、興味対象の遺伝子を含む請求項３で定義されるターゲティングDNA構築物を用いる相同組換えとによる興味対象の遺伝子の挿入である請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記HPRT遺伝子の部位特異的改変が、前記I-CreI変異型によるHPRT遺伝子の切断と、HPRT遺伝子の不活性化カセットを含む請求項３で定義されるターゲティングDNA構築物を用いる相同組換えとによる不活性化カセットの挿入である請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記HPRT遺伝子の部位特異的改変が、前記I-CreI変異型によるHPRT遺伝子の切断と、非相同末端結合による二本鎖破断の修復とによるHPRT遺伝子の不活性化である請求項１又は２に記載の使用。
【請求項９】
非ヒトトランスジェニック動物又は組換え株化細胞を作製するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
組換えヒト株化細胞を作製するための請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記I-CreI変異型が、少なくとも請求項１で定義される工程(ａ)〜(ｆ)と、さらなる工程：
(g2)工程(ｃ)〜(ｆ)のいずれかで得られた異なる変異型を、互いに又はI-CreIと組み合わせてヘテロダイマーを形成し、
(h2)配列番号１〜14の配列のDNA標的を切断できる工程(g2)からのヘテロダイマーを選択及び/又はスクリーニングする
とを含む方法により得ることができる請求項１〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記I-CreI変異型が、少なくとも請求項１で定義される工程(ａ)〜(ｆ)と、さらなる工程：
(g3)単一の変異型において、工程(ｃ)及び工程(ｄ)からの２つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を組み合わせて、(ｉ)−10位〜−８位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号１〜14の配列のDNA標的の−10位〜−８位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii)＋８位〜＋10位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号１〜14の配列のDNA標的の−10位〜−８位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii)−５位〜−３位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号１〜14の配列のDNA標的の−５位〜−３位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv)＋３位〜＋５位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号１〜14の配列のDNA標的の−５位〜−３位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモダイマーI-CreI変異型を得て、及び/又は
(h3)単一の変異型において、工程(ｅ)及び工程(ｆ)からの２つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を組み合わせて、(ｉ)＋３位〜＋５位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号１〜14の配列のDNA標的の＋３位〜＋５位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii)−５位〜−３位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号１〜14の配列のDNA標的の＋３位〜＋５位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii)I-CreI部位の＋８位〜＋10位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号１〜14の配列のDNA標的の＋８位〜＋10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv)−10位〜−８位のヌクレオチドトリプレットが、配列番号１〜14の配列のDNA標的の＋８位〜＋10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモダイマーI-CreI変異型を得て、
(i3)配列番号１〜14の配列のDNA標的を切断できる工程(g3)又は(h3)からの変異型を選択及び/又はスクリーニングする
とを含む方法により得ることができる請求項１〜１０のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１３】
前記I-CreI変異型が、少なくとも請求項１で定義される工程(ａ)〜(ｆ)と、請求項１２で定義される工程(g3)及び/又は工程(h3)と、さらなる工程：
(i4)工程(g3)で得られた変異型を、工程(h3)で得られた変異型、I-CreI又は工程(ｅ)若しくは工程(ｆ)で得られた変異型と組み合わせてヘテロダイマーを形成するか、又は
(i'4)工程(h3)で得られた変異型を、I-CreI又は工程(ｃ)若しくは工程(ｄ)で得られた変異型と組み合わせてヘテロダイマーを形成し、
(j4)配列番号１〜14の配列のDNA標的を切断できる工程(i4)又は(i'4)からのヘテロダイマーを選択及び／又はスクリーニングする
とを含む方法により得ることができる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ヘテロダイマーが、以下の配列の対：
配列番号83と97、配列番号84と98、配列番号85と99、配列番号32と52、配列番号32と53、配列番号32と54、配列番号32と55、配列番号32と56、配列番号32と57、配列番号32と58、配列番号32と60、配列番号32と65、配列番号32と66、配列番号32と67、配列番号32と68、配列番号32と69、配列番号32と70、配列番号32と71、配列番号32と72、配列番号32と73、配列番号32と74、配列番号75と56、配列番号76と56、配列番号77と56、配列番号78と56、配列番号79と56、配列番号80と56、配列番号81と56、配列番号82と56、配列番号86と96、配列番号87と100、配列番号88と101、配列番号89と102、配列番号90と103、配列番号91と104、配列番号92と105、配列番号93と106、配列番号94と107、配列番号95と108、配列番号147と148
から選択される第１モノマーと第２モノマーとからなる請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記I-CreI変異型が、I-CreI中、I-CreIの2位、9位、19位、42位、43位、54位、66位、69位、72位、81位、82位、86位、90位、92位、96位、100位、103位、104位、105位、107位、108位、109位、110位、113位、120位、125位、129位、130位、131位、132位、135位、136位、137位、140位、143位、151位、154位、155位、157位、158位、159位、161位又は162位で１つ又は複数のさらなる置換を含む請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ヘテロダイマーの一方のモノマーが、G19S変異を含む請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
レッシュ-ナイハン症候群のようなHPRT遺伝子における変異に関連する遺伝病を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための請求項１、３〜５及び１１〜１６のいずれか１項で定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体の使用。
【請求項１８】
前記I-CreI変異型又は単鎖誘導体が、前記I-CreI変異型又は単鎖誘導体のゲノムDNA標的を取り囲むHPRT遺伝子の領域と相同性を有する配列で挟まれた、HPRT遺伝子中の変異を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物と組み合わされる請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
請求項１及び１１〜１６のいずれか１項で定義されるI-CreI変異型又は該I-CreI変異型の単鎖誘導体。
【請求項２０】
請求項１９に記載のI-CreI変異型又は単鎖誘導体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド断片を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項３、６、７及び１８のいずれか１項で定義されるターゲティングDNA構築物を含む請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
請求項３、６、７及び１８のいずれか１項で定義されるターゲティングDNA構築物を含むベクター。
【請求項２３】
請求項２０で定義されるポリヌクレオチド又は請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のベクターで改変された宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２０で定義される少なくとも１つのポリヌクレオチド断片を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２５】
請求項２０で定義される少なくとも１つのポリヌクレオチド断片を含むトランスジェニック植物。
【請求項２６】
請求項１９に記載の少なくとも１つのI-CreI変異型若しくは単鎖誘導体及び/又は請求項２０若しくは２１に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む組成物。