【手続補正書】
【提出日】平成23年10月31日(2011.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導され、第１認識半部位を有する第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと、
第２モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼまたはジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導され、第２認識半部位を有する第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと
を含む組換え単鎖メガヌクレアーゼであって、
前記第１および第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがリンカに対しＮ末端となり、第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインが前記リンカに対しＣ末端となるように、ポリペプチドリンカにより共有結合され、
前記第１および第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは一緒に機能して、前記第１認識半部位および前記第２認識半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ配列を、認識、切断することができる、組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２】
前記第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩからなる群から選択されるモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導され、
前記第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、（１）Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩからなる群から選択されるモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ、または（２）Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＡｎｉＩからなる群から選択されるジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのいずれかから誘導される、
請求項１に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項３】
前記第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、前記第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットとは異なる種から誘導される、請求項１に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項４】
前記第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９〜１５１、配列番号２の野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基１１〜１６２、および配列番号３の野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５〜２１０からなる群から選択される第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインと、少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項５】
前記第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９〜１５１、配列番号２の野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基１１〜１６２、配列番号３の野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５〜２１０、配列番号４の野生型Ｉ−ＤｍｏＩの残基９〜９６、配列番号４の野生型Ｉ−ＤｍｏＩの残
基１０５〜１７８、配列番号５の野生型Ｉ−ＳｃｅＩの残基３２〜１２３、配列番号５の
野生型Ｉ−ＳｃｅＩの残基１３４〜２２５、配列番号６の野生型Ｉ−ＡｎｉＩの残基４〜１２１、および配列番号６の野生型Ｉ−ＡｎｉＩの残基１３６〜２５４からなる群から選択される第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインと、少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項２に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項６】
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットはそれぞれ、配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９〜１５１、配列番号２の野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基１１〜１６２、配列番号３の野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５〜２１０、配列番号４の野生型Ｉ−ＤｍｏＩの残基９〜９６、配列番号４の野生型Ｉ−ＤｍｏＩの残基１０５〜１７８、配列番号５の野生型Ｉ−ＳｃｅＩの残基３２〜１２３、配列番号５の野生型Ｉ−ＳｃｅＩの残基１３４〜２２５、配列番号６の野生型Ｉ−ＡｎｉＩの残基４〜１２１、および配列番号６の野生型Ｉ−ＡｎｉＩの残基１３６〜２５４からなる群から独立して選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインと、少なくとも８５％の配列同一性を含み、
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインの少なくとも１つは、表１１、１２、１３および１４のいずれかに開示された少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、
請求項２に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項７】
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ−ＣｒｅＩから誘導され、かつ少なくとも一つの修飾が表１１、１２、１３および１４のいずれかの表１から選択され、
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ−ＭｓｏＩから誘導され、かつ少なくとも一つの修飾が表１２から選択され、
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ−ＣｅｕＩから誘導され、かつ少なくとも一つの修飾が表１３から選択され、または
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ−ＳｃｅＩから誘導され、かつ少なくとも一つの修飾が表１４から選択される、
請求項６に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項８】
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットはそれぞれ、配列番号７〜３０からなる群から選択される認識半部位を有する、請求項２に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項９】
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの少なくとも一つは、配列番号７〜３０からなる群から選択される認識半部位を有し、
他の前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、少なくとも一つの塩基対の修飾が、配列番号７〜３０からなる群から選択される認識半部位と異なる認識半部位を有する、
請求項８に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１０】
前記ポリペプチドリンカは、可撓性リンカである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１１】
前記リンカは、１５〜４０個の残基を含む、請求項１０に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１２】
リンカは、２５〜３１個の残基を含む、請求項１０に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１３】
前記リンカの少なくとも５０％は、極性非荷電残基を含む、請求項１０に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１４】
前記ポリペプチドリンカは、安定な二次構造を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１５】
前記安定な二次構造は、少なくとも二つのαへリックス構造を含む、請求項１４に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１６】
前記安定な二次構造は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のループ、第１のαへリックス、第１のターン、第２のαへリックスおよび第２のループを含む、請求項１４に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１７】
前記リンカは、２３〜５６個の残基を含む、請求項１４に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１８】
真核細胞の染色体中に挿入された外因性配列を含有する遺伝子組換え真核細胞を製造する方法であって、
（ｉ）メガヌクレアーゼをエンコードする第１核酸配列と、
（ｉｉ）前記外因性配列を含む第２核酸配列と
を含む一つ以上の核酸を用いて、真核細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体内に切断部位が作られ、該切断部位で前記外因性配列が前記染色体に挿入され、
前記メガヌクレアーゼは、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼである方法。
【請求項１９】
前記第２核酸は、さらに、前記切断部位を挟む配列に相同性のある配列を含み、前記外因性配列は前記切断部位で相同組換えによって挿入される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２核酸は前記切断部位に対し実質的な相同性を欠き、前記外因性配列は非相同的末端結合によって前記染色体に挿入される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
真核細胞の染色体中に挿入された外因性配列を含有する遺伝子組換え真核細胞を製造する方法であって、
メガヌクレアーゼタンパク質を真核細胞に導入することと、
前記外因性配列を含有する核酸を用いて前記真核細胞にトランスフェクトすること
とを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記外因性配列を前記染色体に挿入し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼである、
遺伝子組換え真核細胞を製造する方法。
【請求項２２】
前記核酸は、さらに、前記切断部位を挟む配列に相同性のある配列を含み、前記外因性配列を前記切断部位で相同組換えによって挿入する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸は、前記切断部位に対し実質的な相同性を欠き、前記外因性配列を非相同的末端結合によって前記染色体に挿入する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
真核細胞の染色体中で標的配列を混乱させることによって遺伝子組換え真核細胞を製造する方法であって、
メガヌクレアーゼをエンコードする核酸を用いて真核細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記標的配列を非相同的末端結合によって混乱させ、
前記メガヌクレアーゼは請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼである方法。
【請求項２５】
遺伝子組換え生物を製造する方法であって、
請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法に従って遺伝子組換え真核細胞を製造することと、
前記該遺伝子組換え真核細胞を成長させ、前記遺伝子組換え生物を製造することと
を含む方法。
【請求項２６】
前記真核細胞が、配偶子、接合子、胚盤胞細胞、胚性幹細胞、およびプロトプラスト細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
真核生物宿主において、ウィルス性病原体のゲノム中の標的配列を混乱させた前記ウィルス性病原体を製造する方法であって、
メガヌクレアーゼをエンコードする核酸を用いて前記真核生物宿主の少なくとも一つの感染細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記ウィルス性ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で
非相同的末端結合により前記標的配列を混乱させ、
前記メガヌクレアーゼは請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼである方法。
【請求項２８】
真核生物宿主において、ウィルス性病原体のゲノム中の標的配列を混乱させた前記ウィルス性病原体を製造する方法であって、
メガヌクレアーゼをエンコードする第１核酸および第２核酸を用いて前記真核生物宿主の少なくとも一つの感染細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記ウィルス性ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で前記ウィルス性ゲノムおよび前記第２核酸の相同組換えにより前記標的配列を混乱させ、
前記メガヌクレアーゼは請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼであり、
前記第２核酸は前記切断部位を挟む配列に相同性のある配列を含む方法。
【請求項２９】
真核生物宿主において、原核細胞系病原体のゲノム中の標的配列を混乱させた前記原核細胞系病原体を製造する方法であって、
メガヌクレアーゼをエンコードする核酸を用いて、前記真核生物宿主に感染する前記原核細胞系病原体の少なくとも一つの細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記原核細胞系ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で非相同的末端結合により前記標的配列を混乱させ、
前記メガヌクレアーゼは請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼである方法。
【請求項３０】
真核生物宿主において、原核細胞系病原体のゲノム中の標的配列を混乱させた前記原核細胞系病原体を製造する方法であって、
メガヌクレアーゼをエンコードする第１核酸および第２核酸を用いて、前記真核生物宿主に感染する前記原核細胞系病原体の少なくとも一つの細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記原核細胞系ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で前記原核細胞系ゲノムおよび前記第２核酸の相同組換えにより前記標的配列を混乱させ、
前記メガヌクレアーゼは請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼであり、
前記第２核酸は前記切断部位を挟む配列に相同性のある配列を含む方法。