(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸内細菌確認用のサルモネラ菌検出用培地であって、ペプトン、寒天、硫黄源および鉄源が含まれ、前記サルモネラ菌検出用培地中の重量比が１〜１０％となるように塩化ナトリウムが含浸された濾紙が浸漬されたサルモネラ菌の検出用培地。
【請求項２】
サルモネラ菌検出用培地中の重量比が１〜１０％となるように塩化ナトリウム水溶液を濾紙に含浸させる塩化ナトリウム含有濾紙調整工程と、
ペプトン、寒天、硫黄源および鉄源が含まれる培地に、前記塩化ナトリウム含有濾紙調整工程で調整した塩化ナトリウム含有濾紙を浸漬させる浸漬工程と、
を行うサルモネラ菌検出用培地の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルモネラ菌等培養の過程で硫化水素を産生する細菌を、ＤＨＬ寒天培地等鉄源を有する分離培地で分離し、ＴＳＩ寒天培地その他確認培地を用いてサルモネラ菌を肉眼で判定する技術に関し、更に詳しくは、硫化水素産生を制御し反応を明瞭化する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ菌は、食中毒原因菌の中で最も多く発生する病原体の一つとなっている。
従って、食品の安全性を確保するために、サルモネラ菌の検査方法の改良は常に求められている。サルモネラ菌の検査の重要な点は、硫化水素産生にある。一般に食中毒原因菌はサルモネラ菌をはじめ、多くの細菌が硫化水素を産生する性質を持っている。硫化水素産生は、培地の中に酸化されて赤色を呈している鉄成分が還元されて、黒色を呈することで認められる。ＤＨＬ寒天培地は選択分離培地としてサルモネラ菌など腸内細菌を分離する代表的な培地であり、同培地においては、菌の硫化水素産生をサルモネラ菌検出の基本的な事項としている。現在普及しているＤＨＬ寒天培地には、抗塩菌を増殖させないために塩化ナトリウムが含まれていない。同培地で選択分離したのち、この種の菌の検査は、確認培養にトリシュガ−アイアン（ＴＳＩ）寒天培地を主として用いている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
図２は特許文献１に記載された従来のＴＳＩ寒天培地でサルモネラ菌を３７℃で２４時
間培養した結果を示すものである。サルモネラ菌等を確認する場合、ＴＳＩ寒天培地は、
斜面と高層部の２か所で、菌の培養によって含有されている糖が酸を産生し、培地に含ま
れているＰＨ指示薬が黄変するカラ−チェンジで、細菌を分類する。同培地の場合、培養
後の斜面部および高層部の色で硫化水素産生およびブドウ糖発酵を確認する。培養後のＴ
ＳI寒天培地は、判定基準として、
斜面部  赤→乳糖または白糖を非分解  黄→乳糖または白糖を分解  
高層部  黄→ブドウ糖分解  赤→ブドウ糖非分解  黒変→硫化水素産生  泡→ガス産生という判定結果を構成している。
ちなみに、サルモネラ菌の場合は、斜面部が赤で、高層部が黄色でかつ硫化水素の産生により黒変が認められる。
【０００４】
一方、同培地の成分であるクエン酸鉄アンモニウム培地中のチオ硫酸ナトリウムが分解されると培地中にＳ（硫黄）が放出される。その硫黄とクエン酸鉄の鉄が反応（Ｓ＋Ｆｅ→ＦｅＳ）して硫化鉄ができる。この硫化鉄は黒色をしているので、目視で硫化水素産生菌の判別が可能になる。現実に市販されているＴＳＩ寒天培地は１L当たり５ｇ（重量比０．５％）の塩化ナトリウムを含有している。また、同じく確認培養の為の培地として硫化水素産生を確かめるためにＳＩＭ寒天培地を使用しているものもある（非特許文献１参照）。
なお、出願人自身は、発明者として、サルモネラ菌等の細菌が、分離培地であるＤＨＬ寒天培地で培養する際にアスコルビン酸等の柑橘デバイスによって硫化水素産生を促進されることを発見している（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００６−２０６２９号公報
【特許文献２】特許第４４２７６３４号公報
【非特許文献１】森地敏樹著「食品微生物検査マニュアル」栄研化学、２００２年６月P．１８０−１８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来のＴＳＩ寒天培地では、例えばサルモネラ菌では、菌の代謝物である硫化水素の産生があまりにも著しい。図２は、本発明の実施例１における従来の方法にてＴＳＩ寒天培地で培養されたサルモネラ菌の図である。図２のように、高層部の色が硫化水素で鉄分を還元したことによって産生された過剰の硫化鉄のために高層部全体が黒変し、特に培養後の高層部の色が赤色（陰性）なのか黄色（陽性）なのかを十分に肉眼で判定できないという課題を有していた。
同時に、サルモネラ菌と他の硫化水素産生する菌とを区別することは、ＴＳＩ寒天培地のみでは不可能とされていた。
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、ブドウ糖発酵を確認するためには、硫化水素産生を抑制して、培地のカラ−チェンジを見やすくする必要があるが、具体的にはＴＳＩ寒天培地の食塩濃度を増加させることで、これを可能とする技術を提供することを目的とする。同時に、食塩の添加されたＴＳＩ寒天培地を用いて、サルモネラ菌と他の菌の塩分濃度による硫化水素産生の違いを利用することで、硫化水素産生を抑制する濃度と菌の増殖を抑制する濃度とを確認し、菌種を推定することを可能にして、課題解決につなげる技術および新しい菌同定基準を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のサルモネラ菌検出用培地は、少なくともペプトン、寒天、硫黄源および鉄源を含み、腸内細菌分離や、腸内細菌確認に用いられる周知の腸内細菌用検出培地に、塩化ナトリウムを加えて作成するサルモネラ菌検出用培地である。サルモネラ菌検出用培地に塩化ナトリウムを加えることで、サルモネラ菌を増殖させつつ、過剰な硫化水素の産生を抑制することができる。
【０００７】
本発明は、サルモネラ菌の検出用選択分離培地であって、ＤＨＬ培地（塩化ナトリウムは含有しない）に加える塩化ナトリウム濃度を０．１ｇ／L〜７ｇ／Lにして作成する腸内細菌の分離に用いられるサルモネラ菌の検出用選択分離培地の発明である。これによりサルモネラ菌の増殖が適正範囲にコントロ−ルされ、過剰な硫化水素の産生を抑制することができる。
【０００８】
本発明は、サルモネラ菌確認用培地であって、ＴＳＩ寒天培地（０．５％の塩化ナトリウムを含んでいる）に、塩化ナトリウムを加え、塩化ナトリウム濃度が０．１ｇ／L〜７ｇ／Lになるようしたものである。これによりサルモネラ菌の増殖が適正範囲にコントロ−ルされ、過剰な硫化水素の産生を抑制することができる。
【０００９】
本発明は、前記サルモネラ菌検出用培地であって、ペプトン、寒天、硫黄源および鉄源が含まれる周知の腸内細菌用検出培地に、該サルモネラ菌検出用培地中の重量比が１〜１０％となるように塩化ナトリウムを含浸させた濾紙を浸漬して作られる。即ち、市販されている従来の０．５％塩化ナトリウム含有のＴＳＩ寒天培地３mlに対して０．０７５ｇ塩化ナトリウムを含ませた濾紙を浸漬することで、ＴＳＩ寒天培地に２．５％塩化ナトリウム含有と同等の効果を発現させることが可能となり、濾紙に含浸された塩化ナトリウムの効果により、サルモネラ菌の増殖が適正範囲にコントロ−ルされ、過剰な硫化水素の産生を抑制することができる。
【００１０】
一般にサルモネラ菌に限らず、細菌は塩分濃度が高い環境では増殖せず、死滅することは既に明らかになっている。食品を保存するために、塩漬けなどの高塩分環境下で、細菌を殺菌することを利用する手段は古代からあった。サルモネラ菌も例外でなく、例えば９％以上の塩分濃度の下では、菌は増殖が阻止される。ただし、サルモネラ菌の場合、培地に塩分を添加すると、菌の増殖に先立ち、硫化水素産生が減少することを本発明者は発見した。これによって、現行０．５％の塩化ナトリウム濃度のＴＳＩ寒天培地では、培養後培地全体が黒変していたものが、塩分濃度を増加させることで培地の一部だけが黒変するにとどまり、培養後の培地の色が赤色であるか、黄色であるかを鑑別することを可能にした。また、本発明の特徴は、菌を殺さずに、サルモネラ菌の硫化水素産生のみを抑制する塩分濃度となるように培地に加える食塩の量を調整した点にある。菌による硫化水素産生が確認されない塩分濃度がサルモネラ菌と、例えばシトロバクタとでは異なる性質を利用して、新たな菌の分類基準とすることができる。
【００１１】
さらに、現行のＴＳＩ寒天培地に塩化ナトリウムを濾紙に含ませたものを加えて、高温高圧滅菌することで、培地の水溶液に２．５％の塩化ナトリウムを含ませた場合と同様の効果を発現させることが可能になった。
【発明の効果】
【００１２】
以上説明したように、本発明は、サルモネラ菌の硫化水素産生を、選択分離培地および確認培地に塩化ナトリウムを加えて制御するものである。選択培地に、主としてＤＨＬ寒天培地またはその他市販されている硫化水素産生を検出するための鉄源を含む培地を用いているが、もともと塩化ナトリウムが加えられていない本培地の塩化ナトリウム濃度を２％とすることで、菌を増殖させつつ、硫化水素の発生のみを阻止することを可能とした。本来、人体に有害とされている硫化水素産生が、塩化ナトリウムの添加によって抑制される効果もこれにより明らかになった。
【００１３】
本発明で用いる確認培地とは、主としてＴＳＩ寒天培地または、硫化水素産生を検出するために鉄源を含む培地、その他菌の硫化水素産生をモニタ−する培地など、全ての培地を含む。ＴＳＩ寒天培地等の確認培地における、黒濁の原因となる硫化水素産生を抑えることで、細菌の糖分解反応を、確実に肉眼で判定する手段を提供することができる。しかも、本発明技術は、従来のＴＳＩ寒天培地などに含まれている塩化ナトリウム量を増やすだけで検査精度の向上を図った技術であり、コストを現状に維持したまま、検査精度を大きく向上させた細菌検査用として極めて有用な発明と言える。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＤＨＬ培地にクエン酸ディスクペ−パ−を置きサルモネラ菌を培養したものである。
【図２】実施例１における従来の方法にてＴＳＩ寒天培地で培養されたサルモネラ菌
【図３】実施例２の実験結果
【図４】実施例３の実験結果
【図５】実施例４の実験結果
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００１５】
図１は、ＤＨＬ寒天培地サルモネラ菌を接種し、中心にクエン酸ディスクペ−パ−を置き、３７℃で２４時間培養したものである。
図左は、本発明の請求項１に記載される「周知の腸内細菌用検出培地」であって、塩化ナトリウムの添加されていないＤＨＬ寒天培地の中央に柑橘抽出ディスクとしてクエン酸を含有した濾紙を置き、２４時間培養して生じたミドリング（黒環をこう呼ぶ）である。
図右は、同ＤＨＬ寒天培地に水溶液濃度にして２％となるように塩化ナトリウムを加え、ミドリングの発現を抑制したものである。
クエン酸によって左側シャ−レでは、硫化水素産生が促進され、硫化鉄のミドリング（黒環をこう呼ぶ）が形成された。同右側は、本来、塩化ナトリウムが含まれていないＤＨＬ寒天培地に２％濃度になるよう塩化ナトリウムを加えたもので、同様にクエン酸ディスクペ−パ−を置き、３７℃で２４時間培養したものである。塩化ナトリウム添加によって、菌は増殖したもののミドリングは形成されず硫化水素の産生が完全に抑えられたことを示す結果となった。
これによって、細菌の産生する有害な硫化水素は、食塩の添加でもって減量できることが示された。
【実施例２】
【００１６】
サルモネラ菌をスクリ−ニングする寒天培地としてＴＳＩ寒天培地を使用した。ＴＳＩ寒天培地は、通常０．５％含む塩化ナトリウムを２．５ないし３％まで増加させた。ＤＨＬ寒天培地で分離したサルモネラ菌のコロニ−をエ−ゼに釣菌し、ＴＳＩ寒天培地の斜面部と、高層部に菌を接種した。これを３７℃で２４時間培養した。
図３上は本発明の実施例２における本発明によって高層部が黄色であることが判明した状況を示すものであり、図３下は塩化ナトリウム濃度を左から、０．５％、
２．５％、３．０％に増加させた培養後の状況を示す。
培養２４時間後、ＴＳＩ寒天培地は、図３下の右二つ（左から、０．５％、２．５％および３％塩化ナトリウム含有ＴＳＩ寒天培地）のように高層部の黄色と硫化鉄による黒変を認めた。増加した塩分濃度が、硫化鉄の形成を抑え、この結果、高層部の色の変化を判定することが可能となった。
【００１７】
以上のように、本実施の形態において塩分濃度を現行の０．５％から２．５％ないし３％とすることにより、サルモネラ菌等細菌の硫化水素産生を、塩分添加で抑制することとなり、ＴＳＩ寒天等の確認培地で、細菌の糖分解反応を確実に判定することを可能にできた。
また、本実施の形態では塩分濃度を３％としたことにより、ビブリオなどの塩分濃度を必要とする菌にとっては好適環境となり、ビブリオの培養を容易にすることもできる。
また、ＴＳＩ寒天培地をクリグラ−寒天培地やＳＩＭ寒天培地とすることにより、特に、高められた塩分がサルモネラ菌等細菌の硫化水素産生を、塩分添加で抑制することとなり、ＳＩＭ寒天培地をはじめとするＴＳＩ寒天培地以外の確認培地で、硫化水素産生を抑えることで、細菌の糖分解反応を確実に判定することができる。
【実施例３】
【００１８】
ＴＳＩ寒天培地に含まれる塩化ナトリウム濃度を現行０．５％から１％、１．５％…５％、５．５％と段階的に引き上げていき、それぞれにサルモネラ菌を接種した。同様に、硫化水素を産生するシトロバクタも接種した。図４のようにサルモネラ菌の場合は、塩化ナトリウム濃度３％で硫化水素の産生が抑制されはじめ、高層部の黄色が鮮やかに目視できるようになった。さらに、４．５％塩化ナトリウム含有培地で、硫化水素の産生を認めなくなった。一方、シトロバクタの場合、３％塩化ナトリウム含有の培地でも、もともとの０．５％塩化ナトリウムの場合と同様の硫化水素産生を認め、硫化水素産生が抑制され始めたのは、塩化ナトリウム濃度が４％を超えてからであった。
【００１９】
サルモネラ菌では、現行のＴＳＩ寒天培地の濃度を０．５％から段階的に０．５％ずつ引き上げていと、２４時間後の硫化水素産生が徐々に抑制され、濃度４％で硫化水素産生が認められなくなる。これに対し、シトロバクタでは、硫化水素の産生を認めなくなるのが５％以上の塩分濃度となる。
以上のように、現行のＴＳＩ寒天培地の塩分濃度を上げることで、サルモネラ菌とシトロバクタの硫化水素産生の有無によって両菌種を区別することとなり、現行のＴＳＩ寒天培地では、サルモネラ菌とシトロバクタは、同じ反応を培養後に示すが、塩分濃度を現行０．５％から３〜５％濃度に引き上げることで、サルモネラ菌と他の菌で区別を可能とすることができる。
【００２０】
また、本実施の形態ではＴＳＩ寒天培地以外（例えば図６に示すＳＩＭ培地）でも塩分濃度を上げることで、サルモネラ菌とサルモネラ菌以外の菌とを硫化水素産生の有無によって両菌種を区別することもできる。
図６は本発明の実施例１におけるＴＳＩ以外の培地であるＳＩＭ寒天培地を用いた場合実験結果である。サルモネラ菌は、２．５％塩化ナトリウムの存在で硫化水素産生が阻害され初め３％でほぼ完全に硫化水素産生がなくなっている。
【実施例４】
【００２１】
厚さ１．１mm直径６mmの円形濾紙に、１００ml当たり３．０ｇの塩化ナトリウムを溶解させた水溶液３０μlを吸収させ、その後に水分を蒸発させた。市販のＴＳＩ寒天培地粉末を１L当たり３５ｇ加熱溶解させたものを３ml試験管に分注し、上記の塩分を含ませた濾紙を一枚加え、１２１℃で高圧・高温で滅菌した。この紙濾紙を添加したＴＳＩ寒天培地にサルモネラ菌を接種し、２４時間培養した。
【００２２】
図５は塩化ナトリウム含有濾紙（培地真ん中に白く見える）を入れたＴＳＩ寒天培地にサルモネラ菌を接種した２４時間後の状況である。２．５％塩化ナトリウム水溶液濃度のＴＳＩ寒天培地と同様の効果が認められた。
即ち、培地は、硫化水素産生による硫化鉄で培地の斜面が黒変したものの、高層部は、サルモネラ菌による酸の産生を示す黄色を呈した。塩分を含んだ濾紙を添加することで、２．５％の塩化ナトリウムを含んだＴＳＩ寒天培地と同じ効果を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
以上のように、本発明の特徴は、主としてサルモネラ等の細菌における硫化水素産生を、塩化ナトリウムで阻害することである。有害な硫化水素を細菌が産生するのを食塩で阻害することは、産業上利用できる知見である。本発明の目的は、塩化ナトリウムの硫化水素産生を抑制する作用を利用してサルモネラの分離を行うことである。ＴＳＩ寒天等の培地で、食塩によって培養後の硫化水素産生を抑えることで、細菌の糖分解反応を確実に判定することが可能となる。現在、メ−カ−によって市販されているＴＳＩ寒天培地は、０，５％の塩濃度になるように塩化ナトリウムが添加されているもののみである。３％の塩化ナトリウムが加えられたＴＳＩ寒天培地を商品化すれば、サルモネラの検査に役立つのみならず、腸炎ビブリオなどの３％塩化ナトリウムを含む海水に適応した好塩菌を検査する場合も、現行の０．５％のもの以上に菌の発育を促す利点もあるので、例えば、３％食塩添加サルモネラ、好塩菌検査用培地と命名して、細菌を検出する培地としての販売が可能である。
【００２４】
細菌の硫化水素を産生する好適塩化ナトリウム濃度の違い、例えば、０％から１０％まで段階的に食塩の濃度に勾配をつけて、０％、０．５％、１％、・・・・１０％といった具合にセット販売することで、硫化水素産生可能濃度を求めて、菌の同定・スクリ−ニングに役立てる用途にも適用できる。
ＤＨＬ培地に塩化ナトリウムを添加して、菌の硫化水素産生を阻害することで菌の検査に応用することが可能となる。
本発明を提供できる具体的産業は、食肉処理、食品加工、集団給食施設、病院等である。
細菌が産生する有害な硫化水素を塩化ナトリウムの添加、または増量で阻害する効果は、環境産業にも役立つ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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