(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＤ−１２ダイズイベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６を含むダイズ植物のイベントの接合性を決定するための方法であって、前記イベントが配列番号１の残基２７３１〜９１２１からなる導入遺伝子構築物を含み、前記導入遺伝子構築物に配列番号１の残基１〜２７３０残基を含む５’隣接ダイズゲノムＤＮＡおよび配列番号１の残基９１２２〜１０，２１２を含む３’隣接ダイズゲノムＤＮＡが隣接しており、前記方法が、
前記ダイズ植物からゲノムＤＮＡのＤＮＡ試料を得るステップと；
前記ＤＮＡ試料を、
ａ．第１のイベントプライマーおよび第２のイベントプライマーであって、前記第１のイベントプライマーが前記導入遺伝子構築物に特異的に結合し、前記第２のイベントプライマーが前記５’ダイズゲノム隣接ＤＮＡまたは前記３’ダイズゲノム隣接ＤＮＡに特異的に結合し、前記第１のイベントプライマーおよび前記第２のイベントプライマーが、ＴＡＱＭＡＮ(登録商標)  ＰＣＲ条件に供されるとイベントアンプリコンを生成する、第１のイベントプライマーおよび第２のイベントプライマー、
ｂ．ＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供されると内在性ダイズ参照遺伝子から参照アンプリコンを生成する参照フォワードプライマーおよび参照リバースプライマー、
ｃ．前記イベントアンプリコンとハイブリダイズする蛍光イベントプローブ、
ｄ．前記参照アンプリコンとハイブリダイズする蛍光参照プローブ
と接触させることによって、接触した試料を生成するステップと；
前記接触した試料を蛍光に基づくエンドポイントＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供するステップと；
前記イベントアンプリコンとハイブリダイズした前記蛍光イベントプローブを定量化するステップと；
前記参照アンプリコンとハイブリダイズした前記蛍光参照プローブを定量化するステップと；
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブの量をハイブリダイズした蛍光参照プローブの量と比較するステップと；
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの蛍光比を比較することによってｐＤＡＢ４４６８−０４１６の接合性を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記アンプリコンが、５０〜１５０残基からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記参照遺伝子が内在性ダイズレクチン遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のイベントプライマーが、配列番号１の残基２５３０〜２７３０またはその相補物に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２のイベントプライマーが、配列番号１の残基９１２２〜９３２２に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記イベントを別のダイズ系統へ育種により遺伝子移入するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記別のダイズ系統が前記イベントを欠く、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アンプリコンが、１００〜２００塩基対からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記参照遺伝子が、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される配列を含む、またはそれとハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記参照プライマーが配列番号５および配列番号６を含み、前記参照プローブが配列番号７を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブが、蛍光色素およびクエンチャーで標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記イベントプローブが、前記イベントプローブの５’末端に前記蛍光色素としてのＦＡＭ、および前記イベントプローブの３’末端にＭＧＢクエンチャーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記参照プローブが、前記参照プローブの５’末端においてＨＥＸで、および前記参照プローブの３’末端においてＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １（ＢＨＱ１）で標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記イベントプローブが配列番号４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記イベントプライマーが、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法の結果が、プレートリーダーにおいて直接読み取られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ試料が、野外のダイズ植物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法を実行するためのキットであって、前記第１のイベントプライマー、前記第２のイベントプライマー、前記参照フォワードプライマー、前記参照リバースプライマー、前記イベントプローブ、および前記参照プローブを含むキット。
【請求項１９】
前記イベントプライマーが配列番号２および配列番号３からなり、前記参照プライマーが配列番号５および配列番号６からなり、前記イベントプローブが配列番号４からなり、前記参照プローブが配列番号７からなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＡＤ−１２ダイズイベントを検出する方法に一部関連する。
【背景技術】
【０００２】
ａａｄ−１２遺伝子（もともとはデルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）由来）は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質をコードする。この形質により、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に対する耐性、およびピリジルオキシ酢酸除草剤に対する耐性が付与される。ａａｄ−１２遺伝子自体は、植物における除草剤耐性について、ＷＯ２００７／０５３４８２に最初に開示された。
【０００３】
植物における異種遺伝子または外来遺伝子の発現は、その外来遺伝子が染色体のどこに挿入されたかに影響される。これは、例えば、クロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）のため、または組み込み部位に近い転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近傍にあるためである可能性がある（Weisingら、Ann. Rev. Genet 22巻:421〜477頁、1988年）。同じ種類のトランスジェニック植物（または他の生物体）における同じ遺伝子が、異なるイベント（events）間で発現レベルの広範な変動を示すことがある。発現の空間パターンまたは時間パターンにも差があることがある。例えば、種々の植物組織における導入遺伝子の相対的な発現量の差は、導入される遺伝子構築物中に存在する転写調節エレメントから予測されるパターンに対応しない可能性がある。
【０００４】
したがって、多くの場合、所与の目的ために申し分のないレベルまで対象の導入された遺伝子を発現するイベント（an event）を特定するために、多数のイベントを創出し、スクリーニングする。商業目的のために、何百から何千もの異なるイベントを作出し、それらのイベントを、導入遺伝子の所望の発現レベルおよび発現パターンを有する単一のイベントについてスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子の発現の所望のレベルおよび／またはパターンを有するイベントは、従来の育種方法を使用して、有性異系交雑によって導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するために有用である。そのような交雑の後代は、元の形質転換体の導入遺伝子の発現特性を維持する。この戦略を使用して、その土地の生長条件によく適合する多数の品種における信頼性の高い遺伝子発現を確実にする。
【０００５】
植物組織の試料中のイベントの存在を検出するために、種々の先行技術の方法を使用することができる。１つの例は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00巻:18〜24頁、2000年）に記載されているようなパイロシークエンス技法である。この方法では、近接するゲノムＤＮＡおよび挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象の領域由来の一本鎖のＰＣＲ産物（挿入配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個々に加え、それが取り込まれた結果、測定される光信号がもたらされる。光信号は、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基または多塩基の伸長の成功によって、導入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することを示す。（この技法は、通常、最初の配列決定のために使用され、特定の遺伝子が既知である場合、それを検出するためには使用されない）。
【０００６】
蛍光偏光は、アンプリコンを検出するために使用することができる別の方法である。この方法に従って、オリゴヌクレオチドを、ゲノムの隣接ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするように設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象の領域由来の一本鎖のＰＣＲ産物（挿入ＤＮＡ内の１つのプライマーおよび隣接ゲノムＤＮＡ配列内の１つのプライマー）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識したｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長は、ｄｄＮＴＰの取り込みをもたらす。取り込みは、蛍光光度計を使用して偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長の成功によって、導入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することを示す。
【０００７】
配列の検出において使用するための分子ビーコンが記載されている。簡単に述べると、隣接ゲノムＤＮＡおよび挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブの特有の構造により、ＦＲＥＴプローブは蛍光部分およびクエンチング部分を極めて近傍に保つ二次構造を含有する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。ＰＣＲ増幅の成功後、ＦＲＥＴプローブが標的配列とハイブリダイズすることにより、プローブの二次構造が除去され、蛍光部分およびクエンチング部分が空間的に分離される。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、隣接ゲノム配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
【０００８】
別名ＴＡＱＭＡＮ(登録商標)（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）として公知の加水分解プローブアッセイは、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法である。簡単に述べると、イベント特異的な検出のために、導入遺伝子内部の１つのオリゴおよび隣接ゲノム配列内の１つのオリゴを用いてＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。ＦＲＥＴプローブがハイブリダイズすることにより、蛍光部分が、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分から離れて切断され、放出される。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、隣接配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
【０００９】
別の課題は、多くのものの中でも、所与の試験のための適切な参照遺伝子を見出すことである。例えば、Czechowskiらの要約に明示されているように、「Affymetrix ATH1全ゲノムGeneChip研究による非常に大きなデータセットは、モデル植物種シロイヌナズナ属（Arabidopsis）(シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）)において非常に安定した発現レベルを有する新世代の参照遺伝子を特定する手段を提供した。数百のシロイヌナズナ属遺伝子が、様々な環境条件下での生育を通した発現安定性に関して、伝統的な参照遺伝子よりも優れていることが見出された。」(Czechowskiら(2005年)Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139巻、5〜17頁)。
【００１０】
Brodmannら（2002年）は、欧州連合において認可されている４つの異なるトウモロコシ品種について、食物中のトランスジェニックトウモロコシの含有量をリアルタイム定量的ＰＣＲによって検出することに関する。Brodmann, P.D., P.D., Ilg E.C.、Berthoud H.、およびHerrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002年 85巻(3)
【００１１】
Hernandezら（2004年）は、リアルタイムＰＣＲと一緒に使用するための４つの可能性のある遺伝子について言及している。Hernandez,M.、Duplan,M.-N.、Berthier,G.、Vaitilingom,M.、Hauser,W.、Freyer,R.、Pla,M.、およびBertheau,Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J. Agric. Food Chem. 2004年、52巻、4632〜4637頁。
【００１２】
Costaら（2007年）は、これらの４つの遺伝子について（リアルタイムＰＣＲの状況においても）考察し、トランスジェニック食料混合問題について、試料の「イベント」（レクチン遺伝子）を検出するための最良の参照遺伝子はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびゼイン遺伝子であると結論付けた。Costa,L. D.、およびMartinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007年、55巻、1264〜1273頁。
【００１３】
Huangら（2004年）は、トウモロコシにおいてＭＯＮ８１０導入遺伝子およびＮＫ６０３導入遺伝子を検出するための参照分子としてプラスミドｐＭｕｌＭ２を使用した。HuangおよびPan、「Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods」、J. Agric. Food Chem.、2004年、52巻(11号)、3264〜3268頁。
【００１４】
Gasparicら（2008年）は、トウモロコシイベント（ＭＯＮ８１０など）を定量的に分析するために、サイクリングプローブ技術、ＴａｑＭａｎ、および種々のリアルタイムＰＣＲ化学との比較から、ＬＮＡ技術を提案した。Gasparic、Cankar、ZelおよびGruden、「Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms」、BMC Biotechnol. 2008年; 8巻: 26頁。
【００１５】
ＵＳ２００７０１４８６４６は、取り込まれたヌクレオチドの量によって検出および定量することができる個々のヌクレオチドの制御された分配を必要とする、定量のためのプライマー伸長法に関する。これは、内部の参照遺伝子を使用するＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法とは異なる。
【００１６】
ＴＣ１５０７のホモ接合遺伝子型と半接合遺伝子型とを区別するために、このイベントに対してインベーダーアッセイが使用され成功している。Gupta,M.、Nirunsuksiri,W.、Schulenberg,G.、Hartl,T.、Novak,S.、Bryan,J.、Vanopdorp,N.、Bing,J.およびThompson,S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding  2008年、21巻、173〜181頁。
【００１７】
Huabang（2009年）は、トランスジェニックトウモロコシについてのＰＣＲに基づく接合性試験に関する。しかし、参照遺伝子は使用されていないようである。Huabang、「An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize」Molecular Plant Breeding、2009年、7巻、3号、619〜623頁。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２で寄託された種子を有するＤＡＳ−６８４１６−４と称されるＡＡＤ−１２ダイズ（ダイズ（Glycine max））イベントを検出する方法に一部関連する。
【００１９】
より詳細には、本発明は、ＡＡＤ−１２ダイズイベントについてのエンドポイントＴａｑＭａｎ  ＰＣＲアッセイに一部関する。一部の実施形態は、ハイスループットな接合性分析をすることができるアッセイを対象とする。本発明は、さらに、接合性の決定において使用するための好ましいレクチン参照遺伝子の発見に一部関する。これらおよび他の関連する手順を使用して、本発明のイベントを含むダイズ系統を独自に特定することができる。
【００２０】
本発明は、本主題の方法のいずれかを使用する植物育種にも一部関する。一部の実施形態では、前記イベント／ポリヌクレオチド配列に、例えば、他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫抑制タンパク質を含めた他の形質を「積み重ねる」ことができる。しかし、本発明は、本明細書に記載の通り、単一のイベントを有する植物を包含する。
【００２１】
さらに、本発明は、試料（例えば、ダイズの）中の対象イベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。アッセイの実施において有用なキットおよび条件も提供される。
本発明は、以下を提供する。
［１］ＡＡＤ−１２ダイズイベントｐＤＡＢ４４６８−０４１６を含むダイズ植物のイベントの接合性を決定するための方法であって、上記イベントがＡＡＤ−１２遺伝子を含む導入遺伝子構築物を含み、上記導入遺伝子構築物に５’隣接ダイズゲノムＤＮＡおよび３’隣接ダイズゲノムＤＮＡが隣接しており、上記方法が、
上記ダイズ植物からゲノムＤＮＡのＤＮＡ試料を得るステップと；
上記ＤＮＡ試料を、
ａ．第１のイベントプライマーおよび第２のイベントプライマーであって、上記第１のイベントプライマーが上記導入遺伝子構築物に特異的に結合し、上記第２のイベントプライマーが上記５’ダイズゲノム隣接ＤＮＡまたは上記３’ダイズゲノム隣接ＤＮＡに特異的に結合し、上記第１のイベントプライマーおよび上記第２のイベントプライマーが、ＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供されるとイベントアンプリコンを生成する、第１のイベントプライマーおよび第２のイベントプライマー、
ｂ．ＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供されると内在性ダイズ参照遺伝子から参照アンプリコンを生成する参照フォワードプライマーおよび参照リバースプライマー、
ｃ．上記イベントアンプリコンとハイブリダイズする蛍光イベントプローブ、
ｄ．上記参照アンプリコンとハイブリダイズする蛍光参照プローブ
と接触させることによって、接触した試料を生成するステップと；
上記接触した試料を蛍光に基づくエンドポイントＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供するステップと；
上記イベントアンプリコンとハイブリダイズした上記蛍光イベントプローブを定量化するステップと；
上記参照アンプリコンとハイブリダイズした上記蛍光参照プローブを定量化するステップと；
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブの量をハイブリダイズした蛍光参照プローブの量と比較するステップと；
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの蛍光比を比較することによってｐＤＡＢ４４６８−０４１６の接合性を決定するステップと
を含む方法。
［２］上記アンプリコンが、５０〜１５０残基からなる、上記［１］に記載の方法。
［３］上記５’隣接ＤＮＡが配列番号１の残基１〜２７３０を含み、上記３’隣接ＤＮＡが配列番号１の９１２２〜１０，２１２を含む、上記［１］に記載の方法。
［４］上記導入遺伝子構築物が、配列番号１の残基２７３１〜９１２１からなる、上記［１］に記載の方法。
［５］上記参照遺伝子が内在性ダイズレクチン遺伝子である、上記［１］に記載の方法。
［６］上記第２のイベントプライマーが、配列番号１の残基２５３０〜２７３０またはその相補物に結合する、上記［１］に記載の方法。
［７］上記第２のイベントプライマーが、配列番号１の残基９１２２〜９３２２に結合する、上記［１］に記載の方法。
［８］上記イベントを別のダイズ系統へ育種により遺伝子移入するために使用される、上記［１］に記載の方法。
［９］上記別のダイズ系統が上記イベントを欠く、上記［８］に記載の方法。
［１０］上記アンプリコンが、１００〜２００塩基対からなる、上記［１］に記載の方法。
［１１］上記参照遺伝子が、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される配列を含む、またはそれとハイブリダイズする、上記［１］に記載の方法。
［１２］上記参照プライマーが配列番号５および配列番号６を含み、上記参照プローブが配列番号７を含む、上記［１］に記載の方法。
［１３］上記プローブが、蛍光色素およびクエンチャーで標識されている、上記［１］に記載の方法。
［１４］上記イベントプローブが、上記イベントプローブの５’末端に上記蛍光色素としてのＦＡＭ、および上記イベントプローブの３’末端にＭＧＢクエンチャーを含む、上記［１３］に記載の方法。
［１５］上記参照プローブが、上記参照プローブの５’末端においてＨＥＸで、および上記参照プローブの３’末端においてＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １（ＢＨＱ１）で標識されている、上記［１３］に記載の方法。
［１６］上記イベントプローブが配列番号４を含む、上記［１］に記載の方法。
［１７］上記イベントプライマーが、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される、上記［１］に記載の方法。
［１８］上記方法の結果が、プレートリーダーにおいて直接読み取られる、上記［１］に記載の方法。
［１９］上記ＤＮＡ試料が、野外のダイズ植物から得られる、上記［１］に記載の方法。
［２０］上記［１］に記載の方法を実行するためのキットであって、上記第１のイベントプライマー、上記第２のイベントプライマー、上記参照フォワードプライマー、上記参照リバースプライマー、上記イベントプローブ、および上記参照プローブを含むキット。
［２１］上記イベントプライマーが配列番号２および配列番号３からなり、上記参照プライマーが配列番号５および配列番号６からなり、上記イベントプローブが配列番号４からなり、上記参照プローブが配列番号７からなる、上記［２０］に記載のキット。
［２２］配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４のゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＶまたはＰｖｕＩＩを用いて消化し、それを使用して対応するＧＥＮＯＭＥＷＡＬＫＥＲ（商標）ライブラリーを作製したことを示す図であり、これを、標的ＤＮＡ配列を増幅するために鋳型として使用した。
【図２】ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を５’端から３’端まで全長配列決定するためのプライマーの位置およびクローニング戦略を示す概略図である。
【図３】ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の全長配列を５’端から３’端まで確認するためのプライマーの位置を示す概略図である。
【図４】ＡＡＤ−１２ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の挿入部位の配列を確認するためのプライマーの位置を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＡＡＤ−１２挿入断片のどちらか側の５’ゲノム隣接配列および３’ゲノム隣接配列の配列を、挿入断片を含めて示す。隣接配列に下線が引かれている。
【００２４】
配列番号２〜７は、本発明に従って使用するためのプライマーおよびプローブの配列を示す。
【００２５】
トランスジェニックＡＡＤ−１２（除草剤耐性をもたらす）ダイズイベントｐＤＡＢ４４６８−４１６を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換によって作製した。このＡＡＤ−１２導入遺伝子挿入断片の５’および３’両末端隣接配列を、ＵＳＳＮ６１／２６３，９５０（２００９年１１月２４日出願）において詳述されている通りクローニングし、配列決定し、特徴付けた。一部の特定の実施形態では、ＡＡＤ−１２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０４４２で寄託された種子を有するＤＡＳ−６８４１６−４と称されるイベント、およびそれから生じる後代としてダイズに存在する。２００９年１０月２２日のブダペスト条約に従って２５００の種子が寄託された。この寄託物は２００９年１１月２日に試験され、同日に種子は発芽可能であった。
【００２６】
特異的なＴＡＱＭＡＮプライマーおよびプローブを、本明細書において詳述されている通り、導入遺伝子と宿主ゲノムＤＮＡとの間の接合領域に位置するＤＮＡ配列に一部従って設計した。プライマーおよびプローブのイベント特異性を、異なるＡＡＤ−１２ダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種であるＭａｖｅｒｉｃｋに対するリアルタイムＰＣＲにおいて、ダイズレクチンを参照遺伝子として用いて２連形式で試験するのに成功した。ＡＡＤ−１２ダイズイベントについてのイベント特異的なエンドポイントＴＡＱＭＡＮアッセイの手順を本明細書において詳述されている通り開発した。
【００２７】
このＡＡＤ−１２ダイズイベントにおける、宿主植物のＤＮＡと組み込まれた遺伝子構築物との間の組み込み接合部の領域にわたる配列は、特有の配列である。これを、ＧＭＯ試験のためにイベント特異的なアッセイ（従来のＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ）を開発してＡＡＤ−１２ダイズイベントｐＤＡＢ４４６８−４１６の存在を検出するために、および育種集団における植物の接合状態を決定するために使用した。本明細書において報告されているイベント特異的なＴＡＱＭＡＮアッセイは、どちらの適用のためにも用いることができる。
【００２８】
本発明は、試料中のトランスジェニックダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の存在を検出するためのアッセイを提供する。本発明の態様は、本明細書において例証または提案される任意の特徴的核酸分子を設計および／または作出する方法を包含する。このイベントを含む植物系統は、本明細書において開示され、提案されている配列を使用して検出することができる。
【００２９】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、除草剤耐性ダイズ系統の特定に関する。本発明は、有性交雑の後代が対象のイベントを含有するかどうかを決定するために対象イベントの存在を検出することに一部関する。さらに、イベントを検出するための方法が包含され、これは、例えば、組換え作物植物に由来する食物の市販前承認および表示を必要とする規制を遵守するために役立つ。
【００３０】
より詳細には、イベントは、ｐＤＡＢ４４６８−０４１６とも称されるＡＡＤ−１２イベントである。本発明は、世代間にわたる植物全体および分子レベルでの安定性および発現についてのその選択および特徴付けのために使用することができる。
【００３１】
本発明に従って使用される対象の合成遺伝子（ａａｄ−１２）は、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）に由来し、フェノキシオーキシン（例えば、２，４−Ｄ、ＭＣＰＡ）、ならびにピリジルオキシオーキシン（例えば、フルロキシピル、トリクロピル）を含めたアリールオキシアルカノエート部分を持ついくつかの除草剤を不活性化することができる酵素をコードする。ａｔＵｂｉ１０プロモーターに駆動されるａａｄ−１２遺伝子を、ダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）法によって導入した。
【００３２】
本発明は、ＡＡＤ−１２ダイズイベントのハイスループットな接合性分析のための、内在性遺伝子を参照（コピー数）対照として利用する蛍光に基づくエンドポイントＴａｑＭａｎ  ＰＣＲアッセイに一部関する。本発明は、さらに、好ましい参照遺伝子であるインベルターゼの発見に一部関する。いくつかの参照遺伝子が、可能性のある選択肢として特定された。
【００３３】
本発明は、ＡＡＤ−１２ダイズイベントに特異的な接合性分析のためのバイプレックス（biplex）エンドポイントＴａｑＭａｎ  ＰＣＲの開発にも一部関する。さらに、本発明は、ＡＡＤ−１２育種試験キットの開発に一部関する。
【００３４】
エンドポイントＴａｑＭａｎアッセイは、「プラス」が、その試料がアッセイした遺伝子について陽性であることを示し、「マイナス」が、その試料がアッセイした遺伝子について陰性であることを示すプラス／マイナス戦略に基づく。これらのアッセイは、一般には、それぞれＡＡＤ−１２導入遺伝子配列および野生型遺伝子配列を特定するための２セットのオリゴヌクレオチド、ならびに導入遺伝子および野生型配列の含有量を測定するための二重標識したプローブを利用する。
【００３５】
インベーダーアッセイはイベントを特徴付けるための強力な技法であるが、ＤＮＡの質に対して非常に感受性である。さらに、このアッセイは、多量のＤＮＡを必要とする。インベーダーは、適正に取り扱われなければインベーダーアッセイを失敗させることもある追加的な変性ステップも必要とする。さらに、インベーダーアッセイのアッセイ時間が長いことにより、商業的な環境において分析するために多数のＡＡＤ−１２イベント４１６試料を効率的に取り扱うためのその柔軟性が制限される。本発明の１つの主要な利点は、時間の節約、および変性ステップの排除である。
【００３６】
ＡＡＤ−１２  ４１６イベントを検出するための本主題のエンドポイントＴａｑＭａｎ分析は、特に多数の試料の分析において、インベーダーを超える驚くべき利点を提供する。
【００３７】
本発明の説明に役立つように、また当業者が本発明を実施する指針となるために、本明細書において定義および例が提供される。特に断りのない限り、用語は、当業者による従来の使用法に従って理解される。米国特許法施行規則第１．８２２条に明記されているＤＮＡ塩基の命名法を使用する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「後代」は、ＡＡＤ−１２ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を含む親植物の任意の世代の子孫を意味する。
【００３９】
トランスジェニック「イベント」は、植物細胞を異種ＤＮＡ、すなわち、対象の導入遺伝子を含む核酸構築物で形質転換すること、植物のゲノムに導入遺伝子を挿入することによって生じる植物の集団を再生させること、および特定のゲノム上の位置への挿入を特徴とする特定の植物を選択することによって作出される。用語「イベント」は、元の形質転換体および異種ＤＮＡを含むその形質転換体の後代を指す。用語「イベント」は、ゲノムＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡを含む、形質転換体と別の品種との間の有性異系交雑によって作出される後代も指す。反復親との戻し交雑を繰り返した後であっても、形質転換された親由来の挿入された導入遺伝子ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡ）は、交雑の後代において同じ染色体上の位置に存在する。用語「イベント」は、元の形質転換体由来のＤＮＡ、および挿入ＤＮＡを含む一方の親系統（例えば、元の形質転換体および自殖によって生じる後代）と挿入ＤＮＡを含有しない親系統との有性交雑の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが予測され得る挿入ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡのすぐ近接の隣接ゲノム配列を含むその後代も指す。
【００４０】
「接合部配列」は、ゲノムに挿入されたＤＮＡが、挿入点に隣接するダイズのネイティブなゲノム由来のＤＮＡに連結している点にわたり、植物の遺伝物質中の一方または他方の接合部配列の特定または検出は、十分にイベントに特徴的である。本明細書に記載のダイズイベントにおける挿入物にわたるＤＮＡ配列および同様の長さの隣接ＤＮＡが包含される。そのような特徴的な配列の特定の例が本明細書において提供されるが、挿入物の接合部、または挿入物とゲノム配列との接合部とオーバーラップする他の配列も特徴的であり、本発明に従って使用することができる。
【００４１】
本発明は、そのような隣接配列、接合部配列、および挿入断片配列を特定することに関する。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコンは、本発明に包含される。本発明に従って、挿入ＤＮＡおよびその端までわたるアンプリコンを使用するＰＣＲ分析方法を使用して、対象の登録商標を持つトランスジェニックダイズ系統に由来する商業化されたトランスジェニックダイズの品種または系統を検出または特定することができる。
【００４２】
これらの挿入断片のそれぞれの全配列は、それぞれの隣接配列の部分と一緒に、本明細書において配列番号１として提供される。配列番号１（全部で１０，２１２塩基対）に関してこのイベントについての挿入断片および隣接配列の位置が以下に示されている。
【００４３】
【表１】
0005907885.tif 000002
【００４４】
挿入断片および隣接配列の構成要素は、図１〜４にさらに例示されている。
【００４５】
本発明の検出技法は、植物育種と併せて、１つまたは複数の追加的な対象の形質を後代に与える取り組みにおいて、対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交雑した後に、どの後代植物が所与のイベントを含むかを決定するために特に有用である。これらの分析方法は、ダイズの育種計画ならびに品質管理、特に商業化されたトランスジェニックダイズ種子に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統の検出キットも、現在製造され、使用することができる。これは、製品登録および製品管理にも有益である。これらは、育種戦略を加速させるために、および連鎖データを確立するために使用することができる。
【００４６】
本明細書において提供される配列を使用して、導入遺伝子の組み込みプロセス、ゲノムの組み込み部位の特性、イベントの選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに遺伝子発現（特に、遺伝子サイレンシング、導入遺伝子のメチル化パターン、位置の影響、およびＭＡＲＳ［マトリックス付着領域］などの潜在的な発現関連エレメントなどに関連する）について研究し、特徴付けることができる。
【００４７】
さらに、本発明は、後裔植物および／または後代植物、好ましくは、本明細書に記載の検出可能なＤＮＡ挿入断片を含むゲノムを有する除草剤耐性ダイズ植物を選択することを包含する。本明細書で使用される場合、用語「ダイズ」は、ダイズ（Glycine max）を意味し、ダイズ植物を用いて育種することができるその全品種を包含する。
【００４８】
本発明は、本発明の植物を少なくとも一方の親として使用して交雑を行うプロセスをさらに包含する。本発明は、例示した植物と、異なる（例えば、純系の親）植物とを交雑し、得られたハイブリッド種子を収穫することによってＦ１ハイブリッド種子を作出するための方法を包含する。得られる植物（どちらかが雌性）の特性は、親植物を慎重に考察することによって改良することができる。
【００４９】
除草剤耐性ダイズ植物は、本明細書で言及されている系統の任意の１つの種子から生長させたダイズ植物からなる第１の親ダイズ植物と、第２の親ダイズ植物との有性交雑を最初に行い、それによって複数の第１の後代植物を作出すること；次いで、除草剤に対して抵抗性である（または、本発明のイベントの少なくとも１つを保有する）第１の後代植物を選択すること；第１の後代植物を自殖させ、それによって、複数の第２の後代植物を作出すること；次いで、第２の後代植物から、除草剤に対して抵抗性である（または、本発明のイベントの少なくとも１つを保有する）植物を選択することによって育種することができる。これらのステップは、第１の後代植物または第２の後代植物を第２の親ダイズ植物または第３の親ダイズ植物と戻し交雑することをさらに含んでよい。次いで本発明のダイズ種子を含むダイズ作物、またはその後代を植え付けることができる。
【００５０】
２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、それぞれ独立に分離して付加された２つの外因性遺伝子を含有する子孫を作出することもできることがまた理解される。適切な後代を自殖させることにより、付加された外因性遺伝子のどちらについてもホモ接合性である植物を作出することができる。栄養繁殖のように、親植物との戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交雑も意図されている。種々の形質および作物のために一般に使用される他の育種方法は当技術分野で公知である。反復親である望ましいホモ接合性の栽培品種または純系統に、単純に遺伝した、高度に遺伝性の形質の遺伝子を伝達するために戻し交雑育種が使用されてきた。伝達される形質の供給源は、供与親と称されている。生じた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から伝達された望ましい形質を有することが予測される。最初の交雑の後、供与親の表現型を保有する個体を選択し、反復親と繰り返し交雑（戻し交雑）する。生じた親は、反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から伝達された望ましい形質を有することが予測される。
【００５１】
本発明は、マーカー利用育種（ＭＡＢ）法において分子マーカーと一緒に使用することができる。本発明のＤＮＡ分子は、当技術分野で公知の通り、遺伝的に連鎖している作物学的に有用な形質を特定する他の方法（例えば、ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲなど）と一緒に使用することができる。ＭＡＢ法を使用して、本発明のダイズ植物（またはその後代および任意の他のダイズの栽培品種または品種）との交雑の後代において除草剤抵抗性形質を追跡することができる。ＤＮＡ分子はこの形質についてのマーカーであり、当技術分野で周知のＭＡＢ法を使用して、本発明の少なくとも１つのダイズ系統、またはその後代が親または祖先であったダイズ植物における除草剤抵抗性形質（複数可）を追跡することができる。本発明の方法を使用して、対象イベントを有する任意のダイズ品種を特定することができる。
【００５２】
本発明の方法は、本発明の植物を用いて育種するステップを含む、除草剤耐性ダイズ植物を作出する方法を包含する。より詳細には、前記方法は、本発明の２つの植物、または本発明の１つの植物と任意の他の植物とを交雑するステップを含んでよい。好ましい方法は、前記交雑の後代を、本発明に従って検出可能なイベントについて前記後代を分析することによって選択するステップをさらに含む。例えば、本発明を使用して、他の望ましい形質、例えば、作物学的形質など、例えば、本明細書において、種々の実施例において試験されるものなどを含む植物を用いた育種サイクルを通して対象イベントを追跡することができる。対象イベントおよび所望の形質を含む植物を検出し、特定し、選択し、例えば育種のさらなるラウンドに直ちに使用することができる。対象イベント／形質は、昆虫抵抗性形質（複数可）および／または別の除草剤耐性形質と育種を通じて組み合わせ、本発明に従って追跡することもできる。後者の好ましい一実施形態は、対象イベントを除草剤であるジカンバに対する抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせて含む植物である。
【００５３】
対象イベントは、例えば、グリホサート抵抗性（例えば、抵抗性植物または細菌のＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルホシネート抵抗性（例えば、Ｐａｔ、ｂａｒ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害性除草剤への抵抗性（例えば、イミダゾリノン［イマゼタピルなど］、スルホニル尿素系、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピリミジニルチオベンゾエート系、および他の化学物質［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡなど］）、ブロモキシニル抵抗性（例えば、Ｂｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシルフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）の阻害剤に対する抵抗性、光化学系ＩＩ阻害性除草剤に対する抵抗性（例えば、ｐｓｂＡ）、光化学系Ｉ阻害性除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ（ＰＰＯ）阻害性除草剤に対する抵抗性（例えば、ＰＰＯ−１）、フェニル尿素除草剤に対する抵抗性（例えば、ＣＹＰ７６Ｂ１）、ジカンバ分解酵素（例えば、ＵＳ２００３０１３５８７９を参照されたい）をコードする形質と組み合わせることができ、その他のものを、単独で、または多数の組合せで積み重ねて、雑草のシフト（weed shift）および／または上述のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性を有効に制御する、または妨げる能力をもたらすことができる。
【００５４】
追加的な除草剤に関して、いくつかの追加的な好ましいＡＬＳ（ＡＨＡＳとしても公知である）阻害剤としては、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド系（例えば、クロランスラム−メチル、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラム、およびペノキススラムなど）、ピリミジニルチオベンゾエート系（例えば、ビスピリバックおよびピリチオバックなど）、ならびにフルカルバゾンが挙げられる。いくつかの好ましいＨＰＰＤ阻害剤としては、メソトリオン、イソキサフルトール、およびスルコトリオンが挙げられる。いくつかの好ましいＰＰＯ阻害剤としては、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルフェンピル、ピラフルフェン、フルチアセット、ブタフェナシル、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、およびジフェニルエーテル系（例えば、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、およびオキシフルオルフェンなど）が挙げられる。
【００５５】
さらに、ＡＡＤ−１２単独に、または１つもしくは複数の追加的なＨＴＣ形質を積み重ねたＡＡＤ−１２に、１つまたは複数の追加的なインプット形質（例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、もしくはストレス耐性など）またはアウトプット形質（例えば、生産量の増加、油プロファイルの改良、繊維品質の改良など）を積み重ねることができる。したがって、本発明を使用して、任意の数の作物害虫を柔軟かつ費用効果的に制御する能力を伴う改良された作物の品質の完全な作物パッケージをもたらすことができる。
【００５６】
対象のＡＡＤ−１２酵素は、トランスジェニック発現を可能にして、ほぼ全ての広葉雑草およびイネ科雑草を制御し得る除草剤の組合せに対する耐性をもたらす。ＡＡＤ−１２は、例えば、他のＨＴＣ形質（例えば、グリホサート抵抗性、グルホシネート抵抗性、イミダゾリノン抵抗性、ブロモキシニル抵抗性など）、および昆虫抵抗性形質（Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ  ３４／４５など）を積み重ねるための優れた除草剤耐性作物（ＨＴＣ）形質としての機能を果たし得る。さらに、ＡＡＤ−１２は、第２の遺伝子または遺伝子群を用いて遺伝子操作した植物の一次形質転換体を選択するために役立つ選択マーカーとしての機能を果たし得る。
【００５７】
本発明のＨＴＣ形質は、他のＨＴＣ形質（これらに限定されないが、グリホサート耐性を含む）との新規の組合せにおいて使用することができる。これらの形質の組合せにより、除草剤（例えば、グリホサート）に対する新しく獲得した抵抗性または固有の耐性によって雑草（および同様のもの）種を制御する新規の方法が生じる。したがって、ＨＴＣ形質に加えて、トランスジェニック作物において、前記酵素によって除草剤耐性を創出する、除草剤を使用して雑草を制御するための新規の方法は、本発明の範囲内である。
【００５８】
さらに、世界中で栽培されているグリホサート耐性作物が一般的である。他のグリホサート耐性作物との輪作において多くの場合、グリホサート抵抗性自生植物を制御することは、輪作作物においては難しい。したがって、作物に個々に積み重ねた、または作物を個々に形質転換した対象のトランスジェニック形質の使用は、他のＨＴＣ自生作物を制御するためのツールを提供する。
【００５９】
別段の指定のない限り、隣接配列に言及する場合、それは配列番号１について特定されたものを指す（上の表を参照されたい）。さらに、配列番号１は、元の形質転換体に挿入された異種ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡのすぐ近接する例示的な隣接ゲノム配列を含む。これらの隣接配列の全部または一部は、イベントを含む親系統の有性交雑の結果として挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが予測され得る。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「系統」は、少なくとも１つの形質について、個体間で遺伝的変異をほとんど示さない、または示さない植物の群である。そのような系統は、何世代か自家受粉させ、選択すること、または組織または細胞の培養技法を使用して、単一の親から栄養繁殖させることによって創出することができる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「栽培品種」および「品種」は同義であり、商業生産のために使用される系統を指す。
【００６２】
「安定性」または「安定な」は、所与の構成要素に関しては、構成要素が代々、好ましくは、少なくとも３世代、実質的に同じレベルで、例えば、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％で維持されることを意味する。安定性は、温度、位置、ストレスおよび植え付け時間に影響を受ける可能性がある。その後の世代を野外条件下で比較することにより、構成要素が同様にもたらされるべきである。
【００６３】
「商業的有用性」は、従来の農業設備を使用して農業者が作物を生産することができるように、および従来の圧搾および抽出用設備を使用して記載の構成要素を有する油を種子から抽出することができるように良好な植物生長力および高い稔性を有することと定義される。商業的に有用であるために、種子の重量、油の含有量、および１エーカー当たりの生産された油の総計によって測定した生産量は、同じ地域で栽培される高価値の形質を有さない、別の匹敵する市販のダイズ品種の平均生産量の１５％以内である。
【００６４】
「作物学的に優良」は、系統が対象イベント（複数可）に起因する昆虫抵抗性に加えて、例えば生産量、成熟度、病害抵抗性などの望ましい作物学的特性を有することを意味する。以下の実施例に記載の、本発明のイベントを含む植物に個々に、または任意の組合せで獲得される作物学的形質は、本発明の範囲内である。これらの作物学的特性およびデータポイントの全てを使用して、そのような植物を、そのような植物を定義するために使用する特性の範囲内の一点として、または一端もしくは両端で特定することができる。
【００６５】
本開示に照らして当業者に理解されるように、検出キットの好ましい実施形態は、例えば、ポリヌクレオチドプローブおよび／またはアンプリコンを含めたプローブおよび／またはプライマーを含んでよい。
【００６６】
隣接配列に「接している」プライマー（複数可）は、一般には、約２００塩基を越えて、または接合部を越えてハイブリダイズするようには設計されない。したがって、典型的な隣接プライマーは、挿入断片の最初から隣接配列に入って２００塩基の範囲内のどちらかの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計され得る。すなわち、配列番号１の残基約２５３０〜２７３０および／または約９１２２〜９３２２由来の（またはそれとハイブリダイズする）適切なサイズの配列を含むプライマーは、本発明の範囲内である。挿入プライマーは、挿入断片のどこにでも同様に設計することができるが、残基約２７３１〜２９３１および約８９２１〜９１２１を、例えば、そのようなプライマーの設計のために非排他的に使用することができる。
【００６７】
当業者は、さまざまな標準のハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲの条件の下で、配列番号１（または相補物）のセグメント、およびその相補物とハイブリダイズするようにプライマーおよびプローブを設計することができ、ここでプライマーまたはプローブが例示された配列と完全に相補的ではないことも認識されよう。すなわち、ある程度のミスマッチが容認され得る。およそ２０ヌクレオチドのプライマーについて、例えば、一般には、ミスマッチ塩基がアンプリコンと逆のプライマーの内部または末端にある場合、１または２ヌクレオチド程度は逆の鎖と結合しなくてよい。種々の適切なハイブリダイゼーション条件が以下に提供される。イノシンなどの合成ヌクレオチド類似体は、プローブにも使用することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ならびにＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブも使用することができる。重要なのは、そのようなプローブおよびプライマーが、本発明のイベントの存在に対して特徴的である（独自に特定し、区別することができる）ことである。
【００６８】
「挿入断片」の構成要素が図に例示されている。これらの構成要素のＤＮＡポリヌクレオチド配列、またはその断片を、本発明の方法においてＤＮＡプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００６９】
本発明の一部の実施形態では、ダイズ植物由来の植物および種子などにおける導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。ＤＮＡ配列、ならびにそのセグメント、および例示された配列の相補物およびその任意のセグメントが提供される。
【００７０】
これらおよび他の関連する手順を使用して、これらのダイズ系統を独自に特定することができる。
【００７１】
一部の実施形態では、新規の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の連続した断片を含むＤＮＡ配列は本発明の態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリヌクレオチドおよび３つの上述のダイズ植物の１つまたは複数由来のダイズのゲノム配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列および／またはこれらのダイズ植物の１つまたは複数に対して特徴的なアンプリコン産物を生成するためのプライマー配列として有用である配列が包含される。
【００７２】
関連する実施形態は、本明細書において特定されるＤＮＡ配列（例えば、配列番号１およびそのセグメントなど）の導入遺伝子部分の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、またはその相補物、およびこれらの配列由来の同様の長さのダイズの隣接ＤＮＡ配列、またはその相補物に関する。そのような配列は、ＤＮＡ増幅方法において、ＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを使用して生成されるアンプリコンは、本明細書で言及されるダイズイベントのいずれかに対して特徴的である。したがって、本発明は、そのようなＤＮＡプライマーおよび相同プライマーによって生成されるアンプリコンも包含する。
【００７３】
本発明は、試料中の、本明細書で言及されるダイズイベントに対応するＤＮＡの存在を検出する方法も包含する。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、これらのダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記イベント（複数可）に対して特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させるステップと；（ｂ）核酸の増幅反応を実施し、それによって、アンプリコンを生成するステップと；（ｃ）アンプリコンを検出するステップとを含んでよい。
【００７４】
本発明の別の検出方法は、試料中の、前記イベントの少なくとも１つに対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記ダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡとハイブリダイズさせ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で対照のダイズ植物（対象のイベントがないＤＮＡ）とハイブリダイズしないプローブと接触させるステップと；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと；（ｃ）プローブのＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む方法を包含する。
【００７５】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のａａｄ−１２イベントを含むダイズ植物を作出する方法であって、（ａ）第１の親ダイズ系統（前記系統の植物に前記除草剤抵抗性形質を付与する本発明の発現カセットを含む）と第２の親ダイズ系統（この除草剤耐性形質を欠く）を有性交雑し、それによって、複数の後代植物を作出するステップと；（ｂ）本発明を使用することによって後代植物を選択するステップとを含む方法を包含する。そのような方法は、場合によって、後代植物を第２の親ダイズ系統と戻し交雑して、前記除草剤耐性形質を含む真の育種（true-breeding）ダイズ植物を作出するさらなるステップを含んでよい。
【００７６】
本発明の一部の実施形態によると、交雑の後代の接合性を決定する方法が提供される。前記方法は、ダイズＤＮＡを含む試料を本発明のプライマーセットと接触させるステップを含んでよい。前記プライマーは、前記ダイズイベントの少なくとも１つ由来のゲノムＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記ダイズイベントの少なくとも１つに対して特徴的である第１のアンプリコンを生成する。そのような方法は、核酸の増幅反応を実施し、それによって、第１のアンプリコンを生成するステップと；第１のアンプリコンを検出するステップと；ダイズＤＮＡを含む試料を、ダイズ植物由来のゲノムＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、ダイズのゲノム領域と相同なネイティブなダイズのゲノムＤＮＡを含む第２のアンプリコンを生成する前記プライマーセットと接触させるステップと；核酸の増幅反応を実施し、それによって、第２のアンプリコンを生成するステップとをさらに含む。この方法は、第２のアンプリコンを検出するステップと、試料中の第１のアンプリコンと第２のアンプリコンとを比較するステップであって、両方のアンプリコンが存在することにより、試料が、導入遺伝子挿入物についてヘテロ接合性であることが示されるステップとをさらに含む。
【００７７】
本明細書に開示されている組成物およびＤＮＡの検出の技術分野で周知の方法を使用するＤＮＡ検出キット。このキットは、試料中の対象のダイズイベントＤＮＡを特定するために有用であり、このＤＮＡを含有するダイズ植物を育種するための方法に適用することができる。キットは、例えば、本明細書に開示されているアンプリコンと相同または相補的であるＤＮＡ配列、または対象イベントの導入遺伝子の遺伝エレメントに含有されるＤＮＡと相同または相補的であるＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応において、またはＤＮＡのハイブリダイゼーション方法においてプローブとして、使用することができる。キットは、検出方法を実行するために必要な試薬および材料も含有することができる。
【００７８】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素など）に付着させた単離された核酸分子である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖、本発明の場合では、ダイズ植物由来であるかイベント由来のＤＮＡを含む試料由来であるかにかかわらず、前記ダイズイベントの１つ由来のゲノムＤＮＡの鎖と相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができるポリアミドおよび他のプローブ材料も含む。
【００７９】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖とアニーリングしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、次いでポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離された／合成された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸の増幅方法によって標的核酸配列を増幅するためのそれらの使用を指す。
【００８０】
プローブおよびプライマーは、一般に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ポリヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。そのようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列とは異なり、標的配列とハイブリダイズする能力を保持するプローブを従来の方法によって設計することができる。
【００８１】
プローブおよびプライマーを調製し、使用するための方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年に記載されている。ＰＣＲのプライマー対は、公知の配列から、例えば、その目的のためのコンピュータプログラムを使用することによって得ることができる。
【００８２】
本明細書に開示されている隣接ＤＮＡおよび挿入断片の配列に基づくプライマーおよびプローブを使用して、従来の方法によって、例えば、そのような配列を再クローニングし、配列決定することによって、開示されている配列を確認すること（および、必要であれば、補正すること）ができる。
【００８３】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅の方法を使用して、試料中のトランスジェニックイベント由来のＤＮＡの存在を特定することができる。核酸分子またはその断片は、ある特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書で使用される場合、２つの核酸分子は、２つの分子が、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いと特異的にハイブリダイズすることができると言える。核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、その「相補物」であると言える。本明細書で使用される場合、分子は、分子の一方のあらゆるヌクレオチドが、他方のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言える。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いとアニーリングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズすることができる場合、「最小限相補的」であると言える。同様に、分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、互いとアニーリングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言える。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989年に記載されている。したがって、完全な相補性から逸脱することは、そのような逸脱により、二本鎖構造を形成する分子の能力が完全に妨げられない限りは許容できる。核酸分子がプライマーまたはプローブとしての機能を果たすためには、用いる特定の溶媒および塩濃度の下で安定な二本鎖構造を形成できるために十分に配列内で相補的であることのみが必要である。
【００８４】
本明細書で使用される場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件下で比較されている核酸配列の相補物と特異的にハイブリダイズし得る核酸配列である。用語「ストリンジェントな条件」は、Sambrookら、1989年、9.52〜9.55において考察されている特定のハイブリダイゼーション手順による、核酸プローブの標的核酸（すなわち、対象とする特定の核酸配列）とのハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrookら、1989年、9.47〜9.52および9.56〜9.58も参照されたい。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、相補的なＤＮＡ断片のひと続きと２重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力に関して使用することができる。
【００８５】
構想される適用に応じて、プローブの標的配列に対する選択性のさまざまな程度を実現するためにハイブリダイゼーションのさまざまな条件を使用することができる。高い選択性を必要とする適用のために、一般には、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を用いることがある、例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによってもたらされるような比較的低塩かつ／または高温の条件を選択することがある。ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション濾過器を高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回洗浄することを伴ってよい。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することは、当業者に公知である。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、低ストリンジェンシーである５０℃で約２．０×ＳＳＣから高ストリンジェンシーである５０℃で約０．２×ＳＳＣまでから選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー条件である室温、約２２℃から高ストリンジェンシー条件である約６５℃まで増加させることができる。温度と塩との両方が変動してよい、または、温度もしくは塩濃度のいずれかは、他方の変数が変化する一方で一定に保たれてよい。そのような選択的な条件は、もしあれば、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを少し容認する。ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列を検出することは当業者に周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および同第５，１７６，９９５号の教示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
【００８６】
特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、本明細書において例証または提案される、その相補物および断片を含めたプライマー（またはアンプリコンもしくは他の配列）の１つまたは複数と特異的にハイブリダイズする。本発明の一態様では、本発明のマーカー核酸分子は、本明細書において例示された配列の１つに記載されている核酸配列、またはその相補物および／もしくは断片を有する。
【００８７】
本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列と、８０％から１００％の間または９０％から１００％の間の配列同一性を共有する。本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような配列と９５％から１００％の間の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交雑の後代を特定するための植物育種方法において、マーカーとして使用することができる。プローブの標的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の数の方法によって検出することができ、それらとしては、これらに限定されないが、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを挙げることができる。
【００８８】
特定の増幅プライマー対を使用する標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補物）を有するプライマーが結合し得る標的核酸配列のみとハイブリダイズすること、および好ましくは特有の増幅産物、アンプリコンを生成することを可能にする条件である。
【００８９】
用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列のみとハイブリダイズすることを示す。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有性交雑によって生じたダイズ植物が、本発明のダイズ植物由来のトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含有するかどうかを決定するために、ダイズ植物の組織試料から抽出したＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位の近接する植物のゲノム内の隣接配列に由来するプライマー、および挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むプライマー対を使用して、イベントＤＮＡの存在に対して特徴的であるアンプリコンを生成する核酸の増幅方法に供することができる。アンプリコンは、ある長さであり、同じくイベントに対して特徴的である配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対の全て合わせた長さ足す１ヌクレオチド塩基対、および／またはプライマー対の全て合わせた長さ足す約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、またはそれ以上のヌクレオチド塩基対（上に列挙されている増大のいずれかを足すまたは引く）にわたってよい。あるいは、プライマー対は、挿入断片のヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンが生成されるように、挿入ＤＮＡの両側の隣接配列に由来してもよい。植物のゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列からある距離に位置してよい。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大約２万ヌクレオチド塩基対までにわたることができる。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成される可能性があるプライマー二量体を特に除外する。
【００９１】
核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた当技術分野で公知の種々の核酸の増幅方法のいずれかによって実現することができる。種々の増幅方法が当技術分野で公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている。２２ｋｂに至るまでのゲノムＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ増幅方法が開発されてきた。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の技術分野で公知の他の方法を、本発明の実施において使用することができる。本明細書において提供される配列に由来するプライマーを使用してイベントからそのような配列を増幅し、その後ＰＣＲアンプリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準のＤＮＡ配列決定を行うことにより、本主題のダイズイベント由来の異種導入遺伝子ＤＮＡ挿入断片の配列または隣接ゲノム配列を検証すること（および必要であれば、補正すること）ができる。
【００９２】
これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技法によって検出することができる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムを用いた染色は、ＤＮＡアンプリコンを検出する周知の一般的な方法である。別のそのような方法は、近接する隣接ゲノムＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する遺伝子ビット分析（Genetic Bit Analysis）である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル内に固定化されている。対象の領域のＰＣＲ後（挿入配列内の１つのプライマーおよび近接する隣接ゲノム配列内の１つのプライマーを使用する）、一本鎖のＰＣＲ産物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよび予測される次の塩基に特異的な標識したｄｄＮＴＰを使用する一塩基伸長反応の鋳型としての機能を果たし得る。読み取りは、蛍光またはＥＬＩＳＡに基づいてよい。信号により、上首尾の増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長に起因して、挿入断片／隣接配列が存在することが示される。
【００９３】
本明細書において言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明確な教示と相反しない限りは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９４】
以下の実施例は、本発明を実施するための手順を例示するため、および本発明のある特定の好ましい実施形態を実証するために含まれる。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。当業者には、以下の実施例に開示されている技法は、それを実施するための好ましい方式を例示するために使用される特定の手法を表していることが理解されたい。しかし、当業者には、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なお同様または類似の結果を得ながら、これらの特定の実施形態において多くの変更を行うことができることが理解されたい。別段の指定のない限り、全ての百分率は重量により、特に断りのない限り、全ての溶媒混合物の割合は体積による。
【００９５】
別段の指定のない限り、以下の略語が使用されている。
ＡＡＤ−１２  アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１
ｂｐ  塩基対
℃  摂氏温度
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
ＤＩＧ  ジゴキシゲニン
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ  キロベース
μｇ  マイクログラム
μＬ  マイクロリットル
ｍＬ  ミリリットル
Ｍ  モル質量
ＯＬＰ  オーバーラッププローブ
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ  植物転写単位
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ  標準操作手順
ＳＳＣ  塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ７．０
ＴＢＥ  トリス塩基、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ８．３
Ｖ  ボルト
［実施例］
【実施例１】
【００９６】
イベント特異的なＴａｑｍａｎアッセイ
イベント特異的なＴＡＱＭＡＮ  ＡＳＳＡＹ（商標）を開発してダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４の存在を検出し、育種集団において植物の接合状態を決定した。イベント特異的なアッセイを開発するために、特異的なＴａｑｍａｎプライマーおよびプローブを、５’挿入断片と植物との接合部に位置するＤＮＡ配列に従って設計した。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を特異的に検出するために、この５’組み込み接合部にわたる１２８ｂｐのＤＮＡ断片を、２つの特異的なプライマーを使用して増幅した。このＰＣＲ産物の増幅量を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって合成された、５’末端にＦＡＭレポーターを含有する標的特異的なＭＧＢプローブによって測定した。ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４に対するこのＴａｑｍａｎ検出方法の特異性を、１５種の異なるａａｄ−１２ダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）に対して、ダイズに特異的な内在性参照遺伝子であるレクチンを用いて２連形式で試験した。
【００９７】
実施例１．１．
ｇＤＮＡの単離
この研究では、１５種の異なるＡＡＤ−１２ダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種のｇＤＮＡ試料を試験した。ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  ９６  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔを使用して抽出した。改変したＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  ９６  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔプロトコールを使用してｇＤＮＡを抽出するために、１試料当たり８つの新鮮なダイズの葉の円盤状切片（leaf disc）を使用した。ｇＤＮＡを、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ法をベンダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）の説明書に従って用いて定量した。この研究のために、試料を、ＤＮａｓｅを含まない水で希釈して濃度を１０ｎｇ／μＬにした。
【００９８】
実施例１．２．
ＴａｑＭａｎアッセイおよび結果
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４に特異的なＴａｑｍａｎアッセイのために、特異的なＴａｑｍａｎプライマーおよびプローブを設計した。これらの試薬は、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４内部のａａｄ−１２を検出するために、以下に列挙されている条件を用いて使用することができる。表１に、イベントＤＡＳ−６８４１６−４を検出するために特別に開発したプライマーおよびプローブの配列が列挙されている。
【００９９】
【表２】
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【０１００】
増幅用のマルチプレックスＰＣＲ条件は、以下の通りである：１×ＰＣＲ緩衝液、０．５〜２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．２μＭのプライマーＳｏｙ４１６−Ｆ、０．２μＭのプライマーＳｏｙ４１６−Ｒ、０．２μＭのプライマーＺＮ＿００７、０．２μＭのプライマーＺＮ＿００８、０．０８μＭのＳｏｙ４１６プローブ、０．０８μＭのＺＮ＿ＬＴ＿００２、４０Ｕ／ｍＬのＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ、全反応液２５μｌ中３０ｎｇのｇＤＮＡ。反応混液を、以下の条件を使用して増幅した：ｉ）９５℃で１５分間、ｉｉ）９５℃で２０秒間、ｉｉｉ）６０℃で６０秒間、ｉｖ）ステップｉｉ〜ｉｉｉを３５サイクル繰り返す、ｖ）４℃で保持する。ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＩＣＹＣＬＥＲ（商標）およびＡＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００サーモサイクラーにおいてリアルタイムＰＣＲを行った。データ解析は、蛍光測定値が設定値に到達したときのＰＣＲのサイクル数であるサイクル閾値（ＣＴ）の測定値に基づいていた。ＣＴ値をｉＣｙｃｌｅｒソフトウェアによって自動的に算出した。
【０１０１】
ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４についてのＴａｑｍａｎ検出方法を、１６種の異なるａａｄ−１２ダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種に対して、ダイズに特異的な内在性レクチンを参照遺伝子として用いて２連形式で試験した。このアッセイにより、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４が特異的に検出され、対照（すなわち、１５種の異なるａａｄ−１２ダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種）に由来するいかなる偽陽性結果も生成または増幅されなかった。イベント特異的なプライマーおよびプローブは、ダイズイベントＤＡＳ−６８４１６−４を検出するために使用することができ、これらの条件および試薬は、接合性アッセイのために適用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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