【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年11月17日(2010.11.17)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオチップをベースにした核酸結合タンパク質を検出するための方法であって、該方法は、以下：
１）数種のグループの核酸捕捉プローブを含有する溶液を、標的核酸結合タンパク質を含有する生物学的サンプルに加える工程であって、該工程によって、該核酸捕捉プローブと該核酸結合タンパク質との間で複合体が形成され、該核酸捕捉プローブは、少なくとも１つの該標的核酸結合タンパク質が結合し得る配列を含み、そして各グループの該核酸捕捉プローブの一本の鎖が、３’突出末端配列を含む、工程；
２）該核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を単離して、該複合体中の該核酸捕捉プローブを収集する工程；
３）プライマーを用いた一本鎖増幅によって該収集された核酸捕捉プローブを増幅する工程であって、該プライマーは、該核酸捕捉プローブの３’突出末端配列にハイブリダイズする、工程；
４）工程３）において増幅した捕捉プローブを、バイオチップの基板上に固定化した一本鎖固定化プローブとハイブリダイズさせる工程であって、該固定化プローブは、該増幅した核酸捕捉プローブに対して相補的な配列を含む、工程；および
５）該ハイブリダイゼーションの結果を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程２）における核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を単離する工程が、前記工程１）からの混合物サンプルをゲル電気泳動し、ゲルスライスを切り出し、そして、ゲル精製キットもしくは電気溶出法によって回収して、単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得るプロセスである、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記工程２）における核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を単離する工程が、前記工程１）からの混合物サンプルをクロマトグラフィーに供し、単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得る工程である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記工程２）における核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を単離する工程が、前記工程１）からの混合物サンプルを、タンパク質を吸着し得る膜を用いて濾過して、単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得る工程である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記工程２）における核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を単離する工程が、各核酸結合タンパク質を特異的に認識する抗体を前記工程１）からの混合物サンプルに加え、そして、抗体精製法により単離して、単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得るプロセスである、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記工程２）における核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を単離する工程が、キャピラリー電気泳動によって前記工程１）からの混合物サンプルを分離し、そして、該核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を収集するプロセスである、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記核酸結合タンパク質が、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）結合タンパク質、または、試験管内進化法によって生成された天然に存在しないタンパク質結合核酸アプタマーである、方法。
【請求項８】
前記ｄｓＤＮＡ結合タンパク質が、転写因子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸捕捉プローブが、核酸結合タンパク質によって結合され得る核酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
各固定化プローブが、その対応する核酸捕捉プローブの突出末端配列に対して相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸捕捉プローブの突出末端が、標識分子によって標識されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識分子が、ビオチン、ジゴキシン、蛍光色素、量子ドット、金粒子、またはナノ粒子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記３’突出末端を有する核酸捕捉プローブの各グループにおける３’突出末端配列は同一であり、そして、前記プライマーの配列は、該３’突出末端配列に対して完全に相補的である、方法。
【請求項１４】
前記プライマーを増幅のために使用する場合、該プライマーは、標識分子で標識される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーの５’末端が標識される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標識分子が、ビオチン、ジゴキシン、蛍光色素、量子ドット、金粒子、またはナノ粒子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プライマーを増幅のために使用する場合、標識分子で標識されたヌクレオチドが、前記増幅プロセスに加えられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識分子が、ビオチン、ジゴキシン、蛍光色素、量子ドット、金粒子、またはナノ粒子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法によって、核酸結合タンパク質を検出するためのキットであって、該キットは、以下：
数種のグループの核酸捕捉プローブであって、該核酸捕捉プローブは、少なくとも１つの生物学的サンプル中の標的核酸結合タンパク質が結合し得る配列を含み、そして、各グループの該核酸捕捉プローブの一本の鎖が、３’突出末端配列を含む、数種のグループの核酸捕捉プローブ；
一本鎖増幅を実施するためのプライマーであって、該プライマーは、該核酸捕捉プローブの３’突出末端配列にハイブリダイズする、プライマー；
バイオチップの基板上に固定化された一本鎖固定化プローブを含むバイオチップであって、該固定化プローブは、該核酸捕捉プローブに対して相補的な配列を含む、バイオチップ
を備える、キット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットであって、さらに以下：
前記核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を単離するためのゲル電気泳動キット；および
該単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得るためのゲル精製キットまたは電気溶出キット
を備える、キット。
【請求項２１】
請求項１９に記載のキットであって、さらに以下：
前記単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得るためのクロマトグラフィーキット
を備える、キット。
【請求項２２】
請求項１９に記載のキットであって、さらに以下：
前記単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得るための、タンパク質を吸着し得る膜
を備える、キット。
【請求項２３】
請求項１９に記載のキットであって、さらに以下：
前記単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得るための、各核酸結合タンパク質を特異的に認識する抗体
を備える、キット。
【請求項２４】
請求項１９に記載のキットであって、さらに以下：
前記核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を収集するための、キャピラリー電気泳動キット
を備える、キット。
【請求項２５】
請求項１９に記載のキットであって、前記核酸結合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）結合タンパク質、または、試験管内進化法によって生成された天然に存在しないタンパク質結合核酸アプタマーである、キット。
【請求項２６】
前記ｄｓＤＮＡ結合タンパク質が、転写因子である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記核酸捕捉プローブが、核酸結合タンパク質によって結合され得る核酸配列を含む、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
各固定化プローブが、その対応する核酸捕捉プローブの突出末端配列に対して相補的である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２９】
前記核酸捕捉プローブの突出末端が、標識分子によって標識されている、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記標識分子が、ビオチン、ジゴキシン、蛍光色素、量子ドット、金粒子、またはナノ粒子である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
請求項３０に記載のキットであって、前記３’突出末端を有する核酸捕捉プローブの各グループにおける３’突出末端配列は同一であり、そして、前記プライマーの配列は、該３’突出末端配列に対して完全に相補的である、キット。
【請求項３２】
前記プライマーを増幅のために使用する場合、該プライマーは、標識分子で標識される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記プライマーの５’末端が標識される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記標識分子が、ビオチン、ジゴキシン、蛍光色素、量子ドット、金粒子、またはナノ粒子である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
標識分子で標識されたヌクレオチドをさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３６】
前記標識分子が、ビオチン、ジゴキシン、蛍光色素、量子ドット、金粒子、またはナノ粒子である、請求項３５に記載のキット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
ｄｓＤＮＡ結合タンパク質は、ｄｓＤＮＡの特定の配列に結合する、タンパク質またはタンパク質分子複合体のグループである。ｄｓＤＮＡ結合タンパク質は、原核生物のリプレッサータンパク質およびオペレータータンパク質、ならびに、真核生物の転写因子（ＴＦ）などを含む。これらのｄｓＤＮＡ結合タンパク質は、ｄｓＤＮＡの特定の配列（オペレーター／プロモーター）への結合によって、標的遺伝子の発現を活性化、阻害、減少または増強し得る。原核生物において、リプレッサータンパク質およびオペレータータンパク質の機能は、比較的単純である。これらは、細胞の代謝に関する酵素をコードする遺伝子、および、抗生物質耐性遺伝子を調節して、外部環境に対する細胞の生理学的な活性を調節する。真核生物において、転写因子は、多くの活動に関与する。細胞周期、アポトーシスおよび腫瘍新生などは、全て、特定の転写因子に関連する。生物系、特に、真核生物の遺伝子発現調節ネットワークにおいて、遺伝子をコードするタンパク質の発現としては、転写因子を介した転写の活性化、転写、転写後修飾（スプライシング、ならびに、ＲＮＡの５’および３’のキャッピング）、翻訳、翻訳後修飾（リン酸化、グリコシル化、アセチル化など）が挙げられ、そして、転写前、転写後、および翻訳後の段階で調節される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
いくつかの実施形態において、工程２）における核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を単離する工程は、以下に記載される５つのプロセスのいずれかを用いて行われ得る：ａ）工程１）からの混合物サンプルをゲル電気泳動し、ゲルスライスを切り出し、そして、ゲル精製キットもしくは電気溶出法によって回収して、単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得る；ｂ）工程１）からの混合物サンプルをクロマトグラフィーに供し、単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得る；ｃ）工程１）からの混合物サンプルを、タンパク質を吸着し得る膜を用いて濾過して、単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得る；ｄ）各核酸結合タンパク質を特異的に認識する抗体を工程１）からの混合物サンプルに加え、そして、抗体精製法（例えば、抗体に結合させるために、プロテインＡ／Ｇコーティングアガロースビーズを用いる）により単離して、単離された核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を得る；ならびに、ｅ）キャピラリー電気泳動装置によって工程１）からの混合物サンプルを分離し、そして、核酸捕捉プローブ−核酸結合タンパク質複合体を自動的に収集する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために、核酸捕捉プローブの突出末端は、標識分子で標識される。好ましい標識分子は、ビオチン、ジゴキシン、蛍光色素、量子ドット、金粒子またはナノ粒子である。より高い感度に達するために、以下のような改善がなされている（「ハイブリダイゼーション前の一本鎖増幅法」）：上記核酸捕捉プローブの各々の一本の鎖は、３’突出末端を有し；工程３）のハイブリダイゼーション反応の前に、収集された核酸捕捉プローブが、１つのプライマーを用いて増幅され、このプライマーの配列は、後の核酸増幅手順のための３’突出末端配列とハイブリダイズし得る。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
より高い感度に達するために、以下のような改善がなされている（「ハイブリダイゼーション前の二本鎖増幅法」）：上記核酸捕捉プローブの各々の一本の鎖は、３’突出末端および５’突出末端の両方を有し；工程３）のハイブリダイゼーション反応の前に、収集された核酸捕捉プローブが、２つのプライマーを用いて増幅され、このプライマーのうちの一方のプライマーは、３’突出末端および５’突出末端の両方を有する核酸捕捉プローブの鎖の３’突出末端とハイブリダイズし得、そして、もう一方のプライマー配列は、３’突出末端および５’突出末端の両方を有する核酸捕捉プローブの鎖の５’突出末端と同じである。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
Ｃ．核酸−タンパク質結合系の調製：３つの転写因子（１．０μｇ  ＡＰ１、３００ｎｇ  ＮＦκＢおよび１．０μｇ  Ｓｐ１）およびタンパク質捕捉プローブ（ＬＰおよびＦＰのアニールさせた生成物）を混合した。一般的な結合緩衝液を、１倍の最終濃度に達するように加えた。この反応混合物を、室温で３０分間インキュベートした。図３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅに示される実験において、反応に、競合プローブを加えた。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
（実験手順）
Ａ．ＤＮＡプローブの調製：全てのプローブは、Ｂｉｏａｓｉａ  Ｉｎｃ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）により合成され、その配列は表２に列挙する。プローブの各グループにおいて、ＬＦＰおよびＬＰ’は対応する転写因子のための捕捉プローブを形成し；そして、ＩＰプローブは、固定化プローブであった。各グループにおける固定化プローブの調製は、実施例１の「ＤＮＡプローブの調製」と同様である。タンパク質捕捉プローブを水中に溶解させ、そして、対応するプローブ（各グループにおいてＬＦＰプローブおよびＬＰ’プローブ）とアニールさせて、二本鎖ＤＮＡを形成させた。各プローブグループの最終濃度は６０ｎＭであった。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
Ｃ．核酸−タンパク質結合系の調製：３つの転写因子（１．０μｇ  ＡＰ１、１００ｎｇ  ＮＦκＢおよび０．１μｇ  Ｓｐ１）およびタンパク質捕捉プローブを混合した。一般的な結合緩衝液を、１倍の最終濃度に達するように加えた。この結合反応を、室温で３０分間行った。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
【図１】図１は、本発明において使用される「末端標識法」を用いた場合の、複数の核酸結合タンパク質の検出の概略を示す。
【図２】図２は、本発明において使用される「末端標識法」を用いた場合の、複数の核酸結合タンパク質の検出のためのプローブ構造の概略を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例１において使用されるアレイ形式を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例１における、３つの核酸結合タンパク質の同時検出の実験結果を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、競合因子であるＡＰ１結合プローブが加えられた場合の、実施例１における、３つの核酸結合タンパク質の同時検出の実験結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、競合因子であるＮＦκＢ結合プローブが加えられた場合の、実施例１における、３つの核酸結合タンパク質の同時検出の実験結果を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、競合因子であるＳｐ１結合プローブが加えられた場合の、実施例１における、３つの核酸結合タンパク質の同時検出の実験結果を示す。
【図４】図４は、本発明において使用される「一本鎖増幅法」を用いた場合の、複数の核酸結合タンパク質の検出の作業概略を示す。
【図５】図５は、本発明において使用される「一本鎖増幅法」を用いた場合の、複数の核酸結合タンパク質を検出するためのプローブおよびプライマーの設計の概略を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例２における「一本鎖増幅法」を用いた場合の、３つの核酸結合タンパク質（ＡＰ１、ＮＦκＢおよびＳｐ１）の同時検出の実験結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例１に記載される「末端標識法」を用いた場合の、実施例２における実験結果を示す。
【図７】図７は、本発明において使用される「二本鎖増幅法」を用いた場合の、複数の核酸結合タンパク質の検出の作業概略を示す。
【図８】図８は、本発明において使用される「二本鎖増幅法」を用いた場合の、複数の核酸結合タンパク質を検出するためのプローブおよびプライマーの設計の概略を示す。