(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子における標的部位の5’上流領域に相同なDNAと標的部位の3’下流領域に相同なDNAとでポジティブ選択マーカーを挟む構造を持つ遺伝子ターゲティングベクターであって、前記ポジティブ選択マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たないが、前記ポジティブ選択マーカーの5’上流にスプライスアクセプター部位とバイシストロン性発現を可能にするDNA配列とが付加されており、さらに、前記標的部位の5’上流領域に相同なDNAの5’上流にスプライスアクセプター部位とバイシストロン性発現を可能にするDNA配列とが付加されたネガティブ選択マーカーが導入されており、
相同組換えによる遺伝子ターゲティングが起こると、前記ポジティブ選択マーカーに付加されたバイシストロン性発現を可能にするDNA配列が存在することにより、前記標的遺伝子のプロモーターが使われて前記ポジティブ選択マーカーの発現がオンになるが、前記ネガティブ選択マーカーが標的部位に挿入されず、
遺伝子をコードしている領域でランダム挿入が起こると、前記ネガティブ選択マーカーに付加されたバイシストロン性発現を可能にするDNA配列が存在することにより、挿入部位の上流に存在する遺伝子のプロモーターが使われて前記ネガティブ選択マーカーの発現がオンになる前記ベクター。
【請求項２】
ポジティブ選択マーカーにポリＡ配列が付加されている請求項１記載のベクター。
【請求項３】
ネガティブ選択マーカーにポリＡ配列が付加されている請求項１又は２記載のベクター。
【請求項４】
さらにリニア化部位が導入されている請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES配列、IRES2配列及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも１つの配列である請求項１〜４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することを含む、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法（ただし、in vivoのヒトでの方法を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子ターゲティングベクター及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が備えている相同組換え能を利用して、ゲノム上の特定の遺伝子だけを破壊、ないし人為的に導入したDNA断片と置き換えることができる（非特許文献１、２）。これを遺伝子ターゲティングと呼ぶ。この手法は、個々の遺伝子機能解析に絶大な威力を発揮してきただけでなく、理想的な遺伝子治療法や品種改良法としても期待されている（非特許文献３）。しかし、一般的な高等動植物細胞における遺伝子ターゲティングの効率は極めて低く、改良法の開発が望まれている。マーカー遺伝子にプロモーターを持たせない、エクソントラップ型のターゲティングベクターを用いるとランダム挿入体の出現頻度が低下し、遺伝子ターゲティング効率の上昇が見込めることがわかっている（非特許文献４、５）。しかし、非標的遺伝子中へのランダム挿入によってもマーカー遺伝子の発現が起こりうるため、さらなる効率化へ向けての改良法の開発が求められていた。 
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Capecchi, MR (1989) Altering the genome by homologous recombination. Science 244: 1288-1292
【非特許文献２】Vasquez KM, Marburger K, Intody Z, et al. (2001) Manipulating the mammalian genome by homologous recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8403-8410
【非特許文献３】Yanez RJ, Porter AC (1998) Therapeutic gene targeting. Gene Ther 5: 149-159
【非特許文献４】Bunz F, Dutriaux A, Lengauer C, et al. (1998) Requirement for p53 and p21 to Sustain G2 Arrest After DNA Damage. Science 282: 1497-1501
【非特許文献５】Adachi N, So S, Iiizumi S, et al. (2006) The human pre-B cell line Nalm-6 is highly proficient in gene targeting by homologous recombination. DNA Cell Biol. 25: 19-24
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、効率が高い遺伝子ターゲティングを可能とする遺伝子ターゲティングベクターを提供することを目的とする。【０００５】
また、本発明は、効率が高い遺伝子ターゲティングを可能とする遺伝子ターゲティングベクターを利用して、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
遺伝子ターゲティングの効率が極めて低いという問題点の最大の要因は、細胞に導入したターゲティングベクターがゲノム上のランダムな位置に挿入される反応（ランダム挿入）が高頻度で起こってしまうことにある。しかし、プロモーターレス型のターゲティングベクターを用いることでターゲティング効率の上昇が期待できるため、こうしたベクター、特にエクソントラップ型のターゲティングベクターを簡便迅速に作製できるようになれば、一定の技術革新が見込めるはずである。【０００７】
本願発明者は、遺伝子ターゲティングベクター（例えば、エクソントラップ型のターゲティングベクター）において、IRES配列や2A配列などのバイシストロン性発現を可能にするＤＮＡ配列を選択マーカーの5’上流に付加することにより、遺伝子ターゲティング効率を向上させる技術を開発した（特願2011-118564、平成23年5月27日出願）。【０００８】
しかし、特願2011-118564の遺伝子ターゲティングベクターでは、正しくターゲティングされたクローンだけでなく、非標的遺伝子中へのランダム挿入が起こったクローンでも選別に使用したマーカー遺伝子（ポジティブ選択マーカー遺伝子）の発現が起こるため、ネガティブ選択の効果が十分とは言えなかった（図4A, B）。【０００９】
本願発明者は、特願2011-118564の遺伝子ターゲティングベクターにおける標的部位の5’相同領域の上流に、スプライスアクセプター配列を持つ自殺遺伝子などのネガティブ選択マーカーを付加することにより、ランダム挿入を起こしたクローンでのポジティブ選択マーカー遺伝子の発現が起こらないようにすることで、遺伝子ターゲティング効率をさらに向上させることに成功し、本発明を完成させるに至った（図5）。なお、本発明においては、遺伝子ターゲティングベクターにネガティブ選択マーカーとなる遺伝子を付加しなくても、標的部位の5’相同領域の上流にスプライスアクセプター配列を付加することで、同様の効果（すなわち、ランダム挿入を起こしたクローンでの選別に使用したマーカー遺伝子の発現が起こらない）が得られると考えられる。本発明の手法をExon-Trap Positive/Negative Selection 法（ExTraPNS法）と命名する。【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）標的部位の5’上流領域に相同なDNAと標的部位の3’下流領域に相同なDNAとでポジティブ選択マーカーを挟む構造を持つ遺伝子ターゲティングベクターであって、前記ポジティブ選択マーカーの5’上流にスプライスアクセプター部位とバイシストロン性発現を可能にするDNA配列とが付加されており、さらに、前記標的部位の5’上流領域に相同なDNAの5’上流にもスプライスアクセプター部位が付加されている前記ベクター。
（２）ポジティブ選択マーカーにポリＡ配列が付加されているが、プロモーターは付加されていない（１）記載のベクター。
（３）標的部位の5’上流領域に相同なDNAの5’上流に付加されたスプライスアクセプター部位の3’下流にポリＡ配列が付加されている（１）又は（２）記載のベクター。
（４）標的部位の5’上流領域に相同なDNAの5’上流に付加されたスプライスアクセプター部位と、その3’下流に付加されたポリＡ配列との間に、ネガティブ選択マーカーが導入されている（３）記載のベクター。
（５）さらにリニア化部位が導入されている（１）〜（４）のいずれかに記載のベクター。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することを含む、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、遺伝子ターゲティングを、従来よりも高効率で行うことができるようになった。本発明の方法は、特に、エクソントラップ型ターゲティングベクターを使用した遺伝子ターゲティングに効果的である。本発明は、基礎生物学分野、医療分野、農畜産分野における遺伝子ノックアウト／ノックインの汎用化・効率化に有効である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2011‐272072の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ターゲティングベクターの構造。（A）一般的な置換型ターゲティングベクターの構造。ターゲティングベクターを細胞内に導入し、選択薬剤存在下でコロニー形成を行うと、標的部位と薬剤耐性遺伝子が組換わった相同組換え体と、染色体上のランダムな位置にターゲティングベクターが挿入された非相同組換え体が得られるが、後者のほうが圧倒的多数を占める。つまり、相同組換え体および非相同組換え体のいずれも薬剤耐性遺伝子をもつため、この薬剤選別だけでは相同組換え体の取得は困難である。しかし、いずれかのアームの外側にDT-Aなどの自殺遺伝子を付加しておくと、非相同組換え体は染色体上に組込まれた自殺遺伝子の発現によって死滅する。図中の楕円は細胞を、その中の棒状の四角は染色体を表す。染色体中の濃い灰色の領域は標的部位、染色体およびターゲティングベクター中の薄い灰色の領域は相同領域を表す。また、ターゲティングベクターのアームに挟まれた領域は薬剤耐性遺伝子を、黒い四角の領域はDT-Aをそれぞれ表す。（B）プロモーターレス型ターゲティングベクターの構造の一例。置換型ターゲティングベクターとは異なり、ポジティブ選択マーカーとして用いる遺伝子に独自のプロモーターをもたせない。このため、理論上、相同組換えによるターゲティングが起こったときのみ、染色体上の標的遺伝子のプロモーターが使われてマーカー遺伝子の発現がオンとなる。
【図２】Multisite Gateway technologyを利用したターゲティングベクター作製の概略。両端にattB配列をもつ5’-アームと3’-アームをPCR増幅したのち、BP組換え反応によって5’-エントリークローンと3’-エントリークローンを作製する（A）。得られた２つのエントリークローンと、pENTR IRES-Hyg、pDEST R4-R3にネガティブ選択用のカセットSA-IRES-DTA-polyAを付加したプラスミドを用いて、LR組換えによりターゲティングベクターを作製する（B）。Hygはハイグロマイシン耐性遺伝子、DTAはジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子、Kmrはカナマイシン耐性遺伝子、Amprはアンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ表す。
【図３】アーム増幅のためのPCRの概略とプライマー配列。attB配列で挟むように各アームをPCRで増幅する。プライマー配列中の下線部は各att配列を、Nは鋳型特異的配列、枠で囲った部分はI-SceIの認識配列をそれぞれ示す。鋳型特異的配列は25nt程度の長さにするとよい。
【図４】特願2011-118564のエクソントラップ型ターゲティングベクターによる遺伝子ターゲティング。（A）一般的な置換型のエクソントラップ型ターゲティングベクターの構造。5’-アームと3’-アームの間にポジティブ選択マーカーをもつ。ポジティブ選択マーカーは独自のプロモーターをもたない代わりに、5’上流にスプライスアクセプター部位、および、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列をもつ。3’下流にはポリA付加シグナルが付加されている。（B）特願2011-118564のエクソントラップ型ターゲティングベクターによる遺伝子ターゲティングの問題点。相同組換えによるターゲティングにより標的遺伝子中に挿入されたクローンだけでなく（図上）、非標的遺伝子中へのランダム挿入が起こったクローンにおいても（図下）、ポジティブ選択マーカー遺伝子の発現が起こりうる。特に、発現レベルの高い遺伝子中に挿入されたクローンでは、標的遺伝子中に挿入されたクローンよりも強い薬剤耐性を獲得できる。このため、エクソントラップのみではネガティブ選択の効果が十分であるとは言えない。
【図５】新規に開発した、ネガティブ選択用のカセットをもつエクソントラップ型ターゲティングベクターを用いた ExTraPNS法による遺伝子ターゲティング（図６の上段に示したベクターを用いた場合を例にとる）。5’相同領域の上流に、スプライスアクセプター配列をもつ自殺遺伝子が付加されているため、ランダム挿入を起こしたクローンにおいてポジティブ選択マーカー遺伝子の発現が起こる可能性が大幅に減少する。相同組換えによるターゲティングが起こった場合は、ネガティブ選択用のカセットの挿入は起こらない。このため、遺伝子ターゲティング効率の上昇が見込める。なお、ネガティブ選択マーカーとなる遺伝子を付加しなくても、5’アームの上流にスプライスアクセプター配列を付加しておけば（図６の下段に示したベクター）同様の効果が期待できる。
【図６】ExTraPNS法による遺伝子ターゲティングに使用できる、ネガティブ選択用のカセットをもつエクソントラップ型ターゲティングベクターの構造の例。上段に示した自殺遺伝子の代わりに、蛍光タンパク質遺伝子（ここではGFP遺伝子）を付加することもできる（中段）。また、単に、5’アームの上流にスプライスアクセプター配列を付加するだけでもよい（下段）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１４】
遺伝子ターゲティングは、相同組換え機構を利用して、染色体上の任意の位置に変異を入れる技術である。しかし、高等生物における相同組換え頻度は低く、一般に細胞内に導入したターゲティングベクターが標的部位に挿入される頻度に比べ、異なる部位にランダムに挿入される頻度の方が100倍以上高い。そこで、相同組換え体を効率よく選別、取得できるよう、ターゲティングベクターに工夫を施す必要がある。最もよく用いられている置換型ターゲティングベクターは、標的部位（欠失させたい領域）の5’上流領域および3’下流領域と相同なDNA断片（以下、それぞれ「5’アーム」および「3’アーム」とよぶこともある）でポジティブ選択マーカー（図１では、薬剤耐性遺伝子）を挟むような構造をもつ（図1A）。ポジティブ選択マーカーとしては、Hyg（ハイグロマイシン耐性遺伝子）、Puro（ピューロマイシン耐性遺伝子）、β-geo（βガラクトシダーゼ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子）などの薬剤耐性遺伝子、GFP遺伝子などの蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが例示される。相同組換えが起こると標的部位がポジティブ選択マーカーと置き換わるため、これを指標として組換え体を選別することができる。ただし、非相同組換えによってランダムに挿入されてもマーカー遺伝子の発現は起こる。このため、非相同組換え体を除去するための工夫として、ターゲティングベクター中のアームの外側にネガティブ選択用の遺伝子を付加しておくのが一般的である。ネガティブ選択用の遺伝子としては、HSV-TK、DT-Aなどの自殺遺伝子などが例示される。別の方法として、プロモーターをもたない薬剤耐性遺伝子（ポジティブ選択マーカー）を用いるプロモーターレス法（「エクソントラップ法」も含む）がある（図1B）。この方法では、相同組換えが起こるとポジティブ選択マーカー遺伝子の発現がオンになる。ただし、非相同組換えによるランダム挿入によってもポジティブ選択マーカー遺伝子の発現がオンになる可能性がある。本発明では、後者の反応による組換え体を減少させるための手法を考案した（ExTraPNS法）。
【００１５】
本明細書では、Multisite Gateway technology(Iiizumi, S, Nomura, Y, So, S, et al. (2006) Simple one-week method to construct gene-targeting vectors: application to production of human knockout cell lines. Biotechniques 41: 311-316)を利用した置換型ターゲティングベクターの作製法を例にとって説明する（図2）。
【００１６】
具体的には、まずattB4配列とattB1配列を両端にもつ5’アーム（本発明における「標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片」に該当する。）とpDONR P4-P1RおよびattB2配列とattB3配列を両端にもつ3’アーム（本発明における「標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片」に該当する。）とpDONR P2R-P3間でBP組換えを行うことにより、5’エントリークローンおよび3’エントリークローンをそれぞれ作製する。（5’アームと3’アームはゲノミックPCRにより増幅、取得しておく。）
5'アーム増幅用のリバースプライマーは、標的遺伝子のエクソン上に設計しておくとよい。これにより、標的遺伝子上において上流のエクソンからポジティブ選択マーカー遺伝子（が挿入されたエクソン）へのナチュラルなスプライシングを可能にするSA部位（splice acceptor site）を5'アーム中に含めることができる。SA部位は、標的遺伝子のスプライスアクセプター配列（SA配列）に限定されるわけではなく、他のSA部位を用いてもよい。
【００１７】
3'アーム増幅用のリバースプライマー（もしくは5'アーム増幅用のフォワードプライマー）に、ベクター直鎖化のための制限酵素サイト（例えば、I-SceI）を付加しておくとよい（図3）。これにより、直鎖化に使用する制限酵素を決定するためのマッピング実験を省略することができる。
【００１８】
次に、この二つのエントリークローンと、attL1配列とattL2配列の間にハイグロマイシン耐性遺伝子を導入したpENTR IRES-Hyg、pDEST R4-R3（Invitrogen）にネガティブ選択用のカセット（ここでは、SA-IRES-DTA-polyA）を付加したプラスミドとの四者間でLR組換えを行う。この２ステップだけで、エクソントラップ型の置換型ターゲティングベクターが完成する（図2）。
【００１９】
ハイグロマイシン耐性遺伝子（他の選択用マーカーでもよい。）の5'上流には、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列（例えば、IRES配列（internal ribosomal entry site ; mRNA内部のリボソーム進入サイト ; encephalomyocarditis virus (EMCV) 由来のものなど）、2Aペプチド配列（2A “self-cleaving” peptide ; Thosea asigna virus (TaV) 由来のものなど）、IRES2など）を付加する。選択用マーカーの5'上流にバイシストロン性発現を可能にするDNA配列が存在するため、遺伝子ターゲティングが起こると標的遺伝子のプロモーターに依存して選択用マーカーの遺伝子発現が起こる。
【００２０】
ハイグロマイシン耐性遺伝子はlox71とloxPで挟んでおくとよい。これにより、遺伝子ターゲティングの後、Creの一過性発現により、選択用マーカーをゲノム中から除去することができる。ただし、マーカー除去のための手法はこれに限定されない。すなわち、他のlox配列やFRT配列などの部位特異的組換え酵素の標的配列も利用することができる。
【００２１】
また、エントリークローンpENTR IRES-Hygにスプライスアクセプター部位を導入してもよい。スプライスアクセプター部位を導入することにより、5'アーム増幅用のリバースプライマーを（エクソンではなく）イントロン中に設定できる。
【００２２】
SA-IRES-DTA-polyAのカセットを5'アームの上流に付加しておくと、ポジティブ選択マーカーのSAよりも上流に別の（つまり、DTAの）SAが存在することになるため、ランダム挿入がおこったクローンが薬剤耐性を獲得する確率が大幅に減少する（図5）。DTA遺伝子の代わりに、他の自殺遺伝子（例えば、HSV-TK）、蛍光タンパク質マーカー等の他の遺伝子（例えば、GFP遺伝子、DsRed遺伝子）を用いてもよい。あるいは、何も遺伝子（やIRES）を挿入せず、単にSA-polyAのカセットを付加するだけでもよい（図6）。
【００２３】
ネガティブ選択用のカセットにDTA遺伝子のような自殺遺伝子やGFP遺伝子のような蛍光タンパク質遺伝子などのネガティブ選択マーカーを入れる場合には、IRES、2Aペプチド配列などのバイシストロン性発現を可能にするDNA配列を付加するとよいが、ネガティブ選択用のカセットに遺伝子やcDNAを入れない場合には、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列は付加しなくてもよい。
【００２４】
以上、ターゲティングベクターの作製（具体的には5'アームと選択用マーカーと3'アームを連結するステップ）はInvitrogen社のMultiSite Gatewayシステムを利用する場合を例にとり説明したが、連結方法はこの手法に限定されない。すなわち、その他の分子生物学的方法による作製や利用（たとえば制限酵素やリガーゼを利用した一般的な手法やIn-Fusion PCR Cloningなど）も可能である。エントリークローン（つまりGatewayのシステム）を利用せずに、通常の方法でターゲティングベクターを作製するためのベースとなるようなベクターとしては、選択用マーカーを含み、標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片と標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片を組み込むための部位、および、リニア化部位が組み込まれているベクターを使用するとよい。
【００２５】
本発明の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することにより、遺伝子ノックアウト細胞を作製することができる。遺伝子ノックアウト細胞は、公知の方法（例えば、Adachi, N, So, S, Iiizumi, S, et al. (2006) The human pre-B cell line Nalm-6 is highly proficient in gene targeting by homologous recombination. DNA Cell Biol. 25: 19-24; Adachi, N, Nishijima, H, Shibahara, K (2008) Gene targeting using the human Nalm-6 pre-B cell line. BioScience Trends. 2: 169-180; Toyoda, E, Kagaya, S, Cowell, IG, et al. (2008) NK314, a topoisomerase II inhibitor that specifically targets the alpha isoform. J. Biol. Chem. 283: 23711-23720）で作製することができる。簡単に説明すると、制限酵素でターゲティングベクターを直鎖化した後、エレクトロポレーション法などの遺伝子導入法により細胞に導入し、細胞を培養し、コロニーを形成させる。次いで、適宜マーカーを利用して、遺伝子変異が導入された細胞を選択する。ホモで遺伝子変異が導入された細胞（ホモ破壊株）を得るには、選択用マーカーを代えて、第２の遺伝子ターゲティングを行うとよい。また、部位特異的組換え酵素発現ベクター（例えば、Cre組換え酵素発現ベクターであるプラスミドpBS185）を細胞に導入することにより、選択用マーカーを除去することができる。選択用マーカーを除去した細胞には、別の変異を導入することができる。遺伝子ターゲティングに適した細胞としては、ヒトNalm-6細胞、ニワトリDT40細胞、マウスES細胞などを例示することができるが、これらに限定されることはない。むしろ本発明により、一般的なヒト細胞株でも遺伝子ターゲティングが容易になった。以下、ヒト線維肉腫由来がん細胞株HT1080（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクより入手可能；http://www.jhsf.or.jp/cgi-bin/HSRRB/C_ViewDetail.cgi?jcrb=IFO50354）を使った実験の説明を詳述する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
〔実施例１〕
（材料及び方法）【００２７】
ターゲティングベクターの構築
準備するもの
1. ExTaqTM ポリメラーゼ（タカラバイオ）
2. PCRプライマー：  HPRT遺伝子の増幅を例にとる。
5'アーム増幅用
(1) HPRT 5'Fw, 5’- GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCACATCACAGGTACCATATCAGTG -3’（配列番号１）; 
(2) HPRT 5'Rv  (エクソン上に設定する), 5’- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCACATCTCGAGCAAGACGTTCAGT -3’（配列番号２）; 
3'アーム用
(3) HPRT 3'Fw, 5’- GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCTGCAGGATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGC -3’ （配列番号３）; 
(4) HPRT 3'Rv  (リニア化部位となるI-SceIサイトを付加しておく), 5’- GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGTAACTCAGGGTAGAAATGCTACTTCAGGC -3’ （配列番号４） 
3. MultiSite Gateway（登録商標） Three Fragment Vector Construction Kit（Invitrogen）
4. 薬剤耐性遺伝子が組み込まれたエントリークローン（pENTR IRES-Hyg）
pENTR IRES-Hygは、pENTR loxPプラスミド（Iiizumi, S, Nomura, Y, So, S, et al. (2006) Simple one-week method to construct gene-targeting vectors: application to production of human knockout cell lines. Biotechniques 41: 311-316）をNotIで消化した後、lox71, IRES, Hyg, pA, loxPを順次付加して作製した。lox71とloxPは合成リンカーDNAを用いて付加した。IRESとpAはpIRESベクター（タカラバイオ；http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100004407）に由来する。HygはpENTR lox-Hyg（Iiizumi, S, Nomura, Y, So, S, et al. (2006) Simple one-week method to construct gene-targeting vectors: application to production of human knockout cell lines. Biotechniques 41: 311-316）に由来する。
5. デスティネーションベクター (pDEST R4-R3) （Invitrogen）  
6. デスティネーションベクター (pDEST R4-R3 SA-IRES-DTA-pA)
pDEST R4-R3 SA-IRES-DTA-pAは、以下の手順で作製した。
1. プライマー DTA-Sal Fw (5'-GTCGACATGGATCCTGATGATGTTGTTGAT-3')（配列番号７） と DTA-Not Rv (GCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTAGGTA) （配列番号８） を用いてPCRを行い、得られたDTA遺伝子断片をpIRESベクター (Clontech, Cat. No. 631605) のNotIサイトにサブクローニングした。PCRは KOD-Plus- DNAポリメラーゼ (TOYOBO) を使用し、下記の条件で行った。
94℃  2 min
94℃  30 sec
65℃  30 sec  ×35サイクル
68℃  40 sec
68℃  7 min
2. pSAβgeoプラスミド (Friedrich, G. & Soriano P. Genes Dev. 5, 1513-1523, 1991) をBamHIで消化し、Klenow断片を用いて末端を平滑化したのち、SA部位（adenovirus type 2 major late transcript splice acceptorに由来）を含む約200 bpの断片を上記1.で作製したベクターのIRES配列の上流（XhoIサイト； Klenow断片により平滑末端化）に付加した。 
3. 上記2.で作製したプラスミドをBglIIとPvuIで消化し、平滑末端化したのち、SA-IRES-DTA-pAを含むDNA断片を pDEST R4-R3プラスミド (Invitrogen) のAflIIIサイト（Klenow断片により平滑末端化）に付加した。
7. 抗生物質含有LB寒天培地：50 μg/mlカナマイシンまたは50 μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地【００２８】
プロトコール
1. ヒトゲノムDNAを鋳型として下記の条件でPCRを行い，att配列で挟まれたHPRTゲノム断片を取得した。5’アームの増幅にはプライマー(1)と(2)を、3’アームの増幅にはプライマー(3)と(4)を使用した。【００２９】
【表１】
0006037290.tif 000002
【００３０】
2. PCR産物を市販のキットで精製し、定量した。
3. BP組換え反応により、5’-エントリークローンおよび3’-エントリークローンを作製した（図2A）。下記のサンプルを0.5 mlチューブ内で混合した。
pDONR P4-P1R または pDONR P2R-P3               50 fmoles
PCRで増幅した5’-アームまたは3’-アーム        50 fmoles
全量                                            8 μl（TE溶液であわせる）
4. 上記反応液4 μl に1 μlのBPクロナーゼ II酵素ミックスを加え、よく混合した。
5. 25℃で4〜5時間インキュベートした。
6. 1 μlの2 μg/μl プロテイナーゼKを加え、よく混合した。
7. 37℃で10分インキュベートした。
8. 5 μlの反応液を50 μlの大腸菌コンピテントセルと混和し、形質転換を行った。回復培養後、組換え体を50 μg/ml カナマイシンを含むLB寒天培地に播いた。
9. カナマイシン耐性コロニーを5〜10個単離し、アルカリSDS法でプラスミドDNAを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、目的のプラスミドと予想されるクローンを2〜3個選んだ。これらの候補プラスミドを適当な制限酵素で消化したのち、アガロースゲル電気泳動を行い、目的のプラスミドであることを確認した。
10. 得られた 5’、 3’ 各エントリークローンを市販のキットで精製し、定量した。
11. LR組換え反応により、ターゲティングベクター（pHPRT-IRES-Hyg）を作製した（図2B）。各サンプルを下記のとおりに0.5 mlチューブ内で混合した。
pDEST R4-R3 または pDEST R4-R3 SA-IRES-DTA-pA         20 fmoles 
5’-エントリークローン                                10 fmoles 
3’-エントリークローン                                10 fmoles 
pENTR IRES-Hyg                                        10 fmoles 
全量                                                   8 μl（TE溶液であわせる）
12. 上記反応液4 μl に1 μlのLRクロナーゼプラス酵素ミックスを加え、よく混合した。
13. 25℃で16時間インキュベートした。
14. 1 μlの2 μg/μl プロテイナーゼKを加え、よく混合した。
15. 37℃で10分インキュベートした。
16. 5 μlの反応液を50 μlの大腸菌コンピテントセルと混和し、形質転換を行った。回復培養後、組換え体を50 μg/ml アンピシリンを含むLB寒天培地に播いた。
17. アンピシリン耐性コロニーを5〜10個単離し、アルカリSDS法でプラスミドDNAを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、目的のプラスミドと予想されるクローンを2〜3個選んだ。これらの候補プラスミドを適当な制限酵素で消化したのち、アガロースゲル電気泳動を行い、目的のプラスミド（すなわちターゲティングベクター）であることを確認した。
18. ターゲティングベクターをキットで精製し、定量した。【００３１】
ターゲティングベクターの直鎖化
準備するもの
1. 制限酵素 I-SceI、10x I-SceI反応バッファー、10 mg/ml BSA（New England Biolabs）
2. 3 M 酢酸ナトリウム：酢酸ナトリウム 40.81 gを純水80 mlに溶かしたのち、酢酸でpHを5.2に合わせ、全量を100 mlとしたもの
3. TE溶液：10 mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）、0.1 mM EDTA (pH 8.0)（4℃保存）【００３２】
プロトコール
1. ターゲティングベクターを制限酵素 I-SceI で消化した。各試薬を下記のとおりに混合し、37℃で4時間以上インキュベートした。
ターゲティングベクター  50 μg 
10x I-SceI バッファー   40 μl 
100x BSA (10 mg/ml)      4 μl 
I-SceI                  15 ユニット
全量                   400 μl（滅菌水であわせる）
2. 40 μlの3 M酢酸ナトリウムと0.9 mlのエタノールを加え、よく混合した。
3. 15,000 rpmで5分遠心した。
4. 0.5 mlの70%エタノールで3回洗浄した。
5. 3回目の遠心後、クリーンベンチ内で滅菌済みチップを使って上清を除去し、風乾した。
6. TE溶液を加え、DNAを溶解した（DNA濃度が2〜4 μg/μlとなるようにした）。
7. 65℃で15分インキュベートした。【００３３】
エレクトロポレーション法による遺伝子導入およびコロニー形成
準備するもの
1. 増殖培地：ES培地（日水製薬）に10% 仔ウシ血清（HyClone）を加えたもの。湯浴で37℃に保温しておく。
2. 直鎖化したターゲティングベクター
3. Cell Line Nucleofector（登録商標） Kit T（Lonza）
4. 選択薬剤（100 mg/ml ハイグロマイシンB）：1 gのハイグロマイシンBを純水10 mlに溶かし、ろ過滅菌したもの（4℃保存）【００３４】
プロトコール
1. 対数増殖期にあるヒトHT1080細胞（2×106個以上）を50 ml遠心チューブに回収した。
2. 1,100 rpmで5分遠心し、上清を静かに除いた。
3. 細胞塊にSolution Tを100 μl加え、細胞数をカウントした。
4. 2×106個の細胞と直鎖化したターゲティングベクター2 μgを混合し、Solution Tで100 μlとしたのち、専用のキュベットに移した。
5. キュベットをエレクトロポレーション装置（Nucleofector II, Lonza）にセットした。
6. プログラムL-005を実行した。
7. 全量をただちに増殖培地4 mlの入った60 mmディッシュに移した。
8. 上記細胞液を1 mlずつ増殖培地9 mlの入った90 mmディッシュ (×4枚) に移した。
9. 37℃で48時間培養した。
10. トリプシン処理した後1,100 rpmで5分間遠心し、細胞を回収した。
11. 適量の増殖培地に懸濁し、細胞数をカウントした。
12. 2〜4×105 cells/dishとなるように、90 mmディッシュ（増殖培地9 ml）に播種した。
13. 37℃で24時間培養した後、25〜40 μlの選択薬剤（100 mg/ml ハイグロマイシン）を加えた。
14. 37℃で2週間培養し、コロニー形成を行った。【００３５】
コロニーの単離とターゲットクローンの選別
準備するもの
1. 選択培地（ハイグロマイシンB含有培地）：増殖培地にハイグロマイシンBを0.25〜0.4 mg/mlとなるよう加えたもの
2. 0.1%トリプシン液：0.1%トリプシン/0.02%EDTA/PBS-
3. 溶解バッファー：20 mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）、250 mM 塩化ナトリウム、1% SDS
4. 10 mg/ml プロテイナーゼK：100 mgのプロテイナーゼKを純水10 mlに溶かし、ろ過滅菌したもの（-20℃保存）
5. 飽和NaCl溶液
6. ExTaqTM ポリメラーゼ
7. PCRプライマー（遺伝子ターゲティングの確認用； Iiizumi et al. Nucleic Acids Res. 2008 Nov;36(19):6333-6342.）
HPRT-F, 5'-TGAGGGCAAAGGATGTGTTACGTG-3'  （配列番号５）
HPRT-R, 5'-TTGATGTAATCCAGCAGGTCAGCA-3'  （配列番号６）【００３６】
プロトコール
1. 選択培地を1.5 ml, 増殖培地を0.75 mlずつそれぞれ24ウェルプレートに分注した。
2. 0.1%トリプシン液で処理した後、軽くピペッティングしながら選択培地1.5 mlの入ったウェルに移した (ゲノム抽出用）。
3. 細胞を移した24ウェルプレートから、0.25 ml細胞液を取り増殖培地0.75 mlの入ったウェルに移した（継代用）。
4. 37℃で2〜3日培養した。
5. ゲノム抽出用24ウェルプレートの各培養液を除去したのち、250 μlの溶解バッファーと1 μlの10 mg/mlプロテイナーゼKを加え、よくピペッティングしながら1.5 mlチューブへ移した。
6. 37℃で一晩（または55℃で1時間）インキュベートした。
7. 80 μlの飽和NaCl溶液を加え、よく混合した。
8. さらに250 μlの2-プロパノールを加え、よく混合した。
9. 15,000 rpm、4℃で15分遠心を行った。
10. 沈殿を除き、0.5 mlの70%エタノールで洗浄した。
11. 沈殿を30〜100 μlのTE溶液に溶解させた。
12. 調製したゲノムDNAを鋳型として、プライマーHPRT-FとHPRT-Rを用いて下記の反応条件でPCRを行い、ターゲットクローンをスクリーニングした。【００３７】
【表２】
0006037290.tif 000003
【００３８】
薬剤耐性遺伝子として、ハイグロマイシン耐性遺伝子の代わりに、ピューロマイシン耐性遺伝子又はeGFP遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子を用いて、上記の操作を繰り返し、ターゲティングベクターを作製した。【００３９】
また、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列として、IRES配列の代わりに、IRES2配列又は2Aペプチド配列を用いて、上記の操作を繰り返し、ターゲティングベクターを作製した。【００４０】
PCRスクリーニングで陽性と判断されたクローンについては、正しい相同組換え反応が起こっていることをサザンブロット解析により確認した。
（結果）
ヒトHT1080細胞を用いて行った遺伝子ターゲティングの結果を下記の表にまとめる。「ネガティブ（負）選択(DT-A)あり」では、SA-IRES-DTA-pAカセットを5'アームの上流に付加したターゲティングベクターを使用した。【００４１】
【表３】
0006037290.tif 000004
【００４２】
以上の結果の通り、エクソントラップ型のターゲティングベクターを使用し、これにネガティブ選択用のカセットを導入すると、ランダム挿入頻度の著しい低下に伴い、高効率で遺伝子ターゲティングを行えることがわかった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、基礎生物学分野、医療分野、農畜産分野における遺伝子ノックアウトや遺伝子トラップの汎用化・効率化に有効である。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトHPRT遺伝子を標的とする5’アーム増幅用のフォワードプライマーのDNA配列を示す。
5’- GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCACATCACAGGTACCATATCAGTG -3’
（下線部はattB4配列である）
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトHPRT遺伝子を標的とする5’アーム増幅用のリバースプライマーのDNA配列を示す。
5’- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCACATCTCGAGCAAGACGTTCAGT -3’
（下線部はattB1配列である）
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトHPRT遺伝子を標的とする3’アーム増幅用のフォワードプライマーのDNA配列を示す。
5’- GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCTGCAGGATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGC -3’
（下線部はattB2配列である）
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトHPRT遺伝子を標的とする3’アーム増幅用のリバースプライマーのDNA配列を示す。
5’- GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGTAACTCAGGGTAGAAATGCTACTTCAGGC -3’
（下線部はattB3配列である）
＜配列番号５＞
配列番号５は、遺伝子ターゲティングの確認用のPCRプライマー(HPRT-F)のDNA配列を示す。
HPRT-F, 5'-TGAGGGCAAAGGATGTGTTACGTG-3'
＜配列番号６＞
配列番号６は、遺伝子ターゲティングの確認用のPCRプライマー(HPRT-R)のDNA配列を示す。
HPRT-R, 5'-TTGATGTAATCCAGCAGGTCAGCA-3'  
＜配列番号７＞
配列番号７は、プライマー DTA-Sal Fw (5'-GTCGACATGGATCCTGATGATGTTGTTGAT-3')のDNA配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８、プライマーDTA-Not Rv (GCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTAGGTA)のDNA配列を示す。
【図１】
0006037290.tif 000005
【図２】
0006037290.tif 000006
【図３】
0006037290.tif 000007
【図４】
0006037290.tif 000008
【図５】
0006037290.tif 000009
【図６】
0006037290.tif 000010
【配列表】
0006037290000001.app