(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面（１１）上の生物学的粒子のクラスター（１２）を検出する方法であって、
該方法は
−光源を使用して、３次元表現が得られる表面を照らし、
−光センサを使用して、表面により反射または透過された光に対応する信号を検出する
ものであり、
該方法は、
ａ）検出されるクラスター（１２）がその上で成長している前記表面（１１）の３次元トポグラフィー表現（２０）を決定する第１のステップ（Ｅ１）（ここで、前記表面（１１）の前記３次元トポグラフィー表現（２０）は、前記表面のトポグラフィーの３次元マップまたは２つの隣接するピクセルの間の強度の変動が前記表面の高度の変動を表す２次元画像である）；
ｂ）前記トポグラフィー表現を前処理する操作する第２のステップ（Ｅ２）（ここで、前処理操作は、基準表面を検出するステップ、基準表面を差し引くステップを含む）、及び
前記３次元トポグラフィー表現において、生物学的粒子のクラスターに潜在的に対応する領域を画定する少なくとも１つの輪郭を検出するステップである
ｃ）前記３次元トポグラフィー表現（２０）において閉領域（２３）を画定するために輪郭（２２）を抽出する第３のステップ（Ｅ３）（ここで、ピクセルを連結している前記輪郭は、同じ勾配または同じグレーレベルに対応する）、
ｄ）生物学的粒子のクラスターに対応し得るものとして前記閉領域（２３）を特定する第４のステップ（Ｅ４）
を含み、
これらのステップは、電子データプロセッサー手段を利用して実行される、方法。
【請求項２】
前記生物学的粒子が、細菌、酵母または真菌等の微生物、および植物または動物細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的粒子が、１００μｍ以下の直径または主要寸法を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記表面（１１）が、培養培地と空気等の周囲媒体との間の界面、機能化基板の表面、および微多孔膜の表面から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記表面のトポグラフィー表現を決定することにある前記第１のステップ（Ｅ１）が、接触なしに、および試料調製なしに行われる光学的方法により実行される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記表面のトポグラフィー表現を決定することにある前記第１のステップ（Ｅ１）が、色共焦点マイクロトポグラフィーにより実行される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記表面のトポグラフィー表現を決定することにある前記第１のステップ（Ｅ１）が、シュリーレン写真またはオンブロスコピーにより実行される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの輪郭を検出することにある前記第３及び第４のステップ（Ｅ３、Ｅ４）が、表面の前記トポグラフィー表現の局所的勾配を測定して閾値化することにより実行される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
連続した時間で、第１のステップ（Ｅ１）並びに第３及び第４のステップ（Ｅ３、Ｅ４）を反復するステップと、第３及び第４のステップ（Ｅ３、Ｅ４）において特定される、経時的に変化する形状またはサイズを有する領域のみを選択するステップとを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
クラスター内に存在する生物学的粒子の量を評価することにある追加的ステップを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
クラスター内に配置された微生物のｉｎ  ｓｉｔｕまたはｅｘ  ｓｉｔｕ同定の追加的ステップを含む、請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面上、例えば培養培地または機能化基板の表面上の、微生物（細菌、酵母、真菌等）等の生物学的粒子、または植物もしくは動物細胞のクラスターを検出する方法に関する。そのような粒子は、微視的な、典型的には約０．５μｍから３ｍｍの、より具体的には、０．５μｍから１０μｍの範囲内にある寸法を示す。
【０００２】
本発明は、特に、微生物のコロニーの検出に適用される。
【背景技術】
【０００３】
多くの用途において、培養培地上、通常は栄養ゲル表面上の細菌または酵母等の微生物の成長を、可能な限り速やかに検出することが望ましい。一般に、ゲロース培養培地の表面は、数ミリメートル（ｍｍ）の距離にわたって延在する数マイクロメートル（μｍ）の局所的な深さ欠陥を示すことが多いことから、正確な平面性から大きく逸脱する。試料とともに運搬される埃または残骸もまた、高い空間周波数を示す局所的表面変形を生じ得る。
【０００４】
細菌および酵母は、可視、近紫外、または近赤外領域の光をほとんど吸収しないため、またその屈折率が周囲媒体の屈折率に非常に近いため、その成長の開始時に同定するのが困難である。したがって、典型的には、１００μｍを超える直径を示すコロニーのみを肉眼により検出することができ、コロニーがそのような直径まで成長するのに要する時間は、典型的には、約６時間（ｈ）から２４ｈである。
【０００５】
好ましくは黒いバックグラウンドに対比させた高度顕微鏡による検査は、１つの可能な手法であるが、実行するのが困難である。
【０００６】
他の技術が一般に使用される。
【０００７】
例えば、微生物の代謝により蛍光物質に変換される様々な非蛍光添加剤を使用して、微生物を蛍光性とすることができ、そのような物質は、長期にわたり微生物内に残留するように選択される。その方法は、細菌が蛍光性となるまでに相当な長さの時間（５ｈを超える）を必要とし、また、蛍光を発生する代謝物が生成される必要がある。
【０００８】
同様に、発色培地により、選択的に微生物を可視化することができるが、染色には肉眼に見えるようになるまで相当な長さの時間（数時間）を必要とするという、同じ問題が生じる。
【０００９】
さらに、それらの方法の全ては、微生物の代謝の深刻な妨害に繋がる危険性を有し、一方でその後の試験（例えば抗生物質に対する感受性の測定）には、微生物が可能な最も好ましい条件下で成長することが必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】フランス特許第２７３８３４３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、微生物のコロニー等の小さい寸法のクラスターの、その成長の開始時における早期検出の達成を可能とする、可能な限り少なく含まれる生物学的粒子の培地を検出する方法を提供することにより、上述の欠点を軽減することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、そのような目的は、表面上の生物学的粒子のクラスターを検出する方法であって、
ａ）前記表面のトポグラフィー表現を決定するステップ、および
ｂ）前記トポグラフィー表現において、生物学的粒子のクラスターに潜在的に対応する領域を画定する少なくとも１つの輪郭を検出するステップ
を含む方法により達成される。
【００１３】
これらのステップは、（特にステップａ）を実行するための）適切な測定デバイスと関連して、好適にプログラムされたコンピューターまたは他の電子データプロセッサー手段を使用して実行される。
【００１４】
本発明の有利な実行例において、
前記生物学的粒子は、細菌、酵母または真菌等の微生物、および植物または動物細胞から選択され得る。
【００１５】
前記生物学的粒子は、１０μｍから３ｍｍ、または好ましくは１００μｍを含む数百μｍ以下、例えば１００μｍ以下の範囲にある直径または主要寸法を示してもよい。
【００１６】
前記表面は、培養培地と空気等の周囲媒体との間の界面、機能化基板の表面、および微多孔膜の表面から選択され得る。
【００１７】
前記表面のトポグラフィー表現を決定することにある前記ステップａ）は、侵害を最小限とすることを保証するために、接触なしに、および試料調製なしに行われる光学的方法により実行され得る。特に、光学的方法は、色共焦点マイクロトポグラフィー、またはシュリーレン写真もしくはオンブロスコピーの方法により構成され得る。
【００１８】
少なくとも１つの輪郭を検出することにある前記ステップｂ）は、表面の前記トポグラフィー表現の局所的勾配を測定して閾値化することにより実行され得る。
【００１９】
本方法はまた、前記トポグラフィー表現を前処理する操作を含んでもよく、前処理操作は、基準表面を検出するステップと、基準表面を差し引くステップとを含む。
【００２０】
本方法は、連続した時間で、ステップａ）およびｂ）を反復するステップと、ステップｂ）において特定される、経時的に変化する形状またはサイズを有する領域のみを選択するステップとを含み得る。
【００２１】
本発明の有利な変形例において、本方法は、検出されたクラスターのサイズ、例えばその体積に関連する指標を定量化することにある追加的ステップｃ）を含み得る。これは、問題となる生物学的粒子の平均サイズが既知である場合に特に有利である。そのような状況下では、このステップｃ）により、クラスター内に存在する生物学的粒子の量を評価することができる。対象となる生物学的粒子の平均サイズを知っているため、個々に考えて、クラスターのサイズが決定されれば、前記クラスター内に存在する生物学的粒子の数を定量することは容易である。本発明のそのような変形例は、生物学的粒子が微生物であり、前記微生物のその後の処理が想定される場合に特に有利であり、この場合コロニーから試料を採取する必要がある。したがって、この変形例により、例えば試料を採取する前に、存在する微生物の量が十分であることを確証することができる。
【００２２】
本発明の有利な変形例において、方法は、クラスター内に配置された微生物のｉｎ  ｓｉｔｕまたはｅｘ  ｓｉｔｕ同定の追加的ステップを含み得る。
【００２３】
本発明の他の特徴、詳細、および利点は、例示のために示される添付の図面を参照してなされる以下の説明を読むことで明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】その上に細菌のコロニーが存在する培養培地の表面を示す図である。
【図２】本発明の実行例における本方法の様々なステップを示す図である。
【図３】本発明の方法の第１の変形例において使用される色共焦点マイクロトポグラフィーの原理を示す図である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、細菌が播種された培養培地に対し色共焦点マイクロトポグラフィーの技術を適用することにより得られた実験結果を示す図である。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅは、細菌が播種された培養培地に対し色共焦点マイクロトポグラフィーの技術を適用することにより得られた実験結果を示す図である。
【図６Ａ】シュリーレン写真の技術に基づく、本発明の方法の第２の変形例を示す図である。
【図６Ｂ】シュリーレン写真の技術に基づく、本発明の方法の第２の変形例を示す図である。
【図６Ｃ】シュリーレン写真の技術に基づく、本発明の方法の第２の変形例を示す図である。
【図６Ｄ】シュリーレン写真の技術に基づく、本発明の方法の第２の変形例を示す図である。
【図７Ａ】オンブロスコピーの技術に基づく、本発明の方法の第３の変形例を示す図である。
【図７Ｂ】オンブロスコピーの技術に基づく、本発明の方法の第３の変形例を示す図である。
【図７Ｃ】オンブロスコピーの技術に基づく、本発明の方法の第３の変形例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図１は、ペトリ皿１０の平面図を示し、皿は、表面１１上に成長した細菌１２のコロニーを有する栄養培地（ゲロース）を含有する。本発明の方法は、これらのコロニーが肉眼に見えない程非常に小さい直径（数十マイクロメートル、例えば３０μｍ以下の直径）を有する、その成長の初期段階において、これらのコロニーを検出することを目的とする。培養培地の表面１１（すなわちゲロース−空気界面）は、ゲロースの表面状態に関連した不規則性１３を示す。図１の例において、ゲロースは、空気に直接露出しており、結果として乾燥する傾向にあり、それにより、その表面の変質、特にその平均レベルの変動がもたらされる。有利には、ゲロース表面上の生物学的粒子のクラスターを検出する方法は、これらの表面不規則性、および表面が受ける変質を考慮する。
【００２６】
本発明の方法は、栄養培地の表面での細菌の増殖が隆起を形成するという既知の事実を利用する。コロニーの成長の初期段階中のこの隆起の高さは、数百ナノメートル規模、またはマイクロメートル規模である。本発明の基礎となる考えは、適切な画像処理に関連した既知の表面トポグラフィー技術を使用して、生物学的粒子のクラスターに関連した隆起を検出することにある。
【００２７】
図２に示されるように、本発明の方法の第１のステップＥ１は、検出されるクラスター１２がその上で成長している表面１１のトポグラフィー表現２０を決定することにある。この図に示される例において、トポグラフィー表現は３次元であり、具体的には、トポグラフィー表現は「３次元シート」の形態である。表面の各点は、Ｏｘｙ面内の座標（ｘ，ｙ）を有し、３次元トポグラフィー表現において、好ましくはＯｘｙ面に垂直な軸Ｏｚに沿ったｚ座標に関連している。この表現は、基準のＯｘ、Ｏｙ、Ｏｚ枠内の３次元表面の形態、または、要素ａｉ，ｊがＯｘｙ面内の座標（ｉ，ｊ）を有する点のｚ軸に沿った高さに対応する行列の形態であってもよい。
【００２８】
第２のステップＥ２は、トポグラフィー表現２０を前処理する操作であり、この操作は、ベース表面を検出して差し引くステップを含む。上で説明されたように、表面１１は明確に画定されない可能性があり、さらには経時的に変動する可能性がある。粒子のクラスターの良好な検出を確実とするために、適切なデータ処理、例えば、典型的にはマイクロメートル当たり約０．００１（μｍ−１）、例えば１／２０００μｍ−１から１／５００μｍ−１の範囲にあるカットオフ周波数でのローパス空間フィルタリングにより抽出されるベース表面を決定する必要がある。培養培地の調製による傷、厚さの変動、さらには不均一な変動、および平面性からの逸脱は、全て消失する。
【００２９】
より単純な変形例において、平面で傾いたベース表面を決定するために、表面の領域の周辺において平均勾配が計算される。
【００３０】
参照番号２１は、フィルタリングされた３次元シート（より一般的には、トポグラフィー表現）を指し、低い空間周波数の不規則性２０１（例えば培養培地１３の不規則性に起因する）は、上述の処理操作により排除されている。シート２１上に残留するものは全て、十分に小さいサイズの、および／または十分に高い空間周波数を含む不規則性および粗さ２０２である。空間周波数の「高い」という用語は、１／５００μｍ−１を超える周波数を意味するように使用される。非常に高い周波数の成分、すなわち数μｍ−１を超える空間周波数に対応する成分を排除することが可能であり、そのような成分は、培養培地を構成するゲルの粗さに対応する。
【００３１】
第３のステップＥ３は、３次元シート２１から輪郭２２を抽出することにある。既知の様式で、輪郭は、シートの局所的勾配の測定、続いて閾値化、または帯域通過空間フィルタリングによって、当業者に知られている輪郭検出器フィルタにより、例えば数／５００μｍ−１から数／１０μｍ−１の範囲にある通過帯域を有するフィルタにより検出され得る。輪郭２２の少なくともいくつかは、第４のステップＥ４において、生物学的粒子のクラスターに対応し得るものとして特定される閉領域２３を画定する。ステップＥ４は、考慮される閉領域を選択する操作を含み得る。例えば、選択基準を適用することができ、それにより、十分に小さい寸法（数十マイクロメートル規模の対角線または直径）の領域のみが、潜在的に生物学的粒子のクラスターを表すものとして維持される。変形例または組合せにおいて、連続した時間で、ステップＥ１〜Ｅ４を反復することができ、また経時的に変動する形状またはサイズを有する領域２２のみを選択することができる。生物学的粒子のクラスターは、経時的に変化する「生きた」構造であり、一方非生物学的構造は、たとえあるとしても、２つの連続した測定の間にほとんど変化しない。また、これによって、クラスターの成長速度を測定することができる。
【００３２】
検出されるクラスターがその上で成長する表面のトポグラフィー表現を決定することにある方法の第１のステップＥ１は、それ自体知られている様々な異なるマイクロトポグラフィー技術を適用することにより実行され得る。検出されるクラスターの成長の妨害を回避するために、接触を必要としない技術、具体的には、試料調製を必要としない（すなわち、染料、フルオロフォア、またはその前駆体の使用によらない）光学的技術を使用することが特に好ましい。
【００３３】
一般に、光学的マイクロトポグラフィー技術は、
光源を使用して、３次元表現が得られる表面を照らすこと、
光センサを使用して、表面により反射または透過された光に対応する信号を検出すること、および、
検出された信号から、表面の３次元トポグラフィー表現を決定すること
を含む。
【００３４】
表面の照明は、周囲媒体から表面に向けて方向付けられてもよい。照明が平行化されていない場合、測定されるゾーン上に集光されてもよい。光源は、空間および／もしくは時間干渉性であってもよく、または非干渉性であってもよい。光源は、多色または単色であってもよい。検出は、相補型金属酸化物−シリコン（ＣＭＯＳ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、光電子増倍管、フォトダイオード等の種類の１次元画像センサ（ストリップ）または２次元画像センサ（マトリックス）により実行され得る。センサは、検出された光のスペクトルの分析を可能とする分光機能を有してもよい。また、センサは、共焦点検出器デバイスを構成するために、ダイヤフラムまたは「ピンホール」と結合されてもよい。
【００３５】
以下において、本発明の好ましい実行例を構成するものとして２つの技術が詳述される。それにもかかわらず、他の光学的技術、例えばオートコリメーションまたは画像処理による表面へのオートフォーカス、干渉および／またはホログラフィー法、反射波面の分析等も、本発明の方法に適用することができる。
【００３６】
表面上の生物学的粒子のクラスターの早期検出に成功裏に適用されている、第１のマイクロトポグラフィー光学技術は、色共焦点マイクロトポグラフィーである。色共焦点マイクロトポグラフィーは、サプライヤーであるＳｔｉｌ  Ｓ．Ａ．により開発されたものであり、フランス特許第２７３８３４３号に詳述されている。
【００３７】
色共焦点マイクロトポグラフィー技術、または色共焦点画像化は、図３に示される。
【００３８】
例えばピンホールに関連した広範囲光源の形態で実装される白色光（または、いずれにしても多色光）の点光源３００は、対物レンズ３１０により集光される光線３０１を放出する。このレンズ３１０は、拡張された軸方向の色収差を示し、その結果、光線３０１の様々なスペクトル成分が、レンズの光軸に沿って離間したそれぞれの焦点３２１、３２２、３２３等に集光される。このようにして集光された垂直入射光線は、試料の表面３３０上に方向付けられる。表面３３０により反射した光は、再びレンズ３１０を通過し、この時は光源３００に向けて伝搬し、反射光の一部が、分光光度計３６０の正面に配置された軸方向に可動性のピンホール３５０に向けて方向付けられるビームスプリッタ３４０により抽出される。これにより空間フィルタリングが達成され、ピンホール３５０と共役な点から来た光線のみが、分光光度計３６０に到達することができる。レンズ３１０の軸方向の色度により、これらの光線は、レンズ３１０と反射面３３０との間の距離Ｈに依存するそれぞれの明確な波長λｉを示す。したがって、分光光度計３６０により測定される波長λｉから、距離Ｈを決定することができる。
【００３９】
このように、表面３３０のトポグラフィー表現を走査により得ることができる。
【００４０】
本発明の方法を実行するためのこの技術の使用は、播種されたゲロース培養培地、ならびに、
１キロヘルツ（ｋＨｚ）のサンプリング周波数、
約３００μｍの距離ダイナミックレンジ、および
１０００ピクセルＣＣＤストリップ（各ピクセルは３００ナノメートル（ｎｍ）の高さをコードする）をその検出器として使用した分光光度計
を特徴とする光学システムを使用することにより、実験的に実証されている。
【００４１】
スーパーピクセル化等の信号処理方法により、３００ｎｍ未満の垂直分解能を得ることができる。そのような既知の方法は、隣接するピクセルのコンテンツを結合することにより分解能を改善するのに役立つ。
【００４２】
例えば、サプライヤーであるＡｌｔｉｍｅｔ製Ａｌｔｉｓｕｒｆ  ５００装置を使用することができる。
【００４３】
実験結果は図４Ａおよび４Ｂに示され、また図５Ａから５Ｅにも示される。これらの図において、３次元シートは、完全に等価でグレースケール（暗灰色は低い高度、薄灰色または白色はより高い高度）を使用する表現により置き換えられる。
【００４４】
図４Ａは、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）が播種されたゲロース培養培地の表面のトポグラフィー表現である。表面が縞状に数十マイクロメートルにわたり歪んでいることが観察され得る。図４Ｂは、ベース表面を差し引く前処理後の同じ表現を示す。表面の歪みは消失するが、約２μｍの高さ、および１０μｍから数百μｍの範囲にある直径を有する細菌のコロニーを観察するのは困難ではない。その後、コロニーは、局所的勾配の計算および閾値化により自動的に特定された。この例において検討されたゲロース表面のサイズは、１．２ｍｍ×５ｍｍであった。
【００４５】
図５Ａは、バックグラウンドを差し引く前の、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が播種された別のゲロース培養培地の表面のトポグラフィー表現である。図５Ｂは、縞状の表面不規則性を示すバックグラウンド表面を示し、図５Ｃは、バックグラウンドが差し引かれた後の表面を示すが、細菌のコロニーが明確に現れている。
【００４６】
図５Ｄおよび５Ｅは、それらのコロニーのうちの２つの１次元プロファイルの経時的な変動（０、１．３ｈ、２．２ｈ、３ｈ、３．９ｈの時点）を示す。約２ｈ後にコロニーが検出可能となること、およびその成長速度を追跡することが可能であることが確認され得る。
【００４７】
この方法において、培地の表面のトポグラフィーの表現は、３次元表現である。検出される輪郭は、体積を画定する閉じたループに対応する。使用される輪郭検出方法に依存して、閉じたループは、同じ勾配または同じ高度に対応するピクセルを相互に連結している。
【００４８】
輪郭により画定される各体積は、指標により定量化され得るが、この指標は、前記体積に含まれるピクセルの重み（すなわち高さ）の積分を含んでもよい。この積分を計算する間、ピクセルの重みは閾値化に供されてもよい。換言すれば、ある特定の閾値を超える重み値のみが考慮される。この閾値は、輪郭を構成する１つもしくは複数のピクセルの重み、または、輪郭により画定された表面積にわたり分布する１つもしくは複数のピクセルの重みに基づいて確立され得る。
【００４９】
体積を構成する微生物の種類が既知である場合、この指標により、そのバイオマスを推定することができる。
【００５０】
別の実行例において、生物学的粒子のクラスターは、「ストリオスコピー」としても知られるシュリーレン写真法により検出される。
【００５１】
シュリーレン写真は、それ自体知られた、フーリエ光学の原理に基づく光学的方法である。図６Ａは、本発明の第２の実行例を行うためのシュリーレン構成を示す。
【００５２】
点光源６００は、実質的に単色の光の発散ビーム６０１を放出し、これがその後対物レンズ６２０により集光される。表面６１１上で成長する検出される微生物のコロニー６１２を有する播種された培養培地を含む透明ペトリ皿６１０は、集光されたビームを通過させるようにレンズ６２０のすぐ下流側に位置付けられる。レンズ６２０の焦点面には、マスク６３０が配置される。マスクは、偏向されることなくレンズおよびペトリ皿を通過してきた光源から来る光線の全てを遮蔽する。表面６１１が完全に平面で均一である（および幾何光学近似の範囲内である）場合、ビーム６０１内の光の全ては、マスクにより遮断される。実際には、コロニー６１２に起因するものを含む表面不規則性６１１は、光線の一部を偏向してマスクを通過させる。フーリエ光学の観点からは、レンズの焦点面内において、表面６１１の空間周波数スペクトルに対応する光の分布が形成され、したがってマスクは高域空間フィルタリングを行うことが知られている。
【００５３】
画像化システム（カメラ６４０）は、マスクの下流側に位置付けられ、培養培地の表面上に焦点を合わせられる。画像化システムにより取得された画像は、表面６１１の局所的勾配に関する情報を含み、したがって、前記表面の３次元シートを再構成することが可能となる（さらにより良いことには、これはすでに部分的に高域フィルタリングに供されており、いかなる前処理も必要としない）。
【００５４】
マスクは有限寸法のものであることを考慮すると、閾値以上の角度で偏向された光線のみが検出される。この閾値は、マスクがレンズの回折パターンと同じサイズを示す場合に最小となる。光源６００が純粋に点光源であると仮定すると（これは常に近似である）、検出され得る唯一の局所的勾配は、λ／（ｎ−１）ｄ（式中、λは使用される光の波長であり、ｄは、レンズの直径であり、ｎは、媒体の屈折率である）を超える勾配である。角度αの局所的勾配は、角度（ｎ−１）αで光線を偏向し、回折を超える偏差のみが観察され得る。実際には、培養培地は数ミリラジアン規模の表面欠陥を有し、いかなる前処理もなしに実行可能とするためには、この理論的境界値よりはるかに大きいマスクが必要となる。マスクの直径は、（ｎ−１）ｌ＊ｐｍａｘ（式中、ｐｍａｘは、表面欠陥の最大局所的勾配であり、ｌは、レンズとマスクとの間の距離である）の規模である必要がある。１μｍの厚さおよび３０μｍの直径を有する微小コロニーは、（１．３５−１）／１５＝２３ミリラジアンの波面に対する平均局所的勾配をもたらし、これは、ゲルの表面欠陥よりはるかに大きく、したがって容易に観察される。コロニーの端部における局所的勾配はさらにより大きく、典型的には、数百ミリラジアン（または１０分の数ラジアン）以上である。
【００５５】
色共焦点画像化等の幾何学的マッピング技術に勝るシュリーレン写真の利点は、微小コロニーのサイズよりも高い横方向の分解能を有する必要がないことであり、黒いバックグラウンドが使用されているため、分解能限界より小さい物体を検出および位置決定するのは困難ではない（ただし、当然ながら、前記分解能限界より互いに近接した２つの物体を分離することはできない）。
【００５６】
別の利点は、単一取得において、観察野が上述の共焦点マイクロトポグラフィー技術を使用した場合よりも広範な領域に及ぶことができることである。したがって、シュリーレン法により画像を取得することによって、ペトリ皿の広範な部分、またはさらに皿の全てを観察することができる。
【００５７】
この方法において、培地の表面のトポグラフィーの表現は２次元表現、すなわち画像であり、２つの隣接するピクセルの間の強度の変動は、照射された物体の表面の高度の変動、および／またはその屈折率の局所的変動を表す。検出される輪郭は、面積を画定する閉じたループに対応する。これらのループは、共通したグレーレベルの変動に対応するピクセルを相互に連結する。
【００５８】
２つの隣接するピクセルの間の高度の変動が、細菌のコロニーにより生成される場合、その端部は、典型的には１０分の数ラジアンを超える、培養培地の表面に対する角度を形成する。そのような勾配は、関連する角度が典型的には１０ミリラジアン未満である培養培地のレベルの変動により形成される勾配より大きい。
【００５９】
図６Ｂは、シュリーレン写真により本発明の方法を実行することができる別の構成を示す。図６Ａの構成とは異なり、照射ビーム３０１’は、透明ペトリ皿６１０を通過する際に平行化され、次いで、皿の下流側の第１のレンズ６２０’により集光される（レンズの焦点距離：２００ｍｍ、直径：５０ｍｍ（これらの値は例示のみを目的として示される））。第２のレンズ６２１（焦点距離：１０ｍｍ、開口数ＮＡ：ｆ／３（ここでも、これらの値は例示のみを目的として示される））は、ペトリ皿の画像を形成する。レンズ６２０’の焦点面内にあるマスク６３０’は、観察表面６１１における局所的勾配変動により、または前記表面における屈折率の局所的変動により反射されなかった光線（および下方に偏向された光線、ただしこれは必須ではない）を遮断する。細菌のコロニーが培養培地の表面６１１上で成長すると、表面に入射する光放射を偏向し、光はマスク６３０’上に集束せずに検出器６４０（例えば、１４００×１０００  ３μｍピクセルを有するカメラ）により検出される。したがって、細菌のコロニー６１２は、表面６１１における局所的勾配のばらつきを生じさせるため、それらは、黒いバックグラウンド上の光の点の形態で、検出器６４０により検出され得る。
【００６０】
図６Ａの構成の場合のように、発散／集束ビームの代わりに平行照射ビームを使用することは、信号の強度を、観察されている表面の部分の位置から独立させる効果を有する。換言すれば、観察野全体にわたり、培養培地６１０の表面６１１上の局所的勾配の位置とは無関係に、観察表面における同じ局所的勾配が、検出器において同じ強度を有する信号を生成する。
【００６１】
図６Ｃは、トリプケース大豆ゲロース（ＴＳＡ）型ゲロースの表面上に播種されてから８時間後の大腸菌型の細菌のコロニーを観察するための、図６Ｂの構成の使用に対応する。白い点は、細菌のコロニーに対応する。画像の右下部分における明るい直角を形成する連続線は、視覚的基準を構成するスライドガラスに対応する。
【００６２】
図６Ｄは、播種から２４時間後の同じ培養培地の写真である。図６Ｄにおける撮影された細菌のコロニーと、透過シュリーレン写真により検出された図６Ｃに示されるものとの間に、良好な一致が見られることが確認され得る。
【００６３】
シュリーレン写真はまた、検出器と同様に光源が培養培地に面するように配置される反射構成においても実行することができる。これは、不透明な培地を観察するのに適切である。
【００６４】
別の実行例において、細菌のコロニーは、オンブロスコピーの技術を実装した構成により観察される。そのような構成を図７Ａに示す。平行光線が、培養培地を含むペトリ皿７１０を通過し、次いで第１のレンズ７２０（レンズの焦点距離：２００ｍｍ、直径：５０ｍｍ（これらの値は、例示のみを目的として示される））により検出器７４０上に集光される。細菌のコロニー７１２が培養培地の表面７１１上に成長すると、高度、ひいては表面７１１上に形成される局所的勾配の変動のために光放射を偏向する。シュリーレン法とは異なり、観察表面上の高度の変動および／または屈折率の変動により偏向された放射は、検出器７４０（１４００×１０００  ３μｍピクセルを有するカメラ、焦点距離ｆ＝１０ｍｍ、開口数ＮＡ＝ｆ／３の対物レンズ（これらの値は例示のみを目的として示される））により検出されない。このデバイスは、検出器７４０により形成された画像に表れる暗いゾーンにより、分析される平面上の局所的勾配を検出するのに役立つ。したがって、この方法において、細菌のコロニー７１２は、薄いバックグラウンド上の暗い点の形態で観察され、このバックグラウンドは、培養培地の表面７１１に対応する。
【００６５】
シュリーレン写真の話題で上述したように、オンブロスコピーを実行する際、培地の表面のトポグラフィーの表現は２次元表現、すなわち画像であり、２つの隣接するピクセルの間の強度の変動は、照射された物体の表面の高度の変動を表す。また、この強度の変動は、前記表面における屈折率の局所的変動を表し得る。
【００６６】
図７Ｂは、ＴＳＡゲロースの表面上に播種されてから８時間後の大腸菌型の細菌のコロニーを観察するために、図７Ａの構成を使用した結果を示す。暗い点は、細菌のコロニーに対応する。これらのコロニーは、図６Ｄの結果（写真）および透過シュリーレン写真により得られた図６Ｃに示される観察に一致する場所にあることが観察され得る。
【００６７】
シュリーレン技術と同様に、オンブロスコピーにより、検出器７４０と同様に光源７００が観察される培養培地を含むペトリ皿７１０に面するように配置される反射構成において、細菌のコロニーの観察を実行することができる。図７Ｃは、そのような構成を示し、光源から生成される光放射は、ビームスプリッタ７５０により偏向され、次いでレンズ７２０により平行化される。そのような構成は、培養培地が不透明である場合に好ましい。
【００６８】
シュリーレン写真および表面マッピングの両方に関して、成長による変化を明確化するために好適な画像処理および連続画像減算の任意の方法を使用することが有利である。
【００６９】
クラスターの場所が特定されたら、細菌自体は、例えばｉｎ  ｓｉｔｕ分析（回折、ラマン分光）により、または質量分析等の他の分析方法による既知の測定を使用して同定され得る。そのような状況下では、分析はｅｘ  ｓｉｔｕで行われ、したがって細菌のコロニーを取り出す必要がある。
【００７０】
トポグラフィーによる位置は、例えば、ある特定の閾値を超える体積のクラスターを選択可能とすることができ、選択されたクラスターは、その後定性分析に供される。
【００７１】
本発明は、培養培地の表面上の微生物のコロニーを検出することに限定されない。検出される生物学的クラスター、より一般的には生物学的粒子が位置する表面は、同等に良好に、固体、例えばガラスまたは機能化シリコンの基板であってもよく、または、濾液中に得られる細菌を回収するために使用され、恐らくは、ただし必ずではないが、培養培地上に設置するのに好適な微細孔フィルタであってもよい。方法の第２のステップＥ２中に実行される前処理操作は、好ましくは、考慮される表面の種類に適合される。
【００７２】
表面の上にある周囲媒体は、真空、またはガスもしくは液体等の流体であってもよく、ガス、特に空気が好ましい。周囲媒体は、汚染の危険性、および該当する場合にはゲロースの揮発の危険性を回避するために、密閉されていてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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