【手続補正書】
【提出日】平成23年1月17日(2011.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリーフロー電気泳動により検体を分離する方法であって、当該フリーフロー電気泳動が、以下の：
少なくとも１の緩衝酸と少なくとも１の緩衝塩基を含み、ここで当該緩衝酸のｐＫａ値が、上記分離媒体のｐＨ値よりも高く、そしてここで当該緩衝塩基のｐＫａ値が、上記分離媒体のｐＨ値よりも低い、前記分離媒体；
少なくとも１の緩衝酸及び少なくとも１の強塩基を含む、陰極安定化媒体；
少なくとも１の緩衝塩基と少なくとも１の強酸基を含む、陽極安定化媒体；
を含み、そして陽極側と陰極側との間の分離媒体におけるｐＨの差異が、電気泳動の間０〜３のｐＨ単位である、
を含む緩衝組成物又はキットを用いて行われる、前記方法。
【請求項２】
前記分離媒体が、以下の：
前記緩衝酸のｐＫａ値が、前記分離媒体のｐＨ値よりも０．２〜２単位、好ましくは０．４〜０．９単位高く；
前記緩衝塩基のｐＫａ値が、前記分離媒体のｐＨ値よりも０．２〜２単位、好ましくは０．４〜０．９単位高く；
電気泳動の間の前記分離媒体における最小ｐＨ値と最大ｐＨ値との差異が、０．２〜３ｐＨ単位であり、好ましくはここで当該ｐＨの差異が、０．５〜２ｐＨ単位であり、かつ最も好ましくは０．５〜１．５ｐＨ単位であり；
前記緩衝酸のｐＫａ値と前記緩衝塩基のｐＫａ値の差異（ΔｐＫａ）が、０．５〜４．０、好ましくは０．８〜２．５、そしてより好ましくは１．２〜１．８であるか、又は前記緩衝酸のｐＫａ値と、前記緩衝塩基のｐＫａ値の差異（ΔｐＫａ）が、２．５〜４、そして好ましくは２．５〜３．３であり；
前記緩衝酸が、生物学的に許容できる緩衝物質から選択され、好ましくはＨＩＢＡ、酢酸、ピコリン酸、ＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、α-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、４-ヒドロキシピリジン及び２-ヒドロキシピリジンからなる群から選ばれ；
前記緩衝塩基が、生物学的に許容される緩衝物質から選ばれ；好ましくはタウリン、グリシン、２-アミノ-酪酸、グリシルグリシン、β-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、クレアチニン、ピリジン-エタノール、ピリジン-プロパノール、ヒスチジン、ＢＩＳＴＲＩＳ、モルフォリノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳ、アメジオール、ベンジルアミン、ジエチルアミノエタノール、トリアルキルアミンからなる群から選ばれ；そして
前記分離媒体がさらに、１又は複数の添加剤を含み、好ましくは、当該添加剤が、他の酸及び／又は塩基、必須一価及び二価アニオン及びカチオン、増粘剤、界面活性剤、タンパク質可溶化剤、アフィニティーリガンド及び還元剤から選ばれ、より好ましくは当該添加剤が、チオウレア、尿素、親水性ポリマー誘導体、例えばＨＰＭＣ、ＰＥＧ、ポリアルコール例えばグリセロール、スクロースなどの炭水化物、デキストリン又はシクロデキストリンなどのキラルセレクター、レクチン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、塩化物イオン、硫酸イオン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、アジドからなる群から選ばれる、
のうちの少なくとも１つによりさらに特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離媒体が、以下の：
すべての緩衝酸と、すべての緩衝塩基との間の濃度比が、陽極に最も近い部位において９：１〜陰極に最も近い部位について１：９までの範囲であり、好ましくは前記分離媒体が、唯一の緩衝酸と唯一の緩衝塩基とを含む２成分の培地であり、ここで分離媒体における緩衝酸と緩衝塩基の濃度がほぼ同じであり；
前記分離媒体が、少なくとも２〜１５の分離された分画であって、前記緩衝酸と緩衝塩基の様々な濃度を含んで、予め形成されたｐＨ勾配をもたらし、好ましくはここで当該分離媒体が、４〜１０の分離した分画を含み；
前記分離媒体中における互いに独立した前記緩衝酸と緩衝塩基との濃度が、５ｍＭ以上、そして好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上、最も好ましくは５０ｍＭ以上である
前記分離媒体の電気伝導性が、３０〜１０００μＳ／ｃｍ、又は５０〜５００μＳ／ｃｍ、又は５０〜４００μＳ／ｃｍ、好ましくは５０〜２００μＳ／ｃｍ、及びより好ましくは５０〜１５０μＳ／ｃｍである、
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
電気泳動のための前記陰極安定化媒体が、さらに以下の：
前記媒体中の少なくとも１の強塩基の濃度が、安定化媒体中に用いられる全ての酸の実質的な脱プロトン化を達成するために十分であり、好ましくは、安定化媒体中の前記酸と前記塩基とのあいだにおける濃度比（酸／塩基比）が、少なくとも１より多いが、５０未満であり、好ましくは当該濃度比が２〜１０であり；
陰極安定化媒体のｐＨが、分離媒体のｐＨよりも高く；
好ましくはここで、
前記緩衝酸が、酸又は両性の化合物から選ばれ、但し両性化合物の塩基官能基のｐＫａが、酸官能基のｐＫａよりも少なくとも３単位低く、ここで当該酸官能基が、３〜１３のｐＫａを有し、より好ましくは、前記緩衝酸が、ＨＩＢＡ、酢酸、ピコリン酸、ＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、α-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、４-ヒドロキシピリジン及び２-ヒドロキシピリジンからなる群から選ばれ；及び／又は
前記強塩基が、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、及び前記媒体中の緩衝酸のｐＫａよりも少なくとも３ｐＫａ単位高いｐＫａを有する他の塩基から選ばれ；
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
電気泳動用の前記陰極安定化媒体が、以下の：
前記陰極安定化媒体が、さらに少なくとも１の緩衝塩基を含み、ただし当該媒体中のすべての酸の濃度が、全ての塩基の濃度よりも高く；
前記安定化媒体中の各緩衝酸のｐＫａが、分離媒体中に用いられる各緩衝酸のｐＫａと等しいか、又は当該ｐＫａよりも高く；
前記安定化媒体中の緩衝酸と前記分離媒体中の緩衝酸とのあいだのΔｐＫａが、１未満、好ましくは０．５未満であり；
前記安定媒体における少なくとも１の緩衝酸が、同様の電気泳動移動度を有し、そして前記分離媒体中で用いられる緩衝酸と同等のｐＫａを有し；そして
前記安定化媒体中における少なくとも１の緩衝酸が、前記分離媒体中に用いられる緩衝酸に同一である；
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記陰極安定化媒体中の各緩衝酸のｐＫａが、分離されるサンプル中の最もアルカリ性の検体のｐＩよりも高く、そして場合により
当該安定化媒体が、以下の：
前記安定化媒体が、１より多くの緩衝酸を含み、好ましくは当該安定化媒体が、少なくとも２又は少なくとも３の緩衝酸を含み；
前記安定化媒体が１より多くの緩衝塩基を含み、
前記安定化媒体中の各緩衝酸のｐＫａ値が、前記分離媒体の最大ｐＨ値よりも高く、好ましくは、前記安定化媒体中の各緩衝酸のｐＫａが、（ｐＩ＋０．３）＜ｐＫａ＜（ｐＩ＋３）の範囲内であり、好ましくは（ｐＩ＋０．５）＜ｐＫａ＜（ｐＩ＋２）の範囲内であり、そして最も好ましくは（ｐＩ＋０．５）＜ｐＫａ＜（ｐＩ＋１．３）の範囲内であり；
前記各緩衝酸のｐＫａ値が（ｐＨmax＋０．３）＜ｐＫａ＜（ｐＨmax＋３）の範囲内、好ましくは（ｐＨmax＋０．５）＜ｐＫａ＜（ｐＨmax＋２）の範囲内、そして最も好ましくは（ｐＨmax＋０．５）＜ｐＫａ＜（ｐＨmax＋１．３）の範囲内であり；
安定化媒体のｐＨが、前記分離媒体の最大ｐＨよりも高いが、好ましくは前記陰極安定化媒体のｐＨが、前記分離媒体の最大ｐＨを約２ｐＨ単位以上超えることがなく；
高いｐＫａを有する緩衝酸（弱酸）の濃度が、最も低いｐＫａを有する緩衝酸（最も強い緩衝酸）の濃度よりも高く増加し、好ましくは当該弱酸の濃度が、前記媒体中の最も対良い緩衝酸の濃度よりも少なくとも２、そしてより好ましくは少なくとも約３のファクター分高くなるように増加し；
前記陰極安定化媒体中の緩衝酸の合計濃度が、前記分離媒体中の緩衝酸の合計濃度よりも約１．１〜５０倍、好ましくは約２〜２０倍、そして最も好ましくは約５〜１５倍高く、
前記安定化媒体中の全ての緩衝酸の合計濃度が、約２０ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭ、そして最も好ましくは約２００ｍＭよりも高い
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記陰極安定化媒体が、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）によりアニオン性検体を分離する際に用いられ、そして前記安定化媒体が、電極（ターミネーター）に対して最も低い有効電気泳動移動度を有する化合物を含み、そしてさらに少なくとも１の強塩基を含み、そしてここで場合により、上記ターミネーターが、緩衝酸であり、そして前記媒体中の緩衝酸のｐＫａが、好ましくはリーダー媒体中で用いられる緩衝塩基のｐＫａよりも高く、好ましくは当該陰極安定化媒体中の緩衝酸のｐＫａと、当該リーダー媒体中の緩衝塩基のｐＫａとの差異(ΔｐＫａ)が、約１〜約３、より好ましくは約１.５〜約２.５であり；及び／又は
上記ターミネーターの濃度が、少なくとも１の強塩基の濃度よりも高く；及び／又は
前記ターミネーターの濃度が、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭであり、そして好ましくは約５０ｍＭ〜約２００ｍＭであるか、又は
ここで、当該陰極安定化媒体が、カチオン性フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）によりカチオン性検体を分離する際に用いられ、そして当該陰極安定化媒体が、少なくとも１の強塩基及び少なくとも１の緩衝酸を含み、ここで当該緩衝酸の濃度が、強塩基の濃度よりも高く；そして場合により
少なくとも１の強塩基の濃度及び上記緩衝酸の濃度が、カチオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度よりも高く；及び／又は
少なくとも１の強塩基の濃度及び上記緩衝酸の濃度が、カチオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度よりも高く、そして緩衝酸及び／又は少なくとも１の強塩基の濃度が、カチオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度に対して１.５〜５０倍増加され、好ましくは当該濃度が２〜２０倍増加され、そして最も好ましくは当該濃度が５〜１５倍増加される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
電気泳動用の前記陽極安定化媒体が、以下の：
前記媒体中の少なくとも１の強酸の濃度が、安定化媒体中に用いられる全ての塩基の実質的にプロトン化を達成するために十分であり、好ましくは当該安定化媒体中の塩基及び酸のあいだの濃度比（塩基／酸の比）が、少なくとも１超であるが、５０未満であり、好ましくは当該濃度比が２〜１０であり；
上記陽極安定化媒体が、分離媒体のｐＨよりも低く；
前記緩衝塩基が、生物学的に許容される塩基と両性の化合物から選ばれ、ただし当該両性化合物中の酸官能基のｐＫａが、当該塩基官能基のｐＫａよりも少なくとも４ユニット大きいことが条件であり、好ましくは当該緩衝塩基が、タウリン、グリシン、２-アミノ-酪酸、グリシルグリシン、β-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、クレアチニン、ピリジン-エタノール、ピリジン-プロパノール、ヒスチジン、ＢＩＳＴＲＩＳ、モルフォリノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳ、アメジオール、ベンジルアミン、ジエチルアミノエタノール、トリアルキルアミンからなる群から選ばれ、そして
上記強酸が塩酸、硫酸、リン酸、及び他の酸であって、前記媒体中の緩衝塩基のｐＫａよりも少なくとも３ｐＫユニット低いｐＫａを有する他の酸から選ばれる、
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記電気泳動用の陽極安定化媒体が、さらに以下の：
少なくとも１の緩衝酸をさらに含む陽極安定化媒体、但し前記媒体中全ての塩基の濃度が全ての酸の濃度よりも高く；
前記安定化媒体中の各緩衝塩基のｐＫａが、前記分離媒体中に用いられる各緩衝塩基のｐＫａと同一であるか、又はそれより低く；
前記安定化媒体中の前記緩衝塩基と、前記分離媒体中の前記緩衝塩基とのあいだのΔｐＫａが、１未満、好ましくは０．５未満であり；
前記安定化媒体中の少なくとも１の緩衝塩基が、前記分離媒体中に用いられる緩衝塩基に対して同等の電気泳動移動度を有し；そして
前記安定化媒体中の少なくとも１の緩衝塩基が、前記分離媒体中に用いられる緩衝塩基に同一である、
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記陽極安定化媒体中の各緩衝塩基のｐＫａが、前記サンプル中の酸性検体のｐＩよりも低く；そして場合により当該陽極安定化媒体が、以下の：
当該陽極安定化媒体が、１又は複数の緩衝塩基を含み、好ましくは当該安定化媒体が、少なくとも２又は少なくとも３の緩衝塩基を含み；
前記陽極安定化媒体中の各緩衝塩基のｐＫａが、（ｐＩ−３）＜ｐＫａ＜（ｐＩ−０．３）の範囲、好ましくは(ｐＩ-２)＜ｐＫａ＜(ｐＩ-０.５)の範囲、そして最も好ましくは(ｐＩ-１.３)＜ｐＫａ＜(ｐＩ-０.５)の範囲内であり；
前記陽極安定化媒体のｐＨが、分離媒体の最小ｐＨ未満であり、好ましくは陽極安定化媒体のｐＨが、分離媒体の最小ｐＨよりも約２ｐＨ単位低いことはなく；そして
前記陽極安定化媒体中の各緩衝塩基のｐＫａ値が、分離媒体の最小ｐＨ値よりも高く、好ましくは各緩衝塩基のｐＫａ値が、(ｐＨmin-３)＜ｐＫａ＜(ｐＨmin−０.３)の範囲、より好ましくは(ｐＨmin-２)＜ｐＫａ＜(ｐＨmin−０.５)の範囲、そして最も好ましくは(ｐＨmin-１.３)＜ｐＫａ＜(ｐＨmin-０.５)の範囲内である、
うちの少なくとも１によりさらに定義される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記陽極安定化媒体が、以下の：
低いｐＫａ（弱塩基）を有する陽極安定化媒体中の緩衝塩基の濃度が、最も低いｐＫａを有する緩衝塩基(最も強い緩衝塩基)の濃度よりも高く増加させられており、好ましくは当該弱塩基の濃度は、当該媒体中の最も強い緩衝塩基の濃度よりも、少なくとも２の因子分、そして好ましくは少なくとも３の因子分高くされており；陽極安定化媒体中の緩衝塩基の合計濃度が、前記分離媒体中の緩衝塩基の合計濃度よりも、１．１〜５０倍、好ましくは約２〜２０倍、そして最も好ましくは、５〜１５倍であり；そして
陽極安定化媒体中の全ての塩基の濃度が、２０ｍＭ超、好ましくは５０ｍＭ超、そして最も好ましくは２００ｍＭ超である
のうちの少なくとも１によりさらに定義される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記陽極安定化媒体が、フリーフロー電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）によりカチオン性検体を分離する際に用いられ、そしてここで当該安定化媒体が、陰極（ターミネーター）に対して最も遅い電気泳動移動度を有する化合物を含み、そしてさらに少なくとも１の強酸を含み、そして場合により、ここで
当該ターミネーターが、緩衝塩基であり、当該媒体中の当該緩衝塩基のｐＫａが、好ましくはリーダー培地中に用いられる緩衝酸のｐＫａよりも低く、より好ましくは陽極安定化媒体中の緩衝塩基のｐＫａと、リーダー媒体中の緩衝酸のｐＫａとのあいだの差異（ΔｐＫａ）が、１〜３であり、最も好ましくは１．５〜２．５であり；及び／又は
当該ターミネーターの濃度が、少なくとも１の強酸の濃度よりも高く；及び／又は
当該ターミネーターの濃度が、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、そして好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭのあいだであり、
ここで当該陽極安定化媒体が、アニオン性フリーフロー電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）によりアニオン性検体を分離する際に用いられ、ここで当該陽極安定化媒体が、少なくとも１の強酸及び少なくとも１の緩衝塩基を含み、ここで当該緩衝塩基の濃度が、当該強酸の濃度よりも高く；そして場合によりここで
当該少なくとも１の強酸と、緩衝塩基の濃度が、アニオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度よりも高く、及び／又は
当該少なくとも１の強酸と、緩衝塩基の濃度が、アニオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度よりも高く、かつここで緩衝塩基及び／又は少なくとも１の強酸の濃度が、互いに独立に、アニオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度よりも、１．５〜５０倍、好ましくは２〜２０倍、もっと好ましくは５〜１５倍高い濃度である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記陽極及び／又は陰極安定化媒体が、さらに、少なくとも１の添加剤、好ましくはここで少なくとも１の添加剤は、他の酸及び／又は塩基、一価及び二価アニオン及びカチオン、増粘剤、界面活性剤、タンパク質可溶化剤、アフィニティーリガンド及び還元剤から選ばれ、より好ましくは当該少なくとも１の添加剤は、チオウレア、尿素、親水性ポリマー誘導体、例えばＨＰＭＣ、ＰＥＧ、ポリアルコール例えばグリセロール、スクロースなどの炭水化物、デキストリン又はシクロデキストリンなどのキラルセレクター、レクチン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、クロリドイオン硫酸イオン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、アジドからなる群から選ばれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定化媒体の伝導性が、約５００μＳ／ｃｍ、好ましくは約１０００μＳ／ｃｍ、最も好ましくは約２０００μＳ／ｃｍよりも高く；及び／又は
前記安定化媒体の伝導性が、分離媒体の伝導性よりも少なくとも３、そして好ましくは少なくとも約５、そして最も好ましくは少なくとも１０の因子の分、分離媒体の伝導性より高い、請求項１〜１３のいずれかに記載の安定化媒体。
【請求項１５】
フリーフロー電気泳動によりサンプル中のリポソーム集合を分離するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、分離媒体が、１０００μＳ／ｃｍの伝導性を有し、好ましくは前記媒体が、６００μＳ／ｃｍ未満の伝導性を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
リポソームの少なくとも１の分画が、２０×１０-9ｍ２／Ｖｓ未満の有効な電気泳動移動度を有し；
前記分離媒体中の緩衝酸の濃度と緩衝塩基の相対濃度が、９：１〜１：９であり、好ましくは分離媒体中の緩衝酸と緩衝塩基の濃度が、実質的に同じであり；及び／又は
分離媒体中のｐＨが、６〜８であり、好ましくは分離媒体が７のｐＨを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の電気泳動分離方法を実施するためのキットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離媒体、請求項１及び４〜７のいずれか一項に記載の陰極安定化媒体、並びに請求項１及び８〜１２のいずれか一項に記載の陽極安定化媒体を含む、前記キット。