【手続補正書】
【提出日】平成22年12月24日(2010.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ホルシチアシド注射剤およびその調製方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬技術領域に属し、具体的には、レンギョウの有効成分であるホルシチアシドから調製される注射製剤に関する。本発明はまた、当該ホルシチアシド注射製剤の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルシチアシド（Forsythoside A）は、モクセイ科レンギョウ属の植物であるレンギョウ（Fructus Forsythiae）から抽出される有効成分である。従来はホルシチン（Forsythin）がレンギョウ抽出工程の指標と考えられていたが、近年、レンギョウの有効成分に関する研究の進展に伴って、ホルシチンには抗菌活性がなく、抗菌活性を発揮するのはホルシチアシドであることが明らかになった。また、ホルシチアシド中ではホルシチアシドＡの含有量が高く、かつ、抗菌作用を発揮するのはほとんどすべてホルシチアシドＡであるが、ホルシチアシドＡは単独で安定して存在することは難しい。そのため、習慣上、通常はホルシチアシドＡを含むホルシチアシド類有効成分をホルシチアシドと称する。ホルシチアシド（Ａ）の構造式は以下のとおりである： 
【０００３】
【化１】
2010514706.tif 000001
【０００４】
文献には、ホルシチアシドはカフェー酸の誘導体であって、分子構造中にはエステル結合とグルコシド結合とを有し、酸、アルカリ及び高温条件化で容易に分解し、分解後に生成されるカフェー酸、Ｄ−ブドウ糖、Ｌ−ラムノースおよび一次グルコシドの抗菌活性は大きく低下する、と示されている。従来この問題には注意が払われなかったため、銀翹解毒丸、銀翹解毒片（漢方薬の名称）等の製剤はカフェー酸のみを検出し、ホルシチアシド（Ａ）は加工過程中で加水分解していた可能性がある。
【０００５】
研究を重ねた結果、発明者は、ホルシチアシドを最大限に分離して高純度のホルシチアシド有効成分を取得し、さらに注射薬剤として調製することができれば、必ずや現存の臨床用薬を補完すると考察するに至った。従来の技術研究において、発明者は高純度のホルシチアシドを抽出する工程方法を取得した。しかしながら、従来技術では、どのような種類の補助材料を選択するか、および、補助材料の用量等のホルシチアシド注射製剤に関する薬学技術について示されておらず、また、従来技術において既知であるホルシチアシドは不安定な特性を有していることも、ホルシチアシドを注射製剤とするうえで大きな困難となり、従来技術においてはこの問題を解決しうるいかなる示唆も認められない。しかしながら、ホルシチアシドの優良な薬効を考慮して、本願の発明者はやはり多くの科学的研究を行い、ホルシチアシドを注射製剤として調製することについて有益な探求を行い、予想しえない効果を得るに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の従来技術の問題に対し、本発明が解決しようとする技術的課題の第一は、ホルシチアシドの注射製剤を提供することである。本発明が解決しようとする技術的課題の第二は、当該ホルシチアシド注射製剤の調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の技術的解決手段によって、はじめて実現される：
【０００８】
本発明が提供するホルシチアシド注射製剤は、主にホルシチアシドと薬用補助材料とから調製され、ここで、ホルシチアシドと薬用補助材料との重量比は１：（０〜５）であり、最も好ましくは１：（０〜３）である。
【０００９】
本発明のホルシチアシド注射製剤は、凍結乾燥粉末注射剤、液体注射剤、輸液製剤である。
【００１０】
本発明で言及するホルシチアシドは、純度９０％以上のホルシチアシド、または注射用に適するホルシチアシドであり、取得源としては、レンギョウ属植物中から抽出して取得してもよく、購入または合成して取得してもよい。
【００１１】
本発明のホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤に用いる薬用補助材料は構成剤と称され、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトールのうちの、一種類または任意の二種類の混合物である。最も好ましい技術的解決手段としては、ホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤中に構成剤を加えない、つまり、ホルシチアシドと構成剤との重量比が１：０である。
【００１２】
本発明のホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤は以下の方法により調製される：ホルシチアシドと構成剤とを重量比に従って混合し、注射用水をホルシチアシドの重量の１０〜５０倍になるまで加えて溶解し、ｐＨ値を３．０〜６．０に調節し、精密ろ過、限外ろ過の後に充填し、表１に示すような凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させる。
【００１３】
【表１】
2010514706.tif 000002
【００１４】
本発明のホルシチアシド液体注射剤に用いる薬用補助材料は安定化剤と称され、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸ソーダカルシウム、エチレンジアミンテトラ酢酸カルシウム、ビタミンＣ、ピロ亜硫酸のうちの、一種類または数種類である。
【００１５】
本発明のホルシチアシド液体注射剤は以下の方法により調製される：注射用水中にホルシチアシドの０〜５倍に相当する重量の安定化剤を加えて攪拌し、完全に溶解させる；全量の０．５〜０．０５％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭する；ホルシチアシドを加えて完全に溶解させ、ｐＨ値を３．０〜６．０に調節する；全量の０．２〜０．０２％の活性炭を加え、室温で攪拌し、ろ過脱炭し、ろ液中に注射用水を全量になるまで加えて、ｐＨ値および活性成分含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、充填、滅菌、包装する。本発明のホルシチアシド輸液製剤に用いる薬用補助材料は安定化剤と称され、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸ソーダカルシウム、エチレンジアミンテトラ酢酸カルシウム、ビタミンＣ、ピロ亜硫酸のうちの、一種類または数種類である。
【００１６】
本発明のホルシチアシド輸液製剤は以下の方法によって調製される：注射用水中に塩化ナトリウムまたはブドウ糖と、ホルシチアシドの０〜５倍に相当する重量の安定化剤を加えて攪拌し、完全に溶解させる；全量の０．５〜０．０５％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭する；ホルシチアシドを加え、攪拌して完全に溶解させる；ｐＨ値を３．０〜６．０に調節する；全量の０．２〜０．０２％の活性炭を加え、均一に混ぜ、室温で攪拌し、ろ過脱炭する；ろ液中に注射用水を全量になるまで加えて、ｐＨ値および活性成分含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、充填、滅菌、包装する。
【００１７】
本発明に述べる液体注射剤および輸液製剤の調製において、加えられる活性炭の重量は全量体積に対する百分比の値である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は上記の技術的解決手段を採用することにより、以下の長所を有する：
１．ホルシチアシドを注射剤の活性成分として用いるのは、本発明が初めてである。ホルシチアシドの研究のホットスポットはその抗菌抗ウィルス作用であり、また、ホルシチアシドは薬物成分の検出指標として用いうると考えられてきたが、この点については実現されていない。従来技術では、ホルシチアシドを注射剤の活性成分として用いることは報告されておらず、どのような種類の補助材料を選択するか、および補助材料の用量等のホルシチアシド注射製剤に関する薬学技術について示されておらず、また、ホルシチアシドを活性成分とする注射剤に関する示唆も認められない。本発明は実験によって厳格にスクリーニングすることにより、薬用補助材料の種類と用量、および凍結乾燥粉末注射剤の凍結乾燥工程について特定した。
【００１９】
本発明はまた、通常の凍結乾燥粉末注射剤の調製においては、往々にして一定量の保護剤補助材料を加える必要があり、これによってはじめて形成しうるという技術的な偏見を克服した。本発明は、ホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤を直接凍結乾燥させれば良好な外形を得られ、かつ比較的容易に凍結乾燥し、補助材料を加えなくてもよいことを示している。ホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤にいかなる薬用補助材料を加えずとも注射剤としての要求を満たすことができることもまた、予期しえない技術的効果である。工程的な簡便性を実現し、コストを節約するとともに、補助材料がもたらす安全性の問題を回避することも可能である。
【００２０】
本発明はホルシチアシドの特性に完全に基づいて創造したものであり、ホルシチアシドの熱に対する不安定性のため、全工程で冷凍または低温を採用して、ホルシチアシドの活性成分の破壊を回避している。凍結乾燥粉末注射剤製品は目が粗く、水を加えた後の再溶解効果は良好である。輸液製剤および液体注射剤もまた、補助材料の作用のもとで、比較的良好な安定性を保持できる。
【００２１】
２．本発明は工業的な生産を実現できる。同時に、本発明は良好な治療効果を有し、解熱抗炎症方面での効果がとりわけ顕著である。また、多種の細菌やウィルスにも有効で、良好な市場展望と社会的実益を有している。従って、本発明は実用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明のホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤の凍結乾燥工程を示す曲線グラフである。
【図２】本発明のホルシチアシド標準試料の液相クロマトグラフである。
【図３】本発明のホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤のサンプルの液相クロマトグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、実施例を組み合わせて本発明の内容をさらに説明する。実施例１〜９は凍結乾燥粉末注射剤に関し、実施例１０〜１４は液体注射剤に関し、実施例１５〜１８は輸液製剤に関する。
【００２４】
実施例１
ホルシチアシド７５ｇを採取し、注射用水１２００ｍｌを加え、攪拌して溶解させ、０．２２μｍの微細孔ろ膜を用いて除菌ろ過し、さらに８０００ダルトンの限外ろ過膜を用いて発熱原（pyrogen）を除いた。中間体検査で合格した後に、注射用水で体積を補い、１０００本に分包し、フリーザーに入れ、凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させた。ホルシチアシド標準試料の液相クロマトグラフを図２に示し、本実施例で調製して得られるホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤の液相クロマトグラフを図３に示す。
【００２５】
凍結乾燥曲線は以下の表１のとおり：
【表２】
2010514706.tif 000003
【００２６】
実施例２
ホルシチアシド７５ｇ、マンニトール７５ｇを採取して混合し、注射用水２０００ｍｌを加え、攪拌して溶解させ、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝塩でｐＨ値を５．５に調節し、０．２２μｍの微細孔ろ膜を用いて除菌ろ過し、さらに６０００ダルトンの限外ろ過膜を用いて発熱原（pyrogen）を除いた。中間体検査で合格した後に、注射用水で体積を補い、１０００本に分包し、フリーザーに入れ、凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させた。凍結乾燥曲線は実施例１と同一である。
【００２７】
実施例３
ホルシチアシド５０ｇ、ブドウ糖１００ｇを採取して混合し、注射用水１０００ｍｌを加え、攪拌して溶解させ、クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩でｐＨ値を５．０〜６．０に調節し、０．２２μｍの微細孔ろ膜を用いて除菌ろ過し、さらに８０００ダルトンの限外ろ過膜を用いて発熱原（pyrogen）を除いた。中間体検査で合格した後に、注射用水で体積を補い、１０００本に分包し、フリーザーに入れ、凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させた。凍結乾燥曲線は実施例１と同一である。
【００２８】
実施例４
ホルシチアシド１００ｇ、マンニトール７５ｇとブドウ糖７５ｇを採取して混合し、注射用水２５００ｍｌを加え、攪拌して溶解させ、酢酸塩緩衝塩でｐＨ値を３．０に調節し、０．２２μｍの微細孔ろ膜を用いて除菌ろ過し、さらに８０００ダルトンの限外ろ過膜を用いて発熱原（pyrogen）を除いた。中間体検査で合格した後に、注射用水で体積を補い、２０００本に分包し、フリーザーに入れ、凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させた。凍結乾燥曲線は実施例１と同一である。
【００２９】
実施例５
ホルシチアシド１００ｇ、マンニトール１００ｇとソルビトール１００ｇを採取して混合し、注射用水３０００ｍｌを加え、攪拌して溶解させ、クエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝塩でｐＨ値を６．０に調節し、０．２２μｍの微細孔ろ膜を用いて除菌ろ過し、さらに８０００ダルトンの限外ろ過膜を用いて発熱原（pyrogen）を除いた。中間体検査で合格した後に、注射用水で体積を補い、２０００本に分包し、フリーザーに入れ、凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させた。凍結乾燥曲線は実施例１と同一である。
【００３０】
実施例６
ホルシチアシド１５０ｇ、ブドウ糖１５０ｇを採取して混合し、注射用水５０００ｍｌを加え、攪拌して溶解させ、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝塩でｐＨ値を４．５に調節し、０．２２μｍの微細孔ろ膜を用いて除菌ろ過し、さらに８０００ダルトンの限外ろ過膜を用いて発熱原（pyrogen）を除いた。中間体検査で合格した後に、注射用水で体積を補い、１０００本に分包し、フリーザーに入れ、凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させた。凍結乾燥曲線は実施例１と同一である。
【００３１】
実施例７
ホルシチアシド１５０ｇ、ブドウ糖１５０ｇとソルビトール１５０ｇを採取して混合し、注射用水６０００ｍｌを加え、攪拌して溶解させ、クエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝塩でｐＨ値を５．５に調節した。０．２２μｍの微細孔ろ膜を用いて除菌ろ過し、さらに８０００ダルトンの限外ろ過膜を用いて発熱原（pyrogen）を除いた。中間体検査で合格した後に、注射用水で体積を補い、１０００本に分包し、フリーザーに入れ、凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させた。凍結乾燥曲線は実施例１と同一である。
【００３２】
実施例８
ホルシチアシド２００ｇ、ソルビトール６００ｇを採取して混合し、注射用水８０００ｍｌを加え、攪拌して溶解させ、クエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝塩でｐＨ値を６．０に調節し、０．２２μｍの微細孔ろ膜を用いて除菌ろ過し、さらに６０００ダルトンの限外ろ過膜を用いて発熱原（pyrogen）を除いた。中間体検査で合格した後に、注射用水で体積を補い、４０００本に分包し、フリーザーに入れ、凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させた。凍結乾燥曲線は実施例１と同一である。
【００３３】
実施例９
ホルシチアシド７５ｇ、マンニトール２００ｇとブドウ糖１７５ｇを採取して混合し、注射用水３７５０ｍｌを加え、攪拌して溶解させ、クエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝塩でｐＨ値を６．０に調節し、０．２２μｍの微細孔ろ膜を用いて除菌ろ過し、さらに８０００ダルトンの限外ろ過膜を用いて発熱原（pyrogen）を除いた。中間体検査で合格した後に、注射用水で体積を補い、１０００本に分包し、フリーザーに入れ、凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥して完成させた。凍結乾燥曲線は実施例１と同一である。
【００３４】
実施例１０
注射用水中に２．５ｇのエチレンジアミンテトラ酢酸ソーダカルシウムを加えて攪拌し、完全に溶解させた。全量２Ｌの０．０５％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭した。７５ｇのホルシチアシドを加えて完全に溶解させ、クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩溶液を加えてｐＨ値を３．０〜６．０に調節し、全量２Ｌの０．０２％の活性炭を加え、室温で攪拌し、ろ過脱炭し、ろ液中に注射用水を全量２Ｌになるまで加え、ｐＨ値を測定し、含有量が確認された後に、透明になるまで繰返しろ過し、１０００本に分包し、滅菌、包装した。
【００３５】
実施例１１
注射用水中に２．５ｇのピロ亜硫酸を加えて攪拌し、完全に溶解させた。全量５Ｌの０．５％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭した。１５０ｇのホルシチアシドを加えて完全に溶解させ、クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩溶液を加えてｐＨ値を３．０〜６．０に調節し、全量５Ｌの０．２％の活性炭を加え、室温で攪拌し、ろ過脱炭し、ろ液中に注射用水を全量５Ｌになるまで加え、ｐＨ値およびホルシチアシド含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、１０００本に分包し、滅菌、包装した。
【００３６】
実施例１２
注射用水中に２．５ｇのエチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウムを加えて攪拌し、完全に溶解させた。全量１０Ｌの０．１％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭した。１５０ｇのホルシチアシドを加えて完全に溶解させ、クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩溶液を加えてｐＨ値を３．０〜６．０に調節し、全量１０Ｌの０．１％の活性炭を加え、室温で攪拌し、ろ過脱炭し、ろ液中に注射用水を全量１０Ｌになるまで加え、ｐＨ値およびホルシチアシド含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、１０００本に分包し、滅菌、包装した。
【００３７】
実施例１３
注射用水中に２２５ｇのビタミンＣを加えて攪拌し、完全に溶解させた。全量５Ｌの０．４％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭した。７５ｇのホルシチアシドを加えて完全に溶解させ、クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩溶液を加えてｐＨ値を３．０〜６．０に調節し、全量５Ｌの０．０５％の活性炭を加え、室温で攪拌し、ろ過脱炭し、ろ液中に注射用水を全量５Ｌになるまで加え、ｐＨ値およびホルシチアシド含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、１０００本に分包し、滅菌、包装した。
【００３８】
実施例１４
注射用水中に３７５ｇのビタミンＣを加えて攪拌し、完全に溶解させた。全量１０Ｌの０．１％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭した。７５ｇのホルシチアシドを加えて完全に溶解させ、クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩溶液を加えてｐＨ値を３．０〜６．０に調節し、全量１０Ｌの０．２％の活性炭を加え、室温で攪拌し、ろ過脱炭し、ろ液中に注射用水を全量１０Ｌになるまで加え、ｐＨ値およびホルシチアシド含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、１０００本に分包し、滅菌、包装した。
【００３９】
実施例１５
注射用水中に９．０ｇの水酸化ナトリウムと０．１ｇのエチレンジアミンテトラ酢酸ソーダカルシウムを加え、攪拌して完全に溶解させた。全量１Ｌの０．０５％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭した。０．６ｇのホルシチアシドを加えて攪拌して完全に溶解させた。クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩溶液を加えてｐＨ値を３．０〜６．０に調節した。全量１Ｌの０．０２％の活性炭を加え、均一に混ぜ、室温で攪拌し、ろ過脱炭した。ろ液中に注射用水を全量１Ｌになるまで加え、ｐＨ値およびホルシチアシド含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、４瓶に分包し、滅菌、包装した。
【００４０】
実施例１６
注射用水中に９．０ｇの水酸化ナトリウムと０．１ｇのピロ亜硫酸を加えて攪拌し、完全に溶解させた。全量１Ｌの０．３％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭した。０．３ｇのホルシチアシドを加え、攪拌して完全に溶解させた。クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩溶液を加えてｐＨ値を３．０〜６．０に調節した。全量１Ｌの０．０５％の活性炭を加え、均一に混ぜ、室温で攪拌し、ろ過脱炭した。ろ液中に注射用水を全量１Ｌになるまで加え、ｐＨ値およびホルシチアシド含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、４瓶に分包し、滅菌、包装した。
【００４１】
実施例１７
注射用水中に５０ｇのブドウ糖と０．９ｇのビタミンＣを加えて攪拌し、完全に溶解させた。全量２Ｌの０．０５％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭した。０．３ｇのホルシチアシドを加え、攪拌して完全に溶解させた。クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩溶液を加えてｐＨ値を３．０〜６．０に調節した。全量２Ｌの０．１％の活性炭を加え、均一に混ぜ、室温で攪拌し、ろ過脱炭した。ろ液中に注射用水を全量２Ｌになるまで加え、ｐＨ値およびホルシチアシド含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、４瓶に分包し、滅菌、包装した。
【００４２】
実施例１８
注射用水中に１００ｇのブドウ糖と１．５ｇのビタミンＣを加えて攪拌し、完全に溶解させた。全量１Ｌの０．５％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭した。０．３ｇのホルシチアシドを加え、攪拌して完全に溶解させた。クエン酸−リン酸二水素ナトリウム緩衝塩溶液を加えてｐＨ値を３．０〜６．０に調節した。全量１Ｌの０．１％の活性炭を加え、均一に混ぜ、室温で攪拌し、ろ過脱炭した。ろ液中に注射用水を全量１Ｌになるまで加え、ｐＨ値およびホルシチアシド含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、４瓶に分包し、滅菌、包装した。
【００４３】
以下、薬理学実験を組み合わせて、本発明のホルシチアシド注射製剤が解熱および抗炎症について良好な治療効果を有することを説明する。ホルシチアシド輸液製剤の薬理学結果については、ホルシチアシド液体注射剤の結果を参照のこと。
【００４４】
１．１解熱薬理学実験（２，４-ジニトロフェノールで発熱させたラットの解熱試験）。
ＳＤラット４８匹を用意し、無作為に、ＮＳグループ、双黄連（漢方薬の名称）コントロールグループ、実施例１〜９のうちいずれかの実施例で調製して得られたホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤グループ、実施例１０〜１４のうちいずれかの実施例で調製して得られたホルシチアシド液体注射剤グループの４グループに分けた。試験の前に、各個体について二回体温を測定し、平均値を取って基礎体温とした。一日あたりの臨床用量の６倍に相当する１０ｍｌ／（ｋｇ・ｄ）の薬剤を、尾に静脈注射して投与した直後に、用事調製した１．５ｍｇ／ｍｌの２，４-ジニトロフェノール１ｍｌ／ｋｇを背部に皮下注射し、０．５、１、１．５、２、３、４ｈでの個体の体温を測定して記録した。
【００４５】
投与後０．５ｈではホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤グループとＮＳコントロールグループとの間に顕著な差異（Ｐ＜０．０５）が現れ、投与後１ｈ〜２ｈではホルシチアシド液体注射剤グループおよびホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤グループとＮＳコントロールグループとの間に、程度の異なる顕著な差異（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）が現れ、双黄連コントロールグループは投与後０．５ｈ〜３ｈではＮＳコントロールグループと比較して差異（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）が現れ、投与後４ｈではＮＳコントロールグループと比較して差異は認められないことが、実験の結果示された。結果については表２を参照。
【００４６】
【表３】
2010514706.tif 000004
注：ＮＳグループと比較して、＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１
【００４７】
１．２ 抗炎症薬理学試験。
１．２．１ホルシチアシド注射製剤の、キシレンで耳を腫脹させたマウスに対する作用
マウス４８匹を用意し、上述した解熱薬理学試験と同様の４グループに無作為に分けた。一日あたりの臨床用量の１０倍に相当する１０ｍｌ／（ｋｇ・ｄ）を注射により４日間投与し、最後の投与の３０ｍｉｎ後に各マウスの左耳にキシレン５０ｕｌを塗布し、右耳はブランクコントロールとした。炎症発症の１５ｍｉｎ後にマウスを絶命させ、両耳を切断して、穿孔器（直径７ｍｍ）で両耳の同一部位からそれぞれ耳片を採取し、計量して、腫脹度と腫脹抑制率を算出した。
【００４８】
【数１】
2010514706.tif 000005
【００４９】
ＮＳグループのマウスの左耳は紅く腫脹し、耳の腫脹度は０．０１４５±０．００３７ｇに達した。それに対し、ホルシチアシドの各注射製剤のグループのマウスおよび双黄連コントロールグループの耳の腫脹度はいずれもＮＳコントロールグループより小さく、また、ＮＳグループと比較して、程度の異なる顕著な差異（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）が認められることが、実験の結果示された。結果については表３を参照。
【００５０】
【表４】
2010514706.tif 000006
注：ＮＳグループと比較して、＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１
【００５１】
１．２．２ ホルシチアシド注射製剤の血管透過性に対する影響の実験
体重１８〜２２ｇのマウス（オスメス同数）４８匹を準備し、上述した解熱薬理学試験と同様の４グループに無作為に分けた。マウスに投与して１ｈ後に、０．１ｍｌ／体重１０ｇの０．５％ Evans Blue生理食塩水溶液を尾に静脈注射し、次いで０．２０ｍｌ／個体の０．６％の酢酸を腹腔内注射した。２０ｍｉｎ後に頚椎脱臼によりマウスを絶命させ、腹部の皮膚および筋肉を切開し、６ｍｌの生理食塩水で３回に分けて腹腔を洗浄し、ピペットで洗浄液を吸い出して、合わせた後生理食塩水を１０ｍｌになるまで加え、３０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離した。上澄み液を取って５９０ｎｍ比色定量し、ＯＤ値を記録して統計分析を行った。
【００５２】
ホルシチアシド液体注射剤グループおよびホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤グループとＮＳグループとを比較すると顕著な差異（Ｐ＜０．０５）が認められ、双黄連コントロールグループとＮＳグループとを比較すると顕著な差異（Ｐ＜０．０５）が認められることが、実験の結果示された。結果については表４を参照。
【００５３】
【表５】
2010514706.tif 000007
注：ＮＳグループと比較して、＊  Ｐ＜０．０５，＊＊  Ｐ＜０．０１
【００５４】
以下、凍結乾燥粉末注射剤を例に、薬用補助材料の選択、調製方法におけるｐＨの選択、および凍結乾燥曲線の選択について具体的に説明し、あわせて、加速実験によりホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤の安定性について具体的に説明する。
【００５５】
２．１． 構成剤の選択
凍結乾燥粉末注射剤に常用される構成剤には、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール等があり、実験を設計して適切な構成剤の種類を選択した。試験の結果は表５のとおりであった：
【００５６】
【表６】
2010514706.tif 000008
【００５７】
【表７】
2010514706.tif 000009
【００５８】
構成剤の用量の検討により、ホルシチアシドとキャリア（構成剤）の重量比が１：（０〜５）のときには、凍結乾燥粉末はいずれも成形できるが、重量比が１：０〜３のときに、凍結乾燥粉末の望ましい成形性、溶解性、再溶解後の透明度が得られることが示された。本発明はキャリア（構成剤）を加えず、直接凍結乾燥しても、比較的良好な外形、望ましい溶解性と透明度を得ることができ、また凍結乾燥も比較的容易である。
【００５９】
２．２． ｐＨ選択
適量のホルシチアシドを採取し、水を加えて溶解し、ｐＨ値を３．０、３．５、４．０，４．５、５．０，５．５，６．０に調節し、ＨＰＬＣを用いてホルシチアシドのピーク面積の値を測定して、ｐＨ値のホルシチアシド含有量に対する影響を考察した。試験の結果から、ｐＨ値が４．５のときホルシチアシドの含有量が最も高く、また、３．０〜６．０というｐＨ値の範囲では、ホルシチアシド含有量の変化は明確ではないことが理解できた。表７を参照。従って、本発明の凍結乾燥粉末注射剤はｐＨ値を３．０〜６．０の間に制御すると特定した。
【００６０】
【表８】
2010514706.tif 000010
【００６１】
２．３． 凍結乾燥工程の曲線選択
２．３．１ 冷凍温度
一般に、棚板の温度は製品の共晶点より５℃〜１５℃低い。以上の測定の結果、当該製品の共晶点は−２０℃であるため、冷凍温度は−３５℃以下であるべきで、選択により−４０℃と定めた。
【００６２】
２．３．２ 冷凍時間
本発明の凍結乾燥粉末注射剤の分包量は１．５ｍｌであり、試験の結果、本発明の凍結乾燥粉末注射剤は、室温から−４０℃にまで温度を下げて完全に凍結するのに４時間を要した。
【００６３】
２．３．３ 昇華速度と乾燥時間
試験により、−２５℃の条件下で、第一段階の乾燥時間に約５時間を要し、第二段階の乾燥温度が３０度未満で、時間が９時間であれば、本発明の凍結乾燥粉末注射剤の水分要求を満足しうることが示された。
【００６４】
以上でスクリーニングされた最適な工程によって凍結乾燥粉末注射剤を３ロット調製し、それぞれ１．５ｍｌの分包を凍結乾燥して、初歩スクリーニングで凍結乾燥工程の曲線を得た（図１参照）。
【００６５】
上記凍結乾燥曲線により凍結乾燥して完成品１０ロットを得て、凍結乾燥に関する水分等のデータを検証した。検証結果については表８を参照。結果は、凍結乾燥粉末注射剤が要求に適合していることを示し、当該曲線が実施可能であることが証明された。
【００６６】
【表９】
2010514706.tif 000011
【００６７】
２．４ 加速試験：
薬物の化学的または物理的変化を加速することにより、薬物製剤の安定性を探求し、処方の設計、工程の改良、品質の研究、包装の改善、輸送、貯蔵に必要な資料を提供する。考察条件は以下のとおり：
包装：市販包装を模す（バイアル＋ブチルゴム栓）
温度：４０℃±２℃
湿度：７５％±５％
【００６８】
【表１０】
2010514706.tif 000012
【００６９】
加速試験の結果は表９に示すとおりであり、試験結果から、ホルシチアシド凍結乾燥粉末注射剤は、凍結乾燥粉末の状態で安定性を保つことができ、性状、含有量ともに明らかな変化はなく、注射製剤としての要求を満たしうることが理解できた。
【００７０】
以下、液体注射剤、輸液製剤を例に、薬用補助材料の選択および調製方法におけるｐＨの選択について具体的に説明し、あわせて、加速実験によりホルシチアシド液体注射剤およびホルシチアシド輸液製剤の安定性について具体的に説明する。
【００７１】
２．５．安定化剤の選択。
液体注射剤、輸液製剤に常用される安定化剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸ソーダカルシウム、エチレンジアミンテトラ酢酸カルシウム、ビタミンＣ、ピロ亜硫酸等があり、実験を設計して適切な安定化剤の種類および用量を選択した。試験の結果は表１０のとおりであった：
【００７２】
【表１１】
2010514706.tif 000013
【００７３】
研究結果により、ホルシチアシドと安定化剤との重量比が１：０〜５のときに、液体注射剤、輸液製剤ともに安定性が保証され、重量比が１：０〜３のときに比較的良好な安定性を保持できることが示された。
【００７４】
２．６． ｐＨ選択
凍結乾燥粉末注射剤のｐＨ選択と同様に、本発明の剤はｐＨ値を３．０〜６．０の間に制御すると特定した。
【００７５】
２．７． 加速試験：
薬物の化学的または物理的変化を加速することにより、薬物製剤の安定性を探求し、処方の設計、工程の改良、品質の研究、包装の改善、輸送、貯蔵に必要な資料を提供する。考察条件は以下のとおり：
包装：市販包装を模す（アンプルまたは輸液瓶）
温度：４０℃±２℃
湿度：７５％±５％
【００７６】
【表１２】
2010514706.tif 000014
【００７７】
加速試験の結果は表１１に示すとおりであり、試験結果から、ホルシチアシド液体注射剤は、液体注射剤、輸液製剤の状態で安定性を保つことができ、性状、含有量ともに明らかな変化はなく、注射製剤としての要求を満たしうることが理解できた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
主にホルシチアシドと薬用補助材料とから調製されてなり、ホルシチアシドと薬用補助材料との重量比が１：（０〜５）であることを特徴とする、ホルシチアシド注射製剤。
【請求項２】
ホルシチアシドと薬用補助材料との重量比が１：（０〜３）であることを特徴とする、請求項１に記載のホルシチアシド注射製剤。
【請求項３】
注射製剤は、凍結乾燥粉末注射剤、液体注射剤または輸液製剤であることを特徴とする、請求項１または２に記載のホルシチアシド注射製剤。
【請求項４】
凍結乾燥粉末注射剤に用いる薬用補助材料は、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトールのうちの、一種類または任意の二種類の混合物であることを特徴とする、請求項３に記載のホルシチアシド注射製剤。
【請求項５】
ホルシチアシドと薬用補助材料との重量比が１：０であることを特徴とする、請求項４に記載のホルシチアシド注射製剤。
【請求項６】
ホルシチアシドと薬用補助材料とを所定の重量比で混合し、注射用水をホルシチアシドの重量の１０〜５０倍になるまで加えて溶解し、ｐＨ値を３．０〜６．０に調節し、精密ろ過、限外ろ過の後に充填し、以下に示すような凍結乾燥曲線に沿って凍結乾燥して得ることを特徴とする、請求項４または５に記載のホルシチアシド注射製剤の調製方法。
【表１】
2010514706.tif 000015
【請求項７】
液体注射剤に用いる薬用補助材料は、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸ソーダカルシウム、エチレンジアミンテトラ酢酸カルシウム、ビタミンＣ、ピロ亜硫酸のうちの、一種類または数種類であることを特徴とする、請求項３に記載のホルシチアシド注射製剤。
【請求項８】
注射用水中にホルシチアシドの０〜５倍に相当する重量の薬用補助材料を加えて攪拌し、完全に溶解させるステップと；
全量の０．５〜０．０５％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭するステップと；ホルシチアシドを加えて完全に溶解させ、ｐＨ値を３．０〜６．０に調節するステップと；
全量の０．２〜０．０２％の活性炭を加え、室温で攪拌し、ろ過脱炭するステップと；
ろ液中に注射用水を全量になるまで加え、ｐＨ値および活性成分含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、充填、滅菌、包装するステップ、
を有することを特徴とする、請求項７に記載のホルシチアシド注射製剤の調製方法。
【請求項９】
輸液製剤に用いる薬用補助材料は、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸ソーダカルシウム、エチレンジアミンテトラ酢酸カルシウム、ビタミンＣ、ピロ亜硫酸のうちの、一種類または数種類であることを特徴とする、請求項３に記載のホルシチアシド注射製剤。
【請求項１０】
注射用水中に塩化ナトリウムまたはブドウ糖と、ホルシチアシドの０〜５倍に相当する重量の薬用補助材料を加えて攪拌し、完全に溶解させるステップと；
全量の０．５〜０．０５％の活性炭を加え、攪拌、ろ過、脱炭するステップと；
ホルシチアシドを加え、攪拌して完全に溶解させ、ｐＨ値を３．０〜６．０に調節するステップと；全量の０．２〜０．０２％の活性炭を加え、均一に混ぜ、室温で攪拌し、ろ過脱炭するステップと；
ろ液中に注射用水を全量になるまで加え、ｐＨ値および活性成分含有量を測定し、合格した後に、透明になるまで繰返しろ過し、充填、滅菌、包装するステップ、
を有することを特徴とする、請求項９に記載のホルシチアシド注射製剤の調製方法。