【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年12月1日(2010.12.1)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞において、細菌性外膜タンパク質の細胞外ループを含むキャリアタンパク質に融合した所定のパッセンジャーポリペプチドを発現及びディスプレイする発現ベクターであって、前記パッセンジャーポリペプチドは所定のリガンドと相互作用可能であり、前記細胞外ループは開裂して前記細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞の外表面に露出したＮ末端、Ｃ末端、またはその両方を生じて該末端には前記所定のパッセンジャーポリペプチドが融合しており、天然のＣ末端及び天然のＮ末端はペプチドリンカーを介して互いに融合している、前記発現ベクター。
【請求項２】
前記外表面に露出した前記Ｎ末端及び前記Ｃ末端に、リガンドが接近可能である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記パッセンジャーポリペプチドのＣ末端が前記キャリアタンパク質のＮ末端に融合しているか、あるいは前記パッセンジャーポリペプチドのＮ末端が前記キャリアタンパク質のＣ末端に融合している、請求項１または２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記細菌性外膜タンパク質がＯｍｐＡまたはＯｍｐＸである、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記細胞外ループが、ＯｍｐＡの第１細胞外ループ、ＯｍｐＸの第２細胞外ループ、またはＯｍｐＸの第３細胞外ループである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記パッセンジャーポリペプチドがストレプトアビジンまたはＴ７結合性ペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記細菌細胞が、大腸菌（Escherichia coli）、ソネ赤痢菌（Shigella sonnei）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shingella flexneri）、サルモネラ菌（Salmonella typhimurium）、腸炎菌（Salmonella enterica）、エンテロバクター・エアロゲネス（Enterobacter aerogenes）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、ペスト菌（Yersinia pestis）、または肺炎桿菌（Klebsiella pnewnoniae）である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項８】
低コピー複製起点をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記低コピー複製起点がｐ１５Ａ複製起点である、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
殺菌性抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記殺菌性抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
少なくとも１つのＳｆｉｌエンドヌクレアーゼ制限酵素部位をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
アラビノースａｒａＢＡＤ大腸菌オペロンプロモーターをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
発現がＬ−アラビノースの添加で誘導され、アラビノースの除去及びグルコースの添加によって停止する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記キャリアタンパク質が核酸分子によってコードされ、前記核酸分子は所定のアミノ酸をコードするコドンが該所定のアミノ酸と構造的に類似する代替アミノ酸をコードする置換コドンで置換されているコドンを少なくとも１つ含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記所定のアミノ酸をコードするすべてのコドンが置換されている、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞が、少なくとも１つの非正準（non-canonical）アミノ酸類似体を前記ディスプレイされたポリペプチド中に組み込む、請求項１５または１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記所定のアミノ酸がロイシンである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記代替アミノ酸がバリンまたはイソロイシンである、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
複数のポリペプチドを発現することが可能な、複数の、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現ベクターを創出すること、及び発現を誘導することを含む、ポリペプチドディスプレイライブラリの製造方法。
【請求項２２】
請求項１から１９のいずれか１項に記載の発現ベクターの発現を誘導することにより細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞の外表面に発現した、キャリアタンパク質の細胞外ループに融合したパッセンジャーポリペプチド。
【請求項２３】
前記細胞外ループが、ＯｍｐＡの第１細胞外ループ、ＯｍｐＸの第２細胞外ループ、またはＯｍｐＸの第３細胞外ループである、請求項２２に記載のパッセンジャーポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載のパッセンジャーポリペプチドを含む、パッセンジャーポリペプチドライブラリー。
【請求項２５】
試料中の所定のリガンドを検出、モニター、または測定するためのアッセイ方法であって、請求項２２または２３記載のパッセンジャーポリペプチドを前記試料と接触させ、前記パッセンジャーポリペプチドが前記リガンドと相互作用するかどうかを観察することを含む、前記アッセイ方法。
【請求項２６】
複製可能な生物学的実体、及び
前記複製可能な生物学的実体の表面にディスプレイされたパッセンジャーポリペプチドであって、循環置換された（circularly permuted）細菌性外膜タンパク質の細胞外末端に融合したパッセンジャーポリペプチド、
を含む組成物。
【請求項２７】
前記細菌性外膜タンパク質がＯｍｐＡである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記細菌性外膜タンパク質がＯｍｐＸである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記パッセンジャーポリペプチドが酵素の基質である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記パッセンジャーポリペプチドが標識を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
前記標識が蛍光剤である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記標識がＣ末端標識である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記標識がＮ末端標識である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記循環置換された（circularly permuted）細菌性外膜タンパク質のＣ末端が、前記複製可能な生物学的実体の表面に露出している、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３５】
前記循環置換された（circularly permuted）細菌性外膜タンパク質のＮ末端が、前記複製可能な生物学的実体の表面に露出している、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３６】
前記複製可能な生物学的実体が、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３７】
前記複製可能な生物学的実体が細菌細胞である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記細菌細胞が大腸菌（Escherichia coli）である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
複数の複製可能な生物学的実体を含むポリペプチドディスプレイライブラリーであって、前記複数の生物学的実体の各々はその表面にディスプレイされたパッセンジャーポリペプチドを含み、前記パッセンジャーポリペプチドが循環置換された（circularly permutated）細菌性外膜タンパク質の細胞外末端に融合している、前記ポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４０】
前記細菌性外膜タンパク質がＯｍｐＡである、請求項３９に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４１】
前記細菌性外膜タンパク質がＯｍｐＸである、請求項３９に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４２】
前記パッセンジャーポリペプチドが標識を含む、請求項３９に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４３】
前記標識が蛍光剤である、請求項４２に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４４】
前記標識がＣ末端標識である、請求項４２に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４５】
前記標識がＮ末端標識である、請求項４２に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４６】
前記複製可能な生物学的実体が、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞である、請求項３９に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４７】
前記複製可能な生物学的実体が細菌細胞である、請求項３９に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【請求項４８】
前記細菌細胞が大腸菌（Escherichia coli）である、請求項４７に記載のポリペプチドディスプレイライブラリー。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
ある態様において、前記キャリアタンパク質ループは開裂され、外表面上に露出したＮ末端、外表面上に露出したＣ末端、またはその両方を生じている。ある態様において、天然Ｃ末端及び天然Ｎ末端はペプチドリンカーを介して互いに融合している。ある態様において、外表面に露出した前記Ｎ末端及び外表面に露出した前記Ｃ末端にリガンドが接近可能である。ある態様において、前記パッセンジャーポリペプチドの前記Ｃ末端は前記キャリアタンパク質のＮ末端に融合している。ある態様において、前記パッセンジャーポリペプチドのＮ末端は前記キャリアタンパク質のＣ末端に融合している。ある態様において、前記キャリアタンパク質はＯｍｐＸである。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
ある態様において、本発明は、本件明細書で説明されるように、開裂され、かつ、Ｎ末端が外表面上に露出しているか、Ｃ末端が外表面上に露出しているか、または両者が外表面上に露出しているキャリアタンパク質ループを有する発現ベクターの発現を誘導することによって生物学的実体の外表面上に発現したポリペプチドを提供する。ある態様において、このポリペプチドはＯｍｐＸ内に発現する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１３】
下記実施例３において示されるように、本発明は、所定のポリペプチドを、Ｎ末端融合タンパク質、Ｃ末端融合タンパク質、またはその両者として、生物学的実体の外面上に存在するキャリアタンパク質に直接連結もしくは融合させて発現させるための発現ベクター、並びにそれらの製造及び使用方法も提供する。本件明細書における、これらの発現ベクターは「Ｎ／Ｃ末端発現ベクター」と呼ばれ、これには実施例３に例示される循環置換（circularly permuted）ＯｍｐＸ（ＣＰＸ）発現ベクターが含まれる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２７】
ある態様においては、本発明のＮ／Ｃ末端融合発現ベクターを基質ライブラリからの基質（例えば、プロテアーゼ及びペプチダーゼの基質）の同定に用いることができる。図１７を参照のこと。従って、Ｎ／Ｃ末端融合発現ベクターを、当該技術分野において公知の方法を用いて蛍光タンパク質を発現するように修飾することができる。例えば、（１）循環置換（circularly permuted）外膜タンパク質（例えば、ＯｍｐＡまたはＯｍｐＸ）、（２）Ｏｍｐ遺伝子配列の下流のリボソーム結合部位、及び（３）標識（例えば、蛍光活性化細胞ソーティングを用いる効率的な検出に適する緑色蛍光タンパク質（例えばａｌａｊＧＦＰ））を含む、二シストロン性発現ベクターの使用が挙げられる。その後、緑色蛍光の強度によって発現をモニターする。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７３】
実施例３
循環置換（circularly permuted）ＯｍｐＸ（ＣＰＸ）
パッセンジャーポリペプチドのＮまたはＣ末端融合体としてのディスプレイ及び発現を、図１４に示されるようにＯｍｐの位相幾何的順序置換によって達成する。Ｎ末端融合構築体又はＣ末端融合構築体を創出するため、外膜タンパク質（この場合にはＯｍｐＸ）の配列再配置を当該技術分野において公知のオーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて達成した。Ho, et al. (1989）Gene 77(1):51-59（これは参照により本件明細書に組み込まれる）；並びに図１４、図２７、図２８、図３０、及び図３２を参照のこと。ポリペプチドパッセンジャー挿入点は、表面露出タンパク質、例えば、単量体Ｏｍｐ（ＯｍｐＡ、ＯｍｐＸ、ＯｍｐＴ等を含む）の非保存表面露出ループ配列内に生じるように、当該技術分野において公知の方法を用いて選択する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８３】
プラスミドｐＢ３３ＮＬＣＰＸ（ｐＢＡＤ３３におけるロイシン非含有循環置換（circularly permuted）ＯｍｐＸ）を、ＰＤ５１５／７０３、ＰＤ７０４／６３２、及びＰＤ６３３／６３４を用いる３つの反応でのｐＢ３３ＮＬＸＴ２のＰＣＲ増幅によって構築した。精製した断片を各々精製し、外側プライマーＰＤ５  １５／６３４を用いる第２回のオーバーラップ反応でプールした。次に、生じる生成物を精製し、ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（加えて、テンプレートの繰り越しを除去するＤｐｎＩ）で消化し、再精製して、ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されているｐＢａｄ３３の大断片にライゲートした。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９４】
【図１】標的タンパク質への高親和性結合を可能にする、新たに同定されたジスルフィドループを示す。上部左のボックス内の第１配列は配列番号１８６であり、上部左のボックス内の第２配列は配列番号１８７であり、上部右のボックス内の第１配列は配列番号１８８であり、上部右のボックス内の第２配列は配列番号１８９であり、下部左のボックス内の第１配列は配列番号１９０であり、下部左のボックス内の第２配列は配列番号１９１であり、下部右のボックス内の第１配列は配列番号１９２であり、下部右のボックス内の第２配列は配列番号１９３である。
【図２】オリゴペプチドの高レベルディスプレイに介在するＯｍｐＡループ１挿入の位置、及び高効率クローニングを可能にするＳｆｉｌクローニング部位の位置の図である。
【図３】図３Ａは、外膜（ＯＭ）のプロテインＡ（ＯｍｐＡ）の第１細胞外ループ（Ｌ１）への挿入を用いた大腸菌表面上でのペプチドのディスプレイの模式図を示す。ＬＰＳ＝リポ多糖。図３Ｂは、いかなる挿入も伴わずにＯｍｐＡを過剰発現するプラスミドｐＢ３３ＯｍｐＡを含む細胞のクローン集団のフローサイトメトリー分析のヒストグラムを示す。細胞は２時間誘導し、１０ｎＭビオチニル化抗−Ｔ７・タグｍＡｂ及びフィコエリトリン結合ストレプトアビジンで標識した。図３Ｃは、図３Ａ、図３Ｂと同様に誘導及び標識されている、Ｔ７・タグペプチドをＯｍｐＡループ１内にディスプレイするプラスミドｐＢ３３ＯＴ１を含む細胞を示す。
【図４】ペプチドをディスプレイしない細胞（ＭＣ１０６１／ｐＢＡＤ３３ＯｍｐＡ）、及びＭＣ１０６１／ｐＢＡＤ１８ＯｍｐＡＬ１を用いてペプチドをディスプレイする細胞と比較して、ペプチドをディスプレイする細胞（ＭＣ１０６１／ｐＢＡＤ３３Ｌ１）においては成長阻害が欠如していることを示す。
【図５】８０回の倍増によるライブラリ多様性の維持を示し、これはライブラリを再利用のために無限に拡張できることを示す。
【図６】図６Ａは、複数の配列アラインメントによって同定される、２つの、ＯｍｐＸにおけるポリペプチドディスプレイ可能部位を示す。第１の配列は配列番号１９４であり、第２の配列は配列番号１９５である。該部位は、それらが（１）細胞表面から約１ｎＭを超えて局在し、（２）異種間で非保存的であり、（３）立体配置的柔軟性を示し、かつ（４）比較的小さなモノマー性Ｏｍｐタンパク質内に局在するので適している。図６Ｂは、ＯｍｐＸの循環置換（circularly permuted）変種へのＮ末端融合体である細菌ディスプレイライブラリを示す。
【図７】図７Ａは、発現プラスミドである、（いかなるパッセンジャータンパク質をも伴わずにＮ末端ＣＰＸを発現する）ｐＢＡＤ３３ＣＰＸ、（ＣｏｌＥ１起点からＧＦＰを発現する）ｐＢＡＤ１８Ｇｒｎ、ｐ１５Ａ起点を有するプラスミドからＧＦＰを発現するｐＢＡＤ３３Ｇｒｎ、Ｎ末端ＣＰＸ足場内にａｌａｊＧＦＰ（Ｇ）及びＳＡ−１（表２）を同時発現するｐＢＡＤ１８ＧＣＳ、及びＮ末端ＣＰＸ足場内にＡｌａｊＧＦＰ（Ｇ）及びＳＡ−１を発現するｐＢＡＤ３３ＧＣＳを含む大腸菌細胞（ＭＣ１０６１）の、フローサイトメトリーを用いて測定される蛍光強度を示す。図７Ｂは、標的ペプチドなしでＯｍｐＡを過剰発現する細菌細胞ＭＣ１０６１／ｐＢＡＤ３３ＯｍｐＡと共にインキュベートされた腫瘍細胞の蛍光顕微鏡分析を示す。細菌は自己蛍光タンパク質（例えば、ａｌａｊＧＦＰ）を内部に、また選択された腫瘍結合性／侵害性ペプチドを外部に、同時発現する。図７Ｃは、ヒト乳癌細胞を標的とする細菌細胞の蛍光顕微鏡分析を示す。ＭＣ１０６１細菌は、プラスミドｐＢＡＤ３３ＯｍｐＡ１５から、自己蛍光タンパク質を内部に（例えば、ＡｌａｊＧＦＰ）、及び選択された腫瘍結合性／侵害性ペプチド（ＹＣＬＳＹＳＮＧＲＦＦＨＣＰＡ（配列番号３１１））を外部に発現する。
【図８】図８Ａは、フローサイトメトリーを用いて測定される、Ｃ−反応性タンパク質結合性ペプチドの富化を示す。誘導された細胞は未選択ライブラリ集団において１０ｎＭのビオチン−ＣＲＰ及び６ｎＭのＳＡＰＥで標識された。図８Ｂは、フローサイトメトリーを用いて測定される、Ｃ−反応性タンパク質結合性ペプチドの富化を示す。誘導された細胞は、２回の磁気選択の後、１０ｎＭのビオチン−ＣＲＰ及び６ｎＭのＳＡＰＥで標識された。図８Ｃは、フローサイトメトリーを用いて測定される、Ｃ−反応性タンパク質結合性ペプチドの富化を示す。誘導された細胞は、２回の磁気選択及び１回のＦＡＣＳの後、１０ｎＭのビオチン−ＣＲＰ及び６ｎＭのＳＡＰＥで標識された。
【図９】磁気選択及びＦＡＣＳを用い、異なる標的リガンド濃度で単離された、表面ディスプレイされた高親和性抗Ｔ７タグｍＡｂ結合性ペプチドの代表的な配列を示す。２回のＭＡＣＳを１０ｎＭの抗体濃度で行い、次いで３３ｐＭの抗体を用いるＦＡＣＳを行った。ボールド体の残基は、それに対して抗体が生じた、最下部に示される野生型Ｔ７タグエピトープと同一の位置を示す。最上部から最下部にかけて、配列の識別子は配列番号１９６〜２０８である。下部記載の野生型配列の識別子は配列番号３１２である。
【図１０】図１０Ａは、フローサイトメトリーを用いる細胞表面ディスプレイされたストレプトアビジン結合性ペプチドと、ここで説明される競合体としてのビオチンとの、結合親和性の測定である。見かけの平衡解離定数（ＫD）の決定。図１０Ｂは、フローサイトメトリーを用いる細胞表面ディスプレイされたストレプトアビジン結合性ペプチドと、ここで説明される競合体としてのビオチンとの、結合親和性の測定である。細胞表面ディスプレイされたペプチドの解離速度定数（ｋdiss）の決定。クローンＳＡ−１及びＳＡ−７のペプチド配列は表２に列挙される。クローンＨＰＱは、比較のため、ＯｍｐＡループ１に挿入された配列ＳＡＥＣＨＰＱＧＰＰＣＩＥＧＲ（配列番号２０９）を含む。
【図１１】抗Ｔ７タグ抗体の抗体エピトープマッピングを示す。示される濃度はＦＡＣＳを用いるスクリーニングに用いられるものである。配列識別子は、上部左のボックスについて：配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、及び配列番号２１４；上部右のボックスについて：配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、及び配列番号２１９；中央左のボックスについて：配列番号２２０、配列番号２２１、及び配列番号２２２；中央右のボックスについて：配列番号２２３、配列番号２２４、及び配列番号２２５；並びに下部のボックスについて：配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、及び配列番号２３０であり、ｗ．ｔ．は配列番号２３１である。
【図１２】ＹＦＰのループ内にグラフト化されたストレプトアビジン結合性ペプチドＳＡ−１の解離速度の測定を示す。フローサイトメトリーを用いて、競合体としてのビオチンの添加後の、ストレプトアビジン被覆１μｍビーズに結合したＹＦＰの蛍光を測定した。
【図１３】フローサイトメトリーを用いて測定された、ストレプトアビジン結合性配列の平衡解離定数を示す。配列識別子は、最上部から最下部に向けて、配列番号２３２、配列番号２３３、及び配列番号２３４である。
【図１４】ＯｍｐＸを用いて例示されるポリペプチドディスプレイのために位相幾何学的順置換Ｏｍｐを用いる末端融合ディスプレイの例を示す。当該技術分野における熟練者が習熟するＰＣＲ法を用いて、表面露出ループ内における末端ポリペプチドディスプレイを達成するため、Ｏｍｐポリペプチド配列の順序が下部ボックスに示されるものとなるように再構成遺伝子配列を組み立てる。
【図１５】図１５Ａは、ＯｍｐＸを過剰発現する対照区大腸菌のフローサイトメトリー分析を示す。細胞をＬＢ成長培地において成長させ、１×洗浄して抗−Ｔ７タグモノクローナル抗体と共にインキュベートし、再度洗浄して１０ｎＭのストレプトアビジンフィコエリトリンと共にインキュベートし、フローサイトメトリーを用いて分析した。図１５Ｂは、１５Ａと同一の試料の緑色対赤色蛍光の２パラメータプロットを示す。図１５Ｃは、モノクローナル抗体（ＭＣ１０６１／ｐＣＰＸ−Ｔ７）によって認識されるＴ７タグペプチドエピトープをディスプレイする大腸菌を示す。細胞を液体成長培地中で成長させ、１×洗浄して抗−Ｔ７タグモノクローナル抗体と共にインキュベートし、再度洗浄して１０ｎＭのストレプトアビジンフィコエリトリンと共にインキュベートし、フローサイトメトリーを用いて分析した。図１５Ｄは、１５Ｃと同一の試料の緑色対赤色蛍光の２パラメータプロットを示す。
【図１６】パッセンジャーポリペプチドのＮ末端ディスプレイ（Ｎ−ＣＰＸ）またはＣ末端ディスプレイ（Ｃ−ＣＰＸ）のいずれかを生じる再構成ＯｍｐＸディスプレイベクター（ＣＰＸ）を用いる、ストレプトアビジンに結合するジスルフィド拘束ペプチド（ＳＡ−１ｐｅｐ）、または抗−Ｔ７エピトープ抗体に結合する非拘束ペプチド（Ｔ７ｐｅｐ）の大腸菌表面上でのディスプレイを示す。一次標識濃度は、蛍光標識に用いられるストレプトアビジン−フィコエリトリンまたは抗−Ｔ７モノクローナル抗体のいずれかの濃度である。
【図１７】ＯｍｐＡループ内にディスプレイされた完全にランダムなライブラリから単離される、ストレプトアビジン結合性ペプチドのコンセンサス配列を示す。配列識別子は、最上部から最下部に向けて、配列番号２３５〜２４５である。
【図１８】腫瘍細胞認識のための内因性蛍光性細菌ディスプレイペプチドライブラリの、フローサイトメトリーを用いたスクリーニングを示す。
【図１９】２つの別個のコンセンサス配列を有するＣＲＰ結合性ペプチドを示す。配列識別子は、最上から最下部に向けて、配列番号２４６〜２５６である。
【図２０】ＺＲ−７５−１ヒト乳癌腫瘍細胞に結合するＯｍｐＡにおける１５量体ライブラリから単離されるペプチド配列を示す。配列識別子は、最上部から最下部に向けて、配列番号２５７〜２６６である。
【図２１】選択前（ソートされていないライブラリ）のＯｍｐＡ１５量体ライブラリ、及びＴ７タグ抗体への結合に基づき１もしくは２回の磁気選択（ＭＡＣＳ）から生じる集団の、サイトメトリー分析を示す。
【図２２】フローサイトメトリーによって測定される、磁気選択によるＣＲＰ結合性ペプチドの富化を示す。
【図２３】腫瘍結合性かつ内在性である細菌の富化を、ＦＡＣＳを用いて示す。
【図２４】フローサイトメトリーによって測定される、大腸菌上のストレプトアビジン結合性ペプチドディスプレイの解離速度定数を示す。
【図２５】図２５Ａは、ＯｍｐＸのループ２にディスプレイされる約１×１０9個の独自クローンを含む、二重拘束ライブラリ（ＸＣＣＸ4ＣＸ7ＣＸ）から選択されるストレプトアビジン結合性ペプチドを示す。配列識別子は、最上部から最下部に向けて、配列番号２６７〜２７５である。図２５Ｂは、ＯｍｐＸのループ２にディスプレイされるＸ4ＣＸ3ＣＸ4ライブラリから選択されるストレプトアビジン結合性ペプチドを示す。配列識別子は、最上部から最下部に向けて、配列番号２７６〜２８４である。
【図２６】２サイクルのＭＡＣＳ及び１サイクルのＦＡＣＳを用いて単離される、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０結合性ペプチドを示す。配列識別子は、最上部から最下部に向けて、配列番号２８５〜２９７である。
【図２７】残基９７で始まって９５で終わる（Ｐ９６は削除）、ＯｍｐＸ  Ｔ７のループ２内でのＴ７ペプチドエピトープのＣ末端ディスプレイに必要な順序及び遺伝的要素を示す。
【図２８】循環置換（circular permutation）及びＯｍｐＸ残基５３／５４の間で開くループを用いてＮ末端融合ディスプレイを構築するための例示方法論を示す。ディスプレイされたポリペプチドは残基９５に融合し、リーダーペプチドはａａ９７の上流に遺伝的に融合する。
【図２９】Ｎ末端ＯｍｐＸディスプレイベクターの構築に用いられるプライマーを示す。プライマーは以下の通りである：プライマー１＝センスttcgagctcggtacctttgaggtggttatgaaaaaaattg（配列番号２９８）プライマー２＝アンチセンスctggcctccacccatctgctggccgccggtcatgctcgccatagtagaagtcgcagctac（配列番号２９９）プライマー３＝センスggccagcagatgggtggaggccagtctggccagtctggtgactacaacaaaaaccagtac（配列番号３００）プライマー４＝アンチセンスcagtagaagtcgctccgcttcctccgaagcggtaaccaacaccgg（配列番号３０１）プライマー５＝センスggaggaagcggagcgacttctactgtaactggcggttacgcacag（配列番号３０２）プライマー６＝アンチセンスaaaacagccaagcttggccaccttggccttattagcttgcagtacggcttttctcg（配列番号３０３）
【図３０】パッセンジャーポリペプチドのＣ末端ディスプレイを可能にするのに必要なＯｍｐＸ断片の配置を示す。Ｃ末端ディスプレイを生じるＯｍｐＸ断片の増幅及び組み立てに必要とされるオリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応の適用から生じるＤＮＡ産生物に沿って図示される。
【図３１】オーバーラップＰＣＲによりＯｍｐＸを用いるＣ末端ディスプレイベクターの構築に用いることができるオリゴヌクレオチドプライマーのアニール部位を示す。プライマーは以下のものである：プライマー１＝センスttcgagctcggtacctttgaggtggttatgaaaaaaattg（配列番号３０４）プライマー２＝アンチセンスctggcctccacccatctgctggccgccggtcatgctcgccatagtagaagtcgcagctac（配列番号３０５プライマー３＝センスgccagcagatgggtggaggccagtctggccagtctggtgactacaacaaaaaccagtac（配列番号３０６）プライマー４＝アンチセンスcagtagaagtcgctccgcttcctccgaagcggtaaccaacaccgg（配列番号３０７）プライマー５＝センスggaggaagcggagcgacttctactgtaactggcggttacgcacag（配列番号３０８）プライマー６＝アンチセンスtgctggccgccggtcatgctcgccatctggccagactggcctccgtattcagtggtctgg（配列番号３０９）プライマー７＝アンチセンスaaaacagccaagcttggccaccttggccttattaacccatctgctggccgccggtcatgc（配列番号３１０）
【図３２】図３２は実質的に図２８と同じものであり、プライマーも図２８と同様である。
【図３３】酵素プロテアーゼ及びペプチド基質の選択、同定、及び改変にＮ末端癒合ディスプレイベクター（Ｎ−ＣＰＸ）を用いる、ポリペプチド酵素基質のディスプレイを示し、ここで、該基質と内部発現ｇｒｅｅ蛍光性タンパク質とは緑色と赤色の蛍光で示される。表面基質を開裂する所定のプロテアーゼで処理された細胞では赤色蛍光が抜けるが緑色蛍光を留める。緑色蛍光（赤ではない）細胞の単離により、所定のプロテアーゼによって開裂または分解することができる基質の同定が可能となる。
【図３４】ロイシンコドンを有さないように改変された遺伝子をコードすることで、様々な合成ロイシン類似体を取り込むペプチドのディスプレイを可能にする、Ｏｍｐ内にペプチドをディスプレイする細胞の、フローサイトメトリー分析を示す。非正準アミノ酸のディスプレイが、トリフルオロロイシン（Ｔｆｌ）及びＯｍｐＸを用いて例示される。この図は、非修飾野生型（最上部）またはロイシン無しＯｍｐＸ（最下部）足場のいずれかを（左）１９アミノ酸（Ｌｅｕ欠乏）、（中央）１９アミノ酸＋トリフルオロロイシン（ロイシン無し）、または（右）２０標準アミノ酸の存在下で用いる、（いかなるロイシン残基をも含まない）Ｔ７タグペプチドのディスプレイのレベルの比較をも示す。これらは抗−Ｔ７タグビオチニル化抗体で標識し、ＰＢＳで１回洗浄して、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（Molecular Probes, Eugene, OR）で標識した。１９＋Ｔｆｌ試料（中央）の約５．６から約６３．７への緑色蛍光の増加により、Ｔｆｌを含むペプチドの細菌ディスプレイライブラリのスクリーニングが可能となる。