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　特願２００２−２６７１２０「組換えバチルスメガテリウム菌」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年　４月　２日出願公開、特開２００４−　９７１５３〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯
　本願は、平成１４年９月１２日を出願日とする出願であって、平成２０年８月２５日付で特許請求の範囲について手続補正がなされたが、平成２０年１０月３１日付で拒絶査定がなされ、これに対して、平成２０年１２月１１日に拒絶査定に対する審判請求がなされるとともに、平成２１年１月１３日付で特許請求の範囲について手続補正がなされたものである。
２．平成２１年１月１３日付の手続補正についての補正却下の決定
［補正却下の決定の結論］
　平成２１年１月１３日付の手続補正を却下する。
［理由］
（１）補正後の本願発明  
　上記補正により特許請求の範囲の請求項１は、補正前の
「【請求項１】　バチルス　メガテリウム菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなり、目的タンパク質を菌体外に分泌する組換えバチルス　メガテリウム菌。」から
「【請求項１】　バチルス　メガテリウム菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域とシスタチン類をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなり、シスタチン類を菌体外に分泌する組換えバチルス　メガテリウム菌。」へと補正された。
　上記補正は、補正前の請求項１に記載した発明を特定するために必要な事項である「目的タンパク質」について「シスタチン類」との限定を付加するものであって、その補正前の当該請求項に記載された発明とその補正後の当該請求項に記載される発明の産業上の利用分野及び解決しようとする課題が同一であるから、請求項１についての補正は、平成１８年改正前特許法第１７条の２第４項第２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。
　そこで、本件補正後の前記請求項１に記載された発明（以下、「本願補正発明１」という。）が、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか（平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するか）について、以下に検討する。
（２）特許法第２９条第２項
（２−１）引用例
　原査定の拒絶の理由で引用文献１として引用された本願出願日前に頒布された刊行物である特開２０００−１５２７８４号公報（以下、「引用例１」という。）には、
(i)「実施例１　特開平4-190793号公報に記載された方法によって抽出された、アルカリセルラーゼ生産菌バチルス　エスピー　KSM-64（FERM P-10482）株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２に示されるオリゴヌクレオチドプライマーＡと、配列番号３〜15に示されるオリゴヌクレオチドプライマーB1〜B13のいずれかとを用いて、PwoDNAポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）によるPCR反応をそれぞれ行うことによって、KSM-64株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開平4-190793号公報の第４図）のプロモーター及びSD配列と、その下流に種々のサイズを有するシグナル領域を含むDNA断片を取得した（図１）。（省略）
　次いで、各DNA断片をSal Iで切断した後、Sal IとSma Iで切断したシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト本社製）との結合反応をT4DNAリガーゼによって行った。結合反応産物によって、大腸菌（Escherichia coli）HB101株（宝酒造社製コンピテントセル）の形質転換を行い、得られた形質転換体の中から、各DNA断片がpHY300PLKに挿入された組換えプラスミドベクターpHLS1〜13を得た（図１）。」（段落【００１３】〜【００１４】）、
(ii) 「 実施例３　実施例２で得られた各組換えプラスミドpHLSLA1〜13による枯草菌（Bacillus subtilis）の形質転換をプロトプラスト法（Mol. Gen. Genet., 168, 111(1978)）によって行い、得られた各組換え枯草菌を種培養培地に接種して、30℃で１日間振盪培養を行った後、種培養培地に植え継いで、30℃で４日間の振盪培養を行った。培養３日目、４日目に培養液の一部を拭き取り、遠心分離によって菌体を除去して得られた上清液のアミラーゼ活性を、可溶性澱粉（シグマ社製）を基質としてジニトロサリチル酸法〔Anal. Chem., 31, 426(1959)〕により測定した。
　この結果、図３に示したように、KSM-64株のアルカリセルラーゼ遺伝子のシグナル配列のサイズが、組換え枯草菌による液化型アルカリα-アミラーゼの生産性に大きな影響を与えることが明らかになり、特に、４〜14残基から成るシグナル配列を用いた場合（pHLSLA2〜8）に、完全なシグナル配列であると考えられる29残基のシグナル配列を用いた場合（pHLSLA13）の２倍以上の生産性が得られた。」（段落【００１６】〜【００１７】）
(iii)「かくして得られる組換えDNAを用いて適当な微生物、好ましくはバチルス属細菌を形質転換し、得られた組換え微生物を適当な培地を用いて、適当な条件下で培養することによって、目的とするタンパク質を大量かつ安定に生産させることができる。用いる培地の種類や培養条件等は特に限定されない。」（段落【００１２】）、と記載されている。
　また、原査定の拒絶の理由で引用文献２として引用された本願出願日前に頒布された刊行物であるMicrobiology,1994年,140(5),p.1001-1013（以下、「引用例２」という。）には、
(i)「１９８０年代、形質導入の遺伝子技術、プラスミド形質転換、プロトプラスト融合及び転位は、バチルス・メガテリウムにおいて、その代謝や発達上の機能の多くの研究に適用するに十分な程度進歩した。さらに、分解することなく外来タンパクを発現、分泌及びプロセシングすることが発見されたことから、外来遺伝子を生産するための宿主としてますます利用されている。」（第１００１頁左欄下から第１５行〜第８行）、
(ii)「ここ数年で、幾つかの研究室がバチルス・メガテリウムが外来遺伝子発現の宿主として多くの利点を有することを示している。まず第１に、それはバチルスの全ての利点を有する、つまり、タンパクを容易に分泌し、グラム陰性菌と違って細胞壁にエンドトキシンを有さず、そして、廉価な基質で高収率を示すことができる生物であることが判明している。第２にバチルスにおけるクローニングにおける問題となるアルカリプロテアーゼを有さない。米、韓、英及び独の研究室は外来タンパク質が分解することなく発現した素晴らしい例を文献化している（Ahmad et al.,1989;Kim et al.,1991; Meinhardt et al.,1989; Ryugus Hillen,1991; Shivakumar et al.,1989Von Tersch  Robbins, 1990）。加えて、Ahnら（1993）は、バチルス・メガテリウムにおいて、バチルス・ズブチリス由来グルカナーゼの分泌のみでなく、効果的なプロセシングをも示している。」（第１００９頁右欄第５行〜第２０行）、と記載されている。
　さらに、本願出願日前に頒布された刊行物であるFEBS LETTERS,1988年,236(1),p.14-18（以下、「引用例３」という。）には、
(i)「大腸菌のペリプラズムに成熟シスタチンCを生産するために、シグナルペプチド及び成熟シスタチンCのN末端側１３アミノ酸をコードする部分を含むシスタチンCのcDNAの５’末端を切除、成熟シスタチンのコード配列を再構成し大腸菌OmpAシグナルペプチドと読み枠を一致させて融合することができる合成リンカーで置換した（第１図）。改変したｃDNA挿入物はλPRプロモーター、最適化されたシャインダルガノ配列及びλcI　857リプレッサーを含む発現ベクターに連結した（第２図）。誘導していない細菌や発現プラスミドを有さない細菌の細胞抽出物とは対照的に、このプラスミドで形質転換した大腸菌の発現を誘導した後、浸透圧ショックにより得られた細胞抽出物は大量の免疫反応性のシスタチンCを含んでいた。」（第１５頁右欄　「３．結果」項第１行〜第１８行）、と記載されている。
　さらに、本願出願日前に頒布された刊行物である日経バイオテクノロジー最新用語辞典９１,1991年,日経BP社,第585頁−第586頁「分泌」の項（以下、「引用例４」という。）には、
(i)「枯草菌を代表とするグラム陽性菌では、細胞質膜を通過した蛋白はそのまま培地中に放出される。」（第５８６頁左欄下から第１６行〜下から第１４行）、
(ii)「一方、大腸菌を代表とするグラム陰性菌では、細胞質膜の外側にはさらに外膜との間にたまってしまい、培地中に放出されることはない。従ってペリプラズム蛋白であるβラクタマーゼや、アルカリホスファターゼを用いた系では、ペリプラズムまでしか分泌されない」（第５８６頁右欄第１２行〜第１８行）、と記載されている。
（２−２）対比
  本願補正発明１は、バチルス　メガテリウム菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域とシスタチン類をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなり、シスタチン類を菌体外に分泌する組換えバチルス　メガテリウム菌、に係るものである。
  そこでまず、本願補正発明１と引用例１に記載された事項を比較すると、引用例１に記載の「バチルス　エスピーKSM-64株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター及びSD配列と、その下流に種々のサイズを有するシグナル領域を含むDNA断片」は本願補正発明１の 「バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を含むＤＮＡ断片」に相当し、引用例１に記載の枯草菌（Bacillus subtilis）と本願補正発明１のバチルス　メガテリウム菌とは共にバチルス属の細菌であること、及び、引用例１では目的タンパク質がアルカリアミラーゼであるのに対して、本願補正発明１ではシスタチン類であることから、両者は、バチルス属の細菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と発現の目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなり、目的タンパク質を菌体外に分泌する組換えバチルス属細菌、である点で共通する。
　一方両者は、１）バチルス属の細菌が、前者がバチルス　メガテリウム菌であるのに対し、後者が枯草菌である点（以下、相違点１）、及び２）目的タンパク質が、前者ではアルカリアミラーゼであるのに対して、後者ではシスタチン類である点、で相違する。
（２−３）判断
　相違点１について検討すると、上記引用例２記載事項(i)(ii)には、外来タンパク質を分泌生産するための宿主としてバチルス　メガテリウム菌を用いること、及び、その利点として、バチルスにおけるクローニングにおける問題となるアルカリプロテアーゼを有さないため、分解することなく外来タンパク質を発現、分泌することが記載されており、引用例１記載事項(iii)は宿主としてバチルス属細菌を用いることが好ましいことが示されており、引用例１の目的タンパク質の分泌生産における宿主として、枯草菌に代えて、引用例２に記載の、同じバチルス属の細菌であり、目的タンパク質の発現、分泌に有利であるバチルス　メガテリウム菌を用いることは、当業者にとって自然な発想であり、容易に想到し得ることである。
　また、相違点２について検討すると、上記の引用例３記載事項(i)にあるように、組換シスタチンを製造する際に、シグナルペプチドをシスタチンに連結したものを含むベクターで大腸菌を形質転換しシスタチンをペリプラズムに分泌させることは、本願出願日前既に周知技術である。一方、上記の引用例４記載事項(ii)にあるように、大腸菌等のグラム陰性菌を宿主とする場合、タンパク質が細胞質膜を通過してもペリプラズムまでしか分泌されないのに対し、枯草菌等のグラム陽性菌を宿主とする場合、細胞質膜を通過したタンパク質がそのまま培地に分泌されることは、本願出願日前既に周知の事項であることから、ペリプラズムへの分泌が周知であるシスタチンを培地中に分泌させることを目的に、引用例１のバチルス属細菌を宿主とした目的タンパク質の分泌生産における目的タンパク質であるアルカリアミラーゼに代えて、上記分泌生産が周知であるシスタチンを用いることは、当業者が容易に想到し得ることである。
　そして、本願補正発明１によって奏される効果について、Bacillus　sp.　KSM−S237由来のアルカリセルラーゼ遺伝子のシグナル配列等を用いた実施例においては、「抗体染色にてシスタチンが大量に菌体外分泌されていることが確認され、タンパク質染色においても充分に生産が確認できる生産レベルであることが認められた」（段落【００３８】）とされているが、上記の引用例２記載事項(ii)にあるようにバチルス　メガテリウムを用いれば分解することなく目的タンパク質を発現、分泌することが知られている以上、シスタチンがある程度分泌されることは当業者が期待し・予測し得る範囲のものであるから、右効果が引用例１、２及び周知技術から予測される以上の格別顕著なものであるとはいえない。
　したがって、本願補正発明１は、引用例１及び２の記載及び上記周知技術から当業者が容易になし得たものであるから、特許法第２９条第２項の規定により、特許出願の際独立して特許を受けることができるものではない。
（２−４）審判請求人の主張
　審判請求人が、平成２３年５月２５日付で提出した回答書における主張について検討する。
（２−４−１）宿主発現系の探索
　請求人は、「しかしながら、バチルス・メガテリウムが外来タンパク質発現のための宿主微生物として用いられるのは、当該微生物が外来タンパク質の分泌発現能に格別優れているからではなく、引用文献２の１００９ページにも記載されるように、当該微生物がエンドトキシンを生産しないため、特に人体や動物への投与を予定する医療用の組換えタンパク質を生産する場合、当該組換えタンパク質を投与される人体や動物におけるエンドトキシンショックを防止する観点から、当該微生物を宿主として使用するのが好ましいからであります。 
 　ところで、バチルス・メガテリウムの異種タンパク質の生産性は、出願時においてはむしろまだまだ未熟なものでありました。それを裏付けるものとして、参考資料１（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００６）,７２：２１１−２２２）のごとき文献が存在し、これによれば、バチルス・メガテリウムのタンパク質生産性は他のバチルス属細菌と比較し決して高いものではなく（２１７頁の表５）、「安定で優れた外来蛋白質発現能を有する」といえるものではありません。なお、当該参考文献１は本願の出願から４年後の文献であるため、本願の出願当時に至っては、バチルス・メガテリウムにおける異種タンパク質生産技術が未熟なものであったことは明白であります。ゆえに当業者であれば、未熟な発現系を敢えて採用して、組換えシスタチン類の効率的な分泌発現を試みるとはいえず、むしろこれとは異なる宿主発現系の探索を採用するものと考えるのが自然であります。」と主張している。（回答書第３頁第１１行〜下から第１行） 
　しかしながら、上記（２−３）のように、外来タンパク質を分泌生産するための宿主としてバチルス　メガテリウム菌を用いることが知られており、また、バチルス　メガテリウム菌が「バチルスにおけるクローニングにおける問題となるアルカリプロテアーゼを有さない。」との利点を有することが知られていることから、当業者にとってバチルス　メガテリウム菌を分泌生産の宿主として用いる動機付けは十分にあり、たとえ、回答書で言及の参考文献１や本願明細書で言及のように外来遺伝子産物が菌体内に蓄積され、菌体外に分泌されなかったという報告（【０００４】）があったとしても、それらは分泌されない例があるということを示しているに過ぎず、当業者が引用例２に基づいてバチルス　メガテリウム菌を用いることを妨げる阻害要因にはならない。
　よって、請求人の上記主張は採用できない。
（２−４−２）分泌シグナルの連結
　請求人は、「本願発明は、予め分泌シグナルを用意し、そこに目的タンパク質としてシスタチン類を単に連結してみた、というものでは決してありません。 
 　シスタチンは、総残基数１２０程度、分子量１２ｋＤａ程度の低分子量タンパク質であり、またシスタチンは元々、哺乳動物の全身の有核細胞から体液中に分泌されるタンパク質であることから、シスタチンを組換えタンパク質で発現させた場合、特に分泌シグナルを用いなくとも細胞外に分泌され易い傾向を有すると考えられます。ゆえに、当業者であれば、シスタチン類の組換え発現において、敢えて分泌シグナルを連結させてみるとはいえません。」と主張している（回答書第４頁第７行〜第１２行）。
　しかしながら、 上記（２−３）のように、シグナルペプチドをシスタチンに連結したものを含むベクターで大腸菌を形質転換しシスタチンをペリプラズムに分泌させることが本願出願日前既に周知技術であることから、当業者であればシスタチン類の組換え発現において敢えて分泌シグナルを連結しないとはいえず、むしろ、分泌シグナル、すなわち、シグナルペプチドを連結しようとするといえることから、また、哺乳動物細胞の分泌シグナルがバチルスでの分泌に適しているとは思えないことから当業者であれば宿主に合わせて本来の哺乳動物細胞の分泌シグナルに代えてバチルス属由来の分泌シグナルを用いようとするといえることから、請求人の上記主張は採用できない。
（２−４−３）菌体外分泌の可否
 　請求人は「また、分泌シグナルが連結された目的タンパク質が、菌体外に効率よく分泌されるか否かは、本出願人が平成２１年３月５日付の手続補正書で述べたように、目的タンパク質の表面電荷の違い（等電点）、分泌プロテアーゼによる分解のし易さ、膜透過性の違い、細胞内のシグナル認識粒子（ＳＲＰ）の構造と機能の違い、細胞外環境（ｐＨなど）等の諸要因が全て具備されたか否かに依存するものであります。更に、目的タンパク質を発現させる宿主の違いも、目的タンパク質の菌体外分泌の可否に影響を与えると考えられます。その証拠に、本願明細書の段落［００３７］に記載のように、同じバチルス属細菌である枯草菌では、シスタチンを菌体外に分泌生産できません。 
 　すなわち、目的タンパク質の菌体外分泌の可否は、多分に不確定要素を含むものであり、単に分泌シグナルを有していればよいというものでは決してありません。」と主張している（回答書第４頁第１３行〜第２４行）。
　 請求人の主張するように「目的タンパク質の菌体外分泌の可否は、多分に不確定要素を含むものであり、単に分泌シグナルを有していればよいというものでは決して」ないかもしれないが、 上記（２−３）の理由により、シスタチンがある程度分泌されることは当業者が期待し得るものであるから、一般的に菌体外分泌について完全な予見性がないからといって、そのことにより、本願補正発明１に、格別の困難性があったとも、格別顕著な効果を有するとも認めることはできず、よって、請求人の上記主張を採用できない。
（３）特許法第３６条第６項第１号
　本願補正発明１は、バチルス　メガテリウム菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域とシスタチン類をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなり、シスタチン類を菌体外に分泌する組換えバチルス　メガテリウム菌、に係るものである。
　一方、本願明細書には、本願補正発明１に係るバチルス　メガテリウム菌について、Bacillus　sp.　KSM−S237由来アルカリセルラーゼ遺伝子のシグナルペプチド等を用いてバチルス　メガテリウム菌を宿主として実際にシスタチンを分泌させた実施例は記載されているが、それ以外のバチルス属由来アルカリセルラーゼ遺伝子のシグナルペプチド等を用いてバチルス　メガテリウム菌を宿主として実際にシスタチンを分泌させた実施例は記載されていない。
　ここで、本願の比較例（本願明細書【００３７】）においては、Bacillus　sp.　KSM−S237由来アルカリセルラーゼ遺伝子のシグナルペプチド等を用いると、枯草菌を宿主とした場合には菌体外への蛋白の分泌が起こらない旨記載されているが、その一方、引用例１により枯草菌を宿主にバチルス属（バチルス　エスピー　KSM-64（FERM P-10482）株）由来アルカリセルラーゼのシグナルペプチド等を用いた場合には菌体外への蛋白の分泌が生じる。これに鑑みると、同じ宿主に対して同じくバチルス属由来アルカリセルラーゼのシグナルペプチド等を用いた場合であっても、シグナルペプチドの起源であるバチルス属の由来の株によっては異なる分泌結果が得られるということが本願出願時の技術常識であるといえる。そうすると、１つの株由来のシグナルペプチドについての実施例が記載されていても、その実施例をもってバチルス属全体について一般化できるという合理的な説明がなされていない本願の発明の詳細な説明は、バチルス属由来アルカリセルラーゼ遺伝子のシグナルペプチド等を用いたバチルス　メガテリウム菌におけるタンパク質分泌について、シグナルペプチドの由来がバチルス属全体の株について裏付けがあるとはいえない。よって、本願補正発明１は本願出願時の技術常識を考慮しても、発明の詳細な説明において発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載されているとはいえないから，本願補正後の請求項１の記載は、特許法３６条６項１号に規定する要件を満たしておらず、本願補正発明１は特許出願の際独立して特許を受けることができるものではない。
（４）むすび
　以上のとおり、本件補正は、平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反するので、特許法第１５９条第１項の規定において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。
３．本願発明について
　平成２１年１月１３日付の手続補正は上記のとおり却下されたので、本願の請求項１に係る発明（以下、「本願発明１」）は、平成２０年８月２５日付手続補正書の特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定される、以下のとおりのものである。
　「【請求項１】　バチルス　メガテリウム菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなり、目的タンパク質を菌体外に分泌する組換えバチルス　メガテリウム菌。」
（１）引用例
　原査定に引用した引用文献１、２及びその記載事項は、上記２．（２）（２−１）に記載したとおりである。
（２）対比、判断
  本願発明１と引用例１に記載された事項は、バチルス属の細菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と発現の目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなり、目的タンパク質を菌体外に分泌する組換えバチルス属細菌、である点で共通する。
　一方両者は、１）バチルス属細菌として、前者がバチルス　メガテリウム菌を用いているのに対し、後者が枯草菌を用いている点で相違する。
　しかしながら、上記２．（２−３）に記載した理由により、上記相違点について本願発明１は当業者が容易に想到し得ることであり、本願発明１は、引用例１及び２の記載から当業者が容易になし得たものであるから、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができるものではない。
４．むすび
  以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。