【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年3月15日(2011.3.15)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
燃料を生産する方法であって、
(a)固定炭素源の存在下における微生物群の培養工程と、
(b)培養された前記微生物から脂質成分を単離する工程と、
及び(c)単離された前記脂質成分を一又は複数の化学反応に供して、アルカンを生成する工程と、を含み、
前記(a)の培養工程において、
(i)前記微生物がそれらの乾燥重量の少なくとも10%を脂質として蓄積し、及び
(ii)前記固定炭素源は、グリセロール、解重合セルロース系物質、スクロース、糖蜜、グルコース、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、マンノース、マンノース、酢酸塩、及びその任意の組合せからなる群から選択され、燃料が生産される、
生産方法。
【請求項２】
前記一又は複数の化学反応が、水素処理、水素化分解、脱酸素および異性化からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
請求項1に従って作製される液体炭化水素の組成物。
【請求項４】
微生物の培養方法であって、解重合セルロース系物質の存在下で従属栄養性増殖を実行できる複数の微細藻類細胞を配置することと、
前記細胞の増殖を可能にするのに十分な期間、前記微細藻類をインキュベートすることを含む、方法。
【請求項５】
前記微細藻類が、ブラクテオコッカス属の種、クロレラ属の種、パラクロレラ属の種、プロトテカ属の種、又はシュードクロレラ属の種から選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
微生物培養物であって、
(a)乾燥細胞重量の少なくとも10%を脂質として含む微生物集団と
(b)リグニンと、フルフラールの一種とからなる群から選択される分子、グルコース、及びキシロースを含有する培養培地と、を含む微生物培養物。
【請求項７】
バイオディーゼル製造方法であって、
(a)第1の微生物培養物中で、脂質生産微生物を培養し、
(b)前記第1の微生物培養物により生産されるバイオマスから脂質を回収し、
(c)前記脂質をエステル転移に供して、脂肪酸エステル及びグリセロールを生産し、並びに
(d)前記グリセロールを第2の微生物培養物へ加えることを含む、方法。
【請求項８】
前記第1及び前記第2の微生物培養物が同一種の微生物の培養物である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
乾燥細胞重量の少なくとも10%を脂質として含む微生物であり、外来ショ糖資化性遺伝子、外来リパーゼ、又は外来多糖類分解酵素をさらに含む、微生物。
【請求項１０】
微生物培養物であって、
(a)乾燥細胞重量の少なくとも10%を脂質として含む微生物群と、及び
(b)(i)スクロース及び(ii)ショ糖インベルターゼ酵素を含む培養培地とを含む、微生物培養物。
【請求項１１】
前記微生物が、ショ糖資化性遺伝子、脂質経路酵素をコードする遺伝子、リパーゼ遺伝子、及び多糖類分解酵素遺伝子からなる群から選択される外来遺伝子を含む、
請求項1、4、7のいずれか一つに記載の方法、請求項6若しくは10に記載の培養物、又は請求項9に記載の微生物。
【請求項１２】
前記微生物が、(i)フルクトキナーゼ遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、ショ糖インベルターゼ遺伝子、及びショ糖輸送体遺伝子からなる群から選択される外来ショ糖資化性遺伝子若しくは(ii)ステアロイルACP不飽和化酵素、グリセロ脂質不飽和化酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質、グリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼ、脂肪アシルACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素、及び脂肪アルデヒドデカルボニラーゼからなる群から選択される脂質経路酵素をコードする遺伝子のいずれか、又は(iii) それぞれ(i)及び(ii)で選択される、外来ショ糖資化性遺伝子及び脂質経路酵素をコードする遺伝子の両者を含む、
請求項1、4、7のいずれか一つに記載の方法、請求項6若しくは10に記載の培養物、又は請求項9に記載の微生物。
【請求項１３】
前記微生物が、微細藻類、油性酵母、及び真菌からなる群から選択される、請求項1若しくは7に記載の方法、請求項6若しくは10に記載の培養物、又は請求項9に記載の微生物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】微生物による油の生産
【技術分野】
【０００１】
本願は2007年6月1日付け出願の米国仮特許出願第60/941,581号、2007年7月10日付け出願の米国仮特許出願第60/959,174号、2007年8月27日付け出願の米国仮特許出願第60/968,291号及び2008年1月28日付け出願の米国仮特許出願第61/024069号に基づいて優先権を主張するものであり、これらの出願の記載内容はこの参照によって任意の目的のためその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、微生物から作られる油、燃料および油脂化学製品の生産に関する。本開示は、特に、油保有微生物(微細藻類、酵母および真菌類を含む)に関し、そして、工業用途目的およびエネルギーまたは食品原料として、有用な化合物(例、脂質類、脂肪酸エステル類、脂肪酸類、アルデヒド類、アルコール類およびアルカン類)の生産のためにそのような微生物を培養する方法に関する。本発明の微生物を、本明細書中において説明されている方法又は他の観点において使用するために選抜または遺伝子操作することができる。
【背景技術】
【０００３】
化石燃料は、埋蔵可燃性地質堆積物で、有機物質であるものの総称であり、数億年にもわたり地殻中で熱および圧力に曝されることにより、原油、石炭、天然ガスまたは重油に転換された、腐食した植物および動物から形成される。
【０００４】
一般の会話においては、化石燃料(別名鉱物燃料)は、他の炭化水素を含有する天然資源(例、石炭、油および天然ガス)と同義的に用いられる。化石燃料の利用は、大規模な産業開発を可能にして、熱を得るための木または泥炭の燃焼と同様に、主に水力発電所を代替した。化石燃料は、有限な再生不能資源である。
【０００５】
電気を発生させるときに、化石燃料の燃焼によるエネルギーはタービンを動かすためにしばしば用いられる。以前の発電では、タービンを回すために燃料の燃焼によって発生する蒸気をしばしば使用したが、より最近の発電所では、燃料の燃焼によってできるガスが直接ガスタービンを回す。20世紀および21世紀の世界的な近代化とともに、化石燃料由来のエネルギー(特に、石油由来のガソリン)の枯渇は、主要な地域紛争および国際紛争の原因のうちの1つである。
【０００６】
人間が化石燃料を燃焼させることは、二酸化炭素排出の最大の源泉であり、二酸化炭素は放射強制を可能にし、且つ地球温暖化に寄与する温室効果ガスの一つである。米国において、90%より多くの温室効果ガス排出は、化石燃料の燃焼から生じる。さらに、他の空気汚染物質(例、酸化窒素、二酸化硫黄、揮発性有機化合物(VOCs)および重金属)が生産される。
【０００７】
人間の活動は、化石燃料の燃焼に由来する二酸化炭素を主に放出することによって温室効果ガスのレベルを上げるが、例えば他のガス(例、メタン)も無視できない存在である。いくつかの温室効果ガスの濃度は、人間活動(例、より高い二酸化炭素濃度を導く化石燃料の燃焼や森林伐採)によって、時間とともに増加してきた。地球温暖化仮説によれば、工業および農業由来の温室効果ガスは、近年観測されている地球温暖化において主要な役割を果たしている。
【０００８】
グローバル経済によるエネルギーの需要増大により、また、炭化水素コストに関しての圧力が増してきた。エネルギーだけではなく、プラスチック工業および化学工業を含む多くの産業は、それらの製造プロセスのための供給原料として、炭化水素が入手できるかどうかに大きく依存する。近年の費用対効果に優れた供給源の代替物は、エネルギーおよびこれらの原料のコストの上昇圧力を緩和することを補助することができるだろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一つの観点では、本発明は、各種実施形態において、リパーゼ、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼ、多糖類分解酵素、脂肪アシルACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質(ACP)からなる群から選択されるタンパク質をコードする外来遺伝子を含む微細藻類細胞、油性酵母、または真菌を含むことが可能な微生物を提供することを対象としている。この微生物(例、微細藻類細胞)を、例えば、表1から選ぶことができる。特定の実施形態では、この細胞はクロレラ属の種(例、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)またはクロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea))である。他の実施形態では、前記微生物は、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジダ属の種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グラシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)からなる群から選択される油性酵母である。さらに他の実施形態においては、前記微生物は、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種からなる群から選択される、真菌である。他の実施形態において、本発明は、例えば細菌宿主(例、大腸菌及びバチラ(Bacilla))で炭化水素修飾酵素を発現し、再生可能ディーゼルを生産する方法を含む。一実施形態では、本方法は、(a)(i)微生物が、乾燥細胞重量の少なくとも10%を脂質として蓄積し (ii)固定炭素源が、グリセロール、解重合セルロース系物質、スクロース(ショ糖)、糖蜜、グルコース(ブドウ糖)、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩およびそれらの任意の組み合わせから選択される条件のもとで、固定炭素源の存在下で微生物群を培養し、(b)前記培養微生物から脂質構成成分を単離し、(c)前記単離した脂質構成成分を一又は複数の化学反応に供して直鎖アルカンを生成し、再生可能ディーゼルを生産する方法を含む。
【００１０】
別の観点においては、本発明は上記の方法に従って作られる液体炭化水素の組成物を対象とする。なお、その組成物はASTM(米国材料試験協会) D975の規格に合致する。
【００１１】
別の観点においては、本発明は、ジェット燃料を生産する方法を対象とする。一実施形態において、前記方法は、(a)(i)微生物が、乾燥細胞重量の少なくとも10%を脂質として蓄積し (ii)固定炭素源が、グリセロール、解重合セルロース系物質、スクロース(ショ糖)、糖蜜、グルコース(ブドウ糖)、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩およびそれらの任意の組み合わせから選択される条件のもとで、固定炭素源の存在下で微生物群を培養し、(b)前記培養微生物から脂質構成成分を単離し、(c)前記単離した脂質構成成分を一又は複数の化学反応に供して直鎖アルカンを生成し、(d)前記直鎖アルカンを開裂させて、ジェット燃料を生産することを含む。
【００１２】
別の観点においては、本発明は、上述した方法に従って生産される液体炭化水素の組成物を対象とする。なお、その組成物はASTM(米国材料試験協会)D1655の規格に合致する。
【００１３】
別の観点において、本発明は、同種の野生株細胞に比べて異なるレベルで、脂質経路酵素を発現するように、遺伝子操作及び/若しくは選抜された微細藻類細胞または酵母細胞を対象とする。いくつかの場合では、前記細胞は、両細胞を同一の条件下で増殖させた場合に、野生型の細胞に比べてより多くの脂質を生産する。いくつかの場合では、前記細胞を、野生型の細胞より高いレベルで脂質経路酵素を発現するように、遺伝子操作および/または選抜する。いくつかの場合では、前記脂質経路酵素を、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール−3リン酸アシルトランスフェラーゼからなる群から選択する。いくつかの場合では、前記細胞を、野生型の細胞より低いレベルで脂質経路酵素を発現するように、遺伝子操作および/または選抜する。(前記脂質経路酵素をより低いレベルで前記細胞が発現する)少なくとも一つの実施形態において、前記脂質経路酵素はクエン酸合成酵素を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、上述した微細藻類細胞または酵母細胞は、野生型の細胞と比べて異なるレベルで脂肪酸合成のグローバル制御因子を発現するように遺伝子操作および/または選抜されて、それにより、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現レベルが野生型の細胞に比べて変更される。いくつかの場合では、前記脂質経路酵素は、脂肪酸を修飾する酵素を含む。いくつかの場合では、前記脂質経路酵素は、ステアロイルACP不飽和化酵素およびグリセロ脂質不飽和化酵素から選ばれる。
【００１５】
別の観点においては、本発明は、一又は複数の外来遺伝子を含む油生産微生物を対象とする。前記外来遺伝子は、脂肪アシルACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの場合では、前記微生物は、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)またはクロレラ属の種(Chlorella sp.)である。他の場合には、前記微生物は本明細書中において説明されている別種である。一実施形態において、前記外来遺伝子をプロモーター(刺激に応答して誘導又は抑制されるもの)と作動可能に連結する。いくつかの場合では、前記刺激を、外部から投入された小分子、熱、寒さおよび光からなる群から選択する。いくつかの場合では、外来遺伝子を、細胞内区画において発現する。いくつかの実施形態では、前記細胞内区画を、葉緑体およびミトコンドリアからなる群から選択する。
【００１６】
一実施形態において、前記外来遺伝子は、脂肪アシルACPチオエステラーゼをコードする。いくつかの場合では、前記外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、炭素数8から18の脂肪酸をアシル担体タンパク質(ACP)から切断するのを触媒する。いくつかの場合では、前記外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、炭素数10から14の脂肪酸をACPから切断するのを触媒する。一実施形態において、前記外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、炭素数12の脂肪酸をACPから切断するのを触媒する。
【００１７】
一実施形態において、前記外来遺伝子は、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードする。いくつかの場合では、前記外来遺伝子によってコードされる還元酵素が、炭素数20から30の脂肪アシルCoAを対応する第一級アルコールへ還元するのを触媒する。いくつかの場合では、前記外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素数8から18の脂肪アシルCoAを対応する第一級アルコールへ還元するのを触媒する。いくつかの場合では、前記外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素数10から14の脂肪アシルCoAを対応する第一級アルコールへ還元するのを触媒する。一実施形態において、前記外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素数12の脂肪アシルCoAをドデカノールへ還元するのを触媒する。
【００１８】
一実施形態において、前記外来遺伝子は、脂肪アシルCoA還元酵素をコードする。いくつかの場合では、前記外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素数8から18の脂肪アシルCoAを対応するアルデヒドへ還元するのを触媒する。一実施形態において、前記外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素数12の脂肪アシルCoAをドデカナールへ還元するのを触媒する。
【００１９】
少なくとも一つの実施形態において、本発明の微生物は、一又は複数の外来ショ糖資化性遺伝子をさらに含む。
【００２０】
別の観点においては、本発明は2つの外来遺伝子を含む微生物であって、第1外来遺伝子が脂肪アシルACPチオエステラーゼをコードし、第2外来遺伝子が脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素およびアシル担体タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする微生物を対象としている。いくつかの場合では、前記微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)またはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)である。他の場合には、前記微生物は本明細書中において説明されている別種である。いくつかの場合では、2つの外来遺伝子をそれぞれ、プロモーター(刺激に応答して誘導又は抑制されるもの)と作動可能に連結する。いくつかの場合では、各々のプロモーターを、同一の刺激に応答して誘導する。
【００２１】
一実施形態において、前記第1外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、炭素数8から18の脂肪酸をACPから切断するのを触媒する。いくつかの実施形態では、前記第2外来遺伝子は、炭素数8から18の脂肪アシルCoAを対応する第一級アルコールに還元するのを触媒する脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードする。いくつかの場合では、前記第1外来遺伝子にコードされるチオエステラーゼは、炭素数10から14の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、前記第2外来遺伝子にコードされる還元酵素は、炭素数10から14の脂肪アシルCoAを対応するアルコールへの還元することを触媒し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素とが同一炭素鎖長のものに作用する。一実施形態において、前記第1外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼは、炭素数12の脂肪酸をACPから切断するのを触媒し、前記第2外来遺伝子によってコードされる還元酵素は、炭素数12の脂肪アシルCoAをドデカノールへ還元するのを触媒する。いくつかの実施形態では、前記第2外来遺伝子は、炭素数8から18の脂肪アシルCoAを対応するアルデヒドへ還元するのを触媒する脂肪アシルCoA還元酵素をコードする。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第2外来遺伝子は脂肪アシルCoA還元酵素をコードし、微生物はさらに脂肪アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第3外来遺伝子を含む。いくつかの場合では、第1外来遺伝子にコードされるチオエステラーゼは、炭素数8から18の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、第2外来遺伝子にコードされる還元酵素は、炭素数8から18の脂肪アシルCoAを対応する脂肪アルデヒドへ還元することを触媒し、第3外来遺伝子にコードされるデカルボニラーゼは、炭素数8から18の脂肪アルデヒドを対応するアルカンに転換することを触媒し、そこでは、前記チオエステラーゼ、前記還元酵素、及び前記デカルボニラーゼは、同一炭素鎖長のものに作用する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第2外来遺伝子は、脂肪アシルACPチオエステラーゼと自然に共発現するアシル担体タンパク質をコードする。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第2外来遺伝子はアシル担体タンパク質をコードし、そして、微生物はさらに脂肪アシルCoA還元酵素および脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする第3外来遺伝子を含む。いくつかの場合では、第3外来遺伝子は脂肪アシルCoA還元酵素をコードし、そして、微生物はさらに脂肪アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第4外来遺伝子を含む。
【００２５】
別の観点においては、本発明は、微生物群において、分子を生産する方法を対象とする。一実施形態においては、本方法は、培養培地中において微生物群を培養する方法であって、前記微生物は、(i) 脂肪アシルACPチオエステラーゼをコードする第1外来遺伝子および(ii)脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素をコードする第2の外来の遺伝子を含み、そして、前記微生物は、アシル担体タンパク質(ACP)に連結される脂肪酸を合成し、脂肪アシルACPチオエステラーゼはACPから脂肪酸を切断することを触媒して、さらなる処理を介して脂肪アシルCoAを生産し、並びに、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素は、アシルCoAを還元してアルコールにするのを触媒する方法である。
【００２６】
微生物群で分子を生産する方法の一つの実施形態において、微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)またはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)である。他の場合には、微生物は、本明細書中において説明されているほかの種である。いくつかの場合では、培養培地は、グリセロールを含む。一実施形態において、グリセロールは、エステル転移プロセスの副産物である。いくつかの場合では、培養培地は、グリセロールおよび少なくとも一つの他の固定炭素源を含む。一実施形態において、前記少なくとも一つの他の固定炭素源は、スクロース(ショ糖)である。いくつかの場合では、グリセロールの全て及び少なくとも一つの他の固定炭素源の全てを、発酵の開始時に微生物に提供する。いくつかの場合では、グリセロールおよび少なくとも一つの他の固定炭素源を、発酵期間中に渡り所定の率で、微生物に供給する。本発明のいくつかの培養方法では、第1の期間に少なくとも一つの他の固定炭素源の非存在下で微生物にグリセロールを提供し、第2の期間に、前記少なくとも一つの他の固定炭素源の存在下で前記微生物を培養する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、外来遺伝子は、第1の刺激に応答して誘導可能なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの場合では、本方法は、第1の刺激を提供すること、 及び、第1の刺激存在下で第1の期間中に微生物群を培養してアルコールを生産することをさらに含む。いくつかの場合では、前記方法は、培養培地および微生物からなる水性バイオマスからアルコールを抽出することをさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記第1外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが炭素数8から18の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、前記第2外来遺伝子によってコードされる還元酵素が炭素数8から18の脂肪アシルCoAを対応する第一級アルコールに還元することを触媒し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素は同一炭素鎖長のものに作用する。いくつかの場合では、前記第1外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが炭素数10から14の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、前記第2外来遺伝子によってコードされる還元酵素が炭素数10から14の脂肪アシルCoAを対応する第一級アルコールに還元することを触媒し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖長のものに作用する。一実施形態においては、前記第1外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが炭素数12の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、前記第2外来遺伝子にコードされる還元酵素が炭素数12の脂肪アシルCoAをドデカノールに還元することを触媒する。いくつかの場合では、微生物は、アシル担体タンパク質をコードする第3外来遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記第3外来遺伝子は、脂肪アシルACPチオエステラーゼと自然に共発現するアシル担体タンパク質をコードする。
【００２９】
別の観点においては、本発明は、微生物群で脂質分子を生産する方法を対象とする。一実施形態においては、前記方法は微生物群を培養培地で培養する方法であって、前記微生物は、(i) 脂肪アシルACPチオエステラーゼをコードする第1外来遺伝子および(ii)脂肪アシルCoA還元酵素をコードする第2の外来の遺伝子を含み、前記微生物は、アシル担体タンパク質(ACP)に連結される脂肪酸を合成し、脂肪アシルACPチオエステラーゼは脂肪酸をACPから切断するのを触媒してさらなる処理を介して脂肪アシルCoAを生産し、並びに脂肪アシルCoA還元酵素はアシルCoAをアルデヒドへ還元することを触媒するのを含む。いくつかの場合では、微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)またはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)である。他の場合には、微生物は、本明細書中において記載される微生物の種である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、外来遺伝子は、第1の刺激に応答して誘導可能であるプロモーターと作動可能に連結され、前記方法は、第1の刺激を提供すること、及び第1の刺激の存在下で第1の期間中微生物群を培養してアルデヒドを生産すること、を含む。一実施形態において、前記方法は、培養培地および微生物群を含む水性バイオマスからアルデヒドを抽出することをさらに含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、前記第1外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが炭素数8から18の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、前記第2外来遺伝子によってコードされる還元酵素が炭素数8から18の脂肪アシルCoAを対応するアルデヒドに還元することを触媒し、前記チオエステラーゼと前記還元酵素が同一炭素鎖長のものに作用する。いくつかの場合では、微生物は、アルデヒドをアルカンへ転換することを触媒する脂肪アルデヒドデカボニラーゼをコードする第3外来遺伝子をさらに含む。
【００３２】
いくつかの場合では、外来遺伝子は、第1の刺激に応答して誘導可能であるプロモーターと作動可能に連結され、前記方法は、第1の刺激を提供すること、及び第1の刺激の存在下で第1の期間の間に微生物群を培養してアルカンを生産すること、をさらに含む。いくつかの場合では、前記方法は、培養培地および微生物群を含む水性バイオマスからアルカンを抽出することをさらに含む。
【００３３】
いくつかの場合では、前記第1外来遺伝子によってコードされるチオエステラーゼが炭素数8から18の脂肪酸をACPから切断することを触媒し、前記第2外来遺伝子によってコードされる還元酵素が炭素数8から18の脂肪アシルCoAを対応するアルコールに還元することを触媒し、前記第3外来遺伝子によってコードされるデカルボニラーゼが炭素数8から18のアルデヒドを対応するアルカンへ転換することを触媒し、前記チオエステラーゼ、前記還元酵素及び前記デカルボニラーゼは、同一炭素鎖長のものに作用する。いくつかの実施形態では、微生物はアシル担体タンパク質をコードする第3外来遺伝子をさらに含む。いくつかの場合では、前記第3外来遺伝子は、脂肪アシルACPチオエステラーゼと自然に共発現するアシル担体タンパク質をコードする。いくつかの場合では、微生物は、アルデヒドをアルカンへ転換することを触媒する脂肪アルデヒドデカルボニラーゼをコードする第4遺伝子をさらに含む。
【００３４】
いくつかの方法において、培養培地は、グリセロールを含む。いくつかの実施形態においては、グリセロールは、エステル転移プロセスの副産物である。いくつかの場合では、培養培地は、グリセロールおよび少なくとも一つの他の固定炭素源を含む。一実施形態においては、前記少なくとも一つの他の固定炭素源は、スクロース(ショ糖)である。いくつかの場合では、グリセロールの全ておよび少なくとも一つの他の固定炭素源の全ては、発酵の開始時に微生物へ提供される。いくつかの場合では、グリセロール及び少なくとも一つのグリセロール以外の固定された前記炭素源を、発酵過程にわたり、所定の率で微生物に提供する。一実施形態では、第1の期間に前記少なくとも一つの他の固定炭素源の非存在下で微生物にグリセロールを提供し、第1の期間の終わりに前記少なくとも一つの他の固定炭素源を提供し、及び第2の期間の間前記少なくとも一つの他の固定炭素源の存在下で前記微生物を培養する。
【００３５】
別の観点においては、本発明は、微生物群で特定の炭素鎖長を有する脂肪酸分子を生産する方法を対象とする。一実施形態においては、前記方法は、培養培地中で脂肪を生産する微生物の群を培養するものであって、前記微生物は特定の炭素鎖長のものに特異的な活性を有する脂肪アシルACPチオエステラーゼをコードする外来遺伝子を含み、前記微生物がアシル担体タンパク質に連結される脂肪酸を合成し、 前記チオエステラーゼは、脂肪酸を特定の炭素鎖長のものへ合成するときに脂肪酸をACPから切断するのを触媒することを含む。いくつかの場合では、微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)またはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)である。他の場合には、微生物は本明細書中において記載される、別種の微生物である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、外来遺伝子が、第1の刺激に応答して誘導可能であるプロモーターと作動可能に連結され、前記方法は、第1の刺激を提供すること、及び第1の刺激の存在下で第1の期間の間微生物群を培養すること、をさらに含む。いくつかの場合では、前記方法は、培養培地および微生物群を含む水性バイオマスから脂肪酸を抽出することをさらに含む。
【００３７】
いくつかの場合では、微生物は、アシル担体タンパク質をコードする第2外来遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記第2外来遺伝子は、脂肪アシルACPチオエステラーゼと自然に共発現するアシル担体タンパク質をコードする。一実施形態においては、アシルACPチオエステラーゼは、炭素数8から18の脂肪酸をACPから切断することを触媒する。
【００３８】
いくつかの場合では、培養培地は、グリセロールを含む。一実施形態においては、グリセロールは、エステル転移プロセスの副産物である。いくつかの実施形態では、培養培地は、グリセロールおよび少なくとも一つの他の固定炭素源を含む。一実施形態においては、前記少なくとも一つの他の炭素源は、スクロース(ショ糖)である。いくつかの場合では、グリセロールの全ておよび少なくとも一つの他の固定炭素源の全てを、発酵の開始時に微生物に提供する。いくつかの場合では、グリセロールおよび少なくとも一つの他の固定炭素源を、発酵過程に渡って、所定量で微生物に供給する。一実施形態においては、第1の期間に少なくとも一つの他の固定炭素源不存在下でグリセロールを微生物に提供し、前記少なくとも一つの他の固定炭素源を第1の期間の終わりに提供し、 及び前記少なくとも一つの他の固定炭素源の存在下で第2の期間中、微生物を培養する。
【００３９】
別の観点においては、本発明は外来遺伝子を含む微細藻類細胞を対象とし、前記外来遺伝子は、リパーゼ、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、フルクトキナーゼまたは多糖類分解酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの場合では、細胞は、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)またはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)である。他の場合には、前記細胞は本明細書中において説明されている、微細藻類の別種である。
【００４０】
いくつかの場合では、外来遺伝子を、プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの場合では、プロモーターは、刺激に応答して、誘導可能または抑制可能である。各種実施形態においては、刺激は、外部から提供される小分子、熱、寒さおよび光からなる群から選択される。いくつかの場合では、外来遺伝子を、細胞内区画において発現する。いくつかの実施形態では、細胞内区画を、葉緑体およびミトコンドリアからなる群から選択する。
【００４１】
いくつかの場合では、前記遺伝子は、表9から選択されるリパーゼと少なくとも70%のアミノ酸の同一性を有するリパーゼをコードする。一実施形態においては、前記リパーゼはノボザイム435(novozym-435)である。一実施形態においては、前記多糖類分解酵素は、クロレラウイルスに内在している。
【００４２】
別の観点においては、本発明は2つの外来遺伝子を含む微細藻類細胞を対象とする。そこでは、第1外来遺伝子はリパーゼをコードし、第2外来遺伝子は多糖類分解酵素をコードする。いくつかの場合では、前記外来遺伝子を、プロモーターと作動可能にそれぞれ連結する。いくつかの場合では、前記外来遺伝子を、刺激に応答して誘導されるプロモーターと作動可能にそれぞれ連結する。いくつかの場合では、前記外来遺伝子を、それぞれ同一の刺激に応答して誘導されるプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの場合では、外来遺伝子は、他のプロモーターを誘導しない少なくとも一つの刺激に応答して誘導されるプロモーターと作動可能にそれぞれ連結される。
【００４３】
別の観点においては、本発明は、微生物内で脂質分子を製造する方法を対象とする。一実施形態においては、前記方法は、(a)細胞密度を増やすのに十分な第1の期間の間、微生物を培養する工程であって、前記微生物が(i)リパーゼをコードする外来遺伝子と、及び/又は(ii)多糖類分解酵素をコードする外来遺伝子を含み、そこでは、前記外来遺伝子が、刺激に応答して誘導されるプロモーターと作動可能に連結され、(b)刺激を提供し、 並びに(c)刺激の存在下で第2の期間の間、前記微生物をインキュベートすることを含む。
【００４４】
別の観点においては、本発明は、微生物内で脂質分子を製造する方法を対象とする。一実施形態においては、前記方法は、(a) 細胞密度を増やすのに十分な第1の期間の間、脂質生産微生物を培養し、(b) 微生物と直接接触したときに、微生物に感染し及び溶解させることができるウイルスを提供し、並びに、(c)第2の期間中、微生物をインキュベートして溶解水性バイオマスを生産することを含む。一実施形態では、前記方法は、前記溶解水性バイオマスから脂質分子を抽出することをさらに含む。
【００４５】
別の観点においては、本発明は外来遺伝子を含む微細藻類細胞を対象とし、前記外来遺伝子は脂質経路酵素のための補因子をコードするか、又は前記補因子の合成に関与するタンパク質をコードする。
【００４６】
別の観点においては、本発明は、脂質生産微生物を培養する方法を対象とする。一実施形態においては、前記方法は、脂質経路酵素のための一又は複数の十分な量の補因子の存在下で微生物を培養し、前記一又は複数の補因子の非存在下における微生物脂質収率に対して微生物脂質収率を増加させることを含む。いくつかの場合では、前記一又は複数の補因子は、一又は複数の脂質経路酵素により要求されるビタミンである。一実施形態においては、前記一又は複数の補因子は、ビオチンである。いくつかの場合では、前記一又は複数の補因子を、前記一又は複数の補因子を生産するよう遺伝子操作された微生物をその培養物に含ませることにより提供する。
【００４７】
別の観点においては、本発明は微生物を発酵させる方法を対象とし、微生物へのエネルギー源としてグルコース(ブドウ糖)及びキシロースを含む混合物を提供することを含む。一実施形態においては、前記混合物は、リグニンをさらに含む。一実施形態においては、前記混合物は、少なくとも一種のフルフラールをさらに含む。いくつかの場合では、前記混合物は、解重合セルロース系物質である。いくつかの場合では、前記混合物は、少なくとも一つのショ糖資化性酵素をさらに含む。一実施形態においては、前記混合物は、ショ糖インベルターゼを含む。
【００４８】
いくつかの場合では、微生物は、ブラクテオコッカス・マイナー(Bracteococcus minor)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、ブラクテオコッカス・メディオヌクレアトゥス(Bracteococcus medionucleatus)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・オバァリス(Chlorella ovalis)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、パラクロレラ・ケッセレリ(Parachlorella kessleri)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、 及びシュードクロレラ・アクアティカ(Pseudochlorella aquatica)からなる群から選択される。他の場合には、微生物は、本明細書中において説明されている、微生物の別種である。いくつかの場合では、微生物は、遺伝子操作されて、少なくとも一つの脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素またはショ糖資化性酵素をコードする外来遺伝子を発現する。
【００４９】
別の観点においては、本発明は、微細藻類を培養する方法を対象とし、セルロース系物質、五炭糖、六炭糖および酢酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの炭素基質を含む栄養源を包含する培養培地で微細藻類を培養することを含む。いくつかの場合では、前記炭素基質はグルコース(ブドウ糖)であり、前記微細藻類はクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)、シュードクロレラ(Pseudochlorella)、ブラクテオコッカス(Bracteococcus)、プロトテカ(Prototheca)およびセネデスムス(Scenedesmus)からなる群から選択される属である。いくつかの場合では、前記炭素基質はキシロースであり、前記微細藻類はクロレラ、シュードクロレラ(Pseudochlorella)、プロトテカ(Prototheca)からなる群から選択される属である。いくつかの場合では、前記炭素基質がスクロース(ショ糖)であり、前記微細藻類は、クロレラおよびブラクテオコッカス(Bracteococcus)からなる群から選択される属である。いくつかの場合では、前記炭素基質がフルクトースであり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)、プロトテカ(Prototheca)およびセネデスムス(Scenedesmus)からなる群から選択される属である。いくつかの場合では、前記炭素基質がアラビノースであり、前記微細藻類はクロレラ属の種である。いくつかの場合では、前記炭素基質がマンノースであり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)、ブラクテオコッカス(Bracteococcus)、プロトテカ(Prototheca)およびセネデスムス(Scenedesmus)からなる群から選択される属である。いくつかの場合では、前記炭素基質がガラクトースであり、前記微細藻類がブラクテオコッカス(Bracteococcus)、パラクロレラ(Parachlorella)クロレラ、シュードクロレラ(Pseudochlorella)、ブラクテオコッカス(Bracteococcus)、プロトテカ(Prototheca)からなる群から選択される属である。いくつかの場合では、前記炭素基質が酢酸塩であり、前記微細藻類がクロレラ、パラクロレラ(Parachlorella)およびプロトテカ(Prototheca)からなる群から選択される属である。
【００５０】
一実施形態において、培養培地は、少なくとも一つのショ糖資化性酵素をさらに含む。いくつかの場合には、微細藻類は、少なくとも一つの脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素、又はショ糖資化性酵素をコードする外来遺伝子を発現するように遺伝子操作された。いくつかの場合では、前記培養培地は、ショ糖インベルターゼを含む。
【００５１】
別の観点においては、本発明は、微細藻類を培養する方法を対象とし、解重合セルロース系物質存在下において、複数の微細藻類細胞を配置することを含む。いくつかの場合では、前記微細藻類を、グリセロール、スクロース(ショ糖)、グルコース(ブドウ糖)、アラビノース、ガラクトース、キシロース、フルクトース、アラビノース、マンノース、酢酸塩およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される他の固定炭素源存在下で、培養する。一実施形態においては、前記微細藻類を、少なくとも一つのショ糖資化性酵素の存在下で培養する。
【００５２】
いくつかの場合には、微細藻類は、ブラクテオコッカス(Bracteococcus)属の種、クロレラ属の種、パラクロレラ(Parachlorella)属の種、シュードクロレラ(Pseudochlorella)属の種、から選択される。いくつかの場合には、微細藻類はブラクテオコッカス・マイナー(Bracteococcus minor)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、ブラクテオオコッカス・メディオヌクレアトゥス(Bracteococcus medionucleatus)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・オバァリス(Chlorella ovalis)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、パラクロレラ・ケッセレリ(Parachlorella kessleri)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、 及びシュードクロレラ・アクアティカ(Pseudochlorella aquatica)から選択される。他の場合には、微細藻類は、本明細書中に記載される微細藻類の別種である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、微細藻類を遺伝子操作して、すくなくとも一つの脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素、またはショ糖資化性酵素をコードする外来遺伝子を発現させる。一実施形態においては、少なくとも一つのショ糖資化性酵素は、ショ糖インベルターゼである。いくつかの場合では、少なくとも一つの脂質修飾酵素は、ステアロイルACP不飽和化酵素、グリセロ脂質不飽和化酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、及びグリセロール−3リン酸アシルトランスフェラーゼから選択される。いくつかの場合では、少なくとも一つの炭化水素修飾酵素は、脂肪アシルACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼおよびアシル担体タンパク質から選択される。
【００５４】
別の観点においては、本発明は、脂質生産微生物を培養する方法を対象とし、前記方法は酢酸の存在下かつ固定窒素源の不存在下で微生物を培養することを含む。いくつかの場合では、前記微生物を十分量の酢酸の存在下で培養して、酢酸非存在下(培養条件は、それ以外ではその二つの培養物の間で同じである)の微生物脂質収率より多く、微生物脂質収率を増加させる。
【００５５】
別の観点においては、本発明は、微細物集団と(グルコース、キシロース、及び分子(リグニンと、フルフラールの一種とからなる群から選択されるもの)を含有する)培養培地とを含む微生物培養物を対象とする。いくつかの場合では、前記微生物は、ブラクテオオコッカス・マイナー(Bracteococcus minor)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、ブラクテオコッカス・メディオヌクレアトゥス(Bracteococcus medionucleatus)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・オバァリス(Chlorella ovalis)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、パラクロレラ・ケッセレリ(Parachlorella kessleri)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、 及びシュードクロレラ・アクアティカ(Pseudochlorella aquatica)から選択される。他の場合には、微生物は本明細書中に記載される微生物の別種である。
【００５６】
別の観点においては、本発明は、微細藻類を培養する方法を対象とする。一実施形態において、前記方法は、(a)従属栄養性増殖を実行することができる微細藻類細胞を提供し、(b)増殖培地(その増殖培地は解重合セルロース系物質を含む)中に前記微細藻類細胞を配置し、及び(c)前記細胞が増殖することが可能な十分な期間、前記微細藻類をインキュべートすることを含む。
【００５７】
別の観点においては、本発明は、バイオディーゼル製造方法を対象とする。一実施形態において、前記方法は、(a)第1微生物培養物中で脂質生産微生物を培養し、(b)前記第1微生物培養物によって生産されるバイオマスから脂質を回収し、(c)前記脂質をエステル転移に供して脂肪酸エステルとグリセロールとを生産し、並びに(d)前記グリセロールを第2微生物培養物に加えることを含む。いくつかの場合では、前記第1微生物培養物および第2微生物培養物は、同一種の微生物の培養物である。いくつかの場合では、第2微生物培養物は、パラクロレラ・ケッセリ(Parachlorella kessleri)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、ブラクテオコッカス・メディオヌクレタス(Bracteococcus medionucleatus)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)およびクロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)からなる群から選択される微生物を含む。他の場合には、第2微生物培養物は、本明細書中に記載される別種の微生物である。
【００５８】
別の観点においては、本発明は、グリセロールおよび少なくとも一つの他の固定炭素源存在下で微生物を培養することを含む発酵方法を対象とする。いくつかの場合では、グリセロールおよび少なくとも一つの他の固定炭素源を、予め定められた比率で同時に微生物に提供する。いくつかの場合では、グリセロールおよび少なく一つの他の固定炭素源の全部を、発酵の開始期に微生物に提供する。いくつかの場合では、グリセロールおよび少なくとも一つの他の固定炭素源の全部を、発酵過程に渡って、あらかじめ定められた率で微生物に供給する。前記方法の一実施形態においては、グリセロールを、第1の期間中、前記少なくとも一つの他の固定炭素源の非存在下で微生物に提供し、第1の期間の終わりに前記少なくとも一つの他の固定炭素源を提供し、及び、前記少なくとも一つの他の固定炭素源存在下において、第2の期間中、微生物を培養する。一実施形態においては、前記少なくとも一つの他の固定炭素源を、第2の期間中、予め定められた率で微生物に供給する。いくつかの場合では、前記少なくとも一つの他の固定炭素源の全てを、第1の期間の終わりに微生物に提供する。前記方法の一実施形態においては、前記少なくとも一つの他の固定炭素源を、第1の期間中、グリセロール非存在下で微生物に提供し、グリセロールを第1の期間の終わりに提供し、及び微生物をグリセロール存在下で第2の期間の間培養する。一実施形態においては、グリセロールは、エステル転移プロセスの副産物である。一実施形態においては、グリセロールは酸性化されている。別の実施形態では、前記グリセロールは非酸性である。いくつかの場合では、少なくとも一つの他の固定炭素源は、グルコース(ブドウ糖)である。いくつかの場合では、少なくとも一つの他の固定炭素源は、解重合セルロース系物質である。一実施形態においては、少なくとも一つの他の固定炭素源は、スクロース(ショ糖)である。
【００５９】
別の観点においては、本発明は、微生物集団、グリセロール、及び少なくとも一つの糖(キシロース、グルコース及びスクロースからなる群から選択されるもの)を含む発酵体を対象とする。一実施形態においては、グリセロールは、脂質エステル転移プロセスの副産物である。いくつかの場合では、微生物はパラクロレラ・ケッセリ(Parachlorella kessleri)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、ブラクテオコッカス・メディオヌクレタス(Bracteococcus medionucleatus)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)およびクロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)からなる群から選択される。他の場合には、微生物は、本明細書中に記載される別種である。
【００６０】
別の観点においては、本発明は、微生物を発酵させる方法を対象とする。一実施形態において、前記方法は、固定炭素エネルギーの唯一の原料として、エステル転移プロセスからの副産物グリセロールを提供することを含む。一実施形態においては、光エネルギーを微生物に提供しない。別の実施形態では、光エネルギーを微生物に提供する。いくつかの場合では、微生物は、パラクロレラ・ケッセリ(Parachlorella kessleri)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、ブラクテオコッカス・メディオヌクレタス(Bracteococcus medionucleatus)、プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)およびクロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)から選ばれる。他の場合には、前記微生物は、本明細書中に記載される別種である。
【００６１】
別の観点においては、本発明は、外来のショ糖資化性遺伝子を含む微生物を対象とする。一実施形態において、遺伝子は、ショ糖輸送体をコードする。一実施形態において、遺伝子は、ショ糖インベルターゼをコードする。一実施形態において、遺伝子は、フルクトキナーゼをコードする。いくつかの場合では、微生物は、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)またはクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)からなる群から選択される種である。他の場合には、微生物は、本明細書中に記載される別種である。
【００６２】
別の観点においては、本発明は、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)またはクロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)の種の細胞であって、前記細胞が外来遺伝子を含む細胞を対象とする。いくつかの場合では、前記外来遺伝子は、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、脂質修飾酵素、炭化水素修飾酵素、及びフルクトキナーゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、細胞外間隙に分泌されるショ糖インベルターゼである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、細胞質にターゲットされるショ糖インベルターゼである。
【００６３】
別の観点においては、本発明は、微生物集団と((i)スクロース(ショ糖)及び(ii)ショ糖インベルターゼ酵素を含む)培養培地とを含む微生物培養物を対象とする。
【００６４】
別の観点においては、本発明は、微生物集団と((i)糖蜜及び(ii)ショ糖インベルターゼ酵素を含む)培養培地とを含む微生物培養物を対象とする。
【００６５】
別の観点においては、本発明は、微生物集団と((i)スクロース、(ii)リグニン、及び(iii)ショ糖インベルターゼ酵素を含む)培養培地とを含む微生物培養物を対象とする。
【００６６】
上で説明されているさまざまな微生物培養物において、微生物は、少なくとも一つの外来ショ糖資化性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記ショ糖資化性遺伝子は、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ又はフルクトキナーゼをコードする。一実施形態において、前記ショ糖インベルターゼは、微生物集団によって発現される外来ショ糖インベルターゼ遺伝子にコードされる分泌可能なショ糖インベルターゼ酵素である。いくつかの場合では、微生物は、脂質経路酵素または炭化水素修飾酵素をコードする少なくとも一つの外来遺伝子を含む。
【００６７】
別の観点においては、本発明は、ショ糖資化性遺伝子をコードするcDNA、並びにハイグロマイシン抗生物質またはG418抗生物質に耐性を付与するタンパク質をコードするcDNA、を含む核酸を対象とする。
【００６８】
特に明記しない限り、上記した種々の方法、組成物、細胞、微生物(microorganisms)、微生物(microbes)、微生物培養物、発酵槽等の実施形態において、前記微生物(microorganism or microbe)は、微細藻類、油性酵母、真菌または細菌であってもよい。いくつかの場合では、前記微生物は、表1にリストされる微細藻類からなる群から選択される。いくつかの場合では、前記微生物は、クロレラ属の種である。いくつかの場合では、前記微生物は、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ( Chlorella antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・キャプスラタ(Chlorella capsulata)、クロレラ・デシカッタ(Chlorella desiccata)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata), クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. Actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウェノフィラ(Chlorella infusionum var.Auxenophila), クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオヴィリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var.Lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)、クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アイリディス(Chlorella vulgaris var. airidis)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルシア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ビリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)及びクロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)からなる群から選択される。いくつかの場合では、前記��生物は、クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)からなる群から選択される油性酵母である。いくつかの場合では、前記微生物は、モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種からなる群から選択される真菌である。
【００６９】
上述された各種実施形態において、微生物は、少なくとも一つの外来ショ糖資化性遺伝子を含むことができる。いくつかの場合では、前記ショ糖資化性遺伝子は、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはフルクトキナーゼをコードする。
【００７０】
上述された各種実施形態において、微生物は、脂質経路酵素をコードする少なくとも一つの外来遺伝子を含むことができる。いくつかの場合では、前記脂質経路酵素は、ステアロイルACP不飽和化酵素、グリセロ脂質不飽和化酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、アシル担体タンパク質およびグリセロール-3リン酸アシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００７１】
上述された各種実施形態において、微生物は、炭化水素修飾酵素をコードする少なくとも一つの外来遺伝子を含むことができる。いくつかの場合では、前記炭化水素修飾酵素は、脂肪アシルACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ及び/又はアシル担体タンパク質からなる群から選択される。
【００７２】
上記した各種実施形態の任意の二以上が一緒に組み合わされて、本発明の範囲内に包含される他の実施形態を生み出す。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】追加的グルコース(ブドウ糖)存在下または非存在下で、且つ各種グリセロール存在下で培養する場合の、クロレラの複数種・株の1リットル当たりの乾燥細胞重量(DCW)を示す図である。
【００７４】
【図２】追加的グルコース(ブドウ糖)と共に各種グリセロール存在下で培養する場合の、クロレラの複数種・株の1リットル当たりの乾燥細胞重量(DCW)を示す図である。
【００７５】
【図３】追加的グルコース(ブドウ糖)と共に各種グリセロール存在下で培養する場合の、クロレラの複数種・株の培養物の相対的脂質濃度を示す図である。
【００７６】
【図４】追加的グルコース(ブドウ糖)存在下または非存在下で、且つ各種グリセロール存在下で培養する場合の、クロレラの複数種・株の脂質濃度を示す図である。
【００７７】
【図５】追加的グルコース(ブドウ糖)と共に各種グリセロール存在下において、グリセロールをグルコースの後に経時的に加えて培養する場合の、クロレラの2つの種・株の乾燥細胞重量(DCW)の脂質%を示す図である。
【００７８】
【図６】追加的グルコース(ブドウ糖)と共に各種のグリセロール存在下で培養する場合の、クロレラの2つの種・株の乾燥細胞重量(DCW)の脂質%を示す図である。
【００７９】
【図７】2%のグルコース(ブドウ糖)及び1%のブドウ糖+1%の試薬級グリセロールの存在下で培養する場合の、クロレラの複数種・株の培養物の相対的脂質濃度を示す図である。
【００８０】
【図８】試薬級グリセロール存在下または非存在下で、且つグルコース(ブドウ糖)の存在下において、グリセロールを経時的に又はグルコースと組み合わせて添加して培養する場合の、クロレラの複数種・株の乾燥細胞重量(DCW)の脂質%を示す図である。
【００８１】
【図９】追加的グルコース(ブドウ糖)と共に各種グリセロール存在下において、グリセロールを経時的に又はグルコースと組み合わせて添加して培養する場合の、クロレラの複数種・株の培養物の相対的脂質濃度を示す図である。
【００８２】
【図１０】追加的グルコース(ブドウ糖)と共に各種グリセロール存在下において、グリセロールを経時的に又はグルコースと組み合わせて添加して培養する場合の、クロレラの複数種・株の1リットル当たりの乾燥細胞重量(DCW)を示す図である。
【００８３】
【図１１】(a)は、グルコース(ブドウ糖)、試薬級グリセロール、非酸性バイオディーゼル副産物グリセロール及び、グリセロールとグルコース(ブドウ糖)との組み合わせの存在下で培養する場合の、スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)の乾燥細胞重量(DCW)の脂質%を示す図である。
【００８４】
(b)は、 各種グリセロール存在下及びグリセロールとブドウ糖との組み合わせの存在下で培養する場合の、ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)の乾燥細胞重量(DCW)の脂質%を示す図である。
【００８５】
【図１２】(a)は、各種グリセロール存在下、及びグリセロールとグルコース(ブドウ糖)との組み合わせの存在下で培養する場合の、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)の乾燥細胞重量(DCW)の脂質%を示す図である。
【００８６】
(b)は、各種グリセロールの存在下、及びバイオディーゼル副産物グリセロールとグルコース(ブドウ糖)との組み合わせの存在下で培養する場合の、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)の1リットル当たりの乾燥細胞重量(DCW)を示す図である。
【００８７】
【図１３】各種グリセロール存在下、及び非酸性バイオディーゼル副産物グリセロールとグルコース(ブドウ糖)との組み合わせの存在下で培養する場合の、ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)の1リットル当たりの乾燥細胞重量(DCW)を示す図である。
【００８８】
【図１４】追加的グルコース(ブドウ糖)と共に、酸化及び非酸性バイオディーゼル副産物グリセロールの存在下において、グリセロールを経時的に又はグルコースと組み合わせて添加して培養する場合の、ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)とセネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)の1リットル当たりの乾燥細胞重量(DCW)を示す図である。
【００８９】
【図１５】キシロース又はグルコース(ブドウ糖)単独と比較した、キシロースとグルコースとの組み合わせによる、クロレラ増殖への相乗効果を示す図である。
【００９０】
【図１６】外来遺伝子を含むクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)形質転換体の遺伝子型同定(ジェノタイピング)を示す。
【００９１】
【図１７】クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)のコドン使用頻度を示す図である。
【００９２】
【図１８】ディー・サリナ(D.salina)およびクロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)のコドン使用を示す図である。
【００９３】
【図１９】図19は、(a)試薬級グリセロール、(b)非酸性バイオディーゼル副産物グリセロール、及び(c)酸性バイオディーゼル副産物グリセロールを示し、それら全ては実施例に記載される実験で使用された。
【００９４】
【図２０】グルコース(ブドウ糖)及びフルクトース上での、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の増殖を示す図である。
【００９５】
【図２１】1%スクロース(ショ糖)上でのクロレラ・フスカ(Chlorella fusca)の増殖を示す図である。
【００９６】
【図２２】1%スクロース(ショ糖)上でのクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)の増殖を示す図である。
【００９７】
【図２３】ショ糖インベルターゼの存在下若しくは非存在下で、グルコース(ブドウ糖)、スクロース(ショ糖)、又はいくつかの糖蜜サンプル内の一つ(BSl、BS2およびHTMと表示されたもの)の存在下で培養する場合の、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の1リットルあたりの乾燥細胞重量(DCW)を示す図である。
【００９８】
【図２４】ショ糖インベルターゼの存在下若しくは非存在下で、グルコース(ブドウ糖)、スクロース(ショ糖)、又はいくつかの糖蜜サンプル内の一つ(BSl、BS2およびHTMと表示されたもの)の存在下で培養する場合の、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の増殖(相対的細胞密度により測定されたもの)を示す図である。
【００９９】
【図２５】サブクローニングに有用な制限酵素部位に加えて、3つの異なるプロモーター(CMV、CVおよびHUPlと表示されたもの)を有する酵母インベルターゼ(SUC2)の種々のプラスミドコンストラクトの図である。
【０１００】
【図２６】暗所でスクロース(ショ糖)上で選抜された、外来ショ糖インベルターゼ遺伝子を含むクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)形質転換体の遺伝子型同定(ジェノタイピング)を示す図である。
【０１０１】
【図２７】出芽酵母(S. cerevisiae)から分泌されたショ糖インベルターゼをコードする遺伝子によって形質転換されたクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)細胞の遺伝子型同定を示す図である。
【０１０２】
【図２８】出芽酵母(S. cerevisiae)から分泌されたショ糖インベルターゼをコードする遺伝子によって形質転換されたクロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)とクロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)細胞の遺伝子型同定を示す図である。
【０１０３】
【図２９】本発明の方法に従って生産される再生可能ディーゼル製品の分析により生じたガスクロマトグラフで、実施例27に記載されるものを説明する図である。
【０１０４】
【図３０】本発明の方法に従って生産される再生可能ディーゼル製品の沸点分布プロットで、実施例27に記載されるものを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
(発明の詳細な説明)
I.定義
特に定められない限り、本明細書中において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は本発明が属する当業者によって共通に理解される意味を有する。以下の参照文献は、本発明において使用する多くの用語の一般的定義を有する技術の一つを提供する。
Singleton et ai, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)、The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)、The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)、及び、Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。
本明細書中で使用される場合、特に他で明示されない限り、以下の用語はそれらが本来持っている意味を有する。
【０１０６】
核酸に関して言及する場合、「微細藻類で活性がある」とは、微細藻類内で機能的である核酸を指す。例えば、トランスジェニック微細藻類に抗生物質耐性を与える抗生物質耐性遺伝子を作動させるのに用いられてきたプロモーターは、微細藻類で活性がある。微細藻類で活性があるプロモーターの例には、ある種の藻類種に内在性のプロモーター及び植物ウイルスに見られるプロモーターを含む。
【０１０７】
「アシル担体タンパク質」又は「ACP」とは、脂肪酸合成の間、4'-ホスホパンテテイン(phosphopantetheine)部分の遠位チオールで、チオールエステルとして成長するアシル鎖と結合するタンパク質であり、脂肪酸合成酵素複合体の構成成分を含むタンパク質である。脂肪アシルACPチオエステラーゼと連動したアシル担体タンパク質を参照して、「天然に共発現された」という用語は、ACPおよびチオエステラーゼが、それらが由来する組織又は生物において天然に(自然に)共発現されることを意味する。共発現する理由は、例えばそれら2つの酵素をコードする遺伝子が共通の制御配列の制御下にあるか、又は、それらが同じ刺激に応答して発現されることである。
【０１０８】
「アシルCoA分子」又は「アシルCoA」は、補酵素Aの4'-ホスホパンテテイン部分の遠位チオールにチオールエステル結合を介して補酵素Aに共有結合するアシル部分を含む分子である。
【０１０９】
「純粋培養」とは、他の生きている生物の混入がない生物の培養物を意味する。
【０１１０】
「バイオディーゼル」は、生物学的に生産される脂肪酸アルキルエステルで、ディーゼルエンジンの燃料としての用途に適しているものである。
【０１１１】
用語「バイオマス」とは、細胞の増殖及び/又は繁殖により生産される物質を指す。バイオマスは、細胞外物質と合わせて、細胞及び/又は細胞内の内容物を含んでもよい。細胞外物質は、限定はされないが、細胞により分泌される化合物を含む。
【０１１２】
「バイオリアクター」とは、細胞が、任意ではあるが浮遊培養で培養される、密閉体または部分的密閉体を意味する。
【０１１３】
本明細書中で用いられる場合、「触媒」とは、生成物の一部とならずに、生成物への反応物の化学反応を容易にするか又は促進することができる薬剤(例、分子、又は高分子複合体)を指す。触媒は、従って反応速度を上昇させ、その反応後、前記触媒は他の反応物に作用して生成物を形成する場合がある。触媒は一般的に、反応に必要な全体の活性化エネルギーを下げて、従って反応がより急速に若しくはより低い温度で進む。従って、反応平衡がより速やかに達成可能である。触媒の例には、生物的触媒である酵素、及び非生物的触媒である熱、化石燃料精製処理で用いられる金属触媒を含む。
【０１１４】
「セルロース系物質」とは、セルロースの消化産物(例、グルコース、キシロース、アラビノース、及び任意の他の化合物(例、二炭糖、オリゴ糖類、リグニン、フルフラール、及び他の化合物))を意味する。セルロース系物質供給源の非制限例には、サトウキビバガス、テンサイ・パルプ(ビートパルプ)、トウモロコシわら、木のチップ、おがくず及びスイッチグラスを含む。
【０１１５】
「共培養(co-culture)」及びその変形例(例、共培養する(co-cultivate))とは、同一のバイオリアクター中、2種類以上の細胞が存在することを指す。前記2種類以上の細胞は、両方ともが微生物(例、微細藻類細胞)であってもよいし、又は異なる細胞種とともに培養される微細藻類細胞であってもよい。培養条件は、2つ以上の細胞種の増殖及び/又は繁殖を促進するものであっても良いし、あるいは2つ以上の細胞種の一つの細胞種(若しくは、その細胞種のサブセット)の増殖及び/又は繁殖を、残りの細胞の細胞増殖を維持しながら促進するものであってもよい。
【０１１６】
用語「補因子」とは、酵素がその酵素活性を実行するのに必要な任意の分子で、基質以外のものを指すように本明細書中で使用される。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「相補的DNA」(「cDNA」)とは、メッセンジャーRNA(mRNA)のDNA表示であり、それは、メッセンジャーRNAの逆転写により、又は増幅(例、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)を介して)により通常得ることができる。
【０１１８】
「培養される」及びその変形例とは、意図する培養条件を用いて一又は複数の細胞の増殖(growth)(細胞サイズ、細胞内含有量、及び/又は細胞活性の増加)及び/又は繁殖(propagation)(有糸分裂を介する細胞数の増加)を意図的に促進することを指す。増殖(growth)と繁殖(propagation)との両者の組合せは、増繁殖(proliferation)ともいう。前記一又は複数の細胞は、微生物(例、微細藻類)のものであってもよい。意図する条件の例には、既知組成培地(公知の性質(例、pH、イオン強度、及び炭素源)を有するもの)の使用、特定の温度、酸素分圧、二酸化炭素レベル、バイオリアクター内での増殖を含む。前記用語は、生物が自然に増殖して究極的に化石化されて地層の原油を生産するように、自然な又はさもなくば人間が直接介入しない微生物の増殖または繁殖を指すものではない。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「細胞溶解」とは、低張性環境における細胞の溶解を指す。細胞溶解は、細胞の内部への過剰浸透または水の動き(過剰水分)によっても生じる。細胞は、内部の水の浸透圧に耐えることができず、破裂する。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」または「発現コンストラクト」とは、宿主細胞の特定核酸の転写を許容する一連の特定核酸を有する核酸コンストラクト(遺伝子組み換えによって又は化学合成によって作成される)を指す。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス又は核酸断片の一部であってもよい。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されて転写される核酸を含む。
【０１２１】
「外来遺伝子」とは、細胞に形質転換される核酸をいう。形質転換された細胞は、組換細胞と呼ばれてもよいし、その細胞に追加的な外来遺伝子が導入されてもよい。外来遺伝子は、異なる種(異種性のもの)、又は形質転換された細胞に対して同一種(相同な)由来であってもよい。相同遺伝子の場合では、それは、その遺伝子の内在性コピーに対して細胞のゲノムの異なる場所を占領する。外来遺伝子は、細胞内で複数コピー存在してもよい。外来遺伝子は、ゲノムへの挿入として又はエピソーム性の分子として細胞において維持可能である。
【０１２２】
「外因的に提供される」とは、細胞培養の培養培地に提供される分子について記載する。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、「脂肪アシルACPチオエステラーゼ」とは、脂質合成の間、アシル担体タンパク質(ACP)からの脂肪酸の切断を触媒する酵素である。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、「脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素」は、アシルCoA分子を第一級アルコールへ還元するのを触媒する酵素である。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「脂肪アシルCoA還元酵素」は、アシルCoA分子をアルデヒドへ還元するのを触媒する酵素である。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、「脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ」は、脂肪アルデヒドをアルカンに転換するのを触媒する酵素である。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「脂肪アルデヒド還元酵素」は、アルデヒドを第一級アルコールへ還元するのを触媒する酵素である。
【０１２８】
「固定炭素源」とは、外気温および外圧で固体又は液体の形態で存在する(好ましくは有機的な)炭素を含む分子を意味する。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、「真菌」とは真菌界に属するキチン質の細胞壁によって特徴づけられる従属栄養生物を意味する。
【０１３０】
「ホモジネート」は、物理的に破壊されたバイオマスを意味する。
【０１３１】
本明細書で使用する場合、「炭化水素」とは、(a)水素原子と炭素原子とだけを含む分子であって、前記炭素原子が共有結合して、直鎖、分岐、環状または部分的に環状である主鎖を形成し、その主鎖に水素原子が結合する分子、または(b)主に水素原子と炭素原子とだけを含む分子、かつ1〜4つの化学反応によって水素および炭素原子だけを含む様に変換可能な分子である。後者の非限定的な例は、単一の酸素原子を含むアルデヒドと同様に、1つの炭素原子および1つの水素原子間の酸素原子を含んでアルコール分子を形成する炭化水素を含む。アルコール類を炭素原子および水素原子だけを含む炭化水素に還元する方法は周知である。炭化水素の他の例は、酸素酸中で有機基が(1またはそれ以上の)水素原子を置換する、エステルである。炭化水素化合物の分子構造は、天然ガスの構成成分であるメタン(CH4)のような最も単純なものから、非常に重く複雑なもの(例、いくつかの分子(例、原油、石油およびビチューメン(bitumens)で見つかるアスファルテン))まで様々である。炭化水素は、ガスであるか、液状であるか、固形状またはこれらの形のいかなる組合せであってもよく、主鎖と隣接した炭素原子間に一又は複数の二重または三重結合を有してもよい。したがって、「炭化水素」という用語は、直鎖、分枝、環状または部分的に環状のアルカン、アルケン、脂質およびパラフィンを含む。例としては、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、オクタン、トリオレイン、及びスクアレンを含む。
【０１３２】
「炭化水素修飾酵素」は、炭化水素の共有結合構造を変える酵素を指す。炭化水素修飾酵素の例には、リパーゼ、脂肪アシルACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素及び脂肪アルデヒドデカルボニラーゼを含む。炭化水素修飾酵素の酵素活性によってできる化合物(例、脂肪酸、アルコール類、アルデヒド、アルカンまたはそこから誘導される他の合成物を含む)は、本明細書において、互換的に炭化水素または脂質と称される。
【０１３３】
「炭化水素比率」の用語は、原子−対−原子に基づく、分子中の炭素原子に対する水素原子の比率を指す。前記比率を用いて、炭化水素分子中での炭素原子および水素原子の数を示すことができる。例えば、最高比率を有する炭化水素は、メタンCH4(4:1)である。
【０１３４】
「疎水性画分」とは、水相と比較して疎水相においてより可溶性である物質の部分、画分をいう。疎水性画分は、水に実質的に溶解しなくて、通常無極性である。
【０１３５】
本明細書中で使用する場合、「脂質収率を増やす」とは、例えば、1リットルあたりの細胞乾燥重量を増やすことによって、例えば脂質を構成する細胞の割合を増やすことによって、または例えば単位時間あたりの培養量1リットルあたりの脂質の全体量を増やすことによって、微生物培養物中の脂質生産量を増加させることをいう。
【０１３６】
「誘導性プロモーター」とは、特定の刺激に応答して作動可能に連結された遺伝子の転写を媒介するものである。
【０１３７】
本明細書中で使用する場合、語句「作動可能に連結」とは、二つの配列(例、制御配列(典型的にはプロモーター)及び連結される配列)間の機能的な連結をいう。プロモーターが遺伝子の転写を媒介することができる場合、プロモーターは外来遺伝子と作動可能に連結をしている。
【０１３８】
「in situ」とは、「その場所で」または「その本来の位置において」を意味する。例えば、培養物は、触媒を分泌する第一の微細藻類及び基質を分泌する第二の微生物を含むことができる。この場合、前記第一および第二の細胞型は、さらなる物質の分離または処理を必要とせずに、特定の化学反応がin situで共培養中に起こるのに必要な構成成分を生成する。
【０１３９】
「栄養分の限界濃度」とは、培養された生物の増殖を制限する培養物の濃度である。「栄養分の非限界濃度」は、所定の培養期間の間に最大限の増殖を支持する濃度である。このように、所定の培養期間の間に生産される細胞数は、栄養分が非限界濃度である場合より、栄養分の限界濃度が存在する場合により低い。栄養分が最大限の増殖を支持する濃度より濃い濃度存在する場合に、栄養分は培養物中に「過剰」であるといえる。
【０１４０】
本明細書中で使用する場合、「リパーゼ」とは、水不溶性脂質基質のエステル結合の加水分解を触媒する水溶性酵素である。リパーゼは、脂質をグリセロールおよび脂肪酸に加水分解するのを触媒する。
【０１４１】
本明細書中で使用する場合、「脂質経路酵素」とは、脂質代謝(すなわち、脂質合成、修飾、分解)に役割を果たす任意の酵素を指す。この用語は、担体タンパク質と同様に、脂質を化学的に修飾するタンパク質を含む。
【０１４２】
「脂質」とは、無極性溶媒(例、エーテル及びクロロホルム)に可溶であり、水に相対的にまたは完全に不溶である炭化水素のクラスである。それらが主に自然状態で疎水性である長い炭化水素尾部から構成されているので、脂質分子がこれらの性質を有する。脂質の例には、(飽和又は不飽和)脂肪酸、グリセリドまたはグリセロ脂質(例、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド若しくは中性油、およびホスホグリセリド若しくはグリセロリン脂質)、非グリセリド(スフィンゴ脂質、ステロール脂質(コレステロールおよびステロイド・ホルモン類を含む)、プレノール脂質(テルペノイドを含む)、脂肪アルコール、ワックスおよびポリケタイド)、そして、複合脂質誘導体(糖結合脂質または糖脂質およびタンパク質結合脂質)を含む。「脂肪」とは、「トリアシルグリセリド」と称する脂質のサブグループである。
【０１４３】
本明細書中で使用する場合、用語「溶解物」は、溶解される細胞の内容物を含む溶液をいう。
【０１４４】
本明細書中で使用する場合、用語「溶解(溶菌)」は、少なくともいくつかの細胞内内容物を放出するのに十分な、生物体の細胞膜及び、任意ではあるが、細胞壁の破損を指し、しばしば、その完全性を損傷する力学的、ウイルス的、又は浸透圧的機構による。
【０１４５】
本明細書中で使用する場合、用語「溶解する(溶菌する)」は、少なくともいくつかの細胞内内容物を放出するのに十分な、生物体の細胞膜及び、任意ではあるが、細胞壁の破壊を指す。
【０１４６】
「微細藻類」とは、任意ではあるが、光合成を行うことができる葉緑体を含む真核微生物、または光合成を行うことができる原核微生物をいう。微細藻類には、エネルギーとして固定炭素源を代謝することができない偏性光合成独立栄養生物と、固定炭素源に依存することができる従属栄養生物を含む。微細藻類は、例えば、細胞分裂直後に姉妹細胞から分離する単細胞生物(例、クラミドモナス(Chlamydomonas))をいい、また、2つの互いに異なる細胞種の単純な多細胞光合成微生物のような微生物(例、ボルボクス(Volvox))を指す。「微細藻類」は、また、細胞(例、クロレラ及びドナリエラ(Dunaliella))を指すことができる。「微細藻類」は、また、細胞間接着を示す他の光合成微生物(例、アグメネルム(Agmenellum)、アナバエナ(Anabaena)およびピロボツリス(Pyrobotrys))も含む。「微細藻類」は、また、光合成を実行する能力を失った偏性従属栄養性微生物(例、ある種の渦鞭毛虫藻類種)を含む。
【０１４７】
「微生物」(microorganismとmicrobe)の用語は、本明細書中において互換的に使われ、微小な単細胞生物をいう。
【０１４８】
本明細書中において使われる、「油性酵母」とは、その乾燥細胞重量の10%より多くを脂質として自然に蓄積することができる酵母、または遺伝子改変の結果として、そうすることができる酵母を意味する。油性酵母には、生物(例、ヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica))と同等に、その乾燥細胞重量の10%より多くを脂質として蓄積することができるように改変された酵母の種(例、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))を含む。
【０１４９】
本明細書中で使用する場合、「浸透圧ショック」の用語は、浸透圧の突然の減少の後の、溶液中での細胞の破裂のことをいう。浸透圧ショックを、時々誘導して、このような細胞の細胞成分を溶液に遊離させる。
【０１５０】
「フォトバイオリアクター」とは、少なくとも一部が、少なくとも部分的に透明であるか、部分的に開口しているかし、それにより、光を透過させることが可能になる容器を指し、その中で一又は複数の微細藻類細胞を培養する。フォトバイオリアクターは、ポリエチレンバッグまたはエルレンマイヤーフラスコの例のように閉じていてもよいし、屋外の池の例のように外環境に開かれていてもよい。
【０１５１】
本明細書中で使用する場合、「多糖類分解酵素」とは、任意の多糖類を、加水分解または解重合するのを触媒できる任意の酵素をいう。例えば、セルラーゼは、セルロースの加水分解を触媒する。
【０１５２】
「多糖類」(または、「グリカン」と呼ばれる)は、グリコシド結合によって結合される単糖類から成り立つ炭水化物である。セルロースは、ある種の植物細胞壁を構成する多糖類の例である。セルロースを酵素により解重合して、より大きな二糖類およびオリゴ糖類と同様に、単糖類(例、キシロース及びグルコース)を産生することができる。
【０１５３】
「ポート」とは、バイオリアクターの構成において、物質(例、ガス、液体および細胞)の流入または流出を可能にするバイオリアクターの開口部をいう。ポートを、通常、フォトバイオリアクターから通じている管に接続する。
【０１５４】
「プロモーター」とは、核酸の転写を導く核酸制御配列のアレイとして定義される。本明細書中で用いる場合、プロモーターは、転写の開始点に近い必要な核酸配列(例、TATA要素(ポリメラーゼIIタイプ・プロモーターの場合))を含む。プロモーターは、任意ではあるが、転写開始点から数千ベースペアに位置することが可能な、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含む。
【０１５５】
本明細書で使用する場合、用語「組換」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質若しくはベクターが異種の核酸若しくはタンパク質の導入により、又は天然の(自然状態の)核酸若しくはタンパク質の変化により修飾されたこと、あるいは、細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、組換細胞は非天然遺伝子(細胞の有する天然(非組換)形態では見いだされない遺伝子)を発現するか、さもなくば、発現される若しくは全く発現されない状態で、異常に発現される天然の遺伝子を発現する。本明細書中の用語「組換核酸」とは、元は、in vitroで核酸操作(例、ポリメラーゼやエンドヌクレアーゼを用いて)により形成され、自然には通常見いだされない形態の核酸を意味する。従って、直線形態の単離された核酸、又は、通常連結されないDNA分子をライゲートする(連結して組み込まれる)ことによりin vitroで形成される発現ベクターは、本発明の目的に関しては、両者とも組換体であると考えられる。一旦組換核酸が宿主または生物に導入されると、それは非組換的に(すなわち、in vitroの操作よりむしろ宿主細胞のin vivoの細胞装置を使って)複製するだろう。しかしながら、そのような核酸(組換的に製造され、しかしその後非組換的に複製されたもの)は、本発明の目的に関しては、それでも組換体であると見なされる。同様に、「組換タンパク質」は、組換技術を使用して(すなわち、上述の組換核酸の発現を介して)作られるタンパク質である。
【０１５６】
本明細書中で使用する場合、用語「再生可能ディーゼル」とは、脂質の水素付加および脱酸素化で製造されるアルカン(例えばC10:0、C12:0、C14:0、C16:0およびC18:0)を指す。
【０１５７】
本明細書中で使用する場合、「超音波処理」の用語は、音波エネルギーを用いて、生物材料(例、細胞)を破壊する処理をいう。
【０１５８】
「フルフラールの種」とは、2-フランカルボキシアルデヒドまたは、同一基本的構造特徴を保持するその誘導体をいう。
【０１５９】
本明細書中で使用する場合、「茎葉」とは、穀粒が収穫された後、残っている、穀物の乾燥した茎および葉をいう。
【０１６０】
「ショ糖資化性遺伝子」とは、発現した時に、細胞がエネルギー源としてスクロース(ショ糖)を利用する能力を補助する遺伝子である。ショ糖資化性遺伝子によってコードされるタンパク質を、本明細書中において、「ショ糖資化性酵素」といい、ショ糖輸送体、ショ糖インベルターゼおよびヘキソキナーゼ(例、グルコキナーゼおよびフルクトキナーゼ)を含む。
【０１６１】
「廃水」は、典型的には洗浄水、洗濯物排水、糞便、尿および他の液体であるか半液体状排出物を含む水溶性廃棄物である。それは、二次処理汚水と同様に、いくつかの形態の都市廃棄物を含む。
【０１６２】
ヌクレオチドまたはアミノ酸同一性パーセントを決定する配列比較のために、典型的には、1つの配列が(複数の)試験配列を比較する参照配列として用いられる。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、サブ配列の座標を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。指定されたプログラムのパラメーターに基づいて、配列比較アルゴリズムは、それから参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【０１６３】
比較のための配列の最適な並べ方は、例えば、局所相同性アルゴリズム(Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))、 相同性アラインメントアルゴリズム(Needleman & Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970))、類似探索方法(Pearson & Lipman, Proc. Nat'l.Acad. Sci. USA 85:2444 (1988))、これらのアルゴリズムのコンピューターを使用した実行(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)、または目視検査(Ausubel et al, supraを一般に参照されたい)によって、実施できる。
【０１６４】
配列同一性及び類似性パーセントを測定するのに適した他のアルゴリズの例は、Altschul et al, J. MoI. Biol. 215:403-410 (1990) に記載されるブラスト(BLAST)アルゴリズムである。ブラスト(BLAST)分析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター(ウェブ・アドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov )を通して、公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列の同じ長さの文字列と並べたときに、いくつかの正の値の閾値Tに適合するか、それを満足する、問い合わせ配列における長さWの短い文字列を同定することにより、高いスコアの配列対(HSPs)を特定する工程を、まず含む。Tとは近隣文字列スコアの閾値をいう(Altschul et al, supra.)。これらの初期近接文字列ヒットは、それらを含むより長いHSPの検索開始のきっかけとして機能する。文字列ヒットは、累積的なアライメントスコアが増加する限り、各々の配列の両方向に向かって拡張する。累積的なスコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターM(一対の一致する残基のための報酬スコア;常に>0)、パラメーターN(残基が一致しない場合の罰則スコア;常に<0)を使用して算出される。アミノ酸配列の場合、スコア算出行列が、累積的なスコアを算出するために用いる。累積的なアライメントスコアは、その最大到達値から量X落ちる時、累積的なスコアが一又は複数の負のスコア残基アラインメントの蓄積のためにゼロまたはそれ以下になる時、またはいずれかの配列の端に達した時に、それぞれの方向への文字列ヒットの拡張を停止する。ある核酸またはポリペプチドが本発明の範囲内かどうか識別するためには、ブラスト(BLAST)プログラムのデフォルト・パラメーターが適切である。(ヌクレオチド配列のための)ブラスト(BLASTN)プログラムは、デフォルトとして、文字列長(W) 11、期待値(E) 10、M=5、N=-4および両方のストランドの比較を使用する。アミノ酸配列の場合には、BLASTPプログラムがデフォルトとして文字列長さ(W)3、期待値(E)10およびBLOSUM62スコア算出行列を使用する。TBLATNプログラム(ヌクレオチド配列に対応するタンパク質配列を使用する)は、デフォルトとして文字列長さ(W)3、期待値(E)10およびBLOSUM 62スコア算出行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:10915 (1989) を参照されたい)を使用する。
【０１６５】
配列同一性パーセントを算出することに加えて、BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似点の統計分析も実行する(例、Karlin & Altschul, Proc. Nat 'I. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい)。BLASTアルゴリズムによって提供される一つの類似性測定は、最小合計確率(P(N))である。そして、それは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、もし試験核酸と参照核酸とを比較し、最小合計確率が、約0.1未満、より好ましくは、約0.01未満および最も好ましくは約0.001未満の場合には、核酸は、参照配列と類似するとみなされる。
【０１６６】
II 一般
ある種の微生物を使用して、(輸送燃料、石油化学産業および/または食品および化粧品産業に、さらにはほかの応用分野においても、経済的に且つ大量に使用する)油、燃料および他の炭化水素若しくは脂質組成物を生産することができるという洞察を、本発明は前提の一部としている。適切な微生物には、微細藻類、油性酵母、真菌を含む。本発明に用いられる微細藻類の適している属は、脂質生産微細藻類のクロレラである。脂質のエステル転移は、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルを産生する。他の酵素及び化学的処理を適合して、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類、アルカンおよびアルケンを生産することができる。本出願には、複数種及び株の微生物の遺伝子改変方法を記載し、油、燃料および油脂化学製品への転換に適している脂質の生産を容易にする特徴を有する微生物を提供するためにクロレラおよび類似した微生物を含む。いくつかの用途では、再生可能ディーゼル、ジェット燃料または他の炭化水素化合物を生産する。また、本出願は、生産性および脂質収率を増加するための、および/または本明細書中に記載の組成物をより費用対効果よく生産するための微細藻類培養方法について記載する。
【０１６７】
特定の実施形態では、本出願では、一又は複数の外来遺伝子を有する微細藻類の遺伝的に改変された種について記載する。例えば、バイオディーゼルに適しているトリセリグリセリド(TAGs)を高水準に生産する微細藻類を改変して、微細藻類TAGsのエステル転移を容易にすることができるリパーゼを発現することができる。前記リパーゼを、誘導性プロモーターを使用して、任意に発現することができる。その結果、細胞を、最初に発酵槽で望ましい密度に増殖させることができ、その後、プロモーターの誘導によってリパーゼが発現され、十分なアルコールがある場合には、任意ではあるが、脂肪酸エステルへのTAGsの転換を導くことができる。
【０１６８】
いくつかの微細藻類脂質は、細胞膜および細胞の他の非水溶部分に隔離される。従って、エステル転移反応の収率を増やすためには、細胞を溶解して脂質へのリパーゼの接触性を増やすことが有益である。例えば、加圧された蒸気の添加を介して力学的に、あるいは微細藻類細胞を溶解させるウイルスを使用するか、前記細胞の溶解タンパク質を生産する遺伝子を発現するか、または微細藻類細胞を溶解させる薬品で培養物を処理することによって、細胞破砕を実行することができる。細胞破砕のための微細藻類の蒸気処理は、例えば、米国特許第6,750,048号明細書に記載されている。
【０１６９】
また、本明細書中には、微細藻類を溶解させる遺伝子(例、例えば溶菌ウイルスの遺伝子)を発現しTAGsを高水準で生産する微細藻類の遺伝子改変について記載する。この遺伝子は誘導性プロモーターを使用して発現することができる。その結果、細胞を最初に発酵槽で望ましい密度に増殖させてその後回収し、それから細胞を溶解させる遺伝子を発現するためにプロモーターを誘導してもよい。例えば、多糖類分解酵素をコードする遺伝子を発現させて、細胞を溶解することができる。
【０１７０】
任意ではあるが、リパーゼを細胞内区画で発現させ、エステル転移まで、大部分の微細藻類脂質と分離した状態にすることができる。一般に、水を調製物から実質的に取り除き、および/または、過剰なアルコールを加えた後、エステル転移を実行することが好ましい。リパーゼは、エステル転移の基質として、アルコールと同様に水を使用することができる。水がある場合には、脂質を、ヒドロキシ基部に抱合して、エステルよりむしろ極性の脂肪酸を生産する。アルコール(例、メタノール)がある場合には、脂質をメチル基に抱合し、輸送燃料のために典型的に好ましい無極性脂肪酸エステルを生産する。状態が脂肪酸エステルを生産するためのエステル転移に適するようになるまで、微細藻類脂質へリパーゼを暴露することを制限するために、リパーゼを、例えば、葉緑体、ミトコンドリアまたは他の細胞小器官において発現させてもよい。このように、区画に発現することによって、細胞が破砕された後まで、大部分の細胞脂質からリパーゼを隔離する。
【０１７１】
他の特定の実施形態において、本出願には、さまざまな炭化水素化合物を生産するために、一又は複数の外来遺伝子を有するように遺伝的に改変された微細藻類、油性酵母、細菌または真菌の種について記載する。例えば、天然にまたは遺伝子組換えによって、脂質を高水準に生産する微細藻類を改変して(又はさらに改変して)、外来の脂肪アシルACPチオエステラーゼを発現させ、それは、脂質合成の間、アシル担体タンパク質(ACP)から脂肪酸の切断を促進することができる。これらの脂肪酸は回収され、またはさらに細胞内の酵素処理を介して、他の炭化水素化合物を生産する。任意ではあるが、脂肪アシルACPチオエステラーゼを、誘導性プロモーターに作動可能に連結される遺伝子から発現してもよく、および/または細胞内区画において発現してもよい。
【０１７２】
脂肪アシルACPチオエステラーゼを、特定の炭素鎖長を有する(脂肪酸合成の間に)成長する脂肪酸に対する特異性に基づいて選択してもよい。例えば、脂肪アシルACPチオエステラーゼは、8から34の炭素原子、好ましくは8から18の炭素原子、さらに好ましくは10から14の炭素原子の範囲の炭素長に特異性を有していてもよい。12の炭素原子を有する脂肪酸に対する特異性が最も好ましい。
【０１７３】
さらに、本発明は二以上の外来遺伝子(例、リパーゼと溶菌遺伝子(例、多糖類分解酵素をコードするもの))を発現するための遺伝的に改変された微細藻類株を提供する。一方または両方の遺伝子を、誘導性プロモーターを用いて発現させることができ、それは、これらの遺伝子の相対的発現タイミングを制御して、脂質収率および脂肪酸エステルへの転換を向上させることを可能にする。本発明は、また、脂質を生産する微生物をショ糖を代謝するように改変するのためのベクター及び方法を提供する。それは、有利な形質である。なぜなら、それは、このように改変された細胞がサトウキビまたは他の栄養源を、油、燃料、油脂化学製品などの生産に適当な脂質に変換することを可能にするからである。
【０１７４】
他の実施形態において、本発明は、二以上の遺伝子(例、脂肪アシルACPチオエステラーゼおよび脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素)(それらの組み合わされた作用によりアルコール生産物を生成する)を発現する遺伝的に改変された微生物株(例、微細藻類、油性酵母、バクテリア、真菌)を提供する。本発明はさらに、外来遺伝子の他の組合せとして、特に限定するものではないが、特異的な長さの脂肪酸を生成するための脂肪アシルACPチオエステラーゼおよび自然に共発現するアシル担体タンパク質、またはアルデヒドを生成するための脂肪アシルACPチオエステラーゼ及び脂肪アシルCoA還元酵素を提供する。本発明は、また、アルカンまたはアルケンを生成するための脂肪アシルACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼの組合せを提供する。一又は複数の外来遺伝子は、誘導性プロモーターを使用して発現することができる。
【０１７５】
本発明は、 例えば微細藻類に所望の増殖特性を提供し、並びに/または生産される脂質の量および/若しくは品質を向上させるために、微細藻類の更なる改変を提供する。例えば、微細藻類を改変して、脂質経路への炭素フラックスを増加させ、及び/又は脂質経路を修飾して、細胞によって生産される脂質の比率若しくは特性を有利に変更することができる。
【０１７６】
本出願は、2つ以上の外来遺伝子(第1の遺伝子が固定炭素源(例、スクロース(ショ糖))の輸送体、第2の遺伝子がショ糖インベルターゼ酵素をコードする)を発現するような、遺伝的に改変された微細藻類株を開示する。結果として得られる発酵可能な生物は、生物学的炭化水素生産の以前から知られた方法によって取得可能であったものよりも低い製造コストで、炭化水素を生産する。上で説明されている2つの外来遺伝子の挿入は、直接的なおよび/またはランダムな突然変異を通して多糖類生合成の破壊と組み合わされ、それは、炭化水素生産にさらに大量の炭素フラックスを導く。栄養性転換、炭化水素生産を変更する改変および外来酵素を用いる処理の個々または組み合わせは、微生物によって生産される炭化水素組成物を変更する。この変更は、生産される炭化水素の量、他の炭化水に対する生産される一又は複数の炭化水素種の量および/または微生物において生産される炭化水素種の種類の変化であってもよい。例えば、微細藻類を改変して、より多くの量および/または割合のTAGsを生成することができる。
【０１７７】
III 油または脂質を生産する微生物
自然に高水準の好適な脂質または炭化水素を生産する微生物が好ましいが、好適な脂質または炭化水素を生産するいかなる種類の生物を使用することができる。微生物による炭化水素の生産は、Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66:486-496及びA Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998)によって総評されている。
【０１７８】
本発明での使用に関しての微生物の選択に影響する考慮には、油、燃料、油脂化学製品の生産のための適した脂質または炭化水素の生産に加え、以下の点を含む。(1)細胞重量の割合として、高い脂質含有量、(2)増殖の容易さ、(3)遺伝的改変の容易さ、及び、(4)バイオマス処理の容易さを含む。特定の実施形態において、野生型または遺伝的に改変された微生物細胞は、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%または少なくとも70%以上の脂質を有する細胞を生じる。好適な生物は、(光がない場合、糖上で)従属栄養的に増殖し、または、例えば、本明細書中において説明される方法を使用して増殖するように改変可能である。形質転換の容易性、並びに微生物内で機能を有する(構成的および/または誘導性の)選択可能なマーカーおよびプロモーターの入手可能性が、遺伝的改変の容易さに影響を与える。処理に関する考慮には、例えば、細胞を溶解させるための有効な手段の入手可能性を含む。
【０１７９】
A.藻類
本発明の一実施形態では、微生物は、微細藻類である。本発明によって使用可能な微細藻類の非限定例を、表1に見いだすことができる。
【０１８０】
(表1)微細藻類の実施例
アクナンセス・オリエンタイルス(Achnanthes orientalis)、アグメヌルム(Agmenellum)、アンフィプロラ・ヒアリン(Amphiprora hyaline)、アンフォラ・コフェイフォルミス(Amphora coffeiformis)、アンフォラ・コフェイフォルミス・リネア(Amphora coffeiformis linea)、アンフォラ・コフェイフォルミス・プンクタタ(Amphora coffeiformis punctata)、アンフォラ・コフェイフォルミス・タヨロリ(Amphora coffeiformis taylori)、アンフォラ・コフェイフォルミス・テヌイス(Amphora coffeiformis tenuis)、アンフォラ・デリカティッシマ(Amphora delicatissima)、アンフォラ・デリカティッシマ・キャピタタ(Amphora delicatissima capitata)、アンフォラ属の種(Amphora sp.)、アナバエナ(Anabaena)、アンキストロデスムス(Ankistrodesmus)、アンキストロデスムス・ファルカタス(Ankistrodesmus falcatus)、ボエケロヴィア・ホオグランディ(Boekelovia hooglandii)、ボロディネラ属の種(Borodinella sp.)、ボツリョコッキス・ブラウニイ(Botryococciis braunii)、ボツリョコッカス・スデティクス(Botryococcus sudeticus)、ブラクテオコッカス・マイナー(Bracteococcus minor)、ブラクテオコッカス・メディオヌクレタス(Bracteococcus medionucleatus)、カルテリア(Carteria)、カエトセロス・グラシリス(Chaetoceros gracilis)、カエトセロス・ムエレリ(Chaetoceros muelleri)、カエトセロス・ムエレリ・スブサルスム(Chaetoceros muelleri subsalsum)、カエトセロス属の一種(Chaetoceros sp.)、クロレラ・アニトラタ(Chlorella anitrata)、クロレラ・アンタルクティカ(Chlorella Antarctica)、クロレラ・アウレオビリディス( Chlorella aureoviridis)、クロレラ・キャンディダ( Chlorella Candida)、クロレラ・カプスレイト(Chlorella capsulate)、クロレラ・デシカート(Chlorella desiccate)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)、クロレラ・フスカ(Chlorella fusca)、クロレラ・フスカ・バー・バクオレタ(Chlorella fusca var. vacuolata)、クロレラ・グルコトロファ(Chlorella glucotropha)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)、クロレラ・インフシオナム(Chlorella infusionum)バール。クロレラ・インフシオナム・バー・アクトフィラ(Chlorella infusionum var. actophila)、クロレラ・インフシオナム・バー・アウゼノフィラ(Chlorella infusionum auxenophila)、クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)、クロレラ・ロボフォラ(Chlorella lobophora)(SAG 37.88株)、クロレラ・ルテオビリディス(Chlorella luteoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・アウレオビリディス(Chlorella luteoviridis var. aureoviridis)、クロレラ・ルテオビリディス・バー・ルテスセンス(Chlorella luteoviridis var. lutescens)、クロレラ・ミニアタ(Chlorella miniata)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ムタビリス(Chlorella mutabilis)、クロレラ・ノクツルナ(Chlorella nocturna)、クロレラ・オヴァリス(Chlorella ovalis)、クロレラ・パルバ(Chlorella parva)、クロレラ・ファトフィリア(Chlorella photophila)、クロレラ・プリングシェイミィ(Chlorella pringsheimii)、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25のいずれかを含む)、クロレラ・プロトセコイデス・バー・アシジコラ(Chlorella protothecoides var.acidicola)、クロレラ・レグラリス(Chlorella regularis)、クロレラ・レグラリス・バー・ミニマ(Chlorella regularis var. minima)、クロレラ・レグラリス・バー・ウンブリカタ(Chlorella regularis var. umbricata)、クロレラ・レイシグリィ(Chlorella reisiglii)��クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)、クロレラ・サッカロフィア・バー・エリプソイデア( Chlorella saccharophila var. ellipsoidea)、クロレラ・サリナ(Chlorella salina)、クロレラ・シンプレックス(Chlorella simplex)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana、クロレラ属の種(Chlorella sp.)、クロレラ・スファエリカ(Chlorella sphaerica)、クロレラ・スティグマトフォラ(Chlorella stigmatophora)、クロレラ・バニエリィ(Chlorella vanniellii)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・エフ・テルティア(Chlorella vulgaris f tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・アウトトロフィカ(Chlorella vulgaris var. autotrophica)、クロレラ・ブルガリス・バーヴィリディス(Chlorella vulgaris var.viridisu)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス(Chlorella vulgaris var. vulgaris)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・テルティア(Chlorella vulgaris var. vulgaris f tertia)、クロレラ・ブルガリス・バー・ブルガリス・エフ・ヴィリディス(Chlorella vulgaris var. vulgaris f viridis)、クロレラ・シャンセラ(Chlorella xanthella)、クロレラ・ゾフィンジエンシス(Chlorella zofingiensis)、クロレラ・ツレボウシオイデス(Chlorella trebouxioides)、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クロロコッカム・インフシオヌム(Chlorococcum infusionum)、クロロコッカム属の一種(Chlorococcum sp.)、クロゴニウム( Chlorogonium)、クロオモナス属の一種(Chroomonas sp.)、クリソスファエラ属の一種(Chrysosphaera sp.)、 クリコスファエラ属の一種(Cricosphaera sp.)、クリプテコディニウム・コーニィ( Crypthecodinium cohnii)、クリプトモナス属の一種( Cryptomonas sp.)、サイクロテラ・クリプティカ(Cyclotella cryptica),サイクロテラ・メネグヒニアナ(Cyclotella meneghiniana)、サイクロテラ属の一種(Cyclotella sp.)、ドナリエラ属の一種(Dunaliella sp.)、ドナリエラ・バルダウィル(Dunaliella bardawil)、ドナリエラ・バイオクラタ(Dunaliella bioculata)、ドナリエラ・グラヌラテ(Dunaliella granulate)、 ドナリエラ・マリタイム(Dunaliella maritime)、ドナリエラ・ミヌタ(Dunaliella minuta)、ドナリエラ・パルヴァ(Dunaliella parva)、ドナリエラ・ペイルセイ(Dunaliella peircei)、ドナリエラ・プリモレクタ(Dunaliella primolecta)、ドナリエラ・サリナ(Dunaliella salina)、 ドナリエラ・テリコラ(Dunaliella terricola)、ドナリエラ・テルチオレクタ(Dunaliella tertiolecta)、ドナリエラ・ヴィリディス(Dunaliella viridis)、ドナリエラ・テルチオレクタ(Dunaliella tertiolecta)、エレモスファエラ・ヴィリディス(Eremosphaera viridis)、エレモスファエラ属の一種(Eremosphaera sp.)、エリプソイデン属の一種(Ellipsoidon sp.)、エウグレナ(Euglena)、フランセイア属の一種(Franceia sp.)、フラギラリア・クロトネンシス(Fragilaria crotonensis)、フラギラリア属の一種(Fragilaria sp.)、グレオカプサ属の一種(Gleocapsa sp.)、グロエオサムニオン属の一種(Gloeothamnion sp.)、ヒメノモナス属の一種(Hymenomonas sp.)、イソクリシス・エーエフエフ・ガルバナ(Isochrysis aff galbana)、イソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)、レポシンクリス(Lepocinclis)、ミクル・アクチニウム(Micr actinium)、ミクル・アクチニウム(Micr actinium)(UTEXLB 2614), モノラフィディウム・ミヌツム(Monoraphidium minutum)、モノラフィディウム属の一種(Monoraphidium sp.)、ナンノクロリス属の一種(Nannochloris sp.)、ナンノクロロプシス・サリナ(Nannochloropsis salina)、ナンノクロロプシス属の一種(Nannochloropsis sp.)、ナビクラ・アクセプタタ(Navicula acceptata)、ナビクラ・ビスカンテラエ(Navicula biskanterae)、ナビクラ・シュードテネロイデス(Navicula pseudotenelloides)、 ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa), ナビクラ・サプロフィラ(Navicula saprophila)、ナビクラ属の一種(Navicula sp.)、ネフロクロリス属の一種(Nephrochloris sp.)、ネフロセルミス属の一種(Nephroselmis sp.)、ニツスチア・コムニス(Nitschia communis)、ニツスチア・アレカンヅフナ(Nitzschia alexandfna)、ニツスチア・コムニス(Nitzschia communis)、ニツスチア・デイシパタ(Nitzschia dissipata)、ニツスチア・フルスツルム(Nitzschia frustulum)、ニツスチア・ハンツスチアナ(Nitzschia hantzschiana)、ニツスチア・インコンスピクア(Nitzschia inconspicua)、ニツスチア・インテルメディア(Nitzschia intermedia)、ニツスチア・マイクロセファラ(Nitzschia microcephala)、ニツスチア・プシラ (Nitzschia pusilla)、ニツスチア・プシラ・エリプティカ(Nitzschia pusilla elliptica)、ニツスチア・プス・イリア・モノエンシス(Nitzschia pus ilia monoensis)、ニツスチア・クアヅラングラー(Nitzschia quadrangular)、ニツスチア属の一種(Nitzschia sp.)、オクロモナス属の一種(Ochromonas sp.)、オオサイスティス・パルバ(Oocystis parva)、オオサイスティス・プシラ(Oocystis pusilla)、オオサイスティス属の一種(Oocystis sp.)、オスシラトリア・リムネティカ(Oscillatoria limnetica)、オスシラトリア属の一種(Oscillatoria sp.)、オスシラトリア・スブレヴィス(Oscillatoria subbrevis)、パラクロレラ・ケッセリ(Parachlorella kessleri)、パスケリア・アシドフィラ(Pascheria acidophila)、パブロバ属の一種(Pavlova sp.)、ファングス(Phagus)、フォルミディウム(Phormidium)、プラティモナス属の一種(Platymonas sp.)、プレウロクリシス・カーター・アエ(Pleurochrysis carter ae)、プレウロクリシス・デンタテ(Pleurochrysis dentate)、プレウロクリシス属の一種(Pleurochrysis sp.)、プロトテカ・ウィクケルハミイ(Prototheca wickerhamii)、プロトテカ・スタグノラ(Prototheca stagnora)、プロトテカ・ポルトリセンシス(Prototheca portoricensis)、 プロトテカ・モリフォルミス(Prototheca moriformis)、プロトテカ・ゾフィ(Prototheca zopfii)、シュードクロレラ・アクアティカ(Pseudochlorella aquatica)、ピラミモナス属の一種(Pyramimonas sp.)、ピロボツリス(Pyrobotrys)、ロドコッカス・オパクス(Rhodococcus opacus)、サルシノイド・クリソフィテ(Sarcinoid chrysophyte)、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)、シゾシツリウム(Schizochytrium)、スピロギラ(Spirogyra)、スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)、スチココッカス属の一種(Stichococcus sp.)、シネココッカス属の一種(Synechococcus sp.)、テツラエヅロン(Tetraedron)、テツラセルミス属の一種(Tetraselmis sp.)、テツラセルミス・スエシカ(Tetraselmis suecica)、タラッシオシラ・ウェイッスフロギィ(Thalassiosira weissflogii)及びヴィリデイエラ・フリデリシアナ(Viridiella fridericiana)。
【０１８１】
1．クロレラ
本発明の好適な実施形態において、微生物は、クロレラ属であり、好ましくは、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)またはクロレラ・エメルソニィ(Chlorella emersonii)である。
【０１８２】
クロレラは、単細胞の緑藻の属である。そして、クロロフィタ(Chlorophyta)門に帰属する。それは、球形の形状で、直径2〜10μmであり、鞭毛なしである。クロレラのいくつかの種は、天然に従属栄養性である。
【０１８３】
クロレラ、特にクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)は、本発明の使用に好適な微生物である。なぜなら、脂質(バイオディーゼルに適する特に長鎖脂質)が高い組成であるからだ。そのほかに、この微細藻類は、従属栄養的に増殖し、本明細書中の実施例において示されるように遺伝的に改変可能である。
【０１８４】
本発明の好適な実施形態において、導入遺伝子の発現のために使用する微生物は、クロレラ属であり、好ましくは、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)またはクロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)である。クロレラでの導入遺伝子の発現例は、文献に見いだされる(例、Current Microbiology Vol. 35 (1997), pp. 356-362、Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2000 Jul;16(4): 443-6、Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341 、Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72: 197-205、Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002、Current Genetics 39:5, 365-370 (2001)、Plant Cell Reports 18:9, 778-780, (1999)、Biologia Plantarium 42(2): 209-216, (1999)、Plant Pathol. J 21(1): 13-20, (2005)を参照されたい)。
また、本明細書中の実施例を参照されたい。他の脂質生産微細藻類(原核微細藻類を含む)も改変可能である(Kalscheuer st al., Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 52, Number 4 / October, 1999を参照されたい)。
【０１８５】
2. クロレラ種の同定
本発明に用いられるクロレラの種は、ゲノムのある種の標的領域の増幅によって同定可能である。例えば、特定のクロレラの種または株の同定を、例えばWu et al, Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42:115-121(リボソームDNA配列を用いたクロレラ種の同定)に記載される方法を用いることによって、ゲノムの任意の領域を使用するプライマー及び方法論を利用して、核及び葉緑体DNAの増幅とシークエンシングを介して達成することができる。良く確立された系統学的解析手法(例、リボソームの内部転写スペーサ(ITSlおよびITS2 rDNA)、18SのrRNA並びに他の保存されたゲノム領域の増幅とシークエンシング)を、当業者が使用して、クロレラ種だけでなく、本明細書中に開示される方法を使用することができる他の炭化水素・脂質生産生物も同定することができる。藻類の同定及び分類方法の例に関しては、例えばGenetics, 2005 Aug;170(4): 1601-10 及び RNA, 2005 Apr;11(4): 361-4を参照されたい。
【０１８６】
B.油性酵母
本発明の一実施形態では、微生物は、油性酵母である。本発明によって使用することができる油性酵母の非限定例は、表2に見いだすことが可能である。
【０１８７】
(表2)油性酵母の例
クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcus curvatus)、クリプトコッカス・テリコルス(Cryptococcus terricolus)、カンジタ属の一種(Candida sp.)、リポマイセス・スタルケィ(Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファ(Lipomyces lipofer)、エンドマイコプシス・バルナリス(Endomycopsis vernalis)、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グルシリス(Rhodotorula gracilis)およびヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica)
【０１８８】
C.その他真菌
本発明の一実施形態では、微生物は、真菌である。本発明によって使用することができる真菌の非限定例は、表3に見いだすことが可能である。
【０１８９】
(表3)真菌の例
モルティエレラ(Mortierella)属の一種、モルティエレラ・ビナセア(Mortierrla vinacea)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、フィリシウム・デバリアヌム(Pythium debaryanum)、ケカビ属シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、アスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペネシリウム・イイラシヌム(Pennicillium iilacinum)、ヘンセヌロ(Hensenulo)属の一種、カエトミウム(Chaetomium)属の一種、クラドスポリウム(Cladosporium)属の一種、マルブランシェア(Malbranchea)属の一種、リゾプス(Rhizopus)属の一種およびフィシウム(Pythium)属の一種
【０１９０】
D.バクテリア
本発明の一実施形態では、微生物は、バクテリア(細菌)である。
【０１９１】
バクテリア(例、大腸菌)の外来遺伝子の発現例は、周知である。例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Sambrook et al. (3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Press)を参照されたい。
【０１９２】
IV.微生物の培養方法
微生物を、遺伝子操作を実行する目的と引き続いて炭化水素(例、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類およびアルカン)を生産する目的との双方のために培養する。前者の型の培養を、小規模且つ少なくとも初期には開始する微生物が増殖することができる状況下で実行する。例えば、開始する微生物が光合成独立栄養生物である場合、最初の培養は光の存在下で実行される。微生物が光に独立して増殖するように進化するか、または改変される場合、培養条件を変えることができる。炭化水素生産目的の培養は、通常大規模に実行される。好ましくは、固定炭素源が存在する。また、培養物を、一定時間または全時間、光に暴露してもよい。
【０１９３】
微細藻類を、液体培地で培養してもよい。培養物を、バイオリアクターの内部に含むことができる。任意ではあるが、バイオリアクターは、光が侵入するのを許容しない。代わりに、微細藻類を、固定炭素源を含み且つ光が細胞に当たるようにするフォトバイオリアクターで培養してもよい。光への微細藻類細胞の暴露(細胞が輸送して利用する固定炭素源がある場合であっても(すなわち混合栄養増殖))は、暗所で細胞を培養することと比較して、それにも関わらず増殖を加速する。培養条件のパラメーターを操作して、炭化水素の総生産量、生産される炭化水素種の組合せおよび/または炭化水素種の製造を最適化することができる。いくつかの場合では、暗所で細胞を培養することが好ましい。例えば、光が培養物にあたるのを許容しない極めて大きい(40,000リットル以上の)発酵槽を使用する場合である。
【０１９４】
微細藻類培養培地は、典型的には構成成分(例、固定窒素源、微量元素、任意ではあるがpH維持のための緩衝液およびリン酸)を含む。他の構成成分には、固定炭素源(例、酢酸またはグルコース)、及び塩(例、特に海水微細藻類のための食塩)を含むことができる。微量元素の例には、例えば、ZnCl2、 H3BO3、 CoCl2-OH2O、 CuCl2-2H2O、MnCl2-4H2O 及び (NH4)6Mo7O24-4H2Oのそれぞれの形態中の亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン及びモリブデンを含む。
【０１９５】
固定炭素源で増殖することが可能な生物に関しては、固定炭素源は、例えば、グルコース(ブドウ糖)、フルクトース、スクロース(ショ糖)、ガラクトース、キシロース、マンノース、ラムノース、N-アセチルグルコサミン、グリセロール、フロリドシドおよび/またはグルクロン酸であり得る。一又は複数の炭素源を、少なくとも約50μM、少なくとも約100μM、少なくとも約500μM、少なくとも約5mM、少なくとも約50mMおよび少なくとも約500mMの濃度の一又は複数の外部から提供される固定炭素源で、供給してもよい。いくつかの微細藻類種は、光の非存在下で固定炭素源(例、グルコース又は酢酸)を利用することによって増殖することができる。このような増殖は、従属栄養性増殖として知られる。クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の場合、例えば、従属栄養性増殖は、バイオマスの高い生産性および細胞中の高い脂質含有量の蓄積を生じる。
【０１９６】
いくつかの微生物は、化合物の異種混合した供給源(例、都市廃棄物、二次処理汚水、廃水並びに固定炭素及び他の栄養物(例、硫酸塩、リン酸塩および硝酸塩)の他の供給源)である固定炭素源上で、自然に増殖するか、あるいは増殖するように改変可能である。汚水の構成成分は、炭化水素の生産で栄養源として役立ち、その培養物は炭化水素の安価な供給源を提供する。
【０１９７】
他の培養パラメーター(例、培養培地のpH、微量元素の種類および濃度、並びに他の培地構成成分)を操作することもできる。
【０１９８】
A. 光合成増殖
微細藻類は、光の存在下で増殖することができる。他のパラメーター(例、波長スペクトルおよび一日毎の明暗時間の比率)と同様に、微細藻類細胞の培養を照射する光子数を、操作することができる。微細藻類を、自然光で培養することもでき、同様に、自然光および人工光の組合せを同時または交互にしてもよい。例えば、クロレラ属の微細藻類を、昼間は自然光の下で、及び夜間は人工光の下で培養してもよい。
【０１９９】
微細藻類のような微生物を増殖するフォトバイオリアクターのガス含有量を、操作することができる。フォトバイオリアクター容量の一部は、液体よりむしろガスを含むことができる。ガス入口部を利用して、ガスをフォトバイオリアクターにポンプで送りこむことができる。任意のガス(空気、空気/CO2混合物、希ガス(例、アルゴン等)を含む)をフォトバイオリアクターにポンプで送りこむことができる。フォトバイオリアクターへのガスの流入速度もまた、操作することができる。フォトバイオリアクターへのガス流速を増やすことは、微細藻類の培養物の濁度を増やす。フォトバイオリアクターへガスを運ぶポートの配置は、所定のガス流速での培養物の濁度に影響を及ぼす場合がある。空気/CO2混合物を調整して、特定の生物にとっての最大限の増殖のためのCO2最適量を生み出すことができる。微細藻類は、例えば、100%の空気よりも、3%CO2/97%空気の下であって、光の下で有意に早く増殖する。3%CO2/97%空気は、天然の空気中よりもほぼ100倍CO2が多い。例えば、約99.75%の空気と0.25%のCO2、約99.5%の空気と0.5%のCO2、約99.0%の空気と1.00%のCO2、約98.0%の空気と2.0%のCO2、約97.0%の空気と3.0%のCO2、約96.0%の空気と4.0%のCO2および約95.00%の空気と5.0%のCO2、等の空気とCO2との混合物を、バイオリアクターまたはフォトバイオリアクターに注入してもよい。
【０２００】
また、微細藻類培養を、装置(例、回転刃及び羽根車、培養物の振とう、かき混ぜ棒、加圧ガスの注入、その他の機器)を使用して混合することに供することもできる。
【０２０１】
フォトバイオリアクターは、微細藻類を含むチャンバーにガス、固体、半固体および液体の流入を可能にするポートを有することができる。ポートは、通常、物質を運搬する管または他の手段に取り付けられる。ガスポートは、例えば、培養物へガスを運搬する。ガスをフォトバイオリアクターにポンプで送りこむことによって、CO2および他のガスを細胞に供給し且つ培養物を通気することにより濁度を生成することに役立てることができる。培養物の濁度の量は、ガスポートの数および位置が変わるにつれて、変化する。例えば、ガスポートを、円筒状ポリエチレンバッグの底部に沿って配置してもよい。CO2を空気に加えてフォトバイオリアクター中に泡立たせる場合に、微細藻類はより急速に増殖する。例えば、5%CO2と95%空気との混合物を、ボツリオコッカス(Botryococcus)細胞を含むフォトバイオリアクターに注入する(例、J Agric Food Chem. 2006 Jun 28;54(13): 4593-9、 J Biosci Bioeng. 1999;87(6): 811-5及び J Nat Prod. 2003 Jun;66(6): 772-8を参照されたい)。
【０２０２】
フォトバイオリアクターを、一又は複数の光源に暴露して、フォトバイオリアクターの表層にあてられる光をエネルギー源として微細藻類に光を提供することができる。好ましくは、光源は、細胞が増殖するのに十分であるが、酸化損傷を引き起こすかまたは光阻害反応を引き起こすほどの強さでない強度で提供する。いくつかの場合では、光源は、太陽の波長帯を模倣またはほぼ模倣する波長帯を有する。他の例においては、異なる波長帯を用いる。フォトバイオリアクターを、屋外又は太陽光が表面を照射することを可能にする温室若しくは他の施設に配置してもよい。ボツリオコッカス(Botryococcus)属の種のための好適な光子強度は、25から500μE m-2 s-1の間である(例えばPhotosynth Res. 2005 Jun;84(l-3): 21-7を参照されたい)。
【０２０３】
フォトバイオリアクターは、培地流入を可能にする一又は複数のポートを有するのが好ましい。1つの物質だけがポートを出入する必要はない。例えば、ポートを利用して、フォトバイオリアクターに培地を流入させ、それからサンプリング、ガス流入、ガス流出または他の目的のために使用可能である。いくつかの場合では、フォトバイオリアクターを、培養開始時に培養培地で満たし、そして培養物を植菌した後に追加の増殖培地を注入しない。つまり、微細藻類バイオマスを、微細藻類が繁殖しその数が増加する期間、水性培地で培養する。しかしながら水性培養培地の量のいくらかは、全時間を通じて、フォトバイオリアクターを通過して流れることはない。このようにいくつかの実施形態によっては、水性培養培地は植菌の後フォトバイオリアクターを通過して流れることはない。
【０２０４】
他の例においては、培養培地は、微細藻類が繁殖して数が増加する全期間にわたってフォトバイオリアクターを通過して流れてもよい。いくつかの実施形態においては、培地を、植菌後で細胞が所望の密度に達する前に、フォトバイオリアクターに注入する。つまり、前記微細藻類の所望の増加が達成されるまで、微細藻類の繁殖のために、ガス流入と培地流入の乱流を起こす措置(乱流措置)を維持しない。
【０２０５】
フォトバイオリアクターは、好ましくは、ガスの流入を可能にする一又は複数のポートを有する。ガスは、栄養物(例、CO2)を提供し、同様に培養培地中に乱流を提供することの双方に役立つことができる。乱流は、水性培養培地の高さレベルの下にガス流入ポートを配置し、従って、フォトバイオリアクターに流入するガスを、培養物の表面で泡立てることにより実現する。一又は複数のガス流出ポートによって、ガスを逃すことを可能にする。それによって、フォトバイオリアクターの圧力が増すことを予防する。好ましくは、ガス流出ポートは、汚染微生物がフォトバイオリアクターに流入するのを妨げる「一方向の」弁に通じる。いくつかの場合では、微細藻類が繁殖し数が増加する期間、細胞をフォトバイオリアクターで培養する。しかしながら、ガス流入により生じる主に培養培地全体に乱流渦を有する乱流措置を、その全期間、維持することができる。他の例では、微細藻類が繁殖し数が増加する全期間、ガス流入により生じる主に培養培地全体に乱流渦を有する乱流措置を維持することができる。いくつかの場合では、フォトバイオリアクターのスケールと渦のスケールとの間の比率の所定範囲を、微細藻類が繁殖し数が増加する間維持しない。他の例においては、このような範囲を維持してもよい。
【０２０６】
フォトバイオリアクターは、好ましくは、培養物のサンプルをとるために使用可能な少なくとも一つのポートを有する。好ましくは、サンプリングポートを、培養物の無菌培養を含む性質を損なうように変更せずに、繰り返し使用することができる。サンプリングポートは、サンプル流入を停止及び開始可能にする弁または他の装置で構成されてもよい。あるいは、サンプリングポートは、連続サンプリングを可能にすることができる。フォトバイオリアクターは、好ましくは、培養物の植菌を可能にする少なくとも一つのポートを有する。このようなポートを、また、他の目的(例、培地流入若しくはガス流入)のために使用してもよい。
【０２０７】
B.従属栄養性増殖
微生物の光合成増殖に代わるものとして、上記の通りに、いくつかの微生物を、固定炭素源が増殖および脂質蓄積のためのエネルギーを提供する従属栄養性増殖条件の下で培養してもよい。
【０２０８】
本発明の1つの従属栄養性培養方法において、(バイオディーゼル生産の費用)、脂質エステル転移の副産物として生産される、粗製、部分精製または精製グリセロールを、例えば、脂質生産微生物培養物を発酵させるための栄養源として使用してもよい。従って、本発明は、第1の微生物培養物中で微生物(例、微細藻類)を培養し、前記培養物から微生物脂質を回収し、前記微生物脂質をエステル転移に供して上記脂肪酸エステルおよびグリセロールを生産し、並びに、栄養源としてグリセロールを第2の微生物培養物に加えること、を含む。第1および第2の微生物培養物は、同じ微生物の培養物でもよいが、同じである必要はない。所望に応じて、連続システムを考案してもよく、それにより培養物から回収される脂質から作り出されるグリセロールを同じ培養物に戻すことができる。
【０２０９】
本発明は、真核及び原核微生物の両者の複数の属(クロレラ属、ナビクラ(Navicula)属、セネデスムス( Scenedesmus)属及びスピルリナ(Spirulina)属の微生物を含む)の発酵のためにグリセロールを使用することを含む、有意に改良された培養パラメーターを提供する。実施例で実証するように、極めて多様な進化系統の微生物(クロレラ、ナビクラ(Navicula)、セネデスムス( Scenedesmus)及びスピルリナ(Spirulina)、並びに複数の異なるクロレラ種および株の培養物)は、精製試薬級グリセロールだけではなくバイオディーゼルエステル転移からの酸性及び非酸性グリセロール副産物上で非常によく増殖する。いくつかの場合では、微細藻類(例、クロレラ株)は、グルコースの存在下よりもグリセロールの存在下でより速い細胞分裂を行う。これらの例において、二段階増殖プロセス(細胞にまずグリセロールを供給して急速に細胞密度を増加させ、その後、グルコースを供給して脂質を蓄積させるプロセス)によって、脂質を生産する効率を改善することができる。エステル転移プロセスのグリセロール副産物の使用は、製造プロセスに戻される場合、有意な経済的利点を提供する。他の供給方法(例、グリセロールおよびグルコースの混合物)も同様に提供される。この種の混合物を供給することも同じ経済的利点を獲得する。さらに、本発明は、代わりの糖類(例、スクロースを様々な組み合わせでグリセロールと共に)を微細藻類に供給する方法を提供する。本発明によって提供されるこれらの利益は、本明細書中において、極めて多様な進化系統の微生物(原核生物および真核生物を含む)上で実証されており、微生物発酵のための本発明の有用性を実証する。
【０２１０】
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の増殖および播種のための標準の方法は公知である(例えばMiao and Wu, J. Biotechnology, 2004, 11 : 85-93 及び Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846を参照されたい)。本発明は、また、クロレラに関する新しい増殖条件を提供する。例えば、クロレラの複数種およびその種中の複数株は、バイオディーゼルのエステル転移からのグリセロール副産物を含むグリセロールの存在下で増殖可能である。
【０２１１】
炭化水素生産のために、細胞(本明細書中で説明する本発明の組換細胞を含む)を、好ましくは大容量で培養し又は発酵する。培養は、大規模な液体容量中(例、例として浮遊培養)であってもよい。他の例には、小規模の細胞培養物で開始し、それを炭化水素の生産と同様に、細胞の増殖(growth and propagation)との組み合わせで大規模なバイオマスへと拡張することを含む。バイオリアクターまたは鋼鉄の発酵槽を使用して、大規模培養容量を収めることができる。ビールおよび/またはワインの製造に用いられるものと似た発酵槽が適している。エタノールの生産に使用する極めて大きい発酵槽も同様である。
【０２１２】
発酵槽中の培養物に適当な栄養源を提供する。これらには、一又は複数の以下のもの(例、固定炭素源(例、グルコース(ブドウ糖)、コーンスターチ、解重合セルロース系物質、スクロース(ショ糖)、サトウキビ、テンサイ、ラクトース、牛乳乳漿または糖蜜)、脂肪源(例、脂肪または植物油)、窒素源(例、タンパク質、大豆粉末、コーンスティープ液、アンモニア(純粋なまたは塩の形)、硝酸若しくは硝酸塩、または分子窒素)、並びにリン源(例、リン酸塩))のような原料を含む。加えて、発酵槽は、培養条件(例、温度、pH、酸素分圧および二酸化炭素レベル)の制御を可能にする。任意ではあるが、ガス状の構成成分(例、酸素または窒素のような)を、液体培養物中で泡立てることができる。例えば、小麦、ジャガイモ、米およびトウモロコシのような他のデンプン(グルコース)源。他の炭素源には、プロセス・ストリーム(例、工業水準グリセロール、黒液、有機酸(例、酢酸)、糖蜜)を含む。炭素源を、また、混合物(例、スクロースおよび解重合されたテンサイ・パルプの混合物)として提供する。
【０２１３】
発酵槽を使用して、細胞がその増殖サイクルのさまざまな相を経ることを可能にする。例えば、炭化水素産生細胞の植菌物を、培地に導入して、その後細胞が増殖を開始する前の遅延期間(遅滞相)がある。遅延期間後に、増殖率は、着実に増加して、対数(又は指数関数)増殖期に入る。そして、指数関数増殖期に続いて、栄養分の減少および/または有毒な物質の増加によって順次増殖が減速する。この減速後、増殖が停止し、細胞に提供される特定の環境に依存して、細胞は静止期または定常期に入る。
【０２１４】
本明細書中に開示される細胞による炭化水素の生産は、対数増殖期の間またはその後、静止期に起こり、そこでは、細胞分裂が無い場合に炭化水素の生産の継続が可能なように栄養物を供給するか、又は利用可能である。
【０２１５】
好ましくは、本明細書中に記載されまたは当該技術分野で既知の条件を用いて増殖される微生物は、少なくとも約20重量%、好ましくは少なくとも約40重量%、より好ましくは、少なくとも約50重量%、および最も好ましくは少なくとも約60重量%の脂質を含む。
【０２１６】
複数のクロレラ種及びあるクロレラ種の複数の株が、等価量の試薬級グリセロールより、エステル転移からのグリセロール副産物の存在下でより良好に実施できることは、予想外の発見であった。エステル転移からのグリセロール副産物は、通常グリセロールに加えて残留メタノールおよび他の夾雑物を含む。例えば、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)の株が、純粋な試薬級グリセロールで増殖する時より、脂質エステル転移反応から得られる酸性および非酸性グリセロール副産物上の方がより良好な生産性を呈することを、図1〜6は実証する。他の微生物(例、セネデスムス( Scenedesmus)及びナビクラ(Navicula)微細藻類)もまた、等価量の試薬級グリセロールよりも、エステル転移からのグリセロール副産物の存在下で、より良好に機能することができる。
【０２１７】
1リットル当たりの乾燥細胞重量:図1は、乾燥細胞重量が純粋グリセロール上よりバイオディーゼルグリセロール副産物上で高いことを実証し、この傾向は細胞をグリセロール単独又はグルコースとの組み合わせで増殖する場合にも当てはまる。図2は、クロレラの他の株で同一の傾向であることを示す。図12(b)は、そのセネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)の1リットル中の乾燥細胞重量が、純粋な試薬級グリセロールより、酸性及び非酸性バイオディーゼル副産物グリセロール上の方が高いことを実証する。図13は、ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)の1リットル中の乾燥細胞重量が純粋な試薬級グリセロール上より、非酸性バイオディーゼル副産物グリセロール上の方が高いことを実証する。
【０２１８】
1リットル中の脂質含有量:図3および図4は、複数のクロレラの種及びあるクロレラ種の複数の株で、細胞が等価濃度の純粋な試薬級グリセロールの存在下で培養される場合よりも、バイオディーゼル副産物グリセロールの存在下で培養される場合、1リットル中の脂質レベルが高いことを実証する。
【０２１９】
細胞重量パーセンテージとしての脂質:図5および図6は、複数のクロレラの種及びあるクロレラ種の複数の株は、細胞が等価濃度の純粋な試薬級グリセロール存在下で培養される場合よりも、バイオディーゼル副産物グリセロールの存在下で培養される場合の方が、脂質としてより高いパーセンテージの乾燥細胞重量を蓄積することを実証する。図11は、スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)とナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)の双方が、等価濃度の純粋な試薬級グリセロールの存在下で培養される場合よりも、バイオディーゼル副産物グリセロールの存在下で培養される場合の方が、脂質としてより高いパーセンテージの乾燥細胞重量を蓄積できることを実証する。図12(a)は、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)が、等価濃度の純粋な試薬級グリセロールの存在下で培養される場合よりも、バイオディーゼル副産物グリセロールの存在下で培養される場合の方が、脂質としてより高いパーセンテージの乾燥細胞重量を蓄積できることを実証する
【０２２０】
別の驚くべき結果は、微生物の複数種(微細藻類(例、クロレラ及びあるクロレラ種の複数株)及び他の微細藻類(例、セネデスムス(Scenedesmus)、ナビクラ(Navicula)、スピルリナ(Spirulina))を含む)は、グルコース単独の存在下よりも、グリセロールおよびグルコースの混合物の存在下で、バイオディーゼル生産者としてより良好な特徴を呈することである。
【０２２１】
1リットル当たりの脂質含有量:図7は、クロレラは、2%グルコースの存在下よりも、1%グリセロール/1%グルコースの存在下の方が、培地1リットル当たりのより高レベルの脂質を蓄積することができることを実証する。
【０２２２】
1リットル中の乾燥細胞重量:図12(b)は、2%グルコースの存在下よりも、1%バイオディーゼル副産物グリセロール/1%グルコースの存在下で培養される場合に、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)の1リットル当たりの乾燥細胞重量がより高いことを実証する。図13は、2%グルコースの存在下よりも、1%バイオディーゼル副産物グリセロール/1%グルコースの存在下で培養される場合に、ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)の1リットル当たりの乾燥細胞重量がより高いことを実証する。
【０２２３】
細胞重量パーセンテージとしての脂質:図8は、クロレラが、グルコース単独の存在下で培養されるよりも等価濃度(重量パーセント)のグリセロールとグルコースとの混合物の存在下で培養される場合の方が、脂質としてより高いパーセンテージの乾燥細胞重量を蓄積できることを実証する。図11(a)は、スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)が、グルコース単独の存在下で培養されるよりも等価濃度(重量パーセント)のバイオディーゼル副産物グリセロールとグルコースとの混合物の存在下で培養される場合の方が、脂質としてより高いパーセンテージの乾燥細胞重量を蓄積できることを実証する。図11(b)は、ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)が、グルコース単独の存在下で培養されるよりも、バイオディーゼル副産物及びグルコースと同様に、等価濃度(重量パーセント)の試薬級グリセロールとグルコースとの混合物の存在下で培養される場合の方が、脂質としてより高いパーセンテージの乾燥細胞重量を蓄積できることを実証する。図12(b)は、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)が、グルコース単独の存在下で培養されるよりも等価濃度(重量パーセント)のバイオディーゼル副産物グリセロールとグルコースとの混合物の存在下で培養される場合の方が、脂質としてより高いパーセンテージの乾燥細胞重量を蓄積できることを実証する。
【０２２４】
単一バッチのグリセロールとグルコースとの混合物としてよりも、微生物(微細藻類(例、クロレラ、セネデスムス( Scenedesmus)及びナビクラ(Navicula))を含む)にグリセロールおよびグルコースをむしろ順次加えるほうが、更なる収率増加を生成することができることはさらなる予想外の発見だった。複数のクロレラ種及びあるクロレラ種の複数の株の属性を、バイオディーゼルグリセロール副産物および試薬級グリセロールの双方の存在下で試験した。
【０２２５】
細胞重量パーセンテージとしての脂質:図8は、クロレラが、第1の期間にグリセロールを培養物に加えて、続いてグルコースを加え、第2の期間の間、培養を続けた方が、実験の開始時に同量のグリセロールとグルコースとを同時に加える場合よりも、脂質としてより高いパーセンテージの乾燥細胞重量を蓄積することができることを実証する。
【０２２６】
1リットル当たりの脂質含有量:図9は、クロレラが、グリセロール及びグルコースを順次培養物に加えた方が、実験の開始時に同量のグリセロールとグルコースとを同時に加える場合よりも、培養物1リットル当たりの高レベルな脂質を呈することを示す。酸性バイオディーゼル副産物グリセロール、非酸性バイオディーゼル副産物または試薬級グリセロールを使用した場合に、この傾向が観察された。
【０２２７】
1リットル当たりの乾燥細胞重量:図10は、2つの異なるクロレラ種の4つの互いに異なる株が、グリセロールとグルコースとを順次加える場合に、実験の開始時に同量のグリセロールとグルコースとを同時に加える場合よりも、培養物1リットル当たりのより高い乾燥細胞重量を蓄積することを実証する。酸性バイオディーゼル副産物グリセロール、非酸性バイオディーゼル副産物または試薬級グリセロールを使用した場合に、この傾向が観察された。図14(a)及び(b)は、第1の期間にバイオディーゼル副産物グリセロールだけを培養物に加えて、その後、グルコースを加える場合の方が、同一量のグリセロールとグルコースを発酵開始時に加えることに比べて、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)およびナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)の両方が、1リットル当たりの乾燥細胞重量の増加を示すことができることを実証する。
【０２２８】
微生物脂質生産の3つの異なる生産性マーカー(1リットル当たりの乾燥細胞重量、1リットル当たりの脂質のグラムおよび脂質としての乾燥細胞重量のパーセンテージ)を、バイオディーゼル副産物の使用および炭素源の時間的分離によって改善する。本発明は従って、進化系統樹の高度に多様な領域由来の複数種の微生物(例、原核生物および真核生物の両者を含む)中で、単位時間当たりのより高い脂質量を生み出す新規方法を提供する。グリセロールを使用する本明細書に開示の脂質および炭化水素製造方法は、微細藻類に限定されず、エネルギー源としてグリセロールを利用することができる任意の微生物と共に使用することができる。
【０２２９】
本発明の交互従属栄養性の増殖方法において、微生物を、栄養源として解重合セルロース系バイオマスを使用して培養してもよい。セルロース系バイオマス(例、茎葉(例、トウモロコシ茎葉))は、安価で容易に入手できる。しかしながら、酵母のための栄養源としてこの物質を使用する試みは失敗した。特にこの種の栄養源が酵母の増殖に抑制的であることがわかった上に、酵母はセルロース系物質(例、ヘミセルロースからのキシロース)から作り出される5炭糖を使用することができない。一方、微細藻類は、処理されたセルロース系物質上で増殖することができる。したがって、本発明は、セルロース系物質および/または5炭糖の存在下で、微細藻類を培養する方法を提供する。セルロース系物質は、一般に以下を含む。
構成成分  乾燥重量パーセント
セルロース  40〜60%
ヘミセルロース  20〜40%
リグニン  10〜30%
【０２３０】
適切なセルロース系物質には、第一次食品若しくは繊維製品の農場から除去されない残りカスで、農作物と同様に草本作物及び木本エネルギー作物の残りカス(つまり、植物の一部(例、主茎および葉))を含む。例には、農業廃棄物(例、サトウキビ・バガス、米外皮、トウモロコシ繊維(軸、葉、外皮および穂軸を含む)、小麦わら、米わら、テンサイ・パルプ、柑橘類のパルプ、柑橘類の皮)、林業廃棄物(例、広葉樹または針葉樹の間伐材、広葉樹または針葉樹の製材加工からの残材)、木材廃棄物(例、製材工場廃棄物(木材チップ、おがくず)及びパルプ工場廃棄物)、都市廃棄物(例、都市固形廃棄物の紙画分、都市木材廃棄物、及び都市緑の廃棄物(例、市町村の草木切り落とし物))、並びに木材建設廃棄物を含む。その他のセルロース系物質には、専用のセルロース系作物(例、スイッチグラス、複合型ポプラ材およびオギ)、サトウキビ繊維、並びにモロコシ繊維を含む。そのような物質から生産される5炭糖には、キシロースを含む。
【０２３１】
驚くべきことに、いくつかのクロレラ種は、本明細書中に示されるように、グルコース若しくはキシロース単独で培養される時よりも、グルコースとキシロースとの組み合わせで培養される方がより高レベルの生産性を呈する。この相乗効果は、セルロース系物質であるキシロースおよびブドウ糖の組合せで、クロレラの培養を可能にするという有意な利点を提供し、それを図15に示す。
【０２３２】
本発明に基づくさらに別の代わりの従属栄養性増殖方法において(それ自体は、任意ではあるが、上記方法と組み合わされて用いられてもよいが)、サトウキビまたはテンサイからの例により製造されるスクロースを栄養源として使用する。下記の「微生物改変」と名付けられる章において更に詳細に記載するように、炭素源としてスクロース(ショ糖)を利用するように微生物(例、クロレラ)の改変を通して、脂質生産を促進するか若しくはより効率化することができる。例えば、ショ糖輸送体およびショ糖インベルターゼの発現によって、クロレラが培養培地から細胞にスクロースを輸送して、及び、スクロースを加水分解して、グルコースとフルクトースとを生ずることを可能にする。任意ではあるが、フルクトキナーゼを、内因性ヘキソキナーゼ活性がフルクトースの最大リン酸化のために不十分である場合に発現することもできる。適切なショ糖輸送体の例は、ジェンバンクアクセション(GenBank Accession)番号CAD91334、CAB92307およびCAA53390である。適切なショ糖インベルターゼの例は、ジェンバンクアクセション番号CAB95010、NP 012104およびCAA06839である。適切なフルクトキナーゼの例は、ジェンバンクアクセション番号P26984、P26420およびCAA43322である。一又は複数のそのような遺伝子をコードする微細藻類(例、クロレラ)の形質転換のためのベクターは、本明細書中で記載されるようにデザイン可能である。
【０２３３】
ショ糖インベルターゼの分泌は、細胞にスクロースを輸送することができる輸送体の発現の必要を不要にすることができる。これは分泌されたインベルターゼが、スクロース分子の転換を触媒して、グルコース分子およびフルクトース分子にし、そして、本明細書中に記載される微生物は、その両者を輸送し及び利用することができるからである。例えば、ショ糖インベルターゼ(例、配列番号:14)で、分泌シグナル(例、配列番号:15(酵母由来)、配列番号:16(高等植物由来)、配列番号:17(真核生物に共通のシグナル配列)および配列番号:18(高等植物および真核生物共通からのシグナル配列の組合せ))有するものの発現は、細胞外でのインベルターゼ活性を生成する。クロレラで活性のある分泌シグナルの例に関しては、Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341を参照されたい。本明細書中において説明される遺伝子工学方法論によって可能になる、このようなタンパク質の発現は、エネルギー源として細胞外グルコースを利用することがすでにできる細胞を、細胞外エネルギー源としてスクロースを利用することができるようにする。本明細書中に示されるように、エネルギー源として細胞外フルクトースと細胞外グルコースとの両者を利用することができる細胞(例、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii))においては、インベルターゼの分泌は、効率的な安価なエネルギー源として、スクロースの使用に必要な唯一の触媒活性を提供することができる。
【０２３４】
例えば、図26に示すように、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)を、3つのプロモーター(カリフラワー・モザイク・ウイルス・35Sプロモーター(CMV)、クロレラウイルス・プロモーター(CV)または、クロレラHUPlプロモーター(HUPl))の内の1つの調節制御下で、ショ糖インベルターゼ遺伝子を有するように設計可能である。この例で使用するショ糖インベルターゼ遺伝子は、C・プロトセコイデス(C protothecoides)のコドン使用を最適化するような、出芽酵母(S. cerevisiae)SUC2遺伝子への改変を含む。最適化された遺伝子のcDNAおよびアミノ酸配列は、配列番号:8および配列番号:19、にそれぞれ対応する。形質転換に使用するプラスミド構築物の図例を、図25に示す。例えば本明細書中において記載されるように、分泌可能なショ糖インベルターゼの発現は、細胞発酵のための栄養源を含む糖蜜、サトウキビ液および他のスクロースの使用を許容する。
【０２３５】
同様に、図27および28は、それぞれに、CMVプロモーターの制御下の出芽酵母(S. cerevisiae)由来のショ糖インベルターゼの遺伝子を有する、それぞれクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)およびクロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)の形質転換結果を示す。
【０２３６】
実施例で更に詳細に記載するように、外来の分泌可能なショ糖インベルターゼを発現する微生物の増殖能力を、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の培養培地にインベルターゼを添加することにより説明する。図23および24は、クロレラ細胞が、純粋な試薬級グルコース上で増殖するのと同様に、サトウキビ処理からの糖蜜廃棄物上で同様に増殖するという驚くべき結果を例示する。
糖蜜には、多数の微生物に有毒であり、その増殖を遅延させるリグニンと他のセルロース系廃棄産物を含むが、そのような毒物の存在下においても、クロレラ細胞が生存することを発見した。図23と24は、細胞外ショ糖インベルターゼの存在または不存在下でグルコース又はスクロース上で増殖することと比較した場合、3つのユニークな出所の糖蜜(BSl、BS2およびHTMと記述される)上での細胞増殖を示す。
【０２３７】
あるいは、ショ糖インベルターゼは、また、スクロース(ショ糖)が細胞に取り込まれ競ることを可能にする任意の炭水化物輸送体を発現する細胞と同様に、ショ糖輸送体を発現する細胞において細胞内に発現可能である。
【０２３８】
実施例12に記載するように、外来遺伝子を、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)に形質転換し発現した。ショ糖資化性遺伝子の発現は、同一又は類似の方法論およびベクター設計を使用して達成可能である。
【０２３９】
バイオリアクターを、従属栄養性増殖方法での使用のために用いることができる。理解されるように、本明細書中に記載の従属栄養性増殖方法において固定炭素源を使用する場合、光合成増殖方法において光を細胞に利用可能にするためになされる対策は不必要である。
【０２４０】
本明細書中において記載の処理条件および従属栄養性増殖方法の具体例を任意の適した態様で組み合わせて、微生物増殖及び脂質生産の効率を改良することができる。加えて、上記の方法での使用にさらにより適切である微生物を生産するために、本発明には、微生物(例、微細藻類)の選抜及び/又は遺伝子改変を含む。例えば、上述の栄養源のいずれかを、増殖及び/または脂質(例、脂肪酸)生産を増加するために利用するより優れた利用能力を有する微生物は、本発明の範囲内である。
【０２４１】
C. 混合栄養性増殖
混合栄養性増殖とは、細胞が増殖し炭化水素を生産するために、光と固定炭素源の双方をエネルギー源として使用することである。混合栄養性増殖は、フォトバイオリアクターにおいて実行可能である。微細藻類は、互いに異なる種類の透明又は半透明の材料でできている閉じたフォトバイオリアクターにおいて維持及び増殖することができる。この種の材料には、プレキシグラス(Plexiglas)(登録商標)、エンクロージャ、ガラスエンクロージャ、例えばポリエチレンのような物質でできたバッグ、透明若しくは半透明のパイプおよび他の材料を含むことができる。微細藻類は、開かれたフォトバイオリアクター(例、水路池、沈殿池、他の閉ざされていない容器)において維持及び増殖することができる。
【０２４２】
D.増殖培地
本発明の方法に従って有用な微生物は、全世界にわたってさまざまな場所および環境で見つかる。他の種からの隔絶およびそれから生じる進化多様性の結果として、最適な増殖並びに脂質および/または炭化水素構成要素の生成のための特定の増殖培地は、予測が困難である。いくつかの場合では、微生物のある種は、若干の阻害成分の存在あるいは微生物の特定株に必要とされるいくつかの必須栄養物の欠如のため、特定の増殖培地で増殖することができない場合がある。
【０２４３】
固体および液体増殖培地は、通常、多種多様なソースから入手可能である、そして、微生物の多種多様な株に適している特定の培地の調製のためのマニュアルが、例えば、(テキサス大学オースチン校(藻類培養コレクション(UTEX))によって維持されるサイト) http://www.utex.org/ のオンライン上で見いだされる。例えば、さまざまな淡水および塩水培地には、下記表4で示されるものを含む。
【０２４４】
(表4)例示的な藻類培地
【表４】
2010528627.tif 000001
【０２４５】
特定の例では、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 31)を培養することに適している培地には、プロテオース培地を含む。この培地は純粋培養に適している、そして、培地(pH 6.8)のI L量は1リットルのブリストル培地にプロテオース・ペプトンのI gを加えることによって調製可能である。ブリストル培地は、2.94mMのNaNO3、0.17mMのCaCl22H2O、0.3mMのMgSO47H2O、0.43mM、1.29mMのKH2PO4、及び1.43mMのNaClを水溶液中に含む。1.5%の寒天培地の場合、15gの寒天を、前記溶液1Lに加えることができる。前記溶液に蓋をして、オートクレーブし、そして、使用する前まで冷温で保管する。
【０２４６】
本発明の方法とともに使用する他の適切な培地は、上記URLのものに相談するか、あるいは微生物培養物を維持する他の機関(例、SAG、CCAPまたはCCALA)と相談することにより容易に同定可能である。SAGはゲッチンゲン(Gottingen)大学(ゲッチンゲン、ドイツ)藻類培養コレクションのことを指す。CCAPは、スコットランド海洋科学協会(スコットランド、英国)によって管理される藻類および原生動物培養コレクションを指す。そして、CCALAは、植物学研究所(Trebon、チェコ共和国)藻類研究室の培養コレクションを指す。
【０２４７】
E.脂質収率を増加させること
処理条件を調整して、特定の用途に適する脂質の収率を増やし及び/又は生産コストを減らすことができる。例えば、特定の実施形態で、微生物(例、微細藻類)を、例えば、固定炭素エネルギー(例、グルコース)を供給しながら、一又は複数の栄養物(例、炭素および/若しくは窒素、リン、または硫黄)の限界濃度の存在下で培養する。窒素の限定は、窒素が過度に提供される培養物中の微生物脂質収率以上の微生物脂質収率に増加させる傾向がある。特定の実施形態では、脂質収率の増加は、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200%、300%、400%または500%である。微生物を、全体の培養期間の一部又はその期間全体にわたって、限界量の栄養分の存在下で培養することもできる。特定の実施形態において、前記栄養分濃度を、全体の培養期間の間に少なくとも二回、限界濃度と非限界濃度との間で繰り返す。
【０２４８】
脂質収率を増やすために、酢酸を、脂質産生微生物(例、微細藻類)のための栄養源中に用いてもよい。酢酸を、脂肪酸合成を開始する代謝の位置(すなわちアセチルCoA)に、直接供給する。このように、培養物中に酢酸を提供することによって、脂肪酸産生を増やすことができる。一般的には、微生物を、特に酢酸がない場合の微生物脂質(例、脂肪酸)収率以上に、微生物脂質収率および/または微生物脂肪酸収率を増やすために、十分量の酢酸の存在下で培養する。
【０２４９】
他の実施形態では、脂質収率は、脂質経路酵素(例、脂肪酸合成酵素)のための一又は複数の補因子の存在下で、脂質生産微生物(例、微細藻類)を培養することによって増加する。一般的には、前記補因子の濃度は、補因子の非存在下での微生物脂質収率より多く、微生物脂質(例、脂肪酸)収率を増やすのに十分である。特定の実施形態では、補因子をコードする外来遺伝子を含む微生物(例、微細藻類)を培養物に包含することによって、前記培養物に前記補因子を提供する。あるいは、補因子の合成に関与するタンパク質をコードする外来遺伝子を含む微生物(例、微細藻類)を包含することによって、前記補因子を培地に提供してもよい。ある種の実施形態では、適切な補因子は、脂質経路酵素(例、ビオチン、パントテナート)に必要な任意のビタミンを含む。本発明での使用に適した補因子をコードする遺伝子、又はそのような補因子の合成に関与する遺伝子は、周知であり、契約および技術(例、上記したもの)を用いて微生物(例、微細藻類)に導入可能である。
【０２５０】
V.脂質経路改変
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の微生物を改変して、生産される脂質の特性及び/若しくは比率を変更し並びに/又は脂質への炭素フラックスを増やす。経路を更に、又は代替的に改変して、脂質の酵素処理によって生産されるさまざまな炭化水素分子の特性及び/若しくは比率を変更してもよい。
【０２５１】
A.生産される脂質若しくは炭化水素の特性又は比率の変更
微細藻類の場合、いくつかの野生型細胞は、すでに良好な増殖特性を有するが、所望のタイプまたは量の脂質を生産しない。例には、ピロボツリス(Pyrobotrys)、フォルミディウム(Phormidium)、アグメネルム(Agmenellum)、カルテリア(Carteria)、レポシンシス(Lepocinclis)、ピロボツリス(Pyrobotrys)、ニッツチア(Nitzschia)、レポシンシス(Lepocinclis)、アナバエナ(Anabaena)、エウグレナ(Euglena)、スピロギラ(Spirogyra)、コロコッカム(Chlorococcum)、テトラエドロン(Tetraedron)、オスシラトリア(Oscillatoria)、ファーガス(Phagus)およびクロロゴニウム(Chlorogonium)を含み、それらは都市汚水または廃水中で増殖するという望ましい増殖特性を有する。このような細胞(クロレラおよび他の微生物の種と同様に)を改変して、脂質生産特性を改善することができる。望まれる特性には、単位量および/若しくは単位時間当たりの脂質収率を最適化すること、(バイオディーゼル生産のため、若しくは炭化水素栄養源を必要とする工業的応用のための)炭素鎖長、二重結合若しくは三重結合の数を(任意ではあるがゼロに)減らすこと、リング構造および環状構造を取り除くか若しくは除去すること、並びに特定種の脂質若しくは個別の脂質集団の水素:炭素比率を増加させることを含む。加えて、適切な炭化水素を生産する微細藻類を改変して、さらにより望ましい炭化水素産出量を有することもできる。このような微細藻類の例には、クロレラ属の種を含む。
【０２５２】
1. 脂肪酸合成の分岐点を制御する酵素の調節
特定の実施形態において、代謝分岐点を脂肪酸合成へと制御する一又は複数の重要酵素を、アップレギュレーションするかまたはダウンレギュレーションして脂質生産を改善することができる。アップレギュレーションは、例えば、転写を増加させる強いプロモーターおよび/またはエンハンサー要素を使用し、目的の酵素をコードする遺伝子を発現する発現コンストラクトで細胞を形質転換することによって達成可能である。このようなコンストラクトは、選択マーカーを含み、従って、形質転換体を選択に供して、前記コンストラクトの増幅とコードされる酵素の発現レベルとの増加を生じることができる。本発明の方法に従って、アップレギュレーションに適する酵素の例には、ピルビン酸をアセチルCoAに変換する役割を担うピルビン酸デヒドロゲナーゼ(例、微細藻類からのいくつかのものには、ジェンバンクアクセション番号 NP_415392、AAA53047、QlXDMl及びCAF05587を含む)を含む。ピルビン酸デヒドロゲナーゼのアップレギュレーションは、アセチルCoAの生成を増加することができて、このことにより脂肪酸合成を増やすことができる。アセチル−CoAカルボキシラーゼは、脂肪酸合成の初期段階を触媒する。したがって、この酵素(例、微細藻類からのいくつかのものには、ジェンバンクアクセション番号BAA94752、AAA75528、AAA81471、YP_537052、YP_536879、NP_045833、及びBAA57908を含む)をアップレギュレートして、脂肪酸の生成を増やすことができる。脂肪酸産生をまた、脂肪酸合成の間成長するアシル鎖を担持する、アシル担体タンパク質(ACP)(例、微細藻類からのいくつかのものには、ジェンバンクアクセション番号A0T0F8、P51280、NP_849041、YP 874433を含む)のアップレギュレーションによって増加させることができる。グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼは、脂肪酸合成の律速段階を触媒する。この酵素(例、微細藻類からのいくつかのものには、ジェンバンクアクセション番号AAA74319、AAA33122、AAA37647、P44857、及びABO94442)のアップレギュレーションにより、脂肪酸産生を増やすことができる。前記のタンパク質は、微細藻類(クロレラ属の種を含む)での発現候補である。
【０２５３】
目的酵素のダウンレギュレーションを、例えば、アンチセンス、触媒RNA/DNA、RNA干渉(RNAi)、「ノックアウト」、「ノックダウン」、または他の突然変異生成技術を使用し、実現することができる。酵素発現/機能を、また、細胞内抗体を使用して阻害してもよい。本発明の方法に従うダウンレギュレーションに適する酵素の例には、クエン酸シンターゼを含む。そして、それはトリカルボン酸(TCA)サイクルの一部としてアセチルCoAを消費する。クエン酸シンターゼのダウンレギュレーションにより、より多くのアセチルCoAを脂肪酸合成経路に押し込むことができる。
【０２５４】
2. 脂肪酸合成遺伝子のグローバルレギュレーターの調整
グローバルレギュレーターは、脂肪酸生合成経路の遺伝子の発現を調整する。したがって、脂肪酸合成の一又は複数のグローバルレギュレーターを、適切に、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションして、複数の脂肪酸合成遺伝子の発現をそれぞれ阻害または上昇させて、最終的には、脂質生産を増加させることができる。例には、ステロール調節要素結合タンパク質(SREBPs)(例、SREBP-IaおよびSREBP-Ic(例、ジェンバンクアクセション番号NP_035610およびQ9WTN3を参照されたい))を含む。例えば、制御点酵素の調節に関して上述のように、グローバルなレギュレーターを、アップまたはダウンレギュレーションすることができる。
【０２５５】
3. 炭化水素修飾酵素の制御
本発明の方法は、また、炭化水素修飾酵素(例、脂肪アシルACPチオエステラーゼ(アクセション番号を有する表5の例を参照されたい)、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素(アクセション番号を有する表6の例を参照されたい)、脂肪アシルCoA還元酵素(アクセション番号を有する表7の例を参照されたい)、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ(アクセション番号を有する表8の例を参照されたい)、脂肪アルデヒド還元酵素またはスクアレンシンターゼ遺伝子(ジェンバンクアクセション番号AF205791を参照されたい))をコードする一又は複数の遺伝子で細胞を形質転換することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アシルACPチオエステラーゼおよび自然に共発現されるアシル担体タンパク質をコードする遺伝子を、任意ではあるが、他の炭化水素修飾酵素をコードする一又は複数の遺伝子と共に細胞へ形質転換してもよい。他の実施形態においては、ACP及び脂肪アシルACPチオエステラーゼは、それらが特定の組織若しくは生物において自然に共発現するかまたは発現しないかどうかにかかわりなく、その2つが微生物および本発明の方法で一緒に使われるときに、利点を付与する相互親和性を有する場合がある。このように、本発明は、ACPから特定長の炭素鎖の切断を促進するために、相互に相互作用する親和性を共有するものたちと同様に、自然に共発現するこれらの酵素の対を意図する。
【０２５６】
さらに他の実施形態において、不飽和化酵素をコードする外来遺伝子を、炭化水素飽和に関する修飾を提供するために、他の炭化水素修飾酵素をコードする一又は複数の遺伝子と組み合わせて、細胞に形質転換することができる。ステアロイルACP不飽和化酵素(ジェンバンクアクセション番号AAFl 5308、ABM45911、及び、AAY86086を参照されたい)は、例えば、ステアロイルACPからオレオイルACPへの転換を触媒する。この遺伝子のアップレギュレーションは、細胞により生産される一不飽和脂肪酸の割合を増やすことができる。一方、ダウンレギュレーションは、一不飽和の割合を減らすことができる。同様に、一又は複数のグリセロ脂質不飽和化酵素(例、ω-6脂肪酸不飽和化酵素、ω-3脂肪酸不飽和化酵素またはω-6-オレイン酸不飽和化酵素)の発現を制御して、飽和脂肪酸に対する不飽和脂肪酸の比率を変更することができる。いくつかの実施形態では、不飽和化酵素を所望の炭素鎖長に関して選択することができ、従って、不飽和化酵素は、特定された炭素長の基質若しくは特定範囲内の炭素長を有する基質中に、部位特異的な修飾を行うことができる。
【０２５７】
特定の実施形態においては、本発明の微生物を遺伝的に改変して、脂肪アシルACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素、脂肪アシルCoA還元酵素、脂肪アルデヒド還元酵素、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼまたは自然に共発現されたアシル担体タンパク質から選ばれる一又は複数の外来遺伝子を発現させる。適切な発現方法をリパーゼ遺伝子発現に関して上記し、それには、他の方法の中でも、誘導性発現及び区画化発現を含む。
【０２５８】
任意の特定理論若しくは細胞メカニズムにより束縛されることを意図することはないが、脂肪アシルACPチオエステラーゼは、脂質合成の間、脂肪酸をアシル担体タンパク質(ACP)から切断する。更なる酵素処理を介して、切断された脂肪酸を、その後補酵素と組み合わせて、アシルCoA分子を産生する。このアシルCoAは、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素がアルコールを生成するのと同様に、脂肪アシルCoA還元酵素がアルデヒドを生成する酵素活性のための基質である。上記の脂肪アシルCoA還元酵素の作用によって生産されるアルデヒドは、アルコールを産生する脂肪アルデヒド還元酵素またはアルカン若しくはアルケンを生成する脂肪アルデヒドデカルボニラーゼの更なる酵素活性のための基質である。
【０２５９】
直前に記した酵素は、特定の炭素原子数を含む基質に作用する特異性を有する。例えば、脂肪アシルACPチオエステラーゼは、ACPから12の炭素原子を有する脂肪酸を切断する特異性を有する場合がある。いくつかの実施形態では、ACP及び長さ特異的チオエステラーゼは、それらを特に組合せ(例えば、外来のACPおよびチオエステラーゼ遺伝子は、それらが由来する特定の組織若しくは生物において自然に共発現する場合がある)として有用なものとする、相互親和性を有する場合がある。従って、各種実施形態では、微生物は、基質に含まれる炭素原子数に関して酵素活性(例、ACPからの脂肪酸の切断、アルデヒド若しくはアルコールへのアシルCoAの還元、又はアルカンへのアルデヒドの転換)を触媒する特異性を有するタンパク質をコードする外来遺伝子を含むことができる。酵素特異性は、各種実施形態において、8から34の炭素原子を有する基質、好ましくは8から18の炭素原子、そして、より好ましくは10から14の炭素原子を有する基質であってもよい。最も好適な特異性は、12の炭素原子を有する基質へのものである。他の実施形態において、前記特異性は、20〜30の炭素原子に対するものであってもよい。
【０２６０】
本発明の微生物及び方法の使用に適する脂肪アシルACPチオエステラーゼには、限定はされないが、表5にリストされるものを含む。
【０２６１】
(表5)脂肪アシル-ACPチオエステラーゼおよびジェンバンクアクセション番号
ウンベルラリア・カリフォルニカ(Umbellularia californica)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAC49001)
キナモム・キャンフォラ(Cinnamomum camphora)-ACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#Q39473)
ウンベルラリア・カリフォルニカ(Umbellularia californica)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#Q41635)
ミリスティカ・フラグランス(Myristica fragrans)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAB71729)
ミリスティカ・フラグランス(Myristica fragrans)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAB71730)
アブラヤシ脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABD83939)
アブラヤシ脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAD42220)
ポピュラス・トメントサ(Populus tomentosa)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABC47311)
シロイヌナズナ脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#NP_172327)
シロイヌナズナ脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAA85387)
シロイヌナズナ脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAA85388)
ゴッシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#Q9SQI3)
クフェア・ランセオラタ(Cuphea lanceolata)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAA54060)
クフェア・ホケリアナ(Cuphea hookeriana)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAC72882)
クフェア・カロフィラ・サブSP・メソステモン(Cuphea calophylla subsp.mesostemon)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABB71581)
クフェア・ランセオレイト(Cuphea lanceolata)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAC19933)
アブラヤシ脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAL15645)
クフェア・ホケリアナ(Cuphea hookeriana)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#Q39513)
ゴッシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAD01982)
ブドウ脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#CAN81819)
マンゴスチン脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAB51525)
カラシナ脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABI18986)
マドフカ・ロンギフォリア(Madhuca longifolia)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAX51637)
アブラナ脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#ABH11710)
イネ(インディカ栽培品種-グループ)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#EAY86877)
イネ(ツバキ栽培品種-グループ)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#NP_001068400)
イネ(インディカ栽培品種-グループ)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#EAY99617)
クフェア・ホケリアナ(Cuphea hookeriana)脂肪アシルACPチオエステラーゼ(ジェンバンク#AAC49269)
【０２６２】
本発明の微生物及び方法の使用に適する脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素は、限定はされないが、表6にリストされるものを含む。
【０２６３】
(表6)ジェンバンクアクセション番号によりリストされる脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素
AAC45217, YPJD47869, BAB85476, YP_001086217, YP 580344, YP 001280274, YP_264583, YP_436109, YP_959769, ZP_01736962, ZP 01900335, ZP_01892096, ZP_01103974, ZP_01915077, YP_924106, YPJ30411, ZP 01222731, YP_550815, YP_983712, YP_001019688, YP_524762, YP_856798, ZP Ol 115500, YPJ)Ol 141848, NP_336047, NP_216059, YP_882409, YP_706156, YP_001136150, YP_952365, ZP 01221833, YP 130076, NP_567936, AAR88762, ABK28586, NP_197634, CAD30694, NP_001063962, BAD46254, NP 001030809, EAZ10132, EAZ43639, EAZ07989, NP_001062488, CAB88537, NP_001052541, CAH66597, CAE02214, CAH66590, CAB88538, EAZ39844, AAZ06658, CAA68190, CAA52019, 及び BAC84377
【０２６４】
本発明の微生物及び方法の使用に適する脂肪アシルCoA還元酵素には、限定はされないが、表7にリストされるものを含む。
【０２６５】
(表7)ジェンバンクアクセション番号によってリストされる脂肪アシルCoA還元酵素
NP_187805, ABO14927, NP_001049083, CAN83375, NP_191229, EAZ42242, EAZ06453, CAD30696, BAD31814, NP_190040, AAD38039, CAD30692, CAN81280, NP_197642, NP_190041, AAL_15288, 及び NP_190042
【０２６６】
本発明の微生物及び方法の使用に適する脂肪アルデヒドデカルボニラーゼは、限定はされないが、表8にリストされるものを含む。
【０２６７】
(表8)ジェンバンクアクセション番号によってリストされる脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ
NP 850932, ABN07985, CAN60676, AAC23640, CAA65199, AAC24373, CAE03390, ABD28319, NP 181306, EAZ31322, CAN63491, EAY94825, EAY86731, CAL55686, XP_001420263, EAZ23849, NP_200588, NP 001063227, CAN83072, AAR90847, 及び AAR97643
【０２６８】
自然に共発現された脂肪アシル-ACPチオエステラーゼおよびアシル担体タンパク質の組み合わせは、本発明の微生物および方法の用途に適している。
【０２６９】
炭化水素修飾酵素の他の例には、以下の米国の特許:(6,610,527; 6,451,576; 6,429,014; 6,342,380; 6,265,639; 6,194,185; 6,114,160; 6,083,731 ; 6,043,072 ; 5,994,114; 5,891,697; 5,871,988; 6,265,639)、そして、更に、ジェンバンクアクセション番号で記載されるもの:(AAOl 8435;ZP_00513891; Q38710; AAK60613; AAK60610; AAK60611; NP_113747; CAB75874; AAK60612; AAF20201; BAAl 1024; AF205791;及びCAA03710)のいずれかに含まれるか参照される核酸配列により含まれるか、参照されるか、あるいはコードされるアミノ酸配列を含む。
【０２７０】
本発明の微生物及び方法を用いた使用のための他の適切な酵素には、表5〜8にリストされるタンパク質のうちの1つと少なくとも70%のアミノ酸同一性を有する、そして、対応する所望の酵素活性(例、アシル担体タンパク質からの脂肪酸の切断、アルデヒド若しくはアルコールへのアシルCoAの還元、又はアルカンへのアルデヒドの転換)を呈するものを含む。他の実施形態においては、前記酵素活性は上記した配列のうちの1つと、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の同一性を有する配列に存在する。そして、その全ては、十分に記載されるように、参照により本明細書中に引用される。
【０２７１】
上記の炭化水素修飾酵素は、微生物(例、微細藻類、油性の酵母、若しくは真菌)又は微生物の群からさまざまな炭化水素の生産に有用である。それによって、脂肪アシルACPチオエステラーゼは脂質合成の間、脂肪酸をアシル担体タンパク質(ACP)から切断する。更なる酵素の処理によって、切断された脂肪酸は、その後、補酵素と組み合わされてアシルCoA分子を生成する。このアシルCoAは、脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素がアルコールを生成するのと同様に、脂肪アシルCoA還元酵素がアルデヒドを生成する酵素活性のための基質である。上記で識別される脂肪アシルCoA還元酵素の作用によって生産されるアルデヒドは、アルコールを生成する脂肪アルデヒド還元酵素又はアルカン若しくはアルケンを生成する脂肪アルデヒドデカルボニラーゼの更なる酵素活性のための基質である。
【０２７２】
炭化水素修飾酵素は、特定の炭素原子数を含む基質に作用するための特異性を有する。例えば、脂肪アシルACPチオエステラーゼは、12の炭素原子を有する脂肪酸をACPから切断するための特異性を有する場合がある。従って、各種実施形態で、微生物は、基質に含まれる炭素原子数に関して酵素活性(例、ACPからの脂肪酸の切断、アルデヒド若しくはアルコールへのアシルCoAの還元、又はアルカンへのアルデヒドの転換)を触媒する特異性を有するタンパク質をコードする外来遺伝子を含むことができる。酵素特異性は、各種実施形態において、8から34の炭素原子を有する基質に対するもの、好ましくは8から18の炭素原子、そして、より好ましくは、10から14の炭素原子を有する基質へのものであってもよい。最も好適な特異性は、12の炭素原子を有する基質に対するものである。他の実施形態においては、前記特異性は、20〜30の炭素原子に対するものであってもよい。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法によって生成される、脂肪酸、又は対応する第一級アルコール、アルデヒド、アルカン若しくはアルケンは、少なくとも約8か、少なくとも約10か、少なくとも約12か、少なくとも約14か、少なくとも約16か、少なくとも約18か、少なくとも約20か、少なくとも約22か、少なくとも約24か、少なくとも約26か、少なくとも約28か、少なくとも約30か、少なくとも約32か、少なくとも約34かより多くの炭素原子を含む。バイオディーゼル、再生可能ディーゼル若しくはジェット燃料の生産のための好適な脂肪酸若しくは工業的応用のための対応する第一級アルコール、アルデヒド、アルカン及びアルケンは、少なくとも約8つの炭素原子またはより多くのものを含む。ある実施形態では、上記脂肪酸、それと共に他の対応する炭化水素分子は、その構造中で、飽和(炭素-炭素の二重若しくは三重結合がなく)されるか、一不飽和(1つの二重結合)であるか、多不飽和(2つ以上の二重結合)であるか、直線(環式でない)でるか、及び/又は、分岐がない。
【０２７４】
発現される外来遺伝子の望ましい組合せを選択することによって、微生物によって生成される生産物を仕立て上げることができる。そして、それらを、その後、水性のバイオマスから抽出することができる。例えば、前記微生物は、(i)脂肪アシルACPチオエステラーゼをコードする外来遺伝子、そして、任意ではあるが、(ii)自然に共発現されたアシル担体タンパク質又は脂肪アシルACPチオエステラーゼに対する親和性を有するアシル担体タンパク質(または逆)、そして、任意ではあるが、(iii)脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素若しくは脂肪アシルCoA還元酵素をコードする外来遺伝子、そして、任意ではあるが、(iv)脂肪アルデヒド還元酵素若しくは脂肪アルデヒドデカルボニラーゼをコードする外来遺伝子を含むことができる。下記のように培養される場合、前記微生物は、ACPに結合される脂肪酸を合成し、脂肪アシルACPチオエステラーゼはACPから脂肪酸の切断を触媒し、更なる酵素処理で、脂肪アシルCoA分子を産生する。脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素は、それが存在する場合、アシルCoAからアルコールへの還元を触媒する。同様に、脂肪アシルCoA還元酵素は、それが存在する場合、アルデヒドへのアシルCoAの還元を触媒する。脂肪アシルCoA還元酵素をコードする外来遺伝子が存在し、発現されてアルデヒド生成物を産生するこれらの実施形態においては、第3外来遺伝子によってコードされる脂肪アルデヒド還元酵素は、アルコールへのアルデヒドの還元を触媒する。同様に、脂肪アルデヒドデカルボニラーゼは、それが存在する場合、アルカンまたはアルケンへのアルデヒドの転換を触媒する。
【０２７５】
この種の酵素をコードする遺伝子を、有意な脂質生産を呈することがすでに知られる細胞(例、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides))から得ることができる。脂質生産に役割を担うことがすでに知られている遺伝子(例、二重結合を飽和させる酵素をコードする遺伝子)をレシピエント細胞に個別に形質転換することができる。しかしながら、本発明を実施するために、どの遺伝子が必要であるかについて推測的仮定をする必要はない。互いに異なる遺伝子を含むDNAのライブラリ(例、良好な脂質生産生物由来のcDNAs)をレシピエント細胞に形質転換してもよい。前記cDNAは、微細藻類において活性のあるプロモーターと作動可能に連結することが好ましい。ライブラリを形質転換した互いに異なるレシピエント微細藻類は、前記ライブラリから様々な遺伝子を受容する。脂質生産性を改善した形質転換体は、当該技術分野で既知のスクリーニング方法(例、炭化水素の分析のためのHPLC、ガスクロマトグラフィ、マススペクトル)(この種の分析の例に関しては、Biomass and Bioenergy Vol. 6. No. 4. pp. 269-274 (1994)、Experientia 38; 47-49 (1982)、及び Phytochemistry 65 (2004) 3159-3165を参照されたい)によって同定される。これらの形質転換体を、その後さらに元のライブラリで形質転換して、及び/又は、任意ではあるが、交配して脂質生産を改善し、さらに次世代の生物を生成する。生物全体を進化させて所望の特性を獲得ための一般的手順は、米国特許第6,716,631号明細書に記載されている。このような方法は、例えば、DNAフラグメントのライブラリを複数の細胞に導入し、それにより、前記断片のうちの少なくとも1つがそのゲノム中のセグメントと組換えを起こすか、細胞のエピソームを経て改変細胞を生成することを伴う。前記改変細胞を、その後、所望の機能を獲得するように進化させた改変細胞に関してスクリーニングする。形質転換のためのベクター及び方法は、リパーゼ遺伝子の発現と関連して議論されるものに類似している。
【０２７６】
さらにまた、サブトラクティブライブラリを使用して、転写が様々な条件下(特に、バイオディーゼル生産のための、若しくは工業応用での原料源として有用な、有効な炭化水素の生産のための微生物を培養する際に用いられる条件下)で転写が誘導される遺伝子を同定することができる。サブトラクティブライブラリは、2つの異なるサンプル間の違いを反映するヌクレオチド配列を含む。このようなライブラリを、各々のサンプル由来のポリヌクレオチド(例、mRNA、cDNA、増幅された配列)群を変性且つハイブリダイズさせる工程を含む手順によって調製する。両方のサンプルに共通の配列をハイブリダイズして、除去し、サンプル間で異なる配列を残す。このように、特定の状況の下で誘導される配列を同定することができる。例えば、この技術を用いて、脂質(例、脂肪酸)生産、特に、任意の所望の培養条件下での脂質生産を増やすことに有用な遺伝子を同定することができる。また、前記サブトラクティブハイブリダイゼーション技術を用いて、本発明に係る発現コンストラクトに有用なプロモーター(例、誘導性プロモーター)を同定することもできる。
【０２７７】
従って、例えば、サブトラクティブライブラリを、独立栄養性(光の下固定炭素源のない条件)か、または従属栄養性(暗がりで固定炭素源がある条件)で増殖する微生物培養物から調製してもよい。特に、従属栄養性の遺伝子を、固定炭素源がある場合で暗所での増殖の間に誘導することができて、従って、暗所での従属栄養性の細胞由来の配列から、独立栄養性の細胞由来の配列を引くことによって生成されるライブラリに存在する場合がある。また、サブトラクティブライブラリを、特定の炭素基質(例、グルコース)が加えられた培養物から調製して、前記基質の代謝に役割を担う遺伝子を同定することができる。限界窒素に対して過剰な窒素の存在下で増殖される培養物から調製されたサブトラクティブライブラリを用いて、炭化水素蓄積生産に逆行して細胞分裂を制御する遺伝子を同定することができる。脂質(例、脂肪酸)が加えられた培養物由来のサブトラクティブライブラリの調製は、その過剰発現が脂肪酸産生を増加させる遺伝子を同定するのを補助することができる。より具体的には、添加される脂肪酸を使用することができる細胞の培養物への脂肪酸の添加は、脂肪酸合成遺伝子のダウンレギュレーションを導き、細胞酸生産をダウンレギュレーションするだろう。一又は複数のこの種の遺伝子の過剰発現は、逆の効果を有するだろう。
【０２７８】
B.脂質経路への炭素フラックスの増加
いくつかの微細藻類は、有意量の非脂質代謝物(例、多糖類)を生産する。多糖類生合成は細胞が利用できる総代謝エネルギーのかなりの割合を使用する場合があるので、脂質生産細胞の突然変異を行い、その後多糖類生産の減少若しくは排除に関してスクリーニングすることによって、より高い脂質収率を生産できる新規な株を生成する。
【０２７９】
フェノール:硫酸アッセイは炭水化物を検出する(Hellebust, Handbook of Phycological Methods, Cambridge University Press, 1978及び、Cuesta G., et al., J Microbiol Methods. 2003 Jan;52(l): 69-73を参照されたい)。1,6ジメチル・メチレンブルーアッセイは、アニオン性多糖類を検出する(例えば、Braz J Med Biol Res. 1999 May 32(5): 545-50、Clin Chem. 1986 Nov; 32(11): 2073-6を参照されたい)。
【０２８０】
多糖類を、また、方法(例、HPLC、分子ふるいクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ)により分析することもできる(例えば、Prosky L, Asp N, Schweizer TF, DeVries JW & Furda I (1988) Determination of insoluble, soluble and total dietary fiber in food and food products: Interlaboratory study. Journal of the Association of Official Analytical Chemists 71, 1017±1023、Int J Biol Macromol. 2003 Nov;33(l-3): 9- 18を参照されたい)。多糖類を、また、ゲル電気泳動を使用して検出することもできる(例えば、Anal Biochem. 2003 Oct 15; 321(2): 174-82; Anal Biochem. 2002 Jan l;300(l): 53-68を参照されたい)。
【０２８１】
VI.脂質および炭化水素を回収する方法
本発明の細胞により生産される炭化水素(例、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類およびアルカン)を、任意の簡便な手段により収穫、さもなくば収集することができる。例えば、細胞から分泌される炭化水素を遠心分離して、疎水層の炭化水素を水性層の汚染物質から分離し、任意ではあるが、遠心分離後中の沈殿物として任意の固形物質から分離することもできる。細胞または細胞画分を含む物質をプロテアーゼで処理して、遠心分離の前か後に汚染タンパク質を分解することもできる。いくつかの場合では、汚染タンパク質は、炭化水素若しくはタンパク質の除去時に炭化水素を形成する炭化水素前駆体に結合(共有結合的な場合もある)する。他の例においては、炭化水素分子は、また、タンパク質を含む調製物中にある。プロテアーゼを、タンパク質を分解するタンパク質(例、ストレプトマイセス・グリセウス由来のプロテアーゼを使用してもよい(SigmaAldrichのカタログ番号 P5147))を含む炭化水素調製物に加えてもよい。好ましくは、消化後、炭化水素を、残存タンパク質、ペプチド断片およびアミノ酸から精製する。この精製は、例えば、上記した方法(例、遠心分離および濾過)によって実現可能である。
【０２８２】
細胞外炭化水素をまた、生きた微細藻類細胞からin vivoで抽出し、その後前記細胞を、さもなくば無菌環境下で、非毒性抽出用溶媒に暴露することによりバイオリアクターに戻し、その後、生細胞と抽出溶媒及び炭化水素の疎水性画分とに分離することができる。そこでは、分離された生細胞を、その後培養容器(例、ステンレス発酵槽またはフォトバイオリアクター)に戻す(Biotechnol Bioeng. 2004 Dec 5;88(5): 593-600 及び Biotechnol Bioeng. 2004 Mar 5;85(5): 475-81を参照されたい)。
【０２８３】
炭化水素を、また、全細胞抽出によって単離してもよい。「細胞溶解」と称される章に記載されるように、細胞をまず破壊して、その後、細胞外炭化水素と同様に細胞内及び細胞膜/細胞壁結合炭化水素を、上記の遠心分離を用いて全細胞マスから回収することができる。
【０２８４】
さまざまな方法が、上記方法により生産される細胞性溶解物由来の炭化水素および脂質を分離することに利用できる。例えば、炭化水素を、疎水性溶媒(例、ヘキサン)で抽出することができる(Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11 : 717を参照されたい)。炭化水素をまた、液化装置(例えば、Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 and Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4): 269-274を参照されたい)、油液化装置(例えば、Minowa et al. 1995, Fuel 74(12): 1735-1738を参照されたい)、及び、超臨界CO2抽出装置(例えば、Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334を参照されたい)を使用して抽出してもよい。
【０２８５】
MiaoとWuは、クロレラ・プロトテオコイデス(Chlorella prototheocoides)の培養物から微細藻類脂質を回収するプロトコルを記載する。そこでは、細胞を遠心分離によって収集し、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥によって乾燥した。得られた細胞粉を乳鉢中で微粉状にし、その後n-ヘキサンで抽出した(Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846)。
【０２８６】
A.細胞溶解
微生物中で生産される細胞内脂質および炭化水素を、いくつかの実施形態においては、微生物の細胞を溶解させた後に抽出する。一度抽出されると、前記脂質および/若しくは炭化水素を、さらに精製して、油、燃料または油脂化学製品を生産することができる。
【０２８７】
培養完了後、微生物を、発酵ブロスから分離することができる。任意ではあるが、分離を遠心分離により実効化し、濃縮ペーストを生成する。遠心分離は、微生物から有意量の細胞内水を除去せず、乾燥工程ではない。バイオマスを、その後、洗浄溶液(例、DI水)で洗浄し、発酵ブロスおよび破片を取り除くことができる。任意ではあるが、洗浄微生物バイオマスを、また、細胞破壊の前に乾燥(オーブン乾燥、凍結乾燥等)することができる。あるいは、発酵完了時に、発酵ブロスの一部若しくは全部から分離せず、細胞を溶解することができる。例えば、細胞を溶解する場合、細胞外液体に対する細胞の比率が1:1(v:v)未満であってもよい。
【０２８８】
脂質および/または炭化水素を含む微生物を溶解して、溶解物を生成することができる。本明細書中において詳述されるように、微生物を溶解する工程(または細胞溶菌と称する)は、任意の簡便な手段(例、熱誘導溶解、塩基添加、酸添加、酵素(例、プロテアーゼ及び多糖類分解酵素(例、アミラーゼ))の使用、超音波使用、力学的溶解、浸透圧ショック、溶菌ウイルスへの感染、並びに/又は一又は複数の溶菌遺伝子の発現)により実現可能である。溶解を実行し、前記微生物によって生産された細胞内分子を放出させる。微生物を溶解するこれらの方法のそれぞれが、単独方法又は同時若しくは順次に組み合わされた方法として使用可能である。
【０２８９】
細胞破壊の程度を、顕微鏡分析によって観察してもよい。本明細書中に記載の一又は複数の方法を使用する場合、典型的に70%以上の細胞破損が、観察される。好ましくは、細胞破損は80%超であり、より好ましくは90%超であり、及び最も好ましくは約100%である。
【０２９０】
特定の実施形態においては、前記微生物を増殖後に溶解して、例えば、抽出若しくはさらなる処理のために細胞性脂質及び/又は炭化水素の暴露を増加させる。リパーゼの発現(例、誘導性プロモーターを介して)のタイミング若しくは細胞溶菌のタイミングを調節して、脂質及び/又は炭化水素の収率を最適化することができる。多くの溶解技術を、以下に記載する。これらの技術を、個々にまたは組み合わせて用いることができる。
【０２９１】
1. 熱誘導溶解
本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解する工程は、前記微生物を含む細胞懸濁物を加熱することを含む。この実施形態において、微生物(若しくは発酵ブロスから単離される微生物懸濁物)を含む発酵ブロスを、微生物(すなわち微生物の細胞壁および細胞膜)が分解または破壊されるまで加熱する。典型的には、適用される温度は、少なくとも50℃である。例えば、少なくとも30℃、少なくとも60℃、少なくとも70℃、少なくとも80℃、少なくとも90℃、少なくとも100℃、少なくとも110℃、少なくとも120℃で、少なくとも130℃またはそれより高いものが、より効率的な細胞溶解に使用される。
【０２９２】
熱処理によって細胞を溶解させることは、微生物を沸騰させることによって実行可能である。あるいは、熱処理(沸騰せずに)を、オートクレーブで実行してもよい。熱処理溶解物を、さらなる処理のために冷却する場合がある。
【０２９３】
細胞破壊を、また、水蒸気処理(すなわち、加圧蒸気の添加を介して)により実行することもできる。細胞破壊のための微細藻類の水蒸気処理は、例えば、米国特許第6,750,048号に記載されている。
【０２９４】
2. 塩基を使用する溶解
本発明の他の好ましい実施形態においては、微生物を溶解する工程には、微生物を含む細胞懸濁物に塩基を加えることを含む。
【０２９５】
塩基は、少なくとも使用する微生物の一部のタンパク質性化合物を加水分解するのに十分なほど強くなければならない。タンパク質を可溶化するのに有用な塩基は、化学の技術分野において既知である。本発明の方法に有用な例示的な塩基には、限定はされないが、(リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびその混合物の)水酸化物、炭酸塩および重炭酸塩を含む。好適な塩基は、KOHである。細胞破壊のための微細藻類の塩基処理は、例えば、米国特許第6,750,048号に記載されている。
【０２９６】
3. 酸性溶解
本発明の別の好ましい実施形態において、微生物を溶解する工程には、前記微生物を含む細胞懸濁物に酸を加えることを含む。酸性溶解を、10〜500mNまたは好ましくは40〜160nMの濃度で酸を使用して実効化する。酸性溶解を、上記の室温(例、40〜160°および好ましくは50〜130℃の温度)で好ましくは実行する。中温(例、室温から100℃及び好ましくは室温から65℃)の場合、酸処理を超音波処理または他の細胞破壊方法と有用に組み合わせてもよい。
【０２９７】
4. 酵素を使用する細胞溶解
本発明の別の好ましい実施形態においては、微生物を溶解する工程には、酵素を用いて微生物を溶解することを含む。微生物を溶解する好適な酵素は、プロテアーゼ及び多糖類分解酵素(例、ヘミセルラーゼ(例、黒色麹菌由来のヘミセルラーゼ、シグマアルドリッチ、St. Louis, MO; #H2125)、ペクチナーゼ(例、リゾプス(Rhizopusu)属の種由来のペクチナーゼ、シグマアルドリッチ、 St. Louis, MO; #P2401)、マンナウェイ4.0L(ノボザイム)、セルラーゼ(例、トリコデルマ・ヴィリデ(Trichoderma viride)由来のセルラーゼ、シグマアルドリッチ、St. Louis, MO; #C9422)、ドリセラーゼ(バシディオマイセテ属の種(Basidiomycetes sp.)由来のドリセラーゼ、シグマアルドリッチ、St. Louis, MO; #D9515))である。
【０２９８】
a)セルラーゼ
本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解するためのセルラーゼは、多糖類分解酵素であり、任意ではあるが、クロレラまたはクロレラウイルス由来である。
【０２９９】
b)プロテアーゼ
プロテアーゼ(例、ストレプトマイセス・グリセウスプロテアーゼ、キモトリプシン、プロテイナーゼK、(Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Yet al., Journal of Polymers and the Environment, Volume 8, Number 1, January 2000 , pp. 29-32(4)に)リストされるプロテアーゼ、その他のプロテアーゼ)を使用して、微生物を溶解することができる。使用可能な他のプロテアーゼには、アルカラーゼ(Alcalase)2.4 FG(ノボザイム)及びフラボウルザイム(Flavourzyme) 100L(ノボザイム)を含む。
【０３００】
c)組み合わせ
プロテアーゼと多糖類分解酵素との任意の組合せ(前述のプロテアーゼと多糖類分解酵素との任意の組合せも)を、使用することもできる。
【０３０１】
5. 超音波を使用する細胞溶解
本発明の別の好ましい実施形態においては、微生物を溶解する工程を、超音波(すなわち超音波処理)を用いて実行する。従って、細胞を、高周波音波によって溶解することができる。音波を、電気的に発生させ、金属先端部を介して、適切に濃縮された細胞懸濁物に運ぶことができる。この超音波処理(またはウルトラ超音波処理)により、細胞懸濁物中に空洞を創成することに基づいて、細胞の完全性を破壊する。
【０３０２】
6. 機械的溶解
本発明の別の好ましい実施形態においては、微生物を溶解する工程を、機械的溶解によって実行する。細胞を機械的に溶解し、任意ではあるが、炭化水素(例、脂質)収集を容易にするために、ホモジェナイズしてもよい。例えば、圧力破壊装置を使用して、スラリーを含む細胞を制限されたオリフィス弁を通してポンプすることができる。高圧(最高1500バー)を適用し、その後出口ノズルを通して即時に拡張する。細胞破壊を、3つの異なる機構(弁上の衝突、オリフィス中での高液体剪断、及び細胞の爆発を引き起こす、放出時の急激な圧力低下)によって実現する。
【０３０３】
あるいは、ボールミルを使用してもよい。ボールミルにおいては、細胞を、小さい研磨粒子(例、ビーズ)で懸濁して強く攪拌する。ビーズ間で研磨する剪断力及びビーズとの衝突のため細胞は壊れる。ビーズは、細胞を破壊し、細胞内容物を放出させる。細胞を破壊するための剪断力(例、混合機(例、例として高速ブレンダー若しくはワーリングブレンダー)、フレンチプレス、又は弱い細胞壁の場合は遠心分離さえも使用して)によって、細胞を破壊することもできる。
【０３０４】
7. 浸透圧ショック(細胞溶解)による細胞溶解
本発明の別の好ましい実施形態においては、微生物を溶解する工程を、浸透圧ショックを適用することによって実行する。
【０３０５】
8. 溶菌ウイルスへの感染
本発明の好ましい実施形態において、微生物を溶解する工程には、前記微生物を溶菌ウイルスに感染させることを含む。多種多様なウイルスは本発明の使用に適する微生物を溶解することが知られ、そして、特定の微生物に対する特定の溶菌ウイルスの選択および使用は当該技術分野の技術レベルの範囲にある。
【０３０６】
例えば、パラメシウム・ブルサリア(Paramecium bursaria)クロレラウイルス(PBCV-I)は、大型、正二十面体、プラーク形成する2本鎖DNAウイルスのグループ(フィコドナヴィリダエ(Phycodnaviridae)科クロロウイルス属)のプロトタイプであって、ある種の単細胞真核クロレラ様緑藻類中で複製及びそれを溶菌するウイルスである。従って、任意の感受性微細藻類は、その培養物を適切なクロレラウイルスで感染させることにより溶解可能である。クロレラの種をクロレラウイルスに感染させる方法は、公知である。例えば、Adv. Virus Res. 2006;66:293-336、 Virology, 1999 Apr 25;257(l): 15-23、Virology, 2004 Jan 5;318(l): 214-23、Nucleic Acids Symp. Ser. 2000;(44): 161-2、J Virol. 2006 Mar;80(5): 2437-44、及び Annu. Rev. Microbiol. 1999;53:447- 94を参照されたい。
【０３０７】
9. 自己消化(溶菌遺伝子の発現)
本発明の別の好ましい実施形態において、微生物を溶解する工程には、自己消化を含む。この実施形態においては、本発明に係る微生物を遺伝学的に改変して、前記微生物を溶解させる溶解タンパク質を生産する。この溶菌遺伝子を、誘導性プロモーターを用いて発現することができ、従って、細胞をまず、発酵槽中で望ましい密度に増殖し、その後、溶菌遺伝子を発現させるプロモーターを誘導して細胞を溶解することができる。一実施形態において、溶菌遺伝子は、多糖類分解酵素をコードする。
【０３０８】
ある他の実施形態において、溶菌遺伝子は、溶菌ウイルス由来の遺伝子である。従って、例えば、クロレラウイルス由来の溶菌遺伝子を、クロレラ属(例、C.プロトセコイデス(C. protothecoides))の藻類細胞において発現することができる。
【０３０９】
適切な発現方法を、リパーゼ遺伝子の発現に関して、本明細書中に記載する。溶菌遺伝子の発現は、好ましくは、誘導性プロモーター(例、刺激(例、小分子、光、熱および他の刺激の存在)により誘導される微細藻類において活性があるプロモーター)を使用して実行可能である。クロレラウイルス由来の溶菌遺伝子は、公知である。例えば、Virology 260, 308-315 (1999)、FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45- 53、Virology 263, 376-387 (1999)、及び Virology 230, 361-368 (1997)を参照されたい。
【０３１０】
B.脂質および炭化水素の抽出
本発明の微生物によって生成される脂質および炭化水素を、有機溶媒で抽出することにより回収してもよい。いくつかの場合では、好適な有機溶媒は、ヘキサンである。典型的には、前記有機溶媒を、溶解成分の前分離をせずに、溶解物へ直接加える。一実施形態においては、上記一又は複数の方法によって生成される溶解物を、脂質および/または炭化水素成分が有機溶媒を有する溶液を形成することを可能にするのに十分な期間、前記有機溶媒と接触させる。いくつかの場合では、前記溶液を、その後、さらに精製して、特定の所望の脂質または炭化水素成分を回収する。ヘキサン抽出方法は、当該技術分野で周知である。
【０３１１】
VII 脂質および炭化水素の処理方法
A.酵素修飾
本明細書中において記載された細胞によって生産される炭化水素(例、脂質、脂肪酸、アルデヒド、アルコール類およびアルカン)を、一又は複数の上記酵素(リパーゼを含む)の使用により修飾することができる。前記炭化水素が細胞の細胞外環境にある場合、酵素が前記炭化水素を修飾するか、又は炭化水素前駆体からその合成を完了する条件下で、一又は複数の酵素をその環境に加えてもよい。あるいは、一又は複数の触媒(例えば酵素)の添加前に、前記炭化水素を細胞性物質から部分的又は完全に単離してもよい。このような触媒を外因的に加えると、それらの活性は細胞の外側でまたはin vitroで生じる。
【０３１２】
B.温熱性修飾および他の触媒修飾
本明細書中において記載されるように、in vivoで細胞により生産される炭化水素、またはin vitroで酵素的に修飾される炭化水素は、任意ではあるが、さらに従来の手段によって処理可能である。前記処理には、サイズを減らすための「クラッキング」を含み、従って、炭化水素分子の水素:炭素比率を増やすことができる。触媒および熱クラッキング方法が、炭化水素およびトリグリセリド油処理において日常的に用いられる。触媒法は、触媒(例、固体酸触媒)の使用に関与する。前記触媒は、シリカ-アルミナまたはゼオライトであってもよく、それらは、炭素間結合の不均等若しくは非対称性の開裂を生じ、結果としてカルボカチオン(carbocation)および水素化物アニオンを生じる。これらの反応中間体は、その後、別の炭化水素と転移若しくは水素移動のいずれかを起こす。この反応は、従って、前記中間体を再生して、自殖性連鎖機構を生じる。炭化水素を処理して、任意にはゼロまで、その中の炭素間の二重結合または三重結合の数を減らすこともできる。また、炭化水素を処理して、その中のリングまたは環状構造を取り除くか又は除去することもできる。また、炭化水素を処理して、水素:炭素比率を増加させることもできる。これには、水素の添加(「水素付加」)及び/又は炭化水素を「クラッキング」してより小さな炭化水素にすることを含むことができる。
【０３１３】
温熱性方法は、炭化水素サイズを減らすために、高温かつ高圧力を使用することに関与する。約800℃の高温および約700kPaの圧力が、使用可能である。これらの条件は「軽(light)」(水素の豊富な炭化水素分子を指すように時々用いられる用語(光子流動と区別される))を生成し、一方、相対的に水素の枯渇した、より重い炭化水素分子を凝縮により生成もする。その方法論により、均一の若しくは対照的な開裂を提供して、アルケンを産生する。そして、任意ではあるが、それは上記の通り、酵素的に飽和される場合がある。
【０３１４】
触媒性及び温熱性方法は、炭化水素処理および石油精製のための製造工場において標準的に用いられる。従って、本明細書中において記載される細胞によって生産される炭化水素を収集および処理するか、又は従来の手段を介して精製してもよい。炭化水素を生産する微細藻類の水素化分解に関する報告については、Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982))を参照されたい。代わりの実施形態では、その画分を別の触媒(例、有機化合物、熱、及び/又は無機化合物)で処理する。バイオディーゼルへの脂質の処理の場合、エステル転移プロセスを、本明細書中における第IV章にて記載するように、使用する。
【０３１５】
本発明の方法を経て生産される炭化水素は、種々の工業的応用に有用である。例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩(LAS)(ほとんど全ての種類の洗剤および洗浄調製物において使用されるアニオン性界面活性剤)の生産は、一般的に、10〜14の炭素原子鎖を含む炭化水素を利用する。例えば、米国特許第:6,946,430号、5,506,201号、6,692,730号、6,268,517号、6,020,509号、6,140,302号、5,080,848号及び5,567,359号を参照されたい。界面活性剤(例、LAS)は、パーソナルケア組成物および洗剤(例、米国特許第5,942,479号、6,086,903号、5,833,999号、6,468,955号、及び、6,407,044号に記載されるもの)の製造に使用可能である。
【０３１６】
VIII ディーゼル車およびジェットエンジンでの使用に適した燃料を生産する方法
生物由来の炭化水素成分(例、バイオディーゼル、再生可能ディーゼルおよびジェット燃料)に使用することに関心が高まっている。なぜなら、化石燃料由来の出発物質を代替しうる再生可能な生物的出発物質が入手可能であり、その利用が望まれているからである。炭化水素成分を生体物質から生産する方法に対する緊急の必要性がある。本発明は、本明細書中に記載の方法によって生産された脂質を(バイオディーゼル、再生可能ディーゼル及びジェット燃料を生産するための生体物質として)使用して、バイオディーゼル、再生可能ディーゼルおよびジェット燃料を生産する方法を提供することによって、この必要性を満たす。
【０３１７】
従来のディーゼル燃料は、パラフィン系炭化水素が豊富な石油蒸留物である。これは、370°から780°Fという広い沸点範囲を有しており、圧縮点火エンジン(例、ディーゼルエンジン車両)での燃焼に適している。米国材料試験協会(ASTM)は、沸点範囲と、他の燃料特性(例、セタン価、曇り点、発火点、粘性、アニリン点、硫黄含有量、含水量、強熱残分、銅片腐食および残留炭素)の許容範囲とに従って、ディーゼルの等級を確立する。技術的には、バイオマスに由来するか若しくは、さもなくば適切なASTM仕様を満たす任意の炭化水素蒸留物質を、ディーゼル燃料(ASTM D975)、ジェット燃料(ASTM Dl 655)またはバイオディーゼル(ASTM D6751)として定義することができる。
【０３１８】
抽出の後、本明細書中に記載の微生物バイオマスから回収される脂質および/または炭化水素成分を、化学処理に供して、ディーゼル車およびジェットエンジンで使用のための燃料を製造することができる。
【０３１９】
A.バイオディーゼル
バイオディーゼルは、生産原料に依存して(金色から濃褐色の間で)色が変化する液体である。それは、実質的に水と混ざらず、高い沸点および低い蒸気圧を有する。バイオディーゼルは、ディーゼルエンジン車での使用のための、ディーゼルに等価なプロセス燃料を指す。バイオディーゼルは、生物分解可能であり、非毒性である。従来のディーゼル燃料を超える、バイオディーゼルのさらなる利点は、より低いエンジン摩耗性である。
【０３２０】
典型的には、バイオディーゼルは、C14〜C18アルキルエステルを含む。様々なプロセスにより、本明細書中に記載のように生産及び単離されたバイオマスまたは脂質をディーゼル燃料に転換する。バイオディーゼルを生産する好ましい方法は、本明細書中に記載の、脂質のエステル転移によるものである。バイオディーゼルとして使用するための好ましいアルキルエステルは、メチルエステル又はエチルエステルである。
【０３２１】
本明細書中に記載される方法によって生産されるバイオディーゼルは、最新のディーゼルエンジン車において、単独で又は任意の濃度で従来のディーゼル燃料と混合して使用可能である。従来のディーゼル燃料(石油ディーゼル)との混合時には、バイオディーゼルは、約0.1%から約99.9%存在してもよい。世界の多くは、任意の燃料混合物でのバイオディーゼルの量を述べるために「B」因子として知られている体系を用いる。例えば、20%のバイオディーゼルを含む燃料を、B20と表記する。純粋なバイオディーゼルを、B100と呼ぶ。
【０３２２】
バイオディーゼルは、家庭用及び商業用のボイラーの暖房用燃料としても使用可能である。既存のオイルボイラーは、ゴム部品を含む場合があり、バイオディーゼルで動作させるには改造が必要である場合がある。改造プロセスは、通常は比較的簡単である(バイオディーゼルが強溶剤であるので、ゴム部品を合成部品に交換することを含む)。その強い溶剤力のために、バイオディーゼルの燃焼によってボイラーの効率が増す。
【０３２３】
バイオディーゼルを、ディーゼル配合物中の添加物として使用し、純粋な超低硫黄ディーゼル(ULSD)燃料の潤滑性を増やすことができ、このことは、バイオディーゼルが実質的に硫黄含有量を有しないので有利である。
【０３２４】
バイオディーゼルは、石油ディーゼルより良好な溶媒であって、以前に石油ディーゼルで動いた車両の燃料ラインの残留堆積物を分解するために使用可能である。
【０３２５】
1. バイオディーゼルの生産
バイオディーゼルは、油分が豊富なバイオマスに含まれるトリグリセリドのエステル転移によって生産可能である。従って、本発明の別の観点では、バイオディーゼルの生産方法を提供する。好ましい実施形態において、バイオディーゼルの生産方法は、(a)本明細書中で開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養する工程と、(b)脂質含有微生物を溶解して溶解物を生産する工程と、(c)溶解した微生物から脂質を単離する工程と、及び(d)脂質組成物をエステル転移し、それによりバイオディーゼルを生産する工程とを含む。
【０３２６】
微生物の増殖方法、微生物を溶解して溶解物を生産する方法、有機溶媒を含む培地中で前記溶解物を処理して異種混合物を形成する方法、処理した溶解物を脂質組成物に分離する方法は、上述した通りであり、バイオディーゼルの生産方法中で使用可能でもある。
【０３２７】
脂質組成物をエステル転移に供して、バイオディーゼルとして有用な長鎖脂肪酸エステルを生産することができる。好ましいエステル転移反応は、下に概説され、塩基触媒エステル転移及び組換リパーゼを使用するエステル転移を含む。
【０３２８】
塩基触媒エステル転移プロセスにおいて、トリアシルグリセリドは、アルカリ触媒(典型的には水酸化カリウム)の存在下で、アルコール(例、メタノールまたはエタノール)と反応する。この反応は、メチルまたはエチルエステルと、副産物としてグリセリン(グリセロール)を形成する。
【０３２９】
a).一般的化学プロセス
動物および植物油は、典型的に、遊離脂肪酸と三価アルコール(グリセロール)とのエステルであるトリグリセリドでできている。エステル転移において、トリアシルグリセリド(TAG)中のグリセロールは、短鎖アルコール(例、メタノールまたはエタノール)と交換される。典型的な反応スキームは、以下の通りである。
【化１】
2010528627.tif 000002
【０３３０】
このスキームにおいて、アルコールを塩基で脱プロトン化し、より強い求核基とする。一般に、エタノールまたはメタノールを、大過剰(最高50倍)で使用する。通常は、この反応は、非常にゆっくり進行するか、全く進行しない。酸または塩基と同様に、熱を使用して、前記反応がより迅速に進行するのを補助することができる。酸または塩基はエステル転移反応によって消費されない。従って、それらは反応物質ではなく触媒である。ほとんど全てのバイオディーゼルは、塩基触媒技術を用いて生産されてきた。なぜなら、この技術には、低い温度と圧力のみが必要であり、98%超の転換収率で生産するからである(但し、出発オイルは水分及び遊離脂肪酸が低い)。
【０３３１】
b)組換リパーゼの使用
エステル転移は、塩基の代わりに酵素(例、リパーゼ)を使用して、実験的に実行されてきた。リパーゼにより触媒されるエステル転移は、例えば、室温から80℃の間の温度、低級アルコールに対するTAGのモル比が1:1より大きく、より好ましくは約3:1で、実行可能である。
【０３３２】
エステル転移での使用に適するリパーゼには、表9にリストされるものを含むが、これらに限定されるものではない。エステル転移に有用なリパーゼの他の例は、例えば米国特許第4,798,793号、4,940,845号、5,156,963号、5,342,768号、5,776,741号およびWO89/01032号に、見出される。
【０３３３】
(表9)エステル転移での使用に適するリパーゼ
黒色麹菌リパーゼABG73614、カンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)リパーゼB(novozym-435)CAA83122、カンジダ・サイリンドゥラセア(Candida cylindracea)リパーゼAAR24090、カンジタ・リポリティカ(Candida lipolytica)リパーゼ(リパーゼL、天野製薬(株))、カンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)リパーゼ(例えば、リパーゼ-OF、名糖産業)、ムカー・ミエヘイ(Mucor miehei)リパーゼ(リポ酵母IM 20)、蛍光菌リパーゼAAA25882、A-IOFGリパーゼ(Lilipase A-IOFG)Q7M4U7_1、リゾムカー・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼB34959、リゾープス・オリザエ(Rhizopus oryzae)リパーゼ(リパーゼF)AAF32408、セラチア・マルセスセンス  リパーゼ(SM Enzyme)ABI13521、テルモマイセス・ラヌギノーサ(Thermomyces lanuginosa)リパーゼCAB58509、リパーゼ P(ナガセChemteX社)およびリパーゼ QLM(名糖産業(株)、名古屋、日本)
【０３３４】
バイオディーゼルに適する脂肪酸エステルの生産のためのリパーゼを使用することへの1つの挑戦は、リパーゼの価格が強塩基プロセスによって使用される水酸化ナトリウム(NaOH)の価格よりもはるかに高いということである。この挑戦は、再利用可能な固定化リパーゼを用いることによって対処された。しかしながら、リパーゼベースのプロセスが生産コストに関して強塩基プロセスと競合することを可能にするために、固定化リパーゼの活性を、最小限のサイクル数の間に再利用された後にまで維持しなければならない。固定化リパーゼは、エステル転移において典型的に使用される低級アルコールによって被毒される。米国特許第6,398,707号(2002年6月4日発行、 Wu et al.)は、固定化リパーゼの活性を高めて、活性が低下した固定化リパーゼを再生させる方法について記載する。
【０３３５】
特定の実施形態において、組換え型リパーゼを、そのリパーゼが作用する脂質を生産する同じ微生物において発現する。適切な組換え型リパーゼには、上記の表9でリストされているか、および/または上記の表9でリストされたジェンバンクアクセション番号を有するもの、又は上記の表9でリストされたリパーゼのうちの1つと少なくとも70%のアミノ酸同一性を有し且つリパーゼ活性を呈するポリペチドを含む。さらなる実施形態において、酵素活性は、上記した配列のうちの1つと少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または少なくとも約99%の同一性を有する配列に存在する。そして、これらの全ては、ここで十分に記述したものとして、参照により本明細書中に取り込まれる。前記リパーゼと選択マーカーをコードするDNAは、好ましくは、コドンを最適化したcDNAである。微細藻類で発現のために遺伝子を再コードする方法は、米国特許第7,135,290号に記載されている。
【０３３６】
2. 標準規格
バイオディーゼルのための一般の国際規格は、EN 14214である。ASTM D6751は、米国およびカナダにおいて参照される最も一般的なバイオディーゼルの標準規格である。ドイツではDIN EN14214を使用し、英国ではBS EN14214を法令順守することを必要とする。
【０３３７】
製品がこれらの標準に合致するかどうか決定する基本的工業試験には、典型的には、ガスクロマトグラフィ、HPLCなどを含む。品質規格を満たすバイオディーゼルは、極めて非毒性であり、50mL/kgを超える毒性評価(LD50)を有する。
【０３３８】
B.再生可能ディーゼル
再生可能ディーゼルは、アルカン(例、C16:0およびC18:0)を含み、従って、バイオディーゼルとは識別可能である。高品質で再生可能ディーゼルは、ASTM D975標準に合致する。
【０３３９】
本発明の方法によって生産される脂質は、再生可能ディーゼルを生産するためための原料となりうる。このように、本発明の別の観点では、再生可能ディーゼルの生産方法を提供する。再生可能ディーゼルは、少なくとも3つのプロセス(熱水処理(水素処理)、水素化処理、間接液化)によって生産可能である。これらのプロセスは、非エステル蒸留物を産生する。これらのプロセスの間に、本明細書中において記載されているように生産及び単離されるトリアシルグリセリドを、アルカンに転換する。
【０３４０】
好ましい実施形態において、再生可能ディーゼルの生産方法は、(a)本明細書中で開示される方法を使用して脂質含有微生物を培養し、(b)微生物を溶解して溶解物を製造し、(c)溶解された微生物から脂質を単離し、及び(d)脂質を脱酸化または水素処理してアルカンを生産して、再生可能ディーゼルを生産することを含む。再生可能ディーゼルを製造するのに適した脂質を、有機溶媒(例、ヘキサン)を使用して微生物バイオマスから抽出するか、又は他の方法(例、米国特許第5,928,696号に記載されているもの)によって得ることができる。
【０３４１】
いくつかの方法においては、最初に、微生物脂質を水素処理と連動して分解し、それぞれ炭素鎖長を減らすとともに二重結合を飽和させる。次に、また、水素処理と連動してその物質を異性化する。ナフサ留分は、その後、蒸留によって除去可能である。次に、D 975標準を満たすように、ディーゼル燃料において望まれる成分を蒸発及び蒸留するように追加の蒸留を行う。一方、D975標準を満たすよう望まれるよりも重い成分を放置する。化学的に油(トリグリセリド油を包含する)を修飾する水素処理法、水素化分解法、脱酸素法および異性化法は、当該技術分野において周知である。例えば、欧州特許出願第EP1741768 (A1)号、 EP1741767 (A1)号、 EP1682466 (A1)号、 EP1640437 (A1)号、 EP1681337 (A1)号、 EP1795576 (A1)号、そして、アメリカ特許第7,238,277号、 6,630,066号、 6,596,155号、 6,977,322号、 7,041,866号、 6,217,746号、5,885,440号、6,881,873号を参照されたい。
【０３４２】
1. 水素処理
再生可能ディーゼルを生産する方法の好ましい実施形態においては、アルカンの生産のための脂質の処理を、脂質組成物の水素処理によって実行する。熱水処理においては、典型的には、バイオマスを、高い温度および圧力で水中にて反応して、油および残留固体を形成する。転換温度は、水を主に液体として維持するのに十分な圧力、100〜170の標準大気(atm)で、一般に300°Fから660°Fである。反応時間は、15〜30分のオーダーにある。反応が完了した後、有機物を水から分離する。これにより、ディーゼルに適した蒸留物を生産する。
【０３４３】
2. 水素化処理
再生可能ディーゼルは、「グリーンディーゼル」と称され、従来の水素化処理技術によって脂肪酸から生産可能である。トリグリセリド含有油は、石油と一緒に供給して水素化処理を行ってもよく、単独で供給して水素化処理を行ってもよい。製品は、ASTM D975仕様に合致するディーゼル燃料である。このように、再生可能ディーゼルを生産する方法の他の好ましい実施形態では、アルカンを生産するための脂質組成物の処理を、脂質組成物の水素化処理により実行する。
【０３４４】
再生可能ディーゼルを製造するいくつかの方法において、トリグリセリドの処理の第一工程は、二重結合を飽和させる水素化処理である。次に、水素および触媒の存在下で、高い温度で脱酸素化が行われる。いくつかの方法において、水素化および脱酸素化は、同じ反応で起こる。他の方法において、脱酸素化は、水素化の前に起こる。次に、任意ではあるが、水素および触媒の存在下で、異性化を実行する。ナフサ成分を、好ましくは、蒸留によって除去する。例えば、アメリカ特許第5,475,160号(トリグリセリドの水素化)、5,091,116号(脱酸素化、水素化およびガス除去)、6,391,815号(水素化)、そして、5,888,947号(異性化)を参照されたい。
【０３４５】
石油精製者は、水素化処理を使用して、供給物を水素で処理することによって不純物を除去する。水素化処理転換温度は、一般的に300°Fから700°Fである。圧力は、一般的に40〜100atmである。反応時間は、典型的には10〜60分のオーダーにある。
【０３４６】
ある種の反応速度を高め、ある種の生成物の選択性を向上させ、水素の消費を最適化するために、固体触媒を採用する。
【０３４７】
水素処理および水素化処理は、究極的に供給物の分子量の減少につながる。トリグリセリド含有油の場合、トリグリセリド分子を、水素化処理条件下で4つの炭化水素分子(プロパン分子および(典型的にはC8からC18の範囲である)3つのより重い炭化水素分子)に還元する。
【０３４８】
3. 間接液化
従来の超低硫黄ディーゼルは、二段階プロセスによって任意の形態のバイオマスから生産可能である。最初に、バイオマスを、合成ガス(水素および一酸化炭素が豊富な気体状混合物)に転換する。その後、前記合成ガスを、触媒的に液体に転換する。典型的には、液体の生産を、フィッシャー・トロプシュ(FT)合成を使用して達成する。この技術を、石炭、天然ガスおよび重質油に適用する。このように、再生可能ディーゼルの生産方法のさらに別の好ましい実施形態では、アルカンを生産するための脂質組成物の処理を、脂質組成物の間接液化によって実行する。
【０３４９】
C.ジェット燃料
2006年の米国でのジェット燃料の年間使用量は、約210億ガロン(約800億リットル)であった。飛行機燃料は、透明から淡黄色である。最も一般的な燃料は、国際的に標準化された仕様セットに対して生み出されたAeroplane AIとして分類される無鉛/パラフィン油ベースの燃料である。飛行機燃料は、おそらく1000以上の多数の互いに異なる炭化水素の混合物である。それらのサイズ(分子量または炭素数)の範囲は、製品の要求(例、氷点または煙点)によって制限される。ケロセン(Kerosone)タイプの飛行機燃料(ジェットAおよびジェットA-1を包含する)は、約8から16の炭素数の炭素数分布を有する。ワイドカットまたはナフサタイプの飛行機燃料(ジェットBを包含する)は、典型的には約5から15の炭素の炭素数分布を有する。
【０３５０】
両方の飛行機燃料(ジェットAおよびジェットB)は、多くの添加物を含有する場合がある。有用な添加物には、抗酸化剤、静電防止剤、腐食抑制剤および燃料系統氷結防止(FSII)剤を含むが、これに限定されるものではない。抗酸化剤は、ゴム状化を防止し、通常は、アルキル化フェノール(例、AO-30、AO-31またはAO-37)をベースとする。静電防止剤は、静電気を消して、スパークを防止する。活性成分としてジノニルナフタレンスルホン酸(DINNSA)を有するStadis 450が例として挙げられる。腐食抑制剤(例、DCI-4A)が民生用及び軍用の燃料に使われる。そして、DCI-6Aは、軍事燃料のために使われる。FSII剤は、例えばDi-EGMEを含む。
【０３５１】
解決策は、藻類燃料と既存のジェット燃料とを混ぜ合わせることである。本発明は、このような解決策を提供する。本発明の方法によって生産される脂質は、ジェット燃料を生産するための、原料として役立つ。このように、本発明の別の観点では、ジェット燃料の生産方法を提供する。本明細書では、本発明の方法によって生産される脂質からのジェット燃料を生産する2つの方法(流動接触分解(FCC)及び水素化脱酸素(HDO))を提供する。
【０３５２】
1. 流動接触分解
流動接触分解(FCC)は、オレフィン(特に重質原油留分からのプロピレン)を生産するために用いる1つの方法である。FCCを用いて植物油(例えば、カノーラ油)を処理することによって、ガソリン燃料として有用な炭化水素流を生じることが可能であるとする、文献での報告がある。
【０３５３】
本発明の方法によって生産された脂質は、オレフィンに転換可能である。そのプロセスは、生産された脂質をFCCゾーンを通じて流し、オレフィン(ジェット燃料として有用である)を含む生成物の流れを集めることに関与する。生産された脂質を分解条件下において分解(cracking)触媒と接触させて、ジェット燃料として有用なオレフィンと炭化水素を含む生成物ストリームを提供する。
【０３５４】
好ましい実施形態において、ジェット燃料を生産する方法は、(a)本明細書中で開示される方法を用いて脂質含有微生物を培養し、(b)前記脂質含有微生物を溶解させて溶解液を生産し、(c)前記溶解液から脂質を単離し、及び(d)前記脂質組成物を処理してジェット燃料を生産することを含む。
【０３５５】
ジェット燃料の生産方法の好ましい実施形態では、脂質組成物を、流動接触分解ゾーンを通じて流すことができる。これには、一実施形態において、脂質組成物を分解条件下で分解触媒に接触させてC2〜C5オレフィンを含む生成物ストリームを提供することを含んでもよい。
【０３５６】
この方法のある実施形態において、脂質組成物に存在する可能性のある任意の汚染物を除去することが望ましい。このように、流動接触分解ゾーンを通じて脂質組成物を流す前に、前記脂質組成物を、前処理する。前処理は、前記脂質組成物をイオン交換樹脂と接触させることを含んでもよい。前記イオン交換樹脂は酸性のイオン交換樹脂(例、アンバーリスト(Amberlyst)(商標)-15)であり、脂質組成物がアップフローまたはダウンフローで流されるリアクターの床として使用可能である。他の前処理には、脂質組成物を酸(例、硫酸、酢酸、硝酸、又は塩酸)と接触させることによる弱酸洗浄を含むことができる。接触は、通常は外気温及び大気圧で、希釈した酸溶液と行われる。
【０３５７】
脂質組成物(任意ではあるが、前処理されたもの)を、炭化水素性成分がオレフィンに分解されるFCCゾーンに流す。接触分解は、反応ゾーンにある脂質組成物を、微細分割された粒子状物質で構成される触媒と接触させることによって達成される。この反応は、水素化分解とは違って、接触分解であり、添加水素または水素の消費がない状態で実行される。分解反応が進行するにつれて、相当量のコークスが触媒上に沈着する。この触媒を、再生ゾーンにおいて触媒からのコークスを燃焼させることによって高温で再生する。コークス含有触媒(以下、本明細書において「コークス触媒」と称する)を、絶えず反応ゾーンから再生ゾーンへ輸送して、再生ゾーンから基本的にコークスのない再生触媒で再生及び置換する。さまざまなガス状の流れによる触媒粒子の流動は、反応ゾーンと再生ゾーンとの間で触媒の輸送を可能にする。触媒の流動化された流れ中の炭化水素を分解する方法(例、本明細書中に記載の脂質組成物物に関するもの)で、反応ゾーンと再生ゾーン戸の間で触媒を輸送し及び再生容器中のコークスを燃焼させる方法は、FCCプロセスの当業者に周知である。C2〜C5オレフィンを生産するために脂質組成物を分解することに有用な例示的なFCC応用例および触媒は、米国特許第6,538,169号、7,288,685号に記載されている。そして、それは参照によってそれらの全体を引用する。
【０３５８】
一実施形態において、本発明の脂質組成物を分解することは、前記FCCゾーンの有するライザーセクション若しくは、代わりにリフトセクションにおいて起こる。前記脂質組成物を、ノズルによって前記ライザーに導入して、前記脂質組成物の急速な気化を生じる。触媒を接触させる前に、前記脂質組成物は、通常約149℃〜約316℃(300°F〜600°F)の温度を有するだろう。前記触媒を混合容器から前記ライザーへ流し、そこで、前記触媒は約2秒以下の時間、前記脂質組成物と接触する。
【０３５９】
混合された触媒および反応された脂質組成物蒸気は、その後、放出口を通してライザーの最上部から排出されて、オレフィンを含む分解生成物蒸気ストリーム並びに(相当量のコークスで覆われ及び「コークス触媒」と一般的に称される)一まとまりの触媒粒子に分離される。脂質組成物と(所望の生成物を望まれない他の生成物へさらに転換する可能性のある)触媒の接触時間を最小化する試みにおいて、任意の配置の分離装置(例、旋回アーム装置)を用いて、生成物ストリームからコークス触媒を迅速に除去する。前記分離装置(旋回アーム分離装置)を、室のより低い部分に設置されたストリッピングゾーンを有する室のより上部に配置する。前記旋回アーム装置により分離された触媒を前記ストリッピングゾーンに滴下する。軽オレフィンを含む分解された炭化水素を含む前記分解生成物蒸気ストリームおよび若干の触媒は、サイクロンと連結する導管を経て、室を出る。前記サイクロンは、前記生成物蒸気ストリームから残留する触媒粒子を除去し、粒子濃度を極めて低レベルに減少させる。前記生成物蒸気ストリームは、その後、分離容器の上部から出る。前記サイクロンによって分離される触媒を、分離容器に戻し、その後、ストリッピングゾーンに戻す。ストリッピングゾーンは、蒸気との向流接触によって、触媒の表面から、吸着炭化水素を除去する。
【０３６０】
低い炭化水素分圧は、軽オレフィンの生産を支持するために作動する。したがって、約35〜172kPa(5〜25psia)の炭化水素分圧を有し、又は、好ましくは約69〜138kPa(10〜20psia)の炭化水素分圧を有する状態で、ライザー圧を、約172〜241kPa(25〜35psia)にセットする。希釈液が10〜55重量%の脂質組成物および好ましくは約15重量%の脂質組成物である程度まで、希釈液として蒸気を使用して、比較的低い炭化水素分圧を実現する。他の希釈液(例、乾性ガス)を用いて、等価な炭化水素分圧に至ることも可能である。
【０３６１】
ライザー放出口の分解ストリームの温度は、約510℃〜621℃(950°F〜1150°F)である。しかしながら、566℃(1050°F)より上のライザー放出口温度は、より多くの乾性ガスおよびより多くのオレフィンを作る。ところが、566℃(1050°F)以下のライザー放出口温度は、より少ないエチレンおよびプロピレンを作る。したがって、FCCプロセスを、好ましくは約566℃〜約630℃の温度で、好ましくは約138kPa〜約240kPa(20〜35psia)の圧力で、稼働することが好ましい。前記プロセスのための他の条件は、(約5〜約20、好ましくは約10〜約15に変動する可能性がある)触媒:脂質組成物の比率である。
【０３６２】
ジェット燃料を生産する方法の一実施形態においては、脂質組成物を、FCCリアクターのリフト部分に導入する。リフト部の温度は、非常に高熱で、約100〜約150の触媒:脂質組成物の比率で、約700℃(1292°F)から約760℃(1400°F)の範囲である。脂質組成物をリフト部に導入することにより、相当量のプロピレンおよびエチレンを生産することが予期される。
【０３６３】
生産されるガスおよび液化炭化水素生産物は、ガスクロマトグラフィ、HPLC、などによって分析可能である。
【０３６４】
2. 水素化脱酸素
本明細書中において記載されるように生産される脂質組成物若しくは脂質を使用するジェット燃料を生産する方法の別の実施形態において、脂質組成物若しくは脂質の構造は、水素化脱酸素(HDO)と称されるプロセスによって、壊される。
【０３６５】
HDOは水素による酸素の除去を意味する、すなわち、物質の構造をこわすと共に、酸素を除去する。オレフィン二重結合を水素化し、任意の硫黄および窒素化合物を除去する。硫黄除去は、水素化脱硫(HDS)と呼ばれている。前処理および原材料(脂質組成物または脂質)の純度は、触媒の活性期間に寄与する。
【０３６６】
通常、HDO/HDS工程では、水素を、供給原料(脂質組成物若しくは脂質)と混合し、その後、その混合物を、単相又は二相の供給原料のいずれかとして、並流して触媒床中を通過させる。HDO/MDS工程の後、生成物画分を分離し、別々の異性化リアクターに受け渡す。生物学的出発物質のための異性化リアクターは、並流リアクターとして文献(FI 100 248)に記載されている。
【０３６７】
炭化水素源(例、本明細書中の脂質組成物若しくは脂質)を水素付加することによって燃料を生産するプロセスを、水素ガスとの並流として、脂質組成物若しくは脂質を、第1の水素付加ゾーンを通過させ、その後、水素ガスを、炭化水素流出物に関する並流として、第2の水素付加ゾーンを通過させることで、前記炭化水素流出物を第2の水素付加ゾーン中で水素付加することにより、実行することもできる。C2〜C5オレフィンを生産するための脂質組成物を分解することに有用な例示的HDO応用例および触媒は、米国特許第7,232,935号に記載され、参照により完全に本明細書中に引用される。
【０３６８】
典型的には、水素化脱酸素工程で、生物学的構成成分(例、本明細書中の脂質組成物若しくは脂質)の構造は分解され、ガスとしての酸素、窒素、リン化合物および硫黄化合物並びに軽質炭化水素を除去し、そして、オレフィン結合を水素付加する。そのプロセスの第二工程(すなわち、いわゆる異性化工程)においては、異性化を、炭化水素鎖の分岐のため及び低温でのパラフィンの機能性を高めるために実行する。
【０３６９】
第一工程(すなわち、分解プロセスのHDO工程)において、水素ガス及び本明細書中に記載の(水素付加されるであろう)脂質組成物若しくは脂質を、並流又は向流として、HDO触媒床システムへ受け渡す。前記触媒床システムは、一又は複数の触媒床、好ましくは1〜3の触媒床を含む。前記HDO工程を、典型的には、並流様式で操作する。2以上の触媒床を含むHDO触媒床システムの場合、一又は複数の床を向流原理を用いて操作してもよい。
【０３７０】
HDO工程において、圧力は、20から150barの間を変化し、好ましくは50から100barの間であり、及びその温度は200および500℃の間を変化し、好ましくは300から400℃の範囲である。
【０３７１】
HDO工程において、周期表のVII族および/またはVIB族からの金属を含む既知の水素付加触媒を、用いることができる。好ましくは、水素付加触媒は、担持されたPd、Pt、Ni、NiMoまたはCoMo触媒であり、前記担持体はアルミナおよび/またはシリカである。典型的には、NiMo/Al2O3およびCoMo/Al2O3触媒を用いる。
【０３７２】
HDO工程の前に、本明細書中の脂質組成物または脂質は、任意ではあるが、緩やかな条件下で前水素付加により処理される場合があり、従って、二重結合の副反応を回避する。このような前水素付加を、前水素付加触媒の存在下で、50から400℃の温度及び1から200barの水素圧力で、好ましくは150および250℃間の温度及び10および100barの水素圧力で実行する。前記触媒は、周期表のVIII族および/またはVIB族の金属を含むことができる。好ましくは、前水素付加触媒は、担持されたPd、Pt、Ni、NiMoまたはCoMo触媒であり、前記担持体はアルミナおよび/またはシリカである。
【０３７３】
HDO工程からの(水素を含む)ガス状ストリームを、冷却し、その後、一酸化炭素、二酸化炭素、窒素、リン化合物および硫黄合成物、ガス状の軽質炭化水素並びに他の不純物をそこから除去する。圧縮後に、精製水素若しくは再利用された水素を、第1触媒床(及び/又は触媒床の間)に加え戻して、引き抜かれたガスストリームを補う。水を、凝縮された液体から除去する。前記液体を、第1触媒床または触媒床間に受け渡す。
【０３７４】
HDO工程の後、生成物を異性化工程に供する。炭化水素が異性化触媒に接触する前に、不純物をできるだけ完全に除去することが、工程にとって実質的である。異性化工程は、任意の引きはがし(ストリッピング)工程を含む。そこでは、HDOステップからの反応生成物を、水蒸気または適切なガス(例、軽質炭化水素、窒素、若しくは水素)で引きはがすことにより精製してもよい。オプションの引きはがし工程を、異性化触媒の単位ストリーム中で、向流様式で実行する。そこでは、ガスおよび液体は互いに接触するか、または向流原理を利用する別々の引きはがし装置中の中心的異性化リアクターの前に接触する。
【０３７５】
引きはがし工程後、水素ガスおよび本明細書中の水素付化脂質組成物若しくは脂質(任意ではあるが、n-パラフィン混合物)を、一又は複数の触媒床を含む異性化反応装置に受け渡す。前記異性化工程の触媒床は、並流又は向流方式のいずれかで操作することができる。
【０３７６】
向流フロー原理を異性化工程に適用することが、そのプロセスにとって重要である。異性化工程において、このことは、オプションの引きはがし工程若しくは異性化反応工程のいずれかか、又はともに向流様式で実施される。
【０３７７】
前記異性化工程およびHDO工程は、同じ圧力容器においてまたは別々の圧力容器において実行可能である。オプションの前水素付加を、HDO及び異性化工程と、別々の圧力容器においてまたは同じ圧力容器において実行する場合がある。
【０３７８】
異性化工程において、圧力は20から150barの範囲で変化し、好ましくは20から100の範囲であり、温度は200から500℃の間であり、好ましくは300から400℃の間である。
【０３７９】
異性化工程において、当該技術分野で既知の異性化触媒を用いることができる。適切な異性化触媒は、分子ふるい及び/若しくはVIII族の金属、並びに/又はキャリアを含む。好ましくは、前記異性化触媒は、(SAPO-11またはSAPO41またはZSM-22またはZSM-23またはフェリエ沸石)、並びに(Pt、PdまたはNi)及び(Al2O3またはSiO2)を含む。典型的な異性化触媒は、例えば、Pt/SAPO-11/Al2O3、Pt/ZSM-22/Al2O3、 Pt/ZSM-23/Al2O3及びPt/SAPO-ll/SiO2である。
【０３８０】
生成物として、ディーゼル燃料またはそれの構成成分として有用な成分であって、生物学的起源の高品質炭化水素成分を得る。そして、前記炭化水素成分の有する密度、セタン価および低温でのパフォーマンスは優れている。
【０３８１】
IX. 微生物改変
上記の如く、本発明のある実施形態では、微生物を遺伝的に改変して脂質生産を向上させること、前記微生物により生成される構成成分の特質若しくは割合を修飾すること、又は様々な栄養源物質上でのde novo増殖特性を改善し若しくは提供することが望ましい。クロレラ(特に、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)、クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)、クロレラ属の種(Chlorella sp.)およびクロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii))は、本明細書中において記載の遺伝子改変方法の使用のための好適な微生物である。但し、他のクロレラ種を、他の様々な微生物と同様に、使用してもよい。
【０３８２】
プロモーター、cDNAおよび3'UTRsは、ベクターの他の要素と同様に、自然源から単離される断片を使用して、クローニング技術で生成可能である(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. 3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Press及びアメリカ特許第4,683,202号を参照されたい)。あるいは、要素を、既知方法を使用して合成的に生成することができる(例えば、Gene. 1995 Oct 16;164(1): 49-53を参照されたい)。
【０３８３】
A.発現のためのコドン最適化
微生物において発現されるポリペチド(例、リパーゼ、選択マーカー)をコードするDNAは、好ましくはコドンを最適化したcDNAである。微細藻類での発現のための遺伝子の再コード方法は、アメリカ特許第7,135,290号に記載されている。例えば、ジェンバンクのコドン使用頻度データベースで、コドン最適化のためのさらなる情報を入手できる。非限定の例として、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、ドナリエラ・サリナ(Dunaliella salina)及びクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)のコドン使用頻度を、それぞれ表10、11及び12に示す。
【０３８４】
(表10)クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)のコドン使用頻度
【表１０】
2010528627.tif 000003
【０３８５】
(表11)ドナリエラ・サリナ(Dunaliella salina)の好適なコドンの選択性
【表１１】
2010528627.tif 000004
【０３８６】
(表12)クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の好適なコドン使用
【表１２】
2010528627.tif 000005
【０３８７】
B.プロモーター
多くのプロモーター(形質転換される藻類に内在性のプロモーター、同様に、形質転換される藻類に内在性ではないプロモーター(すなわち、他の藻類からのプロモーター、高等植物からのプロモーターおよび植物ウイルス若しくは藻類ウイルスからのプロモーター))は、微細藻類において活性がある。微細藻類において活性のある外因性および/または内在性プロモーター並びに微細藻類において機能性の抗生物質耐性遺伝子は、例えば(Curr Microbiol. 1997 Dec;35(6): 356-62 (Chlorella vulgaris)、Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(l): 63-73 (Chlorella ellipsoidea)、 MoI Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5): 572-9 (Phaeodactylum tricornutum)、Plant MoI Biol. 1996 Apr;31(l): l-12 (Volvox carteri)、 Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Nov 22;91 (24): 11562-6 (Volvox carteri)、 Falciatore A, Casotti R, Leblanc C, Abrescia C, Bowler C, PMID: 10383998, 1999 May;l(3): 239-251 (Laboratory of Molecular Plant Biology, Stazione Zoologica, Villa Comunale, 1-80121 Naples, Italy) (Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira weissflogii)、 Plant Physiol. 2002 May;129(l): 7-12. (Porphyridium sp.)、Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Jan 21;100(2): 438-42. (Chlamydomonas reinhardtii)、 Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Feb;87(3): 1228-32. (Chlamydomonas reinhardtii)、 Nucleic Acids Res. 1992 Jun 25;20(12): 2959-65; Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(l): 63-73 (Chlorella)、 Biochem MoI Biol Int. 1995 Aug;36(5): 1025-35 (Chlamydomonas reinhardtii); J Microbiol. 2005 Aug;43(4): 361-5 (Dunaliella)、Yi Chuan Xue Bao. 2005 Apr;32(4): 424-33 (Dunaliella)、 Mar Biotechnol (NY). 1999 May;l(3): 239-251. (Thalassiosira and Phaedactylum)、 Koksharova, Appl Microbiol Biotechnol 2002 Feb;58(2): 123-37 (various species)、 MoI Genet Genomics. 2004 Feb;271(l): 50-9 (Thermosynechococcus elongates)、 J. Bacterid. (2000), 182, 211-215、 FEMS Microbiol Lett. 2003 Apr 25;221(2): 155-9、 Plant Physiol. 1994 Jun;105(2): 635-41 、 Plant MoI Biol. 1995 Dec;29(5): 897-907 (Synechococcus PCC 7942)、 Mar Pollut Bull. 2002;45(1-12): 163-7 (Anabaena PCC 7120)、 Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Mar;81(5): 1561-5 (Anabaena (various strains))、 Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Mar 27;98(7): 4243-8 (Synechocystis)、 Wirth, MoI Gen Genet 1989 Mar;216(l): 175-7 (various species)、 MoI Microbiol, 2002 Jun;44(6): 1517-31 and Plasmid, 1993 Sep;30(2): 90-105 (Fremyella diplosiphon)、 Hall et al. (1993) Gene 124: 75-81 (Chlamydomonas reinhardtii)、 Gruber et al. (1991). Current Micro. 22: 15-20; Jarvis et al. (1991) Current Genet. 19: 317- 322 (Chlorella)に記載される。その他のプロモーターは、米国特許第6,027,900号の表1をも参照されたい。
【０３８８】
外来遺伝子を発現するために使用するプロモーターは、自然にその遺伝子に結合されるプロモーターであってもよいし、又は、異種遺伝子であってもよい。いくつかのプロモーターは、微細藻類の複数の種において活性がある。他のプロモーターは、種特異的である。好適なプロモーターには、プロモーター(例、Chlamydomonas reinhardtii由来RBCS2並びにウイルスプロモーター(例、複数種の微細藻類で活性があることが示された、カリフラワー・モザイクウイルス(CMV)及びクロレラウイルス))を含む(例えば、Plant Cell Rep. 2005 Mar;23(10-11): 727-35、 J Microbiol. 2005 Aug;43(4): 361-5、 Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(1): 63-73を参照されたい)。他の実施形態では、ボツリオコッカス(Botryococcus)リンゴ酸脱水素酵素プロモーター、配列番号:3の任意の部分を含むそのような核酸、又はクラミドモナス・レインハルヅティ(Chlamydomonas reinhardtii)RBCS2プロモーター(配列番号:4)を使用することができる。任意ではあるが、プロモーターを含むこれらの配列の、少なくとも10か、20か、30か、40か、50か、60以上のヌクレオチドを使用する。クロレラ属の種に内在性の好適なプロモーターは、配列番号:1および配列番号:2である。
【０３８９】
クロレラでの外来遺伝子の発現に有用な好適なプロモーターを、本出願の配列表(例、クロレラHUPl遺伝子のプロモーター(配列番号1)、クロレラ・エリプソイデア(Chlorella ellipsoidea)硝酸還元酵素プロモーター(配列番号2))にリストする。クロレラウイルス・プロモーターを使用してクロレラ中に遺伝子を発現することができる(例、アメリカ特許第6,395,965号の配列番号1〜7)。クロレラで活性のある他のプロモーターを、例えば、Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14;204(l): 187-94; Plant MoI Biol. 1994 Oct;26(l): 85-93; Virology. 2004 Aug 15;326(l): 150-9; and Virology. 2004 Jan 5;318(l): 214-23中に見出すことができる。
【０３９０】
C.選択マーカー
多種多様な選択マーカーのいずれかを、クロレラの形質転換に有用なトランスジーン・コンストラクトにおいて採用することができる。適切な選択マーカーの例には、硝酸還元酵素遺伝子、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(HPT)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および(フレオマイシンンに抵抗性を付与する)ble遺伝子を含む。抗生物質に対する微細藻類の感受性を決定する方法は、周知である。例えば、MoI Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5): 572-9である。
【０３９１】
より具体的には、Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362 (参照により本明細書中に完全に引用したものとする)には、NR(硝酸還元酵素)欠損クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)変異体のための選択マーカーとして、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)由来の硝酸還元酵素(NR)遺伝子の使用が記載されている。Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73 (参照により本明細書中に完全に引用したものとする)には、クロレラ・エリプソイデア(Chorella ellipsoidea)の形質転換のための選択マーカーとして、HPT遺伝子の使用が開示されている。Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 197-205 (参照により本明細書中に完全に引用したものとする)には、クロレラ属の種のための選択マーカー(DT)として、Sh bleの使用が報告されている。
【０３９２】
D.誘導性発現
本発明は、また、目的遺伝子を発現するための、誘導性プロモーターの使用を提供する。例えば、細胞を破壊して、反応混合物の水分含量を減少させ、及び/又は脂肪酸エステルへのTAGsの転換を行うのに十分なアルコールの添加の後に、必要ならば、エステル転移を向上するように条件が調節された場合、特に、リパーゼ遺伝子の発現のための誘導性プロモーターの使用は、微生物の増殖後にリパーゼの生産を許容する。
【０３９３】
本発明に有用な誘導性プロモーターには、刺激(例、外因的に提供された小分子(例、グルコース、配列番号:1中で)、温度(加熱若しくは冷却)、光、など)に応答して作動可能に連結された遺伝子の転写を媒介するものを含む。適切なプロモーターは、基本的にサイレントな遺伝子の転写を活性化することができるか、又は、低レベルで転写される遺伝子で、作動可能に連結されたものの転写を好ましくは実質的にアップレギュレートすることができる。後者の場合、リパーゼの転写のレベルは、好ましくは、それが発現される微生物の増殖と、有意に干渉しない。
【０３９４】
クロレラでのトランスジーンの発現を、プロモーター(例、クロレラ・ヘキソース輸送体遺伝子(配列番号:1)を駆動するプロモーター)により、誘導的に実施することができる。このプロモーターは、培養培地中のグルコースの存在下で、強力に活性化される。
【０３９５】
E.2以上の外来遺伝子の発現
さらに、遺伝子改変微生物(例、微細藻類)は、2以上の外来遺伝子(例、リパーゼおよび溶菌遺伝子(例、多糖類分解酵素をコードするもの))を含み並びに発現することができる。一方または両方の遺伝子を、誘導性プロモーターを使用して発現することができる。そして、それによってこれらの遺伝子の発現の相対的タイミングが制御されて、脂質収率および脂肪酸エステルへの転換を向上させることを可能にする。2以上の外来遺伝子の発現は、同一の誘導性プロモーターの制御下でもよいし、互いに異なる誘導性プロモーターの制御下でもよい。後者の条件においては、第1外来遺伝子の発現を、第1の期間(その間、第2外来遺伝子の発現は、誘導されても若しくはされなくてもよい)の間、誘導可能であり、そして、第2外来遺伝子の発現を、第2の期間(それの間、第1外来遺伝子の発現は、誘導されても若しくはされなくてもよい)の間、誘導してもよい。本明細書中では、スクロースを代謝するために脂質生産微生物を改変するベクター及び方法を提供する。そのことは、改変された細胞がサトウキビ原料を脂質へ転換することを可能にするので、有利な形質である。
【０３９６】
また、本明細書中に、2以上の外来遺伝子(例、(それらを組み合わせたことによる作用がアルコール生成物を産生する)脂肪アシルACPチオエステラーゼ及び脂肪アシルCoA/アルデヒド還元酵素)を発現する微生物(例、微細藻類、油性酵母、バクテリア若しくは真菌)の遺伝子改変株を提供する。さらに、限定はされないが、外来遺伝子の他の組み合わせ(例、脂肪アシルACPチオエステラーゼ及びアルデヒドを生成する脂肪アシルCoA還元酵素を含む)を提供する。また、本出願は、アルカンを生成するために、脂肪アシルACPチオエステラーゼ、脂肪アシルCoA還元酵素、及び脂肪アルデヒドデカルボニラーゼの組合せを提供する。一又は複数の外来遺伝子を、誘導性プロモーターを使用して発現してもよい。
【０３９７】
本発明に使用するのに適切な更なる改変例には、2以上の外来遺伝子(一つ目は固定炭素源(例、スクロース)の輸送体をコードし、二つ目はショ糖インベルターゼをコードする)を発現する微細藻類の遺伝子改変株を含む。得られた発酵可能な生物は、生物学的炭化水素生産の以前から知られた方法によって取得可能であったものよりも、低製造コストで炭化水素を生産する。上述される2つの外来遺伝子の挿入は、定方向および/またはランダムな突然変異による多糖類生合成の破壊と組み合わすことが可能であり、それにより、炭化水素生産へのかってない程大きな炭素フラックスを操る。栄養性転換、炭化水素生産を変えるような改変、及び外来酵素を用いた処理は、独立して又は組み合わされて、微生物により生産される炭化水素組成物を変更する。この変更は、生産される炭化水素の量の変化、他の炭化水素に比べて生産される一若しくは複数の炭化水素種の量の変化、及び/又は微生物中で生産される炭化水素種の型の変化であり得る。例えば、微細藻類を改変してより多くの量のTAGs及び/又はTAGsのパーセンテージを生産することができる。
【０３９８】
F.区画化された発現
本発明は、また、目的遺伝子の区画化された発現を提供する。特に、特定の実施形態において、リパーゼの発現を一又は複数の細胞区画(そこでは、エステル転移反応の開始まで、細胞性脂質の大半をリパーゼから隔離する)にターゲットすることは有利である。ターゲティングのために好ましい細胞小器官は、葉緑体、ミトコンドリアおよび小胞体である。
【０３９９】
1. 葉緑体での発現
本発明の一実施形態では、微生物中でのポリペチドの発現を、葉緑体にターゲットする。異種遺伝子を葉緑体にターゲットする方法は、公知で、本発明において採用可能である。外来遺伝子産物を葉緑体へターゲットする方法は、Shrier et al., EMBO J. (1985) 4:25 32  に記載される。また、葉緑体に核遺伝子産物を輸送するための輸送ペプチドの使用に関しては、Tomai et al. Gen. Biol. Chem. (1988) 263:15104 15109 及び米国特許第4,940,835号を参照されたい。葉緑体へのタンパク質の輸送を指揮する方法は、また、Kenauf TIBTECH (1987) 5:40 47において総評される。クロレラに内在性の葉緑体ターゲティング配列(例、葉緑体にターゲットされるタンパク質をコードする葉緑体核ゲノム中の遺伝子(例えば、ジェンバンクアクセション番号AY646197およびAF499684を参照されたい))は公知である。
【０４００】
ワーゲニンゲン(Wageningen)大学国際植物研究所は、ベクター(IMPACTVECTOR 1.4)を販売する。それは、(二重膜システムをシャトルする)菊(Chrysanthemum morifolium)スモールサブユニット・タンパク質の分泌シグナルを用いて、異種タンパク質をクロロプラスト・ストローマ(細胞質)環境に運搬する。シグナルペプチドの適切な処理を可能にするために、成熟したルビスコタンパク質の最初の11アミノ酸を前記タンパク質に融合する(Wong et al., Plant Molecular Biology 20: 81-93 (1992))。シグナルペプチドは、RbcS遺伝子からの天然イントロンを含む。
【０４０１】
別のアプローチにおいて、葉緑体ゲノムを遺伝的に改変して、異種タンパク質を発現する。外来DNAでコートされた高速度タングステン・微粒子を用いてレシピエント細胞を射撃することを利用する形質転換で、クラミドマナス・レインハルドティ(Chlamydomonas reinhardtii)(緑藻)の葉緑体の安定形質転換は、記載されている。例えば、Boynton et al., Science (1988) 240: 1534 1538、Blowers et al. Plant Cell (1989) 1 : 123 132 and Debuchy et al., EMBO J. (1989) 8: 2803 2809を参照されたい。形質転換の技術(タングステン・微粒子を使用するもの)は、Klein et al., Nature (London) (1987) 7:70 73を参照されたい。植物および微細藻類両者のための葉緑体形質転換の他の方法は、公知である。例えばアメリカ特許第5,693,507号、6,680,426号並びにPlant Physiol. 2002 May;129(l): 7-12及びPlant Biotechnol J. 2007 May;5(3): 402-12を参照されたい。
【０４０２】
米国特許第6,320,101号(2001年11月20日発行、カプラン他。それは、参照により本明細書中に引用したものとする)にて記載されるように、細胞1つあたりの葉緑体の数を約1にまで減らすために、細胞を化学的に処理してもよい。その後、少なくとも一つの異種の核酸分子を葉緑体に導入する目的で、粒子銃を介して異種の核酸を細胞に導入することができる。前記異種の核酸を、葉緑体に固有の酵素によって容易に実効化される相同組み換えを介して葉緑体のゲノムに組み込み可能なように、選択する。この目的で、前記異種の核酸には、目的遺伝子に加えて、葉緑体のゲノムに由来する少なくとも一つの核酸配列を含む。また、前記異種の核酸は、典型的には選択マーカーを含む。この技術に関する更なる詳細は、アメリカ特許第4,945,050号および5,693,507号に見出され、これらは参照により本明細書中に引用したものとする。ポリペチドは、従って、葉緑体のタンパク質発現系によって生産可能である。
【０４０３】
米国特許第7,135,620号(2006年11月14日発行、ダニエルその他。それは、参照により本明細書中に引用したものとする)は、葉緑体発現ベクターおよび関連方法について記載する。発現カセットは、コード配列及び(葉緑体中でのコード配列の適切な発現を提供するための)適切な制御配列を含むDNAコンストラクトである。典型的発現カセットには、以下の構成要素(例、(葉緑体中で目的ポリペプチドをコードするDNA配列の転写及び翻訳を提供するであろう)微生物遺伝子由来の5'非翻訳領域若しくは葉緑体遺伝子(例、psbA);目的ポリペプチドをコードするDNA配列;並びに翻訳及び転写終結領域(例、導入遺伝子のRNAを安定化することができる葉緑体遺伝子の3'逆方向反復領域))を含み、それにより外来遺伝子発現を向上させる。前記カセットは、任意ではあるが、抗生物質耐性遺伝子を含むことができる。
【０４０４】
典型的には、前記発現カセットは、適切なゲノムへの挿入のための便利な制限酵素サイトを隣接して付加することが可能である。前記発現カセットは、葉緑体DNA由来のDNA配列を隣接して付加し、葉緑体ゲノムへ前記発現カセットを(特に相同組換えで)安定的に組み込むことを促進することができる。あるいは、前記発現カセットは組み込まれないままである場合がある。その場合には、前記発現カセットは、一般的に葉緑体の複製起点を含み、それは葉緑体中での異種DNAの複製を提供することができる。
【０４０５】
前記発現カセットは、一般に葉緑体で発現ができる遺伝子由来のプロモーター領域を含む。前記プロモーター領域には、葉緑体遺伝子から取得可能なプロモーター(例、ホウレンソウまたはエンドウ由来のpsbA遺伝子、トウモロコシ由来のrbcLおよびatpBプロモーター領域、並びにRrnaプロモーター)を含む場合がある。プロモーターの例は、Hanley- Bowdoin and Chua, TIBS (1987) 12:67 70; Mullet et al, Plant Molec Biol. (1985) 4: 39 54、 Hanley-Bowdoin (1986) PhD. Dissertation, the Rockefeller University、Krebbers et al., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 4985 5002、Zurawaki et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:3251 3270、及び Zurawski et al., Proc. Nat'l Acad Sci. U.S.A. (1982) 79: 7699 7703に記載されている。他のプロモーターを同定し、目的プロモーターをプロモーターがないマーカー遺伝子の5'に配置して、例えば、psbA遺伝子由来のプロモーター(比較的強力な葉緑体プロモーター)から得られる転写に比べてのその実効性を観察することにより、プロモーターのその相対的強さを同定評価することができる。追加的な異種遺伝子発現の効率を、任意の種々の技術により向上することができる。これらには、異種遺伝子の5'側にタンデムに挿入される複数プロモーター(例、psbAダブルプロモーター)の使用、及びエンハンサー配列の付加等を含む。
【０４０６】
クロレラ葉緑体中で活性のある無数のプロモーター(例、ジェンバンクアクセション番号NC_001865(クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)葉緑体、完全ゲノム)に見出されるもの)を、クロレラ葉緑体中で外来遺伝子を発現するために使用する。
【０４０７】
異種遺伝子の誘導発現を提供することが望まれる場合、誘導性プロモーター並びに/または、転写及び/若しくは翻訳のレベルを調節するために提供される配列を(その3'末端に)含む5'非翻訳領域を、発現カセットに含むことができる。例えば、前記5'非翻訳領域は、発現が光によって調節可能な遺伝子由来である場合がある。同様に、3'逆方向反復領域は、異種遺伝子のRNAを安定させるために用いることもできるだろう。誘導性の遺伝子は、特定の目的刺激に応答して発現が増強され、及び前記刺激の不存在下に発現が低いか存在しないことによって同定可能である。例えば、発現増強が光照射の間起こり、その一方で、光がないか少ないと発現を大幅に減少するか、全く発現が起こらない場合に、光誘導性の遺伝子を同定することができる。微小緑藻類由来の光制御プロモーターは公知である(例えば、MoI Genet Genomics. 2005 Dec;274(6): 625-36を参照されたい)。
【０４０８】
終結領域が葉緑体とバクテリア間で相対的に交換可能のように見えるから、使用される終結領域は主に便利なものであるだろう。前記終結領域は、その転写開始領域に自然にあるものでもよいし、目的DNA配列に自然にあるものでもよいし、または、他の供給源から取得可能なものであってもよい。例えば、Chen and Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411を参照されたい。
【０４０９】
発現カセットを、多くの方法のいずれかによって、目的植物細胞に形質転換することができる。これらの方法には、例えば、(葉緑体にDNAを導入することができる)遺伝子銃の方法(Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302 、米国特許第4,945,050号)、 エレクトロポレーション (Fromm et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824 5828)、レーザー光線の使用、マイクロインジェクション、または任意の他の方法を含む。
【０４１０】
微生物(例、微細藻類)中での使用に適した葉緑体発現ベクターの他の記載は、米国特許第7,081,567号(2006年7月25日に発行、Xueその他)、第6,680,426号(2004年1月20日発行、ダニエルその他)及び第5,693,507号(1997年12月2日発行、ダニエルその他)に見出される。
【０４１１】
クロレラの核ゲノムにおいて発現されるタンパク質を、葉緑体ターゲティングシグナルを使用して、葉緑体にターゲットすることができる。クロレラに内在性の葉緑体ターゲティングシグナル(葉緑体へターゲットされるタンパク質をコードするクロレラ核ゲノム中の遺伝子(例えば、ジェンバンクアクセション番号AY646197およびAF499684を参照されたい))は公知である。タンパク質は、また、葉緑体ゲノムに直接遺伝子を挿入することによって、クロレラ葉緑体で発現可能である。葉緑体形質転換は、通常、相同組み換えで起こる。そして、葉緑体ゲノム配列(例えば、クロレラ葉緑体の完全ゲノム配列、ジェンバンクアクセション番号NC_001865を参照されたい)がターゲティングベクターの作製のために既知であれば、葉緑体形質転換を実行することができる。葉緑体の形質転換の詳細については、本明細書中の前のセクションを参照されたい。
【０４１２】
2. ミトコンドリア中での発現
本発明の別の実施形態において、微生物中でのポリペチドの発現を、ミトコンドリアにターゲットする。ミトコンドリアへ異種遺伝子産物をターゲットする方法(Boutry et al. Nature (London) (1987) 328:340 342)は記載されており、微小緑藻類中でのものを含む(例えばMoI Gen Genet. 1993 Jan;236(2-3): 235-44を参照されたい)。
【０４１３】
例えば、適切な分泌シグナルをコードする発現ベクターは、ミトコンドリアに異種タンパク質をターゲットすることができる。ワーゲニンゲン大学国際植物研究所のIMP ACTVECTOR 1.5ベクターは、酵母CoxIV分泌シグナルに使用し、ミトコンドリアマトリックスにタンパク質を運搬することが示された。シグナルペプチド(Kohler et al. Plant J I l : 613-621 (1997))の適切な処理を可能にするために、酵母CoxIVタンパク質の最初の4アミノ酸に前記タンパク質を融合する。他のミトコンドリア・ターゲティング配列(微小緑藻類において機能的なものを含む)は公知である。例えば、FEBS Lett. 1990 Jan 29;260(2): 165-8及び J Biol Chem. 2002 Feb 22;277(8): 6051-8.を参照されたい。
【０４１４】
クロレラの核ゲノムにおいて発現するタンパク質を、ミトコンドリア・ターゲティングシグナルを使用して、ミトコンドリアにターゲットすることができる。ミトコンドリア・タンパク質ターゲティングおよび形質転換の詳細については、本明細書中の前のセクションを参照されたい。
【０４１５】
3. 小胞体中での発現
本発明の別の実施形態において、微生物中でのポリペチドの発現を、小胞体にターゲットする。発現ベクター内に適切な保持シグナルまたはソーティングシグナルを含めることが、タンパク質が小胞体(ER)において保持されて、ゴルジへと下流に行かないことを保証する。例えば、ワーゲニンゲン大学国際植物研究所のIMPACTVECTOR1.3ベクターは、周知のKDEL保持シグナルまたはソーティングシグナルを含む。このベクターを用いて、ER保持により発現レベルを5倍以上改善したと報告された点で実用的利点を有する。これの主な理由は、発現されるタンパク質の翻訳後分解の原因である低い濃度および/または様々なプロテアーゼを、細胞質に存在するよりも、ERが含むことであるように見える。微小緑藻類において機能的なER保持シグナルは、公知である。例えば、Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr 26;102(17): 6225-30を参照されたい。
【０４１６】
G.形質転換
細胞は、任意の適した技術(例、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ガラスビーズ形質転換、及び炭化ケイ素ウィスカー形質転換を含む)で形質転換可能である。本明細書中の実施例を参照されたい。
【０４１７】
トランスジーンをクロレラに導入する任意の便利な技術を、本発明において使用することができる。Dawson et al. (1997) (上記)は、硝酸還元酵素(NR)欠損クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana)変異体にクロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)由来の硝酸還元酵素(NR)遺伝子を導入し、安定形質転換体を生ずるための微粒子銃の使用を記載した。簡潔には、0.4ミクロン・タングステン・ビーズをプラスミドでコートした。 3 X 107のクロレラ・ソロキニアナ(C. sorokiniana)細胞を、非選択的寒天培地の中心3分の1に広げて、PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery(登録商標)システム(バイオラド)で射撃する。
【０４１８】
トランスジーンをクロレラに導入する好適な方法は、Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol.4:63-73.に記載されている方法である。Kimは、CaCl2およびポリエチレングリコール(PEG)を使用する形質転換で、クロレラ・エリプソイデア(Chorella ellipsoidea)プロトプラストの形質転換を報告する。特に、プロトプラストを、1〜2 X 108/Mlの密度に、クロレラ・エリプソイデア(C. ellipsoidea)細胞を増殖することによって調製した。細胞を、回収して、1600gで5分間遠心分離して洗浄し、(0.6Mのソルビトール、0.6Mのマンニトール、4%(重量/容量)のセルロース(Calbiochem)、2%(重量/容量)のマセラーゼ(Calbiochem)および50ユニットのペクチナーゼ(シグマ)を含む)5Mlのリン酸緩衝液(Ph 6.0)の中に再懸濁した。細胞懸濁液を、暗所で穏やかに振とうして16時間、25℃でインキュベートした。得られたプロトプラストを、5分間、400gで、遠心分離によって回収した。ペレットを、0.6Mのソルビトールおよび0.6Mのマンニトールを含むf/2培地の5Mlの中に穏やかに再懸濁して、5分間、400gで遠心分離した。このペレットを、50mMCaCl2を含む0.6Mのソルビトール/マンニトール溶液の1Ml中に再懸濁した。その後、0.4Mlの107〜108のプロトプラストに、25μgのウシ胸腺DNA(シグマ)と共に、5mgのトランスジーンDNAを加えた。室温で15分後に、200μLのPNC(40%のポリエチレングリコール4000、0.8MのNaCl、50Mm CaCl2)を加えて、室温で30分間穏やかに混合した。この後に、(0.6Mのソルビトール/マンニトール溶液、1%のイースト・エキストラクトおよび1%のグルコースを補充した)0.6Mlのf/2培地を加え、そして、形質転換細胞を細胞壁再生のために、暗所で12時間25°Cでインキュベートした。同様の方法が、Huang et al. (2007)(上記) によって使用され、クロレラ属の種(Chlorella sp.)DTに第二水銀還元酵素をコードするトランスジーンを導入した。
【０４１９】
エレクトロコーポレーションは、また、クロレラを形質転換するために用いられてきた。丸山らによって報告((2004)Biotechnology Techniques 8:821-826(参照により本明細書中に完全に引用したものとする))されるように、この技術を使用して、定常期の細胞から調製されたクロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)c-211-1aのプロトプラストへトランスジーンを導入した。導入プラスミドの一過的発現が、600および900V/cmの場の強度および約400msのパルス持続時間で観察され、そこでは、70-kDaのFITC-デキストランへの高い膜透過性が確認された。
【０４２０】
クロレラ中でのトランスジーンの発現の例を、文献(例えば、実施形態として、Current Microbiology Vol. 35 (1997), pp. 356-362、Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2000 Jul;16(4): 443-6、Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341、Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72:197-205、Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002、Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002、Current Genetics 39:5, 365-370 (2001)、Plant Cell Reports 18:9, 778-780, (1999)、Biologia Plantarium 42(2): 209-216, (1999)、Plant Pathol. J 21(1): 13-20, (2005)を参照されたい)に見出すことができる。また、本明細書中の実施例を参照されたい。
【０４２１】
油性酵母(例、ヤロウィア・リポリティリカ(Yarrowia lipolytica))中でのトランスジーンの発現の例を、文献(例えば、Bordes et al., J Microbiol Methods, Jun 27 (2007)を参照されたい)に見出すことができる。真菌類(例、モルチエレラ・アルパイン(Mortierella alpine)、ムカー・シルシネロイデス(Mucor circinelloides)およびアスペルギルス・オクラセウス(Aspergillus ochraceus))中でのトランスジーンの発現の例を、また、文献(例、Microbiology, Jul; 153(Pt. 7): 2013-25 (2007)、Mol Genet Genomics, Jun; 271(5): 595-602 (2004)、Curr Genet, Mar;21(3): 215-23 (1992)、Current Microbiology, 30(2): 83-86 (1995)、Sakuradani, NISR Research Grant, "Studies of Metabolic Engineering of Useful Lipid-producing Microorganisms" (2004)、及び国際特許出願 PCT/JP2004/012021を参照されたい)に見出すことができる。バクテリア(例、大腸菌)中での外来遺伝子の発現の例は、周知である。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al. 3d edition, 2001, Cold Spring Harbor Pressを参照されたい。
【０４２２】
本発明に係る微生物の形質転換のためのベクターは、当業者に馴染みのある公知技術によって調製可能である。複数のクロレラ種の形質転換のために使用するコンストラクトのヌクレオチド配列は、配列番号:25に対応する。一実施形態において、微生物(例、微細藻類)中でのリパーゼ遺伝子発現のための例示的ベクター設計は、微細藻類で活性のあるプロモーターに作動可能に連結されたリパーゼをコードする遺伝子を含む。あるいは、もし、前記ベクターが目的遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含まない場合、ベクター組み込み時に内在性プロモーターが作動可能に連結されるようになるように、前記遺伝子を細胞へ形質転換することができる。プロモーターのない形質転換方法が、微細藻類中で働くことが証明されてきた(例、Plant Journal 14:4, (1998), pp.441-447を参照されたい)。ベクターは、また、例えば、抗生物質若しくは除草剤に耐性を付与するタンパク質(すなわち選択マーカー)をコードする第2の遺伝子を含むことができる。任意ではあるが、一方または両方の遺伝子は、その後ろに、ポリアデニル化シグナルを含む3'末端非翻訳配列が続く。前記2つの遺伝子をコードする発現カセットを、一つのベクターにまたは別々のベクターに物理的に連結することができる。微細藻類の同時形質転換がまた、使用可能である。そこでは、異なったベクター分子を同時に使用して、細胞を形質転換する(例えば、Protist 2004 Dec; 155(4): 381-93を参照されたい)。耐性カセットを欠く細胞が増殖しない条件下で、抗生物質または他の選択マーカーの存在下で増殖する能力に基づいて、形質転換細胞を任意に選択することができる。
【０４２３】
本明細書中に引用される全ての参考文献(例、特許、特許出願および刊行物)は、前に具体的に引用したか否かに関わらず、参照によりその全体を本明細書中に引用する。本明細書中において言及される刊行物を、本発明と関連して使用する可能性のある試薬、方法論および概念を記載し且つ開示する目的のために引用する。これらの参考文献が、本明細書中に記載の発明に関連する先行技術であることの是認として、本明細書中の何れのものも解釈されない。
【０４２４】
本発明がその具体的実施形態と関連して記載されていたにもかかわらず、本発明は更なる改変ができると理解される。本出願は、(一般的に、発明の原理に従い、本発明が属する技術分野内で既知若しくは慣例に入る、並びにこれ以前に記載される必須の特徴へ適用される可能性のある本開示からのズレのようなものを含む)任意のバリエーション、用途、または適応を包含することを意図する。
【実施例】
【０４２５】
X.実施例
以下の実施例を、特許請求された本発明を説明するために提供するが、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０４２６】
テキサス大学培養コレクションからのクロレラ株を、グリセロール及びグルコース上の増殖に関して試験した。以下のクロレラ種および株(クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)(263、397、398、2228株);クロレラ・ソロキニアナ(Chlorella sorokiniana(1663、1665、1669、1671、1810株);クロレラ・サッカロフィア(Chlorella saccharophila)(2911、2469株);クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(31、249、250、株264))を培養した。各々の株を、固形培地から25mlの液体基本培地(2g/Lイースト・エキストラクト、2.94mMのNaNO3、0.17mMのCaCl2・2H2O、0.3mMのMgSO4・7H2O、0.4mMのK2HPO4、1.28mMのKH2PO4、0.43mMのNaCl)に植菌し、75μEm-2s-1の光強度の下で、72時間27℃で、振とう培養する。これらの培養物を、2mlの次の培地((a)基本培地のみ;(b)基本培地に0.1%のグルコースを加えたもの;(c)基本培地に0.5%の試薬級グリセロール(EM Scienceのカタログ#GX0185-6)を加えたもの)を含む24穴プレートに、1x105の細胞/mlの最終的な密度に各々の株を、植菌するために用いた。プレートを、暗所に置き、27℃、74時間、振とう培養した。3通りの条件で増殖されたそれぞれの株のサンプルを、蒸留水で1.9:1に希釈し、600nmでの吸光度をMolecular Devices SpectraMax 340PCの600nmで計測した。全ての株は、基本培地のみと比較してグルコース及びグリセロールの存在下で、増殖を示した。
【実施例２】
【０４２７】
株及び培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(株250)、#2(株264)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#1(株398)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地で維持した。改変プロテオース培地は、1リットル当たり(0.25gのNaNO3、0.09gのK2HPO4、0.025g 0.175gのKH2PO4、0.025gのCaCl22H2O、0.075gのMgSO47H2Oおよび2gのイースト・エキストラクト)から構成される(g/L)。バイオディーゼル生産由来のグリセロール廃棄物(酸性グリセロール(AG)及び非酸性グリセロール(NAG))を、Imperial Western Products (セルマ、CA、米国)から取得した。「純粋」または「試薬級」グリセロールを、EM Science(メルクKGAの一部門)カタログ#GX0185-6から取得した。
【０４２８】
実験設計および増殖測定:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+1%の純粋グリセロール
2. プロテオース+1%の酸性グリセロール
3. プロテオース+1%の非酸性グリセロール
4. プロテオース+1%の純粋グリセロール+ 1 %グルコース(72時間の後に加えられた)
5. プロテオース+1%の酸性グリセロール+ 1 %グルコース(72時間後に加えられた)
6. プロテオース+1%の非酸性グリセロール+ 1 %グルコース(72時間後に加えられた)
【０４２９】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で、互いに異なる培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。72時間の初期増殖の後、1%(w/v)グルコースを、サンプル#4、5および6に加え、さらに24時間培養した。乾燥細胞重量を測定するために、1mlの各々の培地を、エッペンドルフ5415C遠心管で5分間5,000rpmで、遠心分離によってペレット化した。上清を除去後、細胞ペレットを、-80℃で凍結し、研究室スケール凍結乾燥器(Labconco、MO、米国)において凍結乾燥した。結果を、図1に示す。
【実施例３】
【０４３０】
株および培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(株250)、#3(株249)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(株397)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地(実施例2を参照されたい)で維持した。
【０４３１】
実験設計および増殖測定:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+1%純粋グリセロール+1%グルコース
2. プロテオース+1%の酸性グリセロール+1%グルコース
3. プロテオース+1%の非酸性グリセロール+1%グルコース
【０４３２】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で、互いに異なる培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。96時間後、細胞増殖を、乾燥細胞重量(実施例2を参照されたい)に関し測定した。結果を、図2に示す。
【実施例４】
【０４３３】
株及び培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#3(株249)、#4(株31)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(株397)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地(実施例2を参照されたい)で維持した。
【０４３４】
実験計画及び脂質アッセイ:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+1%純粋グリセロール+1%グルコース
2. プロテオース+1%の酸性グリセロール+1%グルコース
3. プロテオース+1%の非酸性グリセロール+1%グルコース
【０４３５】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で、互いに異なるグリセロール(純粋、酸性、非酸性)を含む培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。96時間後、脂質含有量を測定した。細胞の脂質含有量の量を測定するために、100μlの培養物を回収し、同一量の培地で一度洗浄した。各々のチューブに、5μlの洗浄細胞および18Mの硫酸200μlを加えた。前記チューブを、30分間、水浴中90℃でインキュベートし、そして、1mlのリン酸バニリン試薬をそのチューブに加え、15分間37℃でインキュベートした。リン酸バニリン試薬を調製するために、0.12gのバニリンを20mlの水に加え、そして、体積を85%リン酸で100mlに調節した。530nmでの光学濃度を、サンプルとして5μlの水を有する参照用チューブに対して、ガラス・キュベット中で計測した。結果を、図3に示す。
【実施例５】
【０４３６】
株及び培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#2(株264)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#1(株398)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地(実施例2を参照されたい)で維持した。
【０４３７】
実験設計および脂質アッセイ:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+1%の純粋グリセロール
2. プロテオース+1%の非酸性グリセロール
3. プロテオース+1%純粋グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
4. プロテオース+1%の非酸性グリセロール+ 1 %グルコース(72時間後に加えられた)
【０４３８】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で異なるグリセロール(純粋または非酸性)を含む培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。72時間の初期増殖後、1%のグルコースをサンプル#3および#4に加え、さらに24時間培養した。脂質含有量を、全てのサンプル(実施例4参照)で測定した。600nmでの光学濃度もまた、測定して非特異的吸光度をチェックし、脂質量を算出するために、O.D.530nmから減算した。参照カーブは、1から10μgの範囲の(クロロホルムに溶解された)トリオレインから成る。結果を、図4に示す。
【実施例６】
【０４３９】
株及び培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#3(株249)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(株397)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地(実施例2を参照されたい)で維持した。
【０４４０】
実験設計および脂質アッセイ:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+1%純粋グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
2. プロテオース+1%の酸性グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
3. プロテオース+1%の非酸性グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
【０４４１】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で異なるグリセロール(純粋、酸性、非酸性)を含む培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。72時間の初期増殖後、1%のグルコースを、加えて、さらに24時間培養した。乾燥細胞重量および脂質含有量を、全てのサンプル(実施例2および5を参照されたい)で測定した。脂質パーセンテージ(%)を、総脂質量を乾燥細胞重量で割り算して算出した。結果を、図5に示す。
【実施例７】
【０４４２】
株及び培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#2(株264)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#1(株398)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地(実施例2参照)で維持した。
【０４４３】
実験設計および脂質アッセイ:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+1%純粋グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
2. プロテオース+1%の非酸性グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
【０４４４】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で1%の純粋グリセロール又は1%の非酸性グリセロールを含む培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。72時間の初期増殖後、1%のグルコースを加えて、さらに24時間培養した。乾燥細胞重量および脂質含有量を、全てのサンプル(実施例1及び4を参照されたい)で測定した。脂質パーセンテージ(%)を、総脂質量を乾燥細胞重量で割り算して算出した。結果を、図6に示す。
【実施例８】
【０４４５】
株及び培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(株250)、#4(株31)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(株397)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地(実施例2を参照されたい)で維持した。
【０４４６】
実験設計および脂質アッセイ:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+2%グルコース
2. プロテオース+1%グリセロール+1%グルコース
【０４４７】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で、互いに異なる培地に植菌した。培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。96時間の初期増殖後、脂質含有量を、測定した(実施例5を参照されたい)。結果を、図7に示す。
【実施例９】
【０４４８】
株及び培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#3(株249)、#4(株31)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#1(株398)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地(実施例2を参照されたい)で維持した。
【０４４９】
実験設計および脂質アッセイ:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+2%グルコース
2. プロテオース+ 1%グリセロール+1%グルコース
3. プロテオース+ 1%グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
【０４５０】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で、互いに異なる培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。72時間の初期増殖後、1%(w/v)のグルコースを、#3培地に加えて、さらに24時間培養した。乾燥細胞重量および脂質含有量を、全てのサンプル(実施例2および5を参照する)で測定した。脂質パーセンテージ(%)を、総脂質量を乾燥細胞重量で割り算して算出した。結果を、図8に示す。
【実施例１０】
【０４５１】
株および培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(株250)、#3(株249)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(株397)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地(実施例2を参照されたい)で維持した。
【０４５２】
実験設計および脂質アッセイ:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+1%純粋グリセロール+1%グルコース
2. プロテオース+1%純粋グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
3. プロテオース+1%の酸性グリセロール+1%グルコース
4. プロテオース+1%の酸性グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
5. プロテオース+1%の非酸性グリセロール+1%グルコース
6. プロテオース+1%の非酸性グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
【０４５３】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で、互いに異なる培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。
72時間の初期増殖後、1%(w/v)のグルコースを、#2、#4および#6培地に加えて、さらに24時間培養した。脂質含有量を、全てのサンプル(実施例4を参照されたい)で測定した。結果を、図9に示す。
【実施例１１】
【０４５４】
株及び培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#1(株250)、#3(株249)、#4(株31)およびクロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)#2(株397)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地(実施例2を参照されたい)で維持した。
【０４５５】
実験設計および脂質アッセイ:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース+ 1%純粋グリセロール+1%グルコース
2. プロテオース+ 1%純粋グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
3. プロテオース+1%酸性グリセロール+1%グルコース
4. プロテオース+1%酸性グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
5. 1%プロテオース+ 1%の非酸性グリセロール+1%グルコース
6. 1%プロテオース+ 1%の非酸性グリセロール+1%グルコース(72時間後に加えられた)
【０４５６】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で、互いに異なる培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。72時間の初期増殖後、1%(w/v)のグルコースを、#2、#4および#6培地に加えて、さらに24時間培養した。乾燥細胞重量を、全てのサンプル(実施例2を参照されたい)で測定した。結果を、図10に示す。
【実施例１２】
【０４５７】
ベクター構築
CMVプロモーター、ハイグロマイシン耐性cDNAおよびCMV 3'UTR(配列番号:5、pCAMBIA138Oベクターの部分配列、Cambia、キャンベラ、オーストラリア)を含むBamHI-SacII断片を、pBluescriptのBamHIおよびSacIIサイトにクローニングした。本明細書において、それをpHygと称する。
【０４５８】
遺伝子銃によるクロレラの形質転換
Seashell Technology製の S550d金キャリアを、メーカーのプロトコルに従って調製した。直線化pHygプラスミド(20μg)を、50μlの結合用緩衝液および60μl(30mg)のS550d金キャリアと混ぜ合わせ、1分間の氷中でインキュベートした。沈殿用緩衝液(100μl)を加え、そして、混合物をさらに1分間、氷中でインキュベートした。ボルテックス後、DNAコート粒子を、エッペンドルフ5415C微量遠心機で、10秒間、10,000rpmで回転し、ペレット化した。その金ペレットを、500μlの冷却100%のエタノールで一度洗浄し、微量遠心管中で軽くスピンしてペレット化し、50μlの氷冷エタノールに再懸濁した。短時間(1〜2秒)超音波処理後、10μlのDNAコート粒子を、担体膜に直ちにトランスファー(転写)した。
【０４５９】
2×106細胞/mlの菌体密度に到達するまで、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)培養物(テキサス大学培養コレクション250)を、75μmol光子m-2 sec-1の連続照明の下、旋回シェーカー(gyratory shaker)上で、プロテオース培地(2g/lイースト・エキストラクト、2.94mMのNaNO3、0.17mMのCaCl2・2H2O、0.3mMのMgSO4・7H2O、0.4mMのK2HPO4、1.28mMのKH2PO4、0.43mMのNaCl)にて増殖した。細胞を、回収し、滅菌蒸留水で一度洗浄し、50μlの培地の中に再懸濁した。1×107細胞を、非選択プロテオース培地プレートの中心3分の1に撒いた。細胞を、PDS-1000/He Biolistic Particle Deliveryシステム(バイオラド)で射撃した。破裂板(1100および1350psi)を用い、そして、プレートをスクリーン/マクロ・キャリヤ組立体の下9cmおよび12cmに配置した。細胞を、12〜24時間、25℃で回復させた。回復を待って、細胞を、ゴムへらでプレートからこすり落とし、100μlの培地と混合し、ハイグロマイシン含有プレート(200μg/ml)に撒いた。25℃で7〜10日間インキュベート後に、形質転換細胞を代表するコロニーは、1100および1350psi破裂板から、並びに、9および12cmの距離からプレート上に目視可能であった。コロニーをピックし、2度目の選択のために選択的な寒天培地上にスポットした。
【０４６０】
エレクトロポレーションによるクロレラの形質転換
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)培養物を、75μmol光子m-2 sec-1の連続照明の下で2x106 細胞/mlの菌体密度に至るまで、旋回シェーカー上でプロテオース培地中に培養した。細胞を回収し、滅菌蒸留水で一度洗浄し、そして、4x108細胞/mlの菌体密度で、50mMのスクロースを含むトリス-リン酸緩衝液(20mM Tris-HCl(pH 7.0; 1mMのリン酸カリウム)に再懸濁した。約250μlの細胞懸濁液(1x108cells)を、4mmの間隙の使い捨てエレクトロポレーション・キュベットに配置した。細胞懸濁液に、5μgの直線化pHygプラスミドDNAおよび200μgのキャリアDNA(剪断されたサーモン・スパームDNA)を加えた。前記エレクトロポレーション・キュベットを、その後、10分間16℃で、水浴中にインキュベートした。その後、Gene Pulser II(バイオラドLabs、ヘラクレス、CA)エレクトロポレーション装置を使用し、電気的パルス(1100V/cm)を、25μFの静電容量(分流抵抗器を、エレクトロポレーションのために用いなかった)で、前記キュベットに適用した。そのキュベットを、その後、5分間、室温でインキュベートし、次に、その細胞懸濁液を50mlのプロテオース培地に移し、2日間旋回シェーカーで振とうした。回復後、その細胞を、低速の遠心分離によって回収し、プロテオース培地に再懸濁し、さらに、200μg/mlハイグロマイシンを添加したプレート上に、低密度で撒いた。プレートを、75μmol光子m-2 sec-1の連続照明の下でインキュベートした。形質転換体が、1〜2週間で、コロニーとして出現した。コロニーをピックし、2度目の選択のため、選択的な寒天プレートにスポットした。
【０４６１】
遺伝子型同定(ジェノタイピング)
2度目の選択で生き残ったコロニーのサブセットを、小体積で培養し、回収した。約5〜10uL体積のペレットを、ボルテックスして50uLの1OmM NaEDTA中に再懸濁し、その後、10の間100℃でインキュベートした。チューブを、その後短時間ボルテックスし、10秒間超音波処理し、そして1分間、12,000 x gで遠心分離した。テンプレートとして2uLの上清を、50uL PCR反応において使用した。遺伝子型同定(ジェノタイピング)のために使用するプライマーは、配列番号:6および配列番号:7であった。
PCR条件は、以下の通りだった。
95℃ 5分x 1サイクル、
95℃ 30秒−58℃30秒−72℃ 1分30秒x 35サイクル、
72℃ 10分x 1サイクル。
予想される992bp断片が、遺伝子銃の方法での10個のコロニーのうちの6つで及びエレクトロポレーションのシングルコロニーから、見つかった。より低いサイズの非特異的バンドが、全てのレーンに存在した。結果を、図16に示す。増幅された992bp断片の同一性の確認のために、2つの遺伝子銃からのバンドおよびエレクトロポレーションからのバンドをゲルから切り出し、個々にシークエンスした。全3つのバンドの配列は、予想された992bp断片に対応していた。(DNAラダー(ladder): Bionexus(登録商標)、All Purpose Hi-Lo(登録商標)DNAラダー、カタログ # BN2050)。
【実施例１３】
【０４６２】
株及び培地:(a)スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)(UTEX 2340)および(b)ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)(UTEX 667)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。スピルリナ(Spirulina)の保存培養株を、スピルリナ(Spirulina)培地で維持し、そして、ナビクラ(Navicula)を土壌抽出物培地(SEM)で維持した。スピルリナ(Spirulina)培地は、162mMのNaHCO3、38mMのNa2CO3、1.9mMのK2HPO4、29mMのNaNO3、5.75mMのK2SO4、17.1mMのNaCl、0.8mMのMgSO47H2O、0.25mMのCaCl22H2O、2mMのNa2EDTA、0.36mMのFeCl3-OH2O、0.21mMのMnCl2-4H2O、0.037mMのZnCl2、0.0085mMのCoCl2-OH2O、0.017mMのNaMoO4-2H2O、0.78μM CuSO4-5H2O、0.15μM ZnSO4-7H2O、10μM H3BO3および0.001mMのビタミンB12から構成された。土壌抽出物培地は、2.94mMのNaNO3、0.17のmMCaCl2-2H2O、0.3mMのMgSO47H2O、0.43mMのK2HPO4、1.29mMのKH2PO4、0.43mMのNaClおよび土壌抽出物から構成された。バイオディーゼル生産からのグリセロール廃棄物(酸性グリセロール(AG)及び非酸性グリセロール(NAG))を、Imperial Western Products(セルマ、CA、米国)から取得した。
【０４６３】
実験設計および増殖測定:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
(a)
7.スピルリナ(Spirulina)培地+2%グルコース
8.スピルリナ(Spirulina)培地+2%試薬級グリセロール
9.スピルリナ(Spirulina)培地+2%非酸性グリセロール
10.スピルリナ(Spirulina)培地+1%非酸性グリセロール+1%グルコース
(b)
1. SEM+2%グルコース
2. SEM+2%試薬級グリセロール
3. SEM+1%試薬級グリセロール+ 1 %グルコース
4. SEM+2%酸性グリセロール
5. SEM+1%酸性グリセロール+1%グルコース
6. SEM+2%非酸性グリセロール
7. SEM+1%非酸性グリセロール+1%グルコース
【０４６４】
各々の株を、5×105細胞/mlの濃度で、互いに異なる培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。96時間後、脂質含有量を測定した。細胞中の脂質含有量の量を測定するために、100μlの培養物を回収し、等量の培地で一度洗浄した。各々のチューブに、5μlの洗浄細胞および200μlの18M硫酸を加えた。前記チューブを、30分間90℃の水浴でインキュベートし、そして、1mlのリン酸バニリン試薬をチューブに加え、15分間37℃でインキュベートした。リン酸バニリン試薬を調製するために、0.12gのバニリンを20mlの水に加え、85%のリン酸を用いて体積を100mlに調節した。サンプルとして5μlの水を有する参照チューブに対して、ガラス・キュベット中で、530nmでの光学濃度を計測した。参照カーブは、1から10μgの範囲の(クロロホルムに溶解した)トリオレインから成る。
【０４６５】
乾燥細胞重量を測定するために、0.5mlの各々の培養物を、5分間、5000rpmで、遠心分離によりペレット化した。上清を取り除いた後に、細胞ペレットを、-80℃で凍結し、凍結乾燥システム(Labconco、MO、米国)中で、一晩乾燥した。脂質パーセンテージを、総脂質量を乾燥細胞重量で割り算して算出した。結果を、図11に示す。
【実施例１４】
【０４６６】
株及び培地:セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)(UTEX 2552)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地で維持した。改変プロテオース培地は、1リットルにつき0.25gのNaNO3、0.09gのK2HPO4、0.175gのKH2PO4、0.025gのCaCl22H2O、0.075gのMgSO47H20および2gイースト・エキストラクトから構成された(g/L)。
【０４６７】
実験設計並びに増殖測定及び脂質測定:各々の増殖条件については、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
(a)(b)
1. Proteose +2%グルコース
2. Proteose +2%グリセロール
3. Proteose +2%酸性グリセロール
4. Proteose +2%非酸性グリセロール
5. Proteose +1%酸性グリセロール+ 1 %グルコース
【０４６８】
セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)(UTEX 2552)を、5×105細胞/mlの濃度で、互いに異なる培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。96時間後、細胞増殖を乾燥細胞重量により測定し、脂質含有量を蛍光体-バニリンアッセイ(実施例13を参照されたい)で測定した。脂質パーセンテージを、総脂質量を乾燥細胞重量で割り算して算出した。結果を、図12に示す。
【実施例１５】
【０４６９】
株および培地:ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)(UTEX 667)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、土壌抽出物培地(実施例13を参照されたい)で維持した。
【０４７０】
実験設計および増殖測定:各々の増殖条件については、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. SEM +2%グルコース
2. SEM +2%グリセロール
3. SEM +2%酸性グリセロール
4. SEM +1%酸性グリセロール+ 1 %グルコース
5. SEM +2%非酸性グリセロール
6. SEM +1%非酸性グリセロール+ 1 %グルコース
ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)(UTEX 667)を、5×105細胞/mlの濃度で、グルコースまたは異なるグリセロール(純粋、酸性、非酸性)を含む培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。96時間後、細胞増殖を、乾燥細胞重量(実施例13を参照されたい)により測定した。結果を、図13に示す。
【実施例１６】
【０４７１】
株および培地:セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)(UTEX 2552)およびナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)(UTEX 667)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)については改変プロテオース培地およびナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)については土壌抽出物培地で維持した(実施例1を参照されたい)。
【０４７２】
実験設計および増殖測定:各々の株について、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
セネデスムス・アルマツス(Scenedesmus armatus)
5. プロテオース+1%の酸性グリセロール+ 1 %グルコース
6. プロテオース+1%の酸性グリセロール+ 1 %グルコース(72時間後に加えられた)
ナビクラ・ペリクロサ(Navicula pelliculosa)
1. SEM +1%の酸性グリセロール+ 1 %グルコース
2. SEM +1%の酸性グリセロール+ 1 %グルコース(72時間後に加えられた)
【０４７３】
それぞれの株を、5×105細胞/mlの濃度で、培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。72時間の初期増殖後、1%のグルコースを、サンプル#2に加えて、さらに24時間培養した。細胞増殖を、乾燥細胞重量により測定した(実施例13を参照されたい)。結果を、図14に示す。
【実施例１７】
【０４７４】
株および培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 31)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地で維持した(実施例1を参照されたい)。
【０４７５】
実験設計:各々の条件については、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
4. プロテオース
5. プロテオース+0.5%グルコース
6. プロテオース+0.5%キシロース
7. プロテオース+0.25%グルコース+0.25 %キシロース
【０４７６】
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)#4(UTEX 31)を、3×105細胞/mlの濃度で、異なる糖(グルコースまたはキシロース)を含む培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。72時間の増殖後、細胞増殖を、各々の培養物の菌体数を計測することで測定した。結果を、図15に示す。
【実施例１８】
【０４７７】
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の株#1、#3、及び#4を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。その保存培養株を、改変プロテオース培地で維持した(実施例1を参照されたい)。各々の条件については、1mlの次の異なる培地を、24穴プレートに調製した。
1. プロテオース
2. プロテオース+1%グルコース
3. プロテオース+1%フルクトース
【０４７８】
各々の株を、1×106細胞/mlの濃度で、異なる糖(グルコースまたはフルクトース)を含む培地に植菌した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。96時間の増殖後、菌体密度を、各々の培養物のの菌体数を計測することにより測定した。結果を、図20に示す。
【実施例１９】
【０４７９】
スクロース上のクロレラ
材料および方法:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 249)を、3つの50mlフラスコ中のプロテオース培地で、1%スクロースを有するプロテオース培地(2.94mMのNaNO3、0.428mMのK2HPO4、1.28mMのKH2PO4、0.427mMのNaCl、0.17mMのCaCl22H2O、0.3mMのMgSO47H2O、プロテオーゼペプトンlg/L)に、4x105細胞/mlの最終菌体密度になるように、植菌した。インベルターゼ(シグマ#14504)を、0.01U/mlおよび0.05U/mlで2つの培養物に加えた。全3つの培養物を、暗所で60時間、150rpmで振とうしながら増殖させた。
【０４８０】
結果:最終的な細胞カウントを、暗所で約60時間振とうして、全3つの培養物について実施した。前記0.01U/mlおよび0.05U/mlフラスコがそれぞれ1x108および3x108の菌体密度に至る一方で、コントロールフラスコは4.4x105細胞/mlに到達した。各々のフラスコを、実験終了時に顕微鏡分析によって汚染を検査したが、全て汚染はなかった。
【実施例２０】
【０４８１】
スクロース上でのクロレラ株増殖
クロレラ・ケッセレリ(Chlorella kessleri)((a) UTEX 397および(b)UTEX 398)およびクロレラ・フスカ(Chlorella fusca)((a) UTEX 251および(b)UTEX 1801)の培養物を、独立栄養性液体培養物から50mlフラスコ中の10mlの(プロテオース+1%スクロース)培地に、1×106細胞/mlで植菌した。コントロール培養物を、また、プロテオースだけの培地中に、同一密度で植菌した。培養物を、暗所で7日間、28℃、250rpmで振とうして増殖させた。その時点で、菌体密度を血球計数器で測定した。図21〜22に示すように、全4つの株は、開始時の菌体密度およびプロテオースのみのコントロールと比較して、スクロース上で増殖した。
【実施例２１】
【０４８２】
ショ糖インベルターゼを有する糖蜜上でのクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の増殖
植菌のためのクロレラ細胞の調製
クロレラの10ml液体培養を、固体プロテオースプレートから植菌物を取り出し開始した。その培養物を、26℃で約2日間、光の下で増殖させた。増殖を、750nmにて光学濃度計(OD)を使用して、及び乾燥細胞重量を決定することによって測定された。
【０４８３】
糖蜜および糖保存液の調製:以下の表13に示すように、5%の保存液を、グルコース、スクロースおよび(砂糖きびを糖へと商業的に処理することから得られた)3つの互いに異なる糖蜜サンプル(BSl、BS2およびHTMと表記される)を用いて調製した。全ての保存液のpHは6〜6.6の範囲であることを確認し、そして、その保存液を、その後オートクレーブで処理した。
【０４８４】
(表13)糖蜜および糖溶液
【表１３】
2010528627.tif 000006
【０４８５】
インベルターゼ溶液の調製:インベルターゼの40単位/mlの保存液を、10ミリリットルの蒸留水中に、400単位/mgインベルターゼ(シグマ)の1mgを再構成することによって調製した。
【０４８６】
実験条件および準備:10mlの培養物を調整した。前記培養物の各々は、プロテオース基本培地中に、最終濃度1%の糖蜜/糖、0.05単位/mlのインベルターゼ、及びクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の1.0×106細胞/mlから構成された。培養物に、以下の通り番号をつけた。
(1)培地のみのコントロール、
(2)1%のHTM、
(3)1%のBSl、
(4)1%のBS2、
(5)1%のグルコース、
(6)1%のスクロース。
同様のコントロールセットを、また、インベルターゼの添加なしで調製した。培養物を、暗所で28℃、5日間、250rpmで振とうして増殖させた。
【０４８７】
結果:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)細胞の増殖を、暗所でそれぞれの栄養源上、5日間インキュベートした後評価した。図23〜24に示すように、細胞は、純粋な試薬級グルコース上での増殖における収率と同等の収率で、ショ糖インベルターゼの存在下、糖蜜上で増殖可能である。
【実施例２２】
【０４８８】
外来ショ糖インベルターゼ発現のためのクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の遺伝子改変
株および培地:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 250)を、テキサス大学(オースティン、TX、米国)藻類培養コレクションから取得した。保存培養株を、改変プロテオース培地で維持した。改変プロテオース培地は、1リットル当たり、0.25gのNaNO3、0.09gのK2HPO4、0.175gのKH2PO4、0.025gのCaCl22H2O、0.075gのMgSO47H2Oおよび2gのイースト・エキストラクト(g/L)から構成される。
【０４８９】
プラスミド構築:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)中で分泌形態のインベルターゼを発現するために、サッカロマイセス・セルビジア(Saccharomyces cerevisiae)SUC2遺伝子を、3つの互いに異なるプロモーター(カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(CMV)、クロレラウイルス・プロモーター(NC-IA)及びクロレラHUPlプロモーター)の制御下に配置した。酵母SUC2遺伝子を、クロレラ・プロトセコイデス(C. protothecoides)用に最適化したコドン使用頻度に適応させ、及びインベルターゼの細胞外への分泌を導くために必要なシグナル配列を含むように合成した。各々のコンストラクトを、pBluescript KS+にて作製した。EcoRI/AscI、Ascl/XholおよびXhoI/BamHIサイトを、特定プライマーを使用するPCR増幅により、それぞれ、各プロモーター、インベルターゼ遺伝子、およびCMV 3'UTRに導入した。精製したPCR産物を順次クローニングした。最終のコンストラクトの図面を図25に示す。
【０４９０】
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)の形質転換: 6xl06細胞/mlの菌体密度に到達するまで、クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)培養物を、75μmol光子m-2sec-1の連続照明下で旋回シェーカー上、改変プロテオース培地中で増殖させた。
【０４９１】
遺伝子銃による形質転換の場合、Seashell Technology製のS550d金キャリアを、メーカーのプロトコルに従って調製した。簡潔には、Bsalによって直線化されたコンストラクト(20μg)を、60μl(3mg)のS550d金キャリア及び50μlの結合用緩衝液と混合し、1分間氷中でインキュベートした。沈殿用緩衝液(100μl)を加え、混合物をさらに1分間氷中でインキュベートした。軽度のボルテックス後、DNAコート粒子を、10秒間のエッペンドルフ微量遠心機で10,000rpmにてスピンすることによりペレット化した。金ペレットを、500μlの冷却100%エタノールで一度洗浄し、微量遠心機中で軽くスピンしてペレット化し、そして、50μlの氷冷エタノールを用いて再懸濁した。短時間の(1〜2秒)超音波処理後、10μlのDNAコート粒子を、担体膜に直ちにトランスファーした。細胞を回収し、滅菌蒸留水で一度洗浄して、50μlの培地(1×107細胞)に再懸濁し、そして、非選択的なプロテオースプレートの中心3分の1に撒いた。その細胞を、PDS-1000/He Biolistic Particle Deliveryシステム(バイオラド)を用いて射撃した。破裂板(1100および1350psi)を用い、そして、プレートをスクリーン/マクロ・キャリヤ組立体の下9cmおよび12cmに配置した。細胞を、12〜24時間、25℃で回復させた。回復を待って、細胞を、ゴムへらでプレートからこすり落とし、100μlの培地と混合し、1%スクロースを有する改変改変プロテオースプレートに撒いた。暗所、25℃、7〜10日間のインキュベート後に、形質転換細胞を代表するコロニーは、プレート上で目視可能であった。
【０４９２】
エレクトロポレーションを用いた形質転換の場合、細胞を回収し、滅菌蒸留水で一度洗浄し、50mMのスクロースを含むトリス-リン酸緩衝液(20mMTris-HCl(pH 7.0)、1mMのリン酸カリウム)中に、4xl08細胞/mlの密度で再懸濁した。約250μlの細胞懸濁液(lxl08細胞)を、4mmの間隙の使い捨てエレクトロポレーション・キュベットに配置した。その細胞懸濁液に、5μgの直線化プラスミドDNAおよび200μgのキャリアDNA(剪断されたサーモンスパームDNA)を加えた。前記エレクトロポレーション・キュベットを、その後、10分間、16℃で、氷水浴においてインキュベートした。電気的パルス(1100V/cm)を、その後、Gene Pulser II(バイオラドLabs、ヘラクレス、CA)エレクトロポレーション装置を使用し25μFの静電容量(分流抵抗器を、エレクトロポレーションのために使用しなかった)で、キュベットに適用した。そのキュベットを、その後、5分間、室温でインキュベートし、次に、その細胞懸濁液を50mlの改変プロテオース培地に移し、2日間旋回シェーカーで振とうした。回復後、その細胞を、低速(4000rpm)で回収し、改変プロテオース培地に再懸濁し、さらに、1%スクロースを有する改変プロテオースプレート上に、低密度で撒いた。暗所、25℃、7〜10日間のインキュベート後に、形質転換細胞を代表するコロニーは、プレート上で目視可能であった。
【０４９３】
形質転換体のスクリーニングおよびジェノタイピング:暗所で培養した1%スクロースを有する改変プロテオースプレートからコロニーをピックし、約同一量の細胞を、1%スクロースを有する1mlの改変プロテオース液体培地を含む24穴プレートに移した。その培養物を、暗所に保持し、430rpmで5日間、Labnet(バークシア、英国)のオービタルシェーカーによって強く撹拌した。
【０４９４】
クロレラ形質転換体中に導入されたインベルターゼ遺伝子の存在を確認するため、各々の形質転換体のDNAを単離し、遺伝子特異的プライマー(CMVコンストラクト:順方向プライマー(CAACCACGTCTTCAAAGCAA)(配列番号:6)/逆方向プライマー(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(配列番号:9)、CVコンストラクト:順方向プライマー(TTGTCGGAATGTCATATCAA)(配列番号:10)/逆方向プライマー(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(配列番号:11)及びHUPlコンストラクト:順方向プライマー(AACGCCTTTGTACAACTGCA)(配列番号:12)/逆方向プライマー(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(配列番号:13))のセットを用いて増幅した。迅速なDNA単離の場合、ある量(約5〜10uLのサイズ)の細胞を、50uLの10mMNa-EDTAに再懸濁した。その細胞懸濁液を、10分間、100℃でインキュベートし、10秒間超音波処理した。1分間、12000gで遠心分離後、3uLの上清を、PCR反応に使用した。PCR増幅を、DNAサーマルサイクラー(パーキン-エルマーGeneAmp 9600)において実行した。反応混合物(50uL)は、製造業者の使用説明書に従って、3uLの抽出DNA、上記各プライマー100pmol、200uM dNTP、0.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ(NEB)およびTaqDNAポリメラーゼ緩衝液を含んだ。DNAの変性を、第1サイクルで95℃5分間実行し、その後は30秒間実行した。プライマー・アニーリングおよび伸張反応を、それぞれ58℃30秒間、72℃1分間、実行した。PCR産物を、その後、1%のアガロースゲル上でエチジウムブロマイドを使用して染色し、視覚化した。図26は、上で同定される遺伝子特異的プライマーを使用しての、クロレラ・プロトセコイデス(C. protothecoides)形質転換体のPCR遺伝子型の結果を示す。矢印は、前記PCR産物の予想されるサイズを示し、そして、星印は各々の(そのPCR産物が予期されたサイズと合致する)形質転換体のDNAサンプルを示す(V:ベクターのみ、WT:野生型)。
【０４９５】
液体培養での増殖:暗所で5日培養後、遺伝子型が陽性の形質転換体は、暗所で最小液体プロテオース培地+1%のスクロース上で増殖を示した。その一方で、野生型細胞は暗所において、同一培地中では増殖を示さなかった。
【実施例２３】
【０４９６】
出芽酵母(S. cerevisiae)に由来する分泌型インベルターゼを用いた藻類株の形質転換
分泌型インベルダーゼ:分泌型ショ糖インベルターゼ(出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来のジェンバンクアクセション番号 NP_012104)をコードする遺伝子を、1599bpのAsc I-Xho断片としてde novoで合成した。その断片を、順次(Cauliflower Mosaic Virus 35sプロモーター及び3'UTRを、それぞれEcoR I/Asc I及びXho/Sac Iカセットとして有する)pUC19誘導体へサブクローニングした。
【０４９７】
藻類細胞の増殖:これらの実験において使用する培地は、1%の最終濃度の((明示される)スクロース若しくはグルコースの形態の)固定炭素を含む、液体基本培地及び固形基本培地(+1.5%アガロース)であった。この実験において使用する株は、暗所で、付加的な固定炭素源を欠如した基本培地上では増殖しなかった。複数種を、プレートに打ち込み、28℃の暗所で増殖させた。シングルコロニーをピックして、1%のグルコースを含む500mLの液体基本培地に植菌するために使用し、対数期の中間部になるまで暗所にて培養させて、毎日、細胞数を測定した。以下の株の各々について、暗所で唯一の炭素源としてのスクロース上での増殖に関して事前に試験し、そして、これらの株は増殖を示さず、従って、分泌型インベルターゼで形質転換するものとして選抜された。
(1)クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 31)
(2)クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)(UTEX 2341)
及び(3)クロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)(CCAP 211/15)。
【０４９８】
粒子銃を介した藻類細胞の形質転換:十分量の培養物を遠心分離して合計約1〜5x108の細胞を得た。得られたペレットを、固定炭素源を加えない基本培地で洗浄した。細胞を再び遠心分離し、前記ペレットを、5x107から2×108細胞/mlを与えるのに十分な基本培地の容量に再懸濁した。250〜1000μlの細胞を、その後、1%のスクロースを補充した固形基本培地に撒き、滅菌ドラフト(hood)中のプレート上で乾燥させた。プラスミドDNAを、メーカーの推奨(Seashell Technology、ラ・ホーヤ、CA)に従って、金粒子上へ析出させた。破裂板ホルダから9cmの位置にセットされるマクロ・キャリヤ組立体を有する1350psi破裂板を使用するバイオラドPDS He-1000粒子デリバリーシステムを使用して、形質転換を実施した。形質転換後、プレートを、28℃暗所でインキュベートした。全ての株は、複数の形質転換体コロニーを生成した。インベルターゼのインサート無しで、(それ以外は同一の様式で)形質転換されたコントロールプレートは、コロニーを含まなかった。
【０４９９】
クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)形質転換体の分析:ゲノムDNAを、以下の通りにクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)野生型細胞および形質転換体のコロニーから抽出した。細胞を、100ul抽出緩衝液(87.5mMのTris Cl、pH 8.0、50mMのNaCl、5mMのEDTA、pH 8.0、0.25%のSDS)の中に再懸濁し、時々逆さまにして混合しながら、60℃30分間インキュベートした。PCRに関しては、サンプルを、20mMのTris Cl(pH 8.0)中で1:100に希釈した。
【０５００】
ジェノタイピングを、野生株、形質転換体、及びプラスミドから抽出したゲノムDNAに関して行った。サンプルを、マーカー遺伝子に関してジェノタイピングした。プライマー2383(5'CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC 3')(配列番号:20)及び2279(5'CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3')(配列番号:21)を、このジェノタイピングPCRで使用した。使用したPCRプロフィールは、以下の通りだった(5分間94℃の変性;35サイクルの(94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で3分);72℃で5分)。図27に示すように、同一サイズのバンドが、ポジティブコントロール(プラスミド)並びにクロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 31)の2つの形質転換体から増幅された。
【０５０１】
クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)およびクロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)形質転換体の分析:ゲノムDNAを、以下の通りにクロレラ野生株および形質転換体から抽出した。細胞を、100ul抽出緩衝液(87.5mMのTris Cl、pH 8.0、50mMのNaCl、5mMのEDTA、pH 8.0、0.25%のSDS)中に再懸濁し、時々逆さまにして混合しながら、60℃30分間インキュベートした。PCRのために、サンプルを、20mMのTris Cl(pH 8.0)中で1:100に希釈した。ジェノタイピングを、野生株、形質転換体、及びプラスミドから抽出したゲノムDNAに関して行った。サンプルを、マーカー遺伝子に関してジェノタイピングした。プライマー2336(5'GTGGCCATATGGACTTACAA 3')(配列番号:22)及び2279(5'CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3')(配列番号:21)は、プライマーセット2(1215bpの予想産物)と指定され、一方でプライマー2465(5'CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG 3')(配列番号:23)及び2470(5'CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3')(配列番号:24)は、プライマーセット4(1442bpの予想産物)と指定された。使用したPCRプロフィールは、以下の通りだった(94℃で2分間の変性;29サイクルの(94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で1分30秒);72℃で5分)。分泌型インベルターゼを含むコントロールプラスミドを、PCRのコントロールとして使用した。図28は、分泌型インベルターゼをコードする遺伝子を用いての、微細藻類のクロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)(UTEX 2341)種およびクロレラ・エメルソニイ(Chlorella emersonii)(CCAP 21 1/15)種の形質転換を示す。
【０５０２】
インベルターゼコンストラクトの配列は、配列番号:25に対応する。
【実施例２４】
【０５０３】
セルクラスト(Celluclast)(商標)で調製されたセルロース系栄養源上での増殖で、出芽酵母(S. cerevisiae)と比較された藻類株の増殖
株及び培養条件:この研究において使用する藻類株を、下記の表14にリストし、それらは、外因的に提供されるセルロース系物質を有するプロテオース培地中及びいくつかの場合では追加される固定炭素(グルコース形態でのもの)を有するプロテオース培地中で増殖した。24の藻類株(クロレラの11の互いに異なる種にまたがる5つの異なる属、パラクロレラ(Parachlorella)から2つ及びプロトテカ(Prototheca)から2つ、並びにブラクテオコッカス(Bracteococcus)及びシュードクロレラ(Pseudochlorella)から1つずつを含む)をこの研究で使用した。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)(PJ-69-4A株)を、YPD培地(1リットルあたり、10g バクトイースト・エキストラクト、20gバクトペプトンおよび20gグルコース)中で増殖させた。藻類と酵母との両者を、暗所28℃で増殖させた。暗所で、セルロース系物質若しくは他の付加的な固定炭素の非存在下で、プロテオース培地上でのこれらの株の増殖は、起こらないか又は極めて最小限かのいずれかであった。
【０５０４】
酵素的解重合処理を介したセルロース系物質からのグルコースの遊離:爆発処理された湿ったトウモロコシ茎葉材料は、1.4%の硫酸溶液中でトウモロコシ茎葉を調理し得られたスラリーを脱水することにより、National Renewable Energy Laboratory(国立再生可能エネルギー研究所)(Golden, CO)によって調製された。メトラー・トレド・湿気解析装置を使用して、湿ったトウモロコシ茎葉中の乾燥した乾燥固形分は、24%であると決定した。100gの湿ったサンプルを、最終容量420mlに脱イオン水中で再懸濁し、そのpHを、10N NaOHを使用して4.8に調整した。セルクラスト(ノボザイム)(セルラーゼ)を、 4%の最終濃度になるように加え、得られたスラリーを、50℃で72時間、振とうしながらインキュベートした。この物質のpHを、その後、NaOH(ごくわずかな体積変化)で7.5に調整し、0.22umフィルターで濾過滅菌し、-20°Cで保存した。後述するように、シグマ社製のヘキソキナーゼに基づくキットを使用して、グルコース濃度を測定するために、一部のサンプルを残しておいた。
【０５０５】
湿ったトウモロコシ茎葉のセルクラスト(R)処理によって遊離されるグルコース濃度の測定:グルコース濃度を、Sigma Glucose Assay Reagent #G3293を使用して測定した。上記に概略が示されるように処理したサンプルを、400倍に希釈し、そして、40μlを反応物に加えた。前記トウモロコシ茎葉・セルロース系調製物が、約23g/Lのグルコースを含むと決定した。
【０５０６】
(表14)セルロース系栄養源上で増殖する藻類株
【表１４】
2010528627.tif 000007
【０５０７】
表14において、本明細書中で使用される場合、UTEXはテキサス大学(オースティン、テキサス、米国)藻類培養コレクションを指し、SAGはゲッチンゲン(Gottingen、ドイツ)大学藻類培養コレクションを指し、CCAPはスコットランド海洋科学協会(スコットランド、英国)が管理する藻類原生動物培養コレクションを指し、及びCCALAは、植物学研究所(Tfebon、チェコ共和国)藻類研究所培養コレクションを指す。
【０５０８】
セルロース系物質上での増殖測定:セルロースを酵素処理及び糖化して、グルコース、キシロースおよび他の単糖糖にした後、上記のように調製された物質を、24種類の藻類株若しくは出芽酵母(S. cerevisiae)の、それぞれ、プロテオース培地若しくはYPD培地中での増殖のための栄養源として評価した。プロテオース培地を(出芽酵母の増殖のためのYPDにするのと同様に)、種々の量の純粋グルコース及び/又は解重合セルロース系物質を加えることにより、23g/Lの最終的なグルコース濃度(トウモロコシ茎葉のセルロース分解性処理を介して生成されるグルコースの最終濃度)に構成する。様々な濃度のセルロース系物質を、前記23g/Lのグルコースの0、12.5、25、50および100%を提供することにより、各培地に含有させた。これらの構成成分を、下記の表15に示す。適切な培地1mlを、24穴プレートのウエルに加えた。YPD中で28℃にて従属栄養性増殖した出芽酵母(S. cerevisiae)を、20g/Lのグルコースを含むプロテオース培地中で混合栄養性増殖する藻類細胞から調達した。
【０５０９】
(表15)セルロース系栄養源調製物
【表１５】
2010528627.tif 000008
【０５１０】
表15は、明示されたパーセンテージのセルロース系物質を含む培地を産生するプロテオース培地又はYPD培地へ加えられた、それぞれ、プロテオース培地構成成分又はYPD培地構成成分を含むよう改変された解重合トウモロコシ茎葉の体積を示す。全ての場合に、23g/Lの最終グルコース濃度を得るために培地を調製した。対数増殖期の中間部に増殖した酵母または藻類細胞の添加前の培地体積は1mlであった。細胞を、様々な濃度のセルロース系栄養源上で、28℃、暗所、2日間、振とう(300rpm)してインキュベートした。増殖を、UV分光光度計において750nmでの吸光度の測定によって評価した。驚くべきことに、全ての株は、セルクラストを用いて調製されたセルロース系物質上(100%の発酵可能な糖がセルロース系材料由来である培地条件)で、増殖した。
【実施例２５】
【０５１１】
アセレラーゼ(Accellerase)1000(商標)およびセルクラストを用いて調製された様々なセルロース系栄養源上での24種類の株と出芽酵母の増殖
株および培養条件:この実施例において使用する藻類株を、表14(上記)にリストし、(解重合セルロース系物質及び/又は純粋グルコースの形態での)追加的固定炭素をプラスしたプロテオース培地中で増殖させた。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)(pJ69-4a株)は、(解重合セルロース系物質及び/又は純粋グルコースの形態での)追加的固定炭素をプラスしたYPD培地中で増殖した。藻類と酵母の両者は、暗所、28℃で増殖した。
【０５１２】
酵素的解重合処理を介したセルロース系物質からのグルコースの遊離:爆発処理された湿ったトウモロコシ茎葉材料は、1.4%の硫酸溶液中でトウモロコシ茎葉を調理し得られたスラリーを脱水することにより、National Renewable Energy Laboratory(国立再生可能エネルギー研究所)(Golden, CO)によって調製された。また、スイッチグラスを、トウモロコシ茎葉についての同一方法を利用して、National Renewable Energy Laboratory(Golden、CO)により調製した。テンサイ・パルプ(ペクチナーゼ処理を介して生成されたもの)は、Atlantic Biomass社(Frederick、 MD)により供給された。メトラー・トレド湿気解析装置を使用した場合、乾燥固形分は、前記湿ったトウモロコシ茎葉中では24%、スイッチグラス中では26%、およびテンサイ・パルプ中では3.5%であった。トウモロコシ茎葉またはスイッチグラスの100gの湿ったサンプルを、脱イオン水中で、最終体積420mlに再懸濁し、そして、pHを10N NaOHを用いて4.8に調節した。テンサイ・パルプの場合、8.8グラムの乾燥固形分を、脱イオン水で350mlにし、そして、pHを10 N NaOHで4.8に調節した。全ての供給源に関して、アセレラーゼ(Accellerase)1000(商標)(Genencor)(セルラーゼ酵素複合体)を、乾燥バイオマス1グラムに対して0.25mlの酵素の比率で使用した。サンプルを、72時間、50℃で強く攪拌(110rpm)しながらインキュベートした。この材料のpHを、その後、NaOH(ごくわずかな体積変化)で7.5に調節した。そして、0.22umフィルターを通過させ濾過滅菌し、下記に概説される増殖実験に使用した。後述するように、シグマ社製のヘキソキナーゼに基づくキットを使用して、グルコース濃度を測定するために、一部のサンプルを残しておいた。セルロース系栄養源の同一セットを、また、前記の実施例で記載のセルクラスト(ノボエンザイム)(セルラーゼ)を使用して調製した。
【０５１３】
Accellerase 1000を用いて処理した種々のセルロース系栄養源中でのグルコース濃度の測定:グルコース濃度を、シグマ製グルコースアッセイ試薬 #G3293を使用して測定した。上記で概説されるように処理したサンプルを、400倍に希釈し、40ulを反応物に加えた。トウモロコシ茎葉、スイッチグラスおよびテンサイ・パルプ由来のセルロース系調製物が、それぞれ、約23.6、17.1および13.7g/Lのグルコースを含有すると決定した。
【０５１４】
セルロース系物質上での増殖の測定:セルロース系原料をグルコース、キシロースおよび他の単糖へ酵素的解重合した後、上で調製される物質を、24種類の藻類株(表14にリストされるもの)及び出芽酵母の、それぞれ、プロテオース培地またはYPD培地での増殖のための栄養源として評価した。トウモロコシ茎葉、スイッチグラスまたはビートパルプ由来のセルロース系物質の量を変化させながら、一貫した濃度のグルコースを含むように、前記培地を設計した。第1セットのプロテオース培地およびYPD培地は、23.6g/Lの純粋グルコースを含み、一方、第2セットの培地は、解重合トウモロコシ茎葉、スイッチグラスおよびビートパルプ(それらの各々は、23.6g/Lのグルコースを含む)を含有する。スイッチグラス及びビートパルプ培地に6.5及び9.9g/Lの純粋グルコースを補充して、全てのセルロース系培地中のグルコースを23.6g/Lに標準化した。1mlの適切な培地を、24穴プレートのウエルに加えた。28℃でYPD中、従属栄養性増殖した出芽酵母を、酵母ウエル用の植菌物(20ul)として用いた。前記24種類の藻類株用の植菌物20μlを、20g/Lグルコースを含むプロテオース培地中で混合栄養性増殖させた藻類細胞から調達した。全ての細胞を、2日間、暗所で、様々な濃度のセルロース系栄養源上で、28℃にて、振とう(300rpm)しながらインキュベートした。増殖を、UV分光光度計において750nmでの吸光度の測定によって評価した。驚くべきことに、全ての株は、アセレラーゼ1000又はセルクラストを用いて調製されたトウモロコシ茎葉、スイッチグラスまたはビートパルプ上(100%の発酵可能な糖がセルロース系材料由来である培地条件)で、増殖した。出芽酵母は、等量の純粋グルコース上での増殖を凌駕する、セルロース系栄養源と解重合酵素との組み合わせは無かった。そのことは、セルロース系物質中での酵母の増殖への阻害剤が、発酵での生産性に大きなインパクトを与えたことを示す。
藻類株、解重合酵素及び100%セルロース系材料由来の単糖(100%純粋グルコースより優れたもの)を有する栄養源の組み合わせを、表16に示す。
【０５１５】
(表16)藻類、酵素および栄養源の組合せ
【表１６】
2010528627.tif 000009
【実施例２６】
【０５１６】
炭素資化性スクリーニング
株及び培養条件:下で同定される微細藻類の種々の株の種培養を、24穴プレート中で1mlの液体培養物として開始し、光環境下、48時間350rpmで強く撹拌しながら独立栄養的に増殖させた。プレートを、唯一の固定炭素源として、(1%のグルコース(ブドウ糖)、グリセロール、キシロース、スクロース(ショ糖)、フルクトース、アラビノース、マンノース、ガラクトースまたは酢酸塩(アセテート))を含む1.5%のアガロース・ベースの固形プロテオース培地を用いてセットアップした。各々の株について、独立栄養性の24穴プレートからの5μlの培養物を、固形培地上にスポットした。プレートを、28℃、暗所で7日間インキュベートし、付加的な固定炭素を含まないコントロールプレートと比較しての増殖に関して検討した。下記の表17に示すように、増殖を、各々のそれぞれの栄養源でテストされる各々の種に関して観察した。付加的な固定炭素の非存在下で、暗所においてプロテオース培地上でのこれらの株の増殖は、起こらなかったか又は極めて最小限しかないかのいずれかであった。
【０５１７】
(表17)さまざまな固定炭素栄養源上で増殖する藻類種
【表１７Ａ】
2010528627.tif 000010
【表１７Ｂ】
2010528627.tif 000011
【実施例２７】
【０５１８】
再生可能ディーゼルの生産
細胞性生産:クロレラ・プロトセコイデス(Chlorella protothecoides)(UTEX 250)のF-Tankバッチ(約1,200ガロン)を用いて、抽出処理用のバイオマスを生成した。バッチ(#ZA07126)を、100時間稼働させた。その間、グルコースレベルを16g/Lに制御し、その時間の後、コーンシロップの供給を停止した。残留グルコースレベルは、 2時間後、<0g/Lに低下した。これらの結果、最後的に102時間かかった。最終的なブロス体積は、1,120ガロンであった。製造過程中の汚染検査および最終的なブロスサンプルの徹底的な分析の両者によっても、汚染の徴候を示すことは無かった。発酵ブロスを、遠心分離し、ドラム乾燥した。ドラム乾燥細胞を、ヘキサン中で再懸濁し、約1000barでホモジェナイズした。ヘキサン抽出を、その後、標準的な方法を用いて実行し、そして、得られた藻類のトリグリセリド油が残留ヘキサンを含まないと決定した。
【０５１９】
再生可能ディーゼルの生産:藻類のトリグリセリド油は、脂質プロフィール(約3%のC18:0、71%のC18:1、15%のC18:2、1%のC18:3、8%のC16:0および2%の他の構成成分)を有した。前記油を、最初に水素分解(hydrocracking)に供し、その結果、水およびガスへ約20%の収率損失を生じた。水素異性化(hydroisomerization)をその後実行したが、ガスへ約10%の収率損失を伴った。一回目の蒸留を、その後実行し、ナフサ画分を除去し、目的生成物を残した。この一回目の蒸留で、その物質の約20%を、ナフサへと失った。その後、二回目の蒸留を、ASTM D975仕様を満たすのに必要な画分を取り出すのに十分な温度であるが、D975蒸留での90%基準点を満たさなかった底にある画分をそのままにするのに十分な温度で実施した。二回目の蒸留では、前記物質の約30%は、底にある画分中に残された。その後、得られた物質を、全てのASTM D975仕様に関して試験した。
【０５２０】
図29および30は、本発明の方法により生産された最終再生可能ディーゼル産物の、それぞれ、ガスクロマトグラフおよび沸点分布プロットを図説する。表18は、得られた再生可能ディーゼル製品の沸点分布を示し、表19はASTM D975仕様の順守に関して最終産物の分析の結果を示す。
【０５２１】
(表18)再生可能ディーゼル製品の沸点分布
【表１８】
2010528627.tif 000012
【０５２２】
(表19)D975仕様を用いた、再生可能ディーゼル製品に関する分析報告書
【表１９】
2010528627.tif 000013
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2010528627.tif 000014
【図２】
2010528627.tif 000015
【図３】
2010528627.tif 000016
【図４】
2010528627.tif 000017
【図５】
2010528627.tif 000018
【図６】
2010528627.tif 000019
【図７】
2010528627.tif 000020
【図８】
2010528627.tif 000021
【図９】
2010528627.tif 000022
【図１０】
2010528627.tif 000023
【図１１】
2010528627.tif 000024
【図１２】
2010528627.tif 000025
【図１３】
2010528627.tif 000026
【図１４】
2010528627.tif 000027
【図１５】
2010528627.tif 000028
【図１６】
2010528627.tif 000029
【図１７】
2010528627.tif 000030
【図１８】
2010528627.tif 000031
【図１９】
2010528627.tif 000032
【図２０】
2010528627.tif 000033
【図２１】
2010528627.tif 000034
【図２２】
2010528627.tif 000035
【図２３】
2010528627.tif 000036
【図２４】
2010528627.tif 000037
【図２５】
2010528627.tif 000038
【図２６】
2010528627.tif 000039
【図２７】
2010528627.tif 000040
【図２８】
2010528627.tif 000041
【図２９】
2010528627.tif 000042
【図３０】
2010528627.tif 000043