【手続補正書】
【提出日】平成23年9月28日(2011.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７５】
同様に、各時点でのＥＰＡ％ＤＣＷを式：［（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００を用いて計算した。発酵中の８９．９時間経過時、ＥＰＡ％ＤＣＷは９．３５であり、発酵を通じてのその後の他の全時点で、ＥＰＡ％ＤＣＷは増加し、１３７．９時間後に１２．１３のＥＰＡ％ＤＣＷの最大レベルであった。
発酵の当業者は、（表２３に示されるように）特定のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株（例えばＹ４３０５）のオイル特性において、発酵作業自体、培地条件、プロセスパラメータ、スケールアップなどに依存し、また培養物がサンプリングされる特定の時点で、変動性が生じることを理解するであろう。結果として、例えば、株Ｙ４３０５の発酵から生じる微生物オイルが少なくとも約４３％のＥＰＡ、約２４％未満のＬＡ（１８：２）、約１０％未満のオレイン酸（１８：１）、約４％未満のＥＤＡ、約２％未満のＥＴＡ、約１％未満のＡＲＡ、約４％未満のステアリン酸（１８：０）および約４％未満のパルミチン酸（１６：０）（ここで各脂肪酸はＴＦＡの％に相当する）を含有しうることが想定されうる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７６】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．エイコサペンタエン酸を生産するための組換えヤロウィア属エスピー生産宿主細胞であって、
ａ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するΔ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、ここで上記ヤロウィア属エスピー生産宿主細胞は、該生産宿主細胞における総脂肪酸の質量パーセントとして測定された少なくとも約４３．３質量パーセントのエイコサペンタエン酸を生産する、組換えヤロウィア属エスピー生成宿主細胞。
２．Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子またはΔ８デサチュラーゼを
コードする少なくとも１つの遺伝子が、ヤロウィア・リポリティカプロモーターの制御下にある、上記１に記載の組換え生産宿主。
３．ヤロウィア・リポリティカプロモーターが、ＧＰＤ、ＧＰＤＩＮ、ＧＰＭ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ、ＧＰＡＴ、ＹＡＴ１およびＥＸＰ１からなる群から選択される、上記２に記載の組換え生産宿主。
４．Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子またはΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が、Ａｃｏ３、Ｐｏｘ３、Ｐｅｘ２０、Ｐｅｘ１６、Ｌｉｐ１、Ｌｉｐ２およびＯＣＴからなる群から選択されるヤロウィアターミネーターの制御下にある、上記１に記載の組換え生産宿主。
５．Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が少なくとも５つのコピー内に存在する、上記１に記載の組換えヤロウィア属エスピー生産宿主細胞。
６．Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が少なくとも５つのコピー内に存在する、上記１に記載の組換えヤロウィア属エスピー生産宿主細胞。
７．エイコサペンタエン酸を含む微生物オイルを生産するための方法であって、
ａ）エイコサペンタエン酸を含む微生物オイルを生産させる、上記１に記載の生産宿主を培養するステップ；および
ｂ）場合により、ステップ（ａ）の微生物オイルを回収するステップ
を含む、上記方法。
８．総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約２５質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含有する微生物オイル。
９．総脂肪酸の質量パーセントとして１質量パーセント未満のγ−リノレン酸を含有する、上記８に記載の微生物オイル。
１０．総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約３０質量パーセントのエイコサペンタエン酸および約２５質量パーセント未満のリノール酸を含む微生物オイル。
１１．総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約５０質量パーセントのω−３多価不飽和脂肪酸を含む微生物オイル。
１２．総脂肪酸の質量パーセントとして、次の脂肪酸濃度、すなわち
ａ）約４８〜約５５質量パーセントのエイコサペンタエン酸、
ｂ）約１．５〜約３．０質量パーセントのエイコサテトラエン酸、
ｃ）約０．１〜０．７質量パーセントのアラキドン酸、
ｄ）約１．０〜約２．５質量パーセントのジホモ−γ−リノレン酸、
ｅ）約２．０〜約３．５質量パーセントのエイコサジエン酸、
ｆ）約２．０〜約３．０質量パーセントのα−リノレン酸、
ｇ）約１７．０〜約２０．０質量パーセントのリノール酸（１８：２）、
ｈ）約３．５〜約６．５質量パーセントのオレイン酸（１８：１）、
ｉ）約１．０〜約２．０質量パーセントのステアリン酸（１８：０）、
ｊ）約０．５〜約３．５質量パーセントのパルミトレイン酸（１６：１）、および
ｋ）約２．５〜約４．５質量パーセントのパルミチン酸（１６：０）
を含む微生物オイル。
１３．総脂肪酸の質量パーセントとして、次の脂肪酸濃度、すなわち
ａ）少なくとも約４３．３質量パーセントのエイコサペンタエン酸、
ｂ）約２３．６質量パーセント未満のリノール酸（１８：２）、および
ｃ）約９．４質量パーセント未満のオレイン酸（１８：１）
を含む微生物オイル。
１４．総脂肪酸の質量パーセントとして約４．２質量パーセント未満のエイコサジエン酸をさらに含む、上記１３に記載の微生物オイル。
１５．上記１３に記載のオイルに由来するオイル濃縮物。
１６．オイルが、総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約６０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含む、上記１５に記載のオイル濃縮物。
１７．オイルが、総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約７０質量パーセントのエ
イコサペンタエン酸を含む、上記１５に記載のオイル濃縮物。
１８．オイルが、総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約８０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含む、上記１５に記載のオイル濃縮物。
１９．オイルが、総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約９０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含む、上記１５に記載のオイル濃縮物。
２０．上記１３に記載のオイル、ならびにリノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−−リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される追加量の脂肪酸を含むブレンドオイル。
２１．上記１５に記載のオイル濃縮物、ならびにリノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される追加量の脂肪酸を含むブレンドオイル。
２２．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む食品。
２３．食品類似体、機能性食品、医療用食品および医療用栄養剤からなる群から選択される、上記２２に記載の食品。
２４．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む薬剤組成物。
２５．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む調製粉乳。
２６．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む栄養補助食品。
２７．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む医療用食品。
２８．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む動物飼料。
２９．上記１３に記載のオイルを含む微生物バイオマス。
３０．上記２９に記載の微生物バイオマスを含む動物飼料。
３１．飼料が養殖飼料である、上記３０に記載の動物飼料。
３２．飼料が、次の改良、すなわち
ａ）３２〜４５％のタンパク質、
ｂ）４〜２８％の脂肪、
ｃ）１０〜３０％の炭水化物、
ｄ）１．０〜２．５％のミネラル、および
ｅ）１．０〜２．５％のビタミン
を含む、上記３１に記載の養殖飼料。
３３．場合により、
ａ）カロチノイド、
ｂ）結合剤、
ｃ）保存料、
ｄ）化学誘引剤、および
ｅ）香味料
からなる群から選択される改良を含む、上記３２に記載の養殖飼料。
３４．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含有するパーソナルケア製品。
３５．製品がスキンコンディショナーである、上記３４に記載のパーソナルケア製品。
３６．エイコサペンタエン酸に富むヒト、動物または養殖生物用の栄養補助食品を提供するための方法であって、ヒトまたは動物によって摂取または使用可能な形態でエイコサペンタエン酸を含有する上記１３に記載の微生物オイルを備えるステップを含む、方法。
３７．ヒトまたは動物における臨床状態を処置するための方法であって、該臨床状態が処置されるヒトまたは動物に摂取可能な形態で上記１３に記載のオイルを与えるステップを含む、方法。
３８．臨床状態が、心臓代謝疾患、神経行動学的状態、および炎症性障害からなる群から選択される、上記３７に記載の方法。
３９．臨床状態が、代謝症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患、前糖尿病状態、冠動脈心疾患、高血圧、炎症性疾患、ＩＩ型糖尿病、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、神経性食欲不振、やけど、骨関節炎、骨粗鬆症、脂質異常症、レゾルビン関連疾患、アルツハイマー病、注意欠陥／多動性障害、うつ病、双極性障害、統合失調症、分娩後うつ病、および更年期障害からなる群から選択される、上記３８に記載の方法。
４０．ヒトまたは動物におけるＣ反応性タンパク質の血清レベルを変化させるための方法であって、Ｃ反応性タンパク質のレベルを変化させるヒトまたは動物に摂取可能な形態で上記１３に記載のオイルを与えるステップを含む、方法。
４１．臨床状態を治すための上記１３に記載のオイルの使用。
４２．臨床状態を治すための上記１５に記載の濃縮物の使用。
４３．臨床状態を治すための上記２０に記載のブレンドオイルの使用。
４４．臨床状態を治すための上記２１に記載のブレンドオイルの使用。
４５．動物またはヒトにおけるエイコサペンタエン酸の欠乏を処置するための方法であって、該欠乏を処置するため、ヒトまたは動物によって摂取または使用可能な形態で、エイコサペンタエン酸を含有する、上記３０に記載の方法によって生産される微生物オイルを与えるステップを含む、方法。
４６．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８８０２で示されるヤロウィア属エスピー生産宿主。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エイコサペンタエン酸を生産するための組換えヤロウィア属生産宿主細胞であって、
ａ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するΔ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｂ）配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、ここで上記ヤロウィア属生産宿主細胞は、該生産宿主細胞における総脂肪酸の質量パーセントとして測定された少なくとも約４３.３質量パーセントのエイコサペンタエン酸を生産する、組換えヤロウィア属生産宿主細胞。
【請求項２】
Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が少なくとも５つのコピー内に存在するか、または
Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が少なくとも５つのコピー内に存在するか、または
Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が少なくとも５つのコピー内に存在し、そしてΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が少なくとも５つのコピー内に存在する、請求項１に記載の組換えヤロウィア属エスピー生産宿主細胞。
【請求項３】
エイコサペンタエン酸を含む微生物オイルを生産するための方法であって、
ａ）エイコサペンタエン酸を含む微生物オイルを生産させる、請求項１に記載の生産宿主を培養するステップ；および
ｂ）場合により、ステップ（ａ）の微生物オイルを回収するステップ
を含む、上記方法。
【請求項４】
下記の１つを含む微生物オイル：
ａ）総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約２５質量パーセントのエイコサペンタエン酸；
ｂ）総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約３０質量パーセントのエイコサペンタエン酸および約２５質量パーセント未満のリノール酸；または
ｃ）総脂肪酸の質量パーセントとして、少なくとも約４３.３質量パーセントのエイコサペンタエン酸、および、約２３.６質量パーセント未満のリノール酸（１８：２）、および、約９.４質量パーセント未満のオレイン酸（１８：１）。
【請求項５】
請求項４のｃ）に記載の微生物オイルであって、オイルがさらに濃縮され、および／または、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−−リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される追加量の脂肪酸と混合される、上記オイル。
【請求項６】
請求項４のｃ）に記載のオイルまたはその誘導体を含む食品であって、ここで食品は好ましくは食品類似体、機能性食品、医療用食品および医療用栄養剤からなる群から選択される、上記食品。
【請求項７】
請求項４のｃ）に記載のオイルまたはその誘導体を含む薬剤組成物、調製粉乳、栄養補助食品、または動物飼料。
【請求項８】
請求項４のｃ）に記載のオイルを含む微生物バイオマス。
【請求項９】
請求項８に記載の微生物バイオマスを含む動物飼料であって、動物飼料は好ましくは養殖飼料である、上記動物飼料。
【請求項１０】
請求項４のｃ）に記載のオイルまたはその誘導体を含有するパーソナルケア製品であって、パーソナルケア製品は好ましくはスキンコンディショナーである、上記パーソナルケア製品。
【請求項１１】
エイコサペンタエン酸に富むヒト、動物または養殖生物用の栄養補助食品を提供するための方法であって、ヒト、動物または養殖生物によって摂取または使用可能な形態でエイコサペンタエン酸を含有する請求項４のｃ）に記載の微生物オイルを備えるステップを含む、方法。
【請求項１２】
ヒトまたは動物における臨床状態を処置するための方法であって、該臨床状態が処置されるヒトまたは動物に摂取可能な形態で請求項４のｃ）に記載のオイルを与えるステップを含む、方法。