【手続補正書】
【提出日】平成23年1月28日(2011.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における免疫応答を誘発する方法において使用するための、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓからの酵母を含む組成物であって、該酵母は、５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地において培養された、組成物。
【請求項２】
増大したＴｈ１型免疫応答から恩恵を受ける疾患または障害に苦しんでいる個体においてＴｈ１型免疫応答を誘発する際に使用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｔｈ１型免疫応答がインターフェロン−ガンマ産生によって特徴付けられる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記培地が６〜８の間のｐＨレベルで維持される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記酵母が異種抗原を発現する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物であって、
ａ）前記酵母が培養中にある時間の少なくとも（１）８０％または（ｉｉ）９０％にわたって、該酵母が中性ｐＨにおいて培養される；
ｂ）該酵母は、該培地のｐＨがｐＨ５．５未満に低下しないように培養される；または
ｃ）該酵母は、該培地のｐＨが（ｉ）５分間、（ｉｉ）１０分間、（ｉｉｉ）２０分間、（ｉｖ）３０分間、（ｖ）４０分間、（ｖｉ）５０分間、または（ｖｉｉ）６０分間を超えてｐＨ５．５未満に低下することがないように培養される、
組成物。
【請求項９】
酵母を増殖させる方法であって、
ａ）５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で該酵母を培養すること；および
ｂ）該酵母ならびに医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体を含む組成物を処方すること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記培地が６〜８の間のｐＨレベルで維持される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母が異種抗原を発現する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
個体において免疫応答を誘発する際に使用するための、抗原発現酵母を含む組成物であって、該抗原発現酵母は、少なくとも５．５のｐＨレベルで維持された培地において培養された、組成物。
【請求項１４】
Ｔｈ１型免疫応答の強化によって利益を受ける疾患または障害に罹患した個体においてＴｈ１型免疫応答を誘発する際に使用するための、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
培地のｐＨが５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
【請求項１７】
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
さらに酵母を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
前記酵母が凍結または凍結乾燥されている、請求項１９に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明は、培地で酵母を培養することにより酵母を増殖させるための方法であって、培地が酵母培養期間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される方法を提供する。本発明はまた、培地で酵母を培養することにより酵母を増殖させるための方法であって、培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持され、酵母密度が少なくとも０．５酵母単位／ｍＬである方法も提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明はまた、抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、酵母が、５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている方法も提供する。１つの態様では、組成物は、中性ｐＨで培養、維持または回収された酵母を添加した樹状細胞を含む。別の態様では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。本発明の他の態様では、酵母は免疫応答を誘発する。本発明の他の態様では、酵母は抗原を発現し、いくつかの場合では抗原は異種抗原である。いくつかの場合では、異種抗原は酵母表面で発現される。１つの態様では、Ｔｈ１型応答はインターフェロン−ガンマ産生である。別の態様では、Ｔｈ１型応答はＩＬ−１２産生である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明はまた、ｐＨが少なくとも５．５である培地、および酵母を培養するための培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキットも提供する。本発明はまた、ｐＨが５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地、および酵母を培養するための培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキットも提供する。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。１つの態様では、キットはさらに酵母を含む。いくつかの場合では、酵母は凍結または凍結乾燥されている。いくつかの場合では、酵母は、ｐＨが少なくともｐＨ５．５の培地で培養されるか、または５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている。他の場合では、酵母は複製可能である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下を提供する：
（項目１）
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、該培地が、該酵母が培養中にある時間の少なくとも５０％にわたって５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される、方法。
（項目２）
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、前記培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持され、該酵母の密度が少なくとも０．５酵母単位／ｍＬである、方法。
（項目３）
酵母が培養中にある時間の少なくとも５０％にわたって、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で該酵母を培養することによる、酵母を増殖させるための方法。
（項目４）
前記培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目３に記載の方法。
（項目７）
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目６に記載の方法。
（項目８）
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、項目３に記載の方法。
（項目９）
前記酵母が異種抗原を発現する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
項目１、２、または３に記載の方法のいずれか１つにより培養された酵母を含む組成物。
（項目１２）
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培地で培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地のｐＨが少なくとも５．５である、方法。
（項目１３）
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地が５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される、方法。
（項目１４）
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１８）
前記酵母が異種抗原を発現する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記酵母が５．５未満のｐＨで増殖する場合より容易に前記異種抗原が他の細胞または作用物質との相互作用に到達可能である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
項目１２または１３に記載の方法のいずれか１つにより培養された酵母を含む組成物。
（項目２２）
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、該酵母が、少なくとも５．５のｐＨレベルを有する培地で培養されている、方法。
（項目２３）
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるＴｈ１型応答を誘導する方法であって、該酵母が、５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地で培養されている、方法。
（項目２４）
前記組成物が、中性ｐＨで培養、維持または回収された酵母で負荷された樹状細胞を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記酵母が異種抗原を発現する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記Ｔｈ１型応答がインターフェロン−ガンマ産生である、項目２３に記載の方法。
（項目３２）
前記Ｔｈ１型応答がＩＬ−１２産生である、項目２３に記載の方法。
（項目３３）
ｐＨが少なくとも５．５である培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
（項目３４）
５．５〜８の間のｐＨレベルで維持される培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
（項目３５）
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目３４に記載のキット。
（項目３６）
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目３４に記載のキット。
（項目３７）
さらに酵母を含む、項目３４に記載のキット。
（項目３８）
前記酵母が凍結または凍結乾燥されている、項目３７に記載のキット。
（項目３９）
前記酵母が、少なくともｐＨ５．５の培地で培養されるか、または５．５〜８の間のｐ
Ｈレベルで維持される培地で培養されている、項目３７に記載のキット。
（項目４０）
前記酵母が複製可能である、項目３７に記載のキット。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本明細書に開示された本発明は、中性ｐＨ、少なくともｐＨ５．５、またはｐＨ５．５〜８の間、またはｐＨ６〜８の間で酵母を増殖することが、より望ましい生物学的特徴を有する酵母をもたらすという発見に基づく。以下に詳述されるこれらの望ましい特徴のいくつかは、酵母細胞壁を柔軟に、および細胞壁消化酵素による消化に対し感受性に保ちながら、増加した細胞密度で十分に増殖する能力、ならびに他の細胞および／または作用物質に抗原をより接近できるようにする方法での抗原の提示を含むが、これらに限定されない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本明細書では、「抗原」の一般的使用は、適応免疫系により認識され得る任意の分子を指す。１つの態様では、抗原は抗体に特異的に結合する分子である。分子は、タンパク質が自然発生もしくは合成的に得られたタンパク質のいずれかの部分（ペプチド、部分タンパク質、完全長タンパク質）、または細胞組成物の一部（細胞全体、細胞溶解物または破壊細胞）、生物の一部（生物全体、溶解物または破壊細胞）、または糖質もしくはこの部分であり得る。抗原は、単独でまたは（破砕した酵母細胞のような）アジュバントなど別の化合物の使用により、抗原特異的体液性免疫応答を誘発することができる。別の態様では、抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との関連においてＴリンパ球（すなわちＴ細胞）により認識される。別の態様では、抗原は、抗原を投与した動物の細胞および組織内で遭遇する同一または類似の抗原に対し、寛容原（ｔｏｌｅｒａｇｅｎ）として作用することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
これらの方法は、すべての酵母に対し幅広く適用できる。酵母は、３つのクラス、すなわち、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ、ＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓおよびＦｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉの１つに属する単細胞微生物である。病原性酵母株、またはその非病原性変異体を本発明により使用することができるが、１つの態様では、非病原性酵母株が使用される。非病原性酵母株の例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＹａｒｒｏｗｉａが含まれる。１つの態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが使用される。さらに他の態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、および、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが使用される。本発明は上記の種リストに限定されず、当業者は本明細書の教示をいずれのタイプの酵母にも適用できることが理解される。別の態様では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が本発明の方法を実施するのに使用される。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、分子操作の容易さ、および食品添加物としての使用に「一般に安全と認められる」すなわち「ＧＲＡＳ」である（ＧＲＡＳ、ＦＤＡ提案規則６２ＦＲ１８９３８、１９９７年、４月１７日）ため好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
ｐＨレベルは、酵母の培養に重要である。当業者は、培養工程には、酵母培養の開始だけでなく、同様に培養の維持も含まれることを理解するであろう。酵母培養は、いずれのｐＨレベルでも開始することができるが、酵母培養の培地は、時間とともにより酸性（すなわち、ｐＨ低下）になる傾向があるため、培養工程中はｐＨレベルをモニターすることを注意しなければならない。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
他の添加剤は、異種遺伝子の発現誘導など、他の目的で酵母培養に添加することができる。いくつかの態様では、血球凝集素発現の発現を誘導するのに銅が使用される。しかし、銅の使用は、中性ｐＨでは理想的ではなく、そのため、中性ｐＨで増殖される酵母で発現される誘導性遺伝子の調節には、銅以外の添加剤が推奨される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
酵母培養に対する中性ｐＨの効果
酵母の培養における中性ｐＨの使用は、免疫調節および／または免疫応答誘発のためのビヒクルとして酵母を使用するのに望ましい特徴である、いくつかの生物学的効果を促進する。１つの態様では、中性ｐＨでの酵母の培養は、倍加時間に何らのマイナス効果を与えることなく（例えば、倍加時間の減速）を与えることなく、酵母の良好な増殖を可能にする。酵母は、細胞壁の柔軟性を失うことなく高密度まで増殖し続けることができる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
別の態様では、少なくとも５．５のｐＨ、またはｐＨ５．５〜８の間などの中性ｐＨの使用は、すべての回収密度で柔軟な細胞壁を有する酵母および／または細胞壁消化酵素（例えば、グルカナーゼ）に感受性を有する酵母の産生を可能にする。このため、本発明は、従来のアッセイで測定した細胞壁の柔軟性（例えば、グルカナーゼに対する感受性）を有する酵母の方法および組成物を提供する。事前実験は、酵母が、０．５ＹＵ（酵母単位）／ｍｌの回収密度で、細胞壁消化酵素による消化に対する感受性を喪失することを立証した。このため、１つの利点は、０．５ＹＵ／ｍｌでの標準的な増殖培地で培養された酵母により行われる比較を、任意の密度での中性ｐＨ増殖との比較に使用できることである。柔軟な細胞壁を有する酵母は、酵母を宿す細胞におけるサイトカイン（例えば、ＩＮＦ−ガンマ）分泌を促進するなど、独特の免疫応答を示すことができるため、この特性は望ましい。当業者が中性ｐＨの方法を使用すると考えられる別の理由は、細胞壁に位置する抗原への到達性を高められる点である。これは、発現タンパク質の免疫原性の増大、およびフローサイトメトリーなどの標準技術で測定した、抗体検出に有用である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
中性ｐＨで培養された酵母で観察されるさらに別の望ましい特徴は、免疫調節の目的で有益な方法での抗原発現である。１つの態様では、酵母は抗原発現のためのビヒクルとして使用される（例えば、米国特許第５，８３０，４６３号および第７，０８３，７８７号を参照されたい）。抗原は、酵母にとって天然の抗原、あるいは酵母により発現される異種抗原であってよい。いくつかの態様では、抗原発現のための酵母の使用は、様々な疾患および病気（例えば、感染症または癌）と闘うワクチン、予防薬、および治療薬の開発に役立つ。中性ｐＨの方法を用いて、当業者は、抗原が他の細胞（例えば、免疫共刺激性機能または免疫制御のため）または他の作用物質（例えば、検出用抗体）により到達可能な抗原提示酵母を産生することができる。さらに、インフルエンザＨＡ抗原などのいくつかの抗原に中性ｐＨを使用することは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）による処理により、ジスルフィド結合したＨＡの遊離を可能にする。これは、ＨＡ発現酵母が、ｐＨがｐＨ５より下に低下する培地で培養される場合には不可能なことである。いくつかの場合では、これは、わずかな時間でもｐＨがｐＨ５より下に低下する場合に生じる。他の場合では、これは、１もしくは数分または１もしくはより長い時間、ｐＨがｐＨ５より下に低下する場合に生じる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
中性ｐＨの方法に従い培養された酵母が示す別の望ましい特徴は、酵母に曝露した細胞からのＴｈ１型サイトカインの分泌である。Ｔｈ１型サイトカインの例には、インターフェロン−ガンマ、ＩＬ−１２、およびＩＬ−２が含まれるが、これらに限定されない。実施例にさらに詳述されている通り、中性ｐＨプロトコルに従い増殖された酵母が添加された樹状細胞は、低い（酸性）ｐＨ培地で増殖された酵母に比べて、インターフェロン−ガンマ分泌および発現レベルの上昇を示す。中性ｐＨ培養方法を用いる場合、ＩＬ−１２分泌レベルの低下はなかった。このため、当業者は、免疫調節の目的、例えば、増大したＴｈ１型応答から恩恵を受けると考えられる、疾患または障害に苦しんでいる個体においてＴｈ１型応答を誘導するために、本明細書に開示された中性ｐＨの方法を使用することができる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
中性ｐＨの方法を用いて増殖された酵母の組成物
本発明はまた、本明細書に開示された中性ｐＨの方法を用いて増殖された酵母を含む組成物も企図する。１つの態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で天然抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、アジュバントとしての投与など、様々な目的に有用であり得る。別の態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で異種抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、免疫調節を必要としている個体における免疫調節およびワクチン開発など、様々な目的に有用であり得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
これらの組成物はまた、医薬的に許容可能な賦形剤および／または担体を含むこともできる。医薬的に許容可能な担体には、滅菌水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれ得る。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補液、電解質補液（リンゲルデキストロースを基にしたものなど）などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような防腐剤および他の添加剤も存在することができる。医薬的に許容可能な賦形剤を有する、中性ｐＨ条件下で増殖された酵母を含む組成物製剤は、一般に当業者には日常的である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
（実施例１）
酵母培地処方
様々なタイプの培地を、酵母を培養するのに使用およびｐＨレベルが中性になるように調整することができる。使用することができる培地のいくつかの例を以下に提供するが、本発明は、これらの培地成分または培地プロトコルの使用に限定されないことを理解されたい。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
【化１９】
2010517537.tif 000001
別の態様では、コハク酸塩含有緩衝培地を使用する。コハク酸塩含有酵母培地の例は以下である。ｐＨ６．９に調整したＵＤＭＳ培地処方は以下の通りである。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
【化２４】
2010517537.tif 000002
（実施例２）
細胞増殖および培養ｐＨに対する培地ｐＨの効果
図１に示した通り、細胞増殖および培養ｐＨに対する培地ｐＨの効果を試験した。細胞は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２またはリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を補充したＵ２培地で増殖させた。対照培養物は、培地に緩衝液を添加せずにＵ２培地で増殖させた。対照として特筆される条件（培地ｐＨ５．５と同じ）または培地ｐＨ７．２としては、これらの対照物の増殖培地は、酵母を接種する前に塩基（ＮａＯＨ）によりｐＨ５．５またはｐＨ７．２のいずれかに調整した。培養物を３０℃でインキュベートし、細胞数および培養ｐＨを最大１６時間モニターした。結果は、様々なｐＨレベルでの緩衝液が、酵母の増殖速度に影響したことを示す。図１に示した通り、倍加時間は２．８〜４．５時間の範囲であった。非緩衝ｐＨ７培地におけるｐＨは、２．０ＹＵ／ｍＬで約５．５であった。これは、ｐＨを中性レベルに保つためにいくつかの形態の緩衝剤が必要であることを示すものである。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
（実施例３）
細胞壁厚に対する培地ｐＨの効果
培地ｐＨの効果を試験して、細胞壁厚に何らかの効果を有するかどうかを判定した。増殖培地および条件は実施例１と同じであった。培養物は、０．５〜２．０ＹＵ／ｍＬの範囲の密度で回収した。図２の凡例では、培養物を回収した密度がダッシュマークの後ろの数字で記されている。例えば、対照−０．６とは、細胞をｐＨ５．５で非緩衝培地で増殖し、次いで、細胞が０．６ＹＵ／ｍＬ密度に達したときに回収したことを意味する。フラスコ１〜３の条件（例えば１〜０．５、２〜２．０または３〜１．０）は、図の下に記載されており、回収時の細胞密度は凡例に記されている。使用した溶解アッセイプロトコルは以下の通りであった：（１）洗浄した細胞１０ＹＵを１ｍＬのＴｒｉｓ−ＢＭＥで再懸濁する；（２）「時間０」の試料を採取し、６００ｎｍでＯＤを測定する；（３）グルカナーゼ２０Ｕを添加する；（４）３０℃で回転させる；（５）１０分ごとに、試料を採取しＯＤを測定する。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
（実施例４）
７５−１５細胞の構築
ＴＫ７５−１５で表される融合タンパク質は、ＴＥＦ２プロモーターに誘導されるＡｇａ２配列を用いて細胞壁にインフルエンザＨＡタンパク質を発現するように設計した。このコンストラクトでは、Ａｇａ２配列のＣ末端にＨＡ配列を有するタンパク質を構築した。このタンパク質は、Ａｇａ１ｐ（この場合では、ＣＵＰ１プロモーターによって駆動される）も発現する細胞で発現した場合、酵母細胞の外側の細胞壁、およびサイトゾルに局在する。インフルエンザＨＡ抗原を含む融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へとインフレームで融合される以下の配列要素を有する単一のポリペプチドである（融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号１で表される）：１）天然の１８アミノ酸ＥＲ標的シグナル配列（配列番号１の位置１〜１８）を含む、完全長のＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｇａ２タンパク質配列（配列番号１の位置１〜８７）；２）ＨＡ本体からＡｇａ２を隔てるスペーサー（位置８８および８９）；３）シグナル配列（配列番号１の位置９０〜６００）を欠く、およびＨＡの３６個のＣ末端残基を欠き、それによってＣ末端膜アンカーおよび細胞質尾部が排除された、インフルエンザＨＡタンパク質；４）ヒスチジンタグからＨＡタンパク質本体を隔てるトリグリシンスペーサー（配列番号１の位置６０１〜６０３）；および５）Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１の位置６０４〜６０９）。配列番号１の融合タンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に配列番号２で表される。この融合タンパク質およびこれを発現するタルモゲン（Ｔａｒｍｏｇｅｎ）は、７５−１５と呼ぶことができる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
【化２７】
2010517537.tif 000003
（実施例５）
７５−１５細胞増殖および培養ｐＨに対する異なる緩衝剤（ｐＨ６．５培地）の効果
細胞増殖に対する効果および培養ｐＨに対する効果を判定するため、異なる緩衝剤を７５−１５細胞で試験した。これらの緩衝剤を図３に示す。これらの緩衝剤には、コハク酸塩、クエン酸塩、および炭酸塩が含まれる。いずれの緩衝剤も沈殿形成をもたらすことはなかった。使用した緩衝剤のすべてが、標準的な増殖培地に十分に溶解した。すべての試験培養物のｐＨを、酵母の接種前にｐＨ６．５に調整した。培養物を、次いで、振盪フラスコで３０℃で最大１５時間増殖させた。細胞を炭酸塩緩衝剤で増殖させた場合には、最少の増殖が見られた、または増殖は見られなかった。図３に見られる通り、異なる緩衝剤の使用は、増殖速度に影響した。増殖は、中性ｐＨ（少なくともｐＨ５．５）で速かった。特に、コハク酸塩緩衝剤を有する培地は、倍加時間に関して最良であった（約２．５時間の倍加時間）。反対に、酵母細胞をｐＨ５．５未満（より酸性条件）で増殖させた場合、倍加時間は約３．５時間で減速した。クエン酸塩は同様の倍加時間であった（約３．５時間）。０．０５Ｍでのクエン酸塩は、０．０２Ｍでのコハク酸塩より緩衝能力が増大した。これらの実験では、発現誘導のため培養物すべてに０．３５ｍＭの銅を入れた。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
（実施例７）
培地処方試験
酵母培地に添加される他の剤の寄与を試験し、結果を図５に示す。Ｕ２またはＵ４は、基本的な培地組成物を指す。タンパク質発現は、銅誘導性ＣＵＰ１プロモーターの調節下にあるため、ＨＡタンパク質を発現するのに誘導される酵母細胞用の培地に、０．３５ｍＭの銅を添加する。ソイトン（図５のＳｏｙ）は、大豆のペプシン消化により得られる栄養素の市販の複合体混合物である。ソイトンの添加は、最速の増殖および最高収量（３０ＹＵ／ｍＬ）をもたらした。０．０８Ｍのコハク酸の使用は、より良好な緩衝能力を示した。細胞は、３０℃で、ｘ軸に示した時間の間増殖させた。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
（実施例９）
サイトカイン産生に対する中性ｐＨの効果
ｐＨが、ｐＨ５．５より上に維持されたか、またはｐＨ５．５より上に維持されなかった培地で増殖させたＹＶＥＣ酵母（異種抗原を発現していない）を添加した、樹状細胞（ＤＣ）を用いて、中性ｐＨで酵母を培養することがサイトカイン産生に与える効果を実験した。マウス骨髄由来樹状細胞に、ＤＣあたり１０酵母を、ＲＰＭ１培地で４８時間、３７℃で一緒にインキュベートして添加した。次いで、上清を、分泌されたサイトカインについて分析した。図９はこれらの実験結果を示す。下のパネルは、中性ｐＨ（すなわち、少なくとも５．５以上）で増殖される酵母が添加された樹状細胞からのＩＦＮ−ガンマ分泌は著しく増加すること、酵母がｐＨを５．５未満に低下させた培地で培養される場合には、著しい増加は見られないことを示す。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2010517537.tif 000004
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2010517537.tif 000005
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2010517537.tif 000006
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2010517537.tif 000007