【手続補正書】
【提出日】平成23年8月19日(2011.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に導入した場合にＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲのｉｎ  ｖｉｖｏ発現、及び細胞増殖を阻害する単離二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含む、二本鎖分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の様々な態様及び用途は、以下の図面の簡単な説明、及び本発明の詳細な説明、及びその好ましい実施形態を鑑みて当業者に明らかとなる。
[請求項1001]
細胞に導入した場合にＥＢＩ3、ＣＤＫＮ3、ＥＦ−1δ、又はＮＰＴＸＲのｉｎ  ｖｉｖｏ発現、及び細胞増殖を阻害する単離二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含む、二本鎖分子。
[請求項1002]
前記センス鎖が配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項1001に記載の二本鎖分子。
[請求項1003]
前記二本鎖分子が、約19ヌクレオチド長〜約25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項1002に記載の二本鎖分子。
[請求項1004]
介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項1001に記載の二本鎖分子。
[請求項1005]
一般式：
5’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−3’
を有する二本鎖分子であって、式中、［Ａ］は配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、請求項1004に記載の二本鎖分子。
[請求項1006]
請求項1001〜1005のいずれか1項に記載の二本鎖分子を発現するベクター。
[請求項1007]
ＥＢＩ3、ＣＤＫＮ3、ＥＦ−1δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子から成る群から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する癌を治療する方法であって、請求項1001〜1004のいずれか1項に記載の単離二本鎖分子、又は請求項1006に記載のベクターの少なくとも1つを投与する工程を含む方法。
[請求項1008]
治療される前記癌が肺癌である、請求項1007に記載の方法。
[請求項1009]
ＥＢＩ3、ＣＤＫＮ3、ＥＦ−1δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子から成る群から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する癌を治療するための組成物であって、請求項1001〜1004のいずれか1項に記載の単離二本鎖分子又は請求項1006に記載のベクターの少なくとも1つを含む、組成物。
[請求項1010]
治療される前記癌が肺癌である、請求項1009に記載の組成物。
[請求項1011]
肺癌を診断する方法であって、
（ａ）被験体から得た生体試料において、
（ｉ）ＥＢＩ3、ＤＬＸ5、及びＣＤＫＮ3の群から選択されるｍＲＮＡを検出すること、
（ｉｉ）ＥＢＩ3、ＤＬＸ5、及びＣＤＫＮ3の群から選択されるタンパク質を検出すること、及び
（ｉｉｉ）ＥＢＩ3、ＤＬＸ5、及びＣＤＫＮ3の群から選択されるタンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択される方法のいずれか1つによって、遺伝子の発現レベルを求める工程、並びに
（ｂ）前記遺伝子の正常対照レベルと比較した場合の、工程（ａ）において求められる前記発現レベルの上昇を、肺癌の存在と関連付ける工程
を含む、方法。
[請求項1012]
工程（ａ）において求められる前記発現レベルが、前記正常対照レベルより少なくとも10％高い、請求項1011に記載の方法。
[請求項1013]
工程（ａ）において求められる前記発現レベルをＥＢＩ3、ＤＬＸ5、及びＣＤＫＮ3の群から選択されるタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより求める、請求項1011に記載の方法。
[請求項1014]
前記被験体から得た生体試料が生検材料、痰、血液、胸水、又は尿を含む、請求項1011に記載の方法。
[請求項1015]
肺癌患者の予後を判定又は決定する方法であって、
（ａ）患者から得た生体試料において遺伝子の発現レベルを検出する工程、
（ｂ）検出される前記発現レベルを対照レベルと比較する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）の比較に基づいて前記患者の予後を決定する工程
を含み、前記遺伝子がＥＢＩ3、ＤＬＸ5、ＣＤＫＮ3、又はＥＦ−1δから成る群から選択される、方法。
[請求項1016]
前記対照レベルが予後良好な対照レベルであり、該対照レベルと比較した場合の前記発現レベルの上昇が、予後不良であると決定される、請求項1015に記載の方法。
[請求項1017]
前記上昇が前記対照レベルより少なくとも10％高い、請求項1015に記載の方法。
[請求項1018]
前記発現レベルが、
（ａ）ＥＢＩ3、ＤＬＸ5、ＣＤＫＮ3、又はＥＦ−1δのｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＥＢＩ3、ＤＬＸ5、ＣＤＫＮ3又はＥＦ−1δタンパク質を検出すること、及び
（ｃ）ＥＢＩ3、ＤＬＸ5、ＣＤＫＮ3又はＥＦ−1δタンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択される方法のいずれか1つによって求められる、請求項1015に記載の方法。
[請求項1019]
前記患者から得た生体試料が生検材料、痰、又は血液、胸水、又は尿を含む、請求項1015に記載の方法。
[請求項1020]
肺癌を診断するか、又は肺癌患者の予後を判定若しくは決定するためのキットであって、
（ａ）遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬、
（ｂ）前記遺伝子によりコードされるタンパク質を検出するための試薬、及び
（ｃ）前記タンパク質の生物活性を検出するための試薬
から成る群から選択される試薬を含み、前記遺伝子がＥＢＩ3、ＤＬＸ5、ＣＤＫＮ3、又はＥＦ−1δから成る群から選択される、キット。
[請求項1021]
前記試薬が前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブである、請求項1020に記載のキット。
[請求項1022]
前記試薬が前記遺伝子によりコードされる前記タンパク質に対する抗体である、請求項1020に記載のキット。
[請求項1023]
被験体において肺癌を診断する方法であって、
（ａ）診断される被験体に由来する血液試料を準備する工程、
（ｂ）前記血液試料におけるＥＢＩ3タンパク質のレベルを求める工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）において求められる前記ＥＢＩ3レベルを正常対照のＥＢＩ3レベルと比較する工程
を含み、前記血液試料におけるＥＢＩ3レベルが前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、方法。
[請求項1024]
前記血液試料が全血、血清、及び血漿から成る群から選択される、請求項1023に記載の方法。
[請求項1025]
前記ＥＢＩ3タンパク質をイムノアッセイにより検出する、請求項1023に記載の方法。
[請求項1026]
前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡである、請求項1025に記載の方法。
[請求項1027]
（ｄ）前記血液試料におけるＣＥＡのレベルを求める工程、及び
（ｅ）工程（ｄ）において求められる前記ＣＥＡレベルを正常対照のＣＥＡレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるＥＢＩ3レベル及びＣＥＡレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項1023に記載の方法。
[請求項1028]
前記肺癌がＮＳＣＬＣである、請求項1027に記載の方法。
[請求項1029]
（ｄ）前記血液試料におけるＣＹＦＲＡのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｅ）において求められる前記ＣＹＦＲＡレベルを正常対照のＣＹＦＲＡレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるＥＢＩ3レベル及びＣＹＦＲＡレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項1023に記載の方法。
[請求項1030]
前記肺癌がＳＣＣである、請求項1029に記載の方法。
[請求項1031]
（ｄ）前記血液試料におけるｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｅ）において求められる前記ｐｒｏ−ＧＲＰレベルを正常対照のｐｒｏ−ＧＲＰレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるＥＢＩ3レベル及びｐｒｏ−ＧＲＰレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項1023に記載の方法。
[請求項1032]
前記肺癌がＳＣＬＣである、請求項1031に記載の方法。
[請求項1033]
ＥＢＩ3を発現する癌を検出するためのキットであって、
（ｉ）血液試料におけるＥＢＩ3のレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｉ）ＥＢＩ3に対する陽性対照試料
を含む、キット。
[請求項1034]
（ｉｉｉ）血液試料におけるＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｖ）ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰに対する陽性対照試料をさらに含む、請求項1033に記載のキット。
[請求項1035]
前記陽性対照試料がＥＢＩ3、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰに対して陽性である、請求項1034に記載のキット。
[請求項1036]
被験体における肺癌を診断する方法であって、
（ａ）診断を受ける被験体から血液試料を採取する工程、
（ｂ）前記血液試料におけるＮＰＴＸ1及びＣＹＦＲＡのレベルを求める工程、
（ｃ）工程（ｂ）において求められる前記ＮＰＴＸ1レベル及び前記ＣＹＦＲＡレベルを、正常対照のＮＰＴＸ1レベル及びＣＹＦＲＡレベルと比較する工程、及び
（ｄ）前記血液試料において、前記正常対照と比較して高いＮＰＴＸ1レベル及び高いＣＹＦＲＡレベルのいずれか又は両方が、前記被験体が肺癌を患っていることを示唆すると判断する工程
を含む、方法。
[請求項1037]
前記肺癌が扁平上皮癌（ＳＣＣ）である、請求項1036に記載の方法。
[請求項1038]
前記血液試料が全血、血清、及び血漿から成る群から選択される、請求項1036に記載の方法。
[請求項1039]
ＮＰＴＸ1及びＣＹＦＲＡタンパク質を発現する癌を検出するためのキットであって、
（ｉ）血液試料におけるＮＰＴＸ1及びＣＹＦＲＡタンパク質のレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｉ）ＮＰＴＸ1及びＣＹＦＲＡタンパク質に対する陽性対照試料
を含む、キット。
[請求項1040]
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物をＥＢＩ3、ＤＬＸ5、又はＣＤＫＮ3のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチドと前記試験化合物との結合活性を検出する工程、及び
（ｃ）前記ポリペプチドに結合する化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1041]
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物をＥＢＩ3、ＤＬＸ5、又はＣＤＫＮ3のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の前記ポリペプチドの生物活性を検出する工程、及び
（ｃ）ＥＢＩ3、ＤＬＸ5、又はＣＤＫＮ3の前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドの生物活性を、前記試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して抑制する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1042]
前記生物活性が細胞増殖、細胞浸潤、細胞外分泌、ホスファターゼ活性、及びＡｋｔリン酸化の促進の群から選択される、請求項1041に記載の方法。
[請求項1043]
前記ホスファターゼ活性がＥＦ−1δを用いて検出されたものである、請求項1042に記載の方法。
[請求項1044]
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物をＥＢＩ3、ＤＬＸ5、又はＣＤＫＮ3を発現する細胞と接触させる工程、及び
（ｂ）前記試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＥＢＩ3、ＤＬＸ5、又はＣＤＫＮ3の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1045]
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物をＥＢＩ3、ＤＬＸ5、又はＣＤＫＮ3の転写調節領域、及び該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる工程、
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
（ｃ）対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現又は活性レベルを低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1046]
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＣＤＫＮ3ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−1αポリペプチド、ＥＦ−1βポリペプチド、ＥＦ−1γポリペプチド、ＥＦ−1δポリペプチド、及びそれらの機能的等価物から成る群から選択される相互作用パートナーと接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
（ｃ）これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1047]
前記ＥＦ−1δポリペプチドの機能的等価物が、配列番号48から成るポリペプチドを含む、請求項1046に記載の方法。
[請求項1048]
前記ＣＤＫＮ3ポリペプチドの機能的等価物がＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−1αポリペプチド、ＥＦ−1βポリペプチド、ＥＦ−1γポリペプチド、又はＥＦ−1δ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項1046に記載の方法。
[請求項1049]
肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物をＣＤＫＮ3を過剰発現する細胞と接触させる工程、
（ｂ）Ａｋｔ  Ｓｅｒ473のリン酸化を測定する工程、及び
（ｃ）対照と比較して、前記リン酸化を低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1050]
肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＮＰＴＸ1ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＮＰＴＸＲポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
（ｃ）これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1051]
前記ＮＰＴＸ1ポリペプチドの機能的等価物がＮＰＴＸＲ結合ドメインを含む、請求項1050に記載の方法。
[請求項1052]
前記ＮＰＴＸＲポリペプチドの機能的等価物がＮＰＴＸ1結合ドメインを含む、請求項1050に記載の方法。
[請求項1053]
配列番号88又は配列番号89を含むポリペプチドに結合する抗体。
[請求項1054]
ＮＰＴＸ1中和活性を有する、請求項1053に記載の抗体。
[請求項1055]
肺癌を治療又は予防するための組成物であって、薬学的に有効な量の抗ＮＰＴＸ1抗体又はその断片を含む、組成物。
[請求項1056]
前記ＮＰＴＸ1抗体が請求項1053及び1054に記載の抗体である、請求項1055に記載の組成物。
[請求項1057]
被験体において肺癌を治療又は予防する方法であって、該被験体に抗ＮＰＴＸ1抗体又はその断片を投与することを含む、方法。
[請求項1058]
前記ＮＰＴＸ1抗体が請求項1053及び1054に記載の抗体である、請求項1057に記載の方法。
[請求項1059]
ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ（配列番号61）を含むポリペプチド又は該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列であって、配列番号8から成るペプチドの生物学的機能を欠く、ポリペプチド。
[請求項1060]
前記生物学的機能が細胞増殖活性である、請求項1059に記載のポリペプチド。
[請求項1061]
前記ポリペプチドが8個〜30個の残基から成る、請求項1059に記載のポリペプチド。
[請求項1062]
前記ポリペプチドが細胞膜透過性物質で修飾される、請求項1059に記載のポリペプチド。
[請求項1063]
一般式：
［Ｒ］−［Ｄ］
を有し、配列番号8から成るペプチドの生物学的機能を欠くポリペプチドであって、式中、［Ｒ］及び［Ｄ］はリンカーＧＧＧを介して直接的又は間接的に連結してもよく、［Ｒ］は細胞膜透過性物質を表し、［Ｄ］はＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ（配列番号61）を含む断片配列のアミノ酸配列、又は該断片配列を含む該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列を表す、請求項1059に記載のポリペプチド。
[請求項1064]
前記細胞膜透過性物質が：
ポリアルギニン、
Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ／配列番号63、
ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ／配列番号64、
ブホリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ／配列番号65、
トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ／配列番号66、
ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ／配列番号67、
Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ／配列番号68、
Ｋｕ70／ＶＰＭＬＫ／配列番号69、
Ｋｕ70／ＰＭＬＫＥ／配列番号70、
プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ／配列番号71、
ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ／配列番号72、
Ｐｅｐ−1／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ／配列番号73、
ＳｙｎＢ1／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ／配列番号74、
Ｐｅｐ−7／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ／配列番号75、及び
ＨＮ−1／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ／配列番号76
から成る群から選択されるいずれか1つである、請求項1063に記載のポリペプチド。
[請求項1065]
前記ポリアルギニンが11個のＡｒｇ（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ／配列番号77）である、請求項1064に記載のポリペプチド。
[請求項1066]
活性成分として請求項1059〜1065のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、癌の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤。
[請求項1067]
前記癌が肺癌である、請求項1066に記載の薬剤。
[請求項1068]
請求項1059〜1065のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与する工程を含む、癌を治療又は予防する方法。
[請求項1069]
前記癌が肺癌である、請求項1068に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
【図１Ａ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により検出された、１５組の臨床肺癌及び周囲正常肺組織の試料（上パネル）（肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；最上部）、並びに２３種の肺癌細胞株（下パネル）におけるＥＢＩ３の発現を示す。
【図１Ｂ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。癌細胞株及び気管支上皮細胞における内因性ＥＢＩ３タンパク質の発現及び細胞内局在化を示す。ＥＢＩ３は、ＮＣＩ−Ｈ１３７３細胞株及びＬＣ３１９細胞株においては粒状外観を呈した細胞の細胞質で染色されたが、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞株及び気管支上皮由来のＢＥＡＳ−２Ｂ細胞株においては染色されなかった。
【図１Ｃ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。培養培地における肺癌細胞株からのＥＬＩＳＡによる分泌ＥＢＩ３の検出を示す。分泌ＥＢＩ３は、ＥＢＩ３を発現する細胞株の培養培地において検出された。
【図１Ｄ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。１６種の正常成人ヒト組織におけるＥＢＩ３転写産物のノーザンブロット分析の結果である。強いシグナルが胎盤において観察された。
【図１Ｅ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。免疫組織化学による正常組織と腫瘍組織との間のＥＢＩ３タンパク質発現の比較を示す。
【図２Ａ】ＥＢＩ３過剰発現とＮＳＣＬＣ患者の予後不良との関連性を示す図である。肺癌組織及び正常組織におけるＥＢＩ３発現が強い例、弱い例、及び発現のない例を示す。原倍率：×１００（上レーン）、×２００（下レーン）。
【図２Ｂ】ＥＢＩ３過剰発現とＮＳＣＬＣ患者の予後不良との関連性を示す図である。ＥＢＩ３の発現に応じたＮＳＣＬＣ患者の生存率のカプラン・マイヤー分析の結果を示す（ログランク検定によるＰ＝０．００１１）。
【図３Ａ】ＥＬＩＳＡにより求めた、肺癌患者及び健常対照又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者におけるＥＢＩ３の血清中濃度を示す図である。肺ＡＤＣ、肺ＳＣＣ、又はＳＣＬＣの患者に由来する血清におけるＥＢＩ３の分布を示す。黒線：平均血清レベル。ＡＤＣ患者と健常個体／ＣＯＰＤ患者との間の差（それぞれＰ＜０．００１、マンホイットニーＵ検定）、ＳＣＣ患者と健常個体／ＣＯＰＤ患者との間の差（Ｐ＜０．００１）、及びＳＣＬＣ患者と健常／ＣＯＰＤ個体との間の差（Ｐ＜０．００１）は有意であったが、健常個体とＣＯＰＤ患者との間の差は有意ではなかった（Ｐ＝０．１６０）。
【図３Ｂ】ＥＬＩＳＡにより求めた、肺癌患者及び健常対照又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者におけるＥＢＩ３の血清中濃度を示す図である。肺ＡＤＣ、肺ＳＣＣ、又はＳＣＬＣの様々な臨床段階での患者に由来する血清におけるＥＢＩ３の分布を示す。ＬＤは限局性疾患を意味する。ＥＤは広範な疾患を意味する。
【図４Ａ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。左パネルは、肺癌に対する血清マーカーとしてのＥＢＩ３のＲＯＣ曲線分析を示す。Ｘ軸：１−特異度。Ｙ軸：感度。カットオフレベルは、ＥＢＩ３に最適な診断精度及び尤度比（最小の偽陰性及び偽陽性結果）をもたらすように設定した（すなわち、１１．８単位／ｍＬ）。右パネルは、原発性ＮＳＣＬＣの切除前及び切除後のＥＢＩ３の血清レベルを示す。手術後の血清は、外科手術の２ヶ月後に得た。
【図４Ｂ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。同じＮＳＣＬＣ患者の原発性腫瘍組織における血清ＥＢＩ３レベル（Ｕ／ｍＬ）及びＥＢＩ３の発現レベルを示す。
【図４Ｃ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。上パネルは、ＥＢＩ３（青色）、及び肺癌の各々の組織型に対する血清マーカーである他の従来の腫瘍マーカー（ＣＥＡ：赤色、ＣＹＦＲＡ：緑色、ＰｒｏＧＲＰ：黄色）のＲＯＣ曲線分析を示す。Ｘ軸：１−特異度。Ｙ軸：感度。下パネルはＥＢＩ３と他の腫瘍マーカーとの組み合わせ分析を示す。感度及び偽陽性の両方における右のバーは、肺癌の各々の組織型におけるＥＢＩ３、並びに３つの腫瘍マーカー（ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及びＰｒｏＧＲＰ）のいずれかを用いた組み合わせアッセイの感度又は偽陽性を示す。
【図４Ｄ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。ＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す。上パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した、Ａ５４９細胞及びＬＣ３１９細胞におけるＥＢＩ３発現に対する、ｓｉ−ＥＢＩ３（＃１及び＃２）及び対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＣＮＴ／ＯＮ−ｔａｒｇｅｔ、ｓｉ−ＬＵＣ／ルシフェラーゼ）による遺伝子ノックダウン効果を示す。下パネルは、ｓｉ−ＥＢＩ３又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞及びＬＣ３１９細胞のコロニー形成アッセイ及びＭＴＴアッセイを示す。コラム：三連アッセイの相対吸光度。バー：標準偏差。
【図４Ｅ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。高いレベルのＥＢＩ３を発現する２つの独立した形質転換体（ＣＯＳ−７−ＥＢＩ３−＃１及びＣＯＳ−７−ＥＢＩ３−＃２、上パネル）及び対照（ＣＯＳ−７−Ｍ１及びＣＯＳ−７−Ｍ２）を各々三連で培養した。１２０時間後、細胞生存率をＭＴＴアッセイ及びコロニー形成アッセイにより評価した（下パネル）。
【図５Ａ】肺腫瘍及び正常組織におけるＤＬＸ５の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、ＮＳＣＬＣ（腺癌及び扁平上皮癌）及び正常肺組織の臨床試料における遠位欠失ホメオボックス５（ＤＬＸ５）の発現を示す。
【図５Ｂ】肺腫瘍及び正常組織におけるＤＬＸ５の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより明らかにした、肺癌細胞株におけるＤＬＸ５の発現を示す。βアクチン（ＡＣＴＢ）の発現を量的対照とした。
【図５Ｃ】肺腫瘍及び正常組織におけるＤＬＸ５の発現を示す図である。共焦点顕微鏡法により検査したＤＬＸ５タンパク質の細胞内分布（subcellulardistribution）を示す。
【図５Ｄ】肺腫瘍及び正常組織におけるＤＬＸ５の発現を示す図である。ノーザンブロット分析により検出した、正常ヒト組織におけるＤＬＸ５の発現を示す。
【図６Ａ】ＤＬＸ５タンパク質発現の免疫組織化学的評価（immunohistochemicalevaluation）、及びその過剰発現とＮＳＣＬＣ患者に関する予後不良との関連性、及びＳＢＣ−５癌細胞におけるＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡによる成長の阻害を示す図である。ウサギポリクローナル抗ＤＬＸ５抗体を用いた免疫組織化学的染色（対比染色にはヘマトキシリンを用いた）により検出した、５種の正常ヒト組織及び肺ＳＣＣにおけるＤＬＸ５の発現を示す（×２００）。ポジティブ染色は、胎盤（矢印）における合胞体栄養細胞層の細胞質及び／又は核、並びに肺癌細胞において見られた。
【図６Ｂ】ＤＬＸ５タンパク質発現の免疫組織化学的評価、及びその過剰発現とＮＳＣＬＣ患者に関する予後不良との関連性、及びＳＢＣ−５癌細胞におけるＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡによる成長の阻害を示す図である。肺癌（ＳＣＣ、×１００）及び正常肺（×１００）におけるＤＬＸ５の発現の代表的な例、並びにＳＣＣ陽性症例の拡大図（×２００）を示す。
【図６Ｃ】ＤＬＸ５タンパク質発現の免疫組織化学的評価、及びその過剰発現とＮＳＣＬＣ患者に関する予後不良との関連性、及びＳＢＣ−５癌細胞におけるＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡによる成長の阻害を示す図である。ＮＳＣＬＣ患者におけるＤＬＸ５発現レベルによる腫瘍特異的な生存のカプラン・マイヤー分析の結果を示す。
【図６Ｄ】ＤＬＸ５タンパク質発現の免疫組織化学的評価、及びその過剰発現とＮＳＣＬＣ患者に関する予後不良との関連性、及びＳＢＣ−５癌細胞におけるＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡによる成長の阻害を示す図である。ＳＢＣ−５細胞において半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出したＤＬＸ５発現のレベルを示す。対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＰ又はｓｉ−スクランブル／ＳＣＲ）又はｓｉ−ＤＬＸ５のいずれかによる治療の効果を、上部パネルに示す。ＭＴＴアッセイにより検出した、ＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡの細胞生存率に対する効果は、下部パネルに示す。
【図７Ａ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。上部パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、１５種の肺癌臨床試料（１０種のＮＳＣＬＣ及び５種のＳＣＬＣ）（Ｔ）及びそれらに対応する正常肺組織（Ｎ）におけるＮＰＴＸ１の発現を示す。各々の一本鎖ｃＤＮＡの適当な希釈物は臨床肺癌試料のｍＲＮＡから調製し、βアクチン（ＡＣＴＢ）の発現レベルを量的対照とする。下部パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、２３種の肺癌細胞株におけるＮＰＴＸ１の発現を示す。
【図７Ｂ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。ウエスタンブロット分析により検査した、４種の肺癌細胞株におけるＮＰＴＸ１タンパク質の発現を示す。
【図７Ｃ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。４種の肺癌細胞株における内因性ＮＰＴＸ１タンパク質の細胞内局在化を示す。ＮＰＴＸ１は、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ５２０細胞、及びＳＢＣ−５細胞においては粒状外観を呈した細胞の細胞質で染色されたが、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞では染色されなかった。
【図７Ｄ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。ＮＰＴＸ１を発現するＮＣＩ−Ｈ２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ５２０細胞、及びＳＢＣ−５細胞、並びにＮＰＴＸ１を発現しないＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞からの馴化培地における、分泌ＮＰＴＸ１タンパク質のＥＬＩＳＡによる検出を示す。
【図７Ｅ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、９種の臨床肺癌（下部パネル）及び２３種の肺癌細胞株（上部パネル）におけるＮＰＴＸ１及びＮＰＴＸＲの発現を示す。
【図８Ａ】正常組織及び肺癌組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。ノーザンブロット分析により検出した、正常ヒト組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す。
【図８Ｂ】正常組織及び肺癌組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。代表的な肺腺癌（ＡＤＣ）組織及び５種の正常組織（心臓、肝臓、腎臓、副腎）におけるＮＰＴＸ１タンパク質の免疫組織化学的評価の結果を示す。
【図８Ｃ】正常組織及び肺癌組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。組織マイクロアレイ上の抗ＮＰＴＸ１抗体を用いた代表的な肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）におけるＮＰＴＸ１の免疫組織化学的染色の結果を示す（原倍率：×２００）。
【図８Ｄ】正常組織及び肺癌組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。上部パネルは、肺ＡＤＣにおけるＮＰＴＸ１発現が強い例、弱い例、及び発現のない例を示す。下部パネルは、ＮＳＣＬＣ患者におけるＮＰＴＸ１発現による腫瘍特異的な生存のカプラン・マイヤー分析を示す（Ｐ＜０．０００１、ログランク検定）。
【図９Ａ】肺癌患者及び健常ドナー又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者における、ＥＬＩＳＡにより求められるＮＰＴＸ１の血清濃度を示す図である。肺ＡＤＣ、肺ＳＣＣ、又はＳＣＬＣの患者に由来する血清におけるＮＰＴＸ１の分布を示す。ＡＤＣ患者と健常／ＣＯＰＤ個体との間の差（Ｐ＜０．００１、マンホイットニーＵ検定）、ＳＣＣ患者と健常／ＣＯＰＤ個体との間の差（Ｐ＝０．００５）、及びＳＣＬＣ患者と健常／ＣＯＰＤ個体との間の差（Ｐ＝０．００５１）は有意であった。健常個体とＣＯＰＤ個体との間の差は有意ではなかった。
【図９Ｂ】肺癌患者及び健常ドナー又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者における、ＥＬＩＳＡにより求められるＮＰＴＸ１の血清濃度を示す図である。肺癌の様々な臨床段階での患者に由来する血清におけるＮＰＴＸ１の分布を示す。ＬＤは限局性疾患を意味する。ＥＤは広範な疾患を意味する。
【図９Ｃ】肺癌患者及び健常ドナー又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者における、ＥＬＩＳＡにより求められるＮＰＴＸ１の血清濃度を示す図である。ＮＳＣＬＣ患者における外科手術の前及び後（手術後２ヶ月）のＮＰＴＸ１の血清濃度を示す。
【図９Ｄ】肺癌患者及び健常ドナー又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者における、ＥＬＩＳＡにより求められるＮＰＴＸ１の血清濃度を示す図である。同じＮＳＣＬＣ患者の原発性腫瘍組織における血清ＮＰＴＸ１レベル及びＮＰＴＸ１の発現レベルを示す（原倍率：×１００）。
【図１０Ａ】ＮＰＴＸ１のオートクリン細胞成長効果を示す図である。ＮＰＴＸ１に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長阻害を示す。上部パネルは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した、Ａ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞における、ｓｉ−ＮＰＴＸ１（ｓｉ−１、ｓｉ−２）又は対照ｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ又はＳＣＲ）に応じたＮＰＴＸ１の発現を示す。中央のパネルは、ＮＰＴＸ１に関して特異的なｓｉＲＮＡ又は対照プラスミドをトランスフェクトしたＡ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞のコロニー形成アッセイにより検査したコロニーの画像を示す。下パネルは、ｓｉ−ＮＰＴＸ１、ｓｉ−ＬＵＣ、又はｓｉ−ＳＣＲに応じた、ＭＴＴアッセイにより評価したＡ５４９細胞又はＳＢＣ−５細胞の生存率を示す。全てのアッセイは三連ウェルで３回実行した。
【図１０Ｂ】ＮＰＴＸ１のオートクリン細胞成長効果を示す図である。ＣＯＳ−７細胞において一過性に過剰発現されたＮＰＴＸ１の成長促進効果を示す。上パネルは、ウエスタンブロット分析により検出した、ＣＯＳ−７細胞におけるＮＰＴＸ１の一過性発現を示す。下パネルは、ＭＴＴアッセイ（左）及びコロニー形成アッセイ（右）により評価したＣＯＳ−７細胞の生存率を示す。
【図１０Ｃ】ＮＰＴＸ１のオートクリン細胞成長効果を示す図である。左パネルは、哺乳類細胞の成長に対するＮＰＴＸ１のオートクリン／パラクリン効果を示す。細胞生存率はＭＴＴアッセイにより計算した（ＣＯＳ−７細胞は最終濃度０ｎＭ、０．１ｎＭ、又は１ｎＭのＮＰＴＸ１で処理した）（ＰＢＳで示した右レーン）。ＭＴＴアッセイによって、ＣＯＳ−７細胞の培養培地におけるＮＰＴＸ１タンパク質（０ｎＭ、０．１ｎＭ、又は１ｎＭ）の活性に対する抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１、５０ｎＭ）及び対照ＩｇＧ（正常マウス、５０ｎＭ）の競合的中和効果を評価する（抗ＮＰＴＸ１ｍＡｂ及びＩｇＧで示した左及び中央のレーン）。右パネルは、抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（２５ｎＭ又は５０ｎＭ）による、ＮＰＴＸ１を過剰発現した肺癌Ａ５４９細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長の用量依存的な阻害を示す。各々の実験は三連で行なった。
【図１０Ｄ】ＮＰＴＸ１のオートクリン細胞成長効果を示す図である。抗ＮＰＴＸ１抗体による各種肺癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長の阻害を示す。ＭＴＴアッセイにより、抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１、５０ｎＭ）の、ＮＰＴＸ１を過剰発現する肺癌細胞株ＳＢＣ−５（Ｐ＝０．０１２、各々両側ｔ検定）、並びにＮＰＴＸ１を発現しない肺癌細胞株ＳＢＣ−３及びＮＣＩ−Ｈ２１７０の成長に対する効果を評価する。各々の実験は三連で行なった。
【図１１】ＮＰＴＸ１発現プラスミドをトランスフェクトした哺乳類細胞の浸潤能亢進を示す図である。アッセイにより、ヒトＮＰＴＸ１に対する発現プラスミドをトランスフェクトした後のマトリゲルマトリクスにおけるＮＩＨ−３Ｔ３細胞の浸潤性を実証する。左上パネルは、ウエスタンブロット分析により検出したＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＮＰＴＸ１の一過性発現を示す。下パネルは、マトリゲル被覆フィルタを通って移動する細胞のギムザ染色（×２００）及び数を示す。アッセイは各々三連ウェルで３回実行した。
【図１２】ヌードマウスに移植したＡ５４９細胞に対する抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体の効果を示す図である。上パネルには、抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１、３００μｇ／体重）又は正常マウスＩｇＧ（対照１、３００μｇ／体重）で週２回処理した３匹のマウス、及び処理しなかった３匹のマウス（対照２）の平均腫瘍容積をプロットした。値は腫瘍容積の平均±標準誤差として表される。動物に各々の抗体を腹腔内注射により３０日間週２回投与した。下パネルは、抗ＮＰＴＸ１抗体で処理した、ＨＥ染色した腫瘍（Ａ５４９）の組織病理学的検査を示す。ＮＰＴＸ１抗体による処理の３０日後、対照ＩｇＧで処理した腫瘍組織又は処理しなかった腫瘍組織と比較して、抗ＮＰＴＸ１抗体で処理した腫瘍組織においては、線維腫性（fibromatic）変化及び生癌細胞のより有意な減少が観察された。
【図１３Ａ】成長促進経路におけるＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの相互作用を示す図である。ＮＰＴＸ１又はＮＰＴＸＲを発現するＣＯＳ−７細胞を用いて共焦点顕微鏡法を行なった。緑色：ＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）。赤色：ＮＰＴＸＲ。左パネルでは、ＣＯＳ−７細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、ＮＰＴＸ１を検出する抗ｍｙｃ抗体により染色した。右パネルでは、ＣＯＳ−７細胞を、ＮＰＴＸ１に対する抗体（ｍｙｃ−ｔａｇ）及びＮＰＴＸＲ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。
【図１３Ｂ】成長促進経路におけるＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの相互作用を示す図である。ＮＰＴＸ１又はＮＰＴＸＲを発現するＣＯＳ−７細胞を用いて、共焦点顕微鏡法を行なった。左パネルでは、ＣＯＳ−７細胞をＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）及びＮＰＴＸＲ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。右パネルでは、細胞表面上のＮＰＴＸ１を除去するためにグリシン治療を実行した。
【図１３Ｃ】成長促進経路におけるＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの相互作用を示す図である。ＮＰＴＸ１又はＮＰＴＸＲを発現するＳＢＣ−５細胞（Ｃ）を用いて、共焦点顕微鏡法を行なった。左パネルでは、ＳＢＣ−５細胞をＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）及びＮＰＴＸＲ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。右パネルでは、細胞表面上のＮＰＴＸ１を除去するためにグリシン治療を実行した。
【図１３Ｄ】成長促進経路におけるＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの相互作用を示す図である。ＮＰＴＸＲに対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞成長の阻害を示す。上パネルは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した、Ａ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞におけるｓｉ−ＮＰＴＸ１（ｓｉ−１及びｓｉ−２）又は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣ及びｓｉ−ＳＣＲ）に応じたＮＰＴＸ１の発現を示す。下パネルは、ＮＰＴＸＲに対して特異的なｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞のコロニー形成アッセイにより検査したコロニーの画像を示す。中央のパネルは、ＭＴＴアッセイにより評価した、ｓｉ−ＮＰＴＸＲ、ｓｉ−ＬＵＣ、又はｓｉ−ＳＣＲに応じたＡ５４９細胞又はＳＢＣ−５細胞の生存率を示す。全てのアッセイは三連ウェルで３回実行した。
【図１４Ａ】ＮＰＴＸＲとの結合後のＮＰＴＸ１の内在化を示す図である。レシピエントＣＯＳ−７細胞を、ＮＰＴＸ１をトランスフェクトした（＋）ドナーＣＯＳ−７細胞からの馴化培地と共にインキュベートした。ｃ−ｍｙｃタグ付きＮＰＴＸ１が、レシピエント細胞をドナーの馴化培地で処理した３時間後に検出された。緑色：ＮＰＴＸ１。核はＤＡＰＩにより可視化した。（ａ）細胞を、ＮＰＴＸ１を検出するための抗ｍｙｃ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。（ｂ）細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、ＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）について染色した。（ｃ）ＰＢＳで３時間処理した。
【図１４Ｂ】ＮＰＴＸＲとの結合後のＮＰＴＸ１の内在化を示す図である。レシピエントＳＢＣ−５細胞を、ＮＰＴＸ１をトランスフェクトした（＋）ドナーＳＢＣ−５細胞からの馴化培地と共にインキュベートした。ｃ−ｍｙｃタグ付きＮＰＴＸ１が、レシピエント細胞をドナーの馴化培地で処理した３時間後に検出された。緑色：ＮＰＴＸ１。核はＤＡＰＩにより可視化した。（ａ）細胞を、ＮＰＴＸ１を検出するための抗ｍｙｃ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。（ｂ）細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、ＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）について染色した。（ｃ）ＰＢＳで３時間処理した。
【図１４Ｃ】ＮＰＴＸＲとの結合後のＮＰＴＸ１の内在化を示す図である。レシピエントＣＯＳ−７細胞は、ドナーＮＰＴＸ１をトランスフェクトした（＋）ＣＯＳ−７細胞からの馴化培地において、分泌されたＮＰＴＸ１を時間に依存して取り込むように見えた。ドナーＮＰＴＸ１をトランスフェクトした（＋）ＣＯＳ−７細胞からの馴化培地でレシピエントＣＯＳ−７細胞を処理した１時間後又は３時間後、内在化したＮＰＴＸ１を抗ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した。
【図１５Ａ】ＮＰＴＸ１を発現するＣＯＳ−７細胞からの馴化培地における、分泌された外因性ＮＰＴＸ１タンパク質のウエスタンブロット分析による検出を示す図である。
【図１５Ｂ】外因性ＮＰＴＸ１を発現するＣＯＳ−７細胞における、ＮＰＴＸ１のＮＰＴＸＲタンパク質への結合の免疫沈降分析による検出を示す図である。
【図１６Ａ】肺癌及び脳転移におけるＣＤＫＮ３の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、ＮＳＣＬＣの臨床試料（Ｔ）及び対応する正常肺組織（Ｎ）におけるＣＤＫＮ３の発現を示す。
【図１６Ｂ】肺癌及び脳転移におけるＣＤＫＮ３の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、早期原発性ＮＳＣＬＣ（Ｉ期〜ＩＩＩａ期）、進行性原発性ＮＳＣＬＣ（ＩＩＩｂ期〜ＩＶ期）、及びＡＤＣに由来する転移性脳腫瘍の臨床試料（Ｔ）、並びに正常肺組織（Ｎ）におけるＣＤＫＮ３の発現を示す（上パネル）。ＰＣＲ産物のデンシトメトリー強度（Densitometric intensity）を、画像分析ソフトウェアにより定量化した（下パネル）。
【図１６Ｃ】肺癌及び脳転移におけるＣＤＫＮ３の発現を示す図である。ノーザンブロット分析により検出した、正常ヒト組織におけるＣＤＫＮ３の発現を示す。
【図１７Ａ】肺癌におけるＣＤＫＮ３の発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。マウスモノクローナル抗ＣＤＫＮ３抗体を用いた免疫組織化学的染色（対比染色にはヘマトキシリンを用いた）により検出した、６種の正常ヒト組織及びＮＳＣＬＣ症例におけるＣＤＫＮ３の発現を示す（×２００）。
【図１７Ｂ】肺癌におけるＣＤＫＮ３の発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。組織マイクロアレイ上での抗ＣＤＫＮ３抗体を用いた、代表的な手術で摘出したＮＳＣＬＣ（肺ＳＣＣ）及び正常肺の免疫組織化学的染色の結果を示す（×１００）。
【図１７Ｃ】肺癌におけるＣＤＫＮ３の発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。ＮＳＣＬＣ患者におけるＣＤＫＮ３発現による腫瘍特異的な生存のカプラン・マイヤー分析を示す（ログランク検定によるＰ＜０．０００１）。
【図１８Ａ】ＣＤＫＮ３と相互作用する新規の分子としてのＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ／ＶａｌＲＳの同定を示す図である。ＣＤＫＮ３と相互作用するタンパク質のスクリーニングを示す。銀染色によって示される１４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、３１ｋＤａ、及び２５ｋＤａのバンドが抽出された。これらは抗ＣＤＫＮ３モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させたＬＣ３１９細胞に由来する細胞可溶化物において見られたが、正常マウスＩｇＧを用いたものにおいては見られなかった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析配列決定によるそれらのペプチド配列によって、個々のバンドがそれぞれＶＡＲＳ、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ、ＥＦ−１βであると規定された。ＣＤＫＮ３タンパク質のバンドの位置は星印で示す。分子量マーカー（ｋＤａ）の位置は左側に示す。
【図１８Ｂ】ＣＤＫＮ３と相互作用する新規の分子としてのＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ／ＶａｌＲＳの同定を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により検出した、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＣＤＫＮ３、ＶａｌＲＳ、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ、ＥＦ−１β、及びそれらの関連分子ＣＤＫ１の発現を示す。
【図１９Ａ】肺癌におけるＥＦ−１δの発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。ウエスタンブロット分析により検出した、肺癌細胞株におけるＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δタンパク質の発現を示す。
【図１９Ｂ】肺癌におけるＥＦ−１δの発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。組織マイクロアレイ上の抗ＥＦ−１δ抗体を用いた、ＮＳＣＬＣ（肺ＳＣＣ）及び正常肺を含む代表的な手術で摘出した試料の免疫組織化学的染色の結果を示す（×１００）。
【図１９Ｃ】肺癌におけるＥＦ−１δの発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。ＥＦ−１δ発現と、ＮＳＣＬＣ患者における臨床転帰不良との関連性を示す。ＮＳＣＬＣ患者におけるＥＦ−１δ発現による腫瘍特異的な生存のカプラン・マイヤー分析を示した（ログランク検定によるＰ＝０．０００６）。
【図２０Ａ】ＣＤＫＮ３によるＥＦ−１δの脱リン酸化を示す図である。ＬＣ３１９細胞の抽出物に由来する内因性ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δの免疫沈降により確認した、肺癌細胞におけるＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの関連性を示す。ＩＰ：免疫沈降、ＩＢ：免疫ブロット。
【図２０Ｂ】ＣＤＫＮ３によるＥＦ−１δの脱リン酸化を示す図である。様々な細胞周期でのＬＣ３１９細胞における内因性ＣＤＫＮ３（緑色）、及び内因性ＥＦ−１δ（赤色）の共局在化を示す。
【図２０Ｃ】ＣＤＫＮ３によるＥＦ−１δの脱リン酸化を示す図である。外因性及び内因性のＥＦ−１δのリン酸化を示す。外因性ＥＦ−１δを過剰発現するＣＯＳ−７細胞からの細胞抽出物（左パネル）、及びＬＣ３１９細胞からの細胞抽出物（右パネル）をλタンパク質ホスファターゼ（λ−ＰＰａｓｅ）で処理した。λ−ＰＰａｓｅで処理した細胞抽出物においてバンドシフトが検出された。白矢印及び黒矢印は、それぞれリン酸化ＥＦ−１δ及び脱リン酸化ＥＦ−１δを示す。
【図２０Ｄ】ＣＤＫＮ３によるＥＦ−１δの脱リン酸化を示す図である。ＬＣ３１９細胞において外因的に過剰発現されたＣＤＫＮ３による、内因性ＥＦ−１δの脱リン酸化を示す。ＣＤＫＮ３発現ベクターをＬＣ３１９細胞にトランスフェクトした。
【図２１Ａ】ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。ＣＤＫＮ３を一過性に過剰発現したＣＯＳ−７細胞における、外因性ＥＦ−１δの脱リン酸化を示す。内因性ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δを弱く発現するＣＯＳ−７細胞に、Ｆｌａｇ−ＨＡタグ付きＣＤＫＮ３発現ベクター、Ｆｌａｇ−ＨＡタグ付きＥＦ−１δ−発現ベクター、又は２つの発現ベクターの両方をトランスフェクトした。これらの細胞からの全細胞抽出物を、抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット分析に使用した（左パネル）。斜線矢印、白矢印、及び黒矢印は、それぞれＣＤＫＮ３、リン酸化ＥＦ−１δ、及び脱リン酸化ＥＦ−１δを示す。抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降させたこれらの細胞抽出物を、抗ホスホセリン抗体を用いて免疫ブロットした（右パネル）。白矢印はリン酸化ＥＦ−１δを示す。ＩＰ：免疫沈降。ＩＢ：免疫ブロット。
【図２１Ｂ】ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。ＥＦ−１δの配列スキームを示す。ＥＦ−１δの１つの完全長構築物及び４つの欠失構築物を示す。
【図２１Ｃ】ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。ＥＦ−１δにおけるＣＤＫＮ３と結合する領域の免疫沈降実験による同定を示す。ＥＦ−１δにおけるＮ末端１６０アミノ酸ポリペプチドを欠いた、ＥＦ−１δのｌ６１〜２８１構築物は、ＬＣ３１９細胞において内因性ＣＤＫＮ３と相互作用するいかなる能力も保持しなかったが、これはＥＦ−１δにおいてロイシンジッパーモチーフを含有する８９アミノ酸ポリペプチド（コドン７２〜１６０）が、ＣＤＫＮ３との相互作用において重要な役割を果たし得ることを示唆する。ＩＰ：免疫沈降。ＩＢ：免疫ブロット。
【図２２Ａ】ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δの肺癌細胞の成長に対する効果を示す図である。左上パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した、ＬＣ３１９細胞におけるｓｉ−ＣＤＫＮ３（ｓｉ−Ａ及びｓｉ−Ｂ）又は対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、又はスクランブル（ＳＣＲ））に応じたＣＤＫＮ３の発現を示す。右上パネルは、ＭＴＴアッセイにより評価した、ｓｉ−ＣＤＫＮ３、ｓｉ−ＥＧＦＲ、ｓｉ−ＬＵＣ、又はｓｉ−ＳＣＲに応じたＬＣ３１９細胞の生存率を示す。下パネルは、特異的なｓｉＲＮＡ又は対照プラスミドをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞のコロニー形成アッセイを示す。
【図２２Ｂ】ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δの肺癌細胞の成長に対する効果を示す図である。左上パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した、ＬＣ３１９細胞におけるｓｉ−ＥＦ−１δ（ｓｉ−１及びｓｉ−２）又は対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、又はスクランブル（ＳＣＲ））に応じたＥＦ−１δの発現を示す。右上パネルは、ＭＴＴアッセイにより評価した、ｓｉ−ＥＦ−１δ又は対照ｓｉＲＮＡに応じたＬＣ３１９細胞の生存率を示す。下パネルは、ｓｉ−ＥＦ−１δ又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞のコロニー形成アッセイの結果を示す。
【図２３Ａ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。モックベクター又はＣＤＫＮ３発現ベクターをトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の浸潤能の増大を実証する、マトリゲル浸潤アッセイの結果を示す。マトリゲル被覆フィルタを通って浸潤する細胞の数を示す。
【図２３Ｂ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により検出した、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＦ−１α１及びＥＦ−１α２の発現を示す。
【図２３Ｃ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。ＬＣ３１９細胞の抽出物を用いた免疫沈降により確認した、肺癌細胞におけるＣＤＫＮ３とＥＦ−１αとの関連性を示す。ＩＰ：免疫沈降。ＩＢ：免疫ブロット（左パネル）。
【図２３Ｄ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。ＣＤＫＮ３発現ベクターをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞におけるＡｋｔ−リン酸化を示す。ＣＤＫＮ３を発現する細胞からの総タンパク質抽出物を、抗Ａｋｔ抗体、抗ホスホ−Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３）、抗Ｆｌａｇ抗体、又は抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット分析により検出した。モックベクターをトランスフェクトした細胞からのタンパク質抽出物を対照として使用し、βアクチンをローディング対照として使用した。
【図２３Ｅ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。モックベクター又はＣＤＫＮ３発現ベクターをトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ＬＹ２９４００２又はＤＭＳＯ（ビヒクル）と共にプレインキュベートし、浸潤能の増大を実証するマトリゲル浸潤アッセイを行なった。マトリゲル被覆フィルタを通って浸潤する細胞の数を示した。
【図２４Ａ】ＥＦ−１δにおけるＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。そのＮＨ２末端で膜形質導入１１ポリアルギニン配列に共有結合した、５種の細胞透過性ペプチドの概略図を示す。ＥＦ−１δにおけるロイシンジッパーモチーフの配列、及びＥＦ−１δに由来する５種の細胞透過性ペプチドを示す。
【図２４Ｂ】ＥＦ−１δにおけるＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。ＭＴＴアッセイにより評価した、５種の細胞透過性ペプチドに応じたＬＣ３１９細胞の生存率を示す（上パネル）。免疫沈降により検出した、１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０〜１０８ペプチドで処理したＬＣ３１９細胞における内因性ＣＤＫＮ３とＥＦ−１δタンパク質との間の複合体形成の減少を示す（下パネル）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
（ｉ）ポリクローナル抗体：
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により生じさせるのが好ましい。本発明では、抗原は、配列番号８８若しくは配列番号８９、又は配列番号６１等のＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域を含むポリペプチドであるがこれに限定されない。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する共役）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、又はＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ’及びＲは異なるアルキル基である）を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と、関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）によって成長させてもよい。この目的に適した培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。また、ハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫瘍として、ｉｎ  ｖｉｖｏで成長させてもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって作り出してもよい（米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照）。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作り出す好ましい手段は、共有の（commonly-owned）同時係属中の出願に開示されている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
本発明の二本鎖分子を含有する組成物
上記の他に、本発明はまた、分子をコードする、本発明の二本鎖分子又はベクターの少なくとも１つを含む医薬組成物を提供する。特に本発明は、以下の組成物［１］〜［２５］を提供する：
［１］互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖から成る、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲの発現及び細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離二本鎖分子を含む、癌細胞の成長を阻害し、癌を治療するための組成物（該癌細胞及び癌はＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子の中から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する）、
［２］二本鎖分子が配列番号１８（配列番号１の６７９ｎｔ〜６９７ｎｔの位置）、配列番号２０（配列番号１の２８０ｎｔ〜２９８ｎｔの位置）、配列番号４９（配列番号５の３１０ｎｔ〜３２８ｎｔの位置）、配列番号５１（配列番号７の２２５ｎｔ〜２４３ｎｔの位置）、配列番号８４（配列番号８６の１２８０ｎｔ〜１２９８ｎｔの位置）、及び配列番号８５（配列番号８６の１３９３ｎｔ〜１４１１ｎｔの位置）の中から選択される標的配列と一致するｍＲＮＡで作用する、［１］に記載の組成物、
［３］二本鎖分子において、センス鎖が配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有する、［２］に記載の組成物、
［４］治療される癌が肺癌である、［１］に記載の組成物、
［５］肺癌がＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣである、［４］に記載の組成物、
［６］組成物が複数種の二本鎖分子を含有する、［１］に記載の組成物、
［７］複数種の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、［６］に記載の組成物。
［８］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の組成物。
［９］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［８］に記載の組成物。
［１０］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［９］に記載の組成物。
［１１］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［１０］に記載の組成物。
［１２］二本鎖分子が約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド長の間である、［１１］に記載の組成物。
［１３］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一ポリヌクレオチドから成る、［１］に記載の組成物。
［１４］二本鎖分子が一般式：５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である）を有する、［１３］に記載の組成物、
［１５］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］に記載の組成物。
［１６］二本鎖分子がＤＮＡ及び／又はＲＮＡである、［１］に記載の組成物。
［１７］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１６］に記載の組成物。
［１８］センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、ＤＮＡとＲＮＡとから成る、［１７］に記載の組成物。
［１９］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１６］に記載の組成物。
［２０］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５’末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから成る、［１９］に記載の組成物、
［２１］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［２０］に記載の組成物。
［２２］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有する、［１］に記載の組成物。
［２３］二本鎖分子がベクターによってコードされ、組成物に含有される、［１］に記載の組成物。
［２４］二本鎖分子が一般式：５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である）を有する、［２３］に記載の組成物、並びに
［２５］トランスフェクション増強剤と薬学的に許容可能な担体とを含む、［１］に記載の組成物。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
本発明によれば、組成物は、複数種の二本鎖分子を含有することができ、その分子のそれぞれが、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、及び／又はＮＰＴＸＲの同じ標的配列又は異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば、組成物は、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲに指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。代替的に、例えば組成物は、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ及びＮＰＴＸＲから選択される、１つ、２つ又はそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
本発明において、「血液試料におけるＥＢＩ３又はＮＰＴＸ１のレベル」とは、全血における赤血球容積を補正した後、血中に存在するＥＢＩ３又はＮＰＴＸ１の濃度を指す。当業者は、血中の赤血球容積率が個体間で大きく異なることを認識するであろう。例えば、全血における赤血球の割合は男性と女性との間で非常に異なる。さらに、個体間の差は無視することはできない。したがって、血球成分を含む全血中の物質の見かけの濃度は、赤血球容積率に応じて大きく異なる。例えば、血清中の濃度が同じであっても、大量の血球成分を有する試料に対する測定値は、少量の血球成分を有する試料に対する値より低くなる。したがって、血中の成分の測定値を比較するために、赤血球容積を補正した値が通常使用される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６５】
ＩＩ部：ＤＬＸ５関連実験
実施例８  一般的方法
１．肺癌細胞株及び組織試料
この研究において使用されるヒト肺癌細胞株は以下のようであった：肺腺癌（ＡＤＣ）、Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ３、ＰＣ９、及びＮＣＩ−Ｈ１３７３；細気管支肺胞上皮癌（ＢＡＣ）、ＮＣＩ−Ｈ１７８１；肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＥＢＣ−Ｉ、ＬＵ６１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、及びＮＣＩ−Ｈ２１７０；肺腺扁平上皮癌（ＡＳＣ）、ＮＣＩ−Ｈ２２６及びＮＣＩ−Ｈ６４７；肺大細胞癌（ＬＣＣ）、ＬＸ１；並びに小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、及びＳＢＣ−５。全ての細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した適当な培地において単層で成長させ、５％ＣＯ２の加湿空気の雰囲気で３７℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）は、Cambrex Bio Science Inc.（Walkersville，MD）から購入した最適化培地（ＳＡＧＭ）において成長させた。１４種の原発性ＮＳＣＬＣ（７種のＡＤＣ及び７種のＳＣＣ）を、以前に記載されているように（Kato T, et al., Cancer Res 65: 5638-46 (2005)）、書面によるインフォームドコンセントを行なった上で患者から得た。合計で３６９種のＮＳＣＬＣ及び隣接正常肺組織の組織マイクロアレイ上での免疫染色用の試料は、埼玉県立がんセンター（埼玉県、日本）において根治的外科手術を受ける患者から得た。この研究及び全ての臨床材料の使用は、企業研究倫理委員会によって認可されたものであった
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７５】
実施例９  肺癌及び正常組織におけるＤＬＸ５遺伝子の発現
肺癌に対する新規の治療剤及び／又はバイオマーカーの開発のための標的分子を同定するために、初めに、分析した８６種のＮＳＣＬＣ又は１５種のＳＣＬＣの５０％より多くにおいて、５倍以上の発現を示す遺伝子についてｃＤＮＡマイクロアレイによるスクリーニングを実行した（Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22 (14): 2192-205、Taniwaki M, et al, Int J Oncol. 2006 Sep; 29(3): 567-75、Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res. 2003 May; 1(7): 485-99）。スクリーニングした２７６４８種の遺伝子のうち、ＤＬＸ５遺伝子が肺癌の大部分において過剰発現されることが同定され、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験によって１４種のさらなるＮＳＣＬＣ症例のうち９種（７種のＡＤＣのうち２種及び７種のＳＣＣの全て）（図５Ａ）並びに２３種の肺癌細胞株のうち１０種においてその過剰発現が確認されたが、一方で正常気管支上皮に由来するＳＡＥＣ細胞においては、その発現はほとんど検出不可能であった（図５Ｂ）。肺癌細胞における内因性ＤＬＸ５の細胞内局在化を求めるために、続いてヒトＤＬＸ５に特異的なウサギポリクローナル抗体を作出し、ＳＢＣ−５細胞の核において強く染色され、細胞質において弱く染色されることを見出した（図５Ｃ）。ＤＬＸ５のｃＤＮＡをプローブとして用いたノーザンブロット分析により、検査した２３種の組織のうち胎盤においてのみ１．８ｋｂの転写産物に対応する強いシグナルを同定した（図５Ｄ）。さらに、５種の正常組織（心臓、肝臓、腎臓、肺、及び胎盤）におけるＤＬＸ５タンパク質の発現を、抗ＤＬＸ５ポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的分析により肺癌における発現と比較した。ノーザン分析の結果と一致して、胎盤及び肺癌においてはＤＬＸ５の発現が観察されたが、他の４種の正常組織においてはほとんど検出不可能であった（図６Ａ）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７６】
実施例１０  ＮＳＣＬＣ患者でのＤＬＸ５発現と予後不良との関連性
ＤＬＸ５の臨床病理的意義を確認するために、ＤＬＸ５タンパク質の発現を、根治性の外科的切除を受けた３６９人の患者由来の肺癌組織を含有する組織マイクロアレイによりさらに検査した。ＤＬＸ５発現パターンを欠損／弱（０〜１＋にスコア付け）〜強（２＋）の範囲で組織アレイ上で分類した（図６Ｂ）。ポジティブ染色が、２３４種中１９１種（８１．６％）のＡＤＣ腫瘍、９５種中８０種（８４．２％）のＳＣＣ腫瘍、２７種中２４種（８８．９％）のＬＣＣ腫瘍、及び１３種中１０種（７６．９％）のＡＳＣ腫瘍で見出された。次にＤＬＸ５発現（強陽性対弱陽性／欠損）と様々な臨床病理的パラメータとの相関関係を検査し、ｐＴ分類との有意な相関関係が見出された（大きい腫瘍でより高い、Ｐ＝０．００５３、フィッシャーの直接確率検定)（表３Ａ）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７７】
検査した３６９件のＮＳＣＬＣ症例の中で、ＤＬＸ５が１６０症例で強く染色され（４３．４％、スコア２＋)、１４５症例で弱く染色され（３９．３％、スコア１＋）、及び６４症例で染色されなかった（１７．３％、スコア０）（詳細を表３Ａに示す）。腫瘍が強いＤＬＸ５発現を示したＮＳＣＬＣ患者は、欠損／弱いＤＬＸ５発現のものに比べて腫瘍特異的な生存期間が短いことを明らかにした（Ｐ＝０．００４５、ログランク検定、図６Ｃ）。また単変量分析は、患者の予後と、年齢（６５歳未満対６５歳以上）、性別（女性対男性）、組織型（ＡＤＣ対非ＡＤＣ)、ｐＴ分類（Ｔ１対Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４）、ｐＮ分類（Ｎ０対Ｎ１、Ｎ２）、及びＤＬＸ５状態（０、１＋対２＋）を含む他の因子との関連性を評価するのに適用した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７９】
（表３Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＤＬＸ５陽性度と患者の特性との間の関連性（ｎ＝３６９）
2010536366.tif 000001
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８０】
（表３Ｂ）ＮＳＣＬＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル分析
2010536366.tif 000002
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８１】
実施例１１  ＤＬＸ５に対する特定のｓｉＲＮＡによるＮＳＣＬＣ細胞の成長阻害
ＤＬＸ５が肺癌細胞の成長又は生存に不可欠であるか否かを判定するために、ＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＤＬＸ５−＃１及びｓｉ−ＤＬＸ５−＃２）を発現するプラスミド及び２つの対照プラスミド（ＥＧＦＰ及びスクランブルに対するｓｉＲＮＡ）を構築し、肺癌細胞株、ＳＢＣ−５及びＮＣＩ−Ｈ１７８１にトランスフェクトした。ｓｉ−ＤＬＸ５−＃２をトランスフェクトした細胞におけるｍＲＮＡレベルは、これらの２つの対照ｓｉＲＮＡ又はｓｉ−ＤＬＸ５−＃１のいずれかをトランスフェクトしたものに比べて有意に低下した。コロニー数及びＭＴＴアッセイによって測定された生細胞の数で有意な低下が観察され、このことによりＤＬＸ５の上方制御が、癌細胞の成長又は生存に関連することが示唆された（ＳＢＣ−５の代表的なデータを図６Ｄに示す）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８６】
パートＩＩＩ：ＮＰＴＸ１関連実験
実施例１２  一般的方法
１．細胞株及び組織試料
この試験で使用される２３種のヒト肺癌細胞株としては、９種の腺癌（ＡＤＣ；Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ−３、ＰＣ−９、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＮＣＩ−Ｈ１６６６及びＮＣＩ−Ｈ１７８１）と、９種の扁平上皮癌（ＳＣＣ；ＥＢＣ−１、ＬＵ６１、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、及びＳＫ−ＭＥＳ−１）と、１種の大細胞癌（ＬＣＣ；ＬＸ１）と、４種の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ；ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３及びＳＢＣ−５）とが挙げられる。全ての細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した適当な培地中で単層で成長させ、５％ＣＯ２で加湿空気雰囲気下で３７℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）をCambrex Bio Science Inc.（Walkersville, MD）から購入した最適化培地（ＳＡＧＭ）中で成長させた。初代の肺癌組織試料は、以前に記載されたように（Kikuchi 2003、Taniwaki 2006）、書面によるインフォームドコンセントにより取得した。２３８種のＡＤＣ、９５種のＳＣＣ、２８種のＬＣＣ、及び１３種のＡＳＣ、及び隣接正常肺組織を含む、合計で３７４種の原発性ＮＳＣＬＣのホルマリン固定試料は、埼玉県立がんセンター（埼玉県、日本）において外科手術を受けた患者から臨床病理的データと共に早期に得た。１３種のＳＣＬＣを、広島大学（広島県、日本）で剖検を受けた個体から得た。腫瘍検体の組織学的分類は、ＷＨＯ基準に基づいていた（Travis WD）。ＮＳＣＬＣ検体及び死後材料（ＡＤＣを有する２個体）由来の５種の組織（心臓、肝臓、肺、腎臓、及び副腎）も広島大学から入手した。この研究及び言及した全ての臨床材料の使用は、個々の倫理審査委員会によって認可されたものであった。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５００】
実施例１３  肺腫瘍及び正常組織におけるＮＰＴＸ１発現
治療剤の開発のための新規の標的分子及び／又は肺癌に対する診断上のバイオマーカーを求めるために、初めにｃＤＮＡマイクロアレイ（Kikuchi, 2003, 2006, Kakiuchi, 2004, Taniwaki）によって分析された１０１種の肺癌試料の半分以上において、正常な細胞よりも癌細胞で３倍を超える高い発現レベルを示した遺伝子をスクリーニングした。スクリーニングした２７６４８個の遺伝子の中で、ＮＰＴＸ１の過剰発現が、検査した肺癌の大部分で同定され、１５種の内１０種のさらなる肺癌組織及び２３種の内１７種の肺癌細胞株において半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験によってそのトランス活性化を確認した（図７Ａ、上パネル及び下パネル）。その後ヒトＮＰＴＸ１に特異的なマウスモノクローナル抗体を生成し、４つの肺癌細胞株（３つのＮＰＴＸ１陽性細胞株：ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２０、及びＳＢＣ−５対１つのＮＰＴＸ１陰性細胞株、ＮＣＩ−Ｈ２１７０）及び末梢気道上皮由来細胞（ＳＡＥＣ）における内因性ＮＰＴＸ１タンパク質の発現として、ウエスタンブロット分析により確認した（図７Ｂ）。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５０３】
実施例１４  ＮＰＴＸ１発現と予後不良との関連性
ＮＰＴＸ１の生物学的及び臨床病理的な意義を確認するために、ＮＰＴＸ１タンパク質の発現を、３７４人のＮＳＣＬＣ患者由来の原発性ＮＳＣＬＣ組織と、１３人の患者由来のＳＣＬＣ組織とを含有する組織マイクロアレイにより検査した。ＮＰＴＸ１に関する陽性細胞質染色が、手術で切除したＮＳＣＬＣの５６．１％（２１０／３７４）及びＳＣＬＣの６９．２％（９／１３）で観察され、検査した正常肺組織のいずれにおいても染色は観察されなかった（図８Ｃ）。次にそのポジティブ染色と、３７４人のＮＳＣＬＣ患者における様々な臨床病理的パラメータとの相関を検査した。組織アレイ上で、ＮＰＴＸ１発現パターンを、欠損（０でスコア付け）から弱／強陽性（１＋〜２＋とスコア付け）の範囲で分類した（図８Ｄ、上パネル、方法を参照されたい）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５０６】
（表１Ｂ）ＮＳＣＬＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル分析
2010536366.tif 000003
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５０７】
実施例１５  肺癌患者におけるＮＰＴＸ１の血清レベル
ＮＰＴＸ１が分泌タンパク質をコードするので、ＮＰＴＸ１タンパク質が肺癌患者の血清に分泌されたか否かを研究した。ＥＬＩＳＡ実験によって、３２９人の肺癌患者由来の血清学的試料の大部分でＮＰＴＸ１が検出され、肺癌患者におけるＮＰＴＸ１の血清レベルは、１．３６±１．６０ｎｇ／ｍｌ（平均±１ＳＤ）であり、健常個体におけるＮＰＴＸ１の血清レベルは０．５９±０．４４ｎｇ／ｍｌであった（差異は、マンホイットニーＵ検定ではＰ値が０．００１未満で有意であった；図９Ａ）。肺癌の組織型に従って、ＮＰＴＸ１の血清レベルは、ＡＤＣ患者で１．４１±１．２７ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＣ患者で１．０９±０．９５ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＬＣ患者で１．４２±２．３３ｎｇ／ｍｌであり、３つの組織型間の差異は有意なものではなかった。ＮＰＴＸ１の血清レベルは、良性肺疾患のＣＯＰＤ患者で０．６７±０．４８ｎｇ／ｍｌであった。肺癌患者でのＮＰＴＸ１の血清レベルは、正常ボランティア及びＣＯＰＤ患者のものより有意に高かった（Ｐ＜０．０００１）。初期段階の腫瘍を有する患者であっても高レベルの血清ＮＰＴＸ１が検出された。有意には、初期段階疾患（Ｉ期〜ＩＩＩＡ期又はＬＤ期）の患者由来の血清よりも局所進行性肺癌（ＩＩＩＢ期）又は遠隔器官転移（ＩＶ期又はＥＤ期）の患者由来の血清で、さらなるレベルのＮＰＴＸ１がより一般的であった（図９Ｂ）。これらの３２９人の癌患者及び１０２人の健常な対照のデータによって作成した受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、このアッセイにおけるカットオフレベルは、ＮＰＴＸ１に最適な診断精度と尤度比とを与えるように、即ちＮＰＴＸ１で１．２８ｎｇ／ｍｌ（ＮＳＣＬＣで４１．５％、ＡＤＣで４４．３％、ＳＣＣで２９．４％、及びＳＣＬＣで３１．２％の感度で）及びＮＳＣＬＣで９６．１％の特異度で）に設定された。８０人のＣＯＰＤ患者の中で、７人（８．８％）が陽性ＮＰＴＸ１レベルを有していた。次に同じ患者で血清ＮＰＴＸ１レベルをモニタリングするために、対となる術前及び術後の（手術後２ヶ月の）４人のＮＳＣＬＣ患者由来の血清試料を使用してＥＬＩＳＡ実験を実施した。原発腫瘍の外科的切除後、血清ＮＰＴＸ１濃度が劇的に低減した（図９Ｃ）。本発明者らはさらに、手術前に血清を採取した１２人のＮＳＣＬＣ症例（６人のＮＰＴＸ１陽性の腫瘍を有する患者及び６人のＮＰＴＸ１陰性の腫瘍を有する患者）の同じ組において、原発性腫瘍で血清ＮＰＴＸ１値をＮＰＴＸ１の発現レベルと比較した。血清ＮＰＴＸ１のレベルは、原発性腫瘍でＮＰＴＸ１の発現レベルと良好な相関関係を示した（図９Ｄ）。その結果により独立して、初期段階での癌の検出、並びに腫瘍の切除及び疾患の再発のモニタリングのためのバイオマーカーとしての血清ＮＰＴＸ１の高い特異性及び大きな可能性が支持される。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５０８】
実施例１６  腫瘍マーカーとしてのＮＰＴＸ１、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ及びＰｒｏＧＲＰの組み合わせアッセイ
また、診療所において腫瘍検出バイオマーカーとして血清ＮＰＴＸ１レベルの臨床的有用性を評価するために、癌患者及び対照個体由来の同じ組の血清試料において２つの従来の腫瘍マーカー（ＡＤＣ患者ではＣＥＡ、ＳＣＣ患者ではＣＹＦＲＡ、及びＳＣＬＣ患者ではｐｒｏＧＲＰ）の血清レベルもＥＬＩＳＡによって測定した。ＲＯＣ分析によって求められるこのアッセイにおけるカットオフレベルは、最適な診断精度及び尤度比をもたらすように、ＣＥＡではすなわち２．５ｎｇ／ｍｌ（ＡＤＣでは３８．４％の感度で及び９８．０％の特異度で）、ＣＹＦＲＡではすなわち２．０ｎｇ／ｍｌ（ＳＣＣでは２９．４％の感度で及び９８．０％の特異度で）及びｐｒｏＧＲＰではすなわち、４６．０ｐｇ／ｍｌ（ＳＣＬＣでは６２．４％の感度で及び９９．０％の特異度で）に設定された。血清ＮＰＴＸ１とＣＥＡ値との間の相関係数は有意ではなかった（スピアマンの順位相関係数：ｐ＝０．１０９、Ｐ＝０．１４７４）。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１０】
実施例１７  肺癌細胞に対するＮＰＴＸ１のオートクリン成長促進効果
ＮＰＴＸ１の上方制御が肺癌細胞の成長又は生存に関与するか否かを判定するために、２つの異なる対照プラスミド（ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、及びスクランブル（ＳＣＲ）に対するｓｉＲＮＡ）と共に、ＮＰＴＸ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＮＰＴＸ１−１、ｓｉ−ＮＰＴＸ１−２）を発現するようにプラスミドを設計及び構築し、それらをＡ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞にトランスフェクトし、内因性ＮＰＴＸ１の発現を抑制した。ｓｉ−ＮＰＴＸ１−２をトランスフェクトした細胞におけるＮＰＴＸ１の量は、２つの対照ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした細胞に比べて有意に低減した（図１０Ａ、上パネル）。ｓｉ−ＮＰＴＸ１−１は、ＮＰＴＸ１発現に対する抑制効果をほとんど示さなかった。遺伝子発現レベルに対する抑制効果と一致して、トランスフェクトしたｓｉ−ＮＰＴＸ１−２は、コロニー形成アッセイ及びＭＴＴアッセイによって測定されたコロニー数及び細胞生存率の有意な低減をもたらすが、かかる効果は、２つの対照ｓｉＲＮＡ又はｓｉ−ＮＰＴＸ１−１では観察されなかった（図１０Ａ、中央及び下パネル）。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１５】
実施例１８  ＮＰＴＸ１による細胞浸潤の活性化
組織マイクロアレイ上での免疫組織化学的分析によって、ＮＰＴＸ１強陽性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者が、ＮＰＴＸ１弱陽性又はＮＰＴＸ１陰性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者よりも短い癌特異的な生存期間を示すことが示唆されたので、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を使用してマトリゲルアッセイを用いて、細胞浸潤におけるＮＰＴＸ１の考え得る役割を検査した。ＮＰＴＸ１のｃＤＮＡのＮＩＨ−３Ｔ３細胞へのトランスフェクションは、モックベクターをトランスフェクトした細胞に比べて、マトリゲルによるその浸潤活性を有意に高めた（図１１）。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１６】
実施例１９  ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体による肺癌細胞の成長の阻害
本発明はさらに、マウスモデルにおける治療的薬剤としての抗ＮＰＴＸ１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍抑制効果を研究した。本発明者らは、Ａ５４９細胞を７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の皮下に移植し、３０日間、１週間に２回、３００μｇ／体の親和性精製した抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１）、又は正常マウスＩｇＧ（対照）を腫瘍に投与した。抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１）により、Ａ５４９肺癌の成長が有意に抑制されたが、同じ用量の正常マウスＩｇＧは腫瘍成長に影響を与えなかった（Ｐ＝０．０１６、それぞれ両側ｔ検定；図１２、上パネル）。切除腫瘍の凍結切片を用いたＨＥ染色により、抗ＮＰＴＸ１抗体で処理した腫瘍組織において生癌細胞の有意な繊維腫変化及び減少が検出された（図１２、下パネル）。まとめると、これらの結果により、抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１）がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの癌細胞に対する成長抑制効果を有することが明らかになった。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１７】
実施例２０  成長促進経路におけるＮＰＴＸ１に対する受容体としてのＮＰＴＸＲ
既知のＮＰＴＸ１受容体、ＮＰＴＸＲは、シナプス前ヘビ毒毒素タイポキシンのシナプスへの輸送に関与することが示唆され、これはシナプス残屑の除去に関与する新規のニューロンへの取り込み経路を表し得る（Kirkpatrick LL, et al., J Biol Chem 278:17786-92（2000）, Dodds DC, et al., J Biol Chem 272（34）:21488-94（1997））。ＮＰＴＸＲ遺伝子が、肺癌で発現されたか否か、及び成長促進効果に関与していたか否かを研究するために、本発明者らは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験によって肺癌細胞株及び臨床組織におけるＮＰＴＸＲの発現を分析した。ＮＰＴＸＲは、肺癌試料で比較的高いレベルで発現されたが、正常肺では発現されなかった（図７Ｅ）。ＮＰＴＸＲの発現パターンは、これらの腫瘍におけるＮＰＴＸ１発現との良好な一致を示した。上記のように、ＮＰＴＸ１のオートクリン成長促進効果に関して検査したＣＯＳ−７細胞は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析及び免疫組織化学分析により、内因的にＮＰＴＸＲを発現することを確認した（データ図示せず）。このデータによって、ＮＰＴＸ１が肺癌細胞におけるＮＰＴＸＲとの相互作用によって、その成長促進効果を媒介すると考えられることが示唆された。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５２０】
実施例２１  ＮＰＴＸＲとの結合後のＮＰＴＸ１の内在化
ＮＰＴＸ１／ＮＰＴＸＲシグナル伝達の調節に関与する機構を求めるために、本発明者らは、ＮＰＴＸ１及びＮＰＴＸＲの細胞内分布の共焦点顕微鏡観察によって、ＮＰＴＸ１／ＮＰＴＸＲは、細胞が分泌ＮＰＴＸ１に曝されると内在化し得るか否かを検査した。レシピエントＣＯＳ−７細胞又はＳＢＣ−５細胞は、培地においてカバースリップ上で３７℃で一晩成長させた。また、ＮＰＴＸ１ベクターをトランスフェクトしたドナーＣＯＳ−７細胞又はＳＢＣ−５細胞の上清を採取した。それから、レシピエントＣＯＳ−７細胞又はＳＢＣ−５細胞を、ドナー細胞の上清と３時間インキュベートした。本発明者らは、免疫組織化学法によってＮＰＴＸ１とこれらの細胞の表面との結合を検出した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。また、これらの２つの細胞株の表面上で外因性ＮＰＴＸ１と内因性ＮＰＴＸＲとの共局在化が観察された（データ図示されず）。それから、膜透過条件下で免疫組織化学法を行ない、本発明者らは内在化した外因性ＮＰＴＸ１を検出した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。レシピエントＣＯＳ−７細胞のドナーＮＰＴＸ１トランスフェクト（＋）ＣＯＳ−７細胞由来の馴化培地による処理の１時間又は３時間後、内在化したＮＰＴＸ１が、抗ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット法によって検出された。レシピエントＣＯＳ−７細胞は、ドナーＮＰＴＸ１トランスフェクト（＋）ＣＯＳ−７細胞由来の馴化培地において時間に依存的に分泌ＮＰＴＸ１を取り込むと考えられた（図１４Ｃ）。全ての分析は、実験者の処理条件の知識なしの盲検で実行した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５２９】
パートＩＶ：ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δ関連実験
実施例２２  一般的方法
１．細胞株及び臨床組織試料
この試験で使用される１５種のヒト肺癌細胞株は以下のようであった：１５種のＮＳＣＬＣ；ＬＣ１７６、ＬＣ３１９、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５５２、ＰＣ３、ＰＣ９、ＰＣ１４、ＳＫ−ＬＵ−１、ＥＢＣ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＳＷ９００、及びＳＷ１５７３。全ての細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した適当な培地中で単層で成長させ、５％ＣＯ２で加湿空気雰囲気下で３７℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）をCambrex Bio Science Inc.（Walkersville, MD）から購入した最適化培地（ＳＡＧＭ）中で成長させた。７種のＡＤＣ及び７種のＳＣＣを含む原発性ＮＳＣＬＣは、他で記載したように（Kikuchi et al., 2003）取得した。２４３種のＡＤＣ、１０２種のＳＣＣ、２８種のＬＣＣ、及び１２種の腺扁平上皮癌（ＡＳＣ）、及び隣接正常肺組織を含む、合計で３８５種の原発性ＮＳＣＬＣのホルマリン固定試料は、埼玉県立がんセンター（埼玉県、日本）において根治的外科手術を受ける患者から臨床病理的データと共に早期に得た。ＮＳＣＬＣ検体及び死後材料（ＳＣＣを有する２個体）由来の５種の組織（心臓、肝臓、肺、腎臓、及び胃）も広島大学から入手した。この研究及び全ての臨床材料の使用は、個々の研究倫理審査委員会によって認可されたものであった。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４６】
実施例２３  肺腫瘍及び正常組織におけるＣＤＫＮ３発現
治療剤及び／又は診断上のバイオマーカーの開発のための新規の標的分子を検索するために、初めにｃＤＮＡマイクロアレイにより分析した１０１種の肺癌の５０％より多くで３倍を超える発現を示す遺伝子をスクリーニングした。スクリーニングした２７６４８個の遺伝子の中で、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子３（ＣＤＫＮ３）をコードする遺伝子が、肺癌で頻繁に過剰発現され、ＣＤＫＮ３発現の増大が１４件中１２件のさらなるＮＳＣＬＣ症例（７件中６件の腺癌（ＡＤＣ）及び７件中６件の扁平上皮癌（ＳＣＣ））で確認されたことが同定された（図１６Ａ）。興味深いことに、初期段階の原発性肺腫瘍のものと比べて、ＣＤＫＮ３のより高い発現パターンが、脳転移及び進行性原発性肺腫瘍（腺癌、ＡＤＣ）で観察された（図１６Ｂ）。プローブとしてのＣＤＫＮ３のｃＤＮＡによるノーザンブロット法により、２３種の検査した正常ヒト組織の中において睾丸で０．９ｋｂ転写産物に対応する強い強いシグナルが同定され、胸腺、結腸、胃及び骨髄で非常に弱いシグナルが同定された（図１６Ｃ）。また、ＣＤＫＮ３タンパク質の発現を６つの正常組織（心臓、肝臓、腎臓、肺、結腸及び睾丸）で抗ＣＤＫＮ３抗体によって検査し、ＣＤＫＮ３が睾丸（主に一次精母細胞の細胞質）及び肺癌で豊富に発現されたが、その発現は、残りの５つの正常組織ではほとんど検出することができなかったことを見出した（図１７Ａ）。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４７】
実施例２４  ＣＤＫＮ３過剰発現と予後不良との関連性
ＣＤＫＮ３の生物学的及び臨床病理的意義を確認するために、臨床ＮＳＣＬＣにおけるＣＤＫＮ３タンパク質発現を、３８５人の患者由来のＮＳＣＬＣ組織及び１５人の患者由来のＳＣＬＣ組織を含有する組織マイクロアレイにより検査した。ＣＤＫＮ３に対するポジティブ染色（細胞質及び核）が、手術で切除したＮＳＣＬＣの６５．７％（２５３／３８５）及びＳＣＬＣの８０．０％（１２／１５）で観察されたが、検査した正常肺組織のいずれでも染色は観察されなかった（図１７Ｂ）。それから、ポジティブ染色と様々な臨床病理的パラメータとの間の相関関係を３８５人のＮＳＣＬＣ患者で検査した。ＳＣＬＣの試料サイズはさらに評価するには小さすぎた。性別（男性でより高い、Ｐ＝０．００５４、フィッシャーの直接確率検定）、組織学的分類（非ＡＤＣでより高い、Ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定）、及びｐＮ段階（Ｎ１、Ｎ２でより高い、Ｐ＝０．００５７、フィッシャーの直接確率検定）が有意にＣＤＫＮ３陽性度に関連していた（表４Ａ）。腫瘍がＣＤＫＮ３のポジティブ染色を示したＮＳＣＬＣ患者は、ＣＤＫＮ３発現が欠損したものと比べて腫瘍特異的な生存期間が短いことを明らかにした（Ｐ＜０．０００１、ログランク検定）（図１７Ｃ）。単変量分析によって、高齢（６５歳以上）、男性、非ＡＤＣ組織学的分類、進行性ｐＴ段階、進行性ｐＮ段階及びＣＤＫＮ３陽性度は全て、ＮＳＣＬＣ患者では腫瘍特異的な生存率が低いことと有意に関連していた（表４Ｂ）。予後因子の多変量分析では、高齢、進行性ｐＴ段階、進行性ｐＮ段階及びＣＤＫＮ３陽性度が独立した予後因子であることを示していた（表４Ｂ）。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４９】
（表４Ｂ）ＮＳＣＬＣにおける予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル分析
2010536366.tif 000004
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５５０】
実施例２５  ＣＤＫＮ３と相互作用する新規の分子としてのＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳの同定
発癌におけるＣＤＫＮ３の機能を解明するために、肺癌細胞においてＣＤＫＮ３と相互作用するタンパク質を求めた。ＬＣ３１９細胞由来の細胞抽出物を抗ＣＤＫＮ３モノクローナル抗体又はマウスＩｇＧ（陰性対照）で免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後に、タンパク質複合体を銀染色した。抗ＣＤＫＮ３抗体による免疫沈降体で見られたが、マウスＩｇＧによる免疫沈降体では見られなかった、１４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、３１ｋＤａ及び２５ｋＤａのタンパク質バンドを、切り出し、トリプシン消化して、質量分析にかけた。１４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、３１ｋＤａ及び２５ｋＤａバンド由来のペプチドがそれぞれ、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ＶａｌＲＳ；１４０ｋＤａ）、真核性翻訳延長因子１γ（ＥＦ−１γ；５０ｋＤａ）、真核性翻訳延長因子１δ（ＥＦ−１δ；３１ｋＤａ）、真核性翻訳延長因子１β（ＥＦ−１β；２５ｋＤａ）の配列に一致した（図１８Ａ）。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５５３】
実施例２６  ＮＳＣＬＣの成長及び進行に対するＥＦ−１δの効果
ＥＦ−１δの臨床病理的意義を明らかにするために、３８５人の患者由来の肺癌組織を含有する組織マイクロアレイによって、臨床ＮＳＣＬＣにおいてＥＦ−１δタンパク質発現を検査した。ＥＦ−１δに対するポジティブ染色（細胞質及び核）が手術で切除したＮＳＣＬＣの６７．５％で観察された（２６０／３８５）（図１９Ｂ）。ＥＦ−１δに対する染色は、検査した正常肺組織のいずれでもほとんど観察されなかった。ＣＤＫＮ３タンパク質の発現は、これらの腫瘍においてＥＦ−１δ発現と有意に一致していた（Ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定）。ＮＳＣＬＣにおけるＥＦ−１δのポジティブ染色は、性別（男性でより高い；Ｐ＝０．０００４、フィッシャーの直接確率検定）、組織型（非ＡＤＣでより高い；Ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定）、及び進行性ｐＮ段階（Ｎ１、Ｎ２でより高い；Ｐ＝０．０１４１、フィッシャーの直接確率検定）及び５年生存率（Ｐ＝０．０００６、ログランク検定）に有意に関連していた（図１９Ｃ；表５Ａ）。予後因子の多変量分析では、年齢、ｐＴ段階、ｐＮ段階及びＥＦ−１δ陽性度が独立した予後因子であることを示していた（表５Ｂ）。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５５６】
（表５Ｂ）ＮＳＣＬＣにおける予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル分析
2010536366.tif 000005
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５５７】
実施例２７  ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３媒介性脱リン酸化反応
ウエスタンブロット分析により、肺癌細胞で２つの異なるサイズのＥＦ−１δタンパク質が検出された一方で（図２０Ａ）、報告によるとＥＦ−１δはｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのセリン残基及びスレオニン残基でリン酸化された（Minella O, et al., Biosci Rep. 3:119-27（1998））。ｉｎ  ｖｉｖｏでＥＦ−１δリン酸化反応の可能性を検査するために、本発明者らは、タンパク質ホスファターゼの存在又は非存在下でＦｌａｇ−ＨＡタグ付きＥＦ−１δを過剰発現したＣＯＳ−７細胞由来の抽出物をインキュベートし、ウエスタンブロット分析によってＥＦ−１δタンパク質の分子量を分析した。ホスファターゼで処理した抽出物中の大部分のＥＦ−１δタンパク質の測定量は、非処理細胞のものより少なかった（図２０Ｃ、左パネル）。一方、Ｆｌａｇ−ＨＡタグ付きＥＦ−１βタンパク質及びＦｌａｇ−ＨＡタグ付きＥＦ−１γタンパク質の分子量は、ホスファターゼで処理後も変化しなかった（図２０Ｃ、中央の右パネル）。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６０】
実施例２８  ＥＦ−１δにおけるＣＤＫＮ３結合領域の同定
その後、これら２つのタンパク質と、肺癌に対する治療標的としてのその潜在性との関連性の生物学的重要性を研究した。ＣＤＫＮ３との相互作用に必要とされるＥＦ−１δにおけるドメインを求めるために、そのＮ末端及びＣ末端にＦＬＡＧ−ＨＡ配列を有するＥＦ−１δの各々の構築物をＬＣ３１９細胞にトランスフェクトした（ＥＦ−１δ７２〜１６０、ＥＦ−１δ１６１〜２８１、ＥＦ−１δ１〜１６０、ＥＦ−１δ７２〜２８１、及び全長ＥＦ−１δ１〜２８１；図２１Ｂ）。モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降により、ＥＦ−１δ７２〜１６０、ＥＦ−１δ１〜１６０、ＥＦ−１δ７２〜２８１及びＥＦ−１δ１〜２８１がＣＤＫＮ３と相互作用することが可能であったが、ＥＦ−１δ１６１〜２８１は可能ではなかったことが示された（図２１Ｂ）。これらの実験により、ＥＦ−１δにロイシンジッパーモチーフを含有する８９アミノ酸ポリペプチド（コドン７２〜１６０；配列番号４８）がＣＤＫＮ３との相互作用に重要な役割を果たすことが示唆された。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６１】
実施例２９  ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δに対するｓｉＲＮＡによるＮＳＣＬＣ細胞の成長抑制
ＣＤＫＮ３が肺癌細胞の成長又は生存に不可欠であるか否かを判定するために、ＣＤＫＮ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−Ａ及びｓｉ−Ｂ）を発現するプラスミド、及び３つの異なる対照プラスミド（ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）又はスクランブル（ＳＣＲ）に対するｓｉＲＮＡ）を設計及び構築し、それらをＬＣ３１９細胞（図２２Ａ）及びＡ５４９細胞（データ図示せず）にトランスフェクトした。ｓｉ−Ａをトランスフェクトした細胞でのＣＤＫＮ３転写産物の量は、３つの対照ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした細胞に比べて最も有意に低下し、ｓｉ−ＢはＣＤＫＮ３発現に対して抑制効果をほとんど示さなかった（図２２Ａ：上部左パネル）。遺伝子発現に対するその抑制効果と一致して、トランスフェクトしたｓｉ−Ａにより、ＭＴＴ及びコロニー形成アッセイによって測定された細胞生存率及びコロニー数の減少が起こったが、かかる効果は３つの対照又はｓｉ−Ｂでは観察されなかった（図２２Ａ：上部右及び下パネル）。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６３】
実施例３０  ＣＤＫＮ３の過剰発現は、細胞浸潤を増大し、Ａｋｔを活性化するのに十分である。
組織マイクロアレイ上の免疫組織化学的分析により、ＣＤＫＮ３強陽性腫瘍を有する肺癌患者が、腫瘍がＣＤＫＮ３に対して陰性であった患者よりも短い癌特異的な生存期間を示したことが示されたので（図１９Ｂ及び図１９Ｃ）、ＣＤＫＮ３が細胞浸潤能に関与し得るか否かを求めるのに、マトリゲル浸潤アッセイを実行した。マトリゲルによるＣＤＫＮ３発現ベクターをトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の浸潤は、モックベクターをトランスフェクトした対照細胞に比べて有意に高まり（図１９Ｃ）、これによりＣＤＫＮ３がまた、悪性の高い表現型の肺癌細胞に寄与し得ることが示唆された。一方、ＥＦ−１β、γ、δ、及びＶａｌＲＳと関連することが知られたＥＦ−１αは、複数の機能に関与するとされる。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６５】
実施例３１  ＣＤＫＮ３のドミナントネガティブペプチドによるＮＳＣＬＣ細胞の成長阻害
それから、肺癌細胞の成長又は生存に対するＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの間の相互作用の機能的意義を研究するために、これらの２つのタンパク質の結合を阻害することが期待される生体活性細胞透過性ペプチドが、開発された。次に、ＥＦ−１δのコドン７３〜１６０に含まれた１９アミノ酸配列の５つの異なるペプチドを合成した（図２４Ａ）。これらのペプチドをＮＨ２末端で１１個のアルギニン残基（１１Ｒ）を伝達する膜に共有結合させた。５つの１１Ｒ−ＥＦ−１δペプチドの、ＬＣ３１９細胞の培養培地への添加による成長に対する効果を評価し、ここで１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０−１０８ペプチドによる処理が、ＭＴＴアッセイによって測定されるように細胞生存率を有意に低下させた（図２４Ｂ、上パネル）。１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０−１０８の、ＬＣ３１９細胞の培養培地への添加が、免疫沈降実験による内因性ＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの間の複合体形成を低減した（図２４Ｂ、下パネル）。これらのデータにより、１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０−１０８がＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの間の相互作用を特異的に阻害することができることが示された。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６８】
グアニンヌクレオチド交換因子として機能することが知られ、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的送達に関与する、延長因子−１複合体のサブユニットであるＥＦ−１δが、新規のＣＤＫＮ３細胞内標的分子として発見された。アミノアシルｔＲＮＡは、リボソームタンパク質合成におけるアミノ酸供与体である。ｔＲＮＡ分子は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって、対応するアミノ酸でアミノアシル化される。アミノアシルｔＲＮＡは、延長因子−１α（ＥＦ−１α）との三重複合体に変換され、タンパク質合成のためにアミノ酸の直接前駆体を与える。アミノアシルｔ−ＲＮＡとリボソームとの結合に関与するＧタンパク質である延長因子−１（ＥＦ−１）は、４つの異なるサブユニット（ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ及びＶａｌＲＳ）とＥＦ−１αとのグアニン−ヌクレオチド交換複合体から成る（Brandsma et al.,1995；Riis et al., 1990；Nygard et al., 1990；Motorin et al., 1988；Motorin et al., 1991）。ＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）及びサイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）によってリン酸化される。ＥＦ−１複合体の構成要素としてＥＦ−１δは少なくとも哺乳類でＰＫＣによってリン酸化されることが知られている（Venema, R. C., et al, J Biol Chem. 266, 11993-11998.（1991）；Venema R. C., et al, J Biol Chem. 266, 12574-12580.（1991））。一方、ＥＦ−１δの過剰発現が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換し、それらをヌードマウスにおいて腫瘍原性にする可能性があり、さらにそのアンチセンスｍＲＮＡによるＥＦ−１δのブロッキングによって、その発癌性の有意な反転が起こった（Joseph, P., et al., J Biol Chem. 277:6131-6136（2002）；Lei, Y. X., et al., Teratog Carcinog Mutagen. 22:377-383（2002））。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５６９】
一方、ＥＦ−１αは、複数の細胞機能に関与し、ＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳによって調節される（Minella O, et al., Biosci Rep. 3:119-27（1998））。最近の報告により、ＥＦ−１αの２つのアイソフォームの１つであるＥＦ−１α２が、乳癌細胞における細胞移動及び細胞浸潤を刺激することができることが示された一方で（Amiri A, et al., Oncogene 26:3027-40（2007））、このＥＦ−１α２は非転移性対照に比べて、転移性ラット乳腺癌細胞株で過剰発現した（Pencil SD、Breast Cancer Res Treat. 25:165-74（1993）；Edmonds BT, et al., J Cell Sci. 109：2705-14（1996））。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４７】
１０．ＥＢＩ３を発現するＣＯＳ−７形質転換体
ＥＢＩ３を安定発現する形質転換体を標準プロトコルに従って樹立した。ＥＢＩ３の全コード領域を、プライマーセット（５'−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴ−３'：配列番号９２及び５'−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＴＧＴＧＧＣ−３'：配列番号９３）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。産物をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを用いて消化し、ＥＢＩ３タンパク質のＣＯＯＨ末端のｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓエピトープ配列（ＬＤＥＥＳＩＬＫＱＥＨＨＨＨＨＨ：配列番号９４）を含有するｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／ＨｉｓＡ（＋）ベクター（Invitrogen）の適当な部位にクローニングした。ＦｕＧＥＮＥ  ６トランスフェクション試薬（Roche Diagnostics，Basel，Switherland）を製造業者のプロトコルに従って用いて、内因性ＥＢＩ３を発現しないＣＯＳ−７細胞に、ＥＢＩ３を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＢＩ３−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）、又はモックプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、１０％ＦＢＳ及びジェネテシン（０．４ｍｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ中で１４日間培養した。次に、５０個の別個のコロニーをトリプシン処理し、限界希釈アッセイにより安定な形質転換体についてスクリーニングした。各々のクローンにおいてＥＢＩ３の発現を、ウエスタンブロット法及び免疫染色により求めた。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８８】
３．半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD）を使用して培養細胞及び臨床組織から抽出した。抽出ＲＮＡ及び正常なヒト組織のポリＡ  ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）で処理した後、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Life Technologies, Inc.）とを用いて逆転写した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を、合成ＮＰＴＸ１遺伝子特異的プライマー（５'−ＧＴＴＧＧＧＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＡＡＡ−３'：配列番号８０及び５'−ＡＡＡＣＣＡＣＧＡＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＣ−３'：配列番号８１）、合成ＮＰＴＸＲ遺伝子特異的プライマー（５'−ＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴ−３'：配列番号９５及び５'−ＧＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧ−３'：配列番号９６）、又は内部対照としてβアクチン（ＡＣＴＢ）特異的プライマー（５'−ＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴ−３'：配列番号９７及び５'−ＣＴＧＣＧＣＡＡＧＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴ−３'：配列番号９８）を用いて行った。全てのＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００（Applied Biosystems, Foster City, CA）で、９４℃、２分間の初期変性、その後の２２サイクル（ＡＣＴＢでは）又は３５サイクル（ＮＰＴＸ１では）の９４℃、３０秒、５４℃又は６０℃、３０秒、及び７２℃、６０秒を包含した。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
本発明のヘアピンループ構造を有する例示的な二本鎖分子は以下に示される。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ及びＵＵＣＡＡＧＡＧＡから成る群から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＣＡＡＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＣＡＡＧＵＡ−［Ｂ］−ＵＡＣＵＵＧＣＣＣＡＧＧＣＵＣＡＵＵＧ（標的配列番号１８）：配列番号９９−１０６；
ＵＣＡＣＧＧＡＵＧＵＣＣＡＧＣＵＧＵＵ−［Ｂ］−ＡＡＣＡＧＣＵＧＧＡＣＡＵＣＣＧＵＧＡ（標的配列番号２０）：配列番号１０７−１１４；
ＵＡＵＡＧＡＧＵＣＣＣＡＡＡＣＣＵＵＣ−［Ｂ］−ＧＡＡＧＧＵＵＵＧＧＧＡＣＵＣＵＡＵＡ（標的配列番号４９）：配列番号１１５−１２２；
ＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＵＣＵＧＣ−［Ｂ］−ＧＣＡＧＡＣＵＣＵＧＧＵＵＣＵＣＣＡＣ（標的配列番号５１）：配列番号１２３−１３０；
ＧＡＣＡＡＵＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡＣＡ−［Ｂ］−ＵＧＵＧＧＵＧＣＣＡＧＣＣＡＵＵＧＵＣ（標的配列番号８４）：配列番号１３１−１３８；及び
ＣＡＵＣＡＡＧＣＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵＣ−［Ｂ］−ＧＡＵＣＣＣＡＵＧＡＧＧＣＵＵＧＡＵＧ（標的配列番号８５）：配列番号１３９−１４６。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４３】
１１．合成細胞透過性ペプチド
ＣＤＫＮ３の考え得る結合部位を含有したＥＦ−１δタンパク質の一部に対応する１９アミノ酸ペプチド配列は、そのＮＨ２末端で膜伝達１１ポリアルギニン配列と共有結合した（１１Ｒ；Futaki et al., Hayama et al., 2006, 2007を参照されたい）。５種の細胞透過性ペプチドが合成された：１１Ｒ−ＥＦ−１δ７３−９１、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＴＳＧＤＨＧＥＬＶＶＲＩＡＳＬＥＶＥＮ（配列番号１４７）；１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０−１０８、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ（配列番号６２）；１１Ｒ−ＥＦ−１δ１０８−１２６、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＬＥＡＲＬＮＶＬＥＫＳＳＰＧＨＲＡＴＡ（配列番号１４８）；１１Ｒ−ＥＦ−１δ１２５−１４３、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＴＡＰＱＴＱＨＶＳＰＭＲＱＶＥＰＰＡＫ（配列番号１４９）；１１Ｒ−ＥＦ−１δ１４２−１６０、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＡＫＫＰＡＴＰＡＥＤＤＥＤＤＤＩＤＬＦ（配列番号１５０）。ペプチドを調製逆相高圧液体クロマトグラフィで精製した。ＬＣ３１９細胞を、５日間、２．５μＭ、５．０μＭ及び７．５μＭの濃度で１１Ｒペプチドとインキュベートした。培地を適当な濃度の各々のペプチドで４８時間毎に交換し、処理後５日目に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより評価した。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４６】
９．ＲＮＡ干渉アッセイ
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖（Dharmacon, Inc.，Lafayette，CO）（６００ｐＭ）を、３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、ＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９及びＬＣ３１９にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養し、細胞の生存率を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（セルカウンティングキット−８溶液；同仁化学研究所、熊本県、日本）により評価した。ＥＢＩ３発現の抑制を確認するために、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを上記のＥＢＩ３に特異的な合成プライマーを用いて行なった。ＲＮＡｉに関する合成オリゴヌクレオチドの配列は、以下のようであった：
対照１（Ｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ  ｐｌｕｓ；Dharmacon, Inc.；
５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ−３'（配列番号５３に対応するＲＮＡ）、
５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＵＧＡ−３'（配列番号５４に対応するＲＮＡ）、
５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＣＵＡ−３'（配列番号５５に対応するＲＮＡ）、
５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡ−３'（配列番号５６に対応するＲＮＡ）のプール）、
対照２（ルシフェラーゼ／ＬＵＣ：フォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子）；
５'−ＮＮＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３'（配列番号１５１に対応するＲＮＡ）、
ＥＢＩ３−１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＢＩ３−＃１）；
５'−ＵＡＣＵＵＧＣＣＣＡＧＧＣＵＣＡＵＵＧＵＵ−３'（配列番号１７）、
ｓｉ−ＥＢＩ３−＃１の標的配列；
５'−ＣＡＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡ−３'（配列番号１８）、
ｓｉ−ＥＢＩ３−＃２；
５'−ＡＡＣＡＧＣＵＧＧＡＣＡＵＣＣＧＵＧＡＵＵ−３'（配列番号１９）、
ｓｉ−ＥＢＩ３−＃１の標的配列；
５'−ＴＣＡＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴ−３'（標的配列２０）。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010536366000001.app