【手続補正書】
【提出日】平成22年12月16日(2010.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つまたは複数の安定化タンパク質の生成方法であって、以下のステップ；
複数（P）の進化的、構造上または進化的かつ構造上関連するポリペプチドを同定するステップ、
複数の関連ポリペプチドのうち少なくとも第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチドにおいてN個のペプチドセグメントを含む交差位置のセットを選択するステップ、
少なくとも第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドそれぞれのペプチドセグメントを含む組み合わされた組み換えタンパク質のサンプルセット（xPN）を生成するステップ（x＜1）、
発現され折り畳まれた組み合わされた組み換えタンパク質のサンプルセットの安定性を測定するステップ、
安定性を有する組み合わされた組み換えタンパク質の回帰分析を実行して、安定性関与ペプチドセグメントを同定するステップ、
安定性関与ペプチドセグメントを含む安定化ポリペプチドを生成するステップ、および
安定化ポリペプチドの活性および／または安定性を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記安定化ポリペプチドが酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記安定化ポリペプチドが工業用酵素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工業用酵素が、カルボヒドラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、セルラーゼ、β-グルカナーゼ、β-グルコシダーゼ、デキストラナーゼ、デキストリナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ/ペントサナーゼ/キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、プロテアーゼ、オキシゲナーゼ、酸性プロテイナーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、ペプシン、ペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、スブチリシン、リパーゼおよびエステラーゼ、アミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、ペニシリンアシラーゼ、イソメラーゼ、オキシドレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミノ酸酸化酵素、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸β-デカルボキシラーゼ、ヒスチダーゼ、トランスフェラーゼ、およびシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工業用酵素がシトクロムP450である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記安定化ポリペプチドが治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
交差位置のセットを選択するステップが、以下のステップ：
複数の進化的、構造上または進化的かつ構造上関連するポリペプチドの配列をアライメントするステップ、および
配列同一性の領域を同定するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
配列アライメント、ならびにX線結晶解析、NMR、タンパク質構造データベースの検索、ホモロジーモデリング、デノボタンパク質の折り畳み、およびタンパク質構造の計算予測からなる群より選択される1つまたは複数の方法を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
交差位置のセットを選択するステップが、以下のステップ：
少なくとも第1のポリペプチドの残基対間のカップリング相互作用を特定するステップ、
各データ構造が少なくとも第1および第2のポリペプチドの組み換えを含む交差突然変異体を表し、各組み換えが異なる交差位置を有する、複数のデータ構造を生成するステップ、
各データ構造について、データ構造により表される交差突然変異体において破壊されたカップリング相互作用の数に関連する交差破壊を決定するステップ、および
複数のデータ構造から、閾値未満の交差破壊を有する特定のデータ構造を同定するステップであって、特定のデータ構造により表される交差突然変異体の交差位置が同定された交差位置であるステップ
を含む、請求項１、７または８に記載の方法。
【請求項１０】
カップリング相互作用が残基間のコンホメーションエネルギーの決定により特定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
カップリング相互作用が残基間の原子間距離の決定により特定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも第1および第2のポリペプチドのそれぞれについてのコンホメーションエネルギーが、第1および第2のポリペプチドのうちの少なくとも1つについての三次元構造から決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
原子間距離が複数のポリペプチドのうちの少なくとも1つのポリペプチドの三次元構造から決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
カップリング相互作用が閾値を超える残基間のコンホメーションエネルギーにより特定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
閾値が複数のデータ構造についての交差破壊の平均レベルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
交差位置の同定が配列同一性の領域に基づくポリペプチドの考えられる切断点の同定を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
配列同一性の領域が少なくとも4つの残基を含む必要がある、請求項７または１６に記載の方法。
【請求項１８】
PNが50より大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
安定性の測定が、化学安定性測定、機能的安定性測定および熱安定性測定からなる群より選択される技術を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
化学安定性測定が化学変性測定を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
熱安定性測定が熱変性測定を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
機能的安定性測定がリガンドまたは基質結合技術を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
回帰分析が、配列安定性データまたは折り畳みタンパク質と折り畳み不全タンパク質とを比較した場合の多重配列アライメント（MSA）のコンセンサス分析の決定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
配列安定性データが安定性測定と操作可能に関連する配列情報を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
配列安定性分析が、以下の式：
【数１】
2010515683.tif 000001
（式中、T50は従属変数であり、ペプチドセグメントχij（i番目の位置およびj番目の親からの）は独立変数であり、定数項（α0）は親ポリペプチドの予測T50であり、回帰係数αijは親ポリペプチドの対応する参照ペプチドセグメントと比較したペプチドセグメントχijの熱安定性寄与を表す。）
により表される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
コンセンサス分析が安定化ポリペプチドの配列情報および安定性関与ペプチドセグメントの頻度を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
コンセンサス分析が、安定化タンパク質の位置（i）における安定性関与ペプチドセグメントの頻度測定およびコンセンサスエネルギー値を得るための位置：セグメント反復の指数関数評価を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
安定性を促進する安定性関与ペプチドセグメントが、以下の式：
【数２】
2010515683.tif 000002
で表現される安定化タンパク質の全コンセンサスエネルギー値を低下させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
回帰分析が、配列安定性データおよび折り畳みタンパク質と折り畳み不全タンパク質とを比較した場合の多重配列アライメント（MSA）のコンセンサス分析の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
1つまたは複数の安定化タンパク質の生成方法であって、以下のステップ：
交差位置のセットがN個のオリゴヌクレオチドセグメントを定義し、各セグメントがペプチドをコードする、進化的、構造上または進化的かつ構造上関連するポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチドのセットPにおける交差位置を選択するステップ、
交差位置を有する親ポリヌクレオチドのサブセットxPN間（x＜1）での組み換えを実行して、オリゴヌクレオチドセグメントによりコードされるペプチドセグメントを含む組み合わされた組み換えタンパク質のサンプルセットを得るステップ、
発現され折り畳まれた組み合わされた組み換えタンパク質のサンプルセットの安定性を測定するステップ、
安定性を有する組み合わされた組み換えタンパク質の回帰分析を実行して、安定性関与ペプチドセグメントおよびコードするオリゴヌクレオチドセグメントを同定するステップ、
安定性関与ペプチドセグメントをコードするオリゴヌクレオチドの組み合わせによりコードされる安定化ポリペプチドを生成するステップ、および
安定化ポリペプチドの活性および／または安定性を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３１】
安定化ポリペプチドが酵素を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
安定化ポリペプチドが工業用酵素を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
工業用酵素が、カルボヒドラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、セルラーゼ、β-グルカナーゼ、β-グルコシダーゼ、デキストラナーゼ、デキストリナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ/ペントサナーゼ/キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、プロテアーゼ、オキシゲナーゼ、酸性プロテイナーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、ペプシン、ペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、スブチリシン、リパーゼおよびエステラーゼ、アミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、ペニシリンアシラーゼ、イソメラーゼ、オキシドレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミノ酸酸化酵素、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸β-デカルボキシラーゼ、ヒスチダーゼ、トランスフェラーゼ、およびシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工業用酵素がシトクロムP450酵素である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
安定化ポリペプチドが治療用タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
交差位置のセットを選択するステップが、以下のステップ：
親ポリヌクレオチドのセットの配列をアライメントするステップ、および
配列同一性の領域を同定するステップ
を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
配列アライメント、ならびにポリヌクレオチドのセットのメンバーによりコードされるタンパク質の、X線結晶解析、NMR、タンパク質構造データベースの検索、ホモロジーモデリング、デノボタンパク質の折り畳み、およびタンパク質構造の計算予測からなる群より選択される1つまたは複数の方法を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
交差位置のセットを選択するステップが、以下のステップ：
少なくとも第1のポリペプチドの残基対間のカップリング相互作用を特定するステップ、
各データ構造が少なくとも第1および第2のポリペプチドの組み換えを含む交差突然変異体を表し、各組み換えが異なる交差位置を有する、複数のデータ構造を生成するステップ、
各データ構造について、データ構造により表される交差突然変異体において破壊されたカップリング相互作用の数に関連する交差破壊を決定するステップ、および 
複数のデータ構造から閾値未満の交差破壊を有する特定のデータ構造を同定するステップであって、特定のデータ構造により表される交差突然変異体の交差位置が同定された交差位置であるステップ
を含む、請求項３０、３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
カップリング相互作用が残基間のコンホメーションエネルギーの決定により特定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
カップリング相互作用が残基間の原子間距離の決定により特定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
関連するポリペプチドの少なくとも第1および第2のポリペプチドのそれぞれのコンホメーションエネルギーが、第1および第2のポリペプチドのうちの少なくとも1つの三次元構造から決定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
原子間距離が複数のポリペプチドのうちの少なくとも1つのポリペプチドの三次元構造から決定される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
カップリング相互作用が、閾値を超える残基間のコンホメーションエネルギーにより特定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
閾値が複数のデータ構造についての交差破壊の平均レベルである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
交差位置の同定が、ポリヌクレオチドでの配列同一性の領域に基づくポリペプチド中の考えられる切断点の同定を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
配列同一性の領域が少なくとも4つのヌクレオチドを含む必要がある、請求項３６または４５に記載の方法。
【請求項４７】
組み合わされた組み換えライブラリのメンバーの合計数PNが50より大きい、請求項３０に記載の方法。
【請求項４８】
安定性の測定が、化学安定性測定、機能的安定性測定および熱安定性測定からなる群より選択される技術を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４９】
化学安定性測定が化学変性測定を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
熱安定性測定が熱変性測定を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
機能的安定性測定がリガンドまたは基質結合技術を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
回帰分析が、配列安定性データまたは折り畳みタンパク質と折り畳み不全タンパク質とを比較した場合の多重配列アライメント（MSA）のコンセンサス分析の決定を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５３】
配列安定性データが、安定性測定と操作可能に関連する配列情報を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
配列安定性分析が、以下の式：
【数３】
2010515683.tif 000003
（式中、T50は従属変数であり、ペプチドセグメントχij（i番目の位置およびj番目の親からの）は独立変数であり、定数項（α0）は親ポリペプチドの予測T50であり、回帰係数αijは親ポリペプチドの対応する参照ペプチドセグメントと比較したペプチドセグメントχijの熱安定性寄与を表す。）
により表され、
T50値を出力する、
請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５５】
コンセンサス分析が安定化ポリペプチドの配列情報および安定性関与ペプチドセグメントの頻度を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
コンセンサス分析が、安定化タンパク質の位置（i）における安定性関与ペプチドセグメントの頻度測定およびコンセンサスエネルギー値を得るための位置：セグメント反復の指数関数評価を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
安定性を促進する安定性関与ペプチドセグメントが、以下の式：
【数４】
2010515683.tif 000004
により表される安定化タンパク質の全コンセンサスエネルギー値を低下させる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
回帰分析が、配列安定性データおよび折り畳みタンパク質と折り畳み不全タンパク質とを比較した場合の多重配列アライメント（MSA）のコンセンサス分析の組み合わせを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５９】
安定性関与ペプチドフラグメントを特定する方法であって、以下のステップ：
交差位置のセットがN個のオリゴヌクレオチドセグメントを定義し、各セグメントがペプチドをコードする、進化的、構造上または進化的かつ構造上関連するポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチドのセットPにおける交差位置を選択するステップ、
交差位置を有する親ポリヌクレオチドのサブセットxPN間（x＜1）での組み換えを実行し、オリゴヌクレオチドセグメントによりコードされるペプチドセグメントを含む組み合わされた組み換えタンパク質のサンプルセットを得るステップ、
発現され折り畳まれた組み合わされた組み換えタンパク質のサンプルセットの安定性を測定するステップ、
安定性を有する組み合わされた組み換えタンパク質の回帰分析を実行し、安定性関与ペプチドセグメントおよびコードするオリゴヌクレオチドセグメントを同定するステップ、
安定性関与ペプチドセグメントに対する配列データおよび安定性測定をデータベースに出力するステップであって、該データベースがヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方を含むステップ
を含む、上記方法。
【請求項６０】
自動化された請求項１または３０に記載の方法。
【請求項６１】
交差位置がコンピュータにより決定される、請求項１または３０に記載の方法。
【請求項６２】
回帰分析がコンピュータにより実行される、請求項１または３０に記載の方法。
【請求項６３】
以下のステップ：
交差位置のセットがN個のオリゴヌクレオチドセグメントを定義し、各セグメントがペプチドをコードする、進化的、構造上または進化的かつ構造上関連があるポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチドのセットPにおける交差位置を選択するステップ、
交差位置を有する親ポリヌクレオチドのサブセットxPN間（x＜1）での組み換えを実行し、オリゴヌクレオチドセグメントによりコードされるペプチドセグメントを含む組み合わされた組み換えタンパク質のサンプルセットを得るステップ、
サンプルセットにおける発現された組み合わされた組み換えタンパクの安定性測定からのデータを獲得するステップ、
安定性を有する組み合わされた組み換えタンパク質の回帰分析を実行し、安定性関与ペプチドセグメントおよびコードするオリゴヌクレオチドセグメントを同定するステップ、
安定性関与ペプチドセグメントをコードするオリゴヌクレオチドの組み合わせによりコードされる安定化ポリペプチドを生成するステップ、および
安定化ポリペプチド配列をユーザーに出力するステップ
を含む、コンピュータ実装方法。