【手続補正書】
【提出日】平成23年7月21日(2011.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１Ｐと特異的に反応し、かつ、少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖を含み、２つの重鎖および２つの軽鎖を有していてもよい、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
Ａ．それぞれの重鎖が、
（ｉ）アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＱＳＦＧＹＩＦＩＤＨＴＩＨＷＭＲＱＭＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＦＣＡＲＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号２７）
を有するアミノ酸残基の配列；または、
（ｉｉ）上記Ａ（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列
を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ、
Ｂ．それぞれの軽鎖が、
（ｉ）アミノ酸配列：
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮＷＦＱＱＥＰＧＫＡＰＫＬＬＩＳＥＧＮＩＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＫＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２９）
を有するアミノ酸残基の配列；または、
（ｉｉ）上記Ｂ（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列
を含む軽鎖可変ドメインを含む、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
Ａ．それぞれの重鎖が、以下：
（ｉ）配列ＤＨＴＩＨ（配列番号１３）のアミノ酸残基の第１配列；
（ｉｉ）アミノ酸残基ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ（配列番号１８）の第２配列；または、
（ｉｉｉ）配列ＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ（配列番号１５）のアミノ酸残基の第３配列；の少なくとも１つを含み、かつ、
Ｂ．それぞれの軽鎖が、以下：
（ｉ）配列ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１０）のアミノ酸残基の第１配列；
（ｉｉ）配列ＥＧＮＩＬＲＰ（配列番号１１）のアミノ酸残基の第２配列；または、
（ｉｉｉ）配列ＬＱＳＤＮＬＰＦＴ（配列番号１２）のアミノ酸残基の第３配列、
の少なくとも１つを含む、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
Ａ．それぞれの重鎖が、以下：
（ｉ）配列ＤＨＴＩＨ（配列番号１３）のアミノ酸残基の第１配列；
（ｉｉ）アミノ酸残基ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ（配列番号１８）の第２配列；および、
（ｉｉｉ）配列ＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ（配列番号１５）のアミノ酸残基の第３配列；を含み、かつ、
Ｂ．それぞれの軽鎖が、以下：
（ｉ）配列ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１０）のアミノ酸残基の第１配列；
（ｉｉ）配列ＥＧＮＩＬＲＰ（配列番号１１）のアミノ酸残基の第２配列；および、
（ｉｉｉ）配列ＬＱＳＤＮＬＰＦＴ（配列番号１２）のアミノ酸残基の第３配列、
を含む、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
請求項１に記載の単離されたヒト化抗体であって、
Ａ．それぞれの重鎖が、以下：
（ｉ）ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＱＳＦＧＹＩＦＩＤＨTＩＨＷＭＲＱＭＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＦＣＡＲＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３１）；または
（ｉｉ）上記Ａ（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列；
のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の配列を含み、かつ、
Ｂ．それぞれの軽鎖が、以下：
（ｉ）ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮＷＦＱＱＥＰＧＫＡＰＫＬＬＩＳＥＧＮＩＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＫＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号３２）；または
（ｉｉ）上記Ｂ（ｉ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列、
のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の配列を含む、単離されたヒト化抗体。
【請求項５】
請求項４に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
Ａ．それぞれの重鎖が、以下：
（ｉ）配列ＤＨＴＩＨ（配列番号１３）のアミノ酸残基の第１配列；
（ｉｉ）アミノ酸残基ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ（配列番号１８）の第２配列；または、
（ｉｉｉ）配列ＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ（配列番号１５）のアミノ酸残基の第３配列；の少なくとも１つを含み、かつ、
Ｂ．それぞれの軽鎖が、以下：
（ｉ）配列ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１０）のアミノ酸残基の第１配列；
（ｉｉ）配列ＥＧＮＩＬＲＰ（配列番号１１）のアミノ酸残基の第２配列；または、
（ｉｉｉ）配列ＬＱＳＤＮＬＰＦＴ（配列番号１２）のアミノ酸残基の第３配列、
の少なくとも１つを含む、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
請求項４に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
Ａ．それぞれの重鎖の配列が、以下：
（ｉ）配列ＤＨＴＩＨ（配列番号１３）のアミノ酸残基の第１配列；
（ｉｉ）アミノ酸残基ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ（配列番号１８）の第２配列；および、
（ｉｉｉ）配列ＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ（配列番号１５）のアミノ酸残基の第３配列；を含み、かつ、
Ｂ．それぞれの軽鎖の配列が、以下：
（ｉ）配列ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号１０）のアミノ酸残基の第１配列；
（ｉｉ）配列ＥＧＮＩＬＲＰ（配列番号１１）のアミノ酸残基の第２配列；および、
（ｉｉｉ）配列ＬＱＳＤＮＬＰＦＴ（配列番号１２）のアミノ酸残基の第３配列、
を含む、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
請求項１に記載の単離されたヒト化抗体であって、
Ａ．それぞれの重鎖が、以下：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＱＳＦＧＹＩＦＩＤＨＴＩＨＷＭＲＱＭＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＦＣＡＲＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３１）
のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の配列を含み、かつ、
Ｂ．それぞれの軽鎖が、以下：
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮＷＦＱＱＥＰＧＫＡＰＫＬＬＩＳＥＧＮＩＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＫＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号３２）
のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の配列を含む、単離されたヒト化抗体。
【請求項８】
それぞれの重鎖が、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＱＳＦＧＹＩＦＩＤＨＴＩＨＷＭＲＱＭＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＦＣＡＲＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３５）
を有するアミノ酸残基の配列を含む、請求項４に記載の単離されたヒト化抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
Ａ．それぞれの重鎖が、ベクターpATH1009（ATCC受託番号PTA-8421）内の重鎖遺伝子によりコードされる重鎖可変ドメインと同じ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み；かつ、
Ｂ．それぞれの軽鎖が、ベクターpATH1009（ATCC受託番号PTA-8421）内の軽鎖遺伝子によりコードされる軽鎖可変ドメインと同じ軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つのアミノ酸残基がグリコシル化されている、請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント、および医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントの発現のためにコードする、単離された核酸組成物であって、
Ａ．プロモーターとヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントの１または複数の重鎖ポリペプチドをコードする遺伝子を含む第１の発現カセット；および
Ｂ．プロモーターとヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントの１または複数の軽鎖ポリペプチドをコードする遺伝子を含む第２の発現カセット
を含む、組成物。
【請求項１３】
第１および第２の発現カセットを含むプラスミドを含むものである、請求項１２に記載の単離された核酸組成物。
【請求項１４】
受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８４２１で寄託された宿主細胞であってもよい、請求項１２に記載の単離された核酸組成物でトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１５】
対象におけるＳ１Ｐの異常なレベルに関連する疾患または障害を処置するための、請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
Ａ．それぞれの重鎖が、受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８４２２で寄託された、ＣＨＯ細胞株ＬＨ１ ２７５より発現する抗体の重鎖と同じ重鎖を含み；かつ、
Ｂ．それぞれの軽鎖が、受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８４２２で寄託された、ＣＨＯ細胞株ＬＨ１ ２７５より発現する抗体の軽鎖と同じ軽鎖を含む、
単離されたヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
ＣＤＲＬ１（配列番号１０）、ＣＤＲＬ２（配列番号１１）およびＣＤＲＬ３（配列番号１２）により特徴付けられる超可変相補決定領域(CDR)を含むヒト化された軽鎖可変ドメインを含み、かつ、ＣＤＲＨ１（配列番号１３）、ＣＤＲＨ２（配列番号１８）およびＣＤＲＨ３（配列番号１５）により特徴付けられる超可変CDRを含むヒト化された重鎖可変ドメインを含む、Ｓ１Ｐに特異的に反応する単離されたヒト化抗体。
【請求項１８】
配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２のＣＤＲペプチドをコードする軽鎖遺伝子をコードする第一の遺伝子、ならびに配列番号１３、配列番号１８および配列番号１５をコードする重鎖遺伝子をコードする第二の遺伝子を含む、Ｓ１Ｐに特異的に反応するヒト化抗体をコードする単離された核酸組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単離された核酸組成物を含むプラスミドであって、配列番号３３の核酸配列を含む重鎖遺伝子と配列番号３４の軽鎖核酸配列を含む軽鎖遺伝子を含むＳ１Ｐに特異的に反応するヒト化抗体をコードしていてもよい、プラスミド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のプラスミドでトランスフェクションされ、かつ、前記抗体を発現することができる組換宿主細胞であって、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞であってもよく、名称ＬＨ１ ２７５を有し、かつ、受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８４２２で寄託された細胞株であってもよい、組換宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
「化学療法薬」とは、抗癌剤および他の抗過剰増殖剤を意味する。簡単には、「化学療法薬」とは、細胞および組織を破壊することを意図した化学物質を指す。このような薬剤としては、限定されるものではないが、（１）ＤＮＡ傷害薬およびＤＮＡ合成を阻害する薬剤：例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン(doxorubicin)、ドノルビシン(donorubicin)、エピルビシン(epirubicin)）、アルキル化剤（例えば、ベンダムスチン(bendamustine)、ブスルファン(busulfan)、カルボプラチン(carboplatin)、カルムスチン(carmustine)、シスプラチン(cisplatin)、クロラムブシル(chlorambucil)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、ダカルバジン(dacarbazine)、ヘキサメチルメラミン(hexamethylmelamine)、イフォスファミド(ifosphamide)、ロムスチン(lomustine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、メルファラン(melphalan)、ミトタン(mitotane)、マイトマイシン(mytomycin)、ピポブロマン(pipobroman)、プロカルバジン(procarbazine)、ストレプトゾシン(streptozocin)、チオテパ(thiotepa)およびトリエチレンメラミン(triethylenemelamine)）、白金誘導体（例えば、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、シスジアミンジクロロ白金）、テロメラーゼならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトサー(Camptosar)）、（２）（２）チューブリン脱重合薬：例えば、タキソイド（例えば、パクリタキセル(Paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、ＢＡＹ５９−８８６２）、（３）カペシタビン(capecitabine)、クロロデオキシアデノシン(chlorodeoxyadenosine)、シタラビン(cytarabine)（およびその活性化形態、ａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、デカルバジン(dacabazine)、フロクスウリジン(floxuridine)、フルダラビン(fludarabine)、５−フルオロウラシル、５−ＤＦＵＲ、ゲムシタビン(gemcitabine)、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート(methotrexate)、ペントスタチン、トリメトレキサート、６−チオグアニン）などの代謝拮抗物質、（４）抗脈管形成剤（例えば、アバスチン(Avastin)、サリドマイド(thalidomide)、サニチニブ(sunitinib)、レナリドミド(lenalidomide)、血管障害剤（例えば、フラボノイド／フラボン、ＤＭＸＡＡ、コンブレタスタチン誘導体（例えば、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａなど）、（５）抗体または抗体フラグメントなどの生物製品（例えば、ヘルセプチン(Herceptin)、アバスチン(Avastin)、パノレックス(Panorex)、リツキサン(Rituxan)、ゼバリン(Zevalin)、マイロターグ(Mylotarg)、キャンパス(Campath)、ベキサール(Bexar)、エルビタックス(Erbitux)、ルセンチス(Lucentis)）、ならびに（６）内分泌療薬：例えば、アロマターゼ阻害剤（例えば、４−ヒドロアンドロステンジオン(4-hydroandrostendione)、エキセメスタン(exemestane)、アミノグルテヒミド(aminoglutehimide)、アナストロゾール(anastrozole)、レトゾール(letozole)）、抗エストロゲン作用薬（例えば、タモキシフェン(Tamoxifen)、トレミフィン(Toremifine)、ラオキシフェン(Raoxifene)、ファスロデックス(Faslodex)）、ステロイド（デキサメタゾン(dexamethasone)など）、（７）免疫調節剤：例えば、サイトカイン（ＩＦＮ−βおよびＩＬ２など）、インテグリン、他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼに対する阻害剤、（８）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。（９）イマチニブ(imatinib)（グリベック(Gleevec)）のようなチロシンキナ���ゼ阻害剤などのシグナル伝達阻害剤、（１０）熱ショックタンパク質阻害剤、（１１）全てのトランスレチノイン酸などのレチノイド、（１２）増殖因子受容体または増殖因子自体の阻害剤、（１２）ナベルビン(navelbine)、パクリタキセル(paclitaxel)、タキソテール(taxotere)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンデシン(vindesine)およびビノレルビン(vinorelbine)などの抗有糸分裂化合物、（１４）ＣＯＸ阻害剤などの抗炎症薬、ならびに（１５）細胞周期レギュレーター、例えば、チェックポイントレギュレーターおよびテロメラーゼ阻害剤などが含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
発明の概要
本発明は、特に生理学的に（例えば、生体組織、血液など）および生理条件下で、スフィンゴ脂質に対する強い結合親和性、スフィンゴ−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と結合し、中和する能力を含む、治療的および／または診断的見地からの所望の特性を有する抗体および抗スフィンゴ脂質抗体変異体を含む特許性のあるヒト化抗スフィンゴ脂質剤、ならびにイソ型、変異体、異性体および関連化合物に関する。特に、本発明はＳ１Ｐに対する抗体、特にモノクローナル抗体、より詳しくはヒト化モノクローナル抗体およびその変異体を記載する。このような抗体および変異体は好ましくは、このような化合物による処置を必要とすることが分かっている、または必要とすると思われる対象に投与するのに好適な医薬組成物中に含まれる。組成物の他、本発明はまた、このような組成物を含むキット、このような抗Ｓ１Ｐ抗体および変異体を製造する方法、ならびにこのような薬剤を用いる処置方法も提供する。
一実施形態において、S1P と特異的に反応し、かつ、少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。各重鎖は、配列番号27のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約 50% の配列同一性、好ましくは少なくとも約 80% の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ、各軽鎖は、配列番号29のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約 50% の配列同一性、好ましくは少なくとも 約 80% の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
これらのヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントの各重鎖は、配列DHTIH (配列番号 13)のアミノ酸残基の第１配列; アミノ酸残基 AISPRHDITKYNEMFRG (配列番号 18)の第２配列; および/または配列GGFYGSTIWFDF (配列番号 15)のアミノ酸残基の第３配列を含み得; 一方、各軽鎖は、配列 ITTTDIDDDMN (配列番号:10)のアミノ酸残基の第１配列; 配列 EGNILRP (配列番号:11)のアミノ酸残基の第２配列; および/または配列 LQSDNLPFT (配列番号:12)のアミノ酸残基の第３配列を含み得る。
本発明のヒト化抗体は、配列番号31の全長重鎖アミノ酸配列および配列番号32の全長軽鎖アミノ酸配列、または、C末端リジンを欠いている配列番号35の重鎖アミノ酸配列を含む、これらと少なくとも約 80% の同一性を有する配列を含み得る。
本発明によれば、ヒト化抗体は、ATCC 受託番号 PTA-8421 または PTA-8422 におけるベクター pATH1009 によってコードされる重鎖および軽鎖可変ドメイン配列と同じ重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を含み得る。
本発明のヒト化抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、本発明のヒト化抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸、該核酸を用いてトランスフェクトされた宿主細胞、および S1P の異常なレベルに関連する疾患または障害を本発明の組成物を用いて処置する方法がさらに提供される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
「発現カセット」とは、構造遺伝子（すなわち、本発明の抗体などのタンパク質コード配列）の、このような配列に適合した宿主での発現をもたらし得るヌクレオチド分子を指す。発現カセットとしては、ポリペプチドコード配列と、また所望により、例えば転写終結シグナルなどの他の配列と、作動可能なように連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。また、例えばエンハンサーなど、発現の達成に必要または有用な付加的調節エレメントを用いてもよい。よって、発現カセットはプラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え型の「裸のＤＮＡ」ベクターなどを含む。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて作製されている。Kostelny, et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分と連結された。抗体ホモ二量体をそのヒンジ領域において還元して単量体を形成させた後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成された。この方法はまた、抗体ホモ二量体の作製にも利用可能である。Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「ダイアボディー」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するためのもう１つの機構を提供した。これらのフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインの間で対合を可能とするには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。よって、１つのフラグメントのＶＨドメインとＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合して、それにより２つの抗原結合部位を形成することを余儀なくされる。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体に使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するためのもう１つの戦略も報告されている。例えば、Gruber, et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)参照。あるいは、二重特異性抗体は、例えば、Zapata, et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載されているように作製された「線状抗体」であってもよい。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７６】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。Ａタンパク質の親和性リガンドとして妥当性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソ型に依存する。Ａタンパク質は、ヒト重鎖に基づく抗体を精製するのに使用できる(Lindmark, et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。Ｇタンパク質は全てのマウスイソ型とヒトγ３に関して奨励される(Guss, et al., EMBO J. 5:15671575 (1986))。親和性リガンドが結合されたマトリックスはほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは流速を速めることができ。アガロースで達成し得るものよりも短い時間処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫安沈殿法など、タンパク質精製のためのその他の技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１４】
【図１０】図１０は、２つのパネル１０Ａおよび１０Ｂを含む。各パネルはネズミ抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体ＶＬおよびＶＨドメインの発現用のクローニングベクターのマップを示す。図１０Ａは、ＶＬドメインのクローニング用のｐＫＮ１００ベクターのマップである。図１０Ａは、ＶＨドメインのクローニング用のｐＧ１Ｄ２００ベクターのマップである。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５２】
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡを、ＭＨＶ７プライマー（ＭＨＶ７：５’−ＡＴＧＧＲＡＴＧＧＡＧＣＫＧＧＲＴＣＴＴＴＭＴＣＴＴ−３’［配列番号１］）をＩｇＧ２ｂ定常領域プライマーＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３混合物（ＭＨＣＧ１：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’［配列番号２］；ＭＨＣＧ２ａ：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣ−３  ［配列番号３］；ＭＨＣＧ２ｂ：５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’［配列番号４］；ＭＨＣＧ３：５’−ＣＡＡＧＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣ−３’［配列番号５］）と組み合わせて用いてＰＣＲによって増幅した。この反応産物を、ＴＯＰＯ−ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔおよび配列を用いてｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒ (Invitrogen)に連結した。次いで、重鎖の可変ドメインをこのベクターからＰＣＲによって増幅し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＡｐａ  Ｉフラグメントとして挿入し、ＨＣＭＶｉプロモーター、リーダー配列およびγ−１定常領域を含む発現ベクターｐＧ１Ｄ２００（米国特許第７，０６０，８０８号参照）またはｐＧ４Ｄ２００（同文献）に連結して、プラスミドｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨ（図１０）を作製した。３０６Ｄ  ＶＨのコンセンサス配列（下記に示す）は定常領域フラグメントがγ  ２ｂイソ型と一致することを示した。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５４】
重鎖および軽鎖プラスミド  ｐＧ１Ｄ２００３０６ＤＶＨとｐＫＮ１００３０６ＤＶＫをＤＨ４ａ細菌に形質転換させ、グリセロールに入れてストックした。製造業者（Qiagen、ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｆｒｅｅ  ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）ｋｉｔ）によって記載されているように、大量のプラスミドＤＮＡを調製した。Qiagen社のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫｉｔまたはＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ／Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡサンプルを、ＡＢＩ  ３７３０ｘｌ自動シーケンサーを用いて配列決定した、このシーケンサーは蛍光シグナルをそれらの対応する核酸塩基配列への変換も行う。５’および３’末端において、得られた配列がオーバーラップするようにプライマーを設計した。プライマーの長さは１８〜２４塩基であり、好ましくは、それらはＧＣ含量５０％でありかつ推定二量体または二次構造を含まないものとした。Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標）のマウスＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号８および９である（表２）。表２ではＣＤＲ残基（Kabat, EA (1982), Pharmacol Rev, vol. 34: 23-38参照）に下線を施し、下の表３において個別に示している。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５５】
【表２】
2010515427.tif 000001
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５６】
【表３】
2010515427.tif 000002
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５７】
表４においていくつかのキメラ抗体可変（ＶＨおよびＶＬ）ドメインのアミノ酸配列を比較している。これらの変異体を、発現ベクター中へ、生殖系列リーダー配列の後ろにクローニングした。pATH200 (最初の 19 アミノ酸) および pATH300 配列 (最初の 22 アミノ酸) 上の生殖系列リーダー配列には、表４において下線が引かれている。CDR は太字で示されている。表 4 における重鎖および軽鎖配列の各々の C 末端に続くアミノ酸は、イタリック体で示されている。これらは定常ドメインの最初の数アミノ酸であり、可変ドメインの一部ではない。pATH200 および pATH300 シリーズの番号は通常、特定の可変ドメイン変異体の配列を含むベクターを指すが、便宜のため、本明細書において、この命名法は該変異体の可変ドメイン自体を指すため、および区別するために用いられ得ることに注意すべきである。ネズミＶＨおよびＶＬドメインの配列を用いて、どのフレームワーク残基をヒト化抗体に組み込むべきかを確認するための分子モデルを構築した。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５８】
【表４−１】
2010515427.tif 000003
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
【表４−２】
2010515427.tif 000004
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６６】
４．抗体精製
培養上清をＡタンパク質／Ｇカラム（Pierce、カタログ番号５３１３３）に０，．５ｍＬ／分で通すことによって、培養上清からモノクローナル抗体を精製した。移動相は１Ｘ  Pierce社製ＩｇＧ  ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号２１００１）および０．１Ｍグリシン  ｐＨ２．７（Pierce、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、カタログ番号２１００４）で構成した。０．１Ｍグリシン中の抗体収集物を１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ８．０で１０％（ｖ／ｖ）希釈して、ｐＨを中和した。ＩｇＧ１収集物をプールし、１Ｘ  ＰＢＳに対して徹底的に透析した（Pierce社製Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ、３，５００  ＭＷＣＯ、カタログ番号６６３８２）。溶出液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３（１０，０００  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  カタログ番号４２０３）を用いて２，５００ｒｃｆで１時間の遠心分離により濃縮した。抗体濃度は標準として市販の骨髄腫ＩｇＧ１ストック溶液を用いて上記のように定量的ＥＬＩＳＡにより決定した。重鎖アイソタイプのｍＡｂを、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Sigma、ＩＳＯ−２）を用いてＥＬＩＳＡにより決定した。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６７】
５．抗体変異体のＳ１Ｐに対する比較結合
下記表５では変異株とキメラ抗体との比較分析を示している。マウスまたはヒトＩｇＧに対して特異的な、ＨＲＰとコンジュゲートされた二次抗体によって結合抗体を検出して、これらの結果を得た。発色反応を測定し、光学密度（ＯＤ）として報告した。抗体パネルの濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。Ｓ１Ｐコーティングマトリックス単独との二次抗体の相互作用は全く検出されなかった。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６８】
【表５】
2010515427.tif 000005
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７８】
この研究では、構造アライメントプログラム（ＳＲ  ｖ７．６）を用いたＩＭＧＴおよびＫａｂａｔデータベース内のヒト抗体の相同性検索に基づいて、好適なアクセプター構造を選択した。最初のステップは、これらのヒト重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）配列データベース(these human heavy variable (VH) and light variable (VL) sequence databases)にＬＴ１００２  ＶＨおよびＶＬタンパク質配列それぞれについて問い合わせること、バーニア残基(Foote, J. & Winter, G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol. Biol. 224, 487-499 (1992))、カノニカル残基(Morea, et al., Antibody modeling: implications for engineering and design, Methods 20, 267-279 (2000)およびＶＨ−ＶＬ界面残基(Chothia, C., Novotny, J., Bruccoleri, R., & Karplus, M. Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J Mol. Biol. 186, 651-663 (1985))において、ＦＲ内に高い配列同一性を有し、かつ同一カノニカルクラスおよび／または長さのＣＤＲを有するヒトフレームワーク（ＦＲ）を同定することである。このライブラリーの各メンバーの、マウス抗体の個別アライン残基に対する同一性を、前記プログラムを用いて計算した。マウスＦＲと最も同一性の高いＦＲ配列を有するヒト配列を同定し、ヒト「アクセプター」配列の最初のショートリストを作成した。バーニア残基、カノニカル残基およびＶＨ−ＶＬ界面（ＶＣＩ）残基においてマウス抗体と最も同一性の高い配列も計算した。ヒトとマウスとの間でのこれらの位置における相違は、保存的置換と非保存的置換に分類され、ＬＴ１００２との非保存的ＶＣＩの相違が最低値であることを最良のフレームワーク選択とした。ＬＴ１００２のＣＤＲループ  Ｌ３およびＨ１はカノニカル構造に分類することができた。これらのＬ３およびＨ１構造を用いて、同一カノニカル構造を有するヒト抗体ＦＲを選択した。分類されないＣＤＲについては、ＣＤＲ長さがマウス抗体と同一であるヒトフレームワークを選択するよう試みた。この理論的解釈は、ＣＤＲループ構造が、ＣＤＲループ配列自体だけでなく、その基礎となるフレームワーク残基（カノニカル残基）にも依存しているということである。そのため、マッチするカノニカルＣＤＲ構造および／またはＣＤＲ長さを有するヒトフレームワークは、グラフトしたマウスＣＤＲを、抗原結合親和性を維持するのに最も適した配向で保持する可能性が高い。ＣＤＲ  Ｈ３を除く全てのＣＤＲでは、これはヒトフレームワーク配列の選択によって行われた。加えて、可能であれば、普通でないシステインまたはプロリン残基を有するフレームワークを排除した。重鎖および軽鎖配列についてはこれらの計算を別々に実施した。最後に、最良にマッチする配列におけるフレームワーク領域全体での個別配列の相違を比較した。上記比較計算結果に最良にフィットするヒト抗体のうち、抗体  ＡＹ０５０７０７およびＡＪ００２７７３を、軽鎖および重鎖それぞれについて最も適したヒトフレームワークとして選択した。ＡＹ０５０７０７フレームワークは、van den Brink らによって記載されており(Blood, 15 April 2002, Vol. 99, No. 8, pp 2828-2834)、その配列は Genbank を介して入手可能である(受入番号 AY050707; Homo sapiens clone WR3VL immunoglobulin light chain variable region mRNA, partial cds; 2001年11月13日提出, 最新の改���は2002年4月8日)。同様に、ＡＪ００２７７３抗体フレームワークは Snow らによって記載されており[Eur. J. Immunol. 28 (10), 3354-3361 (1998)]、その配列は Genbank を介して入手可能である(受入番号 AJ002772; Homo sapiens mRNA for variable region 5 of immunoglobulin G4 heavy chain patient 2,2; 1998年11月6日提出, 最新の改訂は2006年10月16日)。AY050707(軽鎖)およびAJ002773(重鎖)の配列の両者とも、ヒトおよび他の脊椎動物種の免疫グロブリン(IG)および T 細胞受容体(TR)のヌクレオチド配列の総合データベースである IMGT/LIGM においても見出される。このデータベースは、Marie-Paule Lefranc, LIGM, Montpellier, France によって1989年に作成され、1995年7月以降、オンラインで利用可能となっている。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８１】
ｃ．ヒト化抗体変異体の作製
全長抗体を哺乳類細胞内で発現させるために、ＬＴ１００２の可変ドメインをκ鎖および重鎖のヒト定常領域を含むベクターにクローニングすることによりマウス−ヒトキメラ抗体（ｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐ）を構築した。ＬＴ１００２  ＶＨのＫａｂａｔ  ＣＤＲ  １、２および３を、ＡＪ００２７７３のアクセプターフレームワーク内へグラフトすることによりヒト化重鎖を得た。ＡＪ００２７７３に最も近い生殖細胞遺伝子はＶＨ５−５１であり、このリーダー配列をリーダー配列としてヒト化重鎖変異体に組み込んだ。ＶＨ５−５１リーダー配列を有する、第一ヒト化型ＬＴ１００２  ＶＨであるｐＡＴＨ２００のタンパク質配列を表４に示している。ＬＴ１００２のＶＨドメインの場合では、２位、２７位、３７位、４８位、６７位および６９位の残基はバーニア残基であるかまたはＶＨおよびＶＬドメインの界面にあり、ＣＤＲ配向に影響を及ぼす可能性が高い。３７位はＶＨドメインとＶＬドメインとの界面に重要であるように思われた。ヒトフレームワーク内のこれらの位置にある残基を、対応する位置に見られるネズミ残基で逆突然変異させた。突然変異、Ｖ３７Ｍ、Ｍ４８ＩおよびＹ２７Ｆを個別に試験した。１つの型（ｐＡＴＨ２０５）は３つ全ての突然変異とともに、Ｖ６７Ａと、さらにＩ６９Ｌを含み、別の型（ｐＡＴＨ２０６）は５つ全ての突然変異とＶ２Ａを含んだ。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８２】
ＬＴ１００２  ＶＬのＫａｂａｔ  ＣＤＲ  １、２および３を、ＡＹ０５０７０７のアクセプターフレームワーク内へグラフトすることによりヒト化軽鎖を得た。ＡＹ０５０７０７に最も近い生殖細胞遺伝子はＬ１１であり、このリーダー配列をヒト化軽鎖構築物に組み込んだ。ｐＡＴＨ３００（ＬＴ１００２軽鎖）のタンパク質配列は、表４に示される。生殖系列リーダー配列は、表４において下線によって示される。ＶＬの場合では、４つの非保存バーニア位置４位、３６位、４９位、６４位はＣＤＲループの構造の支持に関与するため、ネズミ残基の逆突然変異のためにそれらの位置を選択した。ＬＴ１００２の分子モデルの検討により、Ｔｙｒ  ６７がＣＤＲ表面に近く、抗原結合面に向かって配向しており、Ｓ１Ｐと相互作用することができる示唆された。そのため、後のヒト化型にＳ６７Ｙ逆突然変異も追加した。２つの突然変異を別々に導入して、Ｙ４９ＳまたはＹ３６Ｆのいずれかを含む２つの型を作製した。次の突然変異組合せを用いていくつかの型を作出した：（Ｙ４９Ｓ、Ｆ４Ｖ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４Ｓ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４Ｓ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｆ４Ｖ、Ｇ６４Ｓ、Ｓ６７Ｙ）、（Ｙ４９Ｓ、Ｇ６４Ｓ、Ｓ６７Ｙ）。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８３】
ｄ．ヒト化リード候補の選択
基本グラフト型（ｐＡＴＨ  ２００およびｐＡＴＨ  ３００）可変領域および逆突然変異を含む全ての変異体をヒトＶＨまたはＶＬ定常領域を含む発現ベクターにクローニングした。キメラ（ｃｈＭＡｂ）抗体と同じ条件下で哺乳類細胞において全てのヒト化変異体を作製し、ＥＬＩＳＡによりＳ１Ｐとの結合について試験した。この際の収率はヒト化変異体についておよそ１０〜２０ｍｇ／ｌ、ｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐについて０．３〜０．５ｍｇ／ｌであった。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、軽鎖および重鎖の推定質量と一致する２５ｋＤａおよび５０ｋＤａにおいて高純度（＞９８％）の２つのバンドが現われた。非還元条件下では推定質量約１５０ｋの単一バンドが観察された。ｃｈＭＡｂは、親マウス抗体と同じ可変領域を含み、ヒト化抗体と同じ定常領域を有し、そのため同じＥＬＩＳＡプロトコールを用いて検出することができるため、ｃｈＭＡｂをヒト化抗体結合アッセイにおいて標準として用いた。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８６】
要約すれば、ＬＴ１００２  ＶＨドメインのヒト化にはネズミフレームワーク配列の１つのアミノ酸しか必要でなかったが、一方、ネズミ親ＬＴ１００２と同等の結合を得るために、ネズミＶＬフレームワークドメイン、３つまたは５つのネズミ残基を保持する必要があった。
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８７】
ｅ．ヒト化リード候補の最適化
ネズミ抗Ｓ１Ｐ抗体は、重鎖のＣＤＲ２内に遊離システイン残基（Ｃｙｓ５０）を含み、この残基は抗体分子を多少不安定にさせる可能性があった。部位特異的突然変異誘発を用いて、システイン残基を、アラニン（ｈｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ３）（ｐＡＴＨ２０７）、グリシン（ｈｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ３）、セリン（ｈｕＭＡｂＨＣＣｙｓＳｅｒＬＣ３）およびフェニルアラニン（ｈｕＭＡｂＨＣＣｙｓＰｈｅＬＣ３）と置換することによりｐＡＴＨ２０１変異体を作出した。また、システイン変異株の重鎖を、５つの逆突然変異を含むヒト化軽鎖（ｐＡＴＨ  ３０８）（ｈｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ５＝ＬＴ１００９）を用いて試験した。これらの変異体を哺乳類細胞で発現させた後、in vitroアッセイのパネルで特性解析した。重要なことには、ヒト化変異体の発現率はｃｈＭＡｂ  Ｓ１Ｐの場合よりも著しく高かった。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９０】
ｉｉｉ．安定性  ヒト化変異体を高温でのチャレンジ後の安定性について試験した。各ヒト化変異体について、上清を６０〜７４℃の範囲の温度に供することによって熱変性転移の近似中心点（ＴＭ）を決定した。これらの温度は、幅広い範囲の温度の間  ５０〜８０℃間での温度刺激の後にネズミ抗体分子で見られた変性プロフィールに基づいて選択した。各変異体の結合特性を温度刺激の前後に決定した。ネズミ抗体はＴＭ６５℃を示した。変異体  ｈｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）は、他の全ての変異体と比較して、優れたＴＭを示した。表６ではリードヒト化候補とそれらの特性を示している。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９１】
表６：リードヒト化Ｓ１Ｐ  ｍＡｂ候補と特性
重鎖および軽鎖中の突然変異の数を示している。種類欄に重鎖および軽鎖の識別を記載する。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９２】
【表６】
2010515427.tif 000006
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９３】
ｉｖ．配列
天然に存在する抗体と同様に、ＬＴ１００９は、１抗体分子に含まれる２つの軽鎖ポリペプチドそれぞれと２つの重鎖ポリペプチドそれぞれに３つの相補性決定領域（それぞれ「ＣＤＲ」）を含む。これらの６つのＣＤＲそれぞれのアミノ酸配列を直下に記載する（「ＶＬ」は免疫グロブリン軽鎖の可変領域を示し、一方「ＶＨ」は免疫グロブリン重鎖の可変領域を示す）：
ＣＤＲ１  ＶＬ：ＩＴＴＴＤＩＤＤＤＭＮ［配列番号１０］
ＣＤＲ２  ＶＬ：ＥＧＮＩＬＲＰ［配列番号１１］
ＣＤＲ３  ＶＬ：ＬＱＳＤＮＬＰＦＴ［配列番号１２］
ＣＤＲ１  ＶＨ：ＤＨＴＩＨ［配列番号１３］
ＣＤＲ３  ＶＨ：ＧＧＦＹＧＳＴＩＷＦＤＦ［配列番号１５］
ＣＤＲ２  ＶＨ：ＡＩＳＰＲＨＤＩＴＫＹＮＥＭＦＲＧ［配列番号１８］
実施例１３：ヒト化Ｓ１Ｐ  ｍＡｂの生産および精製
この実施例では、生体活性脂質スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と高親和性で結合する組換えヒト化モノクローナル抗体（ＬＴ１００９；Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標））の生産を記載する。ＬＴ１００９は、２つの同一軽鎖と２つの同一重鎖からなる、全分子量およそ１５０ｋＤａの全長ＩｇＧ１κイソ型抗体である。重鎖はＮ結合型グリコシル化部位を含む。オリゴ糖構造の性質はまだ決定されていないがコアフコースを含む複雑な二分岐構造であると予想されている。現在のところ主要であろう糖型の性質は分かっていない。多少のＣ末端不均質性は、重鎖の定常ドメイン内にリジン残基が存在することによると思われる。２つの重鎖は、２つの鎖間ジスルフィド結合を通じて互いに共有結合しており、これはヒトＩｇＧ１の構造と一致している。
ＬＴ１００９は、もともと、Ｓ１Ｐで免疫処置したマウスから作製したハイブリドーマを用いて生産したネズミモノクローナル抗体（ＬＴ１００２；Ｓｐｈｉｎｇｏｍａｂ（商標））から得られた。ネズミ抗体のヒト化では、ネズミ親抗体とのその構造類似性で選択されるヒト抗体フレームワークのＣＤＲの代わりに６つのネズミＣＤＲの挿入を必要とした。ヒト化抗体を工学的処理するために、フレームワーク内で一連の置換を行った。これらの置換は逆突然変異と呼ばれ、ヒト残基を、抗体と抗原との相互作用において重要な役割を果たすネズミ残基と置換する。最終的なヒト化型は、重鎖の可変ドメインのヒトフレームワーク内に１つのネズミ逆突然変異と軽鎖の可変ドメインのヒトフレームワーク内に５つのネズミ逆突然変異を含む。加えて、重鎖のＣＤＲ２内に存在する１つの残基もアラニン残基へと置換した。この置換は、抗体分子の安定性および効力を増加させることが分かった。
ヒト化可変ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）をLonza社のＧＳ遺伝子発現系にクローニングして、プラスミド  ｐＡＴＨ１００９を作製した。Lonza社のＧＳ発現系は、抗体遺伝子の定常ドメインを有する発現ベクターと、選択マーカーであるグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）とからなる。ＧＳは、グルタミン酸とアンモニアからのグルタミン生合成に関与する酵素である。抗体遺伝子と選択マーカーの両方を有するベクターを、細胞が外因性グルタミンなしに生存するのに十分なグルタミンを供給した無血清培地中での増殖に適したプロプライエタリーチャイニーズハムスター卵巣宿主細胞系統（ＣＨＯＫ１ＳＶ）にトランスフェクトする。加えて、ベクターによって提供されるＧＳ活性を有する細胞系統だけが生存し得るように内因性ＧＳの活性を阻害するために、この培地に特異的ＧＳ阻害剤であるメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を添加する。その結果得られる、ｐＡＴＨ１００９を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系統をＬＨ１と命名する。
上記の実施例に記載される天然の生殖系列遺伝子のリーダー配列が、プラスミドｐＡＴＨ１００９を作成するために用いられるＧＳ発現ベクター骨格中のリーダー配列によって置換されることに注意すべきである。後者のリーダー配列は、ＬＴ１００９重鎖（配列番号１９および２４）の N 末端における“mewswv”で始まる 19 個のアミノ酸として見出すことができ、LC のリーダーは、“msvpt”で始まる 20 個のアミノ酸（配列番号２０および２６の N 末端に示される）である。
トランスフェクトされたＣＨＯ ＬＨ１細胞を、ＭＳＸの存在下でグルタミンフリー培地中で増殖するそれらの能力について選択し、分離株（クローン）を活性ＬＴ１００９の高レベル分泌について選択した。ＬＨ１ ２７５とは、ＬＴ１００９抗体生産物の全てのロットの生産のためのマスター細胞バンク(Master Cell Bank)(MCB)の作成のために選択された、ｐＡＴＨ１００９ベクターを含むＬＨ１ ＣＨＯ細胞系統のリードクローンに与えられた名称である。こうして、毒性学および臨床開発に毒性学研究および臨床開発のための材料がもたらされた。
ＡＴＣＣ寄託：ｐＡＴＨ１００９プラスミドを含む大腸菌ＳｔＢ１２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（寄託番号  ＰＴＡ−８４２１）。ｐＡＴＨ１００９ベクターを含むＣＨＯ細胞系統  ＬＨ１  ２７５もＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した（寄託番号  ＰＴＡ−８４２２）。ＡＴＣＣは、10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 に所在する。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９４】
配列：
ＬＴ１００９の重鎖および軽鎖ポリペプチドについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を直下に記載する。（Lonza社のＧＳ発現ベクターの）リーダー配列には下線が引かれ；CDRは太字で示される。
LT1009 HC 可変ドメインのアミノ酸配列 ［配列番号１９］：
【化１】
2010515427.tif 000007
LT1009 LC可変ドメインのアミノ酸配列 ［配列番号２０］：
【化２】
2010515427.tif 000008
重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする対応するヌクレオチド配列を直下に示す。リーダー配列(Lonza社の GS 発現ベクターからの)には下線が引かれており; 該リーダーに先行する配列は、HindIII 切断部位(aagctt) および翻訳過程の開始において主要な役割を果たす Kozak コンセンサス配列(gccgccacc)であり; CDR は太字で示される:
LT1009 HC可変ドメインのヌクレオチド配列 ［配列番号２１］：
【化３】
2010515427.tif 000009
LT1009 LC可変ドメインのヌクレオチド配列 ［配列番号２２］：
【化４】
2010515427.tif 000010
LT1009 の完全長 HC ヌクレオチド(cDNA)配列（配列番号２３）; CDR は太字で示され、リーダー領域に下線が引かれており、ヒンジ領域はイタリック体である。リーダーに先行する配列は、HindIII 切断部位(aagctt) および Kozak 配列(gccgccacc)である:
【化５】
2010515427.tif 000011
リーダー(下線付き)を有し、ヒンジ領域を有さない LT1009 HCアミノ酸配列。CDR は太字で示される。［配列番号２４］：
【化６】
2010515427.tif 000012
LT1009 LC 完全長ヌクレオチド配列［配列番号２５］；リーダーに下線が引かれ、CDR が太字で示される; リーダーに先行する配列は、HindIII 切断部位(aagctt) および Kozak 配列(gccgccacc)である：
【化７】
2010515427.tif 000013
下線付きのリーダーおよび太字の CDR を有する、LT1009 LCアミノ酸配列［配列番号２６］： 
【化８】
2010515427.tif 000014
リーダー配列を有さない（かつ、先行するヌクレアーゼ切断部位および Kozak 配列を有さない）LT1009 重鎖および軽鎖の配列は、以下の通りである。CDR は太字で示される。
LT1009 HC の可変ドメインのアミノ酸配列 [配列番号２７]:
【化９】
2010515427.tif 000015
該可変ドメインをコードする、対応する LT1009 HC のヌクレオチド配列 [配列番号２８]:
【化１０】
2010515427.tif 000016
LT1009 LC の可変ドメインのアミノ酸配列 [配列番号２９]:
【化１１】
2010515427.tif 000017
該可変ドメインをコードする、対応する LT1009 LC のヌクレオチド配列 [配列番号３０]
【化１２】
2010515427.tif 000018
リーダーを有さない完全長の LT1009 重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである(CDR は太字で示される):
リーダーを有さず（かつ、先行するヌクレアーゼ切断部位および Kozak 配列を有さず）、かつ、ヒンジ（下線）を含む、LT1009 の完全長重鎖アミノ酸配列。（配列番号３１）
【化１３】
2010515427.tif 000019
リーダーを有さない LT1009 の完全長軽鎖アミノ酸配列。[配列番号３２]:
【化１４】
2010515427.tif 000020
対応するヌクレオチド配列（リーダーまたは先行するヌクレアーゼもしくは Kozak 部位を有さない）は、以下の通りである。遺伝コードの縮重のため、代替のヌクレオチド配列もまた、事実上あらゆる所与のアミノ酸配列をコードし得ることが理解される。
LT1009 の完全長重鎖ヌクレオチド(cDNA)配列 [配列番号３３]:
【化１５】
2010515427.tif 000021
LT1009 の完全長軽鎖ヌクレオチド配列 [配列番号３４]:
【化１６】
2010515427.tif 000022
LT1009 の重鎖上の C 末端リジンは、成熟した重鎖タンパク質上に常に存在するわけではない。
LT1009 重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、タンパク質の最後の(最も C 末端側の)アミノ酸残基としてリジンを示しているが、例えば CHO 細胞クローン LH1 275 において発現する場合、LT1009 は C 末端リジンを含まない。この事はペプチドマッピングによって示され、理論に束縛されることなく、哺乳類の系におけるタンパク質の翻訳後修飾の結果として生じると考えられる。また、理論に束縛されることなく、他の発現系、特に非哺乳類の系においては、成熟した LT1009 重鎖上に C 末端リジンが存在すると考えられる。
CHO 細胞において発現する LT1009 重鎖のアミノ酸配列（即ち、リーダーを有さず、かつ、C 末端リジンを有さない）を以下に示す（CDR は太字で示され、ヒンジはイタリック体で示される）[配列番号３５]:
【化１７】
2010515427.tif 000023
このアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列の例を、以下に配列番号３６として示す。遺伝コードの縮重により、複数のヌクレオチド配列が同じアミノ酸配列をコードし得ることが理解され、そのため、アミノ酸配列をコードするものとして本明細書に示されるこれらのおよび他のヌクレオチド配列は、例示を目的とするものであると認められる。CDR は太字で示され、ヒンジ領域はイタリック体で示される:
【化１８】
2010515427.tif 000024
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２９】
カスパーゼ−３活性化は、Ｓ１Ｐの存在下で抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂを加えることによって増加し、この抗体によるＳ１Ｐの選択的吸収によってＳ１Ｐの保護的抗アポトーシス作用が除かれることが示唆された。ヒト化抗体変異体、ｈｕＭＡｂＨＣＬＣ３（ＬＴ１００４）およびｈｕＭＡｂＨＣＬＣ５（ＬＴ１００６）の両方が、ＬＴ１００２と比較して優れた活性を示した。同時に、全ての変異体を、癌細胞からのＳ１Ｐ誘発性サイトカイン放出に対するそれらの作用について試験した。Ｓ１Ｐは、癌細胞からの細胞馴化培地への著しいＩＬ−８放出を引き起こすことが分かっている。マウス対照抗Ｓ１Ｐ  ｍＡｂを加えることによって卵巣癌細胞からのＩＬ−８放出が濃度依存的に減少した。２つのヒト化変異体  ｈｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ３（ＬＴ１００７）およびｈｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）は、ＨｕＭＡｂＨＣＬＣ３（ＬＴ１００４）およびｈｕＭＡｂＨＣＬＣ５（ＬＴ１００６）よりも大きなＩＬ−８放出の減少を示した。
【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３１】
ヒト化抗体変異体とネズミ抗体を、図１３にて示されるように、ＡＭＤのＣＮＶ動物モデルにおいて新血管新生を阻害するそれらの能力について比較した。マウスにネズミ（Ｍｕ；ＬＴ１００２）、ヒト化変異体［ＬＣ３（ＬＴ１００４）、ＬＣ５（ＬＴ１００６）、ＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ３（ＬＴ  １００７）およびＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ５（ＬＴ１００９）］または非特異的ｍＡｂ（ＮＳ）  ０．５μｇを２回（第０日および第６日）硝子体内投与により投与した後、ブルッフ膜のレーザー破膜に供した。レーザー手術の１４日後にマウスを犠牲にした。対照マウスを水性バッファー（ＰＢＳ）またはイソ型適合非特異的抗体で処置した。ヒト化変異体の３つは、ＣＮＶ領域の測定によって評価されるように、ネズミ抗体と本質的に同等に脈管形成を阻害した。ＣＮＶ病変体積は平均＋ＳＥＭとして表す。軽鎖に５つの逆突然変異を含み、重鎖のＣＤＲ２内にシステイン突然変異を有するヒト化変異体（ｈｕＭＡｂＨＣＣｙｓＡｌａＬＣ５；ＬＴ１００９）は新血管新生を顕著に抑制した。この差は高度に統計的に有意であった。
【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４９】
虚血性および炎症性網膜症モデルでは、これまでに、抗Ｓ１Ｐ抗体での処置後にマクロファージ浸潤の５５％阻害が示されている。これらのデータは十分に確立されたネズミ酸素誘発性網膜症モデル（未熟児網膜症（ＲＯＰ）モデルとしても知られている）を用いて得られた。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを生後７日に７５％酸素中に置き、生後１２日に大気に戻し、片側の眼に３μｇのヒト化抗Ｓ１Ｐ抗体（ＬＴ１００９、Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ（商標））の、他側の眼にビヒクルの眼内圧注射を行った。これらのマウスに生後１７日目にＦ４／８０（汎マクロファージマーカー）に対するＦＩＴＣ標識抗体の眼内圧注射を行い、８時間後に、マウスを安楽死させた。眼球を摘出し、ＰＢＳ緩衝ホルマリン中に室温で５時間固定した。網膜を切開し、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、全てを装着した。Nikon社製蛍光顕微鏡を用いてスライドを観察し、網膜マクロファージを定量した。これらの結果を下記の表７に示す。
【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５０】
【表７】
2010515427.tif 000025
【手続補正５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５５】
【表８】
2010515427.tif 000026
【手続補正６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６０】
【表９】
2010515427.tif 000027
【手続補正６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６５】
【表１０】
2010515427.tif 000028
【手続補正６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７０】
【表１１】
2010515427.tif 000029
【手続補正６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010515427000001.app