(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
密封容器中に提供され、
-  水性溶媒;
-  アデノウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルス;
-  N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである添加剤;及び
-  1種又は複数種の糖
を含む、溶液であって、
（a）前記溶液が、薬学的に許容される滅菌水溶液であり、且つ前記水性溶媒が、薬学的に許容される溶媒であるか、又は
（b）前記溶液が、すぐ使える貯蔵安定性の水溶液である、
前記溶液。
【請求項２】
(a)前記ウイルスが、生ウイルス若しくは死滅ウイルスから構成されるか、又は
(b)前記ウイルスが、生ウイルス若しくは死滅ウイルスから構成され、且つ前記生ウイルスが、全ウイルス若しくは弱毒化生ウイルスであるか、又は
（c）前記ウイルスが、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、インフルエンザウイルス若しくは麻疹ウイルスから選択される、
請求項1に記載の溶液。
【請求項３】
前記添加剤が、(a)N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン、又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、或いは(b)N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの塩酸塩、或いは(c)N,N-ジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項1又は2に記載の溶液。
【請求項４】
(a)スクロースが存在するか、又は(b)スクロースが存在し、且つラフィノースも存在する、請求項1から3のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項５】
非経口投与に適している、請求項1から4のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項６】
-  水性溶媒;
-  請求項1又は2に記載のウイルス;
-   N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル;及び
-  式(IIC):
【化１】
0005869553.tif 000064
(式中、Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキルを表す)
のスルホン化合物;並びに
-  1種又は複数種の糖
を含む、請求項1に記載の溶液。
【請求項７】
(a)前記N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの塩若しくはエステルの濃度が、0.1から1.5Mであり、及び/或いは(b)式(IIC)のスルホン化合物が、メチルスルホニルメタンであり、及び/或いは(c)式(I)のスルホン化合物の濃度が、0.1から1.5Mであり、及び/或いは(d)前記水溶液が、非還元糖又は糖アルコールを含み、及び/或いは(e)前記水溶液が、スクロース又はマンニトールを含み、及び/或いは(f)前記水溶液の糖濃度が、0.05から1Mである、請求項6に記載の溶液。
【請求項８】
（a）アジュバント;生理学的に許容される緩衝剤;等張性調整剤;及び/又は保存剤をさらに含む、並びに/或いは
（b）等張性である、並びに/或いは
（c）密封容器中に窒素下で提供される、並びに/或いは
（d）密封されたバイアル、アンプル、注射器、カートリッジ、フレキシブルバッグ若しくはガラス瓶中に提供される、並びに/或いは
（e）前記ウイルスの単位投与量が存在する、
請求項1から7のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項９】
(a)水溶液中における前記ウイルス、添加剤及び1種又は複数種の糖の滅菌溶液を提供する工程と;
(b)前記溶液を容器中に密封する工程と
を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の溶液を調製する方法。
【請求項１０】
水性溶媒中における前記ウイルス、添加剤、及び1種又は複数種の糖の溶液が、工程(a)で滅菌フィルターを通過する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
(a)水性溶媒中における前記ウイルス、添加剤、及び1種又は複数種の糖の溶液を容器中に密封する工程と;
(b)前記溶液を前記容器中で滅菌する工程と
を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の溶液を調製する方法。
【請求項１２】
前記容器が、バイアル、アンプル、注射器、カートリッジ、フレキシブルバッグ又はガラス瓶である、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
(a)請求項1又は2に記載のウイルス、請求項1から3のいずれか一項に記載の添加剤、及び1種又は複数種の糖の溶液を提供する工程と;
(b)前記添加剤を除去する工程と
を含む、ウイルスの薬学的に許容される水溶液を調製する方法。
【請求項１４】
(c)前記溶液を容器中に密封する工程
をさらに含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスの薬学的に許容される水溶液の製造の間に請求項1又は2に記載のウイルスを保存するための、請求項1から3のいずれか一項に記載の添加剤及び1種又は複数種の糖の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス及びポリペプチドの貯蔵安定性の配合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一部の生物分子は、それらが、単離され、精製され、次いで室温で溶液中にて貯蔵され得るように十分に安定である。しかし、これは、低温での貯蔵を伴う材料及び技術の多くで可能でなく、安定剤の添加、凍結乾燥、真空形成及び空気乾燥が、在庫保存を確実にするために試みられてきた。これらの技術の利用性にもかかわらず、一部の生物材料は、貯蔵の間に不満足な安定性のレベルを依然として示し、一部の技術は、追加の費用及び不都合をもたらす。例えば、冷蔵輸送及び貯蔵は、費用がかかる。さらに冷蔵輸送は、発展途上世界の国々でワクチンなどの医薬の輸送にしばしば利用できない。
【０００３】
特に、凍結乾燥(freeze-drying or lyophilisation)のストレスは、一部の生物材料に非常に損傷を与え得るものとなる。生物学的医薬品の凍結乾燥は、熱感受性バイオマテリアルの溶液又は懸濁液を凍結させ、続いて、一次及び二次乾燥することを含む。この技術は、溶液が融解することなく、真空下サブゼロ温度での水の昇華に基づく。凍結乾燥は、固体タンパク質及びワクチンの医薬品を製造する鍵となる工程に相当する。凍結バイオマテリアルからの水蒸気拡散の速度は、非常に低く、したがって、この過程は時間がかかる。さらに、凍結及び乾燥の両方の段階は、タンパク質をアンフォールディング又は変性し得るストレスをもたらす。
【０００４】
タンパク質は、一定の一次、二次、三次及び一部の場合に四次構造をもつ分子である。この構造は、タンパク質にその特異的な生物学的機能を与える際に重要な役割を果たす。残念なことに、タンパク質などの生物学的医薬品の構造の複雑性は、構造的及び機能的な不安定性をもたらす様々な過程に対してそれらを感受性にさせる。立体構造の完全性及び官能基は、分解から保護されなければならない。
【０００５】
不安定性は、溶液中の様々な共有結合性及び非共有結合性の反応又は修飾の結果であり得る。分解は、一般に二つの主なカテゴリー、すなわち、第一に物理的分解又は非共有結合経路分解、及び第二に共有結合分解経路に分類される。
【０００６】
タンパク質は、タンパク質薬剤の効力及び安定性をかなり低下させ得る界面吸着及び凝集などの物理的過程を経て分解し得る。第二の結果は、界面における吸着によって介在されたアンフォールディングが、しばしば溶液中のタンパク質の不可逆的な凝集の開始工程であり得ることである。疎水性表面でのタンパク質コアの露出は、撹拌、温度又はpHにより誘発されたストレスの結果として吸着をもたらし得;これらすべては、結果として凝集をもたらし得る。
【０００７】
タンパク質は、酸化、異性化、加水分解、ジスルフィドスクランブリング(disulfide scrambling)、ベータ脱離、脱アミド、及び付加体形成などの化学修飾に供し得る。分解の主要な加水分解機構は、ペプチド結合の加水分解、アスパラギン及びグルタミンの脱アミド並びにアスパラギン酸の異性化を含む。加水分解経路の一般的な特徴は、反応の速度に関して、重要な処方可変要素の一つがpHであることである。
【０００８】
タンパク質の安定性が、治療剤の安全性及び効力にかなり影響し得る場合、生物学的医薬製剤中の成分の組成は、タンパク質分解の程度に影響し得る。生物学的医薬品の製剤化の方法も、投与の容易さ及び頻度に影響を与え得る。
【０００９】
不安定性及び凝集の問題のために、ほとんどの現行の安定なタンパク質配合物は、液体配合物ではない。典型的には、タンパク質は凍結乾燥されて、安定なタンパク質配合物を与える。充填剤が、その配合物中に存在する場合が多い。凍結乾燥配合物は、典型的には粉末として、密封バイアル、アンプル又は注射器中に、乾燥形態で分配及び貯蔵される。例えば、国際公開第97/04801号には、使用直前に再構成されなければならない、抗-IgE抗体の安定な凍結乾燥配合物が記載されている。
【００１０】
国際公開第2006/0850082A号には、糖、ヒストンタンパク質などの荷電物質及び乾燥-又は熱-感受性生物学的要素を含む乾燥又は保存生成物が報告されている。この糖は、非晶質固体マトリックスを形成する。しかし、保存された生物学的要素がヒト又は動物に投与される場合、ヒストンは免疫学的結果を有し得る。
【００１１】
国際公開第2008/114021号には、ウイルス粒子を保存する方法が記載されている。この方法は、1種又は複数種の糖、ポリエチレンイミン及びウイルス粒子の水溶液を乾燥して、ウイルス粒子を含む非晶質固体マトリックスを形成する工程を含む。該水溶液は、ポリエチレンイミンをポリエチレンイミンの数平均モル質量(Mn)に基づいて15μM以下の濃度で含有し、かつ糖を含有する。ここで、2種以上の糖が存在する場合、全糖濃度は、0.1Mを超える。
【００１２】
国際公開第2010/035001号には、ポリペプチドの水溶液が、1種又は複数種の糖及びポリエチレンイミン(PEI)の存在下で乾燥、例えば、凍結乾燥される、ポリペプチドを保存する方法が記載されている。得られた乾燥組成物は、典型的には密封バイアル、アンプル又は注射器中で安定な乾燥粉末として提供される。溶液は、患者にポリペプチドを、例えば、注射によって投与するために、その粉末から再構成される。
【００１３】
しかし、乾燥、特に凍結乾燥は、費用がかかり、且つ時間がかかる工程である。それらの使用を避けることができれば、有利である。生物学的に活性な材料は、加熱及び乾燥後に活性の喪失を被ることが多い。さらに、ポリペプチドの使用前に溶媒中で凍結乾燥粉末を再構成すべき必要性は、不都合である。実際、それは、その手順が正確に行われない場合、患者又はその再構成工程を行う医療専門家にとって危険を伴い得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第97/04801号
【特許文献２】国際公開第2006/0850082A号
【特許文献３】国際公開第2008/114021号
【特許文献４】国際公開第2010/035001号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、使用されるために再構成を必要としない液体のウイルス及びタンパク質配合物を提供することが有利である。結果として、安定な液体の注射可能なウイルス及びタンパク質配合物に対する要求がある。高濃縮された安定な液体の注射可能な抗体配合物に対する要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
今や驚くべきことに、ウイルス粒子又はポリペプチドの貯蔵安定性のすぐ使える水溶液が、特定の添加剤及び場合によって1種、2種又はそれを超える種類の糖を用いて提供され得ることが見出された。これらの配合物は、長期間の安定性を保持する。それらは、乾燥又は凍結乾燥工程なしに調製され得る。それらは、使用前に凍結乾燥粉末から溶液を再構成する必要性を回避する。これらの添加剤及び場合によって1種、2種又はそれを超える種類の糖は、ウイルス粒子又はポリペプチドを製造の間に保存し得ることも見出された。さらに、これらの添加物及び場合によって1種、2種又はそれを超える種類の糖が、ヒト又は動物から採取された試料を保存し得ることが見出された。
【００１７】
したがって、本発明は、典型的には非経口投与に適した、薬学的に許容される滅菌水溶液であって、その溶液は密封容器中に提供され、
-  薬学的に許容される水性溶媒;
-  ウイルス粒子又は生理学的に活性なポリペプチド;
-  ポリエチレンイミン;式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル
【化１】
0005869553.tif 000002
【００１８】
(・  式中、
・  R1は、水素若しくはC1〜6アルキルを表し;R4は、水素を表すか;又は
R1及びR4は、これらが結合している原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し;
R2は、水素、C1〜6アルキル又は-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3を表し;
・  R3は、C1〜6アルキルである);又は
式(II)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステル
【化２】
0005869553.tif 000003
【００１９】
(・  式中、
・  Xは、-S(O)2-又は-S+(Rc)-を表し;
・  Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキルを表し;
・  Rcは、カルボキシレートアニオンで及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキルを表す)
から選択される添加剤;及び
-  場合によって1種又は複数種の糖
を含む。
【００２０】
本発明はまた、薬学的に許容される滅菌水溶液であって、その溶液は、
-  薬学的に許容される水性溶媒;
-  請求項1、3又は4のいずれか一項に記載されるとおりのウイルス粒子;
- N-(C1〜6アルキル)グリシン、N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル;及び
-  式(IIC):
【化３】
0005869553.tif 000004
【００２１】
(式中、Ra及びRbは、独立してC1〜6アルキルを表す)
のスルホン化合物;及び
-  場合によって1種又は複数種の糖
を含む溶液を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、
・  本発明による薬学的に許容される滅菌溶液を調製する方法であって、
(a)薬学的に許容される水溶液中におけるウイルス粒子、添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の滅菌溶液を提供する工程と;
(b)該溶液を容器中に密封する工程と
を含む方法;
・  本発明による薬学的に許容される滅菌溶液を調製するさらなる方法であって、
(a)薬学的に許容される水性溶媒中におけるウイルス粒子、添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の溶液を容器中に密封する工程と;
(b)該溶液を該容器中で滅菌する工程と
を含む方法;
・  密封容器中で提供され、
-  水性溶媒;
-  ウイルス粒子又は生理学的に活性なポリペプチド;
-  本発明の添加剤;及び
-  場合によって1種又は複数種の糖
を含むすぐ使える貯蔵安定性の水溶液；
・  本発明のすぐ使える貯蔵安定性の水溶液を調製する方法であって、
(a)水性溶媒中におけるウイルス粒子又はポリペプチド、添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の溶液を提供する工程と;
(b)該溶液を容器中に密封する工程と
を含む方法;
・  本発明のすぐ使える貯蔵安定性の水溶液を調製するさらなる方法であって、
(a)水性溶媒中におけるウイルス粒子又はポリペプチド、添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の溶液を容器に密封する工程と;
(b)該溶液を該容器中で滅菌する工程と
を含む方法;
・  すぐ使える貯蔵安定性の水溶液が提供される密封容器であって、
-  水性溶媒;
-  ウイルス粒子;
- N-(C1〜6アルキル)グリシン、N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル
-  本発明のスルホン化合物;及び
-  場合によって、1種又は複数種の糖
を含む密封容器;並びに
・  密封容器を製造する方法であって、薬学的に許容される水性溶媒中におけるウイルス粒子; N-(C1〜6アルキル)グリシン、N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル;本発明の式(IIC)のスルホン化合物;及び場合によって1種又は複数種の糖の溶液を提供する工程と;該溶液を容器中に密封する工程とを含む方法
を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、
-  ウイルス粒子又はポリペプチドの薬学的に許容される水溶液を調製する方法であって、(a)ウイルス粒子又は生理学的に活性なポリペプチド、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の溶液を提供する工程と、(b)該添加剤を除去する工程とを含む方法;
-  ウイルス粒子又はポリペプチドを前記ウイルス又はポリペプチドの薬学的に許容される水溶液の製造の間に保存するための、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の使用;
-  ヒト又は動物から採取した試料を保存する方法であって、(i)前記試料、(ii)本発明の添加剤及び(iii)場合によって1種又は複数種の糖の水溶液を提供する工程を含む方法;
-  ヒト又は動物由来の試料を得て、保存する方法であって、(a)該ヒト又は動物由来の試料を得る工程と、(b)前記試料、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の水溶液を調製する工程とを含む方法;
- (i)ヒト又は動物から採取した試料、(ii)本発明の添加剤及び(iii)場合によって1種又は複数種の糖を含む水溶液;
-  ヒト又は動物から採取した試料を保存するための、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の使用;及び
-  ウイルス粒子を含む溶液を、前記溶液の凍結乾燥前に保存するための、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の使用
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、添加剤が、凍結乾燥前4時間室温において液体中でのアデノウイルスの安定性を高めるかどうかを評価する実験の結果を示す。Suc=スクロース。Raf=ラフィノース。統計分析は、一元配置分散分析(one-way ANOVA)、続いてボンフェローニ事後検定(Bonffe roni post test)を用いて行った。P値略式、**は、P<0.01を意味する。誤差線は、平均(n=3)の標準誤差を示す。
【図２】図2は、37℃で1週間の熱負荷後のアデノウイルスの液体安定性を調べる実験の結果を示す。
【図３】図3は、液体形態のインフルエンザ血球凝集素(HA)の安定化における添加剤の効果を調べる実験の結果を示す。
【図４ａ】図4aは、4℃で1週間保持した、アデノウイルスの配合物の回復活性についての試験処方の効果を示す。灰色及び白色バーは、試験配合物を表す。x軸上の数字は、M単位の濃度を指す。黒色バーは、対照試料を表す。「開始」=貯蔵のための投入ウイルスの力価、「PBS」=さらなる添加剤を含有しない処方、「糖」=1Mのスクロース、100mMのラフィノースを含む配合物。誤差線=平均の標準(n=3)。
【図４ｂ】図4bは、4℃で1週間保持した、糖(1Mスクロース、100mMラフィノース)を含有するアデノウイルスの配合物の回復活性についての試験配合物の効果を示す。灰色及び白色バーは、試験処方を表す。x軸上の数字は、M単位の濃度を指す。黒色バーは、対照試料を表す。「開始」=貯蔵前の投入ウイルスの力価、「PBS」=さらなる添加剤を含有しない配合物、「糖」=1Mのスクロース、100mMのラフィノースを含有する配合物。誤差線=平均の標準誤差(n=3)。
【図４ｃ】図4cは、37℃で1週間保持した、糖を含有しないアデノウイルスの配合物の回復活性についての試験配合物の効果を示す。灰色及び白色バーは、試験配合物を表す。x軸上の数字は、M単位の濃度を指す。黒色バーは、対照試料を表す。「開始」=貯蔵前の投入ウイルスの力価、「PBS」=さらなる添加剤を含有しない処方、「糖」=1Mのスクロース、100mMのラフィノースを含有する配合物、誤差線=平均の標準誤差(n=3)。
【図４ｄ】図4dは、37℃で1週間保持した、糖(1Mスクロース、100mMラフィノース)を含有するアデノウイルスの処方の回復活性についての試験配合物の効果を示す。灰色及び白色バーは、試験配合物を表す。x軸上の数字は、M単位の濃度を指す。黒色バーは、対照試料を表す。「開始」=貯蔵前の投入ウイルスの力価、「PBS」=さらなる添加剤を含有しない配合物、「糖」=1Mのスクロース、100nMのラフィノースを含有する配合物、誤差線=平均の標準誤差(n=3)。
【図５】図5は、抗T(抗-TNF-α抗体)によるTNF-α中和を示す。試料は、室温で10日間のインキュベーション後にアッセイした。
【図６】図6は、液体配合物中のIgGの安定化に対する添加剤の効果に対する調査の結果を示す。バーは、実施例6由来のそれぞれ同等な熱処理のPBSのみの配合物(つまり、PBSのみの純度を100%に調整)に対する新規な添加剤配合物におけるIgGの純度パーセントを表す。表した処理は、糖のみ(白色)、DMGのみ(灰色)並びにDMG及び糖(黒色)を含み、すべて、実験の1日目に収集した。誤差線は、パーセント点におけるそれぞれの処理の平均IgG純度の標準誤差を表す(n=3)。
【図７】図7は、4℃で貯蔵した、実施例6で調製した配合物について1日目、5日目及び31日目の平均モノマーピークを示す。
【図８】図8は、37℃で貯蔵した、実施例6で調製した配合物について1日目、5日目及び31日目の平均モノマーピークを示す。
【図９】図9は、熱負荷に対してアデノウイルスを安定化させる11種の配合物の能力を、37℃7日後に評価した、実施例7で得た結果を示す。
【図１０】図10は、37℃で7日間の熱負荷に対してMVAを安定化させる11種の配合物の能力を評価した、実施例8で得た結果を示す。
【図１１】図11は、実施例9における設計空間の三次元表示を示す。球形は、試験した設計空間内の配合物を表す。この設計は、Doehlert RSM設計である。
【図１２】図12は、実施例9における分岐PEI(P-Bra)を表すために用いたモデルの統計値を要約する。
【図１３】図13は、微調整後に実施例9におけるモデルで保持された期間を示す。
【図１４】図14は、実施例9におけるモデルを用いて、ラフィノースの三つの異なるレベルでのP-Bra及びスクロースの配合物における予測回復ウイルス力価の面応答をプロットする。ラフィノースのレベルには以下を使用する：「低」=0mMのラフィノース、「中」=150mMのラフィノース、「ラフィノース」=300mMのラフィノース。
【図１５】図15は、設定及びモンテカルロシミュレーションを用いて生成させた、実施例9におけるデータのモデルに基づく最適予測からの出力のスクリーンキャプチャを示す。ハイライトされている予測最適条件は、スクロース=0.74M、分岐PEI(P-Bra)=14 nM、ラフィノース=162.13 mMである。
【図１６】図16は、実施例10における設計空間の表示を示す。番号を付けた円は、試験する設計空間内の処方を表す。この設計は、CCF RSM設計である。円の中の数字は、表7中の試料IDを指す。
【図１７】図17は、実施例10におけるデータを表すために用いたモデルの統計値を要約する。
【図１８】図18は、実施例10における微調整後のモデルで保持された期間を示す。原点を横切らない誤差線は、95%信頼区間における有意な因子を示す。
【図１９】図19は、実施例10におけるTMG及びマンニトールの配合物における予測回復ウイルス力価の面応答プロットである。
【図２０】図20は、設定及びモンテカルロシミュレーション(Monte-Carlo simulation)を用いて生成させた、実施例10におけるデータのモデルに基づく最適予測からの出力のスクリーンキャプチャである。強調表示した処方(行4)は、特定された最適条件である。
【図２１】図21は、実施例11における設計空間の三次元表示を示す。球形は、試験した設計空間内の処方を表す。この設計は、Doehlert RSM設計である。
【図２２】図22は、実施例11においてデータを表すために用いたモデルの統計値を要約する。
【図２３】図23は、実施例11における微調整後にモデルで保持された期間である。原点を横切らない誤差線は、90%信頼区間における有意な因子を示す。
【図２４】図24は、実施例11においてMSM、スクロース及びラフィノースで処方して、+37℃で1週間熱負荷したアデノウイルスの回復を説明するモデルの等高線プロットを示す。ラフィノースは、力価に影響を与えなかったので可変要素として示さないので、モデルから除外された。示された応答は、正の対照(開始力価)のパーセントとしての回復ウイルス力価である。
【図２５】図25は、設定及びモンテカルロシミュレーションを用いて生成させた、実施例11におけるデータのモデルに基づく最適予測からの出力のスクリーンキャプチャを示す。予測最適条件は、1Mのスクロース濃度及び0.95MのMSM濃度を強調表示した。
【図２６】図26は、実施例12における設計空間の三次元表示を示す。球形は、試験した設計空間内の配合物を表す。この設計は、Doehlert RSM設計である。
【図２７】図27は、実施例12におけるデータを表すために用いたモデルの統計値を要約する。
【図２８】図28は、実施例12における微調整後にモデルで保持された期間である。原点を横切らない誤差線は、95%信頼区間における有意な因子を示す。
【図２９】図29は、ラフィノースの異なる三つのレベル、すなわち、「低」=0mMのラフィノース、「中」=150mMのラフィノース、「高」=300mMのラフィノースでのDMG及びスクロースの配合物における実施例12のモデルを用いた、予測ウイルス力価の面応答プロットである。
【図３０】図30は、設定及びモンテカルロシミュレーションを用いて生成させた、実施例12におけるデータのモデルに基づく最適予測からの出力のスクリーンキャプチャを示す。強調表示された予測最適条件は、スクロース濃度0.5M、DMG濃度0.4M及びラフィノース濃度272.5mMである。
【図３１】図31は、実施例12由来のモデルを用いる最適領域プロットを示す。図31Aは、十字形が予測最適条件の印となる等高線プロットである。着色は、可変要素のレベルを示す。図31Bは、予測回復ウイルス活性が、その投入を超えるか又はそれに等しいモデルの領域を強調表示するグラフである。
【図３２】図32は、実施例13において+4℃で6カ月貯蔵後の、様々な配合物由来の回復ウイルス活性を示す。
【図３３】図33は、それぞれの時点及び熱負荷において1Mのスクロース、100mMのラフィノース及び0.7MのDMGを含む、実施例13における「最良の」処方についての回復ウイルス活性を示す。
【図３４】図34は、実施例13の様々な配合物での+37℃の熱負荷における時間経過にわたる回復ウイルス活性の低下を示す。
【図３５】図35は、実施例14における設計空間の表示を示す。番号を付けた円は、試験した設計空間内の配合物を表す。この設計は、CCF RSM設計である。
【図３６】図36は、実施例14におけるデータを表すために用いたモデルの統計値を要約する。
【図３７】図37は、微調整後に実施例14のモデルで保持された期間を示す。原点を横切らない誤差線は、95%信頼区間における有意な因子を示す。
【図３８】図38は、実施例14におけるDMG及びマンニトールの処方における予測回復ウイルス力価の等高線プロットを示す。
【図３９】図39は、+56℃で24時間熱処理後のビバレントF(ab')2断片の活性を示す。
【図４０】図40は、+56℃で熱負荷24時間後、5日後及び7日後の実施例15において残っている残存F(ab')2活性(2μg.ml)を示す。
【図４１】図41は、+40℃で熱負荷14日後;1日後、及び+56℃で13日後の実施例16における様々な時点で残っている残存F(ab')2活性(0.5μg.ml)を示す。
【図４２】図42は、試料注入前に実施例17で獲得された標準トレースと、未使用の正の対照試料の最初の注入とのy-規格化の重なりを示す。FAbは、第3の重量マーカーの直前で溶出し、44kDaを超える推定流体力学的重量を与える。この値は、一価のFAbと一致する。
【図４３】それぞれの条件の第1の注入に相当する、実施例17における7種のHPLCトレースの重なりを示す。
【図４４】それぞれの条件の第1の注入に相当する、実施例17における7種のHPLCトレースの重なりを示す。図44において13分での大きなピーク(標識b)は、添加剤による一方、10分でのより小さいピーク(標識a)は、FAbによる。
【図４５】それぞれの条件の第1の注入に相当する、実施例17における7種のHPLCトレースの重なりを示す。黒色矩形は、拡大され、図45で示される領域を強調表示する。
【図４６】図46は、以下:図46A:条件1:未使用FAb(正の対照);図46B:条件2:PBS中56℃で130時間後のFAb;図46C:条件3:SRミックス中56℃で130時間後のFAb;図46D:条件4:SRミックス及び低(0.1M)DMG中56℃で130時間後のFAb;図46E:条件5:SRミックス及び高(1.0M)DMG中56℃で130時間後のFAb;図46F:条件6:SRミックス及び低(0.1M)TMG中56℃で130時間後のFAb;並びに図46G:条件7:SRミックス及び高(1.0M)TMG中56℃で130時間後のFAbのとおりの実施例17における一連の統合HPLCトレースを示す。
【図４７】図47は、実施例17における7種の条件のそれぞれについての純度(薄灰色)及びモノマー保持率(濃灰色)のパラメータを要約する。試料はすべて、167μg/mLにおいてであった。非熱負荷の正の対照は、未使用であった。他の試料すべてを、56℃(以降、56C)で130時間熱負荷をかけた。角括弧は、試料組成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
要約
ウイルス粒子又はポリペプチドの安定な水溶液が、本発明によって提供される。この溶液は、例えば、使用直前に乾燥粉末から再構成することを必要とせずに患者に投与され得る薬学的に許容される滅菌の液体である。
【００２６】
一つの実施形態において、本発明は、N-アルキル化グリシン誘導体又はこの塩若しくはエステル及び式(IIC)のスルホン化合物によるウイルス粒子の保存に関する。N-アルキル化グリシン誘導体及びスルホン化合物は、相乗的に作用して、液体環境におけるウイルス粒子を安定化させ得る。
【００２７】
溶液は、100ml以下の小容量非経口又は100ml以上の大容量非経口の形態を取り得る。溶液は、例えば、使用直前に乾燥粉末から再構成することを必要とせずに患者に投与され得る薬学的に許容される滅菌の液体である。
【００２８】
溶液は、長期にわたる貯蔵安定性を示し得る。したがって、それらは、冷蔵庫中、すなわち、2から8℃の温度で6から18カ月間貯蔵され得る。ある場合には、溶液は、室温でこのような期間貯蔵され得る。したがって、溶液は、それらが、工場で製造される、例えば、医薬品卸売業者及び薬局に流通させる、及び許容できないレベルの分解が生じることなく使用前に貯蔵されることを可能にするのに十分な安定性を保有する。
【００２９】
典型的には、溶液は、透明な液体として提供される。溶液は、通常無色である。それらは、生理学的に許容される緩衝剤及び/又は張性調整剤及び/又は保存剤をさらに含み得る。したがって、溶液は、等張性であり得る。溶液は、適当な容器中、バイアル、アンプル、注射器、カートリッジ、フレキシブルバッグ又はガラス瓶中に密封される。したがって、それらは、すぐ使える形態で工場において製造される。したがって、それらは、使用直前に凍結乾燥物(lyophilisate)などの固体組成物から再構成しない。
【００３０】
本発明の添加剤はさらに、ウイルス粒子又はポリペプチドを、前記ウイルス粒子又はポリペプチドの溶液の製造の間に保存し得る。さらに、本発明の添加剤は、ヒト又は動物から採取された試料の溶液を保存し得る。
【００３１】
ウイルス粒子
本発明で用いられるウイルス粒子は、生ウイルス、死滅ウイルス、弱毒化生ウイルス、化学的に不活化されたウイルスなどの不活化ウイルス又はビルレント若しくは非ビルレントウイルスなどの全てのウイルスであり得る。生ウイルスは、宿主細胞内で感染及び複製することができる。死滅ウイルスは不活化しており、宿主細胞内で複製することができない。該粒子は、ウイルス様粒子(VLP)又はヌクレオカプシドであってもよい。ウイルスは、原核細胞又は真核細胞に感染性であってもよい。ウイルスは、ヒト又は動物ウイルスであってもよい。
【００３２】
ウイルス粒子は、dsDNAウイルス、ssDNAウイルス、dsRNAウイルス、(+)ssRNAウイルス、(-)ssRNAウイルス、ssRNA-RTウイルス又はdsDNA-RTウイルスであり得るか、又はそれらに由来し得る。限定的であることは意図されないが、一例として、ウイルス粒子は、以下のファミリーのウイルスであり得るか、又はこれらに由来し得る:
アデノウイルス科(Adenoviridae)、例えば、ヒトAd5、Ad2、Ad4、Ad6、Ad24、Ad35、Ad36血清型を含むヒトアデノウイルスA、B、C、D、E又はF;
カルシウイルス科(Caliciviridae)、例えば、ノーウォークウイルス;
コロナウイルス科(Coronaviridae)、例えば、ヒトコロナウイルス299E又はOC43、及びS
ARS-コロナウイルス;
フィロウイルス科(Filoviridae)、例えば、エボラウイルス;
フラビウイルス科(Flaviviridae)、例えば、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス;
ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、例えば、B型肝炎ウイルス;
ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、例えば、単純ヘルペスウイルス、例えば、HSV1又はHSV2、ヒトヘルペスウイルス1、3、4、5又は6;
オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、例えば、限定されるものではないが、インフルエンザAウイルス血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9H2、H7N2、H7N3及びN10N7を含むインフルエンザA、B、C;
パピローマウイルス科(Papillomaviridae)、例えば、ヒトパピローマウイルス;
パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス1、麻疹ウイルス及び耳下腺炎ウイルス;
パルボウイルス科(Parvoviridae)、例えば、アデノ関連ウイルス;
ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、例えば、ヒトポリオウイルス、口蹄疫ウイルス(血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3及びAsia-1を含む);
ポックスウイルス科(Poxviridae)、例えば、ワクチニアウイルス、痘瘡ウイルス及びトリポックスウイルス(鶏痘ウイルス);
レオウイルス科(Reoviridae)、例えば、ブルータングウイルス群;
レトロウイルス科(Retroviridae)、例えば、ヒト免疫不全ウイルス1及び2を含むレンチウイルス;及び
トガウイルス科(Togaviridae)、例えば、風疹ウイルス。
【００３３】
好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、アデノウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科又はポックスウイルス科のウイルスであり得るか、又はこれらに由来し得る。特に好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、インフルエンザウイルス、又は麻疹ウイルスであり得るか、又はこれらに由来し得る。
【００３４】
ウイルス様粒子(VLP)は、ウイルスの構造タンパク質由来のウイルスタンパク質を含むが、ウイルス核酸を欠いている。過剰発現される場合、これらのウイルス構造タンパク質は、自然に粒子に自己組織化する。VLPは、複製能力がない。一部の実施形態において、VLPは、脂質二重層に埋め込まれたウイルスタンパク質である。VLPの例としては、ファージ由来VLP、ヒトパピローマウイルス(HPV)L1主要カプシドタンパク質VLP、ノーウォークウイルスカプシドタンパク質VLP及びインフルエンザウイルス構造タンパク質、例えば、M1タンパク質、HA赤血球凝集素タンパク質及びN1ノイラミニダーゼタンパク質から自己組織化したVLPを含む。
【００３５】
ウイルス粒子は、当業者に周知の標準的技術を用いて調製され得る。例えば、ウイルスは、培養宿主細胞を用いられるべきウイルス株に感染させ、ウイルスが培養細胞中で複製するように感染を進行させることによって調製されてもよく、ウイルスを収穫及び精製するために当技術分野で公知の標準的方法によって放出させ得る。
【００３６】
ポリペプチド
任意のポリペプチド、例えば、生理学的に活性なポリペプチドが、本発明の使用に適している。例えば、ポリペプチドは、6から14アミノ酸などの15アミノ酸未満の小さいペプチド(例えば、オキシトシン、シクロスポリン)、15から50アミノ酸のより大きいペプチド(例えば、カルシトニン、成長ホルモン放出ホルモン1〜29(GHRH))、50から250アミノ酸長の小タンパク質(例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン)、250アミノ酸長を超えるより大きいタンパク質又は2本以上のポリペプチド鎖の複合体を含むマルチサブユニットタンパク質であってもよい。ポリペプチドは、ペプチドホルモン、成長因子又はサイトカインであってもよい。それは、抗原結合ポリペプチド、受容体阻害剤、リガンド模倣体又は受容体遮断薬であってもよい。典型的には、ポリペプチドは、実質的に純粋な形態である。したがって、それは、単離ポリペプチドであってもよい。例えば、ポリペプチドは、組換え体産生後に単離されてもよい。
【００３７】
例えば、ポリペプチドは、成長ホルモン(GH)、プロラクチン(PRL)、ヒト胎盤性ラクトゲン(hPL)、ゴナドトロピン(例えば、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、プロオピオメラノコルチン(POMC)ファミリーのメンバー、バソプレシン及びオキシトシン、ナトリウム利尿ホルモン、副甲状腺ホルモン(PTH)、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン並びに消化管ホルモンから選択されるホルモンであってもよい。
【００３８】
ポリペプチドは、タキキニンペプチド(例えば、サブスタンスP、カシニン、ニューロキニンA、エレドイシン、ニューロキニンB)、血管作動性腸管ペプチド(例えば、VIP(血管作動性腸管ペプチド;PHM27)、PACAP(下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド)、ペプチドPHI27(ペプチドヒスチジンイソロイシン27)、GHRH1-24(成長ホルモン放出ホルモン1〜24)、グルカゴン、セクレチン)、膵臓ポリペプチド関連ペプチド(例えば、NPY、PYY(ペプチドYY)、APP(トリ膵臓ポリペプチド)、PPY(膵臓ポリペプチド)、オピオイドペプチド(例えば、プロオピオメラノコルチン(POMC)ペプチド、エンケファリンペンタペプチド、プロダイノルフィンペプチド、カルシトニンペプチド(例えば、カルシトニン、アミリン、AGG 01)又は別のペプチド(例えば、B型ナトリウム利尿ペプチド(BNP))であってもよい。
【００３９】
ポリペプチドは、上皮成長因子(EGF)ファミリー、血小板由来成長因子ファミリー(PDGF)、繊維芽成長因子ファミリー(FGF)、形質転換成長因子-βファミリー(TGF-β)、形質転換成長因子-α(TGF-α)、エリスロポエチン(Epo)、インスリン様成長因子-I(IGF-I)、インスリン様成長因子-II(IGF-II)のメンバーから選択される成長因子であってもよい。典型的には、成長因子は、形質転換成長因子ベータ(TGF-β)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン、血小板由来成長因子(PDGF)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、ミオスタチン(GDF-8)、成長分化因子-9(GDF9)、酸性繊維芽成長因子(aFGF又はFGF-1)、塩基性繊維芽成長因子(bFGF又はFGF-2)、上皮成長因子(EGF)又は幹細胞成長因子(HGF)である。
【００４０】
ポリペプチドは、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-8(IL-8)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、腫瘍壊死因子-β(TNF-β)、インターフェロン-γ(INF-γ)及びコロニー刺激因子(CSF)から選択されるサイトカインであってもよい。典型的には、サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子(G-C SF)又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である。
【００４１】
ポリペプチドは、血液凝固因子、例えば、因子VIII、因子V、フォン-ウィルブランド因子又は凝固因子IIIであってもよい。
【００４２】
抗体
本発明に使用する抗体は、全長抗体(whole antibody)又はこの抗原結合断片若しくはリガンド結合断片のいずれかであってもよい。
【００４３】
全長抗体
一つの実施形態において、抗体は、免疫グロブリン(Ig)モノマー、ダイマー、テトラマー、ペンタマー、又は他のオリゴマーである。それぞれの抗体モノマーは、4本のポリペプチド鎖(例えば、2本の同一の重鎖及び2本の同一の軽鎖からなる従来の抗体)を含み得る。代替として、それぞれの抗体モノマーは、2本のポリペプチド鎖からなる(例えば、2本の同一の重鎖からなる重鎖抗体)。
【００４４】
抗体は、任意のクラス若しくはアイソタイプの抗体(例えば、IgG、IgM、IgA、IgD又はIgE)又は任意のサブクラスの抗体(例えば、IgGのサブクラスのIgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はIgAのサブクラスのIgA1若しくはIgA2)であってもよい。典型的には、抗体は、IgG、例えば、IgG1、IgG2又はIgG4の抗体である。通常、抗体は、IgG1又はIgG2抗体である。
【００４５】
典型的には、抗体又は抗原結合断片は、哺乳動物起源のものである。したがって、抗体は、霊長類、ヒト、齧歯類(例えば、マウス又はラット)、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマ又はラクダの抗体又は抗体断片であってもよい。抗体又は抗体断片は、サメ又はニワトリ起源のものであってもよい。
【００４６】
抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に向かう実質的に均一な抗体の集団から得られる。ポリクローナル抗体の集団は、異なるエピトープに向かう抗体の混合物を含む。
【００４７】
抗原結合断片又はリガンド結合断片
抗原結合断片は、抗原結合能力又はリガンド結合能力を保有する抗体、例えば、Fab、F(Ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、一本鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合scFv、ディアボディ(diabody)、線状抗体、ドメイン抗体又は多重特異性抗体の任意の断片であり得る。このような断片は、一つ又は複数の抗原又はリガンド結合部位を含む。一つの実施形態において、抗原結合断片又はリガンド結合断片は、4種の骨格領域(例えば、FR1、FR2、FR3及びFR4)及び3種の相補性決定領域(例えば、CDR1、CDR2及びCDR3)を含む。抗原又はリガンドに結合する断片の能力を検出するために適した方法、例えば、免疫アッセイ及びファージディスプレイは、当技術分野で周知である。
【００４８】
抗体又は結合断片は、単一特異性、二重特異性又は多重特異性抗体であってもよい。多重特異性抗体は、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種又はそれを超える異なるエピトープ、抗原又はリガンドに対して結合特異性を有する。二重特異性抗体は、2種の異なるエピトープ、抗原又はリガンドに結合することができる。例えば、二重特異性抗体は、VH及びVLの2対、単一の抗原又はエピトープに結合するそれぞれのVH/VL対を含み得る。二重特異性抗体を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、2本の免疫グロブリン重鎖-軽鎖の対の共発現、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメインの免疫グロブリン定常領域配列への融合、又は抗体断片の化学結合を含む。
【００４９】
二重特異性抗体「ディアボディ」は、同じポリペプチド鎖(VH-VL)において軽鎖可変ドメインと連結した重鎖可変ドメインを含む。ディアボディは、同じ鎖上の二つのドメイン間で対になることを可能にするには短過ぎるリンカー(例えば、ペプチドリンカー)を用いて生成させることができ、その結果、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対にさせられ、二つの抗原結合部位又はリガンド結合部位を有するダイマー分子を生成する。
【００５０】
適当なscFv抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み得、これらのドメインは、1本のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することができるようにする、VH及びVL間のポリペプチドリンカーをさらに含む。
【００５１】
本発明の方法に使用するドメイン抗体は、軽鎖可変ドメイン(例えば、VL)又は重鎖可変ドメイン(例えば、VH)から本質的になっていてもよい。重鎖可変ドメインは、従来の4本の鎖の抗体又は重鎖抗体(例えば、ラクダ科VHH)に由来し得る。
【００５２】
修飾
全長抗体又はこの断片は、二つ又はそれを超える断片又は抗体を一緒に連結するために用いてもよい、リンカーなどの他の部分と結合していてもよい。このようなリンカーは、化学的リンカーであってもよいか、又は断片若しくは全長抗体との融合タンパク質の形態で存在し得る。したがって、リンカーは、同じ又は異なる結合特異性を有する全長抗体又は断片を一緒に連結するために用いることができる。
【００５３】
さらなる実施形態において、抗体又は抗原-若しくはリガンド-結合断片は、毒素、治療薬(例えば、化学治療薬)、放射性同位体、リポソーム、又はプロドラッグ活性化酵素などのさらなる部分に連結される。さらなる部分のタイプは、抗体又は抗原結合断片の最終用途に依存する。
【００５４】
抗体又は抗原-若しくはリガンド-結合断片は、1種若しくは複数種の小分子毒素(例えば、カリケアマイシン、メイタンシン、トリコテン及びCC1065)又は酵素的に活性な毒素若しくはこの断片(例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来のエクソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、クルシン、クロチン、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン又はトリコテセン)に連結されていてもよい。
【００５５】
抗体又は抗原結合断片に連結するために適した放射性同位体としては、限定されるものではないが、Tc99、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212及びP32が挙げられる。
【００５６】
抗体又は抗原-若しくはリガンド-結合断片は、例えば、プロドラッグを活性抗癌剤に変換する又は変換できるプロドラッグ活性化酵素に連結されていてもよい。例えば、アルカリホスファターゼは、リン酸塩含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するために使用でき、アリールスルファターゼは、硫酸塩含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するために使用してもよく、シトシンデアミナーゼは、非毒性5-フルオロシトシンを抗癌剤5-フルオロウラシルに変換するために使用してもよく;セラチア(serratia)プロテアーゼ、テルモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシンなどのプロテアーゼは、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するために有用である。酵素は、抗癌遺伝子療法において多くのプロドラッグの代謝に有用であるとして特定されているニトロレダクターゼであってもよい。代替として、酵素活性を有する抗体又は抗原-若しくはリガンド-結合断片は、プロドラッグを遊離の活性薬剤に変換するために使用できる。
【００５７】
適切な化学治療薬としては、限定されるものではないが、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル;ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン(carboquone)、メツレドーパ(meturedopa)及びウレドーパ(uredopa)などのアジリジン;クロラムブシル、クロルナファジン、イホスファミド、メルファランなどのナイトロジェンマスタード;カルムスチン及びフォテムスチンなどのニトロソ尿素;メトトレキサート及び5-フルオロウラシル(5-FU)などの代謝拮抗剤;デノプテリン及びプテロプテリンなどの葉酸類似体;フルダラビン及びチアミプリンなどのプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、カルモフール及びドキシフルリジンなどのピリミジン類似体;パクリタクセル及びドキセタキセルなどのタキソイド;並びに上記の任意の薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を挙げることができる。
【００５８】
別の実施形態において、抗体又は抗体断片は、PEG化され得る。したがって、一つ又は複数のポリエチレングリコール分子は、抗体分子又は抗体断片分子に共有結合され得る。一つから三つのポリエチレングリコール分子は、それぞれの抗体分子又は抗体断片分子に共有結合し得る。このようなPEG化は、抗体若しくは抗体断片の免疫原性を低下させ、及び/又は抗体若しくは抗体断片の循環半減期を増加させるために主に使用される。
【００５９】
キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体
一つの実施形態において、抗体又は抗原-若しくはリガンド-結合性断片は、種々の天然抗体由来の配列を含むキメラ抗体又はこの断片である。例えば、キメラ抗体又は抗体断片は、特定の種又は抗体クラスの抗体において対応する配列と同一又は相同性である重鎖及び/又は軽鎖の一部を含み得るが一方、鎖の残部は、別の種又は抗体クラスの抗体において対応する配列と同一又は相同性である。典型的には、キメラ抗体又は抗体断片は、マウス及びヒトの抗体成分のキメラを含む。
【００６０】
非ヒト抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。適切なヒト化抗体又は抗体断片は、例えば、レシピエント抗体又は抗原-若しくはリガンド-結合断片の超可変領域由来の(例えば、CDR由来)残基が、所望の特異性、アフィニティー及び/又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域由来の残基(ドナー抗体)で置き換えられる免疫グロブリンを含み得る。一部の場合に、ヒト免疫グロブリンの一部の骨格領域の残基は、対応する非ヒト残基に置き換えることができる。
【００６１】
ヒト化の代替として、ヒト抗体又は抗原結合断片が生成され得る。例えば、免疫後、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)が作製され得る。例えば、キメラで、生殖細胞系列突然変異マウスにおいて抗体重鎖連結領域(JH)遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらし得る。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子は、このような生殖細胞系列突然変異マウスに移入されて、抗原負荷後にヒト抗体の産生をもたらし得る。ヒト抗体又は抗原結合断片は、ファージディスプレイ技術を用いてインビトロで生成され得る。
【００６２】
標的
任意の標的抗原に結合することができる抗体又は抗原結合断片若しくはリガンド結合断片は、本発明の方法における使用に適切である。抗体又は抗体断片は、自己免疫疾患(例えば、I型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病及び重筋無力症)に関連する抗原又はリガンド、癌又は炎症状態に関連する抗原又はリガンド、骨粗鬆症に関連する抗原、アルツハイマー病に関連する抗原、又は細菌抗原若しくはウイルス抗原に結合することができてもよい。
【００６３】
特に、抗体又は抗原結合断片若しくはリガンド結合断片が結合し得る標的は、CD抗原、成長因子、成長因子受容体、アポトーシス受容体などの細胞表面受容体、タンパク質キナーゼ又は腫瘍性タンパク質であり得る。したがって、抗体又は抗原結合断片、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒトIgG1、IgG2若しくはIgG4モノクローナル抗体或いは抗体断片は、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-6(IL-6)、糖タンパク質IIb/IIIa、CD33、CD52、CD20、CD11a、CD3、RSV Fタンパク質、HER2/neu(erbB2)受容体、血管内皮成長因子(VEGF)、上皮成長因子受容体(EGFR)、抗-TRAILR2(抗腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体2)、補体系タンパク質C5、α4インテグリン又はIgEに結合することができてもよい。
【００６４】
より具体的には、抗癌モノクローナル抗体の文脈において、抗体又は抗原結合断片は、上皮細胞接着分子(EpCAM)、ムチン-1(MUC1/Can-Ag)、EGFR、CD20、癌胎児性抗原(CEA)、HER2、CD22、CD33、ルイスY及び前立腺特異的膜抗原(PMSA)に結合することができる抗体又は抗体断片であり得る。この場合もやはり、抗体は、典型的にはキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒトIgG1、IgG2若しくはIgG4モノクローナル抗体である。
【００６５】
適切なモノクローナル抗体としては、限定されるものではないが、インフリキシマブ(キメラ抗体、抗TNFα)、アダリムマブ(ヒト抗体、抗TNFα)、バシリキシマブ(キメラ抗体、抗IL-2)、アブシキシマブ(キメラ抗体、抗GpIIb/IIIa)、ダクリズマブ(ヒト化抗体、抗IL-2)、ゲムツズマブ(ヒト化抗体、抗CD33)、アレムツズマブ(ヒト化抗体、抗CD52)、エドレコロマブ(ネズミIg2a、抗EpCAM)、リツキシマブ(キメラ抗体、抗CD20)、パリビズマブ(ヒト化抗体、RSV標的)、トラスツズマブ(ヒト化抗体、抗HER2/neu(erbB2)受容体)、ベバシズマブ(ヒト化抗体、抗VEGF)、セツキシマブ(キメラ抗体、抗EGFR)、エクリズマブ(ヒト化抗体、抗補体系タンパク質C5)、エファリズマブ(ヒト化抗体、抗CD11a)、イブリツモマブ(ネズミ抗体、抗CD20)、ムロモナブ-CD3(ネズミ抗体、抗T細胞CD3受容体)、ナタリズマブ(ヒト化抗体、抗α4インテグリン)、ニモツズマブ(ヒト化IgG1、抗EGF受容体)、オマリズマブ(ヒト化、抗IgE)、パニツムマブ(ヒト抗体、抗EGFR)、ラニビズマブ(ヒト化抗体、抗VEGF)、ラニビズマブ(ヒト化抗体、抗VEGF)及びI-131トシツモマブ(ヒト化抗体、抗CD20)が挙げられる。
【００６６】
抗体の調製
適切なモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法によって(例えば、Kohlerら、Nature 256:495頁(1975年)により最初に記載されたように)、組換えDNA法によって、及び/又はファージ若しくは他の抗体ライブラリからの単離によって得ることができる。
【００６７】
ハイブリドーマ技術は、宿主動物(例えば、マウス、ラット又はサル)を所望の免疫源で免疫化して、免疫源と特異的に結合する抗体を産生する又は産生できるリンパ球を誘発することを含む。代替として、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球は、適切な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【００６８】
抗体又は抗体断片は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する代替として抗体ファージライブラリから単離することもできる。特に、ファージディスプレイは、本発明の方法に使用する抗原結合断片又はリガンド結合断片を同定するために使用され得る。抗原抗体結合又はリガンド抗体結合相互作用のハイスループットスクリーニングにファージディスプレイを使用することによって、ファージコートタンパク質上にディスプレイされた抗体断片は、抗体ファージライブラリから単離することができる。標的抗原又はリガンドを固体支持体上に固定化することによって、その抗原又はリガンドに結合することができる抗体をディスプレイするファージは、支持体上にそのまま残るが一方、その他のものは、洗浄によって除去され得る。次いで、結合したまま残るそれらのファージは、例えば、選択又はパンニングの反復サイクル後に、溶出又は単離され得る。最終選択で溶出されたファージを使用して、ファージミドを収集し得る適当な細菌宿主に感染させ、関連DNA配列を切り取り、配列決定して、関連抗原又はリガンド結合断片を同定することができる。
【００６９】
所望の抗体を含有するポリクローナル抗血清は、当技術分野で周知の技術を用いて動物から単離される。ヒツジ、ウサギ又はヤギなどの動物は、例えば、対象の抗原に対して、この抗原(免疫源)を動物に注射することによって(時として複数回注射後に)、抗体を生成させるために使用され得る。抗血清の収集後に、抗体は、免疫吸着剤による精製又は当技術分野で公知の他の技術を用いて精製され得る。
【００７０】
本発明の方法で使用される抗体又は抗原結合断片若しくはリガンド結合断片は、自然に存在するヌクレオチド配列又は合成配列から組換え的に作製され得る。このような配列は、例えば、適切な自然に存在するテンプレート(例えば、細胞から単離されたDNA又はRNA)、ライブラリ(例えば、発現ライブラリ)から単離されたヌクレオチド配列、突然変異を自然に存在するヌクレオチド配列中に導入することによって(任意の適切な公知の技術、例えば、ミスマッチPCRを用いて)調製されたヌクレオチド配列、重複プライマーを用いるPCRによって調製されるヌクレオチド配列、又はDNA合成のための技術を用いて調製されたヌクレオチド配列によって単離され得る。親和性成熟(例えば、合成、ランダム又は自然に存在する免疫グロブリン配列から出発して)、CDRグラフティング、ベニアリング(veneering)、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の組合せなどの技術、及び免疫グロブリン配列を操作する他の技術も使用され得る。
【００７１】
対象のこのようなヌクレオチド配列は、当業者に周知の技術によって、本発明に使用する抗体又は抗原結合断片の作製においてインビトロ又はインビボで使用され得る。
【００７２】
モノクローナル抗体又は抗体断片の組換え作製のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング又は発現のために複製可能なベクター中に挿入される。ベクター成分は、一般に、限定されるものではないが、以下、すなわち、シグナル配列、複製起点、1種又は複数種のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列の1種又は複数種を含む。ベクターにおいて、DNAをクローニングする又は発現させるための適切な宿主細胞は、大腸菌(E. coli)などの原核生物の細胞、又は酵母、CHO細胞などの哺乳動物細胞などの高等真核生物の細胞である。グリコシル化抗体の発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物由来である。宿主細胞は、抗体産生のための発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なように変性した従来の栄養培地で培養される。
【００７３】
組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内で産生されるか又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第1のステップとして、宿主細胞又は溶解細胞のいずれかの粒子状破片が、例えば、遠心分離又は限外ろ過によって除去される。抗体が、培地中に分泌される場合、発現系からの上清は最初に、一般に市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮される。細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され得る。
【００７４】
次いで、精製された抗体は、単離され、場合によって、抗原結合断片化若しくはリガンド結合断片化及び/又は誘導体化され得る。
【００７５】
酵素
任意のタンパク質酵素が、本発明における使用に適切である。このような酵素は、活性部位を含み、基質に結合することができる。酵素は、1本のポリペプチド鎖からなるモノマーであってもよい。代替として、酵素は、複数のポリペプチド鎖からなるダイマー、テトラマー又はオリゴマーであってもよい。ダイマー、テトラマー又はオリゴマーはそれぞれ、ホモダイマー若しくはヘテロダイマー、テトラマー又はオリゴマーであってもよい。例えば、酵素は、完全な生物活性又は酵素機能が与えられる前に、会合体(例えば、ダイマー、テトラマー又はオリゴマー)を形成する必要があり得る。酵素は、アロステリック酵素、アポ酵素又はホロ酵素であってもよい。
【００７６】
酵素は、別の部分(例えば、リガンド、抗体、炭水化物、エフェクター分子、又はタンパク質融合パートナー)と結合してもよく、及び/又は1種若しくは複数種の補助因子(例えば、補酵素又は補欠分子族)に結合してもよい。
【００７７】
酵素が結合している部分は、レクチン、アビジン、代謝産物、ホルモン、ヌクレオチド配列、ステロイド、糖タンパク質、糖脂質、又はこれらの成分の任意の誘導体を含み得る。
【００７８】
補助因子は、無機化合物(例えば、鉄、マンガン、コバルト、銅、亜鉛、セレン、モリブデンなどの金属イオン)又は有機化合物(例えば、フラビン又はヘム)を含む。適切な補酵素としては、リボフラビン、チアミン、NAD又はNADP+によって運ばれる鉄水素化物(H-)を含み得る葉酸、補酵素Aに含まれるアセチル基、葉酸に含まれるホルミル、メテニル又はメチル基、及びS-アデノシルメチオニンに含まれるメチル基が挙げられる。
【００７９】
別の実施形態において、酵素は、特に酵素が患者に投与される治療用酵素である場合、PEG化されてもよい。したがって、一つ又は複数のポリエチレングリコール分子が、酵素分子に共有結合してもよい。一つから三つのポリエチレングリコール分子が、それぞれの酵素分子に共有結合してもよい。このようなPEG化は、主として酵素の免疫原性を減少させ及び/又は酵素の循環半減期を増加させるために用いられる。
【００８０】
適切な酵素は、オキシドレダクターゼ(EC1)、トランスフェラーゼ(EC2)、ヒドロラーゼ(EC3)、リアーゼ(EC4)、イソメラーゼ(EC5)又はリガーゼ(EC6)を含めて、国際生化学分子生物学連合酵素分類系のEC番号のもとで分類された任意の酵素を含む。典型的な酵素は、工業的に使用される任意の酵素である。
【００８１】
任意のタイプの基質に特異的である酵素が、本発明の使用に適切である。適切な酵素の例としては、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、セリンプロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ(例えば、システインエンドペプチダーゼ)、カスパーゼ、キマーゼ、キモトリプシン、エンドペプチダーゼ、グランザイム、パパイン、膵エラスターゼ、オリジン、プラスミン、レニン、スブチリシン、トロンビン、トリプシン、トリプターゼ、ウロキナーゼ、アミラーゼ(例えば、α-アミラーゼ)、キシラナーゼ、リパーゼ、トランスグルタミナーゼ、細胞壁分解酵素、グルカナーゼ(例えば、β-グルカナーゼ)、グルコアミラーゼ、凝固酵素、乳タンパク質加水分解物、細胞壁分解酵素、血液凝固酵素、ヘメンチン(hementin)、リゾチーム、繊維分解酵素、フィターゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、マンナナーゼ又はグルコアミラーゼが挙げられる。
【００８２】
したがって、本発明によって保存される酵素は、疾患又は他の病状を治療するために使用される治療用酵素、グルコース又はフルクトースなどの大量生産品の製造のために工業で、食品加工及び食品分析で、洗濯及び自動食器洗い用洗剤で、繊維製品、パルプ、紙及び動物飼料工業で、合成又は精密化学における触媒として、臨床診断においてなどの診断用途で、バイオセンサーで又は遺伝子操作で使用される酵素であり得る。
【００８３】
本発明が適用され得る治療用酵素としては、
- DNAase、例えば、嚢胞性繊維症を有する小児の肺疾患粘液中のDNAを切断するパルモザイム(Pulmozyme)又はドルナーゼなどの組換えDNAase I;
-  胃リパーゼ、例えば、外分泌膵リパーゼ不全に関連する脂質吸収不良の治療用組換え哺乳類胃リパーゼであるメリパーゼ(Meripase);
-  マンノース末端化グルコセレブロシダーゼ、例えば、酵素グルコセレブロシダーゼの欠乏により引き起こされる遺伝性疾患であるゴーシェ疾患の治療用組換えマンノース末端化グルコセレブロシダーゼであるセレザイム(Cerezyme);
-  関連グリコーゲン蓄積症のファブリ疾患の治療に使用されるα-ガラクトシダーゼ;
-  アデノシンデアミナーゼ(ADA)、例えば、重症複合免疫不全であるADA欠乏症を治療するために使用されるプレガデマーゼ(Pregademase);
-  フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、例えば、フェニルケトン尿症の治療に使用されるPEG化組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼのクバン(Kuvan);
-  組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓を治療するために血液線維素溶解に使用されるウロキナーゼ及びストレプトキナーゼ;
-  尿酸オキシダーゼ、例えば、遺伝的に修飾された酵母によって産生され、白血病又はリンパ腫の患者における高尿酸血の治療又は予防に使用される組換え尿酸オキシダーゼであるエリテック(Elitek)(ラスブリカーゼ);
-  小児急性リンパ芽球性白血病の治療に使用されるL-アスパラギナーゼ;
-  因子VIIa、血友病の患者により使用される;
-  因子IX、血友病Bの治療に使用される;及び
-  スーパーオキシドジスムターゼ、例えば、家族性筋萎縮性側索硬化症の治療に使用されるウシスーパーオキシドジスムターゼオルゴテイン(Orgotein)
が挙げられる。
【００８４】
ベーキングなどの食品用途に使用する酵素としては、アミラーゼ、キシラナーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ及びトランスグルタミナーゼが挙げられる。果汁生産及び果実加工に使用する酵素としては、細胞壁分解酵素が挙げられる。醸造に使用する酵素としては、マッシングにおける細菌性α-アミラーゼ、β-グルカナーゼ及びグルコアミラーゼ、発酵における真菌性α-アミラーゼ及び発酵後におけるシステインエンドペプチダーゼが挙げられる。酪農用途に使用する酵素としては、凝固酵素、リパーゼ、リゾチーム、乳タンパク質加水分解物、トランスグルタミナーゼ、及びβ-ガラクトシダーゼが挙げられる。洗剤組成物に使用する酵素としては、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びマンナーゼが挙げられる。動物飼料に使用する酵素としては、繊維分解酵素、フィターゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼが挙げられる。パルプ及び紙加工に使用する酵素としては、セルラーゼ及びヘミセルラーゼが挙げられる。
【００８５】
酵素は、代替として、研究及び開発用途に使用される酵素であってもよい。例えば、ルシフェラーゼは、細胞培養、個々の細胞及び生物全体における遺伝子発現のリアルタイム画像化に使用され得る。さらに、ルシフェラーゼは、例えば、ルシフェラーゼを用いてトランスフェクトされた細胞において特異的プロモーターからの転写活性を試験するために、分子研究におけるリポータータンパク質として使用され得る。酵素はまた、薬剤設計において、例えば、実験室における酵素阻害剤の試験において使用され得る。さらに、酵素はバイオセンサー(例えば、グルコースオキシダーゼを使用する血液グルコースバイオセンサー)において使用され得る。
【００８６】
ルシフェラーゼ酵素は、ホタル、甲虫又は鉄道虫のルシフェラーゼ、又はこれらの誘導体であってもよい。特に、ルシフェラーゼは、北米ホタル(North American firefly)(ホリヌス  ピラリス(Phorinus Pyralis))、ゲンジボタル(Luciola cruciata)(日本のホタル)、ヘイケボタル(luciola lateralis)(日本のホタル)、ルキオラ  ミンゲリカ(Luciola mingelica)(ロシアのホタル)、ベネクケア  ハネギ(Beneckera hanegi)(海洋細菌ルシフェラーゼ)、ヒカリコメツキ(Pyrophorus plagiophthalamus(クリックビートル)、ミヤコマドボタル(Pyrocelia miyako)(ホタル)、イリオモテボタル(Ragophthalamus ohbai)(鉄道虫)、ヒカリコメツキ(Pyrearimus termitilluminans)(クリックビートル)、プリクソトリクス  ヒルトゥス(Phrixothrix hirtus)(鉄道虫)、プリクソトリクス  ウィウィアニイ(Phrixothrix vivianii)、ヒメボタル(Hotaria parvula)及びポトゥリス  ペンシルウァニカ(Photuris pensilvanica)、並びにこれらの突然変異体由来であってもよい。
【００８７】
典型的には、α-ガラクトシダーゼ又はβ-ガラクトシダーゼは、細菌(大腸菌(Escheric
hia coli.)など)、哺乳動物(ヒト、マウス、ラットなど)又は他の真核生物由来である。
【００８８】
酵素は、自然に存在する酵素又は合成酵素であってもよい。このような酵素は、宿主である動物、植物又は微生物由来であってもよい。
【００８９】
酵素の生産に使用される微生物菌株は、天然菌株、又は連続培養及び選択、若しくは組換えDNA技術を用いる突然変異生成及び選択による天然菌株に由来する突然変異菌株であってもよい。例えば、微生物は、真菌類、例えば、テルモミュケス  アケルモニウム(The
rmomyces acermonium)、アスペルギッルス属(Aspergillus)、ペニキッリウム属(Penicillium)、ケカビ属(Mucor)、アカパンカビ属(Neurospora)及びトリコデルマ(Trichoderma)であってもよい。サッカロミュケス  ケレウィセアエ(Saccharomyces cereviseae)又はピシア  パストリス(Pishia pastoris)などの酵母は、本発明の方法に使用する酵素の生産でも使用され得る。
【００９０】
合成酵素は、進化及びDNAシャフリングに向けた、合理的設計などの当技術分野で周知のタンパク質操作技術を用いて誘導され得る。
【００９１】
宿主生物は、所望の酵素をコードするヌクレオチド配列で形質転換されて、酵素の生産の助けとなり、細胞及び/又は培養培地からの酵素の回収を容易にする条件下で培養され得る。
【００９２】
ワクチン免疫原
本発明の使用に適したワクチン免疫原は、ワクチンの任意の免疫原性成分を含む。ワクチン免疫原は、特定の疾患又は病状に対するワクチンとして使用される場合、個体における免疫応答を誘発し得る抗原を含む。ワクチン免疫原は、ワクチン調製物の処方前にそれ自体により提供され得るか、又はそれは、ワクチン調製物の一部として提供され得る。ワクチン免疫原は、ワクチン、又はトキソイドとして有用な結合体であるサブユニットワクチンであってもよい。ワクチン免疫原は、タンパク質、細菌特異性タンパク質、ムコタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、多糖類、ペプチドグリカン、核タンパク質又は融合タンパク質であってもよい。
【００９３】
ワクチン免疫原は、微生物(細菌、ウイルス、真菌など)、原生動物、腫瘍、悪性細胞、植物、動物、ヒト、又はアレルゲン由来であってもよい。ワクチン免疫原は、好ましくはウイルス粒子でない。したがって、ワクチン免疫原は、全ウイルス(whole virus)若しくはビリオン、ウイルス様粒子(VLP)又はウイルスヌクレオカプシドでないことが好ましい。このようなウイルス粒子の保存は、国際公開第2008/114021号に記載されている。
【００９４】
ワクチン免疫原は、例えば、組換えDNA技術を用いて誘導されるような、合成品であってもよい。免疫原は、疾患関連抗原、例えば、病原体関連抗原、腫瘍関連抗原、アレルギー関連抗原、神経障害関連抗原、心臓血管疾患抗原、関節リウマチ関連抗原であってもよい。
【００９５】
特に、ワクチン免疫原が由来する病原体としては、ヒトパピローマウイルス(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、インフルエンザウイルス(A、B及びC型)、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、RSVウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、A型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトT-細胞リンパ腫I型ウイルス(HTLV-I)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、ワクチニアウイルス、サルモネッラ属(Salmonella)、ネイセッリア属(Neisseria)、ボッレリア属(Borrelia)、クラミジア属(Clamydia)、百日咳菌(Bordetella pertussis)などのボルデテッラ属(Bordetella)、プラスモジウム属(Plasmodium)、トキソプラズマ(Coxoplasma)、肺炎球菌(Pneumococcus)、髄膜炎菌(Meningococcus)、クリプトコックス属(Cryptococcus)、ストレプトコックス属(Streptococcus)、コレラ菌(Vibriocholerae)、エルシニア属(Yersinia)、特にペスト菌(Yersinia pestis)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、ハエモピルス属(Haemophilus)、ジフテリア菌(Diptheria)、破傷風菌(Tetanus)、百日咳(Pertussis)、エシェリキア属(Escherichia)、カンジダ属(Candida)、アスペルギッルス属(Aspergillus)、エンタモエバ属(Entamoeba)、ギアルジア属(Giardia)及びトリュパナソマ属(Trypanasoma)を挙げることができる。ワクチンはさらに、多数の家畜の疾患、例えば、口蹄疫(血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3及びAsia-1を含む)、コロナウイルス、ブルータング、ネコ白血病ウイルス、トリインフルエンザ、ヘンドラウイルス及びニパーウイルス、ペスチウイルス、イヌパルボウイルス並びにウシウイルス性下痢ウイルスに対して適切な免疫応答を与えるために使用され得る。
【００９６】
腫瘍関連抗原としては、例えば、黒色腫関連抗原、乳癌関連抗原、大腸癌関連抗原又は前立腺癌関連抗原が挙げられる。
【００９７】
アレルゲン関連抗原としては、ワクチンが投与される個体におけるアレルギー反応を抑制するワクチンの使用に適切な任意のアレルゲン抗原(例えば、花粉、チリダニ、昆虫、食品アレルゲン、塵埃、毒物、寄生虫)が挙げられる。
【００９８】
サブユニットワクチン免疫原
適切なサブユニットワクチン免疫原は、微生物(例えば、ウイルス又は細菌)由来のタンパク質、リポタンパク質又は糖タンパク質の任意の免疫原性サブユニットを含む。代替として、サブユニットワクチン免疫原は、腫瘍関連タンパク質などの疾患関連抗原由来であってもよい。サブユニットワクチン免疫原は、自然に存在する分子又は合成タンパク質のサブユニットであってもよい。ワクチン免疫原は、全長ウイルスタンパク質若しくは細菌タンパク質、糖タンパク質若しくはリポタンパク質であってもよく、又は全長ウイルスタンパク質若しくは細菌タンパク質の断片、糖タンパク質若しくはリポタンパク質の断片であってもよい。
【００９９】
サブユニットワクチン免疫原として適切なウイルスタンパク質は、構造又は非構造ウイルスタンパク質由来であってもよい。適切なウイルスサブユニット免疫原は、ウイルスの他の部分の不存在下でさえも対象の免疫系を刺激することができる。適切なウイルスサブユニットワクチン免疫原としては、カプシドタンパク質、表面糖タンパク質、エンベロープタンパク質、ヘキソンタンパク質、繊維タンパク質、コートタンパク質又はこのようなタンパク質若しくは糖タンパク質の免疫原性断片若しくは誘導体が挙げられる。
【０１００】
例えば、ウイルスサブユニットワクチン免疫原は、インフルエンザA、B又はCのウイルスの表面タンパク質から構成され得る。特に、ワクチン免疫原は、血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、核タンパク質、M1、M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2及び若しくはPB2タンパク質、又はこのタンパク質の任意の免疫原性誘導体若しくは断片であってもよい。免疫原は、HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15及び/又はHA16、これらの任意の免疫原性断片又は誘導体、並びにHAタンパク質、断片又は誘導体の任意の組合せであってもよい。ノイラミニダーゼは、ノイラミニダーゼ1(N1)又はノイラミニダーゼ2(N2)であってもよい。
【０１０１】
ウイルスサブユニットワクチン免疫原は、B型肝炎ウイルスのウイルスエンベロープタンパク質又はこの断片若しくは誘導体であってもよい。例えば、サブユニットワクチン免疫原は、B型肝炎表面抗原(HbsAg)又はこの免疫原性断片若しくは誘導体であってもよい。
【０１０２】
典型的には、細菌サブユニットワクチン免疫原は、細菌細胞壁タンパク質(例えば、フラジェリン、外膜タンパク質、外面タンパク質)、多糖類抗原(例えば、髄膜炎菌(Neisseria meningitis、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumonia))、毒素、又はこのようなタンパク質、多糖類若しくは毒素の免疫原性断片若しくは誘導体である。
【０１０３】
自然に存在するタンパク質の誘導体は、1個又は複数個のアミノ酸の付加、置換及び/又は欠失を有するタンパク質を含む。このようなアミノ酸修飾は、当技術分野で公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発を用いて生成され得る。
【０１０４】
サブユニットワクチン免疫原は、例えば、細菌若しくはウイルスタンパク質又はこの免疫原性断片若しくは誘導体と連結した融合タンパク質のパートナーを含む融合タンパク質であってもよい。適切な融合タンパク質のパートナーは、融合タンパク質発現後に、ウイルス融合タンパク質の多量体への凝集を防止し得る。例えば、融合タンパク質のパートナーは、ウイルスタンパク質が、融合タンパク質のパートナーの非存在下で組換え的に発現される場合、自発的に形成し得るウイルス様構造の形成を防止し得る。適切な融合パートナーは、融合タンパク質の精製を容易にし、又は融合タンパク質産物の組換え発現を増強させることもできる。融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質、金属イオンに結合できるポリヒスチジンセグメント、抗体が結合する抗原、S-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、チオレドキシン、ベータ-ガラクトシダーゼ、エピトープタグ、緑色蛍光タンパク質、ストレプトアビジン又はジヒドロ葉酸レダクターゼであってもよい。
【０１０５】
サブユニットワクチン免疫原は、例えば、単離ペプチド、タンパク質、リポタンパク質、又は糖タンパク質の調製のための当技術分野で公知の技術を用いて調製され得る。例えば、対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子は、病原体から同定及び単離されて、タンパク質の大量生産のための大腸菌又は一部の他の適切な宿主で発現され得る。次いで、対象のタンパク質は、宿主細胞から単離及び精製される(例えば、アフィニティークロマトグラフィーを用いる精製によって)。
【０１０６】
ウイルスサブユニット免疫原の場合、サブユニットは、ウイルス粒子を単離後にウイルス粒子から、又は適切な宿主細胞における組換えDNAクローニング及びウイルスサブユニットタンパク質の発現によって精製され得る。ウイルス粒子を調製するための適切な宿主細胞は、ウイルスを感染させる、及び所望のウイルス抗原を産生することができなければならない。このような宿主細胞としては、微生物、培養動物細胞、トランスジェニック植物又は昆虫の幼虫を含み得る。対象のタンパク質の一部は、宿主細胞から可溶性タンパク質として分泌され得る。ウイルスエンベロープ又は表面タンパク質の場合、このようなタンパク質は、界面活性剤で可溶化して、それらをウイルスエンベロープから抽出し、続いて界面活性剤を除去するために相分離させることが必要であり得る。
【０１０７】
サブユニットワクチン免疫原は、同じ調製物中で組み合わせ、1種、2種、3種又はそれを超える他のサブユニットワクチン免疫原と一緒に保存することができる。
【０１０８】
トキソイド
本発明は、トキソイドに適用され得る。トキソイドは、免疫原性であるが、標的対象に対する毒性をなくすために不活化された(例えば、遺伝子突然変異、化学的処理によって、又は別の部分への結合によって)、例えば、病原体、動物又は植物由来の毒素である。毒素は、例えば、タンパク質、リポタンパク質、多糖類、リポ多糖類又は糖タンパク質であってもよい。したがって、トキソイドは、トキソイド化されたエンドトキシン又はエクソトキシンであってもよい。
【０１０９】
トキソイドは、破傷風毒素、ジフテリア毒素、百日咳毒素、ボツリヌス毒素、クロストリジウム  ディフィシル(C. difficile)毒素、コレラ毒素、志賀毒素、炭疽毒素、細菌細胞溶解素又は肺炎球菌産生毒素などの細菌毒素、及びこの断片又は誘導体由来のトキソイドであり得る。したがって、トキソイドは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド又は百日咳トキソイドであり得る。トキソイドが由来し得る他の毒素形態は、動物又は植物、例えば、ガラガラヘビ(Crotalis atrox)から単離された毒物を含み得る。典型的には、トキソイドは、ボツリヌス毒素又は炭疽毒素由来である。例えば、ボツリヌス毒素は、血清型A、B、C、D、E、F又はGのボツリヌス菌(Clostridium botulinum)由来であり得る。ボツリヌス毒素由来のワクチン免疫原は、同じ調製物中で組み合わせ、ボツリヌス毒素由来の1種又は複数種の他のワクチン免疫原と一緒に保存され得る(例えば、ボツリヌス血清型A、B、C、D、E、F又はG、例えば、A、B及びE由来の免疫原の組合せ)。
【０１１０】
炭疽毒素は、炭疽菌(Bacillus anthracis)の菌株由来であり得る。トキソイドは、炭疽毒素の1種若しくは複数種の成分、又はこのような成分の誘導体、例えば、防御抗原(PA)、浮腫因子(EF)及び致死因子(LF)からなることができる。典型的には、炭疽毒素由来のトキソイドは、防御抗原(PA)からなる。
【０１１１】
トキソイドは、トキソイドワクチンとしての使用のために、例えば、融合タンパク質として別の部分に結合していてもよい。結合トキソイドにおける適切な部分は、トキソイドの精製を補助し(例えば、ヒスチジンタグ)、又は標的対象に対する毒性を低下させる物質を含む。代替として、トキソイドは、それが結合している抗原の免疫原性を増加させることによってアジュバントとして作用し得る。例えば、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のB多糖類は、ジフテリアトキソイドと組み合わせることができる。
【０１１２】
ワクチン免疫原は、同じ調製物中で組み合わせて、1種、2種、3種又はそれを超えるワクチン免疫原と一緒に保存され得る。例えば、ジフテリアトキソイドは、破傷風トキソイド及び百日咳ワクチンと保存され得る(DPT)。ジフテリアトキソイドは、単に破傷風トキソイドと保存され得るか(DT)、又はジフテリアトキソイドは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及び無細胞百日咳と保存され得る(DTaP)。
【０１１３】
トキソイドの調製の技術は、当業者に周知である。毒素遺伝子は、クローニングされて、適切な宿主細胞で発現され得る。次いで、毒素産物は、精製され、例えば、ホルマリン又はグルタルアルデヒドを用いて、化学的にトキソイドに変換され得る。代替として、毒素遺伝子は、例えば、1種又は複数種のアミノ酸の添加、欠失及び/又は置換によって、毒性が低下した又は毒性のない毒素をコードするように操作され得る。次いで、修飾された毒素は、適切な宿主細胞で発現され、単離され得る。毒素遺伝子の毒性は、さらなる部分(例えば、多糖類又はポリペプチド)への毒素遺伝子又はこの断片の結合によって不活化することもできる。
【０１１４】
結合型ワクチン免疫原
結合型ワクチン免疫原は、抗原(例えば、多糖類又は他のハプテン)の担体部分(例えば、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質又はこの任意の免疫刺激性誘導体若しくは断片)への結合体であってもよく、この担体部分は、それが結合している抗原の免疫原性を刺激する。例えば、結合型ワクチン免疫原は、対象の免疫原(例えば、多糖類)と結合した組換えタンパク質、組換えリポタンパク質又は組換え糖タンパク質であってもよい。
【０１１５】
結合型ワクチン免疫原は、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumonia)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、髄膜炎菌(meningococcus)(A、B、C、X、Y及びW135株)又は肺炎球菌(Pneumococcal)株に対するワクチンにおいて使用され得る。例えば、ワクチンは、例えば、七価の肺炎球菌CRM197結合型ワクチン(PCV7)、MCV-4又はb型インフルエンザ菌(Hib)ワクチンであってもよい。
【０１１６】
結合型ワクチン免疫原は、同じ調製物中で組み合わせて、1種、2種、3種又はそれを超える他の結合型ワクチン免疫原と一緒に保存され得る。
【０１１７】
結合型多糖類-タンパク質結合体の調製方法は、当技術分野で周知である。例えば、結合は、リンカー(例えば、B-プロピオン酸アミド、ニトロフェニル-エチルアミン、ハロゲン化ハロアルキル、グリコシド結合)を介して起こり得る。
【０１１８】
ポリエチレンイミン
PEIは、-(CH2-CH2-NH)-と表示される化学単位を繰り返すことを特徴とする脂肪族ポリアミンである。本明細書においてPEIへの言及は、ポリエチレンイミンホモポリマー又はコポリマーを含む。ポリエチレンイミンコポリマーは、ランダム又はブロックコポリマーであり得る。例えば、PEIは、ポリエチレンイミンと、ポリエチレングリコール(PEG)などの別のポリマーとからなっていてもよい。ポリエチレンイミンは、線状又は分岐であってもよい。
【０１１９】
PEIへの言及は、ポリエチレンイミンの誘導体化された形態も含む。ポリエチレンイミンは、様々な位置に窒素原子を有する。窒素原子は、末端アミノ基に存在し(例えば、R-NH2)、ポリマー構造内のアルキル基又はアルキレン基に割り込む基などの内部の基に存在し(例えば、R-N(H)-R')、及びポリマー分岐の交差点に存在する[例えば、R-N(-R')-R"(式中、R、R'及びR"は、例えば、アルキレン基であってもよい)]。アルキル基又はアリール基は、水素原子に加えて又はその代わりに窒素中心に連結していてもよい。このようなアルキル基及びアリール基は、置換されていても、非置換であってもよい。アルキル基は、典型的にはC1〜C4アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル又はtert-ブチルである。アリール基は、典型的にはフェニルである。
【０１２０】
PEIは、ポリエチレングリコールなどの様々な他のポリマーに共有結合しているポリエチレンイミンであってもよい。PEIの他の修飾バージョンが作られており、一部は市販されている:分岐PEI25kDa、jetPEI(登録商標)、LMW-PEI5.4kDa、擬似デンドリマーPEI、PEI-SS-PEI、PEI-SS-PEG、PEI-g-PEG、PEG-co-PEI、PEG-g-PEI、PEI-co-L乳酸アミド-co-コハク酸アミド、PEI-co-N-(2-ヒドロキシエチル-エチレンイミン)、PEI-co-N-(2-ヒドロキシプロプル)メタクリルアミド、PEI-g-PCL-ブロック-PEG、PEI-SS-PHMPA、PEI-g-デクストラン10000及びPEI-g-トランスフェリン-PEG、Pluronic85(登録商標)/Pluronic123(登録商標)-g-PEI。PEIは、完全メチル化ポリエチレンイミン又はポリエチレンイミン-エタンスルホン酸であってもよい。
【０１２１】
PEIは、広範な数平均モル質量(Mn)、例えば、300Daから800kDaで入手できる。好ましくは、数平均モル質量は、300から2000Da、500から1500Da、1000から1500Da、10から100kDa、20から100kDa、30から100kDa、40から100kDa、50から100kDa、60から100kDa、50から70kDa又は55から65kDaである。およそ60kDaの比較的高いMnのPEI又は1200Daの比較的低いMnが適切である。
【０１２２】
好ましくは、PEIの重量平均モル質量(Mw)は、500Daから1000kDaである。最も好ましくは、PEIのMwは、500Daから2000Da、1000Daから1500Da、又は1から1000kDa、100から1000kDa、250から1000kDa、500から1000kDa、600から1000kDa、750から1000kDa、600から800kDa、700から800kDaである。およそ750kDaの比較的高いMw又はおよそ1300Daの比較的低いMwが適切である。
【０１２３】
PEIの重量平均モル質量(Mw)及び数平均モル質量(Mn)は、当業者に周知の方法によって決定され得る。例えば、Mwは、光散乱法、小角中性子散乱法(SANS)、X線散乱法又は沈降速度法によって決定され得る。Mnは、例えば、ゲル透過クロマトグラフィー、粘度法(Mark-Houwinkの方程式)及び蒸気圧法などの束一的方法又は末端基滴定法によって決定され得る。
【０１２４】
様々な形態のPEIが、市販されている(例えば、Sigma、Aldrich)。例えば、およそ60kDa
のMn及びおよそ750kDaのMwを有する、本明細書で用いられる分岐の比較的高い分子量の形態のPEIが、市販されている(Sigma P3143)。このPEIは、以下の式:
【化４】
0005869553.tif 000005
【０１２５】
で表すことができる。
【０１２６】
1300DaのMw及び1200DaのMnを有する、本明細書で用いられる比較的低い分子量の形態のPEIも、市販されている(例えば、Aldrich 482595)。
【０１２７】
式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩又はエステル、及び式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩又はエステル
式(I)及び式(II)の化合物は、この生理学的に許容される塩又はエステルとして存在し得る。
【０１２８】
塩は、典型的には生理学的に許容される酸との塩であり、したがって、無機酸、例えば、塩酸若しくは硫酸、又は有機酸、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、マンデル酸、フマル酸若しくはメタンスルホン酸と形成されるものを含む。塩酸塩が好ましい。
【０１２９】
エステルは、典型的にはC1〜6アルキルエステル、好ましくはC1〜4アルキルエステルである。したがって、エステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、イソブチルエステル又はtert-ブチルエステルであり得る。エチルエステルが好ましい。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、C1〜6アルキル基は、好ましくはC1〜4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。
【０１３１】
疑いを避けるために、式(I)及び式(II)の化合物の定義は、カルボキシレートアニオンがプロトン化されて、-COOHを与え、アンモニウム又はスルホニウムカチオンが薬学的に許容されるアニオンと結合している化合物も含む。さらに疑いを避けるために、上に定義された化合物は、任意の互変異性又はエナンチオマー形態で使用され得る。
【０１３２】
式(I)の化合物
典型的には、R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表す。典型的には、R2は、水素又はC1〜6アルキルを表す。好ましくは、R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2は、水素又はC1〜6アルキルを表す。より好ましくは、R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2はC1〜6アルキルを表す。
【０１３３】
好ましくは、式(I)の化合物は、N-C1〜6アルキルグリシン、N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、より好ましくは、N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。アルキル基は、典型的にはC1〜4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが、特に好ましい。
【０１３４】
式(I)の好ましい化合物は、N-メチルグリシン、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。N-メチルグリシンは、サルコシンとも呼ばれる。N,N-ジメチルグリシンは、ジメチルグリシン(DMG)又は2-(ジメチルアミノ)-酢酸とも呼ばれる。N,N,N-トリメチルグリシンは、トリメチルグリシン(TMG)と呼ばれる。
【０１３５】
代替として、式(I)の化合物は、典型的には式(IA)のグリシン誘導体又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである:
【化５】
0005869553.tif 000006
【０１３６】
(式中、R5及びR6は、独立して、C1〜6アルキル、例えば、メチル又はエチルなどのC1〜4アルキルを表し;R7は、C1〜6アルキル、例えば、メチル若しくはエチルなどのC1〜4アルキル、又は-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3を表す)。式(IA)の好ましい化合物は、トリメチルグリシン(TMG)及びコカミドプロピルベタイン(CAPB)又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。トリメチルグリシンが好ましい。
【０１３７】
代替として、式(I)の化合物は、典型的には式(IB)のプロリン誘導体又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである:
【化６】
0005869553.tif 000007
【０１３８】
(式中、R8及びR9は、独立して、C1〜6アルキル、例えば、メチル又はエチルなどのC1〜4アルキルを表す。好ましくは、式(IB)の化合物は、S-プロリン誘導体である。好ましくは、R8及びR9は両方とも、メチルを表し;この化合物は、プロリンベタインとして公知である。S-プロリンベタイン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルが、特に好ましい:
【化７】
0005869553.tif 000008
【０１３９】
式(IA)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルが好ましい。
【０１４０】
好ましくは、式(I)の化合物は、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。最も好ましくは、式(I)の化合物は、N,N-ジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。
【０１４１】
式(II)の化合物
典型的には、Rcのカルボキシレート及びアミン置換基は、Rcアルキル部分の同じ炭素原子に結合している。典型的には、Rcは、C2〜4又はC2〜3アルキル部分である。
【０１４２】
式(II)の化合物は、典型的には式(IIA)のスルホン化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである:
【化８】
0005869553.tif 000009
【０１４３】
(式中、Rc及びRdは、独立して、C1〜6アルキル、例えば、C1〜4アルキルを表す)。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。好ましいスルホン化合物は、メチルスルホニルメタン(MSM)であり、これは、ジメチルスルホン(DMSO2)としても公知である。
【０１４４】
式(II)の化合物は、典型的には式(IIB)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである:
【化９】
0005869553.tif 000010
【０１４５】
(式中、Rc及びRfは、独立して、C1〜6アルキル、例えば、メチル又はエチルなどのC1〜4アルキルを表し、Rgは、カルボキシレートアニオンで及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキル、例えば、メチル又はエチルなどのC1〜4アルキルを表す)。好ましくは、カルボキシレート置換基及びアミン置換基は、同じ炭素原子に結合している。式(IIB)の好ましい化合物は、S-メチル-L-メチオニン(SMM)又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。
【０１４６】
グリシン誘導体
添加剤は、N-アルキル-グリシン、N,N-ジアルキル-グリシン若しくはN,N,N-トリアルキル-グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。アルキル基は、典型的にはC1〜6アルキル、例えば、C1〜4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。
【０１４７】
本発明に使用する好ましいグリシン誘導体は、N-メチルグリシン、N,N-ジメチルグリシン、N,N,N-トリメチルグリシン並びにこの生理学的に許容される塩及びエステルである。N-メチルグリシンは、サルコシンとも呼ばれる。N,N-ジメチルグリシンは、ジメチルグリシン(DMG)又は2-(ジメチルアミノ)-酢酸とも呼ばれる。N,N,N-トリメチルグリシンは、略してトリメチルグリシン(TMG)と呼ばれ、ベタイン化合物として上に述べられている。
【０１４８】
塩は、典型的には生理学的に許容される酸との塩であり、したがって、無機酸、例えば、塩酸若しくは硫酸、又は有機酸、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、マンデル酸、フマル酸若しくはメタンスルホン酸と形成されるものを含む。塩酸塩が好ましい。
【０１４９】
エステルは、典型的にはC1〜6アルキルエステル、好ましくはC1〜4アルキルエステルである。したがって、エステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、イソブチルエステル又はtert-ブチルエステルであり得る。エチルエステルが好ましい。
【０１５０】
N-アルキル化グリシン誘導体及びスルホン化合物を含有する溶液
1.N-アルキル化グリシン誘導体
N-アルキル化グリシン誘導体は、N-C1〜6アルキルグリシン、N,N-ジ(C1〜6アルキル)-グリシン又はN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシンである。アルキル基は、典型的にはC1〜4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。
【０１５１】
本発明に使用する好ましいグリシン誘導体は、N-メチルグリシン、N,N-ジメチルグリシン、N,N,N-トリメチルグリシンである。N-メチルグリシンは、サルコシンとも呼ばれる。N,N-ジメチルグリシンは、ジメチルグリシン(DMG)又は2-(ジメチルアミノ)-酢酸とも呼ばれる。N,N,N-トリメチルグリシンは、トリメチルグリシン(TMG)と呼ばれる。
【０１５２】
N-アルキル化グリシン誘導体の生理学的に許容される塩又はエステルを用いることができる。したがって、
-  塩は、典型的には生理学的に許容される酸との塩であり、したがって、無機酸、例えば、塩酸若しくは硫酸、又は有機酸、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、マンデル酸、フマル酸若しくはメタンスルホン酸と形成されるものを含む。塩酸塩が好ましい。
【０１５３】
-  エステルは、典型的にはC1〜6アルキルエステル、好ましくはC1〜4アルキルエステルである。したがって、エステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、イソブチルエステル又はtert-ブチルエステルであり得る。エチルエステルが好ましい。
【０１５４】
2.スルホン化合物
スルホン化合物は、式(IIC):
【化１０】
0005869553.tif 000011
【０１５５】
(式中、Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキル、例えば、C1〜4アルキルを表す)
の化合物である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。好ましいスルホン化合物は、メチルスルホニルメタン(MSM)であり、これは、ジメチルスルホン(DMSO2)としても公知である。
【０１５６】
糖
本発明における使用に適切な糖は、還元糖、例えば、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース及びマルトース;好ましくは非還元糖、例えば、スクロース及びラフィノースを含む。糖は、単糖、二糖、三糖、又は他のオリゴ糖であってもよい。「糖」という用語は、糖アルコールを含む。
【０１５７】
ガラクトース及びマンノースなどの単糖;スクロース、ラクトース及びマルトースなどの二糖;ラフィノースなどの三糖;及びスタキオースなどの四糖が想定される。トレハロース、ウンベリフェロース、ベルバスコース、イソマルトース、セロビオース、マルツロース、ツラノース、メレジトース及びメリビオースも、本発明における使用に適切である。適切な糖アルコールはマンニトールである。
【０１５８】
ウイルス活性の保存は、2種以上の糖が用いられる場合に特に有効である。2種、3種又は4種の糖が用いられてもよい。好ましくは、二糖のスクロース、及びラフィノースが用いられる。スクロースは、グルコース及びフルクトースの二糖である。ラフィノースは、ガラクトース、フルクトース及びグルコースから構成される三糖である。
【０１５９】
水性溶媒
水性溶媒は、一般に水である。注射用の水などの純水が一般に用いられる。代替として、生理学的食塩水を用いてもよい。
【０１６０】
他の成分
水性溶液は、緩衝化させ得る。リン酸緩衝剤などの任意の適切な生理学的に許容される緩衝剤を用いることができる。典型的には、pHは、4から9、好ましくは5から8、特には約6.5から7.5に調整される。正確なpHは、例えば、ウイルス粒子の水溶液中の安定性に依存する。
【０１６１】
安定性のために、本発明の溶液は、微生物の汚染及び増殖から保護されるべきである。したがって、保存剤が、例えば、0.001から1重量%の量で存在し得る。処方物中で使用され得る薬学的に許容される抗菌剤の例としては、
-  第四級アンモニウム化合物(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セトリミド及び塩化セチルピリジニウム);
-  水銀剤(例えば、硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀及びチメロサール);
-  アルコール剤(例えば、クロロブタノール、フェニルエチルアルコール及びベンジルアルコール);
-  抗菌エステル(例えば、パラ-ヒドロキシ安息香酸のエステル);
-  キレート剤(例えば、エデン酸二ナトリウム(EDTA));及び
-  他の抗菌剤、例えば、クロルヘキシジン、クロロクレゾール、ソルビン酸及びこれらの塩並びにポリミキシン
が挙げられる。
【０１６２】
毒性調整剤の存在は、患者への投与で刺激性のレベルの低下をもたらす、体液との等張性を得るために望ましいときがある。適切な等張性調整剤の例は、塩化ナトリウム、デクストロース及び塩化カルシウムである。等張性調整剤は、望ましくはこの機能を得るために十分な量で添加される。好ましくは、等張性調整剤は、0.1から10重量%の量で存在する。
【０１６３】
共可溶化剤及びアジュバントなどの他の添加物も、存在していてもよい。アジュバントは一般に、本発明の溶液がワクチンとして使用される場合に存在する。アジュバントは、ワクチンの効力を増加させ、並びに/又は液性応答及び細胞免疫応答を調節するために用いられる。
【０１６４】
適切なアジュバントとしては、限定されるものではないが、鉱塩(例えば、水酸化アルミニウム(「ミョウバン」)、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム)、粒子状アジュバント(例えば、ビロソーム、ISCOMS(サポニン及び脂質の構造化複合体))、微生物誘導体(例えば、MPL(モノホスホリル脂質A)、CpGモチーフ、フラジェリンなどのTLRアジュバントを含む修飾毒素)、植物誘導体(例えば、サポニン(QS-21))及び内因性免疫刺激性アジュバント(例えば、サイトカイン、及びワクチンの有効性を増強するための免疫刺激剤として作用する任意の他の物質)が挙げられる。
【０１６５】
本発明の溶液の作製
本発明の溶液は、ウイルス粒子又はポリペプチドと他の成分とを、選択された水性溶媒中、任意の慣習的な順序で混合することによって調製され得る。ウイルス粒子又はポリペプチドは、必要な量、例えば、単位投与量で提供される。したがって、薬学的有効量のウイルス粒子又はポリペプチドが、溶液中で提供され得る。
【０１６６】
一般に、ウイルス粒子又はポリペプチドの調製物は、添加剤(複数可)及び場合によって1種又は複数種の糖の水溶液と混合される。溶液の成分は、滅菌条件下で混合され得る。代替として、溶液の成分は、最初に混合され、得られた溶液が滅菌され得る。例えば、添加剤(複数可)及び/又は場合による糖は、ウイルス粒子又はポリペプチドの製造の間に添加してもよく、その結果、ウイルス粒子又はポリペプチドは、最終生成物においてと同様に製造の間に安定化される。しかし、一部の場合に、最終生成物の処方前に、精製工程において添加剤(複数可)及び/又は場合による糖を除去することが望ましいことがあり得る。
【０１６７】
ウイルス粒子又はポリペプチドが一緒に混合される溶液は、緩衝化されてもよいか、又は溶液は、ウイルス粒子と混合後に緩衝化されてもよい。それは、HEPES溶液、リン酸緩衝溶液、トリス-緩衝溶液又は純水溶液であってもよい。pHは、必要に応じて調整され得る。典型的には、溶液は、4から9、好ましくは5から8、特には約6.5から7.5のpHを有する。
【０１６８】
添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖は、必要な貯蔵安定性の溶液を与える濃度で存在する。添加剤は、本明細書で定義されるとおりの本発明の添加剤であってもよい。適切な濃度は、通常の実験によって決定及び最適化され得る。特定の場合に用いられる濃度は、
-  特定のウイルス粒子又はポリペプチド;
-  用いられる添加剤;
- 1種又は複数種の糖が存在するかどうか、及びそうであれば、その糖又はそれぞれの糖の同定
を含むいくつかの要因に依存する。
【０１６９】
添加剤及び糖(複数可)は、添加剤と糖(複数可)との間の相乗作用をもたらす量で存在し得る。例えば、相乗作用は、(a)MSMなどのスルホン類とラフィノースの間、及び(b)DMGなどのN,N-ジアルキルグリシンとスクロースの間で生じ得る。適切な濃度は、通常の実験によって決定及び最適化され得る。
【０１７０】
しかし、一般論として、PEIの濃度は、Mnに基づいて、20μM以下、好ましくは15μM以下の範囲である。PEIの濃度は、Mwに基づいて、10μM以下であってもよい。PEIのこのような濃度は、生物活性を保存するのに特に有効である。
【０１７１】
本発明の好ましい実施形態において、PEIは、Mnに基づいて、5μM未満、500nM未満、400nM未満、300nM未満、200nM未満、100nM未満、40nM未満、25nM未満、10nM未満、5nM未満、1nM未満、0.5nM未満、0.25nM未満、0.1nM未満、0.075nM未満、0.05nM未満、0.025nM未満又は0.0025nM未満の濃度で提供される。典型的には、Mnに基づくPEI濃度は、0.0025nM以上、0.025nM以上、又は0.1nM以上である。Mnに基づく適切なPEI濃度範囲は、0.0025nMから5μM、又は0.025から200nMである。さらに好ましい濃度範囲は、0.1nMから5μM、及び0.1nMから200nMである。
【０１７２】
好ましくは、Mwに基づくPEI濃度は、5μM未満、1μM未満、500nM未満、400nM未満、300nM未満、200nM未満、0.1μM未満、0.01μM未満、5nM未満、4nM未満、2nM未満、1nM未満、0.5nM未満、0.25nM未満、0.1nM未満、0.05nM未満、0.02nM未満、0.002nM未満又は0.1nM未満である。典型的には、Mwに基づくPEI濃度は、0.00001nM以上、0.001nM以上又は0.01nM以上である。Mwに基づく適切なPEI濃度範囲は、0.00001から20nM、0.0001から20nM又は0.0001から5nMである。
【０１７３】
一部の場合に、比較的高い分子量のPEIが、比較的低い分子量のPEIに比べてより低い濃度で有効であることが見出される。したがって:
-比較的高いMwの、例えば、20から1000kDaの範囲のPEIが用いられる場合、Mwに基づいて、0.001から500nM、又は0.001から400nM、又は0.001から300nM、又は0.001から200nM、又は0.001から100nM、又は0.001から50nM、又は0.001から5nMのPEIの濃度が好ましい。比較的低いMwの、例えば、300Daから10kDaの範囲のPEIが用いられる場合、0.0001から10μMのPEIの濃度が好ましい。
【０１７４】
-  比較的高いMnの、例えば、20から1000kDaの範囲のPEIが用いられる場合、Mnに基づくPEIの濃度は、好ましくは0.001から500nM、又は0.001から400nM、又は0.001から300nM、又は0.001から200nM、又は0.001から100nM、又は0.001から50nMである。比較的低い、例えば、1Daから10kDaの範囲のMnが用いられる場合、0.0001から10μMのPEIの濃度が用いられる。
【０１７５】
水溶液中の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、一般に0.001Mから2.5M、より特には0.01Mから2.5Mの範囲である。例えば、濃度範囲は、0.1Mから2.5Mであってもよい。用いられる式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの特定の濃度は、ウイルス粒子又はポリペプチド;用いられる式(I)の特定の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、或いは式(II)の特定の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル;1種、2種又はそれを超える糖が存在するかどうか及びその糖(複数可)の同定を含むいくつかの要因に依存する。したがって:
- Xが-S(O)2-を表す式(II)の化合物、若しくはMSMなどの式(IIA)の化合物、又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、好ましくは0.2mMから1M、例えば、0.3
5mMから1M、3.5mMから0.5M、0.035Mから0.5M又は0.035Mから0.25Mである。
【０１７６】
-  式(I)の化合物、又は式(IA)若しくは式(IB)の化合物、例えば、TMG、或いはこの生理学的に許容される塩又はエステルの濃度は、好ましくは0.01Mから2M、例えば、0.07Mから2M、0.2Mから1.5M、0.23Mから1.5M又は0.07Mから0.7Mである。
【０１７７】
- Xが-S+(Rc)-を表す式(II)の化合物若しくは式(IIB)の化合物、例えば、S-メチル-L-メチオニン、又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、好ましくは0.005Mから2M、例えば、0.007Mから2M、0.02Mから2M、0.023Mから1.5M又は0.07Mから1Mである。
【０１７８】
水溶液中のN-アルキルグリシン、N,N-ジアルキルグリシン若しくはN,N,N-トリアルキルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、一般に0.1mMから3M又は1mMから2Mの範囲である。濃度は、1mMから1.5M又は5mMから1Mであってもよい。好ましい濃度は、7mMから1.5M又は0.07Mから0.7Mである。用いられるN-アルキルグリシン、N,N-ジアルキルグリシン若しくはN,N,N-トリアルキルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの特定の濃度は、ウイルス粒子又はポリペプチド;1種又は複数種の糖が用いられるかどうか、もしそうであれば、用いられる糖(複数可)の特定のタイプ、を含むいくつかの要因に依存する。したがって:
-  糖が存在しない場合のN-アルキルグリシン、N,N-ジアルキルグリシン若しくはN,N,N-トリアルキルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの好ましい濃度は、5mMから1.5M又は7mMから1M若しくは0.7Mである。より好ましい濃度は、0.023Mから0.7M、又は0.07Mから0.7M、例えば、約0.07Mである。
【０１７９】
- 1種又は複数種の糖が存在する場合のN-アルキルグリシン、N,N-ジアルキルグリシン若しくはN,N,N-トリアルキルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの好ましい濃度は、一般により低く、1mMから1M又は5mMから1Mの範囲である。より好ましい濃度は、0.007Mから0.7M、例えば、約0.007Mである。
【０１８０】
溶液が、N-アルキル化グリシン誘導体又はこの塩若しくはエステル、式(IIC)のスルホン化合物、及び場合によって1種又は複数種の糖を含有する場合、これらの成分は、必要な貯蔵安定性の溶液を与える濃度で存在する。適切な濃度は、通常の実験によって決定及び最適化され得る。したがって、N-アルキル化グリシン誘導体又はこの塩若しくはエステル及び式(IIC)のスルホン化合物は、相乗性をもたらす量で存在し得る。特定の場合に用いられる濃度は、
-  安定化されるべき特定のウイルス粒子;
-  用いられている添加剤;
- 1種又は複数種の糖が存在するかどうか、もし存在する場合は、その糖又はそれぞれの糖の同定
を含むいくつかの要因に依存する。
【０１８１】
特に:
-  乾燥のための水溶液中のN-アルキル化グリシン誘導体又はこの塩若しくはエステルの濃度は、一般に0.1mMから3M又は1mMから2Mの範囲である。濃度は、1mMから1.5M又は5mMから1Mであってもよい。好ましい濃度は、7mMから1.5M、0.07Mから0.7M、0.1Mから1.5M又は0.5Mから1.25Mである、及び/又は
-  乾燥のための水溶液中の式(IIC)のスルホン化合物の濃度は、一般に0.1mMから3M、1mMから2M又は0.2mMから1M、例えば、0.35mMから1M、3.5mMから0.5M、0.035Mから0.5M又は0.035Mから0.25Mの範囲である。濃度は、0.1Mから1.5M又は0.5Mから1.25Mであってもよい。
【０１８２】
本発明の溶液中に存在する場合、糖の濃度又は糖の全濃度は、少なくとも0.01M、典型的には最大で飽和までである。一般に、糖濃度は、少なくとも0.1M、少なくとも0.2M又は少なくとも0.5M、最大で飽和、例えば、室温での飽和まで又は最大で3M、2.5M若しくは2Mである。したがって、糖濃度は、例えば、0.1Mから3M又は0.2Mから2Mの範囲であり得る。代替として、したがって、糖濃度又は2種以上の糖が存在する場合に全糖濃度は、0.08Mから3M、0.15Mから2M又は0.2Mから1Mの範囲であり得る。適切な範囲は、0.05から1Mである。
【０１８３】
2種以上の糖が本発明の溶液中に存在する場合、好ましくはそれらの糖の1種はスクロースである。スクロースは、0.05M、0.1M、0.25M又は0.5M、最大で飽和、例えば、室温での飽和まで、又は最大で3M、2.5M若しくは2Mまでの濃度で存在し得る。
【０１８４】
スクロースのモル濃度と他の糖(複数可)のモル濃度との比は、典型的には1:1から20:1、例えば、5:1から15:1である。したがって、2種の糖が存在し、且つ特に、スクロースとラフィノースとが存在する場合に、スクロースのモル濃度の比は、典型的には1:1から20:1、例えば、5:1から15:1、好ましくは約10:1である。
【０１８５】
特に好ましい溶液は、以下の成分を含有する:
- 0.8Mから1.2M、例えば、約1Mの濃度でのスクロース;0.8から1.2M、例えば、約1Mの濃度でのTMG;及び/又は200から400mM、例えば、約300mMの濃度でのラフィノース。典型的には、このような溶液はMVAを含む。
【０１８６】
- 0.25から1.5Mの濃度でのスクロース及び/又は0.1から1000nMの濃度でのPEI。典型的には、このような溶液は、アデノウイルスを含む。
【０１８７】
- 0.25から1.5M、例えば、約0.85Mの濃度でのスクロース;0.1から1000nM、例えば、約0.55nMの濃度でのPEI;及び/又は最大で500mM、例えば、約250mMの濃度でのラフィノース。典型的には、このような溶液は、アデノウイルスを含む。
【０１８８】
- 0.8Mから1.2M、例えば、約1Mの濃度でのスクロース;及び/又は0.75から1.15M、例えば、約0.95Mの濃度でのMSM。これらの濃度で、MSMとスクロースとの相乗作用が生じ得る。典型的には、このような溶液は、アデノウイルスを含む。
【０１８９】
- 0.3Mから0.7M、例えば、約0.5Mの濃度でのスクロース;0.2から0.6M、例えば、約0.4Mの濃度でのDMG;及び/又は200から400mM、例えば、約275mMの濃度でのラフィノース。これらの濃度で、DMGとラフィノースとの相乗作用が生じ得る。典型的には、このような溶液は、アデノウイルスを含む。
【０１９０】
本発明の溶液のpHは、必要に応じて調整され得る。典型的には、溶液は、4から9、好ましくは5から8のpH、特には約pH6.5から7.5を有する。
【０１９１】
本発明の溶液は、発熱物質を含まない。したがって、溶液は滅菌される。溶液は、それを滅菌フィルターに通すことによって滅菌され得る。次いで、滅菌された溶液は、容器、例えば、バイアルに導入することができ、次いで、これは、密封される。代替として、滅菌は、例えば、溶液が容器中に密封された後に、オートクレーブで処理することによって行われ得る。
【０１９２】
したがって、溶液は、密封されたバイアル、アンプル、注射器、カートリッジ、フレキシブルバッグ又はガラス瓶中に提供され得る。小容量の非経口投与剤(SVP)として、それは、使い捨てカートリッジ、使い捨て注射器、バイアル、アンプル又はフレキシブルバッグで提供され得る。大容量の非経口投与剤(LVP)として、それは、バイアル、フレキシブルバッグ、ガラス瓶で、又は一部の場合に、使い捨て注射器として提供され得る。
【０１９３】
好ましくは、容器は、非反応性栓を有するバイアルである。栓は、Teflon(商標)でコーティングされていても又は表面仕上げされていてもよい。シリコーンゴム栓又は他の非反応性栓が企図される。
【０１９４】
カートリッジ、注射器、バイアル及びアンプルは、通常はI型若しくはII型ガラス、又はポリプロピレンで構成される。フレキシブルバッグは、典型的には多層プラスチックで構造化されている。カートリッジ、注射器、及びバイアルの栓及び隔膜は、典型的にはエラストマー材料で構成される。フレキシブルバッグのための投入(投薬)ポート及び排出(投与)ポートは、プラスチック及び/又はエラストマー材料であってもよい。溶媒損失を遅延させるために及びフレキシブル包装系を粗雑な取扱いから保護するために、フレキシブルバッグとともにオーバーラップが使用され得る。
【０１９５】
本発明の溶液は、溶液中のウイルス粒子又はポリペプチドに依存して、必要に応じて使用され得る。溶液は、密封容器から、例えば、注射器によって引き抜くことができるか、又は適切な経路で患者に注射することができる。したがって、溶液は、皮下、筋内、静脈内又は腹腔内注射によって投与され得る。溶液は、代替として、輸液で投与され得る。溶液は、投与前に希釈され得る。
【０１９６】
製造の間のウイルス粒子又はポリペプチドの保存
一部の状況では、ウイルス粒子又はポリペプチドが、製造プロセスの間に保存又は安定化されるために、ウイルス粒子又はポリペプチドの溶液の製造の間に本発明の添加剤を使用することが望ましくあり得る。これは、プロセスの収量を増加させ得る。
【０１９７】
典型的には、本発明の添加剤は、ウイルス粒子又はポリペプチドの溶液中で、及びそれにより、最終製品中で保持される。これは、本発明の添加剤が、最終製品中でウイルス粒子又はポリペプチドを継続して安定化するので、有利であり得る。
【０１９８】
代替として、精製工程で本発明の添加剤を除去することが好ましい一部の状況があり得る。このような除去は、当業者に公知の任意の適切な精製技術、例えば、クロマトグラフィーによって行うことができる。的確な精製法は、用いられる添加剤に依存し、適切な技術は、当業者によって容易に選択され得る。
【０１９９】
添加剤が除去されると、ウイルス粒子又はポリペプチドの溶液は、典型的にはバイアル、アンプル、注射器、カートリッジ、フレキシブルバッグ又はガラス瓶などの容器に密封される。
【０２００】
好ましくは、溶液は、例えば、溶液を容器に導入する前に、溶液を滅菌フィルターに通すことによって滅菌される。代替として、最終製品が滅菌であるように、滅菌条件下で製造プロセス及び精製を行うことが好ましくあり得る。
【０２０１】
本発明の添加剤の濃度は、好ましくは上記の「本発明の溶液の作製」の下で上記に示されたとおりである。存在する場合、糖(複数可)の濃度も、上記の「本発明の溶液の作製」の下で示されたとおりである。
【０２０２】
ヒト又は動物から採取した試料の保存
ヒト又は動物から採取した試料は、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖によって保存され得る。試料がヒト又は動物から採取される場合、その試料を、それをアッセイ又は試験することができる別の場所に移すことがしばしば必要である。試料の分解は一般に、試料が冷凍又は冷蔵される場合でさえも、輸送の間に起こる。これは、試料に対するアッセイ及び試験において負の又は不良の結果をもたらし得る。
【０２０３】
ヒト又は動物から採取された試料の溶液中、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の存在は、一般に試料を保存する。
【０２０４】
本発明は、典型的にはヒト又は動物から得られた試料についてインビトロで行われる。試料は、典型的にはヒト又は動物の体液を含む。試料は、好ましくは血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液又は滑液の試料である。試料は、最も好ましくは血液試料である。ヒトから採取された試料、例えば、ヒト血液試料が好ましい。試料は、綿棒で運ばれてもよい。
【０２０５】
ヒト又は動物から採取された試料は、感染性又は非感染性であり得る。ウイルス粒子は、添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖によって保存されるので、ウイルス粒子を含む感染性試料を保存することが特に好ましい。
【０２０６】
ヒト又は動物から採取された試料、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖は、任意の都合のよい順序で水溶液に添加することができる。例えば、
-  試料を、添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖の溶液に添加することができる;又は
-  試料、添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖を、水溶液に同時に添加することができる;又は
-  添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖を、試料の水溶液に添加することができる。
【０２０７】
本発明の添加剤の濃度は、好ましくは上記の「本発明の溶液の作製」の下で上に示されるとおりである。存在する場合、糖(複数可)の濃度も、好ましくは上記「本発明の溶液の作製」の下で示されるとおりである。
【０２０８】
ヒト又は動物から採取された試料、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖を含む水溶液は、典型的には冷蔵庫内又は冷凍庫内に貯蔵される。冷蔵庫の温度は、典型的には2から8℃、好ましくは4から6℃、又は例えば、約4℃である。冷凍庫の温度は、典型的には、-10から-80℃、好ましくは-10から-30℃、例えば、約-20℃である。
【０２０９】
ヒト又は動物から採取された試料、本発明の添加剤及び場合によって1種又は複数種の糖を含む水溶液は、典型的には密封容器、例えば、バイアル、アンプル、注射器、カートリッジ、フレキシブルバッグ又はガラス瓶中に貯蔵される。
【０２１０】
保存された試料が、それが試験又はアッセイされる場所に到達すると、試料は一般に、添加剤、又は存在する場合、糖を前もって除去せず試験又はアッセイされ得る。
【０２１１】
ウイルス粒子の保存性の測定
ウイルス粒子に関する保存性は、物理的若しくは化学的分解及び/又は生物活性の損失に対するウイルス粒子の耐性を指す。
【０２１２】
感染性及び/又は免疫原性などのウイルス活性をアッセイする方法は、当業者に周知であり、限定されるものではないが、細胞培養中のウイルスの増殖、血液中のウイルス特異的抗体の検出、T細胞及び/若しくはB細胞応答を誘発する能力、ウイルス抗原の検出、ウイルスがコードされたDNA若しくはRNAの検出、又は顕微鏡を用いたウイルス粒子の観察を含む。
【０２１３】
さらに、ウイルスの存在は、宿主細胞の形態学的変化を生じさせ、これを測定して、ウイルス活性の指標を与えることができる。検出可能な変化、例えば、ウイルス感染による宿主細胞における変化は、細胞変性効果として公知である。細胞変性効果は、細胞の円形化、方向性喪失(disorientation)、膨張又は収縮、死滅及び表面からの剥離からなり得る。多くのウイルスは、TUNEL(ターミナルウリジンデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識)(Terminal uridine deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling)アッセイなどの技術及び当業者に周知の他の技術によって測定可能な、感染細胞におけるアポトーシス(プログラム細胞死)を誘導する。
【０２１４】
ウイルスは、宿主細胞遺伝子の発現の制御に影響を与えることもでき、これらの遺伝子は、分析して、ウイルス活性が存在するか否かの指標を与えることができる。このような技術は、ウイルス発現産物との酵素反応又は化学反応を完了させるための、細胞培養への試薬の添加を含み得る。さらに、ウイルスゲノムは、ウイルス感染性の検出を高めるために修飾され得る。例えば、ウイルスゲノムは、位相差顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査又は放射線イメージングによって容易に検出され得るマーカーを発現させるために、ウイルスゲノムは遺伝的に修飾され得る。マーカーは、GFP(緑色蛍光タンパク質)などの発現された蛍光タンパク質又は比色反応又は放射性標識化反応に関与し得る発現された酵素であってもよい。マーカーはまた、試験される細胞の特定の機能を妨げる又は阻害する遺伝子産物であり得る。
【０２１５】
プラーク形成単位のアッセイを用いて、ウイルス感染性を測定し、ウイルス力価を示すことができる。このアッセイでは、適切な宿主細胞は、それらがプラスチック製瓶又は皿を覆う細胞の単層を形成するまで、平らな表面で増殖させる。特定の宿主細胞の選択は、ウイルスの型に依存する。適切な宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、CHO、BHK、MDCK、10T1/2、WEHI細胞、COS、BSC1、BSC40、BMT10、VERO、W138、MRC5、A549、HT1080、293、B-50、3T3、NIH3T3、HepG2、Saos-2、Huh7、HEK293及びHeLa細胞が挙げられる。次いで、宿主細胞の単層を、ウイルス粒子に感染させる。感染の結果として、産生された任意のウイルス粒子が、それらの産生部位から遠くに移動することができないように、液体培地は、半固体培地と置き換えられる。ウイルス粒子が細胞に感染し、複製し、次いで、その細胞を死滅させるときに、プラークは形成される。プラークは、例えば、顕微鏡下で他の細胞より丸く、より濃く見える、又は目により視覚化される場合に白色の点として見える細胞変性効果を示す、単層内の細胞の領域を指す;プラーク中心は、ウイルスに誘導される溶解のために細胞を欠くことがあり得る。新たに複製したウイルスは、周囲の細胞に感染し、それらも死滅させる。この過程は、数回繰り返され得る。次いで、細胞は、生細胞だけを染色するメチレンブルーなどの色素で染色される。プラーク内の死細胞は、染まらず、着色背景上で非染色領域として見える。
【０２１６】
各プラークは、1個のウイルスによる1個の細胞の感染性、続いて、そのウイルスの複製及び蔓延の結果である。しかし、細胞を死滅させないウイルスは、プラークを形成し得ない。プラークは、例えば、顕微鏡下で他の細胞より丸く、より濃く見える、又は目により視覚化される場合に白色の点として見える細胞変性効果を示す、単層内の細胞の領域を指す;プラーク中心は、ウイルスに誘導される溶解のために細胞を欠くことがあり得る。ウイルス力価の指標は、「プラーク形成単位」(PFU)を測定することによって与えられる。ウイルス感染性のレベルは、本発明によって保存される生物材料の試料で測定して、本発明の保存混合物を添加することなく乾燥及び/又は熱変化に供した新たに収穫されたウイルス又は試料などの対照試料と比較し得る。
【０２１７】
本発明のウイルス粒子の一部の型、例えば、ウイルスタンパク質、VLP、又は一部の不活化ウイルスは、プラークアッセイでプラークを形成する能力をもたない。この場合、保存性は、当業者に周知である免疫原性を決定する方法などの他の方法によって測定され得る。例えば、抗体又は細胞媒介性宿主免疫応答を測定するインビボ及びインビトロでのアッセイが、当技術分野で公知であり、本発明における使用に適切である。例えば、抗体に基づく免疫応答は、本発明の保存ウイルス粒子を用いた免疫の前後に、動物モデルにおける血清抗体の量、アビディティ及びアイソタイプ分布を比較することによって測定され得る。
【０２１８】
本発明の保存ウイルス粒子の用途
本発明の溶液は、必要に応じて使用され得る。溶液は、密封容器から、例えば、注射器によって引き抜き、適切な経路で患者に注射され得る。したがって、溶液は、皮下、筋内、静脈内又は腹腔内注射によって投与され得る。溶液は、代替として、輸液で投与され得る。溶液は、投与前に希釈され得る。
【０２１９】
ワクチン
本発明の溶液は、ワクチンとして使用し得る。例えば、死滅全ウイルス、弱毒化生ウイルス、化学的不活化ウイルス、VLP又は生ウイルスベクターを含有する溶液は、ワクチンとしての使用に適する。ワクチンとして、ウイルス粒子は、ウイルス感染、ウイルス誘発の毒性を含むがこれに限定されないウイルス感染の続発症、癌及びアレルギーを含むがこれらに限定されない多くの状態の治療又は予防のために、抗原として又はウイルスタンパク質などの抗原をコードするために使用され得る。このような抗原は、宿主の免疫系を刺激して、体液性及び/又は細胞性抗原特異的応答を生じる一つ又は複数のエピトープを含む。
【０２２０】
本発明のワクチンは、ウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)、HIV、HSV2/H
SV1、インフルエンザウイルス(A型、B型及びC型)、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、RSVウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、A型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトT細胞リンパ腫I型ウイルス(HTLV-I)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス、ポックスウイルス及びワクチニアウイルスによる感染を予防又は治療するために使用され得る。ワクチンはさらに、多数の獣医学的疾患、例えば、口蹄疫(血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3及びAsia-1を含む)、コロナウイルス、ブルータングウイルス、ネコ白血病ウイルス、トリインフルエンザ、ヘンドラ及びニパーウイルス、ペスチウイルス、イヌパルボウイルス及びウシウイルス性下痢ウイルスに対する適切な免疫応答を与えるために使用され得る。一つの実施形態において、ワクチンは、サブユニット、結合型又は多価ワクチンである。例えば、本発明のワクチンは、2種以上の異なる型のウイルス、例えば、麻疹、耳下腺炎及び風疹ウイルスによる感染を治療するために使用され得る(例えば、MMRワクチン)。
【０２２１】
本発明によって調製したワクチン安定の保存性を測定するために、当業者に周知の技術を用いてワクチンの効力は測定され得る。例えば、細胞性又は体液性免疫応答の生成は、ワクチンに対する抗体又は免疫細胞応答の生成をモニターすることにより適当な動物モデルで試験され得る。免疫応答を誘発するワクチン試料の能力は、同じ保存技術に供さなかったワクチンと比較され得る。
【０２２２】
ウイルスベクター
ウイルス又はウイルスベクターは、標的細胞に異種遺伝子又は他の核酸配列を移入するために本発明によって使用され得る。適切には、異種配列(すなわち、導入遺伝子)は、標的細胞で発現され得るタンパク質又は遺伝子産物をコードする。適切な導入遺伝子は、望ましいレポーター遺伝子、治療用遺伝子及び免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子(ワクチンとして使用するために)を含む。遺伝子発現不全に関連する疾患の治療又は予防のための手法である遺伝子治療は、細胞内への治療用遺伝子の挿入、続いて必要なタンパク質の発現及び産生を含む。この手法により、損傷遺伝子の置換え又は望ましくない遺伝子の発現の阻止が可能になる。特に、ウイルス又はウイルスベクターは、治療用導入遺伝子又は免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を患者に移入するために、遺伝子治療に使用され得る。
【０２２３】
好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、生ウイルスベクターである。「生ウイルスベクター」によって、標的種に対して非病原性又は低病原性であり、且つ他のウイルス又は微生物に対して保護的な免疫応答を刺激する抗原をコードする1種又は複数種の遺伝子、レポーター遺伝子又は治療用タンパク質が挿入されている生ウイルスベクターが意味される。特に、ウイルスベクターが依然として複製することができ、それにより、挿入核酸配列によってコードされたポリペプチドを発現し、及びワクチンの場合には、感染宿主動物における免疫応答を誘発するように、核酸は、ウイルスベクター中に導入される。一つの実施形態において、生ウイルスベクターは、弱毒化生ウイルスベクターであり、すなわち、野性型ウイルスよりもビルレントでない(疾患を引き起こさない)ように改変されている。
【０２２４】
組換えウイルスを潜在性ワクチンとして使用する基盤には、病原性生物からの特定の遺伝子の、非病原性又は弱毒化ウイルスのゲノム中への組込みが含まれる。次いで、組換えウイルスは、インビボ又はインビトロでのいずれかで特定の真核細胞に感染して、それらに組換えタンパク質を発現させ得る。
【０２２５】
疾患生物由来の配列をコードする遺伝子の挿入によって誘導される生ウイルスベクターワクチンは、弱毒化生ウイルス、不活化ワクチン、サブユニット又はDNA手法に比べて好ましくあり得る。生ウイルスベクターの最も重要な安全性特徴の一つは、受容者が、病因物質それ自体に曝露されることなく病原性生物からの特定の抗原に対して免疫され得ることである。安全性は、宿主に対して弱毒化されるか、又は対象の異種抗原をまだ発現することができるが宿主内で複製することができないウイルスベクターを選択することによってさらに調節される。標的種における安全性の履歴を有するワクチン株は、さらなる安全性特徴を与える。ベクターが必須遺伝子を欠失しているいくつかの系が開発されており、ワクチンの調製は、欠けている機能を与える細胞系で行われる。
【０２２６】
様々なベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスベクターが、標的細胞への異種遺伝子の送達のために使用され得る。対象の異種遺伝子は、ウイルスベクターに挿入され得る。本発明のウイルスベクターは、例えば、複製起点、場合によって異種遺伝子の発現のためのプロモーター、及び場合によってプロモーターの調節因子を備えたウイルスベクターを含み得る。例えば、本発明の実施に有用なアデノウイルスは、E1及び/若しくはE3及び/若しくはE4領域に欠失を有し得るか、又はそうでなければ異種DNAを受け入れるために最大化され得る。
【０２２７】
ウイルスベクターは、対象の異種遺伝子に作動可能に連結された他のウイルス核酸配列と一緒に、構成的プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40ラージT抗原プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(MLP)、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、SV40初期プロモーター、アデノウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、HSVプロモーター(HSV IEプロモーターなど)、HPVプロモーター、例えば、HPV上流調節領域(URR)又はラウス肉腫ウイルスプロモーターを含み得る。組織特異的又は誘導的プロモーターも、対象の異種遺伝子の発現を調節するために使用され得る。プロモーターはまた、発現が設計される宿主細胞と適合性であるように選択され得る。
【０２２８】
ウイルスベクターはまた、エンハンサーなどの他の転写調節エレメントを含み得る。エンハンサーは、プロモーター/遺伝子配列に作動可能に連結される場合、その遺伝子配列の転写を増加させる、シス作用因子として広義に定義される。エンハンサーは、他の発現調節エレメント(例えば、プロモーター)よりも対象の配列からさらに非常に離れた位置から機能することができ、対象の配列に対していずれの方向で位置する場合も作動し得る。
【０２２９】
エンハンサーは、ポリオーマウイルス、BKウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、アデノウイルス、シミアンウイルス40(SV40)、モロニー肉腫ウイルス、ウシパピローマウイルス及びラウス肉腫ウイルスを含む、多くのウイルス源から同定されてきた。適切なエンハンサーの例としては、SV40初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復(LTR)由来のエンハンサー/プロモーター、及びヒト又はマウスCMV由来のエレメント、例えば、CMVイントロンA配列に含まれるエレメントが挙げられる。
【０２３０】
次いで、対象の異種遺伝子を含むウイルスベクターは、貯蔵、凍結乾燥などのさらなる保存技術に供すること、又は患者若しくは宿主細胞への投与の前に、本発明の方法によって保存され得る。
【０２３１】
抗ウイルス活性を示すことが公知であるポリペプチドをコードする核酸、免疫調節分子、例えば、サイトカイン(例えば、TNF-アルファ、IL-6及びIL-2などのインターロイキン、インターフェロン、GM-CSFなどのコロニー刺激因子)、アジュバント並びに共刺激分子及び補助分子は、本発明のウイルスベクターに含め得る。代替として、このようなポリペプチドは、例えば、本発明の保存混合物中で、別個に提供され得るか、又は本発明のウイルスベクターと同時に、連続的に又は別個に投与され得る。
【０２３２】
好ましくは、本発明の保存されたウイルスベクターは、当業者に公知である様々なウイルス技術、例えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びアデノウイルスなどの組換えウイルスベクターによる感染を用いて、適切な宿主細胞に導入され得る。好ましくは、対象の遺伝子を含む本発明の保存されたウイルスベクターの投与は、標的細胞のウイルス感染によって媒介される。
【０２３３】
多数のウイルスに基づく系が、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために開発された。
【０２３４】
例えば、選択された組換え核酸分子は、当技術分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子としてパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスは、単離され、インビボ又はエクスビボのいずれかで被験者の細胞に送達され得る。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo-MLV)に基づき得る。レトロウイルスベクターでは、ウイルス遺伝子(gag、pol及びenv)の1種又は複数種は、一般に対象の遺伝子と置き換えられる。
【０２３５】
多くのアデノウイルスベクターが公知である。アデノウイルスサブグループC血清型2及び5が、ベクターとして一般に使用される。アデノウイルスは、ヒト又は非ヒトアデノウイルスであってもよい。野性型アデノウイルスゲノムは、約35kbであり、その30kbまでを外来性DNAで置き換えることができる。
【０２３６】
調節機能を有する四つの初期転写単位(E1、E2、E3及びE4)、及び構造タンパク質をコードする後期転写物がある。アデノウイルスベクターは、不活化されたE1及び/又はE3遺伝子を有し得る。次いで、ミッシング遺伝子(missing gene)(複数可)は、ヘルパーウイルス、プラスミドによってイントランスで供給され得るか、又はヘルパー細胞ゲノムに組み込まれ得る。アデノウイルスベクターは、E2a温度感受性突然変異体又はE4欠失を利用し得る。最小アデノウイスルベクターは、逆方向末端反復配列(ITR)及び導入遺伝子の周囲のパッケージング配列だけを含むことができ、必要なウイルス遺伝子のすべては、ヘルパーウイルスによってイントランスで提供される。したがって、適切なアデノウイルスベクターとしては、Ad4、Ad5、Ad7、Ad11、Ad14、Ad26、Ad35及びAd36ベクター並びにシミアンアデノウイルスベクター、好ましくはAd4、Ad5、Ad7、Ad35及びAd36ベクターが挙げられる。Ad5が、最も一般的に使用される。
【０２３７】
ウイルスベクターは、ワクチニアウイルス及びトリポックスウイルス、例えば、鶏痘ワクチンを含む、ウイルスのポックスファミリー由来であってもよい。例えば、改変ワクチニアウイルスAnkara(MVA)は、正常のヒト組織を含む、大部分の細胞型で複製しないワクチニアウイルスの株である。したがって、組換えMVAベクターは、本発明のポリペプチドを送達するために使用され得る。
【０２３８】
付加型のウイルス、例えば、アデノ関連ウイルス(AAV)及び単純ヘルペスウイルス(HSV)も、適切なベクター系を開発するために使用され得る。
【０２３９】
投与
本発明による溶液は、様々な公知の経路及び技術を用いてインビボで被験者に投与され得る。溶液は、非経口投与に適している。例えば、ワクチンは、注射剤、懸濁製剤又はエマルション製剤として提供され、従来の針及び注射器を用いて非経口的、皮下、経口、表皮、皮内、筋内、動脈内、腹腔内、静脈内注射によって、又は液体噴流注入システムを用いて投与され得る。ワクチンは、皮膚若しくは粘膜組織に局所的に、例えば、経鼻、髄腔内、腸内、舌下、経直腸若しくは経膣的に投与され、又は呼吸器若しくは肺投与に適した微粉化スプレーとして提供され得る。
【０２４０】
以下の実施例により、本発明が例証される。
【実施例】
【０２４１】
統計
実施例の一部において、以下の統計値を計算した:
R2=決定係数。あてはまりの良さの尺度。R2<0.5=低いモデル有意性。
【０２４２】
Q2=予測精度の推定。予測の良さの尺度。Q2は、有意なモデルについて>0.1でなければならない。Q2は、良いモデルについて>0.5でなければならない。R2-Q2<0.2〜0.3。
【０２４３】
モデル妥当性(MV)=「多様なモデル問題の検定」。モデル妥当性<0.25=統計的に有意なモデル問題の指標、例えば、外れ値、不正確なモデル/変換。
【０２４４】
再現性(Rep)=全体的変動と比較した、反復実験間の変動の尺度。再現性>0.5は、有意を意味する。
【０２４５】
以下の材料、装置及び技術を、特に断りのない限り、実施例1から実施例4で用いた。
【０２４６】
材料
HEK-293細胞(ECACC 85120602)
DMSO(Sigma D1435、ロット118K1455)
スクロース(Sigma 16104、ロット70040)
ラフィノース(Sigma R0250、ロット039K0016)
PBS(Sigma D8662、ロット118K2339)
水(Sigma W3500、ロット8M0411)
5ml  ガラスバイアル(Adelphi Tubes VCD005)
2ml  ガラスバイアル(Adelphi Tubes VCDIN2R)
14ml  凍結乾燥栓(Adelphi Tubes FDIA14WG/B)
14mmキャップ(Adelphi Tubes CWPP14)
アデノウイルスGFP(Vector Biolabs  カタログ1060)
グリシン(Sigma、G7126、118K00181)
N,N-DMG(Sigma D1156、ロット077K1856)
SMM(Sigma、64382、1339210)
TMG(Sigma、B2629、1089K1201)
装置
Modulyo D凍結乾燥機(Thermofisher)
HERA安全クラスIIキャビネット(Thermofisher)
Binder CO2インキュベータ(Binder)
Binder APT line TM MK熱サイクル試験チャンバー(Binder)
Thermo Scientific MaxQ 4450インキュベータ(Thermofisher)
KERN EW220-3NM天秤(VWR)
Elcold -45℃冷凍庫(VWR)
Forma 900シリーズ  -80℃冷凍庫(Thermofisher)
Synergy HTマイクロプレートリーダー(Biotek)
［実施例１］
試料調製
長い充填時間はバッチの変動を増加させ得るので、凍結乾燥前のバイアルの充填時間は、ウイルス回復及びワクチン効力に影響を与え得る。添加剤は、糖のみ又は糖とPEIとの組合せに関して、それらが凍結乾燥前の放置期間の間にウイルスを保護できるかどうか見るために試験した。試料は、2mlのガラス製バイアル中3連で調製した。最終糖濃度は、スクロース1M、ラフィノース100mMであった。最終PEI濃度は、1nMであった。試料の半分に、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するアデノウイルスを添加し、室温で4時間放置した。インキュベーション後、アデノウイルスを残りのバイアルに添加した。Modulyo D凍結乾燥機を用いて、凍結乾燥を3日間行い、ここで、凝縮器は-80℃に、真空は200ミリトールに設定した。凍結乾燥の終了後、バイアルに栓をした。
【０２４７】
アデノウイルス力価の決定
ウイルス力価は、GFPを発現するアデノウイルスに細胞を感染させることによって計算した。96平底培養皿(Jencons、英国)に、HEK293細胞(ECACC 85120602)を1ml当たり105個細胞(1ウェル当たり100μl)で播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%集密度(confluence)に達した後、添加剤を加えたアデノウイルスを含むバイアルを、5%ウシ胎仔血清(FBS)を加えたダルベッコ最小必須培地(DMEM)1mlで再構成した。次いで、再構成したバイアルから100μlを取り、900μlのDMEMに加えることによって、1:10希釈工程を行った。次いで、得られた希釈ウイルス100μlをプレート上の第1列に加え、プレートで1:2希釈を行った。この過程を次の添加剤で繰り返した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて1ウェル当たりGFP発現細胞の数を数えた。1ml当たりプラーク形成単位(PFU)を、希釈を乗じたGFP発現細胞の数から計算した。ウイルス調製物間の有意性は、Prism graphpadを用いて、一元配置分散分析(oneway ANOVA)、続いてテューキー事後検定(turkey post test)によって決定した。**=P<0.01。
【０２４８】
結果及び検討
この実施例における実験は、PEI及び糖が、凍結乾燥前に液体中でウイルス安定性を高めるかどうか調べた。アデノウイルス、糖及びPEIの混合物、又はアデノウイルス及び糖の混合物を凍結乾燥前に4時間インキュベートし、調製して直ちに凍結乾燥させた試料と比較した。これらの結果により、ウイルスのみの対照では、凍結乾燥前に4時間インキュベートした試料及び直ちに凍結乾燥した試料の両方においてアデノウイルスは完全な損失があることが実証された(図1)。糖のみの試料では、ウイルス力価はウイルスのみの対照におけるよりも高かったが、直ちに凍結乾燥した糖添加剤と比較して、4時間インキュベーション後のウイルス力価の有意な損失があった。糖PEI試料では、直ちに凍結乾燥した糖PEI濃縮物と比較して室温で4時間インキュベーション後のウイルスで有意な損失はなかった。これらの結果により、凍結乾燥前にウイルスの安定化において糖とPEIとの組合せを有する利点が実証される。
【０２４９】
［実施例２］
それぞれの添加剤250μl及びアデノウイルス50μlをそれぞれのバイアルに添加し、一連の最終濃度のPEIを得た(以下の表1参照)。ボルテックスした後、ガラスバイアルを37℃のインキュベータに1週間置いた。インキュベーション後、上に示したとおりのアデノウイルスGFPアッセイを用いてウイルス力価を決定した。
【表１】
0005869553.tif 000012
【０２５０】
結果及び検討
この実施例における実験は、37℃で1週間の熱負荷後の水溶液中のアデノウイルスの安定性を調べた。PBS対照は、力価の有意な損失を示したが、0.26μMのPEIを加えた糖は、熱負荷後にアデノウイルスの良好な保存を示した(図2参照)。PEI濃度の上限は、この濃度を超えてウイルス感染性がまったく見られなかったので、2.6μMであるように思われた。
【０２５１】
［実施例３］
試料調製
不活化インフルエンザH1N1 Solomon Islands(NIBSC)の参照バイアル1×57μgを滅菌蒸留水475μlで再構成して、120μg/mlの血球凝集素(HA)濃度を得た。次いで、この溶液を、水、PBS、及びスクロース/ラフィノース/ポリエチレンイミンを含む添加剤溶液中に1/6にさらに希釈し、PBS中1Mのスクロース/100mMのラフィノース/1.6μMのPEI及び20μg/mlのHAの最終濃度を生じさせた。PBS及び添加剤溶液の反復試料を-20℃、+4℃及び+45℃に置く一方、H2O試料は、+4℃の推奨貯蔵温度で維持した。試料のすべてをこれらの温度で5日間維持した。
【０２５２】
インキュベーション後、新たに水により再構成した標準参照バイアルとともに、試料すべてのアリコートをELISAでアッセイした(図3中黒塗りのバー)。残りの試料は、+4℃で冷蔵し、別に新たに再構成した標準参照試料とともに1カ月後に再アッセイした(図3中網掛けのバー)。
【０２５３】
ELISAプロトコル
試料を1/20に希釈して、PBS中1μg/mlのHA濃度を得た。50μl容量のそれぞれの溶液を用いて、ELISAプレート(Nunc maxisorb)の6連のウェルにコーティングし、次いで、37℃で1時間インキュベートし、その後PBS中で3回洗浄した。
【０２５４】
単一特異性ポリクローナルヒツジ抗H1Solomon Islands(NIBSC)を、PBS/0.1%Tween20/5%脱脂乾燥粉乳(PBSTM)を含むブロッキング緩衝液中1/200に希釈した。それぞれのアッセイウェルに50μl容量を添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄し、1ウェル当たり、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ポリクローナルウサギ抗ヒツジ免疫グロブリン(Abcam)のPBSTM中1/1000希釈液50μlを加えた。プレートを37℃でさらに1時間インキュベートし、その後、PBSで4回洗浄した。
【０２５５】
0.05Mのクエン酸/リン酸緩衝剤pH5.0中30%H2O2溶液(Sigma)及び0.4mg/mlのO-フェニレンジアミン(OPD)(Sigma)を含む基質/クロモーゲン溶液50μl/ウェルを添加することによって、アッセイを展開した。プレートを室温で10分間インキュベートした。1MのH2SO450μl/ウェルを添加することによって反応を停止させた。490nm干渉フィルターを備えたSynergy HTマイクロプレートリーダー(Biotek)でプレートを読み取った。
【０２５６】
結果及び検討
分析した、水、PBS又は添加剤混合物中可溶化したHAについて、+4℃及び-20℃の両方で5日間のインキュベーション期間後に実質的な損失が認められ、PBS中HAは、最大の低下を示す(図3参照)。
【０２５７】
添加剤組成物は、5日間のインキュベーション後に水組成物(これは、推奨貯蔵媒体である)に対して同様の結果を示すが、+4℃でさらなる数カ月のインキュベーション後に、添加剤組成物の評価は、水組成物のものより有意に良好であり、さらなる低下は、あったとして非常に少ない。さらに、+4℃で維持した添加剤組成物と-20℃で凍結解凍したものとの差は少ない。インフルエンザウイルスHAの凍結解凍は、凝集が起こることが知られているので、推奨されない(したがって、この実験では水組成物について含めなかった)。
【０２５８】
［実施例４］
ウイルス配合物
CMVプロモーター下で増強されたGFP(緑色蛍光タンパク質)を発現する組換えアデノウイルス(Vector Biolabs)を、アッセイの間の検出を容易にするために用いた。
【０２５９】
この試験では、4種のグリシン作動性化合物及び1種のテチンを、それぞれ、糖(1Mスクロース、100mMラフィノース)と一緒の共配合物中及びそれらの不在下の両方で、0.07〜0.70Mの最終濃度で(アデノウイルスの)保存剤としての効力について試験した。試験したグリシン作動性化合物は、グリシン、サルコシン(モノメチルグリシン)、DMG(ジメチルグリシン)、TMG(トリメチルグリシン)であった。試験したテチンは、SMM(S-メチルメチオニン)であった。ウイルスは、熱負荷の期間を通してウイルス活性を保存する際のそれらの効力を試験するために、添加剤混合物と一緒に配合した。ウイルスを加えたそれぞれの添加剤混合物(以下の表2参照)を、PBS中原液として作製し、300μlを適切に標識した5mlのガラスバイアルに添加した。
【表２】
0005869553.tif 000013
【０２６０】
熱負荷
それぞれの処理の3連を4℃で、さらなる3連を37℃で7日間置いた。この時点で、試料はすべて、それらを実際にアッセイするまで4℃で置いた。
【０２６１】
アデノウイルスアッセイ
アデノウイルスに許容的な細胞(HEK 293、ECACC 85120602)を、1ml当たり105細胞(1ウェル当たり100μl)で96ウェル平底細胞培養皿(VWR、英国)中に播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを冷蔵庫から取り出し、DMEM中連続希釈により10分の1及び100分の1希釈液を作製した。次いで、得られた希釈液(10分の1及び100分の1)のそれぞれ100μlを、HEK293細胞を含むプレートのウェルに添加した。さらに、同じ供給源由来で、添加剤処理で用いた同じ力価(-80℃で貯蔵後)を有する、アデノウイルスのさらなる試料を、解凍し、10分の1希釈シリーズ(DMEM中)を作製するために用いた。10分の1から106分の1の範囲の希釈液も、HEK293を含む個々のウェルに添加した。接種48時間後に、蛍光顕微鏡検査を用いて、1ウェル当たりGFP(緑色蛍光タンパク質)細胞の数を数え、その後に、これを、適用した容量及び接種材料の希釈を考慮に入れて、処理試料のpfu/mlに換算した。
【０２６２】
結果及び検討
4℃で1週間後の回復ウイルス活性(図4a及び図4b)(それぞれ、糖添加なし又は有りでグリシン作動性物質及びSMM)
4℃で1週間後、PBS単独中で配合したアデノウイルス試料は、回復ウイルス活性が、初期の力価の46%であった。しかし、糖(1Mスクロース、100mMラフィノース)と一緒の配合物は、69%まで回復を高めた。グリシン作動性物質又はSMMと一緒で、糖の非存在下でのアデノウイルスの配合物はすべて、52〜71%の回復をもたらした。これは、PBSを上回る有意な改善を示したが、最良のグリシン作動性物質又はSMMの配合物でさえも、糖のものと単に等しい回復をもたらすだけである(図4a参照)。グリシン作動性物質又はSMMが糖と一緒に配合された場合、回復ウイルス活性は、さらに高められなかった(50〜72%)。両方の場合(すなわち、糖の存在下又は非存在下でのグリシン作動性物質又はSMM)で、明らかな用量依存性はなく、すなわち、回復ウイルス活性と、グリシン作動性物質又はSMMの濃度との間の明らかな相関はなかった(図4b参照)。
【０２６３】
37℃で1週間後の回復ウイルス活性(図4c及び図4d)(それぞれ、糖添加なし又は有りでグリシン作動性物質及びSMM)
37℃で1週間後、PBS単独中で処方したアデノウイルス試料は、回復ウイルス活性が、初期の力価の25%であった。糖(1Mスクロース、100mMラフィノース)と一緒の配合物は、38%まで回復を高めた。
【０２６４】
試験濃度範囲の最も高い限度で及び唯一の添加剤としてのグリシン作動性物質の使用は、PBS単独を上回る効力改善をもたらし、それぞれの場合に、グリシン作動性物質濃度と回復ウイルス活性との間に強い正の相関が見られた。試験した濃度範囲(0.07から0.70M)にわたって、活性は、グリシンの場合で29%から45%、サルコシンで29%から49%、DMGで27%から41%、及びTMGで21%から45%に高められた。試験した濃度範囲中のそれぞれのグリシン作動性物質に関して、試験した最高濃度で最良の結果が得られ、唯一の配合剤として糖を用いる場合と同程度に又はそれを超える高いウイルス活性を回復させることが可能であった(図4c参照)。
【０２６５】
糖と一緒の全試験濃度範囲にわたって、以下のグリシン作動性物質である、グリシン、サルコシン、及びDMGの使用は、PBS単独を上回る効力改善をもたらした。サルコシン及びDMGの最低濃度を除いて、回復はまた、糖単独よりも優れていた。それぞれの場合に、グリシン作動性物質濃度と回復ウイルス活性との間に強い正の相関が見られた。試験した濃度範囲にわたって(0.07から0.70M)、活性は、グリシンの場合に41%から54%、サルコシンで37%から56%、及びDMGで37%から52%に高められた(図4d参照)。
【０２６６】
例外は、TMGを糖と共配合した場合に、ある種の拮抗作用が見られることであった。これは、TMG濃度と回復活性との間の負の相関をもたらした。活性は、TMG濃度によって、0.07Mで45%から0.70Mで38.7%に変化した。このデータにより、TMGと糖の正の相互作用が0.07Mでみられ、0.70Mで負の相互作用が見られるので、糖はTMGの最適濃度を変えることが示唆されるが、回復活性は、TMG単独で可能として見られたものを決して超えない(図4d参照)。結局、0.07Mから0.23M(それぞれ、回復活性は33%及び43%)の範囲で唯一の配合剤として用いられる場合、SMMは、アデノウイルス活性を保存する。
【０２６７】
［実施例５］
実施例5において、特に断りのない限り、以下の材料、装置及び技術を用いた:
材料
DMSO(Sigma D1435、ロット118K1455)
スクロース(Sigma 16104、ロット70040)
ラフィノース(Sigma R0250、ロット039K0016)
PBS(Sigma D8662、ロット118K2339)
水(Sigma W3500、ロット8M0411)
5ml  ガラスバイアル(Adelphi Tubes VCD005)
14mm  凍結乾燥用栓(Adelphi Tubes FDIA14WG/B)
14mm  キャップ(Adelphi Tubes CWPP14)
L929細胞(ECCAC 85011426)
抗ヒトTNF-α精製抗体(Invitrogen RHTNFAOO、ロット555790A及び477758B)
ヒトTNF-α(Sigma T6674)
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)(Sigma M5655  ロットMKBB4411)
アクチノミオシンD(Sigma A1410)
装置
HERA安全クラスIIキャビネット(Thermo Fisher)
Binder CO2インキュベータ(Binder)
Binder APT line TM MK熱サイクル試験チャンバー(Binder)
Thermo Scientific MaxQ 4450インキュベータ(Thermofisher)
KERN EW220-3NM天秤(VWR)
Elcold -45℃冷凍庫(VWR)
Forma 900シリーズ  -80℃冷凍庫(Thermofisher)
Synergy HTマイクロプレートリーダー(Biotek)
試料調製
2mlのガラスバイアル中3連に試料を調製した。最終糖濃度は、1Mスクロース、100mM
ラフィノースであった。中和抗体として、PBS1ml中ラット抗TNF-α抗体200μgを用いた(ロット555790A及び47758B)。原液を使用まで2〜8℃で貯蔵した。
【０２６８】
溶液を希釈して、一連の糖濃度を得た(以下の表3参照)。L929 TNF-α中和アッセイ(以下参照)を行う前に、ガラスバイアルを室温で10日間放置した。初期の抗体活性を示すために用いた新鮮な液体原液及び凍結解凍対照をアッセイに含めた。
【表３】
0005869553.tif 000014
【０２６９】
TNF-α中和の評価のためのL929アッセイ
L929細胞をHPA culturesから購入した(カタログ番号85011425)。RPMI培地において2%FBS(ウシ胎仔血清)中1ml当たり3.5×105細胞の密度で細胞懸濁液を調製した。100μlの細胞懸濁液を96ウェルプレート中それぞれのウェルに添加し、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。
【０２７０】
別個の96ウェルプレートにおいて、組換えTNF-αの中和を準備した。それぞれの試料からのヒト抗TNF-αを1:2に連続的に希釈した。組換えヒトTNF-αを添加し、得られた抗体/サイトカイン混合物を37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、1ウェル当たり50μlの抗体サイトカイン溶液を、L929細胞を含むプレートの対応するウェルに移した。0.25μg/mlのアクチノマイシンD50μlをそれぞれのウェルに添加した。
【０２７１】
プレートを加湿インキュベータ中37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。5mg/mlのMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール)溶液10μlをそれぞれのウェルに添加し、プレートを4時間インキュベートした。次いで、培地を捨て、100μlのDMSOをそれぞれのウェルに添加した。プレートを振とうテーブル上に5分間置いて、ホルマザンを溶媒中に完全に混合した。最後に、670nmでのバックグラウンドを引いて、560nmでSynergy HTプレートリーダーで光学密度を測定した。
【０２７２】
結果及び検討
スクロース及びラフィノースの濃度を最適化するために、抗TNF-α抗体を用いて液体安定性試験を構成した(図5)。TNF-α中和の最高レベルは、抗TNF-α抗体の新鮮な液体原液で見られた。冷凍対照も、中和の良好なレベルを示した。PBS中で貯蔵された抗体は、TNF-αの中和をまったく示さなかった。スクロース及びラフィノースの最適濃度は、0.5Mスクロース及び300mMラフィノースであるように見えた。
【０２７３】
［実施例６］
以下の実験材料及び装置を実施例6に用いた。
【０２７４】
材料
14mm (Adelphi Tubes CWPP14)
14mm凍結乾燥用栓(Adelphi Tubes FDIA14WG/B)
5mlガラスバイアル(Adelphi Tubes VCD005)
12×33mmの全回収バイアル(Waters、186000384C)
N,N-DMG(Sigma、D1156、ロット077K1856)
PBS(Sigma D8662、ロット118K2339)
ラフィノース(Sigma R0250、ロット039K0016)
無水リン酸水素二ナトリウム(Sigma、71640、ロット0001433297)
無水硫酸ナトリウム(Sigma、71960、ロット90500)
スクロース(Sigma 16104、ロット80650)
TSKゲルG3000 SWXL 7.8mmI.D. 30.0cmL(Waters、8541、シリアル番号3SWX04PNMP6228)
TSKゲルSWXL 6.0mmI.D. 4.0cmL(Waters、8543、シリアル番号SWXP1448)
水(Sigma W3500、ロット8M0411)
成体ヒツジ血清(Sigma S2263)
装置
Allianceシリーズ2998フォトダイオードアレイ検出器(Waters)
Allianceシリーズe2695分離モジュール(Waters)
Allianceシリーズカラムヒーター(Waters)
Binder CO2インキュベータ(Binder)
Cetiインバータ蛍光顕微鏡(VWR)
Empower2ソフトウェア(Waters)
Forma 900シリーズ  -80℃冷凍庫(Thermofisher)
HERA安全クラスIIキャビネット(Thermo Fisher)
KERN EW220-3NM天秤(VWR)
Thermo Scientific MaxQ 4450インキュベータ(Thermofisher)
IgG配合物
硫酸ナトリウム沈殿によって成体ヒツジ血清から精製したヒツジIgGを用いて、免疫グロブリンの液体貯蔵における添加剤として、糖、及びDMGの効力を調べた。ヒツジIgGを、46μg/μlの濃度(Bradfordアッセイで決定して)で使用前に、4℃で貯蔵した。IgGのアリコートをPBS中で希釈し、300μlの容量中4.6μg/μlの濃度に新規な添加剤を選定した。新規な添加剤成分を以下の表4に示すとおりに変化させた。それぞれの配合物の処理を12回繰り返した。
【表４】
0005869553.tif 000015
【０２７５】
熱負荷
それぞれの添加剤処理の3連を、それぞれの温度負荷(-80℃、+4℃、+37℃、+56℃)で0日目に置いた。実験の1日目、5日目及び31日目に、HPLCによる試験のために60μlのサブ試料を熱負荷から取り出した。
【０２７６】
HPLCに基づくアッセイ
60μlのサブ試料を分離ユニットにおいて最大回収バイアル中に入れ、4℃で保持した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(TSKゲルG3000SWXL)及び互換性ガードカラム(TSKゲルSWXL)を、分離ユニットに直列に(ガードを最初に)結合し、流量1.0ml/分の移動相(0.1Mリン酸ナトリウム、0.1M硫酸ナトリウム、pH6.8)に25℃で調整した。ベースラインが安定した後、移動相へそれぞれの試料を50μl注入した。それぞれの試料の実行時間は、20分であり、分離された分子の検出は、分解能2.4mmで280nmにて検出するPDA(フォトダイオードアレイ検出器)によった。
【０２７７】
ブロッキング
試料の1ブロック当たりそれぞれの添加剤処理の1連を処理し、それぞれのブロックをゲルろ過標準により一括して、データのロバスト性を確認した。
【０２７８】
結果の分析
Empower2ソフトウェアを用いて、5分から20分の保持時間によって有意なピークすべての下の面積を測定した。曲線下の全面積は、ボイドピーク(void peak)下の面積を含み、したがって、カラムを通ってまっすぐにながれ、サイズによって分けることができない分子も計算に含めた。
【０２７９】
IgGの純度は、同定されたピーク(モノマー、会合体及びボイド)下の全面積のパーセントとしてモノマーピーク下の面積を計算することによって測定した。
【０２８０】
次いで、それぞれの処理のIgG純度%を、同じ日及び温度設定のPBS試料の純度に対して換算した。
【０２８１】
1日目と5日目の間のIgG純度%のパーセント点の変化は、それぞれの添加剤処理について5日目の平均から1日目の平均を引くことによって計算した。
【０２８２】
結果及び検討
1日目-糖のみの処方(図6参照)
実験の1日目(24時間熱負荷)で、糖単独で配合した試料は、PBS単独で配合した(及び等しい温度で保持した)ものの95〜105%の平均純度%を有した。+4℃で冷蔵したそれらの糖のみの配合物は、PBS単独と有意には異ならず、この温度で、わずか1日後に糖単独での配合物に対して有意な利点は存在しないことを示唆する。実際、-80℃で保持した糖配合物(すなわち、1回の凍結解凍サイクル)は、PBS単独より有意に劣っていた(95%)。しかし、+37℃及び+56℃で保持したそれらの糖配合物は、PBSのみよりも有意に良好であった(それぞれ、102%及び105%)。さらに、数字は等しい温度で保持されたPBS配合物に対してであるので、この増加は、高温により生じたIgGの初期の解合によって説明することができなかった。この改善は、糖と配合することの真の利点である。
【０２８３】
1日目-DMG配合物(図6参照)
DMGで配合した試料はすべて、PBSで配合したものに対して有意に改善された純度をもたらした(102〜106%)。これらの改善の最も不良なものは、-80℃で貯蔵した試料(すなわち、1回の凍結-解凍)で見られたが(102%)、これは、+4℃で保持したもの(106%)及び37℃で保持したもの(106%)と同様に、糖のみの配合物で改善を示す。56℃で保持したDMG配合物(105%)は、糖単独で配合したものと単に等しいだけであった。
【０２８４】
1日目-DMG及び糖の配合物(図6参照)
糖及びDMGで共配合した試料はすべて、PBSのみの処理(100〜108%)と比較してIgG純度の改善した収率を示した。これらの試料の中で、-80℃で保持したもの(100%)、+4℃で保持したもの(104%)、及び+37℃で保持したもの(104%)は、糖のみを上回る改善であった。+56℃で保持した配合物(108%)は、DMGのみの配合物(105%)及び糖のみの配合物(105%)の両方を上回る改善をもたらした。
【０２８５】
1日目-要約(図6参照)
上に検討した結果は、図6に見ることができる。図は、明らかな傾向を示す。差はわずかである;しかし、この時間尺度は短い。5日目と1日目の間の差は、恐らくはより有意で且つ興味深い。
【０２８６】
モノマーピークの面積
図7及び図8は、それぞれ、4℃及び37℃で貯蔵した、時間経過(1日目、5日目、及び31日目)にわたる配合物すべてについてのモノマーピークの面積を示す。モノマーピークの面積は、回収モノマー性IgGの推定値と考えられる。
【０２８７】
1日目-4℃
図3は、4℃で保持した早くも1日目の配合物が、それらのモノマーピークの面積で差を示すことを示す。これらの差は、添加剤の特有の解合によって介在されることができた。DMG及び糖で配合された処理は、最大のモノマーピーク、したがって、最も多くの回収モノマー性IgGを示した。糖単独で配合した処理は、最小のモノマーIgG、したがって、最も少ない回収モノマー性IgGを示す。PBS又はDMG単独で配合した試料は、有意に異ならず、これらの中間である。
【０２８８】
4℃で1日目から5日目、及び5日目から31日目
4℃で貯蔵した配合物すべてにおいて、同程度の回収モノマー性IgGの低下がある。その後に、5日目と31日目の間で、モノマー性IgGのさらなる損失はない。
【０２８９】
37℃で1日目
図7と図8との比較は、37℃で保持した処理すべては、4℃で保持した等しい配合物に比べてより高い量又は回収モノマー性IgGを有することを示す。これは、温度に介在された解合の証拠である。
【０２９０】
37℃で1日目から5日目
37℃で、DMG単独を除いていずれの処理においても1日目と5日目の間のモノマーの損失はない。この損失の欠如は、熱により介在された解合によって平衡を保たれている分解のためであり得る。
【０２９１】
37℃で5日目から31日目
PBS、又は糖単独、又はDMG単独で配合した試料はすべて、5日目と31日目の間のモノマー性IgGにおいて有意な減少を示す。これらの処理の中で、DMG単独は実際に、最も急な減少を示し、PBSが続く。糖単独での配合物は、PBSを上回ってモノマー性IgGの回収をわずかに高めるが、述べたようになお有意な消失を被る。しかし、DMG及び糖による配合物は、この時間尺度にわたってモノマー性IgGの有意な減少をまったく示さない。したがって、DMG及び糖の共配合物は、IgGの熱安定性強化のための添加剤として有意な可能性を与える。
【０２９２】
［実施例７］
アデノウイルスの安定化
実施例7及び実施例8において、特に断らない限り、以下の材料、装置及び技術を用いた:
材料
化学薬剤
【表５】
0005869553.tif 000016
【０２９３】
生物学的薬剤
【表６】
0005869553.tif 000017
【０２９４】
その他
【表７】
0005869553.tif 000018
【０２９５】
装置
【表８】
0005869553.tif 000019
【０２９６】
液体ウイルス調製物の調製
CMVプロモーター下で増強GFP(緑色蛍光タンパク質)を発現し、SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有する組換えヒトアデノウイルスAd5(Vector Biolabs)を、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。50μlのアリコートを5mlのガラスバイアルに添加した。これらの50μlのウイルス試料に、DMG、MSM及び場合によってスクロースから構成される配合物混合物250μlを添加した。それぞれの配合物混合物をSSC中で作製した。ウイルス試料に添加後のそれぞれの配合物中のDMG、MSM及びスクロースの濃度を、表5に示す:
【表９】
0005869553.tif 000020
【０２９７】
バイアルに栓をして、キャップをし(スクリューキャップ)、その後熱負荷のために37℃で置いた。熱負荷は7日間であって、その後、バイアルすべてを、それらを実際にアッセイするまで4℃に戻した。
【０２９８】
感染性アデノウイルスのアッセイ
96平底細胞培養皿(VWR、英国)に、1ml当たり105細胞(1ウェル当たり100μl)でHEK293(E
CACC 85120602)細胞を播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、細胞を接種した。
【０２９９】
アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを、300μlのSSC中再構成した。次いで、再構成したバイアルから20μlを取り、180μlのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に添加することによって、10分の1希釈工程を行った。10分の1希釈液20μlを取って、それを180μlのDMEMに添加することによって、さらに100分の1希釈(当初の試料の)を行った。次いで、得られた希釈液(10分の1及び100分の1)のそれぞれ100μlを、HEK293細胞を含むプレートのウェルに添加した。
【０３００】
さらに、添加剤処理で用いた同じ供給源からで、同じ力価を有する(-80℃で貯蔵後)アデノウイルスのさらなる試料を解凍し、10分の1の希釈シリーズ(DMEM+10%FBS中)を作製するために用いた。10分の1から106分の1の範囲の希釈液も、HEK293を含む個々のウェルに添加した。接種48時間後に、蛍光顕微鏡を用いて1ウェル当たりGFP(緑色蛍光タンパク質)細胞の数を数えて、その後に、これを、接種材料の適用された容量及び希釈を考慮に入れて、処理試料のpfu/mlに換算した。
【０３０１】
結果
結果を図9に示す。MODDE9.0プログラム(Umetrics、Sweden)を用いて重回帰(MLR)分析によってデータを分析したときに、MSM及びDMGを組み合わせて用いた場合、相乗作用が見られた。
【０３０２】
［実施例８］
MVAの安定化
液体ウイルス調製物の調製
MVAを-80℃での貯蔵から取り出し、解凍した。50μlのアリコートを5mlのガラスバイアルに添加した。これらのバイアルに、上の表1に記載した配合物混合物250μlを添加した。バイアルに栓をし、スクリューキャップを固く締めて、密封した。このバイアルを直ちに熱負荷のために37℃に置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルのすべてを、それらを実際にアッセイするまで4℃に戻した。
【０３０３】
感染性MVAのアッセイ
アッセイプレート(96ウェル)に、BHK-21細胞(1ウェル当たり100μl、105細胞/ml)を播種した。10%FBS及び1%PSを補給したDMEM中に細胞を希釈した。プレートを+37℃、+5%CO2で1から2時間置いた。
【０３０４】
その間に、配合したMVA試料の希釈シリーズを(同じ増殖培地において) 10-1から10-4の範囲で調製した。それぞれの希釈シリーズを4回調製した。BHK-21細胞を含む個々のウェルにそれぞれの希釈液35μlを適用し、ウェルにさらに65μlの培地を継ぎ足した。
【０３０５】
接種後6日目に、細胞変性効果(CPE)の存在又は非存在について記録し、TCID50を計算した。次いで、これらを用いて、熱負荷バイアルにおける1ml当たり感染性MVAの濃度を推定した。
【０３０６】
結果
結果を図10に示す。
【０３０７】
［実施例９］
材料
化学薬剤
【表１０】
0005869553.tif 000021
【０３０８】
生物学的薬剤
【表１１】
0005869553.tif 000022
【０３０９】
その他
【表１２】
0005869553.tif 000023
【０３１０】
装置
【表１３】
0005869553.tif 000024
【０３１１】
方法
実験設計
MODDE9.0(Umetrics)を用いて、Doehlert実験設計を作成した(図11参照)。Doehlert計画は、通常のシンプレックスから構築した応答曲面モデリング設計である。それらは、異なる方向に容易に拡張でき、新たな因子を既存の設計に加えることができる。通常の配合物設計とは異なっていて、非有意な因子は、分析から削除することができ、したがって、交絡因子にならない。
【０３１２】
さらに、設計内の異なる因子は、異なる数のレベルで検定され、したがって、非常に重要であると疑われる因子に対してより多くの検定レベルを割り当てることが可能である。したがって、PEIは7レベルで検定したが一方、スクロースは5レベル、及びラフィノースは3レベルで検定した。このモデルは、二次効果及び相互作用についてモデル化する能力を保有する。この設計は、3因子及び3反復中心点を含み、15の検定試料を生じさせた。
【０３１３】
スクロースは、0と1Mの間で検定した。Doehlert計画の性質は、検定レベルが0mMを含まないことを意味したが、ラフィノースは、0から300mMの範囲にわたって検定した。その代わりに、以下の範囲を検定した:27.5、150.0、及び272.5mM。
【０３１４】
PEIは、0.04〜4000nMの対数範囲にわたって検定した。
【０３１５】
液体環境におけるアデノウイルスの安定性
液体環境における配合されたアデノウイルスの調製及び熱負荷
SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有して、CMVプロモーター下で増強GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15本の5mlガラスバイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと混合した添加剤ブレンド配合物を表6に記載し、SSC中で作製した。
【０３１６】
バイアルに栓をし、キャップをして(スクリューキャップ)、その後、熱負荷のために+37℃で1週間置き、その後、それらを実際にアッセイするまで+4℃に移した。
【表１４】
0005869553.tif 000025
【０３１７】
アデノウイルスのアッセイ
1ml当たり105細胞(1ウェル当たり100μl)で播種することによって、HEK293を接種のために96ウェル平底細胞培養皿に調製し、37℃、5%CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。
【０３１８】
熱負荷をかけたウイルス試料を、DMEM+10%FBS+1%PS中10分の1及び100分の1に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlを、アッセイプレートの個々のウェルに添加した。さらに、元のSSC中アデノウイルスの第2のアリコートを-80℃から解凍し、10倍の希釈シリーズ(10分の1から100,000分の1)も、DMEM+10%FBS+1%PS中で調製した。正の対照希釈シリーズを、用いたそれぞれの96ウェルプレートに2連で接種した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、1ウェル当たりGFPの数を数えた。
【０３１９】
結果
結果を上の表6に示す。図12は、P-Bra+Suc+Raffのデータに基づくモデルが強いものであることを示す。R2(0.93)は、良いあてはまりを示し、Q2(0.72)は、相対的に強い予測モデルを示唆する。
【０３２０】
モデルにおける有意項目(図13参照)は、三つの添加剤すべての一次及び二次効果を含むが、それらの間の相互作用は含まない。
【０３２１】
表面応答プロット(図14)は、スクロース及び分岐PEI(P-Bra)の効果を最も明らかに示す。それぞれのグラフ上のピークは、それぞれ述べたラフィノース濃度(0、150及び300mM)での最適配合物を表す。三つのグラフは、ラフィノースが、最適P-Bra又はスクロース濃度を変えることはあまりないが、最大達成可能な回復ウイルス活性を変えることを示す。
【０３２２】
正の対照も、試験試料と一緒にアッセイしておいた。対照として用いたウイルスは、-80℃で貯蔵していた、このアッセイに用いた同じウイルスのさらなるアリコートであった。この試料のアッセイ力価は、6.7×105pfu/mlであった。モンテカルロシミュレーションを用いて、最適配合物を予測した。一部の処方が100%を超える回復ウイルス活性をもたらすとモデルが予測するので、正の対照を最適化のための目標として用いた(下記参照)。
【０３２３】
予測された最適配合物は、すなわち、スクロース=0.74M、P-Bra=14nM、ラフィノース=162mMである(図15参照)。本明細書で特定した最適配合物は、回復ウイルス力価5.1×105pfu/ml又はウイルス活性のわずか24%の損失をもたらすと予測された。
【０３２４】
［実施例１０］
材料
化学薬剤
【表１５】
0005869553.tif 000026
【０３２５】
生物学的薬剤
【表１６】
0005869553.tif 000027
【０３２６】
その他
【表１７】
0005869553.tif 000028
【０３２７】
装置
【表１８】
0005869553.tif 000029
【０３２８】
方法
実験の設計
MODDE9.0を用いて、中心複合面心(Central Composite Face-Centered)(CCF)デザインを作成した(図16参照)。CCFデザインは、それぞれの因子の3レベルだけを検定するが、なお二次モデルを支持する応答面モデリング(Response Surface Modeling)(RSM)の形式である。通常の配合物設計と異なって、非有意因子を分析から削除することができ、したがって交絡因子とならない。
【０３２９】
液体環境中配合されたMVAの調製及び熱負荷
MVAを、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。MVAの50μlアリコートを15本の5mlのガラスバイアルに添加した。その後、ウイルスの50μlアリコートを15本の5mlガラスバイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を表7に記載し、SSC中で作製した。
【表１９】
0005869553.tif 000030
【０３３０】
バイアルに栓をし、キャップをして(スクリューキャップ)、熱負荷+37℃で1週間置き、その後、それらを実際にアッセイするまで+4℃に置いた。
【０３３１】
MVAのアッセイ
アッセイプレート(96ウェル)に、BHK-21細胞(1ウェル当たり100μl、105細胞/ml)を播種した。細胞を、10%FBS及び1%PSで補給したDMEM中に希釈した。プレートを+37℃、+5%CO2で1〜2時間置いた。
【０３３２】
配合したMVA試料の10倍希釈シリーズを10分の1から10,000分の1の範囲で調製した(同じ増殖培地中)。それぞれの希釈シリーズを5回調製した。それぞれの希釈液100μlを、BH
K-21細胞(上記)を含む個々のウェルに適用した。
【０３３３】
接種後6日目に、CPEの存在又は非存在について記録し、TCIC50を計算した。次いで、これらを用いて、熱負荷バイアルにおける1ml当たり感染性MVAの濃度を推定した。
【０３３４】
その後、配合したMVA試料の2倍希釈シリーズを2,000分の1から32,000分の1の範囲で調製した。これらの希釈液を別個に、しかし前と同様にアッセイした。
【０３３５】
結果
この調査で収集した生データを、上の表7に示す。応答は、7.6×104から7.6×105TCID50/ml、又は開始力価の7.4〜74.0%の範囲であった(図7参照)。このデータから作成したモデルは、四つのモデル評価パラメータすべてで妥当に記録した(R2=0.79、Q2=0.49、モデル妥当性=0.90、再現性=0.59)(図17参照)。
【０３３６】
スクロース、TMG及びラフィノースはすべて、検定した濃度範囲にわたるウイルス回復に対して一次の正の効果を有すると予測された。ラフィノースの効果は、90%信頼区間でわずかに有意であったが、それは、モデルの強度を改善し、モデル階層を保つために必要とされたのでモデル中に保持した。TMGとラフィノースとの相互作用も予測されたので、これは必要であった。最終的に、スクロースの二次非線形効果が見られた。モデル中保持された係数の要約については図18を参照されたい。
【０３３７】
図19は、相互作用を明らかに示す四次元等高線プロットからなる。最適スクロース濃度は、常に0.6から0.8Mであるとわかり、他の添加剤でこれを有意に変えるものはない。一般に、TMG濃度が高いほど、ウイルス活性の回復は大きい。
【０３３８】
Monte-Carloシミュレーション(図20に示す)は、最適条件(1Mスクロース、1MTMG、300mMラフィノース)の検定範囲の極値を示す。これは、最適処方が、検定範囲でカバーされていないことを示唆する。しかし、このシミュレーションは、この最適条件に近い処方が、94%開始力価の回復ウイルス活性をもたらすはずであることを予測する。
【０３３９】
［実施例１１］
材料
化学薬剤
【表２０】
0005869553.tif 000031
【０３４０】
生物学的薬剤
【表２１】
0005869553.tif 000032
【０３４１】
その他
【表２２】
0005869553.tif 000033
【０３４２】
装置
【表２３】
0005869553.tif 000034
【０３４３】
方法
実験設計
実施例9に記載したとおりに、MODDE9.0(Umetics)を用いて、Doehlert実験設計を作成した(図21参照)。したがって、MSMを7レベルで検定したが一方、スクロースは5レベル、ラフィノースは3レベルで検定した。このモデルは、二次効果及び相互作用についてモデル化する能力を保有する。この設計は、3因子及び3反復中心点を含み、15の検定試料を生じさせた。
【０３４４】
スクロースは、0と1Mの間で検定した。Doehlert設計の性質は、検定レベルが0mMを含まなかったことを意味したが、ラフィノースは、0から300mMの範囲にわたって検定した。代わりに、以下の範囲を検定した:27.5、150.0、及び272.5mM。MSMは、0から2Mの線形範囲にわたって検定した。
【０３４５】
液体環境におけるアデノウイルスの安定性
SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有して、CMVプロモーター下で増強GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15本の5mlのガラスバイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を表8に記載し、SSC中で作製した。
【表２４】
0005869553.tif 000035
【０３４６】
バイアルに栓をし、キャップをして(スクリューキャップ)、熱負荷+37℃で1週間置き、その後、それらを実際にアッセイするまで+4℃に置いた。アデノウイルスアッセイは、実施例9に記載したとおりであった。
【０３４７】
結果
生データを表8に示す。データの分析は、相対的に強いモデルを生じた(図22参照)。R2(0.84)は、良い有意性を示し、再現性(0.94)は、高く、モデル妥当性(0.60)は、モデル問題を示すレベル(0.25)を有意に超えていた。
【０３４８】
図23は、モデル微調整後の保持されたモデル係数を示す。MSM及びスクロースの両方は、一次効果として有意な因子である(信頼区間95%で)。95%信頼レベルで他の有意な因子は検出されなかった。しかし、微調整の間の分析は、ある曲率が存在することを示唆した。90%信頼レベルでわずかに有意であった他の2因子を含めることによって、より強いモデルを得た。第1に、MSMの二次効果及びMSMとスクロースの間の相互作用。ラフィノースの効果は、この分析で見られず、それは、モデルから削除した。
【０３４９】
モデルの三次元プロット(図24参照)は、スクロース濃度の増加が、回復ウイルス活性の増加をもたらすことを実証する。ここでの検定範囲は、最適スクロース濃度を含まない。高いスクロースレベルで、中間MSM濃度(約1M)は、保護効果を増強する。一般に、存在するスクロースが多いほど、最適MSM濃度は高い。
【０３５０】
モンテカルロミュレーション(図25)を用いて、添加剤の最適濃度を予測した。1Mのスクロース及び0.95MのMSMの最適条件を特定した。ラフィノースは、モデルで効果を示さないので、最適配合物に必要とされない。しかし、ラフィノースは、いずれかの他の理由のために配合物中に必要とされる場合、負の効果も示さない。最適配合物は、3.8×105pfu/mlの回復ウイルス活性又は初期ウイルス力価の88.4%(4.3×105pfu/mlの正の対照と比較して)をもたらすと予測される。
【０３５１】
［実施例１２］
材料
化学薬剤
【表２５】
0005869553.tif 000036
【０３５２】
生物学的薬剤
【表２６】
0005869553.tif 000037
【０３５３】
その他
【表２７】
0005869553.tif 000038
【０３５４】
装置
【表２８】
0005869553.tif 000039
【０３５５】
方法
実験設計
実施例9に記載したとおりに、MODDE9.0(Umetrics)を用いて、Doehlert実験設計を作成した(図26参照)。DMGを7レベルで検定した一方、スクロースを5レベル、ラフィノースを3レベルで検定した。このモデルは、二次効果及び相互作用についてモデル化する能力を保有する。この設計は、3因子及び3反復中心点を含み、15の検定試料を生じさせた。
【０３５６】
スクロースは、0Mと1Mの間で検定した。Doehlert設計の性質は、0mMを含まないことを意味したが、ラフィノースは、0mMから300mMの範囲にわたって検定した。代わりに、以下の範囲を検定した:27.5、150.0、及び272.5mM。DMGは、0Mから2Mの線形範囲にわたって検定した。
【０３５７】
液体環境におけるアデノウイルスの安定性
SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有して、CMVプロモーター下で増強GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15本の5mlのガラスバイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を表9に記載し、SSC中で作製した。
【表２９】
0005869553.tif 000040
【０３５８】
バイアルに栓をし、キャップをして(スクリューキャップ)、その後、熱負荷+37℃で1週間置いて、その後、それらを実際にアッセイするまで+4℃に置いた。アデノウイルスアッセイは、実施例9に記載したとおりであった。
【０３５９】
結果
非常に強いモデルが、このデータから生成した(表9参照)。このモデルは、四つの指標(R2=0.97、Q2=0.90、モデル妥当性=0.89、再現性=0.96)で高く記録した(図27参照)。モデルは、1回の反復の削除によって微調整の間に強化された。この配合物は、明らかな外れ値としてソフトウェアによってフラグ化した。
【０３６０】
配合物における三つの添加剤すべては、このモデルで有意な因子であることが示された(図28参照)。スクロース及びラフィノースだけが、一次効果を示した一方、DMGは、一次及び二次効果の両方を示した。さらに、ラフィノースとDMGの間の相互作用があった。
【０３６１】
図29は、最適スクロース濃度が、検定したものを超えていることを示す。しかし、生成物の浸透圧上の制約のために、スクロース濃度が、有意に増加していることはありそうにない。一部のレベルで、DMGは、配合物の保護効果を増強し、ラフィノースは、このために最適DMG濃度を変える。
【０３６２】
モンテカルロミュレーションを用いて、最適配合物を予測した(図30参照)。回復ウイルス活性を4.3×105pfu/ml(正の対照の力価)の限界まで最大化するように、プログラムを設定した。予測最適配合物は、0.5Mのスクロース、0.4MのDMG、272nMのラフィノースであり、これは、3.6×105pfu/mlの力価又は開始力価の84%(正の対照に基づいて)をもたらすと予測された。
【０３６３】
図31aは、データの代替の見方を示す。等高線プロットは、いくつかの異なるラフィノース濃度でスクロース濃度に対してプロットしたDMG濃度を示す。このプロットは、ラフィノースが増加するにつれて、より濃い領域(より高いウイルス活性の回復)が、Y軸(DMG濃度)を下に移動させることを示す。黒色の十字形は、予測最適処方を印する。図31bは、回復が100%以上であると予測される領域を示す。
【０３６４】
［実施例１３］
材料
化学薬剤
【表３０】
0005869553.tif 000041
【０３６５】
生物学的薬剤
【表３１】
0005869553.tif 000042
【０３６６】
その他
【表３２】
0005869553.tif 000043
【０３６７】
装置
【表３３】
0005869553.tif 000044
【０３６８】
方法
PBS中10.2×105pfu/mlの力価(解凍後)を有して、CMVプロモーター下で増強GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15本の5mlのガラスバイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド処方を表10に記載し、PBS中で作製した。
【表３４】
0005869553.tif 000045
【０３６９】
これ以降、以下の処理名を用いる:
-  「緩衝剤」=PBS緩衝剤のみで添加剤なし
-  「スクロース」=PBS中1Mのスクロース
-  「ラフィノース」=PBS中100mMのラフィノース
-  「糖類」=PBS中1Mスクロース、100mMのラフィノース、
-  「NE」=PBS中0.7MのDMG、
-  「最良」=PBS中1Mのスクロース、100mMのラフィノース、0.7MのDMG。
【０３７０】
このバイアルに栓をし、キャップ(スクリューキャップ)をして、その後、表11に示した条件下で熱負荷をかけた。適当な時点で、アデノウイルスアッセイを実施例9に記載したとおりに行った。
【０３７１】
結果
集めた多くのデータ点は、アッセイの検出閾値より下であった(表11参照)。
【表３５】
0005869553.tif 000046
【０３７２】
便宜上、これらのデータ点に閾値を割り当てたが、これは、それらが有し得る最大可能値であるからである。このような低いウイルス活性の回復を生じる配合物は、コンパレータ以外にはなにも実用性が少ないので、これは、結果の解釈にあまり影響しないように思われる。このアッセイの検出閾値は、0.03%の回復活性に等しい600pfu/mlである。
【０３７３】
+4℃で保持した試料について、1時点のみを検定した。この温度で6カ月後のウイルス活性の歩留まりは、図32に見ることができる。緩衝剤のみの処理は、50.1%の開始力価の回復を与え、用いたアデノウイルスがこの液体環境で本質的に妥当に安定であることを明らかに示した。この所見は、安定試験の促進に対する必要性も示す。
【０３７４】
「スクロース」処理は、92.1%の活性を回復させ、これは、6カ月後に、緩衝剤単独に対して大きな改善である。対照的に「ラフィノース」は、「緩衝剤単独」に対してわずかな改善であるが「スクロース」より悪い、55.5%の歩留まりであった。組み合わせた「糖類」処理は、単に86.4%の回復ウイルス活性を示した。
【０３７５】
DMGだけの処理(「NE」)は、ウイルス活性のわずかに65.1%を保存したが、糖類と合わせて用いる場合、99.3%の回復活性が見られた。この所見は、+4℃で6カ月後のアデノウイルスの損失ゼロに近い。
【０３７６】
それぞれの時点及び熱負荷でのこの「最良」配合物における回復ウイルス活性を図33に示す。前に検討したように、+4℃で6カ月後に、ほぼ損失ゼロである。
【０３７７】
+25℃及び+37℃の熱負荷での結果(表11及び図34参照)は、「最良」配合物が、その構成成分よりもアデノウイルスの安定化により有効であることを示す。
【０３７８】
［実施例１４］
材料
化学薬剤
【表３６】
0005869553.tif 000047
【０３７９】
生物学的薬剤
【表３７】
0005869553.tif 000048
【０３８０】
その他
【表３８】
0005869553.tif 000049
【０３８１】
装置
【表３９】
0005869553.tif 000050
【０３８２】
方法
実験設計
MODDE9.0を用いて、中心複合面心(Central Composite Face-Centered)(CCF)デザインを作成した。CCFデザインは、それぞれの因子の3レベルだけを検定するが、なお二次モデルを支持する応答面モデリング(Response Surface Modeling)(RSM)の形式である(図35を参照)。通常の処方設計と異なって、非有意因子を分析から削除することができ、したがって交絡因子とならない。
【０３８３】
液体環境における配合MVAの調製及び熱負荷
MVAを、-80℃での貯蔵から回復し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15本の5mlガラスバイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を以下の表12に記載し、SSC中で作製した。バイアルに真空下で栓をし、キャップをし(スクリューキャップ)、その後、熱負荷+37℃に1週間置き、その後、それらを実際にアッセイするまで+4℃に置いた。
【０３８４】
MVAのアッセイ
アッセイプレート(96ウェル)に、BHK-21細胞(1ウェル当たり100μl、105細胞/ml)を播種した。10%FBS及び1%PSを補給したDMEMに細胞を希釈した。プレートを+37℃、5%CO2で1から2時間置いた。
【０３８５】
その間に、配合MVA試料の10倍希釈シリーズを(同じ増殖培地において) 10分の1から10,000分の1の範囲で調製した。それぞれの希釈シリーズを5通りに調製した。(上記の)BHK-21細胞を含む個々のウェルにそれぞれの希釈液100μlを適用した。
【０３８６】
接種後6日目に、ウェルは細胞変性効果(CPE)の存在又は非存在について記録し、TCID50を計算した。次いで、これらを用いて、熱負荷バイアルにおける1ml当たり感染性MVAの濃度を推定した。
【０３８７】
結果
この試験からの粗TCIC50データを表12に示す。
【表４０】
0005869553.tif 000051
【０３８８】
応答は、開始力価の0.5から74.1%まで変化した。モデルは、添加剤両方の一次効果を予測する(図36及び図37参照)。DMG及びマンニトールの両方の場合、バイアル保存は、濃度が増加するにつれて増加する。これは、図38に示した等高線プロットにより明らかに例証される。さらに、DMGとマンニトールの間の相互作用を特定した。
【０３８９】
モンテカルロミュレーションは、検定したそれぞれの添加剤の高い濃度によって、+37℃で1週間の熱負荷後に開始力価の66%を上回って達成すると予測し得ることを示唆し、これは、0.2未満の対数損失を表す。
【０３９０】
［実施例１５］
材料
化学薬剤
【表４１】
0005869553.tif 000052
【０３９１】
生物学的薬剤
【表４２】
0005869553.tif 000053
【０３９２】
その他
【表４３】
0005869553.tif 000054
【０３９３】
装置
【表４４】
0005869553.tif 000055
【０３９４】
方法
ビラレントF(ab')2を、添加剤の様々な濃度の存在下で熱負荷をかけて、異なる点でアッセイした。ELISAアッセイを用いて、残存F(ab')2活性を評価した-これを用いて、受けた損傷の程度を測定した。
【０３９５】
添加剤と一緒の液体環境におけるビバレントF(ab')2の調製及び熱負荷
PBS中ビバレントF(ab')2を、-80℃での貯蔵から取り出し、室温で解凍させた。液体環境における添加剤の保護特性を決定するために、4μg/mlの抗体濃度を有するそれぞれの配合物900μlを作製した-この量は、別個の3時点をアッセイするのに十分である。それぞれの処方の詳細については表13を参照されたい。
【表４５】
0005869553.tif 000056
【０３９６】
-SR/-P(対照)配合物の二つのバイアルを構成した-一つは、+4℃で貯蔵し(正の対照として-予想される損傷なし)、2番目は、他の配合物と一緒に+56℃に置いた(負の対照として:この処方は、高温で24時間後に安定のままであり且つ活性を保持するとは予想されなかった)。
【０３９７】
ビバレントF(ab')2活性のアッセイ
ビバレントF(ab')2の活性をELISAによりアッセイした。PBS中0.5μg/mlに希釈した抗原(ラットIgG2b-カッパ)を、96-ウェルプレートの列AからGに1ウェル当たり100μlコーティングし、同様に、+4℃対照条件について二つの予備のウェルの列Hにコーティングした。1:400,000希釈での正常マウス血清も、正の対照として列Hの二つのウェルに添加した。これらの対照を用いて、その後にデータを正規化した。プレートを+4℃で18時間インキュベートし、次いで0.05%Tween20を含有するPBSで3回洗浄した(洗浄緩衝液)。
【０３９８】
プレートを紙タオル上にブロッティングすることによって乾燥させた。このブロッティングの方法は、洗浄工程ごとに用いた。5%脱脂粉乳及び0.05%Tween20を含有するPBSによって、プレートを1.5時間ブロックした。試料を添加する前に、プレートを洗浄緩衝剤で3回洗浄した。
【０３９９】
熱負荷(又は対照バイアルについては+4℃で)でインキュベーション後、F(ab')2配合物をインキュベータ/冷蔵庫から取り出し、それぞれから250μlを抜き取った。これを洗浄緩衝液で1:2に希釈した。それぞれの希釈試料を2連でプレートに添加し、プレートを2倍に希釈した(最終濃度は、2μg/mlから0.0625μg/mlの範囲である)。バックグラウンドシグナルを測定するために、ビバレントF(ab')2を含まない条件も含めた。プレートを室温で1.5時間インキュベートし、その後、プレートを洗浄緩衝液で5回洗浄した。
【０４００】
ヤギ抗ヒトHRP結合抗体を洗浄緩衝液で1:5000に希釈し、ビバレントF(ab')2を含むウェルすべてに100μlを添加した。ウサギ抗マウスHRP結合体を洗浄緩衝液中1:1000に希釈し、正常マウス血清対照を含有するウェルに100μlを添加した。プレートを室温で1.5時間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液で5回洗浄した。
【０４０１】
100μlのTMB安定化クロモーゲンをそれぞれのウェルに添加し、室温で10分間反応させ、その時点後、200mM硫酸100μlを添加して、反応を停止させた。Synergy HTマイクロプレートリーダーを用いて、プレートを450nmで読み取った。
【０４０２】
統計分析
平均及び標準偏差をそれぞれ2連について取って、データ点を、指定F(ab')2濃度で線グラフとして又は棒グラフとしてプロットした。
【０４０３】
結果
+56℃で24時間熱処理後のビバレントF(ab')2断片の活性
予備試験において、原液F(ab')2(AbD Serotecにより供給されたまま-濃度0.73mg/ml)
を+56℃で貯蔵して、高温での初期の安定性を評価した。抗体は、極端に熱不安定であり、56℃で24時間後に活性があまり残存せず、この抗体を安定化させる添加剤の能力を試験する優れた出発点を与えることがわかった(図39)。
【０４０４】
添加剤の有無による、+56℃で熱処理後のビバレントF(ab')2断片の活性
ビバレントF(ab')2を、添加剤の様々な濃度の存在下で熱負荷をかけ、異なる点でアッセイした(図40参照)。+56℃で24時間貯蔵後、ほとんどの試料は、それらのF(ab')2活性の大部分を維持したが(+4℃で貯蔵した対照試料と比較して)、5日後に、低い糖又は糖なしで配合した試料は、残存F(ab')2活性が、24時間後に残存する活性と比較した場合、21%と33%の間に低下した。高い糖濃度を含有する試料は、+56℃で5日間貯蔵後に少なくとも44%の活性を保持した-これは、PEIの添加によって63%から94%に増加した。
【０４０５】
最終時点は、+56℃で7日目の熱負荷で取った。予想通りに、対照試料は、まったく活性を失っていなかった。低い糖又は糖なしで配合した試料は、それらのF(ab')2活性の大部分を失っていた。高い糖濃度を含有する試料は、24時間試料の少なくとも27%を維持し、これは、10μg/mlのPEIを添加した場合、79%に増加した。
【０４０６】
結論
予想通りに、+4℃で7日間貯蔵した試料は、F(ab')2活性においてまったく損失を受けない。PEIの有無にかかわらず、低い糖濃度を含有する試料は、+56℃で5日後にF(ab')2活性の大部分を失う。最も保護的な処方は、高い糖濃度を含有し、10μg/mlのPEIの添加は、保護をかなり向上させる。5日間の熱負荷後、低い糖濃度試料はすべて、F(ab')2活性の大部分を失った一方、高い糖濃度及びPEIを含有したものは、依然としてF(ab')2活性のかなりのレベルを維持した。
【０４０７】
［実施例１６］
材料
化学薬剤
【表４６】
0005869553.tif 000057
【０４０８】
生物学的薬剤
【表４７】
0005869553.tif 000058
【０４０９】
その他
【表４８】
0005869553.tif 000059
【０４１０】
装置
【表４９】
0005869553.tif 000060
【０４１１】
方法
試験設計
ビラレントF(ab')2を、添加剤の様々な濃度の存在下で熱負荷をかけて、異なる点でアッセイした。ELISAアッセイを用いて、残存F(ab')2活性を評価した-これを用いて、受けた損傷の程度を測定した。
【０４１２】
添加剤と一緒の液体環境におけるビバレントF(ab')2の調製及び熱負荷
PBS中ビバレントF(ab')2を-80℃での貯蔵から取り出し、室温で解凍させた。液体環境での添加剤の保護特性を決定するために、4μg/mlの抗体濃度を有するそれぞれの配合物1050μlを作製した-この量は、別個の4時点をアッセイするために十分である。それぞれの処方の詳細については表14を参照されたい。
【表５０】
0005869553.tif 000061
【０４１３】
-SR/-D(対照)処方の二つのバイアルを構成した-一つは、+4℃で貯蔵し(正の対照として-予想される損傷なし)、2番目は、他の処方と一緒に+40℃に置いた(負の対照として:この処方は、高温で24時間後に安定のままであると予想されなかった)。24時間後、熱負荷をかけた試料を、+56℃に置いて、損傷を促進させた。
【０４１４】
ビバレントF(ab')2活性のアッセイ
ビバレントF(ab')2の活性を実施例15で示したとおりにアッセイした。
【０４１５】
統計分析
それぞれ2連について、平均及び標準偏差を取って、これらのデータ点を指定されたF(ab')2濃度で線グラフとして又は棒グラフとしてプロットした。
【０４１６】
結果
添加剤の有無による、熱処理後のビバレントF(ab')2断片の活性
結果を、図41に示す。+40℃で貯蔵24時間後に、+4℃で貯蔵した対照条件と比較して、F
(ab')2に対する明らかな損傷はない。+56℃でさらに4日間の熱負荷後、非保護F(ab')2の活性は、24時間後の活性の5%に低下した。低濃度の糖を含有した試料は、24時間後に残存する活性の6%(DMGなし)と26%(高DMG)の間で保持した。高い糖を含有した試料は、24時間後に残存する活性の少なくとも37%を保持し、これは、DMGの添加によって60%〜81%に増加した。
【０４１７】
熱負荷後14日目に最終時点を取った(+40℃で24時間、次いで+56℃で13日間)。熱負荷をかけたすべての試料は、その活性の大部分を失っており(3%から14%の活性が残存する)、添加剤が、+56℃で14日間のこれらの過酷な劣化条件下でF(ab')2を完全に保護するには十分でなかったことを示した。
【０４１８】
結論
予想通りに、+4℃で2週間貯蔵した試料は、F(ab')2活性においてまったく損失を受けなかった。低い糖濃度を含有する試料は、DMGの有無にかかわらず、+56℃で5日後にF(ab')2活性の大部分を失った。ほとんどの保護配合物は、DMG及び高い糖濃度を含有した。
【０４１９】
［実施例１７］
材料
【表５１】
0005869553.tif 000062
【０４２０】
装置
【表５２】
0005869553.tif 000063
【０４２１】
方法
試料調製
正及び負の対照試料を、PBS中167μgのFAbとして調製した(正の対照は、HPLC分析直前に新たに調製した)。スクロース-ラフィノースミックスのみの対照は、0.15Mスクロース及び0.015Mラフィノースと一緒にPBS中167μgのFAbとして調製した。試験試料は、以下の0.1M(低)又は1.0M(高)DMG又はTMGの1種とともに、0.15Mスクロース及び0.015Mラフィノースと一緒にPBS中167μgのFAbとして調製した。正の対照を除く試料すべてを、56℃での130時間熱負荷にかけた。これは、全部で7試料をもたらした。
【０４２２】
その負荷後、正の対照を、上記のとおりに調製し、その後、すべての試料を室温で5分間の16.3k・gでの遠心分離にかけて、不溶物を取り除いた。ペレットを乱さないように、上清を注意深くデカントした。次いで、デカントした上清を以下に記載するとおりにHPLC分析に用いた。
【０４２３】
HPLC
試料装填及び注入
試料チャンバーを5℃に、カラムを25℃に保った。試料をブロックとして2回注入した。GFC分子量標準品(BioRAD #151-1901)をそれぞれのブロックの前後に流して、HPLC設定の校正機能を確保した。
【０４２４】
濃硫酸溶液によって25℃でpH6.8に平衡化した0.1MのNa2SO4及び0.1MのNa2HPO4緩衝液中1.0mL/分の流量で、25μLの注入容量を用いた。18分の実行時間を試料及び標準品の両方に用いた。
【０４２５】
データ処理
溶出プロファイルを214nmで追跡した。Empower2ソフトウェアパッケージを用いて、すべての試料について自動積分法を用いた。HPLC法の規格は、以下のとおりである。ピール幅30.00及び閾値50.000とともに、従来の(一次導関数の)積分アルゴリズムを用いた。最低面積及び最低高さをゼロに設定した。抑制積分イベントをゼロ分と7.5分の間の溶出時間に設定した。7.5分の溶出時間において、ピークイベントによる強制ベースラインを用いた。他のイベントは発動しなかった。
【０４２６】
四つのピークを定めた:(1)8.670±0.434分における会合体;(2)10.100±0.465分におけるモノマー;(3)10.574±0.529分における肩及び(4)11.200±0.500における断片。さらなるピーク、すなわち、12分後に溶出するピークのすべては、捨てた。ピークすべてについてピークピッキングパラメータは以下のとおりであった:ピークマッチ(Peak Match)は、Closestに設定した;Y値は、Areaに設定した;当てはめ(Fit)は、Linearに設定し、重み付け(Weighting)は、使用不能であった。
【０４２７】
純度及びモノマー保持率のパラメータ
上記の処理から誘導したピーク面積を用いて、それぞれの条件について純度及びモノマー保持率のパラメータを生成した。純度は、それぞれの試料内の全ピークで除したモノマーピーク面積と定義した。モノマー保持率は、正の対照(非熱負荷)試料におけるモノマーピーク面積で除したモノマーピーク面積と定義した。
【０４２８】
結果
試料及び標準トレース
図42は、分子量標準品(BioRAD、151-1901;薄灰色)及び未使用の一価FAb(濃灰色)のY-規格化HPLCオーバーレイトレースを示す。分子量標準品は、初期のボイドピーク(標識したとおりの)、五つの標準成分(1から5に番号付けした)及び未知のピーク(標識したとおりの)を特徴とする。五つの標準成分の同一性及びサイズは、以下のとおりである:(1)ウシサイログロブリン(thyroglobin)-670kDa;(2)ウシ-グロブリン-158kDa;(3)トリ卵白アルブミン-44kDa;(4)ウマミオグロビン-17kDa;及び(5)ビタミンB12 1.35kDa。図に示すように、一価FAbについて予想されるように、FAbピークは、44kDaを超える流体力学的等価サイズを示す第3の標準の前に溶出する。したがって、FAbは、第3の重量マーカーの直前に溶出し、それに44kDaを超える推定流体力学的重量を与える。この値は、一価FAbと一致する。
【０４２９】
図43から図45はすべて、それぞれの条件の最初の注入に相当する七つのHPLCトレースの重ね合わせを示す。図43における13分での大きいピーク(標識b)は、添加剤による一方、10分での比較的小さいピーク(標識a)は、FAbによる。拡大されており、図44に示される領域を、黒色矩形は強調表示する。
【０４３０】
図43は、本文に記載した七つの条件すべてのフルスケールHPLCトレースである。10分での小さいピーク(標識a)は、抗体断片(FAb)ピークである。13分での大きいピーク(標識b)は、添加剤による。暗色のボックスは、図44で示される領域を拡大し、且つ強調表示する。
【０４３１】
図44は、図43に示したとおりの七つの条件すべての最初の注入の同じ重ね合わせを示す。しかし、図44におけるトレースは、12分後に終わっている。図44は、FAbピークを強調表示し、すべてではないが一部の試料が、モノマーピークの末尾に肩ピークを有することを示す。FAbピークそれ自体は、図45において注釈付き形式で強調表示されている。
【０４３２】
図44は、本文に記載した七つの条件すべてのHPLCトレースを示す。トレースは、12分まで現れる(抗体断片(FAb)ピークは、10分に現れる)。ピークの大きさ及び肩付きにおける区別は、七つの条件間で見ることができる。FAbピークは、図45で強調表示されている。
【０４３３】
図45は、上記七つの条件すべての注釈付きHPLCトレースである。トレースは、10分での抗体断片(FAb)ピークを強調表示するようにズーミングして示す。七つの条件のそれぞれの同一性は、図上で注釈されている。SRは糖ミックス(0.15Mスクロース及び0.015Mラフィノース)であり、DMGはジメチルグリシンであり、TMGはトリメチルグリシンである。添え字「lo」は、添加剤の低濃度を指し、0.1Mである。添え字「hi」は、添加剤の高濃度を指し、1.0Mである。
【０４３４】
図45は、すべての熱負荷試料のものを示し、1.0MのDMG又はTMG(SRミックスを加えた)を有するものは、正の対照(非熱負荷)試料に最も近いトレースを生じる。他方で、PBS単独中で熱負荷をかけたFAbは、最大の損失を受け、肩ピークの著しい増加も認められる。次に低いモノマー高さは、SR単独中で負荷をかけたFAbで現れた。0.1MのDMG又はTMGのいずれかを加えたSRミックスは、SRミックス単独よりも良好であるが、1.0MのDMG(より良好)又は1.0MのTMG(最良)のいずれかを加えたSRミックスに劣る中間の保護を与えた。
【０４３５】
要約すると、付随する最小肩ピークの存在を伴う最大モノマーピーク高さ、この順:
未使用>SR+HiTMG>SR+HiDMG>SR+LoTMG=SR+LoDMG>SR>PBS
で進行した。
【０４３６】
この定性的視覚検査は、以下に検討される定量的積分結果に酷似している。
【０４３７】
統合試料トレース
図46に示すように、上記のHPLC処理法を用いて、七つのHPLCトレースすべてを統合した(それぞれの試料の2回の注入の一方についてのトレースのみを示す)。矢印は、ベースラインからベースライン(三角形)及びベースラインに沿ってx軸上に示される変曲変化(ひし形)の両方を強調表示する。
【０４３８】
-  図46A:条件1:未使用FAb(正の対照)。
【０４３９】
-  図46B:条件2:PBS中56℃で130時間後のFAb(負の対照)。
【０４４０】
-  図46C:条件3:SRミックス中56℃で130時間後のFAb。
【０４４１】
-  図46D:条件4:SRミックス及び低(0.1M)DMG中56℃で130時間後のFAb。
【０４４２】
-  図46E:条件5:SRミックス及び高(1.0M)DMG中56℃で130時間後のFAb。
【０４４３】
-  図46F:条件6:SRミックス及び低(0.1M)TMG中56℃で130時間後のFAb。
【０４４４】
-  図46G:条件7:SRミックス及び高(1.0M)TMG中56℃で130時間後のFAb。
【０４４５】
要約
図47は、上記の七つの条件のそれぞれについて、純度(薄灰色)及びモノマー保持率(濃灰色)のパラメータを要約する。試料すべては、167μg/mLであった。未使用は、非加熱負荷の正の対照であった。他の試料はすべて、56℃で130時間熱負荷をかけた。角括弧は、同じ組成を示す:
- PBS - PBSで希釈したFAb;
- SR - 0.15Mのスクロース及び0.015Mのラフィノースと一緒のFAb;
- SR+lo.DMG - 0.15Mのスクロース及び0.015Mのラフィノース及び0.1MのDMGと一緒のFAb。
【０４４６】
- SR+hi.DMG - 0.15Mのスクロース及び0.015Mのラフィノース及び1.0MのDMGと一緒のFAb。
【０４４７】
- SR+lo.TMG - 0.15Mのスクロース及び0.015Mのラフィノース及び0.1MのTMGと一緒のFAb。
【０４４８】
- SR+hi.TMG - 0.15Mのスクロース及び0.015Mのラフィノース及び1.0MのTMGと一緒のFAb。
【０４４９】
誤差線は、HPLCカラムへの反復注入からの±1標準偏差である。
【０４５０】
結論
図47は、図45の定性的に順序を表す結果と定量的に酷似し、56℃で130時間の熱負荷(HC)前にFAbをPBS中に単に希釈することが、純度の3分の1の損失及びモノマー含量の3分の2の損失をもたらすことを示す。これらの損失は、SRミックス(0.15Mのスクロース及び0.015Mのラフィノース)と一緒のインキュベーションによっていくらか低減する。損失は、SRミックス及び0.1MのDMG又はTMGと一緒のインキュベーションによってさらに最小化される。
【０４５１】
しかし、最も妥当な結果は本質的に、純度及びモノマーの損失の両方が、熱負荷前にFAb溶液にSRミックス及び1.0MのDMG又はTMGの添加によって、完全に回避できることである。
【０４５２】
［実施例１８］
液体環境における診断用試料の維持
方法
ヒト血液試料を、等しい容量の、a)PBS;b)0.7MのDMG;又はc)0.7MのDMG/0.1Mのスクロースで希釈した。25℃で30分間貯蔵後、5μlの血液試料をエッペンドルフ管中250μlのGuav
a(著作権)Viacount(著作権)試薬と混合した。この混合物を室温で5分間インキュベートした。インキュベーション後、Guava PCA(著作権)細胞分析器を用いて、白血球画分の妥当性を評価した。
【０４５３】
結果及び結論
Guava PAC(著作権)細胞分析器からの結果は、試験したDMG及びDMG/スクロース添加剤混合物が、試験した期間にわたって、及び試験した濃度で血液試料中の白血球生存度に悪影響をまったく与えないことを示した。したがって、このような添加剤は、感度があまりよくない診断用検体(例えば、尿、唾液)の完全性に最小の影響を示し、流体中に存在するウイルス又はタンパク質の安定性を高めると推論することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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