(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒性ポリペプチドをコードする配列；および
前記配列を中断するイントロン
を含む核酸であって、
それにより、イントロンがインビトロでは昆虫細胞ではなく哺乳動物細胞においてスプライスされ、昆虫細胞ではなく哺乳動物細胞において、翻訳されて細胞毒性レベルの毒性ポリペプチドを形成するｍＲＮＡを形成する、核酸。
【請求項２】
前記毒性ポリペプチドが、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）、バルナーゼ、リシン、アブリンおよびシュードモナス外毒素からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記毒性ポリペプチドがジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）である、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記毒性ポリペプチドがバルナーゼポリペプチドである、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記配列と作動可能に連結される少なくとも１つの発現エレメントをさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
前記発現エレメントが、プロモーター、ＩＲＥＳ、エンハンサーおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記発現エレメントが、ＣＭＶプロモーター、ＡＦＰプロモーター、ＡＦＰエンハンサー、ｈＳＵＲＶプロモーター、ＣＸＣＲ４プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＣＯＸ２プロモーターおよびＣＣＫＡＲプロモーターからなる群から選択される、請求項５に記載の核酸。
【請求項８】
前記発現エレメントが、ｈＳＵＲＶプロモーターおよびＣＸＣＲ４プロモーターからなる群から選択される、請求項５に記載の核酸。
【請求項９】
前記イントロンがヒト成長ホルモンイントロンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記イントロンがＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含む、ウィルスベクター。
【請求項１２】
前記ベクターがアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）である、請求項１１に記載のウィルスベクター。
【請求項１３】
前記ベクターがＡＡＶ２である、請求項１１に記載のウィルスベクター。
【請求項１４】
前記ベクターがＡＡＶ９である、請求項１１に記載のウィルスベクター。
【請求項１５】
前記ベクターがＩＴＲを含む、請求項１１に記載のウィルスベクター。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ昆虫細胞。
【請求項１７】
Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ＢＴＩ−Ｔｎ−５ＢＩ−４細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ２１細胞からなる群から選択される、請求項１６に記載の昆虫細胞。
【請求項１８】
前記核酸がウィルスゲノムにより含まれる、請求項１６に記載の昆虫細胞。
【請求項１９】
前記核酸がウィルスにより含まれる、請求項１６に記載の昆虫細胞。
【請求項２０】
前記細胞が請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸で安定的に形質転換される、請求項１６に記載の昆虫細胞。
【請求項２１】
複数の請求項１６に記載の細胞；および
培地
を含む、細胞培養物。
【請求項２２】
癌を治療するための医薬組成物であって、治療的有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
癌を治療するための医薬組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含む治療的有効量のアデノ随伴ウィルスを含む、医薬組成物。
【請求項２４】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、子宮頸癌および鼻咽頭癌からなる群から選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
癌を治療するための医薬組成物であって、治療的有効量の請求項１１に記載のウィルスベクターを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１１年１２月８日出願、米国特許仮出願第６１／５６８，５９５号および２０１２年３月３１日出願、米国特許仮出願第６１／６１８，６８９号に対する優先権を主張する。これらの出願は、その全体が各々、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
本発明の開示の一部である配列表は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含むコンピューター読み取り可能な形態および書面での配列表を含む。コンピューター読み取り可能な形態で記録される配列表情報は、書面での配列表と同一である。配列表の対象物は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００３】
序論
本発明の開示は、ウィルス学の分野に、さらに特定的には、昆虫細胞中で増殖され、癌のような哺乳動物疾患の処置のために用いられ得る核酸ベクターの分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
毒性遺伝子およびこのような遺伝子によりコードされるタンパク質は、細胞死を誘導することを伴う疾患の治療、例えば細胞死を引き起こす遺伝子の発現を伴う癌療法のために用いられてきた、または用いるために提案されてきた。自殺遺伝子治療は、癌処置のための魅力的な戦略になってきている（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ．  Ｒ．とＳｉｍｏｎｓ，Ｊ．Ｗ．  Ｕｒｏｌｏｇｙ５４：４０１〜４０６，１９９９年参照）。自殺遺伝子治療は、産物が毒性であるか、またはプロドラッグの投与に併せて毒性産物を生産する遺伝子の送達に依存する（Ｄｅｎｎｉｎｇ，Ｃ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１８２５〜１８３５、１９９７年）。自殺遺伝子治療は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染の処置のために、移植片対宿主病を制御するために、および癌の治療のためにも、広範に研究されてきた。毒性遺伝子、例えばジフテリア毒素Ａ断片（ＤＴ−Ａ）、シュードモナス外毒素（ＰＥ）またはバルナーゼを含有するウィルスベクターの生成は、これらの毒素の極端な毒性のために、実行が難しかった。
【０００５】
毒性遺伝子によりコードされるあるタンパク質は、非常に低レベルの発現で宿主細胞を死滅させ得る。例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）の単一分子は、細胞を死滅させ得る（Ｙａｍａｉｚｕｍｉ，  Ｍ．ら、（１９７８年）Ｃｅｌｌ１５：２４５〜２５０）。ＤＴは、伸長因子２（ＥＦ２）のＡＤＰ−リボシル化を触媒することによりタンパク質合成を害すると考えられる。ＤＴは、アポトーシス媒介性経路により主に死滅させ、および細胞周期非依存性様式で細胞を死滅させると考えられる。これは、いくつかの悪性疾患、例えば前立腺癌が非常に低い有糸分裂指数を有する傾向があるので、ＤＴを魅力的な癌療法にする。同様に、リボヌクレアーゼバルナーゼは、癌細胞を標的にするための強力な毒性作用物質として示唆されてきた（Ｅｄｅｌｗｅｉｓｓ，Ｅら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ３：ｅ２４３４、２００８年）。
【０００６】
しかしながら、標的細胞、例えば癌細胞への毒性遺伝子の送達のために用いられ得るウィルスベクター、例えば組換えアデノウィルス、組換えバキュロウィルスおよびアデノ随伴ウィルスの生産は、宿主細胞に対する毒性遺伝子の毒性により妨害され得る。したがって、毒性遺伝子を保有するウィルスベクターは、ベクターを増殖するために用いられる宿主細胞にとって致死的でない条件下で増殖されるだけでなく、ベクターは、癌細胞のような標的細胞に毒性を及ぼすことができなければならない。
【０００７】
誘導性および／または組織特異的プロモーターの使用によるＤＴ−Ａのような毒性遺伝子の毒性を制限しようとする従来の試みは、多様な結果をもたらしてきた。例えば、Ｍａｘｗｅｌｌら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４６：４６６０〜４６６４、１９８６年）は、切断型メタロチオネインプロモーターを用いて、このプロモーターの基礎発現が、重金属の非存在下でも、タンパク質合成の実質的抑制を生じる、ということを実証した。この抑制は、免疫グロブリン・エンハンサーエレメントの付加により増大され得るが、カドミウムによっては最小限に過ぎなかった。著者は真の特異的細胞毒性を実証できなかったが、しかし、おそらくはこの高度毒性遺伝子の基礎発現の結果として、むしろＤＴ−Ａ媒介性細胞死に対する選択的細胞感受性を実証できなかったに過ぎない。この群は、ＤＴ−Ａの弱毒化突然変異体も導入した（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｆ．ら（１９８７年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．７：１５７６〜１５７９；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．とＭａｘｗｅｌｌ，  Ｉ．Ｈ．（１９９５年）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１３７〜１４３）。この群および他のものによるその後の尽力は、ＤＴ−Ａの弱毒化突然変異体を導入することに（Ｍａｘｗｅｌｌ，  Ｆ．ら（１９８７年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１５７６〜１５７９）、または原核生物制御エレメントを用いて遺伝子発現を厳密に調節することに（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．とＭａｘｗｅｌｌ，  Ｉ．Ｈ．（１９９５年）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１３７〜１４３；Ｐａｕｌｕｓ，  Ｗ．ら（１９９７年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８７：８９〜９５）集中した。両方の場合に、選択的細胞死滅が実証されたが、非特異的細胞死滅の完全廃止は得られなかった。Ｋｅｙｖａｎｉら（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６４：１７１９〜１７２４、１９９９年）は、弱毒化ＤＴ−Ａ突然変異体を発現するためにｔｅｔ抑制遺伝子ベースの系を用いたが、これらの研究者は、（１）ＤＴ−Ａ突然変異体の発現はテトラサイクリン応答性プロモーターにより十分に制御され得るが、しかしその毒性はそうではない、と結論づけた。
【０００８】
米国特許第７，５８２，２９０号（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ．ら）は、前立腺癌のための自殺遺伝子治療に用いるための前立腺特異的プロモーターにより駆動されるジフテリア毒素のＡサブユニット（ＤＴ−Ａ）を発現する複製能欠損アデノウィルス（Ａｄ）を開示する。本特許は、ＤＴによるタンパク質合成の抑制に対する耐性を提供するＥＦ−２タンパク質の位置７０５におけるグリシンからアルギニンへの突然変異を記載する。この特許における発明は、遺伝子療法における複製能欠損アデノウィルスの適用における大きな問題は、複製コンピテントアデノウィルス（ＲＣＡ）の存在であって、これはＡｄベクター中の配列とヘルパー細胞中の相同Ａｄ配列との間の組換えにより生成される、ということを力説している。これらの発明者らは、細胞がＲＣＡを作らない自殺遺伝子治療のためにＤＴ発現アデノウィルスをパッケージするための、ＤＴ−耐性ヘルパー細胞株も開示する。これらの発明者らはさらに、かれらがＴＳＵ細胞（前立腺癌細胞株）からコドン７０５をスパニングするＥＦ−２遺伝子から５００ｂｐ領域を増幅した、ということを開示する。部位特異的突然変異誘発を用いて、これらの発明者らは、コドン７０５を「ＧＧＡ」から「ＡＧＡ」に変えて、グリシンの代わりにアルギニンをコードした。相同組換えを用いて、彼らは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（二倍体ヒト胚性網膜芽細胞（「ＨＥＲ」）由来であり、米国特許第５，９９４，１２８号、第６，２６５，２１２号、第６，０３３，９０８号および第６，３０６，６５２号に記載されている）におけるＥＦ−２タンパク質の位置７０５においてグリシンをアルギニンに取り替えて、アデノウィルスベクターをパッケージングするためのＤＴ耐性ヘルパー細胞株を生成した。これらの細胞は、ヒトホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下でＡｄ血清型５（Ａｄ５）Ｅ１−Ａ＆Ｅ１−Ｂコード配列（Ａｄ５ヌクレオチド４５９〜３５１０）を含有する。これらの発明者らによれば、非重複Ｅ１−欠失アデノウィルスとともに用いられるこれらの細胞は、ウィルスプレップ中のＲＣＡの存在を排除する。
【０００９】
Ｗａｎｇら（Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６：５７９８〜５８０６，２００６年）は、神経膠原繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の転写調節配列を収容して、神経膠腫細胞中のＤＴ−Ａ遺伝子の発現を駆動する組換えバキュロウィルスを記載する。ＧＦＡＰプロモーターは昆虫細胞中では不活性であるため、それらはＤＴ−Ａ毒性遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスを生成し得た。しかしながら、細胞型特異的プロモーター、例えばＧＦＡＰプロモーターは、ウィルス由来の陽性対照配列、例えばヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）媒介性初期遺伝子のエンハンサー／プロモーターと比較して相対的に弱い転写活性を示し、したがって、その適用を制限する。
【００１０】
Ｋｏｈｌｓｃｈｕｔｔｅｒら（Ｔｏｘｉｎｓ２：２７５４〜２７６８，２０１０年）は、ＤＴ−Ａ遺伝子を保有するＡＡＶベクターを記載する（この場合、ＴｅｔＲ抑制因子系を用いて、ＤＴ−Ａの発現を減少させた）。著者らが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にＤＴ−Ａ遺伝子を保有するいくつかのＡＡＶベクターを作製した場合でも、それらのＡＡＶは一般的に、ＤＴ−Ａ遺伝子を有さないＡＡＶベクター、例えばＰＵＭＡ遺伝子を保有するベクター（ＡＡＶＴｅｔＯ２−ＰＵＭＡ）より、２〜３ｌｏｇ低かった。著者らは、より低い力価をＤＴＡタンパク質の残りの発現のせいであるとした。
【００１１】
米国特許第６，７２３，５５１号（Ｋｏｔｉｎら）は、昆虫細胞におけるアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）の産生方法を記載する。これらの発明者らは、ＡＡＶ遺伝子により含まれるイントロンが昆虫細胞中で適正にスプライスされない、と力説する。これらの発明者らは、イントロンを欠くよう工学処理されたＡＡＶ遺伝子を用いることにより、昆虫細胞中でＡＡＶを産生した。しかしながら、この特許は、昆虫細胞中で毒性遺伝子を保有するベクターを増殖させることを教示も示唆もしていない。
【００１２】
現在、癌細胞を死滅させるのに用いるといったような治療的使用のための自殺遺伝子治療ベクターを産生するための付加的組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
昆虫細胞中で毒性遺伝子を保有するウィルスベクターを増殖させる必要性にかんがみて、毒性遺伝子を含む修飾バキュロウィルスベクターおよびアデノ随伴ウィルスベクター、このようなベクターを含む昆虫細胞、このようなベクターおよび細胞の作製方法、ならびにこのようなベクターを用いる処置方法を、本発明者は開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の教示の核酸は、昆虫細胞中で毒性遺伝子を増殖するための核酸であり得る。いくつかの形態では、核酸は、毒性ポリペプチドをコードする配列、および配列を中断するイントロンを含み、本質的にそれらからなり、またはそれらからなり、それによりイントロンを含むＲＮＡは、昆虫細胞によってではなく哺乳動物細胞によってスプライスされ、昆虫細胞においてではなく哺乳動物細胞において、翻訳時に、細胞毒性レベルの毒性ポリペプチドを産生する翻訳可能なｍＲＮＡを形成し得る。いくつかの形態では、核酸は、毒性ポリペプチド、例えば、これらに限定されないが、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）、バルナーゼ、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素または前アポトーシス性ポリペプチドをコードする配列を含み得る。このような毒性ポリペプチド（およびペプチド）をコードする配列は、当業者に周知であり（例えば、Ｅｌｌｅｒｂｙ，Ｈ．Ｍ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：１０３２〜１０３８，１９９９年参照）、公的にアクセス可能な情報源、例えば国立生物工学情報センターのウェブサイトから入手可能である。いくつかの形態では、核酸は、毒性ポリペプチド、例えばジフテリア毒素、例えばＤＴ−Ａをコードし得る。いくつかの形態では、核酸は、毒性ポリペプチド、例えばバルナーゼをコードし得る。
【００１５】
種々の形態において、本発明の教示のイントロンは、昆虫細胞では適正にスプライスされないが、しかし哺乳動物により適正にスプライスされる任意のイントロン、例えば、これらに限定されないが、ヒト成長ホルモン遺伝子からのイントロン、またはＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子からのイントロンであり得る。
【００１６】
種々の形態において、本発明の教示の核酸は、毒性ポリペプチドをコードする配列と作動可能に連結される発現制御配列をさらに含み得る。発現制御配列は、例えばプロモーター、ＩＲＥＳ、エンハンサーおよび／またはそれらの組合せであり得る。
【００１７】
非限定的図解において、図１は、イントロンを含み、プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターと作動可能に連結されるＤＴ−Ａ遺伝子のような毒性遺伝子の遺伝子および転写地図を示す。哺乳動物細胞中への本発明の教示のイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子の導入時、遺伝子は転写され、イントロンのスプライシングにより成熟ＤＴ−Ａ  ｍＲＮＡが哺乳動物細胞中に形成される。成熟ＲＮＡは、機能性ＤＴ−Ａタンパク質に翻訳されて、細胞を死滅させる。ＤＴ−Ａコード配列に基づいた遺伝子地図上の数字（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ００７０３）は、イントロンが挿入されるヌクレオチド位置を示す。ＣＭＶｐｒ＝サイトメガロウィルスプロモーター；ＤＴ−Ａ＝ジフテリア毒素Ａ核酸配列；ｐＡ＝ポリアデニル化シグナル。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明の教示は、上記の核酸を含むウィルスベクターを包含する。種々の形態において、ウィルスベクターは、例えばバキュロウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）またはそれらの組合せ、例えば、米国特許出願公開第２００９０２０３０７１号に記載されたような、しかしコード配列がイントロンで中断される毒性遺伝子をコードする配列も含むよう修飾された、例えばＡＡＶ配列を含むバキュロウィルスであり得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明の教示は、上記の核酸または上記の核酸を含むウィルスゲノムを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでの昆虫細胞を包含する。
【００２０】
種々の形態において、昆虫細胞は、これに限定されないが、当業者に既知の樹立昆虫細胞株の細胞、これに限定されないが、例えばＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ＢＴＩ−Ｔｎ−５ＢＩ−４細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ２１細胞であり得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明の教示は、上記の複数の細胞、および培地を含む細胞培養物を包含する。種々の形態において、このような細胞株は、ウィルス、例えばＡＡＶを蓄積し、この場合、非濃縮細胞培地は、１０９ＡＡＶゲノム／ｍｌを超える、１０１０ＡＡＶゲノム／ｍｌを超える、１０１１ＡＡＶゲノム／ｍｌを超えるまたは１０１２ＡＡＶゲノム／ｍｌを超える力価でウィルスを含み得る。例えば種々の形態において、非濃縮培養細胞培地  １リットルは、少なくとも１０１３、少なくとも１０１４または少なくとも１０１５ＡＡＶウィルス粒子を、本発明の教示のバキュロウィルスで昆虫細胞培養物を感染後、３日以内に含み得る。
【００２２】
種々の形態において、本発明の教示の細胞株または細胞培養物はバキュロウィルスを蓄積し、この場合、非濃縮細胞培地は、１０９ｐｆｕ／ｌを超える、１０１０ｐｆｕ／ｌを超える、１０１１ｐｆｕ／ｌを超える、または１０１２ｐｆｕ／ｌを超える力価で、トランスフェクション後４日以内にウィルスを含み得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明の教示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの毒性遺伝子を含むベクターの増殖方法を包含する。種々の形態において、これらの方法は、昆虫細胞を含む細胞培養物を提供すること；本発明の教示の核酸またはウィルスで細胞を感染させるかまたはトランスフェクトすること；およびウィルス産生に適した条件下で細胞をインキュベートすることを包含する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明の教示は、癌の治療方法を包含する。種々の形態において、これらの方法は、治療を必要とする被験体に本発明の教示の核酸またはウィルスを投与することを包含する。いくつかの形態において、ウィルスは、バキュロウィルスまたはアデノ随伴ウィルスであり得る。本発明の核酸またはウィルスを用いる治療に対する癌対象は、これらに限定されないが、任意の癌、例えば、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、子宮頸癌または鼻咽頭癌であり得る。本発明の教示の種々の実施形態において、本発明の教示のウィルス、例えば本発明の教示のＡＡＶ、または本発明の教示のバキュロウィルスは、哺乳動物を感染させるが、しかし哺乳動物細胞内で複製し得ないウィルスであり得る。
【００２５】
種々の実施形態において、本発明の教示は、疾患、例えば癌の治療のための上記の核酸またはウィルスの使用を包含する。
【００２６】
種々の実施形態において、本発明の教示は、癌の治療に用いるための本明細書中に記載される核酸またはウィルスを包含する。種々の実施形態において、本発明の教示は、癌の治療のための医薬の製造における使用のための本明細書中に記載される核酸またはウィルスを包含する。
【００２７】
種々の実施形態において、昆虫細胞内ではなく哺乳動物細胞が、宿主細胞により翻訳されて、宿主細胞に対して致死性であるポリペプチドを産生し得る成熟ｍＲＮＡを発現できるように、イントロンをさらに含む毒性遺伝子（これらに限定されないが、例えば、ＤＴ−Ａ遺伝子またはバルナーゼ遺伝子を含む）組換えバキュロウィルスまたは核酸を、本発明の教示は包含する。いくつかの形態において、毒性遺伝子のコード配列を中断するイントロンは、哺乳動物細胞により毒性遺伝子の転写体からスプライスされ得るが、しかし昆虫細胞ではそうならない（例えば、図１に記述）。哺乳動物細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト細胞）中へのイントロンを含む毒性遺伝子の導入時に、細胞は、毒性遺伝子の成熟ｍＲＮＡを産生し得る。成熟ｍＲＮＡは、哺乳動物細胞により機能性ＤＴ−Ａタンパク質（または他の毒性タンパク質）に翻訳されて、細胞を死滅させ得る。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明の教示は、昆虫細胞におけるイントロンを含む毒性遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスの産生方法を包含する。これらの実施形態では、組換えバキュロウィルスは、当業者に周知の方法により生成され得る。このような方法としては、これに限定されないが、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞中にバクミドＤＮＡをトランスフェクトすることが挙げられるが、バクミドのようなベクターは、イントロンが挿入される毒性遺伝子を含むよう修飾される。
【００２９】
本発明の教示のいくつかの実施形態は、イントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子またはイントロンを含むバルナーゼ遺伝子のような毒性遺伝子を保有するＡＡＶベクターを包含する。イントロンを伴う毒性遺伝子を含むＡＡＶベクターは、昆虫細胞中で産生され得る。宿主哺乳動物細胞中への導入時に、本発明の教示のＡＡＶベクターにより含まれる毒性遺伝子は、転写され、哺乳動物細胞中でスプライスされて、成熟毒性遺伝子ｍＲＮＡ（例えば、ＤＴ−Ａ  ｍＲＮＡまたはバルナーゼｍＲＮＡ）を形成し得る。成熟毒性遺伝子ｍＲＮＡは、宿主哺乳動物細胞により翻訳されて、毒性タンパク質（例えばＤＴ−Ａまたはバルナーゼ）を産生し、それにより宿主哺乳動物細胞を無能にするかまたは死滅させ得る。
【００３０】
本発明の教示のいくつかの実施形態は、昆虫細胞における毒性遺伝子、例えばＤＴ−Ａ遺伝子またはバルナーゼ遺伝子を保有するＡＡＶベクターの産生方法を包含する。これらの方法では、バキュロウィルスおよびＡＡＶ配列、例えばＢａｃ−Ｒｅｐ−Ｃａｐ（またはＢａｃ−ｉｎＣａｐ−ｉｎＲｅｐ）を含む第１のベクター、およびバキュロウィルスおよびＩＴＲ配列ならびにイントロンにより中断される毒性遺伝子（例えば、ＤＴ−Ａまたはバルナーゼ）を含む第２のベクターは、宿主昆虫細胞と接触させて、宿主細胞を共感染し得る。感染細胞は、イントロンにより中断される毒性遺伝子を含むＡＡＶを生じ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖されるこのような感染細胞は、Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞の培養の感染後３日以内に、非濃縮培地中で少なくとも１０９ウィルスゲノム／ｍｌ、少なくとも１０１０ウィルスゲノム／ｍｌ、少なくとも１０１１ウィルスゲノム／ｍｌまたは少なくとも１０１２ウィルスゲノム／ｍｌという、毒性遺伝子を含む組換えＡＡＶの力価を生じ得る。
【００３１】
本発明の教示のいくつかの態様は、昆虫細胞における毒性遺伝子を保有するＡＡＶベクターの産生の付加的方法を包含する。これらの方法では、昆虫細胞は、イントロンを含む毒性遺伝子（例えばＤＴ−Ａまたはバルナーゼ）に隣接するＡＡＶＩＴＲを含む導入遺伝子のような安定的に組み込まれた導入遺伝子を含むことを提供され得る（例えば図５参照）。これらの実施形態の細胞は、Ｂａｃ−Ｒｅｐ−Ｃａｐで感染され得る。Ｂａｃ−Ｒｅｐ−Ｃａｐでの感染後、細胞は、イントロンを含む毒性遺伝子（例えばＤＴ−Ａ）を含むＡＡＶベクターを産生し得る。種々の形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖される感染細胞の集団は、非濃縮培地中で少なくとも１０９ウィルスゲノム／ｍｌ、少なくとも１０１０ウィルスゲノム／ｍｌ、少なくとも１０１１ウィルスゲノム／ｍｌまたは少なくとも１０１２ウィルスゲノム／ｍｌという、組換えＡＡＶの力価を生じ得る。いくつかの形態において、このような高い値は、感染後約３日以内に獲得され得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明の教示は、ｉｎＤＴＡまたはｉｎバルナーゼを保有する安定的に組み込まれたＡＡＶゲノムを保有する昆虫細胞（例えばＳｆ９）を用いる、毒性遺伝子を保有するＡＡＶベクターの産生を包含する。種々の形態において、このような細胞は、３日間、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスで感染させられ得る。細胞ペレットが収集され、処理されて、ＡＡＶベクターが精製され得る。
【００３３】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の教示は、毒性ポリペプチドをコードする配列、および配列を中断するイントロンを含む核酸であって、それにより、イントロンが昆虫細胞ではなく哺乳動物細胞においてスプライスされ、昆虫細胞ではなく哺乳動物細胞において、翻訳されて細胞毒性レベルの毒性ポリペプチドを形成するｍＲＮＡを形成する、核酸を包含する。いくつかの形態において、毒素遺伝子によりコードされる毒素ポリペプチドは、これらに限定されないが、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）、バルナーゼ、リシン、アブリンまたはシュードモナス外毒素であり得る。いくつかの好ましい形態では、毒素は、それぞれジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）遺伝子またはバルナーゼ遺伝子によりコードされるが、イントロン、例えば、これらに限定されないが、ヒト成長ホルモンイントロンまたはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンにより中断される、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）またはバルナーゼであり得る。種々の形態において、本発明の教示の核酸は、配列と作動可能に連結される少なくとも１つの発現エレメントをさらに含み得る。このような発現エレメントは、プロモーター、ＩＲＥＳ、エンハンサーおよびそれらの組合せのうちの１つ以上を包含し得る。いくつかの形態では、本発明の教示の核酸により含まれる発現エレメントは、ＣＭＶプロモーター、ＡＦＰプロモーター、ＡＦＰエンハンサー、ＳＵＲＶプロモーター、ＣＸＣＲ４プロモーター、ＴＥＲＴプロモーター、ＣＯＸ２プロモーターおよびＣＣＫＡＰプロモーターのうちの１つ以上を包含し得る。いくつかの形態では、本発明の教示の核酸により含まれる発現エレメントは、ｈＡＦＰプロモーター、ｈＡＦＰエンハンサー、ｈＳＵＲＶプロモーター、ｈＣＸＣＲ４プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ｈＣＯＸ２プロモーターおよびｈＣＣＫＡＲプロモーターのうちの１つ以上を包含し得る。いくつかの形態において、発現制御エレメントは、腫瘍細胞において発現を指図し得るプロモーター、例えばｈＳＵＲＶプロモーターまたはＣＸＣＲ４プロモーターであり得る。いくつかの好ましい形態では、発現エレメントは、ｈＳＵＲＶまたはＣＸＣＲ４プロモーターであり得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、毒性遺伝子の配列を中断するイントロンは、哺乳動物細胞によりスプライスされるが、昆虫細胞にはスプライスされない任意のイントロンであり得る。種々の形態において、イントロンは、人工イントロン、ヒト成長ホルモンイントロンまたはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンであり得る。
【００３５】
種々の実施形態において、本発明の教示の核酸またはウィルスベクターは、少なくとも１つのＩＴＲを含み得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明の教示の核酸またはウィルスベクターは、５’から３’への順序で、第１のＩＴＲ、プロモーター、毒性遺伝子の第１の部分、イントロン、毒性遺伝子の第２の部分、ポリアデニル化シグナルおよび第２のＩＴＲを含み得る。種々の形態において、第１のＩＴＲはＡＡＶ  ＩＴＲであり、第２のＩＴＲはＡＡＶ  ＩＴＲであり得る。
【００３７】
本発明の教示のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載される核酸を含むウィルスベクターを包含する。いくつかの形態において、ウィルスベクターは、バキュロウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）またはそれらの組合せであり得るし、特にベクターは、バキュロウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）またはそれらの組合せである。本発明の教示の核酸を含むＡＡＶの非限定例としては、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ２が挙げられる。
【００３８】
本発明の教示のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載される核酸を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでの昆虫細胞を包含する。本発明の教示の種々の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの個々の昆虫細胞、昆虫細胞株、昆虫細胞培養物およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの昆虫細胞集団を包含する。種々の形態において、本発明の教示の昆虫細胞としては、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉＢＴＩ−Ｔｎ−５ＢＩ−４細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ２１細胞が挙げられるが、これらに限定されない。昆虫細胞集団または細胞株としては、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉＢＴＩ−Ｔｎ−５ＢＩ−４細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ２１細胞およびその任意の組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。種々の形態において、昆虫細胞は、ウィルスゲノムにより構成される核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の教示の昆虫細胞は、本発明の教示の核酸を含むウィルスを含み得る。種々の形態において、これらの実施形態のウィルスは、ＡＡＶ、バキュロウィルスまたはそれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態では、本発明の教示の昆虫細胞は、本発明の教示の核酸で安定的に形質転換され得る。
【００３９】
本発明の教示の実施形態は、細胞培養物、例えば昆虫細胞培養物を包含する。種々の形態において、細胞培養物は、本発明の教示の核酸を含む細胞、および細胞培地を包含し得る。種々の形態において、細胞培養物は、細胞培地の濃度に伴うことなく１ｍｌ当たり１０９を超えるウィルスゲノムを、細胞培地の濃度に伴うことなく１ｍｌ当たり１０１０を超えるウィルスゲノムを、細胞培地の濃度に伴うことなく１ｍｌ当たり１０１１を超えるウィルスゲノムを、細胞培地の濃度に伴うことなく１ｍｌ当たり１０１２を超えるウィルスゲノムを含み得る。種々の実施形態において、本発明の教示の細胞株、細胞培養物または細胞集団は、本発明の教示の核酸を含むバキュロウィルスを含み得る。種々の形態において、細胞株、細胞培養物または細胞集団は、非濃縮培地中に１０６ＰＦＵ／ｍｌを超える、非濃縮培地中に１０７ＰＦＵ／ｍｌを超える、非濃縮培地中に１０８ＰＦＵ／ｍｌを超える、または非濃縮培地中に１０９ＰＦＵ／ｍｌを超えるバキュロウィルスを含み得る。
【００４０】
本発明の教示のいくつかの実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの毒性遺伝子を含むベクターの増殖方法を包含する。種々の形態において、これらの方法は、昆虫細胞を含む細胞培養物を提供すること；毒性ポリペプチドをコードする配列および配列を中断するイントロンを含む本発明の教示の核酸で細胞を感染させるかまたはトランスフェクトすること；およびウィルス産生に適した条件下で細胞をインキュベートすることを包含する。種々の形態において、核酸は、ウィルス、例えばバキュロウィルス、ＡＡＶまたはそれらの組合せにより含まれ得る。したがって、種々の形態において、これらの方法は、昆虫細胞を含む細胞培養物を提供すること；およびウィルスベクター、例えば本発明の教示の核酸を含むＡＡＶで、およびＢａｃ−ｉｎＣａｐ−ｉｎＲｅｐのような第２のベクターで細胞を感染させることを包含する。こうした感染は、少なくとも約１日に亘って、少なくとも２日間、少なくとも３日間、約３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、約５日までの間、少なくとも６日間、約６日までの間、７日間、または約７日までの間生じ得る。種々の形態において、これらの方法は、さらに、細胞を溶解して、ＡＡＶを含む溶解物を形成することを含み得る。溶解物は細胞残屑も包含し得るため、この方法は、ベンゾナーゼで細胞残屑を消化することをさらに含む。種々の形態において、これらの方法の核酸を含むＡＡＶは、任意のＡＡＶ、例えばＡＡＶ２またはＡＡＶ９であり得る。いくつかの形態において、昆虫細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉＢＴＩ−Ｔｎ−５ＢＩ−４細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ２１細胞であり得る。いくつかの好ましい形態では、これらの方法における昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞である。
【００４１】
本発明の教示のいくつかの実施形態は、ＨＩＶ感染、移植片対宿主病または癌のような疾患または医学的症状を治療する方法を包含する。種々の形態において、これらの方法は、治療を必要とする被験体に、治療的有効量の本発明の教示の核酸を投与することを含み得る。種々の形態において、核酸は、ウィルス、例えばＡＡＶにより含まれ得るし、それゆえ、この方法は、本発明の教示の核酸を含む治療的有効量のウィルス、例えばＡＡＶを、治療を必要と知る被験体に投与することを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ２またはＡＡＶ９、さらに好ましくはＡＡＶ２であり得る。種々の形態において、開示された方法により治療され得る癌は、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、子宮頸癌または鼻咽頭癌であり得るが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の教示のいくつかの実施形態は、ＨＩＶ感染、移植片対宿主病または癌の治療のための本発明の教示の核酸またはウィルスの使用を包含する。
【００４３】
本発明の教示のいくつかの実施形態は、ＨＩＶ感染、移植片対宿主病または癌の治療に用いるための本発明の教示の核酸またはウィルスを包含する。
【００４４】
本発明の教示のいくつかの実施形態は、ＨＩＶ感染、移植片対宿主病または癌の治療に用いるための本発明の教示の核酸またはウィルスの使用を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、イントロンを含み、プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターと作動可能に連結されるＤＴ−Ａ遺伝子のような毒性遺伝子の遺伝子および転写地図を示す。
【図２】図２は、ヒト成長ホルモンイントロンにより中断されるＤＴ−Ａ遺伝子またはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンにより中断され、ＧＦＰと枠内融合されるバルナーゼ遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスを昆虫細胞中で産生する方法を示す。
【図３】図３は、オープンリーディングフレーム内にイントロンを含むよう修飾されたＤＴ−Ａ遺伝子のような毒性遺伝子を保有する代表的ＡＡＶベクターの遺伝子および転写地図を示す。
【図４】図４は、昆虫細胞中でＤＴ−Ａ遺伝子のような毒性遺伝子を保有するＡＡＶベクターを産生する方法を示す。
【図５】図５は、安定的に組み込まれたＡＡＶ導入遺伝子を有する昆虫細胞におけるイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子のような毒性遺伝子を保有するＡＡＶベクターを産生する代替的方法を示す。Ｂａｃ、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびＩＴＲは、米国特許出願公開第２００９０２０３０７１号に記載されたものと同じである。
【図６】図６〜１１は、本発明の教示の種々の形態において用いられ得るｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミドの地図を示す。各ベクターは、Ｔｎ７ＲおよびＴｎ７Ｌ標的部位；アンピシリン耐性選択マーカー（ＡＭＰ）；ゲンタマイシン耐性選択マーカー；コード配列内に存在しないｈＧＨイントロン；ＡＡＶＩＴＲ；およびＳＶ４０ｐＡ  １４４ｂｐポリアデニル化配列ＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴ（配列番号１）を含む。しかしながら、これらの構成成分は、独立して、本発明の教示の種々の実施形態を実行するために必要とされるわけではない。略号：ＤＴ−Ａ、ジフテリアＡ断片；ＣＭＶ、サイトメガロウィルスプロモーター；ｈＧＨ、ヒト成長ホルモンイントロン；Ｂａｒ、バルナーゼ；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＳＶ４０、シミアンウィルス４０ラージＴ−抗原イントロン；ｈＴＥＲＴ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター。  図６は、ＡＡＶＩＴＲ間に、ＤＴ−Ａコード配列と作動可能に連結されるＣＭＶプロモーターを含むｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミドの地図を示す。この場合、ベクターは、Ｔｎ７ＲおよびＴｎ７Ｌ標的部位；アンピシリン耐性選択マーカー；ゲンタマイシン耐性選択マーカー；コード配列内に存在しないｈＧＨイントロン；ＡＡＶ  ＩＴＲ（複数）；およびＳＶ４０ｐＡ  １４４ｂｐポリアデニル化配列を含む。略号：ＤＴ−Ａ、ジフテリアＡ断片；ＣＭＶ、サイトメガロウィルスプロモーター；ｈＧＨ、ヒト成長ホルモンイントロン。
【図７】図７は、ＡＡＶＩＴＲ間に、ヒト成長ホルモンイントロンにより中断されるＤＴ−Ａコード配列と作動可能に連結されるＣＭＶプロモーターを含むｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミドを示す。この場合、ベクターは、Ｔｎ７ＲおよびＴｎ７Ｌ標的部位；アンピシリン耐性選択マーカー；ゲンタマイシン耐性選択マーカー；コード配列内に存在しないｈＧＨイントロン；ＡＡＶ  ＩＴＲ（複数）；およびＳＶ４０ｐＡ  １４４ｂｐポリアデニル化配列を含む。略号：ＤＴ−Ａ、ジフテリアＡ断片；ＣＭＶ、サイトメガロウィルスプロモーター；ｈＧＨ、ヒト成長ホルモンイントロン；ＳＶ４０、シミアンウィルス４０ラージＴ抗原イントロン。
【図８】図８は、ＡＡＶＩＴＲ間に、ＧＦＰと枠内融合されるバルナーゼコード配列と作動可能に連結されるＣＭＶプロモーターを含むｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミドの地図を示す。この場合、ベクターは、Ｔｎ７ＲおよびＴｎ７Ｌ標的部位；アンピシリン耐性選択マーカー；ゲンタマイシン耐性選択マーカー；コード配列内に存在しないｈＧＨイントロン；ＡＡＶ  ＩＴＲ（複数）；およびＳＶ４０ｐＡ  １４４ｂｐポリアデニル化配列を含む。略号：ＣＭＶ、サイトメガロウィルスプロモーター；ｈＧＨ、ヒト成長ホルモンイントロン；Ｂａｒ、バルナーゼ；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＳＶ４０、シミアンウィルス４０ラージＴ−抗原イントロン。
【図９】図９は、ＡＡＶＩＴＲ間に、ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンにより中断され、ＧＦＰと枠内融合されるバルナーゼコード配列と作動可能に連結されるＣＭＶプロモーターを含むｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミドの地図を示す。この場合、ベクターは、Ｔｎ７ＲおよびＴｎ７Ｌ標的部位；アンピシリン耐性選択マーカー；ゲンタマイシン耐性選択マーカー；コード配列内に存在しないｈＧＨイントロン；ＡＡＶ  ＩＴＲ（複数）；およびＳＶ４０ｐＡ  １４４ｂｐポリアデニル化配列を含む。略号：ＣＭＶ、サイトメガロウィルスプロモーター；ｈＧＨ、ヒト成長ホルモンイントロン；Ｂａｒ、バルナーゼ；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＳＶ４０、シミアンウィルス４０ラージＴ−抗原イントロン。
【図１０】図１０は、ＡＡＶＩＴＲ間に、ヒト成長ホルモンイントロンにより中断されるＤＴ−Ａコード配列と作動可能に連結されるｈＴＥＲＴプロモーターを含むｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミドの地図を示す。この場合、ベクターは、Ｔｎ７ＲおよびＴｎ７Ｌ標的部位；アンピシリン耐性選択マーカー；ゲンタマイシン耐性選択マーカー；コード配列内に存在しないｈＧＨイントロン；ＡＡＶ  ＩＴＲ（複数）；およびＳＶ４０ｐＡ  １４４ｂｐポリアデニル化配列を含む。略号：ＤＴ−Ａ、ジフテリアＡ断片；ｈＧＨ、ヒト成長ホルモンイントロン；ＳＶ４０、シミアンウィルス４０ラージＴ−抗原イントロン；ｈＴＥＲＴ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター。
【図１１】図１１は、ＡＡＶＩＴＲ間に、ＧＦＰコード配列と作動可能に連結されるｈＴＥＲＴプロモーターを含むｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミドの地図を示す。この場合、ベクターは、Ｔｎ７ＲおよびＴｎ７Ｌ標的部位；アンピシリン耐性選択マーカー；ゲンタマイシン耐性選択マーカー；コード配列内に存在しないｈＧＨイントロン；ＡＡＶ  ＩＴＲ（複数）；およびＳＶ４０ｐＡ  １４４ｂｐポリアデニル化配列を含む。略号：ｈＧＨ、ヒト成長ホルモンイントロン；Ｂａｒ、バルナーゼ；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＳＶ４０、シミアンウィルス４０ラージＴ−抗原イントロン；ｈＴＥＲＴ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター。
【図１２】図１２は、バクミドＤＮＡでトランスフェクトした後のＳｆ９細胞中での組換えバキュロウィルスの生成（図１２Ａ、図１２Ｃ）、および感染によるＳｆ９細胞中での組換えバキュロウィルスの増幅（図１２Ｂ、図１２Ｄ）を示す。
【図１３】図１３は、ヒト成長ホルモンイントロンにより中断されるＤＴ−Ａ遺伝子、およびＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンにより中断され、ＧＦＰと枠内融合されるバルナーゼ遺伝子を保有する代表的組換えバキュロウィルスの遺伝子および転写地図を示す。
【図１４】図１４は、毒性遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスで４８時間形質導入することにより哺乳動物（ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３）細胞に及ぼす死滅作用を示す。
【図１５】図１５は、安定的に組み込まれたＡＡＶ導入遺伝子を保有する昆虫細胞における、ヒト成長ホルモンイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子またはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含みＧＦＰ遺伝子と枠内融合されるバルナーゼ遺伝子を保有するＡＡＶベクターの産生方法を示す。
【図１６】図１６は、ヒト成長ホルモンイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子、またはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含み、ＧＦＰと枠内融合されるバルナーゼ遺伝子を保有する代表的ＡＡＶベクターの遺伝子および転写地図を示す。
【図１７】図１７は、哺乳動物細胞に及ぼすＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）の死滅作用を示す。
【図１８】図１８は、毒性遺伝子を保有するＡＡＶベクターで形質導入することによる哺乳動物細胞に及ぼす死滅作用を示す。
【図１９】図１９は、ＡＡＶ２−ｈＳＵＲＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）による細胞死滅の代表的結果を示す。
【図２０】図２０は、種々の腫瘍特異的プロモーターの制御下でのＤＴ−Ａを保有するＡＡＶ２ベクターによる腫瘍細胞の細胞生存度検定を示す。細胞を９６ウェルプレート上に播種し、４倍連続希釈でＡＡＶ２ベクターで４日間形質導入して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光細胞生存度検定キットで細胞生存度を検定した。（ａ）ＨｅｐＧ２細胞、（ｂ）Ｈｅｐ３Ｂ細胞および（ｃ）ＢＥ（２）−Ｍ１７細胞。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
本発明の教示は、イントロンを含む毒性遺伝子を開示するが、この場合、昆虫細胞中での転写後、イントロンはスプライスされず、したがって毒性遺伝子産物は昆虫細胞中に形成されない。このようなイントロン中断毒性遺伝子を含むベクターは、昆虫細胞中で増殖され得る。しかしながら、哺乳動物細胞、例えば癌細胞中への導入時に、毒性遺伝子の転写は成熟ｍＲＮＡの形成を生じ、これは、宿主哺乳動物細胞を死滅させる毒性タンパク質に翻訳される。
【００４７】
図１は、イントロンを含み、ＣＭＶプロモーターと作動可能に連結されるＤＴ−Ａ遺伝子の例示的遺伝子および転写地図を示す。哺乳動物細胞中への本発明の教示のイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子の導入時に、遺伝子は転写され、イントロンのスプライシングにより成熟ＤＴ−Ａ  ｍＲＮＡが哺乳動物細胞中に形成される。成熟ＲＮＡは、機能性ＤＴ−Ａタンパク質に翻訳されて、細胞を死滅させる。ＤＴ−Ａコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ００７０３）に基づいた遺伝子地図上の数字は、イントロンが挿入されるヌクレオチド位置を示す。ＣＭＶｐｒ＝サイトメガロウィルスプロモーター；ＤＴ−Ａ＝ジフテリア毒素Ａ核酸配列；ｐＡ＝ポリアデニル化シグナル。
【００４８】
本明細書中に記載される方法および組成物は、当業者に周知の実験室技法を利用するが、それらは、例えば以下のような実験室マニュアルに見出され得る：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．  Ｒｉｃｈａｒｄ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９５年；Ｓｐｅｃｔｏｒ，  Ｄ．  Ｌ．ら、Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９９８年；およびＨａｒｌｏｗ，  Ｅ．，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９年。昆虫細胞における非相同ポリペプチドの発現の方法、ならびに昆虫細胞中にベクターおよび核酸を導入する方法、および昆虫細胞培養を維持する方法を記載する付加的参考文献としては、例えばＯ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ、１９９４年；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．６３：  ３８２２〜３２８８、１９８９年；Ｋａｊｉｇａｙａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４６４６〜４６５０、１９９１年；Ｒｕｆｆｉｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２〜６９３０、１９９２年；Ｋｉｍｂａｕｅｒら、Ｖｉｒ．２１９：３７〜４４、１９９６年；Ｚｈａｏら、Ｖｉｒ．２７２：３８２〜３９３，２０００年；および米国特許第６，２０４，０５９号（Ｓａｍｕｌｓｋｉら）が挙げられる。
【００４９】
本明細書中に記載される実験は、さらにまた、以下の材料および方法を使用し得る。
【００５０】
細胞培養：ＨＥＫ２９３細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有し、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス、ミズーリ州）を補足されたダルベッコの変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド、カリフォルニア州）中に、３７℃で保持した。ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ＢおよびＷＩ３８細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有し、１０％ウシ胎仔血清を補足されたＥＭＥＭ完全増殖培地（アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））中に３７℃で保持した。ＢＥ（２）Ｍ１７細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関）を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有し、１０％ウシ胎仔血清を補足された５０％ＥＭＥＭ＋５０％Ｆ１２完全増殖培地中に保持した。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａＳｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を含有するＥＳＦ９２１無血清培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ウッドランド、カリフォルニア州）中に２８℃で保持した。
【００５１】
組換えバキュロウィルスの生成および滴定：上記のように構築されたプラスミドを、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞を形質転換するために用いて、組換えバクミドを生成した。標的遺伝子を含有するバクミドを、わずかな修飾で、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）に従って、組換えバキュロウィルスを生成するために用いた。要するに、２ｎｇのプラスミドＤＮＡを、２０μｌのＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞を形質転換するために用いた。５００μｌのＳＯＣ培地中で３７℃でのインキュベーションの４時間後、２５および２．５μｌの培養を選択プレート中に別々にプレート化し、４８時間インキュベートして、白色／青色コロニーを生成させた。一般的には、３つの白色コロニーを各構築物のために選び出して、ミニプレップバクミドＤＮＡを調製した。バクミドＤＮＡをＳｆ９細胞をトランスフェクトするために用いて、組換えバキュロウィルスを生成した。組換えバキュロウィルスを一回増幅して、実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）検定で力価を確定し、２０コピーを１ｐｆｕに変換した経験的試験に基づいたプラーク形成単位（ｐｆｕ）に変換した。
【００５２】
ＡＡＶベクター産生、精製および滴定：ＡＡＶベクター産生、精製および滴定のための方法は、従来、記載されている（Ｃｈｅｎ，  Ｈ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：９２４〜９３０、２００８年）。要するに、Ｓｆ９細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＥＳＦ９２１無血清培地中で２８℃で〜１×１０７細胞／ｍｌに増殖させて、〜５×１０６細胞／ｍｌに希釈した後、感染させた。二重感染を用いて、ＡＡＶベクターを産生した。５感染多重度（ｍｏｉ）のＢａｃ−ＡＡＶ導入遺伝子および１０ｍｏｉのＢａｃ−ｉｎＣａｐ−ｉｎＲｅｐを用いて、２８℃で３日間、Ｓｆ９細胞を感染させて、ＡＡＶベクターを産生した。感染の３日後に、３，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により細胞ペレットを収集した。改質Ｓｆ９溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１％サルコシル、１％トリトンＸ−１００、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で細胞ペレットを溶解し、細胞核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を、ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を用いて消化した。８，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により細胞溶解物を清澄化して、上清を２回の超遠心分離に付して、ＡＡＶベクターを精製した。２ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて、０．００１％プルロニックＦ−６８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を含有するＰＢＳ中にＡＡＶベクターを緩衝液交換した。精製後、実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法でＡＡＶベクターを滴定した。
【００５３】
細胞増殖検定：ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレート中で一晩増殖させて（１．５ｅ＋５細胞／ウェル）、ＡＡＶ２ベクター（１．５ｅ＋９ｖｇ／ウェル）で４８時間、形質導入した。次に、細胞をトリプシン処理して、細胞数を計数した。コンフルエントに達するまでさらに４８時間、細胞を培養して、トリプシン処理し、細胞数を計数して、次に、大型容器中に拡げた。さらに７２時間培養後、細胞をトリプシン処理し、計数した。生存可能細胞を、トリパンブルー染色で計数した。
【００５４】
細胞生存度検定：メーカーのプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光細胞生存度検定キットを用いて細胞生存度を試験した。要するに、細胞（ＷＩ３８、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ＢおよびＢＥ（２）Ｍ１７）を３．２ｅ＋４細胞／ウェルで一晩、９６ウェルプレート上に播種して、４倍連続希釈で４日間、ＡＡＶ２ベクターで形質導入した。試薬を再構成して、細胞に付加した。軌道回転式振盪器上で２分間混合して細胞を溶解した後、プレートを室温で１０分間インキュベートして、次に、発光シグナルを記録した。
【００５５】
本発明の記述、図面およびあらゆる添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別記しない限り、同様に複数形を包含するよう意図される。
【００５６】
本発明者らは、昆虫細胞において毒性遺伝子を含むベクター、ならびに毒性遺伝子を含むベクターを含み得る昆虫細胞培養物を産生するための組成物および方法を開発して来ており、ウィルス、例えばＡＡＶを、非濃縮培地中で少なくとも１０９ウィルスゲノム／ｍｌ、少なくとも１０１０ウィルスゲノム／ｍｌ、少なくとも１０１１ウィルスゲノム／ｍｌまたは少なくとも１０１２ウィルスゲノム／ｍｌの力価に産生し得る。種々の形態において、細胞培養物は、非濃縮培地中に少なくとも１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌ、少なくとも１０７ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも１０８ＰＦＵ／ｍｌ、少なくとも１０９ＰＦＵ／ｍｌまたは少なくとも１０１０ＰＦＵ／ｍｌの力価にバキュロウィルスを産生し得る。
【００５７】
本発明の教示の種々の形態において用いられ得る昆虫細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で増殖し得る任意の昆虫細胞であり得る。このような細胞は当業者に周知であり、例としては、Ｋｏｓｔ，  Ｔ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３（５６７〜５７５、２００５年）ならびに本明細書中で引用される参考文献に開示されたものが挙げられるが、これに限定されない。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は本発明の教示の種々の実施形態の例証であって、いかなる特許請求の範囲をも限定するものではない。本発明の教示の範囲を逸脱しない限り、多数の変形形態がなされ得る、と当業者は理解する。
【００５９】
実施例１
この実施例は、ＤＴ−Ａコード配列と上流で作動可能に連結されるＣＭＶプロモーターを含むｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）であるプラスミドｐＦＢ−ＣＭＶ−ＤＴＡの構造および構築を例証する（図６）。
【００６０】
このプラスミドを構築するために、ＤＴ−Ａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ００７０３）を含有するプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ粘着末端を有するＤＴ−Ａコード配列を含有する断片を生成した。この断片をプラスミドｐＦＢ−ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｐＡのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションして、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＤＴＡを作成した。ＤＴ−Ａ遺伝子中にヒト成長ホルモンイントロンを挿入するために、ＰＣＲ法を用いた。先ず、ヌクレオチド番号１から１０３までの５’−ＤＴ−Ａ配列と一緒に上流接合配列を、フォワードプライマー５’−ＧＡＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＴＡＧＴＣＧＡＧ−３’（配列番号２）およびリバースプライマー
【化１】
0005998229.tif 000002
（配列番号３）（太字は、ヒト成長ホルモンイントロン配列を示す）を用いて増幅した。ヒト成長ホルモンイントロンを、フォワードプライマー
【化２】
0005998229.tif 000003
（配列番号４）（太字は、ヒト成長ホルモンイントロン配列を示す）およびリバースプライマー
【化３】
0005998229.tif 000004
（配列番号５）（イタリック体文字は、ＢｓｔＺ１７Ｉに関する制限部位を示す；太字は、ヒト成長ホルモンイントロン配列を示す）を用いて増幅した。次に、２つのＰＣＲ断片を、フォワードプライマー５’−ＧＡＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＴＡＧＴＣＧＡＧ−３’（配列番号６）およびリバースプライマー５’−ＴＴＴＴＧＴＡＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＧＧＣ−３’（配列番号７）を用いる二次ＰＣＲ増幅を介して一緒に接合した。次いで、接合ＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉで消化し、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＤＴＡのＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ部位にライゲーションして、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を作成し（図１、図７）、およびｐＦＢ−ＣＭＶｔｅｔＯ−ＤＴＡ−ｐ１０−ＴｅｔＲのＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ部位にライゲーションして、ｐＦＢ−ＣＭＶｔｅｔＯ−ｉｎＤＴＡ−ｐ１０−ＴｅｔＲを作成した。ＤＮＡ配列解析により、発現カセットを立証した。
【００６１】
この実施例で用いられるＤＴ−Ａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ００７０３）のＤＮＡ配列を以下に示す：
ｇｔｇａｇｃａｇａａａａｃｔｇｔｔｔｇｃｇｔｃａａｔｃｔｔａａｔａｇｇｇｇｃｇｃｔａｃｔｇｇｇｇａｔａｇｇｇｇｃｃｃｃａｃｃｔｔｃａｇｃｃｃａｔｇｃａｇｇｃｇｃｔｇａｔｇａｔｇｔｔｇｔｔｇａｔｔｃｔｔｃｔａａａｔｃｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｇａａａａｃｔｔｔｔｃｔｔｃｇｔａｃｃａｃｇｇｇａｃｔａａａｃｃｔｇｇｔｔａｔｇｔａｇａｔｔｃｃａｔｔｃａａａａａｇｇｔａｔａｃａａａａｇｃｃａａａａｔｃｔｇｇｔａｃａｃａａｇｇａａａｔｔａｔｇａｃｇａｔｇａｔｔｇｇａａａｇｇｇｔｔｔｔａｔａｇｔａｃｃｇａｃａａｔａａａｔａｃｇａｃｇｃｔｇｃｇｇｇａｔａｃｔｃｔｇｔａｇａｔａａｔｇａａａａｃｃｃｇｃｔｃｔｃｔｇｇａａａａｇｃｔｇｇａｇｇｃｇｔｇｇｔｃａａａｇｔｇａｃｇｔａｔｃｃａｇｇａｃｔｇａｃｇａａｇｇｔｔｃｔｃｇｃａｃｔａａａａｇｔｇｇａｔａａｔｇｃｃｇａａａｃｔａｔｔａａｇａａａｇａｇｔｔａｇｇｔｔｔａａｇｔｃｔｃａｃｔｇａａｃｃｇｔｔｇａｔｇｇａｇｃａａｇｔｃｇｇａａｃｇｇａａｇａｇｔｔｔａｔｃａａａａｇｇｔｔｃｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｃｔｔｃｇｃｇｔｇｔａｇｔｇｃｔｃａｇｃｃｔｔｃｃｃｔｔｃｇｃｔｇａｇｇｇｇａｇｔｔｃｔａｇｃｇｔｔｇａａｔａｔａｔｔａａｔａａｃｔｇｇｇａａｃａｇｇｃｇａａａｇｃｇｔｔａａｇｃｇｔａｇａａｃｔｔｇａｇａｔｔａａｔｔｔｔｇａａａｃｃｃｇｔｇｇａａａａｃｇｔｇｇｃｃａａｇａｔｇｃｇａｔｇｔａｔｇａｇｔａｔａｔｇｇｃｔｃａａｇｃｃｔｇｔｇｃａｇｇａａａｔｃｇｔｇｔｃａｇｇｃｇａｔｃａｇｔａｇｇｔａｇｃｔｃａｔｔｇｔｃａｔｇｃａｔａａａｔｃｔｔｇａｔｔｇｇｇａｔｇｔｃａｔａａｇｇｇａｔａａａａｃｔａａｇａｃａａａｇａｔａｇａｇｔｃｔｔｔｇａａａｇａｇｃａｔｇｇｃｃｃｔａｔｃａａａａａｔａａａａｔｇａｇｃｇａａａｇｔｃｃｃａａｔａａａａｃａｇｔａｔｃｔｇａｇｇａａａａａｇｃｔａａａｃａａｔａｃｃｔａｇａａｇａａｔｔｔｃａｔｃａａａｃｇｇｃａｔｔａｇａｇｃａｔｃｃｔｇａａｔｔｇｔｃａｇａａｃｔｔａａａａｃｃｇｔｔａｃｔｇｇｇａｃｃａａｔｃｃｔｇｔａｔｔｃｇｃｔｇｇｇｇｃｔａａｃｔａｔｇｃｇｇｃｇｔｇｇｇｃａｇｔａａａｃｇｔｔｇｃｇｃａａｇｔｔａｔｃｇａｔａｇｃｇａａａｃａｇｃｔｇａｔａａｔｔｔｇｇａａａａｇａｃａａｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｔｔｃｇａｔａｃｔｔｃｃｔｇｇｔａｔｃｇｇｔａｇｃｇｔａａｔｇｇｇｃａｔｔｇｃａｇａｃｇｇｔｇｃｃｇｔｔｃａｃｃａｃａａｔａｃａｇａａｇａｇａｔａｇｔｇｇｃａｃａａｔｃａａｔａｇｃｔｔｔａｔｃｇｔｃｔｔｔａａｔｇｇｔｔｇｃｔｃａａｇｃｔａｔｔｃｃａｔｔｇｇｔａｇｇａｇａｇｃｔａｇｔｔｇａｔａｔｔｇｇｔｔｔｃｇｃｔｇｃａｔａｔａａｔｔｔｔｇｔａｇａｇａｇｔａｔｔａｔｃａａｔｔｔａｔｔｔｃａａｇｔａｇｔｔｃａｔａａｔｔｃｇｔａｔａａｔｃｇｔｃｃｃｇｃｇｔａｔｔｃｔｃｃｇｇｇｇｃａｔａａａａｃｇｃａａｃｃａｔｔｔｃｔｔｃａｔｇａｃｇｇｇｔａｔｇｃｔｇｔｃａｇｔｔｇｇａａｃａｃｔｇｔｔｇａａｇａｔｔｃｇａｔａａｔｃｃｇａａｃｔｇｇｔｔｔｔｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｇｇｃａｃｇａｃａｔａａａａａｔｔａｃｔｇｃｔｇａａａａｔａｃｃｃｃｇｃｔｔｃｃａａｔｃｇｃｇｇｇｔｇｔｃｃｔａｃｔａｃｃｇａｃｔａｔｔｃｃｔｇｇａａａｇｃｔｇｇａｃｇｔｔａａｔａａｇｔｃｃａａｇａｃｔｃａｔａｔｔｔｃｃｇｔａａａｔｇｇｔｃｇｇａａａａｔａａｇｇａｔｇｃｇｔｔｇｃａｇａｇｃｔａｔａｇａｃｇｇｔｇａｔｇｔａａｃｔｔｔｔｔｇｔｃｇｃｃｃｔａａａｔｃｔｃｃｔｇｔｔｔａｔｇｔｔｇｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃａｔｇｃｇａａｔｃｔｔｃａｃｇｔｇｇｃａｔｔｔｃａｃａｇａａｇｃａｇｃｔｃｇｇａｇａａａａｔｔｃａｔｔｃｔａａｔｇａａａｔｔｔｃｇｔｃｇｇａｔｔｃｃａｔａｇｇｃｇｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｃｃａｇａａａａｃａｇｔａｇａｔｃａｃａｃｃａａｇｇｔｔａａｔｔｃｔａａｇｃｔａｔｃｇｃｔａｔｔｔｔｔｔｇａａａｔｃａａａａｇｃｔｇａ（配列番号８）。
【００６２】
ｈＧＨイントロンを含むＤＴ−Ａコード配列は、以下のとおりである：
ＡＴＧＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＣＧＴＡＣＣＡＣＧＧＧＡＣＴＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＡＴＧＴＡＧＡＴＴＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧｇｔａａｇｃｇｃｃｃｃｔａａａａｔｃｃｃｔｔｔｇｇｃａｃａａｔｇｔｇｔｃｃｔｇａｇｇｇｇａｇａｇｇｃａｇｃｇａｃｃｔｇｔａｇａｔｇｇｇａｃｇｇｇｇｇｃａｃｔａａｃｃｃｔｃａｇｇｇｔｔｔｇｇｇｇｔｔｃｔｇａａｔｇｔｇａｇｔａｔｃｇｃｃａｔｇｔａａｇｃｃｃａｇｔａｔｔｔｇｇｃｃａａｔｃｔｃａｇａａａｇｃｔｃｃｔｇｇｃｔｃｃｃｔｇｇａｇｇａｔｇｇａｇａｇａｇａａａａａｃａａａｃａｇｃｔｃｃｔｇｇａｇｃａｇｇｇａｇａｇｔｇｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｇｃｔｃｔｃｃｇｇｃｔｃｃｃｔｃｔｇｔｔｇｃｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｃｔｃｃｃｃａｇＧＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＴＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＧＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＣＣＣＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＣＧＴＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＧＣＡＣＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＴＡＧＧＴＴＴＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＧＡＡＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＧＴＣＧＧＡＡＣＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＡＧＧＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＧＣＧＴＧＴＡＧＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＧＣＴＧＡＧＧＧＧＡＧＴＴＣＴＡＧＣＧＴＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＣＴＧＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＧＣＧＴＡＧＡＡＣＴＴＧＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＡＣＣＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣＧＡＴＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＴＣＡＧＧＣＧＡＴＧＡ（配列番号３９）。
【００６３】
実施例２
この実施例は、プラスミドｐＦＢ−ＣＭＶｔｅｔＯ−ＤＴＡ−ｐ１０−ＴｅｔＲの構造および構築を例証する。ｐＦＢ−ＣＭＶｔｅｔＯ−ＤＴＡ−ｐ１０−ＴｅｔＲを構築するために、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｖｒＩＩで消化することにより、ｐ１０−駆動性ＴｅｔＲ発現カセットをプラスミドから放出した。放出断片を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｖｒＩＩで消化させておいたプラスミドｐＦＢ−ＣＭＶ−ＤＴＡのＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｖｒＩＩ粘着末端中に挿入した。
【００６４】
実施例３
この実施例は、毒素遺伝子ＯＲＦを中断する哺乳動物イントロンの挿入を例証する。
【００６５】
本発明の教示のいくつかの実施形態のベクターを生成するために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）イントロンを、ヌクレオチド１０３および１０４間のＤＴ−Ａ  ＯＲＦ中に挿入した（出発コドンＡＴＧの最初の文字は、ヌクレオチド番号１を割り当てられる）。ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）イントロンを、ヌクレオチド９および１０間のバルナーゼＯＲＦ中に挿入した。イントロン中断を伴わないＤＴ−ＡおよびバルナーゼＯＲＦを、対照として用いた。毒素コード配列は、イントロン中断を伴うものも伴わないものもすべて、ｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミド中でクローン化した。発現カセットの模式図を図３に示す。
【００６６】
図３は、ＡＡＶ  ＩＴＲが隣接する毒素発現カセットを保有する代表的組換えバキュロウィルスの遺伝子および転写地図を示す。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を保有する第２の組換えバキュロウィルスで昆虫細胞を共感染させることにより、ＡＡＶベクターを産生した。哺乳動物細胞中へのバキュロウィルスまたはＡＡＶベクターの導入時に、成熟毒素ｍＲＮＡがイントロンのスプライシングにより形成され、機能性タンパク質に翻訳されて、細胞を死滅させる。（ａ）ｈＧＨイントロンを挿入され、種々の腫瘍特異的プロモーターの制御下のＤＴ−Ａ遺伝子。ＤＴ−Ａコード配列に基づいた遺伝子地図上の数字（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ００７０３）は、イントロンが挿入されるヌクレオチド位置を示す。（ｂ）ＳＶ４０ＬＴ抗原イントロンにより挿入され、ＧＦＰ遺伝子と枠内融合されるバルナーゼ遺伝子。遺伝子地図上の数字は、バルナーゼコード配列に基づいており（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ１４４４２）、イントロンが挿入されるヌクレオチド位置を示す。（ｃ）イントロン挿入を伴わないＤＴ−Ａ遺伝子およびバルナーゼ遺伝子。
【００６７】
ＳＶ４０ＬＴ抗原イントロンを含むバルナーゼコード配列の詳細な配列を、以下に示す：
ＡＴＧＧＣＡＣＡＧｇｔａｔｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｔｔａａａｔｃｃｔｇｇｔｇｔｔｇａｔｇｃａａｔｇｔａｃｔｇｃａａａｃａａｔｇｇｃｃｔｇａｇｔｇｔｇｃａａａｇａａａａｔｇｔｃｔｇｃｔａａｃｔｇｃａｔａｔｇｃｔｔｇｃｔｇｔｇｃｔｔａｃｔｇａｇｇａｔｇａａｇｃａｔｇａａａａｔａｇａａａａｔｔａｔａｃａｇｇａａａｇａｔｃｃａｃｔｔｇｔｇｔｇｇｇｔｔｇａｔｔｇｃｔａｃｔｇｃｔｔｃｇａｔｔｇｃｔｔｔａｇａａｔｇｔｇｇｔｔｔｇｇａｃｔｔｇａｔｃｔｔｔｇｔｇａａｇｇａａｃｃｔｔａｃｔｔｃｔｇｔｇｇｔｇｔｇａｃａｔａａｔｔｇｇａｃａａａｃｔａｃｃｔａｃａｇａｇａｔｔｔａａａｇｃｔｃｔａａｇｇｔａａａｔａｔａａａａｔｔｔｔｔａａｇｔｇｔａｔａａｔｇｔｇｔｔａａａｃｔａｃｔｇａｔｔｃｔａａｔｔｇｔｔｔｇｔｇｔａｔｔｔｔａｇＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＣＧＧＧＧＴＴＧＣＧＧＡＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＡＴＡＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＴＴＡＣＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＡＡＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＴＧＣＡＧＡＣＧＴＣＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＧＧＣＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＡＡＣＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＴＡＴＴＡＡＣＴＡＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＡＧＡＣＣＧＧＡＴＴＣＴＴＴＡＣＴＣＡＡＧＣＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＡＣＧＧＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号４０）。ＧＦＰと融合される場合、付加配列は、−−−ＧＦＰ−−−  ＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡ（配列番号４１）である。
【００６８】
実施例４
この実施例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード配列と枠内融合されたバルナーゼコード配列と上流で作動可能に連結されるＣＭＶプロモーターを含むプラスミドｐＦＢ−ＣＭＶ−Ｂａｒ−ＧＦＰの構造および構築を例証する（図８）。
【００６９】
ｐＦＢ−ＣＭＶ−Ｂａｒ−ＧＦＰ（図８）を構築するために、バルナーゼコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ１４４４２）を、フォワードプライマー
【化４】
0005998229.tif 000005
（配列番号９）（イタリック体は、ＥｃｏＲＩに関する制限部位を示す）およびリバースプライマー５’−ＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴ−３’（配列番号１０）を用いて、プラスミドｐＦ１Ａ−Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）から増幅した。ＧＦＰコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ５５７６２）を、フォワードプライマー５’−ＣＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号１１）およびリバースプライマー
【化５】
0005998229.tif 000006
（配列番号１２）（イタリック体は、ＫｐｎＩに関する制限部位を示す）を用いて、ｐＦＢ−ＧＦＰプラスミドから増幅した。２回目のＰＣＲを実施して、フォワードプライマー５’− ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号１３）およびリバースプライマー５’−ＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ−３’（配列番号１４）を一緒に用いて、バルナーゼコード配列をＧＦＰコード配列と融合した。融合ＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化して、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）のＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ部位にライゲーションして、ＤＴ−Ａ配列を取り替えて、ｐＦＢ−ＣＭＶ−Ｂａｒ−ＧＦＰを作成した。
【００７０】
この実施例で用いられるバルナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ１４４４２）は、以下のとおりである：
ｃｔｇｇａａａａｃｇｔｃａｃａｔｔｇｃｔｔｃｃｇｃａｔａｔｃｇｇｇｔｃａｇｃａａｃｇｇｃｔａａａａｔｃｃｇｃｔｔｇａａｔａｔｇｔｔｃａｃａｃａａｇｃｃｇｃｔｃａａａａｃａｔｇａｔｔｇａｃｇｃｃｇｔａｔａｃｇｇａａｇａａｃｇｃｃｇａａａａａｃｃｔｔａｃｔａａｇｇａａｔｔｔｃａａｔａａｇａａｇａａａａａｔｃｃｃｇｇｔｔｇｇｔｔｃａｇｃｃｇｇｇｇｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｇｃｔａｇａｔａａａａａｇｔａｃｔａｔｔｔｔｔａａａｔｔｃｔｔｔｃｔａｔｔｃｃｔｔｔｃｔｔｔｃｇｔｔｇｃｔｇａｔａｃａａｔｇａａａａｇｇａａｔｃａｇｃｔｔｃａｃａｔｇａｔｇａａａａｔｇｇｇａｇｇｔａｔｔｇｃｔｔｔｇａａａａａａｃｇａｔｔａｔｃｇｔｇｇａｔｔｔｃｃｇｔｔｔｇｔｔｔａｃｔｇｇｔｇｃｔｔｇｔｃｔｃｃｇｃｇｇｃｇｇｇｇａｔｇｃｔｇｔｔｔｔｃａａｃａｇｃｔｇｃｃａａａａｃｇｇａａａｃａｔｃｔｔｃｔｃａｃａａｇｇｃａｃａｃａｃａｇａａｇｃａｃａｇｇｔｔａｔｃａａｃａｃｇｔｔｔｇａｃｇｇｇｇｔｔｇｃｇｇａｔｔａｔｃｔｔｃａｇａｃａｔａｔｃａｔａａｇｃｔａｃｃｔｇａｔａａｔｔａｃａｔｔａｃａａａａｔｃａｇａａｇｃａｃａａｇｃｃｃｔｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｇｃａｔｃａａａａｇｇｇａａｃｃｔｔｇｃａｇａｃｇｔｃｇｃｔｃｃｇｇｇｇａａａａｇｃａｔｃｇｇｃｇｇａｇａｃａｔｃｔｔｃｔｃａａａｃａｇｇｇａａｇｇｃａａａｃｔｃｃｃｇｇｇｃａａａａｇｃｇｇａｃｇａａｃａｔｇｇｃｇｔｇａａｇｃｇｇａｔａｔｔａａｃｔａｔａｃａｔｃａｇｇｃｔｔｃａｇａａａｔｔｃａｇａｃｃｇｇａｔｔｃｔｔｔａｃｔｃａａｇｃｇａｃｔｇｇｃｔｇａｔｔｔａｃａａａａｃａａｃｇｇａｃｃａｔｔａｔｃａｇａｃｃｔｔｔａｃａａａａａｔｃａｇａｔａａｃｇａａａａａａａｃｇｇｃｔｔｃｃｃｔｇｃｇｇａｇｇｃｃｇｔｔｔｔｔｔｔｃａｇｃｔｔｔａｃａｔａａａｇｔｇｔｇｔａａｔａａａｔｔｔｔｔｃｔｔｃａａａｃｔｃｔｇａｔｃｇｇｔｃａａｔｔｔｃａｃｔｔｔ（配列番号１５）。
【００７１】
この実施例で用いられるＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ配列を以下に示す：
ｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇｇｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇｇｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｇｇｇａｔｔｔｃｃａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇａｇｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｃａｃｃａａａａｔｃａａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａａａａｔｇｔｃｇｔａａｃａａｃｔｃｃｇｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｇｇｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇａｇｇｔｃｔａｔａｔａａｇｃａｇａｇｃｔｇｇｔｔｔａｇｔｇａａｃｃｇｔｃａｇａｔｃｃｇｃｔａｇｃｇｃｔａｃｃｇｇａｃｔｃａｇａｔｃｔｃｇａｇｃｔｃａａｇｃｔｔｃｇａａｔｔｃｔｇｃａｇｔｃｇａｃｇｇｔａｃｃｇｃｇｇｇｃｃｃｇｇｇａｔｃｃａｃｃｇｇｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｃｔｇｔｔｃａｃｃｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｃｔｇｇａｃｇｇｃｇａｃｇｔａａａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇｃｇｔｇｔｃｃｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｔｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃａｃｃｃｔｃｇｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇａｃｃｔａｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｃｇｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａｃａｔｇａａｇｃａｇｃａｃｇａｃｔｔｃｔｔｃａａｇｔｃｃｇｃｃａｔｇｃｃｃｇａａｇｇｃｔａｃｇｔｃｃａｇｇａｇｃｇｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｔｃａａｇｇａｃｇａｃｇｇｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃｃｇｃｇｃｃｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｃｇａｇｇｇｃｇａｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａａｃｃｇｃａｔｃｇａｇｃｔｇａａｇｇｇｃａｔｃｇａｃｔｔｃａａｇｇａｇｇａｃｇｇｃａａｃａｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｃａａｇｃｔｇｇａｇｔａｃａａｃｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａｃｇｔｃｔａｔａｔｃａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｃａｇａａｇａａｃｇｇｃａｔｃａａｇｇｔｇａａｃｔｔｃａａｇａｔｃｃｇｃｃａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｃｔｃｇｃｃｇａｃｃａｃｔａｃｃａｇｃａｇａａｃａｃｃｃｃｃａｔｃｇｇｃｇａｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｇａｃａａｃｃａｃｔａｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃａｇｔｃｃｇｃｃｃｔｇａｇｃａａａｇａｃｃｃｃａａｃｇａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃａｃａｔｇｇｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｔｔｃｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｇａｔｃａｃｔｃｔｃｇｇｃａｔｇｇａｃｇａｇｃｔｇｔａｃａａｇｔａａａｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｃｔｃｔａｇａｔｃａｔａａｔｃａｇｃｃａｔａｃｃａｃａｔｔｔｇｔａｇａｇｇｔｔｔｔａｃｔｔｇｃｔｔｔａａａａａａｃｃｔｃｃｃａｃａｃｃｔｃｃｃｃｃｔｇａａｃｃｔｇａａａｃａｔａａａａｔｇａａｔｇｃａａｔｔｇｔｔｇｔｔｇｔｔａａｃｔｔｇｔｔｔａｔｔｇｃａｇｃｔｔａｔａａｔｇｇｔｔａｃａａａｔａａａｇｃａａｔａｇｃａｔｃａｃａａａｔｔｔｃａｃａａａｔａａａｇｃａｔｔｔｔｔｔｔｃａｃｔｇｃａｔｔｃｔａｇｔｔｇｔｇｇｔｔｔｇｔｃｃａａａｃｔｃａｔｃａａｔｇｔａｔｃｔｔａａｇｇｃｇｔａａａｔｔｇｔａａｇｃｇｔｔａａｔａｔｔｔｔｇｔｔａａａａｔｔｃｇｃｇｔｔａａａｔｔｔｔｔｇｔｔａａａｔｃａｇｃｔｃａｔｔｔｔｔｔａａｃｃａａｔａｇｇｃｃｇａａａｔｃｇｇｃａａａａｔｃｃｃｔｔａｔａａａｔｃａａａａｇａａｔａｇａｃｃｇａｇａｔａｇｇｇｔｔｇａｇｔｇｔｔｇｔｔｃｃａｇｔｔｔｇｇａａｃａａｇａｇｔｃｃａｃｔａｔｔａａａｇａａｃｇｔｇｇａｃｔｃｃａａｃｇｔｃａａａｇｇｇｃｇａａａａａｃｃｇｔｃｔａｔｃａｇｇｇｃｇａｔｇｇｃｃｃａｃｔａｃｇｔｇａａｃｃａｔｃａｃｃｃｔａａｔｃａａｇｔｔｔｔｔｔｇｇｇｇｔｃｇａｇｇｔｇｃｃｇｔａａａｇｃａｃｔａａａｔｃｇｇａａｃｃｃｔａａａｇｇｇａｇｃｃｃｃｃｇａｔｔｔａｇａｇｃｔｔｇａｃｇｇｇｇａａａｇｃｃｇｇｃｇａａｃｇｔｇｇｃｇａｇａａａｇｇａａｇｇｇａａｇａａａｇｃｇａａａｇｇａｇｃｇｇｇｃｇｃｔａｇｇｇｃｇｃｔｇｇｃａａｇｔｇｔａｇｃｇｇｔｃａｃｇｃｔｇｃｇｃｇｔａａｃｃａｃｃａｃａｃｃｃｇｃｃｇｃｇｃｔｔａａｔｇｃｇｃｃｇｃｔａｃａｇｇｇｃｇｃｇｔｃａｇｇｔｇｇｃａｃｔｔｔｔｃｇｇｇｇａａａｔｇｔｇｃｇｃｇｇａａｃｃｃｃｔａｔｔｔｇｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｔａａａｔａｃａｔｔｃａａａｔａｔｇｔａｔｃｃｇｃｔｃａｔｇａｇａｃａａｔａａｃｃｃｔｇａｔａａａｔｇｃｔｔｃａａｔａａｔａｔｔｇａａａａａｇｇａａｇａｇｔｃｃｔｇａｇｇｃｇｇａａａｇａａｃｃａｇｃｔｇｔｇｇａａｔｇｔｇｔｇｔｃａｇｔｔａｇｇｇｔｇｔｇｇａａａｇｔｃｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｃａｇｇｃａｇａａｇｔａｔｇｃａａａｇｃａｔｇｃａｔｃｔｃａａｔｔａｇｔｃａｇｃａａｃｃａｇｇｔｇｔｇｇａａａｇｔｃｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｃａｇｇｃａｇａａｇｔａｔｇｃａａａｇｃａｔｇｃａｔｃｔｃａａｔｔａｇｔｃａｇｃａａｃｃａｔａｇｔｃｃｃｇｃｃｃｃｔａａｃｔｃｃｇｃｃｃａｔｃｃｃｇｃｃｃｃｔａａｃｔｃｃｇｃｃｃａｇｔｔｃｃｇｃｃｃａｔｔｃｔｃｃｇｃｃｃｃａｔｇｇｃｔｇａｃｔａａｔｔｔｔｔｔｔｔａｔｔｔａｔｇｃａｇａｇｇｃｃｇａｇｇｃｃｇｃｃｔｃｇｇｃｃｔｃｔｇａｇｃｔａｔｔｃｃａｇａａｇｔａｇｔｇａｇｇａｇｇｃｔｔｔｔｔｔｇｇａｇｇｃｃｔａｇｇｃｔｔｔｔｇｃａａａｇａｔｃｇａｔｃａａｇａｇａｃａｇｇａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｔｃｇｃａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇａｇｃａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａｇｃｇｇｇａｃｔｃｔｇｇｇｇｔｔｃｇａａａｔｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｃｃｃａａｃｃｔｇｃｃａｔｃａｃｇａｇａｔｔｔｃｇａｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｇａａａｇｇｔｔｇｇｇｃｔｔｃｇｇａａｔｃｇｔｔｔｔｃｃｇｇｇａｃｇｃｃｇｇｃｔｇｇａｔｇａｔｃｃｔｃｃａｇｃｇｃｇｇｇｇａｔｃｔｃａｔｇｃｔｇｇａｇｔｔｃｔｔｃｇｃｃｃａｃｃｃｔａｇｇｇｇｇａｇｇｃｔａａｃｔｇａａａｃａｃｇｇａａｇｇａｇａｃａａｔａｃｃｇｇａａｇｇａａｃｃｃｇｃｇｃｔａｔｇａｃｇｇｃａａｔａａａａａｇａｃａｇａａｔａａａａｃｇｃａｃｇｇｔｇｔｔｇｇｇｔｃｇｔｔｔｇｔｔｃａｔａａａｃｇｃｇｇｇｇｔｔｃｇｇｔｃｃｃａｇｇｇｃｔｇｇｃａｃｔｃｔｇｔｃｇａｔａｃｃｃｃａｃｃｇａｇａｃｃｃｃａｔｔｇｇｇｇｃｃａａｔａｃｇｃｃｃｇｃｇｔｔｔｃｔｔｃｃｔｔｔｔｃｃｃｃａｃｃｃｃａｃｃｃｃｃｃａａｇｔｔｃｇｇｇｔｇａａｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｔｃｇｃａｇｃｃａａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｇｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃａｔａｇｃｃｔｃａｇｇｔｔａｃｔｃａｔａｔａｔａｃｔｔｔａｇａｔｔｇａｔｔｔａａａａｃｔｔｃａｔｔｔｔｔａａｔｔｔａａａａｇｇａｔｃｔａｇｇｔｇａａｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｇａｔａａｔｃｔｃａｔｇａｃｃａａａａｔｃｃｃｔｔａａｃｇｔｇａｇｔｔｔｔｃｇｔｔｃｃａｃｔｇａｇｃｇｔｃａｇａｃｃｃｃｇｔａｇａａａａｇａｔｃａａａｇｇａｔｃｔｔｃｔｔｇａｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｃｔｇｃｇｃｇｔａａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇｃａａａｃａａａａａａａｃｃａｃｃｇｃｔａｃｃａｇｃｇｇｔｇｇｔｔｔｇｔｔｔｇｃｃｇｇａｔｃａａｇａｇｃｔａｃｃａａｃｔｃｔｔｔｔｔｃｃｇａａｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃａｇｃａｇａｇｃｇｃａｇａｔａｃｃａａａｔａｃｔｇｔｃｃｔｔｃｔａｇｔｇｔａｇｃｃｇｔａｇｔｔａｇｇｃｃａｃｃａｃｔｔｃａａｇａａｃｔｃｔｇｔａｇｃａｃｃｇｃｃｔａｃａｔａｃｃｔｃｇｃｔｃｔｇｃｔａａｔｃｃｔｇｔｔａｃｃａｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃａｇｔｇｇｃｇａｔａａｇｔｃｇｔｇｔｃｔｔａｃｃｇｇｇｔｔｇｇａｃｔｃａａｇａｃｇａｔａｇｔｔａｃｃｇｇａｔａａｇｇｃｇｃａｇｃｇｇｔｃｇｇｇｃｔｇａａｃｇｇｇｇｇｇｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃａｇｃｃｃａｇｃｔｔｇｇａｇｃｇａａｃｇａｃｃｔａｃａｃｃｇａａｃｔｇａｇａｔａｃｃｔａｃａｇｃｇｔｇａｇｃｔａｔｇａｇａａａｇｃｇｃｃａｃｇｃｔｔｃｃｃｇａａｇｇｇａｇａａａｇｇｃｇｇａｃａｇｇｔａｔｃｃｇｇｔａａｇｃｇｇｃａｇｇｇｔｃｇｇａａｃａｇｇａｇａｇｃｇｃａｃｇａｇｇｇａｇｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｇａａａｃｇｃｃｔｇｇｔａｔｃｔｔｔａｔａｇｔｃｃｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｃｃｔｃｔｇａｃｔｔｇａｇｃｇｔｃｇａｔｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｃｔｃｇｔｃａｇｇｇｇｇｇｃｇｇａｇｃｃｔａｔｇｇａａａａａｃｇｃｃａｇｃａａｃｇｃｇｇｃｃｔｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｃａｃａｔｇｔｔｃｔｔｔｃｃｔｇｃｇｔｔａｔｃｃｃｃｔｇａｔｔｃｔｇｔｇｇａｔａａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃａｔｇｃａｔ（配列番号１６）。
【００７２】
実施例５
この実施例は、挿入ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン（ＳＶ４０）を有し、ＧＦＰコード配列と枠内融合されるバルナーゼコード配列と上流で作動可能に連結されるＣＭＶプロモーターを含むプラスミドｐＦＢ−ＣＭＶ−ＩｎＢａｒ（ＳＶ４０）−ＧＦＰの構造および構築を例証する（図９）。
【００７３】
バルナーゼ中にＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを挿入し、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＢａｒ（ＳＶ４０）−ＧＦＰを構築するために（図９）、ＰＣＲ法を用いた。バルナーゼコード配列の５’−部分を、全長ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンと一緒に、フォワードプライマー
【化６】
0005998229.tif 000007
（配列番号１７）（イタリック体は、ＥｃｏＲＩ制限部位を示す；太字は、ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン配列を示す）およびリバースプライマー
【化７】
0005998229.tif 000008
（配列番号１８）（太字は、ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン配列を示す）を用いて、ＳＶ４０プラスミド（ｐＵＣＳＶ４０−Ｂ２Ｅ、ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）からＰＣＲ増幅した。バルナーゼコード配列の３’−部分を、ＧＦＰコード配列と一緒に、フォワードプライマー
【化８】
0005998229.tif 000009
（配列番号１９）（太字は、ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン配列を示す）、およびリバースプライマー５’−ＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ−３’（配列番号２０）を用いて、鋳型としてｐＦＢ−ＣＭＶ−Ｂａｒ−ＧＦＰを伴って、ＰＣＲ増幅した。二次ＰＣＲを実施して、これら２つのＰＣＲ断片を、フォワードプライマー５’−ＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＡＡ−３’（配列番号２１）およびリバースプライマー５’−ＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ−３’（配列番号２２）と一緒接合した。接合ＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化して、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）のＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ部位にライゲーションして、ＤＴＡ配列を取り替えて、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＢａｒ（ＳＶ４０）−ＧＦＰを作成した。
【００７４】
実施例６
この実施例は、挿入ヒト成長ホルモンイントロンを有するＤＴ−Ａコード配列と上流で作動可能に連結されるヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴ）を含むプラスミドｐＦＢ−ｈＴＥＲＴ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）の構造および構築を例証する（図１０）。
【００７５】
ｐＦＢ−ｈＴＥＲＴ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）（図１０）を構築するために、ｈＴＥＲＴを、フォワードプライマー
【化９】
0005998229.tif 000010
（配列番号２３）（イタリック体は、ＭｌｕＩに関する制限部位を示す）およびリバースプライマー
【化１０】
0005998229.tif 000011
（配列番号２４）（イタリック体は、ＡｇｅＩに関する制限部位を示す）を用いて、ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞から精製されたゲノムＤＮＡから、ＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＲ断片をＭｌｕＩおよびＡｇｅＩで消化し、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）のＭｌｕＩおよびＡｇｅＩ部位にライゲーションして、ｐＦＢ−ｈＴＥＲＴ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を作成した。
【００７６】
実施例７
この実施例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード配列と上流で作動可能に連結されるヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴ）を含むプラスミドｐＦＢ−ｈＴＥＲＴ−ＧＦＰ（ｈＧＨ）の構造および構築を例証する（図１１）。
【００７７】
ｐＦＢ−ｈＴＥＲＴ−ＧＦＰを構築するために、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰを制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩおよびＡｇｅＩで消化して、ＣＭＶプロモーターを除去し、ｐＦＢ−ｈＴＥＲＴ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）も、同一制限酵素で消化して、ｈＴＥＲＴプロモーターを含む断片を放出した。この断片を、消化ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ（ＣＭＢプロモーターなし）中にライゲーションして、ｐＦＢ−ｈＴＥＲＴ−ＧＦＰｓを生成した。
【００７８】
実施例８
この実施例は、組換えバキュロウィルスの産生を例証する。
【００７９】
これらの実験において、イントロン中断を伴うかまたは伴わない毒素コード配列を、実施例３に記載したようにｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミド中でクローン化した。発現カセットの模式図を、図３に示す。その結果生じたｐＦａｓｔＢａｃプラスミドを用いて、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細菌を形質転換して、白色コロニーからのバクミドＤＮＡを調製した。バクミドＤＮＡを用いて、上記と同様に組換えバキュロウィルスを産生した。結果は、図１２に図示したように、組換えバキュロウィルスはイントロン挿入を伴わないＤＴ−ＡまたはバルナーゼＯＲＦを含有するバクミドＤＮＡから生成され得なかったが、一方、正常レベルの組換えバキュロウィルスが生成され、哺乳動物イントロンにより中断されるＤＴ−ＡまたはバルナーゼＯＲＦを含有するバクミドＤＮＡから増幅された、ということを示す。イントロン中断を伴わない毒素遺伝子を含有するバクミドＤＮＡを有する組換えバキュロウィルスを生成できなかったことは、毒素遺伝子がＣＭＶプロモーター（昆虫プロモーターでない）の制御下にあった場合でも、ＤＴ−Ａまたはバルナーゼが昆虫細胞に対して致死性である、ということを実証している。他方で、イントロン中断毒素遺伝子を含有するバクミドＤＮＡからの組換えバキュロウィルスの生成および増幅が首尾よくなされたことは、ｈＧＨおよびＳＶ４０ＬＴイントロンがともに、昆虫細胞中でスプライスされず、したがって、ＤＴ−ＡおよびバルナーゼＯＲＦの中断のために、毒素が産生されなかった、ということを示している。
【００８０】
図１２は、バクミドＤＮＡでのトランスフェクションによるＳｆ９細胞中での組換えバキュロウィルスの生成（Ａ＆Ｃ）、および感染によるＳｆ９細胞中での組換えバキュロウィルスの増幅（Ｂ＆Ｄ）を示す。
【００８１】
これらの実験では、バキュロウィルス力価を、トランスフェクションの４日後、または増幅の３日後に採取した上清から決定した。ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）（ＣＭＶプロモーターの制御下でヒト成長ホルモンイントロン（ｈＧＨ）を含むＤＴ−Ａコード配列を保有する組換えバキュロウィルス）；ＣＭＶ−ＧＦＰ（ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰコード配列を保有する組換えバキュロウィルス）；ＣＭＶ−Ｂａｒ−ＧＦＰ（ＧＦＰと枠内融合されるバルナーゼコード配列を保有する組換えバキュロウィルス）；ＣＭＶ−ｉｎＢａｒ（ＳＶ４０）−ＧＦＰ（ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含み、ＧＦＰコード配列と枠内融合されるバルナーゼコード配列を保有する組換えバキュロウィルス）；ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）（ＣＭＶプロモーターの制御下でヒト成長ホルモンイントロン（ｈＧＨ）を含むＤＴ−Ａコード配列を保有する組換えバキュロウィルス）；ＣＭＶ−ＧＦＰ（ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰコード配列を保有する組換えバキュロウィルス）；ＣＭＶ−Ｂａｒ−ＧＦＰ（ＧＦＰと枠内融合されるバルナーゼコード配列を保有する組換えバキュロウィルス）；ＣＭＶ−ｉｎＢａｒ（ＳＶ４０）−ＧＦＰ（ＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含み、ＧＦＰコード配列と枠内融合されるバルナーゼコード配列を保有する組換えバキュロウィルス）。ＣＭＶ−ｉｎＢａＲ（ＳＶ４０）−ＧＦＰでトランスフェクション後、約４．４ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌの、またはｐＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）でトランスフェクション後、約９ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌの力価に昆虫細胞中で組換えバキュロウィルスを産生すること、およびＣＭＢ−ｉｎＢａｒ（ＳＶ４０）−ＧＦＰで感染後に約６．１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌの、あるいはＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）またはＣＭＶ−ＧＦＰで感染後に約１．２ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌの力価に昆虫細胞中で組換えバキュロウィルスを産生することに留意されたい。
【００８２】
実施例９
この実施例は、図２に示したように、イントロンを含むＤＴ−Ａコード配列を保有する組換えバキュロウィルスの生成を実証する。
【００８３】
これらの実験では、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、組換えバキュロウィルスを生成した。要するに、プラスミドをＴＥ緩衝液中に１ｎｇ／μｌにそれぞれ希釈して、各希釈プラスミド２μｌをＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細菌中で形質転換した。４８時間インキュベーション後、白色コロニーを選び出して、ミニプレップバクミドＤＮＡを調製した。ミニプレップバクミドＤＮＡを、４日間、Ｓｆ９細胞中にそれぞれトランスフェクトした。イントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子を保有するバクミドでトランスフェクトされたＳｆ９細胞に関して、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察したが、一方、Ｔｅｔリプレッサー発現カセットが存在するか否かに関係なく、ＤＴ−Ａ遺伝子を保有するバクミドでトランスフェクトされたＳｆ９細胞に関しては、ＣＰＥは観察されなかった。これらの結果は、ＤＴ−Ａ毒性遺伝子を保有するバクミドでトランスフェクトされた任意の細胞が絶滅させられ、組換えバキュロウィルスは生成されず、ＣＰＥは観察されなかった、ということを示している。トランスフェクト化Ｓｆ９細胞からの上清をバキュロウィルスストックとして採取し、バキュロウィルスｇｐ６４遺伝子に対応するプライマーを用いて、定量的実時間ＰＣＲでバキュロウィルス力価を確定した。見かけのＣＰＥを示すものからの組換えバキュロウィルスを増幅し、力価を確定した。力価を確定するために、組換えバキュロウィルスをそれぞれ２×ＴＥ緩衝液中に希釈し、９５℃で３０分間加熱して、ウィルス粒子を破壊し、ウィルスＤＮＡ分子を放出した。室温に下げたのち、バキュロウィルス試料をＱＰＣＲ希釈緩衝液で希釈し、フォワードプライマー５’−ＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＣＧ−３’（配列番号２５）およびリバースプライマー５’−ＣＧＧＴＧＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＣＡＣＣＧ−３’（配列番号２６）を用いて、ＱＰＣＲ法で検定した。２０の因数で割る（経験的に決定）ことにより、ＱＰＣＲ力価（ゲノムコピー数／ｍｌ）をプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）に変換した。バキュロウィルス力価を、以下の表１および図１２に示す。ヒト成長ホルモンイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子またはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含むバルナーゼ遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスは高力価に生成され得ないが、一方、イントロン挿入を伴わないＤＴ−Ａ遺伝子またはバルナーゼ遺伝子を保有するバクミドからは、組換えバキュロウィルスは生成されなかった、ということを結果は実証している。イントロン中断毒素ＯＲＦを含有する組換えバキュロウィルスが首尾よく生成および増幅されたことは、哺乳動物イントロンが昆虫細胞中でスプライスされなかった、ということを示している。
【００８４】
それは昆虫プロモーターではないが、しかしＣＭＶプロモーターは昆虫細胞中で何らかの活性を有し、低レベルのヘマグルチニン発現を駆動し得る（Ｈｅ，  Ｆ，  ら、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：２３８，２００８年）。この低レベルのプロモーター活性は、ＤＴ−Ａの何らかの基礎発現を駆動し得て、これが、毒素を発現する任意の昆虫細胞を死滅させた。ＣＭＶプロモーターに対してアンチセンス方向でｌｏｘＰ部位と隣接したＤＴ−Ａ  ＯＲＦを含有するバクミドＤＮＡからは、組換えバキュロウィルスは産生され得なかったが、これは、ｌｏｘＰ部位の潜在性プロモーターＴＡＴＡ様配列でさえ、昆虫細胞を死滅させ得る微量のＤＴ−Ａ発現を駆動し得た、ということを示している。同じ現象はバルナーゼ遺伝子に関しても観察されたが、この場合、組換えバキュロウィルスは、そのＯＲＦがＳＶ４０ＬＴ抗原イントロンにより中断された場合にのみ生成され得ており（図１２ｃ）、これは、バルナーゼが昆虫細胞に対しても毒性であることを示している。他方で、イントロン中断ＤＴ−Ａまたはバルナーゼ−ＧＦＰ遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスが首尾よく生成されることは、ｈＧＨおよびＳＶ４０ＬＴ抗原イントロンが昆虫細胞中でスプライスされず、ＤＴ−Ａおよびバルナーゼ−ＧＦＰ発現がこのイントロン中断により全体的に無効にされた、ということを示している。
表１  ＱＰＣＲ法により確定される組換えバキュロウィルスの力価
【表１】
0005998229.tif 000012
【００８５】
実施例１０
この実施例は、組換えバキュロウィルスにより保有される毒素ＯＲＦからのイントロンのスプライシング、ならびに哺乳動物細胞中での毒素タンパク質の発現を例証する。
【００８６】
毒素ＯＲＦ中に挿入されたイントロンが哺乳動物細胞中でスプライスされ得たか否かを確定するために、イントロン中断ＤＴ−Ａまたはバルナーゼ遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスを用いて、ＨＥＫ２９３細胞中に形質導入した。細胞形態学を調べ、形質導入の２日後に撮影した。
【００８７】
これらの実験では、コンフルエントになるまで、１０％ＦＢＳ、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を補足したＤＭＥＭ培地中で、ヒトＨＥＫ２９３細胞を培養した。次いで、細胞をトリプシン処理し、無血清培地中で１．５ｅ＋５細胞／ウェルで２４−ウェルプレート中にプレート化した。一晩増殖後、培地を除去し、２５０μｌ培地＋２５０μｌ組換えバキュロウィルス、または４００μｌ培地＋１００μｌ組換えバキュロウィルスに取り替えた。Ｓｆ９細胞培地を用いた以外は、同様にして陰性対照を実施した。
【００８８】
図１３は、ヒト成長ホルモンイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子、およびＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含み、ＧＦＰと枠内融合されるバルナーゼ遺伝子を保有する代表的組換えバキュロウィルスの遺伝子および転写地図を示す。哺乳動物細胞中への導入時に、成熟ＤＴ−Ａ  ｍＲＮＡまたはＢａｒ−ＧＦＰ  ｍＲＮＡがイントロンのスプライシングにより形成され、完全機能性ＤＴ−Ａまたはバルナーゼタンパク質に翻訳されて、細胞を死滅させる。ＤＴ−Ａおよびバルナーゼコード配列に基づいた遺伝子地図上の数字は、イントロンが挿入されたヌクレオチド位置を示す。
【００８９】
これらの実験において、哺乳動物細胞中へのイントロンを含むバルナーゼ遺伝子の導入とさらに３日間のインキュベーションの後、顕微鏡下で細胞を調べ、細胞のＣＰＥを記録した。結果を、表２および図１４に示す。図１４は、毒性遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスで４８時間形質導入することにより哺乳動物（ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３）細胞に及ぼす死滅作用を示す。Ａ、ＢおよびＣ：タングステン光源を用いて明視野照明下で２０倍対物レンズを用いて撮影した代表的視野。Ｄ：ＧＦＰ傾向に適した励起および透過波長でフィルタ組合せを用いて、蛍光照明により画像処理した、Ｃと同一の視野。Ａ：Ｂａｃ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）；Ｂ：Ｂａｃ−ＣＭＶ−ｉｎＢａｒ（ＳＶ４０）−ＧＦＰ；Ｃ：Ｂａｃ−ＣＭＶ−ＧＦＰ；Ｄ：ＧＦＰ発現を示すＣと同一画像。図１４における結果は、イントロン中断ＤＴ−Ａまたはバルナーゼ遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスはＨＥＫ２９３細胞の断片化（アポトーシスを受けている細胞の徴候）を引き起こしたが、一方、ＧＦＰ遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスはこの断片化を引き起こさなかった、ということを示す。Ｂａｒ−ＧＦＰを保有するバキュロウィルスで形質導入された２９３細胞では、非常にかすかなＧＦＰ発現が観察された（データは示されていない）。ｈＧＨイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子またはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含むバルナーゼ遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスが１００μｌであれ、２５０μｌであれ、形質導入されると、ＨＥＫ２９３細胞の大半が寄せ集められ、ゆるく引き離されて、重度のＣＰＥを示すが、一方、ＧＦＰを保有する組換えバキュロウィルスで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞はすべて、ＣＰＥのいかなる徴候も示さず、陰性対照と同様に増殖していた。これらの結果は、哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞において、イントロン（ｈＧＨイントロンまたはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン）がスプライシングで切り出されて、ＤＴ−Ａ  ｍＲＮＡまたはバルナーゼ−ＧＦＰ  ｍＲＮＡを形成し、翻訳され、したがって、宿主細胞が機能性ＤＴ−Ａまたはバルナーゼ−ＧＦＰ−融合タンパク質を発現し、それにより宿主ＨＥＫ２９３細胞を死滅させる、ということを実証する。
表２  バキュロウィルス形質導入によるヒトＨＥＫ２９３細胞におけるＤＴ−Ａの発現
【表２】
0005998229.tif 000013
【００９０】
実施例１１
この実施例は、昆虫細胞における毒素ＯＲＦを保有するＡＡＶベクターの産生を例証する。
【００９１】
これらの実験において、ヒト成長ホルモンイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子、またはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含み、ＧＦＰ遺伝子で枠内融合されるバルナーゼ遺伝子を保有するＡＡＶベクターの産生を、昆虫細胞で調べた（図１５、図１６）。図１５は、安定的に組み込まれたＡＡＶ導入遺伝子を保有する昆虫細胞における、ヒト成長ホルモンイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子またはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含みＧＦＰ遺伝子と枠内融合されるバルナーゼ遺伝子を保有するＡＡＶベクターの産生方法を示す。図１６は、ヒト成長ホルモンイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子、またはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含み、ＧＦＰ遺伝子と枠内融合されるバルナーゼ遺伝子を保有する代表的ＡＡＶベクターの遺伝子および転写地図を示す。ＤＴ−Ａコード配列およびバルナーゼコード配列に基づいた遺伝子地図上の数字は、イントロンが挿入されたヌクレオチド位置を示す。
【００９２】
イントロン中断毒素ＯＲＦを保有する組換えバキュロウィルスを用いて、Ｓｆ９細胞でＡＡＶベクター産生を実施した。組換えバキュロウィルスを用いて、ＡＡＶ  ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を発現する第２の組換えバキュロウィルスとともにＳｆ９細胞を３日間共感染させ、ＡＡＶベクターを精製し、滴定した。表３および表４における結果は、ＧＦＰ遺伝子だけを保有するＡＡＶベクターと比較して、ほぼ同じ収率のイントロン中断毒素ＯＲＦを保有するＡＡＶベクターが産生されることを示す。
【００９３】
これらの実験では、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州）中で、Ｓｆ９細胞を約１Ｅ＋９細胞／ｍｌに増殖させた。次に、細胞を新鮮な培地で１：１希釈して、１０ｍｏｉのＢａｃ−ＲｅｐＣａｐ９および５ｍｏｉのＢａｃ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡまたはＢａｃ−ＣＭＶｔｅｔＯ−ｉｎＤＴＡ−ｐ１０−ＴｅｔＲで３日間感染させた。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により細胞ペレットを採取して、ＳＦ９溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％サルコシル、１％トリトンＸ−１００、１２５単位／ｍｌのベンゾナーゼ）中に溶解した。細胞性ＤＮＡを、３７Ｃで６０分間、インキュベートすることにより消化した。８０００ｒｐｍで３０分の遠心分離により細胞溶解物を清澄化し、１．５５ｇ／ｃｃのＣｓＣｌ溶液５ｍｌおよび１．３２ｇ／ｃｃのＣｓＣｌ溶液１０ｍｌを含有するＳＷ２８遠心管上に載せた。１５℃で約１６時間、２８，０００ｒｐｍでの遠心分離後、注射針を用いて遠心管を穿刺することによりｒＡＡＶ含有分画を収集し、２回目のＣｓＣｌ超遠心分離に付した。再び注射針を用いて遠心管を穿刺することによりｒＡＡＶ含有分画を収集し、ＰＢＳ緩衝液中で透析して、塩および洗剤を除去した。メーカーのプロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）に従って、定量的実時間ＰＣＲ検定によりベクター力価を確定した。結果（表３および表４）は、ｔｅｔ抑圧を伴う場合も伴わない場合も、イントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスを用いて、毒性ＤＴ−Ａ遺伝子を保有するｒＡＡＶベクターの高力価がＳｆ９細胞で生じ得る、ということを示すが、これは、イントロンの挿入がＡＡＶベクター産生のために必要であることを示している。
表３  ＤＴ−Ａ遺伝子を保有するＡＡＶベクターの産生
【表３】
0005998229.tif 000014
表４  ヒト成長ホルモンイントロンを含むＤＴ−Ａ遺伝子またはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを含むバルナーゼ遺伝子を保有するＡＡＶ９およびＡＡＶ２ベクターの産生
【表４】
0005998229.tif 000015
【００９４】
これらの結果は、哺乳動物イントロンが昆虫細胞中で機能性ではなく、この結果、イントロン中断毒素ＯＲＦを保有するＡＡＶベクターを首尾よく産生した、ということを確証する。さらに、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９ベクターはともに、同様の収率で産生されたが、これは、このＡＡＶベクター産生が普遍的であり、血清型特異的でなかったことを示している。
【００９５】
実施例１２
この実施例は、ＣＭＶプロモーターの制御下での、ＤＴ−Ａを含有するＡＡＶベクターによる非特異的死滅を例証する。
【００９６】
イントロン中断毒素遺伝子を保有する組換えバキュロウィルスは形質導入により哺乳動物細胞を死滅させ得たため、毒素遺伝子を保有するＡＡＶベクターがＨＥＫ２９３細胞に死滅作用を発揮し得るか否かを検査した。この可能性を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレート上で一晩プレート化し、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９ベクターで形質導入した。結果は、４８時間形質導入後、ＤＴＡまたはバルナーゼ遺伝子を保有するＡＡＶ２またはＡＡＶ９ベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞は、アポトーシスを受けている細胞の典型的現象である断片化細胞形態学を示した。これに対比して、ＧＦＰ遺伝子を保有するＡＡＶ２またはＡＡＶ９ベクターで形質導入された細胞においてはアポトーシスの徴候は認められなかった（データは示されていない）。これらの結果は、イントロンが毒素コード配列からスプライシングにより切り出されて、成熟ｍＲＮＡを形成し、ｍＲＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞を死滅させる毒素タンパク質に翻訳される、ということを実証する。ＡＡＶ２はＡＡＶ９よりはるかに良好なｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入効率を示すため、それはさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のために選択された。細胞増殖検定をＨＥＫ２９３細胞上で実施して、細胞死滅作用をさらに確証した。結果を図１７ａに示す。ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）で形質導入されたＨＥＫ２９３細胞を抑制し、増殖の徴候はなかったが、一方、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰで形質導入された細胞は非処置細胞と同様に増殖した。さらに、細胞生存度検定を実施して、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に及ぼすＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）の細胞傷害性を立証した。結果を、図１７ｂに示す。見事な用量−応答曲線が観察された。ＤＴＡを保有するＡＡＶ２ベクターの減少に伴って、細胞生存度は増大したが、一方、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ処置細胞に関しては細胞生存度の変化は本質的に認められなかった。
【００９７】
図１７は、哺乳動物細胞に及ぼすＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）の死滅作用を示す。（ａ）ＡＡＶ２ベクターで形質導入された２９３細胞の増殖。細胞（１．５Ｅ＋５細胞／ウェル）を２４ウェルプレート中に一晩播種し、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）またはＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰで形質導入した。細胞数を、異なる時点で計数した。それらがコンフルエントに達した後、細胞を大型培養域に分けて、増殖させた。（ｂ）ＡＡＶ２ベクターで形質導入されたＨｅｐ３Ｂ細胞の生存度。Ｈｅｐ３Ｂ細胞（３．２Ｅ＋４細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート中に一晩播種し、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰまたはＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）の４倍連続希釈液で形質導入した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光細胞生存度検定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞生存度を確定した。
【００９８】
図１８は、４８時間、毒性遺伝子を保有するＡＡＶベクターで形質導入することによるヒトＨＥＫ２９３細胞に及ぼす死滅作用を示す。タングステン照明（Ａ、ＢおよびＣ）または蛍光照明（Ｄ）下で、２０倍レンズで画像を撮影した。Ａ．ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）；Ｂ：ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｉｎＢａｒ（ＳＶ４０）−ＧＦＰ；Ｃ：ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ；Ｄ：ＧＦＰ発現を示すＣと同一画像。
【００９９】
これらの実験では、ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）またはＣＭＶ−ｉｎＢａｒ（ＳＶ４０）−ＧＦＰと共にＡＡＶを保有するＨＥＫ２９３細胞が寄せ集められ、ゆるく引き離されて、重度のＣＰＥを示した。しかしながら、ＧＦＰを保有する組換えバキュロウィルスで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞はすべて、ＣＰＥのいかなる徴候も示さず、陰性対照と同様に増殖していた。これらの結果は、哺乳動物細胞において、イントロン（ｈＧＨイントロンまたはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン）がスプライシングで切り出されて、ＤＴ−Ａ  ｍＲＮＡまたはバルナーゼ−ＧＦＰ  ｍＲＮＡを形成し、翻訳され、宿主細胞が機能性ＤＴ−Ａまたはバルナーゼ−ＧＦＰ−融合タンパク質を発現し、それにより宿主ＨＥＫ２９３細胞を死滅させた、ということを実証する。
【０１００】
実施例１３
この実施例は、制御ＡＦＰエンハンサーおよびプロモーター配列下で、イントロンで中断されたリーディングフレームを有するＤＴ−Ａ遺伝子を含むＡＡＶベクターの産生を例証する。
【０１０１】
この実験では、ヒトＡＦＰエンハンサーおよびプロモーター配列を、ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞から精製されたゲノムＤＮＡからともにＰＣＲ増幅した。ＡＦＰエンハンサーを、フォワードプライマー
【化１１】
0005998229.tif 000016
（配列番号２７）（イタリック体はＭｌｕＩに関する制限部位を示す）およびリバースプライマー５’−ＣＴＣＡＡＡＣＴＣＴＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号２８）を用いて増幅した。ＡＦＰプロモーターを、フォワードプライマー５’−ＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＧ−３’（配列番号２９）およびリバースプライマー５’−ＡＣＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＡＴ−３’（配列番号３０）を用いて増幅した。上記のようなＡＦＰエンハンサーに関するフォワードプライマーおよびＡＦＰプロモーターに関するリバースプライマーを用いて、二次ＰＣＲ増幅により、２つのＰＣＲ断片を一緒に接合した。最終ＰＣＲ断片を、ＭｌｕＩおよびＡｇｅＩで消化し、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）のＭｌｕＩおよびＡｇｅＩ部位にライゲーションして、ＣＭＶプロモーターを取り替えて、ｐＦＢ−ｈＡＦＰ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を作成した。
【０１０２】
ＡＡＶ２−ｈＡＦＰ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を、本明細書中に記載された方法により、昆虫細胞中で、１．６９Ｅ＋１５の力価に産生した。
【０１０３】
実施例１４
この実施例は、ヒトサバイビン（ＳＵＲＶ）の制御下で、イントロンで中断されるリーディングフレームを有するＤＴ−Ａ遺伝子を含むＡＡＶベクターの産生を例証する。
【０１０４】
これらの実験では、ヒトサバイビン（ＳＵＲＶ）プロモーター配列を、フォワードプライマー
【化１２】
0005998229.tif 000017
（配列番号３１）（イタリック体はＳｐｅＩに関する制限部位を示す）およびリバースプライマー
【化１３】
0005998229.tif 000018
（配列番号３２）（イタリック体はＡｇｅＩに関する制限部位を示す）を用いて、ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞から精製したゲノムＤＮＡでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片をＳｐｅＩおよびＡｇｅＩで消化し、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）のＳｐｅＩおよびＡｇｅＩ部位にライゲーションして、ＣＭＶプロモーターを取り替えて、ｐＦＢ−ｈＳＵＲＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を作成した。
【０１０５】
ＡＡＶ２−ｈＳＵＲＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を、本明細書中に記載される方法により、昆虫細胞中で培養力価１．４１Ｅ＋１５ｖｇ／１リットルに産生した。
【０１０６】
実施例１５
この実施例は、ヒトシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ２）プロモーター配列の制御下で、イントロンで中断されるリーディングフレームを有するＤＴ−Ａ遺伝子を含むＡＡＶベクターの産生を例証する。
【０１０７】
これらの実験では、ヒトシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ２）プロモーターを、フォワードプライマー
【化１４】
0005998229.tif 000019
（配列番号３３）（イタリック体はＳｐｅＩに関する制限部位を示す）およびリバースプライマー
【化１５】
0005998229.tif 000020
（配列番号３４）（イタリック体はＡｇｅＩに関する制限部位を示す）を用いて、ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞から精製されたゲノムＤＮＡでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩおよびＡｇｅＩで消化し、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）のＳｐｅＩおよびＡｇｅＩ部位にライゲーションして、ＣＭＶプロモーターを取り替えて、ｐＦＢ−ｈＣＯＸ２−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を作成した。
【０１０８】
ＡＡＶ２−ｈＣＯＸ２−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を、本明細書中に記載される方法により、昆虫細胞中で培養力価２．２２Ｅ＋１３ｖｇ／リットルに産生した。
【０１０９】
実施例１６
この実施例は、ヒトコレシストキニンＡ型受容体（ＣＣＫＡＲ）プロモーター配列（Ｔａｋａｔａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３７：８１５〜８２０、２００２年）の制御下で、イントロンで中断されるリーディングフレームを有するＤＴ−Ａ遺伝子を含むＡＡＶベクターの産生を例証する。
【０１１０】
これらの実験では、ヒトコレシストキニンＡ型受容体（ＣＣＫＡＲ）プロモーター配列を、フォワードプライマー
【化１６】
0005998229.tif 000021
（配列番号３５）（イタリック体はＳｐｅＩに関する制限部位を示す）およびリバースプライマー
【化１７】
0005998229.tif 000022
（配列番号３６）（イタリック体はＡｇｅＩに関する制限部位を示す）を用いて、ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞から精製されたゲノムＤＮＡでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩおよびＡｇｅＩで消化し、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）のＳｐｅＩおよびＡｇｅＩ部位にライゲーションして、ＣＭＶプロモーターを取り替えて、ｐＦＢ−ｈＣＣＫＡＲ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を作成した。
【０１１１】
ＡＡＶ２−ｈＣＣＫＡＲ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を、本明細書中に記載される方法により、昆虫細胞中で培養力価１．９６Ｅ＋１４ｖｇ／リットルに産生した。
【０１１２】
実施例１７
この実施例は、ヒトＣＸＣＲ４遺伝子プロモーター配列（Ｃａｒｕｚ，Ｍ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４２６：２７１〜２７８、１９９８年）の制御下で、イントロンで中断されるリーディングフレームを有するＤＴ−Ａ遺伝子を含むＡＡＶベクターの産生を例証する。
【０１１３】
これらの実験では、ヒトＣＸＣＲ４プロモーター配列を、フォワードプライマー
【化１８】
0005998229.tif 000023
（配列番号３７）（イタリック体はＳｐｅＩに関する制限部位を示す）およびリバースプライマー
【化１９】
0005998229.tif 000024
（配列番号３８）（イタリック体はＡｇｅＩに関する制限部位を示す）を用いて、ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞から精製されたゲノムＤＮＡでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩおよびＡｇｅＩで消化し、ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）のＳｐｅＩおよびＡｇｅＩ部位にライゲーションして、ＣＭＶプロモーターを取り替えて、ｐＦＢ−ｈＣＸＣＲ４−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を作成した。
【０１１４】
ＡＡＶ２−ｈＣＸＣＲ４−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）を、本明細書中に記載される方法により、昆虫細胞中で培養力価１．８１Ｅ＋１５ｖｇ／リットルに産生した。
【０１１５】
実施例１８
この実施例は、腫瘍特異的プロモーターの制御下で、ＤＴ−Ａを保有するＡＡＶベクターによる腫瘍特異的死滅を例証する。
【０１１６】
これらの実験では、細胞を２４ウェルプレート上に播種し、上記のような種々の腫瘍特異的プロモーターの制御下で、ＤＴ−Ａを保有するＡＡＶ２ベクターで形質導入した。結果は、神経芽細胞腫ＢＥ（２）−Ｍ１７細胞はｈＳＵＲＶまたはｈＣＸＣＲ４プロモーターの制御下でＤＴ−Ａにより死滅させたが、しかしｈＡＦＰプロモーターの制御下では死滅されず、一方、肝細胞癌Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２細胞は、ＡＦＰ、ＳＵＲＶまたはＣＸＣＲ４プロモーターの制御下でＤＴ−Ａにより死滅させた、ということを示す。正常ヒト肺細胞株ＷＩ３８は、ＡＦＰ、ＳＵＲＶまたはｈＴＥＲＴプロモーターの制御下において、ＤＴ−Ａによる影響を受けなかった。図１９は、ＡＡＶ２−ｈＳＵＲＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）による細胞死滅の代表的結果を示す。これらの実験では、細胞を２４ウェルプレート中に播種し、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ（ａ）、（ｃ）、（ｅ）および（ｇ）、またはＡＡＶ２−ｈＳＵＲＶ−ｉｎＤＴＡ（ｈＧＨ）（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）および（ｈ）で形質導入した。形質導入の３日後に、写真を撮影した。（ａ）＆（ｂ）ＷＩ３８；（ｃ）および（ｄ）ＨｅｐＧ２；（ｅ）および（ｆ）Ｈｅｐ３Ｂ、ならびに（ｇ）および（ｈ）ＢＥ（２）−Ｍ１７細胞。
【０１１７】
３つの腫瘍細胞株も、ヒトＣＯＸ２、ＣＣＫＡＲおよびｈＴＥＲＴプロモーターの制御下でＤＴＡで試験したが、しかし有意な細胞死滅作用は観察されなかった。細胞死滅作用をさらに特性化するために、ＡＦＰ、ＳＵＲＶおよびＣＸＣＲ４プロモーターの制御下でＤＴＡを用いて、細胞生存度検定を実施した。図２０は、種々の腫瘍特異的プロモーターの制御下でのＤＴ−Ａを保有するＡＡＶ２ベクターによる腫瘍細胞の細胞生存度検定を示す。これらの実験では、細胞を９６ウェルプレート上に播種し、４倍連続希釈でＡＡＶ２ベクターで４日間形質導入して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光細胞生存度検定キットで細胞生存度を検定した。（ａ）ＨｅｐＧ２細胞、（ｂ）Ｈｅｐ３Ｂ細胞および（ｃ）ＢＥ（２）−Ｍ１７細胞。３つの腫瘍特異的プロモーターはすべて、ＨｅｐＧ２細胞において転写活性を示す。この中で、ＣＸＣＲ４プロモーターは、高力価のＡＡＶ２ベクターを用いた場合、ＨｅｐＧ２細胞を死滅させるようＤＴＡを駆動する最高活性を示した（図２０ａ）。Ｈｅｐ３Ｂ細胞に関しては、ＳＵＲＶプロモーターの制御下でのＤＴＡは、最強死滅作用を示したが、一方、ＡＦＰおよびＣＸＣＲ４は部分的死滅活性を示した（図２０ｂ）。興味深いことに、ＡＦＰプロモーターはＢＥ（２）−Ｍ１７細胞中では活性でなかったが、一方、ＣＸＣＲ４およびＳＵＲＶ両プロモーターの制御下でのＤＴＡは強力な死滅作用を示した（図２０ｃ）。
【０１１８】
本明細書中で言及される出版物、例えば特許出願、特許およびその他の参考文献はすべて、これらの記載内容が各々、参照により本明細書中で援用される。本明細書中で引用される参考文献についての任意の考察は、それらの著者によってなされた主張を単に要約するものであって、任意の参考文献またはその部分が関連従来技術を構成するということの承認というわけではない。出願人は、引用参考文献についての正確さおよび妥当性に異議を申し立てる権利を保有する。
【図１】
0005998229.tif 000025
【図２】
0005998229.tif 000026
【図３−１】
0005998229.tif 000027
【図３−２】
0005998229.tif 000028
【図４】
0005998229.tif 000029
【図５】
0005998229.tif 000030
【図６】
0005998229.tif 000031
【図７】
0005998229.tif 000032
【図８】
0005998229.tif 000033
【図９】
0005998229.tif 000034
【図１０】
0005998229.tif 000035
【図１１】
0005998229.tif 000036
【図１２】
0005998229.tif 000037
【図１３】
0005998229.tif 000038
【図１４Ａ】
0005998229.tif 000039
【図１４Ｂ】
0005998229.tif 000040
【図１４Ｃ】
0005998229.tif 000041
【図１４Ｄ】
0005998229.tif 000042
【図１５】
0005998229.tif 000043
【図１６】
0005998229.tif 000044
【図１７】
0005998229.tif 000045
【図１８Ａ】
0005998229.tif 000046
【図１８Ｂ】
0005998229.tif 000047
【図１８Ｃ】
0005998229.tif 000048
【図１８Ｄ】
0005998229.tif 000049
【図１９−１】
0005998229.tif 000050
【図１９−２】
0005998229.tif 000051
【図２０−１】
0005998229.tif 000052
【図２０−２】
0005998229.tif 000053
【配列表】
0005998229000001.app