(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子の配列を決定するための方法であって、
（ａ）該生体分子の配列文字列ｓの複数の部分文字列を表すｋ−１長の部分配列のセットを同定するステップ；
（ｂ）該ｋ−１長の部分配列のそれぞれについて、該ｋ−１長の部分配列の４つの異なるｋマー伸長物のプールを同定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定された各プールについて、
（ｉ）該プールを構成する４つのｋマープローブと該生体分子をハイブリダイズさせるステップ；および
（ｉｉ）該生体分子に付着した該ｋマープローブの相対位置を検出するステップであって、ここで、ステップ（ｃ）における該４つのｋマープローブのそれぞれに区別可能なタグが付着されているので、所定のｋマープールに使用される４つの異なる検出可能なタグが存在する、ステップ；ならびに
（ｄ）該検出された付着したプローブに対応する部分配列を順序よく配置して、該生体分子の配列文字列ｓを決定するステップ
を含み、ここで、該生体分子がＤＮＡまたはＲＮＡ分子である、方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）（ｉ）が、前記プールを構成する４つすべてのｋマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせることを含み、その後、ステップ（ｃ）（ｉｉ）においてそれらの付着したｋマープローブの相対位置を検出するので、ステップ（ｃ）（ｉｉ）が、該プールを構成する４つすべての該ｋマープローブの相対位置を検出する結果となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）が、
（Ａ）前記プールを構成する前記４つのｋマープローブから選択された２つの異なるｋマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせることであって、ここで、該２つの選択されたｋマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること；
（Ｂ）（Ａ）の後、該選択されたｋマープローブの両方が関与する１つ以上の結合事象が起こった場合、該生体分子に付着したそれら２つの異なるｋマープローブの相対位置を検出すること；および
（Ｃ）該プールを構成する４つのｋマープローブから選択された別の２つの異なるｋマープローブを用いて、該プールを構成する４つのｋマープローブの６ペアの組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、（Ａ）および（Ｂ）を繰り返し、それによって該プールを構成するｋマープローブの４つすべての相対位置を検出すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）が、
（Ａ）前記プールを構成する４つのｋマープローブから選択された３つのｋマープローブのセットと前記生体分子をハイブリダイズさせることであって、ここで、該３つの選択されたｋマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること；
（Ｂ）（Ａ）の後、該選択されたｋマープローブのうちの２つまたは３つが関与する１つ以上の結合事象が起こった場合、該生体分子に付着しているそれら２つまたは３つのｋマープローブの相対位置を検出すること；および
（Ｃ）該プールを構成する４つのｋマープローブから選択された３つのｋマープローブの異なるセットを用いて、該プールを構成する４つのｋマープローブの４つの３メンバー組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、（Ａ）および（Ｂ）を繰り返し、それによって該プールを構成する該ｋマープローブの４つすべての相対位置を検出すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が、前記ｋマープローブの相対位置を検出するために、ハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシング（ＨＡＮＳ）を用いることを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が、流体チャネルもしくはポアを横切る、またはチャネルもしくはポアの流体体積内の電気信号を、前記ハイブリダイズされた生体分子がそこを通って移動する間にモニターすることを含み、該電気信号が、該生体分子のハイブリダイズされた部分および該生体分子のハイブリダイズされていない部分を示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記検出された電気信号が、前記生体分子にハイブリダイズされた前記ｋマープローブのうちの少なくとも２つの間の識別を可能にする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が、前記生体分子にハイブリダイズされたｋマープローブのうちの少なくとも２つについての相対位置を示す光学信号を検出することを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｋ−１長の部分配列のセットが、配列文字列ｓ内の長さｋ−１のすべての可能な部分文字列を表す、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｋが３から１０までの整数である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｓが、少なくとも１００ｂｐの長さの配列文字列である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生体分子の配列を決定するための装置であって、
（ａ）１セットの命令を規定するコードを記憶するメモリ；および
（ｂ）配列文字列ｓのｋ−１長の部分配列の４つの異なるｋマー伸長物の各プールについて、該プールを構成する４つのｋマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせ、該生体分子に付着したｋマープローブの相対位置を検出することによって得たデータを用いて、該命令を実行して、それにより、該生体分子に付着した検出されたプローブに対応する部分配列を順序よく配置して該生体分子の配列文字列ｓを決定するプロセッサ
を具備し、ここで、該４つのｋマープローブのそれぞれに区別可能なタグが付着されているので、所定のｋマープールに使用される４つの異なる検出可能なタグが存在し、該生体分子がＤＮＡまたはＲＮＡ分子である装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１０年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／４１４，２８２号に対する優先権を主張し、その利益を受け、そしてその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、生体分子のシークエンシングのための方法に関する。より詳細には、一定の実施形態において、本発明は、ハイブリダイズされたプローブの相対位置から生体分子の配列を決定することに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生体高分子シークエンシングとは、生体分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）またはそれらの一部中のヌクレオチド塩基（アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン）の順序の決定を指す。生体分子シークエンシングには、例えば診断学、生物工学、法生物学および創薬において、非常に多くの用途がある。様々な技術が生体高分子シークエンシングのために開発されてきた。
【０００４】
ハイブリダイゼーションによるシークエンシング（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＳＢＨ）は、一本鎖断片またはプローブのセット（一般に、長さｋのすべての可能な４ｋオリゴヌクレオチド）を基板またはハイブリダイゼーションアレイに付着させる、生体分子シークエンシング方法である。そのアレイは、ＤＮＡの一本鎖断片の溶液に暴露される。プローブとＤＮＡとの間でのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡのスペクトル（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、すなわち、その配列中に少なくとも１回出現するすべてのｋマー（ｋ−ｍｅｒ）のセットが明らかになる。ＳＢＨを用いる配列の決定は、検出されたｋマーのスペクトルを表すグラフのオイラー路（すべての辺を通る経路）を見つけることを伴う。そのｋマーについて１つだけの配列がそのスペクトルと一致すると、単一の解への収束が発生する。ハイブリダイズされたｋマーの１つより多くの配列がそのスペクトルと一致すると、曖昧なシークエンシングが発生する。１つの解を有する十分に稠密ないずれのグラフも複数の同等によく支持される解を有するので、現行のＳＢＨ技術には限界がある。
【０００５】
ハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシング（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＨＡＮＳ）は、１つ以上のナノポアまたはあるいはナノチャネル、マイクロポアもしくはマイクロチャネルの使用を伴う、ゲノム長のＤＮＡおよび他の生体分子のシークエンシング方法である。ＨＡＮＳは、未知標的の長い断片を配列既知の短いプローブにハイブリダイズさせることを伴う。この方法は、シークエンシングまたは特性づけされる生体分子（例えば、ＤＮＡ）の特定の部分へのプローブのハイブリダイゼーション位置を検出することに依存する。プローブは、それらがそれらの相補配列を見つける位置であれば標的ＤＮＡのどこにでも結合する。これらの結合事象間の距離は、ナノポア（またはナノチャネル、マイクロポアもしくはマイクロチャネル）を通して標的断片を移動させることにより決定される。ナノポアを横切る電流または電圧を読み取ることにより、標的ＤＮＡの標識されていない骨格と、プローブの結合部位であるその骨格上の箇所とを区別することができる。ＤＮＡはほぼ一定の速度で移動するので、かかる電流または電圧の測定値の経時変化により、標的ＤＮＡ上のプローブ結合部位間の相対距離の測定値が得られる。
【０００６】
プローブの種類ごとに１つずつこれらの測定を行った後、プローブ位置データを分析し、プローブのオーバーラップ位置を突き合せることにより、ＤＮＡ配列を決定する。しかし、ＨＡＮＳを用いる絶対プローブ位置の測定に付随する不正確さのため、なおもシークエンシングの曖昧さが現れることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現行のＳＢＨ、ＨＡＮＳおよび他のシークエンシング技術で遭遇する曖昧さを回避または解消することができる、改善された生体分子シークエンシング方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
１タイプだけのプローブとではなく、電気的に区別できる配列既知の異なるプローブの特別に選ばれたプールと生体分子をハイブリダイズさせるシークエンシング方法を提示する。異なるプローブタイプにタグをつけるので、ハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシング（ＨＡＮＳ）検出システムでそれらを互いに区別することができ、また前記生体分子がポアまたはチャネルを通過する間に該生体分子上のそれらの相対位置を決定することができる。一定の実施形態では、相対プローブ位置を直接決定することを可能にすることにより、前記方法は、以前のシークエンシング方法の際に遭遇する曖昧さを無くす、または大きく低減させる。
【０００９】
ＨＡＮＳアプローチで電気信号を区別する精度および能力には限界があるため、無制限の数のタグを使用して、単一生体分子上に同時にハイブリダイズされた多くの異なるプローブを区別することは、不可能ではなかったとしても、困難である。それ故、本明細書に提示する方法は、既知配列のプローブの一連のプールを使用するものであり、該プールは、それぞれが幾つかの（例えば４つの）メンバーを有し、１回に１プールずつ（または１回に１つの部分プールずつ）生体分子にプールをハイブリダイズさせる。生体分子上の所定のプールからの４プローブの相対位置をＨＡＮＳによって決定する。本明細書中で説明するように、ハイブリダイズされた生体分子のポアまたはチャネルを通る所定の通過において４つの、３つの、またはさらに２つほどの少数の区別可能なタグを使用して、本方法の利点を実現することができる。したがって、これらのシークエンシング方法は、現行のＨＡＮＳシステムの感度限界内で機能する。
【００１０】
本明細書において用いる場合、用語「配列」は、生体分子の配列全体に限定されず、部分配列を含むことができ、および用語「生体分子」は、生体分子全体に限定されず、生体分子の断片を含むことができる。用語「生体分子」は、所定の生体分子（またはその断片）の１つ以上のコピーを含むことができる。例えば、生体分子を１つ以上のプローブとハイブリダイズさせる場合、これは、所定の生体分子の多数のコピーを１つ以上のプローブの多くのコピーとハイブリダイズさせることを意味し得る。
【００１１】
一つの態様において、本発明は、生体分子の配列を決定する方法に関する。この方法は、ハイブリダイゼーションによる区別可能なタギングシークエンシング（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ｄｔＳＢＨ）と呼ぶことができ、（ａ）生体分子の配列文字列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｔｒｉｎｇ）ｓの複数の部分文字列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を表すｋ−１長の部分配列のセットを同定するステップ；（ｂ）該ｋ−１長の部分配列のそれぞれについて、該ｋ−１長の部分配列の４つの異なるｋマー伸長物のプールを同定するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）において同定された各プールについて、（ｉ）該プールを構成する４つのｋマープローブと該生体分子をハイブリダイズさせるステップ；および（ｉｉ）該生体分子に付着したｋマープローブの相対位置を検出するステップ；ならびに（ｄ）検出された付着プローブに対応する部分配列の順序を適切に配置して、該生体分子の配列文字列ｓを決定するステップを含む。一定の実施形態において、ステップ（ｃ）（ｉ）および（ｃ）（ｉｉ）は、一度に、多数のステップで行うことができ、および前記生体分子にハイブリダイズされた４つすべてよりも少数のｋマープローブを用いて行うことができる。
【００１２】
一定の実施形態では、ステップ（ｃ）における前記４つのｋマープローブのそれぞれに区別可能なタグが付着されているので、所定のｋマープールに使用される４つの異なる検出可能なタグが存在する。一定の実施形態において、ステップ（ｃ）（ｉ）は、前記プールを構成する４つすべてのｋマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせ、その後、ステップ（ｃ）（ｉｉ）においてそれらの付着したｋマープローブの相対位置を検出することを含むので、ステップ（ｃ）（ｉｉ）は、該プールを構成する４つすべてのｋマープローブの相対位置を検出する結果となる。
【００１３】
一定の実施形態では、２つほどの少数の区別可能なタグを一度に使用することができる。例えば、一定の実施形態において、ステップ（ｃ）は、（Ａ）前記プールを構成する４つのｋマープローブから選択された２つの異なるｋマープローブと、前記生体分子とをハイブリダイズさせることであって、ここで、２つの選択されたｋマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること（例えば、２つの異なる種／種類のタグを使用し、および該生体分子を該２つの異なるｋマータグのコピーとハイブリダイズさせる）；（Ｂ）（Ａ）の後、該選択されたｋマープローブの両方が関与する１つ以上の結合事象が発生する場合、該生体分子に付着しているそれら２つの異なるｋマープローブの相対位置を検出すること；および（Ｃ）該プールを構成する４つのｋマープローブから選択された別の２つの異なるｋマープローブ（例えば、これらは、互いに異なる２種／種類のｋマープローブである）を用いて、該プールを構成する４つのｋマープローブの６ペアの組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、（Ａ）および（Ｂ）を繰り返し、それによって該プールを構成するｋマープローブの４つすべての相対位置を検出することを含む。
【００１４】
一定の実施形態では、３つの区別可能なタグを一度に使用することができる。例えば、一定の実施形態において、ステップ（ｃ）は、（Ａ）前記プールを構成する４つのｋマープローブから選択された３つのｋマープローブのセットと、前記生体分子をハイブリダイズさせることであって、ここで、３つの選択されたｋマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること（例えば、これらは３つの異なる種／種類のタグであり、および該生体分子を該３つの異なるｋマープローブの多くのコピーとハイブリダイズさせる）；（Ｂ）（Ａ）の後、該選択されたｋマープローブのうちの２つまたは３つが関与する１つ以上の結合事象が起こった場合、該生体分子に付着しているそれら２つまたは３つのｋマープローブの相対位置を検出すること；および（Ｃ）該プールを構成する４つのｋマープローブから選択された３つのｋマープローブ（例えば、これらは互いに異なる３種／種類のｋマープローブである）の異なるセットを用いて、該プールを構成する４つのｋマープローブについての４つの３メンバーの組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、（Ａ）および（Ｂ）を繰り返し、それによって該プールを構成するｋマープローブの４つすべての相対位置を検出することを含む。一定の実施形態では、前記４つのｋマープローブと複数の区別可能なタグとの他の組み合わせが可能である。
【００１５】
一定の実施形態において、ステップ（ｃ）（ｉｉ）は、前記ｋマープローブの相対位置を検出するためにＨＡＮＳを用いることを含む。ＨＡＮＳは、例えば、標的生体分子およびそれに付着された（ハイブリダイズされた）プローブをナノポア、ナノチャネル、マイクロポアまたはマイクロチャネルを通して送ることによって結合事象間の距離を測定することができる、ハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシングである。一定の実施形態において、ステップ（ｃ）（ｉｉ）は、流体チャネルもしくはポアを横切る、またはチャネルもしくはポアの流体体積内の電気信号を、ハイブリダイズされた生体分子がそこを通って移動する間にモニターすることを含み、この電気信号が該生体分子のハイブリダイズされた部分および該生体分子のハイブリダイズされていない部分を示す。一定の実施形態において、前記検出された電気信号は、前記生体分子にハイブリダイズされた前記ｋマープローブ間のうちの少なくとも２つの識別を可能にする。一定の実施形態において、ステップ（ｃ）（ｉｉ）は、前記生体分子にハイブリダイズされたｋマープローブのうちの少なくとも２つについての相対位置を示す光学信号を検出することを含む。
【００１６】
一定の実施形態において、前記ｋ−１長の部分配列のセットは、配列文字列ｓ内の長さｋ−１のすべての可能な部分文字列を表す。一定の実施形態において、ｋは、３から１０まで、例えば、４、５、６または７の整数である。一定の実施形態において、ｓは、少なくとも１００ｂｐの長さの配列文字列、例えば、少なくとも１０００ｂｐの長さ、少なくとも５０００ｂｐの長さ、少なくとも１００，０００ｂｐの長さ、少なくとも１００万ｂｐの長さ、または少なくとも１０億ｂｐの長さの文字列である。
【００１７】
もう一つの態様において、本発明は、ブランチングの曖昧さの解消のために位置平均化を用いるＨＡＮＳアルゴリズムに関する。この方法は、移動窓ＳＢＨまたはナノポア支援ＳＢＨ（nanopore-assisted  SBH）と呼ぶことができ、曖昧さ解消が増進されたものである。前記方法は、生体分子の配列を決定するものであり、（ａ）該生体分子の配列文字列ｓの複数の部分文字列を表すｋマープローブのスペクトルを同定するステップ；（ｂ）該部分文字列を配置して、複数の候補拡大文字列を作るステップであって、候補拡大文字列のそれぞれがステップ（ａ）における部分文字列すべてを含有し、各候補拡大文字列が部分文字列すべての最短可能配置に対応する長さを有するものである複数の候補拡大文字列を作るステップ；（ｃ）該候補拡大文字列に共通する２つ以上のブランチの順序の配置の曖昧さを同定し、該２つ以上のブランチそれぞれに沿った部分文字列に対応する複数のｋマープローブを同定するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）において同定された各ｋマープローブについて、該生体分子を該ｋマープローブとハイブリダイズさせ、該生体分子に沿った該ｋマープローブの絶対位置の近似的尺度（ｍｅａｓｕｒｅ）を得るステップ；（ｅ）該ブランチ内にある、ステップ（ｃ）において同定された各ｋマープローブの絶対位置の尺度の平均を各ブランチについて得ること、および各ブランチについて同定された平均絶対位置尺度に従って２つ以上のブランチを順序よく配置することにより該２つ以上のブランチの相対的順序を決定し、それによって該生体分子の配列文字列ｓを同定するステップを含む。
【００１８】
一定の実施形態では、ステップ（ａ）でのｋマープローブのスペクトルの同定を、ステップ（ｄ）において絶対位置の近似的尺度を得るのと同時に行う（例えば、ここで、ステップ（ａ）と（ｄ）両方をＨＡＮＳによって行うことができる）。一定の実施形態では、ステップ（ａ）をＳＢＨによって行い、ステップ（ｄ）をＨＡＮＳによって行う。
【００１９】
一定の実施形態では、ステップ（ａ）と（ｄ）とを同時に行う。一定の実施形態では、ＨＡＮＳを用いてステップ（ａ）および（ｄ）を行う。一定の実施形態では、ＳＢＨを用いてステップ（ａ）を行う。
【００２０】
一定の実施形態において、ステップ（ｄ）は、流体チャネルもしくはポアを横切る、またはチャネルもしくはポアの流体体積内の電気信号を、前記ハイブリダイズされた生体分子がそこを通って移動する間にモニターすることを含み、この電気信号が該生体分子のハイブリダイズされた部分および該生体分子のハイブリダイズされていない部分を示す。一定の実施形態において、前記ｋマープローブのスペクトルは、前記配列文字列ｓの部分文字列の完全セットを表す。
【００２１】
上記実施形態の構成要素についての説明を本発明のこの態様にも適用することができる。
【００２２】
さらにもう一つの態様において、本発明は、生体分子の配列を決定するための装置に関し、この装置は、（ａ）１セットの命令を規定するコードを記憶するメモリ；および（ｂ）配列文字列ｓのｋ−１長の部分配列の４つの異なるｋマー伸長物の各プールについて、該プールを構成する４つのｋマープローブと該生体分子をハイブリダイズさせ、該生体分子に付着したｋマープローブの相対位置を検出することによって得たデータを用いて、該命令を実行して、それにより、該生体分子に付着した検出されたプローブに対応する部分配列を順序よく配置して該生体分子の配列文字列ｓを決定するプロセッサを具備する。
【００２３】
上記実施形態の構成要素についての説明は、本発明のこの態様にも適用することができる。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
生体分子の配列を決定するための方法であって、
（ａ）該生体分子の配列文字列ｓの複数の部分文字列を表すｋ−１長の部分配列のセットを同定するステップ；
（ｂ）該ｋ−１長の部分配列のそれぞれについて、該ｋ−１長の部分配列の４つの異なるｋマー伸長物のプールを同定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定された各プールについて、
（ｉ）該プールを構成する４つのｋマープローブと該生体分子をハイブリダイズさせるステップ；および
（ｉｉ）該生体分子に付着した該ｋマープローブの相対位置を検出するステップ；ならびに
（ｄ）該検出された付着したプローブに対応する部分配列を順序よく配置して、該生体分子の配列文字列ｓを決定するステップ
を含む方法。
（項目２）
ステップ（ｃ）における前記４つのｋマープローブのそれぞれに区別可能なタグが付着されているので、所定のｋマープールに使用される４つの異なる検出可能なタグが存在する、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップ（ｃ）（ｉ）が、前記プールを構成する４つすべてのｋマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせることを含み、その後、ステップ（ｃ）（ｉｉ）においてそれらの付着したｋマープローブの相対位置を検出するので、ステップ（ｃ）（ｉｉ）が、該プールを構成する４つすべての該ｋマープローブの相対位置を検出する結果となる、項目２に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ｃ）が、
（Ａ）前記プールを構成する前記４つのｋマープローブから選択された２つの異なるｋマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせることであって、ここで、該２つの選択されたｋマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること；
（Ｂ）（Ａ）の後、該選択されたｋマープローブの両方が関与する１つ以上の結合事象が起こった場合、該生体分子に付着したそれら２つの異なるｋマープローブの相対位置を検出すること；および
（Ｃ）該プールを構成する４つのｋマープローブから選択された別の２つの異なるｋマープローブを用いて、該プールを構成する４つのｋマープローブの６ペアの組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、（Ａ）および（Ｂ）を繰り返し、それによって該プールを構成するｋマープローブの４つすべての相対位置を検出すること
を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
ステップ（ｃ）が、
（Ａ）前記プールを構成する４つのｋマープローブから選択された３つのｋマープローブのセットと前記生体分子をハイブリダイズさせることであって、ここで、該３つの選択されたｋマープローブには、互いに区別可能であるタグが付着していること；
（Ｂ）（Ａ）の後、該選択されたｋマープローブのうちの２つまたは３つが関与する１つ以上の結合事象が起こった場合、該生体分子に付着しているそれら２つまたは３つのｋマープローブの相対位置を検出すること；および
（Ｃ）該プールを構成する４つのｋマープローブから選択された３つのｋマープローブの異なるセットを用いて、該プールを構成する４つのｋマープローブの４つの３メンバー組み合わせすべてについてのハイブリダイゼーションおよび検出が遂行されるまで、（Ａ）および（Ｂ）を繰り返し、それによって該プールを構成する該ｋマープローブの４つすべての相対位置を検出すること
を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が、前記ｋマープローブの相対位置を検出するためにＨＡＮＳを用いることを含む、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が、流体チャネルもしくはポアを横切る、またはチャネルもしくはポアの流体体積内の電気信号を、前記ハイブリダイズされた生体分子がそこを通って移動する間にモニターすることを含み、該電気信号が、該生体分子のハイブリダイズされた部分および該生体分子のハイブリダイズされていない部分を示す、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記検出された電気信号が、前記生体分子にハイブリダイズされた前記ｋマープローブのうちの少なくとも２つの間の識別を可能にする、項目７に記載の方法。
（項目９）
ステップ（ｃ）（ｉｉ）が、前記生体分子にハイブリダイズされたｋマープローブのうちの少なくとも２つについての相対位置を示す光学信号を検出することを含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ｋ−１長の部分配列のセットが、配列文字列ｓ内の長さｋ−１のすべての可能な部分文字列を表す、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
ｋが３から１０までの整数である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
ｓが、少なくとも１００ｂｐの長さの配列文字列である、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
生体分子の配列を決定するための方法であって、
（ａ）該生体分子の配列文字列ｓの複数の部分文字列を表すｋマープローブのスペクトルを同定するステップ；
（ｂ）該部分文字列を配置して複数の候補拡大文字列を作るステップであって、該複数の候補拡大文字列のそれぞれがステップ（ａ）における部分文字列すべてを含有し、各候補拡大文字列が該部分文字列すべての最短可能配置に対応する長さを有する、ステップ；
（ｃ）該候補拡大文字列に共通する２つ以上のブランチの順序配置の曖昧さを同定し、該２つ以上のブランチのそれぞれに沿った部分文字列に対応する複数のｋマープローブを同定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）において同定された各ｋマープローブについて、該生体分子を該ｋマープローブとハイブリダイズさせ、該生体分子に沿った該ｋマープローブの絶対位置の近似的尺度を得るステップ；
（ｅ）該ブランチ内にある、ステップ（ｃ）において同定された各ｋマープローブの絶対位置の尺度の平均を各ブランチについて得ること、および各ブランチについて同定された平均絶対位置尺度に従って該２つ以上のブランチを順序よく配置することにより該２つ以上のブランチの相対的順序を決定し、それによって該生体分子の配列文字列ｓを同定するステップ
を含む方法。
（項目１４）
ステップ（ａ）と（ｄ）とが同時に行われる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
ステップ（ａ）および（ｄ）が、ＨＡＮＳを用いて行われる、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ステップ（ａ）が、ＳＢＨを用いて行われる、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ｄ）が、流体チャネルもしくはポアを横切るまたはチャネルもしくはポアの流体体積内の電気信号を、前記ハイブリダイズされた生体分子がそこを通って移動する間にモニターすることを含み、該電気信号が、該生体分子のハイブリダイズされた部分および該生体分子のハイブリダイズされていない部分を示す、項目１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ｋマープローブのスペクトルが、前記配列文字列ｓの部分文字列の完全セットを表す、項目１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
生体分子の配列を決定するための装置であって、
（ａ）１セットの命令を規定するコードを記憶するメモリ；および
（ｂ）配列文字列ｓのｋ−１長の部分配列の４つの異なるｋマー伸長物の各プールについて、該プールを構成する４つのｋマープローブと前記生体分子をハイブリダイズさせ、該生体分子に付着したｋマープローブの相対位置を検出することによって得たデータを用いて、該命令を実行して、それにより、該生体分子に付着した検出されたプローブに対応する部分配列を順序よく配置して該生体分子の配列文字列ｓを決定するプロセッサ
を具備する装置。
【００２４】
下に記載する図面、および特許請求の範囲を参照することで、本発明の目的および特徴をより良く理解することができる。これらの図面は、必ずしも一定の縮小比に従うものではなく、その代わり、一般に、本発明の原理の例証に重点を置いている。これらの図面では、様々な図を通して同様の部材を示すために同様の数字を用いている。
【００２５】
本明細書では特定の実施例および特定の実施形態に関して本発明を詳細に示し、説明するが、本発明の精神および範囲を逸脱することなくそこにある形態および詳細を様々に変更できることは当業者には理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の例示的実施形態による、ＳＢＨハイブリダイゼーションアレイの概略図である。
【図２】図２は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のスペクトルおよびグラフ空間の概略図である。
【図３】図３は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のスペクトルおよびグラフ空間の概略図である。
【図４】図４は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のスペクトルおよびグラフ空間の概略図である。
【図５】図５は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のスペクトルおよびグラフ空間の概略図である。
【図６】図６は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のスペクトルおよびグラフ空間の概略図である。
【図７】図７は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のスペクトルおよびグラフ空間の概略図である。
【図８】図８は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のグラフ空間の概略図である。
【図９】図９は、本発明の例示的実施形態による、２つの別の生体分子にハイブリダイズされたプローブの概略図である。
【図１０】図１０は、本発明の例示的実施形態による、単一の生体分子にハイブリダイズされたプローブの概略図である。
【図１１】図１１は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のグラフ空間の概略図である。
【図１２】図１２は、本発明の例示的実施形態による、生体分子にハイブリダイズされたプローブの概略図である。
【図１３】図１３は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のシークエンシング方法を図示するフローチャートである。
【図１４】図１４は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のグラフ空間の概略図である。
【図１５】図１５は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のグラフ空間の概略図である。
【図１６】図１６は、本発明の例示的実施形態による、生体分子のシークエンシング方法を図示するフローチャートである。
【図１７】図１７は、本発明の例示的実施形態による、コンピュータおよび付随する入力／出力デバイスの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
本願発明のデバイス、システム、方法およびプロセスは、本明細書に記載する実施形態からの情報を用いて開発される変形形態および適応形態を包含すると考えられる。本明細書に記載するデバイス、システム、方法およびプロセスの適応形態および／または修正形態を関連分野の当業者は実施することができる。
【００２８】
本明細書を通して、デバイスおよびシステムが、特定の構成要素を有する、含むまたは具備すると記載されている場合、またはプロセスおよび方法が、特定のステップを有する、含むまたは備えていると記載されている場合、さらに、列挙されている構成要素から本質的になるまたはこの構成要素からなる本発明のデバイスおよびシステムが存在すること、ならびに列挙されている処理ステップから本質的になるまたはこの処理ステップからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが意図される。
【００２９】
ステップの順序または特定の動作を行う順序は、本発明が実施可能であり続ける限り、重要でないことを理解すべきである。さらに、２つ以上のステップまたは動作を同時に行うことができる。
【００３０】
本明細書における、例えば背景の項におけるいずれの出版物についての言及も、ここに提示する請求項のいずれかに対する先行技術としてその出版物が扱われることを承認しているわけではない。背景の項は、明瞭にするために提示するものであり、いずれかの請求項に対する先行技術の説明を意図したものではない。
【００３１】
ＳＢＨは、生体分子文字列ｓの配列を回収する方法である。整数ｋに関する文字列ｓのスペクトルは、ｓの部分文字列である長さｋの文字列（すなわち、ｋマー）（すなわち、文字列ｓの配列内に少なくとも１回出現するｋマー）のセットである。図１に図示するように、旧来のＳＢＨでは、ハイブリダイゼーションアレイ１０を用いて文字列ｓのスペクトルを得る。ｋマーハイブリダイゼーションアレイ１０は、長さｋの各プローブについてＤＮＡのスポット１２を合計４ｋスポット有する。標的ＤＮＡ１４をアレイ１０で洗い出し、それを該標的１４に相補体がある各スポット１２にハイブリダイズさせるかまたはくっつける。ｋマーが標的１４にハイブリダイズしたスポット１２を同定することにより、標的１４のスペクトルを明らかにする。
【００３２】
文字列ｓのスペクトルまたはプローブ空間をグラフ空間にグラフで表すことができ、そこでは、各プローブが、そのｋ−１マープレフィックスからそのｋ−１マーサフィックスまでの辺である。例えば、図２を参照すると、スペクトル２０またはプローブ空間が、単一プローブ「ａｇａｃｃｔ」からなるとき、グラフ空間２２は、ｋ−１マープレフィックス「ａｇａｃｃ」に対応する第一ノード２４と、ｋ−１マーサフィックス「ｇａｃｃｔ」に対応する第二ノード２６と、プレフィックスからサフィックスへの経路を表す、第一ノード２４から第二ノード２６への矢印２８とを含む。
【００３３】
スペクトルが１つより多くのｋマーを含むとき、ｋ−１マープレフィックスまたはｋ−１マーサフィックスを共有するプローブは、グラフ空間内の同じノードを共有する。例えば、図３を参照すると、スペクトル３０が、２つのプローブ「ａｇａｃｃｔ」および「ｇａｃｃｔｇ」からなるとき、一方のプローブのプレフィックス（「ｇａｃｃｔｇ」）は、他方のプローブのサフィックス（「ａｇａｃｃｔ」）と同じである。グラフ空間３２において、前記２つのプローブは、共通ｋ−１マー部分（すなわち「ｇａｃｃｔ」）を有する中央ノード３４を共有し、第一末端ノード３６および第二末端ノード３８は、これら２つのプローブの残りのプレフィックスおよびサフィックス（すなわち、「ａｇａｃｃ」および「ａｃｃｔｇ」）を表す。
【００３４】
同様に、図４を参照すると、スペクトル４０が、２つのプローブ「ａｇａｃｃｔ」および「ａｇａｃｃａ」からなるとき、これらのプローブは、共通ｋ−１マープレフィックス（すなわち、「ａｇａｃｃ」）を有する近位ノード４２を共有する。このケースでのグラフ空間４４は、第一遠位ノード５０および第二遠位ノード５２にそれぞれつながる第一ブランチ４６および第二ブランチ４８も含む。遠位ノード５０、５２は、これら２つのプローブのサフィックス部分（すなわち、「ｇａｃｃｔ」および「ｇａｃｃａ」）を含む。
【００３５】
図５を参照すると、スペクトル６０が複数のプローブを含むとき、その文字列の配列は、最短共通拡大文字列（すなわち、最少数のノードを用いるグラフ空間内のプローブの配置）に従ってグラフ空間６２内にプローブを配置することにより決定することができる。図示するように、スペクトル６０が、「ａｇａｃｃｔ」、「ｇａｃｃｔｇ」、「ｃｃｔｇｃｔ」、「ａｃｃｔｇｃ」および「ｃｔｇｃｔａ」からなるとき、グラフ空間６２内の配置により、拡大文字列の配列が「ａｇａｃｃｔｇｃｔａ」であることが明らかになる。
【００３６】
述べたように、スペクトルに依存してグラフ空間は１本以上のブランチを含むことがあり、この場合、その配列は２方向以上の可能な方向に進むことができる。これらのブランチは、どのブランチが最初に来るのかが不明確であり得るため、文字列の配列の決定を難しくし得る曖昧さを招く。例えば、図６を参照すると、スペクトル７０が、「ｃｃｃａｔｇ」、「ｇｔｇａｔｇ」、「ａｔｇｔａｔ」、「ａｔｇａｇｔ」、「ｇａｔｇｔａ」、「ｔｇａｇｔｇ」、「ｃｃａｔｇａ」、「ｔｇｔａｔｔ」、「ａｔｇａｔｇ」、「ａｇｔｇａｔ」、「ｇａｔｇａｇ」、「ｇａｇｔｇａ」、「ｃａｔｇａｔ」、「ｔｇａｔｇｔ」および「ｔｇａｔｇａ」からなる場合、グラフ空間７２は、プローブ「ｔｇａｔｇｔ」および「ｔｇａｔｇａ」によって共有されるノード「ｔｇａｔｇ」に第一ブランチ７４および第二ブランチ７６を含む。第一ブランチ７４は、ノード「ｔｇａｔｇ」に戻る上方ループ７８を形成する。図示するように、第一ブランチ７４および第二ブランチ７６は、ノード「ｔｇａｔｇ」においてとることができる経路が２つ存在するという曖昧さを生み出す。場合によっては、ブランチの数次第で、例えば、どの経路を最初にとるのか不明確になるだろう。しかし、このケースでは、すべてのプローブを含む解を要求することにより、第一ブランチ７４および上方ループ７８が第二ブランチ７６前に来ることが明確になる。したがって、場合によっては、グラフ空間の曖昧さまたはブランチングにもかかわらず、正しい配列を同定することができる。
【００３７】
しかし、一定の配列については、追加の情報を得ずに正しい配列を明確に回収することが可能でないかもしれない。例えば、図７を参照すると、スペクトル８０が、「ｔａｇｃａｇ」、「ｇｃａｇｔａ」、「ｃｔａｇｃａ」、「ｇｔａｇｃａ」、「ａｇｃａｔａ」、「ｃａｔａｇｃ」、「ｇｃａｔａｇ」、「ｔａｇｃａｔ」、「ｃａｇｔａｇ」、「ａｇｃａｇｔ」、「ａｔａｇｃａ」、「ｔａｇｃａｃ」、「ａｇｔａｇｃ」、「ｇｃｔａｇｃ」および「ａｇｃａｃｃ」からなるとき、上記アプローチ（すなわち、すべてのプローブを含む解を要求すること）は、２つの可能な配列：「ｇｃｔａｇｃａｇｔａｇｃａｔａｇｃａｃｃ」および「ｇｃｔａｇｃａｔａｇｃａｇｔａｇｃａｃｃ」をもたらす。図示するように、この事例でのグラフ空間８２は、ノード「ｔａｇｃａ」における３本のブランチとそのノードから出てとることができる３つの経路、そのノードに接続された上方ループ８４および下方ループ８６を含む。前の例とは異なり、すべてのプローブを使用する解を要求しても、どのループが最初に来るのかは依然として不明確であるので、やはり曖昧な結果となる。この曖昧さを解消するための追加の情報無くして、正しい配列を同定されないかもしれない。
【００３８】
図８を参照すると、ノード「ｔａｇｃａ」におけるブランチまたはループ８４、８６について正しい順序を同定することにより、正しい配列を決定することができる。言い換えると、グラフ空間８２における唯一の曖昧さは、「ｔａｇｃａ」の３本のブランチまたはアウトエッジ（伸長物）の相対順序である。このケースではすべてのプローブを含む解を求めることにより、２つのループ８４、８６が末端ノード「ａｇｃａｇ」の前に来なければならないことが明らかになる。２つのループ８４、８６のいずれが最初に来るかを決めるために追加の情報が必要である。一つの実施形態では、ブランチおよび／またはループの相対順序を区別可能なタグで判定する。
【００３９】
ＳＢＨについて上で述べたように、未知標的の長い断片を配列既知の短いプローブとハイブリダイズさせることによってＤＮＡをシークエンシングすることができる。これらのプローブは、それらがそれらの相補配列を見つける位置であれば標的ＤＮＡのどこにでも結合して結合事象を生じさせることとなる。これらの結合事象間の距離は、例えば、ハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシング（ＨＡＮＳ）の場合のように標的断片およびハイブリダイズされたプローブをナノポア、ナノチャネル、マイクロポアまたはマイクロチャネルを通して送ることによって、測定することができる。例えば、寸法既知の流体狭窄部としての役割を果たすナノメートルサイズの穴（すなわちナノポア）によって溶液の２つのリザーバを分離する。これら２つのリザーバ間へのＤＣ定電圧の印加は、ベースラインイオン電流を生じさせる結果となり、それを測定する。分析物をリザーバに導入すると、分析物は、流体チャネルを通過することができ、そして電解質溶液と分析物との導電率の差により観察電流を変化させることができる。電流の変化の大きさは、分析物が流体チャネル内にある間にその分析物によって置換される電解質の体積に依存する。電流変化の持続時間は、分析物がナノポア狭窄部を通過するのにかかる時間量に関係している。ナノポアを通してのＤＮＡ移動のケースでは、印加されたＤＣ電圧によって生成される電気泳動力によって、物理的移動が駆動され得る。他の駆動源、例えば、圧力、化学ポテンシャルなども考えられる。様々なマイクロ／ナノポア／チャネルベースの検出システムが、公開文献、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１９０５４２号、「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」；米国特許出願公開第２００９／００９９７８６号、「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  Ｆｏｒｍ  Ｔｅｒｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒａｎｇｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」；米国特許出願公開第２０１０／００９６２６８号、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌｌｙ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｄ  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ」；米国特許出願公開第２０１０／０２４３４４９号、「Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｂｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒｅｔｏ」；米国特許出願公開第２０１０／０２６１２８５号、「Ｔａｇｇｅｄ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｍａｐ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」；および米国特許出願公開第２０１０／００７８３２５号、「Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔａｎｃｅｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｂｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒｅｔｏ」（これらの原文は、それら全体が参照により本明細書にすべて援用されている）に記載されており、本明細書に記載する様々な実施形態において使用することができる。次の係属中の特許出願の方法、装置およびシステムも、本明細書に記載する様々な実施形態において使用することができる：Ｏｌｉｖｅｒらによる米国特許出願公開第２０１０／０３１０４２１号、「Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｂｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒｅｔｏ」；およびＯｌｉｖｅｒによる米国特許出願第１２／８９１，３４３号、「Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｉｃｋｉｎｇ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ」（これらの原文は、それら全体が参照により本明細書にすべて援用されている）。
【００４０】
標的およびプローブがナノポアを通って進むと、ナノポアを横切る電流または電圧の読取値により、標的ＤＮＡの標識されていないまたはハイブリダイズされていない骨格とプローブの結合部位である該骨格上のハイブリダイズされている箇所とを区別することができる。ＤＮＡは、ほぼ一定の速度でナノポアを通って移動するので、かかる電流または電圧測定値の経時変化または時間履歴により、標的ＤＮＡ上のプローブ結合部位間の距離の測定値が得られる。
【００４１】
図９を参照すると、第一プローブ９０（例えば、「ｔａｇｃａｇ］）および第二プローブ９２（例えば、「ｔａｇｃａｔ」）を２つの同一の標的生体分子９４に別々にハイブリダイズさせることができる。図示する実施形態では、第一プローブ９０を第一の実際の位置９５でハイブリダイズさせ、第二プローブ９２を第二の実際の位置９６でハイブリダイズさせる。例えば上で説明したナノポアまたは他の技術を用いて、生体分子９４の長さに沿って第一プローブ９０の実測絶対位置９７および第二プローブ９２の実測絶対位置９８を決定することができる。しかし、測定誤差のため、実測絶対位置９７、９８は、実際のまたは真の絶対位置９５、９６とは異なることがあり、これは、これら２つのプローブの順序の不正確な決定をもたらすことがある。図示するように、このケースでの実測位置９７、９８は、「ｔａｇｃａｔ」が「ｔａｇｃａｇ」の前に来ることを示唆しているが、実際の位置９５、９６は、反対の順序配置（すなわち、「ｔａｇｃａｇ」が「ｔａｇｃａｔ」の前に来る順序配置）を示す。
【００４２】
これらの誤差を避けるために、２つのプローブの相対位置を直接測定することが望ましい。一つの実施形態では、区別可能なタグを使用してそれらの相対位置を明らかにする。
【００４３】
区別可能なタグ付けは、各プローブを他のプローブから個々に区別することができるようにプローブにタグを付着させることを指す。具体的には、ハイブリダイズされたプローブが、生体分子に沿って検出されたとき、区別可能なタグにより、検出された特定のプローブの同定が可能になる。例えば、標的と２つのプローブ（ＡおよびＢ）とが関与する反応のケースでは、区別可能なタグ付けをせずに、特定の結合部位がプローブＡに対応するのか、またはプローブＢに対応するのかを告げることは困難または不可能であり得る。
【００４４】
本明細書の中でさらに詳細に説明するように、特定の方法で異なるプローブを一緒にプールすること（これは、単一のハイブリダイゼーション反応物が、標的と１つのプローブではなく、異なる既知配列を有する複数のプローブを含むことを意味する）が有利である。図１０を参照すると、第一のプローブとタグの組み合わせ１００および第二のプローブとタグの組み合わせ１０２（例えば、「ｔａｇｃａｇ」および「ｔａｇｃａｔ」、それぞれが区別可能なタグを有する）を一緒にプールし、単一の生体分子１０４にハイブリダイズさせることができる。図示する実施形態では、第一の組み合わせ１００を第一の実際の位置１０５でハイブリダイズさせ、第二の組み合わせ１０２を第二の実際の位置１０６でハイブリダイズさせる。検出システム（例えばナノ／マイクロポアまたはチャネルベースのシステム）を使用して、生体分子１０４に沿って第一の組み合わせ１００の第一の実測絶対位置１０７および第二の組み合わせ１０２の第二の実測位置１０８を決定することができる。プールしなかった単一プローブハイブリダイゼーション試験の場合と同様に、絶対位置の尺度は、誤差を含み、実測絶対位置１０７、１０８は、実際の絶対位置１０５、１０６とは異なることがあり、その結果、シークエンシングの誤差が生じ得る。しかし、区別可能なタグをプールされたプローブに付着させると、これらのタグによりプローブを一意的に同定することができ、および生体分子はデバイスを直線的に通ってまたは通り過ぎて移動するので、特定のプローブが同定され、および各プローブが、付着またはハイブリダイズされた順序で検出されるので、プローブの正しい順序が明らかになる。異なるプローブおよびハイブリダイズされていない分子骨格を表す逐次電気信号の相対発生率の決定は、絶対位置の決定よりはるかに誤差の起こる確率が低い。この技術を用いて、スペクトル内のすべてのプローブの相対位置を直接測定することができる。本明細書において下でより詳細に説明する手法でプローブをプールすることにより、誤った生体分子シークエンシングをもたらし得る、上で説明した、ブランチおよび／またはループなどの曖昧さを回避することができる。
【００４５】
このようにしてプールおよびタグ付けすることにより、再構成が有意に単純化される。例えば、ＳＢＨに関しては、反復の曖昧さのため、十分に長い一切の配列が曖昧である。類似して、以前のハイブリダイゼーション支援ナノポアシークエンシング（ＨＡＮＳ）技術に関しては、統計的に意味のある選択を行うための十分なデータを集めるために、広範なブランチングがグラフ空間の再構成に必要とされ得る。しかし、区別可能なタグ付けアプローチに関しては、ブランチング無しでシークエンシングが進行し得る。図１１を参照すると、相対順序配置情報が、グラフ空間１１０を通してとる正確な経路を知らせるため、曖昧さが解消され、検索も統計的スコアリングも必要としない。例えば、図示する実施形態では、ハイブリダイズされたプローブの正しい相対順序を決定することにより、上方ループ１１２が下方ループ１１４の前に来ることが明らかになる。
【００４６】
述べたように、プローブに区別可能な様式でタグ付けすると、各結合部位について特定のプローブを同定することができる。プールすることによって招かれる曖昧さを無くすことに加えて、かかるタグ付けは、配列再構成アルゴリズムの特定の態様に有用であり得る。例えば、４つの区別可能なタグの存在は、ハイブリダイゼーションによるシークエンシングへの拡大を可能にし、本明細書では、これを区別可能なタグを付けるハイブリダイゼーションによるシークエンシング（ｄｔＳＢＨ）と呼ぶ。
【００４７】
旧来のＳＢＨの解決は、検出されたｋマーのスペクトルを表すグラフ空間を通るオイラー路（すべての辺またはノードを通る経路）を見つけることを必要とする。ＳＢＨの限界は、１つの解を有する十分に稠密ないずれのグラフも複数の同等によく支持される解を有することから生ずる。しかし、グラフ内の各頂点から出る辺（すなわちノード）（すなわち、ブランチを有するノード）の相対順序を決定することによって、これらの複数の解を区別することができる。
【００４８】
一定の実施形態では、ｄｔＳＢＨを用いて各ｋ−１長の配列から出るすべての経路の相対順序をもたらすために、プローブを一緒にして４つのプローブのグループにプールし、区別可能なタグを付ける。具体的には、ＤＮＡの４ｋ−１個の可能なｋ−１長の配列のそれぞれについて、このｋ−１マーの４つのｋマー伸長物のプールを形成する（例えば、ｋ＝６で、ｋ−１長の配列が「ａｇａｃｃ」であるとき、そのプールは、「ａｇａｃｃａ」、「ａｇａｃｃｃ」、「ａｇａｃｃｇ」および「ａｇａｃｃｔ」からなる）。次に、そのプール内の各ｋマープローブに、特定のプローブと検出されたプローブ結合事象とを関連づけることができるように、区別可能なタグを付ける。一定の実施形態では、４つのプローブのプールを、一度に、それら４つのうちの２つまたは３つのプローブの組み合わせに細分する。この要領で、例えば、ペアになった区別されるプローブの６反応を行うことにより、または３プローブの４反応を一度に行うことにより、同じシークエンシング情報を得ることができる。
【００４９】
ナノポア検出を用いるとき、ＤＮＡは線形様式でナノポアを通って移動する。例えば、所定の標的断片がプローブ結合事象（ｐ１、ｐ２、．．．、ｐｎ）を有する場合、これらの事象は、常に、順序（ｐ１、ｐ２、．．．、ｐｎ）で、または標的が逆方向に移動するときには逆の順序（ｐｎ、ｐｎ−１、ｐｎ−２、．．．、ｐ１）で検出されることとなる。結果として、適切に組み立てられたプローブ結合事象マップには、グラフ空間内の特定のｋ−１マー頂点またはノードから出るすべての辺の完全な順序配置が含まれる。指定された順序で頂点から出る辺を辿ることにより一意的に定義される経路を構成することによって、検索も曖昧さも無しに標的核酸配列を正確に回収することができる。
【００５０】
上の説明は、４つの区別可能なタグに依存したが、物理的に別個のプローブタグ付け用化学基を２つしか用いずに同じ情報を集めることができる。図１２に示すように、４つのプールされたプローブの単一の反応物１２０を、ペアで区別されるプローブの６つの反応物１２２に分割することができる。例えば、単一の反応物１２０において、第一のタグ付きプローブ１２３、第二のタグ付きプローブ１２４、第三のタグ付きプローブ１２５および第四のタグ付きプローブ１２６を同じ生体分子にハイブリダイズさせる。比較すると、６つの反応物１２２では、各反応物が前記４タイプのタグ付きプローブ１２３、１２４、１２５、１２６の６つの可能な組み合わせのうちの１組を含む。６プール（２プローブ）のケースでは、それぞれの連続プローブペアの相対順序が捕捉されるので、これらの相対順序を組み立てて、４プローブ（１プール）のケースで得ることができるのと同じ情報を得ることができる。曖昧さの無い任意長のヌクレオチド配列の再構成に必要な情報を集めるためにたった２つの電気的に区別可能な化学基またはタグの同定しか必要とされないという点を強調する。
【００５１】
一定の実施形態では、４つまたは２つの別個のタグを使用するのではなく、所定のプール内の４プローブの相対位置を、そのプール内の４つのうちの３つのプローブに付着した３つの別個のタグを一度に使用して決定することができ、この場合、ナノ／マイクロポア／チャネル検出システムによってそれら３つの異なるタグを電気的に区別することができる。４プローブの３メンバーグループには４つの組み合わせがある。したがって、そのプール内の４プローブについて可能な３プローブの４つの組み合わせのうちの１組を各反応が含む、４つの独立した反応を実行する。例えば、プローブＡ、Ｂ、ＣおよびＤのプールの４つの異なる３プローブの組み合わせは、次のとおりである：（Ａ、Ｂ、Ｃ）；（Ａ、Ｃ、Ｄ）；（Ａ、Ｂ、Ｄ）；および（Ｂ、Ｃ、Ｄ）。各反応について３プローブの相対位置を決定し、４反応からの情報を組み立てて、１プール（４つの区別可能なタグ）ケースまたは６プール（２つの区別可能なタグ）ケースで得ることができるのと同じ情報（すなわち、４プローブの相対位置）を得る。
【００５２】
本明細書において論ずる様々な実施形態で使用することができる電気的に区別可能なタグの例としては、タンパク質、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、それらの断片、または他の分子が挙げられる。一部の実施形態において、タグには、デンドリマー、ビーズまたはペプチドを挙げることができる。ナノ／マイクロポア／チャネル検出器で使用するとき、タグは、ナノポアもしくは流体チャネルを通る生体分子の移動を遅くするために、プローブより大きい体積または異なる電荷を有してもよい。一定の実施形態では、光学的に区別可能なタグ（例えば、蛍光標識）を使用することができる。
【００５３】
図１３は、生体分子の配列を決定するための方法１３０の実施形態を図示するフローチャートである。図示するように、生体分子の配列文字列ｓの複数の部分文字列を表すｋ−１長の部分配列のセットを同定する（ステップ１３２）。ｋ−１長の部分配列のそれぞれについて、該ｋ−１長の部分配列の４つの異なるｋマー伸長物からなるプールを同定する（ステップ１３４）。同定された各プールについて、（ｉ）該プールを構成する４つのｋマープローブと生体分子をハイブリダイズさせ（ステップ１３６）、（ｉｉ）ハイブリダイズされたｋマープローブの相対位置を検出する（ステップ１３８）。これらの相対位置を得たら、検出された付着されたプローブに対応する部分配列を順序よく配置して（ステップ１４０）、前記生体分子の配列文字列ｓを決定する。一定の実施形態では、区別可能なタグを、同定された各プール内の４つのｋマープローブそれぞれに付着させる（ステップ１４２）。
【００５４】
一定の実施形態では、ＳＢＨの基本的限界を克服するために、例えばナノポアを使用して生体分子に沿ってハイブリダイズしたプローブの絶対位置を測定することができる。この絶対位置情報は、グラフ空間内の頂点またはブランチにおける伸長物の正しい相対順序（すなわち、グラフ空間を通る経路）を決定するための統計学的検出力を与える。
【００５５】
上で論じたように、ハイブリダイズされたプローブの相対位置を決定することにより、ＳＢＨの曖昧さ（すなわち、ブランチおよび／またはループ）を解消することができる。図１４を参照して、グラフ空間１５０は、上方ループ１５２および下方ループ１５４に伴う曖昧さを含み得る。このケースでは、生体分子の正しい配列を決定するために、グラフ空間１５０を通る経路に沿ってどのループが最初に来るのかを決定する必要がある。一つの実施形態では、各ループ内のハイブリダイズされたプローブの絶対位置を測定することによって、ループの順序を決定する。
【００５６】
図１４は、スペクトル内の各プローブについての実測絶対位置を図示するものである。プローブ「ｔａｇｃａｇ」および「ｔａｇｃａｔ」（すなわち、各ループの最初の２つのプローブ）の実測絶対位置が、それぞれ、１０７および１０６であることに注目する。「ｔａｇｃａｔ」の下方実測絶対位置は、下方ループ１５４が上方ループ１５６の前に来ることを示唆している。しかし、測定誤差のため、これは不正確であり得る。下で論ずるように、各ループの最初のプローブだけを考慮するのではなく、それらの各ループ内の２つ以上のプローブの実測絶対位置を平均することによって、ループの順序のより正確な決定を達成することができる。
【００５７】
例えば、図１５を参照すると、上部ループ１５２および下部ループ１５４内のプローブの実測絶対位置の平均は、それぞれ、１０６および１１０．２である。上部ループ１５２についての平均位置がより低いことは、上部ループ１５２が下部ループ１５４よりも前に来ることを示しており、このケースではこれが真である。したがって、２つのループ内の実測絶対位置を平均することによって、各ループの最初の第一プローブの絶対位置（すなわち、このケースでは「ｔａｇｃａｇ」および「ｔａｇｃａｔ」）を単に測定するより正確に、ループの適切な順序が明らかになる。しかし、測定誤差およびこの平均化アプローチの確率的（ｐｒｏｂａｂａｌｉｓｔｉｃ）性質のため、特に各ブランチ（ループ）に少数のプローブしか無い場合には、同定される順序はやはり不正確であり得る。
【００５８】
図１６は、生体分子の配列を決定するための方法１６０の実施形態を図示するフローチャートである。生体分子の配列文字列ｓの複数の部分文字列を表すｋマープローブのスペクトルを同定する（ステップ１６２）。前記部分文字列を配列して（ステップ１６４）、それらの同定された部分文字列すべてを各候補が含有する複数の候補拡大文字列を作る。各候補拡大文字列は、すべての部分文字列の最短可能配置に対応する長さを有する。前記候補拡大文字列に共通する２つ以上のブランチまたはループの順序配置の曖昧さを同定する（ステップ１６６）。前記２つ以上のブランチそれぞれに沿った部分文字列に対応する複数のｋマープローブを同定する（ステップ１６８）。同定された各ｋマープローブについて、前記生体分子を該ｋマープローブとハイブリダイズさせる（ステップ１７０）。前記生体分子に沿ったｋマープローブの絶対位置についての近似的尺度を得る（ステップ１７２）。各ブランチについての相対順序を、（ｉ）ブランチ内にある（ステップ１６８で同定した）各ｋマープローブの絶対位置の尺度の平均を得ること、および（ｉｉ）各ブランチについて同定された平均絶対位置尺度に従って２つ以上のブランチを順序よく配置することによって決定する（ステップ１７４）。正しい順序でのブランチでは、曖昧さが解消されており、前記生体分子の配列文字列ｓを正確に同定することができる。一定の実施形態では、所定のブランチ内のすべてのプローブの実測絶対位置を平均するのではなく、前記方法は、該ブランチ内の該プローブのほんの一部分（すなわち２つ以上）の実測絶対位置を平均することを含む。
【００５９】
図１７は、本発明の一定の実施形態による、コンピュータおよび付随する入力／出力デバイスの概略図２００である。図１７におけるコンピュータ２０５は、汎用コンピュータ（例えば、ＣＰＵ）と、１つ以上のメモリと、１つ以上の記憶媒体と、１つ以上の出力デバイス２１０（例えばディスプレイ）と、１つ以上のユーザー入力デバイス２１５（例えばキーボード）とを備える市販のパーソナルコンピュータであり得る。前記コンピュータは、任意の市販のオペレーティングシステム（例えば、ワシントン州レドモンドのＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの任意のバージョンのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）オペレーティングシステム、またはノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パークのＲｅｄ  Ｈａｔ  ＳｏｆｔｗａｒｅからのＬｉｎｕｘ（登録商標）オペレーティングシステム）を使用して動作する。プロセッサにより動作するときには本発明の方法の実施の際にコンピュータに命令するコマンドを搭載しているソフトウェアを用いてコンピュータをプログラミングする。プログラミング技術分野の当業者には、前記コマンドの一部またはすべてがソフトウェアの形態で、プログラム可能ハードウェア（例えばフラッシュメモリ、ＲＯＭもしくはプログラマブル・ゲート・アレイ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｇａｔｅ  ａｒｒａｙ：ＰＧＡ））の形態で、ハードワイヤード回路の形態で、またはソフトウェア、プログラムされたハードウェアもしくはハードワイヤード回路のうちの２つ以上についての何らかの組み合わせで、与えられることができることが分かるだろう。コンピュータの動作を制御するコマンドは、情報の受信、情報またはデータの処理およびユーザーへの情報の提供などの個々の動作を行うユニットにグループ分けされることが多い。かかるユニットは、単一のコマンド、例えば単一の機械言語命令から、複数のコマンド、例えばより高レベルのプログラミング言語、例えばＣ＋＋、で書かれた複数の行数のコードまで、任意の数の命令を具備することができる。コマンドのかかるユニットは、コマンドがソフトウェアを含もうと、プログラムされたハードウェアを含もうと、ハードワイヤード回路を含もうと、またはこれらの組み合わせを含もうと、一般にモジュールと呼ばれる。前記コンピュータおよび／またはソフトウェアは、入力デバイスから入力を受け入れる、出力デバイスに出力シグナルを提供する、および規則正しいコンピュータ動作を維持するモジュールを含む。一定の実施形態において、前記コンピュータ２０５は、ラップトップコンピュータ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、組み込み型コンピュータ、またはハンドヘルドコンピュータである。前記メモリは、任意の従来のメモリ、例えば、半導体メモリ、光学メモリ、または磁気メモリであるが、これらに限定されない。前記記憶媒体は、任意の従来の機械可読記憶媒体、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭおよび／または磁気テープであるが、これらに限定されない。前記１つ以上の出力デバイス２１０としては、ディスプレイを挙げることができ、該ディスプレイは、任意の従来のディスプレイ、例えば、ビデオモニタ、プリンタ、スピー��および／または文字数字ディスプレイであり得るが、これらに限定されない。前記１つ以上の入力デバイス２１５としては、任意の従来の入力デバイス、例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、マイクロホンおよび／またはリモートコントロールを挙げることができるが、これらに限定されない。前記コンピュータ２０５は、スタンドアローンコンピュータである場合もあり、またはネットワークによって少なくとも１つの他のコンピュータと相互接続されている場合もある。これはインターネット接続であることもある。
【００６０】
一定の実施形態において、図１７のコンピュータ２０５は、本明細書に記載の方法に従って、入力データ（例えばＨＡＮＳおよび／またはＳＢＨ実験からのデータ）から生体分子（例えば、ＤＮＡ）の配列を決定するためのソフトウェアを含む、および／または実行する。一定の実施形態では、前記ソフトウェアの１つ以上のモジュールをリモートサーバーで実行することができる、例えば、ユーザーはインターネット経由で前記ソフトウェアにアクセスし、実行することができる。
【００６１】
等価物
特定の好ましい実施形態に関して本発明を詳細に示し、説明したが、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲を逸脱することなく、そこにある形態および詳細を様々に変化させることができることは、当業者には理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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