(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオンチャネルのＥ１細胞外ループに結合する、モノクローナル抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片であって、前記イオンチャネルが疼痛の調節において機能し、前記抗体又は断片が前記イオンチャネルを、それに結合した後、機能的に改変し、前記イオンチャンネルが、Ｎａｖ１．７ナトリウムイオンチャネルであり、前記抗体がドメインＢ又はドメインＣにおけるＥ１ループに結合する、
上記抗体又はその結合断片。
【請求項２】
抗体が、イオンチャネルのドメインＢにおけるＥ１ループに結合する、請求項１に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片。
【請求項３】
抗体又はその断片が、配列番号１０７〜１１６、１２０、１２１、１２４、１２５、１２８及び１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項１又は２に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片。
【請求項４】
抗体又はその断片が、配列番号１２８及び１２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項３に記載の抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号１、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号２、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号３の配列を含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号４、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号５、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号６の配列を含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号７、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号８、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号９の配列を有するＣＤＲを含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号１０、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号１１、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号１２を有するＣＤＲの配列を含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号１３、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号１４、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１５の配列を有するＣＤＲを含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号１６、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号１７、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号１８の配列を有するＣＤＲを含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号１９、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号２０、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号２１の配列を有するＣＤＲを含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号２２、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号２３、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号２４の配列を有するＣＤＲを含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号２５、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号２６、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号２７の配列を有するＣＤＲを含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号２８、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号２９、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号３０の配列を有するＣＤＲを含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号３１、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号３２、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号３３の配列を有するＣＤＲを含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号３４、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号３５、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号３６の配列を有するＣＤＲを含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号３７、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号３８、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号３９の配列を有するＣＤＲを含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号４０、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号４１、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号４２の配列を有するＣＤＲを含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号４３、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号４４、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号４５の配列を有するＣＤＲを含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号４６、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号４７、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号４８の配列を有するＣＤＲを含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号４９、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号５０、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号５１の配列を有するＣＤＲを含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５２、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号５３、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号５４の配列を有するＣＤＲを含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ヒトＮａｖ１．７に特異性を有する抗体又はその抗原結合断片であって；
軽鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｌ１として配列番号５５、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号５６、ＣＤＲ−Ｌ３として配列番号５７の配列を有するＣＤＲを含み、
重鎖可変ドメインがＣＤＲ−Ｈ１として配列番号５８、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号５９、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号６０の配列を有するＣＤＲを含む；
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
抗体が、それが特異的である関連するイオンチャネルの機能を、インビトロアッセイにおいて少なくとも５パーセント阻害する、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の抗体又は断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、機能的に改変する性質をもつ、イオンチャネルのＥ１部分に向けられる抗イオンチャネル抗体及び前記抗体の断片、前記抗体を含む薬学的組成物、処置、例えば、疼痛の処置／調節における抗体及びそれを含む組成物の使用、並びに前記抗体を作製及び調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオンチャネルは、イオンの電気化学的勾配を下るイオンの流れを可能にすることによって、全ての生細胞の細胞膜電位を確立し、且つ制御することを助けるポア形成タンパク質である。それらは、全ての生物学的細胞を囲む膜の中に存在する。ヒトゲノムは、広範な多様性を示し、且つ分泌、筋収縮、並びに心臓組織及び神経組織における活動電位の発生及び伝播などの多くの細胞過程に重要な役割を果たす４００を超える数のイオンチャネル遺伝子を含む。
【０００３】
イオンチャネルは、いくつかのタンパク質の集合に基づいた大きな分子構造の形をとり得る内在性膜タンパク質である。そのような「多サブユニット」集合体は、通常、膜又は脂質二重層の平面を貫いて、水で満たされたポアの周りに密接して詰め込まれた同一又は相同のタンパク質の配置を含む。通常αサブユニットと呼ばれる、ポア形成サブユニット（単数又は複数）は、イオンチャネルタンパク質の活性及び細胞表面発現を制御するのを助ける、膜結合型か又は細胞質性かのいずれかの補助サブユニットと会合し得る。様々なイオンチャネルのＸ線構造が最近、解明され（Ｄｏｙｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：６９（１９９８）；Ｊｉａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：３３（２００３）；Ｌｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：８９７（２００５））、ポア構造の構成が、イオンチャネルファミリーメンバー間で大部分、保存されていることを示している。ゲーティング過程と呼ばれるイオンチャネルポアの開閉は、様々な細胞過程又は生化学的過程によって引き起こされ得る。
【０００４】
イオンチャネルタンパク質の最も大きいファミリーは、例えば、ナトリウム、カルシウム、及びカリウムイオンチャネルを含む電位開口型チャネル、一過性受容器電位イオンチャネル、過分極活性化型イオンチャネル、内向き整流性イオンチャネル、２ポアドメインカリウムチャネル、及び電位開口型プロトンチャネルで構成される。最後のものは、ｐＨ感受性様式で脱分極させる。
【０００５】
内向き整流性イオンチャネルは、１５個の公式メンバー及び１個の非公式メンバーで構成される。そのファミリーはさらに、相同性に基づいて７個のサブファミリーに細分することができる。
【０００６】
現在のところ、同定されている約１０個の電位開口型カルシウムチャネルがある。
【０００７】
一過性受容器電位イオンチャネルは、相同性に基づいて、以下の６個のサブファミリーに細分される：古典的（ＴＲＰＣ）、バニロイド受容体（ＴＲＰＶ）、メラスタチン（ＴＲＰＭ）、ポリシスチン（ＴＲＰＰ）、ムコリピン（ＴＲＰＭＬ）、及びアンキリン膜貫通タンパク質１（ＴＲＰＡ）。
【０００８】
過分極活性化型イオンチャネルは、環状ヌクレオチドｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに感受性であり、それが、チャネル開口の電位感受性を変化させる。これらのチャネルは、一価陽イオンＫ＋及びＮａ＋に対して透過性である。このファミリーの４つのメンバーがあり、それらは全て、６回膜貫通型αサブユニットの四量体を形成する。これらのチャネルは過分極状態下で開口するため、それらは、心臓、特に洞房結節において、歩調取りチャネルとして機能する。
【０００９】
電位開口型及びリガンド開口型のイオンチャネルは、イオンチャネルタンパク質ファミリーの最も代表的なメンバーである。電位開口型イオンチャネル（例えば、カルシウムチャネル、ナトリウムチャネル、及びカリウムチャネル）の活性は、細胞膜電位の変化によって制御されるが、リガンド開口型イオンチャネル（例えば、ＧＡＢＡ−Ａ受容体、アセチルコリン受容体）は、特異的な細胞内又は細胞外リガンドの結合によって制御される。ゲーティング機構は、非常に複雑であり、様々な膜、ポア構造及び細胞質構造に関係し、イオンチャネルのクラス間で異なる。
【００１０】
電位感受性イオンチャネルと呼ばれることもある、電位開口型イオンチャネルは、心臓組織及び神経組織における細胞興奮性の基盤を与える膜貫通タンパク質のクラスである。これらのチャネルは、細胞過分極又は細胞脱分極のいずれかにより活性化され、細胞膜電位の制御をもたらすイオン流束を生じる。電位開口型ナトリウムチャネルは、一般的に、活動電位の惹起に関与するが、電位開口型カリウムチャネルは、細胞膜再分極を媒介する。様々な電位開口型イオンチャネル間の微調整された相互作用は、心臓活動電位及び神経活動電位の形をとるのに重要である。
【００１１】
電位開口型ナトリウムチャネルの１つのクラスは、９つの異なるアイソフォーム（Ｎａｖ１．１〜１．９）を含み、４つの異なるナトリウムチャネル特異的アクセサリータンパク質が記載されている（ＳＣＮ１ｂ〜ＳＣＮ４ｂ）。それらのアイソフォームの別々の機能活性は、様々な神経細胞型（Ｌｌｉｎａｓら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０５：１９７〜２１３（１９８０）；Ｋｏｓｔｙｕｋら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６：２４２３〜２４３０（１９８１）；Ｂｏｓｓｕら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．５１：２４１〜２４６（１９８４）１９８１；  Ｇｉｌｌｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：４４８〜４５０（１９８４）；Ｆｒｅｎｃｈら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．５６：２８９〜２９４（１９８５）；Ｉｋｅｄａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．５５：５２７〜５３９（１９８６）；Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８９：６０５〜６２７（１９８７）；Ａｌｏｎｓｏ＆Ｌｌｉｎａｓ、１９８９；Ｇｉｌｌｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９：１３６２〜１３７４（１９８９））及び骨格筋（Ｇｏｎｏｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：２５５９〜２５６４（１９８５）；Ｗｅｉｓｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：３６１〜３６４（１９８６））において記載されている。Ｎａｖ１．５及びＮａｖ１．４チャネルは、それぞれ、心臓組織及び筋肉組織に発現した主要なナトリウムチャネルアイソフォームであり、Ｎａｖ１．１、１．２、１．３、１．６、１．７、１．８、及び１．９は、中枢神経系及び末梢神経系に特異的に発現している。天然の毒素である、テトロドトキシン（ＴＴＸ）を用いることによって、その毒素への親和性に基づいた、ナトリウムチャネルアイソフォームの薬理学的分類を確立することが可能になった。したがって、電位開口型ナトリウムチャネルは、ＴＴＸ抵抗性（Ｎａｖ１．５、１．８、１．９）及びＴＴＸ感受性として分類された。
【００１２】
特定のイオンチャネルは、疼痛の調節に関連づけられている（例えば、ＰＮＡＳ２００１年１１月６日、９８巻２３号、１３３７３〜１３３７８、及びＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２、２００４  ２４（３８）８３２〜８３６参照）。イオンチャネルＮａｖ１．７は、神経因性疼痛などの疼痛を調節する能力があると考えられており、それゆえに、特に興味深い、治療介入の標的である。Ｎａｖ１．８及びＮａｖ１．９もまた、疼痛の調節において役割をもつと考えられる。
【００１３】
Ｎａｖ１．７は、遺伝子ＳＣＮ９Ａによってコードされる電位活性化型テトロドトキシン感受性ナトリウムチャネルである。Ｎａｖ１．７の機能獲得型突然変異及び機能喪失型突然変異の両方は、ヒトにおいて、明らかな疼痛に関連した異常を生じる。
【００１４】
もともと、ＳＣＮ９Ａにおける機能獲得型突然変異は、連鎖解析によって、紅痛症（又は原発性肢端紅痛症）及び発作性極度疼痛障害（以前には、家族性直腸痛）の原因として同定された。紅痛症は、四肢における熱及び発赤と共に灼熱痛の発作を伴うまれな常染色体優性障害である。神経障害がなく、その他の点では健康な個体が疼痛を感じることが全くできないことは、非常にまれな表現型である。ごく最近、Ｃｏｘら（２００６）及びＧｏｌｄｂｅｒｇら（２００７）によって報告された２つの研究が、染色体２ｑ２４．３（遺伝子ＳＣＮ９Ａを含む領域）にマッピングされる、常染色体劣性形質のような表現型を記載している。両方の研究において、詳細な神経学的試験により、これらの人々が、鋭い／鈍い及び熱い／冷たい刺激を区別することができるが、痛覚の全体的な欠如をもつことが明らかにされた。全員が、自分自身をかむことによって引き起こされる唇及び／又は舌の傷を有した。全員が頻繁に挫傷及び切り傷を負い、ほとんどの人が、骨折又は髄膜炎を経験していた。
【００１５】
このデータは、イオンチャネルＮａｖ１．７の機能喪失をもたらすＳＣＮ９Ａチャネル病が、神経病、又は認知障害、情動障害、若しくは神経障害の非存在下における疼痛に対する非感受性と関連しているという強力な証拠となっており、臨床的に、Ｎａｖ１．７を疼痛関連標的として確証している。さらに、ＫＯ研究及び動物疼痛モデルから、Ｎａｖ１．７が炎症性疼痛において主要な役割を果たしていると思われる。
【００１６】
図２ａは、４つのドメイン、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ（ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶとも呼ばれる）を含むＮａｖ１．７などのイオンチャネルの図表示である。各ドメインは、６つの膜貫通タンパク質ヘリックスＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６を含む。各膜貫通タンパク質の正確なアミノ酸番号は、用いられたデータベース登録によって異なるが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔは、Ｎａｖ１．７について以下の情報を提供している：ドメインＡにおいて、膜貫通タンパク質Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６は、それぞれ、アミノ酸１２２〜１４５、１５４〜１７３、１８７〜２０５、２１２〜２３１、２４８〜２７１、及び３７９〜４０４に割り当てられる；
ドメインＢにおいて、膜貫通タンパク質Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６は、それぞれ、アミノ酸７３９〜７６３、７７５〜７９８、８０７〜８２６、８３３〜８５２、８６９〜８８９、及び９４３〜９６８に割り当てられる；
ドメインＣにおいて、膜貫通タンパク質Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６は、それぞれ、アミノ酸１１８８〜１２１１、１２２５〜１２５０、１２５７〜１２７８、１２８３〜１３０４、１３２４〜１３５１、及び１４３１〜１４５７に割り当てられる；
ドメインＤにおいて、膜貫通タンパク質Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６は、それぞれ、アミノ酸１５１１〜１５３４、１５４６〜１５６９、１５７６〜１５９９、１６１０〜１６３１、１６４７〜１６６９、及び１７３６〜１７６０に割り当てられる。
公開データベースで入手可能である、その配列のいくつかの天然のバリエーションがあり、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ１５８５８を参照されたい。
【００１７】
本開示において、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６は、異なるアミノ酸割り当てが与えられている場合を含む、上記の実体、又は代替のイオンチャネルにおけるそれに対応する実体を指し、それの天然又は非天然の変種及び異なるアイソタイプにおける対応実体が含まれる。
【００１８】
各ドメインはまた、細胞外親水性ループＥ１、Ｅ２、及びＥ３を含む。各ドメインにおけるＥ１のアミノ酸配列は、膜貫通領域Ｓ１の後から始まり、Ｓ２で終わる。各ドメインにおけるＥ１は、他のドメインにおけるＥ１と異なる。各ドメインにおけるＥ２のアミノ酸配列は、膜貫通領域Ｓ３の後から始まり、Ｓ４で終わる。各ドメインにおけるＥ２は、他のドメインにおけるＥ２と異なる。各ドメインにおけるＥ３のアミノ酸配列は、膜貫通領域Ｓ５の後から始まり、Ｓ６で終わる。各ドメインにおけるＥ３もまた、他のドメインにおけるＥ３と異なる。
【００１９】
Ｎａｖ及びＣａｖイオンチャネルは、４つのドメインＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤを含み、それぞれが６つの膜貫通タンパク質ヘリックスを含むが、Ｋｖイオンチャネル、ＨＣＮイオンチャネル、及びＴＲＰイオンチャネルなどの他のイオンチャネルは１つのドメインを含む。Ｎａｖ及びＣａｖイオンチャネルにおける各ドメインについてのように、Ｋｖイオンチャネル、ＨＣＮイオンチャネル、及びＴＲＰイオンチャネルは、上記のように、６つの膜貫通タンパク質ヘリックスＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、及びＳ６、並びに３つの細胞外親水性ループＥ１、Ｅ２、及びＥ３を含む。
【００２０】
Ｎａｖ１．７イオンチャネルにおいて、細胞外ループ（Ｅループ）は、図２ｃにおける配列番号１０５の以下のアミノ酸残基である：
【表１】
0005872476.tif 000002
【００２１】
Ｎａｖ１．７のいくつかのドメインにおける細胞外ループは、他のイオンチャネルに見出される細胞外ループと類似している。
【００２２】
Ｎａｖ１．７は、末梢神経系、すなわち、侵害受容性後根神経節（ＤＲＧ）に発現しており、最も顕著には、侵害受容性小径ＤＲＧニューロンで発現しており、脳においてはほとんど提示されていない。Ｎａｖ１．７分布（例えば、感覚終末）及び生理機能が、それが、痛刺激を伝達することに主要な役割を果たす素因をつくっている。
【００２３】
末梢神経系におけるＮａｖ１．７の発現は、それを機能遮断抗体の作製のための非常に魅力的な標的にしており、これは、副作用がなく、又は副作用を許容できるレベルまで最小化する、疼痛についての価値のある処置への革新的なアプローチを示している。
【００２４】
神経因性疼痛は、非常によく見られる状態である。米国において、人口の０．６％から１．５％の間、すなわち、１８０万〜４５０万人が罹患していると推定される（Ｐｕｌｌａｒ及びＰａｌｍｅｒ、２００３）。毎年少なくとも１４０万人が、神経因性疼痛の３つの主原因である、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、ヘルペス後神経障害（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）と診断されている。神経因性疼痛の他の原因には、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。神経障害性関連慢性背痛、変形性関節症、及び癌を有する患者を含めたならば、その総数は、少なくとも２倍になるであろう。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、しばしば用いられるが、神経因性疼痛の処置にはあまり効果的ではない。さらに、それらの長期使用は、重篤な胃損傷を引き起こす可能性がある。他方、オピオイド（モルヒネ及び誘導体）の使用は、最も重度の形態である神経因性疼痛、すなわち、癌関連神経障害に制限されている。これは、悪心、嘔吐、呼吸抑制、便秘、及び耐性などの重篤な副作用、並びに耽溺及び乱用の可能性が、長期処置に付随するからである。その後者のことは、他の神経障害でのオピオイドの使用を妨げている（Ｄｅｌｌｅｍｉｊｎ、１９９９；Ｎａｍａｋａら、２００４）。抗てんかん薬（ＡＥＤ）は、脳における異常な神経過剰興奮性を減弱することが知られている。神経過剰興奮性が神経因性疼痛において重要な役割を果たすことを考えると、ＡＥＤが慢性神経因性疼痛の処置に向けられたことは理解できる（Ｒｅｎｆｒｅｙ、Ｄｏｗｎｔｏｎ、及びＦｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ、２００３）。ごく最近の重要な例は、ガバペンチン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ）及びプレガバリン（Ｌｙｒｉｃａ、Ｆｒａｍｐｔｏｎ及びＳｃｏｔｔ、２００４）である。しかしながら、神経因性疼痛の処置のゴールドスタンダードであるガバペンチンでさえも、せいぜい約４０％の患者において５０％、疼痛を低減するだけである（Ｄｗｏｒｋｉｎ、２００２）。さらに、オピオイドと対照的に、ガバペンチンは、癌関連神経因性疼痛の処置に用いられていない。
【００２５】
上記で述べたように、ヒトにおけるＮａｖ１．７の「機能喪失型」突然変異は、疼痛に対する非感受性をもたらす（Ｃｏｘら、２００６）。さらに、ヒトにおけるＮａｖ１．７の「機能獲得型」突然変異は、疼痛表現型の紅痛症及び発作性極度疼痛障害をもたらす（Ｄｉｂ−Ｈａｊｊ、Ｙａｎｇ、Ｗａｘｍａｎ、２００８）。加えて、Ｎａｖ１．７を遮断する末梢作用性小分子は、炎症性疼痛及び神経因性疼痛のラットモデルにおいて痛覚過敏及び異痛症を逆転させる（ＭｃＧｏｗａｎら、２００９）。したがって、末梢作用性Ｎａｖ１．７遮断抗体は、疼痛治療において有益であるはずである。
【００２６】
今まで、イオンチャネルの強力な化学阻害剤が同定されているが、一般的に、これらは、他のイオンチャネルのアイソフォームに対する選択性が弱いことを特徴とする。生体における遍在性分布を考慮すれば、これらの非選択性阻害剤は、利用が限定されている。
【００２７】
抗体は、それらの精巧な特異性により明らかに望ましいが、機能改変抗体を作製することは、１つには、最終的にクローナル抗体が治療適用に必要とされるという理由で、全く簡単というわけではなく、その分野のいくらかの研究者は、イオンチャネルの機能の改変をもたらすのにポリクローナル抗体が必要とされることを指摘している。Ｋｌｉｏｎｓｋｙら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ３１９巻１号、１９２〜１９８ページ）は１９８ページにおいて以下のように述べている：
「ヒトＴＲＰＶ１の前ポア領域・・に対して産生されたウサギ、マウス、又は完全ヒトのモノクローナル抗体のいずれも、チャネル活性化を遮断するのに効果的ではなかったので、この領域における小さいエピトープに対する高親和性結合作用物質を通してチャネル立体構造をロックすることは不可能であると我々は仮定する（Since no rabbit, mouse or fully human monoclonal antibodies generated against the prepore region of human TRPV1 ..were effective in blocking channel activation we hypothesise that it may not be possible to lock the channel conformation through high-affinity binders to small epitopes in this region）。」
【００２８】
ナトリウムチャネル、特に、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、Ｎａｖ１．９は、機能改変抗体を作製することに関して特に困難な標的であったと思われる。しかしながら、本発明者らは、前記イオンチャネルの活性を、機能改変抗体、例えば、抗体のクローン集団を用いて変化させ得ることを今、見出した。今まで、イオンチャネルに対する抗体が作製されているが、疼痛の調節に関与するイオンチャネルに対する、Ｅ１結合性機能改変抗体は開示されていないと思われる。
【００２９】
本発明者らは、機能改変抗体が、疼痛の調節に関与するイオンチャネルのＥ１ループに対して生産され得ることを今、確立した。そのドメインのそれぞれにおけるＥ１ループが比較的短いアミノ酸配列であるため、これは驚くべきことである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
したがって、本発明は、抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片を提供し、前記イオンチャネルが疼痛の調節において機能しており、且つ前記抗体又は断片が、前記イオンチャネルを、それに結合した後、機能的に改変する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＨＥＫ細胞におけるヒトＮａｖ１．７電流への特定のモノクローナル抗体の機能的効果を示す図である。
【図２ａ】Ｎａｖ１．７の図表示である。
【図２ｂ】Ｎａｖ１．７のドメインＡ（配列番号１０１）、ドメインＢ（配列番号１０２）、ドメインＣ（配列番号１０３）、及びドメインＤ（配列番号１０４）についてのアミノ酸配列を示す図である。
【図２ｃ】Ｎａｖ１．７の完全アミノ酸配列（配列番号１０５）を示す図である。
【図３Ａ】インビトロでクローナル９８３抗Ｎａｖ１．７抗体が、電気的に誘導されるＤＲＧスパイク頻度を低下させることを示す図である。
【図３Ｂ】インビトロで抗Ｎａｖ１．７モノクローナル抗体９８３が、電気的に誘導されるＤＲＧスパイク頻度を低下させることを示す図である。
【図３Ｃ】インビトロで抗Ｎａｖ１．７モノクローナル抗体１０８０が、電気的に誘導されるＤＲＧスパイク頻度を低下させることを示す図である。
【図３Ｄ】（ａ）ＨＥＫ細胞に発現した組換えヒトＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクランプ分析を示す図である。９８３モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻害を生じる。（ｂ）ＨＥＫ細胞に発現した組換えヒトＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクランプ分析を示す図である。１０８０モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻害を生じる。
【図３Ｅ】ＨＥＫ細胞に発現した組換えラットＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクランプ分析を示す図である。９８３モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻害を生じる。１０８０モノクローナル抗体は、２５μｇ／ｍｌにおいて、Ｎａｖ１．７電流の約２６％阻害を生じる。
【図３Ｆ】９８３モノクローナル抗体によるヒトＮａｖ１．７阻害の動態を示す図である。
【図３Ｇ】Ｎａｖ１．７ペプチドへの抗体９８３の特異的結合についてのＥＬＩＳＡデータを示す図である。
【図３Ｈ】Ｎａｖ１．７ペプチドへの抗体１０８０の特異的結合についてのＥＬＩＳＡデータを示す図である。
【図４】特定の抗Ｎａｖ１．７抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】特定の抗Ｎａｖ１．７抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図６】特定の抗Ｎａｖ１．７抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】特定の抗Ｎａｖ１．７抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
一態様において、本開示は、疼痛の調節に関連したイオンチャネルの活性を機能的に改変するイオンチャネルＥ１ループ結合性実体を提供し、それには、抗体、抗体断片、タンパク質又はタンパク質性スキャフォールド、核酸又はヌクレオチド、合成分子などの小分子など、特に、抗体、抗体断片、タンパク質若しくはタンパク質性スキャフォールド、又は核酸若しくはヌクレオチドが挙げられる。
【００３３】
疼痛の調節に関与及び／又は関連すると考えられるイオンチャネルには、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．６、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、Ｎａｖ１．９、Ｃａｖ３．１、Ｃａｖ３．２、Ｃａｖ３．３、Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、Ｃａｖ２．３、Ｋｖ２．１、Ｋｖ２．２、Ｋｖ７．ｘ、ＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＡ１、ＡＳＩＣ１、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ３、及びＴＲＰ４が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
一実施形態において、イオンチャネルは、Ｎａｖ１．７など、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、又はＮａｖ１．９についてのナトリウムチャネルである。免疫化に用いられるペプチドは、イオンチャネルの細胞外配列の少なくとも部分を含んでもよく、その細胞外配列がＥ１ループであり、且つイオンチャネルのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、又はＤドメイン由来であってもよい。好ましい実施形態において、ペプチドは、イオンチャネルのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、又はＤドメイン由来のＥ１細胞外領域の少なくとも一部を含む。さらに好ましい実施形態において、ペプチドは、イオンチャネルのＡドメイン又はＢドメイン由来のＥ１細胞外領域の少なくとも一部を含む。好ましくは、ペプチドは、ＢＥ１細胞外領域の少なくとも一部を含む。
【００３５】
本発明の一実施形態において、イオンチャネルはＮａｖ１．７ではない。一実施形態において、本発明は、イオンチャネルのＥ１細胞外ループに結合する、抗Ｅ１イオンチャネル抗体又はその結合断片を提供し、前記イオンチャネルが、疼痛の調節において機能しており、前記抗体又は断片が、前記イオンチャネルを、それに結合した後、機能的に改変し、且つ前記イオンチャネルはＮａｖ１．７ではない。
【００３６】
一実施形態において、イオンチャネルは、カリウムイオンチャネル、Ｋｖ２．１、Ｋｖ２．２、又はＫｖ７．ｘである。
【００３７】
一実施形態において、イオンチャネルは、カルシウムイオンチャネル、例えば、Ｃａｖ３．１、Ｃａｖ３．２、Ｃａｖ３．３、Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、又はＣａｖ２．３である。
【００３８】
一実施形態において、イオンチャネルは、過分極活性化型チャネルＨＣＮ１又はＨＣＮ２である。
【００３９】
一実施形態において、イオンチャネルは、非ゲート型イオンチャネル、例えば、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＡ１、ＡＳＩＣ１、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ３、又はＴＲＰ４である。
【００４０】
一実施形態において、処置、例えば、疼痛の調節、特に疼痛の寛解に用いるＥ１結合性抗イオンチャネル抗体が提供される。
【００４１】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の寛解に用いるＥ１結合性抗イオンチャネル抗体が提供される。
【００４２】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｎａｖ１．７抗体が提供される。
【００４３】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｎａｖ１．８抗体が提供される。
【００４４】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｎａｖ１．９抗体が提供される。
【００４５】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＨＣＮ１抗体が提供される。
【００４６】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＨＣＮ２抗体が提供される。
【００４７】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰＡ１抗体が提供される。
【００４８】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰＶ１抗体が提供される。
【００４９】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰＶ３抗体が提供される。
【００５０】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰＭ８抗体が提供される。
【００５１】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＴＲＰ４抗体が提供される。
【００５２】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗ＡＳＩＣ１抗体が提供される。
【００５３】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ３．１抗体が提供される。
【００５４】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ３．２抗体が提供される。
【００５５】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ３．３抗体が提供される。
【００５６】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ２．１抗体が提供される。
【００５７】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ２．２抗体が提供される。
【００５８】
一実施形態において、調節、例えば、疼痛の、特に本明細書に記載された疼痛のサブグループの寛解に用いるＥ１結合性抗Ｃａｖ２．３抗体が提供される。
【００５９】
本明細書に用いられる場合の機能改変抗体は、イオンチャネルの活性を、例えば、インビトロ又はインビボアッセイで少なくとも１つにおいて２０％など、少なくとも５％、例えば、１０％又は１５％、活性を低下させることによって、変化させる抗体又は（結合断片などの）断片を指すものとする。適切なインビトロアッセイには、本明細書に記載されているようなパッチクランプアッセイ又は他のアッセイが挙げられる。一実施形態において、機能改変抗体は、パッチクランプアッセイにより、電流の振幅を５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又はそれ以上のパーセント、低下させる。
【００６０】
イオンチャネルに機能改変を与える抗体及び機能改変抗体は、本明細書において交換可能に用いられる用語である。
【００６１】
一実施形態において、機能改変は、例えば、イオンチャネルのポア（孔）を遮断し、閉鎖し、又は阻害するのに十分である。この機能改変は、任意の機構によってもたらされてもよく、その機構には、ポアを物理的に遮断すること、例えば、ポアを遮断する、イオンチャネルに立体構造的変化を引き起こすこと、又はイオンチャネルが非機能性状態（静止状態又は不活化状態）をとるように誘発すること、及び／又はイオンチャネルを非機能性状態に維持すること（アロステリック調節）が挙げられる。
【００６２】
一実施形態において、機能改変は、イオンチャネルタンパク質の細胞表面レベルを低下させるのに十分である。この機能改変は、任意の機構によってもたらされてもよく、その機構には、細胞表面における機能性イオンチャネルタンパク質の数を低下させるように導く、イオンチャネルの抗体誘導性内部移行又はエンドサイトーシス又はサイクリングの増加が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６３】
イオンチャネルの機能改変について上記で提案した機構は例であり、機能改変抗体が、イオンチャネルにおいて機能改変効果を生じ得る様式の点において限定するものではない。
【００６４】
Ｎａｖ１．７細胞外ドメイン対他のファミリーメンバーの細胞外ドメインの配列の違いを調べることによって、特定の関心対象の区域を同定することが可能になり、その区域は、例えば、それらの配列に基づいてペプチドを作製することにより、抗体の作製に用いることができる。Ｎａｖ１．７において、ドメインＡアミノ酸１４６〜１５３、ドメインＢアミノ酸７６４〜７７４、ドメインＣアミノ酸１２１３〜１２２４及び１２１６−１２２４、並びにドメインＤアミノ酸１５３５〜１５４５は、特に違い／差異のある領域であり、したがって、抗体を作製するのに特に適し得る。
【００６５】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルのドメインＡの細胞外（又は細胞外アクセス可能）領域にＥ１ループにおいて結合する。
【００６６】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルにおけるドメインＢの細胞外（又は細胞外アクセス可能）領域にＥ１ループにおいて結合する。
【００６７】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルにおけるドメインＣの細胞外（又は細胞外アクセス可能）領域にＥ１ループにおいて結合する。
【００６８】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルにおけるドメインＤの細胞外（又は細胞外アクセス可能）領域にＥ１ループにおいて結合する。
【００６９】
一実施形態において、本発明による抗体又は断片を、問題のイオンチャネルを機能的に改変する他の実体、例えば、イオンチャネルのＥ３領域、例えば、ドメインＡなどのドメインＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤのＥ３領域の部分に結合する抗体又は断片と併用して、用いてもよい。
【００７０】
一実施形態において、Ｅ１結合性抗Ｎａｖ１．７抗体が提供される。
【００７１】
抗Ｎａｖ１．７抗体は、Ｎａｖ１．７へ特異的に結合する抗体である。Ｅ１結合性抗Ｎａｖ１．７抗体は、Ｎａｖ１．７へＥ１領域において特異的に結合する抗体である。
【００７２】
特異的結合とは、抗体が、関連するイオンチャネル、例えば、Ｎａｖ１．７に対して選択性であり、それを他のイオンチャネル及びタンパク質、例えば、同じファミリーにおける他のイオンチャネルと区別することができるという事実を指すものとする。選択的抗体は、例えば、他のイオンチャネルからＮａｖ１．７などの関連するイオンチャネルをアフィニティー精製するために用いることができるものである。
【００７３】
一実施形態において、抗Ｎａｖ１．７抗体は、哺乳類Ｎａｖ１．７、例えば、ヒトＮａｖ１．７に特異的である。
【００７４】
一実施形態において、Ｅ１結合性抗イオンチャネル抗体、例えば、抗Ｎａｖ１．７抗体は、関連するヒトイオンチャネル及び対応するラットイオンチャネルと交差反応する。
【００７５】
一実施形態において、機能改変抗体又は断片は、抗体のクローン集団、例えば、モノクローナル集団である。ポリクローナル抗体がイオンチャネルの機能改変を得るのに必要とされることが、文献中で示唆されている。したがって、本開示が、関連するイオンチャネルを機能的に改変するモノクローナル抗体を提供することは特に驚くべきことである。
【００７６】
本明細書に用いられる場合のモノクローナルとは、単細胞に由来する抗体又は断片を指すものとし、例えば、それは、ハイブリドーマテクロノジーを用いることによる。
【００７７】
クローン集団は、同じアミノ酸配列及び特異性を含む同じ性質、特性を有する抗体又は断片の集団を指すものとする。
【００７８】
一実施形態において、２つ以上、例えば、３つ又は４つの抗イオンチャネル抗体のクローン集団は混合して用いられ、その混合物は、本発明による少なくとも１つ、例えば、２つ、３つ、又は４つの抗体を含む。
【００７９】
一実施形態において、本開示による抗体は抗体全体である。
【００８０】
一実施形態において、抗体又はその断片は、多価及び／又は二重特異性である。本明細書で用いられる場合の多価とは、抗体又は断片の実体において複数の結合部位（例えば、少なくとも２つの結合部位）を指すものとする。本明細書との関連における多価性実体は、同じ特異性をもつ少なくとも２つの結合部位を有する。同じエピトープに結合する結合部位を有する多価抗体は、その実体が、第１及び第２の結合部位と異なる特異性をもつ第３の結合部位を含まない限り、二重特異性とはみなされないものとする。したがって、本開示に用いられる場合の二重特異性は、異なる、すなわち、別個の標的抗原に結合する、抗体又は断片における２つ以上の結合部位を必要とする。
【００８１】
各結合部位が同じ又は異なる標的抗原上の異なるエピトープに結合する、複数の結合部位を有する実体においては、抗体又は断片の実体は、本開示の意味の範囲内において、二重特異性とみなされるものとする。
【００８２】
本明細書で用いられる場合の結合部位は、標的抗原を特異的に結合する抗体又は断片の区域を指すものとする。重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対形成は、本明細書における結合部位の例とみなされるものとする。
【００８３】
一実施形態において、本開示による抗体断片は一価である。換言すれば、１つの結合部位のみを有する。
【００８４】
一実施形態において、抗体は、断片、例えば、単一ドメイン抗体、一本鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又は完全な重鎖と軽鎖の対形成である。
【００８５】
本発明に用いる、本開示の抗体又はその断片は、任意の種由来であり得るが、好ましくは、モノクローナル抗体、ヒト抗体に由来し、又はヒト化断片である。本発明に用いる抗体断片は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡ）又はサブクラス由来であり得、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、又はヒトを含む任意の種から取得されてもよい。
【００８６】
抗体可変ドメインにおける残基は、通常、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムにより番号が付けられる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以後、「Ｋａｂａｔら（上記）」）に示されている。この番号付けシステムは、他に指示されている場合を除き、本明細書で用いられる。
【００８７】
Ｋａｂａｔ残基呼称は、常にアミノ酸残基の直線的番号付けに直接対応するとは限らない。実際の直鎖アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造の、（フレームワークであろうと相補性決定領域（ＣＤＲ）であろうと）構造コンポーネントの短縮又はそれへの挿入に対応して、厳密なＫａｂａｔ番号付けにおいてより少ない、又は追加のアミノ酸を含む場合がある。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、所定の抗体について、「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのその抗体の配列における相同性の残基のアラインメントによって決定され得る。
【００８８】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。Ｋａｂａｔ番号付けを本明細書で用いるものとする。
【００８９】
本明細書では用いられていない、代替の番号システムは、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１〜９１７（１９８７））であり、ＣＤＲ−Ｈ１に等しいループが残基２６から残基３２にわたっている。「ＣＤＲ−Ｈ１」についてのＣｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔ番号付けの組み合わせは、例えば、残基２６〜３５を含むであろう。
【００９０】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【００９１】
様々なウサギ抗体についてのＣＤＲが下記に提供されている：
【表２−１】
0005872476.tif 000003
【表２−２】
0005872476.tif 000004
【００９２】
一実施形態において、本明細書における開示は、本明細書に開示された１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のＣＤＲ配列を含む抗体にまで及ぶ。
【００９３】
一実施形態において、本開示は、本明細書における配列（単数又は複数）由来の単一の可変ドメイン又は１対の可変ドメインを含む抗体にまで及ぶ。
【００９４】
一実施形態において、重鎖の可変ドメインは、上記に掲載された表に示されている配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含み、例えば、ＣＤＲがその「天然の位置」にある場合である。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３などのＣＤＲの天然の位置は、上記の表に示されており、例えば、配列番号４のＣＤＲについての天然の位置は、Ｈ１であり、配列番号５のＣＤＲについての天然の位置は、Ｈ２であり、配列番号６のＣＤＲについての天然の位置は、Ｈ３であるなどである。類似の解釈がまた、軽鎖配列にも適用される。
【００９５】
一例において、本発明の抗体は重鎖を含み、その重鎖の可変ドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３の少なくとも２つが上記の表に示された配列から選択されており、例えば、ＣＤＲがそれらの天然の位置にあり、任意で、それらの天然の対形成にある。本明細書に用いられる場合の天然の対形成とは、同じ抗体由来（すなわち、上記の１つの表由来）のＣＤＲの対形成を指すものとする。ＣＡ１６７＿００９８３についての天然の対形成の例は、配列番号１と２、１と３、及び２と３である。
【００９６】
一実施形態において、本発明による抗体は重鎖を含み、その可変ドメインが、以下に示された配列：
配列番号４  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号６  ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号１０  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号１１  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号１２  ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号１６  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号１７  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号１８  ＣＤＲ−Ｈ３、
又は、
配列番号２２  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号２３  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号２４  ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号２８  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号２９  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号３０  ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号３４  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号３５  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号３６  ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号４０  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号４１  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号４２  ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号４６  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号４７  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号４８  ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号５２  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５３  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号５４  ＣＤＲ−Ｈ３、
又は
配列番号５８  ＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号５９  ＣＤＲ−Ｈ２及び
配列番号６０  ＣＤＲ−Ｈ３、
又はそれと少なくとも９０％、９５％、又は９８％など、少なくとも６０％、７０％、８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００９７】
一実施形態において、本発明による抗体は、重鎖を含み、その重鎖の可変ドメインが、本明細書に開示されているような、例えば、本明細書に列挙された、可変ドメイン又は可変ドメインコンポーネントを含む。
【００９８】
本明細書に用いられる場合の可変ドメインコンポーネントとは、ＣＤＲ及びそれらの組み合わせ、特に本明細書で明確に開示されているようなＣＤＲ及びそれらの組み合わせを指すものとする。
【００９９】
別の実施形態において、本発明の抗体は重鎖を含み、その重鎖の可変ドメインが、本明細書に開示された重鎖可変領域と少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性など、少なくとも６０％、７０％、８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【０１００】
本明細書に用いられる場合の「同一性」は、整列させた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基がその配列間で同一であることを示す。本明細書に用いられる場合の「類似性」は、整列させた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基がその配列間で類似した型であることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンの代わりに用いられてもよい。しばしばお互いに置換することができる他のアミノ酸には以下が挙げられるが、それらに限定されない：
−フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパルテート及びグルタメート（酸性側鎖を有するアミノ酸）
−アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
−システイン及びメチオニン（イオウ含有側鎖を有するアミノ酸）。
同一性及び類似性の程度は、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【０１０１】
本発明はまた、Ｅ１結合性抗イオンチャネル抗体又は断片を提供し、そのイオンチャネルがインビボで疼痛の調節において役割／機能をもち、特に、前記イオンチャネルの機能を選択的に阻害する、本明細書に記載されたイオンチャネルに向けられる抗体、例えば、抗Ｎａｖ１．７抗体であり、前記抗体又は断片は、軽鎖ＣＤＲについて本明細書に示された配列（提供された表及びリストを参照）を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を有し、例えば、そのＣＤＲがその「天然の位置」にある場合である。
【０１０２】
一実施形態において、本発明の抗体は軽鎖を含み、その軽鎖の可変ドメインにおけるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも２つが軽鎖ＣＤＲについて本明細書に示された配列から選択されており、例えば、ＣＤＲはそれらの天然の位置にあり、任意で、それらの天然の対形成にある。本明細書に用いられる場合の天然の対形成とは、１つの抗体由来のＣＤＲが、同じ抗体、特に同じ抗体（すなわち、上記の１つの表由来）の同じ鎖由来のＣＤＲと可変ドメインにおいて対形成する／同じ場所に位置するという事実を指すものとする。
【０１０３】
誤解を避けるために言えば、全ての順列が含まれることは言うまでもない。
【０１０４】
一例において、本発明の抗体は軽鎖を含み、その可変ドメインが、以下に示された配列：
配列番号１  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号３  ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号７  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号８  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号９  ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号１３  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号１４  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号１５  ＣＤＲ−Ｌ３、
又は、
配列番号１９  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２０  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号２１  ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号２５  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号２６  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号２７  ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号３１  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号３２  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号３３  ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号３７  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号３８  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号３９  ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号４３  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号４４  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号４５  ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号４９  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号５０  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号５１  ＣＤＲ−Ｌ３、
又は
配列番号５５  ＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号５６  ＣＤＲ−Ｌ２及び
配列番号５７  ＣＤＲ−Ｌ３、
それと少なくとも９０％、９５％、又は９８％など、少なくとも６０％、７０％、８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【０１０５】
一実施形態において、本発明は軽鎖を含み、その軽鎖の可変ドメインが、例えば記載された任意の重鎖由来の、本明細書に開示されているような可変ドメイン又は可変ドメインコンポーネントを含む。
【０１０６】
別の実施形態において、本発明の抗体は軽鎖を含み、その軽鎖の可変ドメインが、本明細書に開示された重鎖可変領域と少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性又は類似性など、少なくとも６０％、７０％、８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【０１０７】
一実施形態において、１対の可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが提供される。一態様において、同族の対である、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対が提供される。
【０１０８】
本発明の抗体分子は、相補的軽鎖又は相補的重鎖をそれぞれ含む。
【０１０９】
一実施形態において、重鎖及び軽鎖は、天然の対形成であり、換言すれば、例えば、本明細書の単一の表に示されているような、同じ抗体由来である。
【０１１０】
一実施形態において、重鎖及び軽鎖は、非天然対形成を有する。
【０１１１】
本発明によって提供される１つの抗体は、図４に示された抗体９８３と本明細書で呼ばれる。
【０１１２】
さらなる態様において、本発明はまた、本開示による抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【０１１３】
例えば、本明細書に記載されたイオンチャネルに向けられる、ＣＤＲグラフト化（又はヒト化）された（本発明による）抗イオンチャネル抗体、特に、前記イオンチャネルを機能的に改変することを特徴とする抗Ｎａｖ１．７抗体もまた本発明によって提供される。一実施形態において、ＣＤＲグラフト化抗体分子におけるＣＤＲの１つ又は複数は、ウサギ抗体９８３から取得されている。本明細書に用いられる場合、用語「ＣＤＲグラフト化抗体分子」は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖可変領域フレームワーク及び／又は軽鎖可変領域フレームワークへグラフト化されたドナー抗体（例えば、本明細書に記載されているようなラット又はウサギの抗体）由来の１つ又は複数のＣＤＲ（必要に応じて、１つ又は複数の改変ＣＤＲを含む）を含む、抗体分子を指す。概説として、Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、５３５〜５３９、１９９８を参照されたい。
【０１１４】
ＣＤＲがグラフト化される場合、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列は、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／型を考慮して用いられてもよく、それには、ラット、ウサギ、マウス、霊長類、及びヒトのフレームワーク領域が挙げられる。好ましくは、本発明のＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域、及び本明細書で言及されているようなドナー抗体由来のＣＤＲの１つ又は複数を含む可変ドメインを有する。したがって、可変ドメインが、ヒトアクセプターフレームワーク領域、及び非ヒト、好ましくはラット、マウス、又はウサギのドナーＣＤＲを含む、ＣＤＲグラフト化抗体が提供される。
【０１１５】
本発明に用いることができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔら、上記）である。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは、重鎖に用いることができ、ＲＥＩは軽鎖に用いることができ、ＥＵ、ＬＡＹ、及びＰＯＭは、重鎖及び軽鎖の両方に用いることができる。或いは、ヒト生殖細胞系配列を用いてもよい；これらはｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／で入手できる。さらなる代替において、親和性成熟ヒトＶ領域配列のデータベースをフレームワークとして用いてもよい。
【０１１６】
本発明のＣＤＲグラフト化抗体において、アクセプター重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体由来である必要はなく、必要に応じて、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。
また、本発明のＣＤＲグラフト化抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体の配列と同じ配列を厳密に有する必要はない。例えば、通常の残基が、そのアクセプター鎖のクラス又は型についてより高い頻度で存在する残基へ変更されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域における選択された残基が、それらがドナー抗体において同じ位置に見出される残基に対応するように、変更されてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４参照）。そのような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するための必要最低限に抑えられるべきである。変更される必要があり得る、アクセプターフレームワーク領域における残基を選択するためのプロトコールはＷＯ９１／０９９６７に示されている。
【０１１７】
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、ＣＤＲがもともと由来した抗体由来の残基であり、それは、本発明の一実施形態において、ラット、マウス、又はウサギの抗体に由来してもよく、必要に応じて、最終の抗体又は断片へ組み込まれ得る。
【０１１８】
一実施形態において、抗体（又はＦａｂ若しくはＦａｂ’断片などの断片）は、モノクローナル、完全ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体断片である。一実施形態において、抗体、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、完全ヒト又はヒト化抗体である。
【０１１９】
したがって、本発明に用いる抗体は、完全長の重鎖と軽鎖を有する完全抗体分子、又はその断片を含んでもよく、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ  Ｖドメインなど）、ｓｃＦｖ、二価、三価、又は四価抗体、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよいが、それらに限定されない（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６〜１１３６；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３）、２０９〜２１７参照）。これらの抗体断片を作製及び製造するための方法は当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１参照）。本発明に用いる他の抗体断片には、国際公開特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ断片及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、複数の特異性を含んでもよいし、単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５参照）。
【０１２０】
一例において、本発明に用いる抗体は、ラクダ又はラマなどのラクダ科の動物由来であってもよい。ラクダ科の動物は、重鎖抗体と呼ばれる、軽鎖を欠く機能クラスの抗体を有する（Ｈａｍｅｒｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、４４６〜４４８；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６、２３０〜２３５）。これらの重鎖抗体の抗原結合部位は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨＨ）によって提供される３つの超可変ループ（Ｈ１〜Ｈ３）のみに限定される。ＶＨＨの最初の結晶構造により、Ｈ１ループ及びＨ２ループが、通常の抗体について定義された既知のカノニカル構造クラスに制限されないことが明らかになった（Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３００、８３〜９１）。ＶＨＨのＨ３ループは、通常の抗体のそれらより平均して長い（Ｎｇｕｙｅｎら、２００１、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９、２６１〜２９６）。ヒトコブラクダ重鎖抗体の大部分は、それらが産生されている酵素の活性部位への結合を優先する（Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら、１９９８、ＥＭＢＯ  Ｊ、１７、３５１２〜３５２０）。ある場合においては、Ｈ３ループは、残存するパラトープから突出し、ニワトリ卵白リゾチームの活性部位に挿入することが示された（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、１９９６、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３、８０３〜８１１、及びＤｅ  Ｇｅｎｓｔら、２００６、ＰＮＡＳ、１０３、１２、４５８６〜４５９１、及びＷＯ９７０４９８０５）。
【０１２１】
これらのループを他のスキャフォールドにおいてディスプレイし、ＣＤＲライブラリーをそれらのスキャフォールドにおいて作製し得ることが示唆されている（例えば、ＷＯ０３０５０５３１及びＷＯ９７０４９８０５参照）。
一例において、本発明に用いる抗体は、サメなどの軟骨魚由来であってもよい。軟骨魚（サメ、ガンギエイ、エイ、及びキメラ）は、ＩｇＮＡＲとして知られた異型免疫グロブリンアイソタイプを有する。ＩｇＮＡＲは、軽鎖と会合していないＨ鎖ホモ二量体である。各Ｈ鎖は、１つの可変ドメイン及び５つの定常ドメインを有する。ＩｇＮＡＲ  Ｖドメイン（又はＶ−ＮＡＲドメイン）は、２つの密接に関係したサブタイプ、Ｉ及びＩＩへの分類を可能にするいくつかの非カノニカルシステインを有する。タイプＩＩ  Ｖ領域は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３に追加のシステインを有し、そのシステインは、ラクダ科の動物のＶＨＨドメインに観察されるものと類似した、ドメイン拘束ジスルフィド結合を形成すると提唱されている。その上、ＣＤＲ３は、ラクダ科の動物のＶＨＨと類似して、より伸長した立体構造をとり、抗体フレームワークから突出しているであろう。実際、上記のＶＨＨドメインのように、特定のＩｇＮＡＲ  ＣＤＲ３残基もまた、ニワトリ卵白リゾチーム活性部位において結合する能力があることが実証されている（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄら、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５、１７７０〜１７７３）。
【０１２２】
ＶＨＨドメイン及びＩｇＮＡＲ  Ｖドメインを作製する方法の例は、例えば、Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら、１９９８、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９８、１７（１３）、３５１２〜２０；Ｌｉｕら、２００７、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７、７８；Ｓａｅｒｅｎｓら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（５）、５１９６５〜７２に記載されている。
【０１２３】
本発明に用いる抗体には、任意の適切なクラス、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、若しくはＩｇＭ、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４などのサブクラスの抗体全体、及びそれらの機能活性断片若しくは誘導体が挙げられ、それらは、モノクローナル抗体、クローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、又はキメラ抗体であり得るが、それらに限定されない。
【０１２４】
一実施形態において、本開示による抗体又はその特定の断片に用いられる定常領域は、ハイブリッド定常領域又は突然変異型定常領域である。ハイブリッド定常領域は、２つ以上の別個の定常領域、例えば、２つ以上の別個のヒト定常領域由来の部分又はドメインを含む。
【０１２５】
ハイブリッド定常領域の例として、米国特許出願公開第２００７／００４１９７２号に開示されたものが挙げられ、それにおいては、少なくともＣＨ１及びヒンジ領域が１つ又は複数のＩｇＧ２抗体に由来し、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部が１つ又は複数のＩｇＧ４  ＣＨ２及びＣＨ３領域に由来する。エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｉｍｕｍａｂ）（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、ハイブリッド定常領域を含む発作性夜間血色素尿症についてのヒト化抗ヒトＣ５モノクローナル抗体である。それは、ＩｇＧ２由来のＣＨ１及びヒンジと、ＩｇＧ４由来のＣＨ２及びＣＨ３ドメインとのハイブリッド鎖を有する。それはＦｃγＲに結合しないし、補体も活性化しない。それはまた、低い免疫原性を有する（１９６人の患者のたった３人（３％）に検出される抗エクリズマブ抗体の低力価）。
【０１２６】
ＷＯ２００８／０９０９５８は、ＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒンジ、及びＣＨ２、並びにＩｇＧ３由来ＣＨ３ドメインの鎖を含む特定のハイブリッド定常領域を開示する。そのハイブリッドは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３抗体のＣＤＣ活性より高いＣＤＣ活性を有し、ＩｇＧ１と等価のプロテインＡ結合活性を有する。
【０１２７】
さらなるハイブリッド定常領域は、Ｔａｏら（Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎのグループ）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １７３  １０２５〜１０２８、１９９１に開示されている。この論文は、全てのクラスからの多数のＩｇＧドメイン交換を含むが、重要なハイブリッドはｇ１ｇ４及びｇ４ｇ１であり、それぞれ、ＣＨ２ドメインにおいて連結している。ＩｇＧ（１−１−１／４−４）は、ＩｇＧ１と対照的に、補体を活性化することが全くできない。しかしながら、ＩｇＧ（４−４−４／１−１）は、ＩｇＧ４と比較して有意な活性を示したが、ＩｇＧ１と比較してわずかに損なわれていた。重要な違いは、ヒンジであると思われ、多くの論文が、その後に、ヒンジは補体活性化を調節するが、媒介しないことを実証している。
【０１２８】
Ｔａｏら（Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎのグループ）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １７８  ６６１〜６６７、１９９３は、補体活性化におけるアイソタイプ特異的違いを決定するヒトＩｇＧの構造的特徴を開示している。ＩｇＧ４におけるＳｅｒ３３１（ＣＨ２）は、Ｃ１ｑ結合及び補体活性化を妨げる。ＩｇＧ４及びＩｇＧ（１−１−１／４−４）におけるＳｅｒ３３１のＰｒｏへの突然変異誘発は、結合及び活性化を可能にするが、ＩｇＧ１のそれより低いレベルである。興味深いことには、ＩｇＧ１におけるＰ３３１Ｓは結合を可能にするが、活性化を可能にしない。
【０１２９】
Ｚｕｃｋｅｒら、Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ  ５８  ３９０５〜３９０８  １９９８は、複数のドメインがインビボでの半減期に寄与していることを実証するために、組み替えた定常領域エクソンを有するキメラヒト−マウスＩｇＧ抗体を用いている。特に、この論文は、ＩｇＧ（１−１−１／４−４）ハイブリッドなどの半減期を調べている。ＳＣＩＤマウスにおいて、ＩｇＧ（１−１−１／４−４）は、ＩｇＧ４より有意に長いが、ＩｇＧ１よりわずかに短い半減期を有する。ＩｇＧ（４−４−４／１−１）は最も長い半減期を有する。
【０１３０】
突然変異型定常領域の例には、ヒトＣＴＬＡ−４とＩｇＧ１ヒンジ−Ｆｃとの融合体であるＡｂａｔａｃｅｐｔに用いられたものが挙げられる。そのヒンジは、ＣＰＰＣからＳＰＰＳへ変化していた。後者はＯ−ｇｌｙである。突然変異型定常領域は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを媒介せず、低い免疫原性を有する（３％の発生率）。
【０１３１】
そのヒンジは、補体活性化において役割をもつ可能性があると考えられる。結晶学的研究から推定される機能的ヒンジは、ＩｇＧ１の２１６から２３７まで及び、
【化１】
0005872476.tif 000005
の
0005872476.tif 000006
、それぞれからなる。一実施形態において、本開示による抗体又は断片は機能的ヒンジを含む。
【０１３２】
定常領域への突然変異／改変は、例えば、安定性の増加を生じ得、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１９１２６５は、ＩｇＧ１ヒンジの突然変異誘発を開示しており、その突然変異誘発は、ヒトＩｇＧ１の位置２３３〜２３９又は２４９におけるヒンジ領域に１つ又は複数のアミノ酸改変を導入することによってＩｇＧの安定性を増加させた。これは、１週間５５℃まで加熱した際、分解を低下させた。
【０１３３】
或いは、上流ヒンジ部（ヒトＩｇＧ１残基２２６〜２４３、並びに他のＩｇＧサブタイプ及び／若しくは他の種由来の免疫グロブリンにおける対応する残基）並びに／又は隣接ＣＨ１及び／若しくはＣＨ２配列（ヒトＩｇＧ１残基２４９、並びに他のＩｇＧサブタイプ及び／若しくは他の種由来の免疫グロブリンにおける対応する残基）における不安定性アミノ酸（例えば、ヒスチジン又はスレオニン）又は反応性アミノ酸（例えば、リシン又はグルタミン酸）に点突然変異を起こすことによって、改変をもたらしてもよい。
【０１３４】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６、４９５〜４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９８３、４、７２）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、７７〜９６ページ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）などの当技術分野において知られた任意の方法によって調製されてもよい。
【０１３５】
本発明に用いる抗体はまた、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３（１５）、７８４３〜７８４８、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８、及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載された方法による、特定の抗体の生産のために選択された単一のリンパ球から生じた免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローン化及び発現することによる単一リンパ球抗体方法を用いて作製されてもよい。
【０１３６】
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号参照）。
【０１３７】
本発明に用いる抗体はまた、当技術分野において知られた様々なファージディスプレイ方法を用いて作製することができ、その方法には、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２、４１〜５０；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４、１７７〜１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４、９５２〜９５８；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７  １８７、９〜１８；及びＢｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７、１９１〜２８０；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；及びＷＯ９５／２０４０１；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号；及び第５，９６９，１０８号により開示されたものが挙げられる。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳類を含む他の生物体を、ヒト化抗体を作製するために用いてもよい。
【０１３８】
完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び（存在する場合）定常領域が、全てヒト起源であり、又は必ずしも同じ抗体由来であるとは限らないが、ヒト起源の配列と実質的に同一である。完全ヒト抗体の例として、例えば、上記のファージディスプレイ方法により作製された抗体、及び例えば、ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１、及びＥＰ０４６３１５１Ｂ１に一般論として記載されているような、マウス免疫グロブリン可変領域遺伝子及び／又は定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物によって置き換えられているマウスによって産生された抗体を挙げることができる。
【０１３９】
本発明に用いる抗体又は断片は、任意の適切な酵素切断及び／又は消化技術を用いて、例えば、ペプシンでの処理により、任意の抗体全体、特にモノクローナル抗体全体から得ることができる。
【０１４０】
或いは、又は加えて、抗体の出発物質を、抗体可変領域及び／又は定常領域をコードするＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術を用いることによって調製してもよい。標準分子生物学技術を、必要に応じて、アミノ酸又はドメインを改変、付加、又は除去するために用いてもよい。可変領域又は定常領域へのいかなる変更もなお、本明細書に用いられる場合の用語「可変」領域及び「定常」領域に含まれる。
【０１４１】
論じられているように、抗体断片「出発物質」は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、サメ、ラクダ、ラマ、ヤギ、又はヒトを含む任意の種から取得されてもよい。抗体断片の部分は、１つより多い種から取得されてもよく、例えば、抗体断片はキメラであってもよい。一例において、定常領域が１つの種由来であり、可変領域が別の種由来である。抗体断片出発物質はまた改変されていてもよい。別の例において、抗体断片の可変領域は、組換えＤＮＡ操作技術を用いて作製されていてもよい。そのような操作されたバージョンには、天然抗体のアミノ酸配列における、又はそれらへの挿入、欠失、又は変化によって天然抗体可変領域から生じたものが挙げられる。この型の具体的な例には、少なくとも１つのＣＤＲ、並びに任意で、１つの抗体由来の１つ又は複数のフレームワークアミノ酸、及び第２の抗体由来の可変領域ドメインの残部を含む、操作された可変領域ドメインが挙げられる。これらの抗体断片を作製及び製造するための方法は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第６，３３１，４１５号；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３；Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３；Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ａｎｄ  Ａｄａｉｒ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１〜１４２；Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１参照）。
【０１４２】
したがって、一実施形態において、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭドメインであり得る。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、とりわけ、抗体分子が治療的使用を意図されており、且つ抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３のアイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを用いてもよい。或いは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを、抗体分子が治療目的を意図され、且つ抗体エフェクター機能が必要とされない場合、用いてもよい。これらの定常領域ドメインの配列変種もまた用い得ることは認識されているであろう。例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５〜１０８に記載されているように、位置２４１におけるセリンがプロリンへ変化しているＩｇＧ４分子を用いてもよい。抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることもまた、当業者によって理解されているであろう。これらの修飾の型及び程度は、抗体を発現するために用いられる宿主細胞系及び培養条件に依存することが多い。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパルテート異性化、及びアスパラギン脱アミドにおけるバリエーションを挙げることができる。よくある修飾は、（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９〜１３４、１９９５に記載されているような）カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リシン又はアルギニンなど）の喪失である。
【０１４３】
一実施形態において、抗体又は断片の軽鎖は、κか又はλのいずれかのＣＬドメインを含む。
【０１４４】
本明細書で用いられる場合の用語「抗体」又は断片はまた、生体適合性フレームワーク構造へ組み込まれた１つ又は複数のＣＤＲを含む結合作用物質も含み得る。一例において、生体適合性フレームワーク構造は、局在的表面領域において抗原に結合する１つ又は複数のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）をディスプレイすることができる、立体構造的に安定な構造支持体、又はフレームワーク、又はスキャフォールドを形成するのに十分であるポリペプチド又はその部分を含む。そのような構造は、天然のポリペプチド又はポリペプチド「折り畳み」（構造モチーフ）であり得、又は天然のポリペプチド又は折り畳みに対して、アミノ酸の付加、欠失、又は置換などの１つ又は複数の改変を有し得る。これらのスキャフォールドは、ヒト、他の哺乳類、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌、又はウイルスなどの任意の種（又は１つより多い種）のポリペプチド由来であり得る。
【０１４５】
典型的には、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スキャフォールド又は骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｉｎ）、チトクロームｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメイン、及びテンダミスタット（ｔｅｎｄｒａｍｉｓａｔ）に基づいたものを用いてもよい（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ及びＵｈｌｅｎ、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、７、４６３〜４６９参照）。
【０１４６】
一実施形態において、抗体又は断片の総電荷は中性である。
【０１４７】
一実施形態において、抗体又は断片の総電荷は負である。
【０１４８】
一実施形態において、抗体又は断片の総電荷は正である。
【０１４９】
一実施形態において、ＣＤＲは、代替型のスキャフォールド、例えば、フィブロネクチン又はアクチン結合性リピートへグラフト化又は操作されてもよい。
【０１５０】
一実施形態において、抗体又は断片は、ポリマー、毒物又はそれにコンジュゲートした化学阻害剤などの生体毒素を含む毒素などのエフェクター分子を含む。
【０１５１】
生体毒素及び毒物は、細胞シグナル伝達の遮断剤などの天然の調節剤である。本発明による抗体又は断片にコンジュゲートした場合、それらは、抗体により提供される選択性を維持しながら、イオンチャネルへの機能的効果を増強するために用いることができる。例えば、タランチュラコモリグモ毒ペプチドＰｒｏＴｘＩＩは、Ｎａｖ１．７を選択的に阻害することが示されており、例えば、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７４：１４７６〜１４８４、２００８を参照されたい。一実施形態において、毒素は、ボツリヌス毒素、例えば、ボツリヌス毒素Ａである。他の毒素には、テトロドトキシン及びサキシトキシンが挙げられる。
【０１５２】
一実施形態において、抗体又は断片はアプタマーにコンジュゲートされている。アプタマーは、二次構造及び三次構造をとり、且つ結合して、タンパク質活性を調節することができる一本鎖オリゴヌクレオチド配列である。そのような構造の抗体へのコンジュゲーションにより、イオンチャネルの標的特異的調節がもたらされる（直接的効果）。
【０１５３】
一実施形態において、抗体又は断片は、イオンチャネルの合成化学阻害剤などの化学阻害剤にコンジュゲートされている。化学阻害剤の例には、以下の式（Ｉ）の化合物が挙げられる：
【化２】
0005872476.tif 000007
式中、ｎは０又は１である；
ｍは０又は１である；
ｐは０又は１である；
ＹはＣＨ、Ｎ、又はＮＯである；
Ｘは酸素又はイオウである；
Ｗは酸素、Ｈ２、又はＦ２である；
ＡはＮ又はＣ（Ｒ２）である；
ＧはＮ又はＣ（Ｒ３）である；
ＤはＮ又はＣ（Ｒ４）である；
ただし、Ａ、Ｇ、及びＤのうちの１個以下が窒素であるが、Ｙ、Ａ、Ｇ、及びＤのうちの少なくとも１つが窒素又はＮＯである；
Ｒ１が水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルである；
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、非依存的に、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ＯＨ、ＯＣ１〜Ｃ４アルキル、ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＦ３、−ＯＳＯ２ＣＦ３であり、又はＲ２とＲ３、若しくはＲ３とＲ４がそれぞれ一緒になって、０個から２個の間の窒素原子を含み、且つ以下の置換基のうちの１〜２つで置換された、ＡとＧ、又はＧとＤをそれぞれ共有する別の６員芳香環又はヘテロ芳香環を形成し得る：非依存的に、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ＯＨ、ＯＣ１〜Ｃ４アルキル、ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＦ３、−ＯＳＯ２ＣＦ３；
Ｒ５及びＲ６は、非依存的に、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ７、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ８、Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、ＳＯ２Ｒ１０であり、又は一緒になって、（ＣＨ２）ｊＱ（ＣＨ２）ｋであり得る（式中、ＱはＯ、Ｓ、ＮＲ１１、又は結合である；ｊは２〜７である；ｋは０〜２である；Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１１は非依存的に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アリール、若しくはヘテロアリール、又はそれらの鏡像異性体であり、それらの薬学的に許容される塩はニコチン性アセチルコリン受容体の強力なリガンドである）。
ＥＰ０９９６６２２を参照されたい。
【０１５４】
Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（２００３）１１：２０９９〜１１３．ＲＡ  Ｈｉｌｌ、Ｓ  Ｒｕｄｒａ、Ｂ  Ｐｅｎｇ、ＤＳ  Ｒｏａｎｅ、ＪＫ  Ｂｏｕｎｄｓ、Ｙ  ｇ、Ａ  Ａｄｌｏｏ、Ｔ  Ｌｕは、阻害剤として特定のヒドロキシル置換型スルホニル尿素を開示している。
【０１５５】
４，４−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）は、陰イオン輸送阻害剤として用いられている。
【０１５６】
以下もまた、Ｎａｖ１．７の化学阻害剤である：
【表３】
0005872476.tif 000008
【０１５７】
上記表に２と名付けられた化合物、Ｎ−［（Ｒ）−１−（Ｒ）−７−クロロ−１−イソプロピル−２−オキソ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピン−３−イルカルバモイル）−２−（２−フルオロフェニル）−エチル］−４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンズアミドは、ＭｃＧｏｗａｎら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ａｎａｌｇｅｓｉａ  １０９巻、３号、２００９年９月（題が「末梢作用性Ｎａｖ１．７ナトリウムチャネル遮断剤は、炎症性疼痛及び神経因性疼痛のラットモデルにおいて痛覚過敏及び異痛症を逆転させる（Ａ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙ  Ａｃｔｉｎｇ  Ｎａｖ１．７  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ  ａｎｄ  Ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ｏｎ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  Ｐａｉｎ）」である）による論文で論じられている。
【０１５８】
Ｔａｒｎａｗａら（２００７）（「中枢神経系疾患の処置のための電位開口型ナトリウムチャネルの遮断剤（Ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ｏｎ  ＣＮＳ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２：５７）は、最近のナトリウムチャネル遮断剤の医薬品化学を概説した。リドカイン、メキシレチン、カルバマゼピン、フェニトイン、ラモトリギンなどのいくつかの古い薬物、及びラコサミド、オキシカルバゼピン、クロベネチン、ラルフィナミドなどの新しく開発された薬物は、動物モデルにおいて様々な型の慢性疼痛の処置に効果的であることが証明されているナトリウムチャネル遮断剤であり、それらの一部は、臨床的にも用いられている。電位開口型ナトリウムチャネルの化学調節剤のいくつかの他の例は下記に列挙されている：
【化３】
0005872476.tif 000009
図（１５ａ）．Ｍｅｒｃｋによって特許取得された、芳香環及びヘテロ芳香環の組み合わせをもつ化合物
【化４】
0005872476.tif 000010
図（１６）．Ａｔｋｉｎｓｏｎによって特許取得された、ビアリールカルボキサミド化合物
【化５】
0005872476.tif 000011
図（１７）．Ｅｈｒｉｎｇによって特許取得された、芳香環及びヘテロ芳香環の組み合わせをもつ化合物
【化６】
0005872476.tif 000012
図（１８ｂ）．Ｖｅｒｔｅｘによって特許取得された、組み合わされた芳香環及びヘテロ芳香環を有する化合物
【化７】
0005872476.tif 000013
図（１９）．Ｉｏｎｉｘによって特許取得された、組み合わされた芳香環及びヘテロ芳香環を有する化合物
電位開口型ナトリウムチャネルの化学調節剤を記載する他の参考文献：Ａｎｇｅｒら（２００１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４（２）：１１５；  Ｈｏｙｔら（２００７）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７：６１７２；Ｙａｎｇら（２００４）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：１５４７；Ｂｅｎｅｓら（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：２５８２
米国特許第７４５６１８７号は、以下の式の特定のカリウムチャネル阻害剤を開示する：
【化８】
0005872476.tif 000014
式中、Ｒ１は、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、又はアルキルである；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、ニトロ、−ＣＯ２Ｒ７、ＣＯＮＲ４Ｒ５、又はハロである；
Ｒ３はＨ、ＮＲ４Ｒ５、ＮＣ（Ｏ）Ｒ８、ハロ、トリフルオロメチル、アルキル、ニトリル、又はアルコキシである；
Ｒ４及びＲ５は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、若しくはシクロアルキルであってもよい；又はＲ４及びＲ５は一緒になって、飽和、非飽和、若しくは部分的飽和の４〜７員環を形成してもよく、ただし、前記環は任意で、Ｎ、Ｏ、若しくはＳから選択された１つ若しくは複数のさらなるヘテロ原子を含んでもよい；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ６である；
Ｒ６は、Ｈ又はアルキルである；
Ｒ７は、水素、メチル、又はエチルである；
Ｒ８は、メチル又はエチルである；
Ｌは、（ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは１、２、又は３である）である；及び
Ｙは、アリール、複素環基、アルキル、アルケニル、若しくはシクロアルキル、又はその薬学的に許容される塩である。
【０１５９】
Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９巻、第１１刷、２００９年６月１日、３０６３〜３０６６ページは、以下の式の特定の阻害剤を開示している：
【化９】
0005872476.tif 000015
より具体的には：
【化１０】
0005872476.tif 000016
【化１１】
0005872476.tif 000017
【０１６０】
一実施形態において、抗体又は断片にコンジュゲートした実体は、その分子の全体的電荷を変化させる。
【０１６１】
本明細書で用いられる場合のエフェクター分子という用語は、例えば、抗悪性腫瘍剤、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然のポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート金属、ナノ粒子、並びに、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光測定法によって検出され得る化合物などのレポーター群を含む。
【０１６２】
エフェクター分子の例には、細胞毒、又は細胞にとって有害である（例えば、細胞を殺す）任意の作用物質を含む細胞毒性物質を挙げることができる。例として、コンブレタスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアスタリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアンタラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。
【０１６３】
エフェクター分子にはまた、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン、又はデュオカルマイシン）、及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）を挙げ得るが、それらに限定されない。
【０１６４】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２、及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート放射性核種；又は非限定的に、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド、及びスラミンなどの薬物を挙げ得る。
【０１６５】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド、及び酵素が挙げられる。関心対象となる酵素には、タンパク質分解性酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。関心対象となるタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６６】
他のエフェクター分子には、例えば、診断に有用な検出可能な物質を挙げ得る。検出可能な物質の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン放出断層撮影用）、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。一般的には、診断法として用いる、抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについて米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、及びフィコエリトリンが挙げられる；適切な発光物質には、ルミノールが挙げられる；適切な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；並びに適切な放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが挙げられる。
【０１６７】
別の例において、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を増加させ、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ、及び／又は上皮性関門を渡っての免疫系への抗体の送達を増強することができる。この型の適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はＷＯ０５／１１７９８４に記載されているものなどのアルブミン結合化合物が挙げられる。
【０１６８】
エフェクター分子がポリマーである場合、一般的には、それは、合成ポリマーであっても天然ポリマーであってもよく、例えば、任意で置換される直鎖若しくは分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン、若しくはポリオキシアルキレンのポリマー、又は分岐型若しくは非分岐型多糖、例えば、ホモ多糖若しくはヘテロ多糖であり得る。
【０１６９】
上記の合成ポリマー上に存在し得る具体的な任意の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基が挙げられる。
【０１７０】
合成ポリマーの具体的な例として、任意で置換される直鎖又は分岐鎖のポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）などの任意で置換されるポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙げられる。
【０１７１】
適切なポリマーには、ポリ（エチレングリコール）、又は特に、メトキシポリ（エチレングリコール）などのポリアルキレンポリマー又はその誘導体、特に、約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａまでの範囲の分子量を有するものが挙げられる。
【０１７２】
ポリマーのサイズは、必要に応じて変わり得るが、一般的に、５００Ｄａから５００００Ｄａまで、例えば、２００００Ｄａから４００００Ｄａまでなど、５０００Ｄａから４００００Ｄａまでの平均分子量範囲にある。ポリマーサイズは、特に、その製造物の意図される使用、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在化する能力、又は循環半減期を延ばす能力に基づいて選択され得る（概説として、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５参照）。したがって、例えば、その製造物が、例えば腫瘍の処置に用いるために、循環を出て、組織に浸透するように意図される場合、低分子量ポリマー、例えば、約５０００Ｄａの分子量をもつポリマーを用いることが有利であり得る。その製造物が循環内に留まる適用について、より高分子量のポリマー、例えば、２００００Ｄａから４００００Ｄａまでの範囲の分子量を有するポリマーを用いることが有利であり得る。
【０１７３】
一実施形態において、用いられるＰＥＧは、例えば、Ｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって供給される、遊離可能ＰＥＧである。
【０１７４】
一例において、本発明に用いる抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着している。１つの特定の例において、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子が、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を通して付着していてもよい。そのようなアミノ酸は、抗体断片内に天然で存在していてもよいし、組換えＤＮＡ方法を用いて断片へと操作されていてもよい（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号；第５，６６７，４２５号；ＷＯ９８／２５９７１参照）。一例において、本発明の抗体分子は、修飾Ｆａｂ断片であり、その修飾は、エフェクター分子の付着を可能にする１つ又は複数のアミノ酸の、その重鎖のＣ末端への付加である。適切には、付加のアミノ酸は、エフェクター分子が付着し得る１つ又は複数のシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を形成する。２個以上のＰＥＧ分子を付着させるために複数の部位を用いることができる。
【０１７５】
一実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、１つ又は２つのＰＥＧ分子でＰＥＧ化される。
【０１７６】
一実施形態において、ＰＥＧ分子は、軽鎖内のシステイン１７１に連結しており、例えば、参照により本明細書に組み入れられたＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい。
【０１７７】
一実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、表面アクセス可能なシステインを通してＰＥＧ化されている。
【０１７８】
適切には、ＰＥＧ分子は、融合タンパク質に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通して共有結合している。融合タンパク質に付着した各ポリマー分子は、タンパク質内に位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合し得る。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合、又は、特に、イオウ−炭素結合である。チオール基が付着点として用いられる場合、適切に活性化されたＰＥＧ分子、例えば、マレイミドなどのチオール選択性誘導体及びシステイン誘導体が用いられ得る。活性化ＰＥＧ分子は、上記のような分子を含むポリマー融合タンパク質の調製における出発物質として用いることができる。活性化ＰＥＧ分子は、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドなどのチオール反応基を含む任意のポリマーであり得る。そのような出発物質は、商業的に（例えば、Ｎｅｋｔａｒ（以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）入手することができ、又は通常の化学的手順を用いて市販の出発物質から調製することができる。具体的なＰＥＧ分子として、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ（以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ）；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ（以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ）から入手可能）が挙げられる。
【０１７９】
ＰＥＧ分子などのエフェクター分子は、アルデヒド糖を通して、又はより一般的には、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を通しての方法を含む、いくつかの異なる方法によって、抗体に付着し得る。エフェクター分子の付着部位は、ランダムでも部位特異的でもあり得る。
【０１８０】
ランダム付着は、リシンなどのアミノ酸を通して達成される場合が多く、これは結果として、リシンの位置に依存して抗体断片全体にわたるいくつかの部位に付着している、ＰＥＧ分子などのエフェクター分子を生じる。これは一部の場合では成功しているが、付着した、ＰＥＧ分子などのエフェクター分子の正確な位置及び数を制御することができず、これは、例えば、付着しているのがあまりにも少なすぎる場合には、活性の損失、及び／又は、例えば、それらが抗原結合部位に干渉する場合には、親和性の損失をもたらし得る（Ｃｈａｐｍａｎ  ２００２  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５）。結果として、ＰＥＧ分子などのエフェクター分子の制御された部位特異的付着が通常、好まれる方法である。
【０１８１】
ＰＥＧ分子などのエフェクター分子の部位特異的付着は、最も一般的には、システイン残基への付着によって達成され、そのような残基が抗体断片において比較的まれであるからである。抗体ヒンジは、これらがシステイン残基を含み、且つ抗原結合に関与する可能性が高い融合タンパク質の他の領域から離れていることから、部位特異的付着のためによく用いられる領域である。適切なヒンジは、断片内に天然で存在してもよいし、組換えＤＮＡ技術を用いて作製してもよい（例えば、米国特許第５，６７７，４２５号；ＷＯ９８／２５９７１；Ｌｅｏｎｇら、２００１  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６、１０６〜１１９；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７、７８０〜７８３参照）。或いは、又は加えて、部位特異的システインはまた、例えば、エフェクター分子付着のための表面露出システイン（単数又は複数）を生じるように、抗体断片へ操作されてもよい（米国特許第５，２１９，９９６号）。
【０１８２】
したがって、一実施形態において、ＰＥＧ分子は表面露出システインに付着している。
【０１８３】
本明細書に用いられる場合の表面露出システイン（遊離システイン）とは、そのタンパク質が「天然の」折り畳まれた立体構造をとる場合、ＰＥＧ分子などのエフェクター分子をそれにコンジュゲートさせるのにアクセス可能であるシステインを指すものとする。この型の遊離システインを操作する方法の例はまた、米国特許第７，５２１，５４１号に提供されている。
【０１８４】
具体的な天然のポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、又はそれらの誘導体が挙げられる。
【０１８５】
本明細書で用いられる場合の「誘導体」とは、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択性反応基を含むものとする。反応基は、直接的に、又はリンカーセグメントを通して、ポリマーに連結し得る。そのような基の残基は、場合によっては、融合タンパク質とポリマーとの間の連結基としてその製造物の一部を形成することは認識されているであろう。
【０１８６】
本発明はまた、本明細書に記載された抗体、又はその重鎖若しくは軽鎖のその断片をコードする単離されたＤＮＡを提供する。
【０１８７】
さらなる態様において、前記ＤＮＡを含むベクターが提供される。
【０１８８】
ベクターが構築され得る一般的な方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は、当業者によく知られている。この関連において、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって制作されたＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌが参照される。
【０１８９】
さらなる態様において、前記ベクター及び／又はＤＮＡを含む宿主細胞が提供される。
【０１９０】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系が、本発明の融合タンパク質分子をコードするＤＮＡ配列の発現に用いることができる。細菌系、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系、及び他の微生物系を用いてもよいし、真核生物、例えば、哺乳類の宿主細胞発現系もまた用いることができる。適切な哺乳類宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
【０１９１】
本発明はまた、本発明による抗体又はその断片を生産するための方法であって、本発明のベクター（及び／又はＤＮＡ）を含む宿主細胞を、抗体又はその断片をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で培養する段階、及びそれを単離する段階を含む、方法を提供する。
【０１９２】
重鎖及び軽鎖の両方を含む産物の生産のために、細胞系を、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターである、２つのベクターでトランスフェクションしてもよい。或いは、単一のベクターを用いてもよく、そのベクターは、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
【０１９３】
一態様において、配列が、疼痛の調節に関与するイオンチャネル、例えば、Ｎａｖ１．７のＥ１細胞外領域由来である、ペプチドを用いて抗体を作製する方法が提供される。そのようなペプチドは、ポリクローナル抗体を生産するための免疫化プロトコール、及び／又は特定の抗イオンチャネル抗体、例えば、抗Ｎａｖ１．７抗体を選択するためのスクリーニング若しくはパニングプロトコールの両方において、用いられる。一実施形態は、他のイオンチャネル及びそのアイソフォームと最大限の相違点がある、前述の細胞外領域の別々の配列に対応するペプチドを用いる。
【０１９４】
ヒトタンパク質ＳＣＮ９Ａ（アクセッション番号Ｑ１５８５８）としてＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースに寄託されたＮａｖ１．７配列のアミノ酸配列番号付けに基づいて、これらの配列は、以下の通りである：
ドメインＡアミノ酸１４６〜１５３、
ドメインＢアミノ酸７６４〜７７４、
ドメインＣアミノ酸１２１６〜１２２４、及び
ドメインＤアミノ酸１５３５〜１５４５は、特別な違い／差異がある領域であり、したがって、抗体を作製するのに特に適している。
【０１９５】
選択されるペプチドは、通常の線状ペプチドでも環状ペプチドでもよく、上記配列由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含み得る。どちらの場合においても、ペプチドは、担体タンパク質又はレポーター群の高分子担体への次のコンジュゲーションに用いられる単一の官能基を含むように設計される。前記官能基は、システイン残基の側鎖チオール、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸の側鎖カルボキシル、又はＮ末端アミノ基若しくはリシン側鎖残基の一級アミンであり得る。
【０１９６】
前記官能基を有するアミノ酸残基は、天然Ｎａｖ１．７配列に対応してもよいし、天然Ｎａｖ１．７配列への追加であってもよい。Ｎａｖ１．７ペプチド配列におけるこの残基の位置は、配列のいずれかの末端にあってもよいし、任意の内部の位置にあってもよい。一実施形態において、ペプチドは、例えば、以下の配列のいずれかを含む線状ペプチドであり、そのペプチドが由来する、Ｎａｖ１．７のドメインＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤが括弧内に示されている。そのペプチド内で下線の引かれているシステインは、イオンチャネルにおける非天然のシステイン残基である。以下のペプチド内のシステイン残基は、担体タンパク質を付着するために用いられ得る。
【化１２】
0005872476.tif 000018
【０１９７】
これらの配列は、Ｎ末端か又はＣ末端のいずれかで、例えば、Ｎαアセチル基又はアミド基で、それぞれキャッピングされていてもよい。
【０１９８】
他のＮａｖ１．７配列には、以下が挙げられる。
【化１３】
0005872476.tif 000019
【０１９９】
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮａｖ１．７ペプチドは、配列番号１０７〜１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮａｖ１．７ペプチドは、配列番号１０７、１０８、１１０〜１１２、１１４〜１１６、及び１１９〜１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０２００】
他のイオンチャネルのＥ１ループ由来の免疫原は、同様に調製することができ、したがって、例えば、それぞれの免疫原は、例えば、下記の太字で示された、少なくとも４個の連続したアミノ酸残基、及びＮ末端及び／又はＣ末端のいずれかでの追加の残基を示されているような配列順序で含む。この場合もやはり、選択されたペプチドは、Ｎ末端においてＮ−アセチルなどの官能基によって、及び／又はＣ末端においてアミドなどの官能基によってキャッピングされてもよい。ペプチドは、線状ペプチドとして合成されてもよいし、環状ペプチドとして合成されてもよい。いずれの場合においても、ペプチドは、異種タンパク質などの高分子担体への共有結合性付着のための単一の固有官能基を含むように設計される。
【０２０１】
ペプチドがアスパルテート、グルタメート、又はリシン残基を含まず、且つＮ末端がキャッピングされている場合には、固有の官能基は、アミド化学作用による担体への結合のために直接、誘導体化され得るＣ末端カルボン酸であり得る。
【０２０２】
ペプチドがリシン残基を含まない場合には、固有の官能基は、マレイミドなどのさらなる反応基を導入するように誘導体化することができるＮ末端アミノ基であり得る。
【０２０３】
ペプチドが単一のシステイン残基を含む場合には、その側鎖チオールが、マレイミド化学作用により担体へ結合することができる固有の官能基であり得る。
【０２０４】
いずれかの末端における追加の残基（天然か又は非天然のいずれかのアミノ酸）、例えば、システインによって固有の官能基を組み入れて、特異的な結合を可能にしてもよい。
【０２０５】
特定のイオンチャネル由来の配列の例は下記に列挙されており、ペプチドが由来するドメインＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤは、各ペプチドについてその配列の前に表されている：
【化１４】
0005872476.tif 000020
【０２０６】
したがって、一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮａｖ１．３ペプチドは、配列番号１３１〜１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【化１５】
0005872476.tif 000021
【０２０７】
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮａｖ１．６ペプチドは、配列番号１３５〜１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【化１６】
0005872476.tif 000022
【０２０８】
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮａｖ１．８ペプチドは、配列番号１３９〜１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【化１７】
0005872476.tif 000023
【０２０９】
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮａｖ１．９ペプチドは、配列番号１４６〜１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【化１８】
0005872476.tif 000024
【０２１０】
本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＨＣＮ１又はＨＣＮ２ペプチドは、配列番号１５０又は１５１のアミノ酸配列を有する。
【０２１１】
一態様において、環状ペプチドを用いる抗体を作製する方法が提供される。
【０２１２】
本明細書で用いられる場合の環状ペプチドとは、アミノ酸の配列が、ジスルフィド結合などの結合によって連結され、それにより、識別可能な出発点及び／又は終了点をもたないループ又は円を形成するペプチドである。環状ペプチドは、非限定的に、以下などの様々な手段によって対応する線状ペプチドから形成することができる：ペプチド結合を形成する、Ｃ末端カルボキシル基のＮ末端αアミノ基へのライゲーション；或いは、（アスパラギン酸又はグルタミン酸残基の）側鎖カルボキシル基をリシンの側鎖アミノ基若しくはＮ末端αアミノ基へライゲーションさせてもよいし、又はＣ末端カルボキシル基をリシンの側鎖アミノ基へライゲーションさせてもよい；線状配列において少なくとも３個の残基分、お互いに分離した２個のシステイン残基の側鎖チオール間でのジスルフィド結合の形成。線状配列における重複の区域に「環完成結合」を形成することが望ましい場合がある。本明細書に用いられる場合の重複の区域とは、配列に存在する２個以上のアミノ酸の反復があるところを指すものとする。したがって、本明細書に用いられる場合の重複の配列とは、配列中にいくらかの共通性があるところ、例えば、３個又は４個のアミノ酸など、少なくとも２個のアミノ酸が、２つの分離した位置での配列において同じ順序で位置しているところを指すものとする。これらの重複の領域は、整列させて、１つの位置におけるアミノ酸が第２の位置における対応するアミノ酸に取って代わって環化ペプチドを形成するように、ライゲーションすることができる。
【０２１３】
したがって、一実施形態において、ペプチドは、アミド結合を形成することによって環化される。一実施形態において、ペプチドは、ジスルフィド結合を形成することによって環化される。
【０２１４】
一実施形態において、配列は、線状配列における重複の領域でライゲーションされる。
【０２１５】
環状ペプチドは、当技術分野において知られた任意の適切な方法を用いて合成され得る。一実施形態において、環状ペプチドは、アミノ酸側鎖の反応を防ぐために保護基を用い（Ｂａｒｌｏｓ，Ｋ．；Ｇａｔｏｓ，Ｄ．；Ｋｕｔｓｏｇｉａｎｎｉ，Ｓ．；Ｐａｐａｐｈｏｔｉｏｕ，Ｇ．；Ｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．；Ｔｓｅｇｅｎｉｄｉｓ，Ｔ．  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  １９９１、３８巻、６刷  ５６２〜５６８ページ）、続いて、環化し、保護基を除去することによって（Ｋｅｓｓｌｅｒ  Ｈら、１９８９、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｉｄｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、４６１〜４８４ページ；Ｄｅｋｋｅｒ  Ｍら、１９９０、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５、２８７〜３００ページ；Ｇｕｒｒａｔｈ  Ｍ．ら、１９９２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１０、９１１〜９２１；Ｉｚｕｍｉｙａ  Ｎ．ら、１９８１、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２０、１７８５〜１７９１；Ｂｒａｄｙ  Ｓ．Ｆ．ら、１９８３、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｉｇｈｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｖ．Ｊ．Ｈｒｕｂｙ及びＤ．Ｈ．Ｒｉｃｋ編、１２７〜１３０ページ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ；Ｈｅ  Ｊ．Ｘ．ら、１９９４、Ｌｅｔｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．、１、２５〜３０）、合成される。
【０２１６】
驚くべきことに、機能改変抗体は、例えば、たった５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、又は１９個のアミノ酸を含む、非常に短い環状ペプチド配列を用いて作製することができる。これは、ペプチドを環化することによって与えられる強剛性により得る。
【０２１７】
一実施形態において、Ｎａｖ１．７由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸の断片を含む環化ペプチドは、例えば、以下から選択され、そのペプチドが由来する、ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤ及び細胞外ループＥ１、Ｅ２、又はＥ３が括弧内に示されている：
【化１９】
0005872476.tif 000025
【０２１８】
一実施形態において、Ｎａｖ１．７由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸の断片、及び、例えば、担体への付着のための１個の追加のシステイン残基を含む環状ペプチドは、以下から選択され、ペプチドが由来するドメインＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤ、及び細胞外ループＥ１、Ｅ２、又はＥ３が括弧内に表されている：
【化２０】
0005872476.tif 000026
【０２１９】
したがって、本発明の一実施形態において、抗Ｅ１イオンチャネル抗体を作製するのに用いられるＮａｖ１．７環状ペプチドは、配列番号１２３〜１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０２２０】
宿主動物において抗イオンチャネル抗体を生産することを目的として免疫原を調製するために、各ペプチドは、担体タンパク質への共有結合性コンジュゲーションを必要とする。担体タンパク質は、宿主種に対するそれの「外来性」に基づいて選択される；したがって、ウサギ又は齧歯類の免疫化について、適切な担体タンパク質の例は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。上記ペプチドのそれぞれは、線状か環状かに関わらず、上記タンパク質のそれぞれの１つへシステインチオールを通してコンジュゲートすることができ、後者のリシン側鎖アミノ基が、マレイミド官能基で共有結合性に修飾されて、それぞれ、以下を生じている：
・ＫＬＨ−マレイミド
・オボアルブミン−マレイミド、又は
・ＢＳＡ−マレイミド
【０２２１】
本開示は、上記で列挙された担体のそれぞれと別々にコンジュゲーションした本明細書に記載されたペプチドのそれぞれを明確に構想しており、すなわち、宿主を免疫するための４５個の異なる分子が具体的に提供されており、例えば、
【化２１】
0005872476.tif 000027
又は
【化２２】
0005872476.tif 000028
である。したがって、配列番号１０７〜１５１から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドのいずれも、上記で列挙された担体タンパク質のそれぞれとコンジュゲートすることができる。
【０２２２】
上記のように、担体タンパク質は、システイン残基などの固有の官能基を通してコンジュゲートすることができる。しかしながら、ペプチドを担体タンパク質へコンジュゲートするためにシステイン残基の代わりにいかなる代替の天然又は非天然の残基を用いてもよい。システインの代わりに用いられ得る非天然の残基の例は、ホモシステイン残基であり、それは、側鎖に追加のメチレン基をさらに含むシステインの相同体である。したがって、システイン残基を含む、配列番号１０７〜１５１から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドのいずれも、ホモシステイン残基などの担体タンパク質へのコンジュゲーションのための代替の適切な天然又は非天然の残基で、システイン残基を置き換えるように改変されてもよい。
【０２２３】
本開示はまた、本明細書に開示された新規のペプチド及びそれを含む組成物まで及ぶ。
【０２２４】
一般的に、０．００１ｍｇから１ｍｇの間の各ペプチド−担体タンパク質が、宿主動物あたりの各免疫化用量に必要とされる。
【０２２５】
機能改変抗体を生産するのに適した代替の免疫原には以下が挙げられる：関連する完全長ヒトイオンチャネル、例えばＮａｖ１．７、個々のサブドメイン及びサブドメインの切断型を含むその切断型；発現を助け、又は細胞外ループを免疫系に提示するために他の膜貫通タンパク質の領域へ融合したイオンチャネルの領域を有するキメラ分子、及びイオンチャネルの領域を所望の立体構造に拘束するためのイオンチャネルの突然変異型。
【０２２６】
これらの免疫原を、直接的細胞免疫化又は免疫化用のタンパク質の精製のために、哺乳類細胞において発現させてもよい。
【０２２７】
これらの免疫原を、免疫化用のタンパク質の精製のために、大腸菌又は無細胞発現系に発現させてもよい。
【０２２８】
精製されたタンパク質を、免疫化のために脂質小胞又はミセルへ組み込んでもよい。
【０２２９】
これらのイオンチャネルバージョンはまた、免疫化のためのリポ粒子として作製されてもよい。
【０２３０】
加えて、上記免疫原のいずれも、機能改変抗体を同定するためのスクリーニングツールとして利用することができる。
【０２３１】
したがって、一態様において、例えば、少なくとも１つのイオンチャネルＥ１ペプチド−担体タンパク質コンジュゲートで、又は同じ担体タンパク質に別々にコンジュゲートされたいくつかの異なるペプチド（ここで、少なくとも１つはＥ１である）で、若しくは同じ担体タンパク質にコンジュゲートされた混合物として、免疫することにより、宿主に抗体を作製する方法が提供される。
【０２３２】
一実施形態において、方法は、１回、２回、３回、４回、又は５回の免疫化を含む。
【０２３３】
一実施形態において、方法は、それぞれのコンジュゲートペプチド（単数又は複数）での、２回又は３回など、少なくとも２回の免疫化を含む。
【０２３４】
一実施形態において、２回目の免疫化は、ペプチド（単数又は複数）は共通しているが、担体タンパク質が１回目の免疫化に用いられた担体タンパク質と異なっている、異なるコンジュゲートを用いる。
【０２３５】
したがって、一実施形態において、３回目の免疫化は、ペプチド（単数又は複数）は１回目及び２回目の免疫化のそれと共通しているが、担体タンパク質が１回目及び／又は２回目の免疫化に用いられたそれと異なっている、異なるコンジュゲートを用いる。担体タンパク質に対する望ましくない抗体特異性は、このようにして最小限にすることができる。
【０２３６】
連続的免疫化のための適切な担体タンパク質組み合わせには、任意の順序でのＫＬＨ及びオボアルブミン及びＢＳＡが挙げられる。
【０２３７】
担体を変えることは、ペプチドへの応答を最適化することにおいて有利であり得る。
【０２３８】
各免疫化はまた、一般的に、免疫応答を刺激するためにアジュバントの投与を含む。適切なアジュバントとして、フロイント完全又は不完全アジュバント、並びに、ミョウバン、ＱＳ２１、ＭＰＬ、及び／又はＣＰＧを含むアジュバントが挙げられる。
【０２３９】
方法は、抗体又は抗体産生細胞を宿主から分離する段階をさらに含んでもよい。
【０２４０】
一実施形態において、宿主は、マウス若しくはラットなどの齧歯類、ラクダ、ラマ、ブタ、イヌ、霊長類、サメ、又はウサギ、特にウサギである。
【０２４１】
前述のペプチドはまた、レポーター群にコンジュゲートされていてもよい。レポーター群は、例えば、ビオチン、蛍光群、若しくは酵素タグ、又は抗イオンチャネル抗体の検出若しくは単離を可能にする任意の群であり得る。レポーター群−ペプチドコンジュゲートは、生じたポリクローナル血清及びモノクローナル抗体をスクリーニングするために用いることができる。例えば、スクリーニングＥＬＩＳＡは、ストレプトアビジンコーティング化マイクロウェル及び捕獲されるビオチン化ペプチドを含み得る。これに対する免疫血清の滴定により、ペプチド特異的抗体の表面への結合を生じ、その抗体が、次に、第４の抗種（抗ウサギなど）ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ層によって明らかにすることができる。
【０２４２】
レポーター群−ペプチドコンジュゲートはまた、ファージパニングなどのライブラリーに基づいた技術による様式のように、特異的イオンチャネル抗体を単離するために用いることもできる。
【０２４３】
方法はまた、例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を提供するために、さらなる精製段階を含んでもよい。
【０２４４】
方法はまた、前記免疫化に由来する組換えクローン抗体を作製する段階を含んでもよい。
【０２４５】
クローン抗体が組換え的に調製することができる前に、可変領域などの部分、又は抗体の全部を、クローン化及び／又は配列決定することが必要になる場合がある。
【０２４６】
本開示はまた、本明細書の方法から取得可能な、又は取得された抗体産生細胞及び抗体まで及ぶ。
【０２４７】
本開示はまた、本明細書の方法を用いて取得可能な、又は取得された抗体又は適切な抗体断片まで及ぶ。
【０２４８】
本開示はまた、本明細書における抗体又は断片を含む薬学的組成物を含む。
【０２４９】
薬学的組成物は、適切には、治療的有効量の本発明の抗体を含む。用語「治療的有効量」は、本明細書で用いられる場合、標的にされた疾患若しくは状態を処置し、寛解させ、若しくは予防するのに、又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すのに、必要とされる治療剤の量を指す。いずれの抗体についても、治療的有効量は、最初に、細胞培養アッセイにおいてか又は動物モデル、通常には、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、若しくは霊長類においてかのいずれかで推定することができる。動物モデルをまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために用いてもよい。その後、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために用いることができる。
【０２５０】
ヒト対象についての正確な治療的有効量は、病状の重症度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与時間及び投与頻度、合剤（単数又は複数）、反応感度、及び治療に対する許容度／応答に依存する。この量は、日常的実験により決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般的に、治療的有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。薬学的組成物は、便利には、用量あたりの本発明の活性物質の所定量を含む単位用量の形で提供されてもよい。
【０２５１】
組成物を、患者へ個々に投与してもよいし、他の作用物質、薬物、又はホルモンと（例えば、同時に、逐次的に、又は別々に）併用して投与してもよい。
【０２５２】
本発明の抗体又は断片が投与される用量は、処置される状態の性質、疾患の程度及び／又は存在する症状に、並びに抗体又は断片が予防的に用いられることになっているのか、又は既存の状態を処置するために用いられることになっているのかに依存する。
【０２５３】
投薬頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続時間に依存する。抗体分子が短い半減期（例えば、２〜１０時間）を有する場合には、１日に１回又は複数回、投薬する必要があり得る。或いは、抗体分子が長い半減期（例えば、２〜１５日）を有する場合には、１日に１回、１週間に１回、又はさらに１カ月ごと若しくは２カ月ごとに１回、投薬することが必要なだけであり得る。
【０２５４】
薬学的に許容される担体はそれ自体、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導すべきではなく、且つ毒性であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウイルス粒子などの大きく、ゆっくりと代謝される高分子であり得る。
【０２５５】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩などの有機酸の塩を用いることができる。
【０２５６】
治療組成物における薬学的に許容される担体は、追加として、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールなどの液体を含んでもよい。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような組成物中に存在してもよい。そのような担体は、薬学的組成物によって、患者の経口摂取用の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁液として製剤化することが可能になる。
【０２５７】
投与のための適切な形には、非経口投与に適した形、例えば、注射又は注入、例えば、ボーラス注射又は持続注入によるものが挙げられる。製造物が注射又は注入用である場合、それは、油性又は水性の媒体における懸濁液、溶液、又は乳濁液の形をとることができ、懸濁剤、保存剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。或いは、抗体分子は、適切な滅菌液体と共に用いる前の、再構成するための乾燥した形であってもよい。
【０２５８】
いったん製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接、投与することができる。処置される対象は動物であり得る。しかしながら、１つ又は複数の実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適応している。
【０２５９】
適切には、本開示による製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値に類似せず、例えば、製剤のｐＨが７であるならば、８〜９又はそれより上のｐＩが適当であり得る。理論に縛られるつもりはないが、これは最終的に、安定性が向上した最終製剤を提供することができ、例えば、抗体又は断片は溶解した状態のままである。
【０２６０】
本発明の薬学的組成物は、いくつの経路によって投与されてもよく、その経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、腟内、又は直腸内の経路が挙げられるが、それらに限定されない。皮下噴射器もまた、本発明の薬学的組成物を投与するのに用いてもよい。典型的には、治療組成物を、溶液か又は懸濁液かのいずれかの注射剤として調製してもよい。注射前の液体媒体における溶液又は懸濁液に適した固形にもまた調製してもよい。
【０２６１】
組成物の直接的送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内、若しくは筋肉内への注射、又は組織の間質腔へ送達される注射によって達成される。組成物はまた、病変へ投与することができる。投薬処置は、単回投与スケジュールでも複数回投与スケジュールでもよい。
【０２６２】
組成物中の活性成分はタンパク質分子であることは認識されているであろう。したがって、それは、胃腸管内で分解されやすい。したがって、組成物が胃腸管を用いる経路によって投与されることになっている場合には、組成物は、抗体を分解から保護するが、いったんそれが胃腸管から吸収されたならば、抗体を放出する作用物質を含むことが必要であろう。
【０２６３】
薬学的に許容される担体の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．  １９９１）において入手できる。
【０２６４】
一実施形態において、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０２６５】
適切な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、噴霧ガスを含む計量エアロゾル、又は噴霧ガスを含まない吸入可能な溶液が挙げられる。活性物質を含む本開示による吸入可能な粉末は、前述の活性物質だけからなってもよいし、生理的に許容される賦形剤との前述の活性物質の混合物からなってもよい。
【０２６６】
これらの吸入可能な粉末には、単糖（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれらのお互いとの混合物が挙げられる。適切には、単糖又は二糖が用いられ、特に、水和物の形でのラクトース又はグルコースが用いられるが、それらに限らない。
【０２６７】
肺沈着のための粒子は、１〜９ミクロン、例えば、０．１μｍから５μｍまで、特に１μｍから５μｍまでなど、１０ミクロン未満の粒子サイズを必要とする。（抗体又は断片などの）活性成分の粒子サイズは最も重要である。
【０２６８】
吸入可能なエアロゾルを調製するために用いることができる噴霧ガスは当技術分野において知られている。適切な噴霧ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、又はイソブタンなどの炭化水素、並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、若しくはシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素の中から選択される。前述の噴霧ガスは、単独で用いてもよいし、それらの混合物として用いてもよい。
【０２６９】
特に適切な噴霧ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。前述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにそれらの混合物は特に適している。
【０２７０】
噴霧ガス含有吸入可能エアロゾルはまた、共溶媒、安定化剤、表面活性物質（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤などの他の成分、及びｐＨを調整するための手段を含んでもよい。これらの成分の全ては当技術分野において知られている。
【０２７１】
本発明による噴霧ガス含有吸入可能エアロゾルは、５重量％までの活性物質を含んでもよい。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の活性成分を含む。
【０２７２】
或いは、肺への局所投与はまた、例えば、ネブライザー、例えば、コンプレッサーに接続したネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ製のＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）コンプレッサーに接続したＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）ネブライザー）などの装置を用いる、溶液又は懸濁液の製剤の投与によってもよい。
【０２７３】
本発明の抗体又は断片は、溶媒中に分散して、例えば、溶液又は懸濁液の形で、送達することができる。それは、適切な生理的溶液、例えば、生理食塩水、又は他の薬理学的に許容される溶媒若しくは緩衝溶液中に懸濁することができる。当技術分野において知られた緩衝溶液は、約４．０〜５．０のｐＨに達するように、１ｍｌの水あたり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含み得る。懸濁液は、例えば、凍結乾燥した抗体を用いることができる。
【０２７４】
治療用の懸濁液又は溶液の製剤はまた、１つ又は複数の賦形剤を含むことができる。賦形剤は、当技術分野においてよく知られており、それらには、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、及び重炭酸緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェア内にカプセル化することができる。製剤は、一般的に、滅菌製造方法を用いて実質的に滅菌した形で提供される。
【０２７５】
これは、当業者によく知られた方法による、製剤に用いられる緩衝溶媒／溶液の濾過、滅菌緩衝溶媒／溶液中での抗体の無菌的懸濁、及び滅菌容器への製剤の分配による生産及び滅菌を含み得る。
【０２７６】
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルに包んでパッケージングされた単一用量単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供されてもよい。各バイアルは、ある体積、例えば、２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中の単位用量を含む。
【０２７７】
本開示の融合タンパク質分子は、噴霧による送達に適していると考えられる。
【０２７８】
本開示の抗体及び断片は、疼痛、例えば、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、帯状疱疹後神経障害（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）を含む神経因性疼痛を処置するのに適し得る。神経因性疼痛の他の原因には、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。慢性背痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、神経障害関連性疼痛の発生を生じる場合があり、したがって、本開示による抗体又は断片での処置に適している可能性がある。
【０２７９】
一実施形態において、本発明による抗体又は断片は、体性痛、内臓痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、急性疼痛、慢性疼痛、突出痛、及び／又は炎症性疼痛を含む疼痛の処置又は予防に適している。
【０２８０】
一実施形態において、本発明による抗体又は断片は、以下の疼痛の型の１つ又は複数の処置又は予防に適している：異痛症、有痛性知覚脱失、狭心痛、突出痛、複合性局所性疼痛症候群Ｉ型、複合性局所性疼痛症候群ＩＩ型、痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）、痛覚異常鋭敏（ｈｙｐｅｒｐａｔｈｉａ）、特発性疼痛、悪性疼痛、錯感覚、幻肢痛、心因性疼痛。
【０２８１】
一実施形態において、本開示による抗体又は断片は、喘息、喘息における気道過敏、例えば喘息における、慢性咳嗽、及び／又は慢性閉塞性気道の処置に有用である。
【０２８２】
一実施形態において、本開示による抗体又は断片は、炎症、変形性関節症、関節リウマチ、及び／又はそれらのいずれかに伴う疼痛の処置に有用である。
【０２８３】
一実施形態において、本開示による抗体又は断片は、急性損傷、例えば、裂傷、切創、火傷、銃弾による負傷、及び／又は榴散弾による負傷などの創傷に伴う疼痛の処置に有用である。
【０２８４】
論じられているように、本開示による抗体又は断片は、急性疼痛及び慢性疼痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背痛、並びに疾患及び変性症に伴う疼痛などの疼痛の処置に有用である可能性が高い。
【０２８５】
疼痛は、１つ又は複数の原因から生じ得、その原因として、末梢性神経障害、中枢性神経障害、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼、圧迫神経根障害、腰部脊椎管狭窄、坐骨神経圧迫、脊髄根圧迫、肋間神経痛、圧迫神経根障害、及び神経根性腰痛などの神経圧迫又は絞扼性症候群、脊髄根破壊、背痛、神経炎、自己免疫疾患、術後痛、歯痛、直接的外傷、炎症、ＨＩＶ感染、天然痘感染、ヘルペス感染、毒物曝露、浸潤癌、化学療法、放射線療法、ホルモン治療、異物、火傷、先天性欠損、幻肢痛、関節リウマチ、変形性関節症、骨折の疼痛、痛風の疼痛、線維筋痛、多発性硬化症、下痢に伴う疼痛、過敏性腸症候群、偏頭痛、脳炎、糖尿病、慢性アルコール症、甲状腺機能低下、尿毒症、並びにビタミン欠乏が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、本開示による抗体又は断片は、上記適応症の１つ又は複数の症状の処置又は寛解に有用であり得る。
【０２８６】
一実施形態において、本開示による抗体又は断片は、イオンチャネル阻害剤についてスクリーニングするためのアッセイにおける標準として用いられる。
【０２８７】
本明細書の関連において含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）とは、含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとする。
【０２８８】
理論的には、本発明の適切な実施形態が組み合わせられ得る。
【０２８９】
特定の特徴／要素を含むように実施形態が記載されている。本開示はまた、前記特徴／要素からなる、又は本質的にそれらからなる別々の実施形態まで及ぶ。
【０２９０】
本発明はさらに、以下の実施例において、ただ例証として記載され、添付の図を参照する：
【実施例】
【０２９１】
Ｎａｖ１．７の治療抗体の作製／選択
ペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．、Ｆａｒｅｈａｍ、Ｕ．Ｋ．によって供給され、線状ペプチドを、Ａｔｈｅｒｔｏｎ及びＳｈｅｐｐａｒｄ（１９８９）  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓの方法によるＦｍｏｃ固相ペプチド化学によって合成した。Ｎ末端からＣ末端への環状ペプチドについては、コンピュータ支援薬物設計、方法、及び適用、Ｔ．Ｊ．Ｐｅｒｕｎ及びＣ．Ｌ．Ｐｒｏｂｓｔ編、４６１〜４８４ページ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ；Ｔｏｎｉｏｌｏ  Ｃ．、１９９０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、３５、２８７〜３００；Ｇｕｒｒａｔｈ  Ｍ．ら、１９９２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１０、９１１〜９２１；Ｉｚｕｍｉｙａ  Ｎ．ら、１９８１、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２０、１７８５〜１７９１；Ｂｒａｄｙ  Ｓ．Ｆ．ら、１９８３、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｉｇｈｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｖ．Ｊ．Ｈｒｕｂｙ及びＤ．Ｈ．Ｒｉｃｋ編、１２７〜１３０ページ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ；Ｈｅ  Ｊ．Ｘ．ら、１９９４、Ｌｅｔｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．、１、２５〜３０において、Ｂａｒｌｏｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９１の方法により側鎖保護ペプチドとして合成し、環化を液相中で実施し、続いて、Ｋｅｓｓｌｅｒ  Ｈら、１９８９の方法により側鎖を脱保護した。
【０２９２】
ＫＬＨ、ＯＶＡ、又はＢＳＡのいずれかにコンジュゲートしたヒトＮａｖ１．７ペプチドの組み合わせでウサギを免役した（表１）。５回の皮下免疫化（ＫＬＨ、ＯＶＡ、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ＯＶＡ）後、動物を屠殺し、ＰＢＭＣ、脾臓、及び骨髄を採取した。血清を、ヒトビオチン化ペプチドへの結合についてＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【表４】
0005872476.tif 000029
【０２９３】
表は、免疫されるウサギ番号、免疫化のために用いられるペプチド組み合わせ、及びペプチド配列を示す。Ｂ１１は、ドメインＢにおけるループＥ１由来のペプチドである。Ｃ１１はドメインＣにおけるループＥ１由来のペプチドである。Ｄ１１はドメインＤにおけるループＥ１由来のペプチドである。
【０２９４】
Ｔｉｃｋｌｅら、２００９（ＪＡＬＡ、１４巻、５号、３０３〜３０７ページ）に記載された方法を実質的に用いてＳＬＡＭを実施した。簡単に述べれば、ウサギ脾細胞又はＰＢＭＣを用いてＳＬＡＭ培養物を設定し、上清を、まず、ＦＭＡＴにおけるビーズに基づいたアッセイにおいてビオチン化ペプチドに結合する能力についてスクリーニングした。これは、ストレプトアビジンビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に結合したビオチン化ヒトペプチドを用い、ヤギ抗ウサギＦｃ−Ｃｙ５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて結合を明らかにする均一系アッセイであった。その後、このスクリーニングから陽性であったものを、非特異的抗体を同定する陰性スクリーニングに供した。これは、ペプチドを有しないストレプトアビジンビーズ又は無関係のペプチドを有するストレプトアビジンビーズを用い、ヤギ抗ウサギＦｃ−Ｃｙ５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）との結合を明らかにして、ペプチド特異的結合体を同定した。
【０２９５】
１０個のＳＬＡＭ実験から、いくつかのＢ１１特異的、Ｃ１１特異的、及びＤ１１特異的抗体含有ウェルが、上記のスクリーニングを用いて同定された。
【０２９６】
いくつかのこれらのウェルからの、蛍光焦点方法による単一Ｂ細胞単離、及びその後の可変領域遺伝子のクローニングにより、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ後、重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子対がうまく得られた。これらのＶ領域遺伝子をウサギＩｇＧ１完全長抗体としてクローン化し、ＨＥＫ２９３一過性発現系において再発現させた。
【０２９７】
クローン化されたＶ領域の配列分析により、抗ヒトＢ１１特異的のいくつかの固有のファミリーの存在が明らかにされた（下記の表２参照）。これらの抗体のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、図に示されている。抗体を一過性ＣＨＯ系において発現させ、その後、精製して、インビトロ及びインビボでのさらなる特徴づけを可能にした。
【表５】
0005872476.tif 000030
【０２９８】
図４〜７は、抗Ｎａｖ１．７抗体についての配列を示す。その抗体が由来する免疫されたウサギ及びそれらのペプチド特異性が詳述されている。
【０２９９】
抗体試験のためのｈ  Ｎａｖ１．７記録についての手順
溶液及び抗体操作
細胞外溶液は以下を含んだ（ｍＭ）：１３０  ＮａＣｌ、４  ＫＣｌ、１．５  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、３０  グルコース、１０  ＨＥＰＥＳ（Ｔｒｉｓ−ＢａｓｅでｐＨ７．４、及び３００〜３０５ｍモル浸透圧）。細胞内溶液は以下を含み（ｍＭ）：５  ＮａＣｌ、１１５  ＣｓＦ、２０  ＣｓＣｌ、１１０  ＨＥＰＥＳ、１０  ＥＧＴＡ遊離酸（ＣｓＯＨでｐＨ７．２、及び２９０〜２９５ｍモル浸透圧）、それを新鮮な状態にするか、又は凍結させるかのいずれかにした。細胞外溶液及び細胞内溶液を使用前に濾過した。抗体を、９６ウェルポリプロピレン化合物プレート（Ｓａｒｓｔｅｄ、＃８３．１８３５．５００）への移動前に、細胞外溶液中に直接、希釈し、新鮮な状態で（１５分以内で）調製した。選択的ペプチドを用いる実験について、等濃度での抗体及びペプチドを、パッチクランプ実験の前に４℃で少なくとも３０分間、プレインキュベートした。
【０３００】
細胞調製
ヒトＮａｖ１．７チャネル（ＩＸ型電位開口型ナトリウムチャネルαサブユニット）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＣＹＬ３０１１）から購入した。１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ、＃ＤＥ１４−８０２Ｆ）、１％ペニシリン＋ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、ＤＥ１７−６０３Ｅ）、１％非必須アミノ酸（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ１３−１１４Ｅ）、及び４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ、＃１０１３１−０２７）を含む、グルタミン含有標準培地ＤＭＥＭ−Ｆ１２を用いて、コラーゲンＩ型でコーティングされたＴ−７５（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、＃３５６４８５）フラスコ内で細胞を培養した。細胞を、１５，０００細胞／ｃｍ２の密度又は８，０００細胞／ｃｍ２の密度でそれぞれ、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）７０００Ａ（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの新しい一員）で用いる前に２日間又は３日間、プレーティングした。細胞コンフルエンスは９０％を超えることはなかった。実験の当日、細胞を、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｓｉｇｍａ、Ａ７０８９）を用いて収集した。簡単に述べれば、細胞を、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１２−５１６Ｆ）中で２回、洗浄し、１：４の希釈のＡｃｃｕｍａｘ溶液を加え、３７℃で１．５〜２分間、インキュベートした。１０％ＦＢＳを含む、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及びＬ−グルタミン含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１２−７１９Ｆ）（回復培地）を加えて、Ａｃｃｕｍａｘ消化を終息させた。続いて、細胞を、５０ｍｌのファルコンチューブ内で１，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、ペレットを１０ｍｌの回復培地中に再懸濁する。細胞を数え（ＣｏｕｌｔｅｒＺ２）、約１０万細胞／ｍｌで懸濁し、室温で最低９０分間、１５ｍｌのスクリューキャップ式チューブへ移した。その後、細胞を１，０００ｒｐｍで６０秒間、遠心分離した。ペレットを１，０００μｌの細胞外溶液中に穏やかに再懸濁し、１，０００ｒｍｐで３０秒間、２度目の遠心分離を行った。ペレットを１５０μＬの細胞外溶液中に再懸濁し、すぐに、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）で試験した。
【０３０１】
ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）手順
ＡＶＩＶＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＳｅａｌＣｈｉｐ１６（商標）電極アレイ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから購入）を、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）システムのホルダー内に手で置き、細胞のアプライについては、自動調製された。細胞内溶液を各チャンバーの下部へ注入し、細胞外溶液を、１６個のノズルの洗浄装置を通してチャンバーの上部へ灌流した。この時間中、穴に細胞片がない状態を保つために、圧力制御装置で、細胞内側からの陽圧（＋１０ｍｍＨｇ）を維持した。細胞は、各ウェルに（１０Ｋ〜３０Ｋ細胞を含む）４μｌが加えられる前に、統合Ｃａｖｒｏピペッティングロボットによって粉砕された。
【０３０２】
ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）ｈ  Ｎａｖ１．７アッセイ
１０秒後、圧力を＋４ｍｍＨｇから−３０ｍｍＨｇへ切り換え、１６個の穴（電極）のそれぞれに懸濁細胞を引き寄せた。ギガオームシールが得られ、且つ２０秒間、検証されるまで、３６秒ごとに１．６ｍｍＨｇ／秒の速度で−１ｍｍＨｇから−３５ｍｍＨｇへの陰圧ランプを繰り返すことによってシール形成が達成された。−８０ｍＶのピペット電位で７．５ｍｍＨｇ／秒の速度での−４０ｍｍＨｇから−１５０ｍｍＨｇへの陰圧のランプ増加を用いて穴を覆う膜のパッチを破ることによってホールセルアクセスが達成された。ホールセル記録後、細胞を、細胞外溶液で６６秒間、洗浄して、ウェルにおける過剰な細胞を除去した。細胞を５分間、透析させておき、その間、アクセス抵抗をモニターした。ホールセル試運転時点から実験の終了まで、電位プロトコール間、細胞を−８０ｍＶで保持した。１０秒間隔で２０ミリ秒間、−８０ｍＶから０ｍＶへの脱分極ステップによって誘発されるナトリウム電流への抗体効力を評価するために時間経過プロトコールを適用した。各試行が始まる前にホールセル補償が自動的になされ、電気的アクセス抵抗（Ｒａ）が６５％、補正された。−８０ｍＶを保持しながら、Ｐ／Ｎリーク減算プロトコール（Ｎ＝４）を用いて線形リーク減算をオンラインで実施した。
安定化期間後（最高１０分まで）、陰性対照溶液（細胞外溶液）を５分間、アプライし、続いて、抗体を２回、投与した。ウェルへの同じ濃度の化合物の２回の添加の間の間隔は、約１１秒であった。抗体溶液（４５μＬ）を、持続的に吸引しながら、望ましい濃度で、オンラインで加えた（３０μＬ／秒）。抗体への１８分間の曝露中、連続的に電流をモニターした。
【０３０３】
データ解析
以下の場合には、細胞を分析しなかった：
（１）膜抵抗が最初、２００Ｍオーム未満であった、
（２）電流振幅＜２００ｐＡ、
（３）アクセス抵抗が２０Ｍオーム以下、及び
（４）陰性対照添加後、実質的な安定化電流がない。
電流振幅を、ＤａｔａＸｐｒｅｓｓ２ソフトウェア（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定し、ランダウン電流補正を、線形又は指数フィッティング法により、洗浄時間後の最後の１０〜１５個のデータ点、及び陰性対照添加後の最後の１０〜１５個のデータ点に関連した測定に実施した。
抗体添加の前の平均電流補正振幅により電流を標準化した。１８分間の抗体アプライ後の残留応答によって電流阻害を推定した。データは下記の表３に示されている。
表３：
【表６】
0005872476.tif 000031
【０３０４】
図１
図１は、特定のペプチドの存在下又は非存在下における、ＨＥＫ細胞に発現したヒトＮａｖ１．７電流への選択された抗体（２５μｇ／ｍｌ）の機能的効果を示す。Ｎａｖ１．７電流は、反復刺激プロトコールを用いる自動パッチクランプにより記録され、データは、最後の刺激後の標準化Ｎａｖ１．７電流として提示される。選択された抗体を、特定のペプチド（２５μｇ／ｍｌ）の存在下、４℃で３０分間、インキュベートし、その後、Ｎａｖ１．７電流記録のためにＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓシステムへ移した。ペプチドの存在は、系統的に、抗体の阻害効果を逆転させ、したがって、Ｎａｖ１．７電流の阻害が、抗体のＮａｖ１．７細胞外ループとの特異的な相互作用によって媒介されることを示している。
【０３０５】
図３Ｄ（ａ）
ＨＥＫ細胞に発現した組換えヒトＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクランプ分析。９８３モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻害を生じる。データ点は、抗体の存在下における反復電位ステッププロトコールの適用後の標準化ピーク電流振幅（エンドポイント）を表す。
【０３０６】
図３Ｄ（ｂ）
ＨＥＫ細胞に発現した組換えヒトＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクランプ分析。１０８０モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻害を生じる。データ点は、抗体の存在下における反復電位ステッププロトコールの適用後の標準化ピーク電流振幅（エンドポイント）を表す。
【０３０７】
図３Ｅ
ＨＥＫ細胞に発現した組換えラットＮａｖ１．７チャネルの自動パッチクランプ分析。９８３モノクローナル抗体は、Ｎａｖ１．７電流の用量依存性阻害を生じる。１０８０モノクローナル抗体は、２５μｇ／ｍｌにおいてＮａｖ１．７電流の約２６％阻害を生じる。データ点は、抗体の存在下における反復電位ステッププロトコールの適用後の標準化ピーク電流振幅（エンドポイント）を表す。
【０３０８】
図３Ｆ
９８３モノクローナル抗体によるヒトＮａｖ１．７阻害の動態。組換えヒトＮａｖ１．７チャネルを発現するＨＥＫ細胞を、電位ステッププロトコールを用いて０．１Ｈｚで約２０分間、刺激する。データ点は、１０秒ごとに記録されたＮａｖ１．７チャネルの標準化ピーク電流振幅（ランダウン補正済み）を表す。Ｎａｖ１．７電流は、抗体（２５μｇ／ｍｌ）の存在下で低下するが、０．１Ｈｚでのチャネルの反復活性化が維持される場合だけである。プロトコールの終了時点（及び抗体のインキュベーション後）でのみのＮａｖ１．７チャネルの刺激は、Ｎａｖ１．７電流の阻害を生じない。データは、９８３モノクローナル抗体による特異的阻害が、Ｎａｖ１．７チャネルタンパク質の反復活性化（チャネルサイクリング）を必要とすることを示唆している。
【０３０９】
後根神経節インビトロ試験
初代培養調製
生後１日から３日の間の１〜２匹の野生型ラットの子から後根神経節を単離した。神経節を、切開後、ＰＢＳ中で洗浄し、すぐに、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ２６７４）を含むＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１２−６０４Ｆ）溶液中へ置き、酵素消化のために３７℃で約４５分間、インキュベートした。コラゲナーゼ溶液を除去し、１０％ウシ胎児血清（Ｌｏｎｚａ、＃ＤＥ１４８０２Ｆ）、０．５ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１７−６０５Ｅ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、＃ＢＥ１７−６０３Ｅ）、及び２０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加したＤＭＥＭと交換した。その後、神経節を機械的に粉砕し、１０００ｇで５分間、遠心分離し、同じ培地中に再懸濁した。分離された細胞を数え、５０μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ）及び３０μｇ／ｍｌのラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でプレコーティングされたカバーガラス上で１００，０００〜１２０，０００細胞／ｍｌの懸濁液まで希釈し、使える状態になるまで、３７℃、５％ＣＯ２で、インキュベートした。
【０３１０】
初代培養電気生理学
調製から２日間以内のインビトロでの培養（ＤＩＶ）後、分離したＤＲＧを、使用のために採取した。Ｉｋｅｇａｍｉ  ＩＣＤ−４２Ｂ  ＣＣＤカメラを有するＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０ＷＩ正立顕微鏡で細胞を可視化した。５ｋｈｚデジタルサンプリングを用いて、電気生理学的記録が得られ、Ａｘｏｐａｔｃｈ  １Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）増幅器において３ｄＢ、３ｋｈｚ周波数でフィルターにかけられ、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａアナログ−デジタルコンバータ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてデジタル信号へ変換された。ｐＣｌａｍｐ  １０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、全ての記録が得られ、続いて、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  １０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において解析された。Ｓｕｔｔｅｒ  ｐ−９７水平ピペットプーラーでホウケイ酸ガラスピペットから記録電極を引き抜いて、４．５〜６ＭΩの最終抵抗にし、以下を含む（ｍＭ）内部溶液で満たした：１４０Ｋ−メタンスルホネート、５  ＮａＣｌ、１  ＣａＣｌ２、２  ＭｇＣｌ２、１１  ＥＧＴＡ、１０  ＨＥＰＥＳ、２  Ｍｇ−ＡＴＰ、及び１  Ｌｉ−ＧＴＰ；ｐＨをＴｒｉｓ−ｂａｓｅで７．２に調整し、重量オスモル濃度をスクロースで３１０ｍＯｓｍに調整した。バス溶液は以下を含んだ（ｍＭ）：１３０  ＮａＣｌ、２５  グルコース、１０  ＨＥＰＥＳ、４  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、１．２５  ＮａＰＯ４；ｐＨをＮａＯＨで７．３５に調整し、重量オスモル濃度をスクロースで３１０ｍＯｓｍに調整した。液間電位は、１４．２ｍＶであると計算され、全ての報告された電位は、補償するように補正されている。
電位クランプモードにおける陽圧の解除及び手動吸引による密封（＞１ＧΩ）の形成後、容量性電流を補償し、コマンド電位を−７０ｍＶに設定した。細胞膜を破り、細胞が細胞内溶液を５分間、透析するようにさせた。透析後、ホールセルパラメータを記録した。ホールセルキャパシタンスが＞３５ｐＦであり、又は電極抵抗の３倍未満の安定したアクセス抵抗が達成され得ない場合には、細胞を棄却した。増幅器を電流クランプモードへ切り換え、静止膜電位を記録した。その後、活動電位（ＡＰ）又は一続きのＡＰを誘発することを意図された、一連の１．５秒の持続時間の、増加性振幅の脱分極電流ステップを細胞に注入した。最大−３５ｍＶへの脱分極後の単一のステップ中、１つより多いＡＰを誘起することができなかった細胞を棄却した。
その後、細胞を対照溶液か又は抗体溶液かのいずれかで、記録チャンバーを十分満たすように、９０秒間、記録される細胞上へ直接的に高速バス灌流を行うことにより、処理し、その記録チャンバーが十分満たされた時点で、灌流と吸引の両方を停止した。前の一連の脱分極電流ステップを、４０分間にわたって、２分間隔で、典型的には、個々のステップ間に１．５秒の遅延を入れて、繰り返し与え、膜再分極を可能にした。たまに、静止膜電位（ＲＭＰ）が、実験経過中、−６５ｍＶの一定ＲＭＰを維持するために調整されている場合には、定電流を注入した。実験経過中、ＲＭＰがプラス方向かマイナス方向かのいずれかに２０％より多く偏向し、又は保持電流が１００ｐＡより多く変化した細胞を、棄却した。各ステップについての個々の保持電流及び注入電流、加えて、実験経過中、変化したいかなる電気生理学的パラメータも、各細胞について個々に書き留めた。
【０３１１】
データ解析
各脱分極ステップについて活動電位（ＡＰ）を手作業で数え、誘発ＡＰの総数を各時点について合計した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３において、各時点におけるＡＰの数を、時間＝０における誘発ＡＰの数に対して標準化し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアを用いて時間の関数としてプロットした。それぞれのプロットされたデータ点は、特定化された実験条件下での全ての記録された細胞の平均値を表し、誤差バーは計算された標準誤差を表す。
図３Ａ：処理前（時間＝０）及び処理後（時間＝３０分目）の代表的なＤＲＧニューロンからの誘発活動電位の電流クランプトレース。
時間＝２分目での抗体投与後、媒体又は対照抗体で処理された対照と比較した電位。
図３Ｂ：抗体９８３（２５μｇ／ｍｌ）は、時間＝２分目での抗体投与後、媒体又は対照抗体で処理された対照と比較して、誘発活動電位の数を有意に低下させた。
【０３１２】
図３Ｃ：培養ラット後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおける活動電位誘起に関する電気生理学（電流クランプ記録）研究。２５μｇ／ｍｌの用量での１０８０モノクローナル抗体は、ＤＲＧニューロンの電気的に誘導されるスパイク頻度を低下させる。データ点は、抗体適用前の時間０において観察された最初の頻度と比較した、標準化スパイク頻度を表す。
【表７】
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【０３１３】
ペプチド結合ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ９６ウェルプレートを、カーボネートコーティング緩衝液中５ｕｇ／ｍｌストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ０１６−０００−１１４）の１００ｕｌ／ウェルにおいて４℃で一晩、コーティングした。プレートを、ＰＢＳ／ツイーン中で４回、洗浄し、室温で１時間、２００ｕｌ／ウェルのブロッキング溶液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を加えた。プレートを、ＰＢＳ／ツイーン中で４回、洗浄し、室温で１時間、１００ｕｌ／ウェルの５ｕｇ／ｍｌビオチン化ペプチドを加えた。プレートを、ＰＢＳ／ツイーン中で４回、洗浄し、室温で１時間、１００ｕｌ／ウェルの抗体を加えた（プレートに沿って、１０ｕｇ／ｍｌから始まり、ブロッキング溶液中３．１６倍系列で希釈していく）。プレートを、ＰＢＳ／ツイーン中で４回、洗浄し、室温で１時間、１００ｕｌ／ｍｌのヤギ抗ウサギＦｃ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  １１１−０３６−０４６）を加えた。プレートを、ＰＢＳ／ツイーン中で４回、洗浄し、１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加えた。５０ｕｌ／ウェルのＮａＦを加えて、反応を停止させ、吸光度を６３０ｎｍで読み取った。
図３Ｇは、抗体９８３の様々な環状Ｎａｖイオンチャネルペプチド表４への結合についてのＥＬＩＳＡデータを示す。
図３Ｈは、抗体１０８０の様々な環状Ｎａｖイオンチャネルペプチド表４への結合についてのＥＬＩＳＡデータを示す。
両方の場合における特異的結合は、Ｂ１１．７ペプチドについてのみ観察され、その他のＮａｖイオンチャネル由来の等価のループへの結合は観察されなかった。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【配列表】
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