(57)【要約】  ＮＥＫ６（ＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ６）遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤又は線維症治療剤を開示する。
2019022257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤。
【請求項２】
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む線維症治療剤。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群より選ばれる二本鎖核酸分子。
（ａ）５’末端に配列番号１に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号６に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
（ｂ）５’末端に配列番号２に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号７に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｃ）５’末端に配列番号３に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号８に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｄ）５’末端に配列番号４に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号９に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｅ）５’末端に配列番号５に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端に配列番号１０に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
【請求項４】
さらにガイド鎖（アンチセンス鎖）及び／又はパッセンジャー鎖（センス鎖）の３‘末端に１〜１１塩基のリボヌクレオチド残基及び／又はデオキシリボヌクレオチド残基が付加され、突出端を形成している、請求項３記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５】
請求項３又は４に示されたパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端とガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造からなるリンカーを介して連結され、あるいは、請求項３又は４に示されたガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端とパッセンジャー鎖（センス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造からなるリンカーを介して連結されたヘアピン型ＲＮＡ構造を形成している一本鎖核酸分子。
【請求項６】
配列番号１〜５から選ばれるＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含む、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の一本鎖核酸分子：
（Ａ）  領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）を含む又はのみからなり、
５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）の順で配置され、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
かつ前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む；
（Ｂ）領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、領域（Ｘ）、領域（Ｙ）、リンカー領域（Ｌｙ）及び領域（Ｙｃ）を、５’側から３’側にかけてこの順序で含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成し、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｙｃ）が、前記領域（Ｙ）と相補的であり、
かつ前記リンカー領域（Ｌｘ）及び／又はリンカー領域（Ｌｙ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を含む。
【請求項７】
前記リンカー領域（Ｌｘ）及び／又は（Ｌｙ）が、下記式（Ｉ）で表わされる、請求項６記載の一本鎖核酸分子。
【化１】
2019022257.tif 000011
前記式中、
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５又はＣ−６に結合する水素原子又は置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
ｌは、１又は２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−又はＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
前記領域（Ｙｃ）及び前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−又はＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１及びＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記構造（Ｉ)である。
【請求項８】
Ｘ又はＺが、配列番号１１〜２５からなる群より選ばれる配列を含む、請求項６又は７記載の一本鎖核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸分子及び当該核酸分子を有効成分とする医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、過剰なコラーゲンの蓄積により臓器機能が障害を受け、不可逆的に進行する疾患であり、例えば、その発症臓器としては皮膚、肺、肝臓、膵臓、腎臓、骨髄などが知られている。肺の線維症の一種である特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、人口１０万人当たり２０人程度の患者数と罹患率は高くはないものの、診断確定後の平均生存期間が２．５〜５年と治療後の経過はよくないため、日本において難病指定されている。【０００３】
ＩＰＦ治療薬としては、これまでにピルフェニドン、ニンテダニブが日本国厚生労働省より承認を受け上市されている。いずれの薬剤も肺活量低下抑制と無増悪期間延長作用を示し、病態の進行を遅延させるものの、治療効果としては十分満足できるものとはいえず、新たなメカニズムに基づく治療薬の開発が望まれている。【０００４】
一方、本発明の標的である「ＮＥＫ６タンパク質」は、細胞分裂の制御に関わるＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙの１つとして知られるが、医薬品開発の研究対象としてはこれまであまり着目されていない。２００２年に癌の創薬標的としての可能性が報告されるが、ＮＥＫ６タンパク質がＳＭＡＤ２／３タンパク質と相互作用すること、組織の線維化を促進することについて具体的な報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００９７４４１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ブレオマイシン誘発肺線維症モデルを用いた解析から、ＮＥＫ６（ＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ６）のｍＲＮＡレベルの亢進が見られることに着目し研究を進めた結果、ＮＥＫ６がＴＧＦ−β下流で線維化に寄与するＳＭＡＤ系シグナルを制御することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕  ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤；
〔２〕  ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む線維症治療剤；
〔３〕  肺線維症、肝線維症又は腎線維症を治療対象とする、〔２〕の治療剤；
〔４〕  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）からなる群より選ばれる二本鎖核酸分子。
（ａ）５’末端に配列番号１に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号６に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
（ｂ）５’末端に配列番号２に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号７に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｃ）５’末端に配列番号３に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号８に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｄ）５’末端に配列番号４に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号９に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｅ）５’末端に配列番号５に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号１０に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子；
〔５〕  さらにガイド鎖（アンチセンス鎖）及び／又はパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端に１〜１１塩基のリボヌクレオチド残基及び／又はデオキシヌクレオチド残基が付加され、突出端を形成している、〔４〕の二本鎖核酸分子；
〔６〕  〔４〕又は〔５〕に示されたパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端とガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結され、あるいは、〔４〕又は〔５〕に示されたガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端とパッセンジャー鎖（センス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結されたヘアピン型ＲＮＡ構造を形成している一本鎖核酸分子；
〔７〕  配列番号１〜５から選ばれるＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含む、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の一本鎖核酸分子：
（Ａ）  領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）を含む又はのみからなり、
５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）の順で配置され、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
かつ前記領域（Ｘ）が、上記発現抑制配列を含む；
（Ｂ）領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、領域（Ｘ）、領域（Ｙ）、リンカー領域（Ｌｙ）及び領域（Ｙｃ）を、５’側から３’側にかけてこの順序で含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成し、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｙｃ）が、前記領域（Ｙ）と相補的であり、
かつ前記リンカー領域（Ｌｘ）及び／又はリンカー領域（Ｌｙ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域（Ｚ）が、上記発現抑制配列を含む。
〔８〕  前記リンカー領域（Ｌｘ）及び／又は（Ｌｙ）が、下記式（Ｉ）で表わされる、〔７〕の一本鎖核酸分子。
【化１】
2019022257.tif 000003
前記式中、
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５又はＣ−６に結合する水素原子又は置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
ｌは、１又は２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−又は−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
前記領域（Ｙｃ）及び前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−又は−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１及びＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記構造（Ｉ)である；
〔９〕  Ｘ又はＺが、配列番号１１〜２５からなる群より選ばれる配列を含む、〔７〕又は〔８〕の一本鎖核酸分子；
〔１０〕  ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を対象に投与することを含む、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を阻害する方法；
〔１１〕  ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を対象に投与することを含む、線維症を治療する方法；
〔１２〕  ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化の阻害に使用するＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸； 
〔１３〕  線維症治療に使用するＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸；
〔１４〕  ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の使用；及び
〔１５〕  線維症治療剤を製造するための、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の使用。
〔１６〕  ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸が、ＫＢ−００１〜０１１の発現抑制配列（下線部部分）を含む核酸である、〔１５〕の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＮＥＫ６のＣｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ領域の配列及び実施例７で作製したｓｓＰＮ分子の標的部位を示す図である。
【図２】図２は、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤の有効成分となる核酸分子の一例を示す模式図である。（ｓｓＰＮ分子）
【図３】図３は、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤の有効成分となる核酸分子の一例を示す模式図である。（ｓｓＰＮ分子又はｓｓＮｃ分子）
【図４】図４は、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤の有効成分となる核酸分子の一例を示す模式図である。（ｓｓＰＮ分子又はｓｓＮｃ分子）
【図５】図５は、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤の有効成分となる核酸分子の一例を示す模式図である。（ｓｓＮｃ分子）
【図６】図６は、ｓｉＲＮＡを導入した場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を示すグラフである。
【図７】図７ａは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。図７ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ２タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。
【図８】図８ａは、抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降の結果を表す。図８ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降の結果を表す。
【図９】図９は、Ｈｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質を反応させた場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を表す。
【図１０】図１０ａは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるウェスタンブロットの結果を表す。図１０ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるホタルルシフェラーゼの発光量を表す。
【図１１】図１１ａは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１１ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を表す。
【図１２】図１２ａは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１２ｂは、ＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を表す。
【図１３】図１３は、肝星細胞にＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡを導入した場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質（ｐＳＭＡＤ３）のウェスタンブロットの結果を表す。
【図１４】図１４は、肝星細胞に各種ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡを導入した場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質（ｐＳＭＡＤ３）のウェスタンブロットの結果を表す。
【図１５】図１５ａは、肝星細胞においてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６の転写量を表す。図１５ｂは、肝星細胞においてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎの転写量を表す。図１５ｃは、肝星細胞においてＮＥＫ６をノックダウンした場合のαＳＭＡ遺伝子の転写量を表す。
【図１６】図１６は、腎臓線維芽細胞においてＮＥＫ６をノックダウンした場合のリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を表す。
【図１７】図１７ａは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合の血清中ＧＰＴの測定結果を表す。図１７ｂは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合の血清中ＧＯＴの測定結果を表す。
【図１８】図１８は、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を表す。
【図１９】図１９ａは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を表す。図１９ｂは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図１９ｃは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ３ａ１遺伝子の転写量を表す。図１９ｄは、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＴｉｍｐ１遺伝子の転写量を表す。
【図２０】図２０ａは、ＢＤＬモデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＮＥＫ６遺伝子の転写量を表す。図２０ｂは、ＢＤＬモデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を表す。図２０ｃは、ＢＤＬモデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＣｏｌ３ａ１遺伝子の転写量を表す。図２０ｄは、ＢＤＬモデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合のＴｉｍｐ１遺伝子の転写量を表す。
【図２１】図２１は、ＣＣｌ４モデルにおいてＮＥＫ６をノックダウンした場合の肝臓の病理解析の結果を表す。図２１ａはＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群の結果を表す。図２１ｂはＣＣｌ４投与の溶媒投与群の結果を表す。図２１ｃはＣＣｌ４投与の核酸投与群の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いるものである。また、本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。本発明において、塩基数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する。
【００１２】
本発明は、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含むＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤及び当該核酸を有効成分として含む線維症治療剤を提供するものである。以下、本発明の内容について詳細に説明する。
【００１３】
（１）ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸
ＮＥＫ６タンパク質は、細胞分裂の制御に関わる１１個のＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙの１つであり、細胞周期のＭ期においてリン酸化（活性化）される。
【００１４】
本発明の標的であるＮＥＫ６遺伝子は、哺乳類由来の遺伝子であり、好ましくはヒト由来の遺伝子である。ヒト由来のＮＥＫ６遺伝子は、７種のバリアントが報告されているが、その中のアイソフォーム２のＣｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ領域の配列を図１に表す（配列番号５６）。
【００１５】
核酸分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制メカニズムは、特に制限されるものではなく、発現をダウンレギュレーションできるものであればよい。ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制は、ＮＥＫ６遺伝子からの転写産物の生成量の減少、ＮＥＫ６遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、又は前記翻訳産物の活性の減少等によって確認することができる。
【００１６】
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸としては、ＮＥＫ６ ｍＲＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＰＮ分子、ｓｓＮｃ分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイムなどがあげられる。
【００１７】
アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＰＮ分子、ｓｓＮｃ分子、リボザイムは、当業者であれば、上記のヒトＮＥＫ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて容易に取得することができる。好ましくは、ＮＥＫ６ アイソフォーム２のＣｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ領域の配列（配列番号５６）に基づいて作製した核酸である。
【００１８】
（２）ｓｉＲＮＡ
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を以下に説明する。
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と対合するガイド鎖（アンチセンス鎖）、ガイド鎖と二本鎖を形成しているパッセンジャー鎖（センス鎖）からなる核酸分子である。ｓｉＲＮＡは、細胞内においてＡｒｇｏｎａｕｔｅ（ＡＧＯ）タンパク質を中核とする ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）と呼ばれる複合体に取り込まれた後、センス鎖はＡＧＯにより分解され、ガイド鎖はＲＩＳＣに残る。ガイド鎖のシード領域（ガイド鎖の５’末端から２−８塩基の７塩基領域）は、標的配列を認識する上で重要な働きを有していると考えられており、オフターゲット効果を回避する目的から標的遺伝子に特異的なシード領域を選択することが好ましいとされている。したがって、本発明の有効成分である核酸のシード領域についてもＮＥＫ６遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。例えば、ＮＥＫ６遺伝子に相補的であって、且つ、ＮＥＫ７遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ ｄａｔａｂａｓｅ：ＮＭ＿１３３４９４．２）に相補的でない、あるいは、領域中１以上（例えば1〜３）の塩基がＮＥＫ７遺伝子に非相補的（ミスマッチ）である配列をシード領域として含む核酸を選択することがあげられる。また、全長配列についても、例えば、ＮＥＫ６遺伝子に対しては相補的であり、ＮＥＫ７遺伝子に対しては非相補的（ミスマッチ）な塩基を増加させる（例えば、４以上、好ましくは５〜７）ことは、オフターゲット効果を回避する上で有用である。ガイド鎖に含まれる発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５〜３０塩基であり、好ましくは、１９〜２５塩基であり、より好ましくは１９〜２３塩基であり、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
【００１９】
前記発現抑制配列は、３’側に、さらに付加配列を有することで突出端を形成してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜４塩基である。付加配列は、リボヌクレオチド残基でもデオキシリボヌクレオチド残基でもよい。
【００２０】
ガイド鎖の塩基数は、例えば、１９〜５０塩基であり、好ましくは１９〜３０塩基であり、より好ましくは、１９〜２５塩基であり、さらに好ましくは１９〜２３塩基であり、ことさら好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
【００２１】
パッセンジャー鎖の塩基数は、例えば、１９〜５０塩基であり、好ましくは１９〜３０塩基であり、より好ましくは、１９〜２５塩基であり、さらに好ましくは１９〜２３塩基であり、ことさら好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２１塩基である。
【００２２】
パッセンジャー鎖で、ガイド鎖と相補性を示す領域は、例えば、１９〜５０塩基であり、好ましくは１９〜３０塩基であり、より好ましくは、１９〜２５塩基であり、さらに好ましくは１９〜２３塩基である。前記領域は、３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜４塩基であり、付加配列は、リボヌクレオチド残基でもデオキシリボヌクレオチド残基でもよい。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖の相補性を示す領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
【００２３】
ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ６遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、ｓｉＳＮＩＰＥＲ（登録商標）、創薬・診断研究用ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）等のｓｉＲＮＡ配列設計システムに従って得ることができる。
【００２４】
ＮＥＫ６ｓｉＲＮＡは、ＮＥＫ６に特異的に作用するｓｉＲＮＡが好ましく、例えば以下のような二本鎖核酸をあげることができる。
（ａ）５’末端に配列番号１に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号６に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）から形成される二本鎖核酸分子
（ｂ）５’末端に配列番号２に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号７に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｃ）５’末端に配列番号３に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号８に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｄ）５’末端に配列番号４に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号９に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
（ｅ）５’末端に配列番号５に示される配列を含む塩基数１９〜３０のガイド鎖（アンチセンス鎖）と３’末端又は５’末端に配列番号１０に示される配列を含む塩基数１９〜３０のパッセンジャー鎖（センス鎖）とから形成される二本鎖核酸分子
【００２５】
【表１】
2019022257.tif 000004
【００２６】
また、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端とガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結され、あるいは、ガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端とパッセンジャー鎖（センス鎖）の５’末端が、ヌクレオチド残基からなるリンカー配列及び／又は非ヌクレオチド構造のリンカーを介して連結されたヘアピン型ＲＮＡ構造を形成している一本鎖核酸分子であってもよい。
【００２７】
前記ヌクレオチド残基からなるリンカー配列の長さは、特に制限されないが、例えば、前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー配列の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記リンカー配列の塩基数の具体例は、１〜１００塩基、２〜８０塩基、３〜５０塩基である。
【００２８】
前記非ヌクレオチド構造のリンカーの例としては、ヘキサエチレングリコールリンカー、ポリ−（オキシホスフィニコ−オキシ−１，３−プロパンジオール）リンカー、アリルリンカー、又はポリエチレングリコールリンカー等の化学リンカー、カルバメート構造を有するアミノリンカー等をあげることができる。前記非ヌクレオチド構造リンカーの長さは、特に制限されないが、例えば、前記パッセンジャー鎖と前記ガイド鎖とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。
【００２９】
（３）ｓｓＰＮ分子
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つとなるｓｓＰＮ分子について説明する。ｓｓＰＮ分子は、ＷＯ２０１２／０１７９１９に開示される生物学的安定性に優れた一本鎖ＲＮＡ核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
本発明の有効成分となるｓｓＰＮ分子は、ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有することを特徴とする。ｓｓＰＮ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
【００３０】
ｓｓＰＮ分子において、ＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。ＮＥＫ６ ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡ配列は、ＮＥＫ６遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、既存のｓｉＲＮＡ設計システムに従って得ることができ、ｓｓＰＮ分子においても、前記ｓｉＲＮＡの発現抑制配列を、ｓｓＰＮ分子の発現抑制配列として使用することができる。
【００３１】
前記発現抑制配列は、例えば、ＮＥＫ６遺伝子の標的領域に対して、８０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、ことさらに好ましくは９８％以上であり、特に好ましくは１００％である。
【００３２】
特に、ｓｉＲＮＡのシード領域に該当する部分については、ｓｉＲＮＡの場合と同様にＮＥＫ６遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。
【００３３】
ｓｓＰＮ分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制は、例えば、ＲＮＡ干渉が生じることによると推測されるが、このメカニズムにより限定されるものではない。本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。
【００３４】
ｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造と、前記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造との両方を有してもよい。
【００３５】
ｓｓＰＮ分子において、前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、５員環の２位の炭素（Ｃ−２）以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素及び窒素は、例えば、水素が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記プロリン骨格及びプロリノール骨格等は、例えば、生体内物質及びその還元体であるため、安全性にも優れる。
【００３６】
ｓｓＰＮ分子において、前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、６員環の２位の炭素（Ｃ−２）以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよい。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素及び窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記６員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。
【００３７】
前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含んでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
【００３８】
ｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【００３９】
【化２】
2019022257.tif 000005
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５又はＣ−６に結合する水素原子又は置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換れていなくてもよく、又は、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
ｌは、１又は２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−又は−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
ここで、Ｒ１及びＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記構造（Ｉ)である。
【００４０】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１及びＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【００４１】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳである。
【００４２】
前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１又は２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素又は硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型及びＤ型のいずれでもよい。
【００４３】
前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５又はＣ−６に結合する水素原子又は置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４、オキソ基（＝Ｏ）、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等である。
【００４４】
Ｒ４及びＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり、同一でも異なってもよい。Ｒ４及びＲ５としての置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
【００４５】
Ｒ４及びＲ５としての保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」    Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７３）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）及びトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基及びＴＥＭ基等があげられる。
【００４６】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子（例えば、１〜３個）が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【００４７】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子（例えば、１〜３個）が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【００４８】
Ｌ１のｎ及びＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎ及びｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎ及びｍは、例えば、製造コスト及び収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。なお、Ｌ１のｎ及びＬ２のｍは、それぞれのアルキレン鎖の炭素原子数であるが、Ｌ１又はＬ２のアルキレン鎖の一つ以上炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖である場合は、ｎ及びｍは、炭素原子数と置換された酸素原子数の合計数を意味する。
【００４９】
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基である。Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄの置換基及び保護基は、例えば、Ｒ４及びＲ５の置換基及び保護基と同様である。
【００５０】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ及びＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【００５１】
前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−又は−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。ここで、Ｒ１及びＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１及びＲ２が存在する場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基又は前記式（Ｉ）の構造である。Ｒ１及び／又はＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１及び／又はＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１及び／又はＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個又は４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１及びＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【００５２】
前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）と、−ＯＲ１−及び−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）が例示でき、下記式において、ｎ及びｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
【００５３】
【化３】
2019022257.tif 000006
【００５４】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍ及びｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４又は８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７又は８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３及びｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８及びｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８及びｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５及びｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１及びｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−８ａ）に示す。
【００５５】
【化４】
2019022257.tif 000007
【００５６】
ｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）と相補的である。このため、ｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）のみが折り返して前記領域（Ｘ）と二重鎖を形成してもよいし、さらに、他の領域において新たな二重鎖を形成してもよい。以下、前者のｓｓＰＮ分子、すなわち、二重鎖形成が１カ所である分子を「第１のｓｓＰＮ分子」といい、後者のｓｓＰＮ分子、すなわち、二重鎖形成が２カ所である分子を「第２のｓｓＰＮ分子」という。以下に、前記第１のｓｓＰＮ分子及び前記第２のｓｓＰＮ分子について、例示する。
【００５７】
（ｉ）第１のｓｓＰＮ分子
前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）及び前記リンカー領域（Ｌｘ）からなる分子である。
前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよいし、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよい。
【００５８】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列のみからなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
【００５９】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）の少なくとも一方に含まれる。前記第１のｓｓＰＮ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。後者の場合、前記第１のｓｓＰＮ分子は、例えば、ＮＥＫ６遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、ＮＥＫ６遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。前記第１のｓｓＰＮ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｘｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。
【００６０】
前記第１のｓｓＰＮ分子の一例を、図２の模式図に従って説明する。図２（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＰＮ分子について、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記ｓｓＰＮ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図２は、あくまでも、前記領域の連結順序及び二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００６１】
前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的であることを意味する。
【００６２】
また、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなり、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることを意味する。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００６３】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）又は（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ    ・・・（３）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２又は３、
より好ましくは１又は２        ・・・（１１）
Ｘ＝Ｘｃ    ・・・（５）
前記領域（Ｘ）及び／又は前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。
【００６４】
前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５〜３０塩基であり、好ましくは、１９〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基であり、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側及び／又は３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基である。
【００６５】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む場合、その下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基であり、さらに好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘ）の塩基数の具体例は、例えば、１９〜５０塩基であり、好ましくは、１９〜３０塩基、より好ましくは１９〜２５塩基、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。
【００６６】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基であり、さらに好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘｃ）の塩基数の具体例は、例えば、１９〜５０塩基であり、好ましくは、１９〜３０塩基、より好ましくは１９〜２５塩基、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２１塩基である。
【００６７】
前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド残基の他に、前記ヌクレオチド残基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数の具体例は、１〜１００塩基、２〜８０塩基、３〜５０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【００６８】
前記第１のｓｓＰＮ分子の全長は、特に制限されない。前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは４４塩基であり、さらに好ましくは４８塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第１のｓｓＰＮ分子の全長の塩基数の合計の具体例は、３８〜３００塩基、４２〜２００塩基、４４〜１５０塩基、４８〜１００塩基、４８〜８０塩基である。前記第１のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、さらに好ましくは４４ 塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計の具体例は、３８〜３００塩基、４２〜２００塩基、４２〜１５０塩基、４４〜１００塩基、４４〜８０塩基である。
【００６９】
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する第１のｓｓＰＮ分子の具体例として、以下の一本鎖核酸分子をあげることができる。
ＫＢ−００１
５’−ＧＡＧＧＧＡＧＵＵＣＣＡＡＣＡＡＣＣＵＣＵＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＡＧＡＧＧＵＵＧＵＵＧＧＡＡＣＵＣＣＣＵＣＣＡ−３’（配列番号３１）
ＫＢ−００２
５’−ＣＧＡＧＧＣＡＧＧＡＣＵＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＣＣＵＵＧＡＣＡＣＡＧＵＣＣＵＧＣＣＵＣＧＣＣ−３’（配列番号３２）
ＫＢ−００３
５’−ＣＧＵＧＧＡＧＣＡＣＡＵＧＣＡＵＵＣＡＣＧＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＣＧＵＧＡＡＵＧＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＡＣＧＧＣ−３’（配列番号３３）
ＫＢ−００４
５’−ＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＵＣＣＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣ−３’（配列番号３４）
ＫＢ−００５
５’−ＣＡＧＡＧＡＣＣＵＧＡＣＡＵＣＧＧＡＵＡＣＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＧＵＡＵＣＣＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＣＵＣＵＧＧＵ−３’（配列番号３５）
ＫＢ−００６
５’−ＧＧＡＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣＣＡＵ−３’（配列番号４６）
ＫＢ−００７
５’−ＣＵＡＵＧＧＡＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡ−３’（配列番号４７）
ＫＢ−００８
５’−ＧＣＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＡＡＡＧＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＣＵＵＵＵＣＧＡＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＧＣＣＡ−３’（配列番号４８）
ＫＢ−００９
５’−ＣＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＵＣＵＵＵＵＣＧＡＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＧＣＣ−３’（配列番号４９）
ＫＢ−０１０
５’−ＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＣＵＵＣＵＵＵＵＣＧＡＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＧ−３’（配列番号５０）
ＫＢ−０１１
５’−ＧＡＣＵＣＧＵＵＵＡＵＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＧＵＵＧＵＣＵＵＣＧＡＵＡＡＡＣＧＡＧＵＣＣＡ−３’（配列番号６１）
【００７０】
式中、Ｌｘは、リンカー領域Ｌｘであり、下記構造式のＬ−プロリンジアミドアミダイトを示す。
【００７１】
【化５】
2019022257.tif 000008
【００７２】
また、好ましい第１のｓｓＰＮ分子としては、配列番号１〜５から選ばれるＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する配列を含み、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）及び領域（Ｘｃ）のみからなり、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘ）の順で配置され、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
かつ前記領域（Ｘ）が、上記発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子をあげることができる。
【００７３】
さらに好ましくは、前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）の全領域又は部分領域に完全に相補的な上記一本鎖核酸である。特に好ましくは、前記領域（Ｘ） が、配列番号１１〜２５からなる群より選ばれる配列を含む上記一本鎖核酸分子である。
【００７４】
【表２】
2019022257.tif 000009
【００７５】
（ｉｉ）第２のｓｓＰＮ分子
前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記領域（Ｘｃ）の他に、さらに、領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙ）に相補的な領域（Ｙｃ）を有する分子である。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成している。なお、特に示さない限り、前記第２のｓｓＰＮ分子は、前記第１のｓｓＰＮ分子の記載を援用できる。
【００７６】
前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、５’側領域（Ｘｃ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部５’側領域（Ｘ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部３’領域（Ｙ）、前記領域（Ｙｃ）を、３’側領域（Ｙｃ）ともいう。また、前記第２のｓｓＰＮ分子は、例えば、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、３’側領域（Ｘｃ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部３’側領域（Ｘ）、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部５’領域（Ｙ）、前記領域（Ｙｃ）を、５’側領域（Ｙｃ）ともいう。
【００７７】
前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）が連結して構成される」と定義するものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが、前記ｓｓＰＮ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【００７８】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
【００７９】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｙ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
【００８０】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とから形成される前記内部領域（Ｚ）及び前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一つに含まれ、さらに、前記領域（Ｙｃ）に含まれてもよい。好ましくは、前記内部領域（Ｚ）に前記発現抑制配列が含まれるｓｓＰＮ分子である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を有する場合、例えば、前記領域（Ｘ）及び前記領域（Ｙ）のいずれに前記発現抑制配列を有してもよく、また、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列を有してもよい。前記第２のｓｓＰＮ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００８１】
前記第２のｓｓＰＮ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）及び前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方でもよいし、前記内部領域（Ｚ）及び前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方と、さらに他の異なる領域であってもよい。
【００８２】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結等があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態等があげられる。
【００８３】
前記第２のｓｓＰＮ分子が前記リンカー領域（Ｌｙ）を有する場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記ヌクレオチド残基からなるリンカーでもよいし、前述した、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有するリンカーでもよい。後者の場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）で表わすことができ、前記リンカー領域（Ｌｘ）における前記式（Ｉ）の説明を全て援用できる。
【００８４】
前記領域（Ｙｃ）及び前記領域（Ｙ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−又は−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合する。ここで、Ｒ１及びＲ２は、前述のリンカー領域（Ｌｘ）と同様に、存在しても存在しなくてもよい。
【００８５】
前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）及び前記（Ｙ）と、前記−ＯＲ１−及び−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００８６】
前記第２のｓｓＰＮ分子について、前記リンカー領域（Ｌｙ）を有するｓｓＰＮ分子の一例を、図３の模式図に従って説明する。図３（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＰＮ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図３（Ｂ）は、前記ｓｓＰＮ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図３（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域及び前記Ｌｙ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図３は、あくまでも、各領域の連結順番及び二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域の形状等は、これに制限されない。また、図３は、前記領域（Ｘｃ）を５’側に示したが、これには制限されず、前記領域（Ｘｃ）が、３’側に位置してもよい。
【００８７】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されない。各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００８８】
前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である。なお、これには制限されず、例えば、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００８９】
また、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００９０】
前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である。なお、これには制限されず、例えば、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００９１】
また、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、前記領域（Ｙｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【００９２】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）及び前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）との関係は、例えば、下記式（１）及び（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ          ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ      ・・・（２）
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たす。
Ｘ＝Ｙ    ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ    ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ    ・・・（２１）
第２のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）及び（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ    ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ    ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）及び（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ    ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ    ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）及び（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ    ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ    ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）及び（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ    ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ    ・・・（１０）
【００９３】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）及び（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３又は４、
より好ましくは１、２又は３    ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０    ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）及び（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０    ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３又は４、
より好ましくは１、２又は３    ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）及び（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２又は３、
より好ましくは１又は２    ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２又は３、
より好ましくは１又は２    ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）及び（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０    ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０    ・・・（１８）
【００９４】
前記（ａ）〜（ｄ）の第２のｓｓＰＮ分子について、それぞれの構造の一例を、図４の模式図に従って説明する。図４は、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＰＮであり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＰＮ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＰＮ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＰＮ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＰＮ分子の例である。図４において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図４のｓｓＰＮ分子は、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」と表わしたが、これには制限されず、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図４は、あくまでも前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との関係、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状、リンカー領域（Ｌｙ）の有無等は、これには制限されない。
【００９５】
前記（ａ）〜（ｃ）のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）、及び、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントしない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントしない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図４において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＰＮ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【００９６】
他方、前記(ｄ)のｓｓＰＮ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＰＮ分子において、前記領域（Ｘｃ）の５’末端と前記領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【００９７】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙｃ）、及び前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数及びその位置に応じて、適宜決定できる。
【００９８】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９〜５０塩基、２０〜４０塩基、２１〜３０塩基、２１〜２５塩基である。
【００９９】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５〜３０塩基であり、好ましくは、１９〜２５塩基であり、より好ましくは１９〜２３塩基であり、さらに好ましくは、２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側及び／又は３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基であり、ことさらに好ましくは１〜３塩基である。
【０１００】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜４９塩基であり、好ましくは１〜３９塩基であり、より好ましくは１〜２９塩基である。 前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜４９塩基であり、好ましくは１〜３９塩基であり、より好ましくは１〜２９塩基である。前記領域（Ｘｃ）及び（Ｙｃ）のいずれか一方の塩基数は、１〜４塩基であることが好ましく、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【０１０１】
前記内部領域（Ｚ）、前記領域（Ｘｃ）及び前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、又は、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２又は３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）におけるフリーの領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【０１０２】
前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前述の通りである。前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。前記リンカー領域（Ｌｙ）は、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【０１０３】
前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）と同じでもよいし、異なってもよい。
【０１０４】
前記第２のｓｓＰＮ分子の全長は、特に制限されない。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは４４塩基であり、さらに好ましくは４８塩基であり、特に好ましくは５０塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第２のｓｓＰＮ分子の全長の塩基数の合計の具体例は、３８〜３００塩基、４２〜２００塩基、４４〜１５０塩基、４８〜１００塩基、５０〜８０塩基である。前記第２のｓｓＰＮ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及びリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは４４塩基であり、さらに好ましくは４８塩基であり、特に好ましくは５０塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、ことさらに好ましくは８０塩基であり、特に好ましくは６０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計の具体例は、３８〜３００塩基、４２〜２００塩基、４４〜１５０塩基、４８〜１００塩基、４８〜８０塩基、５０〜６０塩基である。
【０１０５】
ｓｓＰＮ分子は、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記非ヌクレオチド構造を有していればよく、その他の構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基及び修飾された修飾ヌクレオチド残基等があげられる。ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【０１０６】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）及び前記領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチドと前記ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、下記（４）〜（７）の残基で構成される。
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
【０１０７】
前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基及び前記非ヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
【０１０８】
ｓｓＰＮ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。ｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基及び前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＰＮ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個である。ｓｓＰＮ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１又は２個である。
【０１０９】
ｓｓＰＮ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明のｓｓＰＮ分子は、例えば、「Ｐ−ｓｓＲＮＡ分子」ともいう。前記Ｐ−ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。前記Ｐ−ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基及び前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【０１１０】
前記Ｐ−ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記Ｐ−ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個である。
【０１１１】
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する好ましいｓｓＰＮ分子として、配列番号１〜５から選ばれるＮＥＫ６遺伝子の発現抑制配列を含み、領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、領域（Ｘ）、領域（Ｙ）、リンカー領域（Ｌｙ）及び領域（Ｙｃ）を、５’側から３’側にかけてこの順序で含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成し、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｙｃ）が、前記領域（Ｙ）と相補的であり、
かつ前記リンカー領域（Ｌｘ）及びリンカー領域（Ｌｙ）が、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域（Ｚ）が、上記発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子をあげることができる。
【０１１２】
（４）ｓｓＮｃ分子
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｓｓＮｃ分子を説明する。
ｓｓＮｃ分子は、ＷＯ２０１２／０５３６８に開示される一本鎖ＲＮＡ核酸分子を意味し、具体的には以下の通りである。
ｓｓＮｃ分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）及び３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）及び内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする。
【０１１３】
ｓｓＮｃ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）において、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が、直接的に連結されている。
【０１１４】
ｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である。このため、５’側において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能であり、また、３’側において、前記領域（Ｙｃ）が前記領域（Ｙ）に向かって折り返し、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
【０１１５】
ｓｓＮｃ分子は、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
【０１１６】
ｓｓＮｃ分子における前記発現抑制配列は、ｓｓＰＮ分子の説明を援用することができる。
【０１１７】
ｓｓＮｃ分子によるＮＥＫ６遺伝子の発現の抑制は、例えば、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに前記発現抑制配列を配置した構造をとることで、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡ干渉に類似する現象（ＲＮＡ干渉様の現象）が生じることによると推測される。なお、ｓｓＮｃ分子のメカニズムもｓｓＰＮ分子のメカニズム同様限定されるものではない。ｓｓＮｃ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、ｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
【０１１８】
ｓｓＮｃ分子において、前記発現抑制配列は、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに含まれる。ｓｓＮｃ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。後者の場合、ｓｓＮｃ分子は、例えば、ＮＥＫ６遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、ＮＥＫ６遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。ｓｓＮｃ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。
【０１１９】
前記内部領域（Ｚ）は、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成される」と表わすものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが、例えば、前記ｓｓＮｃ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【０１２０】
ｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、具体的には、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。ｓｓＮｃ分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域又はその部分領域に相補的な配列を有していればよく、具体的には、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域又はその部分領域に対して相補的な配列を含む、又は、前記相補的な配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域又は相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基又は２塩基である。
【０１２１】
ｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している形態があげられる。
【０１２２】
ｓｓＮｃ分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態があげられる。
【０１２３】
ｓｓＮｃ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有してもよいし、いずれか一方を有してもよい。後者の場合として、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有さない、つまり、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが直接連結された形態があげられる。また、後者の場合として、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有さない、つまり、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが直接連結された形態があげられる。
【０１２４】
前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）は、それぞれ、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【０１２５】
ｓｓＮｃ分子について、前記リンカー領域を有さないｓｓＮｃ分子の一例を、図５の模式図に従って説明する。図５（Ａ）は、前記ｓｓＮｃ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図５（Ｂ）は、前記ｓｓＮｃ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図５（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＮｃ分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）が折り返し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間で二重鎖が形成され、前記３’側領域（Ｙｃ）が折り返し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間で二重鎖が形成される。図５は、あくまでも、各領域の連結順番及び二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【０１２６】
ｓｓＮｃ分子について、前記リンカー領域を有するｓｓＮｃ分子の一例を、図３の模式図に従って説明する。図３（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＮｃ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図３（Ｂ）は、前記ｓｓＮｃ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図３（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＮｃ分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域及び前記Ｌｙ領域が、ループ構造をとる。図３は、あくまでも、各領域の連結順番及び二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【０１２７】
ｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部５’側領域（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されず、例えば、以下の通りである。
前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【０１２８】
また、前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることが好ましい。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、５’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【０１２９】
前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【０１３０】
また、前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることが好ましい。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、３’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【０１３１】
ｓｓＮｃ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）及び前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）及び前記５’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）との関係は、例えば、下記式（１）及び（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ        ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ    ・・・（２）
【０１３２】
ｓｓＮｃ分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の長さの関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たしてもよい。
Ｘ＝Ｙ    ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ    ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ    ・・・（２１）
【０１３３】
ｓｓＮｃ分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）及び（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ    ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ    ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）及び（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ    ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ    ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）及び（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ    ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ    ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）及び（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ    ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ    ・・・（１０）
【０１３４】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）及び（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３又は４、
より好ましくは１、２又は３    ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０        ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）及び（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０        ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３又は４、
より好ましくは１、２又は３    ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）及び（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２又は３、
より好ましくは１又は２    ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２又は３、
より好ましくは１又は２    ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）及び（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０                ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０                ・・・（１８）
【０１３５】
前記（ａ）〜（ｄ）のｓｓＮｃ分子について、それぞれの構造の一例を、図４の模式図に従って説明する。図４は、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＮｃであり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＮｃ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＮｃ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＮｃ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＮｃ分子の例である。図４において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図４のｓｓＮｃ分子は、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」として表わすが、これには制限されず、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図４は、あくまでも、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）との関係、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状等は、これには制限されず、また、リンカー領域（Ｌｘ）及びリンカー領域（Ｌｙ）の有無も、これには制限されない。
【０１３６】
前記（ａ）〜（ｃ）のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）、及び、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントできない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントできない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図４において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【０１３７】
他方、前記(ｄ)のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の５’末端と前記３’側領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【０１３８】
前記５’側領域（Ｘｃ）、前記３’側領域（Ｙｃ）、及び前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数（Ｆ）及びその位置に応じて、適宜決定できる。
【０１３９】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９〜５０塩基、２０〜４０塩基、２１〜３０塩基、２１〜２３塩基である。
【０１４０】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１５〜３０塩基であり、好ましくは、１９〜２５塩基であり、より好ましくは１９〜２３塩基であり、さらに好ましくは２１、２２、２３塩基であり、特に好ましくは２３塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側及び／又は３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基であり、ことさらに好ましくは１〜３塩基である。
【０１４１】
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜４９塩基であり、好ましくは１〜３９塩基であり、より好ましくは１〜２９塩基である。前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜４９塩基であり、好ましくは１〜３９塩基であり、より好ましくは１〜２９塩基である。前記５’側領域（Ｘｃ）及び３’側領域（Ｙｃ）のいずれか一方の塩基数は、１〜４塩基であることが好ましく、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【０１４２】
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、又は、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２又は３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【０１４３】
ｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）のそれぞれの塩基数は、同じであっても異なってもよく、また、その塩基配列も、同じであっても異なってもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【０１４４】
ｓｓＮｃ分子の全長は、特に制限されない。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、ことさらに好ましくは８０塩基であり、特に好ましくは６０塩基である。前記ｓｓＮｃ分子の全長の塩基数の合計の具体例は、３８〜３００塩基、４２〜２００塩基、５０〜１５０塩基、５１〜１００塩基、５２〜８０塩基である。ｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及びリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、ことさらに好ましくは８０塩基であり、特に好ましくは６０塩基である。前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計の具体例は、３８〜３００塩基、４２〜２００塩基、５０〜１５０塩基、５１〜１００塩基、５２〜８０塩基、５２〜６０塩基である。
【０１４５】
ｓｓＮｃ分子の主要構成単位である前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基及び修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。ｓｓＮｃ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【０１４６】
ｓｓＮｃ分子において、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）及び前記３’側領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
【０１４７】
ｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基及び前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基及び非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基
【０１４８】
ｓｓＮｃ分子が、前記リンカー領域（Ｌｘ）及び前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有する場合、例えば、両方の構成単位が同じでもよいし、異なってもよい。具体例として、例えば、両方のリンカー領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基である形態、両方のリンカー領域の構成単位が前記非ヌクレオチド残基である形態、一方の領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基であり、他方のリンカー領域の構成単位が非ヌクレオチド残基である形態等があげられる。
【０１４９】
ｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基及び前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＮｃ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個である。ｓｓＮｃ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜８個、１〜６個、１〜４個、１、２又は３個である。
【０１５０】
ｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、「Ｎ−ｓｓＲＮＡ分子」ともいう。前記Ｎ−ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子があげられる。前記Ｎ−ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基及び前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【０１５１】
前記Ｎ−ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。前記Ｎ−ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個である。
【０１５２】
（５）ｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子の合成方法
ｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法等があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法及びＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。また、本発明のｓｓＰＮ分子及びｓｓＮｃ分子は、ＷＯ２０１２／０５３６８、ＷＯ２０１２／１７９１９、ＷＯ２０１３／２７８４３、ＷＯ２０１６／１５９３７４に記載の製造方法に従って製造することができる。
【０１５３】
（６）アンチセンスポリヌクレオチド
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるアンチセンスポリヌクレオチドについて以下に説明する。
アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡ及び／又はアンチセンスＲＮＡであり、標的とする遺伝子ＲＮＡの全長もしくは一部に対するアンチセンス核酸を細胞内に導入することで効果を発揮する。
アンチセンスポリヌクレオチドの発現阻害のメカニズムとしては、
１）ｍＲＮＡの５’キャップ部位から開始コドンの約２５塩基下流までの領域を標的配列とする翻訳開始複合体の立体的阻害
２）標的ｍＲＮＡと相補的な一本鎖ＤＮＡであり、ＲＮａｓｅＨを介したｍＲＮＡ分解
３）ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエキソンとイントロンの境界領域を標的配列とするスプライシング阻害（ｍＲＮＡの成熟阻害）
があげられるが、ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制するものであれば、そのメカニズムは特に制限されるものではない。
【０１５４】
アンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡとの結合安定性（Ｔｍ値など）、ミスマッチ配列認識能、ヌクレアーゼ耐性、ＲＮａｓｅＨ活性等の点から修飾ヌクレオチド残基を含むことが好ましい。
【０１５５】
修飾ヌクレオチド残基としては、リボース残基、リン酸骨格への修飾が好ましい。
【０１５６】
（７）ｍｉＲＮＡ
ＮＥＫ６遺伝子の発現を抑制する核酸の１つであるｍｉＲＮＡについて以下に説明する。
【０１５７】
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の阻害又はｍＲＮＡの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、細胞内に存在する短鎖（２０−２５塩基）のノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、まず、ＤＮＡから、ｍｉＲＮＡとその相補鎖とを含みヘアピンループ構造を取ることが可能な一本鎖のｐｒｉ−ＲＮＡとして転写される。次にｐｒｉ−ＲＮＡは、核内にあるＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって一部が切断されｐｒｅ−ＲＮＡとなって核外に輸送される。その後、ｐｒｅ−ＲＮＡはさらにＤｉｃｅｒによって切断されることにより、ｍｉＲＮＡとして機能する。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域へ不完全なハイブリダイゼーション結合を行い、そのｍＲＮＡがコードするタンパク質合成を阻害する。
【０１５８】
ＮＥＫ６の遺伝子発現を抑制するｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の遺伝子名又はｍＲＮＡ配列情報に基づいて、例えば、ｍｉＲＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｄｂ．ｏｒｇ／ｍｉＲＤＢ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）等のデータベースに従って得ることができる。
【０１５９】
（８）核酸に使用されるヌクレオチド残基
本発明の有効成分である核酸に使用されるヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）を有する。
【０１６０】
前記ヌクレオチド残基は、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基等があげられる。前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一又は実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一又は実質的に同一である。
【０１６１】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加及び／又は欠失、前記構成要素における原子及び／又は官能基の置換、付加及び／又は欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。
【０１６２】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素又はフルオロ等に置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０１６３】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基及び／又は非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０１６４】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、又は、前記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０１６５】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）及びＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基又はアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０１６６】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）及びＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、及びＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明のｓｓＰＮ分子の５’末端ヌクレオチド残基及び３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０１６７】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基及びメチレンメチルイミノ基を含む。
【０１６８】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。
【０１６９】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基又は前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、又は、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加又は置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、又はこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加又は置換することもできる。
【０１７０】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、及びモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬及びフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３又は６が好ましい。
【０１７１】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０１７２】
核酸分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基又はリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化又は非メチル化、７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸及び三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０１７３】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０１７４】
前記塩基は、例えば、アデニン及びグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基等があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシル及び５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシン及び６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化及び他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリン及びピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ  ジェー  アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、及びイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０１７５】
（９）その他の用語の定義
本発明の有効成分である核酸、リンカー等の説明にて使用される用語は、当該技術分野での通常用いられるものであり、例えば、以下のように示すことができる。
【０１７６】
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状又は分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６又は１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
【０１７７】
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状又は分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個又は複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
【０１７８】
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状又は分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個又は複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個又は複数の二重結合を有してもよい。
【０１７９】
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基及び多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチル及び２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
【０１８０】
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基及び縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）又はフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
【０１８１】
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
【０１８２】
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル及びビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
【０１８３】
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
【０１８４】
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基及びスピロ炭化水素基も含む。
【０１８５】
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、及びナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」又は「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、例えば、ヒドロキシメチル及び２−ヒドロキシエチル等があげられる。
【０１８６】
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、及びｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
【０１８７】
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
【０１８８】
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチル及びキノリン−３−イルメチル等があげられる。
【０１８９】
本発明において、「シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリール及びシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
【０１９０】
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、及びプロピレン等があげられる。
【０１９１】
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、スルファモイル、オキソ等があげられる。
【０１９２】
（１０）ＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤
ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害とは、ＴＧＦ−β刺激により促進されるＳＭＡＤ２及び／又はＳＭＡＤ３のリン酸化が阻害（制御）されることを意味する。
ＳＭＡＤ２／３は、ＴＧＦ−βＩ型レセプターによってリン酸化を受けるＲ−ＳＭＡＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＳＭＡＤ）の１種であり、ＴＧＦ−βによる刺激後、リン酸化（活性化）されたＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３は、Ｃｏ−ＳＭＡＤ（ｃｏｍｍｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ ＳＭＡＤ）であるＳＭＡＤ４とともに核内へ移行する。実施例４に示すように、本発明者らは、ＮＥＫ６タンパク質が、細胞内でＳＭＡＤ２／３タンパク質と相互作用し、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化を促進することを見出した。リン酸化されたＳＭＡＤ２／３タンパク質はＳＭＡＤタンパク質複合体形成し、核内に移行し、α―ＳＭＡ、α２−コラーゲン、インターフェロンβ、インターロイキン−５、ＶＥＧＦ等の転写を亢進する。
【０１９３】
したがって、本発明のＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化阻害剤によってＳＭＡＤシグナル系を阻害することで、α―ＳＭＡ、α２−コラーゲン、インターフェロンβ等の転写制御が可能となり、ひいては創傷治癒過程における、線維芽細胞、肝星細胞等の筋線維芽細胞への分化抑制、線維芽細胞等によるマトリックス合成の制御、炎症・免疫反応の調節等に有用であることが理解できる。
【０１９４】
（１１）線維症治療剤
本発明の線維症治療剤は、肝線維症、肝硬変、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アルコール性肝疾患、原発性硬化性胆菅炎、ヘモクロマトーシス、ウイルソン病、α１−アンチトリプシン欠損症、非ウイルス性鬱血性肝硬変、薬剤性肝障害、膵炎、膵線維症、網膜線維症、声帯瘢痕化、声帯粘膜線維症、喉頭線維症、肺線維症、間質性肺炎、特発性肺線維症、非特異性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、剥離性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺炎、急性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、サルコイドーシス、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、リンパ脈管筋腫症、肺胞蛋白症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、肺ランゲルハンス細胞組織球症、鉄肺症、アミロイドーシス、肺胞微石症、過敏性肺炎、じん肺、感染性肺疾患、薬剤性肺炎、放射線肺炎、嚢胞性線維症、骨髄線維症、腎線維症、慢性腎不全、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、悪性腎硬化症、多発性嚢胞腎、薬剤性腎障害、後腹膜線維症、膠原病、強皮症、先天性角化不全症、腎性全身性線維症の他、気道の線維化、腸管の線維化、膀胱の線維化、前立腺の線維化、皮膚の線維化を含む広く線維化に関する疾患に対する治療剤である。好ましくは、肝線維症、肝硬変、肺線維症、間質性肺炎、腎線維症、慢性腎不全である。
【０１９５】
本発明の線維症治療剤の投与方法は、特に制限されるものではないが、吸入、静注、経皮投与などの非経口投与であることが好ましい。本発明の治療方法における本発明の核酸分子の投与量は、前記疾患の治療上有効な量であれば特に制限されず、疾患の種類、重症度、齢、体重、投与経路等によって異なるが、通常、成人１回あたり約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．００５〜約５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。当該量を、例えば、１日３回〜１ヶ月に１回、好ましくは１日〜１週間に１回の間隔で投与することができる。本発明の線維症治療剤は、通常、薬学的に許容される担体とともに適当な医薬組成物として製剤化されて経口又は非経口の形で投与される。
【０１９６】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。また、特に記載しない限り、ヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に使用した培地は、１０％  ＦＣＳ含有Ｆ−１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ社）であり、ヒト初代肝星細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）に使用した培地は、２％  ＦＣＳ、１％  Ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳｔｅＣＧＳ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）含有ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）である。
【実施例】
【０１９７】
実施例１：  ｓｉＲＮＡを用いたＮＥＫ６のノックダウン
ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、或いはＳｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  ｓｉＲＮＡ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％  ＦＣＳ含有Ｆ−１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ社）から０．１％  ＢＳＡ含有Ｆ−１２Ｋ培地に交換した。トランスフェクションから７２時間後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ  ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによるＮＥＫ６遺伝子の転写量に対する影響を調べた。ＮＥＫ６遺伝子の転写量は、ＮＥＫ６  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００２０５２２１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ  Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。１８ｓ  Ｐｒｏｂｅは下記のカスタム合成１８ｓ  ＭＧＢ  Ｐｒｏｂｅ、カスタム合成１８ｓ  Ｐｒｉｍｅｒ１、カスタム合成１８ｓ  Ｐｒｉｍｅｒ２を、それぞれ０．２μＭ、０．４μＭ、０．４μＭとなるように混合し、リアルタイムＰＣＲを行った。【０１９８】
カスタム合成１８ｓ  ＭＧＢ  Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
５’−ＡＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号５７）
カスタム合成１８ｓ  Ｐｒｉｍｅｒ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’−ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号５８）
カスタム合成１８ｓ  Ｐｒｉｍｅｒ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）：
５’−ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ−３’（配列番号５９）【０１９９】
ｓｉＲＮＡの配列は、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（配列番号５１〜５４を等量混合）及びＳｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  ｓｉＲＮＡ（配列番号５５）を使用した。【０２００】
＜ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ＞
ｓｉＮＥＫ６：５’−ＣＵＧＵＣＣＵＣＧＧＣＣＵＡＵＣＵＵＣ−３’（配列番号５１）
ｓｉＮＥＫ６：５’−ＵＡＵＵＵＧＧＧＵＧＧＵＵＣＡＧＵＵＧ−３’（配列番号５２）
ｓｉＮＥＫ６：５’−ＣＡＡＣＵＣＣＡＧＣＡＣＡＡＵＧＵＵＣ−３’（配列番号５３）
ｓｉＮＥＫ６：５’−ＵＡＣＵＵＧＡＵＣＡＵＣＵＧＣＧＡＧＡ−３’（配列番号５４）
＜Ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  ｓｉＲＮＡ＞
ｓｉＮＥＫ６：５’−ＡＡＧＵＡＣＵＵＣＣＡＵＡＣＵＧＵＣＣＵＣＵＣＣ−３’（配列番号５５）【０２０１】
図６ａにＮＥＫ６に対するＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡが導入された場合のＮＥＫ６のリアルタイムＰＣＲの結果を、図６ｂにＮＥＫ６に対するＳｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  ｓｉＲＮＡが導入された場合のＮＥＫ６のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡの導入は、ＮＥＫ６遺伝子の転写量を抑制した。したがって、用いられたＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡは、効率的に標的遺伝子の発現を抑制したことが示された。【０２０２】
実施例２：  ＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤ２／３タンパク質リン酸化に対する影響
ＮＥＫ６タンパク質がＴＧＦ−βシグナルを制御する可能性を検討するため、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ２／３の量を解析した。【０２０３】
ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）又はＳｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％  ＦＣＳ含有Ｆ−１２Ｋ培地から０．１％  ＢＳＡ含有Ｆ−１２Ｋ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を終濃度５ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。ＴＧＦ−β添加２時間後、細胞を２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，６Ｍ  Ｕｒｅａ，１２％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社），１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）］で溶解し、細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液にβ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＳＭＡＤ２／３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗β−Ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）によりウェスタンブロッティングを行った。【０２０４】
図７ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ−βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。この時、総ＳＭＡＤ３タンパク質の量は変化しなかった。また、図７ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ２タンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ−βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ２の量が減少した。この時、総ＳＭＡＤ２タンパク質の量は変化しなかった。【０２０５】
したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。【０２０６】
実施例３：  ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質との細胞内における相互作用
ＮＥＫ６タンパク質が細胞内でＳＭＡＤ３と相互作用してＳＭＡＤ３をリン酸化しているかを検討するため、共免疫沈降を行った。【０２０７】
ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６がクローニングされた発現ベクター（ｐＥＺ−Ｍ０２  Ｎｅｋ６，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）とＦＬＡＧタグで標識されたヒトＳＭＡＤ３がクローニングされた発現ベクター（ｐＥＺ−Ｍ１１  Ｆｌａｇ−ｈＳｍａｄ３，ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）を、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培地を交換した。トランスフェクション４８時間後、溶解バッファー（１７５ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６，０．１％  ＮＰ４０，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０，１．４ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１％  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）で細胞を回収し、遠心分離によって上清を得た。上清にＴｒｕｅＢｌｏｔ  Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＩＰ  Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）を添加し、遠心分離を行い、非特異的な結合を除去した。そこから得られた上清にコントロールとしてｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、もしくは抗ＮＥＫ６抗体を加え、オーバーナイト４℃にてインキュベートした後に、ＴｒｕｅＢｌｏｔ  Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＩＰ  Ｂｅａｄｓを加え４時間、４℃にてインキュベートした。遠心分離を行って上清を除いた後に、ＴｒｕｅＢｌｏｔ  Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＩＰ  Ｂｅａｄｓを溶解バッファーで洗浄して非特異的な結合を除去した。２×ＳＤＳ  ＰＡＧＥ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，５０ｍＭ  ＤＴＴ）をＴｒｕｅＢｌｏｔ  Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＩＰ  Ｂｅａｄｓに添加して９５℃で５分間加熱し、上清に含まれる共免疫沈降物を回収した。抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降物に対して抗ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が共沈降されるかを検出した。【０２０８】
図８ａに、抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が検出された。【０２０９】
ＳＭＡＤ３タンパク質がＮＥＫ６と細胞内で相互作用しリン酸化されているかを解析するため、ヒトＮＥＫ６発現ベクターとＦＬＡＧタグで標識されたヒトＳＭＡＤ３発現ベクターをＬＬ２９細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に培地を交換した。トランスフェクション４８時間後、溶解バッファー（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６，０．１％  ＮＰ４０，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０，１．４ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１％  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）で細胞を回収し、遠心分離によって上清を得た。得られた上清にＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加し、４℃にてオーバーナイトでインキュベートした。その後、遠心分離を行い、上清を除いた。Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌを溶解バッファーで洗浄して非特異的な結合を除去した。２×ＳＤＳ  ＰＡＧＥ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，５０ｍＭ  ＤＴＴ）をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌに添加して９５℃で４分間加熱し、上清に含まれる共免疫沈降物を回収した。得られた共免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさに基づいて分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌによる共免疫沈降物に対しては抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、抗ＮＥＫ６抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＮＥＫ６タンパク質とリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質が共沈降されるかを検出した。【０２１０】
図８ｂに、抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＮＥＫ６タンパク質とＦＬＡＧ−ＳＭＡＤ３タンパク質が検出された。また、ヒトＮＥＫ６の発現ベクターのトランスフェクションによって、リン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質の量が上昇した。【０２１１】
抗ＮＥＫ６抗体による共免疫沈降物中にＳＭＡＤ３タンパク質が検出されたこと、及び逆に抗ＦＬＡＧ抗体による共免疫沈降物中にＮＥＫ６が検出されたことから、ＮＥＫ６タンパク質とＳＭＡＤ３タンパク質が細胞内で相互作用して複合体を形成することが示された。更に、ヒトＮＥＫ６の発現ベクターのトランスフェクションによってリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質の量が上昇したことから、ＮＥＫ６タンパク質はＳＭＡＤ３タンパク質を細胞内でリン酸化することが示された。【０２１２】
実施例４：  ＮＥＫ６タンパク質によるＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化
ＮＥＫ６タンパク質がＳＭＡＤ３タンパク質を基質として直接リン酸化している可能性を、ＮＥＫ６とＳＭＡＤ３の精製タンパク質を用いて検討した。【０２１３】
Ｈｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質（ｅｕｒｏｆｉｎｓ社）とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を反応溶媒（１５０μＭ  ＡＴＰ，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）と混合し、３０°Ｃにて４５分間インキュベートした。５％  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及び０．０２５％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ  を含む２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを、反応液に等量添加して反応を停止させた後に、９５℃で５分加熱し、サンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、反応液に含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体によりウェスタンブロッティングを行った。【０２１４】
図９にＨｉｓ融合ＮＥＫ６タンパク質とＧＳＴ融合ＳＭＡＤ３タンパク質を反応させた場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６タンパク質を用いることで、リン酸化ＳＭＡＤ３の量が上昇した。したがって、ＮＥＫ６タンパク質はＳＭＡＤ３タンパク質を基質として直接リン酸化することが示された。【０２１５】
実施例５：  ＮＥＫ６のノックダウンによるＳＭＡＤタンパク質複合体の転写活性に対する影響
ＮＥＫ６タンパク質が、ＳＭＡＤタンパク質複合体の核内移行後におこる転写活性も制御しているかを検討するため、ＳＭＡＤタンパク質複合体のＤＮＡ結合配列とルシフェラーゼ遺伝子を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。また、同時に調製したＬＬ２９細胞を用いてウェスタンブロッティングを実施し、ＮＥＫ６のノックダウンについて確認した。【０２１６】
ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡである  ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション２４時間後、培地を１０％  ＦＣＳ含有Ｆ−１２Ｋ培地から０．４％  ＦＣＳ含有Ｆ−１２Ｋ培地に交換した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション４８時間後、ＳＭＡＤタンパク質複合体のＤＮＡ結合配列［ＳＭＡＤ  ｂｉｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＢＥ）］とホタルルシフェラーゼ遺伝子がクローニングされた発現ベクター（ｐＴＬ−ＳＢＥ−ｌｕｃ：５’−ＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号６０），Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）と野生型ウミシイタケルシフェラーゼを含むレポーターアッセイ補正用のベクター（ｐＲＬ−ＴＫ：Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ｗｉｔｈ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクションした。発現ベクターのトランスフェクション２時間後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質を終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。ＴＧＦ−β添加２４時間後において、細胞を２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，６Ｍ  Ｕｒｅａ，１２％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解した。得られた細胞抽出液に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。また、上記と同様に調製したＬＬ２９細胞をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に順じて回収し、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼによる発光を測定した。ホタルルシフェラーゼの発光量をウミシイタケルシフェラーゼによる発光量で補正した。【０２１７】
図１０ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるウェスタンブロットの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少している事が示されたが、ＳＭＡＤ３タンパク質の量は変化しなかった。図１０ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合における、ウミシイタケルシフェラーゼで補正したホタルルシフェラーゼの発光量を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＴＧＦ−βによって上昇するホタルルシフェラーゼの発光量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤタンパク質複合体の転写活性が抑制されることが示された。【０２１８】
実施例６：  ＮＥＫ６のノックダウンによる線維症関連遺伝子の転写量に対する影響
ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して治療的効果を示すことを検討するため、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。【０２１９】
ＩＰＦ患者の肺から樹立されたヒト肺線維芽細胞株ＬＬ２９細胞にヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％  ＦＣＳ含有Ｆ−１２Ｋ培地から０．１％  ＢＳＡ含有Ｆ−１２Ｋ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質を終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。トランスフェクション７２時間後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ  ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによる遺伝子の転写量に対する影響を検出した。Ｃｏｌ１ａ１遺伝子とαＳＭＡ遺伝子の転写量は、Ｃｏｌ１ａ１  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００１６４００４＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、又はαＳＭＡ  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００４２６８３５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ  Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。【０２２０】
図１１ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＣｏｌ１ａ１の転写量、図１１ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＴＧＦ−βによって上昇するＣｏｌ１ａ１、αＳＭＡ、遺伝子の転写量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維症に対して治療的効果を示すことが示された。【０２２１】
実施例７：  一本鎖核酸分子の合成
以下に示す核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ３９００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により合成した。固相担体としてＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）を用い、ＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いた固相合成を行った。固相担体からの切り出し及びリン酸基保護基の脱保護、塩基保護基の脱保護、２’−水酸基保護基の脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。【０２２２】
本発明の下記一本鎖核酸分子において、Ｌｘは、リンカー領域Ｌｘであり、下記構造式のＬ−プロリンジアミドアミダイトを示す。【０２２３】
【化６】
2019022257.tif 000010
【０２２４】
また、下記一本鎖核酸分子中の下線部は、ＮＥＫ６の遺伝子発現抑制配列である。
ＫＢ−００１
５’−ＧＡＧＧＧＡＧＵＵＣＣＡＡＣＡＡＣＣＵＣＵＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＡＧＡＧＧＵＵＧＵＵＧＧＡＡＣＵＣＣＣＵＣＣＡ−３’（配列番号３１）
ＫＢ−００２
５’−ＣＧＡＧＧＣＡＧＧＡＣＵＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＣＣＵＵＧＡＣＡＣＡＧＵＣＣＵＧＣＣＵＣＧＣＣ−３’（配列番号３２）
ＫＢ−００３
５’−ＣＧＵＧＧＡＧＣＡＣＡＵＧＣＡＵＵＣＡＣＧＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＣＧＵＧＡＡＵＧＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＡＣＧＧＣ−３’（配列番号３３）
ＫＢ−００４
５’−ＧＡＵＡＡＧＡＵＧＡＡＵＣＵＣＵＵＣＵＣＣＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＵＣＵＵＡＵＣＵＣ−３’（配列番号３４）
ＫＢ−００５
５’−ＣＡＧＡＧＡＣＣＵＧＡＣＡＵＣＧＧＡＵＡＣＣＣ−Ｌｘ−ＧＧＧＵＡＵＣＣＧＡＵＧＵＣＡＧＧＵＣＵＣＵＧＧＵ−３’（配列番号３５）【０２２５】
実施例８：  ｓｓＰＮ分子（一本鎖核酸分子）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
ＮＥＫ６に対して設計したｓｓＰＮ分子（一本鎖核酸分子）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価を実施した。各項目の測定方法は、上述のＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡとＳｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  ｓｉＲＮＡで行った方法（実施例１、２及び６）に従った。ＫＢ−００１〜００５のｓｓＰＮ核酸は全てＮＥＫ６の転写量を抑制し、標的遺伝子を効率的にノックダウンした。さらに、ＫＢ−００１〜００５のｓｓＰＮ核酸を作用させることにより、リン酸化ＳＭＡＤ３のタンパク質量の減少が確認された。【０２２６】
また、ＫＢ−００１とＫＢ−００３について線維化関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１及びαＳＭＡ）の転写量に及ぼす影響を調べた結果を図１２に示す。図１２ａにＫＢ−００１又はＫＢ−００３を作用させた場合におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子の転写量を、図１２ｂにＫＢ−００１又はＫＢ−００３を作用させた場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を示す。ＫＢ−００１及びＫＢ−００３のいずれのｓｓＰＮ分子も線維化関連遺伝子の転写量を抑制していることを確認した。これらの結果から、ＮＥＫ６に対して設計したｓｓＰＮ分子（一本鎖核酸分子）の線維化抑制作用を確認することができた。【０２２７】
実施例９：  ＮＥＫ６のｉｎ  ｖｉｖｏノックダウンによる抗線維化作用の検証
ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して治療的効果を示すことを確認するため、ブレオマイシン肺線維化モデルマウスに、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡを投与して抗線維化作用を解析する。【０２２８】
７週齢のＣｒｌ：ＣＤ１  （ＩＣＲ）マウス（日本チャールス・リバー社）に、０．４ｍｇ／ｋｇ体重の容量でブレオマイシン（日本化薬株式会社）を投与し、肺線維化モデルマウスを作製する。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡは、２日〜７日に１回の頻度で、５０ｍｇ／ｋｇ体重を最大容量として投与する。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡの投与期間中は、１週間に１回の頻度で実験動物用マイクロＣＴでの画像診断を行う。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡの初回投与から１４〜３０日目に解剖し、肺を摘出する。摘出した肺を用いた線維症関連遺伝子の転写量、線維症関連タンパク質の発現量の測定、病理学的解析等を行う。これらによって、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡ未投与群に比べて、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡ投与群で線維化が抑制されていることを確認することができ、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡの肺線維化モデルマウスでの抗線維化作用を示すことができる。【０２２９】
実施例１０：  肝星細胞におけるＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡのＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化に対する影響
肝星細胞においてＮＥＫ６タンパク質がＴＧＦ−βシグナルを制御する可能性を検討するため、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。【０２３０】
ヒトの肝臓より単離されたヒト初代肝星細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）をポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）コート細胞培養ディッシュ上にて５日間培養した。その後、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＫＢ−００４）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を２％  ＦＣＳ、１％  Ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳｔｅＣＧＳ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）含有ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）から０．２％  ＦＣＳ、１％  ＳｔｅＣＧＳ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ培地に交換した。トランスフェクション７２時間後、リポ多糖（ＬＰＳ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。ＬＰＳ添加１１時間半後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ−β添加３０分後、細胞を２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，６Ｍ  Ｕｒｅａ，１２％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ２％  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社），１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）］で溶解し、細胞抽出液とした。【０２３１】
得られた細胞抽出液にβ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び抗ＳＭＡＤ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗リン酸化ＳＭＡＤ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び抗ＳＭＡＤ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＮＥＫ６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）によりウェスタンブロッティングを行った。【０２３２】
図１３にＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質とリン酸化ＳＭＡＤ２タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ−βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３とリン酸化ＳＭＡＤ２の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質とＳＭＡＤ２タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。【０２３３】
実施例１１：  肝星細胞におけるＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＤ３リン酸化抑制作用
ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡもＴＧＦ−βシグナルを制御する可能性を検討するため、各ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。【０２３４】
ヒトの肝臓より単離されたヒト初代肝星細胞をＰＬＬコート細胞培養ディッシュ上にて５日間培養した。その後、ヒトＮＥＫ６に対する各種ｓｉＲＮＡ（ＫＢ−００６、ＫＢ−００４、ＫＢ−０１１、ＫＢ−００５、ＫＢ−０１０をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を２％  ＦＣＳ、１％  ＳｔｅＣＧＳ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ培地から０．２％  ＦＣＳ、１％  ＳｔｅＣＧＳ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ培地に交換した。トランスフェクション７２時間後、ＬＰＳを終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。ＬＰＳ添加１１時間半後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ−β添加３０分後、細胞を２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，６Ｍ  Ｕｒｅａ，１２％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解し、細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液にβ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎによりウェスタンブロッティングを行った。【０２３５】
図１４に各種ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡによりＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３のタンパク質のウェスタンブロッティング結果を示す。各種ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡの導入により、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ−βにより上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化が抑制されることが複数のＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡ配列を用いる事で示された。【０２３６】
実施例１２：  肝星細胞におけるＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡの線維症関連遺伝子に対する影響
ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞における線維症関連遺伝子の転写量を解析した。【０２３７】
ヒトの肝臓より単離されたヒト初代肝星細胞をＰＬＬコート細胞培養ディッシュ上にて５日間培養した。その後、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＫＢ−００４）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培地を２％  ＦＣＳ、１％  Ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ培地から０．２％  ＦＣＳ、１％  ＳｔｅＣＧＳ含有ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ培地に交換した。トランスフェクション７２時間後、ＬＰＳを終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように培地に添加した。ＬＰＳ添加１１時間半後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質を終濃度５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。ＴＧＦ−β添加２４時間後、ＫＢ−００４をトランスフェクションした細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ  ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＥＫ６のノックダウンによる遺伝子の転写量に対する影響を検出した。ＮＥＫ６遺伝子、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子とαＳＭＡ遺伝子の転写量は、ＮＥＫ６  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００２０５２２１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ０１５４９９７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値、又はαＳＭＡ  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＨＳ００４２６８３５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）での測定値を、１８ｓ  Ｐｒｏｂｅでの測定値で除することで算出した。【０２３８】
図１５ａにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＮＥＫ６の転写量、図１５ｂにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎの転写量、図１５ｃにＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるαＳＭＡ遺伝子の転写量を示す。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡにより、ＴＧＦ−βによって上昇するＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、αＳＭＡ遺伝子の転写量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。【０２３９】
実施例１３：  腎臓線維芽細胞におけるＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡのＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化に対する影響
ＮＥＫ６タンパク質がＴＧＦ−βシグナルを制御する可能性を検討するため、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞においてリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。【０２４０】
ラット腎線維芽細胞株ＮＲＫ−４９Ｆ細胞に、ヒトＮＥＫ６に対するｓｉＲＮＡ（ＫＢ−００４）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、培地を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地から０．１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクション４８時間後、ヒトＴＧＦ−βタンパク質を終濃度５  ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。添加後３０分或いは１時間後、細胞を２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，６Ｍ  Ｕｒｅａ，１２％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解し細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液にβ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した後に、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体（ａｂｃａｍ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。【０２４１】
図１６にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ−βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンによりＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化が抑制されることが示された。【０２４２】
実施例１４：  四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘発肝線維化モデルにおけるＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡの有効性評価
ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを確認するため、ＣＣｌ４モデルマウスに、ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡを静脈内投与して抗線維化作用を解析した。【０２４３】
７週齢雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、１０ｖ／ｖ％ＣＣｌ４含有オリーブ油溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）を、１０  ｍＬ／ｋｇ体重で０，４，７，１１日目に腹腔内投与し、肝線維化モデルマウスを作製した。ＣＣｌ４の初回投与前日の体重で群わけを実施し、群設定は、ＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群（ｎ＝５）、ＣＣｌ４投与の溶媒投与群（ｎ＝１０）、ＣＣｌ４投与の核酸投与群（ｎ＝１０）とした。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡとしてＫＢ−００４を、投与溶媒としてｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３．０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３．０の製品プロトコールに従い、０．３ｍｇ／ｍＬの核酸投与液を作製した。核酸投与群にはＫＢ−００４を含む核酸投与液を３ｍｇ／ｋｇ体重となるように尾静脈投与し、溶媒投与群には核酸投与群と等量の投与溶媒を、ＣＣｌ４の初回投与前日および病態誘発１０日目に尾静脈投与した。肝障害および線維化の評価は病態誘発１３日目で実施した（実施例１５、１６、１７及び１９）。【０２４４】
実施例１５：  ＣＣｌ４モデルでの肝障害マーカーの解析
線維化とは、細胞や組織の障害に対する過剰な創傷治癒過程だと理解されている。そのため、線維化と共に細胞や組織の障害を抑制することは、各種線維症の治療に有効であると考えられている。そこで、ＮＥＫ６のノックダウンが肝障害に対して効果を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおける肝障害マーカーの測定を行った。【０２４５】
病態誘発１３日目に尾静脈よりプレーンのキャピラリー採血管を用いて採血し、３０分以上静置した。静置後の血液を遠心分離し、血清を得た。トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて血清中グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）及びグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）を測定した。測定方法は試薬の説明書に従った。【０２４６】
図１７ａに血清中ＧＰＴの測定結果、図１７ｂに血清中ＧＯＴの測定結果を示した。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡを投与することで、ＣＣｌ４モデルで認められた血清中ＧＰＴ及びＧＯＴの上昇が抑制された。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは肝障害を抑制することが示された。【０２４７】
実施例１６：  ＣＣｌ４モデルでのＳＭＡＤ３タンパク質リン酸化の解析
ＮＥＫ６のノックダウンがＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化に対して効果を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおけるリン酸化ＳＭＡＤ３の量を解析した。【０２４８】
病態誘発１３日目に採取した肝臓を凍結後に粉砕し粉状にした。粉末状の肝臓へ溶解バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ４０，０．１％  ＳＤＳ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  Ｂｅｎｚｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，２％  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ，１％  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を加え、ハンディ超音波発生機を用いて臓器抽出液を調製した。臓器抽出液を遠心分離して得られた上清へβ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及びＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅをそれぞれ終濃度５％、０．０２５％となるように添加した。その後、９５℃で４分加熱してサンプルとした。得られたサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、サンプルに含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＳＭＡＤ３抗体（ａｂｃａｍ社）及び抗ＳＭＡＤ３抗体、抗ＮＥＫ６抗体（ａｂｃａｍ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体によりウェスタンブロッティングを行った。リン酸化ＳＭＡＤ３はトータルＳＭＡＤ３量により補正した。【０２４９】
図１８にＮＥＫ６をノックダウンした場合におけるリン酸化ＳＭＡＤ３タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＮＥＫ６のｓｉＲＮＡを用いることで、ＮＥＫ６のタンパク質の量が減少し、ＴＧＦ−βによって上昇するリン酸化ＳＭＡＤ３の量が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンはＣＣｌ４モデルの肝臓においてＳＭＡＤ３タンパク質のリン酸化を抑制することが示された。【０２５０】
実施例１７：  ＣＣｌ４モデルでの線維症関連遺伝子の解析
ＮＥＫ６のノックダウンが線維化に対して有効性を示すかを検討するため、ＣＣｌ４モデルにおける線維症関連遺伝子の転写量を解析した。【０２５１】
病態誘発１３日目に採取した肝臓からＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡを抽出した。続いて、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行った。ＴａｑＭａｎ  ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用いてＮＥＫ６  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００４８０７３０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び線維症関連遺伝子としてＣｏｌ１ａ１  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｏｌ３ａ１  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１２５４４７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｉｍｐ１    Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１３４１３６１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量を測定し、内部標準である１８ｓ  ｒＲＮＡ  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量との相対比を各遺伝子の転写量とした。  【０２５２】
ＣＣｌ４モデルにおける各遺伝子の転写量を図１９ａ〜ｄに示す。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡの投与によって、ＮＥＫ６遺伝子の転写量が低下した。このことから、用いられたＫＢ−００４は、効率的に標的遺伝子の転写を抑制したことが示された。この時、病態誘発によって誘導される線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｔｉｍｐ１）の転写量は有意に低下した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。【０２５３】
実施例１８：  胆管結紮誘発肝線維化（ＢＤＬ）モデルでの線維症関連遺伝子の解析
ＮＥＫ６のノックダウンが線維症に対して有効性を示すことを検討するため、胆管結紮誘発肝線維化モデルマウス（ＢＤＬモデル）にＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡを静脈内投与して線維症関連遺伝子の転写量を解析した。【０２５４】
９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を体重で群分けし、遺伝子導入試薬ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ３．０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の添付文書に従って調製したＫＢ−００４溶液（０．３ｍｇ／ｍＬ）を３ｍｇ／ｋｇ体重の用量で尾静脈内投与した（ｎ＝１２）。対照群には、溶媒のみを投与した（ｎ＝１５）。投与翌日、総胆管を２箇所結紮し、肝線維化モデルマウスを作製した。偽手術群は、生理食塩水（大塚生食注）を尾静脈内投与し、総胆管の剥離のみ行った（ｎ＝７）。胆管結紮１４日目に肝臓を採取し、上記と同様にしてＮＥＫ６  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００４８０７３０＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、及び線維症関連遺伝子としてＣｏｌ１ａ１  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｏｌ３ａ１  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１２５４４７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｉｍｐ１  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ０１３４１３６１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量を測定し、内部標準であるＧＡＰＤＨ  Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ（Ｍｍ９９９９９９５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の転写量との相対比を各遺伝子の転写量とした。【０２５５】
ＢＤＬモデルにおける各遺伝子転写量を図２０にａ〜ｄに示す。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡの投与によって、ＮＥＫ６遺伝子の転写量が低下した。このことから、用いられたＫＢ−００４は、効率的に標的遺伝子の転写を抑制したことが示された。この時、病態誘発によって誘導される線維症関連遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｔｉｍｐ１）の転写量は有意に低下した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンは線維化を抑制することが示された。【０２５６】
実施例１９：  ＣＣｌ４モデルでの病理解析
ＮＥＫ６のノックダウンがＣＣｌ４誘発肝線維化モデルに対して効果を示すかを検討するため、病理像の観察を行った。【０２５７】
病態誘発１３日目に肝臓の内側右葉を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液を用いて固定した。パラフィンで包埋した後に、組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。【０２５８】
図２１に病理像の代表例を示した。図２１ａはＣＣｌ４未投与の生理食塩水投与群の結果、図２１ｂはＣＣｌ４投与の溶媒投与群の結果、図２１ｃはＣＣｌ４投与の核酸投与群の結果を表す。図２１ｂ中に多く認められる空胞変性は細胞の障害を示し、中央部付近に多く存在する核が染色していない部分は細胞の壊死を示す。ＮＥＫ６  ｓｉＲＮＡを投与することで、ＣＣｌ４モデルの肝臓組織で認められた細胞の障害や壊死が減少した。したがって、ＮＥＫ６のノックダウンはＣＣｌ４誘発肝線維化モデルにおける病理像の変化を抑制することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２５９】
本発明により新規なＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化阻害剤及び線維症治療剤の提供が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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