【手続補正書】
【提出日】平成23年8月3日(2011.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに少なくとも約７０％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができるケトレダクターゼポリペプチドであって、Ｘ１４５に対応する残基にセリンを有する配列番号２または４または１４２に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含み、該ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、Ｘ１４５に対応する残基にセリンを有する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、次のもの：
Ｘ３に対応する残基が、アスパラギン、アスパラギン酸、またはチロシンである；
Ｘ７に対応する残基が、グリシン、ヒスチジン、セリン、またはアスパラギンである；
Ｘ１１に対応する残基が、イソロイシンまたはトレオニンである；
Ｘ１６に対応する残基が、トレオニン、アラニン、バリン、またはグリシンである；
Ｘ１９に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２３に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ４１に対応する残基が、セリン、アラニン、またはバリンである；
Ｘ４５に対応する残基が、グルタミン酸またはグリシンである；
Ｘ４９に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ５７に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ６０に対応する残基が、フェニルアラニン、バリン、またはトレオニンである；
Ｘ６４に対応する残基が、アラニン、セリン、またはトレオニンである；
Ｘ７２に対応する残基が、リジンまたはアルギニン、特にアルギニンである；
Ｘ８２に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、またはアルギニンである；
Ｘ９５に対応する残基が、バリンまたはアラニンである；
Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１０６に対応する残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸である；
Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニンまたはヒスチジンである；
Ｘ１１１に対応する残基が、ロイシンまたはメチオニンである；
Ｘ１１７に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ１２７に対応する残基が、グルタミンまたはアルギニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、またはセリンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、トレオニン、セリン、またはメチオニンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である；
Ｘ１６３に対応する残基が、バリンまたはイソロイシンである；
Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ１７７に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ１９２に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ２００に対応する残基が、プロリン、グルタミン酸、またはリジンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはグルタミンである；
Ｘ２０８に対応する残基が、グルタミン、ヒスチジン、またはアルギニンである；
Ｘ２１０に対応する残基が、トレオニンまたはアラニンである；
Ｘ２１１に対応する残基が、リジンまたはグルタミン酸である；
Ｘ２１４に対応する残基が、メチオニン、バリンまたはトレオニン、またはセリンである；
Ｘ２１７に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ２２３に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである、から選択される１つ以上の特徴を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記立体異性体過剰率が、少なくとも約９０％であり、例えば、該ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６、１２８、１３０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記立体異性体過剰率が、少なくとも約９８％であり、例えば、該ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、５０、５２、５４、５８、６２、６６、７０、７２、７６、７８、８０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４の野生型ポリペプチドよりも改善された率で３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに変換することができ、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、１２６、１３０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに少なくとも約９５％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができ、配列番号４の野生型ポリペプチドと比較して改善された活性および熱安定性を有し、配列番号６、８、１２、１４、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４２、４４、４６、５０、５２、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、および１３３から成る群より選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
宿主細胞における発現の指図に適する少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された、請求項７または８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１】
３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元または変換するために適する反応条件下で、３−ケトチオランと請求項１から６のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させることを含む、基質３−ケトチオランを生成物（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに立体選択的に還元するための方法。
【請求項１２】
３−ケトチオランが、
ａ）少なくとも約７０％の立体異性体過剰率で；または
ｂ）少なくとも約９０％の立体異性体過剰率で；または
ｃ）少なくとも約９８％の立体異性体過剰率で、
（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基質が少なくとも１００ｇ／Ｌであり、該基質の少なくとも９０％が２４時間未満で生成物に変換され、前記ケトレダクターゼポリペプチドが、約０．８〜１．０ｇ／Ｌであり、且つ、配列番号６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２６、１３０、および１３４から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記基質が少なくとも１００ｇ／Ｌであり、該基質の少なくとも９０％が２０時間未満で生成物に変換され、前記ケトレダクターゼポリペプチドが、約０．８〜１．０ｇ／Ｌであり、且つ、配列番号２６、４４、６８、および１０４から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
３−ケトチオランと請求項１に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを含む、組成物。
【請求項１６】
前記方法が、構造式（ＩＩＩ）
【化３−１】
2010536385.tif 000001
の抗生物質の合成のためのものである、請求項１１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
５．要旨
本開示は、３−ケトチオラン（本明細書では、以後、「基質」と呼ぶ）を（Ｒ）−３−ヒドロキシチオラン（本明細書では、以後、「生成物」と呼ぶ）に還元する能力を有するケトレダクターゼポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれらのペプチドの使用方法を提供する。一般に、本開示の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、定義したケト基質の対応するキラルアルコール生成物への変換に関して、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ（「Ｌ．ｋｅｆｉｒ」；配列番号４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（「Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ」；配列番号２）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ（「Ｌ．ｍｉｎｏｒ」；配列番号１４２）から得られる天然由来の野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して、改善された特性を有する。酵素活性の改善としては、立体選択性の増大、酵素活性の増大、熱安定性の増大、溶媒安定性の増大、還元産物阻害の増大、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに少なくとも約７０％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができるケトレダクターゼポリペプチド。
（項目２）
Ｘ１４５に対応する残基にセリンを有する配列番号２または４または１４２に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、そのケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基を有することを条件とする、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、Ｘ１４５に対応する残基にセリンを有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、次のもの：
Ｘ３に対応する残基が、極性、酸性、または芳香族残基である；
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ１１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２３に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ４１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ４５に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ４９に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ５７に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ６４に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ８２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、酸性、塩基性、または脂肪族残基である；
Ｘ１０６に対応する残基が、酸性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１１に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１２６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１２７に対応する残基が、極性または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族残基、非極性、または極性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１６３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ１７７に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ１９２に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、非極性、酸性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ２０８に対応する残基が、極性、拘束、または塩基性残基である；
Ｘ２１０に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；
Ｘ２１４に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ２１７に対応する残基が、芳香族、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ２２６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である、から選択される１つ以上の特徴を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、次のもの：
Ｘ３に対応する残基が、アスパラギン、アスパラギン酸、またはチロシンである；
Ｘ７に対応する残基が、グリシン、ヒスチジン、セリン、またはアスパラギンである；
Ｘ１１に対応する残基が、イソロイシンまたはトレオニンである；
Ｘ１６に対応する残基が、トレオニン、アラニン、バリン、またはグリシンである；
Ｘ１９に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２３に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ４１に対応する残基が、セリン、アラニン、またはバリンである；
Ｘ４５に対応する残基が、グルタミン酸またはグリシンである；
Ｘ４９に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ５７に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ６０に対応する残基が、フェニルアラニン、バリン、またはトレオニンである；
Ｘ６４に対応する残基が、アラニン、セリン、またはトレオニンである；
Ｘ７２に対応する残基が、リジンまたはアルギニン、特にアルギニンである；
Ｘ８２に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、またはアルギニンである；
Ｘ９５に対応する残基が、バリンまたはアラニンである；
Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１０６に対応する残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸である；
Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニンまたはヒスチジンである；
Ｘ１１１に対応する残基が、ロイシンまたはメチオニンである；
Ｘ１１７に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ１２７に対応する残基が、グルタミンまたはアルギニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、またはセリンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、トレオニン、セリン、またはメチオニンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である；
Ｘ１６３に対応する残基が、バリンまたはイソロイシンである；
Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ１７７に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ１９２に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ２００に対応する残基が、プロリン、グルタミン酸、またはリジンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはグルタミンである；
Ｘ２０８に対応する残基が、グルタミン、ヒスチジン、またはアルギニンである；
Ｘ２１０に対応する残基が、トレオニンまたはアラニンである；
Ｘ２１１に対応する残基が、リジンまたはグルタミン酸である；
Ｘ２１４に対応する残基が、メチオニン、バリンまたはトレオニン、またはセリンである；
Ｘ２１７に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ２２３に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである、から選択される１つ以上の特徴を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、次のもの：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である、から選択される特徴の１つ以上または少なくともすべてを有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を
必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または拘束残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２に記載のポリペプチド。
（項目２０）
残基Ｘ１４５に対応する残基がセリンである配列番号２または４または１４２に基づく参照配列の残基９０から２１１と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含むが、但し、該ポリペプチドの該ドメインのアミノ酸配列が、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基を有することを条件とする、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２１）
残基Ｘ１４５に対応する残基が、セリンである、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２２）
残基９０から２１１に対応するアミノ酸配列が、
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０６に対応する残基が、酸性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１１に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１２６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１２７に対応する残基が、極性または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族残基、非極性、または極性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１６３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ１７７に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ１９２に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、非極性、酸性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ２０８に対応する残基が、極性、拘束、または塩基性残基である；
Ｘ２１０に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性または酸性残基である、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基で、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２３）
残基９０から２１１に対応するアミノ酸配列が、
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、またはアルギニンである；
Ｘ９５に対応する残基が、バリンまたはアラニンである；
Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１０６に対応する残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸である；
Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニンまたはヒスチジンである；
Ｘ１１１に対応する残基が、ロイシンまたはメチオニンである；
Ｘ１１７に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ１２７に対応する残基が、グルタミンまたはアルギニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、またはセリンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、トレオニン、セリン、またはメチオニンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、アスパラギン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である；
Ｘ１６３に対応する残基が、バリンまたはイソロイシンである；
Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ１７７に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ１９２に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ２００に対応する残基が、プロリン、グルタミン酸、またはリジンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはグルタミンである；
Ｘ２０８に対応する残基が、グルタミン、ヒスチジン、またはアルギニンである；
Ｘ２１０に対応する残基が、トレオニンまたはアラニンである；
Ｘ２１１に対応する残基が、リジンまたはグルタミン酸である、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基で、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２４）
残基Ｘ７に対応する残基にセリンを有する配列番号２または４または１４２に基づく参照配列の残基１から８９と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記ドメインが、次のもの：
Ｘ３に対応する残基が、極性、酸性、または芳香族残基である；
Ｘ７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２３に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ４１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ５７に対応する残基が、脂肪族または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ８２に対応する残基が、非極性または極性残基である、から選択される１つ以上の特徴をさらに有し得；そして
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基での１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２６）
残基１から８９に対応するアミノ酸配列が、下記の、
Ｘ３に対応する残基が、アスパラギン、アスパラギン酸、またはチロシンである；
Ｘ７に対応する残基が、グリシン、セリン、またはアスパラギンである；
Ｘ１１に対応する残基が、イソロイシンまたはトレオニンである；
Ｘ１６に対応する残基が、トレオニン、アラニン、バリン、またはグリシンである；
Ｘ１９に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２３に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ４１に対応する残基が、セリン、アラニン、またはバリンである；
Ｘ４９に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ５７に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ６０に対応する残基が、フェニルアラニン、バリン、またはトレオニンである；
Ｘ７２に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；および
Ｘ８２に対応する残基が、グリシンまたはセリンである、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基での１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２７）
残基Ｘ２２３に対応する残基にバリンを有する配列番号２または４または１４２に基づく参照配列の残基２１２から２５２と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２８）
残基２１２から２５２に対応するアミノ酸配列が、下記の、
Ｘ２１４に対応する残基が、非極性、脂肪族または極性残基である；
Ｘ２１７に対応する残基が、芳香族、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ２２６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基２１２〜２５２に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基での１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２９）
残基２１２から２５２に対応するアミノ酸配列が、下記の、
Ｘ２１４に対応する残基が、メチオニン、バリン、トレオニン、またはセリンである；
Ｘ２１７に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ２２３に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基２１２〜２５２に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基での１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記立体異性体過剰率が、少なくとも約９０％である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３１）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６、１２８、１３０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、項目３１に記載のポリペプチド。
（項目３２）
前記立体異性体過剰率が、少なくとも約９８％である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３３）
配列番号６、８、１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、５０、５２、５４、５８、６２、６６、７０、７２、７６、７８、８０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、項目３２に記載のポリペプチド。
（項目３４）
配列番号４の野生型ポリペプチドよりも改善された率で３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに変換することができ、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、１２６、１３０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３５）
３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに少なくとも約９５％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができ、配列番号４の野生型ポリペプチドと比較して改善された活性および熱安定性を有し、配列番号６、８、１２、１４、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４２、４４、４６、５０、５２、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３６）
項目１から３５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目３７）
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、および１３３から成る群より選択される、項目３６に記載のポリヌクレオチド。
（項目３８）
宿主細胞における発現の指図に適する少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された、項目３６または３７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目３９）
前記制御配列が、プロモーターを含む、項目３８に記載の発現ベクター。
（項目４０）
前記プロモーターが、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターを含む、項目３９に記載の発現ベクター。
（項目４１）
前記制御配列が、分泌シグナルを含む、項目３８に記載の発現ベクター。
（項目４２）
項目３８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目４３）
Ｅ．ｃｏｌｉである、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４４）
前記発現ベクターを構成するコドンが、前記宿主細胞における発現のために最適化されている、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４５）
３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元または変換するために適する反応条件下で、３−ケトチオランと項目１から３６のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させることを含む、基質３−ケトチオランを生成物（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに立体選択的に還元するための方法。
（項目４６）
３−ケトチオランが、少なくとも約７０％の立体異性体過剰率で（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ケトレダクターゼポリペプチドを用いて、３−ケトチオランが、少なくとも約９０％の立体異性体過剰率で（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元される、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記３−ケトチオラーゼが、少なくとも約９８％の立体異性体過剰率で（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元される、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
前記基質が少なくとも１００ｇ／Ｌであり、該基質の少なくとも９０％が２４時間未満で生成物に変換され、前記ケトレダクターゼポリペプチドが、約０．８〜１．０ｇ／Ｌであり、且つ、配列番号６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２６、１３０、および１３４から成る群より選択される、項目４５に記載の方法。
（項目５０）
前記基質が少なくとも１００ｇ／Ｌであり、該基質の少なくとも９０％が２０時間未満で生成物に変換され、前記ケトレダクターゼポリペプチドが、約０．８〜１．０ｇ／Ｌであり、且つ、配列番号２６、４４、６８、および１０４から成る群より選択される、項目４５に記載の方法。
（項目５１）
約７．５以下のｐＨで行われる、項目４５に記載の方法。
（項目５２）
約５．０から約７．５のｐＨで行われる、項目４５に記載の方法。
（項目５３）
前記ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞、またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解産物を用いて行われる、項目４５に記載の方法。
（項目５４）
前記ケトレダクターゼが、単離および／または精製され、ならびに前記還元反応が、該ケトレダクターゼのための補因子および必要に応じて該補因子のための再生系の存在下で行われる、項目４５に記載の方法。
（項目５５）
前記補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルマート；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記第二級アルコールデヒドロゲナーゼが、ケトレダクターゼである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
構造式（Ｉ）の化合物と項目１に記載のケトレダクターゼとを含む、組成物。
（項目５８）
補因子再生系をさらに含む、項目５７に記載の組成物。
（項目５９）
前記補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルマート；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目５８に記載の組成物。