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　特願２００７−２００５８８「組織脂肪由来幹細胞および格子状物質」拒絶査定不服審判事件〔平成１９年１２月２７日出願公開、特開２００７−３３０２６６〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯・本願発明
　本願は、２００２年７月３１日（パリ条約による優先権主張２００１年９月１０日、米国）を国際出願日とする出願（特願２００３−５２７０５３号）をし、これを分割してその一部につき平成１９年８月１日に新たな特許出願をしたものであって、平成２０年５月８日付けで拒絶査定がなされ、これに対し、平成２０年８月１１日に拒絶査定に対する審判請求がなされたものである。そして，その請求項１に係る発明（以下，「本願発明」という。）は，以下のとおりのものである。
　
「【請求項１】STRO-1及びCD４９ｄを発現し、かつCD106の発現が検出不可能なレベルかまたは低レベルであることを特徴とする、単離された脂肪組織由来幹細胞（ADSC）。」
　
第２　引用例
　原査定の拒絶の理由に引用された，本願優先日前に頒布された刊行物である国際公開第００／５３７９５号（以下，「引用例」という。）には，
　「実施例１
　本実施例は成熟脂肪細胞を実質上含まないヒト脂肪由来幹細胞の単離を実証する。
　未精製の脂肪吸引液は待機手術を受ける患者から取得した。脂肪吸引処置の前に、血液による吸引液の汚染を最小化するために該患者にエピネフリンを投与した。該吸引液を濾して結合した脂肪組織片を結合した液体不要物から単離した。単離した組織を中性のリン酸緩衝食塩水で徹底的にすすいだ後、0.075%(w/v)コラゲナーゼで３７℃、約２０分間断続的に撹拌しながら酵素的に解離した。消化に続いて、コラゲナーゼを中和して、スラリーを約260gで約10分間遠心分離すると、多層の上澄み液と細胞のペレットとを生じた。上澄み液を除いてさらなる使用のために保管し、ペレットは赤血球溶解溶液中に再懸濁して約２５℃で約１０分間撹拌せずにインキュベートした。インキュベーションの後、培地を中和し、細胞を約250gで約10分間再び遠心分離した。２度目の遠心分離に続いて、細胞を懸濁し、生存度(トリパンブルー排除能を用いて)および細胞数を調べた。その後、細胞を約1x106細胞/100mmディッシュの密度でプレーティングした。それらをDMEM＋ウシ胎仔血清(約10%)中３７℃、約5%CO2中で培養した。
　細胞の大部分は付着性で、小さく、単核で、比較的無顆粒の線維芽細胞様の細胞であり、目に見える脂肪滴を含まなかった。大部分の細胞はオイルレッドＯおよびフォン・コッサで陰性に染色された。細胞はまた、HeLa細胞およびHN-12細胞を陽性のコントロールとして用いて、テロメラーゼ(市販のTRAP分析キットを使用)の発現についても調べられた。ヒト陰茎包皮線維芽細胞およびHN-12の加熱細胞抽出液を陰性のコントロールとして使用した。テロメリック(telomeric)生成物を12.5%ポリアクリルアミドゲル(cells)上で分離し、シグナルをホスホイメージングによって決定した。テロメラーゼ活性を表しているテロメリックラダーは、脂肪由来幹細胞において陽性のコントロールと同程度に観察された。陰性のコントロールではラダーは観察されなかった。
　従って、これらの細胞は筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、または血液細胞と同定できなかった。これらの結果は、以前にヒト幹細胞で報告されたのと同様に脂肪由来の細胞がテロメラーゼ活性を発現することを実証する。
　次いで、これらの細胞の部分集団を以下の培地に曝露しそれらの発生上の表現型を評価した:
　集団を軟骨発生培地中で数週間高密度培養した。組織培養およびパラフィン切片の組織学的分析は２、７、１４日目にHE、アルシアンブルー、トルデンブルー(toludene blue)、およびゴルドナーのトリクローム染色にて実施した。免疫組織化学をコンドロイチン-4-硫酸およびケラチン硫酸およびII型コラーゲンに対する抗体を使用して実施した。染色しているマトリックスの定性的評価もまた実施された。その結果、軟骨膜細胞の明確な境界を有する軟骨球状結節は、初期処理後４８時間程度の早さで形成されることが示された。未処理のコントロール細胞は軟骨原性分化の徴候を示さなかった。これらの結果は幹細胞が軟骨原性の発生上の表現型を有することを裏付けている。
　集団はコンフルエントに近い状態まで培養した後、脂肪生成培地に数週間曝露した。プレーティングから２週間後、および４週間後に、オイルレッドＯ染色後の相対不透明度の比色測定により集団を試験した。脂肪生成は２週間目に進行中であり、４週間目ではかなり進行していることが確認された(相対不透明度はそれぞれ1および5.3)。骨髄由来の幹細胞を陽性のコントロールとして用いたところ、これらの細胞はわずかに小さな脂肪分化能を示した(相対密度はそれぞれ0.7および2.8)。
　集団をコンフルエントに近い状態まで培養した後、骨発生培地に数週間曝露した。プレーティングから２週間後および４週間後に、フォン・コッサ染色後の相対不透明度の比色測定により集団を試験した。骨発生は２週間目に進行中であり、４週間目ではかなり進行していることが確認された(相対不透明度はそれぞれ1.1および7.3)。骨髄由来の幹細胞を陽性のコントロールとして用いたところ、これらの細胞はわずかに小さな骨生成能を示した(相対密度はそれぞれ0.2および6.6)。
　集団をコンフルエントに近い状態まで培養した後、筋発生培地に数週間曝露した。プレーティングから１、３、および６週間後に、多核細胞の評価と筋特異的な蛋白(MyoDおよびミオシン重鎖)の発現とによって集団を試験した。ヒト陰茎包皮線維芽細胞および骨格筋芽細胞をコントロールとして使用した。MyoDおよびミオシンを発現している細胞は、幹細胞集団では筋発生培地に曝露した後の全時点で見られ、そのような細胞の割合は３週間、６週間で増加した。多核細胞は６週間で観察された。対照的に、線維芽細胞はいかなる時点においてもこれらの特徴を全く示さなかった。
　これらの結果は成熟脂肪細胞を実質上含まないヒト脂肪由来の多分化能性幹細胞が単離されたことを実証するものである。」（１７頁１８行〜１９頁２２行）と記載され，
　「実施例３
　本実施例はヒト脂肪由来幹細胞のクローン集団の産生を実証する。
　実施例１に記載された方法に従って単離した細胞を約5,000細胞/100mmディッシュでプレーティングし、実施例１で示されたようにして数日間培養した。数回細胞分裂の後、いくつかのクローンをクローニングリングでピックアップし、４８ウェルプレート中のウェルに移した。これらの細胞を、週に二度培地を変えながら、それらが約80%〜約90%コンフルエントになるまで(２／３Ｆ12培地＋20%ウシ胎仔血清および１／３標準培地−実施例１で単離された細胞によって最初に条件付けられた−「クローニング培地」中37℃、約5%CO2中で)数週間培養した。その後、各々の培養物を35mmディッシュに移して増殖させた後、100mmディッシュに再び移してコンフルエントに近い状態まで増殖させた。これに続いて、細胞集団の一つを凍結し、残りの集団を12ウェルプレート上に、1000細胞/ウェルでプレーティングした。
　細胞をクローニング培地中で１５継代以上培養し、実施例１で示されたようにして分化についてモニタリングした。各々のクローンは、何回か連続して分化した後はずっと未分化状態のままであった。
　次いでクローン集団を樹立し、実施例１に記載されるようにして脂肪生成、軟骨発生、筋発生、および骨発生培地に曝露した。各々の培地に曝露すると、少なくとも一つのクローンが骨、脂肪、軟骨、および筋に分化することができ、ほとんどのクローンは少なくとも３つのタイプの組織に分化出来ることが観察された。細胞が筋および軟骨に発達しうることは、これら脂肪由来幹細胞の多分化能をさらに実証するものである。
　これらの結果は、脂肪由来幹細胞が、多くの継代の間、特別に前もって選別された血清のロットを必要とせずに未分化の状態のまま維持されうるということを実証する。結果はまた、該細胞がそのような長期の継代後に多分化能を保持することを実証しており、該細胞が実際に幹細胞であって単なる拘束された前駆細胞ではないことを証明している。」（１９頁３３行〜２０頁２３行）と記載されている。
　
第３　対比
　本願発明と引用例に記載された発明を比較すると，上記の摘示した引用例の記載から明らかなように，両者は，単離された脂肪組織由来幹細胞（ADSC）である点で一致している。
　ところが，本願発明の脂肪組織由来幹細胞が，STRO-1及びCD４９ｄを発現し、かつCD106の発現が検出不可能なレベルかまたは低レベルであるのに対し，引用例に，脂肪組織由来幹細胞の，STRO-1，CD４９ｄ及びCD106の発現については記載されていない点で両者は相違している。
　
第４　判断
　本願明細書の実施例１及び３には，上記引用例に記載される実施例１及び３と同様の内容のものが記載されている。
　そして，本願明細書に記載される実施例１２には，
　「細胞の採集、培養および分化の条件：以前に報告（P. Zuk et al., Tissue Engineering 7:209-226(2001)）されているように、未処理脂肪吸引物から処理脂肪吸引物（PLA）細胞を入手し培養した。ＰＬＡ細胞は非誘導コントロール培地（表13）で維持し、一方、ＭＳＣは特殊化コントロール培地（Clonetics）で維持した。ＰＬＡ細胞は、表13に概略した誘導培地を用いて所望の間葉系系列に誘導した。ＭＳＣは、表13に概略したものと同じ成長因子を補充した市販のコントロール培地を用いて誘導した。」（段落０３１４），
　「ＰＬＡクローンの単離と分析：組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）：ＡＤＳＣの単離：単離された単一細胞を得るために、ＰＬＡ細胞を極めて低いコンフルエンシーで播種した。単ＰＬＡ細胞が限界明瞭なコロニーを形成するまで培養をコントロール培地で維持した。単一ＰＬＡ細胞に由来するコロニーを組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）と称した。ＡＤＳＣを滅菌クローニングリングおよび0.25％トリプシン／EDTAを用いて採集した。採集したＡＤＳＣをクローニング培地（15％ＦＢＳ、F12/ＤＭＥＭ（１:１）中の抗生物質／抗真菌剤１％）で増幅させた。」（段落０３１５），
　「結果　ＰＬＡ細胞はＭＳＣと多くの類似点を共有する：本実施例に記載した結果は、組織脂肪由来幹細胞の多系列潜在能およびそれらのクローン単離株について明らかにする。ＰＬＡ集団の特徴をさらに調べるために、細胞を間接ＩＦおよびＦＣを用いて調べ、市販のヒトＭＳＣ集団と比較した。ＭＳＣは、この幹細胞集団の特定に用いることができる一組の固有細胞表面マーカーを発現することが示されている（表14）（S.P. Bruder et al., Clin. Orthop. S247-256(1998); P.A. Conget et al., J. Cell Physiol. 181:67-73(1999); M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999)）。ＭＳＣと同様に、ＰＬＡ細胞はこれらタンパク質のいくつかを発現し（図23および24）、幹細胞としてのこれら細胞の特徴を支持した。ほぼ100％のＰＬＡおよびＭＳＣ培養が、CD29、CD44、CD90およびCD105／SH2の発現について陽性で、両細胞集団で前記マーカーの各々について高い発現レベルが観察された。両細胞集団はまたSH3抗原を発現し、SH3はSH2とともにＭＳＣの特異的
マーカーと考えられている（S.E. Haynesworth et al., Bone 13:69-80(1992)）。さらにまた、ＰＬＡ細胞およびＭＳＣの大半がまたトランスフェリンレセプター（CD71）について陽性で、これら細胞集団の一部分が複製していることを示した。ＰＬＡおよびＭＳＣは造血細胞系列マーカー、CD31およびCD34を発現しなかった。少数のＰＬＡサンプルがCD45について無視できる程度の染色を示したが、ただしCD45陽性細胞数は全ＰＬＡ細胞数の５％を越えなかった。ＭＳＣとは異なり、粘着分子CD58に対する染色はＰＬＡ細胞では観察されなかった。続いてＩＦの結果をＦＣで確認した（図24、パネルＢ）。ＭＳＣおよびＰＬＡ細胞は両者とも同様なプロフィールを示し、主として比較的小さな顆粒をもたない細胞の集団で構成されていた（図24、パネルＡ）。しかしながら、ＰＬＡ集団のより大きな部分は大型で顆粒をもつ細胞を含み（上右隅）、一方、ＭＳＣ集団のより大きな部分は小型の非顆粒性細胞を含んでいた。ＦＣはＰＬＡおよびＭＳＣの両者でCD44、CD71、CD90およびCD105の発現を確認したが、CD31、CD34、CD45およびCD104については顕著なレベルは検出されなかった。前記のマーカーの他に、ＰＬＡ細胞上でCD13、CD49ｄ、SH3およびSTRO-1の発現がＦＣで検出されたが、CD４、８、11、16、19、33、56、62Eおよび106の発現は検出されなかった（表12）。総合すれば、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーの結果は、ＰＬＡ集団と骨髄由来ＭＳＣとの間でＣＤ発現プロフィールにいくつかの類似性が存在することを示している。」（段落０３１８），及び，
　「ＰＬＡクローン単離株（ＡＤＳＣ）は類似するＣＤマーカータンパク質補完を発現する：ＰＬＡ細胞による多系列分化は、脂肪組織内に多能幹細胞集団が存在するためではなく、むしろ多系列特異的前駆細胞の拘束により生じるのかもしれない。したがって、単一ＰＬＡ細胞に由来するクローン単離株による多系列分化は幹細胞の供給源としてのＰＬＡ細胞の分類に極めて重要である。これと合致して、組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）と称される単一ＰＬＡ細胞コロニーがin vitroで多系列能を示した（図35）。500個のＡＤＳＣ単離株の分析によって、調べたコロニー総数のほぼ６％で分化潜在能が確認された。７つのＡＤＳＣ単離株が三系列分化能を示し、骨形成、脂肪生成および軟骨形成系列の細胞に分化し、分化潜在能陽性ＡＤＳＣの総数のほぼ24％に該当した（表11）。さらにまた、組織学的染色によって測定したとき、分化レベルにおける定性的な増加がまたこれら三系列ＡＤＳＣ集団で観察された。三系列ＡＤＳＣの他に、いくつかの二系列クローン（Ｏ／Ａ、Ｏ／ＣおよびＡ／Ｏ）および単一脂肪生成系列クローンもまた単離された。ＡＤＳＣの単離および増大は、ＩＦによってＣＤ発現の変化が検出されなかったのでクローンのＣＤ発現プロフィールに変化を与えなかった。さらにまた、三系列および二系列ＡＤＳＣ単離株間にも相違は観察されなかった（図36）。不均質なＰＬＡ集団のように、ＡＤＳＣはCD29、CD44、CD71およびCD90発現について陽性であったが、CD31、34、45および104の発現は観察されなかった。したがって不均質なＰＬＡ細胞集団内の多系列ＡＤＳＣ単離株の存在およびそれらの同じＣＤマーカープロフィールは、組織脂肪区画は多分化能を有する幹細胞の供給源であるという説をさらに支持する。」（段落０３２４）と記載されている。
　これらの記載からすれば，脂肪組織から単離した脂肪組織由来幹細胞は，それがクローン化していない不均質なＰＬＡ細胞集団であっても，クローン化したＰＬＡ細胞であっても，STRO-1及びCD４９ｄを発現し、かつCD106の発現が検出不可能なレベルかまたは低レベルであるといえる。そうすると，引用例の実施例１に記載され，本願の実施例１やP. Zuk et al., Tissue Engineering 7:209-226(2001)に記載されるのと同様の方法により単離された，不均質なＰＬＡ細胞集団も，本願の実施例３と同様の方法でクローン化されたものである，引用例の実施例３に記載されるクローン化したＰＬＡ細胞も，STRO-1及びCD４９ｄを発現し、かつCD106の発現が検出不可能なレベルかまたは低レベルである蓋然性が極めて高いといわざるをえない。
　そして，請求人はこの点につき，引用例の実施例１や実施例３に記載される脂肪組織由来幹細胞が，STRO-1及びCD４９ｄを発現し、かつCD106の発現が検出不可能なレベルではないことを具体的根拠を持って示していないし，STRO-1及びCD４９ｄを発現し、かつCD106の発現が検出不可能なレベルである蓋然性が低いことを合理的に説明することもしていない。
　そうであるから，引用例の実施例１や実施例３に記載される脂肪組織由来幹細胞は，STRO-1及びCD４９ｄを発現し、かつCD106の発現が検出不可能なレベルであると判断するほかなく，本願発明と同一の発明が引用例に記載されていることになる。
　
　請求人は，「本願においては、本件明細書記載の実施例１１及び１２に記載されるように、単一細胞に由来する単離クローンを得た上で、その多分化能性およびＣＤマーカー発現プロファイルを決定している」ことを主張しているが，本願明細書の段落０３１８には，ＰＬＡ集団の発現プロファイルも記載されているのであるし，本願発明が単一細胞に由来する単離クローンに限定されているものでもない。
　また，本願発明が，単一細胞に由来する単離クローンであるとしても，単一細胞に由来する単離クローンを得る方法は，引用例の５頁９行〜３４行にも説明されているように，慣用の技術であるし，実施例３にはクローン化したＰＬＡ細胞も記載されているのであるから，単一細胞に由来する単離クローンを得ることは，引用例の記載に基づいて当業者が容易になし得ることにすぎない。
　
第５　むすび　
　以上のとおり，本願発明は，引用例に記載された発明であるから，特許法第２９条第１項第３号に該当し，特許を受けることができないものであり，また，本願発明は，引用例に記載された発明に基づいて，当業者が容易に発明できたものであり，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
　したがって，本出願に係る他の請求項について検討するまでもなく，本出願は拒絶すべきものである。
　よって，結論のとおり審決する。