(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子をスクリーニングする方法であって、培養ケラチノサイトに微粒子を含有させ、増殖及び／又は分化が低下した状態のケラチノサイト集団を作製する工程と、当該集団の増殖及び／又は分化の選択的な活性化能力を指標として候補化合物を評価し、当該活性化能力を有する化合物を皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子として選定する工程とを含んでなり、
前記微粒子が、天然若しくは合成のメラニン、メラノソーム、又は、平均径２μｍのポリスチレンビーズである、方法。
【請求項２】
前記増殖の活性化能力の測定を、細胞数カウント法、アラマーブルーアッセイ、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ、ヘキストアッセイ、ＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン）取り込み量測定法、及び、細胞増殖、細胞分裂若しくは細胞周期に関わる抗体を用いた免疫組織学的測定法から選択される手法で行なう、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分化の活性化能力の測定を、細胞形態観察法、及び、細胞分化に関わる抗体を用いた免疫組織学的測定法から選択される手法で行なう、請求項１記載の方法。
【請求項４】
当該活性化能力を有する化合物を、メラニン含有ケラチノサイトを構成要素とする皮膚モデルに適用し、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去効果を有する化合物を選定する工程を更に含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記の増殖及び／又は分化が低下した状態のケラチノサイト集団を用いて３次元皮膚モデルを構築する工程を更に含んでなるとともに、当該３次元皮膚モデルを用いて前記候補化合物の評価を行なうことにより、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去効果を有する化合物を選定する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚美白方法、並びに、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シミは加齢により発症し、老化した印象を与えて時に深刻な肌悩みとなるため、その対応化粧品は大きな市場を形成している。一過性の日焼けとは違い、持続的で局所的に生じ続けるこのシミの生成メカニズムを解き明かすことが、シミ対応化粧品を開発するために必要であると考えられる。シミにはいくつかの臨床的な種別があるが、本発明ではそのうち、加齢によって多くの人に発症する典型的なシミである日光性色素斑を対象とした。日光性色素斑は、多少のニュアンスの違いがあるものの、老人性色素斑（senile lentigo、lentigo senilis）や日光黒子（solar lentigo）とも呼ばれ、脂漏性部位（手足の裏以外の毛嚢脂腺系がある部位）の慢性的な紫外線暴露部位に後天的に現れる色素斑を指す。お年寄りのこめかみなどによく見られる、大きくて境界がはっきりした典型的なシミがこれに含まれる。以下この日光性色素斑を便宜上シミと表記する。【０００３】
これまでにシミの解決を目標として、シミ部位の解析をもとにしたシミのでき易さの評価法及びそれをもとにした予防法、シミに関与する因子の制御によるシミの解消法などが報告されてきた。シミができる前にシミができ易い状態であるか否かを予知できる手段を提供するため、シミ表皮部位及び正常部位のサンプルを採取し、それぞれについてＮＴ−３、ＡＤＡＭ９又はＨＢ−ＥＧＦを検出することを指標にして上記評価を目指した報告がある（特開２００４−２０５２４６号公報参照）。また、ｃ−ＫＩＴやＥＴを阻害することによりシミ対策を目指した報告もある（特開２００４−８３５５１号公報参照）。【０００４】
しかし、これらの少数の遺伝子のみに着目してシミ形成に関する判断や対処を行なう場合、完全な解決が行えているかという点には懸念がつきまとう。そこで、広範囲の遺伝子の変動を検出して、それらを診断の指標とする報告がなされた（特開２００３−２４５０９７号公報参照）。但し、この報告は皮膚への日光暴露による変動遺伝子を検出したものであるため、シミ自体への広範な解析に基づく判断や対処方法の確立が求められていた。【０００５】
そこで本発明者等は、１６名のボランティアからシミの代表例である日光性色素斑を採取し、遺伝子プロファイル解析を用いて近傍部位と比較した（特開２００７−２８９０６３号公報参照）。その結果から、シミ部位ではメラニン合成遺伝子の活性化に加え、炎症関連の遺伝子の活性化、角化関連の遺伝子の低下とケラチノサイトの増殖の低下が起きていることが判明した。【０００６】
シミ部位のメラニン量は健常部位と比べて大幅に多い。しかし、そのメラニンを生産するメラノサイトの数は、シミ部位においても健常部位の１倍から２倍程度に留まると報告されている（Cario-Andre M, Lepreux S, Pain C et al. Perilesional vs. lesional skin changes in senile lentigo. J Cutan Pathol., 31:441-7 (2004)、Noblesse E, Nizard C, Cario-Andre M et al. Skin ultrastructure in senile lentigo. Skin Pharmacol Physiol, 19:95-100 (2006)、Unver N, Freyschmidt-Paul P, Horster S et al. Alterations in the epidermal-dermal melanin axis and factor XIIIa melanophages in senile lentigo and ageing skin. Br J Dermatol., 155:119-28 (2006)参照）。また、シミ部位の組織像を観察すると、メラノサイトはむしろ透明で、その周りの基底層のケラチノサイトが大量にメラニンを含有していることが観察される（後述の図１（ｂ）及び（ｃ）参照）。つまりシミ部位の着色の大部分は、メラノサイトからメラニンを受け渡され溜め込んだ黒いケラチノサイトが原因となっている。ターンオーバーにより絶えず新生されている表皮にあって、なぜこの黒いケラチノサイトがシミ部位に存在し続けるのかという点は、大きな疑問であった。【０００７】
メラニンを溜め込んだケラチノサイトが滞留し続ける原因として、シミ部位では表皮のターンオーバーが低下しているのではないかという考えが浮かぶ。事実、これまでにシミ部位におけるケラチノサイトの分裂低下の所見を指摘した報告があった（特開２００４−２０５２４６号公報、特開２００７−２８９０６３号公報、Noblesse E, Nizard C, Cario-Andre M et al. Skin ultrastructure in senile lentigo. Skin Pharmacol Physiol, 19:95-100 (2006)、Unver N, Freyschmidt-Paul P, Horster S et al. Alterations in the epidermal-dermal melanin axis and factor XIIIa melanophages in senile lentigo and ageing skin. Br J Dermatol., 155:119-28 (2006)参照）が、メラニンとの関連等の詳細については不明であった。【０００８】
また、これまでシミを除去する方法として、ターンオーバーを高める方法があった（特開平６−７２８４２号公報、特開平６−１４５０３８号公報、特開２００６−４５０８４号公報、特開２００４−５１５４４号公報、特開２００１−３０２４５４号公報参照）。しかし、単なるターンオーバーの亢進だけでは、肌荒れや、ひどい場合には炎症性色素沈着などの副作用を惹起する懸念があり、シミを除去するに至るような効果的な適用方法は見つかっていなかった。【０００９】
また、ケミカルピーリング、レチノイン酸治療、レーザー治療などによるシミ除去美容医療施術があるが（特開２００３−２７７２５１号公報参照）、これらはメラニン含有細胞を増殖促進や光吸収による発熱で破壊して取り除く医療行為であり、一定の効果は望めるものの、痛み、赤み、腫れなどの激しい副作用があり、かつ炎症後色素沈着などにより再発が高い頻度で起こることや、通院や料金などに伴う課題もあった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記課題に鑑み、本発明は、副作用を抑えつつ効率的に皮膚シミ形成の予防及び／又は皮膚シミの改善を行なうことが可能な皮膚美白方法を提供するとともに、副作用の少ない皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子を高い精度で選定することが可能なスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、このような従来の皮膚美白方法に係る課題や、色素沈着現象の疑問に答えるため、１６名のボランティアから採取した日光性色素斑の遺伝子プロファイル解析や免疫抗体染色による解析を通して、シミ部位が近傍の正常部部位と比較して何が違うのかを徹底的に追及した。その結果、シミ部位の基底層ケラチノサイトは一律に増殖及び／又は分化（本明細書ではこれを適宜「増殖・分化」と略称する。）が低下しているのではなく、メラニンを溜め込んだケラチノサイトのみに増殖・分化の著しい低下が見られるという実態を発見した。【００１２】
更に、培養ケラチノサイトでメラニンを貪食させることにより、シミの基底層の状態を作製してその増殖・分化性を調べたところ、同じく増殖・分化が低下しており、サイクリン等の減少がみられることを見出した。これらの結果から、シミ部位ではメラニンを溜め込んだ基底層ケラチノサイトの増殖・分化が低下してしまい、正常なターンオーバーで排出されず、基底層一面に留まってしまうことが、シミ部位の色素沈着の慢性化を引き起こす原因であると考えられた。【００１３】
シミを除去するために、単なる表皮ターンオーバーの亢進を行った場合は、肌の厚みを維持している正常なケラチノサイトの過剰な増殖・分化の傾向を更に増してしまい、肌荒れや、ひどい場合には炎症性色素沈着などの副作用を惹起する懸念がある。これに対して、シミ部位の色素沈着及びその慢性化の原因である、増殖・分化が停滞した黒いケラチノサイトのターンオーバーだけを特異的に亢進させて正常化し、溜まったメラニンを排出すれば、副作用を抑えながらシミを効果的に除去することができると考えられる。
以上の知見に基づいて、本発明者等は本発明を完成させた。【００１４】
第１の観点として、本発明は、皮膚のメラニン含有ケラチノサイトの増殖及び／又は分化を選択的に活性化する工程を含んでなる皮膚美白方法を提供する。
好適な態様によれば、前記選択的活性化工程は、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子を含んでなる薬剤を対象に投与して行なう。
更に好適な態様によれば、前記皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子は、ヨモギエキス、カワラヨモギエキス、及びモモ葉エキスから選択される。【００１５】
第２の観点として、本発明は、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子をスクリーニングする方法であって、培養ケラチノサイトに微粒子を含有させ、増殖及び／又は分化が低下した状態のケラチノサイト集団を作製する工程と、当該集団の増殖及び／又は分化の選択的な活性化能力を指標として候補化合物を評価し、当該活性化能力を有する化合物を皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子として選定する工程とを含んでなる方法を提供する。【００１６】
好適な態様によれば、前記微粒子は、天然若しくは合成のメラニン、メラノソーム、又は、性質の均質なマイクロビーズである。【００１７】
好適な態様によれば、前記増殖の活性化能力の測定は、細胞数カウント法、アラマーブルーアッセイ、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ、ヘキストアッセイ、ＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン）取り込み量測定法、及び、細胞増殖、細胞分裂若しくは細胞周期に関わる抗体を用いた免疫組織学的測定法から選択される手法で行なわれる。【００１８】
好適な態様によれば、前記分化の活性化能力の測定は、細胞形態観察法、及び、細胞分化に関わる抗体を用いた免疫組織学的測定法から選択される手法で行なわれる。【００１９】
好適な態様によれば、この方法は、当該活性化能力を有する化合物を、メラニン含有ケラチノサイトを構成要素とする皮膚モデルに適用し、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去効果を有する化合物を選定する工程を更に含んでなる。【００２０】
好適な態様によれば、この方法は、前記の増殖及び／又は分化が低下した状態のケラチノサイト集団を用いて３次元皮膚モデルを構築する工程を更に含んでなるとともに、当該３次元皮膚モデルを用いて前記候補化合物の評価を行なうことにより、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去効果を有する化合物を選定する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の皮膚美白方法によれば、副作用を抑えつつ効率的に、皮膚におけるシミの形成を予防し、及び／又は、既存のシミを改善することが可能となる。
また、本発明の皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子のスクリーニング方法によれば、副作用の少ない皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子を、高い精度で選定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１（ａ）〜図１（ｃ）は何れも、皮膚組織の顕微鏡写真である。図１（ａ）は、健常部位の皮膚組織のＨＥ染色像の例であり、図１（ｂ）は、日光性色素斑部位の皮膚組織のＨＥ染色像の例であり、図１（ｃ）は、日光性色素斑部位の皮膚組織の透過光像とメラノサイトマーカー（ＴＲＰ−１）による免疫組織染色像との重ね合わせ画像の例である。
【図２】図２（ａ）〜図２（ｃ）は何れも、皮膚のシミ部位の組織の分裂細胞の染色画像である。図２（ａ）は、分裂細胞核をＫｉ６７染色（緑色）したシミ部位組織の免疫組織染色像の例である。図２（ｂ）は、細胞核をＤＡＰＩ染色（青色）で、分裂細胞の核をＫｉ６７染色（緑色）で、メラニンを擬似カラー染色（赤色）で染色した、シミ部位組織の３重染色像の例である。図２（ｃ）及び図２（ｄ）はそれぞれ、図２（ｂ）におけるメラニンを含まない基底層ケラチノサイトの例、及びメラニンを含む基底層ケラチノサイトの例を、部分的に拡大して示す図である。
【図３】図３（ａ）〜図３（ｃ）は何れも、メラニン含有ケラチノサイトの増殖低下を説明するための図である。図３（ａ）は、メラニン源添加３日後のケラチノサイトの位相差顕微鏡像の例である。図３（ｂ）は、図３（ａ）と同視野の透過光顕微鏡像であり、メラニンは黒色で表わされている。図３（ｃ）は、メラニン源の添加後０、２、４、及び７日目における各メラニン濃度での増殖指標（アラマーブルー測定値）を示すグラフである。
【図４】図４（ａ）、図４（ｂ）は何れも、メラニン含有ケラチノサイトへのヨモギエキス添加の影響を示す図である。具体的に、図４（ａ）は、メラニンを含有しないケラチノサイトに、ヨモギエキスを添加したときの増殖指標（アラマーブルーアッセイ）の値を示すグラフであり、図４（ｂ）は、メラニン含有ケラチノサイトにヨモギエキスを添加したときの増殖指標の値を示すグラフである。
【図５】カワラヨモギエキス及びモモ葉エキスが微粒子（マイクロビーズ）含有ケラチノサイトに与える影響を示す増殖指標（アラマーブルーアッセイ）のグラフである。図中、ａは、マイクロビーズを含まないケラチノサイトの結果を示し、ｂ〜ｄは、マイクロビーズ含有ケラチノサイトに対し、薬剤無添加の場合（ｂ）、カワラヨモギエキス０．２％添加の場合（ｃ）、モモ葉エキス０．２％添加の場合（ｄ）の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、具体的な実施の形態を挙げて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施の態様に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない限りにおいて、任意の変更を加えて実施することが可能である。【００２４】
１．皮膚美白方法：
本発明の皮膚美白方法は、皮膚におけるメラニンを含有するケラチノサイト（適宜「メラニン含有ケラチノサイト」と略称する。）の増殖・分化を選択的に活性化する工程を含んでなる。なお、本明細書において「皮膚美白方法」とは、皮膚におけるシミの形成を予防し、及び／又は、既存のシミを改善することにより、皮膚の過剰な色素沈着を予防、及び/又は除去する方法を指すものとする。【００２５】
本発明者等の知見によれば、上述のように、皮膚の基底層ケラチノサイトのうち、メラニン含有ケラチノサイトの増殖・分化が特異的に低下してしまい、正常なターンオーバーで排出されず、基底層一面に留まってしまうことが、シミ部位の色素沈着の慢性化を引き起こす原因であると推測される。但し、単にシミ部位の様々な細胞のターンオーバーを非選択的に亢進してしまうと、メラノサイトの過剰増殖・分化を促進してしまい、シミが抑制できないばかりか、むしろシミの拡大等を招いてしまう懸念もある。また、基底層ケラチノサイトのターンオーバーを一律に亢進した場合にも、肌の厚みを維持している正常なケラチノサイトの過剰増殖・分化を促進してしまい、肌荒れや炎症性色素沈着などの副作用を惹起する懸念がある。【００２６】
これに対して、本発明の美白方法では、メラノサイトや正常なケラチノサイト等のターンオーバーを亢進することなく、シミ部位の色素沈着及びその慢性化の原因である、増殖・分化が停滞したメラニン含有ケラチノサイトの増殖・分化のみを選択的に活性化し、メラニン含有ケラチノサイトのターンオーバーだけを特異的に亢進させて正常化する。これによってシミ部位に蓄積したメラニンを排出し、副作用を抑えながら皮膚におけるシミの形成を予防し、及び／又は、既存のシミを改善することが可能となる。【００２７】
皮膚の基底層におけるメラニン含有ケラチノサイトの増殖・分化を選択的に活性化するための具体的な手法は特に制限されないが、例としては、メラニン含有ケラチノサイトの増殖・分化を選択的に活性化する能力を有する化合物（後述の皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子）を含んでなる薬剤を、対象に投与するという手法が挙げられる。かかる皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子は、本発明のスクリーニング方法によって、効率的に選定することが可能である。皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子の具体例、及び本発明のスクリーニング方法の詳細については、次欄「２．皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子のスクリーニング方法」で説明する。また、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子を含有する薬剤（後述の美白組成物）並びにその投与法については、次々欄「３．美白用組成物」で説明する。【００２８】
２．皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子のスクリーニング方法：
本発明の皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子のスクリーニング方法（適宜「本発明のスクリーニング方法」と略称する）は、培養ケラチノサイトに微粒子を含有させ、増殖・分化が低下した状態のケラチノサイト集団を作製する工程と、当該集団の増殖・分化の選択的な活性化能力を指標として候補化合物を評価し、当該活性化能力を有する化合物を皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子として選定する工程とを含んでなる。【００２９】
なお、本明細書では、皮膚におけるシミの形成を抑制する作用、及び／又は、皮膚における既存のシミを除去する作用を有する因子を、「皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子」等と略称するものとする。【００３０】
微粒子は通常、天然若しくは合成のメラニン、メラノソーム、又は、性質の均質なマイクロビーズから選択される。
メラニン又はメラノソームとしては、ヒト、マウス、イカ等の培養メラノサイトから抽出・精製したメラニン又はメラノソーム等が挙げられる。市販のメラニンの例としては、例えばSigma社製Sepia melanin（イカ由来）が挙げられる。
また、「性質の均質なマイクロビーズ」とは、質量、粒径、硬度などの物理的性質、および表面反応性、凝集性などの化学的性質の均質な合成ビーズをいう。性質の均質なマイクロビーズの材料は特に制限されないが、例としては、ポリスチレン、ポリエチレン等の樹脂から選択される一種又は二種以上の材料が挙げられる。
マイクロビーズの形状やサイズも特に制限されないが、一般的にはその平均径が通常０．１μｍ以上、好ましくは１μｍ以上、また、通常１０μｍ以下、好ましくは３μｍ以下の球状又は略球状である。市販の性質の均質なマイクロビーズの例としては、例えばPolyscience社のPolybead等が挙げられる。【００３１】
微粒子の形態は特に制限されないが、通常は細胞の大きさに対して十分に小さな（例えば直径が通常２μｍ以下の）粒子とする。
また、微粒子の使用割合も特に制限されないが、通常は、細胞に明らかな増殖・分化の低下が見られるとともに、顕著な細胞毒性（例えば、細胞が剥がれてしまう、呼吸活性が見られなくなる等）が生じないような範囲とする。具体的には、微粒子としてメラニンを使用する場合、細胞培養液に対するメラニンの割合は、通常０．０００１質量％以上、中でも０．００１質量％以上、また、通常０．１質量％以下、中でも０．０４質量％以下とすることが好ましい。【００３２】
増殖の活性化能力を測定する手法としては、細胞数カウント法、アラマーブルーアッセイ、ＭＴＴアッセイ、ヘキストアッセイ、ＢｒｄＵ取り込み量測定法、及び、細胞増殖、細胞分裂若しくは細胞周期に関わる抗体（例えば、ＢｒｄＵ、Ｋｉ６７、ＰＣＮＡ等）を用いた免疫組織学的測定法等が挙げられる。これらの測定法の条件及び手順は、当業者には周知である。【００３３】
分化の活性化能力を測定する手法としては、細胞形態観察法、及び、細胞分化に関わる抗体（例えば、ケラチン１、ケラチン１０、フィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ等）を用いた免疫組織学的測定法等が挙げられる。これらの測定法の条件及び手順も、当業者には周知である。【００３４】
また、本発明のスクリーニング方法は、当該活性化能力を有する化合物を皮膚モデルに適用し、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去効果を有する化合物を選定する工程を更に含んでなることが好ましい。皮膚モデルとしては、メラニン含有ケラチノサイトを構成要素とする皮膚細胞の単層培養物、共培養物、若しくは３次元培養物、しみモデルマウス（特開２００５−１０６７４５号公報参照）等が挙げられるが、中でも皮膚細胞の単層培養物が好ましい。なお、これらの皮膚モデルの構築方法や利用方法も、当業者には周知である。【００３５】
特に、本発明のスクリーニング方法は、前記の増殖・分化が低下した状態のケラチノサイト集団を用いて３次元皮膚モデルを構築する工程を更に含んでなるとともに、当該３次元皮膚モデルを用いて前記候補化合物の評価を行なうことにより、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去効果を有する化合物を選定することが好ましい。３次元皮膚モデルとしては、上述の皮膚モデルのうち、３次元培養物、シミモデルマウス等が挙げられるが、中でも３次元培養物が好ましい。【００３６】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には、例えば下記の手順で実施することができる。【００３７】
（１）ヒト正常ケラチノサイトを、適切な培養液（例えば、Defined Keratinocyte-SFM培養液（Invitrogen社製Gibco）等）を用い、適切な培養条件（例えば、５％のＣＯ2ガスを含有する空気雰囲気下、温度３７℃、湿度９５％のインキュベータ内で数日間）で培養する。【００３８】
（２）微粒子を、適切なバッファー（例えばＰＢＳバッファー等）に滅菌下で拡散させ、適当な濃度の懸濁液を作製する。【００３９】
（３）（１）の細胞培養液を、（２）の懸濁液を適切な濃度で含む培養液（例えば、培養液に対するメラニン最終濃度０．００１〜０．０４％Ｗ／Ｖ）と交換し、インキュベーション（例えば上記培養条件で２〜３日）を行ってケラチノサイトにメラニンを貪食させる。その際にコントロールとして、微粒子を添加しない細胞も用意しておく。【００４０】
（４）（３）の操作により増殖・分化低下状態にさせたケラチノサイトの単層培養物を、必要に応じて皮膚モデルの構築に供した後、この単層培養物又は皮膚モデルの培養液を、被験成分（候補化合物）を含む培養液と交換し、更に培養を続ける（例えば単層培養の場合、上記培養条件で２〜３日）。その際にコントロールとして、被験成分を添加しない細胞を用意しておいてもよい。【００４１】
（５）（４）の操作後における細胞の増殖率を測定する。【００４２】
（６）（５）の測定により、微粒子を貪食させて増殖・分化の低下したケラチノサイトの増殖を促進させる成分（化合物）を選出する。更に、微粒子を添加しない正常ケラチノサイトの増殖率に対する当該成分の効果も考慮して、正常細胞に対する増殖促進効果が低い、もしくは無い成分を選出する。【００４３】
（７）（４）の操作後における細胞の分化指標を測定する。【００４４】
（８）（７）の測定により、微粒子を貪食させて増殖・分化の低下したケラチノサイトの分化を促進させる成分を選出する。このとき、微粒子を添加しない正常ケラチノサイトの分化指標亢進率に対する当該成分の効果も考慮して、正常細胞に対する分化促進効果が低い、もしくは無い成分を選出する。【００４５】
ケラチノサイトの増殖又は分化の促進の判断基準としては、通常は、被験成分を添加しない場合を基準とし、被験成分の添加により増殖率又は分化率が統計処理上有意に上昇した場合に、当該成分により増殖又は分化が促進されたものと判断する。ただし、被験成分の添加は、顕著な細胞毒性の起きない濃度範囲で行なうものとする。【００４６】
以上説明した本発明のスクリーニング方法によれば、増殖・分化が低下した状態のケラチノサイト集団の増殖・分化の選択的な活性化能力を指標として候補化合物を評価することにより、副作用の少ない皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子を、高い精度で選定することができる。更に、複数の皮膚モデルを使用した評価を組み合わせることにより、副作用の少ない皮膚シミ形成抑制及び／又は除去効果を有する化合物を、高い精度で選定することが可能となる。【００４７】
本発明のスクリーニング方法により、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子として選定された成分（化合物）を用いれば、メラニンを溜め込んで増殖・分化が低下した、シミ部位の色素沈着の慢性化要因である黒いケラチノサイトの増殖・分化を特異的に正常に戻し、溜まったメラニンを解放することによって、副作用の少ないシミを効果的に予防、改善できるものと思われる。また、チロシナーゼ阻害剤等では難しかった、既存のシミ（即ち、黒いケラチノサイト）の除去が可能となるものと思われる。よって、本発明のスクリーニング方法により選定された皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子は、美白有効成分としての用途が期待される。【００４８】
本発明者等は、上述した本発明のスクリーニング方法に従って、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子の選定を行なった結果、ヨモギエキス、カワラヨモギエキス、及びモモ葉エキスが、メラニン含有ケラチノサイトの増殖・分化を促進する効果を有することを見出した。
ヨモギ（学名Artemisia princeps）及びカワラヨモギ（学名Artemisia capillaris）は、何れもキク科ヨモギ属の多年草である。
「モモ葉」とは、バラ科モモ属の落葉小高木であるモモ（桃、学名Amygdalus persica）の葉をいう。
ヨモギ、カワラヨモギ及びモモ葉の「エキス」は、常法により得ることができ、例えばこれらの植物を抽出溶媒とともに浸漬又は加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、抽出に通常用いられる溶媒であれば、任意のものを用いることができる。例としては、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒等を、それぞれ単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出して得られたエキスをそのまま、あるいは濃縮したエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノール又はエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また、分配法、例えば水／酢酸エチルで抽出したエキス等も用いられる。【００４９】
３．美白用組成物：
本発明のスクリーニング方法により選定された皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子（例えば、上述のヨモギエキス、カワラヨモギエキス、及びモモ葉エキス等）は、通常は美白用組成物（又は美白用皮膚外用剤）の美白有効成分として、上述した本発明の皮膚美白方法に用いることができる。なお、本発明のスクリーニング方法により選定された皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子を美白有効成分として含有する美白用組成物を、本明細書では適宜「本発明の美白用組成物」という。【００５０】
本発明の美白用組成物に対する皮膚シミ形成抑制因子及び／又は皮膚シミ除去因子の割合は、その形態や剤型によっても異なり、限定されるものではないが、通常０．００１質量％以上、中でも０．０１質量％以上、更には０．１質量％以上、また、通常１０質量％以下、中でも５％質量％以下、更には１％質量％以下の範囲とすることが好ましい。【００５１】
本発明の美白用組成物には、所望する剤型に応じて、従来公知の賦形剤や香料等をはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、顔料等の粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等を適宜配合してもよい。更に、所期の効果を損なわない範囲内であれば、この他の薬効成分を本発明の美白用組成物に配合することも可能である。【００５２】
本発明の美白用組成物は、例えば水溶液、油液、その他の溶液、乳液、クリーム、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、カプセル、固形剤等の形態で適用される。従来公知の手法によりこれらの形態に調製したうえで、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤、水−油２層系、水−油−粉末３層系、注射剤、内服剤（例えば錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等）、坐剤等として、身体に塗布、貼付、噴霧、注射、飲用、挿入等することにより、ヒトや動物等の対象に投与することができる。【００５３】
これらの剤型の中でも、本発明の美白用組成物は、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等の皮膚外用剤とすることが、本発明の目的に適している。本発明の美白用組成物のうち、特に皮膚外用剤の剤型としたものを、本明細書では適宜「本発明の美白用皮膚外用剤」という。【００５４】
なお、ここで記す皮膚外用剤には、医薬品、医薬部外品（軟膏剤等）、化粧料［洗顔料、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスク等の基礎化粧品；ファンデーション、口紅等のメーキャップ化粧品；口腔化粧品、芳香化粧品、毛髪化粧品、ボディ化粧品等］が含まれる。特に本発明の美白用組成物は、皮膚シミ形成を予防し、及び／又は、皮膚シミを改善する化粧料としての適用が好適である。【００５５】
本発明の美白用組成物（特に本発明の美白用皮膚外用剤）を用い、その剤型に応じた適切な手法で対象に投与することにより、副作用を抑えつつ効率的に皮膚シミ形成を予防し、及び／又は、皮膚シミを改善することが可能である。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５７】
［実施例１］
ヒトシミ組織の解析結果【００５８】
日光性色素斑部位組織サンプル
組織サンプルは、インフォームドコンセントを行った４０歳代以上の男性ボランティア１６名の背中にあるシミのうち、日光性色素斑を皮膚科医の鑑別により選定し、その日光性色素斑部位の表皮及び真皮上層の組織を局所麻酔下３ｍｍバイオプシーにより採取した。採取に当っては資生堂倫理委員会によるガイドラインに従った。比較部位として、日光性色素斑部位のほかに、同一人の背部近傍の健常部位、及び、臀部（非露光部位）の健常部位からも、表皮及び真皮上層の組織を同様に採取した。【００５９】
皮膚組織切片の染色
比較部位に対するシミ部位の変動タンパク質の皮膚組織内での分布や発現を観察するため、採取組織を凍結ブロックにして薄切切片を作製し、以下に示すＨＥ染色や免疫組織染色等の各種の細胞染色を行った。ばらつきを防ぐため、同一人の３箇所の部位（日光性色素斑部位、健常部位、非露光部位）の組織を一組として一つのブロックに包埋し、１スライド上に切片を載せて同時に染色操作を行った。【００６０】
なお、免疫組織染色にはチラミド増感法（TSA-plus Fluorescein System：Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, U.S.A 参照）を併用し、抗ＴＲＰ−１抗体（Mel-5：Signet Laboratories Inc., Dedham, MA, U.S.A. 参照）及びＫｉ−６７抗体（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, U.S.A. 参照）を用いた。陽性細胞数としては、表皮の長さ１ｍｍあたりにおける陽性細胞の個数を数えた。【００６１】
解析結果
まず、各部位についてＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色を行なった。図１（ａ）は、健常部位の皮膚組織のＨＥ染色像の例であり、図１（ｂ）は、日光性色素斑部位の皮膚組織のＨＥ染色像の例である。図１（ａ）及び（ｂ）の何れも、倍率の異なる２つの画像を上下に重ねて示しており、各画像中の黒線分の長さが５０μｍに相当する。【００６２】
続いて、シミ部位におけるメラノサイト関連遺伝子の亢進を確認するため、メラノサイトマーカーであるＴＲＰ−１タンパク質の組織中での発現様式を、抗ＴＲＰ−１抗体を用いた免疫組織染色法で調べた。ＴＲＰ−１陽性の蛍光シグナルを発する細胞は基底膜のメラノサイトで検出され、９例中９例で、日光性色素斑部位における角層の単位長さ当たりの蛍光シグナルを発する細胞の数が、近傍健常部位に比べて２倍程度多いことが確認できた。これは、上記「背景技術」の欄に記載した既報告の結果群と一致している。【００６３】
図１（ｃ）は、こうして得られた日光性色素斑部位の皮膚組織のメラノサイトマーカー（ＴＲＰ−１）による免疫組織染色像と、同じ部位の皮膚組織の透過光像とを重ね合わせた画像の例である。図１（ｃ）中、黒線分の長さが５０μｍに相当する。矢尻はＴＲＰ−１陽性メラノサイト（緑色）を示し、＊はメラニンを含有する基底層ケラチノサイト（黒色）を示す。図１（ｃ）から、メラノサイトはむしろ透明で、基底層ケラチノサイトが黒色を呈し、メラニンを含有していることが分かる。【００６４】
次に、細胞分裂マーカーであるＫｉ６７抗体を用いて、増殖中の細胞を検出して同様に比較した。その結果、上記とは逆に、日光性色素斑部位の陽性細胞数は近傍健常部位に比べて０．５８倍（ｎ＝１０，ｐ＝０．０２１）であり、減少傾向にあることが観察された。なお、これらの陽性細胞のほとんどがケラチノサイトである。図２（ａ）はシミ部位組織の免疫組織染色（Ｋｉ６７染色）像の例であり、分裂細胞核が緑色に染色されている。図２（ａ）中、白線分の長さが１００μｍに相当する。【００６５】
シミ部位において陽性細胞が少ない理由として、メラニンによる蛍光シグナルの遮光効果が考えられたので、このＫｉ６７陽性細胞像を詳しく観察した。その結果、Ｋｉ６７のシグナルは細胞核で検出されるが、メラニンは細胞核の周りの細胞質に分布していることから、蛍光シグナルの遮光は憂慮すべきほど生じていないことが分かった。それどころか、陽性細胞内の核の周りに分布するはずのメラニンをよく観察すると、そもそもＫｉ６７陽性細胞、つまり分裂細胞の多くは、図２（ａ）に示すように、細胞内（緑色に染色された核の周囲）にメラニンをほとんど含んでいないことが観察された。【００６６】
続いて、この現象がシミ部位に特有の現象なのか否か、その実態を調べるために、以下の測定を行った。【００６７】
まず、シミ部位の組織切片において細胞の位置を判定するために、核をＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）染色によって青に染色し、分裂細胞をＫｉ６７染色によって緑に染色し、メラニンを擬似カラーによって赤に染色することにより、これらの識別を可能とした３重染色像を作製した。こうして得られたシミ部位組織の３重染色像において、単位角層長さあたり、メラニンを含む基底層細胞の総数と、メラニンを含まない基底層細胞の総数とを計数した。また、それらのうちＫｉ６７陽性の分裂細胞の数を計数し、メラニンを含む基底層細胞及びメラニンを含まない基底層細胞のそれぞれの総数で割ることによって、それぞれの分裂細胞の割合を計算した。【００６８】
図２（ｂ）は、シミ部位組織の３重染色像の例である。メラニンを含まない基底層細胞に白丸印を、メラニンを含む基底層細胞には桃丸印を、それぞれ付して表わしている。また、図２（ｂ）に白囲み線で示す部分（メラニンを含まない基底層ケラチノサイトの例、及び、メラニンを含む基底層ケラチノサイトの例）の部分拡大図を、それぞれ図２（ｃ）及び（ｄ）として示す。図２（ｃ）及び（ｄ）では、ケラチノサイトの輪郭を白点線で示している。【００６９】
メラニンを含まない細胞とメラニンを含む細胞との判定基準としては、メラニンがほぼ観察されない細胞（例えば図２（ｃ）に示す細胞）を、メラニンを含まない細胞と判定し、それ以外の細胞（例えば図２（ｄ）に示す細胞）を、メラニンを含む細胞と判定した。また、Ｋｉ６７陽性細胞はその特性上、厳密には基底層ではなく、基底層の一層上の層に検出される場合もあるが、これらも基底層で検出されているものとみなして計算した。【００７０】
メラニンを含む基底層細胞、及び、メラニンを含まない基底層細胞の各々におけるＫｉ６７陽性細胞の割合は、それぞれ下記の式（１）及び（２）に従って算出した。【００７１】
Ｒｍ＝Ｄｍ／Ｂｍ      （１）
上記式（１）において、Ｒｍは、メラニンを含む基底層細胞（melanin）におけるＫｉ６７陽性細胞の割合（Ratio）を表わし、Ｄｍは、メラニンを含む基底層細胞のうち、Ｋｉ６７陽性の分裂細胞数（Divide）を表わし、Ｂｍは、メラニンを含む総基底層細胞数（Basal）を表わす。【００７２】
Ｒｃ＝Ｄｃ／Ｂｃ      （２）
上記式（２）において、Ｒｃは、メラニンを含まない基底層細胞（clear）におけるＫｉ６７陽性細胞の割合を表わし、Ｄｃは、メラニンを含まない基底層細胞のうち、Ｋｉ６７陽性の分裂細胞数を表わし、Ｂｃは、メラニンを含まない総基底層細胞数を表わす。【００７３】
以上の手順に従い、メラニンを含む基底層細胞及びメラニンを含まない基底層細胞のそれぞれの細胞数（図２（ｂ）では、白丸印と桃丸印のそれぞれの細胞数）を計数し、メラニンを含む場合及び含まない場合のそれぞれにおける分裂細胞（図２（ｂ）では、緑色に染色された核を有する細胞）の割合（Ｒｍ、Ｒｃ）を算出して比較した。すると、メラニンを含む基底層細胞における分裂細胞の割合は、メラニンを含まない基底層細胞における分裂細胞の割合と比べ、大幅に少ないことから、メラニン含有ケラチノサイトの分裂が大幅に低下していることが判明した（Ｒｍ／Ｒｃ＝０．１６倍、Ｎ＝１４、Ｐ＝０．００７）。【００７４】
つまり、シミ部位におけるメラニンを溜め込んだ基底層ケラチノサイトが、著しく増殖・分化が低下した状態に陥っていると考えられた。この黒いケラチノサイトがなかなか分裂しないのであれば、基底層での分裂とターンオーバーによって絶えず入れ代わっている通常のケラチノサイトの状態とは異なり、長期に亘って基底層に分布し続けることになる。すると結果的に、メラノサイトからメラニンを受け渡される物理的な時間も増え、高いメラニン含有量が保たれてしまう。この様な増殖・分化の低下状態に陥った黒いケラチノサイトが基底層一面に存在してしまうことが、シミ部位の色素沈着の慢性化要因であると考えられた。事実、ＴＲＰ−１により染色した組織像（上述の図１（ｂ）及び（ｃ）参照）を見ると、メラニン含有ケラチノサイトは基底層一面に分布し、シミ部位の主な着色を担っている。【００７５】
［実施例２］
培養ヒト正常ケラチノサイトを用いた解析結果【００７６】
シミ部位の組織（in vivo）の解析で観察されたメラニン含有ケラチノサイトの増殖・分化の低下現象が、培養細胞（in vitro）系でも観察されるか否かを確認するために、培養ヒト正常ケラチノサイトに微粒子を貪食させて、シミ部位基底層と似た状態を作り出し、解析を行った。【００７７】
細胞培養と微粒子の添加
（１）ヒト正常ケラチノサイトを、５％のＣＯ2ガスを含有する空気雰囲気下、温度３７℃、湿度９５％のインキュベータ内で、Defined Keratinocyte-SFM培養液（Invitrogen社製Gibco）を用いて培養した。【００７８】
（２）微粒子としてメラニン（Sepia melanin（イカ由来）、パウダー状、Sigma社製）を用い、ＰＢＳバッファーに滅菌下で拡散させ、適当な濃度の懸濁液を作製した。【００７９】
（３）（１）の細胞培養液を、（２）の懸濁液を添加した培養液（培養液に対するメラニンの最終濃度０．００１、０．０２、及び０．０４％Ｗ／Ｖ）と交換してインキュベーションを行い、ケラチノサイトにメラニンを貪食させた。その後、上記培養条件で１〜３日後に、メラニンを含まない新鮮な培養液に交換して、余分なメラニンを洗い流した。そして、更に定期的に（２〜３日ごと）培地を交換しながら、培養を続けた。この際、コントロールとしてメラニンを添加しない細胞も用意した。【００８０】
分裂の観察と増殖率の測定
（１）メラニンの添加後、細胞状態の位相差顕微鏡像及び、位相差無し透過光顕微鏡像（メラニン分布を鮮明に見るため）を定期的に撮影し、細胞の分裂の様子を観察した。【００８１】
（２）メラニンの添加後、定期的にアラマーブルーアッセイによって細胞増殖率を測定した。アラマーブルーアッセイは、細胞培養液に１／１０容量のアラマーブルー溶液（Bio Source社）を添加したのち、培養用インキュベータ内で1時間静置した後、培養上清の一部を採取して９６穴プレート等に移し、蛍光プレートリーダーによって５４４ｎｍで励起し、５９０ｎｍで測定を行った。アラマーブルー溶液を添加し測定の終わった細胞培養溶液は、直ちに新鮮な培養液に交換し、培養を継続した。【００８２】
メラニン添加細胞の変動遺伝子の解析
（１）メラニンを添加し、分裂の低下した状態のヒト正常ケラチノサイトと、メラニンを添加していないコントロールから、ISOGEN（日本ジーン社、メーカー推奨プロトコル）によりＲＮＡを抽出し、RNeasy（Qiagen社）により精製した。得られたＲＮＡをバイオアナライザー（アジレントテクノロジー社）で電気泳動し、その品質及び精製度を確認した。【００８３】
（２）調製したＲＮＡを用いて、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子プロファイル解析を行った。サンプルの調製及びハイブリダイゼーションは、アジレント社推奨プロトコルに準じて行なった。総量１００〜３００ｎｇのＲＮＡから、Low RNA Inputリニア増幅＆ラベル化キット（アジレント社）を用いて、ラベルｃＲＮＡを合成した。RNeasy（Qiagen社、メーカー推奨プロトコル）にて精製した後、Whole Human Genomeオリゴアレイ（アジレント社、G4112A）とのハイブリダイゼーション及び洗浄を行い、アジレント社スキャナーによりデータ読み取りを行った。【００８４】
メラニン添加細胞の変動タンパク質の解析
メラニンを添加し、分裂の低下した状態のヒト正常ケラチノサイトと、メラニンを添加していないコントロールからタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングによってターゲットタンパク質の量を比較した。【００８５】
解析結果
メラニン添加３日後のケラチノサイトの位相差顕微鏡像の例を図３（ａ）に示す。また、図３（ａ）と同視野の透過光顕微鏡像を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）において、メラニンは黒色で表わされている。図３（ａ）及び（ｂ）中、黒線分の長さが１００μｍに相当する。図３（ａ）及び（ｂ）に示されるように、ヒト正常ケラチノサイトにメラニンを添加すると、速やかにメラニンを貪食したのち、核の周りに集積した。その後、培養２日目以降からは、顕微鏡像により、細胞分裂の停滞が観察された。【００８６】
図３（ｃ）は、メラニンの添加後０、２、４、及び７日目における、各メラニン濃度での細胞増殖指標（アラマーブルー測定値）を示すグラフである。図３（ｃ）に示すように、メラニン無添加（メラニン濃度０．００％）の場合は培養７日目まで細胞の増殖が観察されるが、メラニン濃度が０．０１％の場合には、４日目から細胞増殖の低下が観察され、メラニン濃度を０．０４％まで引き上げると、濃度依存的に添加２日目から細胞増殖の顕著な低下が観察された。また、メラニン濃度を０．０４％とした場合には、２日目以降のアラマーブルー値はほとんど変わらなくなり、メラニン添加時の値をほぼ保っている。アラマーブルーは細胞の呼吸活性を検出しているので、細胞が死滅してしまった訳ではないことが分かる。つまり、細胞は増殖も分化もせず、止まった状態で生存していると考えられる。【００８７】
なお、メラニンの添加によって、培養液の成分がメラニンに吸着する等の影響が生じないことを確認するべく、培養液をメラニンと共に予めインキュベート（３日）した後、メラニンを除去した培養液を使って細胞を培養し、観察を行なったところ、細胞の増殖にそのような影響は現れなかった。【００８８】
また、微粒子として、マイクロビーズ（平均径２μｍのポリスチレンビーズ、Polyscience社より購入）及びメラノソーム（ヒト正常メラノサイトから超遠心分画法により調製）を用い、上述と同様の実験を行なったところ、やはり同様の現象が生じることが観察された。【００８９】
メラニンを貪食し、分裂が低下したケラチノサイトの状態を更に詳しく解析するために、分裂低下ケラチノサイトと正常ケラチノサイトの双方から全ＲＮＡを抽出し、それらの遺伝子発現プロファイルを比較した。解析には、ヒトの全遺伝子が収載されたＤＮＡマイクロアレイを用いた。その結果、細胞の分裂に必要なサイクリン関係遺伝子のうち、多数の遺伝子の発現が低下していることが分かった。細胞増殖マーカーであるＰＣＮＡも０．５３倍に低下していた。更にサイクリンインヒビター群を見てみると、これらは逆に発現亢進していることが判明した。【００９０】
これらのサイクリンの低下がタンパク質レベルでも起きているか否かを調べるため、ウエスタンブロッティングを用いてサイクリンＤ及びサイクリンＢのタンパク質発現を調べた。その結果、これらのサイクリンは、タンパク質レベルでも発現が低下していることが確認された。【００９１】
上記の結果から、メラニンを溜め込んだケラチノサイトの分裂低下は、単なる毒性というよりは、セルサイクル決定機構の関与する能動的な増殖低下現象であることが示唆される。【００９２】
この様に、メラニンを貪食させた培養ケラチノサイトの分裂が低下したという結果は、シミ部位のメラニンを溜め込んだ基底層ケラチノサイトの分裂が低下していたという上述の観察知見と見事に合致している。つまり、シミ組織で観察されたメラニン含有ケラチノサイトの増殖分化低下現象が、培養細胞の系でも再現されたと考えられる。このようにメラニンを溜め込んで増殖も分化もしない、増殖分化低下状態に陥った黒いケラチノサイトが基底層一面に存在してしまうことが、シミ部位の色素沈着の慢性化要因であると考えられる。【００９３】
［実施例３］
メラニン含有ケラチノサイトの分裂正常化薬剤のスクリーニング【００９４】
実施例２と同様の手順により、培養ヒト正常ケラチノサイトに微粒子を貪食させて細胞分裂が低下した状態を作製し、その正常化、つまり細胞分裂の促進を指標にした薬剤スクリーニング系の構築を行い、その系を用いて薬剤スクリーニングを試みた。【００９５】
スクリーニング系の構築
（１）ヒト正常ケラチノサイトを、５％のＣＯ2ガスを含有する空気雰囲気下、温度３７℃、湿度９５％のインキュベータ内で、Defined Keratinocyte-SFM培養液（Invitrogen社製Gibco）を用いて培養した。また、ヒト正常メラノサイトを、上記と同じ環境下で、Medium254＋HMGS培養液（KURABO）を用いて培養した。【００９６】
（２）微粒子としてメラニン（Sigma社製Sepia melanin（イカ由来）、パウダー状）を用い、ＰＢＳバッファーに滅菌下で拡散させ、適当な濃度の懸濁液を作製した。【００９７】
（３）（２）の懸濁液を添加した培養液（培養液に対するメラニン最終濃度０．００１〜０．０４％Ｗ／Ｖ、細胞数が半分程度に増殖する濃度）を、（１）の細胞培養液と交換してインキュベーションを行い、メラニンを３日間貪食させた（なお、メラニンの添加によって、培養液の成分がメラニンに吸着する等の影響が生じないことを、実施例２と同様の手法により予め確認した。）。その後、メラニンを含まない新鮮な培養液に交換して、余分なメラニンを洗い流した。これに評価対象となる後述の薬剤（候補化合物）を種々の濃度（０．１〜０．８％Ｗ／Ｖ）で添加して、上記培養条件で更に２〜３日間培養を続けた。この際、コントロールとしてメラニンを添加しない細胞も用意し、同様に処理した。【００９８】
（４）薬剤添加後２〜３日目に、アラマーブルーアッセイによって細胞増殖指標を測定した。アラマーブルーアッセイは、細胞培養液に１／１０容量のアラマーブルー溶液（Bio Source社）を添加したのち、培養用インキュベータ内で１時間静置後、培養上清の一部を採取して９６穴プレートに移し、蛍光プレートリーダーによって５４４ｎｍで励起し、５９０ｎｍで測定を行った。【００９９】
薬剤スクリーニング
各種植物抽出液など約２００品の薬剤について、上記のスクリーニング系を用いて実際にスクリーニングを行った。その結果、ヨモギエキス、カワラヨモギエキス、及びモモ葉エキスが、メラニン含有ケラチノサイトの分裂を促進する効果を有することを見出だした（これらの薬剤を適宜「選定薬剤」と称する。）。【０１００】
選定薬剤のうちヨモギエキスを、メラニンを含有しないケラチノサイトに添加したときの増殖指標（アラマーブルーアッセイ）のグラフを図４（ａ）に、メラニン含有ケラチノサイトに添加したときの増殖指標のグラフを図４（ｂ）に示す。ヨモギエキスは、メラニンを含有しないケラチノサイトに添加しても増殖を亢進しないが、メラニン含有ケラチノサイトに対しては細胞増殖を亢進させる効果があることが分かる。【０１０１】
図５は、別の選定薬剤であるカワラヨモギエキス及びモモ葉エキスが、微粒子としてマイクロビーズを含有するケラチノサイトに与える影響を示す増殖指標（アラマーブルーアッセイ）のグラフである。グラフ中、ａは、マイクロビーズを含有しないケラチノサイトに対し、選定薬剤を添加しない状態で培養した場合の増殖指標（アラマーブルーアッセイ）の値を示す。ｂ、ｃ、及びｄは、微粒子としてマイクロビーズ（φ２μｍ、培養液に対し２．２×１０7個／ｍｌ）を用いて得られたマイクロビーズ含有ケラチノサイトに対し、薬剤を添加しない場合（ｂ）、カワラヨモギエキス０．２％を添加した場合（ｃ）、及び、モモ葉エキス０．２％を添加した場合（ｄ）の増殖指標（アラマーブルーアッセイ）の値を示す。図８から、カワラヨモギエキス及びモモ葉エキスが、マイクロビーズを貪食して増殖が低下したケラチノサイトに対して、増殖を亢進させる効果を有することが分かる。【０１０２】
以上の結果から、上記のスクリーニング系を用いて得られた選定薬剤は、メラニンを含有して分裂が低下したケラチノサイトを特異的に分裂させる一方で、正常なケラチノサイトやメラノサイトにはこのような影響を与えない、つまり増殖亢進作用をシミ部位の色素沈着の慢性化要因であるメラニン含有ケラチノサイトに限局して与えることができる。よってこれらの選定薬剤を用いれば、副作用を抑えながら効果的にシミに対処することが可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明は、医薬品や化粧品に関する分野、特に、皮膚シミ形成を予防し、及び／又は、皮膚シミを改善する医薬品や化粧品の分野において、好適に利用することができる。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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