【手続補正書】
【提出日】平成23年8月1日(2011.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性遺伝子座の選択された部分の欠失を含むトランスジェニックニワトリ。
【請求項２】
破壊された内因性遺伝子が、免疫グロブリン遺伝子座である請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項３】
前記破壊された内因性遺伝子が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座である請求項２に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項４】
前記破壊された内因性遺伝子が、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座である請求項２に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項５】
前記破壊された内因性遺伝子が、Ｖ−遺伝子セグメント、Ｊ−遺伝子セグメント、およびＣ−遺伝子セグメント、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子セグメントの欠失を含む請求項２に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項６】
破壊された内因性遺伝子座が、ターゲティング構築物を含む請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項７】
前記ターゲティング構築物が、停止コドン、ａｔｔ−ｐ部位、ナンセンス配列またはそれらの組み合わせを内因性遺伝子座に挿入する請求項６に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項８】
前記ターゲティング構築物が、前記内因性遺伝子座に対する２つの相同領域および該相同領域間に位置する選択マーカーから構成される請求項６に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項９】
内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子および内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の両方の機能性破壊を含む請求項２に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１０】
前記内因性遺伝子座の欠失部分が、少なくとも１０ｋｂを含む請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１１】
トランスジェニックニワトリを生産する方法であって、ターゲティング構築物が細胞のゲノムへの安定した組み込みによって内因性遺伝子の少なくとも一部を破壊するようにターゲティング構築物をニワトリ始原生殖細胞に組み込み、該始原生殖細胞をニワトリ胚に挿入し、該胚からトランスジェニックニワトリを孵化させることを含み、ここで、該ニワトリは、該内因性遺伝子の機能的な破壊を含む方法。
【請求項１２】
前記内因性遺伝子が、免疫グロブリン遺伝子である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン遺伝子が、軽鎖遺伝子である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン遺伝子が、重鎖遺伝子である請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ターゲティング構築物が、Ｖ−遺伝子セグメント、Ｊ−遺伝子セグメント、およびＣ−遺伝子セグメント、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるセグメントを欠失する請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ターゲティング構築物が、停止コドン、ナンセンス配列、ａｔｔ−ｐ部位またはそれらの組み合わせを挿入する請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ターゲティング構築物が、前記内因性遺伝子に対する少なくとも２つの相同領域から構成される請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞のゲノムへの前記ターゲティング構築物の組み込みが、２つの相同領域の間に位置する選択マーカーを前記ターゲティング構築物と前記内因性遺伝子との間に配置する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ターゲティング構築物が、ポジティブ選択マーカーから構成される請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ターゲティング構築物が、ネガティブ選択マーカーから構成される請求項１１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
別の適用では、選択マーカーをコードする配列を含む導入遺伝子は、ｌｏｘＰ部位に隣接することができる。これらの導入遺伝子を保有するトランスジェニック鳥は、生殖細胞系で発現されるプロモーターの管理下でＣｒｅ組み換え酵素を発現する鳥と交配させることができる。この交配から作出された鳥は、選択マーカーの切り出し後に孵化するであろう。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
内因性遺伝子座の選択された部分の欠失を含むトランスジェニックニワトリ。
（項目２）
破壊された内因性遺伝子が、免疫グロブリン遺伝子座である項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目３）
前記破壊された内因性遺伝子が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座である項目２に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目４）
前記破壊された内因性遺伝子が、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座である項目２に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目５）
前記破壊された内因性遺伝子が、Ｖ−遺伝子セグメント、Ｊ−遺伝子セグメント、およびＣ−遺伝子セグメント、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子セグメントの検出を含む項目２に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目６）
破壊された内因性遺伝子座が、ターゲティング構築物を含む項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目７）
ターゲティング構築物が、停止コドン、ａｔｔ−ｐ部位、ナンセンス配列またはそれらの組み合わせを内因性遺伝子座に挿入する項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目８）
前記ターゲティング構築物が、内因性遺伝子座に対する２つの相同領域および相同領域間に位置する選択マーカーから構成される項目６に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目９）
重鎖の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子および内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の両方の機能性破壊を含む項目２に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目１０）
前記内因性遺伝子座の欠失部分が、少なくとも１０ｋｂを含む項目１に記載のトランスジェニックニワトリ。
（項目１１）
トランスジェニックニワトリを生産する方法であって、ターゲティング構築物が細胞のゲノムへの安定した組み込みによって内因性遺伝子の少なくとも一部を破壊するようにターゲティング構築物をニワトリ始原生殖細胞に組み込み、始原生殖細胞をニワトリ胚に挿入し、胚からトランスジェニックニワトリを孵化させることを含み、ここで、該ニワトリは、内因性遺伝子の機能的な破壊を含む方法。
（項目１２）
前記内因性遺伝子が、免疫グロブリン遺伝子である項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記免疫グロブリン遺伝子が、軽鎖遺伝子である項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記免疫グロブリン遺伝子が、重鎖遺伝子である項目１２に記載の方法。
（項目１５）
ターゲティング構築物が、Ｖ−遺伝子セグメント、Ｊ−遺伝子セグメント、およびＣ−遺伝子セグメント、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるセグメントを欠失する項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記ターゲティング構築物が、停止コドン、ナンセンス配列、ａｔｔ−ｐ部位またはそれらの組み合わせを挿入する項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記ターゲティング構築物が、内因性遺伝子に対して少なくとも２つの相同領域から構成される項目１１に記載の方法。
（項目１８）
細胞ゲノムへの前記ターゲティング構築物の組み込みが、２つの相同領域の間に位置する選択マーカーをターゲティング構築物と内因性遺伝子との間に配置する項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ターゲティング構築物が、ポジティブ選択マーカーから構成される項目１１に記載の方法。
（項目２０）
前記ターゲティング構築物が、ネガティブ選択マーカーから構成される項目１１に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
【表７】
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（実施例２０：遺伝子改変ＰＧＣを保有するキメラの子孫における導入遺伝子の遍在発現）
βアクチン−ＧＦＰがゲノムに安定に組み込まれたＰＧＣを保有するキメラを、野生型雌鶏と交配し、胚をＧＦＰの発現についてスコアリングした。胚中の発現の例を図１３に示し、これは、ＧＦＰが発生のステージ３４（Ｈ＆Ｈ）までのトランスジェニック子孫の全組織中で発現することを示す。より高齢の動物では、凍結切片を使用した組織学的実験のために組織を調製した。１〜２週齢のニワトリひなの膵臓、皮膚、肺、脳、卵巣（示さず）、腎臓、嚢（示さず）、十二指腸、胸部、心臓、肝臓、脾臓、胃および精巣由来の組織は、孵化後の発現が動物中に遍在したままであることを証明する（図１４）。