【手続補正書】
【提出日】平成23年3月25日(2011.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ以上の核酸と一つ以上の非ポリマーカチオンとを含む複数の核酸微小粒子を含む組成物であって、該微小粒子が実質的に球状、周囲温度で水溶性であり、０．５ミクロン〜５ミクロンの平均粒径を有し、該微小粒子が、ポリマーポリカチオンを含まず、そして必要に応じて、１０重量％未満の該一つ以上の非ポリマーカチオンと、５０重量％より多い該一つ以上の核酸とを含む、組成物。
【請求項２】
前記微小粒子が、約４重量％〜約１０重量％の間の非ポリマーカチオンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記微小粒子が、６重量％未満の一つ以上の非ポリマーカチオンと、６０重量％より多い前記一つ以上の核酸とを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
非核酸マトリックスおよび非核コア、および必要に応じて、非核エンベロープ（ｎｏｎ−nucleic ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を含まない、請求項１〜３のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項５】
前記非ポリマーカチオンが、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎａ＋、Ｂａ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、およびＬｉ＋からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項７】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項８】
前記核酸が、疎水性部分を含むように修飾される、請求項１〜７のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項９】
前記疎水性部分が、コレステロールである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一つに記載の組成物を含む、エアゾール組成物。
【請求項１１】
核酸微小粒子を作製する方法であって、該方法は：
ａ）ホスホロチオエート化核酸溶液と、０．１Ｍ〜５Ｍの濃度の非ポリマーカチオン溶液とを含む混合物を、該混合物から透明な溶液を形成させるのに十分な温度で十分な時間、インキュベートするステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の溶液を、核酸と非ポリマーカチオンとを含む実質的に球状の微小粒子の集団が形成されるまで、約１〜約１０℃の温度に冷却するステップ
を含み、必要に応じて、
（ｃ）該ステップ（ｂ）の微小粒子を単離するステップ
を含み、さらに必要に応じて、
（ｄ）該単離された微小粒子を、ポリマー水溶液中に再懸濁した後、遠心分離を用いて該微小粒子を沈降させるステップ
を含み、さらに必要に応じて、
（ｅ）該沈降した微小粒子を再懸濁し、該再懸濁された微小粒子を凍結乾燥させて、凍結乾燥微小粒子を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ａ）またはステップ（ｂ）の混合物に、ポリマー溶液を加えるステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ｂ）におけるインキュベーション温度が、約２５℃〜約９０℃であり、そして／または該ステップ（ｂ）におけるインキュベーション時間が、約１分〜約１時間である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、実質的に球状の微小粒子を含むミクロスフィア集団および／または少なくとも５５重量％の核酸を含む微小粒子を生成する、請求項１１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
前記インキュベーション温度が、７０℃である、請求項１１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
核酸微小粒子を作製する方法であって、該方法は：
一つ以上の核酸、一つ以上の非ポリマーカチオン、および一つ以上の非イオン性ポリマーを含む、溶液または分散物を形成するステップと；
複数の実質的に球状の核酸微小粒子を形成するために、該溶液または分散物を冷却するステップであって、該微小粒子が、ポリマーポリカチオンを含まず、非核酸マトリックスも、コアも、エンベロープも含まない、ステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
前記一つ以上の核酸が、疎水性部分を含むように修飾される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記疎水性部分が、コレステロールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記一つ以上の非ポリマーカチオンの、前記一つ以上の核酸に対するモル比が、５０，０００：１以下である、請求項１１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸が、阻害性ＲＮＡ分子である、請求項１１〜１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２１】
前記非ポリマーカチオンが、多価カチオンである、請求項１１〜２０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
前記多価カチオンが、前記混合物中に、約７．５Ｍ以上で存在する、請求項１１〜２１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２３】
前記多価カチオンが、前記混合物中に、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭで存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記非ポリマーカチオンが、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎａ＋、Ｂａ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、およびＬｉ＋からなる群より選択される、請求項１１〜２３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）との混合物である、請求項１２〜２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリマーが、前記混合物中に、約１２．５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）存在する、請求項１２〜２５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２７】
医薬において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項２８】
微小粒子を標的粘膜に送達するための、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項２９】
前記標的粘膜が、頬粘膜、食道粘膜、胃粘膜、腸粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、気管支粘膜、子宮粘膜、および子宮内膜からなる群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
医薬の調製における、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の組成物の使用。
【請求項３１】
前記医薬が、標的粘膜に侵入して作用するために有効な量で患者に投与される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記標的粘膜が、頬粘膜、食道粘膜、胃粘膜、腸粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、気管支粘膜、子宮粘膜、および子宮内膜からなる群より選択される、請求項３１に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
一つ以上の核酸と一つ以上の非ポリマーカチオンとを含む複数の核酸微小粒子を含む組成物であって、該微小粒子が実質的に球状、周囲温度で水溶性であり、０．５ミクロン〜５ミクロンの平均粒径を有し、該微小粒子が、ポリマーポリカチオンを含まない、組成物。
（項目２）
非核酸マトリックスおよび非核コア（ｎｏｎ−nucleic core）を含まない、項目１に記載の組成物。
（項目３）
非核酸マトリックス、非核コアおよび非核エンベロープ（ｎｏｎ−nucleic ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を含まない、項目１に記載の組成物。
（項目４）
上記微小粒子が、約４重量％〜約１０重量％の間の非ポリマーカチオンを含む、項目１に記載の組成物。
（項目５）
上記無機カチオンが、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎａ＋、Ｂａ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、およびＬｉ＋からなる群より選択される、項目４に記載の組成物。
（項目６）
上記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１に記載の組成物。
（項目７）
上記核酸が、ｓｉＲＮＡである、項目１に記載の組成物。
（項目８）
上記組成物中の上記微小粒子が、単分散している、項目１に記載の組成物。
（項目９）
一つ以上の核酸と一つ以上の非ポリマーカチオンとを含む複数の核酸微小粒子を含む組成物であって、該微小粒子は実質的に球状、固体、周囲温度で水溶性であり、０．５ミクロン〜５ミクロンの平均粒径を有し、該微小粒子は、１０重量％未満の該一つ以上の非ポリマーカチオンと、５０重量％より多い該一つ以上の核酸とを含む、組成物。
（項目１０）
上記微小粒子が、６重量％未満の一つ以上の非ポリマーカチオンと、６０重量％より多い上記一つ以上の核酸とを含む、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
核酸微小粒子を作製する方法であって、該方法は：
ａ）アンチセンスホスホロチオエート化核酸溶液を、０．１Ｍ〜５Ｍの濃度の、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＬｉＣｌからなる群より選択されるポリマーカチオン溶液と、混合するステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の混合物を、該混合物から透明な溶液を形成させるのに十分な温度で十分な時間、インキュベートするステップと；
ｃ）ステップ（ｂ）の溶液を、核酸と非ポリマーカチオンとを含む実質的に球状の微小粒子の集団が形成されるまで、約１〜約１０℃の温度に冷却するステップ
を含む、方法。
（項目１２）
上記ステップ（ａ）またはステップ（ｂ）の混合物に、１：１比の１２．５％ポリエチレングリコール：ＰＶＰを含むポリマー溶液を加えるステップをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記ステップ（ｂ）におけるインキュベーション温度が、約２５℃〜約９０℃である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
上記ステップ（ｂ）におけるインキュベーション時間が、約１分〜約１時間である、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
（ｅ）上記ステップ（ｄ）の微小粒子を、単離するステップをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
上記微小粒子が、遠心分離を用いた沈降により単離される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
（ｆ）上記単離された微小粒子を、ポリマー水溶液中に再懸濁した後、遠心分離を用いて該微小粒子を沈降させるステップをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
一つ以上の（ｅ）沈降および（ｆ）再懸濁のステップをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記沈降した微小粒子を再懸濁し、該再懸濁された微小粒子を凍結乾燥させて、凍結乾燥微小粒子を生成するステップを含む、項目１７または項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記方法が、実質的に球状の微小粒子を含むミクロスフィア集団を生成する、項目１１に記載の方法。
（項目２１）
上記方法が、周囲温度で実質的に水溶性のミクロスフィア集団を生成する、項目１１に記載の方法。
（項目２２）
上記方法が、約０．５ミクロン〜約３ミクロンの間の平均粒径を有する微小粒子集団を生成する、項目１１に記載の方法。
（項目２３）
上記方法が、少なくとも５５重量％の核酸を含む微小粒子を生成する、項目１１に記載の方法。
（項目２４）
上記方法が、約５５重量％〜約８５重量％の間の核酸を含む微小粒子を生成する、項目１１に記載の方法。
（項目２５）
上記方法が、約５５重量％〜約９０重量％の間の核酸を含む微小粒子を生成する、項目１１に記載の方法。
（項目２６）
上記方法が、約５５重量％〜約９５重量％の間の核酸を含む微小粒子を生成する、項目１１に記載の方法。
（項目２７）
上記微小粒子が、約４重量％〜約１０重量％の間の非ポリマーカチオンを含む、項目１１に記載の方法。
（項目２８）
上記微小粒子を形成するための上記溶液のｐＨ範囲が、約３〜約１０の間である、項目１１に記載の方法。
（項目２９）
上記非ポリマーカチオン溶液が、ＣａＣｌ２溶液である、項目１１に記載の方法。
（項目３０）
上記非ポリマーカチオン溶液が、ＺｎＣｌ２溶液である、項目１１に記載の方法。
（項目３１）
上記非ポリマーカチオン溶液が、ＭｇＣｌ２溶液である、項目１１に記載の方法。
（項目３２）
上記非ポリマーカチオン溶液が、ＮａＣｌ溶液である、項目１１に記載の方法。
（項目３３）
上記ＣａＣｌ２が１．２５Ｍの濃度で提供され、上記インキュベーション温度が７５℃であり、上記生成される微小粒子が１〜２ミクロンの間のサイズを有する、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
上記ＣａＣｌ２が１Ｍの濃度で提供され、上記インキュベーション温度が７５℃であり、上記生成される微小粒子が１．３〜２．３ミクロンの間のサイズを有する、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
上記インキュベーション温度が、７０℃である、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
上記ＣａＣｌ２の濃度が約０．６７Ｍであるとき、上記生成される微小粒子が、約２〜２．６ミクロンの間のサイズを有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
上記ＣａＣｌ２の濃度が約０．１５Ｍ〜０．７５Ｍの間であるとき、上記生成される微小粒子が、約２〜２．６ミクロンの間のサイズを有する、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
項目１１に記載の方法にしたがって調製される、微小粒子組成物。
（項目３９）
項目１に記載の組成物または項目３８に記載の組成物を含む、エアゾール組成物。
（項目４０）
治療を必要とする対象を治療する方法であって、項目３６に記載のエアゾール組成物を該対象に投与するステップを含む、方法。
（項目４１）
一つ以上の核酸と一つ以上の非ポリマーカチオンとを含む核酸微小粒子であって、該微小粒子が、ポリカチオン性ポリカチオンを含まず、非核酸マトリックス、コア、またはエンベロープを含まない、核酸微小粒子。
（項目４２）
核酸微小粒子を作製する方法であって、該方法は：
一つ以上の核酸、一つ以上の非ポリマーカチオン、および一つ以上の非イオン性ポリマーを含む、溶液または分散物を形成するステップと；
複数の実質的に球状の核酸微小粒子を形成するために、該溶液または分散物を冷却するステップであって、該微小粒子が、ポリマーポリカチオンを含まず、非核酸マトリックス、コア、またはエンベロープを含まない、ステップ
を含む、方法。
（項目４３）
上記一つ以上の核酸が、疎水性部分を含むように修飾される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
上記疎水性部分が、コレステロールである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
上記一つ以上の非ポリマーカチオンの、上記一つ以上の核酸に対するモル比が、５０，０００：１以下である、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
上記冷却ステップが、０．５℃／分の速度で行われる、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
上記冷却ステップが、０．７５℃／分の速度で行われる、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
上記冷却ステップが、０．８℃／分の速度で行われる、項目４２に記載の方法。
（項目４９）
上記冷却ステップが、約４℃で終了する、項目４２に記載の方法。
（項目５０）
上記冷却ステップが、約０℃で終了する、項目４２に記載の方法。
（項目５１）
上記冷却ステップが、約−５℃で終了する、項目４２に記載の方法。
（項目５２）
核酸微小粒子を作製する方法であって、該方法は：
コレステロール修飾核酸、水溶性ポリマーおよび多価カチオンの混合物を、インキュベートするステップと、
微小粒子を形成するのに十分な速度で、時間にわたって該混合物を冷却するステップ
を含む、方法。
（項目５３）
上記冷却ステップが、０．５℃／分の速度で行われる、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
上記冷却ステップが、０．７５℃／分の速度で行われる、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
上記冷却ステップが、０．８℃／分の速度で行われる、項目５２に記載の方法。
（項目５６）
上記冷却ステップが、約４℃で終了する、項目５２に記載の方法。
（項目５７）
上記冷却ステップが、約０℃で終了する、項目５２に記載の方法。
（項目５８）
上記冷却ステップが、約−５℃で終了する、項目５２に記載の方法。
（項目５９）
上記核酸が、阻害性ＲＮＡ分子である、項目５２に記載の方法。
（項目６０）
上記核酸が、ｓｉＲＮＡである、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
上記多価カチオンが、項目３に記載のとおりである、項目５２に記載の方法。
（項目６２）
上記多価カチオンが、Ｍｇ＋＋またはＣａ＋＋である、項目５２に記載の方法。
（項目６３）
上記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、項目５２に記載の方法。
（項目６４）
上記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の混合物である、項目５２に記載の方法。
（項目６５）
上記混合物が、室温でインキュベートされる、項目５２に記載の方法。
（項目６６）
上記混合物が、３７℃でインキュベートされる、項目５２に記載の方法。
（項目６７）
上記混合物が、６５℃でインキュベートされる、項目５２に記載の方法。
（項目６８）
上記インキュベートするステップが、約５分〜約１０分行われる、項目５２に記載の方法。
（項目６９）
上記水溶性ポリマーが、上記混合物中に、約１２．５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）存在する、項目５２に記載の方法。
（項目７０）
上記水溶性ポリマーが、上記混合物中に、約１２．５％（ｗ／ｖ）存在する、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
上記水溶性ポリマーが、上記混合物中に、約１６．７％（ｗ／ｖ）存在する、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
上記水溶性ポリマーが、上記混合物中に、約２０％（ｗ／ｖ）存在する、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
上記多価カチオンが、上記混合物中に、約７．５Ｍ〜１Ｍを超えて存在する、項目５２に記載の方法。
（項目７４）
上記多価カチオンが、上記混合物中に、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、〜約２５ｍＭ、または〜約３５ｍＭで存在する、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
上記多価カチオンが、上記混合物中に、約２５ｍＭで存在する、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
項目４２〜７５のいずれか一つに記載の方法により生成される、微小粒子。
（項目７７）
微小粒子を標的粘膜に送達するための方法であって、標的粘膜に浸透してその上または中で作用するのに有効な量の項目７６に記載の微小粒子と、該標的粘膜を接触させるステップを含む、方法。
（項目７８）
上記標的粘膜が、頬粘膜、食道粘膜、胃粘膜、腸粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、気管支粘膜、子宮粘膜、および子宮内膜からなる群より選択される、項目７７に記載の方法。
本開示は、微小粒子が核酸および非ポリマーカチオンで作られ、湿潤または水性の標的位置（例えば肺組織）への投与に適する、組成物に関する。微小粒子は、標的位置で溶解により核酸を放出して、放出された核酸を標的細胞と自由に相互作用させる、実質的に球状の核酸微小粒子である。