(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸の結晶であり、粉末Ｘ線回折において、２θ（°）１７．１、１７．７、１８．７、１９．９及び２１．０°にピークを有する結晶。
【請求項２】
示差熱熱重量同時測定において、１７８〜１８２℃に熱吸収ピークを有する、請求項１記載の結晶。
【請求項３】
請求項１又は２記載の結晶を有効成分として含有する、医薬。
【請求項４】
請求項１又は２記載の結晶を有効成分として含有する、炎症性腸疾患、アレルギー性皮膚炎、多発性硬化症又は白血病、の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリシン誘導体の結晶及びその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品は、流通や保管等の長期過程に渡って品質が保持される必要があり、有効成分となる化合物には、化学的及び物理学的に高い安定性が要求されている。このため、医薬品の有効成分は、非晶質体に比べて高い安定性が期待できる結晶が採用されることが一般的である。【０００３】
医薬品の有効成分の結晶をスクリーニングするにおいては、結晶を得るための最適条件を見出すことが困難なだけでなく、結晶が得られた場合であっても、しばしば結晶多形の存在が問題となることが多い。それぞれの結晶形は、分子単位では同一構造であるにも関わらず分子充填様式が異なるために、化学的及び物理学的な安定性に差異を生じるからである。【０００４】
また、医薬品の有効成分として採用する結晶形の選択を誤れば、保管時の外部環境によって純度低下、水和度の変化、結晶形転移等が起こり、化合物を一定の品質に維持することが困難となるため、結晶形によっては薬効の低下や副作用等の不測の事態を招くことになる。このため、医薬品の有効成分となる化合物の結晶の取得に成功した場合には、その結晶多形についても厳密な評価検討が必要とされている。【０００５】
一方、以下の化学式（Ｉ）で示される（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸は、炎症性腸疾患、アレルギー性皮膚炎、多発性硬化症及び白血病に対しての治療効果を発揮することが知られている（特許文献１〜４）。
【化１】
0005998933.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／０６８２１３号
【特許文献２】国際公開第２００７／１４５２８２号
【特許文献３】国際公開第２００７／１４８６４８号
【特許文献４】国際公開第２００７／１４８６７６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、化合物の構造から、結晶多形の有無又は安定な結晶形を予測することは不可能であり、さらに結晶を形成できない化合物も存在する場合もあることから、化合物ごとに結晶を形成させる条件を種々検討する必要がある。また、（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸については、医薬品の有効成分として高い有効性が認められているにも関わらず、結晶多形の存在はおろか、そもそも結晶の形成の可否すら知られていないのが現状であり、最適な結晶形の取得が医薬品として開発する上での重要な課題となっていた。【０００８】
そこで本発明は、化学的及び物理学的安定性に優れる（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸の結晶及びその医薬用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸の結晶の形成に成功し、Ａ形、Ｂ形、Ｃ形、Ｄ形及びＥ形（水和物）の結晶多形並びに複数の溶媒和物結晶が存在することを見出し、本発明を完成させた。中でもＢ形、Ｃ形、Ｄ形及びＥ形（水和物）結晶は、低吸湿性で、物理学的安定性においても極めて優れ、Ｂ形、Ｃ形及びＥ形（水和物）結晶は、苛酷な保存条件においても化学的及び物理学的安定性に極めて優れ、Ｃ形結晶は、溶媒に曝される外部環境であっても物理学的安定性に極めて優れるものであった。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）に記載した結晶及びその医薬用途を提供する。
（１）  （Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸の結晶であり、粉末Ｘ線回折において、２θ（°）１７．１、１７．７、１８．７、１９．９及び２１．０°にピークを有する結晶。
（２）  示差熱熱重量同時測定において１７８〜１８２℃に熱吸収ピークを有する、上記（１）に記載の結晶。
（３）  上記（１）又は（２）に記載の結晶を有効成分として含有する、医薬。
（４）  上記（１）又は（２）に記載の結晶を有効成分として含有する、炎症性腸疾患、アレルギー性皮膚炎、多発性硬化症又は白血病、の治療剤又は予防剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の結晶は、非晶質体に比べて化学的及び物理学的安定性に優れることから、医薬品の有効成分として好適であり、薬効の低下や副作用等のリスクを抑制した信頼性の高い医薬の提供に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本化合物のＣ形結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図２】本化合物のＣ形結晶の示差熱熱重量同時測定により得られた示差熱分析曲線を示す図である。
【図３】本化合物のＢ形結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図４】本化合物のＢ形結晶の示差熱熱重量同時測定により得られた示差熱分析曲線を示す図である。
【図５】本化合物のＥ形（水和物）結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図６】本化合物のＥ形（水和物）結晶の示差熱熱重量同時測定により得られた示差熱分析曲線を示す図である。
【図７】本化合物のＡ形結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図８】本化合物のＡ形結晶の示差熱熱重量同時測定により得られた示差熱分析曲線を示す図である。
【図９】本化合物のＤ形結晶の粉末Ｘ線回折図である。
【図１０】本化合物のＤ形結晶の示差熱熱重量同時測定により得られた示差熱分析曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の結晶は、（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸の結晶であり、Ａ形、Ｂ形、Ｃ形、Ｄ形及びＥ形（水和物）という結晶多形の中でもＣ形結晶であることを特徴とする。
【００１４】
（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸（以下、「本化合物」と表記することがある）のそれぞれの結晶形は、粉末Ｘ線回折図が示す特徴的なピーク又は示差熱熱重量同時測定（以下、「ＴＧ−ＤＴＡ」）により得られる示差熱分析曲線（以下、「ＤＴＡ曲線」）が示す吸熱ピークによって識別することができる。なお、粉末Ｘ線回折図やＤＴＡ曲線は測定条件によって多少変わり得るものであり、例えば、粉末Ｘ線回折における回折角２θは、一般的に±０．２°程度の誤差は許容されるものである。
【００１５】
本化合物のＣ形結晶は、図１に示すように、粉末Ｘ線回折において回折角２θ（°）１７．１、１７．７、１８．７、１９．９及び２１．０°に特徴的なピークを有する。また、本化合物のＣ形結晶は、図２に示すＤＴＡ曲線を与え、１８０℃、すなわち１７８〜１８２℃の範囲に吸熱ピークを有する。
【００１６】
本化合物のＢ形結晶は、図３に示すように、粉末Ｘ線回折において回折角２θ（°）５．９、８．３、１１．８、１３．２及び２１．７°に特徴的なピークを有する。また、本化合物のＢ形結晶は、図４に示すＤＴＡ曲線を与え、１６９℃、すなわち１６７〜１７１℃の範囲に吸熱ピークを有する。
【００１７】
本化合物のＥ形（水和物）結晶は、図５に示すように、粉末Ｘ線回折において回折角２θ（°）６．６、８．３、１１．１、１４．６及び１８．２°に特徴的なピークを有する。また、本化合物のＥ形（水和物）結晶は、図６に示すＤＴＡ曲線を与え、１０２℃、すなわち１００〜１０４℃の範囲に吸熱ピークを有する。
【００１８】
本化合物のＡ形結晶は、図７に示すように、粉末Ｘ線回折において回折角２θ（°）５．７、７．４、１１．３及び１２．０°に特徴的なピークを有する。また、本化合物のＡ形結晶は、図８に示すＤＴＡ曲線を与え、１３９℃、すなわち１３７〜１４１℃の範囲に吸熱ピークを有する。
【００１９】
本化合物のＤ形結晶は、図９に示すように、回折角２θ（°）５．８、１１．５、１１．８及び２３．０°に特徴的なピークを有する。また、本化合物のＤ形結晶は、図１０に示すＤＴＡ曲線を与え、１３５℃、すなわち１３３〜１３７℃の範囲に吸熱ピークを有する。
【００２０】
粉末Ｘ線回折図を得るための粉末Ｘ線回折は、粉末Ｘ線回折装置を用いて、以下の条件で測定することができる。なお、測定試料は、試料板（材質：ケイ素；深さ：０．２ｍｍ）に試料を充填し、試料表面を平らにならして作製される。
≪粉末Ｘ線回折条件≫
Ｘ線源                ：  ＣｕＫα線
＊湾曲結晶モノクロメータ（グラファイト）を使用
出力                  ：  ４０ｋＶ／５０ｍＡ
発散スリット          ：  １／２°
発散縦制限スリット    ：  ５ｍｍ
散乱スリット          ：  １／２°
受光スリット          ：  ０．１５ｍｍ
検出器                ：  シンチレーションカウンタ
スキャン方式          ：  ２θ／θスキャン、連続スキャン
測定範囲（２θ）      ：  ２〜６０°
スキャン速度（２θ）  ：  ４°／ｍｉｎ
計数ステップ（２θ）  ：  ０．０２°
【００２１】
吸熱ピークとは、ＤＴＡ曲線上が示すピークトップの温度をいう。ここでＤＴＡ曲線を得るためのＴＧ−ＤＴＡは、ＴＧ−ＤＴＡ装置を用いて、以下の条件で測定できる。
≪ＴＧ−ＤＴＡ条件≫
昇温速度  ：  ５℃／分
雰囲気    ：  窒素（流速：５０ｍＬ／ｍｉｎ）
試料セル  ：  アルミニウムオープンセル
試料量    ：  ４〜６ｍｇ
【００２２】
本化合物のＣ形結晶は、任意の形態の本化合物を０．１〜５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度で芳香族系溶媒に溶解し、０〜３０℃で１〜３０日間静置又は撹拌して得ることができる。
【００２３】
また、本化合物のＣ形結晶は、任意の形態の本化合物を好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５０〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度で、５０〜８０℃のアルコール系溶媒に加熱溶解し、予め得ておいたＣ形結晶を種晶として添加後、５０〜８０℃で１〜４８時間撹拌し、さらに０〜３０℃で１〜２４時間撹拌して得ることができる。
【００２４】
本化合物のＢ形結晶は、任意の形態の本化合物を好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２５〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度でアルコール系溶媒に溶解し、０℃〜３０℃で１〜３０日間静置又は撹拌して得ることができる。
【００２５】
本化合物のＥ形（水和物）結晶は、本化合物の非晶質体１ｇに対して好ましくは水１０〜１０００ｍＬ、より好ましくは３〜１００ｍＬを添加して懸濁させ、０℃〜３０℃で１〜３０日間撹拌して得ることができる。
【００２６】
本化合物のＡ形結晶は、任意の形態の本化合物を好ましくは５〜２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度でトルエンに溶解し、０〜３０℃で１〜３０日間気密静置して得ることができる。
【００２７】
本化合物のＤ形結晶は、任意の形態の本化合物を好ましくは５〜２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度でアルコール系溶媒又はエステル系溶媒に溶解し、０〜３０℃で１〜３０日間静置又は撹拌して得ることができる。
【００２８】
上記の芳香族系溶媒としては、例えば、ベンゼン、クロロベンゼン、トルエン、キシレン又はクメンが挙げられるが、トルエン又はキシレンが好ましい。
【００２９】
上記のアルコール系溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール又は２−ブタノールが挙げられるが、メタノール、エタノール又は２―プロパノールが好ましい。
【００３０】
上記のエステル系溶媒としては、例えば、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル又は酢酸イソブチルが挙げられるが、酢酸メチル、酢酸エチル又は酢酸プロピルが好ましい。
【００３１】
本化合物の結晶は、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル、ウシ、ヒツジ又はヒト）に対する、炎症性腸疾患、アレルギー性皮膚炎、多発性硬化症又は白血病、の治療又は予防に有効な医薬として用いることができる。本化合物の結晶を医薬として、臨床で投与する場合の用量は、症状、年齢、体重、性別又は投与方法等に応じて適宜選択されるが、例えば注射剤の場合には、成人に対して有効成分量として１日０．０１ｍｇ〜５ｇ、経口剤の場合には０．１ｍｇ〜１０ｇが好適であり、それぞれ１回又は数回に分けて投与することができる。
【００３２】
本化合物の結晶を医薬として臨床投与する場合の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等の経口剤、吸入剤、注射剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤若しくは貼付剤等の非経口剤が挙げられる。これら剤形は製剤分野で一般的に用いられる方法に従って調製できる。この場合、必要に応じて、製剤分野において一般的に用いられる賦形剤、安定化剤、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤又は等張化剤等の添加剤が適宜混合されていてもよい。上記の剤形の調製に用いられる、薬理学的に許容される担体及び希釈剤としては、例えば、結合剤（シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ソルビトール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール又はトラガント等）、賦形剤（砂糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、エリスリトール、結晶セルロース、エチルセルロース、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン等）、崩壊剤（部分アルファ化デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン又は低置換度ヒドロキシプロピルセルロース）又は滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ又はショ糖脂肪酸エステル等）が挙げられる。
【００３３】
本化合物の結晶を有効成分として含有する医薬は、投与ユニット当たり、本化合物の結晶を０．００１〜９０重量％含有することが好ましく、０．０１〜７０重量％含有することがより好ましい。
【００３４】
本化合物の結晶は、医薬の製造性、配合性又は溶解性を制御するため、これを粉砕してから配合しても構わない。粉砕後の本化合物の結晶は、Ｄ９０が１０００μｍ以下の粒子径分布を持つことが好ましく、Ｄ９０が１００μｍ以下の粒子径分布を持つことがより好ましい。ここでＤ９０とは、粒子径が小さい方から累積して体積が９０％となる点、すなわち、体積分布の累積頻度が９０％に達する点の粒子径をいう。
【００３５】
本化合物の結晶を粉砕する方法としては、例えば、ジェットミル等の気流体式粉砕機又はハンマーミル、ピンミル若しくはボールミル等の高速回転衝撃式粉砕機を用いた粉砕が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３７】
（参考例１）：本化合物の非晶質体の調製
特許文献１記載の方法により製造した本化合物（１ｇ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶かし、エバポレーターで濃縮後、真空ポンプで３日間減圧乾燥をして、本化合物の非晶質体を得た。【００３８】
（参考例２）：本化合物の非晶質体の調製
特許文献１記載の方法により製造した本化合物（１ｇ）をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶かし、エバポレーターで濃縮後、真空ポンプで１日間減圧乾燥をして、本化合物の非晶質体を得た。【００３９】
（参考例３）：（Ｓ）−２−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）ペンタ−４−エン酸エチル（別名：（Ｓ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）ペント−４−エン酸エチル）の製造
【化２】
0005998933.tif 000003
２０００ｍＬのフラスコにＬ−アリルグリシンエチルエステルトシル酸塩（１００ｇ）を量り取り、系内をアルゴン雰囲気に置換した後、トルエン（５００ｍＬ）とトリエチルアミン（８８．５ｍＬ）を加えて懸濁した。この懸濁液を０℃に冷却した後、塩化２，６−ジクロロベンゾイル（５０．０ｍＬ）を２０分間かけて滴下し、０℃で４５分間撹拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム（５６ｇ）を水（８５０ｍＬ）に溶解して加え、撹拌後、分液した。水層をトルエン（４００ｍＬ）で抽出した後、有機層を合わせて水（４００ｍＬ）で洗浄した。有機層を２８５ｍＬまで減圧濃縮し、得られたトルエン溶液を０℃に冷却した。この溶液にヘプタン（１０００ｍＬ）を滴下し、０℃で２時間撹拌した。結晶を濾取し、氷冷したヘプタン（２００ｍＬ）で洗浄後、減圧乾燥して、８８．３ｇ（収率８８％）の（Ｓ）−２−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）ペンタ−４−エン酸エチルを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 1.31 (3H, t, J =7.1Hz), 2.66 (1H, m), 2.80 (1H, m), 4.20-4.30 (2H, m), 4.93 (1H, ddd, J =5.4, 5.4, 7.8Hz), 5.15 (1H, d, J =9.8Hz), 5.19 (1H, d, J =15.6Hz),5.78 (1H, m), 6.41 (1H, br.d, J =5.4Hz), 7.25-7.34 (3H, m).【００４０】
（参考例４）：（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸エチルの製造
【化３】
0005998933.tif 000004
５００ｍＬのフラスコ内をアルゴン雰囲気に置換した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１４４ｍＬ）とエタノール（１６ｍＬ）を加えた。参考例３で製造した（Ｓ）−２−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）ペンタ−４−エン酸エチル（１６．０ｇ）、特許文献１記載のＮ−（４−ヨードフェニル）−Ｎ−メチル−２−ピリミジニルアミン（別名：Ｎ−（４−ヨードフェニル）−Ｎ−メチルピリミジン−２−アミン）（１６．５ｇ）、臭化テトラｎ−ブチルアンモニウム（１６．３ｇ）、炭酸カリウム（１４．０ｇ）及び酢酸パラジウム（２３０ｍｇ）を順次加え、系内を再度アルゴン雰囲気に置換した後、５０℃で１８時間撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、水（３２０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２６５ｍＬ）で抽出した。抽出液を５％チオ硫酸ナトリウム水溶液（８０ｍＬ）で２回、５％塩化ナトリウム水溶液（８０ｍＬ）で２回洗浄した後、溶液重量が約７５ｇになるまで減圧濃縮した。濃縮液にエタノール（１００ｍＬ）を加えて約７５ｇまで減圧濃縮する操作を３回繰り返し、得られたエタノール溶液に活性炭（８．０ｇ）を加えて室温で３０分間撹拌した。活性炭を濾別し、エタノール（１０ｍＬ）で洗浄した。濾液に活性炭（４．０ｇ）を加えて室温で３０分間撹拌した後、活性炭を濾別し、エタノール１０ｍＬで洗浄した。濾液を７８ｇまで減圧濃縮し、得られたエタノール溶液を５０℃に加熱した。蒸留水（３０ｍＬ）を滴下した後、室温まで放冷し、更に０℃に冷却して１時間撹拌した。結晶を濾取し、氷冷したエタノール／水＝２／１混液（２０ｍＬ）で洗浄後、減圧乾燥して１８．３ｇ（収率７３％）の（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸エチルを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ1.32 (3H, t, J = 7.1Hz), 2.84 (1H, m), 2.97 (1H, m), 3.51 (3H, s), 4.25 (1H, m), 4.28 (1H, m), 5.01 (1H, m), 6.11 (1H, dt, J = 15.6, 7.6Hz), 6.48 (1H, m), 6.52 (1H, d, J = 15.6Hz), 6.58 (1H, t, J = 4.6Hz), 7.24-7.37 (7H, m), 8.33 (2H, d, J = 4.6Hz).【００４１】
（実施例１）：本化合物のＣ形結晶の製造
参考例１で調製した本化合物の非晶質体（３０ｍｇ）を硼硅酸ガラス製バイアル瓶に量り取り、トルエン（１５ｍＬ）を加え、室温で撹拌し溶解した。これを室温、開放状態で静置した。析出物を確認した後、パスツールピペットで溶媒を取り除き、真空ポンプを用いて３０分間減圧乾燥を行い、表題結晶を白色粉末で得た。得られた結晶について、粉末Ｘ線回折装置（株式会社リガク社；２２００／ＲＩＮＴ  ｕｌｔｉｍａ＋ＰＣ）を用いた粉末Ｘ線回折の測定及びＴＧ−ＤＴＡ装置（株式会社リガク社；ＴＧ８１０Ｄ）を用いたＴＧ−ＤＴＡを行った。これら測定の結果を、図１及び図２に示す。
回折角２θ  ：  １７．１、１７．７、１８．７、１９．９、２１．０°
吸熱ピーク  ：  １８０℃【００４２】
（実施例２）：本化合物のＣ形結晶の製造
５００ｍＬのフラスコに参考例４で製造した（Ｓ，Ｅ）−２−（２，６−ジクロロベンズアミド）−５−［４−（メチル−ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］ペント−４−エン酸エチル（５．５０ｇ）を量り取り、４ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１１０ｍＬ）を加えて懸濁した。この懸濁液を５０℃で６時間撹拌した。反応液を０℃まで冷却し、エタノール（５０ｍＬ）を加え、さらに水酸化ナトリウム（１８．５ｇ）を水（５０ｍＬ）に溶解して加え、室温で２０分間撹拌した。反応液を０℃に冷却し、４ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨを約３に調整した後、酢酸エチル（１５０ｍＬ）で抽出した。抽出液を水（１００ｍＬ）で洗浄した後、減圧濃縮した。濃縮物にエタノール（１００ｍＬ）を加えて溶液重量が１８ｇになるまで濃縮した後、ヘプタン（１５ｍＬ）を加え、室温で撹拌した。結晶を濾取し、減圧乾燥して、粗結晶４．６２ｇ（収率８９％）を得た。【００４３】
得られた粗結晶（４．２０ｇ）を、２００ｍＬのフラスコに量り取り、２−プロパノール（５６ｍＬ）を加え、加熱撹拌した。７３℃で溶解を確認した後、冷却を開始した。７０℃で種晶（１９０ｍｇ）を添加した後、５５℃まで冷却し、５５℃で１２時間撹拌した。その後０℃まで冷却し、０℃で１８時間撹拌した。結晶を濾取し、２−プロパノールで洗浄後、乾燥して、本化合物のＣ形結晶３．８５ｇ（収率９２％）を得た。得られた結晶について、粉末Ｘ線回折の測定及びＴＧ−ＤＴＡを行い、結果が図１及び図２と一致することを確認した。【００４４】
（参考例５）：本化合物のＢ形結晶の製造
参考例２で調製した本化合物の非晶質体（３０ｍｇ）を硼硅酸ガラス製バイアル瓶に量り取り、メタノール（１．１ｍＬ）を加え、室温で撹拌溶解した。これを室温、開放状態で静置した。析出物を確認した後、パスツールピペットで溶媒を取り除き、真空ポンプを用いて３０分間減圧乾燥して、本化合物のＢ形結晶を白色粉末として得た。得られた結晶について、粉末Ｘ線回折の測定及びＴＧ−ＤＴＡを行った。これら測定の結果を、図３及び図４に示す。
回折角２θ  ：  ５．９、８．３、１１．８、１３．２、２１．７°
吸熱ピーク  ：  １６９℃
【００４５】
（参考例６）：本化合物のＥ形（水和物）結晶の製造
参考例１で調製した本化合物の非晶質体（３０ｍｇ）を硼硅酸ガラス製バイアル瓶に量り取り、水（１０ｍＬ）を加え、一晩懸濁撹拌を行った。懸濁液から固形物を濾取し、本化合物のＥ形（水和物）結晶を白色粉末として得た。得られた結晶について、粉末Ｘ線回折の測定及びＴＧ−ＤＴＡを行った。これら測定の結果を、図５及び図６に示す。
回折角２θ  ：  ６．６、８．３、１１．１、１４．６、１８．２°
吸熱ピーク  ：  １０２℃
【００４６】
（参考例７）：本化合物のＡ形結晶の製造
参考例２で調製した本化合物の非晶質体（３０ｍｇ）を硅酸ガラス製バイアル瓶に量り取り、トルエン（３ｍＬ）を加え、室温で撹拌溶解した。その後硼硅酸ガラス製バイアル瓶に蓋をして、これを室温、気密状態で静置した。析出物を確認した後、パスツールピペットで溶媒を取り除き、真空ポンプを用いて３０分間減圧乾燥して、本化合物のＡ形結晶を白色粉末として得た。得られた結晶について、粉末Ｘ線回折の測定及びＴＧ−ＤＴＡを行った。これら測定の結果を、図７及び図８に示す。
回折角２θ  ：  ５．７、７．４、１１．３、１２．０°
吸熱ピーク  ：  １３９℃
【００４７】
（参考例８）：本化合物のＤ形結晶の製造
参考例１で調製した本化合物の非晶質体（３０ｍｇ）を硼硅酸ガラス製バイアル瓶に量り取り、エタノール（２ｍＬ）を加え、室温で撹拌溶解した。これを室温、開放状態で静置した。析出物が得られたことを確認した後、パスツールピペットで溶媒を取り除き、真空ポンプを用いて３０分間減圧乾燥して、本化合物のＤ形結晶を白色粉末で得た。得られた結晶について、粉末Ｘ線回折の測定及びＴＧ−ＤＴＡを行った。これら測定の結果を、図９及び図１０に示す。
回折角２θ  ：  ５．８、１１．５、１１．８、２３．０°
吸熱ピーク  ：  １３５℃
【００４８】
（試験例１）：吸湿性評価
≪平衡水分率測定条件≫
試料量              ：  ５〜１２ｍｇ
測定温度            ：  ２５℃
平衡設定重量／時間  ：  ０．０１ｗｔ％／５分間
最大平衡時間        ：  １８０分間
測定範囲            ：  相対湿度５％〜相対湿度９５％〜相対湿度５％
測定間隔            ：  相対湿度５％【００４９】
併せて結晶形の変化の有無を評価するため、吸湿性評価試験後のＡ形、Ｂ形、Ｃ形、Ｄ形及びＥ形結晶（水和物）の各結晶について、粉末Ｘ線回折の測定を行った。結果を表１に示す。なお、Ａ形結晶についてのみ、２５℃、相対湿度９０％で、測定範囲（２θ）を２〜３５°に変更して粉末Ｘ線回折の測定を行った。調湿には、湿度発生装置（ＨＵＭ−１Ａ；株式会社リガク社製）を用いた。【００５０】
【表１】
0005998933.tif 000005
【００５１】
表１に示すように、本化合物のＢ形、Ｃ形、Ｄ形及びＥ形（水和物）結晶は、加湿に伴う重量増加量にほとんど変化はなく、結晶形にも変化はなかった。これらの結果から、本化合物のＢ形、Ｃ形、Ｄ形及びＥ形結晶（水和物）が、物理学的安定性に極めて優れていることが明らかとなった。【００５２】
（試験例２）：固体安定性評価
本化合物の非晶質体、並びにＡ形、Ｂ形、Ｃ形、Ｄ形及びＥ形（水和物）結晶について、６０℃、気密状態で４週間保存し、以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」）により、保存前後の純度を測定した。また、粉末Ｘ線回折の測定及びＴＧ−ＤＴＡを行い、保存による結晶形の変化の有無を評価した。結果を表２に示す。なお、ＨＰＬＣの移動相調製に用いる２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム水溶液（以下、「ＳＤＰ水溶液」）は、リン酸二水素ナトリウム２水和物（９．３６ｇ）を量り取り、蒸留水（３Ｌ）加え、撹拌溶解して調製した。また、ＨＰＬＣの分析用試料は、本化合物の各結晶（１．７５ｍｇ）を１０ｍＬメスフラスコにそれぞれ量り取り、アセトニトリル（２ｍＬ）を加えて溶解した後、ＳＤＰ水溶液で全量を１０ｍＬにして調製した。
≪ＨＰＬＣ条件≫
検出波長        ：  ２１０ｎｍ
カラム          ：  ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＡＳ−３０３
移動相Ａ        ：  ＳＤＰ水溶液／アセトニトリル＝８０：２０（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ        ：  アセトニトリル／ＳＤＰ水溶液＝７０：３０（ｖ／ｖ）
移動相Ｂの組成  ：  ０〜６０分：０→１００％、
６０〜６５分：１００％、
６５〜６６分：１００→０％、
６６〜７５分：０％
流量            ：  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度      ：  ４０℃
試料注入量      ：  ２０μＬ【００５３】
【表２】
0005998933.tif 000006
【００５４】
表２に示すように、本化合物のＡ形、Ｂ形、Ｃ形、Ｄ形及びＥ形（水和物）結晶は、その純度にほとんど変化はなかった。これらの結果から、本化合物のＡ形、Ｂ形、Ｃ形、Ｄ形及びＥ形（水和物）結晶は、非晶質体に比べて化学的安定性に極めて優れていることが明らかとなった。また、本化合物のＢ形、Ｃ形及びＥ形（水和物）結晶は、保存による結晶形の変化は認められなかった。これらの結果から、本化合物のＢ形、Ｃ形及びＥ形（水和物）結晶が、物理学的安定性においても極めて優れていることが明らかとなった。【００５５】
（試験例３）：Ｃ形結晶の保存安定性試験（加速試験）
本化合物のＣ形結晶を、加速条件（４０℃、相対湿度７５％）で、気密状態又は開放状態で６箇月間保存し、以下の条件でＨＰＬＣにより、保存前後の純度を測定した。また、粉末Ｘ線回折の測定及びＴＧ−ＤＴＡを行い、保存による結晶形の変化の有無を評価した。【００５６】
ＨＰＬＣの移動相調製に用いる２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ３．９）（以下、「緩衝液Ｘ」）は、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム水溶液に２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を加えて調製した。ここで、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム水溶液は、リン酸二水素カリウム（８．２ｇ）を量り取り、蒸留水（３Ｌ）に加え、撹拌溶解して調製し、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液は、蒸留水（１Ｌ）にリン酸（１．４ｍＬ）を加え、撹拌混合して調製した。【００５７】
また、ＨＰＬＣの分析用試料調製に用いる２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、「緩衝液Ｙ」）は、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸水素二カリウム水溶液に２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を加えて調製した。ここで、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸水素二カリウム水溶液は、リン酸水素二カリウム（３．５ｇ）を量り取り、蒸留水（１Ｌ）に加え、撹拌して調製した。【００５８】
さらに、ＨＰＬＣの分析用試料は、本化合物のＣ形結晶（１０ｍｇ）を５０ｍＬメスフラスコに量り取り、緩衝液Ｙ／アセトニトリル＝８０／２０の混液で全量を５０ｍＬにして調製した。【００５９】
なお、日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）での合意に基づく「安定性試験ガイドライン」では、医薬品の有効性および安全性を維持するために必要な品質の安定性評価として、通常の貯蔵方法（例えば、２５℃）で長期間保存した場合の化学的影響を予測すると同時に、輸送中等で起こりうる貯蔵方法からの短期的な逸脱の影響を見るための試験として加速試験（４０℃、相対湿度７５％、６箇月）が設定されており、医薬品の承認申請時にはこのデータが必須とされている。【００６０】
≪ＨＰＬＣ条件≫
検出波長        ：  ２１０ｎｍ
カラム          ：  ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８
ＡＳ１２Ｓ０５−２５４６ＷＴ
移動相Ａ        ：  緩衝液Ｘ／アセトニトリル＝８０：２０（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ        ：  アセトニトリル／緩衝液Ｘ＝７０：３０（ｖ／ｖ）
移動相Ｂの組成  ：  ０〜８０分：０→１００％、
８０〜８５分：１００％、
８５〜８６分：１００→０％、
８６〜９５分：０％
流量            ：  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度      ：  ４０℃
試料注入量       ：  ２０μＬ【００６１】
【表３】
0005998933.tif 000007
【００６２】
その結果、表３に示したように、本化合物のＣ形結晶を、加速条件下、気密状態又は開放状態で６箇月保存した後の本化合物の純度は初期値と比べほとんど変化はなかった。また、本化合物のＣ形結晶は、保存による結晶形の変化は認められなかった。加速試験において化学的および物理学的に明確な品質の変化が認められなかったＣ形結晶は、保管、流通を考慮しても、極めて安定である優れた医薬品の有効成分の形態であることが明らかとなった。さらに、Ｃ形結晶は、溶媒（例えば、本化合物の晶析で使用可能な、トルエン、メタノール、２−プロパノール）中でも他の結晶形に転移しない極めて物理学的安定性に優れた結晶であることが明らかとなった。【００６３】
（実施例７）：Ｃ形結晶を用いた速放性錠剤の製造
本化合物のＣ形結晶のピンミル粉砕物（１４．１７ｇ）、Ｄ−マンニトール（３５．９８ｇ；ロケットジャパン；ＰＥＡＲＬＩＴＯＬ（登録商標）５０Ｃ）、結晶セルロース（４２．５ｇ；旭化成；セオラス（登録商標）グレード  ＰＨ−１０１）、部分アルファ化デンプン（４２．５ｇ；旭化成；グレードＰＣＳ）、ヒドロキシプロピルセルロース（８．５ｇ；日本曹達；グレードＬ）、メグルミン（８．５ｇ；メルク）及び酸化マグネシウム（８．５ｇ；富田製薬）を撹拌造粒機（奈良機械製作所；ＮＭＧ−１Ｌ）に投入し、混合後、水（３２．２ｇ）を噴霧して撹拌造粒を行った。造粒後の粉末を４０℃のオーブン内で２時間乾燥し、造粒末を得た。得られた造粒末をコーミル（パウレック；ＱＣ−１９７Ｓ；目開き１１４３μｍ；回転数２０００ｒｐｍ）で整粒し、整粒末を得た。得られた整粒末に対し、クロスカルメロースナトリウム（８．５ｇ；ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ；Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標））及びステアリン酸マグネシウム（０．８５ｇ；太平化学産業）を添加し、Ｖ型混合機（筒井理化学器械、Ｓ−３）で混合して打錠用顆粒を得た。得られた打錠用顆粒を、直径８ｍｍの丸型の臼杵を用いてロータリー式打錠機（菊水製作所；Ｃｏｒｒｅｃｔ  １９）で打錠し、１錠当たり本化合物１５ｍｇ、Ｄ−マンニトール３８．１ｍｇ、結晶セルロース４５ｍｇ、部分アルファ化デンプン４５ｍｇ、ヒドロキシプロピルセルロース９ｍｇ、メグルミン９ｍｇ、酸化マグネシウム９ｍｇ、クロスカルメロースナトリウム９ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム０．９ｍｇを含有する、錠剤重量１８０ｍｇの素錠を得た。【００６４】
（実施例８）：Ｃ形結晶を用いた速放性錠剤の製造
本化合物のＣ形結晶のジェットミル粉砕物（４１．６７ｇ）、乳糖（２３０．８３ｇ；ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ（登録商標）２００Ｍ）、結晶セルロース（１７５ｇ；旭化成；セオラス（登録商標）グレードＰＨ−１０１）及びヒドロキシプロピルセルロース（２５ｇ；日本曹達；グレードＬ）を撹拌造粒機（奈良機械製作所、ＮＭＧ−３Ｌ）に投入し、混合後、水（９５ｇ）を噴霧して撹拌造粒を行った。造粒後の粉末を４０℃のオーブン内で２時間乾燥し、造粒末を得た。目開き１ｍｍのふるいを通した造粒末に対し、クロスカルメロースナトリウム（２５ｇ；ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ；Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標））及びステアリン酸マグネシウム（２．５ｇ；太平化学産業）を添加し、Ｖ型混合機（筒井理化学器械；Ｓ−３）で混合して打錠用顆粒を得た。得られた打錠用顆粒を、直径８ｍｍの丸型の臼杵を用いてロータリー式打錠機（菊水製作所；Ｃｏｒｒｅｃｔ  １９）で打錠し、１錠当たり本化合物１５ｍｇ、乳糖８３．１ｍｇ、結晶セルロース６３ｍｇ、ヒドロキシプロピルセルロース９ｍｇ、クロスカルメロースナトリウム９ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム０．９ｍｇを含有する、錠剤重量１８０ｍｇの素錠を得た。【００６５】
（実施例９）：Ｃ形結晶を用いた速放性錠剤の製造
本化合物のＣ形結晶のジェットミル粉砕物（１０７．１４ｇ）、乳糖（１６５．３６ｇ；ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ（登録商標）２００Ｍ）、結晶セルロース（１７５ｇ；旭化成；セオラス（登録商標）グレードＰＨ−１０１）及びヒドロキシプロピルセルロース（２５ｇ；日本曹達；グレードＬ）を撹拌造粒機（奈良機械製作所；ＮＭＧ−３Ｌ）に投入し、混合後、水（１００ｇ）を噴霧して撹拌造粒を行った。造粒後の粉末を４０℃のオーブン内で２時間乾燥し、造粒末を得た。目開き１ｍｍのふるいを通した造粒末に対し、クロスカルメロースナトリウム（２５ｇ；ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ；Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標））及びステアリン酸マグネシウム（５ｇ；太平化学産業）を添加し、Ｖ型混合機（筒井理化学器械；Ｓ−３）で混合して打錠用顆粒を得た。得られた打錠用顆粒を直径７ｍｍの丸型の臼杵を用いてロータリー式打錠機（菊水製作所；Ｃｏｒｒｅｃｔ  １９）で打錠し、錠剤重量１４０．７ｍｇの素錠を得た。得られた素錠をフィルムコーティング機（フロイント産業；ハイコーターＭＩＮＩ）に投入し、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）  ＯＹ−７３００（日本カラコン；ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０；酸化チタン及びポリエチレングリコール４００の混合物）、三二酸化鉄（癸巳化成）及び黄色三二酸化鉄（癸巳化成）を分散した液を噴霧し、１錠当たり本化合物３０ｍｇ、乳糖４６．３ｍｇ、結晶セルロース４９ｍｇ、ヒドロキシプロピルセルロース７ｍｇ、クロスカルメロースナトリウム７ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム１．４ｍｇ、ＯＹ−７３００  ３．８８ｍｇ、三二酸化鉄０．０８ｍｇ、黄色三二酸化鉄０．０３ｍｇを含有する、フィルムコーティング錠を得た。【００６６】
（実施例１０）：Ｃ形結晶を用いた速放性錠剤の製造
本化合物のＣ形結晶のジェットミル粉砕物（２．８６ｇ）、乳糖（２６６２．９ｇ、ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ（登録商標）２００Ｍ）、結晶セルロース（１０００ｇ、旭化成、；セオラス（登録商標）グレードＰＨ−１０１）を流動層造粒乾燥機（フロイント産業；ＦＬＯ−５）に投入し、流動させながら、７％（ｗｔ.／ｖ）のヒドロキシプロピルセルロース水溶液（１６３３ｇ；日本曹達；グレードＬ）を噴霧して造粒及び乾燥し、造粒末を得た。得られた造粒末をコーミル（パウレック；ＱＣ−１９７Ｓ；目開き１５７５μｍ；回転数２０００ｒｐｍ）で整粒し、整粒末を得た。得られた整粒末に対し、クロスカルメロースナトリウム（２００ｇ；ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ；Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標））及びステアリン酸マグネシウム（２０ｇ；太平化学産業）を添加し、Ｖ型混合機（ダルトン；ＤＶ−１−１０）で混合して打錠用顆粒を得た。得られた打錠用顆粒を直径７ｍｍの丸型の臼杵を用いてロータリー式打錠機（菊水製作所；Ｃｏｒｒｅｃｔ  １９）で打錠し、錠剤重量１４０ｍｇの素錠を得た。得られた素錠をフィルムコーティング機（フロイント産業；ハイコーターＭＩＮＩ）に投入し、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）  ＯＹ−７３００、三二酸化鉄（癸巳化成）及び黄色三二酸化鉄（癸巳化成）を分散した液を噴霧し、１錠当たり本化合物０．１ｍｇ、乳糖９３．２ｍｇ、結晶セルロース３５ｍｇ、ヒドロキシプロピルセルロース４ｍｇ、クロスカルメロースナトリウム７ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム０．７ｍｇ、ＯＹ−７３００  ３．８８ｍｇ、三二酸化鉄０．０８ｍｇ、黄色三二酸化鉄０．０３ｍｇを含有する、フィルムコーティング錠を得た。【００６７】
実施例７〜１０で使用した本化合物のＣ形結晶の粉砕物の粒度は、マイクロトラック粒度分析計（日機装；９２２０ＦＲＡ；湿式）で測定した。本化合物のＣ形結晶の粉砕物粒度分布は、ピンミル粉砕物の場合、Ｄ１０：７．０μｍ、Ｄ５０：２１．９μｍ、Ｄ９０：５６．４μｍであり、ジェットミル粉砕物の場合、Ｄ１０：１．７μｍ、Ｄ５０：３．４μｍ、Ｄ９０：５．８μｍ、又は、Ｄ１０：２．１μｍ、Ｄ５０：３．９μｍ、Ｄ９０：６．６μｍ、であった。なお、これら粉砕処理による結晶形の変化はないことを、粉末Ｘ線回折の測定及びＴＧ−ＤＴＡにより確認した。【００６８】
（試験例４）：製剤の保存安定性評価
実施例７〜１０で得られた錠剤を、４０℃、相対湿度７５％、気密状態で３箇月間保存し、以下の条件でＨＰＬＣにより、保存前後の純度を測定した。結果を表４に示す。なお、ＨＰＬＣの分析用試料は、錠剤１０錠又は１錠を、本化合物濃度が５０又は３００μｇ／ｍＬとなるように緩衝液Ｙ／アセトニトリル＝８０／２０の混液に入れて、撹拌及び遠心した後の上清を用いた。
≪ＨＰＬＣ条件≫
検出波長        ：  ２１０ｎｍ
カラム          ：  ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８
ＡＳ１２Ｓ０５−２５４６ＷＴ
移動相Ａ        ：  緩衝液Ｘ／アセトニトリル＝８０：２０（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ        ：  アセトニトリル／緩衝液Ｘ＝７０：３０（ｖ／ｖ）
移動相Ｂの組成  ：  ０〜８０分：０→１００％
８０〜８５分：１００％
８５〜８６分：１００→０％
８６〜９５分：０％
流量            ：  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度      ：  ４０℃
試料注入量       ：  ２０μＬ（本化合物濃度が３００μｇ／ｍＬのとき）、又は、
８０μＬ（本化合物濃度が５０μｇ／ｍＬのとき）【００６９】
【表４】
0005998933.tif 000008
【００７０】
医薬品の有効成分の形態として化学的に安定な結晶であっても、医薬品の最終形態である錠剤等の製剤中では各種製剤添加剤との接触により不安定化し、医薬品の有効性および安全性の維持に悪影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、表４に示すように、本化合物のＣ形結晶を有効成分として含有するいずれの錠剤においても、加速条件下、気密状態で３箇月保存した後の本化合物のＣ形結晶の純度は初期値と比べほとんど変化はなかった。これらの結果から、本化合物のＣ形結晶は、微粉砕工程を経て製剤化した後においても、化学的安定性に極めて優れていることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本化合物の結晶は、医薬の分野において、医薬、特に炎症性腸疾患、アレルギー性皮膚炎、多発性硬化症又は白血病、の治療剤又は予防剤として利用できる。
【図１】
0005998933.tif 000009
【図２】
0005998933.tif 000010
【図３】
0005998933.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005998933.tif 000016
【図９】
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【図１０】
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