【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年11月10日(2010.11.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
明確にするために、“fra-2tgマウス”、又は“fra-2tg齧歯動物”という用語はそれぞれ、本発明の意味では、広範な又は細胞タイプに特異的な導入遺伝子発現を可能にするプロモーターの制御下で、fra-2ゲノム座又はfra-2 cDNAを有する遺伝子導入齧歯動物/マウスである。
“fra-2”(又は“Fra-2”)によって、関心のある表現型、すなわち線維性疾患、特に肺性線維症でそれ自体を示すような適切な濃度及び位置における好適なプロモーターの制御下で発現するときに起因する、任意の哺乳類種からのfra-2 DNA(又はFra-2蛋白質)を意味する。
選択されたfra-2 DNAは、選択された動物種(例えば、マウスがマウスfra-2 DNA導入遺伝子を有し、ラットがラットfra-2導入遺伝子を有する)の同種fra-2遺伝子と同一でよく、又は異なっていてもよく、例えば特にヒト疾患のためのモデル及びヒト疾患のための阻害剤をスクリーニング又は特徴付けるためのモデルとしての動物の使用を考慮して、ヒトfra-2でよい。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
fra-2/Fra-2 DNA/蛋白質配列は、例えば、ヒト(GenBank Accession No. X16706; Matsui et al., 1990)、マウス(GenBank Accession No. NM_008037; Foletta et al., 1994)又はラット(GenBank Accession No. NM_012954)からの文献で公知である。
本発明の実験では、成分H2-Kb(プロモーター)、IRES-EGFP(レポーター遺伝子)及びLTR(エンハンサー)を遺伝子導入構築に用いた;これらの成分は他の成分と置き換えることができるが、但し体内の濃度及び場所における導入遺伝子の発現は、それ自体を関心のある表現型で示すようなものである。導入遺伝子発現に好適な偏在性プロモーターの例は、ユビキチンCプロモーター、CMVプロモーター/エンハンサー、Pgk1プロモーター又はニワトリβ-アクチンプロモーターである(Schorpp et al., 1996)。導入遺伝子発現を監視するのに好適なレポーターシステムの例は、β-ガラクトシターゼ、EGFP、EYFP、ERFPである。fra-2の広範な発現を保証するための構築物に任意に存在してよい好適なエンハンサー成分の例は、FBJマウス骨肉腫ウィルスからの長い末端反復(LTR)である。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
本発明を導く実験では、以下の実験システムを用いた:第一に、ゲノムマウスλDNAライブラリー(マウス株129 Sv)を、fra-2の4種のエキソンに結合する標識オリゴヌクレオチドを有するマウスfra-2遺伝子のためにスクリーニングした。Fra-2全長遺伝子座を単離し、特徴付け、及び配列を決定した。該4種のエキソンの配列は、公表されているマウスFra-2 cDNA配列と完全に対応した(Foletta et al., 1994)。主要な組織適合性の複雑な分類I抗原H2-Kbのためのプロモーター(Grigoriadis et al., 1993)を、fra-2遺伝子座の前にクローン化し、偏在性導入遺伝子発現を可能にする。生体内における導入遺伝子活性を監視するために、IRES-EGFP(Zhu et al., 1999)配列を、fra-2遺伝子座の後にクローン化し、それに続いてFBJ-マウスサルコーマウィルスの長い末端反復(LTR)をクローン化して、fra-2 mRNAを安定化させ且つ間葉細胞における導入遺伝子発現を保証した(Grigoriadis et al., 1993)。さらに、loxPサイトを、エキソン2の前且つエキソン4の後に配置し、導入遺伝子発現の異なる導入遺伝子コピー数及び濃度により、導入遺伝子多量体のCre-媒介欠損及び数種の遺伝子導入系統の生成を可能にする。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
さらなる特徴では、本発明は、肺性線維症のための動物モデルとしての、肺細胞、例えば気道上皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞及び造血性細胞のfra-2の異所性発現を有する齧歯動物、例えばマウスに関する。これらの特異的な細胞タイプにおける異所性発現を得るために、細胞タイプに特異的なプロモーターが遺伝子導入動物を生成するのに用いられ、例えば、気道上皮細胞のための界面活性蛋白質C(Boggaram, 2003)プロモーター、又はCD4プロモーター(Tanigaki et al., 2004)、CD19プロモーター(Rickert et al., 1997)、造血性細胞のためのLysMプロモーター(Clausen et al., 1999)又は線維芽細胞のためのプロ-α1(I)コラーゲンプロモーター(Rossert et al., 1995)である。これらの細胞タイプに加え、異所性発現が関心のある表現型に関連のある他の細胞に望ましくなり得る。上記細胞と類似して、fra-2発現は、細胞タイプに特異的なプロモーターを用いることにより、これらの細胞における導入遺伝子の配向性発現によって達成することができる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
実施例では、以下の材料及び方法を用いた:
fra-2tgマウスの生成
fra-2全長遺伝子座は、ゲノムλDNAライブラリーから単離し、配列を決定し、及びpBS IIベクターにクローン化する。主要な組織適合性の複雑な分類Iの抗原H2-Kbのためのプロモーター(Grigoriadis et al., 1993)を、fra-2遺伝子座の前にクローン化して、偏在的な導入遺伝子発現を可能にする。導入遺伝子活性を監視するために、IRES-EGFP(Zhu et al., 1999)配列をfra-2遺伝子座とそれに続くFBJ-マウスサルコーマウィルスの長い末端反復(LTR)配列の後にクローン化する(Grigoriadis et al., 1993)。さらに、loxP部位を、エキソン2の前及びエキソン4の後ろに配置し、異なる導入遺伝子のコピー数で導入遺伝子多量体のCre-媒介欠乏及び数種の遺伝子導入系統の生成を可能にする。遺伝子導入構築物を、受精したC57Bl76卵母細胞の前核に注入し、3種の独立性遺伝子導入系統を確立する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
実施例1
fra-2tgマウスの生成及びキャラクタリゼーション
ゲノムfra-2遺伝子座を、遺伝子導入ベクター上に広範な活性H2Kbプロモーターの前且つIRES-EGFPレポーター遺伝子の後に配置する(図1A)。FBJ-マウスサルコーマウィルスの長い末端反復(LTR)配列をfra-2 mRNAの安定化のため、且つ間葉細胞における導入遺伝子発現を保証するために含ませる。エキソン2の前及びエキソン4の後ろに配置されるさらなるloxP部位は、導入遺伝子発現の異なる導入遺伝子コピー数及び濃度により、導入遺伝子多量体のCre-媒介欠乏及び数種の遺伝子導入系統の生成を可能にする。異なる導入遺伝子コピー数を有する3種の独立性遺伝子導入系統が生成される(図1B)。系統12及び13は高濃度の導入遺伝子を発現し(図1C)、それぞれ4〜60種の導入遺伝子コピーを有する。系統15は2種のみの導入遺伝子コピーを有し、いかなる顕在的導入遺伝子発現も示さない(図1C)。かなりの導入遺伝子発現が、脳を除く系統12及び13の全ての組織で観察することができる(図1D)。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
【図１】A)fra-2遺伝子導入ベクターの概略スキーム。H2kbプロモーターをfra-2発現に用いる。fra-2の後にIRES-EGFPレポーター遺伝子を用いて導入遺伝子活性を監視し、LTR配列をmRNA安定化のために含ませる。LoxP部位は、導入遺伝子のCre-リコンビナーゼ-媒介欠乏を可能にする。H2Kb:H2Kbプロモーター;E1-E4:fra-2のエキソン1-4;ポリA:ポリアデニル化信号;Hind III:サザンブロット分析に用いた限定部位。B)ゲノムにおける導入遺伝子のコピー数を決定するための3種の遺伝子導入系統(12、13、15)のサザンブロット分析。マウスの尾からのDNAをHind IIIで温浸させ、fra-2のエキソン2に対応する配列でプローブする。野生タイプ及び遺伝子導入バンドの位置を示す。定量化は、遺伝子導入系統12、13及び15のそれぞれに対して4回、60回及び2回の遺伝子導入コピーを明らかにした。C)遺伝子導入系統12、13及び15からの2種の組織(肝臓及び心臓)によるfra-2発現のためのRNase保護検定。Fra-2の発現は、系統12及び13の両組織で同程度まで増加する。導入遺伝子発現は遺伝子導入系統15では全く検出されない。GAPDHの発現は充填制御として用いる。D)大人(6週間目)の遺伝子導入マウス(系統13)の異なる組織によるRNase保護検定。導入遺伝子は、脳、thy:胸腺、kid:腎臓、spl:脾臓、cal:頭頂部を除いて偏在して発現する。
【図２】A)fra-2tgマウスの早期致死率を示すKaplan Meierプロット。fra-2導入遺伝子の高い発現を有するマウス(系統12及び13)は成人期に病気になり、6週間目辺りで死に始めた。早期致死率は、導入遺伝子の発現を全く示さない系統15のマウスでは見られない。B)fra-2tgマウスの体重に対する増加した肺の比。肺の重さの増加が、系統12及び13の遺伝子導入マウスで観察される(ここでは系統12を示す)が、系統15では観察されない。肺の重さの大きな増加は、遺伝子導入マウスの致死率と一致する。病気は、体重の損失、毛の外見、マウスの弱さ及び息切れにより判断される。
【図３】A)fra-2tg肺の全体的な形態。系統12及び13のマウスは、明らかな線維症を有する劇的に増加した肺を示す。B)fra-2tg肺のH&E-染色切片。系統12及び13のマウスは、間質性肺線維症(上部のパネル)及び血管の狭窄(下部のパネル)を示す。
【図４】A)fra-2tgにおける強皮症様症候群の発生。コラーゲンのためのアニリンブルー染色(青色)は、fra-2tgマウスにおける線維性障害は肺に限定されないが、他の器官(肝臓、皮膚及び心臓が例として示されている)でも観察できることを明らかにした。B)fra-2tgマウスの肺におけるコラーゲン発現の同時PCR分析。線維性コラーゲンタイプI及びタイプIIIの発現は、病気のマウスの肺で増加した。
【図５】A)fra-2tgマウスにおける肺性線維症は、血管及び炎症性細胞の血管周囲の移入で始まる。fra-2tg肺のH&E-染色は、肺性線維症における最初のイベントとしての炎症を説明する(上部のパネル)。炎症性細胞は、主にCD3-陽性T-細胞(黒色染色、矢じり)及び顆粒細胞などのエステラーゼ-陽性骨髄細胞(赤色染色、矢じり)からなる。B)炎症は、RNase保護検定によって説明されるfra-2tgマウスの肺におけるケモカイン及びサイトカインの蓄積を引き起こす。
【図６】A)fra-2tg骨髄で再構築された野生タイプのマウスにおける全く深刻でない肺性線維症。致死性放射線が線維症を容易に移植できないことを立証した後の、fra-2tg骨髄で再構築された野生タイプのマウスの肺及び肝臓切片。B)野生タイプの骨髄で再構築された野生タイプのマウスからの骨髄細胞のFACSプロフィール。C)fra-2tg骨髄で再構築された野生タイプのマウスからの骨髄細胞のFACSプロフィール。ほとんど全ての骨髄細胞が導入遺伝子発現を反映するEGFPレポーター遺伝子を発現することに注意。D)器官/体重比は、全く深刻でない肺性線維症がfra-2tg骨髄で再構築された野生タイプのマウスで発生することを確証する。
【図７】A)野生タイプの骨髄で再構築されたfra-2tgマウスにおける深刻な肺性線維症。致死性放射線は、線維症が野生タイプの骨髄の存在下で発生することを立証した後に、野生タイプの骨髄で再構築されたfra-2tgマウスの肺及び肝臓切片。B)野生タイプの骨髄で再構築された野生タイプのマウスからの骨髄細胞のFACSプロフィール。C)野生タイプの骨髄で再構築されたfra-2tgマウスからの骨髄細胞のFACSプロフィール。ほとんど全ての遺伝子導入EGFP-陽性細胞が消失したことに注意。D)器官/体重比は、肺性線維症が野生タイプの骨髄で再構築されたfra-2tgマウスで発生したことを確証する。
【図８】A)fra-2tgマウスの全層創傷後の遅れた創傷治癒。Fra-2遺伝子導入マウスは、背中の皮膚の全層創傷後に遅れた創傷閉鎖を示す(上部パネル:創傷後8日目、下部パネル:創傷後11日目)。B)コラーゲンからなる増加した量の肉芽組織が、fra-2遺伝子導入マウスの創傷で見える(創傷後11日目;上部パネル:H&E-染色;下部パネル:コラーゲンのための青色CAB-染色)。C)創傷治癒の定量化は、fra-2遺伝子導入マウスにおける遅れた創傷閉鎖が早ければ創傷後3日で始まることを説明する。D-G)創傷時及び創傷後3日目に採取された皮膚生検によるRNase保護検定。fra-2を除くAP-1要素(D)、基質メタロプロテイナーゼ(E)、TIMPs(E)、サイトカイン(F)、TGF-β群要素(F)及びケモカイン(G)の発現における違いは観察することができない。