【手続補正書】
【提出日】平成23年8月3日(2011.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）配列番号５；
（ｉｉｉ）配列番号１１；
（ｉｖ）または配列番号１、配列番号５または配列番号１１と比較して、１、２、３、４、５、６または１０個以下の欠失、挿入および／または置換アミノ酸を有する前記アミノ酸の変異体
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むチオペプチド前駆体タンパク質。
【請求項２】
前駆体がＥｆ−ｔｕチオペプチド阻害剤の生合成前駆体である、請求項１のチオペプチド前駆体タンパク質。
【請求項３】
Ｅｆ−ｔｕ阻害剤がＧＥ２２７０Ａ、ＧＥ３７６４８Ａ、アミチアマイシンまたは下記式Ｉ−ＸＩ
【化１】
2010535481.tif 000001
【化２】
2010535481.tif 000002
【化３】
2010535481.tif 000003
【化４】
2010535481.tif 000004
【化５】
2010535481.tif 000005
【化６】
2010535481.tif 000006
の何れかで示される化合物から成る群から選択される、請求項２のチオペプチド前駆体タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかのチオペプチド前駆体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５】
配列番号５のヌクレオチド配列を含む請求項４の核酸。
【請求項６】
配列番号６のヌクレオチド配列または少なくとも配列番号５を含むその何れかのフラグメントを含む、請求項５の核酸。
【請求項７】
核酸配列が異種転写および翻訳制御配列と作動可能に連結している、請求項４〜６の何れかの核酸。
【請求項８】
核酸が発現ベクターである、請求項７の核酸。
【請求項９】
チオペプチドの生合成のためのポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号２３〜３４の何れか１種、
（ｉｉ）（ｉ）に列挙した対応する野生型アミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６または１０個以下の欠失、挿入または置換アミノ酸を有し、実質的に同じ酵素機能を保持している（ｉ）に列挙したアミノ酸配列の変異体
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１１】
核酸配列が異種転写および翻訳制御配列と作動可能に連結している、請求項１０の核酸。
【請求項１２】
核酸が天然には宿主細胞のゲノム中に見出されない、請求項４〜６の何れかの核酸を含む宿主細胞。
【請求項１３】
さらにチオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子を含む、請求項１２の宿主細胞。
【請求項１４】
チオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子が請求項１０〜１１の何れかに定義の核酸を含む、請求項１３の宿主細胞。
【請求項１５】
ノノムラエ（Nonomuraea）属菌株、プラノビスポラ（Planobispora）属菌株、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属菌株、大腸菌、コリネバクテリウム属菌株、バチルス属菌株およびストレプトマイセス属菌株、例えばストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・アルブス、ストレプトマイセス・ラモシシムス（ramocissimus）、ストレプトマイセス・コリヌス、ストレプトマイセス・フラディアエ、ストレプトマイセス・アズレウスまたはストレプトマイセス・グリセウスから成る種の群から選択される請求項１３または１４の何れかの宿主細胞であって、当該宿主細胞がチオペプチドに耐性を有する宿主細胞。
【請求項１６】
変異微生物であって、対応する野生型微生物と比較して、請求項１〜３の何れかに定義のチオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子を発現しない変異微生物。
【請求項１７】
変異が対応する野生型微生物において請求項１〜３の何れかに定義のチオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子の破壊（disruption）である、請求項１６の変異微生物。
【請求項１８】
微生物がノノムラエ（Nonomuraea）属菌株であり、変異が配列番号１５または配列番号１６を含む遺伝子の破壊である、請求項１７の変異微生物。
【請求項１９】
変異がさらに、請求項４〜８の何れかの核酸で形質転換されている、請求項１６〜１８の何れかの変異微生物。
【請求項２０】
請求項９に定義の１種以上のポリペプチドをコードする１個以上の遺伝子を発現しない、変異微生物。
【請求項２１】
チオペプチドの生合成のためのポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号４７〜６０の何れか１種、
（ｉｉ）（ｉ）に列挙した対応する野生型アミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６または１０個以下の欠失、挿入または置換アミノ酸を有し、実質的に同じ酵素または制御機能を保持している（ｉ）に列挙したアミノ酸配列の変異体
（ｉｉｉ）（ｉ）に列挙した対応するポリペプチドの１種と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有し、実質的に同じ酵素または制御機能を保持している（ｉ）に列挙したアミノ酸配列の変異体
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項２３】
核酸が異種転写および翻訳制御配列と作動可能に連結している、請求項２２の核酸。
【請求項２４】
核酸が天然には宿主細胞のゲノム中に見出されない、請求項２２または２３の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２５】
さらにチオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子を含む、請求項２４の宿主細胞。
【請求項２６】
チオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子が、請求項４〜８の何れかのチオペプチド前駆体タンパク質をコードする核酸および請求項１０〜１１の何れかの核酸からなる群の１個以上から選択される、請求項２５の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２１に定義の１個以上のポリペプチドをコードする改変（tailoring）遺伝子の１個以上の発現を欠いた、チオペプチドの生産が可能な変異微生物。
【請求項２８】
チオペプチド前駆体タンパク質を生産する方法であって、請求項１２、１３、１５または２４〜２６の何れかの宿主細胞を前記チオペプチド前駆体タンパク質の生産に適した条件下で培養する工程を含む方法。
【請求項２９】
チオペプチド化合物を生産する方法であって、請求項１２、１３、１４、１５または２４〜２６の何れかの宿主細胞を前記チオペプチド化合物の生産に適した条件下で培養する工程を含む方法。
【請求項３０】
さらにチオペプチド前駆体またはチオペプチド化合物を実質的に純粋な形態に単離することを含む、請求項２８または２９の方法。
【請求項３１】
チオペプチド化合物がＧＥ２２７０Ａ、ＧＥ３７６４８Ａ、請求項３に示す式Ｉ〜ＸＩの何れかで示す化合物、アミチアマイシン、マイクロコクシン、チオストレプトン、ノシヘプタイド、チオシリン、チオシン類、ノカチアシン類、ベルニナマイシン、Ａ１０２５５Ｂおよびラダマイシンから成る群から選択される、請求項２９または３０の方法。
【請求項３２】
チオペプチド誘導体を生産する方法であって、
（ｉ）宿主細胞内での変異チオペプチド前駆体をコードする配列の遺伝子発現によって、宿主細胞内で変異チオペプチド前駆体を合成し、
（ｉｉ）変異チオペプチド前駆体からチオペプチド誘導体を合成すること
を含む方法。
【請求項３３】
変異チオペプチド誘導体前駆体が請求項１〜１１の何れかに定義の配列番号１、配列番号５または配列番号１１の変異体である、請求項３２の方法。
【請求項３４】
工程ｉｉ）がインビトロで実施される、請求項３２または３３の方法。
【請求項３５】
工程ｉｉ）が工程ｉ）と同じ宿主細胞中でインビボで実施される、請求項３２または３３の方法。
【請求項３６】
チオペプチドまたはチオペプチド誘導体を生産する方法であって、
（ｉ）請求項１〜３の何れかに定義のチオペプチド前駆体タンパク質を含む培養培地を得て、
（ｉｉ）さらにチオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子を含む微生物を、前記培養培地中で培養すること
を含む方法。
【請求項３７】
チオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子が配列番号２３〜３４および配列番号４７〜６０から選択されるポリペプチドをコードするものから選択される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
微生物がノノムラエ（Nonomuraea）属菌株、プラノビスポラ（Planobispora）属菌株、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属菌株およびストレプトマイセス属菌株、例えばストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・アルブス、ストレプトマイセス・ラモシシムス（ramocissimus）、ストレプトマイセス・コリヌス、ストレプトマイセス・フラディアエ、ストレプトマイセス・アズレウスもしくはストレプトマイセス・グリセウスから成る種の群から選択される請求項３６または３７の方法であって、前記微生物がチオペプチドまたはチオペプチド誘導体に対する耐性について選択された菌株である方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
６．  チオペプチド誘導体の生産
培地の組成
（ａ）播種培地
【表５】
2010535481.tif 000007
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
（ｂ）生産培地Ａ
【表６】
2010535481.tif 000008