【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年9月22日(2011.9.22)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒト化抗ＣＤ２２抗体；および
（ｂ）コハク酸緩衝液を含み、ｐＨ４．０ないしｐＨ８．０を有する水溶液；
を含む製剤であって、凍結防止剤も界面活性剤も含有せず、タンパク質が−８０℃から８℃で少なくとも３週間安定している、製剤。
【請求項２】
ヒト化抗ＣＤ２２抗体がＩｇＧ４である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
１５０ｍＭ未満の塩を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
緩衝液の濃度が５０ｍＭないし１００ｍＭである、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
緩衝液の濃度が１ｍＭないし５０ｍＭである、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
抗体が５℃で少なくとも１年間安定しているか、または５℃で少なくとも３年間安定している、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
抗体が、１ｍｇ／ｍｌないし２００ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌないし１００ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌないし２００ｍｇ／ｍｌ、または２０ｍｇ／ｍｌないし１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
抗体が、１０ｍｇ／ｍｌないし３０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌないし３０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌないし５０ｍｇ／ｍｌ、または２０ｍｇ／ｍｌないし５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
抗体が、少なくとも６．０、７．０、または８．０のｐＩを有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
０℃ないし８℃で、または０℃から５℃までで保存される、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
そのｐＨがｐＨ５．０ないしｐＨ６．０である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
そのｐＨがｐＨ５．０ないしｐＨ６．０であり、−８０℃から５℃までで保存される、請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
水溶液が２０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
安定性が、高分子量種の率、低分子量種の率、または酸性種の率のうち少なくとも１つを対照と比較してアッセイすることにより決定される、請求項１に記載の製剤。
【請求項１５】
抗体が少なくとも９５％精製されている、請求項１に記載の製剤。
【請求項１６】
製剤が滅菌である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１７】
（ａ）請求項１に記載の製剤を用意すること、
（ｂ）選択された温度に該製剤を置くこと、および
（ｃ）該選択された温度に該製剤を維持すること
を含む、ヒト化抗ＣＤ２２抗体を保存する方法であって、該製剤中の抗体が少なくとも１週間安定している方法。
【請求項１８】
抗体が、少なくとも１カ月、３カ月、１年、５年、７年、または１０年間安定している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗体が−８０℃または２℃ないし８℃の温度で安定している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗体が−８０℃の温度で保存され、該抗体が少なくとも５年、７年または１０年間安定している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
製剤が選択された温度で凍結されて、工程（ｃ）の後でタンパク質が急速解凍される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
製剤が（ｂ）で凍結され、該凍結が急速凍結である、請求項２８に記載の方法。
【請求項２３】
抗体が中間体物質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質の濃度が、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも３０ｍｇ／ｍｌである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の製剤中に保存することを含む方法により産生された抗体。
【請求項２６】
抗体が請求項１に記載の製剤中で保存される、修飾タンパク質の製造に使用するための抗体。
【請求項２７】
抗体が、コンジュゲートしたタンパク質の製造に使用される、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２８】
タンパク質が毒素にコンジュゲートしている、請求項２５に記載の抗体。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】明細書
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、タンパク質製剤の分野に関し、さらに詳細には抗体製剤に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、出典明示によりその内容を本明細書の一部とする、２００４年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／６０１３１１号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
抗体などのタンパク質は、その後の使用のために作製されて保存されることが多い。そのようなタンパク質は、温度およびタンパク質濃度を含めた様々な条件でタンパク質の安定性を保つ条件で保存されることが重要である。このように、タンパク質の保存のために使用される製剤は、一般に多様な安定化物質を含有する。しかし、そのような物質は、下流のプロセスの効率を低下させること、またはそのタンパク質を下流のプロセスに使用することができる前に１つもしくは複数の安定化物質の除去を必要とすることのいずれかによって、下流での保存されたタンパク質の使用に不都合な影響を与えるおそれがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
様々な温度にわたり安定で、タンパク質を用いる下流プロセスを干渉しうる物質を含有しない、抗体などのタンパク質の製剤についての要求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、タンパク質（例えば、抗体およびその断片）などのポリペプチドを保存するためにある種の製剤を使用して、比較的安定で単純な製剤を形成させることができるという発見に関する。そのような製剤は、そのタンパク質の下流のプロセシングまたは活性が製剤の成分により不都合な影響を受けるという見込みを低減し、短期または長期保存のためのタンパク質試料の調製を単純化する。
【０００６】
したがって、本発明は、単離されたタンパク質およびｐＨ４．０〜８．０を有する水溶液を含有することにより、凍結防止剤も界面活性剤も含有せず、そのタンパク質は−８０℃から８℃で少なくとも３週間安定である製剤を含む。場合によっては、その製剤は１５０ｍＭ未満の塩、例えば、７５ｍＭの塩を含有する。そのタンパク質は、抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）のことがある。例えば、そのタンパク質は抗ＣＤ２２抗体、抗ルイスＹ抗体または抗５Ｔ４抗体のことがある。そのタンパク質は、組換えタンパク質（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）のことがある。場合によっては、そのタンパク質は治療用タンパク質である。
【０００７】
この製剤の水溶液は、水（例えば、ろ過された水もしくは滅菌水）のことがあるし、また、その水溶液には酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、リン酸緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液などの緩衝液が含まれうる。一般に、その緩衝液の濃度は、約０ｍＭから約１５０ｍＭ、例えば、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、または約１ｍＭから約５０ｍＭである。
【０００８】
この製剤のタンパク質成分は、５℃で少なくとも１年間一般に安定であり、例えば、そのタンパク質は、５℃で少なくとも３年間安定である。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、約１ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ、または約２０ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。そのタンパク質は、少なくとも６．０、例えば、少なくとも７．０または少なくとも８．０のｐＩを有しうる。そのタンパク質は、例えば少なくとも９０％または少なくとも９５％まで精製されることができる。
【０００９】
場合によっては、この製剤は、約０℃から約８℃、または約０℃から約５℃で保存される。この製剤のｐＨは約５．０から約６．０のことがあり、場合によっては、この製剤のｐＨは約５．０から約６．０であり、この製剤は約−８０℃から約５℃で保存される。一般に、この製剤は滅菌である。
【００１０】
本発明の一例では、この製剤のタンパク質は、例えば、ヒト化抗ＣＤ２２抗体で、水溶液は約２０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０の水溶液のこともある。本発明の別の例では、そのタンパク質は抗ルイスＹ抗体であり、その水溶液は約１０ｍＭのクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および約７５ｍＭのＮａＣｌである。本発明の第三の例では、そのタンパク質は抗５Ｔ４抗体であり、その水溶液は約１０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ約５．５である。
【００１１】
この製剤の安定性は、例えば高分子量種の率、低分子量種の率、または酸性種の率のうち少なくとも１つを、例えば対照と比較してアッセイすることにより決定することができる。
【００１２】
別の態様では、本発明は、タンパク質を保存する方法に関する。その方法は、上記の製剤を用意すること、その製剤を選択された温度に置くこと、およびその温度で（例えば凍結して）その製剤を維持することを含み、それによりその製剤中のタンパク質は少なくとも１週間、例えば、少なくとも１カ月、３カ月、１年、５年、７年、または１０年間安定である。場合によっては、そのタンパク質は、約２℃から８℃の温度で保存されて安定である。ある実施形態では、そのタンパク質は約−８０℃の温度で保存され、そのタンパク質は少なくとも５年、７年または１０年間安定である。そのタンパク質が凍結される場合、その方法は、そのタンパク質が急速解凍される工程を含むことがある。例えば保存のために、そのタンパク質が凍結される場合、そのタンパク質は急速凍結法を用いて凍結されることがある。場合によっては、緩慢凍結法が使用される。そのタンパク質は、抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）のことがある。一例では、そのタンパク質は、ヒト化抗ＣＤ２２抗体、抗ルイスＹ抗体、または抗５Ｔ４抗体である。ある実施形態では、その抗体は中間体物質である。一般に、そのタンパク質は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも３０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。保存から回収したときに、そのタンパク質は、例えば、標準体の少なくとも７０％の活性を有しうる。場合によっては、保存から回収したときに、この製剤は、対照と比較して５％以下の高分子量産物を含有するか、または保存から回収したときに、この製剤は、例えば対照と比較して１０％以下の高分子量産物および凝集物を含有する。いくつかの実施形態では、この製剤は、１０％以下の高分子量産物、例えば、５％以下の高分子量産物を含有する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、選択され単離されたタンパク質を保存するための好ましい製剤を決定する方法に関する。その方法は、選択され単離されたタンパク質を用意すること、ｐＨ４．０からｐＨ８．０の間の水溶液を含み、かつ約０ｍＭから約１５０ｍＭの間の緩衝液を含む一連の製剤中でその選択され単離されたタンパク質を保存すること、安定性の少なくとも１つのパラメータを決定すること、およびそのタンパク質が安定である製剤を同定することを含み、それにより、そのタンパク質が安定である製剤は、単離され選択されたタンパク質を保存するための好ましい製剤である。その方法のいくつかの実施形態では、安定性の減少は、例えば、対照と比較した、試料中の高分子量タンパク質の量の増加、例えば、対照と比較した、試料中の低分子量種の量の増加、または対照と比較した、酸性種の率の増加のうち少なくとも１つにより示される。場合によっては、タンパク質の多くて０．５％、０．２％、または０．１％が高分子量種である条件が選択される。安定性のパラメータは、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により安定な製剤においてアッセイされた活性のことがあり、その活性は、対照の少なくとも５０％、または対照の少なくとも８０％である。その方法の一例では、安定性パラメータは高分子量種の存在であり、安定な製剤は、多くて５％の高分子量種を含有する。別の例では、安定性のパラメータは高分子量種およびタンパク質凝集物の存在であり、安定な製剤は、多くて１０％の高分子量種およびタンパク質凝集物、または多くて１５％の高分子量種および結合したタンパク質凝集物を含む。場合によっては、高分子量種の率は、対照試料（例えば、保存前の試料）に存在する量と比較される。その方法のなお別の実施形態では、安定性のパラメータは酸性タンパク質および塩基性タンパク質の比であり、安定な製剤におけるその比は、対照と多くて１５％異なる。
【００１４】
本発明は、ｐＨ４．０からｐＨ８．０を有する水溶液を含む製剤中でのポリペプチドの保存を含む方法により産生されたポリペプチド（タンパク質またはペプチド）にも関し、それにより、この製剤は、凍結防止剤や界面活性剤を含有せず、そのタンパク質は、−８０℃から８℃で少なくとも３週間安定である。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは抗体またはその断片（例えば、抗ＣＤ２２、抗ルイスＹ、または抗５Ｔ４）である。抗体またはその断片を分子にコンジュゲートすることができるし、また、分子とのコンジュゲーション、例えばリシンまたはカリケアミシンなどの毒素とのコンジュゲーションに使用することができる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、修飾タンパク質の製造に使用するためのポリペプチド（タンパク質またはペプチド）に関し、それにより、そのポリペプチドは、ｐＨ４．０からｐＨ８．０を有する水溶液を含む製剤中で保存され、その製剤は界面活性剤の凍結防止剤を含有せず、そのタンパク質は、−８０℃から８℃で少なくとも３週間安定である。場合によっては、そのポリペプチドは抗体、例えば、抗ＣＤ２２、抗ルイスＹ、または抗５Ｔ４である。そのポリペプチドは、コンジュゲートしたタンパク質の製造に、例えばリシンまたはカリケアミシンなどの毒素とのコンジュゲーションのために使用することができる。そのようなコンジュゲートしたタンパク質を、本明細書に記載された製剤中で保存することもできる。
【００１６】
別に定義しない限り、本明細書に使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似しているか、または等しい方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を下に記載する。本明細書に言及した全ての出版物、特許出願、特許、およびその他の参照は、その全体が参照により組み込まれている。さらに、材料、方法、および実施例は単に例示的であり、限定することを意図しない。
【００１７】
本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１８】
（図面の記載）
図１Ａは、様々なｐＨおよび様々な温度での１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのサイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）分析の結果を示す棒グラフである。結果を高分子量（ＨＭＷ）種の率として表す。
【００１９】
図１Ｂは、様々なｐＨおよび様々な温度での１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を低分子量（ＬＭＷ）種の率として表す。
【００２０】
図２は、様々なｐＨおよび様々な温度での１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を酸性種の率として表す。
【００２１】
図３は、様々なｐＨで、４０℃で４週間保存された抗ルイスＹ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの描写である。左の画像は、非還元条件で泳動させたゲルのものであり、右の画像は、還元条件で泳動させたゲルのものである。
【００２２】
図４は、図３について記載された試料の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルの描写である。
【００２３】
図５は、様々なｐＨおよび様々な温度で２週間インキュベートされた０．５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＨＭＶ種の率として表す。
【００２４】
図６は、７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で、様々なｐＨおよび様々な温度で２週間インキュベートされた２５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【００２５】
図７Ａは、様々な緩衝液中で、かつ７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で、様々なｐＨおよび４０℃で４週間インキュベートされた１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００２６】
図７Ｂは、様々な緩衝液中で、かつ７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で、様々なｐＨおよび４０℃で４週間インキュベートされた１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＬＭＷ種の率として表す。
【００２７】
図８は、様々な緩衝液中で、かつ７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で、様々なｐＨおよび４０℃で４週間インキュベートされた１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を酸性種の率として表す。
【００２８】
図９Ａは、様々な温度および様々なＮａＣｌ濃度で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中で４週間インキュベートされた３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【００２９】
図９Ｂは、９Ａについて記載された試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００３０】
図９Ｃは、９Ａについて記載された試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＬＭＷ種の率として表す。
【００３１】
図１０は、様々な塩濃度で、かつ振盪に供された１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。結果を単量体の回収率として表す。
【００３２】
図１１Ａは、図１１Ｂに示されるように１０回の凍結−解凍サイクルの後の、１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下での１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。結果を単量体の回収率として表す。
【００３３】
図１１Ｂは、示されるように、１０回の凍結解凍サイクル後の、１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下での１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を単量体の回収率として表す。
【００３４】
図１２は、７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で様々な温度で１カ月間インキュベートされた、５０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中の２５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【００３５】
図１３は、２０ｍＭコハク酸塩（ｐＨ６．０）、コハク酸塩＋７５ｍＭ ＮａＣｌ、コハク酸塩＋０．０１％ポリソルベート８０、またはコハク酸塩＋７５ｍＭ
ＮａＣｌおよびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ）中の１５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。分析前に試料を２４時間振盪した。コハク酸緩衝液中の非振盪タンパク質対照を含める。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００３６】
図１４Ａは、４０℃で４週間、７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下でインキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＨＭＷ種の率の変化として表す。
【００３７】
図１４Ｂは、４０℃で４週間、７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下でインキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＬＭＷ種の率の変化として表す。
【００３８】
図１４Ｃは、４０℃で４週間、７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下でインキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を酸性種の率の変化として表す。
【００３９】
図１５Ａは、様々な温度で様々な時間インキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００４０】
図１５Ｂは、様々な温度で様々な時間インキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＬＭＷ種の率として表す。
【００４１】
図１５Ｃは、様々な温度で様々な時間インキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を酸性種の率として表す。
【００４２】
図１６Ａは、２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中で、かつ様々な凍結−解凍方式で様々なサイクルの間処理された１ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。ＦＦは急速凍結、ＦＴは急速解凍、ＳＦは緩慢凍結、およびＳＴは緩慢解凍である。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００４３】
図１６Ｂは、２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中で、かつ様々な凍結−解凍方式で様々なサイクルの間処理された２５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。ＦＦは急速凍結、ＦＴは急速解凍、ＳＦは緩慢凍結、およびＳＴは緩慢解凍である。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００４４】
図１６Ｃは、ポリソルベート８０含有２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中で、かつ様々な凍結−解凍方式で様々なサイクルの間処理された１ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。ＦＦは急速凍結、ＦＴは急速解凍、ＳＦは緩慢凍結、およびＳＴは緩慢解凍である。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００４５】
図１６Ｄは、ポリソルベート８０含有２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中で、かつ様々な凍結−解凍方式で様々なサイクルの間処理された２５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。ＦＦは急速凍結、ＦＴは急速解凍、ＳＦは緩慢凍結、およびＳＴは緩慢解凍である。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００４６】
図１７Ａは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて分析された振盪研究の結果を示す棒グラフであり、この研究では、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹを、ポリソルベート８０の存在下または不在下で室温で２４時間３６０ｒｐｍで振盪した。結果を単量体の回収率として表す。
【００４７】
図１７Ｂは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて分析された振盪研究の結果を示す棒グラフであり、この研究では、様々な濃度のポリソルベート８０に溶かした１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹを、室温で２４時間３６０ｒｐｍで振盪した。結果を単量体の回収率として表す。
【００４８】
図１８Ａは、図１８Ｂに示されるように１０回の凍結解凍サイクル後に０．０１％ポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を単量体の回収率として表す。
【００４９】
図１８Ｂは、示されるように１０回の凍結解凍サイクル後に０．０１％ポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を単量体の回収率として表す。
【００５０】
図１９Ａは、様々な温度および様々な時間インキュベーション後にポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ
ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００５１】
図１９Ｂは、様々な温度および様々な時間インキュベーション後にポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ
ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果をＬＭＷ種の率として表す。
【００５２】
図１９Ｃは、様々な温度および様々な時間インキュベーション後にポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、７５ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ５．５中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を酸性種の率として表す。
【００５３】
図２０Ａは、抗ＣＤ２２の６カ月保存安定性のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。溶液は、２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０（Ｓ）；２０ｍＭコハク酸塩、１０ｍＭメチオニン、ｐＨ６．０（ＳＭ）；２０ｍＭコハク酸塩、０．０１ポリソルベート８０、ｐＨ６．０（ＳＴ）；または２０ｍＭコハク酸塩、１０ｍＭメチオニン、０．０１ポリソルベート８０、ｐＨ６．０（ＳＭＴ）を含有する。結果をＨＭＷ種の率として表す。
【００５４】
図２０Ｂは抗ＣＤ２２の６カ月保存安定性のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。溶液は、２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０（Ｓ）；２０ｍＭコハク酸塩、１０ｍＭメチオニン、ｐＨ６．０（ＳＭ）；２０ｍＭコハク酸塩、０．０１ポリソルベート８０、ｐＨ６．０（ＳＴ）；または２０ｍＭコハク酸塩、１０ｍＭメチオニン、０．０１ポリソルベート８０、ｐＨ６．０（ＳＭＴ）を含有する。結果を合計ピーク面積の率として表す。
【００５５】
図２０Ｃは、抗ＣＤ２２の保存安定性のＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。条件は図２０Ａおよび２０Ｂに記載した通りである。結果を完全に活性な種の率（ピーク５の％）として表す。
【００５６】
図２１は、様々なｐＨおよび温度で２週間保存された抗５Ｔ４の高分子量産物（ＨＭＷ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。結果を高分子量産物の平均率として表す。
【００５７】
図２２は、塩（ＮａＣｌ）の存在下または不在下で様々なｐＨで、酢酸緩衝液（Ａｃｅ）、クエン酸緩衝液（Ｃｉｔ）、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓ）、またはコハク酸緩衝液（Ｓｕｃ）中で初期の、または４０℃で４週間後の抗５Ｔ４試料中の高分子量産物（ＨＭＷ）または低分子量産物（ＬＭＷ）の率のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【００５８】
図２３Ａは、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中で抗５Ｔ４の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の結果を示すサーモグラムである。
【００５９】
図２３Ｂは、コハク酸緩衝液（ｐＨ６．０）中の抗５Ｔ４の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の結果を示すサーモグラムである。
【００６０】
図２４Ａは、ＮａＣｌの不在下で、かつ様々なｐＨで様々な製剤中の抗５Ｔ４のＤＳＣの結果を示す棒グラフである。
【００６１】
図２４Ｂは、様々なｐＨで１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する様々な製剤中の抗５Ｔ４のＤＳＣの結果を示す棒グラフである。
【００６２】
図２５は、様々なｐＨで１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で様々な緩衝液を含有する製剤中の、４０℃で４週間後の抗５Ｔ４のＣＥＸ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【００６３】
図２６Ａは、様々なｐＨで様々な緩衝液中の、−８０℃または４０℃で６週間後の抗５Ｔ４（２ｍｇ／ｍｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【００６４】
図２６Ｂは、ｐＨ６でクエン酸またはコハク酸緩衝液中の、−８０℃または４０℃で６週間後の抗５Ｔ４（３０ｍｇ／ｍｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【００６５】
図２７Ａは、様々なｐＨで様々な緩衝液製剤中の、４０℃で６週間後の抗５Ｔ４（２ｍｇ／ｍｌ）のＣＥＸ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【００６６】
図２７Ｂは、ｐＨ６でクエン酸またはコハク酸緩衝液中の、４０℃で６週間後の抗５Ｔ４（３０ｍｇ／ｍｌ）のＣＥＸ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【００６７】
図２８は、様々なｐＨで様々な緩衝液製剤中の、４０℃で６週間後の抗５Ｔ４のＳＤＳゲルのキャピラリー電気泳動の結果を示す一組の重ねた電気泳動図の再現である。
【００６８】
図２９Ａは、様々な緩衝液（ｐＨ５．５）を含有し、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の製剤中の、異なる凍結解凍方式での１ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４のＡ４００を示す棒グラフである。ＦＦは急速凍結、ＳＦは緩慢凍結、ＦＴは急速解凍、およびＳＴは緩慢解凍である。
【００６９】
図２９Ｂは、様々な緩衝液（ｐＨ５．５）を含有し、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の製剤中の、異なる凍結解凍方式での１ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４の高分子量（ＨＭＷ）種の率を示す棒グラフである。ＦＦは急速凍結、ＳＦは緩慢凍結、ＦＴは急速解凍、およびＳＴは緩慢解凍である。
【００７０】
図３０Ａは、様々な緩衝液（ｐＨ５．５）を含有し、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の製剤中の、異なる凍結解凍方式での２５ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４のＡ４００を示す棒グラフである。ＦＦは急速凍結、ＳＦは緩慢凍結、ＦＴは急速解凍およびＳＴは緩慢解凍である。
【００７１】
図３０Ｂは、様々な緩衝液（ｐＨ５．５）を含有し、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の製剤中の、異なる凍結解凍方式での２５ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４の高分子量（ＨＭＷ）種の率を示す棒グラフである。ＦＦは急速凍結、ＳＦは緩慢凍結、ＦＴは急速解凍およびＳＴは緩慢解凍である。
【００７２】
図３１Ａは、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の様々な製剤中の１ｍｇ／ｍｌまたは２５ｍｇ／ｍｌの抗５Ｔ４のＡ４００を示す棒グラフである。試料を振盪するか、または振盪しなかった。「＊」は、濁度が機器の上限を超えることを示す。
【００７３】
図３１Ｂは、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の様々な製剤中の１ｍｇ／ｍｌまたは２５ｍｇ／ｍｌの抗５Ｔ４の高分子量種（ＨＭＷ）の率を示す棒グラフである。試料を振盪するか、または振盪しなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
比較的単純な製剤が、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体含有薬、または抗体含有薬などのタンパク質産物の産生における中間体物質などのタンパク質を保存するために用意される。この製剤は、一般に界面活性剤を低ないし無含有であり、無塩ないし相対的に低塩濃度を含み、相対的に低緩衝液濃度を必要とする。この製剤は、比較的広い範囲のタンパク質濃度、ｐＨ、および緩衝液の種類にわたり、抗体などのある種のタンパク質の安定な保存に有効である。そのような製剤は、例えば所望のｐＨ、賦形剤添加、化学修飾、または凍結乾燥に対してタンパク質を容易に調整可能にするさらなる加工について大きな柔軟性をもたらす。ペプチドおよび加工されたタンパク質、例えば、他のペプチドまたは非ペプチド部分にコンジュゲートした抗体などのタンパク質の保存のために、この製剤を使用することもできる。
【００７５】
３つの異なる抗体、すなわち抗ＣＤ２２、抗ルイスＹ、および抗５Ｔ４の保存のために好ましい製剤を同定する方法を例示している具体的な非限定的な例もまた提供される。それらの抗体は、例えば、細胞毒などの化合物に抗体をコンジュゲートすることにより作製される薬物の製造のための中間体物質として使用することができる。中間体物質は、薬物などの化合物の製造に使用される物質、一般にはタンパク質（例えば抗体）である。
【００７６】
製剤
本明細書に記載された製剤は、一般に約ｐＨ３．０〜９．０、例えば、約ｐＨ４．０〜８．０、約ｐＨ５．０〜６．５、または約ｐＨ５．５〜６．０の水溶液中に単離されたタンパク質を含む。この製剤は、凍結防止剤も界面活性剤も含有しない。一般に、この製剤は保存料を含有しない。
【００７７】
本明細書に記載された製剤は、凍結防止剤を含有しない。凍結防止剤は当業者に公知であり、凍結防止剤には、例えば単糖類（例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、リボース、マンノース、およびキシロース）；二糖類（例えば、トレハロース、シュークロース、セロビオース、およびラクトース）；三糖類（例えば、ラフィノース）；糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、ミオイノシトール、リン酸化イノシトール、およびグリセロール）；多糖類（例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、デキストラン、リン酸化デキストラン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロース）；カルボン酸（例えば、ピルビン酸塩および２，３，−ジホスホグリセリン酸塩）；ならびに保護作用のために使用されるタンパク質またはタンパク質混合物（例えば、血液、動物血清、血漿、ヒトアルブミン、ウシアルブミン、ウシゼラチン、および魚ゼラチン）が含まれる。
【００７８】
この新しい製剤は、界面活性剤（非常に低濃度で使用された場合に水の表面張力を低減することができる試薬）を含有しない。界面活性剤は当技術分野で公知であり、界面活性剤には、例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）界面活性剤が含まれる。
【００７９】
一般に、この新しい製剤は保存料を含有しない。保存料は当業者に公知であり、保存料には、例えばアジ化ナトリウム、チメロサールなどの水銀含有化合物、キシレノール、抗生物質、イソチアゾロン、およびアンホテリシンなどの抗細菌剤および抗真菌剤が含まれる。
【００８０】
緩衝液
製剤は、溶液のｐＨを許容できる範囲内に維持する薬剤を意味する緩衝液中に存在しうる。緩衝液には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、グルコン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、または他の有機酸緩衝液が含まれうる。タンパク質と共に使用するのに適したその他の緩衝液は当業者に公知である。ある種の製剤はアミン緩衝液の使用を除外する。緩衝液を含有する製剤においては、その緩衝液は、０ｍＭを超えて１５０ｍＭまでの範囲の濃度で一般に存在する。場合によっては、その緩衝液の濃度は、約５０ｍＭから約１００ｍＭまたは約１ｍＭから約５０ｍＭである。例えば、その緩衝液の濃度は、約１０ｍＭから２０ｍＭでありうる。場合によっては、緩衝液の組合せを使用することができ、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液およびトリス緩衝液を組み合わせて使用することができる。
【００８１】
その他の考慮すべき事項を、緩衝液の選択に適用することができる。例えば、トリスまたはヒスチジン緩衝液などのアミン緩衝液は、ある種のコンジュゲーション手順に適さないため、そのようなコンジュゲーション手順に使用されるであろうタンパク質を含有する製剤には適さない。
【００８２】
一般に、製剤に使用される塩濃度は、添加された塩として表現され、緩衝液、または製剤中に希釈する前にタンパク質試料中に存在した塩によって寄与された、例えばナトリウムを考慮しない。
【００８３】
製剤は、当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。例えば、対象となるタンパク質を含有する製剤に、所望のｐＨの緩衝液と、所望により塩とを導入するために透析を使用することができる。一般に、対象となる単離されたタンパク質を含有する初期試料が用意される。場合によっては、製剤中に希釈する前に初期試料が高タンパク質濃度である場合などには、その初期試料のｐＨまたは塩の量を考慮する必要はない。非常に高い塩濃度または高い緩衝液濃度を含有する初期試料を使用して製剤を調製する場合には、タンパク質を調製する方法は、初期試料の非タンパク質成分を除去または低減するタンパク質調製法（例えば、透析）が一般に使用される。
【００８４】
安定性
製剤が−８０℃から８℃で保存される場合には、少なくて３週間の少なくとも特定の期間、製剤のタンパク質（例えば、抗体）成分が安定であることが、本明細書に記載された製剤の特徴である。一般に、製剤中のタンパク質成分は、５℃で少なくとも１年間安定である。安定性は、一般にタンパク質の立体配座の安定性および／または活性の安定性を指す。製剤に関して、タンパク質が、本明細書に提供された安定性についてのパラメータのうち少なくとも１つに従うならば、そのタンパク質は安定である。一般に、タンパク質の保存中に蓄積する高分子量種の形成を最小にすることが望ましい。このように、安定性の一パラメータは、保存に供された製剤中の高分子量種の量の増加がもしあれば、その増加が対照よりも小さいことである。例えば、製剤中で保存後の、試料中の高分子量種の率は、対照と比較して有意に増加しない。一般に、対照は、実験条件（例えば、−８０°から８℃で３週間）で保存に供されなかった製剤のレプリカである。場合によっては、保存後の高分子量種における製剤のタンパク質成分の率は、総タンパク質の１０％以下、総タンパク質の５％以下、総タンパク質の３％以下、または総タンパク質の２％以下である。高分子量種をアッセイする方法は当技術分野で公知であり、その方法には、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動、およびサイズ排除クロマトグラフィーが含まれる。
【００８５】
アッセイできる別のパラメータは、もしあれば、保存に供された製剤中の低分子量種の量の増加である。一般に、保存中に低分子量種の蓄積を最小にすることが望ましい。例えば、製剤中で保存後の、試料中の低分子量種の率は、対照と比較して有意に増加しない。場合によっては、保存後の高分子量種における製剤のタンパク質成分の率は、総タンパク質の１０％以下、総タンパク質の５％以下、総タンパク質の３％以下、または総タンパク質の２％以下である。低分子量種を当技術分野で公知の方法、例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用してアッセイすることができる。
【００８６】
様々な条件で保存後の製剤中の酸性種および塩基性種の比を、対照における比と比較することができる。一般に、脱アミドを示す酸性種の率が決定される。酸性種の率の増加は、安定性の減少を示す。例えば、安定な製剤は、選択された条件で対照と比較した酸性種の率における多くて１０％の増加を一般に表す。試料中の酸性種の率を決定する方法、例えばＣＥＸ−ＨＰＬＣは、当技術分野で公知である。場合によっては、塩基性種の存在は当技術分野で公知の方法を使用してアッセイされる。製剤中で保存されたタンパク質中に存在する塩基性種の率または種類における変化は、その製剤中のタンパク質種の安定度を示す。
【００８７】
安定性のための別のパラメータは、もしあれば、対照中の凝集物および高分子量種の量の１０％以下である、凝集物およびＨＭＷの増加でありうる。凝集物は、一般に、製剤のタンパク質成分を分離するために使用することができるゲル、カラム、またはその他の分離媒質に進入しない、試料中の物質である。製剤中の高分子量種および凝集物を決定する方法は、当技術分野で公知であり、その方法には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、および光散乱が含まれる。
【００８８】
タンパク質の効力または活性を決定し、かつその効力または活性は、製剤の安定性を確立するためのパラメータとして使用することができる。抗体の場合は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））を使用することができる。イムノアッセイまたは活性のその他のアッセイが使用される場合には、製剤中の抗体が、対照の活性と比較してイムノアッセイにおいてその活性の少なくとも５０％を保持するならば、その抗体は安定である。場合によっては、その製剤は、そのタンパク質がその活性の少なくとも２０％を保持するならば安定である。
【００８９】
安定性の他のパラメータを測定し、かつそのパラメータは、製剤を評価するために使用することもまたできる。例えば、撹拌（振盪）後の製剤中のタンパク質の安定性をアッセイすることができる。輸送の間に試料が安定であり続けることが望ましいことから、これは重要なパラメータでありうる。撹拌に関する製剤の安定性は、ある時間（例えば、１２時間、２４時間、４８時間、またはそれよりも長く）試料を撹拌（例えば、３６０ｒｐｍ）に供して、次に、対照と比較して、不安定性を示す産物（例えば、高分子量種、低分子量種、酸性種）の増加が存在するかどうかを決定することによって、一般にアッセイされる。
【００９０】
当技術分野で公知の他の方法を、製剤中のタンパク質の安定性を評価するために使用することができる。そのような方法の例には、二次および三次構造情報の両方を提供する円偏光二色性、蛍光分光法（例えば、アンフォールディングを示すものとしての疎水性パッチに結合するＢｉｓ−ＡＮＳの存在下で）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ、全体的な熱アンフォールディングを監視する）、および限外ろ過／ダイアフィルトレーションが含まれる。
【００９１】
タンパク質の安定性を評価するために１種より多くのパラメータを使用することができる。
【００９２】
温度
最小限の溶液中にタンパク質を保存することによって、時間が経過してもそのタンパク質が一連の温度にわたり顕著な分解または凝集を示さない方法を提供することが、本明細書に記載された特定の製剤の利点である。一般に、製剤中のタンパク質またはペプチドは、約−８０℃から約４０℃または約−８０℃から約８℃（例えば、約５℃まで）の範囲の温度で少なくとも３日間（例えば、２週間または４週間）安定である。場合によっては、製剤が長期間、例えば少なくとも２カ月、３カ月、６カ月、９カ月、１年、３年、５年、７年、または１０年間安定なことが望ましい。
【００９３】
さらに、製剤中に含まれるタンパク質は、繰り返しの凍結−解凍サイクルにわたり顕著な安定性を示すことができ、そのような処置に続いて解凍された後に安定であり続けることができる。一般に、凍結される製剤は急速凍結され、例えば液体窒素中で凍結される。解凍は一連の温度で、例えば、緩慢解凍である約０℃から約２５℃、または急速解凍である約２６℃から４０℃で行うことができる。急速解凍の一例は、３７℃の水浴中でこの製剤を解凍することである。製剤中のタンパク質は、少なくとも１回の凍結−解凍サイクル、少なくとも５回の凍結−解凍サイクル、または
少なくとも１０回の凍結−解凍サイクルの間安定でありうる。
【００９４】
安定性を保つために製剤を凍結−解凍するための最適な方式を決定することが望ましいことがあり、また、特定の凍結−解凍サイクルに供されるであろうタンパク質について最大の安定性をもたらす製剤を同定することが望ましいこともある。したがって、いくつかの実施形態では、このパラメータが評価される。例えば、様々な組合せの急速凍結、緩慢凍結、急速解凍、緩慢解凍などの様々な凍結−解凍条件下で安定性について被験製剤をアッセイして、最も少ない（例えば、最大の安定性を有する）分解産物を産生する手順を決定することができる。
【００９５】
ポリペプチド
本明細書に記載された製剤に使用されるポリペプチドは、一般に単離されたタンパク質である。「単離された」タンパク質は、細胞性物質、またはタンパク質が由来する細胞もしくは組織起源のその他の混入タンパク質を実質的に有さないか、または化学合成された場合に化学前駆物質もしくはその他の化学物質を実質的に有さない。語「実質的に有さない」は、約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量あたり）のその他のタンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも称される）または化学前駆物質を有する、単離されたタンパク質の調製を意味する。単離されたタンパク質が組換え産生される場合には、そのタンパク質は培地もまた一般に実質的に有さない。すなわち、培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満に相当する。
【００９６】
場合によっては、製剤にタンパク質の組合せが使用される。例えば、医薬として調製される２つの異なる抗体を同一の製剤中に一緒に保存することができる。その他の種類またはタンパク質、または毒性ペプチドを含めたペプチドと組み合わせて、抗体を製剤と共に使用することもまたできる。ペプチドまたはタンパク質断片を製剤と共に使用することができ、例えば、Ｆａｂ断片などの抗体断片を使用することができる。
【００９７】
一般に、「タンパク質」は、完全長タンパク質またはその断片を指す。タンパク質は、天然タンパク質もしくはその断片、または例えば突然変異誘発法もしくは組換え法から生じる遺伝的に操作されたタンパク質もしくはその断片に対応しうる。タンパク質は、場合によっては検出可能な分子（例えば、蛍光分子または放射性同位体）、毒素、薬物、または小分子などの非タンパク質性部分を含むことがある。タンパク質は、例えば非天然アミノ酸を含有することがある。タンパク質は、ハイブリッドタンパク質のことがある。タンパク質は、（例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方を含む）抗体または成熟インスリンタンパク質のように１種類を超える別々のタンパク質を含むことがある。使用されうるタンパク質断片の例には、Ｆａｂ断片またはＦｃ断片が含まれる。場合によっては、製剤と共にペプチドが使用されるか、または上記のように少なくとも１つのタンパク質と少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質断片との組合せが使用される。タンパク質性毒素を、例えば単独で、別のタンパク質もしくはペプチドにコンジュゲートして、または別のタンパク質もしくはペプチドとは別個の実体として製剤中に保存することもまたできる。一般に、本明細書に提供された製剤は、タンパク質について本明細書に記載されたように任意のポリペプチド（タンパク質またはペプチド）に有用である。
【００９８】
ペプチドは、２つ以上の共有結合したアミノ酸（例えば、５、１０、１５、２０、３０、または５０個のアミノ酸）を有する化合物である。一般に、タンパク質は、長さが少なくともアミノ酸５０個であるポリペプチドまたは多数のポリペプチド（例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖を含む抗体分子またはその部分）である。
【００９９】
この製剤を、ペプチドまたは非ペプチド部分にコンジュゲートしたポリペプチドを保存するために使用することもできる。そのような部分の例には、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、ロダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、もしくはＣｙ５．５）、元素部分（例えば、金粒子）、薬物、または毒素が含まれるが、それに限定されるわけではない。そのような分子をポリペプチドにコンジュゲートする方法は、当技術分野において公知である。分子の例には、リシン（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ
９０：２０２０〜２０２６；Ｇｈｅｔｉｅら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：５８７６；Ｃｏｎｒｙら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓ．Ｔｕｍｏｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２３１〜２４１）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（ＰＥ）（Ｓｍｉｔｈ、２００１、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ２（９）：１３１４〜１３１９；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、１９９６、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７：５５７）、タキサン（すなわち、パクリタキセル）（Ｇｕｉｌｌｅｍａｒｄら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．６１：６９４〜６９９）、ドキソルビシン（Ｓｈｏｕｖａｌら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：８２７６〜８２８０；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９６、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｄｒｕｇｓ７（６）：６８７〜６９６；Ｓｈｉｈら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１（１６）：４１９２〜４１９８；Ｓｈｉｈら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３８（２）：９２〜９８；Ａｌｅｘａｎｄｒｕら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５９：１１５〜１２１；Ｔｒａｉｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：２１２〜２１５）、アントラセン（Ｄｉａｓら、２００５、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１６：９４９〜９５８）、メイタンシノイド（Ｔａｓｓｏｎｅら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．６４：４６２９〜４６３６；Ｔｏｌｃｈｅｒら、２００３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１（２）：２１１〜２２２）、アドリアマイシン（Ｈｕｒｗｉｔｚら、１９８３、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４１７：１２５〜３６；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８８、Ｇａｎ
Ｎｏ Ｒｉｎｓｈｏ ３４：８４７〜５０；Ｄｅｇｕｃｈｉら、１９８７、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３７（２）：３５３〜３５８）、放射性同位体（Ｋａｒｕｂｅら、１９９６、Ｎｕｃｌｅａｒ
Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２３：７５３〜７５９；Ｍｉｓｈｒａら、２００４、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．１２（９〜１０）：５５９〜５６７；Ｌｅｅら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．６１：４４７４〜４４８２）、メトトレキサート（Ｒｙｓｅｒら、１９８８ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５（２）：２７７〜２８４；Ｍａｎｄｅｌら、１９９１、Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４９（１）：６０〜６５）、例えば９０−イットリウムなどの別の部分にコンジュゲートした１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−四酢酸（ＤＯＴＡ）（Ｌｕら、２００５、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９４（４）：７８８〜７９７）、ストレプトアビジン（Ｎｇａｉら、１９９５、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２（１）、７７〜８６）、テクネチウム（Ｔｃ）９９ｍ、イットリウム、およびＩｎ１１１放射性コンジュゲートを含めた放射性同位体コンジュゲート産物（例えば、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｍａｒｋｅｔ、第４版、Ｒａｄｅｒ編、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、２００５に挙げられたもの）が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１００】
一般に、製剤のタンパク質成分は、比較的高いｐＩ、例えば少なくとも６．０、７．０、８．０、または８．５のｐＩを有するタンパク質である。このタンパク質は、抗体の場合と同様に、１つを超えるペプチド鎖を有しうる。製剤のタンパク質成分が抗体である場合には、その抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、またはその断片（例えば、Ｆａｂ断片）のことがある。タンパク質は、約１ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約３００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌ、または約２０ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤中に存在しうる。本明細書に記載された製剤に使用される特異的抗体は、ヒト化モノクローナル抗ＣＤ２２抗体、モノクローナル抗ルイスＹ抗体、および抗５Ｔ４抗体である。
【０１０１】
製剤に使用される単離されたタンパク質は、一般に、治療としての潜在性または治療の一部である潜在性を有するタンパク質である。そのようなタンパク質は、本明細書において治療用タンパク質と称され、そのようなタンパク質には抗体が含まれる。
【０１０２】
本明細書に記載されたように使用することができる特異的タンパク質の例には、抗ＣＤ２２（ＵＳ２００４００８２７６４Ａ１およびＵＳ２００４０１９２９００Ａ１参照）、抗ルイスＹ（ＷＯ０５／０１９２７１Ａ１）、および抗５Ｔ４（米国特許出願第６０／６０８４９４号）などの抗体が含まれる。
【０１０３】
ｐＨ
製剤に好ましいｐＨ条件は、約ｐＨ４．０からｐＨ８．０の間である。一般に、ｐＨは約５．５〜６．０である。約５．５〜６．０のｐＨで、モノクローナル抗体を含有する製剤を保存することができ、その製剤は、０℃から約８℃（一般に約１℃から約５℃）で少なくとも３カ月間、例えば、６カ月、１年、または２年間、および例えば−８０℃で長期（少なくとも３年、５年、７年、または１０年間）保存の間安定性を保持する。
【０１０４】
好ましい製剤の同定
本明細書に記載されたいくつかの方法では、好ましい製剤は、対象となる特異的タンパク質について同定される。これらの方法では、本明細書に記載されたタンパク質のような、製剤中に保存される単離されたタンパク質、例えば、抗体などの治療用タンパク質が同定される。そのタンパク質は、治療として使用するための細胞毒（例えば、カリケアミシン）にコンジュゲートされた抗体を製造することなどの、下流の加工に使用できるまで保存される抗体のことがある。その他の例には、フルオレセイン、ロダミンなどの検出可能な標識にコンジュゲートされる抗体の保存、またはポリエチレングリコールとのコンジュゲーションに続いた、抗体をより長期間保存するための凍結乾燥が含まれる。
【０１０５】
単離されたタンパク質の保存のための好ましい製剤を同定するために、タンパク質は、約４．０〜８．０（例えば、ｐＨ５．０〜６．０）の範囲のｐＨおよび約０ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲の塩濃度で一連の被験溶液中に一般に懸濁される。これらの被験溶液は、特定の時間またはいくつかの異なる時間（例えば、３日間、２週間、または４週間）、様々な温度で保存される。次に、これらの試料は、高分子量種、低分子量種、酸性種の率の変化、または凝集物および高分子量種の量の変化などの安定性の少なくとも１つのパラメータについて評価される。製剤のタンパク質成分が安定な試料が、種の保存に好ましい製剤として次に選択される。凍結−解凍サイクル後または撹拌（振盪）後に、追加の評価を実施して、安定性などのその他の安定性パラメータを評価することができる。上記にもたらされた例は、特異的な単離されたタンパク質の保存のために好ましい製剤を同定する方法についての追加の案内を提供する。
【０１０６】
タンパク質の保存法
タンパク質またはペプチド（例えば、抗体、抗体断片、またはペプチドもしくは非ペプチド部分にコンジュゲートしたタンパク質）を保存する方法を本明細書に提供する。これらの方法は、さらなる製造に必要になるまで抗体などのタンパク質を保存するのに、例えば、細胞毒にコンジュゲートした薬物を製造するために、または検出可能に標識された試薬を製造するために、または例えばペプチドもしくは非ペプチド部分とのコンジュゲーションにより修飾されたタンパク質の保存のために特に有用である。
【０１０７】
特許請求された製剤の一部としてのタンパク質（例えば、抗体）の保存は、安定化剤および／または凍結防止剤を含有する製剤と比較して、下流の加工について柔軟性の増加をもたらす。
【０１０８】
例えば、安定なモノクローナル抗体薬物、または強力な抗癌剤とのコンジュゲーション、凍結乾燥、もしくは非経口投与のための液体製剤のためなどの、さらなる加工のための薬物中間体製剤を提供するために、製剤を使用することもできる。一般に、これらの方法には、界面活性剤を含まず、凍結防止剤を含まず、かつ比較的低い緩衝液濃度（例えば、約１０ｍＭから約２０ｍＭ）を有する水溶液の一部として、選択され単離されたタンパク質を保存することが含まれる。一般に、製剤の塩濃度は、相対的に低く、一般に約１００ｍＭ未満、例えば、約０ｍＭから約５０ｍＭ、約１ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、または約５ｍＭから約１０ｍＭである。
【０１０９】
上記の利点および特許請求の範囲から明白な利点以外に、本明細書に記載されたように保存されたタンパク質は、試料間（例えば、分割された単一調製物および本明細書に記載された製剤を用いて保存された分割量からのタンパク質試料）で良好な再現性を有する。さらに、本明細書に記載されたように保存されたタンパク質は、一般に保存後に効率的に加工され、例えば、それらのタンパク質は、凍結防止剤および／または界面活性剤を用いて保存されたタンパク質よりも効率的にコンジュゲートされる。
【実施例】
【０１１０】
本発明を以下の実施例によりさらに例示する。これらの実施例は、例示的な目的だけのために提供される。これらの実施例は、任意の方法で本発明の範囲または内容を限定するものとして解釈してはならない。
【０１１１】
実施例１：ｐＨ
抗ルイスＹ
抗体が安定であるｐＨ範囲を検討するために、１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹの試料を、４から８のｐＨ範囲、具体的にはｐＨ４．０、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、および８．０で調製した。本実施例および下記の実施例において、５ｍｌ
Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ＰＦＡバイアル（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、イリノイ州）の中で、例えば、合計試料容量２ｍｌで試料を一般に調製した。Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェルＵＶプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）中の試料をアッセイするためにＳｐｅｃｔｒａ
Ｍａｘ（登録商標）ＰＬＵＳ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）を用いて測定した２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を使用してタンパク質濃度を決定した。比吸光係数１．３６（ｍｇ／ｍｌ）−１ｃｍ−１を用いてタンパク質濃度を計算した。透析により、選択されたｐＨの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を含有するｐＨ緩衝液中にその試料を調製した。各試料は、７５ｍＭ
ＮａＣｌも含有した。調製された試料をろ過滅菌して、−８０℃の凍結装置の中に置くか、または５℃もしくは４０℃に維持した安定性チャンバーの中に置いた。４週間後に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー）を用いて高分子量種および低分子量種の存在について試料をアッセイした。当技術分野で公知の方法を用いて、分離カラムとしてＴｏｓｏＨａａｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ペンシルベニア州）ＢＩＯＳＥＰ
Ｇ３０００ＳＷＸＬを使用してＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を行った。
【０１１２】
分析前に３７℃の水浴中で凍結試料を解凍した。
【０１１３】
高分子量種の発生はｐＨと共に増加したが、高分子量種はｐＨの関数としての主分解産物ではなかった（図１Ａ）。４０℃で保存された試料についての低分子量種のｐＨプロファイルはＶ型であり、ｐＨ５．５で低分子量種は最小であった（図１Ｂ）。したがって、−８０℃から５℃の温度範囲およびｐＨ４．０から８．０のｐＨ範囲にわたり抗ルイスＹ抗体は安定であった。
【０１１４】
試料の安定性をさらに評価するためにＣＥＸ−ＨＰＬＣ（陽イオン交換クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ）を使用した。Ｄｉｏｎｅｘ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）ＰｒｏＰａｃ
ＷＣＸ−１０カラムを採用してこれらの分析を行った。４０℃で保存された試料において、高ｐＨで酸性種の濃度の増加が見い出された（図２）。しかし、５℃および−８０℃で保存された試料については、抗ルイスＹは全ｐＨ範囲で安定であり、ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータか導出された結論が確認された。
【０１１５】
安定性を評価するなお別の方法として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、還元条件または非還元条件のいずれかで泳動された４〜２０％ゲルを用いて、４０℃で保存された試料をさらに分析した。これらの実験では、分子量における最小の変化量は、したがって最大安定性は、ｐＨ範囲５．０〜６．０の試料のものであったことが実証された（図３）。したがって、４０℃で保存される試料（例えば、抗体）は、約５．０から６．０の間のｐＨで最もよく維持される。
【０１１６】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）を使用して、４０℃で保存された試料をさらに評価した。ＩＥＦ電気泳動を使用して、タンパク質分解の結果としての酸性種の産生による抗体試料のｐＩにおける変化を監視した。
【０１１７】
抗体試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果と一致して、５．０〜５．５のｐＨ範囲の試料は、タンパク質の全荷電に最小量の変化を示した（図４）。
【０１１８】
保存の重要な一側面は、経時的な製剤のｐＨの安定性である。したがって、３つの温度全てで実験の開始時に、保存の２週間後に、および４週間後に試料のｐＨをアッセイした。どの試料でも初発ｐＨからの有意な偏差は存在しなかった（表１）。
【０１１９】
【表１】
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【０１２０】
まとめると、上に提示したデータは、抗ルイスＹが−８０℃から５℃の温度範囲で４〜８のｐＨ範囲で安定であることを実証している。一般に、この抗体の保存に好ましいｐＨは約５．５である。これは、４０℃でこの抗体を保存するための比較的好ましい条件もまた提供する。
【０１２１】
一般に、例えば、試料が０℃未満で保存される場合、試料が０℃から１５℃の間で保存される場合、および試料が約１５℃から４０℃の間で保存される場合には、２つ以上の温度の範囲にわたり安定性を招くｐＨがタンパク質の保存のために選択される。別の非限定的な例では、試料が約−８０℃、５℃、および４０℃で保存される場合である。
【０１２２】
抗ＣＤ２２
第２の抗体（抗ＣＤ２２）、すなわち正常および悪性成熟Ｂ細胞表面に発現するＣＤ２２を標的とするヒト化ＩｇＧ４抗体の保存に及ぼすｐＨの作用も試験した。抗ＣＤ２２の理論的ｐＩは約８．５である。加水分解はｐＨ５．０以下で起こる見込みであるが、脱アミドは７．５よりも大きいｐＨで起こる見込みである。したがって、タンパク質の安定性に及ぼすｐＨの作用を試験して、分析手順が安定性を示す能力を評価し、かつタンパク質保存用製剤のための適切なｐＨを選択するための原理を提供するために、４から８のｐＨ範囲に及ぶ実験を計画した。
【０１２３】
試験するｐＨ値で様々な緩衝液中に０．５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２を含有する抗ＣＤ２２を含有する試料を調製した。５℃、２５℃、または４０℃で、４．０（１０ｍＭコハク酸塩）、５．０（１０ｍＭクエン酸塩）、５．５（１０ｍＭコハク酸塩）、６．０（１０ｍＭヒスチジン）、６．５（１０ｍＭヒスチジン）、７．０（１０ｍＭリン酸塩）、または８．０（１０ｍＭトリス）のｐＨで２週間試料を保存した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、存在する高分子量種の率について試料を分析した。これらの試料（それぞれ０．５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２を含有する）では、２週間後に初期条件で存在する量と比較して５．０から８．０のｐＨ範囲でこれらの試料中の高分子量種の率に有意な増加は存在しなかった（図５）。
【０１２４】
抗ＣＤ２２などの抗体をさらなる（下流の）加工に使用する場合、さらなる加工に適する緩衝液中に中間体物質を提示するように考慮しなければならない。例えば、抗ＣＤ２２に対するカリケアミシンのコンジュゲーションを、ｐＨ７から８．５で第一アミンを含有しない緩衝液中行うことができる。しかし、コンジュゲーション緩衝液中に中間体物質を用意する必要がないことがある。この例では、中間体物質製剤は、緩衝液成分上の第一アミンがコンジュゲーション手順を妨害するであろうということに束縛されるであろう。第一アミンを含有しない溶液でのタンパク質の保存を検討するために、抗ＣＤ２２を２５ｍｇ／ｍｌに濃縮して、５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭコハク酸塩（ｐＨ６．０）、または５０ｍＭコハク酸塩＋５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）のいずれかの中にダイアフィルトレーションまたは透析する実験を実施した。安定性について２週間まで各試料を試験した。７５ｍＭ
ＮａＣｌの存在下または不在下で試料を調製して、−８０℃、４℃、または４０℃で保存した。時間＝０、１週間目および２週間目に、Ａ２８０／Ａ３２０、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＩＥＦ（２週間目）によって試料を分析した。
【０１２５】
これらの実験からのデータは、ｐＨ６．０（コハク酸緩衝液）がｐＨ７．０（ＨＥＰＥＳ）またはｐＨ７．６での組合せ（ＨＥＰＥＳおよびコハク酸塩）よりも大きな安定性をもたらしたことを実証した（図６）。
【０１２６】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣも使用して、−８０℃、５℃、または４０℃で７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で保存された、コハク酸、ＨＥＰＥＳ、または組合せ（上記の通り）中のｐＨ６．０、７．０、または７．６での２５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２を含有する試料中の高分子量種の率を評価した。これらのデータは、塩（ＮａＣｌ）がこれらの試料中の高分子量種の形成に顕著な作用を及ぼさなかったことを実証した（図６）。したがって、塩の存在は、抗体の保存に重大な条件ではない。
【０１２７】
実施例２：ｐＨ／緩衝液
異なる緩衝液が異なるｐＨで好ましい保存条件をもたらすかどうかを決定するために、保存された試料として抗ルイスＹ抗体を用いて、試みの「至適」ｐＨの上下のｐＨ０．５ユニットで緩衝液を試験した。これらの実験では、５．０から６．０のｐＨ範囲で４つの異なる緩衝系を試験した。安定性に及ぼす様々なイオン強度の作用も評価した。これらの実験で使用された緩衝液は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、５．５、および６．０；１０ｍＭ酢酸ナトリウム、７５ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、５．５および６．０；１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０、５．５、および６．０；１０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、５．５および６．０；１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０、５．５、および６．０；１０ｍＭリン酸ナトリウム、７５ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、５．５、および６．０；１０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．０、５．５、および６．０；ならびに１０ｍＭコハク酸ナトリウム、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、５．５、および６．０であった。これらの実験では、上記緩衝液中に抗ルイスＹを透析し、終濃度１ｍｇ／ｍｌに希釈した。次に、これらの試料を−８０℃または４０℃で４週間まで保存してから、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて高分子量種の率および低分子量種の率について分析した。これらの実験では、高分子量種が主分解物ではなく、異なる製剤間での高分子量種レベルの差は無視できることが見い出された（図７Ａ）。ｐＨ５．５で、クエン酸ナトリウムの試料は、全ての緩衝液（ＮａＣｌの添加の存在下または不在下）の間で最低レベルの低分子量種を実証した（図７Ｂ）。
【０１２８】
ＣＥＸ−ＨＰＬＣを用いて試料をさらに分析した。これらのデータから、試験された４つの緩衝液全てで高ｐＨ試料に存在する酸性種の率が増加した（図８）点において、すなわち、５．０から６．０のｐＨ範囲で全ての緩衝液について酸性種の上向き傾向が存在するという点において、ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータからの全般的な観察が確認された。
【０１２９】
これらのデータは、全般的に、抗ルイスＹの安定性が、５．０から６．０のｐＨ範囲で試験された４つの（酢酸Ｎａ、クエン酸、リン酸、およびコハク酸）緩衝液全てで類似していたことを実証している。さらに、（４０℃で安定性を調査する、図７Ｂ）加速安定性研究では、最低量の低分子量種の形成は、クエン酸Ｎａ緩衝液を含有する試料の場合であった。したがって、抗ルイスＹに好ましい緩衝液は、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５である。これらのデータは、抗体などのタンパク質の保存に好ましい製剤を同定する方法も実証している。
【０１３０】
実施例３：塩濃度およびタンパク質濃度
保存用製剤中のタンパク質の安定性に作用を有しうるパラメータとして塩濃度を調査した。実施例２に記載された加速分解プロトコールで、低タンパク質濃度での保存安定性も評価した。これらの実験では、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ＮａＣｌの添加が低分子量種の形成をやや促進した（図７Ｂ）が、試験された全ての緩衝液で酸性種の形成を抑制した（図８）ことが見い出された。
【０１３１】
ＣＥＸ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、種々のモル濃度のＮａＣｌを含有する１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の抗ルイスＹの安定性を評価した。これらのデータから、抗ルイスＹが０から１５０ｍＭ
ＮａＣｌを含有する１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中で５℃および−８０℃で安定であったことが実証された（図９Ａ）。加速分解は、タンパク質濃度３０ｍｇ／ｍｌでＮａＣｌが酸性種の出現を抑制する（図９Ａ）が、高まった低分子量種の形成（図９Ｃ）および高分子量種の形成は異なる条件で比較的安定であった（図９Ｂ）ことを示し、これは、タンパク質１ｍｇ／ｍｌを含有する試料からの観察を確認している（図７および８）。このように、塩濃度７５ｍＭ
ＮａＣｌが全体的な分解を最小にするために最も有利であることが見い出された。
【０１３２】
振盪に伴う安定性
タンパク質の安定性に影響しうる別の条件は、試料が受ける撹拌の量である。したがって、試料が撹拌された場合に、保存用製剤がある量の安定性を保つことが望ましい。様々な条件で撹拌しながらインキュベートされた製剤中の抗ルイスＹの安定性を試験するために実験を行った。これらの実験では、１５０ｍＭ
ＮａＣｌの存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌのいずれかの抗ルイスＹを含有する製剤を、室温で２４時間、３６０ｒｐｍで振盪することにより試験し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて単量体の回収率をアッセイした。
【０１３３】
これらの実験から、振盪に供された場合に濃度３０ｍｇ／ｍｌで存在するときに抗体が安定であったことが実証された（図１０）。１ｍｇ／ｍｌで、ＮａＣｌは単量体の回収をやや低減したことも見い出された。
【０１３４】
したがって、単純な保存用製剤は、振盪により誘導される試料に対するストレスから十分な保護をもたらすことができる。
【０１３５】
凍結／解凍下の安定性
様々な製造方法に使用されるタンパク質は、凍結−解凍サイクル、実際に時には多数回の凍結−解凍サイクルに必然的に供されることがある。したがって、凍結−解凍サイクルによって引き起こされる分解が最小である条件を保存用製剤が提供することは、好都合である。さらに、凍結および解凍のどの条件がタンパク質の最適な保護をもたらすかを決定することが有用である。これらのパラメータを試験するために、１５０ｍＭ
ＮａＣｌの存在または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中に１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌのいずれかで抗ルイスＹを含有する試料を調製した。次に、急速凍結／急速解凍、急速凍結／緩慢解凍、緩慢凍結／急速解凍、または緩慢凍結／緩慢解凍条件で１０回の凍結−解凍サイクルにこれらの試料を供した。液体窒素中で試料を凍結することにより急速凍結を実施し、−８０℃に試料をおくことにより緩慢凍結を実施した。試料を３７℃の水浴中で解凍することにより急速解凍を実施し、試料を室温に置くことにより緩慢解凍を実施した。次に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて各試料中の単量体の量を評価した。
【０１３６】
これらの実験の結果から、凍結／解凍条件にもＮａＣｌ濃度にも無関係に、高タンパク質濃度（３０ｍｇ／ｍｌ）で抗ルイスＹが安定であったことが示された（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。抗ルイスＹは、タンパク質濃度にも、解凍条件にも、ＮａＣｌ濃度にも無関係に緩慢凍結条件で安定であった。しかし、１ｍｇ／ｍｌで、製剤中のＮａＣｌは急速凍結条件での回収率をやや減少させた。
【０１３７】
以上を考慮して、抗ルイスＹが０ｍＭから１５０ｍＭの範囲のＮａＣｌ濃度で−８０℃および５℃で安定であると結論することができる。さらに、加速安定性研究（４０℃での製剤の研究）は、ＮａＣｌが酸性種の形成をやや減少させた一方で、低分子量種の出現を促進したことを示した。これらの結果を考慮して、７５ｍＭ
ＮａＣｌが抗ルイスＹの全体的な分解を最小にするために最適であることが見い出された。
【０１３８】
これらの実験は、本明細書に記載された製剤中に保存される特定のタンパク質について好ましい条件を同定するための方法も実証している。
【０１３９】
抗ＣＤ２２
異なるタンパク質の間の保存条件の可変性を調査して、特定のタンパク質のための保存用製剤を同定する方法をさらに確証するために、抗ＣＤ２２の保存安定性を検討した。これらの実験では、様々な緩衝液中に２５ｍｇ／ｍｌ（図６）の抗ＣＤ２２を含有する製剤を調製して所望のｐＨ、すなわちｐＨ６．０（５０ｍＭコハク酸塩）；ｐＨ７．０（５０ｍＭコハク酸塩および５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ）；ｐＨ７．６（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に到達させて、−８０℃、５℃、２５℃、または４０℃で１カ月間保存してから、高分子量種の率について評価した。
【０１４０】
試験された温度のいずれでも高タンパク質濃度（図６および図１２）で抗ＣＤ２２の保存安定性にＮａＣｌは作用を及ぼさなかったことが見い出された。
【０１４１】
振盪ストレス下での安定性
ＮａＣｌおよびポリソルベート８０の存在下で抗ＣＤ２２に及ぼす表面／空気相互作用の効果を決定するために振盪研究を行った。発送および製造の間に液体としての抗ＣＤ２２の安定性を評価するためにも、この研究を行った。これらの実験では、７５ｍＭ
ＮａＣｌ、０．１％ポリソルベート８０、または７５ｍＭ ＮａＣｌ＋０．１％ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ）を添加した２０ｍＭコハク酸緩衝液、ｐＨ６．０中に１５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２を含有する試料を調製した。試料を３００ｒｐｍで２４時間振盪した。コハク酸緩衝液中に抗ＣＤ２２のみを含有する対照も調製した。次に、高分子量種の率をアッセイした。これらのデータは、ＮａＣｌおよびポリソルベート８０のどちらも振盪時の抗ＣＤ２２の安定性に有益ではないことを実証している（図１３）。
【０１４２】
全体的に見れば、保存用製剤中の抗ＣＤ２２について上に提示したデータは、ＮａＣｌが抗ＣＤ２２の全体的な安定性に実質的な作用を有さないことを実証している。したがって、ＮａＣｌは抗ＣＤ２２製剤に不必要である。
【０１４３】
実施例４：抗体濃度
製剤中での保存安定性に及ぼすタンパク質濃度の効果を調査した。特定のタンパク質のための保存用製剤を同定する場合、および製剤中のこのパラメータの重要性に関係する一般原理を発見する場合には、好ましいタンパク質濃度を決定することが望ましい。
【０１４４】
これらの実験では、ＮａＣｌを含有しないか、７５ｍＭ ＮａＣｌを含有するかのいずれかの１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．５に濃度１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌで抗ルイスＹを含有する試料を調製した。試料を４０℃で４週間保存してから、高分子量種の率の変化（図１４Ａ）、低分子量種の率の変化（図１４Ｂ）、および酸性種の率の変化（図１４Ｃ）についてアッセイした。
【０１４５】
これらの実験の結果は、１ｍｇ／ｍｌおよび３０ｍｇ／ｍｌを含有する製剤について互角の安定性が明らかとなり、低濃度（１ｍｇ／ｍｌ）の方がＮａＣｌの存在にわずかに感受性が高かった。
【０１４６】
保存用製剤中では持続的に安定であることが特に望ましい。したがって、様々な温度、すなわち−８０℃、−２０℃、５℃、２５℃、および４０℃で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ
ＮａＣｌ中で３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹを含有する３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹ製剤の安定性を決定するための研究を実施した。１カ月目、２カ月目、３カ月目、６カ月目、および９カ月目に高分子量種の率（図１５Ａ）、低分子量種の率（図１５Ｂ）、および酸性種の率（図１５Ｃ）について試料を試験した。これらのデータの分析から、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、７５ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ５．５の製剤中で−８０℃から５℃の範囲の温度で９カ月保存後の抗ルイスＹのタンパク質安定性が良好であることが実証された。
【０１４７】
凍結／解凍および振盪安定性
上に示したように（図１０および図１１）、抗ルイスＹは３０ｍｇ／ｍｌの濃度で振盪および凍結／解凍ストレスに感受性ではないと思われた。さらに、抗ルイスＹは解凍速度に無関係に１ｍｇ／ｍｌの濃度で緩慢凍結に感受性ではなかったが、撹拌を伴う１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹの濃度で、および急速凍結条件に置かれた場合にタンパク質の損失が見い出された。
【０１４８】
抗ＣＤ２２／凍結／解凍
凍結−解凍サイクルの作用をさらに検討するために、２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中で、所望によりポリソルベート８０（０．００１％）を含有する、１ｍｇ／ｍｌまたは２５ｍｇ／ｍｌのいずれかの濃度の抗ＣＤ２２を、様々な凍結−解凍方式およびその方式の０、１、５、または１０回のサイクルに供した。その方式は、急速凍結／急速解凍（ＦＦ／ＦＴ）、急速凍結／緩慢解凍（ＦＦ／ＳＴ）、緩慢凍結／急速解凍（ＳＦ／ＦＴ）、および緩慢凍結／緩慢解凍（ＳＦ／ＳＴ）であった。次に、ＨＭＶ種の率をアッセイした。
【０１４９】
これらのデータは、ポリソルベート８０の存在とは無関係に、２５ｍｇ／ｍｌで抗ＣＤ２２が凍結／解凍ストレスに感受性ではないことを実証している（図１６Ｂおよび図１６Ｄ）。しかし、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、抗ＣＤ２２は、急速凍結に感受性である（図１６Ａおよび図１６Ｃ）。このように、この抗体について、試料が凍結−解凍サイクルに供されるならば、界面活性剤を含ませることは必要ではないが、高保存濃度を選択すべきである。
【０１５０】
保存安定性
図５および６は、抗ＣＤ２２が０．５ｍｇ／ｍｌおよび３０ｍｇ／ｍｌで−８０℃から５℃で安定であることを実証している実験結果を示す。４０℃では、２週間保存後に高タンパク質濃度を含有する試料中で高分子量種の率が増加した（図６）が、低タンパク質濃度を含有する試料では高分子量種の率の変化は検出されなかった（図５）。
【０１５１】
実施例５：界面活性剤の作用
タンパク質試料を保存するための多くのプロトコールが、界面活性剤を含ませることを求めている。したがって、保存用製剤に界面活性剤を含ませる必要性を検討した。これらの実験では、１０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液中で、所望により０％、０．００１％、０．００５％、または０．０１％ポリソルベート８０を含有する濃度１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹ抗体を、室温で２４時間、３６０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。次に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて単量体の回収率をアッセイした。
【０１５２】
データから、製剤中のタンパク質が比較的高濃度の３０ｍｇ／ｍｌで存在する場合にポリソルベート８０が必要ないことが実証された。１ｍｇ／ｍｌで、ポリソルベート８０は撹拌ストレスから抗ルイスＹを実際に幾分保護した（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。
【０１５３】
凍結／解凍安定性
様々な凍結／解凍条件の間の抗ルイスＹの安定性に及ぼすポリソルベート８０の作用を調査した。これらの実験では、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中に１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌのいずれかの抗ルイスＹ抗体を含有し、かつポリソルベート８０を含有しないか、または０．０１％ポリソルベート８０を含有するかのいずれかの試料を調製した。次に、上記のように試料を１０サイクルの凍結／解凍に供した。
【０１５４】
３０ｍｇ／ｍｌで、抗ルイスＹは界面活性剤の存在と無関係に凍結／解凍ストレスに感受性でなかった（図１８Ｂ）。抗ルイスＹは、タンパク質濃度にも解凍条件にも無関係に、緩慢凍結条件でもまた安定であった（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。ポリソルベート８０は、３０ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度で、または緩慢凍結が使用されたときならば結果に影響しなかった。１ｍｇ／ｍｌ抗体を含有する試料では、ポリソルベート８０は急速凍結条件で抗ルイスＹを保護した（図１８Ａ）。
【０１５５】
保存安定性
抗ルイスＹの保存安定性に及ぼす界面活性剤の作用を検討した。これらの実験では、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ
ＮａＣｌ中に３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹを含有する試料を調製した。さらに、試料は、０．００１％ポリソルベート８０を有するか、またはポリソルベート８０を有さないかのいずれかであった。試料を−８０℃、−２０℃、５℃、２５℃、または４０℃で１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、または９カ月間インキュベートし、高分子量種の率、低分子量種の率、および酸性種の率を本明細書に記載されたようにアッセイした。
【０１５６】
一般に、これらの実験から、ポリソルベート８０が全温度範囲の−８０℃から４０℃にわたり試験条件で抗ルイスＹの安定性に重大な作用を有さなかったことが実証された（図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃ）。
【０１５７】
全体的に見て、抗ルイスＹを用いた実験の結果は、３０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗ルイスＹが撹拌条件および凍結／解凍ストレス条件で安定なことを実証している。界面活性剤は、この安定性を実現するために必要ではない。濃度１ｍｇ／ｍｌで、抗ルイスは緩慢凍結条件で安定である。界面活性剤は、この条件を実現するために必要ではない。さらに、抗体濃度１ｍｇ／ｍｌで、ポリソルベート８０は撹拌および急速凍結の両方が誘導する変性に対して抗ルイスＹを保護し、一般に、界面活性剤は保存中のタンパク質安定性に有意な作用を有さない。
【０１５８】
抗ルイスＹでの結果と対照的に、ポリソルベート８０は振盪ストレスに対して抗ＣＤ２２を完全には保護しない（図１３）。しかし、図１６のデータに示されたように、２５ｍｇ／ｍｌで抗ＣＤ２２は凍結／解凍ストレス下で安定であり、界面活性剤は必要ない。１ｍｇ／ｍｌで、抗ＣＤ２２は緩慢凍結条件で安定であり、界面活性剤は必要ない。急速凍結条件でのみ、界面活性剤は抗ＣＤ２２に対して追加の保護をもたらした。
【０１５９】
抗ＣＤ２２に及ぼす界面活性剤の作用をさらに検討するために、抗ＣＤ２２の安定性の６カ月間研究を行った。これらの実験では、２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０（Ｓ）；２０ｍＭコハク酸塩、１０ｍＭメチオニン、ｐＨ６．０（ＳＭ）；２０ｍＭコハク酸塩、０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０（ＳＴ）；または２０ｍＭコハク酸塩、１０ｍＭメチオニン、０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０（ＳＭＴ）中で濃度２５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２を調製し、−８０℃、２〜８℃、２５℃、または４０℃で６カ月間インキュベートした。次に、高分子量種の率、合計ピーク面積の率（回収率を示す）、および完全に活性な種の率について試料をアッセイした。ピーク５が完全に活性な種であることに注意されたい。
【０１６０】
一般に、パラメータのどれも抗ＣＤ２２の安定性に全く有意な作用を示さない（図２０Ａ、図２０Ｂ、および図２０Ｃ）。
【０１６１】
全体的に見て、２つの異なる抗体（抗ルイスＹおよび抗ＣＤ２２）についての短期保存データおよび長期保存データの両方は、界面活性剤（ポリソルベート８０）が保存用製剤中の抗体の安定化に必要ないことを実証している。
【０１６２】
実施例６：抗５Ｔ４の保存のための製剤
タンパク質の保存のための製剤を決定する別の例として、５Ｔ４に対する抗体の保存のために、塩濃度、ｐＨ、タンパク質濃度、ならびに緩衝液の種類および濃度というパラメータを評価した。
【０１６３】
ｐＨ
抗５Ｔ４抗体の保存のための製剤に使用される好ましいｐＨを同定するために、１ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４を含有する試料をｐＨ４．０からｐＨ８．０のｐＨ範囲で試験した。各ｐＨの緩衝液中に透析することにより試料を調製した。これらの実験に使用された全ての製剤は、１５０ｍＭ
ＮａＣｌの存在下または不在下の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を採用した。製剤中のタンパク質をろ過滅菌して、−８０℃の凍結装置中に、または５℃、２５℃、もしくは４０℃に維持した安定性チャンバー中に置いた。次に、高分子量種（ＨＭＷ）の存在について試料をアッセイした（図２１）。
【０１６４】
抗５Ｔ４は、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の場合に、ｐＨ範囲全体にわたり５℃、２５℃、および４０℃でＮａＣｌの不在下で最低量の高分子量種を有することが見い出された。この抗体は、ＮａＣｌを含有する製剤中のｐＨ７で、および緩衝液としてリン酸ナトリウムを有するｐＨ８で、凍結／解凍サイクルに対して安定ではなかった。このタンパク質は、４０℃で１５０ｍＭ
ＮａＣｌ存在下でｐＨ４で不安定であることも観察された。
【０１６５】
（上記のように）様々なｐＨで調製および保存されて、４０℃で２週間保存された試料について等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行った。ｐＨ４（ＮａＣｌ不在下）ならびにｐＨ５およびｐＨ６（ＮａＣｌ存在下または不在下）で製剤中に保存された試料は、タンパク質の全荷電に最小量の変化を表したことが見い出された。
【０１６６】
４０℃で２週間保存された抗５Ｔ４のｐＨ選別用試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析もまた行った。ｐＨ５．０からｐＨ７．０のｐＨ範囲の試料は、非還元ゲルで最小量の高分子量種、および還元ゲルで出発物質と比較してタンパク質分子量の最小量の変化を表した。
【０１６７】
これらのデータは、抗５Ｔ４がｐＨ４．０からｐＨ７．０のｐＨ範囲にわたり−８０℃、５℃、および２５℃でＮａＣｌの存在下または不在下で、１０ｍＭリン酸ナトリウム中で安定であることを実証している。ｐＨ選別の加速結果（すなわち高温で得られた結果）に基づき、ｐＨ５からｐＨ６が抗５Ｔ４の安定性のために有利なｐＨ範囲として選択される。
【０１６８】
緩衝液
ｐＨ５．０からｐＨ７．０のｐＨ範囲での製剤中の抗５Ｔ４の安定な保存について、４つの異なる緩衝系を試験した。安定性に及ぼすイオン強度の作用もまた評価した。使用されたこれらの緩衝液は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０；１０ｍＭ酢酸ナトリウム５．５；１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ５．０；１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５；１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０；１０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．５；１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０；１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ５．０；１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５；１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０；１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５；１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０；１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５；１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０；１０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．０；１０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．５；１０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０；１０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．５；１０ｍＭコハク酸ナトリウム、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ５．０；１０ｍＭコハク酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５；１０ｍＭコハク酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；および１０ｍＭコハク酸ナトリウム、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ６．５であった。
【０１６９】
抗５Ｔ４を上記緩衝液中に透析して、終濃度２ｍｇ／ｍｌに希釈した。試料を−８０℃および４０℃で最長４週間保存してから、初期試料（保存前）および４週間保存後にＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて分析した。これらのデータ（図２２）では、高分子量種が主分解産物ではなく、４週間保存後の各製剤中の高分子量種の率が初期試料中に存在する高分子量種の率に匹敵するか、またはそれ未満であったことが見い出された。大部分のＮａＣｌ含有製剤中の低分子量種は増加した。
【０１７０】
タンパク質（抗５Ｔ４）の熱安定性に及ぼす様々な製剤での保存の効果を評価するために熱融解（Ｔｍ）を行った。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用してサーモグラムを作成した。そのようなサーモグラムの例を図２３Ａに示す）。示差走査熱量測定の結果を図２３Ｂに図示する。
【０１７１】
ｐＨ５．０を有する製剤中のタンパク質は、その製剤が緩衝液としてクエン酸塩またはコハク酸塩を使用した場合に、熱安定性が最小であった。対応する無ＮａＣｌ製剤と比較して各ｐＨ／緩衝液条件でＴｍ値が低かったことから、ＮａＣｌは熱不安定化することが見い出された。酢酸、クエン酸、コハク酸、およびリン酸緩衝液中のｐＨ範囲５．５から７．０の他の全ての製剤は、最高のＴｍを表し、したがって、最高の熱安定性を表した。
【０１７２】
ＣＥＸ−ＨＰＬＣも使用して、抗５Ｔ４の安定性を分析した。これら研究では、４０℃で４週間保存後の試料についてＣＥＸ−ＨＰＬＣを行った。これらの結果を図２５に示すが、これらの結果は、試験された４つの緩衝液全てについて、高ｐＨで酸性種の率の増加および塩基性種の率の減少を実証している。ＮａＣｌを含有する一部の製剤もまた、対応する無ＮａＣｌ製剤と比較して高レベルの酸性種および低レベルの塩基性種を有した。
【０１７３】
様々な製剤の安定性をさらに分析するために、４０℃で４週間保存後の試料について還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。これらの試料の分析から、還元ゲルにおいてｐＨ５．５およびｐＨ６．０の製剤中に保存された試料が、出発物質と比較してタンパク質分子量の最小量の変化を保持したことが実証された。
【０１７４】
一般に、これらのデータは、これらの実験に使用された抗５Ｔ４タンパク質が、ｐＨ５．５〜６．５のｐＨで保存された場合に、試験された４つの緩衝液全て（酢酸ナトリウム、クエン酸塩、リン酸塩、およびコハク酸塩）中で類似した安定性を有したことを実証している。加速安定性研究は、ＮａＣｌを含有しなかった製剤中で最小量の低分子量種が形成したことを示した。
【０１７５】
塩（ＮａＣｌ）の作用
上に例示したように、抗５Ｔ４は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中では、−８０℃、５℃、および２５℃でｐＨ５〜６の製剤において、１０ｍＭリン酸ナトリウム中で安定である。しかし、ＮａＣｌは安定性を改善しなかった。したがって、ＮａＣｌは安定性に有益性をもたらさない（図２１）。
【０１７６】
４０℃での加速安定性研究の結果から、ＮａＣｌが高分子量および低分子量の形成を促進して、抗体の熱安定性を低下させることが実証された（図２２、図２４Ａ、図２４Ｂ、および図２５）。
【０１７７】
抗体濃度
保存安定性に及ぼす抗体（タンパク質）濃度の作用を調査した。これらの実験では、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、およびコハク酸ナトリウム緩衝系を、５．５から６．５の狭いｐＨ範囲を用いてもう一度試験した。抗５Ｔ４を緩衝液中に透析して、終濃度２ｍｇ／ｍｌに希釈した。追加セットの試料を、クエン酸塩またはコハク酸塩中に３０ｍｇ／ｍｌ濃度で調製した。試料を６週間まで−８０℃および４０℃で保存してから、分析した。図２６Ａおよび図２６Ｂは、これらの試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を例示する。一般に、これらのデータは、２ｍｇ／ｍｌおよび３０ｍｇ／ｍｌの製剤について互角の安定性が観察されるが、高タンパク質濃度が４０℃で６週間後にやや多量の高分子量種を蓄積したことを実証している。
【０１７８】
４０℃で６週間保存後のこれらの試料についてＣＥＸ−ＨＰＬＣもまた行った。２ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌを含有するｐＨ５．５の製剤について互角の安定性が観察されたが、２ｍｇ／ｍｌのｐＨ５．５の試料は、４０℃で６週間保存後にやや低い率の酸性種を有した（図２７Ａおよび２７Ｂ）。
【０１７９】
キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（ｃｅＳＤＳ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同等法）も使用して、４０℃で６週間保存された２ｍｇ／ｍｌ試料を分析した。これらの実験では、２ｍｇ／ｍｌの試料についてほぼ互角の安定性が観察され、ｐＨ５．５の試料の方がタンパク質分子量のやや小さい変化を示した。２ｍｇ／ｍｌの試料について互角の安定性が観察され、ｐＨ５．５の試料は、キャピラリー電気泳動ＳＤＳ法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ同等法）によりタンパク質ＭＷのやや小さい変化を示している（図２８）。
【０１８０】
凍結／解凍および振盪安定性
０．００５％野菜由来ポリソルベート８０および３％シュークロースの存在下または不在下で、ｐＨ５．５で凍結／解凍および振盪研究条件のタンパク質安定性研究で、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、およびコハク酸ナトリウム緩衝系を試験した。これらの実験では、抗５Ｔ４を緩衝液中に透析して、終濃度２５ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌに希釈した。液体窒素中（約−１９６℃または−８０℃で試料を凍結させてから、３７℃または常温で解凍した。別々のセットの試料を、２０℃で２００ｒｐｍで２４時間振盪した。
【０１８１】
Ａ４００で吸光度を測定することにより凍結／解凍サイクル後に濁度をアッセイし、１ｍｇ／ｍｌの試料について高分子量種の率を決定した。１回の凍結／解凍サイクルの後に、抗５Ｔ４は１ｍｇ／ｍｌで緩慢凍結（ＳＦ）条件（−８０）にやや感受性であり、急速凍結（ＦＦ）条件（液体窒素）に非常に感受性であった。ポリソルベート８０は濁度を最小にして、高分子量種の率は１ｍｇ／ｍｌの試料で増加した。シュークロースは濁度を改善（最小化）して、シュークロースの存在下で、高分子量種の率は急速凍結条件でのみ増加した（図２９Ａおよび図２９Ｂ）。
【０１８２】
高分子量種の濁度および率もまた、タンパク質（抗５Ｔ４）濃度２５ｍｇ／ｍｌを有する試料を用いた多数回（１０回）凍結／解凍サイクル後にアッセイした（図３０Ａおよび図３０Ｂ）。これらのデータから、抗５Ｔ４が２５ｍｇ／ｍｌの濃度で凍結／解凍ストレスに感受性ではないことが実証された。ポリソルベート８０および／またはシュークロースを添加すると、１０回の凍結／解凍サイクル後に濁度および高分子量種の率がわずかに減少した。濁度の結果は、シュークロースが製剤に添加された場合に、抗５Ｔ４の安定性に有益ではないこと、および場合によっては有害であったことも実証している。製剤に酢酸緩衝液を使用した結果、大部分の凍結／解凍条件で濁度のわずかな低下および高分子量種の率の低下が生じた。
【０１８３】
２５ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４を含有する製剤を用いて濁度（Ａ４００）および高分子量種の率を測定することにより、振盪条件での安定性をアッセイした。図３１Ａおよび図３１Ｂは、様々な製剤中の試料の濁度測定結果を図示する。これらのデータは、クエン酸緩衝液を含有する製剤中の場合に、抗５Ｔ４が振盪ストレスに非常に感受性であることを実証している。１ｍｇ／ｍｌおよび２５ｍｇ／ｍｌの試料両方で、ポリソルベート８０を添加された一部の製剤において、濁度および／または高分子量種の率が減少したが、製剤にシュークロースを添加する有益性は存在しない。酢酸緩衝液製剤は、一般に最低の濁度を表した。
【０１８４】
界面活性剤および凍結防止剤
上に記載された実験のいくつか（例えば、図２９Ａ、図２９Ｂ、図３０Ａ、図３０Ｂ、図３１Ａ、および図３１Ｂ）には、製剤が界面活性剤（ポリソルベート８０）および／または凍結防止剤（シュークロース）を含むデータが含まれる。凍結後の安定性に関して、２５ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４を含有する試料は、凍結／解凍ストレスに感受性ではなかった。抗５Ｔ４は、タンパク質濃度にも解凍条件にも無関係に緩慢凍結条件で安定であった。急速解凍プロトコールが適用された場合に、ポリソルベート８０は２５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度の試料の安定性を改善するために必要ではなかった。
【０１８５】
製剤へのシュークロースの添加は、２５ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４を含有する試料についての安定性を改善しなかった。１ｍｇ／ｍｌを含有する試料について、ポリソルベート８０およびシュークロースは、凍結／解凍の間に、特に急速凍結条件で抗５Ｔ４を保護した（図２９Ａおよび図２９Ｂおよび図３０Ａおよび図３０Ｂ）。
【０１８６】
振盪条件での様々な製剤中の抗５Ｔ４の安定性も調査した。ポリソルベート８０は、タンパク質が極めて高いｒｐｍで振盪される場合に、タンパク質濃度２５ｍｇ／ｍｌで抗５Ｔ４製剤の濁度の最小化および高分子量種の率の最小化に貢献した。１ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４を含有する製剤では、ポリソルベート８０は撹拌ストレスからタンパク質を保護した（図３１Ａおよび図３１Ｂ）。
【０１８７】
これらのデータは、高タンパク質濃度（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）について、抗５Ｔ４が凍結／解凍ストレス下で安定であることを実証している。大部分の凍結／解凍条件、特に酢酸緩衝液を含有する製剤中で、製剤に界面活性剤を添加する利点はほとんどまたは全く存在しなかった。さらに、製剤中に凍結防止剤（例えば、シュークロース）を使用する必要は存在しない。ポリソルベート８０は、激しい撹拌条件で抗５Ｔ４を安定化するために有用であった。
【０１８８】
さらに、低タンパク質濃度（例えば、１ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４）を含有する試料は、緩慢凍結条件で安定であったことが見い出された。そのような低タンパク質試料では、ポリソルベート８０およびシュークロースは、凍結／解凍誘導変性に対してタンパク質（抗５Ｔ４）を保護した。また、低タンパク質濃度の試料では、ポリソルベート８０は撹拌誘導変性からタンパク質を保護した。
【０１８９】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に記載したが、上述の記載は例示を意図して、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを意図しないと了解されるべきである。他の態様、利点、および変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１Ａ】様々なｐＨおよび様々な温度での１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのサイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）分析の結果を示す棒グラフである。
【図１Ｂ】様々なｐＨおよび様々な温度での１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図２】様々なｐＨおよび様々な温度での１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図３】様々なｐＨで４週間４０℃で保存された抗ルイスＹ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの描写である。
【図４】図３について記載された試料の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルの描写である。
【図５】様々なｐＨおよび様々な温度で２週間インキュベートされた０．５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図６】７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で、様々なｐＨおよび様々な温度で２週間インキュベートされた２５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図７Ａ】様々な緩衝液中で、かつ７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で、様々なｐＨおよび４０℃で４週間インキュベートされた１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】様々な緩衝液中で、かつ７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で、様々なｐＨおよび４０℃で４週間インキュベートされた１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図８】様々な緩衝液中で、かつ７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で、様々なｐＨおよび４０℃で４週間インキュベートされた１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図９Ａ】様々な温度および様々なＮａＣｌ濃度で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中で４週間インキュベートされた３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図９Ｂ】９Ａについて記載された試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図９Ｃ】９Ａについて記載された試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１０】様々な塩濃度で、かつ振盪に供された１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【図１１Ａ】図１１Ｂに示されるように、１０回の凍結−解凍サイクルの後の、１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下での１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【図１１Ｂ】示されるように、１０回の凍結解凍サイクル後の、１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下での１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１２】７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で様々な温度で１カ月間インキュベートされた、５０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中の２５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１３】２０ｍＭコハク酸塩（ｐＨ６．０）、コハク酸塩＋７５ｍＭ ＮａＣｌ、コハク酸塩＋０．０１％ポリソルベート８０、またはコハク酸塩＋７５ｍＭ
ＮａＣｌおよびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ）中の１５ｍｇ／ｍｌ抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１４Ａ】４０℃で４週間、７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下でインキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１４Ｂ】４０℃で４週間、７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下でインキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１４Ｃ】４０℃で４週間７５ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下でインキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１５Ａ】様々な温度で様々な時間インキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１５Ｂ】様々な温度で様々な時間インキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１５Ｃ】様々な温度で様々な時間インキュベートされた、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌの抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１６Ａ】２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中で、かつ様々な凍結−解凍方式で様々なサイクルの間処理された１ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１６Ｂ】２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中で、かつ様々な凍結−解凍方式で様々なサイクルの間処理された２５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１６Ｃ】ポリソルベート８０含有２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中で、かつ様々な凍結−解凍方式で様々なサイクルの間処理された１ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１６Ｄ】ポリソルベート８０含有２０ｍＭコハク酸塩、ｐＨ６．０中で、かつ様々な凍結−解凍方式で様々なサイクルの間処理された２５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ２２のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１７Ａ】ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて分析された振盪研究の結果を示す棒グラフである。
【図１７Ｂ】ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて分析された振盪研究の結果を示す棒グラフである。
【図１８Ａ】図１８Ｂに示されるように、１０回の凍結解凍サイクル後に０．０１％ポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５中の１ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１８Ｂ】示されるように、１０回の凍結解凍サイクル後に０．０１％ポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１９Ａ】様々な温度および様々な時間インキュベーション後にポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ
ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１９Ｂ】様々な温度および様々な時間インキュベーション後にポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５および７５ｍＭ
ＮａＣｌ中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図１９Ｃ】様々な温度および様々な時間インキュベーション後にポリソルベート８０の存在下または不在下で１０ｍＭクエン酸Ｎａ、７５ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ５．５中の３０ｍｇ／ｍｌ抗ルイスＹのＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図２０Ａ】抗ＣＤ２２の６カ月保存安定性のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図２０Ｂ】抗ＣＤ２２の６カ月保存安定性のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図２０Ｃ】抗ＣＤ２２の保存安定性のＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図２１】様々なｐＨおよび温度で２週間保存された抗５Ｔ４の高分子量産物（ＨＭＷ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図２２】塩（ＮａＣｌ）の存在下または不在下で様々なｐＨで、酢酸緩衝液（Ａｃｅ）、クエン酸緩衝液（Ｃｉｔ）、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓ）、またはコハク酸緩衝液（Ｓｕｃ）中で初期の、または４０℃で４週間後の抗５Ｔ４試料中の高分子量産物（ＨＭＷ）または低分子量産物（ＬＭＷ）の率のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図２３Ａ】クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中で抗５Ｔ４の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の結果を示すサーモグラムである。
【図２３Ｂ】コハク酸緩衝液（ｐＨ６．０）中の抗５Ｔ４の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の結果を示すサーモグラムである。
【図２４Ａ】ＮａＣｌの不在下で、かつ様々なｐＨで、様々な製剤中の抗５Ｔ４のＤＳＣの結果を示す棒グラフである。
【図２４Ｂ】様々なｐＨで１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する様々な製剤中の抗５Ｔ４のＤＳＣの結果を示す棒グラフである。
【図２５】様々なｐＨで、１５０ｍＭ ＮａＣｌの存在下または不在下で様々な緩衝液を含有する製剤中の、４０℃で４週間後の抗５Ｔ４のＣＥＸ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【図２６Ａ】様々なｐＨで様々な緩衝液中の、−８０℃または４０℃で６週間後の抗５Ｔ４（２ｍｇ／ｍｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図２６Ｂ】ｐＨ６でクエン酸またはコハク酸緩衝液中の、−８０℃または４０℃で６週間後の抗５Ｔ４（３０ｍｇ／ｍｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す棒グラフである。
【図２７Ａ】様々なｐＨで様々な緩衝液製剤中の、４０℃で６週間後の抗５Ｔ４（２ｍｇ／ｍｌ）のＣＥＸ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【図２７Ｂ】ｐＨ６でクエン酸またはコハク酸緩衝液中の、４０℃で６週間後の抗５Ｔ４（３０ｍｇ／ｍｌ）のＣＥＸ−ＨＰＬＣの結果を示す棒グラフである。
【図２８】様々なｐＨで様々な緩衝液製剤中の、４０℃で６週間後の抗５Ｔ４のＳＤＳゲルのキャピラリー電気泳動の結果を示す一組の重ねた電気泳動図の再現である。
【図２９Ａ】異なる凍結解凍方式での、様々な緩衝液（ｐＨ５．５）を含有し、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の製剤中の１ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４のＡ４００を示す棒グラフである。
【図２９Ｂ】異なる凍結解凍方式での、様々な緩衝液（ｐＨ５．５）を含有し、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の製剤中の１ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４の高分子量（ＨＭＷ）種の率を示す棒グラフである。
【図３０Ａ】異なる凍結解凍方式での、様々な緩衝液（ｐＨ５．５）を含有し、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の製剤中の２５ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４のＡ４００を示す棒グラフである。
【図３０Ｂ】異なる凍結解凍方式での、様々な緩衝液（ｐＨ５．５）を含有し、ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の製剤中の２５ｍｇ／ｍｌ抗５Ｔ４の高分子量（ＨＭＷ）種の率を示す棒グラフである。
【図３１Ａ】ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の様々な製剤中の１ｍｇ／ｍｌまたは２５ｍｇ／ｍｌの抗５Ｔ４のＡ４００を示す棒グラフである。
【図３１Ｂ】ポリソルベート８０（Ｐ８０）の存在下または不在下で、かつシュークロースの存在下または不在下の様々な製剤中の１ｍｇ／ｍｌまたは２５ｍｇ／ｍｌの抗５Ｔ４の高分子量種（ＨＭＷ）の率を示す棒グラフである。