【手続補正書】
【提出日】平成23年5月25日(2011.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ小胞、及び該ナノ小胞の水性コア内に封入された抗体を含む組成物であって、ここで該小胞が、親水性及び疎水性ブロックを有する両親媒性ブロック共重合体を含み、かつ該親水性ブロック対疎水性ブロックの重合度の比が1：2.5〜1：8の範囲である、前記組成物。
【請求項２】
前記ブロックの一方、好ましくは疎水性ブロックが、3.0〜6.9の範囲の、好ましくは4.0〜6.9の範囲のpKaを有するペンダント基を備える、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記疎水性ブロックが、50〜250の範囲の重合度を有し、かつ親水性ブロックが、少なくとも15の重合度を有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項４】
前記ナノ小胞が、50〜1000nmの範囲の直径を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体が、内因性細胞内標的への特異的結合が可能である、請求項1〜4のいずれか1項記載の組成物。
【請求項６】
前記親水性ブロックが、ポリアルキレンオキシド、好ましくはポリエチレンオキシドである、請求項1〜5のいずれか1項記載の組成物。
【請求項７】
前記親水性ブロックが、両性イオン単量体を含むエチレン性不飽和のラジカル重合可能な単量体から形成される、請求項1〜5のいずれか1項記載の組成物。
【請求項８】
前記両性イオン単量体が、下記一般式を有する、請求項7記載の組成物：
YBX          I
(式中、
Yは、H2C=CR-CO-A-、H2C=CR-C6H4-A1-、H2C=CR-CH2A2、R2O-CO-CR=CR-CO-O、RCH=CH-CO-O-、RCH=C(COOR2)CH2-CO-O、
【化１】
2011520841.tif 000001
から選択されたエチレン性不飽和基であり；
Aは、-O-もしくはNR1であり；
A1は、結合、(CH2)IA2及び(CH2)ISO3-から選択され、ここでIは1〜12であり；
A2は、結合、-O-、O-CO-、CO-O、CO-NR1-、-NR1-CO、O-CO-NR1-、NR1-CO-O-から選択され；
Rは、水素もしくはC1-4アルキルであり；
R1は、水素、C1-4アルキルもしくはBXであり；
R2は、水素もしくはC1-4アルキルであり；
Bは、結合、又は、任意に1個以上のフッ素置換基を含む、直線状分岐状のアルカンジイル、アルキレンオキサアルキレン、もしくはアルキレン(オリゴオキサアルキレン)基であり；
Xは、両性イオン基である。)。
【請求項９】
前記Xが、一般式IIの基である、請求項8記載の組成物：
【化２】
2011520841.tif 000002
(式中、同一であるかもしくは異なる部分A3及びA4は、-O-、-S-、-NH-もしくは原子価結合、好ましくは-O-であり、かつW+は、アンモニウム、ホスホニウムもしくはスルホニウム陽イオン基、並びに、陰イオン部分と陽イオン部分を連結する基、好ましくはC1-12-アルカンジイル基である基を含む基であり、
好ましくはW+は、式-W1-N+R33、-W1-P+R43、-W1-S+R42もしくはW1-Het+の基であり、ここで：
W1は、任意に1個以上のエチレン性不飽和二重結合もしくは三重結合を含む1個以上、好ましくは炭素原子2〜6個のアルカンジイル、二置換型のアリール(アリーレン)、アルキレンアリーレン、アリーレンアルキレン、又は、アルキレンアリールアルキレン、シクロアルカンジイル、アルキレンシクロアルキル、シクロアルキルアルキレンもしくはアルキレンシクロアルキルアルキレンであり、基W1は、任意に1個以上のフッ素置換基及び/又は1個以上の官能基を含み；かつ、
各基R3は、同一であるかもしくは異なり、かつ各々が水素もしくは炭素原子1〜4個のアルキル、好ましくはメチル、もしくはフェニルなどのアリールであるか、又は、基R3の内の2個はそれらに結合された窒素原子と協働して5〜7個の原子を含む脂肪族複素環を形成するか、又は、3個の基R3は、そのいずれかの環が別の飽和もしくは不飽和の環に縮合され得る5〜7個の原子を有する複素環式芳香環として、それらに結合する窒素原子と協働して、各環に5〜7個の原子を含む縮合環構造を形成し、かつ、任意に基R3の1個以上は親水性官能基により置換され；かつ、
基R4は、同一であるかもしくは異なり、かつ各々はR3もしくは基OR3であり、ここでR3は先に定義されるか；又は、
Hetは、例えばピリジンなどの、芳香族窒素-、リン-もしくは硫黄-含有環、好ましくは窒素-含有環である。)。
【請求項１０】
前記両性イオン単量体は、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである、請求項8又は9記載の組成物。
【請求項１１】
前記疎水性ブロックが、エチレン性不飽和単量体のラジカル重合により形成される、請求項1〜10のいずれか1項記載の組成物。
【請求項１２】
前記の疎水性ブロックがそれから形成される単量体が、一般式VIIを有する、請求項11記載の組成物：
Y1B1Q          VII
(式中
Y1は、H2C=CR14-CO-A8-、H2C=CR14-C6H4-A9-、H2C=CR14-CH2A10、R16O-CO-CR14=CR14-CO-O、R14CH=CH-CO-O-、R14CH=C(COOR16)CH2-CO-O、
【化３】
2011520841.tif 000003
から選択されるエチレン性不飽和基であり；
A8は、-O-又はNR15であり；
A9は、結合、(CH2)qA10及び(CH2)qSO3-から選択され、ここでqは1〜12であり；
A10は、結合、-O-、O-CO-、CO-O-、CO-NR15-、-NR15-CO、O-CO-NR15-、NR15-CO-O-から選択され；
R14は、水素又はC1-4アルキルであり；
R15は、水素、C1-4-アルキル又はB1Qであり；
R16は、水素又はC1-4アルキルであり；
B1は、結合、又は任意に1個以上のフッ素置換基を含む直線状分岐状のアルカンジイル、アルキレンオキサアルキレン、又はアルキレン(オリゴオキサアルキレン)基であり；かつ
Qは、式-NR17P、-PR17P及びSR17rの陽イオン基もしくは陽イオン化可能な基であり、ここでpは、2又は3であり、rは1又は2であり、基R17は、同一又は異なり、かつ各々は、水素、C1-24アルキル及びアリールからなる群から選択されるか、又は基R17の2個は、それらに結合されたヘテロ原子と協働して5〜7員の複素環を形成するか、又は3個のR17基は、それらに結合されたヘテロ原子と協働して、その環のいずれかが別の5〜7員の飽和もしくは不飽和環に縮合され得る5〜7員の複素環式芳香環を形成し、かつR17基のいずれかは、アミノ基もしくはヒドロキシル基又はハロゲンにより置換され得；ここで、pが3である場合、基R17の少なくともひとつは、水素でなければならない。)。
【請求項１３】
前記疎水性ブロックが、(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート(DPA)又は(ジエチルアミノ)エチルメタクリレート(DEA)単量体から形成される、請求項1〜12のいずれか1項記載の組成物。
【請求項１４】
前記共重合体のブロックのひとつが、pH-感受性である、請求項1〜13のいずれか1項記載の組成物。
【請求項１５】
(i)前記両親媒性共重合体を水性媒体中に分散する工程；
(ii)工程(i)において形成された組成物を酸性化する工程；
(iii)酸性化された組成物に抗体を添加する工程；及び
(iv)そのpHを中性近傍に上昇させ、該抗体を封入する工程：を含む、請求項14記載の組成物の製造方法。
【請求項１６】
工程(i)の前に、前記両親媒性共重合体が、反応容器内で有機溶媒に分散され、その後この溶媒が蒸発され、該反応容器の内側上に薄膜を形成する予備工程を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
請求項1〜14のいずれか1項記載の組成物を、細胞と接触させることを含む、抗体を細胞へ送達するインビトロ方法。
【請求項１８】
前記細胞が生存している、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記小胞が、細胞により取り込まれ、一旦該細胞の内側で該小胞が解離し、かつ抗体を放出し、これが細胞内標的に結合する、請求項17又は18記載の方法。
【請求項２０】
療法による治療方法において使用するための、請求項1〜14のいずれか1項記載の組成物。
【請求項２１】
抗体が細胞に送達される、療法による治療方法において使用するための、請求項1〜14のいずれか1項記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
好ましくは、基R10は同一である。基R10の少なくともひとつはメチルであることも好ましく、かつより好ましくは基R10は両方ともメチルである。
好ましくはsは2又は3であり、より好ましくは3である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
それから疎水性ブロックが形成され得る好適な単量体は、一般式VIIを有する：
Y1B1Q          VII
(式中
Y1は、H2C=CR14-CO-A8-、H2C=CR14-C6H4-A9-、H2C=CR14-CH2A10、R16O-CO-CR14=CR14-CO-O、R14CH=CH-CO-O-、R14CH=C(COOR16)CH2-CO-O、
【化７】
2011520841.tif 000004
から選択され；
A8は、-O-又はNR15であり；
A9は、結合、(CH2)qA10及び(CH2)qSO3-から選択され、ここでqは1〜12であり；
A10は、結合、-O-、O-CO-、CO-O-、CO-NR15-、-NR15-CO、O-CO-NR15-、NR15-CO-O-から選択され；
R14は、水素又はC1-4アルキルであり；
R15は、水素、C1-4-アルキル又はB1Qであり；
R16は、水素又はC1-4アルキルであり；
B1は、結合、又は任意に1個以上のフッ素置換基を含む直線状分岐状のアルカンジイル、アルキレンオキサアルキレン、又はアルキレン(オリゴオキサアルキレン)基であり；かつ
Qは、式-NR17P、-PR17P及びSR17rの陽イオン基もしくは陽イオン化可能な基であり、ここでpは、2又は3であり、rは1又は2であり、基R17は、同一又は異なり、かつ各々は、水素、C1-24アルキル及びアリールからなる群から選択されるか、又は基R17の2個は、それらに結合されたヘテロ原子と協働して5〜7員の複素環を形成するか、又は3個のR17基は、それらに結合されたヘテロ原子と協働して、その環のいずれかが別の5〜7員の飽和もしくは不飽和環に縮合され得る5〜7員の複素環式芳香環を形成し、かつR17基のいずれかは、アミノ基もしくはヒドロキシル基又はハロゲン原子により置換され得；ここで、pが3である場合、基R17の少なくともひとつは、水素である。)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
(抗体の定量：)
試料の吸光度を、二次抗体(標識されたヤギ抗-ヒトIgG)の数多くの異なる濃度にわたり検量した。この検量曲線は、動態試験時に細胞中に存在する抗体量の算出を可能にした。増大する濃度のポリマーソーム及びその結果としての増大する濃度の二次抗体の試料を調製した(PBS 1mlにつき抗体0.0μg、0.0063μg/ml、0.013μg/ml、0.0251μg/ml、0.0376μg/ml)。細胞の表面上にポリマーソーム(通常の培養培地中1mg/ml)を負荷する主要実験を行った。試料は、数多くの時点(5、15、30、45、60分)にわたりインキュベートし、小胞への細胞取り込みに関するデータを得た(図1参照)。その後全ての試料をPBSで5回洗浄し、あらゆる負荷されない小胞を除去した。トリプシンEDTAを2分間使用し、細胞をウェルプレートから剥離した。その後実施例5に詳述したようにフローサイトメトリー分析を試行するために、細胞をPBS中で調製した。これらのポリマーソームは、あらゆる細胞により取り込まれ、1時間のインキュベーション後の細胞取り込みは70％であった(図2)。ポリマーソームの初回負荷後に、1個の細胞当たりの蛍光は鋭く増大し、強度は5〜30分間は比較的安定し、細胞取り込みは22〜28％の間で変動した。30分時点の後、1個の細胞当たりの蛍光の線形の増加が認められた。吸光度を評価し、その結果各細胞中に存在する抗体の量を概算するために、300μlを採取した。大量の活性抗体が、生存細胞内に送達された(図3)。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
(実施例7：ポリマーソームにより送達された抗体のエンドソーム回避)
図6は、可視化された細胞からの蛍光が常に生じ、それらの細胞の細胞質ゾルをゆっくり満たしていくことを示すビデオから作製した3枚のスライドを示している。これらの試験からの最も重要な知見は、PMPC-PDPAポリマーソームは、細胞により取り込まれるのみではなく、物質を細胞質ゾルへ送達することもできることであり、これは従来のエンドサイトーシス経路を回避することができることを示唆している。