【手続補正書】
【提出日】平成22年5月7日(2010.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも部分的には、新規の置換されたテトラサイクリン化合物が、テトラサイクリンによって制御される遺伝子転写の調節に用いるのに優れた特性を向上させるという知見に基づく。本発明は、細胞内の遺伝子または遺伝子産物の発現を制御するために原核生物のＴｅｔリプレッサー／オペレーター／インデューサー系の構成要素を利用する制御系において使用される化合物、およびこうした化合物を使用した遺伝子または遺伝子産物の発現の制御方法に関する。本発明の系による遺伝子または遺伝子産物の発現制御は、一般に少なくとも二つの構成要素を必要とする。テトラサイクリンに応答する制御配列に作動可能に連結された標的となる核酸配列と、テトラサイクリンの存在または不在のいずれかにおいて前記制御配列と結合して、前記遺伝子または遺伝子産物の転写を活性化するか阻害するタンパク質である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結された標的のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）細胞内で転写を制御する第二のポリペプチドに作動可能に連結された置換されたテトラサイクリン化合物の存在下あるいは非存在下で該ＴＲＥに結合する第一のポリペプチドを含む融合タンパク質とを含む細胞において、ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を制御するための方法であって、該細胞内の標的ヌクレオチド配列の発現が制御されるように、該細胞内で置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節することを包含し、該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：
【化３】
2009537139.tif 000001
（式中、
Ｒ５はヒドロキシルまたはアルキルカルボニルオキシであり、
Ｒ７は水素、メチルまたはアルキルカルボニルアミノであり、
Ｒ９は水素またはアルキルである）
の化合物およびその薬学的に許容される塩であり、ただし、式Ｉの置換されたテトラサイクリン化合物はドキシサイクリンではない、
方法。
（項目２）
前記標的ヌクレオチド配列がタンパク質をコードする、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第一のポリペプチドが前記置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で前記ＴＲＥに結合する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記第一のポリペプチドが前記置換されたテトラサイクリン化合物の存在下ではなく非存在下で前記ＴＲＥに結合する、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記融合タンパク質の前記第一のポリペプチドが変異型Ｔｅｔリプレッサーである、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記変異型ＴｅｔリプレッサーがクラスＢリプレッサーである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記変異型Ｔｅｔリプレッサーが、７１位、９５位、１０１位および１０２位のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置でアミノ酸置換が行われているＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記変異型Ｔｅｔリプレッサーが、７１位、９５位、１０１位および１０２位からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸位置でアミノ酸置換が行われているＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーである、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記融合タンパク質の前記第二のポリペプチドが、単純ヘルペスウイルス粒子タンパク質１６の転写活性化ドメインを含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子が、細胞の染色体中にランダムに組み込まれる、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子が、細胞の染色体中の所定の位置に組み込まれる、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子がｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に導入され、さらに前記細胞を対象に投与することを含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記ｔｅｔオペレーター連結核酸が、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結された細胞の内在性の核酸である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記ｔｅｔオペレーター連結核酸分子が、細胞内に導入された外在性の核酸分子である、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞がさらに第二の標的核酸分子を含有する、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記テトラサイクリン化合物が抗菌活性を有さない、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
Ｒ７およびＲ９が水素である、項目１に記載の方法。
（項目１８）
Ｒ５がヒドロキシルである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
Ｒ５がアルキルカルボニルオキシである、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記アルキルカルボニルオキシがシクロブチルカルボニルオキシである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記アルキルカルボニルオキシがシクロヘキシルカルボニルオキシである、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
Ｒ５がヒドロキシルである、項目１に記載の方法。
（項目２３）
Ｒ９が水素である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
Ｒ７がアルキルカルボニルアミノである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記アルキルカルボニルアミノがメチルカルボニルアミノである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
Ｒ７が水素である、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
Ｒ９がアルキルである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記アルキルがシクロペンチルメチルである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記アルキルがシクロブチルメチルである、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
Ｒ９が水素である、項目１に記載の方法。
（項目３１）
Ｒ５がアルキルカルボニルオキシである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記アルキルカルボニルオキシがプロパニルカルボニルオキシである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
Ｒ７がアルキルカルボニルアミノである、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記アルキルカルボニルアミノがシクロペンチルアセチルアミノである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
Ｒ５がヒドロキシルであり、Ｒ７がメチルである、項目１に記載の方法。
（項目３６）
Ｒ９がアルキルである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記アルキルがｔ−ブチルである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記置換されたテトラサイクリン化合物が、９−ｔ−ブチルドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、５−シクロブタノエートドキシサイクリン、５−シクロヘキサノエートドキシサイクリン、５−プロピオニル−７−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリン、７−アセチルアミノドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロブチルドキシサイクリン、９−ｔ−ブチル−７−メチルドキシサイクリンおよび薬学的に許容されるその塩である、項目１に記載の方法。
（項目３９）
（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結された標的のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下ではなく存在下で該ＴＲＥに結合する変異型Ｔｅｔリプレッサーとを含む細胞内において、ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を制御するための方法であって、該細胞内の標的ヌクレオチド配列の発現が制御されるように、該細胞内で置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節することを包含し、ここで、該変異型Ｔｅｔリプレッサーは、該変異型Ｔｅｔリプレッサーが、式（Ｉ）：
【化４】
2009537139.tif 000002
（式中、
Ｒ５はヒドロキシルまたはアルキルカルボニルオキシであり、
Ｒ７は水素、メチルまたはアルキルカルボニルアミノであり、
Ｒ９は水素またはアルキルである）
の置換されたテトラサイクリン化合物およびその薬学的に許容される塩の存在下で該ＴＲＥに選択的に結合するように選択され、ただし、式Ｉの該置換されたテトラサイクリン化合物はドキシサイクリンではない、方法。
（項目４０）
（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結された標的のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の存在下ではなく非存在下で該ＴＲＥに結合する変異型Ｔｅｔリプレッサーとを含む細胞内において、ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を制御するための方法であって、該細胞内の標的ヌクレオチド配列の発現が制御されるように、該細胞内で置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節することを包含し、ここで、該変異型Ｔｅｔリプレッサーは、該変異型Ｔｅｔリプレッサーが、式（Ｉ）：
【化５】
2009537139.tif 000003
（式中、
Ｒ５はヒドロキシルまたはアルキルカルボニルオキシであり、
Ｒ７は水素、メチルまたはアルキルカルボニルアミノであり、
Ｒ９は水素またはアルキルである）
の置換されたテトラサイクリン化合物およびその薬学的に許容される塩の非存在下でのみ該ＴＲＥに選択的に結合するように選択され、ただし、式Ｉの該置換されたテトラサイクリン化合物はドキシサイクリンではない、方法。
（項目４１）
前記置換されたテトラサイクリン化合物が、９−ｔ−ブチルドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、５−シクロブタノエートドキシサイクリン、５−シクロヘキサノエートドキシサイクリン、５−プロピオニル−７−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリン、７−アセチルアミノドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロブチルドキシサイクリン、９−ｔ−ブチル−７−メチルドキシサイクリンおよび薬学的に許容されるその塩である、項目３９または４０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を制御するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結された標的のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）該置換されたテトラサイクリン化合物の存在下あるいは非存在下で該ＴＲＥに結合する第一のポリペプチドおよび該細胞内で転写を制御する第二のポリペプチドを含む融合タンパク質とを含み、ここで該第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、作動可能に連結され、該制御は、該細胞内で該置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節することを包含し、該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：
【化３】
2009537139.tif 000004
（式中、
Ｒ５はヒドロキシルまたはアルキルカルボニルオキシであり、
Ｒ７は水素、メチルまたはアルキルカルボニルアミノであり、そして
Ｒ９は水素またはアルキルである）
の化合物あるいはその薬学的に許容される塩であり、ただし、式Ｉの置換されたテトラサイクリン化合物はドキシサイクリンではない、
組成物。
【請求項２】
前記標的ヌクレオチド配列がタンパク質をコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第一のポリペプチドが前記置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で前記ＴＲＥに結合する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第一のポリペプチドが前記置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で前記ＴＲＥに結合する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記第一のポリペプチドが変異型Ｔｅｔリプレッサーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記変異型ＴｅｔリプレッサーがクラスＢリプレッサーである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記変異型Ｔｅｔリプレッサーが、７１位、９５位、１０１位および１０２位のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置でアミノ酸置換が行われているＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記変異型Ｔｅｔリプレッサーが、７１位、９５位、１０１位および１０２位からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸位置でアミノ酸置換が行われているＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーである、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記第二のポリペプチドが、単純ヘルペスウイルス粒子タンパク質１６の転写活性化ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記細胞の染色体中にランダムに組み込まれる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記細胞の染色体中の所定の位置に組み込まれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子がｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に導入される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列が、前記細胞の内在性のヌクレオチド配列であり、そして少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列が、前記細胞内に導入された外在性のヌクレオチド配列である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞がさらに第二の標的ヌクレオチド配列を含有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記テトラサイクリン化合物が抗菌活性を有さない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｒ７およびＲ９がそれぞれ水素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｒ５がヒドロキシルである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｒ５がアルキルカルボニルオキシである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アルキルカルボニルオキシがシクロブチルカルボニルオキシである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アルキルカルボニルオキシがシクロヘキシルカルボニルオキシである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｒ５がヒドロキシルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｒ９が水素である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｒ７がアルキルカルボニルアミノである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記アルキルカルボニルアミノがメチルカルボニルアミノである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｒ７が水素である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
Ｒ９がアルキルである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記アルキルがシクロペンチルメチルである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記アルキルがシクロブチルメチルである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
Ｒ９が水素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｒ５がアルキルカルボニルオキシである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記アルキルカルボニルオキシがプロパニルカルボニルオキシである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｒ７がアルキルカルボニルアミノである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記アルキルカルボニルアミノがシクロペンチルアセチルアミノである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
Ｒ５がヒドロキシルであり、Ｒ７がメチルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
Ｒ９がアルキルである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記アルキルがｔ−ブチルである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記置換されたテトラサイクリン化合物が、９−ｔ−ブチルドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、５−シクロブタノエートドキシサイクリン、５−シクロヘキサノエートドキシサイクリン、５−プロピオニル−７−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリン、７−アセチルアミノドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロブチルドキシサイクリン、もしくは９−ｔ−ブチル−７−メチルドキシサイクリンまたは薬学的に許容されるその塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を制御するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結された標的のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）該置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で該ＴＲＥに結合する変異型Ｔｅｔリプレッサーとを含み、ここで、該制御は、該細胞内で該置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節することを包含し、該変異型Ｔｅｔリプレッサーは、該置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で該ＴＲＥに選択的に結合し、該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：
【化４】
2009537139.tif 000005
（式中、
Ｒ５はヒドロキシルまたはアルキルカルボニルオキシであり、
Ｒ７は水素、メチルまたはアルキルカルボニルアミノであり、そして
Ｒ９は水素またはアルキルである）
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ただし、式Ｉの該置換されたテトラサイクリン化合物はドキシサイクリンではない、組成物。
【請求項４０】
細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を制御するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結された標的のヌクレオチド配列と、（ｉｉ）該置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で該ＴＲＥに結合する変異型Ｔｅｔリプレッサーとを含み、ここで、該制御は、該細胞内で該置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節することを包含し、該変異型Ｔｅｔリプレッサーは、該置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で該ＴＲＥに選択的に結合し、該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：
【化５】
2009537139.tif 000006
（式中、
Ｒ５はヒドロキシルまたはアルキルカルボニルオキシであり、
Ｒ７は水素、メチルまたはアルキルカルボニルアミノであり、そして
Ｒ９は水素またはアルキルである）
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩であり、ただし、式Ｉの該置換されたテトラサイクリン化合物はドキシサイクリンではない、組成物。
【請求項４１】
前記置換されたテトラサイクリン化合物が、９−ｔ−ブチルドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、５−シクロブタノエートドキシサイクリン、５−シクロヘキサノエートドキシサイクリン、５−プロピオニル−７−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリン、７−アセチルアミノドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン、９−１’−メチルシクロブチルドキシサイクリン、もしくは９−ｔ−ブチル−７−メチルドキシサイクリンまたは薬学的に許容されるその塩である、請求項３９または４０に記載の組成物。