【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年5月9日(2011.5.9)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する精製された抗体であって、前記抗体がｍＡｂ  ８０６ではない前記抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
検出可能な標識で標識された請求項１記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、治療または診断目的を有する１以上の他の分子または因子に共有結合しているか又は会合している請求項１記載の抗体。
【請求項５】
前記他の分子または因子が、異なる特徴を有する他の抗体または抗体フラグメント、トキシン、リガンド、放射性同位体および化学療法剤から選択される請求項４記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号１からなるＥＧＦ受容体ペプチドを含む免疫原を用いて創製され、前記免疫原が免疫原性キャリアに結合体化されている請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記ＥＧＦ受容体ペプチドが、１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、かつｍＡｂ  ８０６によって認識されるか、もしくは該ｍＡｂ  ８０６が結合する配列番号１のＥＧＦ受容体ペプチドの改変体または突然変異体である請求項６記載の抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体と薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物。
【請求項９】
癌の予防又は治療に使用するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
頭頸部癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌または神経膠腫の予防または治療のための請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
癌の予防又は治療に使用するための請求項８記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
頭頸部癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌、乳癌、前立腺癌または神経膠腫の予防または治療のための請求項１１記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞上、及び切断された状態のＥＧＦＲであるｄｅ２−７  ＥＧＦＲ上で検出できるが、正常な条件下で野生型ＥＧＦＲを発現する正常細胞上では検出できないエピトープに免疫反応性である抗体を創製するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）配列番号１のＥＧＦ受容体ペプチド、および
（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、かつｍＡｂ  ８０６によって認識されるか、もしくは該ｍＡｂ  ８０６が結合する配列番号１のＥＧＦ受容体ペプチドの改変体または突然変異体
からなる群より選択されるＥＧＦ受容体ペプチド
を含む組成物。
【請求項１４】
ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞上、及び切断された状態のＥＧＦＲであるｄｅ２−７  ＥＧＦＲ上で検出できるが、正常な条件下で野生型ＥＧＦＲを発現する正常細胞上では検出できないエピトープと免疫反応性である抗体を選択する方法であって、
配列番号１のＥＧＦ受容体ペプチドまたはそのフラグメントで、候補抗体、または抗体もしくは活性な抗体フラグメントを発現する細胞をスクリーニングする工程を包含する前記方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２５】
本発明は、増殖因子受容体、特にＥＧＦＲにおいて、システインによって各Ｎ−末端およびＣ−末端に結合し、ジスルフィドループペプチドを形成するエピトープペプチド、特にループペプチドの存在および露出を記載する。このループペプチドは連結されていない移行の立体配座で露出され、その存在または量は、オートクリンリガンド生産（リガンドは活性なダイマーに向けてＥＧＦＲを駆動する）、リガンド−非依存性受容体活性化（受容体を発現する細胞にかなり制限された事象）、非連結のレベル、またはこれらの可能性のいずれかの組み合わせを改変するグリコシル化における改変を含む場合に改変または増加される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２０４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２０４】
（実施例１）
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は多くの上皮癌で過剰発現され、観察はしばしば臨床結果の乏しいことに関連付けられている。ＥＧＦＲの過剰発現は通常はＥＧＦＲ遺伝子増幅によって引き起こされ、時々、その細胞外ドメインに内部欠失を保有する変異ＥＧＦＲ（ｄｅ２−７  ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ）の発現に関連付けられている。ＭＡｂ  ８０６は、過剰発現されると、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲおよび野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲのサブセットを共に認識するが、正常な組織で発現されたｗｔ  ＥＧＦＲに結合しない有意な抗腫瘍活性を持つ新規なＥＧＦＲ抗体である。Ａ４３１腫瘍細胞で発現されたｗｔ  ＥＧＦＲのうちの小さな割合（約１０％）に結合するのみにもかかわらず、ｍＡｂ  ８０６はヌードマウスで増殖したＡ４３１異種移植片に対して、強い抗腫瘍活性を呈する。そのユニークな特異性および抗腫瘍活性の態様に導くメカニズムを解明するために、本発明者らは、ｍＡｂ  ８０６のＥＧＦＲ結合エピトープを決定した。酵母の表面に発現されたＥＧＦＲ断片、またはイムノブロット様式でのＥＧＦＲ断片のいずれかへのｍＡｂ  ８０６結合の分析から、ｍＡｂ  ８０６のエピトープを含むようであるジスルフィド結合ループ（アミノ酸２８７−３０２）を同定した。実際に、ｍＡｂ  ８０６は、これらのアミノ酸に対応する合成ＥＧＦＲペプチドに対して、見かけの高親和性（約３０ｎＭ）で結合した。ＥＧＦＲ構造の分析から、このジスルフィド結合ループは、ＥＧＦＲが不活性な連結された立体配座からリガンド結合した活性な立体配座へ変化する場合に起こる、移行形態の受容体の場合にのみ、ｍＡｂ  ８０６が結合するために利用可能であることを示す。ｍＡｂ  ８０６は、小さな割合の一時の受容体に結合してその活性化を妨げ、次いで強力な抗腫瘍効果を生じるようである。最後に、発明者らの所見は、増殖因子受容体の移行形態に対する抗体の作製が、正常組織の標的化を低下させ、依然として抗腫瘍活性を保持する、新規な方法を表し得ることを示唆する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２２８】
可能性のあるｍＡｂ  ８０６結合部位に関して、受容体の連結された形態においてのみ接近可能な残基は、Ｄ２９７を中心とするものである。しかしながら、受容体を過剰発現する細胞株において、ｍＡｂ  ８０６がＥＧＦＲの５〜１０％にのみ結合するとすれば、ｍＡｂ  ８０６は、細胞表面のＥＧＦＲの９５％を形成するＥＧＦＲの連結された形態に結合する可能性が非常に少ない。図６に掲げた構造情報に基づき、ＥＧＦＲの二量体化は、ｍＡｂ  ８０６エピトープ内のいずれのアミノ酸残基もさらに暴露することなく、従って、ｍＡｂ  ８０６結合に対する標的にはならない。抗体のサイズを仮定すれば、Ｄ２９０を中心とする露出されたアミノ酸のいずれも、連結された立体配座にもダイマー立体配座にもいずれにおいても、ｍＡｂ  ８０６に対して接近可能ではない。ＥＧＦＲは連結された立体配座から活性なダイマー状態に移動する場合、そのＥＧＦＲは移行の延びた状態を経過しなければならない。ＥＧＦＲのこの移行形態（図６Ｄ）はモノマーであるか、あるいは恐らくは不活性なダイマーであり得、細胞表面では比較的稀であり、ｍＡｂ  ｍ８０６結合のレベルと合致する。重要なことには、受容体のこの移行形態においては、Ｄ２９０の周りの残基ならびに多数の通常は埋もれたアミノ酸（例えば、Ｙ２９２およびＭ２９４）は抗体の結合に対して接近可能であろう。空間的に考慮すると、Ｄ２９０近くの領域へのｍＡｂ  ８０６の結合は、システインループの外側のアミノ酸との相互作用を必要とすることが強く示され、ｍＡｂ  ８０６エピトープ全体がシステインループ内に含まれることを示唆する本発明者らの親和性のデータと恐らくは合致しない。本発明者らが結合領域としてＤ２９０を除外する場合、エピトープはＤ２９７を含むようにさらに拡大できるが、ｍＡｂ  ８０６はＹ２９２／Ｍ２９４の周りの領域と相互作用しなければならない。一緒に併わせると、唯一の合致する結論は、ＥＧＦＲが二量体化を受ける前に、ｍＡｂ  ８０６はＥＧＦＲの延びた形態においてのみ露出されるアミノ酸に結合することである。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２２９】
（構成的に連結されていない形態のＥＧＦＲへのｍＡｂ  ８０６の結合）
ｍＡｂ  ８０６が非二量体化／連結されていないＥＧＦＲに優先的に結合するのを確認するために、本発明者らは、２９３細胞においてＣＲ１二量体化アームを欠失する（ｄｅＣＲ１−ループ）ＥＧＦＲの突然変異を安定に発現させた（３１）。この領域は、活性なＥＧＦＲダイマーを形成するにおけるその役割のため、およびＣＲ１二量体化アームが連結に関連するＣＲ１：ＣＲ２相互作用に総体的に関与するので、選択された。従って、ｄｅＣＲ１は、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲのように、構成的に連結されていない状態であるべきである。親２９３細胞は、ＦＡＣＳによるｍＡｂ  ５２８の結合によって明らかなように、低レベルの野生型ＥＧＦＲ（ほぼ１×１０４ＥＧＦＲ／細胞）を発現する（図７）。予測されるように、ｍＡｂ  ８０６はこれらの細胞で発現された内因性ＥＧＦＲに結合しない。ｄｅ２−７  ＥＧＦＲは、ｄｅＣＲ１−ループのように、連結できなかったはずであり、かつ二量体化を減少したはずである。２９３細胞のｄｅ２−７  ＥＧＦＲでのトランスフェクションは、他の細胞株において従前に示されたように、ｍＡｂ  ８０６の強力な結合を導いた（図７）。高度に立体配座依存性のｍＡｂ  ５２８がｄｅＣＲ１−ループＥＧＦＲに結合することにより、その立体配座への全体の変化がないことを確認する（図７）。実際に、本発明者らは、ｄｅＣＲ１−ループＥＧＦＲがリガンドに結合できることを先に示しており、これは、さらに、その全体的構造が無傷なままであるという考えを支持する（３１）。２つの独立したｄｅＣＲ１−ループＥＧＦＲを発現するクローンのフローサイトメトリー分析は、ｍＡｂ  ８０６の結合を明瞭に示した（図７）。従って、本発明者らの仮説と合致して、ｍＡｂ  ８０６は、ＥＧＦＲが活性なダイマーを形成する前に、移行の連結されていないＥＧＦＲに結合するようである。ｍＡｂ  ８０６はまた、連結に対して能力を下げられたＥＧＦＲ点突然変異体への結合の増大を示す（以下の実施例２参照）。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３１】
免疫沈澱およびＳｃａｔｃｈａｒｄ分析は共に、ｍＡｂ  ８０６が、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅のため受容体を過剰発現する細胞株である、Ａ４３１細胞（２７）の表面に発現された野生型ＥＧＦＲの５−１０％の間を認識することを示した。低い割合の受容体に結合するにもかかわらず、ｍＡｂ  ８０６はヌードマウスで増殖させたＡ４３１異種移植片に対して強力な抗腫瘍活性を呈する（２２，２３）。ｍＡｂ  ８０６は非連結の（ｕｎｔｅｔｈｅｒ）ＥＧＦＲに優先的に結合するという本発明者らの観察が、この抗腫瘍活性についての可能性あるメカニズムを示唆する。ＥＧＦＲ分子が連結されていない状態となる場合、このＥＧＦＲ分子は不活性な連結された状態と活性なダイマーとの間の移行状態に入る（３７）。ｍＡｂ  ８０６によって結合されるのは、ＥＧＦＲのこの移行の非連結の形態である。次いで、ｍＡｂ  ８０６の結合は、シグナル伝達可能なＥＧＦＲダイマーの形成を妨げる（図８）。従って、所定のいずれの場合であっても、ｍＡｂ  ８０６はＥＧＦＲの小さなパーセンテージに結合するに過ぎないが、延長された時間にわたって、それは、ＥＧＦＲシグナル伝達の実質的な割合を阻害し得、これは次いでインビボで抗腫瘍効果を生じる。ｍＡｂ  ８０６が結合したＥＧＦＲの運命は未知であるが、本発明者らは、従前に、ｍＡｂ  ８０６／ｄｅ２−７  ＥＧＦＲ複合体が内部に移行されることを示している（２７）。あるいは、ＥＧＦＲに特異的な低分子量チロシンキナーゼ阻害剤を用いた細胞の処理に続く場合、ｍＡｂ  ８０６／ＥＧＦＲは不活性な形態で表面上に捕獲されたままであろう（２８，３８）。野生型ＥＧＦＲとは対照的に、ｍＡｂ  ８０６は、ＤＨ８．３（突然変異体受容体に対して特異的な抗体）と比較した場合、細胞表面に発現されるｄｅ２−７  ＥＧＦＲ分子のほぼ半分を認識する（２７）。ｄｅ２−７  ＥＧＦＲに対する、ｍＡｂ  ８０６の増大した反応性は、この突然変異体受容体がＣＲ１二量体化ループを欠き、従って、連結された立体配座を取ることができないという事実と合致する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３２】
ｍＡｂ  ８０６が正常であるが比較的低量のＥＧＦＲの移行の立体配座を認識するならば、なぜ、それは「平均」レベルのＥＧＦＲを発現する正常組織または細胞株に結合しないのであろうか。この観察は、ヨウ素化ｍＡｂ  ８０６が１×１０７細胞を含有するＵ８７ＭＧ神経膠腫（１×１０５ＥＧＦＲ／細胞）の細胞ペレットに結合しないことを本発明者らが示した以前の研究（これは、より小さなＡ４３１細胞ペレットに基づいて、低レベルの結合を測定するのに十分に感受性であった）におけるように、検出の感度には関係しないようである。本発明者らは、グリコシル化がｍＡｂ  ８０６の反応性に影響すること、およびｍＡｂ  ８０６が、小胞体内に通常は存在するＥＧＦＲの高マンノース形態を優先的に認識することを、決定した。さらに、ＥＧＦＲを過剰発現する細胞においては、この高マンノース型受容体のいくらかは細胞膜に誤って向けられる。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３３】
ｍＡｂ  ８０６エピトープの配列相同性はＥｒｂＢ３／Ｂ４においては比較的低いにもかかわらず、システインループのサイズおよび位置は保存されている。さらに、完全に保存された２つのアミノ酸残基（Ｅ２９３およびＧ２９８）があり、電荷が保存されるさらに２つのアミノ酸（Ｅ２９５およびＲ３００）がある。最後に、ＥｒｂＢ３（および恐らくはＥｒｂＢ４）の全体的構造は、連結された立体配座をとる点でＥＧＦＲの全体構造と非常に似ており、この連結された構造は、恐らくは活性化の間に連結解除される（４１）。併わせると、このことは、ＥｒｂＢ３／Ｂ４における同等なシステインループに標的化された抗体が、ｍＡｂ  ８０６と同様な特性（すなわち、腫瘍に限定される特異性および受容体活性化をブロックする能力）を有することを示唆する。より広義には、本発明者らのデータは、増殖因子受容体の移行形態に対する抗体の作製は、正常な組織の標的化を低下させるが依然として抗シグナル伝達活性を保有する、新規な方法を表す。従って、活性な（リガンドが結合した）受容体の構造と、それらの不活性な対照物の構造との間の比較は、受容体の立体配座の変化の間に、一時的に露出されるアミノ酸を同定するはずである。最後に、ｍＡｂ  ８０６は、ＥＧＦＲの構成的に活性な突然変異を発現する細胞を用いて免疫し、そしてこの突然変異した受容体に対して特異的な抗体について選択することによって、作製された。従って、構成的に活性な受容体を用いた免疫化は、受容体の移行形態を認識する抗体を同定する可能性を増大させる、一般化されたストラテジーを提供し得る。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３７】
【化２７】
2008501308.tif 000001
（実施例２）
（細胞表面の上皮増殖因子受容体の機能におけるＣＲ１／ＣＲ２ドメイン相互作用の分析）
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の単離された細胞外ドメインについての最近の結晶学的データは、リガンドによるその活性化についてのモデルを提案した。本発明者らは、受容体活性化の調節に決定的であると考えられている細胞外ドメインの２つの領域（ＣＲ１およびＣＲ２）へ突然変異を導入することによって、細胞表面に提示される全長ＥＧＦＲに関して、このモデルをテストした。ＣＲ１およびＣＲ２ドメインにおける突然変異は、リガンド結合親和性、受容体二量体化、チロシンキナーゼ活性化およびシグナル伝達能力に対して拮抗作用を有する。Ｔｙｒ２４６はＣＲ１ループにおける決定的な残基であり、これは、リガンド結合後における受容体ダイマー接合面の位置決定および安定化に関係し：Ｔｙｒ２４６の突然変異は受容体の機能を損なうか、または廃止する。連結された状態に受容体を制限する相互作用を弱めるＣＲ２における突然変異は、リガンドに対する親和性を増大させることによって、ＥＧＦに対する応答性を増強させる。しかしながら、ＣＲ１／ＣＲ２相互作用の弱めた結果、受容体のキナーゼの自然発生的な活性化を生じない。本発明者らは、負に抑制された連結された状態と、十分に活性な背中合わせの（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）ダイマー立体配座との間のＥＧＦ受容体の移行状態を認識する、抗体（ｍＡｂ８０６）を用いて、リガンド結合後の野生型ＥＧＦ受容体および突然変異ＥＧＦ受容体における立体配座変化を追跡する。本発明者らの結果は、細胞表面上のＥＧＦＲは連結解除され得るが、この形態は不活性であることを示唆し；従って、受容体の連結解除は活性化のためには十分ではなく、そしてリガンド結合は、キナーゼ活性化を達成するための２つのサブユニットの正しい位置決定のために必須である。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２４０】
断片またはさらに全長ＥＧＦ受容体のＥＣＤの構造およびリガンド結合特性は、細胞表面に提示された受容体からのシグナル伝達の複雑性を解決できない。この報告において、リガンド結合、受容体立体配座変化、受容体オリゴマー化およびキナーゼ活性の調節を決定するプロセスにおける、ＣＲ１−ＣＲ２相互作用の本発明者らの理解を向上させるために、本発明者らは、無処置の哺乳動物（Ｂａｆ／３）細胞において、全長ＥＧＦ受容体突然変異体を発現した（１７；１８）。ＢａＦ／３細胞は内因性ＥＧＦ受容体も、検出可能なレベルのリガンド（これは、組換え（突然変異体）受容体を混乱させ得、そして／または活性化し得る）も発現しない。ＣＲ１ループ突然変異体およびＣＲ２  ＥＧＦＲ突然変異体のアベイラビリティー、ならびに立体配座特異的な抗体ｍＡｂ５２８（１９）およびｍＡｂ８０６（２０−２３）のアベイラビリティーにより、本発明者らが、連結の決定基をプローブするのを可能にし、そしてリガンドが受容体に結合する場合の主要な立体配座の移行を検出することを可能にした。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２５２】
ＣＲ２突然変異：Ｖ５８３Ｄ突然変異およびＤ５６３Ｈ突然変異は、ＣＲ２／ＣＲ１ループ相互作用を破壊するように設計された。連結された立体配座において、Ｖ５８７側鎖のγ−メチル基はＹ２４６との密なファンデルワールス力で接触している：Ａｓｐ  γ−カルボキシルの置換はＣＲ１／ＣＲ２接合面を破壊するはずである。同様に、Ｄ５６３のγ−カルボキシルは連結された立体配座においてＹ２４６に水素結合し、アスパラギン酸のカルボキシル基をＨｉｓのイミダゾールで置換することは相互作用を弱化させるであろう。Ｖ５８３Ｄを発現する細胞においては、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞と比較して、高親和性ＥＧＦ結合部位の割合について有利な増加が存在する（各々、１２．６％  対  ２．６％）。この傾向はまた、Ｄ５６３Ｈ突然変異体で観察されるが、この場合には、野生型からの差異は統計学的に有意ではなかった（表３）。高親和性部位の割合の増加は、受容体の連結されていない状態に向かう平衡シフトの指標であり、これは、Ｖ５８３Ｄ突然変異体およびＤ５６３Ｈ突然変異体がＣＲ１／ＣＲ２相互作用を弱化させるという推定を支持する。ＣＲ１およびＣＲ２を共有結合により結合させるジスルフィド結合を創製する可能性を調べるために、本発明者らは、連結された立体配座において適切な距離および側鎖の向きを有する２つの残基：Ｌｅｕ２４５およびＧｌｕ５７８を同定した。最初に、本発明者らは単一突然変異Ｅ５７８Ｃを作製し、次いで、二重突然変異Ｌ２４５Ｃ／Ｅ５７８Ｃを作製した。興味深いことには、Ｅ５７８側鎖はＬ２４５およびＰ２４８の側鎖に近く、従って、Ｅ５７８Ｃ置換は、これらの残基との疎水性相互作用を増加させることによって、ＣＲ１ループ／ＣＲ２接合面のパッキングを改良すると予測され得る。実験的には、Ｅ５７８Ｃ突然変異は、低親和性部位の数に影響することなく高親和性ＥＧＦ結合を完全に消去する（表３）。この位置におけるシステインの導入は、いずれかまたは双方のシステインに富んだドメインのフォールディングに影響しないようである：立体配座依存性抗体ｍＡｂ５２８は突然変異体受容体に結合し、そのリン酸化およびシグナル伝達は依然としてＥＧＦに依存する（後記参照）。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２５４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２５４】
一緒に併わせると、これらの観察は、ＥＧＦＲの「連結された」形態へのリガンド結合が低い親和性で起こることを確認し；低親和性ＥＧＦ結合はＬ１ドメインおよびＬ２ドメインの相対的位置決定とは無関係であるようである。結晶構造の精査は、双方のドメインのリガンド結合表面が連結された立体配座および連結されていない立体配座双方において利用でき、従って、低親和性結合は、恐らくは、いずれかの部位、または双方の部位への結合を独立して反映することを示す。明らかに、連結解除は、高親和性で結合するために利用できる受容体の割合を増加させ得る。高親和性立体配座は、恐らくは、ダイマー複合体におけるＬ１およびＬ２の近接配置に影響することによって、ＣＲ１ループを必要とすることに注意するのは興味深い。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２５７】
「ＣＲ２突然変異体」は、正常レベルの基底の二量体化およびリガンド依存性二量体化を有した。本発明者らは、ＣＲ１／ＣＲ２連結が弱化された突然変異体ＥＧＦＲについてのダイマーの割合の有意な増加を検出せず、これは、突然変異が連結解除を導く場合でさえ、ＢＳ３で架橋可能なダイマー複合体の形成が、リガンドの結合に依存することを示唆する。Ｅ５７８のＣへの突然変異は未対合システインを導入し、概念的にはジスルフィド結合ダイマーの形成に導くことができた。本発明者らは、異なるスペーサー−アームの長さ（ＢＳ３；１１．３Åおよびスルホ−ＥＧＳ、１６．１Å）の架橋剤を用い、ならびに還元条件下および天然条件下で非架橋ダイマーを分析して（データは示さず）、この可能性を調べた：本発明者らは、Ｅ５７８Ｃ突然変異体の自然発生二量体化の証拠を見出さず、Ｃｙｓ５７８は鎖間ジスルフィド結合の形成に導かないと結論する。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２５９】
ＥＧＦＲ突然変異体からの分裂促進的シグナル伝達。最終的に、ＥＧＦＲの機能性は、生物学的応答を刺激するその能力によって測定される。これらの応答は、リガンド結合の親和性、キナーゼ活性化の強度、キナーゼ活性化の大きさ、シグナル伝達の持続時間を含めた、多くのパラメーターに依存する。本発明者らは、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用い、漸増性濃度のＥＧＦへの暴露に続いて、「デノボ」ＤＮＡ合成を誘導するそれらの能力について、ＥＧＦＲ突然変異体をテストした。結果を図１５および表４に示す。まず、細胞系のいずれもリガンド非依存性［３Ｈ］チミジン取り込みを呈しなかった：ＣＲ１ループおよびＣＲ２の間の連結が弱化された場合においてさえ、分裂促進シグナル伝達は受容体の活性化のためにＥＧＦ結合を必要とすることは明らかである。一般的には、ＥＧＦについてのＥＣ５０は高親和性な受容体の占有率と相関するが（表３および表４参照）、Ｅ５７８Ｃの場合には、最大［３Ｈ］チミジン取込みの半分のために必要とされるＥＧＦの濃度と、受容体の最大占有の半分のために必要とされるＥＧＦの濃度との間には、１０倍の差がある。本発明者らは、野生型ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞系において、細胞当たり５００ＲほどがＥＧＦに対する最大応答の半分を達成するのに活性化されなければならないことを確立し（方法については、Ｗａｌｋｅｒら、１９９８参照）：この閾値は、野生型ＥＧＦＲについては約１５ｐＭのＥＧＦで到達し、Ｅ５７８Ｃ細胞については約８０ｐＭのＥＧＦで到達する（表４）。（細胞当たりの受容体の合計数および各ＥＧＦ濃度における占有割合に基づく）同一計算を用い、本発明者らは、Ｙ２４６Ｗ突然変異体が約６０ｐＭのＥＧＦ濃度において最大応答の半分に到達し、Ｙ２４６Ｄ突然変異体は、約４００ｐＭの濃度において到達すると見積もった。分裂促進アッセイにおけるこれらの突然変異体のＥＧＦに対する応答の完全な欠如は、リガンド結合親和性の単純な喪失よりはむしろ増殖性シグナル伝達ユニットを形成するこれらのＥＧＦＲの能力の無いことを反映する。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２６１】
ＥＧＦＲ立体配座の抗体モニタリング。示された結果は、これまで、ＣＲ１ループおよびＣＲ２ドメインの間の相互作用がＥＧＦＲを低親和性に連結し（キナーゼ不活性状態（９））、そしてＣＲ１／ＣＲ１ループ相互作用がＥＧＦＲのリガンド誘導性キナーゼ活性化に必要であるモデルを支持する（４；５）。「中間」状態もまた（Ｆｅｒｇｕｓｏｎらによって提案されているとおり（９））存在するかどうか、およびその特性は何であり得るかは依然として不明確である。本発明者らは、受容体のこの形態が連結されていない、より高い親和性、ダイマーおよびキナーゼ不活性であると予測する。リガンドの不存在において、正しいＣＲ１−ＣＲ１相互作用は形成されないようであるか、あるいはキナーゼ活性化を行うには余りにも一時的である。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２６３】
モノクローナル抗体８０６はΔ２−７切断形ＥＧＦＲならびに受容体を過剰発現する細胞における野生型ＥＧＦＲの部分集団を認識する（２３；３０）。ｍＡｂ８０６は、Δ２−７ＥＧＦＲを発現する神経膠芽腫異種移植片または野生型ＥＧＦＲを過剰発現する癌腫において抗腫瘍剤として活性である（２２；４１；４２）。この抗体は、受容体の活性化形態を選択的に認識すると仮定された（４３）。ＥＧＦＲの単離されたＥＣＤについての研究は、ｍＡｂ８０６がＣＲ２ドメインを欠く、ＥＣＤの表面固定化されるＣ末端切断形態（ａａ１−５０１）と反応するが、Ｎ末端切断形態（ａａ３０３−６２１）とは反応しないことを示した。これは、このエピトープがＣＲ１ドメインのＣ末端部分に向かって位置することを示唆する（Ｊｏｈｎｓら、原稿投稿中）。ｍＡｂ８０６は、細胞当たり約４０，０００個の野生型ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞の表面と弱く反応するが、しかしながら（Ｌ１ドメインおよびほとんどのＣＲ１ドメインを欠く）同等数のΔ２−７受容体を発現するＢａＦ／３細胞はｍＡｂ８０６に強く結合する（図１６）。興味深いことには、ΔＣＲ１ループ突然変異体（これは、ａａ２４４−２５９を欠く：（４））は強いｍＡｂ８０６反応性を有する。ｍＡｂ５２８が細胞表面の正しくフォールディングされたＥＧＦＲを全て認識できると仮定し、ＦＡＣＳ分析を用い、ｍＡｂ８０６  対  ｍＡｂ５２８の中央値の蛍光の比率を計算することによって、ｍＡｂ８０６に反応性のＥＧＦＲの割合を計算することが可能である：直接的比較は可能である。なぜならば、本発明者らは、飽和濃度において双方の抗体を用い、結合は同一の二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８結合化抗マウスＩｇ）によって検出され、ＦＡＣＳ検出は使用範囲において線形であるからである。この分析を用い、ｍＡｂ８０６と反応性の受容体の割合は、野生型ＥＧＦＲについての６〜８％から、Δ２−７およびΔＣＲ１ループＥＧＦＲについての７０〜９０％まで変化する（０．０６〜０．０８および０．０６９〜０．９８のｍＡｂ５２８結合に対するｍＡｂ８０６結合の比率：図１４、データは示さず）。一緒に考え併せると、単離されたＥＣＤおよび細胞受容体についてのデータは、エピトープがＣＲ１ドメインのほとんどのＣ末端部分に存在し、野生型受容体の本来の立体配座によってマスクされ得るが、ＣＲ１ループの欠失によって露出され得ることを示唆する。事実、ＥＧＦＲ−ＥＣＤの結晶構造へのｍＡｂ８０６エピトープのマッピングは、それがＣＲ１ループのＣ末端からすぐのところに位置することを示し（図９Ｂ、９Ｃ参照）：従って、ｍＡｂ８０６エピトープは、背中合わせの二量体形態におけるＣＲ１／ＣＲ１接合面に埋もれている可能性がある。また、ｍＡｂ８０６エピトープは、受容体の連結形態において、部分的に埋もれている。推定の「中間体」においてのみ、ＣＲ１ループ／ＣＲ２またはＣＲ１／ＣＲ１ループ相互作用によってそれがマスクされない場合の、受容体の非連結形態は、利用できる可能性のあるｍＡｂ８０６エピトープである。この抗体は、従って、連結されたＥＧＦＲ複合体、非連結のＥＧＦＲ複合体、および十分に活性なＥＧＦＲ複合体を分析するための感受性のある立体配座プローブを��供し得る。この仮説を検定するために、本発明者らは、ｍＡｂ８０６またはＥＧＦとのプレインキュベーションの前および後における、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞とｍＡｂ８０６との反応性をモニターした。ｍＡｂ８０６が受容体の中間体形態を認識し、中間体形態が連結された（ＣＲ１ループ／ＣＲ２）およびＣＲ１／ＣＲ１非連結状態と動的な平衡にあり、抗体とのプレインキュベーションが平衡をこの種に向けてシフトするはずであり、よって、反応性を増大させるはずである。ＣＲ１／ＣＲ１接合面の形成を支持することによって、ＥＧＦとのインキュベーションは感受性を減少させるはずである。野生型ＥＧＦＲ／Ｂａｆ細胞を、３７℃（系のエネルギーを最大化させるため）において内部移行阻害剤フェニルアルシンオキサイド（２９）の存在下でｍＡｂ８０６に暴露させて、または４℃でＥＧＦに暴露させて、キナーゼ活性状態の形成を可能とするが、内部移行を完全に排除した。ｍＡｂ８０６処理は（１２５Ｉ−ＥＧＦ結合によって測定されるように）ＥＧＦＲの合計数を変化させず、双方の条件下で、９５％を超えるＥＧＦＲが、細胞表面に存在した（データは示さず）。ｍＡｂ８０６、ＥＧＦまたはコントロール緩衝液での予備処理後に、ｍＡｂ５２８、ｍＡｂ８０６またはコントロール抗体との野生型ＥＧＦＲ反応性を、ＦＡＣＳ分析によって測定した。表５は、ｍＡｂ８０６またはＥＧＦでの予備処理によって引き起こされた中央値の蛍光チャネルの変化、ならびにｍＡｂ８０６反応性とｍＡｂ５２８反応性との間の比率を示す。データを提示するこの方法を選択して、絶対中央蛍光値（これは、レーザー電流および検出器の設定の小さな変化に対して非常に感受性である）において、実験の間の変動を克服し、実験データのプーリングを可能とした。１０ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ８０６との３７℃における１時間の細胞のプレインキュベーションは、ｍＡｂ５２８の反応性に影響することなくｍＡｂ８０６との反応性を２倍より大きくし；従って、２つの抗体の間の比率は有意に上昇した。同一条件下でのｍＡｂ５２８とのプレインキュベーションは、引き続いてのｍＡｂ５２８の結合にもｍＡｂ８０６の結合にも効果を有しなかった（データは示さず）。別の実験において、本発明者らは、第二のインキュベーションの間のｍＡｂ８０６の濃度の増加（１０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌ）または暴露の時間の増加（２０分から１時間）は、無視できる効果を有した（データは示さず）ため、増強されたｍＡｂ８０６結合は飽和の欠如に起因しないことを証明した。ｍＡｂ８０６とのプレインキュベーションの効果は、時間依存性および温度依存性であり、３７℃でのプレインキュベーションから３時間後に最大に到達した（データは示さず）。これらの結果は、ｍＡｂ８０６による一時的な非連結形態のＥＧＦＲ受容体のトラッピングに適合する。逆に、ＥＧＦにおける細胞のプレインキュベーションは、ｍＡｂ８０６との反応性を劇的に減少させる。これらの条件下での受容体の内部移行化は５％未満であり、よって、ｍＡｂ８０６結合の減少に有意に寄与することができない。これらの実験において、立体障害またはエピトープのマスキングいずれかを介するＥＧＦの結合後に、ｍＡｂ５２８との���応性は約２０％低下した。考え併わせると、これらの結果は、連結されておらず、結合していない形態の受容体についての、ｍＡｂ８０６による選択的認識を指摘する。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２６５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２６５】
ＣＲ１−ループまたはＣＲ２突然変異体へのｍＡｂ８０６結合の分析（表４）は、以下：ｍＡｂ８０６反応性は、弱化されたＣＲ１−ループ／ＣＲ２相互作用を持つ突然変異体（Ｖ５３８ＢおよびＤ５６３Ｈ）における野生型ＥＧＦＲの少なくとも２倍であり、ＣＲ１／ＣＲ１相互作用を形成できない受容体（Ｙ２４６突然変異体）についての野生型ＥＧＦＲよりも３倍程度高かったこと、を支持する。ＥＧＦとのインキュベーションは、２つのクラスの突然変異体に対して反対の効果を有し：ＥＧＦは活性ダイマーを形成できる受容体（野生型およびＣＲ２突然変異体の全て）のｍＡｂ８０６との反応性を低下させ、他方、ｍＡｂ８０６との反応性は、ＣＲ１−ループ突然変異体について変化しないか、または増強された。これらの突然変異体に対するＥＧＦの効果は、ＣＲ１／ＣＲ１ループ相互作用を形成できないことに伴う、弱いＣＲ１−ループ／ＣＲ２ループ相互作用のＥＧＦによる連結解除と合致する。ＥＧＦによるｍＡｂ８０６反応性の変調は、チロシンリン酸化およびＤＮＡ取り込みによって測定された場合（図１５および表６参照）、ＥＧＦＲキナーゼを活性化する突然変異体ＥＧＦＲの能力、またはそれができないことによく相関する。本発明者らのデータは、ｍＡｂ８０６が、未だバックツーバック（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）ダイマー立体配座に配置されるべき、ＥＧＦＲの非連結形態を優先的に認識するモデルと合致する。従って、ｍＡｂ８０６をツールとして用いて、リガンド結合の際の受容体内の立体配座変化をモニターすることができる。ＥＧＦＲの一過性の、連結されおらず、結合していない立体配座は、いずれの時点においても、全ＥＧＦＲの小さな割合が、文献に報告されているように、受容体を過剰発現する細胞に検出可能な量で存在する（２２；２３；３０）。また、我々のデータは、腫瘍形成を抑制するｍＡｂ８０６の能力を説明するのを助けることもできる：Δ２−７ＥＧＦＲを発現する細胞において、抗体の結合は受容体複合体キナーゼの活性立体配座の形成を立体的に妨げ、他方、野生型ＥＧＦＲを過剰発現する細胞においては、それは非連結ＥＧＦＲ形態を捕獲し、ＣＲ１−ループ間の相互作用およびその後の活性化を妨げることができる。この仮説は、ｍＡｂ８０６での処理後の、Δ２−７ＥＧＦＲのキナーゼ活性化における、報告された減少と合致する（４２）。  
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２８４】
このエピトープマッピング方法を用いて、ｍＡｂ  ８０６は、接触残基として作用するＡｓｐ２９７−Ｃｙｓ３０２、Ｇｌｕ２９３、および恐らくはＣｙｓ２８７を持つ連結されたジスルフィドループ２８７−３０２の１つの面に突き止められた。そのような構造的モチーフは、以前、システインヌースとして記載され、これは、結合特異性において重要なジスルフィド連結された表面露出ループである（３７）。システインヌースは、ウシ呼吸器系シンシチウムウイルスのプロテインＧおよび麻疹ウイルスヘマグルチニンタンパク質を含めた種々のタンパク質についての主な抗原性エピトープとしても同定されている（３８；３９）。これは、ジスルフィド連結ループが好都合な抗原性構造であることを示唆する；それは既に連結されているので、抗原結合の際により小さなエントロピーコストがある。それゆえ、ＥＧＦＲにおける多数の他のジスルフィドループは抗体結合のための潜在的エピトープ標的である。ｍＡｂ  ８０６は、ドメインＩＩ二量体化アームを欠く細胞でのＥＧＦＲへの増大した結合をディスプレイすることが示されている。従って、ｍＡｂ  ８０６は、それが自己抑制性の立体配座から延長されたモノマー立体配座に変化するので受容体の移行形態に結合すると仮定された（先の実施例および（３４）参照）。ｍＡｂ  ８０６結合の際に、ＥＧＦＲモノマーはもはや二量体化し、受容体を活性化できないと考えられ、これは、その抗腫瘍活性を説明する。ここに示されたｍＡｂ  ８０６エピトープはこの仮説と一致する。そのエピトープは、隣接ドメインＩＩ残基によって不明瞭とされた残基Ｇｌｕ２９３およびＣｙｓ３０２を持つ、自己抑制性のモノマー構造において部分的に接近可能であるに過ぎない（図１９Ｄ）。これらの残基は、立体配座移行に際して暴露されるようになり得、ｍＡｂ  ８０６の結合を可能にする。１つのＥＧＦＲモノマーのｍＡｂ  ８０６エピトープは、ＥＧＦＲダイマー構造における他のモノマーに隣接しており、このエピトープへの抗体結合は立体的にＥＧＦＲ二量体化を妨げることができた。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２９８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２９８】
【図１】ｍＡｂ８０６とＥＧＦＲのフラグメントとの反応性。ＥＧＦＲの可溶性フラグメント（１〜５１３および３１０〜５０１）、または増殖ホルモン／ＥＧＦＲフラグメント融合タンパク質（ＧＨ−２７４−５０１、ＧＨ−２８２−５０１、ＧＨ−２９０−５０１およびＧＨ−２９８−５０１）を含有する細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、膜に移動し、ｍＡｂ８０６（左側パネル）または抗−ｍｙｃ抗体９Ｂ１１（右側パネル）で免疫ブロットした。
【図２Ａ】ｍＡｂ８０６と、酵母上にディスプレイされたＥＧＦＲのフラグメントとの反応性。Ａ、酵母ディスプレイＥＧＦＲフラグメントのｍＡｂ８０６標識の平均蛍光シグナルを示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。酵母ディスプレイでは、あるパーセンテージの細胞はそれらの表面にタンパク質を発現せず、その結果、２つのヒストグラムピークがもたらされる。ｍＡｂ８０６は、誘導されないネガティブコントロールに結合しない。
【図２Ｂ】ｍＡｂ８０６と、酵母でディスプレイされたＥＧＦＲのフラグメントとの反応性。Ｂ、１〜５０１ＥＧＦＲフラグメントは、酵母ペレットを３０分間で８０℃まで加熱することによって変性した。１〜５０１フラグメント上の直線ｃ−ｍｙｃ  Ｃ−末端は依然として９Ｅ１０抗体によって認識され、これは、加熱処理が酵母表面ディスプレイフラグメントを含まないことを示す。立体配座感受性ｍＡｂ２２５を用いて、変性を確認した。
【図３Ａ】ＥＧＦＲ誘導ペプチドとのｍＡｂ８０６結合の阻害。Ａ、１〜５０１およびＧＨ−２７４−５０１ＥＧＦＲフラグメントを、２８７−３０２ＥＧＦＲペプチドの存在下または非存在下において、図１に記載したようにｍＡｂ８０６で免疫ブロットした（上方パネル）。ＥＧＦＲフラグメントの存在は、膜をストリップし、抗−ｍｙｃで再度プローブすることによって、ｍＡｂ８０６免疫ブロッティング後に確認した。
【図３Ｂ】ＥＧＦＲ誘導ペプチドとのｍＡｂ８０６結合の阻害。Ｂ、ＥＬＩＳＡプレートを１〜５０１ＥＧＦＲフラグメントでコートし、次いで、増大させる濃度の２８７〜３０２または２８７〜２９８ＥＧＦＲペプチドの存在下でｍＡｂ８０６と共にインキュベートした。データは平均Ａ４０５±ＳＤとして表す。
【図４】化学修飾された２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドとのｍＡｂ８０６結合の阻害。Ａ、ＥＬＩＳＡプレートを５０１−Ｆｃでコーティングし、次いで、増大させる濃度の酸化された、還元されたおよびエージングした（実験手法に記載したように調製）２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドの存在下でｍＡｂ８０６と共にインキュベートした。データは平均パーセンテージ阻害±ＳＤとして表す（誤差棒は非常に小さいので見えない）。Ｂ、ＥＬＩＳＡプレートを５０１−Ｆｃでコーティングし、次いで、増大させる濃度のＳ−カルボキシメチル化２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチド、または２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドのＣＮＢｒ切断から生じたＮ−末端（ＣＧＡＤＳＹＥＭ）（配列番号：）およびＣ−末端（ＥＥＧＶＲＫＣ）（配列番号：）ペプチドの存在下でｍＡｂ８０６と共にインキュベートした。データは平均パーセンテージ阻害±ＳＤとして表す（誤差棒は余りにも小さいので目で見えない）。
【図５】ＢＩＡｃｏｒｅによるペプチドへのｍＡｂ８０６結合の分析。Ａ、２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドをチオールカップリングによって表面に固定化し、ｍＡｂ８０６抗体を濃度を増大させつつ通過させた（３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００および１０００ｎＭ）。次いで、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析によって結合親和性を測定した（インサート）。Ｂ、２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドをアミンカップリングによって表面に固定化し、５００ｎＭの濃度のｍＡｂ８０６抗体を、２８７〜３０２（上方パネル）、２８７〜２９８（中央パネル）または２８７〜３０１（下方パネル）ＥＧＦＲペプチド（５および１０μＭ）の存在下で表面を通過させた。
【図６】ＥＧＦＲ構造内でのｍＡｂ８０６エピトープのつきとめ。Ａ、ｍＡｂ８０６エピトープを含有するシステインループの構造を示す炭素追跡。Ｂ、ＥＧＦＲのリガンド−結合ダイマー形態の空間充填モデル。ダイマーは、各ＥＧＦＲ分子のＣＲ１−ループでつきとめられた２つの二量体化アームによって圧倒的に安定化される。Ｃ、二量体化を妨げる、ドメインＣＲ１およびＣＲ２の間の自動阻害相互作用を示すＥＧＦＲの連結された形態。Ｄ、毒され、隣接分子上の第二のループとの相互作用の準備ができたＣＲ１−ループの二量体化アーム（左側図面）を明瞭に示すＥＧＦＲの拡張された（移行）形態。色：ＥＧＦリガンドはオレンジ色で示され；アミノ酸５７９におけるグリコシル化部位は赤色で示され、ｍＡｂ８０６エピトープは紫色で示される。ＥＧＦＲ構造（３１、３５、３６）および可能な受容体活性化メカニズムは既に詳細に記載されている。
【図７】ＥＧＦＲのＣＲ１−ループ欠失を発現する２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。少量の内因性野生型ＥＧＦＲを発現する親２９３細胞をｄｅ２−７ＥＧＦＲまたはｄｅＣＲ１−ループＥＧＦＲ（２つの独立したクローン）でトランスフェクトし、無関係ＩｇＧ２ｂ抗体（塗り潰ぶしていないヒストグラム）、ｍＡｂ５２８（黒色ヒストグラム）、またはｍＡｂ８０６（灰色ヒストグラム）いずれかで染色した。
【図８Ａ】Ａ、ｍＡｂ８０６の可能な抗腫瘍メカニズム。ｍＡｂ８０６は不活性なＥＧＦＲに結合できないが、受容体が連結解除されるにつれ、ｍＡｂ８０６エピトープは露出されるようになり、抗体に結合できる。受容体へのｍＡｂ８０６の結合はほとんど確実に二量体化を妨げ、よって、ＥＧＦＲシグナル伝達を妨げ、ＥＧＦＲ内在化を誘導することができる。
【図８Ｂ】Ｂ、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４においてシステインループを含有するｍＡｂ８０６のホモロジー。ＥｒｂＢ１に保存されたアミノ酸は赤色で示され、電荷の保存を呈する残基は緑色で示される。
【図８Ｃ】Ｃ、ＣＲ１−ＣＲ２ダイマー界面。Ｎ５７９に付着した第一の炭水化物部位は結晶構造中に明瞭に目に見え、ＣＲ１−ＣＲ２ダイマー界面に位置する。ＥＧＦＲを過剰発現する細胞においては、この部位は経時的に８０％グリコシル化されるに過ぎない。グリコシル化の差は連結のダイナミックス、よって、ｍＡｂ８０６の反応性に影響し得る。
【図９】Ａ）ｈＥＧＦＲドメイン構造の、および本発明研究のために構築された突然変異の模式図。略語：Ｌ、リガンド結合ドメイン；ＣＲ、システイン−リッチのドメイン；ＪＭ、膜近接ドメイン；Ｃ−Ｔ、カルボキシ−末端ドメイン。Ｂ）上方パネル：（Ｇａｒｒｅｔｔ  ら、．，２００２からの）ＴＧＦαを有する複合体におけるＥＧＦＲ  ＥＣＤ（１〜５０１）の非連結ダイマー形態のリボンダイヤグラム。ＥＧＦＲ分子は、青色および緑色に着色され；結合したＴＧＦα分子は紫色に着色される。（後に記載する）ｍＡｂ８０６に対するエピトープはピンク色に着色される。下方パネル：（Ｆｅｒｇｏｓｏｎら、２００３からの）ＥＧＦＲ  ＥＣＤ（１〜６２１）の連結形態のリボンダイヤグラム。ＣＲ２ドメイン（ａａ５０１〜６２１）は黄色で示される。双方のパネルにおいて、インサートは非連結立体配座のＣＲ１−ループの間、または非連結立体配座におけるＣＲ１−ループおよびＣＲ２ドメインの間の相互作用を強調する。構築体において突然変異したアミノ酸はインサートにおいて示される。密接したファンデルワールス接触した原子は点線によって結合され、Ｈ−結合はダッシュ線によって表される。
【図１０】野生型または突然変異体ＥＧＦＲを安定に発現するＢａＦ／３細胞系のＦＡＣＳ分析。実験手法に詳細に記載したように、細胞をｍＡｂ５２８と共にインキュベートし、続いて、Ａｌｅｘａ４８  ８標識抗マウスＩｇと共にインキュベートした。プロットは横軸の蛍光強度、および縦軸の蛍光チャネル当たりの細胞数を表す。ネガティブコントロール（無関係抗体）蛍光は明るい茶色の重なりとして各パネルでプロットされる。
【図１１】野生型および突然変異体受容体に対するＥＧＦ結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析。リガンド結合親和性は、未標識ＥＧＦとの競合によって固定した濃度の１２５Ｉ−ＥＧＦにおいて測定した（実験手法参照）。プロットは、ＲａｄＬｉｇプログラム（ＢｉｏＳｏｆｔ）の「Ｋｅｌｌ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）」バージョンを用いて生データから作成した。
【図１２】野生型および突然変異体ＥＧＦＲの二量体化、および受容体複合体の特異的ホスホチロシン含有量。休止細胞をＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ，１６ｎＭ）またはコントロール緩衝液で処理した。ホモ二機能的細胞−不浸透性架橋剤ＢＳ３を直ちに加え、室温にてインキュベーションを３０分間継続した。反応をクエンチした後、細胞を溶解させ、細胞タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、免疫ブロッティング用のＰＶＤＦ幕に移した。Ａ）ＥＧＦＲタンパク質（頂部）およびホスホチロシン（底部）の免疫検出。ＰＶＤＦ膜をホスホチロシン抗体への露出の後にストリップし、抗−ＥＧＦＲ抗体で再度プローブした。Ｂ）実験手法に記載した定量的走査デンシトメトリーによって測定された、ＥＧＦ刺激の有りおよび無しでの合計ＥＧＦＲ（ダイマー＋モノマー）に対するダイマーの比率。Ｃ）前記した定量的走査デンシトメトリーによって決定された、ＥＧＦＲモノマーおよびダイマータンパク質に対するホスホチロシン含有量の比率。
【図１３】リガンド−依存性チロシンリン酸化およびＭＡＰＫ活性化。Ａ）休止細胞を室温にてＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）に１０分間露出し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で直接溶解させた。タンパク質を４〜１２％ゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ホスホチロシン（頂部）またはホスホ−ＭＡＰＫ（底部）に対する抗体でプローブした。ブロットをストリップし、各々抗−ＥＧＦＲ抗体（抗ＭＡＰＫ抗体で再度プローブして（示さず）、実験手法に記載した特異的タンパク質リン酸化の測定を可能とした。Ｂ）野生型および突然変異体受容体についてのＥＧＦＲタンパク質に対するホスホチロシンの比率。Ｃ）合計ＭＡＰＫタンパク質に対するホスホ−ＭＡＰＫの比率。
【図１４】ＣＲ２突然変異体におけるＥＧＦＲ活性化の用量応答。野生型またはＣＲ２−突然変異体受容体を発現させる細胞を増殖因子血清回収によって静止させ、次いで、コントロール緩衝液、または増大させる濃度のＥＧＦ（０．０３〜１００ｎＭ）に露出した。Ａ）：合計細胞溶解物は４〜１２％グラジエントゲルでのＳＤＳ／ＰＡＧＥ、続いて、抗−ホスホチロシン、抗−ＥＧＦＲまたは抗−ホスホ−ＭＡＰＫ抗体での免疫ブロッティングによって分析した。Ｂ）およびＣ）：フィルムを反応性バンドのデンシトメーター定量につき走査し、ホスホ−Ｓｈｃおよびホスホ−ＭＡＰＫデータはＥＧＦ濃度に対する％最大バンド強度としてプロットした。記号は：塗り潰ぶした丸、野生型ＥＧＦＲ；暗い三角、Ｄ５６３Ｈ−ＥＧＦＲ；明るい三角形、Ｖ５３８Ｄ−ＥＧＦＲ；塗り潰ぶしていない四角形、Ｅ５７８Ｃ−ＥＧＦＲ。
【図１５】野生型または突然変異体ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞のＥＧＦに対するマイトジェニック応答。コントロール緩衝液（白丸）または増大させる濃度のＥＧＦ（黒丸）で処理した細胞への［３Ｈ］チミジン取り込みは実験手法に記載したように測定した。
【図１６】ＣＲ１−ループを欠くＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞へのｍＡｂ５２８およびｍＡｂ８０６抗体結合の比較。野生型、Δ２−７またはΔ−ＣＲ１−ループＥＧＦＲを発現する細胞を、図２に記載したようにｍＡｂ５２８（暗い線）またはｍＡｂ８０６（塗り潰ぶした灰色）いずれかで染色し、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。各ピークについてのメジアン蛍光チャネルは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔにおいて統計学的分析ソフトウェアを用いて決定し、これを用いて、２つの抗体の間の比率を計算した。無関係のクラスがマッチした抗体のコントロール蛍光は、点線の重なりとして表す。
【図１７】ＥＧＦＲの立体配座および活性化。ＥＧＦＲは低親和性から高親和性状態への転移の間における主な立体配座変化を受ける。低親和性立体配座（Ａ）は、２つのシステイン−リッチのドメインＣＲ１およびＣＲ２の間の分子内相互作用によって連結される。連結されたモノマー（Ａ）は連結されたダイマー（Ｂ）または高親和性非連結モノマー（Ｆ）いずれかと平衡している。膜貫通（ＴＭ）および／またはキナーゼドメインは、連結されたダイマー（Ｂ）および非連結ダイマー（Ｃ）の形成を駆動するようである。連結されたダイマー（Ｂ）はＥＣＤおよびキナーゼドメインの間の分子間接触を有するイラストで示す。受容体の連結された形態は低親和性である。非連結モノマーおよびダイマーはより高い親和性を示す。非連結ダイマーの細胞内キナーゼドメインは、リガンド（例えば、ＥＧＦまたはＴＧＦ−α結合がダイマー−リガンド複合体（Ｄ）におけるさらなる再配位を誘導するまで活性化されない。受容体−リガンド複合体は、より高次のオリゴマー（例えば、テトラマーＥ）を形成できる。リガンド結合親和性は内から外へのシグナル伝達（例えば、ＡＴＰ）によってさらに変調される。リガンド結合および二量体化／オリゴマー化は、キナーゼ活性化および基質のリン酸化に導くが、受容体のシグナル伝達もまた内在化、分解および脱リン酸化によってやはり調節される。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｄは、酵母表面にディスプレイされたＥＧＦＲフラグメント２７３〜６２１へのｍＡｂ８０６結合についてのフローサイトメトリーデータを示す。ｃ−ｍｙｃタグによって検出されるＥＧＦＲディスプレイ蛍光は縦軸に示され、ｍＡｂ８０６結合は横軸に示される。（Ａ）ソート１（１０ｎＭ  ｎＡｂ８０６）およびソート２（７５ｎＭ）であり、ソートゲートは実線で示される。（Ｂ）〜（Ｄ）７５ｎＭにおける（Ｂ）、＋（Ｃ）および＋＋（Ｄ）結合、および陽性およびネガティブコントロールの代表的突然変異体。ＷＴ＝野生型ＥＧＦＲ２７３〜６２１。
【図１９】図１９は、酵母表面にディスプレイされたＥＧＦＲ２７３〜６２１および突然変異体に対するｍＡＢ８０６の力価測定を示す。黒色、野生型（＋＋）；暗い灰色、Ｃ２８７Ｒ（＋）；明るい灰色、Ｅ２９３Ｋ（−）。単一部位結合モデルへの全体的フィットは、データの３つの独立した組で行った（四角形、三角形および菱形は別々の組を表す）。
【図２０】ｍＡｂ８０６エピトープ。（Ａ〜Ｂ）ＥＧＦＲ−ＥＧＦダイマー構造の鎖におけるエピトープの前面図および逆面図（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＩＶＯ）。ダイマー構造が用いられる。なぜならば、Ｇｌｕ２９３はモノマー構造では分解されないからである。（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＮＱＬ）。色で示した残基は、結合の喪失のためにライブラリーから単離された突然変異体である。赤色、アラニン置換に際して結合の喪失をやはり引き起こす残基；オレンジ色、引き起こさない残基；灰色、ライブラリーから単離されず、アラニン置換に際して結合の喪失を呈しない残基。（Ｃ）エピトープはジスルフィド結合および２つの塩ブリッジによって拘束される（Ｇｌｕ２９３−Ａｒｇ３００およびＡｓｐ２９７−Ｌｙｓ３０１）。負に荷電した残基、赤色；正、青色；システイン、黄色。イメージは、ダイマー構造における双方のＥＧＦＲ分子上の残基２８７〜３０２を含む（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＩＶＯ）。（Ｄ）（Ａ）におけるように着色した自動阻害されたＥＧＦＲモノマーにおけるｍＡＢ８０６エピトープ、ＥＧＦＲの残りは青色である。