(57)【要約】ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（特にＡＫＰ−００１）を使用して、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防するための医薬または方法を提供する。好ましい実施形態では、ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための組成物であって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、組成物。
【請求項２】
ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための組成物であって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、眼アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、組成物。
【請求項３】
ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための組成物であって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下の式（１）もしくは式（２）で示される化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの溶媒和物を含み、
該式（１）の化合物は、
【化１】
2019022152.tif 000039
（式中、
Ｒ１は水素原子、低級アルキル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ２は未置換のアリールもしくはヘテロアリール基、又はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルキル基、低級アルキレンジオキシ基及びベンジルオキシ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されたアリールもしくはヘテロアリール基を表し、
Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ４は置換もしくは未置換のフェニル基又は置換もしくは未置換の複素環式基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化２】
2019022152.tif 000040
を表し、ここで、ｎは０〜３の整数を表す）で示され、
該式（２）の化合物は、
【化３】
2019022152.tif 000041
（式中、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ３はナフチル基、場合により低級アルキル基で置換されていてもよいヘテロアリール基又は下記式（Ａ）
【化４】
2019022152.tif 000042
の基を表し、ここで、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基又はフェニル基を表すか、或いはＸ１とＸ２は一緒になって低級アルキレンジオキシ基を表し、
Ｒ４は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ５は場合によりハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基、低級アルキルチオカルボニル基、低級ハロアルキルチオカルボニル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基及びニトロ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されていてもよい、フェニル基、チエニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基又はイソオキサゾリル基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｏ−、−ＮＨ−又は
【化５】
2019022152.tif 000043
を表し、ここで、ｎは１〜３の整数を表す、
ただし、Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子を表しそしてＲ３が式（Ａ）の基を表し且つＸ１、Ｘ２及びＸ３の２つが水素原子を表す場合、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の残りの１つは水素原子及びハロゲン原子以外の基を表す）で示される、組成物。
【請求項４】
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記症状、障害または疾患は、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、および血管新生のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する症状、障害または疾患である、請求１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、約０．０１μＭ〜約１０μＭの濃度で前記組成物中に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下：
【化６】
2019022152.tif 000044
（式中、
Ａ１は、ＮまたはＣＨであり；
Ａ２は、ＮＨ、Ｎ−ＣＨ３またはＯであり；
Ｒ１は、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、
Ｒ２は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、または
【化７】
2019022152.tif 000045
であり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、ｎ＝１または２である）
の構造を有する化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、またはそれらの溶媒和物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、５−［（２−クロロ−６−フルオロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール（ＡＫＰ−００１）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＡＫＰ−００１は、約０．０３μＭ〜約３μＭの濃度で前記組成物中に存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が点眼剤であり、前記ＡＫＰ−００１が、約０．０３ｍＭ〜約３ｍＭで該点眼剤中に存在する、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターの新規用途に関する。より詳細には、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター、例えばＡＫＰ−００１を使用して、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための技術、方法、ならびにそのための薬剤、ならびにこの技術を応用した角膜内皮細胞の保存技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。【０００３】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力は極めて限定的である。フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜の内側の内皮細胞が異常を来して角膜の浮腫を生じたりする疾患であり、その原因は不明である。フックス角膜内皮ジストロフィでは、コラーゲン等の細胞外マトリクスが角膜の後部にあるデスメ膜の後面の一部分に沈着しグッテー（Corneal  guttae）およびデスメ膜の肥厚を生じる。グッテー（Corneal  guttae）およびデスメ膜の肥厚はフックス角膜内皮ジストロフィ患者における羞明、霧視の原因であり患者のQOLを著しく損なう。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。【０００４】
フックス角膜内皮ジストロフィについては、フックス角膜患者由来の角膜内皮細胞の培養(非特許文献１および３)や不死化の報告(非特許文献２)があるが、細胞外マトリックスの過剰産生を伴うなどの疾患の特徴を維持した、治療薬、進行予防薬のスクリーニングに適切な細胞の報告はないため、その治療薬の開発には限界があり、現在のところ臨床で使用されている治療薬は存在せず角膜移植に頼らざるを得ない。【０００５】
また特許文献１は、角膜の線維症および／または濁りを治療するためのＴＧＦ−β１インヒビターペプチドを開示する。特許文献２はＴＧＦ−β１，２，３に結合する抗体を開示する。特許文献３は、角膜内皮障害の治療にＮｒｆ２アゴニストまたはアクチベーターが使用され得ること角膜内皮障害の治療にＮｒｆ２アゴニストまたはアクチベーターが使用され得ることを開示する。特許文献４は、トランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−β１）と結合することができ、かつ、サイトカインとの直接的結合によりＴＧＦ−β１の生物活性の強力なインヒビターとなるペプチドを開示する。特許文献５は、ＢＭＰ−７ポリペプチドを含む瘢痕形成抑制剤を開示する。特許文献６は、ＴＧＦ−β阻害作用が治療上または予防上有効である疾患として、角膜障害を概括的に記載する。【０００６】
さらに、角膜内皮の疾患は、小胞体ストレスとも関係している。非特許文献４は、ヒト角膜内皮細胞と小胞体ストレスとの関係に関する基礎研究に関する文献である。特許文献７は、ＴＧＦ−βインヒビターが、ＴＧＦ−βに起因する小胞体ストレスに関連する角膜内皮の疾患を治療し得ることを記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2013-520405公報
【特許文献２】国際公開第2012/167143号
【特許文献３】国際公開第2012/009171号
【特許文献４】特表2007-525204号公報
【特許文献５】特表2006-508169号公報
【特許文献６】国際公開第2004/018430号
【特許文献７】国際公開第2015/064768
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Zaniolo  K,  et  al.  Exp  Eye  Res.;94(1)：22-31.  2012
【非特許文献２】Azizi  B,  et  al.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci.  2；52(13)：9291-9297.  2011
【非特許文献３】Kelliher  C.  et  al.  Exp  Eye  Res  Vol.93(6),  880-888,  2011
【非特許文献４】William  L.  Corwin  et  al.,  Cryobiology：Vol.63,No.1,  46-55  (2011)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルの細胞において、トランスフォーミング増殖因子−β２（ＴＧＦ−β２）に代表される薬剤を用いることでＴＧＦ−βシグナルが障害を生じることを見出し、このような障害に、驚くべきことに、アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターが有効であることが見いだされた。さらに、このような障害がピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（例えば、ＡＫＰ−００１）によって治療可能であることを見出し、本発明を完成させた。このような治療効果は、非常に低い濃度でも確認された。また、本発明者らは、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター、特にＡＫＰ−００１は、角膜内皮に対して毒性が非常に低いことを見出した。【００１０】
加えて、本発明者らは、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（例えば、ＡＫＰ−００１）が、折り畳まれなかったタンパク質によりもたらされる小胞体（ＥＲ）関連ストレスを抑制することを見出し、上記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターが、小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の障害等を治療または予防することが可能であることを見出した。【００１１】
したがって、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための組成物であって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、組成物。
（項目２）
ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための組成物であって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、眼アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、組成物。
（項目３）
ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための組成物であって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下の式（１）もしくは式（２）で示される化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの溶媒和物を含み、
該式（１）の化合物は、
【化１】
2019022152.tif 000002
（式中、
Ｒ１は水素原子、低級アルキル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ２は未置換のアリールもしくはヘテロアリール基、又はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルキル基、低級アルキレンジオキシ基及びベンジルオキシ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されたアリールもしくはヘテロアリール基を表し、
Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ４は置換もしくは未置換のフェニル基又は置換もしくは未置換の複素環式基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化２】
2019022152.tif 000003
を表し、ここで、ｎは０〜３の整数を表す）で示され、
該式（２）の化合物は、
【化３】
2019022152.tif 000004
（式中、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ３はナフチル基、場合により低級アルキル基で置換されていてもよいヘテロアリール基又は下記式（Ａ）
【化４】
2019022152.tif 000005
の基を表し、ここで、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基又はフェニル基を表すか、或いはＸ１とＸ２は一緒になって低級アルキレンジオキシ基を表し、
Ｒ４は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ５は場合によりハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基、低級アルキルチオカルボニル基、低級ハロアルキルチオカルボニル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基及びニトロ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されていてもよい、フェニル基、チエニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基又はイソオキサゾリル基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｏ−、−ＮＨ−又は
【化５】
2019022152.tif 000006
を表し、ここで、ｎは１〜３の整数を表す、
ただし、Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子を表しそしてＲ３が式（Ａ）の基を表し且つＸ１、Ｘ２及びＸ３の２つが水素原子を表す場合、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の残りの１つは水素原子及びハロゲン原子以外の基を表す）で示される、組成物。
（項目４）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記症状、障害または疾患は、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因するものである、項目１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、および血管新生のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する症状、障害または疾患である、請求１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、約０．０１μＭ〜約１０μＭの濃度で前記組成物中に存在する、項目１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下：
【化６】
2019022152.tif 000007
（式中、
Ａ１は、ＮまたはＣＨであり；
Ａ２は、ＮＨ、Ｎ−ＣＨ３またはＯであり；
Ｒ１は、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、
Ｒ２は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、または
【化７】
2019022152.tif 000008
であり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、ｎ＝１または２である）
の構造を有する化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、またはそれらの溶媒和物である、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、５−［（２−クロロ−６−フルオロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール（ＡＫＰ−００１）である、項目１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記ＡＫＰ−００１は、約０．０３μＭ〜約３μＭの濃度で前記組成物中に存在する、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記組成物が点眼剤であり、前記ＡＫＰ−００１が、約０．０３ｍＭ〜約３ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１０に記載の組成物。
（項目１Ａ）
それを必要とする被験体における角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防する方法であって、該方法は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターの有効量を該被験体に投与する工程を含み、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、方法。
（項目２Ａ）
それを必要とする被験体における角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防する方法であって、該方法は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを該被験体に投与する工程を含み、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、眼アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、方法。
（項目３Ａ）
それを必要とする被験体における角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防する方法であって、該方法は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを該被験体に投与する工程を含み、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下の式（１）もしくは式（２）で示される化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの溶媒和物を含み、
該式（１）の化合物は、
【化１】
2019022152.tif 000009
（式中、
Ｒ１は水素原子、低級アルキル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ２は未置換のアリールもしくはヘテロアリール基、又はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルキル基、低級アルキレンジオキシ基及びベンジルオキシ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されたアリールもしくはヘテロアリール基を表し、
Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ４は置換もしくは未置換のフェニル基又は置換もしくは未置換の複素環式基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化２】
2019022152.tif 000010
を表し、ここで、ｎは０〜３の整数を表す）で示され、
該式（２）の化合物は、
【化３】
2019022152.tif 000011
（式中、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ３はナフチル基、場合により低級アルキル基で置換されていてもよいヘテロアリール基又は下記式（Ａ）
【化４】
2019022152.tif 000012
の基を表し、ここで、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基又はフェニル基を表すか、或いはＸ１とＸ２は一緒になって低級アルキレンジオキシ基を表し、
Ｒ４は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ５は場合によりハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基、低級アルキルチオカルボニル基、低級ハロアルキルチオカルボニル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基及びニトロ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されていてもよい、フェニル基、チエニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基又はイソオキサゾリル基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｏ−、−ＮＨ−又は
【化５】
2019022152.tif 000013
を表し、ここで、ｎは１〜３の整数を表す、
ただし、Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子を表しそしてＲ３が式（Ａ）の基を表し且つＸ１、Ｘ２及びＸ３の２つが水素原子を表す場合、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の残りの１つは水素原子及びハロゲン原子以外の基を表す）で示される、方法。
（項目４Ａ）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目１Ａ〜３Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目５Ａ）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目１Ａ〜４Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目６Ａ）
前記症状、障害または疾患は、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因するものである、項目１Ａ〜５Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目７Ａ）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、および血管新生のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する症状、障害または疾患である、請求１Ａ〜６Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目８Ａ）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、約０．０１μＭ〜約１０μＭの濃度で投与される、項目１Ａ〜７Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目９Ａ）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下：
【化６】
2019022152.tif 000014
（式中、
Ａ１は、ＮまたはＣＨであり；
Ａ２は、ＮＨ、Ｎ−ＣＨ３またはＯであり；
Ｒ１は、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、
Ｒ２は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、または
【化７】
2019022152.tif 000015
であり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、ｎ＝１または２である）
の構造を有する化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、またはそれらの溶媒和物である、項目１Ａ〜８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ａ）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、５−［（２−クロロ−６−フルオロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール（ＡＫＰ−００１）である、項目１Ａ〜９Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１Ａ）
前記ＡＫＰ−００１は、約０．０３μＭ〜約３μＭの濃度で投与される、項目１０Ａに記載の方法。
（項目１２Ａ）
前記ＡＫＰ−００１は点眼剤として投与され、前記ＡＫＰ−００１が、約０．０３ｍＭ〜約３ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１０Ａに記載の方法。
（項目１Ｂ）
被験体における角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬の製造のためのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターの使用であって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、使用。
（項目２Ｂ）
被験体における角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬の製造のためのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターの使用であって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、眼アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、使用。
（項目３Ｂ）
被験体における角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬の製造のためのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターの使用であって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下の式（１）もしくは式（２）で示される化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの溶媒和物を含み、
該式（１）の化合物は、
【化１】
2019022152.tif 000016
（式中、
Ｒ１は水素原子、低級アルキル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ２は未置換のアリールもしくはヘテロアリール基、又はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルキル基、低級アルキレンジオキシ基及びベンジルオキシ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されたアリールもしくはヘテロアリール基を表し、
Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ４は置換もしくは未置換のフェニル基又は置換もしくは未置換の複素環式基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化２】
2019022152.tif 000017
を表し、ここで、ｎは０〜３の整数を表す）で示され、
該式（２）の化合物は、
【化３】
2019022152.tif 000018
（式中、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ３はナフチル基、場合により低級アルキル基で置換されていてもよいヘテロアリール基又は下記式（Ａ）
【化４】
2019022152.tif 000019
の基を表し、ここで、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基又はフェニル基を表すか、或いはＸ１とＸ２は一緒になって低級アルキレンジオキシ基を表し、
Ｒ４は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ５は場合によりハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基、低級アルキルチオカルボニル基、低級ハロアルキルチオカルボニル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基及びニトロ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されていてもよい、フェニル基、チエニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基又はイソオキサゾリル基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｏ−、−ＮＨ−又は
【化５】
2019022152.tif 000020
を表し、ここで、ｎは１〜３の整数を表す、
ただし、Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子を表しそしてＲ３が式（Ａ）の基を表し且つＸ１、Ｘ２及びＸ３の２つが水素原子を表す場合、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の残りの１つは水素原子及びハロゲン原子以外の基を表す）で示される、使用。
（項目４Ｂ）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目１Ｂ〜３Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目５Ｂ）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目１Ｂ〜４Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目６Ｂ）
前記症状、障害または疾患は、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因するものである、項目１Ｂ〜５Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目７Ｂ）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、および血管新生のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する症状、障害または疾患である、請求１Ｂ〜６Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目８Ｂ）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、約０．０１μＭ〜約１０μＭの濃度で投与される、項目１Ｂ〜７Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目９Ｂ）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下：
【化６】
2019022152.tif 000021
（式中、
Ａ１は、ＮまたはＣＨであり；
Ａ２は、ＮＨ、Ｎ−ＣＨ３またはＯであり；
Ｒ１は、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、
Ｒ２は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、または
【化７】
2019022152.tif 000022
であり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、ｎ＝１または２である）
の構造を有する化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、またはそれらの溶媒和物である、項目１Ｂ〜８Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１０Ｂ）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、５−［（２−クロロ−６−フルオロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール（ＡＫＰ−００１）である、項目１Ｂ〜９Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１１Ｂ）
前記ＡＫＰ−００１は、約０．０３μＭ〜約３μＭの濃度で投与される、項目１０Ｂに記載の使用。
（項目１２Ｂ）
前記ＡＫＰ−００１は点眼剤として投与され、前記ＡＫＰ−００１が、約０．０３ｍＭ〜約３ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１０Ｂに記載の使用。
（項目１Ｃ）
被験体における角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するためのアンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目２Ｃ）
被験体における角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための眼アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目３Ｃ）
被験体における角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するためのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターであって、該ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下の式（１）もしくは式（２）で示される化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの溶媒和物を含み、
該式（１）の化合物は、
【化１】
2019022152.tif 000023
（式中、
Ｒ１は水素原子、低級アルキル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ２は未置換のアリールもしくはヘテロアリール基、又はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルキル基、低級アルキレンジオキシ基及びベンジルオキシ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されたアリールもしくはヘテロアリール基を表し、
Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ４は置換もしくは未置換のフェニル基又は置換もしくは未置換の複素環式基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化２】
2019022152.tif 000024
を表し、ここで、ｎは０〜３の整数を表す）で示され、
該式（２）の化合物は、
【化３】
2019022152.tif 000025
（式中、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ３はナフチル基、場合により低級アルキル基で置換されていてもよいヘテロアリール基又は下記式（Ａ）
【化４】
2019022152.tif 000026
の基を表し、ここで、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基又はフェニル基を表すか、或いはＸ１とＸ２は一緒になって低級アルキレンジオキシ基を表し、
Ｒ４は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ５は場合によりハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基、低級アルキルチオカルボニル基、低級ハロアルキルチオカルボニル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基及びニトロ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されていてもよい、フェニル基、チエニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基又はイソオキサゾリル基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｏ−、−ＮＨ−又は
【化５】
2019022152.tif 000027
を表し、ここで、ｎは１〜３の整数を表す、
ただし、Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子を表しそしてＲ３が式（Ａ）の基を表し且つＸ１、Ｘ２及びＸ３の２つが水素原子を表す場合、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の残りの１つは水素原子及びハロゲン原子以外の基を表す）で示される、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目４Ｃ）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目１Ｃ〜３Ｃのいずれか一項に記載のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目５Ｂ）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目１Ｃ〜４Ｃのいずれか一項に記載のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目６Ｃ）
前記症状、障害または疾患は、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因するものである、項目１Ｃ〜５Ｃのいずれか一項に記載のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目７Ｃ）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、および血管新生のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する症状、障害または疾患である、請求１Ｃ〜６Ｃのいずれか一項に記載のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目８Ｃ）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、約０．０１μＭ〜約１０μＭの濃度で投与される、項目１Ｃ〜７Ｃのいずれか一項に記載のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目９Ｃ）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下：
【化６】
2019022152.tif 000028
（式中、
Ａ１は、ＮまたはＣＨであり；
Ａ２は、ＮＨ、Ｎ−ＣＨ３またはＯであり；
Ｒ１は、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、
Ｒ２は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、または
【化７】
2019022152.tif 000029
であり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、ｎ＝１または２である）
の構造を有する化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、またはそれらの溶媒和物である、項目１Ｃ〜８Ｃのいずれか一項に記載のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目１０Ｃ）
前記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、５−［（２−クロロ−６−フルオロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール（ＡＫＰ−００１）である、項目１Ｃ〜９Ｃのいずれか一項に記載のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目１１Ｃ）
前記ＡＫＰ−００１は、約０．０３μＭ〜約３μＭの濃度で投与される、項目１０Ｃに記載のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。
（項目１２Ｃ）
前記ＡＫＰ−００１は点眼剤として投与され、前記ＡＫＰ−００１が、約０．０３ｍＭ〜約３ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１０Ｃに記載のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター。【００１２】
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（例えば、ＡＫＰ−００１）を含む、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する障害または疾患（例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ）を処置または予防しうる医薬を提供する。また、本発明は、上記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の障害等を処置または予防しうる医薬を提供する。さらに、本発明は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞の保存のための組成物または角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＡＫＰ−００１でプレトリートメントしたフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞をＴＧＦ−β２で刺激した不死化ヒト角膜内皮細胞の位相差顕微鏡写真を示す。
【図２】図２は、ＳＢ２０３５８０でプレトリートメントしたフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞をＴＧＦ−β２で刺激した不死化ヒト角膜内皮細胞の位相差顕微鏡写真を示す。
【図３】図３は、ＰＨ−７９７８０４でプレトリートメントしたフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞をＴＧＦ−β２で刺激した不死化ヒト角膜内皮細胞の位相差顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、ＶＸ−７０２でプレトリートメントしたフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞をＴＧＦ−β２で刺激した不死化ヒト角膜内皮細胞の位相差顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、カスパーゼ３、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左のレーンから、コントロール（ＴＧＦ−β非添加群）、ＴＧＦ−β添加群、ＴＧＦ−β＋ＳＢ２０３５８０添加群、ＴＧＦ−β＋ＰＨ−７９７８０４添加群、ＴＧＦ−β＋ＶＸ−７０２添加群、ＴＧＦ−β＋ＡＫＰ−００１添加群を示す。
【図６】図６は、ヒト角膜内皮細胞におけるＡＫＰ−００１存在下での細胞生存率のグラフを示す。縦軸は、ＡＫＰ−００１非添加群をコントロール（１００％）として、ＡＫＰ−００１の各濃度（０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ）での細胞生存率（％）を示す。エラーバーは、平均±標準誤差を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示す。ｎ＝５）。
【図７】図７は、ヒト角膜内皮細胞におけるＡＫＰ−００１存在下でのカスパーゼ３／７活性のグラフを示す。縦軸は、ＡＫＰ−００１非添加群をコントロール（１００％）として、ＡＫＰ−００１の各濃度（０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ）でのカスパーゼ３／７活性（％）を示す。エラーバーは、平均±標準誤差を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝５）。
【図８】図８は、ＡＫＰ−００１でプレトリートメントした不死化ヒト角膜内皮細胞をタプシガルギンで刺激して培養した不死化ヒト角膜内皮細胞の位相差顕微鏡を示す。
【図９】図９は、ＡＫＰ−００１点眼を１０回行った後に、細隙灯顕微鏡（ＳＬ−Ｄ７、トプコン）により観察された角膜の写真を示す。ＡＫＰ−００１点眼が行われた角膜は透明であり、充血も認めず、前眼部の炎症などを認めなかった。フルオレセインナトリウム試験紙（昭和薬品化工）にて染色して観察したところ、染色される角結膜の上皮障害を認めなかった（右写真）。
【図１０】図１０は、角膜透明性についてスコア化して評価した結果を示す。ＡＫＰ−００１点眼を１０回行った前後ともにスコアは全ての角膜で０であり、ＡＫＰ−００１点眼が透明性に影響しなかった。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＡＫＰ−００１点眼マウスにおいて、Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）ＨＲ（ＯＣＵＬＵＳ）により角膜厚を計測した代表例を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ビヒクル点眼マウスにおいて、Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）ＨＲ（ＯＣＵＬＵＳ）により角膜厚を計測した代表例を示す。
【図１２】図１２は、Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）ＨＲ（ＯＣＵＬＵＳ）により得たシャインプルーフ像の代表例を示す。
【図１３】図１３は、トノベット（登録商標）（エムイーテクニカ）により測定した眼圧、超音波パキメーター（ＳＰ−１００、トーメーコーポレーション）により測定した中心角膜厚、Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）ＨＲ（ＯＣＵＬＵＳ）により測定した角膜体積（１０ｍｍ径）の点眼前後の値のグラフを示す。
【図１４】図１４は、スキャニングスリット型接触式角膜内皮スペキュラーマイクロスコープ（コーナンメディカル）を用いて撮影した角膜内皮の観察像の代表例を示す。
【図１５】図１５は、ＡＫＰ−００１を１０回点眼した眼球の角膜内皮の染色像（ＺＯ−１、Ｎ−カドヘリン、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびアクチン）を示す。
【図１６】図１６は、ＡＫＰ−００１を１０回点眼した眼球の角膜内皮の染色像（Ａｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＰＩ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１６】
（定義）
本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
【００１７】
本明細書において「細胞分裂因子（マイトージェン）活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ」とは、マイトージェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）をリン酸化する酵素であり、セリン／トレオニンキナーゼのファミリーである。ＭＡＰキナーゼは、様々な細胞外刺激に応答して活性化され、細胞表面から核へのシグナル伝達を仲介するタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ群である。ＭＡＰキナーゼはまた、細胞外シグナル調節性プロテインキナーゼ（extracellular  signal-regulated  protein  kinases）またはＥＲＫとも呼ばれ、３キナーゼカスケードの末端酵素である。関係するが区切られたシグナル伝達経路に対する３キナーゼカスケードの反復が、一経路内で逐次的に作用するモジュール多機能シグナル伝達要素としてのＭＡＰキナーゼ経路の概念を生み、この経路ではそれぞれの酵素がリン酸化してそれによりシーケンスの次のメンバーを活性化することが特徴である。このようにして、標準的ＭＡＰキナーゼモジュールは３つのプロテインキナーゼからなる。すなわち、あるＭＡＰキナーゼキナーゼ（またはＭＥＫＫ）があるＭＡＰキナーゼキナーゼ（またはＭＥＫ）を活性化し、これが、順に、あるＭＡＰＫ／ＥＲＫ酵素を活性化する。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ＪＮＫ（ｃ−ｊｕｎアミノ末端プロテインキナーゼ（またはＳＡＰＫ）））、およびｐ３８カスケードは、それぞれＭＥＫＫ、ＭＥＫおよびＥＲＫ、またはＭＡＰキナーゼスーパーファミリーメンバーを含む３つの酵素モジュールからなる。様々な細胞外シグナルはそれらのそれぞれの細胞表面レセプターと連合すると初期事象をトリガーし、次いでこのシグナルが細胞内部に伝達され、そこで適切なカスケードを活性化する。
【００１８】
ＭＡＰキナーゼはマイトージェン活性化プロテインキナーゼ（またはＥＲＫ）スーパーファミリーであって、ＴＸＹコンセンサス配列を触媒コアに有する。ＥＲＫ１／２、ｐ３８ＨＯＧ、およびＪＮＫ／ＳＡＰＫは、平行経路における関係するが別個の末端酵素である。
【００１９】
Sebolt-Leopold  et  al.,  Nat.Med.,5(7):810-6  (Jul,1999)は、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の小分子インヒビターを同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏカスケードアッセイシステムを記載している。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＥＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫ融合タンパク質を細菌細胞から調製して、これらをこのアッセイシステムにおいてＭＥＫ１のＭＡＰＫへ、ＭＢＰ（myelin  basic  protein（ミエリン塩基性タンパク質））への逐次リン酸化に使用した。ＭＥＫ１を直接阻害するＰＤ１８４３５２［２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド］も見出されている。
【００２０】
本明細書において「ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（「ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビター」ともいう。）」とは、ｐ３８に関連するＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を阻害する任意の薬剤をいう。したがって、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、ＭＡＰキナーゼファミリーメンバーであるｐ３８−ＭＡＰキナーゼを標的とし、低下させる、または阻害する化合物に関する。ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは水溶性のものが好ましい。水溶性でなければ、溶媒として身体に適合しにくいものを使用することが必要となりうるからである。水溶性かどうかについては薬局方の溶解度の定義に基づき分類されうる。すなわち、溶質1gまたは1mLを溶かすのに要する溶媒量として、極めて溶けやすい：1mL未満；溶けやすい：1mL以上10mL未満；やや溶けやすい：10mL以上30mL未満；やや溶けにくい：30mL以上100mL未満；溶けにくい：100mL以上1000mL未満；極めて溶けにくい：1000mL以上10000mL未満；ほとんど溶けない：10000mL以上と定義されており、本明細書においても同様に評価する。水溶性とは、水を溶媒としたときに、これらのうち有効量を溶解させるものであれば、任意の溶解性のものを利用することができることが理解される。
【００２１】
ｐ３８は哺乳類動物ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーメンバーであって、ストレス、紫外光、および炎症性サイトカインにより活性化される。触媒コアにＴＧＹコンセンサス配列を有する。
【００２２】
異常調節されたキナーゼは多くの疾患、特に増殖性および炎症性障害における主な病因であるということが次第に認識されている。癌領域において最初に同定される発癌遺伝子の１つは、上皮増殖因子レセプターキナーゼ（ＥＧＦＲ）に対するものであったが、その過剰発現は肺、乳、脳、前立腺、ＧＩおよび卵巣癌と関連している。例えば、ＭＡＰキナーゼの構成的活性化は多数の癌細胞系統（膵臓、大腸、肺、卵巣、および腎臓）および様々なヒト器官（腎臓、大腸、および肺）由来の原発腫瘍と関連している（Hoshino  et  al.，Oncogene，18（3）:813-22（Jan．1999））。さらに、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼは、炎症の発症および進行と関連する２つのサイトカイン、ＴＮＦαおよびＩＬ−１の産生を調節する。
【００２３】
本明細書において「アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター」とは、投与部位（例えば眼、角膜内皮等）等の特定の部位においてｐ３８  ＭＡＰキナーゼのインヒビターとして有効であるが、体内に入る等、それ以外の場所に移ると速やかに代謝されて不活化または活性が低くなるものをいう。投与部位は種々挙げられるが、経口投与した場合は、消化器官自体（例えば、腸管）なども含まれ、点眼剤の場合は眼が含まれる。
【００２４】
本明細書において「眼アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター」とは、眼においてｐ３８  ＭＡＰキナーゼのインヒビターとして有効であるが、体内に入る等、それ以外の場所に移ると速やかに代謝されて不活化または活性が低くなるものをいう。
【００２５】
本発明において使用されうるｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、国際公開第２００６／０７０９２７号および国際公開第２００８／００１９３０号、Shirota  et  al.,  Drug  Metab  Dispos.  2015  Feb;43(2):217-26、Hasumi  et  al.,  Bioorg  Med  Chem.  2014  Aug  1;22(15):4162-76に記載された化合物が挙げられる。これらの文献に記載されたｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは腸管のアンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼとして記載されている。本発明において、これらのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターが眼においてアンテドラッグとして機能し得ることが見出された。
【００２６】
好ましいｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターとしては、ＡＫＰ−００１（５−［（２−クロロ−６−フルオロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール）が例示されるがそれに限定されない。
【００２７】
使用される濃度として、０．０１ｎＭ〜１００μＭ、約０．１ｎＭ〜１００μＭ、約０．００１〜１００μＭ、約０．０１〜７５μＭ、約０．０５〜５０μＭ、約１〜１０μＭ、約０．０１〜１０μＭ、約０．０５〜１０μＭ、約０．０７５〜１０μＭ、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜１０μＭ、約０．７５〜１０μＭ、約１．０〜１０μＭ、約１．２５〜１０μＭ、約１．５〜１０μＭ、約１．７５〜１０μＭ、約２．０〜１０μＭ、約２．５〜１０μＭ、約３．０〜１０μＭ、約４．０〜１０μＭ、約５．０〜１０μＭ、約６．０〜１０μＭ、約７．０〜１０μＭ、約８．０〜１０μＭ、約９．０〜１０μＭ、約０．０１〜５０μＭ、約０．０５〜５．０μＭ、約０．０７５〜５．０μＭ、約０．１〜５．０μＭ、約０．５〜５．０μＭ、約０．７５〜５．０μＭ、約１．０〜５．０μＭ、約１．２５〜５．０μＭ、約１．５〜５．０μＭ、約１．７５〜５．０μＭ、約２．０〜５．０μＭ、約２．５〜５．０μＭ、約３．０〜５．０μＭ、約４．０〜５．０μＭ、約０．０１〜３．０μＭ、約０．０５〜３．０μＭ、約０．０７５〜３．０μＭ、約０．１〜３．０μＭ、約０．５〜３．０μＭ、約０．７５〜３．０μＭ、約１．０〜３．０μＭ、約１．２５〜３．０μＭ、約１．５〜３．０μＭ、約１．７５〜３．０μＭ、約２．０〜３．０μＭ、約０．０１〜１．０μＭ、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭ、約０．０９〜３５μＭ、または約０．０９〜３．２μＭであり、より好ましくは、約０．０１〜１０μＭ、約０．１〜３μＭ、または約０．１〜１．０μＭを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書において「誘導体」または「類似体」とは、そのコア構造が親化合物のそれと同じかまたはよく似ているが、異なる官能基または付加的な官能基などの化学的または物理的修飾を有するような化合物を指す。誘導体または類似体は、親化合物と同一または類似の生物学的活性を有する。
【００２９】
本明細書において、「薬学的に許容され得る塩」とは、比較的非毒性の、本発明の化合物の無機または有機の酸付加塩をいう。これらの塩は、化合物の最終的な単離および精製の間に一時的に、またはその遊離塩基型で精製された化合物を適切な有機もしくは無機の酸と別々に反応させること、およびそのように形成された塩を単離することによって調製することができる。
【００３０】
本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩基性塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩、メグルミン塩、ジエタノールアミン塩またはエチレンジアミン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ベネタミン塩等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のヘテロ環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００３１】
本発明の化合物の薬学的に許容され得る酸性塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。
【００３２】
本明細書において、「溶媒和物」とは、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を意味し、例えば有機溶媒との溶媒和物（例えば、アルコール（エタノールなど）和物）、水和物等を包含する。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位していてもよい。水和物としては、１水和物、２水和物等を挙げることができる。
【００３３】
本明細書において「ｉＦＥＣＤ」（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｕｃｈｓ’  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。
【００３４】
本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。「ｉＨＣＥＣ」は、不死化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ヒト角膜内皮細胞の略称である。
【００３５】
本明細書において、「プログラム細胞死」とは、あらかじめプログラムされているかのように決まった時期や環境で自発的に細胞が死ぬ現象を指す。プログラム細胞死は、例えば「アポトーシス」を含む意味で使用される。
【００３６】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（トランスフォーミング成長因子−β；略称ＴＧＦ−βとも表示される）」とは、当該分野で用いられるものと同様の意味で用いられ、様々な硬化性疾患や、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症の病態形成を担い、脱毛に深く関与し、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防ぎ、癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。「ＴＧＦ−βシグナル」とは、ＴＧＦ−βによって媒介されるシグナルであって、ＴＧＦ−βによって惹起されるものをいう。ＴＧＦ−βシグナル例えば、ＴＧＦ−β２によって媒介されるシグナルが含まれ、このほか、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３等によって媒介されるシグナルも例示される。ＴＧＦ−βについて、ヒトでは、ＴＧＦ−β１〜β３までの相同性約７０％の３つのアイソフォームが存在し、その作用は類似している。ＴＧＦ−βはレセプターに結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲において活性化されてレセプターに結合できる活性型となり、その作用を発揮する。理論に束縛されることを望まないが、標的細胞におけるＴＧＦ−βの作用はＳｍａｄという情報伝達を担う一連のタンパク質のリン酸化経路によって伝達されるとされている。まず、活性型ＴＧＦ−βが標的細胞表面に存在するＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターに結合すると、ＩＩ型レセプター２分子とＩ型ＴＧＦ−βレセプター２分子からなるレセプター複合体が形成され、ＩＩ型レセプターがＩ型レセプターをリン酸化する。次に、リン酸化Ｉ型レセプターは、Ｓｍａｄ２またはＳｍａｄ３をリン酸化すると、リン酸化されたＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３はＳｍａｄ４と複合体を形成して核に移行し、標的遺伝子プロモーター領域に存在するＣＡＧＡ  ｂｏｘと呼ばれる標的配列に結合し、コアクチベーターとともに標的遺伝子の転写発現を誘導するとされている。
【００３７】
トランスフォーミング（形質転換）増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路は、その標的遺伝子の調節によって、細胞増殖および分化、増殖停止、プログラム細胞死、ならびに上皮間充織分化転換（ＥＭＴ；上皮間葉転換ともいう）といったような、多くの細胞活性を調節することができる。ＴＧＦ−β自体（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）、アクチビンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、移動およびプログラム細胞死等の強力な調節剤である。
【００３８】
ＴＧＦ−βは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および活性化マクロファージを含め、多くの細胞により、および多くの他の細胞型により産生される、約２４Ｋｄのタンパク質である。免疫系に対するＴＧＦ−βの効果の中には、ＩＬ−２レセプター誘導、ＩＬ−１誘発性胸腺細胞増殖の阻害、およびＩＦＮ−γ誘発性マクロファージ活性化の遮断がある。ＴＧＦ−βは、様々な病的状態に関与すると考えられており（Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１）、そして腫瘍抑制物質または腫瘍プロモーターのいずれかとして機能することが十分裏付けられている。
【００３９】
ＴＧＦ−βは、２つのセリン／スレオニンキナーゼ細胞表面レセプターであるＴＧＦ−βＲＩＩおよびＡＬＫ５によって、そのシグナル伝達を媒介する。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＴＧＦ−βＲＩＩがＡＬＫ５レセプターをリン酸化するのを可能とする、リガンド誘発性レセプター二量体化で開始される。そのリン酸化は、ＡＬＫ５キナーゼ活性を活性化して、活性化ＡＬＫ５は次に、下流エフェクターＳｍａｄタンパク質（ＭＡＤの脊椎動物相同体、または「Ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰ（デカペンタプレジック）」タンパク質）、Ｓｍａｄ２または３をリン酸化する。Ｓｍａｄ４とのｐ−Ｓｍａｄ２／３複合体は、核に入って、標的遺伝子の転写を活性化する。
【００４０】
Ｓｍａｄ３は、ＳｍａｄのＲ−Ｓｍａｄ（レセプター−活性化Ｓｍａｄ）サブグループのメンバーであって、ＴＧＦ−βレセプターによる転写活性化の直接メディエーターである。ＴＧＦ−β刺激は、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化および活性化をもたらし、これらは、Ｓｍａｄ４（脊椎動物における「共通（ｃｏｍｍｏｎ）Ｓｍａｄ」または「ｃｏ−Ｓｍａｄ」）と複合体を形成し、これが核と共に蓄積して、標的遺伝子の転写を調節する。Ｒ−Ｓｍａｄは、細胞質に局在し、そしてＴＧＦ−βレセプターによるリガンド誘発性リン酸化で、ｃｏ−Ｓｍａｄと複合体を形成して、核へと移動し、ここで、それらは、クロマチンおよび協同転写因子と関連のある遺伝子発現を調節する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は阻害性Ｓｍａｄ（「Ｉ−Ｓｍａｄ」）であり、すなわち、ＴＧＦ−βにより転写的に誘発されて、ＴＧＦ−βシグナル伝達のインヒビターとして機能する（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１：６５９）。Ｓｍａｄ６／７は、Ｒ−Ｓｍａｄのレセプター媒介活性化を妨げることにより、それらの阻害効果を発揮する；それらは、Ｒ−Ｓｍａｄの動員およびリン酸化を競合的に妨げる、Ｉ型レセプターと関連する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、Ｓｍａｄ６／７相互作用タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす、Ｅ３ユビキチンリガーゼを補充することが知られている。
【００４１】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、このほか、ＢＭＰ−７などによって伝達される経路も存在し、これは、ＡＬＫ−１／２／３／６を経由し、Ｓｍａｄ１／５／８を介して機能が発現されるとされている。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路については、J.  Massagu’e,  Annu.  Rev.  Biochem.  1998.  67:  753-91;Vilar  JMG,  Jansen  R,  Sander  C  (2006)  PLoS  Comput  Biol  2(1):e3;  Leask,  A.,  Abraham,  D.  J.  FASEB  J.18,  816-827  (2004);  Coert  Margadant  &  Arnoud  Sonnenberg  EMBO  reports  (2010)11,  97-105;  Joel  Rosenbloom  et  al.,  Ann  Intern  Med.  2010;  152:  159-166等を参照のこと。
【００４２】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患」とは、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βに誘導される任意の角膜内皮の症状、障害または疾患を指す。本発明では、角膜内皮細胞、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル細胞（例えば、ｉＦＥＣＤ）を、ＴＧＦ−β２に曝露したところ、驚くべきことに種々の障害（例えば、プログラム細胞死）が生じた。このような現象は従来よく解明されていなかった現象である。そして、本発明者らは、このＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患をさらに分析したところ、予想外にも、ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビターによって、この障害を抑制することができることを見出した。ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患はｐ３８  ＭＡＰＫのシグナル伝達経路とは異なるものであり、また、使用したｐ３８  ＭＡＰＫインヒビターはＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を抑制しているものではないことから、これまでに未解明の疾患・障害の発露の経路およびその治療または予防の態様を見出すことができたといえる。また、通常最適に使用されるｐ３８  ＭＡＰＫインヒビターの濃度とも異なる濃度でＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患に対する最適な治療または予防効果がみられていることから、本発明は、角膜内皮について新たな治療／予防技術を提供するものと位置付けることができると考えられる。ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患としては、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior  polymorphous  dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital  hereditary  endothelial  dystrophy)、および特発性角膜内皮障害等において、ＴＧＦ−βの発現がみられるものを挙げることができるがそれらに限定されない。特にＴＧＦ−β２の発現が通常より亢進している角膜内皮細胞または角膜内皮組織では、本発明で見出された障害またはそれに関連する障害が発現または亢進していると考えられることから、そのような角膜内皮細胞または角膜内皮組織がみられる任意の角膜内皮の症状、障害または疾患は、特に本発明の対象として意図される。
【００４３】
本明細書において「小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患」とは、小胞体（ＥＲ）ストレスに関連するものを指し、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、および角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、血管新生等のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連するものを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明が対象とする症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィに関する障害である。フックス角膜内皮ジストロフィに関しては、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−β誘導が関与していることが示されており、ＦＥＣＤにおける細胞喪失に関与し得ることも示されている。したがって、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害は、ＦＥＣＤの有効な治療になり得ることが当然予想される。しかしながら、本発明者らは、予想外にも、ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビターが、ＴＧＦ−βシグナルに起因する障害を抑制できることを見出した。
【００４５】
本発明の医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィの中でもひとつの重要な異常または障害の原因となるＴＧＦ−β２に誘導される細胞障害等を処置しうることから、フックス角膜内皮ジストロフィの治療または予防に有用であることが理解される。特に、本発明では実施例において、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいてＴＧＦ−β２に誘導される細胞障害あるいはプログラム細胞死を抑制することができたことから本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおけるＴＧＦ−β２に関連する重症患者の治療に使用することができると考えられる。本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害や、角膜内皮密度低下、guttaeの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレアおよび角膜実質の浮腫などを処置しまたは予防し得る。
【００４６】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.et  al.(1989).Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,  F.M.(1989).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,  M.  A.(1990).PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1992).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.M.(1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis  ,M.A.  et  al.(1995).PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1999).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,  J.J.et  al.(1999).PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press、Gait,  M.J.(1985).Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.J.(1990).Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.(1991).Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.L.  et  al.(1992).The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.M.  et  al.(1996).Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.T.(I996).Bioconjugate  Techniques,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy  Joyceらの報告｛Joyce,  2004  #161}  {Joyce,  2003  #7｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００４７】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
【００４８】
＜医薬＞
１つの局面において、本発明は、アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。別の局面において、本発明は、眼アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。さらに別の局面において、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（例えば、ＡＫＰ−００１）を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。ここで、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体は、アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターの代表例であり、本発明では眼アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターであり得ることも見いだされた。驚くべきことに、他のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（例えば、ＳＢ２０３５８０、ＶＸ−７０２およびＰＨ−７９７８０４）では、サブμＭでは角膜内皮細胞の障害抑制効果が観察されなかったのに対し、本願発明で使用されるピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（特にＡＫＰ−００１）は、極めて低い濃度（０．０１μＭ）でも角膜内皮細胞の障害抑制効果が観察されたことから、本願発明で使用されるｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、角膜内皮において非常に高い治療効果を発揮することが明らかになった。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与試験においては、安全性においても優れていることが明らかになった。したがって、本発明のピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（特にＡＫＰ−００１）は、治療効果・安全性に優れた医薬として期待される。
【００４９】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior  polymorphous  dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital  hereditary  endothelial  dystrophy)、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される。
【００５０】
さらに別の局面において、本発明は、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（例えば、ＡＫＰ−００１）を含む、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。
【００５１】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、タンパク質のフォールディングの異常に起因するものであり得る。哺乳動物細胞において、フォールディングしなかったり（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）、ミスフォールディングやタンパク質分解の異常などにより凝集したタンパク質（折りたたみ不全タンパク質、変性タンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ともいう。）はユビキチン化され、微小管上を移動するダイニンモーターにより中心体付近に蓄積し、アグリソームという封入体を形成することが知られる。一般的にアグリソームは熱ショックやウイルス感染、酸化ストレスなどによって形成される。ヒトでは、パーキンソン病の神経細胞に見られるＬｅｗｙ小体や、アルコール性肝臓疾患の肝臓細胞で見られるＭａｌｌｏｒｙ小体、筋萎縮性側索硬化症の星状細胞で見られる硝子様小体など、細胞内の封入体が関与する疾患がいくつか知られている。本発明のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、変性タンパク質の産生に関与しているタプシガルギンなどにより誘導されるフォールディングの異常に起因する小胞体（ＥＲ）ストレス抑制し得る。さらに、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、ＴＧＦβに誘導される小胞体（ＥＲ）ストレスをも抑制し得る。
【００５２】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、ならびにこれらにより生じる角膜実質浮腫、角膜上皮浮腫、角膜上皮びらん、角膜実質混濁、および血管新生からなる群より選択される。
【００５３】
別の局面において、本発明は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよび小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。
【００５４】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよび小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、ならびにこれらにより生じる角膜実質浮腫、角膜上皮浮腫、角膜上皮びらん、角膜実質混濁、および血管新生からなる群より選択される。
【００５５】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよび小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明の利用法としては、例えば点眼薬が挙げられるが、これに限定されず、前房内への注射、徐放剤への含浸、結膜下注射、全身投与（内服、静脈注射）などの投与方法も挙げることができる。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターはアンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含み、あるいはアンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターであり、別の好ましい実施形態では、本発明は、眼アンテドラッグ型ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターである。別の実施形態では、本発明において用いられるｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体のうちｐ３８  ＭＡＰを阻害する活性を有する化合物を含み得、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体のうちｐ３８  ＭＡＰを阻害する活性を有する化合物である。そのような化合物は、以下の式（１）で示される化合物（ピリミジニルイソオキサゾール誘導体）および式（２）で示される化合物（ピリジルイソオキサゾール誘導体）、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの溶媒和物を含み得るか、あるいは以下の式（１）で示される化合物（ピリミジニルイソオキサゾール誘導体）および式（２）で示される化合物（ピリジルイソオキサゾール誘導体）、またはその薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの溶媒和物であり得る。
【００５８】
（ピリミジニルイソオキサゾール誘導体）
前記式（１）の化合物は、
【化８】
2019022152.tif 000030
（式中、
Ｒ１は水素原子、低級アルキル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ２は未置換のアリールもしくはヘテロアリール基、又はハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルキル基、低級アルキレンジオキシ基及びベンジルオキシ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されたアリールもしくはヘテロアリール基を表し、
Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ４は置換もしくは未置換のフェニル基又は置換もしくは未置換の複素環式基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、
【化９】
2019022152.tif 000031
を表し、ここで、ｎは０〜３の整数を表す）で示される。
【００５９】
本明細書において、「低級」なる語は、この語が付された基の炭素原子数が６個以下、好ましくは４個以下であることを意味する。
【００６０】
「低級アルキル基」は、直鎖状もしくは分岐鎖状であることができ、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル基等を挙げることができ、中でも、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル及びｎ−ブチル基が好ましく、「低級アルコキシ基」は、該低級アルキル基によって置換されたオキシ（Ｏ）基であり、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ基等を挙げることができ、中でも、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ及びｎ−ブトキシ基が好ましい。
【００６１】
さらに、「ハロゲン原子」には、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子が包含され、特に、フッ素、塩素及び臭素原子が好ましい。
【００６２】
Ｒ１の定義における「低級アルキルアミノ基」は、前記のような低級アルキル基の１個によって置換されたアミノ基を意味し、「ジ低級アルキルアミノ基」は、前記のような低級アルキル基の２個によって置換されたアミノ基を意味する。ここで、ジ低級アルキルアミノ基における２個の低級アルキル基は、同一であってもよく、また、互いに異なっていてもよい。また、「フェニル低級アルキルアミノ基」は、上記低級アルキルアミノ基における低級アルキル部分がさらに１個のフェニル基によって置換されている基を意味する。
【００６３】
Ｒ１の定義における「低級アルキルチオ基」及び「低級アルキルスルフィニル基」は、それぞれ、前記のような低級アルキル基によって置換されたチオ（Ｓ）基及びスルフィニル（ＳＯ）基を意味する。
【００６４】
Ｒ１の定義における「アシルアミノ基」は、アシル化されたアミノ基を意味し、アシル基としては、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどの低級アルカノイル基やベンゾイルなどのアロイル基等を挙げることができ、中でも、アセチル及びベンゾイル基が好ましい。
【００６５】
Ｒ２の定義における「アリール基」としては、例えば、フェニル、ナフチル基等を挙げることができ、中でも、フェニル基が好ましい。また、Ｒ２の定義における「ヘテロアリール基」としては、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１〜２個のヘテロ原子を有する５〜６員の場合によりベンゼン環と縮合していてもよいヘテロアリール基が包含され、例えば、ピリジル、キノリル、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル基等を挙げることができ、中でも特に、ピリジル基が好適である。
【００６６】
Ｒ２の定義における「低級ハロアルキル基」は、１個もしくはそれ以上の同一もしくは異なるハロゲン原子によって置換された前記のような低級アルキル基を意味し、例えば、フルオロメチル、トリフルオロメチル、１，２−ジクロロエチル、１−クロロ−２−ブロモエチル、ペンタフルオロエチル、１−クロロ−ｎ−プロピル、２−ブロモ−２−メチルエチル、３−クロロ−ｎ−ペンチル、２−ブロモ−３−クロロ−ｎ−ヘキシル基等を挙げることができ、中でも特に、１〜５個の同一もしくは異なるハロゲン原子によって置換された炭素数が１又は２個の低級アルキル基が好ましい。
【００６７】
Ｒ２の定義における「低級アルキレンジオキシ基」としては、例えば、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、トリメチレンジオキシ基等を挙げることができ、特に、メチレンジオキシ基が好ましい。
【００６８】
Ｒ４の定義における「複素環式基」としては、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１〜３個のヘテロ原子を有する飽和もしくは不飽和の５〜７員の場合により縮合環を形成していてもよい複素環式基が包含され、例えば、ピリジル、ピリミジニル、アゼピニル、キノリル、インドリル、キナゾリニル、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、ピロリジニル、イソクロマニル基等を挙げることができ、中でも、チエニル及びイソオキサゾリル基が好ましい。
【００６９】
Ｒ４の定義における「置換もしくは未置換のフェニル基」のフェニル基上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、低級ハロアルキル基、低級ハロアルキルチオ基、ヒドロキシル基、アミノ基等を挙げることができ、中でも、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、低級ハロアルキル基及び低級ハロアルキルチオ基が好ましく、特に、ハロゲン原子及び低級アルキル基が好適である。また、Ｒ４の定義における「置換もしくは未置換の複素環式基」の複素環式基上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、低級ハロアルキル基、アミノ基等を挙げることができ、特に、ハロゲン原子及び低級アルキル基が好ましい。
【００７０】
本発明において好ましい一群の化合物は、Ｒ１が水素原子、アミノ基、低級アルキルアミノ基又はジ低級アルキルアミノ基を表す場合の式（１）の化合物であり、中でも、Ｒ１が水素原子を表す場合の式（１）の化合物がより好適である。また、Ｒ１の好ましい置換位置はピリミジン環の２位である。
【００７１】
本発明において好ましい別の一群の化合物は、Ｒ２がハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基及び低級アルキレンジオキシ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されたフェニル基を表す場合の式（１）の化合物であり、中でも、Ｒ２がハロゲン原子、低級アルキル基及び低級アルキレンジオキシ基から選ばれる１又は２個の置換基によって置換されたフェニル基を表す場合の式（１）の化合物がより好ましく、特に、Ｒ２が４−フルオロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、４−クロロフェニル基、３−メチルフェニル基、２−フルオロ−５−メチルフェニル基、４−フルオロ−３−メチルフェニル基、２−フルオロ−４−メトキシフェニル基又は２，３−メチレンジオキシフェニル基である場合の式（１）の化合物が好適である。
【００７２】
本発明において好ましい更に別の一群の化合物は、Ｒ３が水素原子を表す場合の式（１）の化合物である。
【００７３】
本発明において好ましい更に別の一群の化合物は、Ｒ４が置換もしくは未置換のフェニル基を表す場合の式（１）の化合物であり、中でも、Ｒ４が未置換のフェニル基であるか又はハロゲン原子、低級アルキル基及び低級アルコキシ基から選ばれる１もしくは２個の置換基によって置換されたフェニル基を表す場合の式（１）の化合物がより好ましく、特に、Ｒ４が未置換のフェニル基、２−ハロフェニル基、２，６−ジハロフェニル基、２−低級アルキルフェニル基、３−低級アルキルフェニル基、３−低級アルコキシフェニル基又は２，５−ジ低級アルキルフェニル基である場合の式（１）の化合物がより好適である。
【００７４】
本発明において好ましい更に別の一群の化合物は、Ｙが−ＣＨ２−を表す場合の式（１）の化合物である。
【００７５】
本発明により提供される前記式（１）の化合物の代表例としては、次のものを挙げることができる。
【００７６】
３−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（２−メチルアミノピリミジニル）］−５−（フェニルアセチルアミノ）イソオキサゾール、
５−［（２−クロロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（２−メチルアミノピリミジニル）］イソオキサゾール、
４−［４−（２−ジメチルアミノピリミジニル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−（フェニルアセチルアミノ）イソオキサゾール、
５−［（２−クロロフェニル）アセチルアミノ］−４−［４−（２−ジメチルアミノピリミジニル）］−３−（４−フルオロフェニル）イソオキサゾール、
４−［４−（２−ベンジルアミノピリミジニル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−（フェニルアセチルアミノ）イソオキサゾール、
４−［４−（２−ベンジルアミノピリミジニル）］−５−［（２−クロロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）イソオキサゾール、
４−［４−（２−アセチルアミノピリミジニル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−（フェニルアセチルアミノ）イソオキサゾール、
４−［４−（２−アセチルアミノピリミジニル）］−５−［（２−クロロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）イソオキサゾール、
４−［４−（２−ベンゾイルアミノピリミジニル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−（フェニルアセチルアミノ）イソオキサゾール、
４−［４−（２−ベンゾイルアミノピリミジニル）］−５−［（２−クロロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）イソオキサゾール、
３−（４−フルオロフェニル）−５−（Ｎ−メチル−フェニルアセチルアミノ）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、
３−（４−フルオロフェニル）−５−［（２−クロロフェニル）アセチル−Ｎ−メチルアミノ］−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、
５−（Ｎ−エチル−フェニルアセチルアミノ）−３−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、
５−［（２−クロロフェニル）アセチル−Ｎ−エチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、
３−［４−（２−メチルピリジル）］−５−（フェニルアセチルアミノ）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、
５−［（２−クロロフェニル）アセチルアミノ］−３−［４−（２−メチルピリジル）］−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、
３−［２−（６−メチルピリジル）］−５−（フェニルアセチルアミノ）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、
５−［（２−クロロフェニル）アセチルアミノ］−３−［２−（６−メチルピリジル）］−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、
３−［２−（４−メチルピリジル）］−５−（フェニルアセチルアミノ）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、
５−［（２−クロロフェニル）アセチルアミノ］−３−［２−（４−メチルピリジル）］−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール、等。
【００７７】
本発明の式（１）の化合物は、また、場合により塩の形態で存在することができ、その塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩；酢酸、蓚酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩等が挙げられ、中でも、製薬学的に許容されうる塩が好ましい。
【００７８】
上記式（１）の化合物は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００６／０７０９２７号を参照のこと。
【００７９】
（ピリジルイソオキサゾール誘導体）
前記式（２）の化合物は、
【化１０】
2019022152.tif 000032
（式中、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、フェニル低級アルキルアミノ基、アシルアミノ基、低級アルキルチオ基又は低級アルキルスルフィニル基を表し、
Ｒ３はナフチル基、場合により低級アルキル基で置換されていてもよいヘテロアリール基又は下記式（Ａ）
【化１１】
2019022152.tif 000033
の基を表し、ここで、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、低級ハロアルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基又はフェニル基を表すか、或いはＸ１とＸ２は一緒になって低級アルキレンジオキシ基を表し、
Ｒ４は水素原子又は低級アルキル基を表し、
Ｒ５は場合によりハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基、低級アルキルチオカルボニル基、低級ハロアルキルチオカルボニル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基及びニトロ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されていてもよい、フェニル基、チエニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサゾリル基又はイソオキサゾリル基を表し、
Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｏ−、−ＮＨ−又は
【化１２】
2019022152.tif 000034
を表し、ここで、ｎは１〜３の整数を表す、
ただし、Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子を表しそしてＲ３が式（Ａ）の基を表し且つＸ１、Ｘ２及びＸ３の２つが水素原子を表す場合、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の残りの１つは水素原子及びハロゲン原子以外の基を表す）で示される。
【００８０】
本明細書において、「低級」なる語は、この語が付された基の炭素原子数が６個以下、好ましくは４個以下であることを意味する。
【００８１】
「低級アルキル基」は、直鎖状もしくは分岐鎖状であることができ、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル基等を挙げることができ、中でも、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル及びｎ−ブチル基が好ましく、「低級アルコキシ基」は、該低級アルキル基が結合したオキシ（Ｏ）基であり、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ基等を挙げることができ、中でも、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ及びｎ−ブトキシ基が好ましい。また、「低級アルカノイル基」は、該低級アルキル基が結合したカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基であり、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル基等を挙げることができ、中でも、アセチル及びプロピオニル基が好ましい。
【００８２】
さらに、「ハロゲン原子」及び「ハロ」には、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子が包含され、特に、フッ素、塩素及び臭素原子が好ましい。
【００８３】
Ｒ１の定義における「低級アルキルアミノ基」は、アミノ基（−ＮＨ２）の水素原子の１つが前記低級アルキル基によって置換されたアミノ基を意味し、また、「ジ低級アルキルアミノ基」は、アミノ基の２個の水素原子が前記低級アルキル基によって置換されたアミノ基を意味する。ここで、ジ低級アルキルアミノ基における２個の低級アルキル基は、同一であってもよく、また、互いに異なっていてもよい。また、Ｒ１の定義における「フェニル低級アルキルアミノ基」は、前記低級アルキルアミノ基の低級アルキル部分がフェニル基で置換された基であり、例えば、ベンジルアミノ、２−フェニルエチルアミノ、３−フェニル−ｎ−プロピルアミノ、４−フェニル−ｎ−ブチルアミノ、１−フェニルエチルアミノ、１−（フェニルメチル）エチルアミノ基等を挙げることができ、中でも、ベンジルアミノ及び２−フェニルエチルアミノ基が好ましい。
【００８４】
Ｒ１の定義における「アシルアミノ基」は、アシル化されたアミノ基を意味し、アシル基としては、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどの低級アルカノイル基や、ベンゾイルなどのアロイル基等を挙げることができ、中でも、アセチル及びベンゾイル基が好ましい。
【００８５】
Ｒ１の定義における「低級アルキルチオ基」及び「低級アルキルスルフィニル基」は、それぞれ、前記低級アルキル基が結合したチオ（Ｓ）基及びスルフィニル（ＳＯ）基を意味する。
【００８６】
Ｒ３の定義における「場合により低級アルキル基で置換されていてもよいヘテロアリール基」は、未置換であるか又は前記低級アルキル基で置換された単環式もしくは多環式のヘテロアリール基を意味し、ここで、該ヘテロアリール基としては、Ｎ、Ｏ及びＳより選ばれるヘテロ原子を環中に１〜３個含有する５〜１０員の芳香族基が包含され、具体的には、例えば、フリル、ピロリル、チエニル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、キノリル、イソキノリル、キナゾリル基等を挙げることができ、中でも、フリル、ピロリル、チエニル及びピリジル基が好ましい。
【００８７】
Ｒ３の定義における下記式
【化１３】
2019022152.tif 000035
の基において、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はベンゼン環のそれぞれ異なるどの位置に置換していてもよく、その結合部位は特に制限されない。
【００８８】
上記式（Ａ）のＸ１、Ｘ２及びＸ３の定義における「低級ハロアルキル基」は、１個もしくはそれ以上の同一もしくは異なるハロゲン原子によって置換された前記のような低級アルキル基を意味し、例えば、フルオロメチル、トリフルオロメチル、１，２−ジクロロエチル、１−クロロ−２−ブロモエチル、ペンタフルオロエチル、１−クロロ−ｎ−プロピル、２−ブロモ−２−メチルエチル、３−クロロ−ｎ−ペンチル、２−ブロモ−３−クロロ−ｎ−ヘキシル基等を挙げることができ、中でも、１〜５個の同一もしくは異なるハロゲン原子によって置換された炭素数が１又は２個の低級アルキル基が好ましい。
【００８９】
前記式（Ａ）のＸ１、Ｘ２及びＸ３の定義における「低級ハロアルコキシ基」は、前記低級ハロアルキル基が結合したオキシ（Ｏ）基であり、特に、１〜５個の同一もしくは異なるハロゲン原子によって置換された炭素数が１もしくは２個の低級ハロアルコキシ基が好ましい。
【００９０】
式（Ａ）のＸ１、Ｘ２及びＸ３の定義における「低級ハロアルカノイル基」は、１個もしくはそれ以上のハロゲン原子によって置換された前記低級アルカノイル基を意味し、例えば、フルオロアセチル、クロロアセチル、ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、３−フルオロプロピオニル、３−クロロプロピオニル、３−ブロモプロピオニル、４−クロロブチリル基等を挙げることができ、中でも、フルオロアセチル、トリフルオロアセチル、３−フルオロプロピオニル、３−クロロプロピオニル基が好ましい。
【００９１】
式（Ａ）のＸ１、Ｘ２及びＸ３の定義における「低級アルキレンジオキシ基」としては、例えば、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、トリメチレンジオキシ基等を挙げることができ、中でも、メチレンジオキシ及びエチレンジオキシ基が好ましい。
【００９２】
Ｒ５の定義における「低級ハロアルキル基」、「低級アルカノイル基」及び「低級ハロアルカノイル基」は、それぞれ、前記式（Ａ）のＸ１、Ｘ２及びＸ３の定義における「低級ハロアルキル基」、「低級アルカノイル基」及び「低級ハロアルカノイル基」におけると同様の基を挙げることができ、また、それぞれにおける好ましい基も同様のものを挙げることができる。
【００９３】
Ｒ５の定義における「低級アルキルチオカルボニル基」は、前記低級アルキル基が結合したチオカルボニル（Ｃ＝Ｓ）基を意味し、例えば、チオアセチル、チオプロピオニル、チオブチリル、チオペンタノイル、チオヘキサノイル基等を挙げることができ、中でも、チオアセチル及びチオプロピオニル基が好ましい。
【００９４】
Ｒ５の定義における「低級ハロアルキルチオカルボニル基」は、１個もしくはそれ以上のハロゲン原子によって置換された前記低級アルキルチオカルボニル基を意味し、例えば、フルオロチオアセチル、クロロチオアセチル、ブロモチオアセチル、トリフルオロチオアセチル、クロロチオプロピオニル、クロロチオブチリル、ブロモチオペンタノイル、フルオロチオヘキサノイル基等を挙げることができ、中でも、フルオロチオアセチル、クロロチオアセチル、ブロモチオアセチル及びトリフルオロチオアセチル基が好ましい。
【００９５】
前記式（２）において、Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子を表しそしてＲ３が式（Ａ）の基を表し且つＸ１、Ｘ２及びＸ３の２つが水素原子を表す場合、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の残りの１つが水素原子又はハロゲン原子を表す場合の化合物は、特開２０００−８６６５７号公報に開示されており、本発明の式（２）の化合物から除外される。
【００９６】
本発明において好ましい一群の化合物は、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に水素原子、アミノ基、低級アルキルアミノ基又はジ低級アルキルアミノ基を表す場合の式（２）の化合物であり、中でも、Ｒ１及びＲ２がともに水素原子を表す場合の式（２）の化合物がより好適である。また、Ｒ１又はＲ２のいずれか一方が水素原子を表し且つ他方が水素原子以外の基を表す場合の、該水素原子以外の基は、ピリミジン環の２位に置換していることが好ましい。
【００９７】
本発明において好ましい別の一群の化合物は、Ｒ３が下記式
【化１４】
2019022152.tif 000036
の基を表す場合の式（２）の化合物であり、中でも、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表す場合の式（２）の化合物がより好適である。
【００９８】
本発明において好ましい更に別の一群の化合物は、Ｒ４が水素原子を表す場合の式（２）の化合物である。
【００９９】
本発明において好ましい更に別の一群の化合物は、Ｒ５が場合によりハロゲン原子、低級アルキル基、低級ハロアルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシル基、低級アルカノイル基、低級ハロアルカノイル基、低級アルキルチオカルボニル基、低級ハロアルキルチオカルボニル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基及びニトロ基から選ばれる１〜３個の置換基によって置換されていてもよいフェニル基を表す場合の式（２）の化合物であり、中でも、Ｒ５が場合によりハロゲン原子及び低級アルキル基から選ばれる１もしくは２個の置換基によって置換されていてもよいフェニル基を表す場合の式（２）の化合物がより好ましく、特に、Ｒ５がフェニル基、２−ハロフェニル基、２，６−ジハロフェニル基、２−低級アルキルフェニル基、３−低級アルキルフェニル基又は２，５−ジ低級アルキルフェニル基である場合の式（２）の化合物がより好適である。
【０１００】
本発明において好ましい更に別の一群の化合物は、Ｙが−ＣＨ２−又は−（ＣＨ２）２−を表す場合の式（２）の化合物である。
【０１０１】
本発明において特に好ましい化合物は以下のとおりである。
【０１０２】
３−（３−メチルフェニル）−５−（３−フェニルプロピオニルアミノ）−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、
３−（３−メチルフェニル）−５−［（２−メチルフェニル）プロピオニルアミノ］−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、
５−［（３−クロロフェニル）プロピオニルアミノ］−３−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、
３−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−５−（フェニルアセチルアミノ）−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、
５−［（２−クロロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、及び
３−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−５−（３−フェニルプロピオニルアミノ）−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル。
【０１０３】
また、本発明により提供される前記式（Ｉ）の化合物の代表例として、例えば次のものを挙げることができる。
【０１０４】
３−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（２−メチルアミノピリジル）］−５−フェニルアセチルアミノイソオキサゾ−ル、
３−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（２−メチルアミノピリジル）］−５−（３−フェニルプロピオニルアミノ）イソオキサゾ−ル、
４−［４−（２−ベンジルアミノピリジル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−フェニルアセチルアミノイソオキサゾ−ル、
４−［４−（２−ベンジルアミノピリジル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−フェニルプロピオニルアミノ）イソオキサゾ−ル、
４−［４−（２−アセチルアミノピリジル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−フェニルアセチルアミノイソオキサゾ−ル、
４−［４−（２−アセチルアミノピリジル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−フェニルプロピオニルアミノ）イソオキサゾ−ル、
４−［４−（２−ベンゾイルアミノピリジル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−フェニルアセチルアミノイソオキサゾ−ル、
４−［４−（２−ベンゾイルアミノピリジル）］−３−（４−フルオロフェニル）−５−（３−フェニルプロピオニルアミノ）イソオキサゾ−ル、
３−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−５−（Ｎ−メチル−フェニルアセチルアミノ）−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、
３−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−５−［Ｎ−メチル−（３−フェニルプロピオニル）アミノ］−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、
５−［（２−アミノフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、
３−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−５−［（２−ヒドロキシフェニル）アセチルアミノ］−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、
３，４−ジ（４−ピリジル）−５−フェニルアセチルアミノイソオキサゾ−ル、
３，４−ジ（４−ピリジル）−５−（３−フェニルプロピオニルアミノ）イソオキサゾ−ル、
３−［４−（２−メチルピリジル）］−５−フェニルアセチルアミノ−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル、
３−［４−（２−メチルピリジル）］−５−（３−フェニルプロピオニルアミノ）−４−（４−ピリジル）イソオキサゾ−ル等。
【０１０５】
本発明の式（２）の化合物は、また、場合により塩の形態で存在することができ、その塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩；酢酸、蓚酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩等が挙げられ、中でも、製薬学的に許容されうる塩が好ましい。
【０１０６】
上記式（２）の化合物は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／００１９３０号を参照のこと。
【０１０７】
本発明の医薬において、上記ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビターは、単独で使用されてもよく、組み合わせて使用されてもよい。本発明で使用されるｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターの濃度は、通常約０．００１〜１００μＭ（μｍｏｌ／ｌ）、好ましくは約０．０１〜３０μＭ、より好ましくは約０．０３〜１０μＭであり、２種以上のｐ３８  ＭＡＰＫインヒビターを組み合わせて使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、０．０１ｎＭ〜１００μＭ、約０．１ｎＭ〜１００μＭ、約０．００１〜１００μＭ、約０．０１〜７５μＭ、約０．０５〜５０μＭ、約１〜１０μＭ、約０．０１〜１０μＭ、約０．０５〜１０μＭ、約０．０７５〜１０μＭ、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜１０μＭ、約０．７５〜１０μＭ、約１．０〜１０μＭ、約１．２５〜１０μＭ、約１．５〜１０μＭ、約１．７５〜１０μＭ、約２．０〜１０μＭ、約２．５〜１０μＭ、約３．０〜１０μＭ、約４．０〜１０μＭ、約５．０〜１０μＭ、約６．０〜１０μＭ、約７．０〜１０μＭ、約８．０〜１０μＭ、約９．０〜１０μＭ、約０．０１〜５０μＭ、約０．０５〜５．０μＭ、約０．０７５〜５．０μＭ、約０．１〜５．０μＭ、約０．５〜５．０μＭ、約０．７５〜５．０μＭ、約１．０〜５．０μＭ、約１．２５〜５．０μＭ、約１．５〜５．０μＭ、約１．７５〜５．０μＭ、約２．０〜５．０μＭ、約２．５〜５．０μＭ、約３．０〜５．０μＭ、約４．０〜５．０μＭ、約０．０１〜３．０μＭ、約０．０５〜３．０μＭ、約０．０７５〜３．０μＭ、約０．１〜３．０μＭ、約０．５〜３．０μＭ、約０．７５〜３．０μＭ、約１．０〜３．０μＭ、約１．２５〜３．０μＭ、約１．５〜３．０μＭ、約１．７５〜３．０μＭ、約２．０〜３．０μＭ、約０．０１〜１．０μＭ、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭ、約０．０９〜３５μＭ、または約０．０９〜３．２μＭであり、より好ましくは、約０．０１〜１０μＭ、約０．１〜３μＭ、または約０．１〜１．０μＭを挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１０８】
点眼剤として用いられる場合は、涙液などでの希釈も考慮し、毒性にも気を付けながら、上記有効濃度の約１〜１００００倍、好ましくは約１００〜１００００倍、例えば、約１０００倍を基準として製剤濃度を決定することができ、これらを上回る濃度を設定することも可能である。例えば、約０．０１μＭ（μｍｏｌ／ｌ）〜１０００ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）、約０．１μＭ〜１００ｍＭ、約１μＭ〜１００ｍＭ、約１０μＭ〜１００ｍＭ、あるいは約０．１μＭ〜３０ｍＭ、約１μＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは約１μＭ〜１０ｍＭ、約１０μＭ〜１０ｍＭ、約１００μＭ〜１０ｍＭ、約１０μＭ〜１００ｍＭ、約１００μＭ〜１００ｍＭであり、約１ｍＭ〜１０ｍＭ、約１ｍＭ〜１００ｍＭであり得、これらの上限下限は適宜組み合わせて設定されることができ、２種以上の化合物を組み合わせて使用する場合は適宜変更することができる。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、以下：
【化１５】
2019022152.tif 000037
（式中、
Ａ１は、ＮまたはＣＨであり；
Ａ２は、ＮＨ、Ｎ−ＣＨ３またはＯであり；
Ｒ１は、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、
Ｒ２は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、または
【化１６】
2019022152.tif 000038
であり；
Ｒ３は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＣｌまたはＣＨ３であって、ｏ−、ｍ−、またはｐ−の位置のいずれかにあり、ｎ＝１または２である）
の構造を有する化合物、またはその薬学的に許容され得る塩、またはそれらの溶媒和物である。この実施形態において、当業者は、Hasumi  et  al.,  Bioorg  Med  Chem.  2014  Aug  1;22(15):4162-76に記載される、種々の化合物についてのｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害活性等を参酌して、本発明に使用される化合物を適切に設計することができる。
【０１１０】
別の実施形態では、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、５−［（２−クロロ−６−フルオロフェニル）アセチルアミノ］−３−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリミジニル）イソオキサゾール（ＡＫＰ−００１）である。使用されるＳＢ２０３５８０の濃度としては、通常約０．０１μＭ〜約１０μＭであり、好ましくは、約０．０３μＭ〜約３μＭである。
【０１１１】
ＡＫＰ−００１は、炎症性大腸疾患の治療のために、特異的に腸に標的化するように開発されたｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターであり、ＡＫＰ−００１は、望ましくない全身暴露を回避するために初回通過代謝を介して不活性形態に代謝されるようにデザインされている（Shirota  et  al.,  Drug  Metab  Dispos  43:217-226,  February  2015）。また、この文献（Shirota  et  al.,  2015）では、経口投与、静脈内投与等の投与経路による影響について試験されているが、眼に対する影響については試験されていない。そのため、本願明細書において実証されるように、非常に高い有効性で眼疾患を治療することができ、かつ毒性がほとんど観察されなかったことは非常に驚くべきことであった。
【０１１２】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は点眼剤として提供され、ＡＫＰ−００１が、約０．０１ｍＭ〜約１０ｍＭで存在し、好ましくは、約０．０３ｍＭ〜約３ｍＭで存在する。
【０１１３】
上記ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（例えば、ＡＫＰ−００１）は、極めて低い濃度（例えば、サブμＭ）でも、角膜内皮細胞の細胞障害抑制効果を発揮することが明らかになった。ＳＢ２０３５８０、ＶＸ−７０２およびＰＨ−７９７８０４などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターでは、サブμＭで角膜内皮障害の抑制効果が観察されないため、ＡＫＰ−００１において、サブμＭで角膜内皮障害の抑制効果が発揮されたのは予想外であった。
【０１１４】
１つの実施形態では、本発明の治療または予防するための医薬は、角膜内皮を有する任意の動物、例えば哺乳動物を対象とすることができ、好ましくは霊長類の角膜内皮の治療または予防を目的とする。好ましくは、この治療または予防の対象は、ヒトの角膜内皮である。
【０１１５】
別の局面では、本発明は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターの有効量をそれを必要な被験体に投与する工程を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための方法を提供する。
【０１１６】
本明細書において「被験体」とは、本発明の治療および予防するための医薬または方法の投与(移植)対象を指し、被験体としては、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。
【０１１７】
特定の疾患、障害または状態の治療に有効な本発明の医薬の有効量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、必要に応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり０．００１、１、５、１０、１５、１００、または１０００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与回数、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、投与形態、対象臓器等により、適宜選択してもよい。例えば、本発明は点眼剤として使用され得る。また、本発明の医薬を前房内に注入することもできる。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。治療マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【０１１８】
＜保存用組成物および保存方法＞
別の局面において、本発明は、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（特にＡＫＰ−００１）を含む、角膜内皮細胞の保存のための組成物を提供する。さらに別の局面において、本発明は、ピリミジニルイソオキサゾール誘導体およびピリジルイソオキサゾール誘導体などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビター（特にＡＫＰ−００１）の有効量を角膜内皮細胞に接触させる工程を含む、角膜内皮細胞を保存するための方法を提供する。好ましい実施形態では、保存は凍結保存である。本発明において用いられるｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターは、本明細書において説明される任意の形態、例えば、医薬として説明されている実施形態のうち、保存用組成物として適切なものを用いることができると理解される。本明細書において「保存用組成物」とは、ドナーから摘出した角膜片を、レシピエントに移植するまでの期間において保存するため、あるいは増殖前または増殖した角膜内皮細胞を保存するための組成物である。
【０１１９】
１つの実施形態では、本発明の保存用組成物は、従来使用される保存剤または保存液に本発明のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを添加して調製され得る。そのような角膜保存液としては、角膜移植時に通常用いられる保存液（強角膜片保存液（Ｏｐｔｉｓｏｌ  ＧＳ：登録商標）、角膜移植用眼球保存液（ＥＰＩＩ：登録商標））、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。
【０１２０】
本発明の保存用組成物は、臓器移植などに用いられる角膜の保存用に用いられる。また、本発明の保存用組成物は、角膜内皮細胞を凍結保存するための保存液またはその成分としても用いられる。
【０１２１】
凍結保存のために使用される本発明の保存用組成物の別の実施形態では、既存の凍結保存液に本発明のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む保存用組成物を添加して使用することもできる。凍結保存液としては、例えば、タカラバイオにより提供されるＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）シリーズ（ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫＥＲ  ＰＬＵＳ（カタログ番号：ＣＢ０２１）、ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫＥＲ  ２（カタログ番号：ＣＢ０３１）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（カタログ番号：ＣＢ０４３）など）、ＫＭ  ＢＡＮＫＥＲ（コージンバイオ  カタログ番号：ＫＯＪ−１６０９２００５）、およびＦｒｅｅｚｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｆｒｅｅ，  ＣＲＹＯ  Ｄｅｆｉｎｅｄ（Ｃｎｔ−ＣＲＹＯとも記載される）（ＣＥＬＬＮＴＥＣ  カタログ番号：ＣｎＴ−ＣＲＹＯ−５０）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、使用される凍結保存液はＫＭ  ＢＡＮＫＥＲであってもよい。また、当業者であれば、上記凍結保存液の構成成分を適宜変更またはさらなる構成成分を添加し、改変された適切な凍結保存液を使用することができることが理解される。凍結保存のためには、本発明の保存液にグリセロール、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、アセトアミド等をさらに添加してもよい。
【０１２２】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１２３】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１２４】
以下に、本発明の例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、エルランゲン大学（ドイツ）、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの倫理委員会またはそれに準ずるものの承認を受けた。【０１２５】
（調製例：フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）および正常角膜内皮細胞の不死化細胞（ｉＨＣＥＣ）の作製）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来および健常者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤおよびｉＨＣＥＣ）を作製した。【０１２６】
（培養方法）
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ，    Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：３１９８５−０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、２００ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）、０．０８％  コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：１５７１０−０６４）および５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニルフェニル）−５（４−ピリジル）イミダゾール＜４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」という）で培養した。【０１２７】
（取得方法）
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（デスメ膜内皮角膜移植＝ＤＭＥＫ）を実施されたヒト患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３順か培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ；  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて２９３Ｔ  細胞  （ＲＣＢ２２０２；  Ｒｉｋｅｎ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｂａｒａｋｉ，  Ｊａｐａｎ）  に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５  μｇ／ｍｌ  のポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像を確認した。シアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）および不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をみると、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）により維持培養を行った。【０１２８】
（実施例１：ＡＫＰ−００１のｉＦＥＣＤにおける細胞障害抑制効果）
本実施例では、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターであるＡＫＰ−００１のｉＦＥＣＤにおける細胞障害抑制効果を確認し、他のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターであるＳＢ２０３５８０、ＶＸ−７０２およびＰＨ−７９７８０４による細胞障害抑制効果と比較した。【０１２９】
（材料および方法）
培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞（以下、疾患モデル細胞）を培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地はＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を用いた。６ウェルプレートに疾患モデル細胞を１ウェル当たり１．５×１０５個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で４８時間培養した。培地はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを用いた。【０１３０】
４８時間後、培地を除去し、ＡＫＰ−００１、ＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、１３０６７）、ＰＨ−７９７８０４（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ２７２６）、ＶＸ−７０２（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ６００５）を終濃度０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０μＭとなるようにＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓに添加し、２４時間プレトリートメントとして培養した。２４時間後、培地を除去し、１００ｎｇ／ｍｌのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＮＤ３０２−Ｂ２−００２）とともに、ＡＫＰ−００１、ＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、１３０６７）、ＰＨ−７９７８０４（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ２７２６）、またはＶＸ−７０２（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ６００５）を終濃度０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭとなるようにＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓに添加し、２４時間培養を行った。２４時間後、位相差顕微鏡により観察して細胞障害を評価した。コントロールはとしてＴＧＦ−βで刺激していない不死化角膜内皮細胞を用いた。【０１３１】
ＡＫＰ−００１は、Hasumi  et  al.,  Bioorg  Med  Chem.  2014  Aug  1;22(15):4162-76に基づいて合成した。【０１３２】
（結果）
結果を図１〜４に示す。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞をＴＧＦ―βにより刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められる。ＡＫＰ−００１によりプレトリートメントした場合は、０．０１μＭ〜１０μＭと非常に広い濃度域で角膜内皮細胞の障害抑制効果が観察された。特に０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、および３μＭの濃度において効果的に角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。【０１３３】
他方、ＳＢ２０３５８０によりプレトリートメントした場合は、１０μＭおよび３０μＭにおいて角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。また、１μＭおよび３μＭにおいても若干の角膜内皮細胞障害抑制効果が確認された。ＰＨ−７９７８０４によりプレトリートメントした場合は、１μＭおよび３μＭにおいて効果的に角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。さらに、ＶＸ−７０２によりプレトリートメントした場合は特に１μＭおよび３μＭにおいて効果的に角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。【０１３４】
このように、ＡＫＰ−００１以外のｐ３８  ＭＡＰＫインヒビター（ＳＢ２０３５８０、ＶＸ−７０２およびＰＨ−７９７８０４）では、１μＭ以上の濃度で細胞障害抑制効果が確認されるのに対し、ＡＫＰ−００１は、サブμＭという低濃度でも細胞障害を抑制することができることが示された。【０１３５】
（実施例２：ＡＫＰ−００１のｉＦＥＣＤにおけるカスパーゼ活性抑制効果）
本実施例では、ＡＫＰ−００１のｉＦＥＣＤにおけるカスパーゼ活性抑制効果を確認し、他のｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターであるＳＢ２０３５８０、ＶＸ−７０２およびＰＨ−７９７８０４によるカスパーゼ活性抑制効果と比較した。【０１３６】
（材料および方法）
培養した疾患モデル細胞の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地：ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）
６ウェルプレートにフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞を１ウェル当たり１．５×１０５個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で４８時間培養した。培地はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを用いた。４８時間後、培地を除去し、ＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、１３０６７）、ＰＨ−７９７８０４（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ２７２６）、ＶＸ−７０２（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ６００５）、ＡＫＰ−００１をすべて終濃度が０．１μＭとなるようにＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓに添加し、２４時間プレトリートメントとして培養した。【０１３７】
２４時間後、培地を除去し、１００ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＮＤ３０２−Ｂ２−００２）とともに、ＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、１３０６７）、ＰＨ−７９７８０４（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ２７２６）、ＶＸ−７０２（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓ６００５）、ＡＫＰ−００１をすべて終濃度が０．１μＭとなるようにＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓに添加し、２４時間培養を行った。２４時間後に以下の手順でタンパク質のウェスタンブロットを行い、アポトーシスに対する影響を評価した。【０１３８】
１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。【０１３９】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質８μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ，ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体はラビット抗ＰＡＲＰ抗体：１０００倍希釈、ラビット抗Ｃａｓｐａｓｅ３抗体：１０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：３０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。【０１４０】
（結果）
結果を図５に示す。疾患モデル細胞をＴＧＦ−βにより刺激した場合、活性型である約１７ｋＤａの切断されたカスパーゼ３（約１７ｋＤａ）が認められた。また、活性型である約８９ｋＤａの切断されたＰＡＲＰも認められた。また、０．１μＭのＳＢ２０３５８０、ＰＨ−７９７８０４、ＶＸ−７０２を添加した群においても同様に、切断カスパーゼ３およびＰＡＲＰの発現を確認した。一方で、０．１μＭのＡＫＰ−００１を添加した群においては、活性型の切断カスパーゼ３およびＰＡＲＰの活性はほとんど確認されなかった。このように、０．１μＭというサブμＭでは、ＳＢ２０３５８０、ＰＨ−７９７８０４、ＶＸ−７０２においてカスパーゼ活性を抑制することができなかったのに対し、ＡＫＰ−００１においては、０．１μＭの濃度でもカスパーゼ活性を抑制することができたことが明らかになった。【０１４１】
（実施例３：ＡＫＰ−００１存在下でのヒト角膜内皮細胞の細胞生存率の確認）
本実施例では、ヒト角膜内皮細胞を用いて、ＡＫＰ−００１存在下での細胞生存率を確認した。【０１４２】
（材料および方法）
研究用ドナー角膜からヒト角膜内皮細胞をデスメ膜とともに剥離して培養した。培地は、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）＋８％  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＳＨ３００８４．０３）＋５  ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＨＧ０３１１）＋２０μｇ／ｍＬ  Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸セスキマグネシウム水和物（ＳＩＧＭＡ、Ａ８９６０）＋２００ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム二水和物（ＳＩＧＭＡ、Ｃ７９０２）＋０．０８％  コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、０３２−１４６１３）＋５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０−０６４）＋１  μＭ  ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２−１６５４１）＋１０  μＭ  ＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、１３０６７）を用いた。事前に培養皿はラミニン−５１１Ｅ８（Ｎｉｐｐｉ、３８１−０７３６３）によりコーティングしたものを用いた。【０１４３】
培養したヒト角膜内皮細胞をラミニン−５１１Ｅ８コーティングを施した９６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）でコンフルエントになるまで培養した。培地は、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）＋８％  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＳＨ３００８４．０３）＋５  ｎｇ／ｍＬ  上皮増殖因子（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＨＧ０３１１）＋２０μｇ／ｍＬ  Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸セスキマグネシウム水和物（ＳＩＧＭＡ、Ａ８９６０）＋２００  ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム二水和物（ＳＩＧＭＡ、Ｃ７９０２）＋０．０８％  コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、０３２−１４６１３）＋５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０−０６４）＋１μＭ  ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２−１６５４１）＋１０μＭ  ＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、１３０６７）を用いた。【０１４４】
コンフルエントに達したら、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）＋８％  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＳＨ３００８４．０３）＋２０μｇ／ｍＬ＋２００ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム二水和物（ＳＩＧＭＡ、Ｃ７９０２）＋０．０８％  コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、０３２−１４６１３）＋５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０−０６４）によりさらに１週間培養した。【０１４５】
１週間後、培地を除去し、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭとなるようにＡＫＰ−００１を培地に添加し、２４時間培養を行った。培地はＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）＋８％  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＳＨ３００８４．０３）＋２０μｇ／ｍＬ＋２００ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム二水和物（ＳＩＧＭＡ、Ｃ７９０２）＋０．０８％  コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、０３２−１４６１３）＋５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０−０６４）を用いた。【０１４６】
２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態を観察した後に、以下の手順で、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙによる生存細胞率の解析を行った。１ウェル当り５０μｌになるように培地を捨て、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７２）を培地と１：１になるように５０μｌ／ウェル加えた。ここからの作業は遮光で行った。シェイカーを１２０分−１程度で２分間よく混ぜ、１０分間静置した。静置後、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９１２、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ  ９６ｗｅｌｌ、ｗｈｉｔｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に５０μｌを移し、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ７０５１）を用いて吸光度を測定した。【０１４７】
（結果）
結果を図６に示す。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙにより、生存細胞率を測定した結果、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのＡＫＰ−００１を添加によっても細胞障害を認めなかった。一方、３０μＭおよび１００μＭのＡＫＰ−００１の添加により有意に細胞数が低下した。このことは、ＡＫＰ−００１は３０μＭ未満の濃度で細胞に対する毒性が低い可能性が示唆された。【０１４８】
（実施例４：ＡＫＰ−００１存在下でのヒト角膜内皮細胞の細胞生存率の確認）
本実施例では、ヒト角膜内皮細胞を用いて、ＡＫＰ−００１存在下でのカスパーゼ活性を確認した。【０１４９】
（材料および方法）
培養したヒト角膜内皮細胞をラミニン−５１１Ｅ８コーティングを施した９６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）でコンフルエントになるまで培養した。培地は、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）＋８％  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＳＨ３００８４．０３）＋５ｎｇ／ｍＬ  上皮増殖因子（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＨＧ０３１１）＋２０μｇ／ｍＬ  Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸セスキマグネシウム水和物（ＳＩＧＭＡ、Ａ８９６０）＋２００ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム二水和物（ＳＩＧＭＡ、Ｃ７９０２）＋０．０８％  コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、０３２−１４６１３）＋５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０−０６４）＋１  μＭ  ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２−１６５４１）＋１０  μＭ  ＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、１３０６７）を用いた。【０１５０】
コンフルエントに達したら、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）＋８％  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＳＨ３００８４．０３）＋２０μｇ／ｍＬ＋２００ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム二水和物（ＳＩＧＭＡ、Ｃ７９０２）＋０．０８％  コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、０３２−１４６１３）＋５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０−０６４）によりさらに１週間培養した。【０１５１】
１週間後、培地を除去し、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＡＫＰ−００１入りの培地を添加し、２４時間培養を行った。培地：ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）＋８％  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＳＨ３００８４．０３）＋２０μｇ／ｍＬ＋２００ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム二水和物（ＳＩＧＭＡ、Ｃ７９０２）＋０．０８％  コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、０３２−１４６１３）＋５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０−０６４）
２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態を観察した。観察後、以下の手順で、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３/７  Ａｓｓａｙによりカスパーゼ３／７活性の測定を行った。１ウェル当り５０μｌになるように培地を捨て、Ｃａｓｐａｓｅ  Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ  ＢｕｆｆｅｒとＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの混合液）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ８０９１）溶液を培地と１：１になるように５０μｌ／ウェル加えた。ここからの作業は遮光で行った。シェイカーを１２０ｍｉｎ−１程度で２分間よく混ぜ、室温で４０分間静置した。静置後、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９１２、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ  ９６ｗｅｌｌ、ｗｈｉｔｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に８０μｌを移し、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ７０５１）を用いて吸光度を測定した。【０１５２】
（結果）
結果を図７に示す。Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙは、アポトーシス誘導に伴うカスパーゼ３／７の活性を測定することができる。すなわち、カスパーゼ３／７の活性が高いほど、細胞障害が誘導されていることを表す。０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭのＡＫＰ−００１を添加した場合は、コントロール群と比較してＣａｓｐａｓｅ  ３／７の活性に有意な差は認められなかった。一方で１０μ、３０μ、１００μＭのＡＫＰ−００１を添加すると、コントロール群と比較して有意にカスパーゼ３／７が活性化したこと認めた。このことは、ＡＫＰ−００１は１０μＭ以下の濃度で細胞に障害を生じないことが示唆された。【０１５３】
（実施例５：タプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）により誘導されるＥＲストレスによる細胞障害に対するｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤の抑制効果）
タプシガルギンは、折り畳まれなかったタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）がもたらし、これにより小胞体（ＥＲ）ストレスが生じる。本実施例では、ＡＫＰ−００１添加群におけるタプシガルギンにより誘導される細胞障害の抑制効果を確認した。【０１５４】
（材料および方法）
不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。１２ウェルプレートに不死化ヒト角膜内皮細胞（ロット：ｉＨＣＥＣ１−１）を１ウェル当たり８×１０４個の割合で播種し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓの培地を使用して３７℃（５％ＣＯ２）で４８時間培養した。その後、培地を除去し、各阻害剤を添加し、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓの培地を使用して２４時間培養した。その後、培地を除去し、２０μＭのタプシガルギン（和光、２０９−１７２８１）およびＡＫＰ−００１を含む培地（ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）を添加し、３時間培養を行った。その後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。【０１５５】
（結果）
図８に結果を示す。不死化ヒト角膜内皮細胞にＡＫＰ−００１非存在下で、タプシガルギンにより刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められる。他方で、ＡＫＰ−００１でプレトリートメントした場合、角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。このように、ＡＫＰ−００１は、折り畳まれなかったタンパク質によりもたらされる小胞体（ＥＲ）関連ストレスを抑制することもできることが明らかになった。【０１５６】
（実施例６：眼刺激試験）
本実施例では、ＡＫＰ−００１のｉｎ  ｖｉｖｏにおける毒性を確認するために、眼刺激試験を行った。【０１５７】
（材料および方法）
試験開始前に、ウサギの前眼部を観察し、結膜充血、角膜混濁等の異常がないことを確認した。以上の基準を満たしたウサギを試験に使用した。計４匹のウサギを用いて試験を実施した。ウサギの右眼に０．１ｍＭのＡＫＰ−００１を５０μｌ点眼し、３０秒間閉瞼状態で維持した。左眼には、ビヒクルを同様の方法で点眼した。これを３０分ごとに計１０回行った。【０１５８】
点眼前後に細隙灯顕微鏡（ＳＬ−Ｄ７、トプコン）を用いて前眼部の観察を行った。角膜上皮障害の有無につき、フルオレセインナトリウム試験紙（昭和薬品化工）を用いて染色した後に、細隙灯顕微鏡により観察した。また、Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）ＨＲ（ＯＣＵＬＵＳ）を用いて角膜厚、角膜形状、角膜体積を解析した。スキャニングスリット型接触式角膜内皮スペキュラーマイクロスコープ（コーナンメディカル）を用いて角膜内皮の観察を行った。さらに、超音波パキメーター（ＳＰ−１００、トーメーコーポレーション）により中心角膜厚を測定、トノベット（登録商標）（エムイーテクニカ）により眼圧を測定した。【０１５９】
角膜透明性について以下のＧｒａｄｉｎｇにより評価した。【０１６０】
不透明度：混濁の程度（もっとも混濁した領域を読み取る。）
不透明度なし                                                      ０
虹彩を明視できる程度の散在からび慢性の不透明化                    １
虹彩の細部がわずかにぼやけて見える                                ２
虹彩の細部が観察できないが、瞳孔の大きさはかろうじて識別できる    ３
虹彩が透視できない                                                ４
（結果）
ＡＫＰ−００１点眼を１０回行った後に、細隙灯顕微鏡（ＳＬ−Ｄ７、トプコン）により観察したところ角膜は透明であり、充血も認めず、前眼部の炎症などを認めなかった（図９、左側写真）。フルオレセインナトリウム試験紙（昭和薬品化工）にて染色して観察したところ、染色される角結膜の上皮障害を認めなかった（図９、右側写真）。角膜透明性について評価したところ、ＡＫＰ−００１点眼を１０回行った前後ともにスコアは全ての角膜で０であり、ＡＫＰ−００１点眼が透明性に影響しないことを示した（図１０）。【０１６１】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、それぞれＡＫＰ−００１点眼マウスおよびビヒクル点眼マウスにおいて、Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）ＨＲ（ＯＣＵＬＵＳ）により角膜厚を計測した代表例を示す。ＡＫＰ−００１点眼により角膜の厚みの明らかな変化を認めなかった。図１２は、Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）ＨＲ（ＯＣＵＬＵＳ）により得たシャインプルーフ像の代表例を示す。ＡＫＰ−００１点眼により角膜の形状に明らかな変化を認めなかった。【０１６２】
図１３にトノベット（登録商標）（エムイーテクニカ）により測定した眼圧、超音波パキメーター（ＳＰ−１００、トーメーコーポレーション）により測定した中心角膜厚、Ｐｅｎｔａｃａｍ（登録商標）ＨＲ（ＯＣＵＬＵＳ）により測定した角膜体積（１０ｍｍ径）の点眼前後の値をグラフとして示す。眼圧、中心角膜厚、角膜体積全て、ＡＫＰ−００１の１０回の点眼により有意な変化を認めなかった。【０１６３】
図１４にスキャニングスリット型接触式角膜内皮スペキュラーマイクロスコープ（コーナンメディカル）を用いて撮影した角膜内皮の観察像の代表例を示す。ＡＫＰ−００１の１０回の点眼により明らかな変化を認めなかった。【０１６４】
このように、いずれの試験においても、ＡＫＰ−００１を点眼した角膜に以上は認められず、これらの結果は、ＡＫＰ−００１はｉｎ  ｖｉｖｏにおいても安全性が高いことを示している。【０１６５】
（実施例７：組織学的解析）
本実施例では、ＡＫＰ−００１のｉｎ  ｖｉｖｏにおける安全性を確認するために、組織学的解析を行った。【０１６６】
（材料および方法）
ウサギを安楽死させた後に眼球を摘出し組織学的解析を行った。免疫染色法により角膜内皮機能関連マーカーの発現を確認した。強角膜片を０．５％パラホルムアルデヒドにて固定した後に、１％牛血清アルブミンにてブロッキングした。一次抗体として、角膜内皮細胞のバリア機能の指標であるＺＯ−１抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｎ−カドヘリン抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、ポンプ機能の指標であるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ抗体（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を加え、一晩４℃で静置した。その後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−コンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を二次抗体として加えた。また、ＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて核染色を行った。細胞形態を見るためにＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてアクチンの染色を行った。染色した強角膜片をスライドガラスに封入し、共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰＥ、Ｌｅｉｃａ）にて観察した。【０１６７】
また、ウサギを安楽死させた後に眼球を摘出し、細胞死を評価するために、強角膜片をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＰＩ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により染色し、を０．５％パラホルムアルデヒドにて固定し、ＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて核染色を行った。染色した強角膜片をスライドガラスに封入し、共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰＥ、Ｌｅｉｃａ）にて観察した。ポジティブコントロールとしてスタウロスポリン（１０μＭ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をウサギ眼球の前房内に投与して２４時間経過したものを用いた。【０１６８】
（結果）
図１５においてＡＫＰ−００１を１０回点眼した眼球の角膜内皮の染色像を示す（上段）。ＺＯ−１、Ｎ−カドヘリン、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの細胞膜に沿った発現を認める。アクチン染色により角膜内皮は多角形の敷石上の形態であることが示された。ビヒクルを点眼した眼球の染色パターンと同様であり、この結果はＡＫＰ−００１点眼の角膜内皮に対する安全性を示している。【０１６９】
ＡＫＰ−００１を１０回点眼した眼球、Ｖｅｈｉｃｌｅを点眼した眼球ともにＡｎｎｅｘｉｎ  ＶまたはＰＩによる染色を認めなかった（図１６）。ポジティブコントロールとしてスタウロスポリンを前房内投与したものではＡｎｎｅｘｉｎ  ＶまたはＰＩによる染色を認めた。この結果はＡＫＰ−００１点眼の角膜内皮に対して細胞死を誘導せず、この結果はＡＫＰ−００１の安全性が高いことを示している。【０１７０】
（実施例８：製剤例：ＡＫＰ−００１を含有する角膜保存液）
本実施例では、製剤例として、ＡＫＰ−００１を含有する角膜保存液を以下のように製造する。【０１７１】
常法により下に示す保存液を調製する。【０１７２】
ＡＫＰ−００１  有効量（例えば、０．１μＭ）
Ｏｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（Ｂａｕｓｃｈ−Ｌｏｍｂ）適量
全量１００ｍＬ
（実施例９：点眼剤の調製例）
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。【０１７３】
ＡＫＰ−００１                    ０．１ｍＭ
塩化ナトリウム                    ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物    ０．１ｇ
（任意に）ベンザルコニウム塩化物            ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
精製水                            適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）
濃度は、以下からなる基剤を用いて希釈してもよい。【０１７４】
塩化ナトリウム                    ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物    ０．１ｇ
（任意に）ベンザルコニウム塩化物            ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
精製水                            適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）
有効成分以外の各成分としては、例えば、日本薬局方またはその等価物に適合した、市販のものを利用することができる。【０１７５】
（実施例１０：マウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ評価）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ（ＦＥＣＤ）モデルマウスとして８型コラーゲンの変異を有するマウス（Ｃｏｌ８ａ２Ｑ４５５Ｋ／Ｑ４５５Ｋ）を用いる。【０１７６】
（材料および方法）
点眼試験前の角膜内皮像から、ＦＥＣＤの重症度のグレーディングを行い、同程度の症状を持つ生後２０〜２４週齢のＦＥＣＤモデルマウスを用いた。調製したＡＫＰ−００１点眼液（０．１ｍＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭ）を、マウス４５匹に対し毎日朝夕の２回、左右の眼に２μｌずつ点眼する。コントロールには大塚生食注（大塚製薬株式会社）（生理食塩液）を用いる。点眼期間は３ヶ月としその間、実験担当者はＡＫＰ−００１点眼液およびコントロール点眼液についてブラインドの状態で実験を行う。【０１７７】
（点眼液の有用性の評価）
点眼試験開始前に、接触式角膜内皮スペキュラー（ＫＳＳＰ  ｓｌｉｔ−ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｐｅｃｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｋｏｎａｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，  Ｈｙｏｇｏ，  Ｊａｐａｎ））で角膜内皮像を観察し、グレーディングを行う。点眼試験開始後４週間おきに、接触式角膜内皮スペキュラーを用いてマウスの角膜内皮像を観察し、ＡＫＰ−００１点眼液の有用性を評価する。【０１７８】
（期待される結果）
ＦＥＣＤモデルマウスにおける接触式角膜内皮スペキュラーにより観察される角膜内皮細胞密度の減少が、コントロールと比べてＡＫＰ−００１点眼液を投与した個体では抑制されることが期待される。また、コントロールと比べてＡＫＰ−００１点眼液を投与した個体では、ｇｕｔｔａｅの面積の割合が減少することが期待される。【０１７９】
（実施例１１：診断および治療例）
フックス角膜内皮ジストロフィおよび類縁の角膜内皮疾患と診断された際に（具体例としては、1）細隙灯顕微鏡検査によるグッテー形成、デスメ膜肥厚、角膜上皮浮腫、角膜実質浮腫の観察、2）スペキュラマイクロスコープによるグッテー像、角膜内皮障害像の観察、3)ペンタカム、OCT、超音波角膜厚測定装置などによる角膜浮腫の観察、4）遺伝子診断により高リスクと判断された場合）使用する。本発明の組成物を、点眼薬、前房内注射、徐放剤を用いた投与、硝子体内注射、結膜下注射として用いて治療することができる。【０１８０】
有効成分以外の各成分としては、例えば、日本薬局方またはその等価物に適合した、市販のものを利用することができる。【０１８１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は日本国特許出願特願２０１７−１４４５００（２０１７年７月２６日出願）に対して優先権主張を行うものであり、それらの内容全体が本明細書において参照として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１８２】
ｐ３８  ＭＡＰキナーゼインヒビターを含む、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮障害の治療または予防のための医薬が提供され、特に、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害を治療または予防するための医薬が提供された。このような技術に基づく製剤等に関連する技術に関与する産業（製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
2019022152.tif 000059
【図１４】
2019022152.tif 000060
【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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2019022152.tif 000064
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