【事件の表示】
　特許第６１２８１５３号発明「組織染色方法および生体物質検出方法」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。
【結　論】
　特許第６１２８１５３号の明細書及び特許請求の範囲を、平成３０年５月２４日付けの手続補正書により補正された訂正請求書に添付された訂正明細書及び特許請求の範囲のとおり、訂正後の請求項〔１、２〕、３、〔４、６〕について訂正することを認める。 
　特許第６１２８１５３号の請求項１ないし２、４ないし６に係る特許を維持する。 
　特許第６１２８１５３号の請求項３に係る特許についての特許異議の申立てを却下する。
【理　由】
第１　手続の経緯
　特許第６１２８１５３号の請求項１ないし６に係る特許についての出願は、２０１１年（平成２３年）３月１５日(優先権主張　平成２２年８月３１日２件、平成２２年８月３０日)を国際出願日とする特願２０１２−５３１７０９号の一部を平成２７年３月２３日に新たな特許出願としたものであって、平成２９年４月２１日にその特許権の設定登録がされ、同年５月１７日に特許掲載公報が発行され、その後、その請求項１ないし６に係る特許について、同年１１月１５日に特許異議申立人　金山 愼一　（以下「申立人」という。）により、特許異議の申立てがなされ、平成３０年１月２９日付けで取消理由が通知され、その指定期間内である同年４月２日に意見書の提出及び訂正の請求（以下「本件訂正請求」という。）があり、訂正請求書について同年４月２０日付けで手続補正が指令され、その指定期間内である同年５月２４日に手続補正書が提出され、本件訂正請求に対して申立人から同年６月２７日付けで意見書が提出されたものである。
第２　訂正の適否についての判断
１　訂正の内容
　平成３０年５月２４日付け手続補正書により補正された本件訂正請求による訂正（以下「本件訂正」という。）の具体的内容は、以下のとおりである。
（１）請求項１ないし３を一群の請求項とする訂正
ア　請求項１に係る訂正
（訂正事項１−１）
　特許請求の範囲の請求項１に、「蛍光物質を複数集積した樹脂粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織を染色する組織染色方法」とあるのを、「
生体物質認識部位が結合された、
を、
切片を染色した情報から、前記樹脂粒子に基づく輝点数及び／又は発光輝度を計測するために行う
（訂正事項１−２）
　特許請求の範囲の請求項１に、「前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子が、前記蛍光物質がナノ粒子内部に分散された樹脂粒子又は前記蛍光物質がナノ粒子外部に集積した樹脂粒子であり」とあるのを、「前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子が、前記蛍光物質が
前記樹脂
前記樹脂
、当該樹脂粒子の平均粒子径が３０ｎｍ〜８００ｎｍであり
（訂正事項１−３）
　特許請求の範囲の請求項１に、「、
　前記蛍光物質が、有機蛍光色素である組織染色方法。」とあるのを、「
、前
あって、
　目的とする生体物質と前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子とを、反応させたのち、未反応の前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子を除去する工程を有する、
　なお、請求項１の訂正に伴い、請求項１を引用する請求項２も同様に訂正される。
イ　請求項２に係る訂正
（訂正事項２）
　特許請求の範囲の請求項２に、「ナノ粒子内部」とあるのを、「
前記樹脂
ウ　請求項３に係る訂正
（訂正事項３）
　特許請求の範囲の請求項３を削除する。
エ　明細書に係る訂正
（訂正事項４）
　明細書の段落【００１１】の記載、
「　上記課題を解決するために、
　本発明の第１の態様によれば、
　蛍光物質を複数集積した樹脂粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織を染色する組織染色方法において、前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子が、前記蛍光物質がナノ粒子内部に分散された樹脂粒子又は前記蛍光物質がナノ粒子外部に集積した樹脂粒子であり、
　前記蛍光物質が、有機蛍光色素である組織染色方法が提供される。」を、
「　上記課題を解決するために、
　本発明の第１の態様によれば、
　
生体物質認識部位が結合された、
を、
切片を染色した情報から、前記樹脂粒子に基づく輝点数及び／又は発光輝度を計測するために行う
　
前記樹脂
前記樹脂
当該樹脂粒子の平均粒子径が３０ｎｍ〜８００ｎｍであり、
あって、
　目的とする生体物質と前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子とを、反応させたのち、未反応の前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子を除去する工程を有する、
（２）請求項４及び６を一群の請求項とする訂正
ア　請求項４に係る訂正
（訂正事項５−１）
　特許請求の範囲の請求項４に、「前記第１の樹脂粒子が、前記第１の蛍光物質がナノ粒子内部に分散された樹脂粒子又は前記第１の蛍光物質がナノ粒子外部に集積した樹脂粒子であり、」とあるのを、「前記第１の樹脂粒子が、前記第１の蛍光物質が
前記第１の樹脂
前記第１の樹脂
（訂正事項５−２）
　特許請求の範囲の請求項４に、「前記第２の樹脂粒子が、前記第２の蛍光物質がナノ粒子内部に分散された樹脂粒子又は前記第２の蛍光物質がナノ粒子外部に集積した樹脂粒子であり、」とあるのを、「前記第２の樹脂粒子が、前記第２の蛍光物質が
前記第２の樹脂
前記第２の樹脂
（訂正事項５−３）
　特許請求の範囲の請求項４において、「前記第１の蛍光物質及び前記第２の蛍光物質が、有機蛍光色素である」との記載の前に、「
前記第１及び第２の樹脂粒子の平均粒子径がそれぞれ３０ｎｍ〜８００ｎｍであり、
　なお、請求項４の訂正に伴い、請求項４を引用する請求項６も同様に訂正される。
２　訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
（１）請求項１に係る訂正について
ア　訂正の目的の適否
（ア）訂正事項１−１について
　訂正事項１−１は、「蛍光物質を複数集積した樹脂粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織を染色する組織染色方法」が、「組織切片を染色した情報から、前記樹脂粒子に基づく輝点数及び／又は発光輝度を計測するために行う」ものに限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書き第１号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
（イ）訂正事項１−２について
　本件特許についての出願の願書に添付した明細書の段落【００２６】の「〔蛍光物質を複数集積した粒子〕
　本発明において蛍光物質を複数集積した粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたもの（蛍光物質を複数内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子））、粒子外部に集積したもの、粒子の内部、外部によらず集積したものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、していなくてもよい。」との記載によれば、訂正前の記載は、「樹脂粒子」が「ナノ粒子」、すなわち、その大きさがナノオーダーであることを特定しようとしたものであると認められるところ、訂正事項１−２は、その点を明瞭にするととともに、「ナノ」を「平均粒子径が３０ｎｍ〜８００ｎｍであ」ると減縮したものである。
　よって、訂正事項１−２は、特許法第１２０条の５第２項ただし書き第３号に掲げる明瞭でない記載の釈明及び同項ただし書き第１号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
（ウ）訂正事項１−３について
　訂正事項１−３は、「組織染色方法」が、「目的とする生体物質と前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子とを、反応させたのち、未反応の前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子を除去する工程を有する」ものに限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書き第１号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
イ　新規事項の有無
（ア）訂正事項１−１について
　訂正事項１−１は、本件特許についての出願の願書に添付した明細書の「【００５４】
［手順３：蛍光物質内包粒子を用いた組織染色］
　手順２で作製した抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子を用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。染色切片は、コスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理した後、組織アレイスライドを浸漬する液体をキシレン、エタノール、水の順に置換して洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドは、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、湿潤箱中で１時間１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液を用いてブロッキング処理を行った。
【００５５】
　ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに希釈した各抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子を組織切片と３時間反応させた。抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子と反応させた後、組織アレイスライドをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ａｑｕａｔｅｘを用いて封入した。
【００５６】
［手順４：蛍光物質内包粒子を用いて染色した組織の輝点計測］
　手順３で染色した組織切片についてオリンパス社製ＤＳＵ共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフトウェア、Ｇ−ｃｏｕｎｔを用いて輝点の計測を行った。
　Ｃｙ５の観察は、励起フィルター（６４０／３０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（６６０ｎｍ）、蛍光フィルター（６９０／５０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
　テトラメチルローダミンの観察は、励起フィルター（５５０／２５ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（５７０ｎｍ）、蛍光フィルター（６０５／７０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
　ＦＩＴＣの観察は、励起フィルター（４７０／４０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（４９５ｎｍ）、蛍光フィルター（５２５／５０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
　組織アレイスライド中の予めＤＡＢ染色で染色濃度が異なることが予測された８スポットについて、各３０細胞の輝点の数を計測し、１細胞当たりの輝点の数（平均値）を求めた。また、同様に、８スポットについて、各３０細胞の発光輝度を計測し、１細胞当たりの発光輝度（平均値）を求めた。」等の記載に基づくものであるから、本件特許についての出願の願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面（以下「特許明細書等」という。）のすべての記載を総合することにより導かれる技術的事項との関係において、新たな技術的事項を導入しないものである。
　したがって、訂正事項１−１は、特許明細書等に記載した事項の範囲内の訂正であって、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するものである。
（イ）訂正事項１−２について
　訂正事項１−２は、特許明細書等の段落【００２６】の「〔蛍光物質を複数集積した粒子〕
　本発明において蛍光物質を複数集積した粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたもの（蛍光物質を複数内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子））、粒子外部に集積したもの、粒子の内部、外部によらず集積したものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、していなくてもよい。
　ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ等を挙げることができる。」、段落【００３２】の「本発明で用いられる蛍光物質を複数集積した粒子の平均粒径は特に限定されないが、３０〜８００ｎｍ程度のものを用いることができる。平均粒径が３０ｎｍ未満の場合には、集積粒子に含まれる蛍光物質が少なく、目的とする生体物質の定量評価が困難となり、８００ｎｍを超える場合には、病理組織での生体物質との結合が困難となるためである。」との記載に基づくものであるから、特許明細書等のすべての記載を総合することにより導かれる技術的事項との関係において、新たな技術的事項を導入しないものである。
　したがって、訂正事項１−２は、特許明細書等に記載した事項の範囲内の訂正であって、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するものである。
（ウ）訂正事項１−３について
　訂正事項１−３は、特許明細書等の段落【００４４】の「次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片を浸漬させ、未反応蛍光物質集積ナノ粒子の除去を行う。」との記載に基づくものであるから、特許明細書等のすべての記載を総合することにより導かれる技術的事項との関係において、新たな技術的事項を導入しないものである。
　したがって、訂正事項１−３は、特許明細書等に記載した事項の範囲内の訂正であって、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するものである。
ウ　特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　上記ア及びイの検討を踏まえれば、訂正事項１−１ないし１−３は、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかであるから、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第６項の規定に適合するものである。
（２）請求項２に係る訂正について
　訂正事項２は、蛍光物質が内部に分散された粒子が生体物質認識部位が結合された「樹脂粒子」そのものであることを明瞭にするものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書き第３号に掲げる明瞭でない記載の釈明を目的とするものであり、訂正事項１−２と同様に特許明細書等に記載した事項の範囲内の訂正であって、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第５項の規定に適合し、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないから、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第６項の規定に適合するものである。
　また、請求項２は、請求項１を引用していることから実質的に請求項１に係る訂正と同様に訂正されるが、当該訂正は、上記（１）で検討したとおり訂正の要件を満たすものである。
（３）請求項３に係る訂正について
　訂正事項３は、請求項３を削除するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書き第１号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、特許明細書等に記載した事項の範囲内の訂正であって、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第５項の規定に適合し、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないから、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第６項の規定に適合するものである。
（４）明細書に係る訂正について
　訂正事項４は、訂正前の段落【００１１】の記載が訂正前の請求項１の記載に対応したものであったのを、訂正後の請求項１の記載に整合させるものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書き第３号に掲げる明瞭でない記載の釈明を目的とするものであり、訂正事項１−１ないし１−３と同様に特許明細書等に記載した事項の範囲内の訂正であって、特許法第１２０条の５第９項で準用する特許法第１２６条第５項の規定に適合し、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないから、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第６項の規定に適合するものである。
（５）請求項４に係る訂正について
ア　訂正の目的の適否
　特許明細書等の段落【００２６】の「〔蛍光物質を複数集積した粒子〕
　本発明において蛍光物質を複数集積した粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたもの（蛍光物質を複数内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子））、粒子外部に集積したもの、粒子の内部、外部によらず集積したものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、していなくてもよい。」との記載によれば、訂正前の記載は、「第１の樹脂粒子」及び「第２の樹脂粒子」がいずれも「ナノ粒子」、すなわち、その大きさがナノオーダーであることを特定しようとしたものであると認められるところ、訂正事項５−１ないし５−３は、その点を明瞭にするととともに、「ナノ」を第１及び第２の樹脂粒子について「平均粒子径がそれぞれ３０ｎｍ〜８００ｎｍであ」ると減縮したものである。
　よって、訂正事項５−１ないし５−３は、特許法第１２０条の５第２項ただし書き第３号に掲げる明瞭でない記載の釈明及び同項ただし書き第１号に掲げる特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
イ　新規事項の有無
　訂正事項５−１及び５−２は、特許明細書等の段落【００２６】の記載に基づくものであり、訂正事項５−３は、特許明細書等の段落【００３２】の記載に基づくものであるから、いずれも特許明細書等のすべての記載を総合することにより導かれる技術的事項との関係において、新たな技術的事項を導入しないものである。
　したがって、訂正事項５−１ないし５−３は、特許明細書等に記載した事項の範囲内の訂正であって、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第５項の規定に適合するものである。
ウ　特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　上記ア及びイの検討を踏まえれば、訂正事項５−１ないし５−３は、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかであるから、特許法第１２０条の５第９項で準用する同法第１２６条第６項の規定に適合するものである。
（６）請求項６に係る訂正について
　請求項６は、請求項４を引用していることから実質的に請求項４に係る訂正と同様に訂正されるが、当該訂正は、上記（５）で検討したとおり訂正の要件を満たすものである。
３　一群の請求項について
（１）訂正前の請求項１ないし請求項３は、請求項２及び請求項３が上記訂正事項１−１ないし１−３の対象となる請求項１の記載をそれぞれ直接又は間接的に引用しているものであるから、一群の請求項であり、上記訂正事項１−１ないし訂正事項３は、この一群の請求項について訂正を請求するものと認められる。
（２）訂正前の請求項４及び請求項６は、請求項６が上記訂正事項５−１ないし５−３の対象となる請求項４の記載を直接引用しているものであるから、一群の請求項であり、上記訂正事項５−１ないし５−３は、この一群の請求項について訂正を請求するものと認められる。
（３）訂正事項４は、願書に添付した明細書についての訂正であって、段落【００１１】の記載を訂正後の請求項１の記載に整合させるものであるから、請求項１を含む一群の請求項である、請求項１ないし請求項３からなる一群の請求項について行うものと認められる。
４　むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正は特許法第１２０条の５第２項第１号及び第３号に掲げる事項を目的とするものであり、かつ、同条第９項において準用する同法第１２６条第５項及び第６項の規定に適合するので、訂正後の請求項〔１−３〕、〔４、６〕について訂正を認める。
　訂正後の請求項３に係る訂正事項３は、請求項３を削除するものであって、その訂正は認められるものである。そして、特許権者から、訂正後の請求項３について訂正が認められるときは、一群の請求項の他の請求項とは別の訂正単位として扱われることの求めがあったことから、訂正後の請求項〔１−３〕、〔４、６〕について請求項〔１、２〕、３、〔４、６〕を訂正単位として訂正することを認める。
第３　本件発明
　上記第２で述べたように、本件訂正は認められるので、本件の請求項１ないし６に係る発明（以下それぞれ「本件訂正発明１」ないし「本件訂正発明６」という。）は、平成３０年４月２日付け訂正請求書に添付された訂正特許請求の範囲の請求項１ないし６に記載された事項により特定される以下のとおりのものである。
【請求項１】
　生体物質認識部位が結合された、蛍光物質を複数集積した樹脂粒子を、染色試薬として用いて組織切片を染色した情報から、前記樹脂粒子に基づく輝点数及び／又は発光輝度を計測するために行う組織染色方法において、
　前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子が、前記蛍光物質が前記樹脂粒子内部に分散された樹脂粒子又は前記蛍光物質が前記樹脂粒子外部に集積した樹脂粒子であり、当該樹脂粒子の平均粒子径が３０ｎｍ〜８００ｎｍであり、前記蛍光物質が、有機蛍光色素であって、
　目的とする生体物質と前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子とを、反応させたのち、未反応の前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子を除去する工程を有する、組織染色方法。
【請求項２】
　請求項１に記載の組織染色方法において、
　前記蛍光物質が前記樹脂粒子内部に分散された樹脂粒子は、前記蛍光物質を複数内包した樹脂粒子である組織染色方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
　病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法において、
　染色試薬を用いて前記病理切片を染色する工程と、
　染色後の前記病理切片から前記生体物質を検出する工程とを、有しており、
　前記病理切片を染色する工程では、前記染色試薬として、第１の生体物質認識部位が結
合し、かつ、第１の蛍光物質を複数集積した第１の樹脂粒子と、前記第１の生体物質認識部位とは異なる第２の生体物質認識部位が結合し、かつ、前記第１の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する第２の蛍光物質を複数集積した第２の樹脂粒子とを、用い、
　前記第１の樹脂粒子が、前記第１の蛍光物質が前記第１の樹脂粒子内部に分散された樹脂粒子又は前記第１の蛍光物質が前記第１の樹脂粒子外部に集積した樹脂粒子であり、
　前記第２の樹脂粒子が、前記第２の蛍光物質が前記第２の樹脂粒子内部に分散された樹脂粒子又は前記第２の蛍光物質が前記第２の樹脂粒子外部に集積した樹脂粒子であり、
　前記第１及び第２の樹脂粒子の平均粒子径がそれぞれ３０ｎｍ〜８００ｎｍであり、前記第１の蛍光物質及び前記第２の蛍光物質が、有機蛍光色素であることを特徴とする生体物質検出方法。
【請求項５】
　病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法において、
　染色試薬を用いて前記病理切片を染色する工程と、
　染色後の前記病理切片から前記生体物質を検出する工程とを、有しており、
　前記病理切片を染色する工程では、前記染色試薬として、第１の生体物質認識部位が結合し、かつ、有機蛍光色素である第１の蛍光物質を複数集積した第１の粒子と、前記第１の生体物質認識部位とは異なる第２の生体物質認識部位が結合し、かつ、前記第１の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する有機蛍光色素である第２の蛍光物質を複数集積した第２の粒子とを、用い、
　前記生体物質を検出する工程では、
　前記第１の粒子及び前記第２の粒子における１粒子あたりの輝度と、
　輝点数の計測に基づいて求められる輝度分布のピーク値と、から、
　前記第１の粒子及び前記第２の粒子の数を求めることを特徴とする生体物質検出方法。
【請求項６】
　請求項４または５に記載の生体物質検出方法において、
　前記第１の生体物質認識部位が抗ヒトＥＲ抗体であり、
　前記第２の生体物質認識部位が抗ＨＥＲ２抗体であることを特徴とする生体物質検出方法。
第４　取消理由についての判断
１　取消理由の概要
　訂正前の請求項１ないし６に係る特許に対して平成３０年１月２９日付けで特許権者に通知した取消理由は、要旨次のとおりである。
甲第１号証：国際公開第２００７／０９７３１８号（以下「甲１」という。）
（１）取消理由１（特許法第２９条第１項第３号に係る取消理由）
　請求項１ないし３に係る発明は、甲１に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができないものである。よって、その特許は、特許法第２９条の規定に違反してされたものであり、同法第１１３条第２号に該当し、取り消されるべきものである。
（２）取消理由２（特許法第２９条第２項に係る取消理由）
　請求項１ないし３に係る発明は、甲１に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである。よって、その特許は、特許法第２９条の規定に違反してされたものであり、同法第１１３条第２号に該当し、取り消されるべきものである。
（３）取消理由３（特許法第３６条第６項第２号に係る取消理由）
　請求項１ないし６の記載において、「樹脂粒子」及び「ナノ粒子」の記載があるが、両者の関係が不明瞭であり、発明を明確に把握することができない。
　すなわち、「樹脂粒子」が「ナノ粒子」であることを意味するのか、「樹脂粒子」が「ナノ粒子」を備えている（例えば、「樹脂粒子」に「ナノ粒子」が結合している、「樹脂粒子」が「ナノ粒子」を内包している、など。）ことを意味するのか、あるいは、その他の関係を意味するのかが不明瞭である。
　よって、本件発明１ないし６は明確でない。
　したがって、本件の請求項１ないし６に係る特許は、特許請求の範囲の記載が特許法第３６条第６項第２号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであるから、同法第１１３条第４号に該当し、取り消されるべきものである。
２　取消理由で採用した甲号証の記載事項
（１）本件特許に係る出願の優先権主張日前に電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった文献である甲１には、次の事項が記載されている（下線は当審で付加した。）。
（甲１−ア）「［０００１］　本発明は、
消化器癌の内視鏡による早期発見
のための診断用マーカー
（甲１−イ）「［０００３］　・・・
癌細胞或いは癌組織を特異的に染色する診断用マーカー
　しかし、この診断用マーカーは、癌細胞や癌組織に特異的に結合する抗体を蛍光化合物と結合（あるいは蛍光性官能基を抗体に導入）したものであり、確かに癌組織あるいはその周辺の粘膜組織を染色することができるが、癌組織以外の正常組織上にもある程度結合してしまい、また抗体当たりの蛍光化合物量が少なく、従って癌組織と正常組織のコントラストが低く診断精度の高いものではなかった。」
（甲１−ウ）「［０００５］　従って、本発明の目的は、癌組織と正常組織のコントラストを高くすることが可能で、
消化器癌の内視鏡による早期発見
に有益な診断用マーカー
課題を解決するための手段
［０００６］　本発明は、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの粒子であって、その
粒子の表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ上記粒子中に識別性物質を有する、当該粒子を含有する
診断用マーカー
（甲１−エ）「［００１１］　まず、本発明の診断用マーカーを好ましい実施態様について説明する。
　本発明に用いられる粒子は、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの粒子であって、その粒子の表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ該粒子中に識別性物質を有するものであれば特に限定されるものではなく、ベースとなる粒子としても特に限定されるものではなく、シリカ等の無機粒子でも、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル等の有機ポリマーでもよいが、好ましくは水中や生理食塩水中での分散安定性の観点からは
有機ポリマーが適している
（甲１−オ）「［００１２］　上記粒子は、その粒子径が１ｎｍ〜１００μｍの粒子であることが必要であり、好ましくは１０ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは５０ｎｍ〜１００μｍ、最も好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍの粒子であることがよい。粒子径が小さすぎても大きすぎても癌組織と正常組織のコントラストを高くすることができない。」
（甲１−カ）「［００１３］　本発明の診断用マーカーに含有される粒子は、その粒子の表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位を有するものである。
　この
消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位としては
好ましくはレクチンを例示することができる
［００１４］　例えば大腸癌を例にとると、大腸癌が発生した部位には、大腸粘膜細胞の癌化によって、正常な粘膜表面とは異なる糖鎖構造を呈す事が知られている。中でもガラクトシルβ１−３−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（以下、ＴＦ抗原という場合がある。）が良く知られている。
　このＴＦ抗原に対する特異的な結合性の高い物質としてはレクチンが知られており、例えば、Ａｒａｃｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツレクチン。以下、ＰＮＡと略記する場合がある。）、又はＡｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ（マッシュルームレクチン。以下、ＡＢＡと略記する場合がある。）、又はＢａｕｈｉｎｉａ　ｐｕｒｐｕｒｅａ（以下、ＢＰＡと略記する場合がある。）などを例示することができ、これらの物質を粒子の表面に存在させることにより、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位とすることができる。
［００１５］　ＴＦ抗原は大腸癌以外の消化器癌においても発生するので、これらのレクチンは同様に消化器癌全般を対象とする診断用マーカーとする場合に利用することができるが、特に大腸癌には顕著であるので、大腸癌を対象とする診断用マーカーの場合に特にこれらのレクチンは好ましい。
［００１６］　そのほか、消化器癌においては、他にも細胞の癌化の結果としてＮ−アセチルノイラミン酸や、Ｎ−アセチルガラクトサミンがα２，６結合したもの（シアリルＴｎ）等も存在することから、これらと特異的に結合性の高いレクチンを選択する事も可能である。
　また、レクチン以外の、消化器癌細胞認識性分子として、抗体等、例えば市販されているａｎｔｉ−Ｔｈｏｍｓｅｎ　Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ　Ａｎｔｉｇｅｎ，　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，　ｃｌｏｎｅ　Ａ７８−Ｇ／Ａ７等を選択することも可能である。」
（甲１−キ）「［００１８］　また、本発明の診断用マーカーに含有される粒子において、その粒子の表面に有する消化器粘膜に対する結合性の低い部位としては、特に限定されるものではないが、ノニオン性で且つ水和力が高いものがよく、例えば、
Ｎ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖
が、消化器粘膜に対する結合性の低い部位として好ましい
・・・
［００４７］〔マクロモノマーＡの製造〕
　
Ｎ−ビニルアセトアミド
　得られたＮ−ビニルアセトアミドポリマー２０ｇをＤＭＦ１００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．２６ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇ加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド２．６ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１５ｇを回収した。生成物であるビニルベンジル末端Ｎ−ビニルアセトアミドポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これを
マクロモノマーＡ
・・・
［００４９］〔マクロモノマーＣの製造〕
　
Ｎ−ビニルアセトアミド
　得られたＮ−ビニルアセトアミドポリマー２０ｇをＤＭＦ１００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．２６ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇを加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド２．６ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１５ｇを回収した。生成物であるビニルベンジル末端Ｎ−ビニルアセトアミドポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これを
マクロモノマーＣ
（甲１−ク）「［００２５］　本発明の診断用マーカーにおいて、粒子中に有する
識別性物質は
好ましくは蛍光発光性物質が良い
　このような蛍光発光性物質としては、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ダンシル類、ＮＢＤ型色素、フィコビリプロテイン、ＢＯＤＩＰＹ誘導体等を例示することができ、またこれらの蛍光発光性物質を疎水性の高い物質（例えばコレステロールなど）と結合させた誘導体も使用することができる。
　これらの中でも
感度や用いる光源の観点からフルオレセイン類の蛍光発光性物質及びその誘導体（例えばコレステロールをフルオレセイン類物質と結合させた、ラベル化コレステロールなど）や、発光強度が強く水溶性の低いクマリン類（例えばクマリン６など）が最も好ましい
［００２６］　蛍光発光性物質の上記粒子への導入方法についても特に限定されず、識別に必要な感度を保ち、水性環境に溶出が起こらなければ良い。例えば、粒子の合成を行う過程で合成反応系内に導入することにより粒子を構成する分子間に挟持させても良い。このような蛍光発光性物質として好ましい具体例としては、クマリン６（Coumarin 6,　Sigma-Aldrich社製）を例示することができる。
　また、粒子を合成した後に蛍光発光性物質を粒子内に吸収させるなどして導入しても良い。このような蛍光発光性物質として好ましい具体例としては、ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ−５−ｃａｒｂｏｎｙｌ　ａｚｉｄｅ，　ｄｉａｃｅｔａｔｅ（Ｆ６２１８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）を、疎水性の高いコレステロールと結合させたラベル化コレステロール（フルオレセイン化コレステロールとも言う）を例示することができる。このようなラベル化コレステロールはポリマー製の粒子を合成した後に、蛍光発光性物質をその粒子の内部に容易に吸収させて、粒子内に蛍光発光性物質を含有させることができる点からも好ましいものである。」
（甲１−ケ）「［００５１］〔実施例１〕
　上記で得られた
マクロモノマーＡ
微粒子
　遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の
平均粒子径は４００ｎｍ
　得られた微粒子１００ｍｇに対して上記で得られたフルオレセイン化コレステロールを５ｍｇ加え、これをエタノール５ｍＬに分散させた後に、攪拌しながらイオン交換水を１０倍容量加えた。これを遠心分離して微粒子を取り出し、イオン交換水へ再分散を３回繰り返し、これを凍結乾燥することで
フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有する微粒子
　得られたラベル化微粒子１０ｍｇを、ピーナッツレクチン１ｍｇをリン酸緩衝食塩水（商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ　Ｄ８５３７、シグマアルドリッチジャパン社製。以下ＰＢＳと略記する。）１ｍＬに溶解した溶液に加えて攪拌してラベル化微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることでラベル化微粒子の
表面にピーナッツレクチンを吸着させた
診断用マーカー
［００５２］〔実施例２〕
　上記で得られた
マクロモノマーＡ
平均粒子径は４７０ｎｍ
　得られた微粒子１００ｍｇに対し、実施例１と同様にして
フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有させ
　得られたラベル化微粒子１０ｍｇを、０．０５Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 水溶液８００μＬに分散させた。一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2 ＰＯ4 水溶液に水溶性カルボジイミド〔１−エチル−３−（３' −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド〕を１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、これを加えて４℃で３０分間震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ，１０分間）で上澄みを除去し、ピーナッツレクチン１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を加えて攪拌してラベル化微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることでラベル化微粒子の
表面にピーナッツレクチンを結合させた
診断用マーカー
［００５３］〔実施例３〕
　上記で得られた
マクロモノマーＡ
平均粒子径は４００ｎｍ
　得られた微粒子１００ｍｇに対し、実施例２と同様にし
てフルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有させ
　得られたラベル化微粒子１０ｍｇに対し、実施例２と同様にして
ピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ
診断用マーカー
［００５４］〔実施例４〕
　
マクロモノマーＡ
平均粒子径は３６０ｎｍ
　得られた微粒子を、実施例３と同様にしてラベル化し、実施例３と同様にして
ピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ
［００５５］〔実施例５〕
　実施例４で得られたラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させる際に、ピーナッツレクチンの使用量を０．１２５ｍｇに変更した他は実施例４と同様にして、
ラベル化微粒子の表面にピーナッツレクチンを結合させ
診断用マーカー
［００５６］〔実施例６〕
　上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、上記で得られた
マクロモノマーＣ
　遠心分離によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の
平均粒子径は２３０ｎｍ
　得られた微粒子１００ｍｇに対し、実施例２と同様にして
フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有させ
　得られたラベル化微粒子１０ｍｇに対し、実施例２と同様にして
ピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ
診断用マーカー
［００５７］〔実施例７〕
　上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、上記で得られた
マクロモノマーＣ
クマリン６を内包したラベル微粒子
　遠心分離によってこのラベル化微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としてのラベル化微粒子を得た。ラベル化微粒子の
平均粒子径は２３０ｎｍ
　実施例２と同様にして
ピーナッツレクチンをラベル化微粒子の表面に結合させ
診断用マーカー
（２）甲１に記載された発明
ア　（甲１−ア）ないし（甲１−ウ）の記載から、診断用マーカーを用いて消化器における癌組織を染色することが読み取れる。
イ　（甲１−エ）及び（甲１−キ）の記載から、（甲１−ケ）の実施例１ないし７における微粒子は、消化器粘膜に対する結合性の低い部位としてＮ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖を有する有機ポリマーで形成されていることが読み取れる。
ウ　上記ア及びイを踏まえると、（甲１−ア）ないし（甲１−エ）から、甲１には以下の発明が記載されていると認められる。
「　表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ内部に識別性物質を有する、微粒子を含有する診断用マーカーを用いて消化器における癌組織を染色する方法であって、
　前記微粒子は、
消化器粘膜に対する結合性の低い部位としてＮ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖を有する有機ポリマーで形成され、
表面にピーナッツレクチンを吸着させてあり、
フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有し、
平均粒子径が４００ｎｍである、
消化器における癌組織を染色する方法。」
（以下「甲１発明１」という。）
「　表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ内部に識別性物質を有する、微粒子を含有する診断用マーカーを用いて消化器における癌組織を染色する方法であって、
　前記微粒子は、
消化器粘膜に対する結合性の低い部位としてＮ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖を有する有機ポリマーで形成され、
表面にピーナッツレクチンを結合させてあり、
フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有し、
平均粒子径が４７０ｎｍである、
消化器における癌組織を染色する方法。」
（以下「甲１発明２」という。）
「　表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ内部に識別性物質を有する、微粒子を含有する診断用マーカーを用いて消化器における癌組織を染色する方法であって、
　前記微粒子は、
消化器粘膜に対する結合性の低い部位としてＮ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖を有する有機ポリマーで形成され、
表面にピーナッツレクチンを結合させてあり、
フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有し、
平均粒子径が４００ｎｍである、
消化器における癌組織を染色する方法。」
（以下「甲１発明３」という。）
「　表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ内部に識別性物質を有する、微粒子を含有する診断用マーカーを用いて消化器における癌組織を染色する方法であって、
　前記微粒子は、
消化器粘膜に対する結合性の低い部位としてＮ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖を有する有機ポリマーで形成され、
表面にピーナッツレクチンを結合させてあり、
フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有し、
平均粒子径が３６０ｎｍである、
消化器における癌組織を染色する方法。」
（以下「甲１発明４」という。）
「　表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ内部に識別性物質を有する、微粒子を含有する診断用マーカーを用いて消化器における癌組織を染色する方法であって、
　前記微粒子は、
消化器粘膜に対する結合性の低い部位としてＮ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖を有する有機ポリマーで形成され、
表面にピーナッツレクチンを結合させてあり、
フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有し、
平均粒子径が２３０ｎｍである、
消化器における癌組織を染色する方法。」
（以下「甲１発明５」という。）
「　表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び消化器粘膜に対する結合性の低い部位を有し、且つ内部に識別性物質を有する、微粒子を含有する診断用マーカーを用いて消化器における癌組織を染色する方法であって、
　前記微粒子は、
消化器粘膜に対する結合性の低い部位としてＮ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖を有する有機ポリマーで形成され、
表面にピーナッツレクチンを結合させてあり、
クマリン６を識別性物質として内包し、
平均粒子径が２３０ｎｍである、
消化器における癌組織を染色する方法。」
（以下「甲１発明６」という。）
３　判断
　本件特許の請求項３は、上記第２で述べたとおり本件訂正が認められることにより、削除されたため、以下、本件訂正発明１、２、４ないし６に係る取消理由についての判断を示す。
（１）取消理由１について
ア　本件訂正発明１について
（ア）本件訂正発明１と甲１発明１とを対比すると、次のことがいえる。
ａ　甲１発明１の「ピーナッツレクチン」は、「消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い」ものであるから、本件訂正発明１の「生体物質認識部位」に相当する。
ｂ　甲１発明１の「有機ポリマーで形成され」た「微粒子」は、本件訂正発明１の「樹脂粒子」に相当する。
ｃ　本件訂正発明１の「樹脂粒子」に対する「生体物質認識部位」の「結合」とは、特許明細書等の段落【００３５】に「生体物質認識部位と蛍光物質集積ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。」と記載されているものであることに鑑みれば、甲１発明１の「吸着させてあ」ることは、本件訂正発明１の「結合され」ていることに相当する。
ｄ　甲１発明１の「フルオレセイン化コレステロール」は、本件訂正発明１の「有機蛍光色素であ」る「蛍光物質」に相当する。
ｅ　本件訂正発明１の「蛍光物質を複数集積した樹脂粒子」は、本件特許の明細書の段落【００２６】に「本発明において蛍光物質を複数集積した粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたもの（蛍光物質を複数内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子））、粒子外部に集積したもの、粒子の内部、外部によらず集積したものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、していなくてもよい。」と記載されているものであることに鑑みれば、甲１発明１の「内部に識別性物質を有する」「微粒子」であって、「フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有し」ている「微粒子」は、本件訂正発明１の「蛍光物質を複数集積した樹脂粒子」であって、「前記蛍光物質が前記樹脂粒子内部に分散された樹脂粒子」に相当する。
ｆ　甲１発明１の「診断用マーカー」は、本件訂正発明１の「染色試薬」に相当する。
ｇ　甲１発明１の「消化器における癌組織」と、本件訂正発明１の「組織切片」とは、「生体組織」である点において共通する。
ｈ　甲１発明１の「消化器における癌組織を染色する方法」は、本件訂正発明１の「組織染色方法」に相当する。
ｉ　甲１発明１の「有機ポリマーで形成され」た「微粒子」の「平均粒子径が４００ｎｍである」ことは、本件訂正発明１の「当該樹脂粒子の平均粒子径が３０ｎｍ〜８００ｎｍであ」る条件を満たす。
ｊ　甲１発明１の「特定抗原」は、本件訂正発明１の「目的とする生体物質」に相当する。
ｋ　甲１発明１は、「表面に、消化器癌粘膜上の特定抗原に対する特異的な結合性の高い」「ピーナッツレクチンを吸着させ」、「且つ内部に」「フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有し」ている「微粒子を含有する診断用マーカーを用いて消化器における癌組織を染色する方法」であるから、「特定抗原」と「フルオレセイン化コレステロールを識別性物質として含有し」ている「微粒子」とを反応させていることは明らかである。
　よって、甲１発明１は、本件訂正発明１の「目的とする生体物質と前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子とを、反応させ」る工程に相当する工程を備えている。
（イ）そうすると、本件訂正発明１と甲１発明１とは、
「　生体物質認識部位が結合された、蛍光物質を複数集積した樹脂粒子を、染色試薬として用いて生体組織を染色する組織染色方法において、
　前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子が、前記蛍光物質が前記樹脂粒子内部に分散された樹脂粒子であり、当該樹脂粒子の平均粒子径が３０ｎｍ〜８００ｎｍであり、前記蛍光物質が、有機蛍光色素であって、
　目的とする生体物質と前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子とを、反応させる、組織染色方法。」
の発明である点において一致し、次の３点において相違する。
（相違点１）
　染色する生体組織が、本件訂正発明１においては「組織切片」であるのに対し、甲１発明１においては「消化器における癌組織」である点。
（相違点２）
　組織染色方法が、本件訂正発明１においては、「染色した情報から、前記樹脂粒子に基づく輝点数及び／又は発光輝度を計測するために行う」ものであるのに対し、甲１発明１においては、そのような特定がされていない点。
（相違点３）
　目的とする生体物質と前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子とを、反応させたのち、本件訂正発明１は、「未反応の前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子を除去する工程を有する」のに対し、甲１発明１においては、そのような特定がされていない点。
　上記相違点１ないし３は実質的な相違点であるから、本件訂正発明１は甲１発明１と同一ではない。
（ウ）本件訂正発明１と甲１発明２ないし６との対比
　甲１発明２は、甲１発明１の「表面にピーナッツレクチンを吸着させてあり」を「表面にピーナッツレクチンを結合させてあり」に、「平均粒子径が４００ｎｍである」を「平均粒子径が４７０ｎｍである」にそれぞれ置き換えたものに相当する。
　甲１発明３は、甲１発明１の「表面にピーナッツレクチンを吸着させてあり」を「表面にピーナッツレクチンを結合させてあり」に置き換えたものに相当する。
　甲１発明４は、甲１発明１の「表面にピーナッツレクチンを吸着させてあり」を「表面にピーナッツレクチンを結合させてあり」に、「平均粒子径が４００ｎｍである」を「平均粒子径が３６０ｎｍである」にそれぞれ置き換えたものに相当する。
　甲１発明５は、甲１発明１の「表面にピーナッツレクチンを吸着させてあり」を「表面にピーナッツレクチンを結合させてあり」に、「平均粒子径が４００ｎｍである」を「平均粒子径が２３０ｎｍである」にそれぞれ置き換えたものに相当する。
　甲１発明６は、甲１発明１の「表面にピーナッツレクチンを吸着させてあり」を「表面にピーナッツレクチンを結合させてあり」に、「フルオレセイン化コレステロール」を「クマリン６」に、「平均粒子径が４００ｎｍである」を「平均粒子径が４７０ｎｍである」にそれぞれ置き換えたものに相当する。
　ここで、「クマリン６」は、有機蛍光色素である。
　そうすると、本件訂正発明１と甲１発明２ないし６とは、上記相違点１ないし３と実質的に同じ点において相違する。
　よって、本件訂正発明１は甲１発明２ないし６と同一ではない。
（エ）以上のとおり、本件訂正発明１は甲１に記載された発明であるとはいえないから、取消理由１によって本件訂正発明１に係る特許を取り消すことはできない。
イ　本件訂正発明２について
　本件訂正発明２は、「前記蛍光物質が前記樹脂粒子内部に分散された樹脂粒子」について本件訂正発明１を更に限定したものであるから、本件訂正発明１と同様に、甲１発明１ないし６と同一ではない。
　よって、取消理由１によって本件訂正発明２に係る特許を取り消すことはできない。
（２）取消理由２について
ア　本件訂正発明１について
　上記相違点１が想到容易であるかについて検討する。
　甲１発明１は、消化器における癌組織を染色する方法であるところ、ここでの「消化器」は、生体内に存在している状態の「消化器」を意味するものである。
　このことは、（甲１−ア）の「本発明は、消化器癌の内視鏡による早期発見／治療のための診断用マーカーに関するものである。」、（甲１−ウ）の「従って、本発明の目的は、癌組織と正常組織のコントラストを高くすることが可能で、消化器癌の内視鏡による早期発見／治療に有益な診断用マーカー、及びその製造方法を提供することにある。」との記載と整合するものであって、甲１発明１は、内視鏡観察時に行うことを前提とするものである。
　そうすると、内視鏡観察時に行うことを前提とする甲１発明１において、染色する生体組織を組織切片とする動機付けがあるとはいえない。
　したがって、相違点２及び３について検討するまでもなく、本件訂正発明１は甲１発明１に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　同様に、本件訂正発明１は甲１発明２ないし６に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　よって、取消理由２によって本件訂正発明１に係る特許を取り消すことはできない。
イ　本件訂正発明２について
　本件訂正発明２は、「前記蛍光物質が前記樹脂粒子内部に分散された樹脂粒子」について本件訂正発明１を更に限定したものであるから、本件訂正発明１と同様に、甲１発明１ないし６に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
　よって、取消理由２によって本件訂正発明２に係る特許を取り消すことはできない。
（３）取消理由３について
　本件訂正により、請求項１及び２における「樹脂粒子」、並びに請求項４における「第１の樹脂粒子」及び「第２の樹脂粒子」が、それぞれナノオーダーの大きさを有する粒子であることが明瞭になった。
　また、請求項５は、そもそも「ナノ粒子」という表記を用いておらず、取消理由３は該当しない。
　よって、取消理由３によって本件訂正発明１ないし６に係る特許を取り消すことはできない。
４　特許異議申立人の意見について
　申立人は、特許異議申立書の第１４頁１５〜１９行において、甲１の実施例に赤血球を用いた診断用マーカーのＴＦ光源への特異的結合性評価試験及び消化器粘膜への結合性評価試験が記載されていることをもって、甲１には実質的に染色試薬を用いて病理「切片」を染色する工程が記載されている旨主張しているが、上記実施例は診断用マーカーを評価するために大腸癌の粘膜表面のモデル表面として赤血球を用いているにすぎず、甲１は内視鏡による体内組織の診断技術を示したものであって、身体から取り出した組織の「切片」を染色対象とするものではないことから、この主張は前提において誤りである。
　そして、本件訂正により本件訂正発明１及び２について染色する対象が組織「切片」に訂正されたものの、これについて、申立人は意見書において何ら主張していないことから、申立人は依然として、甲１には病理「切片」を染色することについても記載されていると、前提において誤った解釈をしているものである。
第５　取消理由通知において採用しなかった特許異議申立理由について
　本件特許の請求項３は、上記第２で述べたとおり本件訂正が認められることにより、削除されたため、以下、本件訂正発明１、２、４ないし６に係る特許異議申立理由についての判断を示す。
　申立人は、証拠方法として、主たる証拠である甲１に加えて、従たる証拠として下記の甲第２ないし５号証を提出している。
甲第２号証：特表平７−５０８３０９号公報（以下「甲２」という。）
甲第３号証：特開２００２−２２８６５４号公報（以下「甲３」という。）
甲第４号証：特開２００５−３４５７６４号公報（以下「甲４」という。）
甲第５号証：特表２００６−５１９３７６号公報（以下「甲５」という。）
１　特許法第２９条第１項第３号に係る特許異議申立理由について
　申立人は、甲１には、
「　蛍光物質を含む樹脂粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織を染色する組織染色方法において、
  前記蛍光物質を含む樹脂粒子が、前記蛍光物質がナノ粒子内部に分散された樹脂粒子又は前記蛍光物質がナノ粒子外部に集積した樹脂粒子であり、
  前記蛍光物質が、有機蛍光色素である組織染色方法。」
の発明（以下「甲１発明」という。）が記載されていると認定し、本件特許の請求項１及び２に係る発明は、甲１に記載された発明である旨主張している。
　ここで、甲２は、特許明細書等の段落【００３０】でポリスチレンナノ粒子への有機蛍光色素の含有法を例示するために引用された米国特許５３２６６９２号に対応する特許出願の公表公報であり、甲１に記載されたポリスチレン粒子が、蛍光物質を複数集積した樹脂粒子であることを示すために提出されたものである。
　しかしながら、甲１発明は染色する組織が「組織切片」であることを特定するものではないから、本件訂正発明１及び２は、甲１発明と同一ではない。
　よって、本件訂正発明１及び２は、甲１に記載された発明であるとはいえないから、申立人の上記主張は理由がない。
２　特許法第２９条第２項に係る特許異議申立理由について
（１）請求項１及び２について
　申立人は、本件特許の請求項１及び２に係る発明は、甲１発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである旨主張している。
　しかしながら、上記「第４　３（２）ア」で甲１発明１について述べたのと同様に、甲１発明は内視鏡観察時に行うことを前提とするものであるから、甲１発明において、染色する組織を組織切片とする動機付けがあるとはいえない。
　よって、本件訂正発明１及び２は、甲１発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえないから、申立人の上記主張は理由がない。
（２）請求項４について
　申立人は、本件特許の請求項４に係る発明は、甲１発明及び甲３に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである旨主張している。
　甲３は、組織マッピング方法及び組織マップ分析装置に関する文献であって、同一の組織試料に対して異なる物質と反応する試薬で染色するごとに蛍光強度測定を行い画像化することが記載されている。
　しかしながら、本件訂正発明４は、病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法であって、染色試薬を用いて病理切片を染色する工程を有するものであるところ、甲１発明において、染色する組織を病理切片、すなわち組織切片とする動機付けがあるとはいえないことは、上記（１）で述べたとおりである。
　よって、本件訂正発明４は、甲１発明及び甲３に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえないから、申立人の上記主張は理由がない。
（３）請求項５について
　申立人は、本件特許の請求項５に係る発明は、甲１発明並びに甲３及び４に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである旨主張している。
　甲４は、走査型光学装置に関する文献であって、走査光学系により試料上を走査し、蛍光の輝度を検出することが記載されている。
　しかしながら、本件訂正発明５は、病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法であって、染色試薬を用いて病理切片を染色する工程を有するものであるところ、甲１発明において、染色する組織を病理切片、すなわち組織切片とする動機付けがあるとはいえないことは、上記（１）で述べたとおりである。
　よって、本件訂正発明５は、甲１発明並びに甲３及び４に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえないから、申立人の上記主張は理由がない。
（４）請求項６について
　申立人は、本件特許の請求項６に係る発明は、甲１発明及び甲３ないし５に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである旨主張している。
　甲５は、免疫組織化学、免疫細胞化学及び分子細胞遺伝学のための標準に関する文献であって、ＨＥＲ２を検出対象として抗ＨＥＲ２抗体を用いて染色すること、及びＥＲを検出対象とすることが記載されている。
　しかしながら、本件訂正発明６は、本件訂正発明４又は５を生体物質認識部位に関して減縮したものであるから、本件訂正発明４又は５と同様の理由により、甲１発明及び甲３ないし５に記載された事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない
　よって、申立人の上記主張は理由がない。
３　特許法第１７条の２第３項に係る特許異議申立理由について
　申立人は、平成２８年４月２１日に提出された手続補正書による「樹脂粒子」という用語を追加する補正は、本件特許に係る出願の願書に最初に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面（以下「当初明細書等」という。）に記載した事項の範囲においてしたものではないから、本件特許の請求項１ないし４、及び６に係る特許は、特許法第１７条の２第３項に記載する要件を満たしていない補正をした特許出願に対してされたものであり、その特許は同法第１１３条第１項に該当し、取り消されるべきものである旨主張している。
　そこで検討するに、当初明細書等には以下の記載がある。
「　【００２６】
〔蛍光物質を複数集積した粒子〕
　本発明において蛍光物質を複数集積した粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたもの（蛍光物質を複数内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子））、粒子外部に集積したもの、粒子の内部、外部によらず集積したものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、していなくてもよい。
　ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ等を挙げることができる。」
「　【００３０】
　有機蛍光色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への有機蛍光色素の含浸法を用いて作製することができる。」
　段落【００２６】には、蛍光物質を複数集積した粒子を構成するナノ粒子の素材は特に限定されるものではないことが記載され、素材の例として樹脂であるポリスチレン及びポリ乳酸が記載されている。
　この段落【００２６】の記載は、蛍光物質を複数集積した粒子を構成するナノ粒子の素材として、ポリスチレン及びポリ乳酸以外の樹脂を使用することを想定しているものといえる。
　そして、段落【００２６】に「蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、していなくてもよい」と記載されていることに鑑みれば、蛍光物質を複数集積した粒子を構成するナノ粒子の素材としてポリスチレン及びポリ乳酸以外の樹脂を使用することが可能であることも明らかである。
　また、段落【００３０】には、ポリスチレンナノ粒子の場合の製造方法の例が記載されているが、当該記載がナノ粒子を構成する素材をポリスチレンに限定するものとは解されない。
　そうすると、有機蛍光色素を複数集積した粒子として樹脂粒子を使用することは、当初明細書等の全ての記載を総合することにより導かれる技術的事項との関係において、新たな技術的事項を導入するものとはいえない。
　よって、申立人の上記主張は理由がない。
第６　請求項３に対する特許異議の申立てについて
　本件特許の請求項３は、上記第２で述べたとおり本件訂正が認められることにより、削除されたため、本件特許の請求項３についての申立人がした特許異議の申立ては、その対象が存在しないものとなった。
　よって、本件特許の請求項３についての申立人の特許異議の申立ては、不適法であって、その補正をすることができないものであるから、特許法第１２０条の８第１項で準用する同法第１３５条の規定により、却下すべきものである。
第７　むすび
　以上のとおりであるから、取消理由通知に記載した取消理由及び申立人の特許異議申立書に記載した特許異議申立理由によっては、本件請求項１、２、４ないし６に係る特許を取り消すことはできない。
　そして、他に本件請求項１、２、４ないし６に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　また、本件特許の請求項３に対して申立人がした特許異議の申立ては、特許法第１２０条の８第１項で準用する同法第１３５条の規定によって却下すべきものである。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成３０年７月２３日（２０１８．７．２３）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
組織染色方法および生体物質検出方法
　【技術分野】
　【０００１】
　本発明は、組織染色方法、組織評価方法および生体物質検出方法に関する。
　【背景技術】
　【０００２】
　病理診断では、まず採取した組織を固定するために脱水し、パラフィンによるブロック化といった処理を行った後、２〜８μｍの厚さの薄片に切り、パラフィンを取り除き、染色して顕微鏡観察を行う。病理医は、この顕微鏡画像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化等の形態学的な情報、染色情報をもとに診断を行っている。画像のデジタル化技術の発達に伴い、病理診断の分野においても、顕微鏡やデジタルカメラ等を用いてデジタルカラー画像として入力された病理画像から、病理医が病理診断を行う際に必要となる情報を抽出・計測して表示する自動化された病理診断支援装置が普及してきている。
　【０００３】
　例えば、特許文献１には、病理画像から細胞核領域及び細胞質領域をそれぞれ特定する核・細胞質分布推定手段と、病理画像から腺腔領域（細胞組織を殆ど含まない領域）を特定する腺腔分布抽出手段と、癌細胞が存在するか否かを判定する癌部位推定手段と、癌の進行度を判定する進行度判定手段と、癌細胞の分布図や進行度等を表示する画像表示手段と、を有する病理診断支援装置が開示されている。
　【０００４】
　また、特許文献２には、正常部位と癌部位をそれぞれ選択的に染色するような２種類の染料で病理標本を染色し、更にスペクトル画像からランベルト・ベールの法則を用いて染色濃度を評価し、癌細胞の有無を判定する癌細胞の検出方法が開示されている。
　【０００５】
　しかし、いずれの評価法を用いた場合でも、組織染色方法は従来の色素染色法（例えばヘマトキシリン−エオジン染色）、酵素を用いた色素染色法（例えばＤＡＢ染色）であり、その染色濃度は温度、時間等の環境条件により大きく左右され、病理診断支援装置の正確な定量測定性能を生かし切れていない。
　【０００６】
　また、色素に代わる標識試薬として感度性能が高い蛍光色素が組織染色の研究に用いられているが（非特許文献１参照）、発明者らが、特許文献３に開示されている細胞識別・定量方法により、有機蛍光色素であるＦＩＴＣを用い作製した病理切片を蛍光顕微鏡下で観察したところ、その発光輝度は極めて弱く、極微量のバイオマーカーを発光レベルによって自動判別することはできず、更なる改善が必要であることがわかった。
　【先行技術文献】
　【特許文献】
　【０００７】
　【特許文献１】特開２００４−２８６６６６号公報
　【特許文献２】特表２００１−５２５５８０号公報
　【特許文献３】特開昭６３−６６４６５号公報
　【非特許文献】
　【０００８】
　【非特許文献１】「病理と臨床　Ｖｏｌ．２５　２００７年臨時増刊号　診断に役立つ免疫組織化学」文光堂　２００７年
　【発明の概要】
　【発明が解決しようとする課題】
　【０００９】
　これに対し、近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効率的に使用するため、正確な診断法の必要性が高まってきている。病理診断においても、より正確に疾病の診断を行うため、極微量のバイオマーカーを組織切片上で定量的に検出することが求められている。しかし、従来の病理組織染色方法では、安定した定量性能、微量検出性能を得ることは困難であった。
　【００１０】
　本発明は、上記の従来技術における問題に鑑みてなされたものであり、微量の生体物質（バイオマーカー）を定量的に検出することを課題とする。
　【課題を解決するための手段】
　【００１１】
　上記課題を解決するために、
　本発明の第１の態様によれば、
　
生体物質認識部位が結合された、
を、染色試薬として用いて組織切片を染色した情報から、前記樹脂粒子に基づく輝点数及び／又は発光輝度を計測するために行う
　前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子が、前記蛍光物質が
前記樹脂粒子内部
前記樹脂粒子外部
当該樹脂粒子の平均粒子径が３０ｎｍ〜８００ｎｍであり、
って、
　
目的とする生体物質と前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子とを、反応させたのち、未反応の前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子を除去する工程を有する、
　【００１２】
　本発明の第２の態様によれば、
　病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法において、
　染色試薬を用いて前記病理切片を染色する工程と、
　染色後の前記病理切片から前記生体物質を検出する工程とを、有しており、
　前記病理切片を染色する工程では、前記染色試薬として、第１の生体物質認識部位が結合し、かつ、有機蛍光色素である第１の蛍光物質を複数集積した第１の粒子と、前記第１の生体物質認識部位とは異なる第２の生体物質認識部位が結合し、かつ、前記第１の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する有機蛍光色素である第２の蛍光物質を複数集積した第２の粒子とを、用い、
　前記生体物質を検出する工程では、
　前記第１の粒子及び前記第２の粒子における１粒子あたりの輝度と、
　輝点数の計測に基づいて求められる輝度分布のピーク値と、から、
　前記第１の粒子及び前記第２の粒子の数を求めることを特徴とする生体物質検出方法が提供される。
　【発明の効果】
　【００１３】
　本発明の第１の態様によれば、蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いることにより、蛍光観察時の１粒子当たりの輝度が高くなるため、微量の生体物質を感度良く、定量的に検出することができる。
　本発明の第２の態様によれば、微量の生体物質を定量的に検出することができるのに加え、互いに異なる生体物質認識部位が結合され、蛍光波長が互いに異なる蛍光物質が複数集積された粒子を用いるから、１つの病理切片から複数の生体物質を検出することができる。
　【図面の簡単な説明】
　【００１４】
　【図１】１細胞当たりの粒子数と１細胞当たりの輝度の経時変化を示すグラフである。
　【発明を実施するための形態】
　【００１５】
　以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　【００１６】
　本実施形態では、組織染色方法と、これを利用した組織評価方法および生体物質検出方法とを、提供する。
　本実施形態にかかる組織染色方法では、生体物質認識部位が結合した蛍光物質を集積したナノ粒子を用いる。
　【００１７】
　本実施形態にかかる組織評価方法では、生体物質認識部位が結合された蛍光物質又は蛍光物質集積粒子を用い、その輝点の数に基づいて組織切片上に存在するバイオマーカーと結合した蛍光物質又は蛍光物質集積粒子の数を求める。
　【００１８】
　本実施形態にかかる生体物質検出方法は、病理切片から生体物質を特異的に検出する方法であり、基本的には、（１）染色試薬を用いて病理切片を染色する工程と、（２）染色後の病理切片から生体物質を検出する工程とを、有している。
　特に、（２）の工程では、染色試薬として２種類のナノ粒子を使用する。
　一方のナノ粒子には、一定の生体物質認識部位が結合され、かつ、一定の蛍光物質が内包されている。他方のナノ粒子には、一方のナノ粒子の生体物質認識部位とは異なる生体物質認識部位が結合され、かつ、一方のナノ粒子の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する蛍光物質が内包されている。すなわち、各ナノ粒子には、互いに異なる生体物質認識部位が結合され、蛍光波長が互いに異なる蛍光物質が内包されている。そのため、蛍光物質に起因する蛍光波長の違いから、生体物質認識部位に応じた２種の生体物質を検出することができるし、生体物質認識部位の選定から、将来的には現在未確認の抗原を特定することもできると考えられる。
　なお、本発明の好ましい実施形態では、２種類のナノ粒子を用いた例を示すが、生体物質認識部位と蛍光物質（蛍光波長）とが互いに異なれば、３種類以上のナノ粒子を用いて３種類以上の生体物質を検出するものとしてもよい。
　蛍光物質などの種類や特性、生体物質検出方法の詳細は下記のとおりである。
　【００１９】
〔蛍光物質〕
　本発明で用いられる蛍光物質としては、有機蛍光色素、量子ドット（半導体粒子）、希土類粒子を挙げることができる。２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜９００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
　【００２０】
　有機蛍光色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
　【００２１】
　具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン　６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４０５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４３０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５１４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６１０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６６０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７５０、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ　５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ　５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ　５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ　５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ　５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ　６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ　６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
　【００２２】
　量子ドットとしては、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物、又はＩＶ族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「ＩＩ−ＶＩ族量子ドット」、「ＩＩＩ−Ｖ族量子ドット」、「ＩＶ族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
　【００２３】
　具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
　【００２４】
　上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ２、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ２、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
　量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
　【００２５】
　希土類粒子としては、例えば、酸化ネオジム、塩化ネオジム、硝酸ネオジム、酸化イッテルビウム、塩化イッテルビウム、硝酸イッテルビウム、酸化ランタン、塩化ランタン、硝酸ランタン、酸化イットリウム、塩化イットリウム、硝酸イットリウム、塩化プラジオセム、塩化エルビウム、オルトリン酸、リン酸アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム等を用いることができる。
　【００２６】
〔蛍光物質を複数集積した粒子〕
　本発明において蛍光物質を複数集積した粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたもの（蛍光物質を複数内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子））、粒子外部に集積したもの、粒子の内部、外部によらず集積したものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、していなくてもよい。
　ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ等を挙げることができる。
　【００２７】
　本発明で用いられる蛍光物質を複数集積した粒子は、公知の方法により作製することが可能である。
　例えば、有機蛍光色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア　８巻　２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の有機蛍光色素を用いることで種々の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
　【００２８】
　量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー　３３巻　５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
　【００２９】
　量子ドットを外包したシリカナノ粒子は、ケミカル・コミュニケーション　２６７０ページ（２００９）に記載されているＣｄＳｅ／ＺｎＳを５−ａｍｉｎｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌとＡＰＳでキャッピングした粒子を表面に集積したシリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
　【００３０】
　有機蛍光色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への有機蛍光色素の含浸法を用いて作製することができる。
　【００３１】
　量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー　バイオテクノロジー　１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
　【００３２】
　本発明で用いられる蛍光物質を複数集積した粒子の平均粒径は特に限定されないが、３０〜８００ｎｍ程度のものを用いることができる。平均粒径が３０ｎｍ未満の場合には、集積粒子に含まれる蛍光物質が少なく、目的とする生体物質の定量評価が困難となり、８００ｎｍを超える場合には、病理組織での生体物質との結合が困難となるためである。なお、平均粒径は、４０〜５００ｎｍの範囲内であることがより好ましい。ここで、平均粒径を４０〜５００ｎｍとしたのは、４０ｎｍ未満の場合には、高価な検出系が必要となり、５００ｎｍを超える場合には、物理的な大きさから定量範囲が狭まるためである。また、粒径のばらつきを示す変動係数（＝（標準偏差／平均値）×１００％）は特に限定されないが、２０％のものを用いることができる。平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
　【００３３】
〔緩衝液〕
　緩衝液とは、抗原−抗体反応に適した環境を安定して維持するための溶媒である。例えば、リン酸緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液等である。
　【００３４】
〔生体物質認識部位と蛍光物質を集積したナノ粒子との結合〕
　本発明に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応する部位である。例えば、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＲ抗体を蛍光物質集積ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
　【００３５】
　生体物質認識部位と蛍光物質集積ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。
　【００３６】
　また、生体物質認識部位と蛍光物質集積ナノ粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＳＭ（ＰＥＧ）１２を用いることができる。
　【００３７】
　蛍光物質集積シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が有機蛍光色素の場合でも、量子ドットの場合でも、希土類粒子の場合でも同様の手順を適用することができる。
　例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。
　具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ　ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
　【００３８】
　有機蛍光色素集積シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。
　例えば、得られた有機蛍光色素集積シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された有機蛍光色素集積シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を有機蛍光色素集積シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
　【００３９】
　必要により、有機分子で修飾された有機蛍光色素集積シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。
　具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した有機蛍光色素集積シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した有機蛍光色素集積シリカナノ粒子ができる。
　【００４０】
　蛍光物質集積ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が有機蛍光色素の場合でも、量子ドットの場合でも、希土類粒子の場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ有機蛍光色素、量子ドット又は希土類粒子を含浸することにより、官能基もつ蛍光物質集積ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣ又はｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを用いることで、抗体結合した蛍光物質集積ポリスチレンナノ粒子ができる。
　【００４１】
〔染色方法（生体物質検出方法）〕
　以下、本発明の染色方法（生体物質検出方法）について述べる。
　本発明の染色方法は病理切片組織に限定せず、細胞染色にも適用可能である。
　本発明の染色方法が適用できる切片の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
　【００４２】
　１）脱パラフィン工程
　キシレンを入れた容器に、病理切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いで、エタノールを入れた容器に病理切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　次いで、水を入れた容器に、病理切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
　【００４３】
　２）賦活化処理
　公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。
　賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０−１３０℃、時間は５−３０分で行うことができる。
　次いで、水、ＰＢＳを入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　【００４４】
　３）生体物質認識部位が結合された蛍光物質集積ナノ粒子を用いた染色
　生体物質認識部位が結合された蛍光物質集積ナノ粒子のＰＢＳ分散液を病理切片に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光物質集積ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。
　複数（２種以上）の生体物質を検出しようとする場合は、生体物質認識部位が異なる蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液をそれぞれ調製し、病理切片に載せ、目的とする生体物質との反応を行う。病理切片に載せる際に、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液をあらかじめ混合してもよいし、別々に順次載せてもよい。混合比は特に限定されるものではないが、本発明の効果が表れるには両者の比は１：１〜５：１でよい。
　蛍光物質集積ナノ粒子のＰＢＳ分散液には、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含有させてもよい。
　温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
　蛍光物質集積ナノ粒子による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
　次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片を浸漬させ、未反応蛍光物質集積ナノ粒子の除去を行う。ＰＢＳ溶液にはＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含有させてもよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　組織の形態観察のため、ヘマトキシリン−エオジン染色を行ってもよい。
　カバーガラスを切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
　【００４５】
　４）蛍光顕微鏡下の観察
　染色した病理切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、目的とする生体物質の発現レベルを輝点数又は発光輝度に基づいて評価する。
　輝点数又は発光輝度の計測では、用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源は及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
　輝点数又は発光輝度の計測は、画像解析ソフト、例えば、公開解析ソフトＩｍａｇｅＪ、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトＧ−Ｃｏｕｎｔを用いて行うことができる。
　【００４６】
　次に、本発明を上記実施形態に基づいて具体的に実施した実施例について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　【実施例１】
　【００４７】
［手順１：蛍光物質内包粒子の合成］
　テトラメチルローダミン（インビトロジェン社製ＴＡＭＲＡ−ＳＥ）６．６ｍｇと３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬをＤＭＦ中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍｌを４８ｍｌのエタノール、０．６ｍｌのＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）、２ｍｌの水、２ｍｌの２８％アンモニア水と３時間混合した。
　【００４８】
　上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回ずつ行った。
　得られたテトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行い、２００粒子の粒子径を測定したところ、平均粒径１０４ｎｍ、変動係数は１２％であった。
　【００４９】
　同様の方法で、Ｃｙ５−ＳＥ（ロシュ社製）を用いて平均粒子径２０、４２、１０３、２０４、４９８ｎｍのＣｙ５内包・シリカナノ粒子を得た。
　【００５０】
　また、同様の方法で、ＦＩＴＣ−ＳＥ（インビトロジェン社製）を用いて平均粒子径１０６ｎｍのＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子を得た。
　【００５１】
［手順２：蛍光物質内包粒子への抗体の結合］
　手順１で得られた蛍光物質内包シリカナノ粒子（テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子）のそれぞれを、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度が１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗体結合用シリカナノ粒子を得た。
　【００５２】
　一方、抗ヒトＥＲ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去することにより、シリカ粒子に結合可能な還元化抗体溶液を得た。
　【００５３】
　上記で得られた抗体結合用シリカナノ粒子と還元化抗体溶液とを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。
　【００５４】
［手順３：蛍光物質内包粒子を用いた組織染色］
　手順２で作製した抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子を用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。染色切片は、コスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理した後、組織アレイスライドを浸漬する液体をキシレン、エタノール、水の順に置換して洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドは、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、湿潤箱中で１時間１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液を用いてブロッキング処理を行った。
　【００５５】
　ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに希釈した各抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子を組織切片と３時間反応させた。抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質内包シリカナノ粒子と反応させた後、組織アレイスライドをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｍｅｒｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ａｑｕａｔｅｘを用いて封入した。
　【００５６】
［手順４：蛍光物質内包粒子を用いて染色した組織の輝点計測］
　手順３で染色した組織切片についてオリンパス社製ＤＳＵ共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフトウェア、Ｇ−ｃｏｕｎｔを用いて輝点の計測を行った。
　Ｃｙ５の観察は、励起フィルター（６４０／３０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（６６０ｎｍ）、蛍光フィルター（６９０／５０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
　テトラメチルローダミンの観察は、励起フィルター（５５０／２５ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（５７０ｎｍ）、蛍光フィルター（６０５／７０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
　ＦＩＴＣの観察は、励起フィルター（４７０／４０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（４９５ｎｍ）、蛍光フィルター（５２５／５０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
　組織アレイスライド中の予めＤＡＢ染色で染色濃度が異なることが予測された８スポットについて、各３０細胞の輝点の数を計測し、１細胞当たりの輝点の数（平均値）を求めた。また、同様に、８スポットについて、各３０細胞の発光輝度を計測し、１細胞当たりの発光輝度（平均値）を求めた。
　【００５７】
［比較例：蛍光色素単体を用いた組織染色］
　比較例として、Ｃｙ５、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣ蛍光色素単体に抗ヒトＥＲ抗体を結合させたものを用い、手順３と同様の方法で組織アレイスライドを染色し、手順４と同様の方法で組織の輝点を計測した。
　具体的には、組織アレイスライド中の８スポットについて、各３０細胞の輝点の数及び発光輝度を計測し、１細胞当たりの輝点の数及び１細胞当たりの発光輝度を求めた。
　【００５８】
［実験結果Ａ］
　まず、標識体に含まれる蛍光色素の違い（すなわち、発光波長の違い）によるバイオマーカー（ＥＲ）の検出感度の差について検討した。
　表１に、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０３ｎｍ）、テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０４ｎｍ）、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０６ｎｍ）のそれぞれを用いた場合に計測された１細胞当たりの輝点数を示す。表１において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示し、「＋」は、発光が強く、周囲の輝点と区別がつかないことを示している。
　【００５９】
　【表１】
　【００６０】
　表１に示すように、いずれの蛍光物質内包粒子を用いた場合でも、輝点数の差によりバイオマーカーの定量評価が可能となっている。ただし、スポット番号２の組織切片について、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子及びテトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、輝点数を計測可能であったのに対し、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、バックグラウンドレベル以上の輝点は計測されなかった。すなわち、励起波長が長いＣｙ５（励起波長６５０ｎｍ、発光波長６７０ｎｍ）、テトラメチルローダミン（励起波長５５０ｎｍ、発光波長５７０ｎｍ）の内包粒子の方が、ＦＩＴＣ（励起波長４９５ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）の内包粒子と比べて、より微量のバイオマーカーを検出できることがわかる。
　【００６１】
［実験結果Ｂ］
　次に、標識体の粒子径の違いによるバイオマーカー（ＥＲ）の検出感度の差について検討した。
　表２に、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子（平均粒子径２０、４２、１０３、２０４、４９８ｎｍ）のそれぞれと、Ｃｙ５色素単体（比較例）とを用いた場合に計測された１細胞当たりの輝点数を示す。表２において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示し、「＋」は、発光が強く、周囲の輝点と区別がつかないことを示している。
　【００６２】
　【表２】
　【００６３】
　表２に示すように、平均粒子径が４２、１０３、２０４、４９８ｎｍのＣｙ５内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、輝点数を計測可能な各スポットにおいて、輝点数の差によりバイオマーカーの定量評価が可能となっている。しかし、平均粒子径が４９８ｎｍのＣｙ５内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、スポット番号６の組織切片において輝点の区別がつかなくなっており、バイオマーカーが高頻度に発現している場合の定量範囲が狭まることがわかる。
　【００６４】
　また、Ｃｙ５色素単体を用いた場合、平均粒子径２０ｎｍのＣｙ５内包・シリカナノ粒子を用いた場合には、スポット番号１〜４の組織切片では、バックグラウンドレベル以上の輝点がなく、スポット番号５〜８の組織切片では、周囲の輝点と区別がつかないため、微量のバイオマーカーに対する輝点レベルの定量評価が不可能なことがわかる。
　【００６５】
［実験結果Ｃ］
　次に、蛍光色素内包粒子と蛍光色素単体とによるバイオマーカー（ＥＲ）の検出感度を輝点数で比較した。
　表３に、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０３ｎｍ）、テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０４ｎｍ）、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０６ｎｍ）、Ｃｙ５、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣのそれぞれを用いた場合に計測された１細胞当たりの輝点数を示す。表３において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示し、「＋」は、発光が強く、周囲の輝点と区別がつかないことを示している。
　【００６６】
　【表３】
　【００６７】
　表３から、蛍光色素単体を用いて組織染色を行った場合には、スポット番号１〜４の組織切片では、バックグラウンドレベル以上の輝点がなく、スポット番号５〜８の組織切片では、周囲の輝点と区別がつかないため、微量のバイオマーカーに対する輝点レベルの定量評価が不可能なことがわかる。
　一方、標識体として蛍光物質内包粒子を用いた場合には、微量のバイオマーカーに対しても、精度良く定量的に検出することができる。
　【００６８】
［実験結果Ｄ］
　次に、蛍光色素内包粒子と蛍光色素単体とによるバイオマーカー（ＥＲ）の検出感度を発光輝度で比較した。
　表４に、Ｃｙ５内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０３ｎｍ）、テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０４ｎｍ）、ＦＩＴＣ内包・シリカナノ粒子（平均粒子径１０６ｎｍ）、Ｃｙ５、テトラメチルローダミン、ＦＩＴＣのそれぞれを用いた場合に、ＤＳＵ共焦点顕微鏡により取得された画像データに基づいて計測された１細胞当たりの発光輝度を示す。発光輝度の単位はａ．ｕ．（任意単位）である。表４において、「０」は、バックグラウンドレベル以下の発光であることを示している。
　【００６９】
　【表４】
　【００７０】
　表４から、蛍光色素単体を用いた場合と比較して、蛍光物質内包粒子を用いた場合には、より微量なバイオマーカーを検出可能なことがわかる。
　【００７１】
　以上説明したように、蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いることにより、組織切片を蛍光観察する際の１粒子当たりの輝度が高くなるため、微量のバイオマーカー（生体物質認識部位に対応する生体物質）を感度良く、定量的に検出することができる。
　【００７２】
　また、蛍光物質を複数内包した粒子を用いる場合には、蛍光物質が粒子に内包されることにより、蛍光物質の耐久性が高まる。
　【実施例２】
　【００７３】
［手順１：蛍光物質集積粒子の合成］
　テトラメチルローダミン（インビトロジェン社製ＴＡＭＲＡ−ＳＥ）（励起波長５５０ｎｍ、発光波長５７０ｎｍ）６．６ｍｇと３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬをＤＭＦ中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍｌを４８ｍｌのエタノール、０．６ｍｌのＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）、２ｍｌの水、２ｍｌの２８％アンモニア水と３時間混合した。
　【００７４】
　上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回ずつ行った。
　得られたテトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行い、２００粒子の粒子径を測定したところ、平均粒径１０４ｎｍ、変動係数は１２％であった。
　【００７５】
　同様の方法で、Ｃｙ５−ＳＥ（ロシュ社製）（励起波長６５０ｎｍ、発光波長６７０ｎｍ）を用いて平均粒子径１０３ｎｍのＣｙ５集積・シリカナノ粒子を得た。
　【００７６】
［手順２：蛍光物質集積粒子と量子ドットへの抗体の結合］
　手順１で得られた蛍光物質集積シリカナノ粒子（テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子）のそれぞれを、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度が１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗体結合用シリカナノ粒子を得た。
　【００７７】
　一方、抗ヒトＥＲ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去することにより、シリカ粒子に結合可能な還元化抗体溶液を得た。
　【００７８】
　上記で得られた抗体結合用シリカナノ粒子と還元化抗体溶液とを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質集積シリカナノ粒子を得た。
　【００７９】
　インビトロジェン社製ＱＤ６５５抗体標識キット（Ｑ２２０２１ＭＰ）を用いて量子ドットに抗ヒトＥＲ抗体を結合させた。抗体の結合はキットの処方にしたがい、ＳＭＣＣによる量子ドットの活性化、ＤＴＴによる抗体の還元工程を経て、量子ドットと抗体の結合反応を行うことで行った。
　【００８０】
［手順３：蛍光物質集積粒子と量子ドットを用いた組織染色］
　手順２で作製した抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質集積シリカナノ粒子と抗ヒトＥＲ抗体結合・量子ドットを用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。染色切片は、コスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理した後、組織アレイスライドを浸漬する液体をキシレン、エタノール、水の順に置換して洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドは、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、湿潤箱中で１時間１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液を用いてブロッキング処理を行った。
　【００８１】
　ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに希釈した各抗ヒトＥＲ抗体結合・蛍光物質集積シリカナノ粒子又は抗ヒトＥＲ抗体結合・量子ドットを組織切片と３時間反応させた。その後、組織アレイスライドをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｍｅｒｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ａｑｕａｔｅｘを用いて封入した。
　【００８２】
［手順４：染色した組織の輝点、輝度、粒子数計測］
　手順３で染色した組織切片についてオリンパス社製ＤＳＵ共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフトウェア、Ｇ−ｃｏｕｎｔを用いて輝点の計測を行った。
　Ｃｙ５の観察は、励起フィルター（６４０／３０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（６６０ｎｍ）、蛍光フィルター（６９０／５０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
　テトラメチルローダミンの観察は、励起フィルター（５５０／２５ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（５７０ｎｍ）、蛍光フィルター（６０５／７０ｎｍのバンドパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
　ＱＤ６５５の観察は、励起フィルター（３５０／５０ｎｍのバンドパスフィルター）、ビームスプリッター（４００ｎｍ）、蛍光フィルター（５９０ｎｍのロングパスフィルター）のフィルターセットを用いた。
　組織アレイスライド中の予めＤＡＢ染色で染色濃度が異なることが予測された８スポットについて、各６０細胞の輝点の数と各輝点の輝度を計測した。
　【００８３】
［実験結果Ａ］
　まず、蛍光物質集積粒子や量子ドットを用いた場合に得られた各輝点の輝度分布（輝度毎の輝点数）に基づいて、１粒子当たりの輝度を求めた。具体的には、輝度分布から、最も頻度の高い輝度を１粒子当たりの輝度とする。
　Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれを用い、８スポット（各スポットにつき各６０細胞）から輝点を計測した。その結果、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子を用いた測定では輝度８２の輝点数が最も多く、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子を用いた測定では輝度６９の輝点数が最も多く、ＱＤ６５５を用いた測定では輝度６４の輝点数が最も多かった。
　【００８４】
　表５に、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれを用いた場合の、８スポット全体（６０細胞×８スポット）から計測された各輝点の輝度分布を示す。輝度の単位はａ．ｕ．（任意単位）である。表５は、輝度が０−３０、３１−６０、６１−９０、９１−１２０、１２１−１５０、１５１−１８０、１８１−２１０、２１１−２５５の範囲の輝点数を示している。
　【００８５】
　【表５】
　【００８６】
　表５から、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子では、輝度が６１−９０、１５１−１８０、２１１−２５５の範囲にピークが存在していることがわかる。Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子では、輝度８２の輝点数が最も多いため、輝度１５１−１８０に含まれる輝点は２粒子分の合計輝度であり、輝度２１１−２５５に含まれる輝点は３粒子分の合計輝度であることがわかる。このように、輝度分布に基づいて、蛍光物質集積粒子や量子ドット１粒子当たりの輝度を求めることができる。
　【００８７】
［実験結果Ｂ］
　次に、実験結果Ａの結果に基づいて、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子では１粒子当たりの輝度を８２、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子では１粒子当たりの輝度を６９、ＱＤ６５５では１粒子当たりの輝度を６４と仮定して、各スポットでの「１細胞当たりの輝度の和」を「１粒子当たりの輝度」で割ることで、各スポットでの「１細胞当たりの粒子数」を求めた。
　表６に、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれを用いた場合の、各スポットでの１細胞当たりの粒子数を示す。表６において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示している。
　【００８８】
　【表６】
　【００８９】
　表６に示すように、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれについて、１細胞当たりの粒子数の差によりバイオマーカーの発現レベルを定量的に評価することができる。しかし、より微量のバイオマーカーに対する輝点レベルの定量評価（スポット番号２、３）においては、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子を用いた場合の方が、ＱＤ６５５を用いた場合よりも、検出感度が優れていることがわかる。
　【００９０】
［実験結果Ｃ］
　次に、蛍光物質集積粒子又は量子ドットを用いて染色した組織における輝点の経時変化について検討した。
　手順３で染色した組織切片を作製してから０日、３日、３０日、９０日後に、手順４に従って組織アレイスライド中のスポット番号６の組織切片の６０細胞に含まれる輝点の数と各輝点の輝度を計測した。次いで、実験結果Ｂと同様の方法で、１細胞当たりの粒子数を算出した。また、各輝点の輝度の和を細胞数で割ることにより、１細胞当たりの輝度を算出した。
　図１に、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５のそれぞれを用いた場合の、スポット番号６の組織切片について算出された１細胞当たりの粒子数と１細胞当たりの輝度の経時変化を示す。
　図１から、１細胞当たりの輝度は、組織切片の作製から時間が経過するにつれて次第に減少しているが、１細胞当たりの粒子数は、組織切片作製後９０日後も安定した数値を示すことがわかる。すなわち、各粒子が発する蛍光輝度は次第に減少するが、組織切片に存在するバイオマーカーと結合した粒子の数は変化しない。したがって、１細胞当たりの粒子数の差に基づいてバイオマーカーの発現レベルを定量的に評価することで、より安定した評価結果を得ることができる。
　【００９１】
［実験結果Ｄ］
　次に、蛍光物質集積粒子や量子ドットを用いて染色した場合と蛍光色素単体を用いた場合とを比較した。
　蛍光色素単体を用いた場合の例として、Ｃｙ５、テトラメチルローダミンに抗ヒトＥＲ抗体を結合させたものを用い、手順３と同様の方法で組織アレイスライドを染色し、手順４と同様の方法で組織アレイスライド中の８スポットについて、各６０細胞に含まれる輝点の数と各輝点の輝度を計測した。次いで、実験結果Ｂと同様の方法で、１細胞当たりの粒子数を算出した。
　【００９２】
　表７に、Ｃｙ５集積・シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積・シリカナノ粒子、ＱＤ６５５、Ｃｙ５、テトラメチルローダミンのそれぞれを用いた場合の、各スポットでの１細胞当たりの粒子数を示す。表７において、「−」は、バックグラウンドレベル以上の発光がないことを示し、「＋」は、バックグラウンドレベル以上の発光はあるが、輝点の判定はできないことを示している。
　【００９３】
　【表７】
　【００９４】
　表７から、蛍光色素単体での組織染色では、バイオマーカーに対する輝点レベルでの定量評価が不可能であることがわかる。
　【００９５】
　以上説明したように、組織切片から計測された蛍光輝点の数に基づいて、生体物質の発現レベルを評価するので、生体物質の定量評価において、安定した評価結果を得ることができる。
　【００９６】
　また、蛍光物質を複数集積した蛍光物質集積粒子を用いることにより、蛍光観察時の１粒子当たりの輝度が高くなるため、微量の生体物質を感度良く、定量的に検出することができる。
　【実施例３】
　【００９７】
［蛍光物質内包ナノ粒子ａ〜ｆの合成］
［合成例１：蛍光有機色素内包シリカ：Ｃｙ５内包シリカナノ粒子の合成］
　下記工程（１）〜（４）の方法により、「ナノ粒子ａ」を作製した。
　工程（１）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）１ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）とテトラエトキシシラン　４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）とを混合した。
　工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
　工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
　工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
　得られたシリカナノ粒子ａの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径は１１０ｎｍ、変動係数は１２％であった。
　【００９８】
［合成例２：蛍光有機色素内包シリカ：ＴＡＭＲＡ内包シリカナノ粒子の合成］
　下記工程（１）〜（４）の方法により、「ナノ粒子ｂ」を作製した。
　工程（１）：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）２ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）とテトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）とを混合した。
　工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
　工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
　工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
　得られたシリカナノ粒子ｂの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径は１００ｎｍ、変動係数は１５％であった。
　【００９９】
［合成例３：量子ドット内包シリカ：発光波長６５５ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子の合成］
　下記工程（１）〜（４）の方法により、「ナノ粒子ｃ」を作製した。
　工程（１）：ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ６５５）１０μＬとテトラエトキシシラン４０μＬとを混合した。
　工程（２）：エタノール４ｍＬ、１４％アンモニア水１ｍＬを混合した。
　工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
　工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
　得られたシリカナノ粒子ｃのＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径は１３０ｎｍ、変動係数は１３％であった。
　【０１００】
［合成例４：量子ドット内包シリカ：発光波長５８５ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子の合成］
　下記工程（１）〜（４）の方法により、「ナノ粒子ｄ」を作製した。
　工程（１）：ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ５８５）１０μＬとテトラエトキシシラン４０μＬとを混合した。
　工程（２）：エタノール４ｍＬ、１４％アンモニア水１ｍＬを混合した。
　工程（３）：工程（２）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
　工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
　得られたシリカナノ粒子ｄのＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径は１２０ｎｍ、変動係数は１２％であった。
　【０１０１】
［合成例５：蛍光有機内包ポリスチレンナノ粒子：Ｃｙ５内包ポリスチレンナノ粒子の合成］
　下記工程（１）〜（３）の方法により、「ナノ粒子ｅ」を作製した。
　工程（１）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）１ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン６０μＬ、エタノール１２０μＬに溶解させた。
　工程（２）：表面官能基アミノ基で粒径１００ｎｍポリスチレンナノ粒子水分散液（ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）１．５ｍＬを激しく撹拌しているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
　工程（３）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
　得られたポリスチレンナノ粒子ｅのＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径は１００ｎｍ、変動係数は５％であった。
　【０１０２】
［合成例６：蛍光有機内包ポリスチレンナノ粒子：ＴＡＭＲＡ内包ポリスチレンナノ粒子の合成］
　下記工程（１）〜（３）の方法により、「ナノ粒子ｆ」を作製した。
　工程（１）：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）２ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン６０μＬ、エタノール１２０μＬに溶解させた。
　工程（２）：表面官能基アミノ基で粒径１００ｎｍポリスチレンナノ粒子水分散液（ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）１．５ｍＬを激しく撹拌しているところに、工程（１）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
　工程（３）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
　得られたポリスチレンナノ粒子ｆのＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径は１００ｎｍ、変動係数は６％であった。
　【０１０３】
［蛍光物質内包シリカナノ粒子への抗体の結合］
　蛍光物質内包シリカナノ粒子ａ〜ｄに対し、以下の手順により抗体結合を行った。
　詳しくは、ナノ粒子ａ，ｃに対して工程（１）〜（７），工程（８）〜（９），工程（１２）〜（１４）の操作をおこなって抗体を結合し「粒子Ａ，Ｃ」を形成し、ナノ粒子ｂ，ｄに対して工程（１）〜（７），工程（１０）〜（１１），工程（１５）〜（１７）の操作をおこなって抗体を結合し「粒子Ｂ，Ｄ」を形成した。
　【０１０４】
　工程（１）：１ｍｇのナノ粒子ａ〜ｄを純水５ｍＬに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
　工程（２）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
　工程（３）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ａ〜ｄのＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。
　工程（４）：工程（３）で得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ａ〜ｄを、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整した。
　工程（５）：工程（４）で調整した溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。
　工程（６）：反応混合液を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
　工程（７）：ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬＰＢＳを用い再分散させた。
　【０１０５】
　工程（８）：１００μｇの抗ヒトＥＲ抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
　工程（９）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液を得た。
　【０１０６】
　工程（１０）：１００μｇの抗ＨＥＲ２抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
　工程（１１）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液を得た。
　【０１０７】
　工程（１２）：粒子ａまたは粒子ｃを出発原料にして、工程（７）で得られた粒子分散液と工程（９）で得られた還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
　工程（１３）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程（１４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用い再分散させ、抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光物質内包シリカナノ粒子Ａおよび粒子Ｃを得た。
　【０１０８】
　工程（１５）：粒子ｂまたは粒子ｄを出発原料にして、工程（７）で得られた粒子分散液と工程（１１）で得られた還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
　工程（１６）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程（１７）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用い再分散させ、抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光物質内包シリカナノ粒子Ｂおよび粒子Ｄを得た。
　【０１０９】
［蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子への抗体の結合］
　蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ｅ，ｆに対し、以下の手順により抗体結合を行った。
　詳しくは、ナノ粒子ｅに対して工程（１）〜（２），工程（５）〜（７）の操作をおこなって抗体を結合し「粒子Ｅ」を形成し、ナノ粒子ｆに対して工程（３）〜（４），工程（８）〜（１０）の操作をおこなって抗体を結合し「粒子Ｆ」を形成した。
　【０１１０】
　工程（１）：１００μｇの抗ヒトＥＲ抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
　工程（２）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液を得た。
　【０１１１】
　工程（３）：１００μｇの抗ＨＥＲ２抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
　工程（４）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液を得た。
　【０１１２】
　工程（５）：粒子ｅの分散液と工程（２）で得られた還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
　工程（６）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程（７）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用い再分散させ、抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子Ｅを得た。
　【０１１３】
　工程（８）：粒子ｆの分散液と工程（４）で得られた還元化抗ヒトＨＥＲ２抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
　工程（９）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程（１０）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用い再分散させ、抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子Ｆを得た。
　【０１１４】
［蛍光物質への抗体結合］
　比較として、抗ヒトＥＲ抗体をＣｙ５に結合させた「色素Ｇ」と、抗ＨＥＲ２抗体をＴＡＭＲＡに結合させた「色素Ｈ」とを、以下の手順により作製した。
　詳しくは、工程（１）〜（２），工程（５）〜（６），工程（９）〜（１１）の操作をおこなって色素Ｇを形成し、工程（３）〜（４），工程（７）〜（８），工程（１２）〜（１４）の操作をおこなって色素Ｈを形成した。
　【０１１５】
　工程（１）：１００μｇの抗ヒトＥＲ抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
　工程（２）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液を得た。
　【０１１６】
　工程（３）：１００μｇの抗ＨＥＲ２抗体を１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
　工程（４）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液を得た。
　【０１１７】
　工程（５）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）１ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整した。
　工程（６）：工程（５）で調整した溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。
　【０１１８】
　工程（７）：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製）２ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整した。
　工程（８）：工程（７）で調整した溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。
　【０１１９】
　工程（９）：工程（６）で得られた反応混合物に、工程（２）で得られた還元化抗ヒトＥＲ抗体溶液をＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
　工程（１０）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程（１１）：ゲルろ過カラムにより過剰のメルカプトエタノールを除去し、Ｃｙ５結合した還元化抗ＥＲ２抗体溶液（色素Ｇ）を得た。
　【０１２０】
　工程（１２）：工程（６）で得られた反応混合物に工程（４）で得られた還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液をＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
　工程（１３）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程（１４）：ゲルろ過カラムにより過剰のメルカプトエタノールを除去し、ＴＡＭＲＡ結合した還元化抗ＨＥＲ２抗体溶液（色素Ｈ）を得た。
　【０１２１】
　以上の処理により形成した粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈの特性を表８に示す。
　【０１２２】
　【表８】
　【０１２３】
［評価実験：（１）粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈを用いた組織染色］
　作製した粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈを用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。
　染色切片はコスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。あらかじめＤＡＢ染色によりＥＲおよびＨＥＲ２染色濃度を観察し、（１）ＥＲ発現量が高くてＨＥＲ２発現量も高い、（２）ＥＲ発現量が高くてＨＥＲ２発現量が低い、（３）ＥＲ発現量が低くてＨＥＲ２発現量も低い異なる３種のロットを用意し、それぞれ染色を行った。
　【０１２４】
　（１）：キシレンを入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回キシレンを交換した。
　（２）：エタノールを入れた容器に病理切片を３０分浸漬させた。途中３回エタノールを交換した。
　（３）：水を入れた容器に、病理切片を３０分浸漬させた。途中３回水を交換した。
　（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に病理切片を３０分浸漬させた。
　（５）：１２１℃で１０分オートクレーブ処理を行った。
　（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を３０分浸漬させた。
　（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織に載せて、１時間放置した。
　【０１２５】
　（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ａ１０μＬと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｂ１０μＬとを混合し、組織に載せて３時間放置した。
　（９）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｃ１０μＬと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｄ１０μＬとを混合し、（８）とは別なスライドの組織に載せて３時間放置した。
　（１０）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ヒトＥＲ抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｅ１０μＬと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子Ｆ１０μＬとを混合し、（８）および（９）とは別なスライドの組織に載せて３時間放置した。
　（１１）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ヒトＥＲ抗体結合した色素Ｇ１０μＬと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体結合した色素Ｈ１０μＬとを混合し、（８）〜（１０）とは別なスライドの組織に載せて３時間放置した。
　【０１２６】
　（１２）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ３０分浸漬させた。
　（１３）：Ｍｅｒｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ａｑｕａｔｅｘを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。
　【０１２７】
［評価実験：（２）粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈを用いて染色した組織の輝点計測］
　染色した組織切片に励起光を照射して蛍光発光させ、その組織切片からオリンパス社製ＤＳＵ共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオンオングストロング社製輝点計測ソフト、Ｇ−ｃｏｕｎｔを用いて輝点数および発光輝度を計測した。
　Ｃｙ５およびＱｄｏｔ６５５については、励起波長６３３ｎｍ、検出波長６６０ｎｍとした。ＴＡＭＲＡおよびＱｄｏｔ５８５については、励起波長５４３ｎｍ、検出波長５８０ｎｍとして観察を行った。
　輝点数は、組織アレイスライド中の８スポットについて各３０細胞の輝点を計測し、その平均値を求めた。発光輝度は、８スポットそれぞれについて視野全体の蛍光強度を合算し、その平均値を求めた。
　【０１２８】
　表９，表１０に、３種のロットと粒子Ａ〜Ｆ，色素Ｇ〜Ｈの組合せとに応じた「実験例１〜７」における輝点数および発光輝度の計測結果を示す。
　【０１２９】
　【表９】
　【０１３０】
　【表１０】
　【０１３１】
　表９から、蛍光有機色素を単独で抗体に結合した実験例４では、蛍光強度が弱くバックグランド光と区別がつかず、標的とする生体物質が検出できなかった。これに対し、蛍光物質内包粒子を用いた実験例１〜３では、蛍光強度が高く、標的とする生体物質の検出が容易に可能となった。
　表１０から、ＥＲ２およびＨＥＲ２の発現量の異なる切片を用いた実験例５〜７では、それぞれの発現量に応じて輝点数および蛍光強度が変化しており、蛍光物質，生体物質認識部位が互いに異なる粒子を染色試薬として使用すれば、複数の生体物質の発現レベルを同一切片で計測できることがわかった。
　【産業上の利用可能性】
　【０１３２】
　本発明は、微量の生体物質を定量的に検出するのに好適に利用することができる。
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】
　
生体物質認識部位が結合された、
を、染色試薬として用いて組織切片を染色した情報から、前記樹脂粒子に基づく輝点数及び／又は発光輝度を計測するために行う
　前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子が、前記蛍光物質が
前記樹脂粒子内部
前記樹脂粒子外部
当該樹脂粒子の平均粒子径が３０ｎｍ〜８００ｎｍであり、
って、
　
目的とする生体物質と前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子とを、反応させたのち、未反応の前記蛍光物質を複数集積した樹脂粒子を除去する工程を有する、
　【請求項２】
　請求項１に記載の組織染色方法において、
　前記蛍光物質が
前記樹脂粒子内部
　【請求項３】　
（削除）
　【請求項４】
　病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法において、
　染色試薬を用いて前記病理切片を染色する工程と、
　染色後の前記病理切片から前記生体物質を検出する工程とを、有しており、
　前記病理切片を染色する工程では、前記染色試薬として、第１の生体物質認識部位が結合し、かつ、第１の蛍光物質を複数集積した第１の樹脂粒子と、前記第１の生体物質認識部位とは異なる第２の生体物質認識部位が結合し、かつ、前記第１の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する第２の蛍光物質を複数集積した第２の樹脂粒子とを、用い、
　前記第１の樹脂粒子が、前記第１の蛍光物質が
前記第１の樹脂粒子内部
前記第１の樹脂粒子外部
　前記第２の樹脂粒子が、前記第２の蛍光物質が
前記第２の樹脂粒子内部
前記第２の樹脂粒子外部
　
前記第１及び第２の樹脂粒子の平均粒子径がそれぞれ３０ｎｍ〜８００ｎｍであり、
　【請求項５】
　病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法において、
　染色試薬を用いて前記病理切片を染色する工程と、
　染色後の前記病理切片から前記生体物質を検出する工程とを、有しており、
　前記病理切片を染色する工程では、前記染色試薬として、第１の生体物質認識部位が結合し、かつ、有機蛍光色素である第１の蛍光物質を複数集積した第１の粒子と、前記第１の生体物質認識部位とは異なる第２の生体物質認識部位が結合し、かつ、前記第１の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する有機蛍光色素である第２の蛍光物質を複数集積した第２の粒子とを、用い、
　前記生体物質を検出する工程では、
　前記第１の粒子及び前記第２の粒子における１粒子あたりの輝度と、
　輝点数の計測に基づいて求められる輝度分布のピーク値と、から、
　前記第１の粒子及び前記第２の粒子の数を求めることを特徴とする生体物質検出方法。
　【請求項６】
　請求項４または５に記載の生体物質検出方法において、
　前記第１の生体物質認識部位が抗ヒトＥＲ抗体であり、
　前記第２の生体物質認識部位が抗ＨＥＲ２抗体であることを特徴とする生体物質検出方法。