(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の組成物を含むポリヌクレオチドライブラリーであって、
該ライブラリーが、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域、または、T細胞受容体のαおよびβの可変領域であって、同一のクローンファミリー由来の可変領域をコードするcDNAを含み、
各組成物が独立容器中に存在しており、
各組成物が、以下の(i)に記載の単一試料由来cDNA分子および（ii）に記載の試料同定領域を含み、
(i) 以下のaまたはbに記載のcDNA分子を含む単一試料由来cDNA分子
a. 1つまたは複数のB細胞由来の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするcDNA分子、および、1つまたは複数のB細胞由来の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするcDNA分子、または
b. 1つまたは複数のT細胞由来のT細胞受容体α鎖配列をコードするcDNA分子、および、1つまたは複数のT細胞由来のT細胞受容体β鎖配列をコードするcDNA分子
(ii) 該cDNA分子に取り付けられている試料同定領域
該試料同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の他の独立容器中に存在している他の組成物の試料同定領域のヌクレオチド配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項２】
アダプター領域によってcDNA分子が試料同定領域に取り付けられている、請求項1記載のライブラリー。
【請求項３】
アダプター領域がその3'端にヌクレオチドdGを含み、cDNA分子が3'端にヌクレオチドCを含む、請求項2記載のライブラリー。
【請求項４】
各組成物が、試料同定領域に取り付けられたユニバーサルプライマー領域をさらに含み、該ユニバーサルプライマー領域が、各独立容器中で実質的に同一である、請求項1から3のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項５】
単一試料由来cDNA分子が、1つまたは複数のB細胞由来の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする、請求項1から4のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項６】
1つまたは複数のB細胞が形質芽球である、請求項5記載のライブラリー。
【請求項７】
1つまたは複数のB細胞がマウスB細胞である、請求項5または6記載のライブラリー。
【請求項８】
単一試料が単一B細胞である、請求項5から7のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項９】
単一試料由来cDNA分子が、1つまたは複数のT細胞由来のT細胞受容体α鎖配列およびT細胞受容体β鎖配列をコードする、請求項1から4のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項１０】
単一試料が単一T細胞である、請求項9記載のライブラリー。
【請求項１１】
複数の組成物を含むポリヌクレオチドライブラリーであって、
各組成物が独立容器中に存在しており、
該組成物が、単一試料由来の複数のcDNA分子であって、各cDNA分子が3'端にヌクレオチドCを含むcDNA分子と、アダプター領域に連結した試料同定領域を含む試料同定-アダプター領域とを含み、
各試料同定-アダプター領域の試料同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の他の組成物の他の試料同定-アダプター領域の試料同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、
試料同定-アダプター領域が組成物中のcDNA分子に共有結合的に取り付けられており、
単一試料由来のcDNA分子が、
(i) 1つまたは複数のB細胞由来の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするcDNA分子、および、1つまたは複数のB細胞由来の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするcDNA分子、または
(ii) 1つまたは複数のT細胞由来のT細胞受容体α鎖配列をコードするcDNA分子、および、1つまたは複数のT細胞由来のT細胞受容体β鎖配列をコードするcDNA分子
を含む、ポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項１２】
各cDNA分子が可変領域を含む、請求項11記載のライブラリー。
【請求項１３】
可変領域がB細胞免疫グロブリン可変領域である、請求項12記載のライブラリー。
【請求項１４】
可変領域がT細胞受容体可変領域である、請求項12記載のライブラリー。
【請求項１５】
各組成物が、試料同定領域に取り付けられたユニバーサルプライマー領域をさらに含み、該ユニバーサルプライマー領域が、各独立容器中で実質的に同一である、請求項11から14のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項１６】
単一試料が単一B細胞であるかまたは単一T細胞である、請求項11記載のライブラリー。
【請求項１７】
単一B細胞が単一形質芽球である、請求項16記載のライブラリー。
【請求項１８】
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
請求項1〜17のいずれか一項記載のライブラリーを取得する工程；および
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、ポリヌクレオチドライブラリーを1セットのプライマーで増幅する工程。
【請求項１９】
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを配列決定する工程；および
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを選択する工程
をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
プライマーのセットが、1つまたは複数の3'遺伝子特異的プライマー、および任意で5'ユニバーサルプライマーを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
配列決定データを解析しかつ使用するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
請求項1から17のいずれか一項記載のライブラリーから得られる複数のポリヌクレオチドに関連するデータセットを取得する工程であって、データセットが複数のポリヌクレオチドに関する配列決定データを含み、複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドが試料同定領域を含み、各ポリヌクレオチドの各試料同定領域が単一試料に関して固有であって、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、複数のポリヌクレオチド中の第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なるように固有である、工程；
同一の試料同定領域を有するポリヌクレオチドに関連するデータをマッチングさせるためにデータセットをコンピューターで解析する工程であって、マッチはポリヌクレオチドが同じ試料に由来したことを示す、工程；ならびに
コードされた免疫グロブリンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対、または、コードされたT細胞受容体のα鎖配列およびβ鎖配列の対の結合活性を分析するために、同じ試料に由来するポリヌクレオチドをコードするcDNAを選択し、かつ、クローニングする工程。
【請求項２２】
cDNA分子および試料同定領域が、同じDNA鎖に取り込まれている、請求項1から17のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項２３】
組成物が（i）cDNA分子の少なくとも一部および（ii）試料同定領域に相補的なDNA分子をさらに含む、請求項1から17のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項２４】
cDNA分子が、その3'端にCCC配列を含む、請求項3記載のライブラリー。
【請求項２５】
組成物中の可変領域をコードするcDNA分子が同じ細胞に由来する、請求項1から17のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項２６】
少なくとも2つの免疫グロブリンの重鎖可変領域または少なくとも2つの免疫グロブリン軽鎖可変領域が、少なくとも80〜99％の配列同一性を共有している、請求項1から8、11から13、16、および、17のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項２７】
各免疫グロブリンの重鎖可変領域または各免疫グロブリン軽鎖可変領域が、少なくとも80〜99％の配列同一性を示す、請求項1から8、11から13、16、および、17のいずれか一項記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示の全体がすべての目的に関して参照により本明細書に組み入れられる、2011年4月28日出願の米国特許仮出願第61/517,976号、2011年8月24日出願の米国特許仮出願第61/575,652号、2012年2月16日出願の米国特許仮出願第61/599,870号、および2012年3月8日出願の米国特許仮出願第61/608,571号に関する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所によって与えられたN01-HV-28183 NHLBI Proteomics CenterおよびN01-HV-00242 NHLBI Proteomics Centerの下での政府援助を得てなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、印刷された紙コピーの代わりにCD-Rによって提出された、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、「非常に長い」配列表を含む。2012年4月25日に記録された該CD-Rは、それぞれ「CRF」、「コピー1-配列表部分」、「コピー2-配列表部分」および「コピー3-配列表部分」のラベルが貼付されており、各々が、20786PCT＿CRF＿Sequencelising.EXE（138,571,776バイト）と題された1つだけの自己解凍ファイルを含み、該ファイルには、その後20786PCT＿CRF＿Sequencelisting.TXT（795,566,080バイト）と題された1つの圧縮されていないASCIIテキストファイルが含まれる。
【背景技術】
【０００４】
背景
ヒト供給源から治療用モノクローナル抗体を生産することは生物学的および技術的に困難な課題である。これまでに、ヒトハイブリドーマの作製、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウスの使用、およびヒト免疫グロブリンファージディスプレイライブラリの使用を含む、いくつかのアプローチが記述されている。
【０００５】
ヒト骨髄腫融合パートナーは、そのマウス対応物と異なり、ハイブリドーマを作製するうえで効率的ではないため、ヒトハイブリドーマは作製が困難であると考えられる。ヒトハイブリドーマはまた、長期的な培養後、発現された抗体遺伝子を自然に喪失する傾向がある。Epstein-Barrウイルス（EBV）形質転換はB細胞を不死化するが、すべてのEBV形質転換B細胞のうち極めてわずかな割合しか親和性成熟せず、または標的抗原を認識しない。ハイブリドーマの作製は、典型的には治療用モノクローナル抗体を得るための多数のスクリーニングを含む。米国食品医薬品局によって現在承認されている治療用モノクローナル抗体のいずれもが、ヒトハイブリドーマの作製またはB細胞のEBV形質転換を通して創製されたものではなく、これらの方法によって課せられる技術的な困難さと課題を裏付けている。
【０００６】
ヒト抗体配列のファージディスプレイライブラリは、治療用ヒトモノクローナル抗体を生産するための別の方法である。この方法は、ヒト抗体重鎖および軽鎖配列を一緒にランダムに発現する組換えDNA技術を利用して、標的抗原に結合する組合せをスクリーニングすることを可能にする。しかし、この方法は親和性成熟した抗体を生産せず、またこの方法で生産される抗体は通常、低い親和性およびアビディティで抗原に結合する。そこで、高親和性抗体を作製するには連続的な突然変異および選択/スクリーニング工程が必要である。
【０００７】
治療用ヒトモノクローナル抗体を生産する別の方法は、ヒト抗体レパートリーを有するトランスジェニックマウスを創製するかまたは使用することによるものである。免疫化した場合、そのようなマウスは免疫抗原を標的とする抗体を産生し、その後治療用ヒトモノクローナル抗体の生産のためのハイブリドーマを作製することができる。このようなトランスジェニックマウスは特許で保護されており、一般にヒト抗体を作製する場合の使用のために入手可能ではない。
【０００８】
したがって、本発明者らは、例えば、多大の労力と時間を要する抗体のヒト化の必要性、または広範なスクリーニングを実施する必要性を回避しつつ、大量の親和性成熟ヒト抗体を生産することができる組成物、キットおよび方法の必要性を確認した。本明細書で述べる組成物、キットおよび方法はこの必要性に対処するものである。加えて、本明細書で述べる組成物、キットおよび方法は、ヒト抗体空間の外で幅広く適用でき、例えば、単一試料に由来し、ポリヌクレオチドのライブラリ中に存在する関心対象の2つまたは複数のポリヌクレオチドをマッチングさせることを含む、数多くの異なる適用において使用することができる。
【発明の概要】
【０００９】
概要
本明細書では、ポリヌクレオチドを含む組成物であって、該ポリヌクレオチドが、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と、少なくとも一つの同定領域を含む第二の領域とを含み、該第一の領域が該第二の領域に連結している、組成物が開示される。
【００１０】
いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が、直径8μm以上の活性化ヒトB細胞から単離されたIgG免疫グロブリンヌクレオチド配列のVDJ領域を含み、免疫グロブリン領域の5'端が同定領域の3'端に連結している。いくつかの局面では、組成物がクローンファミリーに含まれる。
【００１１】
いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、活性化B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、形質芽球であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、単一のB細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、単一の活性化B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の血中にある単一の活性化B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、ヒト活性化B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、メモリーB細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、形質細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、抗原特異的B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、哺乳動物B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、ヒトB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、マウスB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、関心対象の疾患または状態を有する対象由来のB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、関心対象の疾患または状態から回復しているかまたは回復した対象由来のB細胞、から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、少なくとも一つの関心対象の抗原を投与された対象由来のB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、少なくとも一つの関心対象の抗原とアジュバントとを投与された対象由来のB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の血中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の骨髄中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の脾臓中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の少なくとも一つのリンパ節中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象のリンパ組織中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の腸中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が直径約8〜20μmの活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、直径が8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20μmであるか、または20μmより大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される。いくつかの局面では、面積が約60、70、80、90、100、120、130、140、150、200、250、300、または350μm2であるか、または350μm2より大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される。いくつかの局面では、体積が約250、268、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、もしくは4000μm3であるか、または4000μm3より大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが10％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが15％以上���きい直径を有する活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが20％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、免疫グロブリンを分泌する能力を有する活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、細胞周期の第一間期（G1期）、合成期（S期）、第二間期（G2期）、または有糸分裂期（M期）にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、細胞周期の休止期（G0期）にはないB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、フローサイトメトリーによって休止Bリンパ球のFSC平均値の1.2倍より大きいFSCを有すると特徴づけられるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、フローサイトメトリーによってヒト単球のFSC平均値の0.7〜1.15倍のFSC平均値を有すると特徴づけられるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD19陽性B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD38陽性B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD27陽性B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD20陰性B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD19＋CD20-CD27＋CD38hiB細胞から単離される。
【００１２】
いくつかの局面では、免疫グロブリン領域の5'端が同定領域の3'端に連結している。
【００１３】
いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のVDJ領域を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のVJ領域を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のV、D、および/またはJ領域を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列の重鎖および/または軽鎖を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が、IgG、IgM、IgD、IgE、またはIgA免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が、マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が約200〜2000ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、200ヌクレオチドより短いか、または200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、もしくは2000ヌクレオチド長であるか、または2000ヌクレオチドより長い。
【００１４】
いくつかの局面では、同定領域が複数の同定領域を含む。いくつかの局面では、同定領域が複数の同定領域を含み、複数の同定領域のそれぞれが異なる配列を含む。いくつかの局面では、同定領域が少なくとも一つの試料同定領域と少なくとも一つのプレート同定領域とを含む。いくつかの局面では、同定領域が、免疫グロブリン領域の配列とは異なる配列を含む。いくつかの局面では、同定領域が約2〜100ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、同定領域が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100ヌクレオチド長であるか、または100ヌクレオチドより長い。いくつかの局面では、同定領域が2〜1,000ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、同定領域が100ヌクレオチド長に等しいか、または100ヌクレオチドより長い。いくつかの局面では、同定領域が、連続した非コードヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面では、同定領域が、非コードヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面では、同定領域が、連続しない非コードヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面では、同定領域の配列の長さが免疫グロブリン領域の配列の長さより短い。
【００１５】
いくつかの局面において、本明細書に記載する組成物は、アダプター領域を含む第三の領域を含むことができる。いくつかの局面では、第三の領域がアダプター領域を含み、第三の領域が第一の領域と第二の領域の間にある。いくつかの局面では、第三の領域がアダプター領域を含み、アダプター領域が、その3'端にある少なくとも一つのGヌクレオチドを含む。
【００１６】
いくつかの局面では、同定領域は2〜100ヌクレオチド長であって、免疫グロブリン領域配列とは異なる配列を有し、アダプター領域がその3'端に少なくとも一つのGヌクレオチドを含んでいて、試料同定領域の3'側かつ免疫グロブリン領域の5'側にあり、免疫グロブリン可変領域が高頻度変異を起こして、ナイーブB細胞の生殖細胞系配列とは異なっている。
【００１７】
いくつかの局面では、組成物が容器中に存在している。いくつかの局面では、複数の組成物が容器中に存在している。いくつかの局面では、複数の組成物が、複数のウェルを含む単一のプレートの単一のウェル中に存在している。
【００１８】
いくつかの局面では、組成物が組成物のライブラリー中にあり、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含み、第一の領域が第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中に存在する他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、ライブラリー中の複数の可変免疫ドメイン領域の最後のヌクレオチド配列が少なくとも80〜99％の配列同一性を共有している。
【００１９】
いくつかの局面では、組成物が、複数のポリヌクレオチド組成物を含むライブラリー中に含まれ、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含み、第一の領域が第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の各独立容器中に存在している他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なる。
【００２０】
本明細書には、複数のポリヌクレオチド組成物を含むポリヌクレオチド組成物ライブラリーであって、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含み、第一の領域が第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の各独立容器中に存在している他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なる、ポリヌクレオチド組成物ライブラリーも記載される。
【００２１】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、複数のポリヌクレオチドのそれぞれが独立容器中に存在しており、複数のポリヌクレオチドのそれぞれが、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含み、第一の領域が第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中に存在する他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、複数の可変免疫グロブリン領域のうちの少なくとも二つが、少なくとも80〜99％の配列同一性を共有している、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【００２２】
本明細書には、ポリヌクレオチドのクローンファミリーを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、ファミリー中の各ポリヌクレオチドが、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含み、第一の領域が第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ファミリー中に存在している他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、ファミリー中の可変免疫グロブリン領域のそれぞれが少なくとも80〜99％の配列同一性を示す、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。いくつかの局面では、ライブラリーが複数のクローンファミリーを含む。
【００２３】
本明細書には、ファミリー中の各配列が同定領域に連結している、免疫グロブリン配列のクローンファミリーも記載される。いくつかの局面では、各同定領域が他の同定領域とは異なる。いくつかの局面では、免疫グロブリン配列が重鎖免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、免疫グロブリン配列が軽鎖免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、免疫グロブリン配列が重鎖および軽鎖免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、同定領域の1つまたは複数が軽鎖免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、同定領域の1つまたは複数が重鎖免疫グロブリン配列を含む。
【００２４】
本明細書には、本明細書に記載するクローンファミリーのうちの2つ以上のセットも記載される。
【００２５】
本明細書には、本明細書に記載するクローンファミリーのうちの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれより多いセットも記載される。
【００２６】
本明細書には、ファミリー中の各配列が少なくとも一つの連続するヌクレオチド配列に機能的に連結している、免疫グロブリン配列のクローンファミリーも記載される。いくつかの局面では、免疫グロブリン配列が重鎖免疫グロブリン配列を含み、少なくとも一つの連続するヌクレオチド配列が軽鎖免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、免疫グロブリン配列が軽鎖免疫グロブリン配列を含み、少なくとも一つの連続するヌクレオチド配列が重鎖免疫グロブリン配列を含む。
【００２７】
本明細書には、それぞれがV、D、および/またはJ領域を有し、かつそれぞれが同定領域に連結している、複数の免疫グロブリン配列を取得する工程；ならびに前記複数の配列からの2つ以上の配列をグループ分けして、クローンファミリー中の各配列が、あるV、D、および/もしくはJ領域を有する同じ生殖細胞系免疫グロブリン配列の変異型または前記V、D、および/もしくはJ領域を有する生殖細胞系免疫グロブリン配列である、クローンファミリーを作製する工程を含む、免疫グロブリン配列のクローンファミリーを作製する方法も記載される。
【００２８】
いくつかの局面では、各同定領域が他の同定領域とは異なる。
【００２９】
本明細書には、それぞれがV、D、および/またはJ領域を有し、かつそれぞれが同定領域に連結していて、各同定領域が他の同定領域とは異なる、複数の免疫グロブリン配列を取得する工程；1つまたは複数の同定領域を除去する工程；ならびに前記複数の配列からの2つ以上の配列をグループ分けして、クローンファミリー中の各配列が、あるV、D、および/もしくはJ領域を有する同じ生殖細胞系免疫グロブリン配列の変異型または前記V、D、および/もしくはJ領域を有する生殖細胞系免疫グロブリン配列である、クローンファミリーを作製する工程を含む、免疫グロブリン配列のクローンファミリーを作製する方法も記載される。
【００３０】
本明細書には、第一の同定領域に連結している第一のcDNAを選択する工程、および各cDNAに連結している同定領域の共通の実体に基づいて第二のcDNAを同定する工程を含む、第一の同定領域に連結している第二のcDNAを同定する方法も記載される。
【００３１】
本明細書には、第一のヌクレオチド配列を取得する工程と、第一のヌクレオチド配列を50℃未満においてテンプレートスイッチ活性を有する耐熱性RNase H-逆転写酵素と接触させる工程とを含み、前記接触が3'テールおよび第二のヌクレオチド配列を作製する、第二のヌクレオチド配列上に3'テールを作製する方法も記載される。いくつかの局面では、第一のヌクレオチド配列を、約50℃未満、49、48、47、46、45、44、43、もしくは42℃、または42℃未満において接触させる。いくつかの局面では、第一のヌクレオチド配列を42℃において接触させる。いくつかの局面では、第一のヌクレオチド配列を45.5℃において接触させる。いくつかの局面では、転写酵素がモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）RNase H-逆転写酵素である。いくつかの局面では、転写酵素がSuperScript IIIである。
【００３２】
本明細書には、関心対象の第一の配列の天然配列を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：第一の配列に関係し、かつそれぞれが第一の同定配列に連結している、複数の配列であって、各第一の同定配列が同一であり、前記複数の配列の1つまたは複数が天然配列とは異なるものを取得する工程；および前記複数の配列を比較して、関心対象の第一の配列の天然配列を決定する工程。いくつかの局面では、複数の配列が免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、複数の配列が免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、複数の配列が免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、複数の配列がそれぞれ第二の同定領域に連結していて、各第二の同定領域が同一である。いくつかの局面では、関心対象の第一の配列が免疫グロブリン配列である。いくつかの局面では、複数の配列が免疫グロブリン配列である。
【００３３】
本明細書には、第一の領域と第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含む組成物であって、第一の領域がB細胞由来可変免疫グロブリン領域を含み、第二の領域が同定領域を含み、第一の領域が第二の領域に連結している、組成物も記載される。
【００３４】
本明細書には、複数のポリヌクレオチド組成物を含むポリヌクレオチド組成物ライブラリーであって、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物がB細胞由来可変免疫グロブリン領域と同定領域とを含むポリヌクレオチドを含み、可変免疫グロブリン領域が同定領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の各独立容器中に存在している他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なる、ポリヌクレオチド組成物ライブラリーも記載される。
【００３５】
本明細書には、ポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：対象に関連する発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域を含むポリヌクレオチドを取得する工程；および同定領域を含む第二の領域に第一の領域を連結することによって第一の領域と第二の領域とを含むポリヌクレオチド組成物を生成する工程。
【００３６】
いくつかの局面では、ポリヌクレオチドを取得する工程が、対象に関連するB細胞を取得する工程、および前記細胞を処理してポリペプチドを調製する工程を含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドを取得する工程が、対象に関連するB細胞を処理してポリヌクレオチドを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドを受領する工程を含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドを取得する工程が、対象に関連するB細胞を可溶化してポリヌクレオチドを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドを受領する工程を含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドを取得する工程が、フローサイトメーターを使ってB細胞を取得する工程を含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドを取得する工程が、マイクロフルイディックデバイスを使ってB細胞を取得する工程を含む。
【００３７】
いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が、直径8μm以上の活性化ヒトB細胞から単離されたIgG免疫グロブリンヌクレオチド配列のVDJ領域を含み、免疫グロブリン領域の5'端が同定領域の3'端に連結している。いくつかの局面では、組成物がクローンファミリーに含まれる。
【００３８】
いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、活性化B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、形質芽球であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、単一のB細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、単一の活性化B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の血中にある単一の活性化B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、ヒト活性化B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、メモリーB細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、形質細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、抗原特異的B細胞であるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が哺乳動物B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域がヒトB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域がマウスB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、関心対象の疾患または状態を有する対象由来のB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、関心対象の疾患または状態から回復しているかまたは回復した対象由来のB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、少なくとも一つの関心対象の抗原を投与された対象由来のB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、少なくとも一つの関心対象の抗原とアジュバントとを投与された対象由来のB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の血中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の骨髄中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の脾臓中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の少なくとも一つのリンパ節中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象のリンパ組織中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対象の腸中にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が直径約8〜20μmの活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、直径が8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20μmであるか、または20μmより大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される。いくつかの局面では、面積が約60、70、80、90、100、120、130、140、150、200、250、300、もしくは350μm2であるか、または350μm2より大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される。いくつかの局面では、体積が約250、268、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、もしくは4000μm3であるか、または4000μm3より大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが10％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが15％以上大きい直���を有する活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが20％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、免疫グロブリンを分泌する能力を有する活性化B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、細胞周期の第一間期（G1期）、合成期（S期）、第二間期（G2期）、または有糸分裂期（M期）にあるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、細胞周期の休止期（G0期）にはないB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、フローサイトメトリーによって休止Bリンパ球のFSC平均値の1.2倍より大きいFSCを有すると特徴づけられるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、フローサイトメトリーによってヒト単球のFSC平均値の0.7〜1.15倍のFSC平均値を有すると特徴づけられるB細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD19陽性B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD38陽性B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD27陽性B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD20陰性B細胞から単離される。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が単一のCD19＋CD20-CD27＋CD38hiB細胞から単離される。
【００３９】
いくつかの局面では、免疫グロブリン領域の5'端が同定領域の3'端に連結する。
【００４０】
いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のVDJ領域を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のVJ領域を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のV、D、および/またはJ領域を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列の重鎖および/または軽鎖を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が、IgG、IgM、IgD、IgE、またはIgA免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、可変免疫グロブリン領域が、マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3免疫グロブリン配列を含む。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が約200〜2000ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、免疫グロブリン領域が、200ヌクレオチドより短いか、または200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、もしくは2000ヌクレオチド長であるか、または2000ヌクレオチドより長い。
【００４１】
いくつかの局面では、同定領域が複数の同定領域を含む。いくつかの局面では、同定領域が複数の同定領域を含み、複数の同定領域のそれぞれが異なる配列を有する。いくつかの局面では、同定領域が少なくとも一つの試料同定領域と少なくとも一つのプレート同定領域とを含む。いくつかの局面では、同定領域が免疫グロブリン領域の配列とは異なる配列を含む。いくつかの局面では、同定領域が約2〜100ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、同定領域が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100ヌクレオチド長であるか、または100ヌクレオチドより長い。いくつかの局面では、同定領域が2〜1,000ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、同定領域が100ヌクレオチド長に等しいか、または100ヌクレオチドより長い。いくつかの局面では、同定領域が、連続した非コードヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面では、同定領域が、非コードヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面では、同定領域が、連続しない非コードヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面では、同定領域の配列の長さが免疫グロブリン領域の配列の長さより短い。
【００４２】
いくつかの局面において、本明細書に記載する組成物は、アダプター領域を含む第三の領域をさらに含むことができる。いくつかの局面では、第三の領域がアダプター領域を含み、第三の領域が第一の領域と第二の領域の間にある。いくつかの局面では、第三の領域がアダプター領域を含み、アダプター領域が、その3'端にある少なくとも一つのGヌクレオチドを含む。
【００４３】
いくつかの局面では、同定領域は2〜100ヌクレオチド長であって、免疫グロブリン領域配列とは異なる配列を有し、アダプター領域がその3'端に少なくとも一つのGヌクレオチドを含んでいて、試料同定領域の3'側かつ免疫グロブリン領域の5'側にあり、免疫グロブリン可変領域が高頻度変異を起こして、ナイーブB細胞の生殖細胞系配列とは異なっている。
【００４４】
いくつかの局面では、組成物が容器中に存在している。いくつかの局面では、複数の組成物が容器中に存在している。いくつかの局面では、複数の組成物が、複数のウェルを含む単一のプレートの単一のウェル中に存在している。
【００４５】
いくつかの局面では、組成物が組成物のライブラリー中にあり、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含み、第一の領域が第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中に存在する他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、ライブラリー中の複数の可変免疫ドメイン領域の最後のヌクレオチド配列が少なくとも80〜99％の配列同一性を共有している。
【００４６】
いくつかの局面では、組成物が、複数のポリヌクレオチド組成物を含むライブラリー中に含まれ、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含み、第一の領域が第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の各独立容器中に存在している他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なる。
【００４７】
本明細書には、ポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：対象に関連するB細胞を取得する工程；発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む細胞からポリヌクレオチドを単離する工程；および可変免疫グロブリン領域を同定領域に連結することによって、可変免疫グロブリン領域と同定領域とを含むポリヌクレオチド組成物を生成する工程。
【００４８】
本明細書には、ポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：対象に関連するB細胞由来可変免疫グロブリン領域を含むポリヌクレオチドを取得する工程；および可変免疫グロブリン領域を同定領域に連結することによって、可変免疫グロブリン領域と同定領域とを含むポリヌクレオチド組成物を生成する工程。
【００４９】
いくつかの局面では、ポリヌクレオチドを取得する工程が、B細胞を取得する工程、および前記細胞を処理してポリヌクレオチドを調製する工程を含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドを取得する工程が、B細胞を処理してポリヌクレオチドを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドを受領する工程を含む。
【００５０】
本明細書には、2つ以上のポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：1つまたは複数の対象から取得された複数の試料に関連する複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、1つまたは複数のポリヌクレオチドが、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含み、各試料がB細胞に関連し、各試料に関連する各ポリヌクレオチドが独立容器中に存在している、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程；および、それぞれが前記複数のポリヌクレオチドからのポリヌクレオチドと同定領域とを含む2つ以上のポリヌクレオチド組成物であって、各同定領域の配列がライブラリー中の他のポリヌクレオチドに連結している同定領域の配列とは異なるポリヌクレオチド組成物を、ポリヌクレオチドを同定領域に連結することによって生成する工程。
【００５１】
いくつかの局面では、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、複数のB細胞を取得する工程、および前記細胞を処理してポリヌクレオチドライブラリーを調製する工程を含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、複数のB細胞を処理してポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドライブラリーを受領する工程を含む。
【００５２】
本明細書には、2つ以上のポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：1つまたは複数の対象から取得された複数の試料に関連する複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、1つまたは複数のポリヌクレオチドがB細胞由来可変免疫グロブリン領域を含み、各試料に関連する各ポリヌクレオチドが独立容器中に存在しているポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程；およびそれぞれが前記複数のポリヌクレオチドからのポリヌクレオチドと同定領域とを含む2つ以上のポリヌクレオチド組成物であって、各同定領域の配列がライブラリー中の他のポリヌクレオチドに連結している同定領域の配列とは異なるポリヌクレオチド組成物を、ポリヌクレオチドを同定領域に連結することによって生成する工程。
【００５３】
いくつかの局面では、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、複数のB細胞を取得する工程、および前記細胞を処理してポリヌクレオチドライブラリーを調製する工程を含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、複数のB細胞を処理してポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドライブラリーを受領する工程を含む。
【００５４】
本明細書には、複数のポリヌクレオチド組成物を含むポリヌクレオチド組成物ライブラリーであって、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、cDNA領域の3'端にヌクレオチドCを含む単一試料由来cDNA領域と、アダプター領域に連結した試料同定領域を含む試料同定-アダプター領域とを含み、各試料同定-アダプター領域の試料同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の各独立容器中に存在している他の試料同定-アダプター領域の試料同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、アダプター領域がアダプター領域の3'端にヌクレオチドGを含み、試料同定-アダプター領域が前記CとGの間の結合によってcDNA領域に取り付けられている、ポリヌクレオチド組成物ライブラリーも記載される。
【００５５】
いくつかの局面では、cDNA領域が、DNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたRNAポリヌクレオチドを含む。いくつかの局面では、cDNA領域が、cDNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたmRNAポリヌクレオチドを含む。いくつかの局面では、cDNA領域が3'端に少なくとも一つのCを含み、アダプター領域が3'端に少なくとも一つのGを含む。
【００５６】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来cDNA領域を含み、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、cDNA領域がアダプター領域の3'端に連結しており、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なり、試料同定領域が二本鎖である、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。いくつかの局面では、各ポリヌクレオチドが複数の試料同定領域を含む。
【００５７】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【００５８】
いくつかの局面では、アンプリコン領域の5'端がアダプター領域の3'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が配列
0005998203.tif 000002
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む。いくつかの局面では、ユニバーサルプライマー領域の配列がどのヒト遺伝子エクソンとも完全には相補的でなく、ユニバーサルプライマー領域がアダプター領域に干渉しない最小限の二次構造を有する。いくつかの局面では、ユニバーサルプライマー領域が配列
0005998203.tif 000003
である。いくつかの局面では、アンプリコン領域が、cDNAヌクレオチド配列を含むcDNA領域を含む。いくつかの局面では、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは、少なくとも1ヌクレオチドで相違する。いくつかの局面では、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは、少なくとも2ヌクレオチドで相違する。いくつかの局面では、試料同定領域が少なくとも10ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、試料同定領域が少なくとも1ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、各試料同定領域の配列が表2および表7から選択される。いくつかの局面では、アダプター領域の配列が、その3'端に少なくとも一つのGヌクレオチドを含む。いくつかの局面では、アンプリコン領域が、免疫グロブリン重鎖アンプリコン配列、免疫グロブリン軽鎖アンプリコン配列、T細胞受容体αアンプリコン配列、またはT細胞受容体βアンプリコン配列を含む。
【００５９】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-3'を含み、Aがユニバーサルプライマー領域であり、Bが試料同定領域であり、Cがアダプター領域であり、Dが単一試料由来のアンプリコン領域であり、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【００６０】
本明細書には、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含むポリヌクレオチドであって、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しているポリヌクレオチドも記載される。
【００６１】
いくつかの局面では、アンプリコン領域の5'端がアダプター領域の3'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000004
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む。
【００６２】
本明細書には、配列5'-A-B-C-D-3'を含むポリヌクレオチドであって、Aがユニバーサルプライマー領域であり、Bが試料同定領域であり、Cがアダプター領域であり、Dが単一試料由来のアンプリコン領域である、ポリヌクレオチドも記載される。
【００６３】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが、第一のプレート同定領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一のプレート同定領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【００６４】
いくつかの局面では、単一試料の第一のセットからの各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セットからのライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは異なる。いくつかの局面では、単一試料の第一のセットからの各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セットからのライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは、少なくとも1ヌクレオチドで相違する。いくつかの局面では、単一試料の第一のセットからの各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セットからのライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは、少なくとも2ヌクレオチドで相違する。いくつかの局面では、第一のプレート同定領域が少なくとも10ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、第一のプレート同定領域の配列が表3および表6から選択される。いくつかの局面では、第一のプレート同定領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域の5'端がアダプター領域の3'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000005
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含み、各ポリヌクレオチドが、第二のプレート同定領域、第一の配列決定領域、および第二の配列決定領域をさらに含み、第二のプレート同定領域の5'端がアンプリコン領域の3'端に連結しており、第一の配列決定領域の3'端が第一のプレート同定領域の5'端に連結しており、第二の配列決定領域の5'端が第二のプレート同定領域の3'端に連結している。いくつかの局面では、第二のプレート同定領域の配列が各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と同一である。いくつかの局面では、単一試料の第一のセットからの各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セットからのライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列とは異なる。いくつかの局面では、単一試料の第一のセットからの各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セットからのライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列とは、少なくとも1ヌクレオチドで相違する。いくつかの局面では、単一試料の第一のセットからの各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セットからのライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列とは、少なくとも2ヌクレオチドで相違する。いくつかの局面では、第二のプレート同定領域が少なくとも10ヌクレオチド長である。いくつかの局面では、第二のプレート同定領域の配列が表3および表6から選択される。いくつかの局面では、第一の配列決定領域が
0005998203.tif 000006
を含む。
いくつかの局面では、第二の配列決定領域が
0005998203.tif 000007
を含む。
【００６５】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-E-3'を含み、Aがプレート同定領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料由来のアンプリコン領域であり、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【００６６】
本明細書には、第一のプレート同定領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含むポリヌクレオチドであって、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一のプレート同定領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結している、ポリヌクレオチドも記載される。
【００６７】
いくつかの局面では、第一のプレート同定領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域の5'端がアダプター領域の3'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000008
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含み、各ポリヌクレオチドが、第二のプレート同定領域、第一の配列決定領域、および第二の配列決定領域をさらに含み、第二のプレート同定領域の5'端がアンプリコン領域の3'端に連結しており、第一の配列決定領域の3'端が第一のプレート同定領域の5'端に連結しており、第二の配列決定領域の5'端が第二のプレート同定領域の3'端に連結している。
【００６８】
本明細書には、配列5'-A-B-C-D-E-3'を含むポリヌクレオチドであって、Aがプレート同定領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料由来のアンプリコン領域である、ポリヌクレオチドも記載される。
【００６９】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが、第一の制限部位領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料由来のアンプリコン領域、および第二の制限部位領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一の制限部位領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、第二の制限部位領域がアンプリコン領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【００７０】
いくつかの局面では、第一の制限部位領域が1つまたは複数の制限部位を含む。いくつかの局面では、第一の制限部位領域が、NheI、XhoI、BstBI、EcoRI、SacII、BbvCI、PspXI、AgeI、ApaI、KpnI、Acc65I、XmaI、BstEII、DraIII、PacI、FseI、AsiSIおよびAscIからなる群より選択される1つまたは複数の制限部位を含む。いくつかの局面では、第二の制限部位領域が1つまたは複数の制限部位を含む。いくつかの局面では、第二の制限部位領域が、NheI、XhoI、BstBI、EcoRI、SacII、BbvCI、PspXI、AgeI、ApaI、KpnI、Acc65I、XmaI、BstEII、DraIII、PacI、FseI、AsiSIおよびAscIからなる群より選択される1つまたは複数の制限部位を含む。いくつかの局面では、第一の制限部位領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結しており、アダプター領域の3'端がアンプリコン領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域の3'端が第二の制限部位領域の5'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000009
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む。
【００７１】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-E-F-3'を含み、Aが第一の制限部位領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料由来のアンプリコン領域であり、Fが第二の制限部位領域であり、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【００７２】
本明細書には、第一の制限部位領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料由来のアンプリコン領域、および第二の制限部位領域を含む、ベクターへの挿入用のポリヌクレオチドであって、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一の制限部位領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、第二の制限部位領域がアンプリコン領域に機能的に連結している、ポリヌクレオチドも記載される。
【００７３】
いくつかの局面では、第一の制限部位領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結しており、アダプター領域の3'端がアンプリコン領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域の3'端が第二の制限部位領域の5'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000010
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む。
【００７４】
本明細書には、配列5'-A-B-C-D-E-F-3'を含む、ベクターにおける挿入用のポリヌクレオチドであって、Aが第一の制限部位領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料由来のアンプリコン領域であり、Fが第二の制限部位領域である、ポリヌクレオチドも記載される。
【００７５】
本明細書には、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、およびアダプター領域を含むポリヌクレオチドアダプター分子であって、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結している、ポリヌクレオチドアダプター分子も記載される。いくつかの局面では、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000011
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む。
【００７６】
本明細書には、ユニバーサルプライマー領域とプレート同定領域とを含み、プレート同定領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結している、ポリヌクレオチドプライマーも記載される。いくつかの局面では、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000012
を含み、プライマーが配列決定領域をさらに含み、配列決定領域の3'端がプレート同定領域の5'端に連結している。
【００７７】
本明細書には、本明細書に記載するポリヌクレオチドを含むベクターも記載される。いくつかの局面では、ベクターが複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの局面では、ベクターが、pEE6.4およびpEE12.4からなる群より選択される。
【００７８】
本明細書には、本明細書に記載するベクターまたは本明細書に記載するポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞も記載される。いくつかの局面では、宿主細胞が、CHO細胞、CHO-K1細胞、CHO-S細胞、NS0細胞、dhfr-であるCHO細胞、CHO-dhfr-、DUKX-B11 CHO細胞、およびDG44 CHO細胞からなる群より選択される。
【００７９】
本明細書には、1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するための方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：1つまたは複数の対象から取得した複数の試料に関連する複数のcDNAを含むcDNAライブラリーを取得する工程であって、各cDNAが複数の試料中の単一試料に関連し、各試料に関連する各cDNAが独立容器中に存在している、工程；および1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、アダプター分子を各試料に関連するcDNAに付加する工程であって、アダプター分子が試料同定領域とアダプター領域とを含み、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、各アダプター分子の試料同定領域の配列が、ライブラリー中の各cDNAに付加される他のアダプター分子の試料同定領域の配列とは異なる、工程。
【００８０】
いくつかの局面において、本方法は、1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、アダプター領域の3'端をライブラリー中の各cDNAの3'端に取り付ける工程をさらに含む。いくつかの局面では、cDNAライブラリーを取得する工程が、複数の試料を取得する工程および試料を処理してcDNAライブラリーを調製する工程を含む。いくつかの局面では、アダプター分子がユニバーサルプライマー領域をさらに含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結している。いくつかの局面では、各cDNA領域が、cDNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたmRNAポリヌクレオチドを含む。いくつかの局面では、各試料が細胞を含む。いくつかの局面では、細胞がB細胞である。いくつかの局面では、B細胞が、形質芽球、メモリーB細胞、または形質細胞である。いくつかの局面では、各試料が複数の細胞を含む。いくつかの局面では、cDNAライブラリーを取得する工程が、複数の試料を処理してcDNAライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にcDNAライブラリーを受領する工程を含む。いくつかの局面では、アダプターが、逆転写反応中に生成したcDNAの3'テールにアダプターをアニールすることによって付加される。いくつかの局面では、各cDNAが少なくとも一つのCヌクレオチドを含み、Cが各cDNAの3'端にあり、アダプター領域が少なくとも一つのGヌクレオチドを含み、Gがアダプター領域の3'端にあり、アダプター領域が、前記GとCの間の結合によって各cDNAに取り付けられる。いくつかの局面では、アダプター分子が一本鎖であり、酵素にアダプター分子を二本鎖化させることによって各cDNA中にアダプター分子を組み込む工程をさらに含む。いくつかの局面では、MMLV H-逆転写酵素によって関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、アダプター分子が各cDNAに組み込まれる。
【００８１】
本明細書には、配列決定用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製する方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程であって、各ポリヌクレオチドが、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、工程；および配列決定用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、ポリヌクレオチドライブラリーを1セットのプライマーで増幅する工程であって、配列決定用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドが、第一の配列決定領域、第一のプレート同定領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料由来のアンプリコン領域、および第二の配列決定領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一のプレート同定領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、第一の配列決定領域が関心対象のポリヌクレオチドの5'端にあり、第二の配列決定領域が関心対象のポリヌクレオチドの3'端にある、工程。
【００８２】
いくつかの局面において、本方法は、1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを配列決定する工程をさらに含む。いくつかの局面において、本方法は、1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを454シークエンシングで配列決定する工程をさらに含む。いくつかの局面において、本方法は、1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドをSMRTシークエンシングで配列決定する工程をさらに含む。いくつかの局面において、本方法は、1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドをSOLiDシークエンシングで配列決定する工程をさらに含む。いくつかの局面において、本方法は、1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドをSOLEXAシークエンシングで配列決定する工程をさらに含む。いくつかの局面において、本方法は、1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドをtSMSシークエンシングで配列決定する工程をさらに含む。いくつかの局面では、プライマーのセットが、表1および表5に示すプライマーから選択される。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が実験室でポリヌクレオチドライブラリーを調製する工程を含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、ポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドライブラリーを受領する工程を含む。
【００８３】
本明細書には、配列決定データを解析するための方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：複数のポリヌクレオチドに関連するデータセットを取得する工程であって、データセットが複数のポリヌクレオチドに関する配列決定データを含み、複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドが試料同定領域を含み、各ポリヌクレオチドの各試料同定領域が単一試料に関して固有であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来の複数のポリヌクレオチド中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、工程；および同一の試料同定領域を有するポリヌクレオチドをマッチングさせるためにデータセットを解析する工程であって、マッチはポリヌクレオチドが同じ試料に由来したことを示す、工程。
【００８４】
いくつかの局面では、複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドが、第一のプレート同定領域をさらに含み、各ポリヌクレオチドの各第一のプレート同定領域と試料同定領域との各組合せが単一試料に関して固有であり、単一試料の第一のセットからの各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セットからの複数のポリヌクレオチド中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは異なり、同一の第一のプレート同定領域および同一の試料同定領域を有するポリヌクレオチドをマッチングさせるためにデータセットを解析する工程をさらに含み、両領域間のマッチはポリヌクレオチドが同じ試料に由来したことを示す。いくつかの局面では、データセットを取得する工程が、複数のポリヌクレオチドを取得する工程、および複数のポリヌクレオチドを配列決定してデータセットを実験的に決定する工程を含む。いくつかの局面では、データセットを取得する工程が、複数のポリヌクレオチドを配列決定してデータセットを実験的に決定した第三者から直接的または間接的にデータセットを受領する工程を含む。いくつかの局面では、データセットが電子記憶媒体に格納される。いくつかの局面では、単一試料が単一細胞である。いくつかの局面では、単一試料が単一細胞を含む。いくつかの局面では、単一試料が単一のB細胞を含む。いくつかの局面では、単一試料が複数のB細胞を含む。いくつかの局面では、クローニング用の1つまたは複数のポリヌクレオチドを選択する工程をさらに含む。
【００８５】
本明細書には、関心対象の第一のポリヌクレオチドの選択に基づいて関心対象の第二のポリヌクレオチドを同定するための方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：複数のポリヌクレオチドに関連するデータセットを取得する工程であって、データセットが複数のポリヌクレオチドに関する配列決定データを含み、複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドが試料同定領域を含み、各ポリヌクレオチドの各試料同定領域が単一試料に関して固有であることによって、複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドを異なる単一試料と関連づけており、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来の複数のポリヌクレオチド中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、工程；およびデータセットから第一の単一試料に関連する関心対象の第一のポリヌクレオチドを選択し、関心対象の第一のポリヌクレオチドの試料同定領域に基づいて第一の単一試料中の関心対象の第二のポリヌクレオチドを同定する工程。
【００８６】
いくつかの局面では、複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドが、第一のプレート同定領域をさらに含み、各ポリヌクレオチドの各第一のプレート同定領域と試料同定領域との各組合せが単一試料に関して固有であり、単一試料の第一のセットからの各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セットからの複数のポリヌクレオチド中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは異なり、関心対象の第一のポリヌクレオチドの試料同定領域と第一のプレート同定領域とに基づいて第一の単一試料中の関心対象の第二のポリヌクレオチドを同定する工程をさらに含む。いくつかの局面では、第一の単一試料がB細胞を含む。いくつかの局面では、第一の単一試料が複数のB細胞を含む。いくつかの局面では、第一の単一試料がB細胞を含み、関心対象の第一のポリヌクレオチドが抗体重鎖ヌクレオチド配列を含み、関心対象の第二のポリヌクレオチドが抗体軽鎖ヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面では、第一の単一試料がB細胞を含み、関心対象の第一のポリヌクレオチドが抗体軽鎖ヌクレオチド配列を含み、関心対象の第二のポリヌクレオチドが抗体重鎖ヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面では、データセットを取得する工程が、複数のポリヌクレオチドを取得する工程、および複数のポリヌクレオチドを配列決定してデータセットを実験的に決定する工程を含む。いくつかの局面では、データセットを取得する工程が、複数のポリヌクレオチドを配列決定してデータセットを実験的に決定した第三者から直接的または間接的にデータセットを受領する工程を含む。いくつかの局面では、データセットが電子記憶媒体に格納される。
【００８７】
本明細書には、クローニング用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製する方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程であって、各ポリヌクレオチドが、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、工程；およびクローニング用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、ポリヌクレオチドライブラリーを1セットのプライマーで増幅する工程であって、クローニング用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドが、第一の制限部位領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料由来のアンプリコン領域、および第二の制限部位領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、第一の制限部位領域が関心対象のポリヌクレオチドの5'端にあり、第二の制限部位領域が関心対象のポリヌクレオチドの3'端にある、工程。
【００８８】
いくつかの局面では、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、実験室でポリヌクレオチドライブラリーを調製する工程を含む。いくつかの局面では、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、ポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドライブラリーを受領する工程を含む。
【００８９】
本明細書には、関心対象の分子を作製する方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を取得する工程であって、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結している、工程；および関心対象の分子を作製するのに十分な条件下で宿主細胞を培養する工程。いくつかの局面では、宿主細胞を取得する工程が、実験室でポリヌクレオチドを含む宿主細胞を調製する工程を含む。いくつかの局面では、宿主細胞を取得する工程が、宿主細胞を調製した第三者から直接的または間接的に、ポリヌクレオチドを含む宿主を受領する工程を含む。いくつかの局面では、関心対象の分子がタンパク質である。いくつかの局面では、関心対象の分子が抗体である。いくつかの局面では、関心対象の分子がヒトモノクローナル抗体である。いくつかの局面では、関心対象の分子を収集する工程をさらに含む。
【００９０】
本明細書には、本明細書に記載するポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、または宿主細胞と、使用説明書とを含むキットも記載される。
【００９１】
本明細書には、複数の関心対象の連続しないポリヌクレオチド配列を連結しバーコード化する方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：（a）複数のcDNA分子を提供する工程；（b）関心対象のcDNA分子を物理的に連結する工程；および（c）物理的連結の前、間、または後に、関心対象のcDNAにバーコード配列を付加する工程。
【００９２】
いくつかの局面では、物理的連結はライゲーションによる。いくつかの局面では、物理的連結が組換えによる。いくつかの局面では、物理的連結が、オーバーラップ-伸長配列を用いる工程を含む。いくつかの局面では、バーコード配列が、物理的に連結されたcDNAの末端の一方または両方にある。いくつかの局面では、バーコード配列が、物理的に連結されたcDNAの間にある。いくつかの局面では、ライゲーションが、適合する末端のアニーリングおよびライゲーションによって行われる。いくつかの局面では、適合する末端が制限部位である。いくつかの局面では、ライゲーションが平滑末端ライゲーションによって行われる。いくつかの局面では、オーバーラップ-伸長配列が、オーバーラップ-伸長テールを含むプライマーを使った増幅の過程において付加される。いくつかの局面では、オーバーラップ-伸長配列が、オーバーラップ-伸長テールを含むプライマーを使った逆転写の過程において付加される。いくつかの局面では、オーバーラップ-伸長配列が、逆転写反応中に生成したcDNAの3'テールにアダプターをアニーリングさせることによって付加される。いくつかの局面では、バーコード配列がライゲーションによって付加される。いくつかの局面では、ライゲーションが、適合する末端のアニーリングおよびライゲーションによって行われる。いくつかの局面では、適合する末端が制限部位である。いくつかの局面では、ライゲーションが、バーコード配列を含むアダプターの平滑末端ライゲーションによって行われる。いくつかの局面では、バーコード配列が、バーコード配列を含むプライマーを使った増幅反応の過程において付加される。いくつかの局面では、バーコード配列が、バーコード配列を含むプライマーを使った逆転写反応の過程において付加される。いくつかの局面では、バーコード配列が、逆転写反応中に生成したcDNAの3'テールにアダプターをアニーリングさせることによって付加される。いくつかの局面では、cDNAの3'端が少なくとも一つのCヌクレオチドを含み、アダプターの3'端が少なくとも一つのGヌクレオチドを含み、アダプターが前記CとGの間の結合によって各cDNAに取り付けられる。いくつかの局面では、アダプターが一本鎖であり、酵素にアダプターを二本鎖化させることによって各cDNA中にアダプター分子を組み込む工程をさらに含む。いくつかの局面では、アダプターが、MMLV H-逆転写酵素によって各cDNA中に組み込まれる。いくつかの局面では、オーバーラップ-伸長配列がバーコード配列を含む。いくつかの局面では、関心対象のポリヌクレオチド配列が抗体の重鎖および軽鎖を含む。いくつかの局面では、（d）物理的連結の前、間、または後に、関心対象のcDNAに配列決定領域を付加する工程をさらに含む。いくつかの局面では、配列決定領域がアダプターと共に付加される。いくつかの局面では、（e）NextGenシークエンシングプラットホームを用いる、物理的に連結された関心対象のcDNA分子の配列決定をさらに含む。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームが454シークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがSMRTシークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがSOLiDシークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがSOLEXAシークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがtSMSシークエンシングである。いくつかの局面では、複数のcDNA分子が、少なくとも6個、少なくとも12個、少なくとも24個、少なくとも48個、少なくとも96個、少なくとも384個、少なくとも1536個、またはそれより多いウェルを有するプレートに含まれている単一試料由来のものである。いくつかの局面では、複数のcDNA分子が、それぞれが少なくとも96個のウェルを有する少なくとも1枚、2枚、3枚、4枚、5枚、6枚、7枚、8枚、9枚、10枚、20枚、30枚、40枚、50枚、75枚、100枚、またはより多いプレートに含まれている単一試料由来のものである。
【００９３】
本明細書には、関心対象のポリヌクレオチド配列を含有する複数の試料を連結しバーコード化する方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：（a）試料を複数の容器に分配する工程；（b）試料由来のテンプレートを使って関心対象のポリヌクレオチド配列を合成する工程であって、該合成がバーコード配列の付加をもたらす、工程；および（c）工程（b）において合成した関心対象のポリヌクレオチド配列の連結を達成する工程。
【００９４】
いくつかの局面では、各試料が細胞を含む。いくつかの局面では、細胞がB細胞である。いくつかの局面では、B細胞が、形質芽球、メモリーB細胞、または形質細胞である。いくつかの局面では、各試料が複数の細胞を含む。いくつかの局面では、関心対象のポリヌクレオチド配列が抗体の重鎖および軽鎖を含む。いくつかの局面では、合成がRT-PCR増幅を含む。いくつかの局面では、RT-PCR増幅が一段階で行われる。いくつかの局面では、関心対象のポリヌクレオチドの連結が、オーバーラップ-伸長プライマーを使ったRT-PCR増幅の過程において行われる。いくつかの局面では、（d）バーコード配列の付加または連結の前、間、または後に、配列決定領域を関心対象のポリヌクレオチド配列に付加する工程をさらに含む。いくつかの局面では、配列決定領域がアダプターと共に付加される。いくつかの局面では、（e）NextGenシークエンシングプラットホームを用いる、連結された関心対象のポリヌクレオチド配列の配列決定をさらに含む。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームが454シークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがSMRTシークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがSOLiDシークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがSOLEXAシークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがtSMSシークエンシングである。いくつかの局面では、複数の試料が、少なくとも6個、少なくとも12個、少なくとも24個、少なくとも48個、少なくとも96個、少なくとも384個、少なくとも1536個、またはそれより多いウェルを有するプレートに含まれている単一試料である。いくつかの局面では、複数の試料が、それぞれが少なくとも96個のウェルを有する少なくとも1枚、2枚、3枚、4枚、5枚、6枚、7枚、8枚、9枚、10枚、20枚、30枚、40枚、50枚、75枚、100枚、200枚、500枚またはそれより多いプレートに含まれている単一試料である。
【００９５】
本明細書には、複数の関心対象の連続しないポリヌクレオチド配列を連結しバーコード化する方法であって、以下の工程を含む方法も記載される：（a）単離された1つまたは複数の細胞を得るために細胞を複数の容器に分配する工程；（b）該単離された1つまたは複数の細胞からのテンプレートを使って関心対象のポリヌクレオチド配列を増幅する工程であって、該増幅がバーコード配列の付加をもたらす、工程；および（c）工程（b）において増幅された関心対象のポリヌクレオチド配列の連結を達成する工程。
【００９６】
いくつかの局面では、関心対象のヌクレオチド配列が抗体の重鎖および軽鎖を含む。いくつかの局面では、増幅がRT-PCR増幅を含む。いくつかの局面では、RT-PCR増幅が一段階で行われる。いくつかの局面では、関心対象のヌクレオチドの連結が、オーバーラップ-伸長プライマーを使ったRT-PCR増幅の過程において行われる。いくつかの局面では、（d）バーコード配列の付加または連結の前、間、または後に、配列決定領域を関心対象のポリヌクレオチド配列に付加する工程をさらに含む。いくつかの局面では、配列決定領域がアダプターと共に付加される。いくつかの局面では、（e）NextGenシークエンシングプラットホームを用いる、連結された関心対象のポリヌクレオチド配列の配列決定をさらに含む。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームが454シークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがSMRTシークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがSOLiDシークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがSOLEXAシークエンシングである。いくつかの局面では、NextGenシークエンシングプラットホームがtSMSシークエンシングである。いくつかの局面では、1つまたは複数の細胞が、少なくとも6個、少なくとも12個、少なくとも24個、少なくとも48個、少なくとも96個、少なくとも384個、少なくとも1536個、またはそれより多いウェルを有するプレートに含まれている。いくつかの局面では、1つまたは複数の細胞が、それぞれが少なくとも96個のウェルを有する少なくとも1枚、2枚、3枚、4枚、5枚、6枚、7枚、8枚、9枚、10枚、20枚、30枚、40枚、50枚、75枚、100枚、またはそれより多いプレートに含まれる。
【００９７】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-3'を含み、Aが試料同定領域（バーコード配列）であり、Bが単一試料由来の第一のcDNA領域であり、Cがリンカー領域であり、Dが同じ単一試料由来の第二のcDNA領域であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【００９８】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-3'を含み、Aが単一試料由来の第一のcDNA領域であり、Bがリンカー領域であり、Cが同じ単一試料由来の第二のcDNA領域であり、Dが試料同定領域（バーコード配列）であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【００９９】
本明細書には、複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-3'を含み、Aが単一試料由来の第一のcDNA領域であり、Bが試料同定領域（バーコード配列）を含むリンカー領域であり、Cが同じ単一試料由来の第二のcDNA領域であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリーも記載される。
【０１００】
いくつかの局面では、第一のcDNA領域が抗体重鎖を含み、第二のcDNA領域が抗体軽鎖を含む。いくつかの局面では、ライブラリーが、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも3000種、少なくとも10,000種、少なくとも30,000種、少なくとも100,000種、少なくとも300,000種、少なくとも1,000,000種、少なくとも3,000,000種、少なくとも10,000,000種、少なくとも30,000,000種、またはそれより多いメンバーを含む。いくつかの局面では、ライブラリーが、細胞試料の全トランスクリプトームのうち、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも10、少なくとも30、少なくとも100、少なくとも300、少なくとも1000、少なくとも3000、少なくとも10,000、少なくとも30,000、またはそれより多い遺伝子を含む。いくつかの局面では、ライブラリーが、個体の血液中に存在している相違する抗体種のうち、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも10,000種、少なくとも100,000種、少なくとも1,000,000種、少なくとも10,000,000種、少なくとも100,000,000種、またはそれより多い抗体種を含む。いくつかの局面では、抗体が、形質芽球、形質細胞、メモリーB細胞、長寿命形質細胞、他のB系統細胞またはそれらの組み合わせによって発現される。
[本発明1001]
ポリヌクレオチドを含む組成物であって、ポリヌクレオチドが、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と、少なくとも一つの同定領域を含む第二の領域とを含み、該第一の領域が該第二の領域に連結している、組成物。
[本発明1002]
可変免疫グロブリン領域が、直径8μm以上の活性化ヒトB細胞から単離されたIgG免疫グロブリンヌクレオチド配列のVDJ領域を含み、免疫グロブリン領域の5'端が同定領域の3'端に連結している、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
クローンファミリーに含まれる、本発明1001〜1002のいずれかの組成物。
[本発明1004]
免疫グロブリン領域が、活性化B細胞であるB細胞から単離される、本発明1001〜1003のいずれかの組成物。
[本発明1005]
免疫グロブリン領域が、形質芽球であるB細胞から単離される、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1006]
免疫グロブリン領域が、単一のB細胞であるB細胞から単離される、本発明1001〜1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
免疫グロブリン領域が、単一の活性化B細胞であるB細胞から単離される、本発明1001〜1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
免疫グロブリン領域が、対象の血中にある単一の活性化B細胞であるB細胞から単離される、本発明1001〜1007のいずれかの組成物。
[本発明1009]
免疫グロブリン領域が、ヒト活性化B細胞であるB細胞から単離される、本発明1001〜1008のいずれかの組成物。
[本発明1010]
免疫グロブリン領域が、メモリーB細胞であるB細胞から単離される、本発明1001〜1009のいずれかの組成物。
[本発明1011]
免疫グロブリン領域が、形質細胞であるB細胞から単離される、本発明1001〜1010のいずれかの組成物。
[本発明1012]
免疫グロブリン領域が、抗原特異的B細胞であるB細胞から単離される、本発明1001〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1013]
免疫グロブリン領域が、哺乳動物B細胞から単離される、本発明1001〜1012のいずれかの組成物。
[本発明1014]
免疫グロブリン領域が、ヒトB細胞から単離される、本発明1001〜1013のいずれかの組成物。
[本発明1015]
免疫グロブリン領域が、マウスB細胞から単離される、本発明1001〜1014のいずれかの組成物。
[本発明1016]
免疫グロブリン領域が、関心対象の疾患または状態を有する対象由来のB細胞から単離される、本発明1001〜1015のいずれかの組成物。
[本発明1017]
免疫グロブリン領域が、関心対象の疾患または状態から回復しているかまたは回復した対象由来のB細胞から単離される、本発明1001〜1016のいずれかの組成物。
[本発明1018]
免疫グロブリン領域が、少なくとも一つの関心対象の抗原を投与された対象由来のB細胞から単離される、本発明1001〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1019]
免疫グロブリン領域が、少なくとも一つの関心対象の抗原とアジュバントとを投与された対象由来のB細胞から単離される、本発明1001〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
免疫グロブリン領域が、対象の血中にあるB細胞から単離される、本発明1001〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1021]
免疫グロブリン領域が、対象の骨髄中にあるB細胞から単離される、本発明1001〜1020のいずれかの組成物。
[本発明1022]
免疫グロブリン領域が、対象の脾臓中にあるB細胞から単離される、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1023]
免疫グロブリン領域が、対象の少なくとも一つのリンパ節中にあるB細胞から単離される、本発明1001〜1022のいずれかの組成物。
[本発明1024]
免疫グロブリン領域が、対象のリンパ組織中にあるB細胞から単離される、本発明1001〜1023のいずれかの組成物。
[本発明1025]
免疫グロブリン領域が、対象の腸中にあるB細胞から単離される、本発明1001〜1024のいずれかの組成物。
[本発明1026]
免疫グロブリン領域が直径約8〜20μmの活性化B細胞から単離される、本発明1001〜1025のいずれかの組成物。
[本発明1027]
直径が8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20μmであるか、または20μmより大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される、本発明1001〜1026のいずれかの組成物。
[本発明1028]
面積が約60、70、80、90、100、120、130、140、150、200、250、300、もしくは350μm2であるか、または350μm2より大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される、本発明1001〜1027のいずれかの組成物。
[本発明1029]
体積が約250、268、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、もしくは4000μm3であるか、または4000μm3より大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される、本発明1001〜1028のいずれかの組成物。
[本発明1030]
免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが10％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される、本発明1001〜1029のいずれかの組成物。
[本発明1031]
免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが15％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される、本発明1001〜1030のいずれかの組成物。
[本発明1032]
免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが20％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される、本発明1001〜1031のいずれかの組成物。
[本発明1033]
免疫グロブリン領域が、免疫グロブリンを分泌する能力を有する活性化B細胞から単離される、本発明1001〜1032のいずれかの組成物。
[本発明1034]
免疫グロブリン領域が、細胞周期の第一間期（G1期）、合成期（S期）、第二間期（G2期）、または有糸分裂期（M期）にあるB細胞から単離される、本発明1001〜1033のいずれかの組成物。
[本発明1035]
免疫グロブリン領域が、細胞周期の休止期（G0期）にはないB細胞から単離される、本発明1001〜1034のいずれかの組成物。
[本発明1036]
免疫グロブリン領域が、フローサイトメトリーによって休止Bリンパ球のFSC平均値の1.2倍より大きいFSCを有すると特徴づけられるB細胞から単離される、本発明1001〜1035のいずれかの組成物。
[本発明1037]
免疫グロブリン領域が、フローサイトメトリーによってヒト単球のFSC平均値の0.7〜1.15倍のFSC平均値を有すると特徴づけられるB細胞から単離される、本発明1001〜1036のいずれかの組成物。
[本発明1038]
免疫グロブリン領域が単一のCD19陽性B細胞から単離される、本発明1001〜1037のいずれかの組成物。
[本発明1039]
免疫グロブリン領域が単一のCD38陽性B細胞から単離される、本発明1001〜1038のいずれかの組成物。
[本発明1040]
免疫グロブリン領域が単一のCD27陽性B細胞から単離される、本発明1001〜1039のいずれかの組成物。
[本発明1041]
免疫グロブリン領域が単一のCD20陰性B細胞から単離される、本発明1001〜1040のいずれかの組成物。
[本発明1042]
免疫グロブリン領域が単一のCD19＋CD20-CD27＋CD38hiB細胞から単離される、本発明1001〜1041のいずれかの組成物。
[本発明1043]
免疫グロブリン領域の5'端が同定領域の3'端に連結している、本発明1001〜1042のいずれかの組成物。
[本発明1044]
可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のVDJ領域を含む、本発明1001〜1043のいずれかの組成物。
[本発明1045]
可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のVJ領域を含む、本発明1001〜1044のいずれかの組成物。
[本発明1046]
可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のV、D、および/またはJ領域を含む、本発明1001〜1045のいずれかの組成物。
[本発明1047]
可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列の重鎖および/または軽鎖を含む、本発明1001〜1046のいずれかの組成物。
[本発明1048]
可変免疫グロブリン領域が、IgG、IgM、IgD、IgE、またはIgA免疫グロブリン配列を含む、本発明1001〜1047のいずれかの組成物。
[本発明1049]
可変免疫グロブリン領域が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4免疫グロブリン配列を含む、本発明1001〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1050]
可変免疫グロブリン領域が、マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3免疫グロブリン配列を含む、本発明1001〜1049のいずれかの組成物。
[本発明1051]
免疫グロブリン領域が約200〜2000ヌクレオチド長である、本発明1001〜1050のいずれかの組成物。
[本発明1052]
免疫グロブリン領域が、200ヌクレオチドより短いか、または200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、もしくは2000ヌクレオチド長であるか、または2000ヌクレオチドより長い、本発明1001〜1051のいずれかの組成物。
[本発明1053]
同定領域が複数の同定領域を含む、本発明1001〜1052のいずれかの組成物。
[本発明1054]
同定領域が複数の同定領域を含み、該複数の同定領域のそれぞれが異なる配列を含む、本発明1001〜1053のいずれかの組成物。
[本発明1055]
同定領域が少なくとも一つの試料同定領域と少なくとも一つのプレート同定領域とを含む、本発明1001〜1054のいずれかの組成物。
[本発明1056]
同定領域が、免疫グロブリン領域の配列とは異なる配列を含む、本発明1001〜1055のいずれかの組成物。
[本発明1057]
同定領域が約2〜100ヌクレオチド長である、本発明1001〜1056のいずれかの組成物。
[本発明1058]
同定領域が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100ヌクレオチド長であるか、または100ヌクレオチドより長い、本発明1001〜1057のいずれかの組成物。
[本発明1059]
同定領域が2〜1,000ヌクレオチド長である、本発明1001〜1058のいずれかの組成物。
[本発明1060]
同定領域が100ヌクレオチド長に等しいか、または100ヌクレオチドより長い、本発明1001〜1059のいずれかの組成物。
[本発明1061]
同定領域が、連続した非コードヌクレオチド配列を含む、本発明1001〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1062]
同定領域が、非コードヌクレオチド配列を含む、本発明1001〜1061のいずれかの組成物。
[本発明1063]
同定領域が、連続しない非コードヌクレオチド配列を含む、本発明1001〜1062のいずれかの組成物。
[本発明1064]
同定領域の配列の長さが免疫グロブリン領域の配列の長さより短い、本発明1001〜1063のいずれかの組成物。
[本発明1065]
アダプター領域を含む第三の領域をさらに含む、本発明1001〜1064のいずれかの組成物。
[本発明1066]
アダプター領域を含む第三の領域をさらに含み、該第三の領域が第一の領域と第二の領域の間にある、本発明1001〜1065のいずれかの組成物。
[本発明1067]
アダプター領域を含む第三の領域をさらに含み、該アダプター領域が、その3'端にある少なくとも一つのGヌクレオチドを含む、本発明1001〜1066のいずれかの組成物。
[本発明1068]
同定領域が2〜100ヌクレオチド長であって、免疫グロブリン領域配列とは異なる配列を有し、
アダプター領域がその3'端に少なくとも一つのGヌクレオチドを含み、試料同定領域の3'側かつ免疫グロブリン領域の5'側にあり、
免疫グロブリン可変領域が高頻度変異を起こして、ナイーブB細胞の生殖細胞系配列とは異なっている、本発明1001〜1067のいずれかの組成物。
[本発明1069]
容器中に存在している、本発明1001〜1068のいずれかの組成物。
[本発明1070]
複数の組成物が容器中に存在している、本発明1001〜1069のいずれかの組成物。
[本発明1071]
複数の組成物が、複数のウェルを含む単一のプレートの単一のウェル中に存在している、本発明1001〜1070のいずれかの組成物。
[本発明1072]
組成物が組成物のライブラリー中にあり、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含み、該第一の領域が該第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中に存在する他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、ライブラリー中の複数の可変免疫ドメイン領域の最後のヌクレオチド配列が少なくとも80〜99％の配列同一性を共有している、本発明1001〜1071のいずれかの組成物。
[本発明1073]
組成物が、複数のポリヌクレオチド組成物を含むライブラリー中に含まれ、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含み、該第一の領域が該第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の各独立容器中に存在している他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なる、本発明1001〜1072のいずれかの組成物。
[本発明1074]
複数のポリヌクレオチド組成物を含むポリヌクレオチド組成物ライブラリーであって、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含み、該第一の領域が該第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の各独立容器中に存在している他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なる、ポリヌクレオチド組成物ライブラリー。
[本発明1075]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、該複数のポリヌクレオチドのそれぞれが独立容器中に存在しており、該複数のポリヌクレオチドのそれぞれが、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含み、該第一の領域が該第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中に存在する他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、複数の可変免疫グロブリン領域のうちの少なくとも二つが、少なくとも80〜99％の配列同一性を共有している、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1076]
ポリヌクレオチドのクローンファミリーを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、ファミリー中の各ポリヌクレオチドが、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含み、該第一の領域が該第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ファミリー中に存在している他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、ファミリー中の可変免疫グロブリン領域のそれぞれが少なくとも80〜99％の配列同一性を示す、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1077]
ライブラリーが複数のクローンファミリーを含む、本発明1076のライブラリー。
[本発明1078]
ファミリー中の各配列が同定領域に連結している、免疫グロブリン配列のクローンファミリー。
[本発明1079]
各同定領域が他の同定領域とは異なる、本発明1078のクローンファミリー。
[本発明1080]
免疫グロブリン配列が重鎖免疫グロブリン配列を含む、本発明1078〜1079のいずれかのクローンファミリー。
[本発明1081]
免疫グロブリン配列が軽鎖免疫グロブリン配列を含む、本発明1078〜1080のいずれかのクローンファミリー。
[本発明1082]
免疫グロブリン配列が重鎖および軽鎖免疫グロブリン配列を含む、本発明1078〜1081のいずれかのクローンファミリー。
[本発明1083]
同定領域の1つまたは複数が軽鎖免疫グロブリン配列を含む、本発明1078〜1082のいずれかのクローンファミリー。
[本発明1084]
同定領域の1つまたは複数が重鎖免疫グロブリン配列を含む、本発明1078〜1083のいずれかのクローンファミリー。
[本発明1085]
本発明1078〜1084のいずれかのクローンファミリーのうちの2つまたはそれより多いセット。
[本発明1086]
本発明1078〜1085のいずれかのクローンファミリーのうちの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれより多いセット。
[本発明1087]
ファミリー中の各配列が少なくとも一つの連続するヌクレオチド配列に機能的に連結している、免疫グロブリン配列のクローンファミリー。
[本発明1088]
免疫グロブリン配列が重鎖免疫グロブリン配列を含み、少なくとも一つの連続するヌクレオチド配列が軽鎖免疫グロブリン配列を含む、本発明1087のクローンファミリー。
[本発明1089]
免疫グロブリン配列が軽鎖免疫グロブリン配列を含み、少なくとも一つの連続するヌクレオチド配列が重鎖免疫グロブリン配列を含む、本発明1087のクローンファミリー。
[本発明1090]
それぞれがV、D、および/またはJ領域を有し、かつそれぞれが同定領域に連結している、複数の免疫グロブリン配列を取得する工程；ならびに前記複数の配列からの2つまたはそれより多い配列をグループ分けして、クローンファミリー中の各配列が、あるV、D、および/もしくはJ領域を有する同じ生殖細胞系免疫グロブリン配列の変異型または前記V、D、および/もしくはJ領域を有する生殖細胞系免疫グロブリン配列である、クローンファミリーを作製する工程を含む、免疫グロブリン配列のクローンファミリーを作製する方法。
[本発明1091]
各同定領域が他の同定領域とは異なる、本発明1090の方法。
[本発明1092]
それぞれがV、D、および/またはJ領域を有し、かつそれぞれが同定領域に連結していて、各同定領域が他の同定領域とは異なる、複数の免疫グロブリン配列を取得する工程；1つまたは複数の同定領域を除去する工程；ならびに前記複数の配列からの2つまたはそれより多いの配列をグループ分けして、クローンファミリー中の各配列が、あるV、D、および/もしくはJ領域を有する同じ生殖細胞系免疫グロブリン配列の変異型または前記V、D、および/もしくはJ領域を有する生殖細胞系免疫グロブリン配列である、クローンファミリーを作製する工程を含む、免疫グロブリン配列のクローンファミリーを作製する方法。
[本発明1093]
第一の同定領域に連結している第一のcDNAを選択する工程、および各cDNAに連結している同定領域の共通の実体に基づいて第二のcDNAを同定する工程を含む、第一の同定領域に連結している第二のcDNAを同定する方法。
[本発明1094]
第一のヌクレオチド配列を取得する工程と、第一のヌクレオチド配列を50℃未満においてテンプレートスイッチ活性を有する耐熱性RNase H-逆転写酵素と接触させる工程とを含み、前記接触が3'テールおよび第二のヌクレオチド配列を作製する、第二のヌクレオチド配列上に3'テールを作製する方法。
[本発明1095]
第一のヌクレオチド配列を、約50℃未満、49、48、47、46、45、44、43、もしくは42℃、または42℃未満において接触させる、本発明1094の方法。
[本発明1096]
第一のヌクレオチド配列を42℃において接触させる、本発明1094〜1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
第一のヌクレオチド配列を45.5℃において接触させる、本発明1094〜1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
転写酵素がモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）RNase H-逆転写酵素である、本発明1094〜1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
転写酵素がSuperScript IIIである、本発明1094〜1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
関心対象の第一の配列の天然配列を決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
第一の配列に関係し、かつそれぞれが第一の同定配列に連結している、複数の配列であって、各第一の同定配列が同一であり、前記複数の配列の1つまたは複数が天然配列とは異なるものを取得する工程；および
前記複数の配列を比較して、関心対象の第一の配列の天然配列を決定する工程。
[本発明1101]
複数の配列が免疫グロブリン配列を含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
複数の配列が免疫グロブリン配列を含む、本発明1100〜1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
複数の配列が免疫グロブリン配列を含む、本発明1100〜1102のいずれかの方法。
[本発明1104]
複数の配列がそれぞれ第二の同定領域に連結していて、各第二の同定領域が同一である、本発明1100〜1103のいずれかの方法。
[本発明1105]
関心対象の第一の配列が免疫グロブリン配列である、本発明1100〜1104のいずれかの方法。
[本発明1106]
複数の配列が免疫グロブリン配列である、本発明1100〜1105のいずれかの方法。
[本発明1107]
第一の領域と第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含む組成物であって、第一の領域がB細胞由来可変免疫グロブリン領域を含み、第二の領域が同定領域を含み、該第一の領域が該第二の領域に連結している組成物。
[本発明1108]
複数のポリヌクレオチド組成物を含むポリヌクレオチド組成物ライブラリーであって、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物がB細胞由来可変免疫グロブリン領域と同定領域とを含むポリヌクレオチドを含み、可変免疫グロブリン領域が同定領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の各独立容器中に存在している他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なる、ポリヌクレオチド組成物ライブラリー。
[本発明1109]
ポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
対象に関連する発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域を含むポリヌクレオチドを取得する工程；および
同定領域を含む第二の領域に該第一の領域を連結させることによって該第一の領域と該第二の領域とを含むポリヌクレオチド組成物を生成する工程。
[本発明1110]
対象に関連するB細胞を取得する工程、および前記細胞を処理してポリペプチドを調製する工程を含む、本発明1109の方法。
[本発明1111]
ポリヌクレオチドを取得する工程が、対象に関連するB細胞を処理してポリヌクレオチドを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドを受領する工程を含む、本発明1109〜1110のいずれかの方法。
[本発明1112]
ポリヌクレオチドを取得する工程が、対象に関連するB細胞を可溶化してポリヌクレオチドを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドを受領する工程を含む、本発明1109〜1111のいずれかの方法。
[本発明1113]
ポリヌクレオチドを取得する工程が、フローサイトメーターを使ってB細胞を取得する工程を含む、本発明1109〜1112のいずれかの方法。
[本発明1114]
ポリヌクレオチドを取得する工程が、マイクロフルイディックデバイスを使ってB細胞を取得する工程を含む、本発明1109〜1113のいずれかの方法。
[本発明1115]
可変免疫グロブリン領域が、直径8μm以上の活性化ヒトB細胞から単離されたIgG免疫グロブリンヌクレオチド配列のVDJ領域を含み、免疫グロブリン領域の5'端が同定領域の3'端に連結している、本発明1109〜1114のいずれかの方法。
[本発明1116]
組成物がクローンファミリーに含まれる、本発明1109〜1115のいずれかの方法。
[本発明1117]
免疫グロブリン領域が、活性化B細胞であるB細胞から単離される、本発明1109〜1116のいずれかの方法。
[本発明1118]
免疫グロブリン領域が、形質芽球であるB細胞から単離される、本発明1109〜1117のいずれかの方法。
[本発明1119]
免疫グロブリン領域が、単一のB細胞であるB細胞から単離される、本発明1109〜1118のいずれかの方法。
[本発明1120]
免疫グロブリン領域が、単一の活性化B細胞であるB細胞から単離される、本発明1109〜1119のいずれかの方法。
[本発明1121]
免疫グロブリン領域が、対象の血中にある単一の活性化B細胞であるB細胞から単離される、本発明1109〜1120のいずれかの方法。
[本発明1122]
免疫グロブリン領域が、ヒト活性化B細胞であるB細胞から単離される、本発明1109〜1121のいずれかの方法。
[本発明1123]
免疫グロブリン領域が、メモリーB細胞であるB細胞から単離される、本発明1109〜1122のいずれかの方法。
[本発明1124]
免疫グロブリン領域が、形質細胞であるB細胞から単離される、本発明1109〜1123のいずれかの方法。
[本発明1125]
免疫グロブリン領域が、抗原特異的B細胞であるB細胞から単離される、本発明1109〜1124のいずれかの方法。
[本発明1126]
免疫グロブリン領域が哺乳動物B細胞から単離される、本発明1109〜1125のいずれかの方法。
[本発明1127]
免疫グロブリン領域がヒトB細胞から単離される、本発明1109〜1126のいずれかの方法。
[本発明1128]
免疫グロブリン領域がマウスB細胞から単離される、本発明1109〜1127のいずれかの方法。
[本発明1129]
免疫グロブリン領域が、関心対象の疾患または状態を有する対象由来のB細胞から単離される、本発明1109〜1128のいずれかの方法。
[本発明1130]
免疫グロブリン領域が、関心対象の疾患または状態から回復しているかまたは回復した対象由来のB細胞から単離される、本発明1109〜1129のいずれかの方法。
[本発明1131]
免疫グロブリン領域が、関心対象の抗原を投与された対象由来のB細胞から単離される、本発明1109〜1130のいずれかの方法。
[本発明1132]
免疫グロブリン領域が、関心対象の抗原とアジュバントとを投与された対象由来のB細胞から単離される、本発明1109〜1131のいずれかの方法。
[本発明1133]
免疫グロブリン領域が、対象の血中にあるB細胞から単離される、本発明1109〜1132のいずれかの方法。
[本発明1134]
免疫グロブリン領域が、対象の骨髄中にあるB細胞から単離される、本発明1109〜1133のいずれかの方法。
[本発明1135]
免疫グロブリン領域が、対象の脾臓中にあるB細胞から単離される、本発明1109〜1134のいずれかの方法。
[本発明1136]
免疫グロブリン領域が、対象の少なくとも一つのリンパ節中にあるB細胞から単離される、本発明1109〜1135のいずれかの方法。
[本発明1137]
免疫グロブリン領域が、対象のリンパ組織中にあるB細胞から単離される、本発明1109〜1136のいずれかの方法。
[本発明1138]
免疫グロブリン領域が、対象の腸中にあるB細胞から単離される、本発明1109〜1137のいずれかの方法。
[本発明1139]
免疫グロブリン領域が直径約8〜20μmの活性化B細胞から単離される、本発明1109〜1138のいずれかの方法。
[本発明1140]
直径が8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20μmであるか、または20μmより大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される、本発明1109〜1139のいずれかの方法。
[本発明1141]
面積が約60、70、80、90、100、120、130、140、150、200、250、300、もしくは350μm2であるか、または350μm2より大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される、本発明1109〜1140のいずれかの方法。
[本発明1142]
体積が約250、268、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、もしくは4000μm3であるか、または4000μm3より大きい活性化B細胞から、免疫グロブリン領域が単離される、本発明1109〜1141のいずれかの方法。
[本発明1143]
免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが10％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される、本発明1109〜1142のいずれかの方法。
[本発明1144]
免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが15％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される、本発明1109〜1143のいずれかの方法。
[本発明1145]
免疫グロブリン領域が、対照休止B細胞のメジアン直径よりサイズが20％以上大きい直径を有する活性化B細胞から単離される、本発明1109〜1144のいずれかの方法。
[本発明1146]
免疫グロブリン領域が、免疫グロブリンを分泌する能力を有する活性化B細胞から単離される、本発明1109〜1145のいずれかの方法。
[本発明1147]
免疫グロブリン領域が、細胞周期の第一間期（G1期）、合成期（S期）、第二間期（G2期）、または有糸分裂期（M期）にあるB細胞から単離される、本発明1109〜1146のいずれかの方法。
[本発明1148]
免疫グロブリン領域が、細胞周期の休止期（G0期）にはないB細胞から単離される、本発明1109〜1147のいずれかの方法。
[本発明1149]
免疫グロブリン領域が、フローサイトメトリーによって休止Bリンパ球のFSC平均値の1.2倍より大きいFSC平均値を有すると特徴づけられるB細胞から単離される、本発明1109〜1148のいずれかの方法。
[本発明1150]
免疫グロブリン領域が、フローサイトメトリーによってヒト単球のFSC平均値の0.7〜1.15倍のFSCを有すると特徴づけられるB細胞から単離される、本発明1109〜1149のいずれかの方法。
[本発明1151]
免疫グロブリン領域が単一のCD19陽性B細胞から単離される、本発明1109〜1150のいずれかの方法。
[本発明1152]
免疫グロブリン領域が単一のCD38陽性B細胞から単離される、本発明1109〜1151のいずれかの方法。
[本発明1153]
免疫グロブリン領域が単一のCD27陽性B細胞から単離される、本発明1109〜1152のいずれかの方法。
[本発明1154]
免疫グロブリン領域が単一のCD20陰性B細胞から単離される、本発明1109〜1153のいずれかの方法。
[本発明1155]
免疫グロブリン領域が単一のCD19＋CD20-CD27＋CD38hiB細胞から単離される、本発明1109〜1154のいずれかの方法。
[本発明1156]
免疫グロブリン領域の5'端が同定領域の3'端に連結している、本発明1109〜1155のいずれかの方法。
[本発明1157]
可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のVDJ領域を含む、本発明1109〜1156のいずれかの方法。
[本発明1158]
可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のVJ領域を含む、本発明1109〜1157のいずれかの方法。
[本発明1159]
可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列のV、D、および/またはJ領域を含む、本発明1109〜1158のいずれかの方法。
[本発明1160]
可変免疫グロブリン領域が免疫グロブリンヌクレオチド配列の重鎖および/または軽鎖を含む、本発明1109〜1159のいずれかの方法。
[本発明1161]
可変免疫グロブリン領域が、IgG、IgM、IgD、IgE、またはIgA免疫グロブリン配列を含む、本発明1109〜1160のいずれかの方法。
[本発明1162]
可変免疫グロブリン領域が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4免疫グロブリン配列を含む、本発明1109〜1161のいずれかの方法。
[本発明1163]
可変免疫グロブリン領域が、マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3免疫グロブリン配列を含む、本発明1109〜1162のいずれかの方法。
[本発明1164]
免疫グロブリン領域が約200〜2000ヌクレオチド長である、本発明1109〜1163のいずれかの方法。
[本発明1165]
免疫グロブリン領域が、200ヌクレオチドより短いか、または200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、もしくは2000ヌクレオチド長であるか、または2000ヌクレオチドより長い、本発明1109〜1164のいずれかの方法。
[本発明1166]
同定領域が複数の同定領域を含む、本発明1109〜1165のいずれかの方法。
[本発明1167]
同定領域が複数の同定領域を含み、該複数の同定領域のそれぞれが異なる配列を有する、本発明1109〜1166のいずれかの方法。
[本発明1168]
同定領域が少なくとも一つの試料同定領域と少なくとも一つのプレート同定領域とを含む、本発明1109〜1167のいずれかの方法。
[本発明1169]
同定領域が免疫グロブリン領域の配列とは異なる配列を含む、本発明1109〜1168のいずれかの方法。
[本発明1170]
同定領域が約2〜100ヌクレオチド長である、本発明1109〜1169のいずれかの方法。
[本発明1171]
同定領域が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100ヌクレオチド長であるか、または100ヌクレオチドより長い、本発明1109〜1170のいずれかの方法。
[本発明1172]
同定領域が2〜1,000ヌクレオチド長である、本発明1109〜1171のいずれかの方法。
[本発明1173]
同定領域が100ヌクレオチド長に等しいか、または100ヌクレオチドより長い、本発明1109〜1172のいずれかの方法。
[本発明1174]
同定領域が、連続した非コードヌクレオチド配列を含む、本発明1109〜1173のいずれかの方法。
[本発明1175]
同定領域が、非コードヌクレオチド配列を含む、本発明1109〜1174のいずれかの方法。
[本発明1176]
同定領域が、連続しない非コードヌクレオチド配列を含む、本発明1109〜1175のいずれかの方法。
[本発明1177]
同定領域の配列の長さが免疫グロブリン領域の配列の長さより短い、本発明1109〜1176のいずれかの方法。
[本発明1178]
アダプター領域を含む第三の領域をさらに含む、本発明1109〜1177のいずれかの方法。
[本発明1179]
アダプター領域を含む第三の領域をさらに含み、該第三の領域が第一の領域と第二の領域の間にある、本発明1109〜1178のいずれかの方法。
[本発明1180]
アダプター領域を含む第三の領域をさらに含み、該アダプター領域が、その3'端にある少なくとも一つのGヌクレオチドを含む、本発明1109〜1179のいずれかの方法。
[本発明1181]
同定領域が2〜100ヌクレオチド長であって、免疫グロブリン領域配列とは異なる配列を有し、
アダプター領域がその3'端に少なくとも一つのGヌクレオチドを含み、試料同定領域の3'側かつ免疫グロブリン領域の5'側にあり、
免疫グロブリン可変領域が高頻度変異を起こして、ナイーブB細胞の生殖細胞系配列とは異なっている、本発明1109〜1180のいずれかの方法。
[本発明1182]
組成物が容器中に存在している、本発明1109〜1181のいずれかの方法。
[本発明1183]
複数の組成物が容器中に存在している、本発明1109〜1182のいずれかの方法。
[本発明1184]
複数の組成物が、複数のウェルを含む単一のプレートの単一のウェル中に存在している、本発明1109〜1183のいずれかの方法。
[本発明1185]
組成物が組成物のライブラリー中にあり、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む第一の領域と同定領域を含む第二の領域とを含むポリヌクレオチドを含み、該第一の領域が該第二の領域に連結しており、各同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中に存在する他の同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、ライブラリー中の複数の可変免疫ドメイン領域のヌクレオチド配列が少なくとも80〜99％の配列同一性を共有している、本発明1109〜1184のいずれかの方法。
[本発明1186]
ポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
対象に関連するB細胞を取得する工程；
発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含む細胞からポリヌクレオチドを単離する工程；および
可変免疫グロブリン領域を同定領域に連結することによって、可変免疫グロブリン領域と同定領域とを含むポリヌクレオチド組成物を生成する工程。
[本発明1187]
ポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
対象に関連するB細胞由来可変免疫グロブリン領域を含むポリヌクレオチドを取得する工程；および
可変免疫グロブリン領域を同定領域に連結することによって、可変免疫グロブリン領域と同定領域とを含むポリヌクレオチド組成物を生成する工程。
[本発明1188]
ポリヌクレオチドを取得する工程が、B細胞を取得する工程、および前記細胞を処理してポリヌクレオチドを調製する工程を含む、本発明1187の方法。
[本発明1189]
ポリヌクレオチドを取得する工程が、B細胞を処理してポリヌクレオチドを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドを受領する工程を含む、本発明1187の方法。
[本発明1190]
2つ以上のポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
1つまたは複数の対象から取得された複数の試料に関連する複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、1つまたは複数のポリヌクレオチドが、発現したB細胞可変免疫グロブリン領域を含み、各試料がB細胞に関連し、各試料に関連する各ポリヌクレオチドが独立容器中に存在している、ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程；および
それぞれが前記複数のポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドと同定領域とを含む2つ以上のポリヌクレオチド組成物であって、各同定領域の配列がライブラリー中の他のポリヌクレオチドに連結している同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチド組成物を、ポリヌクレオチドを同定領域に連結することによって生成する工程。
[本発明1191]
ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、複数のB細胞を取得する工程、および前記細胞を処理してポリヌクレオチドライブラリーを調製する工程を含む、本発明1190の方法。
[本発明1192]
ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、複数のB細胞を処理してポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドライブラリーを受領する工程を含む、本発明1190の方法。
[本発明1193]
2つまたはそれより多いポリヌクレオチド組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
1つまたは複数の対象から取得された複数の試料に関連する複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、1つまたは複数のポリヌクレオチドがB細胞由来可変免疫グロブリン領域を含み、各試料に関連する各ポリヌクレオチドが独立容器中に存在している、ポリヌクレオチドライブラリー、を取得する工程；および
それぞれが前記複数のポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドと同定領域とを含む2つ以上のポリヌクレオチド組成物であって、各同定領域の配列がライブラリー中の他のポリヌクレオチドに連結している同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチド組成物、をポリヌクレオチドを同定領域に連結することによって生成する工程。
[本発明1194]
ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、複数のB細胞を取得する工程、および前記細胞を処理してポリヌクレオチドライブラリーを調製する工程を含む、本発明1193の方法。
[本発明1195]
ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、複数のB細胞を処理してポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドライブラリーを受領する工程を含む、本発明1193の方法。
[本発明1196]
複数のポリヌクレオチド組成物を含むポリヌクレオチド組成物ライブラリーであって、各組成物が独立容器中に存在しており、各組成物が、cDNA領域の3'端にヌクレオチドCを含む単一試料由来cDNA領域と、アダプター領域に連結した試料同定領域を含む試料同定-アダプター領域とを含み、各試料同定-アダプター領域の試料同定領域のヌクレオチド配列が、ライブラリー中の各独立容器中に存在している他の試料同定-アダプター領域の試料同定領域のヌクレオチド配列とは異なり、アダプター領域がアダプター領域の3'端にヌクレオチドGを含み、試料同定-アダプター領域が前記CとGの間の連結によってcDNA領域に取り付けられている、ポリヌクレオチド組成物ライブラリー。
[本発明1197]
cDNA領域が、DNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたRNAポリヌクレオチドを含む、本発明1196のライブラリー。
[本発明1198]
cDNA領域が、cDNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたmRNAポリヌクレオチドを含む、本発明1196または本発明1197のライブラリー。
[本発明1199]
cDNA領域が3'端に少なくとも一つのCを含み、アダプター領域が3'端に少なくとも一つのGを含む、本発明1196〜1198のいずれかのライブラリー。
[本発明1200]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来cDNA領域を含み、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、cDNA領域がアダプター領域の3'端に連結しており、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なり、試料同定領域が二本鎖である、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1201]
各ポリヌクレオチドが複数の試料同定領域を含む、本発明1200のライブラリー。
[本発明1202]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1203]
アンプリコン領域の5'端がアダプター領域の3'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が配列：
0005998203.tif 000013
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む、本発明1202のライブラリー。
[本発明1204]
ユニバーサルプライマー領域の配列がどのヒト遺伝子エクソンとも完全には相補的でなく、ユニバーサルプライマー領域がアダプター領域に干渉しない最小限の二次構造を有する、本発明1202〜1203のいずれかのライブラリー。
[本発明1205]
ユニバーサルプライマー領域が配列：
0005998203.tif 000014
である、本発明1202〜1204のいずれかのライブラリー。
[本発明1206]
アンプリコン領域が、cDNAヌクレオチド配列を含むcDNA領域を含む、本発明1202〜1205のいずれかのライブラリー。
[本発明1207]
第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは、少なくとも1ヌクレオチドで相違する、本発明1202〜1206のいずれかのライブラリー。
[本発明1208]
第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは、少なくとも2ヌクレオチドで相違する、本発明1202〜1207のいずれかのライブラリー。
[本発明1209]
試料同定領域が少なくとも10ヌクレオチド長である、本発明1202〜1208のいずれかのライブラリー。
[本発明1210]
試料同定領域が少なくとも1ヌクレオチド長である、本発明1202〜1209のいずれかのライブラリー。
[本発明1211]
各試料同定領域の配列が表2および表7から選択される、本発明1202〜1210のいずれかのライブラリー。
[本発明1212]
アダプター領域の配列が、その3'端に少なくとも一つのGヌクレオチドを含む、本発明1202〜1211のいずれかのライブラリー。
[本発明1213]
アンプリコン領域が、免疫グロブリン重鎖アンプリコン配列、免疫グロブリン軽鎖アンプリコン配列、T細胞受容体αアンプリコン配列、またはT細胞受容体βアンプリコン配列を含む、本発明1202〜1212のいずれかのライブラリー。
[本発明1214]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-3'を含み、Aがユニバーサルプライマー領域であり、Bが試料同定領域であり、Cがアダプター領域であり、Dが単一試料由来のアンプリコン領域であり、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1215]
ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含むポリヌクレオチドであって、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しているポリヌクレオチド。
[本発明1216]
アンプリコン領域の5'端がアダプター領域の3'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000015
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む、本発明1215のポリヌクレオチド。
[本発明1217]
配列5'-A-B-C-D-3'を含むポリヌクレオチドであって、Aがユニバーサルプライマー領域であり、Bが試料同定領域であり、Cがアダプター領域であり、Dが単一試料由来のアンプリコン領域である、ポリヌクレオチド。
[本発明1218]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが、第一のプレート同定領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一のプレート同定領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1219]
単一試料の第一のセット由来の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セット由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは異なる、本発明1218のライブラリー。
[本発明1220]
単一試料の第一のセット由来の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セット由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは、少なくとも1ヌクレオチドで相違する、本発明1218〜1219のいずれかのライブラリー。
[本発明1221]
単一試料の第一のセット由来の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セット由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは、少なくとも2ヌクレオチドで相違する、本発明1218〜1220のいずれかのライブラリー。
[本発明1222]
第一のプレート同定領域が少なくとも10ヌクレオチド長である、本発明1218〜1221のいずれかのライブラリー。
[本発明1223]
第一のプレート同定領域の配列が表3および表6から選択される、本発明1218〜1222のいずれかのライブラリー。
[本発明1224]
第一のプレート同定領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域の5'端がアダプター領域の3'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000016
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含み、各ポリヌクレオチドが、第二のプレート同定領域、第一の配列決定領域、および第二の配列決定領域をさらに含み、第二のプレート同定領域の5'端がアンプリコン領域の3'端に連結しており、第一の配列決定領域の3'端が第一のプレート同定領域の5'端に連結しており、第二の配列決定領域の5'端が第二のプレート同定領域の3'端に連結している、本発明1218〜1223のいずれかのライブラリー。
[本発明1225]
第二のプレート同定領域の配列が各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と同一である、本発明1218〜1224のいずれかのライブラリー。
[本発明1226]
単一試料の第一のセット由来の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セット由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列とは異なる、本発明1218〜1225のいずれかのライブラリー。
[本発明1227]
単一試料の第一のセット由来の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セット由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列とは、少なくとも1ヌクレオチドで相違する、本発明1218〜1226のいずれかのライブラリー。
[本発明1228]
単一試料の第一のセット由来の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セット由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列とは、少なくとも2ヌクレオチドで相違する、本発明1218〜1227のいずれかのライブラリー。
[本発明1229]
第二のプレート同定領域が少なくとも10ヌクレオチド長である、本発明1218〜1228のいずれかのライブラリー。
[本発明1230]
第二のプレート同定領域の配列が表3および表6から選択される、本発明1218〜1229のいずれかのライブラリー。
[本発明1231]
第一の配列決定領域が
0005998203.tif 000017
を含む、本発明1218〜1230のいずれかのライブラリー。
[本発明1232]
第二の配列決定領域が
0005998203.tif 000018
を含む、本発明1218〜1231のいずれかのライブラリー。
[本発明1233]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-E-3'を含み、Aがプレート同定領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料由来のアンプリコン領域であり、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1234]
第一のプレート同定領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含むポリヌクレオチドであって、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一のプレート同定領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結している、ポリヌクレオチド。
[本発明1235]
第一のプレート同定領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域の5'端がアダプター領域の3'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000019
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含み、各ポリヌクレオチドが、第二のプレート同定領域、第一の配列決定領域、および第二の配列決定領域をさらに含み、第二のプレート同定領域の5'端がアンプリコン領域の3'端に連結しており、第一の配列決定領域の3'端が第一のプレート同定領域の5'端に連結しており、第二の配列決定領域の5'端が第二のプレート同定領域の3'端に連結している、本発明1234のポリヌクレオチド。
[本発明1236]
配列5'-A-B-C-D-E-3'を含むポリヌクレオチドであって、Aがプレート同定領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料由来のアンプリコン領域である、ポリヌクレオチド。
[本発明1237]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが、第一の制限部位領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料由来のアンプリコン領域、および第二の制限部位領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一の制限部位領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、第二の制限部位領域がアンプリコン領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1238]
第一の制限部位領域が1つまたは複数の制限部位を含む、本発明1237のライブラリー。
[本発明1239]
第一の制限部位領域が、NheI、XhoI、BstBI、EcoRI、SacII、BbvCI、PspXI、AgeI、ApaI、KpnI、Acc65I、XmaI、BstEII、DraIII、PacI、FseI、AsiSIおよびAscIからなる群より選択される1つまたは複数の制限部位を含む、本発明1237〜1238のいずれかのライブラリー。
[本発明1240]
第二の制限部位領域が1つまたは複数の制限部位を含む、本発明1237〜1239のいずれかのライブラリー。
[本発明1241]
第二の制限部位領域が、NheI、XhoI、BstBI、EcoRI、SacII、BbvCI、PspXI、AgeI、ApaI、KpnI、Acc65I、XmaI、BstEII、DraIII、PacI、FseI、AsiSIおよびAscIからなる群より選択される1つまたは複数の制限部位を含む、本発明1237〜1240のいずれかのライブラリー。
[本発明1242]
第一の制限部位領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結しており、アダプター領域の3'端がアンプリコン領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域の3'端が第二の制限部位領域の5'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000020
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む、本発明1237〜1241のいずれかのライブラリー。
[本発明1243]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-E-F-3'を含み、Aが第一の制限部位領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料由来のアンプリコン領域であり、Fが第二の制限部位領域であり、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1244]
第一の制限部位領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料由来のアンプリコン領域、および第二の制限部位領域を含む、ベクターへの挿入用のポリヌクレオチドであって、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一の制限部位領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、第二の制限部位領域がアンプリコン領域に機能的に連結している、ポリヌクレオチド。
[本発明1245]
第一の制限部位領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結しており、アダプター領域の3'端がアンプリコン領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域の3'端が第二の制限部位領域の5'端に連結しており、ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000021
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む、本発明1244のポリヌクレオチド。
[本発明1246]
配列5'-A-B-C-D-E-F-3'を含む、ベクターにおける挿入用のポリヌクレオチドであって、Aが第一の制限部位領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料由来のアンプリコン領域であり、Fが第二の制限部位領域である、ポリヌクレオチド。
[本発明1247]
ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、およびアダプター領域を含むポリヌクレオチドアダプター分子であって、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結している、ポリヌクレオチドアダプター分子。
[本発明1248]
ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000022
を含み、アダプター領域が少なくとも一つのGを含む、本発明1247の分子。
[本発明1249]
ユニバーサルプライマー領域とプレート同定領域とを含み、プレート同定領域の3'端がユニバーサルプライマー領域の5'端に連結している、ポリヌクレオチドプライマー。
[本発明1250]
ユニバーサルプライマー領域が
0005998203.tif 000023
を含み、プライマーが配列決定領域をさらに含み、配列決定領域の3'端がプレート同定領域の5'端に連結している、本発明1247のプライマー。
[本発明1251]
本発明1001〜1250のいずれかのポリヌクレオチドを含む、ベクタ-。
[本発明1252]
複数のポリヌクレオチドを含む、本発明1251のベクター。
[本発明1253]
pEE6.4およびpEE12.4からなる群より選択される、本発明1251〜1252のいずれかのベクター。
[本発明1254]
本発明1251〜1253のいずれかのベクターまたは本発明1001〜1250のいずれかのポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞。
[本発明1255]
CHO細胞、CHO-K1細胞、CHO-S細胞、NS0細胞、dhfr-であるCHO細胞、CHO-dhfr-、DUKX-B11 CHO細胞、およびDG44 CHO細胞からなる群より選択される、本発明1254の宿主細胞。
[本発明1256]
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
1つまたは複数の対象から取得した複数の試料に関連する複数のcDNAを含むcDNAライブラリーを取得する工程であって、各cDNAが複数の試料中の単一試料に関連し、各試料に関連する各cDNAが独立容器中に存在している、工程；および
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、アダプター分子を各試料に関連するcDNAに付加する工程であって、アダプター分子が試料同定領域とアダプター領域とを含み、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、各アダプター分子の試料同定領域の配列が、ライブラリー中の各cDNAに付加される他のアダプター分子の試料同定領域の配列とは異なる、工程。
[本発明1257]
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、アダプター領域の3'端をライブラリー中の各cDNAの3'端に取り付ける工程をさらに含む、本発明1256の方法。
[本発明1258]
cDNAライブラリーを取得する工程が、複数の試料を取得する工程および試料を処理してcDNAライブラリーを調製する工程を含む、本発明1256〜1257のいずれかの方法。
[本発明1259]
アダプター分子がユニバーサルプライマー領域をさらに含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結している、本発明1256〜1258のいずれかの方法。
[本発明1260]
各cDNA領域が、cDNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたmRNAポリヌクレオチドを含む、本発明1256〜1259のいずれかの方法。
[本発明1261]
各試料が細胞を含む、本発明1256〜1260のいずれかの方法。
[本発明1262]
細胞がB細胞である、本発明1256〜1261のいずれかの方法。
[本発明1263]
B細胞が、形質芽球、メモリーB細胞、または形質細胞である、本発明1256〜1262のいずれかの方法。
[本発明1264]
各試料が複数の細胞を含む、本発明1256〜1263のいずれかの方法。
[本発明1265]
cDNAライブラリーを取得する工程が、複数の試料を処理してcDNAライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にcDNAライブラリーを受領する工程を含む、本発明1256〜1264のいずれかの方法。
[本発明1266]
アダプターが、逆転写反応中に生成したcDNAの3'テールにアダプターをアニールすることによって付加される、本発明1256〜1265のいずれかの方法。
[本発明1267]
各cDNAが少なくとも一つのCヌクレオチドを含み、Cが各cDNAの3'端にあり、アダプター領域が少なくとも一つのGヌクレオチドを含み、Gがアダプター領域の3'端にあり、アダプター領域が、前記GとCの間の結合によって各cDNAに取り付けられる、本発明1256〜1266のいずれかの方法。
[本発明1268]
アダプター分子が一本鎖であり、酵素にアダプター分子を二本鎖化させることによって各cDNA中にアダプター分子を組み込む工程をさらに含む、本発明1256〜1267のいずれかの方法。
[本発明1269]
MMLV H-逆転写酵素によって関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、アダプター分子が各cDNAに組み込まれる、本発明1256〜1268のいずれかの方法。
[本発明1270]
配列決定用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程であって、各ポリヌクレオチドが、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、工程；および
配列決定用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、ポリヌクレオチドライブラリーを1セットのプライマーで増幅する工程であって、配列決定用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドが、第一の配列決定領域、第一のプレート同定領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料由来のアンプリコン領域、および第二の配列決定領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、第一のプレート同定領域がユニバーサルプライマー領域に機能的に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、第一の配列決定領域が関心対象のポリヌクレオチドの5'端にあり、第二の配列決定領域が関心対象のポリヌクレオチドの3'端にある、工程。
[本発明1271]
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを配列決定する工程をさらに含む、本発明1270の方法。
[本発明1272]
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを454シークエンシングで配列決定する工程をさらに含む、本発明1270の方法。
[本発明1273]
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドをSMRTシークエンシングで配列決定する工程をさらに含む、本発明1270の方法。
[本発明1274]
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドをSOLiDシークエンシングで配列決定する工程をさらに含む、本発明1270の方法。
[本発明1275]
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドをSOLEXAシークエンシングで配列決定する工程をさらに含む、本発明1270の方法。
[本発明1276]
1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドをtSMSシークエンシングで配列決定する工程をさらに含む、本発明1270の方法。
[本発明1277]
プライマーのセットが、表1および表5に示すプライマーから選択される、本発明1270の方法。
[本発明1278]
ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が実験室でポリヌクレオチドライブラリーを調製する工程を含む、本発明1270の方法。
[本発明1279]
ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、ポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドライブラリーを受領する工程を含む、本発明1270の方法。
[本発明1280]
配列決定データを解析するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
複数のポリヌクレオチドに関連するデータセットを取得する工程であって、データセットが複数のポリヌクレオチドに関する配列決定データを含み、複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドが試料同定領域を含み、各ポリヌクレオチドの各試料同定領域が単一試料に関して固有であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来の複数のポリヌクレオチド中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、工程；および
同一の試料同定領域を有するポリヌクレオチドをマッチングさせるためにデータセットを解析する工程であって、マッチはポリヌクレオチドが同じ試料に由来したことを示す、工程。
[本発明1281]
複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドが、第一のプレート同定領域をさらに含み、各ポリヌクレオチドの各第一のプレート同定領域と試料同定領域との各組合せが単一試料に関して固有であり、単一試料の第一のセット由来の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セット由来の複数のポリヌクレオチド中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは異なり、同一の第一のプレート同定領域および同一の試料同定領域を有するポリヌクレオチドをマッチングさせるためにデータセットを解析する工程をさらに含み、両領域間のマッチはポリヌクレオチドが同じ試料に由来したことを示す、本発明1280の方法。
[本発明1282]
データセットを取得する工程が、複数のポリヌクレオチドを取得する工程、および複数のポリヌクレオチドを配列決定してデータセットを実験的に決定する工程を含む、本発明1280の方法。
[本発明1283]
データセットを取得する工程が、複数のポリヌクレオチドを配列決定してデータセットを実験的に決定した第三者から直接的または間接的にデータセットを受領する工程を含む、本発明1280の方法。
[本発明1284]
データセットが電子記憶媒体に格納される、本発明1280の方法。
[本発明1285]
単一試料が単一細胞である、本発明1280の方法。
[本発明1286]
単一試料が単一細胞を含む、本発明1280の方法。
[本発明1287]
単一試料が単一のB細胞を含む、本発明1280の方法。
[本発明1288]
単一試料が複数のB細胞を含む、本発明1280の方法。
[本発明1289]
クローニング用の1つまたは複数のポリヌクレオチドを選択する工程をさらに含む、本発明1280の方法。
[本発明1290]
関心対象の第一のポリヌクレオチドの選択に基づいて関心対象の第二のポリヌクレオチドを同定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
複数のポリヌクレオチドに関連するデータセットを取得する工程であって、データセットが複数のポリヌクレオチドに関する配列決定データを含み、複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドが試料同定領域を含み、各ポリヌクレオチドの各試料同定領域は単一試料に関して固有であることによって、複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドを異なる単一試料と関連づけており、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来の複数のポリヌクレオチド中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、工程；および
データセットから第一の単一試料に関連する関心対象の第一のポリヌクレオチドを選択し、関心対象の第一のポリヌクレオチドの試料同定領域に基づいて第一の単一試料中の関心対象の第二のポリヌクレオチドを同定する工程。
[本発明1291]
複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチドが、第一のプレート同定領域をさらに含み、各ポリヌクレオチドの各第一のプレート同定領域と試料同定領域との各組合せが単一試料に関して固有であり、単一試料の第一のセット由来の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列が、前記単一試料の第一のセットとは異なる1つまたは複数の単一試料セット由来の複数のポリヌクレオチド中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列とは異なり、関心対象の第一のポリヌクレオチドの試料同定領域と第一のプレート同定領域とに基づいて第一の単一試料中の関心対象の第二のポリヌクレオチドを同定する工程をさらに含む、本発明1290の方法。
[本発明1292]
第一の単一試料がB細胞を含む、本発明1291の方法。
[本発明1293]
第一の単一試料が複数のB細胞を含む、本発明1291の方法。
[本発明1294]
第一の単一試料がB細胞を含み、関心対象の第一のポリヌクレオチドが抗体重鎖ヌクレオチド配列を含み、関心対象の第二のポリヌクレオチドが抗体軽鎖ヌクレオチド配列を含む、本発明1291の方法。
[本発明1295]
第一の単一試料がB細胞を含み、関心対象の第一のポリヌクレオチドが抗体軽鎖ヌクレオチド配列を含み、関心対象の第二のポリヌクレオチドが抗体重鎖ヌクレオチド配列を含む、本発明1291の方法。
[本発明1296]
データセットを取得する工程が、複数のポリヌクレオチドを取得する工程、および複数のポリヌクレオチドを配列決定してデータセットを実験的に決定する工程を含む、本発明1291の方法。
[本発明1297]
データセットを取得する工程が、複数のポリヌクレオチドを配列決定してデータセットを実験的に決定した第三者から直接的または間接的にデータセットを受領する工程を含む、本発明1291の方法。
[本発明1298]
データセットが電子記憶媒体に格納される、本発明1291の方法。
[本発明1299]
クローニング用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程であって、各ポリヌクレオチドが、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、ユニバーサルプライマー領域の配列が前記複数のポリヌクレオチド中の各ポリヌクレオチド上で実質的に同一であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、工程；および
クローニング用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドを作製するために、ポリヌクレオチドライブラリーを1セットのプライマーで増幅する工程であって、クローニング用の1つまたは複数の関心対象のポリヌクレオチドが、第一の制限部位領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料由来のアンプリコン領域、および第二の制限部位領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の3'端が試料同定領域の5'端に連結しており、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結しており、第一の制限部位領域が関心対象のポリヌクレオチドの5'端にあり、第二の制限部位領域が関心対象のポリヌクレオチドの3'端にある、工程。
[本発明1300]
ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、実験室でポリヌクレオチドライブラリーを調製する工程を含む、本発明1299の方法。
[本発明1301]
ポリヌクレオチドライブラリーを取得する工程が、ポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者から直接的または間接的にポリヌクレオチドライブラリーを受領する工程を含む、本発明1299の方法。
[本発明1302]
関心対象の分子を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
試料同定領域、アダプター領域、および単一試料由来のアンプリコン領域を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を取得する工程であって、試料同定領域の3'端がアダプター領域の5'端に連結しており、アンプリコン領域がアダプター領域に機能的に連結している、工程；および
関心対象の分子を作製するのに十分な条件下で宿主細胞を培養する工程。
[本発明1303]
宿主細胞を取得する工程が、実験室でポリヌクレオチドを含む宿主細胞を調製する工程を含む、本発明1302の方法。
[本発明1304]
宿主細胞を取得する工程が、宿主細胞を調製した第三者から直接的または間接的に、ポリヌクレオチドを含む宿主を受領する工程を含む、本発明1302の方法。
[本発明1305]
関心対象の分子がタンパク質である、本発明1302の方法。
[本発明1306]
関心対象の分子が抗体である、本発明1302の方法。
[本発明1307]
関心対象の分子がヒトモノクローナル抗体である、本発明1302の方法。
[本発明1308]
関心対象の分子を収集する工程をさらに含む、本発明1302の方法。
[本発明1309]
本発明1001〜1308のいずれかのポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、または宿主細胞と、使用説明書とを含むキット。
[本発明1310]
複数の関心対象の連続しないポリヌクレオチド配列を連結しバーコード化する方法であって、以下の工程を含む、方法：
（a）複数のcDNA分子を提供する工程；
（b）関心対象のcDNA分子を物理的に連結する工程；および
（c）物理的連結の前、間、または後に、関心対象のcDNAにバーコード配列を付加する工程。
[本発明1311]
物理的連結がライゲーションによる、本発明1310の方法。
[本発明1312]
物理的連結が組換えによる、本発明1310の方法。
[本発明1313]
物理的連結が、オーバーラップ-伸長配列を用いる工程を含む、本発明1310の方法。
[本発明1314]
バーコード配列が、物理的に連結されたcDNAの末端の一方または両方にある、本発明1310の方法。
[本発明1315]
バーコード配列が、物理的に連結されたcDNAの間にある、本発明1310の方法。
[本発明1316]
ライゲーションが、適合する末端のアニーリングおよびライゲーションによって行われる、本発明1311の方法。
[本発明1317]
適合する末端が制限部位である、本発明1310の方法。
[本発明1318]
ライゲーションが平滑末端ライゲーションによって行われる、本発明1310の方法。
[本発明1319]
オーバーラップ-伸長配列が、オーバーラップ-伸長テールを含むプライマーを使った増幅の過程において付加される、本発明1310の方法。
[本発明1320]
オーバーラップ-伸長配列が、オーバーラップ-伸長テールを含むプライマーを使った逆転写の過程において付加される、本発明1310の方法。
[本発明1321]
オーバーラップ-伸長配列が、逆転写反応中に生成したcDNAの3'テールにアダプターをアニーリングさせることによって付加される、本発明1310の方法。
[本発明1322]
バーコード配列がライゲーションによって付加される、本発明1310の方法。
[本発明1323]
ライゲーションが、適合する末端のアニーリングおよびライゲーションによって行われる、本発明1310の方法。
[本発明1324]
適合する末端が制限部位である、本発明1310の方法。
[本発明1325]
ライゲーションが、バーコード配列を含むアダプターの平滑末端ライゲーションによって行われる、本発明1310の方法。
[本発明1326]
バーコード配列が、バーコード配列を含むプライマーを使った増幅反応の過程において付加される、本発明1310の方法。
[本発明1327]
バーコード配列が、バーコード配列を含むプライマーを使った逆転写反応の過程において付加される、本発明1310の方法。
[本発明1328]
バーコード配列が、逆転写反応中に生成したcDNAの3'テールにアダプターをアニーリングさせることによって付加される、本発明1310の方法。
[本発明1329]
cDNAの3'端が少なくとも一つのCヌクレオチドを含み、アダプターの3'端が少なくとも一つのGヌクレオチドを含み、アダプターが前記CとGの間の結合によって各cDNAに取り付けられる、本発明1310の方法。
[本発明1330]
アダプターが一本鎖であり、酵素にアダプターを二本鎖化させることによって各cDNA中にアダプター分子を組み込む工程をさらに含む、本発明1310の方法。
[本発明1331]
アダプターが、MMLV H-逆転写酵素によって各cDNA中に組み込まれる、本発明1310の方法。
[本発明1332]
オーバーラップ-伸長配列がバーコード配列を含む、本発明1310の方法。
[本発明1333]
関心対象のポリヌクレオチド配列が抗体の重鎖および軽鎖を含む、本発明1310の方法。
[本発明1334]
（d）物理的連結の前、間、または後に、関心対象のcDNAに配列決定領域を付加する工程をさらに含む、本発明1310の方法。
[本発明1335]
配列決定領域がアダプターと共に付加される、本発明1310の方法。
[本発明1336]
（e）NextGenシークエンシングプラットホームを用いる、物理的に連結された関心対象のcDNA分子の配列決定工程をさらに含む、本発明1310の方法。
[本発明1337]
NextGenシークエンシングプラットホームが454シークエンシングである、本発明1310の方法。
[本発明1338]
NextGenシークエンシングプラットホームがSMRTシークエンシングである、本発明1310の方法。
[本発明1339]
NextGenシークエンシングプラットホームがSOLiDシークエンシングである、本発明1310の方法。
[本発明1340]
NextGenシークエンシングプラットホームがSOLEXAシークエンシングである、本発明1310の方法。
[本発明1341]
NextGenシークエンシングプラットホームがtSMSシークエンシングである、本発明1310の方法。
[本発明1342]
複数のcDNA分子が、少なくとも6個、少なくとも12個、少なくとも24個、少なくとも48個、少なくとも96個、少なくとも384個、少なくとも1536個、またはそれより多いウェルを有するプレートに含まれている単一試料由来のものである、本発明1310の方法。
[本発明1343]
複数のcDNA分子が、それぞれが少なくとも96個のウェルを有する少なくとも1枚、2枚、3枚、4枚、5枚、6枚、7枚、8枚、9枚、10枚、20枚、30枚、40枚、50枚、75枚、100枚、またはそれより多いプレートに含まれている単一試料由来のものである、本発明1310の方法。
[本発明1344]
関心対象のポリヌクレオチド配列を含有する複数の試料を連結しバーコード化する方法であって、以下の工程を含む、方法：
（a）試料を複数の容器に分配する工程；
（b）試料由来のテンプレートを使って関心対象のポリヌクレオチド配列を合成する工程であって、該合成がバーコード配列の付加をもたらす、工程；および
（c）工程（b）において合成した関心対象のポリヌクレオチド配列の連結を達成する工程。
[本発明1345]
各試料が細胞を含む、本発明1344の方法。
[本発明1346]
細胞がB細胞である、本発明1344の方法。
[本発明1347]
B細胞が、形質芽球、メモリーB細胞、または形質細胞である、本発明1344の方法。
[本発明1348]
各試料が複数の細胞を含む、本発明1344の方法。
[本発明1349]
関心対象のポリヌクレオチド配列が抗体の重鎖および軽鎖を含む、本発明1344の方法。
[本発明1350]
合成がRT-PCR増幅を含む、本発明1344の方法。
[本発明1351]
RT-PCR増幅が一段階で行われる、本発明1344の方法。
[本発明1352]
関心対象のポリヌクレオチドの連結が、オーバーラップ-伸長プライマーを使ったRT-PCR増幅の過程において行われる、本発明1344の方法。
[本発明1353]
（d）バーコード配列の付加または連結の前、間、または後に、配列決定領域を関心対象のポリヌクレオチド配列に付加する工程をさらに含む、本発明1344の方法。
[本発明1354]
配列決定領域がアダプターと共に付加される、本発明1344の方法。
[本発明1355]
（e）NextGenシークエンシングプラットホームを用いる、連結された関心対象のポリヌクレオチド配列の配列決定工程をさらに含む、本発明1344の方法。
[本発明1356]
NextGenシークエンシングプラットホームが454シークエンシングである、本発明1344の方法。
[本発明1357]
NextGenシークエンシングプラットホームがSMRTシークエンシングである、本発明1344の方法。
[本発明1358]
NextGenシークエンシングプラットホームがSOLiDシークエンシングである、本発明1344の方法。
[本発明1359]
NextGenシークエンシングプラットホームがSOLEXAシークエンシングである、本発明1344の方法。
[本発明1360]
NextGenシークエンシングプラットホームがtSMSシークエンシングである、本発明1344の方法。
[本発明1361]
複数の試料が、少なくとも6個、少なくとも12個、少なくとも24個、少なくとも48個、少なくとも96個、少なくとも384個、少なくとも1536個、またはそれより多いウェルを有するプレートに含まれている単一試料である、本発明1344の方法。
[本発明1362]
複数の試料が、それぞれが少なくとも96個のウェルを有する少なくとも1枚、2枚、3枚、4枚、5枚、6枚、7枚、8枚、9枚、10枚、20枚、30枚、40枚、50枚、75枚、100枚、200枚、500枚またはそれより多いプレートに含まれている単一試料である、本発明1344の方法。
[本発明1363]
複数の関心対象の連続しないポリヌクレオチド配列を連結しバーコード化する方法であって、以下の工程を含む、方法：
（a）単離された1つまたは複数の細胞を得るために細胞を複数の容器に分配する工程；
（b）該単離された1つまたは複数の細胞由来のテンプレートを使って関心対象のポリヌクレオチド配列を増幅する工程であって、該増幅がバーコード配列の付加をもたらす、工程；および
（c）工程（b）において増幅された関心対象のポリヌクレオチド配列の連結を達成する工程。
[本発明1364]
関心対象のヌクレオチド配列が抗体の重鎖および軽鎖を含む、本発明1363の方法。
[本発明1365]
増幅がRT-PCR増幅を含む、本発明1363の方法。
[本発明1366]
RT-PCR増幅が一段階で行われる、本発明1363の方法。
[本発明1367]
関心対象のヌクレオチドの連結が、オーバーラップ-伸長プライマーを使ったRT-PCR増幅の過程において行われる、本発明1363の方法。
[本発明1368]
（d）バーコード配列の付加または連結の前、間、または後に、配列決定領域を関心対象のポリヌクレオチド配列に付加する工程をさらに含む、本発明1363の方法。
[本発明1369]
配列決定領域がアダプターと共に付加される、本発明1363の方法。
[本発明1370]
（e）NextGenシークエンシングプラットホームを用いる、連結された関心対象のポリヌクレオチド配列の配列決定工程をさらに含む、本発明1363の方法。
[本発明1371]
NextGenシークエンシングプラットホームが454シークエンシングである、本発明1363の方法。
[本発明1372]
NextGenシークエンシングプラットホームがSMRTシークエンシングである、本発明1363の方法。
[本発明1373]
NextGenシークエンシングプラットホームがSOLiDシークエンシングである、本発明1363の方法。
[本発明1374]
NextGenシークエンシングプラットホームがSOLEXAシークエンシングである、本発明1363の方法。
[本発明1375]
NextGenシークエンシングプラットホームがtSMSシークエンシングである、本発明1363の方法。
[本発明1376]
1つまたは複数の細胞が、少なくとも6個、少なくとも12個、少なくとも24個、少なくとも48個、少なくとも96個、少なくとも384個、少なくとも1536個、またはそれより多いウェルを有するプレートに含まれる、本発明1363の方法。
[本発明1377]
1つまたは複数の細胞が、それぞれが少なくとも96個のウェルを有する少なくとも1枚、2枚、3枚、4枚、5枚、6枚、7枚、8枚、9枚、10枚、20枚、30枚、40枚、50枚、75枚、100枚、またはそれより多いプレートに含まれる、本発明1363の方法。
[本発明1378]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-3'を含み、Aが試料同定領域（バーコード配列）であり、Bが単一試料由来の第一のcDNA領域であり、Cがリンカー領域であり、Dが同じ単一試料由来の第二のcDNA領域であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1379]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-D-3'を含み、Aが単一試料由来の第一のcDNA領域であり、Bがリンカー領域であり、Cが同じ単一試料由来の第二のcDNA領域であり、Dが試料同定領域（バーコード配列）であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1380]
複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、各ポリヌクレオチドが配列5'-A-B-C-3'を含み、Aが単一試料由来の第一のcDNA領域であり、Bが試料同定領域（バーコード配列）を含むリンカー領域であり、Cが同じ単一試料由来の第二のcDNA領域であり、第一の単一試料由来の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料とは異なる1つまたは複数の試料由来のライブラリー中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列とは異なる、ポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1381]
第一のcDNA領域が抗体重鎖を含み、第二のcDNA領域が抗体軽鎖を含む、本発明1378のポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1382]
少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも3000種、少なくとも10,000種、少なくとも30,000種、少なくとも100,000種、少なくとも300,000種、少なくとも1,000,000種、少なくとも3,000,000種、少なくとも10,000,000種、少なくとも30,000,000種、またはそれより多いメンバーを含む、本発明1378のポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1383]
細胞試料の全トランスクリプトームのうち、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも3000種、少なくとも10,000種、少なくとも30,000種、またはそれより多い遺伝子を含む、本発明1378のポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1384]
個体の血液中に存在している相違する抗体種のうち、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも10,000種、少なくとも100,000種、少なくとも1,000,000種、少なくとも10,000,000種、少なくとも100,000,000種、またはそれより多い抗体種を含む、本発明1378のポリヌクレオチドライブラリー。
[本発明1385]
抗体が、形質芽球、形質細胞、メモリーB細胞、長寿命形質細胞、他のB系統細胞またはそれらの組み合わせによって発現される、本発明1378の抗体種。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
図面のいくつかの概観についての簡単な説明
以下の説明および添付の図面に関して、これらのおよび他の特質、局面、および利点が、よりよく理解されるようになるであろう。
【０１０２】
【図１】B細胞分化。成熟ナイーブB細胞はCD19＋であり、リンパ節および脾臓等の二次リンパ組織において抗原負荷すると、活性化されて増殖かつ分化し得る。それらは、濾胞外病巣（extra-follicular foci）においてまたは胚中心において増殖かつ分化する。濾胞外病巣において分化しているB細胞は、典型的には、分化して短寿命形質細胞になり、通常、それらの起源である二次リンパ組織に存在する。胚中心において分化しているB細胞は、後続の抗原負荷によりさらに刺激されて分化し得るメモリーB細胞になり得るか、または長寿命形質細胞になる潜在性を有する形質芽球になり得る。これらの形質芽球は循環に入り得、骨髄、粘膜組織（IgA＋形質細胞に対して）、および炎症組織等の長寿命形質細胞が存在する様々な組織に輸送される。血中には、通過する形質細胞も一部存在している。上述の細胞タイプのすべてを、血液の循環中に見出すこともできる。
【図２】単一に選別された細胞由来の対合遺伝子の高性能配列決定、クローニング、および発現についての概略図。所望の細胞集団を、それらの細胞表面マーカーの発現に基づき、96ウェルPCRプレート内に単一細胞選別する。逆転写の間、MMLV H−逆転写酵素の鋳型切り替え特性を利用して、バーコード化（サンプルID）DNAアダプター分子を合成された第一鎖cDNAに付加する。次いで、各プレートからのRT産物を別々にプールし、2ラウンドのPCRを実施して、特異的アンプリコン領域（アンプリコン）を増幅する。5'隣接バーコードを有するプライマーを用いてPCRを行って、プレート同定領域（プレートID）を付加する。次いで、アンプリコンを454シークエンシングに送る（a）。得られた配列を、配列アセンブリの前にプレートIDおよびサンプルIDによってサブセットに分ける。プレートIDおよびサンプルIDを用いて、同じ細胞由来のアンプリコンを一緒に対合し、クローニングおよび発現のために所望のクローンを選択する（b）。その特定のアンプリコンのサンプルIDに相補的であるクローニングプライマーを用いることによって、アンプリコンの各プールしたプレートから特異的アンプリコンを増幅することができる。クローニングプライマーは、次いで下流の発現およびスクリーニングのための、哺乳類発現ベクター内にクローンを挿入するために用いられる制限部位領域（RS）も付加する。この例において、アンプリコンは、抗体をコードする免疫グロブリン（Ig）重鎖および軽鎖遺伝子である。次いで、下流のスクリーニングのために、発現した抗体を用いることができる（c）。5'RSおよび3'RS：それぞれ5'および3'制限部位。HCおよびLC：それぞれ重鎖および軽鎖。
【図３】IgアンプリコンにサンプルIDおよびプレートIDを付加するための逆転写およびPCRについての概略図。MMLV H−逆転写酵素であるSuperscript IIまたはSuperscript IIIを用いて、逆転写（RT）を実施した。これらの転写酵素は、3'テーリング活性を有し、新たに合成された第一鎖cDNAの3'末端に数個のシトシンを付加する。−GGG（アダプター領域）で終わるオリゴヌクレオチドは、これに対する塩基対を補足し得、次いで逆転写酵素は、鋳型を該ヌクレオチドに切り替え、転写を継続し、cDNAの3'末端にサンプルIDアダプターの取り込みをもたらす（a）。サンプルIDアダプターは5'不変配列（ユニバーサルプライマー領域）を含有しているため、この配列に相補的な順方向プライマーを後続のPCRに用いることができる。Fwロングプライマー1、Fwショートプライマー1、およびGSP1を用いて第1のPCRを行った。Fwロングプライマー1は、454シークエンシングのためのプレートIDバーコードおよび454 Titanium Primer Aを含有している5'隣接領域を有し、それはアンプリコン内に組み入れられた。Fwショートプライマーは、GSP1プライマーと同様のTmを有し、PCRの効率をわずかに増大させるように含まれた。各GSP1（遺伝子特異的プライマー1）は、相補的遺伝子特異的配列を有し、特異的遺伝子を増幅するために用いられた。ここで、遺伝子特異的プライマーとは、κおよびλ軽鎖、ならびにγ重鎖の遺伝子を増幅するための、これらに対するものである。プライマーに対する配列を（b）に示す。第二のPCRはネステッドPCRであり、Fwプライマー2、ロングGSP2プライマー、およびRVプライマー2を用いて行った。プライマーに対する配列は示されているとおりである。ロングGSP2プライマーは、454シークエンシングのためのプレートIDバーコードおよび454 Titanium Primer Bを含有している5'隣接領域を有し、それはアンプリコン内に組み入れられた。ロングGSP2プライマーは、κおよびλ軽鎖、ならびにγ重鎖を再度増幅する。RVプライマー2は、Fwプライマー2と同様のTmを有し、PCR効率をわずかに増大させるように含まれた。プライマーに対する配列を示す。RTおよび2回のPCRの後、各アンプリコンは、454シークエンシングのための454 Titanium Primer AおよびB、それぞれが単一細胞選別された特定の96ウェルプレートに由来するものとしてアンプリコンを同定する2つの同一のプレートID、ならびに96ウェルプレート上でのその位置を決定するサンプルIDを有する（c）。
【図４】配列決定プライマーおよびクローニングプライマーを用いた、単一細胞選別されたB細胞の成功した増幅。図1aおよび図2における概略図に示されるように、単一細胞選別されたB細胞の96ウェルプレートを逆転写し、プールし、増幅した。κ軽鎖、λ軽鎖、およびγ重鎖に対するバンドを、予想されるサイズ：κおよびλに対して約600bp、ならびにγに対して約700bpにおいてアガロースゲル上で可視化した（a）。γ重鎖の5'末端からのサンガー配列決定のDNAクロマトグラムは、プールしたプレートに対する複数のサンプルIDに相当する「可変」配列を示した（b）。κ軽鎖の3'末端からのサンガー配列決定は、定常領域の後かつ複数の軽鎖に相当するVJ結合部から始まる「可変」配列を示した（c）。A1ウェルに特異的なクローニングプライマーペアを用いて、κ軽鎖を増幅した。サンガー配列決定は、（c）と対照的に、1種のみの混じりけがない配列が増幅されたことを示した（d）。すべての結果は、他の増幅された免疫グロブリン遺伝子の代表的なものである。M：100bp DNAラダー、K：κ軽鎖、L：λ軽鎖、G：γ重鎖。
【図５】CCP＋RA患者は、疾患活動性および分泌される抗シトルリン自己抗体と相関した、末梢血形質芽球パーセンテージを有する。形質芽球はCD19＋CD20−CD27＋CD38＋＋であり、まずCD3−細胞にゲートをかけ、次いで（a）に示されるようにゲートをかけた。同意したRA患者から末梢血を入手し、総PBMCについてのパーセンテージとして形質芽球をプロットした。マン・ホイットニー検定により、CCP＋RA患者は、CCP−RA患者よりも有意に高い（p＜0.05）形質芽球パーセンテージを有することが示された（b）。CCP＋患者において、線形回帰によって、形質芽球パーセンテージは、臨床的疾患活動性指標（CDAI）と有意に相関していた。対数変換した形質芽球パーセンテージに対して線形回帰を実施して、データセットの正規性を獲得した（c）。また、CCP＋形質芽球をモックで選別し、または＞95％の形質芽球排除での形質芽球欠失選別を受けさせ（d）、10％FBSを補充したRPMI中で7日間培養した。上清を回収し、Luminexを用いて抗シトルリン化ペプチド反応性について分析した。各ペプチドに対する抗体反応性の平均蛍光強度を、ペプチド反応性としてプロットした（e）。
【図６】中和抗体のためのクローンの選択およびスクリーニングの戦略。454シークエンシングしたアンプリコンのバイオインフォマティクス分析から、対合したLCおよびHC抗体配列を獲得し、それらのLCおよびHC V(D)J使用法に基づきクローンファミリーにグループ化した。各クローンファミリーにおいて最も高頻度に生じるクローンを選択的にクローン化し、発現させ、関心対象の標的抗原への結合についてELISAを用いてスクリーニングする。次いで、結合抗体を分泌するクローンファミリー全体からの代表的クローンを、中和抗体のスクリーニングのためにクローン化し、発現させる。各抗体の略図は、クローンを表す。
【図７】個々のヒト対象に由来する免疫グロブリン重鎖V(D)J配列およびクローンファミリーの特徴付け。以下の条件：（i）（不履行のために）抗生物質を服用していないが、その免疫システムは感染症を効果的に抑制し、抗生物質なしで劇症感染症を数ヶ月間阻止したヒトにおける慢性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）性骨髄炎を有するヒト；（ii）集中治療室への移動および積極的静脈内抗生物質治療を必要とする急性および劇症黄色ブドウ球菌性菌血症を有するヒト；（iii）慢性活動性関節リウマチ（RA）（＞5の疾患活動性スコア（DAS）を有する）を有する3人のヒト；（iv）三価のインフルエンザワクチン（Fluzone、Sanofi）を受けた後7日目のヒト；ならびに（v）死亡すると予想されたが、化学療法後に長期非進行の状態に入った、転移性肺腺癌を有するヒトから血液を入手した。すべての場合において、ヒト患者は、末梢血形質芽球レベルの上昇を呈し（形質芽球［CD20−CD19＋CD38＋＋CD27＋］である末梢血B細胞の1.5〜6％に及び、正常なヒトにおけるレベルは末梢血B細胞の0.1〜0.2％である）、活性化した免疫応答を示した。図2および3に記載されるように、形質芽球を96ウェルプレート内に単一細胞選別し、バーコード化し、発現させた免疫グロブリンcDNAの454シークエンシングを実施した。バイオインフォマティクス分析を用いて、個々の形質芽球によって発現された重鎖および軽鎖免疫グロブリンを対合した。個々の患者に対する重鎖V(D)J使用法の百分率の円グラフの略図を提示する−各V字状のものは、別個の重鎖V(D)J配列転位を示す形質芽球の百分率を表す。
【図８】ヒト対象由来の免疫グロブリン重鎖V(D)J配列のクラスター化は、クローンファミリーおよびクローンサブファミリーを実証する。図7に記載される調査において産出された免疫グロブリン重鎖配列データベースを、Clustalプログラムを用いた階層的クラスター化に供した。階層的クラスター化によって、各個々のヒトにおける抗体応答を表す進化樹がもたらされた。
【図９】任意のアンプリコンにサンプルIDおよびプレートIDを付加するためのRTおよびPCR、ならびに下流の有用性の概略図。単一細胞または複数の細胞を含む個々のサンプルを、ウェル内で個別に逆転写する。以前に記載したように、逆転写によって、すべての第一鎖cDNAにサンプルIDおよび5'ユニバーサルプライマー領域が付加される（a）。プレートのすべてのウェルからcDNAをプールし、2ラウンドのPCRを行う。第1のPCRは、順方向プライマーとしてFwショートプライマー1、Fwロングプライマー1を用い、配列の5'末端に、454シークエンシングのための454 Titanium Primer A、およびプライマーIDを付加する。Fwショートプライマー1は、GSP1プライマーと同様のTmを有し、PCRの効率をわずかに増大させるために含められた。各GSP1プライマーは遺伝子特異的配列を有し、その遺伝子を特異的に増幅することができる。プライマーに対する配列を示す。留意すべきは、どの遺伝子が増幅されるかにかかわらず、順方向プライマーは一定のままであることである（b）。第二のPCRは、ネステッドPCRである。Fwプライマー2が順方向プライマーであり、逆方向プライマーはロングGSP2プライマーおよびRvプライマー2である。ロングGSP2は遺伝子特異的であり、特異的遺伝子のみを増幅する。これは、アンプリコンの3'末端に、454シークエンシングのための454 Titanium Primer B、およびプライマーIDも付加する。RVプライマー2は、Fwプライマー2と同様のTmを有し、PCR効率をわずかに増大させるために含まれた。プライマーに関する配列を示す。RTおよび2回のPCRの後、すべてのプレートからのアンプリコンをプールし、454シークエンシングする。プレートIDおよびサンプルIDの組み合わせによって、同じサンプルを起源とする配列の同定が可能となる。これによって、複数のサンプル間での配列の比較が可能となる。同じ起源由来の配列を対にして発現させて、T細胞受容体、ならびにIgM、IgE、およびIgA等の他のIgアイソタイプ等、起源細胞からの正確なタンパク質を獲得してもよい（c）。
【図１０】免疫グロブリン重鎖および軽鎖の逆転写のための遺伝子特異的プライマー（RT-GSP）。重鎖および軽鎖遺伝子の逆転写において、プライマーとして、オリゴ(dT)の代わりにRT-GSPを用いた。次いで、cDNAを増幅し、アガロースゲル上で可視化した。RT-GSPプライマー：IgKC_v3（a）、レーン1〜4において（b）、それぞれIgLC_v5、IgLC_v6、IgLC_v7、およびIgLC_v8、レーン1〜4において（c）、それぞれIgHGC_v10、IgHGC_v11、IgHGC_v13、およびIgGC_v15、ならびにIgHGC_v16（d）。プライマー名におけるKC、LC、およびGCは、プライマーが、それぞれκ鎖、λ鎖、およびγ重鎖に特異的であることを示す。ゲル写真における白いバンドは、無関係なレーンを切り取った場所を示す。
【図１１】アダプター領域配列。3'末端側の終端にユニバーサルプライマー領域およびアダプター領域を含むオリゴヌクレオチドを用いて、RNAを逆転写した。次いで、順方向プライマーとしてユニバーサルプライマー領域配列を、かつ逆方向プライマーとして遺伝子特異的配列を用いて、cDNAを増幅した。増幅した産物をアガロースゲル上で可視化した。アダプター領域は、G（a）、レーン1および2において（b)、それぞれGGGGGおよびrGrGrGからなる。rGは、DNAヌクレオチドの代わりにRNAヌクレオチドを示す。
【図１２】ユニバーサルプライマー配列。3'末端にユニバーサルプライマー配列およびアダプター領域を含むオリゴヌクレオチドを用いて、RNAを逆転写した。次いで、ユニバーサルプライマー領域に相補的な順方向プライマー、および遺伝子特異的配列に相補的な逆方向プライマーを用いたPCRによって、cDNAを増幅した。Univ_seq_4（a）、univ_seq_5（b）、およびuniv_seq_f（c）。ゲル写真における縦の白いバンドは、無関係なレーンが切り取られている場所を示す。そうでないレーンは、同じゲル写真に属する。
【図１３】第1のPCR反応のための遺伝子特異的プライマー配列。第1のPCR反応における配列の増幅に用いられた遺伝子特異的プライマー。第1のPCR反応または後続の第2の、ネステッドPCRの産物のいずれかをアガロースゲルで泳動し、可視化した。用いた逆方向プライマーは、レーン1〜3（a）において、それぞれIgKC_v4、IgLC_v5、IgHGC_v13であり、レーン1〜3（b）において、それぞれK_GSP1、L_GSP1、G_GSP1であり、レーン1〜2（c）において、それぞれK_GSP1c、L_GSP1cであり、G_GSP1（d）であり、レーン1〜2（e）において、それぞれL_GSP1d、G_GSP1gであり、レーン1〜4（f）において、それぞれG_GSP1h、G_GSP1k、L_GSP1f、L_GSP1gであり、G_GSP1d（g）であり、レーン1〜8（h）において、それぞれ L_GSP1h〜oであり、レーン1〜6（i）において、それぞれG_GSP1m〜qおよびG_GSP1tである。プライマー名におけるK、L、およびGは、プライマーが、それぞれκ、λ、およびγ免疫グロブリン定常領域に特異的であることを示す。各ゲルは、左側のレーンマーカーから始まり、サンプルレーンが続く。同じゲル写真上のレーン間の白い棒は、間にある無関係なレーンが切り取られている場所を示す。
【図１４】第2のPCR反応のための遺伝子特異的プライマー配列。第2のPCR反応における配列の増幅に用いられた遺伝子特異的プライマー。PCR産物をアガロースゲルで泳動し、可視化した。用いた逆方向プライマーは、レーン1〜3（a）において、それぞれK_GSP2、L_GSP2、G_GSP2であり、レーン1〜3（b）において、それぞれK_GSP2v2a、K_GSP2v2b、L_GSP2v2であり、レーン1〜4（c）において、それぞれK_GSP2v2c、K_GSP2v2c、G_GSP2v2c1、G_GSP2v2c2であり、レーン1〜3（d）において、それぞれK_GSP2v2d〜fであり、レーン1〜3（e）において、それぞれK_GSP2v2g、L_GSP2v2d、およびG_GSP2bである。プライマー名におけるK、L、Gは、それらが、それぞれκ、λ、およびγ免疫グロブリン定常領域に特異的であることを示す。各ゲルは、左側のレーンマーカーから始まり、サンプルレーンが続く。同じゲル写真上のレーン間の白い棒は、間にある無関係なレーンが切り取られていることを示す。
【図１５】ポリヌクレオチド配列の連結ペアを同定するためのバーコード配列がとりうる位置。概略図は、2種の核酸セグメントAおよびB（例えば、2種のcDNA）の物理的連結を例示している。末端のいずれか一方、または両方の末端、またはAおよびBを連結している配列内のどこかにバーコード（BC）が付け加えられる。一態様において、AおよびBは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列を表す。
【図１６】異なるタイプの重複−伸長テール。太線は遺伝子特異的配列に相当し、細線は重複テールに相当する。示されるように、重複は、プライマー配列の重複に完全によるもの、そうでなければ遺伝子特異的配列との部分的または全体的な重複によるものであり得る。示されるように、重複はバーコード配列も含有し得る。構造I、II、およびIIIは、重複の起こりうる位置を示す。
【図１７】抗体軽鎖および重鎖の連結ペアへの外部バーコード付加についての概略図による概観。逆転写反応の産物を示す。LC遺伝子特異的PCRプライマーは、バーコード、配列決定プライマー部位、および制限部位（RE1）を含有しており、これらのエレメントが、結果として生じるPCR産物の3'末端に付加されるのを可能にする。重複−伸長を有しかつ制限部位（RE3）をコードする、LCおよびHCに特異的なプライマーを示す。配列決定プライマー部位および制限部位（RE2）を含有している、HCに特異的な逆方向プライマーも示す。増幅によって、一方の末端にバーコードを有する、示されている連結構造を有する核酸が生じる。
【図１８】抗体軽鎖および重鎖の連結ペアへの内部バーコード付加についての概略図による概観。伸長重複およびバーコード配列を含有しているアダプターを用いて、オリゴ(dT)プライマーを用いたmRNAの逆転写により生じるcDNAを接続する方法を示す。示される方法は、逆転写酵素の3'テーリングおよび鋳型切り替え活性を活用して、接続されるべきcDNAに重複−伸長配列を付加する。この例において、アダプターの一方は、接続されるべきcDNAの一方にバーコードおよび重複−伸長配列の両方を付加し、一方で、接続されるべきもう一方のcDNAには重複−伸長配列のみが付加される。増幅後、連結したcDNAの間に1種のバーコード配列を保持する連結構造が産出される。
【図１９】ユニバーサル配列重複−伸長プライマーを用いた、抗体軽鎖および重鎖の連結ペアへの2種の内部バーコードの付加についての概略図による概観。ユニバーサル配列およびバーコードの両方を含有しているアダプターを用いて、オリゴ(dT)プライマーを用いたmRNAの逆転写により生じるcDNAを接続する方法を示す。この例において、ユニバーサル配列に対するPCRプライマーは、接続されるべきcDNAのそれぞれにユニバーサル配列および重複−伸長配列を付加する。示されている増幅スキームの後、連結したcDNAの間に2種のバーコード配列を保持する連結構造が産出される。
【図２０】重複−伸長アダプターを用いた、抗体軽鎖および重鎖の連結ペアへの2種の内部バーコードの付加についての概略図による概観。バーコードおよび重複−伸長配列の両方を含有しているアダプターを用いて、遺伝子特異的プライマー（GSP）を用いたmRNAの逆転写により生じるcDNAを接続する方法を示す。この例において、cDNAのそれぞれに付加されたアダプター上の重複伸長配列は、アニーリングによるcDNAの接続を可能にする。示されている増幅スキームの後、連結したcDNAの間に2種のバーコード配列を保持する連結構造が産出される。
【図２１】鋳型切り替えにより付加されたアダプターと組み合わせた、逆転写の間のバーコード化GSPの使用。総PBMC RNAおよびuniv_seq_2鋳型切り替えオリゴ、ならびにその第一の部分が固定化（Fixed）_PCR3配列であり、かつ最後の8bpがバーコードである付加的5'隣接配列を有するIgKC_v3 GSP（レーン1〜2）およびIgLC_v5 GSP（レーン3〜4）を用いて、RTを実施した。RT反応のアリコートを、5'プライマーとしての5' VK（レーン1）もしくはVL（レーン3）プライマー、またはUniv_seq_2（レーン2および4）のいずれか、および3'プライマーとしての固定化_PCR3とともに、後続の各PCR反応に用いた。レーン2および4におけるPCR産物はスメアとして泳動され、バーコード化GSPは、RT反応において非特異的であり、かつ鋳型切り替えにより付加されたアダプターとの使用に適さないことが示された。
【図２２】96ウェルプレート内へのフローサイトメトリーによる単一細胞の選別のためのゲーティングスキーム。形質芽球は、CD19＋CD20−CD27＋CD38＋＋として定義される。まず、単一PBMCに、それらのFSCおよびSSCプロファイルに基づきゲートをかけた（示さず）。次いで、CD19＋B細胞の生細胞にゲートをかけ（左パネル）、CD20−B細胞にさらに絞り込み（左から2番目のパネル）、CD27＋CD38＋＋細胞に純化した。IgG＋形質芽球は細胞表面IgGを発現しないため、これにより、IgG＋形質芽球をIgA−およびIgM−として判定した。この集団は、96ウェルプレート内に選別された単一細胞であった。
【図２３】形質芽球は免疫学的負荷を受けている人に存在する。形質芽球は、代表的な健常ドナーにおいて末梢血B細胞の0.15％を占め、感染症（黄色ブドウ球菌およびクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）感染症）、癌（イピリムマブを用いた治療により4年超の非進行者である転移性黒色腫を有する患者、および化学療法を受けた後、3年超の長期非進行者である肺の転移性腺癌を有する患者）、およびワクチン接種（インフルエンザウイルスワクチンの）を含む多様な免疫学的負荷を受けている人においては、0.5％〜16.4％に及ぶ。このことは、活発な液性応答を特徴付けする抗体レパートリーの高性能配列決定を行うための個々の形質芽球の単離のために、関心対象の免疫応答が開始されている広範囲な対象において形質芽球が増加しており、かつこの対象から形質芽球を入手可能であることを示している。
【図２４】一過性のトランスフェクションにおいて、発現した組換え抗体は2〜3週間分泌された。図2に概説されるように、対合した重鎖および軽鎖免疫グロブリンcDNAをPCRによってクローニングし、48ウェルスケールで293T細胞内に同時トランスフェクトした。18日間一日おきに上清を回収した。抗ヒトIgG ELISAを実施して、回収した上清中の分泌された抗体の量を判定し、個々の同時にトランスフェクトされた一団の上清における抗体の濃度をグラフ化した。分泌は9日目までにピークに達する傾向があり、18日目までに実質的に減退した。
【図２５Ａ】インフルエンザワクチンを接種されたヒト由来の対合した抗体重鎖（HC）および軽鎖（LC）は、相補性決定領域（CDR）にわたってバリエーションを呈する。図25A：インフルエンザ抗体の部分的系統樹（dendrogram）。重鎖および軽鎖の対合後、重鎖に対して複合的配列アライメントを産出し、軽鎖に対して別の複合的配列アライメントを産出した。初期設定パラメーターを有するClustalw2 2.1を用いて、両方の複合的配列アライメントを産出した。2つのアライメントを一緒に連結させ、100回のブートストラップ反復を有する近隣結合法を用いたCLC Sequence Viewer v. 6.5.2で樹を築くために用いた。
【図２５Ｂ】インフルエンザワクチンを接種されたヒト由来の対合した抗体重鎖（HC）および軽鎖（LC）は、相補性決定領域（CDR）にわたってバリエーションを呈する。図25B：インフルエンザワクチンを接種された患者由来のクローンファミリーに対する重鎖CDR。図中の識別名は、以下のように配列表における配列名に相当し、：51.A11.1＝NA.51.11.A11.1.454.heavy.3.nb-aa, 49.A08.1＝NA.49.8.A08.1.454.heavy.3.nb-aa, 51.D07.1は、フレーム1におけるNA.51.40.D07.1.454.heavy.3.nbを変換することによって得られたアミノ酸配列である。
【図２５Ｃ】インフルエンザワクチンを接種されたヒト由来の対合した抗体重鎖（HC）および軽鎖（LC）は、相補性決定領域（CDR）にわたってバリエーションを呈する。図25C：インフルエンザワクチンを接種された患者由来のクローンファミリーに対する軽鎖CDR。図中の識別名は、以下のように配列表における配列名に相当する：51.A11.1＝NA.51.11.A11.1.454.light.4.nb-aa, 49.A08.1＝NA.49.8.A08.1.454.light.4.nb-aa, 51.D07.1＝NA.51.40.D07.1.454.light.4.zerom50-aa。
【図２６】組換え抗インフルエンザ抗体は、Fluzoneインフルエンザウイルスワクチンに結合した。図7に記載されるインフルエンザワクチンを接種されたヒトに対して作り出された重鎖および軽鎖抗体レパートリーデータセットの進化樹（図8）の分析を実施して、同定されたクローンファミリーを代表する抗体を選択した。両方のクローンファミリーならびにいくつかのシングレット（singlet）の枝を表す、選択した抗体に対する重鎖および軽鎖をPCRによってクローニングし、293T細胞内に同時トランスフェクトし（図2に概説されるように）、図24に記載されるように、トランスフェクタントから上清を回収した。次いで、組換え抗体を、ELISAプレートにコーティングされたFluzoneワクチンを用いて、Fluzoneインフルエンザウイルスワクチン（Sanofi）に対する反応性についてELISAによって試験した。組換えインフルエンザウイルス抗体をELISAプレート内で100ng/mlにてインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）−結合抗ヒトIgG抗体を用いて、抗体結合を検出した。TMB基質反応を30分間進め、その後、酸停止で反応を抑制した。標準物質を入手できなかったため、読み出しを450nm吸光度として表示する。同定されたクローンファミリーを表す複数の組換え抗体はインフルエンザウイルスワクチンに結合し、一方で、他のクローンファミリーおよび「終端（dead end）」を代表する組換え抗体はインフルエンザワクチンに結合しなかった。
【図２７】クローンファミリーを代表する組換え抗インフルエンザ抗体は、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニンにピコモルの親和力で結合する。ELISAアッセイ（図26）においてインフルエンザワクチンに結合した、Fluzoneワクチンを接種されたヒト由来のクローンファミリーを代表する組換え抗インフルエンザウイルス抗体（図7）を、表面プラズモン共鳴（SPR）装置（ProteOn System, Bio-Rad Laboratories）を用いて試験して、インフルエンザヘマグルチニン（ワクチン内に存在するH3N2 A/パース/16/2009株およびH1N1 A/カリフォルニア/07/2009株の両方）に対する結合親和性を判定した。EDAC-NHS化学反応を用いて組換え抗インフルエンザウイルス抗体を表面に結合させ、分析物としてのヘマグルチニンとともに、H3N2 パースおよびH1N1 カリフォルニア・ヘマグルチニンをリガンドとして独立して試験した。Kaの欄は会合（on）の割合、Kdの欄は解離（off）の割合、およびKDは解離定数を意味する。複数の組換え抗体が、H3N2 パースまたはH1N1 カリフォルニア・ヘマグルチニンのいずれかにピコモルの親和力で結合した。
【図２８】組換え抗インフルエンザウイルス抗体は、マイクロ中和アッセイにおいてインフルエンザウイルス感染力を中和する。Fluzone ELISAで反応性を呈する6種の抗体（図26）を、Fluzoneワクチン中の3株のインフルエンザウイルスのうちの2つである、H1N1 カリフォルニア/07/2009インフルエンザウイルス株およびH3N2 A/パース/16/2009インフルエンザウイルス株を用いたマイクロ中和アッセイにおいて試験するために、受託試験機関（contract research organization）（CRO）Virapur, LLC（SanDiego, CA）に送った。6種の組換え抗体のうちの5種がマイクロ中和アッセイにおいてインフルエンザウイルスを中和し、μg/mlレベルかつおそらくμg/ml未満の濃度で感染力を阻止した。組換え抗体F21はH3N2 パースを中和し、それはELISAアッセイにおいてFluzoneに結合したが、用いたヘマグルチニン分析物の濃度が検出可能である結合に対しておそらく低すぎたために、それはSPR分析においては結合を示さなかった（図27）。
【図２９】フローサイトメトリーによって、組換え抗黄色ブドウ球菌抗体は、固定された黄色ブドウ球菌に結合した。（抗生物質なしで）慢性黄色ブドウ球菌性骨髄炎を制御したヒト（図7に記載される）から作り出した重鎖および軽鎖抗体レパートリーデータセットの進化樹（図8）の分析によって、同定されたクローンファミリーを代表する抗体の選択が可能となる。両方のクローンファミリーならびにいくつかのシングレットの枝を表す、選択した抗体に対する重鎖および軽鎖をPCRによってクローニングし、293T細胞内に同時トランスフェクトし（図2に概説されるように）、図24に記載されるように、トランスフェクタントから上清を回収した。次いで、組換え抗黄色ブドウ球菌抗体を、固定された黄色ブドウ球菌に対する反応性について試験した。用いた二次抗体はFITC結合マウス抗ヒトIgGであり、サンプルをBD LSR IIまたはLSR Fortessaで分析した。陰性対照として用いた2種の抗インフルエンザ抗体とともに、陽性染色のパーセンテージを示す。プロテインAは、二次抗体のアイソタイプであるマウスIgG1に弱く結合するため、二次抗体単独ではバックグラウンドを上回る結合をもたらさなかった。バックグラウンドを上回って観察された染色は、プロテインAを発現する黄色ブドウ球菌のわずかな割合のWood株への組換え抗黄色ブドウ球菌抗体の結合によるものである（a）。アイソタイプを適合させた陰性対照の抗インフルエンザ抗体とともに、2種の陽性結合の抗黄色ブドウ球菌抗体S6およびS11に対するフローサイトメトリーのプロットを示す（b）。黄色ブドウ球菌への抗黄色ブドウ球菌抗体の結合のレベルは、用いた抗体の量に比例していた。黒い実線は10μg/mlの抗体濃度を、黒い点線は5μg/mlを、および灰色の点線は1μg/mlを表す（c）。
【図３０】抗黄色ブドウ球菌抗体は、黄色ブドウ球菌コロニー形成単位の数を低下させた。組換え抗黄色ブドウ球菌抗体を、補体供給源としての幼仔ウサギ血清と組み合わせて黄色ブドウ球菌とインキュベートし、その後連続希釈し、5％トリプチケースソイ寒天（TSA）血液寒天プレート上で一晩増殖させた。次いで、コロニー形成単位（CFU）をカウントし、グラフ化した。2種の組換え抗黄色ブドウ球菌抗体（抗体−aおよび抗体−b）は、黄色ブドウ球菌の殺傷、ゆえにCFU/mlの数の低下をもたらした。
【図３１】慢性黄色ブドウ球菌感染症に対して効果的な免疫応答を開始しているヒトから産出された組換え抗黄色ブドウ球菌抗体の黄色ブドウ球菌抗原標的の同定。黄色ブドウ球菌臨床分離株からタンパク質溶解物を産出した。慢性黄色ブドウ球菌性骨髄炎感染症の進行を阻止している免疫応答を開始しているヒト由来の抗体レパートリーにおいて同定されたクローンファミリーを代表する組換え抗黄色ブドウ球菌抗体を用いて、黄色ブドウ球菌Spa−臨床分離株からのタンパク質を免疫沈降した。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、同定されたバンドを切り出し、質量分析（Agilent XCT-Plus ion trap質量分析計）を用いて、図中に提示される免疫沈降されたタンパク質を同定した。
【図３２】長期非進行者である転移性肺腺癌を有するヒト由来の抗肺腺癌抗体の産出。化学療法後に長期非進行者になった転移性肺腺癌を有するヒトは、持続的に活性化した免疫応答を示す血中形質芽球の持続的な上昇を呈した（図7）。患者の末梢血形質芽球を選別し、抗体レパートリーを配列決定し、クローンファミリーを代表する抗体（図8）をクローン化し、組換えによって発現させた。同定されたクローンファミリーのうちの1つを代表する発現した組換え抗体の1種は、免疫組織化学的染色において独立した肺腺癌に結合した。次いで、組織アレイを用いて、この抗体の反応性をさらに特徴付けした。複数の独立した肺腺癌、扁平上皮細胞癌腫、および健常な肺組織を含有している組織アレイを、100μg/mlのF(ab)ヤギ抗ヒト抗体で一晩ブロッキングした。スライドを、抗肺腺癌抗体または陰性対照としての抗インフルエンザ抗体で染色し、Vector Redで可視化した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。核およびVector Red（赤）の染色のみが画像中でより暗い灰色として現れるように、Photoshopを用いてヘマトキシリンの青色を除去した。この組換え抗体は、（組織アレイに含有されている）試験した5つの独立した肺腺癌組織サンプルのうちの4つに結合したが、肺扁平上皮細胞癌腫または健常な肺組織には結合しなかった。
【図３３】同定された抗肺腺癌抗体（図32）は、肺腺癌細胞株の表面に結合する。組換え抗肺腺癌抗体（図32）は、肺腺癌細胞株H1650の表面を強く染色し、腎臓上皮および肺扁平上皮の腫瘍細胞株のわずかな低レベルの染色を呈した。この抗肺腺癌抗体は、第二の肺腺癌細胞株（H2009）には結合せず、この抗体が免疫組織化学によって試験された5つの独立した肺腺癌組織サンプルのうちの4つに結合した（図32）という本発明者らの観察と一致した。
【図３４】関節リウマチ（RA）患者由来のリウマチ因子抗体の産出。RAを有するヒトから作り出された抗体レパートリーの進化樹（図8）における同定されたクローンファミリーを代表する組換え抗体を選択し、クローン化し、組換えによって発現させた。RA患者に由来する組換え抗体を直接的ELISAにおける一次抗体として用い、抗ヒトIgG-HRPを二次抗体として用い、結合をTMB基質で可視化した。組換え抗体RA2およびRA3は反応性を呈し、ゆえにリウマチ因子抗体を表す。
【図３５】RA患者由来の抗CCPおよび抗ヒストン2A抗体の産出。活動性疾患を有するRA患者から産出されたさらなる組換え抗体を、ヒストン2A ELISAおよび環状シトルリン化ペプチド（CCP）ELISA（CCP2 ELISAキット［Axis Shield］を用いた）を用いて特徴付けした。組換え抗体を125μg/mlで用いた。パネル（a）は、ヒストン2A ELISAからの結果を提示しており、複数の組換え抗体がヒストン2Aに結合した。パネル（b）は、CCP2 ELISAの結果を提示しており、いくつかの組換え抗体が陽性の反応性を呈した。抗CCP2 ELISAは、1つの血清反応陰性および2つの血清反応陽性の対照を含んだ。両方のアッセイに対して、吸光度を読み出しとして記録した。バックグラウンド（点線）を上回る吸光度値を、陽性であると見なした。
【図３６】活動性RA患者由来の抗ヒストン2A抗体の産出を実証する独立した確認実験。RA患者の進化樹に由来する組換え抗体（図8および図35）を、ヒストン2A ELISAアッセイにおいてさらに試験した。抗体を、図35において用いられたものより4倍低い濃度である30μg/mlで用いた。吸光度を読み出しとして記録した。バックグラウンドを上回る吸光度値を、陽性であると見なした。
【図３７】RA抗原アレイを用いた、抗ヒストンおよび抗シトルリン化タンパク質抗体の同定。RA患者に由来する抗体を用いて、様々な天然型およびシトルリン化タンパク質およびペプチドを含有しているRA抗原アレイをプローブした。Cy3標識抗ヒトIgG二次抗体とのインキュベーション後、Axon InstrumentsのGenePixマイクロアレイスキャナでスキャンすることによって、結合を定量した。反応性をヒートマップとして表示する。RAに由来する組換え抗体は、いくつかの別個のシトルリン化または天然型抗原に結合した。
【図３８】Pacific Biosciencesシークエンシングは、IgG重鎖アンプリコンの全長配列の読み取りを提供する。プレート44からのIgG重鎖アンプリコンを、SMRTシークエンシングのためにPacific Biosciencesに提供した。選択されたウェルに相当するバーコードを有する循環コンセンサス配列（circular consensus sequence）（CCS）読み取りの数を示す。
【図３９】血中形質芽球を同定するための代替的細胞表面マーカーおよび他の細胞特質の使用。多様な細胞表面マーカーおよび／または細胞特質の使用によって、形質芽球を同定かつ選別することができる。パネル（a）は、形質芽球が休止B細胞よりも高い前方散乱（FSC）を呈することを実証している。形質芽球はCD19＋CD20−CD27＋CD38hi染色に基づいて同定されており、これらの結果は、B細胞（灰色）が形質芽球（黒）よりも小さいことを実証している。パネル（b）は、FSCと組み合わせた抗CD19染色の使用によって、72％の形質芽球を含有しているB細胞の集団が同定されることを実証している。パネル（c）は、CD19＋B細胞の集団（CD19陽性であるとして事前にゲートをかけられた細胞）に対して、側方散乱（SSC）およびFSCを用いて、37％の形質芽球を含有しているB細胞の集団を同定することができる。パネル（d〜f）は、CD19＋B細胞集団内の形質芽球を同定するためのいくつかの手法を提示している。FSChi細胞にゲートをかけることによって、37％純度の形質芽球が与えられる（c）。FSChiCD20−細胞にゲートをかけることによって、形質芽球の71％純度が与えられた（d）。FSChiCD38＋細胞にゲートをかけることによって、形質芽球の80％純度が与えられた（e）。FSChiCD27＋細胞にゲートをかけることによって、形質芽球の44％純度が与えられた（f）。
【図４０】ヒト芽球（blasting）B細胞（形質芽球）は、平均して休止B細胞よりも大きいが、単球より小さい。シングレットの単球、B細胞、および形質芽球にゲートをかけ、側方散乱および前方散乱のパラメーターを比較した。単球を、それらの特徴的なFSCおよびSSCプロファイルによって、かつCD19−CD3−として定義した。B細胞をCD19＋CD20＋として定義した。形質芽球をCD19＋CD20−CD27＋CD38＋＋として定義した。FSC-A（前方散乱エリア）およびSSC-A（側方散乱エリア）の軸で示された細胞（a）。FSC-W（前方散乱の幅）およびSSC-W（側方散乱の幅）の軸で示された細胞（b）。形質芽球のFSC-A、SSC-A、FSC-W、SSC-Wの中央値を、休止B細胞または単球のもので割り、細胞タイプ間のサイズの関係性を表す割合を得た（c）。形質芽球の20thパーセンタイルのFSC-A、SSC-A、FSC-W、SSC-Wの中央値を、休止B細胞または単球の中央値のもので割り、形質芽球の少なくとも80％が割合よりも大きい、細胞タイプ間のサイズの関係性を表す割合を得た（d）。エラーバーは95％信頼区間を示す。
【図４１】顕微鏡法による、休止B細胞と比較したヒト形質芽球のサイズ。形質芽球および休止B細胞を、それぞれCD19＋CD20−CD27＋CD38＋＋およびCD19＋CD20＋として選別した。次いで、Olympusの顕微鏡を用いて倍率200×で撮影した。ImageJを用いて細胞面積を測定し、面積＝π×r2、式中、直径＝2×半径を用いて直径を決定し、4/3×πr3によって体積を決定した。エラーバーは四分位範囲を意味する。≧8μMまたは≧50μM2または≧268μM3のカットオフは、96％の形質芽球を包含し、92％の休止B細胞を除外する。
【図４２】Superscript IIIは、50℃でおよび50℃未満の温度で鋳型切り替え活性を有する。rGrGrGで終わるアダプターを用いて、レーンの上に示される温度を用いて逆転写（RT）を90分間実施し、3'プライマーとしてGAPDH（配列ATGGTTCACACCCATGACG）を用いて1ラウンドのPCRを行った。見て分かるように、55℃においてアダプターを付加する鋳型切り替え活性は見られず、約450bpにおけるバンドの明度によって示されるように、50℃における最低の活性から、試験した最低温度である42℃における最高の活性まで、鋳型切り替え活性は増大する。マーカーは100bpマーカーである。Superscript IIIは、RNAse H活性の喪失をもたらす特異的突然変異を有し、かつ熱安定性を増大させるポリメラーゼドメインになされた突然変異も有するMMLV逆転写酵素であり、50℃のRT温度において220分間の半減期を有する。より高い熱安定性のために遺伝子操作されている他のMMLV H−酵素は、同様の活性を呈すると予想される。
【図４３】ヒトκ、λ、およびγ定常領域のためのさらなるプライマー。これらのプライマーを第1のPCRに用い、次いで表1からのプライマーを用いて第2のPCRを実施し、PCR産物を2％アガロースゲル上で分離し、画像を撮った。第1のPCRに用いたプライマーは、それぞれκGSP1、κGSP1e、κGSP1f、λGSP1、λGSP1x、およびλGSP1yである。配列は表10にある。同じゲル写真上のレーン間の白い棒は、間にある無関係なレーンが切り取られていることを示す。
【図４４】他のヒト定常領域および遺伝子のためのさらなるプライマー。第1のPCRおよび第2のPCRを行い、産物を2％アガロースゲルで泳動し、撮影した。レーンは、左から：（a）マーカー、μ、α定常領域、TCRα、および（b）マーカー、TCRβである。用いたプライマーおよび配列は表10にある。同じゲル写真上のレーン間の白い棒は、間にある無関係なレーンが切り取られていることを示す。
【図４５】マウス遺伝子のためのさらなるプライマー。第1のPCRおよび第2のPCRを行い、産物を2％アガロースゲルで泳動し、撮影した。レーンは、左から：（a）マーカー、κ、λ、λ、λ、λ軽鎖、およびμ重鎖である。4つのλレーンは、用いられたプライマーのこの組み合わせ：マウス_λ_GSP1aとマウス_λ_GSP2a、マウス_λ_GSP1aとマウス_λ_GSP2b、マウス_λ_GSP1bとマウス_λ_GSP2a、およびマウス_λ_GSP1bとマウス_λGSP2aを有した。（b）マーカーおよびα重鎖。（c）それぞれmo_g12_GSP2dおよびmo_g12_GSP2eを用いた第2のPCRに関するγ1、2a、2c重鎖、マーカー。（d）マーカー、それぞれmo_g3_GSP2d、mo_g3_GSP2eを用いた第2のPCRに関するγ3重鎖、続いてそれぞれmo_g2b_GSP2d、mo_g2b_GSP2eを用いた第2のPCRに関するγ2b重鎖。（e）マーカー、TCRα。（f）マーカー、TCRβ。同じゲル写真上のレーン間の白い棒は、間にある無関係なレーンが切り取られていることを示す。
【図４６】HL-60好中球細胞株による、抗黄色ブドウ球菌抗体を介した黄色ブドウ球菌の殺傷。種々の組換え抗黄色ブドウ球菌抗体（ブドウ球菌1、ブドウ球菌4、ブドウ球菌6、ブドウ球菌7、ブドウ球菌9、ブドウ球菌12）を、黄色ブドウ球菌と4℃で30分間インキュベートし、その後結合していない抗体を洗い流し、黄色ブドウ球菌を、活性化したHL-60細胞および幼仔ウサギ補体と37℃で45分間インキュベートした。次いで、細胞を2回洗浄し、細胞外細菌を5％TSA血液寒天上に連続的にプレーティングし、一晩インキュベートし、コロニー形成単位（CFU）をカウントした。組換え抗体のブドウ球菌6、ブドウ球菌9、およびブドウ球菌12は、20％を上回る黄色ブドウ球菌の殺傷を誘導した。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
詳細な説明
組成物
ポリヌクレオチド
いくつかの局面において、組成物はポリヌクレオチドを含み得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、DNA分子およびRNA分子、ならびにそれらの類似体（例えば、ヌクレオチド類似体を使用してまたは核酸化学を使用して生成されたDNAまたはRNA）のような核酸をさす。所望により、ポリヌクレオチドは、例えば、当技術分野において認識されている核酸化学を使用して、合成的に作成されてもよいし、または、例えば、ポリメラーゼを使用して、酵素的に作成されてもよく、所望により、修飾されてもよい。典型的な修飾には、メチル化、ビオチン化、およびその他の当技術分野において公知の修飾が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよいしまたは二本鎖であってもよく、所望により、検出可能部分と連結されていてもよい。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドには、ハイブリッド分子、例えば、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子が含まれる。
【０１０４】
「G」、「C」、「A」、「T」、および「U」は、各々、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有しているヌクレオチドを一般に表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、修飾型ヌクレオチドまたは代替置換部分をさすこともできる。当業者は、そのような置換部分を保持しているヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に改変することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを、他の部分に置換することが可能であることを十分に承知している。例えば、非限定的に、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有しているヌクレオチドと塩基対合することができる。従って、ヌクレオチド配列において、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有しているヌクレオチドを、例えば、イノシンを含有しているヌクレオチドに置換することが可能である。別の例において、オリゴヌクレオチド内の任意の場所のアデニンおよびシトシンを、それぞれ、グアニンおよびウラシルに置換し、標的mRNAとのG-Uゆらぎ塩基対合を形成させることが可能である。そのような置換部分を含有している配列は、本明細書に記載された組成物および方法のために適当である。
【０１０５】
本明細書において使用されるように、他に示されない限り、「相補的」という用語は、当業者によって理解されるように、第二のヌクレオチド配列との関係について第一のヌクレオチド配列を記載するために使用される時、第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、第二のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ある種の条件の下で、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成することができることをさす。そのような条件は、例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃または70℃、12〜16時間、それに続く、洗浄を含み得る、ストリンジェントな条件であり得る。生物の体内で遭遇し得るような生理学的に関連している条件のような、その他の条件も、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に応じて、二つの配列の相補性試験のための最も適切な条件のセットを決定することができるであろう。
【０１０６】
相補的な配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長または一部分において、第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの一領域の、第二のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの一領域との塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書において、相互に「相補的」であると呼ばれ得る。しかしながら、本明細書において、第一の配列が第二の配列と「実質的に相補的」であると呼ばれる時、それらの二つの配列は、相補的であってもよいし、または1個以上、一般的には、約5個以下、4個以下、3個以下、もしくは2個以下のミスマッチ塩基対を塩基対合領域内に含んでいてもよい。ミスマッチ塩基対を含む二つの配列について、二つのヌクレオチド配列が塩基対合を介して相互に結合する限り、それらの配列は「実質的に相補的」であると見なされるであろう。
【０１０７】
「相補的」な配列は、本明細書において使用されるように、ハイブリダイズする能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソンクリック塩基対および／または非天然の修飾型ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでいてもよいし、またはそれらから完全に形成されていてもよい。そのような非ワトソンクリック塩基対には、G：Uゆらぎ塩基対合またはフーグスティーン塩基対合が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
二つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関する「同一」率という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、BLASTPおよびBLASTNまたは当業者が利用可能なその他のアルゴリズム）のうちの1種を使用して、または目視検査によって測定されるような、比較し、最大の一致のため整列させた時、同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指定された割合で有する二つ以上の配列または部分配列をさす。適用に依って、「同一」率は、比較される配列の一領域、例えば、機能的ドメインに存在してもよいし、あるいは比較される二つの配列の全長に存在してもよい。
【０１０９】
配列比較のため、典型的には、一方の配列が、被験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する時には、被験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する被験配列の配列同一率を計算する。
【０１１０】
比較のための配列の最適アライメントは、例えば、Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)のローカルホモロジーアルゴリズム（local homology algorithm）により、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)のホモロジーアライメントアルゴリズム（homology alignment algorithm）により、Pearson & Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)の類似性検索（search for similarity）法により、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）により、または目視検査（Ausubel et al.（前記）を一般に参照のこと）により実施され得る。
【０１１１】
配列同一率および配列類似率を決定するために適当なアルゴリズムの一例は、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403-410(1990)に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationウェブサイトを通して公に入手可能である。
【０１１２】
同一配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長で、第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの、第二のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの100％の同一性を含む。そのような配列は、本明細書において、相互に「完全に同一」であると呼ばれ得る。しかしながら、いくつかの局面において、本明細書において、第一の配列が第二の配列と「実質的に同一」であると呼ばれる場合、それらの二つの配列は、完全に相補的であってもよいし、または整列させた時、1個以上、一般には、約5個以下、4個以下、3個以下、もしくは2個以下のミスマッチヌクレオチドを有していてもよい。いくつかの局面において、本明細書において、第一の配列が第二の配列と「実質的に同一」であると呼ばれる場合、それらの二つの配列は、完全に相補的であってもよいし、または相互に約50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一であってもよい。
【０１１３】
本明細書において、第一の配列が第二の配列と「別個」であると呼ばれる場合、それらの二つの配列は、整列させた時、少なくとも1個以上のミスマッチヌクレオチドを有する。いくつかの局面において、別個の配列は、整列させた時、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、またはそれより多いミスマッチヌクレオチドを有し得る。いくつかの局面において、別個の配列は、相互に約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％未満、同一であり得る。いくつかの局面において、本明細書において、第一の配列が第二の配列と「別個」であると呼ばれる場合、それらの二つの配列は、実質的にまたは完全に同一の配列を有するが、配列内の異なる修飾パターンに基づき相互に異なっていてもよい。そのような修飾、例えば、メチル化は、当技術分野において一般に公知である。
【０１１４】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライブラリーの中に存在し得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドライブラリーは多数のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの局面において、多数のポリヌクレオチドの中の各ポリヌクレオチドは、単一試料に由来し得る。いくつかの局面において、単一試料は、B細胞のような単一細胞を含み得る。
【０１１５】
本明細書において、ヌクレオチド配列を記載するため、慣習的な表示法が使用される：一本鎖ヌクレオチド配列の左端が5'末端であり；二本鎖ヌクレオチド配列の左方向が5'方向と呼ばれる。5'から3'への新生RNA転写物へのヌクレオチドの付加の方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同一の配列を有するDNA鎖は、「コーディング鎖」と呼ばれ；そのDNAから転写されたmRNAと同一の配列を有し、RNA転写物の5'末端より5'側に位置するDNA鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれ；RNAと同一の配列を有し、コーディングRNA転写物の3'末端より3'側にあるDNA鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。
【０１１６】
「メッセンジャーRNA」または「mRNA」という用語は、イントロンを含まず、ポリペプチドへ翻訳され得るRNAをさす。
【０１１７】
「cDNA」という用語は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかの、mRNAと相補的であるかまたは同一であるDNAをさす。
【０１１８】
「アンプリコン」という用語は、核酸増幅反応、例えば、RT-PCRの増幅産物をさす。
【０１１９】
「ハイブリダイズ」という用語は、相補的な核酸との配列特異的な非共有結合性の結合相互作用をさす。ハイブリダイゼーションは、核酸配列の全部または一部分に起こり得る。当業者は、核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性が、Tmによって決定され得ることを認識するであろう。ハイブリダイゼーション条件に関する付加的な案内は、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.,1989,6.3.1-6.3.6およびSambrook et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,Vol.3に見出され得る。
【０１２０】
本明細書において使用されるように、「領域」とは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の連続的な一部分をさす。領域の例は、本明細書に記載され、同定領域、試料同定領域、プレート同定領域、アダプター領域等を含む。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、1個以上の領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、2個未満、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、またはそれより多い領域を含み得る。いくつかの局面において、領域は連結され得る。いくつかの局面において、領域は機能的に連結され得る。いくつかの局面において、領域は物理的に連結され得る。
【０１２１】
本明細書において使用されるように、「可変領域」とは、組換えイベントから生じる可変性のヌクレオチド配列をさし、例えば、それには、活性化されたT細胞または活性化されたB細胞のような関心対象のT細胞またはB細胞から単離された免疫グロブリンまたはT細胞受容体の配列のV領域、J領域、および／またはD領域が含まれ得る。
【０１２２】
本明細書において使用されるように、「B細胞免疫グロブリン可変領域」とは、B細胞から単離された免疫グロブリン可変ヌクレオチド配列をさす。例えば、免疫グロブリン可変配列には、メモリーB細胞、活性化されたB細胞、または形質芽球のような関心対象のB細胞から単離された免疫グロブリン配列のV領域、J領域、および／またはD領域が含まれ得る。
【０１２３】
本明細書において使用されるように、「同定領域」とは、例えば、少なくとも1種のヌクレオチド配列を後に同定するため、少なくとも1種のヌクレオチド配列に連結され得るヌクレオチド配列標識（例えば、固有のバーコード配列）をさす。
【０１２４】
本明細書において使用されるように、「免疫グロブリン領域」とは、抗体の一方または両方の鎖（重鎖および軽鎖）に由来するヌクレオチド配列の連続的な一部分をさす。
【０１２５】
本明細書において使用されるように、「アダプター領域」とは、第一のヌクレオチド配列を第二のヌクレオチド配列と連結するリンカーをさす。いくつかの局面において、アダプター領域は、リンカーとして機能するヌクレオチド配列の連続的な一部分を含み得る。例えば、アダプター領域は、配列GGGを有することができ、GGGとCCCとの間の結合を介して、第一の配列を第二の配列と連結する。
【０１２６】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドはcDNA領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、試料同定-アダプター領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、試料同定領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、アダプター領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、ユニバーサルプライマー領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、アンプリコン領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、プレート同定アダプター領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、第一のプレート同定領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、第二のプレート同定領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、制限部位領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、第一の制限部位領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、第二の制限部位領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、配列決定領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、第一の配列決定領域を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、第二の配列決定領域を含み得る。
【０１２７】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載された任意の領域を多数含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、第一の試料同定領域および第二の試料同定領域を含み得る。いくつかの局面において、第一の試料同定領域および第二の試料同定領域は、同一であるかまたは実質的に同一である。いくつかの局面において、第一の試料同定領域および第二の試料同定領域は、別個である。いくつかの局面において、同定領域は、免疫グロブリン可変領域と連結される。
【０１２８】
いくつかの局面において、領域の配列は、PCR反応においてプライマーまたはプローブのための標的配列として機能するために少なくとも十分な長さを有するであろう。いくつかの局面において、領域は、1塩基対〜5000塩基対以上の長さを有するであろう。例えば、領域は、1〜10,000ヌクレオチド長、例えば、2〜30ヌクレオチド長であり得、その間の部分範囲を全て含む。非限定的な例として、領域は、1〜30ヌクレオチド、1〜26ヌクレオチド、1〜23ヌクレオチド、1〜22ヌクレオチド、1〜21ヌクレオチド、1〜20ヌクレオチド、1〜19ヌクレオチド、1〜18ヌクレオチド、1〜17ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、18〜26ヌクレオチド、18〜23ヌクレオチド、18〜22ヌクレオチド、18〜21ヌクレオチド、18〜20ヌクレオチド、19〜30ヌクレオチド、19〜26ヌクレオチド、19〜23ヌクレオチド、19〜22ヌクレオチド、19〜21ヌクレオチド、19〜20ヌクレオチド、20〜30ヌクレオチド、20〜26ヌクレオチド、20〜25ヌクレオチド、20〜24ヌクレオチド、20〜23ヌクレオチド、20〜22ヌクレオチド、20〜21ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、21〜26ヌクレオチド、21〜25ヌクレオチド、21〜24ヌクレオチド、21〜23ヌクレオチド、または21〜22ヌクレオチドであり得る。いくつかの局面において、領域は、約1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、30ヌクレオチド、31ヌクレオチド、32ヌクレオチド、33ヌクレオチド、34ヌクレオチド、35ヌクレオチド、36ヌクレオチド、37ヌクレオチド、38ヌクレオチド、39ヌクレオチド、40ヌクレオチド、41ヌクレオチド、42ヌクレオチド、43ヌクレオチド、44ヌクレオチド、45ヌクレオチド、46ヌクレオチド、47ヌクレオチド、48ヌクレオチド、49ヌクレオチド、50ヌクレオチド、またはそれを超える長さを有し得る。いくつかの局面において、領域は、50ヌクレオチド未満、50〜100ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜500ヌクレオチド、500〜600ヌクレオチド、600〜700ヌクレオチド、700〜800ヌクレオチド、800〜900ヌクレオチド、900〜1000ヌクレオチド、または1000ヌクレオチド超の長さを有し得る。いくつかの局面において、領域は、1000ヌクレオチド未満、1000〜2000ヌクレオチド、2000〜3000ヌクレオチド、3000〜4000ヌクレオチド、4000〜5000ヌクレオチド、5000〜6000ヌクレオチド、6000〜7000ヌクレオチド、7000〜8000ヌクレオチド、8000〜9000ヌクレオチド、9000〜10000ヌクレオチド、または10000ヌクレオチド超の長さを有し得る。いくつかの局面において、領域は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドのうちの少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。
【０１２９】
「試料」という用語には、対象（例えば、哺乳動物対象、動物対象、ヒト対象、または非ヒト動物対象）から採取された、RNA、DNA、単一細胞もしくは複数の細胞、または細胞の断片、または体液のアリコートが含まれ得る。試料は、遠心分離、静脈穿刺、採血、排泄、塗布、射精、マッサージ、生検、針穿刺吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、勾配分離、もしくはインターベンション、または当技術分野において公知のその他の手段を含む、現在公知であるかまたは後に発見される任意の手段を使用して、当業者によって選択され得る。試料は、関心対象の試料に関連していることが公知の1種以上のマーカーを使用して、当業者によって選択されてもよい。試料は、細胞分取およびFACSのような、当技術分野において公知の方法を使用して選択されてもよい。試料選択法のさらなる例は、以下の実施例セクションに記載される。
【０１３０】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、単一試料に由来するかまたは関連していてもよい。いくつかの局面において、領域は、単一試料に由来するかまたは関連していてもよい。いくつかの局面において、cDNA領域は、単一試料に由来するかまたは関連していてもよい。いくつかの局面において、アンプリコン領域は、単一試料に由来するかまたは関連していてもよい。「単一試料」には、単一起源から採取されたポリヌクレオチドを含む試料が含まれる。いくつかの局面において、単一起源には、特定の時点で、または特定の位置で、例えば、対象または細胞のフラスコまたは細胞のプレートにおいて採取された試料が含まれる。いくつかの局面において、第一の単一試料が第一の時点で第一の対象から採取され、第二の単一試料が第一の時点と別個の第二の時点で第一の対象から採取される。いくつかの局面において、第一の単一試料が第一の位置で第一の対象から採取され、第二の試料が第一の位置と別個の第二の位置で第一の対象から採取される。いくつかの局面において、第一の単一試料がある時点で第一の対象から採取され、第二の単一試料がある時点で第二の対象から採取される。いくつかの局面において、第一の単一試料がある位置で第一の対象から採取され、第二の試料がある位置で第二の対象から採取される。一つの態様において、試料は、1種以上のB細胞に由来するmRNAを含むポリヌクレオチドを含む。別の態様において、試料は、1種以上のB細胞に由来するcDNAを含むポリヌクレオチドを含む。別の態様において、単一試料は、96穴プレートまたは384穴プレートの単一ウェルに分取された1種以上のB細胞に由来するmRNAを含む。試料は、一般に、原核細胞（例えば、細菌細胞）、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞および酵母細胞）、またはウイルスもしくはファージのような遺伝材料のその他の起源に由来する。「哺乳動物」または「哺乳動物の」という用語には、本明細書において使用されるように、ヒトおよび非ヒトの両方が含まれ、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、およびブタが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの局面において、本発明の方法は、少なくとも96個、少なくとも384個、少なくとも1536個、またはそれより多いウェルを有するプレートにおいて、単一試料に適用される。さらなる局面において、本発明の方法は、各々少なくとも96個のウェルを有する少なくとも1枚、2枚、3枚、4枚、5枚、6枚、7枚、8枚、10枚、15枚、20枚、30枚、またはそれより多いプレートにおいて、単一試料に適用される。
【０１３１】
いくつかの局面において、5'アダプター領域配列および／または試料同定領域は、例えば、RTにおいて、Ig遺伝子のみならず、単一試料に由来する全てのcDNAに付加される。いくつかの局面において、3'遺伝子特異的プライマー（GSP）が、単一試料中の任意の発現遺伝子を増幅するために使用され得る。いくつかの局面において、関心対象の遺伝子を増幅するため、複数の縮重5'プライマーを使用する必要なしに、5'可変領域を有する遺伝子、例えば、T細胞受容体およびB細胞受容体が増幅される。GSPには、IgG、IgM、IgD、IgA、IgE、TCR鎖、およびその他の関心対象の遺伝子に特異的なプライマーが含まれ得る。
【０１３２】
いくつかの局面において、例えば、ネステッドGSPを使用して、複数回のPCRが実施され得る。そのようなネステッドGSPについて、2回目のPCRのためのGSPは、1回目のPCRにおいて使用されたGSPがハイブリダイズした位置に対して5'側のその配列上の位置において、その標的遺伝子配列にハイブリダイズする。
【０１３３】
いくつかの局面において、cDNA領域またはアンプリコン領域は、DNAポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの局面において、cDNA領域またはアンプリコン領域は、cDNAポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの局面において、cDNA領域またはアンプリコン領域は、DNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたRNAポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの局面において、cDNA領域またはアンプリコン領域は、cDNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたmRNAポリヌクレオチドを含み得る。
【０１３４】
いくつかの局面において、ユニバーサルプライマー領域は、任意のヒトエキソンに完全に相補的ではない。いくつかの局面において、ユニバーサルプライマー領域は、発現ヒト遺伝子に完全に相補的ではない。いくつかの局面において、ユニバーサルプライマー領域は、最小の二次構造を有する。
【０１３５】
いくつかの局面において、アンプリコン領域は、免疫グロブリン重鎖アンプリコン配列を含む。いくつかの局面において、アンプリコン領域は、免疫グロブリン軽鎖アンプリコン配列を含む。いくつかの局面において、アンプリコン領域は、T細胞受容体αアンプリコン配列を含む。いくつかの局面において、アンプリコン領域は、T細胞受容体βアンプリコン配列を含む。
【０１３６】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライブラリーの中に存在し、ポリヌクレオチドの領域に基づき、ライブラリーの中に存在する他のポリヌクレオチドから鑑別され得る。
【０１３７】
いくつかの局面において、第一の単一試料に由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と別個の1個以上の試料に由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と別個である。いくつかの局面において、第一の単一試料に由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と別個の1個以上の試料に由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と、少なくとも1ヌクレオチド、異なる。いくつかの局面において、第一の単一試料に由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と別個の1個以上の試料に由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と、少なくとも2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、30ヌクレオチド、31ヌクレオチド、32ヌクレオチド、33ヌクレオチド、34ヌクレオチド、35ヌクレオチド、36ヌクレオチド、37ヌクレオチド、38ヌクレオチド、39ヌクレオチド、40ヌクレオチド、41ヌクレオチド、42ヌクレオチド、43ヌクレオチド、44ヌクレオチド、45ヌクレオチド、46ヌクレオチド、47ヌクレオチド、48ヌクレオチド、49ヌクレオチド、50ヌクレオチド、またはそれ以上、異なる。いくつかの局面において、第一の単一試料に由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と別個の1個以上の試料に由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と、約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％未満、同一であり得る。いくつかの局面において、第一の単一試料に由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と別個の1個以上の試料に由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と、100％未満、同一である。いくつかの局面において、試料同定領域は、単一試料から逆転写された全ての第一鎖cDNA上のデジタルバーコードとして機能する。いくつかの局面において、試料同定領域は、少なくとも1ヌクレオチド長である。いくつかの局面において、試料同定領域は、少なくとも3ヌクレオチドを含んでいてもよく、試料同定領域は、少なくとも1ヌクレオチド、相互に異なっていてもよい。一つの態様において、試料同定領域は、3〜15ヌクレオチド長であり��少なくとも1ヌクレオチド、相互に異なる。いくつかの局面において、試料同定領域は、（各サンプルIDが、少なくとも1ヌクレオチド、相互に異なる、3ヌクレオチド長の試料同定領域を使用して）少なくとも64の異型を含んでいてもよく、またはいくつかの局面において、より多数の異型を含んでいてもよい。いくつかの局面において、試料同定領域の3'側に取り付けられている配列は、少なくとも1個のGを含むアダプター領域であり得る。好ましい態様において、試料同定領域の3'側に取り付けられている配列は、少なくとも2個のGを含むアダプター領域であり得る。一つの態様において、試料同定領域の5'末端に取り付けられている配列は、可変5'領域を有する遺伝子を増幅するため、（ライゲーションもしくはその他の方法により）5'ユニバーサルプライマー配列を後に付加するか、または複数の縮重5'プライマーを使用する必要性を回避するため、PCR増幅において使用され得るユニバーサルプライマー配列である。試料同定領域の例は、表2および8に示される。
【０１３８】
いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と別個である。いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と、少なくとも1ヌクレオチド、異なる。いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と、少なくとも2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、30ヌクレオチド、31ヌクレオチド、32ヌクレオチド、33ヌクレオチド、34ヌクレオチド、35ヌクレオチド、36ヌクレオチド、37ヌクレオチド、38ヌクレオチド、39ヌクレオチド、40ヌクレオチド、41ヌクレオチド、42ヌクレオチド、43ヌクレオチド、44ヌクレオチド、45ヌクレオチド、46ヌクレオチド、47ヌクレオチド、48ヌクレオチド、49ヌクレオチド、50ヌクレオチド、またはそれ以上、異なる。いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と、約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％未満、同一であり得る。いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と、100％未満、同一である。第一のプレート同定領域の例は、表3および7に示される。
【０１３９】
いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と別個である。いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と、少なくとも1ヌクレオチド、異なる。いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と、少なくとも2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、30ヌクレオチド、31ヌクレオチド、32ヌクレオチド、33ヌクレオチド、34ヌクレオチド、35ヌクレオチド、36ヌクレオチド、37ヌクレオチド、38ヌクレオチド、39ヌクレオチド、40ヌクレオチド、41ヌクレオチド、42ヌクレオチド、43ヌクレオチド、44ヌクレオチド、45ヌクレオチド、46ヌクレオチド、47ヌクレオチド、48ヌクレオチド、49ヌクレオチド、50ヌクレオチド、またはそれ以上、異なる。いくつかの局面において、あるポリヌクレオチドにおける第二のプレート同定領域の配列は、第一のプレート同定領域の配列と同一である。いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と、約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％未満、同一であり得る。いくつかの局面において、第一の単一試料セットに由来するライブラリーの中の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と、100％未満、同一である。第二のプレート同定領域の例は、表3および7に示される。
【０１４０】
いくつかの局面において、プレート同定領域（例えば、第一のプレート同定領域または第二のプレート同定領域）は、少なくとも2ヌクレオチドを含み得、プレート同定領域は、少なくとも1ヌクレオチド、相互に異なる。一つの態様において、プレート同定領域は、2〜10ヌクレオチド長であり、少なくとも1ヌクレオチド、相互に異なる。いくつかの局面において、より多数の異なる試料同定領域（分析される単一試料1個につき1個）の使用は、プレート同定領域の必要性を排除し得るため、プレート同定領域の使用は、いくつかの態様においてのみ見出される。いくつかの局面において、合成する必要のある試料同定領域を含有している固有のオリゴヌクレオチドの数を低下させるため、プレート同定領域が使用される。
【０１４１】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは1個以上のアダプター領域を含む。いくつかの局面において、アダプター領域は1個以上のGを含む。いくつかの局面において、アダプター領域は、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれより多いGを含む。いくつかの局面において、アダプター領域は、MMLV H-逆転写酵素の鋳型切り替え特性を使用して、cDNAの3'末端に取り付けられる。アダプター領域を取り付けるための種々の方法が存在し、5'隣接アダプター領域配列を有するプライマーを用いたPCR、粘着末端および平滑末端のライゲーション、鋳型切り替えにより媒介されるヌクレオチドの付加、またはポリヌクレオチドの5'末端、3'末端、もしくは5'末端および3'末端へヌクレオチドを共有結合的に取り付けるその他の方法が含まれるが、これらに限定されない。これらの方法は、分子生物学において一般的に使用されている酵素の特性を利用することができる。PCRは、例えば、好熱性DNAポリメラーゼを使用することができる。相補的であるかまたは実質的に相補的である粘着末端は、突出末端を残す制限酵素によるdsDNAの切断を通して、またはTdT（末端転移酵素）のような酵素の3'テーリング活性によって、作り出される。次いで、粘着末端および平滑末端は、T4リガーゼのようなリガーゼを使用して、相補的なアダプター領域とライゲートされ得る。鋳型切り替えは、cDNAの3'末端に1個以上のシトシン（C）を付加する、MMLV H-逆転写酵素の3'テーリング活性、およびmRNAから相補的なGを有するアダプター領域へと鋳型を切り替える能力を利用する。いくつかの局面において、cDNAは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれより多いCを3'末端に含む。
【０１４２】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、1個以上の制限部位領域を含む。制限部位領域は、1個以上の制限部位を含む。制限部位には、NheI、XhoI、BstBI、EcoRI、SacII、BbvCI、PspXI、AgeI、ApaI、KpnI、Acc65I、XmaI、BstEII、DraIII、PacI、FseI、AsiSI、およびAscIが含まれる。いくつかの局面において、任意の、８塩基レアカッター酵素の制限部位が使用され得る。
【０１４３】
いくつかの局面において、本明細書に記載されたポリヌクレオチドの1個以上の領域は、ポリヌクレオチドの1個以上の他の領域と機能的に連結され得る。いくつかの局面において、単一ポリヌクレオチドの2個以上の別個の領域が、機能的に連結され得る。例えば、ユニバーサルプライマー領域が、アダプター領域と機能的に連結され得る。いくつかの局面において、配列が相互に実質的に同一であるかまたは種類が同一である2個以上の領域が、機能的に連結され得る。例えば、第一の試料同定領域が、第二の試料同定領域と機能的に連結され得る。いくつかの局面において、第一の試料同定領域および第二の試料同定領域の配列は、同一であるかまたは実質的に同一である。いくつかの局面において、第一の試料同定領域および第二の試料同定領域の配列は、異なるかまたは別個である。
【０１４４】
いくつかの局面において、本明細書に記載されたポリヌクレオチドの1個以上の領域は、ポリヌクレオチドの1個以上の他の領域と連結され得る。いくつかの局面において、単一ポリヌクレオチドの2個以上の別個の領域が連結され得る。例えば、ユニバーサルプライマー領域が、アダプター領域と連結され得る。いくつかの局面において、配列が相互に実質的に同一であるかまたは種類が同一である2個以上の領域が、連結され得る。例えば、第一の試料同定領域が、第二の試料同定領域と連結され得る。いくつかの局面において、第一の試料同定領域および第二の試料同定領域の配列は、同一であるかまたは実質的に同一である。いくつかの局面において、第一の試料同定領域および第二の試料同定領域の配列は、異なるかまたは別個である。
【０１４５】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、Aが試料同定領域であり、Bがアダプター領域である、配列5'-A-B-3'を含む。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、Aがユニバーサルプライマー領域であり、Bが試料同定領域であり、Cがアダプター領域である、配列5'-A-B-C-3'を含む。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、Aが試料同定領域であり、Bがアダプター領域であり、Cが単一試料に由来するアンプリコン領域である、配列5'-A-B-C-3'を含む。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、Aがユニバーサルプライマー領域であり、Bが試料同定領域であり、Cがアダプター領域であり、Dが単一試料に由来するアンプリコン領域である、配列5'-A-B-C-D-3'を含む。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、Aがプレート同定領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料に由来するアンプリコン領域である、配列5'-A-B-C-D-E-3'を含む。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドは、Aが第一の制限部位領域であり、Bがユニバーサルプライマー領域であり、Cが試料同定領域であり、Dがアダプター領域であり、Eが単一試料に由来するアンプリコン領域であり、Fが第二の制限部位領域である、配列5'-A-B-C-D-E-F-3'を含む。
【０１４６】
いくつかの局面において、上記配列の各々の領域は、異なる順序で再編成されてもよい（例えば、5'-C-A-D-B-3'または5'-E-A-C-B-D-F-3'または5'-B-A-3'）。いくつかの局面において、上記配列の1個以上の領域が、欠失してもよい（例えば、5'-A-D-3'または5'-B-C-3'）。いくつかの局面において、1個以上の付加的な領域が、上記配列に付加されてもよい（例えば、5'-A-A2-B-3'または5'-A-B-C-D-E-F-G-3'）。そのような例において、1個以上の付加的な領域は、本明細書に開示された任意の領域またはそれらの等価物であり得る。いくつかの局面において、上記配列の1個以上の領域は、修飾されてもよく、例えば、メチル化されてもよい。
【０１４７】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドはアダプター分子を含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドアダプター分子は、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、およびアダプター領域を含み得、ユニバーサルプライマー領域の3'末端が試料同定領域の5'末端に連結されており、試料同定領域の3'末端がアダプター領域の5'末端に連結されている。いくつかの局面において、アダプター分子は、第一鎖cDNAの3'末端に逆転写酵素によって付加されたCと結合する少なくとも2個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの局面において、アダプター分子は、3〜6個のGを含むデオキシリボースポリヌクレオチド（DNA G）を含む。別の態様において、アダプター分子は、3〜6個のGからなるリボースポリヌクレオチド（RNA G）を含む。他の態様において、アダプター分子は、ロックド核酸（LNA）、例えば、LNA Gのようなヌクレオチド類似体を利用し得る。他の態様において、ヌクレオチド塩基は、任意の組み合わせで、Cと塩基対合することができ、他のヌクレオチドとも塩基対合することができる、5-ニトロインドールおよび3-ニトロピロールのようなユニバーサル塩基または縮重塩基であってもよい。
【０１４８】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドはプライマーまたはプローブを含み得る。いくつかの局面において、プライマーはユニバーサルプライマー領域およびプレート同定領域を含み得、プレート同定領域の3'末端がユニバーサルプライマー領域の5'末端に連結されている。
【０１４９】
いくつかの局面において、組成物は、ポリヌクレオチド組成物ライブラリーを含み得る。いくつかの局面において、ポリヌクレオチド組成物ライブラリーは、多数のポリヌクレオチド組成物を含む。いくつかの局面において、各組成物は別々のコンテナに存在する。いくつかの局面において、コンテナは試験管であり得る。いくつかの局面において、コンテナはプレート内のウェルであり得る。いくつかの局面において、コンテナは96穴プレート内のウェルであり得る。いくつかの局面において、コンテナは384プレート内のウェルであり得る。いくつかの局面において、各組成物は、単一試料に由来するcDNA領域を含む。いくつかの局面において、各組成物は、アダプター領域と連結された試料同定領域を含む試料同定-アダプター領域を含む。いくつかの局面において、ライブラリーの中の各試料同定-アダプター領域の試料同定領域の配列は、ライブラリーの中の別々の各コンテナに存在する他の試料同定-アダプター領域の試料同定領域のヌクレオチド配列と別個である。いくつかの局面において、試料同定-アダプター領域は、cDNA領域に取り付けられている。いくつかの局面において、試料同定-アダプター領域は、3'領域間の結合により、cDNA領域に取り付けられている。いくつかの局面において、試料同定-アダプター領域は、G：C結合により、cDNA領域に取り付けられている。いくつかの局面において、cDNA領域は、DNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたRNAポリヌクレオチドを含む。いくつかの局面において、cDNA領域は、cDNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたmRNAポリヌクレオチドを含む。
【０１５０】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの中の多数のポリヌクレオチド組成物は、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも3000種、少なくとも10,000種、少なくとも30,000種、少なくとも100,000種、少なくとも300,000種、少なくとも1,000,000種、少なくとも3,000,000種、少なくとも10,000,000種、少なくとも30,000,000種、またはそれより多いメンバーを含み得る。他の局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの中の多数のポリヌクレオチド組成物は、細胞試料の全トランスクリプトームのうちの少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも3000種、少なくとも10,000種、少なくとも30,000種、またはそれより多い遺伝子を含み得る。他の局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの中の多数のポリヌクレオチド組成物は、個体の血中に存在する異なる抗体種のうちの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも10,000種、少なくとも100,000種、少なくとも1,000,000種、少なくとも10,000,000種、少なくとも1,000,000,000種、またはそれより多い抗体種を含む。これらの抗体種は、形質芽球、形質細胞、メモリーB細胞、長命形質細胞、未感作B細胞、その他のB系列細胞、またはそれらの組み合わせによって発現され得る。
【０１５１】
ベクター
いくつかの局面において、組成物はベクターを含み得る。ベクターは、核酸配列による宿主細胞の形質転換において使用され得る。いくつかの局面において、ベクターは、本明細書に記載された1種以上のポリヌクレオチドを含み得る。一つの態様において、標的ポリペプチドをコードする核酸配列のライブラリーを細胞の集団へ導入し、それにより、ライブラリーのスクリーニングを可能にすることができる。「ベクター」という用語は、それが複製され得る細胞へ導入するため、核酸配列が挿入され得る担体核酸分子をさすために使用される。核酸配列は「外来性」または「異種」であってもよい。「外来性」または「異種」とは、それが、ベクターが導入される細胞にとって異物であるか、または配列は細胞内の配列と相同であるが、その配列が通常は見出されない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、およびウイルス（例えば、バクテリオファージ）が含まれる。当業者は、Maniatis et al.,1988およびAusubel et al.,1994（いずれの参照も参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている標準的な組換え技術を通して、ベクターを構築することができる。いくつかの局面において、ベクターは、抗体の定常領域が予め組み込まれたベクターであり得る。このようにして、当業者は、関心対象の抗体のVDJ領域のみをクローニングし、これらの領域を予め組み込まれたベクターへクローニングすることができる。
【０１５２】
「発現ベクター」という用語は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含有しているベクターをさす。いくつかの場合において、RNA分子は、次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドへ翻訳される。発現ベクターは、多様な「制御配列」を含有し得る。「制御配列」とは、特定の宿主生物における機能的に連結されたコーディング配列の転写、場合によっては翻訳のための核酸配列をさす。転写および翻訳を支配する制御配列に加え、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を果たす核酸配列も含有し得る。
【０１５３】
いくつかの局面において、ベクターはプロモーターを含み得る。いくつかの局面において、ベクターはエンハンサーを含み得る。「プロモーター」とは、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、RNAポリメラーゼおよびその他の転写因子のような制御タンパク質および制御分子が結合することができる遺伝要素を含有し得る。「機能的に位置付けられた」、「機能的に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という用語は、プロモーターが、その配列の転写開始および／または発現を制御するため、核酸配列に対して正確な機能的な位置および／または方向にあることを意味する。プロモーターは、「エンハンサー」と共に使用されもよいしまたは使用されなくてもよい。「エンハンサー」とは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性の調節配列をさす。
【０１５４】
プロモーターは、コーディングセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する5'非コーディング配列を単離することにより入手され得るような、遺伝子または配列に天然に関連したものであり得る。そのようなプロモーターは、「内在性」と呼ばれ得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列に天然に関連したものであり得る。あるいは、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの制御下にコーディング核酸セグメントを位置付けることにより、ある種の利点が得られるであろう。組換えプロモーターまたは異種プロモーターとは、天然環境において核酸配列に通常関連していないプロモーターをさす。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーも、天然環境において核酸配列に通常関連していないエンハンサーをさす。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに他の原核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然には存在」しない、即ち、異なる転写調節領域の異なる要素および／または発現を改変する変異を含有しているプロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。本明細書に開示された組成物に関して、プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列の合成的な作製に加え、PCRを含む、組換えクローニングおよび／または核酸増幅のテクノロジーを使用して、配列が作製されてもよい（各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号を参照のこと）。
【０１５５】
いくつかの局面において、発現のために選ばれた細胞型におけるDNAセグメントの発現を効率的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサー。使用され得るそのようなプロモーターの一例は、大腸菌（E.coli）アラビノースプロモーターまたはT7プロモーターである。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組み合わせの使用に精通している。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al.(1989)を参照のこと。利用されるプロモーターは、組換えタンパク質および／または組換えペプチドの大規模作製において有利であるような、導入されたDNAセグメントの高レベルの発現を指示するため、構成的であってもよいし、組織特異的であってもよいし、誘導可能であってもよいし、かつ／または適切な条件の下で有用であってもよい。プロモーターは、異種であってもよいしまたは内在性であってもよい。
【０１５６】
いくつかの局面において、ベクターは、開始シグナルおよび／または内部リボソーム結合部位を含み得る。特異的な開始シグナルが、コーディング配列の効率的な翻訳のため含まれていてもよい。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む、外来性の翻訳制御シグナルは、必ずしも提供されなくてもよい。当業者は、これを決定し、必要なシグナルを提供することが容易にできるであろう。インサート全体の翻訳を確実にするため、開始コドンは、所望のコーディング配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことが周知である。外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然であってもよいし、または合成であってもよい。翻訳の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることにより増強され得る。
【０１５７】
いくつかの局面において、ベクターは、関心対象の遺伝子をコードするDNAセグメントの発現レベルを増加させるかまたは最適化する配列を含み得る。そのような配列の例には、発現mRNAへのイントロンの付加が含まれる（Brinster,R.L.et al.(1988)Introns increase transcriptional efficiency in transgenic mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,836-40；Choi,T.et al.(1991)A generic intron increases gene expression in transgenic mice.Mol.Cell.Biol.11,3070-4）。DNAセグメントの発現を最適化する方法の別の例は、「コドン最適化」である。コドン最適化は、タンパク質翻訳を最適化するため、稀なコドンの使用を低下させるための、DNAセグメントへのサイレント変異の挿入を含む（Codon engineering for improved antibody expression in mammalian cells.Carton JM,Sauerwald T,Hawley-Nelson P,Morse B,Peffer N,Beck H,Lu J,Cotty A,Amegadzie B,Sweet R.Protein Expr Purif.2007 Oct；55(2)：279-86.Epub 2007 Jun 16.）。
【０１５８】
いくつかの局面において、ベクターはマルチクローニングサイトを含み得る。ベクターは、ベクターを消化するために標準的な組換えテクノロジーと共に使用され得る、複数の制限酵素部位を含有している核酸領域である、マルチクローニングサイト（MCS）を含み得る（参照により本明細書に組み入れられる、Carbonelli et al.,1999、Levenson et al.,1998、およびCocea,1997を参照のこと）。「制限酵素消化」とは、核酸分子内の特定の位置においてのみ機能する酵素による核酸分子の触媒切断をさす。これらの制限酵素の多くは市販されている。そのような酵素の使用は、当業者によって理解されている。ベクターは、外来性配列がベクターにライゲートされることを可能にするため、MCS内を切断する制限酵素を使用して、直鎖化または断片化されることが多い。「ライゲーション」とは、相互に連続していてもよいしまたは連続していなくてもよい二つの核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成する過程をさす。制限酵素およびライゲーション反応を含む技術は、組換えテクノロジーの当業者に周知である。
【０１５９】
いくつかの局面において、ベクターは終結シグナルを含み得る。ベクターまたは構築物は概して、少なくとも1個の終結シグナルを含むであろう。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的な終結に関与するDNA配列から構成される。従って、ある種の態様において、RNA転写物の生成を終了させる終結シグナルが企図される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するため、インビボで必要であり得る。
【０１６０】
使用が企図されるターミネーターには、本明細書に記載された、または当業者に公知の、任意の公知の転写ターミネーターが含まれ、例えば、rho依存性またはrho非依存性のターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。ある種の態様において、終結シグナルは、配列短縮等による、転写可能または翻訳可能な配列の欠如であり得る。
【０１６１】
いくつかの局面において、ベクターは複製開始点を含み得る。
【０１６２】
宿主細胞においてベクターを繁殖させるため、それは、複製が開始される特異的な核酸配列である複製開始点（しばしば「ori」と呼ばれる）を1個以上含有し得る。
【０１６３】
いくつかの局面において、ベクターは、1種以上の選択可能かつ／またはスクリーニング可能なマーカーを含み得る。ある種の態様において、核酸構築物を含有している細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることにより、インビトロまたはインビボで同定され得る。そのようなマーカーは、同定可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含有している細胞の容易な同定を可能にするであろう。一般に、選択可能マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択可能マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、陰性選択可能マーカーは、その存在がその選択を防止するものである。陽性選択可能マーカーの一例は、薬物耐性マーカーである。
【０１６４】
一般的に、薬物選択マーカーの内含は、形質転換体のクローニングおよび同定を補助し、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択可能マーカーである。条件の実行に基づき形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加え、比色分析に基づくGFPのようなスクリーニング可能マーカーを含む、他の型のマーカーも企図される。あるいは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）のようなスクリーニング可能酵素が利用されてもよい。当業者は、場合によってはFACS分析と共に、免疫学的マーカーを利用する方法も、承知しているであろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要ではないと考えられる。選択可能マーカーおよびスクリーニング可能マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【０１６５】
一つの局面において、ベクターは、複数種の関心対象のポリペプチドをコードするDNAセグメントを発現してもよい。例えば、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方をコードするDNAセグメントが、単一ベクターによってコードされ発現され得る。一つの局面において、両DNAセグメントは、同一の発現RNAに含まれていてもよく、別々のポリペプチドとしてのDNAセグメントの発現を可能にするため、細胞内リボソーム結合部位（IRES）配列が使用されてもよい（Pinkstaff JK,Chappell SA,Mauro VP,Edelman GM,Krushel LA.,Internal initiation of translation of five dendritically localized neuronal mRNAs.,Proc Natl Acad Sci USA.2001 Feb 27；98(5)：2770-5.Epub 2001 Feb 20.）。別の局面において、各DNAセグメントは、別々のmRNAの発現をもたらす独自のプロモーター領域を有する（Andersen CR,Nielsen LS,Baer A,Tolstrup AB,Weilguny D.Efficient Expression from One CMV Enhancer Controlling Two Core Promoters.Mol Biotechnol.2010 Nov 27.[Epub ahead of print]）。
【０１６６】
宿主細胞および発現系
いくつかの局面において、組成物は宿主細胞を含み得る。いくつかの局面において、宿主細胞は、本明細書に記載されたポリヌクレオチドまたはベクターを含み得る。いくつかの局面において、宿主細胞には、真核細胞（例えば、昆虫、酵母、もしくは哺乳動物）または原核細胞（例えば、細菌）が含まれ得る。異種核酸配列の発現に関して、「宿主細胞」とは、原核細胞をさすことができ、ベクターを複製しかつ／またはベクターによってコードされた異種遺伝子を発現することができる任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターのためのレシピエントとして使用され得、使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」され得る。「トランスフェクト」または「形質転換」とは、外来性核酸が宿主細胞へ移入または導入される過程をさす。形質転換された細胞には、初代の主細胞およびその子孫が含まれる。
【０１６７】
特定の態様において、宿主細胞はグラム陰性菌細胞である。これらの細菌は、内膜と外膜との間に細胞膜周辺腔を保有しているため、使用するために適している。特に、周辺質と細胞質との間の上述の内膜は、細胞膜としても公知である。従って、そのような細胞膜周辺腔を有する任意の他の細胞が使用され得る。グラム陰性菌の例には、大腸菌、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、コレラ菌（Vibrio cholera）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、百日咳菌（Bordotella pertussis）、火傷病菌（Erwinia amylovora）、根粒菌種（Rhizobium sp.）が含まれるが、これらに限定されない。グラム陰性菌細胞は、さらに、選択されたリガンドと結合することができる候補結合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドのコーディング配列により形質転換された細菌細胞と定義され得る。ポリペプチドは、細胞膜周辺腔に面して、細胞膜の外面に固定され、抗体をコードする配列またはその他の配列を含み得る。ポリペプチドの発現のための一つの手段は、そのような指示を引き起こすことができるリーダー配列をポリペプチドに取り付けることによる。
【０１６８】
多数の原核細胞株および培養物が、宿主細胞として使用するために入手可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝材料のためのアーカイブとして機能する機関であるAmerican Type Culture Collection（ATCC）を通して入手され得る。適切な宿主は、ベクター骨格および所望の結果に基づき、当業者によって決定され得る。例えば、プラスミドまたはコスミドが、多くのベクターの複製のため、原核宿主細胞へ導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される菌細胞には、DH5-α、JM109、およびKC8、ならびにSURE（商標）Competent CellsおよびSOLOPACK（商標）Gold Cells（STRATAGENE（商標）,La Jolla）のような多数の市販の細菌宿主が含まれる。いくつかの局面において、大腸菌LE392のようなその他の菌細胞が、宿主細胞として使用するために企図される。
【０１６９】
様々な細胞型および生物に由来する多くの宿主細胞が、入手可能であり、当業者に公知であろう。同様に、ウイルスベクターが、原核宿主細胞、特に、ベクターの複製または発現を許容するものと共に使用され得る。いくつかのベクターは、原核細胞および真核細胞の両方において複製されかつ／または発現されることを可能にする制御配列を利用し得る。当業者は、それらを維持しベクターの複製を許容するため、上記宿主細胞の全てをインキュベートするための条件をさらに理解するであろう。ベクターの大規模作製、ならびにベクターによってコードされた核酸およびその同族のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの作製を可能にするであろう技術および条件も、理解されており、公知である。
【０１７０】
いくつかの局面において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。例には、CHO細胞、CHO-K1細胞、またはCHO-S細胞が含まれる。その他の哺乳動物宿主細胞には、NS0細胞、ならびにdhfr-であるCHO細胞、例えば、CHO-dhfr-、DUKX-B11 CHO細胞、およびDG44 CHO細胞が含まれる。
【０１７１】
本明細書に開示された組成物の少なくとも一部分または全部を含み得る多数の発現系が存在する。発現系には、真核生物発現系および原核生物発現系が含まれ得る。そのような系は、例えば、特定のリガンドと結合し得ることが同定されたポリペプチド産物の産生のため使用され得る。原核細胞に基づく系は、核酸配列またはその同族のポリペプチド、タンパク質、およびペプチドを産生するために利用され得る。多くのそのような系が広く市販されている。発現系のその他の例には、T7プロモーター、Tacプロモーター、Trcプロモーター、BADプロモーター、λpLプロモーター、テトラサイクリンプロモーター、またはLacプロモーターのような強力な原核生物プロモーターを含有しているベクター、pET発現系および大腸菌発現系が含まれる。
【０１７２】
ポリペプチド
いくつかの局面において、組成物はポリペプチドを含み得る。いくつかの局面において、本明細書に記載されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、例えば、宿主細胞から発現され得る。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語には、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子が含まれる。ネイティブタンパク質とは、天然に存在する非組換え細胞によって産生されたタンパク質；または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞によって産生され、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、もしくはネイティブ配列の1個以上のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する分子を含むタンパク質である。その用語には、1個以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸および重合体の化学的類似体であるアミノ酸重合体も含まれる。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語には、抗原結合タンパク質、抗体、または抗原結合タンパク質の1個以上のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する配列が包含される。「ポリペプチド断片」という用語は、全長ネイティブタンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドをさす。そのような断片は、ネイティブタンパク質と比較して修飾されたアミノ酸を含有していてもよい。ある種の態様において、断片は、約5〜500アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも5アミノ酸、6アミノ酸、8アミノ酸、10アミノ酸、14アミノ酸、20アミノ酸、50アミノ酸、70アミノ酸、100アミノ酸、110アミノ酸、150アミノ酸、200アミノ酸、250アミノ酸、300アミノ酸、350アミノ酸、400アミノ酸、または450アミノ酸の長さを有し得る。有用なポリペプチド断片には、結合ドメインを含む、抗体の免疫学的に機能性の断片が含まれる。結合抗体の場合、有用な断片には、CDR領域、重鎖および／もしくは軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部分、または2個のCDRを含む可変領域のみ等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（1）通常は共に見出されるであろう少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、（2）同一起源、例えば、同一種に由来する他のタンパク質を本質的に含まないか、（3）異なる種に由来する細胞により発現されるか、（4）それが自然界において関連しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくはその他の材料の少なくとも約50％から分離されているか、（5）それが自然界において関連していないポリペプチドと（共有結合性もしくは非共有結合性の相互作用により）機能的に関連しているか、または（6）自然界には存在しないことを意味する。典型的には、「単離されたタンパク質」は、所定の試料の少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約25％、または少なくとも約50％を構成する。ゲノムDNA、cDNA、mRNA、またはその他のRNA、合成起源の核酸、またはそれらの任意の組み合わせが、そのような単離されたタンパク質をコードし得る。好ましくは、単離されたタンパク質は、治療、診断、予防、研究、またはその他の使用に干渉するであろう、天然環境に見出されるタンパク質またはポリペプチドまたはその他の夾雑物を実質的に含まない。
【０１７４】
いくつかの局面において、ポリペプチドには、抗原結合タンパク質（ABP）が含まれ得る。「抗原結合タンパク質」（「ABP」）とは、本明細書において使用されるように、指定された標的抗原と結合する任意のタンパク質を意味する。「抗原結合タンパク質」には、抗体、および免疫学的に機能的な断片のようなそれらの結合部分が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディ（peptibody）は、抗原結合タンパク質の別の例である。抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）の「免疫学的に機能的な断片」（または単に「断片」）という用語は、本明細書において使用されるように、全長鎖に存在するアミノ酸のうちの少なくともいくつかを欠いているが、依然として抗原と特異的に結合することができる、抗体の一部分（その一部分が如何にして入手または合成されたかには関わらない）を含む抗原結合タンパク質の一種である。そのような断片は、標的抗原と結合し、完全抗体を含む、他の抗原結合タンパク質と、所定のエピトープとの結合に関して競合することができるという点で、生物学的に活性である。いくつかの態様において、断片は中和断片である。これらの生物学的に活性な断片は、組換えDNA技術によって作製されてもよいし、または、完全抗体を含む、抗原結合タンパク質の酵素的もしくは化学的な切断によって作製されてもよい。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、Fab、ダイアボディ（diabody）（同一鎖上の2個のドメインの間の対合を許容しない短いペプチドリンカーを介して接続された軽鎖可変ドメインと同一のポリペプチド上の重鎖可変ドメイン）、Fab'、F(ab')2、Fv、ドメイン抗体、および単鎖抗体が含まれるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科動物、またはウサギを含むが、これらに限定されない、任意の哺乳動物起源に由来し得る。体内の特定の標的へ差し向けられるか、二機能性の治療特性を保有するか、または延長された血清半減期を有する治療剤を作るため、本明細書に開示された抗原結合タンパク質の機能的部分、例えば、1個以上のCDRを、第二のタンパク質または低分子と共有結合的に結合させ得ることがさらに企図される。当業者に理解されるように、抗原結合タンパク質は、非タンパク質成分を含んでいてもよい。修飾、異型、作成法、およびスクリーニング法のような、抗原結合タンパク質および抗体に関するさらなる詳細は、参照により実際上その全体が本明細書に組み入れられる、米国特許公開第20110027287号に見出され得る。
【０１７５】
いくつかの局面において、ポリペプチドには抗体が含まれ得る。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプの完全免疫グロブリン、または標的抗原との特異的結合に関して完全抗体と競合することができるそれらの断片をさし、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体を含む。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。完全抗体は、一般に、少なくとも2本の全長重鎖および2本の全長軽鎖を含むが、いくつかの場合、重鎖のみを含み得るラクダ科動物に天然に存在する抗体のように、より少ない鎖を含むであろう。抗体は、単一起源にのみ由来してもよいし、または「キメラ」であってもよく、即ち、抗体の異なる部分が、2種の異なる抗体に由来してもよい。抗原結合タンパク質、抗体、または結合断片は、ハイブリドーマにおいて、組換えDNA技術によって、または完全抗体の酵素的もしくは化学的な切断によって作製され得る。他に示されない限り、「抗体」という用語には、2本の全長重鎖および2本の全長軽鎖を含む抗体に加え、それらの誘導体、異型、断片、およびムテインが含まれる。さらに、明示的に除外されない限り、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ（minibody）、ドメイン抗体、合成抗体（時に「抗体模倣体」と本明細書において呼ばれる）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（時に「抗体複合物」と本明細書において呼ばれる）、およびそれらのそれぞれの断片が含まれる。いくつかの態様において、その用語にはペプチボディも包含される。
【０１７６】
治療的に有効な量のABPが、その必要のある対象へ投与され得る。ABPは、薬学的組成物へと製剤化され得る。これらの組成物は、ABPのうちの1種以上に加え、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知のその他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性でなければならず、活性成分の有効性に干渉してはならない。担体またはその他の材料の正確な性質は、投与の経路、例えば、経口経路、静脈内経路、皮膚経路または皮下経路、経鼻経路、筋肉内経路、腹腔内経路に依り得る。
【０１７７】
経口投与用の薬学的組成物は、錠剤、カプセル、粉末、または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンのような固形担体または佐剤を含み得る。液状の薬学的組成物は、一般に、水、石油、動物油、植物油、鉱油、または合成油のような液状担体を含む。生理学的生理食塩水溶液、デキストロースもしくはその他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールのようなグリコールが含まれていてもよい。
【０１７８】
静脈内注射、皮膚注射、もしくは皮下注射、または罹患部位への注射の場合、活性成分は、発熱性物質を含まず、適当なpH、等張性、および安定性を有する、非経口投与的に許容される水性溶液の形態であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液のような等張性媒体を使用して、適当な溶液を調製することが十分に可能である。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、および／またはその他の添加剤が、必要に応じて、含まれていてもよい。
【０１７９】
ABP投与は、好ましくは、個体への利益を示すために十分な「治療的に有効な量」または「予防的に有効な量」でなされる（場合によって、予防は治療と見なされ得るが）。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間経過は、処置される疾患の性質および重度に依るであろう。処置の処方、例えば、投薬量等の決定は、一般医およびその他の医師の責任にあり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与法、および実務者に公知のその他の因子を考慮に入れる。前述の技術およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol.A.(ed),1980に見出され得る。
【０１８０】
組成物は、処置される状態に依って、単独で、または他の処置と組み合わせて、同時にもしくは逐次的に、投与され得る。
【０１８１】
免疫細胞
試料は免疫細胞を含み得る。免疫細胞には、T細胞およびB細胞が含まれ得る。T細胞（Tリンパ球）には、例えば、T細胞受容体を発現する細胞が含まれる。B細胞には、例えば、活性化されたB細胞、芽球化（blasting）B細胞、形質細胞、形質芽球、メモリーB細胞、B1細胞、B2細胞、辺縁帯B細胞、および濾胞B細胞が含まれる。T細胞には、活性化されたT細胞、芽球化T細胞、ヘルパーT細胞（エフェクターT細胞またはTh細胞）、細胞障害性T細胞（CTL）、メモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、および調節性T細胞が含まれる。試料は、いくつかの適用（例えば、関連するT細胞もしくはB細胞を定義するための較正テスト）において、単一細胞を含み得、または、より一般には、少なくとも1,000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも250,000個、少なくとも500,000個、少なくとも750,000個、もしくは少なくとも1,000,000個の細胞を含み得る。
【０１８２】
B細胞
本明細書において使用されるように、「B細胞」とは、少なくとも1個の再編成された免疫グロブリン遺伝子座を有する細胞をさす。B細胞は、少なくとも1個の再編成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座または少なくとも1個の再編成された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み得る。B細胞は、少なくとも1個の再編成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座または少なくとも1個の再編成された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み得る。B細胞は、適応免疫系の一部であるリンパ球である。B細胞には、細胞表面上にB細胞受容体（BCR）として膜結合型の抗体を発現する細胞、または分泌型抗体として抗体を発現する細胞が含まれる。B細胞は、免疫グロブリン（抗体、B細胞受容体）を発現し得る。抗体は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖から形成されたヘテロ二重体を含み得る。重鎖は、定常領域と結合される可変領域を形成するためのV（variable）遺伝子、D（diversity）遺伝子、およびJ（junctional）遺伝子（VDJ）の遺伝子再編成から形成される。軽鎖は、定常領域と結合される可変領域を形成するためのV遺伝子およびJ遺伝子(VJ)の遺伝子再編成から形成される。可能性のある多数の結合部組み合わせのため、（BCRでもある）抗体遺伝子の可変領域は、膨大な多様性を有し、B細胞が外来抗原を認識し、それに対する応答を開始することを可能にする。
【０１８３】
B細胞の活性化および分化
B細胞は、炎症性免疫応答の状況で抗原を認識した時、活性化され分化する。それらは、一般的に、活性化される2種のシグナルを含み、1種のシグナルはBCR（膜結合型の再編成された免疫グロブリン）を通して伝達され、もう1種はCD40またはその他の同時刺激分子を通して伝達される。この第二のシグナルは、表面上にCD40のためのリガンド（CD40L）を発現しているヘルパーT細胞との相互作用を通して提供され得る。次いで、B細胞は増殖し、抗体遺伝子のヌクレオチド配列にランダムな変化が起こる体細胞突然変異を受ける場合があり、より高い親和性を有する抗体のB細胞が選択される。それらは、IgMアイソタイプをコードする重鎖の定常領域が、IgGアイソタイプ、IgAアイソタイプ、またはIgEアイソタイプをコードする定常領域に切り替わる「クラススイッチ」を受ける場合もある。分化中のB細胞は、最後には、メモリーB細胞となり得、それらは、一般的に、より高い親和性を有し、クラススイッチを受けているが、いくつかのメモリーB細胞は、IgMアイソタイプのままである。メモリーB細胞が活性化され、形質芽球へ分化し、最終的に、形質細胞へ分化する場合もある。分化中のB細胞が、まず、形質芽球となり、次いで、形質細胞へ分化する場合もある。
【０１８４】
親和性成熟およびクローンファミリー
クローンファミリーとは、一般に、2個以上の試料による、関連した免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖のV(D)J配列の使用により定義される。関連した免疫グロブリン重鎖V(D)J配列は、ゲノム内にコードされたV(D)J遺伝子セグメントの共通の使用により同定され得る。クローンファミリー内には、一般に、B細胞遺伝子組換えおよび体細胞突然変異において発生し得る、V(D)Jセグメント内の共通の変異に基づいて変動するサブファミリーが存在する。
【０１８５】
活性化されたB細胞は、遊走して、リンパ組織またはその他の組織で胚中心を形成し、そこで親和性成熟を受ける。B細胞は、胚中心の外側で親和性成熟を受ける場合もある。親和性成熟において、B細胞は、抗体遺伝子のランダムな変異を受けるが、それは、B細胞が活性化された標的抗原と直接結合し認識する抗体の部分をコードする、遺伝子の相補性決定領域（CDR）に集中している。これにより、最初の増殖中のB細胞から、最初のクローンとわずかに異なりかつ相互にわずかに異なる免疫グロブリンを発現するサブクローンができる。クローンは抗原に関して競合し、より高い親和性のクローンが選択され、より低い親和性のクローンはアポトーシスにより死滅する。この過程は、B細胞の「親和性成熟」をもたらし、結果的に、より高い親和性で抗原と結合する免疫グロブリンを発現するB細胞の生成をもたらす。同一の「親」B細胞に起因する全てのB細胞が、クローンファミリーを形成し、これらのクローンファミリーは、同一または類似の抗原エピトープを認識するB細胞を含む。いくつかの局面において、本発明者らは、最も高い親和性のクローンが親和性成熟において選択されるため、より高頻度に存在するクローンは、より高い親和性で抗原と結合するクローンを表すと予想する。いくつかの局面において、異なるV(D)Jセグメント使用を有するクローンは、異なる結合特徴を示す。いくつかの局面において、同一のV(D)Jセグメント使用を有するが、異なる変異を有するクローンは、異なる結合特徴を示す。
【０１８６】
メモリーB細胞
メモリーB細胞は、一般的に、親和性成熟を受けたB細胞であり、クラススイッチを受けている場合もある。これらは、後の抗原負荷に対してより迅速に応答し、抗原に対する親和性成熟を受けた抗体の分泌のために含まれる時間を、未感作生物におけるおよそ14日から、およそ7日へと、有意に短縮することができる細胞である。
【０１８７】
形質芽球および形質細胞
形質細胞は、長命または短命のいずれかであり得る。長命形質細胞は、生物の一生を通して生存し得、短命形質細胞は3〜4日間持続し得る。長命形質細胞は、炎症の区域、粘膜区域（IgA分泌形質細胞の場合）、（脾臓もしくはリンパ節のような）二次リンパ組織、または骨髄のいずれかに存在する。これらの多岐にわたる区域に到達するため、長命形質細胞となるよう運命付けられた形質芽球は、まず、血流を通って移動した後、適切な区域へ輸送する様々なケモカイン勾配を利用する。形質芽球は、親和性成熟を受けた細胞であり、典型的にはクラススイッチを受けており、一般的に、抗体を分泌するが、形質細胞によって産生される抗体の量よりは概して少量である。形質細胞は、抗体分泌専門の細胞である。
【０１８８】
TCR遺伝子およびBCR遺伝子の特徴
組換えの同定は、個々の各適応免疫細胞のDNAおよびそれらの関連RNA転写物に存在するため、RNAまたはDNAのいずれかを配列決定することができる。T細胞またはB細胞に由来する組換え配列は、クローン形質とも呼ばれる。DNAまたはRNAは、T細胞受容体（TCR）遺伝子または抗体をコードする免疫グロブリン（Ig）遺伝子に由来する配列に相当し得る。例えば、DNAまたはRNAは、TCRのα鎖、β鎖、γ鎖、またはδ鎖をコードする配列に相当し得る。T細胞の大部分において、TCRはα鎖およびβ鎖からなるヘテロ二重体である。TCRα鎖はVJ組換えにより生成され、β鎖受容体はV(D)J組換えにより生成される。TCRβ鎖について、ヒトには48個のVセグメント、2個のDセグメント、および13個のJセグメントが存在する。2個の結合部の各々において、数個の塩基が欠失し、他のものが付加され得る（NヌクレオチドおよびPヌクレオチドと呼ばれる）。少数のT細胞においては、TCRがγ鎖およびδ鎖からなる。TCRγ鎖は、VJ組換えにより生成され、TCRδ鎖はV(D)J組換えにより生成される（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Kenneth Murphy,Paul Travers,and Mark Walport,Janeway's Immunology 7th edition,Garland Science,2007）。
【０１８９】
方法において分析されるDNAおよびRNAは、定常領域（α、δ、γ、ε、もしくはμ）を有する免疫グロブリン重鎖（IgH）または定常領域λもしくはκを有する免疫グロブリン軽鎖（IgKもしくはIgL）をコードする配列に相当し得る。各抗体は2本の同一の軽鎖および2本の同一の重鎖を有し得る。各鎖は、定常（C）領域および可変領域から構成される。重鎖について、可変領域は、Vセグメント、Dセグメント、およびJセグメントから構成される。これらのセグメントの各々の型をコードする数種の別個の配列が、ゲノムに存在する。特異的なVDJ組換えイベントが、B細胞の発達中に起こり、特異的な重鎖を生成するようその細胞を特徴付ける。軽鎖における多様性は、D領域が存在しないためVL組換えのみが起こる点を除き、同様に生成される。体細胞突然変異は、しばしば、組換え部位の近位で起こり、数個のヌクレオチドの付加または欠失を引き起こし、B細胞によって生成される重鎖および軽鎖の多様性をさらに増加させる。次いで、B細胞によって生成される抗体の可能性のある多様性は、異なる重鎖および軽鎖の積である。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原認識（または結合）の領域または部位の形成に寄与する。何らかのエピトープに対して特異的応答が開始された後に起こり得る体細胞突然変異の過程が、この多様性に追加される。この過程において、特異的なエピトープを認識することができるB細胞に変異が起こり、より強力に特異的エピトープと結合することができる抗体のより大きな多様性がもたらされる。これらの全ての要因が、B細胞によって生成される抗体の大きな多様性に寄与する。何十億もの、場合によっては、一兆を超える別個の抗体が生成され得る。T細胞多様性の生成のための基本的な前提は、B細胞による抗体生成のものと類似している。T細胞およびB細胞の活性化の要素は、エピトープとの結合である。特異的な細胞の活性化は、同一の型の細胞をより多く産生させ、クローン増大をもたらす。
【０１９０】
相補性決定領域（CDR）または超可変領域は、抗原と結合することができる抗原受容体（例えば、T細胞受容体および免疫グロブリン）の可変ドメインの配列である。各抗原受容体の鎖は、3個のCDR（CDR1、CDR2、およびCDR3）を含有している。T細胞（αおよびβ）ならびに免疫グロブリン（IgHおよびIgKまたはIgL）を作成する2本のポリペプチドが、3個のCDRの形成に寄与する。
【０１９１】
TCRβによってコードされるCDR1およびCDR2の部分は、47個の機能的なVセグメントのうちの1個にある。Tリンパ球の発達中の体細胞組換えイベントによって生成されるCDRの多様性の大部分が、CDR3に見出される。
【０１９２】
BCRの大きな多様性は、個体間および個体内に存在する。BCRは、抗体の重鎖および軽鎖をコードする2種の遺伝子IgHおよびIgK（またはIgL）から構成される。抗原およびMHC分子と結合する3個の相補性決定領域（CDR）配列は、IgHおよびIgK（またはIgL）において最も大きい多様性を有する。IgHによってコードされたCDR1およびCDR2の部分は、44個の機能的なVセグメントのうちの1個にある。未感作B細胞における多様性の大部分は、Bリンパ球の発達中の体細胞組換えイベントを通してCDR3の生成において発生する。組換えは、Vセグメント、Dセグメント、およびJセグメントを、各々1個、有する分子を生成し得る。ヒトにおいては、44個のVセグメント、27個のDセグメント、および6個のJセグメントが存在し；従って、理論上、7,000を超える組み合わせの可能性が存在する。極一部（約5％）のBCRには、2個のDセグメントが見出される。さらに、2個の結合部の各々において、数個の塩基が欠失し、他のものが付加され（NヌクレオチドおよびPヌクレオチドと呼ばれる）、高度の多様性を生成し得る。B細胞活性化の後、体細胞突然変異を通した親和性成熟の過程が起こる。この過程において、活性化されたB細胞の子孫細胞は、遺伝子全体に別個の体細胞突然変異を蓄積するが、CDR領域におけるより高度の変異集中が、抗原に対するより高い親和性を有する抗体の生成をもたらす。体細胞突然変異に加え、活性化されたB細胞は、アイソタイプスイッチの過程を受ける。同一の可変セグメントを有する抗体が、定常セグメントに依って、異なる型（アイソタイプ）を有する場合がある。全ての未感作B細胞がIgM（またはIgD）を発現し、活性化されたB細胞は、大部分がIgGを発現するが、IgM、IgA、およびIgEも発現する。IgM（および／またはIgD）からIgG、IgA、またはIgEへのこの発現スイッチは、組換えイベントを通して起こり、ある細胞を特定のアイソタイプの産生に特化させる。IgM、IgD、およびIgEの各々について1個のセグメントが存在し、IgAについては2個のセグメント、IgGについては4個のセグメントが存在する。
【０１９３】
方法
医療およびバイオテクノロジーにおける使用への適用
抗体およびTCRを同定し、抗体およびTCRの配列をクローンファミリーに分類するための本明細書に記載された組成物および方法の使用は、医療およびバイオテクノロジー研究への多くの有用な新規の適用を有する。抗体クローンファミリーは、親和性成熟を受けた非同一クローンを含み得、TCRクローンファミリーは同一クローンを含み得る。これらの適用には、（1）抗体または抗体由来治療薬の発見および開発；（2）診断薬の発見および開発；（3）健康およびバイオテクノロジー研究において有用な研究ツールの発見および開発；ならびに（4）候補ワクチンの開発および査定ならびにワクチン成分として有用な抗原の同定：が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９４】
本発明は、任意の型のB細胞またはT細胞と共に使用され得るため、細胞起源および特定のB細胞またはT細胞の亜型は、所望の最終産物のプロフィールに基づき選ばれ得る。B細胞またはT細胞の具体的なサブクラスおよびそれらの使用の例は、一般的な材料および方法のセクションのサブセクション「細胞および細胞亜集団の単離および濃縮」に記載される。一般に、細胞は、特定の臨床状態もしくは疾患の経過を有するか、または特定の処置計画を受容したか、または免疫応答を誘導する特定の負荷、免疫感作、もしくは条件のセットに曝された特定のヒトまたは動物の対象に由来し得る。
【０１９５】
治療薬、診断薬、および研究ツールの発見および開発への適用
治療薬、診断薬、または研究ツールとして使用するための抗体または抗体由来分子を開発するためには、まず、抗体および／または抗体の抗原結合領域の誘導体を、インビボまたはインビトロの系で、所望の抗原もしくはエピトープと結合し、かつ／または所望の機能的結果を有するものとして同定または発見することができる。次いで、これらの候補抗体を、意図された産物に特異的な他の所望の特性について、さらにスクリーニングする。これらの標的産物特性は、抗体の型が異なる場合、治療薬であるか、診断薬であるか、研究ツールであるかによって異なるであろう。本発明は、これらの産物経路のいずれかへのさらなる開発のための候補を同定する有用な手段を提供する。
【０１９６】
最終産物の特性の所望のプロフィールに基づき、関連B細胞の起源は、感染性疾患、癌、もしくは自己免疫状態のような疾患を有する患者；癌治療もしくはワクチンのような処置を受ける患者；または疾患を有するか、もしくは免疫感作もしくは疾患モデルの誘導／確立のような免疫応答が誘導されるよう処置された動物であり得るが、これらに限定されない。
【０１９７】
一般に、治療薬、診断薬、または研究ツールとして開発するための、候補抗体または抗原結合領域に由来する候補高分子は、2種の一般アプローチのうちの1種に分類される複数のテクノロジーを介して発見される：（1）ヒトまたは動物の免疫応答のB細胞からの関心対象の抗体の単離；および（2）異種発現され、1種または複数種のディスプレイテクノロジーを使用してスクリーニングされた、免疫グロブリン分子またはそれらの誘導体の発現ライブラリーに由来する抗体の単離（Hoogenboom HR,Trends Biotechnol.,1997,15：62-70；Hammond PW,MAbs,2010,2：157-64；Nissim A,Chernajovsky Y,Handb Exp Pharmacol.,2008,(181)：3-18；Steinitz M,Hum Antibodies,2009；18：1-10；Bradbury AR,Sidhu S,Dubel S,and McCafferty,Nat Biotechnol.,2011,29：245-54；Antibody Engineering(Kontermann RE and Dubel S eds.,Springer,2nd edition)に概説されている）。
【０１９８】
前者のアプローチ（1）について、候補抗体は、例えば、一般的な材料および方法のセクションに記載されたように、関連ドナーから同定された特定のクローンファミリーから選択される。本発明は、候補抗体を発見または同定するため、適切なヒトドナーまたは動物に由来する適切なB細胞（例えば、芽球化B細胞）に、記載されたように適用され得る。例えば、癌治療用抗体候補について、適切なヒトドナーは、免疫応答を介して癌進行を抑制することに成功した患者であり得；または特定の診断用抗体候補について、適切なドナーは、診断マーカーに対する自己抗体を有する患者もしくはマーカーに対して免疫感作されたマウスであり得；または抗体試薬ツール候補について、適切なドナーは、抗体試薬が認識する予定の標的分子および／もしくはエピトープにより免疫感作されたマウス、ウサギ、ヤギ、ラット、ウマ、ニワトリ、イヌ、もしくはその他の動物であり得る。発現および試験のための抗体の配列決定および選択は、一般的な材料および方法のセクションに記載されるようにして実施され得る。そのようなテクノロジーの適用は、より面倒で時間のかかる方法（例えば、ハイブリドーマテクノロジー、ウイルスにより誘導されるB細胞の不死化等）を介してしばしば入手される、候補抗体を提供することができる。
【０１９９】
後者のアプローチ（2）について、ライブラリーおよび／またはライブラリーの選択／濃縮されたサブセットが、次世代シークエンシングプラットフォームを使用して配列決定される時、（1）で入手された1種以上のヒトまたは動物の抗体レパートリーに由来する、重鎖配列および軽鎖配列の対のサブセットまたは完全セットが、試料起源および試料からの最初の同族の対を追跡するため、同定領域を含有している発現ライブラリーを播種するために使用される。可変領域およびフレームワーク領域の情報を、候補抗体を発見するため、1種以上の抗体ディスプレイライブラリーフォーマットへ組み入れることができる。サブセクション「クローン化された軽鎖および重鎖免疫グロブリンペアのクローニングおよび発現」に記載された方法を使用して、Ig遺伝子の可変領域を、発現ベクターへクローニングし、組み入れることができる。異なる重鎖および軽鎖を非内在性（非同族）対合させるコンビナトリアルマッチングであったとしても、適切な最初のB細胞の起源に関する各鎖の同定領域追跡と共に、Fab酵母ライブラリー（Weaver-Feldhaus JM,Lou J,Coleman JR,et al.,FEBS Lett,2004,564：24-34）またはファージミドライブラリー（Kashyap AK,Steel J,Oner AF,et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2008,105：5986-91）を播種するために、例えば、（1）のようにして入手された同族の重鎖および軽鎖の対に由来する断片および／またはドメインを使用することができる。（1）のようにして入手された重鎖および軽鎖の同族対を、ファージミドまたは酵母以外のディスプレイフォーマットで使用することもでき、Fab断片発現構築物以外の抗体誘導体発現構築物で使用することもできる［Antibody Engineering(Kontermann,RE and Dubel S eds.,Springer,2nd edition)］。同定領域の別の適用において、同定領域トラッキングの利益および次世代シークエンシングデータのエラー補正を提供するため、既存のディスプレイライブラリーに同定領域を追加することができる。ライブラリーの型、フォーマット、および発現／ディスプレイ系により、PCR反応を使用して同定領域を組み入れることもできるし、または逆転写後のPCR反応を使用して組み入れることもできる（例えば、一般的な材料および方法のセクションの中のサブセクション「単一B細胞由来の対合した軽鎖および重鎖免疫グロブリン遺伝子の配列決定」を参照のこと）。
【０２００】
候補抗体は、B細胞レパートリー（例えば、一般的な材料および方法のセクションを参照のこと）に由来するかまたはディスプレイ発現ライブラリー「レパートリー」（Kashyap AK,Steel J,Oner AF,et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2008,105：5986-91；Weaver-Feldhaus JM,Lou J,Coleman JR,et al.,FEBS Lett,2004,564：24-34；Ravn U,Gueneau F,Baerlocher L,et al.,Nucleic Acids Res,2010,38：e193；Antibody Enginnering(Kontermann,RE and Dubel S eds.,Springer,2nd edition)）に由来するかに関わらず、抗体分子もしくは抗体誘導体分子または分子のライブラリーを発現させ、所望の抗原／標的および／もしくはエピトープに対する結合についてのアッセイ、またはインビボもしくはインビトロ（エクスビボ試料／調製物を含む）環境において機能的結果を試験するためのアッセイにおいて試験することにより、同定される。発表された報告は、発現ライブラリーにおいて使用するためのB細胞レパートリーから入手された抗体配列のドナー起源を追跡するための同定領域の使用を記載している（例えば、Kashyap AK,Steel J,Oner AF,et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2008,105：5986-91）。本明細書に記載された同定領域テクノロジーは、そのような同定領域使用について有用な改善を、独自に提供する。本発明は、（1）重鎖および軽鎖の同族対について各ドナーのみならず各ドナーのB細胞をも追跡する手段を提供し；（2）クローニングおよび／または試験用により多くの試料を回収するために、最初のB細胞試料を指示する手段を提供し；（3）発現ライブラリー内のコンビナトリアルな非同族対合に関わらず、重鎖および軽鎖の起源を追跡する手段を提供し；（4）選択-濃縮の繰り返しを経て重鎖および軽鎖の起源を追跡する手段を提供する（例えば、Ravn U,Gueneau F,Baerlocher L,et al.,Nucleic Acids Res,2010,38：e193のように、インビトロでのプール選択において、配列進化をモニタリングする時）。
【０２０１】
B細胞免疫応答レパートリーにおいて最も高頻度に表された重鎖または軽鎖の配列を同定し、個々の鎖の頻度の順位に基づき重鎖および軽鎖の対を組み合わせることは、このように実施された時、次世代配列分析においては同族対情報が保持されないという事実にも関わらず、いくつかの候補抗体を同定するための実行可能な方式であることが示されている（Reddy ST,Ge X,Miklos AE,et al.,Nat Biotechnol,2010,28：965-9）。本発明は、この型の頻度分析方法論も可能にするが、単離された独立の重鎖または軽鎖のみならず、レパートリー内の実際の抗体の頻度を査定するために次世代シークエンシングを使用する手段をさらに提供する。
【０２０２】
さらに、本発明は、頻度分析以外の重要な利用可能性を有する少なくとも三つの改善を提供する：（1）重鎖および軽鎖の同族対合を追跡し得るため、免疫応答に由来するの実際の抗体、および免疫応答においてB細胞によって産生された実際の抗体クローンファミリーの発見を同定し得る（クローンは、同一の細胞前駆体から同時進化した特異的な重鎖および軽鎖の同族対を含み、親和性成熟過程における天然対合に関する情報は、次世代シークエンシングを使用して免疫応答を分析するための文献に記載されたアプローチを改善するであろう［例えば、Wu X,Yang ZY,Li Y,Hogerkorp CM,et al.,Science,2010,329：856-61］）；（2）同定領域が、次世代シークエンシングプラットフォームに共通の配列決定エラーについての配列分析に対する影響を、最小化するかまたはさらには排除する手段を提供する（例えば、一般的な材料および方法のセクションの中のサブセクション「他の配列決定データ分析オプション」を参照のこと）；（3）同定領域が、単一細胞レベルで共同時発現された2種以上の配列を関連付け、追跡する能力を提供する。
【０２０３】
抗原、標的、もしくはエピトープとの望ましい結合特性を有することが同定された候補抗体、または所望の機能的効果を有する候補抗体について、結合特性または機能的特性については同一であるが、最終産物プロフィールにとって重要なその他の違いを含有している、類似しているが、より最適である可能性のある抗体の存在について試験するため、それぞれのクローンファミリーから、より多くの抗体をクローニングし発現させることができる（例えば、一般的な材料および方法のセクションを参照のこと）。
【０２０４】
候補がディスプレイ発現ライブラリーから同定される場合、同定領域は、濃縮のスクリーニングにおいては選択されなかったが、同定された候補の同定領域を含有しており、従って、ライブラリーを播種した同一の最初の重鎖および／または軽鎖に由来する配列を同定することにより、候補と類似している可能性のある配列の抗体を同定する手段を提供することができる。インビトロ選択の繰り返しにおいて失われるが、選択された候補抗体と類似している抗体は、可能性のある候補としてのさらなる分析のため、回復または「救済」され得る。そのような救済は、有用な機能的な抗体を見逃す可能性のある、発現系またはアッセイ系におけるバイアス効果を除去することができる（Ravn U,Gueneau F,Baerlocher L,et al.,Nucleic Acids Res,2010,38：e193）。
【０２０５】
所望の結合特性および／または機能的特性を有する候補が同定された後、次いで、所望の下流の産物プロフィールに基づく関連アッセイおよびその他の査定に、それらを進めることができる。受動免疫感作において使用するための治療用抗体の場合、候補は、安定性および凝集のような特性、製剤化および投薬の容易さ、タンパク質の発現および製造、種選択性、薬理学、薬物動態、安全性および毒物学、吸収、代謝、および標的-抗体代謝回転、ならびに免疫原性の査定を含むが、これらに限定されない、ヒトにおける臨床試験のためのまたは動物の健康において使用するための最適候補を決定するためのアッセイおよび前臨床試験モデルに進められる［例えば、Lynch CM,Hart BW,and Grewal IS,MAbs,2009,1：2-11；Chapman K,Pullen N,Coney L,et al.,mAbs,2009,1,505-516；S,Dubel,Handbook of Therapeutic Antibodies：Technologies,Emerging Developments and Approved Therapeutics(John Wiley & Sons,2010)；Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic,(Z.An ed.,John Wiley & Sons,2009)Antibody Engineering(Kontermann,RE and Dubel S eds.,Springer,2nd edition)を参照のこと］。大多数が、ヒトでの試験の前に査定される必要のある多くの特性のうちの少なくとも1種に関して、ヒトにおける治療的試験のためには不十分であるため（即ち、自然減）、かくして多くの候補が選択される。クローンファミリーは、既に特徴決定されたものと類似しているが、前臨床研究において査定される特性のうちの1種以上に関して違いを保有している可能性のある候補について、例えば前記のように発掘してもよい。ある種の特性について最適化するため、特別な抗体工学戦略が利用される必要があり得る［Antibody Engineering(Kontermann,RE and Dubel S eds.,Springer,2nd edition)］。
【０２０６】
診断薬について、本発明は、感染性病原体の検出において使用するため、感染または予防接種によって産生された抗体、TCR、およびクローンファミリーを同定するために使用され得（Selvarajah S,Chatterji U,Kuhn R,et al.,2012,6：29-37；Berry JD,Vet J,2005,170：193-211）、任意の非感染性疾患、病理学的状態、または医学的な処置もしくは治療のためにも使用され得る。そのような抗体、TCR、および／またはクローンファミリーは、バイオマーカーのための有用な診断プローブを提供するか、またはヒトもしくは動物の疾患状態もしくは処置の効果に関する免疫系情報を提供することができる。従って、特異的な抗体もしくはTCR、またはいずれかの免疫受容体クラスの特異的なクローンファミリーは、診断ツールおよび個別化医療のための利用可能性を提供し得る。診断への別の適用において、公知の疾患または処置応答のバイオマーカーを、マウスまたはその他の動物を免疫感作するための免疫原として使用し、それらから、そのバイオマーカーに対する抗体を同定するためにB細胞を採集し（例えば、一般的な材料および方法のセクションを参照のこと）、その後、それを、ELISAまたはその他のイムノアッセイのような診断テストにおいて使用することが可能である（Selvarajah S,Chatterji U,Kuhn R,et al.,2012,6：29-37）。可能性のある診断的利用可能性を有することが同定された後は、候補の抗体、TCR、および／またはクローンファミリーを、診断用産物の所望のプロフィールに関連したアッセイ、モデルに進めることができ、場合によっては治験に進めることができる［Berry JD,Vet J,2005,170：193-211；Diagnostic and Therapeutic Antibodies in Methods in Moleular Medicine,Vol.40(George AJT and Urch CE eds.,Humana Press)；Antibody Engineering(Kontermann,RE and Dubel S eds.,Springer,2nd edition)；Colwill K,Renewable Protein Binder Working Group,and Graslund S,Nat Methods,2011,8：551-8；Pershad K,Pavlovic JD,Graslund S,et al.,Protein Eng Des Sel,2010,23：279-88.］。ある種の特性について最適化するため、特別な抗体工学戦略が利用される必要があり得る［Antibody Engineering(Kontermann,RE and Dubel S eds.,Springer,2nd edition)］。
【０２０７】
研究ツール用抗体について、例えば、前記のようにして同定された候補を、研究ツール用抗体の予定された研究適用における性能を試験するため、進めることができる（例えば、免疫沈降；イムノブロッティング；免疫染色および組織学；イムノアフィニティ精製；捕捉イムノアッセイおよびサンドイッチイムノアッセイおよび検出イムノアッセイ；例えば、Antibodies：A Laboratory Manual,E Harlow and D Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)に記載されたようなもの）。バリデーション基準は、最終的に意図する研究での使用に基づくであろう（Colwill K,Renewable Protein Binder Working Group,and Graslund S,Nat Methods,2011,8：551-8；Pershad K,Pavlovic JD,Graslund S,et al.,Protein Eng Des Sel,2010,23：279-88）。ある種の特性について最適化するため、特別な抗体工学戦略が利用される必要があり得る［Antibody Engineering(Kontermann,RE and Dubel S eds.,Springer,2nd edition)］。
【０２０８】
ワクチンの発見および開発への適用
本発明は、ヒトまたは動物におけるワクチン負荷に対するこれらの免疫受容体クラスの各々の抗体、TCR、およびクローンファミリーを同定するために使用され得る。プローブとして使用された抗体およびその抗体が属するクローンファミリーによって認識されるワクチン成分を同定するため、特異的な抗体を、プローブとして使用することができる。抗体およびクローンファミリーに関するこの情報を、ワクチンの特定の抗原および／またはエピトープを標的とする免疫応答の割合または強度に関する査定をするため、使用することができる。異なるワクチン成分に対する抗体免疫応答の査定を、ワクチンに対する同時のTCRレパートリー応答に関して収集された情報によって補完することができる（例えば、一般的な材料および方法のセクションの中のサブセクション「他の細胞タイプ」および「その他の免疫グロブリン重鎖およびT細胞受容体（TCR）鎖のPCR」を参照のこと）。この情報を、その後、ヒトまたは動物の免疫系から効果的なまたはより最適な応答を生ずるワクチンの成分またはワクチンの異型またはアジュバントを理解するために使用することができる（Haynes BF,Gilbert PB,McElrath MJ,et al.,N Engl J Med,2012,366：1275-86）。そのアプローチは、ワクチンに対する応答について個体または集団を比較するためにも使用され得る。
【０２０９】
感染に対する防御応答のような関心対象の臨床結果と相関し得る、実際の病原体に応答して産生された抗体、TCR、およびクローンファミリーを同定し査定するため、類似の分析を実施することができる（例えば、重度インフルエンザ大流行の生存者に由来する抗体の同定、Yu X,Tsibane T,McGraw PA,et al.,Nature,2008,455：532-6；または広範囲HIV中和血清を有するHIV感染個体に由来する特異的抗体の同定、Wu X,Yang ZY,Li Y,Hogerkorp CM,et al.,Science,2010,329：856-61およびWalker LM,Phogat SK,Chan-Hui PY,et al.,Science,2009,326：285-9）。防御のそのような相関の同定を、前記のようなワクチンおよび／または特異的なワクチン成分によって生じた応答と比較することができ、実際の感染例において見られる所望の結果と相関する免疫応答を生ずるワクチンの能力を査定するため、二つのデータセットを比較することができる。
【０２１０】
従って、本発明は、ヒトまたは動物が実際の感染を被る前に、抗体および／またはTCRのレパートリー配列分析を介して、疾患防御およびワクチン応答の代替読み出し情報を入手する有用な手段を提供する。特定の抗原またはエピトープと結合するものとしてクローンファミリーが同定された後、同一のまたは類似のクローンファミリーがレパートリー間に見出される場合、アッセイを行うことなく、他の免疫応答レパートリーによって標的とされる抗原またはエピトープの同定が可能である。従って、クローンファミリーおよびその抗原／エピトープ結合に関する十分な情報が既知である場合（例えば、一般的な材料および方法のセクションの中のサブセクション「発現したヒト抗体のスクリーニング」を参照のこと）、新たに分析されたレパートリーの配列分析のみによって、それが含有している既知のクローンファミリーについて、そのレパートリーの抗原の読み出し情報が提供され得る。この適用は、ワクチン臨床試験において1人、数人、または多くの対象の間で応答をモニタリングし、1人、数人、または多くの対象についての免疫と感染性疾患との関係を集団レベルでモニタリングする有用な手段を提供することができる。
【０２１１】
さらに、病原体からの防御と相関する抗体、TCR、およびクローンファミリーを、その病原体に対する防御的かつ／または効果的な免疫応答を媒介する特異的な抗原および抗原のセット（既知の抗原および新規の抗原の両方を含む）を同定するために使用することができる。効果的な免疫応答において標的とされた抗原の同定を、免疫感作されたヒトまたは動物において、抗体およびTCRによって媒介される防御的な応答を生ずると予想される、ワクチンに含まれる抗原の選択を案内するために使用することができる。
【０２１２】
アッセイにおいて既知の抗原に結合しない抗体、TCR、およびクローンファミリーは、その抗体および／またはTCRが防御を提供する病原体の可能性のある新規の抗原および／またはエピトープを同定するための候補となる。既知の抗原に結合しないことが既知である抗体は、以前には未同定であった抗原またはエピトープを同定するために、免疫分離（immunoseparation）および質量分析と組み合わせて、プローブとして使用され得る（Zhu YZ,Cai CS,Zhang W,et al.,PLoS One,2010,5：e13915；例えば、一般的な材料および方法のセクションの中のサブセクション「ブドウ球菌感染した患者に由来する抗体を用いたブドウ球菌抗原の免疫沈降」および「ペプチドの質量分析による同定」を参照のこと）。そのような新規の抗原またはエピトープは、免疫感作されたヒトまたは動物において抗体およびTCRによって媒介される防御応答を生ずるかまたは生ずるために寄与すると予想されるワクチン成分として使用され得る。
【０２１３】
微生物性病原体のためのワクチンの開発の推進に加え、腫瘍ワクチンを開発するために、抗体、TCR、およびクローンファミリーを使用することもできる。癌細胞または前癌細胞に対する免疫応答を開始するヒトまたは動物は、癌のための予防的または治療的なワクチンへ組み入れられ得る個々の抗原および抗原の組み合わせを同定するために使用され得る抗体、TCR、およびクローンファミリーを与えることができる。
【０２１４】
1種以上の関心対象のポリヌクレオチドを作製する方法
いくつかの局面において、方法は、1つ以上の対象から入手された多数の試料に関連した多数のcDNAを含むcDNAライブラリーを入手する工程であって、各cDNAが、多数の試料の中の単一試料に関連しており、各試料に関連した各cDNAは別々のコンテナに存在する、工程；各試料に関連したcDNAへアダプター分子を付加する工程であって、アダプター分子が、試料同定領域およびアダプター領域を含み、試料同定領域がアダプター領域と連結されており、各アダプター分子の試料同定領域の配列が、ライブラリーの中の各cDNAに付加された他のアダプター分子の試料同定領域の配列と別個である、工程；ならびに1種以上の関心対象のポリヌクレオチドを作製するため、ライブラリーの中の各cDNAにアダプター領域を取り付ける工程を含む。
【０２１５】
いくつかの局面において、cDNAライブラリーの入手は、多数の試料の入手およびcDNAライブラリーを調製するための試料の加工を含む。いくつかの局面において、cDNAライブラリーの入手は、cDNAライブラリーを調製するために多数の試料を加工した第三者からの直接的または間接的なcDNAライブラリーの受領を含む。
【０２１６】
いくつかの局面において、アダプター分子は、ユニバーサルプライマー領域をさらに含み、ユニバーサルプライマー領域の3'末端は、試料同定領域の5'末端に連結されている。いくつかの局面において、各cDNA領域は、cDNAポリヌクレオチドにハイブリダイズしたmRNAポリヌクレオチドを含む。
【０２１７】
いくつかの局面において、各試料は細胞を含む。いくつかの局面において、細胞はB細胞である。いくつかの局面において、B細胞は、形質芽球、メモリーB細胞、または形質細胞である。いくつかの局面において、各試料は多数の細胞を含む。
【０２１８】
いくつかの局面において、各アダプター領域は、結合、例えば、G：C結合を介して、各cDNAに取り付けられる。
【０２１９】
いくつかの局面において、アダプター分子は一本鎖であり、酵素によってアダプター分子を二本鎖にすることにより、アダプター分子を各cDNAへ組み入れる工程をさらに含む。いくつかの局面において、アダプター分子は、MMLV H-逆転写酵素によって、関心対象のポリヌクレオチドを作製するため、各cDNAへ組み入れられる。
【０２２０】
いくつかの局面において、方法は、当技術分野において一般に公知のPCRおよびその他の増幅反応のような増幅工程を含み得る。
【０２２１】
関心対象のポリヌクレオチドを連結し、バーコード付けする方法
いくつかの局面において、方法は、2種の関心対象のポリヌクレオチド配列、例えば、単一試料に由来する抗体の軽鎖（LC）および重鎖（HC）を連結する工程、ならびに1個以上のバーコードまたは配列同定配列を提供する工程を含む。この局面において、特定の起源または試料、例えば、単一細胞、試料ウェル、単一試料等に由来するポリヌクレオチド配列が決定されることを可能にする同定因子を提供するため、関心対象のポリヌクレオチド配列と1個以上のバーコードとの間に物理的な連結が提供される。単一試料は、1種以上のB系列細胞またはその他の細胞型を含み得る。2種の関心対象のポリヌクレオチド配列を連結する方法の例は、当技術分野において公知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO99/16904、WO93/03151、および米国特許第7,749,697号）。連結されたポリヌクレオチド配列におけるバーコードの使用に関連したその他の利点には、ハイスループット配列決定が推進され、最初の試料へ配列がマッピングされるため、ポリヌクレオチド配列、例えば、免疫グロブリンのHCポリヌクレオチドおよびLCポリヌクレオチドを発現させるために、それを再び配列決定し、PCRクローニングすることができる点が含まれる。ハイスループット配列決定テクノロジーのいくつかは、1〜10+％の配列決定エラー率を示し、バーコードの使用は、生物情報学的エラー補正を推進するための鋳型の反復的な配列決定を可能にする。これは、免疫グロブリンポリヌクレオチドにおける遺伝子変動のような遺伝子変動から、配列決定エラーを区別するために特に重要である。特に、密接に関連した配列が、実際に別個の配列であるか、または配列決定エラーによって作製されたアーチファクトを表すかを確認することは、困難であり得る。バーコードは、個々の鋳型の反復的な配列決定の分析を可能にすることにより、配列決定エラー補正を可能にし、従って、配列が、別個であるか、配列決定エラーに由来するアーチファクトであるか、の決定を提供する。一つの態様において、ポリヌクレオチド配列は、体細胞突然変異によって多様化した、1ヌクレオチドのみが異なっている、免疫グロブリンのHC配列およびLC配列である。
【０２２２】
この局面において、図15に示されるような、物理的に連結されバーコード付けされた構築物が、概して入手される。図15は、2個の核酸セグメントAおよびB（例えば、2個のcDNA）の物理的連結を例示している。バーコード（BC）は、いずれか一つの末端、またはAとBとを接続しているリンカーに添付される。このAとBとの物理的連結、およびバーコードの付加は、以下により詳細に記載されるような、ライゲーション、組換え、増幅、もしくはオーバーラップエクステンション、またはこれらの方法の組み合わせを含む、多数の手段のうちのいずれかを通して達成される。オプションで、より少数のバーコードを使用して多数の連結されたポリヌクレオチドを配列決定することを可能にする化合物バーコード付けを提供するため、図15に示された構築物に、付加的なバーコードが付加されてもよい。また、2個の核酸セグメントを連結するために使用される特定の戦略によっては、センス方向およびアンチセンス方向に関して、セグメントの任意の相対方向が入手され得ること、即ち、cDNAのようなセグメントが、ヘッドトゥテール、ヘッドトゥヘッド、またはテールトゥテールで結合され得ることが理解されるであろう。
【０２２３】
バーコードは、当技術分野において公知の方法を使用して、物理的連結の前、途中、または後に、ポリヌクレオチド配列に付加され得る。これらの方法には、例えば、バーコードアダプターの平滑末端ライゲーションのようなライゲーション法、ならびにホモポリマーテーリング、リンカーの制限酵素消化、または逆転写酵素によるcDNAの3'テーリングによって生成されたもののような適合性末端のアニーリングおよびライゲーションが含まれるが、これらに限定されない。バーコードは、バーコード配列を保持している適当なプライマーを使用して、増幅反応において付加されてもよい。バーコードは、バーコード配列を含有している適当なプライマーを使用して、逆転写反応において付加されてもよい。バーコードは、2種の関心対象の遺伝子の間に位置付けられるよう、オーバーラップエクステンションテールまたはその他の方法を通して、関心対象の遺伝子を連結するために使用されるオリゴヌクレオチドへの組み入れによって付加されてもよい。従って、これらの方法を使用して、バーコードは、物理的に連結されたポリヌクレオチド配列の末端、または2種の関心対象のポリヌクレオチド配列を結合するリンカー配列へ組み入れられ得る。
【０２２４】
一つの態様において、連結は、オーバーラップエクステンションの使用を通して達成される（図16を参照のこと）。一般に、オーバーラップエクステンションテールは、結合される関心対象のポリヌクレオチド配列へ付加される相補的な配列である。関心対象のポリヌクレオチド分子へ添付されたオーバーラップエクステンションテールのアニーリングは、それらが連結されることを可能にする（図17、18、19、および20を参照のこと）。下記のように、オーバーラップエクステンションテールは、核酸増幅および逆転写、ライゲーション、ならびに組換えのようなポリヌクレオチド合成反応を含むが、これらに限定されない、多数の周知の方法を通して付加され得る。連結を達成するために利用可能な多様な方法のため、センス方向およびアンチセンス方向に関して、ポリヌクレオチドセグメントの異なる相対方向が入手され得ること、即ち、セグメント、例えば、抗体の重鎖および軽鎖が、ヘッドトゥテール、ヘッドトゥヘッド、またはテールトゥテールで結合され得ることが認識されるであろう。
【０２２５】
一つの態様において、オーバーラップエクステンションテールは、ポリヌクレオチド合成反応において生成されたポリヌクレオチド配列の連結を可能にする。例えば、オーバーラップエクステンションテールは、オーバーラップエクステンションテールを保持しているプライマーを使用することにより、増幅反応または逆転写反応のようなポリヌクレオチド合成反応の過程で導入され得る。あるいは、ライゲーション反応が使用されてもよい。図17、18、19、および20に示されるように、相補的なオーバーラップエクステンションテールのアニーリングの後、物理的に結合された2個の関心対象のポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドを生成するため、PCRのようなポリヌクレオチド合成反応の伸長期に、5'から3'への方向で、DNAが充填される。
【０２２６】
いくつかの態様において、オーバーラップエクステンションRT-PCR反応は、単一の管において、反応が進行するのと同時に配列が連結されることを可能にし、従って、中間の精製の必要性を排除する。いくつかの態様において、オーバーラップエクステンションテールはバーコード配列を含む。
【０２２７】
図17は、抗体の軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を結合し、少なくとも1個のバーコードを提供するための、オーバーラップエクステンションテールの使用の一例を概して例示する。2個の関心対象のポリヌクレオチド配列を連結するために有用なその他の方法は、以下に説明する。この例において、ポリヌクレオチド合成、例えば、逆転写が起こった後、バーコードを含有しているLC遺伝子特異的PCRプライマー、オプションの配列決定プライマー部位、およびオプションの制限部位（RE1）の使用が、結果として得られるPCR産物の末端にこれらの要素が付加されることを可能にする。エクステンションオーバーラップを含み、オプションの制限部位（RE3）をコードする、LC（一つの態様において、VL領域）およびHC（一つの態様において、VH領域）に特異的なプライマーが示される。一つの態様において、LCは、定常領域の短いセグメントを含むかまたは含まない再編成されたVJを含み、HCは、重鎖の定常領域の短いセグメントを含むかまたは含まない再編成されたV(D)Jを含む。一つの態様において、オーバーラップエクステンションプライマーもバーコード配列を含有している。オプションのRE2を含有しているHCに特異的な逆方向プライマーも使用される。これらのプライマーを用いた増幅が進行するにつれ、示された連結された構造を有する核酸が、一方の末端にバーコードを含んで生成される。単一試料において実施された反応からの産物は、本明細書に開示された他のワークフローに容易に組み込まれ得る。例えば、相対的に最少源の数のバーコードを使用して多数の配列を同定する多重化をさらに可能にするため、オプションの第二のバーコードが付加され、第一のバーコードと共に使用されてもよい。配列決定のためには、単一のバーコードで十分である。
【０２２８】
図17に示された一般スキームの変動は、明らかであり、その例が本明細書に例示される。例えば、バーコードは、最終産物の他方の末端、両端、またはポリヌクレオチド間に位置付けられてもよい。さらに、バーコードは、エクステンションオーバーラップ領域の一部分として含まれてもよい（例えば、RE3の片側、またはバーコードがRE3配列によって分割されていてもよい）。
【０２２９】
（VL配列を含む）LC配列および（VH配列を含む）HC配列は、多様な手段を通して得られ得る。例えば、それらは、オリゴdTプライマーまたは遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いたmRNAの逆転写を通して生成され得る。一つの態様において、最終産物に到達するため、逆転写反応およびその後の増幅反応が同時に実施されてもよい（即ち、RT-PCR反応）。逆転写が使用される時、エクステンションオーバーラップ領域、および制限部位、配列決定プライマー部位、またはユニバーサル配列のようなその他の要素は、例えば、図18、19、および20に示されるように、逆転写反応において生成されたcDNAの3'テーリングにより生成された1個、2個、3個、またはそれより多いC残基との、1個以上のG残基を含むアダプターのアニーリングを介して付加され得る。逆転写酵素による鋳型切り替えは、エクステンションオーバーラップ領域（およびその他の配列要素）がcDNAへ付加されることを可能にする。例えば、図18に示されるように、逆転写酵素の3'テーリング活性および鋳型切り替え活性を活用する時、第一のアダプターは、第一の関心対象のポリヌクレオチドへエクステンションオーバーラップ配列およびバーコードを付加するために使用され得、第一のアダプターのオーバーラップエクステンションに相補的な配列を有する第二のアダプターは、第二の関心対象のcDNAへ付加され得る。相補的なエクステンションオーバーラップ配列は、2個の関心対象のポリヌクレオチドを結合するため、PCRのようなその後の核酸合成反応においてアニールする。オーバーラップの点からの伸長は、2個の関心対象のポリヌクレオチドが、間にバーコードを含んで連結された二本鎖DNA分子をもたらす。2個の連結されたポリヌクレオチド配列の間の内部に位置する2個のバーコードの生成を可能にする変動は、図19および20に示される。
【０２３０】
関心対象のポリヌクレオチド配列を結合するかまたは連結するためのその他の方法には、ライゲーションによるものが含まれる。この態様において、増幅のために使用されるプライマーミックスが、増幅された標的配列が適切な制限酵素によって切断され得、DNAライゲーションによる共有結合性の連結が達成され得るよう、設計される。そのようなプライマーミックスによる増幅の後、標的配列の適合性末端を形成するために必要とされる制限酵素が、混合物に添加される。次いで、標的配列がリガーゼによってライゲートされる。制限酵素消化またはライゲーションの工程の前に、PCR産物の精製は必要とされないが、精製が実施されてもよい。
【０２３１】
別の態様において、関心対象のポリヌクレオチド配列は、組換えにより連結され得る。このアプローチにおいて、増幅された関心対象のポリヌクレオチド配列は、同一の組換え部位を使用して結合され得る。連結は、組換えを推進するため、適切なリコンビナーゼを添加することにより実施される。適当なリコンビナーゼ系には、多様なFRT部位を有するFlpリコンビナーゼ、多様なlox部位を有するCreリコンビナーゼ、attP部位とattB部位との間の組換えを実施するインテグラーゼΦC31、βリコンビナーゼ-six系、およびGin-gix系が含まれる。2個のヌクレオチド配列についての組換えによる連結は、例証されている（VLと連結されたVH）（参照により本明細書に組み入れられる、Chapal,N.et al.1997 BioTechniques 23,518-524）。
【０２３２】
従って、一つの局面において、方法は、単離された単一細胞または同質遺伝子細胞の集団に由来する鋳型を使用して、PCR増幅またはRT-PCR増幅により、関心対象のヌクレオチド配列を増幅する工程、ならびに（1）増幅された関心対象のヌクレオチド配列の連結を達成する工程、および（2）連結されたポリヌクレオチド配列に1個以上のバーコードを付加する工程を含む。方法は、例えば、付加的なバーコード、制限部位、配列決定プライマー部位等を付加するため、連結された産物の付加的な増幅を実施するオプションの工程を含む。
【０２３３】
別の局面において、ドナー由来の単一細胞由来の、バーコード付けされ連結された、抗体の重鎖および軽鎖を含む対のライブラリーを作製する方法が、提供される。この局面は、細胞画分から特定のリンパ球集団についてオプションで濃縮された、ドナー由来のリンパ球含有細胞画分を提供する工程を含む。さらに、リンパ球含有細胞画分または濃縮された細胞画分からの細胞を、多数の容器、コンテナ、またはウェルに個々に分配することにより、単離された単一細胞の集団が入手される。単離された単一細胞の集団に含有されている可変領域をコードする配列の多重分子増幅（例えば、多重RT-PCR増幅）が実施され、重鎖および軽鎖の対（個々の対は単一細胞に由来する）の連結ならびにバーコード付加が達成される。さらに、異なる態様において、方法は二つのオプションの工程を含み得る。第一の工程において、単一細胞の集団の中の個々の単離された単一細胞を、同質遺伝子細胞の集団へと増大させた後、多重RT-PCR増幅を実施し、それにより、同質遺伝子細胞の集団を含む多数の容器、コンテナ、またはウェルを提供することができる（1個の容器、コンテナ、またはウェルに、1種の同質遺伝子細胞の集団）。別のオプションの工程には、連結された軽鎖および重鎖をコードする配列の付加的な増幅を実施する工程が包含される。この付加的な増幅工程は、連結された核酸の量を単に増加させるため、または第一もしくは第二のバーコード配列もしくはその他の配列要素を連結された核酸に付加するため、使用され得る。
【０２３４】
いくつかの局面において、多重RT-PCR増幅は、逆転写（RT）が多重PCR増幅（もしくは代替的な多重分子増幅）とは別に実施される二段階法として実施されてもよいし、またはRT工程および多重PCR増幅工程が1個の管において同一のプライマーにより実施される一段階法として実施されてもよい。
【０２３５】
逆転写（RT）は、逆転写酵素活性を含有している酵素により実施され、単離された単一細胞からの全RNA、mRNA、または標的特異的RNAからのcDNAの生成をもたらす。逆転写のために利用され得るプライマーには、オリゴdTプライマー、ランダムヘキサマー、ランダムデカマー、その他のランダムプライマー、または関心対象のヌクレオチド配列に特異的であるプライマーが含まれる。いくつかの態様において、そのようなプライマーは、バーコード、ユニバーサルプライミング部位、制限部位、配列決定プライマー部位等のような要素を含有していてもよい。
【０２３６】
二段階多重RT-PCR増幅法は、RT工程において生成されたcDNAが、鋳型画分の保管を可能にする複数個の容器に分配され、その後、所望により、増幅へと進められることを可能にする。さらに、複数個の管へのcDNAの分配は、同一鋳型に由来する核酸の複数回の多重PCR増幅の実施を可能にする。この二段階アプローチは、例えば、1個の管において、重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域をコードする配列を増幅し、連結し、同一の鋳型を利用して、異なる管において、重鎖可変領域およびλ軽鎖可変領域をコードする配列を増幅し、連結するために使用され得る。単一細胞は、一般的に、軽鎖のうちの一方のみを発現する。しかしながら、一方の反応の結果を待ってから他方を実施するのではなく、反応を同時に実施する方が、しばしば、容易であろう。さらに、単一細胞からはκのみまたはλのみが増幅されると予想されるため、κおよびλの両方の増幅は、内部陰性対照として機能する。
【０２３７】
一段階多重RT-PCR増幅法においては、逆転写および多重PCR増幅が、同一の容器、コンテナ、またはウェルにおいて実施される。逆転写および多重PCRの両方を一段階で実施するために必要な全ての成分が、最初に、容器、コンテナ、またはウェルに添加され、反応が実施される。一般に、反応が開始された後、付加的な成分を添加する必要はない。一段階多重RT-PCR増幅の利点は、バーコードが連結された本発明のヌクレオチド配列を生成するために必要な工程の数をさらに低下させる点である。これは、同一の反応が多数の容器において実施される、単一細胞のアレイに対する多重RT-PCRを実施する時、特に有用である。一般に、一段階多重RT-PCRに必要とされる組成物には、核酸鋳型、逆転写酵素活性を有する酵素、DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸ミックス（dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPを含むdNTPミックス）、ならびに多重プライマーミックスが含まれる。核酸鋳型は、好ましくは、精製された形態の、細胞の溶解物としての、または完全細胞に含有されている、単離された単一細胞に由来する全RNAまたはmRNAである。
【０２３８】
一つの局面において、方法は、連結されバーコード付けされた関心対象のポリヌクレオチドのライブラリーを生成する。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの中の多数のポリヌクレオチド組成物は、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも3000種、少なくとも10,000種、少なくとも30,000種、少なくとも100,000種、少なくとも300,000種、少なくとも1,000,000種、少なくとも3,000,000種、少なくとも10,000,000種、少なくとも30,000,000種、またはそれより多いメンバーを含み得る。他の局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの中の多数のポリヌクレオチド組成物は、細胞試料の全トランスクリプトームの少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも3000種、少なくとも10,000種、少なくとも30,000種、またはそれより多い遺伝子を含み得る。他の局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの中の多数のポリヌクレオチド組成物は、個体の血中に存在する異なる抗体種のうちの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも10種、少なくとも30種、少なくとも100種、少なくとも300種、少なくとも1000種、少なくとも10,000種、少なくとも100,000種、少なくとも1,000,000種、少なくとも10,000,000種、少なくとも1,000,000,000種、またはそれより多い抗体種を含む。これらの抗体種は、形質芽球、形質細胞、メモリーB細胞、長命形質細胞、未感作B細胞、その他のB系列細胞、またはそれらの組み合わせによって発現され得る。
【０２３９】
上に開示された方法により生成された連結されバーコード付けされたポリヌクレオチド組成物は、好ましくは、本明細書に記載されるNextGenシークエンシングプラットフォームを使用して、有利に、ハイスループット多重配列決定に供され得る。
【０２４０】
上に開示された方法により生成された連結されバーコード付けされたポリヌクレオチド組成物は、本明細書に開示される関心対象のポリペプチドのクローニング、作製、およびスクリーニングのためにも使用され得る。
【０２４１】
配列決定のための1種以上の関心対象のポリヌクレオチドを作製する方法
いくつかの局面において、方法は、多数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーを入手する工程であって、各ポリヌクレオチドが、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料に由来するアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の配列が、多数のポリヌクレオチドの中の各ポリヌクレオチドにおいて実質的に同一であり、第一の単一試料に由来する各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料と別個の1個以上の試料に由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と別個である、工程；ならびに配列決定のための1種以上の関心対象のポリヌクレオチドを作製するため、プライマーのセットにより、ポリヌクレオチドライブラリーを増幅する工程であって、配列決定のための1種以上の関心対象のポリヌクレオチドが、第一の配列決定領域、第一のプレート同定領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料に由来するアンプリコン領域、および第二の配列決定領域を含む、工程、を含む。
【０２４２】
いくつかの局面において、方法は、1種以上の関心対象のポリヌクレオチドを配列決定する工程をさらに含む。いくつかの局面において、配列決定は454シーケンシングである。
【０２４３】
いくつかの局面において、配列決定は、例えば、抗体軽鎖（LC）のおよそ600塩基対（bp）の配列（正確な配列長は5'非翻訳領域（UTR）の長さに依り得る）および重鎖（HC）のおよそ700bpの配列の全体の再構築を可能にするため、順方向および逆方向の配列決定リードが十分にオーバーラップするよう、より長い配列決定リードを含む。従って、いくつかの局面において、少なくとも350〜400bpの配列決定リードを与え、それにより、配列組み立てのために含まれるオーバーラップを達成することができる任意の配列決定テクノロジーが使用され得、600〜700+bpのリードを可能にする配列決定テクノロジーは、順方向プライマーのみを使用した配列決定（5'末端からの配列決定）を可能にするであろう。
【０２４４】
当業者に公知の、核酸を配列決定する技術が、使用され得る。DNA配列決定技術には、標識されたターミネーターまたはプライマーを使用した古典的なジデオキシ配列決定反応（サンガー法）、およびスラブ電気泳動またはキャピラリー電気泳動におけるゲル分離が含まれる。好ましい態様において、次世代（NextGen）配列決定プラットフォームが、本発明の実施において有利に使用される。NextGen配列決定とは、多数の試料を同時にハイスループットに多重配列決定することが可能な、古典的サンガー型より後の多数の配列決定法のうちの任意のものをさす。以下により詳細に記載されるもののような、現在のNextGen配列決定プラットフォームは、同一の配列決定ランにおいて複数の別個の核酸からリードを生成することができる。スループットは、1ラン当たり108塩基〜6×1011塩基と様々であり、スループットは、テクノロジーの改善により急速に増加しつつある。異なるNextGen配列決定プラットフォームの作動の原理も、様々であり、可逆的に終結した（reversibly terminated）標識されたヌクレオチドを使用したシーケンシングバイシンセシス（sequencing by synthesis）、ピロシーケンシング、454シーケンシング、標識されたオリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへの対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーション、標識されたクローンのライブラリーへの対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションに続くライゲーションを使用したシーケンシングバイシンセシス、重合工程における標識されたヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリング、ポロニーシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、およびSOLiDシーケンシングを含み得る。ポリメラーゼまたはリガーゼを使用した逐次または単一の伸長反応、およびプローブのライブラリーとの単一または逐次のディファレンシャルハイブリダイゼーションによる配列決定が証明されている。これらの反応は、多くのクローン配列に対して並行して実施されており、例えば、108種を超える配列の、並行する現在の商業的適用において証明されている。従って、これらの配列決定アプローチは、T細胞受容体（TCR）および／またはB細胞受容体（BCR）のレパートリーならびにその他の関心対象の配列を研究するために使用され得る。
【０２４５】
配列決定技術は、1ラン当たり少なくとも1000リード、1ラン当たり少なくとも10,000リード、1ラン当たり少なくとも100,000リード、1ラン当たり少なくとも500,000リード、または1ラン当たり少なくとも1,000,000リードを生成することができる。
【０２４６】
配列決定技術は、1リード当たり約30bp、約40bp、約50bp、約60bp、約70bp、約80bp、約90bp、約100bp、約110bp、約120bp、約150bp、約200bp、約250bp、約300bp、約350bp、約400bp、約450bp、約500bp、約550bp、約600bp、約650bp、または約700bp、またはそれ以上を生成することができる。
【０２４７】
配列決定技術は、1リード当たり少なくとも30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、50ヌクレオチド、60ヌクレオチド、70ヌクレオチド、80ヌクレオチド、90ヌクレオチド、100ヌクレオチド、110ヌクレオチド、120ヌクレオチド、150ヌクレオチド、200ヌクレオチド、250ヌクレオチド、300ヌクレオチド、350ヌクレオチド、400ヌクレオチド、450ヌクレオチド、500ヌクレオチド、550ヌクレオチド、600ヌクレオチド、650ヌクレオチド、700ヌクレオチド、またはそれ以上を生成することができる。
【０２４８】
使用され得る配列決定技術は、例えば、Helicos True Single Molecule Sequencing（tSMS）（Harris T.D.et al.(2008)Science 320：106-109）である。tSMS技術においては、DNA試料をおよそ100〜200ヌクレオチドの鎖へ切断し、ポリA配列を各DNA鎖の3'末端に付加する。各鎖を、蛍光標識されたアデノシンヌクレオチドの付加により標識する。次いで、DNA鎖を、フローセル表面に固定化された数百万のオリゴT捕捉部位を含有しているフローセルにハイブリダイズさせる。鋳型は約108鋳型/cm2の密度であり得る。次いで、フローセルを装置、例えば、HeliScope（商標）シーケンサーに装填し、レーザーがフローセルの表面を照射し、各鋳型の位置を明らかにする。CCDカメラが、フローセル表面上の鋳型の位置をマッピングし得る。次いで、鋳型蛍光標識を切断し、洗浄除去する。DNAポリメラーゼおよび蛍光標識されたヌクレオチドを導入することにより、配列決定反応を開始させる。オリゴT核酸がプライマーとして機能する。ポリメラーゼが、鋳型によって指示されたように、標識されたヌクレオチドをプライマーに組み入れる。ポリメラーゼおよび組み入れられなかったヌクレオチドを除去する。蛍光標識されたヌクレオチドの組み入れを指示した鋳型を、フローセル表面を画像化することにより検出する。画像化の後、切断工程によって蛍光標識を除去し、所望のリード長が達成されるまで、他の蛍光標識されたヌクレオチドを用いて過程を繰り返す。各ヌクレオチド付加工程で配列情報を収集する。
【０２４９】
使用され得る配列決定技術の別の例は、454シーケンシング（Roche）（Margulies,M et al.,2005,Nature,437,376-380）である。454シーケンシングは二つの工程を含む。第一の工程において、DNAをおよそ300〜800塩基対の断片へ剪断し、断片を平滑末端化する。次いで、オリゴヌクレオチドアダプターを断片の末端へライゲートする。アダプターが、断片の増幅および配列決定のためのプライマーとして機能する。断片を、例えば、5'-ビオチンタグを含有しているアダプターBを使用して、DNA捕捉ビーズ、例えば、ストレプトアビジンによりコーティングされたビーズに付着させることができる。ビーズに付着した断片を、油水エマルションの液滴内でPCR増幅する。その結果、各ビーズ上にクローン増幅されたDNA断片が複数コピー得られる。第二の工程において、ビーズをウェル（ピコリットルサイズ）に捕捉する。ピロシーケンシングを各DNA断片に対して並行して実施する。1個以上のヌクレオチドの付加は、光シグナルを生成し、それが配列決定装置内のCCDカメラによって記録される。シグナル強度は、組み入れられたヌクレオチドの数に比例する。
【０２５０】
ピロシーケンシングは、ヌクレオチド付加によって放出されるピロリン酸（PPi）を使用する。PPiは、アデノシン5'ホスホ硫酸の存在下で、ATPスルフリラーゼによってATPへ変換される。ルシフェラーゼは、ルシフェリンをオキシルシフェリンへ変換するためにATPを使用し、この反応が光を生成し、それが検出され分析される。
【０２５１】
使用され得るDNA配列決定技術の別の例は、SOLiDテクノロジー（Applied Biosystems）である。SOLiDシーケンシングにおいては、ゲノムDNAを断片へ剪断し、断片ライブラリーを生成するため、アダプターを断片の5'末端および3'末端に取り付ける。あるいは、アダプターを断片の5'末端および3'末端にライゲートし、断片を環状化し、内部アダプターを生成するため、環状化された断片を消化し、メイトペア（mate-paired）ライブラリーを生成するため、得られた断片の5'末端および3'末端にアダプターを取り付けることにより、内部アダプターを導入してもよい。次に、ビーズ、プライマー、鋳型、およびPCR成分を含有しているマイクロリアクターにおいて、クローンビーズ集団を調製する。PCR後、鋳型を変性させ、伸長された鋳型を有するビーズを分離するため、ビーズを濃縮する。選択されたビーズの上の鋳型を、ガラススライドへの結合を可能にする3'修飾に供する。
【０２５２】
特異的なフルオロフォアにより同定される中央の決定された塩基（または塩基対）を有する部分ランダムオリゴヌクレオチドの逐次的なハイブリダイゼーションおよびライゲーションにより、配列を決定することができる。色を記録した後、ライゲートされたオリゴヌクレオチドを切断し、除去し、次いで、過程を繰り返す。
【０２５３】
使用され得る配列決定テクノロジーの別の例は、SOLEXAシーケンシング（Illumina）である。SOLEXAシーケンシングは、フォールドバック（fold-back）PCRおよびアンカード（anchored）プライマーを使用した、固体表面におけるDNAの増幅に基づく。ゲノムDNAを断片化し、断片の5'末端および3'末端にアダプターを付加する。フローセルチャネルの表面に付着したDNA断片を伸長し、ブリッジ増幅する。断片を二本鎖にし、二本鎖分子を変性させる。固相合成に続く変性を複数回繰り返すことにより、フローセルの各チャネルにおいて、同一鋳型の一本鎖DNA分子のおよそ1000コピーのクラスターを数百万個作ることができる。プライマー、DNAポリメラーゼ、およびフルオロフォアにより標識された可逆的に終結する（reversibly terminating）4種のヌクレオチドを、逐次配列決定を実施するために使用する。ヌクレオチド取り込みの後、フルオロフォアを励起するためにレーザーを使用し、画像を捕捉し、最初の塩基の同一性を記録する。組み入れられた各塩基から3'ターミネーターおよびフルオロフォアを除去し、組み入れ、検出、および同定の工程を繰り返す。
【０２５４】
使用され得る配列決定テクノロジーの別の例には、Pacific Biosciencesの一分子リアルタイム（SMRT（商標））テクノロジーが含まれる。SMRTにおいては、4種のDNA塩基の各々を、4種の異なる蛍光色素のうちの1種に付着させる。これらの色素は、ホスホ結合（phospholinked）される。単一のDNAポリメラーゼを、鋳型一本鎖DNAの単一分子と共に、ゼロモード導波路（zero-mode waveguide）（ZMW）の底に固定化する。ZMWは、ZMWの外に急速に（マイクロ秒で）拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対して、DNAポリメラーゼによる単一ヌクレオチドの組み入れの観察を可能にする制限構造である。成長中の鎖にヌクレオチドを組み入れるには数ミリ秒かかる。この時間の間に、蛍光標識が励起され、蛍光シグナルを生じ、蛍光タグが切断除去される。色素の対応する蛍光の検出が、組み入れられた塩基を示す。その過程を繰り返す。
【０２５５】
使用され得る配列決定技術の別の例は、ナノポアシーケンシング（Soni G V and Meller A.(2007)Clin Chem 53：1996-2001）である。ナノポアは、直径およそ1ナノメートルの小さな孔である。伝導液へのナノポアの浸漬および電圧の適用によって、ナノポアを通るイオンの伝導によるわずかな電流がもたらされる。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに対して感受性である。DNA分子がナノポアを通ると、DNA分子上の各ヌクレオチドが異なる程度にナノポアを妨害する。従って、DNA分子がナノポアを通る時のナノポアを通る電流の変化が、DNA配列の読み取りを表す。
【０２５６】
使用され得る配列決定技術の別の例は、（例えば、米国特許出願公開第20090026082号に記載されたような）DNAを配列決定するための化学的電界効果トランジスタ（chemFET）アレイの使用を含む。技術の一例において、DNA分子を反応チャンバーに置き、ポリメラーゼと結合した配列決定プライマーに鋳型分子をハイブリダイズさせることができる。配列決定プライマーの3'末端における新たな核酸鎖への1個以上の三リン酸の組み入れを、chemFETによって、電流の変化により検出することができる。アレイは複数のchemFETセンサーを有し得る。別の例において、単一核酸をビーズに付着させ、核酸をビーズ上で増幅し、個々のビーズを、chemFETアレイ上のchemFETセンサーを各々有する個々の反応チャンバーに移し、核酸を配列決定することもできる。
【０２５７】
使用され得る配列決定技術の別の例は、電子顕微鏡の使用（Moudrianakis E.N.and Beer M.Proc Natl Acad Sci USA.1965 March；53：564-71）を含む。技術の一例において、個々のDNA分子を、電子顕微鏡を使用して区別可能な金属標識を使用して標識する。次いで、これらの分子を、平坦な表面に広げ、配列を測定するため電子顕微鏡を使用して画像化する。
【０２５８】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの入手は、実験室におけるポリヌクレオチドライブラリーの調製を含む。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの入手は、ポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者からの直接的または間接的なポリヌクレオチドライブラリーの受領を含む。
【０２５９】
配列決定データを分析する方法
いくつかの局面において、方法は、多数のポリヌクレオチドに関連したデータセットを入手する工程であって、データセットが、多数のポリヌクレオチドについての配列決定データを含み、多数のポリヌクレオチドの中の各ポリヌクレオチドが試料同定領域を含み、各ポリヌクレオチドの各試料同定領域が単一試料に固有であり、第一の単一試料に由来する各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料と別個の1個以上の試料に由来する多数のポリヌクレオチドの中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と別個である、工程；および同一の試料同定領域を有するポリヌクレオチドをマッチさせるため、データセットを分析する工程であって、マッチとは、ポリヌクレオチドが同一の試料に起因することを示す、工程を含む。
【０２６０】
いくつかの局面において、多数のポリヌクレオチドの中の各ポリヌクレオチドは、第一のプレート同定領域をさらに含み、各ポリヌクレオチドの各第一のプレート同定領域および各試料同定領域の各組み合わせは、単一試料に関して固有であり、第一の単一試料セットに由来する各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来する多数のポリヌクレオチドの中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と別個であり、同一の第一のプレート同定領域および同一の試料同定領域を有するポリヌクレオチドをマッチさせるため、データセットを分析する工程であって、両領域間のマッチとは、ポリヌクレオチドが同一の試料に起因することを示す、工程をさらに含む。
【０２６１】
いくつかの局面において、両方のポリヌクレオチドが可変領域を含む。いくつかの局面において、一方のポリヌクレオチドが可変領域を含む。いくつかの局面において、いずれのポリヌクレオチドも可変領域を含まない。
【０２６２】
いくつかの局面において、データセットの入手は、多数のポリヌクレオチドの入手、およびデータセットを実験的に決定するための多数のポリヌクレオチドの配列決定を含む。いくつかの局面において、データセットの入手は、データセットを実験的に決定するために多数のポリヌクレオチドを配列決定した第三者からの直接的または間接的なデータセットの受領を含む。いくつかの局面において、データセットは電子記憶媒体に記憶される。いくつかの局面において、データセットはインターネットで伝送される。
【０２６３】
いくつかの局面において、方法は、コンピューターで実行され、例えば、コンピューターにより実行される方法である。
【０２６４】
いくつかの局面において、単一試料は単一細胞である。いくつかの局面において、単一試料は単一細胞を含む。いくつかの局面において、単一試料は単一B細胞を含む。いくつかの局面において、単一試料は多数のB細胞を含む。いくつかの局面において、単一試料は単一B細胞および1種以上の他の細胞を含む。
【０２６５】
いくつかの局面において、配列決定（例えば、454シーケンシング）から生成されたデータは、454 GS FLXデータ分析ソフトウェアによって分析され、低品質のスコアを有する配列は除去される。次いで、高品質の配列が、Phytonのスクリプトを使用することにより、試料同定領域（いくつかの態様において、試料同定領域とプレート同定領域との組み合わせ）によって細分され得、その後、バイオインフォマティクスアプローチを使用して、例えば、Newblerを使用することにより、配列が組み立てられる。いくつかの局面において、逆リードは第二のプレート同定領域のみを有し得るため、異なる細胞に由来する配列の順方向リードと逆方向リードとの間で配列組み立てが起こる可能性がある。この可能性のある問題を回避するため、順方向リードおよび逆方向リードの両方の重鎖および軽鎖のV(D)J使用を、まず、HighV-QUESTを使用して同定することができる。次いで、配列をV(D)J使用によってさらに分類した後、組み立てることができる。いくつかの局面において、配列組み立ては、ヌクレオチドミスマッチについて不耐性であって、それにより、同一のV(D)J使用を共有する異なる細胞に由来する順方向リードおよび逆方向リードの組み立てを防止し得る。いくつかの局面において、次いで、コンピュータープログラムを使用することにより、V(D)J使用に基づき、配列をクラスター化することができる。
【０２６６】
いくつかの局面において、クローンファミリーおよびクローンサブファミリーを形成する配列の群を同定し、それにより、関心対象の免疫グロブリン配列を同定するため、バイオインフォマティクス法を使用することができる。そのようなバイオインフォマティクス法は、配列類似性の測定を含む。そのようなバイオインフォマティクス法は、個々のヒトに由来するか、1人以上のヒトに由来するか、ある状態を有する1人以上のヒトに由来するか、または異なる状態を有する1人以上のヒトに由来する、関心対象の配列を同定するために使用され得る。
【０２６７】
いくつかの局面において、関連のある免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の配列は、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖のV(D)J配列間の相同性のコンピューターによる系統発生分析を通して同定され得る。いくつかの局面において、個々のV遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント、および／もしくはJ遺伝子セグメント、ならびに／または免疫グロブリンの重鎖および／もしくは軽鎖に由来するその他の配列、またはそれらの組み合わせを表す配列の標準的な分類法（即ち、クラスター化）が、（例えば、ClustalXを使用することにより）クローンファミリーまたはクローンサブファミリーを同定するために使用され得る。
【０２６８】
本明細書において使用されるように、「クローンファミリー」とは、各配列が、V領域、D領域、および／もしくはJ領域を有する同一の生殖系列免疫グロブリン配列の変異バージョンであるか、またはV領域、D領域、および／もしくはJ領域を有する生殖系列免疫グロブリン配列である、V領域、D領域、および／またはJ領域を各々有する多数の免疫グロブリン配列をさす。いくつかの局面において、多数とは多数の重鎖配列である。いくつかの局面において、多数とは多数の軽鎖配列である。いくつかの局面において、多数とは重鎖配列および軽鎖配列の多数の対である。いくつかの局面において、各配列は、V領域、D領域、およびJ領域を有する。いくつかの局面において、各配列は、V領域およびD領域を有する。いくつかの局面において、各配列は、D領域およびJ領域を有する。いくつかの局面において、各配列は、V領域およびJ領域を有する。いくつかの局面において、各配列は、V領域を有する。いくつかの局面において、各配列は、D領域を有する。いくつかの局面において、各配列は、J領域を有する。いくつかの局面において、1個以上の変異が、V領域、D領域、および／またはJ領域の内部に位置している。いくつかの局面において、1個以上の変異が、V領域、D領域、および／またはJ領域の間に位置している。
【０２６９】
いくつかの局面において、全ての重鎖が同一のV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントを使用する抗体のセットが、クローンファミリーである。いくつかの局面において、全ての重鎖が同一のV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントを使用し、P/NヌクレオチドおよびDヌクレオチドの長さの合計が同一の長さである抗体のセットが、クローンファミリーである。いくつかの局面において、全ての重鎖が同一のV遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント、およびJ遺伝子セグメントを使用する抗体のセットが、クローンファミリーである。いくつかの局面において、全ての重鎖が同一のV遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント、およびJ遺伝子セグメントを使用し、V遺伝子セグメントとD遺伝子セグメントとの間のP/Nヌクレオチドが同一の長さであり、D遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントとの間のP/Nヌクレオチドが同一の長さである抗体のセットが、クローンファミリーである。いくつかの局面において、全ての重鎖が同一のV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントを使用し、全ての軽鎖が同一のV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントを使用する抗体のセットが、クローンファミリーである。いくつかの局面において、全ての重鎖が同一のV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントを使用し、P/NヌクレオチドおよびDヌクレオチドの長さの合計が同一の長さであり、全ての軽鎖が同一のV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントを使用し、P/Nヌクレオチドが同一の長さを有する抗体のセットが、クローンファミリーである。いくつかの局面において、全ての重鎖が同一のV遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント、およびJ遺伝子セグメントを使用し、全ての軽鎖が同一のV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントを使用する抗体のセットが、クローンファミリーである。いくつかの局面において、全ての重鎖が同一のV遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント、およびJ遺伝子セグメントを使用し、V遺伝子セグメントとD遺伝子セグメントとの間のP/Nヌクレオチドが同一の長さであり、D遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントとの間のP/Nヌクレオチドが同一の長さであり、全ての軽鎖が同一のV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントを使用し、V遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントとの間のP/Nヌクレオチドが同一の長さである抗体のセットが、クローンファミリーである。
【０２７０】
クローンファミリーを構築する方法
T細胞受容体（TCR）または免疫グロブリン可変遺伝子問い合わせ配列についてのV、D、およびJの使用は、その配列を発生させた可能性が最も高い生殖系列V遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント（適用可能な場合）、およびJ遺伝子セグメントを同定することにより、決定され得る。Dセグメントは、いくつかのTCRおよび免疫グロブリンの配列（例えば、TCRβ、TCRδ、および抗体重鎖配列）に存在するが、他（例えば、TCRα、TCRγ、および抗体軽鎖配列）には存在しない。以下の説明は、Dセグメントを含むが、Dセグメントを欠く可変領域配列にも同一のアプローチが適用され得る。全ての場合において、V(D)J使用の決定は、IMGT/GENE-DB（Giudicelli V,Chaume D,Lefranc MP.IMGT/GENE-DB：a comprehensive database for human and mouse immunoglobulin and T cell receptor genes.Nucleic Acids Res.2005 Jan 1；33(Database issue)：D256-61.）のような、生殖系列のV遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント、およびJ遺伝子セグメントの配列の参照データベースを使用する。
【０２７１】
V(D)J使用を決定するための一つのアプローチにおいて、問い合わせ配列を、各々の生殖系列のV遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント、およびJ遺伝子セグメントと連続的に別々に比較し、各型（V、D、またはJ）の最も類似している遺伝子セグメントを、問い合わせ配列を発生させた可能性が最も高いものとして選択する。V-QUESTおよびHigh V-QUESTが、このアプローチの例である（Giudicelli V,Chaume D,Lefranc MP.IMGT/V-QUEST,an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis.Nucleic Acids Res.2004 Jul 1；32(Web Server issue)：W435-40.；Brochet X, Lefranc MP,Giudicelli V.IMGT/V-QUEST：the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis.Nucleic Acids Res.2008 Jul 1；36(Web Server issue)：W503-8.）。V-QUESTは、まず、問い合わせ配列および各V遺伝子セグメント配列についてペアワイズアライメントを生成する。次いで、Vセグメントの推定3'末端の下流の問い合わせ配列領域および各J遺伝子セグメント配列についてペアワイズアライメントを生成する。Dセグメントが存在する場合には、次いで、V-QUESTは、VセグメントとJセグメントとをマッチさせる領域の間に見出される問い合わせ配列領域および各D遺伝子セグメント配列についてペアワイズアライメントを生成する。V-QUESTは、V-D、V-J、および／またはD-Jの結合領域の境界も推測することができる。
【０２７２】
V(D)J使用を決定するための別のアプローチにおいて、問い合わせ配列を発生させた可能性が最も高い生殖系列のVセグメント、Dセグメント、およびJセグメントの組み合わせを、V、D、およびJについて、それぞれ、三つの異なる工程で同定するのではなく、一工程で同定する。このアプローチは、一つの型のセグメント（V、D、またはJ）の同定が、他の二つの型のセグメントとの可能性のあるマッチに関する情報を考慮に入れ得るという利点を有する。例えば、最適にマッチするDセグメントは、どのVセグメントマッチが考慮されているかに依り得る。SoDAは、このアプローチの一例である（Volpe JM,Cowell LG,Kepler TB.SoDA：implementation of a 3D alignment algorithm for inference of antigen receptor recombinations.Bioinfomatics.2006 Feb 15；22(4)：438-44.）。SoDAは、まず、候補のVセグメント、Dセグメント、およびJセグメントを選択する。問い合わせ配列および各V遺伝子セグメント配列についてペアワイズローカルアライメントを生成し、次いで、スコア閾値を満たすアライメントを有するVセグメントのみを維持する。JセグメントおよびDセグメントについて、これらの工程を繰り返す。次いで、候補のVセグメント、Dセグメント、およびJセグメントの各々の可能性のある組み合わせについて、最適アライメントを生成する。配列アライメントにおいて広く使用されている同一の一般のダイナミックプログラミングアプローチ（Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.(1970)A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins.J.Mol.Biol.48：443-453.）を使用して、V-D結合部、V-J結合部、および／またはD-J結合部における付加的なヌクレオチドの挿入を可能にして、アライメントが生成される。そのような挿入は、生物学的なV(D)J組換えの過程において一般的に起こる。ダイナミックプログラミングによる配列アライメントにおいて、典型的には、挿入、欠失、およびミスマッチに関連したペナルティスコアが存在する。しかしながら、V(D)J使用を決定するためのこのアプローチにおいて、セグメント間の結合部におけるヌクレオチドの挿入についてはペナルティが適用されない。最も高スコアのアライメントを与えるV(D)J組み合わせが、問い合わせ配列についてのV(D)J使用を示すために選択される。このアプローチは、結合配列領域の境界も同定し得る。
【０２７３】
クローンファミリーおよびクローンサブファミリーから、コードされた免疫グロブリンの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の対の発現ならびにそれらの結合特性の特徴決定のための特定のクローンを選択するため、多様なアプローチが使用され得る。いくつかの局面において、クローンファミリーおよび／またはクローンサブファミリーに由来する最も高頻度のクローン、ならびにクローンファミリーおよびクローンサブファミリーに由来する他の代表的なクローンが、発現させられ、結合特性についてスクリーニングされる。クローンは、発現および結合特徴の特徴決定のため、全てのクローン、全てのもしくは選択されたクローンファミリー、および／または全てのもしくは選択されたクローンサブファミリーから、ランダムに選択されてもよい。クローンは、抗体の可変領域におけるより多数の変動の保有に基づき選択されてもよい。系統発生樹を構築し、系統発生樹の特性に基づき、例えば、最も多数のリーフノード（leaf nodes）を有するブランチ（branch）を常に選びながら樹を下行することにより、クローンを選択することもできる。
【０２７４】
いくつかの局面において、方法は、クローニングのための1種以上のポリヌクレオチドを選択する工程をさらに含む。
【０２７５】
第一の関心対象のポリヌクレオチドの選択に基づき、第二の関心対象のポリヌクレオチドを同定する方法
いくつかの局面において、方法は、多数のポリヌクレオチドに関連したデータセットを入手し、ここでデータセットは、多数のポリヌクレオチドについての配列決定データを含み、多数のポリヌクレオチドの中の各ポリヌクレオチドは試料同定領域を含み、各ポリヌクレオチドの各試料同定領域は単一試料に関して固有であり、それによって、多数のポリヌクレオチドの中の各ポリヌクレオチドを別個の単一試料と関連付ける工程であって、第一の単一試料に由来する各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料と別個の1個以上の試料に由来する多数のポリヌクレオチドの中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と別個である、工程；および第一の単一試料に関連した第一の関心対象のポリヌクレオチドをデータセットから選択し、第一の関心対象のポリヌクレオチドの試料同定領域に基づき、第一の単一試料における第二の関心対象のポリヌクレオチドを同定する工程を含む。
【０２７６】
いくつかの局面において、多数のポリヌクレオチドの中の各ポリヌクレオチドは、第一のプレート同定領域をさらに含み、各ポリヌクレオチドの各第一のプレート同定領域と各試料同定領域との各組み合わせは、単一試料に関して固有であり、第一の単一試料セットに由来する各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと別個の1個以上の単一試料セットに由来する多数のポリヌクレオチドの中の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と別個であり、第一の関心対象のポリヌクレオチドの試料同定領域および第一のプレート同定領域に基づき、第一の単一試料において第二の関心対象のポリヌクレオチドを同定する工程をさらに含む。
【０２７７】
いくつかの局面において、両方のポリヌクレオチドが可変領域を含む。いくつかの局面において、一方のポリヌクレオチドが可変領域を含む。いくつかの局面において、いずれのポリヌクレオチドも可変領域を含まない。
【０２７８】
いくつかの局面において、方法は、コンピューターで実行され、例えば、コンピューターにより実行される方法である。
【０２７９】
いくつかの局面において、第一の単一試料はB細胞を含む。いくつかの局面において、第一の単一試料は単一B細胞および1種以上の他の細胞を含む。いくつかの局面において、第一の単一試料は多数のB細胞を含む。いくつかの局面において、第一の単一試料はB細胞を含み、第一の関心対象のポリヌクレオチドは、抗体重鎖ヌクレオチド配列を含み、第二の関心対象のポリヌクレオチドは、抗体軽鎖ヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面において、第一の単一試料はB細胞を含み、第一の関心対象のポリヌクレオチドは、抗体軽鎖ヌクレオチド配列を含み、第二の関心対象のポリヌクレオチドは、抗体重鎖ヌクレオチド配列を含む。
【０２８０】
いくつかの局面において、データセットの入手は、多数のポリヌクレオチドの入手、およびデータセットを実験的に決定するための多数のポリヌクレオチドの配列決定を含む。いくつかの局面において、データセットの入手は、データセットを実験的に決定するため多数のポリヌクレオチドを配列決定した第三者からの直接的または間接的なデータセットの受領を含む。いくつかの局面において、データセットは電子記憶媒体に記憶される。
【０２８１】
クローニングのための1種以上の関心対象のポリヌクレオチドを作製する方法
いくつかの局面において、方法は、多数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーを入手する工程であって、各ポリヌクレオチドが、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、および単一試料に由来するアンプリコン領域を含み、ユニバーサルプライマー領域の配列が、多数のポリヌクレオチドの中の各ポリヌクレオチドにおいて実質的に同一であり、第一の単一試料に由来する各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列が、第一の単一試料と別個の1個以上の試料に由来するライブラリーの中の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と別個である、工程；ならびにクローニングのための1種以上の関心対象のポリヌクレオチドを作製するため、プライマーのセットにより、ポリヌクレオチドライブラリーを増幅する工程であって、クローニングのための1種以上の関心対象のポリヌクレオチドが、第一の制限部位領域、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、アダプター領域、単一試料に由来するアンプリコン領域、および第二の制限部位領域を含む、工程、を含む。
【０２８２】
いくつかの局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの入手は、実験室におけるポリヌクレオチドライブラリーの調製を含む。いくつかの局面において、ポリヌクレオチドライブラリーの入手は、ポリヌクレオチドライブラリーを調製した第三者からの直接的または間接的なポリヌクレオチドライブラリーの受領を含む。
【０２８３】
いくつかの局面において、方法は、1種以上のポリヌクレオチドのクローニング、例えば、本明細書に開示されたベクターへのクローニングをさらに含む。
【０２８４】
関心対象の分子を作製する方法
いくつかの局面において、方法は、関心対象のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を入手する工程；および関心対象の分子を作製するために十分な条件の下で宿主細胞を培養する工程を含む。
【０２８５】
いくつかの局面において、宿主細胞の入手は、実験室におけるポリヌクレオチドを含む宿主細胞の調製を含む。いくつかの局面において、宿主細胞の入手は、宿主細胞を調製した第三者からの直接的または間接的なポリヌクレオチドを含む宿主細胞の受領を含む。
【０２８６】
いくつかの局面において、関心対象の分子はポリペプチドである。いくつかの局面において、関心対象の分子は抗体である。いくつかの局面において、関心対象の分子はヒトモノクローナル抗体である。
【０２８７】
いくつかの局面において、方法は、関心対象の分子を収集する工程をさらに含む。
【０２８８】
いくつかの局面において、ある種のポリペプチド、例えば、1個以上のABP成分を含むポリペプチドまたはABP自体を「再折り畳み」することが望ましい。ある種の態様において、そのようなポリペプチドは、本明細書に記述された発現系を使用して作製される。ある種の態様において、ポリペプチドは、所望の三次構造を形成し、かつ／またはジスルフィド結合を生成するため、「再折り畳み」されかつ／または酸化される。ある種の態様において、そのような構造および／または結合は、ポリペプチドのある種の生物学的活性に関係している。ある種の態様において、再折り畳みは、当技術分野において公知の多数の手法のうちのいずれかを使用して達成される。例示的な方法には、カオトロピック剤の存在下での、可溶化されたポリペプチド剤の典型的には7を超えるpHへの曝露が含まれるが、これに限定されない。例示的なカオトロピック剤はグアニジンである。ある種の態様において、再折り畳み／酸化溶液は、還元剤およびその還元剤の酸化型も含有している。ある種の態様において、還元剤およびその酸化型は、ジスルフィドシャフリングが起こることを可能にする特定の酸化還元電位を生成するであろう比率で存在する。ある種の態様において、そのようなシャフリングはシステインブリッジの形成を可能にする。例示的な酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスGSH、塩化銅、ジチオスレイトールDTT／ジチアンDTT、および2-メルカプトエタノール（bME）／ジチオ-bMEが含まれるが、これらに限定されない。ある種の態様において、再折り畳みの効率を増加させるために共溶媒が使用される。例示的な共溶媒には、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８９】
ある種の態様において、ポリペプチド、例えば、1個以上のABP成分を含むポリペプチドまたはABP自体が、実質的に精製される。いくつかのタンパク質精製技術が、当業者に公知である。ある種の態様において、タンパク質精製は、非ポリペプチド画分からのポリペプチド画分の粗分画を含む。ある種の態様において、ポリペプチドは、クロマトグラフィおよび／または電気泳動の技術を使用して精製される。例示的な精製法には、硫酸アンモニウムによる沈降；PEGによる沈降；免疫沈降；熱変性後の遠心分離；アフィニティクロマトグラフィ（例えば、プロテインA-セファロース）、イオン交換クロマトグラフィ、排除クロマトグラフィ、および逆相クロマトグラフィを含むが、これらに限定されない、クロマトグラフィ；ゲル濾過；ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ；等電点電気泳動；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ならびにそのような技術およびその他の技術の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ある種の態様において、ポリペプチドは、高速タンパク質液体クロマトグラフィまたは高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）によって精製される。ある種の態様において、精製工程を変化させるかまたはある種の工程を省略しても、実質的に精製されたポリペプチドの調製のための適当な方法をもたらすことが可能である。
【０２９０】
ある種の態様において、ポリペプチド調製物の精製の程度が定量化される。精製の程度を定量化するためのいくつかの方法が、当業者に公知である。ある種の例示的な方法には、調製物の特異的結合活性の決定、およびSDS/PAGE分析による調製物内のポリペプチドの量の査定が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製の量を査定するためのある種の例示的な方法は、調製物の結合活性の計算、および初期抽出物の結合活性との比較を含む。ある種の態様において、そのような計算の結果は、「精製倍率」として表される。結合活性の量を表すために使用される単位は、実施される特定のアッセイに依る。
【０２９１】
ある種の態様において、1個以上のABP成分を含むポリペプチドまたはABP自体は、部分精製される。ある種の態様において、部分精製は、より少ない精製工程を使用することにより、または同一の一般精製スキームの異なる型を利用することにより、達成され得る。例えば、ある種の態様において、HPLC装置を利用して実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィは、一般に、低圧クロマトグラフィ系を利用した同一技術より大きい「精製倍率」をもたらすであろう。ある種の態様において、より低い精製度をもたらす方法は、ポリペプチドの全回収またはポリペプチドの結合活性の維持において有利であり得る。
【０２９２】
ある種の例において、電気泳動によるポリペプチドの泳動は、SDS/PAGEの異なる条件により、時には有意に、変動し得る。例えば、Capaldi et al,Biochem.Biophys.Res.Comm.,76：425(1977)を参照のこと。異なる電気泳動条件の下では、精製または部分精製されたポリペプチドの見かけの分子量が、異なる場合があることが理解されるであろう。
【０２９３】
スクリーニングの方法
いくつかの局面において、関心対象の分子は、活性についてスクリーニングされる。いくつかの局面において、関心対象の分子はABPである。いくつかの局面において、関心対象の分子は抗体である。
【０２９４】
いくつかの局面において、本明細書に開示されたライブラリーをスクリーニングする方法は、所望の標的と結合することができるABPを同定するために使用される。ABPの標的分子との結合に基づき、ライブラリーからのABPの選択を可能にするインビトロまたはインビボのスクリーニング法が、企図される。
【０２９５】
一つの態様において、ライブラリーは、当技術分野において認識されているインビトロ無細胞表現型-遺伝子型対応付けディスプレイを使用してスクリーニングされ得る。そのような方法は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第7,195,880号；第6,951,725号；第7,078,197号；第7,022,479号；第6,518,018号；第7,125,669号；第6,846,655号；第6,281,344号；第6,207,446号；第6,214,553号；第6,258,558号；第6,261,804号；第6,429,300号；第6,489,116号；第6,436,665号；第6,537,749号；第6,602,685号；第6,623,926号；第6,416,950号；第6,660,473号；第6,312,927号；第5,922,545号；および第6,348,315号に記載されている。これらの方法は、タンパク質がその起源の核酸と物理的に会合または結合しているよう、インビトロで核酸からタンパク質を転写することを含む。標的分子を用いて発現タンパク質を選択することにより、そのタンパク質をコードする核酸も選択することができる。
【０２９６】
scFvタンパク質の発現を改善するため、上記参照インビトロスクリーニングアッセイに、ある種の試薬の添加または除去が含まれていてもよい。一つの態様において、機能的なscFv分子の産生を改善するため、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素が、インビトロ発現系に添加され得る。別の態様において、scFv分子のVH領域およびVL領域における鎖内ジスルフィド結合形成を可能にするため、穏和な酸化剤（例えば、GSSG（酸化型グルタチオン）／GSH（還元型グルタチオン）、例えば、100mM GSSG/10mM GSH）が、scFvタンパク質のインビトロ翻訳反応混合物に添加され得る。別の態様において、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（DTT））が、scFvのインビトロ翻訳反応混合物から除去され得る。
【０２９７】
別の態様において、結果として得られる抗体に、標識されたアミノ酸が組み入れられるよう、1種以上の標識されたアミノ酸またはそれらの誘導体が、インビトロ翻訳系に添加されてもよい。任意の当技術分野において認識されている標識されたアミノ酸、例えば、放射標識されたアミノ酸、例えば、35S-標識されたメチオニンまたはシステインが、企図される。
【０２９８】
一つの態様において、インビトロスクリーニングアッセイには、抗体または多数の抗体のインビトロ選択の後、抗体または多数の抗体と物理的に会合したmRNAが、該抗体または多数の抗体をコードするcDNAを生成するため、逆転写され得ることが含まれ得る。逆転写のための任意の適当な方法、例えば、酵素、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素によって媒介されるものが、企図される。
【０２９９】
スクリーニング法には、所望の標的と特異的に結合する抗体をコードする核酸の増幅が含まれ得る。一つの態様において、抗体または多数の抗体と物理的に会合したmRNAが、より多くのmRNAを作製するため、増幅され得る。任意の当技術分野において認識されているRNA複製法、例えば、RNAレプリカーゼ酵素の使用が、企図される。別の態様において、抗体または多数の抗体と物理的に会合したmRNAが、まず、cDNAへ逆転写され、その後、PCRにより増幅される。一つの態様において、PCR増幅は、ハイフィデリティプルーフリーディングポリメラーゼ、例えば、サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）由来のKOD1耐熱性DNAポリメラーゼまたはPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen,Carlsbad,Calif.）を使用して達成される。別の態様において、PCR増幅は、増幅されたDNAへの変異の導入をもたらす条件の下で実施され得る（即ち、エラープローンPCR）。
【０３００】
スクリーニング法には、標的に対する改善された親和性を有する抗体を選択するため、標的結合スクリーニングアッセイのストリンジェンシーを増加させることも含まれ得る。任意の当技術分野において認識されている抗体-標的相互作用アッセイのストリンジェンシーを増加させる方法が、企図される。一つの態様において、アッセイ条件のうちの1つ以上（例えば、アッセイ緩衝液の塩濃度）を、所望の標的に対する抗体分子の親和性を低下させるため、変動させることができる。別の態様において、抗体を所望の標的に結合させるための時間の長さを短縮することができる。別の態様において、抗体-標的相互作用アッセイに競合的結合工程を追加することができる。例えば、まず、抗体を所望の固定化標的と結合させることができる。次いで、抗原に対する最も低い親和性を有する抗体が、固定化標的から溶出し、改善された抗原結合親和性を有する抗体の濃縮がもたらされるよう、固定化標的との結合について競合するよう機能する、特定の濃度の非固定化標的を、添加することができる。一態様において、アッセイに添加される非固定化標的の濃度を増加させることにより、アッセイ条件のストリンジェンシーをさらに増加させることができる。
【０３０１】
スクリーニング法は、改善された標的結合を有する1種以上の抗体を濃縮するため、複数回の選択を含んでいてもよい。一つの態様において、選択の各回において、当技術分野において認識されている方法を使用して、さらなるアミノ酸変異を抗体へ導入することができる。別の態様において、選択の各回において、所望の標的に対する増加した親和性を有する抗体を選択するため、所望の標的との結合のストリンジェンシーを増加させることができる。
【０３０２】
スクリーニング法には、インビトロ翻訳系の成分からのRNA-抗体融合タンパク質の精製が含まれ得る。これは、任意の当技術分野において認識されている分離法を使用して、達成され得る。一つの態様において、RNA-抗体融合タンパク質は、ポリデオキシチミジン（ポリdT）樹脂を使用したクロマトグラフィにより分離され得る。別の態様において、RNA-抗体融合タンパク質は、RNA-抗体融合タンパク質の抗体成分に存在するエピトープに特異的な抗体を使用したクロマトグラフィにより分離され得る。一態様において、エピトープは、RNA-抗体融合タンパク質の抗体成分のアミノ酸配列に、例えば、N末端、C末端、または可変領域間リンカーにおいて、組み入れられたアミノ酸配列タグ、例えば、FLAGタグまたはHAタグであり得る。
【０３０３】
ライブラリーからの抗体の選択には、固定化標的分子の使用が含まれ得る。一つの態様において、標的分子を、固体基質、例えば、アガロースビーズに直接連結させることができる。別の態様において、標的分子を、まず、修飾し、例えば、ビオチン化し、その修飾を介して、修飾された標的分子を、固体支持体、例えば、ストレプトアビジン-M280、ニュートラビジン-M280、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne、NA-MyOne、SA-アガロース、およびNA-アガロースと結合させることができる。
【０３０４】
いくつかの局面において、特定の標識された抗原に対する反応性を有する形質芽球またはその他のB系列細胞のみを単一細胞分取するため、蛍光標識された抗原が使用される。他の局面において、単一細胞分取を行う前に、特定の標識された抗原に対する反応性を有する形質芽球またはその他のB系列細胞を濃縮するため、蛍光標識された抗原が使用される。いくつかの局面において、B系列細胞を同定し分取するため、蛍光原性または色素原性の分子が使用され得る。いくつかの局面において、所望の形質芽球またはその他のB系列細胞は、磁気活性化細胞分取（magnetic-activated cell sorting）（MACS）によって単離されてもよいし、さらにはパニングによって単離されてもよい。結果として得られる産物は、一般に、特別に関心対象の細胞型、微生物、細菌、マイコバクテリア、寄生虫、およびウイルスを枯渇させるための、癌抗原、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、分泌型タンパク質、細胞表面抗原、およびその他の抗原を含むが、これらに限定されない、多様な標的に対するモノクローナル抗体である。
【０３０５】
コンピューターによる実行
いくつかの局面において、本明細書に記載された1種以上の方法は、コンピューター上で実行され得る。一つの態様において、コンピューターは、チップセットと連結された少なくとも1個のプロセッサーを含む。チップセットには、メモリー、記憶デバイス、キーボード、グラフィックアダプター、ポインティングデバイス、およびネットワークアダプターも連結される。ディスプレイがグラフィックアダプターに連結される。一つの態様において、チップセットの機能性は、メモリーコントローラーハブおよびI/Oコントローラーハブによって提供される。別の態様において、メモリーは、チップセットではなくプロセッサーに直接連結される。
【０３０６】
記憶デバイスは、ハードドライブ、コンパクトディスクリードオンリーメモリー（CD-ROM）、DVD、またはソリッドステートメモリーデバイスのような、データを保持することができる任意のデバイスである。メモリーは、プロセッサーが使用するインストラクションおよびデータを保持する。ポインティングデバイスは、マウス、トラックボール、またはその他の型のポインティングデバイスであり得、データをコンピューター系に入力するため、キーボードと組み合わせて使用される。グラフィックアダプターは、ディスプレイ上に画像およびその他の情報を表示する。ネットワークアダプターは、コンピューター系を構内ネットワークまたは広域ネットワークに連結する。
【０３０７】
当技術分野において公知であるように、コンピューターは、以前に記載されたものとは異なるかつ／または他のコンポーネントを有していてもよい。さらに、コンピューターは、ある種のコンポーネントを欠いていてもよい。さらに、記憶デバイスは、ローカルかつ／またはコンピューターからリモートであってもよい（ストレージエリアネットワーク（SAN）において具体化されるような）。
【０３０８】
当技術分野において公知であるように、コンピューターは、本明細書に記載された機能性を提供するため、コンピュータープログラムモジュールを実行するために適応している。本明細書において使用されるように、「モジュール」という用語は、指定された機能性を提供するために利用されるコンピュータープログラムロジックをさす。従って、モジュールは、ハードウェア、ファームウェア、および／またはソフトウェアにおいて実行され得る。一つの態様において、プログラムモジュールは、記憶デバイスに記憶され、メモリーにロードされ、プロセッサーにより実行される。
【０３０９】
本明細書に記載された実体の態様には、本明細書に記載されたもの以外のかつ／または異なるモジュールが含まれ得る。さらに、モジュールに帰属する機能性は、他の態様において、他のまたは異なるモジュールによって実施されてもよい。さらに、この説明は、明確および簡便のため、「モジュール」という用語を時に省略する。
【０３１０】
キット
キットは、本明細書に開示されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、および／または宿主細胞、ならびに使用説明を含み得る。キットは、本明細書に開示されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、および／または宿主細胞、1種以上の対照、ならびに当技術分野において周知の様々な緩衝液、試薬、酵素、およびその他の標準的な成分を、適当なコンテナに含み得る。
【０３１１】
コンテナには、1個以上のウェルを含むプレート上の少なくとも1個のウェルが含まれ得る。コンテナには、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、および／または宿主細胞を置くことができ、いくつかの例において、適当に分注することができる、少なくとも1個のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはその他のコンテナ手段が含まれ得る。付加的な成分が提供される場合、キットは、この成分を置くことができる付加的なコンテナを含有していてもよい。キットは、市販のため密封された、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、および／または宿主細胞を含有するための手段、ならびにその他の試薬コンテナも含み得る。そのようなコンテナには、所望のバイアルを保持することができる射出成形または吹込成形されたプラスチックコンテナが含まれ得る。コンテナは、使用説明および／または警告を含むラベルを含み得る。
【実施例】
【０３１２】
実施例は、単なる例示目的のために提示され、決して、本発明のいかなる態様の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して、正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は当然考慮されるべきである。
【０３１３】
別様に指示されていない限り、種々の方法は、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術、および薬理学の従来の方法を当技術分野の技術の範囲内で採用することができる。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins： Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)；Sambrook, et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania： Mack Publishing Company, 1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)；Current Protocols in Molecular Biology (2002- ； Wiley； Online ISBN： 9780471142720； DOI： 10.1002/04711142727)；Current Protocols in Immunology (2001- ； Wiley； Online ISBN： 9780471142737； DOI： 10.1002/0471142735)を参照されたい。
【０３１４】
概略的な材料および方法
血液採取およびPBMCの単離
すべてのヒトサンプルは、インフォームド・コンセントの後にかつ治験審査委員会（IRB）によって認可されたヒト対象プロトコールの下で採取された。血液は、ヘパリンチューブ（Beckton Dickinson and Company、カタログ#BD366664）またはCPTチューブ（Beckton Dickinson and Company、カタログBD362761）内に採取された。ヘパリンチューブの処理には、1mlの血液を微量遠心チューブに移し、12,000rpmで3分間スピンダウンし、血漿を採取し、-80℃で凍結し（抗体反応性について後で試験するために）、残りの血液をFicollに積層し、ヘパリンチューブに対してSX4750 Swinging Bucket Rotor を用いてBeckman Coulter Allegra X-15R卓上遠心機で、最小加速でかつブレーキを使用せずに、室温で20分間遠心分離し、末梢血単核細胞（PBMC）層を採取した。あるいは、CPTチューブを、最小加速でかつブレーキを使用せずに、室温で1,500gで20分間直接遠心分離し、PMBC層を採取した。次いで、採取したPBMCを使用前にPBSで2回洗浄した。
【０３１５】
PBMCを、将来の使用、およびB細胞、メモリーB細胞、形質芽球、形質細胞、または他のB細胞集団の単離のために凍結してもよい。PBMCを凍結するための一つの方法は、クライオバイアル内で90％ウシ胎仔血清（FBS）および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）中にPBMCを再懸濁する工程、次いでバイアル内に含有された細胞をMr. Frosty（Sigma C1562-1EA）内で-80℃にて一晩凍結させる工程を伴う。次いで、凍結した細胞のバイアルを長期保存のために液体窒素中に移しておき、個々のB細胞の単離のためにおよび対合した免疫グロブリン遺伝子についての高性能配列決定のために、後日融解させることができる。融解した細胞は、細胞凝集を防ぐために、1回目の選別の終わりまで、通常25μg/ml（Sigma D4513）の過剰のDNase Iを含有している培地中でインキュベートした。
【０３１６】
細胞および細胞亜集団の単離および濃縮
形質芽球。いくつかのサンプルに対して、まず、改変したPlasma Cells Isolation Kit II（Miltenyi 130-093-628）を用いることによって、PBMCを形質芽球について濃縮した。これは任意の工程である。これは、後の選別に対してより少量の総細胞をもたらし、より短い選別時間につながった。これは、複数のサンプルを同日に、単一細胞に選別する必要がある場合に主に使用された。異なるキットを用いて、異なるB細胞集団を濃縮することも可能である（下記を参照されたい）。5×107個のPBMCごとに、細胞を200μLの氷冷MACSバッファー（0.5％FBSを含むPBS）中に懸濁した。50μLの非形質細胞ビオチン抗体カクテルを添加し、細胞を冷蔵庫内（4℃）で10分間インキュベートした。100μLのMACSバッファー、100μLの非形質細胞マイクロビーズカクテル、および50μLのCD56マイクロビーズを添加し、冷蔵庫内でさらに10分間インキュベートした。次いで、細胞を7mLのMACSバッファーで洗浄し、4℃にて300gで5分間遠心分離し、500μLのMACSバッファー中に再懸濁し、磁場中で平衡化LSカラムにかけた。カラムを4×3mLのMACSバッファーで洗浄し、濃縮した細胞は陰性画分にあった。
【０３１７】
メモリーB細胞。CD19＋マイクロビーズ（Miltenyi 130-050-301）およびCD27＋マイクロビーズ（130-051-601）を用いて、細胞の選別前にメモリーB細胞を濃縮し、選別時間を短縮してもよい。Memory B-cell isolation kit（Miltenyi 130-093-546）等の他の濃縮方法を、それらがCD19＋CD27＋細胞を濃縮するという条件で用いてもよい。5×107個のPBMCごとに、300μLの氷冷MACSバッファーを再懸濁のために用いる。次いで、100μLのCD19マイクロビーズおよび100μLのCD27マイクロビーズを添加し、サンプルを4℃で15分間インキュベートする。次いで、細胞を7mLのMACSバッファーで洗浄し、4℃にて300gで5分間遠心分離し、500μLのMACSバッファー中に再懸濁する。次いで、細胞を磁場中で平衡化LSカラムに通し、2×3mLのMACSバッファーで洗浄する。次いで、LSカラムを磁場から取り出し、細胞を5mLのMACSバッファーで洗い出して、濃縮した細胞を溶出する。
【０３１８】
総B細胞。CD19＋マイクロビーズ（Miltenyi 130-050-301）を用いて、細胞の選別前に総B細胞を濃縮し、例えば選別時間を短縮してよい。他の濃縮方法を、それらがCD19＋細胞を濃縮するという条件で用いてもよい。5×107個のPBMCごとに、400μLの氷冷MACSバッファー中に細胞を再懸濁する。100μLのCD19＋マイクロビーズを添加し、冷蔵庫内（4℃）で15分間インキュベートする。次いで、細胞を7mLのMACSバッファーで洗浄し、4℃にて300gで5分間遠心分離し、500μLのMACSバッファー中に再懸濁する。次いで、細胞を磁場中で平衡化LSカラムに通し、2×3mLのMACSバッファーで洗浄する。次いで、LSカラムを磁場から取り出し、細胞を5mLのMACSバッファーで溶出し、濃縮した細胞を得る。
【０３１９】
他の細胞タイプ。必須というわけではないが、所望の細胞集団のMACS濃縮は、選別時間を短縮することができる。形質細胞、他のB細胞集団、および非B細胞集団を含む他の細胞集団も、適切な試薬を用いたMACSまたは他のシステムを用いて濃縮してよい。例えば、CD3＋マイクロビーズを用いて総T細胞を濃縮してよく、CD8＋およびCD4＋マイクロビーズを用いて、それぞれエフェクターT細胞およびヘルパーT細胞を単離してよい。CD45ROマイクロビーズを用いてメモリーT細胞を単離してよく、CD8＋またはCD4＋ビーズと併用して、それぞれメモリーエフェクターまたはメモリーヘルパーT細胞を単離してよい。
【０３２０】
単一細胞選別
MACS濃縮は選別に必要でないが、形質芽球に対するMACS濃縮を実施して、選別時間を短縮してもよい。PBMCがMACS濃縮を受けている場合、濃縮されていないPBMCのアリコート（約100万個の細胞）も並行して分析し、サンプル中のベースラインの形質芽球のパーセンテージを決定することが可能である。形質芽球を選別するために、暗所にて氷上で20分間、50μLのFACSバッファー（PBSまたは2％FBSを含むHBSS）中で、メーカー推奨の容量のCD3-V450（BD 560365）、IgA-FITC（AbD Serotec STAR142F）、IgM-FITC（AbD Serotec STAR146F）またはIgM-PE（AbD Serotec STAR146PE）、CD20-PerCP-Cy5.5（BD 340955）、CD38-PE-Cy7（BD 335808）、CD19-APC（BD 340437）、およびCD27-APC-H7（BD 560222）で細胞を染色した。いくつかの細胞は、代わりに、IgM-FITCとともにIgG-PE（BD 555787）、CD138-PE（eBioscience 12-1389-42）、またはHLA-DR-PE（BD 555812）で染色されてもよい。形質芽球、メモリーおよびナイーブB細胞の同時選別のために、以下の染色スキームを用いた：IgD-FITC（Biolegend 348205）、IgG-PE（BD 555787）、CD20-PerCP-Cy5.5、CD38-PECy7、IgM-APC（BD 551062）、CD27-APC-H7、IgA-ビオチン（AbD Serotec 205008）、その後にストレプトアビジン-eFluor710（eBioscience 49-4317-82）およびCD19-BV421（Biolegend 302233）が続く。メモリーB細胞は、CD19＋CD27＋IgG＋またはCD19＋CD20＋IgG＋のいずれかとしても選別されており、ナイーブB細胞は、CD19＋IgD＋IgM＋として選別されている。IgA＋形質芽球も選別されており、CD19＋CD20−CD27＋CD38＋＋IgA＋IgM−として定義される。細胞表面マーカーを用いてB細胞または他の細胞集団を表現型で同定可能であり、集団を単一細胞に選別できるのであれば、他の細胞表面マーカーを用いてもよい。下記を参照されたい。次いで、細胞を2mLのFACSバッファーで1回洗浄し、FACSに適した容量で再懸濁した。まず、細胞をBD Aria IIで5mL丸底チューブ内に選別した。典型的には、1回目の選別から80％超の純度が達成された。2mM dNTP（NEB N0447L）、5μMオリゴ(dT)20VN、およびRNase阻害剤である1単位のRibolock（Fermentas EO0384）を含有している6.65μLの低張バッファー（10mM Tris-HCl pH7.6）を含有している96ウェルPCRプレートの1段目の11個の列に単一細胞を選別した。陰性対照として、最後の列を細胞を欠いているままにした。IgG＋形質芽球に対して、ゲーティング（細胞の選別）戦略には、CD19＋CD20−CD27＋CD38＋＋IgA−IgM−を用いた。選別したプレートを、アルミニウム製プレートシーラー（Axygen PCR-AS-600）でシールし、直ちにドライアイスで凍結させ、-80℃で保存した。
【０３２１】
単一細胞選別のゲーティング戦略
B細胞。B細胞に対して、ゲーティング手法は、以下のマーカー：IgM、IgG、IgA、IgD、CD19、またはCD20のうちの1つまたは複数に関する選別を含む。総IgG＋B細胞に対して、ゲーティング手法は、IgG＋に関する選別を含む。総IgA＋B細胞に対して、ゲーティング手法は、IgA＋に関する選別を含む。総IgM＋B細胞に対して、ゲーティング手法は、IgM＋に関する選別を含む。
【０３２２】
活性化B細胞。活性化B細胞には、それらの膜抗原受容体のその同種抗原への結合を介して刺激されているB細胞、および／または同じ高分子抗原に由来するエピトープを認識するT細胞からのT細胞支援を受けているB細胞が含まれる。細胞サイズの増大（例えば、「芽球B細胞」；下記を参照されたい）、1種もしくは複数種の細胞表面マーカーの発現、1種もしくは複数種の細胞内マーカーの発現、1種もしくは複数種の転写因子の発現、細胞周期の休止（G0）期から出ること、細胞周期を進行させること、サイトカインもしくは他の因子の産生、および／または1種もしくは複数種のある特定の細胞表面マーカー、細胞内マーカー、転写因子、もしくは他の因子の下方調節を含む多様な特性によって、活性化B細胞を同定することができる。活性化B細胞を同定する一つの方法は、CD19または免疫グロブリン等のB細胞マーカーの検出を、細胞のサイズもしくは体積の増大、細胞表面活性化マーカーCD69、または細胞透過性アクリジンオレンジによるDNA染色もしくは別の細胞周期分析に基づく細胞周期の進行等の活性化のマーカーと組み合わせることである。
【０３２３】
芽球B細胞。「芽球B細胞」とは、休止B細胞と比較して活性化しているかつサイズが増大しているB細胞である。芽球B細胞には、形質芽球集団ならびに活性化B細胞の他の集団が含まれ、芽球B細胞は、物理的に休止B細胞よりもサイズが大きい。細胞の直径、細胞の体積、電気インピーダンス、FSC、FSCパルスの積分（エリア）（FSC-A）、FSCの高さ（FSC-H）、前方散乱パルスの幅（FCS-W）、側方散乱（SSC）、側方散乱パルスの領域（SSC-A）、側方散乱の高さ（SSC-H）、側方散乱の幅（SSC-W）、自己蛍光、および／または細胞サイズの他の測定法に基づき、それらが物理的により大きいことに基づくB細胞のゲーティング（選択）を含むいくつかの異なる手法を用いて、芽球B細胞を単一細胞に選別することができる。
【０３２４】
フローサイトメトリーにおいて、前方散乱（FSC）は、細胞の流れに沿った光線を用いて測定され、各細胞の比例的サイズおよび直径に関する情報を提供する。FSCを用いて、休止B細胞のFSC中央値よりも大きいFSC、例えば休止B細胞よりも5％大きい、休止B細胞よりも10％大きい、休止B細胞よりも15％大きい、休止B細胞よりも20％大きい、休止B細胞よりも30％大きい、休止B細胞よりも40％大きい、休止B細胞よりも50％大きい、休止B細胞よりも60％大きいFSC-AまたはFSC-Hを有するB細胞を選択することができる。特定サイズの校正ビーズを分析することによって、FSCを用いて、校正ビーズと比較したB細胞の相対的サイズを決定することができる。そうすることによって、特異的にゲートをかけることができ、それにより約8μm、＞8μm、＞9μm、＞10μm、＞11μm、＞12μm、＞13μm、＞14μm、＞15μm、＞16μm、＞17μm、＞18μm、＞19μm、または＞20μmの直径を有するB細胞を選択することができる。
【０３２５】
細胞サイズの別の測定法は、細胞体積である。細胞体積に対する「究極の判断基準」は、電子的測定に基づくCoulterの原理を用いる（Tzur et al, PLoS ONE, 6(1)： el6053. doi：10.1371/journal.pone.0016053, 2011）。インピーダンスによって細胞体積を測定する装置において、液滴の帯電および偏向による選別の方法が最初に用いられたが、現在市販されているフローサイトメーターは、光学的な測定を行うだけである。FSC測定は、粒子と流体との間の屈折率によって影響を受け得るが、細胞サイズを査定するために、FSC測定、とくにFSC-A（FSC積分エリア）が一般に用いられる（Tzur et al, PLoS ONE, 6(1)： el6053. doi：10.1371/journal.pone.0016053, 2011）。FSC-W、SSC、および450/50-A自己蛍光を含む光学的パラメーターを組み合わせることによって、体積予測が改善され得ることを示している者もいる（Tzur et al, PLoS ONE, 6(1)： el6053. doi：10.1371/journal.pone.0016053, 2011）。
【０３２６】
例えば、サイズの増大に基づく活性化B細胞の選択は、CD19等のマーカーを用いてB細胞を同定すること、およびFSCまたはFSC-Aによってサイズを査定することによって達成され得る。サイズの査定のための他のB細胞マーカーおよび／またはパラメーターは、本明細書において記載されている。
【０３２７】
形質芽球。形質芽球の単離に対して、ゲーティング手法は、CD19＋CD38＋＋B細胞に対する選別を含む。IgG＋形質芽球の単離に対して、ゲーティング手法は、CD19＋CD38＋＋IgA−IgM−B細胞に対する選別を含む。IgA＋形質芽球の単離に対して、ゲーティング手法は、CD19＋CD38＋＋IgA＋B細胞に対する選別を含む。IgM＋形質芽球の単離に対して、ゲーティング手法は、CD19＋CD38＋＋IgM＋B細胞に対する選別を含む。加えて、他のゲーティング戦略を用いて、本明細書において記載される方法を実施するのに十分な数の形質芽球を単離することができる。また、以下のマーカー発現パターン：CD19low／＋、CD20low／−、CD27＋、およびCD38＋＋を用いて、形質芽球を単離した。これらすべてのマーカーの使用は、概して単一細胞選別から最も純度の高い形質芽球集団をもたらすが、上記マーカーのすべてを用いる必要があるわけではない。例えば、以下のゲーティング戦略：より大きな細胞に対する高い前方散乱（FSChi）、FSChiCD19low細胞、FSChiかつCD27＋、CD38＋＋、またはCD20−細胞を用いて、形質芽球を単離してもよい。これらのマーカーまたは他のB細胞と形質芽球とを区別し得ることが見出されている他のマーカーのいずれかの組み合わせは、選別された形質芽球の純度を一般的に増大させるが、しかしながら、上記マーカー（FSChiを含む）のいずれか1つは、より低い純度ではあるが、単独で他のB細胞と形質芽球とを区別することができる。
【０３２８】
メモリーB細胞に対して。IgG＋メモリーB細胞に対して、ゲーティング手法は、CD19＋CD27＋IgG＋またはCD19＋CD20＋IgG＋に対する選別を含む。IgA＋メモリーB細胞に対して、ゲーティング戦略は、CD19＋CD27＋IgA＋またはCD19＋CD20＋IgA＋を含む。IgM＋メモリーB細胞に対して、ゲーティング戦略は、CD19＋CD27＋IgM＋またはCD19＋CD20＋IgM＋を含む。
【０３２９】
他の細胞タイプに対して。B細胞、T細胞、または他の細胞集団が、細胞マーカーを用いて表現型で同定可能である限り、それを単一細胞選別することができる。例えば、T細胞はCD3＋またはTCR＋として同定され得、ナイーブT細胞はCD3＋CD45RA＋として同定され得、メモリーT細胞はCD3＋CD45RO＋として同定され得る。エフェクターおよびヘルパーT細胞は、それぞれCD3＋CD8＋およびCD3＋CD4＋として同定され得る。メモリーヘルパーT細胞に対して、CD3＋CD4＋CD45RO＋等のマーカーの組み合わせを用いることによって、細胞集団をさらに細分することができる。
【０３３０】
単一B細胞由来の対合した軽鎖および重鎖免疫グロブリン遺伝子の配列決定
アダプター分子を用いた逆転写
単一細胞を選別したプレートを氷上で融解し、使用前に短時間遠心分離した。プレートを、サーマルサイクラーにおいて55℃3分間、42℃2分間、および4℃無期限でインキュベートした。プレートを再度短時間遠心分離し、エアロゾルの形成を避けるために慎重に開封した。1μLの10μM溶液の適切なアダプター分子（各アダプター分子は、概してサンプル同定領域（サンプルID）を有する）を各ウェルに添加し、すべての陰性対照ウェル（RNA保存バッファーのみ、または非B細胞を含有している）は同一のアダプター分子を受理した。0.75μLのH2O、1μLの10×M-MuLV RTバッファー（NEB B0253S）、0.6μLの50mM MgCl2を含有している2.35μLの混合物、0.25μLのRibolock（40U/μL）、および0.125μLのSuperscript III（200U/μL）（Invitrogen 18080-085）を添加し、ピペッティングによって混合した。プレートを短時間遠心分離し、サーマルプレートシェーカーを用いて42℃で120分間〜8時間インキュベートし、次いで-20℃で保管した。反応後、すべてのウェルからのRT産物を微量遠心チューブにプールした。次いで、プールしたRT産物を、約0.1％の8-ヒドロキシクロロキンを含むフェノール-クロロホルム-イソプロピルアルコール（Sigma 77617）で抽出し、次いでgel-lock phaseチューブ（5 PRIME 2302820）でのクロロホルム抽出で抽出した。次いで、Amicon Ultra-0.5 30kDa（Millipore UFC503096）またはUltra-0.5 100kDa（Millipore UFC510096）を用いた14000gでの5分間のスピン、それに続くTE（1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl pH7.6）を用いた14000gでの5分間のスピン、およびEB（Qiagen 19086）を用いた14000gでの最後の5分間のスピンによって、RT産物を濃縮および脱塩した。Amicon Ultraカラムを新しい遠心分離チューブに反転させ、1000gで2分間遠心分離することによって、RT産物を溶出した。この時点で、RT産物を-20℃または-80℃で保管した。
【０３３１】
タッチダウンPCR
454シークエンシングラン1および2に対して、タッチダウンPCR法を以下のように用いた。PCRラン3および4におけるいくつかのサンプルに対して、PCR法を変更し、対合した重鎖および軽鎖の数の増大につなげた。この変更は、以下の「非タッチダウンPCR」のサブセクションに詳述されている。
【０３３２】
第1のPCRおよび第2の、ネステッドPCRの両方に対して、提供されているGCバッファー中でPhusion Hot Start II DNA polymerase（NEB F-549L）を用いた。IgGに対する、プライマーおよびアダプター分子を表1に示す。サンプルID配列を表2に示す。プレートID配列を表3に示す。図3および9も参照されたい。反応条件には、25μLの最終容量中に、1.8mMのMgCl2最終濃度、200μM dNTP、すべてのプライマーに対して0.2μM、0.2UのPhusionポリメラーゼ、添加物として種々の量のDMSO、および2μLの鋳型が含まれた。第1のPCRについて、λおよびκ軽鎖、ならびにγ重鎖を異なるウェル中で増幅させており、DMSOをそれぞれ8％、5％、および10％の最終濃度で用いる。第1のPCRに用いた順方向プライマーは、FWロングプライマー1およびFWショートプライマー1であった。FWロングプライマー1は、アンプリコン領域（アンプリコン）の5'末端にプレート同定領域（プレートID）を付加するため、異なるプレートIDを含有しているFWロングプライマー1が、異なるサンプルに添加された。κ、λ、およびγ鎖を増幅するために用いた遺伝子特異的逆方向プライマーは、それぞれκGSP1、λGSP1、およびγGSP1であった。第1のPCRに対するサイクル条件には、98℃30秒間での初期変性工程、それに続く98℃10秒間、72℃25秒間の2サイクル；後続のアニーリング工程に対して0.5℃の降下を有する、98℃10秒間、71.5℃〜68.5℃15秒間、および72℃20秒間の7タッチダウンサイクル；98℃10秒間、68℃15秒間、および72℃20秒間の30サイクル；それに続く72℃5分間での最終伸長；ならびに4℃無期限での保持が含まれた。第1のPCRからの産物をTE中に100倍希釈し、2μLを、第2の、ネステッドPCRに用いた。第2のPCRについて、すべてのサンプルにおいて添加物として5％DMSOを用いた。順方向プライマーはFWプライマー2であり、逆方向プライマーはRVプライマー2およびGSPロングプライマー2であった。κGSPロングプライマー2、λGSPロングプライマー2、およびγロングプライマー2を用いて、それらそれぞれのアンプリコンを増幅した。GSPロングプライマー2もアンプリコンの3'末端にプレートIDを付加するため、プレート特異的プレートIDを有する異なるGSPロングプライマー2が、プールされた各プレートサンプルに添加された。第2の、ネステッドPCRに対するサイクル条件には、98℃30秒間の初期変性工程、98℃10秒間、67℃15秒間、および72℃20秒間の30〜40サイクル、それに続く72℃5分間の最終伸長、ならびに4℃無期限での保持が含まれた。
【０３３３】
非タッチダウンPCR
非タッチダウンPCRについて、別様に記述されていない限り、条件はタッチダウンPCRと同一であった。第1のPCRのサイクルパラメーターは、95℃5分間の初期変性、98℃30秒間、62℃30秒間、72℃30秒間の15〜25サイクル、72℃5分間の最終伸長、および4℃無期限での保持であった。第1のPCRは、3遺伝子すべての特異的逆方向プライマーであるκ、λ、およびγ定常領域逆方向プライマーを、それぞれ0.2、0.2、および0.24μMで併用した多重PCRであった。用いた他のすべてのプライマーは、タッチダウンPCRにおけるものと同じであった。遺伝子特異的プライマーは、タッチダウンPCRで用いたものであってよく、第1のPCRに適するように設計されたもののうちのいずれか1つであってもよい（表6）。DMSOを5％の最終濃度で用いており；0.1mg/mlのBSA（NEB B9001S）およびET-SSB（NEB M2401S）をPCR反応に1：100で添加してもよい。第1のPCRの間、80または90μlの総反応容量に4〜6μlのcDNA鋳型を用いた。各PCR1反応を8または9個の10μl反応物に分け、それぞれ異なるウェル中で起こした。PCR後に、第1のPCRを再度プールし、TE0.1中に100×で希釈し、2μlを第2のPCRに用いた。第2のPCRは、各遺伝子特異的プライマーに対する別々の反応であり（多重でない）、反応混合物は、以下の：第2のPCRに機能するように設計された遺伝子特異的定常領域プライマーのいずれかを用いてよく（表6）、プライマーをすべてにわたって0.2μMもしくは0.4μMのいずれかで用いた、または遺伝子特異的プライマーを0.2μMで用いかつ残りを0.4μMで用いたという点を除いて、タッチダウン第2のPCRと同一であった。0.1mg/ml BSAを反応に添加しており、ET-SSBも1：100で用いてよい。第2の半ネステッドPCRのサイクルパラメーターは、95℃5分間の初期変性、98℃30秒間、67℃30秒間、72℃30秒間の20〜35サイクル、72℃5分間の最終伸長、および4℃無期限での保持であった。非タッチダウンPCRについて、第1のPCRおよび第2のPCRに対する組み合わせたPCRサイクルの総数は、典型的には50〜60サイクルであった。PCRサイクルを受けているプールされた異なるウェルは、妥当な量のDNA産物（典型的には、1〜12ng/μl）を得るのに異なるサイクルの数を用いる傾向があるため、各第2のPCRに対して4種の異なるPCRサイクル、例えば23、26、30、および33サイクルを実施し、5μlを2％アガロースゲルで泳動し、比較した。PCR産物の量の定性的判定に基づき、第2のPCRサイクル数のうちの1種からのPCR産物のみを、454シークエンシングランの調製における各プールされたウェルの第2のPCRに用いた。
【０３３４】
ヒトにおける他の免疫グロブリン重鎖、マウスにおける免疫グロブリン重鎖および軽鎖、ならびにヒトおよびマウスにおけるTCR鎖のPCRについて、PCR条件は、第1のPCRが多重でないという点を除いて上記の非タッチダウンPCRのセクションと同一であり、各cDNAは個々に増幅される。表10および11における以下の3'プライマーを、PCR1および2に用いる。
【０３３５】
454 XLR70シークエンシングランのための調製
第1のおよび第2の454ランについて、454 Titaniumシークエンシングラン用の配列決定プライマー（それぞれ、Titanium Primer AおよびB）を、第1のPCRおよび第2の、ネステッドPCRの間、アンプリコンに添加した。5μLの各アンプリコンを、質量DNAラダー（Fermentas SM0383）とともにアガロースゲルで泳動し、画像を撮影し、バンド強度を分析し、AlphaFC Imagerソフトウェア（Cell Biosciences）で定量化した。κ、λ、およびγアンプリコンのそれぞれの5ngを別々にプールし、0.8％アガロースゲルで泳動し、GelGreen（Biotium 41005）で可視化した。適切なサイズ（κおよびλに対しては約600bp、ならびにγに対しては約750bp）のバンドを切り出し、わずかな改変を含むメーカーの指示書に従って、MinElute Gel Extraction kit（Qiagen 28606）を用いて精製した。要するに、アガロースゲルを加熱することなくQGバッファーに溶かし、さらなるQG洗浄工程を行う。PE洗浄バッファーによって5分間静置させ、その後スピンした。さらなるPE洗浄工程も実施した。サンプルを25μLのEBバッファーで溶出した。454での第2のランのために、DNA容量：ビーズ容量について1：0.65の比率を用いて、サンプルをSPRIビーズでも1回浄化した。DNA濃度をPicogreen DNA assay kit（Invitrogen P11496）で決定し、γ：κ：λのDNA濃度が2：1：1になるようにサンプルをプールした。プールしたサンプルは、＞0.5ng/μLの濃度であり、454シークエンシングのために454 DNAシークエンシング機器に送った。
【０３３６】
第3のおよび後の454シークエンシングランについて、プロトコールを変更した。アンプリコンをさらに別々にプールして、各PCR反応からのDNA量を標準化したが、メーカーの指示書に従って、まずSPRIビーズによるクリーンアップを行い、小さなDNA断片を除去した。アンプリコンを3％アガロースゲルで泳動し、適切なバンドを切り出し、以前のようにMinElute Gel Extraction kitを用いて精製した。その後、アンプリコンにSPRIビーズによるもう2ラウンドのクリーンアップを行い、さらにより小さなDNA断片を除去し、Picogreenで定量し、Nanodropで品質チェックをして、OD260/280比が＞1.8であることを確認し、1μlをゲルで泳動して、小さなDNA断片が存在しないことを確認した。λおよびκアンプリコンを1：1の比率でプールし、γをそのままで用いた。次いで、454の指示どおり、DNAを1×109コピーに希釈し、1cpbでのemPCRのために配列決定機器（Roche）に送り、picotiterプレートの一方の領域におけるγ重鎖およびもう一方の領域におけるプールされた軽鎖を配列決定した。
【０３３７】
454 XL＋シークエンシングランのための調製
現在のところ、454 XL＋シークエンシングランは、XLR70ランに用いられたLib-Aシークエンシングキットをサポートしていない。現在のところ、XL＋は、一方向配列決定であるLib-Lキットのみをサポートしている。本発明者らのプロトコールを適合させてXL＋シークエンシングを行うために、XLR70ランに対するプロトコールに従うが、ゲルによるクリーンアップ工程の後、各アンプリコンは（κ、λ、およびγ）は、Lib-L AおよびBアダプターにそれぞれ5サイクルの長さを付加した2種の別々のPCRを受けた。PCR条件は以下のとおりである：5×GCバッファーおよび最終濃度5％のDMSOとともに、Phusionポリメラーゼを用いる。プライマーを0.2μMで用いる。0.1mg/ml BSAを反応に添加する。PCRのサイクルパラメーターは、95℃5分間の初期変性、98℃30秒間、67℃30秒間、72℃30秒間の20〜35サイクル、72℃5分間の最終伸長、および4℃無期限での保持である。各アンプリコンに対して、2種のPCR：一方のPCRにおいて5LIB-LAおよび3LIB-LB、ならびにもう一方のPCRにおいて5LIB-LBおよび3LIB-LAを行う。各アンプリコンが、5'-LibA-アンプリコン-LibB-3'または5'-LibB-アンプリコン-LibA-3'のいずれかになるように、アダプターを添加する。これらのアンプリコンは、5'末端におけるLibA「A」または「B」アダプター（および3'末端における相当する「B」または「A」アダプター）のいずれかを有し、双方向配列決定が可能となる。次いで、新たなLib Aアダプターを有するアンプリコンは、3ラウンドのSPRIビーズによるクリーンアップを受け、その後XLR70ランに対するプロトコールに従って、DNAを定量かつ品質チェックし、その後それを1×109コピーに希釈し、1cpbでのemPCRおよび配列決定のために454シークエンシング機器（Roche）に送る。
【０３３８】
PacBioシークエンシングランのための調製
PacBioシークエンシングランについて、上記のタッチダウンPCRを採用した。「454 XLR70ランのための調製」に関する上記のセクションのとおり、DNAのプールおよびクリーンアップを行った。配列決定要件に十分なDNA（500ng）を得るために、最低1μgのDNAをゲルおよびSPRIクリーンアップのためにプールした。Picogreen定量および1×109への希釈は、それはPacBioシークエンシングに必要でないため、行われなかった。第2のPCRから不十分なDNAが得られた場合には、第2のPCRおよびプール工程を、十分なDNAが得られるまで繰り返した。最低500ngのクリーンアップDNAを、配列決定のためのPacBioシークエンシング機器に送った。
【０３３９】
他の配列決定手法
本明細書において開示される方法は、454またはPacBioシークエンシングに依存しない。λおよびκ軽鎖は約600bpであり、γ重鎖は約700bpである。ゆえに、一般的に所望されることは、順方向および逆方向の配列決定の読み取りが、軽鎖（LC）のおよそ600bpの配列（正確な配列の長さは5'非翻訳領域（UTR）の長さに依存する）および重鎖（HC）のおよそ700bpの配列の全体の再構築を可能にするのに十分なだけ重なり合うような、より長い配列決定の読み取りを有し得る能力である。したがって、少なくとも約350〜400bpの配列決定の読み取りをもたらし得、それによって配列のアセンブリに用いられる重複を達成し得る任意の配列決定技術を利用することができ、およそ600〜700＋bpの読み取りを可能にする配列決定技術は、順方向（Fw）プライマーだけを用いてシークエンスすること（5'末端からの配列決定）を可能にする。
【０３４０】
配列
上記のランに対する配列データを関連機器から受け取り、以下に記載されるように処理した。
【０３４１】
配列の命名
配列決定の読み取りに対応する配列表中の各配列、配列のアセンブリ、または配列からのアミノ酸翻訳は、識別子を有する。そのような各識別子は、ピリオド「．」によって分かれた9つのフィールドを有する。フィールドは1〜9の番号を付されており、以下の情報を与える。：
1．読み取りID。読み取りを判定するために用いられる配列決定技術に関連したソフトウェアによって割り当てられる読み取りID、または配列が生の読み取りでない場合には「NA」。
2．プレート番号。配列が関連付けされているプレート番号。対応する生物学的サンプル情報のために、表12（サンプルマッピングの表に対するプレート）を参照されたい。
3．サンプルID。配列が関連付けされているウェルを示すサンプルID。サンプルIDの数は、1、89も含めて1〜89の間である。サンプルIDとウェル名との間の対応のためには、表2を参照されたい。
4．ウェル名。配列が関連付けされているウェルを含有しているウェル名。ウェル名は、通常の96ウェルプレートの名称、例えばD07に対応する。ウェル名およびサンプルIDは、プレート上の特定のウェルを指定する同等の手段である。
5．コンティグID。コンティグIDは、既定のアセンブリおよび鎖タイプと、ウェルに関連付けされた異なる配列とを区別する。
6．プラットフォーム。プラットフォームのフィールドは、配列の由来となる配列決定技術を示す。プラットフォームに関して可能な値は、454、サンガー、およびPacBioである。
7．鎖タイプ。鎖タイプのフィールドは、配列が、重鎖抗体配列のセット、軽鎖抗体配列のセット、または重鎖および軽鎖抗体配列の両方を含有しているセットに関連しているかどうかを示す。可能な値は、「heavy」、「light」、または「CMB」である。
8．ランID。特定のプラットフォームでの読み取りのセットに対する識別子。
9．配列タイプ。配列のタイプ。可能値は、配列決定技術による生の読み取りに対する「生（raw）」、アセンブルされた読み取り（配列のアセンブリのセクションを参照されたい）に関して、「nb」、「urt」、「multim50」、「zerom50」、もしくは「pb」、または種々のntアセンブリコンセンサス配列に由来するアミノ酸配列に関して、「nb-aa」、「urt-aa」、「multim50-aa」、「zerom50-aa」、もしくは「サンガー-aa」である。
【０３４２】
分析のための配列の調製
454シークエンシングから産出されたデータを、454 GS FLXデータ分析ソフトウェアによって分析し、フィルターを通過した質の高い配列を戻した。454 GS FLXデータ分析ソフトウェアによって用いられたデフォルトのアンプリコンフィルターは厳密であるため、十分な長さの読み取りを得るためにはフィルターの厳密性を緩和する必要があり得る。一つの方法は、454技術会報APP No. 001-2010における提案に従うことである。アンプリコンフィルターの＜vfScanAllFlows＞を「TiOnly」から「False」へ変更することは、フィルターを通過した良質な配列の大幅な増大につながり得る。別のオプションは、＜vfTrimBackScaleFactor＞をより低い数字へ変更することである。454のラン1では標準的なショットガン処理を用い、ラン2では＜vfScanAllFlows＞を「False」へ変更し、ラン3および4では標準的なアンプリコンパイプライン処理を用いた。
【０３４３】
Pacific Biosciencesシークエンシングから産出されたデータを、関連する品質スコアを含むCircular Consensus SequenceとしてPacific Biosciencesから受け取った。
【０３４４】
ウェルへの配列の割り当て
サンプル由来のcDNAを、454またはPacific Biosciencesシークエンシング技術のいずれかを用いて配列決定した。読み取りは、その配列タイプが「生」である配列表中のものである。配列決定の読み取りを分析し、供給源のプレートおよびウェルに割り当てるかまたは破棄した。
【０３４５】
読み取りに対するプレートおよびウェルの割り当ては、定型的表現（regular expression）を用いて、観察された読み取り配列を可能性のあるプレート同定領域、ユニバーサルプライマー領域、およびサンプル同定領域の配列と比較することによってなされた。表13、14、および15に列挙された定型的表現を用いて、3つの段階で比較を行った。
【０３４６】
段階1は、可能性のあるプレート同定領域の分析であって、表13における「プレート同定領域の定型的表現」の欄に列挙された定型的表現のすべてに対して読み取りがチェックされ、配列の最初のヌクレオチドから合致が始まることを必要とした。合致が見出されなかった場合、読み取りを破棄し、プレート／ウェルの割り当てを、もしあれば、次の利用可能な読み取りを用いて処理を継続した。合致が見出された場合、配列に、そのプレートIDとして「プレートID」の欄から対応するIDを割り当てた。プレートの定型的表現に合致する読み取りのヌクレオチドを、後の照合段階の間およびアセンブリの間の使用のために記録した。
【０３４７】
段階2は、ユニバーサルプライマー領域の分析であって、「ユニバーサルプライマーの定型的表現」である：
0005998203.tif 000024
に対して読み取りがチェックされ、読み取りの合致が、プレートの定型的表現に合致する最後の読み取りヌクレオチドに続いて最初のヌクレオチドから始まることを必要とした。読み取りがユニバーサルプライマーの定型的表現に合致しなかった場合、読み取りを破棄し、プレート／ウェルの割り当てを、もしあれば、次の利用可能な読み取りを用いて処理を継続した。そうでなければ、ユニバーサルプライマーの定型的表現に合致する読み取りのヌクレオチドを、後の照合段階の間およびアセンブリの間の使用のために記録した。
【０３４８】
段階3は、可能性のあるサンプル同定領域の分析であって、表14における「サンプル同定領域の定型的表現」の欄に列挙された定型的表現のすべてに対して読み取りがチェックされ、合致が、ユニバーサルプライマーの定型的表現に合致する最後の読み取りヌクレオチドに続いて最初のヌクレオチドから始まることを必要とした。合致が見出されなかった場合、読み取りを破棄し、プレート／ウェルの割り当てを、もしあれば、次の利用可能な読み取りを用いて処理を継続した。合致が見出され、かつサンプルIDの欄が1つの識別子のみを含有していた場合、読み取りのサンプルIDを、サンプルIDの欄に見出されたIDであるように割り当てた。サンプルIDの欄が1つを上回る識別子を含有していた場合、それらの識別子を「サンプルID候補」として見なした。次いで、表15の「サンプルID」の欄における対応するサンプルIDのうちの少なくとも一つがサンプルID候補に合致する、表15の「サンプル同定領域の定型的表現」の欄に列挙された定型的表現のすべてに対して、読み取りが順次チェックされた。読み取りが定型的表現に合致し、かつ合致が、ユニバーサルプライマーの定型的表現に合致する最後の読み取りヌクレオチドの後の最初のヌクレオチドから始まる場合、サンプルID候補からの右端の識別子を読み取りのサンプルIDとして割り当てた。そうでなければ、右端の識別子をサンプルID候補のリストから削除し、いずれかの合致が見出されるまでサンプルID候補のより小規模なリストを用いて処理を繰り返し、または表15における定型的表現のリスト中に合致する定型的表現が見出されない場合には、最後のサンプルID候補（すなわち、サンプルID候補の元のリストにおける左端）を読み取りに対するサンプルIDとして割り当てた。
【０３４９】
プレートIDおよびサンプルIDの割り当て処理の間に破棄された読み取りは、配列表に含めなかった。
【０３５０】
配列のアセンブリ
ウェルと関連付けしたサンプルIDに割り当てたすべての配列読み取りをアセンブルして、コンセンサス配列を見いだした。これらのコンセンサス配列は、選別された細胞において発現した重鎖および軽鎖のmRNA配列に相当する。
【０３５１】
Newbler 2.5（ラン1および2）、ならびに他の配列に対してNewblerバージョン2.6および／またはMiraバージョン3.4.0を用いて、配列をアセンブルした。
【０３５２】
「454」のプラットフォームフィールド、「混合（mixed）」の鎖タイプのフィールド、「1」または「2」のランID、および「nb」の配列タイプを有するリスト中の配列は、Newblerを用いたアセンブリから生じるコンティグである。これらの配列をアセンブルするために、各ヌクレオチドに対する配列および品質スコアの両方を含有している、454シークエンシングからのsff出力ファイルを、Biopythonパッケージおよび上記に記載されるそれらの化合物バーコード（サンプルID＋プレートID）に従って細分された配列を用いて、Python内に読み取り、別々のsffファイルに出力した。次いで、これらのファイルを、sfffile（GS FLXデータ分析ソフトウェアによって提供される）によって、「-force」、「-cdna」、および「-urt」のオプションを用いた、GS FLXデータ分析ソフトウェア一式に提供されている配列アセンブラであるNewblerによって理解されるファイル見出しを有するsffファイルに再解析（reparse）した。次いで、Newblerによって、順方向の読み取りを共有の化合物バーコードとアセンブルした。逆方向の読み取りは3'プレートIDのみを有するため、異なる細胞由来の順方向および逆方向配列の読み取りの間で配列アセンブリが起こり得る可能性がある。この潜在的な課題を回避するために、まず、アセンブルされた順方向およびアセンブルされていない逆方向の読み取りの両方の重鎖および軽鎖V(D)J使用法を、HighV-QUEST（http：//imgt.cines.fr/HighV-QUEST/index.action）を用いて同定することができる。次いで、配列をそれらのV(D)J使用法に従ってさらにグループ化し、その後、同じV(D)J使用法を共有するアセンブルされた1種の順方向の読み取りおよび逆方向の読み取りを用いてNewblerで再度アセンブルすることができる。これを、アセンブルされたすべての順方向の読み取りに対して繰り返すことができる。ヌクレオチドのミスマッチに寛容であるために配列アセンブリを行うこともでき、それによって同じV(D)J使用法を共有する異なる細胞由来の順方向および逆方向の読み取りのアセンブリを防ぐことができる。このように、異なる細胞由来の非常に類似した配列間の逆方向の読み取りの不適切な配列アセンブリを大幅に避けることができる。
【０３５３】
「454」のプラットフォームフィールド、「heavy」または「light」の鎖タイプのフィールド、「3」または「4」のランID、および「nb」の配列タイプを有するリスト中の配列は、454読み取りのアセンブリから生じるコンティグであり、コマンドライン：runAssembly -cdna - o output seqs.fastaqであって、seqs.fastqが単一ウェルのFastQフォーマットに編集された読み取りを含有したこのコマンドラインでNewblerを実行する。
【０３５４】
Newblerが正確に1種の重鎖コンティグまたは正確に1種の軽鎖コンティグを生み出さない、ランID 3またはランID 4の読み取りに対する任意のウェルを、miraでアセンブルすることによって再分析した。「454」のプラットフォームフィールド、「heavy」または「light」の鎖タイプのフィールド、「3」または「4」のランID、および「multim50」または「zerom50」の配列タイプを有するリスト中の配列は、これらのアセンブリから生じるコンティグであり、このコマンドライン：mira --project=seqs -- job=denovo,est,accurate,454 454_SETTINGS -ED：ace=yes -AL：egp=no -CL：pvlc=yes --fastq - notraceinfoでmiraを実行する。
【０３５５】
seqs_in.454.fastqと名付けられたファイルは、単一ウェルのFastQフォーマットに編集された読み取りを含有していた。
【０３５６】
上記のアセンブリコマンドを用いることによってNewblerもmiraもコンティグを生み出さない、ランID 3またはランID 4の読み取りからのウェルに対して、異なるNewblerコマンドを実行した。「454」のプラットフォームフィールド、「heavy」または「light」の鎖タイプのフィールド、「3」または「4」のランID、および「urt」の配列タイプを有するリスト中の配列は、これらのアセンブリから生じるコンティグであって、Newbler は、コマンドライン：runAssembly -cdna -ud -urt - o output seqs.fastaqであって、seqs.fastqが単一ウェルのFastQフォーマットに編集された読み取りを含有したこのコマンドラインで実行された。
【０３５７】
「PacBio」のプラットフォームフィールド、「heavy」の鎖タイプ、および「pb」の配列タイプを有するリスト中の配列は、PacBioプラットフォームからの読み取りのアセンブリから生じるコンティグであり、コマンドライン：mira --project=seqs -- job=denovo,est,accurate,454 454_SETTINGS -ED：ace=yes -AL：egp=no -CL：pvlc=yes --fastq - notraceinfoでmiraを実行する。
【０３５８】
seqs_in.454.fastqと名付けられたファイルは、単一ウェルのFastQフォーマットに編集された読み取りを含有していた。
【０３５９】
アミノ酸配列
「454」のプラットフォームフィールドおよび「nb-aa」、「urt-aa」、「multim50-aa」、または「zerom50-aa」の配列タイプを有するリスト中の配列は、「配列のアセンブリ」において記載される、454読み取りのアセンブリのヌクレオチド配列を翻訳することによって決定されるアミノ酸配列である。
【０３６０】
「PacBio」のプラットフォームフィールドおよび「pb-aa」の配列タイプを有するリスト中の配列は、「配列のアセンブリ」において記載される、Pacifc Biosciences読み取りのアセンブリのヌクレオチド配列を翻訳することによって決定されるアミノ酸配列である。
【０３６１】
「サンガー-aa」の配列タイプを有するリスト中の配列は、サンガー配列決定によって決定される読み取りを直接翻訳することによって決定されるアミノ酸配列である。
【０３６２】
他の配列決定データ分析オプション
上記に記載されるデータ分析のワークフローを用いて、各細胞の重鎖および軽鎖配列を正確に決定することができる。しかしながら、この情報は、本発明者らの「選択スクリーニング」手法（「発現したヒト抗体のスクリーニング」を参照されたい）に絶対に必要なわけではない。選択スクリーニングが機能するために、本発明者らは、まず、対になる抗体配列を、それらの重鎖V(D)J使用法および軽鎖VJ使用法に基づき、クローンファミリーにクラスター化する。したがって、本発明者らは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の完全配列を必要とせず、V(D)J使用法を決定するのに十分な配列情報を使用することができる。したがって、本発明者らは、配列決定エラーを許容することができ、454または他の任意の配列決定技術によって産出されるより低品質な読み取りを使用することができる。すべての配列はアセンブルされる前にそれらの化合物バーコードに従ってまずグループ化され得るため、順方向の読み取りの配列アセンブリは概して問題とはならない。各化合物バーコードは1個のサンプル／細胞に由来するため、同じ化合物バーコードを有する各免疫グロブリン鎖に対して、1種のみの「正しい」配列が存在する。すべての配列決定エラーが同じ塩基で起こることはあり得ないため、次いで、異なる鎖における配列決定エラーを平均することができ、コンセンサス塩基配列を選ぶことが最も正確な配列を与えるということを意味する。曖昧な場合には、高いphred品質スコアを有する塩基が、一般的にその代わりに選出される。454は、より高品質な読み取りのみが残るまで3'末端からの配列読み取りを取り除くため、これは非常に短い読み取りをもたらし得る。本発明者らの方法を用いると、本発明者らは、より低品質な読み取りを許容することができ、それによって454によって産出されるより非常に長い読み取り（400〜500bp）を用いることができる。これらのより長い読み取りを用いて、本発明者らは、順方向の読み取りと逆方向の読み取りとのアセンブリを必要とすることなく、V(D)J使用法を同定することができ、それによっていくつかの局面において3'プレートIDを必須でないものにする。さらには、454シークエンシングの最新世代は、746bpの平均および800bpの様式に至るまで配列決定することができる。ゆえに、順方向と逆方向の読み取りとのアセンブリはもはや必要でないため、順方向の読み取りだけからの配列決定は、重鎖および軽鎖免疫グロブリンのアンプリコン全体を網羅するのに十分であり得、いくつかの局面においては3'プレートIDを必須でないものにもし得る。
【０３６３】
抗体の選択およびクローニング
アセンブリの後、重鎖および軽鎖の配列を分析して、特徴付けのための抗体を選択した。予測されるV(D)J生殖系列使用法および抗体配列に由来する進化樹の調査に基づいて、抗体を選択した。選択された抗体をクローン化し、発現させ、異なるアッセイで特徴付けした。
【０３６４】
V(D)J割り当て
抗体鎖の配列を生殖系列配列の既知のアレルについてのデータベースと比較し、かつ抗体に用いられた生殖系列アレル、どのように生殖系列配列が再結合したか、および生殖系列と比較した抗体における突然変異を予測するソフトウェアであるV-QUEST（Brochet, X. et al., Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)）を用いて、ラン1および2からの重鎖および軽鎖配列を分析した。表18は、さらなる特徴付けに選出された抗体に対するV-QUEST V(D)J割り当ての結果を示しており、ラン1およびラン2からの他のすべてのアセンブリに対して、同様に同じデータが得られた。V-QUESTに類似したソフトウェアであるSoDA（Volpe, Cowell and Kepler, Bioinformatics (2006) 22 (4)： 438-444）を用いて、ラン3およびラン4からのいくつかの配列を分析した。
【０３６５】
患者のゲノムを配列決定する場合、ゲノム配列データをVDJ割り当て分析のための生殖系列配列として用いることができ、患者の抗体配列における体細胞超変異を確実に同定し得る能力をさらに改善する。
【０３６６】
進化樹およびクローンファミリー
ラン1および2からの重鎖の成熟ペプチドに対応するヌクレオチド配列を、それらが由来する患者に対応するセットに分割した。これら個々のセットから、ソフトウェアclustalx2（Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. (2007) Bioinformatics, 23, 2947-2948）を用いて、すべてのパラメーターに対するデフォルト設定を用いてアラインメントおよび樹を作り出した。
【０３６７】
患者由来の配列の進化樹を、個々のクローンファミリー由来の配列のセットからも構築することができる。ファミリーに対する推定先祖抗体の重鎖および軽鎖配列を推論し、それらがすでにセット内にない場合には、配列のセットに加えることができる。セットに対する進化樹を、例えば最大節約法、最大尤度法（Maximum Likelihood）、または任意の適当なアルゴリズムを用いて構築することができ、先祖抗体の配列において樹を根付かせる（root）ことができる。樹が重鎖および軽鎖の共進化を表すように、重鎖のみ、もしくは軽鎖のみに基づいて、または好ましくは個々の重鎖および軽鎖に同時に基づく樹を構築することによって、樹を構築することができる。
【０３６８】
抗体選択
各患者に対して、ラン1またはラン2の配列から築かれた樹と合わせてV-QUEST結果の表を再検討した（TreeViewXで見た：http：//darwin.zoology.gla.a.c.uk/~rpage/treeviewx）。V-QUESTに基づき、代表的な配列を選択して、存在するVDJの異なるファミリーを網羅し、樹上の対応する配列を調査して、分岐群を代表するものであると思われる配列を選出した。典型的には、各分岐群から1種の配列が選択された。選択された配列のいくつかは、多くのメンバーを有するファミリーに由来したが、いくつかは、わずかなメンバーまたは1つのメンバーを有するファミリーからも選択された。選択された配列を表18に記載する。表18における各抗体について、「抗体」の欄は、配列表中の配列と関連付けされた名称のコンティグIDフィールドにおける「−」の後の文字列と同じである。
【０３６９】
クローン化された軽鎖および重鎖免疫グロブリンペアのクローニングおよび発現
ベクター
一方のシステムは、InvitrogenのベクターpcDNA3.3およびpOptivecから改変された、ネオマイシンおよびジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）を選択可能なベクターシステムである。代替的システムは、増幅可能で選択可能なマーカーがグルタミン合成酵素（GS）であるLonza GSシステムである（下記を参照されたい）。免疫グロブリンのκ軽鎖、λ軽鎖、およびγ重鎖をコードする配列を、ベクター内に挿入する。Kozakコンセンサス配列およびリーダー配列はクローン内にすでに存在しており、ゆえにベクター内に遺伝子操作される必要はない。5'-隣接制限部位および1つまたは複数の他の内部制限部位を含有するように、定常領域を合成する。多様な免疫グロブリン重鎖および軽鎖のクローニングを容易にするために、クローン自体が制限部位を含有せず、したがって内部で切断されない可能性を増大させる、多数の制限部位を有するインサートを遺伝子操作する。インサートは、インサート領域の5'末端および定常領域内に遺伝子操作された2つの異なる制限部位において、2つの異なる8塩基カッター制限部位を有する。5'制限部位は、両方の軽鎖に対してFseIおよびPacIであり、γ重鎖に対してAscIおよびAsiSIである。定常領域内に遺伝子操作された制限部位自体は、両方の軽鎖に対してNheIおよびXhoIであり、γ重鎖に対してEcoRIおよびSacIIである。制限部位を含有している定常領域インサートの配列について、表16を参照されたい。次いで、第1のPCR反応からの重鎖または軽鎖クローンを、クローン内に組み入れられる5'隣接制限部位を有するクローニングプライマーを用いて、PCRの第2のラウンドに供する。ここでは相補的末端を有し、かつT4 DNAリガーゼを用いて一緒にライゲーションされる発現ベクターおよびクローンを切断するために、適切な制限酵素を用いる。InvitrogenおよびLonza GSベクターシステムの両方は、増幅可能な選択マーカーを含有している。このマーカーは、InvitrogenシステムにおいてDHFRであり、Lonza GSシステムにおいてGSである。適切な選択因子（DHFRに対するメトトレキサートおよびグルコース合成酵素（GS）に対するL-メチオニンスルホキシイミン）からの選択圧の下で、選択マーカーに連結された遺伝子をそれとともに増幅する。より多コピーの免疫グロブリン遺伝子を用いると、より多量の抗体の分泌がある。これは、抗体を中和するための後のインビボスクリーニングのために、大量の抗体を精製する必要がある場合に有用である。
【０３７０】
クローニングおよび発現
胚中心の成熟の間、最も高い親和性の形質芽球が選択されると仮定して、本発明者らは、最も高い親和性のクローンファミリーは最も多数のクローンも有すると予想する。さらには、各クローンファミリー内で最も高い親和性のクローンは、そのファミリー内で最も高頻度なクローンでもあると考えられる。これらの仮定に基づいて、本発明者らは、いくつかの局面において、各患者サンプル由来の5つの最大クローンファミリーから最も高頻度なクローンを発現させることを選ぶ。それぞれ単一細胞を含有している同じプレートからのすべてのサンプルが一緒にプールされている、第1のPCR cDNAからクローンを増幅する。順方向プライマーは、サンプルIDを含有しており、したがってその特定のサンプルIDでバーコードされたDNAのみを増幅する。サンプルIDは、互いの間にヌクレオチドの相違を含有しているため、これは非常に特異的である。いくつかのサンプルIDは、同一のクローニング順方向プライマーを有し得、これらのプライマーによって増幅されたクローンは、後に細菌のコロニー選択によっても互いに区別されるはずである。順方向および逆方向プライマーの両方は、κ、λ、またはγ定常領域をすでに含有しているベクター内にクローンを組み込む（一列に並んだコーディングフレームとともに）ことを可能にする隣接制限部位（第一および第二の制限部位領域）を含有している。クローニングプライマー配列について、表4および5を参照されたい。軽鎖を改変型pcDNA3.3内にかつ重鎖を改変型pOptivec内にクローニングする、または両方の鎖をLonza GS二重発現ベクター内にクローニングする。哺乳類細胞を、免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子をコードする別々の発現ベクターで二重にトランスフェクトする、または重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含有している二重発現ベクターを単独でトランスフェクトする。次いで、分泌された抗体を含有している上清を回収し、所望の特性についてスクリーニングする。
【０３７１】
ある場合には、DNA合成、ならびに制限酵素および標準的な分子生物学を用いて、適切な定常領域を含有しているベクター内に合成されたDNAを組み入れることによって、Ig遺伝子の可変領域をクローン化してよい。合成の間、突然変異誘発が所望される場合を除いて、アミノ酸配列が変更されない限りは正確なヌクレオチド配列に従う必要はない。このことは、より高い発現レベルをもたらし得るコドン最適化を可能にする。このことは、クローニングのための、制限部位における付加も可能にする。5' UTRおよびバーコード配列等の翻訳されない配列は合成される必要がなく、リーダー配列も、より高い発現レベルで知られる他のシグナルペプチド配列と交換されてよい。これらは、高性能な読み取りと非常に異なり得るIgヌクレオチド配列をもたらすが、発現した場合には同一のアミノ酸配列を与える。
【０３７２】
ある場合には、逆転写の間に付加されるサンプルIDバーコードアダプターは、制限酵素部位をすでに組み入れていてよい。このことは、PCRアンプリコンプールにおいて、サンプルIDバーコードの3'制限部位を有するアダプターをもたらす。クローニングプライマーを用いたクローニングの間、サンプルIDバーコード配列に相補的である5'プライマー、および鎖特異的3'プライマー（κ、λ、およびγ鎖に対する）を用いて、プレート特異的アンプリコンプールから所望のアンプリコンを増幅する。3'プライマーは、3'制限部位を付加する。5'プライマーはウェルIDバーコードの3'制限部位をすでに含有しているため、5'プライマーは制限部位を付加する必要がない。この増幅の後、定常領域インサートを含有しているベクター内へのライゲーションのために、制限酵素を用いてアンプリコンを切断する。制限酵素消化の間、バーコードおよびユニバーサル配列等の、Ig遺伝子配列の5'末端へ付加された配列は、それらが5'制限部位の5'であるため切断される。
【０３７３】
クローニングおよび発現のための代替的方法
別の局面において、DNA合成、ならびに制限酵素および標準的な分子生物学を用いて、適切な定常領域を含有しているベクター内に合成されたDNAを組み入れることによって、Ig遺伝子の可変領域をクローン化してよい。合成の間、突然変異誘発が所望される場合を除いて、アミノ酸配列が変更されない限りは正確なヌクレオチド配列に従う必要はない。このことは、より高い発現レベルをもたらし得るコドン最適化を可能にする。このことは、クローニングのための、制限部位における付加も可能にする。5' UTRおよびバーコード配列等の翻訳されない配列は合成される必要がなく、リーダー配列も、より高い発現レベルで知られる他のシグナルペプチド配列と交換されてよい。これらは、高性能な読み取りと非常に異なり得るIgヌクレオチド配列をもたらすが、発現した場合には同一のアミノ酸配列を与える。
【０３７４】
別の局面において、逆転写の間に付加されるウェルIDバーコードアダプターを、制限酵素部位にすでに組み入れてよい。このことは、PCRアンプリコンプールにおいて、ウェルIDバーコードの3'制限部位を有するアダプターをもたらす。クローニングプライマーを用いたクローニングの間、ウェルIDバーコード配列に相補的である5'プライマー、および鎖特異的3'プライマー（κ、λ、およびγ鎖に対する）を用いて、プレート特異的アンプリコンプールから所望のアンプリコンを増幅する。3'プライマーは、3'制限部位を付加する。5'プライマーはウェルIDバーコードの3'制限部位をすでに含有しているため、5'プライマーは制限部位を付加する必要がない。この増幅の後、定常領域インサートを含有しているベクター内へのライゲーションのために、制限酵素を用いてアンプリコンを切断する。制限酵素消化の間、バーコードおよびユニバーサル配列等の、Ig遺伝子配列の5'末端へ付加された配列は、それらが5'制限部位の5'であるため除去される。
【０３７５】
Lonzaベクター内への重鎖および軽鎖のクローニング
免疫グロブリン定常領域のクローニング
LonzaとのStanford Universityのアカデミックライセンス契約によって、Lonzaベクターを入手した。κおよびλ軽鎖をpEE12.4ベクター内に挿入し、γ重鎖をpEE6.4ベクター内に挿入した。重鎖および軽鎖配列を2つの工程でクローン化した：まず、後に免疫グロブリン鎖の5'末端（リーダーおよびV(D)J配列）が続く定常領域をクローン化した。定常領域インサートは、Integrated DNA Technologies（IDT）によって遺伝子合成され、遺伝子最適化および制限部位の組み入れに適したサイレント突然変異を含有していた。IDTから、IDTの所有物であるpIDTSmartベクター内のインサートを入手した。インサート配列は表17にある。IgG1をγ重鎖定常領域として用いた。κ、λ、およびγ鎖に対して、用いたアレルは、それぞれKm3、Mcg−Ke−Oz−、およびG1m3であった。定常領域をLonzaベクター内に組み入れるために、LonzaベクターおよびpIDTSmart-定常領域インサートを、dam−dcm−コンピテント大腸菌内にすべて個々に形質転換し、メーカーの指示書に従って、Qiagen miniprep kitを用いてプラスミドを精製した。次いで、HindIIIおよびBclIを用いて、プラスミドを37℃で1時間消化し、150Vで、1時間1.2％アガロースゲルで泳動した。消化されたLonzaベクターおよび定常領域インサートを、ゲル精製し、T4 DNAリガーゼを用いて、3：1のインサート：ベクターの比率で室温にて10分間ライゲーションした（Km3またはMcg−Ke−Oz−軽鎖とpEE12.4、およびG1m3γ1重鎖とpEE6.4）。次いで、T4 DNAリガーゼを70℃で8分間不活性化し、標準的な分子生物学の技術を用いて、5μlのライゲーション混合物をヒートショックコンピテントTOP10細胞内に形質転換した。コロニーを拾い、サンガー配列決定によって挿入を検証した。
【０３７６】
免疫グロブリン可変領域のクローニング
次に、λまたはκ軽鎖のいずれかを含有しているpEE12.4を、AscIおよびXmaIを用いて37℃で5時間消化し、ゲル精製した。γ1重鎖を含有しているpEE6.4を、AscIおよびAgeIを用いて37℃で5時間消化し、ゲル精製した。ウェルID特異的順方向プライマーおよび定常領域特異的逆方向プライマー（表4および5）を用いて、第1のPCRの特異的プレートIDの100倍希釈物から、選択されたアンプリコンを選択的に増幅した。順方向プライマーは、プライマーの5'末端にAscI制限部位を有し、かつ逆方向プライマーは、軽鎖および重鎖プライマー定常領域プライマーに対して、それぞれXmaIまたはAgeI制限部位を含有していた。98℃30秒間での初期変性、ならびに98℃10秒間、68℃15秒間、および72℃20秒間での35〜45サイクルを用いてPCRサイクルを行った。最終伸長は、72℃5分間および4℃無期限での保持状態であった。PCR産物を、メーカーの指示書に従って、Millipore製のPCRu96 ultrafiltration plateを用いて精製した。この後、軽鎖に対してAscIおよびXmaIを用いて、ならびにγ1重鎖に対してAscIおよびAgeIを用いて、PCR産物を37℃で3時間二重消化した。次いで、消化された産物を、gelgeen（Biotium）を含む2.5％低融点アガロースで泳動し、青色光の下で可視化した。適切なサイズにおいてバンドを含有しているゲル薄片を切り出した。ゲル薄片を65℃で溶かし、定常領域インサートを含有している適切に消化されかつAntarcticホスファターゼ（NEB）処理されたLonzaベクターを添加し、およびT4 DNAリガーゼと室温で1〜3時間インキュベートすることによって、インゲルライゲーションを実施した。次いで、ヒートショックコンピテント細菌を形質転換し、アンピシリン寒天上にプレーティングした。1つの構築物につき6個のクローンを拾い、2×LB（2×濃縮したLuria-Bertani培養液）中で増殖させた。メーカーの指示書（www.millipore.com/techpublications/tecg1/tn004）に従って、MilliporeのMultiscreen 96-well filter plateを用いてミニプレップを実施して、プラスミドDNAを得た。95℃5分間の初期変性、および95℃1分間、50℃2分間、72℃1分間の40サイクル、および72℃5分間での最終伸長、および4℃無期限での保持を用いて、コロニーPCRを実施した。適切なインサートを有するクローンを、サンガー配列決定のためにSequetech, Mountain View, CA, USAに送った。IMGT HIGHV-Questを用いてクローンのVDJ同定を行い、正しいクローンを、細菌ストック（15％グリセロールを用いて-80℃で保存）およびプラスミドの両方として保管した。
【０３７７】
293Tにおけるモノクローナル抗体の発現
メーカーのプロトコールに従って、Lipofectamine 2000を用いて、対になるpEE12.4-軽鎖およびpEE6.4-重鎖構築物の一過性の二重トランスフェクションを行った。48ウェル、24ウェル、6ウェル、60mmディッシュ、および100mmディッシュでトランスフェクションを行っている。簡潔には、下流のプロテインA精製工程において、ウシIgGと分泌されたヒトIgGとが競合するのを防ぐために、DMEM＋10％ ultralow IgG FBS（Invitrogen）中で293T細胞を培養した。293T細胞を20継代培養し、その後液体N2から新たなアリコートを融解し、使用した。48ウェルプレートのトランスフェクションについて、前日に8×104個の細胞を各ウェルに播種し、翌日約90％コンフルエントまで増殖させた。50ngの各重鎖および軽鎖構築物を、50μlの最終容量で、Optimem培地中でインキュベートし、Lipofectamine 2000も別々に50μlのOptimem培地とインキュベートした。両方のインキュベーションは5〜25分間であった。次いで、Lipofectamine 2000と構築物とを穏やかにピペッティングすることによって混合し、20分間インキュベートし、その後293T細胞に添加して穏やかに混合した。翌日培地を交換し、培養上清を1日おきに（例えば、月曜日、水曜日、および金曜日）2週間回収した。他のサイズのトランスフェクションに対して、以下の量の構築物およびLipofectamine 2000を用いた：24ウェルプレートのトランスフェクションに対して、100ngの各構築物を1.25μlのLipofectamine 2000とともに用いた。60mmディッシュに対して、625ngの各構築物を12.5μlのLipofectamine 2000とともに用いた。100mmディッシュのトランスフェクションに対して、3μgの各構築物を37.5μlのLipofectamine 2000に用いた。
【０３７８】
抗ヒトIgG ELISA
ある場合には、サンプルについてヒトIgG ELISAを行って、培養上清中の発現したIgGの量を定量し、抗体の量を標準化した後に、培養上清を下流での適用に直接用いた。抗ヒトIgG ELISA定量キットをBethyl Laboratoriesから購入し、メーカーの指示書に従って実施した。簡潔には、100μlの捕捉抗体をNunc Maxisorpプレートに4℃で一晩コーティングし、PBST（0.05％Tween20を含むPBS）で5回洗浄した。ウェルをPBS中1％BSAで室温にて1時間ブロッキングし、次いでPBSTで5回洗浄した。次いで、ウェルを、キットからの適切な標準希釈物または希釈した培養上清とともに室温で1時間インキュベートし、次いでPBSTで5回洗浄した。100μlの希釈したHRP検出抗体を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートし、次いでPBSTで5回洗浄した。50μlのTMB基質溶液を添加し、反応を50μlの停止溶液で停止させた。吸光度をSpectraMax M5分光光度計で450nmにて読み取り、4パラメーター曲線を用いて検量線を産出した。抗体を、防腐剤として0.1％アジ化ナトリウムを含むPBS中で4℃にて保管した。
【０３７９】
プロテインAによる発現したモノクローナル抗体のIgG精製
他の場合には、まず抗体を培養上清から精製し、使用前にBCAを用いて定量した。簡潔には、培養上清を1週間に3回、50mlチューブ内に2週間回収し、プロテインAによるIgG精製まで、添加剤としての0.1％アジ化ナトリウムとともに4℃で保存した。培養上清をスピンダウンし、静かに注いで任意の細胞の凝集体を除去した。1M pH9.0 Trisを培養上清に添加して、pH指標片によって判定されるpHが7.5〜8.0の間であることを確認した。Protein A plus agaroseビーズ（Pierce）をPBSで2回洗浄し、その後400μlの50％スラリーを培養上清に添加し、回転装置上で4℃にて一晩インキュベートして、ビーズのさらなる混合を確実にした。培養上清を1000gで5分間スピンし、ビーズをチューブの底から5ml重力流（gravity flow）カラム内へピペッティングで移すことによって、ビーズを回収した。ビーズを4×2mlのPBSで洗浄し、その後低pHの溶出バッファーである、2×1.5mlのIgG溶出バッファー（Pierce）を用いてAmicon-4 100kDa濃縮カラムへ溶出した。溶出された抗体を400μlの1M Tris pH8.0で直ちに中和した。次いで、Amicon-4 100kDa濃縮器において1000gで10分間スピンすることによって抗体を濃縮し、その後に2mLのPBS洗浄、および0.1％アジ化ナトリウムを含む2mlのPBS洗浄が続いた。抗体濃度をBCAアッセイによって決定し、0.5mg/mlに調整した。Protein A Plus Agaroseを、1×2mlのPBS、3×2mlのIgG溶出バッファーでの洗浄、および0.1％アジ化ナトリウムを含む3mlのPBSでの洗浄によって再生し、4℃で保管した。最高5回までカラムを再生することができる。
【０３８０】
発現したヒト抗体のスクリーニング
抗体−抗原結合についてのスクリーニング
まず、選択された抗体（上記のクローニングおよび発現のセクションを参照されたい）を、関心対象の抗原に結合し得るその能力についてスクリーニングし、次いでクローンファミリー全体の抗体を発現させ、抗原を遮断または中和し得るその能力についてスクリーニングする（下記の「機能的スクリーニング」を参照されたい）。まず、関心対象の抗体を含有している上清中のIgG濃度をIgG ELISAによって決定し、それによって抗体−抗原結合スクリーニングにおいて、各サンプルに対して同じ量のIgGを用いることができる。他の場合には、IgGを、プロテインAアガロースビーズを用いて上清から精製し、標準物質としてウシ免疫グロブリンを用いたBCAアッセイで定量した。次いで、抗体のスクリーニングにおける使用前に、精製したIgGを同じ濃度に標準化した。抗原に結合する抗体をスクリーニングするために、本発明者らは、間接的ELISAを実施する。96ウェルプレートを関心対象の抗原で一晩コーティングし、次いで過剰な抗原を洗い流す。次いで、関心対象の抗原を含有している上清をウェルに添加し、4時間インキュベートし、その後にウェルを洗浄する。陽性対照として、抗原に特異的である既知の量の市販抗体（ヒト以外の種由来）を、抗原を含有している別々のウェルに添加する。陰性対照として、無関係な抗原に特異的な市販抗体を、関心対象の抗原を含有している別々のウェルに添加する。次いで、HRP結合二次抗体をウェルに添加し、30分間インキュベートし、余剰分を洗い流す。次いで、テトラメチルベンジジン（TMB）をプレートに添加し、陽性対照のウェルにおいて発色が観察されるまで反応を進行させる。次いで、反応を酸で停止させ、吸光度を測定する。特異的ウェルの上清は、それらがもたらす吸光度の読み出しが、陰性対照におけるものより有意に高い場合、関心対象の抗原に結合する抗体を含有していると見なされる。
【０３８１】
Fluzone ELISA
3株の不活性化ウイルスであるA/カリフォルニア/7/2009株、A/パース/16/2009株、B/ブリスベン/60/2008株からなる、Fluzone由来の2010/2011季節性インフルエンザワクチンを志願者に投与した。結合活性を有する発現した抗体についての初期スクリーニングとして、Fluzone ELISAを行って、ワクチンを接種された志願者に由来するモノクローナル抗体が、インフルエンザワクチン自体に結合するかどうかを判定した。FluzoneワクチンをpH9の炭酸塩バッファー中に100×で希釈し、室温で1時間または4℃で一晩のいずれかでNunc Maxisorpプレートにコーティングした。次いで、プレートをPBST（0.05％Tween20を含むPBS）で5回洗浄し、1％BSAを含むPBSで室温にて1時間ブロッキングした。次いで、100μlの100ng/mlの発現したインフルエンザ抗体を室温で1時間ウェルに添加し、その後PBSTで5回洗浄し、かつ希釈したHRP検出抗体（Bethyl LabsのヒトIgG ELISA定量キットから）を室温で1時間添加した。プレートをPBSTで5回洗浄し、50μlのTMB基質を添加した。最高30分間まで発色を進めさせ、その後50μlの停止溶液で反応を停止した。プレートをSpectroMax M5分光光度計で450nmの吸光度で読み取った。本アッセイに用いた抗体を表19に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３８２】
インフルエンザ抗体親和性についての表面プラズモン共鳴による判定
ProteOn表面プラズモン共鳴バイオセンサー（BioRad Labs）を用いて、モノクローナル抗体（mAb）のHA分子への結合を25℃で分析した。インフルエンザワクチンを接種されたドナーの形質芽球由来の発現したインフルエンザモノクローナル抗体（pH4.5酢酸バッファー中に25nM）を、試験用フローセルにおいて、800共鳴単位（RU）の標的密度で、EDAC-NHS化学反応を用いたアミン結合でGLCセンサーチップに結合させた。未反応の活性エステル基をエタノールアミンで抑制した。精製された組換えヘマグルチニンH3（HA(ΔTM)(H3N2/パース/16/2009)）およびH1（HA(ΔTM)(A/カリフォルニア/07/2009)(H1N1)）を、Immune Technology Corp.（New York, NY）から購入し、空のバッファー対照とともに、100、50、25、12.5、6.25nMに希釈し、120秒間の接触時間および2000秒間の解離時間で、30μL/分の流速で注入した。結合反応速度論およびデータ分析を、BioRadのProteON managerソフトウェアを用いて実施した。HAはいくつかの反復単位からなるため、二価分析物（bivalent analyte）アルゴリズムを用いて、親和性測定結果を算出した。適合させた曲線の正確性を、各適合度（goodness of fit）のx2値が最大結合値（Rmax）の10％を下回ることをチェックすることによって検証した。本アッセイに用いた抗体を表20に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３８３】
RA抗原マイクロアレイでのRA抗体の反応性
抗原をマイクロアレイに焼き付ける（print）ために、抗原をリン酸緩衝食塩水で0.2mg/mLに希釈し、ArrayIt NanoPrint Protein LM210システムを用いて、ArrayIt SuperEpoxyスライドに接着させた。スライドを、疎水性マーカーパップペンで印付けし、3％ウシ胎仔血清および0.05％Tween20を含むPBS中で、30rpmで穏やかに揺すりながら、4℃で一晩ブロッキングした。30rpmで穏やかに揺すりながら、4℃で1時間、アレイを400μLの40μg/mLモノクローナル抗体でプローブした。次いで、アレイを洗浄し、1：2500に希釈したCy3結合抗ヒトIgG/IgM二次抗体中で、30rpmで穏やかに揺すりながら、4℃で45分間インキュベートした。もう1回の洗浄後、GenePix 4300Aマイクロアレイスキャナを用いてスライドをスキャンした。GenePix 7ソフトウェアを用いて、各特質（feature）およびバックグラウンドの蛍光強度中央値を見出した。
【０３８４】
データを分析するために、バックグラウンドの蛍光強度を各特質から差し引き、各アレイでの4つの抗原特質の中央値として表現した。強度中央値を、10を底として対数変換した。これらの値を、Clusterソフトウェアを用いて階層的クラスター分析に供して、互いの類似性に基づいて抗原を配置した。Java（登録商標） TreeViewソフトウェアを用いて、関係性をヒートマップとして表示した。本アッセイに用いた抗体を表21に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３８５】
抗ヒストン2A ELISA
ヒストン2Aに対する抗体の検出のために、直接的ELISAを用いた。マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorp）を、炭酸塩バッファー中20μg/mlの濃度の100μlの組換えH2Aでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有しているPBS中でブロッキング後、RA患者由来の抗体を、希釈バッファー（0.1％BSAおよび0.1％Tween-20を含有しているPBS）中に15μg/ml〜250μg/mlの量設定で用い、100μl/ウェルでプレートに二つ組で添加し、室温で2時間インキュベートした。次いで、モノクローナルの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト抗体の1：5,000希釈物とともに、サンプルを室温で1時間インキュベートした。反応を、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン基質（TMB）（Sigma-Aldrich）の適用によって15分間進め、50μlの2N H2SO4の添加によって停止させた。抗体の相対的定量化を、既知の血清反応陽性RA血清を陽性対照として用いて、450nmでの光学的濃度測定によって実施した。本アッセイに用いた抗体を表22に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３８６】
抗CCP2 ELISA
メーカーの指示書（Eurodiagnostica, Malmo, Sweden）に従って、抗CCP2 ELISAを実施した。要するに、RA患者由来の抗体を、希釈バッファー（0.1％BSAおよび0.1％Tween-20を含有しているPBS）中でおよそ125μg/mlに希釈し、あらかじめブロッキングされている市販のCCP2 ELISAプレートに100μl/ウェルで添加し、室温で2時間インキュベートした。次いで、モノクローナルの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト抗体の1：5,000希釈物とともに、サンプルを室温で1時間インキュベートした。反応を、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン基質（TMB）（Sigma-Aldrich）の適用によって15分間進め、50μlの2N H2SO4の添加によって停止させた。抗体の相対的定量化を、業者によって提供される標準物質および既知の陽性RA血清を用いて、光学的濃度測定によって実施した。本アッセイに用いた抗体を表22に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３８７】
抗リウマチ因子ELISA
リウマチ因子（RF）に対する抗体の検出のために、マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorp）を、炭酸塩バッファー中10μg/mlのウサギIgGでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有しているPBS中でブロッキング後、RA患者由来の抗体は希釈バッファー（0.1％BSAおよび0.1％Tween-20を含有しているPBS）中5μg/mlであり、100μl/ウェルでプレートに二つ組で添加し、室温で2時間インキュベートした。次いで、モノクローナルの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト抗体の1：5,000希釈物とともに、サンプルを室温で1時間インキュベートした。反応を、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン基質（TMB）（Sigma-Aldrich）の適用によって15分間進め、50μlの2N H2SO4の添加によって停止させた。抗体の相対的定量化を、2種の既知のRF＋対照血清を陽性対照として用いて、450nmでの光学的濃度測定によって実施した。本アッセイに用いた抗体を表23に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３８８】
肺癌組織アレイ上での肺腺癌患者由来の抗体の免疫組織化学
2つの異なるタイプの組織マイクロアレイ用スライドをUS Biomaxから購入した。それらは、VLC 12およびBS0481であった。スライドには、肺腺癌を含む多様な肺癌腫組織の中心部、および正常な肺組織対照も含まれる。スライドを、クエン酸pH6.0抗原回復バッファー中で95〜99℃にて40分間加熱し、その後室温まで冷却させた。スライドを、0.02％Triton-Xおよび0.6％H2O2で20分間前処理した。次いで、スライドを、TBST（0.05％Tween20を含むTBS）中10％正常ヤギ血清で2時間ブロッキングし、その後100μg/mlのF(ab)ヤギ−抗ヒトIgG（Jackson Immunoresearch）中で4℃にて一晩さらにブロッキングした。次いで、メーカーの指示書に従って、スライドはアビジン／ビオチンブロッキング（Vector Laboratories）を受けた。次いで、スライドを5または10μg/mlの発現した肺抗体中で室温にて1時間インキュベートし、TBSTで3×5分間洗浄し、次いでビオチン化ヤギ抗ヒト二次抗体と室温で20分間インキュベートした。次いで、スライドをTBSTで3×5分間洗浄し、調製したVectastain ABC試薬と室温で30分間インキュベートした。次いで、スライドを3×5分間のTBSTで洗浄し、Vector Red（Vector Laboratories）で染色し、発色の進行を光学顕微鏡で追跡した。適切な染色時間の後、反応を蒸留水で停止させ、ヘマトキシリンで対比染色した。スライドを水溶性封入し、BX-51顕微鏡で撮影した。本アッセイに用いた抗体を表24に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３８９】
肺腺癌患者由来の発現した抗体の肺癌細胞株への結合についてのフローサイトメトリーによる判定
用いた肺癌細胞株は、A549、H226、H441、H23、H1975、H1437、H2126、H1650、およびH2009であった。陰性対照として、HEK 293T細胞も用いた。2mM EDTAを含み、Ca2＋およびMg2＋を含まないPBS中で細胞を37℃で1時間インキュベートすることによって、細胞を剥離した。これは、細胞を剥離するためのトリプシン処理または他の任意のタンパク質分解性消化でなされ得る細胞表面抗原に損傷を与えるのを防ぐためである。細胞をFACSバッファーで1回洗浄し、その後50μlのFACSバッファー（2％FCSを含むHBSS）中に懸濁し、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.2μg/mlの発現した肺抗体とインキュベートして用量を設定した。最適濃度は、0.2〜1μg/mlの範囲であることが見出された。したがって、それ以降、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/mlの肺抗体を用いた。肺抗体を4℃で30分間インキュベートし、その後96ウェルプレート中で2×200μlのFACSバッファーで洗浄した。次いで、抗ヒトIgG-PEを添加し、暗所にて4℃で15分間インキュベートした。次いで、サンプルを2×200μのFACSバッファーで洗浄し、200μlのFACSバッファー中に再懸濁し、BD LSR IIまたはLSR Fortessaで分析した。生／死の染色として、Sytox blueを用いた。本アッセイに用いた抗体を表24に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３９０】
ブドウ球菌フローサイトメトリー
固定した黄色ブドウ球菌粒子（Wood株）をInvitrogenから入手した。Wood株は、該細菌の一部によって最小限のプロテインAを発現する株である。粒子を、50μlのFACSバッファー中に10×106細胞/50μlで懸濁し、ブドウ球菌個体に由来する10μg/ml、5μg/ml、または1μg/mlの用量設定の、発現した抗体と、4℃で1時間インキュベートした。次いで、固定したブドウ球菌粒子をFACSバッファーで2回洗浄し、その後抗ヒトIgG-FITC抗体と暗所にて4℃で15分間インキュベートした。次いで、粒子を1mlのFACSバッファーで洗浄し、BD LSR IIまたはLSR Fortessaでの分析のために200μlのFACSバッファー中に再懸濁した。本アッセイに用いた抗体を表25に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３９１】
機能的スクリーニング
受容体−リガンド相互作用に対する遮断抗体
抗体を、リガンド−受容体相互作用（例えば、サイトカイン−受容体相互作用）を遮断し得るその能力についてスクリーニングするために、本発明者らは、293T細胞に適切な受容体をコードするベクターをトランスフェクトする。これらの293T細胞は、NF-κB依存的ルシフェラーゼレポーターも安定的にトランスフェクトされており、それによってこれらの安定的にトランスフェクトされた293T細胞は、NF-κBが活性化された場合にルシフェラーゼを発現する。次いで、本発明者らは、トランスフェクトした293T細胞を、抗体候補の存在下または非存在下において適切なリガンドとともに培養する。最後に、293Tルシフェラーゼ依存的発光を測定することによって、細胞をルシフェラーゼ発現についてアッセイする。リガンドとその受容体との間の相互作用、例えばIL-17AとIL-17Rとの間の相互作用は、NF-κBを活性化する。遮断抗体は、リガンド−受容体結合によってNF-κBシグナル伝達を妨げ、それによってルシフェラーゼの発現を無効にする。リガンド−受容体相互作用がNF-κBを活性化しない場合には、他の転写応答エレメント、例えばAP-1応答エレメントなどを用いて、ルシフェラーゼ遺伝子のプロモーターを駆動する。
【０３９２】
サイトカイン機能を阻害し得るまたは機能的アッセイを阻害し得る能力についての抗体のスクリーニング
機能的アッセイを用いても、患者血清におけるまたはクローン化され発現させた抗体における抗サイトカイン抗体についてスクリーニングすることができる。この手法では、発現したヒト抗体を、サイトカインまたは細胞性応答の他の免疫仲介因子誘導を阻害し得るその能力について試験する。
【０３９３】
細菌、ウイルス感染した細胞、寄生生物、または癌細胞を標的とする抗体
細菌、ウイルス感染した細胞、寄生生物、または癌細胞を殺傷するまたは中和する抗体についてスクリーニングするために、本発明者らは、適切な細胞タイプを、熱で不活性化されていない血清（補体因子を含有している）とともに、抗体の存在下または非存在下のいずれかで培養する。抗体が中和抗体である場合、それは、細菌、他の微生物、または癌細胞をオプソニン化し、細胞死を誘導する膜侵襲複合体（MAC）を形成する補体成分を活性化する。中和を試験するために、本発明者らは、生細胞と死細胞とが異なるフルオロフォアで染色される蛍光性live/deadアッセイ（Invitrogen）を実行する。フローサイトメトリーを用いることによって、生細胞および死細胞のパーセンテージについて細胞をアッセイすることができる。最大パーセンテージの死細胞をもたらす抗体は、インビボスクリーニングにおいてさらに分析されることになる優れた中和抗体候補であると考えられる。
【０３９４】
ウイルスを中和する抗体
ウイルスを中和する抗体をスクリーニングするために、本発明者らは、標準的なプラーク減少アッセイまたは他のインビトロ細胞感染アッセイを実施する。中和抗体は、細胞のウイルス感染を減少させると予想される。次いで、抗体候補をインビボモデルにおいて試験する。
【０３９５】
インフルエンザマイクロ中和アッセイ
Fluzone ELISAに結合活性を示したいくつかの発現したインフルエンザ抗体を、マイクロ中和アッセイのために、外部のCRO, Virapur, LLCに送った。簡潔には、100μg/mlから始まる2倍希釈の各抗体と、等量のおよそ100 TCID50感染単位の力価測定したストックウイルスとを、96ウェルプレートのウェル中に四つ一組で混合した。ウイルス／抗体溶液を2時間インキュベートし、次いで80％コンフルエントのMDCK細胞を含有している96ウェルプレートに混合物を移した。細胞、抗体、およびウイルスを37℃でさらに2時間インキュベートし、その後ウイルスを除去し、単層をすすぎ、ウイルス増殖培地を各ウェルに添加した。72時間後、インフルエンザウイルス感染の存在についてウェルを顕微鏡で観察した。本アッセイに用いた抗体を表26に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３９６】
ブドウ球菌阻害アッセイ
対数増殖期にある黄色ブドウ球菌を用いた。それらを96ウェルのポリプロピレンプレートに添加し、ブドウ球菌患者由来の抗ブドウ球菌抗体を10μg/mlで添加した。Baby rabbit complement（Cedarlane）をメーカー推奨の量で添加し、徹底的に混合した。プレートを37℃で45分間インキュベートし、その後1：10、1：100、および1：1000に希釈し、5％TSA血液寒天プレートにプレーティングし、一晩増殖させた。翌日、細菌CFUをカウントし、一覧にした。本アッセイに用いた抗体を表27に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３９７】
ブドウ球菌感染した患者に由来する抗体を用いたブドウ球菌抗原の免疫沈降
1×Haltプロテアーゼ阻害剤とともに100ng/mlのリソスタフィンを含むB-Per Bacterial Protein Extraction Reagent（Pierce）を用いて、室温で30分間黄色ブドウ球菌を溶解することによって、ブドウ球菌タンパク質溶解物を作製し、微量遠心機にて15000rpmで遠心分離することによって不溶性画分を分離した。プロテインG Dynabeadsと室温で1時間インキュベートすることによって、溶解物をあらかじめ浄化した。室温で1時間インキュベートすることによって、ブドウ球菌患者に由来する5μgの抗体をプロテインG Dynabeadsに結合させた。次いで、プロテインGに結合した抗体を、あらかじめ浄化したブドウ球菌溶解物と4℃で一晩インキュベートした。次いで、ビーズをPBST（0.1％Tween20を含むPBS）で3回洗浄し、5×reducing lane sample buffer（Thermo Scientific）と95℃で5分間加熱し、その後4〜12％Criterion Bis-TrisゲルでSDS-PAGEにかけた。RAPIDStain Reagent（Calbiochem）でタンパク質を可視化した。本アッセイに用いた抗体を表28に記載する。主たる表である表18において、抗体の配列を参照することができる。
【０３９８】
ペプチドの質量分析による同定
関心対象の染色されたタンパク質バンドを、ゲルから切り出し、10mM DTTおよび100mMヨードアセトアミドを含有している10mM炭酸水素アンモニウム中に浸し、100％アセトニトリルで処理し、次いで10％アセトニトリルを含有している10mM酢酸アンモニウム中0.1mgトリプシン（Sigma-Aldrich）を用いて37℃で一晩消化した。以前に記載しているように（Lopez-Avila V, Sharpe O, Robinson WH： Determination of ceruloplasmin in human serum by SEC-ICPMS. Anal Bioanal Chem 2006, 386：180-7.）、Agilent 1100 LC systemおよびAgilent XCT Ultra Ion Trap（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いることによって、トリプシン処理したタンパク質をLCMSで同定した。タンパク質を同定するために用いたペプチドの検出のために、SpectrumMillソフトウェア（Agilent）を用いることによって、LCMSデータをSwissProtまたはNCBInrデータベースに対してスキャンした。本アッセイに用いた抗体を表29に記載する。
【０３９９】
実施例1：個々のB細胞由来の対合した重鎖および軽鎖配列についての高性能配列決定
本発明者らは、プレート内の同じウェルを起源とする配列を一義的に同定するために、配列に化合物バーコード（サンプルID＋プレートID）を付加する方法を開発した。本発明者らは、この手法を用いて、個々のB細胞由来の対合した重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を配列決定した。血液、バルク末梢血単核細胞（PBMC）、バルクB細胞、形質芽球、形質細胞、メモリーB細胞、または他のB細胞集団から、個々のB細胞をフローサイトメトリーによって選別することができる（図1）。
【０４００】
まず、96ウェルPCRプレート内にB細胞を単一細胞に選別し、1列のウェルを陰性対照として空のままにした。逆転写（RT）の間、異なるサンプルIDバーコードを含有しているオリゴヌクレオチドは異なるウェルへ添加された。mRNAの逆転写後、MMLV H−逆転写酵素は、鋳型を切り替え、オリゴヌクレオチドを転写し、それおよびサンプルIDを第一鎖cDNAの3'末端内に組み入れる（図2a）。次いで、1プレート由来のすべてのcDNA（サンプルIDでバーコード化された）をプールし、2ラウンドのPCRに供した。PCRの間、5'隣接バーコード配列を有するPCRプライマーを用いることによって、アンプリコンの5'および3'末端に、454シークエンシングプライマー（第一および第二の配列決定領域）およびプレートIDが付加された。ここでは、異なるプレート由来のアンプリコン（アンプリコン領域）は、n個の異なるプレートIDを有し、プレートIDおよびサンプルIDを含む化合物バーコードは、配列を特定細胞から来たものとして配列を一義的に同定し、配列決定した重鎖および軽鎖遺伝子のペア形成を可能にする（図2b〜c）。
【０４０１】
図3は、用いた一般的方法論および関連配列を記載している。プライマーおよびアダプター分子を表1に示す。サンプルID配列を表2に示す。プレートID配列を表3に示す。クローニングプライマーを表4に示し、クローニング順方向プライマーの3'配列を表5に示す。
【０４０２】
本発明者らは、予想されるサイズ：κおよびλ軽鎖に関して約600bp、ならびにγ重鎖に関して約700bpの、PCR産物を得た（図4a）。次に、本発明者らは、サンガー配列決定のために材料を送った。本発明者らは、NCBI BLASTによってκ、λ、およびγ鎖として同定される配列を得た（データ示さず）。DNAクロマトグラムのさらなる調査によって、サンプルIDバーコードから始まるいくつかのピークの混合が示され、本発明者らが、RTの間に異なるウェル中の細胞由来のcDNAにサンプルIDを上手く付加し、かつそれらをその後の2ラウンドのPCRで上手く増幅させたことを示した（図4b）。3'末端からのサンガー配列決定鎖も、異なる細胞由来の遺伝子の増幅により、VJ結合部から始まるいくつかのピークの混合を示し、それは、異なるVおよびJ遺伝子の挿入および欠失およびランダム組換えの結果としてVJ結合部の後で異なった。さらには、本発明者らが、ウェルA1サンプルIDに特異的なクローニングプライマーを用いてPCRを実施した場合、本発明者らは、いくつかのピークの混合よりもむしろ単一ピークを獲得し、本発明者らが、実際にプール内の特異的細胞から配列を増幅することができることを示した（図4c〜d）。
【０４０３】
実施例2：形質芽球の単一細胞選別のためのゲーティングスキーム
本実験のために、形質芽球をCD19＋CD20−CD27＋CD38＋＋として定義した。図22は、96ウェルプレート内への単一形質芽球細胞のフローサイトメトリーによる選別のためのゲーティングスキームを示している。
【０４０４】
上記のように、単一PBMCを調製し、染色した。まず細胞に、それらのFSCおよびSSCプロファイルに基づきゲートをかけた（データ示さず）。次いで、CD19＋B細胞の生細胞にゲートをかけ（左パネル）、CD20−B細胞にさらに絞り込み（左から2番目のパネル）、CD27＋CD38＋＋細胞に純化した。IgG＋形質芽球は細胞表面IgGを発現しないため、これにより、IgG＋形質芽球をIgA−およびIgM−として判定した。この集団は、96ウェルプレート内に選別された単一細胞であった。
【０４０５】
実施例3：形質芽球は免疫学的負荷を受けている対象に存在する
形質芽球は、一般的に健常ドナーにおいてB細胞の約0.15％を占めるが、感染症（例えば、黄色ブドウ球菌およびクロストリジウム・ディフィシル感染症）、進行を伴わない癌（例えば、介入（肺腺癌患者の場合には化学療法、および転移性黒色腫患者の場合にはイピリムマブ療法）後に活性B細胞応答に関連した長期非進行者になった患者の肺の転移性黒色腫および転移性腺癌）、およびワクチンの接種（例えば、インフルエンザ）を含む多様な免疫学的負荷を受けている対象においては、約3.3％〜16.4％に及び得る。
【０４０６】
図23は、対合した抗体レパートリーの高性能配列決定および活発な液性応答抗体レパートリーの特徴付けのために、形質芽球が広範囲な対象に存在していたことおよびそれらから入手可能であったことを示している。このことは、本明細書において開示される方法論を用いて、重鎖および軽鎖（H＆L）の進化樹を獲得することができ、かつ該方法論は、この情報を用いて、例えば：a）新規な抗原の発見；b）ワクチン設計の情報を与えること、例えば、免疫システムを用いて、公知および新規の抗原のどちらが関心対象の病原体または標的のオプソニン化および食作用および／または殺傷／阻害に有用でありそうかを本発明者らに知らせること、かつ任意で、それをワクチン設計に導入すること；c）例えばワクチンから、中和モノクローナル抗体を作製すること；d）結合モノクローナル抗体を作製すること；e）微生物病原体に対する抗体を作製すること；ならびにf）癌に対する抗体を作製すること、のために抗体をクローン化および／または発現させることができることを実証している。これらの例を、以下により詳細に記載する。
【０４０７】
実施例4：CCP＋RAにおける疾患活動性は循環形質芽球と相関している
本発明者らの方法を、同定可能なペアの免疫グロブリン遺伝子の配列決定に用いることができるということが示されているため、本発明者らは、本発明者らの方法を用いて、CCP＋RA患者における形質芽球の抗体レパートリーを調べた。本発明者らは、同意したRA患者から血液サンプルを入手し、フローサイトメトリーによって形質芽球を染色した（図5a）。循環形質芽球を、総PBMCについてのパーセンテージとして表した。本発明者らは、CCP＋RA患者が、CCP−RA患者よりも有意に高い末梢血形質芽球パーセンテージを有することを見出した（図5b）。さらには、CCP−患者においてはそうではないが、CCP＋患者における形質芽球パーセンテージは、疾患活動性と相関していた（r＝0.35およびp＝0.028）（図5c）。
【０４０８】
実施例5：形質芽球は抗CCP抗体を産生した
CCP＋患者は、疾患活動性と相関した形質芽球パーセンテージを有するが、これらの患者は、循環形質芽球パーセンテージを上昇させた進行中の感染症または他の因子を有し得る。CCP＋患者における循環形質芽球の特異性を判定するために、患者由来のRosetteSepで濃縮したB細胞を、10％FBSを補充したRPMI中で培養した。形質芽球が抗体を分泌する唯一の細胞であるために（不活性なままの他のB細胞とともに）、抗IgM、IL-6、BAFF等の他の培地サプリメントを用いなかった。形質芽球のみが抗体を産生することを確認するために、本発明者らは、形質芽球のサンプルの一部を枯渇させた（図5d）。次いで、B細胞を7日間培養し、その後上清を回収し、それをLuminexペプチドアレイにかけた。アレイは、シトルリン化ペプチドに対する抗体反応性をアッセイする。抗体反応性は、モックを枯渇させたB細胞の上清と比較して、形質芽球を枯渇させたサンプルの上清において消失しており、形質芽球が相当量の抗シトルリンペプチド自己抗体を分泌することを示唆した（図5e）。さらには、各サンプルに対して60を上回る平均蛍光強度（MFI）を有するペプチドがカウントされた場合、循環形質芽球パーセンテージと抗体が反応するペプチドの数との間に強い相関が見出された（r＝0.90およびp＝0.0139）。60というMFIが選出され、これは、このMFIを下回る場合に、ペプチド反応性の99％超を、形質芽球を枯渇させたサンプルの上清に収めるためであった。
【０４０９】
実施例6：454シークエンシングおよび配列の分析
上記のように、患者由来の形質芽球を96ウェルプレート内に単一細胞選別し、これらのRNAを逆転写し、それらが上記のようにサンプルID（サンプル同定領域）およびプレートID（プレート同定領域）バーコードを含有するように、材料および方法のセクションにおける「タッチダウンPCR」に従ってPCR増幅した。図3を参照されたい。次いで、454 DNAシークエンシング機器（DNA Sequencing Center, Brigham Young Universityおよび454 sequencing center, Roche）からcDNAの配列を獲得した。
【０４１０】
ショットガンパイプラインを用いた第一の454シークエンシングランから配列を獲得した。454 GS FLXデータ分析一式の修正したアンプリコンフィルターを通して、第二の454シークエンシングランから許容される品質の配列を獲得した。＜vfScanAllFlows＞が「false」に設定され、かつ＜vfBadFlowThreshold＞が「6」に変更されるように、アンプリコンフィルターを修正した。第三および第四のランからの配列は、標準的454アンプリコンフィルターを用いて獲得された。次いで、材料および方法における「ウェルへの配列の割り当て」のセクションに記載されるように、フィルターを通過した配列を処理し、材料および方法における「配列のアセンブリ」に記載されるように、各ウェル内の配列を個々にアセンブルした。次いで、アセンブルした配列をIMGT HighV-Questを用いて解析して、用いられたVDJ領域の同定を得た。
【０４１１】
配列アセンブリおよびV(D)J使用法の同定後、ClustalXを用いて、配列をクローンファミリーにクラスター化した（図6）。あるいは、順方向および逆方向の読み取りの両方を用いて、配列をアセンブルすることができる。この場合、上記のように、細分された順方向配列がまずアセンブルされる。次いで、HighV-QUEST、ならびにプレートIDおよびV(D)J使用法に従った順方向および逆方向配列のサブセットを用いて、順方向および逆方向配列のV(D)J使用法が同定され、Newblerを用いて順方向および逆方向配列がアセンブルされる。免疫グロブリンは非常に類似しているため、配列のより小さなサブセットからのアセンブリによって、異なる細胞由来の配列が間違って対合されるという潜在的な問題は回避される。
【０４１２】
実施例7：進化樹への配列のクラスター化
末梢血単核細胞（PBMC）を、示された診断を有するまたはワクチン接種後のヒト対象から単離した。形質芽球を96ウェルプレートにおける個々のウェル内に単一細胞選別し、各ウェルにおいて単一細胞サンプルを作り、次いで各ウェルにおけるmRNAを逆転写し、次いでウェル内容物をプールし、2ラウンドのPCRに供して、免疫グロブリン重鎖および軽鎖cDNAを増幅した。材料および方法のセクションにおける「タッチダウンPCR」および「非タッチダウンPCR」にそれぞれ記載されるように、逆転写によって、各単一サンプルから産出されたすべてのcDNAに同定サンプルIDが付加され、第一ラウンドおよび第二ラウンドのPCRによって、あらゆるアンプリコンにプレートID、次いで454 Titanium Primer AおよびBが付加された。図3に概略的方法論の概要を示す。プールしたアンプリコンを454シークエンシング技術で配列決定し、上記のように、許容される品質の読み取りを獲得した。材料および方法における「ウェルへの読み取りの割り当て」および「配列のアセンブリ」のセクションに記載されるように、読み取りをウェルに割り当て、アセンブルした。次いで、アセンブルした配列におけるV(D)JセグメントをHighV-QUESTを用いて同定した。次いで、アセンブルした配列と合致する化合物バーコードとを単にまとめることによって、共有の化合物バーコードを有する同定された重鎖および軽鎖を対合させることができる。
【０４１３】
個々のヒト対象由来のアンプリコンを、これらのV(D)Jセグメントに基づいてクラスター化し、同じV(D)Jセグメントを表す配列を、同じクローンファミリーからのものとして分類した（図7）。各円グラフは、同一のV(D)J遺伝子セグメントを発現している個々のヒト対象由来の個々の形質芽球に由来するクローンのパーセンテージ（すなわち、各クローンファミリー中のクローンのパーセンテージ）を表す。ヒト対象には、敗血症（2人の対象）、関節リウマチ（3人の対象）、肺癌（1人の対象）、およびインフルエンザに対するワクチン接種後（1人の対象）の人が含まれた。急性（敗血症およびインフルエンザワクチン）および慢性（関節リウマチおよび肺癌）の症状を経験している対象の両方の形質芽球からクローンファミリーを単離することができることを示すために、これらの対象を選出した。
【０４１４】
図7の個々のヒト対象由来の免疫グロブリン重鎖V(D)J配列を、ClustalXを用いてクラスター化し、Treeviewを用いて根付いていない放射状の樹として示した（図8）。各放射状の樹は、個々のヒト対象に由来する重鎖配列を表す。各放射状の樹に対して、末端側の終端は固有の配列を表す。主要な枝は、クローンファミリーを表し、より小さな枝は、結合部多様性（P-ヌクレオチドもしくはN-ヌクレオチドの付加、またはヌクレオチドの欠失）、体細胞超変異、および親和性成熟によって生じた突然変異によって互いに異なるクローンサブファミリーを表す。
【０４１５】
実施例8：抗体のクローニング、発現、および精製
上記の材料および方法のセクションに記載されるように、選択されたすべての抗体をクローン化し、発現させ、かつ単離した（Lonzaベクター内への重鎖および軽鎖のクローニング；293Tにおけるモノクローナル抗体の発現；抗ヒトIgG ELISA；およびプロテインAによる発現したモノクローナル抗体のIgG精製のセクションを参照されたい）。次いで、以下に論述されるように、精製した抗体をさらなる調査に用いた。
【０４１６】
実施例9：インフルエンザワクチン接種後の対象由来の抗体の特徴付け
上記のように、インフルエンザワクチンを投与されたヒト由来の抗体を選択し、単離した。以下のさらなる特徴付けのために選択された抗体を、適切なセクションにおいて示す。
【０４１７】
Fluzone ELISA
3株の不活性化ウイルスであるA/カリフォルニア/7/2009株、A/パース/16/2009株、B/ブリスベン/60/2008株からなる、Fluzone由来の2010/2011季節性インフルエンザワクチンを志願者に投与した。結合活性を有する発現した抗体についての初期スクリーニングとして、上記のようにFluzone ELISAを実施して、ワクチンを接種された志願者に由来するモノクローナル抗体が、インフルエンザワクチン自体に結合するかどうかを判定した。31種のうち14種の抗体がFluzone ELISAに結合し（図26）、続いてこれらのうちのサブセットを選択し、表面プラズモン共鳴を用いてヘマグルチニンへの結合活性について試験した。Fluzone ELISAによって特徴付けされた抗体は、：Flu14〜Flu23、Flu25〜Flu27、Flu29、Flu30、Flu34、Flu35、Flu37、Flu39〜Flu41、Flu43〜Flu46であった。S1およびS2を陰性対照として用いた。
【０４１８】
インフルエンザ抗体親和性についての表面プラズモン共鳴による判定
上記のように、ProteOn表面プラズモン共鳴バイオセンサー（BioRad Labs）を用いて、モノクローナル抗体（mAb）のHA分子への結合を25℃で分析した。Fluzone ELISAに結合した14種の抗体のうち、10種はH3に結合し、1種はH1に結合したが、3種は結合しなかった（図27）。非結合物のうちの1種、H1結合物、および4種の他のランダムに選出したH3結合物を選択し、受託試験機関（CRO）に送って、マイクロ中和アッセイにおいて中和活性を試験した。SPRによって特徴付けされた抗体は、：Flu14〜Flu22、Flu26、Flu29、Flu34、Flu35、Flu46であった。
【０４１９】
インフルエンザマイクロ中和アッセイ
上記のように、Fluzone ELISAにおいて結合活性を示した発現したインフルエンザ抗体の一部を、マイクロ中和アッセイのために、外部のCRO, Virapur, LLCに送った。アッセイの結果は、以前のアッセイにおいてH1に結合した抗体はH1を中和し、一方で以前のアッセイにおいてH3に結合した抗体はH3を中和することを示した。非結合物は、インフルエンザウイルスを中和しなかった（図28）。マイクロ中和アッセイによって特徴付けされた抗体は、Flu15、Flu16、Flu18、Flu19、Flu20、Flu21であった。
【０４２０】
CDRのバリエーション
上記のように、インフルエンザ抗体を獲得した。図25は、明確にするために引き伸ばした部分的系統樹を示している（a）。クローンファミリーがはっきりと見え、影付きのクローンファミリーは、灰色の囲みで示される割り当てられたV(D)Jを有する。重鎖および軽鎖に対するCDR（囲み領域）にわたるアミノ酸配列を、それぞれ図25（b）および（c）に示し、鎖間でいくつかの残基の相違を示している。
【０４２１】
上記のこれらの結果は、本明細書において記載される組成物および方法を用いることによって、進化樹を獲得することができることを実証している。本明細書において記載される組成物および方法を用いることによって、急性症状を経験している対象の形質芽球等の活性化B細胞から、完全なヒトモノクローナル抗体を単離することができる。本明細書において記載される組成物および方法を用いることによって、これらの完全なヒトモノクローナル抗体は、中和抗体でもあり得る。結果は、本明細書において開示される組成物および方法を用いて、外来抗原を標的とするmAbを単離することができることも実証している。
【０４２２】
実施例10：RAを有する対象由来の抗体の特徴付け
上記のように、関節リウマチ（RA）に罹患しているヒト由来の抗体を選択し、単離した。以下のさらなる特徴付けのために選択された抗体を、適切なセクションにおいて示す。
【０４２３】
RA抗原マイクロアレイでのRA抗体の反応性
材料および方法における「RA抗原アレイでのRA抗体の反応性」のセクションに記載されるように、RA患者に由来する抗体をRA抗原アレイ上にプローブさせ、蛍光をGenePix機でスキャンした。Java（登録商標） TreeViewソフトウェアを用いて、同定された関係性をヒートマップとして表示した（図37）。本アッセイによって特徴付けされた抗体は、：RA1、RA2、RA3、RA4、RA8〜RA13、RA16、RA19、RA22、およびRA23であった。Flu14およびFlu26を陰性対照として用いた。
【０４２４】
抗ヒストン2A ELISA
材料および方法のセクションにおける「抗ヒストン2A ELISA」に記載されるように、H2Aに対する抗体の検出のために、直接的ELISAを実施した。図35aは、試験した各抗体に対して検出された吸光度値を示している。図35aにおいておよび以下の抗CCP2 ELISAにおいて特徴付けされた抗体は、：RA1、RA2、RA4〜RA16、RA19、RA23〜RA24であった。図36は、30μg/mlの抗体を用いた別の独立したELISAでの、選択された抗体（RA1、RA2、RA8、RA9）を示している。
【０４２５】
抗CCP2 ELISA
材料および方法のセクションにおける「抗CCP2 ELISA」に記載されるように、抗CCP2 ELISAを実施した。図35bは、試験した各抗体に対して検出された吸光度値を示している。
【０４２６】
抗リウマチ因子ELISA
RA患者に由来する抗体を直接的ELISAにおける一次抗体として用い、抗ヒトIgG-HRPを二次抗体として用い、TMB基質を用いて可視化した。材料および方法のセクションにおける「抗リウマチ因子ELISA」に記載されるように、リウマチ因子（RF）に対する抗体の検出のために、抗RF ELISAを実施した。図34は、RA2およびRA3抗体が反応性を示したことを示している。ここで特徴付けされた抗体は、：RA1〜RA6、RA8〜RA12、RA14であった。
【０４２７】
上記のこれらの結果は、本明細書において記載される組成物および方法を用いることによって、慢性症状を経験している対象の形質芽球等の活性化B細胞から、抗体を単離することができることを実証している。結果は、本明細書において開示される組成物および方法を用いて、自己抗原を標的とするmAbを単離することができることも実証している。
【０４２８】
実施例11：肺癌を有する対象由来の抗体の特徴付け
上記のように、転移性肺腺癌に罹患している長期非進行のヒト由来の抗体を選択し、単離した。このヒトは、転移性肺腺癌を発症し、癌に屈すると予想されたが、化学療法の後、この患者は、全末梢血B細胞の3.1％を占める形質芽球と関連した、4年を超える長期非進行の状態に入った。この患者における末梢血形質芽球レベルの上昇は、進行中の免疫応答が、この女性の長期非進行に寄与している可能性があることを示した。下記のさらなる特徴付けのために、以下の抗体：LC1、LC5〜LC7、LC9〜LC18を選択した。Flu16を陰性対照として用いた。
【０４２９】
肺癌組織アレイ上での肺腺癌患者由来の抗体の免疫組織化学
材料および方法のセクションにおける「肺癌組織アレイ上での肺腺癌患者由来の抗体の免疫組織化学」に記載されるように、2つの異なるタイプの組織マイクロアレイ用スライドを用いた免疫組織化学を実施した。本発明者らの結果は、発現した抗体のうちの1種が肺腺癌に結合することを実証した（図32）。
【０４３０】
肺腺癌患者由来の発現した抗体の肺腺癌細胞株への結合についてのフローサイトメトリーによる判定
材料および方法のセクションにおける「肺腺癌患者由来の発現した抗体の肺癌細胞株への結合についてのフローサイトメトリーによる判定」に記載されるように、種々の肺癌細胞株への抗体の結合を実施した。本発明者らの結果は、1種の抗体が肺腺癌細胞株に結合すること、かつ肺腺癌に特異的であり得ることを示した（図33）。
【０４３１】
上記のこれらの結果は、本明細書において記載される組成物および方法を用いることによって、癌等の慢性症状を経験している対象の形質芽球等の活性化B細胞から、抗体を単離することができることを実証している。結果は、本明細書において開示される組成物および方法を用いて、自己抗原を標的とするmAbを単離することができることも実証している。
【０４３２】
実施例12：黄色ブドウ球菌感染症を有する対象由来の抗体の特徴付け
抗生物質の非存在下において感染症の免疫介在性制御を有する慢性黄色ブドウ球菌性骨髄炎を有するヒトを含む、黄色ブドウ球菌感染症を有するヒトを、そこから末梢血形質芽球を染色しかつ選別する、末梢血の供給源として用いた。バーコード化、454シークエンシング、およびバイオインフォマティクス分析を用いたcDNA処理によって、黄色ブドウ球菌に対して効果的な免疫応答を開始しているヒトにおける抗体レパートリーの進化樹を作り出した。上記のように、黄色ブドウ球菌感染症に対して効果的な免疫応答を開始しているヒト由来の抗体を選択し、単離した。以下のさらなる特徴付けのために選択された抗体を、適切なセクションにおいて示す。
【０４３３】
ブドウ球菌フローサイトメトリー
材料および方法における「ブドウ球菌フローサイトメトリー」のセクションに記載されるように、抗ブドウ球菌抗体を用いて、固定した黄色ブドウ球菌を染色した。本発明者らの結果は、S6およびS11抗体が、黄色ブドウ球菌の表面に結合すること、かつオプソニン化の候補であり得、黄色ブドウ球菌の食作用および殺傷／阻害をもたらし得ることを示した（図29）。本アッセイにおいて特徴付けされた抗体は、：S1〜S4、S6〜S13であり、陰性対照としてのF26を含む。
【０４３４】
ブドウ球菌阻害アッセイ
材料および方法における「ブドウ球菌阻害アッセイ」に記載されるように、対数増殖期にある黄色ブドウ球菌を抗ブドウ球菌抗体と組み合わせて、抗体の阻害活性を判定した。本発明者らの結果は、クローン化されかつ発現させた抗体のいくつかが、黄色ブドウ球菌に対して強力な殺傷／阻害活性を呈したことを実証している（図30）。本アッセイによって特徴付けされた抗体は、S6およびS9であり、陰性対照としてのLC1を含む。
【０４３５】
ブドウ球菌感染した患者に由来する抗体を用いたブドウ球菌抗原の免疫沈降
材料および方法の「ブドウ球菌感染した患者に由来する抗体を用いたブドウ球菌抗原の免疫沈降」に記載されるように、抗体を用いて、種々のブドウ球菌抗原候補を免疫沈降した。次いで、以下に記載されるように、質量分析を用いて、免疫沈降されたタンパク質を同定した。本アッセイによって特徴付けされた抗体は、S1〜S13であった。
【０４３６】
ペプチドの質量分析による同定
材料および方法の「ペプチドの質量分析による同定」に記載されるように、関心対象の染色されたタンパク質バンドを選択し、質量分析に供した。結果は、S4抗体に対する推定結合標的として、フェノール可溶性モジュリンα1ペプチドまたはδ溶血素のいずれかを同定した。これは、本明細書において開示される方法を用いて、新規な抗原の発見を果たすことができることを実証している（図31）。本アッセイによって特徴付けされた抗体は、S4であった。
【０４３７】
上記のこれらの結果は、本明細書において記載される組成物および方法を用いることによって、細菌感染症等の急性症状を経験している対象の形質芽球等の活性化B細胞から、抗体を単離することができることを実証している。結果は、本明細書において開示される組成物および方法を用いて、外来抗原を標的とするmAbを単離することができること、かつ選択された抗体に結合される抗原の身元を決定することができることも実証している。
【０４３８】
実施例13：芽球細胞および形質芽球の特徴付け
上記のように、進行中の免疫応答によって活性化されるB細胞由来の免疫グロブリン配列を用いて、進行中の免疫応答の進化樹を作り出すことができる。この進化樹は、典型的には、複数の線の先祖由来の活性化B細胞を表す複数のクローンファミリーを特徴とする。ナイーブB細胞由来の配列は、一般的に、それらは活性化されておらず、したがって活性のある進行中の免疫応答に対して全くかほとんど情報を提供しないため、そのような進化樹を作り出すために用いられ得ないと考えられる。活性化B細胞は、まず、活性化されかつサイズがより大きな芽球細胞になる。次いで、これらの芽球細胞は、メモリーB細胞または形質細胞のいずれかへ進む。ヒトにおいて、メモリーB細胞および形質細胞は免疫応答によって生じるが、それらは、以前の免疫学的発作に対する応答によって生じているメモリー細胞および形質細胞の大きなプールをつなぎ合わせ、最近または以前の免疫応答に対して、メモリーB細胞と形質細胞とを区別するのを困難にする。したがって、ヒトにおいて、芽球細胞は、進行中の免疫応答の進化樹を獲得するための配列決定の好ましい候補である。しかしながら、制御された条件で飼育される研究動物（例えば、マウス）において、それらは清潔な環境で飼育されているため、芽球B細胞、メモリーB細胞、および形質細胞はすべて、進化樹を獲得するための配列決定の候補であり、それらは、任意の主要な免疫学的負荷を以前に経験しているメモリー細胞または形質細胞の大きな集団を有しないはずであるため、厳しい免疫応答後、とくに追加免疫注射後に、大部分のメモリーB細胞および形質細胞が発作に対抗することを可能にする。
【０４３９】
ヒトにおいて、T細胞に対してと同様に、進行中の免疫応答の進化樹を獲得するための配列決定に好ましい細胞は、芽球T細胞であると考えられる。マウスに対して、活性化T細胞、芽球T細胞、およびメモリーT細胞はすべて、進化樹を獲得するための配列決定の好ましい候補である。
【０４４０】
芽球B細胞は、典型的なB細胞よりも大きいことが公知である。休止B細胞はそのうちの1種である小リンパ球のサイズは、典型的にはサイズが6〜8μmの間である。芽球リンパ球（T細胞およびB細胞）は、典型的にはサイズが8〜14μmの間である。（図41、Tzur et al, PLoS ONE, 6(1)： e16053. doi：10.1371/journal.pone.0016053, 2011；Teague et al, Cytometry, 14：7 2005も参照されたい）。形質芽球は、以下の発現パターン：CD19low／＋、CD20low／−、CD27＋、およびCD38hiを有し得る。これらのマーカーのすべての使用は、単一細胞選別に対して最も純度の高い集団をもたらすが、形質芽球を単離するために、上記マーカーのすべてを用いる必要があるわけではない。
【０４４１】
図39に例示されるように、より大きな細胞に対してFSChiを用いることによって、形質芽球にゲートをかけることができ、37％純度の形質芽球集団をもたらす。FSChiCD19hi細胞にゲートをかけることによって、72％の形質芽球純度が与えられる。FSChiおよびCD27＋、CD38hi、またはCD20−にゲートをかけることによって、それぞれ44％、80％、および71％の形質芽球純度が与えられる。これらのマーカーまたは他のB細胞と形質芽球とを区別し得ることが見出されている他のマーカーのいずれかの組み合わせを用いて、選別された形質芽球の純度を増大させることができるが、しかしながら、これらのマーカーのいずれか1つは、より低い純度ではあるが、単独で他のB細胞と形質芽球とを区別することができる。
【０４４２】
実施例14：配列決定および分析のための代替的プラットフォーム
材料および方法における「タッチダウンPCR」に記載される方法を用いたPacBioシークエンシングランのために、単一プレートのプレート44からの重鎖の読み取りを調製して、γ重鎖cDNAを増幅した。48回の第2のPCRを行って、PacBioランに対して十分なDNAを得た。「PacBioシークエンシングランのための調製」に記載されるように、DNAのプールおよびクリーンアップを行った。準備および配列決定のために、DNAをPacBioに送った。CCSの読み取りをPacBioから入手し、材料および方法における「ウェルへの配列の割り当て」および「配列のアセンブリ」に従って、ウェルに割り当て、アセンブルした。割り当ての結果は図38にある。これは、本発明者らの方法および組成物が、高性能配列決定に対して、プラットフォーム特異的でないことを示している。
【０４４３】
実施例15：454 XL＋ランでの配列決定および分析
「454 XL＋シークエンシングランのための調製」に記載される方法に従うことによって、配列決定を454 XL＋ランに適合させることができる。454 XL＋シークエンシングランは、現在のところ、Lib-L化学反応のみをサポートしており、一方で本発明者らの454 XLR70ランはLib-A化学反応を利用するため、これを行う必要がある。XLR70ランでのアンプリコン配列決定のために、典型的なLib-A化学反応よりもLib-L化学反応が好まれる状況にも、一般的にこれを適合させることができる。「ウェルへの配列の割り当て」および「配列のアセンブリ」に記載される方法に従って、454 XL＋ランからの読み取りをさらにウェルに割り当て、アセンブルすることができる。454フィルタリング後のXLR70およびXL＋ランからの読み取りを同一の形式で用いることができ、すなわちクローニングおよび発現のための下流での抗体の選択、ならびに抗体の機能的特性のアッセイを、図6および9のとおりにさらに進めることができる。
【０４４４】
実施例16：対合した免疫グロブリン遺伝子のクローニング
各クローンファミリーは同じエピトープを認識し、かつ各ファミリー内の配列の差異は体細胞超変異が原因であると仮定して、本発明者らは、まず、関心対象の抗原に結合する抗体のスクリーニングのために、各クローンファミリーのうちの最も高頻度なクローンをクローン化し、発現させることができる（図6）。胚中心における親和性の成熟および選択の間、最も高い親和性で抗原に結合する中心細胞は、生存因子を求めて他の中心細胞と競合するため、本発明者らは、最も高頻度なクローンを用いる。したがって、本発明者らは、最も高頻度なクローンが最も高い結合親和性も有すると予想する。いったんクローンが抗原に結合し得る抗体として同定されると、次いでクローンファミリー全体からの代表的な対合した免疫グロブリン配列をクローン化し、発現させ、かつ中和抗体であることについてスクリーニングする（図6）。この過程は、クローンファミリー内に含有されている抗体のスペクトルを表す特異的クローンの結合および機能的特性についての直接的な試験および比較を可能にするために、クローンファミリー内の複数のサブクローンを表すまたはクローンファミリー内の異なるアイソタイプの抗体をコードする配列のクローニングおよび発現を伴ってよい。次いで、治療用ヒト抗体としての開発のためのさらなる特徴付けおよび考察のために、所望の結合および機能的特性を呈する特異的クローンを選択する。
【０４４５】
ファミリー（または関心対象の他の任意の抗体セット）からクローニングの候補を選択するための代替的手法は、抗体についての系統樹（phylogenetic tree）（クローンファミリーの場合、生殖系列配列で根付いた）を築くことである。そのような樹における葉ノードは、抗体ファミリーメンバーに相当する。次いで、樹の最上部から降下し、下部に最大数の葉ノードを有する枝を常に選び（同点の場合にはランダムに選び）、次いで葉の上部の最後のノードにおいて、最大数の突然変異を有する葉を選ぶ、または同点の場合にはランダムに選ぶことによって、クローニングの候補を選択する。次いで、必要に応じて、所望の数に到達するまで以下のように候補を繰り返して選択することによって、さらなる候補を選択することができる。樹におけるあらゆるノードに対して、ノードの子孫である葉のいずれも選択されなかった場合、子孫である葉の数をカウントする。最大のそのようなカウントを有するノードに対して（同点の場合にはランダムに選ぶ）、降下は、最大数の子孫葉ノードを有する枝を常に選ぶ（枝間で同点の場合にはランダムに選ぶ）。次いで、葉の上部の最後のノードにおいて、最大数の突然変異を有する葉を選ぶ、または同点の場合にはランダムに選ぶ。
【０４４６】
抗体のファミリー（または関心対象の他の任意の抗体セット）から候補を選択するためのさらに別の手法は、生殖系列と比較して少ない数の非サイレント突然変異によって抗体を列挙し、かつリストから順々に選択し、それによって最も進化している抗体を選ぶことである。
【０４４７】
実施例17：ヒト抗体候補の恒久的トランスフェクションおよび発現
所定のサンプルIDに特異的なクローニングプライマーを用いることによって、配列のプールしたプレートから所望のクローンを選択的に増幅する；これらのプライマーは、クローン内に異なる5'および3'制限部位も組み入れる。次いで、ベクター内にクローンを挿入するために、制限部位を用いる。増幅したクローンは、部分的定常領域配列のみを含有し得るため、ベクターは、増幅したクローンをオープンリーディングフレームに挿入するのに必要とされる適切な制限部位を有するκ、λ、またはγ定常領域のいずれかをすでに含有している。クローンは可変配列を有するため、制限酵素によってその後切断されるであろう、クローン自体にも存在する制限部位の潜在的問題を回避するために、複数の制限部位をベクター内に遺伝子操作する。これにより、できる限り多くのクローンを挿入することが可能となる。用いるベクターは、異なる哺乳類用選択可能マーカーを有する2種の別々のベクター（遺伝子操作された制限部位を有する定常領域遺伝子を含有している、改変型Invitrogen pcDNA3.3またはpOptivecベクター）、または両方の遺伝子を含有している二重発現ベクター（Lonza GSシステム；pEE6.4およびpEE12.4）のいずれかである。定常領域インサートの配列について、それぞれ表16および17を参照されたい。pOptivecにおけるジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）またはLonza GSシステムにおけるグルタミン合成酵素（GS）等の選択マーカーは増幅可能であり、大量の抗体を必要とするさらなるスクリーニング（例えば、インビボスクリーニング）のための、遺伝子増幅および効率的な抗体の産生を可能にする。一方のベクターに軽鎖およびもう一方のベクターに重鎖を有する（改変型pOptivecおよびpcDNA3.3）、または両方の遺伝子を含有している二重発現ベクター（Lonza GSシステム）での二重トランスフェクションのいずれかを用いて、哺乳類細胞をトランスフェクトする。
【０４４８】
改変型Invitrogenベクター。ベクターは、異なる哺乳類用選択可能マーカーおよび遺伝子操作された制限部位を有する2種の別々のベクターである。pcDNA3.3は、選択可能マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を有し、pOptivecは、DHFR選択可能マーカーを有する。ジェネティシンによる選択下で、CHO DHFR細胞に改変型pcDNA3.3およびpOptivecを同時トランスフェクトする。DHFRのコピーを含有している、pOptivecをトランスフェクトされたDHFR細胞のみが生存し、pcDNA3.3におけるネオマイシン耐性遺伝子はジェネティシンに対する耐性を与える。これにより、両方のベクター（一方のベクターに軽鎖およびもう一方のベクターに重鎖を含有している）を上手くトランスフェクトされた細胞の選択が可能となり、したがって機能的免疫グロブリンを産生する。
【０４４９】
Lonza GSシステム。Lonza GSシステムは、pEE12.4およびpEE6.4ベクターを利用する。pEE12.4ベクターは、増幅可能な選択マーカーとしてGS遺伝子を含有しており、pEE6.4は、補助的ベクターである。軽鎖をベクターの一方に、重鎖をもう一方のベクター内にクローニングする。その後、両方のベクターを制限酵素で切断し、一緒にライゲーションして、別々のプロモーター上に重鎖および軽鎖遺伝子の両方を発現し得る1個のベクターを形成する。したがって、1個のベクターから両方の遺伝子の発現を可能にする、二重発現ベクターシステムである。メチオニンスルホキシイミンの選択下で、CHO細胞に二重発現ベクターをトランスフェクトする。ゆえに、トランスフェクトされた細胞を選択する。
【０４５０】
遺伝子増幅
ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）およびGSの両方は、増幅可能な選択マーカーである。それぞれ増大する量のメトトレキサートおよびメチオニンスルホキシイミンからの選択圧の下で、DHFRおよびGS遺伝子を含有しているゲノム領域を複製しているトランスフェクトされた細胞株は、選択用試薬に対して、より耐性があるため生存する。挿入された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子等の選択マーカー付近の遺伝子も増幅され、免疫グロブリンのより多くの遺伝子コピーおよびより大きな産生率をもたらす。インビトロスクリーニング（下記を参照されたい）において中和特性を有することが見出されている抗体を産生するクローンを増幅し、それによって後のインビボ調査のためのより多くの抗体を獲得することができる。
【０４５１】
実施例18：発現したヒト抗体の特異性の同定
抗体スクリーニングは、2つの段階で生じる。本発明者らは、新規な「選択的スクリーニング」過程を利用しており、そこで本発明者らは、まず、中和抗体についてのスクリーニングに用いられる適切なクローンファミリーを選択する。本発明者らは、抗原に結合し得るその能力について、各クローンファミリーのうちの最も高頻度な1〜3個のクローンをスクリーニングする。フローサイトメトリーを用いて細胞に結合する抗体を同定してもよいが、本発明者らのスクリーニングは、典型的には間接的ELISAの形態をとる。これは、まず適切な抗原をELISAプレートに結合させる工程、次いで発現した抗体を含有している上清とともにそれをインキュベートする工程を含む。特異的二次抗体によって、抗原に結合する抗体を検出する。
【０４５２】
いったん結合抗体が同定されると、「選択スクリーニング」というスクリーニング段階において、そのクローンのクローンファミリー全体をクローン化し、発現させる。クローンファミリーにおけるすべての抗体は同じエピトープに結合すると予想されるが、それらは、抗原結合の親和力の点でおよび抗原上でのそれらの位置決めの点でわずかに異なる可能性があり、その相違は結合特性および／または抗体の中和力に影響を及ぼし得、ゆえに、ほとんどの場合には、いくつかの異なる抗体（それらのCDR3領域に小さな相違を持っている）を発現させ、結合および中和特性についてスクリーニングする。
【０４５３】
特異的リガンド／受容体ペアを標的とする抗体を中和するために、まず、293T細胞に、NF-kB転写応答エレメントに連結させたルシフェラーゼ遺伝子を含有しているプラスミド等のシグナル伝達経路レポーター構築物を安定的にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞におけるNF-kBの活性化によって、その活性をルシフェラーゼアッセイで判定することができるルシフェラーゼの発現が誘導される。これは、リガンド−受容体結合によって活性化されたNF-kBシグナル伝達を測定する。ほとんどのシグナル伝達経路がNF-kBを活性化するため、NF-kBは、シグナル伝達の選択肢である。他のシグナル伝達経路をアッセイするために、ルシフェラーゼ遺伝子のプロモーター領域は、例えばAP-1に対するもの等の適切な転写結合部位を含有している。次に、293T細胞に標的受容体をトランスフェクトする。次いで、96ウェルプレートにおいて、293T細胞をリガンドおよび関心対象の結合抗体とともにインキュベートする。24時間または48時間後、ルシフェラーゼアッセイを行って、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を判定する。中和抗体を含むウェルは、全くルシフェラーゼ発現を有しないか、最小量しか有しない。NF-kBシグナル伝達経路におけるリン酸化シグナル伝達タンパク質についてのウェスタンブロッティングによって、結果を検証する。中和抗体は、リガンド−受容体のシグナル伝達を妨げ、その結果としてシグナル伝達タンパク質のリン酸化を無効にする。
【０４５４】
癌抗原および細菌抗原等の生細胞上に存在する抗原に対して、インビトロ中和アッセイは、生／死細胞を検出するアッセイの形式をとり、高性能な形態で行われ得る。96ウェルプレートにおいて、癌細胞または細菌を抗体候補とともにインキュベートする。次いで、生細胞と死細胞とを区別し、かつフローサイトメトリーに適合する染色を各ウェルに適用することができる。生細胞および死細胞を異なるフルオロフォアで染色し、フローを用いて生細胞および死細胞のパーセンテージを与えることによってスクリーニングする。インビトロスクリーニングを通過する抗体を、次いでそれらの中和活性についてインビボでスクリーニングする。
【０４５５】
標準的なプラーク中和アッセイを用いて、ウイルスインビトロ中和アッセイを実施してよい。プラーク中和アッセイを96ウェルプレートで行うことによって、各ウェルを、顕微鏡を用いて撮影することができ、プラークカウントを画像分析ソフトウェアで自動化することができる。中和抗体は、プラーク形成を減少させる。次いで、これらの抗体を、中和活性についてインビボでさらにスクリーニングする。
【０４５６】
ELISA（実施例7）およびフローサイトメトリー（実施例9および10）を用いた結合活性についての成功したアッセイについて、実施例9のセクション「Fluzone ELISA」、実施例11のセクション「フローサイトメトリーによる...」、および実施例12のセクション「ブドウ球菌フローサイトメトリー」を参照されたい。中和活性を有する抗体についての成功したアッセイについて、実施例9のセクション「インフルエンザマイクロ中和アッセイ」を参照されたい。
【０４５７】
実施例19：1ウェルあたり1個を上回る細胞を用いたB細胞の配列決定
複数のB細胞を有する個々のサンプルを、容器内で別々に逆転写する。逆転写によって、すべての第一鎖cDNAにサンプルIDおよび5'ユニバーサルプライマー領域が付加される。1セットの容器のすべての容器からのcDNAをプールし、2ラウンドのPCRを受けさせる。工程は、材料および方法における「タッチダウンPCRおよび非タッチダウンPCR」、「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に記載されるとおりである。プライマーに対する配列も図9に示す。留意すべきは、どの遺伝子が増幅されるかにかかわらず、順方向プライマーは一定のままであることである（b）。RTおよび2回のPCRの後、すべての容器セットからのアンプリコンをプールし、454シークエンシングする。配列のウェルへの割り当ておよび配列のアセンブリは、材料および方法における「ウェルへの配列の割り当て」および「配列のアセンブリ」に記載されるプロトコールに従う。プレートIDおよびサンプルIDの組み合わせによって、同じサンプルを起源とする配列の同定が可能となる。
【０４５８】
たとえ1ウェル内に複数の細胞が存在するとしても、本発明者らは、個々の重鎖と軽鎖とを対合させることができる。共通の祖先に由来するB細胞からの重鎖は、軽鎖がそうであると考えられるように、クローン的に関連していると考えられる。したがって、本発明者らは、ウェルにわたる相関関係を観察することによって、重鎖クローンファミリーを軽鎖クローンファミリーに関連付けすることができる。いったんクローンファミリーの重鎖とクローンファミリーの軽鎖との間に関連付けが確立されると、重鎖クローンファミリーのメンバーである重鎖、および軽鎖クローンファミリーのメンバーである軽鎖を選択することによって、各ウェルにペアを割り当てる。1例の重鎖ファミリーおよび1例の軽鎖ファミリーのみが1ウェル内に存在する場合、ペアの選択は一義的である。どの重鎖および軽鎖が互いに関連しているかを判定した後、進化樹を描くことができ、抗体をそれらの機能的特性についての下流での特徴付けのために選択することができる。
【０４５９】
実施例20：1ウェルあたり1個または複数個の細胞を用いたB細胞の配列決定
いくつかのプレートにおいては1ウェルあたり1個のB細胞に、他のプレートにおいては1ウェルあたり複数のB細胞に、サンプルを選別することができ、その上、重鎖および軽鎖を、1個を上回るB細胞を有するそれらのウェルに対してさらに対合させることができた。本発明者らは、上記の実施例9のインフルエンザワクチン接種患者から産出された配列を調査し、いくつかのウェルは、1個を上回る別個の重鎖配列アセンブリまたは1個を上回る別個の軽鎖配列アセンブリが観察された。RT、PCR、配列決定、ならびに配列のウェルへの割り当ておよび配列のアセンブリは、上記の実施例9におけるプロトコールに従った。どの重鎖および軽鎖が互いに関連しているかを判定するために、すべての重鎖をグループ化することによって、同じVおよびJ遺伝子使用法を有する、ならびにV遺伝子セグメントの終わりとJ遺伝子セグメントの始まりとの間に同じ数のヌクレオチドを有するクローンファミリーに重鎖を割り当てた。すべての軽鎖をグループ化することによって、同じVおよびJ遺伝子使用法を有する、ならびにV遺伝子セグメントの終わりとJ遺伝子セグメントの始まりとの間に同じ数のヌクレオチドを有するクローンファミリーに軽鎖を割り当てた。まず、重鎖および軽鎖の間の対関係を、1個のウェルを共有している（すなわち、同じ化合物バーコードを有している）それらに基づき、正確に1種の重鎖および1種の軽鎖を有するウェルに割り当てた。次いで、重鎖クローンファミリーと軽鎖クローンファミリーとのそれぞれの可能性のある対合に対して、スコアをコンピューターで計算した。重鎖ファミリーおよび軽鎖ファミリーのメンバーが1個のウェルを共有する回数をカウントすることによって、スコアを決定した。次いで、各重鎖ファミリーを、最も高いスコアが達成された軽鎖ファミリーに関連付けし、または1個を上回る軽鎖ファミリーで最も高いスコアが達成された場合には、重鎖ファミリーを軽鎖ファミリーに関連付けしなかった。次いで、全体的に最も高いスコアの重鎖ファミリーから始め、かつペアを割り当てているファミリーの中を1ウェルずつ進み、次いで次の重鎖ファミリーに継続することによって、個々の重鎖および軽鎖を対合させた。所定の重鎖ファミリーに対して、各ウェルに対して、重鎖ファミリーのメンバーである1種の重鎖がウェル内に存在した場合、そのウェルからの、重鎖ファミリーの関連付けされた軽鎖ファミリーに属する軽鎖を、該重鎖のペアであるように割り当てた。1種を上回るそのような軽鎖が存在した場合、ペアを割り当てなかった。すべてのファミリーおよびそれらのファミリー内のすべての鎖が検討されるまで、重鎖と軽鎖とを関連付けするこの過程を継続した。所定の重鎖または軽鎖に対して、該過程によって1個を上回る対合の候補がもたらされた場合、両方の重鎖および軽鎖を破棄した。進化樹を対合した鎖から作り出し、抗体をそれらの機能的特性についての下流での特徴付けのために選択した。進化樹の一部を図25Aに示す。
【０４６０】
実施例21：ヒトモノクローナル抗体を産出するための、選別された形質芽球の使用
急性、亜急性、または進行中の循環形質芽球の産出をもたらす最近または現在の症状を有する対象から、末梢血（全血または末梢血単核細胞（PBMC））に対してフローサイトメトリーを実施して、形質芽球集団を同定する。次いで、このB細胞の集団を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結するか、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。RTの間、ウェル特異的サンプルIDアダプターオリゴヌクレオチドを、反応に添加する。これらのアダプターは、異なるウェルを起源とするものとして配列を同定し得るウェル特異的バーコード配列（サンプルID）を有する。MMLV H−逆転写酵素の3'テーリングおよび鋳型切り替え活性を利用することによって、サンプルIDを第一鎖cDNAの3'末端に付加する。各プレート由来のcDNAを一緒にプールする。第一ラウンドのPCRの間、プレート特異的FWロングプライマー1は、アンプリコンの5'末端にプレートIDを付加する。ゆえに、異なるプレートIDを有するFWロングプライマー1を、各PCR産物に同定バーコード配列を与える異なるプレートに添加する。遺伝子特異的逆方向プライマーを用いて、κ、λ、およびγ鎖を増幅し、それらは、それぞれκGSP1、λGSP1、およびγGSP1である。これらのプライマーは、免疫グロブリン遺伝子の定常領域に結合する。第一ラウンドのPCR由来の産物を希釈し、第二のネステッドPCRに用いる。FWプライマー2を順方向プライマーとして用い、逆方向プライマーのκ、λ、およびγGSPロングプライマーを用いて、それらそれぞれのアンプリコンを増幅する。注目すべきは、各プレートに対するGPSロングプライマー2は、各プレートに対する各アンプリコンの3'末端に共有のプレートIDを付加し、ゆえにそれぞれは、最後には2個のプレートIDおよび1個のサンプルIDバーコードを有して終わる。RT、第1のPCRおよび第2のPCRについてのさらなる詳細は、材料および方法における「非タッチダウンPCR」に見出される。次いで、「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に詳述される方法に従って、複数のプレートをプールし、かつ高性能454 DNAシークエンシングに供し、材料および方法における「ウェルへの配列の割り当て」および「配列のアセンブリ」に詳述される方法に従って、個々の配列を、どの重鎖および／または軽鎖が各ウェルから得られるかについての識別子として働くそれらのバーコードで同定し、ゆえに同じ初期細胞に由来する個々の可変重鎖および軽鎖を合致させるためのガイドを提供する。次いで、進化樹を描き、クローニング、発現、および機能的活性の判定のために抗体を選択する（図6〜8を参照されたい）。
【０４６１】
次いで、実施例8にあるように、所望の特性についてのスクリーニングのために、起源の特定細胞由来の重鎖および軽鎖遺伝子候補をクローン化し、発現させる。いったん安定的または一過的にトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。次いで、関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性を含むがそれらに限定されない所望の特性について、分泌された抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、インフルエンザワクチンを接種されたヒト由来の単一細胞選別された形質芽球から、ヘマグルチニンに対するヒトモノクローナル抗体を獲得するために、本明細書における組成物および方法を用いて、どのようにこれを行ったかを実証している。
【０４６２】
実施例22：ヒトモノクローナル抗体を産出するための、選別された偏りのないまたは抗原特異的なメモリーB細胞の使用
関心対象の抗原への暴露が確認されたかまたは疑われる対象から、末梢血（全血または単離末梢血単核細胞、PBMC）に対してFACSを実施して、メモリーB細胞集団（CD19＋CD20＋CD27＋として定義される）を同定する。加えて、メモリーB細胞表面マーカーを用いておよびフルオロフォア結合抗原（CD19＋CD20＋CD27＋抗原＋）を用いて末梢血またはPBMCを染色することによっても、関心対象の抗原に対して特異的なメモリーB細胞を選別することができる。次いで、この細胞の集団を、ウェル内に単一細胞または複数の細胞のいずれかとしてFACSによって選別する。実施例21に詳細に記載される過程を繰り返して、454シークエンシングから配列をバーコード化し、配列を獲得し、ウェルに配列を割り当て、配列をアセンブルする。HighV-QUESTを用いて、VDJ遺伝子使用法を同定し、実施例8にあるように、クローニングおよび発現のために、進化樹上の各クローンファミリーのいくつかのメンバーを選択する。実施例8に詳述されるように、クローニングおよび発現を行う。いったんトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖全体の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性について、抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、ヒトモノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４６３】
実施例23：ヒトモノクローナル抗体を産出するための、選別された偏りのないまたは抗原特異的な総B細胞の使用
関心対象の抗原への事前の曝露が確認されたかまたは疑われるかあるいは曝露がないかにかかわらない対象から、末梢血（全血または単離末梢血単核細胞、PBMC）に対してFACSを実施して、CD19＋B細胞集団を同定する。次いで、この細胞の集団を、ウェル内に単一細胞または複数の細胞のいずれかとしてFACSによって選別する。実施例21に詳細に記載される過程を繰り返す。実施例21に詳細に記載される過程を繰り返して、454シークエンシングから配列をバーコード化し、配列を獲得し、ウェルに配列を割り当て、配列をアセンブルする。HighV-QUESTを用いて、VDJ遺伝子使用法を同定し、実施例8にあるように、クローニングおよび発現のために、進化樹上の各クローンファミリーのいくつかのメンバーを選択する。いったんトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性について、発現した抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、ヒトモノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４６４】
実施例24：ヒトモノクローナル抗体を産出するための、形質細胞の使用
関心対象の抗原への事前の曝露が確認されたかまたは疑われるかあるいは曝露がないかにかかわらない対象から、末梢血（全血または単離末梢血単核細胞、PBMC）または骨髄細胞に対してFACSを実施して、CD138＋形質細胞集団を同定する。次いで、この細胞の集団を、ウェル内に単一細胞または複数の細胞のいずれかとしてFACSによって選別する。実施例21に詳細に記載される過程を繰り返して、454シークエンシングから配列をバーコード化し、配列を獲得し、ウェルに配列を割り当て、配列をアセンブルする。HighV-QUESTを用いて、VDJ遺伝子使用法を同定し、クローニングおよび発現のために、進化樹上の各クローンファミリーのいくつかのメンバーを選択する。いったんトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性について、発現した抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、ヒトモノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４６５】
実施例25：ヒトモノクローナル抗体を産出するための、芽球B細胞の使用
関心対象の抗原への事前の曝露が確認されたかまたは疑われるかあるいは曝露がないかにかかわらない対象から、末梢血（全血または単離末梢血単核細胞、PBMC）に対してFACSを実施して、FSChi芽球B細胞集団を同定する。芽球細胞は活性化B細胞であり、したがって抗原に対して応答している、かつ活発に増殖している細胞である。これらのB細胞はクローンファミリーからなり、それらの対合した重鎖および軽鎖を用いて、進化樹を獲得することができる。CD69hiおよびCD44hi等のB細胞活性化の他のマーカーも併用してよい。加えて、活性化され、増殖しており、かつ細胞周期にある細胞を判定するために、SYTO Blue（Invitrogen）等の細胞透過性DNA染色を用いて染色され得るDNA内容物も併用して、芽球B細胞を描出してよい。次いで、この細胞の集団を、ウェル内に単一細胞または複数の細胞のいずれかとしてFACSによって選別する。実施例21に詳細に記載される過程を繰り返して、454シークエンシングから配列をバーコード化し、配列を獲得し、ウェルに配列を割り当て、配列をアセンブルする。HighV-QUESTを用いて、VDJ遺伝子使用法を同定し、クローニングおよび発現のために、進化樹上の各クローンファミリーのいくつかのメンバーを選択する。いったんトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性について、発現した抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、ヒトモノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４６６】
実施例26：モノクローナル抗体を産出するための、マウスB細胞の使用
マウスに関心対象の抗原を負荷し、かつ追加免疫注射を数回与えてもよく、その後マウスを屠殺してマウスB細胞を獲得する。マウスB細胞は、血液から、脾細胞から、または骨髄から獲得され得る。フローサイトメトリーを実施して、CD19＋またはB220＋B細胞を獲得する。次いで、このB細胞の集団を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。材料および方法における「非タッチダウンPCR」に詳述されるように、RT、第1のPCRおよび第2のPCRを実施する。マウス遺伝子特異的プライマーは表11に見出され、RTおよびPCRに用いた他のプライマーは表1に見出される。次いで、「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に詳述される方法に従って、複数のプレートをプールし、かつ高性能454 DNAシークエンシングに供し、材料および方法における「ウェルへの配列の割り当て」および「配列のアセンブリ」に詳述される方法に従って、個々の配列を、どの重鎖および／または軽鎖が各ウェルから得られるかについての識別子として働くそれらのバーコードで同定し、ゆえに同じ初期細胞に由来する個々の可変重鎖および軽鎖を合致させるためのガイドを提供する。次いで、進化樹を描き、クローニング、発現、および機能的活性の判定のために抗体を選択する。
【０４６７】
クローニングのための配列を、人工的DNA合成によって獲得することができ、またはクローニングプライマーを用いた第1のPCR産物から増幅することができる。順方向クローニングプライマーは、サンプルID特異的であり、かつアンプリコンのプールから特異的配列を増幅することができる。次いで、クローニングプライマーによって導入されるものに対する相補的制限部位を含有している発現ベクター内に、各重鎖および軽鎖に対する配列をクローニングする。ベクターは、重鎖または軽鎖定常領域のいずれかも含有しており、その（一列に並んだリーディングフレーム）中に重鎖または軽鎖配列をクローニングして、抗体全体を産生する。次いで、重鎖または軽鎖クローンのいずれかを含有しているベクターを、哺乳類発現システム内に二重トランスフェクトする、あるいは両方のアンプリコンを、哺乳類細胞内への単一トランスフェクションを可能にする二重発現ベクター内にクローニングすることができる。
【０４６８】
次いで、上記のように、所望の特性についてのスクリーニングのために、起源の特定細胞由来の重鎖および軽鎖遺伝子候補を発現させる。いったん安定的または一過的にトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。次いで、関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性を含むがそれらに限定されない所望の特性について、分泌された抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、モノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４６９】
実施例27：モノクローナル抗体を産出するための、マウス形質細胞の使用
マウスに関心対象の抗原を負荷し、かつ追加免疫注射を数回与えてよく、その後マウスを屠殺してマウスB細胞を獲得する。典型的には脾細胞および骨髄が用いられるが、マウス形質細胞は、血液から、脾細胞から、または骨髄から獲得され得る。フローサイトメトリーを実施して、CD19low／−B220low／−CD138＋形質細胞を獲得する。次いで、この形質細胞の集団を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。材料および方法における「非タッチダウンPCR」に詳述されるように、RT、第1のPCRおよび第2のPCRを実施する。マウス遺伝子特異的プライマーは表11に見出され、RTおよびPCRに用いた他のプライマーは表1に見出される。次いで、「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に詳述される方法に従って、複数のプレートをプールし、かつ高性能454 DNAシークエンシングに供し、材料および方法における「ウェルへの配列の割り当て」および「配列のアセンブリ」に詳述される方法に従って、個々の配列を、どの重鎖および／または軽鎖が各ウェルから得られるかについての識別子として働くそれらのバーコードで同定し、ゆえに同じ初期細胞に由来する個々の可変重鎖および軽鎖を合致させるためのガイドを提供する。次いで、進化樹を描き、クローニング、発現、および機能的活性の判定のために抗体を選択する。
【０４７０】
クローニングのための配列を、人工的DNA合成によって獲得することができ、または、実施例26に記載されるように、クローニングプライマーを用いた第1のPCR産物から増幅することができる。次いで、上記のように、所望の特性についてのスクリーニングのために、起源の特定細胞由来の重鎖および軽鎖遺伝子候補を発現させる。いったん安定的または一過的にトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。次いで、関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性を含むがそれらに限定されない所望の特性について、分泌された抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、モノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４７１】
実施例28：モノクローナル抗体を産出するための、偏りのないまたは抗原特異的なマウスメモリーB細胞の使用
マウスに関心対象の抗原を負荷し、かつ追加免疫注射を数回与えてもよく、その後マウスを屠殺してマウスB細胞を獲得する。マウスメモリーB細胞は、典型的には脾細胞またはリンパ節から獲得され得る。フローサイトメトリーを実施して、CD19＋またはB220＋およびCD38＋IgG＋メモリーB細胞を獲得する。CD45RO等の他のマーカーも用いてよい。抗原特異的メモリーB細胞を、フルオロフォア結合抗原を用いて染色することによって可視化し、選別してもよい。次いで、このメモリーB細胞の集団を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。実施例26にあるように、RT、第1のPCRおよび第2のPCRを実施し、その後に配列決定、ウェルへの配列の割り当て、および配列アセンブリが続く。次いで、進化樹を描き、クローニング、発現、および機能的活性の判定のために抗体を選択する。
【０４７２】
クローニングのための配列を、人工的DNA合成によって獲得することができ、または、実施例26に記載されるように、クローニングプライマーを用いた第1のPCR産物から増幅することができる。次いで、上記のように、所望の特性についてのスクリーニングのために、起源の特定細胞由来の重鎖および軽鎖遺伝子候補を発現させる。いったん安定的または一過的にトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。次いで、関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性を含むがそれらに限定されない所望の特性について、分泌された抗体を含有している上清をスクリーニングする。図3および9は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、モノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４７３】
実施例29：モノクローナル抗体を産出するための、マウス短寿命形質芽球の使用
マウスに関心対象の抗原を負荷し、かつ追加免疫注射を数回与えてもよく、その後マウスを屠殺してマウスB細胞を獲得する。マウス短寿命形質芽球は、典型的には脾細胞から獲得され得る。これらの形質芽球は、CD19low／−B220low／−およびCD22lowまたはCD11c＋として、ならびにCD138＋としても様々に記載されている。フローサイトメトリーを実施して、形質芽球を獲得する。次いで、この形質芽球の集団を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。実施例26にあるように、RT、第1のPCRおよび第2のPCRを実施し、その後に配列決定、ウェルへの配列の割り当て、および配列アセンブリが続く。次いで、進化樹を描き、クローニング、発現、および機能的活性の判定のために抗体を選択する。
【０４７４】
クローニングのための配列を、人工的DNA合成によって獲得することができ、または、実施例26に記載されるように、クローニングプライマーを用いた第1のPCR産物から増幅することができる。次いで、上記のように、所望の特性についてのスクリーニングのために、起源の特定細胞由来の重鎖および軽鎖遺伝子候補を、それらを用いて発現させる。いったん安定的または一過的にトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。次いで、関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性を含むがそれらに限定されない所望の特性について、分泌された抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、モノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４７５】
実施例30：モノクローナル抗体を産出するための、マウス芽球B細胞の使用
マウスに関心対象の抗原を負荷し、かつ追加免疫注射を数回与えてもよく、その後マウスを屠殺してマウスB細胞を獲得する。マウス芽球B細胞は、典型的には脾細胞から獲得され得る。芽球細胞は活性化B細胞であり、したがって抗原に対して応答している、かつ活発に増殖している細胞である。これらのB細胞はクローンファミリーからなり、それらの対合した重鎖および軽鎖を用いて、進化樹を獲得することができる。芽球B細胞をFSChiとしてゲートをかけてよく、かつCD44hiCD69hi等の細胞表面マーカーによってさらに同定してもよく、芽球B細胞は増殖しているため、SYTO Blue等の細胞透過性DNA染色によって染色されるDNA内容物を増大させていることによって、それらを細胞周期に入っていると同定してもよい。フローサイトメトリーを実施して、芽球B細胞を獲得する。次いで、この形質芽球の集団を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。実施例26にあるように、RT、第1のPCRおよび第2のPCRを実施し、その後に配列決定、ウェルへの配列の割り当て、および配列アセンブリが続く。次いで、進化樹を描き、クローニング、発現、および機能的活性の判定のために抗体を選択する。
【０４７６】
クローニングのための配列を、人工的DNA合成によって獲得することができ、または、実施例26に記載されるように、クローニングプライマーを用いた第1のPCR産物から増幅することができる。次いで、上記のように、所望の特性についてのスクリーニングのために、起源の特定細胞由来の重鎖および軽鎖遺伝子候補を発現させる。いったん安定的または一過的にトランスフェクトされると、対合した重鎖および軽鎖の発現は、最初に選別された細胞の特異性を再現するモノクローナル抗体の産出をもたらす。次いで、関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性を含むがそれらに限定されない所望の特性について、分泌された抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、モノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４７７】
実施例31：偏りのないまたは抗原特異的なヒトIgA＋B細胞からのモノクローナル抗体の獲得
関心対象の抗原への事前の曝露が確認されたかまたは疑われるかあるいは曝露がないかにかかわらない対象から、末梢血（全血または単離末梢血単核細胞、PBMC）に対してまたは骨髄に対してFACSを実施して、IgA＋B細胞を単離する。これらのB細胞は、メモリーB細胞、形質細胞、または形質芽球であってよい。これらのIgA＋B細胞は、IgA＋B細胞を染色するフルオロフォア結合抗原を用いて抗原陽性B細胞を選別することによって、抗原特異的であってもよい。次いで、この細胞の集団を、ウェル内に単一細胞または複数の細胞のいずれかとしてFACSによって選別する。実施例21に詳細に記載される過程を繰り返して、454シークエンシングから配列をバーコード化し、配列を獲得し、ウェルに配列を割り当て、配列をアセンブルし、PCRに用いたIgA定常領域特異的プライマーは表10にある。HighV-QUESTを用いて、VDJ遺伝子使用法を同定し、実施例8にあるように、クローニングおよび発現のために、進化樹上の各クローンファミリーのいくつかのメンバーを選択する。関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性について、発現した抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、ヒトモノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４７８】
実施例32：偏りのないまたは抗原特異的なヒトIgM＋B細胞からのモノクローナル抗体の獲得
関心対象の抗原への事前の曝露が確認されたかまたは疑われるかあるいは曝露がないかにかかわらない対象から、末梢血（全血または単離末梢血単核細胞、PBMC）に対してFACSを実施して、IgM＋B細胞を単離する。これらのB細胞は、メモリーB細胞、形質細胞、または芽球B細胞であってよい。これらのIgM＋B細胞は、IgM＋B細胞を染色するフルオロフォア結合抗原を用いて抗原陽性B細胞を選別することによって、抗原特異的であってもよい。次いで、この細胞の集団を、ウェル内に単一細胞または複数の細胞のいずれかとしてFACSによって選別する。実施例21に詳細に記載される過程を繰り返して、454シークエンシングから配列をバーコード化し、配列を獲得し、ウェルに配列を割り当て、配列をアセンブルし、PCRに用いたIgM定常領域特異的プライマーは表10にある。HighV-QUESTを用いて、VDJ遺伝子使用法を同定し、実施例8にあるように、クローニングおよび発現のために、進化樹上の各クローンファミリーのいくつかのメンバーを選択する。関心対象の標的抗原に対する抗原特異性、ならびに適切な機能的アッセイによる機能性について、発現した抗体を含有している上清をスクリーニングする。図9および6は、それぞれ、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。図26〜27は、進化樹からの選択されたクローン化され発現させた抗体の機能的特徴付けから、ヒトモノクローナル抗体を獲得する別の例を提供している。
【０４７９】
実施例33：偏りのないまたは抗原特異的なマウスIgA＋B細胞からのモノクローナル抗体の獲得
マウスに関心対象の抗原を負荷し、かつ追加免疫注射を数回与えてもよく、その後マウスを屠殺してマウスIgA＋B細胞を獲得する。これらのB細胞は、メモリーB細胞、形質細胞、形質芽球、または芽球B細胞であってよく、典型的には脾細胞から獲得され得る。これらのIgA＋B細胞は、IgA＋B細胞を染色するフルオロフォア結合抗原を用いて抗原陽性B細胞を選別することによって、抗原特異的であってもよい。次いで、このIgA＋B細胞の集団を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。実施例26にあるように、RT、第1のPCRおよび第2のPCRを実施し、その後に配列決定、ウェルへの配列の割り当て、および配列アセンブリが続き、PCRに用いたIgA定常領域特異的プライマーは表11にある。次いで、進化樹を描き、クローニング、発現、および機能的活性の判定のために抗体を選択する。図9および6は、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。
【０４８０】
実施例34：偏りのないまたは抗原特異的なマウスIgM＋B細胞からのモノクローナル抗体の獲得
マウスに関心対象の抗原を負荷し、かつ追加免疫注射を数回与えてもよく、その後マウスを屠殺してマウスIgM＋B細胞を獲得する。これらのB細胞は、メモリーB細胞、形質細胞、形質芽球、または芽球B細胞であってよく、典型的には脾細胞から獲得され得る。これらのIgM＋B細胞は、IgM＋B細胞を染色するフルオロフォア結合抗原を用いて抗原陽性B細胞を選別することによって、抗原特異的であってもよい。次いで、このIgM＋B細胞の集団を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。実施例26にあるように、RT、第1のPCRおよび第2のPCRを実施し、その後に配列決定、ウェルへの配列の割り当て、および配列アセンブリが続き、PCRに用いたIgA定常領域特異的プライマーは表11にある。次いで、進化樹を描き、クローニング、発現、および機能的活性の判定のために抗体を選択する。図9および6は、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。
【０４８１】
実施例35：ヒトT細胞からの1種を上回る配列の配列決定
急性、亜急性、または進行中の循環T細胞の産出をもたらす最近または現在の症状を有する対象から、末梢血（全血または末梢血単核細胞（PBMC））に対してフローサイトメトリーを実施して、関心対象のT細胞を同定する。このT細胞の集団は、活性化T細胞または芽球T細胞であってよい。活性化T細胞を、CD44hi、CD69hi、CD154＋、CD137＋、またはそれもそれらのサイズもしくはFSChiによって描出され得る活性化T細胞である芽球T細胞を用いて同定してよく、かつSYTO Blue等の細胞透過性DNA色素を用いて細胞周期にあると同定してもよい。活性化T細胞は、クローンファミリー内に同一のファミリーメンバーを有する、進化樹にその後クラスター化され得るクローンファミリーからなっているはずであり、それを用いて、下流の機能的分析のためのクローンを選択することができる。次いで、T細胞を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。TCR遺伝子をバーコード化するRTおよびPCRは、材料および方法における「非タッチダウンPCR」に詳述されており、配列決定準備は、材料および方法における「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に詳述されており、かつウェルへの配列の割り当ておよび読み取りのアセンブリは、材料および方法における「ウェルへの配列の割り当て」および「配列のアセンブリ」に詳述されており、TCR遺伝子特異的プライマーは表10に見出される。次いで、進化樹を構築し、次いで、所望の特性についてのスクリーニングのために、起源の特定細胞由来の遺伝子候補を選出して、クローン化し、発現させる。クローニングのための配列を、遺伝子合成するまたはクローニングプライマーを用いた第1のPCR産物から増幅することができる。サンプルIDバーコード配列に特異的な順方向クローニングプライマーを有することによって、クローンのプールから特異的クローンを単離することができる。逆方向クローニングプライマーは、適切な遺伝子に対して相補的である。順方向および逆方向プライマーの両方は、ベクター内にクローン（一列に並んだコーディングフレーム）を組み込むための隣接制限部位を含有している。細胞に、それぞれが関心対象の遺伝子、例えばT細胞のα鎖およびβ鎖のいずれかを含有している2種の発現ベクターを二重にトランスフェクトする、または関心対象の遺伝子の両方を発現する二重発現ベクターを単独でトランスフェクトする。
【０４８２】
いったん安定的または一過的にトランスフェクトされると、関心対象の遺伝子を発現させ、所望のスクリーニングを用いて機能特性についてスクリーニングすることができる。
【０４８３】
実施例36：マウスT細胞からの1種を上回る配列の配列決定
マウスに関心対象の抗原を負荷し、かつ追加免疫注射を数回与えてもよく、その後マウスを屠殺してマウスT細胞を獲得する。T細胞はCD3＋であり、ヘルパーT細胞はCD4＋であり、細胞傷害性T細胞はCD8＋である。このT細胞の集団は、メモリーもしくは活性化T細胞、または芽球T細胞であってよい。メモリーT細胞はCD45RO＋として同定され得る。活性化T細胞を、CD44hi、CD69hi、またはそれもそれらのサイズもしくはFSChiによって描出され得る活性化T細胞である芽球T細胞を用いて同定してよく、かつSYTO Blue等の細胞透過性DNA色素を用いて細胞周期にあると同定してもよい。繰り返しの抗原曝露後、清潔な環境で飼育されたマウスにおけるこれらすべてのT細胞は、次いで進化樹として示され得る大部分のクローンファミリーを有するはずであり、次いでそれを用いて、クローニングおよび発現および下流の機能的分析のためのTCRを選択することができる。
【０４８４】
T細胞を、RNAse阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内に、上記で提案されるマーカーを用いたフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。TCR遺伝子をバーコード化するRTおよびPCRは、材料および方法における「非タッチダウンPCR」に詳述されており、配列決定準備は、材料および方法における「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に詳述されており、かつウェルへの配列の割り当ておよび読み取りのアセンブリは、材料および方法における「ウェルへの配列の割り当て」および「配列のアセンブリ」に詳述されており、TCR遺伝子特異的プライマーは表11に見出される。次いで、進化樹を構築し、次いで、所望の特性についてのスクリーニングのために、起源の特定細胞由来の遺伝子候補を選出して、クローン化し、発現させる。クローニングのための配列を、遺伝子合成するまたはクローニングプライマーを用いた第1のPCR産物から増幅することができる。サンプルIDバーコード配列に特異的な順方向クローニングプライマーを有することによって、クローンのプールから特異的クローンを単離することができる。逆方向クローニングプライマーは、適切な遺伝子に対して相補的である。順方向および逆方向プライマーの両方は、ベクター内にクローン（一列に並んだコーディングフレーム）を組み込むための隣接制限部位を含有している。細胞に、それぞれが関心対象の遺伝子、例えばT細胞のα鎖およびβ鎖のいずれかを含有している2種の発現ベクターを二重にトランスフェクトする、または関心対象の遺伝子の両方を発現する二重発現ベクターを単独でトランスフェクトする。
【０４８５】
いったん安定的または一過的にトランスフェクトされると、関心対象の遺伝子を発現させ、所望のスクリーニングを用いて機能特性についてスクリーニングすることができる。
【０４８６】
実施例37：サンプルからの1種を上回る配列の配列決定
関心対象の核酸を含む単一サンプルを同定する。単一サンプルは、単一細胞または細胞の一集団を有し得る。サンプルを、RNase阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別することができる。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。次いで、このB細胞の集団を、RNase阻害剤とともに低張バッファーを含有しているウェル内にフローサイトメトリーによって単一細胞として選別する。選別された細胞をこの時点で凍結する、または直ちにRT-PCRに用いてcDNAを生成することができる。材料および方法における「非タッチダウンPCR」に詳述されるように、RT、第1のPCRおよび第2のPCRを実施する。次いで、「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に詳述される方法に従って、複数のプレートをプールし、かつ高性能454 DNAシークエンシングに供し、材料および方法における「ウェルへの配列の割り当て」および「配列のアセンブリ」に詳述される方法に従って、個々の配列を、どの重鎖および／または軽鎖が各ウェルから得られるかについての識別子として働くそれらのバーコードで同定し、ゆえに同じ初期細胞に由来する個々の可変重鎖および軽鎖を合致させるためのガイドを提供する。次いで、進化樹を描き、クローニング、発現、および機能的活性の判定のために抗体を選択する。
【０４８７】
次いで、所望の特性または他の必要性についてのスクリーニングのために、起源の特定細胞由来の遺伝子候補を選出して、クローン化し、発現させる。クローニングのための配列を、遺伝子合成するまたはクローニングプライマーを用いた第1のPCR産物から増幅することができる。サンプルIDバーコード配列に特異的な順方向クローニングプライマーを有することによって、クローンのプールから特異的クローンを単離することができる。逆方向クローニングプライマーは、適切な遺伝子に対して相補的である。順方向および逆方向プライマーの両方は、ベクター内にクローン（一列に並んだコーディングフレーム）を組み込むための隣接制限部位を含有している。細胞に、それぞれが関心対象の遺伝子のいずれかを含有している2種もしくはそれを上回る発現ベクターをトランスフェクトする、または関心対象の遺伝子を発現する1種の発現ベクターを単独でトランスフェクトする。
【０４８８】
いったん安定的または一過的にトランスフェクトされると、関心対象の遺伝子を発現させ、所望の場合にはスクリーニングすることができる。図9および6は、本方法を実施するための概略的方法論の一例を提供している。
【０４８９】
実施例38：DNA合成による免疫グロブリンV(D)J領域のクローニング
発現ベクター内へのクローニングのために、所望の免疫グロブリン重鎖および軽鎖V(D)J領域をDNA合成によって人工的に産出することができる。合成に用いられる配列は高性能454配列に直接由来してよく、あるいは関心対象のサンプル由来の重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするcDNAを、個々のサンプルまたは配列のさらなる検証のためにプールしたサンプルから再び配列決定してよく、この配列を用いて、選択された軽鎖および重鎖V(D)J領域を合成する。DNA合成、ならびに制限酵素および標準的な分子生物学を用いて、適切な定常領域を含有しているベクター内に合成されたDNAを組み入れることによって、Ig遺伝子の可変領域をクローン化してよい。合成の間、突然変異誘発が所望される場合を除いて、アミノ酸配列が変更されない限りは正確なヌクレオチド配列に従う必要はない。このことは、より高い発現レベルをもたらし得るコドン最適化を可能にする。このことは、クローニングのための、制限部位における付加も可能にする。5' UTRおよびバーコード配列等の翻訳されない配列は合成される必要がなく、リーダー配列も、より高い発現レベルで知られる他のシグナルペプチド配列と交換されてよい。これらは、高性能な読み取りと非常に異なり得るIgヌクレオチド配列をもたらすが、発現した場合には同一のアミノ酸配列を与える。
【０４９０】
一態様において、増幅したクローンをオープンリーディングフレームに挿入するのに必要とされる適切な制限部位を有するκ、λ、γ、または他の重鎖アイソタイプの定常領域のいずれかをすでに含有しているベクター内に、増幅したV(D)J領域を挿入する。別の態様において、可変領域全体を、定常領域を用いて遺伝子合成してよく、かつ発現および抗体特性についての下流の機能的試験のために、発現ベクター内にクローニングしてよい。
【０４９１】
実施例39：サンプル同定アダプターにすでに存在する制限部位を用いることによる免疫グロブリンV(D)J領域のクローニング
別の局面において、逆転写の間に付加されたサンプルIDアダプターにすでに組み入れられている制限部位を用いて、所望の免疫グロブリン重鎖および軽鎖V(D)J領域をクローン化することができる。このことは、PCRアンプリコンプールにおいて、ウェルIDバーコードの3'制限部位を有するアダプターをもたらす。クローニングプライマーを用いたクローニングの間、ウェルIDバーコード配列に相補的である5'プライマー、および鎖特異的3'プライマー（κ、λ、およびγ鎖に対する）を用いて、プレート特異的アンプリコンプールから所望のアンプリコンを増幅する。3'プライマーは、3'制限部位を付加する。5'プライマーはウェルIDバーコードの3'制限部位をすでに含有しているため、5'プライマーは制限部位を付加する必要がない。この増幅の後、定常領域インサートを含有しているベクター内へのライゲーションのために、制限酵素を用いてアンプリコンを切断する。制限酵素消化の間、バーコードおよびユニバーサル配列等の、Ig遺伝子配列の5'末端へ付加された配列を、それらが5'制限部位の5'であるように切断する。
【０４９２】
実施例40：対合した免疫グロブリン重鎖および軽鎖V(D)J領域のクローニングが後に続く、一方のみの免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）の配列決定によるクローンファミリーの同定
mRNAから抗体の重鎖および軽鎖を逆転写し、各サンプルから産出されたcDNAに別個のサンプルIDを組み入れ、かつ増幅PCRのためにサンプルcDNAをプールする。免疫グロブリンcDNAを増幅し、454高性能シークエンシングを用いて免疫グロブリン重鎖または軽鎖のいずれかを配列決定し、かつ同じゲノムによりコードされるV(D)Jセグメントの使用を示す免疫グロブリン重鎖V(D)Jまたは軽鎖V(D)J配列のそれらの使用に従って、配列をグループ化する。バイオインフォマティクスを用いて、関心対象のクローンファミリーを同定し、次いで配列決定および／またはクローニングのために、同じサンプル由来の所望の免疫グロブリン軽鎖および重鎖V(D)J領域を選択的に増幅する。PCR増幅について、順方向プライマーはサンプルIDを含み、逆方向プライマーは軽鎖または重鎖定常領域に特異的である。プライマーによって、アンプリコン内に制限部位を組み入れることができる。次いで、重鎖または軽鎖定常領域をすでに含有している適切な発現ベクター内に、アンプリコンを挿入することができる。次いで、抗体を発現させ、所望の特性についてスクリーニングすることができる。
【０４９３】
実施例41：サンプルIDのみ（およびプレートIDなし）を用いた、抗体のクローニングおよび発現のための、免疫グロブリン重鎖および軽鎖V(D)J配列決定からのクローンファミリーの同定
各サンプルにおけるmRNAから抗体の重鎖および軽鎖を逆転写し、各サンプルから産出されたcDNA内に別個のサンプルIDを組み入れる。各サンプルIDは、少なくとも6ヌクレオチド長かつ1塩基対相違であり、4096個の別個でありうるサンプルIDをもたらす。別個のサンプルIDを各サンプルに用い、固有のサンプルIDによって、異なるサンプルに由来するcDNAが同定され、かつ個々のサンプルにおいて発現した2種またはそれを上回るcDNAの対合した配列決定およびクローニングが可能となる。454高性能シークエンシングに必要とされるTitaniumアダプターAおよびBを付加するPCRを用いて、重鎖および軽鎖アンプリコンを増幅し、次いですべてのサンプルを配列決定のために送る。材料および方法における「ウェルへの読み取りの割り当て」および「配列のアセンブリ」のセクションに従って、配列をウェルに割り当て、アセンブルする。V(D)J割り当てをHighV-QUESTを用いて行い、それらのV(D)J使用法に基づきクローンファミリーにグループ化する。次いで、選択したクローンを、クローニングプライマーを用いて特異的に増幅し、これはアンプリコン内に制限部位を付加もする。次いで、所望の特性についてのスクリーニングのための抗体の発現のために、適切な重または軽定常領域をすでに含有している発現ベクター内に、アンプリコンをインフレームで挿入する。
【０４９４】
実施例42：ユニバーサルプライマー配列にライゲーションすることによる、対合した配列のクローニング
mRNAから抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を逆転写し、新たに合成されたcDNAにアダプター領域およびサンプルIDバーコードからなる3'配列を付加する。次いで、サンプルを一緒にプールし、T4 DNAリガーゼおよび5'リン酸化アンチセンス用ユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチドを用いて、第1の鎖cDNAの3'末端にユニバーサルプライマー配列を付加する。あるいは、ユニバーサルプライマー配列にライゲーションする前に、第二鎖cDNA合成を行って、mRNA/cDNA混成物の代わりに二本鎖cDNAを獲得してよい。次いで、2ラウンドのPCRを実施して、cDNAを増幅し、かつプレートIDならびに454シークエンシングのためのTitaniumプライマーAおよびBを付加する。あるいは、PCRの間に組み入れる代わりに、T4 DNAリガーゼを用いることによって、DNAライゲーションによってプレートIDおよびTitaniumプライマーを付加してもよい。454シークエンシングの後、配列をアセンブルし、クローンファミリーを同定する。クローンファミリーから選択されたクローンを、アンプリコンに制限部位を付加するクローニングプライマーを用いて、特異的にクローニングしてよい。次いで、適切な重鎖または軽鎖定常領域をすでに有している発現ベクター内に、配列をインフレームで挿入する。次いで、抗体を発現させ、所望の特性についてスクリーニングする。
【０４９５】
実施例43：免疫グロブリン重鎖および軽鎖の逆転写（RT-GSP）のための遺伝子特異的プライマーの試験
重鎖および軽鎖遺伝子の逆転写において、プライマーとして、オリゴ(dT)の代わりにRT-GSPを用いた。次いで、PCRでcDNAを増幅し、アガロースゲル上で可視化した。RT-GSPプライマーは、IgKC_v3（a）、レーン1〜4において（b）、それぞれIgLC_v5、IgLC_v6、IgLC_v7、およびIgLC_v8であり、レーン1〜4において（c）、それぞれIgHGC_v10、IgHGC_v11、IgHGC_v13、およびIgGC_v15であり、ならびにIgHGC_v16（d）であった。プライマー名におけるKC、LC、およびGCは、プライマーが、それぞれκ鎖、λ鎖、およびγ重鎖に特異的であることを示す。ゲル写真における白いバンドは、無関係なレーンを切り取った場所を示す。図10および表6を参照されたい。
【０４９６】
実施例44：アダプター領域配列の試験
3'末端側の終端にユニバーサルプライマー領域およびアダプター領域を含むオリゴヌクレオチドを用いて、RNAを逆転写した。次いで、順方向プライマーとしてユニバーサルプライマー領域配列を、かつ逆方向プライマーとして遺伝子特異的配列を用いて、cDNAを増幅した。増幅した産物をアガロースゲル上で可視化した。アダプター領域は、G（a）、レーン1および2において（b)、それぞれGGGGGおよびrGrGrGからなる。rGは、DNAヌクレオチドの代わりにRNAヌクレオチドを示す。図11および表6を参照されたい。
【０４９７】
実施例45：ユニバーサルプライマー配列の試験
3'末端側の終端にユニバーサルプライマー配列およびアダプター領域を含むオリゴヌクレオチドを用いて、RNAを逆転写した。次いで、ユニバーサルプライマー領域に相補的な順方向プライマー、および遺伝子特異的配列に相補的な逆方向プライマーを用いたPCRによって、cDNAを増幅した。Univ_seq_4（a）、univ_seq_5（b）、およびuniv_seq_f（c）。ゲル写真における縦の白いバンドは、無関係なレーンが切り取られている場所を示す。そうでないレーンは、同じゲル写真に属する。図12および表6を参照されたい。
【０４９８】
実施例46：第1のPCR反応のための遺伝子特異的プライマー配列の試験
第1のPCR反応における配列の増幅において、遺伝子特異的プライマーを用いた。第1のPCR反応または後続の第2のネステッドPCRの産物のいずれかをアガロースゲルで泳動し、可視化した。用いた逆方向プライマーは、レーン1〜3（a）において、それぞれIgKC_v4、IgLC_v5、IgHGC_v13であり、レーン1〜3（b）において、それぞれK_GSP1、L_GSP1、G_GSP1であり、レーン1〜2（c）において、それぞれK_GSP1c、L_GSP1cであり、G_GSP1（d）であり、レーン1〜2（e）において、それぞれL_GSP1d、G_GSP1gであり、レーン1〜4（f）において、それぞれG_GSP1h、G_GSP1k、L_GSP1f、L_GSP1gであり、G_GSP1d（g）であり、レーン1〜8（h）において、それぞれ L_GSP1h〜oであり、レーン1〜6において、それぞれG_GSP1m〜qおよびG_GSP1tであった（プライマー名におけるK、L、およびGは、プライマーが、それぞれκ、λ、およびγ免疫グロブリン定常領域に特異的であることを示す）。各ゲルは、左側のレーンマーカーから始まり、サンプルレーンが続く。同じゲル写真上のレーン間の白い棒は、間にある無関係なレーンが切り取られている場所を示す。図13を参照されたい。また、図43において、より多くのプライマーを試験した。これらのプライマーを第1のPCRに用い、次いで表1からのプライマーを用いて第2のPCRを行い、PCR産物を2％アガロースゲルで泳動し、画像を撮った。第1のPCRに用いたプライマーは、それぞれκGSP1、κGSP1e、κGSP1f、λGSP1、λGSP1x、およびλGSP1yである。また、用いた配列について表6を参照されたい。
【０４９９】
実施例47：第2のPCR反応のための遺伝子特異的プライマー配列の試験
第2のPCR反応における配列の増幅において、遺伝子特異的プライマーを用いた。PCR産物をアガロースゲルで泳動し、可視化した。用いた逆方向プライマーは、レーン1〜3（a）において、それぞれK_GSP2、L_GSP2、G_GSP2であり、レーン1〜3（b）において、それぞれK_GSP2v2a、K_GSP2v2b、L_GSP2v2であり、レーン1〜4（c）において、それぞれK_GSP2v2c、K_GSP2v2c、G_GSP2v2c1、G_GSP2v2c2であり、レーン1〜3（d）において、それぞれK_GSP2v2d〜fであり、レーン1〜3（e）において、それぞれK_GSP2v2g、L_GSP2v2d、およびG_GSP2bであった。プライマー名におけるK、L、Gは、それらが、それぞれκ、λ、およびγ免疫グロブリン定常領域に特異的であることを示す。各ゲルは、左側のレーンマーカーから始まり、サンプルレーンが続く。同じゲル写真上のレーン間の白い棒は、間にある無関係なレーンが切り取られていることを示す。図14および表6を参照されたい。
【０５００】
実施例48：他のヒト可変領域遺伝子のための遺伝子特異的プライマー配列の試験
遺伝子特異的逆方向プライマーを用いて、第1のPCRおよび第2のPCRを行い、産物を2％アガロースゲルで泳動し、撮影した。レーンは、左から：（a）マーカー、μ、α定常領域、TCRα、および（b）マーカー、TCRβである。用いた3'プライマーの配列は表10にある。同じゲル写真上のレーン間の白い棒は、間にある無関係なレーンが切り取られている場所を示す。図44を参照されたい。
【０５０１】
実施例49：マウス可変領域遺伝子のための遺伝子特異的プライマー配列の試験
第1のPCRおよび第2のPCRを行い、産物を2％アガロースゲルで泳動し、撮影した。レーンは、左から：（a）マーカー、κ、λ、λ、λ、λ軽鎖、およびμ重鎖である。4つのλレーンは、用いられたプライマーのこの組み合わせ：マウス_λ_GSP1aとマウス_λGSP2a、マウス_λ_GSP1aとマウス_λGSP2b、マウス_λ_GSP1bとマウス_λGSP2a、およびマウス_λ_GSP1bとマウス_λGSP2aを有した。（b）マーカーおよびα重鎖。（c）それぞれmo_g12_GSP2dおよびmo_g12_GSP2eを用いた第2のPCRに関するγ1、2a、2c重鎖、マーカー。（d）それぞれmo_g3_GSP2d、mo_g3_GSP2eを用いた第2のPCRに関するγ3重鎖、続いてそれぞれmo_g2b_GSP2d、mo_g2b_GSP2eを用いた第2のPCRに関するγ2b重鎖、続いてマーカー。（e）マーカー、TCRα。（f）マーカー、TCRβ。同じゲル写真上のレーン間の白い棒は、間にある無関係なレーンが切り取られている場所を示す。図45および表11を参照されたい。
【０５０２】
実施例50：一方の末端におけるバーコードでの抗体重鎖および軽鎖の連結ペアの産出
図1に示されるように、血液、バルク末梢血単核細胞（PBMC）、バルクB細胞、形質芽球、形質細胞、メモリーB細胞、または他のB細胞集団から、個々のB細胞をフローサイトメトリーによって選別することができる。B細胞を96ウェルPCRプレート内に単一細胞選別し、陰性対照として、ウェルの1列を空のままにする。図17は、関心対象の2種のポリヌクレオチド配列を連結させ、一方の末端にバーコードを付加するために用いられ得る方法についての概略的方法論を記載している。
【０５０３】
メーカーの推奨に従って、市販のone-step RT-PCRキット（例えば、Qiagenのone-step RT-PCRキット）を用いて、単一工程の多重重複−伸長RT-PCRを実施することができる。この特定の実施例では、逆転写反応等のポリヌクレオチド合成反応を用いて、mRNAサンプルからcDNA鋳型を産出する。図17を参照すると、RT-PCR反応のための順方向遺伝子特異的プライマーは、制限酵素部位（RE1）、配列決定プライマー部位、およびバーコードを含有しており、関心対象の第一のcDNAにこれらのエレメントを付加する。2種のさらなるプライマー（RE3を含有していると示される）は、相補的な重複−伸長テールを有する。PCR反応におけるこれらのプライマーの使用は、増幅の間に関心対象の2種のcDNAがアニールしかつ連結するのを可能にする、重複伸長テールを保持する関心対象の2種のcDNAをもたらす。示された例では、LCおよびHC鎖が一方の末端におけるバーコードで物理的に連結している、表示された構造の生成物が産出されると考えられる。
【０５０４】
RE1およびRE2制限部位を用いて、配列決定のための適当なベクター内にPCR産物をクローニングすることができる。
【０５０５】
実施例51：内部バーコードでの抗体重鎖および軽鎖の連結ペアの産出
図1に示されるように、血液、バルク末梢血単核細胞（PBMC）、バルクB細胞、形質芽球、形質細胞、メモリーB細胞、または他のB細胞集団から、個々のB細胞をフローサイトメトリーによって選別することができる。B細胞を96ウェルPCRプレート内に単一細胞選別し、陰性対照として、ウェルの1列を空のままにする。図18は、関心対象の2種のポリヌクレオチドを間に位置するバーコードで連結させるために用いられ得る方法についての概略的方法論を記載している。抗体重鎖および軽鎖のために用いられ得るプライマーおよびオリゴヌクレオチドを表30に示す。RTオリゴヌクレオチドには、AsiSIおよびPacI制限部位が含まれる。サンプルID配列を表2に示す。
【０５０６】
図18に示される方法は、cDNA合成反応の間の逆転写酵素の3'テーリングおよび鋳型切り替え活性に依存する。合成されたcDNAに付加された3'Cテールを、重複伸長配列およびバーコードを保持するアダプター分子のアニーリングに用いることができる。2つのタイプのアダプター分子を用いて、2種のcDNAを連結させる。重複伸長およびバーコード配列を保持する第一のアダプターを、第一のcDNAに付加する。バーコード配列のない、重複伸長の逆相補体を保持する第二のアダプターを、第二のcDNAに付加する。逆転写酵素の鋳型切り替え特性によって、これらの配列は、それらそれぞれのcDNAの3'末端に付加される。
【０５０７】
図18に示されるように、PCR反応において、相補的な重複伸長配列はアニールし、アニール部位から対応するDNAの鎖が合成される。外部プライマーを用いた後続のラウンドのPCRは、連結したcDNA分子の増幅をもたらす。
【０５０８】
増幅反応のためにまたは後にライゲーションにより、プライマー内に組み入れられる適切な制限部位の付加および配列決定プライマー部位の付加によって、配列決定のための適当なベクター内にPCR産物をクローニングすることができる。
【０５０９】
実施例52：ユニバーサル配列重複−伸長プライマーを用いた、2種の内部バーコードでの抗体重鎖および軽鎖の連結ペアの産出
図1に示されるように、血液、バルク末梢血単核細胞（PBMC）、バルクB細胞、形質芽球、形質細胞、メモリーB細胞、または他のB細胞集団から、個々のB細胞をフローサイトメトリーによって選別することができる。B細胞を96ウェルPCRプレート内に単一細胞選別し、陰性対照として、ウェルの1列を空のままにする。図19は、関心対象の2種の連結したポリヌクレオチドの間に2種の内部バーコードを導入するために用いられ得る方法についての概略的方法論を記載している。抗体重鎖および軽鎖のために用いられ得るプライマーおよびオリゴヌクレオチドを表31に示す。RTオリゴヌクレオチドには、AsiSIおよびPacI制限部位が含まれる。サンプルID配列を表2に示す。
【０５１０】
図19に示される方法は、cDNA合成反応の間の逆転写酵素の3'テーリングおよび鋳型切り替え活性に依存する。本実施例において、オリゴ(dT)によりプライムされた（primed）cDNAに付加された3'Cテールを、接続されるcDNAのそれぞれへの、ユニバーサル配列およびバーコードを保持するアダプター分子のアニーリングに用いることができる。逆転写酵素の鋳型切り替え特性によって、これらの配列は、それらそれぞれのcDNAの3'末端に付加される。図19に示されるように、外部のLCおよびHC特異的プライマーと組み合わせて、相補的な重複−伸長配列を保持するユニバーサル配列に対するプライマーを用いた後続の重複−伸長PCRは、LCがHCにそれらの間の2種の内部バーコードで連結している構造体をもたらす。
【０５１１】
増幅反応のためにまたは後にライゲーションにより、プライマー内に組み入れられる適切な制限部位の付加および配列決定プライマー部位の付加によって、配列決定のための適当なベクター内にPCR産物をクローニングすることができる。
【０５１２】
実施例53：重複−伸長アダプターを用いた、2種の内部バーコードでの抗体重鎖および軽鎖の連結ペアの産出
図1に示されるように、血液、バルク末梢血単核細胞（PBMC）、バルクB細胞、形質芽球、形質細胞、メモリーB細胞、または他のB細胞集団から、個々のB細胞をフローサイトメトリーによって選別することができる。B細胞を96ウェルPCRプレート内に単一細胞選別し、陰性対照として、ウェルの1列を空のままにする。図20は、関心対象の2種の連結したポリヌクレオチドの間に2種の内部バーコードを導入するために用いられ得る別の方法についての概略的方法論を記載している。抗体重鎖および軽鎖のために用いられ得るプライマーおよびオリゴヌクレオチドを表32に示す。RTオリゴヌクレオチドには、AsiSIおよびPacI制限部位が含まれる。サンプルID配列を表2に示す。
【０５１３】
図20に示される方法も、cDNA合成反応の間の逆転写酵素の3'テーリングおよび鋳型切り替え活性に依存する。本実施例において、遺伝子特異的プライマーを用いて合成されたcDNAに付加された3'Cテールを、接続されるcDNAのそれぞれへの、自己相補的またはパリンドローム的な重複−伸長配列およびバーコードを保持するアダプター分子のアニーリングに用いることができる。逆転写酵素の鋳型切り替え特性によって、これらの配列は、それらそれぞれのcDNAの3'末端に付加される。後続のLCおよびHC cDNAに付加された重複−伸長配列のアニーリングによって、それらは重複の部位において一つに連結される。図20に示されるように、LCおよびHCに対する外部プライマーを用いた重複−伸長PCRは、LCがHCにそれらの間の2種の内部バーコードで連結している構造体をもたらす。
【０５１４】
増幅反応のためにまたは後にライゲーションにより、プライマー内に組み入れられる適切な制限部位の付加および配列決定プライマー部位の付加によって、配列決定のための適当なベクター内にPCR産物をクローニングすることができる。
【０５１５】
実施例54：バーコードを付加する異なる方法に関する調査
本発明者らは、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを用いた逆転写または増幅反応の過程の間に、バーコード配列を付加し得る様々な方法を調査した。本発明者らは、バーコードの付加を、それらを遺伝子特異的プライマー（GSP）内に、および鋳型切り替えによってcDNAの3'末端に付加され得る1個または複数のGを含有しているオリゴヌクレオチド内にそれらを組み入れることによって試験した。文献および本発明者らの科学的知識に基づき、本発明者らの予想は、本発明者らは、5'バーコード化オリゴヌクレオチドまたは3'バーコード化GSPを用いて、cDNAを効果的にバーコード化することができるであろうというものであった。
【０５１６】
図21に実証されるように、1μgの総PBMC RNAおよび0.5μMのuniv_seq_2鋳型切り替えオリゴ、ならびにその第一の部分が固定化_PCR3配列であり、かつ最後の8bpのAACAATACがバーコードである付加的5'隣接配列を有する0.1μMのIgKC_v3 GSP（レーン1〜2）およびIgLC_v5 GSP（レーン3〜4）を用いて、RTを実施した。RT反応を、Nucleo TraPCR（Macherey-Nagel）を用いてクリーンアップし、50μlの最終容量に溶解した。後続の各PCR反応において、5'プライマーとしての内部5' VK（レーン1）もしくはVL（レーン3）プライマー、またはUniv_seq_2（レーン2および4）のいずれか、および3'プライマーとしての固定化_PCR3とともに、この反応の2μlを用いた。留意すべきは、VKプライマーはκV遺伝子1および2に特異的であり、VLプライマーはλV遺伝子2に特異的であるということである。配列は表33にある。見て分かるように、レーン2および4におけるPCR産物はスメアとして泳動された。対照的に、内部5'プライマーは別個のバンドを産生し（レーン1および3）、プライマーペアが機能すること、ならびにレーン1および3に示されるスメア形成が、プライマーの設計不備に起因するものではあり得ないことを示した。univ_seq_2および3'バーコード化GSPを用いたPCR増幅の間にスメアが得られた場合、全長逆転写されたすべてのcDNA配列にオリゴヌクレオチドが付加されたため、このことは、バーコード化GSPを用いた逆転写が、RT反応において、非特異的にプライムされた核酸配列をもたらすことを示唆している。本発明者らの結果は、5'ユニバーサル配列アダプターおよび3'バーコード化プライマーの使用が、B細胞または他の細胞によって発現される免疫グロブリンまたは他の遺伝子のバーコード化しかつ特異的な増幅のための優れた戦略ではないことを示唆している。
【０５１７】
後から考えると、用いたDNAおよび分子反応のいくつかの生物学的特性が、本発明者らの結果に寄与している可能性がある。逆転写は、通常、42℃または56℃等の低温で実施される。プライミング特異性を促進するために、プライマーのTmよりほんのわずかに下の温度でアニーリング工程が通常実施されるPCRとは異なり、逆転写酵素は高温で不活性化されるため、逆転写に対してこれを行うことはできない。したがって、プライマーのTmよりも非常に低い温度で反応は進行するため、RTの間に用いられる遺伝子特異的プライマーは、典型的には関心対象の遺伝子にあまり特異的でない。そのような状況において、プライマーは、いくつかのミスマッチを有する標的外のmRNA配列にも結合し得、ミスプライミングが生じる。バーコードをGSPに付加する場合、プライマーは、後続のPCRにおける使用のためのバーコードの5'固定化配列を有している必要もある。これに依ってプライマーが非常に長くなり（約60nt）、さらにはるかに高頻度のミスプライミングを有するプライマーをもたらす。しかしながら、PCRの間の特異的増幅は、通常、非常に遺伝子特異的な順方向プライマーを用いることによってなお達成され得、レーン1および3に示されるように、プライマーペアの一方のメンバーが特異的である限り、通常、特異的増幅は存在し得る。
【０５１８】
鋳型切り替え技術を用いてアダプターを付加する場合、このアダプターは、合成されて一本鎖cDNAを形成するすべてのmRNAに付加される。上述のように、とりわけRT酵素のSuperscript IIIは56℃でその鋳型切り替え活性を喪失し、かつ逆転写は42℃で進行するため、バーコード化GSPは相当量のミスプライミングを有すると考えられる。すべての免疫グロブリン遺伝子をPCR増幅し得る能力を喪失し（ゆえに、可変V遺伝子のために、複数の縮重5'プライマーを用いた多重PCRに訴える必要がある）、そうでなければ3'バーコードを喪失すると考えられるため、特異的なネスト5'または3'プライマーを用いることはできない。したがって、TdTテーリングまたは平滑末端クローニング等の5'アダプターを付加する他の方法によってもアダプターは無差別的に付加されるため、バーコード化GSPは、鋳型切り替えにより付加されたアダプターまたは他の任意の5'アダプターとの使用に適さない。したがって、内部3'プライマーまたはネステッドもしくは半ネステッドPCR増幅戦略も必要とされ、バーコード化3'GSPは、B細胞または他の細胞からの遺伝子を特異的に増幅するこれらの戦略の使用を可能としない。本発明者らの結果に基づき、本発明者らがバーコード化GSPは上手く機能しないと考える多くの同じ理由で、バーコード化オリゴ(dT)も上手く機能しないであろうとも予想されるであろう。これらの理由には、B細胞または他の細胞からの遺伝子の特異的増幅に、内部3'プライマーまたはネステッドもしくは半ネステッドPCR増幅戦略を使用し得ないことが含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０５１９】
対照的に、本発明者らの結果（他の実施例を参照されたい）は、バーコード配列と、逆転写反応の間に産出されるcDNAの3'テールにアニールするアダプターとを含むプライマーを用いた逆転写反応の過程の間のバーコード配列付加の優位性を実証している。そのような態様において、アダプター配列は、バーコード配列を含んでよく、抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を標識するために用いられ得る。ゆえに、本明細書において開示されるように、鋳型切り替えまたはcDNAをテーリングする他の任意の方法によって、5'配列自体についての事前の情報のないPCR増幅に用いられ得る配列が付加され、抗体レパートリーの効率的かつ偏りのない発現が可能となる。さらには、この手法によって、抗体に加えてタンパク質をコードする共発現させる他の遺伝子のレパートリーを獲得することが可能となる。さらに、鋳型切り替えアダプターを用いる手法は、複数のV遺伝子を増幅するために縮重順方向プライマーのセットを用いる、当技術分野において開示される方法よりも明白な利点を有する。公知の5'プライマーセットは、：a）レパートリーのほとんどを網羅するが全体を網羅しない；b）ヒト集団における公知のV遺伝子バリアント（多型）を今のところ網羅することができない；およびc）広範な体細胞超変異（SHM）を受けている抗体配列を効果的に増幅することができない可能性があるため、これらの方法は抗体レパートリー全体を確保することもできない。SHMの作用の例について、Scheid et al., Sciencexpress, 14 July 2011を参照されたい。
【０５２０】
したがって、発現させる遺伝子、例えば抗体重鎖および軽鎖のライブラリーの調製のための鋳型切り替えアダプターの使用は、特定の遺伝子ファミリーおよび共発現させる他の遺伝子の偏りのない発現を可能にすることによって、当技術分野において公知の他の方法よりも明白な利点を提供する。TdTテーリングおよび平滑末端ライゲーション等であるがそれらに限定されない他の任意の方法を用いて付加された鋳型切り替えアダプターまたは5'アダプターの使用は、また、上述の理由で、バーコード化3'GSPまたはバーコード化オリゴ(dT)よりもむしろバーコード化5'アダプターの使用により適合する。
【０５２１】
実施例55：フローサイトメトリーでの前方散乱および／もしくは側方散乱による、ならびに／または他の細胞表面マーカーを併用した形質芽球の選別
形質芽球は、活性化されている芽球B細胞であり、増幅している／増幅中であり、かつ親和性成熟を受けている。形質芽球は、活発な免疫応答を示し、本明細書における方法および組成物を実践することによって、それが感染症、ワクチン、自己免疫、または癌抗原であろうとなかろうと、関心対象の標的抗原に結合する抗体のクローンファミリーに関する進化樹のバイオインフォマティクス的構築が可能となる。
【０５２２】
形質芽球は、芽球B細胞であり、かつ休止B細胞より大きい（図40A〜B）。したがって、それらの前方散乱および側方散乱特性を用いたフローサイトメトリーでそれらを選別することができる。図40cに示されるように、形質芽球は、休止CD20＋B細胞より1.04〜1.16倍大きいFSC-W中央値とともに、他のCD20＋B細胞のFSC-A中央値よりも約1.29〜1.66倍大きいFSC-A中央値を有する。形質芽球は、また、95％信頼区間で判定される、単球の0.85〜0.98倍であるFSC-A中央値、および単球の0.92〜1.02倍であるFSC-W中央値を有する。FSC-AおよびFSC-Hは、同じ値を与えるように校正されたフローサイトメーターで測定されるため、ここでFSC-AおよびFSC-Hは置き換え可能でありかつ同等である。SSC-A（およびSSC-H、尺度により）およびSSC-Wに対して同様に、形質芽球は、CD20＋B細胞の0.74〜2.56倍および単球の0.21〜0.84倍であるSSC-A中央値、ならびにCD20＋B細胞の1.01〜1.20倍および単球の0.82〜1.03倍であるSSC-W中央値を有する。休止リンパ球はサイズが同様であるため、B細胞に対する形質芽球の割合は、リンパ球に対するものを表している。
【０５２３】
形質芽球を同定するための代替的手法は、CD20＋B細胞または単球のFSCまたはSSC中央値に対して、形質芽球の20thパーセンタイルのFSCまたはSSCを用いることであり（図44D）、CD20＋B細胞に対するFSC-A（FSC-W）中央値の1.04〜1.50倍（1.02〜1.11倍）、および単球に対する0.70〜0.88倍（0.88〜1.00倍）である。形質芽球は、CD20＋B細胞に対するSSC-A（SSC-W）中央値の0.67〜1.89倍（0.99〜1.11倍）、および単球に対する0.20〜0.62倍（0.77〜0.99倍）である20thパーセンタイルのSSC-A（SSC-W）を有する。これらの数字によって、形質芽球の80％を包含しかつ他のリンパ球を除外するゲーティング・カットオフが可能となる。これによって、単色または二色の染色と合わせてFSC（および／またはSSC）を用いて、単一細胞選別形質芽球の状態の形質芽球にゲートをかけることが可能となる。そのような組み合わせには、FSChiCD19low（図39b）、CD19＋FSChi（図39c）、CD19＋FSChiCD20−（図39d）、CD19＋FSChiCD38hi（図39e）、およびCD19＋FSChiCD27＋（図39f）が含まれてよい。次いで、選別された細胞は、材料および方法における「非タッチダウン」PCRにあるように実施されるバーコード化のためのRT、PCRを受けてよい。配列決定、クローニング、および発現のための下流の調製は、実施例6および8にあるとおりである。留意すべきは、与えられた割合は、95％信頼区間、つまり割合の95％がこの範囲内に入らなくてはならない信頼区間のものであることである。
【０５２４】
実施例56：マイクロ流体装置等の任意のふるい装置上でのサイズによる形質芽球の選別
形質芽球は、活性化されている芽球B細胞であり、増幅している／増幅しているところであり、かつ親和性成熟を受けている。形質芽球は、活発な免疫応答を示し、本明細書における方法および組成物を実践することによって、それが感染症、ワクチン、自己免疫、または癌抗原であろうとなかろうと、関心対象の標的抗原に結合する抗体のクローンファミリーに関する進化樹のバイオインフォマティクス構築が可能となる。
【０５２５】
形質芽球は、芽球B細胞であり、かつ休止B細胞より大きい。形質芽球およびCD20＋B細胞をFACSにより選別し、トリパンブルーで染色して死細胞を排除し、倍率200倍で撮影した。52個の形質芽球および51個のCD20＋B細胞を撮影し、細胞エリアをImageJで測定した。撮影された形質芽球は、直径が7.8〜13μMの間、面積が48〜121μM2の間、および体積が251〜996μM3の間であった。CD20＋B細胞は芽球になっておらずかつより小さく、大多数は、直径が6〜8μM、または50μM2より小さく、または268μM3より小さく、51個のうちの4個の細胞のみがそれよりも大きい（図41）。直径が8μMまたは面積が50μM2または体積が268μM3より大きいまたは小さい細胞を分離し得る任意のふるい装置は、捕捉された形質芽球の96％を有して、CD20＋休止B細胞から形質芽球を分離し得、かつ休止B細胞の92％をふるいにかけて除き得る。そのような装置は、8μMの穴径を有する微細なふるい、または直径が8μMもしくは面積が50μM2もしくは体積が268μM3より大きい細胞のみが通過するのを可能にするもしくは妨げる、水路を有するマイクロ流体装置であってよい。次いで、1ウェルあたり1個のみまたは数個の細胞が存在するように、これらの細胞をマイクロ流体装置におけるアクチュエーター／ポンプによってウェル内に選別することができ、次いで、材料および方法における「非タッチダウン」PCRにあるように、同じ濃度の試薬を用いて、バーコード化のためのRT、PCRを実施してよい。配列決定、クローニング、および発現のための下流の調製は、実施例6および8にあるとおりである。
【０５２６】
実施例57：抗黄色ブドウ球菌抗体は、好中球細胞株による黄色ブドウ球菌の食作用を増進する
黄色ブドウ球菌感染に対して効果的な免疫応答を開始している黄色ブドウ球菌感染症を有するヒト、例えば抗生物質療法を必要とせずに黄色ブドウ球菌を一掃するヒトを、末梢血の供給源として用い、そこからの末梢血形質芽球を染色し、選別する。形質芽球を単一細胞選別し、材料および方法における「非タッチダウンPCR」に詳述されるようにバーコード化し、材料および方法における「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に詳述されるように配列決定のために調製する。進化樹をバイオインフォマティクスにより構築し、各クローンファミリーのいくつかの厳選した代表物を選択し、実施例8にあるように、組換え抗体としての発現のためにクローン化する。約5％プロテインA陽性である黄色ブドウ球菌Wood株を、5％トリプチケースソイ寒天（TCA）血液寒天上にプレーティングし、コロニーを増殖させ、ストックとして4℃で保管する。別のコロニーを拾うことによって、このストックを週に1回新たにする。1mLのこのストックを用いて植菌し、およそ中間対数増殖期に相当するOD550＝0.5まで黄色ブドウ球菌を増殖させる。黄色ブドウ球菌を、4％パラホルムアルデヒド（PFA）中で室温にて15分間軽く固定し、ハンクス平衡塩液（HBSS）で1回洗浄し、その後1μM CFSEで室温にて15分間染色する。次いで、固定した細菌を洗浄し、10μg/mlの発現した組換え抗黄色ブドウ球菌抗体、または陰性対照としての10μg/mlの発現した抗インフルエンザウイルス抗体とともにインキュベートする。次いで、細菌を2回洗浄する。好中球細胞株のHL-60を、25μMレチノイン酸で96時間活性化し、96ウェルプレート中で300rpmにて穏やかに振とうさせながら、標識され固定された細菌と37℃で45分間1：1〜1：100でインキュベートする。次いで、HL-60を2回洗浄し、フローサイトメーターで分析する。HL-60におけるCFSE標識化の量は、食作用を受ける黄色ブドウ球菌の量の指標である。いくつかの発現した抗黄色ブドウ球菌抗体は、ブドウ球菌細胞表面タンパク質に結合し、細菌をオプソニン化し、食作用の増大につながると考えられる。
【０５２７】
実施例58：抗黄色ブドウ球菌抗体は、好中球を介した黄色ブドウ球菌の殺傷を増進する
上記の関連実施例にあるように、黄色ブドウ球菌感染症を効果的に制御しかつ／または一掃し得たヒトを選択し、上記の関連実施例にあるように、形質芽球を単離し、配列決定およびクローニングおよび発現のために、単一細胞選別した。黄色ブドウ球菌臨床分離株を5％TCA血液寒天上にプレーティングし、コロニーを増殖させ、ストックとして4℃で保管した。別のコロニーを拾うことによって、このストックを週に1回新たにした。1mLのこのストックを用いて植菌し、およそ中間対数増殖期に相当するOD550＝0.5まで黄色ブドウ球菌を増殖させた。次いで、黄色ブドウ球菌を、2μg/mlの発現した抗黄色ブドウ球菌抗体とともに4℃で30分間インキュベートし、その後2回洗浄した。HL-60好中球細胞を、25μMレチノイン酸で96時間活性化し、96ウェルプレート中で300rpmにて振とうさせながら、幼仔ウサギ補体および黄色ブドウ球菌とともに37℃で45分間1：1〜1：100の比率でインキュベートした。次いで、HL-60細胞を迅速に氷上に置き、3回洗浄して、緩く接着した黄色ブドウ球菌を除去した。次いで、細胞外黄色ブドウ球菌を連続希釈し、5％TSA血液寒天上にプレーティングし、37℃で一晩培養した。翌日、コロニーをカウントして、コロニー形成単位（CFU）の数を判定した。特異的抗黄色ブドウ球菌組換え抗体によるCFUの減少（黄色ブドウ球菌とのインキュベーション後）は、それらの抗体が、HL-60細胞による黄色ブドウ球菌の、食作用の増進を仲介すること、および殺傷すること、または増殖を低下させることに有効であったことを実証している（図46）。
【０５２８】
実施例59：マウスモデルにおける、発現した抗黄色ブドウ球菌抗体を用いた、黄色ブドウ球菌に感染したマウスの治療
実施例58にあるように、インビトロの殺傷活性、増殖低下活性、または結合活性を実証している抗黄色ブドウ球菌抗体は、インビボでの活性も有し得る。殺傷活性を有する抗黄色ブドウ球菌抗体を、実施例55〜58にあるように、ブドウ球菌感染症を制御し得る、黄色ブドウ球菌に感染したヒトから単離する。マウスに、致死量の黄色ブドウ球菌を与え、次いで対照抗体、または実証された殺傷活性、増殖低下活性、もしくは結合活性を有する組換え抗黄色ブドウ球菌抗体で処理する。マウスは、それらがKaplan-Meier生存試験によって判定される、より長い生存または感染症の重症度の低下を有した場合、保護されると見なされる。それによって、黄色ブドウ球菌感染症の重症度を制御するまたは低下させる、ヒトに由来する抗黄色ブドウ球菌抗体を、黄色ブドウ球菌に対する受動的保護を与え得るその能力について評価する。
【０５２９】
実施例60：ワクチンを開発するための効果的な抗黄色ブドウ球菌免疫応答の抗原標的の使用
殺傷活性、増殖低下活性、または結合活性を示す抗黄色ブドウ球菌抗体によって標的とされる黄色ブドウ球菌抗原は、黄色ブドウ球菌ワクチンの優れた候補である。それらの特異的抗原に対して強い応答を起こすワクチン接種者は、保護され得または黄色ブドウ球菌による感染症の重症度の低下を示し得る。殺傷活性、増殖低下活性、または結合活性を有する抗黄色ブドウ球菌抗体を、殺傷活性、増殖低下活性、または結合活性を有する抗黄色ブドウ球菌抗体を、実施例55〜58にあるように、黄色ブドウ球菌感染症を制御し得る、黄色ブドウ球菌に感染したヒト、および質量分析を用いて同定されるそれらの標的抗原から単離する。マウスにモックベクターをワクチン接種するか、または黄色ブドウ球菌抗原候補をワクチン接種し、次いで、2ヶ月の期間にわたり2回追加免疫する。黄色ブドウ球菌抗原候補を、個々にまたは組み合わせてマウスを免疫してよい。抗黄色ブドウ球菌抗原抗体の力価をELISAによって確認する。次いで、マウスに致死量の黄色ブドウ球菌を接種する。マウスは、それらがKaplan-Meier生存試験によって判定される、より長い生存を有した場合、黄色ブドウ球菌に対して保護されると見なされる。したがって、これらの選択された黄色ブドウ球菌抗原に対する免疫は、保護を与えまたは感染症の重症度を低下させ、本明細書における組成物および方法がワクチン設計に役立ち得ることを示す。
【０５３０】
実施例61：ヒトにおける、インビボでの殺傷活性、増殖低下活性、または結合活性を有する組換え抗黄色ブドウ球菌抗体を用いた、黄色ブドウ球菌に感染したヒトの治療
実施例55〜59にあるように、黄色ブドウ球菌感染症を制御し、かつインビトロおよびインビボでの殺傷活性、増殖低下活性、または結合活性を示すヒトに由来する抗体を用いて、黄色ブドウ球菌に感染した患者を治療し得る。実施例55〜59にあるように、抗体を獲得し、インビトロおよびインビボでの殺傷活性について試験する。製造管理および品質管理に関する基準（Good Manufacturing Practice）（GMP）で製造された抗黄色ブドウ球菌モノクローナル抗体を、黄色ブドウ球菌に感染したヒト、とくにメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）または薬物耐性黄色ブドウ球菌の他の株に感染した患者に静脈内または皮下に与え、有効性について抗生物質単独と比較してもよい。患者が侵襲性黄色ブドウ球菌感染症に対して保護され、より重症度の軽い黄色ブドウ球菌感染症を有し、かつ／または抗生物質のみを与えられたもしくは抗生物質を与えられなかった患者よりも迅速に回復した場合、抗黄色ブドウ球菌抗体は治療的有用性を有すると見なされる。組換え抗黄色ブドウ球菌抗体を、感染症の重症度を低下させるため、および／または感染症の一掃を増進するために、活動性黄色ブドウ球菌感染症を有する患者に治療的に与えることができ、ならびに腎不全のために血液透析を受けている患者、入院中の患者、または黄色ブドウ球菌もしくはMRSAに対してスクリーニング陽性を有する患者等の危険性の高い患者集団に予防的に与えることができる。
【０５３１】
実施例62：ヒトにおける、防御免疫を与えるための、同定された黄色ブドウ球菌抗原を用いた黄色ブドウ球菌ワクチン接種
インビボで殺傷活性または結合活性を示す抗黄色ブドウ球菌抗体によって標的とされ、かつマウスモデルにおいてワクチンを接種された場合に、黄色ブドウ球菌接種に対する保護を与える黄色ブドウ球菌抗原は、ヒトにおける予防的ワクチンの優れた候補であり得る。実施例55〜58および59にあるように、抗黄色ブドウ球菌抗体を、黄色ブドウ球菌感染症を制御するヒトから得てクローン化し、発現させ、かつインビボでの殺傷活性、増殖低下活性、または結合活性についておよびマウスにおけるワクチン候補として試験する。次いで、殺傷活性、増殖低下活性、または結合活性を有する抗黄色ブドウ球菌抗体の標的である黄色ブドウ球菌抗原を含有している黄色ブドウ球菌ワクチンをヒトに与える。偽薬が対照である。黄色ブドウ球菌感染症の発生率または重症度についてコホートを追跡する。ワクチンは、それが、偽薬コホートと比較して、ワクチンを接種されたコホートの黄色ブドウ球菌感染症の発生率または重症度を低下させた場合、成功したと見なされる。
【０５３２】
実施例63：保護の関連要因としての、黄色ブドウ球菌ワクチン候補によって誘導される免疫応答のモニタリング
実施例62にある黄色ブドウ球菌ワクチン候補を用いたヒトの免疫後、関心対象の標的黄色ブドウ球菌抗原に対する堅牢なクローンファミリーが引き出されたかどうかを判定することによって、ワクチン応答をモニターすることができる。ワクチン接種後7〜14日の間血液を採り、形質芽球を単一細胞選別し、材料および方法における「非タッチダウンPCR」および「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に詳述されるようにバーコード化し、454シークエンシングする。進化樹を描き、次いで、実施例8にあるように、各クローンファミリーの2〜3個のメンバーをクローン化し、発現させ、かつ関心対象のブドウ球菌抗原へのそれらの結合についてELISAで試験する。本発明者らは、ワクチンにより誘導される強い抗黄色ブドウ球菌免疫応答を有するヒトは、効果的なヒト免疫応答において標的とされる黄色ブドウ球菌抗原に対する大きなクローンファミリーを示すであろうと予想する。そのような手法は、黄色ブドウ球菌ワクチンの保護の関連要因を提供する潜在性を有し、そうすることで、臨床試験および開発が簡素化されるのを可能にする。この抗体および／またはTCR免疫レパートリーのモニタリングによって、ワクチン候補が有効性を提供するであろう可能性の迅速な査定が可能になると考えられる。
【０５３３】
実施例64：組換え抗肺腺癌抗体を用いた、肺腺癌を有するマウスの治療
細胞表面タンパク質または他の肺腺癌タンパク質に結合する抗肺腺癌抗体は、肺腺癌細胞に対する毒素を標的とするための、または肺腺癌細胞によって発現される他の分子を標的とするためのキャリアとして有用であり得る。実施例11にあるように、細胞表面結合活性を有する抗肺腺癌抗体または他の肺腺癌抗原を、長期非進行の肺腺癌の癌患者から単離する。ヌードマウスに、H1650肺腺癌細胞株を皮下注射し、腫瘍を1週間成長させる。次いで、抗肺腺癌抗体を、細胞結合ドメインでありかつジフテリア毒素を細胞内に入れるRドメインを欠いているジフテリア毒素等の毒素に結合させる。したがって、Rドメインを欠いているジフテリア毒素は、抗体が結合しかつジフテリア毒素負荷物を送達する肺腺癌細胞のみに致死的である。Rドメインのないジフテリア毒素に結合させた対照抗体を対照として用いる。対照におけるよりも腫瘍量がより大幅に減少した場合、肺腺癌抗体は、腺癌細胞を殺傷するためのその負荷物を上手く送達していると見なされる。あるいは、ある場合には、組換え抗体自体が、（結合させた毒素の非存在下において）腫瘍細胞の殺傷を仲介することができ得る、または腫瘍細胞の増殖を阻止することができ得る。
【０５３４】
実施例65：発現した抗肺腺癌抗体を用いた、肺腺癌患者の治療
細胞表面抗原に結合する抗肺腺癌抗体は、肺腺癌細胞に対する毒素を標的とするためのキャリアとして有用であり得る。実施例11にあるように、細胞表面結合活性を有する抗肺腺癌抗体を、長期非進行の肺腺癌の癌患者から単離する。GMPモノクローナル抗体または他の抗肺腺癌モノクローナル抗体を、肺腺癌患者、とくに生検された腺癌細胞が、該モノクローナル抗体によって標的とされる高レベルの細胞表面抗原を発現した患者に静脈内または皮下に与えてよい。肺腺癌抗原に対する組換えモノクローナル抗体、またはそれらが由来するクローンファミリーの他のメンバーを用いて、個々の患者の肺腺癌の生検標本を免疫組織化学的に染色し、腫瘍抗原の発現レベルについての情報を得ることができ、この情報を用いて、個々の患者がこのモノクローナル抗体を用いた療法に応答する可能性があるかどうかを判定することができる。抗肺腺癌抗体を、細胞結合ドメインでありかつジフテリア毒素を細胞内に入れるRドメインを欠いているジフテリア毒素等の毒素に結合させることができる。したがって、Rドメインを欠いているジフテリア毒素は、抗体が結合しかつジフテリア毒素積載物を送達する肺腺癌細胞のみに致死的である。化学療法の標準的治療を比較群の治療に用いる。患者がより長く生存し、または再発もしくは進行の前により長い時間を呈した場合、抗腺癌抗体は、それらの積載物を送達しておりかつ治療的有用性を有すると見なされる。あるいは、ある場合には、肺腺癌抗原に対する組換え抗体自体が、（結合させた毒素の非存在下において）腫瘍細胞の殺傷を仲介することができ得る、または腫瘍細胞の増殖を阻止することができ得る。
【０５３５】
実施例66：ヒトにおける、同定された抗原を用いた、肺腺癌の治療用ワクチン接種
抗肺腺癌抗体によって結合される細胞表面抗原を治療用ワクチンに用いて、確立された肺腺癌を治療し得、または肺腺癌の発症から保護し得る。実施例11にあるように、細胞表面結合活性を有する抗肺腺癌抗体を、長期非進行の肺腺癌の癌患者から単離し、免疫沈降または免疫ブロットおよび質量分析を用いて、標的抗原を同定する。ワクチン接種者に、関心対象の肺腺癌抗原を含有しているワクチンまたは対照ワクチンを与える。次いで、コホートを追跡調査し、ワクチン接種者の肺腺癌の発症率または進行を追跡する。標的抗原をワクチン接種されたヒトが、標準的治療の比較群と比較して、生存を延長しているかまたは再発までの時間を伸ばしている場合、ワクチンは成功したと見なされる。
【０５３６】
実施例67：応答の有効性に対する肺腺癌ワクチン接種の免疫モニタリング
実施例66にある肺腺癌ワクチンを用いたヒトの免疫後、ワクチン内の関心対象の腺癌抗原に対する堅牢なクローンファミリーが引き出されたかどうかを判定することによって、ワクチン応答をモニターすることができる。ワクチン接種後7〜14日の間血液を採り、形質芽球を単一細胞選別し、バーコード化し、材料および方法における「非タッチダウンPCR」および「454 XLR70シークエンシングランのための調製」に詳述されるように454シークエンシングを実施する。進化樹を描き、次いで、実施例8にあるように、各クローンファミリーの2〜3個のメンバーをクローン化し、発現させ、かつ関心対象のブドウ球菌抗原へのそれらの結合についてELISAで試験する。本発明者らは、強い免疫応答を有するヒトは、関心対象の肺腺癌抗原に対する大きなクローンファミリー、および／または関心対象の腺癌抗原に対する多くのクローンファミリーを有するであろうと予想する。この免疫モニタリングによって、本発明者らは、ワクチン候補の有効性を迅速に予測することが可能となる。
【０５３７】
実施例68：逆転写の間の鋳型切り替えのためのSuperscript IIIの使用
本発明者らの方法では、逆転写の間に、サンプル同定領域およびアダプター領域が付加される。これは、RNase H−逆転写酵素の3'テーリング活性および鋳型切り替え活性を利用する。最も頻繁には、Superscript II（Invitrogen）等の逆転写酵素が、その作用温度である42℃で用いられる。50℃の推奨作用温度を有する、熱安定性のために遺伝子操作もされているSuperscript III等のMMLV H−逆転写酵素は、3'テーリング活性を有さず、したがって鋳型切り替え能を有しないことが報告されている（http：//tools.invitrogen.com/content/sfs/ProductNotes/F_Superscript%20III%20Enzyme%20RD-MKT-TL-HL0506021.pdf?ProductNoteId=36）。しかしながら、図42において、本発明者らは、Superscript IIIが3'テーリング活性および鋳型切り替え活性を有することを示した。この特性は、Superscript IIIに対して推奨される逆転写温度の50℃では弱く、なぜSuperscript IIIの3'テーリング活性が以前に報告されていないかを説明し得る。しかしながら、RT温度を50℃から45.5℃へ、42℃へ下げたのにつれて、3'テーリング活性および鋳型切り替えは有意に増大する。本発明者らは、熱安定性のために遺伝子操作されているすべてのMMLV RNase H−逆転写酵素は、より低い作用温度、すなわち42℃〜50℃の間で3'テーリング活性も有すると予想する。
【０５３８】
実施例69：メモリーB細胞および形質細胞の応答、ならびに特異的組織へのホーミングに関連した抗体を同定するための、共発現した遺伝子の分析
本明細書における方法および組成物によって記載されるように、個々のウェルに選別されたB細胞、T細胞、または他の細胞によって産生されるすべてのcDNAのバーコード化により、形質芽球、他のB細胞、T細胞、および他の細胞における遺伝子共発現についての単一細胞レベルでの特徴付けが可能となる。これにより、メモリーB細胞、形質細胞、メモリーT細胞、エフェクターT細胞の特異的タイプ（例えば、Th1、Th2、Th17、またはT-調節性T細胞）に分化するように誘導されているか、または特異的組織もしくは部位（例えば、消化管、皮膚、または脳）へホーミングするように誘導されているB細胞およびT細胞によって発現された特異的抗体およびTCRを同定するための、共発現した遺伝子の使用が可能となる。特異的サンプルにおける個々の細胞または細胞の収集物によって産生されるすべてのcDNAのバーコード化により、そのような特異的遺伝子の共発現を特徴付けするための、第1のPCRおよび第2のPCRの両方に対するさらなる3'PCRプライマーの使用が可能となる。5'プライマーは、可変領域遺伝子を増幅するために用いられたものと同じままである。さらには、共発現した遺伝子の分析により、クローンファミリーの親和性成熟と、メモリーB細胞、短寿命形質芽球、および長寿命形質細胞へのB細胞の分化（表34）、調節性T細胞（Treg）もしくはTh1、Th2、Th17細胞へのナイーブもしくはメモリーT細胞の分化（表35）、または特異的部位へのB細胞もしくはT細胞のホーミングに関連した遺伝子の共発現との間の関係性についてのバイオインフォマティクス分析が可能となる。そのような分析は、効果的な免疫応答を仲介する決定的な抗体またはTCRをさらに突き止めることができる。
【０５３９】
例えば、免疫応答を開始している個体に由来するPMBCを用いて、形質芽球を単一細胞選別する。本明細書における方法および組成物を用いて、異なる組織への形質芽球のホーミングに関連する遺伝子の共発現を分析する（表36を参照されたい）。データセットのバイオインフォマティクス分析により、異なる身体的位置での分泌に関連する抗体が同定される。次いで、実施例8にあるように、インビトロのスクリーニングアッセイにおける特徴付けのために、これらの抗体遺伝子を組換えによって発現させる。
【０５４０】
本発明の様々な局面の精神および範囲から逸脱することなく、形式および詳細における様々な変更がそこでなされ得るということは、関連技術分野における当業者によって理解されるであろう。
【０５４１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、文脈上そうでないことが明白に指示されていない限り、単数形の「一つ（a）」、「一つ（an）」、および「この（the）」は、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【０５４２】
本明細書の本文中で引用されるすべての参考文献、発行済み特許、および特許出願は、あらゆる目的で、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０５４３】
（表１）プライマーおよびアダプター分子
0005998203.tif 000025
＊サンプルID配列については、表2を参照されたい。プレートID配列については、表3を参照されたい。κGSP 2s、λGSP 2s、およびγGSP 2sは、それらがプレートID配列を有しないという点を除いて、κ、λ、およびγGSPロングプライマー2と同一である。XL＋ランを行う場合、またはTitanium LibA化学反応を用いてXLR70ランを行う際に順方向プライマーの読み取りのみが所望される場合、プレートID配列は必要でない。
＊＊プライマー配列は、IMGTデータベース（http：//imgt.cines.fr/）に見出されるすべての異なる定常遺伝子バリアントを増幅し得るように設計された。
【０５４４】
（表２）サンプルID
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0005998203.tif 000027
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【０５４５】
（表３）プレートID
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0005998203.tif 000030
【０５４６】
（表４）クローニングプライマー
0005998203.tif 000031
＊クローニング順方向プライマーは、5'隣接制限部位から始まり、3'末端のサンプルID配列で終わる。これにより、クローニングプライマーが、異なるウェルの起源を有する配列を区別し、かつ特異的サンプルID配列を有するアンプリコンを選択的に増幅することが可能となる。したがって、それぞれが特定のサンプルIDに特異的である、複数のクローニング順方向プライマーが存在する。クローニング順方向プライマーの3'配列は、ウェルIDに相補的であり、表5に提示されている。「Clon」から始まる名称を有するプライマーは、順方向プライマーである。「K」、「L」、または「G」から始まる名称を有するプライマーは、それぞれκ、λ、およびγ鎖に特異的な定常領域である逆方向プライマーである。逆方向プライマーの名称は、プライマーが組み入れるであろう制限部位も意味する。最後に、「DHFR」または「Lonza」は、定常領域プライマーが、それぞれ、付加された定常領域インサートを有する、pcDNA3.3およびpOptivecのベクターセットに対するものか、またはpEE12.4およびpEE6.4のLonzaベクターに対するものかを意味する。
【０５４７】
（表５）クローニングプライマーのウェル特異的配列
0005998203.tif 000032
0005998203.tif 000033
0005998203.tif 000034
【０５４８】
（表６）
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0005998203.tif 000036
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【０５４９】
（表７）
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0005998203.tif 000039
0005998203.tif 000040
【０５５０】
（表８）
0005998203.tif 000041
0005998203.tif 000042
0005998203.tif 000043
【０５５１】
（表９）XL＋シークエンシングのための、アダプターにライゲーションするためのプライマー
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【０５５２】
（表１０）他のヒト遺伝子に対する3'プライマー
0005998203.tif 000045
【０５５３】
（表１１）マウス遺伝子に対する3'プライマー
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＊λGSP1aおよびGSP1bを50：50で混合して、λGSP2aおよびλGSP2bも50：50で混合して、IMGTに見出されるすべてのλ定常領域アレルを増幅することができる。すべてのγGSP1dも均等に混合して、すべてのγ1、2a、2b、2c、および3定常領域アレルを増幅することができる。γGSP2dも50：50で混合して、ならびにγGSP2eも50：50で混合して、IMGTデータベースに見出されるすべてのγ1、2a、2b、2c、および3定常領域アレルを増幅することができる。
【０５５４】
（表１２）患者参照のためのプレート
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【０５５５】
（表１３）
0005998203.tif 000048
0005998203.tif 000049
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【０５５６】
（表１４）
0005998203.tif 000051
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0005998203.tif 000053
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【０５５７】
（表１５）
0005998203.tif 000055
【０５５８】
（表１６）DHFRベクターであるpcDNA3.3およびpOptivecに対する定常領域インサート配列
0005998203.tif 000056
【０５５９】
（表１７）Lonzaベクターに対する定常領域インサート配列
0005998203.tif 000057
【０５６０】
（表１８）発現したすべての抗体
0005998203.tif 000058
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0005998203.tif 000065
＊V-QUESTによって与えられるVDJ識別
【０５６１】
（表１９）Fluzone ELISAに用いた抗体
0005998203.tif 000066
0005998203.tif 000067
【０５６２】
（表２０）表面プラズモン共鳴に用いた抗体
0005998203.tif 000068
【０５６３】
（表２１）RA抗原アレイに用いた抗体
0005998203.tif 000069
【０５６４】
（表２２）ヒストン2A ELISAおよびCCP ELISAに用いた抗体
0005998203.tif 000070
【０５６５】
（表２３）RF ELISAに用いた抗体
0005998203.tif 000071
【０５６６】
（表２４）肺癌組織IHCおよび肺癌細胞株のフローサイトメトリーに用いた抗体
0005998203.tif 000072
【０５６７】
（表２５）黄色ブドウ球菌表面染色に用いた抗体
0005998203.tif 000073
【０５６８】
（表２６）マイクロ中和アッセイに用いた抗体
0005998203.tif 000074
【０５６９】
（表２７）ブドウ球菌阻害アッセイに用いた抗体
0005998203.tif 000075
【０５７０】
（表２８）ブドウ球菌IPに用いた抗体
0005998203.tif 000076
【０５７１】
（表２９）ブドウ球菌質量分析に用いた抗体
0005998203.tif 000077
【０５７２】
（表３０）
0005998203.tif 000078
【０５７３】
（表３１）
0005998203.tif 000079
【０５７４】
（表３２）
0005998203.tif 000080
【０５７５】
（表３３）
0005998203.tif 000081
【０５７６】
（表３４）メモリーB細胞、短寿命形質細胞、長寿命形質細胞、および抗体分泌細胞へのB細胞分化に関連して共発現した遺伝子
0005998203.tif 000082
【０５７７】
（表３５）Treg、Th1、Th2、Th17細胞へのT細胞分化に関連して共発現した遺伝子
0005998203.tif 000083
【０５７８】
（表３６）特異的組織への形質芽球ホーミングに関連して共発現した遺伝子
0005998203.tif 000084
【０５７９】
一般的な参考文献
0005998203.tif 000085
【図１】
0005998203.tif 000086
【図２】
0005998203.tif 000087
【図３】
0005998203.tif 000088
【図４】
0005998203.tif 000089
【図５】
0005998203.tif 000090
【図６】
0005998203.tif 000091
【図７】
0005998203.tif 000092
【図８】
0005998203.tif 000093
【図９】
0005998203.tif 000094
【図１０】
0005998203.tif 000095
【図１１】
0005998203.tif 000096
【図１２】
0005998203.tif 000097
【図１３】
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【図１４】
0005998203.tif 000099
【図１５】
0005998203.tif 000100
【図１６】
0005998203.tif 000101
【図１７】
0005998203.tif 000102
【図１８】
0005998203.tif 000103
【図１９】
0005998203.tif 000104
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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