【手続補正書】
【提出日】平成23年9月28日(2011.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３８】
したがって表１７の結果は、Ｙ４０３６親株と比較して、Ｙ４０３６（ΔＰｅｘ３）株が、平均してより高い脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（約６．０％対４．７％）、より高いＤＧＬＡ％ＴＦＡ（４６％対１９％）、およびより高いＤＧＬＡ％ＤＣＷ（約２．８％対０．９％）を有したことを示す。さらにＹ４０３６（ΔＰｅｘ３）株は、総ＰＵＦＡに対するＤＧＬＡの量に２倍の増大（６７．７％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対３３．３％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）を有し、総ＰＵＦＡに対するＣ２０  ＰＵＦＡ量に１．７倍の増大（８２％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対４７％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）を有した。
改善されたＤＧＬＡ生産性は、ＥＰＡ産生について改変されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株（例えば実施例１０に記載されているようなＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株、およびその誘導体）中において、改善されたＥＰＡ生産性をもまたもたらすという仮説が立てられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３９】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．総脂質含量、総脂質画分、および油画分を有する油性真核生物における総脂肪酸質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％を増大させる方法であって、
ａ）１）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子；および
２）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊；
を含む油性真核生物を備え、それによりＰＥＸ破壊生物を備えること：および
ｂ）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％を比較した場合、総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％を増大させる条件下で、ＰＥＸ破壊生物を生育させること
を含む、上記方法。
２．油性真核生物の乾燥細胞質量に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸のパーセントを増大させる方法であって、
ａ）１）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子；および
２）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊；
を含む油性真核生物を備え、それによりＰＥＸ破壊生物を備えること：および
ｂ）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における乾燥細胞質量に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸のパーセントと比較した場合、乾燥細胞質量に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸のパーセントを増大させる条件下で、ＰＥＸ破壊生物を生育させること
を含む、上記方法。
３．ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の質量％に対して多価不飽和脂肪酸の質量％を比較した場合、総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸質量％の増大が少なくとも１．３である、上記１または２に記載の方法。
４．少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、共役リノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ドコサヘキサエン酸、これらの水酸化またはエポキシ脂肪酸、Ｃ18多価不飽和脂肪酸、Ｃ20多価不飽和脂肪酸、およびＣ22多価不飽和脂肪酸からなる群から選択される、上記１または２に記載の方法。
５．少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸が多価不飽和脂肪酸の組み合わせからなり、組み合わせの質量％が総脂肪酸の質量％に対して増大する、上記１に記載の方法。
６．多価不飽和脂肪酸の組み合わせが、リノール酸、共役リノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ドコサヘキサエン酸、これらの水酸化またはエポキシ脂肪酸、Ｃ20多価不飽和脂肪酸の組み合わせ、Ｃ20〜22多価不飽和脂肪酸の組み合わせ、およびＣ22多価不飽和脂肪酸の組み合わせからなる群から選択される、２つまたはそれ以上の多価不飽和脂肪酸の任意の組み合わせからなる、上記４に記載の方法。
７．ＰＥＸ破壊生物における総脂質含量が、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における総脂質含量と比較した場合、変化させられる、上記１または２に記載の方法。
８．ＰＥＸ破壊生物が、油性性質を有するヤロウィア属、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、リポミセス属、クサレケカビ属、スラウストキトリウム属、シゾキトリウム属、およびサッカロミセス属からなる群から選択される、上記１または２に記載の方法。
９．多価不飽和脂肪酸生合成経路が、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼ、およびΔ９エロンガーゼからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子を含む、上記１または２に記載の方法。
１０．ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊が、タンパク質のＣ末端部分をコードする遺伝子の一部の欠失および遺伝子ノックアウトからなる群から選択される欠失を含んでなる、上記１または２に記載の方法。
１１．ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が、Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、およびＰｅｘ２６ｐからなる群から選択される、上記１または２に記載の方法。
１２．ペルオキシソーム生合成因子は、破壊が遺伝子ノックアウト、またはタンパク質のＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフのＣ末端部分をコードする遺伝子の一部の欠失である、上記１１に記載の方法。
１３．総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％の増大を有し、増大が上記１に記載の方法によって得られる、ＰＥＸ破壊生物における油画分または総脂質画分。
１４．上記１に記載の方法によって、総脂肪酸の質量％に対して質量％が増大している、ＰＥＸ破壊生物の少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の食品、飼料としての、または産業上の利用における使用。
１５．破壊が、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、およびＰｅｘ１６ｐからなる群から選択される、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子中で起きる、ＰＥＸ破壊ヤロウィア・リポリティカ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
総脂質含量、総脂質画分、および油画分を有する油性真核生物における総脂肪酸質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％を増大させる方法であって、
ａ）１）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子；および
２）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊；
を含む油性真核生物を備え、それによりＰＥＸ破壊生物を備えること：および
ｂ）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％を比較した場合、総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％を増大させる条件下で、ＰＥＸ破壊生物を生育させること
を含む、上記方法。
【請求項２】
油性真核生物の乾燥細胞質量に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸のパーセントを増大させる方法であって、
ａ）１）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子；および
２）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊；
を含む油性真核生物を備え、それによりＰＥＸ破壊生物を備えること：および
ｂ）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における乾燥細胞質量に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸のパーセントと比較した場合、乾燥細胞質量に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸のパーセントを増大させる条件下で、ＰＥＸ破壊生物を生育させること
を含む、上記方法。
【請求項３】
総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％の増大を有し、増大が請求項１に記載の方法によって得られる、ＰＥＸ破壊生物における油画分または総脂質画分。
【請求項４】
請求項１に記載の方法によって、総脂肪酸の質量％に対して質量％が増大している、Ｐ
ＥＸ破壊生物の少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の食品、飼料としての、または産業上の利用における使用。
【請求項５】
破壊が、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、およびＰｅｘ１６ｐからなる群から選択される、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子中で起きる、ＰＥＸ破壊ヤロウィア・リポリティカ。