(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベシクル組成物であって：
（Ａ）第一のリポソーム組成物であり：
（１）第一のリン脂質；
（２）コレステロール；および
（３）リン脂質−ポリエチレングリコール−ボロン酸コンジュゲート、
を含む第一のリポソーム組成物で、
ここで、第一の治療用化合物をカプセルに封入している、前記第一のリポソーム組成物と；
（Ｂ）第二のリポソーム組成物であり：
（１）第二のリン脂質；
（２）コレステロール；および
（３）リン脂質−ポリエチレングリコール−グリコシルコンジュゲート、
を含む第二のリポソーム組成物で、
ここで、第二の治療用化合物をカプセルに封入している、前記第二のリポソーム組成物と、
を含んでいる、ベシクル組成物。
【請求項２】
前記ボロン酸が、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸を含む、請求項１に記載のベシクル組成物。
【請求項３】
前記リン脂質−ポリエチレングリコール−ボロン酸コンジュゲートが：
【化１】
0005998158.tif 000018
を含み、
ここでｎ＝３０〜６０である、請求項１に記載のベシクル組成物。
【請求項４】
前記リン脂質−ポリエチレングリコール−グリコシルコンジュゲートが：
リン脂質部分と；
ポリエチレングリコール部分と；
グリコシル部分と、
を含む、請求項１に記載のベシクル組成物。
【請求項５】
前記グリコシル部分が、グルコシル部分を含む、請求項４に記載のベシクル組成物。
【請求項６】
前記グリコシル部分が、ガラクトシル部分を含む、請求項４に記載のベシクル組成物。
【請求項７】
前記グリコシル部分が、マンノピラノシジル部分を含む、請求項４に記載のベシクル組成物。
【請求項８】
前記第一の治療用化合物および前記第二の治療用化合物が各々、インスリンを含む、請求項１に記載のベシクル組成物。
【請求項９】
前記第一および第二のリポソーム組成物が、糖の存在に応答して、そのそれぞれの治療用化合物のある量を放出する、請求項１に記載のベシクル組成物。
【請求項１０】
前記放出されたそれぞれの治療用化合物の量が、糖の濃度に依存する、請求項９に記載のベシクル組成物。
【請求項１１】
前記第一の治療用化合物および第二の治療用化合物が同じである、請求項１に記載のベシクル組成物。
【請求項１２】
糖尿病の処置において有用なベシクル組成物であって：
（Ａ）第一のリポソーム組成物であり：
（１）第一のリン脂質；
（２）コレステロール；および
（３）リン脂質−ポリエチレングリコール−ボロン酸コンジュゲート、
を含む第一のリポソーム組成物であって、ボロン酸の遊離型よりも低い細胞毒性および／または低い炎症性であるボロン酸を含んでおり、
ここで、前記第一のリポソーム組成物がインスリンをカプセルに封入している、第一のリポソーム組成物と、
（Ｂ）第二のリポソーム組成物であり：
（１）第二のリン脂質；
（２）コレステロール；および
（３）グルコシル部分、ガラクトシル部分、またはマンノピラノシジル部分を含むグリコシル部分を含んでいる、リン脂質−ポリエチレングリコール−グリコシルコンジュゲートを含んでおり、
ここで前記第二のリポソーム組成物がインスリンをカプセルに封入している、第二のリポソーム組成物と、
を包含する、有用なベシクル組成物。
【請求項１３】
前記リン脂質−ポリエチレングリコール−ボロン酸コンジュゲートが４−アミノカルボニルフェニルボロン酸を含む、請求項１２に記載のベシクル組成物。
【請求項１４】
前記リン脂質−ポリエチレングリコール−ボロン酸コンジュゲートの前記ボロン酸部分、および前記リン脂質−ポリエチレングリコール−グリコシルコンジュゲートの前記グリコシル部分が、お互いに対して共有結合されている、請求項１３に記載のベシクル組成物。
【請求項１５】
患者に注射可能である組成物であって：
（Ａ）第一のリポソームであり：
（１）ＤＰＰＣ；
（２）コレステロール；および
（３）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ボロン酸コンジュゲートを含み、
ここで、インスリンをカプセルに封入している、前記第一のリポソームと；
（Ｂ）第二のリポソームであり：
（１）ＤＰＰＣ；
（２）コレステロール；
（３）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−グルコシルコンジュゲート；
（４）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ガラクトシルコンジュゲート；および
（５）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノピラノシジルコンジュゲートを含み、
ここで、インスリンをカプセルに封入している、前記第二のリポソームと；
を含んでいる、組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物であって、前記第一のリポソームが：
（１）４０〜７０モル％のＤＰＰＣ；
（２）２０〜５０モル％のコレステロール；および
（３）１〜１５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ボロン酸コンジュゲート、
を含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組成物であって、ここで前記第一のリポソームが：
（１）約５６．４モル％のＤＰＰＣ；
（２）約４０モル％のコレステロール；および
（３）約３．６モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ボロン酸コンジュゲート、
を含む、組成物。
【請求項１８】
請求項１５に記載の組成物であって、ここで前記第二のリポソームが：
（１）４０〜７０モル％のＤＰＰＣ；
（２）２０〜５０モル％のコレステロール；
（３）１〜１５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−グルコシルコンジュゲート；
（４）１〜１５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ガラクトシルコンジュゲート；および
（５）１〜１５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノピラノシジルコンジュゲート、
を含む組成物。
【請求項１９】
請求項１５に記載の組成物であって、ここで前記第二のリポソームが：
（１）約５６．４モル％のＤＰＰＣ；
（２）約４０モル％のコレステロール；
（３）約１．２モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−グルコシルコンジュゲート；
（５）約１．２モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ガラクトシルコンジュゲート；および
（５）約１．２モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノピラノシジルコンジュゲート、
を含む組成物。
【請求項２０】
請求項１５に記載の組成物であって、ここで前記第一のリポソームの前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ボロン酸コンジュゲートの分子が、前記第二のリポソームの前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−グルコシルコンジュゲート、前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ガラクトシルコンジュゲート、および前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノピラノシジルコンジュゲートの分子のうちの少なくとも１つに共有結合される、組成物。
【請求項２１】
請求項１５に記載の組成物であって、ここで前記第一および第二のリポソームのうちの少なくとも１つがグルコースの存在に応答した量のインスリンを放出する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が本明細書において参照によって援用される、２０１１年３月２日出願の、米国特許仮出願第６１／４４８，５５６号から優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援する研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が支給したＲ４３  ＤＫ０８３８１９のもとで政府の支援によって行った。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、身体のインスリン欠乏またはインスリンに対する耐性によって生じる疾患である。Ｉ型糖尿病とは、膵臓のランゲルハンス島のベータ細胞を障害する自己免疫疾患であり、身体のインスリンの量を不十分にさせる。インスリン治療がなければ、Ｉ型糖尿病は、致命的である。ＩＩ型糖尿病は、インスリン産生が不十分であること、またはインスリンに対して患者の身体が適切に反応できないことから生じる。ＩＩ型糖尿病に関連するインスリン耐性は、エネルギー貯蔵のために十分な量の血糖が細胞内に入ることを妨げて、血流中で高血糖を生じる。伝統的には、Ｉ型糖尿病は、毎日、インスリンを繰り返し皮下注射することによって処置される。ＩＩ型糖尿病はまた、経口的にまたは注射によって行われる他の医薬と多くの場合、組み合わされて、インスリンで処置される。１日にインスリンを複数回注射することが必要であり、同様に、食餌の管理および血液の検査を通じて患者の血糖値の注意深いモニタリングも必要である。インスリンポンプは、シリンジによる毎日複数回のインスリン注射の代わりとして用いられる。しかし、インスリンポンプは費用がかさみ、ほとんどの時間装着していなければならず、かつ患者に送達されるインスリンの量を決定するには血液検査を必要とする。血液検査は、患者から血液のサンプルを、通常は指から吸引すること、およびこの血液サンプルを血糖値について試験することを要する。血糖のモニタリングシステムは、間質液中のグルコースの量を定期的にモニタリングするために、皮膚のすぐ下に置かれたセンサーを用いることができる。これらのシステムは、較正を必要とし、これは典型的には、１日あたり２回の指の穿刺につながり、費用がかさむ。さらに、血流中のグルコース濃度と、間質液中のグルコース濃度との間には時間のずれが存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
患者または医療専門者が血糖値を連続的にモニターして、注射されるべき適切な量のインスリンを決定し、かつ１日を通じて定期的にインスリンを注射するする必要なく、グルコース濃度の増大に直接応答して制御された量のインスリンを送達する、システムまたはデバイスが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
治療用化合物を含むベシクル組成物が提供される。このベシクル組成物は、外部誘発因子の存在に応答して治療用化合物を放出できる場合がある。このベシクル組成物は、複数の生体適合性ベシクルを含んでもよい。この生体適合性ベシクルは、その必要な患者の処置のための治療用化合物、およびこの２つ以上の生体適合性ベシクルの間の１つ以上の架橋を含んでもよく、各々の架橋は、化学的な検出性部分および検知部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、この治療用化合物は、対症的な、治療的な、そうでなければ有益的な効果を患者に対して提供する任意の化合物であってもよい。このベシクル組成物は、患者に対する注射に適切であり得る。
【０００６】
複数の生体適合性ベシクルを含むベシクル組成物もまた提供され、この生体適合性ベシクルは、その必要な患者の処置のための治療用化合物、およびこの２つ以上の生体適合性ベシクルの間の１つ以上の架橋を含んでおり、各々の架橋は、ボロン酸部分またはボロン酸誘導体部分および糖部分を含んでいる。
【０００７】
さらに、その必要な患者に治療用化合物を投与する方法が提供される。これらの方法は、処置の必要な患者へベシクル組成物を非経口的に注射することと（このベシクル組成物は、治療用化合物を含んでいる）；誘発性の事象に応答して患者へ治療用化合物を放出することとを包含する。
【０００８】
医学的状態を処置する方法もまた提供され、この方法は、処置の必要な患者に対してベシクル組成物を投与すること（ここで、このベシクル組成物は、その必要な患者の処置のための治療用化合物をロードされる）と；誘発性の事象に応答して患者に治療用化合物を放出することとを包含する。
【０００９】
一般的な説明および以下の詳細な説明は、例示的であって、説明でしかなく、かつ特許請求の範囲で規定されるように、本発明を限定する意図ではない。他の実施形態は、本明細書に提供される詳細な説明を考慮すれば、当業者に明白である。
【００１０】
添付の図面では、化学式、化学構造および実験データを示しており、これは、下に提供される詳細な説明と一緒になって、特許請求された本発明の例示的な実施形態を記載している。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ベシクル組成物の一実施形態を図示する。
【図２】図２は、ベシクル組成物の一実施形態を図示する。
【図３】図３は、ベシクル組成物の一実施形態を図示する。
【図４】図４は、ＮＦ−κＢの核または細胞質の局在化に対するボロン酸誘導体処理の効果を示しているＨｅＬａ細胞の代表的な画像を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、未処理のコントロール（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＵＴＣ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と比較した、遊離の（暗いバー）４−アミノカルボニルフェニルボロン酸を用い、およびそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞中のＮＦ−κＢ分子の核と細胞質の画分との間のピアソンの相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（ＰＣＣ）を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、未処理のコントロール（ＵＴＣ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と比較した、遊離の（暗いバー）３−アミノフェニルボロン酸を用い、およびそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞中のＮＦ−κＢ分子の核と細胞質の画分との間のピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、未処理のコントロール（ＵＴＣ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と比較した、遊離の（暗いバー）５−アミノ−２，４−ジフルオロフェニルボロン酸を用い、およびそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞中のＮＦ−κＢ分子の核と細胞質の画分との間のピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、未処理のコントロール（ＵＴＣ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と比較した、遊離の（暗いバー）３−フルオロ−４−アミノメチルフェニルボロン酸を用い、およびそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞中のＮＦ−κＢ分子の核と細胞質の画分との間のピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、未処理のコントロール（ＵＴＣ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と比較した、遊離の（暗いバー）および４−アミノピリミジンボロン酸を用い、およびそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞中のＮＦ−κＢ分子の核と細胞質の画分との間のピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＵＴＣおよびＬＰＳと比較した、遊離の（暗いバー）４−アミノカルボニルフェニルボロン酸を用い、ならびにそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞の生残画分を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＵＴＣおよびＬＰＳと比較した、遊離の（暗いバー）３−アミノフェニルボロン酸を用い、ならびにそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞の生残画分を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＵＴＣおよびＬＰＳと比較した、遊離の（暗いバー）５−アミノ−２，４−ジフルオロフェニルボロン酸を用い、ならびにそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞の生残画分を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＵＴＣおよびＬＰＳと比較した、遊離の（暗いバー）３−フルオロ−４−アミノメチルフェニルボロン酸を用い、ならびにそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞の生残画分を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＵＴＣおよびＬＰＳと比較した、遊離の（暗いバー）４−アミノピリミジンボロン酸を用い、ならびにそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞の生残画分を示す。
【図７】図７は、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸の結合定数算出のための代表的なプロットを示す。
【図８】図８は、種々のボロン酸誘導体の、構造、グルコース結合親和性、８０ｎＭでのＨｅＬａ細胞生残パーセント、および８０ｎＭでの、ＨｅＬａ細胞中のＮＦ−κＢ分子の核と細胞質画分との間のＰＣＣを示す。
【図９】図９は、４つの代表的なボロン酸−糖ベシクル組成物についての累積的な放出プロットを図示する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、５ｍＭ、７ｍＭ、および１０ｍＭのＰＢＳで誘発することに比較して、５ｍＭ、７ｍＭ、および１０ｍＭのグルコースで誘発された、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸−糖ベシクル組成物からのインスリンの放出についての累積的プロットを図示する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、５ｍＭ、７ｍＭ、および１０ｍＭのＰＢＳで誘発することに比較して、５ｍＭ、７ｍＭ、および１０ｍＭのグルコースで誘発された、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸−糖ベシクル組成物からのインスリンの放出についての異なるプロットを図示する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、１０ｍＭ、３０ｍＭ、および４０ｍＭのグルコースで誘発された、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸−糖ベシクル組成物（「４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ＡＶＴ」）およびコンカナバリンＡベシクル組成物（「ＣｏｎＡ−ＡＶＴ」）からのインスリンの放出のための累積的プロットを図示する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、１０ｍＭ、３０ｍＭ、および４０ｍＭのグルコースで誘発された、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸−糖ベシクル組成物（「４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ＡＶＴ」）およびコンカナバリンＡベシクル組成物（「ＣｏｎＡ−ＡＶＴ」）からのインスリンの放出のための異なるプロットを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明は、本開示の一部を形成する、添付の図面および実施例と関係してなされた以下の詳細な説明を参照することによって、さらに容易に理解され得る。本発明は、本明細書に記載および／または示される、特定の装置、方法、適用、条件またはパラメーターに限定されない。本明細書において用いられる専門用語は、例示のためにのみ特定の実施形態を記載する目的であって、限定を意図するものではない。本明細書および特許請求の範囲で用いられるとおり、単数形である「１つの、ある（不定冠詞：ａ、ａｎ）」および「この、その（定冠詞：ｔｈｅ）」は、複数を包含する。しかし、「複数」という用語は、２つ以上を意味する。特定の数値の言及には、文脈上明確に他を示すのでない限り、少なくともその特定の値を含む。ある値が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを包含する。その特定の値は別々の実施形態を構成する。「約」という用語がある数と組み合わせて用いられる場合、その数の±１０％を包含するものとする。例えば、「約１０」とは、９〜１１を意味する場合がある。
【００１３】
「含む、包含する、備える（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含んでいる、包含している、備えている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語が本明細書または特許請求の範囲で用いられる限りでは、その用語が特許請求の範囲で伝統的な言葉として使用される場合に解釈されるとおり、「含んでいる、包含している、備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の方式で包含されることを意図する。さらに、「または」という用語が使用される（例えば、ＡまたはＢ）範囲内では、「ＡもしくはＢまたはその両方」を意味することが意図される。本出願が、「ＡまたはＢだけ、ただし両方ではない（ｏｎｌｙ  Ａ  ｏｒ  Ｂ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」を示す意図であるならば、「ＡまたはＢだけ、ただし両方ではない」という用語が使用される。従って、「または」という用語の使用は本明細書においては、包含的であって、排他的な使用ではない。
【００１４】
別の実施形態の状況で本明細書において、明確にするために記載される、本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態中で組み合わせて提供されてもよい。逆に、単一の実施形態の文脈で、簡潔にするために記載される、本発明の種々の特徴はまた、別々に提供されても、または任意のサブコンビネーションで提供されてもよい。
【００１５】
本発明は、図１、図２および図３を参照すれば容易に理解され得る。図１では、ベシクル組成物１の一実施形態の模式図が示される。図１に示されるとおり、ベシクル組成物１は、複数の生体適合性ベシクル２を含む。一実施形態では、複数の生体適合性ベシクル２は、例えば、非毒性であり、かつ生分解性であってもよい。図１に示されるとおり、ベシクル組成物１はさらに、１つ以上の化学的な検出性部分３を含む。一実施形態では、１つ以上の化学的な検出性部分３は、例えば、コンジュゲート部分と可逆的に結合し得る１つ以上の化学的部分であってもよい。図１に示されるとおり、ベシクル組成物１はさらに、１つ以上の検知部分４を含む。一実施形態では、１つ以上の検知部分４は、例えば、化学的な検出性部分、例えば、３と可逆的に結合し得る化学的部分であってもよい。本明細書において用いる場合、「検知部分」という句は、生体適合性ベシクルに結合される結合した検知部分（図１に示されるとおり）、および生体適合性ベシクルに結合しない検知部分であるが生理学的な環境（すなわち、患者の体内の環境）に存在する検知部分の両方を包含し得る。図１を振り返れば、第一の生体適合性ベシクル２は、化学的な検出性部分３に結合されるが、第二の生体適合性ベシクル２は、検知部分４に結合される。化学的な検出性部分３および検知部分４は、一緒に結合された場合、架橋５を形成する。
【００１６】
図２は、ベシクル組成物１の別の実施形態を図示する、第一の生体適合性ベシクル２は、ポリマーリンカー６に結合され、このポリマーリンカー６が、化学的な検出性部分３に結合される。第二の生体適合性ベシクル２は、検知部分４に結合される。化学的な検出性部分３および検知部分４は、一緒に結合される場合、架橋５を形成する。
【００１７】
図３は、ベシクル組成物１のさらに別の実施形態を図示する。生体適合性ベシクル２は、第一のポリマーリンカー６に結合され、この第一のポリマーリンカー６は、第一の化学的な検出性部分３に結合される。第二の生体適合性ベシクル２は、第二のポリマーリンカー６に結合され、この第二のポリマーリンカー６は、第二の化学的な検出性部分３に結合される。２つの検知部分４が、一緒に結合されて、各々の化学的な検出性部分３は、検知部分４に結合される。この化学的な検出性部分３および検知部分４は、一緒に結合された場合、架橋５を形成する。
【００１８】
生体適合性ベシクルは、治療用化合物を担持し得る、任意の生体適合性粒子であってもよい。この生体適合性ベシクルは、内部部分を有する形状で、ほぼ球状であり得る。この治療用化合物は、ベシクルの内部部分に、ベシクルの壁に担持されても、ベシクルの外面に結合されてもよく、または任意の他の適切な手段で担持されてもよい。この生体適合性ベシクルは、ポリマー、脂質、タンパク質、炭水化物、他の高分子、水、および塩、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。例えば、この生体適合性ベシクルは、複数の脂質から構成されるリポソームを含んでもよい。この脂質は、飽和脂質を含んでもよい。一実施形態では、この生体適合性ベシクルは、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはそれらの任意の組み合わせから構成されてもよい。この生体適合性ベシクルは、治療用化合物のための送達系として適切であるために十分な保存期間を有し得る。一実施形態では、この生体適合性ベシクルは、約２℃〜約８℃で少なくとも６カ月という保存期間の安定性、または室温で少なくとも７日間という保存期間の安定性を有し得る。
【００１９】
適切なベシクル組成物は、治療用化合物を含んでもよい。一実施形態では、この治療用化合物は、生体適合性ベシクルに位置してもよいし、またはその上に位置してもよい。一実施形態では、このベシクル組成物は、患者の生理学的環境中に治療用化合物を放出し得る。患者の生理学的な環境とは、通常は血流であるが、ベシクル組成物が送達される患者の身体内の任意の環境であってもよい。一実施形態では、この治療用化合物は、生理学的環境中で遊離の検知部分の存在に応答してベシクル組成物から放出される。一実施形態では、治療用化合物の放出を誘発する生理学的環境中の遊離の検知部分は、治療用化合物によって処置を目指す条件の兆候である。ベシクルが患者への注射に適切である処方物では、このベシクル組成物の総重量に基づく治療用化合物の重量パーセンテージは、約０．１％〜約３０％、または約０．２％〜約２０％、または約１％〜約１０％の範囲であり得る。この治療用化合物は、患者に対して、対症的な、治療的な、そうでなければ有益的な効果を提供するために投与される任意の化合物であってもよい。治療用化合物の例としては、インスリンおよびシプロフロキサシンが挙げられる。治療用化合物がインスリンであるいくつかの実施形態では、インスリンは、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬ〜３ｍｇ／ｍＬ、例えば、２ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在してもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、放出される治療用化合物の量は、患者の生理学的環境に存在する検知部分の量に関する。例えば、環境中の放出される治療用化合物の量および検知部分の量は、直線的に比例してもよく、または非線形関数に関連してもよい。従って、生理学的な環境における遊離の検知部分の濃度の増大は、ベシクル組成物から放出される治療用化合物の量の増大を誘発し得る。例えば、ベシクル組成物は、生理学的環境における糖である遊離の検知部分の存在に応答して、治療用化合物インスリンを放出し得る。糖の遊離の検知部分の濃度が増大する場合、放出されたインスリンの濃度もまた増大し得る。糖の例としては、グルコース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロースまたはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。一実施形態では、インスリンの放出は、生理学的な環境におけるグルコースの存在によって誘発され得る。別の実施形態では、糖類を用いて、インスリン以外の治療用化合物の放出を誘発してもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、化学的な検出性部分は、生体適合性ベシクルに直接結合されてもよい。リンカー部分は、化学的な検出性部分と生体適合性ベシクルとの間に位置し得る。生体適合性ベシクルがリポソームである実施形態では、このリンカー部分は、リポソームの一部である脂質に結合されてもよい。このリンカー部分は、生分解性ポリマー部分、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などであってもよい。このリンカー部分は、生体適合性ベシクルと化学的な検出性部分との間に可塑性を提供し得る。リンカー部分の可塑性を特徴付ける１方法は、ポリマー部分の各々の反復単位における不飽和結合の密度である。一実施形態では、リンカー部分を含んでいるポリマーの各々の反復単位は、少なくとも１つの不飽和結合を含んでもよい。リンカー部分の可塑性を特徴付ける別の方法は、その長さによる。リンカー部分がＰＥＧである場合、各々のＰＥＧ部分は独立して、約１００〜約１０，０００Ｄａの範囲、例えば、約５００〜約５，０００Ｄａの範囲などの分子量を有し得る。一実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１０〜１００個のエチレングリコール反復単位を含む。別の実施形態では、このＰＥＧリンカー部分は、約３０〜６０個のエチレングリコール反復単位を含む。
【００２２】
この検知部分は、化学的な検出性部分に対して、共有結合などによって、結合され得る。検知部分は、化学的な検出性部分と一緒になって、ベシクル組成物中に架橋を形成する、生体適合性ベシクルに結合される結合された検知部分であってもよい。あるいは、この検知部分は、遊離の検知部分であって、化学的な検出性部分との結合について結合した検知部分と競合する、遊離の検知部分であってもよい。一実施形態では、生理学的な環境における遊離の検知部分は、化学的な検出性部分と競合的に結合し、それによって生体適合性のベシクルの間の架橋を切断することによって、治療用化合物を放出する誘発因子として機能し得る。
【００２３】
検知部分は、治療用化合物によって処置が目指される疾患または状態に関連し得る。例えば、治療用化合物によって処置が目指され状態が糖尿病または高血糖症を生じる別の代謝障害であるいくつかの実施形態では、治療用化合物の放出を誘発する遊離の検知部分は糖である。糖の例としては、グルコース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。一実施形態では、この糖はグルコースである。処置される状態が糖尿病または高血糖症を生じる別の代謝障害であり、かつ遊離の検知部分が糖である実施形態では、治療用化合物はインスリンであり得る。処置が目指される状態が炎症であるいくつかの実施形態では、治療用化合物の放出を誘発する化合物は、一酸化窒素であってもよい。いくつかの実施形態では、アミロイドβ４２は、潜在的なプラーク形成を処置するための治療用化合物の放出を誘発し得る。他の実施形態では、アルブミン、アルカリホスファターゼ、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、カルシウム、塩化物、二酸化炭素、クレアチニン、直接ビリルビン、γグルタミルトランスペプチダーゼ（γＧＴ）、グルコース、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、リン、カリウム、ナトリウム、総ビリルビン、総コレステロール、総タンパク質、尿酸またはそれらの任意の組み合わせが、遊離の検知部分として機能し得る。
【００２４】
化学的な検出性部分および検知部分は、お互いと可逆的に結合し得る化学基である。この結合は、共有結合のような化学結合であってもよい。化学的な検出性部分と検知部分との間の共有結合は、環境中の競合する遊離の検知部分の存在下で切断され得る。ベシクル組成物が、患者に送達された場合、化学的な検出性部分と検知部分との間の共有結合は、生理学的な環境における遊離の検知部分の存在下で切断され得る。異なる化学的な検出性部分が、各々の生体適合性ベシクルに結合される場合、異なる化学的な検出性部分および検知部分によって形成される架橋は、異なる強度を有し得る。架橋の切断の程度および治療用化合物の放出の速度は、存在する強い架橋、弱い架橋および中度の架橋の数に依存し得る。
【００２５】
適切な化学的な検出性部分としては、ボロン酸またはボロン酸誘導体を挙げることができる。ボロン酸誘導体の例としては、フェニルボロン酸塩、ピリジルボロン酸塩、およびシクロヘキシルボロン酸塩を挙げることができる。一実施形態では、このボロン酸誘導体としては、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニルボロン酸；２，４−ジクロロフェニルボロン酸；４−アミノカルボニルフェニルボロン酸；３−クロロフェニルボロン酸；４−ヒドロキシフェニルボロン酸；４−プロピルフェニルボロン酸；３−［（Ｅ）−２−ニトロビニル）フェニルボロン酸；４−クロロカルボニルフェニルボロン酸無水物；シクロペンテン−１−イルボロン酸；２−ブロモピリジン−３−ボロン酸；２，４−ジｔｅｒｔ−ブトキシピリミジン−５−イルボロン酸；２，４−ｂｉｓ（ベンジルオキシ）ピリミジン−５−ボロン酸；５−フェニル−２−チエニルボロン酸；５−ホルミルチオフェン−３−ボロン酸；またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
【００２６】
検知部分は、化学的な検出性部分がボロン酸またはボロン酸誘導体である実施形態では糖であってもよい。適切な糖類としては、グルコース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、またはそれらの任意の組み合わせを挙げてもよい。一実施形態では、この検知部分は、化学的な検出性部分がボロン酸またはボロン酸誘導体である場合、グルコースであってもよい。いくつかの実施形態では、各々の生体適合性ベシクルは、それに結合されたただ一種のボロン酸またはボロン酸誘導体を有し得る。他の実施形態では、各々の生体適合性ベシクルは、それに結合された一種のボロン酸もしくはボロン酸誘導体、またはその表面に結合された２種以上のボロン酸のいずれかを有し得る。種々のボロン酸誘導体が各々の生体適合性ベシクルに結合される場合、異なるボロン酸誘導体によって形成される架橋は、異なる強度を有し得る。架橋の切断の程度および治療用化合物の放出の速度は、存在する強い架橋、弱い架橋および中度の架橋の数に依存し得る。
【００２７】
ベシクル組成物を形成する、生体適合性ベシクル、化学的な検出性部分、検知部分、および架橋は、多数の方法で配置され得る。この生体適合性ベシクルは各々が、結合された複数の部分を有してもよく、この部分とは、化学的な検出性部分、検知部分、またはその両方である。あるいは、生化学的ベシクルは各々が、結合された唯一の部分、化学的な検出性部分または検知部分のいずれかを有し得る。また、生体適合性ベシクルは各々が、結合された１つの部分を有するいくつかの生体適合性ベシクル、および結合された２つ以上の部分を有する他の生体適合性ベシクルと結合された多数の部分を有してもよい。いくつかの実施形態では、この生体適合性ベシクルは、同じ生体適合性ベシクルに結合された化学的な検出性部分および検知部分の両方を有し得る。一実施形態では、この生体適合性ベシクルは各々が、結合された唯一の化学的な検出性部分または唯一の検知部分を有する。適切なベシクル組成物は、２つ程度の少ない生体適合性ベシクルから構成されてもよい。適切なベシクル組成物はまた、約１０〜約１０８個の生体適合性ベシクルを含んでもよい。一実施形態では、このベシクル組成物は、約１０２〜約１０７個の生体適合性ベシクルを含んでもよい。一実施形態では、このベシクル組成物は、約１０３〜約１０７個の生体適合性ベシクルを含んでもよい。生体適合性ベシクルに結合されたこの部分は、化学的な検出性部分と検知部分との間で架橋が形成されかつ切断されることを可能にする任意の形状に配置されてもよい。この化学的な検出性部分または検知部分は、任意の形状で生体適合性ベシクル上に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、この部分は、生体適合性ベシクルに対して等しく空間を空けている。他の実施形態では、この部分は、無作為な方式で生体適合性ベシクルに結合される。生体適合性粒子、結合した部分および架橋が形成する形状にかかわらず、ベシクル組成物は、折り畳まれたか、そうでなければ凝集された形状を想定し得る。いくつかの実施形態では、このベシクル組成物は、約０．１マイクロメートル〜約５０マイクロメートルの範囲の直径を有し得る。一実施形態では、このベシクル組成物は、約０．５マイクロメートル〜約３０マイクロメートルの範囲の直径を有し得る。一実施形態では、このベシクル組成物は、約１マイクロメートル〜約２０マイクロメートルの範囲の直径を有し得る。
【００２８】
このベシクル組成物は、患者への注射に適切であり得る。注射のための適切性を測定するための１方法は、化学的検出性部分を備えるＰＥＧ脂質組成物によって生じる炎症の程度について試験することである。炎症の程度に関する１測定は、ＮＦ−κβタンパク質アッセイである。一実施形態では、ＮＦ−κβアッセイを用いて試験される化学的な検出性部分を含むＰＥＧ−脂質組成物は、約０．２未満というＰＣＣを生じる。一実施形態では、化学的な検出性部分を含んでいるＰＥＧ−脂質組成物の濃度が約４０ｎＭ〜１６０ｎＭ、例えば、約８０ｎＭの範囲である場合、ＮＦ−κβ分子の核と細胞質画分との間のＰＣＣは、約０．２未満、例えば、約０．１未満である。一実施形態では、化学的な検出性部分を含んでいるＰＥＧ−脂質組成物は、ＮＦ−κβ転位アッセイによって測定される、化学的な検出性部分の単一分子より生じ得る炎症が少ない場合がある。
【００２９】
ベシクル組成物の注射のための適切性を測定する別の方法は、化学的な検出性部分の細胞毒性を測定することである。このベシクル組成物は、化学的な検出性部分が、ＭＴＴ細胞増殖アッセイによって測定されるような約８２％を超える細胞生残を生じると特徴づけられる場合、注射に適切である。この化学的な検出性部分は、化学的な検出性部分が、約４０ｎＭ〜約１６０ｎＭの範囲の濃度で投与される場合、ＭＴＴ細胞増殖アッセイによって測定される８２％を超える細胞生残を生じると特徴づけられ得る。
【００３０】
別の実施形態では、その必要な患者に対して治療用化合物を投与するための方法が提供され、この方法は、ベシクル組成物を患者に非経口的に注射することと（このベシクル組成物は、治療用化合物を含んでいる）、この治療用化合物を誘発性の事象に応答して患者中へ放出することとを包含する。このベシクル組成物は、治療用化合物、生体適合性ベシクル、１つ以上の化学的な検出性部分、１つ以上の検知部分、および化学的な検出性と検知部分との間の架橋から構成され得る。一実施形態では、この誘発性の事象は、治療用化合物によって処置が目指される状態の兆候である。一実施形態では、この誘発性の事象は、生理学的な環境における遊離の検知部分の存在であり得る。いくつかの実施形態では、生理学的な環境における遊離の検知部分の濃度の増大は、治療用化合物の放出を生じ得る。
【００３１】
一実施形態では、この方法は、化学的なセンサーがボロン酸またはボロン酸誘導体であり、この検知部分が糖であり、かつ治療用化合物がインスリンであるベシクル組成物を投与することを包含してもよい。一実施形態では、ボロン酸誘導体としては、フェニルボロン酸塩、ピリジルボロン酸塩、およびシクロヘキシルボロン酸塩を挙げることができる。一実施形態では、このボロン酸誘導体は、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニルボロン酸；２，４−ジクロロフェニルボロン酸；４−アミノカルボニルフェニルボロン酸；３−クロロフェニルボロン酸；４−ヒドロキシフェニルボロン酸；４−プロピルフェニルボロン酸；３−［（Ｅ）−２−ニトロビニル）フェニルボロン酸；４−クロロカルボニルフェニルボロン酸無水物；シクロペンテン−１−イルボロン酸；２−ブロモピリジン−３−ボロン酸；２，４−ジｔｅｒｔ−ブトキシピリミジン−５−イルボロン酸；２，４−ｂｉｓ（ベンジルオキシ）ピリミジン−５−ボロン酸；５−フェニル−２−チエニルボロン酸；５−ホルミルチオフェン−３−ボロン酸；またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。化学的な検出性部分がボロン酸またはボロン酸誘導体である実施形態では、この検知部分は糖であってもよい。糖類の例としては、グルコース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。化学的な検出性部分がボロン酸またはボロン酸誘導体である一実施形態では、この検知部分はグルコースである。いくつかの実施形態では、各々の生体適合性ベシクルは、それに結合されるただ一種類のボロン酸またはボロン酸誘導体を有する。他の実施形態では、各々の生体適合性ベシクルは、それに結合された１種類のボロン酸もしくはボロン酸誘導体、またはそれに結合された２種類以上のボロン酸のいずれかを有する。異なるボロン酸誘導体が、各々の生体適合性ベシクルに結合される場合、異なるボロン酸誘導体によって形成される架橋は、異なる強度を有し得る。架橋の切断の程度および治療用化合物の放出の速度は、存在する強い架橋、弱い架橋および中度の架橋の数に依存し得る。
【００３２】
一実施形態では、誘発性の事象は、患者の高血糖症である場合がある。いくつかの実施形態では、患者の生理学的な環境におけるグルコース濃度の増大は、治療用化合物の放出を誘発し得る。他の実施形態では、患者の生理学的な環境における糖濃度の増大は、ベシクル組成物から放出される治療用化合物の増大を誘発し得る。さらに他の実施形態では、生理学的な環境における糖の存在は、治療用化合物の放出を糖の放出に対して量的に比例して誘発し得る。一実施形態では、この糖とは、ルコース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。一実施形態では、この糖はグルコースである。いくつかの実施形態では、この誘発性の事象は、患者の生理学的な環境における糖の濃度が約１００ｍｇ／ｄＬより大きい場合であり得る。
【００３３】
一実施形態では、ベシクル組成物は、１日２回〜週に１回まで、不定期の日数にわたって投与されてもよい。一実施形態では、ベシクル組成物は、１日に１回、不定期の日数にわたって投与されてもよい。いくつかの実施形態では、このベシクル組成物はさらに、凝集したベシクルから構成されるとして特徴付けられてもよい。
【００３４】
一実施形態では、医学的状態を処置するための方法が提供され、この方法は、処置の必要な患者にベシクル組成物（このベシクル組成物は、その必要な患者の処置のための治療用化合物を充填されている）を投与すること、および治療用化合物を、誘発性の事象に応答して患者中に放出することを包含する。このベシクル組成物は、生体適合性ベシクル、１つ以上の化学的な検出性部分、１つ以上の検知部分、および化学的な検出性部分と検知部分との間の架橋を含んでもよい。このベシクル組成物は、生体適合性ベシクルの凝集を含んでもよい。このベシクル組成物は、例えば、注射による手段を含む、任意の適切な手段で投与され得る。あるいは、このベシクル組成物は、ポンプまたは吸入によって投与されてもよい。一実施形態では、このベシクル組成物は、１日に２回〜週に１回まで、不定期の日数にわたって投与されてもよい。一実施形態では、このベシクル組成物は、１日に１回、不定期の日数にわたって投与されてもよい。
【００３５】
本明細書に記載される方法は、化学的なセンサーがボロン酸またはボロン酸誘導体であり、検知部分が糖であり、かつ治療用化合物がインスリン．であるベシクル組成物を投与することを包含し得る。ボロン酸誘導体としては、フェニルボロン酸塩、ピリジルボロン酸塩、およびシクロヘキシルボロン酸塩を挙げることができる。一実施形態では、ボロン酸誘導体としては、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニルボロン酸；２，４−ジクロロフェニルボロン酸；４−アミノカルボニルフェニルボロン酸；３−クロロフェニルボロン酸；４−ヒドロキシフェニルボロン酸；４−プロピルフェニルボロン酸；３−［（Ｅ）−２−ニトロビニル）フェニルボロン酸；４−クロロカルボニルフェニルボロン酸無水物；シクロペンテン−１−イルボロン酸；２−ブロモピリジン−３−ボロン酸；２，４−ジｔｅｒｔ−ブトキシピリミジン−５−イルボロン酸；２，４−ｂｉｓ（ベンジルオキシ）ピリミジン−５−ボロン酸；５−フェニル−２−チエニルボロン酸；５−ホルミルチオフェン−３−ボロン酸；またはそれらの任意の組み合わせを挙げてもよい。化学的な検出性部分がボロン酸またはボロン酸誘導体である実施形態では、検知部分は糖を含んでもよい。糖類の例としては、グルコース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、またはそれらの任意の組み合わせを挙げてもよい。化学的な検出性部分がボロン酸またはボロン酸誘導体である一実施形態では、検知部分はグルコースを含む。いくつかの実施形態では、各々の生体適合性ベシクルは、それに結合されたただ１種類のボロン酸またはボロン酸誘導体を有し得る。他の実施形態では、各々の生体適合性ベシクルは、それに結合された１種類のボロン酸もしくはボロン酸誘導体、またはそれに結合された２種類以上のボロン酸のいずれかを有し得る。異なるボロン酸誘導体が、各々の生体適合性ベシクルに結合される場合、異なるボロン酸誘導体によって形成される架橋は、異なる強度を有し得る。架橋の切断の程度および治療用化合物の放出の速度は、存在する強い架橋、弱い架橋および中度の架橋の数に依存し得る。
【００３６】
ベシクル組成物はまた、標的機構を備えてもよい。この標的機構は、患者の身体内の特定の目標に対してベシクル組成物を指向する任意の方法であり得る。一実施形態では、この標的機構は、細胞レセプター、抗体、バイオマーカー、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、このベシクル組成物は、造影剤、診断剤またはその両方を含んでもよい。
【００３７】
多数の医学的状態は、代謝性障害を含めて本発明によって処置され得る。代謝性障害の例としては、体の代謝、特に糖尿病に関連する任意の医学的状態が挙げられる。糖尿病を処置するための治療用化合物（例えば、インスリンおよびその改変体）は、２４〜７２時間にわたって正常な血糖値を維持し得る。血流中の糖の正常な血糖値は典型的には約１２６ｍｇ／ｄＬである。
【００３８】
本発明の方法はまた、肺疾患を処置するためにも用いられ得る。本発明の方法が、肺の感染の処置である場合、治療用化合物は、抗生物質であってもよい。この抗生物質は、肺感染を処置するために適切な任意の抗生物質であってもよい。処置されている医学的状態が肺の感染である実施形態では、この治療用化合物は、例えば、シプロフロキサシンであってもよい。
【００３９】
実施例
実施例１
炎症に関するＮＦ−κＢアッセイ
種々のボロン酸化合物の炎症性の能力は、免疫細胞化学およびハイスループットの高接触顕微鏡（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により、ＨｅＬａ細胞のＮＦ−κＢの核転位を測定することによって研究した。１５，０００個のＨｅＬａ細胞を、実験の前夜９６ウェルのプレートにプレートした。実験の当日、その細胞を、ボロン酸（下の表１）を用いて、３つの異なる濃度（４０ｎＭ、８０ｎＭ、および１６０ｎＭ）で２時間処理した。インキュベーションの終わりに、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が含有されるＰＢＳの中で１０分間透過させた。この細胞を、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。非特異的な部位は、５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含有されるＰＢＳでブロックして、抗−ＮＦ−κＢを用いて１時間インキュベートし、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した二次抗体とともにインキュベーションした。インキュベーションの終わりに細胞を洗浄した後、その細胞を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて１分間処理して、さらに分析するまで４℃で保管した。細胞の画像は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  １００自動化ハイスループット顕微鏡システム（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて得て、Ｃｙｔｓｅｅｒソフトウェア（Ｖａｌａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）を用いて分析した。ＮＦ−κＢの共存は、ＮＦ−κＢ分子の核と細胞質画分との間でＰＣＣを測定することによって定量した。ＰＣＣは、同じ細胞の核とＮＦ−κＢの画像の画素の強度の間の重複の指標である。ＰＣＣ値は、−１〜１におよんでもよい。正の相関（ＰＣＣ値）は、ＮＦ−κＢの核転位を示す。負の相関（負のＰＣＣ値）は、核の転位が無いことを示す。
【００４０】
図４は、ＮＦ−κＢの核または細胞質の局在に対するボロン酸処置の効果を図示するＨｅＬａ細胞の代表的な画像を示す。ＤＡＰＩは、白丸で示すが、ＮＦ−κＢは、薄い灰色で示す。薄い灰色で囲まれた白丸は、細胞質ＮＦ−κＢを示すが、核の中で灰色のシグナルで白丸が閉塞されると核ＮＦ−κＢを示す。（Ａ）ＵＴＣ、細胞質ＮＦ−κＢ；（Ｂ）陽性コントロール、ＬＰＳで処理された細胞中のＮＦ−κＢの転位；（Ｃ）２，４−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピリミジン−５−イル−ボロン酸（８０ｎＭ、２時間）、大部分は細胞質ＮＦ−κＢでの処理；および（Ｄ）５−イソキノリンボロン酸（８０ｎＭ、２時間）、大部分は核ＮＦ−κＢでの処理。
【００４１】
図５は、ＵＴＣおよびＬＰＳと比較した、遊離の（暗いバー）４−アミノカルボニルフェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、５−アミノ−２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−フルオロ−４−アミノメチルフェニルボロン酸、および４−アミノピリミジンボロン酸を用い、ならびにそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞中のＮＦ−κＢ分子の核と細胞質の画分との間のＰＣＣを示す。驚くべきことに、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸コンジュゲートは、遊離の４−アミノカルボニルフェニルボロン酸よりも炎症性が少なかった。
【００４２】
表１および図８は、種々のボロン酸誘導体についてのＰＣＣの結果を列挙する。
【表１】
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【００４３】
実施例２
細胞毒性に関するＭＴＴアッセイ
表１のボロン酸誘導体の細胞毒性を、ＭＴＴアッセイで研究した。１５０，０００個のＨｅＬａ細胞を、実験前夜に９６ウェルのプレートにプレートした。実験の当日、その細胞を、ボロン酸誘導体を異なる濃度（４０ｎＭ、８０ｎＭおよび１６０ｎＭ）で２時間用いて処理した。インキュベーションの終わりに、ＭＴＴアッセイ（インビトロ・トキシコロジー・ＭＴＴ・ベースド・アッセイ・キット（Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ＭＴＴ  ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ），Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を、製造業者のプロトコールに従って行った。
【００４４】
図６は、ＵＴＣおよびＬＰＳと比較した、遊離の（暗いバー）４−アミノカルボニルフェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、５−アミノ−２，４−ジフルオロフェニルボロン酸、３−フルオロ−４−アミノメチルフェニルボロン酸、および４−アミノピリミジンボロン酸を用い、ならびにそれらのボロン酸誘導体の各々を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのコンジュゲートとして（明るいバー）用いて処理した、ＨｅＬａ細胞の生残画分を示す。驚くべきことに、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸コンジュゲートは、遊離の４−アミノカルボニルフェニルボロン酸よりも細胞毒性が低かった。
【００４５】
表１および図８は、種々のボロン酸誘導体についての細胞生存率を列挙する。
【００４６】
実施例３
結合アッセイ
グルコースに対するボロン酸誘導体の結合親和性は、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ（コンカナバリン）Ａ（ＣｏｎＡ）を競合の標準として、および種々の濃度のボロン酸誘導体を用いて競合アッセイによって決定した。カルボキシ末端の磁気ビーズは、１００ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．５）中にビーズを懸濁することによって活性化した。グルコサミン（１００ｍｇ／ｍＬ）を、活性化した磁気ビーズに対して、架橋剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とのカルボジイミドカップリングを用いてコンジュゲートした。このコンジュゲーション反応は、９６ウェルのプレートで行った。この反応は、２４時間行った。このビーズは、磁気セパレーター上にマイクロプレートを置くことによって分離し、ｐＨ７．２でＰＢＳを用いて徹底的に洗浄して、未結合のグルコース、過剰のＥＤＣ、およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を除去した。
【００４７】
グルコース末端のビーズを、フルオレセインイソチオシアナートを用いて蛍光的にタグ付けした２．４μＭのＣｏｎＡ（炭水化物の公知の結合因子）（ＣｏｎＡ−ＦＩＴＣ）とともに１時間インキュベートして、試験した各々のボロン酸誘導体の２．５μＭ〜２０μＭにおよぶ濃度で滴定した。以下のコントロールを用いた：（Ａ）カルボキシ末端磁気ビーズ（グルコースに対してコンジュゲートしていない）を、ＣｏｎＡ−ＦＩＴＣで処理して、非特異的な結合を決定した；および（Ｂ）グルコースコンジュゲートしたビーズを、高濃度の非蛍光ＣｏｎＡで処理して、最大結合を決定した。
【００４８】
このウェルを、ＰＢＳを用いてｐＨ７．２で３回洗浄して、未結合のボロン酸誘導体およびＦＩＴＣ−ＣｏｎＡを除去した。このビーズを、ＰＢＳ中で再懸濁して、室温で１５分間撹拌した後、ＦＩＴＣ蛍光を測定した（励起：４９５ｎｍ、トップ発光：５２０ｎｍ；１ウェルあたり６フラッシュ；ボロン酸に対して結合するグルコースの量を定量するためのＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎＩＩ３８４マイクロプレートリーダー中で平均ｎ＝３ウェル）。蛍光強度を測定して、ビーズの表面に結合したＣｏｎＡの量の指標、すなわち［ＣｏｎＡｓ］として用いた。このＣｏｎＡ−糖の相互作用は、糖分子に結合して、結合したＣｏｎＡ−ＦＩＴＣを置き換え、それによって混合物の蛍光強度を減少し得る、ボロン酸誘導体によって阻害されると予想された。
【００４９】
ボロン酸誘導体の結合定数は、蛍光強度から算出した。蛍光強度の低下は、等式２による［ＣｏｎＡｓ］に関連する。
【数１】
0005998158.tif 000008
［ＣｏｎＡｓ］とボロン酸の量［ＢＡ］との間の関係は、等式３によって得られる。
等式３
【数２】
0005998158.tif 000009
単純な置き換えによって等式４が得られ、これから２つの平衡定数の比（ＫｃｏｎＡ／ＫＢＡ）が誘導され得る。
【数３】
0005998158.tif 000010
糖部位の濃度（Ｓ１）は、１／［ＣｏｎＡｓ］対１／［ＢＡ］のプロットの解釈から算出できる。
【００５０】
図７は、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸の結合定数算出のための代表的なプロットを示す。  
【００５１】
表１は、ＣｏｎＡに比較した、種々のボロン酸誘導体の相対的な糖結合親和性（ｌｏｇ（ＫＣｏｎＡ／ＫＢＡ））を列挙する。
【００５２】
図８は、種々のボロン酸誘導体についての構造およびグルコース結合親和性（Ｍ−１）を示す。
【００５３】
実施例４
脂質−ＰＥＧ−リンカー−ボロン酸コンジュゲート類の合成
全ての脂質−ＰＥＧ−リンカー−ボロン酸および糖コンジュゲート類を、カルボジイミド化学を用いて、ボロン酸−リンカーまたは糖部分のアミン誘導体と、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨとのカップリングによって調製した。一般には、５０ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを、２ｍＬの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、続いてＥＤＣ（２．０当量）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（３．０当量）を添加し、その混合物を室温で３０分間撹拌させた。ボロン酸または糖のアミン誘導体を添加して、その反応混合物を、一晩撹拌させた。アンモニウム塩の形態で得られたアミンについて、これらは、反応混合物への添加の前に、室温で３０分間、５００μＬのＤＭＦおよび３５μＬのトリエチルアミン中で撹拌することによって、脱塩した。これらの反応混合物を、４ｍＬのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．１８）で希釈して、３Ｋ  ＭＷＣＯ透析カセットに移し、２Ｌの同じ緩衝液に対して２回、次いで２Ｌの水に対して２回透析し、続いて、凍結乾燥して、所望のコンジュゲートを得た。最終生成物の同一性および純度は、１Ｈ  ＮＭＲ分光分析によって確認した。
【００５４】
実施例５
糖／ボロン酸およびそれらのコンジュゲートで官能化したリポソームの合成
リン脂質−ポリエチレングリコール−グリコシル（ｇｙｃｌｏｓｙｌ）コンジュゲート類の合成。脂質ＰＥＧ−グリコシル（Ｇｌｙｃｏｓｙｌ）種は、参照によって本明細書に援用される、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ（１９９６）１６９−１８５に記載のカルボジイミドカップリング化学を用いて、グルコサミン、ガラクトサミンおよびマンノピラノシドのアミノ基に対してＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのカルボキシル基をコンジュゲートすることによって合成した。このカップリングは、糖分子のＣ２位置で行い、それによって、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５位置は不変で維持した。
【００５５】
インスリンを用いたリポソームのローディング。ヒト組み換えインスリンを、クエン酸塩緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ２．５）に、１５ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解した。脂質（５６．４モル％のＤＰＰＣ、４０モル％のコレステロール、および各々１．２モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−グルコース、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ガラクトース、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノピラノシド）を、エタノールに溶解し、インスリン溶液を用いて５０℃で１５分間水和した。最終の脂質濃度は、５０ｍＭであった。この水和した混合物を、１００ｐｓｉの圧力で、５０℃で４００ｎｍのＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅトラック・エッチ（ｔｒａｃｋ−ｅｔｃｈ）膜を８回通過させた。この親のリポソームは、２４４．１ｎｍという平均直径（適切な平均のリポソーム直径は、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍであり得る）および約５０ｍＭという脂質濃度を有した。インスリンは、受動的なローディングによってカプセルに封入した。リポソームの処方物のｐＨは、５．６（インスリンの等電点）に維持した。リポソームは、クエン酸塩緩衝液（１００ｎＭ、ｐＨ５．６）に対して透析して、カプセルに封入されていないインスリンを除去した。この例では、カプセルに封入されていないインスリンは、生理学的な環境の際の即時的でかつおそらく不必要な影響をインスリンが有することを軽減または防ぐために除去される。いくつかの実施形態では、ベシクル組成物は、患者が高血糖状態を経験した場合など、その患者の生理学的環境（すなわち、「グルコース応答性」効果を有している）におけるグルコースの閾値の存在に対して主にまたは排他的に応答して、インスリンを放出および／または提供することを意図する。本実施例では、カプセルに封入されたインスリンは、約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するが、カプセルに封入されたインスリンの濃度は、インスリンの出発濃度とほぼ同じであってもよいし、またはそれよりも小さくてももしくは大きくてもよいと考えられる。カプセルに封入されていないインスリンは、カプセルに封入されたインスリンの約０％〜５％、または最大で約０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよいが、カプセルに封入されていないインスリンの濃度がより高いことは、患者の必要性およびベシクル組成物が患者の生理学的な環境に導入される培地次第で、許容されるか、または好ましい場合もある。
【００５６】
リン脂質−ポリエチレングリコール−ボロン酸誘導体コンジュゲート類の合成。脂質−ＰＥＧ−ボロン酸は、参照によって本明細書に援用される、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ（１９９６）１６９−１８５に記載のカルボジイミドカップリング化学を用いて、アミノ官能化ボロン酸部分に対してＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨのカルボキシル基をコンジュゲートすることによって合成した。このボロン酸官能化リポソームについての脂質組成は以下であった：５６．４モル％のＤＰＰＣ、４０モル％のコレステロール、および３．６モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ボロン酸。
【００５７】
代表的な脂質−ＰＥＧ−ボロン酸誘導体コンジュゲート種としては以下が挙げられる：
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【００５８】
インスリンローディング、押し出し成型および精製のプロセスは、上記の糖リポソームについて用いたものと同様であった。このリポソームは、１８４±０．１６２ｎｍという平均値を有した（適切な平均リポソーム直径は、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍであり得る）。カプセルに封入されたインスリンは、約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在した。
【００５９】
ベシクル組成物の調製。２種類のインスリンロードされたリポソームの処方物（糖分子、またはボロン酸誘導体のいずれかで官能化された）を、混合して、室温で撹拌し、ベシクル組成物を形成した。その混合物は、１：２〜１：５０におよぶ、リポソームの外部表面上のボロン酸種に対する糖種のいくつかのモル比を用いて調製して、ベシクル組成物の処方に必要な過剰のボロン酸を決定した。混合物のｐＨはまた、生理学的なｐＨで形成されるベシクル組成物を選択するために、７〜１１の間で変化させた。
【表２】
0005998158.tif 000017
【００６０】
ボロン酸および糖部分の化学的架橋の確認。ベシクル組成物が、ボロン酸および糖部分の化学的な架橋によって形成されたことを確認するために、凝集体を、１０ｍＭのグルコースに曝した。この凝集体は、遊離のグルコースとのボロン酸の競合的結合に起因して、グルコースの存在下で容易に切断された。これは、グルコースとのインキュベーションの際に、１μｍ未満にサイズ決めされた粒子の頻度が１３％〜３７％と増大したことによって示された。
【００６１】
実施例６
ボロン酸塩−糖ベシクル組成物からのインスリンのインビトロ放出
小容積の（５００μＬ）の凝集体を、管状透析膜（１００，０００ＭＷＣＯ）の内側に充填して、クリップでシールして、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に対して３０分間透析した後に、グルコースで切断して、誘発因子なしでインスリンの受動拡散をモニターした。これに続いて、一定の間隔で膜の内側の凝集体にグルコース溶液を添加して、ベシクル組成物を切断して、インスリンの放出を誘発した。アリコートを１５分ごとに、外部相から取り出して、インスリン濃度を、２１４ｎｍで吸光度を読むことによってアッセイした。このアッセイを数時間続けて、カプセルに封入されたインスリンの放出の中止を確認した。
【００６２】
図９は、４つの異なるボロン酸塩−グルコースベシクル組成物、（４−アミノカルボニルフェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、３−フルオロ−４−アミノエチルフェニルボロン酸、および５−アミノ−２，４−ジフルオロフェニルボロン酸）についての累積的放出プロットを、グルコース誘発因子の非存在下で図示する。３−アミノフェニルボロン酸ベシクル組成物および４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ベシクル組成物は、それぞれ、それらのインスリン含量のうち１２％および１７％を放出した。
【００６３】
種々の濃度のグルコース誘発因子の添加の際の、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ベシクル組成物からのインスリンの放出を、数時間アッセイした。誘発因子の濃度は、正常血糖および高血糖の状態の血糖値を模倣するように選択した。コントロールのアッセイもまた行い、ここでは、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ベシクル組成物は、グルコースの代わりにＰＢＳで誘発した。４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ベシクル組成物は、グルコース誘発因子の導入後２分内にインスリンの爆発的放出を示した。この放出速度は、グルコースの追加投与が加えられる（これは、爆発的放出の新しいエピソードを誘発した）まで経時的に遅くなる。本実施例では、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ベシクル組成物を切断し、インスリンを放出するために必要なグルコースの最少濃度は、１０ｍｍｏｌ／Ｌであって、これは、１８０ｍｇ／ｄＬという血糖値に相当する。インスリンの爆発的放出は、４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ベシクル組成物が、低血糖症（約９ｍｇ／ｄＬ）または正常血糖症（約１２６ｍｇ／ｄＬ）と類似したグルコース濃度で誘発された場合、観察されず、このことは、本実施例の４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ベシクル組成物が、正常な血糖値を維持するために適切であることを示している。また、これらのベシクル組成物からのインスリン放出速度は、グルコース濃度に依存し、それによって、インスリン過剰症を軽減または回避するのに有用な本発明の実施形態が行われる。
【００６４】
図１０は、５ｍＭ、７ｍＭ、および１０ｍＭのＰＢＳを用いた誘発に比較して、５ｍＭ、７ｍＭ、および１０ｍＭのグルコースで誘発された４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ベシクル組成物（４−アミノカルボニルフェニルボロン酸ＡＶＴ）からのインスリンの放出についての（ａ）累積的な、および（ｂ）示差的なプロットを図示する。
【００６５】
図１１は、１０ｍＭ、３０ｍＭ、および４０ｍＭのグルコースで誘発された４−アミノカルボニルフェニルボロン酸およびＣｏｎＡベシクル組成物からのインスリンの放出についての（ａ）累積的な、および（ｂ）示差的なプロットを図示する。
【００６６】
当業者は、多数の変化および改変が、本明細書に開示される実施形態に対してなされてもよいこと、ならびにこのような変化および改変が、本発明の趣旨から逸脱することなくなされ得ることを理解する。従って、添付の特許請求の範囲は、全てのこのような等価な変化型を、本発明の真の趣旨および範囲内におさまるものとして、包含するものとする。
【図１】
0005998158.tif 000019
【図２】
0005998158.tif 000020
【図３】
0005998158.tif 000021
【図４Ａ】
0005998158.tif 000022
【図４Ｂ】
0005998158.tif 000023
【図４Ｃ】
0005998158.tif 000024
【図４Ｄ】
0005998158.tif 000025
【図５Ａ】
0005998158.tif 000026
【図５Ｂ】
0005998158.tif 000027
【図５Ｃ】
0005998158.tif 000028
【図５Ｄ】
0005998158.tif 000029
【図５Ｅ】
0005998158.tif 000030
【図６Ａ】
0005998158.tif 000031
【図６Ｂ】
0005998158.tif 000032
【図６Ｃ】
0005998158.tif 000033
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
0005998158.tif 000039
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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