(57)【要約】  核酸の光反応技術に使用可能な式Ｉ：2019022158.tif 000044で表される化合物、及び該化合物からなる光反応性架橋剤を提供する。
2019022158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉで表される化合物：
2019022158.tif 000037
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子である。）。
【請求項２】
Ｙが、次の式ＩＩで表される基である、請求項１に記載の化合物：
2019022158.tif 000038
（ただし、式ＩＩにおいて、
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、水酸基、又は−Ｏ−Ｑ1基であり、
Ｒ１３は、水酸基、又は−Ｏ−Ｑ2基であり、
Ｑ1は、
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；  及び  
以下から選択される保護基：
トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
からなる群から選択される基であり、
Ｑ2は、
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；  及び  
以下から選択される保護基：
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
からなる群から選択される基である。）。
【請求項３】
Ｙが、水素原子、次の式ＩＩＩで表される基、又は式ＩＶで表される基である、請求項１に記載の化合物：
2019022158.tif 000039
2019022158.tif 000040
【請求項４】
塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000041
（ただし、式Ｉｂにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
で表される基を有するヌクレオシドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000042
（ただし、式Ｉｂにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
で表される基を有するヌクレオチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000043
（ただし、式Ｉｂにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
で表される基を有する核酸又はペプチド核酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物からなる、光反応性架橋剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物を使用して、ピリミジン環を有する核酸塩基との間に光架橋を形成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可視光域の光による光架橋（光クロスリンク）能を有する光応答性ヌクレオチドアナログ（光応答性ヌクレオチド類似化合物）に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の分野の基本的な技術に、核酸の連結及び核酸の架橋がある。核酸の連結や架橋は、例えば、ハイブリダイゼーションと組みあわせて、遺伝子の導入や、塩基配列の検出のために使用され、あるいは、例えば、遺伝子発現の阻害に使用される。そのために、核酸の連結及び架橋の技術は、分子生物学の基礎研究だけではなく、例えば、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬や診断薬等の開発や製造、工業及び農業分野における酵素や微生物等の開発や製造に使用される極めて重要な技術である。【０００３】
核酸の光反応技術として、５−シアノビニルデオキシウリジンを使用した光連結技術（特許文献１：特許第３７５３９３８号、特許文献２：特許第３７５３９４２号）、３−ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドを使用した光架橋技術（特許文献３：特許第４８１４９０４号、特許文献４：特許第４９４０３１１号）がある。【０００４】
さらに、最近、核酸の二重鎖形成能を利用した様々なナノ構造体の構築が可能となってきており、ナノテクノロジーの分野においても核酸の連結及び架橋の技術が重要となってきている。例えば、非特許文献１は、核酸の光架橋によってオリゴＤＮＡからなるナノシートに耐熱性を付与する技術を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３７５３９３８号公報
【特許文献２】特許第３７５３９４２号公報
【特許文献３】特許第４８１４９０４号公報
【特許文献４】特許第４９４０３１１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｐｈｏｔｏｐｄｙ．Ｓ．Ｔｅｃｈ．，２０１４，２７，４８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
核酸の光反応技術の重要性から、核酸の光反応技術に使用可能な新しい化合物が、さらに求められている。本発明の目的は、核酸の光反応技術に使用可能な新しい光反応性化合物、及び該光反応性化合物を使用した光反応性架橋剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となる光反応性化合物を鋭意探索してきたところ、核酸塩基の塩基部分に代えてピラノカルバゾール骨格構造を備えた化合物が、このような核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となることを見いだして、本発明に到達した。【０００９】
本発明に係る化合物は、特徴的なピラノカルバゾール構造を有しており、比較的に小さなこの構造によって光架橋性を発揮しているために、様々に修飾して多様な用途で使用することができる。さらに、本発明に係る化合物のこの特徴的な構造は、核酸の塩基に類似した構造を有しているために、人工塩基（人工核酸塩基）として使用することができる。すなわち、本発明に係る化合物の特徴的な構造を人工塩基として導入して、人工ヌクレオシド（ヌクレオシドアナログ）、及び人工ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）を製造することができ、このような人工ヌクレオチドを配列中に含んだ人工核酸（修飾核酸）を製造することができる。このような人工核酸が、光反応によって架橋を形成すると、それは、二重らせんの一方の鎖からもう一方の鎖へと形成された光架橋（光クロスリンク）となるので、光反応性の核酸類は、所望の配列に特異的に反応可能な二重らせんの光クロスリンク剤として使用することができる。【００１０】
本発明による光反応性架橋剤は、特徴的なピラノカルバゾール構造に由来して、従来よりも長波長の光照射によって、例えば可視光域の光照射によって、光架橋反応させることができるという特徴を備える。そのために、ＤＮＡや細胞の損傷をできるだけ回避したいという場合に、本発明による光反応性架橋剤は、長波長の光照射によって光架橋可能であるので、特に有利である。【００１１】
なお、本発明の光反応性化合物は、光照射によって光反応を開始するものであるが、それまで安定していた化合物が、光照射というシグナルに応答して反応を開始するという意味を強調して、光反応性を光応答性ということがある。【００１２】
したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
次の式Ｉで表される化合物：
2019022158.tif 000003
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子である。）。
（２）
Ｙが、次の式ＩＩで表される基である、（１）に記載の化合物：
2019022158.tif 000004
（ただし、式ＩＩにおいて、
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、水酸基、又は−Ｏ−Ｑ1基であり、
Ｒ１３は、水酸基、又は−Ｏ−Ｑ2基であり、
Ｑ1は、
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；  及び  
以下から選択される保護基：
トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
からなる群から選択される基であり、
Ｑ2は、
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；  及び  
以下から選択される保護基：
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
からなる群から選択される基である。）。
（３）
Ｙが、水素原子、次の式ＩＩＩで表される基、又は式ＩＶで表される基である、（１）に記載の化合物：
2019022158.tif 000005
2019022158.tif 000006
（４）
塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000007
（ただし、式Ｉｂにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
で表される基を有するヌクレオシドである、（１）に記載の化合物。
（５）
塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000008
（ただし、式Ｉｂにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
で表される基を有するヌクレオチドである、（１）に記載の化合物。
（６）
塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000009
（ただし、式Ｉｂにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
で表される基を有する核酸又はペプチド核酸である、（１）に記載の化合物。
（７）
（１）〜（６）のいずれかに記載の化合物からなる、光反応性架橋剤。
（８）
（１）〜（６）のいずれかに記載の化合物を使用して、ピリミジン環を有する核酸塩基との間に光架橋を形成する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となる新規な化合物を提供する。これは、天然の塩基構造を備えていない、新規な化学構造によるものである。そして、本発明の化合物によれば、従来の光反応性架橋剤よりも長波長の光照射によって光架橋を形成できることから、光照射による核酸や細胞への悪影響を最小限とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ】図１ａは光架橋反応の流れを示す説明図である。
【図１ｂ】図１ｂは光照射時間を０〜１５秒と変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。
【図１ｃ】図１ｃは光照射時間を０〜１５秒と変化させた場合の各光照射時間における光架橋率を算出して作成したグラフである。
【図２ａ】図２ａは光架橋反応の流れを示す説明図である。
【図２ｂ】図２ｂは照射する光波長を４５０〜５５０ｎｍと変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。
【図３ａ】図３ａは光開裂反応の流れを示す説明図である。
【図３ｂ】図３ｂは照射する光波長を３２０〜３４０ｎｍと変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。
【図３ｃ】図３ｃは各波長の光照射によって開裂した光架橋体の割合（転化率％）を示すグラフである。
【図４】図４は各波長での光照射時間（秒）と細胞生存率（％）を対比したグラフである。
【図５】図５はSPCXによる光架橋反応の流れを示す説明図である。
【図６】図６はSPCXによる光架橋試験のＵＰＬＣによる解析のチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
【００１６】
［化合物の構造］
本発明の化合物は、次の式Ｉで表される化合物を含む：
（Ｉ）
2019022158.tif 000010
【００１７】
式Ｉにおいて、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子である。
【００１８】
式Ｉにおいて、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。ハロゲン原子としては、例えばＢｒ、Ｃｌ、Ｆ、Ｉの原子をあげることができる。フッ化メチル基としては、例えば−ＣＨ2Ｆ、−ＣＨＦ2、−ＣＦ3をあげることができる。フッ化エチル基としては、例えば−ＣＨ2−ＣＨ2Ｆ、−ＣＨ2−ＣＨＦ2、−ＣＨ2−ＣＦ3、−ＣＨＦ−ＣＨ3、−ＣＨＦ−ＣＨ2Ｆ、−ＣＨＦ−ＣＨＦ2、−ＣＨＦ−ＣＦ3、−ＣＦ2−ＣＨ3、−ＣＦ2−ＣＨ2Ｆ、−ＣＦ2−ＣＨＦ2、−ＣＦ2−ＣＦ3をあげることができる。Ｃ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基としては、例えば−ＣＨ2−ＳＨ基、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＨ基、−ＣＨ（ＳＨ）−ＣＨ3基、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＳＨ基、−ＣＨ2−ＣＨ（ＳＨ）−ＣＨ3基、−ＣＨ（ＳＨ）−ＣＨ2−ＣＨ3基をあげることができる。好適な実施の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、−ＮＨ2基、−ＯＨ基、−ＣＨ3基とすることができ、好ましくは、水素原子とすることができる。
【００１９】
好適な実施の態様において、Ｒ１を上述の基とすると同時にＲ２を水素原子とすることができる。
【００２０】
好適な実施の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、式Ｉの左端の六員環において、窒素原子の結合する炭素原子をＣ１位と付番して、六員環の炭素原子を時計回りに順にＣ２位、Ｃ３位、Ｃ４位、Ｃ５位、Ｃ６位と付番した場合に、Ｃ２位、Ｃ３位、Ｃ４位、Ｃ５位のいずれかの位置の炭素原子の置換基とすることができる。好適な実施の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれＣ３位及びＣ４位の置換基とすることができる。好適な実施の態様において、Ｒ１をＣ３位の置換基とすると同時に、Ｒ２をＣ４位の水素原子とすることができる。
【００２１】
式Ｉにおいて、Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子とすることができる。
【００２２】
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、次の式Ｉ’で表される化合物とすることができる：
（式Ｉ’）
2019022158.tif 000011
【００２３】
式Ｉ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｙは、式Ｉにおいて記載した基である。
【００２４】
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、次の式Ｉ”で表される化合物とすることができる：
（式Ｉ”）
2019022158.tif 000012
【００２５】
式Ｉ”において、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｙは、式Ｉにおいて記載した基である。
【００２６】
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、次の式Ｉ'''で表される化合物とすることができる：
（式Ｉ'''）
2019022158.tif 000013
【００２７】
式Ｉ'''において、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｙは、式Ｉにおいて記載した基である。
【００２８】
好適な実施の態様において、Ｙは、水素原子とすることができ、この場合に式Ｉの化合物は、次の式ＶＩで表される化合物である：
（ＶＩ）
2019022158.tif 000014
【００２９】
式ＶＩにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置する。
【００３０】
好適な実施の態様において、Ｙは、水素原子とすることができ、この場合に式Ｉ’の化合物は、次の式ＶＩ’で表される化合物である：
（ＶＩ’）
2019022158.tif 000015
【００３１】
式ＶＩ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基である。
【００３２】
好適な実施の態様において、Ｙは、次の式ＩＩで表される基とすることができ、この場合に式Ｉの化合物は、次の式Ｖで表される化合物となる：
（ＩＩ）
2019022158.tif 000016
【００３３】
（Ｖ）
2019022158.tif 000017
【００３４】
式Ｖにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、式ＩＩについて記載した基である。
【００３５】
好適な実施の態様において、Ｙは、上記の式ＩＩで表される基とすることができ、この場合に式Ｉ’の化合物は、次の式Ｖ’で表される化合物となる：
（Ｖ’）
2019022158.tif 000018
【００３６】
式Ｖ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、式ＩＩについて記載した基である。
【００３７】
式ＩＩにおいて、Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、Ｒ１２は、水酸基、又は−Ｏ−Ｑ1基であり、Ｒ１３は、水酸基、又は−Ｏ−Ｑ2基である。
【００３８】
上記Ｑ1は、
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；  及び  
以下から選択される保護基：
トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
からなる群から選択される基とすることができる。
【００３９】
上記Ｑ2は、
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；  及び  
以下から選択される保護基：
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
からなる群から選択される基とすることができる。
【００４０】
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）ホスホロアミダイト基は、次の構造を有しており、
2019022158.tif 000019
上記ジアルキル基となるＲ基とＲ’基は、それぞれＣ１〜Ｃ４のアルキル基とすることができる。このような２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）ホスホロアミダイト基として、例えば、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルホスホロアミダイト基、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルホスホロアミダイト基、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基をあげることができる。
【００４１】
メチルホスホンアミダイト基は、次の構造を有しており、
2019022158.tif 000020
上記Ｒ基とＲ’基は、それぞれ水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基とすることができる。
【００４２】
エチルホスホンアミダイト基は、次の構造を有しており、
2019022158.tif 000021
上記Ｒ基とＲ’基は、それぞれ水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基とすることができる。
【００４３】
オキサザホスホリジン基は、次の構造を有しており、
2019022158.tif 000022
上記の構造において、水素原子がＣ１〜Ｃ４のアルキル基によって置換された置換体も含む。
【００４４】
チオホスファイト基は、次の構造を有しており、
2019022158.tif 000023
上記の構造において、水素原子がＣ１〜Ｃ４のアルキル基によって置換された置換体も含む。
【００４５】
−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩は、それぞれのトリエチルアミン（ＴＥＡ）の塩である。
【００４６】
−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩は、それぞれのジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）の塩である。
【００４７】
好適な実施の態様において、Ｑ1は、Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。
【００４８】
好適な実施の態様において、Ｑ1は、上述の保護基とすることができ、好ましくは、ジメトキシトリチル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基とすることができ、特に好ましくはジメトキシトリチル基とすることができる。
【００４９】
好適な実施の態様において、Ｑ2は、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。
【００５０】
好適な実施の態様において、Ｑ2は、上述の保護基とすることができ、好ましくは、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）ホスホロアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基とすることができ、特に好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基とすることができる。
【００５１】
［ヌクレオシドアナログ］
好適な実施の態様において、Ｙは、デオキシリボースとすることができ、すなわち、次の式ＩＩＩで表される基とすることができ、この場合に式Ｉの化合物は、次の式ＶＩＩで表されるヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド）アナログである：
【００５２】
（ＩＩＩ）
2019022158.tif 000024
【００５３】
（ＶＩＩ）
2019022158.tif 000025
【００５４】
式ＶＩＩにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置する。
【００５５】
好適な実施の態様において、Ｙは、デオキシリボースとすることができ、すなわち、上記の式ＩＩＩで表される基とすることができ、この場合に式Ｉ’の化合物は、次の式ＶＩＩ’で表されるヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド）アナログである：
【００５６】
（ＶＩＩ’）
2019022158.tif 000026
【００５７】
式ＶＩＩ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基である。
【００５８】
好適な実施の態様において、Ｙは、リボースとすることができ、すなわち、次の式ＩＶで表される基とすることができ、この場合に式Ｉの化合物は、次の式ＶＩＩＩで表されるヌクレオシド（リボヌクレオシド）アナログである：
【００５９】
（ＩＶ）
2019022158.tif 000027
【００６０】
（ＶＩＩＩ）
2019022158.tif 000028
【００６１】
式ＶＩＩＩにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置する。
【００６２】
好適な実施の態様において、Ｙは、リボースとすることができ、すなわち、上記の式ＩＶで表される基とすることができ、この場合に式Ｉ’の化合物は、次の式ＶＩＩＩ’で表されるヌクレオシド（リボヌクレオシド）アナログである：
【００６３】
（ＶＩＩＩ’）
2019022158.tif 000029
【００６４】
式ＶＩＩＩ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基である。
【００６５】
上記の式ＶＩＩ及び式ＶＩＩＩで表されるヌクレオシド（リボヌクレオシド）アナログは、塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000030
【００６６】
（ただし、式Ｉｂにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置する。）
で表される基を有するヌクレオシド（ヌクレオシドアナログ）ということができる。
【００６７】
上記の式ＶＩＩ’及び式ＶＩＩＩ’で表されるヌクレオシド（リボヌクレオシド）アナログは、塩基部分として、次の式Ｉｂ’：
2019022158.tif 000031
【００６８】
（ただし、式Ｉｂ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基である。）
で表される基を有するヌクレオシド（ヌクレオシドアナログ）ということができる。
【００６９】
さらに、本発明は、塩基部分として、上記の式Ｉｂ又は式Ｉｂ’で表される基を有するヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）にもある。さらに、本発明は、塩基部分として、上記の式Ｉｂ又は式Ｉｂ’で表される基を有する核酸（修飾核酸）又はペプチド核酸（修飾ペプチド核酸）にもある。
【００７０】
［ヌクレオチドアナログ］
好適な実施の態様において、Ｑ1を、Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基とすることができ、Ｑ2を、水素原子とすることができる。すなわち、上記式Ｉで表される化合物は、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログ分子とすることができる。
【００７１】
［修飾核酸］
好適な実施の態様において、Ｑ1を、Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸として、Ｑ2を、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。すなわち、上記式Ｉで表される化合物は、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログが配列中に取り込まれた修飾核酸又は修飾オリゴヌクレオチドとすることができる。本発明において、このように調整された光応答性修飾核酸と光応答性修飾オリゴヌクレオチドをまとめて光応答性修飾核酸ということがある。本発明に係る修飾核酸において、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログが配列中の末端に位置していてもよく、この場合にはＱ1又はＱ2のいずれかの側のみがＱ1又はＱ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結される修飾ヌクレオチド又は修飾核酸となる。また、上記の核酸に代えてペプチド核酸を用いて、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログが配列中に取り込まれた光応答性修飾ペプチド核酸とすることができる。
【００７２】
［化合物の構造］
本発明に係る化合物は、式Ｉ等において、天然のヌクレオシド及びヌクレオチドが備えているべきプリン塩基あるいはピリミジン塩基による塩基構造を備えていない。それにもかかわらず、本発明に係る化合物は、１本鎖の修飾核酸として形成されると、これと相補的な１本鎖の核酸と二重らせんを形成することができる。そして、ピラノカルバゾール部分が光反応によって架橋を形成することができる。
【００７３】
［修飾核酸製造用試薬］
好適な実施の態様において、Ｑ1を、上述の保護基とすることができ、Ｑ2を、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸、あるいは上述の保護基、とすることができる。すなわち、上記式Ｉ、式Ｉ’、式Ｉ”、及び式Ｉ'''で表される化合物は、光反応性修飾核酸の製造用試薬（合成用試薬）とすることができる。
【００７４】
好適な実施の態様において、Ｑ1を、上述の保護基とすることができ、Ｑ2を、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基、あるいは上述の保護基、とすることができる。よく知られているように、このような構造を備えた化合物は、核酸合成用のモノマーとして使用することができ、公知のＤＮＡ合成装置によって使用可能な試薬とすることができ、例えばホスホロアミダイト法、及びＨ−ホスホネート法によって使用可能な修飾核酸合成用試薬(修飾核酸合成用モノマー）とすることができる。
【００７５】
また、Ｑ1を、上述の保護基として、Ｑ2を、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とした構造はいわゆるモノマーとは言えない構造となっており、修飾核酸と言える構造となっている。このような場合には、そこから合成して鎖長を伸長するための製造用試薬（合成用試薬）として使用することができる。
【００７６】
光反応性修飾核酸製造用試薬（光反応性修飾核酸合成用試薬）として、例えば、後述するスキーム１の化合物５、化合物６として記載されたモノマー、及び後述するスキーム２に記載されたモノマーをあげることができる。
【００７７】
［光反応性架橋剤］
本発明に係る化合物は、ピラノカルバゾール部分が光反応によって架橋を形成することができる。本発明に係る化合物を、１本鎖の修飾核酸として形成すると、これと相補的な１本鎖の核酸と二重らせんを形成することができ、ピラノカルバゾール部分が光反応によって架橋を形成することができ、結果として、二重らせんの一方の鎖からもう一方の鎖へと形成された鎖間の光架橋（光クロスリンク）を形成することができる。すなわち、本発明に係る化合物は、光反応性架橋剤として使用することができる。
【００７８】
［光架橋の形成］
本発明に係る修飾核酸は、これを１本鎖核酸として使用すると、これと相補的な１本鎖核酸とハイブリダイズして二重らせんを形成することができる。二重らせんの形成にあたって、ピラノカルバゾール構造部分に対して、相補鎖中において塩基対を形成すべき位置にある核酸塩基については、特段の制約がなく、自由に選択できる。形成された二重らせんに光照射を行うと、二重らせんを形成する核酸鎖の間に、光反応によって架橋を形成することができる。この光架橋は、配列中でピラノカルバゾール構造部分が核酸塩基として位置する位置から配列中で１塩基分だけ５’末端側に位置する核酸塩基に対して、相補鎖中において塩基対を形成する位置にある核酸塩基と、ピラノカルバゾール構造との間に形成される。言い換えれば、この光架橋は、ピラノカルバゾール構造部分に対して、相補鎖中において塩基対を形成すべき位置にある核酸塩基から、配列中で１塩基分だけ３’末端側に位置する核酸塩基と、ピラノカルバゾール構造との間に形成される。
【００７９】
［光架橋の塩基特異性］
本発明において、ピラノカルバゾール構造が光架橋を形成可能である相手方の塩基は、ピリミジン環を有する塩基である。一方で、ピラノカルバゾール構造は、プリン環を有する塩基とは光架橋を形成しない。すなわち、本発明に係る光架橋性の化合物は、天然の核酸塩基としては、シトシン、ウラシル、及びチミンに対して光架橋を形成し、一方で、グアニン及びアデニンに対しては光架橋を形成しないという、特異性を有している。
【００８０】
［光反応性架橋剤の配列選択性］
本発明に係る光反応性修飾核酸（光架橋性修飾核酸）は、修飾核酸と相補的な塩基配列を有する配列とハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた後に、光架橋させることができる。これによって、目的とする特定の配列に対してのみ光クロスリンク反応（光架橋反応）を行わせることができる。すなわち、本発明に係る光反応性架橋剤は、非常に高い塩基配列選択性を、所望に応じて配列設計して、付与することができる。
【００８１】
［光照射の波長］
光架橋のために照射される光の波長は、例えば３５０〜６００ｎｍの範囲、好ましくは４００〜６００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００〜５５０ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００〜５００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００〜４５０ｎｍの範囲とすることができ、特に４００ｎｍの波長を含む光が好ましい。好適な実施の態様において、これらの範囲の波長にある単波長のレーザー光を使用することができる。このように本発明では、可視光域の波長の光照射によって、光架橋を形成することができる。従来の光反応性架橋剤では、これらの範囲よりも短波長の光照射を必要としていた。本発明によれば、従来の光反応性架橋剤よりも長波長の光照射によって光架橋を形成できることから、光照射による核酸や細胞への悪影響を最小限とすることができる点で、有利である。
【００８２】
［光架橋の開裂］
本発明の化合物によれば、光架橋を形成した後に、さらに光照射によって光開裂をすることができる。すなわち、本発明に係る光反応性の化合物は、可逆的な光架橋を可能とするものであり、可逆的な光架橋剤として使用することができる。
【００８３】
この光架橋の可逆性から想起されるように、本発明の化合物による可逆性光架橋剤を使用すれば、特定の塩基配列を有する核酸を、生理的条件下で、分離し、回収し、又は検出することができる。したがって本発明は可逆性光架橋剤を使用して、所望の塩基配列を有する核酸を、分離し、回収し、又は検出する方法にもある。
【００８４】
光開裂のために照射される光の波長は、例えば３００〜３５０ｎｍの範囲、好ましくは３００〜３４０ｎｍの範囲とすることができ、特に３１２ｎｍの波長を含む光が好ましい。好適な実施の態様において、これらの範囲の波長にある単波長のレーザー光を使用することができる。
【００８５】
［光反応の温度］
好適な実施の態様において、光架橋反応を進行させるためには、一般に０〜５０℃、好ましくは０〜４０℃、さらに好ましくは０〜３０℃、さらに好ましくは０〜２０℃、さらに好ましくは０〜１０℃、さらに好ましくは０〜５℃の範囲の温度で光照射を行う。光開裂反応を進行させるためには、一般に５５〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃、さらに好ましくは６０〜９０℃、さらに好ましくは６０〜８０℃の範囲の温度で光照射を行う。
【００８６】
［光反応の条件］
本発明による光架橋及び光開裂は、光反応を利用しているために、ｐＨ、塩濃度などに特段の制約がなく、核酸類等の生体高分子が安定に存在可能なｐＨ、塩濃度とした溶液中で、光照射によって行うことができる。
【００８７】
［光反応の時間］
本発明による光架橋及び光開裂は、極めて迅速に進行する。例えば、光反応性の化合物として知られるソラレンであれば数時間を要する（３５０ｎｍ光照射）ような場合に、それよりもはるかに長波長の光照射によって、例えばわずか１０秒間〜６０秒間（４００ｎｍ光照射）で光反応が進行して光架橋する。すなわち、本発明に係る光架橋剤を使用すれば、例えば１〜１２０秒間、又は１〜６０秒間の光照射によって、光反応を進行させて光架橋を形成させることができる。さらに、本発明による光架橋は、上記の波長及び温度を採用して、例えば１〜１２０秒間、又は１〜６０秒間の光照射によって、光反応を進行させて光架橋を開裂させることができる。
【００８８】
［修飾核酸合成用モノマー及び修飾核酸の合成］
後述するスキーム１又はスキーム２に記載の手法、あるいは当業者に公知の手法を使用して、ピラノカルバゾール構造を有する化合物（例えば後述するスキーム１の化合物２）から、本発明に係る修飾核酸を得るための合成用モノマー（製造用試薬）（例えば後述するスキーム１の化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、あるいはスキーム２において対応する化合物）を得ることができる。本発明に係る修飾核酸の合成用モノマーの構造は上述した通りであり、これを、ホスホロアミダイト法、及びＨ−ホスホネート法等の公知の手法における核酸合成試薬として使用すれば、光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（式ＶＩＩの化合物、式ＶＩＩＩの化合物）が配列中に取り込まれた核酸又はオリゴヌクレオチド（本発明に係る修飾核酸）あるいはペプチド核酸を得ることができる。このように、本発明に係る修飾核酸合成モノマーは、ホスホロアミダイト法、及びＨ−ホスホネート法等の公知の手法において核酸合成試薬として使用できる点で、優れたものである。
【実施例】
【００８９】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。【００９０】
［ヌクレオシドアナログ（光反応性素子）の合成］
次のスキーム１に示す合成経路に沿って、光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（ヌクレオシドアナログ、あるいは光反応性素子又は光架橋素子ということがある）、さらに修飾核酸合成モノマーの合成を行った。【００９１】
スキーム１：
2019022158.tif 000032
【００９２】
［化合物２の合成］
二口ナスフラスコに２−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂａｚｏｌｅ（２．０ｇ、１１ｍｍｏｌ）、ＩｎＣｌ3（２６０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を入れ、還流管をつけ、窒素置換を行った。オイルバスを９０℃にセットし、二口ナスフラスコにＥｔｈｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｌａｔｅ（４ｍｌ）を加え９０℃，２４ｈ撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認した後、水２ｍＬを加え反応をクエンチした。酢酸エチルに溶かし、抽出を行った。硫酸ナトリウムを用い、脱水を行い、エバポレータにより溶媒を除去した。その後、カラム（ヘキサン：酢酸エチル＝８：１）により精製を行い、化合物２を得た。（収量：５０３ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ、収率：２５％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  １１．６７（ｓ，１Ｈ），８，４７（ｓ，１Ｈ），８，１７（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），７．５０−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．２５（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．５４Ｈｚ），６．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７５Ｈｚ）【００９３】
［化合物４の合成］
二口ナスフラスコに化合物２（３２４ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）、ＫＯＨ（２２４ｍｇ，４．００ｍｍｏｌ）を入れ、窒素置換を行った。脱水アセトニトリルを３６ｍＬとＴＤＡ−１を２４μＬ入れて３０分撹拌した。その後、クロロシュガー（６７４ｍｇ、１．９４ｍｍｏｌ）を加え一晩撹拌した。反応液を濾過した後、エバポレータにより溶媒を除去した。除去後の混合液にメタノール４０ｍＬに溶解させた後、ナトリウムメトキシド５４ｍｇとクロロホルム５ｍＬを加え、４時間撹拌した。その後、濾過、エバポレータによる溶媒の除去を行った。その後、カラム（クロロホルム）による精製を行い、化合物４を得た。（収量：８０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、収率：１７％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．５０（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２８，８．０），７．３１（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．１７），６．７１（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２），６．３８（ｄ，１Ｈ，４．６Ｈｚ），５．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．１０（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．０７Ｈｚ），３．９５−３．８７（ｍ，３Ｈ），２．７４（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，８．２Ｈｚ），２．２６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，６．９，３．３Ｈｚ）【００９４】
［化合物５、化合物６の合成］
以降の合成は常法に従い、ジメトキシトリチル化、アミダイト化を行った。【００９５】
［光応答性核酸含有ＤＮＡの合成］
ＤＮＡ自動合成機（ＡＢＩ３４００）を用い、修飾ＤＮＡの合成を行った。その後、２８％アンモニア水溶液による切り出しを行った後、６５℃で４時間加熱し、脱保護を行った。ＳｐｅｅｄＶａｃによりアンモニアを除去、ＨＰＬＣによる精製を行った。その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析を行い目的物の同定を行った。
Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  ［Ｍ＋Ｈ］+  ２７９８．４０，Ｆｏｕｎｄ  ２７９８．７２【００９６】
［光架橋反応］
１０μＭ修飾ＯＤＮ、１０μＭ相補鎖ＯＤＮ、５０μＭ  ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭカコジル酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）を９０℃で１分間加熱し、４℃で静置した。その後、ＵＶ−ＬＥＤ（ＯｍｎｉＣｕｒｅ，ＬＸ４０５−Ｓ）を用いて４００ｎｍの光照射を４℃で行った。図１ａはこの光架橋反応の流れを示す説明図である。【００９７】
［ＵＰＬＣ解析］
ＤＮＡサンプル５０μＬをＵＰＬＣ用バイアル瓶に移し、ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフ）解析を行った。解析には５０ｍＭギ酸アンモニウムとアセトニトリルを用い、分析開始時ギ酸アンモニウム１００％、１０分時点でギ酸アンモニウム９０％、アセトニトリル１０％になるように直線的に溶媒比率を変化させた。流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２６０ｎｍで分析を行った。図１ｂ及び図１ｃにこれらの結果をまとめて示す。【００９８】
［結果］
図１ｂは、光照射時間を０〜１５秒と変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。図１ｂの横軸は保持時間［分］である。相補鎖ＯＤＮ、修飾ＯＤＮ、光架橋されたＯＤＮのピークの位置をそれぞれ図１ｂ中に示す。図１ｃは、光照射時間を０〜１５秒と変化させた場合の各光照射時間における光架橋率を算出して作成したグラフである。図１ｃの横軸は光照射時間［秒］、縦軸は架橋率［％］を示す。【００９９】
［光架橋可能な光波長の検討］
上記の光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（ピラノカルバゾール構造を有する光架橋素子）（ＰｙｒａｎｏＣａｒｂａｚｏｌｅ  Ｐｈｏｔｏ−Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）（PCＸ）について、光架橋可能な波長を以下のように検討した。【０１００】
１０μＭ  ＯＤＮ（Ｘ）、１０μＭ  ｃＯＤＮ、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒをアニーリング後４℃で光照射を行いＵＰＬＣにより解析した。図２ａはこの光架橋反応の流れを示す説明図である。図２ｂにこの結果をまとめて示す。【０１０１】
［結果］
図２ｂは、照射する光波長を４５０〜５５０ｎｍと変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。図２ｂの横軸は保持時間［分］である。相補鎖ＯＤＮ（ｃＯＤＮ）、修飾ＯＤＮ（ＯＤＮ（PCＸ））、光架橋されたＯＤＮ（＊）のピークの位置をそれぞれ図２ｂ中に示す。このように、４５０ｎｍから開始して少なくとも５５０ｎｍまでの波長の光照射によって、光架橋可能であることがわかった。【０１０２】
［光開裂可能な光波長の検討］
上記の光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（PCＸ）の光架橋体に対して、光開裂可能な波長を以下のように検討した。【０１０３】
１０μＭの光架橋体に対して３７℃で３２０ｎｍ、３３０ｎｍ、３４０ｎｍに対して光照射を行った。その後、同様に解析を行った。図３ａはこの光開裂反応の流れを示す説明図である。図３ｂ及び図３ｃにこの結果をまとめて示す。【０１０４】
図３ｂは、照射する光波長を３２０〜３４０ｎｍと変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。図３ｂの横軸は保持時間［分］である。相補鎖ＯＤＮ（ｃＯＤＮ）、修飾ＯＤＮ（ＯＤＮ（PCＸ））のピークの位置をそれぞれ図３ｂ中に示す。光架橋されたＯＤＮのピークは、保持時間４．５〜５分の間に位置するピークである。図３ｃは、各波長の光照射によって開裂した光架橋体の割合（光開裂率％又は転化率％）を示すグラフである。このように、少なくとも３２０〜３４０ｎｍまでの波長の光照射によって光開裂可能であること、この範囲内において３３０ｎｍの光照射が最も光開裂率が高いことがわかった。【０１０５】
［照射光波長の細胞への影響の検討］
長波長の光照射が、短波長の光照射と比較して、細胞へのダメージが少ないことを検討するために、以下の実験を行った。【０１０６】
９６穴プレートに５×１０5ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞（ＧＦＰ−ＨｅＬａ細胞、ヒト子宮頸癌由来株）を１００μＬ分注し、ＣＯ2インキュベータで４８時間培養した。その後、３６６ｎｍ、４００ｎｍ、又は４５０ｎｍの波長の光で光照射を行った後、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔを１０μＬずつ入れ、ＣＯ2インキュベータで４時間呈色した後、マイクロプレートリーダを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。この結果を、図４にまとめて示す。【０１０７】
［結果］
図４は、各波長での光照射時間（秒）と細胞生存率（％）を対比したグラフである。この結果から、３６６ｎｍの光照射では数秒の光照射でも細胞生存率が大きく低下しているのに対して、４００ｎｍ、４５０ｎｍでは、数十秒光照射を行ってもほとんど細胞生存率が低下していない。すなわち、このことからもピラノカルバゾールが細胞毒性の少ない長波長の光で操作可能であることが明らかとなった。【０１０８】
［ヌクレオシドアナログ（光反応性素子）（SPCX）の合成］
光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子として、次の構造を有するピラノカルバゾール誘導体（SPCX）の合成を、スキーム２に従って行った。
SPCX：
2019022158.tif 000033
【０１０９】
［スキーム２］
2019022158.tif 000034
【０１１０】
合成は、スキーム２に示すように、上述したスキーム１と同様に、２−ヒドロキシカルバゾールを出発物質として行った。スキーム２において、枠内に記載された箇所以外は、スキーム１と同様の手順によって合成を行った。枠内に記載された箇所については、以下にさらに詳細に説明する。【０１１１】
［ピラノカルバゾール誘導体(S-ピラノ)の合成］
スキーム２の枠内の合成について以下のように行った。【０１１２】
次の反応を後述のように行った。
2019022158.tif 000035
【０１１３】
５０ｍＬナスフラスコにピラノカルバゾールヌクレオシド（８００ｍｇ，２．２８ｍｍｏｌ）と無水酢酸（２０ｍＬ）、ＤＭＡＰ（５０ｍｇ）を加え、室温で２時間撹拌した。その後ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で反応の進行を確認後、エバポレータにより溶媒を除去した後、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）によるカラム精製を行った。黄色粘性液体（７．９９ｍｇ，１．７７ｍｍｏｌ，７８％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲにより目的物と同定した。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）  ∂  ８．５０（ｓ，１Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｄ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ），７．５０（ｔ，１Ｈ），７．３１（ｔ，１Ｈ），６．７０（ｔ，１Ｈ），６．３４（ｄ，１Ｈ），５．４１（ｄ，１Ｈ），５．１６（ｔ，１Ｈ），４．５０（ｄ，１Ｈ），３．７８（ｑ，２Ｈ），２．６０−２．６８（ｍ，１Ｈ），２．１４−２．１８（ｍ，１Ｈ），１．１８（ｓ，６Ｈ）．【０１１４】
次の反応を後述のように行った。
2019022158.tif 000036
【０１１５】
５０ｍＬナスフラスコに３’，５’−アセチルピラノカルバゾールヌクレオシド（７．９９ｍｇ，１．７７ｍｍｏｌ）にたいし、ローソン試薬（１，００ｇ，２．４８ｍｍｏｌ）を加え、窒素置換、１００℃で３時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で新たなスポットの出現を確認し、反応を停止した。その後、ＡｃＯＥｔに溶解させた後、ＮａＣｌ水溶液と分液を行い、有機相を回収し、エバポレータで溶媒を除去した。その後、アンモニア水溶液を加え、室温で６０時間撹拌した後、アンモニアの除去、凍結乾燥による水の除去を行った後、カラム精製（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）により目的物を回収した。1Ｈ−ＮＭＲにより目的物の同定を行った。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）  ∂  ８．５６（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｄ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ），７．５１（ｔ，１Ｈ），７．３５（ｔ，１Ｈ），６．７２（ｔ，１Ｈ），６．２１（ｄ，１Ｈ），５．４１（ｄ，１Ｈ），５．１６（ｔ，１Ｈ），４．５１（ｄ，１Ｈ），３．９０（ｑ，１Ｈ），３．９０（ｑ，２Ｈ），２．４８−２．６５（ｍ，１Ｈ），２．１２−２．１６（ｍ，１Ｈ）．【０１１６】
［SPCXによる光架橋試験］
スキーム２によって得られた修飾核酸合成モノマーを用いて、光応答性核酸含有ＤＮＡの合成を行って、光架橋反応することを確認した。【０１１７】
実験には下記ＯＤＮ（SPCＸ）とｃＯＤＮを使用して、後述のように行った。
ＯＤＮ（SPCＸ）    ５’−ＴＧＣＡSPCＸＣＣＧＴ−３’
ｃＯＤＮ            ５’−ＡＣＧＧＧＴＧＣＡ−３’【０１１８】
１０μＭのＯＤＮ（SPCＸ）と１０μＭのｃＯＤＮを１００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭカコジル酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解させた後、９０℃で１分間加熱した後、４℃で冷却した。その後４℃条件下で４５０ｎｍ（ＬＥＤ）の光照射を行った。その後、ＵＰＬＣによる解析を行った。ＵＰＬＣでの解析条件は下記の通りである。測定波長２６０ｎｍ、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ、ギ酸アンモニウムとアセトニトリル混合溶液を用い、初期条件はギ酸アンモニウム９９％、アセトニトリル１５％、分析終了（１０分）時点でギ酸アンモニウム８５％、アセトニトリル１５％の条件で分析を行った。
この光架橋反応の流れを示す説明図を、図５に示す。【０１１９】
［結果］
光架橋試験のＵＰＬＣによる解析結果を図６に示す。
ＵＰＬＣで解析を行った結果、光照射前に確認できたｃＯＤＮとＯＤＮ（SPCＸ）のピークが光照射時間依存的に減少し、新たなピークが確認でき、光架橋反応の進行が確認された。４５０ｎｍの光照射を１０秒行うことにより光架橋していることから、ピラノカルバゾール（PCＸ）よりもＳ−ピラノカルバゾール（SPCＸ）はさらに高い光反応性を有するものであった。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明は、核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となる新規な化合物を提供する。本発明は産業上有用な発明である。
【図１ａ】
2019022158.tif 000045
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月27日(2019.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉで表される化合物：
2019022158.tif 000056
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
Ｙは、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子である。）。
【請求項２】
Ｙが、次の式ＩＩで表される基である、請求項１に記載の化合物：
2019022158.tif 000057
（ただし、式ＩＩにおいて、
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、水酸基、又は−Ｏ−Ｑ１基であり、
Ｒ１３は、水酸基、又は−Ｏ−Ｑ２基であり、
Ｑ１は、
Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；
及び
以下から選択される保護基：
トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
からなる群から選択される基であり、
Ｑ２は、
Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；
及び
以下から選択される保護基：
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、−ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、−ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
からなる群から選択される基である。）。
【請求項３】
Ｙが、次の式ＩＩＩで表される基、又は式ＩＶで表される基である、請求項１に記載の化合物：
2019022158.tif 000058
【請求項４】
塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000059
（ただし、式Ｉｂにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）で表される基を有するヌクレオシドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000060
（ただし、式Ｉｂにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）で表される基を有するヌクレオチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
塩基部分として、次の式Ｉｂ：
2019022158.tif 000061
（ただし、式Ｉｂにおいて、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１〜Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）で表される基を有する核酸又はペプチド核酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物からなる、光反応性架橋剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物を使用して、ピリミジン環を有する核酸塩基との間に光架橋を形成する方法。
【国際調査報告】
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