(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＡＣＰ−５ｂの立体構造に依存したエピトープを認識し、その線状に並んだ一次構造から形成されるいかなるエピトープも認識せず、ＴＲＡＣＰ−５ａに結合しないモノクローナル抗体。  
【請求項２】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８６６のハイブリドーマＴｒＫ−１２６。
【請求項３】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８６７のハイブリドーマＴｒＫ−１２７。
【請求項４】
請求項２に記載のハイブリドーマが産生する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項３に記載のハイブリドーマが産生する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
１つ又は複数の請求項１に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出するＴＲＡＣＰ−５ｂの検出方法。
【請求項７】
請求項４及び５に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、請求項６に記載のＴＲＡＣＰ−５ｂの検出方法。
【請求項８】
請求項４及び５に記載のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡにより、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
請求項４に記載のモノクローナル抗体及び請求項５に記載のモノクローナル抗体を用いた、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、請求項７に記載の検出方法。
【請求項１０】
請求項４に記載のモノクローナル抗体及び請求項５に記載のモノクローナル抗体を用いた、ラテックス凝集法（比濁法）により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、請求項７に記載の検出方法。
【請求項１１】
骨吸収のマーカーとして骨疾患の臨床検査に用いる、請求項６から１０までのいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１２】
１つ又は複数の請求項１に記載のモノクローナル抗体を構成成分として含む、ＴＲＡＣＰ−５ｂの検出に用いるためのキット。
【請求項１３】
請求項４に記載のモノクローナル抗体及び請求項５に記載のモノクローナル抗体を構成成分として含む、ＴＲＡＣＰ−５ｂの検出に用いるためのキット。
【請求項１４】
請求項８に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
（１）固相支持体；
（２）請求項４に記載のモノクローナル抗体及び標識された請求項５に記載のモノクローナル抗体、あるいは請求項５に記載のモノクローナル抗体及び標識された請求項４に記載のモノクローナル抗体；及び
（３）標識を検出するための成分；
を構成成分として含むキット。
【請求項１５】
請求項９に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
（１）磁気ビーズ；
（２）請求項４に記載のモノクローナル抗体及び標識された請求項５に記載のモノクローナル抗体、あるいは請求項５に記載のモノクローナル抗体及び標識された請求項４に記載のモノクローナル抗体；及び
（３）標識を検出するための成分；
を構成成分として含むキット。
【請求項１６】
請求項１０に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
（１）ラテックス粒子；及び
（２）請求項４に記載のモノクローナル抗体及び請求項５に記載のモノクローナル抗体；
を構成成分として含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ−５ｂ：別名、破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いたＴＲＡＣＰ−５ｂの検出方法、並びにこれに用いるキットに関する。
本発明のモノクローナル抗体によれば、骨吸収のマーカーとして骨疾患の医学的治療や臨床検査の分野において極めて有効である。
【背景技術】
【０００２】
血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ：Tartrate Resistant acid Phosphatase EC3.1.3.2）はその大部分が破骨細胞由来の酸性ホスファターゼとされ、その測定は、破骨細胞の機能を評価する指標として有用とされており、骨吸収マーカーとして興味が持たれている（非特許文献１）。一方、血清中の酸性ホスファターゼは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、原点より０〜５の６つのバンドに分けられ、その中で５番目が酒石酸抵抗性であることから、Ｂａｎｄ５酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ５）と呼ばれている。これはさらに電気泳動により糖鎖へのシアル酸結合の多い５ａと、ほとんどシアル酸結合のない５ｂに分けられる。そして、５ａは血小板やその他からの酵素であって血中値が変動しないのに対して、５ｂのみが骨吸収に伴い変動するため、５ｂが破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの本体であると考えられている（特許文献１）。
なお、Clinical Chemistry誌（非特許文献２）でも破骨細胞由来のＡＣＰを、ＴＲＡＣＰ−５ｂと略記することを勧めている。よって本明細書においても破骨細胞由来で骨吸収の指標となるＡＣＰを意味するものはＴＲＡＣＰ−５ｂとして、破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼと酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂを同義としてＴＲＡＣＰ−５ｂと表記する。【０００３】
破骨細胞の活性を表す酸性ホスファターゼの指標としてＴＲＡＣＰ活性を求める従来の活性測定法は、特異性、感度、測定の煩雑さおよび測定時間の点で問題を有している。
一般的に活性測定法によるＴＲＡＣＰ−５ｂの測定は、酒石酸の存在下で合成基質としてリン酸エステルを用いて酵素反応により生ずる反応生成物（アルコールやフェノール類）を比色定量することにより酵素活性を求めている。その際、酒石酸が前立腺由来酸性ホスファターゼを阻害し、残存した酸性ホスファターゼ活性を基質で測定することにより、ＴＲＡＣＰ活性をＴＲＡＣＰ−５ｂ活性とみなして求めている。しかしながら、検体中に存在する破骨細胞由来以外の赤血球由来や血小板由来の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼも測定してしまうため、特異性の点で問題を有する。上記方法の改善法としては、血清を５倍に希釈した液を３７℃で１時間インキュベートする前処理をした後、残りのＴＲＡＣＰ活性を、酒石酸存在下、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を用いて測定する方法が知られている（非特許文献３及び非特許文献４）。この方法は赤血球由来酸性ホスファターゼの影響は回避できるが、血小板由来酸性ホスファターゼの影響は除くことは出来ない。さらにより特異的な活性測定法として、本発明者らは、ＴＲＡＣＰ−５ｂと赤血球や血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性がフッ素に対する感受性に差のあることを利用したＴＲＡＣＰ−５ｂ測定法を報告した（特許文献２）。しかしながら、赤血球及び血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの影響はないものの、ＴＲＡＣＰ−５ａの影響を除くことができず、またＴＲＡＣＰ−５ｂ活性を総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性からフッ素存在下で阻害されなかった活性を差し引きすることにより求めており、精度の点でさらなる改良が求められている。さらに上記フッ素を利用した方法にＴＲＡＣＰ−５ａの阻害物質を組み合わせて用いることにより、より特異的にＴＲＡＣＰ−５ｂ活性を測定する方法が報告されている（特許文献３）。しかしながら、フッ素のみを用いる方法より特異的ではあるものの、やはり差し引きで破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ−５ｂ活性を求めているため同様に、精度の点で問題を残している。【０００４】
ヒトＴＲＡＣＰ−５ａとＴＲＡＣＰ−５ｂはともに３２５アミノ酸からなるヒトＡＣＰ５遺伝子（http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ACP5）産物（配列番号１）由来のイソフォームであり、１〜２１番目までの分泌シグナル配列が切除されて、ＴＲＡＣＰ−５ａが形成されるのに対し、ＴＲＡＣＰ−５ｂはさらに、カテプシンＫによって１６２〜１８１番目までのペプチドが切除され、１６１番目のシステインと２１９番目のシステインがＳＳ結合を介して結合する約１６ｋＤａと約２３ｋＤａのサブユニット構造を有している。【０００５】
免疫学的測定法によるＴＲＡＣＰ−５ｂの測定方法として、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いた免疫測定法も知られている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９及び非特許文献１０）。これらの方法は、ＴＲＡＣＰ−５ａおよびＴＲＡＣＰ−５ｂの両者を測定してしまうため、ＴＲＡＣＰ−５ａの影響を無視できない（非特許文献１１）。さらに、ＴＲＡＣＰ−５ｂをより特異的に測定する免疫学的測定法が報告されている（特許文献４）。この方法はよりＴＲＡＣＰ−５ｂ活性に特異的であるが、測定に用いる抗体がＴＲＡＣＰ−５ｂに特異的ではなく、ＴＲＡＣＰ−５ａとも反応するため、ＴＲＡＣＰ−５ａとＴＲＡＣＰ−５ｂの至適ｐＨの差を利用して活性測定で測定値を算出している。そのため、末期腎疾患などのＴＲＡＣＰ−５ａが亢進している患者検体での影響が懸念され、また、健常者検体と骨吸収が亢進している患者検体での差が小さく、骨吸収マーカーとして感度は十分とは言えない（非特許文献１２）。【０００６】
本願発明者らも、従前にＴＲＡＣＰ−５ａとＴＲＡＣＰ−５ｂを識別できるモノクローナル抗体の作成を試みている（特許文献６）。その結果一定の選択性を有する抗体の作成に成功しているもののその選択性については改良の余地があり、臨床試験に用いるためにはさらなる改良が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2002-510050号公報
【特許文献２】特開平10−37198号公報
【特許文献３】特開2001−231595号公報
【特許文献４】WO99/50662号公報
【特許文献５】特表2002-510050号公報
【特許文献６】特許第4164804号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】骨代謝マーカー，福永仁夫，中村利孝，松本俊夫編，メディカルレビュー社，１９９５
【非特許文献２】Clin.Chem.47:1497.2001
【非特許文献３】日大医誌.49:904-911.1990
【非特許文献４】Clin.Chem.33:458-462.1987
【非特許文献５】J Clin Endocrinol Metab.71:442-451.1990
【非特許文献６】J Bone Miner Res.13:683-687.1998
【非特許文献７】Immunol Lett.70:143-149.1999
【非特許文献８】J Bone Miner Res.14:464-469.1999
【非特許文献９】Clin Chem.45:2150-2157.1999
【非特許文献１０】Clin Chem.46:1751-1754.2000
【非特許文献１１】Calcif Tissue Int, on line 14, Sepember, 2009
【非特許文献１２】Clin. Chim. Acta 301:147-158, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
かかる問題に鑑み、本発明は、骨吸収マーカーである破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ−５ｂ）に対して、さらに特異性と親和性の高いモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いたＴＲＡＣＰ−５ｂの検出方法およびそれに使用するキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記糖鎖修飾の違いを含むＴＲＡＣＰ−５イソフォームを認識するという課題を解決するため、本願発明者らは、ヒト由来のＴＲＡＣＰ−５ｂではなく、あえてヒトとは糖鎖修飾の異なるカイコにおいて絹糸腺中に産生させたリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ−５ｂを用いて、特異性と親和性の高いモノクローナル抗体を取得し、その抗体について解析を行った。【００１１】
即ち、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［２８］の通りである。
［１］ＴＲＡＣＰ−５ｂの立体構造に依存したエピトープを認識し、その線状に並んだ一次構造から形成されるいかなるエピトープも認識しないモノクローナル抗体；
［２］受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８６６のハイブリドーマＴｒＫ−１２６；
［３］受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８６７のハイブリドーマＴｒＫ−１２７；
［４］［２］に記載のハイブリドーマが産生する［１］に記載のモノクローナル抗体；
［５］［３］に記載のハイブリドーマが産生する［１］に記載のモノクローナル抗体；【００１２】
［６］１つ又は複数の［１］に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出するＴＲＡＣＰ−５ｂの検出方法；
［７］［４］及び［５］に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する［６］に記載のＴＲＡＣＰ−５ｂの検出方法；
［８］［４］に記載のモノクローナル抗体及び［５］に記載のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡにより、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、［７］に記載の検出方法；
［９］［４］に記載のモノクローナル抗体及び［５］に記載のモノクローナル抗体を用いた、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、［７］に記載の検出方法；
［１０］［４］に記載のモノクローナル抗体及び［５］に記載のモノクローナル抗体を用いた、ラテックス凝集法（比濁法）により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、［７］に記載の検出方法；
［１１］  骨吸収のマーカーとして骨疾患の臨床検査に用いる、［６］から［１０］のいずれかに記載の検出方法。【００１３】
［１２］１つ又は複数の［１］に記載のモノクローナル抗体を構成成分として含む、ＴＲＡＣＰ−５ｂの検出に用いるためのキット；
［１３］［４］に記載のモノクローナル抗体及び［５］に記載のモノクローナル抗体を構成成分として含む、ＴＲＡＣＰ−５ｂの検出に用いるためのキット；
［１４］［８］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
（１）固相支持体；
（２）［４］に記載のモノクローナル抗体及び標識された［５］に記載のモノクローナル抗体、あるいは［５］に記載のモノクローナル抗体及び標識された［４］に記載のモノクローナル抗体；及び
（３）標識を検出するための成分；
を構成成分として含むキット；
［１５］［９］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
（１）磁気ビーズ、
（２）［４］に記載のモノクローナル抗体及び標識された［５］に記載のモノクローナル抗体、あるいは［５］に記載のモノクローナル抗体及び標識された［４］に記載のモノクローナル抗体；及び
（３）標識を検出するための成分；
を構成成分として含むキット；
［１６］［１０］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
（１）ラテックス粒子；及び
（２）［４］に記載のモノクローナル抗体及び［５］に記載のモノクローナル抗体；
を構成成分として含むキット。【００１４】
［１７］カイコ絹糸腺中に産生され、カイコ特異的な糖鎖修飾を受けたリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ−５ｂを抗原とした抗体であって、ＴＲＡＣＰ−５ｂの立体構造に依存したエピトープを認識し、その線状に並んだ一次構造から形成されるいかなるエピトープを認識しないモノクローナル抗体；
［１８］［２］または［３］に記載のハイブリドーマが産生する、［１７］に記載の抗体；
［１９］赤血球、血小板、好中球および前立腺由来の酸性ホスファターゼに対しては実質的に交差反応性を示さない、［１７］または［１８］のいずれかに記載のモノクローナル抗体。【００１５】
［２０］［１７］から［１９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて免疫測定法により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出するＴＲＡＣＰ−５ｂの検出方法；
［２１］［１７］から［１９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡにより、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、［２０］に記載の検出方法；
［２２］［１７］から［１９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いた、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、［２０］に記載の検出方法；
［２３］［１７］から［１９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いた、ラテックス凝集法（比濁法）により、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを検出する、［２０］に記載の検出方法；
［２４］  骨吸収のマーカーとして骨疾患の臨床検査に用いる、［２０］から［２３］のいずれかに記載の検出方法。【００１６】
［２５］［１７］から［１９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を構成成分として含む、ＴＲＡＣＰ−５ｂの検出に用いるためのキット；
［２６］［２１］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、固相支持体、［１７］から［１９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体、標識された他の別なＴＲＡＣＰ−５ｂに対する抗体、および標識を検出するための成分を構成成分として含むキット；
［２７］［２２］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、磁気ビーズ、［１７］から［１９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体、及び標識された他の別なＴＲＡＣＰ−５ｂに対する抗体、および標識を検出するための成分を構成成分として含むキット；
［２８］［２３］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、ラテックス粒子；及び［１７］から［１９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を構成成分として含むキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、生体試料中のＴＲＡＣＰ−５ｂを従来法より効率よく検出定量することが可能であり、様々な疾患の診断の一助とすることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＥＬＩＳＡ測定法によるＴＲＡＣＰ−５ｂ測定
【図２】ＥＬＩＳＡ測定法における特異性検定
【図３】ＣＬＥＩＡ法によるＴＲＡＣＰ−５ｂ測定
【図４】ＣＬＥＩＡ法における特異性検定
【図５】ラテックス凝集法によるＴＲＡＣＰ−５ｂ測定
【図６】ＡＣＰ５（ＴＲＡＣＰ−５）アミノ酸配列、及び各種修飾予想部位
【図７】＜比較例＞Ｔｒｋ−６２とＴｒｋ−４９のエピトープマッピング
【図８】＜比較例＞Ｔｒｋ−６２とＴｒｋ−４９のエピトープ部位
【図９】Ｔｒｋ−１２６とＴｒｋ−１２７のエピトープマッピング
【図１０】Ｔｒｋ−１２６とＴｒｋ−１２７を用いたＴＲＡＣＰ−５ｂのドットブロッティングとウェスタンブロッティング
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、組み換えヒトＴＲＡＣＰ−５ｂを免疫原として使用することにより得ることができる。本明細書の以後に記載する実施例では遺伝子組み換えカイコから精製しているが、培養細胞、大腸菌など、ヒトＴＲＡＣＰ−５ｂを発現できる宿主であれば、限定されない。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば精製ヒトＴＲＡＣＰ−５ｂを免疫原として動物を免疫し、その動物が産生する抗ヒトＴＲＡＣＰ−５ｂ抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。
【００２０】
上記ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち、上述のようにして得たヒトＴＲＡＣＰ−５ｂを、フロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等の既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に１〜３週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は１μｇ〜１００ｍｇの間とされているが、一般的には５０μｇ程度が好ましい。免疫回数は２〜７回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞とを融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットなどの脾臓等より得ることができる。
上記融合法としては、既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法(Nature.256,495.1975)によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
【００２１】
上記融合した細胞からヒトＴＲＡＣＰ−５ｂを認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によってＨＡＴ培地およびＨＴ培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。９６穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒトＴＲＡＣＰ−５ｂに対する抗体が含まれている場合には、ヒトＴＲＡＣＰ−５ｂをプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体等の２次標識抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法により、ヒトＴＲＡＣＰ−５ｂに対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはＨＲＰの他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤であるＢＳＡのみを結合したアッセイプレートによるＥＬＩＳＡを同時に行うことでヒトＴＲＡＣＰ−５ｂ特異的抗体のスクリーニングができる。つまりヒトＴＲＡＣＰ−５ｂプレートで陽性であり、ＢＳＡによるＥＬＩＳＡで陰性のクローンを選択できる。
【００２２】
本発明のハイブリドーマとしては、ヒトＴＲＡＣＰ−５ｂを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、特にヒトＴＲＡＣＰ−５ｂと反応し、かつ赤血球、血小板、好中球、前立腺由来の酸性ホスファターゼと交差反応しないモノクローナル抗体を産生するものが望ましい。
特に本発明のモノクローナル抗体としては、臨床検査に用いた時その検査結果が骨吸収をより明確に反映するために、検出系中でヒトＴＲＡＣＰ−５ａと結合せず、ＴＲＡＣＰ−５ｂのみを認識結合するモノクローナル抗体が好ましい。
ここで「ヒトＴＲＡＣＰ−５ｂに結合し、ヒトＴＲＡＣＰ−５ａに結合しない」とは、当該技術分野における検出系（たとえば、サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ）において、ヒトＴＲＡＣＰ−５ａよりもヒトＴＲＡＣＰ−５ｂに対して検出系中で、約１００倍以上、より好ましくは約５００倍以上の反応性を示すものであることを示す。
【００２３】
上記ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。
上記の上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。たとえば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ、プロテインＧなどによるアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法によって検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを高感度で且つ特異的に検出することができる。対象となる検体としては、検体から採取、単離された血液、血清、血漿、骨などの組織等が挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法による検出方法としては、サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、ラテックス凝集法（比濁法）、組織免疫染色法等が挙げられる。
【００２５】
ＴＲＡＣＰ−５ｂの酵素活性の測定を利用した免疫測定法としては、例えば、検体、例えば血清中のＴＲＡＣＰ−５ｂを、本発明のモノクローナル抗体に結合させ、結合したＴＲＡＣＰ−５ｂに対して、ＴＲＡＣＰ−５ｂの酵素基質、例えばＰ‐ニトロフェニルリン酸またはその塩を酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを免疫測定できる方法が挙げられる。その方法においては、具体的には、ＴＲＡＣＰ−５ｂを以下のようにして測定できる。まず、固相支持体に吸着している本発明のモノクローナル抗体に、測定すべき検体を加え、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂと抗体とを抗原抗体反応させてＴＲＡＣＰ−５ｂを抗体に結合させる。次いで、その固相支持体を洗浄液で洗浄して、抗体に吸着しなかった検体由来の成分を除去した後、反応系にＴＲＡＣＰ−５ｂの酵素基質、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸またはその塩を加え、抗体に結合しているＴＲＡＣＰ−５ｂと基質とを反応させる。反応停止液で酵素反応を停止した後、反応により生成したフェノール類、例えば、ｐ−ニトロフェノールを、通常３９０ｎｍ〜４５０ｎｍ、好ましくは４００〜４３０ｎｍの波長で吸光度を測定する。その吸光度の大きさは、ＴＲＡＣＰ−５ｂ酵素活性を反映するので、その値から、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを測定できる。
本発明では、上記した測定法から明らかな通り、抗体は固相支持体に結合させて用いるのが好ましく、固相支持体としては、通常、ＥＬＩＳＡ法等の固相免疫測定法に用いる固相支持体が用いられるが、特に限定されない。例えば、固相支持体の材料として、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ポリエチレン、ナイロン、メタアクリレートなどが挙げられる。固相支持体の形状としては、プレート、（磁気）ビーズ、ラテックス粒子等が挙げられる。
固相支持体に吸着している抗体を調製するには、直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して固相支持体にＴＲＡＣＰ−５ｂに対する抗体を結合させる。感作抗体量は、１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であることが多い。
固相支持体としての（磁気）ビーズを用いて、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）を行う場合は、通常の化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）で用いられる試薬、キットなどを使用しうる。
固相支持体としてのラテックス粒子を用いて、ラテックス凝集法を行う場合は、通常のラテックス凝集法で用いられる試薬、キットなどを使用しうる。
【００２６】
本発明の測定方法を実施するときは、ＴＲＡＣＰ−５ｂを免疫測定するためのキットであって、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体を含むキットを用いて行える。
このキットにおいては、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体に関しては、固相支持体と抗体溶液とを別々に作製しておき、ＴＲＡＣＰ−５ｂを測定する際、抗体を固相支持体に吸着させてもよく、あらかじめ、抗体を固相支持体に吸着させた状態で提供してもよい。このキットにおいては、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。
さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００２７】
本発明においては、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法により、ＴＲＡＣＰ−５ｂを測定することもできる。この場合、モノクローナル抗体として、本発明抗体以外に、他のＴＲＡＣＰ−５ｂに対する別な抗体も用いて実施することができる。サンドイッチアッセイによるＴＲＡＣＰ−５ｂを測定する方法の具体例は、以下の通りである。まず、一次抗体として本発明抗体を、固相支持体、例えば、プレートに吸着させ、検体、例えば、血清中のＴＲＡＣＰ−５ｂと反応させ、固相支持体を洗浄し、次いで、吸着したＴＲＡＣＰ−５ｂと、ビオチン化した２次抗体、例えばビオチン化した別なＴＲＡＣＰ−５ｂに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とを反応させ、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ酵素反応、次いで、発色反応を行うことにより、ＴＲＡＣＰ−５ｂを検出することができる。また、２次抗体を直接ペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼ等により酵素標識したものを用いることにより、同様の測定をすることができる。また、２次標識抗体に結合させる物質は測定方法によって酵素に限られるものではなく、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００２８】
本発明において、本発明抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡを行うときは、サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ用のキットを用いて実施することができる。
サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法で本発明の測定方法を実施するときは、例えば、ＴＲＡＣＰ−５ｂを免疫測定するためのキットであって、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体、ｉｉｉ）標識された、別なＴＲＡＣＰ−５ｂに対する抗体、及びｉｖ）標識を検出するための成分を含むキットを用いることによっても、ＴＲＡＣＰ−５ｂを測定することができる。
標識を検出するための成分とは、抗体が標識されたものを測定するための成分で、標識がビオチンの場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ酵素基質、及び過酸化水素を含む試薬であり、標識がアルカリホスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルリン酸を含む試薬である。このキットには、必要に応じ、洗浄液を含んでいてもよい。
本発明において、このキットを使用するときは、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂを抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００２９】
更に本発明においては、検体中のＴＲＡＣＰ−５ｂの存在を、本発明のモノクローナル抗体を利用した組織免疫染色法によって検出することもできる。即ち、例えば、ヒトの破骨細胞組織などから通常の方法により、例えば凍結切片を調製し、これに本発明のモノクローナル抗体を反応させ、次いで例えば、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素で標識した二次抗体と反応させ、次いで発色させることにより、ＴＲＡＣＰ−５ｂの存在を特異的に検出することができる。
このような、組織免疫染色法による検出は、ｉ）本発明のモノクローナル抗体、ｉｉ）標識された二次抗体およびｉｉｉ）発色試薬を構成成分として含むキットを用いて実施できる。標識された二次抗体としては、例えばペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素で標識した、動物由来の抗ＩｇＧ抗血清、抗ＩｇＧポリクローナル抗体などが挙げられ、発色試薬としては、標識に用いた酵素を発色するための通常用いられる発色基質などの試薬が用いられる。
【００３０】
本発明において、本発明抗体を用いた化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）やラテックス凝集法を行う場合は、公知の化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）用キットやラテックス凝集法用のキットを用いて実施することができる。
【００３１】
エピトープ (epitope) とは、抗体が認識する抗原の一部分のことを指す。完全長ＴＲＡＣＰ−５自体は３２５アミノ酸から形成されるが、抗体はその全体を認識するわけではなく、抗原の比較的小さな一部分のみを認識して結合する。エピトープとして機能するためには少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは５アミノ酸残基の長さが必要である。この抗体結合部分を「エピトープ」又は「抗原決定基 (antigenic determinant)」 とも呼ぶ。
「エピトープ」を認識するとは、そのエピトープを含む抗原が、立体構造を保持、または立体構造がほどかれたいずれかの条件下において、該エピトープ部分に対応する抗体が結合できることを言う。また「エピトープ」を認識しないとは、抗原が立体構造を保持した、および立体構造がほどかれたいずれの条件下においても、対応する抗体が実質的に結合しないことを意味する。
本発明における立体構造とは、アミノ酸配列を意味する一次構造、それが折りたたまれて形成されるへリックスやβ―シートなどを含む二次構造、二次構造をもったポリペプチドがさらに折りたたまれた三次構造、および三次構造をもった複数のポリペプチド間で会合し空間的配置を形成することからなる四次構造のことを指し、好ましくは該抗原が通常存在すると考えられる生体内環境もしくはそれに類じた環境において該抗原がとり得る構造を言う。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例、比較例及び参考例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００３３】
＜実施例１＞
（１）モノクローナル抗体作製用抗原の選択と準備
抗ヒトＴＲＡＣＰモノクローナル抗体作成のための抗原として、遺伝子組換えカイコ絹糸腺中に産生させたリコンビナントＴＲＡＣＰ−５ｂを準備した。リコンビナントＴＲＡＣＰ−５ｂの調製法は特許５１７７４３１号公報に記載される方法にて作製した。
ヒトリコンビナントＴＲＡＣＰ−５ｂを含む遺伝子組み換えカイコより絹糸腺を摘出し、３００ｇの絹糸腺を得た。絹糸腺を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）５６００ｍＬ中に懸濁させ、ローターステーター型ホモジナイザーによってホモジナイズした。その後１０，０００ｒｐｍ，２０分遠心分離し、その上清をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（φ４０ｍｍ×４０ｃｍ）（ＧＥヘルスケア）にアプライし、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含む上記トリス緩衝液の直線濃度勾配（０−１．０Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性は、基質パラニトロフェニルリン酸を用い測定し、活性の高い部分をプールした。それを濃縮後、０．７Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．２に透析し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００カラム（φ１６ｍｍ×６０ｃｍ）（ＧＥヘルスケア）にアプライし、同様に溶出したフラクションの酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性を測定し、活性部分をプールした。それを２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．２で２倍に希釈し、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰカラム（５ｍＬ）（ＧＥヘルスケア）にアプライし、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含む上記２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．２の直線濃度勾配（０．３５Ｍ−１Ｍ ＮａＣｌ）塩濃度勾配にかけ溶出した。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ高活性フラクションをプールし、濃縮することにより、精製ヒトリコンビナントＴＲＡＣＰ−５ｂを１．２ｍｇ得た。
なお、タンパク量はＡ２８０により確認し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い銀染色の結果、分子量３５，０００付近でシングルバンドであることにより確認した。単一バンドになった酵素は精製ＴＲＡＣＰ−５ｂとして免疫抗原とした。【００３４】
（２）免疫
精製ヒト組換えＴＲＡＣＰ−５ｂを１ｍｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２で希釈し、５０μｇ（５０μｌ）をとってフロインド完全アジュバンド（ＷＡＫＯ）５０μｌと乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液をＢａｌｂ／ｃ ６週齢雌マウス（日本クレア）にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。２週間後には同量のＴＲＡＣＰ−５ｂ（５０μｇ／ｍｌ）をフロインド不完全アジュバンド（ＷＡＫＯ）と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降２週間後に同様の操作を行い、４回目には最終免疫としてＴＲＡＣＰ‐５ｂ ５０μｇ／ｍｌを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２で調製しマウス尾静脈注射により投与した。【００３５】
（３）ハイブリドーマの確立
最終免疫より３日後にＴＲＡＣＰ−５ｂにより感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）（ＭＥＲＫ）を用いて脾細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合した。その融合比率は脾臓細胞数８×１０７個に対して骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個で、４：１であった。融合細胞は１０％ ＦＣＳ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）ＨＡＴ（コスモバイオ）培地に分散し４８穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト）に分注して３７℃、５％ ＣＯ２条件にて培養した。以下の検討に用いたハイブリドーマ数は３０００であった。【００３６】
（４）スクリーニング
約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。
スクリーニング用プレートを作製するために上記（１）にて精製したＴＲＡＣＰ−５ｂを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２緩衝液中に溶解し、０．５μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に培養上清１００μｌを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３，３’５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）（カイノス）を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４５０ｎｍにて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローン（２９クローン）は限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チェックした。【００３７】
（５）抗体の確認
ＥＬＩＳＡによって精製ＴＲＡＣＰ−５ｂとの反応性を確認すると、上記２９クローン中クローンＴｒＫ−１２６、ＴｒＫ−１２７ではアフィニティーに差があったが、プレートと感度よく反応した。その結果、クローンＴｒＫ−１２６、ＴｒＫ−１２７をＴＲＡＣＰ−５ｂを認識したものとして選択した。得られた抗体をモノクローナル抗体タイピングキット（ＲＯＣＨＥ）にて検定した結果、以下の表１のような結果であった。
【表１】
0006037043.tif 000002
【００３８】
上記ハイブリドーマＴｒＫ−１２６及びＴｒＫ−１２７は、２０１４年６月６日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構内特許微生物寄託センターに対して受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８６６（ＴｒＫ−１２６）及びＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８６７（ＴｒＫ−１２７）で受領され、２０１４年６月２３日生存確認後、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８６６（ＴｒＫ−１２６）及びＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８６７（ＴｒＫ−１２７）が付与された（受託証２０１４年６月３０日発行）。
以下に、寄託を特定する内容を記載する。
［１］寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  製品評価技術基盤機構産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター
あて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）
［２］寄託日：２０１４年６月６日
［３］受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８６６（ハイブリドーマＴｒＫ−１２６）
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８６７（ハイブリドーマＴｒＫ−１２７）【００３９】
（６）モノクローナル抗体の作製及び精製
上記（５）で得られたハイブリドーマＴｒＫ−１２６、ＴｒＫ−１２７ １×１０７細胞個をプリスタン（シグマ アルドリッチ）０．５ｍｌ投与後２週間の、１０週齢、Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（日本クレア）に腹腔内投与し、約２週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。上記（４）のスクリーニングで行ったＥＬＩＳＡ法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安４０％で処理し、ＰＢＳに透析した後、プロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア）により精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。するとＴｒＫ−１２６、ＴｒＫ−１２７ともに非還元では分子量約１５０，０００に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約５０，０００のバンドと２５，０００の２本のバンドが確認された。精製された抗体はＴｒＫ−１２６、ＴｒＫ−１２７ともにマウス１匹あたり約１０ｍｇまたはそれ以上であって工業的利用を行うには十分量であった。【００４０】
（７）サンドイッチＥＬＩＳＡ測定法によるＴＲＡＣＰ−５ｂ測定と特異性検定
モノクローナル抗体ＴｒＫ−１２６，ＴｒＫ−１２７を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡ測定法によるＴＲＡＣＰ−５ｂ測定試薬を作製した。また、本測定法の特異性を調べるためにＮａｔｉｖｅ−ＴＲＡＣＰ−５ｂ、ＴＲＡＣＰ−５ａを用いて下記の実験を行い、公知のモノクローナル抗体ＴｒＫ−６２及びＴｒＫ−４９を用いたＴＲＡＣＰ−５ｂサンドイッチＥＬＩＳＡ測定法と比較した（日本特許第４１６４８０４号公報）。測定方法は以下のとおりである。
固相プレート（Ｎｕｎｃ）上にＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを利用して精製したモノクローナル抗体ＴｒＫ−１２６を２μｇ／ｗｅｌｌになるように分注し、４℃で２日間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）洗浄液にて３回洗浄した後、１．５％ＢＳＡ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を２００μＬ加えて４℃で一晩ブロッキングした。標識抗体は前出と同様の方法で精製したモノクローナル抗体ＴｒＫ−１２７をＨＲＰ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学）を用いて、ＡＬＰ標識した。ここで、標識抗体濃度は１μｇ／μｌとした。【００４１】
このようにして作製したプレートと標識抗体を使用し、サンドイッチＥＬＩＳＡ測定法によるＴＲＡＣＰ−５ｂ測定の有用性を評価した。具体的には、含有ＴＲＡＣＰ−５ｂを算出したヒト血清由来のＴＲＡＣＰ−５ｂ試料を５０μｌを抗体結合プレート上に加えた。室温で１時間反応させ、反応終了後、前出の洗浄液にて３回洗浄して１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した二次抗体を加えた。さらに室温で１時間反応させ、反応終了後、前出の洗浄液にて３回洗浄して１００μｌの３，３’５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）（カイノス）を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４５０ｎｍにて吸光度を測定した。【００４２】
測定の結果、本発明で得られた抗体を用いた測定系においてＴＲＡＣＰ−５ｂの濃度依存的に吸光度が上昇することを確認した（図１）。【００４３】
同様に、ヒト血清由来のＴＲＡＣＰ−５ｂのみ終濃度２５ｎｇ／ｍＬにあわせた試料、あるいはＴＲＡＣＰ−５ｂ及びＴＲＡＣＰ−５ａをそれぞれ終濃度２５ｎｇ／ｍＬにあわせた試料５０μｌを抗体結合プレート上に加えた。室温で１時間反応させ、反応終了後、前出の洗浄液にて３回洗浄して１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した二次抗体を加えた。さらに室温で１時間反応させ、反応終了後、前出の洗浄液にて３回洗浄して１００μｌの３，３’５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）（カイノス）を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４５０ｎｍにて吸光度を測定した。【００４４】
測定の結果、公知のＴＲＡＣＰ−５ｂサンドイッチＥＬＩＳＡ測定法（特許第４１６８０４号公報）はＮａｔｉｖｅ−ＴＲＡＣＰ−５ｂ、ＴＲＡＣＰ−５ａ共に反応性を示したがＴｒＫ−１２６，ＴｒＫ−１２７によるサンドイッチＥＬＩＳＡ測定法はＴＲＡＣＰ−５ｂ特異的に反応性を示すことが確認された（図２）。    【００４５】
（８）化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）によるＴＲＡＣＰ−５ｂ測定
モノクローナル抗体ＴｒＫ−１２６，ＴｒＫ−１２７を使用して、磁気ビーズを用いたＴＲＡＣＰ−５ｂ測定試薬を作製した。また、本測定法の特異性を調べるために公知の方法（特許第４１６８０４号公報）に用いられている抗体を同様の測定試薬を作製し、Ｎａｔｉｖｅ−ＴＲＡＣＰ−５ｂ、ＴＲＡＣＰ−５ａに対する反応性を比較した。測定方法は以下のとおりである。
５ｍｇのＴｒＫ−１２６またはＴｒＫ−６２をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）により磁気ビーズに感作させた。標識抗体として、２００μｇのＴｒＫ−１２７またはＴｒＫ−４９をＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学）を用いて、ＡＬＰ標識した。ここで、標識抗体濃度は１μｇ／μｌとした。【００４６】
上記で作成した磁気ビーズと標識抗体を使用し、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）によるＴＲＡＣＰ−５ｂ測定の有用性を評価した。具体的には、含有ＴＲＡＣＰ−５ｂを算出したヒト血清試料３０μｌに２μｇの抗体感作磁気ビーズに加え、約２０分撹拌した。磁石により磁気ビーズを集積させながら０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）洗浄液にて３回洗浄した後、ＡＬＰ標識抗体を１μｇ含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を加え約２０分撹拌した。磁石により磁気ビーズを集積させながら０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）洗浄液にて３回洗浄した後、ＡＬＰの基質であるＡＭＰＰＤ（和光純薬）を１００μｌ加えた。室温で約５分撹拌し、波長４７７ｎｍに発光極大を持つ光の発光量を測定した。【００４７】
測定の結果、本発明で得られた抗体を用いた測定系においてＴＲＡＣＰ−５ｂの濃度依存的に発光カウントが上昇することを確認した（図３）。【００４８】
同様にヒト血清由来のＴＲＡＣＰ−５ｂのみを終濃度２５ｎｇ／ｍＬにあわせた試料、あるいはＴＲＡＣＰ−５ｂ及びＴＲＡＣＰ−５ａをそれぞれ終濃度２５ｎｇ／ｍＬにあわせた試料３０μｌに２μｇの抗体感作磁気ビーズに加え、約２０分撹拌した。磁石により磁気ビーズを集積させながら０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）洗浄液にて３回洗浄した後、ＡＬＰ標識抗体を１μｇ含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を加え約２０分撹拌した。磁石により磁気ビーズを集積させながら０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）洗浄液にて３回洗浄した後、ＡＬＰの基質であるＡＭＰＰＤ（和光純薬）を１００μｌ加えた。室温で約５分撹拌し、波長４７７ｎｍに発光極大を持つ光の発光量を測定した。【００４９】
測定の結果、公知の測定法（日本特許登録番号４１６８０４）はＮａｔｉｖｅ−ＴＲＡＣＰ−５ｂ、ＴＲＡＣＰ−５ａ共に反応性を示したがＴｒＫ−１２６，ＴｒＫ−１２７によるサンドイッチＥＬＩＳＡ測定法はＴＲＡＣＰ−５ｂ特異的に反応性を示すことが確認された（図４）。【００５０】
（９）ラテックス凝集法によるＴＲＡＣＰ−５ｂ測定
モノクローナル抗体ＴｒＫ−１２６，ＴｒＫ−１２７を使用して、２種類のモノクローナル抗体をラテックスに感作し、ラテックス試薬を作製した。ラテックス試薬作製は下記のように行った。
１％ラテックス懸濁液２ｍＬと、０．１ｍｇ／ｍＬ ＴｒＫ−１２６及びＴｒＫ−１２７抗体溶液２ｍＬとを混合し、約１時間攪拌した。遠心後、沈殿を１％ＢＳＡ溶液に懸濁し、再度約１時間攪拌した。再び遠心後、沈殿をＰＢＳ溶液中に懸濁し、ラテックス試薬を得た。
上記で調製したラテックス試薬を用いて、ラテックス免疫凝集測定（ＬＡＴＥＸ測定）によりヒト血清中のＴＲＡＣＰ−５ｂを定量可能なことを確認した。【００５１】
具体的には、含有ＴＲＡＣＰ−５ｂを算出したヒト血清試料３５μｌに対しＴｒｉｓ緩衝液を含む第一試薬１００μｌ、作製したラテックス試薬を含む第二試薬１００μｌを反応させ、日立７１８０型自動分析装置を用いて、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて１９−３４測光ポイント間（第二試薬添加後約１分後から５分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。結果として、図５に示すように、ＴＲＡＣＰ−５ｂ濃度依存的な吸光度上昇が確認された。【００５２】
＜比較例１＞
ＴｒＫ−６２、ＴｒＫ−４９のエピトープの同定
（１）ペプチドスライドの作成（Ｒｅｐｌｉｔｏｐｅ）
ＮＣＢＩデータベースより取得したＡＣＰ５（ＴＲＡＣＰ−５）アミノ酸配列（配列番号１）及び文献にて報告されている各種修飾予想部位は図６の通りである。
２０〜３２５Ａ．Ａについて、JPT社ペプチドスライドサービス（Ｒｅｐｌｉｔｏｐｅ, フナコシhttp://www.funakoshi.co.jp/news/071201spdf/071201s_p24.pdf）にて、１０Ａ．Ａ．刻みのペプチドに分けてスポットを依頼した（表２；配列番号２〜６１）。
【表２】
0006037043.tif 000003
【００５３】
（２）ＲｅｐｌｉｔｏｐｅによるＴｒＫ−６２及びＴｒＫ−４９のエピトープ解析
作成したペプチドスライドを、ＴｒＫ−６２，ＴｒＫ−４９を用いてエピトープマッピングを行い、発色法により解析した（図７）。
具体的には、前記ペプチドスライドをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて室温で６０分間ブロッキング処理を行った。その後一次抗体としてＴｒＫ−６２またはＴｒＫ−４９を１μｇ／ｍＬの濃度にて、室温で６０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄後、ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）を０．５μｇ/ｍＬの濃度にて、室温で６０分間反応させた。再度ＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄後、ＨＲＰの発色基質である３，３’,  ５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）（カイノス）を加えた。一定時間のインキュベートの後、顕微鏡観察によりスポットの発色の程度を確認した。
解析の結果、ＴｒＫ−６２，ＴｒＫ−４９共に、ＴＲＡＣＰ−５ｂに特異的に存在する糖鎖の結合箇所付近にエピトープを有することが判り、これによりＴＲＡＣＰ−５ｂへの反応特異性を高めていると考えられた(図８)。【００５４】
＜実施例２＞
ＴｒＫ−１２６、ＴｒＫ−１２７のエピトープ解析
（１）ＲｅｐｌｉｔｏｐｅによるＴｒＫ−１２６及びＴｒＫ−１２７のエピトープ解析
以上の結果をふまえ、ＴｒＫ−１２６及びＴｒＫ−１２７のエピトープ解析を発光法により行った。  
具体的には、前記ペプチドスライドをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて室温で６０分間ブロッキング処理を行った。その後一次抗体としてＴｒＫ−１２６またはＴｒＫ−１２７を１μｇ／ｍＬの濃度にて、室温で６０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄後、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア）付属の二次抗体を添加し、室温で６０分間反応させた。再度ＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄後、キット付属の検出試薬を加えた。一定時間のインキュベートの後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（ＧＥヘルスケア）により、スポットの発光の程度を確認した。
解析の結果、ＴｒＫ−１２６及びＴｒＫ−１２７ともに各配列ペプチドとの反応性を示さなかった（図９）。そこで次に、これらの２抗体を用いてドットブロット解析及びウェスタンブロット解析を行った。【００５５】
（２）ウェスタンブロット法、ドットブロット法による反応性確認
（２−１）ドットブロット法による反応性確認
精製したＴＲＡＣＰ−５ｂを１．０μｇＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）へ滴下し、１時間ブロッキングを行った。次にＴｒＫ−１２６及びＴｒＫ−１２７（抗体濃度５μｇ／ｍｌ含むＰＢＳ−Ｔ）をそれぞれ転写したメンブレンに１時間反応させた。反応後、メンブレンをＰＢＳ−Ｔにて洗浄し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ）を、それぞれ３０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、メンブレン用ＴＭＢ溶液（和光純薬工業）にて検出を行なった（図１０）。
（２−２）ウェスタンブロット法による反応性確認
精製したＴＲＡＣＰ−５ｂを１．０μｇ、２．０μｇ非還元下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）へ転写し、１時間ブロッキングを行った。その後（２−１）に記載された同様の手法にて反応、検出を行った（図１１）。【００５６】
解析の結果、ＴｒＫ−１２６及びＴｒＫ−１２７ともにドットブロット法によるＴＲＡＣＰ−５ｂとの反応性が確認された一方、ウェスタンブロット法ではともに検出されなかった。これらの結果から、ＴｒＫ−１２６及びＴｒＫ−１２７はＴＲＡＣＰ−５ｂのネイティブな立体構造を認識し、そのエピトープは線状に並んだ一次構造から形成されるエピトープではなく、ＴＲＡＣＰ−５ｂの立体構造に依存したエピトープを認識する抗体であると考えられた。【００５７】
一次構造上相同性の高いＴＲＡＣＰ−５ａとＴＲＡＣＰ−５ｂであるが、その立体構造は大きく異なる。それ故、ＴＲＡＣＰ−５ｂの立体構造に依存したエピトープを認識する抗体は、公知の測定法（日本特許登録番号４１６８０４）記載のＴｒＫ−６２，ＴｒＫ−４９（そのエピトープの一次構造はＴＲＡＣＰ−５ａにも存在する）に較べて、ＴＲＡＣＰ−５ｂ特異的結合性が増していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上に詳細に説明した通り、本発明の免疫測定法では、測定対象目的物質（ＴＲＡＣＰ−５ｂ）に対して反応性及び選択性の高い抗体を組み合わせて使用することで反応系中の競合物質の影響を除き、目的物質を特異的に精密測定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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