(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする子宮頸癌細胞増殖抑制剤。
【化１】
0006037969.tif 000005
【請求項２】
式（Ｉ）におけるｎが４である式（ＩＩ）で表される５−（３，４，５トリハイドロキシフェニル）吉草酸である請求項１記載の子宮頸癌細胞増殖抑制剤。
【化２】
0006037969.tif 000006
【請求項３】
請求項１または２に記載の子宮頸癌細胞増殖抑制剤を有効成分とする子宮頸癌の予防および／または治療剤。
【請求項４】
外用剤であることを特徴とする請求項３記載の子宮頸癌の予防および治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茶カテキン由来の代謝物質を有効成分とする新しい子宮頸癌細胞増殖抑制剤に関するものであり、更に詳細には式（ＩＩ）記載の５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄを有効成分とすることを特徴とした子宮頸癌細胞増殖抑制剤並びにそれらを含有し、子宮頸癌の予防もしくは改善のために用いられる治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌（悪性腫瘍）は、日本人の死因別死亡率の第１位である。平成２２年１年間の癌による死亡者数は３５万３４９９人であり、総死亡数の２９．５％をも占めていることが報告されている。また、癌の発生には、遺伝的要因や環境要因など様々な要因が考えられており、特に近年では、喫煙や飲酒、食事などの生活習慣と発癌との関連性が強く指摘されている。
【０００３】
子宮癌は女性にとって最も普遍的に起こる悪性腫瘍の一つであり、子宮の入り口に発生する子宮頸癌と子宮内部に発生する子宮体癌とに大きく分けられる。特に近年では、３９歳以下における罹患者数が増加傾向にあり、この場合進行が早く悪性度も高い。子宮癌の初期症状には不正出血、下腹部痛等があり、癌が進行して骨盤にまで達すると、神経圧迫をきたして腰痛が起こり、場合によっては死に至ることが報告されている。
【０００４】
子宮頸癌の治療には、外科療法、化学療法、放射療法があり、子宮頸癌が遠隔転移等のために切除しきれない場合や手術後に癌が再発した場合には、化学療法による治療が行われる。子宮頸癌の化学療法で一般的に使用される抗癌剤として、例えば、パクリタキセル、シスプラチン、イリノテカン等が挙げられる。これら抗癌剤を用いた化学療法では白血球減少による免疫力の低下等が伴いやすく、副作用のない有効な抗癌剤が求められている。
【０００５】
植物ポリフェノールの一種である茶由来のカテキン類には、抗菌、抗ウイルス、抗酸化、抗う蝕、抗突然変異、血小板凝集抑制、血中コレステロール低下、血糖上昇抑制、抗アレルギー、消臭作用など、非常に広範な生理活性があることが知られており、様々な分野で利用されている。
また、カテキン類を経口摂取した後の生体内動態に関する研究も広く行われている。カテキン類は優れた生体調節作用をもつものの、生体内への吸収量（生体利用率）は非常に低いと考えられており、近年ではカテキン類自体よりも、腸内細菌により分解されて生じた代謝物が主に生体内へ吸収されると考えられている。実際にラットや人に茶を経口投与した試験では、尿中には５−フェニル−γ−バレロラクトンやフェニル酢酸などが検出されることが報告されている（非特許文献１、２、３、４）。
腸内細菌によるカテキン類の分解に関しては多く報告されている。カテキン類は腸内細菌により、主に５−フェニル−γ−バレロラクトン（５−ｐｈｅｎｙｌ−γ−ｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ）や４−ハイドロキシ−５−フェニル吉草酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｐｈｅｎｙｌ−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）に変換され、さらには５−フェニル吉草酸（５−ｐｈｅｎｙｌ−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、３−フェニルプロピオン酸（３−ｐｈｅｎｙｌ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、フェニル酢酸(ｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、安息香酸（ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）などに変換する（非特許文献５、６、７）。このようにカテキンは微生物分解を受けやすいことから、経口摂取後に生体内に吸収されるのは、カテキン類よりも微生物分解により生成した代謝物である可能性の方が高いと考えられている。
カテキン代謝物の生体内での機能性に関する知見としては、上記に示した５−フェニル−γ−バレロラクトンおよび５−フェニル−４−ハイドロキシ吉草酸の血圧上昇抑制作用、５−（３，４，−ジハイドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの抗炎症作用、５−（３，４，５−トリハイドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの食道扁平上皮癌細胞、ヒト結腸腺癌細胞に対する増殖抑制効果および抗炎症作用などが報告されている（特許文献１、非特許文献８、非特許文献９）。しかしながら、子宮頸癌細胞に対する効果については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−１４４５３２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．,４９，  ４１０２−４１１２，２００１．
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１３，  １７７−１８４，２０００.
【非特許文献３】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．,５１，５５６１−５５６６  ２００３．
【非特許文献４】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５１，６８９３−６８９８  ２００３.
【非特許文献５】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．, ５８,   １３１３−１３２１, ２０１０.
【非特許文献６】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．, ５８,   １２９６−１３０４, ２０１０.
【非特許文献７】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．,４５，  ８８８−８９３，１９９７.
【非特許文献８】Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３６，８１１−８２２，２００４．
【非特許文献９】Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．,１５，  ８７３−８７６，２００５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、カテキン代謝物の新たな機能性を利用した子宮頸癌細胞増殖抑制剤を提供するとともに、それを含有した予防および／または治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、主なカテキン類の代謝物として報告のある式（I）記載の化合物の生理活性作用を検討した。その結果、このカテキン代謝物には、ヒト子宮頸癌細胞モデルであるＨｅＬａ細胞増殖抑制効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。カテキン代謝物が子宮頸癌細胞増殖抑制効果をもつことは、これまでに報告された例はなく、全く新しい知見である。
【００１０】
すなわち、本願請求項１記載の発明は、式（I）で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする子宮頸癌細胞増殖抑制剤である。
【化１】
0006037969.tif 000002
【００１１】
本願請求項２の発明は、式（Ｉ）におけるｎが４である５−（３，４，５トリハイドロキシフェニル）吉草酸で表される請求項1記載の子宮頸癌細胞増殖抑制剤である。
【化２】
0006037969.tif 000003
さらに本願請求項３の発明は、請求項１または２記載の子宮頸癌細胞増殖抑制剤を有効成分とする子宮頸癌の予防および／または治療剤である。
請求項４記載の本願発明は、外用剤であることを特徴とする請求項３記載の子宮頸癌の予防および／または治療剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明はカテキン代謝物である式（I）記載の化合物を有効成分とした新しい子宮頸癌細胞増殖抑制剤を提供するものである。また、本発明は医薬品などに幅広く応用出来る汎用性の高いものであり、子宮頸癌の予防および／または治療につなげることができる。なお、カテキン代謝物は茶の長い食経験に基づき、副作用を起こす可能性が低い化合物と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ、および５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄのヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）の増殖阻害活性を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明におけるカテキン代謝物は、公知の有機化学合成法（非特許文献１０、１１、１２）を組み合わせることにより得ることができる。また腸内細菌による微生物変換法により製造することも可能である（非特許文献５、６、７）。
【００１５】
【非特許文献１０】Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．,８９，４，ｐｐ８６３−９２７，１９８９．
【非特許文献１１】有機合成化学会誌，５９，２，１０９−１２０，２００１．
【非特許文献１２】Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．３４６，１１１−１２４，２００４．
【００１６】
上記の有機化学合成法や微生物変換法により得られるカテキン代謝物は、医薬上許容しうる規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば、粗精製物であってもよく、さらに得られた合成物や抽出物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせて純度を上げても良い。
【００１７】
有機合成方法によって該目的化合物を製造する場合、種々の既知精製手段を選択し、組み合わせて行うことができる。例えばアルコール等の極性溶媒、または非極性溶媒を用いて行う溶剤抽出方法や、遠心分離、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等の精製手段が挙げられる。
【００１８】
微生物変換によりカテキン代謝物を製造する場合、ラットやヒトの腸内細菌を含む糞や盲腸内容物を培養して腸内細菌を増殖させた後、この培養菌体を緩衝液、生理食塩水、水などに懸濁させた溶液に出発原料（基質）となるカテキン類を加え嫌気条件でインキュベーション処理を行うことでカテキン代謝物を製造することが出来る。
【００１９】
前記に示した微生物を培養する場合には、該微生物が生育できる栄養源含有培地に接種し、嫌気的条件下で培養する。培養菌体を得るための微生物の培養および基質存在下での微生物の培養は、一般的な嫌気性微生物の培養方法を採用することができる。また、培養菌体を集菌した後、前記基質の存在下でインキュベーション処理する場合にも、嫌気条件下で行うことが望ましい。培養に用いられる培地としては、前記微生物が生育できる培地であれば特に限定されないが、例を挙げればＧＡＭブイヨン（日水製薬（株）製）などが利用可能である。
培養条件は、前記微生物が生育しうる範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ６．０〜７．５、３５〜４０℃であり、好ましくはｐＨ６．５〜７．３、３７〜３９℃である。培養時間は通常２４〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間である。上述した各種の培養条件は、使用する微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、最適条件を選択することができる。
【００２０】
また、微生物変換によりカテキン代謝物を製造する場合、調製時には数種類のカテキン代謝物を含む抽出物が得られるが、精製を重ねることで高純度の茶カテキン代謝物を得ることが出来る。有機合成方法と同様に種々の既知精製手段を選択し、組み合わせて行うことで所望する純度が得られる。例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ブタノールなどを用いた溶媒抽出、合成樹脂吸着剤の脱吸着を利用する方法、シリカゲルなどのカラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを単独あるいは適宜組み合わせて分離・精製することで、抽出物中の茶カテキン代謝物の含有率を調節することが出来る。
【００２１】
本発明で得られる化合物又はカテキン代謝物は、必要に応じて無機塩基もしくは有機塩基との塩を形成させることができるが、薬学的に許容される塩が好ましい。本発明で得られる化合物又はカテキン代謝物の塩の形成に適した無機塩基は、例えば、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩および重炭酸塩等である。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンのようなモノ―、ジ―、およびトリ―アルキルアミン塩、モノ―、ジ―およびトリ―ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、Ｎ―メチルグルコサミン塩等を挙げる事ができる。
【００２２】
本発明の子宮頸癌細胞増殖抑制剤は利用の形態は限定されないが、外用剤にして子宮頸癌の予防および／または治療剤として用いてもよい。本発明において、外用剤とは、日本薬局方に収められている医薬品で飲用しないものであれば特に限定されるものではなく、上記有効成分に薬学的に許容される担体を添加して、外用の製剤とすることが出来る。製剤形態としては、液剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、テープ剤、パッチ剤、エアゾール剤などが挙げられ、皮膚表面や粘膜などから体内へ吸収されるものであれば、どのような形態でもよい。
【００２３】
本発明の子宮頸癌細胞増殖抑制剤、あるいは子宮頸癌の予防および／または治療剤は、各種ビタミン剤（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥなど）と併用して利用することが可能である。
【００２４】
医薬部外品としては厚生労働大臣が指定した医薬部外品で飲用しないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、液剤、テープ剤、ビタミン含有保健剤などが挙げられる。
【実施例１】
【００２５】
以下に、製造例、試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
製造例１：微生物変換による５−（３，４，５トリハイドロキシフェニル）吉草酸［５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ］の製造方法
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（♂、日本チャールスリバー株式会社）３匹から糞便（３．６ｇ）を採取し、ＧＡＭブイヨン（組成（１Ｌ中）：ペプトン１０ｇ、ダイズペプトン３ｇ、プロテオーゼペプトン１０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、溶性デンプン５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１、日水製薬（株）製）５００ｍｌに入れ、３７℃で２日間嫌気培養を行った。次いで、この培養液を滅菌済みの遠心管に入れ、９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。上清を捨て、菌体に２００ｍｌの滅菌水を加えて菌体を洗浄した後、再度遠心分離を行った。得られた菌体を２００ｍｇのエピガロカテキン（ＥＧＣ）を含む１５０ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁させ、３７℃の嫌気条件下でインキュベーションした。培養２日目に培溶液５０ｍｌを回収し、２Ｍ塩酸水を２．５ｍｌ加えｐＨ５．５に調整し、一旦冷凍保存を行った。また培養４日後に残りの培溶液１００ｍｌに２Ｍ塩酸水を５ｍｌ加えｐＨ５．５に調整した。これらの培養液を合わせて、高速遠心分離（１５０００×ｇ、２０分）に供し、菌体を除去した。次いで、１００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行った後、酢酸エチル相を合わせてエバポレーターに供して有機溶媒を除去し、乾固させた。乾固物を１０％メタノール水溶液で溶解し、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。
【００２７】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０×１５０ｍｍ、５μｍ、（株)資生堂製）、流速：９．８ｍｌ/分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；メタノール：水：酢酸（１０：９０：１  容量比（v/v/v））、溶媒Ｂ；メタノール：酢酸（１００：１  容量比（v/v））、グラジエント；０分：Ａ９５％  Ｂ５％、３０分：Ａ６０％  Ｂ４０％、４０分：Ａ２０％  Ｂ８０％、４３分：Ａ１０％  Ｂ９０％、４５分：Ａ９５％  Ｂ５％、検出器：ＵＶ２３０ｎｍとした。
分画したフラクションをそれぞれＬＣ／ＭＳ分析に供し、代謝物の含まれる画分を確認した。ＬＣ／ＭＳ分析条件を以下に記載する。
【００２８】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧ（２．０×１００．０ｍｍ、５μｍ 、(株)資生堂製）、カラム温度：４０℃、流速：０．２ｍｌ／分、移動相Ａ（水／アセトニトリル／酢酸＝１００／２．５／０．１  容量比(ｖ／ｖ／ｖ))、Ｂ（水／アセトニトリル／メタノール／酢酸＝５０／２．５／５０／０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント：０−２分  アイソクラティック  Ａ１００％、２−２５分  リニアグラジエント  Ａ  １００−０％、Ｂ０−１００％、２５．１−３３分  アイソクラティック  Ａ１００％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍ、インターフェース：ＥＳＩ、ポラリティ：ネガティブ
【００２９】
ＬＣ／ＭＳ分析の結果から、代謝物が含まれる画分を確認し、エバポレーターで濃縮乾固した。乾固物に５ｍｌの純水を加えて溶解し、再度減圧下で濃縮乾固した。この操作を３回繰り返し行い、有機溶媒相に含まれていた酸を完全に除去した。乾固物に少量の純水を加えて溶解し、凍結乾燥に供した。これにより５−（３，４，５−トリハイドロキシフェニル）−吉草酸［５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ］：１５ｍｇ（ＨＰＬＣ面積百分率９８．０％以上）を得た。
【００３０】
製造例２：有機合成方法による５−（３，４，５トリハイドロキシフェニル）吉草酸［５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ］の製造方法
５ｍｌのジクロロメタンに９５０．５ｍｇの３，４，５−トリベンジルオキシベンジルアルコール［３，４，５−ｔｒｉｂｅｎｚｙｌｏｘｙｂｅｎｚｙｌａｌｃｏｈｏｌ］と１．４ｇのデス−マーチンペルヨージナン［Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ］を加え、室温で３時間攪拌した。その後、５ｍｌの５％チオ硫酸ナトリウム溶液を加えて３０分間攪拌し、２０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル相を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和食塩水の順で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後ろ過し、ろ液をエバポレーターで減圧濃縮することで、３，４，５−トリベンジルオキシベンズアルデヒド［３，４，５−ｔｒｉｂｅｎｚｙｌｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ］を８５１ｍｇ得た。
【００３１】
次に、２０ｍｌのテトラヒドロフランに[３−(エトキシカルボニル)プロピル]−トリフェニルホスホニウムブロミド［［３−（ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］―ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ］を加えてアルゴン置換し、氷冷下で２０分間攪拌した。その後、１．１ｍｌのナトリウムビス(トリメチルシリル)アミド［Ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ａｍｉｄｅ］のテトラヒドロフラン溶液を加え、氷冷下にて１時間攪拌した。さらに、３，４，５−トリベンジルオキシベンズアルデヒド［３，４，５−ｔｒｉｂｅｎｚｙｌｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ］のテトラヒドロフラン溶液（１７０．２ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｌ加え、室温で２日間攪拌した。攪拌後、３０ｍｌの飽和塩化アンモニウム水を加え、５０ｍｌのジエチルエーテルで抽出した。得られたジエチルエーテル相を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和食塩水の順で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後ろ過し、ろ液をエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮液をヘキサン／ジエチルエーテル＝１５０／５０（ｖ／ｖ）混合溶液を加えて４℃で一晩放置した後ろ過し、得られたろ液を再度減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、Ｅｔｈｙｌ（Ｚ）−５−（３，４，５−ｔｒｉｂｅｎｚｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−ｐｅｎｔｅｎｏａｔｅを９４２ｍｇ得た。
【００３２】
得られたＥｔｈｙｌ（Ｚ）−５−（３，４，５−ｔｒｉｂｅｎｚｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−ｐｅｎｔｅｎｏａｔｅの全量を２ｍｌのメタノールと２ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させ、２ｍｌの３Ｍ水酸化カリウム溶液を加えて室温で５時間攪拌した。次に、２Ｍ塩酸を加えて溶液をｐＨ４．０に調整し、２０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル相を水、飽和食塩水の順で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後ろ過した。ろ液をエバポレーターで減圧濃縮し、（Ｚ）−５−（３，４，５−ｔｒｉｂｅｎｚｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄを７１３ｍｇ得た。
【００３３】
得られた（Ｚ）−５−（３，４，５−ｔｒｉｂｅｎｚｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄの全量を８ｍｌの酢酸エチルに溶解させ、基質溶液を調製した。基質溶液に６００．７ｍｇのパラジウムカーボン（１０ｗｔ％含水品）［Ｐａｌｌａｄｉｕｍ，１０ｗｔ％（ｄｒｙ），ｏｎ  ｃａｒｂｏｎ  ｐｏｗｄｅｒ，ｗｅｔ］を加えてアルゴン置換し、水素ガス供給下、室温で６時間攪拌させた。その後、反応液をろ過し、ろ液をエバポレーターで減圧濃縮した。得られた濃縮液をアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解し、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。
【００３４】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０×１５０ｍｍ、５μｍ、（株)資生堂製）、流速：９．５ｍｌ/分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ/ｖ/ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１  容量比（ｖ/ｖ/ｖ））、グラジエント；０分：Ａ９０％  Ｂ１０％、３分：Ａ９０％  Ｂ１０％、１５分：Ａ０％  Ｂ１００％、２０分：Ａ０％  Ｂ１００％、２１分：Ａ９０％  Ｂ１０％、２６分：Ａ９０％  Ｂ１０％、検出器：ＵＶ２８０ｎｍとした。
【００３５】
分画したフラクションを再度減圧濃縮し、５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄを３３１．７ｍｇ得た。
【００３６】
得られた精製物を１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、以下のケミカルシフトが得られ、目的の化合物であることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ６．２３（２Ｈ，ｓ），２．４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），１．５９（４Ｈ，ｍ）
【００３７】
試験例：５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄの子宮頸癌細胞増殖阻害活性試験
以下に子宮頸癌細胞増殖阻害活性試験について説明する。
試験に供した５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄは製造例１〜２記載の方法により調製したものを使用した。
本試験に用いた細胞は、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）である。培地は、牛胎児血清１０％（ｖ／ｖ）を含むダルベッコ変法イーグル培地に２μｇ／ｍｌのｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ、２μｇ/ｍｌのａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｉｃｏｔｉｃ、０．３Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、２Ｎ塩酸でｐＨ７．０−７．４に調整したものを用いた。培養は、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で行った。
本試験における培養は、９６穴マイクロプレートで行った。各ウエルに２．０×１０３個の細胞を植え込み、２４時間前培養した。次に、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で溶解した５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄを、最終濃度が１００、２０、４．０、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４、０．００１２８μｇ／ｍｌとなるように加えた。ポジティブコントロールにはＡｄｒｉａｍｙｃｉｎを用い、最終濃度が１０、２．０、０．４、０．０８、０．０１６、０．００３２、０．０００６４μｇ／ｍｌとなるように加えた。また、本試験では１つの試験濃度に３ウエルずつ与え行った。
５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄを添加した後は、５％ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で７２時間培養した。培養後、１ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）食塩水を５０μｌ添加し、同条件下でさらに３時間培養した。その後、マイクロプレートを遠心分離して上清を除去し、回収した細胞を１５０μｌのＤＭＳＯに溶解させ、各試験区の細胞生存率を測定した。測定した結果をグラフにプロットし、指数近似による近似曲線を作成し、そこからＩＣ５０値を算出した。なお、５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄと類似構造を持つカテキン代謝物である４−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄおよび５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−γ―ｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅは特許文献２の方法で調製し、上記の方法でヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）の増殖阻害活性を調べた。
【００３８】
【特許文献２】特開２０１１−８７４８６号公報
【００３９】
【表１】
0006037969.tif 000004
【００４０】
表１に示すように、供試したカテキン代謝物においてヒト子宮頸癌細胞増殖抑制効果が確認された。５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄのヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）の増殖抑制効果はＩＣ５０値で５．５８μＭであった。一方、同じカテキン代謝物であり類似構造を有する４−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄおよび５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−γ―ｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅのヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）の増殖抑制効果はＩＣ５０値で５０μＭ以上であることから、本発明の代謝物は少なくとも８倍以上の効果を有することが分かった。
【実施例２】
【００４１】
製造例：皮膚外用液剤
本製造例は、皮膚外用液剤の製造例であり、組成および配合比は次のとおりである。
【００４２】
組成 配合比（重量％）
５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ  ５．０％
グリセリン ５．０％
プロピレングリコール ４．０％
オレイルアルコール ０．１％
エタノール ０．１％
安息香酸 ０．０５％
精製水 残量
計 １００．０％
【００４３】
皮膚外用液剤の調製は次のようにして行った。すなわち、精製水に５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ（製造例２）、グリセリン、プロピレングリコールを加え溶解した。一方、エタノールにオレイルアルコール、安息香酸を室温で溶解した。これを精製水部に加えて可溶化し、濾過後、充填した。
【００４４】
製造例：軟膏
本製造例は、軟膏の製造例であり、組成および配合比は次のとおりである。
【００４５】
組成 配合比（重量％）
５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ ３．０％
ハッカ油 ０．５％
ティーツリー油 ０．３％
ワセリン ２５．０％
ステアリルアルコール ２０．０％
プロピレングリコール １２．０％
ＰＯＥ硬化ヒマシ油 ４．２％
モノステアリン酸グリセリン １．０％
プロピルパラベン ０．１％
メチルパラベン ０．１％
精製水 残量
計 １００．０％
【００４６】
軟膏の調製は次のようにして行った。すなわち、精製水に上記の成分を湯浴上で加温融解させて混合した後、混合物を室温に冷却し、５−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄを含有する軟膏を得た。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明におけるカテキン代謝物は子宮頸癌細胞の増殖を抑制することから、子宮頸癌の予防および／または治療剤として医薬品や医薬部外品などで利用することが出来るものである。
【図１】
0006037969.tif 000007