【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年4月4日(2011.4.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】治療薬
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、アドレノモジュリン仲介シグナル伝達に関連する細胞表面ポリペプチドに基づく治療薬及び治療薬を同定するスクリーニングアッセイに関する。
【０００２】
背景技術
細胞シグナル伝達は生存にとって重要であり、それが無いと、物理的又は化学的に単離された細胞はアポトーシスを受ける。癌細胞においては多くの接触依存的プロセスが異常となっているが、腫瘍の８０％における細胞の生存にはアドレノメデュリン媒介シグナル伝達が必須であることがわかっている。多くのホルモン及びサイトカインが特異的受容体に結合するが、アドレノメデュリン（ＡＭ））はカルシトニン受容体様受容体として知られた受容体を介して作用する。
【０００３】
カルシトニン生物活性ペプチドは、カルシトニン、アミリン、２つのカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ１及びＣＧＲＰ２）、及びアドレノメデュリン（ＡＭ）を含む。カルシトニンは、３２アミノ酸のペプチドであり、哺乳動物及び多くの非哺乳動物の甲状腺の傍濾胞「Ｃ」細胞に見出される。カルシトニンは、ミネラル（カルシウム及びリン酸塩）バランスを調節する。カルシトニンは、破骨細胞誘発性の骨吸収の阻害剤として作用することにより高カルシウム血症を引き起こす。ＣＧＲＰは、カルシトニン遺伝子の組織特異的プロセッシングによって生成される３７アミノ酸である。カルシトニンは、甲状腺の主要産物であるが、ＣＧＲＰは神経組織の主要産物である。ＣＧＲＰは、潜在的な心臓血管薬であり、アミリンに類似する構造を有する。ＣＧＲＰは２ｔｕｎｏアイソフォーム（ＣＧＲＰ−Ｉ及びＣＧＲＰ−ＩＩ）が見出され、これらは３アミノ酸が相違するのみである。
【０００４】
アドレノメデュリン（ＡＭ）は、５２アミノ酸の降圧ペプチドである。それはＣＧＲＰ及びアミリンと構造的な類似性を有している。ＡＭは、末梢組織、副腎髄質、肺、及び腎臓で生成され、虚血において調節されない。ＡＭの受容体は多くの組織、例えば、中枢神経系の星状細胞、眼の虹彩筋肉、骨、血管、心臓、腎臓及び皮膚に存在する（Ｕｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  ＥＥｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００５  Ａｕｇ；３２  （８）：６７５−８０；  Ｓｕｍａｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ．  ２００５  ＪｕＩ  １５；１０６（２）：５３４−４１；  Ｃｏｒｎｉｓｈ  Ｊ，  Ｒｅｉｄ  Ｊ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．  ２００１  Ｓｅｐ；２（ｌ）：  １５−２４；  Ｙｏｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｇｕｌ．  Ｐｅｐｔ．  ２００５  Ａｐｒ  １５；１２７（ｌ−３）：２３９−４４；  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  ２００４  Ｄｅｃ；８（４）：３１６−２１；  Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００３  Ｊａｎ；１４８（ｌ）：３０−８）。一般に、カルシトニンファミリーのペプチドは、ジスルフィドを含む６−７アミノ酸のＮ末端環構造及びアミド化されたＣ末端を有する。
【０００５】
カルシトニンファミリーのペプチドは、Ｇ−タンパク連結型膜レセプター（ＧＲＣＲｓ）を介して作用する。カルシトニンレセプターの遺伝子はクローニングされている。それは、ファミリー「Ｂ」においてＧＰＣＲｓとホモログであり、典型的には調節ペプチド（セクレチン、グルカゴン、ＶＩＰ）を認識する。カルシトニン受容体のホモログ、カルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ、ＣＬとしても知られる）が同定され（ヒト４６１アミノ酸、ラット／マウス４６３アミノ酸）、カルシトニン受容体と５５％の相同性を有している（Ｎｊｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｓｃｉ．  ８５，  ３８５−３８８  （１９９３）；  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  １１，  １１８７−１１９５  （１９９３）；  Ｆｌｕｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｕｎ．  ２０６，  ３４１−３４７  （１９９５）；  Ｋａｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  ２５３４４−  ２５３４７  （１９９５））。ＧＰＣＲのファミリー「Ａ］クラスの２つの関連するメンバー、ＲＤＣ１及びＧ１ＯＤは、各々ＣＧＲＰ及びＡＭの受容体として同定された。
【０００６】
唯一、ＣＲＬＲは、ＡＭに対する応答においてシグナルを変換できず、ＣＲＬＲのリガンド特異性、結合及び活性化を誘発するためにＲＡＭＰ（レセプター活性変調タンパク質）の存在が必要とされるからである。ＲＡＭＰは、小さな固有の膜タンパク質のファミリーであり、１４，０００〜１７，００００Ｋｄの推定サイズを持つ。ＲＡＭＰは約１２０アミノ酸から構成され、およそ１００アミノ酸の大きな細胞外ドメイン、１つの膜スパンニングドメイン、及び約１０アミノ酸の短い細胞内領域を有する。
【０００７】
ＣＲＬＲは、ＲＡＭＰファミリー、ＲＡＭＰ１−３のどのメンバーが発現されるかによって、ＣＧＲＰレセプター又はＡＭレセプターのいずれかとして作用しうることが示された。ＲＡＭＰ１、２及び３は、Ｎ末端シグナルペプチド、細胞外Ｎ末端、Ｃ末端近傍の単一の膜貫通ドメイン、及び細胞質Ｃ末端、を含む。ＲＡＭＰ１−３は３１％の同一性を示す。ＲＡＭＰ−２及びＲＡＭＰ−３は、約３０％の同一性を有する。ＲＡＭＰｓはＣＲＬＲの原形質膜への輸送に関連している可能性がある。
【０００８】
ＲＡＭＰファミリーの３つのメンバー、ＲＡＭＰ１、２及び３は、ＣＲＬＲの異なるリガンド特異性を生じさせる。即ち：
ＲＡＭＰ  ｌ  ＋  ＣＲＬＲ  ＝  ＣＧＲＰ受容体
ＲＡＭＰ２  ＋  ＣＲＬＲ  ＝  ＡＭ  受容体
ＲＡＭＰ３  ＋  ＣＲＬＲ  ＝  ＡＭ受容体
である。
ＲＡＭＰ１は、原形質膜においてＣＲＬＲを末端グリコシル化、成熟糖タンパク質及びＣＧＲＰ受容体として表現するが、ＴＡＭＰ−２及び３はＣＲＬＲを未成熟な中心グリコシル化ＡＤＭ受容体として表現する（ＭｃＬａｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。
本発明は、ＲＡＭＰ−ＣＬＲＬ相互作用に影響する能力を有する治療薬の同定に関する。そのような薬剤は、特に、癌治療のターゲットである。
【０００９】
発明の概要
本発明の第一の態様では、（ｉ）ＲＡＭＰ−３、（ｉｉ）ＲＡＭＰ−２及び（ｉｉｉ）ＲＡＭＰ−１タンパク質から選択される１又は複数のＲＡＭＰタンパク質（受容体活性調節タンパク質）のカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）と結合、及び／又は影響を調節することができる薬剤が提供される。
【００１０】
一実施態様では、薬剤はＲＡＭＰタンパク質の細胞外ドメインと結合する。特別な実施態様では、ＲＡＭＰタンパク質はヒトＲＡＭＰタンパク質である。特に、薬剤はＲＡＭＰ−３とＣＲＬＲとの相互作用を調節することができる。
【００１１】
一実施態様では、本発明の薬剤は、
（ａ）図３に示されるヒトＲＡＭＰ−３タンパク質の位置１から位置３１の連続するアミノ酸配列に含まれる連続するアミノ酸残基の配列を含む１から３１アミノ酸残基のペプチド部分、
（ｂ）図３に示されるヒトＲＡＭＰ−３タンパク質の位置３２から位置４６の連続するアミノ酸配列に含まれる連続するアミノ酸残基の配列を含む１から１５アミノ酸残基のペプチド部分、及び
（ｃ）図３に示されるヒトＲＡＭＰ−３タンパク質の位置４７から位置９９の連続するアミノ酸配列に含まれる連続するアミノ酸残基の配列を含む１から５３アミノ酸残基のペプチド部分、
から選択される少なくとも１つのリガンドと結合する。
【００１２】
一実施態様では、薬剤は、
（ａ）図３に示されるヒトＲＡＭＰ−３タンパク質の位置１から位置３２の連続するアミノ酸配列に含まれる連続するアミノ酸残基の配列を含む１から３２アミノ酸残基のペプチド部分、
（ｂ）図３に示されるヒトＲＡＭＰ−３タンパク質の位置３３から位置４６の連続するアミノ酸配列に含まれる連続するアミノ酸残基の配列を含む１から１４アミノ酸残基のペプチド部分、及び
（ｃ）図３に示されるヒトＲＡＭＰ−３タンパク質の位置４７から位置９９の連続するアミノ酸配列に含まれる連続するアミノ酸残基の配列を含む１から５３アミノ酸残基のペプチド部分、
から選択される少なくとも１つのリガンドと結合する。
【００１３】
典型的には、ペプチド部分は５から１５アミノ酸長の間である。ペプチド部分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、互いに独立して、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４アミノ酸残基を持つことができる。それらは、５から１３、５から１１又は５から９残基、例えば１３アミノ酸残基、１１アミノ酸残基又は９アミノ酸残基を持つことができる。また、ペプチド部分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が（互いに独立して）、５、６、７、８、１０、１２、１４又は１５アミノ酸残基を持つものも本発明の範囲内である。ペプチド部分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）について、より大きなアミノ酸残基の数も可能であり、１７、１８、１９、２０、２５間３０残基を含む。ペプチド部分（ｃ）は、より大きな数のアミノ酸残基を持つことができ、例えば、３１、３２、３５、４０、４５、５０及び５３アミノ酸残基を含む。本発明の薬剤は、本明細書に記載したペプチド部分の少なくとも一つを含むエピトープに結合しうる。
【００１４】
ペプチド部分（ｂ）は、推定ＣＲＬＲ結合ドメインの全部又は一部を含み得る。薬剤は、ヒトカスパーゼ−３及びヒトカルパイン−１を用いてＲＡＭＰ−３細胞外ドメインを酵素消化することによって生成されるヒトＲＡＭＰ−３の断片に結合しうる。
また、
（ａ）次のアミノ酸配列：ＧＣＰＲＡＧＧＣＮＥ  ＴＧＭＬＥＲＬＰＬＣ  ＧＫＡＦＡＤＭＭＧＫ  ＶＤＶＷＫＷＣＮＬに含まれる連続配列を含む１から１５のアミノ酸残基のペプチド部分；及び
（ｂ）次のアミノ酸配列：ＥＳＦＴ  ＮＣＴＥＭＥＡＮＷ  ＧＣＹＷＰＮＰＬＡＱ  ＧＦＩＴＧＩＨＲＱＦ  ＦＳＮＣＴＶＤＲＶＨ  ＬＥＤＰＰＤＥＶＬに含まれる連続配列を含む１から１５のアミノ酸残基のペプチド部分
から選択されるペプチド部分の少なくとも一つに結合する薬剤も本開示に含まれる。
上記の配列は、例えば図３のアミノ酸配列を含むＲＡＭＰ−３に含まれている。
【００１５】
本発明の薬剤は、任意に、以下の２つの可能性のうち１又はそれ以上を持つ。
１．前記ＲＡＭＰ及びＣＲＬＲタンパク質を発現するＳＷ−１３細胞の増殖を少なくとも１０％阻害でき、前記増殖はＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いて測定される。
２．アドレノメデュリン投与に応答したヒトＭＧ６３骨肉腫細胞におけるｃＡＭＰ生成を、薬剤無しでアドレノメデュリン投与に比較して、少なくとも約１５％阻害できる。
薬剤は、ＲＡＭＰタンパク質、例えばＲＡＭＰ−３に結合できてもよい。一実施態様では、薬剤はＲＡＮＰ−３の細胞外ドメイン、例えば図３のアミノ酸残基１〜９９を含む配列に結合できてもよい。
【００１６】
本明細書に記載するデータは、一方はＲＡＭＰ−３とＣＲＬＲとの間の相互作用、他方はＲＡＭＰ−３／ＣＲＬＲ結合複合体とアドレノメデュリン等のリガンドとの間のいずれかの阻害剤がガン及び血管新生の防止に用途を有することを示す。このような薬剤は、糖尿病の兆候、例えば糖尿病性細小血管障害の緩和を含む糖尿病の治療にも用途を有する。
【００１７】
本発明の一態様によると、カルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）の機能に対するポリペプチドの影響を調節する薬剤であって、該ポリペプチドが、
ｉ）図１、２又は３で表される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチド又はその変異体、
ｉｉ）  上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリッドし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるペプチド、
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含み、該薬剤が医薬としての使用に特徴づけられるポリペプチド：
からなるのグループより選択される薬剤が提供される。
【００１８】
本明細書で使用される「ＣＲＬＲ機能又は活性」とは、ＣＲＬＲの全ての生物学的活性を指す。特異的な「機能」は、リガンドに対するＣＲＬＲ活性化を含み、リガンドの例として、アデノメジュリン（ＡＭ）及びＣＧＲＰが含まれる。典型的には、ＡＭ又はＣＧＲＰに対するＣＲＬＲ活性化は、ｃＡＭＰ発現及び他の第二のメッセンジャーシステムの活性化を含む。
【００１９】
ＡＭ又はＣＧＲＰ等のリガンドは本発明のポリペプチド、即ちＲＡＭＰタンパク質に結合するので、当該ポリペプチドがＣＲＬＲに結合したときのみ、本発明の薬剤を変調、例えばＲＡＭＰタンパク質のＣＲＬＲとの結合の阻害のために使用することができる。ＲＡＭＰタンパク質、例えばＲＡＭＰ−１、ＲＡＭＰ−２及びＲＡＭＰ−３のＣＲＬＲとの結合を阻害することにより、ＣＲＬＲ活性化に影響を与え、例えば、抑制又は抑止することができる。前記の阻害は、例えば、ＲＡＭＰタンパク質上、ＣＲＬＲ上、及び／又はＲＡＭＰ／ＣＲＬＲ複合体内のリガンド結合部位を直接又は間接的にブロックした結果であってもよい。一実施態様では、薬剤は、ＲＡＭＰ−３タンパク質のＣＲＬＲ結合領域ではない細胞外ドメインのアミノ酸配列に結合する。それに代わる実施態様では、薬剤はアゴニストであってもよく、即ち、ＲＡＭＰ／ＣＲＬＲ受容体とリガンドとの相互作用を模倣し、よってＣＲＬＲ受容体の刺激及び受容体による増加した又は通常でないシグナル伝達を導いてもよい。
【００２０】
好ましい実施態様では、薬剤は抗体物質である。一実施態様では、抗体物質はＲＡＭＰ−３と結合する。抗体は、ＲＡＮＰ−３に特異的に結合してもよい。
本明細書の開示範囲には、医薬として使用するための薬剤が含まれる。
【００２１】
本発明の更なる態様では、薬剤芽、例えば抗体物質又はタンパク質、例えば融合タンパク質である場合、本発明の薬剤の発現のために適合されたベクターが提供される。また本発明は、本明細書に記載されるベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞も提供する。
本発明の更なる態様では、本明細書に記載するような薬剤、例えば抗体の製造方法が提供される。
【００２２】
幾つかの実施例の詳細な説明
本明細書では以下の用語及び略語が使用される。
定義
特に断らない限り、技術用語は従来の用途に従って使用される。分子生物学における共通の用語の定義は、例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０−１９−  ８５４２８７−９）；  Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．  ，１９９４  （ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；  及びＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．  ），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５  （ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。免疫学の分野の当業者に知られた定義及び追加情報は、例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｗ．  Ｅ．  Ｐａｕｌ，  ｅｄ．  ，  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９９に見出される。
【００２３】
抗体断片（特異的抗原結合性を持つ断片）：様々な抗体断片が同定されており、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦＶ、、一本鎖Ｆｖ  （ｓｃＦｖ）及びシングルドメイン抗体を含むドメイン抗体を含む。これらの抗体断片は、以下のとおりに定義される：（１）Ｆａｂ：完全な軽鎖および一方の重鎖の一部を得るために、全抗体を酵素パパインで消化することによって、または同等に遺伝子操作によって生じる、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片、（２）Ｆａｂ’：完全な軽鎖および重鎖の一部を得るために、全抗体をペプシンで処理し、続いて還元することによって得られる、抗体分子の断片（抗体１分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる）、（３）（Ｆａｂ’）２：全抗体を酵素ペプシンで処理し、続いて還元しないことによって、または同等に遺伝子工学によって得られる抗体の断片、（４）Ｆ（Ａｂ’）２：ジスルフィド結合によって結合している２つのＦＡｂ’断片の二量体、（５）Ｆｖ：２つの鎖として表される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された断片。ｄｓＦＶ：ジスルフィド結合によって連結している軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域ならびに（６）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）：遺伝子融合された一本鎖分子として、適したポリペプチドリンカーによって連結している軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子。一本鎖抗体は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）とも呼ばれ得る。
【００２４】
シングルドメイン抗体は、その相補性決定領域が一本鎖ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例として、それだけには限らないが、重鎖抗体、天然に軽鎖を欠いている抗体、従来の４鎖抗体から誘導した単一ドメイン抗体、遺伝子操作された抗体および抗体から導いたもの以外の単一ドメインスキャフォールドが挙げられる。単一ドメイン抗体は、当技術分野のいずれであってもよく、または任意の未来の単一ドメイン抗体であってもよい。単一ドメイン抗体は、それだけには限らないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含め、いずれの種に由来するものであってもよい。単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠いている重鎖抗体として知られる、天然に存在する単一ドメイン抗体であってもよい。このような単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ９４０４６７８に開示されている。これらの断片を作製する方法は、当技術分野では常法として用いられている。
【００２５】
ｄＡＢ  （ドメイン抗体）は、抗体の最小の機能的結合単位であり、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に相当する。ドメイン抗体は、約１３ｋＤａの分子量、すなわち、全抗体の大きさの１／１０未満を有する。ドメイン抗体は、２種の治療標的と結合するｄＡｂを含み得る。これらとして、ＩｇＧ様分子、ＰＥＧ化融合タンパク質および抗血清アルブミン融合タンパク質が挙げられる。ＩｇＧ様抗体では、２種の可変ドメインが、各ＩｇＧのアーム上で２種の治療標的と結合する。
【００２６】
細胞株／細胞培養：「細胞株」又は「細胞培養」は、インビトロで成長又は維持された、より高等な真核生物細胞である。細胞の後代は、親細胞と完全に同一でない（形態学的に、遺伝子型的に、または表現型的にのいずれかで）場合もあると理解される。「異種」とは、比較される実体の残りと、遺伝子型的に別個の実体に由来することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、遺伝子工学技術によって、異なる供給源に由来するプラスミドまたはベクター中に配置することができ、これは、異種ポリヌクレオチドである。その天然コード配列から取り出され、天然には、連結して見られないコード配列と作動可能に連結しているプロモーターは、異種プロモーターである。「単離された」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、天然に関連している物質を実質的に含まないものである。実質的に含まないとは、天然に関連している物質を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％含まないことを意味する。
【００２７】
相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲは、結合した抗体の三次元構造と相補的な抗原結合表面を形成する抗体分子の可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）領域のいずれかにある３つの超可変領域である。これらの相補性決定領域は、重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」として示される。ＣＤＲは、抗原抗体結合に関与しており、ＣＤＲ３は、抗原抗体結合に特異的な独特の領域を含む。したがって、抗原−結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域各々に由来するＣＤＲ領域を含む６つのＣＤＲを含み得る。ＣＤＲ領域内の単一のアミノ酸の変更が、特異的抗原に対する抗体の親和性を変更する場合がある（Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版１４３〜５頁、２０００年参照のこと）。ＣＤＲの位置は、例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８３年によって正確に規定されている。Ｉｇの軽鎖および重鎖は各々、３つのＣＤＲを有し、それぞれ、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と呼ばれている。定義によれば、Ｋａｂａｔら、（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＮＩＨ出版番号９１−３２４２）によって説明された番号付け規則を用いて、軽鎖のＣＤＲは、位置２４および３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、５０および５６（Ｌ−ＣＤＲ２）、８９および９７（Ｌ−ＣＤＲ３）の残基によって結合しており、重鎖のＣＤＲは、３１および３５ｂ（Ｈ−ＣＤＲ１）、５０および６５（Ｈ−ＣＤＲ２）、９５および１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）の位置の残基によって結合している。
【００２８】
Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  （１９８７）  ａｎｄ  （１９９１）からの番号付けスキームを参照する。これらの概要では、Ｋａｂａｔは、各サブクラスの抗体の多数のアミノ酸配列を列挙しており、そのサブクラスにおいて各残基位置の最もよく生じるアミノ酸を列挙している。Ｋａｂａｔは、列挙された配列中の各アミノ酸に残基番号を割り当てる方法を使用しており、残基番号を割り当てるためのこの方法は、当技術分野では標準となっている。本発明の目的上、Ｋａｂａｔ概要に含まれない候補抗体アミノ酸配列に残基番号を割り当てるためには、以下のステップをたどる。一般に、候補配列を、Ｋａｂａｔにおいて任意の免疫グロブリン配列または任意のコンセンサス配列とアラインする。アラインメントは手作業で行ってもよいし、一般に是認されたコンピュータプログラムを用いてコンピュータによって行ってもよく、このようなプログラムの一例として、この説明において論じられるＡｌｉｇｎ２プログラムがある。アラインメントは、ほとんどのＦａｂ配列に共通するいくつかのアミノ酸残基を用いることによって容易になり得る。例えば、軽鎖および重鎖は各々、通常、同じ残基番号を有する２個のシステインを有し、ＶＬドメインでは、２個のシステインは、通常残基番号２３および８８にあり、ＶＨドメインでは、２個のシステイン残基は、通常２２および９２番が付けられる。フレームワーク残基は、通常、常にではないが、ほぼ同じ数の残基を有するが、ＣＤＲは大きさが変わる。例えば、アラインされるＫａｂａｔにおける配列中のＣＤＲよりも長い候補配列に由来するＣＤＲの場合には、通常、さらなる残基の挿入を示すよう残基番号に接尾語を加える（例えば、図５中の、残基１００ａｂｃｄｅを参照のこと）。例えば、残基３４および３６についてＫａｂａｔ配列とアラインするが、その間に、残基３５とアラインする残基を有さない候補配列については、単純に数３５を残基に割り当てない。
【００２９】
ＣＤＲ及びＦＲ残基は、構造的定義に従っても決定される  （Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）におけるように）。これらの２つの方法が、ＣＤＲのわずかに異なる同定をもたらす場合には、構造定義は好ましいものであるが、配列定義法によって同定される残基が、コンセンサス配列に移入するフレームワーク残基の決定にとって重要なＦＲ残基と考えられる。
【００３０】
定常領域：エフェクター機能を持つ抗体分子の部分である。本明細書の開示では、使用する変異抗体は、ヒト免疫グロブリンから誘導された定常領域を含むことができる。重鎖定常領域は、５種のアイソタイプ：α、δ、ε、γまたはμのいずれかから選択され得る。種々のサブクラスの重鎖（例えば、重鎖のＩｇＧサブクラス）は、異なるエフェクター機能に関与している。したがって、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクター機能を有するヒト化抗体を作製することができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ型であり得る。
【００３１】
エピトープ：アミノ酸配列の特異性によって決定した場合の、薬剤によって認識される抗体上の部位である。２種の薬剤は、競合結合アッセイにおいて測定されるように、それぞれ他方と抗原との結合を競合的に阻害（遮断）する場合に、同一エピトープに結合するといわれる（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５〜１５０２頁、１９９０年を参照のこと）。あるいは、２種の抗体は、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原中のほとんどのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合を低減または排除する場合に、同一のエピトープを有する。２種の抗体は、それぞれ他方と抗原との結合を部分的に阻害する場合、および／または一方の抗体の結合を低減または排除する一部のアミノ酸突然変異が、他方の結合を低減または排除する場合に、重複するエピトープを有するといわれる。
【００３２】
フレームワーク領域（ＦＲ）：抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にある３つの高度に多様性の相補性決定領域（ＣＤＲ）に隣接する比較的保存された配列である。したがって、抗体重鎖または軽鎖の可変領域は、ＦＲおよび３つのＣＤＲからなる。いくつかのＦＲ残基は、結合している抗原と接触し得るが、ＦＲ、特に、ＣＤＲと直接隣接するＦＲ残基は、主に、可変領域を抗原結合部位にフォールディングすることに関与している。理論に拘束されるものではないが、フレームワーク領域は、ＣＤＲを、抗原結合にとって適当な配向に保持するのに役立つ。軽鎖および重鎖フレームワーク領域中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら（１９９１年、前掲）によって説明される番号付け規則に従う。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。「ヒト」フレームワーク領域は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一である（約８５％以上、通常、９０〜９５％以上）フレームワーク領域である。
【００３３】
阻害する：相互作用、例えば、（ｉ）ＲＡＭＰタンパク質とリガンドとの間の結合、又は（ｉｉ）ＲＡＭＰタンパク質とＣＲＬＲとの間の結合、又は（ｉｉｉ）ＲＡＭＰ／ＣＲＬＲ複合体とリガンドとの結合、を妨害、ブロック、又は阻止する化学種は、相互作用を阻害すると考えられる。典型的には、阻害は１００％のブロックをもたらさないが、相互作用の量及び／又は速度を減少させる。
【００３４】
免疫原性：対象者に投与したとき、タンパク質、治療部位、又は免疫反応（体液性又は細胞性）を誘発するを薬剤をターゲティングする能力の尺度である。
【００３５】
免疫グロブリン：免疫グロブリン（Ｉｇ）分子及びＩｇ分子の免疫原的活性部分、例えば、抗原と特異的に結合（又は相互作用）する抗原結合部位を含む分子である。
【００３６】
天然の抗体又は免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）は、ジスルフィド結合で相互に連結された４つのペプチド、即ち２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。２つの重鎖は、ジスルフィド結合によって互いに連結しており、各重鎖は、ジスルフィド結合によって軽鎖と連結している。２種類の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する、５種の主な重鎖のクラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。全長免疫グロブリン軽鎖は、通常、約２５Ｋｄ、すなわち、２１４個のアミノ酸長である。全長免疫グロブリン重鎖は、通常、約５０Ｋｄ、すなわち、４４６個のアミノ酸長である。軽鎖は、ＮＨ２末端の可変領域遺伝子（約１１０個のアミノ酸長）およびＣＯＯＨ末端のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。重鎖も同様に、可変領域遺伝子（約１１６個のアミノ酸長）およびその他の定常領域遺伝子のうち１種によってコードされる。
【００３７】
抗体の基本構造単位は、一般的に、２つの同一の免疫グロブリン鎖の対を含むテトラマーであり、各対は、１つの軽鎖及び１つの重鎖を有している。各対では、軽鎖および重鎖可変領域が抗原と結合し、定常領域はエフェクター機能を媒介する。免疫グロブリンはまた、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２、ならびに二機能性ハイブリッド抗体および一本鎖をはじめとする種々のその他の形で存在する（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５頁、１９８７年；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：５８７９〜５８８３頁、１９８８年；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｎ．Ｙ．、第２版、１９８４年；ＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ３２３：１５〜１６頁、１９８６年）。
【００３８】
各鎖は異なる配列ドメインを含む。軽鎖は２つのドメイン、即ち可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は４つのドメイン、即ち可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨｌ、ＣＨ２及びＣＨ３、集合的にＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）両方の可変領域が、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、経胎盤性移動性、補体結合およびＦｃ受容体との結合などの重要な生物学的特性を付与する。免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断されたフレームワーク領域を含む（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｅ．Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８３年参照のこと）。上記で示されたように、ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープとの結合に関与している。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基間の構造的相補性にある。
【００３９】
キメラ抗体は、その軽鎖及び重鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン可変及び定常領域遺伝子から、典型的には遺伝子加工により組み立てられた抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する遺伝子の可変セグメントを、κおよびγ１またはγ３などのヒト定常セグメントと接続してもよい。一例では、したがって、治療用キメラ抗体は、マウス抗体由来の可変または抗原−結合ドメインおよびヒト抗体由来の定常またはエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質であるが、その他の哺乳類種を用いてもよく、または分子技術によって可変領域を作製してもよい。キメラ抗体を作製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８０７，７１５号参照のこと。
【００４０】
「ヒト化」免疫グロブリン又は抗体は、ヒトのフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ラット又は合成）免疫グロブリンからの１又はそれ以上のＣＤＲとを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、ヒト化免疫グロブリン中のすべてのＣＤＲは、ドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は、存在する必要はないが、それらがある場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも、約８５〜９０％、例えば、約９５％以上同一でなければならない。したがって、ＣＤＲの可能性があるものを除くヒト化免疫グロブリンのすべての部分が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同一の抗原と結合する。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークからとられたアミノ酸による制限された数の置換を有し得る。ヒト化またはその他のモノクローナル抗体は、抗原結合またはその他の免疫グロブリン機能に対して実質的に影響のないさらなる保存的アミノ酸置換を有し得る。例示的保存的置換として、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒなどのものがある（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５８５，０８９号参照のこと）。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子工学によって構築することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２５，５３９号および同５，５８５，０８９号参照のこと。
【００４１】
ヒト抗体は、軽鎖及び重鎖遺伝子がヒト由来である抗体のことである。ヒト抗体は、当該技術で知られた方法により製造することができる。ヒト抗体は、注目する抗体を分泌するヒトＢ細胞を不死化することによって作製することができる。不死化は、例えば、ＥＢＶ感染によって、またはヒトＢ細胞を骨髄腫またはハイブリドーマ細胞と融合してトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）細胞を作製することによって達成できる。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイ法によって作製することもでき（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／００１０４７；およびＷｉｎｔｅｒ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１参照のこと）、またはヒトコンビナトリアルモノクローナル抗体ライブラリーから選択することもできる（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ｗｅｂｓｉｔｅ参照のこと）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して調製してもよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１２２２７；およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０７４１参照のこと）。
【００４２】
抗体は、ファージディスプレー技術を用いて得ることもできる。ファージディスプレー技術は、当該技術で知られており、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：  ５８１−５９７  及び  Ｃｋａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：  ６２４−６２８を両方とも参考としてここに取り入れるものとする。ファージディスプレイ技術はまた、抗体の親和性を増大するために使用することもできる。抗体親和性を増大するには、抗体配列を多様化し、ファージ抗体ライブラリーを構築し、抗原に対するより高度な親和性結合物を選択する（例えば、すべて、参照により本明細書に組み込まれる、ＭａｒｋｓらＢｉｏ／  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９〜７８３頁、ＢａｒｂａｓらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３頁およびＳｃｈｉｅｒらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１〜５６７頁参照のこと）。
【００４３】
アプタマー：本発明の薬剤はアプタマーであってもよい。アプタマーは、アミノ酸、薬物、タンパク質及び他の分子に対して生成され得る人工核酸リガンドと定義されている。それらは、吸着、回収及び再増幅の反復プロセスによって合成核酸の複合体ライブラリから単離される。
【００４４】
ＲＮＡアプタマーは特定の標的分子に対する親和性を持つ核酸分子である。それらは、リガンド結合特性によっって抗体に結合している。それらは、種々の理由のために有用な薬剤と考えることができる。具体的には、それらは、さまざまな溶液状態および濃度に可溶性であり、その結合特異性は、界面活性剤およびその他の穏やかな変性剤などの試薬によって大きくは乱れない。さらに、それらは、単離および製造するのに比較的費用がかからない。それらはまた、容易に改変して、特性の改善された種を作製できる。広範な研究によって、核酸は、大部分は非毒性であり、非免疫原性であると示されており、アプタマーはすでに臨床適用を見出している。さらに、相補的ＲＮＡ一本鎖の存在下で不活性なｄｓＲＮＡ分子を作製することによって生体サンプル中のアプタマーの活性を調節する方法が知られている（Ｒｕｓｃｏｎｉら、２００２年）。
【００４５】
従来技術から、結合、播種及び増幅の繰り返しサイクルによって、生成配列プールから単離する方法が知られている。そのような方法は、米国特許第５，４７５，０９６号、第５，２７０，１６３号及び欧州特許第０５３３  ３８号に記載されており、典型的にはＳＥＬＥＸ  （Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸ−ｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と呼ばれる。基本的なＳＥＬＥＸ系は、例えば、アプタマーが、標的分子と結合および／またはそれと光架橋および／またはそれを光活性化または光不活化できる光反応性基を含む、光−ＳＥＬＥＸを用いることによって改変されている。その他の改変として、キメラ−ＳＥＬＥＸ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＳＥＬＥＸ）、混合−ＳＥＬＥＸ（Ｂｌｅｎｄｅｄ−ＳＥＬＥＸ）、カウンター−ＳＥＬＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）、溶液−ＳＥＬＥＸ（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ＳＥＬＥＸ）、ケミ−ＳＥＬＥＸ（Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）、組織−ＳＥＬＥＸ（Ｔｉｓｓｕｅ−ＳＥＬＥＸ）および無転写ＳＥＬＥＸ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ＳＥＬＥＸ）（ＤＮＡ鋳型と結合しているＲＮＡのランダムな断片を連結して、オリゴヌクレオチドライブラリーを形成する方法を記載する）が挙げられる。しかし、これらの方法は、濃縮されたリガンド結合性核酸分子を生成するものの、不安定な生成物を依然として生成する。安定性の問題を克服するために、鏡像異性の「シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）」（ＷＯ０１／９２５６６）を作製することが知られている。この方法は、まず、標的の化学的鏡像を作製するステップ、次いで、この鏡像に対するアプタマーを選択するステップ、最後に、ＳＥＬＥＸによって選択されたアプタマーの化学的鏡像を作製するステップを含む。最終的な標的分子、例えば、Ｄ−アミノ酸からなるペプチドの非天然鏡像異性体に対して、Ｄ−リボース糖単位に基づいて天然ＲＮＡを選択することによって、天然Ｌ−アミノ酸標的に対するシュピーゲルマーが作製され得る。非天然鏡像異性体標的と強力に結合するアプタマーが単離され、配列決定されると、分子対称の法則は、Ｌリボース糖に基づいて化学的に合成されたＲＮＡは、天然標的、すなわち、選択標的の鏡像と結合することを意味する。この方法は、便宜上、反射選択またはミラー選択と呼ばれ、作製されたＬ−リボース種は、それらが正常な酵素切断に対してあまり感受性でない、すなわち、それらがヌクレアーゼ耐性であるために、生物学的環境において相当により安定である。
【００４６】
免疫反応性：薬剤、しばしば抗体が特異的抗原を認識及び結合する能力の尺度である。「特異的に結合する」とは、個々の薬剤又は抗体が抗原と特異的に免疫反応する能力を意味する。この結合は、薬剤、例えば、それだけには限らないが、抗体分子と、抗原間の非ランダム結合反応である。結合特異性は、通常、薬剤の、注目する抗原および無関係の抗原と異なって結合し、したがって、２種の異なる抗原間を、特に、２種の抗原が独特のエピトープを有する場合に区別する能力の基準点から決定される。
一般に、特異性は、抗原のパネルを使用するＥＬＩＳＡなどの結合アッセイによって決定され得る。本発明の薬剤は、細胞上のＲＡＭＰタンパク質、例えば、ＲＡＭＰ−１、ＲＡＭＰ−２またはＲＡＭＰ−３を認識し得る。
【００４７】
モノクローナル抗体：は、Ｂリンパ球の単一クローンにより、又は単一の抗体の軽鎖及び重鎖がトランスフェクトされた細胞により生産される。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、骨髄腫細胞を免疫脾臓細胞と融合することからハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって製造する。通常、モノクローナル抗体は、特異的ハイブリドーマ細胞または培養で増殖されたハイブリドーマ細胞の後代によって産生される。抗体を産生するハイブリドーマまたはその他の細胞は、遺伝子突然変異またはその他の変化の対象であり得、これは、産生される抗体の結合特異性を変更する場合も、しない場合もある。
【００４８】
核酸：「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの重合体であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び類似物を任意の組み合わせで含んでいる。核酸は、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を発揮し得る。用語「核酸」は、二本鎖、一本鎖および三重らせん分子を含む。特に断りのない限り、または必要でない限り、核酸である本明細書に記載される本発明の任意の実施形態は、二本鎖の形および二本鎖の形を作り上げると知られる、もしくは予測される２つの相補的な一本鎖の形の各々の両方を包含する。
【００４９】
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書中で交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを意味する。ポリマーは直鎖であっても分岐していてもよく、改変されたアミノ酸またはアミノ酸類似体を含む場合もあり、非アミノ酸によって中断されている場合もある。この用語はまた、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意のその他の操作もしくは改変、例えば、標識構成要素とのコンジュゲーションによって改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。
【００５０】
アミノ酸置換は、或る領域、例えば可変領域の１又はそれ以上のアミノ酸の変化又は修飾から完全な再設計までの範囲である。アミノ酸置換は、ペプチドのフォールディングまたは機能的特性に有害に影響を及ぼさない保存的置換であることが好ましい。その中で保存的置換がなされ得る機能的に関連するアミノ酸の群として、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン／メチオニン；リシン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン（ｔｒｙｏｓｉｎｅ）／トリプトファンがある。本発明のポリペプチドは、グリコシル化型または非グリコシル化型であり得、翻訳後修飾される場合もあり（例えば、アセチル化およびリン酸化）、または合成的に修飾してもよい（例えば、標識基の結合）。
【００５１】
本明細書で使用する「変異体」ポリペプチドは、１又はそれ以上の置換、付加、欠失、切断によりアミノ酸配列が相違しており、それらは任意に組み合わせて存在してもよい。好ましい変異体の中には、保存的アミノ酸置換によって参照ポリペプチドと異なるものがある。このような置換は、所与のアミノ酸が、同様の特徴の別のアミノ酸と置換しているものである。以下のアミノ酸の限定するものではない一覧は、保存的置換（同様）と考えられる：ａ）アラニン、セリンおよびトレオニン、ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸、ｃ）アスパラギンおよびグルタミンｄ）アルギニンおよびリシン、ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリンならびにｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
【００５２】
上記したように、本発明の第一の態様は、（ｉ）  ＲＡＭＰ−３、（ｉｉ）ＲＡＭＰ−２及び（ｉｉｉ）ＲＡＭＰ−１タンパク質から選択される１又はそれ以上のＲＡＭＰタンパク質（レセプター活性変調タンパク質）のカルシトニンレセプター様レセプター（ＣＲＬＲ）に結合できる及び／又はその効果を変調させることができる薬剤を提供する。
【００５３】
一実施態様では、薬剤はＲＡＭＰタンパク質の細胞外ドメインに結合する。典型的には、薬剤はＲＡＭＰ−３  とＣＲＬＰとの相互作用を変調させることができる。
一実施形態では、薬剤は、ヒトＳＷ−１３細胞の増殖を少なくとも１０％阻害でき、前記阻害は、ＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いて測定される。薬剤は、ＲＡＭＰ−３とＣＲＬＰの相互作用を調節でき、例えば、それに干渉できることが好ましい。
【００５４】
典型的には、薬剤は少なくとも１２％まで増殖を阻害することができる。幾つかの実施態様では、薬剤は少なくとも２０％、そして任意に少なくとも２５％まで増殖を阻害できる。さらなる態様では、薬剤は少なくとも３０％、さらに任意に少なくとも少なくとも４０％まで増殖を阻害することができる。
一実施形態では、薬剤は、アドレノメデュリンによって刺激された場合のヒトＭＧ６３骨肉腫細胞におけるｃＡＭＰの産生を少なくとも約１５％、例えば、少なくとも１５％、１６％、１７％、１８％および１９％低減または阻害できる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ｃＡＭＰの産生を少なくとも約２０％、例えば、２１％、２２％または２５％阻害できる可能性がある。通常、薬剤は、ＲＡＭＰ−３とＣＲＬＰの相互作用を調節できる。
【００５５】
本明細書に開示される薬剤は、ＲＡＭＰタンパク質の効果を変調させることができ、ＲＡＭＰタンパク質は、ｉ）図１に示される核酸配列にコードされるポリペプチド、又はその変異体；ｉｉ）  上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリッドし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるペプチド、及びｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含み、該薬剤が医薬としての使用に特徴づけられるポリペプチドであり、ＲＡＭＰ−２は、ｉ）図２に示される核酸配列にコードされるポリペプチド、又はその変異体；ｉｉ）  上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリッドし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるペプチド、及びｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含み、該薬剤が医薬としての使用に特徴づけられるポリペプチドであり、ＲＡＭＰ−３は、ｉ）図３に示される核酸配列にコードされるポリペプチド、又はその変異体；ｉｉ）  上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリッドし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるペプチド、及びｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含み、該薬剤が医薬としての使用に特徴づけられるポリペプチドである。
薬剤は、上記で定義されるＲＡＭＰ−３タンパク質の作用を調節することが好ましい。
本明細書に開示される薬剤は、抗体および抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、アプタマーまたは化合物から選択される抗体生成物であり得る。
本発明の好ましい一実施形態では、前記薬剤はアンタゴニストである。あるいは、前記薬剤はアゴニストである。
【００５６】
本発明の更なる態様では、カルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）機能に対する、図１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または図１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失もしくは置換によって改変されている変異体ポリペプチドの作用を調節する薬剤が提供され、前記ポリペプチドはＣＲＬＲ機能を調節し、前記薬剤は医薬品として使用されることを特徴とする。
【００５７】
さらに、本明細書の開示は、ここに記載するポリペプチド配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列、又はその断片及び機能的等価なポリペプチドを特徴とする。一実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に例示されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００５８】
本明細書の開示は、図４、５または６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片、または図４、５もしくは６に示されるアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失もしくは置換によって改変されている変異体を含み、前記ポリペプチドはＣＲＬＲ機能を調節する。具体的には、薬剤は、ＣＲＬＲ機能に対する上記ＲＡＭＰタンパク質の作用を調節する。
【００５９】
本明細書で使用される「図４、５又は６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片」とは、１から９９個のアミノ酸、例えば、１から５０個のアミノ酸、例えば、１から３０個のアミノ酸または１０から３０個のアミノ酸を含む断片を含む。断片は、ＲＡＭＰタンパク質のＮ末端配列であることが好ましい。例えば、断片は、図４、５または６に示されるアミノ酸配列のＮ末端の１〜１０個、１０〜２０個または２０〜３０個のアミノ酸を含むことができる。ＲＡＭＰタンパク質のその他の断片は、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸残基長であり得る。
本開示内容には、図７、８もしくは９に示されるアミノ酸配列の１種または複数を含むポリペプチド断片、または図７、８もしくは９に示されるアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失もしくは置換によって改変されているその変異体ポリペプチドが含まれ、前記ポリペプチドはＣＲＬＲ機能を調節する。
【００６０】
一実施態様では、本開示の薬剤は、ポリペプチドである。このポリペプチドは、図４、５もしくは６に示されるアミノ酸配列またはその断片または変異体を含むことができ、前記ポリペプチドは、ＲＡＭＰタンパク質のリガンドおよび／またはＣＲＬＲのリガンドと結合する。
薬剤は、図４、５または６に示されるアミノ酸配列のＮ末端に１から３０個のアミノ酸を含み、場合によって５から３０個のアミノ酸、さらに場合によって約１０から３０個のアミノ酸をＮ末端に含むポリペプチド断片であり得る。一実施形態では、断片は、図７、８または９から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００６１】
一実施態様では、薬剤はポリペプチドに限られず、薬剤は検出可能なマーカーを含む。好ましくは、従来の標識またはタグ、例えば、放射活性および／または蛍光および／またはエピトープ標識またはタグを含めた、マーカーを有する薬剤が提供される。
一実施形態では、薬剤は、抗体生成物、例えば、抗体または抗体の活性結合部分である。本発明の一実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体またはその活性結合部分である。
本発明の好ましい一実施形態では、前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体、例えば、ヒト抗体の不変または定常領域とともに前記抗体の可変領域を含むように組換え法によって作製されたものである。
【００６２】
上記に詳細に記載したように、キメラ抗体は、マウス又はラット抗体のＶ領域の全てがヒト抗体Ｃ領域と結合した組み換え抗体である。ヒト化抗体は、ヒト抗体Ｖ領域由来のフレームワーク領域をげっ歯類抗体Ｖ領域由来の相補性決定領域と融合している組換えハイブリッド抗体である。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｖ領域の変動の大部分がそこに限定される、抗体の重鎖および軽鎖両方のＮ末端ドメイン内の領域である。これらの領域は、抗体分子の表面にループを形成する。これらのループは、抗体および抗原間の結合表面を提供する。非ヒト動物由来の抗体は、外来抗体に対する免疫応答および循環からのその除去を誘発する。キメラ抗体およびヒト化抗体は両方とも、ヒト対象に注射した場合に、組換えハイブリッド抗体内に低減された量のげっ歯類（すなわち、外来）抗体があるために、抗原性が低減されており、他方、ヒト抗体領域は、免疫応答を誘発しない。これは、より弱い免疫応答および抗体のクリアランスの減少をもたらす。これが、ヒト疾患の治療において治療抗体を使用する場合に望ましいことであることは明らかである。ヒト化抗体は、少ない「外来」抗体領域を有するよう設計され、したがって、キメラ抗体よりも免疫原性でないと考えられる。本発明の一実施形態では、本開示内容の薬剤は、キメラ抗体である。場合によって、薬剤は、ＲＡＭＰ−３と結合するキメラ抗体またはヒト化抗体または抗体断片である。
【００６３】
一実施態様では、抗体製造物は、例えば、本明細書の図１、２および３に記載されるＲＡＭＰ−１、ＲＡＭＰ−２およびＲＡＭＰ−３タンパク質のうち少なくとも１つと結合する、本明細書に記載される抗体断片、例えば、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体（ｄＡＢ）またはナノボディである。抗体生成物は、ＣＲＬＲタンパク質に対するＲＡＭＰタンパク質の作用を調節することが好ましい。このような調節は、例えば、ＲＡＭＰ／ＣＲＬＲヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｅｏｄｉｍｅｒ）とリガンドとの結合の阻害であり得る。理論に拘束されるものではないが、ＲＡＭＰ／ＣＲＬＲヘテロ二量体によって形成される受容体は、特異的リガンド、例えば、アドレノメデュリンおよびＣＧＲＰの受容体として作用すると考えられる。本開示内容の薬剤は、ＲＡＭＰタンパク質とＣＲＬＲの会合および／またはリガンドと受容体の結合に干渉するように働くことができる。一実施形態では、ＲＡＭＰタンパク質はＲＡＭＰ−３である。本発明の好ましい一実施形態では、前記薬剤は抗体断片である。
【００６４】
上記に示したように、免疫グロブリン又は抗体の様々な断片、すなわち、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、ｓｃＦｖｓなどが当技術分野で公知である。Ｆａｂ断片は、共有結合している、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなる多量体タンパク質であり、抗原と特異的に結合できる。Ｆａｂ断片は、完全な免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断（例えば、パパインを用いる）によって作製される。Ｆａｂ２断片は、２つの接続しているＦａｂ断片を含む。これらの２つの断片が免疫グロブリンヒンジ領域によって接続されている場合に、Ｆ（ａｂ’）２断片が生じる。Ｆｖ断片は、共有結合によって結合している、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなる多量体タンパク質であり、抗原と特異的に結合できる。断片はまた、１つの軽鎖可変領域または軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むその断片のみを含み、重鎖可変領域または重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むその断片と会合しておらず、会合した軽鎖部分を含まない一本鎖ポリペプチドおよび抗体断片から形成される多重特異性抗体でもあり得、これは、例えば、ＵＳ特許第６，２４８，５１６号に記載されている。Ｆｖ断片または単一領域（ドメイン）断片は、通常、関連する同定された領域の宿主細胞株における発現によって作製される。これらのおよびその他の免疫グロブリンまたは抗体断片は、本発明の範囲内であり、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙまたはＪａｎｅｗａｙらＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（上記で引用された）などの標準的な免疫学の教本に記載されている。現在、分子生物学によって、これらの断片の直接合成（細胞における発現による、または化学的に）ならびにその組合せの合成が可能となっている。
【００６５】
単一の可変領域、いわゆる一本鎖抗体可変領域断片（ｓｃＦＶ）を生成させることが可能である。特異的モノクローナル抗体のためのハイブリドーマが存在する場合には、ＲＴ  ＰＣＲによって前記ハイブリドーマから抽出されたｍＲＮＡからｓｃＦｖ’ｓを単離することは十分に当業者の知識の範囲内である。あるいは、ｓｃＦｖ’ｓを発現するクローンを同定するためにファージディスプレイスクリーニングを行ってもよい。あるいは、前記断片は、「ドメイン抗体断片」である。ドメイン抗体は、抗体の最小の結合部分（約１３ｋＤａ）である。この技術の例は、すべて参照によりその全文が組み込まれる、ＵＳ６，２４８，５１６、ＵＳ６，２９１，１５８、ＵＳ６，１２７，１９７およびＥＰ０３６８６８４に開示されている。
本発明の一実施形態では、抗体断片は、一本鎖抗体可変領域断片である。抗体または免疫グロブリンの断片はまた、二特異性機能、すなわち、２種の異なる抗原の２種の異なるエピトープとの結合を有し得る。
一実施形態では、ＲＡＭＰタンパク質に対するキメラ／ヒト化モノクローナル抗体は、原核細胞または真核細胞のトランスフェクションまたは形質転換に適切に適応している発現ベクターにおいて融合ポリペプチドとして作製できる。
【００６６】
本発明の更なる好ましい実施態様では、前記抗体はオプソニン抗体である。食作用は、マクロファージおよび多形白血球によって媒介され、微生物、損傷を受けた細胞または死細胞、細胞片、不溶性粒子および活性化された凝固因子の摂取および消化に関与する。オプソニンは、上記の異物の食作用を容易にする物質である。したがって、オプソニン抗体は、同じ機能を提供する抗体である。オプソニンの例として、抗体のＦｃ部分または補体Ｃ３がある。
【００６７】
本発明の一実施態様では、前記抗体又は抗体断片は、治療薬と結合又は架橋している。前記治療薬は、化学療法薬であることが好ましい。前記治療薬は、以下からなる群から選択されることが好ましい：シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メルファラン、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｌｉｎｅ）、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｇ−ＣＳＦ、エトポシド、コルヒチン、デフェロキサミン（ｄｅｒｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）メシレートおよびカンプトセシン。一実施形態では、抗体生成物は、例えば、ＰＥＧ分子とコンジュゲートしていてもよい。
薬剤と、例えば、ＲＡＭＰタンパク質、例えば、ＲＡＭＰ−３との結合は、場合によって、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍを超える親和性を有する結合である。結合は、リガンドに対して特異的である場合も、非特異的である場合もあるが、いくつかの場合には、ＲＡＭＰ−１、ＲＡＭＰ−２またはＲＡＭＰ−３と関連のない特定のその他のリガンドと、より低い程度の親和性の非特異的結合がある。
【００６８】
よって、本発明の薬剤は、例えば、抗体又は抗体断片、例えばＦａｂ断片である。しかし、上記で定義されるアプタマー、化合物、融合タンパク質、タンパク質、ペプチドまたはそれらの組合せもあり得る。特定の抗体および断片は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖである。天然に、本発明の薬剤の範囲内に、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト、またはヒト化である抗体または断片がある。ＲＡＭＰタンパク質と結合し、結合が本明細書に記載されるその他の薬剤は、本発明内に包含される。
【００６９】
抗体の単離方法は当該分野で知られている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。単離法は、免疫グロブリンアイソタイプに応じて変わり得る。精製法は、塩析（例えば、硫酸アンモニウムを用いる）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、中性ｐＨで実施し、漸増イオン強度の段階勾配を用いて溶出する陽イオンまたは陰イオン交換カラムで）、ゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過ＨＰＬＣ）およびプロテインＡ、プロテインＧ、ヒドロキシアパタイトおよび抗免疫グロブリンなどの親和性樹脂でのクロマトグラフィーを含み得る。特に、本発明の薬剤は、プロテインＧ−セファロースカラムを用いることによって精製される。
【００７０】
殆どの適用では、一般に、ポリペプチド、例えば抗体が、少なくとも部分的に他の細胞性成分から精製されろのが好ましい。ポリペプチドは、総タンパク質の重量パーセントとして、少なくとも約５０％純粋であることが好ましい。タンパク質は、少なくとも約５０〜７０％純粋であることがより好ましい。臨床使用には、ポリペプチドは、少なくとも約８０％純粋であることが好ましい。
本発明の薬剤は、任意の適した手順によって、例えば、組換え法によって、または化学合成によって製造できる。次いで、製造されたペプチドを、それだけには限らないが、ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および逆相ＨＰＬＣを含めた当技術分野で公知の技術によって互いに分離してもよい。あるいは、本発明の薬剤は、本開示内容に提供される情報を、タンパク質合成の標準法とともに用いて化学合成できる。適した方法は、固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術である。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）製のものなどの自動ペプチドシンセサイザーが市販されている。
【００７１】
また、本発明には、抗体製造物、例えば抗体又はここに記載した抗体断片の製造方法、場合によって、本明細書で定義されるキメラ抗体またはヒト化抗体を製造する方法であって、
ｉ）前記抗体の製造を促す条件で、抗体または抗体断片をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させるステップと、
ｉｉ）前記細胞またはその増殖環境から前記抗体を精製するステップと
を含む方法も含まれる。
本発明のなおさらなる態様では、本明細書において上記で記載されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が提供される。
本発明のさらなる態様では、本発明のハイブリドーマ細胞株を用いて本発明のモノクローナル抗体を製造する方法が提供される。ハイブリドーマ細胞を用いるモノクローナル抗体の製造は、当技術分野で周知である。モノクローナル抗体を製造するために使用される方法は、Ｎａｔｕｒｅ２５６、４９５〜４９７頁（１９７５年）中、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって、また、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ．ＩＩ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ編、１９８１年中、ＤｏｎｉｌｌａｒｄおよびＨｏｆｆｍａｎ、「Ｂａｓｉｃ  Ｆａｃｔｓ  ａｂｏｕｔ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」によって開示されており、これらは参照により組み込まれる。
【００７２】
本発明の更なる態様では、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の調製方法であって、
ｉ）免疫適格性哺乳類を、図４、５または６に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１種のポリペプチド、または本明細書で定義されるその断片または変異体を含む免疫原で免疫化するステップと、
ｉｉ）免疫化された免疫適格性哺乳類のリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成するステップと、
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体を、（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性についてスクリーニングするステップと、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して増殖させ、および／または前記モノクローナル抗体を分泌させるステップと、
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収するステップと
を含む方法が提供される。
【００７３】
本発明の一実施態様では、（ｉ）のポリペプチドは図７、８又は９に示すアミノ酸配列又はポリペプチド変異体を含み、前記変異体は、図７、８又は９に示すアミノ酸配列の少なくとも１つの残基の付加、欠失又は弛緩により修飾され、前記ポリペプチドはＣＲＬＲ機能を変調させる。
前記免疫適格性哺乳類は、マウスであることが好ましい。あるいは、前記免疫適格性哺乳類はラットである。
本発明の代替実施形態では、前記薬剤は、核酸分子である。核酸は、例えば、アンチセンス核酸、アプタマーまたは低分子干渉ＲＮＡであり得る。
【００７４】
本発明の一実施態様では、前記核酸は小さなインターフェアリングＲＮＡであり得る。小インターフェアリングＲＮＡは、以下の（１）−（５）の配列からなる群から選択できる。
ＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＡ  （１）
ＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡ  （２）
ＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡ  （３）
ＣＵＡＵＧＡＧＡＣＡＧＣＵＧＵＣＣＡＡ  （４）
ＧＵＵＣＵＵＣＵＣＣＡＡＣＵＧＣＡＣＣ  （５）
【００７５】
遺伝子機能を特異的に除去する技術は、ｓｉＲＮＡ分子に含まれる配列に対して相補的なｍＲＮＡの破壊をもたらす、細胞への二本鎖ＲＮＡの導入によるものであり、低分子阻害または干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる。ｓｉＲＮＡ分子は、互いにアニーリングされて二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、ＲＮＡの２つの相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。ｓｉＲＮＡ分子は、通常、除去される遺伝子のエキソンから導かれる。
ＲＮＡ干渉の機序は、解明されつつある。多数の生物は、二本鎖ＲＮＡの存在に、ｓｉＲＮＡの形成につながるカスケードを活性化することによって応答する。二本鎖ＲＮＡの存在は、二本鎖ＲＮＡを、リボヌクレオタンパク質複合体の一部となる、より小さい断片（ｓｉＲＮＡ、約２１〜２９ヌクレオチドの長さ）に処理するＲＮアーゼＩＩＩを含むタンパク質複合体を活性化する。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的であるｍＲＮＡを切断するためにＲＮアーゼ複合体のガイド分子として働き、それによってｍＲＮＡの破壊をもたらす。
【００７６】
本発明の他の態様では、抗体、抗体断片、融合タンパク質、ペプチドまたはタンパク質である本明細書に記載される薬剤をコードする核酸配列を含む単離核酸を提供する。
本発明の薬剤は、ペプチド配列、例えば、抗体、融合タンパク質、ペプチドまたはタンパク質を含む場合は、核酸配列によってコードされ得る。本発明は、本明細書で定義される薬剤をコードする任意の核酸配列を含む。本発明はまた、本発明の薬剤をコードするが、遺伝暗号の縮重の結果として野生型核酸とは異なる核酸配列を含む。
【００７７】
また、本発明は、薬剤をコードする核酸配列と少なくとも９０％相同性を共有する核酸を含む。  特に、核酸は、本発明の抗体またはその断片をコードする核酸と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し得る。
【００７８】
本発明の一態様では、本発明の薬剤が抗体、その断片又は融合タンパク質であるとき、前記薬剤をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸が提供される。
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２種の相補的な核酸分子が、互いに対して一定量の水素結合を行う時に起きる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸の周囲の環境条件、ハイブリダイゼーション法の性質ならびに使用される核酸分子の組成および長さに従って変わり得る。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１年）；およびＴｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  パートＩ、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年）に論じられている。Ｔｍは、所与の核酸分子の鎖の５０％がその相補鎖とハイブリダイズされる温度である。以下は、ハイブリダイゼーション条件の例として見出されているが制限されるものではない：
極めて高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることが可能となる）
ハイブリダイゼーション：６５℃で５×ＳＳＣ、１６時間
洗浄２回：              室温（ＲＴ）で２×ＳＳＣ  各１５分
洗浄２回：              ６５℃で０．５×ＳＳＣ、各２０分間
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることが可能となる）
ハイブリダイゼーション：６５℃〜７０℃で５×〜６×ＳＳＣ、１６〜２０時間
洗浄２回：              ＲＴで２×ＳＳＣ、各５〜２０分間
洗浄２回：              ５５℃〜７０℃で１×ＳＳＣ、各３０分間
低いストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることが可能となる）
ハイブリダイゼーション：ＲＴ〜５５℃で６×ＳＳＣ、１６〜２０時間
洗浄少なくとも２回：    ＲＴ〜５５℃で２×〜３×ＳＳＣ、各２０〜３０分間。
【００７９】
更なる態様において、本発明は、上記の核酸及び宿主中でタンパク質又はポリペプチドを発現するのに必要な結合した調節配列を含む発現ベクターを提供する。このような調節配列として、例えば、プロモーター、終結配列およびエンハンサーが挙げられる。
別の関連態様では、本発明は、上記の核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。このような宿主細胞は、必要な増殖条件下、適当な培地中で培養される場合、核酸またはベクターが所望のポリペプチド／タンパク質の発現において有効となる形で核酸またはベクターを含むようにトランスフェクトまたは形質転換されている。使用される宿主細胞は、使用されるベクターによってトランスフェクトし、本発明のＤＮＡを発現することができる限りは、特に限定されない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母およびＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞などを使用できる。本発明とともに使用するのに適した、原核生物の宿主細胞の例として、大腸菌が挙げられる。真核細胞の宿主細胞の例として、トリ、昆虫、植物および動物細胞、例えば、ＣＯＳ７、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００８０】
形質転換体又はトランスフォームした細胞により、本発明の薬剤、例えば融合タンパク質、抗体又は抗体断片は、細胞内又は培養媒体中で生成される。次いで、産生された抗体（または抗体断片）を回収することによって、本発明の第１の態様の薬剤を得ることができる。得られた抗体またはタンパク質は、方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーなどを適当に組み合わせることによって単離および精製できる。
【００８１】
例えば、細胞は適切な媒体中で培養され、消費した媒体は抗体源として使用できる。場合によって、マトリックスコーティングしたチャンネルまたはビーズおよび細胞共培養物を含め、抗体産生細胞の増殖を増強してもよい。多量の抗体の製造のためには、通常、腹水を得ることがより都合がよい。腹水を産生させる方法は、通常、ハイブリドーマ細胞を免疫学的に未処置の組織適合性または免疫寛容哺乳類、特に、マウスに注射するステップを含む。哺乳類は、場合によって、適した組成物、例えば、プリスタンの事前投与によって腹水産生のために抗原刺激される。本発明の抗体はまた、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）前掲に記載される慣例の組換え法を用いることによって得てもよい。例えば、本発明の核酸配列は、適した発現ベクター（転写のための制御配列、例えば、プロモーターを含む）にクローニングできる。次いで、発現ベクターを宿主細胞に入れる。宿主細胞を、ポリヌクレオチドが転写され、タンパク質に翻訳されるような適した条件下で増殖させる。本発明の抗体の重鎖および軽鎖は別個に産生させ、次いで、ジスルフィド結合再配列によって組み合わせてもよい。あるいは、本発明の抗体の各鎖をコードする別個のポリヌクレオチドを有するベクターまたは別個の転写物として両鎖をコードする単一のポリヌクレオチドを有するベクターを、単一の宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、次いで、宿主細胞が、全分子を産生し、組み立て得る。宿主細胞は、分子の正常な炭水化物相補体を提供し得る高等真核細胞であることが好ましい。したがって、宿主細胞において融合タンパク質または抗体が産生され、当技術分野で標準の技術を用いて精製できる。
【００８２】
本発明の更なる態様では、例えば、図１、２または３に示される配列を有するＲＡＭＰタンパク質、または前記核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、図１、２または３に示されるアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドをコードする核酸分子の発現レベルを調べるアッセイが提供され、この方法は、
ｉ）単離された細胞サンプルを、ＲＡＭＰタンパク質をコードする核酸分子と結合する結合物質（複数可）と接触させるステップと、
ｉｉ）前記サンプルにおける前記核酸分子の発現を標準サンプルと比較するステップと
を含む。
結合物質（複数可）は、図１、２または３中のアミノ酸配列によって表される前記ポリペプチドと特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーおよび抗体から選択できる。一実施形態では、アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００８３】
本発明の一態様では、患者におけるガンを同定するための診断アッセイであって、
ｉ）単離された細胞サンプルを提供するステップと、
ｉｉ）（ｉ）におけるサンプルを、図１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または本明細書で定義されるその断片または変異体をコードする核酸分子または前記核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、図１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドをコードする核酸分子と結合する結合物質（複数可）と接触させるステップと、
ｉｉｉ）正常な対応する対照サンプルと比較した場合の、前記サンプル中の前記核酸分子の発現を調べるステップと
を含む診断アッセイが提供される。
本発明の好ましい一実施形態では、前記結合物質（複数可）は、オリゴヌクレオチドプライマーである。前記アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応であることが好ましい。本発明の代替の好ましい実施形態では、前記結合物質は、図１、２もしくは３中のアミノ酸配列によって表される前記ポリペプチドまたは少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって参照アミノ酸配列から変わっているアミノ酸配列を含むポリペプチド変異体と特異的に結合する抗体である。
【００８４】
本発明の更なる態様は、
ａ）図１、２または３に示される核酸配列からなる核酸分子、
ｂ）上記（ｉ）の核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるＲＡＭＰタンパク質の活性を調節する薬剤についてスクリーニングする方法を提供し、
前記方法は、細胞表面にＲＡＭＰタンパク質を発現する細胞を、試験化合物と接触させるステップと、試験化合物の、ＲＡＭＰタンパク質の活性を調節する能力を調べるステップとを含む。
【００８５】
本開示は、ＣＲＬＲ機能を変調させる薬剤の同定におけるＲＡＭＰタンパク質の使用を提供し、ＲＡＭＰタンパク質は、
ｉ）図１、２または３によって示される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはその変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるポリペプチド、および
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重する核酸を含むポリペプチド
からなる群から選択される。
本開示内容はまた、ＣＲＬＲと、
ｉ）図１、２または３に示される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはその変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるポリペプチド、および
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重する核酸を含むポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤の同定におけるＣＲＬＲの使用を提供する。し、ＲＡＭＰタンパク質は、
ｉ）図１、２または３によって示される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはその変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるポリペプチド、および
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重する核酸を含むポリペプチド
からなる群から選択される。
本開示内容はまた、ＣＲＬＲと、
ｉ）図１、２または３に示される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはその変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるポリペプチド、および
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重する核酸を含むポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤の同定におけるＣＲＬＲの使用を提供する。
【００８６】
本発明の更なる態様によれば、図１、２又は３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、もしくは本明細書で定義されるその断片もしくは変異体をコードする核酸分子と特異的に反応する結合物質または図１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、もしくは本明細書で定義されるその断片もしくは変異体と特異的に反応する薬剤を含むキットが提供される。
本発明の好ましい一実施形態では、前記キットは、前記核酸分子または前記ポリペプチドと特異的に反応するオリゴヌクレオチドまたは抗体をさらに含む。
前記キットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび核酸の増幅を実施するのに必要な成分を含むことが好ましい。前記キットは、前記ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、核酸を制御するための一連の機器を含むことが好ましい。
【００８７】
本発明の代替的な好ましい実施態様では、前記キットは図１、２又は３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または本明細書で定義されるその断片または変異体と特異的に反応する抗体を含む。
前記キットは、例えば、前記ポリペプチド（複数可）と特異的に結合する一次抗体と特異的に反応する二次抗体および前記二次抗体の前記一次抗体との結合を検出するために必要な酵素試薬を含めた、イムノアッセイを実施するのに必要な成分を含むことが好ましい。
【００８８】
本発明の更なる態様によれば、
ａ）図１、２または３に示される核酸配列からなる核酸分子、
ｂ）上記（ｉ）の核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの活性を調節する薬剤についてスクリーニングする方法が提供され、
この方法は、
（ｉ）ポリペプチドまたはその配列変異体と、試験される少なくとも１種の薬剤を含む調製物を形成するステップと、
（ｉｉ）前記ポリペプチドの活性に対して前記薬剤の活性を調べるステップと
を含む。
【００８９】
ＲＡＭＰ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に相当する図４から６（図７から９を含む）に示すアミノ酸配列は、ＲＡＭＰのＣＲＬＲへの結合の変調等を介してＣＲＬＲ機能を変調する分子の構造ベースの設計に使用できる。このような「構造ベースの設計」はまた、「合理的薬物設計」としても知られている。ＲＡＭＰ  ＥＣＤは、例えば、すべて周知の方法である、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴または相同性モデリングによって三次元分析できる。分子モデリングソフトウェアシステムにおける構造情報の使用もまた、本発明によって包含される。このようなコンピュータ支援モデリングおよび薬物設計は、例えば、分子の化学的コンホメーション解析、静電ポテンシャル、タンパク質フォールディングなどの情報を利用し得る。本発明の１つの特定の方法は、標的の結合する可能性が高い部位について、ＲＡＭＰ  ＥＣＤの３次元構造を分析するステップと、予測反応部位を組み込む新規分子を合成するステップと、上記の新規分子をアッセイするステップとを含むことができる。
本発明の好ましい方法では、前記薬剤はアンタゴニストである。本発明のスクリーニング法によって同定される薬剤は、抗体、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、小さい有機分子、（例えば、ペプチド、環状ペプチド）および本明細書に開示されるポリペプチドのドミナントネガティブ変異体を含み得る。
【００９０】
上記したように、本発明は、或る実施態様において、ここに記載したポリペプチドから誘導される「ドメインネガティブ」ポリペプチドも提供する。ドミナントネガティブポリペプチドとは、細胞機構と相互作用することによって、細胞機構とのその相互作用から活性タンパク質と置き換わるか、または活性タンパク質と競合し、それによって活性タンパク質の作用を低減する、タンパク質の不活性変異体である。例えば、リガンドと結合するが、リガンドの結合に応じてシグナルを伝達しないドミナントネガティブ受容体は、リガンドの発現の生物学的効果を低減し得る。同様に、標的タンパク質と正常に相互作用するが、標的タンパク質をリン酸化しないドミナントネガティブな触媒的に不活性のキナーゼは、細胞シグナルに応じた標的タンパク質のリン酸化を低減し得る。同様に、遺伝子の制御領域中の別の転写因子と、またはプロモーター部位と結合するが、遺伝子転写を増大しないドミナントネガティブ転写因子は、転写を増大することなくプロモーター結合部位を占有することによって正常な転写因子の作用を低減し得る。
【００９１】
当業者は、本開示によるペプチド薬剤のアミノ酸配列の修飾が、標的配列に対するペプチドの結合性及び／又は安定性を向上させうる事を理解するであろう。さらに、ペプチドの改変はまた、ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増大し、それによって、本明細書に開示されるポリペプチドの活性を阻害するのに必要なペプチドの有効量を低減し得る。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得る望ましくない副作用を低減し、有利である。改変として、制限ではなく例として、アセチル化およびアミド化が挙げられる。あるいは、または好ましくは、前記改変は、組換えまたは合成型のペプチドの製造における改変されたアミノ酸の使用を含む。当業者には明らかであろうが、改変されたアミノ酸として、例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、Ｎ６−アセチルリシン、Ｎ６−メチルリシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルリシン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチルリシン、シクロヘキシアラニン、Ｄ−アミノ酸、オルニチンが挙げられる。その他の改変として、ハロ（例えば、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、ヒドロキシまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択される１、２または３個の置換基によって場合によって置換されていてもよいＣ２、Ｃ３またはＣ４アルキルＲ基を有するアミノ酸が挙げられる。また、ｐ５３結合活性を保持するペプチドは、環化によって改変され得るということも当業者には明らかである。環化は当技術分野で公知である（ＳｃｏｔｔらＣｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  （２００１年）、８：８０１〜８１５頁；ＧｅｌｌｅｒｍａｎらＪ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ（２００１年）、５７：２７７〜２９１頁；ＤｕｔｔａらＪ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ（２０００年）、８：３９８〜４１２頁；ＮｇｏｋａおよびＧｒｏｓｓ  Ｊ  Ａｍｅｒ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ（１９９９年）、１０：３６０〜３６３頁参照のこと。
【００９２】
更なる態様において、本発明は、ＣＲＬＲ機能を変調させる薬剤の同定におけるポリペプチドの使用を提供し、ポリペプチドは、
ｉ）図１、２または３に示される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはその変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるポリペプチド、および
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重する核酸を含むポリペプチド
からなる群から選択される。
本発明のなおさらなる態様は、ＣＲＬＲと、
ｉ）図１、２または３によって示される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはその変異体、
ｉｉ）上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるポリペプチド、および
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重する核酸を含むポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤の同定におけるＣＲＬＲの使用を提供する。
【００９３】
医薬的方法、製造物の使用
他の態様では、本発明は、前記した試薬の医薬としての使用を提供する。更なる態様では、前記の試薬を含有する医薬組成物を提供する。組成物は、少なくとも一つの付加的な製薬上許容される成分、例えば、賦形剤、希釈剤又は担体を含んでいてもよい。好ましくは、組成物は、非経口投与を意図するものである。特別な実施態様では、組成物は、抗体、例えばＲＡＭＰ−３タンパク質に結合する抗体である試薬を含む。
【００９４】
保護の範囲は、それらが実際にそのような試薬を含有するか否かに関わりなく、そしてそのような試薬が製薬上有効な量で含まれているか否かに関わりなく、本発明の試薬を含む又は含むことを意図した偽の又は不正な製造物を含む。従って、パッケージが本発明の化学種又は組成物を含むことを表示した記載又は指示を含むパッケージ、及びそのような組成物又は化学種である又は含む、あるいは含むことを意図した製造物は、保護の範囲に含まれる。
【００９５】
本発明の更なる実施態様では、本発明の試薬を含有する医薬組成物が提供される。好ましい実施態様では、試薬は抗体、特にＲＡＭＰ−３タンパク質に結合する抗体である。
【００９６】
本明細書の開示には、図４、５又は６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はそれらの断片又は変異体ポリペプチドであって、前記変異体が図４、５又は６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基の少なくとも１つの付加、欠失又は置換によって修飾され、前記変異体ポリペプチドがＣＲＬＲ機能を変調させるものを含有する組成物が含まれる。
【００９７】
本明細書で使用する「図４、５又は６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片」は、１〜５０アミノ酸、例えば１〜３０アミノ酸、例えば１〜３０アミノ酸を含む断片を含む。図４、５又は６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片は、図７、８又は９に示されるアミノ酸配列又は変異体ポリペプチドであって、前記変異体が図７、８又は９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基の少なくとも１つの付加、欠失又は置換によって修飾され、前記変異体ポリペプチドがＣＲＬＲ機能を変調させるものを含んでいてもよい。
【００９８】
また、本明細書の開示は、
ｉ）図４、５又は６に示される核酸配列の全部又は一部を含む核酸分子；
ｉｉ）上記（ｉ）の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ポリペプチドをコードする核酸分子であって、そのポリペプチドがＣＲＬＲ機能を変調させる核酸分子からなる群から選択される、ワクチンとして使用するための核酸分子を含有する医薬組成物を含む。
【００９９】
本明細書の開示は、図４、７、８又は９に示される核酸配列を含む核酸分子を含有する組成物も想定している。
本発明の好ましい実施態様では、前記組成物はアジュバント及び／又はキャリアを含む。
【０１００】
アジュバントは、免疫細胞の活性を変調させることにより抗原に対する特異的な免疫反応を増強する物質又は手段である。アジュバントの例は、例示のみだが、フロイントアジュバント、ムラミールジペプチド、リポソームを含む。キャリアは、第二の分子に結合したときに、後者に対する免疫反応を増強する免疫原性分子である。幾つかの抗原は本来的に免疫原性ではなく、外来タンパク質分子、例えばキーホール−リンペットヘモシアニン又は破傷風トキソイドと結合したときに抗体反応を生じさせる。そのような抗原は、Ｂ細胞エピトープを含むがＴ細胞エピトープは含まない。そのような複合体のタンパク質部分（「キャリア」タンパク質）は、ヘルパーＴ細胞を刺激するＴ細胞エピトープを提供し、それは翻って抗原特異的Ｂ細胞のプラズマ細胞への分化を刺激して、抗原に対する抗体を産生する。ヘルパーＴ細胞は、他の免疫細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞も刺激し、キャリアは細胞媒介免疫性並びに抗体の産生において類似の役割を果たし得る。
【０１０１】
投与時には、本発明の薬剤組成物および製剤は、製薬上許容される調製物で投与される。このような調製物は、製薬上許容される濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合性担体、補充性の免疫増強剤、例えば、アジュバントおよびサイトカインならびに、場合によってその他の治療薬（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メルファラン、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｌｉｎｅ）、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンＣ、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｇ−ＣＳＦ、エトポシド、コルヒチン、デフェロキサミン（ｄｅｒｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）メシレートおよびカンプトセシンを、通常、含み得る。
本発明の組成物および製剤は、注射を含めた任意の従来の経路によって、または経時的な段階的注入によって投与してよい。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下または経皮であり得る。抗体を治療的に使用する場合には、１つの特定の投与経路として、肺のエアゾールによるものがある。抗体を含むエアゾール送達系を調製するための技術は、当業者には周知である。一般に、このような系は、抗体の生物学的特性、例えば、パラトープ結合能（例えば、参照により組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年、１６９４〜１７１２頁中、ＳｃｉａｒｒａおよびＣｕｔｉｅ、「Ａｅｒｏｓｏｌｓ」参照のこと）を大きくは損なわない成分を利用すべきである。当業者ならば、過度の実験に頼ることなく、抗体エアゾールを作製するための種々のパラメータおよび条件を容易に決定できよう。
【０１０２】
本発明の組成物および製剤は、通常、有効量で投与される。「有効量」とは、単独またはさらなる用量と一緒に、所望の応答を引き起こす組成物の量である。癌などの特定の疾患を治療する場合には、所望の応答として、疾患の進行の阻害がある。これは、疾患の進行を一時的に単に減速することを含み得るが、より好ましくは、疾患の進行を恒久的に停止することを含む。これは、常法によってモニターでき、または本明細書で検討される本発明の診断法に従ってモニターできる。
対象に投与される薬剤の用量は、種々のパラメータに一致して、特に、使用される投与様式および対象の状態に一致して選択できる。その他の因子として、所望の治療期間が挙げられる。対象における応答が、適用された初期用量では不十分である事象では、高用量（または異なる、より限局化された送達経路によって事実上高い用量）を、患者の耐容性が許容する限り、使用してもよい。
【０１０３】
一般に、抗体の用量は、当技術分野における任意の標準的な手順に従って、約１ｎｇ〜約１ｍｇの間、好ましくは、１０ｎｇ〜１００μｇの間の用量で製剤され、投与される。核酸またはその変異体が使用される場合には、標準的な手順に従って、通常、１ｎｇ〜０．１ｍｇの間の用量が製剤され、投与される。組成物の投与のためのその他のプロトコールは、当業者には公知であり、それでは、投薬量、注射スケジュール、注射部位、投与様式（例えば、骨内）などは前記のものとは異なる。ヒト以外の哺乳類への組成物の投与（例えば、試験目的のまたは獣医治療目的の）は、上記と実質的に同様の条件下で実施する。本明細書で使用する場合、対象とは、哺乳類、好ましくはヒトであり、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類を含む。
投与時には、本発明の医薬品および製剤は、製薬上許容される量で、製薬上許容される組成物中で適用される。用語「製薬上許容される」とは、有効成分の生物活性の有効性に干渉しない非毒性材料を意味する。このような調製物は、塩、緩衝剤、保存料、適合性担体および場合によってその他の治療薬を、通常、含み得る。医薬において使用される場合には、塩は製薬上許容されるべきであるが、便宜上、製薬上許容されない塩を用いて、その製薬上許容される塩を調製することもあり、本発明の範囲から排除されない。このような薬理学上および製薬上許容される塩として、それだけには限らないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、製薬上許容される塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製してもよい。
【０１０４】
薬剤組成物および製剤は、必要に応じて、製薬上許容される担体を含むことができる。本明細書で使用する場合、用語「製薬上許容される担体」とは、ヒトに投与するのに適している、１種または複数の適合性固体または液体増量剤、希釈剤または封入物質を意味する。用語「担体」とは、適用を容易にするために有効成分と組み合わされる天然または合成の、有機または無機成分を示す。薬剤組成物の構成要素はまた、所望の製薬上の有効性を実質的に損なう相互作用がないような方法で、本発明の分子と、また互いに混合され得る。
薬剤組成物および製剤は、適した緩衝剤、例えば、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、塩でのリン酸を含み得る。薬剤組成物および製剤はまた、場合によって、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの適した保存料を含み得る。
経口投与に適した組成物は、各々、所定量の活性化合物を含有する、カプセル剤、錠剤、トローチ剤などの個別の単位として提示され得る。その他の組成物として、水性液または非水性液中の懸濁液、例えば、シロップ剤、エリキシル剤またはエマルジョン剤が挙げられる。
【０１０５】
非経口投与に適した組成物は、好ましくは、レシピエントの血液と等張である、抗体または核酸の滅菌水性または非水性調製物を含むことが好都合である。この調製物は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用い、公知の方法に従って製剤できる。滅菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈液または溶媒中の、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、滅菌注射用溶液または懸濁液であり得る。許容されるビヒクルおよび使用してよい溶媒の中には、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌硬化油が、溶媒または懸濁媒として従来使用されている。この目的のために、合成モノまたはジ−グリセリドをはじめ、任意の無刺激性硬化油を使用してもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も、注射用物質の調製において使用してよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内、などの投与に適した担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見ることができる。
本発明のさらなる態様は、医薬として使用するための、本明細書で定義される薬剤または組成物を提供する。医薬品として使用するための好ましい薬剤として、抗体生成物、例えば、抗体または抗体断片がある。特定の薬剤として、ＲＡＭＰ−３と結合する抗体生成物がある。特に、抗体生成物は、ヒトＲＡＭＰ−３タンパク質と結合する。
【０１０６】
本発明の一態様では、本開示内容の薬剤を用いて癌を治療できる。本発明のさらなる態様によれば、対象において癌を治療する方法であって、本発明の薬剤の有効量を投与するステップを含む方法が提供される。本発明の好ましい方法では、前記対象はヒトである。
本発明のさらなる態様によれば、癌に対して動物を免疫化する方法であって、本発明の組成物の有効量を投与するステップを含む方法が提供される。本発明の好ましい方法では、前記動物はヒトである。
【０１０７】
本明細書において、用語「癌」とは、自己増殖のための能力、すなわち、迅速に増殖する細胞増殖を特徴とする異常な状況または状態を有する細胞を指す。この用語は、すべての種類の癌性増殖または発癌プロセス、転移組織または悪性に形質転換された細胞、組織または臓器を、病理組織学的種類または侵襲性のステージに関わらず、含むものとする。用語「癌」は、種々の臓器系の悪性腫瘍、例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸管および泌尿生殖器に影響を及ぼすものならびにほとんどの結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌などの悪性腫瘍を含む腺癌を含む。用語「癌腫」とは、当技術分野で承認されており、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍、例えば、呼吸器系の癌腫、胃腸系の癌腫、泌尿生殖器系の癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫および黒色腫を指す。例示的癌腫として、子宮頚部、肺、前立腺、乳房、頭頚部、結腸および卵巣の組織から形成されるものが挙げられる。
用語「癌腫」はまた、癌肉腫も含み、例えば、癌性および肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む。「腺癌」とは、腺性組織に由来する癌腫または腫瘍細胞が認識可能な腺性構造を形成する癌腫を指す。用語「肉腫」は、当技術分野で承認されており、間葉誘導の悪性腫瘍を指す。さらなる種類の癌として、白血病、皮膚癌、頭蓋内癌および脳癌が挙げられる。
【０１０８】
癌の病理生物学におけるＡＭの特異的な活性は、５つの領域の作用、すなわち、癌細胞増殖の刺激、免疫応答の間接的な抑制、血管新生の促進、侵襲性腫瘍表現型の奨励およびアポトーシス生存因子に分類される。したがって、本発明の薬剤または組成物は、例えば、血管新生または癌細胞増殖の阻害による癌性状態の治療、遅延および／または予防において有用であり得る。
本開示内容の薬剤を含む薬剤製剤は、化学療法薬と連続して、または実質的に同時にのいずれかで組み合わせて投与してよい。
【０１０９】
本発明の一態様では、本発明の薬剤および／または組成物または薬剤を含む製剤を用いて、骨粗しょう症を治療できる。したがって、本発明の一態様によれば、対象において骨粗しょう症を治療する方法であって、本発明の薬剤の有効量を投与するステップを含む方法が提供される。本発明の好ましい方法では、前記対象はヒトである。
本発明のさらなる態様では、本発明の薬剤および／または薬剤を含む組成物または製剤を用いて、肥満症を治療、例えば、そのレベルを低減できる。また、薬剤を、肥満症の治療のための医薬の製造に用いてもよい。したがって、本発明の一態様によれば、対象において肥満症を治療する方法であって、本発明の薬剤の有効量を投与するステップを含む方法が提供される。本発明の好ましい方法では、前記対象はヒトである。
【０１１０】
また、本発明の一態様として、血管障害、例えば、糖尿病性血管障害、微小血管障害および大血管障害から選択される血管障害を治療または低減する医薬の製造のための、本明細書に記載される薬剤の使用が含まれる。血管障害、例えば、糖尿病性血管障害を治療する方法であって、本発明の薬剤を対象に投与するステップを含む方法が、本発明の一態様として含まれる。
本発明のさらなる態様では、本発明の薬剤および／または薬剤を含む組成物または製剤を用いて、炎症性障害および／または炎症反応を治療できる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、対象において炎症性障害を治療する方法であって、本発明の薬剤の有効量を投与するステップを含む方法が提供される。本発明の好ましい方法では、前記対象はヒトである。
【０１１１】
炎症性障害は、アテローム性動脈硬化症、リウマチ関節炎、変形性関節症、痛風、紅斑性狼瘡、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎および皮膚筋炎、脈管炎、髄炎、滑膜炎、細菌性心内膜炎、骨髄炎、乾癬、肺炎、線維性肺胞炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、肺気腫、ケイ肺症、塵肺症、結核、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群および重症筋無力症、乳腺炎、蹄葉炎、喉頭炎、慢性胆嚢炎、橋本甲状腺炎および炎症性乳房疾患からなる群から選択され得る。一実施形態では、炎症性障害は、移植後の組織または臓器拒絶の結果であり得る。特定の実施形態では、炎症性障害は、アテローム性動脈硬化症、リウマチ関節炎、変形性関節症、敗血症および多発性関節炎からなる群から選択される。
患者が罹患しているか、罹患のリスクがあるか、罹患している疑いがある実施形態では、障害は、例えば、アテローム性動脈硬化症などの炎症性疾患の結果としての血栓症、心筋梗塞、卒中、一過性脳虚血発作、閉塞性末梢血管疾患、末梢動脈の閉塞およびその合併症からなる群から選択される。
【０１１２】
本明細書にはまた、アテローム性動脈硬化性障害の実際の部位または疑われる部位への本発明の薬剤の局所投与が開示されている。このような投与は、アテローム性動脈硬化性障害、例えば、破裂し得るアテローム斑に罹患している、罹患していると疑われる患者の治療において有用であり得る。投与はカテーテルによるものであり得る。
本発明の薬剤を用いて心不全を治療できる。また、心不全を治療するための医薬の製造のための本明細書に記載される薬剤の使用も提供される。
【０１１３】
本発明のさらなる態様では、本発明の薬剤、および／または薬剤を含む組成物または製剤を用いて、敗血症を治療できる。薬剤はまた、敗血症の治療のための医薬の製造のために使用できる。したがって、本発明の態様によれば、対象において敗血症を治療する方法であって、本発明の薬剤の有効量を投与するステップを含む方法が提供される。本発明の好ましい方法では、前記対象はヒトである。
本発明の一実施形態では、薬剤は、創傷の治療において有用であり得る、すなわち、創傷治癒の補助において有用である。本発明のさらなる態様は、対象において創傷を治療する方法であって、本発明の薬剤の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。本発明の好ましい方法では、前記対象はヒトである。また、創傷を治療するための医薬の製造のための本発明の薬剤の使用も提供される。
【０１１４】
本明細書において、「創傷」の治療とは、とりわけ、潰瘍および病変、例えば、切り傷またはやけどのような皮膚の創傷およびそれと関連している状態の治療を含む。
本明細書において、「治療」とは、治療されている個体または細胞の自然経過を変更しようと企てた臨床介入を指し、予防のため、または臨床病理の過程の間のいずれで実施してもよい。望ましい効果として、疾患の発症または再発を防ぐこと、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の減少、疾患進行速度の低下、病状の寛解または緩和および緩解または予後の改善が挙げられる。本明細書において、用語「治療」とは、示された状態／障害の治療および予防を含むものとする。
【０１１５】
さらに、
（１）本明細書に記載される薬剤、および
（２）本明細書に記載される方法において薬剤を使用するための使用説明書
を含むパッケージまたはキットオブパーツ（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）が提供される。
本明細書で定義されるパッケージは、反復投薬のために提供するための２以上の投与量単位を含むことができる。２以上の投与量単位が存在する場合には、このような単位は、活性薬剤組成物の用量および／または物理的形態の点で同一である場合もあるし、異なっている場合もある。
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」ならびにこの変形、例えば「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、それに制限しない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）こと」を意味し、その他の部分、付加物、構成要素、整数またはステップを排除することを意図しない（また、排除しない）。
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解釈されない限り、単数形は、複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合は、本明細書では、文脈上他の意味に解釈されない限り、単数だけでなく複数をも企図するものと理解されるべきである。
本発明の特定の態様、実施形態または実施例とともに記載される、特長、整数、特徴、化合物、化学部分または基は、矛盾しない限りは、本明細書に記載される任意のその他の態様、実施形態または実施例に適用可能であると理解されるべきである。
本発明の実施形態を、以下、単に例として、以下の図ならびに材料および方法を参照して記載する。
【０１１６】
実施例
ＲＡＭＰ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質の生成
Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｔｏｙｏｂｏ）からのＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼキットを用いた高品位ＰＣＲを使用してＲＡＭＰのＥＣＤ領域を生成した。テンプレートＤＮＡは、購入したヒト脳ｃＤＮＡサンプル（Ａｍｂｉｏｎ）から得た。
各５０μｌ反応液について、室温又は氷上の０．５ｍｌのＰＣＲチューブに以下のものを入れた：
２７．５μｌ  ＰＣＲグレードＨ２Ｏ
２．５μｌ  ＤＭＳＯ
５μｌ  １０×ＰＣＲバッファー：ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼについて
５μｌ  ｄＮＴＰｓ（最終濃度０．２ｍＭ）
２μｌ  ＭｇＳＯ４（最終濃度１ｍＭ）ｌμｌテンプレートＤＮＡ
３μｌ  ５’プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ，最終濃度０．３μＭ）
３μｌ  ３’プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ，最終濃度０．３μＭ）
１μｌ  ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）
５０μｌ  全容量
【０１１７】
この反応を２回実施し、第１の反応は以下のプライマーを用いて全ＲＡＭＰ  ＥＣＤより大きな領域を単離するために実施した：
ＲＡＭＰ１
フォワード
ＣＧＡＧＣＧＧＡＣＴＣＧＡＣＴＣＧＧＣＡＣ
リバース
ＣＴＴＣＣＴＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣ
ＲＡＭＰ２
フォワード
ＧＴＣ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＣＴ  ＧＣＴ
リバース
ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＡＧＴＡＡＣＡＴＧ  ＧＴＴＡＴＴ  ＧＴ
ＲＡＭＰ３
フォワード
ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＧＣ
リバース
ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＧＧＣ
反応物は、ＱＩＡＧＥＮ  ＱｉＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット標準プロトコールを用い、ベンチトップ遠心分離を使用して精製した。
【０１１８】
第２のＰＣＲ反応は、上記のプライマーを用いた反応の生成物を使用した。以下のプライマーを用い、これたのプライマーは挿入されたＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨｌ制限部位を有していた：
ＲＡＭＰｌ
フォワード
ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧ
リバース
ＧＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡ
ＲＡＭＰ２
フォワード
ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＡＧＧ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  Ｃ
リバース
ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴＡＣＡ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＡＴＧ
ＲＡＭＰ３
フォワード
ＣＡＧ  ＡＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  Ｇ
リバース
ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧ  ＣＣＡ  ＧＣＣＡＴＧ  ＧＣＧ  ＡＣＡ  ＧＴ
この反応からのサンプルは、ＱＩＡＧＥＮ  ＱｉＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用い、ベンチトップ遠心分離を使用して精製した。
生成物のサイズを最初にスクリーニングするため、それらを１．５％臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲル上を、２００ｖで３０分間走らせた。生成物をＳｉｇｍａ社から入手可能な標準マーカーに対して比較した。
生成物の遺伝子配列決定を実施し、生成物を最終決定した。
この点より前のＥＣＤタンパク質は、特に断らない限り「挿入物」と呼ぶ。
【０１１９】
挿入物及びベクターの調製
１．制限
（これらの量は、１μｇのＤＮＡ濃度に基づく）
制限反応は、以下のプロ値コールを用いて挿入物及びベクター（ｐＧＥＸ−６Ｐ１）の両方で実施した。
１μｌ  ＤＮＡ
２μｌ  ｌ０×バッファーＥ
２μｌ  １０×ＢＳＡ
１μｌ  ＢａｍＨ−１
１μｌ  ＥｃｏＲ−１
１３μｌ  ＤＮａｓｅフリーＨ２Ｏ
２０μｌ  全容量
この反応物を、３７℃で１時間又は１６℃で終夜のいずれかでインキュベートした。
この反応からの生成物をＱＩＡＧＥＮ  ＱｉＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用い、ベンチトップ遠心分離標準プロトコールを使用して精製した。
【０１２０】
２．ベクター脱ホスホリル化
これらの量は、ｌμｇのＤＮＡ濃度に基づく。
１μｌ  ＤＮＡ  
１μｌ  ｌ０×アンタークティックホスファターゼ反応バッファー
１ｕｌ  アンタークティックホスファターゼ
７μｌ  ＤＮａｓｅフリーＨ２Ｏ
１０μｌ  全容量
３７℃で１時間インキュベーション。
【０１２１】
３．ライゲーション（プラスミド＋挿入物）
これらの量は、ｌμｇのＤＮＡ濃度に基づく。
１μｌ  ベクター
１μｌ  挿入物ＤＮＡ
５μｌ  ×２  ライゲーションバッファー
１μｌ  Ｔ４リガーゼ
２μｌ  ＤＮａｓｅフリーＨ２Ｏ
１０μｌ  全容量
１６℃で終夜インキュベーション。
【０１２２】
ライゲーション反応からの全容量は以下のステップで用いた：
１０μｌ  ＤＮＡ
１０μｌ  ×ｌＯトランスフォーメーションバッファー
１００μｌ  Ｅ−Ｃｏｌｉ（ＴＯＰ１０）コンピテント細胞
７０μｌ  ＤＮａｓｅフリーＨ２Ｏ
２００μｌ  全容量
×１０  トランスフォーメーションバッファー（３００ｍＭ  ＭｇＣＩ２，１００ｍＭ  ＣａＣＩ２）
６．５ｍｌ  蒸留水
０．５ｍｌ  ２Ｍ  ＣａＣｌ２
３．０ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２
１０ｍｌ  全容量
１．氷上に２０分間置く。
２．室温に１０分件置く。
３．１ｍｌのＬＢブロスベース（ＬＥＮＮＯＸ  Ｌ  ブロスベース）を添加する。
４．３７℃で１時間インキュベーション。
５．１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上にサンプルを拡げる。
６．３７℃で終夜インキュベーション。
【０１２３】
培養
プレートからのコロニーをピックアップし、１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢブロスベース（ＬＥＮＮＯＸ  Ｌ  ブロスベース）に入れ、次いで、振盪インキュベータに３７℃で終夜配置した。
培養物をＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｐｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）標準プロトコールを用い、テーブルトップ遠心分離を使用して清浄化した。
トランスフォーメーションが有効に起こったことを確認するため、プラスミドのサンプル上で遺伝子配列決定を実施した。
【０１２４】
タンパク質発現
以下のプロトコールに従ってタンパク質発現を行った。
トランスフォーメーション
１μｌ  ＤＮＡ（１〜１０ｎｇ）
１０μｌ  ×１０トランスフォーメーションバッファー
１００μｌ  Ｅ−Ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）コンピテント細胞
８９μｌ  蒸留Ｈ２Ｏ
２００μｌ  全容量
１．氷上に２０分間置く。
２．室温に１０分間置く。
３．１ｍＩのＬＢブロスベース（ＬＥＮＮＯＸ  Ｌブロスベース）を添加する。
４．３７℃で１時間インキュベーション。
５．１０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上にサンプルを拡げる。
３７℃で終夜インキュベーション。
細胞を培養するのに以下のプロトコールを用いた。
【０１２５】
培養
コロニーを採取して５ｍｌ  ２×ＹＴＡ媒体（１０μｇ／ｍｌアンピシリン）に配する。
２×ＹＴＡ媒体
１６ｇ  トリプシン
１０ｇ  イースト抽出物
５ｇ  ＮａＣＩ
９００ｍｌ  蒸留Ｈ２Ｏ
ｐＨ７はＮａＯＨで調節した。全容量は、蒸留Ｈ２Ｏで１Ｌに調整し、オートクレーブで滅菌した。１０μｇ／ｍｌの濃度のアンピシリンを添加した。以下のプロトコールステップを続けた：
１．振盪インキュベータで３７℃において２時間インキュベートした。
２．１５０μｌの１００ｍＭ  ＩＰＴＧを培地に添加した。
３．振盪インキュベータで３７℃において更に４〜８時間インキュベートした。
【０１２６】
タンパク質抽出
タンパク質は、Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用し、標準的プロトコールを用いて抽出した。これは、プロテアーゼ阻害剤を添加する付加的ステージを含む。可溶性及び不溶性の両方の画分を保存して分析した。
タンパク質の確認
このプロセスは、抗−ＧＳＴ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたウェスタンブロットを使用して実施した。ウェスタンブロットは、抗−ＧＳＴ抗体プロトコールに述べられているように実施した。
【０１２７】
タンパク質精製
大規模タンパク質製造は２Ｌ培地を用いて実施した。
タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合システムを用いて精製した。
ＧＳＴは天然にＭｒ２６，０００で生じ、それはＥ．ｃｏｌｉ中で全酵素活性をもって発現され得る。ＧＳＴ融合タンパク質は、細菌溶解物から固定化グルタチオンを用いたアフィニティクロマトグラフィにより精製される。ＧＳＴ融合タンパク質は、アフィニティ媒体により捕捉され、洗浄により不純物が除去される。融合タンパク質は、還元されたグルタチオンを用いてマイルドで非変性的条件下で溶離される。サンプルの精製にＧＳＴｒａｐ  ＨＰ  ５ｍｌカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる。
精製プロセスは、タンパク質抗原性及び機能を保存する。ひとたび溶離されると、ＧＳＴは部位特異的プロテアーゼを用いてタンパク質から切断される。このプロセスは、ＧＳＴ遺伝子融合システムハンドブック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に述べられているように実施される。
上記の精製方法は、分別精製のプロセスを付加されてもよい。ひとたびタンパク質が精製されると、ペプチドの接合形態が送られてモノクローナル抗体の生成に使用される。ン起こりのタンパク質溶液は特異的なプロテアーゼで処理されＧＳＴタグが除去される。
【０１２８】
機能試験ＥＣＤタンパク質
ＭＧ６３ヒト骨芽細胞様細胞をｓｉＲＮＡでマニピュレートして種々のＰＡＭＰ細胞フェノタイプを生成する：
・ＲＡＭＰ１、２及び３ネガティブ細胞、ＣＲＬＲポジティブ細胞（ライン１）。
・ＲＡＭＰ２及び３ネガティブ細胞、ＲＡＭＰ１及びＣＲＬＲポジティブ細胞（ライン２）。
・ＲＡＭＰ１及び３ネガティブ細胞、ＲＡＭＰ２及びＣＲＬＲポジティブ細胞（ライン３）。
・ＲＡＭＰ１及び２ネガティブ細胞、ＲＡＭＰ３及びＣＲＬＲポジティブ細胞（ライン４）。
ＲＡＭＰ１：ＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＡ（Ｑｉａｇｅｎ）
ＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡ（Ｑｉａｇｅｎ）
ＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡ（Ｑｉａｇｅｎ）
ＲＡＭＰ１遺伝子の性質により１つのｓｉＲＮＡは出現しないので、幾つかのｓｉＲＮＡを試験する。
ＲＡＭＰ２：ＣＵＡＵＧＡＧＡＣＡＧＣＵＧＵＣＣＡＡ（ＭＷＧ）
ＲＡＭＰ３：ＧＵＵＣＵＵＣＵＣＣＡＡＣＵＧＣＡＣＣ（ＭＷＧ）
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、ハンドブックに述べられているＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）標準プロトコールを用いて実施する。
【０１２９】
機能試験１
第１の実験は、ＥＣＤフラグメントが無傷のＲＡＭＰ細胞上でＲＡＭＰフェノタイプを生じさせるか否かを決定する（ライン１）。
・固体、黒色９６−ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中において１０４から１０６細胞／ｍｌの細胞濃度での培養（５０μｌ容量）。
・３７℃で終夜インキュベーション（５％ＣＯ２及び湿度９５％）細胞培養培地を吸引。
・ＰＢＳ中で作成した５０μｌ容量のＥＣＤ又はアゴニストを添加し、５分間曝露。
○ＥＣＤに対する容量応答性は有効濃度を決定する為に実施される。
○アゴニスト（アドレノメジュリンＡＭ、カルシトニン遺伝子関連ペプチドＣＧＲＰ）に対する容量応答性は応答がアゴニストにより誘発されるか否かを決定する為に実施される。
・ＥＣＤ及びアゴニストの両方添加時に、ｃＡＭＰ蛍光偏光（ＦＰ）バイオトラック免疫アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて個々のｃＡＭＰ反応を測定する。
・ＥＣＤ及び対応するアゴニストの用量は組み合わせ（例えば、ＲＡＭＰ１及びＣＧＲＰ）で適用され、第２のメッセンジャーが測定される（上記の通り）。
【０１３０】
機能試験２
この実験は、
Ｔｈｉｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  ｗｉｌｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＲＡＭＰ  ＥＣＤが所定のＲＡＭＰフェノタイプを再設定、例えばＲＡＭＰ１型細胞をＲＡＭＰ２型細胞に変換、する能力を決定する（ライン２、３及び４）
・用量応答曲線は、ＲＡＭＰに結合するリガンドを用いて実施される。第２のメッセンジャー反応が測定される。ＥＣ５０濃度が決定される。
・ＥＣＤ用量応答曲線は、問題とするリガンドのＥＣ５０濃度での存在下で作成される。第２のメッセンジャー反応が測定される。
・そのリガンドに対して第２のメッセンジャーの減少が見られたら、ＥＣＤに対する対応するリガンドが適用され、第２のメッセンジャー反応が測定される。
これら２ｔｕｎｏ最初の実験は、ＥＣＤ領域が生物学的活性を持つか否かを決定する助けとなる。
【０１３１】
抗体生成
ＥＣＤペプチドは上記のように発現され精製される。抗体は以下のプロトコールを用いて作成される。
マウス及びラット免疫化プロトコール
以下の免疫化プロトコールに従って、ＲＡＭＰ−３の細胞外ドメインに対する抗体が生成される：
免疫に先立って、免疫前血清をマウスから取り出した。４匹のマウスにＲＡＭＰ−３の細胞外ドメインに相当するペプチドを注射した：
１０  ２０  ３０  ４０  ５０  ６０
ＧＣＰＲＡＧＧＣＮＥ  ＴＧＭＬＥＲＬＰＬＣ  ＧＫＡＦＡＤＭＭＧＫ  ＶＤＶＷＫＷＣＮＬＳ  ＥＦＩＶＹＹＥＳＦＴ  ＮＣＴＥＭＥＡＮＷ
７０  ８０  ９０  ９９
ＧＣＹＷＰＮＰＬＡＱ  ＧＦＩＴＧＩＨＲＱＦ  ＦＳＮＣＴＶＤＲＶＨ  ＬＥＤＰＰＤＥＶＬ（図６も参照）。
注射は、約１月の間隔での、さらなる４回の注射でブーストした。マウスからのサンプル血液を採り、ポリクローナル抗体を含む血漿を分離した。
使用したアジュバントはフロインド（第１の注射には完全、残りの一連のためには不完全）。
抗原及びアジュバントは通常注射の直前にその部位で混合する。理想的には、最初から最後まで十分な抗原が与えられるが、これは常に必要なわけではない。２０％までの抗原が混合時に喪失されるが、これは許容される。
齧歯類に注射される全容量は０．２ｍｌ（好ましくはマウスについては０．１ｍｌ未満）である。この半分が抗原であり、半分がアジュバントであり、従って抗原は注射された０．１ｍｌ又は０．０５ｍｌの最大量における必要なミリグラム数を与えるのに十分な濃度である。
【０１３２】
参考として次のプロトコールが含まれる：
ウサギ免疫化プロトコール
必要ならば免疫前血清を採取する。ウサギに通常は４週間間隔で注射する。注射の間に２週間以上かつ８週間以下が経過してよい。最大全部で５注射をしてもよく、その手技は理想的には６月以内に完了する。血液サンプルを通常は第３の注射の後に採取し、免疫状態を検査する。
手技の最後に、通常はウサギを犠牲にし、血清を採取する。あるいは、動物から許容最大限の出血をさせて解放してもよい。最も通常のアジュバントはフロイント（第１の注射には完全、残りの一連のものには不完全）である。好ましい場合は、低刺激（又は無刺激）アジュバントを代わりに使用してもよい。
抗原及びアジュバントは通常注射の直前にその部位で混合する。理想的には、少なくとも４注射（好ましくは５注射）について、最初十分な抗原が与えられる。２０％までの抗原が混合時に喪失されるが、これは許容される。典型的には各動物に各場合に０．５ｍｌ以下の全容量が注射される。この半分が抗原であり、半分がアジュバントである。従って抗原は注射された０．２５ｍｌの最大量における必要なミリグラム数を与えるのに十分な濃度である。
【０１３３】
ウェスタンブロット  プロトコール
サイズマーカーとともに２本のレーンで走らせた図６の最初のＥＣＤペプチドのブロットをプローブするために抗体のウェスタンブロットを使用した。抗体１及び２は予測されるサイズの１４ＫＤａにおいてタンパク質バンドへの明らかな結合を示した。抗体３は、同じサイズで非常に強い結合を示したが、この実験ではＡＢ４は検出されなかった。
タンパク質調製（（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで決定したタンパク質抽出収率に基づく）
使用したタンパク質はＲＡＭＰ  ＥＣＤであった。１０μｌのＬａｅｍｌｌｉバッファーをマイクロチューブに添加した。ＤＴＴを添加した（５％の全容量）。１００〜１５０μｇのタンパク質を含むタンパク質サンプル容量を、他の試薬と共に添加した。次いでマイクロチューブを摂氏７０度で２分間加熱した後、氷上に配置した。
分離
１５％アクリルアミドゲル１５％を使用した。
以下のレシピに従ってランニングバッファーを作成した：
ランニングバッファー：
トリス塩基  ６０．５５
グリシン  ２８８．２７ｇ
ＳＤＳ  ２０  ｇｄＨ２Ｏ  −  全体を２リットルとする。
ゲルを、タンク内に配置され一部をランニングバッファーに浸した電極ハウスに入れた。次いで、ゲルを２０分間保持した。サンプルをレーンに取り込み、ゲルを２００Ｖで４０分間走査した。
移動
濾紙（典型的にはクロマトグラフィ紙）を約７×２０ｃｍ片にし、ＰＶＤＦ膜を７×２０ｃｍに切断した。ＰＶＤＦ膜を予め１００％メタノールを用いて１０秒間ぬらし、ｄＨ２Ｏ中に浸漬した。濾過パッドを以下のものを含む移動バッファーに浸した：
移動バッファー
トリスバッファー  １２．１１ｇ
グリシン  ５７．６５ｇ
メタノール−１００ｍｌ
ｄＨ２Ｏ−全体を４リットルとする量。
膜サンドウィッチをキットの指示書に従って組み立てた。サンドウィッチを移動アセンブリ内に配置し、移動タンクを移動バッファーで満たした。
冷却ブロックを−２０℃の貯蔵から取り出し、移動装置に配置した。ゲルを１００Ｖｄｅ１時間走査させた。
ＰＤＶＦのプロ−ビング
ブロットを５％ミルク中で１時間ブロックした。抗−ＲＡＭＰ−３  ＥＣＤ抗体を、１：００  ５％ミルクに希釈し、ブリットとともに終夜インキュベートした後、ＰＢＳ中５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３×５分間洗浄した。二次抗体ＨＲＰ  抗−マウスを、１：１０００  ５％ミルクで希釈して添加し１時間インキュベートした。ＰＢＳ中５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３×５分間更に洗浄し、次いで水での３×５分間の洗浄を実施した。
ブロットを可視化するため、ＥＣＬ溶液をブロットに添加して両方のスライドを確実に浸した（ＥＣＬはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから入手可能）。ブロットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの写真フィルムを用いて明らかにした。
【０１３４】
抗体ブロック能力
抗体がＲＡＭＰに結合する能力を試験するために、抗体のブロック能力を決定するアッセイを実施した：
・ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞を１０ｐｍｏｌのＡＭで処理し、ｃＡＭＰ反応を測定した（上記の方法、例えば、ｃＡＭＰ蛍光分極（ＦＰ）バイオトラック免疫アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用）。（ＲＡＭＰ−１試薬が試験される場合、このアッセイは、試薬のブロック能力を試験するリガンドとしてＣＧＲＰを用いても実施できる）。
・細胞は、抗体で１時間前処理した。
・ＡＭのＥＣ５０用量を適用し（１０ｐｍｏｌ）、ｃＡＭＰ反応を測定した。
ポリクローナルは、ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞における環状ＡＭＰの増加に対するアドレノモジュリンの効果を調節して、それらの能力を試験するために使用した。試験した全てのポリクローナル抗体は、アドレノモジュリンのｃＡＭＰ生産に対する影響を減少させた。図１２に示した結果は、ＲＡＭＰ−３に対して生じたポリクローナル抗体が、ＭＧ６３のｃＡＭＰ生産を少なくとも１５％まで阻害したことを示している。
モノクローナル抗体生成
抗体４は最大の阻害を示したが、それはウェスタンブロットに見られず、ＡＢ３の結合曲線が低希釈において非常に強かったので、モノクローナル抗体は３番目のマウスを用いて作成した。モノクローナル抗体を作成するのに使用した手法は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５）、並びにＤｏｎｉｌｌａｒｄ及びＨｏｆｆｍａｎ，”Ｂａｓｉｃ  Ｆａｃｔｓ  ａｂｏｕｔ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ．ＩＩ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ編集、１９８１に開示されており、これらを参考として取り入れる。
クローンのスクリーニングは、約１０００クローンから実施し、ペプチドのＧＳＴタグへの非結合性に基づいて５７６を選択した。これらのクローンの中で、ＥＬＩＳＡデータを得て、最高の５つを更なる実験のために選択した。
抗体機能
５つのモノクローナル抗体を、それらのＡＭ機能に対する効果について試験した。ＳＷ−１３細胞の増殖／生存を、ＭＴＴアッセイ（アッセイの詳細は、ｗｗｗ．ｌｇｃｐｒｏｍｏｃｈｅｍ-ａｔｃｃ．ｃｏｍ参照）。以下のプロトコールを使用した。
培養培地
ＤＭＥＭ
２０％ＦＣＳ
５％  抗生剤／有糸分裂
５％  ピルビン酸ナトリウム
細胞を９６ウェルプレートに、各ウェル５０μｌの培地を用いて１×１０６でプレートした。この方法にＳＷ−１３細胞（ヒト副皮質癌細胞系）を用いた。抗体を１：５０希釈で各ウェルに適用し、終夜インキュベートした。
１０μｌのＭＴＴ試薬を添加し、次いで約２〜４時間、紫色沈殿物が現れるまでインキュベートした。１００μｌの洗浄試薬を添加して細胞を溶解させて沈殿物を可溶化し、次いで室温で暗中２時間放置した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５７０ｎｍでの吸収を記録した。
生成された各モノクローナル抗体は、１２〜４５％の範囲で増殖の阻害を誘発した。図１３参照。（１：５０の濃度は、約５ナノグラム／ウェルの最終濃度と等しい。）
【０１３５】
本開示には、以下のパラグラフの内容も含まれる。
１．    カルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）の機能に対するポリペプチドの影響を調節する薬剤であって、該ポリペプチドが、
ｉ）図１、２又は３で表される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチド又はその変異体、
ｉｉ）  上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリッドし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるペプチド、
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含み、該薬剤が医薬としての使用に特徴づけられるポリペプチド：
からなるのグループより選択される薬剤  。
２．薬剤がアンタゴニストであるパラグラフ１に記載の薬剤。
３．薬剤がアゴニストであるパラグラフ１に記載の薬剤。
４．薬剤がポリペプチドであるパラグラフ１に記載の薬剤。
５．薬剤が図４、５又は６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はその断片又は変異体であるパラグラフ１に記載の薬剤。
６．図４、５又は６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片が、図４、５又は６に示されるアミノ酸配列のＮ末端の１から３０アミノ酸を含む断片を包含する、パラグラフ５に記載の薬剤。
７．図４、５又は６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片が、図７、８又は９から選択されるアミノ酸配列からなる断片を包含する、パラグラフ５に記載の薬剤。
８．薬剤が検出可能マーカーと共に供給されるパラグラフ５に記載の薬剤。
９．薬剤が抗体又は抗体の活性な結合部分であるパラグラフ１に記載の薬剤。
１０．抗体がモノクローナル抗体又はその活性な結合部分であるパラグラフ９に記載の薬剤。
１１．抗体がキメラ抗体であるパラグラフ９に記載の薬剤
１２．抗体が、該抗体の可変領域とヒト抗体の不変又は定常領域を含むように、組換え法によって生産されるヒト化抗体であるパラグラフ９に記載の薬剤。
１３．抗体が抗体断片であるパラグラフ９に記載の薬剤。
１４．抗体断片が一本鎖抗体可変領域断片であるパラグラフ１４に記載の薬剤。
１５．抗体が検出可能マーカーと共に供給されるパラグラフ９乃至１４のいずれかに記載の薬剤。
１６．抗体又は抗体断片が化学療法剤と結合又はクロスリンクするパラグラフ９乃至１４のいずれかに記載の薬剤。
１７．薬剤が核酸分子であるパラグラフ１に記載の薬剤。
１８．核酸がアンチセンス核酸、アプタマー又は小分子干渉ＲＮＡであるパラグラフ１７に記載の薬剤。
１９．前記パラグラフのいずれかに記載の薬剤及びアジュバント又は薬剤的に許容な担体を含む医薬組成物。
２０．ｉ）図４、５又は６に表される核酸配列の全て又は一部を含む核酸分子；
ｉｉ）上記（ｉ）核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＲＬＲ機能を調節するポリペプチドをコードする核酸分子、
からなるグループより選択される核酸分子を含むワクチンとしての使用のための医薬組成物。
２１．核酸分子が、図４、７、８又は９で表される核酸配列を含むパラグラフ２０の組成物。
２２．パラグラフ１１のキメラ抗体又はパラグラフ１２のヒト化抗体の発現に適合されるベクター。
２３．パラグラフ２２のベクターで形質転換又は形質移入される細胞。
２４．パラグラフ１１のキメラ抗体又はパラグラフ１２のヒト化抗体の産生のための方法であって、
ｉｉｉ）ヒト化又はキメラ抗体をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換又は形質移入される細胞を提供し、
ｉｖ）該抗体の製造を生じさせる条件下で該細胞を生育させ、
ｖ）該細胞又はその生育環境から該抗体を精製する、
ことを含む方法。
２５．パラグラフ１０のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞。
２６．パラグラフ２５のハイブリドーマ細胞株を使用してパラグラフ２５のモノクローナル抗体を生産する方法。
２７．ｉ）免疫応答性の哺乳動物を図４、５又は６で表されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は断片又はここで定義されるその変異体を含む抗原で免疫し、
ｉｉ）免疫した免疫応答性哺乳動物のリンパ球をハイブリドーマ細胞を形成させるためにミエローマと融合させ、
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体を（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性によりスクリーニングし、
ｉｖ）生育及び／又は該モノクローナル抗体を分泌させるためにハイブリドーマ細胞を＾培養し；及び
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収する、
ステップを含む、パラグラフ１０に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の調製方法。
２８．（ｉ）のポリペプチドが図７、８又は９に示されるものから選択されるアミノ酸配列を含むパラグラフ２７に記載の方法。
２９．ｉｉｉ）単離された細胞サンプルを提供し、
ｉｖ）（ｉ）のサンプルと図１、２又は３に表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はその断片又は変異体をコードする核酸分子、又は該核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、図１、２又は３に表されるアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドをコードする核酸分子と結合する結合薬剤と接触させ、
ｖ）対応する正常サンプルと比較して、該サンプル中の該核酸分子の発現を決定する：
ステップを含む被検対象中の癌の判定のための診断アッセイ。
３０．結合約合いがオリゴヌクレオチドプライマーであるパラグラフ２９のアッセイ。
３１．結合薬剤がオリゴヌクレオチドプライマーであるパラグラフ２９のアッセイ。
３２．結合薬剤が、図１、２又は３のアミノ酸配列で表される該ポリペプチドと特異的に結合する抗体であるパラグラフ２９に記載の薬剤。
３３．ａ）図１、２又は３に示される核酸配列からなる核酸分子；
ｂ）上記（ｉ）の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子；
からなるグループより選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドの活性を調節する薬剤のスクリーニングする方法であって、
ｉ）ポリペプチド又はその配列変異体及び少なくとも１つの試験薬剤を含む調製物を作製し、
ｉｉ）該ポリペプチドの活性について該薬剤の活性を測定するスクリーニング方法。
３４．  ＣＲＬＲ機能を調節する薬剤の同定におけるポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドが、
ｉ）図１、２又は３で表される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチド又はその変異体、
ｉｉ）  上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリッドし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるペプチド、
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含み、該薬剤が医薬としての使用に特徴づけられるポリペプチド、
からなるのグループより選択される使用  。
３５．  ＣＲＬＲと、
ｉ）図１、２又は３で表される核酸配列からなる核酸分子によってコードされるポリペプチド又はその変異体、
ｉｉ）  上記（ｉ）で定義される核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリッドし、ＣＲＬＲ機能を調節する核酸分子によってコードされるペプチド、
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）で定義される核酸配列に対する遺伝子コードの結果として縮重する核酸を含むポリペプチド、
からなるのグループより選択されるポリペプチドとの相互作用を調節する薬剤の同定におけるＣＲＬＲの使用  。
３６．パラグラフ１乃至１８のいずれかの薬剤、又はパラグラフ２１のいずれかの組成物の医薬のための使用。
３７．パラグラフ１乃至１８のいずれかの薬剤の有効量を投与することを含む被検対象における癌の治療方法。
３８．パラグラフ２０又は２１の組成物の有効量を投与することを含む癌について動物を免疫する方法。
３９．パラグラフ１乃至１８のいずれかの薬剤の有効量を投与することを含む被検対象における骨粗鬆症の治療方法。
４０．パラグラフ１乃至１８のいずれかの薬剤の有効量を投与することを含む被検対象における肥満の治療方法。
４１．パラグラフ１乃至１８のいずれかの薬剤の有効量を投与することを含む被検対象における炎症性疾患の治療方法。
４２．炎症性疾患が、アテローム性動脈硬化症、リウマチ様関節炎、変形性関節症及び多発性関節炎から選択されるパラグラフ４１の方法。
４３．パラグラフ１乃至１８のいずれかの薬剤の有効量を投与することを含む被検対象における創傷の治療方法。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＲＡＭＰ１のＤＮＡ配列（上）（配列番号：１）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：２）を示す図である。
【図２】ＲＡＭＰ２のＤＮＡ配列（上）（配列番号：３）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：４）を示す図である。
【図３】ＲＡＭＰ３のＤＮＡ配列（上）（配列番号：５）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：６）を示す図である。
【図４】ＲＡＭＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：７）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：８）を示す図である。
【図５】ＲＡＭＰ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：９）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：１０）を示す図である。
【図６】ＲＡＭＰ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：１１）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：１２）を示す図である。
【図７Ａ】ＲＡＭＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の切断されたＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８）を示す図である。断片の長さは太字で示した。
【図７Ｂ】ＲＡＭＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の切断されたＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８）を示す図である。断片の長さは太字で示した。
【図７Ｃ】ＲＡＭＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の切断されたＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８）を示す図である。断片の長さは太字で示した。
【図８Ａ】ＲＡＭＰ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の切断されたＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６及び３７）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６及び４７）を示す図である。断片の長さは太字で示した。
【図８Ｂ】ＲＡＭＰ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の切断されたＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６及び３７）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６及び４７）を示す図である。断片の長さは太字で示した。
【図８Ｃ】ＲＡＭＰ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の切断されたＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６及び３７）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６及び４７）を示す図である。断片の長さは太字で示した。
【図９Ａ】ＲＡＭＰ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の切断されたＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４及び５５）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３）を示す図である。断片の長さは太字で示した。
【図９Ｂ】ＲＡＭＰ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の切断されたＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列（上）（配列番号：４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４及び５５）及び該ＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列（下）（配列番号：５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２及び６３）を示す図である。断片の長さは太字で示した。
【図１０Ａ】ＣＲＬＲのＤＮＡ配列（上）（配列番号：６４）及びアミノ酸配列（下）（配列番号：６５）を示す図である。
【図１０Ｂ】ＣＲＬＲのＤＮＡ配列（上）（配列番号：６４）及びアミノ酸配列（下）（配列番号：６５）を示す図である。
【図１１】マウス抗−ＲＡＭＰポリクローナル抗体についてのＥＬＩＳＡデータを示す図である。
【図１２】ポリクローナル抗−ＲＡＭＰ−３抗体の、ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞のおけるアデノメジュリンが環状ＡＭＰを増大させる効果を調節する能力を試験した結果を示すグラフである。全ての抗体がアデノメジュリンの効果を減少させた。
【図１３】モノクローナル抗−ＲＡＭＰ−３抗体の、（増殖部位にマッピングされるミトコンドリアスクシネートデヒドロゲナーゼのＭＴＴアッセイに基づいて）増殖阻害を油発する能力を試験した結果を示すグラフである。１：５０の濃度は約５０ｎｇの最終濃度に等しい。
【図１４】マウス１からのポリクローナル抗体のウエスタンブロットである。
【図１５】マウス２からのポリクローナル抗体のウエスタンブロットである。
【図１６】マウス３からのポリクローナル抗体のウエスタンブロットである。