【手続補正書】
【提出日】平成23年9月9日(2011.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＷＯ０６０２１８８６、ＷＯ０６０２１８８４、ＷＯ０６０２１８８１、およびＷＯ０４０７６４１２に記載されたタンパク質キナーゼ阻害薬の合成での改変ケトレダクターゼの使用に関する。いくつかの実施形態において、プロテインキナーゼ阻害薬の合成方法において、方法のステップは、基質である式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンを本開示のケトレダクターゼを用いて、式（ＩＩ）のその対応する（Ｓ）−アルコール生成物、（Ｓ）−１−［２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル］−エタノールに還元または変換することを含むことができる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができるケトレダクターゼポリペプチド。
（項目２）
Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号２、４または９８に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列がＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を有することを条件とする、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
上記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、Ｘ１９０に対応する残基に脂肪族、非極性、拘束された、またはシステイン残基を有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
上記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目５）
上記ケトレダクターゼが、次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族または非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ１４２に対応する残基が、極性残基、特にセリンまたはアスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；
Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目６）
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ６０に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリンまたはシステインである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４２に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１４９に対応する残基が、グリシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１５０に対応する残基が、アスパラギン酸またはヒスチジンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；
Ｘ２０５に対応する残基が、アルギニンである；および
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはチロシンである、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目７）
次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；および
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目８）
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；および
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目９）
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；および
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１０）
次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基；
特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１１）
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１２）
次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目１３）
上記立体異性体過剰率が少なくとも約９０％である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１４）
上記立体異性体過剰率が少なくとも約９９％である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１５）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
上記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも高い率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１７）
配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１６に記載のポリペプチド。
（項目１８）
上記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約４５０％大きい率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、項目４に記載のポリペプチド。
（項目１９）
配列番号８、１０、１４、１６、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
上記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約１５００％大きい率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、項目４に記載のポリペプチド。
（項目２１）
配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２１に記載のポリペプチド。
（項目２２）
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の量に対して約１重量％未満の量のポリペプチドを用いて実施するとき、約２４時間未満で２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の少なくとも約９５％を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに変換することができる、項目４に記載のポリペプチド。
（項目２３）
配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２４）
ケトレダクターゼポリペプチドであって、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基９０〜２１１と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含むが、但し、ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列がＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を有することを条件とする、ケトレダクターゼポリペプチド。
（項目２５）
上記ケトレダクターゼドメインは、Ｘ１９０に対応する残基が脂肪族、非極性、拘束された、またはシステイン残基であるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載にポリペプチド。
（項目２６）
上記ケトレダクターゼドメインは、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載にポリペプチド。
（項目２７）
上記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ１４２に対応する残基が、極性残基、特にセリンまたはアスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；
Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２８）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリンまたはシステインである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４２に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１４９に対応する残基が、グリシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１５０に対応する残基が、アスパラギン酸またはヒスチジンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ１９０に対応する残基が、アラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはチロシンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２９）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３０）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３１）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに；
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３２）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３３）
残基９０〜２１１に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、トリプトファンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３４）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３５）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３６）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３７）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族または非極性、または脂肪族残基である、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３８）
配列番号２、４または９８に基づく上記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する上記ケトレダクターゼポリペプチド領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、グリシン、ヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ６０に対応する残基が、アラニンである、を有し；ならびに
上記アミノ酸配列が、上記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目３９）
改変ケトレダクターゼポリペプチドであって、上記改変ケトレダクターゼポリペプチドが由来する野生型ケトレダクターゼと比較して、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに還元するための逆の立体選択性が可能である、改変ケトレダクターゼポリペプチド。
（項目４０）
アセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元することができる、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓケトレダクターゼに由来する、改変ケトレダクターゼポリペプチド。
（項目４１）
上記ポリペプチドがアセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに少なくとも約９０％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる、項目４０に記載のポリペプチド。
（項目４２）
上記ポリペプチドがアセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる、項目４０に記載のポリペプチド。
（項目４３）
上記改変ポリペプチドが配列番号２または４または９８のＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を含む、項目４０に記載のポリペプチド。
（項目４４）
項目１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目４５）
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３から成る群より選択される、項目４４に記載のポリヌクレオチド。
（項目４６）
宿主細胞での発現を導くのに好適な少なくとも１つの制御配列に操作可能に連結された項目４４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目４７）
上記制御配列がプロモータを含む、項目４６の記載の発現ベクター。
（項目４８）
上記プロモータがＥ．ｃｏｌｉプロモータを含む、項目４７に記載のベクター。
（項目４９）
上記制御配列が分泌シグナルを含む、項目４７の記載の発現ベクター。
（項目５０）
項目４６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目５１）
Ｅ．ｃｏｌｉである、項目５０に記載の宿主細胞。
（項目５２）
発現ベクターを含むコドンが宿主細胞での発現に最適化されている、項目５０に記載の宿主細胞。
（項目５３）
３’、４’、および５’位の１つ以上で場合により置換された２’，６’置換アセトフェノン基質を対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元する方法であって、上記基質を対応する置換（Ｓ）−アルコール生成物に立体選択的に還元または変換するのに好適な反応条件下で、上記基質を項目１〜４３のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるステップを含む、方法。
（項目５４）
上記基質が２’，６’−ジクロロ−３’フルオロアセトフェノンであり、上記対応する（Ｓ）−アルコール生成物が（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールが９９％を超える立体異性体過剰率で形成される、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
上記ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
上記方法が少なくとも２００ｇ／Ｌの基質および２ｇ／Ｌ未満のポリペプチドを用いて実施されるとき、上記基質の少なくとも約９５％が２４時間未満で上記生成物に還元される、項目５３に記載の方法。
（項目５８）
上記ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞、またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解物を用いて実施される、項目５３に記載の方法。
（項目５９）
上記ケトレダクターゼが、単離および／または精製され、そして上記還元反応が該ケトレダクターゼの補因子および場合によっては該補因子の再生系の存在下で行われる、項目５３に記載の方法。
（項目６０）
上記補因子再生系がグルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸エステル；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
上記第二級アルコールデヒドロゲナーゼが、ケトレダクターゼである、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
３’，４’および５’位の１つ以上にて場合により置換された２’，６’−置換アセトフェノン、および／または対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノール、ならびに項目１に記載のケトレダクターゼを含む、組成物。
（項目６３）
上記基質が式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンであり、および上記対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールが式（ＩＩ）の（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールである、項目６２に記載の組成物。
（項目６４）
補因子再生系をさらに含む、項目６２に記載の組成物。
（項目６５）
上記補因子再生系がグルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸エステル；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目６４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元することができる、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓケトレダクターゼに由来する、ケトレダクターゼポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２、４または９８のＸ１９０に対応する残基にプロリン残基を有する、ケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、アセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに
ｉ）少なくとも約９０％、または
ｉｉ）少なくとも約９９％
の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を生成物である（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができるポリペプチドであり、該ポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号２、４または９８に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＸ１９０に対応する残基にプロリンを有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ６０に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリンまたはシステインである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４２に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１４９に対応する残基が、グリシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１５０に対応する残基が、アスパラギン酸またはヒスチジンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；
Ｘ２０５に対応する残基が、アルギニンである；および
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはチロシンである、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記立体異性体過剰率が、
ｉ）少なくとも約９０％、または、
ｉｉ）少なくとも約９９％
であり、かつ
前記ポリペプチドが場合により、配列番号１０、１４、１８、２０、２２、２４、２８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも高い率で前記基質を前記生成物に還元することがさらに可能であり、かつ
該ポリペプチドが場合により、配列番号１０、１４、１８、２０、２２、２４、２８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約４５０％大きい率で前記基質を前記生成物に還元することがさらに可能であり、かつ
該ポリペプチドが場合により、配列番号１０、１４、１８、２２、２４、２８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約１５００％大きい率で前記基質を前記生成物に還元することがさらに可能であり、かつ
該ポリペプチドが場合により、配列番号１８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、前記２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の量に対して約１重量％未満の量の該ポリペプチドを用いて実施するとき、約２４時間未満で該２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の少なくとも約９５％を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに変換することができ、かつ
該ポリペプチドが場合により、配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、場合により、配列番号９、１３、１７、１９、２１、２３、２７、３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５５、５７、５９、６１、６３、６７、６９、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３から成る群より選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
宿主細胞での発現を導くのに好適な少なくとも１つの制御配列に操作可能に連結された請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
３’、４’、および５’位の１つ以上で場合により置換された２’，６’置換アセトフェノン基質を対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元するための方法であって、該基質を対応する該置換（Ｓ）−アルコール生成物に立体選択的に還元または変換するのに好適な反応条件下で、該基質を請求項１〜９のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるステップを含む、方法。
【請求項１４】
（ｉ）前記基質が２’，６’−ジクロロ−３’フルオロアセトフェノンであり、前記対応する（Ｓ）−アルコール生成物が（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールであり、かつ場合により、該（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールが９９％を超える立体異性体過剰率で形成されるか、
（ｉｉ）前記ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号１０、１４、１８、２０、２２、２４、２８、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、６０、６２、６４、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｉｉｉ）前記方法が少なくとも２００ｇ／Ｌの基質および２ｇ／Ｌ未満の該ポリペプチドを用いて実施されるとき、該基質の少なくとも約９５％が２４時間未満で該生成物に還元される、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
構造式（ＶＩＩ）のプロテインチロシンキナーゼ阻害薬化合物（その塩、水和物、および溶媒和物を含む）を生成するための方法であって、該方法は、好適な反応条件下で請求項１〜９のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドを使用して、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に還元または変換するステップを含む、方法。
【請求項１６】
構造式（ＶＩＩＩ）のプロテインチロシンキナーゼ阻害薬化合物（その塩、水和物、および溶媒和物を含む）を生成するための方法であって、該方法は、好適な反応条件下で請求項１〜９のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドを使用して、式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に還元または変換するステップを含む、方法。
【請求項１７】
３’，４’および５’位の１つ以上にて場合により置換された２’，６’−置換アセトフェノン、および／または対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノール、ならびに請求項１〜９のいずれか一項に記載のケトレダクターゼを含む、組成物であって、その基質は、場合により式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンであり、および該対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールが式（ＩＩ）の（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールである、組成物。