【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年5月16日(2011.5.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
本発明によれば、以下の段階を含む、蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法が提供される。まず最初に、測定容量中の粒子が、一連の励起パルスによって励起され、放射された蛍光が、光子カウントのシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を検出することによってモニターされる。この目的のために、共焦点エピイルミネーテッド（ｅｐｉ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ）顕微鏡が、高反復速度（例えば１００ＭＨｚ）のレーザーパルス励起光と組み合わせて使用されることが好ましい。所定幅のカウント時間区間における光子カウント数、並びに対応する励起パルスに対する光子カウントの検出遅延時間が決定される。以下に詳述するように、前記検出遅延時間の関数が得られ、次の段階として、少なくとも２つの独立変数（ａｒｇｕｍｅｎｔｓ）の確率関数
【数１】
2003522946.tif 000001
が決定される。式中、１つの独立変数は、光子カウント数であり、別の独立変数は、検出遅延時間の前記関数である。その後、前記確率関数
【数２】
2003522946.tif 000002
に基づき、少なくとも２つの独立変数の関数として、粒子の分布が決定される。式中、一つの独立変数は粒子の比明度（またはその測度（ｍｅａｓｕｒｅ））であり、別の独立変数は、粒子の蛍光寿命（又はその測度）である。蛍光強度及び寿命分布分析（ＦＩＬＤＡ）と呼ばれる本発明による方法は、完全な濃度、即ち、従来のＦＬＡでは直接得られない量を決定することができる。本発明によるこのような相関法において使用される場合、組み合わされた情報（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により、ＦＩＤＡ及び蛍光寿命分析のみと比較して、大幅に向上した精度が得られる。ある閾値強度以上の単一分子からの蛍光バーストを調べるＢＩＦＬと比較して、ＦＩＬＤＡは、好ましくは、全てのデータの連続（ｗｈｏｌｅ ｄａｔａ ｓｔｒｅａｍ）の相対的な変動を分析するので、異なる分子からの同時光子放射の可能性を明らかにする。従って、本発明は、ＢＩＦＬよりも、はるかに高濃度において使用することもできる。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
各光子の検出遅延時間ｔは、不連続の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）区間において表される。この定義において、生成関数の独立関数ξ及びηを、ｅｉφの形で選択することが都合がよい。この選択のため、Ｇ（ξ，η）及びＰ（ｎ，ｔ）は、迅速なアルゴリズムによって算出され得る二次元フーリエ変換によって相互に関係付けられる（ブリハム（Ｂｒｉｇｈａｍ）， Ｔｈｅ Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ， プレンティス−ホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ）， エングウッド・クリフス（Ｅｎｇｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ）， ＮＪ， １９７４）。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
各光子の検出遅延時間の確率分布は、あらかじめ放出又は検出された光子の数や光子を放出する分子の座標のいずれにも依存しない、所定の種を特徴付ける関数として考察され得る。これは、Ｐ（ｎ，ｔ）が
Ｐ（ｎ，ｔ）＝Ｐ（ｎ）Ｐ（ｔ｜ｎ）， （４）
として得られ得ることを意味する。ここで、Ｐ（ｔ｜ｎ）は、ｎ個の光子の積算検出遅延時間の確率分布であり、Ｐ（ｎ）は、所定のカウント時間区間内にｎ個の光子を検出するための確率関数である。Ｐ（ｔ｜ｎ）は、ｎ回のたたみ込みによってＰ（ｔ｜１）から計算されるので、Ｐ（ｔ｜ｎ）の一次元生成関数は、Ｐ（ｔ｜１）の生成関数のｎ乗である：
【数３】
2003522946.tif 000003
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
どのようにＰ（ｎ）を算出するかという問題は、カスク（Ｋａｓｋ）らによって説明されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， １３７５６−１３７６１， １９９９； この内容は、本明細書に開示として援用される）。Ｐ（ｎ）は、その生成関数によって（ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｅｌｐ ｏｆ）算出され、単一種の場合には、
【数４】
2003522946.tif 000004
として表される。ここで、Ｂ（ｒ）は、空間（ｓｐａｔｉａｌ）明度関数であり、ｑは、見掛けの（ａｐｐａｒｅｎｔ）比明度であり、Ｔは、カウント時間区間の幅であり、ｃは、見掛けの濃度であり、ｄＶは、容量要素である。式８の右辺の積分は、数値的に（ｎｕｍｅｒｉｃａｌｌｙ）算出され得る。空間明度と対応する容量要素との関係（式８の右辺の計算に必要とされる）は、好ましくは、３つの補正パラメーター、ａ１、ａ２、及びａ３の経験から得られた式によって表される。
【数５】
2003522946.tif 000005
ここで、ｕ＝ｌｎ［Ｂ（０）／Ｂ（ｒ）］であり、Ａ０は、容量の単位を選ぶために使用される係数である。但し、空間明度Ｂ及び容量要素ｄＶの関係は、
【数６】
2003522946.tif 000006
によっても表され得る。真の濃度と見掛けの濃度との関係及び真の比明度と見掛けの比明度との関係は、ＦＩＭＤＡの理論において得られる（パロ（Ｐａｌｏ）ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７９， ２８５８−２８６６， ２０００： この内容は、本明細書に開示として援用される）。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
Ｐ（ｔ｜１）を計算する場合、選ばれた周期は、レーザー励起期間と一致すべきである。ここで、蛍光遅延変動は、パルス期間Ｎｌの間、ゼロになる必要がないことが考慮される。連続励起パルス０＜ｔ≦Ｎｌの間に、Ｐ（ｔ｜１）が算出されると、その後、区間Ｎｌ≦ｔ≦Ｎｔにおいて、関数はゼロに引き伸ばされる（ｐａｄｄｅｄ ｂｙ ｚｅｒｏｓ）。ここで、Ｎｔは、ｔ次元でのＰ（ｎ，ｔ）の周期の値を意味する。Ｎｔの値は、分布Ｐ（ｎ，ｔ）が実際にゼロになるところに選択される。その後、式６は、Ｐ（ｎ，ｔ）のフーリエイメージの計算に適用される。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
上記に説明したように、Ｐ（ｔ｜１）及びその生成関数を計算するとき、選択された確率分布の期間は、レーザー励起期間と当然一致すべきである。パルス期間を幅ΔのＮｌ検出遅延時間区間に分割するとすると、δ−励起に対応する、理想的な区分された（ｐｅｒｉｏｄｉｚｅｄ）確率分布は、区間０＜ｔ≦Ｎｌにおいて、
【数７】
2003522946.tif 000007
として表される。τは、蛍光寿命を示す。（同様に区分された関数である）時間応答関数Ｒ（ｔ）による、Ｐδ（ｔ）のたたみ込みの最も簡単な計算方法は、フーリエ変換による、
【数８】
2003522946.tif 000008
である。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
正確さのために、Ｐ（ｔ｜１）は、高時間分解能で計算され得る。後述の実験２で行われたように、例えば、ここでは８倍高い分解能を使用し得る。区間０＜ｔ≦ＮｌにおいてＰ（ｔ｜１）を計算し、その後、区間Ｎｌ≦ｔ＜Ｎｔにおいて一連のゼロによって、関数を補正する。ここで、Ｎｔは、ｔ次元でのＰ（ｎ，ｔ）の区分の値を示す。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
フィッティングの加重値（Ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｆ Ｆｉｔｔｉｎｇ）
単純化のために、連続したカウント時間区間におけるカウント数は独立していると推定され得る。分子座標は少しのカウント区間において大きく相関するので、この推定は、厳密には正しくないが、所定の対（ｐａｉｒ）（ｎ，ｔ）を有するイベント数は、平均付近で二項分布している。ここで、Ｍは実験当たりのカウント時間区間の数である。これにより、最小二乗の式（ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ｐｒｏｂｌｅｍ）
【数９】
2003522946.tif 000009
の加重値Ｗ（ｎ，ｔ）に関する以下の式が得られる：
【数１０】
2003522946.tif 000010
ここで、χ２は、最小二乗パラメーターであり、
【数１１】
2003522946.tif 000011
は、測定されたＦＩＬＤＡヒストグラムであり、Ｐ（ｎ，ｔ）は、理論分布である。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
より一般的な態様における本発明に戻ると、確率関数の第二独立変数は、各光子の単なる個々の検出遅延時間であるだけでなく、むしろ所定のカウント時間区間において検出された光子全てに対する積算検出遅延時間のような、その関数である。但し、分子は、単一の励起パルスから２つの光子をほとんど放出することができないが、以下に示す実施例において、カウント時間区間当たり１０，０００励起パルスがあり、それにより、この時間中、単一分子からの数１０個の光子を検出することができる理由が説明される。第二独立変数の有利な選択は、特に、測定容量当たり１分子よりわずかに低いだけである、本方法を実施するための光学濃度が使用されるならば、短い時間区間において測定される一連の光子は、単一分子によって放出されそうであるという、蛍光の性質に関連する。古典的な寿命分析では、この情報はない。この理由により、試料中に存在する２つの粒子種の比明度値が同じであるとしても、本発明による方法は、より正確な分析方法であることがわかる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
好ましい態様では、検出遅延時間の前記関数は、同じカウント時間区間において検出される光子カウントの検出遅延時間の次数（ｏｒｄｅｒ）に関して不変である。好ましくは、検出遅延時間の前記関数は、合計又は平均である。各光子の検出遅延時間、即ち、対応する励起パルスに対する光子カウントの検出時間は、検出遅延時間との既知の関係を有する整数によって表され得る。この関係は、理想的には、擬似線形（ｑｕａｓｉ−ｌｉｎｅａｒ）である。検出遅延時間の関数は、好ましくは前記整数の合計又は平均である。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
さらに好ましい態様において、前記幅のカウント時間区間の一組の異なる値が使用され、前記幅は、前記確率関数のもう１つの独立変数である。この特別な場合には、粒子の拡散係数（又はその測度）は、有利に決定され得る。その結果、それは、粒子の分布関数の第三独立変数になる。本発明のこの態様は、蛍光強度寿命多重分布分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＦＩＬＭＤＡ）と呼ばれる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
カウント時間区間は、連続した時間であることもあり、重なり合っていることもある。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
ヒストグラム（又は確率関数）の第二確率変数が、所定のカウント時間区間において測定される光子数における検出遅延時間に対する励起光の合計又は平均であることが好ましいので、既知の多次元蛍光変動法と比べて、本発明による方法は、非常に特別である。単独で用いる場合、どのような値であっても、この変数は非常に小さい。それは、光子カウント数と関連する場合にのみ、その意味を持つ。明度及び寿命分析を組み合わせる場合、２つの変数の直接的な選択は、光子カウント数及び検出遅延時間に対する個々の励起光である；しかし、本発明の選択により、直接的な選択よりもはるかに正確な方法が得られる。この特別な選択の成功の別の理由は、ヒストグラム（又は確率関数）のフィット関数が、そのフーリエ変換により、即ち、生成関数の表現を用いて、迅速に算出され得ることである。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５４】
検出器パルス並びにレーザートリガーパルスは、コンピューター差込み式カードに通される。エボテック（ＥＶＯＴＥＣ）製のこのカードは、２つのサブユニットからなり、その一方は、時間相関単一光子カウント（ＴＣＳＰＣ）モジュールである。このモジュールは、付随するレーザーパルスに対する光子カウントの遅延時間を検出している。時間をデジタル化する変換器（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｄｉｇｉｔａｌ ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）（ＴＤＣ）は、７０ｐｓの分解能及び２ＭＨｚの変換速度で、この時間情報を定量化する。他方のサブユニットは、首尾よく検出された光子カウントの全ての対の間の時間の不足（光子間隔時間）を得るための、５０ｎｓの時間分解能の内部時計を用いる電子カウンターである。従って、検出される光子カウント毎に、２つの独立した時間、即ち、蛍光寿命情報を含む、一致したレーザーパルスに対する光子カウントの顕微鏡でしか判別できない遅延時間（ｎｓ）、並びに蛍光強度及び変動情報をコードする顕微鏡でしか判別できない光子間隔時間（μｓ〜ｍｓ）が同時に記録される。これらの蛍光から、生データの２つの一次元ヒストグラム、即ち、（ｉ）１００μｓのカウント時間区間において収集された光子カウント数分布（ＦＩＤＡ）、及び（ｉｉ）遅延時間分布（ＦＬＡ）が算出される。更に、１００μｓのカウント時間区間にわたって積算された光子カウント数及び遅延時間の両方を含む二次元ＦＩＬＤＡヒストグラムが、本発明によって確立される。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７９】
実験２
装置の基本的な部分として、パルスレーザー、時間を振幅に変換する変換器（ｔｉｍｅ ｔｏ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）（ＴＡＣ）及びデータ獲得カードと組み合わせて、エピイルミネーテッド共焦点顕微鏡を使用する。検出された各光子について、２つの時間間隔、即ち、先の光子カウントから通された時間及び光子検出とその結果生じるレーザーパルスとの間の時間間隔、を同時に決定して節約した（ｓａｖｅｄ）。ＴＡＣの時間分解能を７０ｐｓにして、最初の時間間隔を、５０ｎｓのカードクロック（ｃａｒｄ ｃｌｏｃｋ）期間の単位で測定する。生データから、所定幅のカウント時間区間（通常１００μｓ）及び遅延時間の所定の分解能値（２８０又は５６０ｐｓ）において、ＦＩＤＡ（従来技術）、ＦＬＡ（従来技術）、及びＦＩＬＤＡ（本発明）に対して、一次元又は二次元分布を算出した。一連の測定において、ＴＡＣのチャンネル幅が一定でない場合の他のデータを修正するために、光子のランダム光源として日光をモニターする検出器を用いて、少なくとも１つの測定を行った。白濁した（ｍｉｌｋｙ）試料からの付随するレーザーの散乱光をモニターする検出器を用いて別の測定を行い、装置の点拡張機能（ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を決定した。また、常に存在する２つの“種”と考えられている暗色散乱ラマンカウントの独立した評価を得るためには、純水における測定が有用であった。それらは、いずれもポアソニアンカウント数分布を有するが、非常に異なる遅延時間分布を有する。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８１】
図５は、本実験の測定されたヒストグラムの強度グラフを示す。Ｘ軸は、光子遅延時間に対する平均化されたパルスである；ｙ軸は、光子カウント数であり、高強度は高イベント数に対応する。図５では、強度グラフとして、測定された分布
【数１２】
2003522946.tif 000012
の３つの例を示す。２つの例は単一種に対するものであり、３つ目の例は、それらの混合物に対するものである（Ｍは、実験当たりのカウント時間区間の総数である）。データ点（ｎ，ｔ）＝（１，０）及び（１，１）（励起パルスの上端（ｒａｉｓｉｎｇ ｅｄｇｅ）の最も低い部分に相当）が、標準偏差の５単位までフィッティング曲線からしばしば外れることを除き、フィッティングの加重残差（示されていない）は、無作為に分散している。上方のグラフは、Ｃｙ５溶液（３つの色素の中で寿命が最も短い）において測定された分布＃１２を視覚化し、中間のグラフは、Ｂｏｄｉｐｙ６３０溶液（寿命が最も長い）において測定された分布＃７であり、一番下のグラフは、これら色素の混合物に対応する分布＃３０でる。実際は、技術的にフィッティングされる関数のｘ−独立変数は、平均遅延時間よりもむしろ合計であるが、平均遅延時間の分布関数は、視覚的により有益に見える。