【手続補正書】
【提出日】平成23年8月23日(2011.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類体細胞を、該細胞が再プログラミングされて多能性状態になるように、Ｗｎｔ経路をモジュレートする薬剤に接触させることを含む、インビトロで哺乳類体細胞を再プログラミングする方法。
【請求項２】
前記方法が、
ａ）前記薬剤を含有する培養培地中で前記細胞を培養すること；
ｂ）少なくとも１０日間前記薬剤を含有する培養培地中で前記細胞を培養すること；
ｃ）前記Ｗｎｔ経路をモジュレートする薬剤に前記細胞を接触させることにより、少なくとも５倍ＥＳ様細胞コロニーの数を増強すること；
ｄ）前記Ｗｎｔ経路をモジュレートする薬剤に前記細胞を接触させることにより、少なくとも１０倍ＥＳ様細胞コロニーの数を増強すること；
ｅ）Ｗｎｔ３ａ馴化培地中で前記細胞を培養すること；
ｆ）Ｗｎｔ馴化培地中で前記細胞を培養すること；
ｇ）前記細胞を前記Ｗｎｔ経路をモジュレートする第２の薬剤と接触させること；または
ｈ）外因性の可溶性で生物学的に活性なＷｎｔタンパク質を含有する培地中で前記細胞を培養すること
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が
ａ）ヒト細胞である；
ｂ）終末分化した細胞である；
ｃ）線維芽細胞である；
ｄ）その型の細胞において通常存在するよりも高レベルで少なくとも１つの再プログラミング因子を発現するかもしくは含有するように改変される；
ｅ）遺伝的に改変されない；または
ｆ）その細胞型の細胞において通常存在するよりも高レベルでｃ−Ｍｙｃを発現するように遺伝的に改変されない、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記Ｗｎｔタンパク質がＷｎｔ３ａである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記再プログラミングされた細胞が多能性であることを確認することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を再プログラミングした後に該細胞を所望の細胞型にインビトロで分化させることをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ａ）前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が形態学的基準によりＥＳ様細胞を同定することをさらに含む；
ｂ）前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が再プログラミングされた細胞を選択するための化学的選択を実施することを含まない；または
ｃ）前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が多能性状態に再プログラミングされる細胞を多能性状態に再プログラミングされない細胞から分離することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
治療を要する個体を治療するための組成物であって、該組成物は、個体から得られた体細胞を含み、ここで該体細胞の少なくとも一部分は、請求項１記載の方法に従って再プログラミングされており、
場合により該細胞を１つ以上の所望の細胞型に分化させた後に、該個体に該再プログラミングされた細胞の少なくとも一部分を投与することを特徴とする、組成物。
【請求項９】
（ｉ）改変または処理を行わない場合よりも高いレベルで少なくとも１つの再プログラミング因子を発現または含有するように改変または処理を受けている哺乳類体細胞；および、（ｉｉ）Ｗｎｔ経路の活性を増大させ、そして該体細胞を多能性状態に再プログラミングすることに寄与する薬剤を含む、組成物。
【請求項１０】
前記体細胞が、
ａ）その型の体細胞に通常存在するよりも高レベルで少なくとも１つの再プログラミング因子を発現または含有するように改変される；
ｂ）遺伝的に改変されない；
ｃ）その型の体細胞において通常存在するよりも高レベルでｃ−Ｍｙｃを発現するように遺伝的に改変されない；または
ｄ）その型の体細胞において通常存在するよりも高レベルで少なくとも１つの再プログラミング因子を発現するかもしくは含有するように改変される、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
下記工程：
（ａ）Ｗｎｔ経路の活性をモジュレートする薬剤および候補薬剤を含有する培地中で哺乳類体細胞の集団を培養すること；
（ｂ）適当な時間の後、適当な時間に亘って培養物中に該細胞およびその子孫を維持した後にＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するかどうかを決定すること；
を含む、哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用である薬剤を同定する方法であって、該培地が該候補薬剤を含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ＥＳ様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該候補薬剤を同定する、方法。
【請求項１２】
下記工程：
（ａ）Ｗｎｔ経路の活性を増大させる薬剤および候補薬剤に哺乳類体細胞の集団を接触させること；
（ｂ）適当な時間に亘り細胞培養系中に該細胞を維持すること；および、
（ｃ）ＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が該培養系中に存在するかどうかを決定することを含む、ＥＳ様状態に哺乳類体細胞を再プログラミングするために有用な薬剤をインビトロで同定する方法であって、該細胞を該候補薬剤に接触させていなかった場合に予測されるものよりも高値のレベルでＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ＥＳ様状態に哺乳類体細胞を再プログラミングするために有用であるものとして該薬剤を同定する、方法。
【請求項１３】
哺乳類体細胞の再プログラミング方法であって、該細胞が再プログラミングされるように細胞外シグナリング分子の存在下に該細胞を培養することを含む、方法。
【請求項１４】
前記細胞外シグナリング分子が、細胞受容体の細胞外ドメインへのその分子の結合が前記細胞内のシグナル伝達経路を開始または改変する分子である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記シグナル伝達経路がＷｎｔ経路である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
下記工程：
（ａ）Ｗｎｔ経路モジュレーターを含有する培地中で哺乳類体細胞の集団を培養すること；
（ｂ）適当な時間の後、適当な時間に亘って培養物中に該細胞およびその子孫を維持した後にＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するかどうかを決定すること；
を含む、多能性状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用なＷｎｔ経路モジュレーターを同定するための方法であって、該培地が該Ｗｎｔ経路モジュレーターを含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ＥＳ様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該Ｗｎｔ経路モジュレーターを同定する、方法。
【請求項１７】
下記成分：
（ａ）Ｗｎｔ経路モジュレーターを含有する細胞培養培地；および、
（ｂ）複数の哺乳類体細胞であって、ここで（ｉ）該細胞が１つ以上の再プログラミング因子を発現するように遺伝的に改変されているか、もしくは一過性にトランスフェクトされているか；（ｉｉ）該細胞が、内因性の多能性遺伝子のためのプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーをコードする核酸配列を含有するように遺伝的に改変されているか；または（ｉｉｉ）該細胞培養培地が、ｃ−Ｍｙｃ以外の再プログラミング因子を代替する１つ以上の小分子、核酸、またはポリペプチドを含有する、哺乳類体細胞；
を含有する、組成物。
【請求項１８】
ａ）前記細胞培養培地がＷｎｔ−３ａＣＭを含む；および／または
ｂ）前記１つ以上の再プログラミング因子がＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、およびＫｌｆ４から選択される、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
ｉＰＳ細胞およびＷｎｔ経路を活性化する薬剤を含む、組成物。
【請求項２０】
哺乳類体細胞を再プログラミングするための医薬の製造におけるＷｎｔ経路をモジュレートする薬剤の使用。
【請求項２１】
哺乳類体細胞を再プログラミングするための組成物であって、Ｗｎｔ経路をモジュレートする薬剤を含む、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本明細書に記載した実施形態の全ては本発明の種々の態様に適用されることを意図している。さらにまた、本発明の種々の実施形態およびその要素は、適切である場合は常時、１つ以上の他のそのような実施形態および／または要素と組み合わせることができることも意図している。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
哺乳類体細胞を、該細胞が再プログラミングされるように、Ｗｎｔ経路をモジュレートする薬剤に接触させることを含む、哺乳類体細胞を再プログラミングする方法。
（項目２）
前記細胞を再プログラミングすることが、該細胞を多能性状態に再プログラミングすることを含む、項目１記載の方法。
（項目３）
接触させることが、前記薬剤を含有する培養培地中で前記細胞を培養することを含む、項目１記載の方法。
（項目４）
接触させることが、少なくとも１０日間前記薬剤を含有する培養培地中で前記細胞を培養することを含む、項目１記載の方法。
（項目５）
前記Ｗｎｔ経路をモジュレートする薬剤に前記体細胞を接触させることが、少なくとも５倍ＥＳ様細胞コロニーの数を増強する、項目１記載の方法。
（項目６）
前記Ｗｎｔ経路をモジュレートする薬剤に前記体細胞を接触させることが、少なくとも１０倍ＥＳ様細胞コロニーの数を増強する、項目１記載の方法。
（項目７）
前記方法が、Ｗｎｔ馴化培地中で前記細胞を培養することを含む、項目１記載の方法。
（項目８）
前記方法が、Ｗｎｔ３ａ馴化培地中で前記細胞を培養することを含む、項目１記載の方法。
（項目９）
前記細胞がヒト細胞である、項目１記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が終末分化した細胞である、項目１記載の方法。
（項目１１）
前記細胞が線維芽細胞である、項目１記載の方法。
（項目１２）
前記体細胞が、その型の体細胞において通常存在するよりも高レベルで少なくとも１つの再プログラミング因子を発現するか含有するように改変される、項目１記載の方法。
（項目１３）
前記体細胞が遺伝的に改変されない、項目１記載の方法。
（項目１４）
前記体細胞が、その細胞型の体細胞において通常存在するよりも高レベルでｃ−Ｍｙｃを発現するように遺伝的に改変されない、項目１記載の方法。
（項目１５）
前記細胞をさらにＷｎｔ経路をモジュレートする第２の薬剤と接触させる、項目１記載の方法。
（項目１６）
外因性の可溶性で生物学的に活性なＷｎｔタンパク質を含有する培地中で前記細胞を培養する、項目１記載の方法。
（項目１７）
前記Ｗｎｔタンパク質がＷｎｔ３ａである、項目１６記載の方法。
（項目１８）
前記再プログラミングされた細胞が多能性であることを確認することをさらに含む、項目１記載の方法。
（項目１９）
前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が形態学的基準によりＥＳ様細胞を同定することをさらに含む、項目１記載の方法。
（項目２０）
前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が再プログラミングされた細胞を選択するための化学的選択を実施することを含まない、項目１記載の方法。
（項目２１）
前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が多能性状態に再プログラミングされる細胞を多能性状態に再プログラミングされない細胞から分離することをさらに含む、項目１記載の方法。
（項目２２）
前記再プログラミングされた細胞を対象に投与することをさらに含む、項目１記載の方法。
（項目２３）
前記細胞を再プログラミングした後に該細胞を所望の細胞型にインビトロで分化させることをさらに含む、項目１記載の方法。
（項目２４）
前記分化した細胞を対象に投与することをさらに含む、項目２３記載の方法。
（項目２５）
下記工程：
（ａ）個体から体細胞を得ること；
（ｂ）項目１記載の方法に従って該体細胞の少なくとも一部分を再プログラミングすること；および、
（ｃ）場合により該細胞を１つ以上の所望の細胞型に分化させた後に、該個体に該再プログラミングされた細胞の少なくとも一部分を投与すること；
を含む、治療を要する個体を治療する方法。
（項目２６）
前記個体がヒトである、項目２５記載の方法。
（項目２７）
前記方法が細胞の集団に対して実施され、そして該方法が多能性状態に再プログラミングされる細胞を多能性状態に再プログラミングされない細胞から分離することをさらに含む、項目２５記載の方法。
（項目２８）
前記細胞をインビトロで分化させること、および、場合により、細胞療法が有用である状態に対する治療を要する個体に該分化した細胞を投与することをさらに含む、項目２５記載の方法。
（項目２９）
（ｉ）改変または処理を行わない場合よりも高いレベルで少なくとも１つの再プログラミング因子を発現または含有するように改変または処理を受けている哺乳類体細胞；および、（ｉｉ）Ｗｎｔ経路の活性を増大させ、そして該体細胞を多能性細胞に再プログラミングすることに寄与する薬剤を含む、組成物。
（項目３０）
前記体細胞が、その型の体細胞に通常存在するよりも高レベルで少なくとも１つの再プログラミング因子を発現または含有するように改変される、項目２９記載の組成物。
（項目３１）
前記薬剤がＷｎｔ３ａタンパク質である、項目２９記載の組成物。
（項目３２）
前記体細胞が遺伝的に改変されない、項目２９記載の組成物。
（項目３３）
前記体細胞が、その型の体細胞において通常存在するよりも高レベルでｃ−Ｍｙｃを発現するように遺伝的に改変されない、項目２９記載の組成物。
（項目３４）
前記体細胞が、その型の体細胞において通常存在するよりも高レベルで少なくとも１つの再プログラミング因子を発現するか含有するように改変される、項目２９記載の組成物。
（項目３５）
下記工程：
（ａ）Ｗｎｔ経路の活性をモジュレートする薬剤および候補薬剤を含有する培地中で哺乳類体細胞の集団を培養すること；
（ｂ）適当な時間の後、適当な時間に亘って培養物中に該細胞およびその子孫を維持した後にＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するかどうかを決定すること；
を含む、哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用である薬剤を同定する方法であって、該培地が該候補薬剤を含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ＥＳ様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該候補薬剤を同定する、方法。
（項目３６）
前記特徴がコロニー形態、ＥＳ細胞により選択的に発現される内在性遺伝子の発現、ＥＳ細胞により選択的に発現される遺伝子の発現制御配列に作動可能に連結した検出可能なマーカーの発現、免疫無防備状態のマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、および分娩まで生存するキメラの形成に関与する能力から選択される、項目３５記載の方法。
（項目３７）
前記細胞が少なくとも１つの再プログラミング因子を発現するように改変されている、項目３５記載の方法。
（項目３８）
前記培地がＷｎｔ馴化培地である、項目３５記載の方法。
（項目３９）
前記培地がＷｎｔ３ａ馴化培地である、項目３５記載の方法。
（項目４０）
前記Ｗｎｔ経路の活性をモジュレートする薬剤がＷｎｔ３ａタンパク質である、項目３５記載の方法。
（項目４１）
前記候補薬剤が小分子である、項目３５記載の方法。
（項目４２）
前記方法が、哺乳類体細胞の再プログラミングを増強するために有用である薬剤を同定することを含み、前記培地が前記候補薬剤を含有していない場合に予測されるものより高値のレベルでＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ＥＳ様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングを増強するために有用であるものとして該候補薬剤を同定する、項目３５記載の方法。
（項目４３）
工程（ｂ）が適当な時間に亘って培養物中に前記細胞およびその子孫を維持した後にＥＳ細胞コロニーの１つ以上の特徴を有する細胞コロニーが存在するかどうかを決定することを含み、前記培地が前記候補薬剤を含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでＥＳ細胞コロニーの１つ以上の特徴を有する細胞コロニーが存在するとき、ＥＳ様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該候補薬剤を同定する、項目３５記載の方法。
（項目４４）
前記細胞が少なくとも１つの再プログラミング因子を発現する、項目３５記載の方法。
（項目４５）
下記工程：
（ａ）Ｗｎｔ経路の活性を増大させる薬剤および候補薬剤に哺乳類体細胞の集団を接触させること；
（ｂ）適当な時間に亘り細胞培養系中に該細胞を維持すること；および、
（ｃ）ＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が該培養系中に存在するかどうかを決定することを含む、ＥＳ様状態に哺乳類体細胞を再プログラミングするために有用な薬剤を同定する方法であって、該細胞を該候補薬剤に接触させていなかった場合に予測されるものよりも高値のレベルでＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ＥＳ様状態に哺乳類体細胞を再プログラミングするために有用であるものとして該薬剤を同定する、方法。
（項目４６）
前記特徴が、コロニー形態、ＥＳ細胞により選択的に発現される内在性遺伝子の発現、ＥＳ細胞により選択的に発現される遺伝子の発現制御配列に作動可能に連結した検出可能なマーカーの発現、免疫無防備状態のマウスに注射した場合に内胚葉、中胚葉および外胚葉の特徴を有する細胞に分化する能力、および分娩まで生存するキメラの形成に関与する能力から選択される、項目４５記載の方法。
（項目４７）
前記Ｗｎｔ経路の活性を増大させる薬剤がＷｎｔ３ａタンパク質である、項目４５記載の方法。
（項目４８）
前記候補薬剤が小分子である、項目４５記載の方法。
（項目４９）
前記細胞が少なくとも１つの再プログラミング因子を発現する、項目４５記載の方法。
（項目５０）
工程（ｂ）が適当な時間に亘って培養物中に前記細胞およびその子孫を維持した後にＥＳ細胞コロニーの１つ以上の特徴を有する細胞コロニーが存在することを決定することを含み、前記培地が前記候補薬剤を含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでＥＳ細胞コロニーの１つ以上の特徴を有する細胞コロニーが存在するとき、ＥＳ様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該候補薬剤を同定する、項目４５記載の方法。
（項目５１）
細胞が再プログラミングされるように細胞外シグナリング分子の存在下に該細胞を培養することを含む、哺乳類体細胞の再プログラミング方法。
（項目５２）
前記細胞外シグナリング分子が、細胞受容体の細胞外ドメインへのその分子の結合が細胞内のシグナル伝達経路を開始または改変する分子である、項目５１記載の方法。
（項目５３）
前記シグナル伝達経路がＷｎｔ経路である、項目５２記載の方法。
（項目５４）
下記工程：
（ａ）Ｗｎｔ経路モジュレーターを含有する培地中で哺乳類体細胞の集団を培養すること；
（ｂ）適当な時間の後、適当な時間に亘って培養物中に該細胞およびその子孫を維持した後にＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するかどうかを決定すること；
を含む、多能性状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用なＷｎｔ経路モジュレーターを同定するための方法であって、該培地が該Ｗｎｔ経路モジュレーターを含有していない場合に予測されるものとは異なるレベルでＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ＥＳ様状態への哺乳類体細胞の再プログラミングをモジュレートするために有用であるものとして該Ｗｎｔ経路モジュレーターを同定する、方法。
（項目５５）
前記方法が、（ｉ）少なくとも１０のＷｎｔ経路モジュレーターを試験すること；および（ｉｉ）該Ｗｎｔ経路モジュレーターのうちの１つ以上を、他の試験したＷｎｔ経路モジュレーターの少なくとも５０％よりも再プログラミングの速度または効率に対して有意に高い作用を有するものとして同定することを含む、項目５４記載の方法。
（項目５６）
前記方法が、少なくとも２０のＷｎｔ経路モジュレーターを試験することを含む、項目５４記載の方法。
（項目５７）
前記方法が、前記Ｗｎｔ経路モジュレーターのうちの１つ以上を、他の試験したＷｎｔ経路モジュレーターの少なくとも７５％よりも再プログラミングの速度または効率に対して有意に高い作用を有するものとして同定することを含む、項目５４記載の方法。
（項目５８）
前記Ｗｎｔ経路モジュレーターが小分子である、項目５４記載の方法。
（項目５９）
適当な時間の後、前記培地が前記Ｗｎｔ経路モジュレーターを含有していない場合に予測されるものよりも多い数でＥＳ細胞の１つ以上の特徴を有する細胞が存在するとき、ＥＳ様状態へ細胞を再プログラミングする速度または効率を上昇させるために有用であるものとして該Ｗｎｔ経路モジュレーターを同定する、項目５４記載の方法。
（項目６０）
下記成分：
（ａ）Ｗｎｔ経路モジュレーターを含有する細胞培養培地；および、
（ｂ）複数の哺乳類体細胞であって、ここで（ｉ）該細胞が１つ以上の再プログラミング因子を発現するように遺伝的に改変されているか、もしくは一過性にトランスフェクトされているか；（ｉｉ）該細胞が、内因性の多能性遺伝子のためのプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーをコードする核酸配列を含有するように遺伝的に改変されているか；または（ｉｉｉ）該細胞培養培地が、ｃ−Ｍｙｃ以外の再プログラミング因子を代替する１つ以上の小分子、核酸、またはポリペプチドを含有する、哺乳類体細胞；
を含有する、組成物。
（項目６１）
前記細胞培養培地がＷｎｔ−３ａＣＭを含む、項目６０記載の組成物。
（項目６２）
前記１つ以上の再プログラミング因子がＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、およびＫｌｆ４から選択される、項目６０記載の組成物。
（項目６３）
ｉＰＳ細胞およびＷｎｔ経路を活性化する薬剤を含む、組成物。
（項目６４）
前記Ｗｎｔ経路を活性化する薬剤がＷｎｔ３ａタンパク質である、項目６３記載の組成物。
（項目６５）
哺乳類体細胞を再プログラミングするための医薬の製造におけるＷｎｔ経路をモジュレートする薬剤の使用。