【手続補正書】
【提出日】平成23年5月25日(2011.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つのI-CreI単量体のうちの一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメイン内に1つずつ存在する少なくとも2つの置換を有し、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的を切断でき、かつ少なくとも以下の工程：
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築する工程、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築する工程、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングする工程、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングする工程、
(e) 工程(a)の第1シリーズから、少なくとも(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングする工程、
(f) 工程(b)の第2シリーズから、少なくとも(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられた変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングする工程、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得る工程、
(h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を、単一の変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモ二量体I-CreI変異型を得る工程、
(i) 工程(g)及び／又は(h)で得られた変異型を組み合わせて、ヘテロ二量体を形成する工程、および
(j) マウスROSA26遺伝子座からの上記のDNA標的配列を切断できる工程(i)からのヘテロ二量体を選択及び／又はスクリーニングする工程
を含む方法により得ることができるI-CreI変異型。
【請求項２】
I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の前記置換が、44位、68位、70位、75位及び／又は77位にあり、I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン内の前記置換が、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位にある請求項1に記載の変異型。
【請求項３】
I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対する変異型の特異性を改変する1つ又は複数の置換をI-CreIの137位〜143位に含む請求項1又は2に記載の変異型。
【請求項４】
マウスROSA26遺伝子座からのDNA標的配列に対する変異型の結合及び／又は切断特性を改良する1つ又は複数の置換をI-CreI配列全体に含み、前記置換が好ましくはG19S、I24V、S79G、V105A、K107R、V151A、D153G及びK158Eからなる群より選択される請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項５】
前記置換が、元のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L及びVからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項６】
I-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位に異なる変異を有する第1及び第2単量体の会合により得られ、マウスROSA26遺伝子座からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できるヘテロ二量体である請求項1〜5のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項７】
前記DNA標的が、配列番号5〜14及び16〜30の配列からなる群より選択され、
前記第1単量体及び第2単量体が、好ましくはそれぞれ少なくとも以下の置換：
- N30H、Y33S、Q44E、R68C、R70S、D75N及びN30D、Y33R、Q38T、Q44K、R68E、R70S、I77R、
- S32N、Y33G、Q44K、R70E、D75N及びS32T、Q38W、Q44K、R68E、R70S、I77R、
- Y33R、Q38N、S40Q、Q44N、R70S、D75R、I77D及びN30H、Y33S、Q44A、R70S、D75Q、I77E、
- K28S、Q38R、S40K、Q44D、R68Y、R70S、D75S、I77R及びY33C、Q38A、R68A、R70K、D75N、
- Y33C、Q44T、R70S、D75Y及びS32D、Q38C、Q44D、R68Y、R70S、D75S、I77R、
- S32T、Y33C、R68T、R70N、D75N及びS32T、Q38W、Q44K、R70E、D75N、
- R70S、D75R、I77Y及びY33R、Q38A、S40Q、Q44A、R70S、D75N、
- K28S、Q38R、S40K、Q44T、R68N、R70N、D75N及びY33H、Q38S、Q44K、R68Y、R70S、D75Q、I77N、
- K28A、Y33S、Q38R、S40K、Q44N、R68Y、R70S、D75R、I77V及びS32T、Y33C、Q44A、R70S、D75N、
- S32D、Y33H、Q44K、R68E、R70S、I77R及びS32D、Y33H、Q44D、R68N、R70S、D75N、
- N30R、S32D、R68S、R70K、D75N及びD75N、
- K28R、Y33A、Q38Y、S40Q、R68Y、R70S、D75R、I77Q及びY33R、Q38A、S40Q、R70S、I77K、
- K28R、N30D、D75E、I77R及びS32D、Q38C、Q44A、R70S、D75R、I77Y、
- Y33R、Q38A、S40Q、R70S、D75N及びR70S、D75Y、I77R、
- Y33R、Q38A、S40Q、Q44N、R68Y、R70S、D75R、I77V及びN30R、S32D、Q44T、R68H、R70H、D75N、
- Y33P、S40Q、Q44K、R68Y、R70S、D75Q、I77N及びS32A、Y33C、R68Y、R70S、D75R、I77Q、
- K28A、Y33S、Q38R、S40K、R68N、R70S、D75N、I77R及びS32N、Y33G、Q44A、R68A、R70K、D75N、
- N30H、Y33S、Q44Y、R70S、I77V及びY33R、S40Q、Q44A、R70S、D75N、
- S32D、Y33H、R68T、R70N、D75N及びN30R、S32D、Q44T、R68N、R70N、D75N、
- S32R、Y33D、Q44A、R70S、D75N及びY33S、Q38R、S40H、R68H、R70H、D75N、
- Y33P、S40Q、Q44K、R68Y、R70S、D75Q、I77N及びK28R、Y33A、Q38Y、S40Q、Q44T、R68H、R70H、D75N、
- K28Q、Q38R、S40K、Q44A、R70S、D75E、I77R及びN30R、S32D、Q44K、R68Y、R70S、D75Q、I77N、
- Y33T、Q38A、R68H、R70H、D75N及びN30H、Y33S、R70S、I77K、
- Y33T、S40T、R68A、R70K、D75N及びK28R、Y33A、Q38Y、S40Q、R70S、並びに
- S32D、Y33H、Q44N、R70S、D75R、I77D及びS32D、Q38C、R70S、I77K
を含む請求項6に記載の変異型。
【請求項８】
それぞれ、第1単量体が配列番号82〜106の配列のいずれかのものであり、第2単量体が配列番号107〜116、4、117〜130の配列のいずれかのものである請求項7に記載の変異型。
【請求項９】
前記DNA標的が配列番号15であり、
第1単量体が、I24V、Q44Y、R70S及びD75N；I24V、Q44Y、R68Y、R70S、D75Y及びI77R；I24V、Q44Y、R70S、D75N及びI77V；I24V、Q44Y、R68N、R70S及びD75R；I24V、Q44Y、R68S、R70S及びD75R；I24V、Q44Y、R70S及びD75Q；I24V、Q44Y、R68Y、R70S、D75R及びI77V；I24V、Q44Y、R70S、D75Y及びI77Tからなる群より選択され、第2単量体が、K28E、Y33R、Q38R、S40R、Q44A、R68H、R70Q及びD75N；K28E、Y33R、Q38R、S40R、Q44A、R70N及びD75N；K28E、Y33R、Q38R、S40K、Q44A、R68H、R70Q及びD75N；K28E、Y33R、Q38R、S40K、Q44V、R70A及びD75N；K28E、Y33R、Q38R、S40K、Q44A、R70G及びD75Nからなる群より選択され、好ましくは第1単量体が配列番号39、43、45、49、50、51、53及び54の配列からなる群より選択され、第2単量体が配列番号60、61、63、65及び66の配列からなる群より選択される請求項6に記載の変異型。
【請求項１０】
前記DNA標的が配列番号15であり、第1単量体及び第2単量体がそれぞれ、少なくとも以下の置換：I24V、Q44Y、R70S、D75Y、I77T及びK28E、Y33R、Q38R、S40R、Q44A、R68S、R70Q、D75Nを含み、好ましくは第1単量体及び第2単量体がそれぞれ、配列番号54及び配列番号62である請求項6に記載の変異型。
【請求項１１】
前記DNA標的が配列番号15であり、第1単量体が、I24V、Q44Y、R68N、R70S及びD75R；I24V、Q44Y、R68S、R70S及びD75R；I24V、Q44Y、R70S及びD75Q；I24V、Q44Y、R68Y、R70S、D75R及びI77V；I24V、Q44Y、R70S、D75Y及びI77Tからなる群より選択され、第2単量体が、K28E、Y33R、Q38R、S40K、Q44A、R70S、D75N及びK28E、Y33R、Q38R、S40K、Q44A、R68T、R70N、D75Nからなる群より選択され、好ましくは第1単量体が配列番号49、50、51、53及び54の配列からなる群より選択され、第2単量体が配列番号64及び67の配列からなる群より選択される請求項6に記載の変異型。
【請求項１２】
前記DNA標的が配列番号15であり、第1単量体が配列番号72及び73の配列からなる群より選択され、第2単量体が配列番号74〜77の配列からなる群より選択される請求項6に記載の変異型。
【請求項１３】
核局在化シグナル及び／又はタグを含む請求項1〜12のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１４】
配列番号82〜106、107〜116、4、117〜130；39、43、45、49、50、51、53及び54；60、61、63、65及び66；54、62；64、67；72、73；74〜77の配列と少なくとも95%の配列同一性を有する請求項1〜13のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１５】
偏性ヘテロ二量体であり、第1単量体がD137R変異をさらに含み、第2単量体がR51D変異をさらに含むか、或いは第1単量体がE8R又はE8K及びE61R変異をさらに含み、第2単量体がK7E及びK96E変異をさらに含む請求項6〜14のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の1つの変異型の2つの単量体又はコアドメイン或いはその両方の組み合わせ、好ましくはペプチドリンカーで連結された請求項7、8及び9〜15のいずれか1項で定義される第1及び第2単量体を含む単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１７】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の変異型又は請求項16に記載の単鎖キメラメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項１８】
請求項17に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメント、好ましくは2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含み、そのそれぞれが、請求項6〜15のいずれか1項に記載のヘテロ二量体変異型の単量体の1つをコードする発現ベクター。
【請求項１９】
請求項1、6、7及び9のいずれか1項で定義されるマウスROSA26遺伝子座に存在するゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列で挟まれたマウスROSA26遺伝子座に導入される配列を含むターゲティング構築物を含むベクターであって、好ましくは、マウスROSA26遺伝子座に存在するゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する前記配列が、配列番号3の3131位〜3330位、3401位〜3600位、4628位〜4827位、5495位〜5694位、5519位〜5718位、5817位〜6016位、5903位〜6102位、6320位〜6519位、7305位〜7504位、7981位〜8180位、8215位〜8414位、8305位〜8504位、8494位〜8693位、8589位〜8788位、8660位〜8859位、8921位〜9120位、9191位〜9390位、9467位〜9666位、10174位〜10373位、11469位〜11668位、12302位〜12501位、12325位〜12524位、12446位〜12465位、12702位〜12901位、12815位〜13014位及び12865位〜13064位から選択される配列を含むマウスROSA26遺伝子座のフラグメントであるか、又はマウスROSA26遺伝子座に存在するゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する前記配列が、前記切断部位の上流及び下流の配列を含むマウスROSA26遺伝子座のフラグメントであり、そのことにより切断部位に隣接するコード配列の欠失を可能にする、前記ベクター。
【請求項２０】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項16に記載の1つの単鎖キメラメガヌクレアーゼ及び／又は請求項18又は19に記載の少なくとも1つの発現ベクター、好ましくは請求項19で定義される前記変異型のゲノムDNA標的部位を取り囲む領域と相同性を有する配列で挟まれたマウスROSA26遺伝子座に導入される配列を含むターゲティングDNA構築物を含む組成物。
【請求項２１】
請求項17に記載のポリヌクレオチド又は請求項18若しくは19に記載のベクターにより改変された宿主細胞。
【請求項２２】
請求項17又は18で定義される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２３】
請求項17又は18で定義される1つ又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
【請求項２４】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項16に記載の1つの単鎖キメラメガヌクレアーゼ、請求項18又は19に記載の1つのベクターの、非治療目的でのマウスゲノムの工学的改変のための使用であって、好ましくは前記変異型、単鎖キメラメガヌクレアーゼ又はベクターが、請求項19で定義されるターゲティングDNA構築物と会合し、より好ましくは前記ターゲティングDNA構築物が、請求項19で定義されるマウスROSA26遺伝子座に存在するゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列で挟まれた興味対象の生成物をコードするDNA配列と結局はマーカー遺伝子とを含むカセットを含む、前記使用。