【手続補正書】
【提出日】平成22年4月21日(2010.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物候補のスクリーニングおよび薬物発見の改善のための方法であって、
(a)標的酵素と、標的酵素の基質とを接触させる工程、
(b)単一分子検出装置を用いて力学測定を行うことによって、標的酵素の基質の存在下での標的酵素のベースライン力学的特性を測定する工程、
(c)標的酵素および標的酵素の基質と、１つ以上の薬物候補とを接触させる工程、
(d)単一分子検出装置を用いて力学測定を行うことによって、標的酵素の基質および1つ以上の薬物候補の存在下での標的酵素の力学的特性を測定する工程、ならびに
(e)工程(b)のベースライン力学的特性と、工程(d)の力学的特性とを比較する工程
を含み、
工程(b)のベースライン力学的特性および工程(d)の力学的特性が同じ単一分子検出装置および同じ力学測定を用いて測定され、
それにより、薬物候補がスクリーニングされ、薬物発見が改善される、
方法。
【請求項２】
単一分子検出装置が、磁気トラップまたは光学トラップを利用する装置、量子ドット標識と結びつけた高解像度蛍光画像化を利用する装置、および原子間力顕微鏡検査を利用する装置からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標的酵素がポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、および逆転写酵素からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ポリメラーゼがヒトポリメラーゼ、ウイルスポリメラーゼまたは細菌ポリメラーゼである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
ウイルスポリメラーゼがウイルス逆転写酵素である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ウイルス逆転写酵素がHIV-1逆転写酵素である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
標的酵素がポリメラーゼであり、標的酵素の基質がポリヌクレオチドであり、分子測定がポリヌクレオチド基質に沿ったポリメラーゼの移動の測定、または重合中のポリヌクレオチド基質の長さにおける時間依存的変化の測定である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
分子測定が磁気トラップまたは光学トラップを利用する単一分子検出装置を用いて行われる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
試験される薬物候補の阻害機構および／または干渉機構を正確に特徴付ける詳細な酵素力学データを提供する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
標的酵素および標的酵素の基質を用いて１つ以上の薬物候補の干渉機構を同定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
標的酵素が核酸ポリメラーゼである、請求項３記載の方法。
【請求項１３】
核酸ポリメラーゼの基質が核酸鋳型であり、さらに、核酸ポリメラーゼの力学的特性が、核酸ポリメラーゼのその基質に沿った時間依存的位置である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
薬物候補と、核酸鋳型に沿った核酸ポリメラーゼの移動との間の干渉のリアルタイム追跡をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
薬物候補のスクリーニングのための単一分子検出装置であって、
少なくとも１つの試料を保持するための試料容器、前記試料は、標的酵素、標的酵素の少なくとも１つの基質、および任意に、薬物候補を含む；
力測定システムを有する操作可能なトラップデバイス、該操作可能なトラップデバイスは、磁石、光学ピンセットまたは原子間力顕微鏡から選択され、標的酵素および／または標的酵素の少なくとも１つの基質をトラップし、力学測定を行い、それにより標的酵素の力学的特性が得られる；
標的酵素および／または標的酵素の少なくとも１つの基質の定位置を維持するための位置検知システム、あるいは標的酵素および／または標的酵素の少なくとも１つの基質に対して一定の力を維持するための力検知システム；ならびに
処理手段、該処理手段は、位置および／または力検知システムならびに操作可能なトラップデバイスと連絡しており、操作可能なトラップデバイスを制御し、標的酵素の力学的特性を保存、分類、定量および転送する、
を備える、単一分子検出装置。
【請求項１６】
力学測定が、標的酵素の基質に沿った標的酵素の時間依存的速度の測定、標的酵素の基質の長さにおける時間依存的変化の測定、標的酵素の基質の弾性における変化の測定、蛍光プローブまたは量子ドットからのシグナルの測定、ならびに標的酵素による基質結合および基質処理の効率または精度の測定からなる群より選択される、請求項１５記載の装置。
【請求項１７】
標的酵素が核酸ポリメラーゼであり、核酸ポリメラーゼの基質が核酸鋳型であり、さらに、核酸ポリメラーゼの力学的特性が、核酸ポリメラーゼのその基質に沿った時間依存的位置である、請求項１５記載の装置。
【請求項１８】
試料容器がマルチウェルプレートである、請求項１５記載の装置。
【請求項１９】
位置検知システムおよび／または力検知システムが、四分割フォトダイオード（ＱＰＤ）および／または音響光学偏向器（ＡＯＤ）結晶を備える、請求項１５記載の装置。
【請求項２０】
力学的特性を分析するための使用説明書が記録されたコンピュータ可読媒体をさらに備える、請求項１５記載の装置。
【請求項２１】
コンピュータ可読媒体が、
(i)標的酵素の基質の存在下での標的酵素の力学的特性を測定する；
(ii)標的酵素の基質および1つ以上の薬物候補の存在下での標的酵素の力学的特性を決定する；ならびに
(iii)工程(i)の力学的特性と、工程(ii)の力学的特性とを比較する
ための使用説明書を有し、ここで、工程(i)のベースライン力学的特性および工程(ii)の力学的特性が同じデバイスおよび同じ力学測定を用いて測定される、
請求項２０記載の装置。
【請求項２２】
薬物候補のスクリーニングおよび薬物発見の改善のための方法であって、
(a)薬物候補のリストを作成する工程；
(b)(i)標的酵素と、標的酵素の基質とを接触させる工程；
(ii)単一分子検出装置を用いて力学測定を行うことによって、標的酵素の基質の存在下での標的酵素のベースライン力学的特性を測定する工程；
(iii)標的酵素および標的酵素の基質と、１つ以上の薬物候補とを接触させる工程；
(iv)工程(ii)と同じ単一分子検出装置を用い、単一分子検出装置を用いて同じ力学測定を行うことによって、標的酵素の基質および1つ以上の薬物候補の存在下での標的酵素の力学的特性を測定する工程；
(v)工程(ii)のベースライン力学的特性と、工程(iv)の力学的特性とを比較する工程
を含む方法によってリスト上の薬物候補をスクリーニングする工程；ならびに
(c)工程(b)(iv)の力学的特性からの工程(b)(ii)のベースライン力学的特性の偏差の程度を測定する工程；ならびに
(d)有意な偏差を有しない薬物候補をリストから除外する工程、それにより、薬物候補がスクリーニングされ、薬物発見が改善される、
を含む、方法。
【請求項２３】
力学測定が、標的酵素の基質に沿った標的酵素の時間依存的速度の測定、標的酵素の基質の長さにおける時間依存的変化の測定、標的酵素の基質の弾性における変化の測定、蛍光プローブまたは量子ドットからのシグナルの測定、ならびに標的酵素による基質結合および基質処理の効率または精度の測定からなる群より選択される、請求項１または２２記載の方法。
【請求項２４】
力学測定により、標的酵素の単一分子および／または標的酵素の基質の単一分子の力学的特性が検出される、請求項１または２２記載の方法。
【請求項２５】
標的酵素が核酸ポリメラーゼである、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
１つ以上の薬物候補が核酸修飾剤である、請求項１２または２５記載の方法。
【請求項２７】
１つ以上の薬物候補が、ヌクレオチドもしくはヌクレオシドの鎖終結アナログまたは核酸ポリメラーゼの競合的インヒビターである、請求項１２または２５記載の方法。
【請求項２８】
核酸ポリメラーゼの基質が核酸鋳型であり、さらに、核酸ポリメラーゼの力学的特性が、核酸ポリメラーゼのその基質に沿った時間依存的位置である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
標的酵素および／または標的酵素の基質を固定化することをさらに含む、請求項１または２２記載の方法。
【請求項３０】
工程(b)の力学的特性からの工程(d)の力学的特性の有意な偏差を有しない１つ以上の薬物候補を却下する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
基質に対する正常な酵素的活性は、動力学的「力学的特性」を生じる。用語「力学的特性」は、本明細書で使用されるように、その基質と相互作用するときの単一分子の酵素の生体力学的痕跡をいう。生体力学的痕跡は、光学的ピンセットなどのnm範囲の移動を検出し得る機器を用いて測定され得る。上記のように、この動力学的力学的特性は、「力学測定」を行なうことにより、例えば、伸長および緩和動力学を含む基質ポリマーの弾性；核酸に結合したポリメラーゼなどの線形基質の「プロセッシング」酵素の時間依存性速度；酵素的結合によって引き起こされる基質の変形;および／または基質結合とプロセッシングの効率もしくは精度の変化を測定することにより測定され得る。