【手続補正書】
【提出日】平成23年4月22日(2011.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、鳥類胚性幹細胞(ES)に由来する遺伝的に安定している連続継代性鳥類細胞株を得るための方法であって、該鳥類細胞株が増殖因子およびフィーダー層の存在しない基礎培地中で増殖することができ、かつ複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない方法：
a) 産卵あたりの発生段階にあるトリ胚を単離する段階であって、該トリがガンカモ目から選択され、かつ該トリのゲノムが、複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しやすい内在性プロウイルス配列を含まない段階；
b) 段階a)の胚を分離することによって得られた鳥類胚性幹(ES)細胞を、以下を補充した基礎培地に懸濁する段階：
‐インスリン成長因子1(IGF-1)および毛様体神経栄養因子(CNTF);
‐動物血清；ならびに
‐任意に、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン6受容体(IL-6R)、幹細胞因子(SCF)、および線維芽細胞増殖因子(FGF)を含む群から選択される増殖因子；
c) 段階b)で得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、ES細胞を少なくとも1継代の間さらに培養する段階；
d) IL-6、IL-6R、SCF、FGFを含む群より選択される増殖因子をすべて培地から任意に除去し、ES細胞を少なくとも1継代の間さらに培養する段階；
e) IGF-1およびCNTFを培地から除去し、細胞を少なくとも1継代の間さらに培養する段階；
f) 何代かの継代後に、フィーダー層の完全な除去を得るために、培地中のフィーダー細胞の濃度を漸進的に減少させていき、細胞をさらに培養する段階；
g) 増殖因子およびフィーダー層の存在しない基礎培地中で増殖することができる、ES細胞に由来する接着性鳥類細胞株を得る段階であって、該遺伝的に安定している連続継代性鳥類細胞株が複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない段階。
【請求項２】
以下の段階を含む、鳥類胚性幹細胞(ES)に由来する遺伝的に安定している連続継代性鳥類細胞株を得るための方法であって、該鳥類細胞株が増殖因子およびフィーダー層の存在しない基礎培地中で増殖することができ、かつ複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない、請求項1記載の方法：
a) 産卵あたりの発生段階にあるトリ胚を単離する段階であって、該トリがガンカモ目から選択され、かつ該トリのゲノムが、複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しやすい内在性プロウイルス配列を含まない段階；
b) 段階a)の胚を分離することによって得られた鳥類胚性幹(ES)細胞を、以下を補充した基礎培地に懸濁する段階：
‐インスリン成長因子1(IGF-1)および毛様体神経栄養因子(CNTF);ならびに
‐動物血清；
c) 段階b)で得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、ES細胞を少なくとも1継代の間さらに培養する段階；
e) IGF-1およびCNTFを培地から除去し、細胞を少なくとも1継代の間さらに培養する段階；
f) 何代かの継代後に、フィーダー層の完全な除去を得るために、培地中のフィーダー細胞の濃度を漸進的に減少させていき、細胞をさらに培養する段階；
g) 増殖因子およびフィーダー層の存在しない基礎培地中で増殖することができる、ES細胞に由来する接着性鳥類細胞株を得る段階であって、該遺伝的に安定している連続継代性鳥類細胞株が複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない段階。
【請求項３】
段階f)の後、何代かの継代後に動物血清の完全な除去を得るために、培地中の動物血清の濃度を漸進的に減少させていく、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
接着性鳥類細胞株が懸濁培養条件に適合化される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
段階e)における培地からの増殖因子IGF-1およびCNTFの除去が同時に行われる、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
トリがアヒルである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
アヒルがペキンアヒルである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
アヒルがタイワンアヒルである、請求項6記載の方法。
【請求項９】
遺伝的に安定している連続継代性鳥類細胞株が、以下の特徴のうちの少なくとも1つを有し、かつ、該細胞が複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法：
‐高い核-細胞質比、
‐内因性テロメラーゼ活性、
‐直径約10μm；
‐37℃での約30時間またはそれ未満の倍加時間；
‐および任意に、該細胞が、アルカリホスファターゼ、SSEA-1、EMA-1、ENS-1を含む群から選択される1つまたは複数のさらなるマーカーを発現し得る。
【請求項１０】
以下の段階を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法によって得られ得る遺伝的に安定している連続継代性鳥類細胞において、ウイルスを複製する方法：
a) 該鳥類細胞を関心対象のウイルスに感染させる段階；
b) 該ウイルスを複製するために、該感染鳥類細胞を培養する段階；
c) 細胞培養上清中および/または該細胞内のウイルスを回収する段階。
【請求項１１】
ウイルスが、ポックスウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、サーコウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、ビルナウイルス、およびレトロウイルスを含む群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスが、改変ワクシニアAnkara(MVA)ウイルス、Lister-Elstreeワクシニアウイルス、LC16m8ワクシニアウイルス、CVI78ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス(fowl pox virus)、カナリア痘ウイルス(すなわち、ALVAC)、NYVAC、ユキヒメドリ痘ウイルス(juncopox virus)、キュウカンチョウ痘ウイルス(mynah pox virus)、鳩痘ウイルス(pigeonpox virus)、オウム痘ウイルス(psittacine pox virus)、ウズラ痘ウイルス(quail pox virus)、スズメ痘ウイルス(spallowpox virus)、ムクドリ痘ウイルス(starling pox virus)、シチメンチョウ痘ウイルス(turkey pox virus)を含む群の中から選択されるポックスウイルスまたは組換えポックスルウイルスである、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスが、好ましくは、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、センダイウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、ヒトパラインフルエンザI型およびIII型、牛疫ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、アヒルパラインフルエンザウイルスを含む群の中から選択されるパラミクソウイルスまたは組換えパラミクソウイルスである、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスが、ヒトインフルエンザウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルスの中から選択されるオルトミクソウイルス、組換えオルトミクソウイルス、または再集合体オルトミクソウイルスである、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスが、好ましくは、シンビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの中から選択されるトガウイルス、またはその組換えトガウイルスである、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスが、細網内皮症ウイルス、アヒル伝染性貧血ウイルス、suck脾臓壊死ウイルスの中から選択されるレトロウイルス、またはその組換えレトロウイルスである、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスが、パルボウイルス、好ましくはアヒルパルボウイルスまたはその組換えパルボウイルスである、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスが、好ましくは、鶏アデノウイルス、ガチョウアデノウイルス、アヒルアデノウイルス、およびハトアデノウイルスの中から選択されるアデノウイルス、またはその組換えアデノウイルスである、請求項10記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスが、ビルナウイルス、好ましくは伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスである、請求項10記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスが、好ましくは、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、およびウエストナイルウイルスの中から選択されるフラビウイルスである、請求項10記載の方法。
【請求項２１】
鳥類細胞がアヒルEB24細胞、EB26細胞、およびEB66細胞株から選択される、請求項10〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
適切な場合、免疫応答を増大させる薬学的に許容される物質と組み合わせられるワクチンであって、請求項10〜21のいずれか一項記載の方法によって得られるウイルスまたはそのウイルス抗原タンパク質を含み、細胞基材に複製能のある内在性レトロウイルスが存在しない、ワクチン。
【請求項２３】
ウイルスが、無傷のウイルス粒子として存在するウイルス、および分解されたウイルス粒子として存在するウイルスを含む群から選択される、請求項22記載のワクチン。
【請求項２４】
請求項1〜9のいずれか一項記載の方法によって得られ得る鳥類細胞株に由来し、かつウイルスに感染した鳥類細胞を含むワクチン。
【請求項２５】
以下の段階を含む、組換えタンパク質およびペプチドを生産する方法：
a) 発現ベクターの一過性または安定的トランスフェクションにより、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法によって得られ得る遺伝的に安定している連続継代性鳥類細胞株を遺伝子改変する段階；
b) 任意に、該組換えタンパク質またはペプチドを発現する該改変鳥類細胞株を選択する段階；および
c) 組換えペプチドまたはタンパク質を精製する段階。
【請求項２６】
請求項1〜9のいずれか一項記載の方法によって得られ得る遺伝的に安定している連続継代性鳥類細胞株であって、該鳥類細胞株の細胞が、以下の特徴のうちの少なくとも1つを有し、かつ、該細胞が複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない、鳥類細胞株：
‐高い核-細胞質比、
‐内因性テロメラーゼ活性、
‐直径約10μm；
‐37℃での約30時間またはそれ未満の倍加時間；
‐および任意に、該細胞が、アルカリホスファターゼ、SSEA-1、EMA-1、ENS-1を含む群から選択される1つまたは複数のさらなるマーカーを発現し得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明は、鳥類胚性幹細胞(ES)に由来するEBxと命名された連続継代性二倍体鳥類細胞株を得るための方法であって、該鳥類細胞株が複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない方法を提供する。
本説明の残りの部分では、下記の図面の説明文について言及する。
[請求項1001]
以下の段階を含む、鳥類胚性幹細胞(ES)に由来するEBx(登録商標)と命名された連続継代性二倍体鳥類細胞株を得るための方法であって、該鳥類細胞株が複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない方法：
a) 産卵あたりの発生段階にあるトリ胚を単離する段階であって、該トリのゲノムが、複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しやすい内在性プロウイルス配列を含まない段階；
b) 段階a)の胚を分離することによって得られた鳥類胚性幹(ES)細胞を、以下を補充した基礎培地に懸濁する段階：
‐インスリン成長因子1(IGF-1)および毛様体神経栄養因子(CNTF);
‐動物血清；ならびに
‐任意に、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン6受容体(IL-6R)、幹細胞因子(SCF)、および線維芽細胞増殖因子(FGF)を含む群から選択される増殖因子；
c) 段階b)で得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞層上に播種し、ES細胞を少なくとも1継代の間さらに培養する段階；
d) IL-6、IL-6R、SCF、FGFを含む群より選択される増殖因子をすべて培地から任意に除去し、ES細胞を少なくとも1継代の間さらに培養する段階；
e) IGF-1およびCNTFを培地から除去し、細胞を少なくとも1継代の間さらに培養する段階；
f) 何代かの継代後に、フィーダー層の完全な除去を得るために、培地中のフィーダー細胞の濃度を漸進的に減少させていき、細胞をさらに培養する段階；
g) 何代かの継代後に、動物血清の完全な除去を得るために、培地中の動物血清の濃度を任意に漸進的に減少させていく段階ならびに：
h) 任意に動物血清を含まない、増殖因子、フィーダー層の存在しない基礎培地中で増殖することができる、ES細胞に由来する接着性鳥類EBx(登録商標)細胞株を得る段階であって、該連続継代性二倍体鳥類細胞株が複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない段階；
i) 接着性アヒルEBx(登録商標)細胞株を懸濁培養条件に任意にさらに適合化する段階。
[請求項1002]
トリがガンカモ目から選択される、請求項1001記載の方法。
[請求項1003]
トリがアヒル、好ましくはペキンアヒルである、請求項1002記載の方法。
[請求項1004]
トリがキジ目から選択される、請求項1001記載の方法。
[請求項1005]
トリがev-0家畜ニワトリである、請求項1004記載の方法。
[請求項1006]
請求項1001〜1005のいずれか一項記載の方法によって得られ得る連続継代性二倍体鳥類細胞株であって、該鳥類細胞株の細胞が、以下の特徴のうちの少なくとも1つを有し、かつ、該細胞が複製能のある内在性レトロウイルス粒子を産生しない、鳥類細胞株：
‐高い核-細胞質比、
‐内因性テロメラーゼ活性、
‐直径約10μm；
‐37℃での約30時間またはそれ未満の倍加時間；
‐および任意に、該細胞が、アルカリホスファターゼ、SSEA-1、EMA-1、ENS-1を含む群から選択される1つまたは複数のさらなるマーカーを発現し得る。
[請求項1007]
以下の段階を含む、請求項1006記載の連続継代性二倍体鳥類細胞において、または請求項1001〜1005のいずれか一項記載の方法によって得られ得る連続継代性二倍体鳥類細胞において、ウイルスを複製する方法：
a) 該鳥類細胞を関心対象のウイルスに感染させる段階；
b) 該ウイルスを複製するために、該感染鳥類細胞を培養する段階；
c) 細胞培養上清中および/または該細胞内のウイルスを回収する段階。
[請求項1008]
ウイルスが、ポックスウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、サーコウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、ビルナウイルス、およびレトロウイルスを含む群より選択される、請求項1007記載の方法。
[請求項1009]
ウイルスが、改変ワクシニアAnkara(MVA)ウイルス、Lister-Elstreeワクシニアウイルス、LC16m8ワクシニアウイルス、CVI78ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス(fowl pox virus)、カナリア痘ウイルス(すなわち、ALVAC)、NYVAC、ユキヒメドリ痘ウイルス(juncopox virus)、キュウカンチョウ痘ウイルス(mynah pox virus)、鳩痘ウイルス(pigeonpox virus)、オウム痘ウイルス(psittacine pox virus)、ウズラ痘ウイルス(quail pox virus)、スズメ痘ウイルス(spallowpox virus)、ムクドリ痘ウイルス(starling pox virus)、シチメンチョウ痘ウイルス(turkey pox virus)を含む群の中から選択されるポックスウイルスまたは組換えポックスルウイルスである、請求項1008記載の方法。
[請求項1010]
ウイルスが、好ましくは、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、センダイウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、ヒトパラインフルエンザI型およびIII型、牛疫ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、アヒルパラインフルエンザウイルスを含む群の中から選択されるパラミクソウイルスまたは組換えパラミクソウイルスである、請求項1007記載の方法。
[請求項1011]
ウイルスが、ヒトインフルエンザウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルスの中から選択されるオルトミクソウイルス、組換えオルトミクソウイルス、または再集合体オルトミクソウイルスである、請求項1007記載の方法。
[請求項1012]
ウイルスが、好ましくは、シンビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの中から選択されるトガウイルス、またはその組換えトガウイルスである、請求項1007記載の方法。
[請求項1013]
ウイルスが、細網内皮症ウイルス、アヒル伝染性貧血ウイルス、suck脾臓壊死ウイルスの中から選択されるレトロウイルス、またはその組換えレトロウイルスである、請求項1007記載の方法。
[請求項1014]
ウイルスが、パルボウイルス、好ましくはアヒルパルボウイルスまたはその組換えパルボウイルスである、請求項1007記載の方法。
[請求項1015]
ウイルスが、好ましくは、鶏アデノウイルス、ガチョウアデノウイルス、アヒルアデノウイルス、およびハトアデノウイルスの中から選択されるアデノウイルス、またはその組換えアデノウイルスである、請求項1007記載の方法。
[請求項1016]
ウイルスが、ビルナウイルス、好ましくは伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスである、請求項1007記載の方法。
[請求項1017]
ウイルスが、好ましくは、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、およびウエストナイルウイルスの中から選択されるフラビウイルスである、請求項1007記載の方法。
[請求項1018]
請求項1007〜1017のいずれか一項記載の方法よって得られたウイルス。
[請求項1019]
適切な場合、免疫応答を増大させる薬学的に許容される物質と組み合わせられる、請求項1018に記載されるウイルスを含むワクチン。
[請求項1020]
ウイルスが、無傷のウイルス粒子として存在するウイルス、および分解されたウイルス粒子として存在するウイルスを含む群から選択される、請求項1019記載のワクチン。
[請求項1021]
適切な場合、免疫応答を増大させる薬学的に許容される物質と組み合わせられる、請求項1018に記載されるウイルスから得られた少なくとも1つのウイルス抗原タンパク質を含むワクチン。
[請求項1022]
請求項1006記載の鳥類細胞株、または請求項1001〜1005のいずれか一項記載の方法によって得られ得る鳥類細胞株に由来し、かつウイルスに感染した鳥類細胞を含むワクチン。
[請求項1023]
以下の段階を含む、組換えタンパク質およびペプチドを生産する方法：
a) 発現ベクターの一過性または安定的トランスフェクションにより、請求項1001〜1005のいずれか一項記載の方法によって得られ得るか、または請求項1006記載の、連続継代性二倍体鳥類細胞株を遺伝子改変する段階；
b) 任意に、該組換えタンパク質またはペプチドを発現する該改変連続継代性二倍体鳥類細胞株を選択する段階；および
c) 該遺伝子改変連続継代性二倍体鳥類細胞株によって発現された組換えペプチドまたはタンパク質を精製する段階。