【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年8月29日(2011.8.29)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵によってＬ−リジンを産生する方法であって、
炭素源としてスクロースを含有し、発酵培地においてフルクトースをグルコースに転換するのに有効な量のグルコースイソメラーゼを含有する該発酵培地において、フルクトース−ホスホトランスフェラーゼ系ＩＩ酵素（フルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩのトランスフェラーゼ活性が減弱または遮断されているＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株を増殖させるステップと、
該スクロースからＬ−リジンを産生するために該菌株を発酵させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
フルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩの活性が減弱または遮断されている前記Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株が、前記スクロースおよびグルコースイソメラーゼを含有する前記発酵培地において増殖された場合、フルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩの活性が減弱も遮断もされていないこと以外は同一の比較菌株、またはフルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩの活性が減弱もしくは遮断されていて、該グルコースイソメラーゼを含まない以外は同じ発酵培地において増殖された比較菌株よりも多くのＬ−リジンを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩの活性の減弱または遮断が、前記菌株のｐｔｓＦ遺伝子の破壊または欠失によってもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記グルコースイソメラーゼが、前記発酵培地に外因性に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記グルコースイソメラーゼが、前記Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株中で産生され、該菌株から前記培地中へ排出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発酵培地が、該発酵培地において前記スクロースの一部をフルクトースおよびグルコースに転換するのに有効な量のインベルターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩのトランスフェラーゼ活性が減弱または遮断されている菌株が、該菌株からのフルクトースの排出を減弱または遮断する変異をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記菌株においてグルコースキナーゼが過剰に発現される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記菌株においてグルコースイソメラーゼが過剰に発現される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記菌株においてグルコースキナーゼおよびグルコースイソメラーゼが過剰に発現される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
フルクトースのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株中への移入を減弱または遮断する、ｐｔｓＦ遺伝子における第１の変異を有し、該菌株からのフルクトースの排出を減弱または減少させる変異をさらに有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株。
【請求項１２】
前記Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株においてグルコースイソメラーゼおよびグルコースキナーゼのうちの少なくとも１つを過剰に発現するように構成された組換え型核酸コード手段をさらに含む、請求項１１に記載のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株。
【請求項１３】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株であって、該菌株をスクロースを含む培地で増殖した場合、フルクトースの該菌株中への移入を減弱または遮断するｐｔｓＦ遺伝子における第１の変異を有し、かつ、グルコースイソメラーゼを発現し、該グルコースイソメラーゼを該菌株から発酵培地中へ排出するように構成された組換え型核酸コード手段を有する、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株。
【請求項１４】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株からのフルクトース排出を減弱または減少させる変異を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでのスクロースからのアミノ酸の産生
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００７年９月２６日に出願された、係属中の米国仮特許出願第６０／９５５，３４８号に対する優先権を主張する。上記出願は、あたかもそれが本明細書に完全に再度記載されているように、参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、炭素源としてスクロースを使用して、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌によってアミノ酸を産生するための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、炭素源としてスクロースを使用した、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのＬ−リジンの産生に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍの多くの商業的発酵は、炭素源としてグルコースを使用する。したがって、多くの細菌産生培養物が、炭素源としてグルコースを使用して産生速度および／または収量を最適化するように設計されてきた。商業的に重要なアミノ酸であるＬ−リジンの産生は、最適化の特定の標的であった。
【０００４】
コストおよび他の可能性のある考慮すべき事項があるので、代替の非グルコース炭素源の使用は、世界のある場所において好ましい可能性がある。１つの可能性のある非グルコース炭素源は、スクロースである。スクロースは、例えば、サトウキビまたはサトウダイコンから得ることができる。残念ながら、微生物によるスクロースの輸送および利用は、グルコースとは異なることが多いため、炭素源としてスクロースを使用した、多くの微生物からの望ましいアミノ酸またはファインケミカル産物の産生は、効率の低下を引き起こす可能性がある。炭素源としてスクロースを使用する微生物が、グルコースで最適に増殖するように設計されている場合は特にそうである可能性がある。発酵によるＬ−リジンなどのアミノ酸の製造に最も一般に使用される微生物の１つであるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの場合もそうである。
【０００５】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるスクロース利用の代謝経路は、非特許文献１によって提案された。Ｗｉｔｔｍａｎｎらは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍがホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）によって起こるスクロース取り込み機構を有し、このＰＴＳにおいてスクロースのグルコース環がリン酸化され、続いてグルコース−６−リン酸とフルクトースに細胞内で加水分解されると仮定した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＰＴＳは、それぞれフルクトース、スクロースおよびグルコースを優先的に輸送する、それぞれｐｔｓＦ遺伝子、ｐｔｓＳ遺伝子およびｐｔｓＧ遺伝子によってコードされる、フルクトース−ｐｔｓ、スクロース−ｐｔｓおよびグルコース−ｐｔｓと命名された膜結合ＥＩＩタンパク質複合体の別々のセットと相互作用する、それぞれｐｔｓＩ遺伝子およびｐｔｓＨ遺伝子によってコードされる、酵素ＩおよびＨｐｒと命名された２つの一般的に共有された細胞質タンパク質の組み合わせを利用する一般的な炭水化物輸送系である（非特許文献２）。未知の特異性を有するタンパク質をコードするＨＣｇｌ２９３３およびＮＣｇｌ２９３４と命名された２つのｐｔｓ遺伝子もある（同文献）。
【０００６】
Ｗｉｔｔｍａｎｎらはさらに、加水分解後に生じるフルクトースは、細胞から分泌され、次いでフルクトース−ＰＴＳ取り込み系およびマンノースＰＴＳ取り込み系（後者は、現在ではグルコース−ＰＴＳと同じと考えられている）を通して再移入されることを示唆した。複数のスクロース取り込み系（スクロース−ＰＴＳ、フルクトース−ＰＴＳ、およびグルコース−ＰＴＳ）が存在し、したがって細胞中への複数の炭素入口点が存在することが、スクロースの好ましくない産生力の可能性のある理由として仮定された。
【０００７】
グルコースでのリジン産生の際には、炭素の約６５％が、リジンの合成に使用されるＮＡＤＰＨを生成するためのペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に向かう。しかしながら、スクロースでのリジン合成の際には、全炭素の半分弱がフルクトース−１，６−リン酸として解糖系に入るため、非常に低い百分率の炭素がＰＰＰに向かうと考えられている。
【０００８】
図１に例示するように、野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍがスクロースにおいて増殖する場合、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞に入ることになるフルクトースの約９０％は、フルクトース−ＰＴＳを通してフルクトース−１−リン酸として入ると考えられている。フルクトース−１−リン酸はリン酸化されて、フルクトース−１，６−リン酸が産生される。主に、６−ホスホフルクトキナーゼが主として不可逆的酵素であり、スクロースで増殖したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてフルクトース−１，６−ビホスファターゼ活性がほんの少ししかないという理由から、フルクトース−１，６−リン酸はＰＰＰ経路を通過しないと考えられている。したがって、フルクトース−１，６−二リン酸は、優先的に解糖系およびＴＣＡ回路に入ることになり、商業的レベルのリジン合成のための還元力を提供しない。
【０００９】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに入るフルクトースの約１０％は、グルコース−ＰＴＳ系によってフルクトース−６−リン酸として取り込まれると考えられている。フルクトース−６−リン酸は、フルクトース−６−リン酸からグルコース−６−リン酸を産生するために糖新生方向で機能するグルコース−６−リン酸イソメラーゼの作用によってＰＰＰフラックスに向けられる炭素量に寄与する可能性がある。解糖系およびＰＰＰシャントを通じての経路を含めた、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるスクロース利用の１つの代謝経路案を図１に示す。
【００１０】
スクロースでのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍからのリジン産生の増加が評価されている。産生を増加させるために使用することができる１つの方法が、非特許文献３によって説明された。
【００１１】
Ｇｅｏｒｇｉらの戦略は、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ遺伝子ｆｂｐを過剰に発現させるための構成的プロモーターの使用を含むものとされている。しかしながら、この戦略は、スクロースでの増殖に最適化されるが、グルコースにおいて準最適である増殖につながる可能性がある特性を有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの菌株の作製をもたらす可能性があるため、好ましくない可能性がある。これは、菌株の経済的に実行可能な用途の柔軟性を潜在的に低減する可能性があり、条件が変化するにつれて経済的に有利であるものに応じて、炭素源としてスクロースまたはグルコースを使用できるようには機能しない可能性がある。
【００１２】
スクロースでのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍからのリジン産生を増加させるための別の考えられている戦略が、特許文献１ならびに非特許文献４において報告されている。この戦略において、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼが過剰に発現される。これは、フルクトース−１，６−ＰがＰＰＰに戻るのを可能にし、最終的にＮＡＤＰＨ量を増加させるとされている。ＧｅｏｒｇｉらおよびＢｅｃｋｅｒらの基本戦略を、図５に例示する。
【００１３】
炭素源としてスクロースを使用した、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍからのリジン産生をおそらく増加させる別の提案が、非特許文献５において報告された。Ｍｏｏｎは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｉｕｍ  ａｃｅｔｏｙｂｕｔｙｌｉｃｕｍフルクトースキナーゼ遺伝子の発現が、そうでなければフルクトキナーゼ活性を欠く親菌株の対数期増殖の間に排出（ｅｘｐｏｒｔ）される、スクロースでの増殖の間に形質転換菌株から培地中へ排出されるフルクトースを減少させることを実証した。Ｍｏｏｎらは、フルクトース−ｐｔｓ活性を欠くがフルクトキナーゼ酵素を発現するｐｔｓＦ変異株が、より高い光学濃度へ増殖し、フルクトキナーゼ活性を欠く変異株よりも良好に排出されたフルクトースを利用することができることも実証した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるフルクトキナーゼの発現は、フルクトースを、細胞から排出し次いでＰＴＳ系を経由して主にフルクトース１−リン酸として再移入する代わりに、ＰＰＰシャントへと進み、おそらくリジン産生を増加させることになるフルクトース−６−Ｐに転換することを可能にすることになると仮定された。Ｍｏｏｎらによって仮定された図式を、図６に例示する。
【００１４】
炭素源としてフルクトースおよびスクロースを使用したリジン産生の反応速度論は、非特許文献６、および非特許文献７において報告されている。改変Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞へのＥ．ｃｏｌｉキシロースイソメラーゼ遺伝子の導入は、非特許文献８において報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０５９１３９号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｗｉｔｔｍａｎｎら、「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｆｌｕｘｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｌｙｓｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｃｒｏｓｅ  ａｓ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ」、Ａｐｐｌ．＆  Ｅｎｖｉｒｏ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４年）７０巻（１２号）：７２７７〜７２８７頁
【非特許文献２】Ｔａｎａｋａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００８年）１５４巻、２６４〜２７４頁）
【非特許文献３】Ｇｅｏｒｇｉら、「Ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｏｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，  Ｆｒｕｃｔｏｓｅ，  ａｎｄ  Ｓｕｃｒｏｓｅ：  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｍａｌｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ」、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇ．（２００５年）７巻：２９１〜３０１頁
【非特許文献４】Ｂｅｃｋｅｒら、「Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｒｕｃｔｏｓｅ  １，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｌｕｘ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｐｅｎｔｏｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｏｆ  ｌｙｓｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５年）７１巻：８５８７〜８５９６頁
【非特許文献５】Ｍｏｏｎら、「Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｓｕｇａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２」ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００５年）２４４巻：２５９〜２６６頁
【非特許文献６】Ｋｉｅｆｅｒら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ，  ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ａｎｄ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ａｓ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｌｙｓｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」、Ｊ．Ｉｎｄｕｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．＆  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２年）２８巻：３３８〜３４３頁
【非特許文献７】Ｋｉｅｆｅｒら、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｙｓｉｎｅ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｏｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｒ  Ｆｒｕｃｔｏｓｅ」、Ａｐｐｌ．＆  Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４年）７０巻（１号）：２２９〜２３９頁
【非特許文献８】Ｋａｗａｇｕｃｈｉら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｘｙｌｏｓｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」、Ａｐｐｌ．＆  Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００６年）７２巻（５号）：３４１８〜３４２８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
スクロースでの増殖に最適化されているが、グルコースでの増殖に好ましい特性を保持する微生物の菌株を作製することが望ましいことになる。スクロースが入手可能な場合は、かかる菌株は、経済的により好ましい、スクロースからのアミノ酸の発酵生産をもたらすことができ、スクロースが入手不可能である、またはグルコースほど豊富もしくは安価でない場合は、かかる菌株は、グルコースからのアミノ酸の発酵生産に効率的に使用することができるはずである。本発明の目的は、かかる菌株を作製することである。本発明の目的はさらに、本発明の実施形態によって作製された菌株を使用してリジンを産生することである。好ましくは、リジン産生の量および／または速度は、本発明の実施形態において作製される細菌において、より大きいことになる。もちろん、特許請求の範囲によって定義される本発明は、本発明の目的の１つまたは複数を満たすためのその能力によって限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、炭素源としてスクロースを使用した、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌によるアミノ酸の産生に関する。一態様において、本発明は、フルクトース輸送機構を減弱または遮断した微生物の新規な菌株およびその作製方法を提供する。別の態様において、スクロースでの最適な増殖のために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの内在性ＰＴＳの天然の特徴を活用する、培地における酵素を使用した発酵方法を提供する。
【００１９】
一実施形態において、グルコースイソメラーゼおよび／またはインベルターゼを添加した発酵ブロスにおいて微生物を発酵させることができる。別の実施形態において、グルコースイソメラーゼおよび／またはインベルターゼを細胞において発現させ、培地中へ排出することもできる。別の態様において、本発明の微生物は、減弱もしくは遮断されたフルクトース輸送機構またはフルクトース排出機構を有するように変異させたものである。さらに別の態様において、グルコース−６−リン酸の形成を経て移入されたフルクトースをＰＰＰシャントの方向へ駆動するために、細胞質においてグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼを発現するように微生物を操作することができる。これらの微生物、培地またはその両方を使用してアミノ酸を産生する方法も本発明の態様に含まれる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
発酵によってアミノ酸を産生する方法であって、
炭素源としてスクロースを含有し、発酵培地においてフルクトースをグルコースに転換するのに有効な量のグルコースイソメラーゼを含有する該発酵培地においてフルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩのトランスフェラーゼ活性が減弱または遮断されているＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株を増殖させるステップと、該アミノ酸を産生するために該微生物を発酵させるステップと
を含む方法。
（項目２）
前記アミノ酸がＬ−リジンであることを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記フルクトース−ＰＴＳの減弱または遮断が、前記菌株のｐｔｓＦ遺伝子の破壊または欠失によってもたらされる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記グルコースイソメラーゼが、前記発酵培地に外因性に添加される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記グルコースイソメラーゼが、前記Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株中で産生され、該菌株から前記培地中へ排出される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記発酵培地が、該発酵培地において前記スクロースの一部をフルクトースおよびグルコースに転換するのに有効な量のインベルターゼをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
発酵によってアミノ酸を産生する方法であって、
炭素源としてスクロースを含有する発酵培地において、フルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩのトランスフェラーゼ活性が減弱または遮断されており、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株からのフルクトースの排出を減弱または遮断する変異をさらに含む該菌株を増殖させるステップと、
該アミノ酸を産生するために該菌株を発酵させるステップと
を含む、方法。
（項目８）
前記菌株においてグルコースキナーゼが過剰に発現される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記菌株においてグルコースイソメラーゼが過剰に発現される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記菌株においてグルコースキナーゼおよびグルコースイソメラーゼが過剰に発現される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
フルクトースのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株中への移入を減弱または遮断する、該ｐｔｓＦ遺伝子における第１の変異を有し、該菌株からのフルクトースの排出を減弱または減少させる変異をさらに有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株。
（項目１２）
前記Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株においてグルコースイソメラーゼおよびグルコースキナーゼのうちの少なくとも１つを過剰に発現するように構成された組換え型核酸コード手段をさらに含む、項目１１に記載のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株。
（項目１３）
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株がスクロースを含む培地上で増殖した場合、フルクトースの該菌株中への移入を減弱または遮断するｐｔｓＦ遺伝子における第１の変異を有し、かつ、グルコースイソメラーゼを発現し、該グルコースイソメラーゼを該菌株から発酵培地中へ排出するように構成された組換え型核酸コード手段を有する、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株。
（項目１４）
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株からのフルクトース排出を減弱または減少させる変異を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるスクロースおよびフルクトースの野生型代謝を示す図である。
【図２】Ｍｏｏｎら、「Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｓｕｇａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２」ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４４巻：２５９〜２６６頁（２００５年）によって記載されているものなど、フルクトース−ＰＴＳノックアウト変異体を提供する本発明の実施形態によるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのスクロースおよびフルクトースの代謝経路を示す図である。ＭｏｏｎらのＰＴＳノックアウト変異体型を、発酵培地におけるグルコースイソメラーゼの添加または分泌とともに本発明において使用する。
【図３】Ｍｏｏｎらによって記載されているものなど、フルクトース−ＰＴＳノックアウト変異体とともに、インベルターゼおよびグルコースイソメラーゼが発酵培地中へ添加または分泌されている本発明の実施形態によるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのスクロースおよびフルクトースの代謝経路を示す図である。
【図４】フルクトース−ＰＴＳノックアウトおよびフルクトース排出輸送体のノックアウトの両方を有する変異細胞内で、グルコースイソメラーゼがクローン化され、発現された、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのスクロースおよびフルクトース代謝経路を示す図である。
【図５】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいてフルクトース−１，６−二リン酸が過剰に発現している、従来技術のスクロースおよびフルクトースの代謝経路を示す図である。この経路は、ＷＯ２００５／０５９１３９Ａ２ならびにＢｅｃｋｅｒら、「Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＯＦ  Ｆｒｕｃｔｏｓｅ  １，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｌｕｘ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｐｅｎｔｏｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｏｆ  ｌｙｓｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１巻：８５８７〜８５９６頁（２００５年）において報告されている。
【図６】フルクトースキナーゼも発現している、Ｍｏｏｎらによる従来技術のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのスクロースおよびフルクトースの代謝経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
先の背景技術および発明の概要ならびに以下の詳細な説明には、当業者が本発明をよりよく理解するのを助けることができるおよび／または本明細書で説明された本発明を当業者が容易に実施することができるようにすることになる、組成物、細菌の菌株ならびにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ変異体および遺伝子操作された発現ベクターを作製する方法の説明を提供する様々な参考文献の引用が含まれる。したがって、当技術分野で公知の多数の参考文献の顕著な説明を再現するよりはむしろ、本明細書で引用するすべての参考文献は、かかる参考文献が、リジンおよび他のアミノ酸を産生するために、菌株の有効性、変異体および組換え体を作製する方法、菌株の性質および入手の可能性ならびにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの発酵プロセスを教示する程度まで、これによって参照することにより組み込まれる。組み込まれた参考文献の任意の教示が、本明細書で提供された説明と矛盾する程度まで、この説明が支配する。
【００２２】
本発明は、炭素源としてスクロースを使用した、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌によるファインケミカルの産生に関する。これらのファインケミカルは、例えば、アミノ酸またはビタミンでもよい。産生することができるアミノ酸には、例えば、Ｌ−リジン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニン、およびホモセリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
細菌の細胞におけるＮＡＤＰＨ量の増加は、特にＮＡＤＰＨが限定因子である同化プロセスにおいて、産生収量を増加させることが、本発明で決定された。異化作用からの化学エネルギーを、アミノ酸の形成などのエネルギーを必要とする生合成反応へ輸送する方法は、水素原子または電子の形である。
【００２４】
還元剤として効果的であるために、水素原子は、かなりの自由エネルギーを有さなければならない。かかる高エネルギーの水素原子は、燃料分子からの水素原子の除去および特異的な補酵素へ、特にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）の酸化型へのその運搬を触媒する脱水素酵素によって細胞燃料から得られる。ＮＡＤＰＨと命名された、還元された、または水素を運搬する、この補酵素の形は、異化反応から電子を必要とする生合成反応へのエネルギーに富んだ電子の担体である。
【００２５】
好ましくは、ＮＡＤＰＨ有効性は、ペントースリン酸経路の酸化分岐を通して炭素フラックスを増加させることによって増加する。理論上は、グルコースがペントースリン酸経路において排他的に代謝された場合、グルコース１分子あたり１２分子のＮＡＤＰＨが生成されるが、ＴＣＡ回路（トリカルボン酸、クエン酸回路とも称される）において代謝されるグルコース１分子あたり２分子のＮＡＤＰＨしか産生されない。Ｉｓｈｉｎｏ，  Ｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７巻：１５７〜１６５頁（１９９１年）。本発明は、ペントースリン酸経路を通したスクロースおよびスクロース産物の炭素フラックスが増加した改変細菌細胞を培養することによって、Ｌ−アミノ酸を産生する方法を提供する。
【００２６】
ヘキソース一リン酸経路とも称される、ペントースリン酸経路（「ＰＰＰ」）は、グルコースの異化の代替経路である。ペントースリン酸経路は、ＮＡＤＰＨを産生し、リジン発酵条件下でより活性がある。Ｉｓｈｉｎｏ，  Ｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７巻：１５７〜１６５頁（１９９１年）。天然においてＰＰＰを通して送られるスクロースは少ないため、スクロースから形成されるＮＡＤＰＨは比較的少ない。ＰＰＰは、Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅらの米国特許第６，８３０，９０３号において、さらに論じられている。
【００２７】
一態様において、本発明は、減弱または遮断されたフルクトース取り込み機構の結果としてＮＡＤＰＨ量が増加した、１つまたは複数の新規な微生物の菌株を提供する。かかる減弱または遮断は、例えば、フルクトース−ＰＴＳ取り込み経路における酵素をコードする遺伝子の破壊または除去によって達成することができる。かかる酵素は、例えば、ｐｔｓＦ遺伝子（配列番号２）によってコードされるフルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩ（配列番号１）とすることができる。ｐｔｓＦの破壊の例は、以下の実施例１で説明されている。当業者は、フルクトース取り込みを減少させ、または排除するために、他の遺伝子も効果的に破壊または減弱することができると認識することができる。
【００２８】
スクロースの取り込み由来のフルクトースは、まず排出機構によって排出された後に細胞に再び入るため、例えばＭｏｏｎらによって記載されているように、フルクトース−ＰＴＳ酵素変異体の使用によるなど、スクロースで増殖した微生物におけるフルクトース取り込みの減少または排除は、培地におけるフルクトースの蓄積を必ずもたらすことになる。このフルクトースは、グルコースイソメラーゼの作用によってグルコースに転換することができる。このグルコースは、さもなければフルクトース−ＰＴＳ酵素を経由して優先的に細胞に入ることになるフルクトースが、まずフルクトース−１−リン酸に変えられる場合に起こるなど、次いでグルコースホスホトランスフェラーゼ系（グルコース−ＰＴＳ）によって効率的に取り込まれ、解糖を通じて優先的に進むよりはむしろ直ちにＰＰＰシャントに入るグルコース−６−リン酸に転換されることになる。グルコースは、グルコース−ＰＴＳによってフルクトースよりもはるかに効率的に細胞中へ運搬されるため、異性化の平衡は、排出されたフルクトースをグルコースに転換する方向へ駆動されることになる。本発明の本実施形態におけるスクロース利用の代謝経路案を図２に示す。
【００２９】
本発明の本態様において、グルコースイソメラーゼは、培地中に含まれる。培地中にグルコースイソメラーゼを含めることは、例えば、発酵の開始前に酵素を添加することを通して、発酵中に酵素を添加することを通して、または必要に応じて酵素を連続的に添加することを通して達成することができる。グルコースイソメラーゼを、液状酵素、および固定化酵素、またはその２つの混合物として添加することができる。本発明の好ましい実施形態において、十分なグルコースイソメラーゼを、フルクトースからグルコースへの転換の平衡を維持するために添加する。グルコースイソメラーゼは、デキストロースからの高フルクトースコーンシロップの商業的な製造において一般に使用され、Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳの一部門であるＧｅｎｅｃｏｒ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）などの商業的な製造業者から産業的な量で容易に入手可能である。
【００３０】
本態様の別の実施形態において、微生物は、培地中に排出されるグルコースイソメラーゼを産生するように転写される遺伝子を含むことができる。これは、上記のような、グルコースイソメラーゼの培地への添加に取って代わるかまたはこれを補充することができる。例えば、グルコースイソメラーゼの遺伝子（配列番号３）（Ｅ．Ｃ．５．３．１．５  Ｄ−キシロースケトール−イソメラーゼ）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓなどの生物からクローン化し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの菌株において発現させることができる。グルコースイソメラーゼの１つの例を、配列番号４に示す。他の生物においてグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子も使用することができ、例えば、遺伝子はＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍの菌株から得ることができる。例えば、Ｔａｔｅｎｏら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（２００７年）７７巻：５３３〜５４１頁およびＳａｌｉｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（１９９７年）６３巻：４３９２〜４４００頁によって記載された、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｃｓｏＢ遺伝子のＰＳ２タンパク質のベクターおよびシグナル配列などの、培地中に排出されることになる融合タンパク質を産生するために必要なシグナル配列を含有するベクターのような、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて組換え遺伝子を発現させるためのプロモーターを含有するベクターは、当技術分野で周知である。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、上記の、フルクトース−ＰＴＳ酵素におけるノックアウト変異を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの増殖においてグルコースイソメラーゼに加えて、インベルターゼ酵素の培地への添加を含む。本実施形態の代謝経路案を、図３に示す。インベルターゼの添加は、グルコースおよびフルクトースをスクロース炭素供給物の少なくとも一部から直接的に形成することになり、グルコースイソメラーゼによるグルコースへの転換に使用できる、細胞外のフルクトース量をさらに増加させる。本実施形態は、フルクトース−ＰＴＳによるフルクトース−１−リン酸の産生を避けると同時に、細胞においてグルコース−リン酸の産生を駆動し続けるために、グルコース−ＰＴＳ酵素とスクロース−ＰＴＳ酵素の両方の使用を十分に利用する。インベルターゼの商業的な量は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）などの製造業者から容易に入手可能である。
【００３２】
さらに別の態様において、本発明は、フルクトース−ＰＴＳ酵素と、スクロースで増殖したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞からのフルクトースの排出を担うフルクトース排出輸送体との両方における二重の変異を提供し、したがって排出輸送体の活性が排除または減少される。本態様の実施形態は、細胞において保持されるフルクトースが、急速にグルコース、次いでグルコース−６−リン酸に転換されるように、グルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼの細胞内発現の増加をさらに含むことができる。グルコキナーゼの１つの例は、配列番号５によるグルコースキナーゼである。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるグルコースキナーゼをコードする１つのｇｌｋ遺伝子（配列番号６）が、Ｐａｒｋら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｋ，  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｏｆ  Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８８巻：２０９〜２１５頁（２０００年）によって報告されている。グルコキナーゼを過剰に発現する実施形態は、菌株が、グルコース−６−リン酸への最終的な転換のために、保持されたフルクトースからグルコースイソメラーゼによって形成された過剰のグルコースを転換するための十分な内在性グルコキナーゼ活性をさもなければ有さない場合、特に有益である。本実施形態におけるスクロース利用の代謝経路を、図４に示す。
【００３３】
フルクトース排出輸送体の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は公知ではないが、その存在は、Ｍｏｏｎらによって報告されているように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞が炭素源としてスクロースを使用して増殖した場合に起こる、フルクトースの観察された輸送によって認識される。したがって、Ｍｏｏｎ  らによって記載されたｐｔｓＦ変異体などの、フルクトースＰＴＳ変異を有する菌株を使用して開始する場合、菌株は、化学的手段やその他によって通常の無作為の変異誘発を受け、スクロースで増殖することができるが、フルクトースを排出しない細胞が選択される。フルクトースを輸送しない細胞を選択する１つの方法が、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら、「Ｎｅｗ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｐｌａｔｅ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｒｕｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｕｎｇｉ」、Ｒｅｖ  Ｉｂｅｒｏａｍ  Ｍｉｃｒｏｌ（２００６年）２３巻：１８９〜１９１頁によって記載されている。Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚらは、トランスフルクトシル化活性を有する細胞を、寒天培地上で増殖した細胞コロニーの周りの青いハローによって特定することができるアッセイを教示している。したがって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐｔｓＦ変異体は、スクロース最小培地上で増殖した場合、かかる青いハローを産生することになるが、フルクトース排出輸送体活性を欠く変異体は、ハローを有さないことになり、かかる変異体の選択が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの化学的に変異誘発した集団の視覚的なスクリーニングの単なる事項になる。さらに、当業者は、発酵培地におけるフルクトースおよび／またはグルコースの濃度を検出するために使用することができる複数のアッセイを認識することになる。例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができるか、または例えば、Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ＡＧから供給されるキットで、従来の比色アッセイを使用することができる。
【００３４】
以下の例は、本発明の様々な態様を実施するための一般的な手引書として提供し、限定することを目的としていない。
【実施例】
【００３５】
（実施例１）
実施例１は、ｐｔｓＦ遺伝子（配列番号２）によってコードされるフルクトース−ＰＴＳ酵素ＩＩ（配列番号１）の破壊を開示している。これは、スクロースで増殖する培養物の増殖培地におけるフルクトース濃度の増加をもたらす。このプロセスによって、Ｍｏｏｎらによって記載されたものと類似したｐｔｓＦ変異体が生じることになる。
【００３６】
以下のプライマーを使用して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｔｓＦ遺伝子の６９０塩基対の内部領域を増幅する。プライマーは、以下のものである。
【００３７】
【化１】
2010539941.tif 000001
ＰＣＲ増幅条件を、以下のように使用する。ＰＣＲ反応の最終的な体積は、１００μｌである。５０ｎｇの高分子量のＤＮＡおよび２．５単位のＴａｑポリメラーゼとともに、１００ｎｇの各プライマーを使用する。反応緩衝液を製造業者が推奨する濃度で入れ、ｄＮＴＰも２００μＭの最終濃度で入れる。以下のようなサイクリングパラメーターを使用する：９４℃で１分間、続いて９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分間（３０サイクル）、７２℃で７分間、続いて４℃。ＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、カナマイシン耐性遺伝子を有する自殺ベクターｐＢＧＳ１３１中へクローン化し、結果として生じるクローンを使用して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを形質転換する（ＮＲＲＬ  １１４７４）。組み込み体を、１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地プレート上で選択する。フルクトース−ＰＴＳ系のノックアウトを、細胞をスクロースで増殖した場合の培地中のフルクトースの蓄積によって確認する。
【００３８】
（実施例２）
実施例２は、スクロースを含有するリジン発酵培地へのグルコースイソメラーゼの添加を説明する。
【００３９】
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのＬ−リジン産生菌株、例えば、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４として寄託された菌株を、約３０℃で約１８時間、２０ｍｌの種培地において増殖する。次いでこの系２ｍｌを、炭素源の少なくとも１つの成分としてスクロースを含有する発酵培地に移し、３０℃で２４時間増殖する。グルコースイソメラーゼを、液状酵素または固定化酵素のどちらかとして発酵培地へ添加する。糖の約半分がフルクトースであり、残りの半分がグルコースである、平衡を維持するのに十分な酵素を最初に添加する。当業者であれば認識されるように、正確なグルコースイソメラーゼの量は、発酵条件によって決まる。グルコースイソメラーゼの連続的な添加は、グルコースイソメラーゼの活性をフルクトースからグルコースへの転換のために十分高く維持するために必要であることがある。
【００４０】
（実施例３）
実施例３は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐｔｓＦ変異体バックグラウンド菌株におけるフルクトース排出変異体の作製を説明する。
【００４１】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｔｓＦ変異体を使用して、推定上のフルクトース排出輸送体の変異体を作製することができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｔｓＦ変異体に変異誘発を起こすことにする。ｐｔｓＦ変異体を中間対数期まで増殖させ、遠心分離によってペレット化し、２ｍｌの無菌のＴＭ緩衝液（ＫＯＨでｐＨ６．０に調整された、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ６ｇ／ｌ、マレイン酸５．８ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．０ｇ／ｌ、Ｃａ（ＮＯ３）２  ５ｍｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／ｌ）中で再懸濁する。２ｍｌの細胞懸濁液へ、５０μｌのＮ１−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）の５．０ｍｇ／ｌ溶液を添加し、次いで３０℃で３０分間インキュベートする。次いで、１０ｍｌのＴＭ緩衝液を添加し、細胞を遠心分離によってペレット化し、ＴＭ緩衝液中で２回洗浄し、ＫＯＨを使用してｐＨ７．２に調整された４．０ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（リン酸緩衝液）中で再懸濁した。細胞懸濁液を、１プレートあたり約２００〜３００コロニーを達成するようにさらに希釈し、以下の最小培地上でプレートアウトした。
（ＮＨ４）ＳＯ４        １０ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４            １ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ      ０．４ｇ／ｌ
ＮａＣｌ                １ｇ／ｌ
尿素                    ２．５ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ      ０．０１ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ    ０．０１ｇ／ｌ
Ｌ−アラニン            ０．５ｇ／ｌ
Ｌ−メチオニン          ０．５ｇ／ｌ
Ｌ−トレオニン          ０．２５ｇ／ｌ
ビオチン                ０．０５ｍｇ／ｌ
チアミン                ０．２ｍｇ／ｌ
ナイアシンアミド        ０．０５ｇｌ／
スクロース              １ｇ／ｌ
寒天                    １５ｇ／ｌ  。
【００４２】
コロニーが増殖した後（２〜５日）、４０℃でメチルチアゾリルジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（０．２ｍｇ／ｍｌ）、フェナジンメトサルフェート（２．５ｍｇ／ｌ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ２Ｕ／ｍｌおよびｐＨ５．０リン酸クエン酸緩衝液を含有する軟寒天（０．７％  ｗ／ｖ）でプレートを覆った。フルクトースを分泌するコロニーは、青いハローを有し、分泌しないコロニーは、ハローを有さない。青いハローのないコロニーを、採取し、精製し、試験し、それらが、スクロース最小培地（同上であるが、寒天なし）上で増殖し、フルクトースが培地中にあるかを測定することによって、フルクトースを分泌しないことを確認する。フルクトースを分泌しないが、スクロースで増殖するものは、フルクトース排出輸送体が欠けている。
【００４３】
（実施例４）
実施例４は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐｔｓＦ変異体菌株におけるグルコキナーゼおよびグルコースイソメラーゼの細胞内発現を説明する。
【００４４】
グルコキナーゼ（配列番号６）およびグルコースイソメラーゼ（配列番号３）を含有する複製プラスミドの構築。以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによってＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ  ＤＮＡ由来のグルコースイソメラーゼの遺伝子を増幅する。順方向プライマー、
【００４５】
【化２】
2010539941.tif 000002
は、遺伝子の発現に必要なｔａｃプロモーターおよびリボソーム結合部位を含有する。逆方向プライマーは、
【００４６】
【化３】
2010539941.tif 000003
である。これら２つのプライマーは、ｔａｃプロモーターに作動可能に連結しているグルコースイソメラーゼ遺伝子を増幅する。この断片を、ｐＤ１０のＳｍａＩ部位（米国特許第７，１４１，３８８号）中へ直接クローン化する。クローンを、正しい方向にあるものを求めてスクリーニングする。このプラスミドは、ｐＤ１０ｘｙｌＡと称される。
【００４７】
以下のプライマーを使用して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のグルコキナーゼ遺伝子をクローン化する。
【００４８】
順方向プライマーは、
【００４９】
【化４】
2010539941.tif 000004
であり、
逆方向プライマーは、
【００５０】
【化５】
2010539941.tif 000005
である。
【００５１】
これらの２つのプライマーは、ｐＤ１０ｘｙｌＡにおけるＥｃｏＲＶ部位中へ直接クローン化されることになるグルコキナーゼ遺伝子を増幅する。再び、グルコキナーゼ遺伝子を有するクローンを、正しい方向を求めてスクリーニングする。
【００５２】
ｐＤ１０ｘｙｌＡｇｌｋと称される正しいクローンは、ｔａｃプロモーターによって制御される発現を有する合成オペロンにおけるグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼの遺伝子を含有する。プラスミドｐＤ１０ｘｙｌＡｇｌｋを、米国特許第７，１４１，３８８号に記載されているように、実施例３で説明されたフルクトース排出輸送体変異体中へエレクトロポーションによって導入する。コロニーを、クロラムフェニコールへの耐性を求めて選択する。これらのコロニーは、プラスミドｐＤ１０ｘｙｌＡｇｌｋを含有する。
【００５３】
理解の明確さを目的とする例示および実施例を手段としてこれまで少し詳しく本発明を完全に説明してきたが、当業者には、その条件、処方および他のパラメーターの広範な、同等の範囲とともに本発明を修正または変更することによって本発明を実施することができることが、本開示の利点とともに明らかであろう。さらに、当業者には、かかる修正または変更が添付の特許請求の範囲内に包含されるよう意図されていることが、本開示の利点とともに明らかであろう。
【００５４】
本明細書において言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関係する当業者の技能のレベルを示し、各刊行物、特許または特許出願が、参照により組み込まれることが明確におよび個々に示されているかのように、同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において言及された刊行物、特許および特許出願のいずれも、先行技術であるとは認められない。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2010539941.tif 000006
【図２】
2010539941.tif 000007
【図３】
2010539941.tif 000008
【図４】
2010539941.tif 000009
【図５】
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【図６】
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