(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、植物体の脱分化または再分化を促進することを特徴とする植物体の生産方法。
【請求項２】
請求項１に記載の植物体の生産方法であって、
前記転写因子が、以下の（ａ）のタンパク質であることを特徴とする植物体の生産方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１に記載の植物体の生産方法であって、
前記転写因子が、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する機能を有するタンパク質であることを特徴とする植物体の生産方法。
【請求項４】
請求項１に記載の植物体の生産方法であって、
前記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）または（ｄ）の遺伝子が用いられることを特徴とする植物体の生産方法。
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列を含む遺伝子と相補的な塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物体の生産方法であって、
前記機能性ペプチドが、以下の式（１）〜（４）のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする植物体の生産方法。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（ここで、式（１）中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（ここで、式（２）中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（ここで、式（３）中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（ここで、式（４）中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物体の生産方法であって、
前記機能性ペプチドが、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする植物体の生産方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物体の生産方法であって、
前記機能性ペプチドが、以下の（ｅ）または（ｆ）のペプチドであることを特徴とする植物体の生産方法。
（ｅ）配列番号２０または２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド
（ｆ）配列番号２０または２１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するペプチド
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物体の生産方法であって、
前記機能性ペプチドが、以下の式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする植物体の生産方法。
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（ここで、式（５）中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物体の生産方法であって、
前記機能性ペプチドが、以下の式（６）〜（８）のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする植物体の生産方法。
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（ここで、各式（６）〜（８）中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２は、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物体の生産方法であって、
前記機能性ペプチドが、配列番号２２〜３７、１３３、５９、６０のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする植物体の生産方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物体の生産方法であって、
前記機能性ペプチドが、配列番号３８または３９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする植物体の生産方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の植物体の生産方法であって、
前記転写因子をコードする遺伝子と前記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクタを、植物細胞に導入する形質転換工程を含むことを特徴とする植物体の生産方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の植物体の生産方法であって、
さらに、前記組換え発現ベクタを構築する発現ベクタ構築工程を含むことを特徴とする植物体の生産方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の植物体の生産方法により生産された、脱分化または再分化が促進されるように改変されたことを特徴とする植物体。
【請求項１５】
脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたことを特徴とするキメラタンパク質。
【請求項１６】
脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有することを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項１７】
脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする部分と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする部分とを含むことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１８】
脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含むことを特徴とする組換え発現ベクタ。
【請求項１９】
脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクタを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項２０】
請求項１９に記載の形質転換体であって、
前記形質転換体が植物体であることを特徴とする形質転換体。
【請求項２１】
植物体の生産を行うためのキットであって、
脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクタを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱分化または再分化が促進されるように改変された植物体の生産方法、形質転換体、ならびにその方法に用いられるタンパク質、キメラタンパク質、遺伝子、キメラ遺伝子、ＤＮＡ、組換え発現ベクタおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
花き園芸植物の多くは遺伝的に固定（純化）されていないため、研究用材料や商品等としてこれらを用いる場合には、培養等によってクローンを増殖する技術が求められる。また、この培養技術は、遺伝子組換えにより形質転換された植物体を作製する過程でも使用される重要な技術である。
【０００３】
培養増殖の一つの方法として、葉片等の組織片からのカルス増殖（脱分化）と、そこからの不定芽形成（再分化）を経る方法があるが、それぞれの段階への移行しやすさは、植物種ごとに大きく異なり、この移行をいかに効率化するかが、培養増殖や形質転換の効率を上げる最も重要なポイントとなっている。
【０００４】
例えば、花き園芸植物の一つであるトレニア（Torenia fournieri Lind.）の形質転換、不定芽形成では、通常、不定芽が出始めるまでに６０日程度を要し、１００日経過時でも使用組織片数に対して５％程度の数の不定芽形成にとどまり、非常に効率が悪かった。
【０００５】
また、植物体の形質転換体の取得には、植物種によって期間が異なるが、例えば、トレニア等では最短４ヶ月程度、タバコ、キク等で半年程度、バラ、カーネーション等で１年程度、リンドウ、トルコキキョウ等では１年半〜２年程度開花までに要し、材料となる植物の状態や導入遺伝子の性質等によっては、遺伝子組換え体が数系統しか得られない場合があった。
【０００６】
例えば、特許文献１には、脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクタを植物細胞に導入して、上記転写因子を植物細胞内で生産させることにより脱分化が促進されるように改変された植物体を生産することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−３２５５８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、脱分化または再分化が促進されるように改変された植物体の生産方法、形質転換体、ならびにその方法に用いられるタンパク質、キメラタンパク質、遺伝子、キメラ遺伝子、ＤＮＡ、組換え発現ベクタおよびキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させることにより、植物体の脱分化または再分化を促進する植物体の生産方法である。
【００１０】
前記植物体の生産方法において、前記転写因子が、以下の（ａ）のタンパク質であることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
【００１１】
前記植物体の生産方法において、前記転写因子が、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する機能を有するタンパク質であることが好ましい。
【００１２】
前記植物体の生産方法において、前記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）または（ｄ）の遺伝子が用いられることが好ましい。
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列を含む遺伝子と相補的な塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子
【００１３】
前記植物体の生産方法において、前記機能性ペプチドが、以下の式（１）〜（４）のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（ここで、式（１）中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（ここで、式（２）中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（ここで、式（３）中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（ここで、式（４）中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。)
【００１４】
前記植物体の生産方法において、前記機能性ペプチドが、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
【００１５】
前記植物体の生産方法において、前記機能性ペプチドが、以下の（ｅ）または（ｆ）のペプチドであることが好ましい。
（ｅ）配列番号２０または２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド
（ｆ）配列番号２０または２１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するペプチド
【００１６】
前記植物体の生産方法において、前記機能性ペプチドが、以下の式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（ここで、式（５）中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
【００１７】
前記植物体の生産方法において、前記機能性ペプチドが、以下の式（６）〜（８）のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（ここで、各式（６）〜（８）中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２は、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。)
【００１８】
前記植物体の生産方法において、前記機能性ペプチドが、配列番号２２〜３７、１３３、５９、６０のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
【００１９】
前記植物体の生産方法において、前記機能性ペプチドが、配列番号３８または３９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
【００２０】
前記植物体の生産方法において、前記転写因子をコードする遺伝子と前記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクタを、植物細胞に導入する形質転換工程を含むことが好ましい。
【００２１】
前記植物体の生産方法において、さらに、前記組換え発現ベクタを構築する発現ベクタ構築工程を含むことが好ましい。
【００２２】
本発明は、前記植物体の生産方法により生産された、脱分化または再分化が促進されるように改変された植物体である。
【００２４】
本発明は、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質である。
【００２６】
本発明は、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子である。
【００２８】
本発明は、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする部分と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする部分とを含むＤＮＡである。
【００２９】
本発明は、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクタである。
【００３０】
本発明は、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクタを含む形質転換体である。
【００３１】
また、前記形質転換体が植物体であることが好ましい。
【００３２】
本発明は、植物体の生産を行うためのキットであって、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクタを含むキットである。
【発明の効果】
【００３３】
本発明では、植物細胞の脱分化または再分化を抑制する遺伝子の働きを抑制することにより、脱分化または再分化が促進されるように改変された植物体を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例において用いる組換え発現ベクタを構築するための構築用ベクタの構築方法を示す工程図である。
【図２】実施例において用いる構築用ベクタｐ３５ＳＧに、転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸをコードする遺伝子とＭＹＢ１０６遺伝子とを組み込む工程図である。
【図３】形質転換用ベクタｐＢＣＫＨの構築方法を示す工程図である。
【図４】本発明の実施例１および比較例１〜３における感染後の日数（日）とシュート出現カルス数との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００３６】
本発明者らは、植物自身の持つ遺伝子の働きを抑制することで植物の性質を変える遺伝子組換えの手法（ＣＲＥＳ−Ｔ法）を用いて、モデル植物であるシロイヌナズナの多数の遺伝子を花き園芸植物のモデルであるトレニアに導入し、有用な形質を選抜する過程で、特定の遺伝子を導入した際に、他の遺伝子を導入したものよりも遺伝子組換え体が多数得られることを見出した。この植物細胞の脱分化または再分化を抑制する遺伝子を新たに同定し、これを用いることにより、脱分化または再分化が促進されるように改変された植物体を生産することができる。これにより、植物体の培養と形質転換の効率を向上することができる。
【００３７】
例えば、従来の２／３程度の期間（形質転換体の選抜に使用する薬剤としてハイグロマイシンを使用したトレニアの場合は約４０日）で不定芽が形成され、従来の不定芽形成期間（前記トレニアの場合は約６０日）で従来の２倍程度の不定芽が得られる。
【００３８】
本実施形態に係る植物体の生産方法は、脱分化または再分化を促進することにより一定の効果がある分野に有用性がある。例えば、本実施形態に係る植物体の生産方法により、形質転換体の作出の期間が短縮し、作出数が増大するため、培養増殖や形質転換等における作業効率が大幅に向上する。形質転換体が例えば従来の２／３程度の短期間で得られ、必要な系統数を容易に確保することができる。また、培養により栄養増殖する必要のある花き園芸植物等の培養において、省力化、低コスト化が可能となる。
【００３９】
本実施形態に係る植物体の生産方法は、植物細胞の脱分化または再分化を抑制する遺伝子の機能を抑制する技術であって、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させる。これによって、植物細胞の脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写が抑制され、植物細胞の脱分化または再分化が誘導、促進される。
【００４０】
ここで、植物細胞の脱分化または再分化は次のように促進される。すなわち、上記キメラタンパク質における上記転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、脱分化または再分化を抑制すると推定される標的遺伝子に結合する。上記転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより脱分化または再分化を抑制すると推定されるタンパク質の生成が減少し、その結果、植物細胞の脱分化または再分化を促進することができる。
【００４１】
＜キメラタンパク質＞
本実施形態に係る植物体の生産方法で用いられるキメラタンパク質は、上述したように、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。
【００４２】
また、本実施形態に係る植物体の生産方法で用いられるキメラタンパク質は、内在性の遺伝子に対して、優性に作用するものであるため、植物が二倍体や複二倍体であったり、あるいは植物に機能重複遺伝子が存在したりしても、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の発現を抑制することができる。それゆえ、遺伝子導入可能なあらゆる植物について、植物細胞の脱分化または再分化が促進される。
【００４３】
［転写因子］
脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子は、植物細胞の脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子であれば特に限定されるものではない。このような転写因子には、種々の植物が有する同様の機能を有する転写因子が含まれる。
【００４４】
このような転写因子の代表的な一例としては、例えば、ＭＹＢ１０６タンパク質が挙げられる。ＭＹＢ１０６タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、シロイヌナズナのＭＹＢファミリータンパク質の１つである。本実施形態では、例えば、このＭＹＢ１０６タンパク質に後述する機能性ペプチドを融合させることにより、転写因子であるＭＹＢ１０６タンパク質を転写抑制因子に転換させる。
【００４５】
本実施形態で用いられる転写因子としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＭＹＢ１０６タンパク質に限定されるものではなく、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子であればよい。具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても、上記機能を有していれば用いることができる。なお、上記の「配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」における「１個または複数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００４６】
また上記転写因子としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、例えば、２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上の相同性を有するタンパク質であって、かつ、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する機能を有するタンパク質も含まれる。なお、ここで「相同性」とは、アミノ酸配列中に占める同じ配列の割合であり、この値が高いほど両者は近縁であるといえる。
【００４７】
本実施形態で用いられるキメラタンパク質を生産させる際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本実施形態に係る植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。
【００４８】
上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写因子のアミノ酸配列に対応するものであればよい。具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＭＹＢ１０６タンパク質を用いる場合には、このＭＹＢ１０６タンパク質をコードする遺伝子（以下、「ＭＹＢ１０６遺伝子」と称する場合がある）が挙げられる。ＭＹＢ１０６遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号２（アクセッションNo.AY519581、AGI code At3g01140）に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４９】
もちろん、本実施形態で用いられるＭＹＢ１０６遺伝子、または、転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号２に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等が挙げられる。
【００５０】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等の従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシは高くなる（ハイブリダイズしにくくなる）。
【００５１】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマ対を用いることができる。このプライマ対を用いて、植物のｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う方法等により、上記遺伝子を得ることができる。また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００５２】
［機能性ペプチド］
本実施形態で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（以下、「転写抑制転換ペプチド」と称する場合がある）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者らによって見出された転写抑制転換ペプチド（特開２００１−２６９１７７号公報、特開２００１−２６９１７８号公報、特開２００１−２９２７７６号公報、特開２００１−２９２７７７号公報、特開２００１−２６９１７６号公報、特開２００１−２６９１７９号公報、国際公開第０３／０５５９０３号パンフレット、Ohta,M., Matsui,K., Hiratsu,K., Shinshi,H. and Ohme−Takagi,M., The Plant Cell, Vol.13, pp.1959−1968, August,2001、Hiratsu,K., Ohta,M., Matsui,K., Ohme−Takagi,M., FEBS Letters, 514(2002), pp.351−354等を参照）が挙げられる。
【００５３】
本発明者らは、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦ遺伝子群の一つであるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得ていた。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子およびこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功していた（例えば、上記特開２００１−２６９１７７号公報、特開２００１−２６９１７８号公報、特開２００１−２９２７７６号公報、特開２００１−２９２７７７号公報参照）。また、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦ遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３タンパク質（例えば、上記特開２００１−２６９１７６号公報参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質（例えば、上記特開２００１−２６９１７９号公報参照）をコードする遺伝子、および、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見出している。さらに、本発明者らは、これらタンパク質は、カルボキシル基末端領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）を含む共通のモチーフを有することを明らかにしている。そして、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。
【００５４】
また、本発明者らは、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また上記ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している。
【００５５】
したがって、本実施形態において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦタンパク質であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、同ＡｔＥＲＦ４タンパク質、同ＡｔＥＲＦ７タンパク質、同ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、ジンクフィンガータンパク質の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、同ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、これらから切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等が挙げられる。
【００５６】
上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、以下の式（１）〜（４）のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（ここで、式（１）中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（ここで、式（２）中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（ここで、式（３）中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（ここで、式（４）中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。)
【００５７】
（式（１）の転写抑制転換ペプチド）
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。すなわち、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基を含むオリゴマが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００５８】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００５９】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。すなわち、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基を含むオリゴマが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６０】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基を含むペンタマ（５ｍｅｒ）の具体的な配列を、配列番号４０、４１に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列である。
【００６１】
（式（２）の転写抑制転換ペプチド）
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。すなわち、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基を含むオリゴマが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６２】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６３】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。すなわち、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基を含むオリゴマが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６４】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基を含むペンタマ（５ｍｅｒ）の具体的な配列は、４２、４３に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４３に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基を含むテトラマ（４ｍｅｒ）の具体的な配列は、配列番号４４に示す。
【００６５】
（式（３）の転写抑制転換ペプチド）
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００６６】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。すなわち、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基を含むオリゴマが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６７】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
【００６８】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときの容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００６９】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基を含むオリゴマの具体的な配列を、配列番号４５〜５３に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４５、４６または４７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４８、４９または５０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５１、５２または５３に示すアミノ酸配列である。
【００７０】
（式（４）の転写抑制転換ペプチド）
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基を含むヘキサマ（６ｍｅｒ）であり、その具体的な配列は、配列番号７、１６、５４に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５４に示すアミノ酸配列である。
【００７１】
特に、本実施形態において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＥＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者らが新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００７２】
（転写抑制転換ペプチドのより具体的な例）
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。これらオリゴペプチドは、本発明者らが上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、上記国際公開第０３／０５５９０３号パンフレット参照)。
【００７３】
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｅ）または（ｆ）記載のオリゴペプチドが挙げられる。
（ｅ）配列番号２０または２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド
（ｆ）配列番号２０または２１に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
【００７４】
上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号２０または２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」における「１個または複数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００７５】
上記アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法またはＧａｐｐｅｎｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法またはこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−ＫやＭｕｔａｎｔ−Ｇ（いずれも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて変異が導入される。
【００７６】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。
【００７７】
その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記式（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００７８】
（転写抑制転換ペプチドの他の例）
本発明者らは、さらに、上記モチーフの構造について検討し、新たに６つのアミノ酸を含むモチーフを見出している。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（ここで、式（５）中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
【００７９】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）または（９）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに分類する。
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（ここで、各式（６）〜（９）中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２は、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β３は、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｎを示し、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。)
【００８０】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９または６０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。このうち、配列番号２９、３０、３２、３４、１３３、５９または６０のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２２、２５、３５、３６または３７のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２６、２７、２８、３１または３３のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２３または２４のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００８１】
また、上記式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号３８または３９で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００８２】
（キメラタンパク質の生産方法）
上記で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本実施形態では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードする遺伝子とのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。
【００８３】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「転写抑制転換ポリヌクレオチド」と称する場合がある）と上記転写因子をコードする遺伝子とを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する。
【００８４】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００８５】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３４、５５、５７に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、配列番号６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３５、５６、５８に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９５、９６に示されるポリヌクレオチドが挙げられる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号３〜３９、１３３、５９、６０に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
【００８６】
【表１】
0005907483.tif 000002
【００８７】
本実施形態で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカ機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００８８】
＜植物体の生産方法の一例＞
本実施形態に係る植物体の生産方法は、上記で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させる過程を含んでいればよく、特に限定されるものではない。本実施形態に係る植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクタ構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げられる。このうち、本実施形態では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００８９】
（発現ベクタ構築工程）
本実施形態において行われる発現ベクタ構築工程は、上記で説明した転写因子をコードする遺伝子と、上記で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドとを含む組換え発現ベクタを構築する工程であればよく、特に限定されるものではない。組換え発現ベクタは、さらにプロモータを含んでもよい。
【００９０】
上記組換え発現ベクタの母体となるベクタとしては、従来公知の種々のベクタを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系のベクタ等が挙げられる。特に、植物体へのベクタの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクタを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクタとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等が挙げられる。
【００９１】
上記プロモータは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモータであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモータを好適に用いることができる。そのようなプロモータとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータ（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモータ、ノパリン合成酵素のプロモータ、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモータ、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモータ等が挙げられる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータまたはアクチンプロモータをより好ましく用いることができる。これらのプロモータを用いれば、得られる組換え発現ベクタでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。また、上記プロモータは、脱分化または再分化時に特異的に遺伝子を発現させることができるプロモータであることがさらに好ましい。このようなプロモータを用いることにより、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を脱分化または再分化時にのみ発現させて、他の組織に影響を与えることなく、植物体の脱分化または再分化を促進することが可能となる。
【００９２】
上記プロモータは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクタ内に導入されていればよく、組換え発現ベクタとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００９３】
上記組換え発現ベクタは、上記プロモータおよび上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネータ、選別マーカ、エンハンサ、翻訳効率を高めるための塩基配列等が挙げられる。また、上記組換え発現ベクタは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクタを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００９４】
ターミネータは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネータ）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネータ）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネータをより好ましく用いることできる。
【００９５】
上記形質転換ベクタにおいては、ターミネータを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモータがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【００９６】
上記選別マーカとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。そのような薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子が挙げられる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００９７】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列が挙げられる。このｏｍｅｇａ配列をプロモータの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクタには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【００９８】
上記組換え発現ベクタの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクタに、上記プロモータ、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、ならびに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモータと（必要に応じてターミネータ等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクタに導入すればよい。
【００９９】
キメラ遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネータが含まれる場合には、上流から、プロモータ、上記キメラ遺伝子、ターミネータの順となっていればよい。また、組換え発現ベクタを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【０１００】
また、上記組換え発現ベクタの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクタの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【０１０１】
（形質転換工程）
本実施形態において行われる形質転換工程は、上記で説明した組換え発現ベクタを植物細胞に導入して、上記で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
【０１０２】
上記組換え発現ベクタを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Aida R, Shibata M (1995) Agrobacterium-mediated transformation of torenia (Torenia fournieri). Breed Sci 45: 71−74; Aida R, Kishimoto, Tanaka Y, Shibata M (2000) Modification of flower color in torenia (Torenia fournieri Lind) by genetic transformation. Plant Sci 153: 33−42を用いることができる。
【０１０３】
組換え発現ベクタを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【０１０４】
上記組換え発現ベクタが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
【０１０５】
ここで、本実施形態に係る植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクタは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクタを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、上記で説明した組換え発現ベクタ構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１０６】
（その他の工程、その他の方法）
本実施形態に係る植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクタ構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等が挙げられる。
【０１０７】
目的の遺伝子が導入された植物を選抜する方法は特に限定されるものではなく、植物体における導入遺伝子の発現状況から選抜すればよい。例えば、目的の遺伝子に加え「マーカ遺伝子」を同時に導入する方法が挙げられる。マーカ遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、培地に抗生物質等を入れて選抜すればよい。マーカ遺伝子として色素を作る酵素遺伝子（ＧＵＳ遺伝子等）を用いる場合は、培地に基質を加えて選抜すればよい。マーカ遺伝子としてそれ自身が蛍光を発する蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）を用いる場合は、蛍光顕微鏡での観察等により細胞が発する蛍光を確認し、選抜すればよい。
【０１０８】
本実施形態に係る植物体の生産方法では、上記キメラ遺伝子を植物体に導入するため、当該植物体から、有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能となる。また、当該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に当該植物体を量産することも可能となる。したがって、本実施形態に係る植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１０９】
なお、本実施形態における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくともいずれかが含まれる。つまり、本実施形態では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。そのような植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖、分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本実施形態に係る植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【０１１０】
また、本実施形態に係る植物体の生産方法は、組換え発現ベクタで形質転換する方法に限定されるものではなく、他の方法を用いてもよい。具体的には、例えば、上記キメラタンパク質そのものを植物体に投与してもよい。この場合、最終的に利用する植物体の部位において脱分化または再分化を促進できるように、若年期の植物体にキメラタンパク質を投与すればよい。またキメラタンパク質の投与方法も特に限定されるものではなく、公知の各種方法を用いればよい。
【０１１１】
（本実施形態により得られる植物体とその有用性、ならびにその利用）
本実施形態に係る植物体の生産方法は、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を植物体で発現させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、脱分化または再分化の促進に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより脱分化または再分化を促進することができる。したがって、本実施形態には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。
【０１１２】
（本実施形態に係る植物体の具体例）
ここで、本実施形態に係る脱分化または再分化が促進される植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、例えば、脱分化または再分化の促進によりその有用性が高まる植物が挙げられる。そのような植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。裸子植物としては、例えば、スギ目のスギ科、マツ科、ヒノキ科の植物やマキ科の植物等が挙げられる。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよい。双子葉植物としては、例えば、シロイヌナズナ等のアブラナ科、ツバキ科等の植物等が挙げられる。また、単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、ムギ等のイネ科、ホシクサ科等の植物が挙げられる。
【０１１３】
また、本実施形態に係る脱分化または再分化が促進された植物体は、果実や種子を商品とする植物、花や植物体そのものを商品とする園芸植物であってもよい。そのような植物体の具体例をさらに挙げると、ナタネ、ジャガイモ、ホウレンソウ、大豆、キャベツ、レタス、トマト、カリフラワ、さやいんげん、かぶ、めかぶ、大根、ブロッコリ、メロン、オレンジ、スイカ、ネギ、ゴボウ等の各種の食用植物、あるいはバラ、キク、あじさい、カーネーション等の園芸植物がある。
【０１１４】
本実施形態に係る植物体の生産方法は、特に、遺伝子組換え花き等の遺伝子組換え植物体の培養増殖や形質転換等に好適に適用される。遺伝子組換え植物体の培養物を増殖する場合でも、形質転換体が従来より短期間で得られ、必要な系統数を容易に確保することができ、省力化、低コスト化が可能となる。遺伝子組換え植物としては、例えば、トレニア（Torenia fournieri Lind.）、キク、バラ、カーネーション等の遺伝子組換え花き、イネ、ダイズ、コムギ等が挙げられる。本実施形態に係る植物体の生産方法を適用することにより、より有用な遺伝子組換え植物を作出するための開発を、時間、経費、労力を削減して行うことができる。
【０１１５】
トレニアは、インドシナ原産のアゼトウガラシ科の一年草である。トレニアは、草丈を小さく育てられる（例えば、最小７ｃｍ程度で開花）、挿し芽で簡単に維持、増殖できる、花が咲くまでの期間が短い、日長に関係なくプラントボックスのような湿度の高い栽培条件でも正常に開花する、２倍体（２ｎ＝１８）でゲノムサイズが小さい（１７１Ｍｂｐ=シロイヌナズナとほぼ同等）、遺伝子組換えの手法が確立されている等の特徴を有し、本実施形態に係る植物体の生産方法が好適に適用される。
【０１１６】
（本実施形態に係る形質転換体の具体例）
ここで、本実施形態に係る、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクタを含む形質転換体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、例えば、上記形質転換された植物体の他に、アグロバクテリウム、大腸菌、酵母、ウイルス等が挙げられる。
【０１１７】
（本実施形態に係る植物体の生産方法の利用の一例）
本実施形態に係る植物体の生産方法の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本実施形態に係る植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち植物体の脱分化または再分化促進キット等が挙げられる。
【０１１８】
この植物体の脱分化または再分化促進キットの具体例としては、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクタを少なくとも含んでいればよい。上記組換え発現ベクタを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファ等が挙げられる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【０１１９】
（脱分化または再分化が促進された植物体の生産方法）
本発明者らは、ＭＹＢ１０６タンパク質や種々の植物に保存されている同様の転写因子が、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子であることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。したがって、そのような転写因子をコードする遺伝子を利用して、脱分化または再分化の促進が制御された植物体を生産する方法も本実施形態に含まれる。
【０１２０】
すなわち、本実施形態に係る脱分化または再分化の促進が制御された植物体の生産方法は、以下の（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質をコードする遺伝子を用いるものである。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する機能を有するタンパク質
【０１２１】
あるいは、本実施形態に係る脱分化または再分化の促進が制御された植物体の生産方法は、以下の（ｃ）または（ｄ）記載の遺伝子を用いるものである。
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列を含む遺伝子と相補的な塩基配列を含む遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、脱分化または再分化を抑制する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子
【０１２２】
この植物体の生産方法は、脱分化または再分化を抑制する上記転写因子をコードする遺伝子の発現を抑制させるか、過剰発現させることにより可能となる。上記遺伝子の発現を抑制する方法としては、例えば、アンチセンス法、ジーンターゲッティング法、ＲＮＡｉ法、コサプレッション法、遺伝子破壊型タギング法等が挙げられる。また、上記遺伝子を過剰発現させる方法としては、例えば、適当なプロモータとその下流に配置された上記遺伝子とを含むベクタを構築し、植物に導入する方法等が挙げられる。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２４】
［実施例１］
本実施例においては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチドをＭＹＢ１０６遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクタを構築し、これをトレニアにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、トレニアを形質転換した。
【０１２５】
＜形質転換用ベクタ構築用ベクタの構築＞
形質転換用ベクタ構築用ベクタであるｐ３５ＳＧを、図１に示すように、以下の工程（１）〜（４）の通りに構築した。
【０１２６】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクタ上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号１３８）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号１３９）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号１４０）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号１４１）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
【０１２７】
（２）クローンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータ（以下、「ＣａＭＶ３５Ｓ」と称する場合がある）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下、「Ｎｏｓ−ｔｅｒ」と称する場合がある）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
【０１２８】
（３）以下の配列番号１４２、１４３の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａｌ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号１４２、１４３の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、および制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3'（配列番号１４２）
5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3'（配列番号１４３）
【０１２９】
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、 ベクタｐ３５ＳＧを完成させた。
【０１３０】
＜転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクタの構築＞
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクタであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧを、図２に示すように、以下の工程（１）〜（２）の通りに構築した。
【０１３１】
（１）１２アミノ酸転写抑制転換ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンＴＡＡを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
5'-gggcttgatctggatctagaactccgtttgggtttcgcttaag-3'（配列番号１４４）
5'-tcgacttaagcgaaacccaaacggagttctagatccagatcaagccc-3'（配列番号１４５）
（２）ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧを構築した。
【０１３２】
＜形質転換用ベクタの構築＞
構築用ベクタのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクタであるｐＢＣＫＨを、図３に示すように、以下の工程（１）〜（３）の通りに構築した。
【０１３３】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203, 1990）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。
【０１３４】
（２）インビトロジェン社から購入したＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクタコンバージョンシステムのＦｒａｇｍｅｎｔＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を回収した。
【０１３５】
（３）回収したＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１３６】
＜構築用ベクタへのＭＹＢ１０６遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクタｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＭＹＢ１０６タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）の通りに組み込んだ。
【０１３７】
（１）シロイヌナズナ葉から調製したｍＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリから、以下のプライマを用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナＭＹＢ１０６遺伝子のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマ１    5'-GATGGGCAGATCGCCATGTTGTGATAAGGC-3'（配列番号１３６）
プライマ２    5'-GAACATCGTCGCGGAATCGGACGGTGAAGA-3'（配列番号１３７）
ＭＹＢ１０６遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２および１に示す。
【０１３８】
（２）得られたＭＹＢ１０６コード領域のＤＮＡ断片を、図２に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクタｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１３９】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調製して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったものを得た。
【０１４０】
＜組換え発現ベクタの構築＞
上記構築用ベクタ上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクタｐＢＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクタを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）の通りに行った。
【０１４１】
（１）まず、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧ  １．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＣＫＨ  ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５．５μＬを加えた。
【０１４２】
（２）この溶液にＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ  ４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１４３】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５α等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１４４】
＜組換え発現ベクタにより形質転換した植物体の生産＞
アグロバクテリウム法により、ＭＹＢ１０６−ＳＲＤＸ遺伝子を用いて、トレニアの葉片８００枚の形質転換を行い、不定芽形成時期と不定芽数とを調査した。
【０１４５】
以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＣＫＨ−ＭＹＢ１０６−ＳＲＤＸで、トレニアの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。トレニア植物の形質転換は、Aida R, Shibata M (1995) Agrobacterium-mediated transformation of torenia (Torenia fournieri). Breed Sci 45: 71−74; Aida R, Kishimoto, Tanaka Y, Shibata M (2000) Modification of flower color in torenia (Torenia fournieri Lind) by genetic transformation. Plant Sci 153: 33−42に従った。
【０１４６】
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＣＫＨ−ＭＹＢ１０６−ＳＲＤＸを、土壌細菌（（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＥＨＡ１０５株）にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍＬ）を含む液体ＬＢ培地で１晩培養した。次いで、培養液をＬＢ培地プレートにまき、２５℃で３〜５日程度置いた。これを滅菌水に懸濁し、３ｍｍ角程度に切った葉片を浸した後、共存培地（表２）においた。１週間後、葉片をハイグロマイシン選抜培地（表３）に移し、以降２週間ごとに新しい選抜培地に移した。
【０１４７】
【表２】
0005907483.tif 000003
【０１４８】
【表３】
0005907483.tif 000004
【０１４９】
ＭＹＢ１０６−ＳＲＤＸ遺伝子の導入により、４０日で不定芽を形成し始め、６０日で１００程度のシュートが得られた。図４は、感染（遺伝子導入）後の日数（日）とシュート出現カルス数との関係を示すグラフである。
【０１５０】
［比較例１〜３］
ＭＹＢ１０６−ＳＲＤＸ遺伝子の代わりに対照遺伝子としてＡｔ５ｇ５８９００−ＳＲＤＸ（比較例１：配列番号１４６、配列番号１４９のアミノ酸配列に対応）、Ａｔ３ｇ６１１２０−ＳＲＤＸ遺伝子（比較例２：配列番号１４７、配列番号１５０のアミノ酸配列に対応）、Ａｔ５ｇ０３６８０−ｏｘ遺伝子（比較例３：配列番号１４８、配列番号１５１のアミノ酸配列に対応）を用いた以外は、実施例１と同様にしてトレニアの葉片各８００枚の形質転換を行い、不定芽形成時期と不定芽数とを比較した。結果を図４に示す。
【０１５１】
図４に示すように、遺伝子対照遺伝子では６０日目で不定芽を形成し始めた。また、１００日経過時でも５０以下の不定芽形成にとどまった。
【０１５２】
このように、実施例１のようにＭＹＢ１０６−ＳＲＤＸ遺伝子を導入したものでは、比較例１〜３の対照遺伝子を導入したものに比べて、脱分化または再分化が促進され、それにより早期にかつ多数の形質転換不定芽が得られたと考えられる。すなわち、標的遺伝子の働きを抑制するＳＲＤＸ配列を付加していないＭＹＢ１０６遺伝子は、本来、脱分化または再分化を抑制する働きを有していると推測された。また、ＭＹＢ１０６遺伝子にＳＲＤＸ配列を付加してその機能を抑制することにより、不定芽形成の効率を大幅に向上することができた。ＭＹＢ１０６遺伝子の制御により、培養と形質転換の効率が大幅に向上する可能性が高く、ダイズやコムギ等の形質転換効率が非常に低い作物に適用することにより、商業的にも大きな価値を生み出す可能性がある。
【図１】
0005907483.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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