【手続補正書】
【提出日】平成23年3月30日(2011.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
さらなる好ましい実施形態においては、Ｒｃは、Ｈ、ＣＯ２Ｒ’、ＣＯＲ’、−ＳＯ３Ｒ’、−ＮＨＲ’ であり、ここで、Ｒ’は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキル又はＣ１−Ｃ１２アルキルである。最も好ましい実施形態においては、Ｒａは、−ＮＨ２、Ｒｂは、−ＯＨ、そしてＲｃは、Ｈである。好ましくは、ｏは１、２、３又は４である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
他の態様において、本発明は、本発明の化合物、及び９９ｍＴｃ、１８６／１８８Ｒｅ、１１１Ｉｎ＋３、６７／６８Ｇａ＋３、９０Ｙ＋３、１０９Ｐｄ＋２、１０５Ｒｈ＋３、１７７Ｌｕ、６４／６７Ｃｕ、１６６Ｈｏ、２１３Ｂｉを含む錯体も提供し、今後、本発明の錯体とも示す。好ましくは、本発明の錯体は、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ又は１８６Ｒｅを含む。テクネチウムは、画像診断剤に特に有効であり、好ましくは一つか二つ以上の放射性核種、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ又は９６Ｔｃである。上記にも示したとおり、医学画像のための好ましい放射性同位体は９９ｍＴｃである。その１４０ｋｅＶガンマ光子が、広く利用されているガンマカメラとの使用に理想的である。それは短い半減期（６時間）を有し、患者の線量測定を考慮すると好ましい。レニウムは、放射線治療剤として特に有効であり、好ましくは、放射性核種、１８６Ｒｅ若しくは１８８Ｒｅ、又はこれらの混合物である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
実施例１：Ｐｔｅ−Ｇｌｕ（Ｈ−Ｈｉｓ（t−（４−Ｎ−ブチル））−ＯＨ）−ＯＨ  （５−（４−（４−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ブチルアミノ）−２−（４−（（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチルアミノ）ベンズアミド）−５−オキソペンタン酸）の合成
（ａ）Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（t（４−ＮＨ２Ｂｕ））−ＯＭｅの合成
１−アジド−４−クロロブタンは、Yao, L. et al, J. J. Org. Chem. 2004, 69, 1720をベースとし修正し、合成した。そこで、７．８７ｇ（１２１ｍｍｏｌ）のＮａＮ３をアルゴン雰囲気下で２２０ｍｌのジオキサンに懸濁させた。懸濁液に、１８．８６ｇの１−ブロモ−４−クロロブタンを添加し、混合物を室温で１８時間攪拌した。５５０ｍｌの水を添加した後、３３０ｍｌのジエチルエーテルで混合物を２回抽出した。合わせたエーテル抽出物を、３３０ｍｌの水及び３３０ｍｌ塩化ナトリウム水溶液（１０％）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮し、１４．１１ｇの黄白色の油分として、１−アジド−４−クロロブタンを約９５％の純度で得た。（１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ= １．６５〜１．９５（ｍ、Ｃ（２）Ｈ２、Ｃ（３）Ｈ２、４Ｈ）；３．３３（ｔ、３Ｊ＝３．３、Ｃ（１）Ｈ２、２Ｈ）；３．５７（ｔ、３Ｊ＝６．２、Ｃ（４）Ｈ２、２Ｈ）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
２００ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ、１当量）の上記で得られたＮ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレン−１０−ホルミル−Ｐｔｅ−Ｇｌｕ（ＮＨ（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ｔ−Ｂｕ−４−イル）ＯＭｅ）−ＯｔＢｕに２２ｍｌの１ＭのＨＣｌを添加した。混合物を５０℃で２時間攪拌した。約１５℃に冷却した後、１．７６ｇの固体水酸化ナトリウムを添加した。室温で、１時間攪拌した後、ｐＨをギ酸の添加によりｐＨ＝２．５に調整した。逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ、固相：Ｅｕｒｏｐｒｅｐ６０−６０Ｃ−１８；６０A；３５−７０μｍ、１４０ｇ；３６ｃｍｘ２６ｍｍ、液相：０−１０分、９９．９％Ｈ２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨ、１０〜４０分、３４．９％ＭｅＯＨ、６５％Ｈ２Ｏ、０．１％ＨＣＯＯＨ）により生成物を単離し、黄色がかった樹脂として１２０ｍｇのＰｔｅ−Ｇｌｕ（Ｈ−Ｈｉｓ（t−（４−Ｎ−ブチル））−ＯＨ）−ＯＨを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ及びＤ２ＳＯ４、ｃａｌ．：δ（Ｈ２Ｏ）＝４．７９）：δ＝０．４〜０．６（ｍ、ＣＢｕ（３）Ｈ２）；０．７５〜０．９（ｍ、ＣＢｕ（２）Ｈ２）；〜１．１〜１．２５（ｍ、Ｃβ−ＧｌｕＨＡ）；１．２５〜１．４（ｍ、Ｃβ−ＧｌｕＨＢ）；１．５０（ｔ、３Ｊ＝７．１、Ｃγ−ＧｌｕＨ２）；２．１〜２．３（ｍ、ＣＢｕ（４）Ｈ２）；２．４５（２ｄｄ、Ｃβ−ＨｉｓＨ２）；３．１〜３．３（ｔ、ＣＢｕ（１）Ｈ２）；３．４〜３．５（ｔ、Ｃα−ＨｉｓＨ）；３．５〜３．６（ｑ、３ＪＥ＝４．６、３ＪＺ＝９．４４、Ｃα−ＧｌｕＨ）；４．０８（ｓ、ＣＰｔｅ（９）Ｈ２）；〜６．４９（ｓ、Ｃｉｍ（５）Ｈ）；６．６５（ｄ、３Ｊ＝６．７、２ｘＣＰｔｅ（５’）Ｈ）；６．９５（ｄ、３Ｊ＝６．１、２ｘＣＰｔｅ（６’）Ｈ）；７．６８（ｓ、Ｃｉｍ（２）Ｈ）；７．８３（ｓ、ＣＰｔｅ（７）Ｈ）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
実施例２：Ｒｅ（ＣＯ）３−Ｈｉｓ−葉酸錯体の合成
実施例１で得られたＰｔｅ−Ｇｌｕ（Ｈ−Ｈｉｓ（t−（４−Ｎ−ブチル））−ＯＨ）−ＯＨ （５−（４−（４−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ブチルアミノ）−２−（４−（（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチルアミノ）ベンズアミド）−５−オキソペンタン酸）（１５．０ｍｇ、２３μｍｏｌ）と、［Ｒｅ（Ｂｒ）３（ＣＯ）３］［Ｅｔ４Ｎ］２（２０．０ｍｇ、２６μｍｏｌ）をＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（４ｍＬ、１：１）中に懸濁し、ｐＨを希釈ＮａＨＣＯ３でｐＨ８に調整した。ＨＰＬＣで出発物質が完全に変換していると示されるまで、その結果生じた黄色の溶液を５０℃で１．５時間攪拌した。混合物を室温まで冷却し、希釈ＨＣｌ（０．１Ｍ）を添加してｐＨを２〜３に調整した。沈殿物を遠心分離（１０分、３５００ｒｐｍ）により単離し、減圧下で乾燥させ、茶色固体としてＲｅ−錯体（５）を得たＨＲ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝９２０．２１３１（計算値、Ｃ３２Ｈ３５Ｎ１１Ｏ１０Ｒｅ：  ９２０．２１２６）、ＨＰＬＣ純度：＞７０％。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
実施例３：９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｈｉｓ−葉酸錯体の合成
実施例２と同じく、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の実施例１で得られたＰｔｅ−Ｇｌｕ（Ｈ−Ｈｉｓ（t−（４−Ｎ−ブチル））−ＯＨ）−ＯＨ （５−（４−（４−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ブチルアミノ）−２−（４−（（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチルアミノ）ベンズアミド）−５−オキソペンタン酸）の原液を［Ｎａ］［９９ｍＴｃＯ４］に添加し、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｈｉｓ−葉酸を製造し、最終濃度１０−５Ｍとなった。密閉反応バイアルを６０分、１００℃で加熱し、対応物を良好な収率（＞９８％）で形成した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
ｃ）保護されたγ−（４−アジド−ブタノイル）−葉酸アミドの合成
アルゴン雰囲気下、炎熱乾燥させたフラスコ中で、乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ、４Aを超える分子篩）中に、Ｎ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレン−１０−ホルミル−プテロイン酸（１９８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を懸濁させ、そして、Ｅｔ３Ｎ（１０４μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）を添加した。ＨＢＴＵ（３８０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を１時間攪拌した。結果として生じたオレンジ色の溶液に、０℃で、Ｅｔ３Ｎ（２１０μＬ、１．５ｍｍｍｏｌ）を含有する乾燥ＤＭＦ（９ｍＬ）中のｃ）で得られたアミンＴＦＡ塩（１８６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。結果として生じた透明の黄色溶液を０℃で１時間攪拌し、その後室温まで温めた。減圧下で揮発性成分を除去し、残留物をシリカゲル上でＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１７：１→１０：１）によるフラッシュクロマトグラフィーで精製し、黄色固体として対応する保護されたアジド葉酸（２９０ｍｇ、９２％）を得た：融点１２５〜１３０℃；ＨＲ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］＋＝６５７．２６１７（計算値Ｃ９Ｈ１５Ｎ４Ｏ４Ｎａ：６５７．２６２４）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
ワンポット合成Ｂ：脱保護されたアジド葉酸（ステップ４ｅ）で得られたもの；４０μＬ、ＭｅＯＨ／ＰＢＳ、ｐＨ７．４（５：１）中で約１０−３Ｍ）を、Ｌ−プロパルギルグリシン（２０μＬ、水中１０−２Ｍ）、Ｃｕ（ＯＡｃ）２（５μＬ、水中１０−２Ｍ）及びアスコルビン酸ナトリウム（２０μＬ、水中１０−２Ｍ）と混合した。１００℃で３０分間加熱した後、混合物を室温に冷却し、ＰＢＳ（０．６ｍＬ、０．１５Ｍ、ｐＨ７．４）中の［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋（１００μＬ、〜１ＧＢｑ／ｍＬ）に添加した。さらなる１００℃、６０分の加熱の後、所望の錯体のクリーンな形成をＨＰＬＣ（ＨＰＬＣシステム２）で確認した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
実施例７：生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験
生体内分布の研究を４〜５週年齢の雄の胸腺欠損ヌードマウス（ＮＭＲＩ、ｎｕ／ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して行った。動物を順化させ、腫瘍細胞接種の前５日より、葉酸が欠損している齧歯目の規定食を食べさせた。マウスには、各々の肩の皮下組織に、ＫＢ−腫瘍細胞懸濁液（５×１０６細胞）を皮下接種した。腫瘍サイズがおよそ０．５〜１．５ｃｍ３のサイズに達したとき、放射性葉酸生体内分布の研究を、腫瘍細胞接種の後、約１４日行った。実験は、３重で行った。９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−Ｈｉｓ−葉酸、及び９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−トリアゾール−葉酸（１００μＬ中１．５ＭＢｑ）を、各々、側尾部静脈（ｌａｔｅｒａｌ  ｔａｉｌ  ｖｅｉｎ）より投与した。抗葉酸と組み合わせた実験のために、ペメトレキセド（ＰＭＸ；  Ａｌｉｍｔａ（登録商標）；Ｌｉｌｌｙ、Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示に従いＮａＣｌ０．９％で希釈した。放射性トレーサーの１時間前に側尾部静脈を介してそれを投与した（１００μＬ中４００μｇ）。９９ｍＴｃ−放射性葉酸単独又は予め注射されたＰＭＸと共に投与された後、１時間、４時間及び２４時間で動物を屠殺した。選択した組織を分離し、秤量し、γ−カウンターで放射能を測定し、組織のｇあたりの注入活性（ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）の割合（％ＩＡ／ｇ）を決定した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）オートラジオグラフィー：生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）オートラジオグラフィーは、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）オートラジオグラフィーのための腫瘍と腎臓の近接のセクションで行った。腫瘍セクションのスライドを、室温で、１０分間、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液、（８１７０ｍＭ、ｐＨ７．６、５ｍＭのＭｇＣｌ２と共に）中に０．２５（ｗ／ｖ）ＢＳＡと共に、プレインキュベートした。その後、そのセクションを９９ｍＴｃ−Ｈｉｓ−葉酸又は９９ｍＴｃ−トリアゾール−葉酸（１％ＢＳＡ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の０．５ＭＢｑ／ｍＬ）の溶液に６０分室温でインキュベートした。インキュベーションの後、セクションを５分間、冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２５％ＢＳＡ）中で２回、リンスし、その後、純粋Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で５分間洗浄し、最終的には冷ＭｉｌｌｉＱでリンスした。セクションは空気乾燥させ、蛍光イメージングスクリーンに露出した。その結果を図５に示した。