(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
0005998613.tif 000008
で示される新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
請求項１に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項３】
請求項１に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする抗癌剤。
【請求項４】
請求項１に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する食品。
【請求項５】
請求項１に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する化粧品。
【請求項６】
請求項１に記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬品又は医薬部外品。
【請求項７】
ケルセチンとシナピン酸を金属塩存在下で加熱処理することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする請求項１記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ケルセチン誘導体の製造方法、及び新規ケルセチン誘導体を含有する抗炎症剤ならびに抗癌剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タマネギやエシャロットの鬼皮に多く含まれているケルセチンは、フラボノイドの１種であり、非常に多くの果実や野菜中には配糖体の形で含まれている。その作用として、抗酸化作用を始め、抗アレルギー、抗がん、循環器疾患や高血圧、糖尿病等メタボリックシンドロームなど、様々な症状に効果を及ぼす報告がある（非特許文献１）。ケルセチン自身にも抗炎症作用が見られ、ＴＮＦ−α産生抑制作用があることが報告されている（非特許文献２）。さらに、ケルセチンには癌細胞のＤＮＡを損傷し、アポトーシスを引き起こす形での抗がん活性のみならず、抗がん剤の排出遺伝子の発現を阻害し、薬剤の効果を高める報告もある（特許文献１）。
【０００３】
ケルセチンは、上記のような有用性を有することから、その抽出方法ついてもいくつか検討されており、例えば、特許文献２では還元性物質存在下にて玉葱の薄皮抽出物中のケルセチン含有量を増大させる方法が開示されており、また、特許文献３では低級アルコールを用い安価にケルセチンを抽出する方法が報告されている。その他、特許文献３、４では微生物を用いた発酵法によるケルセチン含有量の増加が試みられている。しかし、いずれの報告も、風味を良好にした結果の副産物として、含有するケルセチン量が増大したものや、ケルセチン及びその配糖体の含量を増大させることに注目したものであり、ケルセチンの高機能化を試みたものではない。
【０００４】
一方、シナピン酸は植物の二次代謝産物の一つであり、樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体として植物界に多く存在する成分である。例えばリンゴなどの果実や、小麦などの穀物などに含まれている。また、シナピン酸の前駆体がアブラナ科の植物に多く含まれている。
【０００５】
シナピン酸やシナピン酸誘導体の有用性としては、例えば、シナピン酸を含有する抗菌剤（特許文献５）、シナピン酸におけるげっ歯類の脳保護効果および認知改善効果（非特許文献３）、シナピン酸誘導体を有効成分とする脳機能改善剤（特許文献６）、シナピン酸を有効成分とする抗酸化剤（特許文献７）、ジヒドロシナピン酸を有効成分とする抗酸化剤および発癌予防剤（特許文献８）などが知られている。
【０００６】
このように、ケルセチンやシナピン酸は食経験の豊かな天然物質であり、生体調節機能に優れた安全な化合物である。よって多岐に渡る各々の誘導体についての取り組みも多い。
【０００７】
シナピン酸、ケルセチン、それらの誘導体を、原料やリード化合物として、効率的に製造する技術も提案されている。例えば、ヒドロキシけい皮酸誘導体の製造方法（特許文献９）、キノベオン製造方法（特許文献１０）、フェノール酸糖エステルの製造法（特許文献１１）、キノリノン配糖体の製造方法（特許文献１２）、酵素法によるフェルラ酸エステル類化合物の製造方法（特許文献１３）、けい皮酸誘導体の酵素合成法（特許文献１４）等が知られている。
【０００８】
近年、生活スタイルの変化や、ストレスの増大などに起因し、化学物質過敏症、花粉症、アトピー性皮膚炎、乾癬など炎症性疾患の罹患患者数が増大傾向にある。
これら炎症性疾患の多くはヒト腫瘍壊死因子（Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α：ｈＴＮＦ−α）に代表される内因性サイトカインの異常産生が原因であることが知られており、有用な抗炎症剤についていくつか提案されている。例えば、特許文献１５や特許文献１６ではイヌカラマツ、タブノキなどの樹木からの抽出物を有効成分とする抗炎症剤を提案されており、特許文献１７では抗炎症作用のあるペプチド又はその酸付加塩、及び、担体を含む抗炎症剤、特許文献１８ではビチス（Ｖｉｔｉｓ）属に属する植物の種子、サビアナタケ（Ｆｕｓｃｏｐｏｒｉａ）属に属するきのこ、マルス（Ｍａｌｕｓ）属に属する植物の果皮の抽出物を有効成分とするタイプ２ヘルパーＴ細胞型サイトカイン産生抑制剤、特許文献１９では柿の葉、ヨモギ、杉の葉、ミント、ヘチマ、シラカバ、ブドウ種子、アマチャヅル、ギムネマ、グアバ、クコ、クマザサ、ジャスミン、スギナ、ドクダミ、ハトムギ、ビワの葉、モロヘイヤ、ウド、サフラン、クワ、ラフマ、ベニバナ、トチュウ、スズラン、ゼンマイ等の植物から抽出されるフラボノイド化合物を有効成分とするＴｈ２サイトカイン発現抑制剤が提案されている。
【０００９】
また、ライフスタイルの変化は日本人の死亡原因の変化ももたらし、厚生労働省の統計によると、悪性新生物が死亡原因である例が昭和５６年以降死因の第一位を占め続け、現在なおその死亡原因に対する割合が上昇し続けている。すなわち、癌細胞の増殖を抑え、発症を予防することがよりよい生活を送る為に求められている。日常的に摂取が可能な抗癌活性を持つ天然物由来化合物としては前記ケルセチンを初めとしたフラボノイド類が一般的である（非特許文献４）。
しかしながら、例えば植物由来の抽出物については、日常的に摂取することは可能である一方、抗炎症活性、抗癌活性のいずれも、当該活性をもたらす物質の効果が十分とはいえず、被食経験を有する原料よりもたらされる、より高い活性を持ち合わせた物質が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第２５１４５００号公報
【特許文献２】特許第４３１３９６１号公報
【特許文献３】特許第４０３８５３７号公報
【特許文献４】特許第４０３１６３７号公報
【特許文献５】特開平７−１９４３５６号公報
【特許文献６】特開平７−１７９３３８号公報
【特許文献７】特開２０００−２５６２６０号公報
【特許文献８】特開２００３−９５９７６号公報
【特許文献９】特開２００３−５５３１４号公報
【特許文献１０】特許第３３３７２５１号公報
【特許文献１１】特開平９−３２２７９４号公報
【特許文献１２】特開平１１−２６９１９１号公報
【特許文献１３】特開２００７−１０号公報
【特許文献１４】特開２００９−２０７４９２号公報
【特許文献１５】特開２０００−２２６３２３号公報
【特許文献１６】特許第４３１５２５５号公報
【特許文献１７】特許第４２７８０２８号公報
【特許文献１８】特開２００４−７５６１９号公報
【特許文献１９】特開２００１−１１４６８６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  １６（２）  １７２−１９４
【非特許文献２】Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，１１（１５），２００６
【非特許文献３】唐木田  文仁，金沢大学十全医学会雑誌  第１１７巻  第１号  ２−９（２００８）
【非特許文献４】Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２３（４），５１９−５３４（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、ケルセチンやシナピン酸やこれらの誘導体に関する前記の状況を鑑みて、より優れた生理活性を有する化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、意外にもケルセチンとシナピン酸を金属塩存在下で加熱処理するという簡便且つ安全な方法により、ケルセチン、シナピン酸に比べて優れた抗炎症活性、抗癌活性を有する新規なケルセチン誘導体を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
したがって、本発明は、ケルセチン、シナピン酸と比べて優れた抗炎症作用および抗癌作用を有する新規ケルセチン誘導体を提供し、さらに該新規ケルセチン誘導体を、効率よく、安全に生成する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、前記新規ケルセチン誘導体を含有することを特徴とする、抗炎症剤および抗癌剤を含有する食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の要旨は、
〔１〕式（１）：
【００１５】
【化１】
0005998613.tif 000002
【００１６】
で表される新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩、
〔２〕前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする抗炎症剤、
〔３〕前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする抗癌剤、
〔４〕前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする食品、
〔５〕前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする化粧品、
〔６〕前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする医薬品又は医薬部外品、
〔７〕ケルセチンとシナピン酸を金属塩存在下で加熱処理することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする前記〔１〕記載の新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明で用いる新規ケルセチン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩（以下、新規ケルセチン誘導体という）は、前駆物質であるケルセチン、シナピン酸と比べて、抗炎症作用および抗癌作用に優れていることから、新規な抗炎症剤および抗癌剤として有用である。
本発明の新規ケルセチン誘導体は、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１で得られたクロマトグラムを示している。上から、反応前のクロマトグラム、（１）金属塩としてミネラルウォーターを用いたクロマトグラム、（２）リン酸三マグネシウム八水和物（ミネラルプレミックスの主成分）を用いたクロマトグラムを用いたクロマトグラムを示している。図中、Ａのピークは本発明の新規ケルセチン誘導体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２０】
本発明で用いる新規ケルセチン誘導体は、
式（１）：
【００２１】
【化２】
0005998613.tif 000003
【００２２】
で表される化合物である。
【００２３】
前記新規ケルセチン誘導体の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００２４】
前記新規ケルセチン誘導体は、ケルセチン、シナピン酸などの原料化合物を金属塩存在下で加熱処理することで得られる。
前記原料化合物のケルセチンは、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来の原料化合物としては、完全に精製されたものである必要はなく、各原料化合物を含む混合物も使用できる。また、前記原料化合物には塩類も含まれるが、本発明では、これらの誘導体も原料として使用することができる。
前記原料化合物の塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の塩類が挙げられる。
ただし、前記新規ケルセチン誘導体の生成効率や回収率を高める観点からは、前記原料化合物合計で５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、例えば玉葱鬼皮や、エシャロット鬼皮、柑橘類等の原料からの抽出物や凍結乾燥品等を使用しても良い。
【００２５】
また、本発明の製造方法では、前駆体としてシナピン酸も必要である。シナピン酸は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のシナピン酸を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明の新規ケルセチン誘導体が得られるのであれば、シナピン酸以外の成分を含む混合物も使用できる。
ただし、新規ケルセチン誘導体の回収量の観点からは、シナピン酸換算で５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、例えば、リンゴ果実、アブラナ等の原料からの抽出物、凍結乾燥品等を使用してもよい。
【００２６】
本発明の製造方法では、ケルセチン、シナピン酸、またはケルセチンとシナピン酸との混合物を適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであれば、ケルセチンやシナピン酸の水への溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、ケルセチンやシナピン酸が十分に溶解すれば良い。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。新規ケルセチン誘導体を含む反応後組成物に対して最終的な精製を十分に適用せずにその組成物を食品に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。
【００２７】
得られるケルセチン、シナピン酸、またはケルセチンとシナピン酸との混合物を含有する溶液中のケルセチンおよびシナピン酸の濃度について特に制限はないが、それぞれの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、ケルセチンおよびシナピン酸の濃度は各々の溶媒に対しケルセチンおよびシナピン酸がそれぞれ飽和する濃度近くが好ましい。
また、ケルセチン、シナピン酸は前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。例えば、ケルセチン含有溶液とシナピン酸含有溶液とを混合する場合、それぞれの溶液中のケルセチン濃度、シナピン酸濃度がともに飽和濃度以上であっても、混合液とした場合には、飽和濃度近くになるように調整しておけばよい。
【００２８】
本発明では、原料化合物を反応させて目的の新規ケルセチン誘導体を得るために、前記原料化合物を含有する溶液（以下、原料溶液）に金属塩を添加する。
【００２９】
前記金属塩としては、酸性塩、塩基性塩、正塩のいずれでもよく、また、単塩、複塩、錯塩のいずれでもよい。さらに、金属塩は１種類であっても、複数種類の混合物であってもよい。金属塩の例としては、食品添加物として認可されているものが安全性の面で好ましい。例えば、食品に添加することが認められているマグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銅塩等が挙げられる。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス（田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物）のように金属塩を数種類含む混合物が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記原料溶液中における前記金属塩の含有量としては、目的の新規ケルセチン誘導体を生成可能な量であればよく、特に限定はない。
【００３０】
前記金属塩存在下であれば、酸性条件下で、新規ケルセチン誘導体を生成する反応は進む。
ただし、得られる新規ケルセチン誘導体の使用目的や精製、単離作業の有無、食品に添加する場合には味の面等を考慮して、適宜反応条件を選択することが望ましい。
【００３１】
次に、金属塩存在下で、前記原料溶液を加熱処理する。この加熱処理により、目的の新規ケルセチン誘導体の生成反応を行う。前記生成反応を効率的に進ませるために、前記原料溶液の加熱温度は９０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考えて、加圧加熱を行うことが望ましい。例えば、開放容器に原料溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器に原料溶液を入れて前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。目的の新規ケルセチン誘導体の生成効率及び回収効率を高める点から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度と溶媒量の兼ね合いによるものであり、加熱温度、溶媒量に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で原料溶液を加熱する場合は、溶液温度が１３０℃になってから、５分〜６時間の加熱を行うことが好ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて原料溶液を加熱する場合、溶媒のみ又は金属塩を含有する溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。
【００３２】
前記加熱処理による新規ケルセチン誘導体の生成反応の終了は、例えば、後述の実施例に記載するＨＰＬＣによる成分分析により新規ケルセチン誘導体の生成量を確認して判断すればよい。
【００３３】
また、安全な原料のみを用いた工程で前記新規ケルセチン誘導体を製造した場合には、前記新規ケルセチン誘導体を含む混合物の状態で後述のように食品、医薬品、医薬部外品又は化粧品に使用することが可能である。例えば、天然由来の原料化合物を含水エタノール溶媒に溶解し、ミネラルウォーターやミネラルプレミックスを用い、加熱処理した場合には、得られる液状の反応物を食品原料の一つとして使用することが可能である。
【００３４】
また、風味の改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応物を濃縮して新規ケルセチン誘導体の濃度を高める、あるいは前記反応物を精製し新規ケルセチン誘導体の純品を得ることができる。前記濃縮や精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して新規ケルセチン誘導体を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。また、前記濃縮や精製には、再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も使用できる。
【００３５】
前記新規ケルセチン誘導体を前記反応物から分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。
【００３６】
また、前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒を除去することで、粉末状の固形物を得ることができる。
【００３７】
本発明で使用する原料化合物の安全性は、すでに一般的に確認されていることから、本発明で得られる新規ケルセチン誘導体の安全性も同様に優れたものであると考えられる。
【００３８】
以上のようにして得られる新規ケルセチン誘導体はいずれも、原料であるケルセチン、シナピン酸に比べて、より強い抗炎症作用および抗癌作用を有する。
したがって、前記新規ケルセチン誘導体を有効成分として含有する抗炎症剤および抗癌剤を提供することができる。
【００３９】
前記抗炎症剤および抗癌剤は、前記新規ケルセチン誘導体のみを含有していてもよいが、前記新規ケルセチン誘導体をエタノール又はエタノール含有水溶液などの溶媒に溶解した液剤としたり、公知の方法で乳剤、懸濁剤としたりしてもよい。前記抗炎症剤中の前記新規ケルセチン誘導体の含有量は、０．００１重量％以上であればよい。
【００４０】
また、本発明の新規ケルセチン誘導体は、食品、化粧品、医薬品、医薬部外品等に配合して使用することもできる。
【００４１】
前記食品としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態のものでもよい。菓子類としては、その容量等から保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。また、新規ケルセチン誘導体は後述のように、抗炎症作用を有することから、慢性的炎症の軽減、それに伴うメタボリックシンドロームの予防効果などを目的に、容易に摂取できるハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレットなどにすることもできる。なお、食品には、機能性食品、健康食品、健康志向食品等も含まれる。
【００４２】
前記化粧品としては、クリーム、ローション、溶液、エアゾル、石鹸、シャンプー、リンス、洗顔クリーム等のスキンケア用品を例示できる。
【００４３】
前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりしてもよいし、胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、前記の製剤に公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、液剤を注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
【００４４】
前記医薬部外品としては、例えば、歯磨き、マウスウオッシュ、マウスリンス、また、ドリンク剤等が挙げられる。
【００４５】
本発明の新規ケルセチン誘導体を用いて食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品を調製する場合、本発明の効果が損なわれない範囲内で食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品に通常用いられる成分を適宜任意に配合することができる。
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせることができる。
化粧品、医薬品又は医薬部外品の場合には、主剤、基材、界面活性剤、起泡剤、湿潤剤、増粘剤、透明剤、着香料、着色料、安定剤、防腐剤、殺菌剤等と組み合わせ、常法に基づいて、液状、軟膏状あるいはスプレー噴射可能な最終形態等にすることができる。
【００４６】
本発明の新規ケルセチン誘導体を食品に添加する場合には、該食品中に対して、通常は０．００１〜２０重量％添加することが好ましい。
【００４７】
本発明の新規ケルセチン誘導体を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００４８】
本発明の新規ケルセチン誘導体を化粧品又は医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、通常０．００１〜３０重量％添加するのが好ましい。
【００４９】
また、本発明の新規ケルセチン誘導体は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。
【００５０】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
（実施例１：新規ケルセチン誘導体の生成方法検討）
ケルセチン二水和物（東京化成工業（株）製）１００ｍｇ、シナピン酸（和光純薬工業（株）製）１００ｍｇをエタノール２ｍＬに溶解し、（１）ミネラルウォーター（商品名「ゲロルシュタイナー」サッポロ飲料（株）製）２ｍＬ、（２）リン酸三マグネシウム八水和物（和光純薬工業（株）製、ミネラルプレミックスの主成分）１００ｍｇ、水２ｍＬをそれぞれ加えて、ケルセチン、シナピン酸含有溶液（ｐＨ：（１）４．９、（２）５．５）を３種類調製した。このケルセチン、シナピン酸含有溶液をオートクレーブ（三洋電機（株）製、「ＳＡＮＹＯ  ＬＡＢＯ  ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」）にて１３０℃、３０分間加熱した。得られた反応溶液からそれぞれ１ｍＬを取り出して、メタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。
【００５２】
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）），  Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：１００％Ａ／０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂまで３３分間、１００％Ｂで７分間（全て直線）
【００５３】
得られたクロマトグラムを図１に示す。上から、反応前、（１）、（２）の反応溶液のクロマトグラムをそれぞれ示している。反応後には、ケルセチンやシナピン酸以外のピークが検出され、複数の化合物が生成されていることが確認された。
反応前後で生成量に顕著な差があったのが、後述する新規ケルセチン誘導体であるＡのピークである。なお、（１）、（２）両方ともＡのピークは確認できたが、生成効率としては（１）の方が良かった。これは、金属塩の溶媒への溶解度の差が出た可能性がある。
【００５４】
（実施例２：新規ケルセチン誘導体の大量生成）
ケルセチン二水和物１ｇ、シナピン酸１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、ミネラルウォーター２０ｍＬを加えて、ケルセチン、シナピン酸含有溶液（ｐＨ＝４．９）を得た。このケルセチン、シナピン酸含有溶液をオートクレーブにて１３０℃、１８０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析したところ、実施例１と同様のクロマトグラムが確認できた。
【００５５】
（実施例３：新規ケルセチン誘導体の単離・構造決定）
実施例２で得られた反応物のうち、図１のＡで示したピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ、新規化合物（以下ＵＨＡ２０３７）を１７２ｍｇ得た。単離精製したＵＨＡ２０３７は、黄色粉末状の物質であった。
【００５６】
次いで、前記ＵＨＡ２０３７の分子量を高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値は４８１．４２７５であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ２５Ｈ２１Ｏ１０（Ｍ−Ｈ-）：４８１．４２８２
分子式Ｃ25Ｈ22Ｏ10
【００５７】
次に、前記ＵＨＡ２０３７を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ２０３７が式（１）で表される構造を有することを確認した。式（１）で表される新規ケルセチン誘導体は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。
【００５８】
ＮＭＲ測定値について、ＵＨＡ２０３７を
【００５９】
【化３】
0005998613.tif 000004
【００６０】
として、その1Ｈ核磁気共鳴スペクトル、13Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表１に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ6）で測定した。
【００６１】
【表１】
0005998613.tif 000005
【００６２】
また、ＵＨＡ２０３７の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水：難溶
メタノール：溶解
エタノール：溶解
ＤＭＳＯ：溶解
クロロホルム：溶解
酢酸エチル：溶解
【００６３】
（実施例４：加熱温度によるＵＨＡ２０３７の生成量の違い）
ケルセチン二水和物１００ｍｇ、シナピン酸１００ｍｇ、エタノール２ｍＬ、ミネラルウォーター２ｍＬの混合溶液（ｐＨ＝４．９）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００６４】
その結果、１１０℃以上でＵＨＡ２０３７の生成は確認できた。ケルセチンおよびシナピン酸の合計量からの生成比率（重量％）は、７０℃、９０℃が非生成、１１０℃が極微量、１３０℃が６．５％となり、１３０℃での加熱がもっとも多くＵＨＡ２０３７を生成していた。
【００６５】
（実施例５：ＵＨＡ２０３７の抗炎症作用の検討）
ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球性白血病細胞）を４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  シグマアルドリッチジャパン社製）、１０％ウシ胎児血清（Ｆｏｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、０．１μＭホルボールエステル（ＰＭＡ）（シグマアルドリッチジャパン社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマアルドリッチジャパン社製）中にて５％ＣＯ2、３７℃、２４時間培養し、単球・マクロファージに分化誘導した。分化誘導後、ケルセチン、シナピン酸、実施例２，３で得られたＵＨＡ２０３７を各０．３７〜３０μＭとなるように添加し、さらにリポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ、Ａｌｅｘｉｓ社）を１００ｎｇ／ｍＬの終濃度で添加し４８時間培養を行った。
培養上清中のヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦ−α）はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）にて測定を行い、比較した。
【００６６】
前記ＥＬＩＳＡは、マキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、ＮＵＮＣ製）を用いて行った。抗ヒトＴＮＦ−α抗体（ａｂｃａｍ社）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）バッファー（組成：塩化ナトリウム１３７ｍＭ，リン酸水素二ナトリウム８．１ｍＭ，塩化カリウム２．７ｍＭ，リン酸二水素カリウム１．５ｍＭ）で調整し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、２０％イムノブロックを含むＰＢＳ（−）バッファー３００μＬを各ウェルにアプライした。２５℃で２時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、各培養上清を５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、抗ヒトＴＮＦ−α抗体（ａｂｃａｍ社）を０．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で調整し、各ウェルにアプライした。２５℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＨＲＰ標識）をＰＢＳ（−）／０．１％  ＢＳＡで適当量希釈し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で１時間の静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×５回で洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ−酵素免疫測定（ＥＩＡ）−基質−キット試薬（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を５０μＬずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、０．５Ｍ  硫酸を２５μＬずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０ｎｍで検出を行い、ＴＮＦ−α産生量を比較した。これらから得られたデータを基に算出したＴＮＦ−α産生阻害率と各化合物濃度の関係から、ＴＮＦ−αの産生を５０％阻害する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度：ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を算出した（表２）。
【００６７】
その結果、ケルセチン、シナピン酸添加時と比較して、ＵＨＡ２０３７添加時のＴＮＦ−α産生量が有意に抑制されていることが見いだされ、抗炎症作用を有するケルセチンと比べ、極めて強い抗炎症作用を有することが示された。したがって、ケルセチンとシナピン酸を新規ケルセチン誘導体に変換する高い有意性が示された。
【００６８】
【表２】
0005998613.tif 000006
【００６９】
（実施例６：ＵＨＡ２０３７のヒト骨髄球性白血病細胞に対する抗癌作用）
ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｏｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。細胞の培養としては、４ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳを含む高栄養培地ＲＰＭＩ−１６９０を培養液とし、継代培養を行った。試験は細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用いた。試験当日にＨＬ−６０細胞を５×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように細胞数を調整し、９６ウェルプレートに、１ウェルあたり１００μＬずつ播種した。
試料調整については、実施例２，３より得られたものをＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、これを６．３〜１００μＭとなるようにＨＬ−６０細胞の培養液に懸濁し、試験を開始した。試料の種類は、ＵＨＡ２０３７に加え、ケルセチン、シナピン酸、さらに、ネガティブコントロールとしてＤＭＳＯを用いた。
生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８」（（株）同人化学研究所製）を用いてＭＴＴ法にて検出を行った。つまり、試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加し、よく攪拌した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で１時間の遮光反応を行った。その後にプレートリーダー（「ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｍｏｄｅｌ  ６８０」、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度）を算出した。結果を表３に示す。これらの結果から、ＵＨＡ２０３７のＩＣ50が最も低かったことから、強い癌細胞増殖抑制能が認められた。
ＵＨＡ２０３７は、前駆物質のケルセチンやシナピン酸よりも、細胞生存率が低く、ＨＬ−６０細胞の増殖を抑制する効果がより高いことが示唆され、ケルセチンとシナピン酸を新規ケルセチン誘導体に変換する高い有意性が示された。
【００７０】
【表３】
0005998613.tif 000007
【００７１】
（実施例７：ＵＨＡ２０３７含有エキスの調製）
玉葱鬼皮抽出エキスパウダー（ケルセチン含有素材）１０ｇ、りんご濃縮７倍果汁（シナピン酸含有素材）１５ｇ、エタノール１０ｍＬ、ミネラルウォーター１０ｍＬを加えて調製した混合溶液（ｐＨ＝３．５）を、オートクレーブにて１３０℃、１８０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、ＵＨＡ２０３７含有エキスを２０ｇ得た。得られたＵＨＡ２０３７含有エキス２０ｇ中には、実施例３と同様の手法で確認したところＵＨＡ２０３７が０．０５６ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００７２】
（実施例８：ＵＨＡ２０３７を含有する食品）
実施例７で得たＵＨＡ２０３７含有エキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。このミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。
【００７３】
（実施例９：ＵＨＡ２０３７を含有する医薬品）
実施例７と同様の方法で得たＵＨＡ２０３７含有エキスをエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに添加して吸着させた後に、減圧乾燥させた。この吸着物を用いて常法に従い、打錠品を得た。処方は、ＵＨＡ２０３７含有エキスを１０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、癌の治癒を目的とする医薬品として有効に利用できる。
【００７４】
（実施例１０：ＵＨＡ２０３７を含有する化粧品）
テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット１重量部、ポリオキシエチレンステアリルエーテル０．５重量部、親油型モノステアリン酸グリセリン１重量部、ピルビン酸０．５重量部、ステアリルアルコール０．５重量部、アボガド油１重量部、実施例７で得たＵＨＡ２０３７含有エキス０．１重量部を混合し、常法に従って溶解させ、これに、乳酸ナトリウム１重量部、プロピレングリコール５重量部、カルボキシビニルポリマー０．１重量部、ごく少量の香料及び精製水８９．３重量部を加え、ホモゲナイザーにかけて乳化して、乳液を得た。本乳液は、ＵＨＡ２０３７を含有することから、乾癬やアトピー性皮膚炎の皮膚疾患治療や予防効果をもつ薬用化粧品として有効に利用できる。
【００７５】
（実施例１１：ＵＨＡ２０３７を含有する医薬部外品）
実施例７で得たＵＨＡ２０３７含有エキス１．２ｇを１０ｍＬのエタノールに溶解し、これにタウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ及びポリビニルピロリドン１０ｇを溶解した精製水を混合した後、精製水で１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間加熱滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を完成させた。本ドリンク剤は、栄養補給の目的に加えて、炎症性サイトカインの異常産生を治癒することを目的とする医薬部外品として有効に利用できる。
【図１】
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