【事件の表示】
　特許第６１０１０１１号発明「フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。
【結　論】
　特許第６１０１０１１号の特許請求の範囲を訂正請求書に添付された訂正特許請求の範囲のとおり、訂正後の請求項１、〔２、４〜６〕、３について訂正することを認める。
　特許第６１０１０１１号の請求項１ないし６に係る特許を維持する。
【理　由】
第１　手続の経緯
　特許第６１０１０１１号の請求項１ないし６に係る特許（以下、「本件特許」という。）についての出願は、平成２４年７月１３日に特許出願され、平成２９年３月３日にその特許権の設定登録がされ、その後、その特許について、同年９月２０日に特許異議申立人豊田英徳により特許異議の申立てがされ、同年１０月３１日付けで取消理由が通知され、同年１２月２２日に意見書の提出及び訂正請求がされ、訂正請求に対して特許異議申立人から平成３０年２月１９日に意見書が提出され、同年３月１５日付けで取消理由通知（決定の予告）がされ、同年５月１８日に意見書の提出及び訂正請求がされ、訂正請求に対して特許異議申立人から同年７月５日に意見書が提出されたものである。
第２　訂正の適否についての判断
　本件特許の訂正について、平成２９年１２月２２日及び平成３０年５月１８日に訂正請求書が提出されているが、「・・・訂正の請求がされた場合において、その特許異議申立事件において先にした訂正の請求があるときは、当該先の請求は、取り下げられたものとみなす。」（特許法第１２０条の５第７項）と規定されているから、平成３０年５月１８日付け訂正請求書における訂正の請求のみを審理の対象とする。
１　訂正の内容
　平成３０年５月１８日付け訂正請求書における訂正請求による訂正（以下、「本件訂正」という。）の内容は、以下の(１)ないし(３)のとおりである。
(１)　請求項１における「アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、トレハロース、キシリトール、スクロース、αシクロデキストリン、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムおよび硫酸アンモニウムから選択される１種または２種以上の化合物」を「アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、およびキシリトールから選択される１種または２種以上の化合物」に訂正する。
(２)　請求項２における「アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、トレハロース、キシリトール、スクロース、αシクロデキストリン、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムおよび硫酸アンモニウムから選択される１種または２種以上の化合物」を「アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、およびキシリトールから選択される１種または２種以上の化合物」に訂正する。
(３)　請求項３における「アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、トレハロース、キシリトール、スクロース、αシクロデキストリン、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムおよび硫酸アンモニウムから選択される１種または２種以上の化合物」を「アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、およびキシリトールから選択される１種または２種以上の化合物」に訂正する。
２　一群の請求項、訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
(１)　一群の請求項 
　訂正前の請求項４ないし６はいずれも訂正請求の対象である請求項２の記載を引用する関係にあることから、訂正前の請求項２及び４ないし６は一群の請求項に該当する。そして、本件訂正は、前記１のとおり請求項１及び３とともに請求項２も訂正するものであるが、その請求の趣旨は、「・・・訂正後の請求項１〜６について訂正することを求める。」とされているので、本件訂正は特許法第１２０条の５第４項に適合する。
(２)　訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　訂正事項(１)ないし(３)は、いずれも、選択される化合物を限定するものである。そうしてみると、これらの訂正は、特許請求の範囲の減縮を目的とし、新規事項の追加に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
(３)　小括
　以上のとおりであるから、本件訂正は、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に掲げる事項を目的とするものであり、かつ、同条第９項で準用する同法第１２６条第４項から第６項までの規定に適合する。したがって、訂正後の請求項１、〔２、４〜６〕、３について訂正を認める。
第３　特許異議の申立てについて
１　本件訂正発明
　本件特許の請求項１ないし６に係る発明は、平成３０年５月１８日付け訂正請求書に添付された訂正特許請求の範囲の記載からみて、その特許請求の範囲の請求項１ないし６に記載された事項により特定される以下のとおりのものである。
【請求項１】　配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるか、又はケカビ（Mucor）属に由来するフラビン結合グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）を含む組成物において、安定化剤として、アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、およびキシリトールから選択される１種または２種以上の化合物を共存させる工程を含む、ＦＡＤ−ＧＤＨの安定性を向上させる方法。
【請求項２】　配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるか、又はケカビ（Mucor）属に由来するＦＡＤ−ＧＤＨおよび、アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、およびキシリトールから選択される１種または２種以上の化合物を含むグルコース測定用組成物。
【請求項３】　配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるか、又はケカビ（Mucor）属に由来するＦＡＤ−ＧＤＨと、アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、およびキシリトールから選択される１種または２種以上の化合物を共存させることを特徴とする、グルコース測定用組成物の製造方法。
【請求項４】　請求項２記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
【請求項５】　請求項２記載の組成物を含むグルコースアッセイキット。
【請求項６】　請求項２記載の組成物を含むグルコースセンサー。
（以下、これらの請求項に係る各発明をそれぞれの請求項の番号に対応させて「訂正発明１」、「訂正発明２」、・・・「訂正発明６」といい、また、これらの発明をまとめて「本件訂正発明」という場合がある。）
２　異議申立理由の概要
　特許異議申立人は、以下の証拠を提出し、訂正前の請求項１ないし６に係る特許は、甲第１〜９号証に記載された発明に基き、容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、上記請求項に係る特許を取り消すべきものである旨を主張し、また、訂正前の請求項１ないし６に係る特許は、その発明の詳細な説明の記載が同法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであり、かつ、その特許請求の範囲の記載が同法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであることから、取り消されるべきものである旨主張している。
　甲第１号証；国際公開第２０１０／１４０４３１号
　甲第２号証；国際公開第２０１２／０７３９８６号
　甲第３号証；特開２００８−１５４５７３号公報
　甲第４号証；特開２００７−１２９９６５号公報
　甲第５号証；特開平６−２８４８８６号公報
　甲第６号証；蛋核酵，1985，Vol.30，pp.1115-1126.
　甲第７号証；Protein Sci, 1999, Vol.8, pp.222-233.
　甲第８号証；特表２０１０−５１５７１３号公報
　甲第９号証；国際公開第２００９／００６３０１号
　甲第１０号証；今堀和友ら監修、生化学辞典第４版、2007年、株式会社東京化学同人発行、pp.828-829.
　甲第１１号証；B Albertsら著、中村桂子ら監訳、細胞の分子生物学第４版、2004年、株式会社ニュートンプレス発行、pp.134-135.
　甲第１２号証；豊田英徳が平成29年8月31日に作成した「Mucor prainii由来ＦＤＡ−ＧＤＨ（本件発明の配列番号１）の分子表面予測アミノ酸、及びMucor属由来４種ＦＡＤ−ＧＤＨのマルチプルアライメント」
　（以下、これらの各甲号証のことを、単に、甲１、甲２・・・という場合がある。）
３　甲号証の記載
　本件特許の出願日である平成２４年７月１３日よりも前に頒布された以下の証拠には、以下の事項が記載されている。
(１)　甲第１号証
ア　請求の範囲
(ア)　請求項１
　「以下の（i）から（iii）の性質：
（i）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す、
（ii）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａである、
（iii）基質特異性：D-グルコースに対する反応性に対して、マルトース、及びD-ガラクトース、及びD-キシロースに対する反応性が低い、
を備えるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。」（３９ページ２〜９行）
(イ)　請求項９
　「配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるを有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。」（４０ページ１１〜１５行）
イ　明細書
(ア)　技術分野
　「本発明は、フラビン化合物を補酵素とする新規なフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、およびその製造法に関する。」（段落[0001]）
(イ)　発明を実施するための最良の形態
　「上記のような方法で製造された、本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、夾雑糖化合物の存在下においても正確にグルコース量を測定できることから、グルコースセンサなどへの応用・実用化に好適に用いることができる。」（段落[0040]）
(ウ)　実施例７
　「Mucor属由来フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子のクローニングと形質転換体による発現
（１）ｍＲＮＡの調製
　Mucor prainii NISL0103をマルツエキス培地（・・・）３ｍＬに接種し、２日、３０℃で振とう培養した。この培養液を濾紙濾過し、菌糸体を回収した。得られた菌糸を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。次いで、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からｍＲＮＡを得た。
（２）ＧＤＨ部分アミノ酸配列の決定
　実施例２より得られたＭｐＧＤＨをスーパーセップエース１０−２０％（和光純薬工業社製）に供し、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをQuick-CBB（和光純薬工業社製）を用いて染色し、当該酵素の分子量に相当するバンド部分を切り出した。切り出したゲル断片を外部機関に委託し、その中に含まれるタンパク質の内部アミノ酸配列情報を取得した。その結果、得られたアミノ酸配列は、ＬＶＥＮＦＴＰＰＴＰＡＱＩＥ（配列番号５）およびＩＲＮＳＴＤＥＷＡＮＹＹ（配列番号６）であった。
（３）ＧＤＨ遺伝子配列の決定
　上記の部分アミノ酸配列情報に基づき、ミックス塩基を含有するディジェネレートプライマー（プライマーの一例を配列番号７（フォワードプライマー）、配列番号８（リバースプライマー）に示す）を作製した。・・・上記（１）にて調製したMucor prainii NISL0103のｍＲＮＡをテンプレートとし、PrimeScript RT-PCR Kit（タカラバイオ社製）を用いて、本キットのプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写反応には本キット付属のオリゴｄＴプライマーを、ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅には配列番号７、８に示すディジェネレートプライマーを用いた。反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、800bp程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、Ligation Convenient Kit（ニッポンジーン社製）を用いて、pT7Blue（ノバジェン社製）に前記増幅ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、組換えプラスミドpTMGD-1を構築した。
　次いで、得られたpTMGD-1を用い、公知のヒートショック法により大腸菌JM109コンピテントセル（ニッポンジーン社製）を形質転換した。得られた形質転換体からGenElute Plasmid Miniprep Kit（シグマ社製）を用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミド中に含まれる前記増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した（767bp）。
　得られた前記増幅ＤＮＡ断片の配列情報を元に、3'-Full RACE Core Set（タカラバイオ社製）を用いて3'側のＧＤＨ遺伝子未知領域を、また、5'-Full RACE Core Set（タカラバイオ社製）を用いて5'側のＧＤＨ遺伝子未知領域を決定した。いずれも各キットのプロトコールに従い、3'-Full RACE Core Setでは本キット付属の３サイトアダプタープライマーおよび配列番号９に示すプライマーを用い、また、5'-Full RACE Core Setでは配列番号１０、１１、１２、１３、１４に示すプライマーをそれぞれ用いた。前記の方法に従って得られた複数のプラスミド中に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号２および配列番号４に示す全鎖長1926bpのMucor prainii NISL0103由来ＧＤＨ遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列により予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１および配列番号３に示す。」（段落[0081]〜[0085]）
(２)　甲第２号証
ア　請求の範囲
(ア)　請求項１
　「以下の（i）から（iv）の性質：
（i）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す、
（ii）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａである、
（iii）基質特異性：D-グルコースに対する反応性に対して、マルトース、及びD-ガラクトース、及びD-キシロースに対する反応性が低い、
（iv）５０℃、１５分間の熱処理において５０％以上の残存活性を有する、
を備えるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。」（４６ページ２〜１１行）
(イ)　請求項２
　「配列番号１または配列番号３で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と８５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる請求項１記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。」（４６ページ１２〜１６行）
イ　明細書
(ア)　技術分野
　「本発明は、新規なフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造法およびそれに用いる酵母形質転換体に関する。」（段落[0001]）
(イ)　発明を実施するための最良の形態
　「上記のような方法で製造されたフラビン結合型ＧＤＨは、夾雑糖化合物の存在下においても正確にグルコース量を測定できることから、グルコースセンサなどへの応用・実用化に好適に用いることができる。」（段落[0044]）
(ウ)　実施例７
（Mucor属由来フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子のクローニングと酵母形質転換体の作製）
（１）ｍＲＮＡの調製
　Mucor prainii NISL0103をマルツエキス培地（・・・）３ｍＬに接種し、２日、３０℃で振とう培養した。この培養液を濾紙濾過し、菌糸体を回収した。得られた菌糸を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。次いで、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からｍＲＮＡを得た。
（２）ＧＤＨ部分アミノ酸配列の決定
　実施例２より得られたＭｐＧＤＨをスーパーセップエース１０−２０％（和光純薬工業社製）に供し、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをQuick-CBB（和光純薬工業社製）を用いて染色し、当該酵素の分子量に相当するバンド部分を切り出した。切り出したゲル断片を外部機関に委託し、その中に含まれるタンパク質の内部アミノ酸配列情報を取得した。その結果、得られたアミノ酸配列は、ＬＶＥＮＦＴＰＰＴＰＡＱＩＥ（配列番号５）およびＩＲＮＳＴＤＥＷＡＮＹＹ（配列番号６）であった。
（３）ＧＤＨ遺伝子配列の決定
　上記の部分アミノ酸配列情報に基づき、ミックス塩基を含有するディジェネレートプライマー（プライマーの一例を配列番号７（フォワードプライマー）、配列番号８（リバースプライマー）に示す）を作製した。・・・上記（１）にて調製したMucor prainii NISL0103のｍＲＮＡをテンプレートとし、PrimeScript RT-PCR Kit（タカラバイオ社製）を用いて、本キットのプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写反応には本キット付属のオリゴｄＴプライマーを、ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅には配列番号７、８に示すディジェネレートプライマーを用いた。反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、800bp程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、Ligation Convenient Kit（ニッポンジーン社製）を用いて、pT7Blue（ノバジェン社製）に前記増幅ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、組換えプラスミドpTMGD-1を構築した。
　次いで、得られたpTMGD-1を用い、公知のヒートショック法により大腸菌JM109コンピテントセル（ニッポンジーン社製）を形質転換した。得られた形質転換体からGenElute Plasmid Miniprep Kit（シグマ社製）を用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミド中に含まれる前記増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した（767bp）。
　得られた前記増幅ＤＮＡ断片の配列情報を元に、3'-Full RACE Core Set（タカラバイオ社製）を用いて3'側のＧＤＨ遺伝子未知領域を、また、5'-Full RACE Core Set（タカラバイオ社製）を用いて5'側のＧＤＨ遺伝子未知領域を決定した。いずれも各キットのプロトコールに従い、3'-Full RACE Core Setでは本キット付属の３サイトアダプタープライマーおよび配列番号９に示すプライマーを用い、また、5'-Full RACE Core Setでは配列番号１０、１１、１２、１３、１４に示すプライマーをそれぞれ用いた。前記の方法に従って得られた複数のプラスミド中に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号２および配列番号４に示す全鎖長1926bpのMucor prainii NISL0103由来ＧＤＨ遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列により予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１および配列番号３に示す。」（段落[0085]〜[0089]）
(３)　甲第３号証
ア　特許請求の範囲
(ア)　請求項１
　「フラビン化合物を補酵素とする可溶性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含む組成物において、該酵素と該酵素の基質とならない糖類、またはアミノ酸類、より選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させる工程を含む、該化合物を共存させない場合と比べてＧＤＨの安定性を向上させる方法。」
(イ)　請求項３
　「添加する化合物がトレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル-α-D-グルコシド、シクロデキストリン、α-D-メリビオース、スクロース、セロビオース、グリシン、アラニン、セリン、ＢＳＡ、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウム、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、アラビノース、ソルビタン、2-デオキシ-D-グルコース、キシロース、フルクトース、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フェニルアラニン、プロリン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンからなる群より選ばれるいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項１〜２に記載の熱安定性を向上させる方法。」
(ウ)　請求項５
　「請求項１〜４のいずれかに記載の方法により熱安定性が向上した、可溶性ＧＤＨを含む組成物。」
(エ)　請求項８
　「請求項５〜７の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。」
(オ)　請求項９
　「請求項５〜７の組成物を含むグルコースセンサ。」
イ　発明の詳細な説明
(ア)　「・・・特許文献１に記載のＦＡＤＧＤＨの熱安定性は５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率であると書かれている。
　しかし、これは、あくまでも野生株から培養、精製して得られた酵素標品での結果であり、我々が検討したところ、該酵素の大腸菌組換え体においては、酵素表面に多糖が付加されておらず、著しく熱安定性が低下することがわかった。
　我々がアスペルギルス・オリゼ株から取得したＦＡＤＧＤＨと、アスペルギルス・オリゼのＦＡＤＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現して取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ＡＯＧＤＨ）の熱安定性を比較したところ、同じ、５０℃、１５分処理において、前者は約７７％の活性を維持していたが、後者のｒＦＡＤＧＤＨでは、約１３％の活性しか維持できていなかった。
　また、我々はアスペルギルス・テレウス株(NBRC 33026)から取得したＦＡＤＧＤＨと、アスペルギルス・テレウスのＦＡＤＧＤＨ遺伝子を大腸菌で発現して取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ＡＴＧＤＨ）の熱安定性を比較したところ、同じ、５０℃、１５分処理において、前者は約９０％の活性を維持していたが、後者のｒＦＡＤＧＤＨでは、約２％の活性しか維持できていなかった。
　血糖センサ用チップの作製工程においては、加熱乾燥処理を施す場合があり、組換え体を利用する場合には、大幅な熱失活をおこす危険性があり、熱安定性を向上させる必要があった。」（段落【０００６】〜【０００７】）
(イ)　「本発明によるＧＤＨ組成物の安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。また、保存安定性の優れたＧＤＨ組成物を用いた血糖値測定試薬の提供を可能にする。」（段落【００１１】）
(ウ)　「本発明の方法に適用することができる、補酵素としてＦＡＤをとるＧＤＨ（ＦＡＤ結合型ＧＤＨ）としては、特に限定されるものではないが、例えば、真核生物の範疇に属する糸状菌のペニシリウム(Penicillium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属などの微生物に由来するものが挙げられる。」（段落【００１４】）
(エ)　実施例
ａ　試験例１：ＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性の測定方法
　「本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ ＰＭＳ溶液 
６．８ｍＭ 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ D-グルコース溶液 
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、D-グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞ 
　反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤTEST）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤBLANK）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのD-グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
　｛−（ΔＯＤTEST−ΔＯＤBLANK）×3.0×希釈倍率｝／｛16.3×0.1×1.0｝
　なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。」（段落【００４７】〜【００４８】）
ｂ　実施例５：糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ組換え体標品の調製
　「アスペルギルス・オリゼＴＩ株（土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。）、および、アスペルギルス・テレウスNBRC33026株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３，４、および、配列番号７，８に示す４種類のオリゴＤＮＡを合成し、夫々のｍＲＮＡから調製した夫々のｃＤＮＡをテンプレートとしてKOD-Plus（東洋紡績製）を用いてアスペルギルス・オリゼ、および、アスペルギルス・テレウスのＧＤＨ（ＡＯＧＤＨ）遺伝子を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、pBluescript（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、２種類の組換えプラスミド（pAOGDH，pATGDH）を構築した。これらの組換えプラスミドを、コンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて夫々導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子、および、ＡＴＧＤＨの塩基配列の決定を行った（配列番号１、５）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、アスペルギルス・オリゼで５９３アミノ酸（配列番号２）、および、アスペルギルス・テレウスで５６８アミノ酸（配列番号６）であった。・・・
　これら形質転換体をＴＢ培地（２．４％酵母エキス、１．２％ポリペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、５０μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．０）にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて培養温度２５℃、通気量２Ｌ／分、攪拌回転速度１７０ｒｐｍで４８時間培養した。
　培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に６６０ｎｍでの菌体濁度が約５０となるように懸濁し、６５ＭＰａの圧力でホモジナイザー破砕を行った。破砕液を遠心分離して得た上清に終濃度９％となるようポリエチレンイミンを添加することで核酸等を沈殿させ、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Octyl−セファロースカラムおよびPhenyl−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去しＧＤＨ組換え体標品を調製した。」（段落【００４９】）
ｃ　実施例７：グルコース測定系を用いた各種安定化剤のＦＡＤＧＤＨ熱安定化効果の検討 
　「検討は、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
　まず、実施例５で所得したアスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＬＤ組換え体標品（ｒＡＯＦＡＤＧＤＨ）を約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液０．９ｍｌに、表１記載に各種安定化剤を夫々の終濃度となるように添加して、合計容量を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。また、コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
　２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
　これらの検討の結果、ＦＡＤＧＤＨの基質とならない糖類やある種のアミノ酸類を添加することにより、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性が増大することが明らかとなった（表１）。
　アミノ酸類よりも糖類の方が高い熱安定化効果が見られ、その中でも、トレハロース、マンノース、グルコン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル-α-D-グルコシド、α-D-メリビオースで高い効果が見られた。
【表１】
」（段落【００５１】〜【００５２】）
ｄ　実施例１３：グルコース測定系を用いた各種安定化剤のＦＡＤＧＤＨ熱安定化効果の検討 
　「検討は、先述の試験例１のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
　まず、実施例５で所得したアスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤＧＬＤ組換え体標品（ｒＡＴＦＡＤＧＤＨ）を約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液０．９ｍｌに、表１記載に各種安定化剤を夫々の終濃度となるように添加して、合計容量を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。また、コントロールには、各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
　２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。 
　これらの検討の結果、ＦＡＤＧＤＨの基質とならない糖類やある種のアミノ酸類を添加することにより、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性が増大することが明らかとなった（表９、表１０）。 
　アミノ酸類よりも糖類の方が高い熱安定化効果が見られ、その中でも、トレハロース、マンノース、メレジトース、グルコン酸ナトリウム、グルクロン酸ナトリウム、ガラクトース、メチル-α-D-グルコシド、α-D-メリビオース、スクロース、グリシン、アラニン、セリン、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、硫酸アンモニウム、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、アラビノース、ソルビタン、2-デオキシ-D-グルコース、キシロース、フルクトース、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸、フェニルアラニン、プロリン、リジン塩酸塩、サルコシン、タウリンで高い効果が見られた。
　・・・
【表１０】
」（段落【００６５】〜【００６７】）
４　引用発明、並びに本件訂正発明１と引用発明の対比
　前記３(１)より、甲１には、Mucor prainii NISL0103より得た配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＦＡＤ−ＧＤＨが記載されており、当該ＧＤＨは正確にグルコース量を測定できるものである。そうしてみると、甲１には、Mucor prainii NISL0103に由来する配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコース測定用組成物についての発明（以下、この発明を「甲１発明」という。）が記載されているものと認められる。また、同様に、甲２にも、Mucor prainii NISL0103に由来する配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコース測定用組成物についての発明（以下、この発明を「甲２発明」という。）が記載されているものと認められる。（以下、甲１発明及び甲２発明をまとめて引用発明という場合がある。）
　甲１発明における配列番号３で示されるアミノ酸配列及び甲２発明における配列番号３で示されるアミノ酸配列は、本件訂正発明１における配列番号１で示されるアミノ酸配列と一致する（注：このアミノ酸配列のことを「本件アミノ酸配列」という。）。そうしてみると、両者は、本件アミノ酸配列からなるか、又はケカビ属に由来するＦＡＤ−ＧＤＨを含む組成物である点において一致し、本件訂正発明１は、当該組成物に、安定化剤として、アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、およびキシリトールから選択される１種または２種以上の化合物（以下、これらの化合物のことを「本件安定化剤化合物」という。）を共存させる工程を含む、ＦＡＤ−ＧＤＨの安定性を向上させる方法であるのに対して、引用発明では、安定化剤として本件安定化剤化合物をＦＡＤ−ＧＤＨに共存させるものではない点において相違する。
５　判断
(１)　平成３０年３月１５日付け取消理由通知（決定の予告）に記載した取消理由について
　上記取消理由は、平成２９年１２月２２日付け訂正請求書に添付された訂正特許請求の範囲の請求項１ないし６に係る発明は、甲第１、３及び４号証に記載された発明に基き、容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないというものであり、具体的には、ＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコース測定用組成物についての発明である甲１発明に、甲３や甲４に示されたトレハロース、シクロデキストリン、スクロース、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム又はクエン酸水素二アンモニウム、硫酸アンモニウムより選ばれるいずれか１つ以上の化合物を添加することにより、当該ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性を向上させることを想到するのは、当業者であれば格別の創意を要するものとは認められないというものである。
　しかし、本件訂正により、ＦＡＤ−ＧＤＨを含む組成物に、トレハロース、シクロデキストリン、スクロース、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸、硫酸アンモニウムから選択される１種または２種以上の化合物を共存させる方法は削除された。したがって、本件訂正発明が特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないということはできない。
(２)　平成２９年１０月３１日付け取消理由通知に記載した取消理由について
ア　特許法第２９条第２項について
　上記取消理由は、訂正前の請求項１ないし６に係る発明は、甲第１〜４、６、７、１０及び１１号証に記載された発明に基き、容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないというものである。
　しかし、甲３及び４には、アルギニン、オルニチン、キシリトール、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸及びリンゴ酸がＦＡＤ−ＧＤＨの安定性を向上させることの具体例は示されていないところ、本件特許の明細書（以下、単に「本件明細書」という。）の表１ないし４には、これらの化合物がケカビ属由来の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨの安定性を向上させたことが示されている。また、リジン、グリシン、グルタミン酸及びグルコン酸について、甲３の表１にはアスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの安定性を向上させた結果が、甲３の表１０にはアスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤ−ＧＤＨの安定性を向上させた結果が記載されているものの、これらの結果は、本件明細書の表１ないし３に示されたケカビ属由来の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨの安定性を向上させた結果と比較して劣るものである。
　そうしてみると、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるか、又はケカビ属に由来するＦＡＤ−ＧＤＨを含む組成物に、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸及びキシリトールから選択される１種または２種以上の化合物を共存させることにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの安定性を向上させる本件訂正発明が特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないということはできない。
イ　特許法第３６条第４項第１号及び第６項第１号について
　上記取消理由は、訂正前の請求項１ないし６に係る特許は、その発明の詳細な説明の記載が特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであり、また、その特許請求の範囲の記載が同法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであるというものであって、具体的には、ケカビ属由来のＦＡＤ−ＧＤＨには、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨとは、分子表面の状態が類似しないものがある（甲１２）ところ、タンパク質の熱安定性には、溶媒と接するタンパク質分子の表面の状態が重要であるということが本件特許の出願時の技術常識であったというのであれば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤ−ＧＤＨと分子表面の状態が類似しないケカビ属由来のＦＡＤ−ＧＤＨについては、実施可能要件及びサポート要件を満たさないというものである。
　ここで、特許異議申立人自身は、特許権者が審査の過程で主張した、タンパク質の熱安定性には、タンパク質が変性する前のタンパク質分子の表面の状態が重要であるということが技術常識であることは認めておらず、タンパク質の安定化の程度は、タンパク質と接する溶媒の要因によって決まる旨を主張しているところ、甲６及び７を検討しても、これらの証拠のみでは、タンパク質の安定化では、タンパク質分子の表面の状態が重要であるのか、又は、溶媒によって決まるのかは不明である。このように、タンパク質の熱安定性には溶媒と接するタンパク質分子の表面の状態が重要であるということが技術常識として確立していたということはできないので、上記理由はその前提を欠くものであり、この理由によって本件特許を取り消すことはできない。
(３)　取消理由通知において採用しなかった特許異議申立理由について
　特許異議申立人は、甲５を副引用例とした場合又は甲６ないし９のいずれかを副引用例とした場合にも、本件訂正発明に係る特許を取り消すべきものである旨を主張する。
ア　甲５を副引用例とした場合について
　甲５には、安定化剤を用いて溶液中で酵素を安定化せしめる方法であって、酵素がグルコースデヒドロゲナーゼで安定化剤がグリシン又はアルギニンである場合について記載されている（請求項１、実施例５）が、甲５に記載された酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ、すなわち、フラビン結合グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）であるかは不明であるし、ケカビ属に由来するグルコースデヒドロゲナーゼであるかについても不明である。そうしてみると、引用発明に甲５の記載を組み合わせることにより、本件訂正発明が進歩性を欠くということはできない。
イ　甲６ないし９のいずれかを副引用例とした場合について
　甲６には、ショ糖の添加により蛋白質の変性や酵素の失活が防止できることが古くから知られていると記載されており（１１１５ページ右欄２〜４行）、また、甲８には、タンパク質水溶液の安定剤としてトレハロース又はショ糖などの水置換用の糖が記載されている（段落【０００５】）が、本件訂正により、ショ糖（スクロース）及びトレハロースは削除されている。
　甲７には、グルコン酸を含む一群のカルボン酸化合物と物理的・化学的特性の異なる５種のタンパク質（ＲＮａｓｅ　Ａ、シトクロムｃ、トリプシンインヒビター、ミオグロビン、リゾチウム）の実験結果を基に、「用いられるタンパク質にかかわらず、全体としての疎水性及び電荷のようなタンパク質のいくつかの物理化学的性質は、これらのカルボン酸塩の存在下で、全体的な熱安定性につながる代償的役割を果たすようである。」と記載されている（２３１ページ左欄４５〜４９行）。しかし、例えば、前記(２)アのとおり、ＦＡＤ−ＧＤＨの安定化にグルコン酸を使用した場合であっても、酵素の由来によっては安定化効果が異なることからも理解できるように、甲７に記載された一群のカルボン酸化合物であればいかなるタンパク質に対しても優れた安定化効果を示すということはできない。
　甲９の特許請求の範囲には、安定化すべきタンパク質を第１安定化剤及び第２安定化剤と組み合わせることにより、タンパク質の温度安定化溶液又はゲルを得る方法が記載されているが、本件訂正発明は、１種の安定化剤で安定化を達成する方法である。
　したがって、引用発明に甲６ないし９の記載を組み合わせることにより、本件訂正発明が進歩性を欠くということはできない。
第４　むすび
　以上のとおりであるから、取消理由通知に記載した取消理由及び特許異議申立書に記載した特許異議申立理由によっては、本件訂正発明に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件訂正発明に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成３０年８月１４日（２０１８．８．１４）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】
　配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるか、又はケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属に由来するフラビン結合グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）を含む組成物において、安定化剤として、アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、
および
　【請求項２】
　配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるか、又はケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属に由来するＦＡＤ−ＧＤＨおよび、アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、
および
　【請求項３】
　配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるか、又はケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属に由来するＦＡＤ−ＧＤＨと、アミノグアニジン、アルギニン、リジン、オルニチン、グリシン、グルタミン酸、シトラコン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、グルコン酸並びにこれらの塩化合物、
および
　【請求項４】
　請求項２記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
　【請求項５】
　請求項２記載の組成物を含むグルコースアッセイキット。
　【請求項６】
　請求項２記載の組成物を含むグルコースセンサー。