(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
羊膜から単離され、かつコーティングされていない組織培養プラスチック上での接着細胞培養により得られた羊膜由来接着細胞であって、前記得られた細胞はＲＴ−ＰＣＲによってＯＣＴ−４−（オクタマー結合タンパク質４）かつＨＬＡ−Ｇ−を呈するものであり、フローサイトメトリーによってＣＤ４９ｆ＋かつＣＤ９０＋を呈するものであり、さらに血管新生能力を有する、羊膜由来接着細胞。
【請求項２】
フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋（血管内皮増殖因子受容体１）およびＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋（血管内皮増殖因子受容体２）を呈する、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項３】
フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋（アンジオポエチン受容体）、ＴＥＭ−７＋（腫瘍内皮細胞マーカー７）、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−（アンジオテンシン−Ｉ変換酵素、ＡＣＥ）、ＣＤ１４６−（メラノーマ細胞接着分子）、またはＣＸＣＲ４−（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４）のうちの１つまたは複数を呈する、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項４】
フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋（アンジオポエチン受容体）、ＴＥＭ−７＋（腫瘍内皮細胞マーカー７）、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−、およびＣＸＣＲ４−を呈する、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項５】
フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＶＥ−カドヘリン−を呈する、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項６】
フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとして、さらに、ＣＤ２００＋を呈する、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項７】
７日間の５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとして、ＣＤ３４を発現しない、請求項１に記載の単離された細胞。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞を含む、単離された細胞集団。
【請求項９】
集団における細胞の少なくとも５０％が請求項１に記載の細胞である、請求項８に記載の単離された細胞集団。
【請求項１０】
集団における細胞の少なくとも９０％が請求項１に記載の細胞である、請求項８に記載の単離された細胞集団。
【請求項１１】
請求項１に記載の単離された羊膜由来接着細胞を含む組成物。
【請求項１２】
前記細胞集団は第２の型の細胞を含み、前記第２の型の細胞が、胚性幹細胞、血液細胞、末梢血から単離された幹細胞、胎盤血から単離された幹細胞、胎盤灌流液から単離された幹細胞、胎盤組織から単離された幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系間質細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、内皮細胞、血管芽細胞、内皮前駆細胞、周皮細胞、心筋細胞、筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、胚性幹細胞、または胚性幹細胞に似ているように操作された細胞である、請求項８に記載の単離された細胞集団。
【請求項１３】
前記第２の型の細胞が前記集団において少なくとも１０％の細胞を構成する、請求項１２に記載の単離された細胞集団。
【請求項１４】
前記第２の型の細胞が前記集団において少なくとも２５％の細胞を構成する、請求項１２に記載の単離された細胞集団。
【請求項１５】
前記第２の型の細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項１２に記載の単離された細胞集団。
【請求項１６】
前記造血幹細胞または造血前駆細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１５に記載の単離された細胞集団。
【請求項１７】
羊膜から単離され、かつコーティングされていない組織培養プラスチック上での接着細胞培養により得られた羊膜由来接着細胞であって、前記得られた細胞は血管新生能力を有し、ＲＴ−ＰＣＲによってＯＣＴ−４−を呈し、フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＣＤ４９ｆ＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−を呈し、かつ
（ａ）フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９８、ＣＤ２００、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−７、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１、もしくはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ（ＣＤ３０９）のうちの１つもしくは複数を発現し、
（ｂ）フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ−Ｇ、もしくはＶＥ−カドヘリンの発現を欠くか、もしくはＲＴ−ＰＣＲで測定するとＳＯＸ２の発現を欠くか、
（ｃ）ＡＣＴＡ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＢＡＩ１、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＨＧＡ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＳＦ３、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＤＩＬ３、ＥＮＰＰ２、ＥＰＨＢ２、ＦＢＬＮ５、Ｆ２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＩＧＦ、ＦＬＴ４、ＦＮ１、ＦＳＴ、ＦＯＸＣ２、ＧＲＮ、ＨＧＦ、ＨＥＹ１、ＨＳＰＧ２、ＩＦＮＢ１、ＩＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＭＤＫ、ＭＭＰ２、ＭＹＯＺ２、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４、ＰＧＫ１、ＰＲＯＸ１、ＰＴＮ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＴＮＦ、ＴＮＮＩ１、ＴＮＦＳＦ１５、ＶＡＳＨ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、もしくはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲのｍＲＮＡを発現するか、
（ｄ）タンパク質ＣＤ４９ｄ、コネキシン−４３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ベータ２−ミクログロブリン、ＣＤ３４９、ＣＤ３１８、ＰＤＬ１、ＣＤ１０６、ガレクチン−１、ＡＤＡＭ１７、アンジオテンシノーゲン前駆体、フィラミンＡ、アルファ−アクチニン１、メガリン、マクロファージアセチル化ＬＤＬ受容体ＩおよびＩＩ、アクチビン受容体ＩＩＢ型前駆体、Ｗｎｔ−９タンパク質、グリア線維酸性タンパク質、アストロサイト、ミオシン結合タンパク質Ｃ、もしくはミオシン重鎖非筋細胞Ａ型のうちの１つもしくは複数を発現するか、
（ｅ）ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲ、もしくはガレクチン−１を、細胞が増殖する培地中へ分泌するか、
（ｆ）同等数の骨髄由来間葉系幹細胞より高いレベルでマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、もしくはｍｉＲ−２９６を発現するか、
（ｇ）同等数の骨髄由来間葉系幹細胞より低いレベルでマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、もしくはｍｉＲ−１６を発現するか、
（ｈ）ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、もしくはｍｉＲ−１６を発現するか、または
（ｉ）２１％のＯ２下でのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、もしくはＶＥＧＦの発現と比較して、約５％未満のＯ２において培養された場合、増加したレベルのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、もしくはＶＥＧＦを発現する、
単離された羊膜由来接着細胞。
【請求項１８】
ＲＴ−ＰＣＲによってＯＣＴ−４−を呈し、フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＣＤ４９ｆ＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−を呈し、かつ
（ａ）フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９８、ＣＤ２００、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−７、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１、および／もしくはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ（ＣＤ３０９）を発現し、
（ｂ）フローサイトメトリーで測定可能なマーカーとしてＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ−Ｇ、および／もしくはＶＥ−カドヘリンの発現を欠くか、ならびに／またはＲＴ−ＰＣＲによってＳＯＸ２の発現を欠き、
（ｃ）ＡＣＴＡ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＢＡＩ１、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＨＧＡ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＳＦ３、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＤＩＬ３、ＥＮＰＰ２、ＥＰＨＢ２、ＦＢＬＮ５、Ｆ２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＩＧＦ、ＦＬＴ４、ＦＮ１、ＦＳＴ、ＦＯＸＣ２、ＧＲＮ、ＨＧＦ、ＨＥＹ１、ＨＳＰＧ２、ＩＦＮＢ１、ＩＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＭＤＫ、ＭＭＰ２、ＭＹＯＺ２、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４、ＰＧＫ１、ＰＲＯＸ１、ＰＴＮ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＴＮＦ、ＴＮＮＩ１、ＴＮＦＳＦ１５、ＶＡＳＨ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、もしくはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲのｍＲＮＡを発現し、
（ｄ）ＣＤ４９ｄ、コネキシン−４３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ベータ２−ミクログロブリン、ＣＤ３４９、ＣＤ３１８、ＰＤＬ１、ＣＤ１０６、ガレクチン−１、ＡＤＡＭ１７、アンジオテンシノーゲン前駆体、フィラミンＡ、アルファ−アクチニン１、メガリン、マクロファージアセチル化ＬＤＬ受容体ＩおよびＩＩ、アクチビン受容体ＩＩＢ型前駆体、Ｗｎｔ−９タンパク質、グリア線維酸性タンパク質、アストロサイト、ミオシン結合タンパク質Ｃ、および／もしくはミオシン重鎖非筋細胞Ａ型のうちの１つもしくは複数を発現し、
（ｅ）ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲ、およびガレクチン−１の１つもしくは複数を、細胞が増殖する培地中へ分泌し、
（ｆ）同等数の骨髄由来間葉系幹細胞より高いレベルでマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、および／もしくはｍｉＲ−２９６を発現し、
（ｇ）同等数の骨髄由来間葉系幹細胞より低いレベルでマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、および／もしくはｍｉＲ−１６を発現し、
（ｈ）ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、および／もしくはｍｉＲ−１６を発現し、ならびに／または
（ｉ）２１％のＯ２下でのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、および／もしくはＶＥＧＦの発現と比較して、約５％未満のＯ２において培養された場合、増加したレベルのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、および／もしくはＶＥＧＦを発現する、
請求項１７に記載の単離された羊膜由来接着細胞。
【請求項１９】
請求項１７に記載の単離された細胞集団。
【請求項２０】
請求項１８に記載の単離された細胞集団。
【請求項２１】
請求項１または３のいずれかに記載の細胞を含む、恒久型または分解可能型の脱細胞化または合成のマトリックスまたはスキャフォールド。
【請求項２２】
羊膜、脱水細胞外マトリックス、胎盤コラーゲン、または胎盤細胞外膜である、請求項２１に記載のマトリックスまたはスキャフォールド。
【請求項２３】
請求項１に記載の細胞の集団、又は請求項８〜１０のいずれか１項に記載の単離された細胞集団を含む、循環系の疾患または障害を有する個体を治療するための医薬組成物。
【請求項２４】
治療上有効量の請求項１に記載の羊膜由来接着細胞、又は請求項８〜１０のいずれか１項に記載の単離された細胞集団を含む、ＣＮＳ中、またはＣＮＳ周囲の血流の途絶を有する個体を治療するための医薬組成物。
【請求項２５】
治療上有効量の請求項１に記載の羊膜由来接着細胞、又は請求項８〜１０のいずれか１項に記載の単離された細胞集団を含む、肢中、または肢の周囲の血流の途絶を有する個体を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／１１６，２４８号の恩典を主張し、その米国仮特許出願の開示は全体として参照により組み入れられている。
【０００２】
本明細書で「羊膜由来接着細胞」（ＡＭＤＡＣ）と呼ばれる、羊膜由来の新規な血管新生細胞、およびそのような細胞の集団が本明細書に提供される。羊膜由来接着細胞は、以前に記載された胎盤幹細胞とは異なり、組織培養プラスチック接着性胎盤幹細胞を含む。
【背景技術】
【０００３】
細胞組成物、例えば、幹細胞組成物は、いくつかの生理的欠乏、例えば、骨髄置換についての魅力的な治療となっている。さらなる細胞集団、例えば、血管新生の能力および／または性質を有する幹細胞または前駆細胞の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様において、組織培養プラスチックに接着性であり、かつ逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した場合、例えば、３０サイクルのＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合の胚性腫瘍由来幹細胞株（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９７３から入手できる、ＮＴＥＲＡ−２）などの適切な対照細胞株と比較して、ＯＣＴ−４−（ＰＯＵ５Ｆ１またはオクタマー結合タンパク質４としても知られたＯＣＴ−４について陰性）である、本明細書でＡＭＤＡＣとも呼ばれる、単離された羊膜由来接着細胞が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋（血管内皮増殖因子受容体１）および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋（キナーゼ挿入ドメイン受容体としても知られた血管内皮増殖因子受容体２）である。別の具体的な実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ４９ｆ＋（インテグリン−α６＋）である。具体的な実施形態において、前記細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４であり、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＨＬＡ−Ｇである。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、またはＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４−細胞は、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。別の具体的な実施形態において、細胞はＯＣＴ−４−であり、例えば、３０サイクルのＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２を発現しない。
【０００５】
別の実施形態において、前記ＯＣＴ−４−細胞は、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ２９＋、ＣＤ７３＋、ＡＢＣ−ｐ＋、およびＣＤ３８−のうちの１つまたは複数である。
【０００６】
別の具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４−細胞は、免疫局在性によって決定した場合、さらに、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋（アンジオポエチン受容体）、ＴＥＭ−７＋（腫瘍内皮細胞マーカー７）、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−（アンジオテンシン−Ｉ変換酵素、ＡＣＥ）、ＣＤ１４６−（メラノーマ細胞接着分子）、ＣＸＣＲ４−（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４）のうちの１つまたは複数である。より具体的な実施形態において、前記細胞は、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−、およびＣＸＣＲ４−である。別のより具体的な実施形態において、本明細書に提供された羊膜由来接着細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、および／またはＴｉｅ−２のうちの１つまたは複数、または全部である。具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞または羊膜由来接着細胞集団は、ＮＴＥＲＡ−２細胞、または同等数の細胞を有するＮＴＥＲＡ−２細胞集団の少なくとも２ｌｏｇ分少ないＯＣＴ−４についての、例えば＞２０サイクルにおける、ＰＣＲ増幅ｍＲＮＡを発現する。別の具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４−細胞は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥ−カドヘリン−（ＣＤ１４４−）である。別の具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４−細胞は、免疫局在性によって決定した場合、さらに、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋について陽性である。別の具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４細胞は、４〜２１日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）への曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。
【０００７】
別の態様において、組織培養プラスチックに接着性であり、かつＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−およびＳＯＸ−２−、フローサイトメトリーによって決定した場合、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である、単離された羊膜由来接着細胞が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、ＯＣＴ−４−、ＳＯＸ−２−細胞は、フローサイトメトリーによって決定した場合、さらに、ＨＬＡ−Ｇ−またはＣＤ２７１−である。より具体的な実施形態において、前記細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４およびＳＯＸ−２、フローサイトメトリーによって決定した場合、ＣＤ９０−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１１７、ＣＤ２７１、およびＨＬＡ−Ｇ−である。
【０００８】
別の態様において、組織培養プラスチックに接着性であり、かつＣＤ３０９（ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋としても知られている）について陽性である、単離された羊膜由来接着細胞が本明細書に提供される。
【０００９】
別の態様において、組織培養プラスチックに接着性であり、かつＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋，ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、またはＶＥ−カドヘリン−のうちの１つまたは複数である、単離された羊膜由来接着細胞が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、前記細胞は、例えば＞２０サイクルにおける、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ−，ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、およびＶＥ−カドヘリン−である。別の具体的な実施形態において、細胞は、４〜２１日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。
【００１０】
別の実施形態において、羊膜由来接着細胞は、ＯＣＴ−４−、ＣＤ４９ｆ＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、前記細胞は、免疫局在性またはフローサイトメトリーによって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−（メラノーマ細胞接着分子）、またはＣＸＣＲ４−のうちの１つまたは複数である。より具体的な実施形態において、前記細胞は、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−、およびＣＸＣＲ４−である。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、および／またはＴｉｅ−２−のうちの１つまたは複数である。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、免疫局在性によって決定した場合、さらに、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、およびＴｉｅ−２−である。
【００１１】
別の実施形態において、例えば、３０サイクルのＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＦＧＦ４、ＩＦＮＧ、ＣＸＣＬ１０、ＡＮＧＰＴ４、ＡＮＧＰＴＬ３、ＦＧＡ、ＬＥＰ、ＰＲＬ、ＰＲＯＫ１、ＴＮＭＤ、ＦＬＴ３、ＸＬＫＤ１、ＣＤＨ５、ＬＥＣＴ１、ＰＬＧ、ＴＥＲＴ、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＭＭＰ−１３、ＤＬＸ５、またはＢＧＬＡＰについてのｍＲＮＡを発現しない、単離された羊膜由来接着細胞が本明細書に提供される。別の実施形態において、フローサイトメトリーによって決定した場合、インバリアント鎖、ＨＬＡ−ＤＲ−ＤＰ−ＤＱ、ＣＤ６、ＣＤ２７１のうちの１つまたは複数を構成的に発現しない、単離された羊膜由来接着細胞が本明細書に提供される。
【００１２】
羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団が本明細書にさらに提供される。具体的な実施形態において、前記集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の細胞が羊膜由来接着細胞である。一実施形態において、前記細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、前記単離された細胞集団は羊膜ではない。別の実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−およびＨＬＡ−Ｇ−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋である羊膜由来接着細胞を含む、単離された細胞集団であって、前記単離された細胞集団が羊膜ではない、細胞集団が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、前記集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の細胞が前記羊膜由来接着細胞である。別の実施形態において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団であって、前記細胞が組織培養プラスチックに接着性であり、前記細胞がＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋およびＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、前記細胞が、免疫局在性によって決定した場合、さらに、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−、またはＣＸＣＲ４−のうちの１つまたは複数であるか、または、例えば＞２０サイクルの、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＨＬＡ−Ｇ−であり、前記単離された細胞集団が羊膜ではない、細胞集団が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、前記集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の細胞は前記羊膜由来接着細胞である。別の実施形態において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団であって、前記細胞が組織培養プラスチックに接着性であり、前記細胞がＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、前記細胞が４〜２１日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現せず、前記単離された細胞集団が羊膜ではない、細胞集団が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、前記集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の細胞は前記羊膜由来接着細胞である。別の実施形態において、羊膜由来接着細胞を含む上記の細胞集団のいずれも、例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基質上で、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、または塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの血管新生因子の存在下で培養された場合、新芽またはチューブ様構造を形成する。
【００１３】
別の実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４であり、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＣＤ９、ＣＤ５４、ＣＤ１０５、またはＣＤ２００について陽性である、単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、前記単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋、ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋である羊膜由来接着細胞である。より具体的な実施形態において、前記羊膜由来接着細胞は、４〜２１日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。具体的な実施形態において、前記羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着性である。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基質上で、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、または塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの血管新生因子の存在下で培養された場合、新芽またはチューブ様構造を形成する。
【００１４】
別の実施形態において、ＡＣＴＡ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＢＡＩ１、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＨＧＡ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＳＦ３、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＤＩＬ３、ＥＮＰＰ２、ＥＰＨＢ２、ＦＢＬＮ５、Ｆ２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＩＧＦ、ＦＬＴ４、ＦＮ１、ＦＳＴ、ＦＯＸＣ２、ＧＲＮ、ＨＧＦ、ＨＥＹ１、ＨＳＰＧ２、ＩＦＮＢ１、ＴＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＭＤＫ、ＭＭＰ２、ＭＹＯＺ２、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４、ＰＧＫ１、ＰＲＯＸ１、ＰＴＮ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＴＮＦ、ＴＮＮＩ１、ＴＮＦＳＦ１５、ＶＡＳＨ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲのうちの１つまたは複数、または全部についてのＲＮＡを発現する、前記単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である、細胞集団、例えば、ヒト細胞集団が本明細書に提供される。
【００１５】
別の実施形態において、ＣＤ４９ｄ、コネキシン−４３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ベータ２−ミクログロブリン、ＣＤ３４９、ＣＤ３１８、ＰＤＬ１、ＣＤ１０６、ガレクチン−１、ＡＤＡＭ１７前駆体（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン１７）（ＴＮＦ−アルファ変換酵素）（ＴＮＦ−アルファコンバターゼ）、アンジオテンシノーゲン前駆体、フィラミンＡ（アルファ−フィラミン）（フィラミン１）（内皮アクチン結合タンパク質）（ＡＢＰ−２８０）（非筋細胞フィラミン）、アルファ−アクチニン１（アルファ−アクチニン細胞骨格アイソフォーム）（非筋細胞アルファ−アクチニン１）（Ｆ−アクチン架橋結合タンパク質）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２前駆体（メガリン）（糖タンパク質３３０）（ｇｐ３３０）、マクロファージスカベンジャー受容体Ｉ型およびＩＩ型（マクロファージアセチル化ＬＤＬ受容体ＩおよびＩＩ）、アクチビン受容体ＩＩＢ型前駆体（ＡＣＴＲ−ＩＩＢ）、Ｗｎｔ−９タンパク質、グリア線維酸性タンパク質、アストロサイト（ＧＦＡＰ）、ミオシン結合タンパク質Ｃ心筋型（心筋ＭｙＢＰ−Ｃ）（Ｃ−タンパク質、心筋アイソフォーム）、またはミオシン重鎖非筋細胞Ａ型（細胞性ミオシン重鎖、Ａ型）（非筋細胞ミオシン重鎖−Ａ）（ＮＭＭＨＣ−Ａ）のうちの１つまたは複数、または全部を発現する、細胞集団、例えば、羊膜由来接着細胞集団、または前記単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団が、本明細書に提供される。
【００１６】
別の態様において、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲ、またはガレクチン−１のうちの１つまたは複数、または全部を、例えば、細胞（複数可）が増殖する培地中へ分泌する、細胞集団、例えば、羊膜由来接着細胞集団、または前記単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団が、本明細書に提供される。
【００１７】
別の実施形態において、骨髄由来間葉系幹細胞より高いレベルで血管新生マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する、細胞集団、例えば、羊膜由来接着細胞集団、または前記単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団であって、前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、および／またはｍｉＲ−２９６のうちの１つまたは複数、または全部を含む、細胞集団が本明細書に提供される。別の実施形態において、骨髄由来間葉系幹細胞より低いレベルで血管新生マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の１つまたは複数、または全部を発現する、細胞集団、例えば、羊膜由来接着細胞集団、または前記単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団であって、前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、および／またはｍｉＲ−１６のうちの１つまたは複数、または全部を含む、細胞集団が本明細書に提供される。特定の実施形態において、ＡＭＤＡＣ、またはＡＭＤＡＣの集団は、血管新生ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、および／またはｍｉＲ−１６のうちの１つまたは複数、または全部を発現する。
【００１８】
別の具体的な実施形態において、正常酸素圧条件（例えば、約２０％または約２１％のＯ２）と比較して、低酸素条件（例えば、５％未満のＯ２）下で増加したレベルのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、および／またはＶＥＧＦを発現する、羊膜由来血管新生細胞または羊膜由来血管新生細胞集団が本明細書に提供される。
【００１９】
別の具体的な実施形態において、単離された羊膜由来接着細胞集団は、さらに、第２の型の細胞を含む。具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、前記集団において細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９８％を構成する。具体的な実施形態において、第２の型細胞は、胎盤血、臍帯血、粗骨髄、または他の組織内に含まれ、またはそれらから単離される。より具体的な実施形態において、前記第２の型細胞は、胚性幹細胞、血液細胞、末梢血から単離された幹細胞、胎盤血から単離された幹細胞、胎盤灌流液から単離された幹細胞、胎盤組織から単離された幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、周皮細胞、筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、血管芽細胞、または心筋芽細胞である。別の具体的な実施形態において、前記第２の型細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞である。別のより具体的な実施形態において、前記第２の型細胞は、前記集団において細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９８％を構成する。
【００２０】
別の具体的な実施形態において、上記細胞のいずれも、培養で増殖され、またはすでに増殖されている。別の具体的な実施形態において、上記細胞のいずれも、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、または２０回、またはそれ以上、継代されている前記細胞の培養物由来である。別の具体的な実施形態において、上記細胞のいずれも、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回、４１回、４２回、４３回、４４回、４５回、４６回、４７回、４８回、４９回、または少なくとも５０回、またはそれ以上、培養で倍加している培養物由来である。
【００２１】
別の態様において、組成物、例えば、羊膜由来接着細胞、または本明細書で提供する羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団のいずれかを含む医薬組成物を本明細書で提供する。具体的な実施形態において、組成物は、マトリックスもしくはスキャフォールド、例えば、天然組織マトリックスもしくはスキャフォールド、例えば、恒久型または分解可能型の脱細胞化組織マトリックスもしくはスキャフォールド、あるいは合成マトリックスもしくはスキャフォールドである。より具体的な実施形態において、前記マトリックスまたはスキャフォールドは、管の形または他の３次元の類器官の形に形成されている。他のより具体的な実施形態において、前記マトリックスは、脱細胞化マトリックスである。他の具体的な実施形態において、組成物は、生理学的に許容される溶液、例えば、生理食塩溶液、培地または同様な溶液中の本明細書で提供する１つもしくは複数の単離された羊膜由来接着細胞、または羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団を含む。
【００２２】
別の態様において、循環系の疾患または障害を有する個体を治療する方法であって、本明細書で述べる１つまたは複数の羊膜由来接着細胞を前記個体に、前記疾患または障害の１つまたは複数の症状の検出可能な改善に十分な量および時間で投与することを含む、上記方法を本明細書で提供する。他の実施形態において、循環系の疾患または障害を有する個体を治療する方法であって、羊膜由来接着細胞を前記個体に、心臓機能の１つまたは複数の徴候の検出可能な改善に十分な量および時間で投与することを含み、心臓機能の前記徴候が胸部心拍出量（ＣＯ）、心係数（ＣＩ）、肺動脈楔入圧（ＰＡＷＰ）、心係数（ＣＩ）、短縮率（％ＦＳ）、駆出分画（ＥＦ）、左室駆出分画（ＬＶＥＦ）、左室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）、収縮力（ｄＰ／ｄｔ）、羊膜由来接着細胞の投与前の個体と比較して心房もしくは心室機能の減少、パンピング効率の増加、パンピング効率の損失率の低下、血行動態機能の損失の減少、または心筋症に伴う合併症の減少である、上記方法を本明細書で提供する。
【００２３】
具体的な実施形態において、前記疾患または障害は、心筋梗塞である。他の具体的な実施形態において、前記疾患または障害は、心筋症である。他の具体的な実施形態において、前記疾患または障害は、動脈瘤、狭心症、大動脈狭窄、大動脈炎、不整脈、動脈硬化症、動脈炎、非対称性心室中隔肥大（ＡＳＨ）、アテローム動脈硬化症、心房細動および粗動、細菌性心内膜炎、バーロー症候群（僧帽弁逸脱症）、徐脈、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、心拡大、心臓炎、頸動脈疾患、大動脈縮窄、先天性心臓欠陥、先天性心不全、冠動脈疾患、アイゼンメンガー症候群、塞栓症、心内膜炎、先端紅痛症、細動、線維筋性形成異常、心ブロック、心雑音、高血圧、低血圧、特発性乳児動脈石灰化、川崎病（皮膚粘膜リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節疾患、乳児多発性動脈炎）、代謝症候群、微小血管狭心症、心筋炎、発作性心房頻拍（ＰＡＴ）、結節性動脈周囲炎（多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎）、心膜炎、末梢血管疾患、重症肢虚血、静脈炎、肺動脈弁狭窄（肺動脈狭窄）、レイノー病、腎動脈狭窄、腎血管性高血圧、リウマチ性心疾患、糖尿病性血管症、中隔欠損、無症候性虚血、症候群Ｘ、頻脈、高安動脈炎、ファローの四徴、大血管転位症、三尖弁閉鎖症、総動脈幹症、心臓弁膜症、静脈瘤性潰瘍、拡張蛇行静脈、血管炎、心室中隔欠損、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、心内膜床欠損、急性リウマチ熱、急性リウマチ性心膜炎、急性リウマチ性心内膜炎、急性リウマチ性心筋炎、急性リウマチ性心疾患、僧帽弁の疾患、僧帽弁狭窄、リウマチ性僧帽弁閉鎖不全症、大動脈弁の疾患、他の心内膜構造の疾患、虚血性心不全（急性および亜急性）、狭心症、急性肺性心疾患、肺塞栓症、慢性肺性心疾患、脊柱後側弯性心疾患、心筋炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、心内膜弾性線維症、房室ブロック、心律動障害、心筋変性、脳血管疾患、動脈、細動脈および毛細血管の疾患、または静脈およびリンパ管の疾患である。
【００２４】
他の具体的な実施形態において、前記疾患または障害は、前大脳動脈の閉塞および狭窄、または大脳動脈の閉塞である。一態様において、個体の脳におけるまたは周囲の血流の途絶を有する、例えば、個体の脳または中枢神経系（ＣＮＳ）におけるまたは周囲の血流の途絶に起因する症状または神経学的欠損を有する個体を治療する方法であって、治療上有効量の単離ＡＭＤＡＣを前記個体に投与することを含む、上記方法を本明細書で提供する。特定の実施形態において、血流の途絶は個体の脳またはＣＮＳの無酸素性損傷または低酸素性損傷をもたらす。
【００２５】
他の具体的な実施形態において、前記疾患または障害は、末梢動脈の閉塞および狭窄である。一態様において、肢におけるまたは周囲の血流の途絶を有する、例えば、個体の末梢血管系におけるまたは周囲の血流の途絶に起因する症状または血管の欠損を有する個体を治療する方法であって、治療上有効量の単離ＡＭＤＡＣを前記個体に投与することを含む、上記方法を本明細書で提供する。特定の実施形態において、血流の途絶は、個体の肢および／または四肢の無酸素性損傷または低酸素性損傷をもたらす。
【００２６】
別の態様において、創傷または外傷に罹患している個体を治療する方法であって、前記創傷または外傷の検出できる改善に十分な量で、かつ時間にわたり本明細書で述べる１つまたは複数の羊膜由来接着細胞を前記個体に投与することを含む、上記方法を本明細書で提供する。
【００２７】
治療の方法の別の具体的な実施形態において、前記細胞を注射により前記個体に投与する。より具体的な実施形態において、前記注射は、個体の心臓の虚血性部位への注射である。治療の方法の他の具体的な実施形態において、前記細胞を静脈内注入により前記個体に投与する。治療の方法の他の具体的な実施形態において、上述の羊膜由来接着細胞を含むマトリックスまたはスキャフォールドの個体への埋め込みにより、前記細胞、または前記細胞の集団、または前記細胞を含む細胞の集団を前記個体に投与する。
【００２８】
本明細書で提供する単離された羊膜由来接着細胞および細胞集団は、例えば、米国特許第７，２５５，８７９号または米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号に記載されている単離胎盤幹細胞または細胞集団ではない。本明細書で提供する単離された羊膜由来接着細胞は、内皮前駆細胞、羊膜上皮細胞、栄養膜、栄養膜細胞層、胚生殖細胞、胚幹細胞、胚の内細胞塊から得られる細胞または胚の生殖隆起から得られる細胞でもない。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、用語「約」は、例えば、表示された数字または値の１０％内を意味する。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、本明細書に記載された羊膜由来接着細胞に関しての用語「血管新生の」は、細胞が血管もしくは血管様新芽を形成し得ること、または細胞が別の細胞集団、例えば、内皮細胞において血管新生（例えば、血管または血管様構造の形成）を促進し得ることを意味する。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、用語「血管新生」は、限定されるわけではないが、内皮細胞活性化、遊走、増殖、マトリックスリモデリング、および細胞安定化を含む血管形成の過程を指す。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、用語「幹細胞」は、胎生発育中または出生後組織置換および修復中のいずれかで、必ずしも無限にというわけではないが、広範に増殖し、多数の組織の形成に寄与することができる任意の所定の細胞集団の機能的性質と定義する。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、用語「前駆細胞」は、胎生発育中または出生後組織置換および修復中のいずれかで、必ずしも無限にというわけではないが、広範に増殖し、幹細胞と比較して、限定されたセットの複数の組織の形成に寄与することができる任意の所定の細胞集団の機能的性質と定義する。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、用語「由来した」は、単離された、または別なふうに精製されたことを意味する。例えば、羊膜由来接着細胞は、羊膜から単離される。用語「由来した」は、組織、例えば、羊膜から直接単離された細胞から、および一次単離物から培養または拡大された細胞から培養される細胞を包含する。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「免疫局在性」は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞ソーティング、磁気細胞ソーティング、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学などにおいて、免疫タンパク質、例えば、抗体またはその断片を用いる、化合物、例えば、細胞マーカーの検出を意味する。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、用語「単離された細胞」は、その細胞が由来する組織、例えば、羊膜または胎盤の他の細胞から実質的に分離されている細胞を意味する。例えば、細胞の収集中および／または培養中、幹細胞が天然で付随している細胞の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％が細胞から除去されている場合には、細胞は「単離されている」。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、用語「単離された細胞集団」は、その細胞集団が由来する組織、例えば、羊膜または胎盤の他の細胞から実質的に分離されている細胞集団を意味する。例えば、羊膜由来接着細胞の収集中および／または培養中、細胞集団、または細胞集団が由来する細胞が天然で付随している細胞の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％が細胞から除去されている場合には、細胞は「単離されている」。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、細胞は、特定のマーカーについて、例えば、免疫局在性によって、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＲＴ−ＰＣＲによって、そのマーカーがバックグラウンドより高く検出できる場合、「陽性」である。例えば、細胞は、例えば、ＣＤ１０５について、ＣＤ１０５がバックグラウンドより（例えば、アイソタイプ対照と比較して）検出可能的に多い量で細胞上で検出可能である場合には、陽性として記載される。例えば、抗体媒介性検出の関連において、特定の細胞表面マーカーが存在する指標として「陽性」とは、そのマーカーが抗体、例えば、そのマーカーに特異的な蛍光標識抗体を用いて検出可能であることを意味し、「陽性」はまた、細胞がそのマーカーを、例えば、血球計算器において、バックグラウンドより検出可能的に高いシグナルを生じる量で有することを意味する。例えば、細胞がＣＤ１０５に特異的な抗体で検出可能に標識され、かつその抗体からのシグナルが対照（例えば、バックグラウンド）より検出可能的に高い場合、細胞は「ＣＤ１０５＋」である。反対に、同じ関連における「陰性」とは、細胞表面マーカーが、バックグラウンドと比較してそのマーカーに特異的な抗体を用いて検出できないことを意味する。例えば、細胞が、ＣＤ３４に特異的な抗体で検出可能に標識されない場合、細胞は「ＣＤ３４−」である。本明細書で他に規定がない限り、表面抗原分類（「ＣＤ」）マーカーは抗体を用いて検出される。例えば、ＯＣＴ−４は、ＯＣＴ−４についてのｍＲＮＡが、例えば３０サイクルの、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、検出可能である場合には、存在すると決定することができ、細胞はＯＣＴ−４＋である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】羊膜由来接着細胞およびＮＴＥＲＡ−２細胞による幹細胞関連遺伝子の発現を示す図である。
【図２】羊膜由来接着細胞（ＡＭＤＡＣ）の細胞表面上のＴＥＭ−７の発現を示す図である。
【図３−１】（Ａ、Ｂ）羊膜由来接着細胞による選択された血管新生タンパク質の分泌を示す図である。
【図３−２】（Ｃ、Ｄ）羊膜由来接着細胞による選択された血管新生タンパク質の分泌を示す図である。
【図４】ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）チューブ形成への羊膜由来接着細胞馴化培地の血管新生効果を示す図である。
【図５】ヒト内皮細胞遊走への羊膜由来接着細胞馴化培地の血管新生効果を示す図である。
【図６】ヒト内皮細胞増殖への羊膜由来接着細胞馴化培地の効果を示す図である。
【図７】ＨＵＶＥＣおよび羊膜由来接着細胞によるアセチル化ＬＤＬの取込みを示す図である。
【図８】ＨＵＶＥＣおよび羊膜由来接着細胞のチューブ形成を示す図である。
【図９】低酸素条件下および正常酸素圧条件下での羊膜由来接着細胞によるＶＥＧＦおよびＩＬ−８の分泌を示す図である。
【図１０】正常酸素圧（約２１％Ｏ２）条件下および低酸素（約５％未満Ｏ２）条件下における細胞マーカーＴｉｅ２の発現を示す図である。Ｙ軸：フローサイトメトリーによるＴｉｅ２陽性の細胞のパーセンテージ。
【図１１】羊膜由来接着細胞の心筋細胞への分化能を示す図であって、ＡＭは羊膜由来接着細胞（ＡＭＤＡＣ）を指し、ＨＤは未処理の懸滴を指し、ＨＤ  ＩＮＤは誘導条件に曝露された懸滴を指し、ＨＤ  ＩＮＤ＋５−ＡＺＡは５−アザシチジンの存在下または非存在下における誘導を指す。ＣＴＲＬは未処理の懸滴対照を指す。
【図１２】ニワトリ漿尿膜血管新生モデルにおける血管新生へのＡＭＤＡＣのプラス効果を示す図である。ロット１、ロット２、ロット３：３つの別個の細胞調製物由来のＡＭＤＡＣ。ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子（陽性対照）。ＭＤＡＭＢ２３１：血管新生乳癌細胞株（陽性対照）。Ｙ軸：血管形成の程度。
【図１３】ニワトリ漿尿膜血管新生モデルにおける血管新生へのＡＭＤＡＣ馴化培地のプラス効果を示す図である。ロット１、ロット２、ロット３：３つの別個の細胞調製物由来のＡＭＤＡＣ。ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子（陽性対照）。ＭＤＡＭＢ２３１：血管新生乳癌細胞株（陽性対照）。Ｙ軸：血管形成の程度。
【図１４】アストロサイトの培養物、アストロサイトと骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）の共培養物、またはアストロサイトとＡＭＤＡＣの共培養物に存在する過酸化水素発生反応性酸素種を示す図である。１４Ａ：ＡＭＤＡＣ、ロット１；１４Ｂ：ＡＭＤＡＣ、ロット２。ＨＡ（ヒトアストロサイト）単独、アストロサイト＋Ｈ２Ｏ２、およびアストロサイト＋ＢＭ−ＭＳＣ＋Ｈ２Ｏ２の条件は、図１４Ａおよび図１４Ｂについて同じである。ＲＦＵ  ＲＯＳ活性：反応性酸素種についての相対的蛍光単位。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
５．詳細な説明
５．１  羊膜由来接着細胞の特徴
本明細書で「羊膜由来接着細胞」またはＡＭＤＡＣと呼ばれる、羊膜から単離可能な独特な接着性血管新生細胞、およびそのような細胞の集団が本明細書に提供される。羊膜由来接着細胞は、一見、外見は、間葉系細胞に似て、全般的に線維芽細胞様形を有する。細胞は、細胞培養表面、例えば、組織培養プラスチックに付着する。
【００４１】
ＡＭＤＡＣは、他の羊膜由来または胎盤由来の細胞からそれらを区別する細胞マーカーを表示する。例えば、一実施形態において、羊膜由来接着細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−（オクタマー結合タンパク質４）である。別の具体的な実施形態において、ＯＣＴ−４−羊膜由来接着細胞は、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ４９ｆ＋である。別の具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４−細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＨＬＡ−Ｇ−である。別の具体的な実施形態において、ＯＣＴ−４−は、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋（血管内皮増殖因子受容体１）および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋（血管内皮増殖因子受容体２）である。具体的な実施形態において、ＯＣＴ−４−羊膜由来接着細胞またはＯＣＴ−４−羊膜由来接着細胞集団は、ＮＴＥＲＡ−２細胞または同等数の細胞およびＲＮＡ増幅サイクルを有するＮＴＥＲＡ−２細胞集団より、例えば２０サイクルにおけるＯＣＴ−４について少なくとも２ｌｏｇ分少ないＰＣＲ増幅ｍＲＮＡを発現する。別の具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４−細胞は、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、またはＣＤ１１７である。より具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４細胞は、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、細胞は、ＯＣＴ−４−またはＨＬＡ−Ｇ−であり、追加として、ＣＤ４９ｆ−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、細胞は、ＯＣＴ４−、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。別の具体的な実施形態において、ＯＣＴ−４−細胞は、例えば、３０サイクルのＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２を発現しない。したがって、具体的な実施形態において、細胞は、免疫局在性またはフローサイトメトリーによって決定した場合、ＯＣＴ−４−、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−であり、例えば３０サイクルの、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２−である。
【００４２】
別の実施形態において、前記ＯＣＴ−４−細胞は、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ２９＋、ＣＤ７３＋、ＡＢＣ−ｐ＋、およびＣＤ３８−のうちの１つまたは複数である。
【００４３】
別の具体的な実施形態において、例えば、ＯＣＴ−４−  ＡＭＤＡＣは、追加として、
免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、ＴＥＭ−７＋（腫瘍内皮細胞マーカー７）、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−（アンジオテンシン−Ｉ変換酵素、ＡＣＥ）、ＣＤ１４６−（メラノーマ細胞接着分子）、もしくはＣＸＣＲ４−（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４）のうちの１つまたは複数、またはＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＨＬＡ−Ｇであり得る。より具体的な実施形態において、前記細胞は、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−、およびＣＸＣＲ４−であり、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＨＬＡ−Ｇ−である。一実施形態において、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、および／またはＣＤ１３３−のうちの１つまたは複数である。具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、および／またはＣＤ１３３−のうちの１つまたは複数、または全部である。
【００４４】
別の具体的な実施形態において、前記細胞は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥ−カドヘリン−である。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋について陽性である。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、４〜２１日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。より具体的な実施形態において、前記細胞は、４〜２１日間の２５〜７５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、または４〜２１日間の５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。よりいっそう具体的な実施形態において、前記細胞は、４〜２１日間の１ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。さらにより具体的な実施形態において、前記細胞は、７〜１４日間、例えば、７日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。
【００４５】
具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋，ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、および／またはＣＤ２００＋のうちの１つまたは複数である。具体的な実施形態において、羊膜由来細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥ−カドヘリン−、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋，ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、例えば、４〜２１日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。
【００４６】
別の実施形態において、羊膜由来接着細胞は、ＯＣＴ−４−、ＣＤ４９ｆ＋、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７である。より具体的な実施形態において、前記細胞は、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−、またはＣＸＣＲ４−のうちの１つまたは複数である。より具体的な実施形態において、前記細胞は、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４３、ＣＤ１４６、およびＣＸＣＲ４である。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、および／またはＴｉｅ−２−のうちの１つまたは複数である。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、およびＴｉｅ−２−である。
【００４７】
別の実施形態において、ＯＣＴ−４−羊膜由来接着細胞は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ｆ−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ９８−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋、および／もしくはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋（ＣＤ３０９＋）のうちの１つもしくは複数、もしくは全部、または免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４４−、ＣＤ１４６−、ＣＤ２７１−、ＣＸＣＲ４−、ＨＬＡ−Ｇ−、および／もしくはＶＥ−カドヘリン−の１つもしくは複数、もしくは全部、またはＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２−である。
【００４８】
特定の実施形態において、単離された組織培養プラスチック接着性羊膜由来接着細胞はＣＤ４９ｆ＋である。具体的な実施形態において、前記ＣＤ４９ｆ＋は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ９８＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋、および／もしくはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋（ＣＤ３０９＋）のうちの１つもしくは複数、もしくは全部、または追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４４−、ＣＤ１４６−、ＣＤ２７１−、ＣＸＣＲ４−、ＨＬＡ−Ｇ−、ＯＣＴ−４−、および／もしくはＶＥ−カドヘリン−の１つもしくは複数、もしくは全部、またはＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２−である。
【００４９】
特定の他の実施形態において、単離された組織培養プラスチック接着性羊膜由来接着細胞は、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ９０＋、およびＣＤ１１７−である。具体的な実施形態において、前記ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ９０＋、およびＣＤ１１７−細胞は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋、および／もしくはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋（ＣＤ３０９＋）のうちの１つもしくは複数、もしくは全部、または追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４４−、ＣＤ１４６−、ＣＤ２７１−、ＣＸＣＲ４−、ＯＣＴ−４−、および／もしくはＶＥ−カドヘリン−の１つもしくは複数、もしくは全部、またはＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２−である。
【００５０】
別の実施形態において、単離された羊膜由来接着細胞または羊膜由来血管新生細胞集団は、標準培養条件下で、例えば３０サイクルの、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、インターフェロンγ（ＩＦＮＧ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、アンジオポエチン４（ＡＮＧＰＴ４）、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、フィブリノーゲンα鎖（ＦＧＡ）、レプチン（ＬＥＰ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、プロキネチシン１（ＰＲＯＫ１）、テノモジュリン（ＴＮＭＤ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、細胞外リンクドメイン含有タンパク質１（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｉｎｋ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １）（ＸＬＫＤ１）、２型カドヘリン５（ＣＤＨ５）、白血球細胞由来ケモタキシン１（ＬＥＣＴ１）、プラスミノーゲン（ＰＬＧ）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、（性決定領域Ｙ）−ボックス２（ＳＯＸ２）、ＮＡＮＯＧ、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（ＭＭＰ−１３）、遠位欠失ホメオボックス５（ＤＬＸ５）、および／または骨ガンマ−カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）タンパク質（ＢＧＬＡＰ）についてのｍＲＮＡを構成的に発現しない。他の実施形態において、単離された羊膜由来接着細胞または羊膜由来血管新生細胞集団は、（ＡＲＮＴ２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ＮＴ−５、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）、低酸素誘導タンパク質２（ＨＩＧ２）、ヘムオキシゲナーゼ（デサイクリング）１（ＨＭＯ×１）、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤ３）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、トランスフォーミング増殖因子β１受容体（ＴＧＦＢ１Ｒ）、および肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ／ｃ−ｍｅｔ）についてのｍＲＮＡを発現する。
【００５１】
別の態様において、本明細書に記載された羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団が本明細書に提供される。細胞集団は、均一な集団、例えば、少なくとも約９０％、９５％、９８％、または９９％が羊膜由来接着細胞である細胞集団であり得る。細胞集団は、不均一であり得、例えば、多くとも集団における細胞の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％が羊膜由来接着細胞である細胞集団である。しかしながら、単離された細胞集団は、組織、すなわち、羊膜ではない。
【００５２】
一実施形態において、ＡＭＤＡＣを含む単離された細胞集団、例えば、ＡＭＤＡＣについて実質的に均一な細胞集団であって、前記ＡＭＤＡＣが組織培養プラスチックに接着性であり、かつ前記ＡＭＤＡＣがＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ―４−である、細胞集団が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、例えば、免疫局在性またはＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＣＤ４９ｆ＋またはＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態において、前記ＡＭＤＡＣの集団は、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、前記単離された細胞集団は羊膜ではない。より具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−および／またはＨＬＡ−Ｇ−、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋である。具体的な実施形態において、前記集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、前記羊膜由来接着細胞である。別の具体的な実施形態において、前記ＡＭＤＡＣは、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、またはＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、前記ＡＭＤＡＣは、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、ＯＣＴ−４−、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。別の具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、例えば、３０サイクルのＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２を発現しない。よりいっそう具体的な実施形態において、集団は、ＡＭＤＡＣを含み、前記ＡＭＤＡＣが、免疫局在性またはフローサイトメトリーによって決定した場合、ＯＣＴ−４−、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−、例えば、３０サイクルのＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２−である。
【００５３】
別の具体的な実施形態において、前記細胞集団における前記ＡＭＤＡＣは、免疫局在性またはフローサイトメトリーによって決定した場合、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、またはＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、免疫局在性またはフローサイトメトリーによって決定した場合、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−またはＨＬＡ−Ｇ−であり、免疫局在性またはフローサイトメトリーによって決定した場合、さらに、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、前記細胞集団におけるＡＭＤＡＣは、ＯＣＴ−４−、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。別の具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、例えば、３０サイクルのＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２を発現しない。したがって、より具体的な実施形態において、細胞は、免疫局在性またはフローサイトメトリーによって決定した場合、ＯＣＴ−４−、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−、例えば３０サイクルの、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２−である。よりいっそう具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、ＯＣＴ−４−またはＨＬＡ−Ｇ−であり、さらに、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。より具体的な実施形態において、ＡＭＤＡＣは、ＯＣＴ−４−、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋，ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−である。
【００５４】
別の実施形態において、前記細胞集団における羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着性であり、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−、もしくはＣＸＣＲ４−のうちの１つもしくは複数、またはＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＨＬＡ−Ｇ−であり、前記単離された細胞集団は羊膜ではない。別の実施形態において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団であって、前記細胞が組織培養プラスチックに接着性であり、前記細胞が、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋であり、４〜２１日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現せず、前記単離された細胞集団が羊膜ではない、細胞集団が本明細書に提供される。上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、前記集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、前記羊膜由来接着細胞である。
【００５５】
別の実施形態において、上記の羊膜由来接着細胞含有細胞集団のいずれも、例えば、コラーゲンＩ型およびＩＶ型のような細胞外マトリックスタンパク質、または例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような血管新生因子の存在下で、例えば、胎盤コラーゲン、例えば、またはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基質中または基質上で、少なくとも４日間で、最長１４日間まで、培養された場合、新芽またはチューブ様構造を形成する。
【００５６】
羊膜由来接着細胞および羊膜由来接着細胞集団は、血管新生関連遺伝子または心筋形成関連遺伝子に関連したタンパク質の特徴的な発現を示す。特定の実施形態において、ＡＣＴＡ２（アクチン、アルファ２、平滑筋、大動脈）、ＡＤＡＭＴＳ１（トロンボスポンジン１型モチーフを有するＡＤＡＭメタロペプチダーゼ１）、ＡＭＯＴ（アンジオモチン）、ＡＮＧ（アンジオゲニン）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ１（アンジオポエチン様１）、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＢＡＩ１（脳特異的血管新生インヒビター１）、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＥＡＣＡＭ１（癌胎児抗原関連細胞接着分子１）、ＣＨＧＡ（クロモグラニンＡ）、ＣＯＬ１５Ａ１（コラーゲンＸＶ型、アルファ１）、ＣＯＬ１８Ａ１（コラーゲンＸＶＩＩＩ型、アルファ１）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲンＩＶ型、アルファ１）、ＣＯＬ４Ａ２（コラーゲンＩＶ型、アルファ２）、ＣＯＬ４Ａ３（コラーゲンＩＶ型、アルファ３）、ＣＳＦ３（コロニー刺激因子３（顆粒球））、ＣＴＧＦ（結合組織増殖因子）、ＣＸＣＬ１２（ケモカイン（ＣＸＣモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１））、ＣＸＣＬ２、ＤＮＭＴ３Ｂ（ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ）、ＥＣＧＦ１（チミジンホスホリラーゼ）、ＥＤＧ１（内皮細胞分化遺伝子１）、ＥＤＩＬ３（ＥＧＦ様リピートおよびジスコイジンＩ様ドメイン３）、ＥＮＰＰ２（エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ２）、ＥＰＨＢ２（ＥＰＨ受容体Ｂ２）、ＦＢＬＮ５（ＦＩＢＵＬＩＮ５）、Ｆ２（凝固因子ＩＩ（トロンビン））、ＦＧＦ１（酸性線維芽細胞増殖因子）、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＦＩＧＦ（ｃ−ｆｏｓ誘導性増殖因子（血管内皮増殖因子Ｄ））、ＦＬＴ４（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ４）、ＦＮ１（フィブロネクチン１）、ＦＳＴ（フォリスタチン）、ＦＯＸＣ２（フォークヘッドボックスＣ２（ＭＦＨ−１、間葉フォークヘッド１））、ＧＲＮ（グラニュリン）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＨＥＹ１（ＹＲＰＷモチーフ１関連ｈａｉｒｙ／ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｏｆ−ｓｐｌｉｔ（ｈａｉｒｙ／ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｏｆ−ｓｐｌｉｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＹＲＰＷ  ｍｏｔｉｆ  １））、ＨＳＰＧ２（ヘパラン硫酸プロテオグリカン２）、ＩＦＮＢ１（インターフェロン、ベータ１、線維芽細胞）、ＩＬ８（インターロイキン８）、ＩＬ１２Ａ、ＩＴＧＡ４（インテグリン、アルファ４；ＣＤ４９ｄ）、ＩＴＧＡＶ（インテグリン、アルファＶ）、ＩＴＧＢ３（インテグリン、ベータ３）、ＭＤＫ（ミッドカイン）、ＭＭＰ２（マトリックスメタロプロテアーゼ２）、ＭＹＯＺ２（ミオゼニン２）、ＮＲＰ１（ニューロピリン１）、ＮＲＰ２、ＰＤＧＦＢ（血小板由来増殖因子β）、ＰＤＧＦＡ（血小板由来増殖因子α）、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭ１（血小板／内皮細胞接着分子）、ＰＦ４（血小板因子４）、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ１）、ＰＲＯ×１（プロスペロホメオボックス１）、ＰＴＮ（プレイオトロフィン）、ＳＥＭＡ３Ｆ（セマフォリン３Ｆ）、ＳＥＲＰＩＮＢ５（セルピンペプチダーゼインヒビター、クレイドＢ（オボアル��ミン）、メンバー５）、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＩＭＰ２（メタロプロテイナーゼの組織インヒビター２）、ＴＩＭＰ３、ＴＧＦＡ（トランスフォーミング増殖因子、アルファ）、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）、ＴＨＢＳ２、ＴＩＥ１（免疫グロブリン様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ１）、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ＴＮＮＩ１（トロポニンＩ、１型）、ＴＮＦＳＦ１５（腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１５）、ＶＡＳＨ１（バソヒビン１）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１（血管内皮増殖因子受容体１）、および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲのうちの１つまたは複数、または全部についてのＲＮＡを発現する細胞、またはそれらを発現する、単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団が、本明細書に提供される。
【００５７】
ヒト細胞が用いられる場合、遺伝子命名は、完全にヒト配列を参照し、当業者によく知られているように、代表的な配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋに見出すことができる。配列に対するプローブは、公表されている配列によって決定することができ、または商業的供給源を通して、例えば、特定のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブまたはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｒｒａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、パート番号４３７８７１０）であり得る。
【００５８】
羊膜由来接着細胞および羊膜由来接着細胞集団は、血管新生関連タンパク質の特徴的な発現を示す。特定の実施形態において、ＣＤ４９ｄ、コネキシン−４３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ベータ２−ミクログロブリン、ＣＤ３４９、ＣＤ３１８、ＰＤＬ１、ＣＤ１０６、ガレクチン−１、ＡＤＡＭ１７前駆体（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン１７）（ＴＮＦ−アルファ変換酵素）（ＴＮＦ−アルファコンバターゼ）、アンジオテンシノーゲン前駆体、フィラミンＡ（アルファ−フィラミン）（フィラミン１）（内皮アクチン結合タンパク質）（ＡＢＰ−２８０）（非筋細胞フィラミン）、アルファ−アクチニン１（アルファ−アクチニン細胞骨格アイソフォーム）（非筋細胞アルファ−アクチニン１）（Ｆ−アクチン架橋結合タンパク質）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２前駆体（メガリン）（糖タンパク質３３０）（ｇｐ３３０）、マクロファージスカベンジャー受容体Ｉ型およびＩＩ型（マクロファージアセチル化ＬＤＬ受容体ＩおよびＩＩ）、アクチビン受容体ＩＩＢ型前駆体（ＡＣＴＲ−ＩＩＢ）、Ｗｎｔ−９タンパク質、グリア線維酸性タンパク質、アストロサイト（ＧＦＡＰ）、ミオシン結合タンパク質Ｃ心筋型（心筋ＭｙＢＰ−Ｃ）（Ｃ−タンパク質、心筋アイソフォーム）、および／またはミオシン重鎖非筋細胞Ａ型（細胞性ミオシン重鎖、Ａ型）（非筋細胞ミオシン重鎖−Ａ）（ＮＭＭＨＣ−Ａ）を発現する細胞、またはそれらを発現する、単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団が、本明細書に提供される。
【００５９】
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞はさらに、例えば、内皮細胞、内皮前駆細胞などにおいて、血管新生を促進するタンパク質を分泌する。特定の実施形態において、羊膜由来接着細胞、羊膜由来接着細胞集団、または、例えば、前記単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団は、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲ、ガレクチン−１のうちの１つまたは複数、または全部を、例えば、細胞（複数可）が増殖する培地へ、分泌する。
【００６０】
別の実施形態において、上記の羊膜由来接着細胞含有細胞集団のいずれも、前記羊膜由来接着細胞と接触して内皮細胞集団において新芽またはチューブ様構造の形成を引き起こすことができる。具体的な実施形態において、羊膜由来血管新生細胞は、ヒト内皮細胞と共培養され、例えば、コラーゲンＩ型およびＩＶ型などの細胞外マトリックスタンパク質、ならびに／または、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような血管新生因子の存在下で、例えば、胎盤コラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基質中または基質上で、少なくとも４日間および／または最長１４日間まで、培養された場合、新芽またはチューブ様構造を形成し、または内皮細胞新芽を支援する。
【００６１】
別の実施形態において、上記の羊膜由来接着細胞含有細胞集団のいずれも、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、またはインターロイキン−８（ＩＬ−８）などの血管新生因子を分泌し、それにより、コラーゲンＩ型およびＩＶ型などの細胞外マトリックスタンパク質の存在下で、例えば、胎盤コラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基質中または基質上で培養された場合、ヒト内皮細胞が新芽またはチューブ様構造を形成するように誘導することができる。
【００６２】
別の実施形態において、骨髄由来間葉系幹細胞より高いレベルで血管新生マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する、細胞集団、例えば、羊膜由来接着細胞集団、または単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団であって、前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、および／またはｍｉＲ−２９６のうちの１つまたは複数、または全部を含む、細胞集団が本明細書に提供される。別の実施形態において、骨髄由来間葉系幹細胞より低いレベルで血管新生マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の１つまたは複数、または全部を発現する、細胞集団、例えば、羊膜由来接着細胞集団、または単離された細胞集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の細胞が羊膜由来接着細胞である細胞集団であって、前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、および／またはｍｉＲ−１６のうちの１つまたは複数、または全部を含む、細胞集団が本明細書に提供される。特定の実施形態において、ＡＭＤＡＣ、またはＡＭＤＡＣの集団は、血管新生ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、（血管新生ｍｉＲＮＡクラスター１７〜９２のメンバー）、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、および／またはｍｉＲ−１６のうちの１つまたは複数、または全部を発現する。
【００６３】
したがって、一実施形態において、組織培養プラスチックに接着性であり、かつＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ４９ｆ＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−であり、かつ（ａ）免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９８、ＣＤ２００、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−７、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１、もしくはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ（ＣＤ３０９）のうちの１つもしくは複数を発現し、（ｂ）免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ−Ｇ、もしくはＶＥ−カドヘリンの発現を欠き、もしくはＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２の発現を欠き、（ｃ）ＡＣＴＡ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＢＡＩ１、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＨＧＡ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＳＦ３、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＤＩＬ３、ＥＮＰＰ２、ＥＰＨＢ２、ＦＢＬＮ５、Ｆ２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＩＧＦ、ＦＬＴ４、ＦＮ１、ＦＳＴ、ＦＯＸＣ２、ＧＲＮ、ＨＧＦ、ＨＥＹ１、ＨＳＰＧ２、ＩＦＮＢ１、ＩＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＭＤＫ、ＭＭＰ２、ＭＹＯＺ２、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４、ＰＧＫ１、ＰＲＯＸ１、ＰＴＮ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＴＮＦ、ＴＮＮＩ１、ＴＮＦＳＦ１５、ＶＡＳＨ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲについてのｍＲＮＡを発現し、（ｄ）タンパク質ＣＤ４９ｄ、コネキシン−４３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ベータ２−ミクログロブリン、ＣＤ３４９、ＣＤ３１８、ＰＤＬ１、ＣＤ１０６、ガレクチン−１、ＡＤＡＭ１７、アンジオテンシノーゲン前駆体、フィラミンＡ、アルファ−アクチニン１、メガリン、マクロファージアセチル化ＬＤＬ受容体ＩおよびＩＩ、アクチビン受容体ＩＩＢ型前駆体、Ｗｎｔ−９タンパク質、グリア線維酸性タンパク質、アストロサイト、ミオシン結合タンパク質Ｃ、もしくはミオシン重鎖非筋細胞Ａ型のうちの１つもしくは複数を発現し、（ｅ）ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲ、もしくはガレクチン−１を、細胞が増殖する培地中へ分泌し、（ｆ）同等数の骨髄由来間葉系幹細胞より高いレベルでマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、もしくはｍｉＲ−２９６を発現し、（ｇ）同等数の骨髄由来間葉系幹細胞より低いレベルでマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、もしくはｍｉＲ−１６を発現し、（ｈ）ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、もしくはｍｉＲ−１６を発現し、および／または（ｉ）２１％のＯ２下でのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、もしくはＶＥＧＦの発現と比較して、約５％未満のＯ２において培養された場合、増加したレベルのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、もしくはＶＥＧＦを発現する、単離された羊膜由来接着細胞が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、単離された羊膜由来接着細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ４９ｆ＋、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−であり、かつ（ａ）免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ９８、ＣＤ２００、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−７、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１、および／もしくはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ（ＣＤ３０９）を発現し、（ｂ）免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ４、ＨＬＡ−Ｇ、および／もしくはＶＥ−カドヘリンの発現を欠き、もしくはＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＳＯＸ２の発現を欠き、（ｃ）ＡＣＴＡ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＭＯＴ、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＢＡＩ１、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＨＧＡ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＳＦ３、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＤＩＬ３、ＥＮＰＰ２、ＥＰＨＢ２、ＦＢＬＮ５、Ｆ２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＩＧＦ、ＦＬＴ４、ＦＮ１、ＦＳＴ、ＦＯＸＣ２、ＧＲＮ、ＨＧＦ、ＨＥＹ１、ＨＳＰＧ２、ＩＦＮＢ１、ＩＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＭＤＫ、ＭＭＰ２、ＭＹＯＺ２、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４、ＰＧＫ１、ＰＲＯＸ１、ＰＴＮ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＴＮＦ、ＴＮＮＩ１、ＴＮＦＳＦ１５、ＶＡＳＨ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＲＩ／ＦＬＴ１、および／またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲについてのｍＲＮＡを発現し、（ｄ）ＣＤ４９ｄ、コネキシン−４３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ベータ２−ミクログロブリン、ＣＤ３４９、ＣＤ３１８、ＰＤＬ１、ＣＤ１０６、ガレクチン−１、ＡＤＡＭ１７、アンジオテンシノーゲン前駆体、フィラミンＡ、アルファ−アクチニン１、メガリン、マクロファージアセチル化ＬＤＬ受容体ＩおよびＩＩ、アクチビン受容体ＩＩＢ型前駆体、Ｗｎｔ−９タンパク質、グリア線維酸性タンパク質、アストロサイト、ミオシン結合タンパク質Ｃ、および／もしくはミオシン重鎖非筋細胞Ａ型の１つもしくは複数を発現し、（ｅ）ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲ、および／もしくはガレクチン−１を、例えば、細胞が増殖する培地中へ分泌し、（ｆ）同等数の骨髄由来間葉系幹細胞より高いレベルでマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、および／もしくはｍｉＲ−２９６を発現し、（ｇ）同等数の骨髄由来間葉系幹細胞より低いレベルでマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、および／もしくはｍｉＲ−１６を発現し、（ｈ）ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、および／もしくはｍｉＲ−１６を発現し、ならびに／または（ｉ）２１％のＯ２下でのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、および／もしくはＶＥＧＦの発現と比較して、約５％未満のＯ２において培養された場合、増加したレベルのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８、もしくはＶＥＧＦを発現する。上記の列挙された特徴の１つまたは複数を有する、ＡＭＤＡＣ含有細胞集団、例えば、ＡＭＤＡＣ集団が本明細書にさらに提供される。
【００６４】
別の実施形態において、上記の羊膜由来接着細胞含有細胞集団のいずれも、血管新生因子を分泌する。具体的な実施形態において、細胞集団は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および／またはインターロイキン−８（ＩＬ−８）を分泌する。他の具体的な実施形態において、羊膜由来血管新生細胞含有細胞集団は、１つまたは複数の血管新生因子を分泌し、それによって、ヒト内皮細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの創傷治癒アッセイにおいて遊走するように誘導する。他の具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞含有細胞集団は、ヒト内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞、または筋芽細胞の成熟、分化、または増殖を誘導する。
【００６５】
別の実施形態において、上記の羊膜由来接着細胞含有細胞集団のいずれも、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、コラーゲンＩ型もしくはＩＶ型、および／または１つもしくは複数の血管新生因子、例えば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、もしくはｂＦＧＦの存在下で、例えば、胎盤コラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基質上で培養された場合、アセチル化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を取り込む。
【００６６】
別の実施形態において、細胞が、組織培養プラスチックに接着性であり、かつＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋，ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、またはＶＥ−カドヘリン−である、羊膜由来接着細胞含有細胞集団が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、前記細胞集団における細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋，ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、またはＶＥ−カドヘリン−である羊膜由来細胞である。別の具体的な実施形態において、前記集団における細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋，ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、およびＶＥ−カドヘリン−である羊膜由来細胞である。別の具体的な実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋，ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、またはＶＥ−カドヘリン−である前記細胞は、４〜２１日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。別の具体的な実施形態において、前記細胞はまたＶＥ−カドヘリン−である。
【００６７】
羊膜由来接着細胞を含む、本明細書に提供される細胞集団は、血管または脈管構造に似ている新芽またはチューブ様構造を形成することができる。一実施形態において、羊膜由来接着細胞含有細胞集団は、血管新生成分、例えば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはｂＦＧＦの存在下で培養された場合、新芽またはチューブ様構造を形成する。より具体的な実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋，ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、またはＶＥ−カドヘリン−である前記羊膜由来細胞は、前記細胞集団が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の存在下で培養された場合、新芽またはチューブ様構造を形成する。
【００６８】
本明細書に記載された羊膜由来接着細胞は、上記の特徴、例えば、細胞表面マーカーおよび／もしくは遺伝子発現プロファイルの組合せ、ならびに／または初代培養中もしくは幹細胞の培養に適した培地における増殖中の血管新生能力および機能を示す。そのような培地として、例えば、１〜１００％のＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、１〜１００％のＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ）、１〜１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．１〜５×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ、Ｓｉｇｍａ）、０．１〜５×リノレン酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）、１０−５〜１０−１５Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０−２〜１０−１０Ｍのアスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）、１〜５０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１〜５０ｎｇ／ｍＬの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および１００Ｕペニシリン／１０００Ｕストレプトマイシンを含む培地が挙げられる。具体的な実施形態において、培地は、６０％のＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、４０％のＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ）、２％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）、１×リノレン酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０−９Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０−４Ｍのアスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍＬの（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および１００Ｕペニシリン／１０００Ｕストレプトマイシンを含む。他の適切な培地は下に記載されている。
【００６９】
本明細書に提供される、単離された羊膜由来接着細胞集団は、例えば、容器内に、約、少なくとも約、またはたった約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、またはそれ以上の羊膜由来接着細胞を含み得る。様々な実施形態において、本明細書に提供される、単離された細胞集団における細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、羊膜由来接着細胞である。すなわち、単離された羊膜由来接着細胞の集団は、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％ほどの非幹細胞を含み得る。
【００７０】
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、基質上で培養することができる。様々な実施形態において、基質は、羊膜由来接着細胞の培養および／または選択を達成することができる任意の表面であり得る。典型的には、基質はプラスチック、例えば、組織培養ディッシュまたはマルチウエルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、生体分子または合成模倣剤、例えば、ＣＥＬＬＳＴＡＲＴ（商標）、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）ＡＣＦ−基質、オルニチン、もしくはポリリシン、または細胞外マトリックスタンパク質、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどで処理、コーティング、またはインプリントすることができる。
【００７１】
羊膜由来細胞、例えば、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞、およびそのような細胞の集団は、１つまたは複数の胎盤から単離することができる。例えば、本明細書に提供される、単離された羊膜由来細胞集団は、破壊された羊膜組織、例えば、組織消化物（すなわち、羊膜の酵素消化によって得られる細胞の収集物）から得られる、またはそれらの内に含まれるそのような細胞を含む胎盤細胞の集団であって、前記細胞集団が羊膜由来細胞について濃縮されており、かつ組織が単一の胎盤由来または２つ以上の胎盤由来である、胎盤細胞集団であり得る。単離された羊膜由来細胞を、培養および拡大して、そのような細胞の集団を作製することができる。羊膜由来接着細胞を含む胎盤細胞集団もまた、培養および拡大して、羊膜由来接着細胞の集団を作製することができる。
【００７２】
特定の実施形態において、上記のマーカーおよび／または遺伝子発現特徴のいずれかを示すＡＭＤＡＣは、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、または２０回、またはそれ以上、継代されている。特定の他の実施形態において、上記のマーカーおよび／または遺伝子発現特徴のいずれかを示すＡＭＤＡＣは、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回、４１回、４２回、４３回、４４回、４５回、４６回、４７回、４８回、４９回、または少なくとも５０回、またはそれ以上、培養で倍加されている。
【００７３】
５．２  他の細胞型を含む羊膜由来接着細胞集団
本明細書に記載される、単離された羊膜由来接着細胞含有細胞集団は、第２の細胞型、例えば、羊膜由来接着細胞ではない胎盤細胞、または、例えば、胎盤細胞ではない細胞を含み得る。例えば、単離された羊膜由来接着細胞集団は、第２の型の細胞集団を含むことができ、例えば、それと組み合わせることができ、前記第２の型の細胞は、例えば、胚性幹細胞、血液細胞（例えば、胎盤血、胎盤血液細胞、臍帯血、臍帯血液細胞、末梢血、末梢血液細胞、胎盤血、臍帯血、または末梢血由来の有核細胞など）、血液から単離された幹細胞（例えば、胎盤血、臍帯血、または末梢血から単離された幹細胞）、胎盤幹細胞（例えば、米国特許第７，４６８，２７６号および米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号に記載された胎盤幹細胞。それらの特許および特許出願の開示は全体として参照により本明細書に組み入れられている）、胎盤灌流液由来の有核細胞、例えば、胎盤灌流液由来の総有核細胞、臍帯幹細胞、血液由来有核細胞集団、骨髄由来間葉系間質細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来造血幹細胞、粗骨髄、成体（体性）幹細胞、組織内に含まれる幹細胞集団、培養細胞、例えば、培養幹細胞、完全分化細胞（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊水細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、心臓細胞など）の集団、周皮細胞などである。具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞含有細胞集団は、胎盤幹細胞または臍帯由来の幹細胞を含む。第２の型の細胞が血液または血液細胞である特定の実施形態において、赤血球が細胞集団から除去されている。
【００７４】
具体的な実施形態において、第２の型の細胞は造血幹細胞である。そのような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤血、臍帯血、または末梢血内に、胎盤血、臍帯血、または末梢血由来の総有核細胞中に、胎盤血、臍帯血、または末梢血由来の単離されたＣＤ３４＋細胞集団中に、未処理の骨髄中に、骨髄由来の総有核細胞中に、骨髄由来の単離されたＣＤ３４＋細胞集団中などに含まれ得る。
【００７５】
別の実施形態において、単離された羊膜由来接着細胞集団は、血管系由来の複数の成熟細胞または前駆細胞と組み合わせられる。様々な実施形態において、細胞は、内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞、心筋細胞、周皮細胞、血管芽細胞、筋芽細胞、または心筋芽細胞である。
【００７６】
別の実施形態において、第２の型の細胞は、胚性幹細胞に関連した多能性のマーカーおよび機能を発現するために培養で操作された非胚性細胞型である。
【００７７】
上記の単離された羊膜由来接着細胞集団の具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞と第２の型の細胞の一方または両方は、細胞の意図されたレシピエントに対して自己であり、または同種である。
【００７８】
羊膜由来接着細胞、および羊膜由来接着細胞以外の複数の幹細胞を含む組成物がさらに本明細書に提供される。具体的な実施形態において、組成物は、胎盤から得られる幹細胞、すなわち、胎盤幹細胞、例えば、米国特許第７，０４５，１４８号、第７，２５５，８７９号、および第７，３１１，９０５号、ならびに米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号に記載されているような胎盤幹細胞を含み、それらの特許および特許出願のそれぞれの開示は全体として参照により本明細書に組み入れられている。具体的な実施形態において、前記胎盤幹細胞は、ＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、かつ細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合、前記幹細胞を含む胎盤細胞集団において１つもしくは複数の胚様体の形成を促進し；またはＯＣＴ−４−であり、かつ細胞集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養された場合、幹細胞を含む胎盤細胞集団において１つもしくは複数の胚様体の形成を促進し；またはそれらの任意の組合せである。より具体的な実施形態において、前記ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、およびＣＤ１０５−である。別のより具体的な実施形態において、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別のより具体的な実施形態において、前記ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別のより具体的な実施形態において、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−Ｇ＋幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋、およびＣＤ２００＋である。別のより具体的な実施形態において、前記ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋幹細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態において、前記ＯＣＴ−４＋幹細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態において、胎盤幹細胞は、起源が母体である（すなわち、母体の遺伝子型を有する）。別のより具体的な実施形態において、胎盤幹細胞は起源が胎児である（すなわち、胎児の遺伝子型を有する）。
【００７９】
別の具体的な実施形態において、組成物は、羊膜由来接着細胞および胚性幹細胞を含む。別の具体的な実施形態において、組成物は、羊膜由来接着細胞、および間葉系間質細胞または間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系間質細胞または骨髄由来間葉系幹細胞を含む。別の具体的な実施形態において、組成物は、骨髄由来造血幹細胞を含む。別の具体的な実施形態において、組成物は、羊膜由来接着細胞、ならびに造血前駆細胞、例えば、骨髄、胎児血液、臍帯血、胎盤血、および／または末梢血由来の造血前駆細胞を含む。別の具体的な実施形態において、組成物は、羊膜由来接着細胞および体性幹細胞を含む。より具体的な実施形態において、前記体性幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、内皮幹細胞、心筋幹細胞、または筋肉幹細胞である。
【００８０】
他の具体的な実施形態において、第２の型の細胞は、前記集団において約、少なくとも、またはたった１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％の細胞を構成する。他の具体的な実施形態において、前記組成物におけるＡＭＤＡＣは、前記組成物における少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の細胞を構成する。他の具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞は、前記集団において約、少なくとも、またはたった１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％の細胞を構成する。
【００８１】
単離された羊膜由来接着細胞集団における細胞は、別の型の複数の細胞、例えば、幹細胞集団と、各集団における総有核細胞数と比較して、約１００，０００，０００：１、５０，０００，０００：１、２０，０００，０００：１、１０，０００，０００：１、５，０００，０００：１、２，０００，０００：１、１，０００，０００：１、５００，０００：１、２００，０００：１、１００，０００：１、５０，０００：１、２０，０００：１、１０，０００：１、５，０００：１、２，０００：１、１，０００：１、５００：１、２００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１：２００、１：５００、１：１，０００、１：２，０００、１：５，０００、１：１０，０００、１：２０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１：５００，０００、１：１，０００，０００、１：２，０００，０００、１：５，０００，０００、１：１０，０００，０００、１：２０，０００，０００、１：５０，０００，０００、または約１：１００，０００，０００の比で組み合わせることができる。単離された羊膜由来接着細胞集団における細胞は、複数の細胞型の複数の細胞とも同様に組み合わせることができる。
【００８２】
５．３  培養での増殖
任意の哺乳動物細胞に関する本明細書に記載された羊膜由来接着細胞の増殖は、増殖のために選択された特定の培地に一部、依存する。最適な条件下で、羊膜由来接着細胞は、典型的には、約２４時間で数が二倍になる。培養中、本明細書に記載された羊膜由来接着細胞は、培養における基質、例えば、組織培養容器（例えば、組織培養ディッシュプラスチック、フィブロネクチンコーティング化プラスチックなど）の表面に接着し、単層を形成する。典型的には、細胞は、羊膜の消化後２〜７日内に培養において樹立する。それらは、１日当たり約０．４〜１．２回の集団倍加で増殖し、少なくとも３０〜５０回の集団倍加を起こすことができる。細胞は、コンフルエンス未満で拡大中には間葉系細胞／線維芽細胞様表現型を示し、コンフルエンス時点で立方状／丸石様外観を示し、培養中の増殖は、強く接触阻止される。羊膜由来血管新生細胞集団は、培養での拡大中、胚様体を形成することができる。
【００８３】
５．４  羊膜由来血管新生細胞を得る方法
羊膜由来接着細胞、および羊膜由来接着細胞含有細胞集団は、例えば、羊膜組織の消化の特定の方法によって、作製する、例えば、他の細胞または細胞集団から単離することができ、任意で、続いて、羊膜由来接着細胞のマーカーもしくはマーカーの組合せ、特徴の存在もしくは非存在についての生じた細胞または細胞集団の評価、または羊膜細胞を得て、羊膜由来接着細胞に特有のマーカーに基づいて選択することを行ってもよい。
【００８４】
本明細書に提供される、羊膜由来接着細胞、および単離された羊膜由来接着細胞含有細胞集団は、例えば、羊膜組織の消化、続いて接着細胞についての選択によって作製することができる。一実施形態において、例えば、単離された羊膜由来接着細胞、または単離された羊膜由来接着細胞含有細胞集団は、（１）羊膜組織を第１の酵素で消化して、羊膜の間葉系層由来の細胞から羊膜の上皮層由来の細胞を分離し、（２）その後、羊膜の間葉系層を第２の酵素で消化して、単細胞懸濁液を形成し、（３）前記単細胞懸濁液における細胞を組織培養表面、例えば、組織培養プラスチック上で培養し、（４）培地の交換後、前記表面に接着する細胞を選択し、それによって、単離された羊膜由来接着細胞含有細胞集団を生じることによって、作製することができる。具体的な実施形態において、前記第１酵素はトリプシンである。より具体的な実施形態において、前記トリプシンは、消化されるべき羊膜組織の１グラム当たり５〜２０ミリリットル、例えば、１０ミリリットルの溶液中に０．２５％のトリプシン（ｗ／ｖ）の濃度で用いられる。別のより具体的な実施形態において、前記トリプシンでの消化は、３７℃で約１５分間、進めることができ、３回まで繰り返される。別の具体的な実施形態において、前記第２酵素はコラゲナーゼである。より具体的な実施形態において、前記コラゲナーゼは、消化されるべき羊膜組織の１グラム当たり５ｍＬ中５０Ｕ／Ｌから５００Ｕ／Ｌの間の濃度で用いられる。別のより具体的な実施形態において、前記コラゲナーゼでの消化は、３７℃で約４５〜６０分間、進めることができる。別の具体的な実施形態において、コラゲナーゼでの消化後形成された単細胞懸濁液は、段階（２）と段階（３）の間に、例えば、７５μＭ〜１５０μＭのフィルターを通して濾過される。別の具体的な実施形態において、前記第１酵素はトリプシンであり、前記第２酵素はコラゲナーゼである。
【００８５】
単離された羊膜由来接着細胞含有細胞集団は、別の実施形態において、羊膜由来接着細胞の１つまたは複数の特徴を示す、羊膜由来の細胞、例えば、本明細書の他の箇所で記載された羊膜組織を消化することによって得られる細胞を選択することによって得ることができる。一実施形態において、例えば、細胞集団は、（ａ）ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４について陰性であり、かつ（ｂ）免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＣＤ９、ＣＤ５４、ＣＤ１０５、ＣＤ２００のうちの１つまたは複数について陽性である羊膜細胞を選択する段階、および前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成する段階を含む方法によって作製される。具体的な実施形態において、前記羊膜細胞は追加として、ＶＥ−カドヘリン−である。具体的な実施形態において、細胞集団は、（ａ）ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４について陰性で、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥ−カドヘリンについて陰性であり、かつ（ｂ）免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＣＤ９、ＣＤ５４、ＣＤ１０５、ＣＤ２００のそれぞれについて陽性である胎盤細胞を選択する段階、および前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成する段階によって作製される。特定の実施形態において、免疫局在性による選択は、ＲＴ−ＰＣＲによる選択の前に行われる。別の具体的な実施形態において、前記選択段階は、１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦの存在下で４〜２１日間の培養後、細胞マーカーＣＤ３４を発現しない細胞を選択することを含む。
【００８６】
別の実施形態において、例えば、細胞集団は、組織培養プラスチックに接着性であり、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋およびＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋である羊膜細胞を選択する段階、ならびに前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成する段階を含む方法によって作製される。具体的な実施形態において、細胞集団は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４−であり、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ−、およびＨＬＡ−Ｇ−である羊膜細胞を選択する段階を含む方法によって作製される。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ９＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−、および／またはＣＸＣＲ４−（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４）のうちの１つまたは複数、または全部である羊膜細胞を選択する段階、およびこれらの特徴の１つまたは複数を示さない細胞からその細胞を単離する段階によって作製される。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＶＥ−カドヘリン−である羊膜細胞を選択する段階、およびＶＥ−カドヘリン＋である細胞からその細胞を単離する段階によって作製される。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団は、追加として、免疫局在性によって決定した場合、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である羊膜細胞を選択する段階、ならびにＣＤ１０５−またはＣＤ２００−である細胞からその細胞を単離する段階によって作製される。別の具体的な実施形態において、前記細胞は、４〜２１日間の１〜１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦへの曝露後、免疫局在性によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。
【００８７】
細胞の選択において、羊膜由来接着細胞に特異的な特徴について細胞集団全体を試験する必要はない。その代わりに、細胞集団の１つまたは複数のアリコートの細胞（例えば、約０．５％〜２％）をそのような特徴について試験してもよく、その結果を集団における残りの細胞に帰することができる。
【００８８】
選択された細胞は、その細胞の試料（例えば、約１０４〜約１０５細胞）を基質、例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で、４〜１４日間、例えば、７日間、ＶＥＧＦ（例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で培養し、新芽および／または細胞ネットワークの出現について細胞を視覚的に検査することによって本明細書に提供される羊膜由来接着細胞であると確認することができる。
【００８９】
羊膜由来接着細胞は、細胞選択の技術分野において知られた任意の方法を用いて上記マーカーによって選択することができる。例えば、接着細胞は、例えば、免疫局在性、例えば、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳにおいて、１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する抗体（複数可）を用いて選択することができる。選択は、磁気ビーズと連結した抗体を用いて達成することができる。特定のマーカーに特異的である抗体は、当技術分野において知られていて、市販されており、例えば、ＣＤ９（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ５４（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ１０５（Ａｂｃａｍ、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｃｏ，ＭＥなど）、ＣＤ２００（Ａｂｃａｍ）、サイトケラチン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）に対する抗体がある。他のマーカーに対する抗体もまた市販されており、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、およびＣＤ４５は、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手できる。ＲＴ−ＰＣＲに適したＯＣＴ−４配列へのプライマーは、例えば、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅもしくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから、商業的に入手することができ、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ４８６５１３におけるヒト配列から容易に導き出すことができる。
【００９０】
羊膜由来接着細胞を得るために、胎盤および羊膜組織を得て、そのような組織を処理する詳細な方法は、下記に提供されている。
【００９１】
５．４．１  細胞収集組成物
一般的に、細胞は、生理学的に許容される溶液、例えば、細胞収集組成物を用いて、哺乳動物胎盤、例えば、ヒト胎盤由来の羊膜から得ることができる。好ましくは、細胞収集組成物は、アポトーシスを阻止または抑制し、細胞死、溶解、分解などを阻止または抑制する。細胞収集組成物は、発明の名称が「胎盤幹細胞を収集し、臓器を保存するための改良された媒体（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｓ）」である、関連した米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号に詳細に記載されており、その特許出願の開示は全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【００９２】
細胞収集組成物は、羊膜由来接着細胞の収集および／または培養に適した任意の生理学的に許容される溶液、例えば、緩衝成分、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）の添加あり、または添加なしの食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水、クレブス液、改変クレブス液、イーグル液、０．９％のＮａＣｌなど）、培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）などを含み得る。
【００９３】
細胞収集組成物は、収集時点から培養時点まで、細胞、例えば、羊膜由来接着細胞を保存する、すなわち、細胞が死滅するのを防ぎ、または細胞死を遅らせ、死滅する細胞集団における細胞数を低下させるなどの傾向がある、１つまたは複数の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤またはＪＮＫ阻害剤）、血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシウム、降圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンまたは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）、壊死阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、またはクロナゼパム）、ＴＮＦ−α阻害剤、および／または酸素運搬パーフルオロカーボン（例えば、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデシルブロミドなど）であり得る。
【００９４】
細胞収集組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮアーゼまたはＤＮアーゼなどを含み得る。そのような酵素として、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼなど）、ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（商標）、ヒアルロニダーゼなどが挙げられるが、それらに限定されない。組織消化酵素を含む細胞収集組成物の使用は、下記でより詳細に論じられている。
【００９５】
細胞収集組成物は、殺菌的または静菌的有効量の抗生物質を含み得る。特定の非限定的実施形態において、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフィキシム、またはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）またはキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、またはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態において、抗生物質は、グラム（＋）および／またはグラム（−）細菌、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓなどに対して活性がある。
【００９６】
細胞収集組成物はまた、以下の化合物の１つまたは複数を含み得る：アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）；マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；一実施形態において内皮完全性および細胞生存能を維持するのに十分な量で存在する、２０，０００ダルトンより大きい分子量の高分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ、または約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する合成または天然のコロイド、デキストランまたはポリエチレングリコールなどの多糖）；抗酸化剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在する、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣ、またはビタミンＥ）；還元剤（例えば、０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）；細胞へのカルシウム流入を防ぐ作用物質（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）；一実施形態において残留血液の凝固防止を助けるのに十分な量で存在する、抗凝固剤（例えば、約１０００ユニット／ｌ〜約１００，０００ユニット／ｌの濃度で存在するヘパリンまたはヒルジン）；またはアミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在する、アミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、またはイソブチルアミロライド）。
【００９７】
本明細書に記載された羊膜由来接着細胞はまた、例えば、下記のような消化中および消化後に、単純な生理学的に許容される緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水、０．９％のＮａＣｌ溶液、細胞培地などへ収集することができる。
【００９８】
５．４．２  胎盤の収集および処理
一般的に、ヒト胎盤は、出産後、または例えば、帝王切開後、それの娩出後直ちに、回収される。好ましい実施形態において、胎盤は、インフォームドコンセント後で、かつ患者の完全な病歴が得られて、胎盤と関連づけられた後で、患者から回収される。好ましくは、病歴は出産後、継続する。そのような病歴は、胎盤またはそれから採取された細胞のその後の使用を調整するために用いることができる。例えば、ヒト胎盤細胞、例えば、羊膜由来接着細胞は、病歴に照らして、胎盤に関連づけられる、乳児、または近親者について、すなわち、乳児の両親、兄弟、または他の親類についての個別化医療のために用いることができる。
【００９９】
羊膜由来接着細胞の回収前に、臍帯血および胎盤血が取り出される。特定の実施形態において、出産後、胎盤における臍帯血が回収される。胎盤は、通常の臍帯血回収プロセスに供することができる。典型的には、針またはカニューレを用い、重力の助けを受けて、胎盤を放血させる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌら、米国特許第５，４１５，６６５号参照）。針またはカニューレは、通常、臍静脈中に配置され、胎盤は、胎盤からの臍帯血の排出を助けるために優しくマッサージされる。そのような臍帯血回収は、例えば、ＬｉｆｅＢａｎｋ  ＵＳＡ、Ｃｅｄａｒ  Ｋｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ．、ＶｉａＣｏｒｄ、Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、およびＣｒｙｏｃｅｌｌによって商業的に実施される場合がある。好ましくは、胎盤は、臍帯血回収中の組織破壊を最小限にするためにさらなる操作なしに重力排出される。
【０１００】
典型的には、胎盤は、例えば、灌流または組織解離による、臍帯血の回収および細胞の収集のために、分娩室または出産室から別の場所、例えば、実験室へ輸送される。胎盤は、好ましくは、例えば、無菌のジプロック方式プラスチックバッグ内に近位臍帯をクランプして胎盤を置き、その後、そのプラスチックバッグを断熱容器内に置くことによって、（胎盤の温度を２０〜２８℃の間で維持する）無菌の断熱輸送装置内で輸送される。別の実施形態において、胎盤は、実質的には、米国特許第７，１４７，６２６号に記載されているような臍帯血収集キット中で輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩から４〜２４時間後、実験室へ送達される。特定の実施形態において、近位臍帯が、臍帯血回収前に、好ましくは、胎盤ディスクへの挿入部から４〜５ｃｍ（センチメートル）内の所でクランプされる。他の実施形態において、近位臍帯は、臍帯血回収後であるが、胎盤のさらなる処理の前に、クランプされる。
【０１０１】
細胞収集前の胎盤は、無菌条件下で、例えば、４〜２５℃（摂氏）の温度、例えば、室温で保存することができる。胎盤は、いかなる残留臍帯血も取り出すために胎盤を灌流する前に、例えば、０〜２４時間の間、最長４８時間まで、または４８時間より長く、保存してもよい。一実施形態において、胎盤は、娩出後約０時間から約２時間までの間に、採取される。胎盤は、例えば、４〜２５℃（摂氏）の温度で抗凝固溶液中で保存することができる。適切な抗凝固溶液は当技術分野においてよく知られている。例えば、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、またはワルファリンナトリウムの溶液を用いることができる。好ましい実施形態において、抗凝固溶液は、ヘパリン溶液（例えば、１：１０００溶液中１％ｗ／ｗ）を含む。放血した胎盤は、好ましくは、細胞を収集する前に、３６時間だけ保存される。
【０１０２】
５．４．３  羊膜組織の物理的破壊および酵素消化
一実施形態において、羊膜は、胎盤の残りの部分から、例えば、鈍的切開により、例えば、手指を用いて、分離される。羊膜は、酵素消化および接着性細胞回収の前に、例えば、パーツまたは組織断片へ、解体することができる。羊膜由来接着細胞は、羊膜全体から、または羊膜の小断片、例えば、面積が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または約１０００平方ミリメートルである羊膜の断片から、得ることができる。
【０１０３】
羊膜由来接着細胞は、一般的に、胎盤羊膜またはその部分から、娩出後およそ最初の３日間内の任意の時点であるが、好ましくは、娩出後約０時間から４８時間の間、または娩出後約８時間から約１８時間の間に、収集することができる。
【０１０４】
一実施形態において、羊膜由来接着細胞は、羊膜組織から、１つまたは複数の組織消化酵素を用いる酵素消化によって抽出される。羊膜またはその部分は、例えば、上記のような細胞収集組成物へ溶解または混合された１つまたは複数の酵素で消化してもよい。
【０１０５】
特定の実施形態において、細胞収集組成物は、１つまたは複数の組織破壊性酵素（複数可）を含む。酵素消化は、好ましくは、例えば、逐次的順番で用いられる、酵素の組合せ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼの組合せ、例えば、ディスパーゼとコラゲナーゼの組合せを用いる。１つより多くのプロテアーゼが用いられる場合、プロテアーゼは、羊膜組織を消化するのに同時に用いてもよく、または連続的に用いてもよい。一実施形態において、例えば、羊膜組織は、トリプシンで３回、その後、コラゲナーゼで１回、消化される。
【０１０６】
一実施形態において、羊膜組織は、１つまたは複数のマトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、および粘液溶解性酵素で酵素消化される。具体的な実施形態において、羊膜組織は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼの組合せで消化される。別の具体的な実施形態において、羊膜組織は、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄ．）およびヒアルロニダーゼの組合せで消化される。羊膜組織を破壊するのに用いることができる他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼなどのセリンプロテアーゼが挙げられる。セリンプロテアーゼは、血清中のアルファ２ミクログロブリンによって阻害される可能性があり、それゆえに、消化に用いられる媒体は、特定の実施形態において、無血清であり得る。特定の他の実施形態において、ＥＤＴＡおよびＤＮアーゼが、羊膜組織の消化において、例えば、細胞回収の効率を増加させるために、用いられる。特定の他の実施形態において、消化物は、粘稠性消化物内に細胞が捕捉されるのを避けるために、希釈される。
【０１０７】
組織消化酵素の典型的な濃度として、例えば、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＶについて５０〜２００Ｕ／ｍＬ、ディスパーゼについて１〜１０Ｕ／ｍＬ、ならびにエラスターゼについて１０〜１００Ｕ／ｍＬが挙げられる。プロテアーゼは、羊膜由来接着細胞を単離するために、組み合わせて、すなわち、同じ消化反応において２つ以上のプロテアーゼを用いることができ、または連続して用いることができる。例えば、一実施形態において、羊膜組織またはその部分は、まず、例えば１５分間、３７℃で、約０．２５％の濃度の適切な量のトリプシンで、続いて、例えば４５分間、約１〜約２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩで、消化される。
【０１０８】
一実施形態において、羊膜由来接着細胞は、以下のように得ることができる。羊膜を、サイズがおよそ０．１’’×０．１’’〜約５’’×５’’、例えば、２’’×２’’の断片へ切断する。上皮単層を、羊膜の胎児側から、以下のように３回のトリプシン処理によって取り出す。羊膜の断片を、温かい（例えば、約２０℃〜約３７℃）トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％）を含む容器内へ置く。トリプシンの体積は、羊膜の１グラム当たり約５ｍＬから羊膜の１グラム当たり約５０ｍＬまでの範囲であり得る。容器を、温度を一定に維持しながら、約５分間〜約３０分間、例えば、１５分間、撹拌する。その後、羊膜の断片を、羊膜断片を手作業で取り出す、または濾過によるなどの任意の適切な方法によってトリプシン溶液から分離する。トリプシン処理段階を少なくとも１回より多く繰り返すことができる。
【０１０９】
最終のトリプシン処理が完了すれば、羊膜の断片を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／１０％ＦＢＳ、ＰＢＳ／５％ＦＢＳ、またはＰＢＳ／３％ＦＢＳなどの温かいトリプシン中和溶液で満たされた容器へ戻す。容器を、約５秒間〜約３０分間、例えば、５分間、撹拌する。その後、羊膜の断片を、上記のようなトリプシン中和溶液から分離し、羊膜の断片を、温かいＰＢＳ、ｐＨ７．２で満たされた容器へ置く。容器を約５秒間〜約３０分間、撹拌し、その後、羊膜断片を、上記のようにＰＢＳから分離する。
【０１１０】
その後、羊膜の断片を温かい（例えば、約２０℃〜約３７℃）消化溶液で満たされた容器へ置く。消化溶液の体積は、羊膜の１グラム当たり約５ｍＬから羊膜の１グラム当たり約５０ｍＬまでの範囲であり得る。消化溶液は、ＤＭＥＭなどの適切な培地中に消化酵素を含む。典型的な消化溶液には、コラゲナーゼＩ型（約５０Ｕ／ｍＬ〜約５００Ｕ／ｍＬ）；コラゲナーゼＩ型（約５０Ｕ／ｍＬ〜約５００Ｕ／ｍＬ）、加えてディスパーゼ（約５Ｕ／ｍＬ〜約１００Ｕ／ｍＬ）；ならびにコラゲナーゼＩ型（約５０Ｕ／ｍＬ〜約５００Ｕ／ｍＬ）、ディスパーゼ（約２Ｕ／ｍＬ〜約５０Ｕ／ｍＬ）、およびヒアルロニダーゼ（約３Ｕ／ｍＬ〜約１０Ｕ／ｍＬ）が挙げられる。容器を、羊膜消化が実質的に完了するまで（およそ１０分間〜約９０分間）、３７℃で撹拌する。その後、温かいＰＢＳ／５％ＦＢＳを、羊膜組織の１グラム当たり約１ｍＬ〜羊膜組織の１グラム当たり約５０ｍＬの比率で容器へ加える。容器を約２分間〜約５分間、撹拌する。その後、細胞懸濁液を、４０μｍ〜１００μｍのフィルターを用いて濾過し、いかなる未消化組織も除去する。細胞を、温かいＰＢＳ（約１ｍＬ〜約５００ｍＬ）中に懸濁し、その後、２００×ｇ〜約４００×ｇで約５分間〜約３０分間、例えば、３００×ｇで約１５分間、２０℃で遠心分離する。遠心分離後、上清を除去し、細胞を適切な培地中に再懸濁する。細胞懸濁液を濾過（４０μｍ〜７０μｍのフィルター）して、いかなる残存する未消化組織も除去し、単細胞懸濁液を得る。
【０１１１】
この実施形態において、懸濁液中の細胞を収集し、本明細書の他の箇所で記載されているように培養して、単離された羊膜由来接着細胞、およびそのような細胞の集団を得る。この実施形態における残存する未消化羊膜は廃棄することができる。羊膜組織から遊離した細胞については、例えば、収集を、例えば、遠心分離によって、行い、標準細胞培地中で培養することができる。
【０１１２】
本明細書における消化プロトコールのいずれかにおいて、消化によって得られる細胞懸濁液を、例えば、約５０μｍから約１５０μｍまで、例えば、約７５μｍから約１２５μｍまでの細孔を含むフィルターを通して、濾過することができる。より具体的な実施形態において、細胞懸濁液は、２つ以上のフィルター、例えば、１２５μｍのフィルターと７５μｍのフィルターを通して濾過することができる。
【０１１３】
本明細書に記載された方法のいずれかと併せて、ＡＭＤＡＣは、上記のセクション５．１に記載されているように、ＡＭＤＡＣの１つまたは複数の特徴を発現する細胞を選択することによって、消化中に遊離した細胞から単離することができる。
【０１１４】
ＡＭＤＡＣはまた、例えば、トリプシンでの消化、続いてのコラゲナーゼでの消化を含む特定の２段階単離方法を用いて単離することができる。したがって、別の態様において、羊膜またはその部分を、上皮細胞が前記羊膜から遊離するようにトリプシンで消化する段階、前記上皮細胞から羊膜またはその部分を取り出す段階、羊膜またはその部分を、羊膜由来接着細胞が前記羊膜またはその部分から遊離するように、コラゲナーゼでさらに消化する段階、および前記羊膜由来接着細胞を前記羊膜から分離する段階を含む、羊膜由来接着細胞を単離する方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態において、羊膜またはその部分の消化は、少なくとも１回、繰り返される。別の具体的な実施形態において、羊膜またはその部分のコラゲナーゼでの消化は、少なくとも１回、繰り返される。別の具体的な実施形態において、トリプシンは、約０．１％〜１．０％（最終濃度）である。より具体的な実施形態において、トリプシンは、約０．２５％（最終濃度）である。別の具体的な実施形態において、コラゲナーゼは、約５０Ｕ／ｍＬ〜約１０００Ｕ／ｍＬ（最終濃度）である。より具体的な実施形態において、コラゲナーゼは、約１２５Ｕ／ｍＬ（最終濃度）である。別の具体的な実施形態において、単離方法は、追加として、前記羊膜由来接着細胞を細胞培養で培養する段階、および前記培養において前記羊膜由来接着細胞を非接着細胞から分離して、濃縮された羊膜由来接着細胞集団を得る段階を含む。より具体的な実施形態において、前記濃縮された羊膜由来接着細胞集団における少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が前記羊膜由来接着細胞である。
【０１１５】
上記方法のより具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４について陰性であり、フローサイトメトリーによって決定した場合、ＨＬＡ−Ｇ＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ１１７−のうちの１つまたは複数である。
【０１１６】
５．４．４  羊膜由来接着細胞の単離、ソーティング、および特徴付け
細胞ペレットを、上記のような新鮮な細胞収集組成物中に、または細胞維持に適した媒体、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）；Ｉｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏの培地（ＩＭＤＭ）、例えば、２Ｕ／ｍＬのヘパリンおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含むＩＭＤＭ無血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＮＹ）；ＦＢＳ（例えば、２％ｖ／ｖ）を含む緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ）の混合物などの中に再懸濁することができる。
【０１１７】
フィブロネクチンなどの追加の細胞外マトリックスコーティングがある、またはない、例えば、表面上で、例えば、組織培養プラスチック上で、培養されている羊膜由来接着細胞は、異なる接着性によって継代または単離することができる。例えば、上記のセクション５．４．３に記載されているように実施された、羊膜組織のコラゲナーゼ消化から得られる細胞懸濁液は、例えば、組織培養プラスチック上の培地中で３〜７日間、培養することができる。培養中、懸濁液中の複数の細胞は培養表面に付着し、連続培養後、羊膜由来接着細胞を生じる。羊膜由来接着細胞を生じない非接着細胞は、培地交換中に除去される。
【０１１８】
羊膜から収集された細胞の数および型を、例えば、形態および細胞表面マーカーの変化を免疫局在性、例えば、フローサイトメトリー、細胞ソーティング、免疫細胞化学法（例えば、組織特異的または細胞マーカー特異的抗体での染色）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）などの標準細胞検出技術を用いて測定することによって、光学顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡を用いる細胞の形態の検査によって、ならびに／または、ＰＣＲおよび遺伝子発現プロファイリングなどの当技術分野においてよく知られた技術を用いて遺伝子発現の変化を測定することによって、モニターすることができる。これらの技術はまた、１つまたは複数の特定のマーカーについて陽性である細胞を同定するために用いることができる。例えば、ＣＤ３４に対する１つまたは複数の抗体を用いて、細胞が検出可能な量のＣＤ３４を含む（もしそうならば、その細胞はＣＤ３４＋である）かどうかを上記技術を用いて決定することができる。
【０１１９】
羊膜由来細胞、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ分離、異なる接着性、または両方の組合せによって単離されている細胞は、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を用いてソーティングすることができる。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光性質に基づいて、細胞を含む粒子を分離するためのよく知られた方法である（例えば、Ｋａｍａｒｃｈ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５１：１５０−１６５参照）。個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起によって小さな電気的変化が生じ、それによって、混合物からプラスの粒子およびマイナスの粒子の電磁気的分離が可能になる。一実施形態において、細胞表面マーカー特異的抗体またはリガンドは、別々の蛍光標識で標識される。細胞は、用いられた抗体に結合するそれらの能力に基づいて細胞の分離を可能にする細胞ソーターによって処理される。ＦＡＣＳソーティングされた粒子は、分離およびクローニングを容易にするために、９６ウエルまたは３８４ウエルのプレートの個々のウエルへ直接、堆積させてもよい。
【０１２０】
１つのソーティングスキームにおいて、胎盤由来の細胞、例えば、羊膜由来接着細胞は、マーカー、ＣＤ４９ｆ、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、および／またはＦｌｔ−１／ＶＥＧＦＲ１の発現に基づいてソーティングすることができる。好ましくは、細胞は、例えば、細胞の試料においてＲＴ−ＰＣＲによってＯＣＴ−４の発現を決定することによって、ＯＣＴ−４−であると同定され、試料における細胞が、３０サイクル後、ＯＣＴ−４についてのｍＲＮＡの検出可能な産生を示すことができない場合には、細胞はＯＣＴ−４−である。例えば、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋およびＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋である羊膜由来の細胞が、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ−およびＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋、ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ならびに／またはＶＥ−カドヘリン−のうちの１つまたは複数である細胞からソーティングすることができる。具体的な実施形態において、ＣＤ４９ｆ＋、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋、ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、および／もしくはＶＥ−カドヘリン−のうちの１つもしくは複数である羊膜由来の組織培養プラスチック接着性細胞、またはＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋、ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、およびＶＥ−カドヘリン−である細胞は、ソーティングされて、そのようなマーカー（複数可）の１つまたは複数を発現しない細胞から分離され、選択される。別の具体的な実施形態において、追加としてＣＤ３１＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１３３−、および／またはＴｉｅ−２＋のうちの１つまたは複数、または全部であるＣＤ４９ｆ＋、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１＋細胞は、そのような特徴の１つまたは複数、またはいずれをも示さない細胞からソーティングされる。別の具体的な実施形態において、追加としてＣＤ９＋、ＣＤ１０−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９８＋、Ｔｉｅ−２＋、ＴＥＭ−７＋、ＣＤ３１−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−、ＣＤ１４３−、ＣＤ１４６−、および／またはＣＸＣＲ４−のうちの１つまたは複数、または全部であるＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１−細胞は、そのような特徴の１つまたは複数、またはいずれをも示さない細胞からソーティングされる。
【０１２１】
羊膜由来接着細胞についての選択は、消化から生じる細胞懸濁液に、または消化物から収集される単離された細胞に、例えば、遠心分離またはフローサイトメトリーを用いる分離によって、実施することができる。発現したマーカーによる選択は、単独で、または、例えば、培養中にそれらの接着性に基づいて細胞を選択する工程と共に、達成することができる。例えば、接着性選択は、マーカー発現に基づいたソーティング前または後に達成することができる。
【０１２２】
胎盤細胞の抗体媒介性検出およびソーティングに関して、特定のマーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出およびソーティング（例えば、蛍光活性化細胞ソーティング）に適した任意のフルオロフォアまたは他の標識と組み合わせて用いることができる。特定のマーカーに対する抗体／フルオロフォア組合せとして、ＣＤ１０５に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート型モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手できる）；ＣＤ２００に対するフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート型モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ−ビオチン（ＣＤ３０９、Ａｂｃａｍ）などが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書に開示されたマーカーのいずれかに対する抗体は、抗体の検出を容易にする、抗体について任意の標準標識で標識することができ、その標識として、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン（ＰＥ）、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【０１２３】
羊膜由来接着細胞は、単一のマーカーに対する抗体で標識し、その単一マーカーに基づいて検出および／もしくはソーティングすることができ、または複数の異なるマーカーに対する複数の抗体で同時に標識し、複数のマーカーに基づいてソーティングすることができる。
【０１２４】
別の実施形態において、磁気ビーズを用いて、細胞を分離する、例えば、本明細書に記載された羊膜由来接着細胞を他の羊膜細胞から分離することができる。細胞は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）技術を用いてソーティングしてもよく、その技術とは、粒子を、磁気ビーズ（０．５〜１００μｍ直径）を結合するそれらの能力に基づいて分離するための方法である。磁気ミクロスフェアに様々の有用な修飾を施すことができ、それらには、特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加が挙げられる。その後、ビーズは、結合を可能にするように細胞と混合される。その後、細胞を、磁場に通過させて、特定の細胞表面マーカーを有する細胞を分離して取り出す。一実施形態において、その後、これらの細胞を、単離し、追加の細胞表面マーカーに対する抗体に結合した磁気ビーズと再混合することができる。細胞を、再び、磁場に通過させ、抗体を両方とも結合した細胞を単離する。その後、そのような細胞を、クローン単離のためにマイクロタイターディッシュなどの別個のディッシュへ希釈することができる。
【０１２５】
羊膜由来接着細胞は、（生存能を評価するための）トリパンブルー排除アッセイ、フルオレセインジアセテート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ；および（増殖を評価するための）チミジン取込みアッセイまたはＭＴＴ細胞増殖アッセイなどの当技術分野において知られた標準技術を用いて生存能、増殖力、および寿命について評価することができる。寿命は、長期培養で倍加した最大数の集団を決定することによるなどの当技術分野においてよく知られた方法によって決定してもよい。
【０１２６】
羊膜由来接着細胞はまた、当技術分野において知られた他の技術、例えば、所望の細胞の選択的増殖（陽性選択）、望まない細胞の選択的破壊（陰性選択）；混合集団における、例えば、ダイズ凝集素とのような、異なる細胞凝集能に基づいた分離；凍結融解方法；濾過；通常の遠心分離およびゾーン遠心分離；遠心性水簸（向流遠心分離）；単位重力分離；向流分配；電気泳動などを用いて他の胎盤細胞から分離することができる。
【０１２７】
５．５  羊膜由来接着細胞の培養
５．５．１  培地
単離された羊膜由来接着細胞、またはそのような細胞の集団は、細胞培養物を惹起し、または播種するために用いることができる。細胞は、一般的に、ラミニン、コラーゲン（例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、および細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．））などの細胞外マトリックスまたは生体分子でコーティングされていない、またはコーティングされた無菌組織培養容器に移される。
【０１２８】
ＡＭＤＡＣは、例えば、幹細胞の培養に適した培地において樹立することができる。樹立培地には、例えば、ＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、または６０％ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、４０％ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ）、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）、１×リノレン酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０−９Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０−４Ｍのアスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および１００Ｕペニシリン／１０００Ｕストレプトマイシンを含む培地（本明細書では「標準培地」と呼ぶ）を挙げることができる。
【０１２９】
羊膜由来接着細胞は、細胞、例えば、接着性胎盤幹細胞の培養に許容されると当技術分野において認識されている、任意の培地中、および任意の条件下で培養することができる。好ましくは、培地は、血清を含む。様々な実施形態において、ＡＭＤＡＣの培養または継代培養のための培地には、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭＳＣＭ−ｓｆ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（登録商標）−ＡＣＦ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）、標準培地、ＥＧＦを欠く標準培地、ＰＤＧＦを欠く標準培地、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ）、ＥＧＭ−２ＭＶ（Ｌｏｎｚａ）、２％、１０％、および２０％ＥＳ培地、ＥＳ−ＳＳＲ培地、またはα−ＭＥＭ−２０％ＦＢＳが挙げられる。羊膜由来接着細胞の培養に許容される培地には、例えば、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ（高グルコースまたは低グルコース）、Ｅａｇｌｅの基本培地、ＨａｍのＦ−１０培地（Ｆ１０）、ＨａｍのＦ−１２培地（Ｆ１２）、Ｉｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ、Ｌｏｎｚａ）、ＡＤＶＡＮＣＥＳＴＥＭ（商標）培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ  ＦＲＥＥなどが挙げられる。様々な実施形態において、例えば、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、ＬＡ＋ＢＳＡ（リノレン酸−ウシ血清アルブミン）、デキストロース、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変基本培地、低グルコース）／ＭＣＤＢ  ２０１（ニワトリ線維芽細胞基本培地）；約２〜約２０％、例えば、約１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、例えば、既知組成ウシ胎仔血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ）を含むＤＭＥＭ−ＨＧ（高グルコース）；約２〜約２０％、例えば、約１５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＧ；約２〜約２０％、例えば、約１０％のＦＢＳ、約２〜約２０％、例えば、約１０％のウマ血清、およびヒドロコルチゾンを含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地）；約２〜約２０％、例えば、約１０％のＦＢＳ、ＥＧＦ、およびヘパリンを含むＭ１９９；約２〜約２０％、例えば、約１０％のＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、およびゲンタマイシンを含むα−ＭＥＭ（基礎培地）；１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、およびゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ；約２〜約２０％、例えば、約１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（例えば、既知組成ウシ胎仔血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ）、抗生物質／抗真菌剤（例えば、約１００ユニット／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、および／または０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．））、および０．００１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．）を含むＤＭＥＭ−ＬＧ；２〜２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ベータ−メルカプトエタノールを追加したＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）−ＤＭＥＭ基本培地；ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物を追加したＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）基本培地；２〜２０％ＦＢＳを含むアルファ−ＭＥＭ；ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、アスコルビン酸、ＦＢＳ、ゲンタマイシンを追加したＥＢＭ２（商標）基本培地など。
【０１３０】
培地は、１つまたは複数の成分を追加することができ、その成分には、例えば、血清（例えば、ＦＣＳまたはＦＢＳ、例えば、約２〜２０％（ｖ／ｖ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ））；ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つまたは複数の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；ならびに、単独かまたは組合せのいずれかでの、例えば、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン硫酸塩、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチンなどの微生物汚染を制御するための１つまたは複数の抗生物質および／または抗真菌剤が挙げられる。
【０１３１】
羊膜由来接着細胞（ＡＭＤＡＣ）は、標準組織培養条件で、例えば、組織培養ディッシュまたはマルチウエルプレートにおいて、培養することができる。細胞はまた、懸滴培養を用いて培養することができる。この方法において、細胞を、約５ｍＬの培地中に１ｍＬあたり約１×１０４細胞で懸濁し、１滴または複数滴の培地を、組織培養容器、例えば、１００ｍＬのペトリ皿の蓋の内側に置く。液滴は、例えば、多チャンネルのピペッターからの、例えば、１滴または複数滴であり得る。蓋を注意深く逆さにし、ディッシュの底に接するように置き、そのディッシュは、多量の液体、例えば、ディッシュ雰囲気における含水量を維持するのに十分な無菌ＰＢＳを含んでおり、そして、細胞を培養する。ＡＭＤＡＣはまた、Ｔ−フラスコ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＹＰＥＲＦＬＡＳＫ（登録商標）、Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（Ｎｕｎｃ）、１−トレイ、２−トレイ、４−トレイ、１０−トレイ、または４０−トレイの細胞スタックなどの標準、または高容量、または高処理量培養システムで培養することができる。
【０１３２】
一実施形態において、羊膜由来接着細胞は、細胞において未分化表現型を維持するように働く化合物の存在下で培養される。具体的な実施形態において、その化合物は、置換型３，４−ジヒドロピリジモール［４，５−ｄ］ピリミジンである。より具体的な実施形態において、化合物は、以下の化学構造を有する化合物である：
【０１３３】
【化１】
0005869342.tif 000002
化合物を、羊膜由来接着細胞、またはそのような細胞の集団と、例えば、約１μＭから約１０μＭの間の濃度で接触させることができる。
【０１３４】
５．５．２  羊膜由来接着細胞の拡大および増殖
いったん、単離された羊膜由来接着細胞、またはそのような細胞の単離された集団（例えば、細胞または細胞集団がｉｎ  ｖｉｖｏで通常、付随している羊膜細胞の少なくとも５０％から分離した羊膜由来接着細胞、またはそのような細胞の集団）が得られたならば、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖および拡大することができる。例えば、接着細胞または羊膜由来接着細胞の集団は、組織培養容器、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウエルプレートなどの中で、４０〜７０％コンフルエンスまで、すなわち、細胞およびそれらの子孫が組織培養容器の培養表面積の４０〜７０％を占有するまで、細胞が増殖するのに十分な時間、培養することができる。
【０１３５】
羊膜由来接着細胞は、細胞増殖を可能にする密度で培養容器内に播種することができる。例えば、細胞を低密度（例えば、約４００〜約６，０００細胞／ｃｍ２）〜高密度（例えば、約２０，０００細胞／ｃｍ２以上）で播種してもよい。好ましい実施形態において、細胞は、空気中約０体積％〜約５体積％のＣＯ２で培養される。いくつかの好ましい実施形態において、細胞は、空気中約０．１％〜約２５％のＯ２、好ましくは、空気中約５％〜約２０％のＯ２で培養される。細胞は、好ましくは、約２５℃〜約４０℃、好ましくは約３７℃で培養される。
【０１３６】
細胞は、好ましくは、インキュベーター内で培養される。培養中、培地は、静置であり得、または、例えばバイオリアクタを用いる培養の間、撹拌され得る。羊膜由来接着細胞を、好ましくは、低酸化ストレス下で（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインなどを添加して）増殖させる。
【０１３７】
羊膜由来接着細胞をコンフルエンスまで増殖させてもよいが、好ましくは、細胞をコンフルエンスまで増殖させない。例えば、いったん４０％〜７０％コンフルエンスが得られたならば、細胞を継代してもよい。例えば、細胞を、それらを組織培養表面から分離するために、当技術分野において周知の技術を用いて、酵素処理する、例えば、トリプシン処理することができる。ピペッティングによって細胞を取り出し、細胞の数を数えた後、約２０，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ２、好ましくは、約５０，０００細胞／ｃｍ２、または約４００〜約６，０００細胞／ｃｍ２を、新鮮な培地を含む新しい培養容器へ継代することができる。典型的には、新しい培地は、その細胞が取り出された培地と同じ型である。羊膜由来接着細胞は、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、または２０回、またはそれ以上、継代することができる。ＡＭＤＡＣは、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回、４１回、４２回、４３回、４４回、４５回、４６回、４７回、４８回、４９回、または少なくとも５０回、またはそれ以上、培養中に倍加することができる。
【０１３８】
５．６  羊膜由来接着細胞の保存
羊膜由来接着細胞は、例えば、本明細書に記載された組成物の収集中、または組成物の作製前に、例えば、本明細書に記載された方法を用いて、保存することができる、すなわち、長期貯蔵を可能にする条件、または、例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を抑制する条件下に置くことができる。
【０１３９】
羊膜由来接着細胞は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号に記載されているように、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、および／または酸素運搬パーフルオロカーボンを含む組成物を用いて、保存することができ、その特許出願の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。一実施形態において、そのような細胞、またはそのような細胞の集団を保存する方法は、前記細胞または細胞集団を、アポトーシス阻害剤および酸素運搬パーフルオロカーボンを含む細胞収集組成物と接触させる段階であって、前記アポトーシス阻害剤が、アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較して細胞集団においてアポトーシスを低減または阻止するのに十分な量および時間、存在する、段階を含む。具体的な実施形態において、前記アポトーシス阻害剤はカスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態において、前記アポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤である。より具体的な実施形態において、前記ＪＮＫ阻害剤は、羊膜由来接着細胞の分化または増殖を調節しない。別の実施形態において、前記細胞収集組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素運搬パーフルオロカーボンを別々の相で含む。別の実施形態において、前記細胞収集組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素運搬パーフルオロカーボンを乳濁液中に含む。別の実施形態において、細胞収集組成物は、追加として、乳化剤、例えば、レシチンを含む。別の実施形態において、前記アポトーシス阻害剤および前記パーフルオロカーボンは、細胞と接触する時点において約０℃から約２５℃の間である。別のより具体的な実施形態において、前記アポトーシス阻害剤および前記パーフルオロカーボンは、細胞と接触する時点において約２℃から約１０℃の間、または約２℃から約５℃の間である。別のより具体的な実施形態において、前記接触段階は、前記細胞集団の輸送中に行われる。別のより具体的な実施形態において、前記接触段階は、前記細胞集団を凍結融解中に行われる。
【０１４０】
羊膜由来接着細胞集団は、例えば、前記細胞の集団をアポトーシス阻害剤および臓器保存化合物と接触させる段階であって、前記アポトーシス阻害剤が、アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較して細胞集団においてアポトーシスを低減または阻止するのに十分な量および時間、存在する、段階を含む方法によって、保存することができる。具体的な実施形態において、臓器保存化合物は、ＵＷ溶液（米国特許第４，７９８，８２４号に記載されている；ＶｉａＳｐａｎとしても知られている；Ｓｏｕｔｈａｒｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４９（２）：２５１−２５７（１９９０）も参照）、またはＳｔｅｒｎら、米国特許第５，５５２，２６７号に記載された溶液である。別の実施形態において、前記臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、またはそれらの組合せである。別の実施形態において、細胞収集組成物は、追加として、２つの相の中かまたは乳濁液としてかのいずれかで、酸素運搬パーフルオロカーボンを含む。
【０１４１】
方法の別の実施形態において、羊膜由来接着細胞を、灌流中、アポトーシス阻害剤および酸素運搬パーフルオロカーボン、臓器保存化合物、またはそれらの組合せを含む細胞収集組成物と接触させる。別の実施形態において、羊膜由来接着細胞を、組織破壊、例えば、羊膜組織の酵素消化の工程中、そのような細胞収集組成物と接触させる。別の実施形態において、羊膜由来接着細胞を、組織破壊、例えば、羊膜組織の酵素消化による収集後、前記細胞収集組成物と接触させる。
【０１４２】
典型的には、羊膜由来接着細胞の収集、濃縮、および単離の間、低酸素および機械的ストレスによる細胞ストレスを最小または除去することが好ましい。それゆえに、方法の別の実施形態において、羊膜由来接着細胞、または羊膜由来接着細胞を含む細胞集団を、前記保存中、６時間未満、収集、濃縮、または単離の間、低酸素に曝し、低酸素条件は、例えば、通常の大気酸素濃度未満、正常な血液酸素濃度未満などである酸素濃度である。より具体的な実施形態において、前記細胞または前記細胞集団を、前記保存中、２時間未満、前記低酸素条件に曝す。別のより具体的な実施形態において、前記細胞または前記細胞の集団を、収集、濃縮、または単離の間、１時間未満、もしくは３０分間未満、前記低酸素条件に曝し、または低酸素条件に曝さない。別の具体的な実施形態において、前記細胞集団を、収集、濃縮、または単離の間、ずり応力に曝さない。
【０１４３】
羊膜由来接着細胞は、一般的に、または本明細書に開示された特定の方法によって、例えば、小さい容器、例えば、アンプル内の凍結保存媒体中に、凍結保存することができる。適切な凍結保存媒体として、例えば増殖培地を含む培地、または細胞凍結媒体、例えば、市販されている細胞凍結媒体、例えば、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｃ２６９５、Ｃ２６３９（ＤＭＳＯを含まないＣｅｌｌ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ＩＸ）、またはＣ６０３９（基礎培地、グリセロール、仔ウシ血清、およびウシ血清を含むＣｅｌｌ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｇｌｙｃｏｅｒｏｌ  １×）、Ｌｏｎｚａ  ＰＲＯＦＲＥＥＺＥ（商標）２×媒体、メチルセルロース、デキストラン、ヒト血清アルブミン、ウシ胎仔血清、仔ウシ胎児血清、またはＰｌａｓｍａｌｙｔｅが挙げられるが、それらに限定されない。凍結保存媒体は、好ましくは、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはグリセロールを、例えば、約１％〜約２０％、例えば、約５％〜１０％（ｖ／ｖ）の濃度で含み、任意で、ウシ胎仔血清またはヒト血清を含んでもよい。凍結保存媒体は、追加の作用物質、例えば、メチルセルロースおよび／またはグリセロールを含んでもよい。単離された羊膜由来接着細胞を、好ましくは、凍結保存中、約１℃／分で冷却する。好ましい凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃、好ましくは約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存細胞は、使用のための解凍前に液体窒素の気相に移すことができる。いくつかの実施形態において、例えば、いったんアンプルが約−８０℃に達したならば、それらを液体窒素貯蔵場所へ移す。凍結保存はまた、制御速度フリーザーを用いて行うことができる。凍結保存細胞を、好ましくは、約２５℃〜約４０℃の温度で、好ましくは約３７℃の温度までで解凍する。
【０１４４】
５．７  羊膜由来接着細胞のバンクの作製
羊膜由来接着細胞を、いくつかの異なる方法で培養し、そのような細胞のロットの１セット、例えば、個々に投与可能な用量の１セットを作製することができる。複数の胎盤から得られる血管新生性羊膜細胞のロットのセットは、細胞バンクにおいて、例えば、長期貯蔵として準備することができる。一般的に、羊膜由来接着細胞は、種培養物を形成するための最初の細胞培養物から得られ、その種培養物は、制御条件下で、およそ同等数回の倍加から細胞集団を形成するように拡大される。ロットは、好ましくは、単一の胎盤の組織に由来するが、複数の胎盤の組織に由来し得る。
【０１４５】
１つの非限定的実施形態において、羊膜由来接着細胞のロットまたは用量は以下のように得られる。まず、羊膜組織を破壊し、例えば、上記のセクション５．４．３に記載されているように、連続的なトリプシン消化およびコラゲナーゼ消化を用いて消化させる。コラゲナーゼ消化組織由来の細胞を、例えば、約１〜３週間、好ましくは約２週間、培養する。非接着細胞の除去後、形成する高密度コロニーを、例えば、トリプシン処理によって収集する。これらの細胞を収集し、都合良い容量の培地中に再懸濁し、継代数０の細胞と定義する。
【０１４６】
その後、継代数０の細胞を、拡大培養に播種するのに用いることができる。拡大培養は、別個の細胞培養装置、例えば、ＮＵＮＣ（商標）によるＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙの任意の配置であり得る。継代数０培養物における細胞は、例えば、１×１０３個、２×１０３個、３×１０３個、４×１０３個、５×１０３個、６×１０３個、７×１０３個、８×１０３個、９×１０３個、１×１０４個、１×１０４個、２×１０４個、３×１０４個、４×１０４個、５×１０４個、６×１０４個、７×１０４個、８×１０４個、９×１０４個、または１０×１０４個の接着細胞を拡大培養に播種するために、任意の程度に細分することができる。好ましくは、約１×１０３個から約３×１０４個までの継代数０細胞が、各拡大培養に播種するのに用いられる。拡大培養の回数は、継代数０細胞の数に依存し得、接着細胞が得られた特定の胎盤（複数可）に依存して数がより多くなったり少なくなったりすることがある。
【０１４７】
その後、拡大培養は、培養中の細胞密度が特定の値、例えば、約１×１０５細胞／ｃｍ２に達するまで増殖することができる。細胞は、この時点で収集して凍結保存するか、または上記のように新しい拡大培養へ継代するかのいずれかであり得る。細胞は、使用前に、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、または２０回、継代することができる。集団倍加の累積数の記録は、好ましくは、拡大培養（複数可）中、維持される。継代数０培養物由来の細胞は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１２回、１４回、１６回、１８回、２０回、２２回、２４回、２６回、２８回、３０回、３２回、３４回、３６回、３８回、または４０回の倍加、または６０回の倍加までの間、拡大することができる。しかしながら、好ましくは、個人用量へ細胞集団を分割する前の集団倍加の数は、約１５回倍加から約３０回倍加の間である。細胞は、拡大工程を通して連続的に培養することができ、または拡大中の１点または複数点において凍結することができる。
【０１４８】
個人用量に用いられるべき細胞は、後での使用のために凍結、例えば、凍結保存することができる。個人用量は、例えば、１ｍＬあたり約１００万〜約５千万細胞を含むことができ、全部で約１０６細胞から約１０１０細胞の間を含むことができる。
【０１４９】
したがって、一実施形態において、羊膜由来接着細胞を含む細胞バンクは、ヒト分娩後胎盤由来の初代培養羊膜由来接着細胞を第１の複数回の集団倍加の間、拡大する段階、その細胞を凍結保存してマスター細胞バンクを形成する段階、任意で、マスター細胞バンク由来の複数の細胞を第２の複数回の集団倍加の間、拡大する段階、拡大された細胞を凍結保存してワーキング細胞バンクを形成する段階、任意で、ワーキング細胞バンク由来の複数の拡大された羊膜由来接着細胞を第３の複数回の集団倍加の間、拡大する段階、および生じる拡大された細胞を個人用量で凍結保存する段階であって、前記個人用量は集団的に細胞バンクを構成する、段階を含む方法によって作製することができる。バンクは、羊膜由来接着細胞単独の用量もしくはロットを含むことができ、または羊膜由来接着細胞のロットと、別の種類の細胞、例えば、別の種類の幹細胞もしくは前駆細胞のロットもしくは用量との組合せを含むことができる。好ましくは、各個人用量は、羊膜由来接着細胞のみを含む。別の具体的な実施形態において、前記初代培養における前記細胞の全部が同じ胎盤由来である。別の具体的な実施形態において、前記個人用量は、約１０４〜約１０５細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個人用量は、約１０５〜約１０６細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個人用量は、約１０６〜約１０７細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個人用量は、約１０７〜約１０８細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個人用量は、約１０８〜約１０９細胞を含む。別の具体的な実施形態において、前記個人用量は、約１０９〜約１０１０細胞を含む。
【０１５０】
特定の実施形態において、羊膜由来接着細胞は、ワーキング細胞バンクから解凍し、複数回の集団倍加の間、培養することができる。所望の数の細胞が生成した、または所望の数の集団倍加が起こったとき、接着細胞を、例えば、遠心分離によって収集し、例えば、デキストラン、例えば、５％デキストランを含む溶液中に再懸濁することができる。特定の実施形態において、デキストランはデキストラン４０である。特定の実施形態において、細胞を、２度目に収集し、デキストランおよび凍結保存剤、例えば、１０％ＨＳＡおよび２％〜２０％、例えば５％ＤＭＳＯを含む５％デキストラン（例えば、デキストラン−４０）溶液を含む溶液中に再懸濁し、凍結保存する。凍結保存された羊膜由来接着細胞は、例えば、使用直前に、解凍することができる。
【０１５１】
好ましい実施形態において、胎盤が得られたドナー（例えば、母親）を少なくとも１つの病原体について検査する。特定の実施形態において、母親が検査された病原体について陽性であると判定された場合には、その胎盤由来の全ロットは廃棄される。そのような検査は、継代数０細胞の樹立前もしくは樹立後、または拡大培養中を含む、羊膜由来接着細胞のロットの作製中のいかなる時点でも行うことができる。存在が検査される病原体としては、非限定的に、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどを挙げることができる。
【０１５２】
５．８  羊膜由来接着細胞の使用
羊膜由来接着細胞を含む組成物を本明細書で提供する。そのような組成物の例としては、医薬組成物（下の５．８．１項参照）；マトリックスおよびスキャフォールド（下の５．８．２項参照）ならびに羊膜由来接着細胞により条件づけられた培地（下の５．８．３項参照）などがある。
【０１５３】
５．８．１  羊膜由来接着細胞を含む組成物
特定の実施形態において、羊膜由来接着細胞は、医薬組成物中に含まれている、または医薬組成物の成分である。細胞は、個体に容易に投与することができる形で、例えば、医学的用途に適した容器内に含まれている羊膜由来接着細胞として準備することができる。そのような容器は、例えば、注射器、滅菌済みプラスチックバッグ、フラスコ、ジャーまたはアニオン（anion）由来血管新生細胞集団を容易に分配することができる他の容器であってよい。例えば、容器は、血液バッグまたはレシピエントへの液体の静脈内投与に適する他のプラスチック製の医学的に許容されるバッグであってよい。容器は、特定の実施形態において、細胞の凍結保存を可能にするものである。本明細書で提供する組成物、例えば、医薬組成物中の細胞は、単一ドナーまたは複数のドナーに由来する羊膜由来接着細胞を含み得る。細胞は、意図するレシピエントと完全にＨＬＡ一致、または部分的にもしくは完全にＨＬＡ不一致であり得る。
【０１５４】
したがって、一実施形態において、本明細書で提供する組成物中の羊膜由来接着細胞は、容器に入れた羊膜由来接着細胞を含む組成物の形でそれを必要とする個体に投与する。他の具体的な実施形態において、容器は、バッグ、フラスコまたはジャーである。より具体的な実施形態において、前記バッグは、滅菌済みプラスチックバッグである。より具体的な実施形態において、前記バッグは、例えば、静脈内注入、ボーラス注射などによる前記接着細胞の静脈内投与に適する、可能にするまたは容易にする。バッグは、投与前または投与中に細胞と１つまたは複数の他の溶液、例えば、薬物との混合を可能にするために相互に接続されている複数の内腔または区画を含み得る。他の具体的な実施形態において、凍結保存前に、羊膜由来接着細胞を含む溶液は、細胞の凍結保存を促進する１つまたは複数の化合物を含む。他の具体的な実施形態において、前記羊膜由来接着細胞は、生理学的に許容される水溶液中に含まれている。より具体的な実施形態において、前記生理学的に許容される水溶液は、０．９％ＮａＣｌ溶液である。他の具体的な実施形態において、前記羊膜由来接着細胞は、前記細胞のレシピエントとＨＬＡが一致している胎盤細胞を含む。他の具体的な実施形態において、前記羊膜由来接着細胞は、前記細胞のレシピエントと少なくとも部分的にＨＬＡが不一致である細胞を含む。他の具体的な実施形態において、前記羊膜由来接着細胞は、複数のドナーに由来している。様々な具体的な実施形態において、前記容器は、約、少なくとも、または多くても１×１０６個の前記細胞、５×１０６個の前記細胞、１×１０７個の前記幹細胞、５×１０７個の前記細胞、１×１０８個の前記細胞、５×１０８個の前記細胞、１×１０９個の前記細胞、５×１０９個の前記細胞、１×１０１０個の前記細胞を含む。前述の凍結保存集団のいずれかの他の具体的な実施形態において、前記細胞は、約、少なくとも、またはわずか５回、わずか１０回、わずか１５回、またはわずか２０回継代された。前述の凍結保存集団のいずれかの他の具体的な実施形態において、前記細胞は、前記容器中で増殖させた。具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞の単一単位用量は、様々な実施形態において、約、少なくとも、またはわずか１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個またはそれ以上の羊膜由来接着細胞を含み得る。
【０１５５】
特定の実施形態において、本明細書で提供する医薬組成物は、５０％の生存細胞またはそれ以上を含む羊膜由来接着細胞の集団（すなわち、集団における細胞の少なくとも５０％が機能し得るまたは生存している）を含む。好ましくは、集団における細胞の少なくとも６０％が生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団における細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が生存可能である。
【０１５６】
５．８．２  羊膜由来接着細胞を含むマトリックス
マトリックス、ヒドロゲル、スキャフォールドおよび同類のものを含む組成物を本明細書でさらに提供する。そのような組成物は、液体懸濁液中のそのような細胞の代わりにまたはそれに加えて用いることができる。
【０１５７】
マトリックスは、例えば、恒久的または分解性脱細胞化組織、例えば、脱細胞化羊膜または合成マトリックスであってよい。マトリックスは、３次元スキャフォールドであってよい。より具体的な実施形態において、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチンまたはビトロネクチンを含む。他のより具体的な実施形態において、マトリックスは、羊膜または羊膜由来生体材料である。他のより具体的な実施形態において、前記マトリックスは、細胞外膜タンパク質を含む。他のより具体的な実施形態において、前記マトリックスは、合成化合物を含む。他のより具体的な実施形態において、前記マトリックスは、生物活性化合物を含む。他のより具体的な実施形態において、前記生物活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体または５０００ダルトン未満の有機分子である。
【０１５８】
本明細書で述べる羊膜由来接着細胞は、天然マトリックス、例えば、羊膜物質などの胎盤生体材料上に播種することができる。そのような羊膜物質は、例えば、哺乳類胎盤から直接切り離された羊膜、固定または熱処理された羊膜、実質的に乾燥した（すなわち、＜２０％Ｈ２Ｏ）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜および絨毛膜などであってよい。本明細書で提供する羊膜由来接着細胞を播種することができる好ましい胎盤生体材料は、その開示が参照によりその全体として本明細書に組み込まれているＨａｒｉｒｉ、米国出願公開第２００４／００４８７９６号に記載されている。
【０１５９】
別の具体的な実施形態において、マトリックスは、細胞外マトリックスを含む組成物である。より具体的な実施形態において、前記組成物は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。
【０１６０】
本明細書で述べる単離された羊膜由来接着細胞は、例えば、注射に適したヒドロゲル溶液中に懸濁させることができる。ヒドロゲルは、例えば、共有、イオンまたは水素結合により架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する３次元解放格子構造を生ずる有機ポリマー（天然または合成）である。そのような組成物に適したヒドロゲルは、ＲＡＤ１６などの自己集合性ペプチドを含む。一実施形態において、細胞を含むヒドロゲル溶液は、例えば、型中で硬化させて、移植のためにその中に分散した細胞を有するマトリックスを形成することができる。そのようなマトリックス中の羊膜由来接着細胞は、例えば、移植の前に有糸分裂により増殖させるように培養することもできる。ヒドロゲル形成材料としては、アルギン酸などの多糖とその塩、ペプチド、ポリホスファジン、およびイオン的に架橋したポリアクリル酸エステル、またはそれぞれ温度もしくはｐＨにより架橋するポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックコポリマーなどがある。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルまたはマトリックスは、生分解性である。
【０１６１】
特定の実施形態において、本明細書で提供する細胞を含む組成物は、ｉｎ  ｓｉｔｕ重合性ゲルを含む（例えば、米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号；Ansethら、J. Control Release、７８巻（１〜３号）、１９９〜２０９頁（２００２年）；Wangら、Biomaterials、２４巻（２２号）、３９６９〜８０頁（２００３年）を参照）。いくつかの実施形態において、ポリマーは、水、緩衝塩溶液、または荷電側基を有するアルコール水溶液などの水溶液に少なくとも部分的に溶けるか、あるいはその一価イオン性塩である。陽イオンと反応させることができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリホスファゼン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリビニル酢酸、スルホン酸化ポリスチレンなどのスルホン酸化ポリマーである。アクリルもしくはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーもしくはポリマーとの反応によって生成する酸性側基を有するコポリマーも用いることができる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基および酸性ＯＨ基である。
【０１６２】
具体的な実施形態において、マトリックスは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくは混合物、またはヒアルロン酸製の多繊維糸から構成されていてよい、フェルトである。糸は、クリンピング、裁断、カーディングおよびニードリングからなる標準繊維加工技術を用いてフェルトにすることができる。他の好ましい実施形態において、本発明の細胞を、複合構造であってよい泡状スキャフォールド上に播種する。さらに、３次元フレームワークは、矯正、置換または補強すべき体内の特定の構造のような有用な形状に成形することができる。用いることができるスキャフォールドの他の例としては、不織マット、多孔性発泡体または自己集合性ペプチドなどがある。不織マットは、グリコールおよび乳酸の合成吸収性コポリマーからなる繊維（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）を用いて形成することができる。凍結乾燥法または凍結乾燥などの方法により形成される、例えば、ポリε−カプロラクトン／ポリグリコール酸（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなる発泡体（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号参照）もスキャフォールドとして用いることができる。
【０１６３】
本明細書で述べる羊膜由来接着細胞は、３次元フレームワークまたはスキャフォールド上に播種し、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植することができる。そのようなフレームワークは、例えば、組織形成、例えば、骨形成または血管系の形成を刺激する１つまたは複数の増殖因子、細胞、薬物または他の成分と組み合わせて移植することができる。
【０１６４】
本明細書で提供する胎盤羊膜由来接着細胞は、他の実施形態において、複合構造であってよい泡状スキャフォールド上に播種することができる。そのような泡状スキャフォールドは、矯正、置換または補強すべき体内の特定の構造の一部のような有用な形状に成形することができる。いくつかの実施形態において、フレームワークは、細胞の付着を促進するために、細胞の播種の前に例えば、０．１Ｍ酢酸で処理した後、ポリリシン、ＰＢＳおよび／またはコラーゲン中でインキュベートする。マトリックスの外表面は、マトリックスをプラズマコーティングすること、あるいは１つもしくは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）、細胞マトリックスおよび／または例えば、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロースおよび植物ゴムなどであるが、これらに限定されない他の物質を添加することなどにより、細胞の付着または増殖および組織の分化を改善するために修飾することができる。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、マトリックスは、それを非トロンボゲン形成性にする物質を含む、またはそれにより処理する。これらの処理および物質は、内皮の増殖、移動および細胞外マトリックス沈着を促進し、持続させる可能性もある。これらの物質および処理の例は、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質などの天然物質、ＥＰＴＦＥおよびＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．）などのセグメント化ポリウレタン尿素シリコーンなどの合成物質を含むが、これらに限定されない。マトリックスは、ヘパリンなどの抗血栓薬も含んでいてよく、スキャフォールドは、本明細書で提供する接着細胞を播種する前に表面電荷を変化させるために処理することもできる（例えば、プラズマによるコーティング）。
【０１６６】
フレームワークは、細胞の付着を促進するために本明細書で提供する羊膜由来接着細胞を播種する前に処理することができる。例えば、本発明の細胞の播種の前に、ナイロンマトリックスを０．１モルの酢酸で処理し、ポリリシン、ＰＢＳおよび／またはコラーゲン中でインキュベートして、ナイロンを被覆することができた。硫酸を用いてポリスチレンを同様に処理することができる。
【０１６７】
さらに、３次元フレームワークの外表面は、フレームワークをプラズマコーティングすること、あるいは１つもしくは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）、細胞マトリックスおよび／または例えば、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロースおよび植物ゴムなどであるが、これらに限定されない他の物質を添加することなどにより、細胞の付着または増殖および組織の分化を改善するために修飾することができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、マトリックスは、マトリックスを非トロンボゲン形成性にする物質、例えば、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質などの天然物質、ならびにｅＰＴＦＥまたはＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．）などのセグメント化ポリウレタン尿素シリコーンなどの合成物質を含むか、またはそれらにより処理する。そのような材料は、スキャフォールドを非トロンボゲン形成性にするために例えば、ヘパリン、およびプラズマコーティングなどの材料の表面電荷を変化させる処理によりさらに処理することができる。
【０１６９】
羊膜由来接着細胞を含む治療用細胞組成物は、マトリックス−細胞複合体の形で提供することもできる。マトリックスは、生体吸収性であるか否か、液体、ゲルまたは固体であるかどうかを問わず、生体適合性のスキャフォールド、格子、自己集合性構造および同類のものを含み得る。そのようなマトリックスは、治療的細胞処理、外科的修復、組織エンジニアリングおよび創傷治癒の技術分野において公知である。特定の実施形態において、細胞は、マトリックスに接着している。他の実施形態において、細胞は、マトリックス空隙内に捕捉または含まれている。最も好ましいものは、細胞がマトリックスに密接に関連して増殖し、治療的に用いる場合、レシピエントの細胞の内方増殖を刺激し、支持する、あるいは血管新生を刺激または支持するマトリックス−細胞複合体である。マトリックス−細胞組成物は、移植、注射、外科的接着、他の組織との移植、注射などを含むが、これらに限定されない当技術分野で公知のいずれかの方法で個体の体内に導入することができる。いくつかの実施形態において、マトリックスは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで生じる。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ重合性ゲルを本発明により用いることができる。そのようなゲルの例は、当技術分野で公知である。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、播種された細胞がフレームワーク上または内で増殖し得るか、または他の細胞の協力によりもしくは協力なしにｉｎ  ｖｉｖｏで置換組織を定着させる助けとなり得る場合、本明細書で提供する細胞をスキャフォールドなどの、そのような３次元マトリックス上に播種し、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植する。３次元フレームワーク上の羊膜由来接着細胞またはその共培養の増殖は、好ましくは、例えば、損傷または罹患組織の修復のためにｉｎ  ｖｉｖｏで利用することができる、３次元組織またはその基礎の形成をもたらす。例えば、３次元スキャフォールドは、例えば、血管の修復；または循環系もしくは冠構造の態様に用いる管構造を形成するのに用いることができる。本発明の一態様によれば、羊膜由来接着細胞またはその共培養をスキャフォールド、発泡体またはヒドロゲルなどの３次元フレームワークまたはマトリックス上に接種または播種する。フレームワークは、一般的に平面、一般的に円筒形または管状などの様々な形状に構成することができ、あるいは考慮中の矯正構造に要求または求められるような完全に自由な形状であってよい。いくつかの実施形態において、羊膜由来接着細胞は、３次元構造上で増殖するが、他の実施形態において、細胞は、生存するのみ、または死滅さえするが、レシピエントにおける新たな組織の内方増殖または血管発生を刺激または促進する。
【０１７１】
本発明の細胞は、培養で自由に増殖させ、培養から除去し、３次元フレームワーク上に接種することができる。ある濃度の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約１０６〜５×１０７個細胞の３次元フレームワークへの接種は、好ましくは比較的短期間で３次元担持の確立をもたらす。さらにいくつかの適用において、所望の結果によってより多数またはより少数の細胞を使用することが好ましい可能性がある。
【０１７２】
具体的な実施形態において、マトリックスは、幅がそれが最終的に挿入される管状器官の内周にほぼ等しい条片（例えば、形状が矩形）に切断することができる。羊膜由来接着細胞は、スキャフォールド上に接種し、液体培地中に浮遊または懸濁させることによりインキュベートすることができる。融合の適切な段階で、長辺を合わせることによりスキャフォールドを丸めて管にすることができる。適切な径の適切な材料の繊維を用いて２辺を縫い合わせることによって閉じ目を閉鎖することができる。細胞が内腔を閉塞することを防ぐために、管状フレームワークの解放端の１つをノズルに取り付けることができる。液体培地を、インキュベーションチャンバーに接続した供給源チャンバーからノズルに強制的に通して、管状フレームワークの内側を通る流れを作りだすことができる。他の解放端は、培地を収集チャンバーから供給源チャンバーを経て再循環することができる該収集チャンバーに入る流出開口部に取り付けることができる。管は、インキュベーションが完了したときに、ノズルおよび流出開口部から取り外すことができる。例えば、国際出願番号ＷＯ９４／２５５８４を参照のこと。
【０１７３】
一般的に、次の方法のいずれかを用いて２つの３次元フレームワークを組み合わせて本発明による管にすることができる。２つまたはそれ以上の平らなフレームワークを他の上に置き、縫い合わせる。得られた２層シートを丸め、上述のように合わせ、固定する。特定の実施形態において、内層とする１つの管状スキャフォールドに羊膜由来接着細胞を接種し、インキュベートすることができる。第２のスキャフォールドは、管状フレームワークの外周よりわずかに大きい幅を有する平らな条片として成長させることができる。適切な成長が達成された後、平らなフレームワークを管状スキャフォールドの外側に巻きつけた後、平らなフレームワークの２つの端の閉じ目を閉鎖し、平らなフレームワークを内側の管に固定する。他の実施形態において、２つまたはそれ以上の、径のわずかに異なる管状網を別個に成長させることができる。より小さい径を有するフレームワークをより大きいものの内側に挿入することができる。これらの方法のそれぞれについて、二重の層の管に方法を再適用することによって追加の層を加えることができる。スキャフォールドは、羊膜由来接着細胞の増殖の任意の段階で結合させることができ、所望の場合、結合したスキャフォールドのインキュベーションを継続することができる。
【０１７４】
上のことと関連して、本明細書で提供する細胞および治療用組成物は、埋め込み型機器とともに用いることができる。例えば、羊膜由来接着細胞は、例えば、ステント、人工弁、心室補助機器、ググリエルミ（Guglielmi）デタッチャブルコイルなどと併用投与することができる。機器は、そのような療法を必要とする個体に提供される主要な療法を構成するので、細胞および同類のものは、埋め込まれた機器の領域における適切な治癒を助ける、刺激する、または促進するための支持または二次療法として用いることができる。本発明の細胞および治療用組成物は、埋め込み型機器をｉｎ  ｖｉｖｏで用いる場合の問題を最小限にするために、特定の埋め込み型機器を前処理するのにも用いることができる。被覆機器を含む、そのような前処理済み機器は、それらの埋め込みを受ける患者における忍容性がより良好であり、局所もしくは全身感染、または例えば、血管の再狭窄もしくはさらなる閉塞のリスクが低い可能性がある。
【０１７５】
５．８．３  羊膜由来接着細胞により条件づけられた培地
羊膜由来接着細胞により条件づけられた培地、すなわち、該接着細胞により分泌または排泄された１つまたは複数の生体分子を含む培地を本明細書でさらに提供する。様々な実施形態において、条件づけ培地は、細胞が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間もしくはそれ以上、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０集団倍加、もしくはそれ以上増殖した培地を含む。他の実施形態において、条件づけ培地は、羊膜由来接着細胞が少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の密集度に、または１００％の密集度まで増殖した培地を含む。そのような条件づけ培地は、細胞、例えば、幹細胞、例えば、胎盤幹細胞、胚幹細胞、胚生殖細胞、成人幹細胞または同類のものの集団の培養を支持するために用いることができる。他の実施形態において、条件づけ培地は、羊膜由来接着細胞および羊膜由来接着細胞でない細胞が一緒に培養された培地を含む。
【０１７６】
条件づけ培地は、本明細書で提供する接着細胞を含み得る。したがって、羊膜由来接着細胞を含む細胞培養を本明細書で提供する。具体的な実施形態において、条件づけ培地は、複数、例えば、羊膜由来接着細胞の集団を含む。
【０１７７】
５．９  改変羊膜由来接着細胞
５．９．１  遺伝的に改変された羊膜由来接着細胞
別の態様において、本明細書で述べる羊膜由来接着細胞は、例えば、対象の核酸もしくはポリペプチドを産生するように、または対象の核酸もしくはポリペプチドを産生する分化細胞、例えば、骨形成細胞、筋細胞、周皮細胞もしくは血管新生細胞を発生させるように遺伝的に改変することができる。例えば、羊膜由来接着細胞は、血管新生促進分子、可溶性因子などの血管新生因子ならびにケモカイン、例えば、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）またはケモカイン受容体などの受容体または移動促進分子を産生するように改変することができる。遺伝子改変は、例えば、非組込み複製ベクター、例えば、乳頭腫ウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター；組込み複製ベクター、例えば、レトロウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベクター；または複製能欠損ウイルスベクターを含むが、これらに限定されないウイルスに基づくベクターを用いて達成することができる。ＤＮＡを細胞に導入する他の方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、粒子銃の使用、直接ＤＮＡ注入などを含む。
【０１７８】
本明細書で提供する接着細胞は、１つまたは複数の適切な発現制御エレメント、例えば、プロモーターもしくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、内部リボソームエントリー部位により制御された、またはそれらと有効に関連したＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトすることができる。好ましくは、そのようなＤＮＡは、選択できるマーカーを組み込んでいる。外来ＤＮＡの導入後に、遺伝子組換え接着細胞は、例えば、富化培地中で増殖させ、次いで選択培地に切替えることができる。一実施形態において、羊膜由来接着細胞を遺伝子工学により改変するのに用いるＤＮＡは、対象のポリペプチド、例えば、サイトカイン、増殖因子、分化剤または治療用ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１７９】
該接着細胞を遺伝子工学により改変するのに用いるＤＮＡは、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞におけるヌクレオチド配列の発現を促進するための当技術分野で公知の任意のプロモーターを含む。例えば、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、乳頭腫ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルスプロモーター、エラスチン遺伝子プロモーターなどを含むが、これらに限定されない。具体的な実施形態において、プロモーターは、ヌクレオチド配列が所望の場合にのみ発現するように調節可能である。プロモーターは、誘導性（例えば、メタロチオネインおよび熱ショックタンパク質に関連するもの）または構成的であり得る。
【０１８０】
別の具体的な実施形態において、プロモーターは、組織特異的であり、または組織特異性を示す。そのようなプロモーターの例は、ミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Shani、１９８５年、Nature、３１４巻、２８３頁）（骨格筋）を含むが、それに限定されない。
【０１８１】
本明細書で開示する羊膜由来接着細胞は、そのような細胞における１つまたは複数の遺伝子の発現を「ノックアウト」または「ノックダウン」するために遺伝子工学により改変するか、別の方法で選択することができる。細胞に固有の遺伝子の発現は、例えば、相同組換えにより遺伝子を完全に不活性化することによる発現の阻害により減少させることができる。一実施形態において、例えば、タンパク質の重要な領域をコードするエキソン、または当領域の５’側のエキソンは、標的遺伝子からの正常ｍＲＮＡの産生を妨げ、該遺伝子の不活性化をもたらす正の選択可能マーカー、例えば、ｎｅｏによって中断される。遺伝子は、遺伝子の一部における欠失をつくることによっても、または遺伝子全体を欠失させることによっても不活性化することができる。ゲノムにおいて遠く離れた標的遺伝子と相同の２つの領域を有する構築物を用いることにより、２つの領域の間にある配列を欠失させることができる（Mombaertsら、１９９１年、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、８８巻、３０８４頁）。標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、モルホリノ、ＤＮＡザイム、小干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡおよびリボザイム分子も接着細胞における標的遺伝子活性のレベルを低下させるのに用いることができる。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫応答に関して最も万能であることが示された。三重らせん分子は、標的遺伝子活性のレベルを低下させるのに用いることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、L. G. Davisら（編）、１９９４年、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、第２版、Appleton & Lange、Norwalk、Conn.を参照のこと。
【０１８２】
具体的な実施形態において、本明細書で開示する羊膜由来接着細胞は、対象のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を用いて遺伝子組換えを行うことができ、この場合、対象のポリペプチドの発現は、外因性因子、例えば、ポリペプチド、小有機分子などにより制御可能である。対象のポリペプチドは、治療用ポリペプチドであってよい。より具体的な実施形態において、対象のポリペプチドは、ＩＬ−１２またはインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）である。他のより具体的な実施形態において、対象のポリペプチドは、インターロイキン１受容体アンタゴニストとジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）との融合体であり、外因性因子は、抗葉酸剤、例えば、メトトレキサートである。そのような構築物は、メトトレキサートとの接触により、ＩＬ−１ＲａまたはＩＬ−１ＲａとＤＨＦＲとの融合体を発現する羊膜由来接着細胞の遺伝子組換えに有用である。そのような構築物は、例えば、慢性関節リウマチの治療に用いることができる。この実施形態において、ＩＬ−１ＲａとＤＨＦＲとの融合体は、メトトレキサートなどの抗葉酸剤への曝露により翻訳段階で上方制御される。したがって、他の具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞を遺伝子工学により改変するのに用いる核酸は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいてよく、前記第１および第２のポリペプチドは、外因性因子の存在下で翻訳段階で上方制御される融合タンパク質として発現する。ポリペプチドは、一時的または長期に（例えば、数週間または数カ月間にわたり）発現させることができる。そのような核酸分子は、遺伝子組換え細胞の正の選択を可能にする、または遺伝子組換え細胞の視覚化を可能にするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。他のより具体的な実施形態において、該ヌクレオチド配列は、例えば、適切な視覚化条件下で蛍光性であるポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする。より具体的な実施形態において、そのような核酸分子は、ＩＬ−１Ｒａ−ＤＨＦＲ−ＩＲＥＳ−Ｌｕｃを含んでいてよく、ＩＬ−１Ｒａは、インターロイキン１受容体アンタゴニストであり、ＩＲＥＳは、内部リボソームエントリー部位であり、ＤＨＦＲは、ジヒドロ葉酸レダクターゼである。
【０１８３】
５．９．２  不死化羊膜由来接着細胞系
哺乳類羊膜由来接着細胞は、増殖促進タンパク質の産生および／または活性が外部要因によって調節可能であるように、増殖促進遺伝子、すなわち、適切な条件下でトランスフェクト細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の適切なベクターをトランスフェクトすることにより条件付きで不死化することができる。好ましい実施形態において、増殖促進遺伝子は、例えば、ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ポリオーマラージＴ抗原、Ｅ１ａアデノウイルスまたはヒト乳頭腫ウイルスのＥ７タンパク質などであるが、これらに限定されない癌遺伝子である。他の実施形態において、羊膜由来接着細胞は、Narushima M.ら（Nature Biotechnology、２００５年、２３（１０巻、１２７４〜１２８２頁）によってヒト膵β細胞系について例示されたように、ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えを用いて不死化することができる。
【０１８４】
増殖促進タンパク質の外部調節は、外部から調節可能なプロモーター、例えば、活性を、例えば、トランスフェクト細胞の温度または細胞と接触している培地の組成を加減することによって制御することができるプロモーターの制御下に増殖促進遺伝子をおくことによって達成することができる。一実施形態において、テトラサイクリン（ｔｅｔ）制御性遺伝子発現システムを用いることができる（Gossenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻、５５４７〜５５５１頁、１９９２年；Hoshimaruら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９３巻、１５１８〜１５２３頁、１９９６年を参照）。ｔｅｔが存在しない場合、このベクター内のｔｅｔ制御性トランス作用因子（ｔＴＡ）は、ｔｅｔオペレーター配列に融合されたヒトサイトメガロウイルスからの最小プロモーターであるｐｈＣＭＶ＊−１からの転写を強力に活性化する。ｔＴＡは、大腸菌（Escherichia coli）のトランスポゾン−１０−由来ｔｅｔ耐性オペロンのレプレッサー（ｔｅｔＲ）と単純疱疹ウイルスのＶＰ１６の酸性ドメインとの融合タンパク質である。ｔｅｔの低い非毒性濃度（例えば、０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ）は、ｔＴＡによるトランス活性化をほぼ完全に無効にする。
【０１８５】
一実施形態において、ベクターは、選択可能マーカー、例えば、薬物耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。細菌ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）は、本方法で用いることができる１つのそのようなマーカーである。ｎｅｏＲを有する細胞は、例えば、増殖培地への例えば、１００〜２００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８の添加などの当業者に公知の手段により選択することができる。
【０１８６】
トランスフェクションは、レトロウイルス感染を含むが、これに限定されない当業者に公知の様々な手段のいずれかにより達成することができる。一般的に、細胞培養は、ベクターのプロデューサー細胞系から収集された条件づけ培地とＮ２サプリメント含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２の混合物とともにインキュベートすることによってトランスフェクトすることができる。例えば、上述のように調製した胎盤細胞培養は、１容量の条件づけ培地と２容量のＮ２サプリメント含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で約２０時間インキュベートすることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで例えば、５日後に感染させることができる。次いで、選択可能マーカーを有するトランスフェクト細胞を上述のように選択することができる。
【０１８７】
トランスフェクションの後、培養を増殖を可能にする、例えば、細胞の少なくとも３０％が２４時間の期間に倍加することを可能にする表面上で継代させる。好ましくは、基質は、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）および／またはラミニン（１０μｇ／ｍＬ）を被覆した組織培養プラスチック、ポリリシン／ラミニン基質またはフィブロネクチンで処理した表面からなるポリオルニチン／ラミニン基質である。次いで、培養に３〜４日ごとに１つまたは複数の増殖促進因子を添加してもよくまたは添加しなくてもよい増殖培地を供給する。増殖促進因子は、培養が５０％未満の密集度である場合に増殖培地に加えることができる。
【０１８８】
条件付き不死化羊膜由来接着細胞系は、８０〜９５％の密集度である場合に、トリプシン処理によるなどの標準的な技術を用いて継代させることができる。継代数約２０まで、いくつかの実施形態では、選択を維持すること（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞についてはＧ４１８の添加により）が有益である。細胞は、長期保存のために液体窒素で凍結することもできる。
【０１８９】
クローン細胞系は、上述のように調製した条件付き不死化接着細胞系から単離することができる。一般的に、そのようなクローン細胞系は、限界希釈またはクローニングリングを用いるなどの標準的な技術を用いて単離し、拡大することができる。クローン細胞系は、上述のように一般的に補給し、継代することができる。
【０１９０】
クローニングすることができるが、その必要がない、条件付き不死化ヒト羊膜由来接着細胞系は、分化を促進する培養条件下で増殖促進タンパク質の産生および／または活性を抑制することにより、一般的に分化するように誘導することができる。例えば、増殖促進タンパク質をコードする遺伝子が外部から調節可能なプロモーターの制御下にある場合、増殖促進遺伝子の転写を抑制するために、条件、例えば、温度または培地の組成を修正することができる。上で述べたテトラサイクリン制御性遺伝子発現システムについては、分化は、増殖促進遺伝子の転写を抑制するためのテトラサイクリンの添加によって達成することができる。一般的に、４〜５日間にわたる１μｇ／ｍＬテトラサイクリンが分化を開始させるのに十分である。さらなる分化を促進するために、追加の薬剤を増殖培地に含めることができる。
【０１９１】
５．１０  羊膜由来接着細胞を用いる治療の方法
５．１０．１  循環系疾患
本明細書で提供する羊膜由来接着細胞、そのような細胞の集団および羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団は、血管新生により利益を得ると思われる様々な疾患状態または状態を示す個体を治療するのに用いることができる。そのような疾患状態または状態の例としては、心筋梗塞、脳卒中、うっ血性心不全、末梢動脈疾患、左心低形成症候群、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍、熱傷、非癒合骨折、腫瘍に関連した骨損失、変型性関節症、顎顔面骨修復などがある。羊膜由来接着細胞およびそのような細胞の集団は、外傷性組織喪失を示す個体における血管新生を促進するためまたは瘢痕形成を予防するために、あるいは人工関節全置換術または義歯を有する個体に用いることもできる。
【０１９２】
より具体的な実施形態において、本明細書で提供する羊膜由来接着細胞およびそのような細胞の集団は、循環系の不全を有する個体、例えば、および末梢血管疾患または冠動脈疾患を有する個体を治療するのに用いることができる。
【０１９３】
一態様において、心臓または循環系の疾患または損傷を有する患者に治療用細胞組成物を投与すること、および心臓機能の改善について患者を評価することを含み、前記細胞組成物が本明細書で述べる羊膜由来接着細胞を含む、心臓疾患または損傷を有する患者を治療する方法を本明細書で提供する。一実施形態において、心臓疾患は、心筋症である。具体的な実施形態において、心筋症は、特発性または既知の原因の心筋症である。他の具体的な実施形態において、心筋症は、本質的に虚血性または非虚血性である。他の実施形態において、心臓または循環系の疾患は、血管形成術、動脈瘤、狭心症、大動脈狭窄、大動脈炎、不整脈、動脈硬化症、動脈炎、非対称性心室中隔肥大（ＡＳＨ）、アテローム動脈硬化症、心房細動および粗動、細菌性心内膜炎、バーロー症候群（僧帽弁逸脱症）、徐脈、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、心拡大、心筋症、心臓炎、頸動脈疾患、大動脈縮窄、先天性心疾患（先天性心臓欠陥）、先天性心不全（心不全）、冠動脈疾患、アイゼンメンガー症候群、塞栓症、心内膜炎、先端紅痛症、細動、線維筋性形成異常、心ブロック、心雑音、高血圧、低血圧、特発性乳児動脈石灰化、川崎病（皮膚粘膜リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節疾患、乳児多発性動脈炎）、代謝症候群、微小血管狭心症、心筋梗塞（心臓発作）、心筋炎、発作性心房頻拍（ＰＡＴ）、結節性動脈周囲炎（多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎）、心膜炎、末梢血管疾患、重症肢虚血、糖尿病性血管症、静脈炎、肺動脈弁狭窄（肺動脈狭窄）、レイノー病、腎動脈狭窄、腎血管性高血圧、リウマチ性心疾患、中隔欠損、無症候性虚血、症候群Ｘ、頻脈、高安動脈炎、ファローの四徴、大血管転位症、三尖弁閉鎖症、総動脈幹症、心臓弁膜症、静脈瘤性潰瘍、拡張蛇行静脈、血管炎、心室中隔欠損、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群または心内膜床欠損の１つまたは複数を含む。
【０１９４】
他の実施形態において、心臓または循環系の疾患は、急性リウマチ熱、急性リウマチ性心膜炎、急性リウマチ性心内膜炎、急性リウマチ性心筋炎、慢性リウマチ性心疾患、僧帽弁の疾患、僧帽弁狭窄、リウマチ性僧帽弁閉鎖不全、大動脈弁の疾患、他の心内膜構造の疾患、虚血性心不全（急性および亜急性）、狭心症、肺循環の疾患（急性肺性心疾患、肺塞栓症、慢性肺性心疾患）、脊柱後側弯性心疾患、心筋炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、心内膜弾性線維症、房室ブロック、心律動障害、心筋変性、脳血管疾患、前大脳動脈の閉塞および狭窄、大脳動脈の閉塞、動脈、細動脈および毛細血管の疾患（アテローム動脈硬化症、動脈瘤）、または静脈およびリンパ管の疾患を含む循環系の疾患の１つまたは複数を含む。
【０１９５】
一実施形態において、治療は、他の細胞型を含むまたは含まない、羊膜由来接着細胞を含む治療用細胞組成物を用いた心筋症を有する患者の治療を含む。他の好ましい実施形態において、患者は、治療による、例えば、心臓に存在する幹細胞または前駆細胞などの他の細胞の増殖を支持する該細胞の能力による、組織の内部成長または組織の血管発生による、また有益な細胞因子、ケモカイン、サイトカインおよび同類のものの存在による恩恵を経験するが、該細胞は、患者に取り込まれたり、増殖したりしない。他の実施形態において、患者は、該細胞を用いた治療上の処置による恩恵を受けるが、該細胞は、患者において長期間生存しない。一実施形態において、該細胞は、数、生存能または生化学的活性が徐々に減退し、他の実施形態において、細胞における該減退には、活性、例えば、増殖、分裂または生化学的活性の一定の期間が先行する可能性がある。他の実施形態において、老化、生育不能または死細胞でさえ、有益な治療効果を有することができる。
【０１９６】
個体に本明細書で提供する羊膜由来接着細胞または治療用組成物を投与する場合の循環系の疾患または障害を有する個体における改善は、循環系の疾患または障害の１つまたは複数の症状の検出可能な改善によって評価または実証することができる。
【０１９７】
別の実施形態において、個体に本明細書で提供する羊膜由来接着細胞または治療用組成物を投与する場合の循環系の疾患または障害を有する個体における改善は、羊膜由来接着細胞の投与前の個体と比較して、１つまたは複数の心臓機能の徴候の検出可能な改善、例えば、胸部心拍出量（ＣＯ）、心係数（ＣＩ）、肺動脈楔入圧（ＰＡＷＰ）および心係数（ＣＩ）、短縮率（％ＦＳ）、駆出分画（ＥＦ）、左室駆出分画（ＬＶＥＦ）、左室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）、収縮力（ｄＰ／ｄｔ）、圧容積ループ、心仕事量の測定値、心房もしくは心室機能の増加、パンピング効率の増加、パンピング効率の損失率の低下、血行動態機能の喪失の減少、および心筋症に伴う合併症の減少の１つまたは複数の検出可能な改善の実証によって評価または実証することができる。
【０１９８】
本明細書で提供する治療用組成物の投与を受ける個体における改善は、主観的評価指標、例えば、投与後の彼または彼女の健康状態に関する個体の自己評価によっても評価することができる。
【０１９９】
該細胞の投与の成功は、特定の実施形態において、投与された羊膜由来接着細胞の個体における生存に基づくものでない。成功は、それよりむしろ、上記のように、心臓または循環系の健康の改善の１つまたは複数の評価指標に基づく。したがって、該細胞は、取り込まれ、患者の心臓とともに拍動したり、血管中に取り込まれたりする必要はない。
【０２００】
特定の実施形態において、本明細書で提供する治療の方法は、治療用羊膜由来接着細胞が、間葉系に沿って、例えば、心筋形成（cardiomyogenic）、血管新生もしくは血管発生表現型に向かって、または筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、心筋層細胞、心外膜細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞（例えば、血管平滑筋細胞）に分化することを誘導することを含む。
【０２０１】
羊膜由来接着細胞またはそのような細胞を含む治療用組成物のそれを必要とする個体への投与は、例えば、移植術、移植（例えば、細胞自体またはマトリックス−細胞組合せの一部としての細胞の）、注射（例えば、疾患または状態の部位への直接的、例えば、心筋梗塞を有していた個体の心臓における虚血部位への直接的）、注入、カテーテルを介しての送達、または細胞療法を提供するための当技術分野で公知の任意の他の手段により達成することができる。
【０２０２】
一実施形態において、治療用細胞組成物を、例えば、個体における１つまたは複数の部位への注射によりそれを必要とする個体に投与する。具体的な実施形態において、治療用組成物を、例えば、心臓における虚血部位への心臓内注射により投与する。他の具体的な実施形態において、該細胞を、心臓の表面上に、隣接部位内に、またはより遠隔の部位に注射する。好ましい実施形態において、該細胞は、罹患または注射部位に存在し得る。
【０２０３】
冠動脈または血管系の疾患または状態を有する個体に羊膜由来接着細胞を該細胞が治療上有益であると思われる時点に投与することができる。特定の実施形態において、例えば、本発明の細胞または治療用組成物は、心筋梗塞の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０日以内に投与する。心筋梗塞に時間的に近接している、例えば、１〜３または１〜７日以内の投与は、時間的に遠い、例えば、心筋梗塞の３または７日後の投与より好ましい。他の実施形態において、本発明の細胞または治療用組成物は、疾患または状態の最初の診断の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０日以内に投与する。
【０２０４】
心筋梗塞の治療用のキットも本明細書で提供する。該キットは、例えば、薬学的に許容される担体と混合することにより薬学的に許容される形に調製することができる治療用細胞組成物、およびアプリケータならびに使用説明書を備えている。理想的には、キットは、現場、例えば、医師の診療室で、または心筋梗塞もしくは同様な心臓事象を有していたと診断された患者に適用されるために救急医療提供者が用いることができる。
【０２０５】
本明細書で提供する治療の方法の具体的な実施形態において、羊膜由来接着細胞を、幹細胞（すなわち、羊膜由来接着細胞でない幹細胞）、筋芽細胞、筋細胞、心筋芽細胞、心筋細胞、あるいは筋芽細胞、筋細胞、心筋芽細胞および／または心筋細胞の前駆細胞とともに投与する。
【０２０６】
具体的な実施形態において、本明細書で提供する治療の方法は、羊膜由来接着細胞、例えば、該細胞を含む治療用組成物を心臓または循環系の疾患を有する患者に投与することと、および心臓機能の改善について患者を評価することを含み、治療用細胞組成物をマトリックス−細胞複合体として投与する。特定の実施形態において、マトリックスは、少なくとも細胞を含む、好ましくは生体吸収性のスキャフォールドである。
【０２０７】
この目的のために、心臓発生、血管新生、血管原性または血管発生経路に沿った幹または前駆細胞分化を刺激する１つまたは複数の因子の存在下でインキュベートした羊膜由来接着細胞の集団を本明細書で提供する。そのような因子は、当技術分野で公知であり、分化の適切な条件の決定は、通常の実験により達成することができる。そのような因子は、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、細胞産物、脱メチル化剤、および心臓発生、血管新生、血管原性または血管発生経路または系統に沿った例えば幹細胞の分化を刺激することが現在公知であるか、または後に判定される他の刺激物などの因子を含むが、これらに限定されない。
【０２０８】
羊膜由来接着細胞は、脱メチル化剤、ＢＭＰ、ＦＧＦ、Ｗｎｔ因子タンパク質、ヘッジホッグおよび／または抗Ｗｎｔ因子の少なくとも１つを含む因子の存在下での細胞の培養によって、心臓発生、血管新生、血管原性または血管発生経路または系統に沿って分化させることができる。
【０２０９】
脱メチル化剤を含めることにより、細胞が間葉系に沿って心筋形成経路に向かって分化することが可能になる傾向がある。分化は、例えば、心臓ミオシン、骨格ミオシンもしくはＧＡＴＡ４の少なくとも１つの発現により；または自発的もしくは別の方法で誘導される拍動調律の獲得により；または不整脈を誘発せずに患者の心筋に少なくとも部分的に取り込まれる能力により判断することができる。そのような分化を開始させるのに用いることができる脱メチル化剤は、５−アザシチジン、５−アザ−２’ −デオキシシチジン、ジメチルスルホキシド、塩化クレリトリン、レチノイン酸またはその塩、２−アミノ−４−（エチルチオ）酪酸、プロカインアミドおよびプロカインを含むが、これらに限定されない。
【０２１０】
本明細書における特定の実施形態において、上で特定した１つまたは複数の因子により誘導される細胞は、心筋形成、血管新生、血管原性または血管発生細胞、あるいは前駆細胞になり得る。好ましくは少なくとも一部の細胞は、レシピエントの心筋、心臓の血管および他の構造、心臓または末梢血管などを含むが、これらに限定されない心血管系に少なくとも部分的に取り込まれ得る。特定の他の実施形態において、分化した羊膜由来接着細胞は、心筋形成細胞またはそれらの前駆細胞の２つまたはそれ以上の特徴を獲得した細胞に分化し、レシピエントの心臓または血管系に部分的または完全に取り込まれ得る。具体的な実施形態において、個体に投与された細胞は、不整脈の増加、心臓欠陥、血管欠陥または個体の循環系もしくは健康の他の異常をもたらさない。特定の実施形態において、羊膜由来接着細胞は、患者の心筋、血管、血液および同類のものに天然で存在する幹細胞の分化を促進するように作用して、それら自体を、例えば、心筋に、あるいは心筋形成、血管新生、血管原性または血管発生系に少なくとも沿って分化させる。
【０２１１】
羊膜由来接着細胞およびそのような細胞の集団は、個体、例えば、心臓または循環系の疾患、障害もしくは状態を有するまたは発症する個体に治療的または予防的に投与することができる。そのような疾患、障害もしくは状態は、アテローム動脈硬化症、心筋症に起因するうっ血性心不全、または心臓損傷、例えば、心筋梗塞または創傷（急性または慢性）などによる虚血性損傷を含み得る。
【０２１２】
特定の実施形態において、個体に例えば、羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団中の治療上有効な量の羊膜由来接着細胞を投与する。具体的な実施形態において、該集団は、約５０％の羊膜由来接着細胞を含む。他の具体的な実施形態において、該集団は、羊膜由来接着細胞の実質的に均一な集団である。他の実施形態において、該集団は、少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３３％、４０％、６０％、６６％、７０％、７５％、８０％または９０％の羊膜由来接着細胞を含む。
【０２１３】
羊膜由来接着細胞は、細胞と、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＩＬ−８、抗トロンボゲン薬（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼおよびＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）；抗トロンビン化合物、血小板受容体アンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害薬および／または血小板阻害薬、抗アポトーシス薬（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯ誘導体および類似体ならびにそれらの塩、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはカスパーゼ阻害薬）、抗炎症薬（例えば、Ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害薬、ペミロラスト、トラニラスト、レミカード、シロリムス、非ステロイド抗炎症化合物、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、テポキサリン、トルメチンまたはスプロフェン）、免疫抑制もしくは免疫調節薬（例えば、カルシニューリン阻害薬、例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムスもしくはエベロリムスなどのｍＴＯＲ阻害薬；アザチオプリンおよびミコフェノール酸モフェチルなどの抗増殖薬；コルチコステロイド、例えば、プレドニゾロンもしくはヒドロコルチゾン；モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体、バシリキシマブ、ダクリズマ、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）などのポリクローナル抗Ｔ細胞抗体およびモノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３などの抗体、または開示が参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第７，４６８，２７６号および米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号に記載されている接着性胎盤幹細胞）、および／または抗酸化剤（例えば、プロブコール；ビタミンＡ、ＣおよびＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、または抗酸化剤誘導体、前述のものの類似体もしくは塩）などの他の治療薬を含む治療用組成物の形で個体に投与することができる。特定の実施形態において、羊膜由来接着細胞を含む治療用組成物は、１つもしくは複数の追加の細胞型、例えば、成人細胞（例えば、線維芽細胞もしくは内皮細胞）または幹もしくは前駆細胞をさらに含む。そのような治療薬および／または１つもしくは複数の追加の細胞は、それを必要とする個体に個別に、または併用して、あるいは２つまたはそれ以上のそのような化合物または薬剤を投与することができる。
【０２１４】
特定の実施形態において、治療すべき個体は、哺乳動物である。具体的な実施形態において、治療すべき個体は、ヒトである。具体的な実施形態において、個体は、家畜である。他の具体的な実施形態において、治療すべき個体は、ウマ、ヒツジ、ウシもしくは仔ウシ、ブタ、イヌまたはネコである。
【０２１５】
５．１０．２  脳卒中および他の虚血性疾患
特定の実施形態において、治療上有効量のＡＭＤＡＣを個体に投与することを含む、例えば、脳内もしくは周囲、末梢血管系における血流の途絶を有する個体を治療する方法を本明細書で提供する。特定の具体的な実施形態において、虚血は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、重症肢虚血（ＣＬＩ）である。特定の他の実施形態において、虚血は、中枢神経系（ＣＮＳ）の虚血である。特定の他の実施形態において、虚血は、末梢動脈疾患、虚血性血管疾患、虚血性心疾患、虚血性脳疾患または虚血性腎疾患である。
【０２１６】
具体的な実施形態において、血液の流れの前記途絶は、脳卒中である。より具体的な実施形態において、前記脳卒中は、虚血性脳卒中である。他のより具体的な実施形態において、前記脳卒中は、出血性脳卒中、例えば、頭蓋内脳出血または特発性くも膜下出血である。他の具体的な実施形態において、前記途絶は、血腫である。より具体的な実施形態において、血腫は、硬膜血腫、硬膜下血腫またはくも膜下血腫である。他の具体的な実施形態において、前記血腫は、頭蓋上の外力、例えば、頭部損傷によって引き起こされる。他の具体的な実施形態において、前記途絶は、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、例えば、再発性ＴＩＡである。他の具体的な実施形態において、前記途絶は、血管れん縮、例えば、出血性脳卒中後の血管れん縮である。
【０２１７】
該方法の別の具体的な実施形態において、前記治療上有効量は、前記個体によって示される脳もしくはＣＮＳ内もしくは周囲の血液の流れの途絶、の１つもしくは複数の症状、またはそれに起因する神経学的欠損、例えば、無酸素性損傷もしくは低酸素性損傷、の消失、その検出可能な改善、その重症度の軽減、進行の緩徐化をもたらすＡＭＤＡＣの数である。他の具体的な実施形態において、例えば、血液の流れの前記途絶後の脳もしくはＣＮＳ内または周囲の血液の流れの二次的またはその後の途絶によって引き起こされる神経学的損傷を低減または消失させるために、前記治療上有効量の単離ＡＭＤＡＣを前記個体に予防的に投与する。
【０２１８】
別の具体的な実施形態において、脳内または周囲の血液の流れの途絶の前記症状、例えば、脳卒中、無酸素性損傷もしくは低酸素性損傷は、１つもしくは複数の片麻痺（身体の一側の麻痺）；片側不全麻痺（身体の一側の脱力）；顔面の筋脱力；しびれ感；感覚の低下；臭覚、味覚、聴覚もしくは視覚の変化；臭覚、味覚、聴覚もしくは視覚の喪失；眼瞼の下垂（眼瞼下垂）；眼筋の検出可能な衰弱；咽頭反射の低下；嚥下能力の低下；瞳孔対光反応性の低下；顔面の感覚の低下；平衡の低下；眼振；呼吸数の変化；心拍数の変化；片側を振り向く能力の低下もしくは不能を伴う胸鎖乳突筋の衰弱；舌の脱力；失語症（発語もしくは言語理解不能）；失行症（随意運動の変化）；視野欠損；記憶障害；半側無視もしくは半側空間無視（病変の反対側の視野の側の空間に対する注意の欠陥）；分裂思考；錯乱；性欲過剰身ぶりの発生；病態失認（欠陥の存在の持続的否認）；歩行困難；運動協調の変化；めまい；平衡失調；意識消失；頭痛；および／または嘔吐の１つまたは複数である。
【０２１９】
別の具体的な実施形態において、上述の治療の方法は、第２の治療薬を前記個体に投与することを含む。より具体的な実施形態において、前記第２の治療薬は、神経保護薬である。より具体的な実施形態において、前記第２の治療薬は、ＮＸＹ−０５９（フェニルブチルニトロンのジスルホニル誘導体：二ナトリウム４−（（ｔｅｒｔ−ブチルイミノ）−メチル）ベンゼン−１，３−ジスルホネートＮ−オキシドまたは二ナトリウム４−（（オキシド−ｔｅｒｔ−ブチルアザニウムイリデン）メチル）ベンゼン−１，３−ジスルホネート；ジスフェントン（disufenton）としても公知である）である。他のより具体的な実施形態において、第２の治療薬は、血栓溶解薬である。より具体的な実施形態において、前記血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である。脳内または周囲の血液の流れの途絶が出血である実施形態において、第２の治療薬は、抗高血圧薬、例えば、ベータ遮断薬もしくは利尿薬、利尿薬とカリウム保持性利尿薬との配合、ベータ遮断薬と利尿薬との配合、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬と利尿薬との配合、アンジオテンシンＩＩ拮抗薬と利尿薬との配合、および／またはカルシウムチャンネル遮断薬とＡＣＥ阻害薬との配合であってよい。他のより具体的な実施形態において、第２の治療薬は、カルシウムチャンネル遮断薬、グルタミン酸拮抗薬、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）作動薬、抗酸化剤またはフリーラジカルスカベンジャーである。
【０２２０】
治療の方法の別の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを、前記個体の脳内または周囲の血流の途絶の１つまたは複数の症状の発現の２１〜３０、例えば、２１日以内に、例えば、脳卒中、無酸素性損傷または低酸素性損傷の症状の発現の２１〜３０、例えば、２１日以内に前記個体に投与する。治療の方法の他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを、前記個体の脳内または周囲の血流の途絶の１つまたは複数の症状の発現の１４日以内に前記個体に投与する。治療の方法の他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを、前記個体の脳内または周囲の血流の途絶の１つまたは複数の症状の発現の７日以内に前記個体に投与する。治療の方法の他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを、前記個体の脳内または周囲の血流の途絶の１つまたは複数の症状の発現の４８時間以内に前記個体に投与する。他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを、前記個体の脳内または周囲の血流の途絶の１つまたは複数の症状の発現の２４時間以内に前記個体に投与する。他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを、前記個体の脳内または周囲の血流の途絶の１つまたは複数の症状の発現の１２時間以内に前記個体に投与する。他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを、前記個体の脳内または周囲の血流の途絶の１つまたは複数の症状の発現の３時間以内に前記個体に投与する。
【０２２１】
具体的な実施形態において、血液の流れの途絶は、重症肢虚血である。他のより具体的な実施形態において、前記ＣＬＩは、血流量を著しく減少させる、下肢の動脈における重症閉塞である。他のより具体的な実施形態において、前記ＣＬＩは、人が動いていないときの虚血性安静時痛、下肢および足の重度疼痛、足または下肢の治癒しないびらん、足の疼痛またはしびれ感、下肢または足の光沢があり、滑らかで、乾燥した皮膚、足指の肥厚、下肢または足の脈拍の不存在または減弱、解放びらん、治癒しない皮膚感染または潰瘍、下肢または足の乾燥した壊疽（乾燥した黒い皮膚）によって特徴づけられる。他の具体的な実施形態において、ＣＬＩは、指または肢全体の喪失をもたらし得る。方法の他の具体的な実施形態において、前記治療上有効量は、前記個体によって示される脳もしくはＣＮＳ内もしくは周囲の血液の流れの途絶、の１つもしくは複数の症状、それに起因する肢機能の喪失もしくは酸素奪取（低酸素症／無酸素症）、例えば、無酸素性損傷もしくは低酸素性損傷、の消失、その検出可能な改善、その重症度の軽減、進行の緩徐化をもたらすＡＭＤＡＣの数である。他の具体的な実施形態において、例えば、血液の流れの前記途絶後の肢内または周囲の血液の流れの二次的またはその後の途絶によって引き起こされる組織損傷を低減または消失させるために、前記治療上有効量の単離ＡＭＤＡＣを前記個体に予防的に投与する。
【０２２２】
５．１０．３  用量および投与経路
それを必要とする個体へのＡＭＤＡＣの投与は、治療すべき疾患または状態に適切な任意の医学的に許容される経路によるものであってよい。上述の治療の方法の他の具体的な実施形態において、前記ＡＭＤＡＣをボーラス注射により投与する。他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを静脈内注入により投与する。具体的な実施形態において、前記静脈内注入は、約１〜約８時間にわたる静脈内注入である。他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを頭蓋内投与する。他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを筋肉内投与する。他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを腹腔内投与する。他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを動脈内投与する。より具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを虚血の範囲内に投与する。他のより具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを虚血の末梢の部位に投与する。治療の方法の他の具体的な実施形態において、前記ＡＭＤＡＣを筋肉内、皮内または皮下投与する。
【０２２３】
上述の治療の方法の別の具体的な実施形態において、前記ＡＭＤＡＣを前記個体に１回投与する。他の具体的な実施形態において、前記単離ＡＭＤＡＣを前記個体に２回以上の独立した投与で投与する。他の具体的な実施形態において、前記投与は、約１×１０４個から１×１０５個までの単離ＡＭＤＡＣ（例えば、前記個体の１ｋｇ当たりのＡＭＤＡＣ）を投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体の１ｋｇ当たり約１×１０５個から１×１０６個までの単離ＡＭＤＡＣを投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体の１ｋｇ当たり約１×１０６個から１×１０７個までの単離ＡＭＤＡＣを投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体の１ｋｇ当たり約１×１０７個から１×１０８個までの単離胎盤細胞を投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体の１ｋｇ当たり約１×１０６個から約２×１０６個までの単離胎盤細胞を；前記個体の１ｋｇ当たり約２×１０６個から約３×１０６個までの単離胎盤細胞を；前記個体の１ｋｇ当たり約３×１０６個から約４×１０６個までの単離胎盤細胞を；前記個体の１ｋｇ当たり約４×１０６個から約５×１０６個までの単離胎盤細胞を；前記個体の１ｋｇ当たり約５×１０６個から約６×１０６個までの単離胎盤細胞を；前記個体の１ｋｇ当たり約６×１０６個から約７×１０６個までの単離胎盤細胞を；前記個体の１ｋｇ当たり約７×１０６個から約８×１０６個までの単離胎盤細胞を；前記個体の１ｋｇ当たり約８×１０６個から約９×１０６個までの単離胎盤細胞を；または前記個体の１ｋｇ当たり約９×１０６個から約１×１０７個までの単離胎盤細胞を投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体に前記個体の１ｋｇ当たり約１×１０７個から約２×１０７個までの単離胎盤細胞を投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体に前記個体の１ｋｇ当たり約１．３×１０７個から約１．５×１０７個までの単離胎盤細胞を投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体に前記個体の１ｋｇ当たり約３×１０７個までの単離胎盤細胞を投与することを含む。具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体に約５×１０６個から約２×１０７個までの単離胎盤細胞を投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体に約２０ミリリットルの溶液中の約１５０×１０６個の単離胎盤細胞を投与することを含む。
【０２２４】
具体的な実施形態において、前記投与は、前記個体に約５×１０６個から約２×１０７個までの単離胎盤細胞を投与することを含み、前記細胞は、１０％デキストラン、例えば、デキストラン−４０、５％ヒト血清アルブミンおよび場合によって免疫抑制剤を含む溶液に含まれている。他の具体的な実施形態において、前記投与は、約５×１０７個から３×１０９個までの単離胎盤細胞を静脈内に投与することを含む。より具体的な実施形態において、前記投与は、約９×１０８個の単離胎盤細胞または約１．８×１０９個の単離胎盤細胞を静脈内に投与することを含む。他の具体的な実施形態において、前記投与は、約５×１０７個から１×１０８個までの単離胎盤細胞を頭蓋内に投与することを含む。より具体的な実施形態において、前記投与は、約９×１０７個の単離胎盤細胞を頭蓋内に投与することを含む。
【０２２５】
５．１１  羊膜由来接着細胞の分化
本明細書で提供する羊膜由来接着細胞は、分化させることができる。一実施形態において、該細胞は、例えば、該細胞を血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と接触させることにより、または下の５．１１．２、６．３．３もしくは６．３．４項で述べるように、前記細胞が内皮細胞、筋発生性細胞または周皮細胞の少なくとも１つの特性を示すのに十分に分化させた。より具体的な実施形態において、内皮細胞、筋発生性細胞または周皮細胞の前記特性は、ＯＣＴ−４−、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋、ＣＤ９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋およびＶＥ−カドヘリン−である羊膜細胞と比べて増加している、ＣＤ９、ＣＤ３１、ＣＤ５４、ＣＤ１０２、ＮＧ２（神経／神経膠抗原２）またはアルファ平滑筋アクチンの１つまたは複数の発現である。他のより具体的な実施形態において、内皮細胞、筋発生性細胞または周皮細胞の前記特性は、ＯＣＴ−４−、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ＋、およびＶＥＧＦＲ１／Ｆ１ｔ−１＋である羊膜細胞と比べて増加している、ＣＤ９、ＣＤ３１、ＣＤ５４、ＣＤ１０２、ＮＧ２（神経／神経膠抗原２）またはアルファ平滑筋アクチンの１つまたは複数の発現である。
【０２２６】
５．１１．１  血管新生の誘導
本明細書で提供する羊膜由来接着細胞からの血管新生は、次のように達成することができる。羊膜由来接着細胞は、例えば、内皮細胞培地、例えば、ＥＧＭ（登録商標）−２（Ｌｏｎｚａ）または６０％ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、４０％ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ）；２％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ）；１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；５×１０−９Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）；１０−４Ｍアスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）；表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地中で継代数3まで培養する。次いで、細胞を、例えば、１ミリリットル当たり約１０〜５０ｎｇの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含むＦＢＳ（０〜５体積／体積％）を含む同じ培地またはＤＭＥＭ中１ウエル当たり例えば約１．５×１０４個細胞の密度で例えば９６ウエルプレートでＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）またはコラーゲン−１を含む基質上で平板培養する。培地は、週約２回交換することができる。血管新生は、例えば、５０倍〜１００倍の倍率の顕微鏡下で可視の血管様構造の発生および管の形成についての細胞の目視検査により証明される。
【０２２７】
５．１１．２  心臓細胞への分化の誘導
本明細書で提供する羊膜由来接着細胞の筋発生性（心臓発生）分化は、例えば、心筋への分化を誘導する細胞培養条件で細胞を平板培養することにより達成することができる。好ましい心筋細胞培地は、レチノイン酸、１μＭ；塩基性線維芽細胞増殖因子、１０ｎｇ／ｍＬ；およびトランスフォーミング増殖因子ベータ−１、２ｎｇ／ｍＬ；および表皮増殖因子、１００ｎｇ／ｍＬを添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳを含む。ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をＣＢＳの代わりに用いることができる。あるいは、羊膜由来接着細胞を、１〜１００、例えば、５０ｎｇ／ｍＬのＣａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｎ−１を添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳ中で２４時間培養する。他の実施形態において、羊膜由来接着細胞は、タンパク質不含有培地中で１０〜１４日、５〜７日間培養し、次いで、例えば、１％臍帯血血清を添加した１％ＨＥＰＥＳ緩衝液中でヒト心筋をホモジナイズすることによって調製したヒト心筋抽出物で刺激することができる。
【０２２８】
分化は、例えば、ＲＴ／ＰＣＲによる心臓アクチン遺伝子発現の実証により、または細胞の可視拍動により確認することができる。接着細胞は、１つまたは複数のこれらの特性を示すときに、心臓細胞に分化したとみなされる。
[実施例]
【実施例１】
【０２２９】
６．１  羊膜からの接着細胞の単離および拡大
この実施例では、羊膜由来接着細胞の単離および拡大を示す。
【０２３０】
６．１．１  単離
羊膜由来接着細胞は、羊膜から次のように単離した。羊膜／絨毛膜を胎盤から切り離し、羊膜を手作業で絨毛膜から分離した。羊膜を滅菌済みＰＢＳですすいで、残存血液、血塊および他の物質を除去した。滅菌済みガーゼを用いて、すすぎによって除去されなかったさらなる血液、血塊または他の物質を除去し、羊膜をＰＢＳで再びすすいだ。過剰のＰＢＳを膜から除去し、羊膜を小刀で２”×２”断片に切断した。上皮細胞の放出のために、滅菌済みジャケット付きガラスの処理容器を配管およびコネクタを用いて循環式３７℃水浴に接続し、撹拌プレート上に設置することによって処理容器を据え付けた。トリプシン（０．２５％、３００ｍＬ）を処理容器中で３７℃に加温し、羊膜断片を加え、羊膜／トリプシン懸濁液を例えば、３７℃で１００ＲＰＭ〜１５０ＲＰＭで１５分間撹拌した。滅菌済みレセプタクルを処理容器に隣接する滅菌野に置き、滅菌済みの７５μｍ〜１２５μｍスクリーンをレセプタクルに挿入することにより、滅菌スクリーニングシステムを組み立てた（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）。羊膜断片を１５分間撹拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移し、例えば、滅菌済みピンセットを用いて羊膜断片を処理容器に戻し、上皮細胞を含むトリプシン溶液を捨てた。上述のように羊膜断片を３００ｍＬのトリプシン溶液（０．２５％）を用いて再び撹拌した。スクリーンを約１００〜１５０ｍＬのＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ溶液を捨てた。羊膜断片を１５分間撹拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移した。次いで、羊膜断片を処理容器に戻し、上皮細胞を含むトリプシン溶液を捨てた。上述のように羊膜断片を３００ｍＬのトリプシン溶液（０．２５％）を用いて再び撹拌した。スクリーンを約１００〜１５０ｍＬのＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ溶液を捨てた。羊膜断片を１５分間撹拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移した。次いで、羊膜断片を処理容器に戻し、上皮細胞を含むトリプシン溶液を捨てた。羊膜断片をＰＢＳ／５％ＦＢＳ中（羊膜とＰＢＳ／５％ＦＢＳ溶液との１：１の体積比）で３７℃で約２〜５分間撹拌して、トリプシンを中和した。新たな滅菌スクリーニングシステムを組み立てた。トリプシンを中和した後、処理容器の内容物を新たなスクリーンに移し、羊膜断片を処理容器に戻した。室温で、滅菌済みＰＢＳ（４００ｍＬ）を処理容器に加え、処理容器の内容物を約２〜５分間撹拌した。スクリーンを約１００〜１５０ｍＬのＰＢＳですすいだ。撹拌後、処理容器の内容物をスクリーンに移し、処理フラスコをＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ溶液を捨てた。次いで、処理容器に３００ｍＬの予熱ＤＭＥＭを満たし、羊膜断片をＤＭＥＭ溶液中に移した。
【０２３１】
羊膜由来接着細胞の放出のために、処理済み羊膜を次のようにコラゲナーゼでさらに処理した。適切な量のコラゲナーゼ粉末（供給業者から受領したコラゲナーゼロットの活性によって異なる）をＤＭＥＭに溶解することにより、滅菌コラゲナーゼ保存溶液（５００Ｕ／ｍＬ）を調製した。溶液を０．２２μｍフィルターにより濾過し、個々の滅菌済み容器に分注した。ＣａＣｌ２溶液（０．５ｍＬ、６００ｍＭ）を各１００ｍＬ用量に加え、各用量を凍結した。コラーゲナーゼ（１００ｍＬ）を処理容器中の羊膜断片に加え、処理容器を３０〜５０分間、または目視検査により羊膜消化が完結するまで撹拌した。羊膜消化が完結した後、１００ｍＬの予熱した滅菌済みＰＢＳ／５％ＦＢＳを処理容器に加え、処理容器をさらに２〜３分間撹拌した。撹拌後、フラスコの内容物を滅菌済み６０μｍスクリーンに移し、真空濾過により液体を収集した。処理容器を４００ｍＬのＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ溶液を滅菌濾過した。次いで、濾過済み細胞懸濁液を２０℃で３００ｘｇで１５分間遠心分離し、細胞ペレットを予熱ＰＢＳ／２％ＦＢＳ（合計約１０ｍＬ）に再懸濁した。
【０２３２】
６．１．２  樹立
新たに単離した血管新生羊膜細胞を、６０％ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、４０％ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ）；２％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ）；１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１０ｎｇ／ｍＬリノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１ｎ−デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）；１００μＭアスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）；１０ｎｇ／ｍＬ表皮増殖因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；および１０ｎｇ／ｍＬ血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む増殖培地に加え、１ｃｍ２当たり１００００個細胞の播種密度でＴフラスコ中で平板培養した。培養装置（単数または複数）を３７℃、５％ＣＯ２で＞９０％の湿度でインキュベートした。細胞の付着、増殖および形態を毎日モニターした。培地交換により、非付着細胞およびデブリを除去した。培地交換は、週２回行った。典型的な線維芽細胞様／紡錘形形状を有する接着細胞は、最初の平板培養後数日目に出現した。密集度が４０％〜７０％に達したとき（最初の平板培養後４〜１１日目）、室温で５分間のトリプシン処理（０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ）により細胞を収集した。ＰＢＳ−５％ＦＢＳにより中和した後、細胞を室温で２００〜４００ｇで５〜１５分間遠心分離し、増殖培地に再懸濁した。この時点に、ＡＭＤＡＣ系が最初の継代で成功裏に樹立されたとみなされた。最初の継代の羊膜由来接着細胞を場合によって凍結保存または拡大した。
【０２３３】
６．１．３  培養手順
羊膜由来接着細胞を上述のように増殖培地中で培養し、適切な組織培養−処理培養装置（単数または複数）中に１ｃｍ２当たり２０００〜４０００個の密度で播種した。次いで、培養装置（単数または複数）を３７℃、５％ＣＯ２で＞９０％の湿度でインキュベートした。培養中、ＡＭＤＡＣは、付着し、増殖すると思われた。細胞の増殖、形態および密集度を毎日モニターした。培養を５日以上に延長した場合、培地交換を週２回行って新鮮な栄養物を補給した。密集度が４０％〜７０％に達したとき（播種後３〜７日目）、室温で（３７℃）５分間のトリプシン処理（０．０５％〜０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ）により細胞を収集した。ＰＢＳ−５％ＦＢＳにより中和した後、細胞を室温で２００〜４００ｇで５〜１５分間遠心分離し、増殖培地に再懸濁した。
【０２３４】
この方法で単離し、培養したＡＭＤＡＣは、平板培養された１×１０６個の細胞から一般的に３３５３０＋／−１５０９０コロニー形成単位（線維芽細胞）（ＣＦＵ−Ｆ）を生じさせた。
【実施例２】
【０２３５】
６．２  羊膜由来接着細胞の表現型の特徴づけ
６．２．１  遺伝子およびタンパク質発現プロファイル
この実施例では、特有の細胞表面マーカー、ｍＲＡおよびプロテオーム発現を含む羊膜由来接着細胞の表現型の特徴付けについて述べる。
【０２３６】
試料の調製：羊膜由来接着細胞は、実施例１で述べたように得た。継代数6の細胞を上の実施例１で述べたように増殖培地中で約７０％の密集度まで増殖させ、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄した。ＮＴＥＲＡ−２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９７３）を、４．５ｇ／Ｌグルコース、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させた。有核細胞の計数を実施して、２×１０６〜１×１０７個細胞の最小値を得た。次いで、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて細胞を溶解し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒを用いて溶解物を得た。次いで、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを用いてＲＮＡの単離を実施した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ１０００分光光度計を用いて２５ｎｇ／μＬのＲＮＡ／反応でＲＮＡの量および質を測定した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキットを用いてｃＤＮＡ反応物を調製した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックスを用いて実時間ＰＣＲ反応を行わせた。反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００実時間ＰＣＲシステムで標準モードで４０サイクル行わせた。
【０２３７】
試料の分析および結果：実時間ＰＣＲ法ならびに特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現プローブおよび／またはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ヒト血管新生アレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、幹細胞関連の血管新生および心筋形成マーカーの発現について細胞の特徴付けを行った。結果は、適切な細胞対照と比較した対象の遺伝子の相対的発現、または普遍的に発現するハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ、１８ＳまたはＧＵＳＢ）と比較した対象の遺伝子の相対的発現（デルタＣｔ）として表した。
【０２３８】
羊膜由来接着細胞は、様々な幹細胞に関連した血管新生および心筋形成遺伝子を発現し、ＮＴＥＲＡ−２細胞と比較してＯＣＴ−４発現の相対的欠如を示した。表１に選択した血管新生、心筋形成および幹細胞遺伝子の発現を要約する。
【０２３９】
【表１−１】
0005869342.tif 000003
【０２４０】
【表１−２】
0005869342.tif 000004
【０２４１】
【表１−３】
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【０２４２】
【表１−４】
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【０２４３】
別の実験において、ＡＭＤＡＣは、アリール炭化水素神経栄養因子２（ＡＲＮＴ２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュートロフィン３（ＮＴ−３）、ＮＴ−５、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）、酸素誘導タンパク質２（ＨＩＧ２）、ヘムオキシゲナーゼ（デサイクリング）１（ＨＭＯ×１）、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］（ＳＯＤ３）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、トランスフォーミング増殖因子β１受容体（ＴＧＦＢ１Ｒ）および肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ／ｃ−ｍｅｔ）の遺伝子を発現することがさらに認められた。
【０２４４】
６．２．２  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のためのフローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、細胞の同一性を明らかにするための羊膜由来接着細胞の表現型マーカーを定量化する方法として用いた。細胞試料は、凍結保存から得た。解凍の前および試薬の調製中は、細胞バイアルを乾燥氷上に保持した。その後、３７℃水浴を用いて試料を急速に解凍した。凍結前細胞数を最初の解凍後細胞数依存性希釈の計算に用いた。手短に述べると、クリオバイアルを３７℃水浴中で緩やかに撹拌しながら約３０秒間解凍した。解凍の直後に、約１００〜２００μＬの冷（２〜８℃）解凍溶液（２．５％アルブミンおよび５％Ｇｅｎｔｒａｎ４０を含むＰＢＳ）をクリオバイアルに加え、混合した。緩やかに撹拌した後、クリオバイアル中の全量を等体積の冷解凍溶液（２〜８℃）を含む１５ｍＬコニカルチューブ中に移した。上清を除去する前に細胞をコニカルチューブ中で室温で４００ｇで５分間遠心分離した。残存体積をピペット（推定）で測定し、２５０×１０３細胞／１００μＬ緩衝液の細胞濃度が得られるように、残存体積および細胞ペレットを室温でＰＢＳ中１％ＦＢＳに再懸濁した。例えば、１×１０６個の細胞を４００μＬの１％ＦＢＳに再懸濁することとなる。細胞懸濁液を予めラベル表示した５ｍＬ  ＦＡＣＳチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に入れた。各一次抗体イソタイプについて、１００μＬの細胞懸濁液を１つのイソタイプ対照チューブ中に分割して入れた。表現型分析の前に、可能な４対数ダイナミックレンジにわたり良好なシグナル対ノイズ比およびＣＤ抗原の十分な検出を達成するために、すべての抗体の濃度を最適化した。各試料を染色するために用いた各イソタイプおよび試料抗体の体積を測定した。イソタイプおよび試料チューブ中の抗体の量（μｇ単位）を標準化するために、各抗体の濃度を（１／実際の抗体濃度（μｇ／μＬ））×（２．５×１０５細胞に対するμｇ単位の抗体の所望の最終的な量）＝＃μＬの添加抗体として計算した。イソタイプおよび試料の抗体のマスターミックスを、各チューブに加えた適切な量の抗体を用いて調製した。細胞は、室温、暗所で１５〜２０分間染色した。染色後、各試料中の非結合抗体を遠心分離（４００ｇｘ５分）により除去した後、１５０μＬの室温の１％ＦＢＳ  ＰＢＳに再懸濁する前に２ｍＬの１％ＦＢＳ  ＰＢＳ（室温）を用いて洗浄した。次いで、製造業者の指示に従って使用の準備をしたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩまたはＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターで試料を分析した。多パラメーターフローサイトメトリーデータセット（側方散乱（ＳＳＣ）、前方散乱（ＦＳＣ）および積分蛍光プロファイル（ＦＬ））を、オンザフライ機器補償パラメーターを設定せずに取得した。製造業者の指示に従ってＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエアを用いて取得した後に補償パラメーターを決定した。これらの機器設定を各試料に適用した。これらの試験に用いた発蛍光団結合体は、すべてがＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のアロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７（ＡＦ６４７）、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）およびペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）であった。表２に血管新生マーカーを含む選択した細胞表面マーカーの発現を要約する。
【０２４５】
【表２】
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【０２４６】
別の実験において、ＡＭＤＡＣ細胞を抗ヒトＣＤ４９ｆ（クローンＧｏＨ３、フィコエリスリン結合；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ．５５５７３６）で標識し、フローサイトメトリーにより分析した。ＡＭＤＡＣの約９６％が抗ＣＤ４９ｆで標識された（すなわち、ＣＤ４９ｆ＋であった）。
【０２４７】
他の実験において、ＡＭＤＡＣは、免疫局在化によりＣＤ４９ａ、ＣＤ１０６、ＣＤ１１９、ＣＤ１３０、ｃ−ｍｅｔ（肝細胞増殖因子；ＨＧＦＲ）、ＣＸＣケモカイン受容体１（ＣＸＣＲ１）、ＰＤＧＦＲＡおよびＰＤＧＦＲＢを発現することが免疫局在化によりさらに認められた。ＡＭＤＡＣはまた、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ６２Ｅ、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１２Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、インスリン受容体（ＣＤ２２０）、インターロイキン受容体４（ＩＬ４−Ｒ；ＣＤ１２４）、ＩＬ６−Ｒ（ＣＤ１２６）、ＴＮＦ−Ｒ１ａおよび１ｂ（ＣＤ１２０ａ、ｂ）、ならびにｅｒｂＢ２／Ｈｅｒ２の発現を欠くことが免疫局在化により認められた。
【０２４８】
６．２．３  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための免疫組織化学（ＩＨＣ）／免疫蛍光化学（ＩＦＣ）
継代数6の羊膜由来接着細胞を４ウエルチャンバースライド上で約７０％密集度まで増殖させ、４％ホルマリン溶液でそれぞれ３０分間固定した。固定後、スライドをＰＢＳで５分間にわたり２回すすいだ。次いで、スライドを湿潤チャンバー中で二次抗体としての同じ宿主からの１０％正常血清、２×カゼインおよびＰＢＳ中０．３％トリトン×１００とともに室温で２０分間インキュベートした。過剰の血清を拭い取り、スライドを加湿チャンバー中で一次抗体（ヤギポリクローナルＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ））とともにインキュベートした。インキュベーションの時間および温度は、用いる抗体についての最適な条件を選択することによって決定した。一般的に、インキュベーションの時間は、３７℃で１〜２時間または４℃で一夜である。次いで、スライドをＰＢＳでそれぞれ５分間にわたり３回すすぎ、一次抗体の宿主に対する蛍光結合抗免疫グロブリン二次抗体（ウサギ抗ヤギ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））とともに湿潤チャンバー中で室温で２０〜３０分間インキュベートした。その後、スライドをＰＢＳでそれぞれ５分間３回すすぎ、ＤＡＰＩ  ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）マウンティング溶液を用いてカバースリップをマウントして核を対比染色した。細胞染色は、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡を用いて可視化した。すべての写真は、対応するイソタイプ（ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））のバックグラウンドに対して標準化した等露光時間で撮影した。表３に羊膜由来接着細胞による血管新生タンパク質の発現に関する結果を要約する。
【０２４９】
【表３】
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【０２５０】
羊膜由来接着細胞は、表３に示すタンパク質の１つである血管新生マーカー腫瘍内皮マーカー７（ＴＥＭ−７）を発現した。図２を参照のこと。
【０２５１】
６．２．４  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための膜プロテオミクス
膜タンパク質の精製：継代数6の細胞を増殖培地中で約７０％密集度まで増殖させ、トリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞溶解の前に細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む溶液とともに１５分間インキュベートした。次いで、１０ｍＭ  ＨＣｌ溶液の添加（それにより洗剤の使用を避ける）により細胞を溶解し、４００ｇで１０分間遠心分離して、ペレットにし、核を除去した。ポストニュークリア上清を超遠心分離チューブに移し、Ｔ−１２７０ローター付きＷＸ８０遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ、ＮＣ）を用いて１０００００ｇで１５０分間遠心分離して、膜タンパク質ペレットを得た。
【０２５２】
プロテオリポソームの発生、固定化および消化：膜タンパク質ペレットをＮａｎｏｘｉｓ緩衝液（１０ｍＭトリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）を用いて数回洗浄した。膜タンパク質ペレットを１．５ｍＬのＮａｎｏｘｉｓ緩衝液に懸濁し、ＶＩＢＲＡ−ＣＥＬＬ（商標）ＶＣ５０５超音波処理装置（Ｓｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ）を用いて氷上で２０分間チップ音波処理した（tip-sonicated）。プロテオリポソームのサイズは、ＦＭ１−４３色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｂａｄ、ＣＡ）により染色し、蛍光顕微鏡による可視化により測定した。プロテオリポソーム懸濁液のタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定した。次いで、プロテオリポソームを標準ピペットチップを用いてＬＰＩ（商標）フローセル（Ｎａｎｏｘｉｓ  ＡＢ、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）上に注入し、１時間固定化した。固定化後、一連の洗浄ステップを行い、５μｇ／ｍＬのトリプシン（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉ、ＮＪ）をＬＰＩ（商標）フローセル上に直接注入した。チップを３７℃で一夜インキュベートし、トリプシンぺプチドをＬＰＩ（商標）チップから溶出し、次いで、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて脱塩した。
【０２５３】
ＬＴＱリニアイオントラップＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析：各トリプシン消化試料を１８０分勾配（緩衝液Ａ：水、０．１％ギ酸；緩衝液Ｂ：アセトニトリル、０．１％ギ酸）を用いて軸方向脱溶媒和真空補助ナノキャピラリーエレクトロスプレーイオン化（ＡＤＶＡＮＣＥ）源（Ｍｉｃｈｒｏｎ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に直接接続した０．２ｍｍ×１５０ｍｍ  ３μｍ  ２００Å  ＭＡＧＩＣ  Ｃ１８カラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上で分離した。ＡＤＶＡＮＣＥ源は、３μＬ／分というかなりより高い流量で動作しながらも伝統的なｎａｎｏＥＳＩと同等の感度を達成する。溶出したペプチドは、各完全スキャン質量スペクトル後の１０データ依存性ＭＳ／ＭＳスキャンを用いたＬＴＱリニアイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。各生物学的試料について、７つの反復分析データセットを収集した。
【０２５４】
バイオインフォマティクス：各細胞系について収集された７つの反復分析データセットに対応する７つのＲＡＷファイルをＳｏｒｃｅｒｅｒ  Ｓｏｌｏ（商標）ワークステーション（Ｓａｇｅ−Ｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）上でのＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムの実行を用いてＩＰＩ  Ｈｕｍａｎ  Ｄａｔａｂａｓｅに対する１回の検索として検索した。１．２ａｍｕのペプチド質量許容範囲を指定し、メチオニンの酸化は、ディフェレンシャル修正として指定し、カルバミドメチル化は、スタティック修正として指定した。Ｔｒａｎｓ−Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（ＴＰＰ）のＳｃａｆｆｏｌｄソフトウエアの実行を用いて、膜プロテオームデータをソートし、パースした。タンパク質が９５％のペプチド確率、９５％のタンパク質確率および１つ特有ペプチドにより同定された場合、タンパク質を分析にかけることを考慮した。組織内で開発したカスタムＰｅｒｌスクリプトを用いて膜プロテオームデータセット間の比較を行った。
【０２５５】
結果：表４に示すように、羊膜由来接着細胞は、種々の血管新生および心筋形成マーカーを発現した。
【０２５６】
【表４】
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【０２５７】
６．２．５  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のためのセクレトームプロファイリング
タンパク質アレイ：継代数6の羊膜由来接着細胞を増殖培地中で等細胞数で平板培養し、４日後に条件づけ培地を収集した。ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ血管新生タンパク質アレイ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）を用いて細胞条件づけ培地中の複数の血管新生サイトカイン／増殖因子の同時定性分析を実施した。手短に述べると、タンパク質アレイを２ｍＬの１×ブロッキング緩衝液（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに室温で３０分間（ｍｉｎ）インキュベートして、膜をブロックした。その後、ブロッキング緩衝液を傾斜し、膜を１ｍＬの試料（各細胞により４日間条件づけられた増殖培地）とともに室温で１〜２時間インキュベートした。次いで、試料を傾斜し、膜を２ｍＬの１×洗浄緩衝液Ｉ（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で室温で振とうしながら３×５分洗浄した。次いで、膜を２ｍＬの１×洗浄緩衝液ＩＩ（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で室温で振とうしながら２×５分洗浄した。その後、１ｍＬの希釈ビオチン結合抗体（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を各膜に加え、室温で１〜２時間インキュベートし、上述のように洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、希釈ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（２ｍＬ）を各膜に加え、膜を室温で２時間インキュベートした。最後に、膜を再び洗浄し、仕様書に従ってＥＣＬ（商標）検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともにインキュベートし、結果を視覚化し、Ｋｏｄａｋ  Ｇｅｌ  Ｌｏｇｉｃ  ２２００イメージングシステムを用いて解析した。ＡＭＤＡＣによる種々の血管新生タンパク質の分泌を図３に示す。
【０２５８】
ＥＬＩＳＡ：細胞条件づけ培地中の単一血管新生サイトカイン／増殖因子の定量分析をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）製の市販のキットを用いて行った。手短に述べると、ＥＬＩＳＡアッセイを製造業者の指示に従って実施し、条件づけ培地中のそれぞれの血管新生増殖因子の量を１×１０６細胞に対して標準化した。羊膜由来接着細胞（ｎ＝６）は、１００万個の細胞当たり約４５００ｐｇのＶＥＧＦおよび１００万個の細胞当たり約１７２００ｐｇのＩＬ−８を示した。
【０２５９】
【表５】
0005869342.tif 000010
【０２６０】
別の実験において、ＡＭＤＡＣは、アンジオテンシン−１、アンジオテンシン−２、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１；血小板内皮細胞接着分子）、ラミニンおよびフィブロネクチンも分泌することが確認された。
【０２６１】
６．２．６  ＡＭＤＡＣマイクロＲＮＡ発現による血管新生活性の確認
この実施例では、ＡＭＤＡＣが、骨髄由来間葉幹細胞よりもそれぞれが血管形成機能に関連づけられる高いレベルの特定のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低いレベルの特定の他のｍｉＲＮＡを発現することを実証する。
【０２６２】
プロ血管新生ｍｉＲ−２９６が増殖因子受容体のレベルを調節することにより血管新生機能を調節することは公知である。例えば、内皮細胞中のｍｉＲ−２９６は、肝細胞増殖因子調節チロシンキナーゼ基質（ＨＧＳ）ｍＲＮＡを直接標的とすることにより血管新生に有意に寄与し、ＨＧＳのレベルの低下をもたらし、それにより増殖因子受容体ＶＥＧＦＲ２およびＰＤＧＦＲｂのＨＧＳ媒介性分解を低減する。Wurdingerら、Cancer Cell、１４巻、３８２〜３９３頁（２００８年）を参照のこと。さらに、ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−１６は、血管形成に関与する重要なプロ血管新生因子であるＶＥＧＦの発現を制御し、ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−１６の低酸素誘発性低下がプロ血管新生サイトカインであるＶＥＧＦの増加に寄与することが示された。Kuelbacherら、Trends in Pharmacological Sciences、２９巻（１号）、１２〜１５頁（２００７年）を参照のこと。
【０２６３】
ＡＭＤＡＣは、上の実施例１で述べたように準備した。ＡＭＤＡＣおよびＢＭ−ＭＳＣ細胞（比較物として用いた）を、ＭＩＲＶＡＮＡ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号１５６０）を用いたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の調製に供した。０．５×１０６〜１．５×１０６個の細胞を変性溶解緩衝液中で破壊した。次に、試料を酸−フェノール＋クロロホルム抽出にかけて、小ＲＮＡ種に高度に富むＲＮＡを単離した。１００％エタノールを加えて、試料を２５％エタノールとした。この溶解物／エタノール混合物をガラス繊維フィルターに通したとき、大ＲＮＡが固定化され、小ＲＮＡ種がろ液中に収集された。次いで、ろ液のエタノール濃度を５５％に増加させ、混合物を第２のガラス繊維フィルターに通し、ここで小ＲＮＡが固定化された状態になった。このＲＮＡを洗浄し、低イオン強度溶液中に溶出させた。回収された小ＲＮＡの濃度および純度は、２６０および２８０ｎｍでのその吸光度を測定することによって求めた。
【０２６４】
ＡＭＤＡＣは、次の血管新生ｍｉＲＮＡを発現することが認められた：ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、（血管新生ｍｉＲＮＡクラスター１７−９２のメンバー）、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６。ＡＭＤＡＣはまた、骨髄由来間葉幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）と比較したとき、より高いレベルの次の血管新生ｍｉＲＮＡを発現することが認められた：ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２（血管新生ｍｉＲＮＡクラスター１７−９２のメンバー）、ｍｉＲ−２９６。これらの結果は、ＡＭＤＡＣが高いレベルのＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲを発現するという所見（上を参照）とよく相関している。反対に、ＡＭＤＡＣは、ＢＭ−ＭＳＣと比較したとき、より低いレベルの次の血管新生ｍｉＲＮＡを発現することが認められた：ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ｂ、（血管新生ｍｉＲＮＡクラスター１７−９２のメンバー）、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６。ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−１６の発現の低下は、ＡＭＤＡＣに認められるＶＥＧＦのより高いレベルの発現と相関していた。
【実施例３】
【０２６５】
６．３  羊膜由来接着細胞の機能の特徴づけ
この実施例では、血管新生および分化能に関連するＡＭＤＡＣの各種特性を実証する。
【０２６６】
６．３．１  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のためのＨＵＶＥＣチューブの形成
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を継代数３以下でＥＧＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）中で３日間継代培養し、約７０％〜８０％の密集度で収集した。ＨＵＶＥＣを基礎培地／抗生物質（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ））で１回洗浄し、同じ培地に所望の濃度で再懸濁した。ＨＵＶＥＣは、準備してから１日以内に用いた。ヒト胎盤コラーゲン（ＨＰＣ）を１０ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ２．２５）中１．５ｍｇ／ｍＬの濃度とし、緩衝液で「中和」してｐＨ７．２とし、使用時まで氷上に保持した。ＨＰＣをＨＵＶＥＣ懸濁液と４０００細胞／μｌの最終細胞濃度で混合した。得られたＨＵＶＥＣ／ＨＰＣ懸濁液を直ちに１ウエル当たり３μｌで９６ウエルプレートにピペットで移した（蒸発を避けるためにプレートの周囲を滅菌済みＰＢＳで予め満たさなければならない、１条件当たりｎ＝５）。コラーゲンの重合を可能にするために培地を添加せずにＨＵＶＥＣ滴を３７℃、５％ＣＯ２で７５〜９０分間インキュベートした。「乾燥」インキュベーションの完了後、各ウエルに２００μｌの条件づけＡＭＤＡＣ培地（ｎ＝５細胞系）または対照培地（例えば、陰性対照としてのＤＭＥＭ／Ｆ１２および陽性対照としてのＥＧＭ−２）を緩やかに注入し、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。条件づけ培地は、継代数6の羊膜由来接着細胞を増殖培地中で４〜６時間インキュベートすることにより調製し、付着および広がりの後に、培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２に２４時間にわたって交換した。インキュベーション後、ＨＵＶＥＣ滴を乱さずに、培地をウエルから除去し、ウエルをＰＢＳで１回洗浄した。次いで、ＨＵＶＥＣ滴を１０秒間固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ細胞染色キットを用いて１分間染色し、その後、滅菌水で３回すすいだ。染色された滴を風乾し、Ｚｅｉｓｓ  ＳｔｅＲｅｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ８顕微鏡を用いて各ウエルの画像を得た。次いで、コンピュータソフトウエアパッケージ「ＩｍａｇｅＪ」および／またはＭａｔＬａｂを用いて画像を解析した。画像は、カラーから８ビットグレースケール画像に変換し、閾値を設定して白黒画像に変換した。次いで、カウント（個々の粒子の数）、総面積、平均サイズ（個々の粒子の）およびアッセイにおける内皮チューブ形成の量に等しい面積分率を含む、ピクセル密度データをもたらす、粒子解析機能を用いて、画像を解析した。
【０２６７】
条件づけ培地は、増殖チューブ形成の誘発によって実証された（図４参照）ように、内皮細胞に対して血管形成作用を及ぼした。
【０２６８】
６．３．２  ＨＵＶＥＣ移動アッセイ
この実験で、羊膜由来接着細胞の血管新生能が実証された。ＨＵＶＥＣをフィブロネクチン（ＦＮ）被覆１２ウエルプレートで密集状態まで増殖させ、単層を１ｍＬプラスチックピペットチップで「傷つけ」て、ウエルを横切る無細胞ラインを作った。「傷つけ」られた細胞を、３日間の増殖後に５つの羊膜由来接着細胞系から得られた血清不含有条件づけ培地（ＦＢＭ２；Ｃａｍｂｒｅｘ）とともにインキュベートすることにより、ＨＵＶＥＣの移動を試験した。細胞を含まないＦＢＭ２培地を対照として用いた。１５時間後に、無細胞領域内への細胞移動を倒立顕微鏡を用いて記録した（ｎ＝３）。次いで、コンピュータソフトウエアパッケージ「ＩｍａｇｅＪ」および／またはＭａｔＬａｂを用いて画像を解析した。画像は、カラーから８ビットグレースケール画像に変換し、閾値を設定して白黒画像に変換した。次いで、カウント（個々の粒子の数）、総面積、平均サイズ（個々の粒子の）およびアッセイにおける内皮移動の量に等しい面積分率を含む、ピクセル密度データをもたらす、粒子解析機能を用いて、画像を解析した。細胞移動の程度を最初に記録された傷ラインのサイズを対照として評価し、結果を１×１０６個細胞に対して標準化した。
【０２６９】
羊膜由来接着細胞により分泌された栄養因子は、細胞移動の誘発により実証された（図５参照）ように、内皮細胞に対して血管新生作用を及ぼした。
【０２７０】
別の実験において、ＨＵＶＥＣをＦＮ被覆９６ウエルプレートで密集状態以下に増殖させ、５つの羊膜由来接着細胞系のそれぞれの血清不含有条件づけ培地（ＥＢＭ−２培地、３日）とともに細胞をインキュベートすることにより、増殖の誘発を試験した。ＥＢＭ−２培地を陰性対照として用い、ＥＧＭ−２を陽性対照として用いた。４８時間後に、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＺ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いたＤＮＡ含量の測定により、細胞増殖を評価した。エラーバーは、反復分析値（ｎ＝３）の標準偏差を表し、結果を１×１０６個細胞に対して標準化した。
【０２７１】
羊膜由来接着細胞により分泌された栄養因子は、ＨＵＶＥＣの増殖を示唆する、ＤＮＡ濃度の増加をもたらした。図６を参照のこと。ここで「ＣＭ」は条件づけ培地である。
【０２７２】
６．３．３  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のためのアセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）取込み
培養中の内皮細胞および小グリア細胞は、蛍光性ＡｃＬＤＬを取り込むそれらの能力によって同定することができる。ＬＤＬのアポタンパク質のリシン残基がアセチル化されている場合、ＬＤＬ複合体は、ＬＤＬ受容体にもはや結合せず、その代わりに内皮細胞およびマクロファージによって高度に細胞特異的に取り込まれ得る。
【０２７３】
羊膜由来接着細胞をＶＥＧＦを含まない増殖培地またはＶＥＧＦを含むＥＧＭ２−ＭＶ（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で増殖させて、一般的に羊膜由来接着細胞の血管新生能ならびに羊膜由来接着細胞の分化能に対するＶＥＧＦの効果を評価した。細胞を１２ウエルプレートにおけるそれらのそれぞれの培地中で７０〜８０％の密集度に達するまで４〜７日間培養し、その後、１０μｇ／ｍＬアセチル化ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに一夜インキュベートした。次いで、細胞をＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色し、蛍光顕微鏡を用いてそれらのアセチル化ＬＤＬ取込みについて評価した。アセチル化ＬＤＬ取込みの対照細胞としてのＨＵＶＥＣをＥＧＭ２−ＭＶ中で増殖させ、上述のように分析した。羊膜由来接着細胞は、通常の増殖条件下ではアセチル化ＬＤＬの極わずかな取込みを示したが、ＶＥＧＦによる刺激により誘導され／分化させられて、それらの取込みを増加した。図７を参照のこと。
【０２７４】
６．３．４  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のためのチューブ形成
羊膜由来接着細胞をＶＥＧＦを含まない増殖培地またはＶＥＧＦを含むＥＧＭ２−ＭＶ中で増殖させて、一般的に細胞の血管新生能ならびに細胞の分化能に対するＶＥＧＦの効果を評価した。チューブ形成の対照細胞としてのＨＵＶＥＣをＥＧＭ２−ＭＶ中で増殖させた。細胞をそれぞれの培地中で７０〜８０％の密集度に達するまで４〜７日間培養した。冷（４℃）ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（５０μＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１２ウエルプレートのウエルに分注し、プレートを３７℃で６０分間インキュベートして、溶液をゲル化させた。ＡＭＤＡＣおよびＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン処理し、適切な培地（ＶＥＧＦを含むおよび含まない）に再懸濁し、１００μｌの希釈細胞（１〜３×１０４個細胞）をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）含有ウエルのそれぞれに加えた。０．５〜１００ｎｇ  ＶＥＧＦの存在または不存在下での重合ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上の細胞をＣＯ２インキュベーター中に３７℃で４〜２４時間入れた。インキュベーション後、標準光学顕微鏡を用いてチューブ形成の徴候について細胞を評価した。
【０２７５】
羊膜由来接着細胞は、ＶＥＧＦの不存在下では極わずかなチューブ形成を示したが、ＶＥＧＦによる刺激により誘導され／分化させられて、チューブ様構造を形成した。図８を参照のこと。
【０２７６】
６．３．５  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための低酸素反応性
内皮細胞および／または内皮前駆細胞の血管新生機能性を評価するために、低酸素および酸素正常状態条件下で血管新生増殖因子を分泌する細胞の能力に関して細胞を評価することができる。低酸素条件下での培養は、条件づけ培地中で測定することができる、内皮細胞または内皮前駆細胞による血管新生増殖因子の分泌の増加を通常誘発する。羊膜由来接着細胞をそれらの標準増殖培地中で等細胞数で平板培養し、約７０〜８０％の密集度まで増殖させた。その後、細胞を血清不含有培地（ＥＢＭ−２）に切替え、酸素正常状態（２１％Ｏ２）または低酸素（１％Ｏ２）条件下で４８時間インキュベートした。条件づけ培地を収集し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｎｓ製の市販のＥＬＩＳＡキットを用いて血管新生増殖因子の分泌を分析した。ＥＬＩＳＡアッセイを製造業者の指示に従って実施し、条件づけ培地中のそれぞれの血管新生増殖因子（ＶＥＧＦおよびＩＬ−８）の量を１×１０６個細胞に対して標準化した。
【０２７７】
羊膜由来接着細胞は、低酸素条件下で種々の血管新生増殖因子の高い分泌を示した。図９を参照のこと。
【０２７８】
別の実験において、ＡＭＤＡＣを標準増殖培地中で等細胞数で平板培養し、約７０〜８０％の密集度まで増殖させた。その後、細胞を血清不含有培地（ＥＢＭ−２）に切替え、酸素正常状態（２１％Ｏ２）または低酸素（１％Ｏ２）条件下で４８時間インキュベートした。細胞を、血管発生および血管形成に関与する受容体である細胞マーカーＣＤ２０２ｂ（Ｔｉｅ２、Ｔｅｋまたはアンジオテンシン１受容体としても公知である）についてフローサイトメトリー分析に供した。条件づけ培地を収集し、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｎｓ）を用いて血管新生増殖因子の分泌を分析した。フローサイトメトリー分析を上述のように実施し、ＥＬＩＳＡアッセイを製造業者の指示に従って実施した。条件づけ培地中のそれぞれの血管新生増殖因子の量を１×１０６個細胞に対して標準化した。ＡＭＤＡＣは、酸素正常状態条件と比較して低酸素条件下でＣＤ２０２ｂの高い発現を示した。図１０を参照のこと。
【０２７９】
６．３．６  羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための心筋形成分化
前駆細胞の心筋細胞系への分化を誘発するために、懸滴培養（ＨＤ、細胞の増殖を停止させ、分化過程を開始させるため）と特定の因子による増殖停止細胞のその後の処理との組合せを数段階で実施した。懸滴培養の後、細胞を、アクチビンＡ、骨形態発生タンパク質４（ＢＭＰ４）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２としても公知）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡとしても公知）およびディックコプフ（dickkopf）類似体１（ＤＫＫ１）の組合せにより１６日間の期間にわたって誘導した。手短に述べると、羊膜由来接着細胞を標準増殖培地中で約７０％の密集度まで増殖させた。次いで、細胞をトリプシン処理し、前述のように緩衝液で洗浄した。７００個の細胞を含む２０μｌの滴を適切な培地中に懸垂させ、マルチチャンネルピペットを用いて１００ｍｍペトリ皿の蓋の内側に入れた。蓋を注意深く反転させ、滴が乾燥しないようにするために２５ｍＬの滅菌済みＰＢＳを含む皿の上に置いた。懸滴培養を５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で４８時間インキュベートした。その後、さらなる誘導のために細胞の凝集体を系統特異的分化培地を含む０．１％ゼラチンで被覆した培養プレートに再播種した。
【０２８０】
刺激ステップを次のように進めた：段階１、４日ＢＭＰ４（０．５ｎｇ／ｍＬ）；段階２、５日ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、アクチビンＡ（３ｎｇ／ｍＬ）；段階３、３日ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍＬ）；段階４、４日ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＤＫＫ１（１５０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（５ｇ／ｍＬ）（＋／−５〜１０ｎＭ  ５−アザシチジン）。その後、処理細胞の全ＲＮＡを調製し、心筋形成マーカーについてのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を前述のように実施した。
【０２８１】
結果から、羊膜由来接着細胞は、種々の心筋形成マーカーを発現するように誘導／分化させることができることが示された。図１１を参照のこと。
【０２８２】
６．３．７  ＡＭＤＡＣ条件づけ培地に対するＨＵＶＥＣの反応
ＡＭＤＡＣを、６０％ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）；４０％ＭＣＢＤ−２０１（Ｓｉｇｍａ）；２％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ）、１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１０ｎｇ／ｍＬリノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１ｎ−デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）；１００μＭアスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ）；１０ｎｇ／ｍＬ表皮増殖因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；および１０ｎｇ／ｍＬ血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む増殖培地中で４８時間培養し、次いで、血清不含有培地中でさらに４８時間培養した。ＡＭＤＡＣ培養からの条件づけ培地を収集し、血清不足ＨＵＶＥＣｓを５、１５および３０分間刺激するために用いた。その後、ＨＵＶＥＣｓを溶解し、血管形成経路シグナル伝達に役割を果たすことが公知であるリンタンパク質についてＢＤ（商標）ＣＢＡ（サイトメトリービーズアッセイ）細胞シグナリングフレックスキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色した。ＡＭＤＡＣは、ＨＵＶＥＣｓにおけるＡＫＴ−１（アポトーシス過程を阻害する）、ＡＫＴ−２（インスリンシグナル伝達経路における重要なシグナル伝達タンパク質である）およびＥＲＫ  １／２細胞増殖経路の強い活性化因子であることが認められた。これらの結果は、ＡＭＤＡＣの血管新生能力をさらに実証するものである。
【実施例４】
【０２８３】
６．４  ＡＭＤＡＣによる血管新生の誘導
この実施例では、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）を用いたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて血管新生を誘発することを示す。
【０２８４】
２つの別個のＣＡＭアッセイを実施した。第１のＣＡＭアッセイでは、ＡＭＤＡＣの異なる調製物からの完全な細胞ペレットを評価した。第２のＣＡＭアッセイでは、異なるＡＭＤＡＣ調製物の上清を評価した。線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を陽性対照として、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を参照（陰性対照）として用いた。試験のエンドポイントは、すべての処理および対照群の血管密度を測定することであった。
【０２８５】
６．４．１  細胞を用いたＣＡＭアッセイ
上述のように調製し、凍結保存した本明細書でロット１、ロット２およびロット３と呼ぶ、３つのＡＭＤＡＣ細胞調製物を用いた。ＡＭＤＡＣを投与のために解凍し、ＣＡＭに投与した細胞の数を測定した。
【０２８６】
試験デザイン：本試験に各群１０個の胚を有する７群を含めた。本試験のデザインを表６に記述する。
【０２８７】
【表６】
0005869342.tif 000011
【０２８８】
ＣＡＭアッセイ手順：新鮮な受精卵を標準孵卵器中で３７℃で３日間インキュベートした。３日目に、卵を無菌条件下で割り、胚を１２枚の１００ｍｍプラスチックプレートに入れ、底部の棚上に貯水槽を備えた胚インキュベーター中で３７℃で培養した。インキュベーター中の湿度が一定に保たれるように小型ポンプを用いて空気を貯水槽中に連続的に通気した。６日目に、滅菌済みシリコーン製「Ｏ」リングを各ＣＡＭ上にのせ、７．６９×１０５個細胞／４０μＬの培地／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）混合物（１：１）の密度のＡＭＤＡＣを無菌フード内の各「Ｏ」リング内に供給した。表２Ａおよび２Ｂに用いた細胞の数および投与のために各細胞調製物に加えた培地の量を示す。媒体対照胚に４０μＬの媒体（ＰＢＳ／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）混合物、１：１）を投与し、陽性対照に４０μｌのＤＭＥＭ培地／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）混合物（１：１）中１００ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを投与し、培地対照に４０μｌのＤＭＥＭ培地のみを投与した。各投与が終了した後、胚をインキュベーターに戻した。８日目に、胚をインキュベーターから取り出し、１００倍の倍率の画像キャプチャシステムを用いて各「Ｏ」リングの下の血管密度を測定している間に室温に維持した。
【０２８９】
血管密度は、ＣＡＭ上の処理部位に存在する血管の数を示す０〜５の数または１〜３２の指数を用いた血管新生採点システムにより測定した。より高い得点数は、より高い血管密度を表すが、０は、血管新生なしを表す。各投与部位における抑制のパーセントは、各個別の実験ごとに対照試料から得られた平均評点で割った当部位について記録された評点を用いて計算した。所定の化合物の各用量における抑制のパーセントは、８〜１０個の胚から当用量において得られたすべての結果をプールすることによって計算した。
【０２９０】
【表７】
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【０２９１】
結果
血管密度の採点の結果を図１２に示す。結果から、幹細胞懸濁液のそれぞれ、または１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、もしくはＭＤＡＭＢ２３１乳癌細胞懸濁液で処理したニワトリ漿尿膜の血管密度評点が媒体対照ＣＡＭと比較して統計的に有意に高かった（Ｐ＜０．００１、Ｓｔｕｄｅｎｔの「ｔ」検定）ことが明らかにわかる。幹細胞を培養するために用いた培地は、血管密度に影響を及ぼさなかった。さらに、ＡＭＤＡＣ調製物の血管密度の誘導はある程度の変動を示したが、変動は統計的に有意でなかった。このことから、５つの幹細胞調製物のそれぞれの誘導能力がほぼ同じであったと結論される。
【０２９２】
６．４．２  ＡＭＤＡＣ細胞上清を用いたＣＡＭアッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞および上のＡＭＤＡＣ  ＣＡＭアッセイで述べた各種幹細胞調製物の上清試料を第２のＣＡＭアッセイに用いた。ＡＭＤＡＣ  ＣＡＭアッセイと同様に、ｂＦＧＦおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を陽性対照として用いた。
【０２９３】
試験デザイン：本試験に各群１０個の胚を有する７群を含めた。本試験のデザインを表８に記述する。
【０２９４】
【表８】
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【０２９５】
ＣＡＭアッセイ手順：アッセイの手順は、ＡＭＤＡＣ  ＣＡＭアッセイにおいて上で述べたのと同じであった。唯一の差異は、各幹細胞調整物およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の上清を被験物質として用いたことであった。投与のために、各上清をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）と混合し（体積で１：１）、４０μＬの混合物を各胚に投与した。
【０２９６】
結果
血管密度の評点（図１３参照）は、各幹細胞調製物の上清による血管形成の誘導が異なることを示すものである。３ロットのＡＭＤＡＣの上清試料は、それぞれＰ＜０．０１、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．０２（Ｓｔｕｄｅｎｔの「ｔ」検定）で血管誘導に対する有意な効果を示した。予想されたように、陽性対照ｂＦＧＦもＣＡＭアッセイＮｏ．１で上で認められたような血管形成の強力な誘導を示した（Ｐ＜０．００１、Ｓｔｕｄｅｎｔの「ｔ」検定）。しかし、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の上清は、媒体対照と比較して血管形成に対する有意な誘導を示さなかった。前に示したように、培養培地単独は、何らの影響も及ぼさなかった。
【実施例５】
【０２９７】
６．５  ＡＭＤＡＣは神経保護作用を示す
この実施例では、ＡＭＤＡＣが酸素グルコース不足（ＯＧＤ）障害アッセイを用いた低酸素および低グルコース条件で神経保護作用を有し、活性酸素種を減少させることを実証する。したがって、これらの結果は、ＡＭＤＡＣが脳卒中または末梢血管疾患などの虚血状態の治療に有用であり、虚血状態に起因する再潅流傷害を防止するであろうことを示すものである。
【０２９８】
ヒトニューロン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カタログ番号１５２０）を製造業者の推奨に従って培養した。手短に述べると、培養容器を滅菌蒸留水中ポリＬ−リシン（２μｇ／ｍＬ）で３７℃で１時間被覆した。容器を再蒸留Ｈ２Ｏで３回洗浄した。ニューロン培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を容器に加え、インキュベーター中で３７℃に平衡化した。ニューロンを解凍し、遠心分離せずに容器に直接加えた。その後の培養中、培養の開始の翌日およびその後は隔日に培地を交換した。ニューロンは、一般的に４日目までに傷害を受ける準備が整った。
【０２９９】
ＯＧＤ培地（ダルベッコの修正イーグル培地−グルコース不含有）は、１つには液体培地中の酸素の溶解度を減少させるために最初に培地を水浴中で加温することによって調製した。溶存酸素を除去するために、０．５μｍ拡散石（diffusing stone）を用いて１００％窒素を培地中に３０分間通気した。へぺス緩衝液を１ｍＭの最終濃度で加えた。スパージの終了時に培地をニューロンに直接加えた。浸漬型酸素センサーを用いて酸素レベルを確認するために培地の小試料を分割採取した。酸素レベルは、一般的に０．９％〜約５．０％酸素に低下した。
【０３００】
ガス処理前にチャンバーを少なくとも４時間（一夜が好ましい）３７℃のインキュベーター中に入れることにより、低酸素チャンバーを準備した。培養容器中の培地を除去し、脱気培地を入れ替え、培養容器を低酸素チャンバー中に入れた。次いで、システム全体に９５％Ｎ２／５％ＣＯ２ガスを２０〜２５Ｌｐｍの速度で少なくとも５分間通して低酸素チャンバーをフラッシュした。システムをインキュベーター中で３７℃で４時間インキュベートし、１時間後にチャンバーをもう一度脱気した。
【０３０１】
傷害処置の終了時に、ＯＧＤ培地を吸引し、温培地をニューロンに加えた。２４〜２８時間後に、ＡＭＤＡＣおよびニューロンをニューロン培地に懸濁した６ウエルプレートの１ウエル当たり各１０００００個の細胞の等数で平板培養し、ニューロンに加え、６日間共培養した。
【０３０２】
各条件について６ウエルプレートにおけるランダム視野の顕微鏡写真を撮影した。典型的なニューロンの形態を有する細胞を同定し、ニューライト長を記録した。ニューライトの平均長は、ニューロンの健康と正の相関を有するものであり、ニューロンとＡＭＤＡＣの共培養でより長く、ＡＭＤＡＣが傷害から細胞を防護していることが示唆される。
【０３０３】
活性酸素種アッセイ
ＡＭＤＡＣは、低酸素時にスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼおよびヘムオキシゲナーゼ遺伝子を発現すると判断された。活性酸素種を除去し、そのような種から細胞を保護するＡＭＤＡＣの能力を、過酸化水素を活性酸素種発生源として用いたアッセイで究明した。
【０３０４】
アッセイの説明：標的細胞（星状細胞、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ポリＬ−リシンをプレコートした９６ウエル黒色ウエルプレートに６０００個／ｃｍ２で播種した。星状細胞を３７℃の増殖培地中で５％二酸化炭素で一夜付着させる。翌日、培地を除去し、細胞を蛍光発生プローブである細胞透過性色素ＤＣＦＨ−ＤＡ（ジクロロフルオレセイン二酢酸塩）とともにインキュベートした。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはハンクス緩衝塩類溶液で洗浄することにより、過剰な色素を除去した。次いで、１０００μＭ過酸化水素を３０〜６０分間加えることにより、細胞を活性酸素種で傷害を加えた。次いで、過酸化水素含有培地を除去し、血清不含有、グルコース不含有増殖培地と交換した。ＡＭＤＡＣ（ロット１もしくはロット２と呼ぶいずれかの細胞）またはＢＭ−ＭＳＣを６０００個／ｃｍ２で加え、細胞をさらに２４時間培養した。次いで、細胞を標準蛍光プレートリーダーで４８０Ｅｘおよび５３０Ｅｍで読み取った。培地の活性酸素種含量は、細胞質ゾル中のＤＣＦＨ−ＤＡのレベルと正比例していた。活性酸素種含量は、所定のＤＣＦ標準曲線との比較により測定した。すべての実験は、Ｎ＝２４で行った。
【０３０５】
アッセイのために、２０ＸＤＣＦＨ−ＤＡ保存溶液をウシ胎児血清不含有の細胞培養培地で１×に希釈し、均一になるまで撹拌することにより１×ＤＣＦＨ−ＤＡを使用直前に調製した。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）希釈物は、必要に応じてＤＭＥＭまたはＤＰＢＳ中で調製した。標準曲線は、１ｍＭ  ＤＣＦ標準を細胞培養培地で希釈し、１００μｌのＤＣＦ標準を蛍光測定に適する９６ウエルプレートに移し、１００μｌの細胞溶解緩衝液を加えることにより、０μＭ〜１０μＭの濃度範囲の１：１０希釈系列として作製した。蛍光は、４８０Ｅｘおよび５３０Ｅｍで読み取った。
【０３０６】
結果：用いた両ロットのＡＭＤＡＣは、星状細胞共培養中の活性酸素種の濃度を有意に低下させた。図１４Ａおよび１４Ｂを参照のこと。これに対して、ＢＭ−ＭＳＣは、星状細胞共培養中の活性酸素種を有意に低下させなかった。
【０３０７】
６．６  羊膜由来接着細胞を用いる治療の方法
６．６．１  心筋梗塞の治療
５０歳代なかばの男性が２０分間以上の左腕へと放射する胸痛、息切れ、悪心、動悸、発汗を提示している。心電図結果ならびにクレアチンキナーゼの血中濃度の上昇および低下により、心臓の前壁の心筋梗塞（貫壁性）の鑑別診断がなされている。ニトログリセリンおよびストレプトキナーゼによる患者の安定化後に、患者には０．９％生理食塩水中１×１０８〜５×１０８個のＡＭＤＡＣを局所麻酔のもとで心臓用注射器を用いて罹患部位に直接投与する。患者は、救急体制で次の７２時間モニターする。梗塞部位の血行再建の程度を評価するために、患者を心電図および／または色素視覚化技術により治療後の次の３カ月間にわたりさらにモニターする。心電図結果がＡＭＤＡＣの投与前より正常に目に見えて近い場合、または視覚化された梗塞部位が目に見えて血行再建されている場合、治療の有効性は立証される。
【０３０８】
６．６．２  心筋症の治療
患者が息切れ、下肢およびくるぶしの腫脹ならびに不規則心拍を提示している。他の原因の排除後および確認心電図により、心筋症の診断がなされている。超音波検査図により、患者はうっ血性心筋症を有することが確認される。患者には０．９％生理食塩水中１×１０８〜５×１０８個のＡＭＤＡＣを局所麻酔のもとで心臓用注射器を用いて心臓動脈に直接投与する。患者は、より正常な血流量を示す超音波検査図の変化について、また息切れの感覚の改善ならびに下肢およびくるぶしの腫脹の低減について次の３カ月間にわたってモニターする。これらの徴候のいずれかがモニタリング期間中に改善を示す場合、患者に関し治療の有効性は立証される。
【０３０９】
６．６．３  末梢血管疾患の治療
患者は懸垂（dangling）時に赤くなる足の冷感、刺痛感、ならびに下肢の疼痛、脱力および疲労を提示している。糖尿病の排除の後、末梢動脈疾患の診断がなされる。患者に４５０ｍＬの０．９％生理食塩水中１×１０９〜５×１０９個のＡＭＤＡＣを静脈内投与し、次の３カ月間にわたり週２回モニターする。上述の症状のいずれかがモニタリング期間中に改善する場合、治療の有効性は立証される。
【０３１０】
６．６．４  末梢血管疾患の治療
患者は懸垂時に赤くなる足の冷感、刺痛感、ならびに下肢の疼痛、脱力および疲労を提示している。糖尿病の排除の後、末梢動脈疾患の診断がなされる。患者に５ｍＬの０．９％生理食塩水中１×１０８〜５×１０８個のＡＭＤＡＣを筋肉内投与し、かつ／または同等な量を静脈内もしくは動脈内、足の指の間に局所的に投与し、次の３カ月間にわたり週２回モニターする。上述の症状のいずれかがモニタリング期間中に改善する場合、治療の有効性は立証される。
【０３１１】
６．６．５  末梢血管疾患の併用治療
患者は懸垂時に赤くなる足の冷感、刺痛感、ならびに下肢の疼痛、脱力および疲労を提示している。糖尿病の排除の後、末梢動脈疾患の診断がなされる。患者に４５０ｍＬの０．９％生理食塩水中１×１０９〜５×１０９個のＡＭＤＡＣを静脈内投与し、次の３カ月間にわたり週２回モニターする。患者に１日２回服用するシロスタゾール（Cilostazol）１００ｍｇも処方する。上述の症状のいずれかがモニタリング期間中に改善する場合、治療の有効性は立証される。
【０３１２】
６．６．６  末梢血管疾患の併用療法
患者は懸垂時に赤くなる足の冷感、刺痛感、ならびに右下肢の疼痛、脱力および疲労を提示している。糖尿病の排除の後、末梢動脈疾患の診断がなされる。患者は血管形成術および大腿動脈にステントを埋め込む手術を受ける。患者にその後、４５０ｍＬの０．９％生理食塩水中１×１０９〜５×１０９個のＡＭＤＡＣを静脈内投与し、次の３カ月間にわたり週２回モニターする。上述の症状のいずれかがモニタリング期間中に改善する場合、治療の有効性は立証される。
【０３１３】
６．６．７  ＡＭＤＡＣを用いる脳卒中の治療
５２歳の男性が身体の左側の片麻痺および部分的失語症を提示している。虚血性脳卒中の診断がなされる。磁気共鳴撮像法を用いて虚血の部位を特定した後、患者について罹患側の頭蓋に開口部を造るための手術の準備をする。開口部を造った後、１〜２ｍＬの０．９％生理食塩溶液中５×１０７〜１×１０８個のＡＭＤＡＣを虚血部位に投与する。脳卒中のいずれかの症状、特に片麻痺または失語症の改善の徴候について患者を次の７〜１４日間にわたってモニターする。上述の症状のいずれかがモニタリング期間中に改善する場合、治療の有効性は立証される。
【０３１４】
６．６．８  ＡＭＤＡＣを用いる脳卒中の治療
５２歳の男性が身体の左側の片麻痺および部分的失語症を提示している。虚血性脳卒中の診断がなされる。磁気共鳴撮像法を用いて虚血の部位を特定した後、患者について罹患側の頭蓋に開口部を造るための手術の準備をする。開口部を造った後、４５０ｍＬの０．９％生理食塩溶液中１×１０９〜５×１０９個のＡＭＤＡＣを静脈内投与する。脳卒中のいずれかの症状、特に片麻痺または失語症の改善の徴候について患者を次の７〜１４日間にわたってモニターする。上述の症状のいずれかがモニタリング期間中に改善する場合、治療の有効性は立証される。
【０３１５】
同等物：
本発明は、本明細書で述べた特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、述べたものの他の本発明の様々な変更形態は、前述の説明および添付図から当業者に明らかになるであろう。そのような変更形態は、添付する特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。
【０３１６】
それらの開示がそれらの全体として参照により組み込まれている、種々の刊行物、特許および特許出願が本明細書で引用されている。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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