(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリカン及び／又は複合糖質を精製する方法であって、
（ａ）グリカン及び／又は複合糖質を含有するサンプルを、脱脂綿を含む固定相にアプライし；
（ｂ）第一溶媒で固定相を洗浄し；及び
（ｃ）第二溶媒で固定相からグリカン及び／又は複合糖質を溶出する
ことを含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）において、グリカン及び／又は複合糖質を含有するサンプルは有機溶媒を含み；該有機溶媒はアセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、又はテトラヒドロフランを含み；好ましくは、有機溶媒は７０％ｖ／ｖから８８％ｖ／ｖの間のアセトニトリル水溶液であり；より好ましくは、有機溶媒は７５％ｖ／ｖから８５％ｖ／ｖの間のアセトニトリル水溶液であり；より好ましくは、有機溶媒は８３％ｖ／ｖのアセトニトリル水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、第一溶媒は、水、有機溶媒及び酸を含む溶媒混合物であり；好ましくは、有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、又はテトラヒドロフランであり、酸は、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、又はヘプタフルオロ酪酸であり；より好ましくは該溶媒混合物は、７５％ｖ／ｖから９０％ｖ／ｖの有機溶媒と、０．１％ｖ／ｖから１％ｖ／ｖの酸の水溶液；又は７０％ｖ／ｖから９５％ｖ／ｖの有機溶媒と、０．１％ｖ／ｖから３％ｖ／ｖの酸の水溶液；より好ましくは溶媒混合物は８３％ｖ／ｖのアセトニトリルと０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸水溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）において、第二溶媒は極性溶媒を含み；好ましくは極性溶媒は水、ジメチルスルホキシド、又はジメチルホルムアミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第二溶媒は、第一溶媒よりも多く極性溶媒を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
複合糖質は、糖タンパク質、糖ペプチド又は糖脂質であり；好ましくは糖ペプチドは、ＩｇＧ糖ペプチドであり；より好ましくはＩｇＧの糖ペプチドは、トリプシンＩｇＧのＦｃのＮ−糖ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
グリカンがＮ−グリカンである、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
固定相は再使用可能である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
固定相は脱脂綿を含み；好ましくは固定相は脱脂綿からなる、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
固定相は約５００μｇの脱脂綿を含む、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
方法が溶出グリカン及び／又は複合糖質に関する質量分光分析を行う工程を更に含み；好ましくは質量分光分析はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ検出である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
方法が溶出した糖ペプチドの糖ペプチドレベルでのグリコシル化プロファイリングの工程を更に含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
固定相は開口した容器内に保持されており；好ましくは開口型容器は、ピペット、マルチチャンネルピペット又はピペットチップである、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
精製工程は、糖タンパク質のＰＮＧａｓｅ Ｆ処理後にグリカンを除去し、還元的アミノ化により蛍光標識した後でグリカンを除去し、又はタンパク質分解消化物からＮ−糖ペプチドを濃縮するために使用することができる、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４の何れか一項に記載の方法を実施するためのグリカン及び／又は複合糖質を精製するためのキットであって、該キットが、
脱脂綿を含む固定相を含有するキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、精製方法に関する。特に、本発明は、グリカン又は複合糖質を精製するための方法に関する。
【０００２】
その速度、分解能及び感受性のため、現代の質量分析は、タンパク質の同定、部位特異的グリコシル化プロファイルの決定、及び糖ペプチド又は放出されたグリカンのレベルでのグリカンの構造特性評価を含むタンパク質グリコシル化の詳細な構造的特徴づけのための大きな機会を提供する。
【０００３】
糖ペプチド及びグリカンの効率的なイオン化と検出のために、濃縮又は精製工程がしばしば要求される。(Mechref et al., Chem.Rev. 2002, 102, 321-369に記載されているように)黒鉛化炭素固相抽出（ＳＰＥ）、ヒドラジンカップリング、及びレクチン又は抗体親和性クロマトグラフィーの次に、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）が特にこの目的のために適していることが見いだされている。
【０００４】
レクチンと抗体の特異性は、多くの場合、プールからグリカン又は糖ペプチドの一部の分離を可能にするのみであるが、ＨＩＬＩＣ及び黒鉛化炭素ＳＰＥは、広範囲の複合糖質の単離のために使用することができ、これらの吸着クロマトグラフィー法を広範囲のグライコミクス研究及びグライコプロテオミクス研究に適用可能にしている。
【０００５】
ＨＩＬＩＣ ＳＰＥは、トリプシンＮ−糖ペプチドの濃縮に特に有用であることが見出されている。この目的のために、ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ固定相は、移動相の添加剤としてトリフルオロ酢酸を用いたイオン対形成モードで(Mysling et al Anal.Chem. 2010, 82, 5598-5609に記述されるように)適用されている。
【０００６】
あるいは、炭水化物を基材とした固定相、例えばセファロース及び微結晶性セルロースなどが、(Wada, Y et al.; Anal.Chem. 2004, 76, 6560-6565に記述されるように)Ｎ−糖ペプチド単離のために 適用されている。
【０００７】
これらの炭水化物を基材とした固定相の重要な特徴は、それらが非イオン性であることである。従って、ＨＩＬＩＣ吸着は、固定相とのグリカン部分の水素結合によって支配され、一方で非グリコシル化ペプチド、脂質、塩及び洗剤活性剤は、保持が低いか、或いは全く保持を示さない傾向にある(Wuhrer et al., Mass Spectrom.Rev. 2009, 28, 192-206に記載される通り)。
【０００８】
複合糖質の保持は、通常、８０％の範囲でのアセトニトリル濃度で達成されるが、一方溶出は高水含量で実施される。要求される溶出条件は、オンラインとオフラインモードの両方でＨＩＬＩＣを質量分析と非常に適合性を持たせている。
【０００９】
ＩｇＧのＦｃのＮ−グリコシル化プロファイルは、バッチモードまたは９６ウェルプレートハイスループット形式で行われる、セファロース並びに微結晶性セルロースによるＨＩＬＩＣ ＳＰＥの後で、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより再現可能な堅牢な方法で分析することができることが知られている (Selman et al.; Anal.Chem. 2010, 82, 1073-1081)。
【００１０】
グリカン及び複合糖質などの分子を精製するための効率的かつ効果的な方法に対する必要性が依然として存在する。
【００１１】
複合糖質やグリカンなどの分子の簡単かつ迅速に精製を可能にするデバイスを製造するために、脱脂綿（ｃｏｔｔｏｎ ｗｏｏｌ）を使用することができることが本出願人により見出された。本発明は、糖タンパク質のＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）処置の後に、Ｎ−グリカンを抽出するとき、例えばＩｇＧのＦｃのＮ−グリコシル化プロファイリング用として、及び界面活性剤及び塩を首尾良く除去するために、単純、高速かつ堅牢な精製手順の鍵となる部分として、脱脂綿マイクロチップの使用を可能にする。
【００１２】
本発明によれば、
（ａ）綿を含む固定相を提供し；
（ｂ）グリカン及び／又は複合糖質を含有するサンプルを固定相にアプライし；
（ｃ）第一溶媒で固定相を洗浄し；及び
（ｄ）第二溶媒で固定相からグリカン及び／又は複合糖質を溶出する
工程を含むグリカン及び／又は複合糖質を精製する方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、工程（ｂ）において、グリカン及び／又は複合糖質を含有するサンプルは有機溶媒を含み；ここで該有機溶媒はアセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、又はテトラヒドロフランを含有する。
【００１４】
好ましくは、有機溶媒は７０％ｖ／ｖから８８％ｖ／ｖの間のアセトニトリル水溶液であり；より好ましくは、有機溶媒は７５％ｖ／ｖから８５％ｖ／ｖの間のアセトニトリル水溶液であり；より好ましくは、有機溶媒は８３％ｖ／ｖのアセトニトリル水溶液である。  
【００１５】
好ましくは、工程（ｃ）において、第一溶媒は、水、有機溶媒及び酸を含む溶媒混合物である。より好ましくは、有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、テトラヒドロフランであり、酸は、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、又はヘプタフルオロ酪酸である。
【００１６】
好都合なことに、上記の溶媒混合物は、７５％ｖ／ｖから９０％ｖ／ｖの有機溶媒と、０．１％ｖ／ｖから１％ｖ／ｖの酸の水溶液を含む。あるいは、上記の溶媒混合物は、70%ｖ／ｖから95%ｖ／ｖの有機溶媒と、０．１%ｖ／ｖから３％ｖ／ｖの酸の水溶液を含む。好ましくは、溶媒混合物は８３％ｖ／ｖのアセトニトリルと０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸水溶液を含む。
【００１７】
好ましくは、工程（ｄ）において、第二溶媒は極性溶媒を含む。より好ましくは、極性溶媒は、水、ジメチルスルホキシド、又はジメチルホルムアミドである。
【００１８】
任意で、第二溶媒は、第一溶媒よりも極性溶媒を含む。
【００１９】
好ましくは、工程（ｃ）において、洗浄は固定相から、塩、非グリコシル化ペプチド、脂質、界面活性剤、過剰な還元末端標識、還元剤、変性剤及び変性タンパク質を除去する。
【００２０】
任意で、複合糖質は、糖タンパク質、糖ペプチド又は糖脂質である。好ましくは、本方法は、グリカン又は糖ペプチドの精製のためである。
【００２１】
好都合には、糖ペプチドは、ＩｇＧ糖ペプチドである。
【００２２】
好ましくは、ＩｇＧの糖ペプチドは、トリプシンＩｇＧのＦｃのＮ−糖ペプチドである。
【００２３】
任意で、グリカンは、Ｎ−グリカンである。
【００２４】
好都合には、固定相は、再使用可能である。
【００２５】
好ましくは、固定相は、脱脂綿を含む。
【００２６】
好ましくは、固定相は、脱脂綿からなる。
【００２７】
好ましくは、固定相は、約５００μｇの脱脂綿を含む。固定相は、約２５０から７５０μｇの脱脂綿を含有することができる。
【００２８】
好ましくは、本方法は溶出グリカン及び／又は複合糖質に関する質量分光分析又は蛍光検出を行う工程を更に含む。
【００２９】
任意で、質量分光分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの検出である。
【００３０】
好ましくは、蛍光色素による還元的アミノ化によって標識されたグリカンは、蛍光検出によるＨＰＬＣ、又はレーザー誘起蛍光検出キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ−ＬＩＦ）により分析される。
【００３１】
好都合には、本方法は、溶出した糖ペプチドの糖ペプチドレベルでのグリコシル化プロファイリングの工程を更に含む。
【００３２】
好ましくは、固定相は開口した容器内に保持されている。容器は、一端で又は両側で開放されてもよい。好ましくは、容器は、両端で開放されている。
【００３３】
任意で、開口型容器は、ピペット、マルチチャンネルピペット又はピペットチップである。
【００３４】
好都合には、精製工程は、糖タンパク質のＰＮＧａｓｅ Ｆ処理後にグリカンを除去し、還元的アミノ化により蛍光標識した後でグリカンを除去し、又はタンパク質分解消化物からＮ−糖ペプチドを濃縮するために使用することができる。
【００３５】
本発明の更なる態様によれば、グリカン及び／又は複合糖質を精製するためのキットが提供され、そのキットは綿を含む固定相、及び本発明の方法によるグリカン及び／又は複合糖質を精製するための説明書を含有する。キットは、固定相を保持するための容器を更に含むことができる。好ましくは、キットは、開放端容器内に位置する固定相を含む。
【００３６】
任意で、キットは、綿の固定相を保持しているピペットチップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本発明は、添付の図面を参照して、例として説明され、ここで；
【図１】図１は、綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップの製造を示す４つの写真を含む。カット綿（Ａ）から、およそ５００μｇを採取し（Ｂ）、鈍金属針（Ｃ）を用いて１０μｌのピペットチップ内に押し込む。綿は、チップ（Ｄ）の端部に押し下げられる；
【図２】図２は綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを用いて調製したＩｇＧの糖ペプチドの二つのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量分光分析プロファイルを示す。質量スペクトルは、ＣＨＣＡマトリックス（Ａ）を用いた正のリフレクトロンモード及びＤＨＢマトリックス（Ｂ）を用いた正のリニアモードで記録された。ＩｇＧ１とＩｇＧ２の糖ペプチドは、それぞれ切れ目なく伸びた矢と破線の矢により示されている：正方形、Ｎ−アセチルグルコサミン；三角形、フコース；暗い円、マンノース；明るい円、ガラクトース；菱形、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＰＥＰ、ペプチド部分；
【図３】図３は、綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥのマイクロチップを適用するＩｇＧ１の糖ペプチドプロファイリングのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの再現性により記録されたＩｇＧ１のＦｃのＮグリコシル化プロファイリングを示す。ＩｇＧ１糖ペプチドはＣＨＣＡマトリックス（Ａ，Ｃ）を用いたリフレクトロンモード、及びＤＨＢマトリックス（Ｂ，Ｄ）を用いたリニアモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより検出された。サンプルは、中和法を用いて消化した後に調製し、三つの異なるブランドのカット綿（Ａ、Ｂ）から調製した綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップにより脱塩した。得られたプロファイルは、真空遠心分離により乾燥し、配列決定グレードのトリプシン（Ｃ、Ｄ）で消化した後に、セファロースビーズ又は綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥのマイクロチップによって精製された糖型のパターンと比較した。各々の独立した実験において、相対強度とＲＳＤｓが８つの複製から計算された；
【図４】図４は、ＩｇＧ糖ペプチドの脱塩及び精製のための綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップの再現性を示す。分析は、ＣＨＣＡマトリックスによるリフレクトロンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより行った。トリプシン消化ＩｇＧのプールを、綿のＨＩＬＩＣマイクロチップ（Ａ及びＢ）又は８つの異なる綿ＨＩＬＩＣのマイクロチップ（Ｃ及びＤ）の何れかにより、８回脱塩した。実験は、４つの異なる日において反復された。
【図５】図５は、綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを適用するＩｇＧ２の糖ペプチドの再現性を示す。ＩｇＧ２糖ペプチドはＣＨＣＡマトリックス（Ａ，Ｃ）を用いたリフレクトロンモード、及びＤＨＢマトリックス（Ｂ，Ｄ）を用いたリニアモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより検出された。サンプルは、中和法を用いて消化した後に調製し、三つの異なるブランドのカット綿（Ａ、Ｂ）から調製した綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップにより脱塩した。得られたプロファイルは、真空遠心分離により乾燥し、配列決定グレードのトリプシン（Ｃ、Ｄ）で消化した後に、セファロースビーズ又は綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥのマイクロチップによって精製された糖型のパターンと比較した。各々の独立した実験において、相対強度とＲＳＤｓが８つの複製から計算された；
【図６】図６は、綿ＨＩＬＩＣ（Ａ）の前と綿ＨＩＬＩＣ精製（Ｂ）の後での、プロテインＡ捕捉ＩｇＧから放出されたＮグリカンのＲＰ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを示す。
【図７】図７は、綿ＨＩＬＩＣ（Ａ）の前と綿ＨＩＬＩＣ精製（Ｂ）の後での、プロテインＡ捕捉ＩｇＧから放出されたＮグリカンのＬＰ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを示す。
【図８】図８は、綿ＨＩＬＩＣ（Ａ）の前と綿ＨＩＬＩＣ精製（Ｂ）の後での、プロテインＡ捕捉ＩｇＧから放出されたＮ−グリカンのリニアネガティブモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを示す。
【図９】図９は、綿ＨＩＬＩＣ（Ａ）の前と綿ＨＩＬＩＣ精製（Ｂ）の後での、トランスフェリンから放出されたＮ−グリカンのリニアネガティブモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを示す。
【図１０】図１０は、還元的アミノ化により、２−アミノ安息香酸（ＡＡ）で標識したヒト血漿タンパク質由来のＰＮＧａｓｅ Ｆが放出し、その後綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥのマイクロチップを用いて精製されたＮ−グリカンのリニア陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す；
【図１１】図１１は、綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを使用して精製後に、ウシフェチュイン由来のトリプシン性糖ペプチド（Ａ）及びＰＮＧａｓｅ放出型Ｎ−グリカン（Ｂ）のリニア陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図１２】図１２は、綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを使用して精製後に、ヒトのアポトランスフェリン糖ペプチド由来のトリプシン性糖ペプチド（Ａ）及びＰＮＧａｓｅ放出型Ｎ−グリカン（Ｂ）のリニア陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【００３８】
本発明によれば、複合糖質及び／又はグリカンの抽出のための綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップの手順が提供される。複合糖質は、別の部分に共有結合されている炭水化物を含む部分である。複合糖質は、糖タンパク質、糖ペプチド、ペプチドグリカン、脂質及びリポ多糖が含まれる。好ましい複合糖質は、糖タンパク質、糖ペプチド及びペプチドグリカンである。好ましくは、複合糖質は、糖ペプチドである。好ましくは、複合糖質は、糖タンパク質である。
【００３９】
この手順は良好な再現性を示しており、カット綿の特定のブランド又はバッチに依存しているようには見えない。この脱脂綿マイクロチップは安価であり、研究室で容易にかつ迅速に調製することができる。
【００４０】
マイクロチップは、ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣマイクロチップを含み、様々な固定相で導入されている。幾つかの他のマイクロチップとは対照的に、綿固定相は、液体の吸引及び分注の両方で適所にとどまる。更に、固定相は、（Craft et al., J.Proteome Res. 2002, 1, 537-547に記載されるように）酸性及び高アセトニトリル条件と適合性があるように見えた。
【００４１】
ＨＩＬＩＣ ＳＰＥのマイクロチップを確立した次に、二つの更なる修飾がＩｇＧのＦｃのＮ−グリコシル化プロファイルプロトコル（以前にCraft, et al J.Proteome Res. 2002, 1, 537-547に記述）に導入された。第一に、トリプシン性切断が、より高価な配列決定グレードのトリプシンの代わりにＴＰＣＫ処置済みのトリプシンを用いて行った。第二に、プロテインＡ溶出液からのギ酸を除去するために適用される、かなり労力のいる真空遠心分離工程は、単純な中和法により置き換えられており、プロトコルを自動化用に容易でより適するようにしている。
【００４２】
未加工綿は主にセルロースからなる（９０％超） (Fan Qinguo,編者, 2005, Chemical testing of textiles, 336頁; Woodhead Publishing ISBN: 1855739178)。綿は、衣類、綿棒（Ｑチップ）及びカット綿などの様々な市販製品で使用されている。カット綿と綿棒用の脱脂綿の製造のために、未加工綿は広範囲に漂白が施され、その後繊維は梳かれ、無作為化され、高圧水で処理され、繊維を交差させて結ぶ。製造プロセスの最中で、わずかなワックスとタンパク質が綿から除去され、その結果、カット綿は実質的に純粋なセルロースから構成される。
【００４３】
セファロース及び微結晶性セルロースなどのポリＨＥＡ及び炭水化物ＨＩＬＩＣ固定相と同様に、脱脂綿は、非イオン性、中性固定相であり、ＨＩＬＩＣ保持は単に水素結合によって引き起こされると予想される。これとは対照的に、（Wuhrer et al., Mass Spectrom.Rev. 2009, 28, 192-206に記載されるように）イオン性相互作用は、塩及び／又はイオン対試薬の添加によって調節されうる、ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ並びにアミン系固定相によるＨＩＬＩＣ保持に寄与し得る。
【００４４】
セファロース及び微結晶性セルロースは、再現可能なＩｇＧのＦｃのＮ−グリコシル化プロファイルに首尾良く適用され、脱脂綿ＨＩＬＩＣマイクロチップは、同じ目的のために使用することができ、使用の容易性、微量のサンプルに対する適合性、ＭＡＬＤＩ標的プレート上にサンプルを直接溶出することの可能性に関する具体的な利点を有する。
【００４５】
特記すべきは、本発明者らは、脱脂綿ＨＩＬＩＣのマイクロチップは、塩及び大半の非グリコシル化ペプチドの除去に適しているだけでなく、トリプシン消化由来のＳＤＳなどの界面活性剤を除去に適していることを見いだした。従って、脱脂綿マイクロチップは、変性剤及び界面活性剤が、多くの場合、タンパク質の溶解性及びタンパク質の切断を改善するために添加される、グライコミクス及びプロテオミクスのアプリケーションにおけるサンプル浄化装置としての役割を果たすことができる。
【００４６】
炭水化物系のＨＩＬＩＣ固定相は、(Ruhaak et al., Anal.Bioanal.Chem. 2010, 397, 3457-3481に記載されるように)質量分析法により血漿の総Ｎ−グライコーム解析のために更に使用することができる。アミノ酸（ＡＡ）−標識されたＮ−グリカンは、変性したタンパク質と一緒に、過剰の標識、還元剤、種々の塩、血漿脂質、及び多量の界面活性剤を含有する標識混合物から精製され、続いてＭＳを用いてグリカンを検出する。脱脂綿のマイクロチップは、酵素的なＮ−グリカン放出後に塩及び界面活性剤の除去のために同様に適しており、このことは、好適なＳＰＥ溶出条件とともに、Ｎ−グリカンの効率的な質量分析による検出をもたらす（図６、７、８及び９）。
【００４７】
本発明の脱脂綿マイクロチップは、トリプシン性ＩｇＧ消化物のダ簡単かつ迅速なサンプル調製のための便利な装置であり、ガラクトシル化、シアリル化、フコシル化などのＩｇＧ ＦｃのＮ−グリコシル化機能、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析による二分するＮ−アセチルグルコサミンの発生率の決定を可能にする。
【００４８】
ＩｇＧの生物学的活性は、ＦｃのＮ−グリコシル化によって調節され、これは、抗体依存性細胞傷害及び補体依存性細胞傷害の両方に影響を及ぼす。従って、生物工学的に生成されたＩｇＧのＦｃのＩｇＧのＮ−グリコシル化は、生物工学的に作製設計されている（次世代治療用抗体）。
【００４９】
脱脂綿ＨＩＬＩＣのマイクロチップは、質量分光分析用の少量のサンプルの調製のために特に便利な道具であり、（１）多くの場合、疾患関連のＩｇＧグリコシル化の変化を示す臨床サンプルのＩｇＧのＦｃ Ｎ−グリコシル化プロファイリング、及び（２）組換え発現ＩｇＧの解析に適用することができる。
【００５０】
他のＨＩＬＩＣ固定相と同様に、脱脂綿マイクロチップは、複雑なタンパク質分解消化物からのＮ−糖ペプチドの濃縮、糖タンパク質や糖ペプチドのＰＮＧａｓｅ Ｆによる処理後のＮ−グリカンの抽出、又は還元的アミノ化による蛍光標識化後の糖鎖の浄化などの他の典型的なＨＩＬＩＣ ＳＰＥ用途でも有用である。脱脂綿のチップは手で調製される。それ自体はチップ間の容量のバラツキを考慮されなければならない。容量の必要量はサンプルによって異なり、ユーザー自身の用途に容易に確立することができる。
【００５１】
脱脂綿ＨＩＬＩＣのマイクロチップは、少数のサンプルを処理するためには良い選択である一方、それらはまた、多チャンネルピペットを使用して、またはロボットプラットフォームにＳＰＥ方法を移すことにより、より多数のサンプルにも適用可能である。
【実施例】
【００５２】
実験 
ＩｇＧの精製
ポリクローナルヒトＩｇＧを、固定化されたタンパク質による親和性クロマトグラフィーにより、血漿から精製した（Wuhrer et al., Proteomics 2007, 7, 4070-4081に開示される技術に従い、若干の改変を伴って）。 
【００５３】
ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。９６ウェルＯＦ１１００フィルタープレートの各ウェルに（Ｏｒｏｃｈｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｌｏｍｂａｒｄ，ＩＬ）、５０μｌのＰＢＳ、約５μｌのビーズと２μｌのヒト血漿を含有する５０μｌの泥状物がアプライされた。プレートは蓋で覆い、１時間穏やかに撹拌しながら室温でインキュベートした。
【００５４】
インキュベーション後に、ビーズは真空マニホールド上で３×２００μｌのＰＢＳと３×２００μｌの水で洗浄した。捕捉されたヒトポリクローナルＩｇＧを、プロテインＡから放出し、１００ｍＭのギ酸（Ｆｌｕｋａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を４０μｌによる５分間のインキュベーション及び遠心分離（１８ｇで１分）のそれぞれにより、ポリプロピレン９６ウェルＶ底プレート（Ｖ９６マイクロウェル；ＮＵＮＣ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に溶出した。遠心分離後に、溶出物は３００ｍＭの重炭酸アンモニウムを２０μｌで中和された（最終ｐＨ＞７）。あるいは、溶出物は２時間の真空遠心分離により乾燥させた。
【００５５】
トリプシン消化
トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）で処理されたトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を氷冷した２０ｍＭの酢酸（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対してμｌあたり０．０５μｇのトリプシンの最終濃度まで溶解し、使用するまで−８０℃で一定分量で保存した。中和したＩｇＧサンプルの各々に対して、８μｌのトリプシンストック（合計で４００μｇ）及び１２μｌの水が添加された。サンプルを３分間振盪し、３７℃で一晩インキュベートした。トリプシン性ＩｇＧ消化物は、ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップの脱塩・精製まで−２０℃で貯蔵した。
【００５６】
１ｍｇのフェチュイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＭの重炭酸アンモニウムの２００μｌに溶解し、６０℃で４０分間還元した。システインのアルキル化は、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに溶解した３０μｌの１００ｍＭのヨードアセトアミドによって達成され、その後暗所で室温で３０分間インキュベートした。アルキル化反応は３０分間蛍光ランプ（ガス放電灯）の下に試料を置くことによって停止させた。トリプシン消化は、２０μｇの配列決定等級の改変型トリプシンを用いて一晩３７℃で達成した。
【００５７】
Ｎ−グリカン放出
プロテインＡで精製したＩｇＧ由来のＮ−グリカンが(Ruhaak et al., Anal.Chem. 2008, 80, 6119-6126に記載されるように）放出された。簡潔には、乾燥したＩｇＧのサンプルを６０℃で１０分間、２μｌのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（２％）で変性した。続いて、２％のＴｅｒｇｉｔｏｌ−型ＮＰ−４０（ＮＰ−４０）、２．５×ＰＢＳ及び０．０５ｍＵのＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する放出混合物の２μｌが与えられた。サンプルは、Ｎ−グリカンの放出のため、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５８】
ヒトアポトランスフェリン（０．１ｍｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０ｍＭのＤＴＴを含有する２１μｌの５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中に溶解し、４０分間６０℃で還元した。システインのアルキル化が、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムに溶解した４μｌの２００ｍＭのヨードアセトアミドによって達成され、その後暗所で室温で３０分間インキュベートした。アルキル化は、３０分間、蛍光ランプ（ガス放電灯）の下にサンプルを置くことによって停止させた。サンプルに対して、Ｎ−グリカンの放出のために、６ｍＵのＰＮＧａｓｅ Ｆを加えて、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５９】
綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを調製する
３つの異なるブランドのカット綿（Ｄａ，Ｄｙｎａｒｅｔａｉｌ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｅｔｏｓ，Ｅｔｏｓ ｂｖ，Ｂｅｖｅｒｗｉｊｋ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｂｅｌｌａ，Ｇｒｏｕｐｅ Ｌｅｍｏｉｎｅ；Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）は、地元の小売店で購入し、ＨＩＬＩＣ ＳＰＥのマイクロチップの調製のために使用した。製造業者によると、カット綿は１００％純粋な綿から作られた。脱脂綿の小片は平均重量が５００μｇであり、カット綿から採取され、鈍針を使用して１０μｌのピペットチップ（Ｒａｉｎｉｎ，Ｔｉｅｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の終端に押し込まれた。マイクロチップは、使用するまで密閉された箱に保存された。
【００６０】
Ｎ−グリカン及びトリプシン性ＩｇＧの糖ペプチドの綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥ
綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを１０μｌの水で５回洗浄し、８３％のアセトニトリル（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ ＢＶ，Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で３回、その溶液を吸引し分配することによって調整した。調製されたチップの１０％未満で、溶媒吸引時の流れが遅く、不十分であることが見いだされ、従ってそのようなチップは廃棄された。綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップに対するサンプルの適用に対して、３９μｌのアセトニトリルが８μｌのトリプシン性ＩｇＧ消化物又はＮ−グリカン放出サンプルに添加され、混合物を上下にピペット操作して、糖ペプチドの吸着させた。吸着されたグリカン又は糖ペプチドを、０．１％ＴＦＡを含有する８３％アセトニトリルを１０μｌで３回洗浄し、水２μｌでＭＡＬＤＩプレート上に直接溶出した。
【００６１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ
リフレクトロン陽性モードにおけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるＩｇＧのＦｃのＮ−グリコペプチドプロファイリングのために、糖ペプチドを研磨したステンレス鋼ＭＡＬＤＩプレート（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥのマイクロチップから水２μｌを使用して直接溶出し、空気乾燥させた。サンプルは２μＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ、５ｍｇ／ｍｌの５０％のアセトニトリル；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）が重ねられ、空気乾燥させた。
【００６２】
リニアポジティブモードでのグリコシル化プロファイリングのために、ＩｇＧ糖ペプチドはＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ ６００／３８４ ＭＡＬＤＩプレート（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）上に直接溶出し、空気乾燥させた。サンプルは１μｌのジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ，０．１％のＴＦＡを含む５ｍｇ／ｍｌの５０％のアセトニトリル；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）で重ねられた。ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐプレートは約５ｍｍ（ｉ．ｄ．）の穴を５つ含む穿孔した蓋で覆い、室温で制御しながらＤＨＢマトリックスを空気乾燥させた。
【００６３】
サンプルは、ウルトラフレックスＩＩ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）で分析し、質量スペクトルはｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）で処理した。同様に、グリカンは綿ＨＩＬＩＣマイクロＳＰＥからＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ ＭＡＬＤＩプレートへ直接溶出され、空気乾燥させ、１μｌのＤＨＢが重ねられた。
【００６４】
結果
ＩｇＧの精製およびトリプシン性切断
ＩｇＧは、プロテインＡ−セファロースビーズを５μｌを含む９６ウェルフィルタープレート中でヒト血漿の２μｌ（約２０μｇのＩｇＧ抗体）からアフィニティー捕獲され、続いて１００ｍＭギ酸４０μｌによりＩｇＧを溶出させた。プロトコルの以前に記載されたバージョンは、真空遠心分離によるサンプルの乾燥を含むが(Wuhrer et al., Proteomics 2007, 7, 4070-4081)、この手順は、現在のプロトコルにおいては重炭酸アンモニウムによる中和工程によって置き換えられた。 
【００６５】
ＩｇＧのトリプシンによる切断は、２００μｇの配列決定等級の改変型トリプシン又は４００μｇのＴＰＣＫ処置トリプシンのどちらかにより、３７℃で一晩のインキュベーションにより実施された。ＩｇＧの糖ペプチドを、９６ウェルプレート形式でセファロースＨＩＬＩＣ ＳＰＥにより精製し、リフレクトロン陽性モードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。中和手順において得られたＩｇＧのＦｃのＮ−グリコペプチドプロファイルは、使用されたトリプシンとは無関係に、以前に説明した真空遠心分離法で観察されたものと非常に類似していた（データ非表示）。
【００６６】
綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを用いた糖ペプチドの精製
綿はＩｇＧ糖ペプチドのＨＩＬＩＣ ＳＰＥにおける固定相としての可能性について評価を行った。この目的のために、カット綿の小片（約５００μｇ）をピペットチップの末端に充填した（図１）。カット綿（Ａ）から、およそ５００μｇを採取し（Ｂ）、鈍金属針（Ｃ）を用いて１０μｌのピペットチップ内に押し込む。綿は、チップ（Ｄ）の末端部に押し下げられる；
【００６７】
得られたＳＰＥマイクロチップは、ＩｇＧ糖ペプチドのＨＩＬＩＣモードでの濃縮について試験された。具体的には、アセトニトリルをヒト血漿ＩｇＧのトリプシン消化物のアリコートに添加し、糖ペプチドをＨＩＬＩＣ ＳＰＥ固定相に吸着させた。０．１％のＴＦＡを含有する８３％のアセトニトリルの１０μｌで３回洗浄した後、保持された糖ペプチドを水２μｌでＭＡＬＤＩプレート上に直接溶出させ、続いてＩｇＧのＦｃのＮ−グリコペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロファイリングを行った。
【００６８】
リフレクトロンモード及びリニアモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって記録されたグリコペプチドプロファイルの例を図２に示す。得られたＩｇＧ１及びＩｇＧ２のＮ−グリコシル化プロファイルは、逆相−ＳＰＥ脱塩又はセファロースＨＩＬＩＣ ＳＰＥ精製のどちらかを使用して、ＩｇＧ糖ペプチドの９６ウェルプレートのサンプル調製後、先に得られたものと非常に類似していた（図３）。
【００６９】
図２は綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを用いて調製したＩｇＧの糖ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量分光プロファイルを示す。質量スペクトルは、ＣＨＣＡマトリックス（Ａ）を用いたリフレクトロンモード及びＤＨＢマトリックス（Ｂ）を用いたリニアモードで記録された。ＩｇＧ１とＩｇＧ２の糖ペプチドは、それぞれ切れ目なく伸びた矢と破線の矢により示されている：正方形、Ｎ−アセチルグルコサミン；三角形、フコース；暗い円、マンノース；明るい円、ガラクトース；菱形、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＰＥＰ、ペプチド部分。
【００７０】
綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを使用して空の溶出から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロファイルは、ＭＡＬＤＩマトリックスの対照（マトリックスのみ、サンプルは未滴）と実質的に同一であることが見いだされ、脱脂綿に関連する汚染物質のピークはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロファイルに検出されなかった（データ非表示）。
【００７１】
綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥの検証
一つの綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップは、トリプシンのＩｇＧ消化物のプールから糖ペプチド精製のため８回使用され、続いて溶出した糖ペプチドのリフレクトロンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行った（図４Ａおよび図４Ｂに示されるように）。
【００７２】
この実験は、実験ごとに新しい綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥチップを使用して、異なる４日において繰り返された。実験の別の組において、８つの異なるチップが、上述のトリプシン性ＩｇＧ消化物のプールからのＩｇＧのＦｃのＮ−グリコシル化プロファイリングのために使用された（図４Ｃ及び４Ｄに示されるように）。この実験は、各実験ごとに新しいチップを使用して、異なる４日において繰り返された。高度に再現性のあるＩｇＧのＦｃのＮグリコシル化プロファイルが、綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥの後で、サンプルチップを反復して使用するか又はマイクロスケールでの精製と濃縮のために別々のチップを使用するかに無関係に得られた。
【００７３】
図４は、ＩｇＧ糖ペプチドの脱塩及び精製のための綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップの再現性を示す。分析は、ＣＨＣＡマトリックスによるリフレクトロンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより行った。トリプシン消化ＩｇＧのプールを、綿のＨＩＬＩＣマイクロチップ（Ａ及びＢ）又は８つの異なる綿ＨＩＬＩＣのマイクロチップ（Ｃ及びＤ）の何れかにより、８回脱塩した。実験は、４つの異なる日において反復された。
【００７４】
完成した方法の検証
ＩｇＧのＦｃのＮ−グリコシル化プロファイリングは対照の個体の血漿の８つの一定分量と並行して行われた。これには、プロテインＡ捕捉、溶出液の中和、ＴＰＣＫトリプシンを用いた切断、綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析が含まれる。この実験は、異なる３日において反復された。質量分光分析は、リフレクトロンモード及びリニアモードで実施され、ＩｇＧ１（図３Ａおよび図３Ｂに示されている）とＩｇＧ２（図５Ａ、５Ｂ、６Ａおよび６Ｂに示されている）のＦｃのＮ−グリコシル化プロファイルの両方が、一日のうちで及び日によっての変動性が低く記録することができたことを実証している。
【００７５】
前述した綿素材の次に、２つの別のブランドの脱脂綿がＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップの調製およびＩｇＧのＦｃのＮ−グリコシル化プロファイリングで使用された。全３つのブランドの脱脂綿はＩｇＧ１（図３Ａ及び３Ｂ）とＩｇＧ２（図５Ａ、５Ｂ、６Ａ及び６Ｂに示される）の両方において非常に似た結果を与えた。
【００７６】
更に、本方法を、以前にSelman et al Anal.Chem. 2010, 82, 1073-1081により記述されたアプローチと比較した。この従来の方法に比べて主な相違点は、（１）真空遠心分離によるプロテインＡ溶出液の乾燥が中和工程に置換されたこと、（２）配列決定等級のトリプシンが、ＴＰＣＫ処理トリプシンに置き換えられたこと、及び（３）マイクロチップ綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥが、セファロースビーズを用いた９６ウェルプレートＨＩＬＩＣ ＳＰＥの代わりに実行されたことである。
【００７７】
第三のアプローチは、Ｓｅｌｍａｎらによる先に記載されたサンプル調製（即ち、プロテインＡによる捕捉、真空遠心分離による乾燥、配列決定等級トリプシによるＩｇＧの消化）を、綿ＨＩＬＩＣのＳＰＥ精製及びリフレクトロンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析と組み合わせた。全ての異なるプロトコールにおいて、非常に似たＩｇＧ１（図３Ｃ及び３Ｃ）及びＩｇＧ２（図５Ａ、５Ｂ、７Ａ及び７Ｂに示す）のＦｃのＮグリコシル化プロファイルがリフレクトロンモード及びリニアモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより得られた。
【００７８】
図３は、綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを適用するＩｇＧ１の糖ペプチドの再現性を示す。ＩｇＧ１糖ペプチドは、ＣＨＣＡマトリックス（Ａ，Ｃ）を用いたリフレクトロンモード、及びＤＨＢマトリックス（Ｂ，Ｄ）を用いたリニアモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより検出された。サンプルは、中和法を用いて消化した後に調製し、三つの異なるブランドのカット綿（Ａ、Ｂ）から調製した綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップにより脱塩した。
【００７９】
図５は、綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを適用するＩｇＧ２の糖ペプチドの再現性を示す。ＩｇＧ２糖ペプチドはＣＨＣＡマトリックス（Ａ，Ｃ）を用いたリフレクトロンモード、及びＤＨＢマトリックス（Ｂ，Ｄ）を用いたリニアモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより検出された。サンプルは、中和法を用いて消化した後に調製し、三つの異なるブランドのカット綿（Ａ、Ｂ）から調製した綿のＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップにより脱塩した。得られたプロファイルは、真空遠心分離により乾燥し、配列決定グレードのトリプシン（Ｃ、Ｄ）で消化した後に、セファロースビーズ又は綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥのマイクロチップによって精製された糖型のパターンと比較した。各々の独立した実験において、相対強度とＲＳＤｓが８つの複製から計算された；
【００８０】
得られたプロファイルは、真空遠心分離により乾燥し、配列決定グレードのトリプシン（Ｃ、Ｄ）で消化した後に、セファロースビーズ又は綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥのマイクロチップによって精製された糖型のパターンと比較した。各々の独立した実験において、相対強度とＲＳＤｓが８つの複製から計算された;
【００８１】
綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップを用いたグリカンの精製
別の分野の適用として、綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥマイクロチップは、ＰＮＧａｓｅ Ｆ放出後に、グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳサンプル調製用に試験された。Ｎ−グリカンは、界面活性剤（ＳＤＳ、ＮＰ−４０）と塩（ＰＢＳ）を含むヒトＩｇＧサンプル及びヒトトランスフェリンサンプルから酵素的に放出された。中性と酸性（シアル化）Ｎ−グリカンの両方が、綿ＨＩＬＩＣマイクロＳＰＥ精製後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより検出されたが、一方ＳＰＥ精製をしていないグリカン放出サンプルの直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析はＮ−グリカンの記録を認めなかったが、界面活性剤のクラスタにより占められていた（図６、図７、図８および図９）。
【００８２】
図６、図７、図８および図９は、綿ＨＩＬＩＣマイクロＳＰＥ精製後のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳからのスペクトルを示す。ＩｇＧから酵素的に放出されたＮ−グリカン（図６、図７、図８、スペクトルＡ−Ｆ）及びヒトトランスフェリン（図９、スペクトルＧ、Ｈ）が、事前の綿ＨＩＬＩＣマイクロＳＰＥによる精製が無い場合（左のパネル：スペクトルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）及びある場合（右パネル：スペクトルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）で、リフレクトロンポジティブモード（図６、スペクトルＡ、Ｂ）、リニアポジティブモード（図７、スペクトルＣ、Ｄ）及びリニアネガティブモード（図８と９、スペクトルＥ−Ｈ）におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析された。グリカンは、正イオンモードでナトリウム付加体として、及び陰イオンモードで脱プロトン種として記録された：＊、カリウム付加体；正方形、Ｎ−アセチルグルコサミン；三角形、フコース；暗い円、マンノース；明るい円、ガラクトース；紫の菱形、Ｎ−アセチルノイラミン酸。
【００８３】
図１０は、ＡＡで標識したヒト血漿タンパク質からのＰＮＧａｓｅ Ｆ放出Ｎ−グリカンのリニア陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。Ｎ−グリカンはＰＮＧａｓｅ Ｆによるヒト血漿蛋白質（２μｌの血漿）から前述のように放出され(Ruhaak et al, 2008, Anal Chem., 80, 6119-6126)、綿ＨＩＬＩＣマイクロＳＰＥにより精製され、ＤＨＢによりＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ標的プレート上で測定された；正方形、Ｎ−アセチルグルコサミン；三角形、フコース；暗い円、マンノース；明るい円、ガラクトース；菱形、Ｎ−アセチルノイラミン酸；＊、ポストソース分解産物。
【００８４】
図１１（スペクトルＡ及びＢ）は、ウシフェチュイン（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリー番号：Ｐ１２７６３）由来のトリプシン性糖ペプチド（Ａ）及びＰＮＧａｓｅ放出型Ｎ−グリカン（Ｂ）のリニア陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。糖ペプチド及びグリカンを綿ＨＩＬＩＣマイクロＳＰＥにより精製し、ＤＨＢによりＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ標的プレート上で測定した。（Ａ）実線の矢印は、小分子量の糖ペプチド（Ｌ１４５ＣＰＤＣＰＬＬＡＰＬＮＤＳＲ１５９）；破線の矢印、中間分子量の糖ペプチド（Ｖ１６０ＶＨＡＶＥＶＡＬＡＴＦＮＡＥＳＮＧＳＹＬＱＬＶＥＩＳＲ１８７）；点線の矢印、大分子量の糖ペプチド（Ｒ７２ＰＴＧＥＶＹＤＩＥＩＤＴＬＥＴＴＣＨＶＬＤＰＴＰＬＡＮＣＳＶＲ１０３）；（Ｂ）〜、フェツインペプチドＨ３１３ＴＦＳＧＶＡＳＶＥＳＳＳＧＥＡＦＨＶＧ Ｋ３３３；＊、ナトリウム付加体；￥、カリウム付加体；正方形、Ｎ−アセチルグルコサミン；三角形、フコース；暗い円、マンノース；明るい円、ガラクトース；ダイヤモンド、Ｎ−アセチルノイラミン酸。
【００８５】
図１２（スペクトルＡ及びＢ）は、ヒトアポトランスフェリン糖ペプチド（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリー番号：Ｐ０２７８７）由来のトリプシン性糖ペプチド（Ａ）及びＰＮＧａｓｅ放出型Ｎ−グリカン（Ｂ）のリニア陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。糖ペプチド及びグリカンを綿ＨＩＬＩＣマイクロＳＰＥにより精製し、ＤＨＢによりＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ標的プレート上で測定した。（Ａ）実線の矢印は、小分子量の糖ペプチド（Ｃ４２１ＧＬＶＰＶＬＡＥＮＹＮＫ４３３）；破線の矢印、大分子量の糖ペプチド（Ｑ６２２ＱＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬＦＲ６４２）；￥、ポストソース分解産物；＊、タンパク質分解性消化の最中のＮ末端ペプチド分解によるアンモニア損失（Ｂ）＊、ナトリウム付加体；￥、カリウム付加体；正方形、Ｎ−アセチルグルコサミン；三角形、フコース；暗い円、マンノース；明るい円、ガラクトース；菱形、Ｎ−アセチルノイラミン酸。
【００８６】
従って、これらの実験は、界面活性剤および塩を除去したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析用のために綿ＨＩＬＩＣ ＳＰＥによりＮ−グリカン放出サンプルを首尾良く浄化したことを実証した。
【００８７】
この明細書において明らかに先行公開された文書の一覧又は議論は、必ずしもその文書が技術水準の一部であるか又は共通の一般的な知識であるとの承認として取られるべきではない。
【図２Ａ】
0005907540.tif 000002
【図２Ｂ】
0005907540.tif 000003
【図３Ａ】
0005907540.tif 000004
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0005907540.tif 000006
【図３Ｄ】
0005907540.tif 000007
【図４Ａ】
0005907540.tif 000008
【図４Ｂ】
0005907540.tif 000009
【図４Ｃ】
0005907540.tif 000010
【図４Ｄ】
0005907540.tif 000011
【図５Ａ】
0005907540.tif 000012
【図５Ｂ】
0005907540.tif 000013
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
0005907540.tif 000018
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
0005907540.tif 000020
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１】
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