(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fcポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたpCONS(配列番号1)を含むポリヌクレオチド構築物を含む、対象において二本鎖DNAである自己抗原に対する免疫寛容を誘発するための、医薬組成物。
【請求項２】
前記FcポリペプチドがIgG1のCHドメインを含む、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチド構築物が発現ベクターである、請求項1または2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、前記対象の免疫細胞に形質転換またはトランスフェクトされるものである、請求項1から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記免疫細胞がB細胞である、請求項4に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記細胞がex vivoで形質転換される、請求項4または5に記載の医薬組成物。
【請求項７】
配列番号2に記載されたアミノ酸配列を含む第1のドメイン; および
Fcポリペプチドを含む第2のドメイン
を含む融合ポリペプチドを含む、二本鎖DNAである自己抗原に対する自己免疫障害を治療するための医薬組成物。
【請求項８】
前記自己免疫障害がSLEである、請求項7に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患および障害を治療するのに有用な方法および組成物に関する。1態様において、本発明は、全身性エリテマトーデス(SLE)を治療するための遺伝子構築物およびポリペプチドならびに方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
高ガンマグロブリン血症の存在はしばしば、慢性炎症状態と関連し、腎機能の喪失をもたらすプロセスである、腎臓中に沈着する免疫複合体を形成し得る自己抗原に対する複数の抗体(Ab)を特徴とする自己免疫疾患である、全身性エリテマトーデス(SLE)において一般に観察される。
【０００３】
(NZB×NZW)F1(NZB/W F1)マウスは、ヒトSLEと非常に類似した全身性自己免疫疾患を自然発症する。これらの動物は、二本鎖(ds)DNA、クロマチンおよびヒストンを含むいくつかの自己Agに対する血清自己Abを生じ、腎臓糸球体における病原性Abおよび免疫複合体の沈着に続発する腎不全により死亡する。B細胞はSLEの発症に重要であり、これらのリンパ球の遺伝的欠損はループスから保護できるが、T細胞もこの疾患の病因において等しく重要である。特に、SLEにおけるTヘルパー(Th)細胞は、自己Abのイディオタイプ内のT細胞決定基を認識でき、自己Abの産生のためにB細胞を補助する。それにもかかわらず、SLEにおけるポリクローナルIgGのレベルの上昇は、その罹患率および死亡率の両方に大きく寄与する、疾患の主要な病原要素を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】PCT出願公開WO 93/10151
【特許文献２】米国特許第5,457,035号
【特許文献３】米国特許第5,858,352号
【特許文献４】米国特許第6,051,416号
【特許文献５】米国特許第6,083,716号
【特許文献６】PCT出願公開WO 03/046124
【特許文献７】米国特許第4,751,180号
【特許文献８】米国特許第4,935,233号
【特許文献９】米国特許第6,126,938号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ashkenaziら、PNAS USA 88: 10535、1991
【非特許文献２】Byrnら、Nature 344: 677、1990
【非特許文献３】HollenbaughおよびAruffo、「Construction of Immunoglobulin Fusion Polypeptides」、Current Protocols in Immunology、補遺4、10.19.1〜10.19.11頁、1992
【非特許文献４】Baumら、EMBO J.13: 3992、1994
【非特許文献５】Levineら、「New Generation Vaccines Second Edition」、Levineら編、Marcel Dekker, Inc.、351-361頁(1997)
【非特許文献６】Levineら、「New Generation Vaccines Second Edition」、Levineら編、Marcel Dekker, Inc.、437-446頁(1997)
【非特許文献７】Buttertonら、「New Generation Vaccines Second Edition」、Levineら編、Marcel Dekker, Inc.、379-385頁(1997)
【非特許文献８】Fennellyら、「New Generation Vaccines Second Edition」、Levineら編、Marcel Dekker, Inc.、363-377頁(1997)
【非特許文献９】Huston,J.S.ら、PNAS 85: 5879(1988)
【非特許文献１０】Whitlow,M.ら、Protein Engineering 6: 989(1993)
【非特許文献１１】Newton,D.L.ら、Biochemistry 35: 545(1996)
【非特許文献１２】Lieberman、Pharmaceutical Dosage Forms、Marcel Dekker、第1-3巻(1998)
【非特許文献１３】Remington's Pharmaceutical Science、第17版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.(1985)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ポリクローナルIgGの産生の増大(高ガンマグロブリン血症)および体液性免疫応答の混乱は、全身性エリテマトーデス(SLE)の重要な特徴である。ヒトと同様に、雌性(NZB×NZW)F1(NZB/W F1)ループス易発性マウスは、自己抗原に対して反応性である場合に免疫複合体を形成できるIgGの血清レベルが増大している。これらの免疫複合体は腎臓中に沈着でき、糸球体腎炎(SLEにおける死亡率の主要な原因)を引き起こす可能性があるので、IgG産生の低下は、SLEの予後の利益になる可能性が高いであろう。本発明は、マウスIgG中のT細胞決定基のコンセンサス配列をコードするミニ遺伝子の体細胞性B細胞移入は、IgG NZB/W F1マウスの持続的な産生上昇を阻害でき、腎疾患の加速からの保護および引き続く動物の生存の増加を生じることを実証している。高ガンマグロブリン血症からの保護に関与する機構には、細胞接触非依存的な様式でCD4+T細胞の抗原特異的な刺激を抑制する、TGFβ産生CD8+CD28-T細胞の増殖が含まれる。重要なことに、ミニ遺伝子保護されたマウス由来のCD8+CD28-T細胞を高ガンマグロブリン血症を有するNZB/W F1マウスへ養子移入することによってもまた、腎疾患の発症から保護する。これらのデータは、高ガンマグロブリン血症を抑制することによりマウスループス腎炎の発症を遅延させ得る免疫調節回路の、ミニ遺伝子ベースの誘導の可能性を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、SLEの動物モデル(例えば、NZB/W F1マウス)において、抗原刺激に対するCD4+T細胞の反応性を低下させるIgミニ遺伝子で誘導されたCD8+T細胞により高ガンマグロブリン血症および引き続く腎臓疾患の加速が、抑制でき、したがって、マウスの腎疾患の阻害および引き続く生存の増加を引き起こすことを、実証している。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ミニ遺伝子のマップ、転写物および遺伝子産物を示す図である。a.hIgG1をコードする構築物の模式図(Ig単独、pIg[上]; pConsと組み合わせたIg、pIgCons[中]; またはpNegと組み合わせたIg、pIgNeg[下])。b.異なるミニ遺伝子(pIg、pIgCons、pIgNeg)でトランスフェクトしたCOS-7細胞から抽出したRNAに対するRT-PCR。予測された分子サイズは、左側に「ミニ遺伝子」と示されている。MWM、分子量マーカー。c.異なるミニ遺伝子でトランスフェクトしたCOS-7細胞の溶解物に対する、予測された分子量の融合タンパク質のウエスタンブロット。MWM、分子量マーカー。d.pIgまたはpIgConsでトランスフェクトしたB細胞(それぞれ(B/pIg)または(B/pIgCons))に対する、pConsで免疫したマウス由来のpCons特異的T細胞系統(T)の増殖応答; P<0.004。特異性は、単独で培養した場合のpIgConsでトランスフェクトしたB細胞(B/pIgCons)の増殖の欠如と、B細胞およびpConsペプチドと共培養したがpNegペプチドとは共培養しなかった場合のT細胞系統の最適な増殖とにより示される。6つの実験の代表。
【図２】pIgConsによるNZB/W F1マウスの処置が、処置された動物のタンパク尿の発症の遅延および生存の増加と関連することを示す図である。各マウスは、材料および方法において記載したように、関連のミニ遺伝子でトランスフェクトした6×105のB細胞を受けた。PBS対照群はPBSのみを受けた。a.処置の5週後のタンパク尿、pIgCons対pIgまたはpIgNeg、P<0.01。処置の10週後、pIgCons対pIgまたはpIgNeg、それぞれP<0.0001およびP<0.0002。b.pIg、pIgCons、pIgNegまたはpCMVプラスミドでトランスフェクトしたB細胞の移入後50週までの生存について、マウスをモニタリングした。対照群のマウスはPBSのみを受けた。Kaplan Meyer分析によりP<0.004。
【図３】本研究で使用したマウスの腎臓の組織学を示す。a.ヘマトキシリン-エオシン染色により、pIgまたはpIgNegで処置したマウスと比較して、pIgConsで処置したマウスでは糸球体の関与が低下しており、組織構造が保存されていたことが示される。b〜c.免疫蛍光染色により、pIgConsで処置したマウスと比較した、pIgで処置したマウスおよびpIgNegで処置したマウスの糸球体におけるhIgG(b)およびmIgG(c)沈着の増加が示される。倍率: 200×。d.pIg(左)、pIgNeg(中)およびpIgCons(右)で処置したマウス由来の腎臓の累積糸球体活性スコア(GAS)および尿細管間質活性スコア(TIAS)。GASおよびTIASの両方についてP<0.0001。
【図４】ミニ遺伝子ワクチン接種後の抗Ig応答を示す図である。処置の5週後および10週後の、処置マウスおよび対照(1群当たりn=6〜12)における、抗ヒトIgG(a)および抗マウスIgG(b)応答の平均±SD。5週後および10週後の両方においてP<0.0001。
【図５】ミニ遺伝子ワクチン接種に対するT細胞応答を示す図である。Ag特異的T細胞応答を、処置の4週後(a、b)および8週後(c、d)に測定した。平均(±SD)刺激指数をy軸上に示す(1群当たり4〜9匹のマウス)。バックグラウンドcpm: 0.5〜2.0×103。aおよびc、ペプチド(x軸)のみの存在下での増殖。bおよびd、ペプチド(x軸)+IL-2の存在下での増殖。4週後ではP<0.07; 8週後ではP<0.05。
【図６】ミニ遺伝子ワクチン接種の2週間後の、末梢単核細胞についてのフローサイトメトリー分析を示す図である。a.pIg(左)、pIgNeg(中央)およびpIgCons(右)で処置したマウス由来のCD3+T細胞上のCD8の表面発現は、pIg処置したマウスおよびpIgNeg処置したマウスと比較して、pIgConsマウス中でのCD8+細胞の増殖を示す。b-c.(ゲートされた)CD8+T細胞区画内で、CD8+CD28-細胞はpIgConsマウスでは増殖したが、対照マウスでは増殖しなかった; P<0.005(b)、P<0.001(c)。d.pIgCons処置したマウス(黒)およびpIgNeg処置したマウス(灰色)由来のゲートされたCD8+CD28-リンパ球中の細胞内TGF-βについての染色は、pIgNeg群のマウスではなく、pIgCons群のマウスのT細胞中での、このサイトカインの発現を示す。個々のマウスに対する二連の実験の代表(n=5/群)。
【図７】pIgCons処置したマウスのCD8+CD28-リンパ球のin vitroおよびin vivoの活性を示す図である。a.CD8+CD28-細胞は、CD4+T細胞の増殖をin vitroで抑制する(標的に対するエフェクターの比のスカラー用量); pIgまたはpIgNegに対してP<0.02; 1: 1の比では有意でない。b.pIgCons処置したマウスから精製したCD8+CD28-T細胞のin vivo移入は、高ガンマグロブリン血症を有するマウスにおいてタンパク尿を遅延させる。pIgConsで処置したマウス(●)(n=6)またはpIgNegで処置したマウス(○)(n=8)由来の1×107のCD8+CD28-T細胞を、血清IgG>10mg/mlを有する雌性NZB/W F1マウス中に移入し、タンパク尿(100mg/dl以上)の発症について1週間毎にレシピエントをモニタリングした。Kaplan Meyer分析によりP<0.001。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書中に提供する例示的な記載は、例示および説明に過ぎず、特許請求した本発明を限定するものではない。さらに、本発明は、記載した特定の実施形態に限定されず、それ自体もちろん変化してよい。さらに、特定の実施形態を記載するために使用した専門用語は、限定を意図するものではない。
【００１０】
値の範囲に関して、文脈が明らかに他を示さない限り、本発明は、下限の単位の少なくとも10分の1までの、その範囲の上限と下限との間に介在する各値を包含する。さらに、本発明は、任意の他の示された介在する値を包含する。さらに、本発明は、示された範囲から具体的に排除されない限り、その範囲の上限および下限のいずれかまたは両方を除いた範囲も包含する。
【００１１】
特段定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味である。当業者は、本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料もまた本発明を実施または試験するために使用できることも、理解するであろう。さらに、本明細書中で言及する全ての刊行物は、参照により組み込まれる。
【００１２】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈が明確に他を指定しない限り、単数形「1つの」(「a」、「an」および「the」)は複数形の指示対象を含むことに留意すべきである。したがって、例えば「(1つの(a))対象ポリペプチド」に対する言及は、複数のこのようなポリペプチドを含み、「(1つの(the))因子」に対する言及は、1つまたは複数の因子に対する言及および当業者に公知のその等価物などを含む。
【００１３】
「CD8+T細胞」は、CD8細胞表面マーカーを有することを特徴とするTリンパ球のクラスを示す。CD8+T細胞はMHCクラスI拘束性「CTL」または「サプレッサーT細胞」である。
【００１４】
「CD4+T細胞」は、CD4細胞表面マーカーを有することを特徴とするTリンパ球のクラスを示す。CD4+T細胞はMHCクラスII拘束性Tリンパ球である。タイプ1またはタイプ2の「ヘルパーT細胞」と呼ばれる、2つのタイプのCD4+T細胞が存在する。
【００１５】
免疫応答は、抗原と免疫系の細胞との相互作用を介して、抗原に対して生じる。生じた免疫応答は、体液性または細胞媒介性の免疫応答(伝統的には、それぞれ抗体および細胞性エフェクター機構の保護を特徴とする)へと、大まかに識別され得る。これらのカテゴリーの応答は、Th1型応答(細胞媒介性応答)およびTh2型免疫応答(体液性応答)と称されている。Th1型免疫応答は、抗原特異的なハプロタイプ制限されたCTLの生成およびナチュラルキラー細胞応答を特徴とし得る。マウスにおいて、Th1型応答は、IgG2aサブタイプの抗体の生成をしばしば特徴とするが、ヒトにおいて、これらはIgG1型抗体に対応する。Th2型免疫応答は、マウスのIgG1、IgAおよびIgMを含む広い範囲の免疫グロブリンアイソタイプの生成を特徴とする。
【００１６】
これら2つの型の免疫応答の発生の背後にある推進力は、免疫系の細胞を補助するように機能し、Th1応答またはTh2応答のいずれかへと実際の免疫応答を駆動する多数の同定されたタンパク質メッセンジャーである、サイトカインである。したがって、高レベルのTh1型サイトカインは、所定の抗原に対する細胞媒介性の免疫応答の誘導を支持する傾向があるが、高レベルのTh2型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。Th1型免疫応答とTh2型免疫応答との識別が絶対的なものではないことを念頭に置くことが重要である。伝統的に、Th1型応答は、Tリンパ球によるINF-γおよびIL-2サイトカインの産生と関連する。しばしばTh1型免疫応答の誘導と直接関連する他のサイトカイン(例えばIL-12)は、T細胞によって産生されない。対照的に、Th2型応答は、IL-4、IL-5、1L-6、IL-10および腫瘍壊死因子-β(TNF-β)の分泌と関連する。
【００１７】
B細胞とT細胞との間の差異は、B細胞およびT細胞が抗原を認識する方法にある。B細胞はその未変化の形態の抗原を認識する。例えば、B細胞は、結合した免疫グロブリンを含む膜結合した抗原認識ドメインを使用して、血液またはリンパ中の抗原を認識する。T細胞(例えば、ヘルパーT細胞)は、T細胞レセプターに対して抗原提示細胞のMHC分子により提示されるペプチドフラグメントとして、プロセシングされた形態の抗原を認識する。
【００１８】
B細胞が抗原を認識すると、B細胞は、抗原を認識した免疫グロブリンドメインと共に、エンドサイトーシスのプロセスを介して抗原を取り込む。次いで、B細胞は、抗原をプロセシングし、MHCタンパク質に対して抗原の一部を付着させる。この複合体は細胞膜の外側に移動し、その場所で、Bリンパ球の細胞膜上の類似の構造と適合するTリンパ球によって認識され得る。B細胞およびT細胞の構造が一致する場合、Tリンパ球は、その表面上に提示された抗原の断片に対する抗体を産生するBリンパ球を活性化する。
【００１９】
殆どの抗原がT依存的であり、したがって、CD4+Tヘルパー細胞は、最大の抗体産生に必要である。B細胞が適切な抗原をプロセシングしてT細胞に提示すると、Tヘルパー細胞は、B細胞を活性化するサイトカインを分泌する。これらのサイトカインはB細胞の増殖および形質細胞への分化、ならびに抗体の産生を誘発する。他方、CD8を含むサプレッサーT細胞は、抗体の産生を低下させる。サプレッサーT細胞は、特に自己抗原に関連するので、免疫応答の調節に必須である。
【００２０】
本明細書中で使用する場合、用語「Fcポリペプチド」は、Fc領域の任意または全てのCHドメインを含む抗体のFc領域からなるポリペプチドのネイティブ形態およびムテイン(mutein)形態を含む。例示的なFcポリペプチドは、ヒトIgG1抗体由来のFcポリペプチドを含む。1つの代替として、融合ポリペプチドが、抗原性ポリペプチド(例えばpCons)に作動可能に連結された免疫グロブリン由来のポリペプチドを使用して調製される。抗体由来のポリペプチドの種々の部分(Fcドメインを含む)に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドの調製は、例えば、Ashkenaziら、PNAS USA 88: 10535、1991、Byrnら、Nature 344: 677、1990およびHollenbaughおよびAruffo、「Construction of Immunoglobulin Fusion Polypeptides」、Current Protocols in Immunology、補遺4、10.19.1〜10.19.11頁、1992に記載されている。
【００２１】
融合Fc構築物またはミニ遺伝子は、ポリペプチド/Fc融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなミニ遺伝子は、適切な発現ベクター中に挿入できる。ポリペプチド/Fc融合ポリペプチドは、この融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターまたは組換えポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞中で発現され、アセンブルおよびプロセシングが可能になる。PCT出願公開WO 93/10151 (本明細書中で参照により組み込まれる)に記載される1つの適切なFcポリペプチドは、ヒトIgG1抗体のFc領域のN末端ヒンジ領域からネイティブのC末端へと伸びる単鎖ポリペプチドである。別の有用なFcポリペプチドは、本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第5,457,035号およびBaumら、EMBO J.13: 3992、1994に記載されるFcムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸19がLeuからAlaに変化し、アミノ酸20がLeuからGluに変化し、アミノ酸22がGlyからAlaに変化していることを除き、PCT出願公開WO 93/10151中に示されたネイティブのFc配列のアミノ酸配列と同一である。Fc部分を含む上記融合ポリペプチドは、APCによってプロセシングされる利点を提供し、その結果APCにより適切に提示される。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、抗体の重鎖または軽鎖の可変部分を置き換え得る。
「ポリヌクレオチド」とは一般に、任意のポリリボヌクレオチド(RNA)またはポリデオキシリボヌクレオチド(DNA)をいい、これらは、未修飾または修飾されたRNAまたはDNAであり得る。ポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖のDNA、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖のRNA、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるRNAが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドには、一本鎖であり得る、またはより典型的には、二本鎖、もしくは一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得る、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子も含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、RNAもしくはDNAを含むまたはRNAおよびDNAの両方を含む、三重鎖領域をいう。ポリヌクレオチドには、1つまたは複数の修飾された塩基、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有する、DNAまたはRNAを含む、DNAまたはRNAが含まれる。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンなどの異常な塩基が含まれる。多様な修飾が、DNAおよびRNAに対してなされ得る。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に見出されるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。オリゴヌクレオチドは比較的短いポリヌクレオチドである。本発明の方法および組成物で使用されるポリヌクレオチドの例は、哺乳動物IgG(例えば、マウスIgGまたはヒトIgG)中のT細胞決定基を有するペプチド、特にコンセンサスペプチドpCons(FIEWNKLRFRQGLEW(配列番号2)、I-EdおよびKdに結合)をコードするポリヌクレオチドを含む。1態様において、このポリヌクレオチドは、配列5'-TTTATCGAGTGGAATAAGCTGCGATTTCGTCAGGGCCTGGAGTGG-3' (配列番号1)を含む。さらなる態様において、本発明は、コンセンサスペプチドpConsの変異体または機能的フラグメント(例えば、pCons配列の1、2または3つのアミノ酸が、異なるアミノ酸またはpConsもしくはその変異体の10、11、12、13または14個の連続するアミノ酸を含むpConsの機能的フラグメントで置換されている変異体)をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００２２】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに連結された2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のポリペプチドをいう。「ポリペプチド」とは、短い鎖(一般に、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる)および長い鎖(一般にタンパク質と呼ばれる)の両方をいう。ポリペプチドは、コドンが通常コードするアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。好ましくは、このポリペプチドは、哺乳動物IgG(例えば、マウスIgGまたはヒトIgG)中のT細胞決定基を有するペプチドを含む。例示的なポリペプチドはpCons(配列番号2)を含む。さらなる態様において、本発明は、コンセンサスペプチドpConsの変異体または機能的フラグメント(例えば、pCons配列の1、2または3つのアミノ酸が異なるアミノ酸によって置換されている変異体)に関する。このポリペプチドは好ましくは、少なくとも10アミノ酸(例えば、少なくとも15アミノ酸)かつ100アミノ酸まで(例えば20アミノ酸まで)の長さを有する。別の態様において、配列番号2のpConsポリペプチドまたはその変異体もしくはフラグメントは、1つまたは複数のD-アミノ酸を含んでもよい。D-アミノ酸(L-アミノ酸の対語として)は、生体安定性を増大させ、酵素による分解を減少させる。
【００２３】
ポリペプチドは、天然のプロセシング(例えば、翻訳後プロセシング)または当該分野で周知の化学的修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は、文献中に充分に記載されており、当該分野で公知である。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド中のいずれの場所でも生じ得る。このような修飾は、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で、同じまたは様々な程度まで、存在してもよい。また、所定のポリペプチドは、多数の型の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、分岐ありまたはなしの環状であってもよい。環状、分岐および分岐環状のポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセシングから生じてもよく、合成的方法によって作製してもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーRNA媒介性のタンパク質へのアミノ酸の付加(例えば、アルギニル化)、およびユビキチン化が含まれる。本発明の方法および組成物において有用なポリペプチドの例は、上記のような、配列番号2に示されるpConsポリペプチドまたはその変異体およびフラグメントを含む。
【００２４】
本発明は、免疫寛容を生じさせることにより免疫保護的であるpCons抗原を提供する。このような抗原は、免疫寛容誘発性の保護的免疫応答を刺激するために、多数の方法で宿主に送達できる。例えば、自己抗原(例えばpCons)は、融合ポリペプチドとして送達できる。この融合ポリペプチドは、異種ポリペプチドまたは小分子に連結された自己抗原を含む。典型的には、この異種ポリペプチドまたは小分子は、自己抗原の取り込み、プロセシングまたは送達を補助する。例示的な異種ポリペプチドには、Fcポリペプチド、タンパク質導入ドメイン(例えばTAT)または当該分野で公知の他のアジュバントポリペプチドが含まれる。有利なことに、本発明は、B細胞の体細胞性提示を介して送達されたpCons抗原が、直接的注射と比較して改善された免疫寛容誘発性の応答を提供することを実証している。
【００２５】
本発明の抗原は、それを必要とする対象に、例えば、ポリヌクレオチドワクチン、ポリペプチドワクチンまたは生ワクチンとして、投与してもよい。
【００２６】
本発明は、Fcポリペプチドコード配列と作動可能に関連した自己抗原(例えば、pCons)を含むミニ遺伝子を提供する。このミニ遺伝子は、対象の免疫系に抗原を送達するために使用される。
【００２７】
あるいは、この抗原は、それを必要とする対象へのポリペプチドの直接投与によって送達してもよい。
【００２８】
これらの抗原は、MHCクラスIおよび/またはIIを介した抗原の提示を生じる本発明のミニ遺伝子を含む弱毒化ベクターまたは遺伝子操作された細胞を介して送達できる。用語「弱毒化」は、細菌またはウイルスに関して使用する場合、ベクター(例えば、細菌またはウイルス)が、その細菌が生物に感染した場合に増殖および/または疾患もしくは他の有害作用を引き起こすその能力の一部または全てを失っていることを意味する。例えば、「弱毒化」細菌は、全く複製できないか、または1回もしくは数回の複製に限定され得る。あるいはまたはさらに、「弱毒化」細菌は、細菌の病原性に関与する1つまたは複数の遺伝子中に1つまたは複数の変異を有してもよい。多くの遺伝子、遺伝子座またはオペロンが公知であり、それらにおける変異が弱毒化細菌を生じるであろう。生ワクチンとして使用される弱毒化細菌の例には、そのgalE遺伝子またはhtrA遺伝子中に変異を保有するサルモネラ・チフィ(S.typhi)、およびそのctxA遺伝子中に変異を保有するビブリオ・コレラ(V.cholerae)が含まれる。例えば遺伝子操作された弱毒化ベクター中でのpConsの送達は、MHCに関連したpConsのエンドサイトーシスおよび提示を生じ、その結果、T細胞は上記のように適切に抑制されるであろう。
【００２９】
免疫保護組成物での使用のためにPCONを発現するのに使用される微生物には、以下が含まれるがこれらに限定されない: カンピロバクター属(Campylobacter)種、エルシニア属(Yersinia)種、ヘリコバクター属(Helicobacter)種、ガストロスピリラム属(Gastrospirillum)種、バクテロイデス属(Bacteroides)種、クレブシエラ属(Klebsiella)種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)種、ストレプトコッカス・ゴルドニ(Streptococcus gordonii)、エンテロバクター属(Enterobacter)種、サルモネラ属(Salmonella)種、シゲラ属(Shigella)種、エロモナス属(Aeromonas)種、ビブリオ属(Vibrio)種、クロストリジウム属(Clostridium)種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種および大腸菌(Escherichia coli)(例えば、米国特許第5,858,352号および米国特許第6,051,416号、ならびにLevineら、「New Generation Vaccines Second Edition」、Levineら編、Marcel Dekker, Inc.、351-361頁(1997)、Levineら、「New Generation Vaccines Second Edition」、Levineら編、Marcel Dekker, Inc.、437-446頁(1997)、Buttertonら、「New Generation Vaccines Second Edition」、Levineら編、Marcel Dekker, Inc.、379-385頁(1997)およびFennellyら、「New Generation Vaccines Second Edition」、Levineら編、Marcel Dekker, Inc.、363-377頁(1997)を参照のこと)。例えば、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、エルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis)、大腸菌、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヘリコバクター・フェリス(Helicobacter felis)、ガストロスピリラム・ホミニス(Gastrospirillum hominis)、ビブリオ・コレラ、ビブリオ・パラヘモリチカス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・チフィ、サルモネラ・ガリナルム(Salmonella gallinarum)、サルモネラ・プローラム(Salmonella pullorum)、サルモネラ・コレレスイス(Salmonella choleraesuis)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)およびエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)。腸管毒性、腸管出血性、腸管侵入性、腸管病原性または他の株が含まれるがこれらに限定されない大腸菌が、本発明において使用できる。
【００３０】
あるいは、またはさらに、本発明のミニ遺伝子を含む非細菌性の弱毒化ベクター(例えば、複製欠損ウイルスベクター)が、本発明の方法および組成物において使用され得る。本発明の方法および組成物において有用なこのようなウイルスベクターには、以下が含まれるがこれらに限定されない: ワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、アデノウイルス、AAV、ワクシニアウイルスNYVAC、改変ワクシニアウイルス株アンカラ(MVA)、セムリキ・森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスおよびヘルペスウイルス。
【００３１】
なおさらなる態様において、自家またはアロジェニックな抗原提示細胞(例えば、B細胞)は、適切な発現ベクター(ウイルスベクターを含む)を使用してex-vivoで遺伝子操作され得、その結果、pConsは、APCによるプロセシングおよび提示を促進するために、Fcポリペプチドと関連して細胞内で発現される。
【００３２】
適切なウイルスベクターの例には、単純疱疹ウイルスベクター、ワクシニアウイルスまたはアルファウイルスのベクターおよびレトロウイルスが含まれる(レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれる)。1実施形態において、これらのベクターは、複製欠損ウイルスベクターである。これらのウイルスを使用する遺伝子移入技術は当業者に公知である。レトロウイルスベクターは、例えば本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に安定に組み込むために使用できるが、このような組換えは望ましくない場合がある。対照的に、複製欠損アデノウイルスベクターは染色体外に残留し、したがって一過的な発現を可能にする。
【００３３】
特定の実施形態において、生ベクターとして使用されるアデノウイルスは、複製欠損のヒトまたはサルのアデノウイルスである。典型的に、これらのウイルスはE1欠失を含み、E1遺伝子で形質転換された細胞系統上で増殖し得る。適切なサルアデノウイルスは、例えば、チンパンジーから単離されたウイルスである。本発明での使用に適切なウイルスの例には、C68(Pan9としても知られる)(本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第6,083,716号)ならびにPan5、6およびPan7(本明細書中で参照により組み込まれるPCT出願公開WO 03/046124)が含まれる。したがって、これらのベクターは、産物が発現されるように抗原またはミニ遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチドを挿入するために操作することができる。このような組換えアデノウイルスベクターの使用剤形および製造は、本明細書中で参照により組み込まれるPCT出願公開WO 03/046124中に詳細に示されている。
【００３４】
本発明は、pCons免疫原性抗原の送達を促進し、天然のプロセシングに類似した免疫寛容誘発性の抗原提示を提供する様式でのプロセシングを促進するための方法を使用する、免疫原性組成物およびワクチンを提供する。pCons抗原は、主要組織適合複合体(MHC)クラスIIおよびクラスIを介した提示を誘導可能な1つまたは複数のベクターで送達される。
【００３５】
弱毒化送達ベクターは、宿主細胞の細胞質中に、自己抗原(例えばpCons)に作動可能に連結されたFcポリペプチドを含む潜在的に免疫保護的な抗原を放出し、その後、これらはプロセシングされて免疫系に例示される。このような抗原は、MHCクラスI分子を介して免疫系に提示され、CD8+T細胞(サプレッサーTを含む)の抗原刺激を生じる。
【００３６】
本発明は、体細胞性IgGコンセンサスペプチドミニ遺伝子移入が高ガンマグロブリン血症を減少でき、SLEの認められた動物モデル(例えばNZB/W F1マウス)において腎疾患を遅延できることを実証している。Ig過剰(SLEの症状)を引き起こすIgGの持続的な産生は、CD8+T細胞により抑制できる。注目すべきは、ミニ遺伝子により誘導されたCD8+CD28-サプレッサーによるCD4+T細胞応答の抑制は、Suciu-Focaおよび共同研究者による以前の観察(MHCクラスI制限されたAg特異的CD8+CD28-T細胞は、それらの標的におけるアネルギーを含む機構を介して、Ag特異的CD4+T細胞の増殖応答を抑制できた)との興味深い類似性を有している。また、SLEにおけるCD8+CD28-T細胞の保護効果の知見は、SLE患者におけるCD8+Tサプレッサー細胞の機能障害と疾患活性との間の相関の以前の知見と関連して、興味深いものであり得る。
【００３７】
pConsの体細胞性ミニ遺伝子移入により誘導される保護の機構は、NZB/W F1マウスへ可溶性ペプチドとしてpConsを投与した場合に観察されたものとは異なる。それらの実験では、ミニ遺伝子としてpConsを使用した際には観察されない、Foxp3発現細胞の増殖が観察された。この差異は、遺伝子ワクチン接種のコードされた産物の半減期と比較して、可溶性ペプチドがin vivoで異化を加速していたという事実と関係する可能性がある。また、ミニ遺伝子ワクチン接種により提供されるAPCおよび/またはサプレッサーT細胞にとってのpConsの長期にわたるin vivoアベイラビリティは、延長された応答または免疫細胞についての異なる取り扱いを導く。例えば、ミニ遺伝子は、可溶性ペプチドとしての外因性抗原(Ag)の取り込みを提供するのではなく、内因性Agの取り扱いと類似した様式で、エンドサイトーシス経路(MHC分子の負荷が生じる場所)内のコードされた遺伝子のアベイラビリティを引き起こすことができるであろう。pConsミニ遺伝子の保護効果に寄与し得る場合はいつでも、研究は、体細胞性B細胞ワクチン接種の新たな可能性への適用可能性を拡大する。70個ほどの僅かなB細胞中へのミニ遺伝子の体細胞移入は、インフルエンザウイルスに対する保護的T細胞免疫を誘導するのに有効であることが示された。
【００３８】
本発明は、体細胞性B細胞へのミニ遺伝子移入が、自己免疫において保護的な免疫寛容誘発性の応答を誘導できることを実証している。この適用の意味は、このストラテジーによる介入の新たな可能性を示し、この方法を介したサプレッサーCD8+Tの誘導が、免疫調節回路および高ガンマグロブリン血症を調節できることを示唆する。
【００３９】
「ワクチン」とは、本明細書中で使用する場合、対象に投与された場合に免疫反応を誘導する分子を含む組成物をいう。1態様において、この免疫反応は、PConsなどの自己抗原に対するT細胞活性化の抑制である。ワクチンは、ポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子および炭水化物分子、ならびに各々の誘導体および組合せ(例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物-タンパク質コンジュゲート、2つまたはそれ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の融合物など)を含むことができる。当業者に容易に理解されるように、ワクチンはさらに、希釈剤、アジュバント、担体またはそれらの組合せを含んでもよい。
【００４０】
ワクチンは、個別の成分からなってもよい。本明細書中で使用する場合、「個別の成分」とは、ワクチンが、対象に個別に投与すべき2つの別々のワクチンを含んでいる状況をいう。その意味では、個別の成分からなるワクチンは、個別のワクチン成分を含むキットまたは包装物とみなしてもよい。例えば、本発明の文脈において、包装物は、弱毒化細菌ベクターを含む第1の免疫原性組成物および同じまたは異なる自己抗原を含む弱毒化ウイルスベクターを含む第2の抗原性組成物を含んでもよい。
【００４１】
ワクチンは、ワクチン中に存在する抗原(単数または複数)が、ワクチン接種された対象にその抗原(単数または複数)に対する免疫応答を開始するまたは低下させる場合に、免疫反応を「誘導する」。免疫系の活性化または低下(抑制)により示されるように、ワクチン接種された対象は免疫応答(ワクチン抗原特異的B細胞の産生、およびCD8+CD28-T細胞の活性増加を伴うCD4+T細胞の抑制が含まれる)を生じるであろう。生じた免疫応答は、ELISPOT、ELISA、クロム放出アッセイ、細胞内サイトカイン染色、FACS分析およびMHCテトラマー染色(ペプチド特異的細胞を同定するため)を含むいくつかの方法により測定され得る。当業者はまた、一次免疫応答または二次免疫応答を測定するためにこれらの方法を使用できる。
【００４２】
「抗原」は、その抗原に曝露された対象において免疫応答を生じさせることが可能な物質である。抗原は通常ポリペプチドであり、宿主の免疫応答の焦点である。「エピトープ」または「抗原決定基」は、T細胞および抗体が特異的に結合する抗原の部分をいう。抗原は複数のエピトープを含み得る。本発明の抗原は、好ましくは、ヒトおよびマウスのIgG抗体のVHのFRI/CDR1領域中のT細胞決定基中に見出される保存された配列を含む。このような抗原の例には、配列番号2を含むpConsが含まれる。
【００４３】
本発明の種々の態様において、自己抗原(例えばpCons)は、リンカーの使用によって、Fcポリペプチドまたは他の異種ポリペプチドに作動可能に連結される。ミニ遺伝子が使用される場合、自己抗原コード領域とFcポリペプチドとは、リンカーコード領域によって分離され得る。典型的には、リンカーはペプチドリンカー部分であろう。リンカー部分の長さは、自己抗原-Fc融合ポリペプチドの発現の生物学的活性を最適化するために選択され、過度の実験なしに経験的に決定できる。このリンカー部分は、約1アミノ酸残基と30アミノ酸残基との間の長さのペプチドとすることができ、典型的には約2アミノ酸残基と15アミノ酸残基との間である。例示的なリンカー部分は、--Gly-Gly-、GGGGS (配列番号3)、(GGGGS)n (配列番号4)、GKSSGSGSESKS (配列番号5)、GSTSGSGKSSEGKG (配列番号6)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG (配列番号7)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG (配列番号8)、またはEGKSSGSGSESKEF (配列番号9)である。連結部分は、例えば、Huston,J.S.ら、PNAS 85: 5879(1988)、Whitlow,M.ら、Protein Engineering 6: 989(1993)およびNewton,D.L.ら、Biochemistry 35: 545(1996)に記載される。他の適切なペプチドリンカーは、参考により本明細書中に組み込まれる米国特許第4,751,180号および米国特許第4,935,233号に記載されたリンカーである。所望のペプチドリンカーをコードするDNA配列は、任意の適切な従来技術を使用して、本発明のDNA配列間に、それと同じリーディングフレームで挿入できる。例えば、このリンカーをコードする化学合成したオリゴヌクレオチドを、pConsポリヌクレオチド配列とFcポリヌクレオチド配列との間に連結できる。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーで分離された、2つ〜4つの自己抗原(例えばpCONs)とFcポリペプチドドメインとを含むことができる。
【００４４】
弱毒化ベクターまたは自家もしくはアロジェニックの免疫細胞中で発現される本発明のミニ遺伝子を含む各免疫寛容誘発性の組成物(ワクチン)は、例えば、皮下、筋内、鼻腔内、吸入またはさらに経口により、哺乳動物対象に投与される。この組成物/ワクチンは、同種または異種のプライム-ブーストストラテジーの一部として投与できる。
【００４５】
弱毒化ベクターまたは自家もしくはアロジェニックの免疫細胞中で発現される本発明のミニ遺伝子またはpConsポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む各免疫寛容誘発性の組成物(ワクチン)は、例えば、皮下、筋内、経鼻、吸入またはさらに経口により、哺乳動物対象に投与される。この組成物/ワクチンは、同種または異種のプライム-ブーストストラテジーの一部として投与できる。
【００４６】
弱毒化ワクチンは、哺乳動物に直接投与できる。本発明の方法を使用して得られる免疫原性組成物およびワクチンは、任意の適切な様式での投与のための医薬組成物として製剤化できる。1つの投与経路は経口である。他の投与経路には、直腸、髄腔内、頬側(例えば、舌下)吸入、鼻腔内および経皮などが含まれる(例えば、米国特許第6,126,938号を参照のこと)。1より多い経路が、特定の組成物を投与するために使用できるが、特定の経路がしばしば、別の経路(例えば、ex-vivoの細胞操作を介したもの)よりも即時かつ有効な反応を提供できる。
【００４７】
投与すべき免疫保護組成物は、医薬的に許容可能な溶液(例えば、水溶液、しばしば生理食塩水または緩衝化溶液)中に提供される。本発明の医薬組成物には、種々の広範な適切な製剤が存在する。例えば、Lieberman、Pharmaceutical Dosage Forms、Marcel Dekker、第1-3巻(1998); Remington's Pharmaceutical Science、第17版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.(1985)および同様の刊行物を参照のこと。これらの組成物はまた、アジュバントを含んでもよい。
【００４８】
経口投与に適切な製剤は、以下を含み得る: (a)液状溶液(例えば、希釈剤(例えば、緩衝化した水、生理食塩水またはPEG 400)中に懸濁した有効量の組換え細胞); (b)各々が所定量の免疫原性組成物を含む、カプセル剤、サシェ剤または錠剤; (c)適切な液体中の懸濁物; および(d)適切なエマルジョン。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、トラガント、結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味料、色素、崩壊剤および医薬的に適合性の担体のうち、1つまたは複数を含み得る。ロゼンジ形態は、香料、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガント中に活性成分を含むことができ、ならびにトローチは、活性成分に加えて当該分野で公知の担体を含む、不活性基剤(例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムのエマルジョン、ゲルなど)中に活性成分を含む。弱毒化ワクチンまたは細胞性調製物は、経口投与する場合、消化から保護すべきであると理解される。これは、ワクチンを組成物と複合させて酸性加水分解および酵素的加水分解に対してワクチンを抵抗性にすること、または適切な抵抗性担体(例えば、リポソームまたは腸溶コーティングカプセル)中にワクチンを詰めることのいずれかによって、典型的には達成される。弱毒化された細菌、ウイルスまたは細胞性調製物を消化から保護する手段は当該分野で周知である。この医薬組成物は、例えばリポソーム中に、または活性成分の徐放を提供する製剤中に、カプセル化できる。
【００４９】
弱毒化ワクチンは、単独でまたは他の適切な成分と組み合わせて、吸入を介して投与すべきエアロゾル製剤(例えば、これらは「噴霧」できる)へと製造され得る。エアロゾル製剤は、圧縮された許容可能な噴霧剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など)中に配置できる。
【００５０】
対象に投与される用量は、本発明の文脈では、有益な治療および/または予防応答を対象において経時的にもたらすのに充分でなければならない。この用量は、使用される特定の免疫-免疫寛容誘発性組成物の効力および対象の状態、ならびに治療すべき対象の体重もしくは血管表面積によって決定されるであろう。用量のサイズはまた、特定の対象における特定のワクチンの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定されるであろう。
【００５１】
感染症または他の状態の治療または予防において投与すべきワクチンの有効量の決定において、医師は、存在する場合、ワクチンの毒性、疾患の進行および自己抗原に対する抗体産生またはTヘルパー細胞応答を評価する。
【００５２】
これらの組成物は、自己免疫障害または疾患(例えばSLE)を有するかまたは獲得する危険性のある対象に、その疾患もしくは障害およびその合併症の発症を少なくとも予防または少なくとも部分的に停止させるために、投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」と定義される。治療用途に有効な量は、例えば、免疫-免疫寛容誘発性組成物、投与様式、対象の体重および全般的健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存するであろう。組成物の単一または複数の用量が、対象が要求しかつ許容する投薬量および頻度、ならびに投与経路に依存して、投与され得る。さらに、ブースターが、同じまたは異なる製剤中で投与され得る。
【００５３】
特定の実施形態において、治療有効用量の免疫保護組成物が、対象に投与される。PCONs-Fc融合ポリペプチドまたは他の抗原を発現する弱毒化生細菌または非細菌の量は一般に、1対象当たり約5×105から5×1011個までの微生物の範囲であり、より一般的には1対象当たり約5×108から5×109個までの微生物の範囲である。
【００５４】
第1の用量の免疫保護組成物に対する免疫応答の存在は、次の用量を投与する前に、公知の方法(例えば、初回免疫の前および後に個体から血清を得ること、ならびに個体の免疫状態の変化を実証することによる(例えば、免疫沈降アッセイまたはELISAまたはウエスタンブロットまたはフローサイトメトリーアッセイなど))によって決定され得る。第1の用量に対する免疫応答(例えば、低下した免疫応答)の存在は、以前の経験に基づいて、免疫応答が生じるのに充分な時間である一定期間にわたり、第1の免疫後に待機することによっても、推測され得る。
【００５５】
これらの免疫保護組成物は、PCONsに関して免疫学的にネイティブな個体に典型的に投与される。通常、本発明の免疫学的組成物の2〜4回の投与で充分であり得るが、さらなる投与が、高レベルの免疫を達成するために必要とされ得る。一般に、任意の個体への投与は、疾患の最初の徴候の前に開始すべきである。
【００５６】
本発明が提供する組成物の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順を使用して決定される。ED50(集団の50%において治療に有効な用量)は、本明細書中に提示する手順および当業者に公知の他の手順を使用して決定できる。
【００５７】
開示されたミニ遺伝子は、臨床および研究実験室において使用するために包装され得る。例えば、Fcポリペプチドに作動可能に連結されたpCONsをコードするポリヌクレオチドを含む本発明のミニ遺伝子は、発現ベクターを作製する際に使用するために提供され得る。あるいは、ミニ遺伝子は、発現ベクター中にて提供してもよい。なお別の態様では、このミニ遺伝子は、対象を免疫する際に使用するために宿主ベクター中にて提供してもよい。本発明の免疫原性組成物は、哺乳動物に遺伝子ワクチンを投与するためのパック、ディスペンサーデバイスおよびキット中に包装され得る。例えば、1つまたは複数の単位投薬形態を含むパックまたはディスペンサーデバイスが提供される。典型的には、化合物の投与のための指示書が、その化合物が示された状態の治療に適しているというラベル上の適切な表示と共に、この包装物に提供されるであろう。
【００５８】
以下の具体的な実施例は、例示的であり非限定的であることを意味する。当業者は、以下の組成物および方法において種々の改変および置換がなされ得ることを理解するであろう。このような改変および置換は、本発明から逸脱しておらず、本明細書中に包含される。
【実施例】
【００５９】
材料および方法
マウス。(NZB×NZW)F1(NZB/W F1)(H-2d/z)マウスはThe Jackson Laboratory(Bar Harbor、ME)から購入したか、あるいはUCLAで繁殖させ、機関のガイドラインに従って処置した。全ての実験は雌性マウスに対して実施した。
【００６０】
抗原。コンセンサスペプチドpCons(FIEWNKLRFRQGLEW、I-EdおよびKdに結合)およびネガティブ対照ペプチドpNeg(AIAWAKARARQGLEW)は、NZB/W F1マウスの抗dsDNA IgGのいくつかの異なるJ558 VH領域に共通したT細胞決定基を含む合成ペプチドである11。別の対照ペプチドpHyHEL(VKQRPGHGLEWIGEI)は、鶏卵リゾチーム(HEL)に対するものでありかつまたI-Edに結合するマウスmAbのCDR1/フレームワーク2 VH領域に由来する10。ペプチドは、Chiron(San Diego、CA)にてマイクロクラウン法によって合成し、HPLC上で単一のピークになるまで精製し、予測されたアミノ酸含量について質量分析法によって分析した。
【００６１】
ミニ遺伝子プラスミド構築物。pCMVscriptベクター(pCMV)(Stratagene、La Jolla、CA)は、哺乳動物細胞中でクローニングされた挿入物の発現を駆動する、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含む。pCMVを骨格として使用して、ミニ遺伝子を、ポリリンカーのEcoRI部位中に挿入した。pIgプラスミドは、ヒトPBMCからPCRによってクローニングしたIgG1のCH2-CH3をコードする。順方向プライマーは開始コドンおよびXbaI制限部位(下線部)を含み(5-ATGTCTAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC-3')、逆方向プライマーは、hIgG1の3'末端に特異的である(5'-CGGCCGTCGCACTCATTTACC-3')。PCRサイクル条件は以下のとおりであった: 95℃で2分間、その後(94℃で30秒間、57℃で30秒間および72℃で45秒間)×30サイクル、次いで72℃で10分間。pIgConsプラスミドおよびpIgNegプラスミドはそれぞれ、pIgとpConsまたはpNegペプチドとの両方をコードする(図1a)。pConsについてのオリゴヌクレオチドは以下のとおりであった:
5'-CTAGATTTATCGAGTGGAATAAGCTGCGATTTCGTCAGGGCCTGGAGTGGA-3'および
5'-CTAGTCCACTCCAGGCCCTGACGAAATCGCAGCTTATTCCACTCGATAAAT-3'、
pNegについては
5'-CTAGAGCTATCGCTTGGGCTAAAGCTCGCGCTAGACAAGGTTTAGAGTGGA-3'および
5'-CTAGTCCACTCTAAACCTTGTCTAGCGCGAGCTTTAGCCCAAGCGATAGCT-3'。
【００６２】
各プラスミドについて、順方向および逆方向のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、XbaI部位内のヒトIgG1配列の5'末端でインフレームで挿入した。プラスミドDNAを、endo-free Maxi-prepキット(Qiagen、Valencia、CA)を使用して、形質転換された大腸菌から精製した。mRNA転写物の発現を確認するRT-PCRのための総RNAの抽出およびcDNAの合成を、以下の標準的な手順に従って実施した。総細胞RNAを、3×108細胞から、TRIzol試薬(Invitrogen Life Technologies、Carlsbad、CA)を用いて抽出した。RT-PCRを、Hybrid PCR Expressサーモサイクラー(Milford、MA)で、Platinum Taqキットと共にInvitrogen Superscript One-Step RT-PCRを使用して実施した。増幅を、共通の逆方向プライマー5'-GTCACAAGATTTGGGCTCAAC-3'および以下の順方向プライマーを用いて実施した: IgG1について、5'-ATGTCTAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC-3'; pConsについて、5'-ATGTCTAGATTTATCGAGTGG-3'; pNegについて、5'-ATGTCTAGAGCTATCGCTTG-3'。
【００６３】
使用したPCR条件は以下のとおりであった: 95℃で2分間、その後(94℃で30秒間、57℃で30秒間および72℃で45秒間)×30サイクル、次いで72℃で10分間。ハウスキーピングβ-アクチン遺伝子を、プライマー(5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'および5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3')を用いて、同じPCR条件を使用して平行して増幅した。配列分析を、Big Dye Terminator(Applied Biosystem、Foster City、CA)を使用して、ABI 3100機器での自動化配列決定によって実施した。
【００６４】
選択された実験において、真核生物COS-7細胞(ATCC、Manassas、VA)を、製造業者の指示に従って、Fugene 6(Roche、Indianapolis、IN)を使用して、これらのプラスミドでトランスフェクトした。タンパク質溶解物の分解を、ヤギ抗ヒトIgG1-HRPコンジュゲート(Sigma、Saint Louis、MO)を使用してウエスタンブロットによって実施した。
【００６５】
体細胞性B細胞へのミニ遺伝子移入。体細胞性B細胞へのミニ遺伝子移入は、別の箇所で詳細に記載してある。簡潔に述べると、脾臓単細胞懸濁物を、無菌条件下でマウスから調製し、B細胞を、VarioMACSセパレータ(Miltenyi Biotec)で、抗CD19磁気ビーズ(Miltenyi Biotec、Auburn、CA)を使用して富化(96%以上)のためにソーティングした。4×106の精製されたB細胞を、Ca2+およびMg2+を含むPBS200μl中に再懸濁し、25μgのプラスミドと共に37℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を完全培地(10% FCS、10mM Hepes、200mM  グルタミン、100mM  ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を補充したRPMI 1640)中に希釈し、5%CO2中で37℃で一晩インキュベートした。トランスフェクトした細胞中のミニ遺伝子の発現の残留は1カ月まで持続し(37)、マウスへの移入前のトランスフェクションの効率は通常、FITCコンジュゲート化抗ヒトIgG1 mAb(Sigma)による細胞内染色と組み合わせた、CD19に対するFITCコンジュゲート化mAb(BD Biosciences、San Diego、CA)による表面染色を介して、蛍光標識細胞分取によって評価した。細胞内染色を、製造業者の指示に従って、BD Cytofix/Cytopermキットを使用して実施した。上記のようにトランスフェクトしたB細胞をPBS中で洗浄し、マウスへの移入のために200μlのPBS中に希釈した。ミニ遺伝子発現リンパ球の数を、各マウスへの6×105のトランスフェクトされたB細胞の移入前に、蛍光標識細胞分取によって概算した。体細胞性B細胞ミニ遺伝子移入およびマウスの処置に使用したプラスミドは、pIg、pIgCons、pIgNegおよびpCMVであった。対照群のマウスはPBSのみを受けた。
【００６６】
マウスのモニタリング。タンパク尿を、Albustixストリップ(Bayer、Elkhart、IN)を使用して、1週間間隔で、処置の前および後に、全ての群のマウスで評価した。
【００６７】
組織学。腎臓切片(4μm厚)を、標準的な手順に従って、ヘマトキシリンおよびエオシン(H/E)で染色した。病理スコアリングは、糸球体活性スコア(GAS)および尿細管間質活性スコア(TIAS)を含んでおり、0〜3のスケールで盲検様式で実施した(このとき、0=病変なし; 1=糸球体の30%未満に病変; 2=30%〜60%の間に病変; 3=糸球体の60%より多くに病変。GASは、糸球体増殖、核崩壊、類線維素壊死、炎症細胞、細胞性半月体およびヒアリン沈着を含む。TIASは、間質炎症、細尿管細胞壊死および/または平板化、ならびに細尿管内腔中の上皮細胞またはマクロファージを含む。生スコアを平均化して、各個々の特徴についての平均スコアを得、次いでこの平均スコアを合計して平均スコアを得、複合腎臓生検スコアを得た。免疫蛍光研究のために、切片を冷アセトン中で10分間固定し、2%ウシ血清アルブミン(BSA)で洗浄して1時間ブロッキングし、その後ウサギ抗マウスIgGまたはウサギ抗ヒトIgG(Sigma)を添加し、その後FITCコンジュゲート化抗ウサギ抗体(BD Biosciences)を添加して、H/Eで対比染色した。
【００６８】
T細胞増殖アッセイ。脾細胞(赤血球溶解後に回収)を、ペプチド(20μg/ml)および/または100Uの組換えIL-2(R&D Systems、Minneapolis、MN)の存在下で、200μlの容量のHL-1培地(Cambrex、Rockland、ME)中、2〜5×105細胞/ウェルにて3連のウェル中に播種した。培地単独またはコンカナバリンAを含む培地による培養物を、それぞれネガティブ対照およびポジティブ対照として使用した。細胞を、3日間5%CO2中で37℃で維持し、最後の12〜18時間にわたり1μCiの[3H]-チミジン([3H]-Thy)でパルスし、[3H]-ThyのDNA取り込みを、自動化カウンター(Beckman Coulter、Fullerton、CA)において液体シンチレーションカウントによって評価した。結果を、それぞれ6〜8匹のマウスの群の3連の、平均刺激指数±SDとして表す。
【００６９】
ELISA。血清を、ミニ遺伝子処置の前および後にNZB/W F1マウスから収集し、実験で使用するまで-80℃で保存した。Ab力価、ならびにIgG、IgG1およびIgG2aの総血清レベルを、製造業者の指示に従って、BD BiosciencesおよびR&D Systems製の市販のELISAキットを使用して試験した。
【００７０】
フローサイトメトリー。洗浄およびFc-γRブロッキングの後、表面マーカーに対するAbまたは対照のアイソタイプが一致した蛍光色素標識Abを、PBS/2%FCS中に4℃で20分間添加した。表面染色のために、以下の蛍光色素標識mAbを使用した: 抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25、抗CD28、抗CD19、抗NK1.1、抗CD44、抗CD62L、抗CD45RB、抗CD69。細胞内染色を、製造業者の指示を使用して、標識化抗Foxp3または抗TGF-βmAbを用いて引き続き実施した。抗Foxp3 mAb(eBiosciences、San Diego、CA)以外、全てのmAbはBD Biosciences製であった。
【００７１】
統計的分析。連続的な結果の群間の差異を、スチューデントt検定を使用して比較した。ベースラインおよび別々の追跡時点で評価した連続的な結果の群間の差異を、対応ありt検定を使用して評価した。群間の生存を、Kaplan-Meier分析を使用してモデル化した。全ての分析は、Prism 4ソフトウェア(GraphPad、San Diego)を使用して実施した。P<0.05の値を有意とみなした。
【００７２】
ミニ遺伝子の構築および発現。発病前のNZB/W F1マウスに、ヒトIgG1(hIgG)をコードするプラスミド(pIgプラスミド)(図1a)の体細胞性ミニ遺伝子移入を行った。このアプローチにより、ミニ遺伝子由来のIgGと内因性マウスIgGとの間の識別が可能となった。研究で使用したさらなる構築物は以下を含んだ: i)pCMVプラスミド(ネガティブ対照の空プラスミド); ii)pIgNeg(pNeg(MHCクラスIIに結合するが、NZB/W F1マウスにおけるT細胞活性化にも疾患にも影響を与えないペプチド)と共にhIgG1をコードするプラスミド); ならびにiii)pIgCons(pCons Igコンセンサスペプチドと共にhIgG1をコードするプラスミド(pConsは、SLEからNZB/W F1マウスを保護するペプチドである))。mRNA転写物の確認を、pIgConsまたはpIgNegまたはpIgプラスミドでトランスフェクトしたCOS-7細胞に対するRT-PCRによって実施し(図1b)、Ig発現を、ウサギ抗hIgG1 mAbを使用して細胞溶出物に対するウエスタンブロットによって分析した(図1c)。最後に、pCons特異的T細胞系統は、pIgConsでトランスフェクトしたB細胞に応答して増殖したが、pIg(図Id)または他の対照プラスミドでトランスフェクトされたB細胞に対しては応答しなかった。
【００７３】
pIgConsを用いた体細胞性B細胞ミニ遺伝子移入は、腎疾患の加速から、NZB/W F1マウスを保護する。比較可能な低レベルの抗DNA Igを有する20〜22週齢の腎炎前の雌性NZB/W F1マウスは、pIg(n=19匹のマウス)またはpIgCons(n=19匹のマウス)でトランスフェクトしたそれぞれ6×105のB細胞を、静脈内に一回受けた。対照マウスは、pIgNeg(n=11)もしくはpCMV(n=6)のいずれかでトランスフェクトした同様の数のB細胞を受けたか、またはPBSのみを受けた(n=8)。タンパク尿を、処置の開始前に測定し(処置を開始した時点でタンパク尿であったマウスはいなかった)、その後1週間間隔でモニタリングした。Ig力価の測定のために、処置前および30週間にわたり処置後1週間おきに、末梢血から血清を収集した。
【００７４】
pIgを受けたマウスは、空のプラスミドpCMVまたはPBSのいずれかを受けた対照マウスと比較して、タンパク尿の加速を生じた(図2a)。pCMV処置した対照マウスおよびPBS処置した対照マウス間で有意な差異は観察されず、このことは、プラスミド自体は、処置された動物において腎疾患に影響を与えなかったことを示唆する。有意なことに、pIgConsで処置したマウスは、pIgで処置したマウスと比較して、処置の5週後および10週後の両方で、かなり低いレベルのタンパク尿を有した(図2a)。pIgNegを受けたマウスは、pIg処置したマウスと同様のタンパク尿の加速が生じていたため(図2a)、pIg誘導された腎疾患の加速からの保護は、pConsに特異的に関連した。
【００７５】
マウスの生存および腎組織病理。タンパク尿に対する体細胞性ミニ遺伝子移入の影響は、処置された動物の異なる生存と関連した。疾患予後に対する高ガンマグロブリン血症の有害な効果は、pIgCons処置したマウスと比較して、pIg処置したマウスの死亡率の加速に反映された(図2b)。pIgNeg処置した動物は、pIg処置したマウスと類似の低い生存率を有し、これは、pConsのみが、Igで加速された疾患に対する保護効果を発揮し、マウスの生存の増加を生じたことを示唆する。さらに、pCMV処置したマウスは、PBS処置した対照と類似の生存率を有したため、プラスミド自体はマウスの生存に影響を与えなかった(図2b)。
【００７６】
腎病理を、異なる群のマウスにおいて分析した(図3)。腎臓の構造は、pIg対照マウスおよびpNeg対照マウスと比較して、pIgConsで処置したマウスにおいて保存されていた(図3a)。空のベクターを受けたpCMVマウスの腎構造は比較的保存されていたので、プラスミド自体は腎病理に影響を与えなかった。重要なことに、hIgの沈着は、pIgマウスおよびpIgNegマウスの糸球体において観察されたが、pIgConsマウスでは観察されず(図3b)、mIgの沈着は、対照では観察されたが、pIgCons処置したマウスでは観察されなかった(図3c)。また、糸球体および尿細管の活性スコアは、pIg処置した対照マウスおよびpIgNeg処置した対照マウスよりも、pIgCons処置したマウスにおいてより低かった(図3d)。
【００７７】
処置した動物におけるIg発現。pIgおよびpIgNegを受けたマウスは、pIgCons処置したマウスまたはPBSもしくはpCMVで処置した対照マウスと比較して、腎疾患が加速していたという知見は、pConsが同時に発現されない限り、Igのミニ遺伝子発現が腎疾患に寄与するということを示唆した。pConsが媒介する保護効果は、プラスミド由来のIgの産生の上昇の遮断または内因性Ig産生の遮断に関連し得るであろう。これら2つの可能性間を識別するために、ミニ遺伝子由来のhIgGの血清力価を、処置の5週後および10週後に異なる群のマウスにおいて分析した(図4)。同様のレベルのhIgGがpIg、pIgConsおよびpIgNegを受けたマウスの血清中で検出されたので(図5a)、pConsの保護効果は、異なる群のマウスにおけるhIgGの差示的発現に関連しなかったことが見出された。対照として、hIgGは、IgGをコードするミニ遺伝子を受けていないマウスの血清中では検出不能であったが、空のプラスミドまたはPBSのいずれかを受けたマウスの血清中では検出可能であった(図4a)。これらのデータにより、プラスミド由来のIgの発現が異なる群のマウスにおいて比較可能であり、pIgCons処置したマウスで観察された保護効果がpConsに帰することが示された。遺伝子治療はコードされた遺伝子産物に対するAbを誘導し12〜14、抗hIgG応答は循環hIgGの力価に影響を与えることができたので、抗hIgG Abの血清濃度を、異なる群のマウスにおいて分析した。類似の(低い)レベルの抗hIgG Abが、pIg、pIgConsおよびpIgNegを受けたマウスにおいて見出され、pCMV処置された対照マウスおよびPBS処置された対照マウスには存在しなかった。しかし重要なことに、処置後のマウスIgGの血清レベルの分析により、pIgConsで処置されたマウスのみが、処置の5週後および10週後の両方でIgGの力価が減少していることが示され(図4b)、このことは、pConsと内因性IgG産生の低下との間の関連を示している。全ての他の条件は、循環マウスIgGの血清濃度に影響を与えなかった。
【００７８】
pIgConsにより誘導される細胞性免疫応答。T細胞の応答性を、異なるミニ遺伝子で処置したマウスの群間で比較した。Ag特異的なリンパ球の増殖を、rIL-2の非存在下または存在下で、処置の4週後および8週後に測定した。図6に示すように、それぞれのミニ遺伝子産物のAgに対する有意な増殖は、いずれのマウス群でも観察されなかった。しかし、培養物への外因性IL-2の添加は、処置の4週後および8週後の両方で、pIgCons処置したマウスにおいてpConsによる刺激に対する低応答性を逆転したが、pIgNeg処置したマウスまたは他の対照においては逆転しなかった(図5)。これらのデータは、pIgCons処理した動物のみが、抗原刺激に対して低反応性のT細胞を有していたことを示した。この観察の示唆するところをよりよく理解するために、フローサイトメトリーを使用して、pIgConsの投与が、T細胞、B細胞およびNK細胞を含む選択された脾臓免疫細胞サブセットの数に影響を与えたかどうかを決定した。処置後2カ月間モニタリングした限りでは、ミニ遺伝子処置後に、B細胞またはNK細胞の百分率数には有意な変化は観察されなかった。T細胞について、CD8+T細胞の増殖が、対照群と比較して、pIgCons群中で観察された(図6a)。CD4+T細胞について、表現型および/またはCD25、CD44、CD62L、CD45RBもしくはCD69の発現において差異は存在しなかった。その代わり、pIgConsによる処置後のCD8+T細胞区画の増殖は、増大した数のCD8+CD28-T細胞(これは、以前にT細胞抑制に関連していた表現型である17-20)と関連した(図6b-c)。pIgCons処置したマウスにおける増殖したCD8+CD28-T細胞は、pIgNeg処置したマウスまたは対照由来のCD8+CD28-T細胞では発現されなかった細胞内TGF-βを発現したことに注目すべきである(図6d)。pIgConsマウス対対照におけるこれらの表現型の差異は、処置の2週後の早さで存在し(図6)、処置の4週後までにより顕著になった。pIgCons処置された動物由来の(他の群のマウス由来ではない)ソートされたCD8+CD28-T細胞は、刺激されたCD4+T細胞の増殖を阻害したことに注目すべきである(図7a)。抑制効果は、トランスウェル実験において維持され、培養物中に抗TGF-β Abが存在することにより遮断された。このことは、CD8+CD28-T細胞が媒介する抑制が、細胞接触を必要とせず、TGF-βに一部依存したことを示している。pIgCons由来のCD8+サプレッサーがin vivoで腎疾患の発症を遅延させ得るかどうか試験するために、養子移入実験を実施した。pIgCons処置したマウス由来のCD8+CD28-T細胞の、高ガンマグロブリン血症を有するNZB/W F1マウスへの移入は、pIgNeg処置された対照由来のCD8+CD28-T細胞を受けたマウスと比較して、レシピエント動物におけるタンパク尿の発症を遅延させた(図7b)。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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