(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
商用化された培養培地であるDMEM ハイグルコース(high glucose)、RPMI-1640及びHam’s F-12を1:1:1の割合で混合した基本培地によってABM-M(アドバンスド基本培地-間葉系幹細胞；Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地を調製する方法において、DMEM高グルコース(highglucose)、RPMI-1640及びHam'sF-12の各培地を比較して、各培地の中で重複する成分は、高い方の濃度を選択して、DMEM高グルコース(highglucose)の培地に含まれていない成分なら、DMEM高グルコース(highglucose)の培地に追加して含ませ、各培地の中で一つの培地にだけ入っている成分は濃度はそのまま維持して、DMEM高グルコース(highglucose)の培地に含まれていない成分なら、DMEM高グルコース(highglucose)の培地に追加して含ませ、各培地の成分の中で、同一供給源である成分は、一つの成分を選択して、選択した一つの成分が各培地に重複する成分であれば、高い方の濃度を選択して、DMEM高グルコース(highglucose)培地に含まれていない成分なら、DMEM高グルコース(highglucose)培地に追加して含ませ、DMEM高グルコース(highglucose)の培地に含ませる成分は、アミノ酸(AminoAcids)では、L-アラニン(L-Alanine) 9mg/L、L-アスパラギン無水物(L-AsparagineAnhydrous) 50mg/L、L-アスパラギン酸(L-Asparticacid) 20mg/L、L-グルタミン酸(L-Glutamicacid) 20mg/L、L-ヒドロキシL-プロリン(L-(L-(L-Hydroxy-L-proline) 20mg/L、L-プロリン(L-Proline) 34.5mg/Lであり、無機塩(InorganicSalts)では、硫酸銅５水和物(CupricSulfatePentahydrate) 0.0025mg/L、硫酸鉄(II)７水和物(FerrousSulfateHeptahydrate) 0.834mg/L、リン酸水素二ナトリウム無水物(SodiumPhosphateDibasicAnhydrous) 142.04mg/L、硫酸亜鉛７水和物(ZincSulfateHeptahydrate) 0.863mg/Lであり、ビタミン(Vitamins)では、D-ビオチン(D-Biotin) 0.2mg/L、P-アミノ安息香酸(P-AminobenzoicAcid;PABA) 1mg/L、ビタミン(Vitamine)B12 1.36mg/Lであり、その他の成分(Othercomponents)では、ハイポキサンチン(Hypoxanthine) 4.08mg/L、還元型L-グルタチオン(L-GlutathioneReduced) 1mg/L、リノール酸(Linoliecacid) 0.084mg/L、プトレシン(Putrescine)+2HCL 0.161mg/L、チオクト酸(ThiocticAcid) 0.21mg/L、チミジン(Thymindine) 0.73mg/Lである、ことを特徴とする間葉系幹細胞の基本培養培地の調製方法。
【請求項２】
請求項１において、 ABM-M培地には、胎児、子牛、馬、または、人間の血清、L-グルタミン(L-glutamine)、抗生剤及び抗真菌剤の中から更に一つ以上を含む間葉系幹細胞の基本培養培地の調製方法。
【請求項３】
請求項１において、ABM-M培地には、10-20％のウシ胎児血清と2-4mMのL-stinetineiグルタミン(L-glutamine)を更に含む間葉系幹細胞の基本培養培地の調製方法。
【請求項４】
請求項１において、同一供給源である成分から選択される一つの成分は、アミノ酸(AminoAcids)では、L-アルギニンモノヒドロクロライド(L-ArginineMonohydro chloride)、L-アスパラギン酸(L-Asparticacid)、L-シスチンジヒドロキシクロライド(L-CystineDihydrochloride)、L-ヒスチジンモノヒドロクロライド(L-HistidineMonobydrochlorideMonohydrate)であり、無機塩(InorganicSalts)では、塩化カルシウム二水和物(CalciumChlorideDihydrate)、硫酸鉄(II)７水和物(FerrousSulfateHeptahydrate)、硫酸マグネシウム無水物(MagnesiumSulfateAnhydrous)、リン酸二水素ナトリウム無水物(SodiumPhosphateDibasicAnhydrous)であり、ビタミン(Vitamins)では、ピリドキサル塩酸塩(PyridoxalHydrochloride)である、ことを特徴とする間葉系幹細胞の基本培養培地の調製方法。
【請求項５】
請求項１において、ABM-M培地は、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、CD73、HLA-ABC陽性表面マーカーを80％以上発現するが、CD44、CD105、CD90、CD73とCD166陽性表面マーカーは、95％以上発現、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80とHLA-DR陰性表面マーカーを5％以下発現する、ことを特徴とする間葉系幹細胞の基本培養培地の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄及び脂肪から由来した間葉系幹細胞の基本培養培地に関するものとして、特に、骨髄及び脂肪由来の間葉系幹細胞を体外で培養する過程で、従来の商用化された培地（常用培地）を利用する培養に比べ間葉系幹細胞の増殖率を高め、採取から大量培養までの時間を短縮し得、このように早期培養された間葉系幹細胞を利用して、骨形成細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞の治療剤として、多重分化可能な間葉系幹細胞の基本培養培地の調製方法、間葉系幹細胞の基本培養培地及びこれの利用により培養分化した細胞治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、組織工学を利用する再生医学分野で、幹細胞利用技術が、難病治療における新たな分野として提示されている。よって、幹細胞の研究に対する関心は高まり、増殖と分化を通じて組織を形成し得る幹細胞が、ほぼ全ての疾病治療だけでなく、組織損傷などを解決し得ると認識されている。
【０００３】
幹細胞(Stem cell)は、未分化状態で自己複製能力を持ちながら、適当な条件下で特定細胞に分化する性質を有している。幹細胞は、その起源によって胚性幹細胞(Embryonic stem cell)と成体幹細胞(Adult stem cell)に区分される。  ヒト胚性幹細胞は、人間の生命体で発生し得る胚芽から得られるため、細胞増殖及び分化能力は優れるが、生命倫理的問題を抱えている。成体幹細胞は、胚性幹細胞に比べ分化能力は限定されるが、人体の各種臓器に既存する細胞を骨髄、血液、脳、皮膚などから採取して幹細胞に発展させているため、倫理的問題は少ない。
【０００４】
間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell)は、最初に成体骨髄から分離され(Y. Jiang etal., Nature, 418:41, 2002)、その後、皮膚、血管、筋肉及び脳組織から骨髄のような間葉系幹細胞が確認された(J.G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001:M. Sampaloesi et al., Science, 301:487, 2003:Y. Jiang et al., Hematol., 30:896, 2002)。  また、最近、脂肪組織から骨髄のような分化能を有する脂肪由来の間葉系幹細胞(Adiopose-derived stem cell)が確認された(B. Cousin et al., BBRC., 301:1016, 2003:A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004:S. Bronthos et al., J. Cell Physiol., 189:54, 2001:M.J. Seo et al., BBRC., 328:258, 2005)。
【０００５】
人間の骨髄から間葉系幹細胞を分離するための技法と脂肪組織から間葉系幹細胞分離する技法は、それぞれ、Pittengerなど(Science 284:143, 1997)とvan(J. Clin Invest., 58:699, 1976)などの文献に開示されている。  これらの文献では、細胞培養のためにアルファ(alpha)-MEMやDMEM培地及び10-20％のウシ胎児血清を使用した。
【０００６】
しかし、骨髄及び脂肪組織などの成体組織内に間葉系幹細胞は希に存在し、このような細胞の数々は、未分化状態で増殖率が低く、同時に長期間維持が非常に難しいため、特異的にスクリーンされた培地なしでは、体外での増殖培養及び保存が困難であるとの欠点がある。
【０００７】
哺乳動物の細胞培養培地は、約50種程度の成分で構成され、これらは、大きく、細胞の生合成に利用される部分と生物学的なエネルギー代謝に利用される部分、そして、色々な代謝作用の触媒的な役割と、細胞内の生理的な現象の調節に利用される部分などに分けられる。  即ち、細胞培養に使用される培地は、等張液成分と緩衝液成分、そして、エネルギー供給源であるアミノ酸、ビタミン及び無機塩類を含む栄養成分とその他の多種の添加剤(supplement)などで構成されている。
【０００８】
また、細胞の特性に応じて、5〜20％程度の血清を供給することで、細胞増殖に適切な各種のホルモン、成長因子、脂肪、ビタミンなどを供給し、タンパク質分解酵素の成長と活性を抑え、pH調節用緩衝剤の役割をするなど、哺乳動物細胞の成長と活性を促進させる。  哺乳動物細胞培養のための培地を構成する成分の数々は、濃度だけでなく、その組成面でも各培地の種類によって異なる。このような方法で、1950年頃、モーガン(Morgan)などが体液組成を根拠にM119倍地を作りだし、胎児細胞(primary chick)を培養した(Morgan,et al., 1950)。
【０００９】
培養培地の種類は、大きく MEM(Minimal essential medium)(Eagle, 1955)、Rosewel Park Memorial Institute(RPMI)-1640(Moore et al., 1967)及び DEME(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium)(Dulbecoo, et al., 1959)のように、より単純、且つ細胞培養で共通的に使用される培地と IMDM(Iscove’s modification of DMEM)、Ham’s F(Ham,1965)及びCMRL(Connaught Medical Research Laboratories)-1666のように、より複雑、且つ色々な製品が強化された培地に分けられる。
【００１０】
哺乳動物細胞の成長曲線は、通常2〜3日程度の遅延期(Lag phase)を有し、グルタミン代謝産物であるアンモニウムとブドウ糖代謝産物である乳酸の蓄積により、遅延期末から生きた細胞の濃度が急激に減少する。哺乳動物細胞の主な代謝経路には、ブドウ糖とグルタミン(glutamine)が主要炭素源及びエネルギー源として使用される。  哺乳動物細胞によりブドウ糖が代謝すると、該当過程を経てピルビン酸(Pyrubic acid)になる。また、ペントースリン酸経路(Pentose Phosphate pathway)により、ペントースを生成し核酸を合成する。該当過程で生成されたピルビン酸は、TCA回路により二酸化炭素と水に分解されたり、乳酸、或いは、脂肪酸になる場合もある。  哺乳動物細胞の代謝に使用される炭素源の中、特異なのはグルタミン(Glutamine)であるが、代謝過程中、一部はグルタメート(Glutamate)になり、グルタメートは、TCA回路に入り、別のアミノ酸合成のための炭素骨格(Carbon skeleton)を作る。哺乳動物細胞の重要排泄物は、乳酸とアンモニアであるが、アラニン(Alanine)の排出もまた重要である。乳酸塩(Lctate)とアンモニアは、細胞内部とリソゾームのpHを変化させるため、細胞の毒性として作用する場合もある。
【００１１】
このように、培養される細胞の種類によって生理的機能と栄養的要求量が異なるため、細胞培養に使用される培地の種類もまた、特性に応じて異なる必要がある。従って、人間の骨髄及び脂肪組織などの成体組織から由来した未分化状態の間葉系幹細胞を体外で増殖培養するためには、未分化状態の間葉系幹細胞の成長条件に合った培地の組成は異なるはずである。
【００１２】
従来、未分化状態の間葉系幹細胞を体外で増殖培養する培養培地に関して、下記のように多くの研究が進められてきた。
【００１３】
特許文献１(「間葉系幹細胞を利用した成長因子の大量生産方法」)は、DMEMを基本とし、Ham’s F-12を添加して間葉系幹細胞から成長因子の分化を促進、人間成長因子の大量合成を造作す
る無血清培地に対して述べているが、これは、DMEMとHam’s F-12を混合した基本培地に間葉系幹細胞の増殖より、間葉系幹細胞から塩基性繊維牙細胞成長因子、脈管内皮細胞成長因子、または、人間形質転換成長因子‐βを大量生産するためのものである。
【００１４】
特許文献２(「大豆タンパク質加水分解物を含む臍帯血由来の間葉系幹細胞の体外増殖に必要な培地組成物」)は、ウシ胎児血清の量を減らすために、幹細胞培養培地の構成成分として、大豆タンパク質加水分解物をウシ胎児血清が含まれた低ブドウ糖のDMEM培地に添加する技術に関するものである。
【００１５】
特許文献３(「間葉系幹細胞を利用して毛乳頭組織を製造する方法」)と特許文献４(「間葉系幹細胞を利用して毛乳頭組織を製造する方法」)は、間葉系幹細胞をDMEM培地、DMEM/F-12、F-12、McCoy’s5A、RPMI 1640培地、ウイリアム培地E(Williams’medium E)、または、IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Modification)培地で培養した後、毛乳頭組織への分化を誘導する技術として、商用化された基本培養培地にヒドロコルチゾン(hydrocortisone)、インシュリン(Insulin)、トランスフェリン(Transferrin)及びソディウムセレナイト(Sodium selenite)が追加された培地に関するものである。
【００１６】
特許文献５(「間葉系幹細胞の培養培地及びこれを利用した間葉系幹細胞の培養方法」)は、商用化された培地に栄養混合物(Nutrient Mixture)を混合した培地を基本とし、追加的に間葉系幹細胞の成長因子であるインシュリン、ヒドロコルチゾン、EGF、LIF、GM-CSFなどを添加し培養する技術として、既に商用化された培養培地に栄養混合物を混合する技術である。
【００１７】
特許文献６(「人間脂肪組織由来の多分化能幹細胞及びこれを含む細胞治療剤」)は、DMEM培地を基本とし、NAC、rEGF、BPE、インシュリン(insulin)などが添加されたケラチノサイト(Keratinocyte)-SFM培地を添加して、間葉系幹細胞を増殖する技術に関するもので、基本細胞培養培地は、DMEM培地である。
【００１８】
特許文献７(「成体幹細胞の培養物、または、その分画物を含む癌予防及び治療用薬学組成物」)と特許文献８(分離された全分化能成体幹細胞及びその分離と培養方法)は、DMEM/Ham’s  F-12混合培地、DMEM培地及びDMEM/F-12を利用して間葉系幹細胞培養する技術である。
【００１９】
このように、従来の技術を探って見ると、既に商用化された培地を基本とし、成長因子などの添加剤を添加して培養する技術に限定されている。
【００２０】
これに反し、本出願人が出願して登録を受けた特許文献９(軟骨細胞早期培養のための軟骨細胞の特異的な培養方法)は、従来の商用化された培地に成長因子などの添加剤無添加の培養培地を開発したものである。  特許文献９の軟骨細胞早期培養培地(ABM-C)を利用して、骨髄及び脂肪などの成体組織から分離された間葉系幹細胞を培養したが、図１３に示すように、細胞培養の間、形態異常が発生、また、付着性の喪失により細胞培養培地に浮遊し、体外(invitro)で付着して増殖する間葉系幹細胞はそれ以上増殖しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】大韓民国登録特許 10-0899329
【特許文献２】大韓民国登録特許 10-2009-0090850
【特許文献３】大韓民国登録特許 10-1022032
【特許文献４】大韓民国登録特許 10-2010-0110905
【特許文献５】大韓民国登録特許 10-0908481
【特許文献６】大韓民国登録特許 10-0679642
【特許文献７】大韓民国登録特許 10-2009-0121541
【特許文献８】大韓民国登録特許 10-2006-0010847
【特許文献９】大韓民国登録特許 10-1037002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、本発明の目的は、人間の骨髄及び脂肪組織など、成体組織から由来した未分化状態の間葉系幹細胞を急速な成長速度で大量増殖培養可能な間葉系幹細胞の基本培養培地を提供することにある。
【００２３】
本発明の別の目的は、間葉系幹細胞の基本培養培地を用いて、体外(invitro)で成体組織から由来した未分化状態の間葉系幹細胞を骨形成細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞に分化させ、未分化した間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上述した本発明の目的は、商用化された培養培地の構成成分の種類を分析後、2種類以上の培養培地を組合わせて、多種類の候補基本培養培地組成を準備する段階と、候補基本培養培地組成を対象に、10〜20％のウシ胎児血清が含まれた完全培地から間葉系幹細胞の増殖率を分析し、間葉系幹細胞の早期培養に適した基本培養培地組成をスクリーンする段階を含む間葉系幹細胞の基本培養培地の調製方法により達成される。
【００２５】
また、本発明の目的は、商用化された培養培地であるDMEM高グルコース(highglucose)、RPMI-1640及びHam'sF-12を1:1:1の割合で混合した基本培地によってABM-M(アドバンスド基本培地-間葉系幹細胞；Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地を調製する方法において、DMEM高グルコース(highglucose)、RPMI-1640及びHam'sF-12の各培地を比較して、各培地の中で重複する成分は、高い方の濃度を選択して、DMEM高グルコース(highglucose)の培地に含まれていない成分なら、DMEM高グルコース(highglucose)の培地に追加して含ませ、各培地の中で一つの培地にだけ入っている成分は濃度はそのまま維持して、DMEM高グルコース(highglucose)の培地に含まれていない成分なら、DMEM高グルコース(highglucose)の培地に追加して含ませ、各培地の成分の中で、同一供給源である成分は、一つの成分を選択して、選択した一つの成分が各培地に重複する成分であれば、高い方の濃度を選択して、DMEM高グルコース(highglucose)培地に含まれていない成分なら、DMEM高グルコース(highglucose)培地に追加して含ませることによって調製した間葉系幹細胞の基本培養培地により達成される。
【００２６】
本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地において、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含ませる成分は、アミノ酸(AminoAcids)では、L-アラニン(L-Alanine) 9mg/L、L-アスパラギン無水物(L-AsparagineAnhydrous) 50mg/L、L-アスパラギン酸(L-Asparticacid) 20mg/L、L-グルタミン酸(L-Glutamicacid) 20mg/L、L-ヒドロキシL-プロリン(L-(L-(L-Hydroxy-L-proline) 20mg/L、L-プロリン(L-Proline) 34.5mg/Lであり、無機塩(InorganicSalts)では、硫酸銅５水和物(CupricSulfatePentahydrate) 0.0025mg/L、硫酸鉄(II)７水和物(FerrousSulfateHeptahydrate) 0.834mg/L、リン酸水素二ナトリウム無水物(SodiumPhosphateDibasicAnhydrous) 142.04mg/L、硫酸亜鉛７水和物(ZincSulfateHeptahydrate) 0.863mg/Lであり、ビタミン(Vitamins)では、D-ビオチン(D-Biotin) 0.2mg/L、P-アミノ安息香酸(P-AminobenzoicAcid;PABA) 1mg/L、ビタミン(Vitamine)B12 1.36mg/Lであり、その他の成分(Othercomponents)では、ハイポキサンチン(Hypoxanthine) 4.08mg/L、還元型L-グルタチオン(L-GlutathioneReduced) 1mg/L、リノール酸(Linoliecacid) 0.084mg/L、プトレシン(Putrescine)+2HCL 0.161mg/L、チオクト酸(ThiocticAcid) 0.21mg/L、チミジン(Thymindine) 0.73mg/Lであることを特徴とする。
【００２７】
本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地において、ABM-M培地には胎児、子牛、馬、または、人間の血清、L-グルタミン(L-glutamine)、抗生剤及び抗真菌剤の中から一つ以上が含まれる。
【００２８】
本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地において、ABM-M培地には、10-20％のウシ胎児血清と2mMのL-グルタミン(L-glutamine)が余計に含まれる。
【００２９】
本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地において、同一供給源の成分から選択される一つの成分は、アミノ酸(Amino Acids)では、L-アルギニンモノヒドロクロライド(L-Arginine Monohydrochloride)、L-アスパラギン酸(L-Aspartic acid)、L-シスチンジヒドロキシクロライド(L-Cystine Dihydrochloride)、L-ヒスチジンモノヒドロクロライド(L-Histidine Monobydrochloride Monohydrate)であり、無機塩(Inorganic Salts)では、塩化カルシウム二水和物(Calcium Chloride Dihydrate)、硫酸鉄(II)７水和物(Ferrous Sulfate Heptahydrate)、硫酸マグネシウム無水物(Magnesium Sulfate Anhydrous)、リン酸二水素ナトリウム無水物(Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous)であり、ビタミン(Vitamins)では、ピリドキサル塩酸塩(Pyridoxal Hydrochloride)であることを特徴とする。
【００３０】
本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地において、ABM-M培地は、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、CD73、HLA-ABC陽性表面マーカーを80％以上発現するが、CD44、CD105、CD90、CD73とCD166陽性表面マーカーは95％以上発現、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80とHLA-DR陰性表面マーカーを5％以下発現することを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の目的は、ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地で間葉系幹細胞が培養された後、ウシ胎児血清、デキサメタゾン(Dexamethasone)、ベータグリセロリン酸(β-Glycerophosphate)、アスコルビン酸(Ascorbic acid)を含むα−MEM培地で再び培養分化され、骨形成細胞に分化することを特徴とする骨欠損治療用細胞治療剤により達成する。
【００３２】
また、本発明の目的は、ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地で間葉系幹細胞が培養された後、デキサメタゾン(Dexamethasone)、アスコルビン酸(Ascorbic acid)とピルビン酸ナトリウム(Sodium pyruvate)、TGF-β、BMP-2を含むDMEM 低グルコース(low glucose)培地で再び培養分化され、軟骨細胞に分化することを特徴とする骨関節炎治療用細胞治療剤により達成する。
【００３３】
また、本発明の目的は、ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地で間葉系幹細胞が培養された後、ウシ胎児血清、デキサメタゾン(Dexamethasone)、インドメタシン(Indomethacin)、インシュリン(Insulin)を含むα−MEM培地で再び培養分化され、脂肪細胞に分化することを特徴とする脂肪組織形成用細胞治療剤により達成する。
【発明の効果】
【００３４】
上述した本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地により、人間成体幹細胞である未分化した間葉系幹細胞の大量増殖培養が急速な成長速度で可能であり、1ヶ月以上の長期培養増殖でも細胞の核型を維持し、骨形成細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞の誘導体に分化させ、細胞治療剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、骨髄由来の間葉系幹細胞を対照群であるMSC-BMに、添加剤と10％のウシ胎児血清を含む培地及び本発明によって提供されるABM-M培地に、添加剤と10％のウシ胎児血清を含む培地が入っているT75フラスコに、375,000細胞濃度で接種し、10日間培養した後、間葉系幹細胞の成長を示したグラフ。
【図２】図２は、脂肪由来の間葉系幹細胞を対照群であるADSCGM及び本発明によって提供されるABM-M培地に、10％のウシ胎児血清を含む培地が入っているT75フラスコに、375,000細胞濃度で接種し、7日間培養した後、間葉系幹細胞の成長と、継代培養して、T175フラスコに、875,000細胞濃度で接種し、7日間培養した後、間葉系幹細胞の成長を示すグラフ。
【図３】図３は、骨髄由来の間葉系幹細胞を対照群であるMSC-BMに、添加剤と10％のウシ胎児血清を含む培地及び本発明によって提供されるABM-M培地に、添加剤と10％のウシ胎児血清を含む培地で増殖した間葉系幹細胞の増殖率を示したグラフ。
【図４】図４は、脂肪由来の間葉系幹細胞を対照群であるADSCGM及び本発明によって提供されるABM-M培地に、10％のウシ胎児血清を含む培地で増殖した間葉系幹細胞の継代培養別増殖率を示したグラフ。
【図５】図５は、対照群であるMSCGM培地、または、ADSCGM培地で培養された骨髄、または、脂肪由来の間葉系幹細胞と本発明によって提供されるABM-Mに、10％のウシ胎児血清と2mM L-グルタミン(L-glutamine)を含む培養培地で培養した骨髄、または、脂肪由来の間葉系幹細胞を柔細胞分析の施行により細胞のサイズ及び表現型の変化を示したグラフ(SS：Granular content within cell、FS：cell size)。
【図６】図６は、本発明によって提供されるABM-M培地に、10％のウシ胎児血清と2mM  L-グルタミン(L-glutamine)を含む培地で培養した骨髄由来の間葉系幹細胞の免疫学的細胞特性分析に対するヒストグラムを示したグラフ。
【図７】図７は、本発明によって提供されるABM-M培地に、10％のウシ胎児血清と2mM  L-グルタミン(L-glutamine)を含む培地で培養した脂肪由来の間葉系幹細胞の免疫学的細胞特性分析に対するヒストグラムを示したグラフ。
【図８】図８は、本発明によって提供されるABM-M培地に、10％のウシ胎児血清と2mM L-グルタミン(L-glutamine)を含む培地で培養した骨髄及び脂肪由来の間葉系幹細胞を培養した後、骨形成細胞分化用培養培地(10％のウシ胎児血清、10mM ベータグリセロリン酸(β-glycerol phosphate)、50uM アスコルビン酸(ascorbic acid)と10-7M デキサメタゾン(dexamethasone)を含む培地)で2-3週の間、再培養分化した後のアルカリフォスファターゼ(ALPase)とフォン  コッサ(von Kossa)染色の図面代用写真。
【図９】図９は、本発明によって提供されるABM-M培地に、10％のウシ胎児血清と2mM  L-グルタミン(L-glutamine)を含む培地で培養した骨髄及び脂肪由来の間葉系幹細胞を培養した後、脂肪細胞分化用培地(10％のウシ胎児血清、10-7M デキサメタゾン(dexamethasone)、100uM インドメタシン(indomethacin)と10ug/mL インシュリン(Insulin)を含む培地)で2週の間、再培養分化した後のoil Red-O染色の図面代用写真。
【図１０】図１０は、本発明によって提供されるABM-M培地に、10％のウシ胎児血清と2mM L-グルタミン(L-glutamine)を含む培地で培養した骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した後、軟骨細胞への分化を誘導するために、5×105程度の細胞300gを5分間遠心分離して細胞の塊を作った後、10-7M デキサメタゾン(dexamethasone)、50uM アスコルビン酸(Ascorbic acid)、1nM ピルビン酸ナトリウム(sodium pyruvate)、10ng/mL TFG-βと100ng/mL BMP-2を含むDMEM ハイグルコース(high glucose)培地で3週の間、再培養分化した軟骨組織をパラフィン包埋過程を経て、5um連続切片を製作し、H/E染色、サフラニン(safranin) O染色、アルシアン  ブルー(alcian blue)染色、シリウス  レッド(sirius red)染色、COMP染色、コラーゲン(collagen) type IIとI染色の図面代用写真。
【図１１】図１１は、本発明によって提供されるABM-M培地で、10％のウシ胎児血清と2mM L-グルタミン(L-glutamine)を含む培地で培養した骨髄由来の間葉系幹細胞を10回継代培養した後、核型を分析した図面代用写真。
【図１２】図１２は、本発明によって提供されるABM-M培地で、10％のウシ胎児血清と2mM L-グルタミン(L-glutamine)を含む培地で培養した脂肪由来の間葉系幹細胞を10回継代培養した後、核型を分析した図面代用写真。
【図１３】図１３は、従来のABM-M培地で、間葉系幹細胞の細胞培養の間、間葉系幹細胞の形態異常及び付着性喪失の写真。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、骨髄及び脂肪などの成体組織から由来した間葉系幹細胞の基本培養培地を提供するが、本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地は、商用化された培地構成成分の種類を分析した後、2種類以上の培地を組合わせて、多種類の候補基本培養培地組成を準備する段階と、候補基本培養培地組成を対象に、10〜20％のウシ胎児血清を含む完全培地から間葉系幹細胞の増殖率を分析し、間葉系幹細胞に適した基本培養培地組成をスクリーンする段階を含み調製される。
【００３７】
このように調製した、本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地を利用して、急速な成長速度で早期培養した間葉系幹細胞が免疫学的細胞特性を示すかを分析、骨形成細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞への分化のために分化能を分析、染色体異常による突然変異が発生せず、長期間の培養が可能であるかの確認のための細胞核型を分析し、骨欠損治療用、骨関節炎治療用及び脂肪組織形成を通じた脂肪細胞治療用細胞治療剤に使用できるかの有無を検証することになる。
【００３８】
ここで、本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地を利用して、細胞治療剤として使用できるかの有無を検証するためには、免疫学的細胞特性、分化能及び細胞核型の分析が必要であるが、次のような手順に沿った実験を通じての検証が望ましい。先ず、スクリーンされた培地組成で培養した間葉系幹細胞の免疫学的細胞特性を分析する段階と;スクリーンされた培地組成で培養した間葉系幹細胞の分化能を分析する段階;及びスクリーンされた培地組成で培養した間葉系幹細胞の長期間培養可能の有無を確認するための細胞核型を分析する段階で検証することである。
【００３９】
以下、本発明に対して具体的に説明することとする。
【００４０】
本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地であるABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地は、商用化された培養培地であるDMEM ハイグルコース(high glucose)、RPMI-1640及びHam’s F-12を1:1:1の割合で混合した基本培地によって調製される。  DMEM ハイグルコース(high glucose)培地を基本成分とし、上記基本培地をDMEM ハイグルコース(high glucose)、RPMI-1640及びHam’s F-12の各培地と比較する。 次に、各培地の中で重複する成分はより高い方の濃度を選択して、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含まれていない成分は、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に追加して含ませる(表１の備考欄の１)。  各培地の一つの培地にだけ入っている成分の濃度はそのまま維持し、DMEM ハイグルコース(high glucose)に含まれていない成分は、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に追加して含ませる(表１の備考欄の２)。  各培地の成分中、同一供給源である成分は、一つの成分を選択して、選択した一つの成分が各培地の重複する成分であれば、高い方の濃度を選択し、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含まれていない成分は、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に追加して含ませる(表１の備考欄の３)。 結果として、下記の表１のように調製される。
【００４１】
商用化された培地の組成及びABM-M培地の組成
【００４２】
【表１】
0005872046.tif 000002
【００４３】
上記表１の備考欄に開示された通り、本発明によって提供されるABM-M培地の基本成分であるDMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含まれていない成分で追加され含ませる成分は、アミノ酸(Amino Acids)では、L-アラニン(L-Alanine)、L-アスパラギン酸無水物(L-Aspartic acid)、L-アスパラギン酸(L-Aspartic acid)、L-グルタミン酸(L-Glutamic acid)、L-ヒドロキシL-プロリン(L-Hydroxy-L-proline)、L-プロリン(L-Proline)であり、無機塩(Inorganic Salts)では、硫酸銅５水和物(Cupric Sulfate Pentahydrate)、硫酸鉄(II)７水和物(Ferrous Sulfate Heptahydrate)、リン酸二水素ナトリウム無水物(Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous)、硫酸亜鉛７水和物(Zinc Sulfate Heptahydrate)、ビタミン(Vitamins)では、D-ビオチン(D-Biotin)、P-アミノ安息香酸(P-Aminobenzoic Acid;PABA)、ビタミン(Vitamine)B12、その他の成分(Other components)では、ハイポキサンチン(Hypoxanthine)、還元型L-グルタチオン(L-Glutathione Reduced)、リノール酸(Linoliec acid)、プトレシン(Putrescine)+2HCL、チオクト酸(Thioctic Acid)、チミジン(Thymindine)である。
【００４４】
上述した本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地であるABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地を調製した表１の備考欄に対する説明は、次の通りである。
【００４５】
(1)各培地の中で重複する成分は、高い方の濃度を選択するが、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含まれていない成分で、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含ませるものは、表１の備考欄の１に該当する。
【００４６】
これは、従来、特許文献9のDMEM、PRMI-1640で構成されたABM-Cの培地に、本発明によって提供される成体幹細胞から由来した間葉系幹細胞を培養した結果、細胞の形態異常及び付着性の喪失が誘発したため、これの補強のために、増殖率及び細胞の合成と関連する成分を補強した。
【００４７】
アミノ酸であるグリシン(Glycine)、L-グルタミン(L-Glutamine)、L-イソロイシン(L-Isoleucine)、L-ロイシン(L-Leucine)、L-リジン(L-Lysine)、L-メチオニｂ(L-Methionine)、L-フェニルアラニン(L-Phenylalaine)、L-セリン(L-Serine)、L-トレオニン(L-Threonine)、L-トリプトファン(L-Tryptophan)、L-チロシン(L-Tyrosine)、L-バリン(L-Valine)は、タンパク質合成の主要アミノ酸として、高い方の濃度を選択することで、タンパク質合成の増進と同時に細胞の増殖を高めた。
【００４８】
無機質塩である塩化カリウム(Patassium Chloride)、塩化ナトリウム(Sodium Chloride)は、細胞内外の浸透圧と関連するため、適正浸透圧の維持のために高い方の濃度を選択した。
【００４９】
ビタミン類であるアスコルビン酸リン酸(Ascorbic Acid Phosphate)、塩化コリン(Choline Chloride)、D-ビオチン(D-Biotin)(DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含む)、D-パントテン酸カルシウム(D-Ca Pantothenate)、葉酸(Folic Acid)、ミオイノシトール(Myo-Inositol)、ニコチンアミド(Nicotinamide)、リボフラビン(Riboflavin)、塩酸チアミン水和物(Thiamine Hydrochloride)、ビタミン(Vitamine) B12(DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含む)は、抗酸化剤として、細胞の高増殖により生成された老廃物を取除くために高い方の濃度を選択した。
【００５０】
その他の成分であるD-グルコース無水物(D-Glucose Anhydrous)は、主要エネルギー源として、高増殖の維持のためのエネルギー源として高い方の濃度を選択、ピルビン酸ナトリウム(Sodium Pyruvate)は、細胞内合成に関して高い方を選択した。Phenol Red Sodium Saltは、細胞の増殖とは関連しないが、細胞の活発な増殖により排出された老廃物で、Phenol Redの色が赤色から黄色に変化するため、高増殖率により排出された老廃物の量を視覚的に測定するために高い方の濃度を選択した。
【００５１】
プロリン(Proline)は、コラーゲンの主成分として、細胞外基質合成の主要成分である。高増殖の間葉系幹細胞内コラーゲン合成を増加させるのために、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含ませた。
【００５２】
アスパラギン酸(Aspartic acid)は、ほぼ全てのタンパク質に含まれており、クエン酸回路に連結された、プリン塩基とピリミジン塩基のアミノ基供給体である。従って、高増殖率を示す細胞のDNA合成の主要供給源は、プリンとピリミジン塩基を主要供給体とし、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含ませた。
【００５３】
L-グルタミン酸(L-Glutamic acid)は、細胞内の新陳代謝の重要なアミノ酸として、細胞の活発な増殖のために、DMEM ハイグルコース(hig
h glucose)培地に含ませた。
【００５４】
(2)各培地の一つの培地にだけ入っている成分の濃度はそのまま維持し、DMEM ハイグルコース(high glucose)に含まれていない成分で、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含ませるものは、表１の備考欄の２に該当する。
【００５５】
DMEM及びRPMI-1640で構成され増殖率を高めたABM-C培地での間葉系幹細胞の場合、細胞付着性が喪失された。これの補強のために、細胞内のコラーゲン合成を高め、高まった合成により誘発した老廃物を取除くために、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地にない成分を含ませた。
【００５６】
アミノ酸であるL-アラニン(L-Alanine)は、細胞の免疫と合成に関与するアミノ酸として、間葉系幹細胞の増殖を高めるために含ませ、アミノ酸であるL-ヒドロキシ-L-プロリン(L-Hydroxy-L-Proline)、その他の成分であるチオクト酸(Thioctic Acid)とリノール酸(Linoleic Acid)、ビタミン類であるP-アミノ安息香酸(P-Aminobenzoic Acid)(PABA)は、細胞内のコラーゲン構成成分として、細胞内のコラーゲン合成と細胞の付着性を高めるために、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含ませた。
【００５７】
無機質塩である硫酸銅５水和物(Cupric Sulfate Penatahydrate)と硫酸亜鉛７水和物(Zinc Sulfate Heptahydrate)、その他の成分である還元型グルタチオン(Glutathione Reduced)は、抗酸化剤として、高増殖率を示す細胞内の多様な老廃物の排出を更に増進させ、高い細胞増殖率を示すために、EME ハイグルコース(high glucose)培地に含ませた。
【００５８】
その他の成分であるチミジン(Thymidine)、プトレシン(Putrescine)+2HCL、ヒポキサンチン(Hypoxanthine)は、DNA合成に関与する成分として、細胞増殖を高めるためには、DNA合成を先行する必要があるため、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含ませた。
【００５９】
(3)各培地の成分の中、同一供給源である成分は、一つの成分を選択し、選択した一つの成分が各培地に重複する成分であれば高い方の濃度を選択、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含まれていない成分で、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地に含ませるのは、表１の備考欄の３に該当する。
【００６０】
アミノ酸であるL-アルギニン(L-Arginine)、L-アスパラギン(L-Asparagine)、L-システイン(L-Cysteine)/シスチン(cystine)、L-ヒスチジン(L-Histidine)、無機質塩であるカルシウム(Calcium)塩化物(Chloride)/硝酸塩(Nitrate)、三硝酸鉄(Ferric Nitrage)/硫酸第一鉄(Ferrous Sulfate)、リン酸ナトリウム(Sodium Phosphate)、ビタミン類であるピリドキサール塩酸塩(Phridoxal Hydrochloride)/ピリドキシン塩酸塩(Pyridoxine Hydrochloride)の場合、同一供給源成分が２つ以上追加されると、培地内の浸透圧が高まり細胞に悪影響を及ぼし得るので、同一成分は、高い方の濃度成分に限り、一つの供給源だけを選択した。
【００６１】
また、培地製造の際に生成し得る塩の最小化のために、無機塩から水和物(hydrate)が少量付いている成分を選択した。
【００６２】
リン酸ナトリウム(Sodium phosphate)は、例外的に高い方の濃度を選択すると、培地全体の浸透圧が上昇し、細胞に悪影響を及ぼし得るので、適正浸透圧の維持のために142.04mg/Lを選択した。
【００６３】
塩化マグネシウム６水和物(Magnesium Chloride Hexahydrate)と硫酸マグネシウム無水物(Magnesium Sulfate Anhydrous)は、細胞内代謝の主要物質であるマグネシウム(Magnesium)の供給源として、培地製造の際、塩の生成を減らすために無水化の硫酸マグネシウム無水物(Magnesium Sulfate Anhydrous)を選択するが、重複する成分であるため、高い方の濃度を選択した。
【００６４】
上記のような理由により、表１に開示された通り、アミノ酸(Amino Acids)成分の場合、L-Arginine Free Base(RPMI)とL-Arginine Monobydrochloride(DEMEとF12)の中では、L-Arginine Monobydrochloride(211mg/L)を選択、L-Asparagine MonobydrateとL-Asparatic acidでは、L-Asparatic acid(20mg/L)を選択、L-Cysteine Monobydrochloride MonobydrateとL-Cystine Dibydrochlorideでは、L-Cystine Dibydrochloride(62.6mg/L)を選択、L-HistidimeとL-Histidine Monobydrochloride Monobydrateでは、L-Histidine Monobydrochloride Monobydrate(42mg/L)を選択するのである。
【００６５】
無機塩(Inorganic Salts)成分の場合、Calcium Chloride DihydrateとCalcium Nitrate Tetrahydrateの中では、Calcium Chloride Dihydrate(265mg/L)を選択、Ferric Nitrate NonabydrateとFerrous Sulfate Heptabydrateでは、Ferrous Sulfate Heptabydrate(0.834mg/L)を選択、Magnesium Chloride HexabydrateとMagnesium Sulfate Anbydrousでは、Magnesium Sulfate Anbydrous(97.67mg/L)を選択、Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousとSodium Phosphate Monobasic Anhydrousでは、Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous(142.04mg/L)を選択するのである。
【００６６】
ビタミン(VITAMINS)成分の場合、Pyridoxal HydrochlorideとPyridoxine Hydrochlorideの中、Pyridoxal Hydrochloride(4mg/L)を選択するのである。
【００６７】
上述の通り、骨髄及び脂肪などの成体組織から由来する間葉系幹細胞を体外で培養するための間葉系幹細胞の基本培養培地(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell、ABM-M)組成は、DMEM ハイグルコース(high glucose)、RPMI-1640及びHam’s F-12倍地の組成から出発するが、DMEM ハイグルコース(high glucose)の成分を基本成分として調製される。
【００６８】
即ち、本発明によって提供されるABM-M培地、間葉系幹細胞は、細胞の増殖及び合成が不活発な成体幹細胞に分類され、アミノ酸濃度が高いDMEM ハイグルコース(high glucose)培地の成分を基本成分とし、DMEM ハイグルコース(high glucose)培地には無いか、或いは、濃度が低いアミノ酸、無機塩、ビタミンなどの構成成分の濃度を調整した培地である。
【００６９】
間葉系幹細胞は、人間を含めた哺乳動物の成体組織から由来したmultipotencyを有する未分化細胞を指し、成体組織は、骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、臍帯血などが含まれる。
【００７０】
上記骨髄、または、脂肪組織などの成体組織から間葉系幹細胞を様々な方法を通じて分離できる。例えば、パーコール(Percoll)など、密度勾配遠心分離による分離方法(Majumdar MK et al., J. Cell Physiol. 176:57, 1998;Majka SM et al., J. Clin. Invest., 111:71, 2003)(collagnease)の利用、或いは、コラゲナーゼ(collagnease)などの酵素処理で分離した細胞をLuria(Luria et al., Transfusion, 11:345, 1971)などの方法で、培養容器の底に付着して育つ全細胞を分離する方法などで、容易に分離できる。
【００７１】
本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地は、成体組織である骨髄、血液、脳、皮膚、脂肪、臍帯血などから分離された間葉系幹細胞を培養するためのもので、必要に応じて、一つ以上の成分を添加可能であるが、胎児子牛、馬、または、人間の血清及びL-グルタミン(L-glutamine)を始め、微生物の汚染防止のための抗生剤及び抗真菌剤を添加して使用でき、好ましくは、10-20％のウシ胎児血清と2-4mMのL-グルタミン(L-glutamine)を添加することが望ましい。
【００７２】
間葉系幹細胞の基本培養培地(ABM-M)を通じた増殖率の確認のために、間葉系幹細胞は、本発明によって提供される基本培養培地で培養する。このように培養された間葉系幹細胞の免疫学的細胞特性を探って見ると、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、CD73、HLA-ABC陽性表面マーカーは、80％以上発現し、ここで特に、CD44、CD105、CD90、CD73とCD166陽性表面マーカーは、95％以上発現、CD31、CD34、CD45、CD80とHLA-DR陰性表面マーカーは、5％以下発現する免疫学的細胞特性を示す。
【００７３】
また、プラスティック培養容器に付着して増殖する螺旋状(spindle-shape)の形態学的特性を示し、二分化状態で増殖して分化能力を持つ特徴を示す。
【００７４】
また、上記培養された間葉系幹細胞は、骨形成細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞として分化可能な多分化能の間葉系幹細胞であることを確認できた。
【００７５】
本発明はまた、間葉系幹細胞がABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地で培養された後、ウシ胎児血清、デキサメタゾン(Dexamethasone)、β-ベータグリセロリン酸(phosphate)、アスコルビン酸(Ascorbic acid)を含むα-MEM培地で再び培養され、骨形成細胞に分化し得る間葉系幹細胞を含む骨欠損治療用細胞治療剤を提供する。
【００７６】
本発明または、間葉系幹細胞がABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地で培養された後、デキサメタゾン(Dexamethasone)、アスコルビン酸(Ascorbic acid)、ピルビン酸ナトリウム(Sodium pyruvate)、TGF-β、BMP-2を含むDMEM 低グルコース(low glucose)培地で再び培養され、軟骨細胞に分化し得る間葉系幹細胞を含む骨関節炎治療用細胞治療剤を提供する。
【００７７】
本発明はまた、間葉系幹細胞がABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell)培地で培養された後、ウシ胎児血清、デキサメタゾン(dexamethasone)、インドメタシン(Indomethacin)、インシュリン(Insulin)を含むα-MEM培地で再び培養され、脂肪細胞に分化し得る間葉系幹細胞を含む脂肪組織形成用細胞治療剤を提供する。
【００７８】
以下、本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell、ABM-M)での間葉系幹細胞の増殖率を別の培地と比較、ABM-M培地で培養された間葉系幹細胞の免疫学的細胞特性を確認、ABM-M培地で培養された間葉系幹細胞の分化能確認及びABM-M培地で培養された間葉系幹細胞の細胞核型維持に対して、下記の実施例を通じて、より詳細な説明を行なう。
【実施例１】
【００７９】
本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地(ABM-M)の増殖力の比較
【００８０】
ABM-M培地内で骨髄及び脂肪組織など、成体組織から由来した間葉系幹細胞に対する増殖力を分析するために、凍結保管された骨髄由来の間葉系幹細胞と脂肪由来の間葉系幹細胞をロンザ(Lonza)社から購入し、骨髄由来の間葉系幹細胞は、Poietics MSCGMTM Bullekitで培養、脂肪由来の間葉系幹細胞は、Poietics ADSC-GMTM Bullekitにて、培養社の専用培地と比較した。
【００８１】
1-1．骨髄及び脂肪組織由来の間葉系幹細胞の準備
【００８２】
ロンザ(Lonza)社から購入した骨髄由来の間葉系幹細胞を37℃の水浴で迅速に解凍した後、5mLのMSCGMTM培地を有する15mLチューブに入れて、300gで5分間遠心分離した。遠心分離後、上層液培地を除去、新しいMSCGM培地10mLで縣濁し、細胞数及び細胞生存率を測定した。準備した細胞は、T25フラスコで当り5,000個の細胞を接種し、37℃と5％CO2を維持しながら培養した。3-4日毎、培養容器別にMSCGM培地5mLで培養液の交換を行ないながら培養、細胞がフラスコ床面積の90％以上成長すると継代培養を実施した。2次、3次及び4次培養を行い、試験用細胞数を準備した。
【００８３】
ロンザ(Lonza)社から購入した脂肪組織由来の間葉系幹細胞を37℃の水浴で迅速に解凍した後、5mL ADSC-GM培地を有する15mLチューブに入れて、300gで5分間遠心分離した。遠心分離後、上層液培地を除去、新しいADSC-GM培地10mLで縣濁し、細胞数及び細胞生存率を測定した。準備した細胞は、T25フラスコで当り5,000個の細胞を接種し、37℃と5％CO2を維持しながら培養した。3-4日毎、培養容器別に10％のウシ胎児血清を含むADSC-GM培地5mLで培養液の交換を行ないながら培養、細胞がフラスコ床面積の90％以上成長すると継代培養を実施した。2次、3次及び4次継代培養を行い、試験用細胞数を準備した。
【００８４】
1-2．ABM-M培地での骨髄由来の間葉系幹細胞の増殖比較
【００８５】
MSCGM培地で4次まで継代培養された骨髄由来の間葉系幹細胞をMSCGM培地を対照群とし、本発明によって提供されるABM-M培地での増殖力を調査した。MSCGM培地は、MSC-BMである基本培地と添加剤(50mL growth supplement、0mL L-glutamine、0.5mL
penicillin-streptomyで構成)で構成されているため、ABM-M培地でも添加剤を添加して比較試験を実施した(表２)。
【００８６】
本発明によって提供されるABM-M培地とMSCGM倍地との増殖力培地組成
【００８７】
【表２】
0005872046.tif 000003
【００８８】
4次継代培養後、表２の培地組成が入っているT75フラスコにァイ当り5,000個の細胞を接種し、37℃と5％CO2を維持しながら培養した。3-4日毎、培養容器別に其々の培地で培養液の交換を行ないながら10日間培養した後、細胞数を測定した。
【００８９】
図１と図３を通じて探って見ると、対照群の場合、MSC-BMに10％のウシ胎児血清(FBS)を添加した培地(MSC-BM+FBS)は、10日間増殖せず、添加剤を添加したMSC-BMであるMSCGM培地もまた、増殖が行なわれなかった。
【００９０】
しかし、試験群である本発明によって提供されるABM-M培地に、10％のウシ胎児血清(FBS)を添加した培地(ABM-B+FBS)は、MSCGMより高い増殖を示し、倍加時間(doubling time)も速かった。ABM-Mに添加剤を含めた培地もまた、MSCGMより高い増殖と速い倍加時間(doubling time)を示したため、ABM-M培地組成が骨髄由来の間葉系幹細胞の増殖率を高めたことを確認した。
【００９１】
MSCGM培地では、骨髄由来の間葉系幹細胞の増殖が行なわれない反面、10％のウシ胎児血清と2mM L-グルタミン(L-glutamine)を含むABM-M培地で、骨髄由来の間葉系幹細胞は増殖された。これは、MSCGM培地で培養した間葉系幹細胞の増殖能は喪失したが、ABM-M培地では増殖能を維持することを示している。
【００９２】
ABM-M培地での増殖能持続の確認のために、5次継代培養で回収した細胞をT150フラスコでァイ当り5,000個の細胞を接種し、37℃と5％CO2を維持しながら培養した。3-4日毎、培養容器別に10％のウシ胎児血清、2mM L-グルタミン(L-glutamine)を含むABM-M培地で培養液の交換を行ないながら10日間培養した後、細胞数を測定した結果、3,357,500の細胞を回収、接種細胞数750,000対比447％の増殖率を示し、増殖能の持続を確認した。従って、本発明によって提供されるABM-M培地は、骨髄由来の間葉系幹細胞の増殖能に優れることを確認できた。
【００９３】
各培養培地別、骨髄由来の間葉系幹細胞の増殖分析結果
【００９４】
【表３】
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【００９５】
1-3．ABM-M培地での脂肪由来の間葉系幹細胞の増殖比較
【００９６】
ADSC-GM培地で4次まで継代培養した脂肪由来の間葉系幹細胞をADSC-GM培地を対照群とし、ABM-M培地での増殖力を調査した。ADSC-GM培地は、ADSCC-BMである基本培地と添加剤(50mLウシ胎児血清、50mL L-glutamine、0.5mL gentamicin-amphotercinで構成)で構成されるため、本発明によって提供されるABM-M培地に10％のウシ胎児血清と2mM L-グルタミン(L-glutamine)を添加して比較試験を実施した。
【００９７】
4次継代培養後、其々の培地が入っているT75フラスコにァイ当り5,000個の細胞を接種し、37℃と5％CO2を維持しながら培養した。3-4日毎、培養容器別に其々の培地で培養液の交換を行ないながら7日間培養した後、細胞数を測定した。また、回収した細胞を継代培養して、培地が入っているT175フラスコにァイ当り5,000個の細胞を接種し、37℃と5％CO2を維持しながら培養した。3-4日毎、培養容器別に其々の培地で培養液の交換を行ないながら7日間培養した後、細胞数を測定した。
【００９８】
図２、図４及び表５を通じて探って見ると、対照群であるADSC-GMより試験群である本発明のABM-M培地で、10％のウシ胎児血清を含む培地(ABM-M+FBS)が、5、6次継代培養で速い倍加時間(doubling time)を示すと同時に回収した細胞も多いため、本発明によって提供されるABM-M培地による脂肪由来の間葉系幹細胞の増殖率が高いことを確認した(表４)。
【００９９】
各培養培地別、脂肪由来の間葉系幹細胞の増殖分析結果
【０１００】
【表４】
0005872046.tif 000005
【実施例２】
【０１０１】
本発明によって提供されるABM-M培地で培養した間葉系幹細胞の免疫学的特性分析
【０１０２】
実施例1の1-2と1-3の培養培地で培養した細胞をTypeLE express処理して分離、400gで5分間遠心分離して細胞を獲得した後、FASC溶液で2回洗浄、洗浄した細胞を5×105個ずつ分注してanti-CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、CD73、HLA-ABC、CD31、CD34、CD45、CD80とHLA-DR抗体で2分間反応させた後に洗浄、FACS溶液で浮遊させ柔細胞分析器を利用して分析した。細胞表面を分析して、間葉系幹細胞の表現型を確認した。
【０１０３】
その結果、対照群であるMSC-GMとADSC-GM培地で培養した間葉系幹細胞と同じく、10％のウシ胎児血清、2mM L-グルタミン(L-glutamine)を含むABM-M培地で培養した細胞で、CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、CD73、HLA-ABCは陽性発現をCD14、CD31、CD34、CD45、CD80とHLA-DRは陰性発現を示し、間葉系幹細胞の特性を有することを確認した(表５)。
【０１０４】
ABM-M培地で培養した間葉系幹細胞の免疫学的細胞特性
【０１０５】
【表５】
0005872046.tif 000006
【実施例３】
【０１０６】
ABM-M培地で培養した間葉系幹細胞の分化能分析
【０１０７】
実施例1の1-2と1-3の培養培地で培養した細胞をトリプルX(triplex)処理して分離、400gで5分間遠心分離して獲得した細胞をin vitro条件で多重分化能を確認した。
【０１０８】
培養した間葉系幹細胞の多重分化能確認のために、Schallmoser kなど(Schallmoser K, et al., Tissue Eng Par C Mechod 14:185,2008)の方法に従い、次のような分化を誘導した。
【０１０９】
骨形成細胞への分化は、図８に図示された通り、ABM-M培地で早期培養した間葉系幹細胞を10％のウシ胎児血清、10mM ベータグリセロリン酸(β-glycerolphosphate)、50uM アスコルビン酸(Ascorbic acid)と10-7M デキサメタゾン(dexamethasone)を含むα-MEM培地で更に2-3週間培養分化した後、アルカリフォスファターゼ(alkaline phosphatase)発現の有無は、カリフォスファターゼ(ALPase)染色で測定、カルシウムの蓄積は、フォン  コッサ(von Kossa)染色で確認した。
【０１１０】
脂肪細胞への分化は、図９に図示された通り、ABM-M培地で早期培養した間葉系幹細胞を10％のウシ胎児血清、10-7M デキサメタゾン(dexamethasone)、100uM インドメタシン(indomethacin)と10ug/mL インシュリン(insulin)を含むα-MEM培地で更に2週間培養分化した後、oil Red-O染色で細胞内に蓄積した脂肪滴を染色して確認した。
【０１１１】
軟骨細胞で分化を誘導するために、図１０で図示された通り、ABM-M培地で早期培養した5ラ105程度の間葉系幹細胞を300gで5分間遠心分離して細胞の塊を作った後、10-7M dexamethasone、50uM アスコルビン酸(ascorbic acid)、1nM ピルビン酸ナトリウム(sodium pyruvate)、10ng/mL TGF-β、100mg/mL BMP-2を含むDMEM 低グルコース(low glucose)培地で更に3週間培養分化した。分化誘導された軟骨組織は、パラフィン包埋過程を経て5um連続切片を製作、H/E染色、サフラニン(sasfranin) O染色、染色、シリウス  レッド(sirius red)染色、COMP染色、コラーゲン(collagen) typeIIとI染色を通じて、軟骨組織への分化能を確認した。
【０１１２】
本発明によって提供されるABM-M培地で培養した骨髄及び脂肪由来の間葉系幹細胞を２度の継代培養後、多重分化を誘導して、誘導していない対照群と比較した。骨形成細胞で誘導し、ALP染色とカルシウムの沈着を遂行した結果、分化を誘導しなかった対照群と違って、アルカリフォスファターぜ（alkaline phosphatase）の発現及びカルシウムの沈着を確認した。また、脂肪細胞に誘導してoil Red-O染色を遂行した結果、分化を誘導しなかった対照群と違って、脂肪細胞に分化することを確認した。間葉系幹細胞の塊で軟骨細胞への分化を誘導し、サフラニン(safranin) O染色、アルシアン  ブルー(alcian blue)染色、シリウス  レッド(sirius red)染色、COMP染色、コラーゲン(collagen) typeIIとI染色を通じて、正常軟骨と類似するグリコサミノグリカン(glycosaminoglycan)(GAG)、プロテオグリカン(proteoglycan)、コラーゲン(collagen) typeIの発現が確認された。
【実施例４】
【０１１３】
ABM-M培地で培養した間葉系幹細胞の核型分析
【０１１４】
実施例1の1-2と1-3のように、相異なる個体から由来した骨髄及び脂肪組織などの成体組織から間葉計幹細胞を分離して、10％のウシ胎児血清と2mM L-グルタミン(L-glutamine)を含むABM-M培地で10回の継代培養後、培養された間葉系幹細胞の核型を分析した。20個の分裂中期像をGTG分染法を利用して分析、国際命名規約(international System for Cytogenetic Nomenclature)(2009)に準じて核型を表記した。観察を行なった5個全ての分裂中期で、図１１は、正常な46、XY核型を、図１２は、正常な46、XX核型を示した。
【０１１５】
上述の通り、本発明によって提供される間葉系幹細胞の基本培養培地(ABM-M培地)は、従来の間葉系幹細胞培養培地に比べ、間葉系幹細胞の細胞特性及び分化能を維持、また、細胞成長及び増殖に優れる培地であるため、これを利用して間葉系幹細胞を大量培養することで、純粋な間葉系幹細胞を獲得できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図８】
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【図９】
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