【手続補正書】
【提出日】平成22年11月30日(2010.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）パート（ａ）のヌクレオチド配列の補体、
（ｃ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号１０と同一でない配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）パート（ｃ）のヌクレオチド配列補体
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなり、補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
Δ８デサチュラーゼ活性を有する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる組み換えコンストラクト。
【請求項４】
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる細胞であって、前記細胞が酵母であり、好ましくはその乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母である、細胞。
【請求項５】
（ａ）請求項４に記載の酵母細胞を提供するステップと、
（ｂ）長鎖多価不飽和脂肪酸が生成される条件下で、好ましくは、酵母がその乾燥細胞重量の少なくとも２５％を油として産生する油性細胞である（ａ）の酵母細胞を成長させるステップと
を含んでなる、酵母細胞中で長鎖多価不飽和脂肪酸を製造する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法から得られる微生物油。
【請求項７】
ａ）請求項２に記載のΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する単離されたポリヌクレオチドを含んでなり、コンストラクトが、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、少なくとも１つの第２の組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなり、好ましくは酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択され、油がアラキドン酸、エイコサジエン酸、エイコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される長鎖多価不飽和脂肪酸を含んでなるその乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母。
【請求項８】
請求項７に記載の酵母から得られる微生物油。
【請求項９】
ａ）（ｉ）配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクト、および
（ｉｉ）エイコサジエン酸源またはエイコサトリエン酸源
を含んでなる、油性酵母を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクトが発現して、エイコサジエン酸がジホモ−γ−リノール酸に、またはエイコサトリエン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の酵母を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のジホモ−γ−リノール酸またはエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸及びエイコサテトラエン酸からなる群から選択される、多価不飽和脂肪酸を生成する方法。
【請求項１０】
ａ）ｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｉｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結するΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも１つの第２の組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、酵母細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の酵母細胞にリノレン酸源を提供するステップと、
ｃ）ジホモ−γ−リノール酸が形成される条件下で（ｂ）の酵母細胞を成長させるステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７１】
配列番号１７６に記載のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴＰによって評価し、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）配列（配列番号１７３）に対して３８．７０（Ｅ値２ｅ−３９）のｐＬｏｇ値を得た。ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼは、Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ法を使用して、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ配列と３９．４％同一である。Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ法（Ｈｅｉｎ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１８３：６２６〜６４５頁（１９９０年））によって実施された配列％同一性計算は、ペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーター（ＫＴＵＰＬＥ＝２）で、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）バイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行った。ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用して、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ配列と３１．８％同一である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９〜１９１頁（１９９２年））によって実施した配列％同一性計算は、ペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーターで（ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行った。ＢＬＡＳＴスコアおよび確率は、ここで配列番号１７５として述べられている核酸断片が、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ全体をコードすることを示唆する。
以下に本発明の態様を示す。
１．（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｂ）パート（ａ）のヌクレオチド配列の補体
を含んでなり、補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチド。
２．ヌクレオチド配列が配列番号１を含んでなり、配列番号１が配列番号９と同一でない、上記１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
３．（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号１０と同一でない配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｂ）パート（ａ）のヌクレオチド配列の補体
を含んでなり、補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチド。
４．ヌクレオチド配列が、配列番号９と同一でない配列番号１９７を含んでなる、上記３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
５．Δ８デサチュラーゼ活性を有する、上記１に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
６．Δ８デサチュラーゼ活性を有する、上記３に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
７．Δ８デサチュラーゼ活性が、配列番号１０に記載のポリペプチドのΔ８デサチュラーゼ活性と少なくとも機能的にほぼ同等である、上記５に記載のポリペプチド。
８．Δ８デサチュラーゼ活性が、配列番号１０に記載のポリペプチドのΔ８デサチュラーゼ活性と少なくとも機能的にほぼ同等である、上記６に記載のポリペプチド。
９．少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、上記１または３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる組み換えコンストラクト。
１０．上記１または上記３のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる細胞。
１１．前記細胞が酵母である、上記１０に記載の細胞。
１２．酵母が、その乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母である、上記１１に記載の細胞。
１３．油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、上記１２に記載の細胞。
１４．（ａ）上記１０に記載の酵母細胞を提供するステップと、
（ｂ）長鎖多価不飽和脂肪酸が生成される条件下で（ａ）の酵母細胞を成長させるステップと
を含んでなる、酵母細胞中で長鎖多価不飽和脂肪酸を製造する方法。
１５．酵母が、その乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母である、上記１４に記載の方法。
１６．酵母がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種である、上記１５に記載の方法。
１７．上記１２に記載の酵母から得られる微生物油。
１８．ａ）上記１または上記３に記載のΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する単離されたポリヌクレオチドを含んでなり、ポリペプチドをコードするコンストラクトが、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼからなる群から選択される、少なくとも１つの第２の組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、その乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母。
１９．ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、上記１８に記載の酵母。
２０．酵母細胞がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種であり、油がアラキドン酸、エイコサジエン酸、エイコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される長鎖多価不飽和脂肪酸を含んでなる、上記１９に記載の酵母。
２１．第１の組み換えＤＮＡコンストラクトが、Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、配列番号２および配列番号１９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記１８に記載の油性酵母。
２２．ａ）（ｉ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する組み換えコンストラクト、および
（ｉｉ）エイコサジエン酸源
を含んでなる、油性酵母を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクトが発現して、エイコサジエン酸がジホモ−γ−リノール酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の酵母を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のジホモ−γ−リノール酸を回収するステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。
２３．ａ）（ｉ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する組み換えコンストラクト、および
（ｉｉ）エイコサトリエン酸源
を含んでなる、油性酵母を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクトが発現して、エイコサトリエン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の酵母を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を生成する方法。
２４．ａ）ｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する上記１または上記３のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｉｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結するΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも１つの第２の組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、酵母細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の酵母細胞にリノレン酸源を提供するステップと、
ｃ）ジホモ−γ−リノール酸が形成される条件下で（ｂ）の酵母細胞を成長させるステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。