【手続補正書】
【提出日】平成23年2月28日(2011.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる標的核酸または１以上の標的核酸の少なくとも１つの変異ヌクレオチドの有無または量を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）前記試料を、ハイブリダイゼーション条件下に、標的核酸配列の第１領域に対する第１オリゴヌクレオチドプライマーで処理する工程であって、該第１プライマーのヌクレオチド配列は、その標的核酸の該第１領域にそれが実質的に相補的であるようなもので、そのため標的核酸の第１領域にアニーリングし、これによりその標的核酸にアニーリングした第１オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作り、該第１領域は変異被疑ヌクレオチドを含む診断部分であり、３’末端のヌクレオチド、または３’末端の１、２もしくは３ヌクレオチド以内のヌクレオチドは変異被疑ヌクレオチドに相補的であり、そのため第１プライマーがその変異被疑ヌクレオチドを含む標的領域にアニーリングすると、アニーリングした第１プライマーは伸長可能となり、第１プライマーが正常ヌクレオチドを含む標的領域にアニーリングすると、アニーリングした第１プライマーは伸長可能とならない工程、
（ｂ）アニーリングした第１プライマーを、伸長可能であれば伸長させて第１プライマーの伸長産物を合成するのに適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下に、工程（ａ）の混合物を維持する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の混合物を分解条件下に維持する工程であって、そのため、第１プライマーの伸長産物が存在すればこれは該分解条件下に分解され、それにより前記標的核酸、または標的核酸中の変異ヌクレオチドの存在および／もしくは量の指標である、検出可能な信号を発生させ、第１プライマーの伸長産物が生じなければ該分解条件下で第１プライマーの伸長産物の分解は起こらず、そのため検出可能な信号は発生せず、これが前記標的核酸または標的核酸中の変異ヌクレオチドの非存在の指標となり、前記分解条件はエキソヌクレアーゼ活性を含み、
（ｉ）該ヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つはラベルされ、かつ／または
（ｉｉ）前記第１プライマーはラベルされ、
いずれの場合も、そのため、第１プライマーの伸長産物が分解して該ラベルから検出可能な信号が発生する工程を含む方法。
【請求項２】
前記第１プライマーはラベルされている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１プライマーの３’末端ヌクレオチドが変異被疑ヌクレオチドに相補的である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記分解は、鋳型に依存する分解として行なわれる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼによってもたらされる５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性であり、前記ＤＮＡポリメラーゼは、工程（ｂ）で使用されるものと同じであり、かつ／または前記ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）は、標的核酸配列の第１領域に対する第１オリゴヌクレオチドプライマー、および標的核酸配列の同じ鎖の第２領域に対する第２オリゴヌクレオチドプライマーで試料を処理して、ハイブリダイゼーション条件下に標的核酸にアニーリングされる第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作る工程を含み、
該第１プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の該第１領域にアニーリングできるように標的核酸の該第１領域に実質的に相補的になるようなものであり、
該第２プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の該第２領域にアニーリングできるように標的核酸の前記第２領域に実質的に相補的になるようなものであって、かつ
その標的核酸の第２領域は、標的核酸の第１領域の３’に位置するようになっている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）はさらに、アニーリングした第１および第２プライマーを、適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下に、伸長可能であれば伸長させて、第１および第２プライマーの伸長産物を合成する工程を含み、工程（ｃ）では、第２プライマーの伸長の結果として第１プライマーの伸長産物の分解が起こる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）はさらに、標的核酸配列の第１領域に対する少なくとも２つの型の第１オリゴヌクレオチドプライマーで試料を処理して、ハイブリダイゼーション条件下に標的核酸にアニーリングされる第１オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作ることを含み、
該第１プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の該第１領域にアニーリングできるように標的核酸の該第１領域に実質的に相補的であるようなものであり、かつ
第１プライマーの該第１型の３’末端ヌクレオチドは、変異被疑ヌクレオチドに相補的であり、かつ
第１プライマーの該第２型の３’末端ヌクレオチドは、対応する正常ヌクレオチドに相補的であって、
これにより工程（ｂ）で、標的核酸配列中の変異被疑ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの該第１型がアニーリングする場合は第１プライマーの第１型の伸長産物が合成され、一方、標的核酸中の対応する正常ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの該第１型がアニーリングする場合は伸長産物が合成されず、かつ
これにより工程（ｂ）で、標的核酸配列中の正常ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの該第２型がアニーリングする場合は第１プライマーの第２型の伸長産物が合成され、一方、標的核酸中の対応する変異ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの該第２型がアニーリングする場合は伸長産物は合成されない、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）第１プライマーの前記第１型と第２型とは分解可能であり、前記２つの型の第１プライマーに、前記第１プライマーの両方の型が伸長された場合にその第１プライマーの伸長産物の分解の際に識別可能な信号を発生する異なるラベルが付けられているか、または
（ｉｉ）第１プライマーの前記第２型は分解可能でなく、第１プライマーの第２型は、修飾されたヌクレオチドまたは修飾された結合または非ヌクレオチドを含み、これにより前記第１プライマーの第２型の伸長産物が、第２プライマーから開始される伸長を阻止し、それにより変異被疑ヌクレオチドを含む標的核酸を濃縮する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＰＣＲ反応の一部であり、
試料を変性条件下に処理して、プライマー伸長産物を、このような伸長産物が形成されたその鋳型から分離し、
前記のように生産した一本鎖を、適切なヌクレオシド三リン酸、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、１以上の型の第１プライマー、第２プライマーおよび第３プライマーと、同時または順次のいずれかにて接触させ、前記または各第１プライマーは、第１プライマーの伸長産物の分解により検出可能な信号が発生するようにラベルされ、これにより、可能な場合、前記のように生産した一本鎖を鋳型として用いてさらに伸長産物が合成され、かつ５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する該核酸ポリメラーゼによって成し遂げられる、第１プライマーの伸長産物の分解が第２プライマーの伸長時に起こり、かつ該第３プライマーは、第２プライマーの伸長産物にアニーリングできるように第２プライマーの伸長産物に実質的に相補的な配列を含み、
以上の工程を充分な回数繰り返して、それにより前記標的核酸または標的核酸中の変異ヌクレオチドの存在下に前記または各第１プライマーの分解から、検出可能な信号をもたらすことを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）前記第１プライマーは、５’末端でない位置でラベルされるか、または
（ｉｉ）前記第１プライマーは、相互作用性対である第１および第２ラベルを含む、請求項６または請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記第１プライマーは、５’末端から少なくとも３、６、または９ヌクレオチド離間したところでラベルされる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記第１プライマーは、（ａ）前記標的核酸配列の第１領域に相補的なプライミング部分を含み、かつさらに（ｂ）前記標的核酸配列に相補的でない、非核酸またはヌクレオチドの配列の第１尾部を５’端に含み、かつさらに（ｃ）非核酸またはヌクレオチドの配列の第２尾部であって、前記第１尾部に連結され、かつ該第２尾部が前記標的核酸配列にアニーリングできるように第１プライマーのプライミング部分に相補的な領域に隣接する標的核酸配列に実質的に相補的である第２尾部を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記第１プライマーは、第１尾部で二本鎖部分を含み、前記第１尾部に相補的な尾部相補体オリゴヌクレオチドが前記第１尾部配列にアニーリングされ、
該第１プライマーは第１ラベルでラベルされ、かつ該尾部相補体オリゴヌクレオチドは第２ラベルでラベルされ、そして
該第１ラベルと第２ラベルとは相互作用性対である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記第１プライマーは、その第１プライマーにハイブリダイズできる第１相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでおり、
前記第１プライマーは、前記第１相補体オリゴヌクレオチドに対するよりも強い親和性で前記標的核酸にハイブリダイズでき、かつ
前記第１プライマーおよび前記第１相補体オリゴヌクレオチドは、第１ラベルと第２ラベルとからなる相互作用性ラベル対の一方のメンバーで各々ラベルされ、
前記標的核酸の増幅に伴い、前記第１プライマーは、前記第１相補体オリゴヌクレオチドよりも前記標的ヌクレオチドの増幅産物に優先的にハイブリダイズするようになっており、それにより前記相互作用性ラベル対は分離される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記第２プライマーは、第２プライマーにハイブリダイズできる第２相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでおり、
前記第２プライマーは、前記第２相補体オリゴヌクレオチドに対するよりも強い親和性で前記標的核酸にハイブリダイズでき、かつ
前記プライマーおよびその相補体オリゴヌクレオチドは、第１ラベルと第２ラベルとからなる相互作用性ラベル対の一方のメンバーで各々ラベルされ、
前記標的核酸の増幅に伴い、前記プライマーは、前記相補体オリゴヌクレオチドよりも前記標的ヌクレオチドの増幅産物に優先的にハイブリダイズするようになっており、それにより前記相互作用性ラベル対は分離される、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記第３プライマーは、第３プライマーにハイブリダイズできる第３相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでおり、
前記第３プライマーは、前記第３相補体オリゴヌクレオチドに対するよりも強い親和性で前記標的核酸にハイブリダイズでき、かつ
前記プライマーおよびその相補体オリゴヌクレオチドは、第１ラベルと第２ラベルとからなる相互作用性ラベル対の一方のメンバーで各々ラベルされ、
前記標的核酸の増幅に伴い、前記プライマーは、前記相補体オリゴヌクレオチドよりも前記標的ヌクレオチドの増幅産物に優先的にハイブリダイズするようになっており、それにより前記相互作用性ラベル対は分離される、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
前記第１ラベルと第２ラベルとは、各々フルオロフォアおよびクエンチャーである、請求項１１または請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。