(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼC（PKC）アクチベータおよび薬学的に許容される担体を含む、虚血症イベントを罹患した患者の卒中の少なくとも一症状を治療するための医薬組成物であって、当該PKCアクチベータが、下記のＡ環ブリオログおよびＢ環ブリオログまたはそれらの組み合わせからなる群より選択される医薬組成物。
【化１】
0005872138.tif 000011
【請求項２】
請求項1に記載の医薬組成物であって、前記投与は前記卒中の１〜３日目の間に開始される医薬組成物。
【請求項３】
請求項1に記載の医薬組成物であって、当該治療は１〜６週間の期間継続する医薬組成物。
【請求項４】
請求項1に記載の医薬組成物であって、前記治療は卒中誘導性の脳障害または記憶障害を逆転させる医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の医薬組成物であって、当該Ａ環またはＢ環ブリオログが、600から755の分子量を有し、０．２５ｎＭから１０μＭのPKC親和性を有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Miao-Kun Sun and Daniel L. Alkon
本出願は、2007年2月9日出願の米国仮出願番号 60/900,339と2007年5月24日出願の米国仮出願番号60/924,662の優先権を主張し、これらの全体は引用することによりここに組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本願発明は、プロテインキナーゼC（PKC）を活性化する化合物または神経成長細胞（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）若しくは他の神経栄養因子を増強する化合物による卒中の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
A.  卒中（stroke）
卒中は、脳血管障害（CVA）としても知られており、脳の一部への血液供給が妨げられる深刻な神経障害である。脳への血液供給は閉塞（虚血性卒中、塞栓性卒中、若しくは血栓性卒中）または血管の破裂（出血性卒中）を含むいくつかの様式で妨げられてもよい。卒中は、脳灌流の障害による神経機能の突然の喪失を伴う。この灌流障害は通常、動脈性であるが、静脈性の可能性もある。
【０００４】
障害された灌流を有する脳の部分は、もはや十分な酸素を受け取らない。これが、脳の細胞を死なせ、または深刻に損傷させ、局所的な脳の機能を障害する虚血カスケードを開始する。卒中は医学的緊急事態であり、もし迅速に診断および治療がなされなければ永続的な神経障害または死さえも引き起こす可能性がある。それは、３番目に多い死亡原因であり、米国や近代化された欧州諸国における成人身体障害の主要要因である。平均して、卒中は４５秒ごとに発生し、３分ごとに誰かが死亡している。卒中による死者５人のうち、３人が男性、2人が女性である。
【０００５】
医学的緊急事態、および前臨床試験において脳虚血の病理過程の阻止に効果的であると示された多数の薬剤にもかかわらず、rTPAを用いた血栓溶解療法が現在、虚血性卒中の治療に使用可能な唯一の選択肢である。この治療は初期の動脈の再疎通を達成するために設計され、時間依存性である（効果的なのはそのイベント後の3時間以内）。梗塞の発達を阻止するためのrTPAおよび他の見込みのある薬剤の有効性は、早期の投与、または可能であれば更に虚血性イベント前の投与にかかっている。虚血性卒中の治療の狭い治療時間帯（therapeutic time window）が、効果的な静脈内血栓溶解療法を受ける候補患者をわずか約5%にする。
【０００６】
重大な脳障害は、即時の虚血性イベントの後の虚血性卒中において起こる。脳虚血／卒中における「遅発性の」脳障害と細胞死はよく確立された現象であり、治療機会を表す。限局的で重度の卒中の梗塞の中心におけるニューロンは直ちに死に、薬学的介入によって救済されることはない。しかしながら、限局的な虚血性卒中における中心の周辺の脳細胞からなる虚血の周縁部、および広範囲な脳虚血における敏感なニューロン／ネットワークは、減少した血液供給によって維持される。この周縁部の脳細胞の障害は「遅発性の」様式で起こり、脳虚血／卒中の後、第二段階としての4〜6時間、または、いわゆる第三段階として数日および数週間後に開始する。例えば、約15分の脳虚血の後、海馬CA1ピラミッド状細胞は、2〜3日以内に退化し始め、虚血性イベントの一週間後最大程度の細胞死に達する。広範囲脳虚血と虚血周縁部の敏感なニューロン構造は「危険な状況にある(at-risk)」細胞である。介入を通じたそれらの救済、またはその後数日若しくは数週間における更なる障害が、長期障害における劇的な相違を決定する。
【０００７】
本願発明は、虚血性イベント後、より広い治療時間帯、例えば数時間から数日以内から数週間などに亘って、脳虚血／卒中に罹患した患者に対して、PKCアクチベータ、他の化合物およびその組み合わせの一時的、周期的または長期的な投与を含む新たな治療戦略を提供する。
【０００８】
B. プロテインキナーゼC
PKCは、非受容体セリン-スレオニンプロテインキナーゼ最大の遺伝子ファミリーの一つとしてとして特定された。80年代初期におけるNishizukaとその共同研究者によるPKCの発見（Kikkawa et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 13341）、およびホルボールエステルのための主要な受容体としてのその特定（Ashendel et al. (1983) Cancer Res., 43: 4333）以来、多数の生理的シグナル伝達のメカニズムはこの酵素によるとされてきた。PKCへの強烈な関心は、カルシウム、およびジアシルグリセロール（およびそのホルボールエステル模倣剤）、即ち、その形成が成長および分化因子の作用によりリン脂質のターンオーバーと連結するエフェクター、によりインビトロで活性化される独特の能力に由来する。
【０００９】
PKCの活性化は学習および記憶を改善することが示された(米国特許番号 PCT/US02/13784; PCT/US03/07102; 60/287,721; 60/362,081; 10/172,005; 10/476,459; それぞれ、その全体は引用することによりここに組み込まれる)。しかしながら、本開示より前には、PKC介在性の学習および記憶の改善は、卒中後の記憶欠損および脳障害の治療のためのメカニズムとして認識されていなかった。さらに、ここに開示されるPKCアクチベータ、具体的には、学習および記憶を改善する化合物は、脳虚血／卒中後の脳機能復元活性を持つとは認識されていなかった。
【００１０】
歴史的に、卒中治療は、少数の利用可能な治療選択肢に限られていた。現在利用可能な唯一の薬物治療は、例えば、抗血栓剤（血栓治療、例えば組織プラスミノゲンアクチベータの静脈内注射など）からなるが、これは虚血性イベントから3時間以内に投与されなければならない。多くの種類の見込みのある神経保護剤は臨床試験で試験されたが、特に卒中後に使用される際の効果のなさ、または関連する毒性のため、臨床的使用が承認されたものはない。この発明の開示において提示される化合物は、ヒトにおいて耐容性が良好であると既に証明された投与量（ブリオスタチン-1投与量）で、虚血の24時間後に、動物モデルにおいて治療が開始された場合に効果的であった。プロテインキナーゼC (PKC)を標的とする化合物、例えばブリオスタチン-1、直接的なPKCアクチベータおよびメチルカテコールアセト酢酸、即ちメチルカテコール誘導体など、エンハンサー、または神経成長因子(NGF)、脳由来の神経栄養性因子(BDNF)、若しくは他の神経栄養性因子、これはおそらくPKCの標的のうちの1つであり、これらを活性化または動態化する手段は、ラット（動物虚血モデル）において脳虚血により誘導された脳障害および記憶障害に対する治療価値を持つことがわかった。卒中治療の治療薬としてのこれらの物質の発展がこの発明によって提供される。
【発明の概要】
【００１１】
本願発明は、卒中に罹患した患者を特定する工程と、プロテインキナーゼC(PKC)アクチベータまたは4-メチルカテコール酢酸(MCBA)および、薬学的に許容される担体を含む、卒中の少なくとも一症状を治療するのに効果的な量の医薬組成物を前記患者に投与する工程とを含む卒中の治療方法を提供する。
【００１２】
ある実施形態において、当該PKCアクチベータはFGF-18、大環状ラクトン、ベゾラクタム、ピロリジノンまたはこれらの組み合わせである。好ましい実施形態において、当該大環状ラクトンは、ブリオスタチンまたはネリスタチンである。もう一つの実施形態において、当該ネリスタチンはネリスタチン-１である。もう一つの実施形態において、当該ブリオスタチンはブリオスタチン-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18である。さらに好ましくは、当該ブリオスタチンはブリオスタチン-1である。
【００１３】
もう一つの好ましい実施形態において、医薬組成物は4-メチルカテコール酢酸(MCBA)、他のメチルカテコール誘導体または脳由来の神経栄養因子を含む。MCBAおよび他のメチルカテコール誘導体は、神経成長因子(NGF)、脳由来の神経栄養因子(BDNF)または他の神経栄養因子を活性化または上方調節する。NGFは、入れ代わりにNGFを上方調節、活性化または増強するPKCの活性を活性化、上方調節、または増強する。
【００１４】
ある実施形態において、本願発明の医薬組成物の投与は前記卒中から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14日以内に開始される。もう一つの実施形態において、前記投与は前記卒中の１〜2日目、1〜3日目、1〜4日目、1〜5日目または1〜7日目の間に開始される。もう一つの実施形態において、本願発明の医薬組成物の投与は前記卒中から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24 時間以内に開始される。さらにもう一つの実施形態において、本願発明の医薬組成物の投与は前記卒中の1〜3時間、1〜5時間、1〜10時間、1〜24時間、3〜5時間、3〜10時間、3〜24時間、5〜10時間、5〜24時間または10〜24時間後に開始される。さらにもう一つの実施形態において、本願発明の医薬組成物の投与は前記卒中／虚血性イベント後、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24時間後に開始される。さらにもう一つの実施形態において、本願発明の医薬組成物の投与は、前記卒中／虚血性イベント後、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日後に開始される。
【００１５】
ある実施形態において、本願発明の医薬組成物の投与を含む治療は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12週間の期間継続する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、訓練試験に亘るラットの空間水迷路パフォーマンス（a spatial water maze performance）を示す。データは、平均±標準誤差として示される。Bry, ブリオスタチン-1; Isch, 脳虚血; MCDA, 4-メチルカテコール酢酸。
【図２】図2は、プローブ試験中の標的クアドラント(quadrant)率を示している。Bry, ブリオスタチン-1; Isch, 脳虚血; MCDA, 4-メチルカテコール酢酸 *: p < 0.05, NS: p > 0.05。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
A. 定義
ここで使用される場合、組成物の「投与」は、経口、皮下、腹腔内および筋肉内を含むいずれの投与経路も含む。
【００１８】
ここで使用される場合、「有効な量」は卒中と関連する一または一以上の症状を減少させるのに十分な量である。
【００１９】
ここで使用される場合、「プロテインキナーゼCアクチベータ」または「PKCアクチベータ」は、プロテインキナーゼCに結合することによってプロテインキナーゼCに触媒される反応の速度を増加する物質を意味する。
【００２０】
ここで使用される場合、「患者」の用語は哺乳類を意味する。
【００２１】
ここで使用される場合、「薬学的に許容される担体」の用語は活性成分が組み合わされてもよく、その組み合わせの後で、患者に活性成分を投与するために使うことが可能な化学的な組成物を意味する。ここで使われるように、「生理学的に許容される」エステルまたは塩の用語は、医薬組成物の他のいかなる成分とも適合性のある活性成分のエステルまたは塩の形態を意味し、これは組成物が投与される患者に対して非毒性である。
【００２２】
ここで使用される場合、「薬剤的に許容される担体」はまた、以下の一または一以上を含むが、これらに限定されない：賦形剤、界面活性剤、分散剤、不活性希釈剤、造粒および崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、着色剤、防腐剤、ゼラチンなどの生理的に分解可能な組成物、水性媒体および溶媒、油性媒体および溶媒、懸濁化剤、分散または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、緩衝剤、塩、増粘剤、充填剤、乳化剤、酸化防止剤、抗生物質、抗真菌薬、安定剤、ならびに薬学的に許容されるポリマー性または疎水性の材料。本願発明の医薬組成物に含まれてもよい他の「追加の成分」は当該分野において知られ、例えば引用することによりここに組み込まれるGenaro, ed., 1985, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.,に記載される。
【００２３】
ここに記載される医薬組成物の製剤は、薬学分野において既知の、または今後発展するどのような方法によって調製されてもよい。一般に、そのような調製方法は、活性成分を担体または一もしくは一以上の他の副成分(accessory ingredient) と合わせる工程、およびもし必要なら次に製品を所望の単回または複回投与単位に成形または包装する工程を含む。
【００２４】
ここにおいて提供される医薬組成物の記載は、原則、ヒトに対する倫理的投与に適した医薬組成物に向けられるが、このような組成物は一般的にあらゆる種類の動物への投与に適していることが当業者により理解されるだろう。様々な動物への投与に適した組成物にするための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の修飾はよく理解されており、通常の熟練した獣医薬理学者は、たとえあるとしても、単なる通常の実験によってそのような修飾を設計および実施することができる。本願の医薬組成物の投与を検討される患者は、ヒトおよび他の霊長類、ならびに他の哺乳類を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
新しい治療薬の開発へ向けた進歩および数種類の動物モデルの利用可能性にも関わらず、なおスクリーニングのための改良動物モデルの差し迫った必要性がある。
【００２６】
B. プロテインキナーゼC (PKC)
PKC 遺伝子ファミリーは現在、11遺伝子から成り、以下の4つのサブグループに分けられている：1) 典型的なPKCα, β1, β2（β1およびβ2は同じ遺伝子の選択的にスプライスされた形態である)およびγ、2) 新規なPKCδ, ε, ηおよびθ、3) 異型のPKCζ, λ, ηおよびi、ならびに4) PKCμ。PKCμは新規なPKCアイソフォームに類似するが、推定上の膜貫通ドメインを有することにより異なる（Blohe et al. (1994) Cancer Metast Rev. 13: 411; Ilug et al. (1993) Biochem J. 291: 329; Kikkawa et al. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 31によって再検討された）。α, β1, β2およびγアイソフォームはCa2+、リン脂質およびジアシルグリセロール依存であり、PKCの典型的なアイソフォームを代表し、一方、他のアイソフォームはリン脂質およびジアシルグリセロールによって活性化されるが、Ca2+には依存しない。すべてのアイソフォームは５つの可変（V1-V5）領域を包含し、α, βおよびγアイソフォームは高度に保存された４つの（C1-C4）構造ドメインを含む。PKCα, βおよびγ以外のすべてのアイソフォームはC2ドメインを欠き、当該λおよびηアイソフォームもまたジアシルグリセロールが結合するC1における2つのシステインリッチ亜鉛フィンガードメインの９個を欠く。C1ドメインはまた、すべてのアイソフォーム間で高度に保存された偽基質の配列を含み、これは当該酵素の不活性コンフォメーションを作り出すために、基質結合部位をブロックすることによって自己調節機能を果たす（House et al. (1987) Science 238, 1726）。
【００２７】
これらの構造的特徴のために、様々なPKCアイソフォームは、生理学的刺激に反応する情報伝達（Nishizuka (1989) Cancer 10: 1892）、並びに悪性形質転換および分化（Glazer (1994) Protein Kinase C, J.F. Kuo, ed., Oxford U. Press at pages 171-198）において高度に特殊化した役割を持つと考えられる。既知PKCモジュレータの議論については、PCT/US97/08141, 米国特許番号 5,652,232; 6,080,784; 5,891,906; 5,962,498; 5,955,501; 5,891,870および5,962, 504(それぞれその全体は引用することによりここに組み込まれる)を参照されたい。
【００２８】
個々のPKCアイソザイムが、薬理学的開発の基礎を提供する生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしているという証拠が増加している。一つは、PKCの特異的な（好ましくは、アイソザイム特異的な）アクチベータの設計である。このアプローチは、触媒ドメインはPKCのアイソザイム特異性に主に関与するドメインではないという事実によって複雑になっている。これらは、逆の生物学的効果により他の情報伝達経路の効果を覆す方法を提供してもよい。代わりに、急性の活性化後、PKCの下方調節を誘発することによりPKCアクチベータは長期の拮抗作用を生じてもよい。ブリオスタチンは現在、抗がん剤として臨床試験中である。ブリオスタチンは、PKCの調節ドメインに結合することおよび当該酵素を活性化することが知られている。ブリオスタチンは、アイソザイム選択的なPKCアクチベータの例である（例えば、WO 97/43268を参照されたい；この全体は引用することによりここに組み込まれる。）。既知PKCモジュレータの議論については、PCT/US97/08141、米国特許番号5,652,232; 6,043,270; 6,080,784; 5,891,906; 5,962,498; 5,955,501; 5,891,870および5,962,504（それぞれその全体は引用することによりここに組み込まれる）を参照されたい。
【００２９】
PKCアクチベータのいくつかの部類は特定されている。しかしながら、ホルボールエステルは、その癌促進活性のため最終的な薬剤開発のための適切な化合物ではない（Ibarreta et al. (1999) Neuro Report 10 (5&6): 1035-40）。PKCを活性化するために作用する大環状ラクトン（すなわち、ブリオスタチン類やネリスタチン類）は特に興味深い。ブリオスタチン類化合物の中でも、ブリオスタチン-１はPKCを活性化することが示され、癌促進活性を欠いていることが証明された。ブリオスタチン-１の投与量反応曲線が二相性であるため、ブリオスタチン-1もまたPKCアクチベータとしてとりわけ有用である。さらに、ブリオスタチン-１は、PKCα、PKCδおよびPKCεを含むPKCアイソザイムの分化調節を説明する。ブリオスタチン-１は、動物ならびにヒトにおける毒性および安全性試験を受け、抗がん剤として積極的に調査される。試験におけるブリオスタチン-１の使用により、ヒトにおける主要な副作用は筋肉痛であることが明らかにされた。有効投与量の一例は、静脈注射による一週間あたり40μg/m2である。
【００３０】
大環状ラクトン、および特にブリオスタチン-１は米国特許番号4,560,774（その全体は引用することによりここに組み込まれる）に記載されている。大環状ラクトンおよびその誘導体は、他にも米国特許番号 6,187,568、米国特許番号6,043,270、米国特許番号5,393,897、米国特許番号5,072,004、米国特許番号5,196,447、米国特許番号4,833,257、米国特許番号4,611,066（その全体が引用することによりここに組み込まれる）に記載されている。上記の特許は様々な化合物、および抗炎症剤または抗癌剤としての使用を含む大環状ラクトンの様々な使用を記載する。(Szallasi et al. (1994) Journal of Biological Chemistry 269(3): 2118-24; Zhang et al. (1996) Caner Research 56: 802-808; Hennings et al. (1987) Carcinogenesis 8(9): 1343-1346; Varterasian et al. (2000) Clinical Cancer Research 6: 825-828; Mutter et al. (2000) Bioorganic & Medicinal Chemistry 8: 1841-1860) (それぞれ、その全体は引用することによりここに組み込まれる)。
【００３１】
当業者に理解されるように、大環状ラクトン化合物とその誘導体、特にブリオスタチンの部類はコンビナトリアル合成技術に適し、それ故、化合物ライブラリーは、組成物の有効性および安全性を含み、これらに限定されない薬理学的パラメータを最適化するために作成され得る。加えて、これらのライブラリーは、好ましくはαセクレターゼおよび／またはPKCを調節するそれらのメンバーを決定するために試験され得る。
【００３２】
天然物および発酵培養液のコンビナトリアルライブラリーハイスループットスクリーニング (combinatorial libraries high throughput screening) の結果、いくつかの新規な薬剤が発見された。現在、化学的多様性の産出およびスクリーニングは、リード化合物発見のための主要な技術として広範に利用されており、これは確かに薬の発見の領域での主要な基礎的進歩である。さらに、「リード」化合物の特定後でさえも、コンビナトリアル技術は所望の生物活性の最適化のための有益なツールを提供する。理解されるように、対象の反応は、すぐに薬学的、他の生物学的、若しくは医療関連の活性、または原料関連の品質のスクリーニングのための化合物コンビナトリアルライブラリーの創作に役立つ。本願発明の目的のためのコンビナトリアルライブラリーは化学的に関連する化合物の混合であり、これは所望の特性のため一緒にスクリーニングされてもよい；前記ライブラリーは溶液中にあってもよく、または固体担体に共有結合していてもよい。単一反応での多くの関連化合物の製造により、実施される必要のあるスクリーニング過程の数は大きく減少および単純化される。適切な生物学的特性のスクリーニングは従来の方法によってなされてもよい。したがって、本願発明は、またαセクレターゼおよび／またはPKCを効果的に調節するために結合する一または一以上の独創的な化合物の能力を決定する方法を提供する。
【００３３】
以下に記載されるコンビナトリアルライブラリーを作成するため、様々な技術が当該分野で利用可能であるが、本願発明は前述の例や記載によって限定されることを意図しないことが理解されるだろう。（例えば、Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14: 83; 米国特許番号 5,359,115; 5,362,899; 米国 5,288,514: PCT 公報 WO 94/08051; Chen et al. (1994) JACCS 1  6:266 1:  Kerr et al. (1993) JACCS I 1 5:252; PCT 公報 W092/10092, W093/09668; W091/07087およびW093/20242を参照されたい。それぞれ、引用することによりここに組み込まれる）。したがって、約16から1,000,000のオーダーまたはそれ以上のダイバーソマー (diversomer) を合成することができ、特定の活性または特性をスクリーニングすることができる。
【００３４】
ブリオスタチンの類似体、通常ブリオログと言われ、これは本願発明の方法における使用に適したPKCアクチベータのある特定の部類である。以下の表はいくつかのブリオログの構造的特徴をまとめたものであり、これはブリオログはPKCへの親和性が非常に多様であることを証明する（0.25 nMから10 μM）。構造的に、それらはすべて類似している。ブリオスタチン-１は2つのピラン環と1つの六員環状アセタールを有しているが、ほとんどのブリオログ中でブリオスタチン-１のピランのうちの一つは2番目の六員アセタール環に置換されている。例えば、強酸または強塩基の両方において、この修飾はブリオスタチン-1に比べてブリオログの安定性を低減させるが、生理的pHにおいてはほとんど重要性を持たない。ブリオログはまた、ブリオスタチン-１（988）と比較して、より低い分子量(約600から755の範囲に及ぶ)および、血液脳関門を横断する輸送を促進する特性を有する。
【表１】
0005872138.tif 000002
【００３５】
類似体１(Wender et al. (2004) Curr Drug Discov Technol. 1: 1; Wender et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95: 6624; Wender et al. (2002) Am Chem Soc. 124: 13648 (それぞれの全体は引用することによりここに組み込まれる))は、PKCに対する最も高い親和性を有する。このブリオログはブリオスタチン-１よりも約100倍強力である。類似体１のみが、ブリオスタチンよりもPKCに対する高い親和性を示す。ブリオスタチン-１のA環を欠く類似体2は、PKCに対する高い親和性を維持する最も単純な類似体である。活性なブリオログに加え、26 位でアセチル化された類似体７dは事実上、PKCに対する親和性を持たない。
【化１】
0005872138.tif 000003
【００３６】
B環ブリオログも本願発明の方法における使用に適している。これら合成のブリオログは低ナノモル範囲で親和性を有する（Wender et al. (2006) Org Lett. 8: 5299 (その全体は引用することによりここに組み込まれる)）。このB環ブリオログは完全に合成であるという利点を有し、天然の供給源からの精製を必要としない。
【化２】
0005872138.tif 000004
【００３７】
適当なブリオスタチン類似体の第三の部類はA環ブリオログである。これらのブリオログは、PKCに対して、ブリオスタチンIよりもわずかに低い親和性を有するが (ブリオログ 3, 4, 5はそれぞれ 6.5, 2.3, 1.9 nM )、より低い分子量を有する。
【００３８】
多くのジアシルグリセロール (DAG) の誘導体はプロテインキナーゼCに結合し、活性化させる(Niedel et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 36; Mori et al. (1982) J. Biochem (Tokyo) 91: 427; Kaibuchi et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 6701)。しかしながら、DAGとDAGの誘導体は、薬剤として限られた価値しかない。ジアシルグリセロールによるPKC活性化は一過性のものであり、それはジアシルグリセロールがジアシルグリセロールキナーゼおよびリパーゼによって速やかに代謝されるためである (Bishop et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6993; Chung et al. (1993) Am. J. Physiol. 265: C927; その全体は引用することによりここに組み込まれる)。脂肪酸置換が活性化強度を決定する。不飽和脂肪酸を有するジアシルグリセロールは最も活性である。立体異性配置もまた重要である。1,2-sn 配置を有する脂肪酸は活性であるが、一方、2,3-sn-ジアシルグリセロールと1,3-ジアシルグリセロールはPKCに結合しない。シス-不飽和脂肪酸はジアシルグリセロールと相乗的である。本願発明の一つの実施形態において、用語「PKCアクチベータ」は、DAGまたはDAGの誘導体、例えばホルボールエステルなどを明確に除外する。
【００３９】
イソプレノイドは本願発明の方法における使用に適したPKCアクチベータである。例えば、ファルネシルチオトリアゾールは、Kd 2.5μM でPKCを活性化する合成のイソプレノイドである。ファルネシルチオトリアゾールは、例えば、ジオレオイルグリセロールと等しい効力を持つが (Gilbert et al. (1995) Biochemistry 34: 3916;その全体は引用することによりここに組み込まれる)、加水分解可能な脂肪酸エステルを持たない。ファルネシルチオトリアゾールおよび関連化合物は、安定で持続性のPKCアクチベータを代表する。その低い分子量(305.5)および荷電群の欠如のために、ファルネシルチオトリアゾールは容易に血液脳関門を横断するだろう。
【化３】
0005872138.tif 000005
【００４０】
オクチリンドラクタムV (Octylindolactam V) は、テレオシジンに関連する非ホルボール系のプロテインキナーゼCアクチベータである。オクチリンドラクタムV、特にその(-)-エナンチオマー、の利点は、より高い代謝安定性、高い効力（Fujiki et al.  (1987) Adv. Cancer Res. 49: 223; Collins et al. (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 104: 1159; それぞれその全体は引用することによりここに組み込まれる。)(EC50 = 29nM)、および血液脳関門を横断する輸送を促進する低い分子量である。
【化４】
0005872138.tif 000006
【００４１】
グニジマクリン (Gnidimacrin) は、濃度0.1-1 nMでマウス白血病および固形腫瘍に対して強力な抗癌活性を示すダフナン型ジテルペンである。それは、K562細胞において3 nM以下の濃度でPKCアクチベータとして作用し、G1/S相で、Cdc25Aの抑制とそれに続くサイクリン依存キナーゼ2(Cdk2)の阻害（5 ng/ mlで達成される100％阻害）により細胞周期の進行を調節する。グニジマクリンはブリオスタチンに類似する複素環天然産物であるが、それより幾分小さい（分子量774.9)。
【化５】
0005872138.tif 000007
【００４２】
イリパリダール (Iripallidial) は アイリス・パルリダ (Iris pallida)から単離された二環式トリテルペノイドである。イリパリダールは、マイクロモルからナノモル範囲にわたるGI50（成長を50％阻害するのに必要な濃度）でNCI60細胞株において抗増殖活性を示す。それは高い親和性（Ki = 75.6 nM）でPKCαと結合する。それは、RasGRP3依存性の様式でERK1/2のリン酸化を誘発する。分子量486.7。イリパリダールはブリオスタチンのわずか約半分の大きさであり、荷電群を欠いている。
【化６】
0005872138.tif 000008
【００４３】
インゲノール (Ingenol) はホルボールに関連するジテルペノイドであるが、非常に低い毒性しか有さない。これはトウワタ植物 (milkweed plant) であるユーホルビア・ペプルス（Euphorbia peplus）に由来する。インゲノール3,20-ジベンゾエートは、例えば、[3H]ホルボールジブチレートと、PKCに対する結合において競合する（結合Ki = 240 nM）((Winkler et al. (1995) J.Org.Chem. 60: 1381; 引用することによりここに組み込まれる)。インゲノール-3-アンゲレートは、局所的に用いられる際、扁平上皮癌ならびに黒色腫に対する抗癌活性を有する(Ogbourne et al. (2007) Anticancer Drugs. 18: 357; 引用することによりここに組み込まれる)。
【化７】
0005872138.tif 000009
【００４４】
ナフタレンスルホンアミド、これはN-(n-ヘプチル)-5-クロロ-1-ナフタレンスルホンアミド(SC-10)およびN-(6-フェニルヘキシル)-5-クロロ-1-ナフタレンスルホンアミドを含み、PKCアクチベータの別の部類の物質である。SC-10は、ホスファチジルセリンのメカニズムと類似のメカニズムを用いて、カルシウム依存性の様式でPKCを活性化する(Ito et al. (1986) Biochemistry 25: 4179; 引用することによりここに組み込まれる。)。ナフタレンスルホンアミドはブリオスタチンとは異なるメカニズムで作用し、ブリスオタチンまたはPKCアクチベータのもう一つの部類の物質と一緒に相乗効果を示すことが期待されるだろう。構造的には、ナフタレンスルホンアミドはカルモジュリン(CaM)アンタゴニストW-7と類似するが、CaMキナーゼに対する効果はないと報告されている。
【化８】
0005872138.tif 000010
【００４５】
リノレン酸誘導体DCP-LA (2-[(2-ペンチルシクロプロピル)メチル]シクロプロパンオクタン酸)は既知PKCのほとんど知られていないアイソフォーム特異的なアクチベータの一つである。DCP-LAは、100 nMで最大効果を示し、選択的にPKCεを活性化する(Kanno et al. (2006) J. Lipid Res. 47: 1146)。SC-10と同様に、DCP-LAは、ジアシルグリセロール結合部位の代わりに、PKCのホスファチジルセリン結合部位と相互作用する。
【００４６】
PKCを直接活性化することへの代替的アプローチは、内因性アクチベータ、ジアシルグリセロールのレベルを増加することである。ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、例えば6-(2-(4-[(4-フルオロフェニル)フェニルメチレン]-1-ピペリジニル)エチル)-7-メチル-5H-チアゾロ[3,2-a]ピリミジン-5-オン (R59022)および[3-[2-[4-(ビス-(4-フルオロフェニル)メチレン]ピペリジン-1-イル)エチル]-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-4(1H)-キナゾリノン(R59949)などは、内因性のリガンド、ジアシルグリセロールのレベルを高め、それによりPKCの活性化を生ずる (Meinhardt et al. (2002) Anti-Cancer Drugs 13: 725)。
【００４７】
様々な線維芽細胞成長因子、例えば線維芽細胞成長因子18（FGF-18）およびインスリン成長因子などはPKC経路を経て機能する。FGF-18の発現は学習において上方調節され、インスリン成長因子の受容体は学習に関わっている。これらの、または他の成長因子によるPKC情報伝達経路の活性化は、プロテインキナーゼCを活性化する付加的で見込みのある手段を提供する。
【００４８】
成長因子アクチベータ、例えば4-メチルカテコール誘導体、例えば、4-メチルカテコール酢酸 (MCBA)などは、NGFやBDNFのような成長因子の合成および／または活性化を刺激し、またPKC並びにシナプス形成および／または神経分岐の原因である収束的経路を活性化する。
【００４９】
本願発明の化合物は、種々の経路によって、ならびに経口、直腸、非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内など）、硬膜外、髄腔内、関節腔内、局所性および口腔投与のための形態を含む様々な投与形態で投与され得る。成人のヒトへの投与量の範囲は、患者の年齢、体重、および状態を含む多くの要因ならびに投与経路に依存するだろう。
【００５０】
すべての書籍、論文、特許または他の刊行物および参考文献の全体は引用することによりここに組み込まれる。ここにおけるいずれの化合物に対する言及も、ラセミ体、並びに単一の鏡像異性体を含む。
【００５１】
［例］
以下の実施例は本願発明をさらに説明するものであり、決してその範囲を限定するものとして解釈されてはならない。
【００５２】
例1：卒中の広範囲虚血モデル
ラット（雄性、ウィスター (Wistar)、200-225 g）は無作為に6つの群（８匹ごと）に分けられ、実験前の一週間飼育された。脳の血流および酸素供給の一時的または持続的制限の結果、虚血性卒中となる。血管性の記憶障害を誘導するために用いられる広範囲虚血モデルは、短期間の全身性低酸素症と組み合わされた二血管閉塞であった。両側総頚動脈の結紮は麻酔下（ペントバルビタール、60 mg/kg、腹腔内）で行われた。手術から1週間の回復後、ラットは14分の低酸素（ガラスジャー中5%酸素）にさらされた。コントロールのラット（擬似治療され、溶媒コントロール (vehicle controls)である）は両方の総頸動脈を分離させるために同じ切開を受け、14分空気にさらされた(ガラスジャー中)。体温は、外科的処置の間および動物が完全に回復するまで、熱光源を用いて、37-37.5 ℃に保たれた。
【００５３】
例2：ブリオスタチンおよびMCDA治療
ブリオスタチン-１は20 μg/m2で投与され（尾静注、2投与量／週、10投与量）、これは低酸素性イベント終了24時間後に開始された。４-メチルカテコールアセト酢酸(MCDA、強力なNGFおよびBDNFブースター)は、別々の群のラットに1.0 mg/kg（腹腔内、同じ5週間の期間で毎日）で投与された。
【００５４】
最後のブリオスタチン-1、MCDAまたは担体投与の1週間後、ラットは水迷路空間学習課題 (water maze spatial learning task)（一日あたり2つの訓練試験を4日間）、次いでプローブ試験 (probe test) で試験された。可視プラットフォーム試験 (visible platform test) はプローブ試験後に行われた。結果は図1に示される。
【００５５】
全体では、6つの群間に有意な学習差があった(図1; F5,383 = 27.480, p < 0.001; ANOVA)。詳細な分析は、試験を通して逃避潜伏期 (escape latency) に有意差がなく(F7,63 = 0.102, p > 0.05)、コントロールラットに比べ著しく学習が障害されたため(群差: F1,127 = 79.751, p < 0.001)、虚血性の群は空間迷路課題 (spatial maze task)を学習しなかったが、一方、その他の５つの群のラットはすべて課題を学習した(MCDA 治療の虚血性ラット：p < 0.05 、他の4つの群：試行を通じてp < 0.001)ことを明らかにした。ブリオスタチン-１治療は、コントロールラット（ブリオスタチン-１治療の虚血性群対コントロールラット：F1,127 = 0.001, p > 0.05)と統計的に差がない行動レベルまで、その行動（ブリオスタチン-1治療の虚血性群対虚血性ラット：F1,127 = 72.782, p < 0.001）を大きく改善した。MCDA治療もまた虚血性ラットの学習を改善したが（MCDA治療の虚血対虚血ラット; F1,127 = 15.584, p < 0.001）、MCDA治療の虚血とコントロールラットとの差は5週間の治療後、有意なままであった(MCDA治療の虚血対コントロールラット: F1,127 = 16.618, p < 0.001)。コントロールとブリオスタチン-1のみの群間（ブリオスタチン-１対コントロール：F1,127 = 0.010, p > 0.05）、およびコントロールとMCDAのみの群間 (MCDA対コントロール: F1,127 = 0.272, p > 0.05)に差はなかった。
【００５６】
虚血性群のラットは、プローブ試験で標的選択（target preference）を示さなかったが（(F3,31 = 0.096, p > 0.05)、その他の５つの群のラットはすべてプローブ試験で標的クアドラント(quadrant)選択を示した (すべて、p < 0.005)。データは標的クアドラント率（標的クアドラント距離をプローブ試験中の非標的クアドラント値の平均で割る；図２）を用いて分析された。標的クアドラント率には群間で有意差があった（F5,47 = 5.081, p < 0.001)。詳細な分析は、コントロールと虚血性ラット間(F1,15 = 9.451, p < 0.01)、虚血性とブリオスタチン-１治療の虚血性間(F1,15 = 10.328, p < 0.01)およびMCDA治療の虚血性と虚血性ラット間(F1,15 = 5.623, p < 0.05)には群差があるが、コントロールとブリオスタチン-1治療の虚血性ラット間(F1,15 = 0.013, p > 0.05)、MCDA治療の虚血性とコントロール群間(F1,15 = 2.997, p > 0.05)、コントロールとブリオスタチン-１のみのラット間(F1,15 = 0.064, p > 0.05)、およびコントロールとMCDAのみのラット間(F1,15 = 0.0392, p > 0.05)には差がないことを明らかにした。プローブ試験の後に決定された可視プラットフォーム試験は群間では有意差がないことを明らかにし(F5,47 = 0.115, p > 0.05)、このことはラットの感覚運動能力に有意な群差がなかったことを示す。
【００５７】
例3：ブリオスタチン治療
広範囲な脳虚血／低酸素症は、持続的に両側総頸動脈を閉塞させることによりオスのウィスターラット（225-250 g)において誘導され、14分の低酸素（約5％）と組み合わせられる。ブリオスタチン-1は15 μg/m2（尾静脈経由、2投与量／週、10投与量）で投与され、 虚血／低酸素イベント終了から約24時間後に開始する。空間学習(2試験／日、4日間)および記憶（１分間のプローブ試験、最後の試行の24時間後）課題は、最後の服用の9日後に行われた。全体では、群(F3,255 = 31.856, p<0.001)と群x試行(F21,255 =1.648, p<0.05)の間に有意差はなかった。広範囲の脳虚血は空間学習を障害した(虚血対擬似手術、F1,127 = 79.751, p>0.001)。学習障害はブリオスタチン-1治療により復元されたが(ブリオスタチン-1+虚血対虚血：F1,127=50.233, p<0.001)、一方、ブリオスタチン-１のみでは学習に影響を与えなかった（ブリオスタチン-１対擬似手術：F1,127 = 2.258, p>0.05；最後の投与の9日後）。
【００５８】
記憶保持試験において、擬似手術のラットは標的クアドラント選択を示した。このような良好な記憶保持は虚血性ラットにおいては観察されず、これは障害された空間記憶を示す。ブリオスタチン-１治療は、虚血後の記憶保持を擬似手術のラットのレベルまで効果的に復元した。ブリオスタチン-１のみでは、標的クアドラント選択に擬似手術コントロールラットと比較した有意な効果は与えなかった。クアドラント率（標的クアドラントの水泳距離を非標的クアドラントにおける平均水泳距離によって割ることにより計算された；F3,31 = 6.181, p<0.005）には群間で有意差があった。詳細な分析は、虚血ラットと擬似手術コントロールラット間(F1,15 = 9.451, p<0.01)、虚血ラットとブリオスタチン-１治療の虚血ラット間(F1,15 = 10.328, p<0.01)には有意差があるが、ブリオスタチン-１治療の虚血ラットと擬似手術コントロール間(F1,15 = 0.0131, p>0.05)および擬似手術コントロールラットとブリオスタチンのみのラット間 (F1,15 = 0.161, p>0.05) には有意差がないことを明らかにした。これらの結果は、脳虚血／低酸素症により空間学習および記憶の障害が生じたことを示すものであり、これは虚血性イベントの約7週間後に試験されたものである。適切な介入がない時間枠中、当該障害は持続し、回復不可能であったが、たとえ虚血イベントの24時間後という広い治療時間帯に治療が開始された時でも、長時間のブリオスタチン-１治療により復元した。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
（１）  卒中を治療する方法であって、虚血性イベントに罹患した患者を特定する工程と、プロテインキナーゼC（PKC）アクチベータ、4-メチルカテコール酢酸（MCBA）、または他のメチルカテコールの誘導体および薬学的に許容される担体を含む、卒中の少なくとも一症状を治療するのに効果的な量の医薬組成物を前記患者に投与する工程とを含む方法。
（２）  （１）に記載の方法であって、当該PKCアクチベータがFGF-18、大環状ラクトン、ベンゾラクタム、ピロリジノン、またはその組み合わせである方法。
（３）  （２）に記載の方法であって、当該大環状ラクトンがブリオスタチンまたはネリスタチンである方法。
（４）  （３）に記載の方法であって、当該ブリオスタチンがブリオスタチン-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18である方法。
（５）  （４）に記載の方法であって、当該ブリオスタチンはブリオスタチン-1である方法。
（６）  （３）に記載の方法であって、当該ネリスタチンはネリスタチン-１である方法。
（７）  （１）に記載の方法であって、当該医薬組成物は4-メチルカテコール酢酸を含む方法。
（８）  （１）に記載の方法であって、前記投与は前記卒中から1日以内に開始される方法。
（９）  （１）に記載の方法であって、前記投与は前記卒中から2日以内に開始される方法。
（１０）  （１）に記載の方法であって、前記投与は前記卒中から3日以内に開始される方法。
（１１）  （１）に記載の方法であって、前記投与は前記卒中の1〜2日目の間に開始される方法。
（１２）  （１）に記載の方法であって、前記投与は前記卒中の1〜3日目の間に開始される方法。
（１３）  （１）に記載の方法であって、当該治療は1週間の期間継続する方法。
（１４）  （１）に記載の方法であって、当該治療は2週間の期間継続する方法。
（１５）  （１）に記載の方法であって、当該治療は3週間の期間継続する方法。
（１６）  （１）に記載の方法であって、当該治療は4週間の期間継続する方法。
（１７）  （１）に記載の方法であって、当該治療は6週間の期間継続する方法。
（１８）  （１）に記載の方法であって、前記治療は卒中誘導性の脳障害を逆転させる方法。
（１９）  （１）に記載の方法であって、前記治療は卒中誘導性の記憶障害を逆転させる方法。
【図１】
0005872138.tif 000012
【図２】
0005872138.tif 000013