【手続補正書】
【提出日】平成23年7月6日(2011.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）バイオリアクター中の細胞培地に、可溶性rHuPH20をコードする細胞の接種材料を接種して、細胞培養物を作るステップ、ここで、
細胞は可溶性rHuPH20をコードする核酸を150〜300コピー含有し、
バイオリアクターは少なくとも100リットルの細胞培養物を含有し、
細胞培養物100リットルにつき約1010〜1011個の細胞が接種され、
細胞は設定温度で培養される；
b）細胞に、細胞成長およびピーク細胞密度を増加させ、可溶性rHuPH20合成を増加させるのに十分な量のグルコース、L-アラニル-L-グルタミン、ヒトインスリンおよび酵母エキスを含有する第1フィード培地を供給するステップ、ここで、該フィード培地は細胞培養体積の0.5％または約0.5％〜20％または約20％の体積で培養物に加えられる；
c）細胞に、可溶性rHuPH20合成を増加させ、細胞周期停止を誘発するのに十分な量のグルコース、L-アラニル-L-グルタミン、酵母エキスおよび酪酸ナトリウムを含有する第2フィード培地を供給し、
温度を、ステップa）における温度と比較して、細胞周期停止を増加させ、細胞生存度を増加させ、可溶性ヒアルロニダーゼを安定化するのに十分な温度まで低下させるステップ、ここで、
L-アラニル-L-グルタミンの量は、ステップb）におけるL-アラニル-L-グルタミンの量と比較して減らされ、
酵母エキスの量は、ステップb）における酵母エキスの量と比較して増やされ、
該フィード培地は、細胞培養体積の0.5％または約0.5％〜20％の体積で培養物に加えられる；
d）細胞に、可溶性rHuPH20合成を増加させ、細胞周期停止を増加させるのに十分な量のグルコース、L-アラニル-L-グルタミン、酵母エキスおよび酪酸ナトリウムを含有する第3フィード培地を供給し、
温度を、ステップc）における温度と比較して、細胞周期停止を増加させ、細胞生存度を増加させ、可溶性ヒアルロニダーゼを安定化するのに十分な温度まで低下させるステップ、ここで、
L-アラニル-L-グルタミンの量は、ステップc）におけるL-アラニル-L-グルタミンの量と比較して減らされ、
酵母エキス、グルコースおよび酪酸ナトリウムの量は、ステップc）における酵母エキス、グルコースおよび酪酸ナトリウムの量と比較して増やされ；
該フィード培地は、細胞培養体積の0.5％または約0.5％〜20％の体積で培養物に加えられる；
e）細胞に、可溶性rHuPH20合成を増加させ、細胞周期停止を増加させるのに十分な量のグルコース、L-アラニル-L-グルタミン、酵母エキスおよび酪酸ナトリウムを含有する第4フィード培地を供給し、
温度を、ステップd）における温度と比較して、細胞周期停止を増加させ、細胞生存度を増加させ、可溶性ヒアルロニダーゼを安定化するのに十分な温度まで低下させるステップ、ここで、
L-アラニル-L-グルタミンおよびグルコースの量は、ステップd）におけるL-アラニル-L-グルタミンおよびグルコースの量と比較して減らされ、
酪酸ナトリウムの量は、ステップd）における酪酸ナトリウムの量と比較して減らされ、
該フィード培地は、細胞培養体積の0.5％または約0.5％〜20％の体積で培養物に加えられる；
f）生存度が低下して少なくともまたは約50％を下回るまで細胞を培養し続けるステップ；
g）収集細胞培養液を得るステップ；および
h）収集細胞培養液からrHuPH20を精製するステップ
を含む、可溶性rHuPH20を生産するための方法。
【請求項２】
ステップa）における温度が37℃またはその前後である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップc）における温度が36.5℃またはその前後である、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
ステップd）における温度が36℃である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップe）における温度が35.5℃である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
収集細胞培養液が精製に先だって濾過される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
可溶性rHuPH20の精製がカラムクロマトグラフィーによって達成される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
カラムクロマトグラフィーがビーズ状架橋アガロースカラムクロマトグラフィー、ビーズ状架橋フェニル置換アガロースカラムクロマトグラフィー、アミノフェニルボロネートカラムクロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
フィード培地が細胞培養体積の4％または約4％の体積で培養物に加えられる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
a）バイオリアクター中の細胞培地に、可溶性rHuPH20をコードする細胞の接種材料を接種して、細胞培養物を作るステップ、ここで、
細胞は可溶性rHuPH20をコードする核酸を150〜300コピー含有し、
バイオリアクターは少なくとも100リットルの細胞培養物を含有し、
接種細胞密度は4×105細胞/mLまたはその前後であり、
細胞は37℃またはその前後で培養される；
b）細胞に、33g/Lグルコース、32mM L-アラニル-L-グルタミン、16.6g/L酵母エキスおよび33mg/Lインスリンを含有するかその前後の濃度の各成分を含有する第1フィード培地を供給するステップ、ここで、該フィード培地は細胞培養体積の4％または約4％の体積で培養物に加えられる；
c）細胞に、33g/Lグルコース、16mM L-アラニル-L-グルタミン、33.4g/L酵母エキスおよび0.92g/L酪酸ナトリウムを含有するかその前後の濃度の各成分を含有する第2フィード培地を供給するステップ、ここで、該フィード培地は細胞培養体積の4％または約4％の体積で培養物に加えられ、
温度は36.5℃に下げられる；
d）細胞に、50g/Lグルコース、10mM L-アラニル-L-グルタミン、50g/L酵母エキスおよび1.8g/L酪酸ナトリウムを含有するかその前後の濃度の各成分を含有する第3フィード培地を供給するステップ、ここで、該フィード培地は細胞培養体積の4％または約4％の体積で培養物に加えられ、
温度は36℃に下げられる；
e）細胞に、33g/Lグルコース、6.6mM L-アラニル-L-グルタミン、50g/L酵母エキスおよび0.92g/L酪酸ナトリウムを含有するかその前後の濃度の各成分を含有する第4フィード培地を供給するステップ、ここで、該フィード培地は細胞培養体積の4％または約4％の体積で培養物に加えられ、
温度は35.5℃に下げられる；
f）生存度が低下して少なくともまたは約50％を下回るまで細胞を培養し続けるステップ；
g）収集細胞培養液を得るステップ；
h）収集細胞培養液を濾過するステップ；
i）ビーズ状架橋アガロースカラムクロマトグラフィー、ビーズ状架橋フェニル置換アガロースカラムクロマトグラフィー、アミノフェニルボロネートカラムクロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを使ってrHuPH20を収集培養液から精製するステップ
を含む、可溶性rHuPH20を生産するための方法。
【請求項１１】
a）バイオリアクター中の細胞培地に、可溶性rHuPH20をコードする細胞の接種材料を接種して、細胞培養物を作るステップ、ここで、
細胞は可溶性rHuPH20をコードする核酸を150〜300コピー含有し、
バイオリアクターは少なくとも100リットルの細胞培養物を含有し、
接種細胞密度は4×105細胞/mLまたはその前後であり、
細胞は37℃またはその前後で培養される；
b）細胞に、33g/Lグルコース、32mM L-アラニル-L-グルタミン、83.3g/L酵母エキスおよび33mg/Lインスリンを含有するかその前後の濃度の各成分を含有する第1フィード培地を供給するステップ、ここで、該フィード培地は細胞培養体積の4％または約4％の体積で培養物に加えられる；
c）細胞に、33g/Lグルコース、13mM L-アラニル-L-グルタミン、166.7g/L酵母エキスおよび0.92g/L酪酸ナトリウムを含有するかその前後の濃度の各成分を含有する第2フィード培地を供給するステップ、ここで、該フィード培地は細胞培養体積の4％または約4％の体積で培養物に加えられ、
温度は36.5℃に下げられる；
d）細胞に、50g/Lグルコース、10mM L-アラニル-L-グルタミン、250g/L酵母エキスおよび1.8g/L酪酸ナトリウムを含有するかその前後の濃度の各成分を含有する第3フィード培地を供給するステップ、ここで、該フィード培地は細胞培養体積の4％または約4％の体積で培養物に加えられ、
温度は36℃に下げられる；
e）細胞に、33g/Lグルコース、6.7mM L-アラニル-L-グルタミン、250g/L酵母エキスおよび0.92g/L酪酸ナトリウムを含有するかその前後の濃度の各成分を含有する第4フィード培地を供給するステップ、ここで、該フィード培地は細胞培養体積の4％または約4％の体積で培養物に加えられ、
温度は35.5℃に下げられる；
f）生存度が低下して少なくともまたは約50％を下回るまで細胞を培養し続けるステップ；
g）収集細胞培養液を得るステップ；
h）収集細胞培養液を濾過するステップ；および
i）ビーズ状架橋アガロースカラムクロマトグラフィー、ビーズ状架橋フェニル置換アガロースカラムクロマトグラフィー、アミノフェニルボロネートカラムクロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを使ってrHuPH20を収集培養液から精製するステップ
を含む、可溶性rHuPH20を生産するための方法。
【請求項１２】
100Lの細胞培養物につき、少なくともまたは約0.5、1、5、10、15、20、25、30、35または40グラムの可溶性rHuPH20が生産される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
可溶性rHuPH20の比活性が、少なくともまたは約80000、100000、120000、140000、160000または180,000単位/mgである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
バイオリアクター中の細胞培養物の体積が200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000もしくは3500リットルまたはその前後である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
可溶性rHuPH20をコードする細胞がDG44 CHO細胞である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
rHuPH20が配列番号47に記載の核酸によってコードされる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
5000単位/mLより高い酵素活性を持つ可溶性rHuPH20を含む細胞培養培地。
【請求項１８】
酵素活性が10,000、12,000、14,000、16,000、18,000、20,000、22,000もしくは24,000単位/mLまたはその前後である、請求項17に記載の細胞培養培地。
【請求項１９】
5000単位/mLより高い酵素活性を持つ可溶性rHuPH20を含む、収集細胞培養液。
【請求項２０】
酵素活性が10,000、12,000、14,000、16,000、18,000、20,000、22,000もしくは24,000単位/mLまたはその前後である、請求項19に記載の収集細胞培養液。