【手続補正書】
【提出日】平成23年1月28日(2011.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの異なるホモ二量体LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ単量体(親の単量体)に由来する第１単量体及び第２単量体からなり、それぞれの親のホモ二量体LAGLIDADGエンドヌクレアーゼの２つの単量体間の分子間相互作用を形成する、前記親の単量体の興味対象の対応する残基の少なくとも１対の変異を有する偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼであって、前記対の第１変異が第１単量体内にあり、前記対の第２変異が第２単量体内にあり、前記変異の対が、それぞれの親のホモ二量体エンドヌクレアーゼにより切断されるDNA標的の１つの異なる半分を含む非パリンドロームハイブリッドDNA標的を切断できる機能的ヘテロ二量体の形成を妨げることなく、各単量体からの機能的ホモ二量体の形成を損なう、偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項２】
前記単量体が、第１単量体及び第２単量体のそれぞれについて、以下の変異の対：
ａ)97位のロイシンの芳香族アミノ酸での置換、及び54位のフェニルアラニンの小さいアミノ酸での置換、
ｂ)137位のアスパラギン酸の塩基性アミノ酸での置換、及び51位のアルギニンの酸性アミノ酸での置換、
ｃ)８位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸での置換、及び７位のリジンの酸性アミノ酸での置換、並びに
ｄ)61位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸での置換、及び96位のリジンの酸性アミノ酸での置換、
(これらの位置は、I-CreIアミノ酸配列である配列番号１を参照にして示す)
の少なくとも１つを有する請求項１に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項３】
ａ)で定義される97位のロイシンの芳香族アミノ酸での置換を有する単量体が、54位のフェニルアラニンのトリプトファンでの置換をさらに含む請求項２に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項４】
ａ)で定義される54位のフェニルアラニンの小さいアミノ酸での置換を有する単量体が、58位のロイシン又は57位のリジンのメチオニンでの置換をさらに含む請求項２に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項５】
ｃ)又はｄ)で定義される８位又は61位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸での置換を有する単量体が、７位及び96位のリジン残基の少なくとも一方のアルギニンでの置換をさらに含む請求項２に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項６】
前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸である請求項２又は５に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項７】
前記塩基性アミノ酸が、アルギニンである請求項２、５又は６に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項８】
前記芳香族アミノ酸が、フェニルアラニンである請求項２〜４のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項９】
前記小さいアミノ酸が、グリシンである請求項２〜４及び８のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項１０】
変異D137Rを少なくとも有する第１単量体と、変異R51Dを少なくとも有する第２単量体とからなる請求項１〜９のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項１１】
請求項２のａ)、ｂ)、ｃ)又はｄ)で定義される変異の少なくとも２対を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項１２】
一方の単量体が、７位及び96位のリジン残基の酸性アミノ酸での置換を含み、他方の単量体が、８位及び61位のグルタミン酸残基の塩基性アミノ酸での置換を含む、請求項１１に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項１３】
請求項２のａ)、ｃ)及びｄ)で定義される３対の変異を含む請求項１１又は１２に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項１４】
K7R、E8R、E61R、K96R及びL97F又はK7R、E8R、F54W、E61R、K96R及びL97Fの変異を少なくとも有する第１単量体と、K7E、F54G、L58M及びK96E又はK7E、F54G、K57M及びK96Eの変異を少なくとも有する第２単量体とからなる請求項１３に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項１５】
I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる変異をさらに含む２つのI-CreI単量体変異型からなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項１６】
それぞれの親のホモ二量体エンドヌクレアーゼにより切断されるDNA標的の１つの異なる半分に相当する興味対象のゲノム配列からの非パリンドロームハイブリッドDNA標的を切断できる請求項１５に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ。
【請求項１７】
ペプチドリンカーで連結された、請求項１〜１６のいずれか１項で定義される偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼの第１単量体と第２単量体とを含む単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼの単量体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単量体又は請求項１７に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドフラグメントの少なくとも１つを含む組換えベクター。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼの２つの単量体の１つずつをそれぞれがコードする２つのポリヌクレオチドフラグメントを含み、前記フラグメントが、前記２つの単量体の生成を可能にする調節配列に機能的に連結されている発現ベクター。
【請求項２２】
請求項１７に記載の単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含み、前記フラグメントが、前記単鎖メガヌクレアーゼの生成を可能にする調節配列に機能的に連結されている発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１又は１６で定義されるハイブリッドDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を有する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む、請求項２１又は２２に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ターゲティングDNA構築物が、ａ)請求項１又は１６で定義されるハイブリッドDNA標的を取り囲む領域と相同性を有する配列と、ｂ)ａ)の配列と接する、導入される配列とを含む請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項１９又は２１で定義される１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメント、或いは請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１９又は２１で定義される１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２７】
請求項１９又は２１で定義される１つ又は２つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
【請求項２８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ、請求項１７に記載の１つの単鎖メガヌクレアーゼ、請求項１９若しくは２１で定義される１つ若しくは２つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の１つのベクター、請求項２５に記載の１つの宿主細胞、請求項２７に記載の１つのトランスジェニック植物、請求項２６に記載の１つの非ヒトトランスジェニック動物の、分子生物学のため、インビボ若しくはインビトロ遺伝子工学のため、及びインビボ若しくはインビトロゲノム工学のための使用。
【請求項２９】
前記偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼにより切断されるハイブリッドDNA標的配列を含む興味対象部位において２本鎖核酸破断を誘導することにより、DNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘導するための請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記２本鎖核酸破断が、特定の配列を修復するため、特定の配列を改変するため、変異された遺伝子の代わりに機能的遺伝子を回復させるため、興味対象の内因性遺伝子を減弱又は活性化させるため、興味対象部位に変異を導入するため、外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するため、内因性遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は検出するため、染色体腕を転座させるため、又はDNAを修復されないままにして分解させるためである請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記偏性へテロ二量体メガヌクレアーゼ、単鎖メガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック動物が、請求項２３又は２４で定義されるターゲティングDNA構築物と会合している請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
請求項１又は１６で定義されるハイブリッドDNA標的を含むベクター上に位置する興味対象部位中で、該ベクターを請求項１〜１６のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ又は請求項１７に記載の単鎖メガヌクレアーゼと接触させることにより２本鎖核酸を破断させ、そのことにより、前記偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼの切断部位を取り囲む配列と相同性を示す別のベクターとの相同組換えを誘導する工程を含む、遺伝子工学の方法。
【請求項３３】
１)請求項１又は１６で定義されるハイブリッドDNA標的を含むゲノム遺伝子座の２本鎖を、該DNA標的を請求項１〜１６のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ又は請求項１７に記載の単鎖メガヌクレアーゼと接触させることにより破断させ、２)前記破断されたゲノム遺伝子座を、標的にされた遺伝子座との相同性を有する配列で挟まれた前記遺伝子座に導入される配列を含むターゲティングDNA構築物との相同的組換えに適する条件下に維持する工程を含むゲノム工学の方法。
【請求項３４】
１)請求項１又は１６で定義される少なくとも１つのハイブリッドDNA標的を含むゲノム遺伝子座の２本鎖を、該標的を請求項１〜１６のいずれか１項に記載の偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ又は請求項１７に記載の単鎖メガヌクレアーゼと接触させることにより破断させ、２)前記破断されたゲノム遺伝子座を、標的にされた遺伝子座を取り囲む領域と相同性を有する染色体DNAとの相同組換えに適する条件下に維持する工程を含むゲノム工学の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ、請求項１７に記載の１つの単鎖メガヌクレアーゼ、請求項１９若しくは２１で定義される１つ若しくは２つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のベクターを含む組成物。
【請求項３６】
標的にされた遺伝子座との相同性を有する配列で挟まれた興味対象部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含む請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ、請求項１７に記載の１つの単鎖メガヌクレアーゼ、請求項１９若しくは２１で定義される１つ若しくは２つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のベクターの、必要とする個体に任意の手段により投与される前記個体における遺伝病を予防、改善又は治癒するための医薬品を製造するための使用。
【請求項３８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ、請求項１７に記載の１つの単鎖メガヌクレアーゼ、請求項１９若しくは２１で定義される１つ若しくは２つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のベクターの、必要とする個体に任意の手段により投与される前記個体におけるDNA媒介物を示す感染性因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
【請求項３９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ、請求項１７に記載の１つの単鎖メガヌクレアーゼ、請求項１９若しくは２１で定義される１つ若しくは２つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のベクターの、インビトロでの、生物由来生成物、又は生物学的使用を意図する生成物における、DNA媒介物を示す感染性因子の増殖を阻害し、不活性化し、又は欠失させるため、或いは物体を消毒するための使用。
【請求項４０】
前記感染性因子がウイルスである請求項３８又は３９に記載の使用。