【手続補正書】
【提出日】平成23年6月9日(2011.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アプタマーを同定するための方法であって：
（ａ）核酸の候補混合物を調製し；
（ｂ）ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し；
（ｃ）核酸−ターゲット分子複合体を、遅いオフ速度の濃縮プロセスに曝露し；
（ｄ）候補混合物から核酸−ターゲット分子複合体を分配し；
（ｅ）核酸−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合（ｆｒｅｅ）核酸を生成し；
（ｆ）未結合核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な配列が濃縮された核酸混合物を得て、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定可能であり；
（ｇ）必要に応じて（ｂ）〜（ｆ）を反復し；そして
（ｈ）ターゲット分子に対する少なくとも１つのアプタマーを同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈する、及び／又は核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物に、少なくとも１つの競合剤を添加することを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記の少なくとも１つの競合剤分子が、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロホスフェートからなる群より独立に選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
前記ポリアニオンが、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、硫酸デキストラン、およびポリデキストランからなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが：
ａ．（ｉ）核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物が平衡結合を達成することを可能にし；（ｉｉ）（ｉ）の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈し；そして（ｉｉｉ）（ｉｉ）の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物をインキュベーションする；
ｂ．（ｉ）核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物が平衡結合を達成することを可能にし；（ｉｉ）（ｉ）の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を、少なくとも１つの競合剤分子と混合し；（ｉｉｉ）（ｉｉ）の後、競合剤および核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物をインキュベーションする；あるいは
ｃ．（ｉ）核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物が平衡結合を達成することを可能にし；（ｉｉ）（ｉ）の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を、少なくとも１つの競合剤分子と混合し；（ｉｉｉ）（ｉ）の後、核酸−ターゲット分子複合体を含有する候補混合物を希釈し；そして（ｉｖ）競合剤および核酸−ターゲット分子複合体を含有する希釈された候補混合物をインキュベーションする、
工程のいずれかを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
前記候補混合物が一本鎖核酸または二本鎖核酸である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記候補混合物がＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
前記候補混合物が少なくとも１つの化学的に修飾された核酸を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
前記の化学的に修飾された核酸が、
ａ．リボース位、デオキシリボース位、リン酸位、および塩基位からなる群より独立に選択される１以上の位で化学的置換を含む；または
ｂ．２’位糖修飾、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、５位ピリミジン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、５−ブロモウラシルの置換、５−ブロモデオキシウリジンの置換、５−ブロモデオキシシチジンの置換、主鎖修飾、メチル化、３’キャップ、および５’キャップからなる群より独立に選択される；または
ｃ．５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［２−（１Ｈ−インドール−３イル）エチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンからなる群より独立に選択される、
請求項８の方法。
【請求項１０】
前記ターゲット分子が、タンパク質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、ペプチド、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、増殖因子、組織、および規制物質からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
そのターゲット分子からの解離速度が遅いアプタマーを同定するかまたは産生するための方法であって：
（ａ）核酸の候補混合物を調製し；
（ｂ）ターゲット分子と候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物中、他の核酸に比較してターゲット分子に対して増加したアフィニティを有する核酸がターゲット分子に結合し、核酸−ターゲット分子複合体を形成し；
（ｃ）候補混合物およびターゲット分子を、平衡結合を達成するのに十分な期間、一緒にインキュベーションし；
（ｄ）少なくとも１つの競合剤分子を（ｃ）の混合物に過剰に添加し；
（ｅ）（ｄ）由来の候補混合物、ターゲット分子／アプタマー複合体および競合剤分子の混合物を、あらかじめ決定された期間、インキュベーションし；
（ｆ）候補混合物から核酸−ターゲット分子複合体を分配し；
（ｇ）核酸−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合核酸を生成し；
（ｈ）未結合核酸を増幅して、増加したアフィニティでターゲット分子に結合可能な核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る
工程を含み、それによってターゲット分子に対するアプタマーを同定可能である、前記方法。
【請求項１２】
（ｉ）必要に応じて工程（ｂ）〜（ｈ）を反復し；そして
（ｈ）ターゲット分子に対する少なくとも１つのアプタマーを同定する、ここで、アプタマーはそのターゲット分子からの比較的遅い解離速度を有する
工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
（ｅ）における、あらかじめ決定された期間が：
（ｉ）少なくとも１０分間、
（ｉｉ）少なくとも２０分間、
（ｉｉｉ）少なくとも３０分間、
（ｉｖ）少なくとも４５分間、
（ｖ）少なくとも１時間、
（ｖｉ）少なくとも２時間、
（ｖｉｉ）少なくとも３時間、
（ｖｉｉｉ）少なくとも４時間、
（ｉｘ）少なくとも５時間、
（ｘ）少なくとも６時間
より選択される、請求項１１または１２の方法。
【請求項１４】
ａ．（ｇ）の未結合核酸または（ｈ）の混合物由来の核酸を配列決定し、それによって前記ターゲットのアプタマーを同定する工程；または
ｂ．こうして同定されたアプタマーに基づいて、アプタマーを調製する工程；
をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つまたは各々の核酸において、１つ、いくつかまたはすべてのピリミジンが、５位で化学的に修飾されている、修飾された核酸を候補混合物が含む、請求項の１〜１４のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
候補混合物の核酸中のすべてのＴ残基及び／又はすべてのＵ残基及び／又はすべてのＣ残基が、５位で化学的に修飾されている、請求項１５の方法。
【請求項１７】
ａ．５位化学的修飾が：
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［２−（１Ｈ−インドール−３イル）エチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンより選択される；または
ｂ．図１４に示される化学的修飾の群より独立に選択される、
請求項１６の方法。
【請求項１８】
同定されるかまたは産生されるアプタマー（単数または複数）の解離速度（ｔ１／２）が：
（ｉ）３０分間以上；
（ｉｉ）約３０分間〜約２４０分間；
（ｉｉｉ）３０分間〜６０分間
（ｉｖ）６０分間〜９０分間
（ｖ）９０分間〜１２０分間
（ｖｉ）１２０分間〜１５０分間
（ｖｉｉ）１５０分間〜１８０分間
（ｖｉｉｉ）１８０分間〜２１０分間
（ｉｘ）２１０分間〜２４０分間の間
より選択される、請求項の１〜１７のいずれか一項の方法。