【手続補正書】
【提出日】平成23年4月19日(2011.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明の他の特色および長所は、その好ましい態様の以下の説明および特許請求の範囲から明らかであろう。本明細書において引用される全ての参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。
[請求項1001]
足場組成物、動員組成物、および展開組成物を含む装置であって、該展開組成物が感染症模倣免疫モジュレーターを含む、装置。
[請求項1002]
感染症模倣免疫モジュレーターが核酸を含む、請求項1001記載の装置。
[請求項1003]
核酸がシトシン-グアノシンオリゴヌクレオチド（CpG-ODN）を含む、請求項1002記載の装置。
[請求項1004]
感染症模倣免疫モジュレーターがPEI-CpG-ODN配列を含む、請求項1001記載の装置。
[請求項1005]
腫瘍抗原をさらに含む、請求項1001記載の装置。
[請求項1006]
免疫原性因子をさらに含む、請求項1001記載の装置。
[請求項1007]
免疫原性因子が、toll様受容体リガンド、CpG-ODN配列またはその誘導体、腫瘍抗原、増殖因子、熱ショックタンパク質、細胞死産物、およびサイトカインからなる群より選択される、請求項1006記載の装置。
[請求項1008]
動員組成物が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を含む、請求項1001記載の装置。
[請求項1009]
動員組成物が、封入されたGM-CSFを含む、請求項1001記載の装置。
[請求項1010]
足場組成物を提供する段階、動員組成物および展開組成物を該足場組成物の中に組み入れるかまたは該足場組成物の上にコーティングする段階を含む、足場を作出する方法であって、該展開組成物が感染症模倣免疫モジュレーターを含む、方法。
[請求項1011]
組み入れるかまたはコーティングする段階を繰り返して複数の層を作製する、請求項1010記載の方法。
[請求項1012]
免疫原性因子を足場組成物の中に組み入れるかまたは足場組成物の上にコーティングする段階をさらに含む、請求項1010記載の方法。
[請求項1013]
足場組成物と、該足場組成物の中に組み入れられているかまたは該足場組成物の上にコンジュゲートされている生物活性組成物とを含む装置を、被験体に投与する段階を含む、インサイチューで持続的に樹状細胞をプログラムする方法であって、該足場組成物が、樹状細胞を誘引して該樹状細胞に免疫原性因子を導入し、それによって該樹状細胞を活性化し、かつ該足場組成物から離れて遊走するように該樹状細胞を誘導する、方法。
[請求項1014]
足場組成物と、該足場組成物の中に組み入れられているかまたは該足場組成物の上にコンジュゲートされている生物活性組成物とを含む装置を、被験体に投与する段階を含む、ワクチンの効力を増加させる方法であって、該足場組成物が、樹状細胞を誘引して該樹状細胞に免疫原性因子を導入し、それによって該樹状細胞を活性化し、かつ該足場組成物から離れて遊走するように該樹状細胞を誘導し、それによってワクチン接種手法の有効性を増加させる、方法。
[請求項1016]
足場組成物と、該足場組成物の中に組み入れられているかまたは該足場組成物の上にコンジュゲートされている生物活性組成物とを含む装置を、被験体に投与する段階を含む、癌に対するワクチン接種を被験体に行う方法であって、該足場組成物が、樹状細胞を誘引して該樹状細胞に免疫原性因子および腫瘍抗原を導入し、それによって該樹状細胞を活性化し、かつ該足場組成物から離れて遊走するように該樹状細胞を誘導し、それによって該被験体に抗腫瘍免疫を付与する、方法。
[請求項1017]
装置が、腫瘍部位にまたは腫瘍部位の近傍に局所投与される、請求項1016記載の方法。
[請求項1018]
樹状細胞が形質細胞様樹状細胞を含む、請求項1016記載の方法。
[請求項1019]
足場組成物と、封入された動員組成物とを含む装置を、被験体に導入する段階を含む、インサイチューで樹状細胞をプログラムする方法であって、該動員組成物のパルスが前記導入段階から1〜7日以内に該装置から放出されて、残余量の該動員組成物が残り、続いて数週間にわたる残余量の緩徐な放出があり、それによって樹状細胞の動員、保持、およびその後の該装置からの放出を媒介する、方法。
[請求項1020]
動員組成物がGM-CSFを含む、請求項1019記載の方法。
[請求項1021]
パルスが、装置と会合した動員組成物の量の少なくとも50％を含む、請求項1019記載の方法。
[請求項1022]
パルスが、装置と会合した動員組成物の量の少なくとも60％を導入段階後1〜5日で放出することを含み、かつ残余量が、該パルスの後、数週間にわたって放出される、請求項1019記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
アルジネートは、分子量、分解速度、および足場形成法を制御することによって、特定の応用のために処方される可能性がある用途の広い多糖に基づくポリマーである。カップリング反応を用いて細胞接着配列RGDなどの生物活性エピトープをポリマー骨格に共有結合的に付着させることができる。アルジネートポリマーは、多様な足場タイプに形成される。注射可能なハイドロゲルは、カルシウムイオンなどの架橋剤を付加することによって低分子量アルジネート溶液から形成されうるが、マクロ孔の足場は、高分子量のアルジネートディスクの凍結乾燥によって形成される。足場処方の差は、足場分解の動態を制御する。アルジネート足場からのモルフォゲンまたは他の生物活性物質の放出速度は、空間的および時間的に制御された様式でモルフォゲンを提示するように足場処方によって制御される。この制御された放出は、全身の副作用を消失させて、多数回注射の必要性をなくすのみならず、埋め込み部位での宿主細胞および足場に播種された移植細胞を活性化する微小環境を作製するために用いることができる。
部分的に酸化されたアルジネート
2011511834.tif 000001
RGD改変アルジネート
（SEQ ID NO:12として開示される「GGGGRGDSP」）
2011511834.tif 000002
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
インビトロDC遊走アッセイおよびDC活性化
DC株、JAWSII（ATCC, Manassas, VA）をインビトロ実験のために用いて、20％FBS（Invitrogen, Carlsbad, CA）および5 ng/ml GM-CSFを添加したα-MEM（Invitrogen, Carlsbad, CA）において維持した。DC活性化に及ぼすCpGに富むオリゴヌクレオチド（CpG-ODN）のインビトロ効果を決定するために、JAWSII細胞を5μg/ml CpG-ODN 1826、5'-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3'（SEQ ID NO:10）（Invivogen, San Diego, CA）と共に24時間培養して、0、50、または500 ng/ml GM-CSFの存在下で12時間培養した。DC活性化に及ぼす縮合CpG-ODNの効果を査定するために、混合物をボルテックスミキサーによって撹拌しながらODN-1826溶液をPEI溶液中に滴下することによってCpG-ODNをPEI分子と縮合した（Huang YC, Riddle F, Rice KG, and Mooney DJ. Hum Gene Ther. 5, 609-17. (2005）；参照により本明細書に組み入れられる）。PEIとCpG-ODN（NH3+：PO4-）との電荷比を縮合の際に7で一定に維持した。DC活性化に関する陽性対照として、DCをまた、刺激因子、TNF-α（10 ng/ml）（Peprotech, Rocky Hill, NJ）、およびLPS（10 ng/ml）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と共に培養した。次にDCを採収して一次抗体（BD Pharmingen, San Diego, CA）：PE結合CD86（B7、共刺激分子）、FITC結合CCR7、およびFITC結合MHCIIによって染色した。細胞をFACSによって分析して、アイソタイプ対照を用いて陽性FITCおよびPEに従ってゲートを設定し、各表面抗原に関して染色陽性の細胞のパーセンテージを記録した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
インビボDC遊走および活性化アッセイ
ブランク足場およびPEI-ODN対照（5'- tcc atg agc ttc ctg agc tt -3'（SEQ ID NO:13））10μgまたはPEI-CpG-ODN縮合体10μgを負荷した足場の存在下または非存在下でGM-CSFを含有する足場を、7〜9週齢の雄性C57BL/6Jマウスの背部の皮下嚢に埋め込んだ。組織学的検査のために、足場を切除して、Z-固定液において固定して、パラフィンに包埋して、ヘマトキシリンおよびエオジンによって染色した。DC動員を分析するために、足場を切除して、コラゲナーゼ溶液（Worthingtion, 250 U/ml）を用いて37℃で45分間撹拌して内植組織を単細胞浮遊液に消化した。細胞浮遊液を40μmセルストレーナーの中に注いで、足場の粒子から細胞を単離して、細胞を沈降させて冷PBSによって洗浄した後、Z2コールターカウンター（Beckman Coulter）を用いて計数した。得られた細胞集団を、フローサイトメトリーによって分析するために蛍光マーカーに結合させた一次抗体（BD Pharmingen, San Diego, CA）によって染色した。APC結合CD11c（樹状細胞マーカー）およびPE結合CD86（B7、共刺激分子）染色をDC動員分析のために行い、APC結合CD11c、FITC結合CCR7、およびPE結合MHCII染色をDCプログラミング分析のために行った。細胞を、アイソタイプ対照を用いて陽性FITC、APC、およびPEに従ってゲートを設定して、各表面抗原に関して染色陽性の細胞のパーセンテージを記録した。足場から鼠径リンパ節に向かうインビボDC遊出を追跡するために、凍結乾燥フルオレセインイソチオシアネート（FITC）（Molecular Probes, Carlsbad, CA）250μgを、足場の処理の前にPLGミクロスフェアと混合することによって足場に組み入れ、3％FITC溶液330μlと共に足場を30分間インキュベートすることによってFITCを適用した。FITC着色足場をC57BL/6Jマウスの左脇腹皮下に埋め込んで、鼠径リンパ節（LN）を、足場埋め込み後の様々な時点で採収した。LNからの細胞浮遊液をコラゲナーゼにおける30分間の消化、および70μmセルストレーナーを通して組織を押しつけることによって調製し、フローサイトメトリーによってCD11c(+)FITC(+)細胞数に関して検査した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
マトリクスは以下のように作出された。D,L-ラクチドおよびグリコリドの85：15、120 kDのコポリマー（PLG）（Alkermes, Cambridge, MA）を気体発泡プロセスにおいて利用してマクロ孔性のPLGマトリクスを形成した（Harris, L.D., Kim, B.S., and Mooney, D.J. Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming. J. Biomed.Mater. Res. 42,396-402(1998)）。GM-CSFは、高圧CO2発泡プロセスを用いてPLG足場に封入された（54％効率）。GM-CSFを封入するPLGミクロスフェアは、標準的なダブルエマルションを用いて作出された（Cohen S., Yoshioka T., Lucarelli, M., Hwang L.H., and Langer R. Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid) microspheres. Pharm. Res. 8,713-720 (1991)）。腫瘍溶解物を組み入れるために、C57BL/6Jマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor Maine）の背部皮下で成長させたB16-F10腫瘍の生検を、コラゲナーゼ（250 U/ml）（Worthington, Lakewood, NJ）において消化して、液体窒素での急速凍結および融解（37℃）4サイクルに供した後、400 rpmで10分間遠心した。腫瘍溶解物を含有する上清を収集してPLGミクロスフェアと共に凍結乾燥して、得られた混合物を用いてPLG足場に基づく癌ワクチンを作出した。CpG-ODNをPLG足場に組み入れるために、CpG-ODN 1826、5'-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3'（SEQ ID NO:10）（Invivogen, San Diego, CA）を最初に、混合物をボルテックスミキサーによって撹拌しながらODN-1826溶液をPEI溶液に滴下することによって、ポリ(エチレンイミン)（PEI、分子量〜25,000 g mol-1、Sigma Aldrich）分子と縮合させた。PEIとCpG-ODN（NH3+：PO4-）の電荷比を、縮合のあいだ7で一定に維持した。PEI-CpG-ODN縮合体溶液を50％（重量／体積）ショ糖溶液60μlと共にボルテックスミキサーによって撹拌して凍結乾燥し、乾燥ショ糖と混合して最終重量を150 mgとした。ショ糖含有縮合体をブランク、GM-CSFおよび／または腫瘍溶解物を負荷したPLGミクロスフェアと混合してPLG癌ワクチンを作出した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011511834000001.app