【手続補正書】
【提出日】平成23年1月18日(2011.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系細胞調製物の状態を評価する方法であって、前記調製物中の伸長グリカン構造、または、少なくとも２つの、グリカン構造の群の存在を検出するステップを含み、前記グリカン構造またはグリカン構造の群は、式Ｔ１
2010516241.tif 000001
であり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ６はＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基シアル酸、好ましくはＮｅｕ５Ａｃα２またはＮｅｕ５Ｇｃα２、最も好ましくはＮｅｕ５Ａｃα２であり；
Ｒ３はＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基Ｆｕｃα１（Ｌ−フコース）またはＮ−アセチル（Ｎ−アセトアミド、ＮＣＯＣＨ３）であり；
Ｒ４はＨ、ＯＨまたはグリコシド結合した単糖残基Ｆｕｃα１（Ｌ−フコース）であり、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ４がＨではない場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ７はＮ−アセチルまたはＯＨであり；
Ｘは前記細胞由来の天然オリゴ糖主鎖構造、好ましくはＮ−グリカン、Ｏ−グリカンもしくは糖脂質構造であり、またはｎが０である場合、Ｘは無であり；
Ｙはリンカ基、好ましくはＯ−グリカンおよびＯ−結合末端オリゴ糖および糖脂質のための酸素、ならびにＮ−グリカンのためのＮ、またはｎが０である場合、無であり；
Ｚは担体構造、好ましくは細胞により産生された天然担体であり、例えばタンパク質または脂質であって、好ましくは担体上のセラミドもしくは分岐グリカンコア構造、またはＨであり；
アーチはガラクトピラノシルからの結合が左側の残基の３位または４位いずれかに対するものであること、およびＲ４構造が他の４または３位にあることを表し；
ｎは０または１の整数であり、ｍは１ないし１０００、好ましくは１ないし１００、および最も好ましくは１ないし１０の整数（担体上のグリカンの数）であり、
ただし、
Ｒ２およびＲ３のうち１つはＯＨまたはＲ３はＮ−アセチルであり、
左側の第１の残基が右側の残基の４位に結合する場合、Ｒ６はＯＨであり、
かつ、
前記グリカン構造は伸長構造であって、前記結合剤は前記構造およびさらに少なくとも１つの還元末端伸長エピトープに結合し、これはＸを置換する、またはＸの一部の、単糖エピトープであり、前記単糖エピトープは、式Ｅ１：
ＡｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎであり、Ａはアノマー構造アルファまたはベータであり、ｘは結合位置２、３または６であり；およびＨｅｘはヘキソピラノシル残基Ｇａｌ、またはＭａｎであり、ｎは０または１の整数であり、
ｎが１である場合、ＡｘＨｅｘＮＡｃはβ４ＧａｌＮＡｃまたはβ６ＧａｌＮＡｃであり、
ただし、
ＨｅｘがＭａｎである場合、ＡｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、
ＨｅｘがＧａｌである場合、ＡｘＨｅｘはβ３Ｇａｌまたはβ６Ｇａｌまたはα３Ｇａｌまたはα４Ｇａｌであり、
または、
前記伸長構造は式ＭＵＣ、（Ｒ）ｎＧａｌＮＡｃα（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）ｍであり、独立に、ｎは０または１、ｍは１、ＲはＳＡα６またはＧａｌβ３であり、ＳＡはシアル酸であり、ＲがＧａｌβ３である場合、ｎは１であり、または、前記伸長構造はＧａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒであり、ならびに、前記グリカン構造は幹細胞集団関連構造であり、任意に前記細胞調製物が混入構造に関して評価されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記グリカン構造が、
Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ、Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ／α、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ、ＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ、ＳＡα３Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ／α、ＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ、ＳＡα６Ｇａｌβ４Ｇｌｃ、ＳＡα６Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ、ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＳＡα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ、Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓ  ａ）、ＳＡα３Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ（シアリル−Ｌｅｗｉｓ  ａ）、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ（Ｈ−１型）、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓ  ｂ）、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（２型ラクトサミン基盤）、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓ  ｘ）、ＳＡα３Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃ（シアリル−Ｌｅｗｉｓ  ｘ）、  Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（Ｈ−２型）およびＦｕｃα２Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅｗｉｓ  ｙ）
からなる群より選択され、
式Ｅ１：
ＡｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｎの伸長構造に結合し、Ａはアノマー構造アルファまたはベータであり、ｘは結合位置２、３、または６であり、Ｈｅｘはヘキソピラノシル残基Ｇａｌ、またはＭａｎであり、およびｎは０または１の整数であり、
ただし、
ｎが１である場合、ＡｘＨｅｘＮＡｃはβ６ＧａｌＮａｃであり、
ＨｅｘがＭａｎである場合、ＡｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、
ＨｅｘがＧａｌである場合、ＡｘＨｅｘはβ３Ｇａｌまたはβ６Ｇａｌであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記結合物質が式Ｔ８Ｅベータ
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−３／４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｐ
の構造を認識し、
ｘは結合位置２、３、または６であり、
ｍ、ｎおよびｐは独立に０または１の整数であり、
ＭおよびＮは単糖残基であって
ｉ）独立に無（その位置における遊離水酸基）
および／または
ｉｉ）Ｇａｌの３位または／およびＧｌｃＮＡｃの６位に結合するシアル酸であるＳＡ
および／または
ｉｉｉ）ＧａｌがＧｌｃＮＡｃの他の位置（４または３）に結合する場合に、Ｇａｌの２位および／またはＧｌｃＮＡｃの３もしくは４位に結合するＦｕｃ（Ｌ−フコース）残基であり、
ただし、ｍ、ｎおよびｐは独立に０または１であり、
Ｈｅｘはヘキソピラノシル残基ＧａｌまたはＭａｎであり、
ただし、
ｐが１の場合、βｘＨｅｘＮＡｃはβ６ＧａｌＮＡｃであり、
ｐが０の場合、ＨｅｘはＭａｎであり、かつβｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、またはＨｅｘはＧａｌであり、かつβｘＨｅｘはβ３Ｇａｌもしくはβ６Ｇａｌであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記結合物質が
式Ｔ１０Ｅ
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβｘＨｅｘ（ＮＡｃ）ｐのＩＩ型ラクトサミンを基盤とする構造を認識し、
ただし、
ｐが１である場合、βｘＨｅｘＮＡｃはβ６ＧａｌＮＡｃであり、
ｐが０である場合、ＨｅｘはＭａｎであり、かつβｘＨｅｘはβ２Ｍａｎであり、または、ＨｅｘはＧａｌであり、かつβｘＨｅｘはβ６Ｇａｌであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記結合物質が式Ｔ１０ＥＭａｎ：
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎ
のＩＩ型ラクトサミンを基盤とする構造を認識し、変数は請求項２の式Ｔ８Ｅベータに対して記載されるものと同様であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、前記結合物質が
式Ｔ１０ＥＧａｌ（ＮＡｃ）：
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβ６Ｇａｌ（ＮＡｃ）ｐ
のＩＩ型ラクトサミンを認識し、変数は請求項２の式Ｔ８Ｅベータに対して記載されるものと同様であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記構造が、Ｏ−グリカンコアＩＩシアリル−Ｌｅｗｉｓ  ｘ構造ＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ６（ＲＧａｌβ３）ＧａｌＮＡｃであり、抗体ＣＨＯ１３１により認識されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記抗体が前記間葉系細胞の５０％超で認識されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項３に記載の方法において、前記結合物質が、
式Ｔ９Ｅ
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−３［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ
のＩ型ラクトサミンを基盤とした構造を認識することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、結合試薬の以下の組み合わせの１つが用いられ、前記試薬はＩ型およびＩＩ型アセチルラクトサミンならびにそのフコシル化バリアントもしくは非シアル化フコシル化バリアント；または好ましくはＦｕｃα２−末端および／もしくはＦｕｃα３／４−分岐構造を含むフコシル化Ｉ型およびＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン構造；または好ましくはＦｕｃα２−末端を含むフコシル化Ｉ型およびＩＩ型Ｎ−アセチルラクトサミン構造を認識することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法において、前記結合物質が、
式
［Ｍα］ｍＧａｌβ１−４［Ｎα］ｎＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ
のＩＩ型ラクトサミンを基盤とする構造を認識することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法において、前記伸長オリゴ糖構造が、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、ＳＡα３／６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、ＳＡα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ、ＳＡα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法において、前記検出がモノクローナル抗体、グリコシダーゼ、グリコシル転移酵素、植物レクチン、動物レクチンおよびそれらのペプチド模倣物からなる群より選択される組み替えタンパク質である結合剤により行われることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記結合剤が、生体材料または他の細胞型を含む細胞材料を含む試料からヒト幹細胞を選別または選択するために用いられることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記結合剤が、異なるヒト幹細胞型間の選別または選択のために用いられることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法により得られた細胞集団。
【請求項１７】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法において、前記グリカン構造がＮ−グリカンコア構造を有するＮ−グリカンを含むＮ−グリカンサブグライコーム中に存在し、前記Ｎ−グリカンがＮ−グリコシダーゼにより細胞から遊離できることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法において、前記グリカン構造が、Ｏ−グリカンコア構造を有するＯ−グリカンを含むＯ−グリカンサブグライコーム中に存在し、または前記グリカン構造が、糖脂質コア構造を有する糖脂質を含む糖脂質サブグライコーム中に存在し、前記グリカンがグリコシルセラミダーゼにより遊離できることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の方法において、前記細胞調製物の細胞表面グライコームの存在または非存在が検出されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の方法において、前記細胞調製物が前記細胞調製物の細胞集団内の混入する構造、時間依存的変化または細胞集団の状態の変化に関して、前記細胞調製物内のグリカンの質量分析を用いたグリコシル化分析により、評価／検出されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
幹細胞由来の請求項１に記載のグリカン構造と、当該グリカン構造と結合する結合剤を有する組成物。
【請求項２２】
試料内の幹細胞の濃縮および検出のためのキットであって、請求項１ないし２０のいずれかに記載のグリカン構造を検出するための結合剤を含む少なくとも１つの試薬と、前記試薬を用いて幹細胞の濃縮を行うための説明書とを含み、任意に幹細胞の濃縮を行うための手段を含むことを特徴とするキット。