【手続補正書】
【提出日】平成22年3月2日(2010.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変アミノ−アシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）をコードするポリヌクレオチドを含有する第一ベクターを含む組成物であって、該ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡ分子と対形成するべきアミノ酸との相互作用に必要な該ＡＡＲＳのアミノ酸結合領域をコードする１つ以上のコドンにて突然変異され、そして該改変シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子に非−天然アミノ酸をチャージすることができる、組成物。
【請求項２】
前記結合領域が、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下または５個以下の連続したアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記改変ＡＡＲＳが、改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｒｐＲＳ、改変ＴｙｒＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰｈｅＲＳが、アミノ酸配列位置番号４１２、４１５、４１８および４３７からなる群より選択されるアミノ酸配列位置にて突然変異される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＴｒｐＲＳが、アミノ酸配列位置番号４、５、７、１３２、１３３、１４１および１４３からなる群より選択されるアミノ酸位置にて突然変異される、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＭｅｔＲＳが、アミノ酸配列位置番号１３にて突然変異される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
ｔＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含有する第二ベクターをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記第一ベクターおよび前記第二ベクターが、同じベクターである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第一ベクターおよび前記第二ベクターが、異なるベクターである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｔＲＮＡが、改変される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ｔＲＮＡが、天然ｔＲＮＡの親和性より大きい親和性で、対応するウォブル縮重コドンと塩基対形成する突然変異アンチコドンを含有するように改変される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＡＡＲＳおよび前記ｔＲＮＡが、同じかまたは異なる生物からのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記非−天然アミノ酸が、アジドノルロイシン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−エチニル−１Ｈ−ピロール−３−イル）プロパン酸、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、αアミノカプリル酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−トレオニンおよびＮ−アセチルガラクトサミン−α−セリンからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
改変アミノ−アシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）を含むポリペプチドであって、この場合、該改変ＡＡＲＳは、ｔＲＮＡ分子と対形成するべきアミノ酸との相互作用に必要な該ＡＡＲＳのアミノ酸結合領域内の１つ以上のアミノ酸残基にて突然変異され、そして該改変ＡＡＲＳは、ｔＲＮＡ分子に非−天然アミノ酸をチャージすることができる、ポリペプチド。
【請求項１５】
前記結合領域が、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下または５個以下の連続したアミノ酸残基を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記改変ＡＡＲＳが、改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｒｐＲＳ、改変ＴｙｒＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＰｈｅＲＳが、アミノ酸配列位置番号４１２、４１５、４１８および４３７からなる群より選択されるアミノ酸配列位置にて突然変異される、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＴｒｐＲＳが、アミノ酸配列位置番号４、５、７、１３２、１３３、１４１および１４３からなる群より選択されるアミノ酸位置にて突然変異される、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＭｅｔＲＳが、アミノ酸配列位置番号１３にて突然変異される、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む翻訳系。
【請求項２１】
前記翻訳系が、宿主細胞を含む、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項２２】
前記改変ＡＡＲＳが、前記宿主細胞とは異なる生物に由来する、請求項２１に記載の翻訳系。
【請求項２３】
改変ｔＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項２４】
前記改変ｔＲＮＡ分子が、前記宿主細胞とは異なる生物に由来する、請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２５】
前記改変ｔＲＮＡ分子が、真核細胞に由来し、前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、栄養素要求株である、請求項２１に記載の翻訳系。
【請求項２７】
１種以上の非−天然アミノ酸を含有する培養基をさらに含む、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項２８】
前記１種以上の非−天然アミノ酸が、アジドノルロイシン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−エチニル−１Ｈ−ピロール−３−イル）プロパン酸、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、αアミノカプリル酸、アジドホモアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−トレオニンおよびＮ−アセチルガラクトサミン−α−セリンからなる群より選択される、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項２９】
前記改変ＡＡＲＳが、改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｒｐＲＳ、改変ＴｙｒＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項３０】
標的ポリペプチドの１つ以上の指定位置に非−天然アミノ酸を組み込む方法であって、該方法が、
（１）該ポリペプチドの１つ以上の指定位置での非−天然アミノ酸の組み込みのための該ポリペプチドの構造変化を決定する工程；
（２）請求項１に記載の第一ポリヌクレオチド、またはそれによってコードされている改変ＡＡＲＳを含む翻訳系を提供する工程；
（３）該非−天然アミノ酸を該翻訳系に提供する工程；
（４）目的とするポリペプチドをコードするテンプレートポリヌクレオチドを該翻訳系に提供する工程；および
（５）該テンプレートポリヌクレオチドの翻訳を可能にし、それによって該ポリペプチドの指定位置に該非−天然アミノ酸を組み込む工程；
を含み、
工程（１）〜（４）が、任意の順序で実施される、
方法。
【請求項３１】
前記翻訳系が、細胞を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（３）が、前記非−天然アミノ酸を含有する溶液と前記翻訳系を接触させることによって実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記改変ＡＡＲＳによる前記非−天然アミノ酸の活性化についての特異性定数（Ｋｃａｔ／ＫＭ）が、前記天然アミノ酸についてのものより少なくとも５倍大きい、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記改変ＡＡＲＳが、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％または８％以下の率でｔＲＮＡにミスチャージする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｔＲＮＡが、改変ｔＲＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第一ポリヌクレオチドまたは第二ポリヌクレオチドが、前記ｔＲＮＡまたはＡＡＲＳの発現を制御する、恒常的活性型プロモーター配列または誘導性プロモーター配列のいずれかをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
改変ＡＡＲＳを含有する細胞についてスクリーニングする工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記非−天然アミノ酸の組み込みを検証する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記改変ＡＡＲＳが、ＰｈｅＲＳ、ＴｙｒＲＳ、ＴｒｐＲＳおよびＭｅｔＲＳからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３０に記載の方法によって作製される、ポリペプチド。
【請求項４１】
標的ポリペプチドの１つ以上の指定位置に少なくとも１つの非−天然アミノ酸を組み込むための方法であって、該方法が、少なくとも１つの非−天然アミノ酸を含有する翻訳系を提供する工程；改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｙｒＲＳ、改変ＴｒｐＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される１つ以上の改変ＡＡＲＳを該翻訳系に提供する工程；目的とする標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該翻訳系に提供する工程；および目的とする翻訳を可能にし、それによって該標的ポリペプチドに少なくとも１つの非−天然アミノ酸を組み込む工程を含む、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法によって作製される、ポリペプチド。
【請求項４３】
前記改変ＡＡＲＳが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ｔＲＮＡが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する、請求項７に記載の組成物。
【請求項４５】
前記改変ＡＡＲＳが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記改変ＡＡＲＳが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項４７】
前記改変ｔＲＮＡが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する、請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項４８】
前記宿主細胞が、酵母細胞、真正細菌細胞、真核細胞；真菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞およびシュードモナス属細胞からなる群より選択される、請求項２１に記載の翻訳系。
【請求項４９】
前記改変ＡＡＲＳが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する、請求項３０に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリペプチドがヒト成長ホルモンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が栄養素要求株である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が、酵母細胞、真正細菌細胞、真核細胞；真菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞およびシュードモナス属細胞からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｔＲＮＡが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する、請求項３４に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的ポリペプチドがヒト成長ホルモンである、請求項４１に記載の方法。