(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドプライマーを含んで酵素を含まない第１の試薬液と、酵素を含んでオリゴヌクレオチドプライマーを含まない第２の試薬液と、を用意する調整工程と、
前記調整工程の後に、核酸増幅反応の反応場であるウェルとは異なる固化用容器内で、前記第１の試薬液と前記第２の試薬液とを別個に凍結乾燥する固化工程と、
前記固化工程を経た前記第１の試薬液及び前記第２の試薬液を前記ウェルに配置する収容工程と、を含む、核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【請求項２】
前記収容工程は、複数の前記ウェルの各々に、固化された、２種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む前記第１の試薬液を収容する工程を含む、
請求項１記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法に関する。より詳しくは、核酸増幅反応の反応場となるウェル内に、反応に必要な１種類以上の物質を含む固化された試薬が収容された核酸増幅反応用マイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体産業における微細加工技術を応用し、シリコンやガラス製の基板上に化学的及び生物学的分析を行うためのウェルや流路を設けたマイクロチップが開発されてきている。これらのマイクロチップは、例えば、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサなどに利用され始めている。【０００３】
このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称され、化学的及び生物学的分析の高速化や高効率化、集積化あるいは、分析装置の小型化を可能にする技術として注目されている。μ−ＴＡＳは、少量の試料で分析が可能なことや、マイクロチップのディスポーザブルユーズ（使い捨て）が可能なことから、特に貴重な微量試料や多数の検体を扱う生物学的分析への応用が期待されている。【０００４】
μ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された複数の領域内に物質を導入し、該物質を化学的に検出する光学検出装置がある。このような光学検出装置としては、例えば、マイクロチップ上のウェル内で核酸増幅反応等の複数の物質間の反応を進行させ、生成する物質を光学的に検出する反応装置（例えばリアルタイムＰＣＲ装置）などがある。【０００５】
従来、マイクロチップ型の核酸増幅装置では、核酸増幅反応に必要な試薬及び鋳型ＤＮＡを予め全て混合し、この混合液をマイクロチップに配設された複数のウェル内に導入して反応を行う方法が取られている。しかし、この方法では、ウェル内に混合液が導入されるまでに一定の時間が必要であるため、その間に混合液内で反応が進行し、非特異的な核酸増幅を容易にし、定量性を低下させてしまう問題が生じていた。【０００６】
前述の問題に対し、例えば特許文献１には、ウェルに核酸増幅反応に必要な複数の試薬が所定の順序で積層されて固着化されたマイクロチップが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１６０７２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本技術は、簡便かつ精度の高い分析が可能な核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本技術は、核酸増幅反応に必要な物質のうち、少なくとも一部を含む試薬液を乾燥させる固化工程と、固化された該試薬液を核酸増幅反応の反応場であるウェルに配置する収容工程と、を含む、核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法を提供する。
前記固化工程は、前記試薬液を凍結乾燥する工程を含むことが好ましい。
前記固化工程の前に、組成の異なる複数の前記試薬液を用意する調製工程を含み、該試薬液には、オリゴヌクレオチドプライマーを含んで酵素を含まない第１の試薬液と、酵素含んでオリゴヌクレオチドプライマーを含まない第２の試薬液と、が含まれていても良い。
また、前記固化工程は、前記第１の試薬液と前記第２の試薬液とを別個に凍結乾燥する工程を含んでいても良い。
さらに、前記収容工程は、複数の前記ウェルの各々に、固化された、２種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む前記第１の試薬液を収容する工程を含んでいても良い。
本技術はまた、前記第１の試薬液と前記第２の試薬液のうち、何れか一の試薬液を前記固化工程によって固化し、前記収容工程の前に、前記固化工程に用いていない試薬液を前記ウェルに滴下して、該ウェル内で乾燥させる固着化工程を含む、核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法を提供する。
前記固着化工程は、前記試薬液を真空乾燥する工程を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本技術により、簡便で精度の高い分析を可能とする核酸増幅反応用マイクロチップが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本技術の第一実施形態に係るマイクロチップ１ａの構成を説明するための模式図である。
【図２】マイクロチップ１ａのウェル４３内の構成を説明するための模式図である。
【図３】マイクロチップ１ａの製造方法を説明するためのフローチャートである。
【図４】マイクロチップ１ａの変形実施形態の構成を説明するための模式図である。
【図５】本技術の第二実施形態に係るマイクロチップ１ｂのウェル４３内の構成を説明するための模式図である。
【図６】マイクロチップ１ｂの製造方法を説明するためのフローチャートである。
【図７】本技術の第三実施形態に係るマイクロチップ１ｃのウェル４３内の構成を説明するための模式図である。
【図８】本技術に係るマイクロチップにおける核酸増幅の開始時刻を示す図面代用グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．本技術の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
２．本技術の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
（１）基板層の成形
（２）試薬液の調製
（３）試薬液の固化
（４）試薬の収容
（５）基板層の貼り合わせ
３．第一実施形態の変形実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
４．本技術の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
５．本技術の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
（１）試薬液の固着化
（２）試薬の収容
６．本技術の第三実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
【００１３】
１．本技術の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図１は、本技術の第一実施形態に係るマイクロチップ１ａの構成を説明する模式図である。図１Ａは上面模式図であり、図１Ｂは、図１ＡのＰ−Ｐ断面に対応する断面模式図である。
【００１４】
図中符号１ａで示す核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、「マイクロチップ」とも称する）には、試料溶液が導入される領域として、外部からサンプル等の液体が導入される導入部２と、核酸増幅反応の反応場となるウェル４１〜４５と、導入部２と各ウェルとを接続する流路３１〜３５が設けられている。また、ウェル４１〜４５には、後述するように、核酸増幅反応に必要な物質の少なくとも一部を含む試薬Ｒ１，Ｒ２が収容されている（図１Ｂにおいて、試薬Ｒ１，Ｒ２、不図示）。図１及びその説明においては、流路３１により試料溶液が供給される５つのウェルを全てウェル４１とし、同様に流路３２，３３，３４，３５により試料溶液の供給を受ける各々の５つのウェルを、ウェル４２，４３，４４，４５として説明する。また、試料溶液とは、核酸増幅反応において増幅の対象となる鋳型核酸であるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を含む溶液を指す。
【００１５】
本技術に係るマイクロチップを用いて行う「核酸増幅反応」については、温度サイクルを実施する従来のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法が含まれる。等温増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＳＭＡＰ（SMartAmplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には核酸の増幅を目的とする、変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイムＰＣＲ法などの増幅核酸の定量を伴う反応も包含される。
【００１６】
マイクロチップ１ａは、導入部２、流路３１〜３５及びウェル４１〜４５が形成された基板層１２に基板層１１が貼り合わされ、さらに基板層１１に基板層１３が貼り合わされることにより構成されている（図１Ｂ参照）。マイクロチップ１ａでは、基板層１１と基板層１２との貼り合わせを大気圧に対して負圧下で行った場合、導入部２、流路３１〜３５、ウェル４１〜４５の内部を大気圧に対して負圧（１／１００気圧）となるように気密に封止することができる。マイクロチップ１ａにおいて、試料溶液が導入される領域を大気圧に対し負圧とすることにより、試料溶液の導入時にマイクロチップ内部の陰圧によって試料溶液が吸引され、微細な流路構造が形成されたマイクロチップ１ａの内部への試料溶液の導入が、より短時間で行えるようになる。
【００１７】
基板層１１，１２，１３の材料は、ガラスや各種プラスチック類とできる。好ましくは、基板層１２，１３をガス不透過性を備える材料で構成する。マイクロチップ１ａの外面を構成する基板層１２，１３をＰＣなどのガス不透過性を備える材料とすることで、ウェル４１〜４５内に導入された試料溶液が、核酸増幅反応における加熱によって気化し、基板層１１を透過して消失（液抜け）するのを防止できる。また、マイクロチップ１ａの試料溶液が導入される領域を、大気圧に対し負圧として気密に封止した場合には、マイクロチップ１ａ外からの空気の浸透を防いで内部の負圧を保持するためにも、基板層１２，１３をガス不透過性を備える材料で構成することが好ましい。
【００１８】
ガス不透過性を備える基板層の材料は、ガラス、プラスチック類、金属類及びセラミック類などが採用できる。プラスチック類としては、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタアクリレート：アクリル樹脂）、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＳ（ポリスチレン）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＥ（ポリエチレン）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ジエチレングリコールビスアリルカーボネート、ＳＡＮ樹脂（スチレン−アクリロニトリル共重合体）、ＭＳ樹脂（ＭＭＡ−スチレン共重合体）、ＴＰＸ（ポリ（４−メチルペンテン−１））、ポリオレフィン、ＳｉＭＡ（シロキサニルメタクリレートモノマー）−ＭＭＡ共重合体、ＳｉＭＡ−フッ素含有モノマー共重合体、シリコーンマクロマー（Ａ）−ＨＦＢｕＭＡ（ヘプタフルオロブチルメタクリレート）−ＭＭＡ３元共重合体、ジ置換ポリアセチレン系ポリマー等が挙げられる。金属類としては、アルミニウム、銅、ステンレス（ＳＵＳ）、ケイ素、チタン、タングステン等が挙げられる。セラミック類としては、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、窒化アルミ（ＡｌＮ）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化ジルコニア（ＺｒＯ２）、石英等が挙げられる。
【００１９】
基板層１１は、弾性を有する材料で構成されることが好ましい。マイクロチップ１ａにおいて、導入部２を封止する基板層１１を、弾性を有する材料とすることによって、針などの穿刺部材の一部をマイクロチップ１ａ外部から導入部２に穿通することが可能となる。針を接続したシリンジ等に予め試料溶液を充填しておき、基板層１１をその針で穿通すると、封止されていた導入部２がシリンジ内部とだけ接続されて、気泡を生じることなく試料溶液のマイクロチップ１ａ内への導入が可能となる。
【００２０】
また、試料溶液が導入される領域を、大気圧に対し負圧として気密に封止した場合には、針の先が導入部２に到達した時点で、マイクロチップ１ａ外部と導入部２との圧力差によって、シリンジ内の試料溶液は、導入部２へ自動的に吸引される。
【００２１】
基板層１１を弾性を有する材料により形成しておくことで、試料溶液導入後、針を導入部２から抜いた際、基板層１１の自己封止性により穿刺箇所が自然に封止されるようにできる。本技術においては、基板層の弾性変形による針の穿刺箇所の自然封止を、基板層の「自己封止性」と定義するものである。
【００２２】
弾性を有する基板層の材料としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン系エラストマーの他、アクリル系エラストマー、ウレタン系エラストマー、フッ素系エラストマー、スチレン系エラストマー、エポキシ系エラストマー、天然ゴムなどが挙げられる。
【００２３】
なお、本技術に係るマイクロチップ１ａの各ウェルに保持された物質を、光学的に分析する場合においては、各基板層の材質には、光透過性を有し自家蛍光が少なく波長分散が小さいことで光学誤差の少ない材料を選択することが好ましい。
【００２４】
次に、マイクロチップ１ａのウェルに収容された試薬について説明する。図２では、マイクロチップ１ａの各ウェルを代表して、ウェル４３について模式的に示す。ウェル４３には、固形の試薬Ｒ１，Ｒ２が収容されている。試薬Ｒ１，Ｒ２には、核酸増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質の少なくとも一部が含まれている。具体的には、増幅の対象であるＤＮＡ、ＲＮＡ等の塩基配列の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（以下「プライマー」とも称する」）、核酸モノマー（ｄＮＴＰｓ）、酵素、反応緩衝液に含まれる成分などである。また、核酸増幅反応に直接必要ではないが、増幅した核酸鎖を検出するための蛍光標識等の標識を備えたプローブや、二本鎖の核酸にインターカレートする検出用試薬なども、増幅核酸鎖の検出に必要な物質として、試薬Ｒ１，Ｒ２に含まれる成分とできる。
【００２５】
試薬Ｒ１と試薬Ｒ２に含まれる核酸増幅反応に必要な成分は、各々異なる組成であっても良い。例えば、試薬Ｒ１を、プライマーを含んで酵素を含まない試薬液（第１の試薬液）とし、試薬Ｒ２を、酵素を含んでプライマーを含まない試薬液（第２の試薬液）とすることもできる。このようにプライマーが含まれる試薬Ｒ１に酵素が含まれず、酵素が含まれる試薬Ｒ２にプライマーが含まれないことによって、試料溶液がウェル内に導入されるまでプライマーと酵素が混合されず、プライマーダイマーの発生が抑えられる。試薬Ｒ１を、酵素を含んでプライマーを含まない試薬液（第２の試薬液）とし、試薬Ｒ２を、プライマーを含んで酵素を含まない試薬液（第１の試薬液）としても良く、試薬Ｒ１，Ｒ２の組成は任意とできる。なお、試薬Ｒ１，Ｒ２は、図２に示される形状には限定されず、ウェル４３内に収容可能な体積であれば、いずれの形状であっても良い。また、マイクロチップ１ａに設けられた複数のウェルに同一の組成の試薬Ｒ１，Ｒ２が収容されていても良く、異なる組成の試薬Ｒ１，Ｒ２が各ウェルに収容されていても良い。
【００２６】
２．本技術の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
マイクロチップ１ａの製造方法について、図３に示すフローチャートを参照して説明する。
（１）基板層の成形
図３中、符号Ｓ１は基板層の成形工程である。本工程では、基板層１２に、導入部２、流路３１〜３５、ウェル４１〜４５を成形する。基板層１２への導入部２等の成形は、公知の手法によって行うことができる。例えば、ガラス製基板層のウェットエッチング又はドライエッチングによって、あるいはプラスチック製基板層のナノインプリント、射出成型又は切削加工である。また、導入部２等は、基板層１１に成形されても良く、あるいは基板層１１に一部を、基板層１２に残りの部分を成形させても良い。
【００２７】
（２）試薬液の調製
図３中、符号Ｓ２は試薬液の調製工程である。本工程では、マイクロチップ１ａに収容する試薬Ｒ１，Ｒ２の組成に合わせ、液状又はゲル状の試薬液を調製する。試薬液には、核酸増幅反応に必要な物質のうち少なくとも一部が含まれていれば良く、その組成は任意とできる。例えば、プライマーのみが含まれる試薬Ｒ１と、酵素のみが含まれる試薬Ｒ２を用意しても良い。また、調製する試薬液の種類は２種類には限定されず、一の試薬液に含まれる核酸増幅反応に必要な物質は、１種類であっても、数種類であっても良い。
【００２８】
調製工程で用意される試薬液にプライマーが含まれる場合、プライマーは１種類であっても、複数種類であっても良い。本技術に係るマイクロチップ１ａの製造方法においては、ある塩基配列からなるプライマーに対し、異なる塩基配列を含むプライマーは、別の種類のプライマーと定義する。すなわち、増幅対象である標的核酸鎖について、１本の核酸鎖の塩基配列に対してデザインされたプライマーと、その相補鎖の塩基配列に対してデザインされたプライマーとを合わせた一対のプライマーセットは、２種類のプライマーを含むものと定義する。これらのプライマーの種類についての定義は、後述する第二実施形態及び第三実施形態においても、同様である。
【００２９】
試薬液の組成については、例えば、プライマーを含んで酵素を含まない試薬液と、酵素を含んでプライマーが含まれない試薬液とを調製した場合、核酸増幅反応開始時に導入された試料溶液がウェルに到達するまで、プライマーと酵素が混合されず、プライマーダイマーによる核酸の非特異的な増幅が抑えられ、好適である。またプライマーを含む試薬液には、２種類以上のプライマーが含まれていることが好ましい。
【００３０】
試薬液の調製工程Ｓ２において、試薬液や、そこに加えられるプライマー溶液や酵素溶液は冷温に保持されることが好ましい。試薬液等の冷温での保持は、氷上に試薬液等の入った容器を置いたり、アルミブロック等のチューブを保持する器具を予め冷凍庫などに置き、冷却された状態で使用することによって可能である。
【００３１】
（３）試薬液の固化
図３中、符号Ｓ３ａは試薬液の固化工程である。本工程では、調製工程Ｓ２で用意された複数の試薬液を固化する。すなわち、試薬液を乾燥させ、固相状態の試薬Ｒ１，Ｒ２を作製する工程である。固化工程Ｓ３ａについては、図３に示すように二段階に分け、「試薬液の滴下」の工程Ｓ３ａ−１、「凍結乾燥」の工程Ｓ３ａ−２、の順に説明する。なお、図３は、調製工程Ｓ２で用意された試薬液が２種類の場合のフローチャートである。
【００３２】
[試薬液の滴下の工程Ｓ３ａ−１]
本工程では、前述の、試薬液の調製工程Ｓ２において調製された試薬液を、固化工程Ｓ３ａで使用する固化用容器に滴下する。複数種類の試薬液を調製工程Ｓ２で用意した場合は、試薬液を各々別の固化用容器に滴下し、別個に固化させる。また、マイクロチップ１ａの複数のウェル４１〜４５に、同じ組成の試薬Ｒ１を収容する場合も、ウェルの数に応じた数の固化用容器を用意し、各々の固化用容器に試薬液を滴下する。固化用容器は、いずれの材質であっても良いが、次の凍結乾燥の工程Ｓ３ａ−２で設定する温度や気圧に耐性を有するものが好ましい。
【００３３】
[凍結乾燥の工程Ｓ３ａ−２]
本工程では、前述の、容器に滴下された試薬液を乾燥して固化する。乾燥方法としては、例えば、凍結乾燥が好適である。また、凍結乾燥には、予備凍結、一次乾燥（昇華凍結）、二次乾燥（結合水の除去）の各工程を含むことが好ましい。予備凍結においては、凍結温度は共晶点（試薬液が凍結する温度）以下であれば良いが、酵素の失活の防止や試薬液を完全に凍結させる目的のために−４０℃程度で凍結させることが望ましい。一次乾燥においては、予備凍結工程で凍結させた試薬液を乾燥させる。この時、試薬液を共晶点以下で乾燥させることにより、乾燥途中での溶解が防止され、試薬液に含まれる水分を昇華させることが可能となる。一次乾燥における真空度は、例えば１００Ｐａ以下であることが望ましい。１００Ｐａにおける水の沸点は約−２０℃であるため、上述した試薬液の共晶点に近く、乾燥途中の試薬液の溶解が防止される。一次乾燥の真空度は、調製した試薬液の共晶点に応じて、適切な値を選択すれば良い。二次乾燥では、一次乾燥後の試薬液に含まれる成分に付いている分子状態の水を除去する。試薬液に含まれる成分の失活、変性等が起こらない程度の温度まで加熱し、試薬液の乾燥度を高めても良い。なお、本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法において、固化工程Ｓ３ａの乾燥方法は、凍結乾燥に限定されない。
【００３４】
（４）試薬の収容
図３中、符号Ｓ４は試薬Ｒ１，Ｒ２の収容工程である。本工程では、前述の試薬液の固化工程Ｓ３ａによって固化用容器内に作製された固形状の試薬Ｒ１，Ｒ２を固化用容器から取出し、基板層の成形工程Ｓ１によっていずれかの基板層に形成されたウェルに収容する。基板層１２に設けられた複数のウェルにおいて、試薬Ｒ１，Ｒ２を収容するウェルはいずれであっても良く、一つであっても複数であっても良い。また、一のウェルに収容する試薬Ｒ１，Ｒ２の数や種類は、任意とでき、複数のウェルに、同一の組成から成る試薬Ｒ１，Ｒ２を収容しても良く、異なる組成からなる試薬Ｒ１，Ｒ２を収容しても良い。試薬Ｒ１、又は試薬Ｒ２にプライマーが含まれる場合には、一の試薬に含まれるプライマーの種類は２種類以上であることが好ましい。例えば、含有するプライマーが各々異なる試薬Ｒ１と試薬Ｒ２を用意し、マイクロチップ１ａに設けられた複数のウェルに、試薬Ｒ１と試薬Ｒ２とが別のウェルに配置されるように収容する。この場合、１回の核酸増幅反応によって、複数の塩基配列の異なる核酸鎖の増幅について解析することが可能となり、マイクロチップ１ａを用いた解析がより簡便となる。
【００３５】
（５）基板層の貼り合わせ
図３中、符号Ｓ５は基板層の貼り合わせ工程である。本工程では、試薬Ｒ１，Ｒ２が収容されたいずれかの基板層に、他の基板層を貼り合わせる。基板層１１，１２，１３の貼り合わせには、例えば、熱融着、接着剤、陽極接合、粘着シートを用いた接合、プラズマ活性化結合、超音波接合等の公知の手法により行うことができる。また、基板層１１，１２，１３の貼り合わせを、大気圧に対して負圧下で行うことにより、試料溶液が導入される、導入部２、流路３１〜３５、ウェル４１〜４５の各領域を大気圧に対して負圧（例えば１／１００気圧）とすることができる。ウェル４１〜４５を封止する基板層１１に、ＰＤＭＳ等の弾性に加えてガス透過性を有する材料を用いた場合には、基板層１１，１２を貼り合わせた後、負圧（真空）下に静置すれば、導入部２等の各領域に存在する空気が基板層１１を透過して排出されるため、マイクロチップ１ａ内部を大気圧に対して負圧（真空）にできる。なお、マイクロチップ１ａの内部を大気圧に対し負圧とする工程は、本技術に係るマイクロチップの製造方法において、必須ではない。
【００３６】
本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップ１ａにおいては、核酸増幅反応に必要な物質の一部を含む試薬Ｒ１，Ｒ２が、分析場であるウェル４１〜４５内に予め収容されている。このため、核酸増幅反応に必要な残りの物質と標的核酸鎖を含む試料溶液をウェル４１〜４５内に供給するのみで核酸増幅反応を開始することができる。また、複数の固形状の試薬Ｒ１，Ｒ２をウェル４１〜４５内に収容することにより、核酸増幅反応に必要な複数の物質を、解析開始時まで分離した状態でマイクロチップ１ａ内に保持することができる。このため、マイクロチップ１ａを用いた核酸増幅反応においては、プライマー同士がアニーリングしてプライマーダイマー等を生じることが抑制され、核酸の非特異的増幅が低減される。さらに、試薬Ｒ１，Ｒ２の調製を各々固化用容器で行うことにより、核酸増幅反応に使用する物質を分けて固化することが容易である。このため、本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法によって、簡便かつ精度の高い分析が可能な核酸増幅反応用マイクロチップの製造が可能となる。
【００３７】
３．第一実施形態の変形実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図４に、第一実施形態の変形実施形態に係るマイクロチップ１ａ−２のウェルに収容された試薬Ｒについて、ウェル４３を代表として模式的に示す。マイクロチップ１ａ−２は、ウェル４３等の各ウェルに収容されている試薬Ｒ以外の構成については、第一実施形態と同一である。第一実施形態と同一の構成については、同一の符号を付し説明については、省略する。また、マイクロチップ１ａ−２を構成する基板層１１，１２，１３の材料は、マイクロチップ１ａにおいて同一の符号を付した基板層と同じである。
【００３８】
マイクロチップ１ａ−２のウェル４３には、１種類の試薬Ｒが収容されている。マイクロチップ１ａ−２の製造工程は、試薬液の調製工程Ｓ２において、調製される試薬液の種類以外は図３に示すフローチャートと同一であり、製造工程の説明は省略する。図４のウェル４３に示すように、マイクロチップ１ａ−２に収容される試薬Ｒは、１種類であっても良い。例えば、酵素を含む試薬Ｒをウェル４３に収容し、核酸増幅反応開始時に、プライマー等、他の核酸増幅反応に必要な成分を試料溶液と混合してマイクロチップ１ａ−２導入しても良い。
【００３９】
本技術に係るマイクロチップ１ａ−２においては、一部の核酸増幅反応に必要な成分を、予めウェル４１〜４５内に収容することによって、ウェル内に試料溶液が導入されるまで、ウェル内の試薬Ｒに含まれる成分と他の成分とを分離しておくことが可能である。このため、核酸増幅反応が開始されるまで、例えば酵素とプライマーを分けておくことができ、プライマーダイマー等による非特異的な核酸増幅が抑えられ、マイクロチップ１ａ−２を用いて、精度の高い分析が可能となる。
【００４０】
４．本技術の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図５に、本技術の第二実施形態に係るマイクロチップ１ｂのウェルに収容された試薬Ｒ１，Ｒ２について、ウェル４３を代表として模式的に示す。マイクロチップ１ｂは、ウェル４３等の各ウェルに収容されている試薬Ｒ１，Ｒ２の形状以外の構成については、第一実施形態と同一である。第一実施形態と同一の構成については、同一の符号を付し説明については、省略する。また、マイクロチップ１ｂを構成する基板層１１，１２，１３の材料は、マイクロチップ１ａにおいて同一の符号を付した基板層と同じである。
【００４１】
図５に示す試薬Ｒ１，Ｒ２は、マイクロチップ１ａに収容された試薬と同様に、固形の試薬であり、核酸増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質の少なくとも一部が含まれている。試薬Ｒ１，Ｒ２の組成については、マイクロチップ１ａに収容されている試薬Ｒ１，Ｒ２と同一であるため、説明は省略する。マイクロチップ１ｂに収容された試薬Ｒ１，Ｒ２について、マイクロチップ１ａにおける試薬Ｒ１，Ｒ２と異なる点は、ウェル４３に収容された試薬のうち一部が、ウェル４３内に固着されていることである（図５参照）。
【００４２】
５．本技術の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
マイクロチップ１ｂの製造方法について、図６に示すフローチャートを参照して説明する。基板層の成形工程Ｓ１、試薬液の調製工程Ｓ２、基板層の貼り合わせ工程Ｓ５、の各工程については、第一実施形態と同一であるため、説明は省略し、試薬液の固着化工程Ｓ３ｂ及び試薬の収容工程Ｓ４について説明する。
【００４３】
（１）試薬液の固着化
図６中、符号Ｓ３ｂは、試薬液の固着化工程である。本工程では、調製工程Ｓ２で用意された複数種類の試薬液のうち、１種類の試薬液をウェル４３内に固着化する。すなわち、試薬液をウェル４３内で乾燥させ、乾燥状態となった試薬液がウェル内に固着された状態にする工程である。固着化工程Ｓ３ｂについては、図６に示すように「試薬液の滴下」の工程Ｓ３ｂ−１、「真空乾燥」の工程Ｓ３ｂ−２、の順に説明する。また、マイクロチップ１ｂの製造においては、試薬液の固着化工程Ｓ３ｂに用いない他の試薬液は、第一実施形態と同様に試薬液の固化工程Ｓ３ａによって、固形状にする。
【００４４】
[試薬液（Ｒ２）の滴下の工程Ｓ３ｂ−１]
本工程では、前述の、試薬液の調製工程Ｓ２において調製された試薬液のうち、１種類の試薬液を、基板層の成形工程Ｓ１において基板層１２等に形成された各ウェルに滴下する。この時、ウェルが形成された基板層１２は、冷却されていることが好ましい。
【００４５】
[真空乾燥の工程Ｓ３ｂ−２]
本工程では、前述の試薬液が滴下された基板層１２を真空下（６００−１０００Ｐａ）に置き、試薬液を乾燥させる。第一実施形態における試薬液の固化工程Ｓ３ａと異なり、本工程では基板層１２を変形させない乾燥方法を選択する必要があり、例えば、真空乾燥が好適である。乾燥方法については、その他、試薬液に含まれる物質の性質に合わせて、風乾とすることも可能である。
【００４６】
（２）試薬の収容
図６中、符号Ｓ４は、試薬の収容工程である。前述の試薬液の固着化工程Ｓ３ｂの結果、第一実施形態とは異なり、マイクロチップ１ｂにおいては試薬Ｒ２がウェル４３内に存在する。本工程では、この試薬Ｒ２が予め固着化されたウェルに、別途、試薬液の固化工程Ｓ３ａにより用意した試薬Ｒ１を収容する。マイクロチップ１ｂに収容する固化された試薬Ｒ１は、１種類には限定されず、任意とできる。
【００４７】
本技術に係るマイクロチップ１ｂでは、核酸増幅反応に必要な物質の一部を含む試薬Ｒ１，Ｒ２が、分析場であるウェル４１〜４５内に予め保持されている。このため、マイクロチップ１ａと同様に、マイクロチップ１ｂを用いて核酸増幅反応を行う際には、核酸増幅反応に必要な残りの物質と標的核酸鎖を含む試料溶液のみをウェル４１〜４５内に導入すれば良く、簡便に核酸増幅反応を行うことができる。また、ウェル４１〜４５内に保持された組成の異なる複数の固形状の試薬Ｒ１，Ｒ２に含まれる成分は、核酸増幅反応の開始時まで分離した状態が維持される。このため、例えば酵素とプライマーとを、各々試薬Ｒ１と試薬Ｒ２に含む成分とすることによって、プライマーダイマー等の発生による核酸の非特異的増幅が抑制が可能となる。
【００４８】
６．本技術の第三実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成
図７に、第三実施形態に係るマイクロチップ１ｃのウェルに収容された試薬Ｒについて、ウェル４３を代表として模式的に示す。マイクロチップ１ｃは、ウェル４３等の各ウェルに収容されている試薬Ｒ以外の構成については、第一実施形態と同一である。第一実施形態と同一の構成については、同一の符号を付し説明については、省略する。また、マイクロチップ１ｃを構成する基板層１１，１２，１３の材料は、マイクロチップ１ａにおいて同一の符号を付した基板層と同じである。
【００４９】
マイクロチップ１ｃのウェル４３には、核酸増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質の少なくとも一部が含まれている試薬Ｒが固着されている（図７）。試薬Ｒに含まれる核酸増幅反応に必要な成分は、１種類であっても良く、複数種類であっても良い。
【００５０】
マイクロチップ１ｃの製造工程では、基板層の成形工程Ｓ１、試薬液の調製工程Ｓ２、及び基板層の貼り合わせ工程Ｓ５については、第一実施形態と同様であり、説明は省略する。試薬液をウェル４３に固着化させる工程については、第二実施形態の、試薬液の固着化工程Ｓ３ｂと同様に、所定の組成に調製された試薬液を基板層１２に設けられた各ウェルに滴下し、真空乾燥等によって試薬液をウェル４３内に固着化させる。
【００５１】
試薬液の滴下の際、調製された試薬液は、冷温に保存されていることが好ましい。また、各ウェルが形成された基板層１２も冷温に保存されることが好ましい。例えば、予めアルミブロックなどの基板層１２を保持する器具を冷凍庫で冷やしておき、冷却された器具の上に基板層１２を置き、試薬液の滴下を行っても良い。マイクロチップ１ｃにおいて、ウェル４３等に固着化される試薬Ｒは、１種類であっても良く、組成の異なる試薬Ｒ１，Ｒ２としても良い。複数の試薬Ｒ１，Ｒ２をウェル４３内に固着化させる場合は、いずれか一の試薬液をウェル４３内に滴下し、真空乾燥等により固着化させ、その固着化された試薬Ｒ１の上に、次の試薬液を滴下し乾燥させ、この滴下と乾燥の工程を繰り返しても良い。
【００５２】
試薬液の調製工程から試薬液の乾燥工程の開始まで、試薬液を低温に保つことによって、試薬液に含まれる核酸増幅反応に必要な成分において、物質の結合や酵素の活性が抑えられる。このため、プライマーダイマー等の発生が抑制され、核酸の非特異的増幅が低減する。
【００５３】
なお本技術は、以下のような構成もとることができる。
（１）核酸増幅反応に必要な物質のうち、少なくとも一部を含む試薬液を乾燥させる固化工程と、固化された該試薬液を核酸増幅反応の反応場であるウェルに配置する収容工程と、を含む、核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（２）前記固化工程は、前記試薬液を凍結乾燥する工程を含む、上記（１）記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（３）前記固化工程の前に、組成の異なる複数の前記試薬液を用意する調製工程を含み、該試薬液には、オリゴヌクレオチドプライマーを含んで酵素を含まない第１の試薬液と、酵素含んでオリゴヌクレオチドプライマーを含まない第２の試薬液と、が含まれる、上記（１）又は（２）記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（４）前記固化工程は、前記第１の試薬液と前記第２の試薬液とを別個に凍結乾燥する工程を含む、上記（３）記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（５）前記収容工程は、複数の前記ウェルの各々に、固化された、２種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む前記第１の試薬液を収容する工程を含む、上記（３）又は（４）記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（６）前記第１の試薬液と前記第２の試薬液のうち、何れか一の試薬液を前記固化工程によって固化し、前記収容工程の前に、前記固化工程に用いていない試薬液を前記ウェルに滴下して、該ウェル内で乾燥させる固着化工程を含む、上記（３）記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
（７）前記固着化工程は、前記試薬液を真空乾燥する工程を含む、上記（６）記載の核酸増幅反応用マクロチップの製造方法。
【実施例】
【００５４】
＜実施例１＞  
１．核酸増幅反応における非特異的増幅の検出
本技術に係るマイクロチップを用いた核酸増幅反応における、核酸鎖の非特異的増幅の抑制について、検証した。【００５５】
[材料及び方法]
１．マイクロチップの製造
本実施例に使用したマイクロチップは、内部に収容される試薬の作製方法等が異なる４種類のマイクロチップである。４種類のいずれのマイクロチップについても、ＰＤＭＳ製及びガラス製の基板を材料に用いた。また、本実施例で行う核酸増幅反応に必要な試薬として、インフルエンザＡ型の増幅に用いる４種類のプライマー、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、反応緩衝液を用意した。試薬液の調製工程から収容工程までは、各々のマイクロチップごとに下記に説明する。【００５６】
＜１＞マイクロチップ１
本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップの比較例として、マイクロチップ１（以下、Ｍ１と称する）を製造した。Ｍ１の製造においては、４種類のプライマー、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、及び反応緩衝液を含む試薬液を調製した。基板層に成形されたウェル内に１．２μｌの試薬液を滴下し、約２時間の真空乾燥（約１０００Ｐａ）処理によってウェル内に試薬液を固着化させた。【００５７】
＜２＞マイクロチップ２
マイクロチップ２（以下、Ｍ２と称する）は、固化された試薬がウェル内に収容されたマイクロチップである。Ｍ２の製造においては、４種類のプライマー、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、及び反応緩衝液を含む試薬液の調製は、氷上に固化用容器を置いて冷却しながら行った。１．２μｌの試薬液が入った固化用容器を、−４０℃に６時間以上置いて、試薬液を凍結させた。試薬液が凍結した後、固化用容器を、凍結乾燥機（ＦＤＵ−２２００，ＥＹＥＬＡ）にセットした。試薬液の凍結状態を保ったまま、真空下（約６〜８Ｐａ）で、試薬液の乾燥を１２時間以上行った。その後、ドライチャンバーの温度を３０℃に設定し、試薬液の乾燥をさらに６時間以上行った。凍結乾燥によって固化された試薬は、固化用容器から取り出し、基板層に成形されたウェルに収容した。【００５８】
＜３＞マイクロチップ３
マイクロチップ３（以下、Ｍ３と称する）は、含有する物質の異なる複数の固化された試薬がウェル内に収容されたマイクロチップである。Ｍ３の製造においては、４種類のプライマー、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、及び反応緩衝液の核酸増幅反応に必要な成分のうち、プライマーを含む試薬液（以下、ＦｌｕＡと称する）を冷却しながら調製した。また、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、及び反応緩衝液を含む試薬液（以下、ＲＭと称する）についても、冷却しながら調製した。調製した試薬液を、ＦｌｕＡについては０．４μｌ、ＲＭについては０．８μｌ、別の固化用容器に滴下した。固化用容器に入れた各々の試薬液を、Ｍ２と同様に、凍結乾燥によって固化した。固化されたＦｌｕＡ及びＲＭを、固化用容器から取り出し、一のウェルに両方が収容されるように、各々基板層に成形されたウェルに収容した。【００５９】
＜４＞マイクロチップ４
マイクロチップ４（以下、Ｍ４と称する）は、複数回に分けて、含有する成分の異なる試薬液がウェル内に固着化されたマイクロチップである。Ｍ４の製造においては、Ｍ３と同様に、試薬液ＦｌｕＡと試薬液ＲＭを調製した。０．４μｌのＦｌｕＡをウェル内へ滴下し、Ｍ１と同様に真空乾燥によってウェル内へ固着させた。ＦｌｕＡが固着されたウェルを有する基板層を冷却し、低温に保った状態で、ＦｌｕＡが固着されたウェルに０．８μｌのＲＭを滴下した。再び、Ｍ１と同様に真空乾燥を行い、ＲＭをウェル内に固着させた。
【００６０】
以上４種類の、試薬が収容、又は固着化されたウェルを有する基板層については、ウェルを封止するために、他の基板層を貼り合わせた。酸素プラズマ照射（Ｏ２：１０ｃｃ，ＲＦ出力：１００Ｗ、ＲＦ照射時間：３０秒）により、各基板層の表面を処理し、真空下で貼り合わせ、マイクロチップＭ１〜４を完成させた。【００６１】
２．核酸増幅反応
上記の工程によって製造されたマイクロチップＭ１〜４を用いて、核酸増幅反応を行った。核酸増幅にはＬＡＭＰ法を用いた。Ｍ１からＭ４に試料溶液を導入し、６３℃において核酸増幅反応を行った。試料溶液には、Ａ型インフルエンザ陽性検体（ポジティブコントロール，以下、ＰＣと称する）と、Ａ型インフルエンザ陰性検体（ネガティブコントロール，以下、ＮＣと称する）と、水（ノンテンプレートコントロール，以下、ＮＴＣと称する）を用いた。増幅核酸鎖の検出は蛍光検出によって行い、検出用試薬としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いた。【００６２】
[結果]
図８に本実施例の結果を示す。図８は、Ｍ１〜４の各マイクロチップにおいて、核酸増幅の開始を、試料溶液ごとに示す。核酸増幅の開始の時刻は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによって得られた蛍光強度をプロットした増幅曲線が、立ち上がって所定の閾値に達した時と定義した。なお、図８に示すＭ１’は、Ｍ１と同一の製造工程によって製造されたマイクロチップであり、Ｍ１と同様に核酸増幅反応に用いた。【００６３】
核酸増幅反応の結果、Ｍ１〜４のマイクロチップ（Ｍ１については、Ｍ１’を参照）において、ＰＣを導入したウェルでの核酸増幅が検出された。すなわち、ウェルに収容された試薬は、核酸増幅反応に使用可能な状態で保存されていることが示された。一方、ＮＣ及びＮＴＣが導入されたＭ１〜４のマイクロチップのウェルにおいても、核酸の増幅が観察された。これは、マイクロチップＭ１〜Ｍ４のウェル内で核酸鎖の非特異的増幅が起きたことを示している。本実施例で行った核酸増幅反応において、核酸の鋳型核酸鎖に特異的な増幅は、核酸増幅反応開始後３０分以内に検出されている（図８）。そのため、本来、核酸増幅が生じないはずのＮＣ及びＮＴＣが導入されたウェルにおいて、反応開始後３０分以内に核酸増幅が生じることは、マイクロチップを用いて行う解析に支障をきたす。【００６４】
図８に示すように、Ｍ３における非特異的な核酸増幅の開始は、核酸増幅反応開始後５０分以降であった。一方、比較例であるＭ１における非特異的な核酸増幅の開始は、反応開始後２０分程度から検出されている。この結果から、Ｍ３を用いた核酸増幅反応では、非特異的核酸増幅が抑制されていることが示された。【００６５】
Ｍ２とＭ４における、非特異的な核酸増幅の開始は、一部のウェルにおいては、３０分を過ぎたあたりであった。Ｍ３の結果に比べ、Ｍ２及びＭ４の結果では、非特異的な核酸増幅の開始時刻が早かった。しかし、核酸増幅反応開始後３０分以内に、ＮＴＣ及びＮＣにおいて核酸増幅は認められなかった。この結果から、Ｍ２及びＭ４では、Ｍ１（比較例）に比べ、非特異的な核酸増幅は抑制されていることが示された。また、Ｍ２及びＭ４における非特異的な核酸増幅の抑制効果は、同程度であった。【００６６】
本実施例の結果から、核酸増幅反応に必要な物質を含む試薬がウェルに収容されたマイクロチップを用いることにより、核酸増幅反応において非特異的な核酸増幅の抑制が確認された。特に、プライマーを含んで酵素を含まない試薬液と、酵素を含んでプライマーを含まない試薬液とが、各々固化されてウェルに封止されているマイクロチップ（Ｍ３）においては、非特異的な核酸増幅が大きく抑制された。すなわち、本技術に係るマイクロチップの製造法によって製造されたマイクロチップでは、非特異的な核酸増幅が低減し、分析の精度が向上していた。【００６７】
また、酵素とプライマーとを含む固相状の試薬が収容されたマイクロチップ（Ｍ２）や、プライマーを含む試薬が固着化されたウェルに酵素を含む試薬液が滴下されて作製されたマイクロチップ（Ｍ４）においても、比較例（Ｍ１）に比べ、非特異的な核酸増幅反応が抑制されていることが観察された。これは、マイクロチップの製造工程において、冷却状態の酵素とプライマーが混合された後に乾燥された試薬を用いて行う核酸増幅反応において、非特異的な核酸増幅反応が抑制されたことを示している。以上から、本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップは、試料溶液等を導入することのみで簡便に分析が行える上、非特異的な核酸増幅が抑制されるため、精度が高い分析が可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップによれば、簡便かつ高精度に核酸増幅による分析を行うことができる。そのため、臨床における遺伝子型判定や感染病原体判定などのための核酸増幅を行う装置として、本技術に係る核酸増幅反応用マイクロチップは用いられ得る。
【符号の説明】
【００６９】
Ｒ，Ｒ１，Ｒ２：試薬、１ａ，１ａ−２，１ｂ，１ｃ：マイクロチップ、１１，１２，１３：基板層、２：導入部、３１，３２，３３，３４，３５：流路、４１，４２，４３，４４，４５：ウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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