(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）腫瘍関連抗原に結合する抗体、および
（ｉｉ）腫瘍関連抗原をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、
から成る群より選択される一つ以上の成分を含み、
前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：１の核酸配列を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とハイブリダイズする核酸、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、
から成る群より選択される核酸によってエンコードされた配列を有する、腫瘍関連抗原を発現する性質を有する癌もしくは腫瘍性疾病の予防または治療のための医薬組成物であって、
前記癌もしくは腫瘍が、乳房癌腫である、医薬組成物。
【請求項２】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体である、または抗体のフラグメントである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が、治療薬または診断薬にコンジュゲートする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記腫瘍関連抗原が、配列番号：２、５８〜６０、６８および６９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
腫瘍関連抗原の発現を特徴とする癌もしくは腫瘍性疾病の癌もしくは腫瘍細胞を分析またはモニタリングする方法であって、
（ａ）配列番号：１の核酸配列からなる核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とハイブリダイズする核酸、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、
から成る群より選択される核酸によってエンコードされた配列を有する前記腫瘍関連抗原を用いて、；
（ｉ）前記腫瘍関連抗原をコードする核酸の、および／または
（ｉｉ）前記腫瘍関連抗原の、
生体サンプル中の量を検出または決定することを含み、
前記量の検出または決定が、
（ｉ）前記腫瘍関連抗原をコードする前記核酸に、または前記腫瘍関連抗原に特異的に結合する薬剤と前記生体サンプルを接触させること、および
（ｉｉ）前記薬剤と、前記核酸もしくは前記腫瘍関連抗原との複合体の形成を検出することまたは前記複合体の量を決定することを含み、
前記腫瘍関連抗原をコードする前記核酸に特異的に結合する前記薬剤が、前記核酸に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり、
前記腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記薬剤が、前記腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体であり、
前記癌もしくは腫瘍が、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、食道癌、卵巣癌、頭頸部癌、腎臓癌または乳房癌腫である、方法（ただし、ヒトに対する医療行為を除く）。
【請求項６】
前記薬剤が、検出可能な様式で標識される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記疾病の前記モニタリングが、前記疾病に罹患しているまたは前記疾病に罹患すると推測される患者からのサンプルにおいて前記疾病の退行、経過または発症を判定することを含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
第一時間点での第一サンプルの量の検出または決定、第二時間点でのさらなるサンプルの量の検出または決定、ならびにこれら二つのサンプルの比較を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生体サンプルが、体液および／または体内組織を含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体である、または抗体のフラグメントである、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍関連抗原が、配列番号：２、５８〜６０、６８および６９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍細胞中の腫瘍関連抗原の発現を検出するためのキットであって、
前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：１の核酸配列からなる核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とハイブリダイズする核酸、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、
から成る群より選択される核酸によってコードされた配列を有する；
（ｉ）前記腫瘍関連抗原をコードする核酸の、および／または
（ｉｉ）前記腫瘍関連抗原の、
量の検出または決定のための薬剤を含み、
前記核酸を検出するための前記薬剤が、前記核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり、
前記腫瘍関連抗原を検出するための前記薬剤が、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体であり、
前記腫瘍が、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、食道癌、卵巣癌、頭頸部癌、腎臓癌または乳房癌腫である、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
インターディシプリナリー・アプローチおよび伝統的な治療を余すところなく使用しているにもかかわらず、癌は、未だ、主な死亡原因の一つである。最近の治療コンセプトは、組換え腫瘍ワクチンおよび他の特定の施策、例えば抗体療法、の使用による全治療コンセプトに患者の免疫系を組み込むことを目指している。
【背景技術】
【０００２】
こうした戦略の成功の前提条件は、患者の免疫系のエフェクター機能を介在強化することによる、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原またはエピトープの認識にある。
【０００３】
腫瘍細胞は、生物学的に、それらの元良性細胞と実質的に異なる。これらの相違は、腫瘍発生中に獲得される遺伝子改変に起因し、その結果、とりわけ、癌細胞では質的にまたは量的に改変された分子構造の形成も生じる。
【０００４】
この種の腫瘍関連構造は、腫瘍保有宿主の特定の免疫系によって認識され、腫瘍関連抗原と呼ばれる。腫瘍関連抗原の特異的認識には、二つの機能的に結合した単位である、細胞メカニズムおよび液性機構がある：ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、それぞれ、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩおよびＩの分子上に提示されるプロセッシングされた抗原を認識し、一方、Ｂリンパ球は、プロセッシングされていない抗原に直接結合する循環性抗体分子を産生する。
【０００５】
腫瘍関連抗原の潜在的な臨床的−治療的重要性は、免疫系によって腫瘍細胞上の抗原を再認識することで、細胞傷害性エフェクターメカニズムが開始し、Ｔヘルパー細胞の存在下、癌細胞を排除することができるという事実に由来する（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：５２５−３１，１９９８）。
【０００６】
従って、腫瘍免疫学の目的の中心は、これらの構造を分子的に定義することである。これらの抗原の分子的性質は、長い間、謎であった。適切なクローニング技術の開発後にやっと、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３−７，１９９１）のターゲット構造を分析したり、または循環性自己抗体（Ｓａｈｉｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７０９−１６，１９９７）をプローブとして使用することにより、腫瘍のｃＤＮＡ発現ライブラリを腫瘍関連抗原について系統的にスクリーニングすることが可能となった。
【０００７】
このために、ｃＤＮＡ発現ライブラリが、新鮮な腫瘍細胞から作製され、適する系においてタンパク質として組換え発現した。患者から単離した免疫エフェクター、すなわち、腫瘍特異的溶解パターンを有するＣＴＬクローン、または循環性自己抗体は、それぞれの抗原をクローニングするために利用されていた。
【０００８】
近年、これらのアプローチにより、様々な腫瘍において抗原が多重度に定義された。
【０００９】
しかし、伝統的な方法において抗原同定に利用されるプローブは、通常は既に進行癌に罹患している患者からの免疫エフェクター（循環性自己抗体またはＣＴＬクローン）である。
【００１０】
多数のデータは、腫瘍が、例えば、Ｔ細胞の寛容化およびアネルギー化をもたらすことがあること、ならびにその疾病の過程で、特に、有効な免疫認識を生じさせ得る特異性が、その免疫エフェクターの能力から失われることを示している。
【００１１】
現行の患者研究は、以前に発見され、利用されている腫瘍関連抗原の真の作用の信頼できる証拠を、まだ、呈示していない。従って、自然免疫応答を誘発するタンパク質が、誤ったターゲット構造であることを、除外することはできない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、癌の診断および治療のためのターゲット構造を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本目的は、本件特許請求の範囲の内容によって達成される。
本発明に従って、腫瘍細胞において選択的にまたは異常に発現する遺伝子を特定することで、腫瘍関連抗原を提供することができる。これらの遺伝子および／もしくは遺伝子産物ならびに／または誘導体および／もしくはそれらのフラグメントは、治療および診断アプローチのためのターゲット構造として有用である。
【００１４】
本発明に従って同定される腫瘍関連抗原は、（ａ）配列表の配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸を基準にして縮重している核酸、および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的である核酸、から成る群より選択される核酸によってエンコードされたアミノ酸配列を有する。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原は、配列表の配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸によってコードされたアミノ酸配列を有する。
【００１６】
さらなる好ましい実施形態において、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原は、配列表の配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、２９、３１、３６、４０、４２、４６、５０〜６０、６３、６８および６９から成る群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む。
【００１７】
本発明は、一般に、腫瘍性疾患を治療、予防、診断および／またはモニタリングするための、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原のまたはそれらの部分もしくは誘導体の、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸のまたはそれらの部分もしくは誘導体のまたは前記コーディング核酸に対する核酸の、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはそれらの部分もしくは誘導体に対する抗体もしくはＴ細胞の、および／あるいは本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはそれらの部分もしくは誘導体を発現する宿主細胞の使用に関する。
【００１８】
これは、これらの抗原、核酸、抗体、Ｔ細胞および／または宿主細胞のうちの二つ以上を併用することができ、一つの実施形態では、本発明に従って同定されるもの以外の腫瘍関連抗原と、それらをコードする核酸もしくは前記コーディング核酸に対する核酸、前記腫瘍関連抗原に対する抗体もしくはＴ細胞および／または前記腫瘍関連抗原を発現する宿主細胞を併用することができる。
【００１９】
本発明の実施形態において、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはそれらの部分もしくは誘導体に対する抗体を使用する場合、任意にはＭＨＣ分子との複合体として、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはそれらの部分もしくは誘導体に対するＴ細胞受容体も、使用することができる。
【００２０】
腫瘍関連抗原の非膜貫通部分、特に細胞外部分、またはそれらを含む部分に対応する、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の一部は、治療、予防、診断および／またはモニタリングに特に適する。
【００２１】
従って、本発明によると、腫瘍関連抗原の非膜貫通部分、特に細胞外部分、もしくはそれらを含む部分、または本発明に従って同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸に対応する部分に対応する本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の一部は、治療、予防、診断および／またはモニタリングに好ましい。
【００２２】
同様に、腫瘍関連抗原の非膜貫通部分、特に細胞外部分、またはそれを含む部分に対応する、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の一部に対する抗体を使用することが、好ましい。
【００２３】
治療、予防および／または診断に好ましい疾病として、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原のうちの一つ以上が、選択的に発現しまたは異常発現する疾病が挙げられる。
【００２４】
さらに、本発明は、既知遺伝子の選択的スプライシング（スプライス変異体）または代替オープンリーディングフレームを使用する改変翻訳によって生じる、核酸およびタンパク質またはペプチドに関する。
【００２５】
この態様において、本発明は、配列表の配列番号：２８および４９から成る群より選択される核酸配列を含む核酸に関する。
【００２６】
さらに、この態様において、本発明は、配列表の配列番号：２９および５０から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質またはペプチドに関する。
【００２７】
腫瘍関連スプライス変異体は、腫瘍関連トランスクリプトおよび腫瘍関連タンパク質／抗原を産生し得る。これらは、腫瘍細胞の検出および腫瘍の治療的ターゲッティング、両方のために、分子マーカーとして利用することができる。
【００２８】
患者からのサンプルにおける腫瘍細胞の検出は、例えば、スプライス変異体特異的オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅した核酸を抽出した後、本発明に従って行うことができる。
【００２９】
本発明によると、すべての配列依存検出システムが検出に適する。これらは、ＰＣＲに加えて、例えば、遺伝子チップ／マイクロアレイシステム、ノーザンブロット、ＲＮアーゼ保護アッセイ（ＲＤＡ）およびその他である。
【００３０】
すべての検出システムは、検出が、少なくとも一つのスプライス変異体特異的核酸配列での特異的ハイブリダイゼーションに基づく点で共通している。
【００３１】
しかし、スプライス変異体がエンコードする特異的エピトープを認識する抗体により、本発明に従って腫瘍細胞を検出することもできる。
【００３２】
前記抗体は、前記スプライス変異体に特異的であるペプチドを免疫処置に使用することによって作製することができる。健常な細胞において好適に生産される遺伝子産物の変異体（単数または複数）とは明瞭に異なるアミノ酸配列が、特に、免疫処置に適する。
【００３３】
この場合、抗体を用いた腫瘍細胞の検出は、患者から単離したサンプル上で、または静脈内投与された抗体でイメージングして行うことができる。
【００３４】
診断に使用できることに加えて、新規または改変エピトープを有するスプライス変異体は、本明細書において説明するような抗体またはＴリンパ球のターゲッティングにこれらのエピトープを利用できるので、免疫療法の魅力的なターゲットである。
【００３５】
受動免疫療法では、この場合、スプライス変異体特異的エピトープを認識する抗体またはＴリンパ球を養子移入する。他の抗原の場合のように、これらのエピトープを含むポリペプチドから標準技術を用いて抗体を産生させることもできる。
【００３６】
あるいは、前記エピトープを含有するペプチドをコードする核酸を免疫処置に利用することもできる。エピトープ特異的Ｔリンパ球をインビトロまたはインビボで産生させる様々な技術が公知であり、詳細に記載されており（例えば、Ｋｅｓｓｌｅｒ  ＪＨら，２００１、Ｓａｈｉｎら，１９９７）、これらもまた、スプライス変異体特異的エピトープを含有するペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸に基づく。
【００３７】
スプライス変異体特異的エピトープを含有するペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸は、能動免疫療法（例えば、ワクチン接種、ワクチン療法）において医薬活性物質として使用することもできる。
【００３８】
一つの態様において、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその腫瘍関連抗原をコードする核酸を認識する、および好ましくは、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現を有する細胞に対して選択的である薬剤を含む医薬組成物に関する。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、（Ｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の発現もしくは活性を阻害する、ならびに／または  （ＩＩ）腫瘍阻害もしくは腫瘍破壊活性を有し、および本発明に従って同定される腫瘍関連抗原を発現するもしくは異常発現する細胞に対して選択的である、ならびに／または  （ＩＩＩ）投与されたとき、ＭＨＣ分子と、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部、例えばペプチドエピトープ、との複合体の量を選択的に増加させる薬剤を含む医薬組成物に関する。
【００４０】
特定の実施形態において、前記薬剤は、細胞死の誘導、細胞増殖の減少、細胞膜への損傷またはサイトカインの分泌を生じさせることができ、好ましくは、腫瘍阻害活性を有する。
【００４１】
一つの実施形態において、前記薬剤は、腫瘍関連抗原をコードする核酸と選択的にハイブリダイズする、アンチセンス核酸である。
【００４２】
さらなる実施形態において、前記薬剤は、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を好ましくは含むｓｉＲＮＡであり、この場合、前記センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ２本鎖を形成し、ならびに前記センスＲＮＡ鎖は、前記腫瘍関連抗原をコードする核酸、好ましくは前記腫瘍関連抗原をコードするｍＲＮＡ、内の約１９から約２５の連続したヌクレオチドから成るターゲット配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
さらなる実施形態において、前記薬剤は、前記腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体、特に、前記腫瘍関連抗原に選択的に結合する補体活性化抗体または毒素結合抗体である。
【００４３】
好ましい実施形態において、前記腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体は、治療に有用な物質にカップリングされ、および／または前記腫瘍関連抗原を発現するもしくは異常発現する前記細胞に天然もしくは人口エフェクターメカニズムをリクルートする。
【００４４】
さらなる実施形態において、前記薬剤は、細胞上にＭＨＣ分子によって結合した腫瘍関連抗原またはその一部を認識し、このようにして標識された細胞を溶解する、細胞傷害性Ｔリンパ球である。
【００４５】
さらなる実施形態において、前記薬剤は、前記腫瘍関連抗原またはその一部を特異的に認識する他の細胞のエフェクター機能を強化する、Ｔヘルパーリンパ球である。
【００４６】
さらなる実施形態において、前記薬剤は、二つまたはそれ以上の薬剤を含み、これらは、各々、異なる腫瘍関連抗原を認識し、および／または異なる腫瘍関連抗原の発現もしくは活性を阻害し、および／または腫瘍阻害もしくは腫瘍破壊活性を有し、異なる腫瘍関連抗原を発現するもしくは異常発現する細胞に対して選択的であり、および／または投与されたとき、ＭＨＣ分子と異なる腫瘍関連抗原もしくはその一部との複合体の量を選択的に増加させ、これらの場合、前記異なる腫瘍関連抗原のうちの少なくとも一つは、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原である。
【００４７】
好ましくは、腫瘍に選択的に限定される腫瘍関連抗原は、この特定の位置にエフェクターメカニズムをリクルートするための標識として役立つ。
【００４８】
本発明は、前記薬剤、それ自体は、腫瘍関連抗原の活性を阻害せず、または腫瘍阻害または腫瘍破壊活性を有さないが、そうした効果を媒介する、特に、特定の位置、特に、腫瘍もしくは腫瘍細胞にエフェクターメカニズム、特に、細胞傷害能を有するものをリクルートすることによって媒介する、実施形態を含む。
【００４９】
本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の活性は、タンパク質またはペプチドの任意の活性であり得る。一つの実施形態において、この活性は、酵素活性である。
【００５０】
本発明によると、「発現または活性を阻害する」というフレーズは、発現または活性の完全なまたは本質的に完全な阻害、および発現または活性の低減を含む。
【００５１】
投与されたとき、ＭＨＣ分子と本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部との複合体の量を選択的に増加させる薬剤は、（ｉ）腫瘍関連抗原またはその一部、（ｉｉ）前記腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸、（ｉｉｉ）前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞、および（ｉｖ）前記腫瘍関連抗原由来のペプチドエピトープとＭＨＣ分子との単離した複合体から成る群より選択される一つ以上の成分を含む。
【００５２】
本発明は、さらに（ｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部、（ｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸、（ｉｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原にまたはその一部に結合する抗体、（ｉｖ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、（ｖ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、（ｖｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞、および（ｖｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部とＭＨＣ分子との単離した複合体から成る群より選択される一つ以上の成分を含む医薬組成物に、関する。
【００５３】
一つの実施形態において、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸は、発現ベクター内に医薬組成物として存在し、プロモーターに機能的に連結している。
【００５４】
さらなる実施形態において、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸は、下でさらに説明するように、ウイルス内医薬組成物として存在する。
【００５５】
さらなる実施形態において、本発明の医薬組成物として存在する宿主細胞は、腫瘍関連抗原もしくはその一部を分泌し、表面でそれを発現し、好ましくは、前記腫瘍関連抗原またはその一部に結合するＭＨＣ分子をさらに発現する。
【００５６】
一つの実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＨＣ分子を内因的に発現する。さらなる実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＨＣ分子および／または腫瘍関連抗原もしくはその一部を組換え様式で発現する。
【００５７】
前記宿主細胞は、好ましくは、非増殖性である。好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【００５８】
さらなる実施形態において、本発明の医薬組成物として存在する抗体は、モノクローナル抗体である。
【００５９】
さらなる実施形態において、前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体あるいは、天然抗体または合成抗体のフラグメントである。
【００６０】
前記抗体は、本明細書でいう治療薬または診断薬は治療にまたは診断に有用な薬剤にカップリングさせることができる。
【００６１】
本発明の医薬組成物として存在するアンチセンス核酸は、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸の６〜５０、特に、１０〜３０、１５〜３０および２０〜３０の連続したヌクレオチドから成る配列を含むことができる。
【００６２】
さらなる実施形態において、直接、または核酸の発現によって本発明の医薬組成物により得られる腫瘍関連抗原またはその一部は、細胞の表面のＭＨＣ分子に結合し、前記結合によって、好ましくは、細胞溶解性応答が引き起こされ、および／またはサイトカインの放出が誘導される。
【００６３】
配列番号：１の核酸をターゲッティングするｓｉＲＮＡの特定の実施形態では、そのセンスＲＮＡ鎖が、配列番号：７０の配列を有し、そのアンチセンスＲＮＡ鎖が、配列番号：７１の配列を有するか、そのセンスＲＮＡ鎖が、配列番号：７２の配列を有し、そのアンチセンスＲＮＡ鎖が、配列番号：７３の配列を有する。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、医薬適合性の担体および／またはアジュバントを含む。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、腫瘍関連抗原の選択的発現または異常発現を特徴とする疾病の治療または予防に使用される。好ましい実施形態において、前記疾病は、腫瘍性疾患、好ましくは癌である。
【００６６】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、治療または予防に使用することができるワクチンの形態である。
【００６７】
そうしたワクチンは、好ましくは、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原もしくはその一部、および／または本発明に従って同定される腫瘍関連抗原もしくはその一部をコードする核酸を含む。
【００６８】
特定の実施形態において、前記核酸は、ウイルスまたは宿主細胞内に存在する。
【００６９】
本発明は、さらに、治療、予防、診断またはモニタリングする方法、すなわち、本発明に従って同定される一つ以上の腫瘍関連抗原の発現または異常発現を特徴とする疾病、好ましくは腫瘍性疾患、特に癌の、それらの退縮、進行、経過および／または発症の判定に、関する。
【００７０】
一つの実施形態において、前記治療または予防は、本発明の医薬組成物の投与を含む。
【００７１】
一般に、本発明の前記診断方法および／またはモニタリング方法は、患者から、好ましくは、前記疾病に罹患している、前記疾病に罹患しているもしくは罹患すると推測される、または前記疾患の可能性を有する患者から単離した生体サンプルにおける、（ｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸、（ｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部、（ｉｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部に対する抗体、および（ｉｖ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原もしくはその一部に特異的である、Ｔリンパ球、好ましくは細胞傷害性リンパ球もしくはＴヘルパーリンパ球、および／または前記腫瘍関連抗原もしくはその一部とＭＨＣ分子との複合体から成る群より選択される一つ以上のパラメータの量の検出および／または決定に関する。
【００７２】
前記量の検出および／または決定を遂行するための手段は、本明細書において説明するが、当業者には明らかである。
【００７３】
好ましくは、前記核酸、前記腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の存在ならびに／あるいは前記核酸、前記腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の量は、前記疾病でない患者と比較して増加し、前記疾病の存在または前記疾病の発現の可能性を示す。
【００７４】
本発明の診断および／またはモニタリング方法は、前記核酸、前記腫瘍関連抗原もしくは前記その一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の量の検出または決定により、前記疾病の転移挙動を評価および／または予測することが可能である実施形態、好ましくは、前記核酸、前記腫瘍関連抗原もしくは前記その一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の存在ならびに／あるいは前記核酸、前記腫瘍関連抗原もしくは前記その一部、前記抗体および／または前記Ｔリンパ球の量が、前記疾病でないまたは前記疾病の転移がない患者と比較して増加し、前記疾病の転移挙動または前記疾病の転移挙動の可能性を示す実施形態も含む。
【００７５】
特定の実施形態において、前記量の検出または決定は、（ｉ）腫瘍関連抗原もしくは前記その一部をコードする前記核酸に、前記腫瘍関連抗原もしくは前記その一部に、前記抗体もしくは前記その一部に、または前記Ｔリンパ球に特異的に結合する薬剤と生体サンプルを接触させること、および（ｉｉ）前記薬剤と、前記核酸もしくはその一部、前記腫瘍関連抗原もしくはその一部、前記抗体もしくはその一部または前記Ｔリンパ球の複合体の、形成を検出することまたは量を決定することを含む。
【００７６】
一つの実施形態において、前記疾病は、二つ以上の異なる腫瘍関連抗原の発現または異常発現を特徴とし、量の検出または決定は、二つ以上の異なる腫瘍関連抗原もしくはそれらの部分をコードする二つ以上の核酸の、二つ以上の異なる腫瘍関連抗原もしくはそれらの部分の、二つ以上の異なる腫瘍関連抗原にもしくはそれらの部分に結合する二つ以上の抗体の、および／または二つ以上の異なる腫瘍関連抗原もしくはそれらの部分に特異的な二つ以上のＴリンパ球の、あるいはＭＨＣ分子とそれらの複合体の、量の検出または決定を含む。さらなる実施形態では、患者から単離した生体サンプルを、比較可能な正常生体サンプルと比較する。
【００７７】
本発明のモニタリング方法は、好ましくは、第一時間点での第一サンプルおよびさらに第二時間点でのサンプルにおける上述のパラメータのうちの一つ以上の、量の検出および／または決定を含み、それら二つのサンプルを比較することにより、その疾病の経過を判定する。
【００７８】
本発明によると、核酸もしくはその一部の検出または核酸もしくはその一部の量の決定は、前記核酸もしくは前記その一部に特異的にハイブリダイズするオリゴ−もしくはポリヌクレオチドプローブを使用して行うことができ、または前記核酸もしくは前記その一部の選択的増幅により、例えば、ＰＣＲ増幅手段により、行うことができる。
【００７９】
一つの実施形態において、前記オリゴ−またはポリヌクレオチドプローブは、前記核酸の６〜５０、特に、１０〜３０、１５〜３０および２０〜３０の連続したヌクレオチドから成る配列を含む。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明の方法において検出またはその量の決定対象の腫瘍関連抗原もしくはその一部量は、細胞内の、細胞表面に、またはＭＨＣ分子との複合体として存在する。
【００８１】
本発明によると、腫瘍関連抗原もしくはその一部の検出、または腫瘍関連抗原もしくはその一部の量の決定は、前記腫瘍関連抗原または前記その一部に特異的に結合する抗体を使用して行うことができる。
【００８２】
本発明によると、抗体の検出または抗体の量の決定は、前記抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチドを使用して行うことができる。
【００８３】
本発明によると、腫瘍関連抗原もしくはその一部および／またはそれとＭＨＣ分子の複合体に対して特異的であるＴリンパ球の、検出または量の決定は、前記腫瘍関連抗原または前記その一部とＭＨＣ分子との複合体を提示する細胞を使用して行うことができる。
【００８４】
加えて、Ｔリンパ球は、ＭＨＣ分子と腫瘍関連抗原もしくはその一部との複合体によって特異的刺激されて誘発される、それらの増殖、それらのサイトカイン生産およびそれらの細胞傷害活性によって、検出することができる。Ｔリンパ球は、組換えＭＨＣ分子、または一つ以上の腫瘍関連抗原の免疫原性フラグメントと二つ以上のＭＨＣ分子の複合体を利用して検出することもできる。
【００８５】
本発明の方法における検出または量の決定に使用される薬剤、例えば、オリゴ−もしくはポリヌクレオチドプローブ、抗体、タンパク質もしくはペプチドまたは細胞は、好ましくは、検出可能な様式で、詳細には、検出可能なマーカー、例えば放射性マーカーまたは酵素マーカーによって、標識される。
【００８６】
特定の態様において、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現を特徴とする疾病を治療、予防、診断またはモニタリングする方法に関し、この方法は、前記腫瘍関連抗原またはその一部に結合する、および治療薬または診断薬にカップリングしている抗体の投与を含む。
【００８７】
前記抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。さらなる実施形態において、前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体または、天然抗体のフラグメントである。
【００８８】
そのような生体サンプルとしては、例えば、血液、血清、骨、髄、痰、気管支吸引液、および／または気管支洗浄液が挙げられる。
【００８９】
一つの特定の態様において、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現を特徴とする疾病に罹患している患者の治療方法に関し、この方法は、（ｉ）前記患者、または同じ種の別の個体、特に、健常な個体、または異なる種の個体、のいずれかから得られた免疫反応性細胞を含有するサンプルを提供すること、（ｉｉ）細胞溶解性Ｔ細胞の産生が前記腫瘍関連抗原またはその一部に対して有利に働く条件下で、前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞と前記サンプルを接触させること、および（ｉｉｉ）細胞溶解性Ｔ細胞を、前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する細胞を溶解させるのに適する量で患者に導入することを含む。一つの実施形態において、前記方法は、得られた細胞溶解性Ｔ細胞のＴ細胞受容体をクローニングすること、およびそのＴ細胞受容体をコードする核酸を、前記患者、または同じ種の別の個体、特に、健常な個体、または異なる種の個体、いずれかから得られたＴ細胞に移入することを含む、それらのＴ細胞は、このようにして所望の特異性を受け、例えば（ｉｉｉ）のもとで、患者に導入することができる。
【００９０】
一つの実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＨＣ分子を内因的に発現する。さらなる実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＨＣ分子および／または前記腫瘍関連抗原もしくはその一部を組換え発現する。
【００９１】
好ましくは、前記宿主細胞は、その表面に、ＭＨＣ分子によって前記腫瘍関連抗原またはその一部を提示する。前記宿主細胞は、好ましくは、非増殖性である。
【００９２】
好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【００９３】
本発明は、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現を特徴とする疾病の治療法にも関し、この方法は、（ｉ）異常な量の腫瘍関連抗原を発現する患者からの細胞を同定すること、（ｉｉ）前記細胞のサンプルを単離すること、（ｉｉｉ）前記細胞を培養すること、および（ｉｖ）前記細胞を、それらの細胞の免疫応答の誘発に適する量で、患者に導入することを含む。
【００９４】
本発明は、さらに（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸を基準にして縮重している核酸、および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的である核酸から成る群より選択される核酸に関する。
【００９５】
また、本発明は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、２９、３１、３６、４０、４２、４６、５０〜６０、６３、６８および６９から成る群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含むタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸に関する。
【００９６】
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸を含む組換え核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子に関する。
【００９７】
本発明は、本発明の核酸または組換え核酸分子を含有する宿主細胞にも関する。
【００９８】
前記宿主細胞は、ＭＨＣ分子をコードする核酸を含むこともできる。一つの実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＨＣ分子を内因的に発現する。
【００９９】
さらなる実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＨＣ分子および／あるいは本発明の核酸もしくは組換え核酸分子またはその部分を組換え発現する。
【０１００】
好ましくは、前記宿主細胞は、非増殖性である。好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【０１０１】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明に従って同定される核酸とハイブリダイズし、および遺伝子プローブとしてまたは「アンチセンス」分子として使用することができるオリゴヌクレオチドに関する。
【０１０２】
本発明に従って同定される核酸またはその部分とハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプライマーまたはコンピテントプローブの形態での核酸分子は、例えば、ＰＣＲ増幅、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションにより、本発明に従って同定される前記核酸に相同である核酸を見つけるために使用することができる。
【０１０３】
ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー下、さらに好ましくは中ストリンジェンシー下、および最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で行うことができる。
【０１０４】
さらなる態様において、本発明は、（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸を基準にして縮重している核酸、および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的である核酸から成る群より選択される核酸によってエンコードされる、タンパク質またはペプチドに関する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、２９、３１、３６、４０、４２、４６、５０〜６０、６３、６８および６９から成る群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む、タンパク質またはペプチドに関する。
【０１０５】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の免疫原性フラグメントに関する。前記フラグメントは、好ましくは、ＭＨＣ分子または抗体に、好ましくは、ヒトＨＬＡ受容体またはヒト抗体に結合する。
【０１０６】
本発明によると、フラグメントは、好ましくは、アミノ酸数が少なくとも６、詳細には、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０の配列を含む。
【０１０７】
この態様において、本発明は、特に、配列表の配列番号５１〜６０、６８および６９から成る群より選択される配列を有するまたは含むペプチド、その一部または誘導体に関する。
【０１０８】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部に結合する薬剤に関する。
【０１０９】
好ましい実施形態において、前記薬剤は、タンパク質またはペプチド、特に、抗体、Ｔ細胞受容体またはＭＨＣ分子である。
【０１１０】
さらなる実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組み合わせ技術によって産生された抗体、または抗体のフラグメントである。
【０１１１】
一つの好ましい実施形態において、本発明は、（ｉ）本発明に従って同定される腫瘍関連抗原またはその一部と（ｉｉ）本発明に従って同定される前記腫瘍関連抗原または前記その一部が結合するＭＨＣ分子との複合体に選択的に結合するが、（ｉ）または（ｉｉ）のみには結合しない抗体に関する。
【０１１２】
特に、本発明は、配列表の配列番号５１〜６０、６８および６９から成る群より選択される配列を有するまたは含むペプチド、その一部または誘導体に特異的に結合するような薬剤、特に抗体に関する。
【０１１３】
本発明によると、用語「結合」は、好ましくは、特異的結合に関する。「特異的結合」は、抗体などの薬剤が、エピトープなどのターゲットに、別のターゲットへの結合と比較して特異的に強く結合することを意味する。
【０１１４】
薬剤は、第二ターゲットの解離定数より低い解離定数（ＫＤ）を有する第一ターゲットに結合する場合、第二ターゲットと比較して強く第一ターゲットに結合する。
【０１１５】
好ましくは、その薬剤が特異的に結合するターゲットの解離定数（ＫＤ）は、その薬剤が特異的に結合しないターゲットの解離定数（ＫＤ）より、１０倍よりさらに、好ましくは２０倍よりさらに、さらに好ましくは５０倍よりさらに、さらにいっそう好ましくは１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍よりさらに低い。
【０１１６】
そうした特異的抗体は、例えば、上述のペプチドを使用して免疫することによって得ることができる。
【０１１７】
さらに、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原もしくはその一部に結合する本発明の薬剤または本発明の抗体と治療薬または診断薬とのコンジュゲートに関する。
一つの実施形態において、前記治療薬または診断薬は、毒素である。
【０１１８】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現を検出するためのキットに関し、このキットは、（ｉ）前記腫瘍関連抗原もしくはその一部をコードする核酸の、（ｉｉ）前記腫瘍関連抗原もしくはその一部の、（ｉｉｉ）前記腫瘍関連抗原もしくはその一部に結合する抗体の、および／または（ｉｖ）前記腫瘍関連抗原もしくはその一部またはそれらとＭＨＣ分子の複合体に対して特異的であるＴ細胞の、検出または量の決定のための薬剤を含む。
【０１１９】
一つの実施形態において、前記核酸またはその一部を検出するための薬剤は、前記核酸の選択的増幅のための核酸分子であり、それらは、前記核酸の６〜５０、特に、１０〜３０、１５〜３０および２０〜３０の連続したヌクレオチドから成る配列を含む。
(発明の詳細な説明)
【０１２０】
本発明によると、「参照」、例えば、参照サンプルまたは参照生物は、試験サンプルまたは試験生物、すなわち患者から本発明の方法において得られた結果を相関および比較するために使用することができる。
【０１２１】
一般に、前記参照生物は、健常な生物、詳細には、癌に罹患していない生物である。
【０１２２】
「参照値」は、十分に多数の参照を測定することにより、ある参照から経験的に決定できる。
【０１２３】
好ましくは、参照値は、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、好ましくは少なくとも５０、または好ましくは少なくとも１００の参照を測定することによって決定される。
【０１２４】
核酸の「誘導体」は、単一または多数の、例えば、少なくとも２、少なくとも４、または少なくとも６、好ましくは３以下、４以下、５以下、６以下、１０以下、１５以下または２０以下のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加が、前記核酸に存在することを意味する。さらに、用語「誘導体」は、ヌクレオチド塩基に基づく核酸の、糖またはリン酸に基づく化学的誘導体も含む。用語「誘導体」は、自然に発生しないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸も含む。
【０１２５】
本発明によると、核酸は、好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。本発明によると、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産高分子および化学合成分子を含む。
【０１２６】
本発明によると、核酸は、１本鎖または２本鎖および線状または共有結合環状閉鎖分子として存在し得る。
【０１２７】
本明細書で用いる場合、用語「ＲＮＡ」は、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。
【０１２８】
「リボヌクレオチド」は、ベータ−Ｄ−リボ−フラノース部分の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。
【０１２９】
この用語は、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、単離したＲＮＡ、例えば、部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産ＲＮＡ、ならびに一または二以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により天然ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。そうした改変としては、非ヌクレオチド材料の、例えば、ＲＮＡの末端（単数もしくは複数）への、または内部での、例えば、ＲＮＡの一または二以上のヌクレオチドでの付加を挙げることができる。
【０１３０】
ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非鎖ヌクレオチド、例えば、非天然ヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドも包む場合がある。これらの改変ＲＮＡは、類似体または非天然ＲＮＡの類似体と呼ばれることもある。
【０１３１】
本発明に記載する核酸は、好ましくは、単離されている。
本発明によると、用語「単離した核酸」は、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、インビトロで増幅されたこと、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産されたこと、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル−電気泳動分画によって、精製されたこと、または（ｉｖ）例えば化学合成によって、合成された核酸を意味する。単離した核酸は、組換えＤＮＡ法による操作に利用可能な核酸である。
【０１３２】
ある核酸は、別の核酸に、それら二つの配列が互いにハイブリダイズでき、安定な２本鎖を形成できる場合、「相補的」であり、このハイブリダイゼーションは、好ましくは、ポリヌクレオチド間で特異的ハイブリダイゼーションできる条件（ストリンジェント条件）のもとで行われる。
【０１３３】
ストリンジェント条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％  ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。
【０１３４】
ハイブリダイゼーション後、そのＤＮＡを導入した膜を、例えば、２×ＳＣＣ、室温で洗浄し、その後、０．１〜０．５×ＳＣＣ／０．１×ＳＤＳ中、６８℃以下の温度で洗浄する。
【０１３５】
本発明によると、相補的核酸は、少なくとも４０％、詳細には、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、および好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のヌクレオチドを有する。
【０１３６】
用語「同一性百分率」は、最高アラインメント後に得られる、比較対象の二配列間の同一性であり、ヌクレオチドのまたはアミノ酸残基の百分率を示すためのものである。
【０１３７】
この百分率は、純粋に統計学的なものであり、それら二配列間の差は、ランダムに、且つ、それらの全長にわたって分配される。
【０１３８】
従来、二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の配列比較は、これらの配列を、それらを最適にアラインした後、比較することによって適便に行い、前記比較をセグメントごとにまたは配列類似の局所的範囲を特定し、比較する「比較領域（window of comparison）」ごとに行っていた。
【０１３９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業に加え、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所ホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所ホモロジーアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、作成される。
【０１４０】
比較対象の二つの配列間の同一位置の数を測定し、この数を、比較した位置の数で割り、得られた結果に１００をかけることにより同一性百分率を計算して、これら二配列間の同一性百分率を得る。
【０１４１】
本発明によると、腫瘍関連抗原をコードする核酸は、単独もしくは、他の核酸、特に、異種核酸との組み合わせで存在する。
【０１４２】
好ましい実施形態において、核酸は、前記核酸に対して相同、または非相同である、発現制御配列または調節配列に機能的に連結される。
【０１４３】
コーディング配列の発現または転写が、調節配列の制御下または影響下にあるように、それらが、互いに共有結合で連結されている場合、そのコーディング配列とその調節配列は、互いに「機能的に」連結されていることとなる。
【０１４４】
コーディング配列を機能的タンパク質に翻訳すべき場合には、前記コーディング配列に機能的に連結された調節配列を用いてその調節配列を導入して、そのコーディング配列内でのフレームシフト、または所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳することができない前記コーディング配列が生じないように、前記コーディング配列を転写する。
【０１４５】
本発明によると、用語「発現制御配列」または「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および遺伝子の発現を調節する他の制御要素を含む。
【０１４６】
本発明の特定の実施形態において、前記発現制御配列を、調節することができる。調節配列の正確な構造は、種または細胞タイプを関数として変化し得るが、一般に、転写開始および翻訳開始に関与する５'非転写配列および５'非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含む。
【０１４７】
さらに具体的には、５'非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御を行うプロモーター配列を含むプロモーター領域である。調節配列は、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含む。
【０１４８】
本発明によると、さらに、核酸は、タンパク質の分泌を制御するペプチドまたはの宿主細胞の前記核酸がエンコードするペプチドをコードする、別の核酸との組み合わせで存在する。
【０１４９】
本発明によると、核酸は、コード化タンパク質を引き起こすペプチド、または宿主細胞の細胞膜上に結合するまたは前記細胞の特定の細胞器官に区画化させるペプチド、をコードする別の核酸との組み合わせで存在する。
同様に、核酸の組み合わせにより、レポーター遺伝子または任意の「タグ」を表すことが可能である。
【０１５０】
好ましい実施形態において、本発明によると、組換え核酸は、ベクターであり、適切な場合にはプロモーターを伴って、核酸、例えば本発明に従って同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸、の発現を制御する。
【０１５１】
用語「ベクター」は、ここではその最も一般的な意味で用いており、ならびに核酸を、例えば、原核細胞および／または真核細胞への導入および適切な場合にはゲノムへの組み込みを可能にする、核酸のためのあらゆる媒介物を含む。
【０１５２】
この種のベクターは、好ましくは、それらの細胞内で複製され、および／または発現される。媒介物は、例えば、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイル衝撃、リポソーム投与、アグロバクテリアを利用した導入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスを介した挿入における使用に適用できる。
【０１５３】
ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。
【０１５４】
本発明に従って同定した腫瘍関連抗原をコードする核酸は、宿主細胞のトランスフェクションに使用することができる。
【０１５５】
ここでの核酸は、組換えＤＮＡと組換えＲＮＡの両方を意味する。組換えＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートのインビトロ転写によって作製することができる。
【０１５６】
さらに、これは、適用前に、安定化配列、キャッピングおよびポリアデニル化によって修飾することができる。
【０１５７】
本発明によると、用語「宿主細胞」は、外来性核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞を示す。
【０１５８】
本発明によると、用語「宿主細胞」は、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。
哺乳動物細胞、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類からの細胞が、特に好ましい。
【０１５９】
これらの細胞は、多種の細胞タイプに由来し、霊長類細胞および霊長類細胞系統を含むことができる。
【０１６０】
具体的には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞、および胚性幹細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【０１６１】
核酸は、宿主細胞内に、単一のコピーの形、または二つ以上のコピーの形で存在し、ならびに一つの実施形態では、宿主細胞において発現される。
【０１６２】
本発明によると、用語「発現」は、その最も一般的な意味で用いており、ならびにＲＮＡの生産、またはＲＮＡおよびタンパク質の生産を含む。
【０１６３】
また、「発現」には、核酸の部分的発現を含む。さらに、発現は、一過的に、または安定的に遂行される。哺乳動物細胞における好ましい発現系は、ｐｃＤＮＡ３．１およびｐＲｃ／ＣＭＶ（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含み、これらは、選択可能マーカー、例えば、Ｇ４１８に対する耐性を付与する（および従って、安定的にトランスフェクトされた細胞系統の選択を可能にする）遺伝子、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサー−プロモーター配列を含有する。
【０１６４】
ＭＨＣ分子が腫瘍関連抗原またはその一部を提示する本発明の場合、発現ベクターが、前記ＭＨＣ分子をコードする核酸配列も含む。
ＭＨＣ分子をコードする核酸配列を、腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸として同じ発現ベクター上に提示させることができ、または両方の核酸を、異なる発現ベクター上に提示させることができる。後者の場合では、二つの発現ベクターを一つの細胞に共トランスフェクトすることができる。
【０１６５】
宿主細胞が、腫瘍関連抗原またはその一部もＭＨＣ分子も発現しない場合、それらをコードする両方の核酸をその細胞に、同じ発現ベクターでトランスフェクトでき、または異なる発現ベクターでトランスフェクトできる。
【０１６６】
その細胞が、ＭＨＣ分子をはじめから発現する場合、腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸配列のみをその細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１６７】
本発明は、腫瘍関連抗原をコードする核酸の増幅のためのキットも含む。こうしたキットは、例えば、腫瘍関連抗原をコードする核酸にハイブリダイズする一対の増幅プライマーを含む。
【０１６８】
前記プライマーは、好ましくは、プライマー二量体の形成を回避するために、前記核酸配列の６〜５０、特に、１０〜３０、１５〜３０および２０〜３０の連続したヌクレオチドから成る配列を含み、オーバーラップが無い。
【０１６９】
前記プラマーの一方は、腫瘍関連抗原をコードする核酸の一つの鎖にハイブリダイズし、他方のプライマーは、その腫瘍関連抗原をコードする核酸を増幅させることができる配列のその相補鎖にハイブリダイズするができる。
【０１７０】
「アンチセンス分子」または「アンチセンス核酸」は、核酸の発現を調節するために、特に、減少させる、ために使用することができる。
【０１７１】
本発明によると、用語「アンチセンス分子」または「アンチセンス核酸」は、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチドまたは修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドであって、に生理条件下で、特定の遺伝子を含むＤＮＡに、または前記遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって前記遺伝子の転写および／または前記ｍＲＮＡの翻訳を阻害する、オリゴヌクレオチドを指す。
【０１７２】
本発明によると、「アンチセンス分子」は、その天然プロモーターに対して逆の配向を有する核酸またはその一部を含有する構造体も含む。
【０１７３】
核酸またはその一部のアンチセンス転写ものは、酵素を特定する天然ｍＲＮＡと共に２本鎖を形成することができ、それ故、そのｍＲＮＡの蓄積および活性酵素への翻訳を阻害することができる。
【０１７４】
もう一つの利用可能性としては、核酸を不活性化するリボザイムとして使用できる。本発明に従って好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸の６〜５０、特に、１０〜３０、１５〜３０および２０〜３０の連続したヌクレオチドから成る配列を有し、好ましくは、そのターゲット核酸またはその一部に完全に相補的である。
【０１７５】
好ましい実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端または５'上流部位、例えば、翻訳開始部位、転写開始部位またはプロモーター部位とハイブリダイズする。さらなる実施形態において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３'非翻訳領域またはｍＲＮＡスプライシング部位とハイブリダイズする。
【０１７６】
一つの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、一つのヌクレオチドの５'末端ともう一つのヌクレオチドの３'末端が、ホスホジエステル結合によって互いに連結されている、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの組み合わせから成る。これらのオリゴヌクレオチドは、従来の様式で合成することができ、または組換え生産することができる。
【０１７７】
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、「修飾」オリゴヌクレオチドである。
【０１７８】
ここで、オリゴヌクレオチドは、そのターゲットに結合するその能力を損なうことなく、例えば、その安定性または治療有効度を増大させる目的で、様々な方法で修飾することができる。本発明によると、用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、（ｉ）その少なくとも二つヌクレオチドが、合成ヌクレオシド間結合（つまり、ホスホジエステル結合ではないヌクレオシド間結合）によって互いに連結されている、および／または（ｉｉ）核酸内に通常見いだされない化学基で、そのオリゴヌクレオチドが共有結合で連結している、オリゴヌクレオチドを意味する。
【０１７９】
好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスフェート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸三エステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【０１８０】
用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、共有結合修飾塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドも含む。
【０１８１】
「修飾オリゴヌクレオチド」は、例えば、その３'位のヒドロキシル基およびその５'位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖残基を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１８２】
修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、２'−Ｏ−アルキル化リボース残基、またはリボースではない別の糖、例えばアラビノースを含むことができる。
【０１８３】
オリゴヌクレオチドに関して上で説明したすべての実施形態がポリヌクレオチドにも適用することが可能である。
【０１８４】
本明細書で用いる場合、「低分子干渉ＲＮＡ」すなわち「ｓｉＲＮＡ」は、好ましくは長さが１０ヌクレオチドより大きい、さらに好ましくは長さが１５ヌクレオチドより大きい、および最も好ましくは長さが１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの、単離したＲＮＡ分子を意味し、ターゲット遺伝子の同定またはｍＲＮＡの分解に用いられる。
【０１８５】
ヌクレオチド数１９〜２５の範囲が、ｓｉＲＮＡに最も好ましいサイズである。
【０１８６】
本発明のｓｉＲＮＡは、部分精製ＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡまたは組換え生産ＲＮＡ、ならびに一または二以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により天然ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含むことができる。そうした改変としては、非ヌクレオチド材料の、例えば、ｓｉＲＮＡの末端（単数もしくは複数）への、もしくはｓｉＲＮＡの一または二以上の内部ヌクレオチドなどへの付加；ｓｉＲＮＡを耐ヌクレアーゼ分解性にする修飾（例えば、２'−置換リボヌクレオチドの使用もしくは糖−リン酸骨格への修飾）；またはｓｉＲＮＡ内の一または二以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドを置換することを挙げることができる。
【０１８７】
さらに、修飾オリゴヌクレオチドについて上記で説明したように、ｓｉＲＮＡを修飾して、特に一または二以上のホスホロチオエート結合を導入して、その安定性を増加させることができる。
【０１８８】
また、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖が、３'−オーバーハングを含むことができる。本明細書で用いる場合、「３'−オーバーハング」は、ＲＮＡ鎖の３'末端から伸びる少なくとも一つの非対合ヌクレオチドを指す。
【０１８９】
従って、一つの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、長さが１から約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む）、好ましくは長さが１から約５ヌクレオチド、さらに好ましくは長さが１から約４ヌクレオチド、および特に好ましくは、長さが約２から約４ヌクレオチドの、少なくとも一つの３'−オーバーハングを含む。ｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖が３'−オーバーハングを含む実施形態において、それらのオーバーハングの長さは、各鎖について同じであっても、または異なってもよい。
【０１９０】
最も好ましい実施形態において、３'−オーバーハングは、そのｓｉＲＮＡの両方の鎖上に存在し、長さは２ヌクレオチドである。例えば、本発明のｓｉＲＮＡの各鎖は、ジデオキシチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）などの３'−オーバーハングを含むことができる。
【０１９１】
あるいは、ピリミジンヌクレオチドを修飾類似体に置換すること、例えば、２'−デオキシチミジンに３'−オーバーハング内のウリジンヌクレオチドを置換することが可能であり、それによりＲＮＡｉ分解効率に影響を及ぼさない。
【０１９２】
特に、組織培地において、２'−デオキシチミジン内に２'−ヒドロキシルが存在していないため、３'−オーバーハングのヌクレアーゼ耐性を有意に強化できる。
【０１９３】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、二つの相補的１本鎖ＲＮＡ分子を含む場合があり、または二つの相補的部分が塩基対合しており、且つ、１本鎖の「ヘアピン」領域によって共有結合で連結されている１本鎖分子を含むことができる。
【０１９４】
すなわち、センス領域およびアンチセンス領域は、リンカー分子によって共有結合で接続することができる。前記リンカー分子は、ポリヌクレオチドリンカー、または非ヌクレオチドリンカーである。
【０１９５】
どの理論においても、後者のタイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、「ダイサー」タンパク質（またはその等価物）によって細胞間で切断されて、二つの個別の塩基対合ＲＮＡ分子から成るｓｉＲＮＡが形成すると考えられている。
【０１９６】
本明細書で用いる場合、「ターゲットｍＲＮＡ」は、ダウンレギュレーションのターゲットであるＲＮＡ分子を指す。
【０１９７】
ｓｉＲＮＡは、ターゲッティング部位を変えることなくｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターから発現させることができる。
【０１９８】
ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現は、最初に転写される核酸がプリンであるときにしか有効でないと考えられるからである。
【０１９９】
本発明のｓｉＲＮＡは、任意のターゲットｍＲＮＡ配列（「ターゲット配列」）内の約１９〜２５の連続したヌクレオチドから成る任意のひと配列にターゲッティングすることができる。ｓｉＲＮＡについてのターゲット配列を選択する技術は、例えば、２００２年１０月１１日改定のＴｕｓｃｈｌ  Ｔ．らの「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」（この全開示は、本明細書に参照として取り入れられている）に開示されている。「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」は、Ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ上の、米国、ニューヨークのＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙのＤｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌが管理するウェブサイトで利用可能であり、そのＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウェブサイトにアクセスし、「ｓｉＲＮＡ」のキーワードで検索することにより見つけることができる。
【０２００】
従って、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、そのターゲットｍＲＮＡ内の約１９から約２５ヌクレオチドの任意の連続したひと配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２０１】
一般に、このターゲットｍＲＮＡ上のターゲット配列は、好ましくは開始コドンから５０から１００ｎｔ下流で（すなわち、３'方向で）開始する、そのターゲットｍＲＮＡと一致する所与のｃＤＮＡ配列から選択することができる。
【０２０２】
しかし、ターゲット配列が、５'もしくは３'非翻訳領域、または開始コドンの付近の領域に位置する場合もある。
【０２０３】
ｓｉＲＮＡは、当業者には公知の多数の技術を使用して得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、当該技術分野において公知の方法、例えば、Ｔｕｓｃｈｌらの米国特許公開出願２００２／００８６３５６（この全開示は、本明細書に参照として取り入れられている）に記載されているショウジョウバエインビトロ系、を使用して、化学合成または組換え生産することができる。
【０２０４】
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、適切に保護したリボヌクレオシドホスホロアミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して化学合成する。
ｓｉＲＮＡは、二つの別個の相補的ＲＮＡ分子として、または二つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として、合成することができる。
【０２０５】
あるいは、任意の適切なプロモーターを使用して、組換え環状ＤＮＡプラスミドまたは線状ＤＮＡプラスミドからｓｉＲＮＡを発現させることもできる。本発明によると、本明細書においてｓｉＲＮＡの投与または医薬組成物へのｓｉＲＮＡへの組み込みを指す場合、こうした実施形態を含む。
【０２０６】
プラスミドからの本発明のｓｉＲＮＡの発現に適するプロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター配列またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列を含み、サイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。
【０２０７】
他の適するプロモーターの選択は、当該技術分野における技術の範囲内である。
また、本発明の組換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境でのｓｉＲＮＡの発現を誘導しまたは調節するプロモーターを含むことができる。
【０２０８】
組換えプラスミドから発現したｓｉＲＮＡは、標準的な技術によって培養細胞発現系から単離することができ、または細胞内で発現させることができる。
【０２０９】
インビボで細胞にｓｉＲＮＡを輸送するための組換えプラスミドの使用については、より詳細に以下で論じる。
【０２１０】
ｓｉＲＮＡは、二つの別個の相補的ＲＮＡ分子として、または二つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として、組換えプラスミドから発現させることができる。
【０２１１】
ｓｉＲＮＡを発現させることに適するプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現させるために核酸配列をプラスミドに挿入する方法、および対象となる細胞への組換えプラスミドの輸送方法は、当該技術分野における技能の範囲内である。
【０２１２】
ｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターからインビボの細胞内で発現させることもできる。前記組換えウイルスベクターは、ｓｉＲＮＡのエンコード配列、およびそれらのｓｉＲＮＡ配列を発現させるために適する任意のプロモーターを含む。
【０２１３】
前記組換えウイルスベクターは、特定の組織または特定の細胞内環境でのｓｉＲＮＡの発現を誘導しまたは調節するプロモーターを含むことができる。
【０２１４】
ｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターから、二つの別個の相補的ＲＮＡ分子として、または二つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として発現させることができる。
【０２１５】
用語「ペプチド」は、オリゴ−およびポリペプチドを包含し、ならびにペプチド結合によって共有結合で連結された２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６より多く、好ましくは２１以上で、好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０、特に１００以下のアミノ酸を含む物質を指す。
【０２１６】
用語「タンパク質」は、大きなペプチド、好ましくは、１００より多くのアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に、用語「ペプチド」および「タンパク質」は、同義語であり、本明細書では同義で用いている。
【０２１７】
好ましくは、本発明に従って記載するタンパク質およびペプチドは、単離されている。用語「単離したタンパク質」または「単離したペプチド」は、タンパク質またはペプチドがその天然の環境から分離されていることを意味する。
【０２１８】
単離したタンパク質またはペプチドは、本質的に精製されている状態にある。用語「本質的に精製されている」は、そのタンパク質またはペプチドに、自然界でまたはインビボで随伴する他の物質が本質的にないことを意味する。
【０２１９】
こうしたタンパク質およびペプチドは、例えば、抗体を産生する際に、および免疫学的もしくは診断アッセイの際に、または治療薬として、使用することができる。
【０２２０】
本発明に従って記載するタンパク質およびペプチドは、生体サンプル、例えば組織または細胞から単離することができ、様々な原核または真核発現系において組換え発現させることもできる。
【０２２１】
本発明のために、タンパク質もしくはペプチドの、またはアミノ酸配列の「誘導体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。
【０２２２】
アミノ酸挿入変異体は、アミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合を含み、また単一または二つ以上の特定のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基が挿入されている。
【０２２３】
挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、一または二以上のアミノ酸残基をアミノ酸配列内の特定の部位に挿入するが、ランダム挿入による産物を適切にスクリーニングすることによっても可能である。
【０２２４】
アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも一つの残基が除去され、その場所に別の残基が挿入されることを特徴とする。
【０２２５】
相同タンパク質もしくはペプチド間で保存されないアミノ酸配列内の位置での修飾、および／またはアミノ酸の、類似した特性、例えば疎水性、親水性、電気陰性度、側鎖の体積など、を有する他のものでの置換（保存的置換）が好ましい。
【０２２６】
保存的置換は、例えば、あるアミノ酸と、置換対象のアミノ酸と同じグループ内の下に列挙する別のアミノ酸との交換に関する：
１．小さな脂肪族の、非極性あるいはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
２．負のチャージを帯びた残基およびそれらのアミド：Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．正のチャージを帯びた残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大きな脂肪族の、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【０２２７】
３残基が、タンパク質構造において特定の役割を果たすため、括弧にて示されている。Ｇｌｙは、側鎖を有さない唯一の残基であり、これにより鎖に柔軟性を付与する。Ｐｒｏは、独特の配置を有しており、これによりポリペプチド構造の相当な変化を導くことができる。Ｃｙｓは、分子内、またはもう一つのＣｙｓとの分子間のジスルフィド架橋を形成することができる。
【０２２８】
上で説明したアミノ酸変異体は、公知ペプチド合成技術を利用して、例えば、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４）および類似の方法または組換えＤＮＡ操作などによって、容易に作製することができる。置換、挿入または欠失を有するタンパク質およびペプチドを作製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に詳細に記載されている。
【０２２９】
本発明によると、タンパク質およびペプチドの「誘導体」は、タンパク質またはペプチドに結合する任意の分子、例えば、カルボキシレート、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチド、の単一または多数の置換、欠失および／または付加も含む。
【０２３０】
用語「誘導体」は、前記タンパク質およびペプチドのすべての機能的化学的等価物にも及ぶ。
【０２３１】
本発明によると、好ましくは、腫瘍関連抗原の一部またはフラグメントは、それを採取したタンパク質またはペプチドの機能特性を有する。こうした機能特性は、抗体との相互作用、他のペプチドまたはタンパク質との相互作用、核酸の選択的結合および酵素活性を含む。
【０２３２】
本発明の腫瘍関連抗原の一部またはフラグメントは、好ましくは、その腫瘍関連抗原の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０の連続したアミノ酸から成る配列を含む。
【０２３３】
本発明の腫瘍関連抗原の一部またはフラグメントは、その腫瘍関連抗原の８以下、特に、１０以下、１２以下、１５以下、２０以下、３０以下または５５以下の連続したアミノ酸から成る配列を含む。腫瘍関連抗原の一部またはフラグメントは、好ましくは、非膜貫通部分、特に、その抗原の細胞外部分に一致する、腫瘍関連抗原の一部である、またはそれらを含有する。
【０２３４】
本発明の腫瘍関連抗原の好ましい部分またはフラグメントは、特に、インビボでの細胞傷害性Ｔリンパ球の刺激に適するだけでなく、エクスビボでの治療的養子移入のための拡張または刺激Ｔリンパ球産生にも適する。
【０２３５】
本発明によると、腫瘍関連抗原をコードする核酸の一部またはフラグメントは、上記で定義したような、腫瘍関連抗原および／または前記腫瘍関連抗原の一部もしくはフラグメントを少なくともコードする核酸の部分に関する。
【０２３６】
腫瘍関連抗原をコードする核酸の一部またはフラグメントは、好ましくは、そのオーブンリーディングフレームに一致する核酸の部分である。
【０２３７】
本発明によると、特定の実施形態は、腫瘍関連抗原に由来する「ドミナントネガティブ」タンパク質またはペプチドを生産する方が好ましい。
【０２３８】
ドミナントネガティブタンパク質またはペプチドとは、細胞機構との相互作用により、細胞機構とのその相互作用から活性タンパク質もしくはペプチドを除いたり、またはその活性タンパク質もしくはペプチドと競合し、それによって前記活性タンパク質の効果を減少させる、不活性タンパク質またはペプチド変異体である。
【０２３９】
ターゲットタンパク質に特異的に結合する特定の抗体を含有する抗血清は、様々な標準的なプロセスで作製することができる。
【０２４０】
例えば、Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎによる「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３７２２−９；Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅによる「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２およびＥｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗによる「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」ＩＳＢＮ  ０８７９６９５４４７参照。
【０２４１】
それによって、アファイン、および天然形の複合膜タンパク質を認識する特異的抗体を産生させることもできる（Ａｚｏｒｓａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２９：３５−４８，１９９９；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８９９−１９０４，１９８９；Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３４：１０７−１１６，２０００）。
【０２４２】
これは、治療的に使用することができる抗体の作製だけでなく、多くの診断用途にも特に適する。これに関しては、全タンパク質で、細胞外部分配列で、ならびに生理的にフォールディングした形態のターゲット分子を発現する細胞で免疫することができる。
【０２４３】
モノクローナル抗体は、伝統的にはハイブリドーマ技術を使用して作製される。（技術の詳細については、Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎによる「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３７２２−９；Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅによる「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ＩＳＢＮ：  ０８７９６９３１４２；Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗによる「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」  ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７参照）。
【０２４４】
抗体分子の小部分のパラトープ、のみが、抗体のそのエピトープへの結合に関与することは、公知である（Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６），Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ参照）。
【０２４５】
そのｐＦｃ'およびＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。
【０２４６】
ｐＦｃ'領域が酵素的に除去されたまたはｐＦＣ'領域なしで産生された抗体は、Ｆ（ａｂ'）２フラグメントと呼ばれ、完全抗体の両方の抗原結合部位を有する。
【０２４７】
同様に、Ｆｃ領域が酵素的に除去されたまたは前記Ｆｃ領域なしで産生された抗体は、Ｆａｂフラグメントと呼ばれ、無傷抗体分子の一方の抗原結合部位を有する。
【０２４８】
さらに、Ｆａｂフラグメントは、抗体の共有結合Ｌ鎖と前記抗体のＨ鎖の一部とから成り、Ｆｄと呼ばれる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主決定因子であり（単一Ｆｄフラグメントは、抗体の特異性を改変することなく、１０以下の異なるＬ鎖と会合することができる）、Ｆｄフラグメントは、単離しても、エピトープに結合する能力を保持している。
【０２４９】
抗原エピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）およびパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）は、抗体の抗原結合部分内に位置する。ＩｇＧ免疫グロブリンのＨ鎖のＦｄフラグメントとＬ鎖のＦｄフラグメントの両方が、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によって、それぞれ、隔てられている４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）を含有する。
これらのＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、さらに特にＨ鎖のＣＤＲ３領域は、大いに、抗体特異性に関与する。
【０２５０】
これが、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲおよび／またはＦＣ／ｐＦｃ'領域に共有結合で連結させて機能的抗体を産生することで、「ヒト化」抗体の開発を可能にした。
【０２５１】
もう一つの例として、ＷＯ  ９２／０４３８１には、マウスＦＲ領域の少なくとも一部がヒト起源のＦＲ領域で置換されているヒト化マウスＲＳＶ抗体の産生および使用が記載されている。この種の抗体は、抗原結合能力を有する無傷抗体のフラグメントを含み、多くの場合、「キメラ」抗体と呼ばれる。
【０２５２】
本発明によると、用語「抗体」は、抗体のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメント；Ｆｃおよび／またはＦRおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＬ鎖−ＣＤＲ３領域が相同ヒト配列または非ヒト配列で置換されている、キメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＬ鎖−ＣＤＲ３領域が相同ヒト配列または非ヒト配列で置換されている、キメラＦ（ａｂ'）２−フラグメント抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＬ鎖−ＣＤＲ３領域が、相同ヒト配列または非ヒト配列で置換されている、キメラＦａｂ−フラグメント抗体；ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、相同ヒト配列または非ヒト配列で置換されているキメラＦｄ−フラグメント抗体も含む。
【０２５３】
用語「抗体」は、「１本鎖」抗体も含む。
【０２５４】
本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合するタンパク質およびペプチドも含む。この種の結合物質は、例えば、免疫された形態で簡単に溶液中で作製することができる縮重ペプチドライブラリによって、または同様にしてファージ・ディスプレイ・ライブラリによっても、得ることができる。
【０２５５】
同様に、一または二以上のアミノ酸を有するペプチドのコンビナトリアルライブラリを作製することもできる。さらに、ペプトイドおよび非ペプチド合成残基のライブラリを作製することもできる。
【０２５６】
腫瘍関連抗原を発現する細胞および組織を表示するために特定の診断用物質に抗体をカップリングさせることもできる。さらに、治療に有用な物質にそれらをカップリングさせることもできる。
【０２５７】
診断用物質は、（ｉ）検出可能なシグナルを出し；（ｉｉ）第二標識と相互作用して、第一もしくは第二標識、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）から出た検出可能なシグナルを修飾し；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状もしくは他の物理的パラメータによって移動度、例えば電気泳動移動度、に影響を及ぼす、または（ｉｖ）捕捉部分、例えば、親和性、抗体／抗原もしくはイオン錯体形成を生じさせる、ように機能する任意の標識、を含む。蛍光標識；発光標識；発色団標識；放射性同位体標識；同位体標識、好ましくは安定な同位体標識；同重体標識；酵素標識；粒子標識、特に金属粒子標識、磁性粒子標識、ポリマー粒子標識；小さな有機分子、例えばビオチン；受容体または結合分子、例えば細胞付着タンパク質もしくはレクチンのリガンド；結合剤の使用により検出することができる、核酸および／またはアミノ酸残基を含む標識配列などのような構造が、標識として適する。
【０２５８】
診断物質は、限定されないが、硫酸バリウム、ヨーセタム酸、ヨーパン酸、カルシウムイポデート、ジアトリゾエートナトリウム、メグルミンジアトリゾエート、メトリザミド、チロパノエートナトリウムおよび放射線診断薬（陽電子放射体、例えばフッ素−１８および炭素−１１）、ガンマ線放射体、例えばヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１、核磁気共鳴用核種、例えばフッ素およびガドリニウム、を含む）を含む。
【０２５９】
本発明によると、用語「治療に有用な物質」は、治療効果を発揮することができる任意の分子を意味する。本発明によると、治療に有用な物質は、好ましくは、一または二以上の腫瘍関連抗原を発現する細胞に選択的に誘導されるものであり、抗癌剤、放射性ヨウ素標識化合物、毒素、細胞増殖抑制薬または細胞溶解薬などを含む。
【０２６０】
抗癌剤は、例えば、アミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビジン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン−α、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトタン、プロカルバジンＨＣｌ、チオグアニン、硫酸ビンブラスチンおよび硫酸ビンクリスチンを含む。
【０２６１】
他の抗癌剤は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．、特に、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５２（Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉ  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ））に記載されている。
【０２６２】
毒素は、タンパク質、例えば、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素または緑膿菌外毒素であり得る。残留毒素が、コバルト−６０などの高エネルギー放出性放射性核種である場合もある。
【０２６３】
用語「主要組織適合性複合体」または「ＭＨＣ」は、すべての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体を指す。ＭＨＣタンパク質または分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識のためにペプチドに結合し、それらを提示することにより、正常免疫反応における白血球と抗原提示細胞の間のシグナリングに関与する。
【０２６４】
ＭＨＣ分子は、細胞内プロセッシング区画内のペプチドに結合し、Ｔ細胞による認識のために抗原提示細胞の表面にこれらのペプチドを提示する。ＨＬＡとも呼ばれるヒトＭＨＣ領域は、染色体６上に位置し、クラスＩおよびクラスＩＩ領域を含む。
【０２６５】
本発明のすべての態様のうちの一つの好ましい実施形態において、ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ分子である。
【０２６６】
本明細書で用いる場合、「減少させる」または「阻害する」は、レベル、例えば、タンパク質またはｍＲＮＡのレベルに関して、参照サンプル（例えば、ｓｉＲＮＡで処理していないサンプル）と比較して、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上、および最も好ましくは７５％以上のレベルで総合的減少を生じさせることができることを意味する。
【０２６７】
このＲＮＡまたはタンパク質発現の減少または阻害は、ターゲットにしたｍＲＮＡ切断または分解により発生し得る。
【０２６８】
タンパク質発現または核酸発現についてのアッセイは、当該技術分野において公知であり、例えば、タンパク質発現についての、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、およびＲＮＡについての、ノーザンブロットまたはリボヌクレアーゼ保護アッセイを含む。
【０２６９】
本発明によると、用語「患者」は、人類、非ヒト霊長類または別の動物、特に哺乳類、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯動物、例えばマウスおよびラットを意味する。特に好ましい実施形態において、患者は、人類である。
【０２７０】
本発明によると、「異常発現」は、発現が、健常な個体における状態と比較して改変される、好ましくは増加されることを意味する。
【０２７１】
本発明によると、用語「増加した」または「増加した量」は、好ましくは、少なくとも１０％、特に、少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％の増加を意味する。物質の量は、それが、試験サンプルでは検出できるが、参照サンプルでは不在または検出できない場合、その参照サンプルと比較したその試験サンプル、例えば生体サンプル、の増加でもある。
【０２７２】
本発明によると、用語「疾病」は、腫瘍関連抗原が発現または異常発現される、あらゆる病的状態を指す。本発明によると、「異常発現」は、発現が、健常な個体における状態と比較して改変される、好ましくは増加されることを意味する。
【０２７３】
発現の増加は、少なくとも１０％、特に、少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％の増加を指す。一つの実施形態において、腫瘍関連抗原は、罹病個体の組織においてしか発現されず、一方、健常な個体における発現は、抑制される。
【０２７４】
こうした疾病の一例は、癌であり、本発明によると、用語「癌」は、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液の癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸の癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、胃腸の癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳、鼻および咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌および肺癌ならびにこれらの転移を含む。
それらの例は、肺癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、または上に記載した癌タイプまたは腫瘍の転移である。本発明によると、癌という用語は、癌転移も含む。
【０２７５】
「腫瘍」は、急速な無制御細胞増殖によって増殖し、新たな増殖停止を開始させる刺激後も増殖し続ける、異常な細胞または組織群を意味する。
腫瘍は、構造的機構および正常な組織との機能協調を部分的にまたは完全に欠如しており、通常、異質な組織塊を形成し、これは、良性である場合も、または悪性である場合もある。
【０２７６】
「転移」は、癌細胞のその原発部位から身体の別の部分への拡大を意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の解離、細胞外基質の浸潤、体腔および血管に入るための内皮基底膜侵入、およびその後、血液により輸送された後、
ターゲット器官の浸潤に依存する。最後に、ターゲット部位での新たな腫瘍の増殖は、血管形成に依存する。
腫瘍転移は、残存した腫瘍細胞または腫瘍成分が転移能力を維持および発達できるので、多くの場合、原発腫瘍の除去後でさえ発生する。一つの実施形態において、本発明の用語「転移」は、原発腫瘍および局所リンパ節系から遠く離れた転移を示す「遠隔転移」に関する。
【０２７７】
本発明によると、生体サンプルは、体液を含む組織サンプル、および／または細胞サンプルであってもよく、ならびに従来の様式で、例えば、パンチ生検を含む組織生検により、および血液、気管支吸引液、痰、尿、糞便または他の体液の採取により、得ることができる。本発明によると、用語「生体サンプル」は、生体サンプルのフラグメントも含む。
【０２７８】
本発明によると、用語「免疫反応性細胞」は、適切な刺激で免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞または細胞溶解性Ｔ細胞）に成熟することができる細胞を意味する。
【０２７９】
免疫反応性細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未成熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞ならびに未成熟Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞を含む。腫瘍関連抗原を認識する細胞溶解性Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞の産生を望む場合、免疫反応性細胞と、腫瘍関連抗原を発現する細胞とを、細胞溶解性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞の産生、分化および／または選択に有利である条件下で接触させる。抗原にさらされるとＴ細胞前駆体が細胞溶解性Ｔ細胞に分化することは、その免疫系のクローン選択に似ている。
【０２８０】
用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」は、本明細書では同義で用いており、Ｔヘルパー細胞、および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞を包含する。
【０２８１】
いくつかの治療方法は、患者の免疫系の反応に基づき、一つ以上の腫瘍関連抗原を提示する癌細胞などの抗原提示細胞の溶解を生じさせる。
【０２８２】
これに関連して、例えば、腫瘍関連抗原とＭＨＣ分子の複合体に特異的な自己細胞傷害性Ｔリンパ球を、細胞異常を有する患者に投与することが挙げられる。そうした細胞傷害性Ｔリンパ球のインビトロでの産生は、公知である。
【０２８３】
Ｔ細胞を分化させる方法の一例は、ＷＯ−Ａ−９６３３２６５において見出すことができる。一般に、血液細胞などの細胞を含有するサンプルを患者から採取し、それらの細胞を、前記複合体を提示し、細胞傷害性Ｔリンパ球を増殖させることができる細胞（例えば、樹状細胞）と接触させる。そのターゲット細胞は、トランスフェクトされた細胞、例えばＣＯＳ細胞であってもよい。
【０２８４】
これらのトランスフェクトされた細胞は、それらの表面上に所望の複合体を提示し、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞と接触させると、細胞傷害性Ｔ細胞が増殖するよう刺激する。その後、それらのクローン増幅させた自己細胞傷害性Ｔリンパ球を患者に投与する。
【０２８５】
抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を選択するもう一つの方法では、ＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド複合体の蛍光原性四量体を、細胞傷害性Ｔリンパ球の特異的クローンを得るために使用する（Ａｌｔｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６，１９９６；  Ｄｕｎｂａｒら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３−４１６，１９９８）。
【０２８６】
本発明は、所望の複合体を提示する細胞（例えば、樹状細胞）を、治療対象の患者の細胞傷害性Ｔリンパ球と組み合わせて、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球を増殖させる、養子移入と呼ばれる治療方法（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（５）：１９１７，１９８６；  Ｒｉｄｄｅｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：２３８，１９９２；  Ｌｙｎｃｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３−１４１０，１９９１；  Ｋａｓｔら，Ｃｅｌｌ  ５９：６０３−６１４，１９８９）も含む。
【０２８７】
増殖した細胞傷害性Ｔリンパ球を、その後、特定の異常細胞が特定の複合体を提示する細胞異常を有する患者に投与する。その後、それらの細胞傷害性Ｔ細胞が異常細胞を溶解し、それによって、所望の治療効果が達成される。
【０２８８】
さらに、所望の複合体を提示する細胞（例えば、樹状細胞）は、健常な個体または別の種（例えばマウス）の細胞傷害性Ｔリンパ球と組み合わせることができ、これにより、高い親和性で特定の細胞傷害性Ｔリンパ球を増殖させることができる。
これらの増殖した特定のＴリンパ球の高親和性Ｔ細胞受容体をクローニングし、場合によっては、様々な程度にヒト化し、こうして得られたＴ細胞受容体を、その後、例えばレトロウイルスベクターを使用して、遺伝子導入により、患者のＴ細胞に形質導入することができる。
【０２８９】
その後、これらの遺伝子改変Ｔリンパ球を使用して、養子移入を行うことができる（Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９６２−７０，２００１；  Ｋｅｓｓｅｌｓら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９５７−６１，２００１）。
【０２９０】
養子移入は、本発明に従って適用することができる治療法の形態に限られない。細胞傷害性Ｔ細胞は、それ自体が公知の様式で、インビボで産生させることもできる。
【０２９１】
一つの方法は、前記複合体を発現する非増殖性細胞を使用する。この場合に使用される細胞は、その複合体を、通常、発現する細胞、例えば、放射線照射腫瘍細胞、またはその複合体（すなわち、抗原性ペプチドとその提示ＭＨＣ分子）の提示に必要な一方もしくは両方の遺伝子をトランスフェクトした細胞となる。
【０２９２】
もう一つの好ましい形態は、例えばリポソーム移入によりまたはエレクトロポレーションにより、細胞に導入することができる組換えＲＮＡの形態で腫瘍関連抗原を導入する。
その結果、細胞は、対象の複合体を提示し、後に増殖する自己細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される。
【０２９３】
アジュバントと腫瘍関連抗原またはそのフラグメントを併用して、抗原提示細胞へのインビボでの導入を可能にすることにより、同様の効果を達成することができる。腫瘍関連抗原またはそのフラグメントは、タンパク質として、ＤＮＡとして（例えば、ベクター内ＤＮＡ）またはＲＮＡとして例示できる。
【０２９４】
腫瘍関連抗原は、ＭＨＣ分子のためのペプチドパートナーを生じさせるようにプロセッシングし、一方、そのフラグメントは、さらなるプロセッシングを必要とせずに提示させることができる。
【０２９５】
後者は、特に、これらがＭＨＣ分子に結合できる場合の事例である。樹状細胞は、有効な免疫応答に必要なＴヘルパー細胞応答も生じさせることができるので、完全抗原が、樹状細胞によってインビボでプロセッシングされる投与形式が好ましい（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐら，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．７４：７５−９，２０００；  Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３−７０２，１９９８）。
【０２９６】
一般に、有効量の腫瘍関連抗原を患者に、例えば、内皮注射によって投与することができる。しかし、注射は、リンパ節の節内に行うこともできる（Ｍａｌｏｙら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：３２９９−３０３，２００１）。
【０２９７】
本発明に従って記載する医薬組成物および治療方法は、本明細書に記載する疾病の治療または予防のための免疫処置またはワクチン接種にも使用することができる。
【０２９８】
本発明によると、用語「免疫処置」または「ワクチン接種」は、好ましくは、抗原に対する免疫応答の増加または活性化に関する。腫瘍関連抗原またはそれらをコードする核酸を使用した癌に対する免疫作用を試験するために、動物モデルを使用することができる。
【０２９９】
例えば、ヒト癌細胞をマウスに導入して腫瘍を生じさせ、腫瘍関連抗原をコードする一または二以上の核酸を投与することができる。核酸による免疫処置の有効性についての一つの尺度として、癌細胞に対する効果（例えば、腫瘍サイズの減少）を測定することができる。
【０３００】
免疫処置またはワクチン接種のための組成物の一部として、好ましくは、免疫応答を誘導するためまたは免疫応答を増大させるために、一または二以上の腫瘍関連抗原またはそれらの刺激性フラグメントを一または二以上のアジュバントと一緒に投与する。
【０３０１】
アジュバントは、腫瘍関連抗原に導入され、または刺激性フラグメントと一緒に投与して、免疫応答を強化する物質である。アジュバントは、（細胞外にまたはマクロファージ内に）抗原保有者(reservoir)を生じさせ、マクロファージを活性化し、および／または特定のリンパ球を刺激することによって、免疫応答を強化することができる。
【０３０２】
アジュバントは公知であり、限定されないが、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈｅｍ）、サポニン、例えばＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈｅｍ）、ＤＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈｅｍ；ＷＯ  ９６／３３７３９）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８およびＱＳ−Ｌ１（Ｓｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６，１９９７）、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、モンタナイド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｅｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−９，１９９５参照）、ならびに生体分解性油、例えばスクアレンおよび／またはトコフェロール、から調製される様々な油中水型乳剤を含む。
【０３０３】
好ましくは、ペプチドをＤＱＳ２１／ＭＰＬとの混合物で投与する。ＤＱＳ２１のＭＰＬに対する比は、一般には約１：１０から１０：１、好ましくは約１：５から５：１、および特に好ましくは約１：１である。ヒトに投与するためのワクチン製剤は、一般に、ＤＱＳ２１およびＭＰＬを約１μｇから約１００μｇの範囲で含有する。
【０３０４】
そうしたサイトカインは、例えば、ワクチンの保護作用を増大させることが証明されたインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１４３２−１４３４，１９９５参照）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８を含む。
【０３０５】
免疫応答を強化する多数の化合物があり、従って、ワクチン接種の際に使用することができる。前記化合物は、タンパク質または核酸、例えばＢ７−１およびＢ７−２（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対応する）の形態で得られる共刺激分子を含む。
【０３０６】
本発明は、核酸、タンパク質またはペプチドの投与に提供される。タンパク質およびペプチドは、それ自体公知の様式で、投与することができる。
【０３０７】
一つの実施形態において、エクスビボ法により、すなわち、患者から細胞を除去し、前記細胞を遺伝子修飾して腫瘍関連抗原を導入し、それらの改変された細胞を患者に再び導入することによって、核酸を投与することができる。
【０３０８】
この実施形態には、一般に、患者の細胞への遺伝子の機能的コピーをインビトロでの導入し、およびそれらの遺伝子改変細胞をその患者へ再導入することを含む。
【０３０９】
前記遺伝子の機能的コピーは、それらの遺伝子改変細胞において遺伝子を発現させることができる調節要素の機能的制御下にある。
【０３１０】
トランスフェクション法および形質導入法は、当業者には公知である。本発明は、ウイルスおよびターゲット制御リポソームなどのベクターを使用して核酸をインビボで投与することを提供する。
本発明によると、核酸の医薬組成物への投与または導入に言及する場合、これは、その核酸がそうしたベクター内に存在する実施形態を含む。
【０３１１】
好ましい実施形態において、腫瘍関連抗原をコードする核酸を投与する場合、ウイルスまたはウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含む）、セムリキ森林ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスおよびＴｙウイルス様粒子から成る群より選択される。
【０３１２】
アデノウイルスおよびレトロウイルスが特に好ましい。レトロウイルスは、一般に、複製能欠失型である（すなわち、それらは、感染性粒子を生じさせることができない）。
【０３１３】
核酸を細胞にインビトロまたはインビボで導入する方法は、核酸のトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥを伴った核酸のトランスフェクション、対象の核酸を有する上記ウイルスでのトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介トランスフェクションなどを含む。
【０３１４】
特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に導入することが好ましい。そうした実施形態において、細胞に核酸を投与するために使用される担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）は、結合ターゲット制御分子を有するコードができる。
【０３１５】
例えば、ターゲット細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体またはターゲット細胞上の受容体のリガンドなどの分子を、前記核酸担体に導入するまたは付着させることができる。好ましい抗体は、腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体を含む。
【０３１６】
リポソームを介して核酸を投与することが所望される場合、エンドサイトーシスに関連した表面膜タンパク質に結合するタンパク質結合をリポソーム製剤に組み込むことで、ターゲット制御および／または取り込みを可能にすることができる。
【０３１７】
こうしたタンパク質は、特定の細胞タイプに特異的なカプシドタンパク質またはそれらのフラグメント、内在タンパク質に対する抗体、細胞内部位にアドレッシングするタンパク質などを含む。
【０３１８】
本発明の治療用組成物は、医薬適合製剤として投与することができる。こうした製剤は、通常、医薬適合濃度の塩、緩衝物質、保存薬、担体、免疫強化補助物質、例えば、アジュバント、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＲＮＡ、ならびに適宜、他の治療活性成分を含有することができる。
【０３１９】
本発明の治療活性化合物は、注射または注入を含む、任意の従来的経路で投与することができる。
【０３２０】
この投与は、例えば、経口的に、静脈内的に、腹腔内的に、筋肉内的に、皮下的にまたは経皮的に行うことができる。好ましくは、抗体は、肺エーロゾルによって治療投与される。アンチセンス核酸は、好ましくは、遅速静脈内投与によって投与される。
【０３２１】
本発明の組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる用量と一緒に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。
【０３２２】
一または二以上の腫瘍関連抗原が発現する特定の疾病または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは、その疾病の経過の抑制に関する。
【０３２３】
これは、その疾病の進行を遅らせること、特に、その疾病の進行を中断させまたは逆行させることを含む。
【０３２４】
ある疾病またはある状態の治療において所望の反応が、前記疾病または前記状態の発現の遅延または発現の予防である場合もある。
【０３２５】
本発明によると、癌の診断または治療は、既に形成した、または形成するかもしれない転移癌の診断または治療も含む。
【０３２６】
本発明によると、用語「処置」は、治療的および予防的処置、すなわち、予防を含む。
【０３２７】
本発明の組成物の有効量は、治療すべき状態、その疾病の重症度、患者の個々のパラメータ（年齢、生理状態、サイズおよび体重を含む）、治療継続期間、（もしあれば）併用する治療のタイプ、特定の投与経路および類似の因子に依存すると考えられる。
【０３２８】
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、ならびに所望の反応または所望の効果を生じさせるために有効な量の治療活性物質を含有する。
【０３２９】
本発明の組成物の投与用量は、様々なパラメータ、例えば、投与のタイプ、患者の状態、所望の投与期間などに依存し得る。患者における反応が最初の用量では不十分である場合、さらに多い用量（または別の、より局所的な投与経路によって達成される有効にさらに多い用量）を使用することができる。
【０３３０】
治療のため、または免疫応答を生じさせるもしくは増大させるために、一般には１ｎｇから１ｍｇ、好ましくは１０ｎｇから１００μｇの腫瘍関連抗原の用量が処方され、投与される。腫瘍関連抗原をコードする核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の投与が所望される場合、１ｎｇから０．１ｍｇの用量が処方され、投与される。
【０３３１】
本発明の医薬組成物は、一般に、医薬として適合量でおよび医薬適合性組成物として投与される。
【０３３２】
用語「医薬適合性」は、その医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性材料を指す。
【０３３３】
この種の製剤は、通常、塩、緩衝物質、保存薬、担体、および適宜他の治療活性化合物を含有することができる。医薬品として使用されるとき、前記塩は、医薬適合性を有しなければならない。
【０３３４】
しかし、医薬適合性を有しない塩でも、医薬適合を有する塩の調製に使用することができ、本発明に含むことができる。
【０３３５】
この種の薬理適合性および医薬適合性を有する塩は、限定的されないが、次の酸から調製される：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。医薬適合性を有する塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩として、調製することもできる。
【０３３６】
本発明の医薬組成物は、医薬適合性の担体を含むことができる。本発明によると、用語「医薬適合性を有する担体」は、ヒトへの投与に適する一または二以上の相溶性固体または相溶性液体フィラー、希釈剤または封入物質を指す。
【０３３７】
用語「担体」は、容易に適用するために活性成分と併用される天然または合成天然の有機成分または無機成分を指す。本発明の医薬組成物の成分は、通常、所望の医薬的効能を実質的に害する相互作用が発生するようなものではない。
【０３３８】
本発明の医薬組成物は、適する緩衝物質、例えば、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸および塩でのリン酸を含有することができる。
【０３３９】
本医薬組成物は、適宜、適する保存薬、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールも含有することがある。
【０３４０】
本医薬組成物は、通常、均一な剤形で提供され、ならびにそれ自体公知の様式で調製することができる。本発明の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、ロゼンジ、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシル、または乳剤の形態とすることができる。
【０３４１】
非経口投与に適する組成物は、通常、活性化合物の滅菌した水性または非水性製剤を含み、好ましくは、この製剤が、受容者の血液と等張であることを含む。
相溶性担体および相溶性溶媒の例は、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌固定油が溶解媒体または懸濁媒体として使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０３４２】
本発明は、以下に示す図面および実施例により詳細に説明されるが、これら図面および実施例は説明としてのみ用いられるのであり、限定として理解されるべきではない。当業者は、本記載および本実施例に基づいてさらなる実施形態に拡げることができるものであり、これらも本発明により保護される。
実施例：
材料および方法
本明細書において述べる技術および方法は、それ自体が公知の様式で行い、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。キットおよび試薬の使用を含むすべての方法は、それらのメーカーの情報に従って行う。
【０３４３】
ＲＮＡ抽出、ポリ−ｄ（Ｔ）プライムドｃＤＮＡの作製および従来のＲＴ−ＰＣＲ分析
【０３４４】
イソチオシアン酸グアニジウムをカオトロピック剤として使用することにより、天然組織材料から全ＲＮＡを抽出した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ＆  Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−９，１９８７）。酸性フェノールで抽出し、イソプロパノールで沈殿させた後、前記ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水に溶解した。
【０３４５】
４μｇの全ＲＮＡからのファーストストランドｃＤＮＡ合成を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）により、メーカーの情報に従って、２０μＬ反応混合物中で行った。使用したプライマーは、ｄＴ（１８）オリゴヌクレオチドであった。ｃＤＮＡの完全性および量を、３０サイクルＰＣＲでのｐ５３の増幅によってチェックした（（配列番号３３、３４）、ハイブリダイゼーション温度  ６７℃）。
【０３４６】
多数の正常組織および腫瘍からファーストストランドｃＤＮＡのアーカイブを作製した。発現研究のために、これらのｃＤＮＡの０．５μＬを、ＧＯＩ特異的プライマー（下記参照）および１ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、３０μＬの反応混合物中で増幅させた。各反応混合物には、１５０μＭ  ｄＮＴＰ、０．３μＭの各プライマー、および３μＬの１０×反応緩衝液を含有させた。
【０３４７】
前記プライマーが、二つの異なるエキソン内に位置するようにそれを選択し、偽陽性結果となるゲノムＤＮＡの汚染による干渉の排除を、非逆転写ＤＮＡをテンプレートとして検査することによって確認した。
【０３４８】
１５分、９５℃でＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを活性化した後、３５サイクルのＰＣＲを行った（９４℃で０．５分、特定のハイブリダイゼーション温度で０．５分、７２℃で０．５分、そして７２℃で６分の最終伸長）。
【０３４９】
この２０μＬの反応物を、臭化エチジウム染色アガロースゲルで分画し、分析した。
【０３５０】
ランダム六量体プライムドｃＤＮＡの作成および定量的リアルタイムＰＣＲ
【０３５１】
幾つかの遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲで定量した。ＰＣＲ産物を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎをインターカレートするレポーター色素として使用して検出した。
【０３５２】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎのレポーター蛍光は、溶解状態では抑制され、その色素は、２本鎖ＤＮＡフラグメントに結合した後にしか活性しない。各ＰＣＲサイクル後のＧＯＩ特異的プライマーを使用した特異的増幅の結果としてのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光が増加することを定量に利用する。ターゲット遺伝子の発現は、絶対定量するか、調査対象の組織において定常発現するコントロール遺伝子の発現と比較して定量する。
【０３５３】
発現は、いわゆるハウスキーピング遺伝子としての１８ｓ  ＲＮＡに対してサンプルを正規化した後、ΔΔ−Ｃｔ法（米国、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。反応は、二重で行い、三重で判定した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）をそのメーカーの取扱説明書に従って使用した。ｃＤＮＡは、上記で説明したプロトコルにしたがってランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。
【０３５４】
このＰＣＲ（センスプライマー  ３００ｎＭ、アンチセンスプライマー  ３００ｎＭ；９５℃、１５分間の初期変性；３０秒間、９５℃；３０秒間のアニーリング；３０秒間、７２℃；４０サイクル）に、３０μＬの全量中、各５μＬの希釈ｃＤＮＡを用いた。使用したプライマーの配列は、それぞれの実施例で示す。
【０３５５】
クローニングおよびシークエンス分析
完全長および遺伝子フラグメントのクローニングを従来の方法によって行った。配列を確認するために、校正ポリメラーゼｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、対応する逆遺伝子を増幅させた。
【０３５６】
ＰＣＲ完了後、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによりアデノシンをそのアンプリコンの末端にライゲートして、メーカーの取扱説明書に従ってそれらのフラグメントをＴＯＰＯ−ＴＡベクターにクローニングした。塩基配列決定は、業者に委託した。従来の予測プログラムおよびアルゴリズムを使用して、その配列を分析した。
【０３５７】
細胞増殖分析
ｓｉＲＮＡ２本鎖をトランスフェクションして２４時間後、濃度をふったＦＣＳを添加した培地中で４８時間、１×１０４個の細胞を培養した。
ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）をメーカーの取扱説明書に従って使用して新たに合成したＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの組み込みを、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  マルチレベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定して、増殖を分析した。
【０３５８】
細胞周期分析およびアポトーシス
濃度をふったＦＣＳを添加した培地中で細胞を培養し、４８時間後に集菌し、ヨウ化プロピジウムで染色し、その後、フローサイトメトリーＤＮＡ含量分析を行った。アポトーシス細胞、および細胞周期のＳ／Ｇ２／Ｍ期の細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ−Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して定量した。
【０３５９】
細胞移動
実験開始１２時間前に無血清培地中で培養した細胞を、８．０μｍ多孔質膜を有するトランスウエルチャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、細胞移動アッセイした。ｓｉＲＮＡ実験のために、細胞を、上記で説明したようなｓｉＲＮＡ２本鎖でトランスフェクションした２４時間後、無血清条件に移した。
【０３６０】
４００μＬの無血清培養基中の４×１０４個の細胞をチャンバーの上に添加した。チャンバーの下は、ＦＣＳ、ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｃｈ）またはＳＤＦ−１α／ＣＸＣＬ１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを化学誘因剤として添加した８００μＬの培地を含む。２４時間後、前記膜の下側に移動した細胞を氷冷メタノールで固定し、膜を切除し、顕微鏡用スライドの上にのせて、蛍光顕微鏡検査用Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｄａｋｏ）にセットした。
【０３６１】
５回ランダムに選んだ視野内の細胞（倍率１００ｘ）を各膜について計数した。すべての実験は、三重で行った。（ｉ）上下のチャンバーに化学誘引剤を添加しない条件、および（ｉｉ）上下のチャンバーに化学誘因剤添加した条件で同じ実験をして、細胞のケモキネシスに対する効果を分析した。
【０３６２】
インビトロ浸潤アッセイ
実験開始１２時間前に無血清培地中で培養した細胞を、８．０μｍ多孔質膜を有するトランスウエルチャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、インビボ浸潤アッセイした。無血清培地中１ｍｇ／ｍＬに希釈した１００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、チャンバーの上を作製した。
ゲル化のために５時間、３７℃でチャンバーをインキュベートした。ｓｉＲＮＡ実験のために、細胞を、上記で説明したようなｓｉＲＮＡ２本鎖でトランスフェクションした２４時間後、無血清条件に移した。
【０３６３】
４００μＬの無血清培養基中の１×１０５個の細胞をチャンバーの上に添加した。チャンバーの下は、ＦＣＳを化学誘因剤として添加した８００μＬの培地を含む。２４時間後、前記膜の下側の浸潤細胞を氷冷メタノールで固定し、膜を切除し、顕微鏡用スライドの上にのせて、蛍光顕微鏡検査用Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｄａｋｏ）にセットした。
【０３６４】
５回ランダムに選んだ視野内の細胞（倍率１００ｘ）を各膜について計数した。すべての実験は、三重で行った。
【０３６５】
（実施例1）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＩＳＣ−４６８の同定
ＩＳＣ−４６８（配列番号：１）は、２１２個のアミノ酸から成るタンパク質（配列番号：２）をエンコードし、２３．６ｋＤａの分子量を有する。
【０３６６】
これは、妊娠中に発現する胎盤特異的タンパク質として以前に記載されている（Ｆａｎｔら，Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．６３：４３０−６，２００２）。
【０３６７】
このタンパク質は、バイオインフォマティクスツール（ＴＭｐｒｅｄ，ＳＯＵＳＩ）の分析から、ａａ  １〜２３からなる切断可能なシグナルペプチド、それに続く短い推定膜貫通ドメイン（ａａ  ２５〜４７）を有すると予測される。
【０３６８】
残りの部分のタンパク質は、細胞外にあると予測され、従って、モノクローナル抗体についてのターゲット構造として、本発明に従って使用することができる。
【０３６９】
本発明に従って、ＩＳＣ−４６８に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号：３、４）をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来のｃＤＮＡを増幅した。
【０３７０】
予想通り、胎盤は、この遺伝子を発現する唯一の健常組織として確認された（図１）。有意な発現は、他のいずれの正常器官組織においてもまったく検出されなかった。最も驚くべきことに、癌被検物を調査したとき、結腸、膵臓、食道、胃、肺、乳房、卵巣、頭頸部、腎臓、前立腺および肝臓の癌腫をはじめとする多数の異種腫瘍タイプにおいて高い、有意なレベルの発現が見つかった（図１および２ならびに表１）。
【０３７１】
６０個の乳癌腫サンプルにおけるＩＳＣ−４６８発現を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析した結果、すべてのサンプルの８０％が、有意なレベルのＩＳＣ−４６８を発現することが明らかになった（図２０Ａ、Ｂ）。
【０３７２】
【表１】
0006037593.tif 000002
【０３７３】
腫瘍のＩＳＣ−４６８トランスクリプトの選択的で高い発現は、以前には知られておらず、本発明において、血清および骨髄における播種性腫瘍細胞の検出ならびに他の組織への転移を検出するためのＲＴ−ＰＣＲなどの分子診断法に、利用することができる。
【０３７４】
この分子は、さらに、治療アプローチのための特異的ターゲットとして使用することができる。
【０３７５】
本発明に従ってＩＳＣ−４６８特異的抗体を産生するために、中でも、以下のペプチドを選択した：配列番号：５８、５９、６０、６８、６９、２。
【０３７６】
それらの抗体の特異性は、ＩＳＣ−４６８−ｅＧＦＰトランスフェクト細胞を免疫蛍光分析して確認した（図２１aＡ）。
【０３７７】
内因発現性乳癌腫細胞系統ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９のＩＳＣ−４６８の細胞内局在化を、免疫蛍光分析した。ＭｅＯＨ固定細胞（図２１aＢ）または非固定細胞（図２１bＣ）を染色した結果、ＩＳＣ−４６８が、前記発現性細胞の細胞質膜に局在していることが明らかとなった。染色の特異性は、ＩＳＣ−４６８発現をＲＮＡｉ誘導でノックダウンし、細胞質膜の染色をなくすことでよって確認した。
【０３７８】
さらに、ＩＳＣ−４６８特異的抗体を、正常乳房および乳癌腫の臨床サンプルにおけるＩＳＣ−４６８発現の免疫組織化学的分析に使用した。ＩＳＣ−４６８の発現は、正常乳房被検物では検出できなかった（図２２Ａ、Ｂ）。
【０３７９】
コントロール的に、乳癌腫被検物は、ＩＳＣ−４６８の強い均一な発現を示した（図２２Ｃ、Ｄ）。発現した癌細胞の細胞質膜で強いシグナルを示した。これにより、ＩＳＣ−４６８が癌細胞において選択的に発現される膜タンパク質であることが確認される。
【０３８０】
ＩＳＣ−４６８の細胞外ドメインは、本発明において、モノクローナル抗体による免疫診断および治療のためのターゲット構造として使用することができる。加えて、ＩＳＣ−４６８は、本発明において、腫瘍特異的免疫応答（ＴおよびＢ細胞媒介免疫応答）を誘導するためのワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド）として利用することができる。
【０３８１】
ＩＳＣ−４６８発現のＲＮＡｉ誘導ノックダウンは、ＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ（配列番号：７０〜７３）を特異的にターゲッティングするｓｉＲＮＡ２本鎖で細胞にトランス
フェクションすることで可能となる。内因発現性乳癌腫細胞系統ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９をトランスフェクションした結果、ＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ発現が安定的で特異的に減少した（図２３）。
【０３８２】
ＩＳＣ−４６８発現の生理的役割を洞察するために、幾つかのＲＮＡｉ系インビトロ細胞アッセイを行った。ｓｉＲＮＡ２本鎖を乳癌腫細胞系統ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９にトランスフェクションし、ＢｒｄＵ系増殖アッセイで分析したところ、それぞれのコントロールと比較して細胞増殖が明瞭に減少した（図２４）。
【０３８３】
ＦＡＣＳ系細胞周期分析に結果、Ｇ１／Ｓ停止に起因して、細胞増殖が抑制されることが示された（図２５Ａ、Ｂ）。加えて、ＩＳＣ−４６８のＲＮＡｉ誘導ノックダウンにより、ＡＫＴリン酸化が阻害され、内因発現性癌細胞におけるＡＫＴシグナリング経路に大いに影響を及ぼすことが示された（図２６）。
【０３８４】
さらに、ＭＣＦ−７細胞の増殖は、ＩＳＣ−４６８特異的ペプチド（配列番号：６８、６９）に対して産生したＩＳＣ−４６８特異的抗体と共に細胞をインキュベートしたとき、影響を与えないコントロール抗体と比較して、減弱した（図２７）。
【０３８５】
これらの結果から、ＩＳＣ−４６８は、おそらく前記ＡＫＴシグナリング経路などの増殖因子誘導活性化を媒介して、癌細胞を増殖させる重要な要因であることが示された。ＩＳＣ−４６８それ自体が、増殖因子、ケモカインまたは他の物質の受容体、共受容体または膜結合シャペロンを提示し得る。
【０３８６】
さらに、癌細胞の移動能力に対するＩＳＣ−４６８発現の影響を分析した。乳癌腫細胞系統ＭＣＦ−７およびＢＴ−５４９におけるＩＳＣ−４６８発現をＲＮＡｉ誘導ノックアウトしたところ、トランスウエル移動アッセイの評価から、細胞の走化性、ケモキネシスおよび浸潤が明瞭に減損することが示された（図２８Ａ、Ｂ、Ｃ）。
【０３８７】
走化性、ケモキネシスおよび浸潤は、癌細胞が他の器官への転移するための重要な要因である。従って、癌細胞におけてＩＳＣ−４６８の発現が、癌細胞転移についての陽性要因になり得る。
【０３８８】
乳癌腫において、ＩＳＣ−４６８の発現は、その腫瘍のエストロゲン−受容体の状態と相関している。６０個の乳癌腫サンプルにおけるＩＳＣ−４６８発現の定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、エストロゲン−受容体陽性乳癌腫が受容体−陰性腫瘍より有意に高いＩＳＣ−４６８発現レベルを示すことが明らかとなった（図２９）。
【０３８９】
従って、エストロゲン−受容体陽性乳癌腫細胞系統ＭＣＦ−７において、１７β−エストラジオールを処理することで、ＩＳＣ−４６８の発現を誘導することができた（図３０）。
【０３９０】
（実施例2）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＩＳＣ−５０７の同定
ＩＳＣ−５０７（配列番号：５）は、８５．６ｋＤａの分子量を有する７５４  ａａのタンパク質（配列番号：６）をエンコードする。ＩＳＣ−５０７は、付着タンパク質および／またはエンドペプチダーゼとして機能するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ活性を有する亜鉛結合タンパク質ファミリーのメンバーである。
【０３９１】
このファミリーのメンバーは、受精、神経発生、筋肉発達および免疫応答をはじめとする多数の生体プロセスに関与すると記載されている（Ｓｅａｌｓら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７（ｌ）：７−３０，２００３）。
【０３９２】
ＩＳＣ−５０７は、一つの膜貫通ドメイン（ａａ  ６７１〜６８７）、大きなＮ末端細胞外領域およびより短いＣ末端細胞質領域を有する。
【０３９３】
ＩＳＣ−５０７発現は、精子の成熟に重大に関与する哺乳動物精巣上体、精巣に隣接する小腺、に特異的に限定されると報告されている。文献によると、ＩＳＣ−５０７は、精巣上体から精子表面に輸送され、先体反応中に精子頭に再分配される（Ａｄａｃｈｉら，Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．６４：４１４−２１，２００３）。
【０３９４】
ＩＳＣ−５０７特異的プライマー（配列番号：７、８）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法の結果、精巣における選択的発現が確認され、ならびに前立腺およびリンパ節由来組織における弱い発現を除き(表２、図４)、他のいずれの正常組織においもＩＳＣ−５０７が存在しないことが確認された(表２、図３)。
【０３９５】
しかし、そして最も驚くべきことに、有意な数の前立腺癌においてＩＳＣ−５０７の発現が観察された（図３、４）。このタンパク質が癌に関与することは以前に報告されていなかった。
【０３９６】
【表２】
0006037593.tif 000003
【０３９７】
正常な組織に対して毒性がなく、ならびに前立腺癌のＩＳＣ−５０７発現が頻繁で有意なものであるため、本発明によると、このタンパク質は価値のある診断および治療マーカーになる。
【０３９８】
本発明によると、これは、ＲＴ−ＰＣＲによる、血清、骨髄、尿における播種性腫瘍細胞の検出および他の器官への転移の検出を含む。加えて、ＩＳＣ−５０７の細胞外ドメインは、本発明に従って、モノクローナル抗体による免疫診断および治療のためのターゲット構造として使用することができる。
【０３９９】
加えて、ＩＳＣ−５０７は、本発明に従って、腫瘍特異的免疫応答（ＴおよびＢ細胞媒介免疫応答）を誘導するためのワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド）として利用することができる。
【０４００】
ＩＳＣ−５０７を検出するための抗体は、以下のペプチドおよびタンパク質を用いて産生することができる：配列番号：５１、５２、５３、５４、５５、６、５６および５７。
【０４０１】
本発明によると、ＩＳＣ−５０７に結合する抗体は、治療または診断のために有用であり得る。
【０４０２】
（実施例3）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＩＳＣ−４６６の同定
ＩＳＣ−４６６（配列番号：９）は、４８．２ｋＤａの分子量を有する４２６  ａａのタンパク質（配列番号：１０）をエンコードする。これは、妊娠特異糖タンパクのファミリーに属する。
【０４０３】
ヒト妊娠特異糖タンパク（ＰＳＧ）は、妊娠中に胎盤合胞体栄養細胞によって主に生産される、および免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であるグループの分子である（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎら，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５２（２）：２４３−９，１９９９）。
他のＰＳＧと同様に、ＩＳＣ−４６６も胎盤に限定されると報告されている。
【０４０４】
本発明に従って、ＩＳＣ−４６６に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号１１、１２）をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来のｃＤＮＡを増幅した。
ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、正常胎盤においてＩＳＣ−４６６トランスクリプトが発現し、ならびに胸腺および卵巣において弱い発現が示されている（表３、図５aＡ）。他のい
ずれの正常器官組織においても有意な発現は検出されなかった。
【０４０５】
最も驚くべきことに、癌細胞系統を調査した結果、乳癌（図５bＣ）、肺癌（図５bＣ）、卵巣癌腫（図５bＤ）ならびに頭頸部および腎臓癌腫（図５aＢ）をはじめとする多数の腫瘍タイプにおいて高く、有意なレベルの発現が見つかった。
【０４０６】
【表３】
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【０４０７】
結腸直腸癌腫にＩＳＣ−４６６が存在するという観察結果（Ｓａｌａｈｓｈｏｒら，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ．５：６６，２００５）とは対照的に、本発明者らの調査から、本発明において、ＩＳＣ−４６６は、頭頸部、乳、卵巣、前立腺癌および黒色腫の診断および治療マーカーとなることが明かとなった。
【０４０８】
（実施例4）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＩＳＣ−５１８の同定
ＩＳＣ−５１８（配列番号：１３）は、２３７  ａａの翻訳産物（配列番号：１４）をエンコードする。しかし、これまでのところ、利用できる組織分布に関するデータおよび癌への関連付けはない。
【０４０９】
ＩＳＣ−５１８は、バイオインフォマティクス的に予測された仮説遺伝子／タンパク質である。配列分析の結果、このタンパク質が膜貫通ドメイン（ａａ  １０２〜１１８）を有することが明らかになった。細胞外Ｃ末端は、細胞表面糖タンパクにある機能的ドメインを特徴とする。
【０４１０】
本発明に従って、ＩＳＣ−５１８に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号：１５、１６）をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来のｃＤＮＡを増幅した。
【０４１１】
この遺伝子を発現する唯一の正常組織が精巣であることが判明し、一方、これに対して、他のいずれの正常器官においてもＩＳＣ−５１８の有意な発現は検出されなかった（図６）。最も驚くべきことに、癌被検物を調査した結果、肝細胞癌腫において高く、有意なレベルの発現が発見された（図７)。
【０４１２】
0006037593.tif 000005
【０４１３】
バイオインフォマティックの結果から、ＩＳＣ−５８１がエンコードするタンパク質は細胞表面分子を示すことが分かった。以前には知られていないが、この表面分子を選択的発現することにより、これを、治療、ならびに腫瘍細胞を検出する診断法および腫瘍細胞を除去する治療法の開発のためのターゲットとすることができる。
【０４１４】
（実施例5）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＩＳＣ−４７７の同定
ＩＳＣ−４７７（配列番号：１７）は、１３０  ａａの翻訳産物（配列番号：１８）をエンコードする。ＩＳＣ−４７７は、仮説タンパク質である。公的に利用できる組織分布に関するデータおよび癌への関連付けはない。
【０４１５】
構造分析からＩＳＣ−４７７は、疎水性領域を示し、膜貫通領域またはシグナルペプチドであり得る。
【０４１６】
本発明に従って、ＩＳＣ−４７７に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号：１９、２０）をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来のｃＤＮＡを増幅した。
【０４１７】
この遺伝子を発現することが判明した正常組織は、胎盤および卵巣だけあった。対照的に、他のいずれの正常器官においてもＩＳＣ−４７７の有意な発現は検出されなかった（図８aＡ）。
【０４１８】
最も驚くべきことに、癌被検物を調査した結果、肺、卵巣、結腸および胃癌において高く、有意なレベルの発現が見つかった（図８abＡ〜Ｄ）。発現レベルは、正常卵巣の発現より明らかに高い。
【０４１９】
【表５】
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【０４２０】
（実施例6）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＩＳＣ−４８９の同定
ＩＳＣ−４８９（配列番号：２１）は、３６３  ａａの翻訳産物（配列番号：２２）をエンコードする。このタンパク質は、新たに記載されたＧタンパク結合受容体のファミリーのメンバーである。しかし、公的に利用できる組織分布に関するデータおよび癌への関連付けはない。
【０４２１】
本発明に従って、ＩＳＣ−４８９に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号：２３、２４）をＲＴ−ＰＣＲにおいて使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来のｃＤＮＡを増幅した。
【０４２２】
この遺伝子を発現することが判明した正常組織は、胎盤および食道（弱い発現）だけであった。コントロール的に、他のいずれの正常器官においても、ＩＳＣ−４８９の有意な発現は検出できなかった（図９aＡ）。
【０４２３】
最も驚くべきことに、癌被検物を調査した結果、頭頸部および胃癌において高く、有意なレベルの発現が見つかった（図９aＢ、９bＣ）。
【０４２４】
Ｇタンパク質結合受容体ファミリーのメンバーとして、ＩＳＣ−４８９は、細胞表面にターゲッティングすることができる、７つの膜貫通ドメインと幾つかの細胞外ループを有する膜内在性タンパク質である。
【０４２５】
【表６】
0006037593.tif 000007
【０４２６】
本発明によると、頭頸部癌腫におけるＩＳＣ−４８９は顕著に発現し、および予想外に高い出現率を有するので、このタンパク質が非常に興味深い治療および診断マーカーとなる。
【０４２７】
（実施例7）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＩＳＣ−４６１の同定
ＩＳＣ−４６１（配列番号：２５）は、４７．１ｋＤＡの分子量を有する４１９  ａａタンパク質（配列番号：２６）をエンコードする。
【０４２８】
これは、妊娠特異糖タンパクのファミリーに属する。ヒト妊娠糖衣糖タンパク（ＰＳＧ）は、妊娠中に胎盤合胞体栄養細胞によって主に生産され、および免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であるグループの分子である（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎら，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５２（２）：２４３−９，１９９９）。
【０４２９】
他のＰＳＧと同様に、ＩＳＣ−４６１も胎盤に限定されると報告されている。
【０４３０】
本発明に従って、ＩＳＣ−４６１に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号：１１、２７）をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来のｃＤＮＡを増幅した。
【０４３１】
予想通り、胎盤はこの遺伝子を発現することが確認され、加えて、精巣および卵巣において弱い発現が確認された（図１０aＡおよび１０aＢ）。他のいずれの正常器官組織においても有意な発現はまったく検出されなかった。
【０４３２】
最も驚くべきことに、癌由来の組織および癌細胞系統を調査した結果、乳癌（図１０b
Ｃ）、卵巣癌腫（図１０bＤ）および黒色腫（図１０aＢ、１０bＣ）をはじめとする多数
の腫瘍タイプにおいて高く、有意なレベルの発現が発見された。
【０４３３】
【表７】
0006037593.tif 000008
【０４３４】
本発明のさらなる目的は、診断と治療の両方に利用できるＩＳＣ−４６１のスプライス変異体を同定することであった。
【０４３５】
スプライス変異体の調査の結果、スプライス形態（配列番号：２８）およびそれらがエンコードするタンパク質（配列番号：２９）を同定することができた。
【０４３６】
（実施例8）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＩＳＣ−４６５の同定
ＩＳＣ−４６５（配列番号：３０）は、４７．０ｋＤＡの分子量を有する４１９  ａａタンパク質（配列番号：３１）をエンコードする。
【０４３７】
これは、妊娠特異糖タンパクのファミリーに属する。ヒト妊娠糖衣糖タンパク（ＰＳＧ）は、妊娠中に胎盤合胞体栄養細胞によって主に生産され、および免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であるグループの分子である（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎら，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５２（２）：２４３−９，１９９９）。
【０４３８】
他のＰＳＧと同様に、ＩＳＣ−４６５も胎盤に限定されると報告されている。
【０４３９】
本発明に従って、ＩＳＣ−４６５に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号：１１、３２）をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来のｃＤＮＡを増幅した。予想通り、胎盤はこの遺伝子を発現す
ることが確認され、加えて、正常卵巣において弱い発現が確認された（図１１Ａ）。他のいずれの正常器官組織においても有意な発現はまったく検出されなかった。
【０４４０】
最も驚くべきことに、癌由来の組織および癌細胞系統を調査した結果、多数の腫瘍タイプ（図１１Ａ、１１Ｂ）、特に、乳癌（図１１Ｂ）において、高く、有意なレベルの発現が発見された。
【０４４１】
【表８】
0006037593.tif 000009
【０４４２】
腫瘍のＩＳＣ−４６５トランスクリプトの選択的で高い発現は、以前には知られておらず、本発明において、血清および骨髄の播種性腫瘍細胞を検出ならびに他の組織への転移を検出するためのＲＴ−ＰＣＲなどの分子診断法に、利用することができる。この分子は、さらに、治療アプローチのための特異的ターゲットとして使用することができる。
【０４４３】
（実施例9）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＭｅｍ−０３０の同定
Ｍｅｍ−０３０（配列番号：３５）は、６７．９ｋＤＡの分子量を有する５９２  ａａタンパク質（配列番号：３６）をエンコードする。
【０４４４】
Ｍｅｍ−０３０は、ＧＴＰ、ＧＤＰおよびＧＭＰに結合することができ、ＧＴＰからＧＤＰへならびにＧＭＰへの加水分解を触媒することができる大きなＧＴＰアーゼである、ＧＢＰ−タンパク質に属する（Ｃｈｅｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１５８３４−９，１９８５）。
【０４４５】
ＧＴＰアーゼは、細胞増殖、分化、シグナル伝達および細胞内タンパク質輸送において重要な役割を果し、ならびにインターフェロンを誘導できる（Ｂｏｅｈｍら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１２）：６７１５−２３，１９９８）。
【０４４６】
また、Ｍｅｍ−０３０は、内皮細胞に対する炎症性サイトカイン、例えばＩＦＮ−ｇ、インターロイキン  １−ｂ（ＩＬ−１ｂ）および腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）１、の増殖効果を妨げる（Ｇｕｅｎｚｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２０（２０）：５５６８−７７，２００１）。
【０４４７】
本発明において、Ｍｅｍ−０３０に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号：３７，３８）をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来のｃＤＮＡを増幅した。Ｍｅｍ−０３０は、ユビ
キタス発現パターンを示す（図１２Ａ、表９）。
【０４４８】
最も驚くべきことに、癌由来の組織および癌細胞系統を調査した結果、多数の腫瘍タイプ（図１２Ａ、１２Ｂ）、特に、頭頸部癌腫において、高い、有意なレベルの過剰発現が発見された。
【０４４９】
【表９】
0006037593.tif 000010
【０４５０】
バイオインフォマティクス分析および文献分析の結果、Ｍｅｍ−０３０の相同遺伝子も魅力的な治療ターゲット（配列番号：３９）であり、６６．６ｋＤＡの分子量を有する５８６  ａａのタンパク質（配列番号：４０）をエンコードする。
【０４５１】
バイオインフォマティックの結果、両方のタンパク質が、細胞表面分子を提示することを示した。この表面分子は以前には知られていない選択的過剰発現をするため、治療のための、ならびに腫瘍細胞を検出する診断法および腫瘍細胞を除去する治療法の開発のためのターゲットになる。
【０４５２】
（実施例10）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＭｅｍ−０５５の同定
Ｍｅｍ−０５５（配列番号：４１）は、２７．９ｋＤＡの分子量を有する２５０  ａａタンパク質（配列番号：４２）をエンコードする。この遺伝子がエンコードするタンパク質は、低ｐＨ下でタンパク質ジスルフィド結合を減少させることができる、リソソームチオールレダクターゼである。
【０４５３】
この酵素は、抗原提示細胞において構成的に発現され、他の細胞タイプではガンマ−インターフェロンによって誘導される。この酵素は、ＭＨＣクラスＩＩ限定抗原プロセッシングにおいて重要な役割を有する（Ａｒｕｎａｃｈａｌａｍら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９７（２）：７４５−５０，２０００）。
【０４５４】
Ｍｅｍ−０５５の局在化およびタンパク質トポロジーを、バイオインフォマティクスツール（ＴＭＰＲＥＤ、ＳＯＵＳＩ）を用いた推定シグナル配列および推定膜貫通ドメインの分析によって予測した。Ｍｅｍ−０５５は、細胞外Ｃ末端を有すると考えられる。
【０４５５】
本発明に従って、Ｍｅｍ−０５５に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号：４３，４４）をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来のｃＤＮＡを増幅した。Ｍｅｍ−０５５は、ユビ
キタス発現パターンを示す（図１３Ａ、表１０）。
【０４５６】
最も驚くべきことに、癌由来の組織内でのＭｅｍ−０５５発現を調査した結果、多数の腫瘍タイプ（図１３Ａ、１３Ｂ）、特に、胃癌において、高い、有意なレベルの過剰発現が発見された。
【０４５７】
【表１０】
0006037593.tif 000011
【０４５８】
Ｍｅｍ−０５５は、推定的細胞外ドメインを有し、および多種の癌腫タイプおいて予想外の過剰発現をするので、治療および診断のためのターゲット構造となる。
【０４５９】
（実施例11）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＭｅｍ−０６２の同定
Ｍｅｍ−０６２（配列番号：４５）は、３０．７ｋＤＡの分子量を有する２７１  ａａタンパク質（配列番号：４６）をエンコードする。
【０４６０】
コンピュータに基づくスクリーニング法により、Ｍｅｍ−０６２は、以前に同定できており、精巣、前立腺および胎盤特異的に発現されると記載されている（Ｂｅｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３１２（４）：１２０９−１５，２００３）。
【０４６１】
本発明に従って、Ｍｅｍ−０６２に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号：４７，４８）をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用した。驚くべきことに、Ｍｅｍ−０６２は、精巣−癌特異的な発現パターンを示した（図１４Ａ、表１１）。他のいずれの正常器官組織においても発現は検出されなかった。最も驚くべきことに、癌由来の組織を調査した結果、特に卵巣癌腫において、有意なレベルのＭｅｍ−６２発現が発見された（図１４Ｂ）。
【０４６２】
【表１１】
0006037593.tif 000012
【０４６３】
可変スプライシングにより、オルターナティブトランスクリプト（配列番号４９）およびその翻訳産物（配列番号：５０）が生じる。
【０４６４】
（実施例１２）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＭｅｍ−０６８の同定
Ｍｅｍ−０６８（配列番号：６１）は、新たに同定されたｃＤＮＡクローンである。
【０４６５】
バイオインフォマティック予測アプローチ（Ｇｅｎｓｃａｎ）により、Ｍｅｍ−０６８は、染色体９上の多エキソン遺伝子（配列番号：６２）として説明することができる。推定タンパク質配列（配列番号：６３）は、７５１個のａａを有するものであり、８２．４ｋＤＡの分子量を有するタンパク質を形成する。
【０４６６】
本発明に従って、Ｍｅｍ−０６８に対する遺伝子特異的プライマー対をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用した。驚くべきことに、Ｍｅｍ−０６８は、精巣−癌特異的な発現パターンを示す（図１５Ａ、表１２）。胎盤（弱い発現）を除き、他のいずれの正常器官組織においても発現は検出されなかった。
【０４６７】
最も驚くべきことに、癌由来の組織を調査した結果、特に腎細胞癌腫および胃癌において、有意なレベルのＭｅｍ−０６８発現が発見された（図１５Ｂ）。
【０４６８】
【表１２】
0006037593.tif 000013
【０４６９】
膜貫通型予測プログラムＴＭｐｒｅｄによると、Ｍｅｍ−０６８は、細胞表面で発現される場合があり、このことが、それを、治療または診断のための興味深いターゲットにする。
【０４７０】
（実施例１３）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＭｅｍ−０７１の同定
Ｍｅｍ−０７１（配列番号：６４）は、染色体１上の２つのエキソンにエンコードされる、新たなｃＤＮＡクローンである。
【０４７１】
本発明に従って、Ｍｅｍ−０７１に対する遺伝子特異的プライマー対をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来
のｃＤＮＡを増幅した。この遺伝子を発現することが判明した唯一の正常組織が精巣であった（図１６Ａ）。コントロール的に、癌被検物を調査した結果、腎細胞癌腫および胃癌において高い、有意なレベルの発現が発見された（図１６Ｂ）。
【０４７２】
【表１３】
0006037593.tif 000014
【０４７３】
腎細胞癌腫におけるＭｅｍ−０７１は予想外の高い発生率のため、本発明によると、このタンパク質は、非常に興味深い診断および治療マーカーとなることができる。
【０４７４】
（実施例１４）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＭｅｍ−０７２の同定
Ｍｅｍ−０７２（配列番号：６５）は、染色体１６上の３つのエキソンにエンコードされる、新たに同定された遺伝子である。
【０４７５】
本発明に従って、Ｍｅｍ−０７２に対する遺伝子特異的プライマー対をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来
のｃＤＮＡを増幅した。試験したすべての正常組織におい発現は見られなかった（図１７Ａ、表１４）。癌由来の組織および癌細胞系統を調査した結果、肺癌サンプルにおいて高い、有意なレベルの発現が発見された（図１７Ｂ）。
【０４７６】
【表１４】
0006037593.tif 000015
【０４７７】
肺腫瘍におけるＭｅｍ−０７２の選択的で高い発現は、以前には知られておらず、本発明に従って、血清および骨髄における播種性腫瘍細胞の検出ならびに他の組織への転移の検出のためのＲＴ−ＰＣＲなどの分子診断法に、利用することができる。この分子は、さらに、治療アプローチのための特異的ターゲットとして使用することができる。
【０４７８】
（実施例１５）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＭｅｍ−１０６の同定
Ｍｅｍ−１０６（配列番号：６６）は、染色体２上にイントロンなしでエンコードされる、新たに同定された遺伝子である。
【０４７９】
本発明に従って、Ｍｅｍ−１０６に対する遺伝子特異的プライマー対をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用した。
【０４８０】
驚くべきことに、Ｍｅｍ−１０６は、精巣−癌特異的な発現パターンを示した（図１８Ａ、表１５）。他のいずれの正常器官組織においても発現は検出されなかった。最も驚くべきことに、癌由来の組織を調査した結果、特に卵巣癌腫において有意なレベルのＭｅｍ−１０６発現が発見された（図１８Ｂ）。
【０４８１】
【表１５】
0006037593.tif 000016
【０４８２】
Ｍｅｍ−１０６は、多種の癌腫タイプにおいてその予想外の過剰発現をするため、治療および診断のためのターゲット構造となる。
【０４８３】
（実施例１６）
治療用および診断用癌ターゲットとしてのＭｅｍ−１３１の同定
Ｍｅｍ−１３１（配列番号：６７）は、新たに同定されたｃＤＮＡクローンである。Ｍｅｍ−１３１は、染色体１５上の２エキソン遺伝子である。
【０４８４】
本発明に従って、Ｍｅｍ−１３１に対する遺伝子特異的プライマー対をＲＴ−ＰＣＲ分析において使用して、正常組織および腫瘍組織の総合パネル(comprehensive panel)由来
のｃＤＮＡを増幅した。
【０４８５】
ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、正常な活性化ＰＢＭＣにおいてのみ、Ｍｅｍ−１３１トランスクリプトが発現した（表１６、図１９aＡ）。他のいずれの正常器官組織においても有
意な発現は検出されなかった。
【０４８６】
最も驚くべきことに、癌サンプルを調査した結果、乳癌（図１９bＢ）、肺癌（図１９bＢ＋Ｃ）および卵巣癌腫（図１９bＣ）をはじめとする多数の腫瘍タイプにおいて、高い、有意なレベルの発現が発見された。
【０４８７】
【表１６】
0006037593.tif 000017
【０４８８】
本発明者らの調査の結果、本発明に従って、Ｍｅｍ−１３１が、肺、乳および卵巣癌腫のための診断および治療マーカーとして示された。
本発明は、以下の態様を含む。
１．（Ｉ）腫瘍関連抗原の発現もしくは活性を阻害する、ならびに／または
（ＩＩ）腫瘍阻害活性を有し、および腫瘍関連抗原を発現するもしくは異常発現する細胞に対して選択的である、ならびに／または
（ＩＩＩ）投与されたとき、ＭＨＣ分子と腫瘍関連抗原またはその一部との複合体の量を選択的に増加させる
薬剤を含む医薬組成物であって、
前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってエンコードされた配列を有する、医薬組成物。
２．（ＩＩ）に属する前記薬剤が、細胞死を誘導し、細胞増殖を減少させ、細胞膜を損傷させまたはサイトカインを分泌させる、１．に記載の医薬組成物。
３．（Ｉ）または（ＩＩ）に属する前記薬剤が、前記腫瘍関連抗原をコードする前記核酸と選択的にハイブリダイズするアンチセンス核酸である、１．に記載の医薬組成物。
４．（Ｉ）または（ＩＩ）に属する前記薬剤が、前記腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体である、１．に記載の医薬組成物。
５．前記薬剤が、
（ｉ）前記腫瘍関連抗原またはその一部、
（ｉｉ）前記腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸、
（ｉｉｉ）前記腫瘍関連抗原またはその一部に結合する抗体、
（ｉｖ）前記腫瘍関連抗原をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、
（ｖ）前記腫瘍関連抗原をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、
（ｖｉ）前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞、および
（ｖｉｉ）前記腫瘍関連抗原またはその一部とＭＨＣ分子を単離した複合体
から成る群より選択される一つ以上の成分を含む、１．に記載の医薬組成物。
６．前記薬剤が、各場合、異なる腫瘍関連抗原の発現もしくは活性のいずれも選択的に阻害する、異なる腫瘍関連抗原を発現するもしくは異常発現する細胞のいずれに対しても選択的である、またはＭＨＣ分子と異なる腫瘍関連抗原もしくはその一部との前記複合体の量を増加させる、二つ以上の前記薬剤を含み、
前記腫瘍関連抗原の少なくとも一つが、
（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってエンコードされた配列を有する、１．に記載の医薬組成物。
７．  （ｉ）腫瘍関連抗原またはその一部、
（ｉｉ）腫瘍関連抗原またはその一部をコードする核酸、
（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原またはその一部に結合する抗体、
（ｉｖ）腫瘍関連抗原をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、
（ｖ）腫瘍関連抗原をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、
（ｖｉ）腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞、および
（ｖｉｉ）腫瘍関連抗原またはその一部とＭＨＣ分子を単離した複合体
から成る群より選択される一つ以上の成分を含み、
前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってエンコードされた配列を有する、医薬組成物。
８．（ｉｉ）の前記核酸が、発現ベクター内に存在する、５．または７．に記載の医薬組成物。
９．前記宿主細胞が、前記腫瘍関連抗原またはその一部を分泌する、５．または７．に記載の医薬組成物。
１０．前記宿主細胞が、前記腫瘍関連抗原またはその一部に結合するＭＨＣ分子をさらに発現する、５．または７．に記載の医薬組成物。
１１．前記宿主細胞が、前記ＭＨＣ分子および／また前記腫瘍関連抗原もしくは前記その一部を組換え様式で発現する、１０．に記載の医薬組成物。
１２．前記宿主細胞が、前記ＭＨＣ分子を内因的に発現する、１０．に記載の医薬組成物。
１３．前記宿主細胞が、抗原提示細胞である、５．、７．、１０．または１２．に記載の医薬組成物。
１４．前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体である、または抗体のフラグメントである、４．、５．または７．に記載の医薬組成物。
１５．前記抗体が、治療薬または診断薬にカップリングする、４．、５．、７．または１４．に記載の医薬組成物。
１６．前記癌の治療または予防に使用することができる、１．〜１５．のいずれかに記載の医薬組成物。
１７．前記癌が、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、黒色腫、結腸腫瘍、胃腫瘍、膵臓腫瘍、ＥＮＴ腫瘍、腎細胞癌腫または子宮頸癌腫、結腸癌腫または乳房癌腫である、１６．に記載の医薬組成物。
１８．前記腫瘍関連抗原が、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、２９、３１、３６、４０、４２、４６、５０〜６０、６３、６８および６９から成る群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む、１．〜１７．のいずれかに記載の医薬組成物。
１９．ワクチンの形態である、１．、２．、５．〜１３．および１６．〜１８．のいずれかに記載の医薬組成物。
２０．治療用途および／または予防用途のための、１９．に記載の医薬組成物。
２１．腫瘍関連抗原の発現または異常発現を特徴とする疾病を診断またはモニタリングする方法であって、
（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってエンコードされた配列を有する前記腫瘍関連抗原を用いて、；
（ｉ）前記腫瘍関連抗原をコードする核酸のもしくはその一部の、および／または
（ｉｉ）前記腫瘍関連抗原もしくはその一部の、および／または
（ｉｉｉ）前記腫瘍関連抗原もしくはその一部に対する抗体の、および／または
（ｉｖ）患者から単離した生体サンプルにおける前記腫瘍関連抗原にもしくはその一部に特異的であるＴリンパ球の、
量を検出または決定することを含む方法。
２２．前記量の検出または決定が、
（ｉ）前記腫瘍関連抗原をコードする前記核酸にもしくは前記その一部に、前記腫瘍関連抗原もしくは前記その一部に、前記抗体に、または前記Ｔリンパ球に特異的に結合する薬剤と前記生体サンプルを接触させること、および
（ｉｉ）前記薬剤と、前記核酸もしくは前記その一部、前記腫瘍関連抗原もしくは前記その一部、前記抗体または前記Ｔリンパ球との複合体の形成を検出することまたは前記複合体の量を決定すること
を含む、２１．に記載の方法。
２３．前記腫瘍関連抗原をコードする前記核酸にまたは前記その一部に特異的に結合する前記薬剤が、前記核酸にまたは前記その一部に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである、２２．に記載の方法。
２４．前記腫瘍関連抗原または前記その一部に特異的に結合する前記薬剤が、前記腫瘍関連抗原にまたは前記その一部に特異的に結合する抗体である、２２．に記載の方法。
２５．前記抗体に特異的に結合する前記薬剤が、前記抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチドである、２２．に記載の方法。
２６．前記Ｔリンパ球に特異的に結合する前記薬剤が、前記腫瘍関連抗原または前記その一部とＭＨＣ分子との前記複合体を提示する細胞である、２２．に記載の方法。
２７．前記疾病の前記モニタリングが、前記疾病に罹患しているまたは前記疾病に罹患すると推測される患者からのサンプルにおいて前記疾病の退行、経過または発症を判定すること含む、２１．から２６．のいずれかに記載の方法。
２８．第一時間点での第一サンプルの量の検出または決定、第二時間点でのさらなるサンプルの量の検出または決定、ならびに前記二つのサンプルの比較を含む、２７．に記載の方法。
２９．前記薬剤が、検出可能な様式で標識される、２２．〜２８．のいずれかに記載の方法。
３０．前記サンプルが、体液および／または体内組織を含む、２１．〜２９．のいずれかに記載の方法。
３１．腫瘍関連抗原の発現または異常発現を特徴とする疾病を治療または予防する方法であって、
前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってエンコードされた配列を有する；
１．〜２０．のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
３２．腫瘍関連抗原の発現または異常発現を特徴とする疾病を治療、予防、診断またはモニタリングする方法であって、
前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってエンコードされた配列を有する；
前記腫瘍関連抗原にまたはその一部に結合する、および治療薬または診断薬にカップリングする抗体を投与することを含む方法。
３３．前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体である、または抗体のフラグメントである、２４．または３２．に記載の方法。
３４．腫瘍関連抗原の発現または異常発現を特徴とする疾病に罹患している患者を治療する方法であって、
前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってエンコードされた配列を有する；
（ｉ）免疫反応性細胞を含有するサンプルを提供すること、
（ｉｉ）細胞溶解性Ｔ細胞またはサイトカイン放出性Ｔ細胞の産生が前記腫瘍関連抗原または前記その一部に対して有利に働く条件下で、前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する宿主細胞と前記サンプルを接触させること、
（ｉｉｉ）細胞溶解性Ｔ細胞またはサイトカイン放出性Ｔ細胞を、前記患者に前記腫瘍関連抗原またはその一部を発現する細胞を溶解するのに適する量で導入すること
を含む方法。
３５．前記宿主細胞が、前記腫瘍関連抗原にまたはその一部に結合するＭＨＣ分子を組換え発現する、３４．に記載の方法。
３６．前記宿主細胞が、前記腫瘍関連抗原にまたはその一部に結合するＭＨＣ分子を内因的に発現する、３４．に記載の方法。
３７．１．〜２０．のいずれかに記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、患者の癌の発生を抑制する方法。
３８．前記腫瘍関連抗原が、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、２９、３１、３６、４０、４２、４６、５０〜６０、６３、６８および６９から成る群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む、２１．〜３７．のいずれかに記載の方法。
３９．（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってエンコードされている前記タンパク質もしくはポリペプチドに、またはその一部に、特異的に結合する薬剤。
４０．前記タンパク質またはポリペプチドが、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、２９、３１、３６、４０、４２、４６、５０〜６０、６３、６８および６９から成る群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む、３９．に記載の薬剤。
４１．抗体である、３９．または４０．に記載の薬剤。
４２．前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体である、または抗体のフラグメントである、４１．に記載の薬剤。
４３．（ｉ）タンパク質もしくはポリペプチドまたはその一部と、
（ｉｉ）前記タンパク質もしくはポリペプチドまたは前記その一部が結合するＭＨＣ分子と
の複合体に選択的に結合し、（ｉ）または（ｉｉ）のみには結合しない前記抗体であって、
前記タンパク質またはポリペプチドが、
（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってエンコードされている、抗体。
４４．前記タンパク質またはポリペプチドが、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、２９、３１、３６、４０、４２、４６、５０〜６０、６３、６８および６９から成る群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む、４３．に記載の抗体。
４５．モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体である、または抗体のフラグメントである、４３．または４４．に記載の抗体。
４６．３９．〜４２．のいずれかに記載の薬剤または４３．〜４５．のいずれかに記載の抗体と治療薬または診断薬とのコンジュゲート。
４７．前記治療薬または診断薬が、毒素である、４６．に記載のコンジュゲート。
４８．腫瘍関連抗原の発現または異常発現を検出するためのキットであって、
前記腫瘍関連抗原が、
（ａ）配列番号：１、５、９、１３、１７、２１、２５、２８、３０、３５、３９、４１、４５、４９、６１、６２および６４〜６７から成る群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の前記核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の前記核酸を基準にして縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の前記核酸に相補的である核酸
から成る群より選択される核酸によってコードされた配列を有する；
（ｉ）前記腫瘍関連抗原をコードする核酸のもしくはその一部の、および／または
（ｉｉ）前記腫瘍関連抗原もしくはその一部の、および／または
（ｉｉｉ）前記腫瘍関連抗原もしくはその一部に結合する抗体の、および／または
（ｉｖ）前記腫瘍関連抗原またはその一部とＭＨＣ分子との複合体に対して特異的であるＴ細胞の、
量の検出または決定のための薬剤を含むキット。
【図面の簡単な説明】
【０４８９】
【図１】ＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ発現  Ａ．ＩＳＣ−４６８特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法の結果、胎盤を除いて、試験したすべての正常組織内で有意な発現を示さなかった。  Ｂ．頭頸部、肝臓、腎臓および結腸癌腫におけるＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ発現。  Ｃ．乳、卵巣および胃癌腫におけるＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ発現。
【図２】正常コントロール組織および乳癌におけるＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ発現の定量ＰＣＲ分析  ＩＳＣ−４６８特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法の結果、正常精巣、胎盤、胃およびＰＢＭＣならびにすべての乳癌腫生検において選択的ｍＲＮＡ発現を示した。
【図３】正常精巣および前立腺癌腫における特異的ＩＳＣ−５０７発現  遺伝子特異的ＩＳＣ−５０７プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、正常精巣（Ａ）および前立腺癌腫生検（Ｂ）においてｃＤＮＡ増幅を示す。
【図４】ＩＳＣ−５０７の定量発現  ＩＳＣ−５０７特異的プライマーを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲの結果、精巣、リンパ節および前立腺サンプルならびに前立腺癌サンプルにおいて選択的発現を示した。
【図５ａ】正常精巣および多種腫瘍サンプルにおけるＩＳＣ−４６６発現  ＩＳＣ−４６６特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、胎盤を除き正常組織内での発現を示さなかった（Ａ）が、頭頸部癌腫生検および腎臓癌腫生検では発現を示した（Ｂ）。
【図５ｂ】正常精巣および多種腫瘍サンプルにおけるＩＳＣ−４６６発現  ＩＳＣ−４６６特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、乳および肺癌腫細胞系統ならびに卵巣癌腫細胞系統においても明瞭な発現が検出された（ＣおよびＤ）。
【図６】ＩＳＣ−５１８  ｍＲＮＡ発現  ＩＳＣ−５１８特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、精巣を除き正常組織内での発現を示さなかった。
【図７】ＩＳＣ−５１８の定量的発現  定量ＲＴ−ＰＣＲの結果、正常精巣においておよび１つの肝臓癌腫プールにおいて高い、選択的な発現を示した。
【図８ａ】正常および腫瘍組織におけるＩＳＣ−４７７発現  ＩＳＣ−４７７特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法の結果、胎盤および卵巣正常組織において選択的発現を示し（Ａ）、中でも胃癌腫（Ｂ）において高い発現を示した。
【図８ｂ】正常および腫瘍組織におけるＩＳＣ−４７７発現  ＩＳＣ−４７７特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法の結果、乳、結腸および肺癌腫（Ｃ）ならびに卵巣および膵臓癌腫サンプル（Ｄ）において高い発現を示した。
【図９ａ】ＩＳＣ４８９  ｍＲＮＡ発現  ＩＳＣ−４８９特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果、胎盤コントロール組織において選択的発現を示し、加えて、肺癌腫サンプル（Ａ）、胃癌腫（Ｂ）において様々なレベルの発現を示した。
【図９ｂ】ＩＳＣ４８９  ｍＲＮＡ発現  ＩＳＣ−４８９特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果、胎盤コントロール組織において選択的発現を示し、加えて、肺癌腫サンプル（Ｃ）、胃癌腫（Ｃ）、頭頸部腫瘍（Ｃ）および肝臓癌腫サンプル（Ｃ）において様々なレベルの発現を示した。
【図１０ａ】正常精巣および多種腫瘍サンプルにおけるＩＳＣ−４６１発現  ＩＳＣ−４６１特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法の結果、胎盤コントロール組織において選択的な発現を示し、加えて、乳癌腫および黒色腫（Ｂ）において、様々なレベルの発現を示した。
【図１０ｂ】正常精巣および多種腫瘍サンプルにおけるＩＳＣ−４６１発現  ＩＳＣ−４６１特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法の結果、胎盤コントロール組織において選択的な発現を示し、加えて、乳癌腫、肺癌腫および黒色腫細胞系統（Ｃ）、および卵巣癌腫細胞系統（Ｄ）において、様々なレベルの発現を示した。
【図１１】胎盤および癌由来サンプルにおけるＩＳＣ−４６５  ｍＲＮＡ発現    ＩＳＣ−４６５特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果、胎盤（Ａ）および乳癌、黒色腫、肺癌または胃癌由来の幾つかの細胞系統（Ｂ）において、選択的発現を示した。
【図１２】Ｍｅｍ−０３０の定量的発現  Ａ．Ｍｅｍ−０３０特異的プライマーを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲの結果、調査したすべての頭頸部癌腫サンプルにおいて有意な過剰発現を示した。以下の正常組織を分析した：膀胱、脳、骨髄、頸部、結腸、十二指腸、心臓、肺、リンパ節、乳房、筋肉、卵巣、ＰＢＭＣ、活性化ＰＢＭＣ、胎盤、前立腺、網膜、脾臓、胃、精巣、胸腺および扁桃腺。  Ｂ．食道、肝臓、子宮癌腫および黒色腫由来組織におけるＭｅｍ−３０発現の普及(prevalence)。
【図１３】Ｍｅｍ−０５５の定量的発現  Ｍｅｍ−０５５特異的プライマーを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲの結果、正常コントロール組織において高い、選択的な発現を示し、胃および肺癌由来の組織において有意な過剰発現を示す（Ａ）。Ｍｅｍ−０５５は、肝臓癌腫、卵巣癌腫および乳癌サンプルにおいても過剰発現する（Ｂ）。
【図１４】Ｍｅｍ−０６２  ｍＲＮＡ発現    Ｍｅｍ−０６４特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、精巣において選択的発現を示し、肺癌由来組織において弱い発現を示した（Ａ）。Ｍｅｍ−０６４トランスクリプトの強い、有意な発現レベルが、様々な卵巣腫瘍において検出できた（Ｂ）。
【図１５】正常精巣および腎細胞癌腫における特異的Ｍｅｍ−０６８発現  遺伝子特異的Ｍｅｍ−０６８プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、、正常精巣においてｃＤＮＡ増幅を示し、胎盤（Ａ）、腎細胞癌腫および胃癌において（Ｂ）、弱いｃＤＮＡ増幅を示す。
【図１６】正常精巣および多種腫瘍サンプルにおけるＭｅｍ−０７１発現    Ｍｅｍ−０７１特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果、精巣を除き正常組織内で発現を示さなかった（Ａ）。腎細胞癌腫サンプルおよび胃癌においても明瞭な発現が検    出された（Ｂ）。
【図１７】Ｍｅｍ−０７２  ｍＲＮＡ発現  Ｍｅｍ−０７２特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果、正常組織内では発現を示さず（Ａ）、様々な肺癌サンプルにおいて有意な発現を示した（Ａ＋Ｂ）。
【図１８】正常組織および腫瘍組織におけるＭｅｍ−１０６発現  Ｍｅｍ−１０６特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法の結果、精巣を除き正常組織内で発現を示さなかった（Ａ）。卵巣および前立腺癌腫ならびに黒色腫および結腸癌細胞系統における高い発現を調査した（Ｂ）。
【図１９ａ】Ｍｅｍ−１３１  ｍＲＮＡ発現  Ｍｅｍ−１３１特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法の結果、活性化ＰＢＭＣを除き、試験したすべての正常組織内で有意な発現を示さなかった。
【図１９ｂ】Ｍｅｍ−１３１  ｍＲＮＡ発現  乳および肺癌腫におけるＭｅｍ−１３１  ｍＲＮＡ発現。肺および卵巣癌腫におけるＭｅｍ−１３１  ｍＲＮＡ発現。
【図２０】ＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ発現  ＩＳＣ−４６８特異的プライマーを用いた、（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲおよび（Ｂ）リアルタイムＰＣＲの結果、正常精巣、胎盤において、および乳癌腫生検の８０％において、選択的ｍＲＮＡ発現を示した。
【図２１ａ】ＩＳＣ−４６８発現の免疫蛍光分析  （Ａ）抗ＩＳＣ−４６８抗体の特異性を、ＩＳＣ−４６８−ｅＧＦＰトランスフェクト細胞を染色して確認した。（Ｂ）ＩＳＣ−４６８特異的ＲＮＡｉ２本鎖または非サイレンシングコントロール２本鎖のいずれかのトランスフェクトＭｅＯＨ固定細胞の染色。
【図２１ｂ】ＩＳＣ−４６８発現の免疫蛍光分析  （Ｃ）ＩＳＣ−４６８特異的ＲＮＡｉ２本鎖または非サイレンシングコントロール２本鎖のいずれかのトランスフェクト非固定細胞の染色。
【図２２】ＩＳＣ−４６８発現の免疫組織化学分析  正常な乳房組織において検出可能な発現はなかった（Ａ）１００ｘ、（Ｂ）２００ｘ。コントロール的に、乳癌腫被検物において強い均一な膜染色が観察された（Ｃ）１００ｘ、（Ｄ）２００ｘ。
【図２３】ＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ発現のＲＮＡｉ誘導ノックダウン  ＩＳＣ−４６８特異的ｓｉＲＮＡ２本鎖を細胞にトランスフェクションした結果、コントロール細胞と比較してＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ発現が明瞭にノックダウンした。
【図２４】細胞増殖分析  ＩＳＣ−４６８特異的ｓｉＲＮＡ２本鎖を細胞にトランスフェクションした結果、コントロール細胞と比較して細胞増殖の有意な減少が生じた。
【図２５】細胞周期分析  ＩＳＣ−４６８特異的ｓｉＲＮＡ２本鎖を細胞にトランスフェクションした結果、コントロール細胞と比較して、（Ａ）ＭＣＦ−７および（Ｂ）ＢＴ−５４９乳癌腫細胞においてＧ１／Ｓ期が停止した。
【図２６】ＡＫＴリン酸化（phosphorylierung）  ＩＳＣ−４６８特異的ｓｉＲＮＡ２本鎖を細胞にトランスフェクションした、コントロール細胞と比較してＡＫＴリン酸化の明瞭な減少が生じた。
【図２７】抗体媒介増殖阻害  ＩＳＣ−４６８特異的抗体とＭＣＦ−７乳癌腫細胞をインキュベーションした結果、影響がないコントロール抗体とインキュベートした細胞と比較して増殖の減少が生じた。
【図２８】細胞増殖分析  ＩＳＣ−４６８特異的ｓｉＲＮＡ２本鎖を細胞にトランスフェクションした結果は、コントロール細胞と比較して、（Ａ）走化性、（Ｂ）ケモキネシスおよび（Ｃ）浸潤の明瞭な減少が生じた。
【図２９】エストロゲン受容体相関関係  乳癌腫サンプルにおけるＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡの発現レベルと、エストロゲン受容体の状態は相関する。中央値、第１０および第９０パーセンタイルとエラーバーを示す。
【図３０】１７β−エストラジオール処理  エストロゲン受容体陽性乳癌腫細胞系統ＭＣＦ−７を１００ｎＭ  １７β−エストラジオールで処理することによって、ＩＳＣ−４６８  ｍＲＮＡ発現を誘導した。エストロゲン受容体陰性細胞系統ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、誘導は見られなかった。
【図３１ａ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図３１ｂ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図３１ｃ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図３１ｄ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図３１ｅ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図３１ｆ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図３１ｇ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図３１ｈ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図３１ｉ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図３１ｊ】配列  本明細書において言及する配列を示す。
【図１】
0006037593.tif 000018
【図２】
0006037593.tif 000019
【図３】
0006037593.tif 000020
【図４】
0006037593.tif 000021
【図５ａ】
0006037593.tif 000022
【図５ｂ】
0006037593.tif 000023
【図６】
0006037593.tif 000024
【図７】
0006037593.tif 000025
【図８ａ】
0006037593.tif 000026
【図８ｂ】
0006037593.tif 000027
【図９ａ】
0006037593.tif 000028
【図９ｂ】
0006037593.tif 000029
【図１０ａ】
0006037593.tif 000030
【図１０ｂ】
0006037593.tif 000031
【図１１】
0006037593.tif 000032
【図１２】
0006037593.tif 000033
【図１３】
0006037593.tif 000034
【図１４】
0006037593.tif 000035
【図１５】
0006037593.tif 000036
【図１６】
0006037593.tif 000037
【図１７】
0006037593.tif 000038
【図１８】
0006037593.tif 000039
【図１９ａ】
0006037593.tif 000040
【図１９ｂ】
0006037593.tif 000041
【図２０】
0006037593.tif 000042
【図２１ａ】
0006037593.tif 000043
【図２１ｂ】
0006037593.tif 000044
【図２２】
0006037593.tif 000045
【図２３】
0006037593.tif 000046
【図２４】
0006037593.tif 000047
【図２５】
0006037593.tif 000048
【図２６】
0006037593.tif 000049
【図２７】
0006037593.tif 000050
【図２８】
0006037593.tif 000051
【図２９】
0006037593.tif 000052
【図３０】
0006037593.tif 000053
【図３１ａ】
0006037593.tif 000054
【図３１ｂ】
0006037593.tif 000055
【図３１ｃ】
0006037593.tif 000056
【図３１ｄ】
0006037593.tif 000057
【図３１ｅ】
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【図３１ｆ】
0006037593.tif 000059
【図３１ｇ】
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【図３１ｈ】
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【図３１ｉ】
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【図３１ｊ】
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【配列表】
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