(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
TCRアルファ鎖可変ドメイン及びTCRベータ鎖可変ドメインを含み、YLEPGPVTA (配列番号１) HLA-A2複合体と結合する特性と、配列番号45の細胞外アルファ鎖配列及び配列番号46の細胞外ベータ鎖配列を有する参照TCRのものの少なくとも２倍のYLEPGPVTA-HLA-A2複合体についての結合親和性及び/又は結合半減期とを有するＴ細胞レセプター(TCR)であって、
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号７、８及び９のアルファ鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含み、かつ/又は前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34及び35のベータ鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含む、
TCR。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列１〜109と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも94%又は100%の配列同一性を有するアルファ鎖可変ドメイン、及び配列番号10〜35のベータ鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含むベータ鎖可変ドメインを含む請求項１に記載のTCR。
【請求項３】
配列番号７、８及び９のアルファ鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含むアルファ鎖可変ドメイン、及び配列番号３のアミノ酸配列１〜112と少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも94%又は100%の配列同一性を有するベータ鎖可変ドメインを含む請求項１に記載のTCR。
【請求項４】
αβヘテロダイマーTCRであり、かつ
TRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57が、ともにシステインに変異され、前記システインが、TCRのアルファ及びベータ定常ドメイン間にジスルフィド結合を形成するアルファ及びベータ鎖定常ドメイン配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項５】
αβヘテロダイマーTCRであり、かつ
定常ドメイン配列が、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然ジスルフィド結合により連結されているアルファ及びベータ鎖定常ドメイン配列を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項６】
検出可能な標識、治療薬剤、PK改変部分又はこれらのいずれかの組み合わせと会合している、請求項１〜５のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項７】
前記治療薬剤が、TCRのアルファ若しくはベータ鎖のＣ又はＮ末端と共有結合している抗CD3抗体である請求項６に記載のTCR。
【請求項８】
配列番号２及び３の細胞外アルファ及びベータ鎖配列を有するTCRと比べてグリコシル化が改変されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも２つのTCRを含む多価TCR複合体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のTCRをコードするDNA又はRNA。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のTCRを提示する単離細胞。
【請求項１２】
(i) 配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はSである)の配列で置き換えられている；
(ii) 配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はAである)の配列で置き換えられている；
(iii) 配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はGである)の配列で置き換えられている；
(iv) 配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はSである)の配列で置き換えられており、アルファ鎖のＣ末端は、配列番号45の番号付けに基づいてF196からS203まで(両端含む)の８アミノ酸が切断されている；
(v) 配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はAである)の配列で置き換えられており、アルファ鎖のＣ末端は、配列番号45の番号付けに基づいてF196からS203まで(両端含む)の８アミノ酸が切断されている；
(vi) 配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はGである)の配列で置き換えられており、アルファ鎖のＣ末端は、配列番号45の番号付けに基づいてF196からS203まで(両端含む)の８アミノ酸が切断されている；
からなる群より選択されるTCRアルファ鎖アミノ酸配列と、
(vii) 配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIである)；
(viii) 配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びIである)；
(ix) 配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びQである)；
(x) 配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIであり、108位〜131位のアミノ酸が配列番号44で置き換えられ、254位〜258位のアミノ酸が配列番号47で置き換えられている)；
(xi) 配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIであり、257位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xii) 配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIであり、256位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xiii) 配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIであり、255位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xiv) 配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がA及びQであり、257位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xv) 配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がA及びQであり、256位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xvi) 配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がA及びQであり、255位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xvii) 配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びIであり、257位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xviii) 配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びIであり、256位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xix) 配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びIであり、255位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)
からなる群より選択されるTCRベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列と
を含む、請求項７に記載のTCR。
【請求項１３】
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(vii)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(x)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(ix)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(v)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(viii)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(vii)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xi)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xii)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiii)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiv)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xv)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xvi)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(v)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xvii)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(v)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xviii)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(v)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xix)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xi)であるか；
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xii)であるか；又は
前記アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、前記ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiii)である
請求項12に記載のTCR。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド-HLA-A2複合体として提示されるYLEPGPVTAペプチド(gp100タンパク質に由来する)と結合するＴ細胞レセプター(TCR)に関し、該TCRは、天然のgp100 TCRアルファ及び/又はベータ可変ドメインと比べて変異しており、かつ参照gp100 TCRのものの少なくとも２倍の、前記複合体との結合親和性及び/又は結合半減期を有する。
【背景技術】
【０００２】
YLEPGPVTA (配列番号1)ペプチドは、ヒト糖タンパク質100 (gp100)タンパク質の280〜288番のアミノ酸残基に相当する。Gp100は、メラノーマがん細胞上で広範囲に、そして著しく過剰発現される。例えば、ある研究(Trefzerら、(2006) Melanoma Res. 16(2): 137〜45)は、28名のメラノーマ患者からの192のメラノーマ転移のうちの82%がgp100を発現したことを見出した。いくつかの研究は、メラノーマ組織においてgp100の発現レベルがより高いことを報告した(Hofbauerら、(2004) J Immunother. 27(1): 73〜8、Barrowら、(2006) Clin Cancer Res. 12:764〜71)。YLEPGPVTA (配列番号1)ペプチドは、gp100+ / HLA-A2がん細胞上のクラスI HLA分子により提示される(Salgallerら、(1996) Cancer Res 56: 4749〜4757)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
よって、YLEPGPVTA HLA-A2複合体は、本発明のTCRが標的にできるがんマーカーを提供する。例えば、本発明のTCRは、細胞障害性薬剤をがん細胞に送達する目的のために用いることができるか、又は養子療法として知られる治療プロセスにおいて患者に投与するために、Ｔ細胞に形質転換して、Ｔ細胞がそのHLA複合体を提示する腫瘍細胞を破壊できるようにすることができる。しかし、前者の目的のためには、TCRが著しくより高い親和性及び/又は著しくより遅い解離速度(off-rate)を有して、TCRが標的腫瘍細胞上に長期間存在することが望ましい。後者の目的のために、TCRが、ペプチド-HLA複合体に特異的な天然のTCRよりも該複合体についてのいくらかより高い親和性及び/又はより遅い解離速度を有するが、前者の目的ほどは高くない親和性を有することが望ましい。親和性の劇的な増加は、TCR遺伝子改変CD8Ｔ細胞における抗原特異性の喪失と関連し、これは、これらのTCRを形質移入したCD8Ｔ細胞の非特異的活性化をもたらすことがあり、よって、養子療法のためには中程度の親和性のTCRが好ましい(Zhaoら、(2007) J Immunol. 179: 5845〜54; Robbinsら、(2008) J Immunol. 180: 6116〜31;及び公開されたWO 2008/038002を参照されたい)。本発明は、このようなTCRを提供する。
【０００４】
TCRは、国際免疫遺伝学(International Immunogenetics; IMGT) TCR命名法と、TCR配列のIMGT公共データベースへのリンクを用いて記載される。天然のアルファ-ベータヘテロダイマーTCRは、アルファ鎖とベータ鎖とを有する。概して、各鎖は、可変、連結及び定常領域を含み、ベータ鎖は、可変領域と連結領域との間に短い多様性領域も通常含有するが、この多様性領域は、しばしば、連結領域の一部とみなされる。各可変領域は、フレームワーク配列内に埋め込まれている３つのCDR (相補性決定領域)を含み、そのうちの１つはCDR3とよばれる超可変領域である。いくつかのタイプのアルファ鎖可変(Vα)領域と、いくつかのタイプのベータ鎖可変(Vβ)領域とがあり、これらは、それらのフレームワーク、CDR1及びCDR2配列、並びに部分的に規定されるCDR3配列により区別される。Vαタイプは、IMGT命名法において、ユニークTRAV番号により呼称される。よって、「TRAV17」とは、ユニークフレームワークと、CDR1及びCDR2配列と、TCRごとに保存されているが、TCRごとに変動するアミノ酸配列も含むアミノ酸配列により部分的に規定されるCDR3配列とを有するTCR Vα領域を規定する。同様にして、「TRBV19」は、部分的に規定されたCDR3配列だけとともにユニークフレームワーク領域とCDR1及びCDR2配列とを有するTCR Vβ領域を規定する。
TCRの連結領域は、ユニークIMGT TRAJ及びTRBJ命名法により、そして定常領域は、IMGT TRAC及びTRBC命名法により同様に規定される。
【０００５】
ベータ鎖多様性領域は、IMGT命名法において、TRBDの略号で呼称され、上記のように、連鎖されたTRBD/TRBJ領域は、しばしば連結領域と一緒とみなされる。
αβTCRのα鎖およびβ鎖は、一般的に、２つの「ドメイン」、すなわち可変及び定常ドメインをそれぞれが有するとみなされる。可変ドメインは、可変領域と連結領域との連鎖からなる。本明細書及び特許請求の範囲において、用語「TCRアルファ可変ドメイン」は、よって、TRAV領域とTRAJ領域との連鎖、用語TCRアルファ定常ドメインは、細胞外TRAC領域又はＣ末端短縮TRAC配列のことをいう。同様に、用語「TCRベータ可変ドメイン」は、TRBV領域とTRBD/TRBJ領域との連鎖、用語TCRベータ定常ドメインは、細胞外TRBC領域又はＣ末端切断TRBC配列のことをいう。
【０００６】
IMGT命名法により規定されるユニーク配列は、TCRの分野の当業者に広く知られ、利用可能である。例えば、これらは、IMGT公共データベースにおいて見出すことができる。「T cell Receptor Factsbook」(2001) LeFranc and LeFranc、Academic Press、ISBN 0-12-441352-8もIMGT命名法により規定される配列を開示するが、その出版日及びそのことによる時間のずれにより、そこに含まれる情報は、IMGTデータベースを参照して確認する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は、天然のgp100 TCRクローンが、以下のアルファ鎖及びベータ鎖V、J及びC遺伝子用法(usage)を有することを確認した。
アルファ鎖-TRAV17/TRAJ29/TRAC(天然のgp100 TCRアルファ鎖の細胞外配列は、配列番号２に示す)。
ベータ鎖:-TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2 (天然のgp100 TCRベータ鎖の細胞外配列は、配列番号３に示す(TRBV19配列は、IMGT命名法においてそれぞれTRBV19*01、*02および*03と呼ばれる３つの対立遺伝子バリアントを有し、上記の天然のgp100 TCRクローンは、*01変動を有することに注意されたい。同様にして、TRBJ2-7配列は、２つの既知の変動を有し、これは、上記のTCRクローンに存在する*01配列である。「*」との修飾文字がない場合は、１つの対立遺伝子のみが関連する配列について知られていることを意味する)。
【０００８】
用語「野生型TCR」、「天然TCR」、「野生型gp100 TCR」及び「天然gp100 TCR」は、配列番号２及び３の細胞外アルファおよびベータ鎖を有するこの天然に存在するTCRのことを言うために、同意語として用いられる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明によると、YLEPGPVTA (配列番号１) HLA-A2複合体と結合する特性を有し、TCRアルファ可変ドメイン及び/又はTCRベータ可変ドメインを含むＴ細胞レセプター(TCR)であって、前記TCRが、(i)配列番号２および３の細胞外アルファおよびベータ鎖配列を有する天然gp100 TCRに比べて、そのアルファ鎖可変ドメイン(配列番号２のアミノ酸１〜109)及び/又はそのベータ鎖可変ドメイン(配列番号３のアミノ酸１〜112)において変異されており、(ii)参照gp100 TCRのものの少なくとも２倍のYLEPGPVTA-HLA-A2複合体についての結合親和性及び/又は結合半減期を有し、ここで、該参照gp100 TCRは、配列番号45の細胞外アルファ鎖配列と、配列番号46の細胞外ベータ鎖配列とを有することを特徴とするTCRが提供される。
【００１０】
配列番号45は、C157がT157 (すなわちTRACのT48)に置換され、K113がN113に置換された以外は天然アルファ鎖細胞外配列番号２であることに注意されたい。同様に、配列番号46は、C169がS169 (すなわちTRBC2のS57)に置換され、A187がC187に置換され、D201がN201に置換された以外は天然ベータ鎖細胞外配列番号３である。天然アルファおよびベータ鎖細胞外配列と比べたこれらのシステイン置換は、リフォールディングされた可溶性TCR、すなわち細胞外アルファ及びベータ鎖をリフォールディングすることにより形成されるTCRを安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。参照TCRと同様な安定ジスルフィド連結可溶性TCRの使用により、結合親和性及び結合半減期の評価がより簡便になる。配列番号45のアルファ鎖及び配列番号46のベータ鎖における配列番号２及び３の天然アルファ及びベータ鎖と比べたその他の変異は、これらが天然配列と比べて結合親和性又は結合半減期に影響しないという意味において「サイレント」である。よって、本発明のTCRが、参照gp100 TCRのものの少なくとも２倍の YLEPGPVTA-HLA-A2複合体についての結合親和性及び/又は結合半減期を有するならば、これは、上記の天然gp100 TCRクローンに関するこれらの基準も暗に満たす。
「配列番号45の細胞外アルファ鎖配列と配列番号46の細胞外ベータ鎖配列とを有する参照gp100 TCR」とは、以下、「参照TCR」又は「参照gp100 TCR」のいずれかと同意として用いる。
【００１１】
結合親和性(平衡定数KDに反比例)及び結合半減期(T1/2と表される)は、任意の適切な方法により決定できる。TCRの親和性を２倍にすることにより、KDが半分になることが認識される。T1/2は、解離定数(koff)により除されるln2として算出される。よって、T1/2を２倍にすることにより、koffが半分になる。TCRについてのKD及びkoffの値は、TCRの可溶性の形態、すなわち疎水性膜貫通ドメイン残基を除去するように切断された形態について通常測定される。よって、TCRの可溶性の形態が、YLEPGPVTA-HLA-A2複合体についての結合親和性及び/又は結合半減期を有するという要件を満たすならば、所定のTCRがその要件を満たすことが理解される。好ましくは、所定のTCRの結合親和性又は結合半減期は、数回、例えば３回以上、同じアッセイプロトコールを用いて測定され、結果の平均をとる。好ましい実施形態において、これらの測定は、本明細書における実施例３の表面プラズモン共鳴(BIAcore)法を用いて行われる。参照gp100 TCRは、この方法により測定したおよそ19μMのKDを有し、koffはおよそ１s-1 (すなわちT1/2はおよそ0.7s)であった。
【００１２】
上記のように、YLEPGPVTAは、HLA A2複合体において提示される天然gp100 280-288ペプチドである。しかし、このペプチドのわずかに改変したバージョン(YLEPGPVTV (配列番号６))が、HLA-A2との結合の増進を示し、ペプチド-HLA複合体の安定性を増加することが公知である(Salgallerら、(1996) Cancer Res 56: 4749〜57)。つまり、バリアントYLEPGPVTVペプチド-HLA-A2複合体は、YLEPGPVTA-HLA-A2複合体と結合できる可能性のあるTCRの評価におけるアッセイ作業のためにより適切である。このようなTCRは、両方のペプチドHLA複合体と、実質的に類似のKD及びT1/2で結合する。
【００１３】
本発明のTCRは、参照gp100 TCRのものの少なくとも２倍のYLEPGPVTA-HLA-A2複合体についての親和性及び/又は結合半減期を有しながら、許容できるYLEPGPVTA-HLA-A2複合体特異性、例えば参照gp100 TCRのものと類似の特異性を保持する。一般的に、治療剤、例えば細胞傷害性薬剤又は免疫エフェクター薬剤を、HLA複合体を提示する細胞に送達するためのターゲティング薬剤として要求されるTCRは、参照gp100 TCRよりも、上記のYLEPGPVTA-HLA-A2複合体について著しくより高い親和性及び/又はより長い結合半減期を有するべきである。養子療法のためにＴ細胞を形質移入するためにTCRが要求される場合、例えばより低い親和性及び/又はより短い結合半減期(まだ、それぞれ参照TCRのものの少なくとも２倍であるが)が一般的に要求される。
例えば、本発明のTCRは、複合体についてのKDが、≦８μM、≦５μM、≦１μM、≦0.1μM、≦0.01μM、≦0.001μM若しくは≦0.0001μMであり、かつ/又は複合体についての結合半減期(T1/2)が、≧1.5s、≧３s、≧10 s、≧20 s、≧40 s、≧60 s、≧600 s若しくは≧6000 sであってよい。
【００１４】
本発明の目的のために、TCRは、少なくとも１つのTCRアルファ及び/又はTCRベータ可変ドメインを有する部分である。一般的に、これらは、TCRアルファ可変ドメインとTCRベータ可変ドメインとの両方を含む。これらは、αβヘテロダイマーであってよいか、又は単鎖フォーマットであってよい。治療剤を抗原提示細胞に送達するためのターゲティング薬剤として用いるために、αβヘテロダイマーTCRは、可溶性の形態(すなわち細胞質ドメインの膜貫通を有さない)であり得る。安定性のために、このような可溶性TCRは、例えばWO 03/020763に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基間に、導入されたジスルフィド結合を有することが好ましい。本発明のαβヘテロダイマーに存在する一方又は両方の定常ドメインは、１つ以上のＣ末端にて、例えば15アミノ酸まで、又は10アミノ酸まで、又は8若しくはそれより少ないアミノ酸まで切断され得る。養子療法における使用のために、αβヘテロダイマーTCRは、例えば、細胞質及び膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖として形質移入できる。必要であれば、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合が存在できる(例えばWO 2006/000830を参照されたい)。治療剤を抗原提示細胞に送達するためのターゲティング薬剤としての使用のために、可溶性TCRは、単鎖フォーマットであってよい。これらは、Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ又はVα-L-Vβ-CβタイプのαβTCRポリペプチド(ここで、Vα及びVβはそれぞれTCRα及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCRα及びβ定常領域であり、Lはリンカー配列である)を含む。養子療法は、天然ジスルフィド結合フォーマット及び導入されたジスルフィド結合フォーマットの両方、若しくは単鎖TCR構築物として膜貫通ドメイン、又は/及びこの主題の周辺の変動を組み込んだ全長TCR配列を採用できる。
【００１５】
フォーマットが何であっても、本発明のTCRは、配列番号２及び３の細胞外アルファ及びベータ鎖配列をそれらのアルファ可変ドメイン(配列番号２のS1からA109まで広がる)及び/又はベータ可変ドメイン(配列番号３のD1からT112まで広がる)に有する天然gp100 TCRと比べて変異されている。天然gp100 TCR又は参照gp100 TCRは、本発明のTCRとYLEPGPVTA-HLA-A2複合体との間の相互作用についての高い親和性及び/又は遅い解離速度を引き起こす種々の変異をその中に導入できる鋳型として用いることができる。本発明の実施形態は、配列番号２のS1からA109まで広がるα鎖可変ドメイン及び/又は配列番号３のD1からT112まで広がるβ鎖可変ドメインと比べて変異されるTCRを、少なくとも１つのその相補性決定領域(CDR)及び/又は可変ドメインフレームワーク領域内に含む。
【００１６】
変異は、それらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、制限酵素に基づくクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)の手順を含む任意の適当な方法を用いて行うことができる。これらの方法は、標準的な分子生物学の教科書の多くに詳説されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)突然変異誘発及び制限酵素に基づくクローニングに関するさらなる詳細は、Sambrook及びRussell、(2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (第３版) CSHL Pressを参照されたい。LICの手順についてのさらなる情報は、(Rashtchian、(1995) Curr Opin Biotechnol 6 (1): 30〜6)で見出すことができる。
【００１７】
本発明の高親和性gp100 TCRを作製するためのある方法は、WO 2004/044004に記載されるような、このようなTCRを提示するファージ粒子の多様なライブラリーからの選択である。
【００１８】
参照gp100 TCRのものと類似のVα及びVβ遺伝子用法を含み、そのことにより類似の可変ドメインアミノ酸配列を含む任意のαβTCRが、簡便な鋳型TCRを作製できることに注意されたい。よって、鋳型αβTCRの一方又は両方の可変ドメインをコードするDNA中に、本発明の変異された高親和性TCRを生成するために要求される変更を導入できる。当業者には明確なように、必要な変異は、いくつかの方法、例えば部位特異的突然変異誘発により導入できる。
【００１９】
本発明の好ましいTCRは、そのアルファ可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列１〜109と少なくとも90% (例えば少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%)の配列同一性(すなわち、天然Vαドメインの残基の10%未満(又は７%未満又は好ましくは６%未満)が変更される)、及び/又はそのベータ可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列１〜112と少なくとも90% (例えば少なくとも93%、好ましくは少なくとも94%)の配列同一性(すなわち、天然Vβドメインの残基の10%未満(又は７%未満又は好ましくは６%未満)が変更される)を有するものを含む。単一の変更は、単一の挿入、欠失又は変異を含む。配列同一性は、例えば手動又はコンピュータプログラムの使用のいずれかによる配列アラインメントにより決定できる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明のTCRは、94D位、97L位、98V位若しくは102G位の１つ以上のアミノ酸残基が変異されていることを除いて配列番号２のS1からA109まで広がるアルファ鎖可変ドメインを有し、かつ/又は27L位、28N位、29H位、30D位、31A位、50Q位、51I位、52V位、53N位、54D位、61A位、94S位、95I位、96G位、97G位、98P位若しくは100E位の１つ以上のアミノ酸残基が変異されていることを除いて配列番号３のD1からT112まで広がるベータ鎖可変ドメインを有する。例えば、本発明のTCRは、配列番号２に示す番号付けを用いて94S、 94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A又は102Dの１つ以上のアルファ鎖可変ドメインアミノ酸残基を有し、かつ/又は配列番号３に示す番号付けを用いて27I、28F、29Q、30K、31K、50W、51A、51G、52Q、52Y、52T、53G、53F、54N、54H、61T、94L、95Y、95H、95W、95F、95S、95V、96C、97E、97A、98G、100Q又は100Pの１つ以上のベータ鎖可変ドメインアミノ酸残基を有する。
【００２１】
本発明の特異的TCRは、配列番号７、８及び９のアルファ鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つ、及び/又は配列番号10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34及び35のベータ鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つを含むものを含む。よって、野生型アルファ鎖の可変ドメイン配列(配列番号２のS1からA109)を有するTCRは、配列番号10〜35の１つを有するベータ鎖と会合させ得る。代わりに、配列番号７〜９の１つを有するアルファ鎖は、配列番号３の野生型ベータ鎖の可変ドメイン配列(D1からT112)と会合させ得る。代わりに、配列番号７〜９を有するアルファ鎖は、配列番号10〜35の１つを有するベータ鎖と会合させ得る。
【００２２】
主にそれらの高い親和性及び遅い解離速度(すなわち長い半減期)のためにターゲティングの使用のための可溶性TCRとして現在好ましいものは、配列番号８のアルファ鎖可変ドメインアミノ酸配列(X = S又はA又はG)と、配列番号27のベータ鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含むものである。このような好ましいTCRは、αβヘテロダイマーフォーマット、すなわちTRAC及びTRBCドメインを含むフォーマットにあることが好ましい。上述のように、このようなTRAC及びTRBCドメインは、一方のＣ末端又は両方のＣ末端にて切断されてよい。例えば、参照TCRアルファ鎖の定常ドメインのＣ末端は、15アミノ酸まで、又は10アミノ酸まで、又は８若しくはそれ未満のアミノ酸までの欠失により切断されてよい。
【００２３】
上記のTCRの表現型サイレントバリアントも、本発明の一部をなす。用語「表現型サイレントバリアント」は、ペプチド-HLA複合体との相互作用についての親和性及び/又は解離速度を変化させない変更を定常及び/又は可変ドメイン中に組み込んだこと以外は本発明のTCRと配列が同一であるTCRのことをいう。このようなバリアントのある例は、TCRアルファ定常ドメインが、配列番号２の番号付けを用いて130セリン(S)アミノ酸残基を置換するフェニルアラニン(F)アミノ酸残基を含有する本発明のTCRにより提供される。
【００２４】
上記のように、本発明のαβヘテロダイマーTCRは、それらの定常ドメイン間にジスルフィド結合が導入されてよい。このタイプの好ましいTCRは、TRACのThr 48とTRBC1又はTRBC2のSer 57とがシステイン残基(これらのシステインは、TCRのTRAC定常ドメイン配列とTRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列との間にジスルフィド結合を形成する)により置き換えられた以外はTRAC定常ドメイン配列とTRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列とを有するものを含む。
【００２５】
前の段落で述べた鎖間結合を導入するか又は導入せずに、本発明のαβヘテロダイマーTCRは、TRAC定常ドメイン配列とTRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列とを有してよく、TCRのTRAC定常ドメイン配列とTRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列とは、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然ジスルフィド結合により連結されてよい。
上記のように、本発明の可溶性TCRは、検出可能な標識(TCRを用いてYLEPGPVTA HLA-A2複合体を提示する細胞の存在を検出する診断目的のために)；治療剤；PK改変部分(例えばPEG化により)；又は上記の組み合わせと(共有結合的に又は他で)会合してよい。
【００２６】
診断目的のための検出可能な標識は、それらに限定されないが、蛍光若しくは発光標識、放射性標識、MRI若しくはCT造影剤、又は検出可能な生成物を生成する酵素を含む。
本発明のTCRと会合し得る治療剤は、それらに限定されないが、放射活性化合物、プロドラッグ活性化酵素(例えばDT-ジアフォラーゼ(DTD)又はビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質(BPHL))、化学療法剤(例えばシスプラチン)、毒素(シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、例えばPE38、カルシマイシン又はジフテリア毒素)、免疫調節性抗体断片、例えば抗CD3若しくは抗CD16又は免疫調節性サイトカイン(例えばIL-2)を含む。毒性の効果が所望の場所で確実に発揮されるために、毒素は、化合物が緩慢に放出されるように、又は不安定なリンカーにより毒素をTCRにカップリングさせることによりTCRと連結されたリポソームの内側にあり得る。このことは、体内の輸送中に効果を損なうことを防ぎ、関連する抗原提示細胞にTCRが結合した後に毒素が最大限の効果を確実に有するようにする。
【００２７】
その他の適切な治療剤は、以下のものを含む。
・小分子細胞傷害性薬剤、すなわち哺乳動物細胞を死滅させる能力を有する、700ダルトン未満の分子量を有する化合物。このような化合物は、細胞傷害性効果を有することができる毒性の金属も含有し得る。さらに、これらの小分子細胞傷害性薬剤は、プロドラッグ、すなわち生理条件下で崩壊又は変換されて細胞傷害性薬剤を放出する化合物も含むと理解される。このような薬剤の例は、シスプラチン、マイタンシン誘導体、ラケルマイシン、カリチアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イフォスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーナトリウムフォトフリン(sorfimer sodiumphotofrin) II、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート(trimetreate glucuronate)、オーリスタチンEビンクリスチン及びドキソルビシン；
・ペプチド細胞毒素、すなわち哺乳動物細胞を死滅させる能力を有するタンパク質又はその断片。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素A、DNアーゼ及びRNアーゼ；
・放射性核種、すなわちα若しくはβ粒子又はγ線の１つ以上の並列の放射により減衰する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素131、レニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210及び213、アクチニウム225並びにアスタチン213。キレート化剤を用いて、高親和性TCR又はそのマルチマーとのこれらの放射性核種の会合を容易にすることができる；
【００２８】
・免疫賦活剤、すなわち免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えばIL-2及びIFN-γのようなサイトカイン；
・スーパー抗原及びその変異体；
・TCR-HLA融合体、ここで、HLAは免疫原性抗原を規定する；
・IL-8、血小板因子４、メラノーマ成長刺激タンパク質などのようなケモカイン；
・抗Ｔ細胞又はNK細胞決定因子抗体(例えば抗CD3又は抗CD28又は抗CD16)を含む、抗体は又はその断片；
・補体活性化因子；
・異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス/細菌タンパク質ドメイン、ウイルス/細菌ペプチド。
【００２９】
ある好ましい実施形態は、抗CD3抗体、又は抗CD3抗体の機能的断片若しくはバリアントと会合した本発明のTCRにより提供される。本明細書に記載される組成物及び方法において用いるために適切な抗体断片及びバリアント/類似体は、それらに限定されないが、ミニボディ、Fab断片、F(ab')2断片、dsFv及びscFv断片、又はその他の抗体足場タンパク質を含み、例えばNanobodies(商標) (Ablynx (Belgium)により販売されるこれらの構築物は、ラクダ科動物(例えばラクダ又はラマ)抗体に由来する合成単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む)、ドメイン抗体(Domantis (Belgium)により販売される、親和性成熟単一免疫グロブリン可変重鎖ドメイン又は免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含む)、ユニボディ(UniBodies) (Genmabにより販売される、ユニボディは、抗体のヒンジ領域が除去された改変完全ヒトIgG4抗体である)、三官能性(Trifunctional)抗体(２つの異なる抗原についての結合部位を有するモノクローナル抗体)、アフィボディ(Affibodyにより販売される、アフィボディは、スタフィロコッカスプロテインAのIgG結合ドメインの１つに由来する58アミノ酸残基のタンパク質ドメインである３へリックス束ドメインに基づく)、アンチカリン(ヒトリポカリンから合成された抗体模倣物であって、二重ターゲティングタンパク質、いわゆるデュオカリンとしてフォーマットすることもできる)又はDARPin (設計されたアンキリンリピートタンパク質；Designed Ankyrin Repeat Protein) (これは、遍在する結合分子である反復タンパク質、例えばアンキリンまたはロイシンリッチ反復タンパク質に基づく抗体模倣物の別の例である)を含む。
【００３０】
本発明のより具体的なTCR-抗CD3融合体は、以下からなる群より選択されるTCRアルファ鎖アミノ酸配列：
(i)   配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はSである)の配列で置き換えられている；
(ii)  配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はAである)の配列で置き換えられている；
(iii) 配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はGである)の配列で置き換えられている；
(iv)  配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はSである)の配列で置き換えられており、アルファ鎖のＣ末端は、配列番号45の番号付けに基づいてF196からS203まで(両端含む)の８アミノ酸が切断されている；
(v)   配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はAである)の配列で置き換えられており、アルファ鎖のＣ末端は、配列番号45の番号付けに基づいてF196からS203まで(両端含む)の８アミノ酸が切断されている；
(vi)  配列番号45のTCRアルファ鎖配列、ここで、アミノ酸１〜109は、配列番号８(ここで、１位のアミノ酸はGである)の配列で置き換えられており、アルファ鎖のＣ末端は、配列番号45の番号付けに基づいてF196からS203まで(両端含む)の８アミノ酸が切断されている；
【００３１】
と、以下からなる群より選択されるTCRベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列：
(vii) 配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIである)；
(viii)      配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びIである)；
(ix)  配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びQである)；
(x)   配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIであり、108位〜131位のアミノ酸がRTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG (配列番号44)で置き換えられ、254位〜258位のアミノ酸がGGEGGGSEGGGS (配列番号47)で置き換えられている)；
(xi)  配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIであり、257位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xii) 配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIであり、256位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xiii)      配列番号36のTCRベータ鎖-抗CD3配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIであり、255位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xiv) 配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がA及びQであり、257位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xv)  配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がA及びQであり、256位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xvi) 配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がA及びQであり、255位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xvii)      配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びIであり、257位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xviii)     配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びIであり、256位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである)；
(xix) 配列番号36の配列を有するTCRベータ鎖-抗CD3(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びIであり、255位のアミノ酸がSであり、258位のアミノ酸がGである；
とを含む。
【００３２】
このようなTCR-抗CD3融合体の例は、以下のとおりである：
アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(vii)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(x)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(ix)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(v)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(viii)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(vii)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xi)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xii)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(i)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiii)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiv)である、請求項18でクレームされるTCR；
【００３３】
アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xv)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xvi)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(v)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xvii)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(v)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xviii)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(v)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xix)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xi)である、請求項18でクレームされるTCR；
アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xii)である、請求項18でクレームされるTCR；及び
アルファ鎖アミノ酸配列が(vi)であり、ベータ鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiii)である、請求項18でクレームされるTCR。
【００３４】
本発明のαβヘテロダイマーTCRは、養子療法において有用性を有するので、本発明は、本発明のTCRを提示する単離細胞、特にＴ細胞も含む。本発明の高親和性TCRをコードするDNA又はRNAでＴ細胞を形質移入するために適切ないくつかの方法が存在する(例えばRobbinsら、(2008) J. Immunol. 180: 6116〜6131を参照されたい)。本発明の高親和性TCRを発現するＴ細胞は、gp100+ HLA-A2+がんの養子療法に基づく治療における使用のために適切である。当業者に知られるように、養子療法を行うことができるいくつかの適切な方法が存在する(例えばRosenbergら、(2008) Nat Rev Cancer 8 (4): 299〜308を参照されたい)。
【００３５】
いくつかの目的のために、本発明のTCRを、いくつかのTCRを含む複合体にマルチマー形成させて、多価TCR複合体を形成できる。多価TCR複合体の生成において用いることができる、マルチマー形成ドメインを含有するいくつかのヒトタンパク質が存在する。例えば、モノマーscFv断片と比較して血清中の持続が増加し、解離速度が著しく低下したscFv抗体断片のテトラマーを生成するために用いられているp53のテトラマー形成ドメイン(Willudaら(2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385〜14392)。ヘモグロビンもテトラマー形成ドメインを有し、これは、この種類の用途のために用い得る可能性がある。本発明の多価TCR複合体は、マルチマー形成していない野生型又は本発明のＴ細胞レセプターヘテロダイマーと比較して、YLEPGPVTA-HLA-A2複合体についての結合能力が増進され得る。つまり、本発明のTCRの多価複合体も、本発明に含まれる。本発明によるこのような多価TCR複合体は、インビトロ又はインビボで特定の抗原を提示する細胞を追跡又はターゲティングするために特に有用であり、このような用途を有するさらなる多価TCR複合体の生成のための中間体としても有用である。
【００３６】
養子療法における使用を意図する本発明のTCRは、形質移入されたＴ細胞により発現される場合にグリコシル化される。公知のように、形質移入されたTCRのグリコシル化パターンは、形質移入された遺伝子の変異により改変され得る。
【００３７】
患者への投与のために、本発明のTCR及び本発明のTCRで形質移入されたＴ細胞は、医薬的に許容され得る担体とともに医薬組成物中に用いることができる。本発明による治療用又はイメージング用のTCR、多価TCR複合体及び細胞は、医薬的に許容され得る担体を通常含む滅菌医薬組成物の一部として、通常、供給される。この医薬組成物は、任意の適切な形態にあり得る(患者へそれを投与する所望の方法に依存する)。これは、単位剤形で提供してよく、密閉された容器内で通常、提供され、キットの一部として提供してもよい。このようなキットは、通常(必須ではないが)、使用説明書を含む。これは、複数の上記の単位剤形を含んでよい。
【００３８】
医薬組成物は、任意の適当な経路、好ましくは非経口(皮下、筋内、又は好ましくは静脈内を含む)経路による投与に適応され得る。このような組成物は、薬学の分野において既知の任意の方法により、例えば活性成分を担体又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより調製できる。
本発明の物質の投与量は、治療される疾患若しくは障害、治療される個体の年齢及び状態などに応じた広い限度間で変動でき、医師が、最終的に、使用される適切な投与量を決定する。
本発明は、以下の図面に言及する以下の実施例においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図1A及び2Aはそれぞれ、K113がN113 (すなわちTRACのN4)で置換された以外はTRAV17/TRAJ29/TRAC遺伝子用法を有する天然gp100 TCRアルファ鎖の細胞外アミノ酸配列と、TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2遺伝子用法を有する天然gp100 TCRベータ鎖の細胞外アミノ酸配列とを示す(それぞれ配列番号２及び３)。  図1B及び2Bはそれぞれ、参照gp100 TCRアルファ及びベータ鎖とも呼ばれる可溶性野生型gp100 TCRアルファ及びベータ鎖をコードするDNA配列を示す。これらの配列は、さらなるシステイン残基を含んで、非天然ジスルフィド結合を形成する。さらなるシステイン残基をコードする変異されたコドンに陰影を付して示す。NdeI及びHindIII制限酵素認識配列に下線を付す。  図1C及び2Cはそれぞれ、図1B及び2BのDNA配列から生成される、可溶性野生型gp100 TCR又は参照gp100 TCR、アルファ及びベータ鎖細胞外アミノ酸配列(それぞれ配列番号45及び46) (細菌での効率的な発現のために挿入された、導入された先頭のメチオニンがない)を示す。導入されたシステインを、太字及び下線で示す。
【図２】図1A及び2Aはそれぞれ、K113がN113 (すなわちTRACのN4)で置換された以外はTRAV17/TRAJ29/TRAC遺伝子用法を有する天然gp100 TCRアルファ鎖の細胞外アミノ酸配列と、TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2遺伝子用法を有する天然gp100 TCRベータ鎖の細胞外アミノ酸配列とを示す(それぞれ配列番号２及び３)。  図1B及び2Bはそれぞれ、参照gp100 TCRアルファ及びベータ鎖とも呼ばれる可溶性野生型gp100 TCRアルファ及びベータ鎖をコードするDNA配列を示す。これらの配列は、さらなるシステイン残基を含んで、非天然ジスルフィド結合を形成する。さらなるシステイン残基をコードする変異されたコドンに陰影を付して示す。NdeI及びHindIII制限酵素認識配列に下線を付す。  図1C及び2Cはそれぞれ、図1B及び2BのDNA配列から生成される、可溶性野生型gp100 TCR又は参照gp100 TCR、アルファ及びベータ鎖細胞外アミノ酸配列(それぞれ配列番号45及び46) (細菌での効率的な発現のために挿入された、導入された先頭のメチオニンがない)を示す。導入されたシステインを、太字及び下線で示す。
【図３】図3A〜Cは、高親和性gp100 TCRバリアントのアルファ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。変異された残基は、太字及び下線で示す。
【図４】図4A〜Zは、高親和性gp100 TCRバリアントのベータ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。変異された残基は、太字及び下線で示す。
【図５】図5Aは、高親和性gp100 TCRによるYLEPGPVTV (配列番号6)バリアントgp100ペプチドを用いてパルスしたT2細胞のインビトロ染色のフローサイトメトリーデータを示す。  図5Bは、高親和性gp100 TCRによるYLEPGPVTV (配列番号6)バリアントgp100ペプチドを用いてパルスしたT2細胞の顕微鏡画像を示す。
【図６】図6は、リンカー、すなわち配列番号48のGGGGS (下線)を介してgp100 TCRベータ鎖のN末端にて融合した抗CD3 scFv抗体断片(太字タイプ)のアミノ酸配列を示す。gp100 TCRベータ鎖は、配列番号27の可変領域を含有する。
【図７】図7は、非放射活性細胞傷害性アッセイにおける、メラノーマ株化細胞Mel526を死滅させる抗CD3 scFv-gp100高親和性TCRによるＴ細胞の再指向(redirection)を示す応答曲線である。
【図８】図8Aは、Ｔ細胞の形質導入のための、野生型gp100-特異的TCR遺伝子(ブタテッショウウイルス-1 2A配列(太字及び下線)を含むWTアルファ鎖-2A-WTベータ鎖構築物)のDNA配列を示す。  図8Bは、図8AのDNA配列から生成されるＴ細胞形質導入のための野生型gp100-特異的TCRのアミノ酸配列を示す。ブタテッショウウイルス-1 2A配列は、太字及び下線で示す。
【図９】図9a及び9bは、ELISPOTアッセイにおける、種々の標的細胞に応答した、gp100 TCRを形質導入したＴ細胞のIFN-γ放出を示す。これらの図は、高親和性gp100 TCRを形質導入したＴ細胞の特異的活性化が、天然gp100 TCRを形質導入したＴ細胞と比較して増加することを示す。
【図１０】図10は、TCR-pMHC親和性が増加する異なるgp100 TCR-抗CD3 scFv融合体により活性化されたCD8+Ｔ細胞のIFN-γ放出を示す。
【図１１】図11は、異なるgp100 TCR-抗CD3 scFv融合体により活性化されたCD8+Ｔ細胞のIFN-γ放出を示す。
【図１２】図12は、ヒトメラノーマ異種移植片を有する免疫不全マウスを用いてgp100高親和性TCR-抗CD3 scFv融合タンパク質の抗腫瘍効力を試験するインビボモデルにおける平均腫瘍量の進化を示す。
【実施例】
【００４０】
実施例１
参照gp100 TCRアルファ及びベータ鎖可変領域配列の、pGMT7に基づく発現プラスミドへのクローニング
参照gp100 TCR可変アルファ及びTCR可変ベータドメインを、gp100Ｔ細胞クローンから単離したトータルcDNAからPCR増幅した。アルファ鎖の場合、制限部位NdeI、細菌での発現の効率的な開始のために導入されたメチオニンをコードするアルファ鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドA1 (ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatcc 配列番号39)と、制限部位SalIをコードするアルファ鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドA2 (ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg 配列番号40)とを用いて、アルファ鎖可変領域を増幅した。ベータ鎖の場合、制限部位NdeI、細菌での発現の効率的な開始のために導入されたメチオニンをコードするベータ鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドB1 (tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaa 配列番号41)と、制限部位AgeIをコードするベータ鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドB2 (tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc 配列番号42)とを用いて、ベータ鎖可変領域を増幅した。
【００４１】
アルファ及びベータ可変領域を、Cα又はCβのいずれかを含有するpGMT7に基づく発現プラスミドに、(Sambrook及びRussellによるMolecular Cloning a Laboratory Manual第３版)に記載される標準的な方法によりクローニングした。プラスミドを、Applied Biosystems 3730xl DNAアナライザを用いて配列決定した。
NdeI及びSalIで切断したTCRアルファ鎖をコードするDNA配列をpGMT7+ Cαベクターにライゲーションし、これをNdeI及びXhoIで切断した。NdeI及びAgeIで切断したTCRベータ鎖をコードするDNA配列を、これもまたNdeI及びAgeIで切断した別のpGMT7+ Cβベクターにライゲーションした。
ライゲーション
ライゲーションしたプラスミドで、コンピテント大腸菌(Escherichia coli) XL1-blue株の細胞を形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含有するLB/寒天プレートに播種する。37℃にて１晩のインキュベーションの後に、単一コロニーを採取し、100μg/mlアンピシリンを含有する10 mlのLB中で、37℃にて１晩、振とうしながら成長させる。クローニングされたプラスミドを、Miniprepキット(Qiagen)を用いて精製し、挿入断片を、自動DNAシーケンサー(Lark Technologies)を用いて配列決定する。
【００４２】
図1C及び2Cはそれぞれ、それぞれ図1B及び2BのDNA配列から生成される、可溶性ジスルフィド連結参照gp100 TCRα及びβ鎖細胞外アミノ酸配列(細菌での効率的な発現のために挿入された、導入された先頭のメチオニンがない) (それぞれ配列番号45及び46)を示す。システインが、ヘテロダイマーTCRを形成するようにリフォールディングの際に人工的に鎖間ジスルフィド結合をもたらすように、アルファ及びベータ鎖の定常領域中に置換されたことに注意されたい。導入されたシステインに、陰影を付して示す。図1B及び2BのDNA配列中の制限酵素認識配列に下線を付す。
【００４３】
実施例２
可溶性参照gp100 TCRの発現、リフォールディング及び精製
実施例１のようにして調製したそれぞれTCRα鎖及びβ鎖を含有する発現プラスミドで、別々に大腸菌Rosetta (DE3)pLysS株を形質転換し、単一アンピシリン耐性コロニーを、37℃にてTYP (アンピシリン100μg/ml)培地中でOD600が約0.6〜0.8になるまで成長させた後に、タンパク質発現を、0.5 mM IPTGを用いて誘導した。細胞を、誘導の３時間後に、30分間、4000 rpmにてBeckman J-6B中での遠心分離により採集した。細胞ペレットを、25 ml Bug Buster (NovaGen)を用いてMgCl2及びDNアーゼIの存在下で溶解した。封入体ペレットを、30分間、13000 rpmにてBeckman J2-21遠心分離機中での遠心分離により回収した。３回の洗剤での洗浄を次いで行って、細胞破片及び膜成分を除去した。各回に、封入体ペレットを、Tritonバッファー(50 mM Tris-HCI pH8.0、0.5% Triton-X100、200 mM NaCl、10 mM NaEDTA)中でホモジナイズした後に、15分間、4,000 rpmにて遠心分離によりペレットにした。洗剤及び塩を、次いで、以下のバッファー中での同様の洗浄により除去した：50 mM Tris-HCl、1 mM NaEDTA、pH 8.0。最後に、封入体を30 mgの分割量に分け、-70℃にて凍結した。封入体タンパク質収率は、6Mグアニジン-HClでの可溶化により定量し、OD測定をHitachi U-2001分光光度計で行った。タンパク質濃度を、次いで、吸光係数を用いて算出した。
【００４４】
およそ30 mgのTCRβ鎖可溶化封入体及び60 mgのTCRα鎖可溶化封入体を、凍結ストックから融解し、15 mlのグアニジン溶液(6Mグアニジン塩酸塩、50 mM Tris HCl pH8.1、100 mM NaCl、10 mM EDTA、10 mM DTT)に希釈して、鎖の完全な変性を確実にした。完全に還元され、変性されたTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、次いで、１リットルの以下のリフォールディングバッファーに注入した：100 mM Tris pH 8.1、400 mM L-アルギニン、2 mM EDTA、5M尿素。レドックス対(システアミン塩酸塩とシスタミン二塩酸塩、それぞれ6.6 mM及び3.7 mMの最終濃度まで)を加えたおよそ５分後に、変性したTCR鎖を加えた。溶液を約１時間放置した。リフォールディングされたTCRを、透析チューブセルロース膜(Sigma-Aldrich; 製品番号D9402)中で10LのH2Oに対して５℃±３℃にて18〜20時間透析した。この時間の後に、透析バッファーを２回、新鮮な10 mM Tris pH 8.1 (10L)に交換し、透析を５℃±３℃にてさらに約８時間継続した。
【００４５】
可溶性TCRを、誤って折り畳まれた分解生成物及び不純物から、透析したリフォールディングされた物質をPOROS 50HQアニオン交換カラムに載せ、結合したタンパク質を、10 mM Tris pH 8.1中の０〜500 mM NaClの勾配を６カラム容量にわたって用いて、Akta精製装置(GE Healthcare)を用いて溶出することにより分離した。プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Calbiochem)を、ピーク画分に加えた。画分を、次いで４℃で貯蔵し、クーマシー染色SDS-PAGEで分析した後にプールして濃縮した。最後に、可溶性TCRを精製し、PBSバッファー(Sigma)で予め平衡化したGE Healthcare Superdex 75HRゲル濾過カラムを用いて特徴決定した。およそ50 kDaの相対分子量にて溶出されたピークをプールし、濃縮した後に、BIAcore表面プラズモン共鳴分析により特徴決定した。
【００４６】
実施例３
結合の特徴決定
BIAcore分析
表面プラズモン共鳴バイオセンサ(BIAcore 3000(商標))を用いて、可溶性TCRとそのペプチド-MHCリガンドとの結合を分析できる。このことは、可溶性ビオチン化ペプチド-HLA (「pHLA」)複合体を生成することにより容易になり、これは、ストレプトアビジンで被覆された結合表面(センサチップ)に固定化できる。センサチップは、４つの個別のフローセルを含み、これらは、４つの異なるpHLA複合体へのＴ細胞レセプター結合を同時測定することを可能にする。pHLA複合体を手動で注入することにより、精密なレベルの固定化されたクラスＩ分子を容易に操作することが可能になる。
ビオチン化クラスＩHLA-A*02分子を、インビトロにて、構成されたサブユニットタンパク質と合成ペプチドとを含有する、細菌により発現された封入体からリフォールディングし、その後、精製及びインビトロ酵素ビオチン化を行った(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9〜15)。Ｃ末端ビオチン化タグを有するHLA-A*02重鎖を発現させ、このタグは、適当な構築物中でタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを置き換える。得られた封入体の発現レベルは、約75 mg/リットル細菌培養物であった。HLA軽鎖又はβ2-ミクログロブリン(β2m)も、適当な構築物から大腸菌において封入体として、約500 mg/リットル細菌培養物のレベルで発現された。
【００４７】
大腸菌細胞を溶解し、封入体をおよそ80%の純度まで処理した。合成ペプチド(gp100 YLEPGPVTA)をDMSOに、４mg/mlの最終濃度まで溶解する。b2m及び重鎖の封入体を、別々に、6Mグアニジン-HCl、50 mM Tris pH 8.1、100 mM NaCl、10 mM DTT、10 mM EDTA中で変性させた。0.4 M L-アルギニン、100 mM Tris pH 8.1、3.7 mMシスタミン二塩酸塩、6.6 mMシステアミン塩酸塩を含有するリフォールディングバッファーを調製し、５℃未満で冷却した。好ましくは、ペプチドをまずリフォールディングバッファーに加え、その後、変性されたb2mを加え、次いで変性された重鎖を加える。gp100 YLEPGPVTAペプチドを、リフォールディングバッファーに４mg/リットル(最終濃度)まで加える。次いで、30 mg/リットルのb2m、その後、30 mg/リットルの重鎖(最終濃度)を加える。リフォールディングの完了は、４℃にて少なくとも１時間で到達することが可能であった。
【００４８】
バッファーを、10容量の10 mM Tris pH 8.1中での透析により交換した。溶液のイオン強度を十分に低減するために、２回のバッファー交換が必要であった。タンパク質溶液を、次いで、1.5μmのセルロースアセテートフィルタを通して濾過し、POROS 50HQアニオン交換カラム(8 mlベッド容量)に載せた。タンパク質を、10 mM Tris pH 8.1中の０〜500 mM NaClの直線勾配で、Akta精製装置(GE Healthcare)を用いて溶出した。およそ250 mM NaClにて溶出されたHLA-A*02-ペプチド複合体及びピーク画分を回収し、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Calbiochem)を加え、画分を氷上で冷却した。
ビオチン化タグを付加したpHLA分子のバッファーを、10 mM Tris pH 8.1、5 mM NaClに、同じバッファーで平衡化したGE Healthcare fast脱塩カラムを用いて交換した。ちょうど溶出の際に、タンパク質含有画分を氷上で冷却し、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Calbiochem)を加えた。ビオチン化試薬を、次いで加えた：１mMビオチン、５mM ATP (pH８に緩衝)、7.5 mM MgCl2及び５μg/ml BirA酵素(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9〜15に従って精製)。混合物を、次いで、室温にて１晩インキュベートした。
【００４９】
ビオチン化pHLA-A*02分子を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製した。GE Healthcare Superdex 75 HR 10/30カラムを、濾過したPBSで予め平衡化し、１mlのビオチン化試薬混合物を載せ、カラムを、PBSで0.5 ml/分にて、Akta精製装置(GE Healthcare)を用いて展開した。ビオチン化pHLA-A*02分子は、およそ15 mlでの単一ピークとして溶出された。タンパク質を含有する画分をプールし、氷上で冷却し、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを加えた。タンパク質濃度を、クーマシー結合アッセイ(PerBio)を用いて決定し、ビオチン化pHLA-A*02分子の分割量を、-20℃にて凍結貯蔵した。
このような固定化された複合体は、Ｔ細胞レセプターとコレセプターCD8ααとの両方と結合でき、これらはともに可溶性相に注入できる。可溶性TCRのpHLA結合特性は、TCRを可溶性又は固定化された相のいずれかで用いるならば、定性的及び定量的に類似しているように観察される。このことは、可溶性種の部分活性の重要な制御であり、ビオチン化pHLA複合体が、非ビオチン化複合体と同様に生物学的に活性であることも示唆する。
【００５０】
BIAcore 3000 (商標)表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサは、小さいフローセル内のセンサ表面付近の、応答単位(RU)として表される屈折率の変化を測定し、これは、レセプター-リガンド相互作用を検出し、それらの親和性及び動態パラメータを分析するために用いることができる本質である。BIAcore実験を、25℃の温度にて、運転バッファーとしてPBSバッファー(Sigma、pH 7.1〜7.5)を用い、タンパク質試料の希釈を調製して行った。ストレプトアビジンをフローセルに、標準的なアミンカップリング法により固定化した。pHLA複合体をビオチンタグにより固定化した。次いで、アッセイを、可溶性TCRを一定流速にて異なるフローセルの表面上を通過させ、そのようにしている間のSPR応答を測定することにより行った。
【００５１】
平衡結合定数
上記のBIAcore分析法を用いて、平衡結合定数を決定した。参照gp100 TCRのジスルフィド連結可溶性ヘテロダイマー形の系列希釈を調製し、５μl/分の一定流速にて、２つの異なるフローセルに注入した。１つは、約300 RUの特異的YLEPGPVTA HLA-A2複合体(又はバリアントペプチドYLEPGPVTV HLA-A2複合体)で被覆され、次のものは約300 RUの非特異的HLA-A2-WT1 wtペプチド(RMFPNAPYL)複合体で被覆されていた。応答を、各濃度について、対照セルからの測定を用いて標準化した。標準化されたデータ応答を、TCR試料の濃度に対してプロットし、非線形曲線適合モデルに適合させて、平衡結合定数KDを算出した(Price及びDwek、Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (第２版) 1979、Clarendon Press、Oxford)。参照gp100 TCRのジスルフィド連結可溶化形(実施例２)は、およそ19μMのKDを示した。同じBIAcoreデータから、T1/2は、およそ0.8ｓであった。
この親和性の決定は、HLA-A*0201を載せた、gp100 YLEPGPVTA (配列番号１)ペプチドのバリアントペプチド (YLEPGPVTV-配列番号６)を用いても反復した。可溶性ジスルフィド連結参照gp100 TCRは、YLEPGPVTV (配列番号６)-HLA*0201複合体(およそ19μM)について、gp100 YLEPGPVTA (配列番号１)-HLA*0201複合体について得られたものと同様の親和性(KD)を有する。
【００５２】
動態パラメータ
上記のBIAcore分析法も用いて、平衡結合定数と解離定数とを決定した。
高親和性TCR (以下の実施例４を参照)について、KDを、解離速度定数koff及び会合速度定数konを実験的に測定することにより決定した。平衡定数KDは、koff/konとして算出した。
TCRを、２つの異なるセル(１つは、約300 RUの特異的YLEPGPVTA HLA-A*02複合体(又は明記する場合はYLEPGPVTV HLA-A*02複合体)で被覆され、次のものは、約300 RUの非特異的HLA-A2-ペプチド複合体で被覆された)に注入した。流速は、50μl/分に設定した。典型的には、KDの約10倍に等しい濃度の250μlのTCRを注入した。緩衝液を、次いで、応答がベースラインに戻るまで、又は２時間を超えるまでバッファーを流した。動態パラメータを、BIAevaluationソフトウェアを用いて算出した。解離段階を、半減期の算出を可能にする単一指数減衰等式に適合させた。
【００５３】
実施例４
天然gp100 TCRの高親和性バリアントの作製
ファージディスプレイは、高親和性変異体を同定するためにgp100 TCRバリアントのライブラリーを作製できる１つの手段である。(Liら、(2005) Nature Biotech 23 (3): 349〜354)に記載されるTCRファージディスプレイ及びスクリーニング法を、実施例２の参照gp100 TCRに用いた。６つ全てのgp100 TCR CDR領域(参照TCRにおいて天然TCRにおけるのと同じである)を、突然変異誘発の標的にし、各CDRライブラリーを別々にピックアップしてスクリーニングした。
参照gp100 TCRのものの少なくとも２倍(よって、天然TCRのものの少なくとも２倍)の親和性及び/又は結合半減期を有するTCRを同定し、これらは、配列番号２に示す番号付けを用いて94S、94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A若しくは102Dの１つ以上のアルファ鎖可変ドメインアミノ酸残基、及び/又は配列番号３に示す番号付けを用いて27I、28F、29Q、30K、31K、50W、51A、51G、52Q、52Y、52T、53G、53F、54N、54H、61T、94L、95Y、95H、95W、95F、95S、95V、96C、97E、97A、98G、100Q若しくは100Pの１つ以上のベータ鎖可変ドメインアミノ酸残基を有した。
【００５４】
高親和性TCRのアルファ鎖(配列番号７、８及び９)及びベータ鎖(配列番号10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34及び35)の可変領域のアミノ酸配列の具体例を、それぞれ図3A〜C及び4A〜Zに示す。これらのアルファ鎖は、CDR3においてのみ変異され、ベータ鎖は、CDR1、CDR2及びCDR3の１つ以上において変異される。
TCRヘテロダイマーを、上記の実施例２の方法を用いてリフォールディングした(定常領域に導入されたシステインを含んで、人工的な鎖間ジスルフィド結合をもたらす)。このようにして、(a) 参照TCR ベータ鎖と配列番号７、８及び９の可変ドメインを含むように変異されたアルファ鎖、(b)参照TCRアルファ鎖と配列番号10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34及び35のベータ鎖可変ドメインを含むように変異された参照TCRベータ鎖、(c)変異可変ドメインを含むベータ及びアルファ鎖の種々の組み合わせからなるTCRを調製した。
【００５５】
これらの高親和性可溶性ジスルフィド連結gp100 TCRと、天然ペプチド YLEPGPVTA HLA-A*02複合体との間の相互作用を、上記のBIAcore法を用いて分析し、結合データを表１に示す。表1Aは、バリアントペプチドYLEPGPVTV HLA-A*02複合体に対して試験した場合のこれらの高親和性TCRについての結合データを示す。
これらの高親和性可溶性ジスルフィド連結gp100 TCRとYLEPGPVTV HLA-A*02複合体との間の相互作用を、上記のBIAcore法を用いて分析し、結合データを表２に示す。
【００５６】
【表１】
0005872464.tif 000002
【００５７】
【表１Ａ】
0005872464.tif 000003
【００５８】
上記の表１及び表1Aは、天然gp100 YLEPGPVTAペプチド HLA-A*02複合体又はバリアントgp100 YLEPGPVTVペプチドHLA-A*02複合体のいずれかに対して試験したそれぞれの高親和性TCRについて、実験誤差の範囲内で、非常に類似した動態パラメータが得られたことを示す。この観察の後に、いくつかの高親和性TCRを、バリアントYLEPGPVTVペプチドHLA-A*02複合体(表２を参照)に対してのみ試験した。これらのTCRは、天然ペプチドHLA-A*02複合体について非常に類似した動態パラメータを示すことが予測される。
【００５９】
【表２】
0005872464.tif 000004
【００６０】
注：上記の表において、配列番号８の可変ドメインを有するTCRは、変動可能なアミノ酸ＸをＳとして有した。しかし、変動可能なアミノ酸ＸがＡであるバリアントは、本質的に類似であるT1/2及びKDを有した。
【００６１】
実施例５
高親和性gp100 TCRを用いるインビトロ細胞染色
以下のアッセイを行って、配列番号８(Ｘ=Ｓ)のVαと配列番号27のVβとを有する実施例４の可溶性高親和性gp100 TCRが、バリアントYLEPGPVTV (配列番号6)ペプチドでパルスしたT2細胞を染色できることを証明した。
この実施例の目的のために、ビオチンタグを、配列番号27のVβを有するgp100ベータ鎖の定常ドメインのＣ末端に融合し、遺伝子全体(Vβ+Cβ+ビオチンタグ)をpGMT7に基づく発現プラスミドに挿入した。TCRベータ鎖-ビオチンタグを、実施例２に記載した方法を用いて発現させた。αβTCR-ビオチンタグを、実施例２に記載した方法を用いてリフォールディングさせた。リフォールディングされたTCRを、実施例２に記載した方法を用いて第１アニオン交換ステップにおいて精製した。次いで、TCRを、実施例３に記載した方法を用いてビオチン化した。最後に、ビオチン化TCRを、実施例２に記載したようにして、GE Healthcare Superdex 75HRゲル濾過カラムを用いて精製した。
【００６２】
試薬
R10アッセイ媒体：10% FCS (熱不活化、Gibco、cat# 10108-165)、88% RPMI 1640 (Gibco、cat# 42401-018)、１%グルタミン(Gibco、cat# 25030-024)及び１%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco、cat# 15070-063)。
FACSバッファー：PBS/0.5% BSA (Promega、cat# W3841)。２mM EDTA
顕微鏡観察バッファー：PBS/0.5% BSA (Promega、cat# W3841)、400μM CaPO4、400μM MgPO4
【００６３】
フローサイトメトリーの方法
T2リンパ芽球様細胞を、バリアントgp100ペプチド(YLEPGPVTV (配列番号6))又は無関係のペプチド(ELAGIGILTV (配列番号43))で、さまざまな濃度(10-7〜10-9 M)にて少なくとも90分間、37℃/５% CO2にてR10培地中でパルスした。
パルスの後に、細胞をFACSバッファー中で３回洗浄し、１×106細胞を、高親和性ビオチン化gp100 TCR (５μg/ml)と30分間室温にてインキュベートし、FACSバッファーで２回洗浄し、ストレプトアビジン-PE (５μg/ml: BD biosciences、cat# 349023)と20分間室温にてインキュベートした。FACSバッファーで洗浄した後に、結合した高親和性gp100 TCRを、フローサイトメトリーにより、Beckman Coulter FC500フローサイトメーターを用いて定量した。gp100 TCRを省略したか、又は無関係のTCRを加えた、ペプチドでパルスしたT2細胞を用いる対照を含めた。
【００６４】
結果
10-9 M〜10-7 Mの間のYLEPGPVTV (配列番号６)バリアントgp100ペプチドでパルスしたT2細胞は、可溶性高親和性gp100 TCRにより染色されることが、うまく証明された。試験に対する対照のペプチドでパルスしたT2細胞の染色を示すサイトメトリーヒストグラムについての図5Aを参照されたい(塗りつぶした曲線が「TCRなし」対照である)。
【００６５】
顕微鏡観察の方法
バリアントペプチドYLEPGPVTV (配列番号６)でパルスしたT2細胞の染色を、蛍光顕微鏡観察により、高親和性ビオチン化gp100 TCRを用いて視覚化した。T2細胞のパルス及び染色を、上記の「フローサイトメトリー」に記載されるようにして行った。染色及び洗浄の後に、３×104細胞をR10 (フェノールレッドを含まない)中でもう一度洗浄し、最終的に、400μlのR10 (フェノールレッドを含まない)に再懸濁し、包囲したガラスカバースライド(Nunc、Lab-tek、cat# 155411)に移して、３次元蛍光顕微鏡観察の前に定着させた。
蛍光顕微鏡観察を、63倍の油対物レンズ(Zeiss)を備えるAxiovert 200M (Zeiss)顕微鏡を用いて行った。300Wキセノンアークランプ(Sutter)を有するラムダLS光源を照明のために用い、光強度を最適レベルまで、0.3及び0.6の減光フィルタを光路に配置することにより低減した。励起及び発光スペクトルを、TRITC/DiIフィルタセット(Chroma)を用いて分離した。細胞を、３次元で、ｚ−スタック取得(21平面、１μm間隔)により画像にした。画像取得及び分析は、Metamorphソフトウェア(Universal Imaging)と用いて、記載されるようにして行った(Irvineら、(2002) Nature 419 (6909): 845〜9及びPurbhooら、Nature Immunology 5 (5): 524〜30)。
【００６６】
結果
図5Bは、高親和性ビオチン化gp100 TCRが、YLEPGPVTV (配列番号６)ペプチドでパルスされたT2細胞とうまく結合したことを示す。
実施例６
可溶性抗CD3 scFv-gp100 TCR融合体の発現、リフォールディング及び精製
配列番号36 (図６)は、リンカー、すなわち配列番号48のGGGGS (下線)を介してgp100 TCRβ鎖のＮ末端にて融合されたが、タンパク質合成の効率的な開始のための導入された先頭のメチオニンを有さない抗CD3 scFv抗体断片(太字タイプ)のアミノ酸配列である。gp100 TCRβ鎖は、配列番号27の可変ドメインを含有する。
本実施例におけるTCR融合体のgp100 TCRα鎖は、X = Sである配列番号８の可変ドメイン(図3B)を含有する。
上記の構築物は、次のようにして調製した。
【００６７】
ライゲーション
(a)TCR Vα鎖及び(b)配列番号36の融合配列(１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIである)をコードする合成遺伝子を、pGMT7 + Cα(ジスルフィド結合の形成を可能にするシステインが導入されている)ベクター及びpGMT7に基づく発現プラスミドにそれぞれ別々にライゲーションし、これらは、大腸菌Rosetta (DE3)pLysS株における高い発現レベルのためのT7プロモーターを含有した(Panら、Biotechniques (2000) 29 (6): 1234〜8)。先頭のメチオニンを、TCRアルファ鎖可変ドメインのＮ末端及び配列番号36の融合配列のＮ末端に導入して、細菌におけるタンパク質合成の効率的な開始を可能にしたことに注意されたい。
【００６８】
発現
発現プラスミドで、大腸菌Rosetta (DE3)pLysS株を別々に形質転換し、単一のアンピシリン耐性コロニーを、37℃にてTYP (アンピシリン100μg/ml)培地中で約0.6〜0.8のOD600まで成長させた後に、タンパク質発現を、0.5 mM IPTGを用いて誘導した。細胞を、誘導の３時間後に、30分間、4000 rpmにてBeckman J-6B中での遠心分離により採集した。細胞ペレットを、25 ml Bug Buster (NovaGen)を用いてMgCl2及びDNアーゼの存在下で溶解した。封入体ペレットを、30分間、4,000 rpmでの遠心分離により回収した。３回の洗剤での洗浄を次いで行って、細胞破片及び膜成分を除去した。各回に、封入体ペレットを、Tritonバッファー(50 mM Tris-HCI pH8.0、0.5% Triton-X100、200 mM NaCl、10 mM NaEDTA)中でホモジナイズした後に、15分間、13000 rpmにてBeckman J2-21中での遠心分離によりペレットにした。洗剤及び塩を、次いで、以下のバッファー中での同様の洗浄により除去した：50 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM NaEDTA。最後に、封入体を30 mgの分割量に分け、-70℃にて凍結した。
リフォールディング
およそ20 mgのTCRα鎖及び40 mgのscFv-TCRβ鎖可溶化封入体を、凍結ストックから融解し、20 mlのグアニジン溶液(6Mグアニジン塩酸塩、50 mM Tris HCl pH8.1、100 mM NaCl、10 mM EDTA、20 mM DTT)に希釈して、37℃の水浴で30分〜１時間インキュベートして、鎖の完全な変性を確実にした。完全に還元され、変性されたTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、次いで、１リットルの以下のリフォールディングバッファーに注入した：100 mM Tris pH 8.1、400 mM L-アルギニン、2 mM EDTA、5M尿素。レドックス対(システアミン塩酸塩とシスタミン二塩酸塩(それぞれ10 mM及び1 mMの最終濃度まで))を加えたおよそ５分後に、変性したTCRα及びscFv-TCRβ鎖を加えた。溶液を約30分間放置した。リフォールディングされたscFv-TCRを、透析チューブセルロース膜(Sigma-Aldrich; 製品番号D9402)中で10LのH2Oに対して18〜20時間透析した。この時間の後に、透析バッファーを２回、新鮮な10 mM Tris pH 8.1 (10L)に交換し、透析を５℃±３℃にてさらに約８時間継続した。可溶性の正しく折り畳まれたscFv-TCRを、分解生成物及び不純物から、以下に記載される３ステップ精製法により分離した。
【００６９】
第１精製ステップ
透析したリフォールディングされた物質をPOROS 50HQアニオン交換カラムに載せ、結合したタンパク質を、０〜500 mM NaClの勾配を６カラム容量にわたって用いて、Akta精製装置(GE Healthcare)を用いて溶出した。ピーク画分(約20mS/cmの電気伝導度で溶出される)を４℃にて貯蔵した。ピーク画分を、Instant Blue Stain (Novexin)で染色するSDS-PAGEにより分析した後にプールした。
【００７０】
第２精製ステップ
カチオン交換精製
アニオン交換でプールした画分を、scFv-TCR融合体のpIに応じて、20 mM MES pH6〜6.5で希釈することによりバッファー交換した。可溶性で正しく折り畳まれたscFv-TCRを、誤って折り畳まれた分解生成物及び不純物から、希釈したプールした画分(20 mM MES pH6〜6.5中)を、POROS 50HSカチオン交換カラムに載せ、結合したタンパク質を、０〜500 mM NaClの勾配を６カラム容量にわたって用いて、Akta精製装置(GE Healthcare)を用いて溶出することにより分離した。ピーク画分(約10 mS/cmの電気伝導度で溶出される)を４℃にて貯蔵した。
【００７１】
最終精製ステップ
第２精製ステップからのピーク画分を、Instant Blue Stain (Novexin)で染色するSDS-PAGEにより分析した後にプールした。プールした画分を、次いで、最終精製ステップのために濃縮し、ここでは、可溶性scFv-TCRを精製し、PBSバッファー(Sigma)で予め平衡化したSuperdex S200ゲル濾過カラム(GE Healthcare)を用いて特徴決定した。およそ78 kDaの適切な分子量で溶出されるピークを、Instant Blue Stain (Novexin)で染色するSDS-PAGEにより分析した後にプールした。
上記の実施例６により調製された構築物を、配列番号48のリンカー配列GGGGSを、代替リンカー配列、例えば配列番号49のGGGSG、配列番号50のGGSGG、配列番号51のGSGGG、及び配列番号47のGGEGGGSEGGGSから選択される配列で置換することにより、かつ/又は配列番号36のアミノ酸D1をAで置換することにより、かつ/又は配列番号36のI2をQで置換することにより、かつ/又は配列番号８のS1をA若しくはGで置換することにより変動させ得る。別の変動において、配列番号36のベータ可変ドメイン配列形成部分を、配列番号27から配列番号13、17、23又は26に変更し得る。
【００７２】
実施例７
非放射活性細胞傷害性アッセイ
このアッセイは、51Cr放出細胞傷害性アッセイの比色による代替であり、細胞溶解の際に放出される酵素である乳酸脱水素酵素(LDH)を定量的に測定する。培養上清中に放出されるLDHを、30分結合酵素アッセイを用いて測定し、これは、テトラゾリウム塩(INT)を、赤色のフォルマザン生成物に変換させる。形成された色の量は、溶解された細胞の数に比例する。吸光度のデータは、標準的な96ウェルプレートリーダーを用いて490nmにて回収される。
【００７３】
材料
- CytoTox96 (登録商標)非放射活性細胞傷害性アッセイ(Promega) (G1780)は、基質ミックス、アッセイバッファー、溶解溶液及び停止溶液を含有する。
- アッセイ媒体：10% FCS (熱不活化、Gibco、cat# 10108-165)、フェノールレッド非含有88% RPMI 1640 (Invitrogen、cat# 32404014)、１%グルタミン、200 mM (Invitrogen、cat# 25030024)、１%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen cat# 15070063)
- Nuncマイクロウェル丸底96ウェル組織培養プレート(Nunc、cat# 163320)
- Nunc-ImmunoプレートMaxisorb (Nunc、cat# 442404)
【００７４】
方法
標的細胞の調製
本アッセイにおいて用いた標的細胞は、腫瘍株化細胞Mel526 (メラノーマ株化細胞HLA-A2+ gp100+)及びA375 (メラノーマ株化細胞HLA-A2+ gp100-)からであった。標的細胞を、アッセイ媒体中で調製した。標的細胞濃度は、２×105細胞/mlに調整して、１×104細胞/50μl-ウェルとした。
【００７５】
エフェクター細胞の調製
本アッセイにおいて用いたエフェクター細胞は、PBMC (末梢血単核細胞)であった。エフェクター対標的の比率は、50:１(５×105細胞/50μl-ウェルを与える１×107細胞/ml)。
【００７６】
試薬/試験化合物の調製
種々の濃度の抗CD3 scFv-gp100 TCR融合体(30 nM〜0.03 pM)を、アッセイ媒体中への希釈により調製した。抗CD3 scFv-gp100 TCR融合体を、実施例６に従って調製した。
【００７７】
アッセイの準備
アッセイの構成要素を、以下の順序でプレートに加えた。
- 50μlの標的細胞(上記のようにして調製した)を各ウェルへ
- 50μlのエフェクター細胞(上記のようにして調製した)を各ウェルへ
- 50μlの試薬(上記のようにして調製した)を各ウェルへ。
いくつかの対照を、以下のようにして調製した。
- エフェクター自発放出：50μlのエフェクター細胞のみ。
- 標的細胞自発放出：50μlの標的細胞のみ。
- 標的最大放出：50μlの標的細胞のみ。
- アッセイ媒体対照：150μlの媒体のみ。
- 溶解溶液についてのアッセイ媒体容量対照: 150μlの媒体のみ。
全てのウェルを、３重で、150μlの最終容量で調製した。
【００７８】
プレートを250×gで４分間遠心分離し、次いで、37℃にて24時間インキュベートした。上清採集の45分前に、15μlの溶解溶液を、標的細胞最大放出及びアッセイ媒体容量対照のウェルに加えた。
プレートを、250×gで４分間遠心分離した。アッセイプレートの各ウェルからの50μlの上清を、平底96ウェルNunc Maxisorbプレートの対応するウェルに移した。基質ミックスを、アッセイバッファー(12 ml)を用いて再構成した。50μlの再構成された基質ミックスを、次いで、プレートの各ウェルに加えた。プレートを、アルミホイルで覆い、室温にて30分間インキュベートした。50μlの停止溶液をプレートの各ウェルに加えて、反応を停止した。490nmでの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で、停止溶液の添加の１時間後に記録した。
【００７９】
結果の計算
培養培地バックグラウンドの吸光度の値の平均を、実験、標的細胞自発放出及びエフェクター細胞自発放出の全ての吸光度の値から差し引いた。
容量補正対照の吸光度の値の平均を、標的細胞最大放出対照について得られた吸光度の値から差し引いた。
最初の２つのステップで得られた補正された値を、以下の式に用いて、パーセント細胞傷害性を計算した。
%細胞傷害性= 100×(実験−エフェクター自発−標的自発) / (標的最大−標的自発)
【００８０】
結果
図７のグラフは、gp100提示細胞(Mel526細胞)と特異的に結合する抗CD3 scFv-gp100高親和性TCR (実施例６に記載されるようにして調製)により再指向されたＴ細胞によるメラノーマ細胞の特異的死滅を示す。
【００８１】
実施例８
天然gp100 TCRの高親和性バリアントでのＴ細胞の形質移入
(a) 293Ｔ細胞のExpress-In媒介一過性形質移入によるレンチウイルスベクターの調製
第３世代のレンチウイルスパッケージング系を用いて、所望のTCRをコードする遺伝子を含有するレンチウイルスベクターをパッケージングする。293Ｔ細胞に、４つのプラスミド(実施例8cに記載するTCRアルファ鎖-P2A-TCRベータ鎖単一ORF遺伝子を含有する１つのレンチウイルスベクターと、感染性であるが非複製性のレンチウイルス粒子の構築のために必要なその他の成分を含有する３つのプラスミド)を、Express-In-媒介形質移入(Open Biosystems)を用いて形質移入する。
形質移入のために、プレート上に均質に分布し、50%集密よりもわずかに高い細胞を含む、１つのT150フラスコの指数関数的成長期にある293Ｔ細胞を採用する。Express-In分割量を室温にする。３mlの血清フリー培地(RPMI 1640 + 10 mM HEPES)を、滅菌15 mlコニカルチューブに入れる。174μlのExpress-In試薬を、血清フリー培地に直接加える(このことにより、試薬の、DNAに対する3.6:1の重量比率が得られる)。チューブを３〜４回逆さまにすることにより十分に混合し、室温にて５〜20分間インキュベートする。
【００８２】
別の1.5 mlマイクロチューブ中で、15μgのプラスミドDNAを、通常、約22μlのあらかじめ混合したパッケージングミックス分割量(18μg pRSV.REV (Rev発現プラスミド)、18μg pMDLg/p.RRE (Gag/Pol発現プラスミド)、７μgのpVSV-G (VSV糖タンパク質発現プラスミド)に加え、ピペットで上下させて、確実にDNAミックスが均質になるようにした。およそ１mlのExpress-In/血清フリー培地をDNAミックスに滴下し、次いで、ピペットで穏やかに上下させた後に、Express-In/血清フリー培地の残りに戻した。チューブを３〜４回逆さまにし、室温にて15〜30分間インキュベートする。
【００８３】
古い培養培地を、細胞のフラスコから除去する。Express-In/培地/DNA (３ml)複合物をフラスコに、293Ｔ細胞の縦型フラスコの底に直接加える。フラスコをゆっくりと平らにして細胞を覆い、フラスコを非常に穏やかに揺り動かして、均一な分布を確実にする。１分後に、22 mlの新鮮な培地(R10+HEPES: RPMI 1640、10%熱不活化FBS、１% Pen/Strep/L-グルタミン、10 mM HEPES)を加え、注意してインキュベーターに戻す。37℃/5% CO2にて１晩インキュベートする。24時間後に、パッケージングされたレンチウイルスベクターを含有する培地の採集に進む。
パッケージングされたレンチウイルスベクターを採集するために、細胞培養上清を、0.45ミクロンのナイロンシリンジフィルタを通して濾過し、培養培地を10,000 gにて18時間(又は112,000 gで２時間)遠心分離し、上清のほとんど(ペレットを乱さないように注意する)を除去し、ペレットを、残った数mlの上清に再懸濁する(通常、チューブあたり31 mlの開始容量から約２ml)。１mlの分割量でドライアイス上で急速凍結させ、-80℃にて貯蔵する。
【００８４】
(b) 興味対象の遺伝子を含有する、パッケージングされたレンチウイルスベクターでのＴ細胞の形質導入
パッケージングされたレンチウイルスベクターでの形質導入の前に、ヒトＴ細胞(要求に応じてCD8若しくはCD4又はその両方)を、健常ボランティアの血液から単離する。これらの細胞を計数し、50 U/ml IL-2含有R10中で、１mlあたり１×106細胞(0.5 ml/ウェル)にて48ウェルプレート中で、あらかじめ洗浄した抗CD3/CD28抗体被覆マイクロビーズ(Dynal Ｔ細胞エキスパンダー、Invitrogen)とともに、細胞あたり３ビーズの比率で１晩インキュベートする。
１晩の刺激の後に、0.5 mlのそのままのパッケージングされたレンチウイルスベクターを所望の細胞に加える。37℃/5% CO2にて３日間インキュベートする。形質導入の３日後に細胞を計数し、0.5×106細胞/mlに希釈する。必要により、IL-2を含有する新鮮な培地を加える。形質導入の５〜７日後にビーズを除去する。細胞を計数し、IL-2を含有する新鮮な培地を、２日間隔で、置き換えるか又は加える。細胞を0.5×106と１×106細胞/mlの間に保つ。細胞は、第３日からフローサイトメトリーにより分析でき、第５日から機能的アッセイ(例えばIFNγ放出についてのELISPOT)のために用いることができる。第10日から、又は細胞の分割が遅くなり、サイズが減少してから、少なくとも４×106細胞/バイアル(90% FBS/10% DMSO中で１×107細胞/ml)の分割量にて貯蔵のために細胞を凍結させる。
【００８５】
(c) 上記の方法(a)及び(b)によるＴ細胞形質移入のための野生型(wt)TCR遺伝子
図8Aは、天然gp100 TCR (最大ヒト細胞発現のために最適化されたコドン)をコードするDNA配列(配列番号37)である。これは、全長アルファ鎖(TRAV17)-ブタテッショウウイルス-1 2A-全長ベータ鎖(TRBV19)単一オープンリーディングフレーム構築物である。2A配列に下線を付し、2A配列のタンパク質分解による除去を支援するためのフューリン切断部位をコードするヌクレオチドが先行する(図8Bと関連して、以下でさらに論じる(配列番号38))。2A配列の3'末端にてmRNAのタンパク質翻訳中にスキップするペプチド結合は、２つのタンパク質を生成する：1)アルファ TCR鎖-2A融合体。2) ベータTCR鎖。配列番号37 (図8A)は、NheI及びSalIの制限部位(下線)を含む。
【００８６】
図8Bは、図8Aに対応するアミノ酸配列(配列番号38)である。
図8Bにおいて：
M1-N20は、野生型アルファ鎖TCRの成熟の際に除去されるリーダー配列である；
S21-S223は、配列番号２の野生型アルファ鎖配列に相当する；
S21-R250は、野生型アルファ鎖細胞外ドメインに相当する；
I251-L267は、成熟TCRのアルファ鎖膜貫通領域である；
W268-S270は、成熟TCRのアルファ鎖細胞内領域である；
R273-R276は、P2A配列A281-P299を、ゴルジ装置においてタンパク質分解により除去することを支援するための、フューリン切断部位である；
G271、S272、S277〜G280、R300は、フューリン切断及びP2A配列の完全な機能を可能にするフレキシブルリンカーである；
M301-V319は、野生型ベータ鎖TCRの成熟の際に除去されるリーダー配列である；
D320-D561は、配列番号３の野生型ベータ鎖配列に相当する；
D320-E581は、野生型ベータ鎖細胞外ドメインに相当する；
I582-V603は、成熟TCRのベータ鎖膜貫通領域である；
K604-G610は、成熟TCRのベータ鎖細胞内領域である。
【００８７】
(d) 野生型および高親和性gp100 TCRで形質移入されたＴ細胞
上記の(a)及び(b)に記載した手順の後に、gp100アルファwt-2A-ベータwt TCR遺伝子(配列番号37 (図8A))を、pELNSxvレンチベクターに、両方のDNA構築物にユニークなNheI及びSalI制限部位を用いて挿入し、形質移入されたＴ細胞を創出した。
同様にして、Ｔ細胞を、(a)配列番号２の野生型アルファ鎖の可変ドメイン配列(S1〜A109)が、配列番号10〜35の１つを有するベータ鎖可変ドメインと会合したTCR、又は(b)配列番号７〜９の１つを有するアルファ鎖可変ドメインが配列番号３の野生型ベータ鎖の可変ドメイン配列(D1〜T112)と会合したTCR、又は(c) 配列番号７〜９の１つを有するアルファ鎖可変ドメインが配列番号10〜35の１つを有するベータ鎖可変ドメインと会合したTCRをコードすること以外は、配列番号37 (図8A)と同一の遺伝子で形質移入することにより創出できる。
【００８８】
実施例９
野生型-親和性TCRを形質導入したＴ細胞と比較した、腫瘍株化細胞に応答する、gp100改善親和性TCRを形質導入したＴ細胞の活性化の増加。
ELISPOTプロトコール
以下のアッセイを行って、腫瘍株化細胞に応答するTCR形質導入細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)の活性化を証明した。ELISPOTアッセイを用いて測定されるIFN-γ生成を、細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)活性化の読み出しとして用いた。
【００８９】
試薬
アッセイ媒体：10% FCS (Gibco、Cat# 2011-09)、88% RPMI 1640 (Gibco、Cat# 42401)、１%グルタミン(Gibco Cat# 25030)及び１%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco Cat# 15070-063)。
洗浄バッファー：0.01 M PBS/0.05% Tween 20
PBS (Gibco Cat# 10010)
ヒトIFNγELISPOT PVDF-酵素キット (Diaclone、France; Cat# 856.051.020)は、必要なその他の全ての試薬を含有する(捕捉及び検出抗体、脱脂粉乳、BSA、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ及びBCIP/NBT溶液、並びにヒトIFN-γ PVDF ELISPOT 96ウェルプレート)。
【００９０】
方法
標的細胞の調製
この方法において用いた標的細胞は、天然エピトープ提示細胞であった。Mel526メラノーマ、Mel624メラノーマ、MeWo及びSKMel5、これらは全てHLA-A2+ gp100+である。A375メラノーマ(HLA-A2+ gp100-)を、陰性対照株化細胞として用いた。HLA-A2+ヒト初代肝細胞(ロットHEP2、ScienCellから入手)は、gp100-と決定され(gp100 mRNA発現がRT-PCRにより検出されなかった)、陰性対照として用いた。十分な標的細胞(50,000細胞/ウェル)を、遠心分離により３回、1200 rpmにて10分間、Megafuge 1.0 (Heraeus)中で洗浄した。細胞を、次いで、アッセイ媒体中に106細胞/mlにて再懸濁した。
【００９１】
エフェクター細胞の調製
この方法において用いたエフェクター細胞(Ｔ細胞)は、CD4+とCD8+ Ｔ細胞との１：１混合物であった(PBLからのネガティブ選択により得られた(CD4及びCD8ネガティブ単離キット、Dynalを用いる))。細胞を、抗CD3/CD28被覆ビーズ(Ｔ細胞エキスパンダー、Invitrogen)で刺激し、興味対象の完全αβTCR(実施例８に記載され、図8Bに示す構築物に基づく)をコードする遺伝子を有するレンチウイルスで形質導入し、形質導入の10〜13日後まで、50U/ml IL-2を含有するアッセイ媒体で増殖させる。これらの細胞を、次いで、アッセイ媒体中に入れた後に、1200 rpm、10分間、Megafuge 1.0 (Heraeus)での遠心分離により洗浄した。細胞を、次いで、アッセイ媒体中に、最終的に必要とされる濃度の４倍で再懸濁した。
【００９２】
ELISPOT
プレートを、以下のようにして調製した：100μlの抗IFN-γ捕捉抗体を、プレートあたり10 ml滅菌PBSで希釈した。100μlの希釈された捕捉抗体を、次いで、各ウェルに分割した。プレートを、次いで、４℃にて１晩インキュベートした。インキュベーションの後に、プレートを洗浄し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96ウェルプレート洗浄装置; Dynex)、捕捉抗体を除去した。プレートを、次いで、100μlの滅菌PBS中の２% 脱脂乳を各ウェルに加えて、プレートを室温にて２時間インキュベーションすることによりブロックした。脱脂乳を、次いで、プレートから洗浄し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96ウェルプレート洗浄装置、Dynex)、いずれの残りの洗浄バッファーを、ELISPOTプレートをペーパータオル上ではたいてたたくことにより除去した。
【００９３】
アッセイの構築物を、次いで、以下の順序でELISPOTプレートに加えた。
50μlの標的細胞106細胞/ml (合計で50,000標的細胞/ウェルを与える)。
50μlの可溶性高親和性gp100 TCR (300nMの最終濃度を与えるように1.2μMにて)を、TCRを形質導入したＴ細胞のgp100特異的活性化を遮断するために加えることができる。
ウェルあたり200ulの最終容量を与えるのに十分な媒体(アッセイ媒体)。
50μlのエフェクター細胞(5,000の混合CD4/8+細胞/ウェル)。
プレートを、次いで、１晩インキュベートした(37℃/５% CO2)。次の日に、プレートを３回(プログラム1、プレートタイプ2、Ultrawash Plus 96ウェルプレート洗浄装置、Dynex)、洗浄バッファーで洗浄し、ペーパータオル上でたたいて、過剰な洗浄バッファーを除去した。100μlの１次検出抗体を、次いで、各ウェルに加えた。１次検出抗体を、550μlの蒸留水をDiacloneキットとともに供給される検出抗体のバイアルに加えることにより調製した。100μlのこの溶液を、次いで、10 ml PBS/1% BSAで希釈した(単一のプレートに要求される容量)。プレートを、次いで、室温にて少なくとも２時間インキュベートした後に、３回(プログラム1、プレートタイプ2、Ultrawash Plus 96ウェルプレート洗浄装置、Dynex)、洗浄バッファーで洗浄し、過剰の洗浄バッファーを、ペーパータオル上でプレートをたたくことにより除去した。
【００９４】
２次検出を、100μlの希釈ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼを各ウェルに加え、プレートを室温にて１時間インキュベートすることにより行った。ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼは、10μlのストレプトアビジン-アルカリホスファターゼを10 ml PBS/1% BSAに加えることにより調製した(単一のプレートに要求される容量)。プレートを、次いで、３回(プログラム1、プレートタイプ2、Ultrawash Plus 96ウェルプレート洗浄装置、Dynex)、洗浄バッファーを用いて洗浄し、ペーパータオル上でたたいて過剰の洗浄バッファーを除去した。Diacloneキットとともに供給される100μlのBCIP/NBT溶液を、次いで、各ウェルに加えた。現像中に、プレートをホイルで覆い、５〜15分間放置した。現像しているプレートを、この期間中にスポットについて定期的に調べて、反応を停止するのに最適な期間を決定した。プレートを、シンク満杯の水道水で洗浄して、現像反応を停止し、振って乾燥させた後に、プレートを３つの構成部分に分解した。プレートを、次いで、50℃にて１時間乾燥させた後に、メンブレン上に形成されたスポットをImmunospotプレートリーダー(CTL; Cellular Technology Limited)を用いて計数した。
【００９５】
結果
種々のgp100-陽性及び対照株化細胞又は対照肝細胞に応答する、活性化されたTCR形質導入Ｔ細胞によるIFNγの放出を、ELISPOTアッセイ(上記のようにして)により試験した。各ウェルにおいて観察されたELISPOTスポットの数を、Prism (Graph Pad)を用いてプロットした。
実施例８に記載され図8Bに示す構築物に基づくが、以下の表に記載されるTCRアルファ鎖及びベータ鎖可変ドメインを有する、a) TCR番号１(配列番号38のアミノ酸配列)、b) TCR番号２又はc) TCR番号３を発現する混合CD4+/CD8+Ｔ細胞を、gp100+ HLA-A2+腫瘍株化細胞Mel526、Mel624、SKMel5若しくはMeWo、又はgp100-HLA-A2+ A375若しくはHEP2とインキュベートした。gp100特異的遮断は、配列番号８のVαと配列番号27のVβとを有する300nMの実施例４のgp100 TCR (実施例２に記載するようにして調製)を加えることにより行った。
【００９６】
【表３】
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【００９７】
図9aは、TCR番号１を形質導入したＴ細胞が、Mel526、Mel624及びSKMel5メラノーマ株化細胞のみに応答してIFNγを放出し、これは、配列番号８のVαと配列番号27のVβとを有する300nMの実施例４のgp100 TCRにより効率的に遮断されたことを示す。
改善された親和性のgp100 TCR番号２を形質導入したＴ細胞は、これらの腫瘍株化細胞に対するより大きい応答を示し、これは、配列番号８のVαと配列番号27のVβとを有する300nMの実施例４のgp100 TCR により効率的に遮断された。
図9bは、TCR番号１を形質導入したＴ細胞が、Mel526細胞に応答してIFNγを放出し、これは、300nMのgp100 TCRにより効率的に遮断されたことを示す。IFNγ放出は、MeWo細胞に対して非常に乏しかった。
TCR番号２を形質導入したＴ細胞及びTCR番号３を形質導入したＴ細胞は、Mel526及びMeWo細胞の両方に対してより大きい応答を示し、これは、300nMのgp100 TCRにより効率的に遮断された。
【００９８】
実施例10
さまざまなTCR親和性を有するいくつかのgp100 TCR-抗CD3融合体の効力の評価
ELISPOTプロトコール
以下のアッセイを行って、種々のgp100 TCR-抗CD3融合タンパク質が、細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)を、gp100ペプチド-HLA-A2複合体を提示する腫瘍株化細胞に応答して活性化する効力を比較した。ELISPOTアッセイを用いて測定されるIFN-γ生成を、Ｔ細胞活性化の読み出しとして用いた。ELISPOTアッセイは、前の実施例９に記載される。
【００９９】
試薬
アッセイ媒体、洗浄バッファー、PBS及びヒトIFNγELISPOT PVDF-酵素キットは、実施例９に記載した通りに用いた。
【０１００】
方法
標的細胞の調製
この方法において用いた標的細胞は、HLA-A2+ gp100+である天然エピトープ提示細胞Mel526メラノーマ細胞であった。十分な標的細胞(50,000細胞/ウェル)を、1200 rpmにて10分間、Megafuge 1.0 (Heraeus)中で１回の遠心分離により洗浄した。細胞を、次いで、アッセイ媒体中に、106細胞/mlにて再懸濁した。
【０１０１】
エフェクター細胞の調製
この方法において用いたエフェクター細胞(Ｔ細胞)は、CD8+Ｔ細胞であった(PBLからのネガティブ選択により得られた(CD8ネガティブ単離キット、Dynal、Cat# 113.19を用いる))。エフェクター細胞を解凍し、アッセイ媒体中に入れた後に、1200 rpmにて10分間、Megafuge 1.0 (Heraeus)中での遠心分離により洗浄した。細胞を、次いで、アッセイ媒体中に、最終的に必要とされる濃度の４倍で再懸濁した。
【０１０２】
試薬/試験化合物の調製
種々の濃度の各gp100 TCR-scFv (10 nM〜0.1 pM)を、アッセイ媒体中で４×最終濃度を得るように希釈することにより調製した。試験したgp100 TCR-scFv融合体は、結果の部分で同定し、実施例６に記載するようにして調製した。
【０１０３】
ELISPOT
プレートを、実施例９に記載するようにして調製した。
アッセイの構成要素を、以下の順序でELISPOTプレートに加えた。
50μlの標的細胞106細胞/ml (合計で50,000標的細胞/ウェルを与える)
50μlの試薬(TCR-抗CD3融合体；種々の濃度)
50μlの媒体(アッセイ媒体)
50μlのエフェクター細胞(5,000 CD8+細胞/ウェル)。
プレートを、次いで、１晩インキュベートした(37℃/５%CO2)。プレートの洗浄、１次抗体の調製及び１次抗体の検出は、実施例９に記載するようにして行った。
２次検出及び現像を、実施例９に記載するようにして行った。プレートを、次いで、50℃にて１時間乾燥させた後に、メンブレン上に形成されたスポットをImmunospotプレートリーダー(CTL; Cellular Technology Limited)を用いて計数した。
【０１０４】
結果
本実施例で試験したgp100 TCR-抗CD3 scFv融合体は、配列番号２(アミノ酸１〜109)の可変ドメイン(アミノ酸１〜109)を有する配列番号45のgp100 TCRアルファ鎖配列、又は配列番号８(X = S)の可変ドメイン(アミノ酸１〜109)を有するgp100 TCRアルファ鎖配列と、配列番号36のgp100 TCRベータ鎖-抗CD3 scFv (１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIであり、108〜131のアミノ酸残基が、バリアントリンカー、すなわちRTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG (配列番号44)で置き換えられ、254〜258のアミノ酸残基が、バリアントリンカー、すなわちGGEGGGSEGGGS (配列番号47)で置き換えられ、配列番号27のベータ鎖可変ドメインを有する(これは、以下の表に示すように、配列番号３(配列番号３のD1〜T112)の可変ドメイン、又は配列番号13の可変ドメイン、又は配列番号17の可変ドメイン、又は配列番号23の可変ドメイン、又は配列番号26の可変ドメインに変更できる))とを含む。TCR-抗CD3融合体は、実施例６に記載するようにして調製した。
【０１０５】
各ウェルにおいて観察されたELISPOTスポットの数を、融合構築物の濃度に対して、Prism (Graph Pad)を用いてプロットした(図10を参照)。これらの用量応答曲線から、EC50の値を決定した(EC50は、最大応答の50%を誘導するTCR-抗CD3融合体の濃度にて決定される)。
図10におけるグラフは、gp100提示細胞と特異的に結合するgp100 TCR-抗CD3融合体による、CD8+Ｔ細胞の特異的活性化を示す。
以下の表は、各gp100 TCR-抗CD3融合体のEC50と、WT TCR (TCR番号１)と比較したTCR/ペプチド-HLA親和性の改善とを示す。
【０１０６】
【表４】
0005872464.tif 000006
【０１０７】
全体として、この実験は、より高い親和性のTCR部分を有するTCR-抗CD3融合体が、CD8+Ｔ細胞のより良好な活性化をもたらすことを示す。これらの結果は、gp100ペプチド-HLA-A2複合体についてのTCRの親和性と、TCR-抗CD3融合体がCD8+Ｔ細胞を活性化する効力との間の相関関係を証明する。TCR番号７-抗CD3融合体は、その他の試験した他のTCR融合体と比較して、優れた効力を証明した。
【０１０８】
実施例11
高親和性gp100-抗CD3融合体の効力を試験する、Ｔ細胞再指向アッセイ
ELISPOTプロトコール
以下のアッセイを行って、種々のgp100 TCR-抗CD3融合タンパク質が、細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)を、gp100ペプチド-HLA-A2複合体を提示する腫瘍株化細胞に応答して活性化する効力を比較した。ELISPOTアッセイを用いて測定されるIFN-γ生成を、Ｔ細胞活性化の読み出しとして用いた。
【０１０９】
試薬
アッセイ媒体：10% FBS (熱不活化) (Sera Laboratories International、Cat# EU-000-F1) 88% RPMI 1640 (Invitrogen、Cat# 42401018)、１% L-グルタミン(Invitrogen、Cat# 25030024)及び１%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen、Cat# 15070063)。
洗浄バッファー：0.01 M PBS、１包を１Lの脱イオン水で希釈(Sigma、Cat# P3813)/0.05% Tween 20 (Sigma、Cat# P7949)
PBS (Invitrogen、cat# 10010015)
希釈バッファー：10% FBS (熱不活化) (Sera Laboratories International、cat# EU-000-F1)を含有するPBS (Invitrogen、cat# 10010015)
ヒトIFNγELISPOT PVDF-酵素キット(10プレート) (BD; Cat# 551849)、これは、PVDF ELISPOT 96ウェルプレート、捕捉抗体、検出抗体及びストレプトアビジン-HRP (セイヨウワサビペルオキシダーゼ)を含む。
AEC基質試薬セット(BD、cat# 551951)
【０１１０】
方法
標的細胞の調製
この方法において用いた標的細胞は、HLA-A2+ gp100+である天然エピトープ提示細胞Mel526メラノーマ細胞であった。A375メラノーマ(HLA-A2+ gp100-)を、陰性対照株化細胞として用いた。十分な標的細胞(50,000細胞/ウェル)を、1200 rpmにて10分間、Megafuge 1.0 (Heraeus)中で１回の遠心分離により洗浄した。細胞を、次いで、アッセイ媒体中に、106細胞/mlにて再懸濁した。
【０１１１】
エフェクター細胞の調製
この方法において用いたエフェクター細胞(Ｔ細胞)は、CD8+Ｔ細胞であった(PBLからのネガティブ選択により得られた(CD8ネガティブ単離キット、Dynal、Cat# 113.19を用いる))。エフェクター細胞を解凍し、アッセイ媒体中に入れた後に、1200 rpmにて５分間、Megafuge 1.0 (Heraeus)中での遠心分離により洗浄した。細胞を、次いで、アッセイ媒体中に、１mlあたり1.6×105細胞で再懸濁して、50μl中のウェルあたり8,000細胞とした。
【０１１２】
試薬/試験化合物の調製
種々の濃度の各gp100 TCR-scFv (10 nM〜0.1 pM)を、アッセイ媒体中で４×最終濃度を得るように希釈することにより調製した。試験したgp100 TCR-scFv融合体は、結果の部分で同定し、実施例６に記載するようにして調製した。
【０１１３】
ELISPOT
プレートを、次のようにして調製した。50μlの抗IFN-γ捕捉抗体を、プレートあたり10 mlの滅菌PBSで希釈した。100μlの希釈した捕捉抗体を、次いで、各ウェルに分割した。プレートを、次いで、４℃にて１晩インキュベートした。インキュベーションの後に、プレートを、次いで、シンク中に捕捉抗体をはたき落とし、ブルーロール上にたたいて残存抗体を除去し、各ウェルに200μlのアッセイ媒体を加え、プレートを室温にて２時間インキュベートすることによりブロッキングした。ブロッキングアッセイ媒体を、シンクにはたくことにより除去し、いずれの残存媒体も、ELISPOTプレートをペーパータオル上でたたくことにより除去した。
【０１１４】
アッセイの構成要素を、次いで、ELISPOTプレートに、以下の順序で加えた。
50μlの標的細胞106細胞/ml (合計で50,000標的細胞/ウェルを与える)
50μlの試薬(TCR-抗CD3融合体;種々の濃度)
50μlの媒体(アッセイ媒体)
50μlのエフェクター細胞(8,000 CD8+細胞/ウェル)。
【０１１５】
プレートを、次いで、１晩インキュベートした(37℃/５%CO2)。次の日に、プレートを３回(プログラム1、プレートタイプ2。Ultrawash Plus 96ウェルプレート洗浄装置、Dynex)、洗浄バッファーで洗浄し、ペーパータオル上でたたいて、過剰の洗浄バッファーを除去した。100μlの１次検出抗体を、次いで、各ウェルに加えた。１次検出抗体を、40μlを10 mlの希釈バッファー(単一プレートに要求される容量)に加えることにより調製した。プレートを、次いで、室温にて少なくとも２時間インキュベートした後に、３回(プログラム1、プレートタイプ2、Ultrawash Plus 96ウェルプレート洗浄装置、Dynex)、洗浄バッファーで洗浄し、過剰の洗浄バッファーを、ペーパータオル上でプレートをたたくことにより除去した。
【０１１６】
２次検出を、100μlの希釈ストレプトアビジン-HRPを各ウェルに加え、プレートを室温にて１時間インキュベートすることにより行った。ストレプトアビジン-HRPは、100μlのストレプトアビジン-HRPを10 mlの希釈バッファー(単一のプレートに要求される容量)に加えることにより調製した。プレートを、次いで、３回(プログラム1、プレートタイプ2、Ultrawash Plus 96ウェルプレート洗浄装置、Dynex)、洗浄バッファーを用いて洗浄した後に、PBSで２回洗浄し、これは、ウェルあたり200μlを加えることにより手動でピペット操作し、シンクにはたき出した。プレートをペーパータオル上でたたくことにより過剰のPBSを除去した。100μlのAEC基質試薬を、次いで、各ウェルに加えた。基質を、10滴のAEC色素原を10 ml AECバッファー(単一のプレートに要求される容量)に加えることにより調製した。現像中に、プレートをホイルで覆い、５〜15分間放置した。現像しているプレートを、この期間中にスポットについて定期的に調べて、反応を停止するのに最適な期間を決定した。プレートを、脱イオン水で洗浄して現像反応を停止し、たたいて乾燥させた後に、プレートを３つの構成部分に分解した。プレートを、次いで、室温にて少なくとも１時間風乾させた後に、メンブレン上に形成されたスポットをImmunospotプレートリーダー(CTL; Cellular Technology Limited)を用いて計数した。
【０１１７】
結果
本実施例において試験したgp100 TCR-抗CD3 scFv融合体を、以下に、タンパク質１、２、３及び４として記載する。
タンパク質１は、配列番号45の配列を有するが、配列番号８(X = S)の可変ドメインを有するgp100 TCRアルファ鎖と、１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIである配列番号36のgp100 TCRベータ鎖-抗CD3 scFvとを含む。
タンパク質２は、配列番号45の配列を有するが、配列番号８(X = G)の可変ドメインを有するが、そのＣ末端にて８アミノ酸残基(F196〜S203、両端含む)が切断されたgp100 TCRアルファ鎖と、１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びQである配列番号36のgp100 TCRベータ鎖-抗CD3 scFvとを含む。
タンパク質３は、配列番号45の配列を有するが、配列番号８(X = A)の可変ドメインを有するが、そのＣ末端にて８アミノ酸残基(F196〜S203、両端含む)が切断されたgp100 TCRアルファ鎖と、１位及び２位のアミノ酸がそれぞれA及びIである配列番号36のgp100 TCRベータ鎖-抗CD3 scFvとを含む。
タンパク質４は、配列番号45の配列を有するが、配列番号８(X = G)の可変ドメインを有するが、そのＣ末端にて８アミノ酸残基(F196〜S203、両端含む)が切断されたgp100 TCRアルファ鎖と、１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIである配列番号36のgp100 TCRベータ鎖-抗CD3 scFvとを含む。
【０１１８】
TCR-抗CD3融合体は、実施例６に記載するようにして調製した。
高親和性gp100 TCR-抗CD3融合タンパク質により再指向された活性化CD8Ｔ細胞によるIFNγ放出を、ELISPOTアッセイ(上記のようにして)により試験した。各ウェルにおいて観察されたELISPOTスポットの数を、Prism (Graph Pad)を用いてプロットした(図11を参照)。用量応答曲線から、EC50の値を決定した(EC50は、最大応答の50%を誘導するTCR-抗CD3融合体の濃度にて決定される)。
図11のグラフは、gp100提示細胞と特異的に結合するgp100 TCR-抗CD3融合体による、CD8+Ｔ細胞の特異的活性化を示す。このアッセイにより、４つのgp100 TCR-抗CD3融合タンパク質の試験が可能になり、これらは全て、Ｔ細胞の効率的な再指向と、以下の表に示す非常に類似した効力とを示した。
【０１１９】
【表５】
0005872464.tif 000007
【０１２０】
実施例12
高親和性gp100-抗CD3融合体のインビボ効力
高親和性gp100-抗CD3融合体は、ヒトYLEPGPVTA gp100ペプチド-HLA-A2複合体及びヒトCD3に特異的であり、マウスgp100ペプチド-HLA複合体又はCD3と結合しない。よって、抗腫瘍効力を、ヒトメラノーマ異種移植モデルを用いて免疫不全マウスにおいて研究した。
【０１２１】
ベージュ/SCID Mel526異種移植モデル：
Mel526ヒトメラノーマ株化細胞を、ヒト異種移植モデルを確立するために選択した。なぜなら、gp100ペプチド-HLA-A2複合体及び高親和性gp100-抗CD3融合体を示すMel526細胞は、インビトロでMel526細胞の再指向された溶解を示したからである。免疫不全ベージュ/SCIDマウス(Ｔ，Ｂ、NK細胞機能の不全)を、このモデルにおいて用いた。
【０１２２】
細胞の移植
Mel526腫瘍細胞(２×106/マウス)を、ヒトPBMC細胞(５×106/マウス)と、PBS (200μl/マウス)中で混合し、第０日に各マウスに皮下注射した。４名の健常ヒト提供者を起源とするPBMCを、８匹のマウスの６群に均一に分配した。
【０１２３】
研究の設計：
各群８匹の動物を、ビヒクル対照(PBS+マウス血清)又は高親和性gp100 TCR-抗CD3融合体で、Mel526腫瘍細胞とPBMC又はMel526細胞単独の皮下注射の１時間後に開始して、５日間連続で静脈内処置した。研究設計の詳細は、以下の表に示す。本実験で試験したgp100 TCR-抗CD3融合体は、配列番号８(X = S)のアルファ可変ドメインを含有するgp100 TCRアルファ鎖と、配列番号36 (１位及び２位のアミノ酸がそれぞれD及びIである)のgp100 TCRベータ鎖-抗CD3 scFvとを含む。このTCR-抗CD3融合体は、実施例６で説明した。
【０１２４】
【表６】
0005872464.tif 000008
【０１２５】
研究の読み出し
腫瘍サイズ及び体重を、研究の間中(週３回)、腫瘍/PBMCの移植の日に開始して測定した。腫瘍の寸法は、外側カリパスを用いて長さ及び幅を測定することにより決定した。長さは、腫瘍の最大の水平方向寸法に相当し、幅は、腫瘍の最短の寸法に相当する。平均腫瘍容量(平均+SD；平均+SEM)を評価し、グラフに示した。腫瘍成長のデータは、それぞれの個別に同定されるマウスについて記録した。腫瘍量は、以下の式を用いて算出した：V = 長さ×幅2/2。
【０１２６】
結果
図12は、各研究群における平均腫瘍量を示す。エフェクター細胞なしで標的細胞を注射し、その後にビヒクル処置(群１)をした場合と、エフェクター細胞とともにＴ細胞を注射し、その後にビヒクル処置(群２)をした場合は、第11日から開始して、測定可能な腫瘍の成長を示した。群２における腫瘍の成長速度は、群１における腫瘍の成長速度と同様であった。
高親和性gp100 TCR-抗CD3処置は、測定可能な腫瘍成長における著しい治療効力を示し、Mel 526腫瘍成長における用量依存的な阻害が、PBMCエフェクター細胞の存在下で誘導された。
【図１Ａ】
0005872464.tif 000009
【図１Ｂ】
0005872464.tif 000010
【図１Ｃ】
0005872464.tif 000011
【図２Ａ】
0005872464.tif 000012
【図２Ｂ】
0005872464.tif 000013
【図２Ｃ】
0005872464.tif 000014
【図３Ａ】
0005872464.tif 000015
【図３Ｂ】
0005872464.tif 000016
【図３Ｃ】
0005872464.tif 000017
【図４Ａ】
0005872464.tif 000018
【図４Ｂ】
0005872464.tif 000019
【図４Ｃ】
0005872464.tif 000020
【図４Ｄ】
0005872464.tif 000021
【図４Ｅ】
0005872464.tif 000022
【図４Ｆ】
0005872464.tif 000023
【図４Ｇ】
0005872464.tif 000024
【図４Ｈ】
0005872464.tif 000025
【図４Ｉ】
0005872464.tif 000026
【図４Ｊ】
0005872464.tif 000027
【図４Ｋ】
0005872464.tif 000028
【図４Ｌ】
0005872464.tif 000029
【図４Ｍ】
0005872464.tif 000030
【図４Ｎ】
0005872464.tif 000031
【図４Ｏ】
0005872464.tif 000032
【図４Ｐ】
0005872464.tif 000033
【図４Ｑ】
0005872464.tif 000034
【図４Ｒ】
0005872464.tif 000035
【図４Ｓ】
0005872464.tif 000036
【図４Ｔ】
0005872464.tif 000037
【図４Ｕ】
0005872464.tif 000038
【図４Ｖ】
0005872464.tif 000039
【図４Ｗ】
0005872464.tif 000040
【図４Ｘ】
0005872464.tif 000041
【図４Ｙ】
0005872464.tif 000042
【図４Ｚ】
0005872464.tif 000043
【図５Ａ】
0005872464.tif 000044
【図５Ｂ】
0005872464.tif 000045
【図６】
0005872464.tif 000046
【図７】
0005872464.tif 000047
【図８Ａ】
0005872464.tif 000048
【図８Ｂ−１】
0005872464.tif 000049
【図８Ｂ−２】
0005872464.tif 000050
【図９】
0005872464.tif 000051
【図１０】
0005872464.tif 000052
【図１１】
0005872464.tif 000053
【図１２】
0005872464.tif 000054
【配列表】
0005872464000001.app