(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６の生物活性を妨げるタンパク質を、ニューロン特異的誘導性プロモーターの制御下でコードする核酸分子、ここで、該核酸分子によってコードされるタンパク質は、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６の生物活性を低減または抑制するものであり、及び
（ｂ）ニューロン特異的誘導性プロモーターに結合し、それを活性化することができるトランス活性化因子タンパク質をコードする核酸分子を含む１種類のベクターまたは少なくとも２種類のベクターの混合物。
【請求項２】
ベクターが、ウイルスベクターである請求項１のベクター。
【請求項３】
ウイルスベクターが、レンチウイルス又はＡＡＶである請求項２のベクター。
【請求項４】
レンチウイルスが、組込み不能レンチウイルスウイルスである請求項３のベクター。
【請求項５】
ベクターが、非ウイルスベクターである請求項１のベクター。
【請求項６】
ベクターが、さらに、細胞特異的標的化のためのペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含有する及び／あるいは細胞特異的発現を可能にする核酸を含有する請求項１から５のいずれか１つのベクター。
【請求項７】
細胞特異的標的化のためのポリペプチドが、細胞型特異的エピトープを認識する抗体である請求項６のベクター。
【請求項８】
細胞特異的標的化のためのペプチドが、細胞型特異的表面プロモーターを認識するペプチドである請求項６のベクター。
【請求項９】
プロモーターが、ＣａｍＫＩＩプロモーターである請求項１のベクター。
【請求項１０】
トランス活性化タンパク質が、リバーステトラサイクリン制御トランス活性化因子：ｒｔＴＡである請求項１から９のいずれか１つのベクター。
【請求項１１】
サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６の生物活性を妨げるタンパク質が、ＩＮＫ４ファミリーであり、
ＩＮＫ４ファミリーのメンバーが、ｐ１６INK4a、ｐ１５INK4B、ｐ１８INK4Cまたはｐ１９INK4Dである請求項１０のベクター。
【請求項１２】
化合物が、Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーのメンバーである請求項１から１１のいずれか１つのベクター。
【請求項１３】
Ｃｉｐ／Ｋｉｐファミリーのメンバーが、ｐ２１Cip、ｐ２７Kip1またはｐ５７Kip2である請求項１２のベクター。
【請求項１４】
（ａ）神経変性疾患又は（ｂ）細胞周期の不定期の活性化に関連する疾患の予防または治療用の請求項１から１３のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか１つに記載のベクターを含有する（ａ）神経変性疾患又は（ｂ）細胞周期の不定期の活性化に関連する疾患の予防または治療用医薬組成物。
【請求項１６】
神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項１４のベクター。
【請求項１７】
ベクターが、対流増加送達によって神経系に適用される請求項１４のベクター。
【請求項１８】
神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項１５の医薬組成物。
【請求項１９】
ベクターが、対流増加送達によって神経系に適用される請求項１５の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）（ｉ）ＣＤＫ４／ＣＤＫ６阻害剤または（ｉｉ）ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６発現および／または活性を妨げるＲＮＡを誘導性プロモーターの制御下にてコードする遺伝子と、（ｂ）前記プロモーターのトランス活性化因子タンパク質をコードする遺伝子とを含有するベクターを提供する。このベクターは細胞に導入され、その細胞でその保護機能を発揮して（ｉ）細胞死を防ぐ、または（ｉｉ）細胞死の進行を遅らせる。治療有効性を有するこのベクター構築物は治療用途で使用され、例えば神経変性疾患を防ぐ、またはその進行を遅らせることができる。代替方法としては、細胞周期の不定期の活性化が起こる障害において、疾患修飾法としてベクター構築物を用いることができる。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、標的細胞の細胞周期調節に影響を及ぼす遺伝子治療アプローチに基づく。さらに、遺伝子治療に伴う既存のリスクおよび中枢神経によりもたらされる遺伝子治療の特定の問題はさらに、（ｉ）ウイルスまたは（ｉｉ）安全な遺伝子導入のための非ウイルスベクター、（ｉｉｉ）細胞型特異的認識システム、（ｉｖ）細胞型特異的発現システムおよび（ｖ）対流増加送達（convection-enhanced delivery）による制御送達、好ましくは、（ｉ）〜（ｖ）の組み合わせによって対処される。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、年齢に関連する、高齢の不治の神経変性疾患であり、高齢化社会に莫大な社会経済的負担を負わせている。２０年（２０２５）未満以内に、ＥＵ人口の約１／３が、６５歳を超え、約１／４が８０歳を超えるため、認知症のリスクがある。現在、約８００万人と推定されているヨーロッパにおける認知症患者数は、２０５０年までに１４００万人に上ると考えられる。世界中で、認知症患者は現在の２４００万人から２０２０までに４２００万人に増加し、２０年ごとに２倍となって２０４０年までに８１００万人に上ると考えられる。先進国での増加速度は、２００１年から２０４０年の間に１００％であるが、インド、中国およびそのアジア近隣諸国で３００％と予測されている（FERRI ET AL., 2005）。現在、ＥＵにおける１６００億ユーロを超える年間費用によって既に、ＡＤは世界で３番目に費用がかかる疾患となっている。ＡＤの医療費は、ＥＵにおいて２０２５年までに２４００億ユーロに上昇すると考えられる。６６〜１００歳のＡＤに罹る生涯のリスクは、男性３３％、女性４５％である（VAN DER FLIER AND SCHELTENS, 2005）。
【０００３】
ＡＤは、進行性神経変性、最終的にはニューロン死を引き起こす進行性構造崩壊のプロセスを特徴とする。ニューロンのこの減少は、典型的ではあるが、特異的ではない神経病理学的な顕著な特徴、つまり細胞内神経原線維変化および細胞外老人斑の形態の異常分子凝集物の沈着に関連する。神経原線維変化は、過剰リン酸化形態の微小管関連タンパク質で構成される「対らせん状フィラメント」によって構成されている。老人斑は、かなり大きなアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）からのタンパク分解切断によって誘導される凝集Ａβ−ペプチドからなる。神経原線維変化と老人斑の両方の病原的役割はまだ不明である。しかし、現時点では、細胞死のプロセスにおけるこれらの分子沈着物の原因的役割の証拠がなく、大抵の場合、神経変性の原因ではなく結果が表されている。したがって、ＡＤの予防および／または治療のための分子標的としてのその適性は、非常に制限される。
【０００４】
ＡＤにおける神経変性は、細胞骨格タンパク質のニューロン発芽および再組織化を特徴とする、異常な構造的ニューロン可塑性に関連する（ARENDT ET AL., 1995A, B, c; 1997）。これらのプロセスは、Ｒａｓ−ＭＡＰ−キナーゼ−経路の異常な活性化によって細胞内で仲介される（図１）。疾患のごく初期段階にて、かつＡＥの神経原繊維病状または蓄積の前に、この経路が活性化される（GARTNER ET AL., 1999）。ＡＤの経過における異なる脳領域にわたる神経変性の分布および進行はさらに、ニューロン可塑性のパターンに一致し（つまり、高い程度の可塑性を有する脳領域は、最も早く関与するのに対して、低い程度の可塑性を有する領域は、最も進んだ段階でのみ影響を受ける）（ARENDT ET AL., 1998）、構造的可塑性の仲介に関与する、神経変性と分子メカニズムとの間の関連を示している。
【０００５】
構造的可塑性の仲介に関与する分裂促進（mitogentic）情報伝達メカニズムである、Ｒａｓ−ＭＡＰ−キナーゼ−経路の異常な活性化（HEUMANN ET AL., 2000; ARENDT ET AL., 2004）は明らかに、細胞周期の再活性化を含む成熟した脳におけるニューロンの最終分化段階と適合性でない、様々な下流作用を引き起こしている。細胞周期段階特異的なマーカータンパク質の再発現によって示されるように（ARENDT ET AL., 1996; ARENDT 2000, 2001, 2003）、ニューロンはＧ0期から出て、Ｓ期まで、さらにそれを超えて進行する。３つの独立した方法で、ＡＤにおける神経変性プロセス中のニューロンにおけるＤＮＡ複製の明確な証拠が得られた（図２、MOSCH ET AL., 2007）。ＤＮＡ複製は、神経変性によって残された領域で起こらない。Ｍ期に、かつそれを超えて進行する指標がないため、ニューロンはＧ2期からＭ期への移行で死滅する可能性が非常に高い。
【０００６】
現在、この疾患の明確な原因はまだ不明であり、危険因子の有効な予防も疾患の治療法もない。ＡＤは、障害の主な原因の１つであり、未だ対処されていない医学的必要性のある最も急速に増大している領域である。ＡＤの発症を５年遅らせることができる治療を発見することができれば、ＡＤ患者数を５０年後に半分に減らすことができる。したがって、神経変性を予防することによって、または神経変性の進行を単に遅らせることによって、老人人口の生活の質がかなり向上し、医療サービス利用および介護の対費用効果が最適化される。
【発明の概要】
【０００７】
このように、本発明の基礎をなす技術的な問題は、ＡＤなどの神経変性疾患、さらに細胞周期の不定期の活性化に関連する疾患を治療または予防するのに適した手段を提供することである。
【０００８】
前記の技術的問題の解決は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態を提供することによって達成される。脳の発達中および神経変性中のニューロン死は、細胞周期制御因子の再発現およびＤＮＡの部分的または完全な複製によって証明される、細胞周期の再活性化を伴う。細胞周期の再活性化のこのプロセスは、ＡＤ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、虚血または他の疾患など様々な起源の発生的細胞死および神経変性など、多様な条件下での細胞死に関連するという観察から、細胞周期活性化とニューロン死との間の重要な関係が示されている。さらに、この示唆を支持する証拠は、急性細胞死の様々な生体外（in vitro）パラダイム下での細胞周期遮断の神経保護作用によって与えることができる。
【０００９】
ＡＤにおいて、神経変性は、脳全体に均一に分布していない。むしろ、空間および時間の系統的分布を有する特徴的なパターンを示す。ＡＤにおける細胞周期のニューロン再活性化は、細胞死に対して脆弱である可能性があるニューロンで起こり、つまり、細胞周期の再活性化により影響を受けたニューロンのパターンは、神経変性のパターンと根本的に同一である。これは、細胞周期の再活性化が、最終的に細胞死を引き起こす病原性連鎖（pathogenetic chain）における初期の事象であることを示している。したがって、ニューロンにおける細胞周期活性化の重要な分子スイッチは、神経変性疾患の予防および／または治療に適した分子標的である。本発明をもたらす実験の間、ニューロンの細胞周期リエントリーの遮断によって、好ましくは、長く続き、安全な、ニューロン特異的かつ調節された導入遺伝子発現を可能にする新規な遺伝子治療ツールを使用することによって、進行性神経変性を防ぐことができることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１：ＡＤにおける形態調節不全（morpho-dysregulation）により引き起こされる細胞内情報伝達事象の概略図
これらの事象は、ｐ２１ｒａｓ／ＭＡＰ−キナーゼ情報伝達の異常な活性化、分化制御の低下、細胞周期のその後のリエントリーおよび部分的完了を含み、最終的に細胞死が起こる。
【００１１】
図２：独立した３つの方法によって評価されたＡＤにおけるニューロンＤＮＡ複製
Ａ：突出した４ｎピークは、ＡＤにおけるニューロンのＰＩ染色後のレーザースキャン・サイトメトリーによって得られる。
Ｂ：１７番染色体のプローブとの発色性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によって、ＡＤにおける四倍体ニューロン（右パネル）ならびに二倍体ニューロン（左パネル）が明らかにされている。
Ｃ：単一ニューロンのレーザー捕獲顕微解剖後のＡｌｕ反復配列のＰＣＲ増幅によって、ＡＤにおけるさらなる４ｎ ＤＮＡピークが明らかにされている。
【００１２】
図３：本発明の治療学的コンセプト
生体外（Ａ〜Ｄ）および生体内（Ｅ／Ｆ）でのｐ１６INK4aの異所発現による変性に対する保護
Ａ／Ｂ：マウスの脳の微小外植片；Ｂ：ｐ１６INK4aをトランスフェクトした後にオカダ酸（１０ｎＭ）によって誘導されたアポトーシスの低減された速度（ＴＵＮＥＬ）。
Ｃ／Ｄ：ＧＦＰまたはｐＥＧＦＰ−Ｎ−ｐ１６INK4aのいずれかをトランスフェクトされた肝細胞。Ｄ：ｐ１６INK4aは、スタウロスポリン誘導細胞死を防ぐ。
Ｅ／Ｆ：ｐ１６INK4aの誘導性ニューロン特異的発現を有する遺伝子導入マウスの海馬（ＣａｍＫＩＩプロモーター、ｔｅｔシステム）。
Ｆ：ｐ１６INK4a発現の誘導が、ＮＭＤＡによって誘導されるニューロン死を防ぐ（変性ニューロンのＦｌｕｏｒｏｊａｄｅ染色：矢印）
【００１３】
図４：遺伝子導入マウスの皮質におけるｐ１６INK4aの誘導性ニューロン特異的発現
ＣａｍＫＩＩプロモーター制御ｔＴＡ発現が、Ｄｏｘ投与に依存して、ｔｅｔ０／ＣＭＶｍｉｎプロモーター関連ｐ１６INK4a発現の調節を可能にする（左、Ｄｏｘあり、オフ状態；右、Ｄｏｘなし、オン状態；ｐ１６INK4aの免疫細胞化学的検出）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
このように、本発明は、
（ａ）（ｉ）サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６の生物活性を妨げるタンパク質、または（ｉｉ）ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６発現および／または活性を妨げるＲＮＡをコードする核酸分子；
（ｂ）好ましくは誘導物質の存在下にて、（ａ）の誘導性プロモーターに結合し、それを活性化することができる、トランス活性化因子タンパク質をコードする（発現性）核酸分子；を含む、１種類のベクターまたは少なくとも２種類のベクターの混合物に関する。
核酸分子（ａ）および（ｂ）は、１つのベクターにおいて、または２つのベクターにおいて別々の実体として存在することができる。
【００１５】
ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６発現および／または活性を妨げる多くの種類のＲＮＡ、例えば、ＲＮＡ−ＲＮＡおよび／またはＲＮＡ−タンパク質相互作用の他のメカニズムに基づく抑制効果を示す、ＲＮＡｉまたはＲＮＡｓは当業者には公知である。
好ましい実施形態において、（ａ）の核酸分子によってコードされるタンパク質は、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６の生物活性を低減または抑制する。
【００１６】
したがって、本発明は、ニューロンの細胞周期リエントリーの遮断によって進行性神経変性を防ぐ新規な治療的概念を提供する。本発明は特に、治療有効性が高く、副作用が最小限である、または副作用がない、神経変性を遅らせる、または防ぐ、遺伝子治療的概念に関する。本発明では、重要な分子調節スイッチＣＤＫ４およびＣＤＫ６を標的とし、分化ニューロンにおける細胞周期を遅らせる、または完全に停止し、その結果、細胞が救出される、遺伝子治療アプローチが用いられる。この概念は、細胞周期リエントリー、ニューロンにおける細胞死の重要な誘因の抑制に基づき、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６のダウンレギュレーションによって、例えば（ｉ）その生理学的阻害剤ｐ１６INK4aまたは他の阻害剤の異所発現および（ｉｉ）ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６発現および／または活性を妨げるＲＮＡの使用により達成される。
【００１７】
本発明の概念の原則的な有効性は、生体外および生体内条件下の双方で証明されていることに基づく。ｐ１６INK4aの異所発現、オカダ酸などのニューロンアポトーシスの強力な誘導物質にさらされた脳スライス培養物におけるＣＤＫ４およびＣＤＫ６の分子阻害剤によるニューロンの極めて効率的な保護を実証することができた（図３）。
【００１８】
さらに、ＣａｍＫＩＩプロモーターおよびｔｅｔ発現系の制御下にて、時間依存的に調節可能な、かつ主にニューロン特異的な、ｐ１６INK4aの発現を可能にする遺伝子導入マウスモデルにおいて、ＮＭＤＡ誘導アポトーシスおよび虚血性細胞死（図３）に対する神経保護作用、ならびに低減されたアポトーシス関連膠細胞反応を実証することができた。これは、例えば、ｐ１６INK4aの異所発現による、Ｇ0期からＧ1期への移行の主要な分子スイッチ、ＣＤＫ４のダウンレギュレーションが、分化ニューロン表現型を回復させ、様々な実験的変性条件下にて、ニューロンならびに他の細胞型を細胞死から救出することを強く示している。
【００１９】
細胞周期活性化の重要な分子スイッチであるＣＤＫ４およびＣＤＫ６の活性を調節することができる好ましいＣＤＫ阻害剤は、ＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６INK4a、ｐ１５INK4B、ｐ１８INK4Cおよびｐ１９INK4Dが特に好ましい）またはＣｉｐ／Ｋｉｐファミリー（ｐ２１Cip、ｐ２７Kip1およびｐ５７Kip2が特に好ましい）に属する。個々のＩＮＫ４およびＣｉｐ／Ｋｉｐ阻害剤は、ＣＤＫ４／ＣＤＫ６の抑制に対して組織および細胞特異的な特性を有する。
【００２０】
ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６をコードする遺伝子（１種または複数種）の発現および／またはＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６の活性を低減または抑制するために使用することができるさらなる方法は当業者にはよく知られている。例えば、小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ、非コードＲＮＡの形態のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく遺伝子サイレンシングが近年、細胞培養および生体内の両方での遺伝子発現を研究するための価値あるツールとして現れている（BANTOUNAS ET AL., 2004; ZHOU ET AL., 2006）。ｍＲＮＡ認識およびそのダウンレギュレーションを標的とする方策は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、触媒核酸−リボザイムおよびデオキシリボザイムならびに干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉｓ）がそれに含まれる、いわゆる「小さな抑制性核酸」のアンチセンス作用に基づく。これらの核酸すべてが、配列特異的なワトソン−クリック型塩基対を介して標的分子、例えばＣＤＫ４またはＣＤＫ６をコードする遺伝子を認識し、メッセンジャーＲＮＡとの相補複合体が形成される。これらの抑制性核酸の作用メカニズムは異なる。標的分子に結合した場合に、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ−ｍＲＮＡ二重鎖を形成し、「ハイブリダイゼーション抑止」によって翻訳をブロックし、あるいはＲＮａｓｅ Ｈを活性化し、ＲＮＡの分解が起こる（STEIN AND CHENG, 1993）。リボザイムおよびデオキシリボザイムは、触媒機構を介してＲＮＡリン酸ジエステル結合の切断を促進する（EMILSSON ET AL., 2003）。アンチセンス、リボザイムおよびデオキシリボザイムの手法は、治療用途用の核酸を設計するために広く用いられている（CHRISTOFFERSEN AND MARR, 1995; LEWIN AND HAUSWIRTH, 2001; OPALINSKA AND GEWIRTZ, 2002）。
【００２１】
近年、種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムが、ＨＩＶ−Ｉ感染患者の生体外での治療（SULLENGER AND GILBOA, 2002）など、多くの前臨床試験および臨床試験の対象となっている（KURRECK, 2003）。さらに、最初のアンチセンスオリゴヌクレオチドＦｏｍｉｖｉｒｓｅｎ（Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ）が、サイトメガロウイルスに感染したＡＩＤＳ患者の治療に見事に導入された。核酸技術は、中枢神経系（ＣＮＳ）障害の治療のための可能性のある治療的アプローチとしても認められている。ＣＮＳの標的遺伝子の同定における最新の業績および抑制アプローチの使用は、TRULZSCH AND WOOD (2004)およびGONZALES-ALEGRE AND PAULSON (2007)に概要が述べられている。
【００２２】
ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６発現への上述のＲＮＡに基づく干渉に対する好ましい標的である、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の領域も当業者には公知である。遺伝子サイレンシングアプローチの好ましい領域の例は：
（ａ）ｃｄｋ４またはｃｄｋ６ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域；
（ｂ）ｃｄｋ４またはｃｄｋ６ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ領域；
（ｃ）ｃｄｋ４またはｃｄｋ６のｍＲＮＡのコード領域（ＣＤＲ）；
（ｄ）ゲノムのイントロンまたはエクソン（例えば、単独での、または１つまたは複数のさらなるエクソンと組み合わされた、第１エクソン）
（ｅ）プロモーター領域；である。
領域（ａ）〜（ｄ）のいずれかを標的とするための好ましいＲＮＡは：ミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１２４ａ、ｍｉｒ３４、ｍｉｒ１６）、ｎｃ（非コード）ＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。
【００２３】
サイレンシング剤の直接的なトランスフェクション（例えば、単純な脂質に基づくプロトコルによる）は、外因的に送達されたＲＮＡｉの低サイレンシング活性、遺伝子サイレンシングの一時的作用およびいわゆる「標的外（off-target）」の作用の誘導（非標的遺伝子のサイレンシングの誘導）など、特定の不利点を有する。治療におけるＲＮＡ干渉の適用の最も重要な制限の１つは、標的細胞へのＲＮＡｉ分子の送達効率が低いことである。それらは細胞内ヌクレアーゼによって急速に分解され、長期間の研究（および潜在的な治療用途）は実質的に不可能である。さらに、特定の細胞型（例えば、１次ニューロン）は従来から、裸の核酸をトランスフェクトするのが非常に難しい。ノックダウンの寿命を延ばすために、センスおよびアンチセンス配列が塩基対を形成するのを可能にするヘアピン構造の形成を仲介するスペーサーを含むように、ＲＮＡｉシーケンスを適応させる。このように、ｓｈＲＮＡの発現のための、ベクターをベースとするシステムが開発され、それによって、ｐｏｌＩＩＩ（例えば、Ｕ６、Ｈ１）プロモーターの制御下にて、サイレンシング核酸が発現される。さらに最近では、ｓｈＲＮＡを送達するためにミクロＲＮＡシャトルが使用されており、この方法の重要な特徴は、ｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、ＣＭＶまたはシナプシン）がウイルスベクターにおいて使用されることである。それによって、ウイルスベクターにおけるこれらの発現カセットのいずれかの包含は、ＣＤＫ４またはＣＤＫ６をコードする遺伝子の効率的な送達および長期のサイレンシングを可能にする。
【００２４】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６発現の、ＲＮＡｉに基づくサイレンシングのためのＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ミクロ、非コードＲＮＡ、リボザイムまたはデオキシリボザイムである、ベクターを提供することである。
【００２５】
遺伝子調節用の試薬の送達に伴う既存のリスクおよび中枢神経系によりもたらされる特定の問題、例えば長時間の遺伝子発現の欠如、非ニューロンにおける未制御かつ意図しない導入遺伝子発現および導入遺伝子発現の制御されていない強度は、（ｉ）ウイルスまたは（ｉｉ）安全な遺伝子導入のための非ウイルスベクター、（ｉｉｉ）細胞型特異的認識システム、（ｉｖ）細胞型特異的発現システムおよび（ｖ）調節可能な導入遺伝子発現システム、好ましくは（ｉ）〜（ｖ）の１つまたは複数の組み合わせを使用することによって対処することができる。広範であるが、発現の細胞型特異的標的分布は、細胞型特異的認識および発現システムと（ｖｉ）対流増加送達（ＣＥＤ）との組み合わせによって達成されるだろう。
【００２６】
遺伝子治療ツールのモジュール・キャラクターによって、細胞の不定期の細胞周期リエントリーが決定的に重要である、多種多様な他の神経疾患、例えばパーキンソン病、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症または増殖性硝子体網膜症などの治療のために、別の基準に上記の概念を適合させることが可能となる。さらに、非ニューロン細胞の不定期の細胞周期リエントリーが決定的に重要である、広範囲の非神経疾患、例えば癌、免疫増生性疾患、心肥大、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎、乾癬、ＡＩＤＳ等（表１；ARENDT, 2008）などに適用可能である。ＡＤに加えて、マリグノーマ（malignoma）および心血管障害に、この新たな方策の直接的な焦点が置かれている。
【００２７】
【表１】
0005869884.tif 000002
【００２８】
ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６の生物活性を妨げるタンパク質をコードする核酸分子の発現を制御するために、十分に確立された異なるオン／オフ調節システムが、遺伝子発現を調節するのに利用可能である。基本的に、そのシステムは、２つの異なる発現単位：（Ａ）誘導性プロモーターによって制御される対象の遺伝子を保有する単位（特徴（ａ）））、（Ｂ）好ましくは恒常的に発現され、誘導性プロモーター活性の活性化または抑制を仲介する特異的な物質に結合することができるトランス活性化因子タンパク質を保有するもう１つの単位（特徴（ｂ））からなる。
（Ｂ）に関しては、少なくとも以下の６つのシステムが、ヒトまたはげっ歯類で使用するために開発されており、本発明に有用である。
（ｉ）Ｔｅｔオン／オフ（GOSSEN AND BUJARD, 1992; GOSSEN ET AL., 1995; BARON AND BUJARD, 2000）、
（ｉｉ）Ｐｉｐ（プリスチナマイシン誘導タンパク質）オン／オフ（FUSSENEGGER ET AL., 2000）；
（ｉｉｉ）マクロライド応答性Ｅ．ＲＥＸ技術（WEBER ET AL., 2002）、
（ｖ）抗プロゲスチン依存性（WANG ET AL., 1997）、
（ｖ）エクジソン依存性（CHRISTOPHERSON ET AL., 1992; No ET AL., 1996）および
（ｖｉ）ラパマイシン依存性システム（RIVERA ET AL.,1996; LlBERLES ET AL., 1997）。
【００２９】
（ｉ）誘導物質ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）は、ヒトにおいて忍容性がよく、
（ｉｉ）抗生物質として広く使用されており、
（ｉｉｉ）Ｄｏｘは脂溶性であり、脳を含むかなりの組織浸透性を有し（UEBERHAMET AL., 2005）、それはＣＮＳ遺伝子治療を開発するため、ｔｅｔシステムを使用するのに必須であり、
（ｉｖ）Ｄｏｘの経口投与によって、生体内での急速かつ用量依存的な遺伝子誘導／抑制スイッチが可能となり（AURISICCHIO ET AL., 2001）、
（ｖ）ｔｅｔシステムは既に、遺伝子発現を調節するためのウイルスおよび非ウイルスベクターの産生に使用されており、
（ｖｉ）個々の細胞における遺伝子発現のレベルが誘導物質の容量と直接相関するため、段階的転写応答が可能となることから、患者に適用するのに最も適しているため、Ｔｅｔオン／オフシステムが好ましい。
【００３０】
Ｔｅｔオンシステムにおいて、テトラサイクリンオペロンのリバースリプレッサー（ｒｔｅｔＲ）は、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写因子に融合し、リバーステトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）が確立される。これは、誘導性プロモーターに結合し、テトラサイクリンまたはその類似のドキシサイクリンの存在下にて対象の遺伝子の転写を活性化する。誘導性プロモーターは、サイトメガロウイルス最小プロモーター（ＣＭＶｍｉｎ）に融合したＴｅｔオペレーターｔｅｔ０からなる。
【００３１】
これらのシステムにおける潜在的に高い基本的発現はさらに、以下の方策によって低減されるだろう。
・修飾ＴＲＥエレメントおよび改変最小ＣＭＶプロモーターで構成される密なＴＲＥ構築物を使用することによって、対象の遺伝子の基礎的発現が低減されるだろう。
・ｔｅｔＯ配列に融合した弱いニューロン特異的プロモーター（ＣａｍＫＩＩまたはシナプシン）でＣＭＶプロモーターを置換することによって、基礎的活性も低減されると同時に、さらにニューロン特異性が高められる。アルブミンプロモーターを適応させるために、同様な方策がうまく用いられている（ZABALA ET AL., 2004）。
・ＴＴＲＥ応答性プロモーターと相互作用し、かつドキシサイクリンの存在下にて基礎的発現を能動的にサイレンスする、２つの異なるキメラリプレッサーがある。
［ａ］ヒトＫｏｘ−１タンパク質のリプレッサードメイン（ＫＲＡＢ）に融合した細菌ｔｅｔＲタンパク質および
［ｂ］ｍＳｉｎ３−ヒストンデアセチラーゼ複合体の漸増に関与する、ヒトＭａｄ−１ドメインに融合したｔｅｔＲタンパク質。
本発明では、ＫＲＡＢリプレッサータンパク質およびｔｅｔＲ−Ｍａｄ−１を使用する方策が好ましい。
【００３２】
・第４のアプローチは、上述（SAQR ET AL., 2006）のＣａｍＫＩＩプロモーターとトランス活性化因子シーケンスとの間のｔＴＳサイレンサー配列（ＴＲＥに特異的に結合し、さらにＤｏｘの非存在下で転写を抑制する、テトラサイクリン制御転写サイレンサー）のクローニングである。
【００３３】
・代替方法としては、トランス活性化因子とＴＲＥ保有構築物の両方の比を変化させるか、または適用を遅らせることによって、ｔｅｔシステムの強固さが向上する。代替方法としては、基礎バックグラウンドを減らす、反対方向を有する両方のｔｅｔエレメントを保有する単一調節性脳特異的ベクターを使用することができる。必要な場合、かつ発現レベルが低すぎる場合には、３’末端でのウッドチャック転写後調節因子（ＷＰＲＥ）の組込みが代わりに考慮される。
【００３４】
・別々のベクターにクローン化されたプロモーターおよびリプレッサー／トランス活性化因子エレメントを有する非組込み性（non-integrating）エピソームベースのベクターに、調節可能な発現システムを組み込むことによって、治療的要求に応じて発現を調節することが可能となり、したがって、治療の安全性がさらに高まる。このように、ウイルスの割合を変化させることによって、相対的な発現レベルを制御することが可能であり、したがって、単一ベクターシステムおよび組込み事象に伴う問題を避けることが可能である。さらに、非組込み性ベクターは、発現プロファイルも変化させる複合体エピソームコンカテマー（高力価で使用しなければならないＡＡＶベクターで見られる）を形成しない。
【００３５】
本発明に使用することができる様々なウイルスベクターは当業者には公知である。例えば、レンチウイルスのベクターは、中枢神経系に遺伝子送達ために選択されるツールである。このベクターは、比較的大きな導入遺伝子容量（８〜１０ｋｂ）を有し、高力価に産生され、低い免疫原性を有し、レトロウイルスベクターと異なり、分裂終了ニューロンを効率的に形質導入し、導入遺伝子の安定かつ長期の発現を生じさせることができる（検討のため、WONG ET AL., 2006参照）。標的細胞へのエントリーに続いて、レンチウイルスのベクターは、宿主ゲノムに安定に組み込まれる。挿入変異に関連する安全性の問題は、非組込み性ウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を使用することによって避けることができる。ＡＡＶベクターは効率的に神経細胞型を形質導入し、低い免疫原性を有するが（検討のため、TENENBAUM ET AL., 2004参照）、それらは、導入遺伝子能力（４〜５ｋｂ）によって制限され、マウスにおける活性遺伝子がそれに組み込まれることも示されている（NAKAI ET AL., 2003）。
【００３６】
さらに有望なことには、分裂細胞の形質導入で非効率的であると本来は述べられていた組込み不能（integration-deficient）レンチウイルスベクター（CASE ET AL., 1999; NALDINI ET AL ., 1996）が最近、生体外（Lu ET AL. 2004; SAENZ ET AL.,2004; VARGAS JR. ET AL., 2004）および生体内（YANEZ-MUNOZ ET AL., 2006; NIGHTINGALE ET AL., 2006）での導入遺伝子発現を維持することが明らかとなっている。これらのベクターは、インテグラーゼ遺伝子のコード配列の変異によって組込み不能になっており、複製シグナルなく、核において環状形で存在する。成体のＣＮＡにおいて、この組込み不能なレンチウイルスのベクターからの効率的かつ持続した導入遺伝子発現が、げっ歯類の眼球組織および脳組織で確認された。さらに、これらのベクターを用いた治療遺伝子の送達は、網膜変性のげっ歯類モデルの救済を仲介した（YANEZ-MUNOZ ET AL., 2006）。したがって、組込み不能なレンチウイルスのベクターが特に好ましい。
【００３７】
さらに、本発明に使用することができる様々な非ウイルスベクターが当業者には公知である。ウイルスベクター仲介送達に加えて、およびその代替として、非ウイルスベクター仲介遺伝子導入が既に、ＣＮＳなどの様々な臓器にうまく適用されている。腫瘍退縮が生じる臨床的に有効な異なるアプローチが最近、再検討されている（OHLFEST ET AL., 2005B）。非ウイルスベクターのいくつかの利点がある。それは、（ｉ）産生が容易であり、（ｉｉ）その構成が単純であり、（ｉｉｉ）ウイルスベクターとして潜在的に安全であることである。（ｉｖ）制御されない複製のリスクはなく、（ｖ）その合成はウイルスベクターと比較して安価である（一部には、哺乳動物細胞不含システムにおいてそれが容易に産生されるため）。ウイルスベクターとは逆に、（ｖｉ）トランスフェクション効率を妨げ、副作用を生じさせる可能性のある非ウイルスベクターに対するヒトの既存の免疫がない（BESSIS ET AL. 2004）。
【００３８】
例えば、分枝鎖および直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、効率的かつ可変性の遺伝子送達を示す。ＰＥＩは正に荷電しており、負に荷電したＤＮＡを２００ｎｍ未満のサイズに圧縮し、細胞エントリーが促進され、エンドソームの破裂が起こる。分岐度は、トランスフェクション効率に影響する（KICHLER 2004）。ＰＥＩは、ＣＮＳ標的化に特に有望であり、いくつかの利点を有し、（ｉ）ＤＮＡ／ＰＥＩは、ＣＮＳに投与された場合に忍容性がよく（LEMKINE ET AL. 2002; OHLFEST ET AL. 2005A; OH ET AL. 2007）、（ｉｉ）脳は、ＰＥＩの魅力的な標的であり、ＰＥＩは全身投与後でも高濃度であった（JOHANSSON ET AL., 2004）。細胞特異性を高めるために、（ｉｉｉ）標的細胞の表面受容体に対して高親和性を有する異なるリガンドにＰＥＩを結合させることができる。
【００３９】
さらに好ましい実施形態において、本発明のベクターまたはベクターの混合物はさらに、細胞特異的標的化のためのペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含有する。細胞型特異的標的化は、例えば、ペプチドおよびポリペプチドに、好ましくは細胞特異的表面受容体に対する抗体に非ウイルスベクターを結合させることによって達成することができる。
【００４０】
細胞表面上の適切な分子標的構造の選択は、細胞型特異的遺伝子送達に重要であり（KIRCHEIS, 2001）、以下の態様は、抗体は（ｉ）ニューロンに対する強力な特異性を有し、（ｉｉ）非毒性であり、（ｉｉｉ）生体内での免疫細胞の活性化の減少を全く引き起こさないか、またはわずかに引き起こす、と考える必要がある。さらに、（ｉｖ）それらは重要な生理学的機能を妨げない。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、天然に産生されていようと、一部もしくは完全に合成的に産生されていようと、免疫グロブリンを表す。この用語は、免疫グロブリン結合性ドメインと相同である結合性ドメインを有するタンパク質も含む。これらのタンパク質は、天然源から誘導されるか、または一部もしくは完全に合成的に産生される。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプおよびＦａｂ、Ｆ（ａｂ1）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄ断片である。
【００４１】
適切な標的は、チロシンキナーゼ（Ｔｒｋ）Ａ受容体によって表され、ＡＤにおいて最も初期に、および最も重篤に影響を受けるコリン作動性ニューロン上に特異的に位置する（ARENDT ET AL., 1983)。ＴｒｋＡ受容体に結合した後、完全なＡｂ−ＴｒｋＡ−受容体複合体は内部に取り入れられる（LESAUTEUR ET AL., 1996）。これによって、生理学的リガンドＮＧＦと共にそれが起こるため、結合型ＰＥＩの適切なインターナリゼーションが可能となる。代替方法としては、抗ＮＧＦ抗体を使用することができる。ＮＧＦに結合した後、抗体−ＮＧＦ−複合体もＴｒｋＡ受容体に結合し、続いて、ＮＧＦのみと比較してインターナリゼーションが促進される（SARAGOVI ET AL. 1998）。
さらなる実施形態において、コリン作動性ニューロンの代替の細胞表面分子、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、ニューロン細胞接着分子（ＮＣＡＭ）およびニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）などが特異的に標的化される。
【００４２】
さらなる実施形態において、ニューロンに裸のＲＮＡｉをシャトルするために最近使用されている修飾狂犬病ウイルス糖タンパク質（ｒｖｇ）（KUMAR ET AL., 2007）がＰＥＩと結合され、それによって、運搬ＲＮＡｉの安定化が促進される。注目すべきことには、ｐ７５ＮＴＲ、ＮＣＡＭおよびｎＡＣｈＲは細胞表面上の狂犬病タンパク質に結合し、インターナリゼーションを促進する。この実施形態において、ペプチドの内因性神経向性を用いて、ＡＤにおいて選択的に冒されるコリン作動性ニューロンを特異的に標的化する。さらに、それによって、血液脳関門を容易に通過することが可能となり、その結果、このツールの末梢性投与が可能となる。
【００４３】
治療される標的組織または器官、例えば脳のみでの発現を達成するために、本発明のベクターの核酸分子を組織特異的プロモーターに結合させて、遺伝子治療に使用することができる。このように、さらなる好ましい実施形態において、細胞型特異的発現は、発現の細胞特異的制御によって、例えばニューロン特異的プロモーターによって達成することができる。ニューロンに対して選好性（preference）を有する多くのプロモーターが特徴付けられており、種々のシャトル／発現システムによって生体内で試験された（HiOKI ET AL., 2007）。ＣａｍＫＩＩおよびシナプシン（ＳＹＮ）プロモーターはほとんど、ニューロンにおいて発現されることから、多くの利点を有する。ＣＭＶおよびＵ１ ｓｎＲＮＡなどの他のプロモーターは主に、グリア細胞における遺伝子発現を仲介する。ＮＳＥプロモーターは、ニューロンに対する相対的特異性のみを有し、グリア細胞においても発現される。ＳＹＮプロモーターは、ニューロン発現に対して最も高い特異性を示し（＞９６％）（HIOKI ET AL., 2007）、ｐ２１ｒａｓのニューロン特異的発現を有する遺伝子導入マウスの作製に既にうまく適用されている（HEUMANN ET AL., 2000; ARENDT ET AL., 2004; GARTNER ET AL., 2005; SEEGER ET AL., 2005; ALPAR ET AL., 2006）。最近、ＣａｍＫＩＩプロモーターの高いニューロン特異性が実証された（UEBERHAM ET AL., 2005; 2006）。
【００４４】
対象の遺伝子の発現レベルは、（ａ）HIOKI ET AL. (2007)に従ってＣＭＶエンハンサーと融合することによってハイブリッドプロモーターを産生することによる、プロモーター活性の増強によって、または（ｂ）３’非翻訳領域にウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を組み込むことによって（PATERNA ET AL., 2000）、さらに改善することができる。
【００４５】
本発明は、（ａ）神経変性疾患または（ｂ）細胞周期の不定期の活性化に関連する疾患を予防または治療する方法で使用される、上述のベクターも提供する。
【００４６】
本発明は、（ａ）神経変性疾患または（ｂ）細胞周期の不定期の活性化に関連する疾患の予防または治療に使用される医薬組成物の製造のための、上記で定義される（ａ）ベクターの使用にも関する。好ましい実施形態において、前記神経変性疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）である。
【００４７】
好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容される担体も含有する。適切な薬剤担体等の例は当技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型エマルジョンなどのエマルジョン、種々の種類の湿潤剤、滅菌溶液等が挙げられる。かかる担体は、従来の方法によって配合され、適切な用量で被検者に投与される。適切な組成物の投与は、異なる方法によって、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって行われる。当然のことながら、投与経路は、疾患、例えばＡＤの性質、その位置および医薬組成物に含有される化合物の種類に応じて異なる。投与計画は、主治医および他の臨床因子によって決定される。医療技術においてよく知られているように、いずれか１人の患者の投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間および投与経路、疾患の種類およびステージ（例えば、ＡＤ）、全身の健康状態および同時に投与されている他の薬物などの多くの因子に依存する。
【００４８】
本発明のベクターの送達は、例えば、標的部位、例えば脳に直接適用することによって、または例えば、髄腔内、脳脊髄内、鼻腔内、腹腔内または経口投与によって達成することができる。
血液脳関門は、ウイルスベクター仲介遺伝子治療またはＰＥＩなどの治療薬の脳への送達にかなりのハードルである。このバリアを効率的にバイパスする技術の開発は、神経疾患の管理に大変革をもたらすだろう。血液脳関門の浸透圧破壊は、薬物の投与前に濃縮マンニトール溶液を動脈内注入することによって達成される。このアプローチは一過的に、内皮細胞の密着結合を開くが、薬物は、その下の基底膜に蓄積すると思われ、組織浸透が制限される（MULDOON ET AL., 1999）。
【００４９】
対照的に、対流増加送達（ＣＥＤ）では、脳または脊髄に直接移植される、非常に微細な頭蓋内カテーテル（外径０．４ｍｍ未満）が用いられる。正確に制御された低注入速度（０．５〜１０μｌ／分）でのこれらのカテーテルによる薬物の注入によって、脳細胞外空間内に薬物分布が生じる（KRAUZE ET AL., 2005）。その結果、カテーテルチップの正確な位置付けおよび血液脳関門を通過することができない治療薬の使用によって、別々の神経解剖学的構造内に薬物を区分することが可能であり、全身毒性のリスクが限定される。
【００５０】
実質内、脳室内および髄腔内投与などの直接的な頭蓋内薬物送達の他の技術ならびにカプセル化細胞および生分解性ポリマーと比較して、ＣＥＤの主な利点は、ＣＥＤは拡散に依存せず、適切な薬物分布を達成することである。ＣＥＤは、カテーテルチップと脳細胞外空間との間に生じる圧力勾配に沿って治療薬を分布する。その結果、濃度勾配の下に短い距離で不均一に薬物分布を生じる、拡散に依存する技術と対照的に、ＣＥＤは、その分子サイズにかかわらず、長い距離にわたって（カテーテルチップから５ｃｍまで）薬物の制御された、均一な分布を可能にする（GILL ET AL., 2003; GILLIES ET AL., 2005）。これは明らかに、少ない数の移植カテーテルを使用した、臨床的に有意な脳の容積にわたる治療に使用されるベクターの送達において多大な利点を提供する。
以下の実施例によって本発明を説明する。
【００５１】
実施例１
３つの異なる方法によって評価された、ＡＤにおけるニューロンＤＮＡ複製の研究
（Ａ）スライドベースのサイトメトリー（Slide-based cytometry）（ＳＢＣ）
Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＬＳＣ，ＣｏｍｐｕＣｙｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）および適切なソフトウェアＷｉｎＣｙｔｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．４を使用して、ＳＢＣを行った。ＳＢＣの条件を上述の本発明の適用に対して最適化した（Lenz et al., 2004; Mosch et al., 2006）。各蛍光事象をサイズ、周囲長、対象スライド上でのｘ−ｙ位置、最大（最高画素）および全体の積分蛍光強度に関して記録した。各標本について分析細胞数８０，０００〜１２０，０００で、各海馬傍回全体をスキャンした。積分ＰＩ蛍光値によって、細胞の相対ＤＮＡ含有量を決定し、ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＭｏｄｆｉｔＬＴ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｐｓｈａｍ，ＭＥ，ＵＳＡ）を使用して、これらのデータをさらに解析した。この方法によって、２ｎ、２ｎ〜４ｎまたは４ｎのＤＮＡの一定量を含有する細胞集団を明確に識別した（図２Ａ）。大部分の細胞は２ｎピークによって表されたが、ＡＤ脳ではさらに、同年齢の健康な対照の脳には存在しない４ｎピーク（矢印）がはっきりと得られた。
【００５２】
（Ｂ）色素生産性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＣＩＳＨ）
１７番染色体のセントロメアのα−サテライト配列を標的化するＺｙｔｏＤｏｔＣＥＮ  １７プローブ（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ，Ｂｒｅｍｅｒｈａｖｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でハイブリダイゼーションを行った。ヒツジ由来の抗ジゴキシゲニン抗体のペルオキシダーゼ結合型Ｆａｂ断片（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および色原体として硫酸アンモニウムニッケル／ＤＡＢ／０．０１５％ Ｈ2Ｏ2を使用して、ジゴキシゲニン標識プローブを免疫組織化学的に可視化した。対象スライド上に滴下された固定化ヒトリンパ球および標準条件下で培養され、カバースリップ上で増殖されたヒーラ細胞を対照として使用した。嗅内皮質のすべての皮層全体にわたって採取されたニューロン核４００〜５００個を各ケースについて分析した。１７番染色体プローブとの発色性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によって一貫して、ニューロン、星状膠細胞および小膠細胞を含むすべての細胞型において異なるハイブリダイゼーションスポットが現れた。脳切片のハイブリダイゼーション後に、対照およびＡＤ患者両方の嗅内皮質におけるニューロンの大部分で２つのハイブリダイゼーションスポットが得られた。さらに、スポットがない、１つまたは３つのスポットを有するニューロンはあまり確認されなかった。図２Ｂは、２つのスポット（左）および４つのスポット（右）（矢印）を有するＡＤの進行症例におけるニューロンを示す。スケールバー：１０μｍ。
【００５３】
（Ｃ）顕微解剖および定量的ＰＣＲ
ニューロフィラメントに対する免疫反応性により同定された単一ニューロンをレーザーマイクロダイセクターで脳スライスから切り出し（ＰＡＬＭ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｍ，Ｐ．Ａ．Ｌ．Ｍ．Ｍｉｃｒｏｌａｓｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＧ，Ｂｅｒｎｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、続いてＤＮＡ定量化にかけた。Ａｌｕ反復配列（Walker et al., 2003）、霊長類においてコピー数約１００万に達する真核生物ゲノムにおける、あるクラスの短散在エレメントのリアルタイムＰＣＲ増幅によって、個々のニューロンのＤＮＡ含有量を定量化した（Houck et al., 1979; Batzer and Deininger, 2002）。真核生物ゲノムにおける他の短散在エレメントと比較して、コピー数が高く、多型のレベルが低いため、Ａｌｕ反復配列が選択された（Roy-Engel et al., 2001）。いくつかの個体における異なるコピー数または単一ヌクレオチド多型による人為的影響の残りのリスクは、各患者の２つの異なる脳領域を個人内比較することによって避けられた。「Ｐｒｉｍｅｒ３」プログラム（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3 www.cgi）を用いて、Ａｌｕ反復配列の保存領域に位置するＡｌｕオリゴヌクレオチドプライマーａｌｕ−ｆｏｒ  ５’−ＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣ−３’およびａｌｕ−ｒｅｖ  ５’−ＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣ−３’をデザインした。リアルタイムＰＣＲ定量化は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ２０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で行われた。Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ２０００  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．６によってデータを解析し、ＰｌｏｔＩＴ  ３．２（ＳＰＥ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、統計を行った。ヒト脳組織と同様に処理されたヒトリンパ球を対照に用いた。１つのリンパ球および２つのリンパ球それぞれに対して、２．０７ｐｇ±０．６（平均±ＳＤ）および４．０６ｐｇ±０．５のＤＮＡ量が得られた。各ケースに関して、嗅内皮質のすべての層から試料採取された少なくとも２０個のＳＭＩ３１１−免疫反応性細胞をマイクロダイセクターで捕獲し、ＰＣＲのために処理した。
【００５４】
ＣＩＳＨに続いて、顕微鏡下にて個々に同定された嗅内皮質におけるニューロンのレーザー捕獲顕微解剖に続いて、Ａｌｕ反復配列のＰＣＲ増幅によって、同じ状況で単細胞ＤＮＡ含有量をさらに解析した。この方法によって得られた単細胞ＤＮＡ含有量の度数分布が図２Ｃに示される（上のパネル）。ＡＤを対照と比較すると、より高いサイズのクラスに対するシフトおよび分布形状の差異が明らかとなる。対照群の分布は、２．５〜３．５ｐｇ／細胞で１つの最大値を有し、それは、最初のバリデーション実験で決定される２ｎＤＮＡ含有量に対するサイズに相当する。さらに、ＡＤ群は、おそらく四倍体ニューロン（４ｎ）を表す、６．５〜７．５ｐｇ／細胞のサイズ群において第２の最大値を示した（図２Ｃ、下のパネル）。
【００５５】
実施例２
ｐ１６INK4aのクローニングおよび遺伝子導入マウスの作製
ｐ１６INK4aをクローニングするために、ヒト線維芽細胞ＲＮＡを単離し、ランダムｐｄＮ６−プライマーおよびSuperscript II RT（Gibco社）を用いて逆転写し、得られたｃＤＮＡを以下の特異的プライマー対：ｐ１６−フォワード：５’−ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＧＣＧおよびｐ１６−リバース：５’−ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＴを用いて増幅した。
【００５６】
アガロースゲル電気泳動に続いて、クローニングベクター（つまり、ＰＵＣ１８シリーズ［Ｐｒｏｍｅｇａ社］からの）におけるｓｕｒｅ  ｃｌｏｎｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、ｐ１６ｒＮＫ４ａ配列をクローニングし、ｐＵＣ１８−ｐ１６が得られた。このプラスミドをＣａＣｌ2コンピテントＪＭ１０９大腸菌細胞において形質転換し、アンピシリンの存在下にて寒天平板で培養した。コロニーを採取し、ＬＢ培地で培養し、Qiagen Maxi-prepを使用して単離し、インサートを配列決定した。制限酵素を使用して、ｐ１６INK4aインサートを切断し、さらに、マルチクローニング部位において制限酵素で前もって直鎖化されたｐＳｉｎＲｅｐ５ベクターにサブクローニングした。ｐＳｉｎＲｅｐ５ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入された、Ｓｉｎｄｂｉｓ発現システムに属する（「Ｓｉｎｄｂｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍ」；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カタログ番号Ｋ７５０−０１）。
【００５７】
新たに産生されたｐＳｉｎＲｅｐ５−ｐ１６INK4aベクターを直鎖化し、ＳＰ６ポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写した。ＳＰ６ポリメラーゼによって、ＤＨ−ＢＢヘルパープラスミドからもＲＮＡを転写した。ＤＨ−ＢＢヘルパーＲＮＡおよびＳｉｎＲｅｐ５−ｐ１６ＲＮＡをリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ社から購入）と混合し、ＢＨＫ培養細胞に添加した。この同時トランスフェクションから２４時間後に、培地を取り出し、２０００×ｇで遠心分離し、壊死組織片を除去し、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）−ｐ１６ウイルスを含有する残りの上清を、実施例３に示す実験のウイルスストック溶液として使用した。
【００５８】
ｐＵＣ１８−ｐ１６プラスミドで開始し、制限酵素でｐ１６INK4a配列を切断し、さらに発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）においてサブクローニングし、それを実施例３に示す実験に使用した。
【００５９】
遺伝子導入マウスを作製するために、ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する以下の特異的プライマー対を使用して、ｐ１６INK4aｃＤＮＡを増幅し、ｐＢＩベクターにサブクローニングすることが可能となり（ｐ１６−Ｍｌｕ−Ｆ：ｃｔｃａｃｇｃｇｔａｇｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｔｇｇａｇｃｃｇｇｃｇ；ｐ１６−Ｈｉｎｄ−Ｒ：ａｔｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃｔｇｇｔｔｃｔｔｔｃａａｔｃｇｇｇｇａｔ）、その結果、ｐＢＩ−ｐ１６INK4aが得られる。異種ｔＴＡシステムを使用して、ｐ１６INK4aの誘導性神経特異的発現を有する遺伝子導入マウスを作製した。簡潔には、ルシフェラーゼの二方向転写ユニットおよびｐ１６INK4aを保有する遺伝子導入ラインｐtetｐ１６INK4a（Ｃ５７Ｂ１／６−ＤＢＡバックグラウンドであり、および従来の方法によりマウス卵母細胞におけるｐＢＩ−ｐ１６INK4aの微量注入によって産生された）の個体をトランス活性化因子ラインＣａｍＫＩＩ（Ｃ５７Ｂ１／６−ＮＭＲＩバックグラウンド）の個体と交配した。１２：１２時間の一定の昼夜サイクル下で動物を収容し、標準的な食餌を与え（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４，Ａｌｔｒｏｍｉｎ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｆ−ｒ  Ｔｉｅｒｅｒｎａｈｒｕｎｇ，Ｌａｇｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、すべての条件下にて無制限に、水／ドキシサイクリン塩酸塩にアクセスできるようにした。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ２４  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９８６（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って、動物実験を行い、地方自治体によって承認された。
【００６０】
ドキシサイクリン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｄｏｘ）を水に５０μｇ／ｍｌに溶解し、茶色の瓶に入れ、それを１週間に２回交換し、転写を防いだ。遺伝子導入タンパク質の発現は、Ｄｏｘの代わりに淡水を使用することによって誘導された。実施例３に記載の実験において、Ｐ１６INK4a発現性マウスおよび対照を使用した。
【００６１】
実施例３
生体外および生体内でのｐ１６INK4aの異所発現による変性に対する保護
（Ａ）生体外での神経保護実験（結果を図３Ａ＋Ｂに示す）
（Ａ）シンドビスウイルスまたは（Ｂ）シンドビス−ｐ１６INK4aウイルスのストック希釈溶液をラット脳スライスに形質導入した。ニューロン死を誘導する、オカダ酸（１０ｎＭ ＯＡ，２４時間）でのラット脳スライスの処理に続いて、脳スライスを４％ＰＦＡと共にインキュベートし、ｄＵＴＰ−ローダミンとのＴＵＮＥＬ反応を行った。図３Ａ：赤色が、シンドビス形質導入微小外植片における多くのアポトーシスニューロンを示している。図３Ｂは、シンドビス−ｐ１６INK4a形質導入培養微小外植片（ＴＵＮＥＬ；ｄＵＴＰ−ローダミン）を示し、少ない数のアポトーシスニューロンと共にニューロン細胞死の減少が実証されている。
【００６２】
（Ｂ）生体外での神経保護実験（結果を図３Ｃ＋Ｄに示す）：
リポフェクタミン法を用いて、一次マウス肝細胞にｐＥＧＦＰ−Ｎ（Ｃ）またはｐＥＧＦＰ−Ｎ−ｐ１６（Ｄ）構築物をトランスフェクトし、生体外にて６穴プレートで培養した。２４時間後に、スタウロスポリンを培地に添加し、アポトーシスを誘導した。細胞ブレブ形成によって示されるように、ｐＥＧＦＰ−Ｎトランスフェクト肝細胞が死んだのに対して（Ｃ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ−ｐ１６トランスフェクト肝細胞は生存した（Ｄ）。
【００６３】
（Ｃ）生体内での神経保護（結果を図３Ｅ＋Ｆに示す）
Ｐ１６INK4a発現性マウス（飲料水からドキシサイクリンを除去した後に、遺伝子導入ｐ１６INK4aが発現される）およびＰ１６INK4a非発現性マウス（遺伝子導入ｐ１６INK4a発現の抑制は、飲料水中で投与されたドキシサイクリンによるものである）をＮＭＤＡで処理した。定位装置によって、ＮＭＤＡを投与した（ＮＭＤＡ ２μｇ／μｌ ＰＢＳ；注入速度０．１μｌ／分；注入時間５分；領域：海馬内）。１４日間の生存時間の後、マウスを屠殺し、脳を４％パラホルムアルデヒドで灌流し、染色ニューロンを検出するために、スライスをＦｌｕｏｒｏｊａｄｅで染色した。Ｐ１６INK4a発現性マウス（図３Ｆ）は、ｐ１６INK4a発現が抑制されたマウス（図３Ｅ）と対照的に、少ない数のアポトーシスニューロンを示す。
【００６４】
Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂは、細胞体およびニューロンが変性するプロセスの両方を選択的に染色するアニオン性蛍光色素である。この方法は、最初に記述された方法からわずかに改変された（Schmued et al., 1997）。ゼラチン（２％）コートスライド上に切片を載せ、５０℃で５０分間空気乾燥させ、８０％エタノール中に水酸化ナトリウム１％を含有する溶液に３分間浸した。７０％エタノール中で１分間インキュベートし、蒸留水中で２分間洗浄した後、振盪テーブル上の０．０６％過マンガン酸カリウム溶液に、スライドを１５分間移動した。蒸留水中で（１分間）すすいだ後、スライドをＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ染色溶液中で２０分間インキュベートした。染色溶液を調製するために、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ（Ｈｉｓｔｏ−Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＵＳＡ）１０ｍｇを蒸留水１００ｍＬに溶解し、このストック溶液１０ｍＬを０．１％酢酸９０ｍＬで希釈して、染色溶液を得た。染色後、スライドを水ですすぎ、乾燥させ、カバーガラスを載せた。一連のＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ染色切片を用いて、ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ（商標）（ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０５．４，ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ，ＵＳＡ）を適用して、病変容積を決定した。簡潔には、１０個に１個のＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂ染色スライス上で病変を取り囲み、ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ（商標）によって断面積を決定した。
【００６５】
実施例４
ドキシサイクリンの存在下での抑制された遺伝子導入ｐ１６INK4a発現（図４，左）と比較した、ドキシサイクリンを除去した後の、遺伝子導入マウスの皮質（ニューロン）におけるｐ１６INK4aの誘導性ニューロン特異的発現
異種ｔＴＡシステムを用いて、ｐ１６INK4a［ｔＴＡＣａｍＫＩＩａ／ｔＴＡ−応答性プロモーター（Ｐtet）ｐ１６INK4a］の誘導性ニューロン特異的発現を有する遺伝子導入マウスを作製した（Baron and Bujard, 2000; Gossen and Bujard, 1992; Gossen et al., 1995）。このｔＴＡシステムにおいて、トランス活性化因子（ｔＴＡ）、大腸菌由来ｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）ＤＮＡ結合性ドメインと単純ヘルペスウイルスに由来するＶＰ１６タンパク質の転写活性化ドメインの融合タンパク質（Gossen and Bujard, 1992）を、ｔＴＡタンパク質のニューロン特異的発現を可能にするＣａｍＫＩＩａプロモーターの制御下に置く。ｔＴＡタンパク質はｔｅｔオペレーター（ｔｅｔ０）配列に特異的に結合し、続いて、導入遺伝子（ｐ１６INK4a）と組み合わせられる、隣接するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最小プロモーターからの転写を誘導する。テトラサイクリンまたはその誘導体ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）は、ｔｅｔ０に対するｔＴＡの結合を阻止し、ＣＭＶプロモーター下でクローニングされた導入遺伝子の転写活性化が停止される（ここで、ｐ１６INK4a発現が阻止される）。対照的に、Ｄｏｘの除去によって、導入遺伝子発現の誘導が可能となる（ここで、ｐ１６INK4a発現が可能となる）。
【００６６】
この目的のために、二方向プロモーターＰtet−ｂｉｌの制御下にてｐ１６βINK4aおよびルシフェラーゼｃＤＮＡの両方からなる、染色体組込みｐtetＰ１６INK4aベクター（Ueberham et al., 2008）を保有する、マウス系を使用した（Baron et al., 1995）。このｐtetｐ１６INK4a系を作製するために、ｐＢＩ−５ベクターへのサブクローニングを可能にするＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する以下の特異的なプライマー対を用いて（CVU89934, GenBank at NCBI, Bethesda, MD, USA; (Baron et al., 1995; Baron and Bujard, 2000）（ｐ１６−Ｍｌｕ−Ｆ：ｃｔｃａｃｇｃｇｔａｇｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｔｇｇａｇｃｃｇｇｃｇ；ｐ１６−Ｈｉｎｄ−Ｒ：ａｔｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃｔｇｇｔｔｃｔｔｔｃａａｔｃｇｇｇｇａｔ）、ヒトｐ１６INK4aｃＤＮＡ（上記参照）を増幅し、プラスミドｐＢＩ−ｐ１６INK4aが得られた。プラスミドｐＢＩ−ｐ１６INK4aを制限エンドヌクレアーゼによって直鎖化し、従来の卵母細胞注入（Ｃ５７Ｂ１／６−ＤＢＡバックグラウンド）による遺伝子導入マウスの作製に使用した。標準ＰＣＲ法を用いて、得られたファウンダーマウス（founder mice）をトランスジェナイティ（transgeneity）について試験した。ｐＢＩベクターは、共に受け継がれたが、ＰtetＰ１６INK4aマウス系においてサイレントなままである、ルシフェラーゼおよびｐ１６INK4aｃＤＮＡの二方向転写ユニットからなる。
【００６７】
ニューロン特異的発現を得るために、ＰtetＣｐ１６INK4a系を、カルシウム−カルモジュリンキナーゼＩＩａプロモーターにより制御されたトランス活性化因子タンパク質（ｔＴＡ）を発現するマウス系と交配させた（ｔＴＡＣａｍＫＩＩａ−ラインＢ，Ｃ５７Ｂ１／６−ＮＭＲＩバックグラウンド（Mayford et al., 1996））。発達中のｐ１６INK4aの制御されていない発現を防ぐために、動物が妊娠している間、５％ショ糖水溶液に溶解されたドキシサイクリン塩酸塩（Ｄｏｘ；０．０５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を飲料水に供給した。１日おきに新たな溶液を調製した。飲料水中に同一用量のＤｏｘを得た非遺伝子導入同胞は、薬物の毒性作用を示さなかった。ｐ１６INK4a発現の誘導は、飲料水からＤｏｘを取り除き、代わりに淡水を供給することによって達成された。１２：１２時間の一定の昼夜サイクル下で動物を収容し、標準的な食餌を与え（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４，Ａｌｔｒｏｍｉｎ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｆ−ｒ  Ｔｉｅｒｅｒｎａｈｒｕｎｇ，Ｌａｇｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、すべての条件下にて無制限に、水または水／ドキシサイクリン塩酸塩にアクセスできるようにした。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ２４  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９８６（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って、動物実験を行い、地方自治体によって承認された。
【００６８】
その結果を図４に示す：ＣａｍＫＩＩプロモーターで制御されたｔＴＡ発現によって、Ｄｏｘ投与に依存して、ｔｅｔ０／ＣＭＶｍｉｎプロモーター関連ｐ１６INK4a発現の調節が可能となる（左，Ｄｏｘあり，オフ状態；右，Ｄｏｘなし，オン状態）。
【００６９】
定義づけ：ｐＢＩ−ｐ１６INK4a（プラスミド）ベクターを作製するために、プラスミドｐＢＩ−５を使用し；Ｐtetｐ１６INK4aマウス系を作製するために、ベクターｐＢＩ−ｐ１６INK4aを使用した。
【００７０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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