(57)【要約】  ＤＮＡのメチル化レベルを基準に尿路上皮癌のリスクを判定する方法の提供。尿路上皮細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、検出したＤＮＡメチル化レベルから、該尿路上皮組織の癌化リスクを判定することを含む、尿路上皮組織の癌化リスクの判定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿路上皮組織の癌化リスクの判定方法であって、
尿路上皮細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
検出したＤＮＡメチル化レベルから、該尿路上皮組織の癌化リスクを判定すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、バイサルファイト処理された前記ゲノムＤＮＡを用いて、前記少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、パイロシークエンシング法、質量分析、ビーズアレイ法又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが、配列番号２で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが、配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７に基づいて、前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが第４染色体の１８３，７１０，４７３位、１８３，７１０，４５５位、１８３，７１０，４４１位、１８３，７１０，３４９位、１８３，７１０，３４４位、１８３，７１０，３１８位、及び１８３，７１０，３１１位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが第１２染色体の５４，４３８，４１９位、及び５４，４３８，４２６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが第４染色体の３８，８０７，２５９位であり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが第７染色体の２９，１８７，０１９位であり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが第１染色体の３，０７８，０１３位である、
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１２塩基の鎖長を有し、かつ、バイサルファイト処理された後の、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子に含まれる少なくとも１つのＣｐＧサイトにハイブリダイズする、尿路上皮癌のリスク判定のためのプライマー又はプローブ。
【請求項７】
前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが、配列番号２で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが、配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
請求項６記載のプライマー又はプローブ。
【請求項８】
ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７に基づいて、前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが第４染色体の１８３，７１０，４７３位、１８３，７１０，４５５位、１８３，７１０，４４１位、１８３，７１０，３４９位、１８３，７１０，３４４位、１８３，７１０，３１８位、及び１８３，７１０，３１１位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが第１２染色体の５４，４３８，４１９位、及び５４，４３８，４２６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが第４染色体の３８，８０７，２５９位であり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが第７染色体の２９，１８７，０１９位であり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが第１染色体の３，０７８，０１３位である、
請求項６記載のプライマー又はプローブ。
【請求項９】
配列番号６〜１５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及びその相補鎖からなる群より選択される、請求項６〜８のいずれか１項記載のプライマー又はプローブ。
【請求項１０】
配列番号６及び７で示されるポリヌクレオチド、配列番号８及び９のポリヌクレオチド、配列番号１０及び１１のポリヌクレオチド、配列番号１２及び１３のポリヌクレオチド、配列番号１４及び１５のポリヌクレオチド、又はそれらの相補鎖の組み合わせからなるプライマーセットである、請求項９記載のプライマー又はプローブ。
【請求項１１】
被験体における尿路上皮癌のリスクの判定方法であって、
被験体の尿路上皮細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、ゲノムＤＮＡ、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
検出したＤＮＡメチル化レベルから、該被験体における尿路上皮癌のリスクを判定すること、
を含む方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、バイサルファイト処理された前記ゲノムＤＮＡを用いて、前記少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、パイロシークエンシング法、質量分析、ビーズアレイ法又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが、配列番号２で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが、配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
請求項１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７に基づいて、前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが第４染色体の１８３，７１０，４７３位、１８３，７１０，４５５位、１８３，７１０，４４１位、１８３，７１０，３４９位、１８３，７１０，３４４位、１８３，７１０，３１８位、及び１８３，７１０，３１１位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが第１２染色体の５４，４３８，４１９位、及び５４，４３８，４２６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが第４染色体の３８，８０７，２５９位であり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが第７染色体の２９，１８７，０１９位であり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが第１染色体の３，０７８，０１３位である、
請求項１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿路上皮癌のリスクの判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿路上皮癌は、時間的及び空間的多発性、すなわち腎孟、尿管及び膀胱の多数箇所又は広範囲における同時性及び異時性の病変の発生を臨床病理学的特徴とする。空間的多発性の顕著な例として、腎孟から尿道まで全尿路に及ぶほど広汎に進展する、高異型度平坦型の上皮内癌がある。高異型度平坦型の上皮内癌は、悪性度が高く予後不良である非乳頭状(結節状)の浸潤性尿路上皮癌の前駆病変とされる。これに対し、低異型度の表在性乳頭状尿路上皮癌は頻回の再発を繰り返すが（異時的な多発性）、予後良好である。ただし、低異型度の乳頭状尿路上皮癌が再発を繰り返すうちに異型度を増し、高異型度の乳頭状尿路上皮癌を経て、非乳頭状（結節状）の浸潤性尿路上皮癌に進展することがある。【０００３】
尿路においては、膀胱鏡を用いて病変を観察することが可能であり、また非侵襲的に細胞診を反復して施行することができること、何より膀胱全摘術がＱＯＬを著しく制限することから、尿路上皮癌の治療法としては、経尿道的切除術（ＴＵＲ）やＢＣＧ注入による温存療法がまず選択される。一方で、尿路上皮癌は、その多発性のため、手術療法が成功したようにみえても容易に終診とはなしえず、長期の慎重な経過観察が必要である。医師は、患者のＱＯＬと生命予後をより良く保つために、手術療法の適用時期と術式についての適切な判断が求められる。【０００４】
近年、ＤＮＡのメチル化の異常が、がん化に深く関与することが明らかになり、注目を集めている。癌細胞における特徴的なエピジェネティック異常として、一部の遺伝子プロモーター領域におけるＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化が知られている。ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域であり、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。ＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化の異常は、がん抑制遺伝子の不活化などを通じて発がんに関与する。大腸癌、胃癌、腎細胞癌等において、臨床病理学的因子と相関したＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化亢進が報告されている（非特許文献１〜４、特許文献１〜４）。尿路上皮癌について、臨床試料のＤＮＡメチル化率測定による尿路上皮がんの発生リスク予測等について報告されている（非特許文献５）。さらに、尿路上皮癌症例から得られた非癌尿路上皮が正常尿路上皮と異なるＤＮＡメチル化プロファイルを示すことが報告され、ＤＮＡメチル化異常が尿路上皮癌の時間的及び空間的多発性に寄与していることが示唆されている（非特許文献６）。また、必ずしも尿路上皮癌の時間的及び空間的多発性に着目したものではないが、ホメオティック遺伝子ＨＯＸ遺伝子群、転写因子をコードするＴＢＸ２・ＧＡＴＡ２、受容体型チロシンキナーゼＦＧＦＲ３、ヒストンメチル化酵素ＥＺＨ２のＤＮＡメチル化尤進や、反復配列ＬＩＮＥ−１のＤＮＡメチル化減弱等と尿路上皮癌との関連が報告されている（非特許文献７）。【０００５】
メチル化ＤＮＡの解析方法として、バイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）法を利用する方法が既に確立され、汎用されている。バイサルファイト法を基本原理とするメチル化ＤＮＡ解析方法としては、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法、ＢＡＣアレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法（ＢＡＭＣＡ法）がよく利用されている。特許文献１には、ＢＡＭＣＡ法により特定の遺伝子のＣｐＧサイトにおけるメチル化レベルを検出することによって、尿路上皮癌の発生リスク及び予後不良リスク等を検出する方法が開示されている。しかしながら、当該方法では、ＢＡＣクローン上の多数のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率の平均量を、ＢＡＣ全体のハイブリダイゼーションによって測定しており、診断精度の高いＣｐＧサイトが不明である上、測定方法が煩雑で医療実装困難であった。特許文献２には、ビーズアレイ法、質量分析（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法）、パイロシークエンシング、メチル化感受性高解像能融解曲線分析、定量ＰＣＲ、バイサルファイト処理物の直接シークエンシング、ＣＯＢＲＡ法などにより特定の遺伝子のＣｐＧサイトにおけるメチル化レベルを検出することによって、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法が開示されている。特許文献３、４には、特定の遺伝子のＣｐＧサイトにおけるメチル化レベルをイオン交換クロマトグラフィーによる保持時間の違いに基づいて検出することによって、癌の予後を判定する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２０７１６２号公報
【特許文献２】国際公開公報第２０１３／１６８６４４号
【特許文献３】国際公開公報第２０１５／１２９９１６号
【特許文献４】国際公開公報第２０１７／０３８９８３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４，９８８−９９３（２００４）
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，８６８１−８６８６（１９９９）
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４，１８６５４−１８６５９（２００７）
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９，５４３８−５４４２（１９９９）
【非特許文献５】Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１０１（１），２３１−２４０（２０１０）
【非特許文献６】病理と臨床，３５（９），８５２−８５７（２０１７）
【非特許文献７】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２３８．，１８３−２１５（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＤＮＡのメチル化レベルを基準に尿路上皮癌のリスクを判定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、尿路上皮癌患者の尿路上皮組織において正常組織と比べてより高度にメチル化している遺伝子を同定した。さらに、これらの遺伝子のＤＮＡメチル化レベルを測定することで、尿路上皮癌の発症リスクを判定できることを見出した。【００１０】
したがって、本発明は、以下を提供する。
〔１〕尿路上皮組織の癌化リスクの判定方法であって、
尿路上皮細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
検出したＤＮＡメチル化レベルから、該尿路上皮組織の癌化リスクを判定すること、
を含む方法。
〔２〕前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、バイサルファイト処理された前記ゲノムＤＮＡを用いて、前記少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することを含む、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、パイロシークエンシング法、質量分析、ビーズアレイ法又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる、〔２〕記載の方法。
〔４〕前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが、配列番号２で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが、配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７に基づいて、前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが第４染色体の１８３，７１０，４７３位、１８３，７１０，４５５位、１８３，７１０，４４１位、１８３，７１０，３４９位、１８３，７１０，３４４位、１８３，７１０，３１８位、及び１８３，７１０，３１１位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが第１２染色体の５４，４３８，４１９位、及び５４，４３８，４２６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが第４染色体の３８，８０７，２５９位であり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが第７染色体の２９，１８７，０１９位であり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが第１染色体の３，０７８，０１３位である、
〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕少なくとも１２塩基の鎖長を有し、かつ、バイサルファイト処理された後の、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子に含まれるＣｐＧサイトにハイブリダイズする、尿路上皮癌のリスク判定のためのプライマー又はプローブ。
〔７〕前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが、配列番号２で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが、配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
〔６〕記載のプライマー又はプローブ。
〔８〕ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７に基づいて、前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが第４染色体の１８３，７１０，４７３位、１８３，７１０，４５５位、１８３，７１０，４４１位、１８３，７１０，３４９位、１８３，７１０，３４４位、１８３，７１０，３１８位、及び１８３，７１０，３１１位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが第１２染色体の５４，４３８，４１９位、及び５４，４３８，４２６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが第４染色体の３８，８０７，２５９位であり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが第７染色体の２９，１８７，０１９位であり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが第１染色体の３，０７８，０１３位である、
〔６〕記載のプライマー又はプローブ。
〔９〕配列番号６〜１５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及びその相補鎖からなる群より選択される、〔６〕〜〔８〕のいずれか１項記載のプライマー又はプローブ。
〔１０〕配列番号６及び７で示されるポリヌクレオチド、配列番号８及び９のポリヌクレオチド、配列番号１０及び１１のポリヌクレオチド、配列番号１２及び１３のポリヌクレオチド、配列番号１４及び１５のポリヌクレオチド、又はそれらの相補鎖の組み合わせからなるプライマーセットである、〔９〕記載のプライマー又はプローブ。
〔１１〕被験体における尿路上皮癌のリスクの判定方法であって、
被験体の尿路上皮細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
検出したＤＮＡメチル化レベルから、該被験体における尿路上皮癌のリスクを判定すること、
を含む方法。
〔１２〕前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、バイサルファイト処理された前記ゲノムＤＮＡを用いて、前記少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することを含む、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕前記ＤＮＡメチル化レベルの検出が、パイロシークエンシング法、質量分析、ビーズアレイ法又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる、〔１２〕記載の方法。
〔１４〕前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが、配列番号２で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが、配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが、配列番号４で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトであり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが、配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、
〔１１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の方法。
〔１５〕ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７に基づいて、前記ＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトが第４染色体の１８３，７１０，４７３位、１８３，７１０，４５５位、１８３，７１０，４４１位、１８３，７１０，３４９位、１８３，７１０，３４４位、１８３，７１０，３１８位、及び１８３，７１０，３１１位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトが第１２染色体の５４，４３８，４１９位、及び５４，４３８，４２６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり、
前記ＴＬＲ１のＣｐＧサイトが第４染色体の３８，８０７，２５９位であり、
前記ＣＰＶＬのＣｐＧサイトが第７染色体の２９，１８７，０１９位であり、
前記ＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトが第１染色体の３，０７８，０１３位である、
〔１１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、簡便かつ高い感度及び特異性で、尿路上皮癌のリスクを判定することができる。本発明は、検診受診者等において将来の尿路上皮癌発生を防ぐための生活習慣改善等の予防介入の指針を与え、または実際に発症した場合の早期診断を可能にし、さらには患者のＱＯＬ及び生存率の向上に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＤＮＡメチル化レベルの変化を解析するための、インフィニウム（登録商標）アッセイにおける２，７５０プローブを用いた主成分分析。（Ｃ）：正常組織由来の検体（ｎ＝２６）、（Ｎ）：尿路上皮癌患者の非癌組織由来の検体（ｎ＝４７）、（Ｔ）：尿路上皮癌組織由来の検体（ｎ＝４６）。
【図２】正常組織（Ｃ）及び尿路上皮癌患者の非癌組織（Ｎ）における診断閾値を満たしたＣｐＧサイト数のヒストグラム。
【図３】インフィニウム（登録商標）アッセイとパイロシークエンシング又はＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）間でのＤＮＡメチル化レベル検出値の相関。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、「尿路上皮癌」とは、腎盂、尿管、尿道を含む尿路の上皮細胞に発生する癌をいう。尿路上皮癌は異時性又は同時性に多発するため、本明細書における「尿路上皮癌」とは、原発癌、及び組織内で転移した癌を含む。また、本明細書において、「被験体」としては、ヒト、例えば、尿路上皮癌のリスクの判定を必要とする者（例えば検診受診者）、尿路上皮癌に罹患した疑いのある患者などが挙げられる。
【００１４】
本明細書において、「癌のリスク」とは、癌を発症しているか、又は将来発症するリスクをいう。また本明細書において、「組織の癌化リスク」とは、組織が癌を有しているか、又は将来有するリスクをいう。該「組織」としては、以前に癌が観察されたことのない組織、及び癌を有する疑いのある組織が挙げられる。
【００１５】
本明細書において、「ＣｐＧサイト」とは、ＤＮＡ中でシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味する。ＣｐＧサイトが高頻度で出現する領域は、ＣｐＧアイランドと呼ばれる。ＣｐＧアイランドは、遺伝子のコード領域に近い位置、例えばプロモーター領域に存在することが多く、したがって遺伝子のＣｐＧサイトは、該遺伝子のコード領域に近い位置に存在するＣｐＧアイランド、又は該遺伝子のプロモーター領域に多く存在する。本明細書において、「（ある）遺伝子のＣｐＧサイト」とは、別途定義されない場合、好ましくは該遺伝子のコード領域に近い位置に存在するＣｐＧアイランドに含まれるＣｐＧサイトを意味し、より好ましくは該遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧサイトを意味する。
【００１６】
本明細書において、「ＤＮＡメチル化」とは、ＤＮＡにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。また本明細書において、あるＣｐＧサイトの「ＤＮＡメチル化レベル」とは、該ＣｐＧサイトにおいてＤＮＡがメチル化されている割合を意味する。本明細書において、ＤＮＡメチル化レベルが高い及び低いとは、それぞれ、ＤＮＡがメチル化されている割合が高いこと及び低いことを意味する。
【００１７】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも９５％の同一性」とは、９５％以上の同一性、好ましくは９６％以上の同一性、より好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１８】
本発明は、尿路上皮組織の癌化リスクの判定方法であって、
被験体の尿路上皮細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
検出したＤＮＡメチル化レベルから、該尿路上皮組織の癌化リスクを判定すること、
を含む方法、を提供する。
また本発明は、被験体における尿路上皮癌のリスクの判定方法であって、
被験体の尿路上皮細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡにおける、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すること、及び、
検出したＤＮＡメチル化レベルから、該被験体における尿路上皮癌のリスクを判定すること、
を含む方法、を提供する。
【００１９】
本発明の方法において用いられる尿路上皮細胞又はそれを含む組織由来のゲノムＤＮＡとしては、尿路上皮細胞又はそれを含む組織から調製されたゲノムＤＮＡ、尿中の尿路上皮細胞由来ＤＮＡ又はセルフリーＤＮＡ、などが挙げられる。該尿路上皮細胞又はそれを含む組織としては、例えば、外科手術や生検において採取した新鮮尿路上皮組織、採取後凍結した凍結尿路上皮組織、採取後ホルマリン固定及びパラフィン包埋を施した尿路上皮組織、尿から濃縮した尿路上皮細胞などが挙げられる。このうち、組織中のゲノムＤＮＡの分解等を抑制し、より効率よくＤＮＡメチル化レベルの検出を行えるという観点からは、凍結尿路上皮組織が好ましい。
【００２０】
尿路上皮組織又は尿路上皮細胞からサンプルＤＮＡを調製する手法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ＤＮＡを調製する公知の方法としては、フェノールクロロホルム法、又は市販のＤＮＡ抽出キット、例えば後述するＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、Ｃｌｅａｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、ＺＲ  Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴｒｉｍＧｅｎ社製）、を用いるＤＮＡ抽出方法などが挙げられる。尿中の尿路上皮細胞由来ＤＮＡ又はセルフリーＤＮＡもまた、市販の尿中の細胞由来ＤＮＡ又はセルフリーＤＮＡ精製用キットを用いて調製することができる。
【００２１】
好ましくは、調製されたゲノムＤＮＡは、バイサルファイト処理される。ＤＮＡのバイサルファイト処理の方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。バイサルファイト処理のための公知の方法としては、例えば、後述するＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（４８）（Ｑｉａｇｅｎ社製）や、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｐｔｙ社製）、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｐＧ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｔｕｒｂｏ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）などの市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【００２２】
さらに、前記バイサルファイト処理されたＤＮＡを増幅することが好ましい。増幅の手法には特に制限はないが、好ましくはＰＣＲが利用される。増幅の手法及び条件は、増幅対象のＤＮＡの配列、長さ、量などに応じて、公知の手法及び条件を適宜選択して用いることができる。
【００２３】
後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、５つの遺伝子（ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６）のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルが、正常尿路上皮組織と、尿路上皮癌患者由来の尿路上皮組織とで異なることを明らかにした。したがって、本発明の方法においてＤＮＡメチル化レベルを検出する対象となるＣｐＧサイトは、該５遺伝子（すなわち、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６）からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトである。好ましくは、本発明の方法においてＤＮＡメチル化レベルを検出する対象となるＣｐＧサイトは、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１及びＣＰＶＬからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトである。
【００２４】
したがって、前述したようにバイサルファイト処理されたＤＮＡをＰＣＲ等で増幅する場合、該５遺伝子、好ましくはＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１及びＣＰＶＬからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧサイトを含む領域が増幅される。好ましくは、該５遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧアイランド又はプロモーター領域の一部又は全部を含むＤＮＡ領域が増幅される。より好ましくは、ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１及びＣＰＶＬからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のＣｐＧアイランド又はプロモーター領域の一部又は全部を含むＤＮＡ領域が増幅される。さらに好ましくは、配列番号１〜５のいずれかで示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ領域が増幅される。さらに好ましくは配列番号１〜４のいずれかで示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ領域が増幅される。
【００２５】
ＴＥＮＭ３はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１０７３９４６で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＨＯＸＣ４はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿７０５８９７で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＴＬＲ１はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００３２５４で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＣＰＶＬはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１３３４９８１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＰＲＤＭ１６はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０７１３９７で特定されるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２６】
好ましくは、本発明で用いられるＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである。好ましくは、本発明で用いられるＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトは、第４染色体の１８３，７１０，４７３位、１８３，７１０，４５５位、１８３，７１０，４４１位、１８３，７１０，３４９位、１８３，７１０，３４４位、１８３，７１０，３１８位、及び１８３，７１０，３１１位からなる群より選択される少なくとも１つの位置に存在するＣｐＧサイトである。
【００２７】
好ましくは、本発明で用いられるＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトは、配列番号２で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである。好ましくは、本発明で用いられるＨＯＸＣ４のＣｐＧサイトは、第１２染色体の５４，４３８，４１９位、及び５４，４３８，４２６位に存在する。
【００２８】
好ましくは、本発明で用いられるＴＬＲ１のＣｐＧサイトは、配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである。好ましくは、本発明で用いられるＴＬＲ１のＣｐＧサイトは、第４染色体の３８，８０７，２５９位に存在する。
【００２９】
好ましくは、本発明で用いられるＣＰＶＬのＣｐＧサイトは、配列番号４で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである。好ましくは、本発明で用いられるＣＰＶＬのＣｐＧサイトは、第７染色体の２９，１８７，０１９位に存在する。
【００３０】
好ましくは、本発明で用いられるＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトは、配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである。好ましくは、本発明で用いられるＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトは、第１染色体の３，０７８，０１３位に存在する。
【００３１】
本明細書において、ＣｐＧサイトの染色体上の位置は、基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７上の位置を基準にして表されている。本発明で用いられる好ましいＣｐＧサイトを表１に記載する。
【００３２】
【表１】
2019181941.tif 000002
【００３３】
本発明の方法において、ＤＮＡメチル化レベルを検出するＣｐＧサイトは、好ましくは表１に記載の染色体上の位置に存在するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つである。より好ましくは、本発明の方法においてＤＮＡメチル化レベルを検出するＣｐＧサイトは、第４染色体の１８３，７１０，４７３位、１８３，７１０，４５５位、１８３，７１０，４４１位、１８３，７１０，３４９位、１８３，７１０，３４４位、１８３，７１０，３１８位、及び１８３，７１０，３１１位（以上、ＴＥＮＭ３の遺伝子領域）、第１２染色体の５４，４３８，４１９位、及び５４，４３８，４２６位（以上、ＨＯＸＣ４の遺伝子領域）、第４染色体の３８，８０７，２５９位（以上、ＴＬＲ１の遺伝子領域）、ならびに第７染色体の２９，１８７，０１９位（以上、ＣＰＶＬの遺伝子領域）に存在するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つである。
【００３４】
ＤＮＡメチル化レベルの検出の感度又は特異性をより向上させることができるという観点からは、前述したＣｐＧサイトを組み合わせて検出対象としてよい。該組み合わせの好ましい例としては、表１に示すＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトのいずれか１つ以上と、表１に示す他のＣｐＧサイトのいずれか１つ以上との組み合わせ、表１に示すＴＥＮＭ３のＣｐＧサイトのいずれか２つ以上の組み合わせ、などが挙げられる。該組み合わせのより好ましい例としては、下記表２に記載のＣｐＧサイトの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つが挙げられる。
【００３５】
【表２】
2019181941.tif 000003
【００３６】
本発明の方法において、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する手法としては、所与のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを定量できる手法であればよく、公知の手法を適宜選択することができる。かかる公知の手法としては、例えば以下に示す第１〜第８の手法が挙げられる。
【００３７】
第１の手法は、３’末端にメチル化シトシン又は非メチル化シトシンに相補的な塩基を有するように構築されたプローブを用いた１塩基伸長反応を利用して、ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡのメチル化を定量する方法である。例えば、第１の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。なお、このバイサルファイト処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、メチル化シトシン残基は変換されない（Ｃｌａｒｋ  ＳＪら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９４年、２２巻、２９９０〜７頁参照）。次いで、このようにバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、全ゲノム増幅を行い、酵素による断片化（通常３００〜６００ｂｐ程度の断片化）を行い、一本鎖に解離させる。
【００３８】
第１の手法では、バイサルファイト処理によって変換されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、該プローブの３’末端の塩基が、前記ＣｐＧサイトのシトシンに相補的な塩基であるプローブを調製する。すなわち、該ＣｐＧサイトがメチル化されている場合には、プローブの３’末端の塩基はグアニンとなり、該ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合には、プローブの３’末端の塩基はアデニンとなる。
【００３９】
そして、このような前記ＣｐＧサイトに相補的な３’末端の塩基のみが異なる２種類のプローブと、前記一本鎖ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、蛍光標識した塩基存在下、１塩基伸長反応を行う。その結果、該一本鎖断片のＣｐＧサイトがメチル化されている場合、３’末端の塩基がグアニンであるプローブ（メチル化検出用プローブ）には１塩基伸長反応により蛍光標識した塩基が取り込まれるが、３’末端の塩基がアデニンであるプローブ（非メチル化検出用プローブ）には、３’末端の塩基のミスマッチのため１塩基伸長反応が起こらず、蛍光標識した塩基は取り込まれない。一方、該一本鎖断片のＣｐＧサイトがメチル化されていない場合、非メチル化検出用プローブには蛍光標識した塩基が取り込まれるが、メチル化検出用プローブには蛍光標識した塩基は取り込まれない。したがって、メチル化検出用プローブ及び／又は非メチル化検出用プローブが発する蛍光の強度からＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。
【００４０】
また、かかる第１の手法においては、別の態様として、前記メチル化検出用プローブ及び非メチル化検出用プローブの代わりに、バイサルファイト処理によって変換されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、該プローブの３’末端の塩基が前記ＣｐＧサイトのグアニンに相補的な塩基となっているプローブを用いてもよい。そして、かかるプローブと、前記一本鎖ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、蛍光物質にて標識したグアニン及び／又は該蛍光物質とは異なる蛍光色素にて標識したアデニンの存在下、１塩基伸長反応を行う。その結果、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合には、当該プローブに蛍光標識したグアニンが取り込まれることになり、一方、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合には、当該プローブに蛍光標識したアデニンが取り込まれることになるため、前記プローブに取り込まれた各蛍光物質が発する蛍光の強度からＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。
【００４１】
かかる第１の手法の好ましい例としては、例えば、ビーズアレイ法（例えば、インフィニウム（登録商標）アッセイ）が挙げられる。
【００４２】
第２の手法は、質量分析によりメチル化ＤＮＡを定量する方法である。例えば、第２の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記ＣｐＧサイトを少なくとも一つ含むＤＮＡを、Ｔ７プロモーターを付加したプライマーで増幅する。次いで、増幅したＤＮＡをＲＮＡに転写し、ＲＮａｓｅにより塩基特異的な切断反応を行う。そして、かかる切断反応産物を質量分析計にかけ、質量測定を行う。
【００４３】
そして、質量測定によって得られたメチル化シトシン残基由来の質量（シトシンの質量）と、非メチル化シトシン残基由来の質量（ウラシルの質量）とを比較し、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００４４】
かかる第２の手法の好ましい例としては、例えば、質量分析計を用いたＤＮＡメチル化解析法（例えば、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）、Ｊｕｒｉｎｋｅ  Ｃら、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、２００５年、５７３巻、８３〜９５頁、及び後述の実施例２を参照）が挙げられる。
【００４５】
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）では、バイサルファイト処理後のＣｐＧサイトを含むＤＮＡを増幅し、ＲＮＡに転写した後、ＲＮＡａｓｅによりウラシルの部位で特異的に切断する。これにより、ＤＮＡのメチル化の有無に応じて長さの異なるＲＮＡ断片が生成される。得られたＲＮＡ断片を質量分析に欠けることで、ＣｐＧサイトがメチル化された断片と非メチル化断片とが分子量の差に従って分離され、検出される。該ＣｐＧサイトを含むＤＮＡの増幅のためのプライマーは、ＥｐｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ用プライマー設計ソフト）等を用いて設計することができる。ＲＮＡ断片の質量分析には、一塩基の質量の差異を検出できるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳ（例えば、ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４）が用いられる。メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片との質量の比から、ＤＮＡのメチル化レベルが算出される。
【００４６】
第３の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。なお、このバイサルファイト処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、下記伸長反応（シークエンス反応）においてはウラシルはチミンとして示される。次いで、このようにバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを少なくとも一つ含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。そして、前記ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。このようにして得られたメチル化シトシン残基由来の発光の強度（シトシンの発光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の発光の強度（チミンの発光強度）とを比較し、例えば、下記式によって前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベル（％）を算出する。
ＤＮＡメチル化レベル（％）＝シトシンの発光強度×１００／（シトシンの発光強度＋チミンの発光強度）。
【００４７】
第３の手法としては、例えば、パイロシークエンシング法（登録商標、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）１０：１０３−１１０参照）等が挙げられる。
【００４８】
第４の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドを増幅する。次いで、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出する。前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドの融解曲線を、メチル化・非メチル化対照検体を鋳型とする増幅産物の融解曲線と比較し、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００４９】
第４の手法としては、例えば、メチル化感受性高解像能融解曲線分析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ：ＭＳ−ＨＲＭ、Ｗｏｊｄａｃｚ  ＴＫら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．，２００８年、３巻、１９０３〜８ページ参照）が挙げられる。
【００５０】
第５の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合に増幅可能なプライマーセット、及び前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合に増幅可能なプライマーセットを調製する。そして、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドを、これらのプライマーセットを用いて各々増幅する。そして、得られた増幅産物の量、すなわちメチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量、及び非メチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量を比較することにより、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００５１】
さらに、かかる第５の手法においては別の態様として、先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドを有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドを有し、前記レポーター蛍光色素とは異なるレポーター蛍光色、及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡに前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズしたゲノムＤＮＡを鋳型として前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する。このようにして検出されたメチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度と、非メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００５２】
第５の手法としては、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を用いたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法等のメチル化特異的定量ＰＣＲ法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＭＳ−ＰＣＲ）  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ    ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）が挙げられる。
【００５３】
第６の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを鋳型として、直接シークエンシング反応を行う。そして、決定された塩基配列に基づく蛍光強度、すなわちメチル化シトシン残基由来の蛍光強度（シトシンの蛍光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の蛍光強度（チミンの蛍光強度）とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００５４】
さらに、かかる第６の手法においては別の態様として、先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドをＰＣＲ反応等によってクローニングする。そして、得られた複数のクローンニング産物の塩基配列を各々決定し、メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的な塩基配列を有するクローニング産物の個数と、非メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的な塩基配列を有するクローニング産物の個数とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００５５】
第６の手法としては、例えば、バイサルファイト直接シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、バイサルファイトクローニングシークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が挙げられる（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＬＳら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００９年、５５巻、１４７１〜８３ページ参照）。
【００５６】
第７の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを含む領域をＰＣＲにて増幅する。次いで、増幅したＤＮＡ断片を、該ＣｐＧサイトがメチル化されている場合とされていない場合とで配列が異なる箇所を認識する制限酵素で処理する。そして、電気泳動することによって分画された、メチル化ＣｐＧサイトに由来する制限酵素断片と非メチル化ＣｐＧサイトに由来する制限酵素断片とのバンドの濃さを定量的に解析することにより、該ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。
【００５７】
第７の手法としては、例えば、ＣＯＢＲＡ（バイサルファイトと制限酵素との併用による解析）が挙げられる。
【００５８】
第８の手法は、イオン交換クロマトグラフィーを用いる方法である。例えば、第８の手法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いでこれを断片化して、ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ断片を得る。得られたＤＮＡ断片を鋳型として、ＣｐＧサイトを含む領域をＰＣＲにて増幅する。次いで、増幅したＤＮＡ断片を、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、ＣｐＧサイトがメチル化されているＤＮＡとメチル化されていないＤＮＡとを分離する。
【００５９】
第８の手法において、ＰＣＲの増幅産物の鎖長は、ＰＣＲの増幅時間の短縮、ならびにイオン交換クロマトグラフィーでの分析時間の短縮や分離性能の維持等の要素を勘案して適宜選択することができる。例えば、ＣｐＧサイトが多いサンプルＤＮＡを用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、１０００ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、５００ｂｐ以下がさらに好ましい。一方、ＣｐＧサイトが少ないサンプルＤＮＡを用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイズを避けられる１５ｍｅｒ付近のプライマーを使用する場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長である３０〜４０ｂｐが下限となる。一方で、ＣｐＧサイトの含有率がリッチになるようにプライマーを設計するのが好ましい。例えば、ＣｐＧサイトのシトシンが、ＰＣＲ増幅産物の鎖長に対して２％以上含まれるのが好ましく、５％以上含まれるのがより好ましい。
【００６０】
第８の手法では、非メチル化シトシン残基は、ゲノムＤＮＡのバイサルファイト処理によってウラシルに変換された後、ＰＣＲによりさらにチミンへと変換される。一方、メチル化シトシン残基は、バイサルファイト処理及びＰＣＲの後にもシトシンのままである。この塩基の違いにより、メチル化シトシンを含む断片（メチル化断片）と非メチル化断片は、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、保持時間が異なる別個のピークとして検出される。すなわち、メチル化断片は、非メチル化断片と比べて、より保持時間が短いピークとして検出される。したがって、イオン交換クロマトグラフィーでのピークの保持時間に基づいて、ＣｐＧサイトのＤＮＡがメチル化しているか否かを判定することができる。さらに、イオン交換クロマトグラフィーにかけるＤＮＡに複数のＣｐＧサイトが含まれている場合、より多数のＣｐＧサイトがメチル化されているほど、ピークの保持時間はより短くなる。したがって、該ピークの保持時間に基づいて、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。あるいは、該ピークの面積又は高さに基づいて、メチル化断片及び非メチル化断片それぞれの存在量や存在比率を算出することも可能である。
【００６１】
好ましくは、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルが既知のサンプル（対照）と比較するか、又はＤＮＡメチル化レベルが既知のサンプルを用いて予め作成した検量線を用いることによって、ＣｐＧサイトのＤＮＡがメチル化しているか否か、又はＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを判定する。あるいは、ＤＮＡメチル化レベルが既知のサンプルを用いて、ＣｐＧサイトが高度にメチル化されているメチル化断片のピークの保持時間とメチル化レベルの低い断片のピークの保持時間とを分ける基準となる保持時間（本明細書において基準保持時間ともいう）を予め決定しておく。例えば、基準保持時間より早い保持時間で検出された断片は、高度にメチル化されたＤＮＡと判定される。
【００６２】
第８の手法で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、好ましくはアニオン交換クロマトグラフィーである。カラムの充填剤としては、表面に強カチオン性基を有する基材粒子であれば特に限定されないが、国際公開公報第２０１２／１０８５１６号に示される、充填剤表面に強カチオン性基と弱カチオン性基の両方を有する基材粒子が好ましい。より好ましくは、該基材粒子は、強カチオン性基（好ましくは４級アンモニウム塩）を有する親水性重合体の層が疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されている被覆重合体粒子と、該被覆重合体粒子表面に導入された弱カチオン性基（好ましくは３級アミノ基）とを含む基材粒子である。クロマトグラフィー分析の際のカラム温度は、好ましくは３０℃以上９０℃未満である。
【００６３】
以上、本発明において「ＤＮＡメチル化レベルを検出する手法」として好適に用いることのできる手法を例示したが、手法はこれに限定されるものではない。前記第１〜第８の手法では、前述のとおり、尿路上皮組織から調製されたゲノムＤＮＡは、さらにバイサルファイト処理に供される。したがって、本発明の方法においてＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルの検出に用いられるゲノムＤＮＡは、好ましくは、尿路上皮細胞組織又はそれを含む組織由来の、バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡである。
【００６４】
本発明の方法においては、検出したＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルから、被験尿路上皮組織の癌化リスク、又は被験体の尿路上皮癌のリスクが判定される。好ましくは、該被験尿路上皮組織の癌化リスクが高いか否か、又は該被験体が尿路上皮癌のリスクが高いか否かが判定される。より好ましくは、該被験尿路上皮組織が将来尿路上皮癌を保有するリスクが高いか否か、又は該被験体が将来尿路上皮癌を発症するリスクが高いか否かが判定される。リスク判定のための具体的な指標は、当業者であれば、ＤＮＡメチル化レベルを検出する手法に合わせて適宜設定することができる。
【００６５】
リスク判定の手順の実施形態について以下に述べる。第一の実施形態においては、まず各ＤＮＡメチル化レベル検出手法について、各々のＣｐＧサイトに対し受信者操作特性（ＲＯＣ）解析を行い、感度（陽性率）及び特異度（陰性率）を求め、感度及び特異度の和が最大となるＤＮＡメチル化レベルを指標（カットオフ値）として設定する。
【００６６】
前記第一の実施形態においては、尿路上皮組織の癌化によってメチル化レベルが亢進するＣｐＧサイト（例えば、表１に示すＴＥＮＭ３のＣｐＧサイト）については、本発明の方法で検出されたＤＮＡメチル化レベルがカットオフ値より高い場合、ＤＮＡメチル化レベルは診断閾値を超えたと判断され、被験組織又は被験体は高リスク群に分類されるが、検出されたメチル化レベルが該カットオフ値以下であれば、その被験組織又は被験体は高リスク群ではないと分類される。一方、尿路上皮組織の癌化によってメチル化レベルが低減するＣｐＧサイト（例えば、表１に示すＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイト）については、本発明の方法で検出されたＤＮＡメチル化レベルがカットオフ値より低い場合、ＤＮＡメチル化レベルは診断閾値を超えたと判断され、被験組織又は被験体は高リスク群に分類されるが、検出されたメチル化レベルが該カットオフ値以上であれば、その被験組織又は被験体は高リスク群ではないと分類される。
【００６７】
前記第一の実施形態において、複数のＣｐＧサイトのメチル化レベルが検出される場合は、ＤＮＡメチル化レベルが前記診断閾値を超えたＣｐＧサイトの数又は割合を、リスク判定のための指標とすることができる。例えば、調べた全てのＣｐＧサイトのメチル化レベルがいずれも診断閾値を超えた場合に、被験組織又は被験体を高リスク群に分類することができる。あるいは、調べたＣｐＧサイトのうちの一定割合以上でメチル化レベルが診断閾値を超えた場合に、被験組織又は被験体を高リスク群に分類することができる。あるいは、一定数以上のＣｐＧサイトのメチル化レベルが診断閾値を超えた場合に、被験組織又は被験体を高リスク群に分類することができる。一方、これらの基準を満たさなかった被験組織又は被験体は、高リスク群ではないと分類することができる。
【００６８】
リスク判定の手順の第二の実施形態においては、被験組織又は被験体由来の標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（サンプル）についてのイオン交換クロマトグラフィー解析（前記第８の手法）で得られたピークの保持時間を、メチル化していない該標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（陰性対照）又はメチル化した該標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（陽性対照）についての保持時間と比較することによって、該ＣｐＧサイトのメチル化レベルの決定又は尿路上皮癌のリスク判定を行う。
【００６９】
前記第二の実施形態においては、尿路上皮組織の癌化によってメチル化レベルが亢進するＣｐＧサイト（例えば、表１に示すＴＥＮＭ３のＣｐＧサイト）については、陰性対照のピークよりも短い保持時間のピークがサンプルから検出された場合、サンプルはメチル化されていると判定され、又は被験組織又は被験体が高リスク群に分類される。あるいは、陽性対照と同等の保持時間のピークがサンプルから検出された場合、サンプルはメチル化されていると判定され、又は被験組織又は被験体が高リスク群に分類される。一方、尿路上皮組織の癌化によってメチル化レベルが低減するＣｐＧサイト（例えば、表１に示すＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイト）については、陽性対照のピークよりも長い保持時間のピークがサンプルから検出された場合、サンプルはメチル化されていないと判定され、又は被験組織又は被験体が高リスク群に分類される。あるいは、陰性対照と同等の保持時間のピークがサンプルから検出された場合、サンプルはメチル化されていないと判定され、又は被験組織又は被験体が高リスク群に分類される。
【００７０】
このように、本発明によれば、異形成等の組織学的に明らかな前癌病変等を生ずるより先に、簡便な手法で尿路上皮癌のリスクを判定することができる。また本発明によれば、組織学的観察等の熟練を要する検査を行う必要なく、被験体の尿路上皮癌のリスクを判定することができる。本発明の方法により尿路上皮癌の発生の高リスク群患者を早期に発見することができれば、予防的に介入を行って尿路上皮癌の発生を回避したり、早期の治療により彼らの生命予後を改善することができる。あるいは、本発明の方法により尿路上皮癌の発生のリスクの高くない患者を選別することができれば、検診受診回数などを減らして、ＱＯＬを改善することができる。
【００７１】
したがって、本発明はまた、前記本発明の方法により尿路上皮癌の高リスク群に分類された被験体に予防介入することに関する。これにより、該高リスク群の被験体における尿路上皮癌の予防、早期診断、又は早期治療を可能にする。さらに本発明は、前記本発明の方法により尿路上皮癌と判定された被験体を治療することを含む、尿路上皮癌の治療方法を提供する。治療の手段としては、外科手術、薬物や放射線等による化学療法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００７２】
さらに本発明は、尿路上皮組織の癌化リスク、又は被験体の尿路上皮癌のリスクの判定のためのプライマー又はプローブを提供する。該プライマー又はプローブは、少なくとも１２塩基の鎖長を有し、かつ、バイサルファイト処理された後の、５遺伝子（ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６）からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子に含まれる少なくとも１つのＣｐＧサイトにハイブリダイズする。好ましくは、該プライマー又はプローブは、該５遺伝子（ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６）のいずれか１つにおける少なくとも１つのＣｐＧサイトにハイブリダイズする。ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６のＣｐＧサイトの例は、前記表１に示したとおりである。
【００７３】
本発明のプライマー又はプローブの一例は、配列番号１〜５のいずれかで示される領域、好ましくは配列番号１〜４のいずれかで示される領域に含まれる少なくとも１つのＣｐＧサイトにハイブリダイズするプライマー又はプローブである。本発明のプライマーの別の一例は、配列番号１〜５のいずれかで示される領域、より好ましくは配列番号１〜４のいずれかで示される領域を増幅するプライマーである。
【００７４】
本発明のプライマー又はプローブの好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記５遺伝子のＤＮＡの断片における前記ＣｐＧサイトを含む領域にハイブリダイズし、かつその３’末端にメチル化シトシン又は非メチル化シトシンに相補的な塩基を有するように構築されたプライマー又はプローブである（例えば前述した第１の手法に用いることができるプライマー又はプローブ）。
【００７５】
本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記５遺伝子のＤＮＡの断片における前記ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行うことができるプライマー（シークエンシングプライマー）である（例えば前述した第３の手法に用いることができるプライマー又はプローブ）。別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記５遺伝子のＤＮＡの断片における前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドにハイブリダイズするプローブである（例えば前述した第４の手法に用いることができるプライマー又はプローブ）。
【００７６】
本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記５遺伝子のＤＮＡの断片における、メチル化された又はメチル化されていない前記ＣｐＧサイトを含む領域を特異的に増幅可能なプライマーセットである（例えば前述した第５の手法もしくは第８の手法におけるＰＣＲ増幅に用いることができるプライマーセット）。
【００７７】
本発明のプライマー又はプローブの鎖長は少なくとも１２塩基であればよいが、好ましくは少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基、さらに好ましくは１５〜４０塩基である。また本発明のプライマー又はプローブは、標識（例えば蛍光標識）されていてもよい。また本発明のプライマー又はプローブは、好ましくは、前記第１〜第８の手法のいずれかに用いることができるプライマー又はプローブである。また本発明のプライマーは、好ましくはＰＣＲプライマーである。
【００７８】
本発明のプライマー又はプローブのより好ましい例としては、配列番号６〜１５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及びその相補鎖が挙げられる。さらに好ましい例としては、配列番号６及び７で示されるポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖の組み合わせ、配列番号８及び９で示されるポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖の組み合わせ、配列番号１０及び１１で示されるポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖の組み合わせ、配列番号１２及び１３で示されるポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖の組み合わせ、あるいは配列番号１４及び１５で示されるポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖の組み合わせからなるプライマーセットが挙げられる。
【００７９】
さらに、本発明は、前記本発明のプライマー又はプローブを含む、尿路上皮組織の癌化リスク、又は被験体の尿路上皮癌のリスクの判定のためのキットを提供する。好ましくは、本発明のキットは、前記第１〜第８の手法のいずれかによる尿路上皮組織の癌化リスク又は被験体の尿路上皮癌のリスクの判定のために用いられる。
【００８０】
本発明のキットは、前記本発明のプライマー又はプローブ以外の成分を含むことができる。このような成分の例としては、バイサルファイト処理に必要な試薬（例えば、亜硫酸水素ナトリウム溶液等）、ＰＣＲ反応に必要な試薬（例えば、デオキシリボヌクレオチドや耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等）、インフィニウム（登録商標）アッセイに必要な試薬（例えば、蛍光物質にて標識されたヌクレオチド）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）に必要な試薬（例えば、塩基特異的な切断反応を行うためのＲＮａｓｅ）、パイロシークエンシングに必要な試薬（例えば、ピロリン酸の検出のためのＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン−５’−ホスホ硫酸、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、一本鎖ＤＮＡを分離するためのストレプトアビジン等）、ＭＳ−ＨＲＭ法に必要な試薬（例えば、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーター等）、標識の検出に必要な試薬（例えば基質や酵素）、陽性対照や陰性対照サンプル、試料（組織由来のゲノムＤＮＡ等）の希釈や洗浄に用いる緩衝液等などが挙げられる。また、キットには、その使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８２】
〔患者及び組織サンプル〕
尿路上皮癌症例より得られた非がん尿路上皮組織（Ｎ）（ｎ＝４７）及び尿路上皮癌組織（Ｔ）（ｎ＝４６）、ならびに非尿路上皮がん症例から得られた正常尿路上皮組織（Ｃ）（ｎ＝２６）をサンプルに用いた。組織サンプルは、国立がん研究センター病院にて外科手術を受けた患者から得られた。全ての患者からは、書面によるインフォームドコンセントを得た。また、本実施例の全ての研究は、国立がん研究センターの倫理委員会の承認を受けて実施された。【００８３】
採取した組織は凍結保存された。得られた新鮮凍結組織サンプルを、フェノール−クロロホルムにて処理し、次いで透析を施すことによって、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ５００ｎｇを、ＥＺ  ＤＮＡメチレーション−ゴールド（ＴＭ）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、バイサルファイト処理した。【００８４】
〔実施例１  癌化組織におけるＣｐＧサイトのメチル化の検出〕
（インフィニウム（登録商標）アッセイ）
４８５，７６４のＣｐＧ部位におけるＤＮＡメチル化状態を、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ  Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、１ＣｐＧサイトの解像度にて解析した。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ  Ｂｅａｄ  Ｃｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）は、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子の９９％、ＣｐＧアイランドの９６％をカバーするとされている。より詳細には、包括的にＤＮＡメチル化状態を解析することを目的として、プロモーター領域、５’非翻訳領域、第１エクソン、遺伝子内、３’非翻訳領域を解析対象に含み、９９％の参照配列遺伝子を網羅しているとされる。【００８５】
バイサルファイト処理したＤＮＡに対し、インフィニウム（登録商標）アッセイキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて全ゲノム増幅処理を行った（Ｂｉｂｉｋｏｖａ，Ｍ．ら、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００９年、１巻、１７７〜２００頁参照）。増幅したＤＮＡ断片を、前記チップ上のプローブとハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしたＤＮＡに対し、１塩基伸長反応にて蛍光標識した塩基を取り込ませた。これにより、メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズしたメチル化検出用プローブ、及び非メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡ断片とハイブリダイズした非メチル化検出用プローブのそれぞれを蛍光標識した。次いで、製造会社のプロトコールに従って、ｉＳｃａｎ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて蛍光シグナルを測定した。得られたデータは、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて解析した。【００８６】
（ＤＮＡメチル化レベルの算出）
各ＣｐＧサイトにおいて、メチル化検出用プローブ及び非メチル化検出用プローブからのシグナルの合計に対する、メチル化検出用プローブからのシグナルの相対比を算出した。すなわち、各ＣｐＧサイトからのメチル化レベルは、所謂β値（範囲：０．００〜１．００）として表された。【００８７】
（統計解析）
得られたメチル化レベルのデータについて、Ｗｅｌｃｈ  ｔ検定を行い、（Ｃ）サンプルと比較して（Ｎ）サンプルで有意なメチル化異常を示すＣｐＧサイトを同定した。次に、ヨンクヒールタプストラ傾向性検定により、（Ｃ）、（Ｎ）、（Ｔ）と段階的にＤＮＡメチル化レベルが変化するＣｐＧサイトを同定した。その結果、両検定ともに有意なＣｐＧサイトが２，７５０個見出された。これらのサイトにおけるＤＮＡメチル化異常は、正常組織（Ｃ）と比較して尿路上皮癌患者の非癌組織（Ｎ）で有意に多く発生し、癌組織（Ｔ）でさらに頻度が増加することから、尿路上皮組織の癌化に寄与すると考えられた。【００８８】
（主成分分析）
前記２，７５０個のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベル（β値）について主成分分析を行った。その結果、（Ｃ）、（Ｎ）、（Ｔ）が明らかに異なる分布を示したことから（図１）、（Ｎ）が既にＤＮＡメチル化異常を伴った前癌段階であることが推定された。【００８９】
（ＲＯＣ解析）
ＤＮＡメチル化異常を指標として（Ｎ）を（Ｃ）から見分けられるか検討するため、前記２，７５０個のＣｐＧサイトについてＲＯＣ解析を行った。各サイトのメチル化レベルについて感度と特異度によるＲＯＣ曲線を作成し、感度と特異度の和が最大となるとき（ＲＯＣ曲線のグラフ上の左上隅に最も近づくとき）のメチル化レベルを仮の診断閾値（カットオフ値）として設定した。すなわち、（Ｃ）に比して（Ｎ）でＤＮＡメチル化が充進するＣｐＧサイトについては、サンプルのＤＮＡメチル化レベルがカットオフ値より大きい場合に、そのサンプルを、診断閾値を満たした（癌化リスクが高い）とみなした。逆に（Ｃ）に比して（Ｎ）でＤＮＡメチル化が低減するＣｐＧサイトについては、サンプルのＤＮＡメチル化レベルがカットオフ値より小さい場合に、そのサンプルを、診断閾値を満たした（癌化リスクが高い）とみなした。さらに、各サイトについて、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を測定した。【００９０】
図２は、横軸に診断閾値を満たしたＣｐＧサイト数、縦軸にサンプル数をとったヒストグラムを示す。ヒストグラムは（Ｃ）と（Ｎ）が明確に分かれた二峰性を示し、（Ｃ）と（Ｎ）が明らかに異なるメチル化プロファイルを示すことが確認された。したがって、これらのＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを基準として、尿路上皮癌を発症している又は発症する可能性の高いサンプルと、尿路上皮癌の発症の可能性が低いサンプルとを区別し、尿路上皮癌のリスク判定を行うことができると考えられた。【００９１】
〔実施例２  尿路上皮癌マーカーの評価〕
実施例１で作成したＲＯＣ曲線のＡＵＣが０．９５以上であるＣｐＧサイトを含む５遺伝子（ＴＥＮＭ３、ＨＯＸＣ４、ＴＬＲ１、ＣＰＶＬ及びＰＲＤＭ１６）を選択し、これらの遺伝子のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルをＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）又はパイロシークエンシングにて確認した。【００９２】
（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）法）
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）法は、バイサルファイト処理後のＤＮＡを増幅し、ＲＮＡに転写し、さらにＲＮＡａｓｅにより塩基特異的に切断した後、質量分析計によって、メチル化ＤＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡ断片との分子量の差を検出する方法である。【００９３】
ＴＥＮＭ３遺伝子のＣｐＧサイトに対し、ＥｐｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ用プライマー設計ソフト）を用いてＭａｓｓＡＲＲＡＹのプライマー設計を行った。設計した１プライマーセット当たり、ＤＮＡポリメラーゼ３種とアニール温度４段階程度の条件との組み合わせを平均して試行し、定量性の良好な至適ＰＣＲ条件を決定した。解析対象となる全てのＣｐＧサイトについて採用したＰＣＲ条件で定量性が良好であることを確認した。なお、ＭａｓｓＡＲＲＡＹにおけるＰＣＲ標的配列は１００〜５００ｂｐ程度とやや長いので、標的ＣｐＧサイト周辺の多数のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを合わせて評価することができる。本解析に用いたプライマーの配列とＰＣＲ条件を表３に、標的配列を表４に示す。【００９４】
【表３】
2019181941.tif 000004
【００９５】
【表４】
2019181941.tif 000005
【００９６】
バイサルファイト処理したＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、次いでインビトロ転写反応を行った。得られたＲＮＡをＲＮＡａｓｅによりウラシルの部位で特異的に切断し、各サンプルのゲノムＤＮＡのメチル化の有無に応じた長さの異なる断片を生成した。得られたＲＮＡ断片を、一塩基の質量の差異を検出できるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４）にかけ、質量分析を行った。得られた質量分析結果を、解析ソフトウェア（ＥｐｉＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製）を用いてリファレンス配列にアラインメントし、メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片との質量の比から、メチル化レベルを算出した。【００９７】
（パイロシークエンシング）
パイロシークエンシングは、表５に示す条件にて行った。また、標的配列を表６に示した。【００９８】
【表５】
2019181941.tif 000006
【００９９】
【表６】
2019181941.tif 000007
【０１００】
（結果）
その結果、５遺伝子のいずれについても、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）又はパイロシークエンシングによる解析結果と、インフィニウム（登録商標）アッセイによる解析結果との間には強い相関がみられた（図３）。したがって、これらの５遺伝子のＣｐＧサイトが尿路上皮癌のリスク判定のためのマーカーとして使用できることが示された。【０１０１】
５遺伝子のＣｐＧサイトについて、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）又はパイロシークエンシングで測定されたＤＮＡメチル化レベルを用いて再度ＲＯＣ解析を行った。一部のＣｐＧサイトは互いに近接していたため、まとめて１つのＣｐＧユニットとして解析した。結果を表７に示す。【０１０２】
【表７】
2019181941.tif 000008
【０１０３】
表７に示すＣｐＧサイト又はユニットは、いずれもＲＯＣ曲線のＡＵＣが大きく、単独でも高い感度及び特異度での尿路上皮癌リスク判定を可能にすることが示された。さらにこれらＣｐＧサイト又はユニットを組み合わせることによって、感度と特異度、及び再現性をさらに向上させることができると期待された。表８には、表７に示すＣｐＧサイト又はユニットのうちの２つの組み合わせの例を示す。これらの組み合わせによるリスク判定の感度と特異度はいずれも９６％以上であった。【０１０４】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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