【手続補正書】
【提出日】平成23年8月31日(2011.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【図１】抗ＰＳＣＡミニボディーの概略図である。ミニボディーをコードする遺伝子は、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ヒンジ−ＣＨ３の順に組み立てられ、ヒンジおよびＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１由来である。上記タンパク質は、８０ｋＤａの二量体に自己組織化する。
【図２−１】２Ｂ３  ＳｃＦｖ変異体タンパク質配列の比較を示す図である。ＶＬ配列およびリンカーの一部が上部枠中にあり、リンカーの残りおよびＶＨ配列は下部の枠中にある。また、ＣＤＲも示されており、野生型配列に下線が引かれている。突然変異は、異なる陰影で強調されている。親のＳｃＦｖ  Ｐ−２Ｂ３配列（配列番号４）ならびに変異体Ｃ５（配列番号５）、Ａ２（配列番号６）およびＡ１１（配列番号７）ＳｃＦｖ配列が示されている。
【図２−２】同上
【図３−１】親の２Ｂ３ミニボディー（配列番号９）のＤＮＡ配列（配列番号８）および翻訳されたタンパク質配列を示す図である。また、以下のタンパク質セグメントの出発点も示されている：シグナルペプチド（哺乳類分泌の）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、１５個のアミノ酸のドメイン間ペプチドリンカー、重鎖可変領域（ＶＨ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列および１０個のアミノ酸伸長およびヒトＩｇＧ１ＣＨｊドメインとそれに続く２つの停止コドン。
【図３−２】同上
【図３−３】同上
【図４】非還元条件での、４つのミニボディー、すなわち、親（ｐ）、Ａ１１、Ａ２およびＣ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。矢印は、ミニボディーの予測分子量を示す。
【図５】予測される分子サイズにおける均一ピークを示す、Ａ１１ミニボディーのサイズ排除ＨＰＬＣを示す図である。
【図６ａ】親和性ランキングを示す図である。（Ａ）競合ＥＬＩＳＡ結合実験によるランキング：プレートをＣＥＡでコーティングし、ビオチン化された完全な（intact）抗ＣＥＡキメラ抗体をプローブとして使用した。
【図６ｂ】親和性ランキングを示す図である。（Ｂ）フローサイトメトリーによるランキング：各ミニボディーの５ｐｇ／ｍｌをＰＳＣＡ発現細胞とともにインキュベートした。次いで、細胞を、ＰＥコンジュゲートした抗ヒトＦｃを用いて染色した。
【図７】ＬＡＰＣ−９ＡＤ（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）異種移植片（xenograft）を保有するヌードマウスの同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す図である。マウスにＩ−１２４放射標識Ａ１１ミニボディー変異体を注射し、連続スキャンした。Ａ、Ｂ、Ｃ；矢状断面；Ｄ、Ｅ、Ｆ；冠状断面。Ａ、Ｄ；白色の長方形としてＲＯＩ（関心領域）を示す、同時記録マイクロＰＥＴおよびマイクロＣＴ。Ｂ、Ｅ；マイクロＰＥＴ像およびＲＯＩ。Ｃ、Ｆ；マイクロＰＥＴ像のみ。
【図８】２Ｂ３ミニボディー変異体の生体内分布およびマイクロＰＥＴ画像化ランキングを示す図である。生体内分布の単位は、ｙ−カウンターにおける、注射時間の２１または２５時間後の、秤量した組織１ｇあたりの％ＩＤ値である。マイクロＰＥＴ画像化値は、図６に示され、材料および方法に記載されるように、４つのＲＯＩの平均値について取得した。
【図９】ＰＳＣＡデータおよび特性のまとめを示す図である。
【図１０】本発明の種々の構築物を示す図である。
【図１１−１】２Ｂ３変異体を製造するスキームを示す図である。
【図１１−２】同上
【図１２】種々の構築物のマイクロＰＥＴ画像化および生体内分布データを示す図である。
【図１３】Ａ１１および親２Ｂ３のマイクロＰＥＴ画像化および生体内分布結果を示す図である。
【図１４】親２Ｂ３および変異体Ａ１１抗ＰＳＣＡミニボディーを使用した、膵臓癌Ｃａｐａｎ−１異種移植マウスのマイクロＰＥＴ画像化および体内分布データを示す図である。
【図１５】親２Ｂ３および変異体Ａ１１抗ＰＳＣＡミニボディーを使用した、膵臓癌ＭＩＡ  ＰａＣａ−２異種移植マウスのマイクロＰＥＴ画像化および体内分布データを示す図である。
【図１６ａ−１】親２Ｂ３（配列番号１０）および変異体Ａ２（配列番号１１）抗ＰＳＣＡミニボディーのアミノ酸配列を示す図である。
【図１６ａ−２】変異体Ａ１１抗ＰＳＣＡミニボディーのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。
【図１６ｂ】変異体Ｃ５抗ＰＳＣＡミニボディーのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミニボディー、ダイアボディー、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−Ｆｃからなる群から選択される抗原結合タンパク質構築物であって、選択された構築物が、本明細書においてＡ１１、Ａ２またはＣ５と表される、ミニボディーまたはｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨドメインと実質的に同一であるＶＬおよびＶＨドメインを有する構築物。
【請求項２】
ミニボディー、ダイアボディーおよびｓｃＦｖ−Ｆｃからなる群から選択される抗原結合タンパク質構築物であって、選択された構築物が、それぞれ、抗ＰＳＣＡ抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインと実質的に同一であるＶＬおよびＶＨドメインを有する構築物。
【請求項３】
前記抗ＰＳＣＡ抗体が、親和性成熟抗体である、請求項２に記載の抗原結合タンパク質構築物。
【請求項４】
抗ＰＳＣＡ抗体のＶＬおよびＶＨ鎖可変ドメインが、抗体のヒンジ領域、アミノ酸リンカーおよび免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインと融合しているミニボディーである、請求項１から３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項５】
ダイアボディーである、請求項１から３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項６】
抗ＰＳＣＡ抗体がヒト化抗体であり、ＣＨ３ドメインがヒト免疫グロブリン分子に由来する、請求項１から５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項７】
ヒンジ領域が、ヒトＩｇＧヒンジ領域である、請求項６に記載の構築物。
【請求項８】
抗ＰＳＣＡ抗体が２Ｂ３である、請求項２から７のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項９】
抗原結合タンパク質が、配列番号１０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むミニボディーであり、前記ミニボディーが、抗体２Ｂ３の親和性と同等以上の親和性でＰＳＣＡと結合する、請求項２に記載の構築物。
【請求項１０】
前記ミニボディーが、抗体２Ｂ３の親和性を超える親和性でＰＳＣＡと結合する、請求項９に記載の構築物。
【請求項１１】
配列番号１０、１１、１２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のミニボディー。
【請求項１２】
抗ＰＳＣＡ抗体が、１Ｇ８（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１２）、２Ａ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２０３）、２Ｈ９（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１４）、３Ｃ５（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１６）、３Ｅ６（ＡＴＣＣ番号ＨＢ１２６１８）、３Ｇ３（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１５）または４Ａ１０（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６１７）と表されるモノクローナル抗体である、請求項２または３に記載の構築物。
【請求項１３】
ミニボディー、ダイアボディーおよびｓｃＦｖ−Ｆｃからなる群から選択される抗原結合タンパク質構築物であって、選択される構築物が、抗ＰＳＣＡ抗体のＣＤＲ領域を含む構築物。
【請求項１４】
前記抗ＰＳＣＡ抗体が、抗体２Ｂ３の親和性と同等以上の親和性でＰＳＣＡと結合する、請求項１３に記載の構築物。
【請求項１５】
前記抗ＰＳＣＡ抗体が、２Ｂ３、Ａ２、Ａ１１またはＣ５と表されるものから選択される、請求項１４に記載の構築物。
【請求項１６】
前記構築物がミニボディーである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１７】
治療薬とコンジュゲートしている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１８】
治療薬が、細胞傷害性薬剤である、請求項１７に記載の構築物。
【請求項１９】
細胞傷害性薬剤が、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アルブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリスインヒビター、マイタンシノイド類およびグルココルチコイドリシンからなる群から選択される、請求項１８に記載の構築物。
【請求項２０】
治療薬が放射性同位元素である、請求項１８に記載の構築物。
【請求項２１】
放射性同位元素が、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅからなる群から選択される、請求項２０に記載の構築物。
【請求項２２】
プロドラッグをその活性型に変換できる抗癌薬プロドラッグ活性化酵素と連結している、請求項１から１６のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項２３】
ＰＳＣＡが、ヒトＰＳＣＡである、請求項２に記載の構築物。
【請求項２４】
検出可能マーカーで標識されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項２５】
マーカーが、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素である、請求項２４に記載の構築物。
【請求項２６】
マーカーが１２４Ｉである、請求項２５に記載の構築物。
【請求項２７】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗ＰＳＣＡ抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）タンパク質を発現する前立腺癌細胞の増殖をイン・ビトロで阻害する方法であって、前記癌細胞を、前記癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の、請求項１から２３のいずれか一項に記載の構築物と接触させる工程を含む方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によって、前立腺癌細胞を死滅させる方法。
【請求項３０】
前記構築物が、配列番号２に示す、アミノ酸位置２２のロイシンで始まり、アミノ酸位置９９のアラニンで終了するＰＳＣＡタンパク質を認識し、結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞に、化学療法薬を投与する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞に、放射線療法を施す工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の構築物と、医薬上許容される賦形剤、担体または安定剤とを含む医薬組成物。
【請求項３４】
凍結乾燥製剤または水溶液である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
非ヒト被験体における前立腺、膀胱または膵臓癌の処置または検出において使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３６】
インビボで癌細胞を画像化する方法であって、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の抗体が投与された癌を有すると疑われる哺乳類において、前記抗体を検出する工程を含み、かつ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ光学画像化、生物発光光学画像化、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピュータ断層撮影法およびマイクロＰＥＴからなる群から選択される方法を用いて前記抗体を検出し、それによって、インビボで癌細胞を画像化することを含む方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２−２】
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