【手続補正書】
【提出日】平成22年11月10日(2010.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素反応においてサンプル中でｃＤＮＡを合成するための方法であって、
以下の工程：
ａ．ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する第１酵素、逆転写酵素活性を有する第２酵素、バッファー、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチド、ならびに酵素および生成されたｃＤＮＡの増幅のための試薬を同時に供給する工程、
ｂ．リボ核酸を含むサンプルを添加する工程、ならびに、
ｃ．第１酵素および第２酵素が活性を示すように選ばれる１以上の温度工程において、工程ａ）およびｂ）からの作用物質をインキュベートする工程、
を含み、その後、こうして当該方法において生成されたｃＤＮＡを増幅することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
反応が、６５℃〜９５℃の高温での少なくとも１つの温度工程を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当該方法において生成されるｃＤＮＡは、その後ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、かつ反応はランダムプライマーを含み、および／または、特異的プライマーおよび／または任意に１つ以上のプローブを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ターミナルトランスフェラーゼ活性は、ポリアデニル化活性であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが、原核生物ＲＮＡ、真核生物ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、古細菌ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非ポリアデニル化ＲＮＡ、およびｒＲＮＡ、ならびにそれらの混合物を含む群から選ばれるリボ核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アンカーオリゴヌクレオチドが、ポリ（Ａ）オリゴヌクレオチド、ポリ（Ｃ）オリゴヌクレオチド、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチド、ポリ（Ｇ）オリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）オリゴヌクレオチド、５’−テールを更に含むポリ（Ａ）オリゴヌクレオチド、５’−テールを更に含むポリ（Ｃ）オリゴヌクレオチド、５’−テールを更に含むポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチド、５’−テールを更に含むポリ（Ｇ）オリゴヌクレオチド、および５’−テールを更に含むポリ（Ｕ）オリゴヌクレオチドを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
アンカーオリゴヌクレオチドが、６〜１５０ヌクレオチドの間の長さを有し、かつ３’末端にアンカー配列を任意に有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アンカーオリゴヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、またはロックド核酸、ホスホロチオエート−デオキシリボ核酸、シクロヘキセン−核酸（ＣｅＮＡ）、Ｎ３'−Ｐ５'−ホスホロアミデート（ＮＰ）、またはトリシクロ−デオキシリボ核酸（ｔｃＤＮＡ）であることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
リボヌクレオチドが、アデノシン−５'−三リン酸、チミン−５'−三リン酸、シトシン−５'−三リン酸、グアニン−５'−三リン酸、ウラシル−５'−三リン酸、塩基アナログを有するリボヌクレオチドを含む群から選択され、かつリボヌクレオチドが任意に修飾または標識されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
デオキシリボヌクレオチドが、デオキシアデノシン−５'−三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミン−５'−三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシトシン−５'−三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアニン−５'−三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウラシル−５'−三リン酸（ｄＵＴＰ）を含む群から選択され、かつデオキシリボヌクレオチドが任意に修飾または標識されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
デオキシリボヌクレオチドの標識が、放射性標識、例えば32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、3Ｈ、蛍光色素、例えばフルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、キサンテン、ローダミン、６−カルボキシ−２'，４'，７'，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４'，５'−ジクロロ−２'，７'−ジメトジフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン１１０等；ウンベリフェロン等のクマリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８等のベンズイミド、テキサスレッド、臭化エチジウム、アクリジン色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素等のフェナントリジン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７等のシアニン色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、およびキノリン色素、およびアレクサ色素を含む群から選択され得ることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
修飾が、ビオチン化、ジゴキシゲニン標識、およびハプテンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
デオキシリボヌクレオチドの濃度が、反応中少なくとも０．０１ｍＭであり、かつ反応中最大で１０ｍＭであることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
デオキシリボヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰが、０．２ｍＭ〜２ｍＭの濃度で存在することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
バッファーが６〜１０の範囲のｐＨを有し、かつＭｇ2+イオンを含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ターミナルトランスフェラーゼ活性またはポリアデニル化活性を有する酵素が、原核生物起源、真核生物起源、ウイルス起源、古細菌起源、および植物起源の酵素を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ポリアデニル化活性を有する酵素が、大腸菌由来のポリ（Ａ）ポリメラーゼ、酵母由来のポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ウシ由来のポリ（Ａ）ポリメラーゼ、カエル由来のポリ（Ａ）ポリメラーゼ、およびヒトポリ（Ａ）ポリメラーゼを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
逆転写酵素活性を有する酵素が、ウイルス、細菌、古細菌、真核生物に由来する酵素、およびそれらの遺伝子配列変異誘発の変化により、または対応するバッファー条件の結果としてのみ、当該機能を得る酵素を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
逆転写酵素活性を有する酵素が、熱安定性生物に由来する酵素であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
逆転写酵素活性を有する酵素が、ＨＩＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＥＡＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、サーマスサーモフィルス（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｍ−ＭＬＶ ＲＮａｓｅ Ｈ-（スーパースクリプト、スーパースクリプト ＩＩ、スーパースクリプト ＩＩＩ）、モンスタースクリプト（エピセンター）、オムニスクリプト、センシスクリプト逆転写酵素（キアゲン）、サーモスクリプトおよびサーモ−Ｘ（共にインビトロジェン）、アックスクリプト逆転写酵素（ストラタジェン）を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程ｃ）における作用物質のインキュベーションを、第１酵素および第２酵素が活性を示すように選択された１以上の温度工程において行う、請求項１〜２０のうちの１項に記載の方法。
【請求項２２】
ポリアデニル化活性を有する第１酵素、逆転写酵素活性を有する第２酵素、任意にバッファー、任意に少なくとも１つのリボヌクレオチド、任意に少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、および任意にアンカーオリゴヌクレオチド、任意にランダムプライマー、任意にホモポリマー状核酸、およびＤＮＡ合成活性を有する酵素、を含む反応混合物。
【請求項２３】
ポリアデニル化活性を有する第１酵素、逆転写酵素活性を有する第２酵素、バッファー、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチド、任意にランダムプライマー、任意にホモポリマー状核酸、およびＤＮＡ合成活性を有する酵素、任意に少なくとも１つの特異的プライマー、を含み、プライマーまたはＤＮＡ合成活性を有する酵素等の増幅工程のために必須の成分が任意に同じ容器内にあり、ただし一時的に不活性化されるか、または最初にその他の試薬と空間的に分離されることを特徴とする、請求項２２に記載の反応混合物。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の反応混合物を含むキット。