【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年7月20日(2011.7.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二量体として存在する遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項２】
ホモ二量体として存在する請求項１に記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項３】
二量体が非共有結合の二量体である、請求項１又は２に記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項４】
可能性のあるＮ−グリコシル化部位のうち少なくとも８０％、および糖の割合が１０％（ＡＣＥ２分子全体に対する重量％）より多く、好ましくは１５％よりも多く、特に２０％よりも多いことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項５】
グリコシル化されたＮ−グリコシル化部位の少なくとも７０％がグリコシル化され、それぞれ独立して式１ないし８：
【化１】
2011519264.tif 000001
から選択される構造を有することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項６】
すべての可能性のあるＮ−グリコシル化部位がグリコシル化されていることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に１００％のグリコシル化されたＮ−グリコシル化部位が式１ないし８の構造をもつことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項８】
ＡＣＥ２二量体の単量体ユニットの分子量が、少なくとも９０ｋＤａ、好ましくは少なくとも９２ｋＤａ、特に好ましくは少なくとも９４ｋＤａ、とりわけ少なくとも９６ｋＤａ、非常に好ましくは少なくとも９８ｋＤａ、および最も好ましくは少なくとも１０１ｋＤａであることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項９】
ＡＣＥ２ポリペプチド鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうち１８−７４０のアミノ酸またはその酵素活性のある断片であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちＳｅｒ７４０に対応するセリンがＯ−グリコシル化されていることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、最も好ましくは１００％のグリコシル化されたＮ−グリコシル化部位がシアル酸を有し、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちＡｓｎ５３、Ａｓｎ９０、Ａｓｎ１０３、Ａｓｎ３２２、Ａｓｎ４３２、Ａｓｎ５４６、Ａｓｎ６９０に対応するグリコシル化されたＮ−グリコシル化部位がシアル化されていることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、特に少なくとも５５％、最も好ましくは少なくとも７０％のグリコシル化されたＮ−グリコシル化部位が少なくとも二つのシアル酸を有することを特徴とする請求項１ないし１１のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項１３】
ポリペプチド鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１８−６１５からなる遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド。
【請求項１４】
ＡＣＥ２二量体の分画が、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは９５％存在する、請求項１ないし１２のいずれかに定義される遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチドを含む製剤。
【請求項１５】
膜貫通ドメインであるＡＣＥ２ポリペプチド分画が２０％よりも少なく、好ましくは１０％よりも少なく、特に５％よりも少なく、最も好ましくは１％よりも少なく、および特に０％であることを特徴とする請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
ＡＣＥ２多量体分画が２０％よりも少なく、好ましくは１０％よりも少なく、特に好ましくは５％よりも少なく、最も好ましくは１％よりも少なく、および特に０％であることを特徴とする請求項１４または１５に記載の製剤。
【請求項１７】
ＡＣＥ２単量体の割合が、存在するＡＣＥ２分子の１０％より少ない請求項１４ないし１６のいずれか記載の製剤。
【請求項１８】
ＡｎｇＩＩ（アンジオテンシンＩＩ）をＡｎｇ１−７（アンジオテンシン１−７）に変換する触媒活性のｃｃａｔが、少なくとも４ｓ−１、好ましくは少なくとも５ｓ−１、特に好ましくは少なくとも６ｓ−１、非常に好ましくは少なくとも７ｓ−１、最も好ましくは７.６ｓ−１である請求項１４ないし１７のいずれか記載のＡＣＥ２製剤。
【請求項１９】
ＡＣＥ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの真核細胞への挿入、ＡＣＥ２ポリペプチドを発現、および発現したＡＣＥ２二量体を回収するステップを含み、ここで発現においてＺｎ２＋の濃度が好ましくは少なくとも０．５ないし５μＭであり、好ましくは２．５ないし３．５μＭである、請求項１ないし１２のいずれか記載の遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法を用いて得られる遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチドまたは製剤。
【請求項２１】
請求項１ないし１３又は２０のいずれかに定義されたＡＣＥ２ポリペプチドを発現し、好ましくはＣＨＯ細胞株である、ＡＣＥ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入させた安定的な真核細胞株。
【請求項２２】
請求項１ないし１３又は２０のいずれかに定義された遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１４ないし１８のいずれかに定義された遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２４】
全身、局所、経口又は経鼻投与又は吸入剤として適切に製剤された請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
全身投与のために適切に製剤された請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
静脈内投与である請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
治療薬の製造のための請求項１ないし１３又は２０のいずれかに定義されているＡＣＥ２ポリペプチドの使用。
【請求項２８】
治療薬の製造のための請求項１４ないし１８のいずれかに定義されているＡＣＥ２ポリペプチド製剤の使用。
【請求項２９】
高血圧、心不全、例えば、鬱血性心不全、急性または慢性心不全、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化症、腎不全または腎機能不全、多発性嚢胞腎、多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）、または肺疾患、たとえば慢性閉塞性肺疾患、肺炎、喘息、慢性気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、肺高血圧、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核、肺水腫、ＡＬＩ、ＡＲＤＳ又は肺癌の治療薬の製造のための請求項１ないし１３又は２０のいずれかに定義されているＡＣＥ２ポリペプチド、又は請求項１４ないし１８のいずれかに定義されている製剤の使用。
【請求項３０】
治療される疾患がＡＬＩ又はＡＲＤＳから選択される請求項２９に記載のポリペプチドの使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ＡＣＥ２ポリペプチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えタンパクの生産の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ２）は、レニン−アンジオテンシン系において鍵酵素となっている。カルボキシペプチダーゼとして、膜に固定されており、主に肺、腎臓および心臓の細胞に発現しているが、内皮細胞にも存在し、様々なペプチド基質を分解する。有名で代表的な基質は、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）であり、これは分解されてアンジオテンシン１−７（Ａｎｇ１−７）となり、アンジオテンシンＩは分解されてアンジオテンシン１−９となるが、またアペリンおよびブラジキニンもある。ＡｎｇＩＩおよびＡｎｇ１−７は、レニン−アンジオテンシン系のアンタゴニストである。ペプチドの比率を変更することによって、ＡＣＥ２は血管の厚さおよび内皮細胞の浸透性に応答して、器官のホメオスタシスに影響している。ＡＣＥ２の発現は、とりわけ、サイトカインによって制御されており、ＡＣＥ２にとって最も重要な基質であり、様々な炎症性疾患の病変の結果、増加するＡｎｇＩＩによって減少する。
【０００３】
ＡＣＥ２は、急性肺疾患の二つの形態であり、肺におけるダウンレギュレーションを受けたＡＣＥ２発現に関わるＡＲＤＳまたはＡＬＩの治療に用いられている。この治療には遺伝子組換え可溶性ヒトＡＣＥ２を用いる。これは、全身投与され、急速に全臓器において上昇したＡｎｇＩＩの濃度を減少させ、従ってＡｎｇ１−７を生産する。これによって、否定的な作用である増加したＡｎｇＩＩ濃度を補うことができる。この場合、適切な薬理学的プロフィールを持つ製品が入手可能なことが望ましい。そのような適切な物質とは、臓器への良好な分布、薬理学的に有用な半減期だけでなく、低い免疫原性という特徴を持つものである。とりわけ、製品は酵素活性を持ち、良好な溶解性および溶液中で安定であり、再生可能であり高純度で経済的に生産されることが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ティップニスら（J Biol Chem ２７５、（４３） （２０００）：３３２３８−４３）は、ＡＣＥ２（当該文献中ＡＣＥＨと呼ばれている。）の単離およびそのｃＤＮＡの単離について記載している。ＣＨＯ細胞中、分子量１２０ｋＤａのグリコシル化されたタンパク単量体が生産された。脱グリコシル化によりタンパク質の分子量は８５ｋＤａとなった。
【０００５】
【非特許文献２】ドノヒュー（Circ Res ８７、（５） （２０００）：１−９）は、ＣＨＯ細胞における可溶性ＡＣＥ２の発現について記載している。それによると、完全にグリコシル化されず分子量が約９０ｋＤａであるという特徴を有するとされている。さらに、様々なＡＣＥ２の配列および抗−ＡＣＥ２抗体の配列の比較を行っている。
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０２３２７０Ａ２では、Ｓｆ９昆虫細胞におけるＡＣＥ２単量体の発現後におけるＡＣＥ２の結晶化について記載している。続く質量分析により、そのタンパク質の分子量は８９.６ｋＤａであることがわかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
酵素置換療法が十分に作用するには、生産過程において、純度が高く、薬理学的に有効な製品を、経済的に再生できるものである必要がある。可溶性のＡＣＥ２の細胞外の分画は、７つのグリコシル化部位を持つ。非グリコシル化ＡＣＥ２は、低い溶解性しか持たず、凝集傾向があり、より免疫原性を有し、短い半減期である。加えて、より小さい流体力学直径を持つことにより、第１に、精製において有害な作用を持つ。それゆえ、本発明は、生体内での良好な半減期をもつ高活性なＡＣＥ２を提示することにある。この目的は請求項における主題として達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、二量体として存在する遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチドに関する。遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチドはグリコシル化されていることが好ましく、ここで、ＡＣＥ２ポリペプチド単量体中のグリコシル基は、少なくとも合計１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のシアル酸残基を含むことであり、好ましくは、少なくとも１４のシアル酸残基を有することであり、そのＡＣＥ２ポリペプチドは二量体で存在することである。本発明は、グリコシル化された単量体のＡＣＥ２も含み、その分子量および詳細はここに示す。二量体は、ホモ二量体であることが好ましい。とりわけ、その単量体単位は同一の配列およびグリコシル基を有することが好ましい。一般に、二量体の単量体の単位同士は、非共有結合で結合している。単量体は、二量体から直接得られるか、または、変性過程を経て得られる。本明細書中のすべての好ましいグリコシル化は、二量体および二量体中の一つまたは両方の単量体を含む単量体のいずれにも適用可能である。特に、二量体は二つの亜鉛イオンを含むことが好ましい。
【０００９】
本発明は、以下の非限定的な図面および実施例においてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１  ＡＣＥ２発現および選択カセット；
【００１１】
【図２】図２  生成したクローンの履歴のＡＣＥ２−特異的ウエスタンブロット解析；
【００１２】
【図３】図３  ＡＣＥ２単量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；
【００１３】
【図４】図４  クローン選択；
【００１４】
【図５】図５  ＬＣ−ＭＳによるグリコシル化分析；
【００１５】
【図６】図６  ＡＣＥ２のプレパラティブサイズ分離；
【００１６】
【図７】図７  ３種におけるＡＣＥ２の薬物動態；
【００１７】
【図８】図８  Ａｎｇ１−７およびＡｎｇＩＩの定量のための較正曲線。ペプチドは、記載の濃度の範囲でウォーターズのＣ１８μボンダパック逆相カラム２.１×３００ｍｍ、１０μＭ、１２５Åを有するＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分離した；
【００１８】
【図９】図９  Ｎ−端ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル。ＱおよびＫは同じ分子量を持つことに注目；
【００１９】
【図１０】図１０  ＡＣＥ２およびＮ−グリコシル化したものの配列予測；
【００２０】
【図１１】図１１  グリコシル化部位１０３（A）、部位４３２（B）、部位５４６（C）、部位６９０（D）、部位９０（E）の詳細なスペクトル；
【００２１】
【図１２】図１２  Ｃ末端がＯ−グリコシル化されたペプチドのスペクトル。構造帰属は暫定的と分類されるものである；
【００２２】
【図１３】図１３  分解したグリカンのＬＣ−ＭＳ；
【００２３】
【図１４】図１４  ナイーブＰＡＧＥ（左、タンパク質のバンドは銀染色により視覚化した。）およびＳＥＣ（右、２２０ｍＭのＮａ−リン酸によりｐＨ７.０とした１０％アセトニトリル中、ゾルバックスＧ−４５０カラムを用い、クロマトグラムは２１４ｎｍで測定した。）を用いたＡＣＥ２二量体の構造決定；
【００２４】
【図１５】図１５  ＡＣＥ２二量体（保持時間８.５５分、８.９３分）のサイズ排除クロマトグラフィー。標準物質：チログロブリン（６７０ｋＤａ、７.４３分）、ガンマ−グロブリン（１５８ｋＤａ）、卵白アルブミン（４３ｋＤａ、１０.０８分）、ミオグロブリン（１７ｋＤａ、１１.０８分）、ビタミンＢ−１２（１.３ｋＤａ、１２.７１分）；
【００２５】
【図１６】図１６  皮質（Ａ）、大脳（Ｂ）およびＡＣＥ２二量体発現クローン細胞抽出物のＡＣＥ２−特異的ウエスタンブロット解析。Ｄは、純粋なＡＣＥ２二量体；
【００２６】
【図１７】図１７  ＡＣＥ２の単量体形態のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析クロマトグラム。実験条件：カラム：ゾルバックスＧＦ２５０、緩衝液：２２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋１０％ＣＨ３ＣＮ、ｐＨ８.０、１ｍＬ／分；
【００２７】
【図１８】図１８  ＡＣＥ２二量体（Ａ）およびＡＣＥ２単量体（Ｂ）のＰＡＧＥによる分析；タンパク質は銀染色により視覚化（ａ）およびＡＣＥ２−特異的ウエスタンブロット（ｂ）；
【００２８】
【図１９】図１９  ＡＣＥ２単量体と比較したＡＣＥ２二量体の酵素活性の決定。蛍光ラベルした基質クマリン−ＡＰＫ−ＤＮＰは初期の一定濃度であり、および４つの異なる酵素濃度を用い、対応する蛍光曲線を比較した；
【００２９】
【図２０】図２０  ＡＣＥ２二量体投与（２.５ｍｇ／ｋｇ、青のカラム）またはＡＣＥ２単量体の投与（２.５ｍｇ／ｋｇ、グレーのカラム）２４時間および４８時間後のＡＣＥ２の血清中の活性。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
用語「シアル酸残基」は、Ｎ−アセチルノイラミン酸タイプ（Ｎｅｕ５Ａｃ）の残基、とりわけ、Ｎ−またはＯ−グリコシル化されたものを意味する。
【００３１】
基本的に、治療剤の安定性は半減期を考慮するのに非常に重要な基準となるため、従って、薬効にも重要である。
【００３２】
遺伝子組換えヒトＡＣＥ２は、これまでもっぱら単量体として同定されてきており、その機能、その結晶構造およびその高特異的阻害剤との相互作用からは、文献中にはそのように記載されてきた。
【００３３】
それゆえ、例えば、タウラーらは、ヴィッカーズらの文献（J Biol Chem ２７７ （１７）、２００２：１４８３８−１４８４３）を引用し、Ｓｆ９昆虫細胞中のＡＣＥ２は、最終精製段階において、サイズ排除クロマトグラフィーによって単量体として精製されることを示している。単量体分子量は８９.６ｋＤａであった（J Biol Chem ２７９（１７）、２００４：１７９９６−１８００７）。
【００３４】
市販されるＡＣＥ２（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、カタログ番号９３３−ＺＮ、バッチ番号ＦＩＵ０３５０７１）も単量体の形態であり、ティップニスらが述べた方法（２０００年、上述）を用いて生産され、違いは発現系がＣＨＯ細胞の代わりにＮＳＯであることである。単量体は、還元的条件下であっても非−還元的条件下であっても分子量は１２０ｋＤａであった。
【００３５】
ドノヒューらによると、ＣＨＯ細胞に発現したＡＣＥ２単量体は、続く分泌の際には９０ｋＤａの分子量を持っていることを示した。
【００３６】
すべての文書および出版物は、ここに参考文献として組み込む。
【００３７】
本発明の治療剤の安定化のため、本発明に即してもっぱら安定なＡＣＥ２二量体を製造するため、および、ＡＣＥ２単量体に比べて生産性および薬理学的な利点が得られる方法が開発された。
【００３８】
二量化は以下のような利点がある：
・生理的溶液中での溶解性およびバイオアベイラビリティの向上：二量体は、高溶解性でインビボでの半減期およびバイオアベイラビリティが向上する。
・非凝集性：ＡＣＥ２二量体へ、さらなるＡＣＥ２分子の付加はされず、安定した複合体を形成する。
・プロテアーゼによる攻撃の減少：個別のタンパク質分画および最も起こりやすいＣ末端部分が二量体の内側を向いているので、Ｃ末端は分解されない。
・半減期の延長：免疫原性の低下、溶解性の向上およびタンパク質分解の可能性の減少により、タンパク質の半減期が延長する。
・タンパク質の精製の単純化：ＡＣＥ２二量体の流体力学直径は、その構造および前述の溶媒和鞘の促進により予測値よりも大きい。それゆえ、ＡＣＥ２二量体は、タンパク質発現から生じる通常の不純物から容易に分離できる。例えば、血清アルブミン（６７ｋＤａ）は、サイズ排除カラムによって分離できる。
【００３９】
好ましくは、遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチドは、可能性のあるＮ−グリコシル化部位の少なくとも８０％がグリコシル化され、糖の割合が、１０％（ＡＣＥ２に対する重量％）または１１％、１２％、１３％、１４％、好ましくは、１５％または１６％、１７％、１８％、１９％よりも多いこと、とりわけ２０％または２１％、２２％、２３％、２４％または２５％であることが好ましい。
【００４０】
高純度および酵素活性の高い、非常に複雑にグリコシル化したＡＣＥ２の再生可能な生産方法が開発された。生成物は、糖を高い割合で有する特徴をもち（＞２０重量％）、および複合体は非常に分岐し、部分的に負に荷電した糖構造を持つ。これらは、溶解性、バイオアベイラビリティ、酵素活性だけでなく、生成物の薬理学的特徴にもよい影響を持つ。細胞代謝に適した培地を用いて、適切な発現コンストラクト、適切な発現宿主、最適な選択戦略を選択するだけでなく、綿密なクローン解析および選択を行うことにより、望ましい生成物を分泌する細胞株を製造することができる。
【００４１】
ＡＣＥ２は、すでにＳｆ９昆虫細胞およびＮＳＯマウス細胞において発現されてきた。それらは主として、インビトロ試験に用いられた。ＣＨＯ細胞におけるＡＣＥ２の一過性の発現と見られる結果も見られる。これまで、適切に高生産性の細胞株は見出されていない。また、これに対応して、とりわけＮ−グリコシル化といった生成物の性質を考慮したクローンの選択も実施されていない。
【００４２】
タンパク質の溶解性は、そのアミノ酸配列だけでなく、その折りたたみ、さらに転写後修飾によっても決定される。荷電した糖構造は、タンパク質の溶解性の増加の主要因となり、薬理学的プロフィールに大きな影響を与える。それゆえ、複雑に分岐した糖構造の存在は、このタンパク質の半減期への肯定的な影響があることがＥＰＯに対して示された。
【００４３】
原則として、様々な発現系が遺伝子組換えＡＣＥ２に考えられるが、真核宿主は、Ｎ−グリコシル化部位が欠けているため、試されてこなかった。
【００４４】
好ましくは、少なくとも７０％のグリコシル化部位が、それぞれ独立して、１ないし８の構造を持つＮ−グリコシル化されていることである。
【化１】
2011519264.tif 000002
【００４５】
好ましくは、すべてのＮ−グリコシル化部位がグリコシル化されていることである。
【００４６】
式１−８において、一つの単量体ユニットのＮ−グリコシル化部位が、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、とりわけ１００％グリコシル化されていることが好ましい。
【００４７】
好ましくは、ＡＣＥ２単量体ユニットは、分子量が少なくとも９０ｋＤａ、好ましくは９２ｋＤａ、とりわけ好ましくは少なくとも９４ｋＤａ、更に好ましくは少なくとも９６ｋＤａ、および非常に好ましくは少なくとも９８ｋＤａ、最も好ましくは少なくとも１００ｋＤａ、１００.５ｋＤａ、１０１ｋＤａ、１０１.５ｋＤａまたは少なくとも１０２ｋＤａであることである。絶対分子量−例えば、水和鞘を含まないペプチドそれ自体−は、ペプチドマッピングによって決められる。よりグリコシル化された形態の分子量は少なくとも、１０３ｋＤａ、１０４ｋＤａ、１０５ｋＤａ、１０６ｋＤａ、１０７ｋＤａまたは少なくとも１０８ｋＤａである。
【００４８】
分子量決定は、水和鞘によって影響を受けるが、たとえば、水系でのクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動−ではより高分子量として得られる。具体的態様としては、ＡＣＥ２の二量体中の単量体ユニットは、ゲル電気泳動によって決定したが、見かけ分子量が、少なくとも１０１ｋＤａまたは少なくとも１０２ｋＤａ、好ましくは少なくとも１０５ｋＤａ、特に好ましくは少なくとも１０９ｋＤａ、とりわけ少なくとも１１３ｋＤａ、非常に好ましくは少なくとも１１７ｋＤａおよび、最も好ましくは少なくとも１１９ｋＤａである。
【００４９】
他の具体的態様としては、単量体の（みかけまたは完全な）分子量が最大１０２ｋＤａ、１０３ｋＤａ、１０４ｋＤａ、１０８ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１１２ｋＤａ、１１６ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１３５ｋＤａまたは１４０ｋＤａである。ＡＣＥ２の高分子量化は、例えば、ＰＥＧ付加することにより可能である。
【００５０】
好ましくは、（二量体を形成しない）単量体の分子量が少なくとも８２ｋＤａ、好ましくは少なくとも８６ｋＤａ、特に好ましくは少なくとも９０ｋＤａ、とりわけ好ましくは少なくとも９４ｋＤａ、非常に好ましくは少なくとも９８ｋＤａ、最も好ましくは少なくとも１０１ｋＤａまたは最大１０２ｋＤａ、１０３ｋＤａ、１０４ｋＤａ、１０８ｋＤａ、１１０ｋＤまたは最大１１２ｋＤａである。これらの分子量は、ペプチドマッピング法を用いて決定することができる。
【００５１】
好ましくは、ＡＣＥ２ポリペプチドは、膜貫通領域を持たないことである。それゆえ、ＡＣＥ２は可溶性であることが好ましい。特に好ましい具体的態様は、可溶性ＡＣＥ２ポリペプチドを含むことであり、ポリペプチド鎖が、アミノ酸１８−７４０またはその酵素的に活性な断片からなることである。さらに好ましくは、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１８−６１５からなることである。
【００５２】
遺伝子組換えヒトＡＣＥ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、他の哺乳類からのＡＣＥ２、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、霊長類または家畜もほとんどの治療への適用に好ましい。ＡＣＥ２は、様々な種において同一であるＡｎｇＩＩを基質に持ち、すべての哺乳類に一般的な酵素である。このように、原則として異質な臓器にも用いられることができる。それゆえ、本発明のタンパク質はＡＣＥ２の由来に関わらず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、霊長類または家畜のものを用いることができる。しかし、好ましい具体的態様は、ＡＣＥ２の起源および治療される臓器は同じであることが好ましい。
【００５３】
好ましくは、ＡＣＥ２ポリペプチドのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１においてＳｅｒ７４０（例えば、Ｃ末端）に対応するセリン（またはＣ末端アミノ酸）がＯ−グリコシル化されていることである。
【００５４】
好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、とりわけ好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％グリコシル化され、Ｎ−グリコシル化部位がシアル酸であることである；好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちのＡｓｎ５３、Ａｓｎ９０、Ａｓｎ１０３、Ａｓｎ３２２、Ａｓｎ４３２、Ａｓｎ５４６、Ａｓｎ６９０がシアル化されていることである。
【００５５】
特に具体的態様としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ５３に対応するアスパラギンがモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。好ましくは、一つのＡＣＥ２製剤中、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸がモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。
【００５６】
特に具体的態様としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ９０に対応するアスパラギンがモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。好ましくは、一つのＡＣＥ２製剤中、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸がモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。
【００５７】
特に具体的態様としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ１０３に対応するアスパラギンがモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。好ましくは、一つのＡＣＥ２製剤中、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸がモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。
【００５８】
特に具体的態様としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ３２２に対応するアスパラギンがモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。好ましくは、一つのＡＣＥ２製剤中、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸がモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。
【００５９】
特に具体的態様としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ４３２に対応するアスパラギンがモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。好ましくは、一つのＡＣＥ２製剤中、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸がモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。
【００６０】
特に具体的態様としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ５４６に対応するアスパラギンがモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。好ましくは、一つのＡＣＥ２製剤中、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸がモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。
【００６１】
特に具体的態様としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ６９０に対応するアスパラギンがモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。好ましくは、一つのＡＣＥ２製剤中、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸がモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。
【００６２】
特に具体的態様としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ７４０に対応するアスパラギンがモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。好ましくは、一つのＡＣＥ２製剤中、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸がモノ−、ビ−、トリ−またはテトラ−シアル化されていることである。
【００６３】
好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、とりわけ好ましくは少なくとも５５％、および、最も好ましくは少なくとも７０％のＮ−グリコシル化部位が少なくとも２つのシアル酸でグリコシル化されていることである。従って、好ましくは、あるＡＣＥ２製剤が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸でシアル化されていることである。
【００６４】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ５３に対応するアスパラギンが、Ｎ−グリコシル化されていることであり、好ましくはグリカンの構造が、式１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００６５】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ９０に対応するアスパラギンが、Ｎ−グリコシル化されていることであり、好ましくはグリカンの構造が、式１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００６６】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ１０３に対応するアスパラギンが、Ｎ−グリコシル化されていることであり、好ましくはグリカンの構造が、式１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００６７】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ３２２に対応するアスパラギンが、Ｎ−グリコシル化されていることであり、好ましくはグリカンの構造が、式１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００６８】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ４３２に対応するアスパラギンが、Ｎ−グリコシル化されていることであり、好ましくはグリカンの構造が、式１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００６９】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ５４６に対応するアスパラギンが、Ｎ−グリコシル化されていることであり、好ましくはグリカンの構造が、式１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００７０】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＡｓｎ６９０に対応するアスパラギンが、Ｎ−グリコシル化されていることであり、好ましくはグリカンの構造が、式１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００７１】
さらに、本発明は遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド製剤に関する。ポリペプチドは、ここに定義する（ＡＣＥ２単量体または二量体または二量体の単量体ユニット）。ここで、ポリペプチドの一部は、見かけの分子量が、ゲル電気泳動によって１００ｋＤａまたは１０１ｋＤａよりも小さいことであり、好ましくは１０４ｋＤａよりも小さい、非常に好ましくは１０８ｋＤａより小さい、とりわけ１１２ｋＤａより小さい、特に好ましくは１１７ｋＤａ、最も好ましくは１１９ｋＤａより小さい、２０％より小さい、好ましくは１０％より小さい、特に好ましくは５％より小さい、最も好ましくは１％より小さい、とりわけ０％であること、およびこれらのいずれの組合せであってもよい。例えば、ＡＣＥ２ポリペプチドで１００ｋＤより小さいものは、０％しか存在せず、およびＡＣＥ２ポリペプチドの１００ｋＤａより小さいものは、２０％より少ないことである。あらゆるＡＣＥ２が関わる形態の分画は、例えば天然ゲル電気泳動法によって決定された。
【００７２】
同様に、分子量はペプチドマッピングによって決定することができる絶対分子量である。このようにＡＣＥ２ポリペプチドの分画が、８６ｋＤａよりも小さい、または８９ｋＤａよりも小さい、好ましくは９２ｋＤａよりも小さい、非常に好ましくは９４ｋＤａよりも小さい、とりわけ９７ｋＤａよりも小さい、特に好ましくは１００ｋＤａよりも小さい、および最も好ましくは１０１ｋＤａより小さく、２０％よりも少なく、好ましくは１０％よりも少なく、特に好ましくは５％よりも少なく、最も好ましくは１％よりも少なく、特に０％であり、それらのいずれの組合せであってもよい。例えば、ＡＣＥ２ポリペプチドのうち８６ｋＤよりも小さいものは、０％であり、ＡＣＥ２ポリペプチドのうち９７ｋＤａより小さいものは２０％よりも少ないことである。
【００７３】
好ましくは、ＡＣＥ２ポリペプチド膜貫通ドメインが２０％より少ないことであり、好ましくは１０％よりも少ないことであり、特に好ましくは５％よりも少ないことであり、最も好ましくは１％よりも少ないことであり、特に０％である。
【００７４】
好ましくは、ＡＣＥ２の多量体は２０％より少ないことであり、好ましくは１０％より少ないことであり、特に好ましくは５％より少ないことであり、最も好ましくは１％より少ないことであり、特に０％であることである。用語「ＡＣＥ２多量体」とは、３またはそれ以上のＡＣＥ２ポリペプチドの複合体を意味する。加えて、ＡＣＥ２二量体の製剤は、ＡＣＥ２単量体の分画は好ましくは２０％よりも少ないことであり、好ましくは１０％よりも少ないことであり、特に好ましくは５％よりも少ないことであり、最も好ましくは１％よりも少ないことであり、特に０％であることが好ましい。加えて、ＡＣＥ２単量体の製剤は、ＡＣＥ２二量体は好ましくは２０％よりも少ないことであり、好ましくは１０％よりも少ないことであり、特に好ましくは５％よりも少ないことであり、最も好ましくは１％より少ないことであり、特に０％であることが好ましい。
【００７５】
好ましくは、ＡＣＥ２中におけるＡＣＥ２二量体の分画は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９９％であることである。さらなる具体的態様としては、組合せてまたは独立して、ＡＣＥ２分子中におけるＡＣＥ２単量体の分画は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９９％であってもよい。
【００７６】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちのＡｓｎ５３に対応する部分がＮ−グリコシル化されたアスパラギンをもつＡＣＥ２ポリペプチドが、好ましくは６０％よりも多く、好ましくは７０％よりも多く、特に好ましくは８０％よりも多く、非常に好ましくは９０％よりも多く、最も好ましくは９９％よりも多く、および特に１００％であることであり、好ましくはグリカンの構造が、１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００７７】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちのＡｓｎ９０に対応する部分がＮ−グリコシル化されたアスパラギンをもつＡＣＥ２ポリペプチドが、好ましくは６０％よりも多く、好ましくは７０％よりも多く、特に好ましくは８０％よりも多く、非常に好ましくは９０％よりも多く、最も好ましくは９９％よりも多く、および特に１００％であることであり、好ましくはグリカンの構造が、１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００７８】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちのＡｓｎ１０３に対応する部分がＮ−グリコシル化されたアスパラギンをもつＡＣＥ２ポリペプチドが、好ましくは６０％よりも多く、好ましくは７０％よりも多く、特に好ましくは８０％よりも多く、非常に好ましくは９０％よりも多く、最も好ましくは９９％よりも多く、および特に１００％であることであり、好ましくはグリカンの構造が、１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００７９】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちのＡｓｎ３２２に対応する部分がＮ−グリコシル化されたアスパラギンをもつＡＣＥ２ポリペプチドが、好ましくは６０％よりも多く、好ましくは７０％よりも多く、特に好ましくは８０％よりも多く、非常に好ましくは９０％よりも多く、最も好ましくは９９％よりも多く、および特に１００％であることであり、好ましくはグリカンの構造が、１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００８０】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちのＡｓｎ４３２に対応する部分がＮ−グリコシル化されたアスパラギンをもつＡＣＥ２ポリペプチドが、好ましくは６０％よりも多く、好ましくは７０％よりも多く、特に好ましくは８０％よりも多く、非常に好ましくは９０％よりも多く、最も好ましくは９９％よりも多く、および特に１００％であることであり、好ましくはグリカンの構造が、１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００８１】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちのＡｓｎ５４６に対応する部分がＮ−グリコシル化されたアスパラギンをもつＡＣＥ２ポリペプチドが、好ましくは６０％よりも多く、好ましくは７０％よりも多く、特に好ましくは８０％よりも多く、非常に好ましくは９０％よりも多く、最も好ましくは９９％よりも多く、および特に１００％であることであり、好ましくはグリカンの構造が、１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００８２】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちのＡｓｎ６９０に対応する部分がＮ−グリコシル化されたアスパラギンをもつＡＣＥ２ポリペプチドが、好ましくは６０％よりも多く、好ましくは７０％よりも多く、特に好ましくは８０％よりも多く、非常に好ましくは９０％よりも多く、最も好ましくは９９％よりも多く、および特に１００％であることであり、好ましくはグリカンの構造が、１、２、３、４、５、６、７または８であることである。
【００８３】
好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のうちのＳｅｒ７４０に対応する部分がＯ−グリコシル化されたアスパラギンをもつＡＣＥ２ポリペプチドが、好ましくは６０％よりも多く、好ましくは７０％よりも多く、特に好ましくは８０％よりも多く、非常に好ましくは９０％よりも多く、最も好ましくは９９％よりも多く、および特に１００％であることである。
【００８４】
好ましくは、ＡＣＥ２ポリペプチド又は製剤の触媒活性はＡｎｇ１−７（アンジオテンシン１−７）変換速度が、ccatが少なくとも４ｓ−１、好ましくは５ｓ−１、特に好ましくは少なくとも６ｓ−１、非常に好ましくは少なくとも７ｓ−１、および最も好ましくは少なくとも７.６ｓ−１であることである。Ａｎｇ１−７は、ＡＣＥ２によってＡｎｇＩＩ（アンジオテンシンＩＩ）から生成する。変換は、実施例に記載されたとおり、単純な方法によって試験される。このＡＣＥ２の変換または酵素活性は、他のアッセイデータから推定される。活性は、例えば、ＷＯ２００８／０４６１２５Ａで測定されたとおりである。
【００８５】
さらなる目的としては、本発明は遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチド又は製剤の生産方法に関する。ここで、当該方法は、ＡＣＥ２をコードしているポリヌクレオチド（好ましくは膜貫通部位のないもの）を真核細胞に導入し、ＡＣＥ２ポリペプチド発現し、発現したＡＣＥ２を集める（特に二量体の形態のもの）過程を含む。その後、本発明のＡＣＥ２ポリペプチド、とりわけ、高分子量の分子を製造するために細胞を選択する。
【００８６】
好ましくは、ＡＣＥ２をコードしているポリヌクレオチドはベクターにおいて提供される。
【００８７】
好ましくは、ＡＣＥ２はマーカー、好ましくはＤＨＦＲによって選択される。好ましくは、マーカーは、ベクターに含まれていることである。
【００８８】
好ましくは、ベクターは発現したＡＣＥ２ｍＲＮＡのためのＩＲＥＳを持っていることである（またはそれをコードしていることである）。
【００８９】
好ましくは、真核細胞はＣＨＯ細胞である。
【００９０】
本発明は、このような方法により得られる遺伝子組換えＡＣＥ２ポリペプチドまたは製剤に関する。
【００９１】
本発明のさらなる目的としては、形質転換したポリヌクレオチドでＡＣＥ２をコードする安定した真核細胞株（または普通の細胞）を提供することである。とりわけ上述したようなＡＣＥ２を発現するＣＨＯ細胞株（または細胞）が好ましい。細胞株は上述したような望ましい性質を持つものが選択され、例えば、単量体からなる二量体の分子量は少なくとも１０２ｋＤａである。
【００９２】
細胞は好ましくは、ＡＣＥ２生産性を少なくとも１０ｐｇ／細胞／日、好ましくは１５ｐｇ／細胞／日、特にこのましくは２０ｐｇ／細胞／日を有することである。
【００９３】
ＡＣＥ２の発現は、十分なＺｎ２+イオンの存在下で起こる。好ましくは、少なくとも０.５、とりわけ５μＭＺｎ２+までで用いられる。とりわけ、発酵は２.５−３.５μＭＺｎ２+で行われる。発現細胞中の栄養培地中のＺｎ２+の濃度は、例えば、少なくとも０.５μＭ、０.７５μＭ、１.０μＭ、１.２５μＭ、１.５μＭ、１.７５μＭ、２.０μＭ、２.２５μＭ、または、少なくとも２.５μＭまたは３.０μＭであってよい。さらなる処理過程も好ましくは、Ｚｎ２+存在下行われることである。
【００９４】
本発明のさらなる目的としては、本発明に基づくＡＣＥ２生成物の医薬または医薬製剤に関する。とりわけ、高血圧、心不全、例えば、鬱血性心不全、急性または慢性心不全、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化症、腎不全または腎機能不全、多発性嚢胞腎、多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）、または肺疾患、たとえば慢性閉塞性肺疾患、肺炎、喘息、慢性気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、肺高血圧、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核、肺水腫、急性肺障害（ＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）または肺癌の治療または予防がある。一般的な適用疾患は、ＷＯ２００４／０００３６７Ａに記載されているが、当該ＡＣＥ２生成物は本件にも適している。
【００９５】
本発明に従い、ＡＣＥ２タンパク質を含む医薬組成物または医薬が提供される。そのような組成物には、医薬的に許容される塩、付加的な緩衝液、等張化剤または医薬的に許容される担体がある。医薬の担体物質は、互換性を高め、溶解性を向上させるだけでなく、活性成分のバイオアベイラビリティの促進にも役立つ。例えば、乳化剤、増粘剤、還元物質、デンプン、アルコール溶液、ポリエチレングリコールおよび脂質がある。適切な医薬担体の選択は、投与経路に高度に依存している。経口投与には、液体または固体の担体が用いられ、注射には溶液の最終組成物が必要である。
【００９６】
好ましくは、本発明のＡＣＥ２組成物は、緩衝物質または等張物質を含むことである。緩衝液は医薬のｐＨを生理的条件に適合させ、および、ｐＨ変化を減じ、または緩衝することができる。例えば、リン酸緩衝液がある。等張物質は、浸透圧を調節し、これにはイオン性物質を含んでいてもよく、例えば、無機塩、例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌがあり、または非イオン性物質、例えばグリセリンまたは糖質がある。
【００９７】
好ましくは、本発明の組成物または医薬の使用は、全身、局所、経口または鼻腔内投与または吸入剤として適切に調製される。本発明の組成物のこれらの投与形態は、速やかな複雑でない吸収が可能である。ＡＣＥ２組成物が経口投与を目的とする場合、好ましくは胃酸に耐えうる剤形またはカプセル化されていることである。経口投与の場合には、例えば固体または液体の医薬品が直接または溶解されてまたは希釈されて用いられる。
【００９８】
本発明の医薬は、好ましくは、静脈内、動脈内、筋肉内、血管内、腹腔内または皮下投与用に製剤されていることである。例えば注射剤または輸液剤はこの目的に適している。血流に直接投与する形態は、医薬の活性成分が全身に分布し、速やかに標的に到達する。
【００９９】
実施例
【実施例１】
【０１００】
非常にグリコシル化されたＡＣＥ二量体
【０１０１】
ヒトＡＣＥ２配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の可溶性分画を、増幅されたＤＨＦＲ選択マーカーがすでに加えられた、発現ベクター中でクローニングしたことにより、ＡＣＥ２遺伝子の発現が促進された。この末端であり、ＡＣＥ２およびＤＨＦＲをコードしている遺伝子の間に、弱毒化したＩＲＥＳを挿入することにより、同一のｍＲＮＡにおいてＡＣＥ２およびＤＨＦＲのバイシストロニック転写を可能にする。ＡＣＥ２の発現および選択カセットは、図１にグラフによって示されている。両方のタンパク質が同一のプロモーターの制御下で発現するため、ＡＣＥ２の発現は、ＭＴＸアンタゴニストを用いたＤＨＦＲ選択の方法によって、意図的に促進することができる。この戦略によって、一定の品質を持った高収率な生成物を作り出す特に安定な発現細胞株を製造することができる。これは、また組換え体の発現にはあまり適しない特定の標的タンパク質の細胞株にとって合理的な生成物の滴定方法が得られることを意味する。
【０１０２】
このベクターをＣＨＯｄｈｆｒ細胞に導入し、継続的にＭＴＸ圧力を増加させながら、ＡＣＥ２遺伝子のコピー回数を増幅させた。細胞内ＦＡＣＳ分析およびタンパク質の化学的だけでなく酵素的分析も行うことにより、いくつかの選択およびサブクローンサイクルを行うことによって、最適な性質を持つ最もよい生成物を選択した。とりわけ、特異的酵素活性を持つ最も適切なクローンを選択するために、三つの異なる基質、生産物の同質性、細胞生産性、および、糖の複雑さを考慮した。図２は、生産細胞株を樹立するのに用いた個々のクローンを継続的に培養した残基のウエスタンブロット法による継続的な分析の概略を示す。それぞれのクローンの生成物の性質は、右から左へといくに従い増加し、相当な質量増加が見られた。これは、高度にグリコシル化されたクローンの特異的選択によって起こった。最後に、最も分子量の大きい発現物質であった一つのクローン（クローン５Ｂ９）を用いて生産細胞株を樹立した（１８４）。
【０１０３】
酵素活性によって高活性で複雑なＮ−グリコシル化されたＡＣＥ２による、６つのクローンで進めることとした。可溶性ＡＣＥ２は８３ｋＤａの分子量を持つのに対し、クローンは、１２０ｋＤａ付近まで持っている。変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行い、その糖構造がわかる。図３は、現生産過程によって生産されたＡＣＥ２（レーンＢ）と通常のＮＳＯ（レーンＡ）中で生産されたＡＣＥ２を比較した。本発明のＡＣＥ２ポリペプチド−ここでは単量体とされる−は、高度にグリコシル化されおよび単一のバンドとして約１２０ｋＤａに現れたのに対し、参照物質は８３ｋＤａないし１２０ｋＤａに現れ高度に不均一であることを示した。
【０１０４】
予備的クローンはタンパク質なしの成長培地に移された（ポリムン社）。この市販に入手可能な培地は、化学的に精製され、血清フリーで、動物性のタンパク質は含まず、ＣＨＯ細胞においておよび遺伝子組換え糖タンパクの発現に最適化されている。２.５-３.５μＭＺｎ２＋において発酵した。６つのクローンは、すべて培地のもとに置き、生産過程において適切かを測定した。とりわけ、成長率および質量増加を記録した（図４）。さらに、発現した生成物およびクローンを正確に分析した。すべてのクローンは高活性であり、生産性は、２０−３０ｐｇ／細胞／日であった。糖の構造およびその不均質さも分析した。最後に１Ｂ４が選択された。それはすべての生産過程において、均一な糖構造を示した。７つのすべてのＮ−グリコシル化部位は、変化を受けた。それらは、末端シアル酸から、少なくとも二、場合によっては三分岐の複合グリコシル化を受けた。
【０１０５】
このクローンに基づいてマスターセルバンクを作り、および試験をし、およびＧＭＰ適合クラスの精製工程を有する等、ＧＭＰ適合クラスの生産工程が構築された。
【０１０６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＡＣＥ２タンパク質配列；自己シグナル配列（下線部）は、宿主細胞からの放出によって切断される。）：
【０１０７】
MSSSSWLLLSLVAVTAA
QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS
【０１０８】
ＡＣＥ２が二量化すると、疎水性のタンパクユニットは複合体の内側に向き、Ｎ−結合糖鎖といった荷電残基は外に向き、荷電を持つ生理的溶液の中で構造体を溶媒和する。完全にＮ−グリコシル化されたＡＣＥ２の二量体は、Ｚｎ２＋存在下で見られた。それは、二量体の複合体は、２つの同一のサブユニットからなり、静電的に結合し、生理的溶液中ではもはや分離しなかった。ＡＣＥ２の分子それぞれ１４の高度に荷電したシアル酸構造、二量体にあっては２８のシアル酸構造を持ち、糖タンパクの分泌をもたらす。２つのＺｎ２＋イオンは、それぞれ複合体の内部に、構造を安定化するように含まれている。糖鎖中の高い電荷は、分子を生理的溶液中において溶媒和し、関連の荷電したタンパクドメインを外に向ける。生産プロセスではＡＣＥ２二量体のみが構築される最終産物である。
【０１０９】
ＡＣＥ２の生産に当たり、十分なＺｎ２＋イオンが必要である（好ましくは、１．５−５μＭのＺｎ２＋が用いられることである。特に発酵は、２．５−３．５μＭのＺｎ２＋下で行われることである）。以下の処置はＺｎ２＋イオンの存在下で行われる。
【０１１０】
精製は、陰イオン交換樹脂の段階、硫酸アンモニウム沈殿の段階、ＨＩＣの段階、陽イオン交換樹脂の段階に続き、さらなる高分解能の陰イオン交換樹脂の段階を経て行われた。すべての媒体は、リン酸緩衝液であり、塩化ナトリウムを含んだものである。
の段階がある。最終試料の緩衝液は、注射用の生理的グリシン溶液である。
【実施例２】
【０１１１】
生成物の性質
【０１１２】
複雑で高度にグリコシル化されたＡＣＥ２単量体または二量体のユニットである単量体は、共有結合した糖構造を持つため、示されたアミノ酸配列よりもはるかに高分子量である。それゆえ、ペプチドマッピングは分子量１０２ｋＤａを示すが、非グリコシル化したＡＣＥ２は８３ｋＤａしか示さない。糖の割合は２３％で一致し、以下に記述する生成物の性質にとって重要である。強い水和のために単量体ユニットはＳＤＳ−ＰＡＧＥで標準試料を指標として、１２０ｋＤａ（図３）を示す。
【０１１３】
天然には、膜結合型ＡＣＥ２は発現せず、ＡＣＥ２の溶解性分画が存在するだけである。膜結合ドメインが失われているため、完全にグリコシル化されている。
複雑で高度にシアル化されていて、そのような負電荷に荷電した糖構造を持つＡＣＥ２は、グリコシル化されていない、または不完全にグリコシル化されたＡＣＥ２に比べて、溶解性が高い。このように、１５ｍｇ／ｍＬまでの生理的緩衝タンパク製剤は、容易に製造することができる。
【０１１４】
さらに、生成物は長期間の保存にも溶液中で安定的であり、活性も失わず、安定な二量体から離れて、分解または凝集しない。一方、脱グリコシル化されたＡＣＥ２は、低い濃度の領域でも沈殿を生成する。これは、ＰＮＧａｓｅＦを用いた脱グリコシル化の実験によって示される。ＡＣＥ２にとって理論的に安定な指標は、４１.２であるが、これは不安定なタンパク質に分類され、糖構造はこの計算に考慮されていない。しかし、製剤は何ヶ月も安定であり、これは糖の割合が高いことによっていることが明らかにわかる。より溶媒和されたＡＣＥ２は、この製剤がもっぱらＡＣＥ２の二量体（または単量体への人工的な分離をした場合には、もっぱら単量体）からなることを示しているのに対し、グリコシル化されていないＡＣＥ２は、多量体形成および凝集しやすい。
【０１１５】
荷電した糖残基の大きな分画は、流体力学直径を増加させるため、実質的に存在するＡＣＥ２製剤の溶媒和鞘を増加させる。この状態は、ＡＣＥ２のサイズ排除カラムクロマトの生成実験によって研究された。ここで、タンパク質は、計算値の８３ｋＤａではなく、もっぱら見かけ分子量２５０ｋＤａ二量体で存在する。ＡＣＥ２の実験的精製のクロマトグラムを、図６に示す。ＡＣＥ２は保持時間が６９分だった（最初の図）。これは、分子量が、チログロブリン（最初の図において、７４分、１５８ｋＤａ）およびガンマグロブリン（最初の図において、５８分、６７０ｋＤａ）の間にあることを示している。この高分子量領域においては、実質的に培地の残基の混入が起こることはないため、非常に高純度の生成物が単純な分離過程を経て得られる。
【実施例３】
【０１１６】
生成物の薬理学的性質
【０１１７】
本発明のＡＣＥ２製剤は、生理的緩衝溶液中において、安定で、高純度で、凝縮したタンパク質溶液中で行われ、それ以上の安定化を要することなく貯蔵できる。例えば、リン酸緩衝液が用いられる。
【０１１８】
ＡＣＥ２は単量体または二量体として、溶液中で安定であり、高い糖の割合のために凝集しない。また、ＡＣＥ２製剤は、完全な酵素活性を有する。
【０１１９】
その溶解性のために、ＡＣＥ２は静脈内へボーラス投与することができる。同様の理由により、バイオアベイラビリティも投与後すぐに保証される。
【０１２０】
高度に分岐し、複雑な糖の割合のためにＡＣＥ２は、ゆっくりとしか分解しない。このことにより、様々な種類において測定されたが、少なくとも１０.５時間の半減期を有し、とりわけアカゲザルにおいて長時間となった。図７は、ＡＣＥ２を３種の動物に静脈内投与した場合の半減期を示す。
【０１２１】
シアル酸の割合が高いことは、ＡＣＥ２の免疫反応を中和する効果を蓄積できないことを示す。これは、ＡＣＥ２の外因性投与が逆効果であるだけでなく、自家製のＡＣＥ２は、細胞内において中和できることを示す。
【０１２２】
ＡＣＥ２製剤は、すべての関連する生成物の性質を持つため、ｒｈＡＣＥ２による治療も有効とする。
【実施例４】
【０１２３】
特異的ＡＣＥ２活性の決定
【０１２４】
ＡＣＥ２製剤の特異的活性の実験は、ＡｎｇＩＩ（Asp−Arg−Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe）の変換を測定することにより決定された。すべての測定は、１００μＬアリコートで３回行われた。酵素反応は５０ｍＭ ＭＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＭ ＺｎＣｌ２および０.０１％Ｂｒｉｊ−３０、ｐＨ６.５の８０μＭ ＡｎｇＩＩ溶液中に、２５０ｎｇ／ｍＬ ＡＣＥ２を加えることで開始した。試料は、注意深く攪拌し、３７℃で正確に１８分間培養した。酵素反応は、１００ｍＭ ＥＤＴＡを加えて停止させた。分析のため、溶液はＲＰ−ＨＰＬＣによって分離され、１ｍＬ／分の流量で（ウォーターズＣ１８μボンダパック、２.１（３００ｍｍ、１０μＭ、１２５Å）０.０８％Ｈ３ＰＯ４中、１０％ないし６０％ＣＨ３ＣＮの直線的勾配で２０分間で溶出した。また、ＡｎｇＩＩおよびＡｎｇ１−７のピークは、クロマトグラムで検出され、統合された。ペプチド濃度は、図８に示される適切なカリブレーション曲線のもと決定された。また、酵素的変換特異的酵素活性も決定した。
【０１２５】
ＡＣＥ２生成物の活性は、上述の通り決定した。表１は、ピークの積分値だけでなく、計算上の酵素データも示す。
【０１２６】
酵素のデータおよび反応条件を示す。３回の平均値を示す。
【表１】
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【０１２７】
ＡＣＥ２製剤は、ＡｎｇＩＩ変換を測定することにより、ｃｃａｔが８.０±０.３ｓ−１触媒活性を有し、Ａｎｇ１−７では８.８±０.２ｓ−１であった。両方の数値とも、整合的であり、ヴィッカーズらのＡＣＥ２のデータである３.５ｓ−１よりもはるかに高かった（J Biol Chem ２７７、（１７） （２００２）：１４８３８−４３）。反応条件は同一であった。我々の測定した製剤の活性が２４０％高かった理由は、転写後の修飾に違いなく、本件では、ヴィッカーズらがほとんど述べなかった最初のグリコシル化の試薬と考えられる。この物質は、昆虫の細胞に発現し、同一のアミノ酸配列を有し、分岐の程度が遙かに少なく、グリコシル化が分岐の程度が少ない。さらに、Ｒ＆Ｄシステムズにより市販されているＡＣＥ２製剤（カタログ番号９３３−ＺＮ）は、より小さい活性しか持たず、ｃｃａｔが２.０±０.１s−１であった。本発明の製剤の本質的な性質は、当初転写後の修飾によって行われていた特に高い酵素活性である。
【実施例５】
【０１２８】
遺伝子組換えＡＣＥ２のグリコプロテオミクス解析
【０１２９】
ＣＨＯ−ＡＣＥ２の発現したＣＨＯ細胞の、精製されたサンプルは、２つの方法によって分析した。
【０１３０】
最初にトリプシンペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳ−アルキル化を用いて製造し、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（およびＭＳ−ＭＳ）によって分析した。Ｎ端ペプチドおよびいくつかの内部ペプチドが見つかった。可能性のある７つのＮ−グリコシル化部位のうち、５つがフコースおよび様々な量のシアル酸を持つグリカン構造を主に持つ二つに分岐したグリコシル化された形態であった。Ｃ末端ペプチドは、Ｏ−グリコシル化されていると考えられる。
【０１３１】
次に、遊離の、減少したＮ−グリカンを炭素−ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析した。二つに分岐し、フコースを持ち、ジ−シアル化したグリカンについては、フコースはα１、６に、およびシアル酸はα２、３に結合している。単量体はジ−シアル化し、二つに分岐したグリカンに加え、相当な量の三つに分岐したオリゴ糖が見つかった。粗見積りでは、グリコシル化されたＡＣＥ２の分子量は１０１−１０２ｋＤａであり、すなわち、約１７％が糖質を構成している。
【０１３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離されたｈＢＣｈＥのタンパク質消化
【０１３３】
一定分量のＡＣＥ２について、記載のとおり、脱染し、カルバミドメチル化し、配列決定品質のトリプシンとともに消化し、ゲル断片を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。抽出物は、濃縮遠心分離機により乾燥し、０.１％ギ酸を含む水で、続くＬＣ−ＭＳ分析の前に戻した。オリゴ糖分析には、ペプチドをＰＮＧａｓｅ Ｆで消化し、グリカンをＣ１８ ＳＰＥカートリッジを用いて精製した。
【０１３４】
トリプチンペプチドおよびグリコールペプチドのＭＳ分析
【０１３５】
質量分析は、標準的なエレクトロスプレーユニット、キャップ−ＬＣシステム（ウォーターズ・ミクロマス社）および最近の文献に述べられているように１０ポートの溶媒交換モジュールを有する（レオダイン）［Ｋｏｌａｒｉｃｈ、２００６］Ｑ−ＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ Ｇｌｏｂａｌ装置（ウォーターズ・ミクロマス社）を用いて行った。サンプルは、まず、溶媒に水を用い、アクアシルＣ１８予備カラム（３０×０.３２ｍＭ、サーモエレクトロン）に吸着させた。分析カラムであるバイオベーシックＣ１８カラム（１００×０.１８ｍｍ、Ｔサーモエレクトロン社）を溶媒交換の前に５％アセトニトリルに維持し、続いて、直線的な勾配で５％から５０％アセトニトリルに、流速２μＬ／分で流した。すべての溶出溶媒は０.１％ギ酸を含む。
【０１３６】
サンプルは、ＭＳ−およびＭＳ−ＭＳによって分析した。データ分析は、ＭａｓｓＬｙｎｘ４.０ ＳＰ４ソフトウエア（ウォーターズ・ミクロマス社）を用いて行った。
【０１３７】
ＡＣＥ２から遊離したＮ−グリカンの分析
【０１３８】
水素化ホウ素還元されたグリカンを多孔性グラファイトカーボンカラムで分離し、質量分析法によって定量した。
【実施例６】
【０１３９】
グリコシル化の分析
【０１４０】
分子量、すべてのグリコシル化部位だけでなく、ＡＣＥ２タンパク質配列により結合した糖の構造もここで決定した。試料は、トリプシン消化、Ｓ−アルキル化およびＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析した。
・グリコシル化された生成物のタンパクの分子量は、１０２ｋＤａであり、糖の割合は全体の２３％であることがわかった；
・Ｎ末端およびすべての内部ペプチドの配列がここで決定された（配列情報を参照）；
・仮定されていた７つのＮ−グリコシル化部位（５３、９０、１０３、３２２、４３２、５４６および６９０）は、すべて二つに分岐し、複合シアル酸を含むフコース化糖構造であった；
・Ｃ末端ペプチドはＯ−グリコシル化されていた。
【０１４１】
糖残基の構造は、開裂および還元後、炭素−ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって決定された。それぞれ、およびすべての二つに分岐した構造体は、二つのα２、３−結合したシアル酸および、α１、６−結合したフコースを含んでいる。少量の三つに分岐した構造体も見られた（図１１）。選択戦略をとったとは、完全にグリコシル化され、シアル酸を含む発現物が得られたことを意味する。
【０１４２】
方法：
【０１４３】
試料製剤
ＡＣＥ２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、脱染、アルキル化およびトリプシンを用いて消化され分離された（Kolarich et al、Proteomics ６ （２００６）：３３６９−３３８０）。ゲル抽出物を乾燥し、ＬＣ−ＭＳによる分析の前に０.１％ギ酸に溶かした。糖の分析には、ペプチドはＰＮＧａｓｅ Ｆと消化され、Ｃ１８ ＳＰＥカラムで分離した。
【０１４４】
質量分析
すべての質量分析は、Q−TOF Ultima Global装置（ウォーターズ・ミクロマス社）を用い、標準電子スプレーおよびキャップＬＣシステム（ウォーターズ・ミクロマス社）を用いて行った（Kolarich、２００６）。
【０１４５】
試料は、水中でアクアシルＣ１８予備カラム（３０×０.３２ｍＭ、サーモエレクトロン）で濃縮した。分離したカラムは、Ｃ１８予備カラム（１００×０.１８ｍｍ、サーモエレクトロン）であり、アセトニトリルの濃度勾配下で用いられた。試料は、ＭＳおよびＭＳ−ＭＳによって分析した。
【０１４６】
遊離のＮ−グリカンの分析
水素化ホウ素を用いたグリカンの還元による生成物は、多孔性グラファイトカーボンカラムによって分離した。
【実施例７】
【０１４７】
ｒｈＡＣＥ２の二量化
【０１４８】
実施例１に従い生成したＡＣＥ２は、二量体であり、この実施例では二量体を分離せずに分析した。変性分析法に対し、従来的な処理方法では、二量体はそのままであった（図３）。用語「ＡＣＥ２の二量化」とは、すべての疎水性のタンパクユニットは複合体の内側を向いており、荷電した残基、例えばＮ−結合糖鎖は、外に突き出ており、同じく荷電している生理的な媒体中で構造体を溶媒和する。完全にＮ−グリコシル化されたＡＣＥ２の二量体の発現は、Ｚｎ２+存在下でなされる。この場合の二量体の複合体は、静電気で結合し、生理的溶液中ではもはや分解は受けない同一の二つのサブユニットからなる。これにより、糖タンパクは毎回１４の高度に荷電したシアル酸構造、二量体では２８のシアル酸構造を分泌する。それぞれ二つのＺｎ２+原子が複合体に組み込まれ、これが構造を安定化している。糖鎖における高荷電は、生理的水溶液中で分子を溶媒和し、関係する荷電したタンパクドメインを外に向かせる。製造プロセスは、ＡＣＥ２二量体が最終産物としてもっぱら存在するように組み立てられている。
【０１４９】
これは、ｒＡＣＥ２の生成の際に十分なＺｎ２+イオンが存在し（好ましくは１.５−５μＭ Ｚｎ２+下で製造されるために可能となっている；特に、発酵は、２.５−３.５μＭ Ｚｎ２+下で行われることである）、さらなる処理においてもイオンの存在下行われることで可能となる。
【０１５０】
図１４及び１５では、ＡＣＥ２二量体複合体は異なる方法で決定されている。ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動に続き、銀染色すると、タンパク質は約２５０ｋＤａに単一のバンドで現れる。サイズ分離クロマトグラフィーでも、２２０ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液でｐＨ７.０とした１０％アセトニトリルで、ゾルバックスＧ−４５０カラムを用いて、分子量約２５０ｋＤａに対応する保持時間に単一のピークとして現れる。いずれの場合においても、二量体のタンパク質がもっぱら検出された。単量体または高分子量の凝集体は、見られなかった。
【実施例８】
【０１５１】
ＡＣＥ２二量体−膜結合型のＡＣＥ２との違い
【０１５２】
ＡＣＥ２は、膜貫通型タンパク質として、すべての高等動物に、レニンアンジオテンシン系の不可欠な酵素として主に腎、心臓、肺および肝細胞に発現する。膜結合型ＡＣＥ２は、本来、脂質二重膜構造中、他の膜タンパク質とともに活性コンホメーションにあるＡＣＥ２を安定化し、またＡＣＥ２の細胞外ドメインをタンパク分解から守る。可溶性ＡＣＥ２の薬理学的性質および特に可溶性タンパク質の活性および安定性を促進するためには、安定なＡＣＥ２二量体構造をもっぱら製造する発現および製造戦略を立てなければならない。第一に、タンパクのＣ末端ドメインおよびその転写後修飾が二量化に本質的に重要である。ＡＣＥ２二量体構造の特異点を強調するために、膜結合型ＡＣＥ２をネイティブＰＡＧＥおよびＡＣＥ２−特異的ウエスタンブロット法を用いて分析した（図１６）。列ＡおよびＢは細胞抽出物を示し（皮質および大脳）、列Ｃは実施例１に従い合成されたＡＣＥ２二量体のクローン生成物の細胞抽出物を示す。膜結合生成物Ｃは、細胞外部分のみを構成するものであったが、実施例１の発現物質に比べ、はるかに低分子量であった（ＣおよびＤ）。これは膜結合型ＡＣＥ２が単量体として存在していることを示唆している。一方、薬理学的に有利な発現生成物は二量体からなる。列Ｄは、精製した最終生成物を分析した。これによれば、分子量約２４０ｋＤａで単一のバンドとして現れた。
【実施例９】
【０１５３】
ＡＣＥ２二量体の改善された薬理学的性質
【０１５４】
ＡＰＮ ０１は、もっぱらＡＣＥ２二量体構造からなる生理的ＡＣＥ２タンパク形態を示す。ここでは、二つのＡＣＥ２単量体は、非共有結合性の複合体を形成している。もっぱらＡＣＥ２二量体を含む安定な最終生成物を得るために、分子生物学的構造、発現細胞株、発酵過程、精製、および、貯蔵および投与用緩衝液を選択し、またはデザインした。二量体はより大きな複合体に凝集せず、また生理学的条件下では単量体に分離することもない。
【０１５５】
図１５（分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：ＡＰＮ ０１をサイズ分離標準物質（Ｂｉｏ−ＲＡＤ ＧＦ−標準物質、青の曲線）と比較した。分析条件：カラム：ゾルバックスＧＦ２５０、緩衝液：２２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋ １０％ＣＨ３ＣＮ、ｐＨ８.０、流量１ｍＬ／分）。ＡＰＮ ０１は、８.６分に単一のピークで溶出し、これはチログロブリン（６８０ｋＤａ、保持時間７.４分）およびウシガンマグロブリン（１５８ｋＤａ、保持時間８.９分）の間であった。この複合体の分子量の計算値は、約２１４ｋＤａである。これは、想定されていたそれぞれのユニットが１０２ｋＤａを持つ二つのＡＣＥ２の分子量におよそ合致する。
【０１５６】
比較の目的で、参照物質としてＣＨＯ細胞におけるＡＣＥ２単量体を製造し、同様にＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析した。そのクロマトグラムが図１７に示されている。単量体は保持時間９.０分で溶出し、これは分子量約１１０ｋＤａである。両方の生成物をＰＡＧＥで比較した（図１８ａ参照）。ＡＰＮ ０１（Ａ）は約２４０ｋＤａの分子量に対応するバンドに現れるのに対し、単量体の形態（Ｂ）は約１００ｋＤａに現れる。ＡＣＥ２−特異的ウエスタンブロット法により、これらの生成物の同一性が示されている（図１８ｂ）。
【０１５７】
蛍光ラベルした基質を用いて活性の測定したところ、両方の生成物は同一の特異的酵素活性を示した。図１９に示すとおり、同一の酵素濃度においては、単量体および二量体は互いに重なる曲線を示した。
【０１５８】
両方の生成物の薬理学的性質を比較するために、両製剤２.５ｍｇ／ｋｇをＢ１−６のマウスに腹腔内にボーラス投与し、２４および４８時間後に血清試料のＡＣＥ２酵素活性を測定した（図２０）。それぞれの個体が１００μＬの生理的タンパク質溶液を受け取れるように、タンパク質濃度を調節した。毎回、７動物をＡＰＮ ０１（ＡＣＥ２二量体）で処置し、５動物をＡＣＥ２単量体で処置した。ＡＣＥ２投与の前にはいずれの血清試料においてもＡＣＥ２活性は見られなかったので、すべての回において投与後の全身のＡＣＥ２活性を測定した。投与後ちょうど２４時間後、両方のグループは顕著な違いが見られた（ｔ試験、ｐ＜０.００１）：ＡＣＥ２二量体で処置された動物は、ＡＣＥ２濃度が０.９μｇ／ｍＬであったのに対し、ＡＣＥ２単量体で処置された動物は０.２μｇ／ｍＬの濃度の動物が一つあるのみだった。４８時間後、ＡＣＥ２ホモ二量体で処置されたグループは、まだ０.２μｇ／ｍＬの活性が残っていたのに対し、単量体で処置されたグループは全身のＡＣＥ２活性は検出されなかった。これらのデータは、ＡＣＥ２二量体が、薬理学的に非常に有利な性質を持つことを示す。