【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年11月5日(2010.11.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に無定形のタンパク質微粒子を含む微粒子の注射用組成物であって、該組成物は、１ｍｌの該組成物当たり少なくとも約５０ｍｇの該タンパク質の濃度を提供し、該タンパク質の溶液は、媒体中で測定され、所与の経路によって投与された時、識別可能な値の選択された薬物動態学的特性を有し、該微粒子の組成物は、該所与の経路によって投与された時、該媒体中で、該選択された薬物動態学的特性の識別可能な値と実質的に同じ値を示す、組成物。
【請求項２】
前記タンパク質の分子量が、少なくとも約２５，０００ダルトンである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質が、生理学的条件下、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌで可溶性である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記選択された薬物動態学的特性が、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、曲線下面積（ＡＵＣ）、相対的バイオアベイラビリティ、および血中グルコースレベルの抑制である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、皮下注射用組成物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
有効量の前記組成物を、臨床的に許容しうる量の力を用いて、約２分未満内で注射することができる請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記タンパク質が、抗体またはインシュリンである請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記タンパク質が、モノクローナル抗体である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
臨床的有効量の前記タンパク質が、前記組成物の約１０ｍｌ以下で分散する請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
臨床的有効量の前記タンパク質が、前記組成物の約２ｍｌ以下で分散する請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質微粒子の平均粒径が約５０ミクロン以下であり、前記注射用組成物が、２０ゲージまたはそれより細い注射針を通過する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、前記タンパク質を、少なくとも約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、前記タンパク質を、少なくとも約３００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、前記タンパク質を、少なくとも約４００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、前記タンパク質を、少なくとも約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
約４００ｍｇ／ｍｌまでの前記タンパク質を含有する前記組成物１ｍｌを、臨床的に許容しうる量の力を用いて、約４５秒以下で、注射することができる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗体が、前記微粒子の総重量に対して、約２０〜約１００重量％の該微粒子を構成する請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１８】
医薬において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
医薬の製造における、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】薬物動態学的および薬力学的特性を保持するタンパク質マイクロスフェア
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００６年１１月７日に出願された出願第１１／５５７，４８６号の一部継続であり、出願第１１／５５７，４８６号は、２００５年５月１２日に出願された出願第１１／１２７，７０４号の一部継続であり、出願第１１／１２７，７０４号は、２００４年７月１９日に出願された出願第１０／８９４，４１０号の一部継続である。この出願は、２００４年５月１２日に出願された、米国仮出願第６０／５７０，２７４号への優先権を主張する。これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用され、本明細書の一部を成す。
【０００２】
本開示は、活性剤の、形態が実質的に球状であってもよい、小粒子の組成物に関する。活性剤は、高分子量のタンパク質でもよく、通常、実質的に無定形のモノクローナル抗体を始めとする、実質的に無定形の高分子量タンパク質である。本開示では、モノクローナル抗体を始めとする高分子量のタンパク質を高濃度で注射または注入することができる組成物を提供することが記載され、したがって、臨床的に有効な用量のそのような活性剤を、組成物の低容積で、組成物１０ｍｌ以下で、より一般的には、注入可能な皮下ボーラス注射で一般的な注入可能な低容積注射を含む、注射器用途で見られる一般的な容積で、送達する能力を提供する。本開示の組成物に形成された活性剤は、哺乳類に注射された時、未変化の薬物動態学的および薬力学的特性を発揮する。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
開示の分野
生体高分子ナノ粒子および微粒子の製造に関しては過去に数種の技術が使用されてきている。従来の技術として、粒子形成のための噴霧乾燥およびミル加工が挙げられ、５ミクロン以下のサイズの粒子を製造するために使用することができる。
【０００４】
特許文献１および特許文献２には、固体形状の組換えヒト成長ホルモン、ｈＧＨの製造であって、無定形複合体を作るために、亜鉛との複合体形成を行い、次いで超音波ノズルでミクロン化し、液滴を凍結するために液体窒素に噴霧する製造が記載されている。液体窒素は、次いで−８０℃の温度で蒸発させ、得られた物質は、凍結乾燥される。
【０００５】
微粒子およびマイクロスフェアは、１ミリメーター未満、通常１００ミクロン未満、１０ミクロン未満の場合もある直径を有する固体または半固体状粒子であり、これは、タンパク質、合成ポリマー、多糖類およびこれらの組合せを始めとする種々の物質で形成されうる。マイクロスフェアは、多くの異なる用途（主として、分離、診断および活性剤送達）に使用されてきている。
【０００６】
制御された活性剤送達分野では、分子は、小球形粒子内に組み入れられまたはカプセル化されることが多く、または後続放出用の一体マトリクスに組み入れられる。合成ポリマー、天然のポリマー、タンパク質および多糖類からこれらのマイクロスフェアを作るために、数多くの異なる技術が日常的に使用され、相分離、溶剤蒸発、コアセルベーション、乳化、および噴霧乾燥が挙げられる。一般的に、ポリマーは、これらのマイクロスフェアの支持構造体を形成し、関心のある活性剤が、ポリマー構造体に組み入れられる。
【０００７】
標的活性剤をカプセル化するために脂質を使用して製造された粒子が、現在、入手可能である。リポソームは、単一または複数のリン脂質および／またはコレステロール２分子層で構成される球形粒子である。リポソームは、サイズが１００ナノメーター以上で、種々の水溶性または脂溶性活性剤を運ぶことができる。たとえば、複数の水性コンパートメントを囲む２分子層膜に配置され、粒子を形成する脂質は、特許文献３、Ｓｉｎｉｌ  Ｋｉｍで記載されているように、後続送達のための水溶性活性剤をカプセル化するために使用してもよい。
【０００８】
粒子、特に活性剤送達、分離および診断分野における使用に適用することができる粒子を製造する新しい方法の開発が、現在、必要とされている。利用性の観点から最も望ましい粒子は、以下の特徴を有する：狭いサイズ分布を有し、実質的に球状で、実質的に活性剤だけからなり、生化学的一体性および活性剤の生物学的活性を保持する小球形粒子である。さらに、小球形粒子を生産する方法は、以下の望ましい特徴を有する：生産が簡単で、本質的に水性プロセスであり、高収率でありおよび後続のふるい分けを必要としない方法である。また、活性剤の薬物動態学的および薬力学的特性を保持する粒子処方物が望ましい。活性剤の薬力学的パラメーターは、肉体の生化学的および生理学的効果を反映する。活性剤の薬物動態学的（ＰＫ）パラメーターは、体内の特定の代謝を反映し、ＰＫパラメーターの測定は、活性剤挙動をモニターするために使用できる。
【０００９】
活性剤の測定されたＰＫパラメーターと薬力学的特性との間には、強力な相関関係がある。たとえば、特定の活性剤に関する有効用量とＰＫパラメーターとの間の相関関係は、十分に確立され、ＰＫパラメーターは、投与方法を変更する必要があるか否かを決定するために、あるいは活性剤代謝に影響する患者の生理機能に変化があったか否かを決定するために、使用することができる。長い期間の治療が完了するまで、活性剤の治療効果を直接定量化することが困難な場合もあり、ＰＫパラメーターの測定を、治療期間内の活性剤挙動の尺度の１つとして使用してもよい。たとえば、癌または他の疾患を治療するために与えられる抗体のＰＫ特性は、治療中、モニターすることができる。非粒子形の活性剤と比べて、確立されたＰＫパラメーターに関して、実質的に同じ値を示すが、粒子の形を取る処方物の利点を持つ処方物を有することは、有益であろう。また、免疫反応につながる免疫学的刺激を起こさない粒子処方物を有することも有益であろう。そのような反応は、たとえば、粒子が簡単に溶解せず、注射する部位に蓄積物を形成する場合に起こるかもしれない。測定薬物動態学的パラメーターとして、Ｃｍａｘ（ピーク血清濃度）、Ｔｍａｘ（Ｃｍａｘに到達する時間）、ＡＵＣ（血清濃度曲線の下の面積）およびＦｒｅｌ（相対的バイオアベイラビリティ）が挙げられるが、これらに限定されない。測定ＰＫパラメーターは、特定の媒体中で測定され、媒体が血流、または体内のある他の部分である場合、通常、インビボで測定される。ＰＫ測定が媒体中でなされるので、ＰＫ値は、通常、タンパク質のような関心のある物質または活性剤を含有する組成物に関して測定される。
【００１０】
タンパク質は、鎖長が三次および／または四次構造のより高いレベルを製造するのに十分なアミノ酸の配列である。これは、「ペプチド」またはそのような構造を持たない他の小分子量活性剤から区別される。
【００１１】
抗体（イムノグロブリン）は、外来分子（抗原）または侵入生物に応答して、免疫細胞（Ｂリンパ球）によって産生されるタンパク質である。抗体は、外来分子または細胞に非常にきつく結合することが多く、こうすることで、食作用または補体誘発溶解によって分解するために、それを不活性化またはマーキングする。より高等な脊椎動物は、イムノグロブリンの５つのクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを有し、それぞれ、免疫応答において異なる役割を持つ。
【００１２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、高度に特異的な、精製抗体（イムノグロブリン分子）であり、免疫細胞（Ｂリンパ球）のただ１個のクローンから誘導され、ただ１個の外来分子（抗原）の特異的部位を認識する。モノクローナル抗体は、実験室操作（マウス、キメラ、ヒト化）によって量産することができる。用語「モノクローナル抗体」は、広い意味で使用され、具体的には、イムノグロブリンＦｃ領域を有するモノクローナル抗体、多エピトープ特異性を持つ抗体組成物、二重特異性抗体、ジアボディーおよび一本鎖分子、ならびに抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ）をカバーする。
【００１３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、細胞の１クローンから誘導される抗体の実験室由来の集団でありえ、１つの特定の抗原部位の結合において、非常に特異的である。それらは、ほぼ１５０ｋＤａの大タンパク質で、４つのポリペプチド鎖：それぞれ約２５ｋＤａの２つの軽鎖と、それぞれ約５０ｋＤａの２つの重鎖とで構成される。それらは大分子量であるため、モノクローナル抗体の溶液は、非常に粘稠で、現在、静脈内注射で送達される。
【００１４】
ポリクローナル抗体は、単一の外来分子（抗原）の多くの部位に特異的な様々な抗体（イムノグロブリン分子）である。自然のままの免疫応答はポリクローナル性である。血清からの抗体の精製製剤も、種々の治療用途に使用される。ＩＶＩＧと言われるそのような製剤の１つは、血液由来の精製ＩｇＧ抗体の代表である。そのような製剤は、しばしば、免疫抑制個体の受動免疫を与えるために使用される。
【００１５】
捕捉分子といわれる抗体は、２つの異なるレセプター成分の間の溶融物と、「Ｆｃ領域」と呼ばれる抗体分子の部分とで構成され、単一成分試薬によって提供される親和性より格段に増加した親和性を持つ、成長因子およびサイトカインブロッカーを産生する。捕捉分子は、たとえば、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されてきている。
【００１６】
抗体は、治療効果を達成するために、比較的大量に送達されることを必要とすることが多い。たとえば、多くの抗体の送達用量は、１００〜８００ｍｇの間である。これら大量の物質の注射可能性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）には、実質的な配合および送達に関し、難問が存在する。そのような大用量の小容量は、通常、高粘度であり、したがって、ほぼｌ０ｍｌを十分超える大容量、たとえば、約５００ｍｌ、時には約２５０ｍｌと５００ｍｌとの間で、抗体を静脈内送達する必要がある。静脈内送達は、患者にとって非常に不快で、臨床現場を必要とし、費用も時間もかかる。
【００１７】
本開示による迅速な微粒子溶解技術は、処方物より低い粘度を持つ、高濃度懸濁物の形成を可能にし、薬剤が、高濃度の可溶型であるが、微粒子は迅速に溶解し、活性剤は、未変化の薬物動態学的および薬力学的パラメーターを発揮するので、この市場に重要な利益をもたらす。さらに、粒子処方物は、注射時に容易に可溶化することができ、可溶型で注射する時、薬剤の薬物動態学的特性および薬力学的特性を保持することができる。同様に、高分子量のタンパク質を含む他の活性剤も、本開示から利益を享受する。本開示では、高い濃度を比較的少ない容量で送達することができる、注入可能性および注射可能性特性を有する組成物が記載されている。本開示以前は、モノクローナル抗体、他の抗体、または約２５ｋＤａを超える分子量を持つ他の高分子量タンパク質は、２０ゲージ以下、２１ゲージ以下、２２ゲージ以下、２３ゲージ以下、２４ゲージ以下、２５ゲージ以下、２６ゲージ以下、２７ゲージ以下、または２８ゲージ以下のような微細針であって、標準のシリンジに結合して使用される針を用いて、高濃度注射することはできなかった。本開示の以前では、臨床的に有効な用量のタンパク質を含有して、そのようなタンパク質を、少ない容量、たとえば、１０ｍｌ以下、９ｍｌ以下、８ｍｌ以下、７ｍｌ以下、６ｍｌ以下、５ｍｌ以下、４ｍｌまたは３ｍｌ以下で、あるいは皮下注射送達と一致する容量、たとえば、２ｍｌ以下または１ｍｌ以下で、送達することは不可能であった。これらの分子に関連する微粒子技術を使用することにより、これまで必要とされたような、これらの分子の高容量注射に関する問題が解決される。さらに、活性剤の処方物の薬力学的および薬物動態学的パラメーターは変化しない。また、この開示は、低分子量のタンパク質物質を、高濃度で、および小注射容量内で短い送達時間の間に送達することを補助することにも有用である。本開示によれば、注射による送達に一致した容量、たとえば、２ｍｌ以下を、臨床的に許容しうる量の力を用いて、臨床的に許容しうる時間枠内、たとえば、２分以下で送達することができる。
【００１８】
モノクローナル抗体を生産する方法は、面倒な作業であり、高い価格であることが明らかにされている。したがって、ｍＡｂが、非常に効率的および安全な方法で、標的箇所に正確に送達されることは重要である。微粒子の製造および送達において、ｍＡｂが高い収率で易溶性微粒子またはマイクロスフェアに形成されるかどうか、それらのそれぞれの化学的一体性を保持するかどうか、ｍＡｂのような物質の場合、皮下投与、経口投与または他の投与経路によって送達することが可能な非常に良好な注射可能性を持つどうかも重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許第５，６５４，０１０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６６７，８０８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４２２，１２０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本開示の態様または目的は、実質的に無定形または非結晶性の抗体微粒子を提供することである。
【００２１】
本開示の他の態様または目的は、実質的に無定形または非結晶性の抗体微粒子を含む注入可能な組成物を提供することである。
【００２２】
本開示のさらなる態様または目的は、たとえ、タンパク質の分子量が約２５，０００ダルトン以上であっても、約１０ｍｌ以下の組成物で、臨床的に有効な用量のタンパク質を提供する注入可能な組成物を提供することである。
【００２３】
本開示のさらなる態様または目的は、たとえ、タンパク質の分子量が約２５，０００ダルトン以上であっても、臨床的に有効な用量のタンパク質を、約２ｍＬ以下の組成物で提供する注入可能な組成物を提供することである。
【００２４】
本開示のさらなる態様または目的は、活性剤が、少なくとも約２５，０００ダルトンの分子量を持つ場合、特に利点のある用途を見出す、臨床的に有効な用量１ｍｌ当たり少なくとも約５０ｍｇの活性剤を持つ微粒子を提供することである。
【００２５】
本開示の他の態様または目的は、皮下注射（これに限定されない）のような、高濃度での注射による活性剤送達で、臨床的に有効な方法を用いて、微粒子を使用する方法を提供することである。
【００２６】
本開示のさらなる態様または目的は、比較的高分子量のタンパク質物質の微粒子を製造するプロセスである。
【００２７】
本開示の他の目的または態様は、微粒子、通常はマイクロスフェアであって、易溶性であり、すなわちＰＢＳ緩衝液中、生理学的ｐＨで約１０分以内の溶解性を発揮し、一方、化学的一体性を示し、すなわち、少なくとも約９０％の化合物が微粒子において化学的に無処理であり、およびとりわけ注入可能な形態、すなわち少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの懸濁物で、注射が可能であることを示し、および過剰な力を使うことなく、微細針によって懸濁物を送達することができる微粒子を提供することである。
【００２８】
本開示の他の態様または目的は、活性剤の確立された薬物動態学的特性および薬力学的特性を保持する、活性剤の微粒子を提供することである。
【００２９】
本開示の他の態様、目的および利点は、本開示の実施形態による以下の記載、具体的には本明細書に記載された種々の特徴の記載されたおよび記載されていない組合せ、添付された図面に示された関連する情報を含むものから理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
実質的に無定形のタンパク質微粒子を含む微粒子の注射用組成物であって、該組成物は、１ｍｌの該組成物当たり少なくとも約５０ｍｇの該タンパク質の濃度を提供し、該タンパク質の溶液は、媒体中で測定され、所与の経路によって投与された時、識別可能な値の選択された薬物動態学的特性を有し、該微粒子の組成物は、該所与の経路によって投与された時、該媒体中で、該選択された薬物動態学的特性の識別可能な値と実質的に同じ値を示す、組成物。
（項目２）
上記タンパク質の分子量が、少なくとも約２５，０００ダルトンである項目１に記載の組成物。
（項目３）
上記タンパク質が、抗体である項目１に記載の組成物。
（項目４）
上記タンパク質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ＩＶＩＧ、抗体フラグメント、捕捉分子、一本鎖抗体、その組換え型およびこれらの組合せからなる群から選択される抗体を含む項目１に記載の組成物。
（項目５）
上記タンパク質が、モノクローナル抗体である項目１に記載の組成物。
（項目６）
上記タンパク質が、インシュリンである項目１に記載の組成物。
（項目７）
上記タンパク質が、生理学的条件下、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌで可溶性である、項目２に記載の組成物。
（項目８）
上記選択された薬物動態学的特性が、Ｃｍａｘである項目１に記載の組成物。
（項目９）
上記選択された薬物動態学的特性が、Ｔｍａｘである項目１に記載の組成物。
（項目１０）
上記選択された薬物動態学的特性が、曲線下面積（ＡＵＣ）である項目１に記載の組成物。
（項目１１）
上記選択された薬物動態学的特性が、相対的バイオアベイラビリティである項目１に記載の組成物。
（項目１２）
上記組成物が、約５００ｍｇ／ｍｌまでの上記タンパク質の濃度を提供する項目１に記載の組成物。
（項目１３）
上記組成物が、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの上記タンパク質の濃度を提供する項目１に記載の組成物。
（項目１４）
上記組成物が、約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの上記タンパク質の濃度を提供する項目１に記載の組成物。
（項目１５）
上記組成物が、皮下注射用組成物である項目１に記載の組成物。
（項目１６）
臨床的有効量の上記タンパク質微粒子が、上記組成物の約１０ｍｌ以下で分散する項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
臨床的有効量の上記タンパク質微粒子が、上記組成物の約２ｍｌ以下で分散する項目１５に記載の組成物。
（項目１８）
臨床的有効量の上記組成物を、臨床的に許容しうる量の力を用いて、約２分未満内で注射することができる項目１５に記載の組成物。
（項目１９）
上記タンパク質微粒子の平均粒径が約５０ミクロン以下であり、上記注射用組成物が、２０ゲージまたはそれより細い注射針を通過する項目１に記載の組成物。
（項目２０）
約４００ｍｇ／ｍｌまでの上記タンパク質を含有する上記組成物１ｍｌを、臨床的に許容しうる量の力を用いて、約４５秒以下内で注射することが可能である項目１に記載の組成物。
（項目２１）
上記微粒子が、さらに、賦形剤を含む項目１に記載の組成物。
（項目２２）
実質的に無定形の抗体を含む微粒子であって、該抗体の溶液が、媒体中で測定し、所与の経路で投与された時、識別可能な値の選択された薬物動態学的特性を持ち、該微粒子が、同じ媒体中で測定され、該所与の経路によって投与された時、該選択された薬物動態学的特性の識別可能な値と実質的に同じ値を示す、微粒子。
（項目２３）
上記選択された薬物動態学的特性が、１つ以上のＣｍａｘ、Ｔｍａｘ、曲線下面積（ＡＵＣ）および相対的バイオアベイラビリティからなる群から選択される項目２２に記載の微粒子。
（項目２４）
上記抗体が、モノクローナル抗体である項目２２に記載の微粒子。
（項目２５）
上記微粒子が、約５０ミクロン以下の粒径のマイクロスフェアである項目２２に記載の微粒子。
（項目２６）
上記微粒子が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ＩＶＩＧ、モノクローナル抗体フラグメント、捕捉分子、一本鎖抗体、その組換え型およびこれらの組合せからなる群から選択される抗体を含む項目２２に記載の微粒子。
（項目２７）
上記微粒子が、さらに、賦形剤を含む項目２２に記載の微粒子。
（項目２８）
上記抗体が、上記微粒子の総重量に対して、約２０〜約１００重量％の該微粒子を構成する項目２２に記載の微粒子。
（項目２９）
薬物動態学的特性を所与の媒体中で測定し、所与の経路によって投与する、選択された薬物動態学的特性を必要とする用途のためにタンパク質微粒子組成物を投与するための方法であって、該方法は、
媒体内で識別可能な値の選択された薬物動態学的特性を有する、可溶型のタンパク質分子を提供するステップと、
該タンパク質分子から微粒子を形成するステップと、
該微粒子を投与するために、該微粒子を該組成物として処方するステップと、
該組成物を個体に投与し、それによって、該媒体内で測定し、および該所与の経路によって投与された時、該微粒子組成物が、該識別可能な値と実質的に同じ値である該選択された薬物動態学的特性の値を有するステップと、
を含む方法。
（項目３０）
上記タンパク質分子が治療剤である項目２９に記載の方法。
（項目３１）
上記タンパク質分子が抗体である項目２９に記載の方法。
（項目３２）
上記タンパク質分子がインシュリンである項目２９に記載の方法。
（項目３３）
上記タンパク質分子が、上記媒体において少なくとも約０．５１ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌで可溶性である、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
上記選択された薬物動態学的特性が、１つ以上のＣｍａｘ、Ｔｍａｘ、曲線下面積（ＡＵＣ）および相対的バイオアベイラビリティからなる群から選択される項目２９に記載の方法。
（項目３５）
上記処方するステップでは、上記組成物中に、上記タンパク質分子を、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目２９に記載の方法。
（項目３６）
上記処方するステップでは、上記組成物中に、上記タンパク質分子を、少なくとも約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目２９に記載の方法。
（項目３７）
上記処方するステップでは、上記組成物中に、上記タンパク質分子を、少なくとも約４００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目２９に記載の方法。
（項目３８）
上記処方するステップでは、上記組成物中に、上記タンパク質分子を、少なくとも約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目２９に記載の方法。
（項目３９）
上記処方するステップでは、皮下送達用の組成物が調製され、上記投与するステップは皮下的に実行される、項目２９に記載の方法。
（項目４０）
上記投与するステップは、上記タンパク質分子の不溶性微粒子型によるものであり、該タンパク質分子は、上記個体の免疫系の細胞によってエンドサイトーシスされない、項目２９に記載の方法。
（項目４１）
上記投与するステップでは、上記組成物を臨床的に許容しうる量の力を用いて、約２分未満内に注射する、項目２９に記載の方法。
（項目４２）
上記投与するステップでは、少なくとも１ｍｌの上記組成物を、臨床的に許容しうる量の力を用いて、約４５秒以下で注射する、項目２９に記載の方法。
（項目４３）
上記投与するステップでは、２０ゲージまたはそれより細い針による、項目２９に記載の方法。
（項目４４）
タンパク質の天然型の薬物動態学的特性を模倣する方法であって、
天然型で投与した時、選択された薬物動態学的特性を有する天然のタンパク質分子を提供するステップと、
該タンパク質分子から微粒子を形成し、非天然型のタンパク質分子を提供するステップと、
該非天然型のタンパク質微粒子を、該選択された薬物動態学的特性を模倣する様式で投与するステップと、
を含む方法。
（項目４５）
上記形成するステップにより、上記タンパク質分子を、組成物として少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目４４に記載の方法。
（項目４６）
上記形成するステップにより、上記タンパク質分子を、組成物として少なくとも約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目４４に記載の方法。
（項目４７）
上記形成するステップにより、上記タンパク質分子を、組成物として少なくとも約４００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目４４に記載の方法。
（項目４８）
上記形成するステップにより、上記タンパク質分子を、組成物として少なくとも約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目４４に記載の方法。
（項目４９）
実質的に無定形のタンパク質微粒子の懸濁物を含む微粒子の注射用組成物であって、該組成物は、組成物１ｍｌ当たり少なくとも約５０ｍｇの濃度の該タンパク質を提供し、該タンパク質の分子量は、少なくとも約２５，０００ダルトンであり、有効量の該組成物を、臨床的に許容しうる量の力を用いて、約２分未満で注射することができる、組成物。
（項目５０）
上記有効量が、約２ｍｌ以下の用量で含有される項目４９に記載の組成物。
（項目５１）
上記組成物が、上記タンパク質分子を、少なくとも約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目４９に記載の組成物。
（項目５２）
上記組成物が、上記タンパク質分子を、少なくとも約３００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目４９に記載の組成物。
（項目５３）
上記組成物が、上記タンパク質分子を、少なくとも約４００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目４９に記載の組成物。
（項目５４）
上記組成物が、上記タンパク質分子を、少なくとも約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目４９に記載の組成物。
（項目５５）
約４００ｍｇ／ｍｌまでの上記タンパク質を含有する処方物１ｍｌを、臨床的に許容しうる量の力を用いて、約４５秒未満で、注射することができる、項目４９に記載の組成物。
（項目５６）
適用するために微粒子形態でタンパク質分子を投与する方法であって、
少なくとも約２５，０００ダルトンの分子量を持つタンパク質分子を提供するステップと、
該タンパク質分子を微粒子に形成するステップと、
該微粒子を投与するために、該微粒子を組成物として処方するステップと、
該処方物を、個体に投与するステップと、
を含み、該微粒子は、臨床的に許容しうる量の力を用いて、約２分未満内で注射することができる、方法。
（項目５７）
上記処方するステップでは、上記タンパク質分子が、上記組成物中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
上記処方するステップでは、上記タンパク質分子が、上記組成物中、少なくとも約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
上記処方するステップでは、上記タンパク質分子が、上記組成物中、少なくとも約４００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
上記処方するステップでは、上記タンパク質分子が、上記組成物中、少なくとも約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供される、項目５６に記載の方法。
（項目６１）
実質的に無定形のタンパク質微粒子の懸濁物を含む微粒子の注射用組成物であって、該組成物は、該組成物１ｍｌ当たり少なくとも約５０ｍｇの濃度の該タンパク質を提供し、該タンパク質の溶液は、媒体中で測定され、所与の経路によって投与された時、識別可能な値の選択された薬力学的特性を有し、該組成物は、該所与の経路によって投与された時に、該媒体中、実質的に同じ識別可能な値の該選択された薬力学的特性を示す、組成物。
（項目６２）
上記タンパク質がインシュリンである項目６１に記載の組成物。
（項目６３）
上記薬力学的特性が、血中グルコースレベルの抑制である項目６１に記載の組成物。
（項目６４）
上記組成物が、上記タンパク質分子を、上記処方物中、少なくとも約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目６１に記載の組成物。
（項目６５）
上記組成物が、上記タンパク質分子を、該組成物中、少なくとも約３００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目６１に記載の組成物。
（項目６６）
上記組成物が、上記タンパク質分子を、該組成物中、少なくとも約４００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目６１に記載の組成物。
（項目６７）
上記組成物が、上記タンパク質分子を、該組成物中、少なくとも約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で提供する項目６１に記載の組成物。
（項目６８）
上記タンパク質が抗体である項目４９に記載の組成物。
（項目６９）
上記抗体がモノクローナル抗体である項目６８に記載の組成物。
（項目７０）
上記懸濁物が、上記モノクローナル抗体を、３００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で含む、項目６９に記載の組成物。
（項目７１）
上記懸濁物が、上記モノクローナル抗体を、３２５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で含む、項目７０に記載の組成物。
（項目７２）
上記懸濁物が、上記モノクローナル抗体を、３５０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で含む、項目７１に記載の組成物。
本開示は、高い用量の注射可能特性を持つタンパク質微粒子に関する。タンパク質が活性剤であり、微粒子は、実質的に無定形または非結晶性である。これらの組成物で、非常に高い濃度の活性剤を、非常に少ない容量で送達することができる。これらの微粒子における活性剤は、可溶型で投与した場合の特性と比較して、薬力学的特性および薬物動態学的特性が、変化していない。
【００３１】
本開示の活性剤は、治療薬剤または診断剤であってもよい。本開示の代表的な実施形態では、活性剤は、タンパク質のような巨大分子であり、モノクローナル抗体を始めとする抗体が挙げられる。他の実施形態では、活性剤を含有する粒子は、薬剤を必要とする対象に、任意の適切な経路によって、インビボ送達することに適しており、あるいはこの種の巨大分子には実施できない、皮下注射および／または眼球注射の取り組みが挙げられる。
【００３２】
また、本開示は、薬物動態学的特性および薬力学的特性を保持し、活性剤の小球形粒子またはマイクロスフェアを含む微粒子を製造する方法および使用する方法に関する。製造法によれば、溶解された相分離促進剤を含有する溶剤に、活性剤を溶解し、単一液相の溶液を形成する。溶剤は、水性溶剤でも、水混和性溶剤でもよい。溶液は、次いで、固相を構成する活性剤と、液相を構成するＰＳＥＡおよび溶剤とを有する液−固相分離に供する。液−固相分離は、数々の方法、たとえば、溶液の温度を、溶液の相転移温度未満に変えることにより、引き起こすことができる。
【００３３】
本開示の実施形態では、溶液を、液−固相分離に供する方法は、溶液を、溶液中の活性剤の相転移温度未満に冷却することにより行う。当該温度は、溶液の凍結点を超えても、未満でもよい。凍結点が相転移温度を超える溶液については、溶液に、ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールのような凍結点降下剤を加えて、溶液の凍結点を下げ、溶液中の相分離を溶液が凍結することなく起こすようにしてもよい。
【００３４】
本開示の相分離促進剤は、溶液を、活性剤が固化し、不連続相として小球形粒子の懸濁物を形成し、一方相分離促進剤は、連続相に溶解したままである相変化のステップに供する時に、溶液中での活性剤の液−固相分離を強化または誘発する。すなわち、相分離促進剤は相変化を起こさないが、活性剤は相変化を起こす。
【００３５】
また、本開示における粒子を製造する方法は、粒子の液−固相分離を制御し、形成する粒子のサイズおよび形状を制御する追加のステップを含んでもよい。相分離を制御する方法として、イオン強度、ｐＨ、相分離促進剤の濃度、溶液中の活性剤の濃度の制御、または溶液温度の変化速度の制御が挙げられ、これらの制御は、相分離を誘発するために、相分離の前に、またはこれらのどれかまたはいくつかを行う。
【００３６】
本開示の他の実施形態では、小球形粒子は、粒子形成後、連続相でＰＳＥＡから分離される。さらなる実施形態では、分離方法は、活性剤は液体媒体に対し溶解性がなく、相分離促進剤は液体媒体に対し溶解性がある、液体媒体で、粒子を含有する溶液を洗浄することにより行われる。液体洗浄媒体は、液体媒体中で活性剤の溶解性を減らす薬剤を含有してもよい。また、液体洗浄媒体は、１種以上の賦形剤も含有してよい。賦形剤は、小球形粒子用の、または活性剤用の、または担体剤用の安定剤として作用することができる。また、賦形剤は、活性剤または粒子に、粒子からの活性剤の制御放出、または生体組織を通る活性剤の透過の変更のような、追加の特徴を持たせることもできる。
【００３７】
他の実施形態では、小粒子はＰＳＥＡを含まないが、ＰＳＥＡ相からの分離の前に、後続の加工ステップのために、ＰＳＥＡ相の存在下に、採取されてもよい。他の実施形態では、溶液は、水性または水混和性溶剤を含む水溶液である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例３で記載するように製造された、抗第ＶＩＩＩ因子のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの光学顕微鏡画像。
【図２】実施例３で記載するように製造された、抗第ＶＩＩＩ因子のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの偏光光学顕微鏡画像。
【図３】実施例３で記載するように観察された、抗第ＶＩＩＩ因子のモノクローナル抗体のマイクロスフェア走査電子顕微鏡写真。
【図４Ａ】実施例４に記載するような抗第ＶＩＩＩ因子のモノクローナル抗体（出発物質および溶解マイクロスフェア）のゲル電気泳動像。
【図４Ｂ】実施例４に記載するような抗第ＶＩＩＩ因子のモノクローナル抗体（出発物質および溶解マイクロスフェア）のゲル電気泳動像。
【図５】実施例５に記載するように観察された、抗第ＶＩＩＩ因子のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの走査電子顕微鏡写真。
【図６】実施例５に記載するような抗第ＶＩＩＩ因子のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの数、表面積および体積分布による粒度分布を報告する。
【図７】実施例６に記載するように製造された、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの光学顕微鏡画像。
【図８】実施例８に記載するように製造された、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの光学顕微鏡画像。
【図９】実施例６に記載するように製造された、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの走査電子顕微鏡写真。
【図１０】実施例６に記載するように製造された、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの数分布による粒度分布を報告する。
【図１１】抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェア（２スリット構成を持つ）および実施例１０に記載するようなヘキサトリアコンタン：シリコンの混合物のＸ線粉末回折。
【図１２】実施例７に記載するように、ポロキサマーで冷却中の抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの立体配座安定性の蛍光モニタリングを報告する。
【図１３】温度に対する活性剤濃度をプロットした二次元状態図。
【図１４】小球形粒子に製造した時のインシュリンの化学安定性の全体的な保持性を示すＨＰＬＣ分析。
【図１５】アルファ−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）の円偏光２色性（ＣＤ）プロット図。
【図１６】ＤＮアーゼの小球形粒子の光学顕微鏡写真。
【図１７】ＳＯＤ小球形粒子の光学顕微鏡写真。
【図１８】実施例２２に記載するように、本開示のインシュリン粒子、または溶解性インシュリンを投与されたラットの血清グルコース濃度レベルのプロット図。
【図１９】実施例２４に記載するように、ＩｇＧマイクロスフェアの注射可能性を示すプロット図。
【図２０】実施例２５に記載するように、ＩｇＧマイクロスフェアの注射可能性を示すプロット図。
【図２１】実施例２６に記載するように、種々の濃度のＩｇＧマイクロスフェアを、スプラーグ−ドーレイラットに注射するのに要する時間を示す棒グラフ。
【図２２】図２２ａおよびｂは、実施例２７に記載するように、本開示の粒子形態に処方されたＩｇＧ、または可溶型のＩｇＧ（ＩＶＩＧ）を投与されたウサギのＩｇＧの血清濃度レベルを示すプロット図である。図２２ｂは、図２２ａと同じプロット図であるが、スケールが異なる。
【図２３】実施例２７に記載するように、本開示の粒子形態に処方されたＩｇＧ、または可溶型のＩｇＧのいずれかを投与された動物のＣｍａｘのグラフ。
【図２４】実施例２７に記載するように、本開示の粒子形態に処方されたＩｇＧ、または可溶型のＩｇＧのいずれかを投与された動物のＴｍａｘのグラフ。
【図２５】実施例２７に記載するように、本開示の粒子形態に処方されたＩｇＧ、または可溶型のＩｇＧのいずれかを投与された動物の曲線下面積のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示は、多くの異なる形態の実施形態を受け入れる余地がある。実施形態は、本開示が、開示の原理の例示として考えられるという理解で開示され、本開示の広い態様は示された実施形態に限定されない。
【００４０】
必要に応じて、本開示の詳細な実施形態をここに開示するが、開示された実施形態は、種々の形に具体化されてもよい、開示の単なる例示であることを理解すべきである。したがって、本明細書中の具体的な詳細は、限定として解釈されるのではなく、単なる請求項の根拠、および本開示を事実上任意の適正な方法でいろいろ使用するために、当業者に教示するための代表的な根拠として解釈される。
【００４１】
本開示は、実質的に無定形または非結晶性の、タンパク質である活性剤の小粒子の組成物に関する。具体的な用途は、活性剤の分子量が少なくとも約２５，０００ダルトンの場合に見出される。本開示は、活性剤の小粒子であって、形状は実質的に球状でもよい粒子の組成物に関する。このアプローチから利益を受けることができる活性剤は、高分子量のタンパク質、特に、実質的に無定形のモノクローナル抗体を始めとする、実質的に無定形の高分子量タンパク質である。開示は、高濃度のモノクローナル抗体を含む高分子量タンパク質の、注射可能なまたは注入可能な組成物を提供する可能性があり、したがって、臨床的に有効な用量のそのような活性剤を、組成物の低容量で、組成物１０ｍｌ以下であってもよく、および通常、標準の注射器で見られる容量で、送達する能力を提供する。本開示によれば、本粒子の活性剤は、可溶型で投与された場合の活性剤としての薬力学的特性および薬物動態学的特性と同じ特性を発揮する。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、開示の粒子は、投与された時、インビボで素早く溶解し、免疫細胞によって邪魔されないため、可溶型で送達された活性剤に類似する薬力学的特性および薬物動態学的特性の値を得ると考えられる。インビトロでの活性剤の溶解性は、その活性剤が、粒子形態の時にインビボで確立したＰＫパラメーターを発揮するか否かを決定するために使用することができると考えられる。そのような活性剤は、インビボ条件に類似するインビトロ条件下で、０．５ｍｇ／ｍｌ以上、または１ｍｇ／ｍｌ以上のインビトロ溶解性を示すことができる。
【００４２】
製造方法によれば、溶解した相分離促進剤を含有する溶剤に、活性剤を溶解し、単一液体連続相である溶液を形成する。溶剤は、水性溶剤でも、水混和性溶剤でもよい。次いで、前記溶液を、たとえば、溶液の温度を活性剤の相転移温度未満に下げることによって、相変化を起こさせ、それによって、活性剤が液−固相分離を受け、不連続相を構成する実質的に無定形または非結晶性の小粒子の懸濁物を形成し、一方相分離促進剤は、連続相中に残る。
【００４３】
本発明は、活性剤の通常実質的に球状形態の小粒子の組成物に関する。活性剤は、高分子量タンパク質でもよく、実質的に無定形型の高分子量タンパク質、たとえば、実質的に無定形のモノクローナル抗体が挙げられる。本発明は、高濃度のモノクローナル抗体が挙げられる高分子量タンパク質の、注射可能なまたは注入可能な組成物を提供することが可能であり、したがって、臨床的に有効な用量のそのような活性剤を、組成物は低容量で、組成物１０ｍｌ以下、さらには２ｍｌ以下で、通常、標準の注射器で見られる容量で、送達する能力を提供する。さらに、組成物は、臨床的に許容しうる量の力を用いて、臨床的に許容しうる時間枠内、たとえば、２分以内で注射によって送達することができる。臨床的に効果的な量の力は、医療関係者や患者のような個人によってつくりだすことができる量の力と考えることができる。
【００４４】
また、活性剤の小球形粒子のこれらの組成物を製造する方法および使用する方法も、本開示によって意図されるものである。製造方法によれば、溶解した相分離促進剤（ＰＳＥＡ）を含有する水性溶剤または水混和性溶剤に、活性剤を溶解し、単一液相の溶液を形成する。次いで、該溶液を、固相を構成する活性剤と、液相を構成するＰＳＥＡおよび溶剤とを有する液−固相分離に供する。液−固相分離は、数多くの方法、たとえば、溶液の温度を変化させること、たとえば活性剤の相転移温度未満に下げること、および／またはエネルギーの追加によって、起こすことができる。前記方法は、治療薬剤を必要とする対象に送達することができる、治療薬剤の小球形粒子を形成するのに最も適している。また、前記方法は、巨大分子の固形小球形粒子、特に、モノクローナル抗体物質が挙げられるタンパク質のような、熱に不安定な巨大分子を形成するのにも最も適している。本開示は、注入可能な巨大分子を提供することが可能である。
【００４５】
活性剤
本開示の活性剤は、治療薬剤または診断剤になりうるタンパク質である。活性剤は、高分子量のタンパク質であるのが有利である。典型的な薬剤は、無定形形態のタンパク質であって、無定形の抗体が挙げられる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、血清からの抗体画分の製剤、および抗体フラグメント、特に一般的に「Ｆａｂ」フラグメントまたは領域として知られている抗原結合画分、一本鎖抗体、および組換え型のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、または他の抗体、および称呼「捕捉分子」によって当該分野で現在認められているものを包含する。また、抗体は、本明細書で記載されたようなアプローチによるものも含み、塗布され、またはカプセル化されたような、処理された抗体の先に記載した形態のいかなるものも言う。
【００４７】
捕捉分子は、２つの異なるレセプター成分間の溶融物と、「Ｆｃ領域」と呼ばれる抗体分子の部分とで構成され、単一成分試薬によって提供される親和性より格段に増加した親和性を持つ、成長因子およびサイトカインブロッカーを産生する。
【００４８】
以下の参考文献は、捕捉分子に関するさらなる情報を提供する。「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｔｒａｐｓ：Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｃｔｉｏｎ」；Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ  ＡＮ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＬＲ，Ｒｕｄｇｅ  ＪＳ，Ｗｏｎｇ  Ｖ，Ｋｏｅｈｌｅｒ−Ｓｔｅｃ  ＥＭ，Ｈａｒｔｎｅｔｔ  Ｃ，Ｐｙｌｅｓ  ＥＡ，Ｘｕ  Ｘ，Ｄａｌｙ  ＴＪ，Ｙｏｕｎｇ  ＭＲ，Ｆａｎｄｌ  ＪＰ，Ｌｅｅ  Ｆ，Ｃａｒｖｅｒ  Ｓ，ＭｃＮａｙ  Ｊ，Ｂａｉｌｅｙ  Ｋ，Ｒａｍａｋａｎｔｈ  Ｓ，Ｈｕｔａｂａｒａｔ  Ｒ，Ｈｕａｎｇ  ＴＴ，Ｒａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉ  Ｃ，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ＧＤ，Ｓｔａｈｌ  Ｎ；Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２００３）；Ｖｏｌｕｍｅ，（Ｎｕｍｂｅｒ），Ｐａｇｅｓ：９（１）：４７−５２．「Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｔｒａｐ  Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｂｕｒｄｅｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ａｓｃｉｔｅｓ，ａｎｄ  Ｃａｕｓｅｓ  Ｄｒａｍａｔｉｃ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｎ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ」；Ｂｙｒｎｅ  ＡＴ，Ｒｏｓｓ  Ｌ，Ｈｏｌａｓｈ  Ｊ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｍ，Ｈｕ  Ｌ，Ｈｏｆｍａｎｎ  ＪＩ，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ＧＤ，Ｊａｆｆｅ  ＲＢ；Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００３）；Ｖｏｌｕｍｅ，（Ｎｕｍｂｅｒ），Ｐａｇｅｓ：１５；９（１５）：５７２１−８．「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｃａｌ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｔｒａｌ  Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄ  Ｏｖｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍａｔｅ  ｂｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｔｒａｐ  Ｒ１Ｒ２」；Ｗｕｌｆｆ  Ｃ，Ｗｉｌｓｏｎ  Ｈ，Ｗｉｅｇａｎｄ  ＳＪ，Ｒｕｄｇｅ  ＪＳ，Ｆｒａｓｅｒ  ＨＭ；Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００２）；Ｖｏｌｕｍｅ，（Ｎｕｍｂｅｒ），Ｐａｇｅｓ：１４３（７）：２７９７−８０７．Ｖｏｌｕｍｅ，（Ｎｕｍｂｅｒ），Ｐａｇｅｓ：１４３（７）：２７９７−８０７。
【００４９】
本開示の代表的な実施形態では、活性剤はモノクローナル抗体で、これは天然でも合成でもよい。治療用途で使用されるモノクローナル抗体の例として、アダリムマブ（関節炎の治療用；Ａｂｂｏｔから、商標名Ｈｕｍｉｒａの下で入手可能）、アブシキシマブ（循環器疾患の対処用；Ｃｅｎｔｏｃｏｒから商標名ＲｅｏＰｒｏの下で入手可能）；ダクリズマブ（移植用の免疫抑制剤、Ｒｏｃｈｅから商標名Ｚｅｎａｐａｚの下で入手可能）、リツキシマブ（非ホジキンリンパ腫の治療；ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから商標名ＲｉｔｕｘｉｎまたはＲｉｔｕｘａｎの下で入手可能）、バシリキシマブ（免疫抑制剤；Ｎｏｖａｒｔｉｓから商標名Ｓｉｍｕｌｅｃｔの下で入手可能）、パリビズマブ（呼吸器合胞体ウィルスの予防用；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅから商標名Ｓｙｎａｇｉｓの下で入手可能）、インフリキシマブ（炎症性疾患の治療；Ｃｅｎｔｏｃｏｒから商標名Ｒｅｍｉｃａｄｅの下で入手可能）、トラスツズマブ（乳がんの治療；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから商標名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの下で入手可能）、ゲムツズマブ（骨髄癌の治療；ＩＤＥＣから商標名Ｍｙｌｏｔａｒｇの下で入手可能）、アレムズツマブ（白血病の治療；Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ／ＩＬＥＸから商標名Ｃａｍｐａｔｈの下に入手可能）およびイブリツモマブ（リンパ腫の治療；ＩＤＥＣから商標名Ｚｅｖｕｌｉｎの下に入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本開示の他の実施形態では、活性剤は、血清から製造される抗体の製剤である。そのような製剤の１つはガンマガードリキッド（Ｇａｍｍａｇａｒｄ  Ｌｉｑｕｉｄ）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社，Ｗｅｓｔｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡから入手可能）であり、これは、免疫抑制された個人を治療するために、しばしば使用される、高度に精製および濃縮されたイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の、使用準備が完了した、滅菌された液体製剤である。
【００５１】
抗体「Ｆａｂ」画分または領域の例として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。現在、アイルランド、ダブリンのＴｈｒｏｍｂｏＧｅｎｉｃｓ社によって開発されているＴＧＸ−６Ｂ４は、血小板の粘着を抑制するＧＰ１ｂに対する抗体であって、動脈血栓症の早期段階を阻止する新規なアプローチであることが示されている。ジゴキシン特異的Ｆａｂフラグメントは、センソ中毒（ｔｏａｄ  ｖｅｎｏｍ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ）の治療において効果があることが報告されている（Ｈｅａｒｔ２００３；８９：１２−４７２，Ｔｏｘａｌｅｒｔ，１５：ｉｓｓｕｅ１，１９９８）。ヒト化Ｆａｂフラグメントは、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞中のヒトＦｃ（エプシロン）ＲＩアルファのＩｇＥ結合ドメインを認識することが示されてきている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１：第１２９巻，Ｉｓｓｕｅ１  ５−１２）。多価Ｆａｂ’フラグメントを使用する、抗腫瘍放射免疫療法に関する他の情報は、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）８１，９７２−９８０に見出される。
【００５２】
他の高分子量のタンパク質の例として、ＡＡＴ、ＤＮアーゼ、スーパーオキサイドジスムターゼ、サブチリシンおよび他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。通常、高分子量は、約２５，０００程度の分子量を持つタンパク質を示し、タンパク質の特別な必要性または特性、またはその意図する用途に依存する。低分子量のタンパク質も、高濃度で、たとえば注射により投与するという同じ必要性の範囲で、本開示から利益を享受することができる。そのようなタンパク質は、当該分野で公知であり、たとえば、２００４年７月１９日に出願された米国特許出願第１０／８９４，４１０号、および２００４年７月２１日に出願された第１０／８９６，３２６号参照。
【００５３】
微粒子、小球形粒子またはマイクロスフェア
本開示の微粒子またはマイクロスフェアの平均幾何学粒径は、動的光散乱法（たとえば、光相関分光法、レーザー回折、小角レーザー光散乱法（ＬＡＬＬＳ）、媒体−角度レーザー光散乱法（ＭＡＬＬＳ））により、光遮蔽法（たとえば、コールター分析法）により、またはレオロジーまたは顕微鏡法（光または電子）のような他の方法によって測定して、通常２００ミクロン未満、通常約０．０１μｍ〜約２００μｍ、通常約５０μｍ以下であり、０．１μｍ〜１０μｍ、または約０．５μｍ〜約５μｍの可能性もあり、約０．５μｍ〜約３μｍでもよい。
【００５４】
小球形粒子またはマイクロスフェアは、実質的に球状である。「実質的に球状」は、粒子の断面の最も短い垂直軸に対する最も長い長さの比が、約１．５以下であることを意味する。実質的に球状は、対象中心線を必要とするものではない。さらに、粒子は、粒子全体のサイズと比較した時に規模が小さく、なお実質的に球状であれば、線、くぼみまたは突起のような粗い表面であってもよい。通常、粒子の長軸と短軸との間の長さの比は、約１．３３以下である。粒子の長軸と短軸との間の長さの比は、約１．２５以下であってもよい。面接触は、実質的に球状であるマイクロスフェアにおいて、最小化され、これにより、貯蔵時、粒子の望ましくない凝集が最小化される。多くの結晶またはフレークは、イオン性または非イオン性相互反応によって凝集が起こりうる、大きな表面接触面積を可能にしうる平坦な面をしている。球は、ずっと小さな面積との接触を可能にする。
【００５５】
また、微粒子は、実質的に同じ粒径を持ちうる。比較的大きいおよび小さい粒子の両方が存在する広い粒度分布を持つ粒子は、より大きな粒子の間の隙間をより小さい粒子に埋めさせ、新しい接触面を作る。広い粒度分布は、結合凝集のために接触する機会を多く作ることにより、より大きな球を生じることができる。本開示の球状微粒子は、通常、狭い粒度分布内にあり、これによって、接触凝集の機会を最小化している。「狭い粒度分布」は、小球形粒子の１０パーセンタイルの体積径に対する９０パーセンタイルの体積径の比が５以下である粒度分布を意味する。小球形粒子の１０パーセンタイルの体積径に対する９０パーセンタイルの体積径の比は、３以下も可能である。通常、小球形粒子の１０パーセンタイルの体積径に対する９０パーセンタイルの体積径の比は、２以下である。
【００５６】
幾何学的標準偏差（ＧＳＤ）も、狭い粒度分布を表わすために使用することができる。ＧＳＤ計算は、１５．９％未満および８４．１％未満の累積量での有効カットオフ直径（ＥＣＤ）の測定に関与する。ＧＳＤは、１５．９％未満のＥＣＤに対する８４．１７％未満のＥＣＤの比の平方根と等しい。ＧＳＤについては、ＧＳＤが＜２．５の場合、および１．８未満の場合も、狭い粒度分布を有する。
【００５７】
本開示の典型的な形態では、微粒子またはマイクロスフェアについての活性剤は、半結晶性、非結晶性、または実質的に無定形である。
【００５８】
マイクロスフェアは、実質的に無定形または非結晶性である活性剤で構成することができ、すなわち、無定形または半結晶性形態である。本明細書で使用する「無定形」は、一般的に、マイクロスフェア内のタンパク質（複数を含む）または他の活性剤（複数を含む）の結晶格子がない活性剤のランダムな固形形態を言い、「半結晶性」は、一般的に、マイクロスフェアの活性剤含有率が、活性剤（複数を含む）の結晶格子形態の５０％未満である活性剤（複数を含む）のランダムな固形形態を言う。
【００５９】
通常、微粒子またはマイクロスフェアは、実質的に非多孔性であり、０．５ｇ／ｃｍ３を超える、０．７５ｇ／ｃｍ３を超える、約０．８５ｇ／ｃｍ３を超える密度を持つ。密度の典型的な範囲は、約０．５ｇ／ｃｍ３〜約２ｇ／ｃｍ３であり、約０．７５ｇ／ｃｍ３〜約１．７５ｇ／ｃｍ３または約０．８５ｇ／ｃｍ３〜約１．５ｇ／ｃｍ３であってもよい。本開示による実質的に無定形または非結晶性の微粒子は、より易溶性であり、結晶性微粒子のようなそのように構成されていない微粒子より速い溶解速度を示す。
【００６０】
本開示の微粒子またはマイクロスフェアは、高含有率の活性剤を発揮することができる。活性剤に加えて、特定の目的（複数を含む）を達成するために、所望により、物質を含ませることができるが、微粒子を製造する多くの他の方法が必要とする、有意量のバルク剤または類似の賦形剤を必要としない。たとえば、多くの用途において、マイクロスフェアは、９５重量％以上の粒子を含む。通常、活性剤は、粒子の約２０％〜１００重量％存在し、約５０％〜約１００重量％、約８０％〜約１００重量％、さらに約９０％〜約１００重量％存在してもよい。本明細書で範囲が記載されている場合、範囲内の任意の範囲またはそれらの組合せを含むことを意味する。
【００６１】
高含有率の活性剤を示す微粒子またはマイクロスフェアは、次に、他の態様において、微粒子またはマイクロスフェアの懸濁物、特に注射可能な懸濁物であって、活性剤が前記懸濁物中、１００ｍｇ／ｍｌを超える、１２５ｍｇ／ｍｌを超える、１５０ｍｇ／ｍｌを超える、１７５ｍｇ／ｍｌを超える、２００ｍｇ／ｍｌを超える、２５０ｍｇ／ｍｌを超える、２７５ｍｇ／ｍｌを超える、３００ｍｇ／ｍｌを超える、３２５ｍｇ／ｍｌを超える、および３５０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で存在する懸濁物を提供する。したがって、本発明の種々の態様では、高分子量タンパク質、特に本明細書で記載される無定形抗体が、先に記載したような濃度で、注射可能な懸濁物中に提供される。
【００６２】
本開示のさらなる態様は、微粒子またはマイクロスフェアは、賦形剤の含有を伴いあるいは伴わず、活性剤の生化学的一体性および生物学的活性を保持することである。本開示によれば、微粒子中の活性剤は、可溶型で活性剤を使用する処方物および組成物に比較して、類似の薬物動態学的特性および薬力学的特性を示す。
【００６３】
粒子のインビボ送達
本開示における活性剤を含有する微粒子、小球形粒子またはマイクロスフェアは、注射用経路による薬剤を必要とする対象へのインビボ送達に適している。特に適切な送達経路は、注射用経路で、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、くも膜下、硬膜外、動脈内、関節内などの経路が挙げられる。他の送達経路、たとえば、局所、経口、直腸、経鼻、肺、経膣、口腔、舌下、経皮、経粘膜、耳または眼球内経路でも実施することはできるが、通常、本開示の利点は、注射用の用途でより明らかになる。本開示の目的に最も利点のあるものは、しばしば、注入可能な送達経路である。微粒子またはマイクロスフェアは、高分子量のタンパク質または活性剤であるにもかかわらず、シリンジに吸入することができ、細い針によって注射することができることは重要である。適切な送達経路は、細い針を用いる注射であり、皮下、眼球投与などが含まれる。微細針は、少なくとも２０ゲージサイズ、通常、約２２ゲージと約３０ゲージ以上との間のサイズの針を意味する。微細穴針は、少なくとも２４ゲージの細さが有利であり、少なくとも２６ゲージの細い穴がより有利であり、少なくとも２８ゲージの細さがさらにより有利である。
【００６４】
微粒子またはマイクロスフェアは、注射される組成物１ｍｌ当たり、少なくとも約５０ｍｇのタンパク質の濃度で注射することができる。たとえば、約１０ｍｌ以下の容量であれば、送達容量中、約１００〜約８００ｍｇのタンパク質を注射することができ、通常、多くの用途で少なくとも約２ｍｌである。また、送達は、通常の注射時間内でなされる。通常、そのような時間は、約２０秒以下である。
【００６５】
本明細書で記載する粒子を製造する本方法は、所望または必要により、賦形剤、他の成分または添加剤とともに、またはなしで、粒子の形成を提供する。また、添加剤を使用せずタンパク質それ自身からタンパク質微粒子またはマイクロスフェアを生産することも、本開示によるアプローチであり、その場合、用途に大きな利点を提供する。２ｍｌ以下のような注射による送達に一致する容量を、臨床的に許容しうる量の力を用いて、臨床的に許容しうる時間枠内、たとえば２分以内で送達することができる。
【００６６】
微粒子の製造方法
連続相
活性剤の微粒子またはマイクロスフェアを製造する本開示の方法は、第一溶剤に溶解した活性剤および相分離促進剤を含む単一液相の溶液を準備することから始める。溶液は、有機溶剤または混和性有機溶剤の混合物を含む有機系であってもよい。また、溶液は、水性媒体、水混和性有機溶剤、水混和性有機溶剤の混合物、またはこれらの組合せを含む水性系の溶液でもよい。水性媒体は、水、通常の生理食塩水、緩衝液、緩衝生理食塩水などでよい。適切な水混和性有機溶剤として、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（Ｎ−メチル−２−ピロリドン）、２−ピロリジノン（２−ピロリドン）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセタミド、酢酸、乳酸、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、３−ペンタノール、ｎ−プロパノール、ベンジルアルコール、グリセロール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−８、ＰＥＧ−９、ＰＥＧ−１２、ＰＥＧ−１４、ＰＥＧ−１６、ＰＥＧ−１２０、ＰＥＧ−７５、ＰＥＧ−１５０、ポリエチレングリコールエステル類、ＰＥＧ−４ジラウレート、ＰＥＧ−２０ジラウレート、ＰＥＧ−６イソステアレート、ＰＥＧ−８パルミトステアレート、ＰＥＧ−１５０パルミトステアレート、ポリエチレングリコールソルビタン類、ＰＥＧ−２０ソルビタンイソステアレート、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテル類、ＰＥＧ−３ジメチルエーテル、ＰＥＧ−４ジメチルエーテル、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリプロピレンアルギネート、ＰＰＧ−１０ブタンジオール、ＰＰＧ−１０メチルグルコースエーテル、ＰＰＧ−２０メチルグルコースエーテル、ＰＰＧ−１５ステアリルエーテル、プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、プロピレングリコールラウレートおよびグリコフロール（テトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテル）、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンを含むアルカン類、またはこれらの組合せなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
単一連続相は、第一溶剤に溶解性または混和性のある相分離促進剤の溶液を先ず準備することによって製造することができる。これに次いで、活性剤を溶液に加える。活性剤を溶液に直接加えてもよく、または活性剤を先ず第二溶剤に溶解し、ついで一緒に溶液に加えてもよい。第二溶剤は、第一溶剤と同じ溶剤でもよく、または先のリストから選択される、溶液に混和性のある他の溶剤であってもよい。典型的な状況では、活性剤を周辺温度以下で溶液に加え、この温度は、特に、特定のタンパク質のような熱に不安定な分子には重要である。「周辺温度」は、約２０℃〜約４０℃の室温付近の温度を意味する。しかし、加熱により薬剤の活性に重大な低下が起こらない限り、系を加熱して、系に対する活性剤の溶解性を増やすこともできる。
【００６８】
相分離促進剤
本開示の相分離促進剤（ＰＳＥＡ）は、溶液を、活性剤が固体または半固体となって不連続相として小球形粒子の懸濁物を形成し、一方相分離促進剤は連続相中に溶解したままである、相分離のステップに供した時に溶液から活性剤の液−固相分離を増強または誘発する。相分離促進剤は、溶液が相分離条件に置かれた時、活性剤の溶解性を減少させる。適切な相分離促進剤として、前記溶液に溶解するまたは混和するポリマーまたはポリマーの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。適切なポリマーの例として、直鎖または分岐状ポリマー、コポリマーおよびブロックコポリマーが挙げられる。これらのポリマーは、水溶性、半水溶性、水混和性または不溶性であってもよい。
【００６９】
本開示の代表的な形態では、相分離促進剤は、水溶性または水混和性である。使用してもよいポリマーの種類として、炭水化物系ポリマー、ポリ脂肪アルコール類、ポリ（ビニル）ポリマー、ポリアクリル酸、ポリ有機酸、ポリアミノ酸、コポリマーおよびブロックコポリマー（たとえば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７またはＦ６８のようなポロキサマー）、ｔｅｒｔ−ポリマー、ポリエーテル類、天然ポリマー、ポリイミド類、界面活性剤、ポリエステル類、分岐状および環状ポリマー、およびポリアルデヒド類が挙げられる。
【００７０】
特に適切なポリマーは、活性剤粒子の投与の意図する経路に関して、医薬添加剤として許容しうるポリマーである。医薬的に許容しうる添加剤として、種々の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、たとえば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００など、および種々の分子量のポロキサマー、たとえば、ポロキサマー１８８、およびプルロニックＦ１２７またはプルロニックＦ６８のようなポリマーが挙げられる。他のポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシエチルデンプンである。他の両親媒性ポリマーも、単独でまたは組合わせて使用することができる。また、相分離促進剤として、プロピレングリコールとエタノールとの混合物のように、ポリマーでないものも使用できる。
【００７１】
液−固相分離
溶液中の活性剤の液−固相分離は、温度の変化（上昇または下降）、圧力の変化、ｐＨの変化、溶液のイオン強度の変化、活性剤の濃度の変化、相分離促進剤の濃度の変化、溶液の浸透圧の変化、これらの組合せなどの当該分野で公知の方法によって、誘発することができる。
【００７２】
本開示の一実施形態では、相変化は温度誘発相変化である。多くの実施形態において、温度誘発相変化を、溶液中の活性剤の相転移温度未満の温度に下げることによって行う。
【００７３】
図１３は、溶剤、ＰＳＥＡおよび活性剤を含有する溶液に関する二次元位相図１０である。該状態図は、溶液の温度に対し、活性剤濃度をプロットしている。ＰＳＥＡの濃度は、一定を保っている。
【００７４】
図１３の状態図には、飽和曲線１２；過飽和曲線１４；これらの間に準安定区域１６；飽和曲線の下の第一区域１８であって、系が、全ての成分が液相である、均質な単一液相である区域；および過飽和曲線の上の第二区域２０であって、系が、活性剤の固相と、ＰＳＥＡおよび溶剤の液相とを有する２相系である区域がある。相状態図は、系の温度、純粋な液相、液−固相中の成分の相対濃度、およびこれら２つの相の間の転移を囲む条件を決定するのに、有益である。
【００７５】
本明細書で開示する活性剤の微粒子またはマイクロスフェアの製造は、不飽和溶液（図１３中、点Ａ’）から冷却し、溶液が存在しうる任意の固相と平衡にある点Ａで飽和に達することを含みうる。さらに冷却すると、状態は、溶液が、所与の温度での平衡溶解度に対応するものより多くの活性剤を含有するところに達する、すなわち、溶液は過飽和になる。固相の自発的形成は、点Ｂに達するまで起こらない。点Ｂは、準安定域の境界線上の点である。準安定域の幅は、到達可能な最高過冷却ΔＴｍａｘ＝Ｔ２−Ｔ１または過飽和ΔＣｍａｘ＝Ｃ＊２−Ｃ＊１で表わすことができる。これらの２つの表記は、熱力学的に等価である。
【００７６】
【化１】
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線Ａ’−Ａ−Ｂは、準安定溶液を製造する多重熱方法を表わす。等温過程において、出発点は、Ａ’’である。一定の温度で濃度を増やすことによって、点Ａで再び飽和に達する。点Ｃへの濃度の等温増加（たとえば、溶剤蒸発、または活性剤の植種／添加による）により、再び準安定限界に達するまで、溶液は準安定領域へ進む。準安定限界を超えた時、溶液は、不安定になり、固相の自発的形成が突然起こる。
【００７７】
等温的に得た値（ΔＣｍａｘ）Ｔ＝Ｃ＊３−Ｃ＊２は、対応する多重熱的に得た値ΔＴｍａｘ＝Ｔ３−Ｔ２と異なる可能性がある。準安定限界に到達するまで、準安定域の境界線に近づくにつれ、固体粒子形成に必要な時間は減少する。
【００７８】
多重熱的過程では、冷却速度は、制御された速度で行われ、粒子のサイズおよび形を制御する。制御された速度は、約０．２℃／分〜約５０℃／分であることを意味し、０．２℃／分〜３０℃／分であってもよい。変化の比率は、一定、直線的な比率、非直線的な比率、断続的、またはプログラムされた比率（複数の相サイクルを有する）である可能性がある。粒子は、溶液内でＰＳＥＡから分離することができ、以下で検討するように、洗浄によって精製することができる。
【００７９】
本開示は、活性剤が液体状態から固体状態に進み、一方ＰＳＥＡおよび溶剤は相変化を起こさず、液体として残る相変化を起こすように、活性剤の濃度、ＰＳＥＡの濃度、温度、またはこれらの任意の組合せを調整することを意図する。また、ｐＨ、イオン強度、浸透性などの変化により、相変化を増強、促進、制御または抑制することも意図する。凍結点が比較的高い、または凍結点が相転移温度を超える溶液については、該溶液に、凍結点降下剤、たとえば、プロピレングリコール、スクロース、エチレングリコール、アルコール類（たとえば、エタノール、メタノール）または凍結点降下剤の水性混合物を含ませ、系の凍結点を下げ、系を凍結することなく、系の相変化を可能にすることができる。また、前記プロセスは、温度を、系の凍結点未満に下げるように行うこともできる。本明細書に記載されたプロセスは、特に、熱に対し不安定な分子（たとえば、タンパク質）に適している。
【００８０】
任意の賦形剤
本開示の微粒子は、１種以上の賦形剤を含んでもよい。賦形剤は、活性剤または微粒子に、微粒子、活性剤または担体剤の安定性の増加、微粒子からの活性剤の放出の制御、または生体組織による活性剤の透過の変性のような、追加の特徴を与えることもできる。適切な賦形剤として、炭水化物（たとえば、トレハロース、スクロース、マンニトール）、カチオン類（たとえば、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋）、アニオン類（たとえば、ＳＯ４２−）、アミノ酸（たとえば、グリシン）、脂質、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、トリグリセリド、胆汁酸またはそれらの塩類（たとえば、コール酸またはその塩類、たとえばコール酸ナトリウム；デオキシコール酸またはその塩類）、脂肪酸エステル、およびＰＳＥＡとしての機能未満のレベルで存在するポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。賦形剤を使用する場合、該賦形剤は、溶液の相状態図に重大な影響を与えない。
【００８１】
粒子の分離および洗浄
本開示の代表的な実施形態では、微粒子またはマイクロスフェアを、溶液中の相分離促進剤からそれらを分離することによって、採取する。さらに他の実施形態では、分離の方法は、微粒子またはマイクロスフェアを含有する溶液を、活性剤は溶解せず、相分離促進剤は可溶性である液体媒体で洗浄することにより行われる。洗浄方法のいくつかは、透析ろ過によって、または遠心分離によって行われてもよい。液体媒体は、水性媒体でも有機溶剤でもよい。水溶解度が低い活性剤については、液体媒体として、水性媒体または２価のカチオンのような活性剤の水溶解度を下げる薬剤を含有する水性媒体を使用することができる。多くのタンパク質のように水溶解度が高い活性剤については、有機溶剤または硫酸アンモニウムのようなタンパク質沈殿剤を含有する水性溶剤を使用してもよい。
【００８２】
本開示の代表的な実施形態では、微粒子またはマイクロスフェアを、溶液中の相分離促進剤からそれらを分離することによって、採取する。さらに他の実施形態では、分離の方法は、微粒子またはマイクロスフェアを含有する溶液を、活性剤は溶解せず、相分離促進剤は可溶性である液体媒体で洗浄することにより行われる。洗浄方法のいくつかは、透析ろ過によって、または遠心分離によって行われてもよい。液体媒体は、水性媒体でも有機溶剤でもよい。水溶解度が低い活性剤については、液体媒体として、水性媒体または２価のカチオンのような活性剤の水溶解度を下げる薬剤を含有する水性媒体を使用することができる。多くのタンパク質のように水溶解度が高い活性剤については、有機溶剤または硫酸アンモニウムのようなタンパク質沈殿剤を含有する水性溶剤を使用してもよい。
【００８３】
液体媒体としての使用に適する有機溶剤の例として、連続相に適するとして先に特定した有機溶剤が挙げられ、塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ペンタンなどが挙げられる。また、これらの溶剤の任意のものの混合物も使用が意図される。一処方物は、塩化メチレンまたは塩化メチレンおよびアセトンの１：１混合物である。液体媒体は、たとえば、凍結乾燥、蒸発または乾燥による簡単な除去のために、低沸点であってもよい。
【００８４】
また、液体媒体は、液体二酸化炭素のような超臨界液、または超臨界点に近い流体であってもよい。超臨界液は、相分離促進剤、特にいくつかのポリマーに適した溶剤であるが、タンパク質粒子には非溶剤である。超臨界液は、それ自身だけで、または共溶剤とともに使用することができる。以下の超臨界液、液体ＣＯ２、エタン、またはキセノンを使用することができる。可能性のある共溶剤として、アセトニトリル、ジクロロメタン、エタノール、メタノール、水、または２−プロパノールを挙げることができる。
【００８５】
本明細書で記載される、ＰＳＥＡから微粒子またはマイクロスフェアを分離するために使用される液体媒体は、液体媒体中の活性剤の溶解性を減らす薬剤を含有してもよい。粒子が、液体媒体中で最小の溶解性を発揮し、微粒子またはマイクロスフェアの収率を最大化することが最も望ましい。インシュリンのようないくつかのタンパク質について、溶解性の減少は、Ｚｎ２＋のような２価のカチオンをタンパク質に添加することにより、達成することができる。複合体を形成するために使用することができる他のイオンとして、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋などが挙げられるが、これらに限定されない。複合体の溶解性は、水溶液中の複合体の透析ろ過を可能にするくらい十分に低い。
【００８６】
また、液体媒体は、活性剤または微粒子に、先に検討したように、微粒子、および／または活性剤または担体剤の安定性の増加、微粒子からの活性剤の放出の制御、または生体組織による活性剤の透過の変性のような、追加の特徴を与えることができる賦形剤を１種以上含有してもよい。本開示の他の形態では、微粒子またはマイクロスフェアを、ＰＳＥＡ含有溶液から分離させない。
【００８７】
水性ベースのプロセス
他の実施形態では、本システムの生産プロセスは、水性溶剤または水混和性溶剤を含む水性システムの方法である。適切な水混和性溶剤の例として、連続相に関して先に挙げたものが挙げられるが、これらに限定されない。水性ベースプロセスを使用する１つの利点は、溶液を緩衝液処理することができること、および溶液は、活性剤を保護するために、生化学的安定化を与える賦形剤を含有することができることである。これは、活性剤がタンパク質の場合、特に有利である可能性がある。
【実施例】
【００８８】
（実施例１）
この実施例では、注入可能な抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のマイクロスフェアの５００μｌバッチを製造する１手順を提供する。５００μｌのモノクローナル抗体の１０のバッチを、エッペンドルフチューブで、以下のようにして製造した。
【００８９】
４０ｍＭ酢酸アンモニウム（ＡＡ）緩衝液（ｐＨ６．５）の製造：３．０８グラムのＡＡ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を１リットルの脱イオンＨ２Ｏに溶解することによって、４０ｍＭのＡＡ緩衝液を製造する。ＡＡは易溶性で、ｐＨが約６．４の緩衝液を形成し、これを希水酸化アンモニウムでｐＨ６．５に調整する。
【００９０】
４０ｍＭのＡＡ緩衝液中１０％ポロキサマー１８８、５００ｍＬの製造：５０グラムのポロキサマー１８８（ＢＡＳＦ）を、ステップ１で記載したような４０ｍＭのＡＡ緩衝液５００ｍＬに溶解する。ただし、ｐＨ調整は必要ない。）この分量のポロキサマーの溶解は、数回の添加で達成することができる。最終ｐＨは、約ｐＨ６．４のあたりである。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、凍結を保つ。
【００９１】
緩衝液交換：２ＰＤ１０脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、５ｍＬのタンパク質用に使用する。全カラム容量は３．５ｍＬであり、それぞれ、２．５ｍＬ以下の交換を対象にする。各カラムを、４０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液２５ｍＬ以上で濯ぎ、該緩衝液でカラムを飽和する。その後、リン酸塩緩衝液中の抗第ＶＩＩＩ因子２．５ｍＬ、次いで追加のＮＨ４ＯＡｃ緩衝液１ｍｌをカラムに挿入し、カラムを満たす。追加の４０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液２．５ｍＬを入れて、タンパク質を集める。
【００９２】
好ましい透析カセットは、３〜１２ｍＬの総容量および１０，０００ダルトンのＭＷカットオフを持つ１Ｐｉｅｒｃｅであり、緩衝液を５ｍＬのタンパク質で置き換える。脱イオンＨ２Ｏで、使用前に、カセットを、たとえば、１８Ｇ１／２針のついた５〜１０ｍＬのシリンジを使用して、水和させる。先ず、空気をカセットに注入し、膜壁を分離する。そして試料を注入する。空気をカッセトから排出し、より良好な試料−膜接触を得る。フロートを上に加え、カセットをゆっくりした速度で回転させる。各緩衝液交換は、容量で、少なくとも約１０倍であるべきである。
【００９３】
タンパク質濃度：タンパク質濃度は、２８０ｎｍで吸光度を測定し、検量線によって決定する。必要であれば、タンパク質は、所望の作用濃度に従う緩衝液を含むことができる。
【００９４】
１０％ポロキサマー溶液のｐＨを、酢酸でｐＨ６．０およびｐＨ６．１に調整する。５ｍＬのタンパク質を、５００μＬのバッチ１０個に分ける。次いで、４０ｍＭのＡＡ中の１０％ポロキサマー１８８（ｐＨ６．０）１０００μＬを、５個のエッペンドルフチューブに加え、４０ｍＭのＡＡ中の１０％ポロキサマー１８８（ｐＨ６．１）ｌ０００μＬを、別の５個のエッペンドルフチューブに加える。溶液を、穏やかな渦攪拌および手による混合でよく混合する。溶液は、透明から僅かに曇るくらいに見えるべきである。試料を１〜２時間（約４Ｃ）保温し、徐冷を行う。試料をドライアイス／エタノール混合物で冷却し、一晩、凍結乾燥または−８０Ｃの冷凍室内に置き、脱イオンＨ２Ｏを全て除去する。
【００９５】
全ての脱イオンＨ２Ｏを除去したら、１ｍＬのＭｅＣｌ２／５％アセトンを、各エッペンドルフチューブ中の乾燥試料に加える。試料を混合し、６０００〜８０００ＲＰＭで３分間遠心分離する。上澄み液を遠心分離機から注意深く取り出し、デカントし、洗浄をさらに２回繰り返す。
【００９６】
最後の洗浄が完了した後、上澄み液をデカントし、低い、非常に穏やかなＮ２流れを使用して、追加の溶剤を除去し、粉末の懸濁を避ける。乾燥したチューブを、凍結乾燥機に置き、残留溶剤を除去し、抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のマイクロスフェアを集める。
【００９７】
（実施例２）
この実施例では、エッペンドルフチューブで、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの５００μｌバッチを製造するための他の手順を提供する。
【００９８】
４０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）の製造：３．０８グラムのＡＡ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を１リットルの脱イオンジＨ２Ｏに溶解することによって、４０ｍＭの酢酸アンモニウム（ＡＡ）緩衝液を製造する。ＡＡは易溶性であり、ｐＨが約６．４の緩衝液を形成する。ｐＨを希酢酸でｐＨ６．０に調整する。
【００９９】
４０ｍＭのＡＡ緩衝液中の１５％ポロキサマー１８８、５００ｍＬの製造：７５グラムのポロキサマー１８８（ＢＡＳＦ）を、４０ｍＭのＡＡ緩衝液５００ｍＬに溶解する（ステップ１に記載するように。ただしｐＨ調整は必要ない）。この分量のポロキサマーの溶解は、数回の添加で行うことができる。最終ｐＨは、約ｐＨ６．４のあたりである。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、凍結を保つ。
【０１００】
緩衝液交換：２ＰＤ１０脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、５ｍＬのタンパク質用に使用する。全カラム容量は３．５ｍＬである。各カラムを、４０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液２５ｍＬ以上で濯ぎ、該緩衝液でカラムを飽和する。その後、リン酸塩緩衝液中の抗−ＣＤ３４、２．５ｍＬ、次いで追加のＮＨ４ＯＡｃ緩衝液１ｍｌをカラムに挿入し、カラムを満たす。４０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液２．５ｍＬを入れて、タンパク質を集める。３〜１２ｍＬの総容量および１０，０００ＭＷのＭＷカットオフを持つ１Ｐｉｅｒｃｅ透析カセットを使用し、緩衝液を５ｍＬのタンパク質で置き換える。試料を注入する。フロートを上に加え、カセットを使用してゆっくりした速度で回転させる。
【０１０１】
タンパク質濃度は、２８０ｎｍで吸光度を測定し、検量線を使用して決定する。必要であれば、タンパク質は、所望の作用濃度に従う緩衝液で希釈する。この実施例の作用濃度は、１．８ｍｇ／ｍｌ（最終濃度は、０．９ｍｇ／ｍｌである）と決定した。
【０１０２】
１５％ポロキサマー溶液のｐＨを、酢酸でｐＨ５．８およびｐＨ５．９に調整する。５ｍＬのタンパク質を、５００μＬのバッチ１０個に分ける。４０ｍＭのＡＡ中の１５％ポロキサマー１８８、５００μＬを、ｐＨ５．８で、５個のエッペンドルフチューブに加え、４０ｍＭのＡＡ中の１５％ポロキサマー１８８、５００μＬを、ｐＨ５．９で、別の５個のエッペンドルフチューブに加える。
【０１０３】
溶液を、穏やかな渦攪拌および手による混合でよく混合すると、溶液は、透明から僅かに曇り、試料を１〜２時間「金魚鉢」（約４Ｃ）で保温し、徐冷を行う。
【０１０４】
試料を氷／エタノール混合物で素早く凍結し、一晩、凍結乾燥し、脱イオンＨ２Ｏを全て除去する。あるいは試料を−８０Ｃの冷凍室に置く。全ての脱イオンＨ２Ｏを除去したら、１ｍＬのＭｅＣｌ２／５％アセトンを、各エッペンドルフチューブ中の乾燥試料に加え、次いで十分混合し、６０００〜８０００ＲＰＭで３分間遠心分離する。上澄み液をデカントし、洗浄をさらに２回繰り返す。
【０１０５】
最後の洗浄が完了した後、上澄み液をデカントし、低い、穏やかなＮ２流を使用して、追加の溶剤を除去する。殆ど乾燥したチューブを、凍結乾燥機に置き、残留溶剤を除去し、モノクローナル抗体のマイクロスフェアを集める。
【０１０６】
（実施例３）
本実施例は、溶剤としてポロキサマーを用い、マイクロスフェアを冷却下で形成する、抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のマイクロスフェアの製造を記載する。ｐＨ７．０で濃度が５．３〜５．５ｍｇ／ｍｌ（塩化ナトリウムなし）の４０ｍＭのリン酸塩緩衝液中の抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体は、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）によって提供された。抗第ＶＩＩＩ因子は、分子量が約１５０ｋＤのマウスのモノクローナル抗体であり、精製プロセスで使用する。濃度５．３ｍｇ／ｍＬのこのモノクローナル抗体５ｍＬを、０．２２μｍのフィルターを通してろ過し、透析カセットを使用して、４０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析した。タンパク質濃度を、光学密度２８０ｎｍで吸光度を測定することによって決定した。ＢＡＳＦ社（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）から入手可能なポロキサマー１８８ＮＦ（Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ６８）の１０％溶液を、ｐＨ６．０で調製し、０．２２ミクロンフィルターでろ過した。酢酸アンモニウムは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）によって提供された。分子量カットオフ１０，０００および試料容量３〜１２ｍＬの透析カセット「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ」は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって提供された。モノクローナル抗体溶液０．５ｍＬのアリコートを、２０個の１ｍＬマイクロフュージチューブに挿入した。１０％ポロキサマー溶液１ｍＬを、０．５ｍＬの抗第ＶＩＩＩ因子（５．３ｍｇ／ｍＬで）を含有する各チューブに加え、溶液を室温で穏やかに混合し、２９℃で半時間保温した。
【０１０７】
次いで、溶液を４℃で１時間保温した。冷却中、モノクローナル抗体を含有するマイクロスフェアが形成するにつれ、透明な溶液が不透明になった。次いで、マイクロスフェア中に入り込んだタンパク質の収率を、以下のようにして求めた。マイクロスフェア懸濁物のアリコートを取出し、遠心分離によってマイクロスフェアを溶液から分離し、上澄み液中のタンパク質濃度を、光学密度２８０ｎｍで吸光度を測定することにより求めた。保温後、チューブをフラッシュ冷凍し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、乾燥粉末は、抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のマイクロスフェアとポロキサマーとを含有していた。
【０１０８】
９５％塩化メチレンおよび５％アセトンの溶液１ｍＬを各チューブに加え、遠心分離し、上澄み液を除去することによって、ポロキサマーを除去した。洗浄操作を３回繰り返した。窒素ガスを使用して湿ったペレットを乾燥し、真空を用いて残留溶剤を除去した。乾燥粉末を光学顕微鏡で検査した。光学顕微鏡画像（図１）および偏光光学顕微鏡画像（図２）は、０．５〜５ミクロンのサイズ範囲の球形粒子を示す。試料をＳＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ４８００，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）に送った。
【０１０９】
抗第ＶＩＩＩ因子の抗体のマイクロスフェア試料を、両面導電性炭素接着性タブを使用して、ＳＥＭ標本マウントに取付けた。白金／パラジウム８０：２０の薄い（１０〜１５ｎｍ）導電層を、Ｄｅｎｔｏｎ  ＤＶ−５０２真空蒸着装置を使用して、蒸着によって試料に塗布した。次いで、試料を画像化し、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４８００Ｆｉｅｌｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ＳＥＭで２〜３ｋＶの加速電圧を使用し、デジタル方式で記録した。走査電子顕微鏡写真（図３）は、０．５〜６ミクロンのサイズ範囲の球形粒子を示す。
【０１１０】
偏光線が等方性試料を通過する場合、全ての結晶軸は完全に等価であるので、いかに試料が配向していても、試料は、偏光線に対し何の効果も持たないだろう。この効果は、完全なまたは等方性消光として知られ、立方晶系のような高度な対称性を持つ結晶に起こる。非晶質、無定形試料は、同じ挙動が得られる。偏光光学顕微鏡画像では、マイクロスフェアは、明るいハローに囲まれた暗い円として見える。これらの画像は、試料の配向とは無関係で、その球状の形および無定形構造を示す。
【０１１１】
（実施例４）
この実施例は、実施例３に従って製造した、抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のマイクロスフェアのゲル電気泳動を示す。トリスアセテートゲル、３〜８％、１．５ｍｍ×１０ウェル、トリスアセテートＳＤＳランニング緩衝液、ＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ試料緩衝液、Ｍａｒｋ１２分子量標準および「ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ」乾燥溶液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって提供された。ゲル電気泳動は、タンパク質およびペプチドの分離および特徴づけ、ならびにタンパク質の分子量の推定に、広く使用されている分析技術である。
【０１１２】
抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のマイクロスフェアは、実施例３に従って製造し、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に３７℃で溶解した。４０μｌの３つの異なるバッチを同時に泳動した。天然抗第ＶＩＩＩ因子の溶液４０μｌを、コントロールとして同時に泳動した。電気泳動について、泳動時間は１時間で、電圧は１５０ｍＶであった。
【０１１３】
図４は、天然のモノクローナル抗体と比較した時、溶解モノクローナル抗体（マイクロスフェアから放出された）がゲル中で同様に移動することを示す２つのゲル画像を表わす。全試料が１５０ｋＤ分子量マーカーに移動し、これは、配合の結果、タンパク質サイズが変化していないことを示唆する。汚染度も類似し、ゲルウェルに汚れはなかった。これは、分子の凝集が最小限であったことを示唆する。
【０１１４】
（実施例５）
この実施例では、溶剤としてＰＥＧ／ＰＶＰを用い、マイクロスフェアを加熱下で形成することによる、抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体のマイクロスフェアの製造を記載する。Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）の、４０ｍＭのリン酸塩緩衝液（塩化ナトリウムなし）中の抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体を、マイクロスフェアに形成した。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）から入手しうるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３３５０ダルトン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）４０，０００ダルトンおよび酢酸ナトリウムを使用して、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％ＰＥＧ／ＰＶＰ（ｗ／ｖ）溶液（Ｈ５．６）を製造した。
【０１１５】
２５％ＰＥＧ／ＰＶＰ溶液４００μｌを、濃度５．３ｍｇ／ｍＬの抗第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体の溶液８００μｌに、室温で加えた。溶液を混合し、６５℃で半時間保温した。６５℃での保温後、溶液を、冷水での保温により、約２０℃に素早く冷却（クエンチ）した。冷却時、モノクローナル抗体で構成されるマイクロスフェアが形成されるにつれ、透明な溶液は混濁した。懸濁物を遠心分離し、上澄み液を除去した。過剰のＰＥＧ／ＰＶＰを、脱イオン水で洗浄することにより除去した。
【０１１６】
図５は、この実施例の手順に従って製造したマイクロスフェアの走査型電子顕微鏡画像を示す。マイクロスフェアの試料を調製し、ＡＭＲＡＹ  ＡＭＲ−１０００走査型電子顕微鏡（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって分析した。試料を、炭素系接着剤を使用して、炭素タブにテープで止め、ＳＥＭ標本位置に取り付けた。試料を、白金／パラジウム８０：２０の薄い塗膜で真空塗布した。図５の走査電子顕微鏡写真は、１〜３μｍのサイズ範囲の球形粒子を示す。
【０１１７】
レーザー光散乱（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ２３０，Ｍｉａｍｉ  ＦＬ）により、粒度分布を、この実施例に従って製造したマイクロスフェアの水性懸濁物に関して測定した。粒度分布は狭く、９０％を超える粒子が２μｍ未満であった。さらに、数、表面積、または容量による粒度分布を重ね合わせると、全ての粒子はほぼ同じサイズで、明らかな凝集は見られなかった。図６参照。
【０１１８】
（実施例６）
この実施例では、ポロキサマー溶剤を用い、マイクロスフェアは冷却を用いて形成することで、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアを製造した。抗ＣＤ３４は、分子量が約１４６ｋＤの、マウスのＩｇＧ１ラムダモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体は、Ｉｓｏｌｅｘ（登録商標）３００およびＩｓｏｌｅｘ（登録商標）３００ｉ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）と組合わせて、幹細胞選択のような細胞外治療のために使用される。幹細胞選択システムおよび治療は、自家末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）産生物を加工し、ＣＤ３４陰性腫瘍をもつ患者の骨髄破壊的治療後の造血再構築に適用されるＣＤ３４＋細胞が豊富な集団を得るために用いられる。
【０１１９】
ｐＨ５．５で濃度が２．３〜２．５ｍｇ／ｍＬの、０．１５Ｍの塩化ナトリウムおよび０．００１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む、０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の抗ＣＤ３４モノクローナル抗体は、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）によって提供された。濃度２．２ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体５ｍＬを、０．２２μｍを通してろ過し、４０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。ＢＡＳＦ社（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）から入手しうるポロキサマー１８８ＮＦ（Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ６８）の１５％溶液（ｐＨ６．０）を調製し、０．２２μｍのフィルターでろ過した。酢酸アンモニウムは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）によって提供された。分子量カットオフ１０，０００および試料容量３〜１２ｍＬの透析カセット「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ」は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって提供された。モノクローナル抗体の溶液０．５ｍＬのアリコートを、２０個の１ｍＬマイクロフュージチューブに挿入した。１５％ポロキサマー溶液０．５ｍＬを、０．５ｍＬの抗ＣＤ３４を２．０ｍｇ／ｍＬで含有する各チューブに加え、溶液を室温で穏やかに混合し、２９℃で半時間保温した。
【０１２０】
次いで、溶液を４℃で１時間保温した。冷却中、モノクローナル抗体で構成されるマイクロスフェアが形成するにつれ、透明の溶液は不透明になった。次いで、マイクロスフェア中に入り込んだタンパク質の収率を、以下の方法で求めた。マイクロスフェア懸濁物のアリコートを取出し、遠心分離によってマイクロスフェアを溶液から分離し、上澄み液中のタンパク質濃度を、光学密度２８０ｎｍで吸光度を測定することにより求めた。保温後、チューブをフラッシュ冷凍し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、乾燥粉末は、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアとポロキサマーとを含有していた。
【０１２１】
９５％塩化メチレンおよび５％アセトンの溶液１ｍＬを各チューブに加え、遠心分離し、上澄み液を除去することによって、ポロキサマーを除去した。洗浄操作を３回繰り返した。窒素ガスを使用して湿ったペレットを乾燥し、真空を用いて残留溶剤を除去した。乾燥粉末を光学顕微鏡で検査し、試料をＳＥＭに送った。光学顕微鏡画像（図７）は、０．５〜５ミクロンのサイズ範囲の球形粒子を示す。抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの走査電子顕微鏡写真を、上記実施例５に記載するように、観察した（図９）。
【０１２２】
空気力学的飛行時間測定（ＴＳＩエアロサイザー（Ａｅｒｏｓｉｚｅｒ））により、粒度分布を、この実施例に従って製造した抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの乾燥粉末５ｍｇに関して測定した。数による粒度分布は狭く、平均空気力学的直径は１．３μｍであり９５％の粒子が３．６μｍ未満であった（図１０）。
【０１２３】
（実施例７）
また、実施例６の抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの立体配座安定性をモニターした。実施例６で記載した条件において、ｐＨ６．０および濃度１．６ｍｇ／ｍＬの、４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中の抗ＣＤ３４、１．５ｍＬを、４０ｍＭ酢酸アンモニウム中の１５％ポロキサマー（２５℃でｐＨ６．０）１．５ｍＬと混合し、蛍光染料８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸（ＡＮＳ）の１０ｍＭ溶液３μＬを加え、溶液を穏やかに混合し、蛍光セルに移した。
【０１２４】
抗ＣＤ３４抗体の立体配座安定性を、タンパク質のトリプトファン残基およびチロシン残基の内部蛍光、およびＡＮＳ染料の外部蛍光を使用してモニターした。蛍光セルにおける粒子の形成は、２５０ｎｍで励起された光の弾性散乱５００ｎｍでの第二オーバートーンの検出を使用して追った。実施例は、Ｐｅｌｔｉｅｒ恒温多重セルホルダー付属品を備えたＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｂｉｏｍｅｌｔ蛍光分光光度計を使用して行った。試料を２５℃で１分間保温し、０．０６℃／分の速度で３１℃に加熱し、５℃／分の速度で２℃に冷却し、この温度で１時間保温した。コントロール試料は、４０ｍＭ酢酸アンモニウム中の１０μＭのＡＮＳ（ｐＨ６．０）、４０ｍＭ酢酸アンモニウム７．５％ポロキサマー中１０μＭのＡＮＳ（ｐＨ６．０）、および４０ｍＭ酢酸アンモニウム中の１０μＭのＡＮＳを含む０．８ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ｐＨ６．０）を含んでいた。
【０１２５】
図１２は、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体の立体配座安定性の蛍光モニタリング結果を示す。蛍光データーは、タンパク質配置が、マイクロスフェア形成中に変わらなかったことを支持している。
【０１２６】
（実施例８）
この実施例によれば、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアは、ポロキサマーまたはＰＥＧ／ＰＶＰ溶剤を用い、加熱を組み入れて製造された。ｐＨ５．５および濃度２．３〜２．５ｍｇ／ｍＬの、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の抗ＣＤ３４モノクローナル抗体は、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）によって提供された。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手できる、試料容量２．５ｍＬの脱塩カラムを使用し、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体５ｍＬを、４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）に対し、ｐＨ６．３で透析した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍの光学密度で吸光度を測定することによって調べた。モノクローナル抗体の溶液０．５ｍＬのアリコートを、１０個の１ｍＬマイクロフュージチューブ中に置き、１５％ポロキサマー１８８ＮＦ（ＢＡＳＦ社，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪによるＬｕｔｒｏｌ  Ｆ６８）の０．３ｍＬアリコートを、０．５ｍＬの抗ＣＤ３４、２．１ｍｇ／ｍＬを含有するチューブに加え、溶液を室温で穏やかに混合し、７０℃で半時間保温した。
【０１２７】
７０℃の保温後、溶液を、冷水での保温により、２３℃に素早く冷却（クエンチ）した。冷却中、モノクローナル抗体で構成されるマイクロスフェアが形成されるにつれ、透明な溶液は混濁した。懸濁物を遠心分離し、上澄み液を除去した。過剰のポロキサマーを、脱イオン水の洗浄により除去した。光学顕微鏡画像（図８）は、０．５〜５μｍのサイズ範囲で球形粒子を示す。
【０１２８】
（実施例９）
この実施例では、溶剤としてＰＥＧ／ＰＶＰを用い、冷却下でマイクロスフェアを形成する、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアの製造を記載する。ｐＨ５．５で濃度２．３〜２．５ｍｇ／ｍＬの、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の抗ＣＤ３４モノクローナル抗体は、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）によって提供された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３３５０Ｄａ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）４０，０００Ｄａおよび酢酸ナトリウムは、全て、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）によって提供された。
【０１２９】
１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の２５％ＰＥＧ／ＰＶＰ溶液（ｐＨ５．６）を製造し、０．２２μｍフィルターでろ過した。５ｍＬのモノクローナル抗体を、濃度２．２ｍｇ／ｍＬで、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、透析カセット「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ」（分子量カットオフ１０，０００および試料容量３〜１２ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により提供）を使用して透析した。モノクローナル抗体を、４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ６．０に対して透析した。次いで、２００μｌの２５％ＰＥＧ／ＰＶＰ溶液（ｗ／ｖ）を、５００μｌの抗ＣＤ３４モノクローナル抗体に、濃度２．０ｍｇ／ｍＬで加え、溶液を室温で穏やかに混合し、２９℃で半時間保温した。ポロキサマーではなくＰＥＧ／ＰＶＰを、９５％塩化メチレン／５％アセトン溶液を用いて洗浄して除去したこと以外、実施例６に記載されたように、操作を続けた。
【０１３０】
（実施例１０）
この実施例は、実施例６に従って製造したモノクローナル抗体のマイクロスフェアのＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）を示す。高分解能Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析を、長く細い焦点のＸ線チューブを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＸＲＤ−６０００Ｘ線粉末回折装置を用い、Ｃｕ  Ｋα照射（ＳＳＣＩ，Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を使用して行った。
【０１３１】
チューブの電圧および電流値を、それぞれ、４０ｋＶおよび４０ｍＡに設定した。発散スリットおよび散乱スリットを１°に設定し、受光スリットを０．１５ｍｍに設定した。あるいは、発散スリットおよび散乱スリットを０．５°に設定し、受光スリットを０．１５ｍｍに設定した。回折照射をＮａＩシンチレーション検出器で検出した。１〜２０°２θで０．５°／分（４．８秒／０．０２°ステップ）でのθ−２θ連続走査を使用した。シリコン標準を、装置の調節をチェックするために分析した。データーを集め、ＸＲＤ−６０００ｖ．４．１を使用して分析した。ヘキサトリアコンタン：シリコンの８０：２０混合物からなる低角度標準を動かし、明確に定義された「ｄ」値について、低角度で、装置解析を行った。
【０１３２】
図１１は、抗ＣＤ３４のモノクローナル抗体のマイクロスフェアおよびヘキサトリアコンタン：シリコンの８０：２０混合物のＸＲＰＤパターンを示す。ヘキサトリアコンタン：シリコン混合物のＸＲＰＤは、結晶状態を示す特有のピークを有し、一方、抗体マイクロスフェアのＸＲＰＤパターンは、連続的で、特有のピークを持たず、これは、無定形、非結晶性状態に典型的である。
【０１３３】
（実施例１１）
抗ＣＤ３４から、概して実施例２に倣い、本開示によるマイクロスフェアを作成した。マイクロスフェアを、５％ＰＥＧ３３５０溶液に、表Ｉに示す濃度で懸濁した。ある容量の懸濁マイクロスフェアを、シリンジに吸引させ、２５ゲージの注射用針によって４ポンドの店で買ったブタ肩肉にうった。各注射は２０秒以内に行い、目詰まりはなかった。この実施例において、マイクロスフェア懸濁物を、２５ゲージ針によってシリンジに吸引させ、シリンジ内容物を完全にブタ肉に注射する能力を示す、注入可能性の結果を表Ｉに記録する。
【０１３４】
表Ｉ
【０１３５】
【表１】
2010509243.tif 000002
表Ｉに報告された結果は、高濃度のこれらのタンパク質マイクロスフェアを、細い（２５ゲージ）針に吸引させることができ、そこから注射することに成功したことを示す。これは、皮下環境、すなわち皮膚を通し筋肉内に注射可能であるという示唆を提供する。
【０１３６】
（実施例１２）
組換えヒトインシュリンを、９０％ｗ／ｗを超えて含有するインシュリンマイクロスフェアから本開示によるマイクロスフェアを作成した。インシュリンマイクロスフェアを、５％ＰＥＧ３３５０溶液に、表Ｉに示す濃度で懸濁した。１ｍＬの懸濁マイクロスフェアをシリンジに吸引し、２８ゲージのインシュリン針によって、１０ポンドの店で買ったスモークハムに打った。各注射は２０秒以下で行い、目詰まりはなかった。この実施例において、マイクロスフェア懸濁物を、２８ゲージ針によってシリンジに吸引させる能力を示す注入可能性、およびこの実施例において、シリンジ内容物をハムに完全に注射する能力を示す注射可能性の結果を表ＩＩに記録する。
【０１３７】
表ＩＩ
【０１３８】
【表２】
2010509243.tif 000003
表ＩＩに報告された結果は、高濃度のこれらのタンパク質マイクロスフェアを、細い（２８ゲージ）針に吸引させることができ、そこから１０ポンドの１片のハムに注射することに成功したことを示す。この後のステップでは、皮下環境において、おおむね注射可能性があることを示唆している。３００ｍｇ／ｍｌの注射は、５．８ニュートンの力で行った。
【０１３９】
（実施例１３）
インシュリン微粒子またはマイクロスフェアを、一般的方法により製造する。１６．６７％ＰＥＧ３３５０を含有する、ｐＨ５．６５で緩衝された溶液（０．０３３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液）を調製した。攪拌しながら、亜鉛結晶性インシュリンの濃厚なスラリーを、この溶液に加えた。最終溶液のインシュリン濃度は、０．８３ｍｇ／ｍＬであった。溶液を約８５〜９０℃に加熱した。インシュリン結晶は、この温度範囲内で、５分以内で完全に溶解した。溶液の温度を制御された速度で下げると、約６０℃でインシュリン小球形粒子の形成が始まった。ＰＥＧの濃度が上がるにつれ、収率が増えた。このプロセスでは、平均が１．４μｍの様々な粒度分布を持つ微粒子またはマイクロスフェアが得られる。
【０１４０】
マイクロスフェアが溶解しない条件下で透析ろ過によってマイクロスフェアを洗浄して、形成したインシュリン微粒子またはマイクロスフェアを、ＰＥＧから分離した。インシュリンマイクロスフェアを、Ｚｎ２＋を含有する水溶液を使用し、懸濁物から洗い流した。Ｚｎ２＋イオンは、インシュリンの溶解性を減少させ、収率を下げ、マイクロスフェアの凝集を起こす溶解を防ぐ。
【０１４１】
図１４は、マイクロスフェアの製造プロセス中のインシュリンの化学安定性を示す。ＨＰＬＣ分析は、前記プロセスに関連する高分子量化合物では、増加を示さず、２量体率（％）、Ａ２１デサミドインシュリン率（％）および他の化合物の率（％）における、インシュリン出発物質に対する増加は、ＵＳＰ限界以内であった。
【０１４２】
（実施例１４）
また、本開示は、該開示の典型的な注入可能な送達経路に特に適する、アルファ−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）の小球形粒子を製造するために使用することもできる。ＡＡＴの分子量は、約４４ｋＤａである。この実施例では、ＡＡＴ小球形粒子（１０〜３００ｍｇスケール）のジャケット付きカラムバッチ製造について報告する。
【０１４３】
１６％ＰＥＧ３３５０および０．０２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含有する１０ｍＭ酢酸アンモニウムで、ｐＨ６．０で緩衝した溶液を、ジャケット付きビーカー中で、マグネット攪拌棒で混合し、３０℃に加熱した。ビーカーの温度は、循環水浴を使用して制御した。攪拌しながら、組換えＡＡＴ（ｒＡＡＴ）の濃厚溶液を、この溶液に加え、ｐＨを６．０に調整した。最終溶液中のｒＡＡＴ濃度は、２ｍｇ／ｍｌであった。ｒＡＡＴは、この温度で、この溶液組成物に完全に溶解した。容器の全内容物を、ジャケット付きカラムに移し、２５〜３０℃に加熱した。カラム用の循環水浴を、−５℃に下がるように設定した。カラムおよび内容物を、約１℃／分で、約４℃に冷却した。ｒＡＡＴ小球形粒子が冷却ステップ中に形成した。マイクロスフェア懸濁物を、ガラス製結晶皿で凍結し、凍結乾燥して、水および緩衝液を除去した。
【０１４４】
凍結乾燥後、タンパク質小球形粒子からＰＥＧを抽出するため、ＰＥＧ／タンパク質ケーキを、塩化メチレン（ＭｅＣｌ２）で洗浄した。利用した他の洗浄媒体は、塩化メチレン：アセトン１：１、または塩化メチレン：ペンタン１：１であった。合計で最初の洗浄容量の３倍まで、洗浄操作を繰り返した。最終ペレットを、少量のアセトンまたはペンタンに再懸濁し、窒素ガスへの直接曝露、または回転蒸発によって乾燥した。
【０１４５】
（実施例１５）
この実施例では、ＡＡＴ小球形粒子（２００〜２０００ｍｇスケール）ジャケット付き容器バッチ製造。このタイプの製造は、ジャケット付きカラムと同じ処方物組成物を用いて行ったが、より大きな容量に対応することができ、スケールアップにより適していた。このスケールでは、処方物を、通常５００〜１０００ｍｌ、ジャケット付き容器中、７５ｒｐｍで、Ａ型パドル翼で混合し、３０℃に加熱した。容器温度は、循環水浴を使用して制御した。溶液を同じ容器中に保ち、水浴源を３０℃の浴から２℃の浴に変えた。容器および内容物を、約１℃／分で、温度４℃に冷却した。ｒＡＡＴ小球形粒子が冷却ステップ中で形成した。温度を、熱電対を使用してモニターし、懸濁物が４℃に達した時、さらに３０分この温度の近辺で保った。該保持ステップ後、小球形粒子の懸濁物を、４℃付近で透析ろ過によって濃縮し、ポリマーおよび容量の約７５％を除去した。残った小球形粒子の懸濁物を予備冷却凍結乾燥トレーで薄膜として凍結し、凍結乾燥し、水および残っている緩衝液を除去した。
【０１４６】
タンパク質の小球形粒子を、有機溶剤を用いる遠心分離（実施例１８で記載したように）、あるいは超臨界液（ＳＣＦ）抽出により、残っている乾燥ポリマーから分離した。ＳＣＦ抽出に関し、乾燥した物質を、高圧抽出チャンバーに移し、これをＣＯ２で２５００ｐｓｉ（室温で）に加圧した。作業圧力に到達すると、エタノールを７０：３０のＣＯ２：エタノール混合物として、入り口の流体流れに導入した。この超臨界液はポリマーを溶解し、小球形粒子を残した。このプロセスの終わりに、システムをエタノールで洗い流し、ゆっくりと減圧した。
【０１４７】
（実施例１６）
この実施例は、ＡＡＴバイオ活性の保持を説明する。比活性を判定するために、ｒＡＡＴの小球形粒子を、室温で、０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。得られた溶液を、ｐ−ニトロアニリド基をＣ末端に含有する合成ペプチドを加水分解するブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）の活性を阻害するｒＡＡＴの能力を測定するアッセイによって、分析した。次いで、ｒＡＡＴの小球形粒子の同じ溶液を、タンパク質濃度に関して、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用して試験した。また、コントロールｒＡＡＴ出発物質の溶液も、両アッセイで分析した。前記活性アッセイは、試料当たり、１ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質に基づく活性を測定するために開発されたので、ＢＣＡによって測定された時、活性値を、実際のタンパク質濃度に基づいて補正し、比活性値を与えた。
【０１４８】
【化２】
2010509243.tif 000004
ｒＡＡＴによるブタ膵臓エラスターゼの阻害
【０１４９】
【表３】
2010509243.tif 000005
このように、比活性は、ＡＡＴから小球形粒子を作成した後、バイオ活性の保持を示した。
【０１５０】
（実施例１７）
この実施例は、溶剤としてＰＥＧまたはポロキサマーを用い、マイクロスフェアを冷却下に形成する、ヒト化モノクローナル抗体のマイクロスフェアの製造を記載する。４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．９）中の４ｍｇ／ｍＬヒト化モノクローナル抗体（抗ＣＤ２５モノクローナル抗体）の溶液１ｍＬを、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）から入手可能なＰＥＧ３３５０Ｄａの３０％（ｗ／ｖ）水溶液１ｍＬと混合した。あるいは、該溶液を、ＢＡＳＦ社（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）から入手可能なポロキサマー１８８ＮＦ（Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ６８）の３０％（ｗ／ｖ）水溶液１ｍＬと混合した。混合物を、水浴中３５℃で１０分間保温し、次いで約０．７℃／分の速度で２℃に冷却した。
【０１５１】
次いで、試料を、光学顕微鏡を使用し、１０×および１００×の倍率で観察し、どちらかのポリマーを使用して球形粒子の形成を示した。マイクロスフェアの殆どは、直径が約２ミクロンであるように見えたが、それより小さいものもあった。直径が５ミクロンを超えるマイクロスフェアは殆どなかった。
【０１５２】
（実施例１８）
この実施例は、ＡＡＴの構造的一体性の保持を説明する。粒子工学分野で主要な関心事は、作製中のタンパク質の安定性および保存安定性である。タンパク質の酸化、脱アミド化および特に凝集のような主要な劣化経路は、免疫原生を含む、タンパク質処方物の副作用の原因であると考えられる。したがって、規制事項として、最終粒子処方物中には、劣化生成物が非常に低レベルであることが要求される。ＨＰＬＣ、ＣＤおよびＤＳＣのような物理化学的特性評価を、タンパク質の変性が形成中に起こったか否かを調べるために利用した。
【０１５３】
円偏光２色性（ＣＤ）は、摂動を受けたタンパク質の構造的な変化を評価するために、または操作されたタンパク質の構造を親タンパク質と比較するために使用される最も一般的な方法である。ＣＤ法は、タンパク質の折りたたみ、およびタンパク質の二次および三次構造を評価している。
【０１５４】
二次構造は、「遠紫外線」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）内のＣＤスペクトル観察によって調べることができる。これらの波長では、規則的な、折りたたまれた環境内に位置する場合、発色団はペプチド結合である。アルファら旋構造、ベーターシート構造およびランダムコイル構造は、それぞれ、ＣＤスペクトルの特徴的な形状および大きさを引き起こす。したがって、任意のタンパク質に存在する、各二次構造タイプの近似する画分は、その遠紫外線ＣＤスペクトルを、各構造タイプに関して、そのような参考スペクトルの画分の倍数の合計として、分析することによって調べることができる。
【０１５５】
「近紫外線」スペクトル領域（２５０〜３５０ｎｍ）中のタンパク質のＣＤスペクトルは、三次構造のある態様に感受性がある可能性がある。これらの波長では、発色団は、芳香族アミノ酸およびジスルフィド結合であり、それらが作り出すＣＤシグナルは、タンパク質の三次構造全てに感受性がある。２５０〜２７０ｎｍの領域内のシグナルは、フェニルアラニン残基に起因すると考えられ、２７０〜２９０ｎｍのシグナルは、チロシンに起因すると考えられ、２８０〜３００ｎｍのシグナルは、トリプトファンに起因すると考えられる。ジスルフィド結合は、近紫外線スペクトル全体の広く弱いシグナルを引き起こす。
【０１５６】
ｒＡＡＴ原液およびリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４，Ｔ＝２５℃，タンパク質濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）中の小球形粒子から放出されたＡＡＴの遠紫外線ＣＤスペクトルを図１５に示す。各スペクトルは、１０回の走査の平均を表わす。
【０１５７】
遠紫外線ＣＤスペクトルは識別不能であり、ＡＡＴの出発物質の構造と同一の構造を持つＡＡＴ分子を得ることになる後続の放出時に、ＡＡＴから小球形粒子が作製されたことを実証する。
【０１５８】
小球形粒子を０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、逆相ＨＰＬＣで分析した。出発ｒＡＡＴタンパク質のコントロール溶液と比較すると、クロマトグラムの出現に明らかな違いはない。
ＨＰＬＣシステム：
ＨＰＬＣカラム−Ｐｈｅｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ、５ミクロン、Ｃ４、３００Ａ、２５０×４．６ｍｍ
Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２９６５  Ｐｕｍｐ／自動サンプラー
波長−２８０ｎｍ
注射用量−７５ｕｌ
濃度の勾配：
移動相１：水中０．１％ＴＦＡ
移動相２：水中９０％（ｃ／ｖ）のアセトニトリル中０．０８５％のＴＦＡ
実効時間−６０分
流速−１．０ｍｌ／分  。
【０１５９】
（実施例１９）
ＤＮアーゼの小球形粒子を製造した。ＤＮアーゼは分子量が約３８ｋＤａである。配合例：０．１８ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ（ストック１ｍｇ／ｍｌから）、１８．２％ＰＥＧ３３５０（ストック２５％から）、および９ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．１５）（ストック１Ｍから）の溶液を製造した。この懸濁物を−８０℃の冷凍室で冷却し、冷凍したら、マニホールド凍結乾燥機で凍結乾燥し、続いてＭｅＣｌ２／アセトンで遠心分離によって洗浄した。
【０１６０】
試した初期濃度は、０．ｌｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼおよび２０％ＰＥＧ３３５０であった。しかし、３７℃から０℃への冷却を試したが、析出せず、別量のＤＮアーゼを加えて、上記濃度を得た。この溶液を、−８０℃の冷凍室で冷却し、冷凍したら、マニホールド凍結乾燥機で凍結乾燥し、次いでＭｅＣｌ２／アセトンで遠心分離によって洗浄した。図１６参照。
【０１６１】
活性（Ｓｉｇｍａから購入したＤＮＡ−メチルグリーンを使用するＤＮアーゼ−Ｉのアッセイ）。出発物質の理論的活性は、７７５Ｋｕ／ｍｇのタンパク質と記載されている。ストック溶液は、０．１４５ｍｇ／ｍｌのタンパク質であると測定された。この濃度を、０．０１９９ｍｇ／ｍｌの最終濃度５ｍｌに希釈した。活性は、７７５  Ｋｕ／ｍｇ＊０．０１９９ｍｇ／ｍｌ＝１５．４６Ｋｕ／ｍｌであるべきである。
【０１６２】
【化３】
2010509243.tif 000006
Ｋｕ／ｍｌ＝−０．０００４×４０×１／−０．００１１＝１４．５５Ｋｕ／ｍｌ
理論値との比較：小球形粒子／理論値＊１００％＝％活性：
１４．５５Ｋｕ／ｍｌ／１５．４６Ｋｕ／ｍｌ＊１００％＝９４．１％  。
【０１６３】
（実施例２０）
スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ；分子量約３２ｋＤａ）の小球形粒子を製造する。０．６８ｍｇ／ｍｌのＳＯＤ（ストック５ｍｇ／ｍｌから）、２４．１５％ＰＥＧ３３５０（ストック３１．２５％から）、９．１ｍＭ酢酸アンモニウム（ストック１Ｍから）の溶液（最終ｐＨ４．９９）であって、水酸化アンモニウムおよび酢酸で調整した。該溶液を、４０℃から０℃に、５０分（約０．８℃／分）で冷却し、析出が、２５℃付近で始まった。懸濁物を、液体窒素でフラッシュ凍結し、マニホールド凍結乾燥機で凍結乾燥し、続いてＭｅＣｌ２／アセトンで遠心分離によって洗浄した。小球形粒子が形成し（図１７参照）、アセトンの大部分を除去した。
【０１６４】
（実施例２１）
サブチリシン（分子量約３５，２３０ダルトン）の小球形粒子を、非ポリマー相分離促進剤を使用して製造した。初期系の連続相は、冷却中タンパク質の相分離を誘発する非ポリマー相分離促進剤を含有してもよい。サブチリシンの小球形粒子は、本開示に従って、プロピレングリコールおよびエタノールの混合物を使用し、いかなるポリマーも使用せずに形成することができる。このシステムで、プロピレングリコールは、凍結点降下剤として作用し、エタノールは、相分離促進剤として作用する。また、プロピレングリコールは、小球形粒子の球状形状の形成を補助する。
【０１６５】
３５％プロピレングリコール、１０％ホルメート、０．０２％ＣａＣｌ２中の２０ｍｇ／ｍＬサブチリシン溶液を製造した。次いで、混合しながら、３５％プロピレングリコール−サブチリシン溶液を、６７％エタノールに加えた。溶液は、室温で透明を保った。しかし、−２０℃に１時間冷却すると、粒子の懸濁物が形成した。遠心分離により粒子を集め、９０％エタノールで洗浄した後、コールター粒径分析を、懸濁物流体として無水エタノールを用いて行った。コールターで得られた粒子の結果は、平均粒径が２．２ミクロンの不連続な粒子と一致し、９５％の粒子は、０．４６ミクロンと３．９４ミクロンとの間であった。光学顕微鏡評価により、これらの結果は実質的に球形粒子を示すということが確認された。粒子のＳＥＭ分析により、コールターの結果が確認された。
【０１６６】
溶液中のサブチリシンのサブチリシン小球形粒子への変換後のサブチリシン酵素活性の保持を、比色検定によって確認した。小球形粒子についての活性の理論的全単位を、冷却前のエタノール−サブチリシン−プロピレングリコール溶液中で測定されたサブチリシンの全単位から、上澄み液（サブチリシン粒子の分離後）中に見られる全単位を差し引くことによって計算した。割合として表わされる理論的単位によって割られるサブチリシンの小球形粒子に関して見られる実際の全単位は、粒子形成後のサブチリシン活性の保持率を表わす。この計算によって、サブチリシンの小球形粒子の形成後、１０７％の理論的サブチリシン活性が保持された。
【０１６７】
（実施例２２）
この実施例では、インシュリンのマイクロスフェアの薬力学的特性を試験する。亜鉛−インシュリンのマイクロスフェアを、本開示の方法に従って処方した。マイクロスフェアの製剤の一部を、リン酸塩緩衝された生理食塩水に懸濁し、渦攪拌し、Ｚｎ−インシュリンを再可溶化した。３匹のラットの１群にＺｎ−インシュリンのマイクロスフェアを皮下注射し、３匹の第二群にマイクロスフェアから誘導した再可溶化Ｚｎ−インシュリンの溶液を皮下注射した。両群の各動物は、総量で１０．４単位のインシュリンを受けた。２匹のラットの第三群は、生理食塩水の注射を受けた。注射後、ラットの血中グルコースレベルをモニターした。図１８に示すように、インシュリンのマイクロスフェアを受けたラットおよび可溶型のインシュリンを受けたラットの群は両方とも、血中グルコースレベルが抑制されているのが実証された。さらに、両群のラットは、経時的にグルコース低下レベルで非常に類似のプロットを示し、これは、マイクロスフェア形態のインシュリンが、可溶型のインシュリンと非常に類似する方法で挙動することを示唆している。
【０１６８】
（実施例２３）
この実施例では、ＩＶＩＧのマイクロスフェアを製造する１方法を記載する。液体ＩＶＩＧ（１０％，ＴＶＲ，ロット番号ＬＥ１２Ｄ００２）を、Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から入手した。マイクロスフェアの生産のため、液体ＩＶＩＧを、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．０）に対して透析し、２．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、同量のポリマー溶液と混合する前に、５０℃に加熱した。ポリマー溶液は、２５％ＰＥＧ８０００、１０ｍＭのトレハロースおよび１００ｍＭの酢酸アンモニウムであった。該溶液をｐＨ５．８に調整し、６５℃に前もって温めた。混合物を、−２０℃の冷凍庫に素早く置き、マイクロスフェアを形成させた。次いで、シェルフ凍結乾燥機（Ａｄｖａｎｔａｇｅ，ＶｉｒＴｉｓ，ＳＰ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）で凍結乾燥する前に、マイクロスフェアを、０．２２μｍのＨｏｌｏｆｉｂｅｒ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、透析ろ過ユニットで約１０倍に濃縮した。凍結乾燥されたマイクロスフェアを、塩化メチレン：アセトン（８０：２０）混合物で４回洗浄し、窒素ガス下で乾燥した。
【０１６９】
（実施例２４）
この実施例では、１ｍＬの注射容量における、３００ｍｇ／ｍＬの抗体マイクロスフェアの懸濁物の注射可能性を実証する。凍結乾燥されたＩＶＩＧのマイクロスフェアを、実施例２３に記載するように、製造した。それらを、濃度３００ｍｇ／ｍＬで、２０％のＰＥＧ３００、５％のポロキサマー１８８、１０％のエタノールおよび６５％の水で構成されている水性ベースの希釈液に懸濁した。３００ｍｇ／ｍＬの懸濁物の１ｍＬを、２６ゲージの針が付いた１ｃｃシリンジに入れた。この組立て品を、Ｉｎｓｔｒｏｎモデル３４３２ロードテスターに取り付けた。シリンジおよび２６Ｇ針からの懸濁物の送達速度を、１０〜３０秒／ｍＬの間で種々変更した。懸濁物を送達するために必要な力の量を、ニュートンで測定した。図１９のデーターは、ａ）３００ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧのマイクロスフェアは、２６Ｇ針を通って注射可能であった、およびｂ）マイクロスフェアの懸濁物を注射するために必要な力は、注射の速度に逆比例していたことを示す。すなわち、送達の速度が遅いほど、少ない力でよかった。この実施例は、臨床的に許容しうる力、時間および針のサイズのパラメーター下で、高用量の抗体のマイクロスフェアを注射することができることを示す。
【０１７０】
ＩＶＩＧ抗体のマイクロスフェアの懸濁物を、本質的に、先に記載したように製造し、マイクロスフェア懸濁物の実際のタンパク質濃度を測定するために調べた。抗体濃度は、３連の測定結果の平均として決定し、該３連のそれぞれは、２連の測定結果から導き出した。結果は、抗体濃度は、再現的に、３００ｍｇ／ｍｌを超える（３１４．６ｍｇ／ｍｌ，３０７．８ｍｇ／ｍｌ，３０３．３ｍｇ／ｍｌ，３１４．６ｍｇ／ｍｌ）、３２５ｍｇ／ｍｌを超える（３３８．９ｍｇ／ｍｌ）、および３５０ｍｇ／ｍｌを超える（３６３．８ｍｇ／ｍｌ，３５１．２ｍｇ／ｍｌ，３５９．８ｍｇ／ｍｌ）値を示した。
【０１７１】
（実施例２５）
この実施例は、１ｍＬの注射容量における、４００ｍｇ／ｍＬ抗体マイクロスフェアの懸濁物の注射可能性を示す。凍結乾燥したＩＶＩＧマイクロスフェアを、実施例２３に記載するように製造した。それらを、濃度４００ｍｇ／ｍＬで、２０％のＰＥＧ３００、５％のポロキサマー１８８、１０％のエタノールおよび６５％の水で構成される水性ベースの希釈液に懸濁した。４００ｍｇ／ｍＬの懸濁物１ｍＬを、２６ゲージ針が付いた１ｃｃシリンジに入れた。この組立て品を、Ｉｎｓｔｒｏｎモデル３４３２ロードテスターに取り付けた。シリンジおよび２６Ｇ針からの懸濁物の送達速度を、３０〜４５秒／ｍＬの間で種々変更した。懸濁物を送達するために必要な力の量を、ニュートンで測定した。図２０のデーターは、４００ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧのマイクロスフェアは、２６Ｇ針を通って注射可能であり、および送達速度が３０秒／ｍＬ〜４５秒／ｍＬで遅い場合、注射するために必要な力は少なかったことを示す。この実施例は、力、時間および針のサイズが臨床的に許容しうる範囲であれば、非常に高用量の抗体マイクロスフェアを注射することができることを示す。
【０１７２】
（実施例２６）
この実施例では、高濃度のＩＶＩＧ抗体のマイクロスフェアのインビボ注射可能性を記載する。この試験は、５０〜３００ｍｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度のＩＶＩＧのマイクロスフェアの懸濁物の、単一皮下注射による、スプラーグ−ドーレイラットへの注射可能性を実証するために設定された。２４匹のスプラーグ−ドーレイ（ＳＤ）ラットは、２５７グラムと２８８グラムとの間の重さであった。注射に関し、ラットを１群当たり３匹のラットの種々の濃度の処置群にランダムに指定した。凍結乾燥されたＩＶＩＧのマイクロスフェアを実施例２３に記載するように製造し、それらを、０．２２ミクロンのフィルターで滅菌ろ過された、２０％のＰＥＧ３００、５％のポロキサマー１８８、１０％のエタノールおよび６５％の水を含む希釈液に懸濁した。各ラットに、２６ゲージ針によって、１ｍｌのマイクロスフェアを皮下注射した。各注射に関し、時間（秒）を測定した。結果を図２１にまとめる。データーは、ＩＶＩＧマイクロスフェアを注射するために必要な時間は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で１０秒から、３００ｍｇ／ｍＬで約２２秒の範囲であったことを示す。このデーターからの結果は、高濃度でのこれらのマイクロスフェアのインビボ注射の実施可能であることを示唆する。臨床的に許容しうる量の力を用いて、手操作でマイクロスフェアを注射することができる。
【０１７３】
（実施例２７）
この実施例では、マイクロスフェアに処方されたＩｇＧの薬物動態学的特性を、可溶性ＩｇＧの特性と比較した。これらの実験に関し、ＩＶＩＧと言われる、血漿からのＩｇＧ抗体の精製画分を使用した。ＩＶＩＧを使用して、実施例１に従い、ＩｇＧを含有するマイクロスフェアを製造した。ウサギの１群に、ＩｇＧ−含有マイクロスフェアを皮下注射し、第二群に、可溶性ＩｇＧ（すなわち、ＩＶＩＧ）を皮下注射した。さらに、動物の第三群は、静脈注射でＩＶＩＧを受けた。各動物は、１５０ｍｇのＩｇＧ／体重１キログラムを受けた。皮下注射のために使用したＩＶＩＧ溶液は、約１６１〜１７８ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含み、一方ＩｇＧマイクロスフェアの懸濁物は、約１４４〜１７３ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含有した。ＩＶＩＧの静脈注射は、１６１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧで行われた。
【０１７４】
処方物の注射後、血清ＩｇＧ濃度を、Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｐｒｏｓｐｅｃシステムを使用して、ネフェロメトリ法で測定した。図１９は、マイクロスフェア形態のＩｇＧを皮下注射された動物の群、可溶型のＩＶＩＧを皮下投与された群、ＩＶＩＧ溶液を静脈内投与された動物の群に関し、経時的な平均ＩｇＧ血清濃度のプロットを示す。データーは、各処方物に関する薬物動態学的パラメーター値を調べるために使用した。表ＩＩＩで、排出速度定数（ｋｅ）、半減期（ｔｌ／２）、クリアランス（ＣＬ）および分配量（Ｖｄ）の計算値は、静脈内に与えられたＩＶＩＧ溶液に関して示す。これらの値は、薬物動態学的パラメーターを計算するために使用する。
【０１７５】
表ＩＩＩ
【０１７６】
【表４】
2010509243.tif 000007
表ＩＶは、ＩｇＧ含有マイクロスフェアを皮下的に受けた群、またはＩＶＩＧ溶液を皮下的に受けた群の薬物動態学的パラメーターを比較している。また、結果は、図２２〜２５にグラフとしても載せている。最高血漿濃度（Ｃｍａｘ）およびＣｍａｘに達するまでの時間（Ｔｍａｘ）は、図２２およびデーターの検討から求めた。時間０から時間ｔでの最終測定可能濃度までの血清濃度曲線の下の面積（ＡＵＣ０−ｔ）は、台形法則によって求めた。ＡＵＣ０−∞は、等式：ＡＵＣ０−∞＝ＡＵＣ０−ｔ＋Ｃｔ／ｋｅに従って求めた。
【０１７７】
ＡＵＣ０−∞値を用量によって割り、用量−正規化平均ＡＵＣ０−∞を得た。相対的バイオアベイラビリティは、静脈内処方物に関する用量−正規化平均ＡＵＣ０−∞と比べた、皮下送達された処方物の用量−正規化平均ＡＵＣ０−∞の比として計算した。
【０１７８】
表ＩＶおよび図２３〜２５に示すように、マイクロスフェアに処方されたＩｇＧを皮下送達で受けた動物の群と、ＩＶＩＧ溶液を皮下送達で受けた動物の群との間に、Ｃｍａｘ、ＴｍａｘおよびＡＵＣ０−ｔに関する値で重なり合う範囲を含む識別可能な値が存在する。また、表ＩＶによれば、マイクロスフェアに処方されたＩｇＧを皮下送達で受けた動物の群と、ＩＶＩＧ溶液を皮下送達で受けた動物の群との間に、ＡＵＣ０−∞の値で重なり合う範囲を含む識別可能な値が存在する。これは、活性剤のマイクロスフェア組成物のＰＫ値が、活性剤の溶液組成物のこれらのＰＫ値と実質的に同じであったことを示す。したがって、活性剤を、マイクロスフェア組成物に変換する処方は、これらのＰＫ値を有意に変更しなかった。同時に、活性剤の溶液形態と比べた時に活性剤のマイクロスフェア組成物は、微細針による皮下送達の間、粘度を下げる利点を加え、マイクロスフェア形態の活性剤の一体性および安定性を増強した。
【０１７９】
表ＩＶ
【０１８０】
【表５】
2010509243.tif 000008
本明細書で開示される実施形態は、本開示の単なる例示であり、種々の形態で具体化されたものであることは理解されるべきである。したがって、本明細書で開示された具体的な詳細は、限定として解釈されるものではなく、単に、請求項の根拠として、および当業者が本開示を事実上任意の適正な方法で種々使用するための教示の代表的な根拠として、解釈されるものである。記載されてきた本開示の実施形態は、本開示の原理のいくつかの用途を説明するものであり、個々に開示し、またはここで請求する特徴の組合せを含み、変更がなされてもよい。