【手続補正書】
【提出日】平成22年11月29日(2010.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ、切断物質、上流のプライマー、および下流の切断抵抗性プローブを含む組成物であって、該切断抵抗性プローブが、オーバーラップ構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性となる切断感受性部分とを含み、ここで、該切断抵抗性プローブが標的に対して相補的なセグメントを含み、該セグメントの5’端位が+1位に指定され、かつ、+1位に対する3'位が+2位に指定される、
ポリメラーゼ、切断物質、上流のプライマー、および下流の切断抵抗性プローブを含む組成物。
【請求項２】
切断抵抗性部分が、+1位の下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
切断抵抗性プローブが、+2位の下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
切断抵抗性プローブが、+1位に対して上流でありかつそれに接触する2個またはそれより多いひと続きのチミジンを有する、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
切断抵抗性プローブが、+1位に対して上流でありかつそれに接触する3個またはそれより多いひと続きのチミジンを有する、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
改変がチオホスフェートである、請求項2記載の組成物。
【請求項７】
改変が2'-O-メトキシである、請求項2記載の組成物。
【請求項８】
切断抵抗性プローブが、シグナルを提供できる少なくとも一つの標識部分を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
切断抵抗性プローブが、検出可能シグナルの生成を消光させるように効果的に配置される相互作用シグナル生成標識部分の対を含み、
該標識部分が、FENヌクレアーゼ切断に対して感受性がある部位によって分離されている、
請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
相互作用シグナル生成部分の対が、消光部分と蛍光部分とを含む、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
非オーバーラップ切断構造が切断されると分離するように、前記相互作用シグナル生成部分の対が効果的に配置される、請求項9記載の組成物。
【請求項１２】
前記相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、+1位に機能的に結合し、
前記相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが、5'フラップに機能的に結合している、
請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
プライマーと同じ標的領域に対しては相補的であり、かつ標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを含む、上流のオリゴヌクレオチド
をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
下流の切断抵抗性プローブに相補的な標的の領域に対して上流にあり、かつ近接している標的の領域に対して相補的な、上流のオリゴヌクレオチド
をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１５】
リバースプライマーをさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１６】
ポリメラーゼが、5'-3'ヌクレアーゼ活性を実質的に欠損する、請求項1記載の組成物。
【請求項１７】
切断物質が5'ヌクレアーゼを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１８】
5'ヌクレアーゼがFEN-1ヌクレアーゼである、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
FEN-1ヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
FEN-1ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項18記載の組成物。
【請求項２１】
ポリメラーゼが熱安定性である、請求項1記載の組成物。
【請求項２２】
切断抵抗性プローブの3'ヌクレオチドがブロッキング基を有する、請求項1記載の組成物。
【請求項２３】
ポリメラーゼ、切断物質、上流のオリゴヌクレオチド、および下流の切断抵抗性プローブを含む組成物であって、ここで、該切断抵抗性プローブが、オーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含み、
かつ、該上流のオリゴヌクレオチドが、標的に対して非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを有する、
組成物。
【請求項２４】
請求項1記載の組成物と、
そのためのパッケージング材料と
を含む、キット。
【請求項２５】
以下を含む、組成物：
（i）切断物質；
（ii）3'から5'の順に、第一の領域、伸長領域、および第二の領域を含む、標的核酸；
（iii）該標的核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、上流のプライマー；
（iv）該標的核酸に相補的ではない5'領域と、該標的核酸の該第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、かつ
オーバーラップ構造が形成されると、該切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると、該切断物質による切断に対して感受性となる切断感受性部分とをさらに含む、下流の切断抵抗性プローブ；ならびに
（v）ポリメラーゼ。
【請求項２６】
以下を含む、組成物：
（i）切断物質；
（ii）3'から5'の順に、第一の領域、伸長領域、および第二の領域を含む、標的核酸；
（iii）該標的核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ
標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを含む、
上流のオリゴヌクレオチド；
（iv）該標的核酸に相補的ではない5'領域と、該標的核酸の該第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、
オーバーラップ構造が形成されると、該切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性となる、該切断感受性部分とをさらに含む、
下流の切断抵抗性プローブ；ならびに
（v）ポリメラーゼ。
【請求項２７】
ポリメラーゼ、上流のプライマー、およびオーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性となる切断感受性部分とを含む、切断抵抗性プローブと共に、標的核酸配列を含む試料をインキュベートすることによって、切断構造を形成する工程、ならびに
切断物質による切断に対して感受性である該プローブ中のある位置の切断構造を切断し、シグナルを生成させる工程であって、ここで、該シグナルの生成が、試料中に標的核酸配列が存在することを示す、工程
を含む、試料中の標的核酸配列の存在を示すシグナルを生成する方法。
【請求項２８】
ポリメラーゼ、標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを有する上流のオリゴヌクレオチド、およびオーバーラップ構造が形成されると、切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると、切断物質による切断に対して感受性となる切断感受性部分とを含む切断抵抗性プローブと共に、標的核酸配列を含む試料をインキュベートすることによって、切断構造を形成する工程、ならびに
切断物質による切断に対して感受性である該プローブ中のある位置の切断構造を切断し、シグナルを生成させる工程であって、ここで、該シグナルの生成が、試料中に標的核酸配列が存在することを示す、工程
を含む、試料中の標的核酸配列の存在を示すシグナルを生成する方法。
【請求項２９】
標的核酸を含む試料をポリメラーゼ、上流のプライマー、および切断抵抗性プローブと共にインキュベートすることによって、切断構造を形成する工程、ならびに
切断物質による切断に対して感受性である該プローブ中のある位置の切断構造を切断し、核酸断片を放出させる工程、ならびに
試料中の標的配列の存在の指標として、該断片の放出を検出および／または測定する工程
を含む、標的核酸配列を検出または測定する方法。
【請求項３０】
切断物質、
上流のプライマー、
オーバーラップ構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性となる切断感受性部分とを含む、下流の切断抵抗性プローブ、
ポリメラーゼ、および
標的核酸
を、以下の段階に関して許容される条件下で混合する工程、ならびに
シグナルを検出および／または測定する工程
を含む、試料中の標的核酸配列を検出するための方法：
（i）上流のプライマーと下流の切断抵抗性プローブとをアニールさせる段階、
（ii）上流のプライマーを伸長させる段階であって、ここで、ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成し、下流の切断抵抗性プローブと共に切断構造を形成する、段階、および
（iii）検出可能シグナルを生成するために、切断物質によって切断構造を切断する段階。
【請求項３１】
下流の切断抵抗性プローブが、フラップを形成する5'領域と、標的核酸に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
以下の工程を含む、標的核酸を検出する方法：
（a）標的核酸の第一の領域に少なくとも部分的に相補的な上流のプライマー、および、
5'領域と、標的核酸の第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、かつ、オーバーラップ構造が形成されると切断抵抗性部分が切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断感受性部分が切断物質による切断に対して感受性となる切断感受性部分とを含む、下流の切断抵抗性プローブ
を提供する工程；
（b）標的核酸と、上流のプライマーおよび下流の切断抵抗性プローブ3'領域との間で二重鎖を形成させる条件下で、標的核酸ならびに上流のプライマーおよび下流の切断抵抗性プローブを混合する工程；
（c）切断構造を形成するために十分な長さの伸長領域に相補的な核酸鎖の重合化により上流のプライマーを伸長させる条件下で、二重鎖をポリメラーゼ活性に供する工程；
（d）切断構造の形成に依存する形で、下流の切断抵抗性プローブ内に位置する部位で、切断構造の切断が起こり、それによって下流の切断抵抗性プローブが切断されるという条件の下で、切断物質を提供する工程；
（e）下流の切断抵抗性プローブの切断を検出する工程。
【請求項３３】
ポリメラーゼ活性により、切断構造を形成するために十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドが重合化され、
該重合化された相補的な核酸が、その3'端で、二重鎖において下流のオリゴヌクレオチドに近接する、
請求項32記載の方法。
【請求項３４】
ポリメラーゼ活性により、切断構造を形成するために十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドが重合化され、
該伸長領域の長さが、伸長領域が完全な二重鎖核酸であるような長さである、
請求項32記載の方法。
【請求項３５】
下流の切断抵抗性プローブの5'領域が5'フラップを形成する、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
以下の工程を含む、標的核酸を検出する方法：
（a）標的核酸の第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、上流のプライマー、
標的核酸の伸長領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを含む、上流のオリゴヌクレオチド、および
5'領域と標的核酸の第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、オーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性となる切断感受性部分とを含む、下流の切断抵抗性プローブ
を提供する工程；
（b）標的核酸と上流のプライマー、上流のオリゴヌクレオチド、および下流の切断抵抗性プローブの3'領域との間に二重鎖を形成させる条件下で、標的核酸、上流のプライマー、上流のオリゴヌクレオチド、および下流の切断抵抗性プローブを混合する工程；
（c）上流のプライマーを伸長させ、かつ切断抵抗性プローブを切断させる条件下で、該二重鎖をポリメラーゼ活性および切断活性に供する工程；ならびに
（d）下流の切断抵抗性プローブの切断を検出する工程。
【請求項３７】
以下の工程を含む、標的核酸を検出する方法：
（a）3'から5'の順に第一の領域と第二の領域とを含む、標的核酸、
3'から5'の順に第一の領域と第二の領域とを含む、鋳型核酸、
該標的核酸の第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、第一の上流のオリゴヌクレオチド、
該標的核酸に相補的ではないが該鋳型核酸の第一の領域に少なくとも部分的に相補的である5'領域と、該標的核酸の第二の領域に相補的である3'領域とを含み、オーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性となる切断感受性部分とを含む、第一の切断抵抗性プローブ、
該鋳型核酸に相補的ではない5'領域と、該鋳型核酸の第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、オーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性とならない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性となる切断感受性部分とを含む、第二の切断抵抗性プローブ、
切断物質、および
核酸ポリメラーゼ
を提供する工程；
（b）該標的核酸、該鋳型核酸、該第一の上流のオリゴヌクレオチド、該第一の切断抵抗性プローブ、該第二の切断抵抗性プローブ、該切断物質、および該核酸ポリメラーゼを、以下の段階を可能にする反応条件下で混合する工程：
該標的核酸と該第一の上流のオリゴヌクレオチドおよび該第一の切断抵抗性プローブのそれぞれとの間で、二重鎖を形成させる段階であって、ここで、第一の切断抵抗性プローブの5'領域が、第一の切断構造の第一のフラップを形成する、段階、
第一のフラップを切断物質によって切断し、それによって第一のフラップを放出させる段階、
該放出された第一のフラップ、鋳型核酸、および第二の切断抵抗性プローブと第二の二重鎖を形成する段階であって、ここで、該第二の切断抵抗性プローブの5'領域が、第二の切断構造の第二のフラップを形成する、段階、および、
第二のフラップを切断物質によって切断する段階；ならびに
（c）第二のフラップの切断から生成されたシグナルを検出する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
本発明のさらなる特色および長所は、態様の以下の説明、その図面、および特許請求の範囲からより十分に明らかとなるであろう。
[請求項101]
下流の切断抵抗性プローブが、オーバーラップ構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含む、
ポリメラーゼ、切断物質、上流のプライマー、および下流の切断抵抗性プローブを含む組成物。
[請求項102]
切断抵抗性部分が、+1位の下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項101記載の組成物。
[請求項103]
切断抵抗性プローブが、+2位の下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項101記載の組成物。
[請求項104]
切断抵抗性プローブが、肘部(elbow)に対して上流でありかつそれに接触する2個またはそれより多いひと続きのチミジンを有する、請求項101記載の組成物。
[請求項105]
切断抵抗性プローブが、肘部に対して上流でありかつそれに接触する3個またはそれより多いひと続きのチミジンを有する、請求項101記載の組成物。
[請求項106]
改変がチオホスフェートである、請求項102記載の組成物。
[請求項107]
改変が2'-O-メトキシである、請求項102記載の組成物。
[請求項108]
切断抵抗性プローブが、標的相補的領域を含み、
該標的相補的領域が、切断に対して抵抗性ではなく、かつプライマーの伸長が行われる温度より低いTmを有する、
請求項101記載の組成物。
[請求項109]
切断抵抗性プローブが、シグナルを提供できる少なくとも一つの標識部分を含む、請求項101記載の組成物。
[請求項110]
切断抵抗性プローブが、検出可能シグナルの生成を消光させるように効果的に配置される相互作用シグナル生成標識部分の対を含み、
該標識部分が、FENヌクレアーゼ切断に対して感受性がある部位によって分離されている、
請求項101記載の組成物。
[請求項111]
相互作用シグナル生成部分の対が、消光部分と蛍光部分とを含む、請求項110記載の組成物。
[請求項112]
非オーバーラップ切断構造が切断されると分離するように、前記相互作用シグナル生成部分の対が効果的に配置される、請求項110記載の組成物。
[請求項113]
前記相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、+1位に機能的に結合し、
前記相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが、5'フラップに機能的に結合する、
請求項112記載の組成物。
[請求項114]
プライマーと同じ標的の領域に対して相補的であり、かつ標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを含む上流のオリゴヌクレオチド
をさらに含む、請求項101記載の組成物。
[請求項115]
下流の切断抵抗性プローブに相補的である標的の領域に対して上流でありかつ該標的の領域に近接する標的の領域に、相補的である上流のオリゴヌクレオチド
をさらに含む、請求項101記載の組成物。
[請求項116]
リバースプライマーをさらに含む、請求項101記載の組成物。
[請求項117]
ポリメラーゼが、5'-3'ヌクレアーゼ活性を実質的に欠損する、請求項101記載の組成物。
[請求項118]
切断物質が5'ヌクレアーゼを含む、請求項101記載の組成物。
[請求項119]
5'ヌクレアーゼがFEN-1ヌクレアーゼである、請求項104記載の組成物。
[請求項120]
FEN-1ヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項105記載の組成物。
[請求項121]
FEN-1ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項105記載の組成物。
[請求項122]
ポリメラーゼが熱安定性である、請求項101記載の組成物。
[請求項123]
切断抵抗性プローブの3'ヌクレオチドがブロッキング基を有する、請求項101記載の組成物。
[請求項124]
下流の切断抵抗性プローブが、オーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含み、
上流のオリゴヌクレオチドが、標的に対して非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを有する、
ポリメラーゼ、切断物質、上流のオリゴヌクレオチド、および下流の切断抵抗性プローブを含む組成物。
[請求項125]
下流の切断抵抗性プローブに相補的である標的の領域に近接する標的の領域に上流のオリゴヌクレオチドが相補的である、請求項119a記載の組成物。
[請求項126]
上流のオリゴヌクレオチドと下流の切断抵抗性プローブの標的相補的領域が、標的核酸にハイブリダイズした場合にギャップによって分離されている、請求項119b記載の組成物。
[請求項127]
上流のオリゴヌクレオチドと下流の切断抵抗性プローブとの標的相補的領域が、標的核酸にハイブリダイズした場合にニックによって分離されている、請求項119b記載の組成物。
[請求項128]
請求項101記載の組成物と、
そのためのパッケージング材料と
を含む、キット。
[請求項129]
切断物質が5'ヌクレアーゼを含む、請求項120記載のキット。
[請求項130]
5'ヌクレアーゼがFEN-1ヌクレアーゼである、請求項121記載のキット。
[請求項131]
切断抵抗性プローブの3'ヌクレオチドがブロッキング基を有する、請求項120記載のキット。
[請求項132]
切断抵抗性プローブが、シグナルを提供できる少なくとも一つの標識部分を含む、請求項120記載のキット。
[請求項133]
切断抵抗性プローブが、相互作用シグナル生成標識部分の対を含む、請求項120記載のキット。
[請求項134]
相互作用シグナル生成部分の対が、消光部分と蛍光部分とを含む、請求項125記載のキット。
[請求項135]
相互作用シグナル生成標識部分の対の少なくとも一つのメンバーが、切断抵抗性プローブの5'フラップに機能的に結合している、請求項125記載のキット。
[請求項136]
少なくとも一つの標識部分が、切断抵抗性プローブの5'フラップに機能的に結合している、請求項124記載のキット。
[請求項137]
標的核酸をさらに含む、請求項101記載の組成物。
[請求項138]
プライマーと同じ標的の領域に対して相補的であり、かつ標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを含む上流のオリゴヌクレオチド
をさらに含む、請求項114記載のキット。
[請求項139]
29の領域に対して上流でありかつ該領域に近接する標的の領域に、相補的である上流のオリゴヌクレオチド
をさらに含む、請求項118記載のキット。
リバースプライマーをさらに含む、請求項118記載のキット。
[請求項140]
ポリメラーゼが、5'-3'ヌクレアーゼ活性を実質的に欠損する、請求項118記載のキット。
[請求項141]
請求項124記載の組成物と、
そのためのパッケージング材料と
を含む、キット。
[請求項142]
以下を含む、組成物:
(i)切断物質;
(ii)3'から5'の順に、第一の領域、伸長領域、および第二の領域を含む、標的核酸;
(iii)該標的核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、上流のプライマー;
(iv)該標的核酸に相補的ではない5'領域と、該標的核酸の該第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、
オーバーラップ構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とをさらに含む、
下流の切断抵抗性プローブ;ならびに
(v)ポリメラーゼ。
[請求項143]
以下を含む、組成物:
(i)切断物質;
(ii)3'から5'の順に、第一の領域、伸長領域、および第二の領域を含む、標的核酸;
(iii)該標的核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ
標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを含む、
上流のオリゴヌクレオチド;
(iv)該標的核酸に相補的ではない5'領域と、該標的核酸の該第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、
オーバーラップ構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性である、該切断感受性部分とをさらに含む、
下流の切断抵抗性プローブ;ならびに
(v)ポリメラーゼ。
[請求項144]
ポリメラーゼ、
上流のプライマー、および
オーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含む、切断抵抗性プローブと共に、
標的核酸配列を含む試料をインキュベートすることによって、切断構造を形成する工程、ならびに
シグナルの生成が試料中に標的核酸配列が存在することを示す、シグナルを生成するために切断物質による切断に対して感受性である該プローブにおける位置で切断構造を切断する工程
を含む、試料中の標的核酸配列の存在を示すシグナルを生成する方法。
[請求項145]
切断抵抗性プローブが、プローブを切断に対して抵抗性にする+1位の下流の一つまたは複数の改変を含む、請求項144記載の方法。
[請求項146]
切断抵抗性プローブが、+2位の下流でプローブを切断に対して抵抗性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項144記載の方法。
[請求項147]
切断抵抗性プローブが、肘部に対して上流でありかつそれに接触する2個またはそれより多いひと続きのチミジンを有する、請求項142または144記載の方法。
[請求項148]
改変がチオホスフェートである、請求項145記載の方法。
[請求項149]
改変が2'-O-メトキシである、請求項145記載の方法。
[請求項150]
切断抵抗性プローブが、切断に対して感受性でありかつプライマーの伸長が行われる温度より低いTmを有する標的相補的領域を含む、請求項144記載の方法。
[請求項151]
切断抵抗性プローブが、シグナルを提供できる少なくとも一つの標識部分を含む、請求項144記載の方法。
[請求項152]
相互作用シグナル生成標識部分の対を含む切断抵抗性プローブが、検出可能シグナルの生成を消光させるように効果的に配置され、
該標識部分が、FENヌクレアーゼ切断に対して感受性がある部位によって分離されている、
請求項144記載の方法。
[請求項153]
相互作用シグナル生成部分の対が消光部分と蛍光部分とを含む、請求項152記載の方法。
[請求項154]
非オーバーラップ切断構造が切断されると分離するように、前記相互作用シグナル生成部分の対が効果的に配置される、請求項152記載の方法。
[請求項155]
前記相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが+1位に機能的に結合し、
該相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが5'フラップに機能的に結合する、
請求項152記載の方法。
[請求項156]
ポリメラーゼが熱安定性である、請求項144記載の方法。
[請求項157]
切断物質がFENヌクレアーゼである、請求項144記載の方法。
[請求項158]
FENヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項157記載の方法。
[請求項159]
FENヌクレアーゼが熱安定性である、請求項157記載の方法。
[請求項160]
切断抵抗性プローブが、シグナルを提供できる少なくとも一つの標識部分を含む、請求項144記載の方法。
[請求項161]
プライマーと同じ標的の領域に相補的であるオリゴヌクレオチドをさらに含む方法であって、
上流のオリゴヌクレオチドが、標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドをさらに含む、請求項144記載の方法。
[請求項162]
下流の切断抵抗性プローブに相補的である標的の領域に対して上流でありかつ該領域に近接する標的の領域に、相補的である上流のオリゴヌクレオチド
をさらに含む、請求項144記載の方法。
[請求項163]
リバースプライマーをさらに含む、請求項144記載の方法。
[請求項164]
前記ポリメラーゼが、5'-3'ヌクレアーゼ活性を実質的に欠損する、請求項144記載の方法。
[請求項165]
ポリメラーゼ、
標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを有する、上流のオリゴヌクレオチド、および
オーバーラップ構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含む、切断抵抗性プローブと共に、
標的核酸配列を含む試料をインキュベートすることによって、切断構造を形成する工程、ならびに
シグナルの生成が試料中に標的核酸配列が存在することを示す、シグナルを生成するために切断物質による切断に対して感受性である該プローブにおける位置で切断構造を切断する工程
を含む、試料中の標的核酸配列の存在を示すシグナルを生成する方法。
[請求項166]
標的核酸を含む試料をポリメラーゼ、上流のプライマー、および切断抵抗性プローブと共にインキュベートすることによって、切断構造を形成する工程、ならびに
核酸断片を放出するために、切断物質による切断に対して感受性である該プローブにおける位置で切断構造を切断する工程、ならびに
試料中の標的配列の存在の指標として断片の放出を検出および/または測定する工程
を含む、標的核酸配列を検出または測定する方法。
[請求項167]
切断物質、
上流のプライマー、
オーバーラップ構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含む、下流の切断抵抗性プローブ、
ポリメラーゼ、および
標的核酸を、
以下の段階に関して許容される条件下で混合する工程、ならびに
シグナルを検出および/または測定する工程
を含む、試料中の標的核酸配列を検出するための方法:
(i)上流のプライマーと下流の切断抵抗性プローブとをアニールさせる段階、
(ii)ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成し、下流の切断抵抗性プローブと共に切断構造を形成する、上流のプライマーを伸長させる段階、および
(iii)検出可能シグナルを生成するために切断物質によって切断構造を切断する段階。
[請求項168]
下流の切断抵抗性プローブが、フラップを形成する5'領域と、標的核酸に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含む、請求項167記載の方法。
[請求項169]
以下の工程を含む、標的核酸を検出する方法:
(a)標的核酸の第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、上流のプライマー、および
5'領域と標的核酸の第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、オーバーラップ構造が形成されると該切断抵抗性部分が切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると該切断感受性部分が切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含む、下流の切断抵抗性プローブ
を提供する工程;
(b)標的核酸ならびに上流のプライマーおよび下流の切断抵抗性プローブを、標的核酸と上流のプライマーおよび下流の切断抵抗性プローブの3'領域との間で二重鎖を形成させる条件下で混合する工程;
(c)切断構造を形成するために十分な長さの伸長領域に相補的な核酸鎖の重合化によって上流のプライマーを伸長させる条件下で、二重鎖をポリメラーゼ活性に供する工程;
(d)切断構造の切断が、切断構造の形成に依存的に下流の切断抵抗性プローブ内に位置する部位で起こり、それによって下流の切断抵抗性プローブを切断させる条件下で、切断物質を提供する工程;
(e)下流の切断抵抗性プローブの切断を検出する工程。
[請求項170]
ポリメラーゼ活性により、切断構造を形成するために十分な長さの伸長領域に相補的なヌクレオチドが重合化され、
重合化された相補的核酸が、その3'端で二重鎖において下流のオリゴヌクレオチドに近接する、
請求項169記載の方法。
[請求項171]
ポリメラーゼ活性により、切断構造を形成するために十分な長さの伸長領域に相補的なヌクレオチドが重合化され、
伸長領域の長さが、伸長領域が完全な二重鎖核酸であるような長さである、
請求項169記載の方法。
[請求項172]
下流の切断抵抗性プローブの5'領域が5'フラップを形成する、請求項169記載の方法。
[請求項173]
以下の工程を含む、標的核酸を検出する方法:
(a)標的核酸の第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、上流のプライマー、
標的核酸の伸長領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ標的に非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを含む、上流のオリゴヌクレオチド、および
5'領域と標的核酸の第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、オーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含む、下流の切断抵抗性プローブ
を提供する工程;
(b)標的核酸と上流のプライマー、上流のオリゴヌクレオチド、および下流の切断抵抗性プローブの3'領域との間に二重鎖を形成させる条件下で、標的核酸、上流のプライマー、上流のオリゴヌクレオチド、および下流の切断抵抗性プローブを混合する工程;
(c)上流のプライマーを伸長させかつ切断抵抗性プローブを切断させる条件下で、二重鎖をポリメラーゼ活性および切断活性に供する工程;ならびに
(e)下流の切断抵抗性プローブの切断を検出する工程。
[請求項174]
以下の工程を含む、標的核酸を検出する方法:
(a)3'から5'の順に第一の領域と第二の領域とを含む、標的核酸、
3'から5'の順に第一の領域と第二の領域とを含む、鋳型核酸、
該標的核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的である、第一の上流のオリゴヌクレオチド、
該標的核酸に相補的ではないが該鋳型核酸の該第一の領域に少なくとも部分的に相補的である5'領域と、該標的核酸の該第二の領域に相補的である3'領域とを含み、オーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含む、第一の切断抵抗性プローブ、
該鋳型核酸に相補的ではない5'領域と、該鋳型核酸の該第二の領域に少なくとも部分的に相補的である3'領域とを含み、オーバーラップ構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性ではない切断抵抗性部分と、非オーバーラップ切断構造が形成されると切断物質による切断に対して感受性である切断感受性部分とを含む、第二の切断抵抗性プローブ、
切断物質、および
核酸ポリメラーゼ
を提供する工程;
(b)該標的核酸、該鋳型核酸、該第一の上流のオリゴヌクレオチド、該第一の切断抵抗性プローブ、該第二の切断抵抗性プローブ、該切断物質、および該核酸ポリメラーゼを、以下の段階を可能にする反応条件下で混合する工程:
第一の切断抵抗性プローブの5'領域が第一の切断構造の第一のフラップを形成する、該標的核酸と該第一の上流のオリゴヌクレオチドおよび該第一の切断抵抗性プローブのそれぞれとの間で二重鎖を形成させる段階、
第一のフラップを該切断物質によって切断し、それによって第一のフラップを放出させる段階、
該第二の切断抵抗性プローブの5'領域が第二の切断構造の第二のフラップを形成する、放出された第一のフラップ、該鋳型核酸、および該第二の切断抵抗性プローブと第二の二重鎖を形成する段階、および
第二のフラップを該切断物質によって切断する段階;ならびに
(c)該第一および該第二の二重鎖が形成されると、該第一の上流のオリゴヌクレオチドおよび該第一の切断抵抗性プローブおよび該放出されたフラップおよび該第二の切断抵抗性プローブが少なくともニックによって分離される場合のみ該シグナルが生成される、第二のフラップの切断から生成されたシグナルを検出する工程。