【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年5月12日(2011.5.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】  追加的な官能化側鎖を有する新規なアシル−ジペプチド様化合物
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一端部に電気的に中性または荷電状態の酸基を有し、他端部に追加的な官能化された側鎖を有する、下記一般式（I）で表される新規なＮ−アシル−ジペプチド様化合物：
【化１】
2003518086.tif 000001
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍ、ｎは０〜１０の整数を表し、下添字ｐ、ｑは１〜１０の整数を表し、
ＹはＯまたはＮＨを表し、
ＸおよびＺの一方は下記の群の中から選択される電気的に中性または荷電状態の酸基を表し：
カルボキシル、
カルボキシ[(C1-5)アルコキシ]、
カルボキシ[(C1-5)アルキルチオ]、
ホスホノ[（C1-5）アルコキシ]、
ホスホノ[（C1-5）アルキルチオ]、
ジヒドロキシホスホリルオキシ[（C1-5）アルコキシ]、
ジヒドロキシホスホリルオキシ[（C1-5）アルキルチオ]、
ジヒドロキシホスホリルオキシ、
ヒドロキシスルホニルオキシ、
ヒドロキシスルホニル[（C1-5）アルコキシ]、
ヒドロキシスルホニル[（C1-5）アルキルチオ]、
ヒドロキシスルホニルオキシ[（C1-5）アルコキシ]、
ヒドロキシスルホニルオキシ[（C1-5）アルキルチオ、
[カルボキシ（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、
[ジカルボキシ（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、
[アンモニオ（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、
｛カルボキシ[アミン（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、
ＸおよびＺの他方は下記式（ＩＩ）を有する追加的な官能化された側鎖を表し：
【化２】
2003518086.tif 000002
（ここで、
ＡはＯ、ＳまたはＮＨを表し、
下添字ｒは０または１に等しい整数であり、
下添字ｓは１〜１０の整数であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：
フォルミル、
アセチル、
シアノ、
ハロゲノ、
アミノ、
ブロモまたはイオド−アセトアミド、
アシルアミド、
ジアシルイミド、
スルフヒドリル、
アルキルチオ、
ヒドロキシル、
1、2−ジヒドロキシエチル、
アルコキシ、
アシロキシ、
ビニル、
エチニル、
遊離カルボキシル、
エステル化、混合無水物、アミドまたはヒドラジドの形をしたカルボキシル、
アジド、
チオシアノ）
【請求項２】
追加的な官能化された側鎖が下記一般式（III）で表される請求項１に記載の化合物：
【化４】
2003518086.tif 000003
（ここで、
下添字ｓは４、５または６を表し、
Ｗは下記の群中から選択される基：
フォルミル、
アミノ、
ヒドロキシル、
1、2−ジヒドロキシエチル、
カルボキシル）
【請求項３】
ＹがＮＨである下記一般式（IＶ）で表される請求項1または２に記載の化合物：
【化５】
2003518086.tif 000004
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
置換基ＸまたはＺの１つは以下の群：カルボキシル、ジヒドロキシホスホリルオキシ、カルボキシ[(C1-5)アルコキシ]、カルボキシ[（C1-5）アルキルチオ]、カルボキシ[（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、[ジカルボキシ（C1-5）アルキル]アミノカルボニルおよび｛カルボキシ[アミンの（C1-5）アルキル]−アミノカルボニルの中から選択される酸基を表し、置換基の他方は6-アミノヘキサノイルオキシ、6-オキソアシロキシ、ヘキサノイルオキシ、6-ヒドロキシヘキサノイルオキシ、6、7−ジヒドロキシヘプタノイルオキシまたは3−カルボキシプロパノイルオキシ基の中から選択される）
【請求項４】
下記の群の中から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物：
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−デカン−１、１０−ジオール−１−二水素ホスフエート１０−（６、７−ジヒドロキシヘプタノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−デカン−１，１０−ジオール１−二水素ホスフエート１０−（６−オキソヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］ペンチル｝アミド５−Ｏ−（６，７−ジヒドロキシヘプタノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノールアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド５−Ｏ−（６−オキソヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノールアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド５−Ｏ−（６−ヒドロキシヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（３ＲＳ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノールアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシ−テトラ−デカノイルアミノ］−デカン−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−（６−アミノヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（９Ｒ、３Ｒ）−３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノールアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシ−テトラデカノールアミノ］−デカン−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−（６−アミノヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（９Ｒ、３Ｓ）−３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノールアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシ−テトラ−デカノイルアミノ］−デカン−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−（６−アミノヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−デカン−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−（６−ヒドロキシヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］  −５−（６−オキソヘキシル）アミノ）ペンチルの２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−（ジヒドロキシホスホリルオキシ）ブタノエート−と、その無機または有機塩基付加塩、
（８Ｒ、２Ｒ）−２−［（Ｒ）−３−］ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−３−オキソ−４−アザ−８−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−ノナン−１、９−ジオール１−Ｏ−カルボキシメチルエーテル９−Ｏ−（６−オキサヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（８Ｒ、２Ｓ）−１−（カルボキシメチル）−チオ−２−［（Ｒ）−３−テトラ−デカノイルオキシ−テトラデカノールアミノ］−３−オキソ−４−アザ−８−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−ノナン−９−オル−９−Ｏ−（７−アミノヘプタノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（（８Ｒ、２Ｒ）−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−３−オキソ−４−アザ−８−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−ノナン−１、９−オル１−Ｏ−（２、２−ジカルボキシエチル）エーテル９−Ｏ（６−ヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−（６−ブロムアセテートヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（９Ｒ、３ＲＳ）−３−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−デカン−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−Ｏ−（６−オキソヘキサノエート））と、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノールオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機またはそれの有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−スクシニルアミドヘキサノールオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイル−アミノ］ペンチル｝アミドと、その無機またはそれの有機塩基を有するアミドと付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−グリシニルオキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機またはそれの有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−スクシニルオキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機またはそれの有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］ペンチル｝アミド  β−Ｎ−（３−アミノプロピル）アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド  β−Ｎ−［（１Ｓ）−１−カルボキシ−５−アミノペンチル］アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノイルオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド  β−Ｎ−［（１Ｓ）−１−カルボキシ−５−アミノペンチル］アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド  β−Ｎ−［（１Ｓ）−１，２−ジカルボキシキシエチル］アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノイルオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド  β−Ｎ−［（１Ｓ）−１，２−ジカルボキシエチル］アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−アセチル−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノールオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］
ペンチル｝アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−（２−デカノイルオキシオクタノイル）−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノールオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機または有機塩基付加塩。
【請求項５】
下記の群の中から選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物：
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−デカン−１、１０−ジオール１−二水素ホスファート  １０−（６、７−ジヒドロキシヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］−デカン−１、１０−ジオール  １−リン酸二水素１０−（６−オキソヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］ペンチル｝アミド  ５−Ｏ−（６，７−−ジヒドロキシヘプタノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノールアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］ペンチル｝アミド５−Ｏ−（６−オキソヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（３ＲＳ、９Ｒ）、（９Ｒ、３Ｒ）および（９Ｒ、３Ｓ）−３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノールアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラ−デカノイルアミノ］デカン−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−（６−アミノヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
（３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］−デカン−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−（６−ヒドロキシヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩、
｛２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］−５−（６−オキソヘキシル）アミノ｝ペンチル２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−（ジヒドロキシホスホリルオキシ）−ブタノエートと、
その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ジヒドロキシフォスホリルオキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−スクシニルオキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノイルオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド  β−Ｎ−（（１Ｓ）−１−カルボキシ−５−アミノペンチル）アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノイルオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド  β−Ｎ−［（１Ｓ）−１，２−ジカルボキシエチル］アミドと、その無機または有機塩基付加塩、
【請求項６】
下記（１）〜（５）の工程からなる、一端部に電気的に中性または荷電状態の酸基を有し、他端部に追加的な官能化された側鎖を有する請求項１に記載の一般式（I）で表されるＮ−アシル−ジペプチド様化合物の製造方法であって、
（１）  ω位が官能化されたアミノ酸の（ｑ＋１）位のアミン官能基とω位のＹＨをオルソゴナルにブロッキング剤でブロックし、
（２）  残った遊離のカルボン酸官能基を還元剤を作用させて、対応するアルコールにし、
（３）  （ｑ＋１）位のアミン官能基をフリーにし、それを式：Ｒ2ＯＨのカル
ボン酸の官能性誘導体（ここで、Ｒ2は上記定義のもの）でアシル化し、
（４）  その後に、末端のアルコールまたはアミノ官能基をフリーにして、下記一般式（Ｖ）の官能化されたアミノアルコールとし：
【化６】
2003518086.tif 000005
（ここで、
Ｙは、ＨＯまたはＮＨ2を表し、
Ｒ2は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｐとｑは各々１〜１０の整数を表す）
（５）このアミノアルコールを不活性溶媒中でペプチド縮合剤の存在下で下記一般式（ＶＩ）：
【化７】
2003518086.tif 000006
（ここで、
Ｒ1は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｍとｎは０〜１０の整数であり、
Ｘは遊離またはエステル化されていてもよい上記定義の酸基を表し）
のωアミノ酸誘導体と縮合させて、下記一般式（ＶＩＩ）のジペプチド様化合物にする：
【化８】
2003518086.tif 000007
（ここで、
置換基Ｒ4およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐおよびｑは上記定義のものを表す）
必要な場合にはさらに、末端の遊離アルコール官能基を下記一般式（ＶIII）の置換試薬、アルキル化剤またはアシル化剤で置換、アルキル化またはアシル化する：
【化９】
2003518086.tif 000008
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはそれの先駆体）、
さらに必要な場合には、カップリング剤の存在下で、接触水素化または脱保護反応を行って、一般式（Ｉ）の誘導体を得る：
【化１０】
2003518086.tif 000009
(ここで、置換基および下添字Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、ｍ、ｐおよびｑは上記と同じ意味を有する)
【請求項７】
下記一般式（IV）：
【化１１】
2003518086.tif 000010
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは電気的に中性または荷電状態の酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
のアシル-ジペプチド様化合物を得るための請求項６に記載の方法であって、
（１）式：Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）pＣＨＮＨ2（ＣＨ2）q-1ＣＯＯＨ
のジアミノ酸の（ｑ＋１）位およびω位のアミン官能基をアシドリシスおよび水素化分解可能なブロッキング試薬によってブロッキングし、
（２）残った遊離カルボン酸官能基に還元剤を作用させて対応するアルコールにし、
（３）（ｑ＋１）位のアミン官能基をフリーにして、それを式Ｒ2ＯＨのカルボン酸の官能性誘導体（ここで、Ｒ2は上記定義のもの）によってアシル化し、
（４）水素化分解によって末端アミン官能基をフリーにして一般式（ＩＸ）のアミノアルコールとし：
【化１２】
2003518086.tif 000011
（ここで、
Ｒ2は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｐとｑは各々１〜１０の整数を表す）
（５）このアミノアルコールを不活性溶媒中でペプチド縮合剤の存在下で下記一般式（ＶＩ）：
【化１３】
2003518086.tif 000012
（ここで、
Ｒ1は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｍは1〜10の整数であり、
ｎは0〜10の整数であり、
Ｘは下記式：
【化１４】
2003518086.tif 000013
のジアルキルオキシまたはジアリールオキシ−ホスホリルオキシ基である）
のヒドロキシル化したωアミノ酸誘導体と縮合させて、下記一般式（Ｘ）のジペプチド様化合物にする：
【化１５】
2003518086.tif 000014
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐおよびｑは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
必要な場合にはさらに、末端の遊離アルコール官能基を下記一般式（ＶIII）の置換試薬、アルキル化剤またはアシル化剤で置換、アルキル化またはアシル化する：
【化１６】
2003518086.tif 000015
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはそれの先駆体）、
さらに必要な場合には、カップリング剤の存在下で、接触水素化または脱保護反応を行って、一般式（ＸＩ）の誘導体を得る：
【化１７】
2003518086.tif 000016
（ここで、置換基Ｗ、Ｒ1、Ｒ2、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは上記と同じ意味を有する）
【請求項８】
下記一般式（XII）：
【化１８】
2003518086.tif 000017
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
のアシル-ジペプチド様化合物を得るための請求項１０に記載の方法であって、
（１）式：Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）pＣＨＮＨ2（ＣＨ2）q-1ＣＯＯＨ
のジアミノ酸の（ｑ＋１）位およびω位のアミン官能基をアシドリシスおよび水素化分解可能なブロッキング試薬によってブロッキングし、
（２）残った遊離カルボン酸官能基に還元剤を作用させて対応するアルコールにし、
（３）（ｑ＋１）位のアミン官能基をフリーにして、それを式Ｒ2ＯＨのカルボ
ン酸の官能性誘導体（ここで、Ｒ2は上記定義のもの）によってアシル化し、
（４）水素化分解によって末端アミン官能基をフリーにして一般式（XIII）のアミノアルコールとし：
【化１９】
2003518086.tif 000018
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は、未置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい2〜24の炭素原子を有する飽和または不飽和カルボン酸に由来するアシル基を表し、
pとqは1〜10の整数を表し、
下添字sは1〜10、好ましくは2〜7の整数である）
（５）このアミノアルコールを不活性溶媒中でペプチド縮合剤の存在下で下記一般式（ＶＩ）：
【化２０】
2003518086.tif 000019
（ここで、
Ｒ1は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｍは１〜１０の整数であり、
ｎは０〜１０の整数であり、
Ｘは下記式：
【化２１】
2003518086.tif 000020
のジアルキルオキシまたはジアリールオキシ−ホスホリルオキシ基である）
のヒドロキシル化したωアミノ酸誘導体と縮合させて、下記一般式（XIV）のジペプチド様化合物にする：
【化２２】
2003518086.tif 000021
（ここで、
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑおよびｓは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
さらに、触媒水素化または脱保護反応によって下記一般式（ＸＶ）の誘導体を得る：
【化２３】
2003518086.tif 000022
（ここで、置換基Ｗ、Ｒ1、Ｒ2と下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは上記定義のものを表し、Ｗは好ましくは以下の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロ、ブロモまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはこれらの先駆体）
【請求項９】
下記一般式（ＩＶ）：
【化２４】
2003518086.tif 000023
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
のアシル-ジペプチド様化合物を得るための請求項１０に記載の方法であって、
（１）式：Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）pＣＨＮＨ2（ＣＨ2）q-1ＣＯＯＨ
のジアミノ酸の（ｑ＋１）位およびω位のアミン官能基をアシドリシスおよび水素化分解可能なブロッキング試薬によってブロッキングし、
（２）残った遊離カルボン酸官能基に還元剤を作用させて対応するアルコールにし、
（３）（ｑ＋１）位のアミン官能基をフリーにして、それを式Ｒ2ＯＨのカルボン酸の官能性誘導体（ここで、Ｒ2は上記定義のもの）によってアシル化し、
（４）水素化分解によって末端アミン官能基をフリーにして一般式（ＩＸ）のアミノアルコールとし：
【化２５】
2003518086.tif 000024
（ここで、Ｒ2は未置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい炭素原子数が２〜２４の飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数）
（５）このアミノアルコールを不活性溶媒中でペプチド縮合剤の存在下で下記一般式（ＶＩ）：
【化２６】
2003518086.tif 000025
（ここで、
Ｒ1は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｍは１〜１０の整数であり、
ｎは０〜１０の整数であり、
ＸはＲＯ−ＣＯ−（ここで、Ｒはアルキル基））
のジアルキルオキシまたはジアリールオキシ−ホスホリルオキシ基である）
のヒドロキシル化したωアミノ酸誘導体と縮合させて、下記一般式（XVI）のジペプチド様化合物にする：
【化２７】
2003518086.tif 000026
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑおよびｓは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
必要な場合にはさらに、末端の遊離アルコール官能基を下記一般式（ＶIII）の置換試薬、アルキル化剤またはアシル化剤で置換、アルキル化またはアシル化する：
【化２８】
2003518086.tif 000027
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、
アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはそれの先駆体）、
さらに必要な場合には、カップリング剤の存在下で、接触水素化または脱保護反応を行って、一般式（XVII）の誘導体を得る：
【化２９】
2003518086.tif 000028
（ここで、置換基Ｗ、Ｒ1、Ｒ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは上記定義のものを表す）
【請求項１０】
下記一般式（ＩＶ）：
【化３０】
2003518086.tif 000029
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
のアシル-ジペプチド様化合物を得るための請求項１０に記載の方法であって、
（１）下記一般式（XVI）：
【化３１】
2003518086.tif 000030
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐおよびｑは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
のジペプチド様化合物の遊離のヒドロキシル官能基を、アシドリシスによって容易にエステル化されたカルボキシル官能基を遊離する保護基でブロックし、
（２）必要に応じてカルボキシル官能基を選択的に活性化し、還元剤を作用させて対応する第一アルコールとし、
（３）この第一アルコールをリン酸化剤で処理してアルコール官能基を燐酸エステルに変換し、
（４）酸で処理して保護されているヒドロキシル官能基をフリーにし、
（５）下記一般式（VIII）の試薬を用いて置換、アルキル化またはアシル化する：
【化３２】
2003518086.tif 000031
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはそれの先駆体）、
さらに必要な場合には、カップリング剤の存在下で、接触水素化または脱保護反応を行って、一般式（XI）の誘導体を得る：
【化３３】
2003518086.tif 000032
（ここで、置換基Ｗ、Ｒ1、Ｒ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは上記定義のものを表す）
【請求項１１】
下記一般式（ＩＶ）：
【化３４】
2003518086.tif 000033
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
のアシル-ジペプチド様化合物を得るための請求項１０に記載の方法であって、
（１）下記一般式（XVI）：
【化３５】
2003518086.tif 000034
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐおよびｑは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
のジペプチド様化合物のエステルの形をしたカルボキシル官能基を例えばベンジル基による水素化によって脱保護し、
（２）得られた酸を部分的に保護されたアミノ酸またはジアミノアルカンとペプチドカップリング剤の存在下でペプチド結合させ、
（３）必要な場合には、得られた化合物を下記一般式（VIII）：
【化３６】
2003518086.tif 000035
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシルまたはその他の誘導体）
の試薬を用いて、必要な場合には活性化剤の存在下で、置換、アルキル化またはアシル化し、
（４）得られた化合物を脱保護して、下記一般式（XVIII）の化合物を得る：
【化３７】
2003518086.tif 000036
（ここで、置換基Ｗ、Ｒ1、Ｒ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは上記の意味を有し、Ｒ3はアミノアルキル、カルボキシアルキル、ジカルボキシアルキルまたはアミノカルボキシアルキル基を表す）
【請求項１２】
請求項1の一般式（I）の化合物または請求項３の一般式（IV）の化合物の鏡像異性体およびジアステレオアイソマー。
【請求項１３】
オルニチンまたはリシン誘導体鎖のω位置のアミン官能基のブロッキングをＮ−ベンジルオキシカルボニル化で行い、アルカリ媒体中での銅塩と酸基とを反応させた後に、この銅カルボン酸エステルをクロロ蟻酸ベンジルと反応させ、酸性媒体中で銅キレートによってカルボキシル官能基をフリーにし、α−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル化し、α−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル化およびω−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル化誘導体にする、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
遊離カルボキシル官能基の還元をボラン−ジメチル硫黄錯体によって行うか、カルボキシル誘導体をアルキルクロロホルメートとの反応で行って混合無水物とし、それをアルカリ金属またはアルカリ土類金属の硼素化水素で還元して第一アルコール官能基を有する対応するヒドロキシル誘導体を得る、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
ベンジルオキシカルボニル基の除去をトリエチルアミンを含むヒドロキシル型溶媒中での水素化分解によって行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
遊離アミンをペプチドカップリング試薬、特にホスホリルを保護するＩＤＱの存在下にα−アシルアミノω−ホスホリルカルボン酸とカップリングさせて保護されたジペプチド様化合物にする請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
エステル化試薬、特にＥＤＣｌの存在下に、ジペプチド様化合物のアルコール官能基を官能化されたω酸でアシル化してアルケニルエステルにする請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
アルケニルエステルのアルケニル官能基をジオール基でジヒドロオキシ化反応させ、ジペプチド様化合物の官能基の脱保護後、パーヨード酸との反応で酸化してアルデヒド官能基を有する化合物にする請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
ジペプチド様化合物のアルコール官能基をω−アミノアルカノン酸でアシル化する請求項10に記載の方法。
【請求項２０】
触媒の存在下に水素化分解によって完全な脱保護反応を行って追加的アミノアルカノイル側鎖を有するジペプチド様化合物を得る、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
カップリング反応で使われるパートナー酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸Ｎ−アシルβ−ベンジルエステルを得るために、アシル化剤の存在下でアミノ酸のβ−ベンジルエステルのアミン官能基を脂肪酸誘導体でアシル化して得られるアスパラギン酸またはグルタミン酸誘導体である請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
アスパラギン酸またはグルタミン酸Ｎ−アシル誘導体がオルニチンまたはリシンからのα−Ｎアシルアミノアルコールとカップリングされ、得られたジペプチド様化合物を触媒の存在下で水素化分解反応して、カルボキシル官能基を有するジペプチド様化合物にする請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
ジペプチド様化合物のヒドロキシル官能基をアルケニル基でω官能化された酸を用いてアシル化し、アルケニル基をジヒドロオキシ化し、脱保護し、パーヨード酸で酸化して一般式XVIIの化合物を得る請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
ジペプチド様化合物のヒドロキシル官能基をω−アミノアルカノイック酸でアシル化し、脱保護反応して一般式（XVII）の化合物を得る、請求項６に記載の方法。
【請求項２５】
オルニチンまたはリシンの還元で得られるアミノアルコールをω−アルケニルトリフラートでアルキル化し、それをＥＤＣｌのようなアシル化剤の存在下でαアシルアミノω−ホスホリルカルボン酸とカップリングし、アルケニル基を酸化オスミウム（VIII）の存在下でジヒドロオキシ化し、保護基を外し、過沃素酸ナトリウムでジオール官能基を酸化してアルデヒド官能基を有する化合物にする請求項６に記載の方法。
【請求項２６】
セリンのＮ−保護された誘導体をＯ−アルキル化反応し、アシドリシスによってアミン官能基の保護基を外し、アシル化剤の存在下でアミン官能基を再度、３−ヒドロキシルオキシ脂肪酸化物でアシル化してＮ−アシル−Ｏ−アルキルセリン誘導体とし、それをペプチドカップリング剤の存在下でアミノアルコールとカップリングし、遊離ＯＨ官能基をω−官能化されたアルカノン酸でアシル化してＸがカルボキシアルキルオキシ基である一般式（Ｉ）の化合物を得る請求項６に記載の方法。
【請求項２７】
出発材料のアミノ酸がシステインまたはホモシステインであり、これをp-メトキシベンジルブロモ酢酸でアルキル化し、３−ヒドロオキシ脂肪酸誘導体で窒素原子にアシル化し、得られたＳ−アルキルおよびＮ−アシル誘導体をペプチドカップリング剤の存在下で５−アミノ−２−［３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オルと結合して縮合生成物を作り、遊離の第一アルコール官能基をω−官能化されたアルカノン酸でアシル化し、必要な場合にはさらに脱保護反応してＸがカルボキシアルキルチオ基である一般式（I）の化合物にする、請求項６に記載の方法。
【請求項２８】
セリンのp-メトオキシベンジルオキシカルボニル誘導体をアルカリ媒体中でジベンジルメチレンマロネートによってＯ-アルキル化し、酸処理でアミン官能基をフリーにし、遊離したアミン官能基をアシル化剤の存在下で３−ヒドロオキシ脂肪酸でアシル化し、得られたＮ−アシルＯ−アルキル誘導体をペプチドカップリング剤の存在下でアミノアルコールとカップリングさせてジペプチド様化合物を作り、そのＯＨ官能基をアルケニルまたはアミノ基でω−官能化されたアルカノン酸でアシル化し、得られたアルケニル誘導体をジヒドロオキシ化し、水素化分解による脱保護反応させ、パーヨード酸で酸化してＸがジカルボキシアルキルオキシ基である一般式（I）の化合物を得る、請求項６に記載の方法。
【請求項２９】
出発材料としてＯ−ホスホリルホモセリンのベンジルエステルを使用し、３−ベンジルオキシテトラデカン酸でＮ−アシル化し、このベンジルエステルを選択的に水素化分解し、ペプチドカップリング剤の存在下でオルニチンのα-Ｎ−ドデカノイルオキシテトラデカン酸誘導体とカップリングしてジペプチド様化合物を作り、カルボジイミドの存在下でアルケニルまたはアミノでω-官能化したアルカノン酸で残った遊離ヒドロキシル官能基をアシル化し、アルケニル誘導体の場合にはジヒドリル化してジヒドロオキシ化し、次いで触媒存在したで水素化で脱保護し、過沃素酸げ酸化して、Ｒ1がヒドロキシアルカノイル基で、Ｒ2がアシロキシアルカノイル基である一般式(Ｉ)の化合物を得る、請求項６に記載の方法。
【請求項３０】
アスパラギン酸またはグルタミン酸から誘導される中間のジペプチド様化合物の遊離ヒドロキシル官能基をアシドリシスし易い基でブロッキングし、エステル化されたカルボキシル官能基を他の脱保護方法、特に水素化分解によって脱保護し、好ましくは混合無水物の形へ活性化した後、アルカリ金属ボロヒドリドのような還元剤で還元し、得られたヒドロキシル官能基をリン酸エステル化し、ヒドロキシル保護基を酸性媒体中で加水分解し、再生したヒドロキシル官能基をω−官能化したカルボン酸でアシル化し、ジヒドロオキシ化反応し、水素化分解と触媒の存在下に脱保護し、過沃素酸で酸化してアルデヒド官能基を有する一般式（ＸＩ）の化合物にする、請求項６に記載の方法。
【請求項３１】
アスパラギン酸またはグルタミン酸から誘導される中間のジペプチド様化合物のエステル化されたカルボキシル官能基を脱保護し、カルボキシル官能基をカップリング剤の存在下で部分的に保護されたアミノアルカンまたはアミノ酸とカップリングし、脱保護反応すなわち水素化分解か、ω−官能化したアルカノン酸でアシル化し、アルケニル誘導体の場合にはジヒドロオキシ化し、次いで脱保護、特に水素化分解し、過沃素酸で酸化して一般式（Ｉ）または一般式（ＸＶＩＩ）の化合物にする、請求項６に記載の方法。
【請求項３２】
活性成分として少なくとも一種の請求項１の一般式（Ｉ）の化合物を、純粋なジアステレオアイソマーまたはそれの混合物の形、ラセミ混合物または光学活性形態で、電気的に中性または荷電状態で含み、薬学的に許容される不活性、無毒なキャリヤまたは佐薬と組み合されまたは混合された医薬組成物。
【請求項３３】
治療上許容される有機または無機塩基との少なくとも一種の一般式（Ｉ）の化合物の塩を活性成分として含む請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
純粋なジアステレオアイソマーまたはその混合物の形をした一般式（Ｉ）の化合物と、医薬ビヒクルまたは佐薬とを組み合せまたは混合した請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
免疫応答を調節するために抗原にグラフトされた請求項１の化合物。
【請求項３６】
請求項３５に記載のグラフトされた化合物を含む医薬組成物。
【請求項３７】
治療効果を改善し、および／または、ミサイル療法を行う医薬キャリヤにグラフトされた請求項１に記載の化合物。
【請求項３８】
請求項３７に記載のグラフトされた化合物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は化学の分野関し、より詳細には、本発明はペプチド化学の分野に関し、より正確には官能化された追加的な側鎖スペーサを有するアシル化されたジペプチド様(pseudodipeptides)化合物に介するものであり、この化合物は接合体（conjugate）の形で選択的にグラフトでき、追加的な側鎖スペーサは生物的活性および生理化学的な点で独特な性質を分子に与える。アシル化ジペプチド様化合物は上記の追加的な側鎖スペーサによってその本来の性質を調整され、新しい機能、能力が与えられる。その特性は追加した化学種に応じ変わる。
官能化した追加的な側鎖スペーサを有する分子は医薬のキャリヤ、抗原またはビヒクルに結合（コンジュゲート）できる。このバイオ共役によって少なくとも2つの化学種を含む結合体ができ、個々の成分とは異なる性質を有する新しい分子複合体を形成する。従って、相互結合することによって自然または合成の化合物に固有の薬理特性を付与でき、出発化合物に比較して改良された薬理学的および物性化学的特性を有する新しい化合物を作ることができる。このバイオ接合体はヒト医学および動物の治療および診断の全て分野に応用できる。
【０００２】
【従来の技術】
種々のホモまたはヘテロな二官能性カップリング剤が既に公知であり、多くの物質、例えばペプチド、蛋白質、砂糖、オリゴサッカライド、アミノ酸、多糖、ヌクレイン酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、共役分子結合可能なほぼ全ての官能基を有する分子との結合に利用されている。最近の研究は互いに異なる特性（メッセージ）を有する2つの分子から抗原性構造物を合成することに向かっている。
Good et al. [Science, 235 : 1059-1062 (1987)]には追加的なTリンホカイトとＢリンパ球認識エピトープとを含むペプチドの合成法を報告している。
Bessler and Jung [Res. Immunol., 5 : 548-553 (1992)]はペプチドおよび免疫活性化剤から成る接合体を開示している。
Hoffmann et al. [FEMS Immunol. Med. Microbiol., 17 : 225-234 (1997)]は糖タンパクとメリチンから誘導された合成ペプチドとの接合体を開示している。
Ulrich and Meyers [Vaccine Design, Plenum Press, New York, 495  524 (1995)]はハプテンおよびMPLアジュバント（Monophosphoryl Lipid A）は同じリポソームでしか免疫応答能率が良くないことを観察している。彼らはMPLとハプテンとの間の共有結合の可能な存在を提案している。事実、ワクチンのアジュバントとして使しとハプテン−アジュバント接合体は非常に効率的であることがわかる。
Ikeda et al. [Chem. Pharm. Bull., 47 (4), 563-568 (1999)]はペプチド腫瘍から派生した抗原に連結したリポLipid Aの構造上の類似体の合成を報告し、それが試験管内の分裂促進活性を有することを証明している。
【０００３】
共役の概念は蛋白質または蛋白多糖体接合体にも等しく適用できる。事実、ワクチンとしてだけ使用した多糖は、5才以下の子供にはＴ細胞による応答に依存しないので弱い免疫応答しか引き起こさないということは周知である [Gotschlich et al. (1977); Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Peltola et al., (1977), Pediatrics : 60 : 730-737]。これとは逆に、多糖を蛋白質キャリヤに結合すると非常に強い免疫応答をする。この現象は1931年にAvery and Goebel [(1931), J. Exp. Med., 54 : 437 - 447]によって発見された。最近発見された多くのワクチンはこの分野の進歩を反映している。そうしたワクチンとしては特にヘモフィラス インフルエンザ(Haemophilus influenzae)と、ストレプトコッカスニューモニアの各種血清型にワクチンが挙げられる[Powell and Newman, (1995), Vaccine Design, Plenum Press, New York]。後者の場合には多価ワクチンが開発されている[Sood et Fatton, (1998), Exp. Opin. Invest. Drugs, 7 : (3), 333 -347]。
【０００４】
多糖−蛋白質単位に結合したアジュバントから成る複合体がさらに新しい機会を広げる。バイオ結合（bioconjugates）の化学合成法が開発され、2、3年前は思いもよらなかった多くのプロジェクトが現在はできており、現在ではホモまたはヘテロな二価性試薬が広範囲に利用でき、共役方法に関する文献も多数出ている[Hermanson, (1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York]。
例としては還元アミノ化法 [Roy et al., (1984), Canad. J. Biochem. Cell Biol., 62 : 270-279, Hermansson, p. 472]を挙げることができる。この方法を用いるとアルデヒド官能基を有する分子をペプチドまたは蛋白質分子上の第一アミンに共役結合でき、蛋白多糖体接合体または医薬キャリヤと共役結合できる。
この反応で非常に安定したジアルキルアミン化合物ができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の対象は、官能化したアミノ酸に由来するジペプチド様化合物にあり、その遊離アミノ官能基は脂肪酸によってアミド化され、このジペプチド様化合物いずれか一方の末端には官能化された追加的な側鎖スペーサが付いている。
より正確には、本発明は下記一般式（I）で表されるN−アシル化されたジペプチド様化合物に関するものであり、ジペプチド様化合物の一端には電気的に中性または荷電状態の酸基を有し、他端には官能化された追加的な側鎖スペーサを有している：
【０００６】
【化４１】
2003518086.tif 000037
【０００７】
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍ、ｎは０〜１０の整数を表し、下添字ｐ、ｑは１〜１０の整数を表し、
ＹはＯまたはＮＨを表し、
ＸおよびＺは追加的な官能化側鎖か、下記の群の中から選択される電気的に中性または荷電状態の酸基を表す：
カルボキシル、
カルボキシ[(C1-5)アルコキシ]、
カルボキシ[(C1-5)アルキルチオ]、
ホスホノ[（C1-5）アルコキシ]、
ホスホノ[（C1-5）アルキルチオ]、
ジヒドロキシホスホリルオキシ[（C1-5）アルコキシ]、
ジヒドロキシホスホリルオキシ[（C1-5）アルキルチオ]、
ジヒドロキシホスホリルオキシ、
ヒドロキシスルホニルオキシ、
ヒドロキシスルホニル[（C1-5）アルコキシ]、
ヒドロキシスルホニル[（C1-5）アルキルチオ]、
ヒドロキシスルホニルオキシ[（C1-5）アルコキシ]、
ヒドロキシスルホニルオキシ[（C1-5）アルキルチオ、
[カルボキシ（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、
[ジカルボキシ（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、
[アンモニオ（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、
｛カルボキシ[アミン（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、
ただし、置換基ＸまたはＺの少なくとも一つのは追加的な官能化側鎖である）
【０００８】
XまたはZによって表される追加の基は下記一般式（II）に対応する：
【化４２】
2003518086.tif 000038
【０００９】
（ここで、
ＡはＯ、ＳまたはＮＨを表し、
下添字ｒは０または１に等しい整数であり、
下添字ｓは１〜１０の整数であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：
フォルミル、
アセチル、
シアノ、
ハロゲノ、
アミノ、
ブロモまたはイオド−アセトアミド、
アシルアミド、
ジアシルイミド、
スルフヒドリル、
アルキルチオ、
ヒドロキシル、
1、2−ジヒドロキシエチル、
アルコキシ、
アシロキシ、
ビニル、
エチニル、
遊離カルボキシル、
エステル化、混合無水物、アミドまたはヒドラジドの形をしたカルボキシル、
アジド、
チオシアノ）
【００１０】
本発明の特に対象とする新規なN−アシルジペプチド様化合物は、一端には電気的に中性または荷電状態の酸基を有し、他端には官能化された追加的な側鎖スペーサを有する下記一般式（Ｉ）にある：
【化４３】
2003518086.tif 000039
【００１１】
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は、未置換またはヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよい炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
下添字ｍ、ｎは０〜１０の整数を表し、下添字ｐ、ｑは１〜１０の整数を表し、
ＸおよびＺは電気的に中性または荷電状態の酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表し、
ＹはＯまたはＮＨを表し、
ＸおよびＺの酸基は下記の群の中から選択されるのが好ましい：
カルボキシル、
カルボキシ[(C1-5)アルコキシ]、
カルボキシ[(C1-5)アルキルチオ]、
ホスホノ[（C1-5）アルコキシ]、
ホスホノ[（C1-5）アルキルチオ]、
ジヒドロキシホスホリルオキシ[（C1-5）アルコキシ]、
ジヒドロキシホスホリルオキシ[（C1-5）アルキルチオ]、
ジヒドロキシホスホリルオキシ、
ヒドロキシスルホニルオキシ、
ヒドロキシスルホニル[（C1-5）アルコキシ]、
ヒドロキシスルホニル[（C1-5）アルキルチオ]、
ヒドロキシスルホニルオキシ[（C1-5）アルコキシ]、
ヒドロキシスルホニルオキシ[（C1-5）アルキルチオ、
追加的な官能化側鎖ＸまたはＺは上記定義のものを表すが、１、２−ジヒドロキシエチル基は除く）
【００１２】
置換基ＸまたはＺが電気的に中性の酸基を表素場合には遊離のカルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸または燐酸であり、置換基ＸまたはＺが荷電状態の酸基を表す場合には無機または有機の塩基、好ましを医薬上許容される塩基を加えて塩にしたカルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸または燐酸の塩である。治療用でない塩基の場合には同定、精製および脱気をする。
塩にする治療用塩基としては主としてナトリウム、カリウムまたはリチウムの水酸化物のようなアルカリ塩基、アンモニウム塩、カルシウム、ストロンチウム、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属の水酸化塩基、鉄金属およびその類似物の塩、塩基性アミノ酸の第一、第二および第三アミンの誘導体のような有機塩基、リシンおよびオルニチン塩基またはアミノ糖のような塩基反応するものが挙げられる。治療を目的としない塩基の例にはブルシン、ストリキニーネ、N-メチルグルコザミンまたはＮ−メチルモルフォリンがある。既に述べたように、これらから誘導される塩は分離、同定または精製手段として使える。
ｍが１で、ｎが０のときには上記分子はセリンまたはアスパラギン酸から得られる。ｍが２で、ｎが０の場合に考えられる分子は主としてホモセリンまたはグルタミン酸から得られる。
Ｙ＝ＮＨで、ｐが３で、ｑが１の場合の化合物はシトルリン、オルニチンまたはアルギニンの化合物にすることができる。
ｐが４で、ｑが１の場合の化合物はホモアルギニンまたはリシンの化合物になる。
【００１３】
置換基ＸまたはＺが下記一般式（III）：
【化４４】
2003518086.tif 000040
（ここで、
下添字ｓは１〜１０の整数、特に４、５または６を表し、
の追加的基を表す場合には、Ｗは下記の群中から選択するのが好ましい：
フォルミル、
アミノ、
ヒドロキシル、
1、2−ジヒドロキシエチル、
カルボキシル）
【００１４】
本発明のジペプチド様化合物の中で特に好ましい化合物は下記一般式（IV）の化合物である：
【化４５】
2003518086.tif 000041
【００１５】
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は、未置換またはヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよい炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
置換基ＸまたはＺの１つは以下の群：カルボキシル、ジヒドロキシホスホリルオキシ、カルボキシ[(C1-5)アルコキシ]、カルボキシ[（C1-5）アルキルチオ]、カルボキシ[（C1-5）アルキル]アミノカルボニル、[ジカルボキシ（C1-5）アルキル]アミノカルボニルおよび｛カルボキシ[アミンの（C1-5）アルキル]−アミノカルボニルの中から選択される酸基を表し、置換基の他方は6-アミノヘキサノイルオキシ、6-オキソアシロキシ、ヘキサノイルオキシ、6-ヒドロキシヘキサノイルオキシ、6、7−ジヒドロキシヘプタノイルオキシまたは3−カルボキシプロパノイルオキシ基の中から選択される）
【００１６】
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、互いに同一でも異なっていてもよく、未置換か、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよびアルキルチオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよい。このアシル基としてはラウリン酸、2-ヒドロキシオクタン酸、2-デカノイルオキシオクタン酸、3-ラウリルオキシミリスチン酸、3-ヒトロキシミリスチン酸、3-ミリトスイルミリスチン酸および3-パルミトイルミリスチン酸に由来するものが好ましい。
本発明で特に好しい化合物は下記の表に示すジペプチド様化合物である。
【００１７】
【表１】
2003518086.tif 000042
【００１８】
【表２】
2003518086.tif 000043
【００１９】
本発明で特に好しい化合物は以下の化合物である：
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機または有機塩基付加塩（実施例１．２）、
３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−デカン−１、１０−ジオール−１−二水素ホスフエート１０−（６、７−ジヒドロキシヘプタノエート）と、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．１）、
３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−デカン−１，１０−ジオール１−二水素ホスフエート１０−（６−オキソヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．２）、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］ペンチル｝アミド５−Ｏ−（６，７−ジヒドロキシヘプタノエート）と、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．３）、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノールアミノ］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−ヒドロキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド５−Ｏ−（６−オキソヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．４）、
（３ＲＳ，９Ｒ）、（３Ｒ，９Ｒ）、（３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノールアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシ−テトラ−デカノイルアミノ］−デカン−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−（６−アミノヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．６、２．７、２．８）、
（３−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−デカン−１、１０−ジオール１−リン酸二水素１０−（６−ヒドロキシヘキサノエート）と、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．９）、
｛２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノールアミノ］−５−（６−オキソヘキシル）アミノ｝ペンチル２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−（ジヒドロキシホスホリルオキシ）−ブタノエートと、
その無機または有機塩基付加塩（実施例２．１０）、
【００２０】
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノールオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．１６）、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−スクシニルオキシ−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミドと、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．１９）、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノイルオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド  β−Ｎ−（（１Ｓ）−１−カルボキシ−５−アミノペンチル）アミドと、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．２２）、
Ｎ−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラデカノイル］−Ｄ−アスパラギン酸、α−Ｎ−｛（４Ｒ）−５−（６−アミノヘキサノイルオキシ）−４−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンチル｝アミド  β−Ｎ−［（１Ｓ）−１，２−ジカルボキシエチル］アミドと、その無機または有機塩基付加塩（実施例２．２４）、
【００２１】
これらの化合物は独特な薬理特性を有し、特に免疫修飾に関して独特な特性を有している。従って、特にワクチン組成の製造においてポリペプチドまたは多糖の抗原、多糖に結合したポリペプチドからなる化合物と混合するか、共有結合させることができる。特に、これらの化合物はウイルスおよび微生物の感染予防または自己免疫疾患の治療において使用できる。
本発明化合物はさらに、追加的な側鎖スペーサの親水度および疎水性に応じた共有結合性複合体を形成するので、治療用分子のベクターとして使用することもてきる。また、治療用分子と共役可能なその化学性およびその両親和性を利用して細胞膜、細胞質、膜受容器に対する分子の透過性を改良することができる。
本発明化合物は単独で使用でき、さらには経口、経腸管外、経直腸、局所投与、皮下投与可能な治療用分子と共有結合させ、あるいはさせないで使用できる。また、本発明化合物は、インビボで非経口投与して細胞の免疫性を促進する前に、血液細胞と一緒に生体内でインキュベーションすることによって治療用分子と共有結合させることもできる。
この分子は例えばワクチンで使われる免疫系のアジュバントと類似した性質を示し、抗原と共有結合し（または、しないで）ウイルス、パラサイト、微生物および菌類に起因する疾患を予防する。本発明化合物のいくつかは共有結合性の有無とは無関係に自己免疫疾患の治療で使用できる。
一方、共有結合した（または、しない）本発明化合物のいくつかは、造血性およびリンパ性器官からくる免疫性幹細胞のサイトカイン産生または熟成を誘発する性質を示す。
本発明化合物は、該当抗原の存在下または不存在下で樹状細胞の熟成およびに単核細胞の分化機能を促進し、免疫性を促進する。
本発明のいくらか化合物は、特に骨髄内の造血系の分化を促進し、ある種の免疫系の機能不善を改善し、修正し、特に抗ウイルス性質を示す。
本発明の化合物は特にその低毒性で重要である。本発明化合物は抗原に共有結合した状態またはしない状態で、人間および動物の感染予防、治療に一回の投与で0.005mg〜100mg、体重当たり毎日の投与で0.005〜200mg使用でき、これは個体に従って変動する。
【００２２】
本発明の他の対象は、一端部に電気的に中性または荷電状態の酸基を有し、他端部に追加的な官能化側鎖を有する一般式（I）で表されるＮ−アシル−ジペプチド様化合物の製造方法にある。
この方法は、下記工程からなる：
（１）  ω位が官能化されたアミノ酸の（ｑ＋１）位のアミン官能基とω位のＹＨをオルソゴナルブロッキング剤でブロックし、
（２）  残った遊離のカルボン酸官能基に還元剤を作用させて、対応するアルコールにし、
（３）  （ｑ＋１）位のアミン官能基をフリーにし、それを式：Ｒ2ＯＨのカル
ボン酸の官能性誘導体（ここで、Ｒ2は上記定義のもの）でアシル化し、
（４）  その後に、末端のアルコールまたはアミノ官能基をフリーにして、下記一般式（Ｖ）の官能化されたアミノアルコールとし：
【００２３】
【化４６】
2003518086.tif 000044
【００２４】
（ここで、
Ｙは、ＨＯまたはＮＨ2を表し、
Ｒ2は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｐとｑは各々１〜１０の整数を表す）
（５）このアミノアルコールを不活性溶媒中でペプチド縮合剤の存在下で下記一般式（ＶＩ）：
【００２５】
【化４７】
2003518086.tif 000045
【００２６】
（ここで、
Ｒ1は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｍとｎは０〜１０の整数であり、
Ｘは遊離またはエステル化されていてもよい上記定義の酸基を表し）
のωアミノ酸誘導体と縮合させて、下記一般式（ＶＩＩ）のジペプチド様化合物にする：
【００２７】
【化４８】
2003518086.tif 000046
【００２８】
（ここで、
置換基Ｒ4およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐおよびｑは上記定義のものを表す）
必要な場合にはさらに、末端の遊離アルコール官能基を下記一般式（ＶIII）の置換試薬、アルキル化剤またはアシル化剤で置換、アルキル化またはアシル化する：
【００２９】
【化４９】
2003518086.tif 000047
【００３０】
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはそれの先駆体）、
さらに必要な場合には、カップリング剤の存在下で、接触水素化または脱保護反応を行って、一般式（Ｉ）の誘導体を得る：
【００３１】
【化５０】
2003518086.tif 000048
(ここで、置換基および下添字Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、ｎ、ｍ、ｐおよびｑは上記と同じ意味を有する)
【００３２】
本発明のさらに他の対象は、下記一般式（IV）のホスホジペプチド様化合物の製造方法にある：
【００３３】
【化５１】
2003518086.tif 000049
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは電気的に中性または荷電状態の酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
この本発明方法は下記を特徴とする：
（１）式：Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）pＣＨＮＨ2（ＣＨ2）q-1ＣＯＯＨ
のジアミノ酸の（ｑ＋１）位およびω位のアミン官能基をアシドリシスおよび水素化分解可能なブロッキング試薬によってブロッキングし、
（２）残った遊離カルボン酸官能基に還元剤を作用させて対応するアルコールにし、
（３）（ｑ＋１）位のアミン官能基をフリーにして、それを式Ｒ2ＯＨのカルボン酸の官能性誘導体（ここで、Ｒ2は上記定義のもの）によってアシル化し、
（４）水素化分解によって末端アミン官能基をフリーにして一般式（IX）のアミノアルコールとし：
【化５２】
2003518086.tif 000050
（ここで、
Ｒ2は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｐとｑは各々１〜１０の整数を表す）
（５）このアミノアルコールを不活性溶媒中でペプチド縮合剤の存在下で下記一般式（ＶＩ）：
【化５３】
2003518086.tif 000051
（ここで、
Ｒ1は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
mは1〜10の整数であり、
nは0〜10の整数であり、
Xは下記式：
【化５４】
2003518086.tif 000052
のジアルキルオキシまたはジアリールオキシ−ホスホリルオキシ基である）のヒドロキシル化したωアミノ酸誘導体と縮合させて、下記一般式（Ｘ）のジペプチド様化合物にする：
【化５５】
2003518086.tif 000053
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐおよびｑは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
必要な場合にはさらに、末端の遊離アルコール官能基を下記一般式（ＶIII）の置換試薬、アルキル化剤またはアシル化剤で置換、アルキル化またはアシル化する：
【化５６】
2003518086.tif 000054
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはそれの先駆体）、
さらに必要な場合には、カップリング剤の存在下で、接触水素化または脱保護反応を行って、一般式（ＸＩ）の誘導体を得る：
【化５７】
2003518086.tif 000055
（ここで、置換基Ｗ、Ｒ1、Ｒ2、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは上記と同じ意味を有する）
【００３４】
本発明のさらに他の対象は、下記一般式（XII）のホスホジペプチド様化合物の製造方法にある：
【化５８】
2003518086.tif 000056
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
この本発明方法は下記を特徴とする：
（１）式：Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）pＣＨＮＨ2（ＣＨ2）q-1ＣＯＯＨ
のジアミノ酸の（ｑ＋１）位およびω位のアミン官能基をアシドリシスおよび水素化分解可能なブロッキング試薬によってブロッキングし、
（２）残った遊離カルボン酸官能基に還元剤を作用させて対応するアルコールにし、
（３）（ｑ＋１）位のアミン官能基をフリーにして、それを式Ｒ2ＯＨのカルボ
ン酸の官能性誘導体（ここで、Ｒ2は上記定義のもの）によってアシル化し、
（４）水素化分解によって末端アミン官能基をフリーにして一般式（XIII）のアミノアルコールとし：
【化５９】
2003518086.tif 000057
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は、未置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい2〜24の炭素原子を有する飽和または不飽和カルボン酸に由来するアシル基を表し、
pとqは1〜10の整数を表し、
下添字sは1〜10、好ましくは2〜7の整数である）
（５）このアミノアルコールを不活性溶媒中でペプチド縮合剤の存在下で下記一般式（ＶＩ）：
【化６０】
2003518086.tif 000058
（ここで、
Ｒ1は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｍは１〜１０の整数であり、
ｎは０〜１０の整数であり、
Ｘは下記式：
【化６１】
2003518086.tif 000059
のジアルキルオキシまたはジアリールオキシ−ホスホリルオキシ基である）
のヒドロキシル化したωアミノ酸誘導体と縮合させて、下記一般式（XIV）のジペプチド様化合物にする：
【化６２】
2003518086.tif 000060
（ここで、
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑおよびｓは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
さらに、触媒水素化または脱保護反応によって下記一般式（ＸＶ）の誘導体を得る：
【化６３】
2003518086.tif 000061
（ここで、置換基Ｗ、Ｒ1、Ｒ2と下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは上記定義のものを表し、Ｗは好ましくは以下の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロ、ブロモまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはこれらの先駆体）
【００３５】
本発明のさらに他の対象は、下記一般式（IV）のホスホジペプチド様化合物の製造方法にある：
【化６４】
2003518086.tif 000062
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
この方法は下記を特徴とする：
（１）式：Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）pＣＨＮＨ2（ＣＨ2）q-1ＣＯＯＨ
のジアミノ酸の（ｑ＋１）位およびω位のアミン官能基をアシドリシスおよび水素化分解可能なブロッキング試薬によってブロッキングし、
（２）残った遊離カルボン酸官能基に還元剤を作用させて対応するアルコールにし、
（３）（ｑ＋１）位のアミン官能基をフリーにして、それを式Ｒ2ＯＨのカルボン酸の官能性誘導体（ここで、Ｒ2は上記定義のもの）によってアシル化し、
（４）水素化分解によって末端アミン官能基をフリーにして一般式（ＩＸ）のアミノアルコールとし：
【化６５】
2003518086.tif 000063
（ここで、Ｒ2は未置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい炭素原子数が２〜２４の飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数）
（５）このアミノアルコールを不活性溶媒中でペプチド縮合剤の存在下で下記一般式（ＶＩ）：
【化６６】
2003518086.tif 000064
（ここで、
Ｒ1は非置換または上記定義の置換基で置換されていてもよい、２〜２４の炭素原子を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、
ｍは１〜１０の整数であり、
ｎは０〜１０の整数であり、
ＸはＲＯ−ＣＯ−（ここで、Ｒはアルキル基））
のジアルキルオキシまたはジアリールオキシ−ホスホリルオキシ基である）
のヒドロキシル化したωアミノ酸誘導体と縮合させて、下記一般式（XVI）のジペプチド様化合物にする：
【化６７】
2003518086.tif 000065
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑおよびｓは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
必要な場合にはさらに、末端の遊離アルコール官能基を下記一般式（ＶIII）の置換試薬、アルキル化剤またはアシル化剤で置換、アルキル化またはアシル化する：
【化６８】
2003518086.tif 000066
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはそれの先駆体）、
さらに必要な場合には、カップリング剤の存在下で、接触水素化または脱保護反応を行って、一般式（XVII）の誘導体を得る：
【化６９】
2003518086.tif 000067
（ここで、置換基W、R1、R2と、下添字m、n、p、q、rおよびsは上記定義のものを表す）
【００３６】
本発明のさらに他の対象は、下記一般式（IV）のホスホジペプチド様化合物の製造方法にある：
【化７０】
2003518086.tif 000068
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
この方法は下記を特徴とする：
（１）下記一般式（XVI）：
【化７１】
2003518086.tif 000069
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐおよびｑは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
のジペプチド様化合物の遊離のヒドロキシル官能基を、アシドリシスによって容易にエステル化されたカルボキシル官能基を遊離する保護基でブロックし、
（２）必要に応じてカルボキシル官能基を選択的に活性化し、還元剤を作用させて対応する第一アルコールとし、
（３）この第一アルコールをリン酸化剤で処理してアルコール官能基を燐酸エステルに変換し、
（４）酸で処理して保護されているヒドロキシル官能基をフリーにし、
（５）下記一般式（VIII）の試薬を用いて置換、アルキル化またはアシル化する：
【化７２】
2003518086.tif 000070
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシル、混合無水物、アミドまたはヒドラジド、アジド、チオシアノまたはそれの先駆体）、
さらに必要な場合には、カップリング剤の存在下で、接触水素化または脱保護反応を行って、一般式（XI）の誘導体を得る：
【化７３】
2003518086.tif 000071
（ここで、置換基W、R1、R2と、下添字m、n、p、q、rおよびsは上記定義のものを表す）
【００３７】
本発明のさらに他の対象は、下記一般式（IV）のホスホジペプチド様化合物の製造方法にある：
【化７４】
2003518086.tif 000072
（ここで、
Ｒ1およびＲ2は炭素原子数が２〜２４の直鎖または分枝鎖を有する飽和または不飽和のカルボン酸に由来するアシル基を表し、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アシロキシ、アミノ、アシルアミノ、アシルチオおよび（Ｃ１−２４アルキル）チオ基の中から選択される置換基で置換されていてもよく、
下添字ｍおよびｎは０〜１０の整数であり、
下添字ｐおよびｑは１〜１０の整数であり、
ＸおよびＺは酸基を表すか、追加的な官能化側鎖を表す）
この方法の特徴は下記の点にある：
（１）下記一般式（XVI）：
【化７５】
2003518086.tif 000073
（ここで、置換基Ｒ1およびＲ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐおよびｑは上記定義のものを表し、Ｒは容易に水素化分解し易い基である）
のジペプチド様化合物のエステルの形をしたカルボキシル官能基を例えばベンジル基による水素化によって脱保護し、
（２）得られた酸を部分的に保護されたアミノ酸またはジアミノアルカンとペプチドカップリング剤の存在下でペプチド結合させ、
（３）必要な場合には、得られた化合物を下記一般式（VIII）：
【化７６】
2003518086.tif 000074
（ここで、
Ａは脱離基、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ2官能基、
下添字ｒは１または０であり、
下添字ｓは１〜１０、好ましくは２〜６であり、
Ｗは下記の基の中から選択される：フォルミル、アセチル、シアノ、ハロー、アミノ、ブロムまたはイオド、アセタミド、アシルアミド、ジアシルアミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、ヒドロキシル、1、2-ジヒドロキシエチル、アシロキシ、ビニル、エチニル、遊離またはエステル化されたカルボキシルまたはその他の誘導体）
の試薬を用いて、必要な場合には活性化剤の存在下で、置換、アルキル化またはアシル化し、
（４）得られた化合物を脱保護、例えば水素化分解によって、下記一般式（XVIII）の化合物を得る：
【化７７】
2003518086.tif 000075
（ここで、置換基Ｗ、Ｒ1、Ｒ2と、下添字ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓは上記の意味を有し、Ｒ3はアミノアルキル、カルボキシアルキル、ジカルボキシアルキルまたはアミノカルボキシアルキル基を表す）
【００３８】
アシルアミノ基を有するキラル中心の立体化学は出発材料のアミノ酸の形態によって決まり、アシルアミノ基の立体化学は出発材料の脂肪酸の形態に依存する。ＬまたはＤ形態またはラセミ混合物のジアミノ酸から出発できる。Ｌ、Ｄまたはラセミ混合物のヒドロキシル化アミノ酸から出発することができる。一般の式（Ｉ）、（ＩＶ）、（ＸＩＩ）または（ＸＶＩ）の化合物の全て立体異性体またはジアステレオアイソマーが本発明の範囲に含まれる。
一般に、本発明化合物はω−官能化されたＮ−アシルアミノ酸の酸官能基とモノ−Ｎ−アシルジアミノ酸のカルボキシル基の還元で得られるアミノアルコールのアミン官能基とのカップリングによって作られる。残った遊離アルコール官能基はＯ−アシル化またはアルキル化して追加的な官能化側鎖スペーサを導入する。必要な場合には活性官能基を遊離させるために拘束後に選択的に修飾できる。
最終化合物の脱保護で酸官能基をフリーにする。
本発明化合物の好ましい製造方法（図１）では、ω−官能化されたアミノ酸がα−アミノω−ヒドロキシル酸、例えばセリンまたはホモセリンであり、これに一連の反応：Ｎ−保護反応（例えば、ｔ−ブトキシカルボニル誘導体の形）、カルボン酸エステルのＯ−アルキル化によるベンジルエステルの形成およびＯＨ官能基のリン酸エステル化での保護されたリン酸基の導入を行う。ホスエート型の保護基はフェニル、ベンジルまたはｏ−キシリル基にすることができる。フェニル基が好ましい。次に、保護基を除去してアミン官能基をフリーにする（例えばトリフルオロ酢酸でｔ−ブチルオキシカルボニル誘導体を処理）し、脂肪酸の活性誘導体、好ましくは３−ヒドロキシテトラデカン酸の誘導体、例えば３−ドデカノイルオキシテトラデカン酸によってアシル化する。この活性形はアシルクロリド、活性エステル、混合無水物またはアミド結合を形成できる任意の化学種にすることができる。次に、残っているベンジルエステルを選択的水素化分解によって除去してα位置にアシルアミド基を有し、ω位置に（ＲＯ）2Ｐ（Ｏ）Ｏ−基を有するカルボキシル酸にする。
ペプチド結合の相手は例えばオルニチンまたはリシンのようなα、ω−ジアミノ酸から一連の反応で得られる。すなわち[Organic Preparation [Organ Preparations and Procedures international (23(1992):191-194)]に開示の方法に従った銅複合体を介した例えばベンジルオキシカルボニル誘導体によるω−位置のアミン官能基の選択的保護反応、銅複合体の除去および例えばｔ−ブチルオキシカルボキシル誘導体によるα位置のアミン官能基の保護基で得られる。他の保護基を用いることもできる。遊離カルボキシル官能基は例えばジメチルスルフィドボラン錯体を使用した還元によって、または、[Tetrahedron Letters, 32 (1991) 923  926]に開示された方法に従って水素化硼素ナトリウムによる予め作った混合無水物の処理によって第一アルコールに変える。α−位置のアミン官能基を酸性媒体中で（例えばトリフルオロ酢酸）で処理し、次いで、活性化された脂肪酸誘導体、好ましくは３−ヒドロキシテトラデカン酸誘導体、例えば３−ベンジルオキシテトラデカン酸でＮ−アシル化する。必要な場合には、遊離ＯＨ官能基をこの段階で例えばベンジルオキシメチルエーテルの形で保護する。ω−アミノ官能基は他の保護基に対して不活性な試薬、例えば、保護基がベンジルオキシカルボニルの場合にはトリエチルアミンを含むアルコール型溶媒中での選択的水素化分解によってで処理してフリーにする。
【００３９】
好ましい合成方法では、得られたアミンをＩＩＤＱまたは他のペプチドカップリング試薬の存在下で上記のようにして製造したω−ホスホリルα−アシルアミン−カルボキシル酸とカップリングして、保護されたホスホリレート化ジペプチド様化合物にする。この化合物を残っている遊離ヒドロキシル官能基にω−官能化された酸（例えばＥＤＣｌまたは他のエステル化剤）の存在下での６−ヘプテン酸でＯ−アシル化する（図５）。このエステルのアルケニル官能基を触媒量または化学量論量のオスミウムテトラオキサイドの存在下でジヒドロキシ化し、次いで、ホスファートの保護基および必要に応じて存在するベンジルエーテル形のヒドロキシル官能基を適切な触媒の存在下の水素化分解で除去する（実施例２．１）。最後のステップは、隣接するジオール基を例えば過沃素酸を使用して酸化して反応性アルデヒド官能基にする（実施例２．２）。アルデヒド官能基の第一アルコールへの還元はω−ヒドロキシアシル基を有する誘導体で行う（実施例２．９）。
変形方法では、ペプチド結合生成物をω−アミンアルカノン酸誘導体、例えば６−ベンジルオキシカルバノイルアミノヘキサン酸でＯ−アシル化する（図１１）。得られた化合物を適切な触媒の存在下の水素化分解による脱保護反応によって追加的側鎖スペーサのアミンアルカノイルを有するジペプチド様化合物が得られる（実施例２．６）。
第２の好しい変形方法では、ペプチド結合の相手をＤ−またはＬ−アスパラギン酸誘導体にするか、必要に応じてＤ−またはＬ−グルタミン酸誘導体にする（図２）。アスパラギン酸誘導体はこのアミノ酸のβ−ベンジルエステルのアミン官能基の脂肪酸によるＮ−アシル化、アシル化試剤の存在下の好ましくは３−オキシ脂肪酸誘導体、例えば３−ドデカノイルオキシテトラデカン酸による反応で得られる。この化合物を上記形式のアミノアルコールと結合してジペプチド様化合物を得る。それを触媒（例えばパラジウムまたはプラチナで被覆した炭素）の存在下で水素化分解反応してカルボキシル酸官能基を有するジペプチド様化合物にする（実施例１．２）か、例えばホスホアミド化（phosphoramidite）方法によるリン酸エステル化反応と、それに続く水素化分解反応によってカルボキシル酸基とリン酸官能基とを有するジペプチド様化合物にする（実施例１．３）。
【００４０】
あるいは、上記で得たジペプチド様化合物（図２）のヒドロキシル官能基をω−官能化された酸でアシル化する。このω−官能化された酸はω−アルケニル酸またはω−アミノアルカノン酸にするのが好ましい。ヘプテン酸を使った場合（図８）には、ジペプチド様化合物はＯ−ヘプテニル誘導体になり、これを酸化オスミウム（VIII）の存在下でジヒドロキシ化し、その後脱保護し（実施例２．３）、過沃素酸で酸化し（実施例２．４）、形成されたアルデヒド官能基を水素化硼素ナトリウムのような還元剤で還元してω−ヒドロキシアルカノイル官能基有するジペプチド様化合物を得る（実施例２．５）。
６−アミノヘキサン酸またはグリシンのＮ−ベンジルオキシカルボニル誘導体のようなω−アミノアルカノン酸の場合には（図２４）、保護されたＯ−アミノアシル化ジペプチド様化合物が得られる。これを水素化分解（実施例２．１３、実施例２．１８）で脱保護してアミノアシル誘導体にする。
第２の変形例（図１３）では、［図２］に記載の中間ジペプチド様化合物の遊離ヒドロキシル官能基を保護し、好ましくはテトラヒドロピラニルエーテルの形で保護し、エステル化されたカルボキシル官能基を水素化分解または他の脱保護方法で脱保護し、次いで、混合無水物の形で活性化後、水素化硼素ナトリウムのような還元剤でに還元する。得られたヒドロキシル基を好ましくは燐酸アミド（phosphoramidite）法によってリン酸エステル化し、その後、テトラヒドロピラニルエーテルを酸性条件下で加水分解し、生じたヒドロキシル官能基をω−官能化したカルボキシル酸でアシル化して再生させる。このω−官能化したカルボキシル酸はアルケニル酸またはω−アミノアルカノン酸が好ましい。６−ベンジルオキシカルボニルアミノヘキサン酸の場合には、ジペプチド様化合物は保護されたＯ−アミノアシル化誘導体になる。これを水素化分解する（実施例２．７、実施例２．８）。あるいは、上記のモノリン酸化中間体を保護されたアスパラギン酸のβ−ベンジルエステル（図２）のＮ−アシル誘導体のペプチド結合によって得ることができ（図１５）、例えばベンジルオキシメチルまたはテトラヒドロフラニルエーテルまたはオルニチンのアミノアルコール誘導体（図１）スチルシリルの形で得る得ることができる。これをベンジルエステルの形で酸官能基をフリーにし、第一アルコールに還元し、この官能基をホスホリル化し、保護されているアルコール官能基の保護をベンジルオキシメチル、テトラヒドロピラニルまたはシリルエーテルの形で外す。
【００４１】
第３の変形例では［図２］に記載の中間ジペプチド様化合物をジカルボン酸誘導体、好ましくは塩基またはカップリング剤存在下での無水琥珀酸で、Ｏ−アシル化する（図２７）。次いで、形成されたエステルを水素化分解によって脱保護する（実施例２．１９）。脱保護したＯ−アミノアシル誘導体を無水琥珀酸で処理してスクシニルアミノアシル基を有するジペプチド様化合物にする（実施例２．１７）。
好ましい第３の変形方法では上記のようにしてオルニチンまたはリシンから得られたアミノアルコールをω−アルケニルトリフラート、例えばヘプト−６−エニルトリフラートでアルキル化する（図１７）。第二アミンを有するこのアミノアルコールをＥＤＣＩまたは他のアシル化剤の存在下での上記のホスホリルω−アシルアミノ酸とのカップリングしてエステルにする。アルケニル基を酸化オスミウム（VIII）の存在下でジヒドロキシ化し、触媒存在下の水素化分解によって保護基を外し、近接するジオール官能基を過沃素酸ナトリウムで酸化し、反応性アルデヒド官能基にする（実施例２．１０）。
【００４２】
好ましい第４の変形法（図１９）では、Ｎ−保護されたセリン誘導体、例えばSynthesis (1989), 36-37に開の方法に従って調製したｐ−メトオキシベンジルオキシカルボニル誘導体をベンジルブロモ酢酸でＯ−アルキル化する。アミン官能基の保護基を例えばジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸で処理して外し、アミン官能基をアシル化剤の存在下で好ましくは３−オキシ脂肪酸誘導体、例えば３−ドデカノイルオキシテトラデカン酸または酸塩化物またはその他の活性化した脂肪酸を使用してＮ−アシル化する。得られたＮ−アシルＯ−アルキルセリン誘導体をＩＩＤＱのようなペプチドカップリング剤の存在下で上記のアミノアルコールと結合する（図１）。次いで、遊離ＯＨ官能基をカルボジイミドのような活性化剤の存在下でω−官能化されたアルカノン酸でアシル化する。この官能化された酸はω−アルケン酸またはω−アミノアルカノン酸誘導体にするのが好ましい。例えばヘプト−６−エン酸を用いるとジペプチド様化合物はＯ−（６−ヘプトニル）誘導体になる。これをジヒドロキシ化し、酸化オスミウム（VIII）の存在下で水素化分解で脱保護し、過沃素酸で酸化する（実施例２．１１）。
【００４３】
好ましい第５の変形方法では、出発材料のアミノ酸がシステインまたはホモシスチンである（図２０）。例えばシステインをｐ−メトキシベンジルブロモ酢酸でＳ−アルキル化し、次いで、アシル化剤または酸の存在下またはハロゲン化物またはその他の活性化した脂肪酸を用いて３−オキシ脂肪酸誘導体、好ましくは３−テトラデカノイルオキシテトラデカン酸でＮ−アシル化する。次いで、得られたシステインのＳ−アルキルＮ−アシル−誘導体をＩＩＤＱまたはその他のペプチドカップリング剤の存在下で５−アミノ−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］ペンタン−１−オルとカップリングする。遊離ＯＨ官能基はＯ−ベンゾトリアゾリルエステルのような活性化されたエステルの形のω−官能化されたアルカノン酸でＯ−アシル化合物する。
【００４４】
この酸は７−（ｐ−メトオキシ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘプタン酸のようなω−アミノ・アルカノン酸であるのが好ましい。得られた化合物を水溶性酸媒体中で完全脱保護して７−アミノヘプタン酸側鎖スペーサを有するジペプチド様化合物を得る（実施例２．１２）。
【００４５】
本発明の他の好しい変形方法（図２１）では、セリンのＮ−ｐ−メトオキシベンジルオキシカルボニル誘導体をアルカリ媒体中でジベンジルメチレンマロネートでＯ−アルキル化する。アミノ保護基を酸処理で除去し、遊離したアミン官能基を好ましくは好ましくは３−アシルドデカノイルオキシテトラデカン酸のような３−オキシ脂肪酸誘導体で、アシル化剤または官能化された脂肪酸誘導体の存在下、例えば酸塩化物またはその他の活性化した脂肪酸を用いて、Ｎ−アシル化する。得られたＮ−アシルＯ−アルキルセリン誘導体をＩＩＤＱまたはその他のどのペプチドカップリング剤の存在下で上記アミノアルコールに結合する（図１）。ジペプチド様化合物の遊離ＯＨ官能基をω−官能化されたアルカノン酸でＯ−アシル化する。この酸はω−アルケニル酸またはω−アミノアルカノン酸誘導体、例えばヘプト−６−エン酸にするのが好ましい。次いで、ジペプチド様化合物をＯ−（６−ヘプトニル）誘導体にし、それを順次酸化オスミウム（VIII）の存在下でジヒドロキシ化し、水素化分解により脱保護し、過沃素酸で酸化して、ヘキサノイル側鎖スペーサと６−オキソマロニル基とを有する誘導体にする（実施例２．１３）。
【００４６】
別の好しい変形方式（図２２）では上記（図１１）の６−アミノヘキサノイル誘導体をアシル化剤として例えばＯ−ブロムブロモ酢酸のスクシンイミジルエステルを使用してアセトアミド基でＮ−アシル化する。この反応では６−（ブロモアセトアミド）ヘキサノイル側鎖スペーサを有する誘導体が得られる（実施例２．１４）。
好ましい第８の変形方法（図２３）では、Ｏ−ホスホリルセリンベンジルエステル（図１を参照）を３−ベンジルオキシテトラデカン酸、好ましくは３−ベンジルオキシテトラデカン酸およびイソブチルクロロ炭酸塩から調製された混合無水物を使用してＮ−アシル過する。次いで、ベンジルエステルを上記方法で選択水素化分解する。ω−Ｎ−ベンジルオキシオルニチン（図１を参照）に由来するカルボニルジアミノアルコールはカップリング剤の存在下または活性化されたエステルまたは活性化された脂肪酸を使用して３−ドデカノイルオキシテトラデカン酸でＮ−アシル化し、アミノ官能基を選択水素化分解で遊離させる。このアミンをカップリング剤の存在下または活性化されたエステルまたは活性化された脂肪酸を使用してホモセリンのＮ−（３−ベンジルオキシテトラデカノイル）Ｏ−（ジフェニル−オキシホスホリル）誘導体と結合する。得られたジペプチド様化合物をω−官能化されたアルカノン酸、例えばカルボジイミドの存在下でＯ−アシル化する。この酸はω−アルケニル酸またはω−アミノアルケニル酸誘導体であるのが好ましい。例えば、ヘプト−６−エン酸を使用すると、ジペプチド様化合物はＯ−（６−ヘプトニル）誘導体となり、それを順次酸化オスミウム（VIII）の存在下でジヒドロキシ化し、適切な触媒の存在下で水素化分解して脱保護し、過沃素酸で酸化して、６−オキソヘキサノイル側鎖を有する誘導体にする（実施例２．１５）。
【００４７】
好ましい第９の変形方法（図２９、図３１、図３４）では、［図２］に記載の中間ジペプチド様化合物のエステル化されたカルボキシル官能基を脱保護し、このカルボキシル官能基をカップリング剤の存在下で官能化されたアミノアルカンと結合させる。官能性置換されたアミノアルカンはα、ω−ジアミノアルカンまたはアミノ酸誘導体であるのが好ましい。１−アミノ−３−ベンジルオキシカルボニルアミノプロパン（図２９）の場合には、カップリング反応生成物を水素化分解反応する（実施例２．２０）。Ｎ−Ｚ−リシンベンジルエステル（図３１）およびアスパラギン酸のα，β−ジベンジル（図３４）の場合には、カップリング反応生成物を好ましくは水素化分解で脱保護する（実施例２．２１、実施例２．２３）か、ω−官能化されたアルカノン酸、好ましくは６−アミノヘキサン酸Ｎ−ベンジルオキシカルボニル誘導体でＯ−アシル化する。得られたエステルを水素化またはその他の脱保護方法で脱保護する（実施例２．２２、実施例２．２４）。
【００４８】
本発明はさらに、純粋な鏡像異性体および／または立体異性体または立体異性体混合物の形をした一般の式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＩＸ）、（ＸＩＩＩ）および（ＸＶＩ）の中間体に関するものである。
本発明はさらに、中性または荷電状態の一般式（Ｉ）の少なくとも一つの化合物を活性成分として含み、薬学的に許容される非活性で無毒なビヒクルまたは佐薬と組合せまたは混合したむ医薬組成物に関するものである。
本発明は特に、一般式（Ｉ）の少なくとも一つの化合物の治療用の無機または有機塩基との塩を活性成分として含む医薬組成に関するものである。
本発明はさらに、純粋な鏡像異性体および／または立体異性体または立体異性体混合物の形をした一般の式（Ｉ）の化合物と、医薬の佐薬またはビヒクルと組合せまたは混合した医薬組成に関するものである。
【００４９】
医薬形態としては非経口投与薬、経消化路、塗布薬（ゲル）、吸入剤、糖衣錠、タブレット、カプセル、注射薬、サスペンション、経粘膜剤、経皮剤、局所投与剤、エアーゾル等を挙げることができる。
本発明化合物は免疫応答を調整するために抗原にグラフトでき、また、治療効果またはターゲット作用を改善するために医薬のキャリヤにグラフトでき、注射用水溶液またはサスペンションの形で共役した形で注射で投与でき、必要に応じてアミンまたはヒドロキシアルキルアミンで中和できる。例としてはＨ１Ｎ１抗原、ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍのＳＹＶＰＳＡＥＱＩノナペプチド抗原および医薬キャリヤ、例えばＡＺＴ、ｍａｃｒｏｌｉｄｓのような抗生物質、ｄ４Ｔおよび中枢神経系ＣＮＳに作用する物質を挙げることができる。
以下、図１〜図８６を参照して本発明の実施例を説明する。
【００５０】
【実施例】
第1シリーズの実施例
合成中間体の製造
実施例1.1
1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラ−デカノイル−アミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-10-オル（図1）
1.1.1  4-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシ−テトラ−デカノイル−アミノ]ブタン酸
a. N-tert-ブチルオキシカルボニル-DL-ホモセリン
Ｈ2Ｏ（20ml）中のホモセリンブロモの水溶液（2g；16.78mmol）を1-Mソーダ溶液（16.78ml）、次いで炭酸セシウム（3,01g；9.23mmol）へ添加した。5分間撹拌後、溶液を氷/ウォーターバスで冷却した。次に、ジオキサン（60ml）およびt-ブチルピロ炭酸を加えた。反応液を氷水のウォーターバス中で1時間、その後、室温で5時間撹拌下に保った。溶剤は減圧蒸発し、得られた乾いたケークを次のステップで直接使った。
b. N-t-ブチルオキシカルボニル-DL-ベンジルホモセリネート
上記ステップのケークにジメチルホルムアミド（20ml）を加え、溶剤を乾燥蒸発させた。次に、反応液にジメチルホルムアミド（60ml）と臭化ベンジル（4.5ml；20,13mmol）とを加えた。この時点で白い沈殿物が形成れれた。混合物を16時間、撹拌下に保った。溶剤を減圧して除き、ケークを酢酸エチル（2×20ml）で抽出した。有機相をＨ2Ｏ（20ml）、食塩水（20ml）、次いで蒸留水で洗浄した。残渣を酢酸エチル(2×20ml)に取り、有機相をＨ2Ｏ（20ml）で洗った。硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶剤を蒸発させた。得られたケークは次のステップでそのまま使った。
c. ベンジルN-t-ブチルオキシカルボニル-O-(ジフェニルオキシホスホリル）-DL-ベンジルホモセリネート
上記ステップの乾燥したケークをCH2Cl2（60ml）に溶し、4−(N,N-ジメチルアミノピリジン（DMAP）（4,11g；33.56mmol）を加えた。反応液を10分間拡販し、ピリジン（12ml）とジフェニルクロルホスフエート（6.95ml；33.56mmol）とを加えた。溶液を室温で18時間攪拌してから1N-HCl（5×20ml）、Ｈ2Ｏ（30ml）および食塩水（30ml）で洗った。有機相MgSO4を通して乾燥し、溶剤を減圧して除去した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン/酢酸エチル混合物4/1で溶出）で精製してホスホリレート化物（7.49g；82.4％）を結晶性固形物として回収した。
融解点：63.5-64.0℃
d. ベンジルO-(ジフェニルオキシホスホリル）-DL-ベンジルホモセリネート,トリフルオロ酢酸塩
上記ステップ（7.88g；15.4mmol）のホスホリレート化物をトリフルオロ酢酸（15ml）に溶かし、室温で撹拌下に2.5時間保った。溶剤を高真空で除去し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフ（MeOH/CH2Cl2溶離液10/1）で精製して脱保護されたアミントリフルオロ酢酸塩（7.17g；88.9％）を結晶性固形物として回収した。
融点. ＝ 73.0（73.5℃）
e． 2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）ベンジルブタノエート
[Bull. Chem. Soc. Jpn., 60 (1987), 2205 - 2214]に記載の方法で調製した（R）-3-ドデカノイルオキシテトラデカン酸（4.284g；10.07mmol（1当量）をTHF（30ml）に溶かし、-15℃まで冷却した。次に、N-メチルモルホリン（1,108ml；10.07mmol（1当量）とイソブチルクロロ炭酸塩（1.31ml；10.07mmol；1当量）を加えた。反応液を-15℃で30分間撹拌した。反応液にＴＨＦ／Ｅｔ3Ｎ混合物（30ml/5ml）中のベンジルO-(ジフェニルオキシホスホリル）-DL-ベンジルホモセリン（5.724g；10.07mmol；1当量）を加えた。室温で18時間撹拌後、溶剤を減圧して除去した。ケークをＨ2Ｏ（20ml）で希釈し、酢酸エチル（2×30ml）で抽出した。有機相を合わせ、水（20ml）および食塩水（20ml）で洗い、MgSO4を乾燥し、溶剤を蒸発させた。シリカゲルのフラッシュフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン/酢酸エチル溶離液2/1）で精製して所望のベンジルエステル（7.455g；87％）を結晶性固形物として回収した。
融点＝ 31.0−32.1℃、
【表３】
2003518086.tif 000076
f．4-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]−ブタン酸
上記ステップ（2.23g；2.6mmol）で得られたベンジルエステルのHPLC-グレートのメタノールMeOH（300ml）溶液を３っ首丸底フラスコ中で室温で炭素-10％パラジウム（1g）の存在下で1時間、１気圧の水素で水素化した。触媒を濾過して除去し、濾液を蒸発させるとは無色のアルコールが得られる。この生成物が均質であることを薄層クロマトグラフィおよびNMRで確認し、精製処理しないで、直接共役ステップで使った。
Rf＝0.75（CH2Cl2−MeOH−Et3N、10/1/0.5）
【表４】
2003518086.tif 000077
1.1.2  （2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンタン-1-オル
ａ.  D-オルニチン銅塩
1M−NaOH（30ml）中のD-オルニチン（5.25g；30mmol）溶液に水（50ml）中の硫酸第二銅五水和物（3.814g；15.3mmol）溶液を加えた。室温で2時間、撹拌後、溶剤を乾燥蒸発させた。ケークにメタノール（60ml）を加えると紫に着色した固形物が形成される。それをジオキサンおよびメタノールで洗い、次のステップで直接使った。
【００５１】
ｂ．（2R）-2-アミノ-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ）ペンタノエート銅
紫色の固形物を1N−NaOH（40ml）およびジオキサン（70ml）に溶かした。反応液を氷水のウォーターバスで冷却し、クロロ蟻酸ベンジル（5.14ml；36mmol）を加えた。3時間、氷水ウォーターバスで、次いで、室温で15時間撹拌した後、紫色の沈殿物を濾過で回収し、95％ EtOH（40ml）、Ｈ2Ｏ（50ml）およびEtOH（60ml）で順に洗った。沈殿物を乾燥器（T <45℃、減圧下）で乾燥した。２段階プロセスでの収率は8.27g（すなわち理論収率の93％）であった。
（参考：Organic Preparations and Procedures international, 23 : (1992) 191-194)。
【００５２】
C．（2R）-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ）-2-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノ）ペンタン酸
上記ステップで得られた銅塩を2N−HCl（400ml）に溶かし、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（27.8mmol、8.15g）を加えた。混合物を2.5時間攪拌し、5N−NaOH（約160ml）を加えてpH 7に中和した。白い沈殿物がこの時点で形成された。混合物を氷水ウォーターバスで2.5時間攪拌した。沈殿を濾過し、濾液が無色になるまで冷水で洗い、60℃の乾燥器で乾燥した。この固形物を1N−NaOH（156ml）に溶かし、溶液を氷水ウォーターバスで冷却した。この溶液にジオキサン（160ml）中のt-ブチルピロカーボネート（7.7g；35.2mmol）を加えた。混合物を0℃で45分間、その後室温で16時間攪拌した。有機溶剤を蒸発させ、ケークを酢酸エチル（70ml）に溶かした。水相に2N−HClを加えることによってpH 3に酸性化し、AcOEt（100ml）で洗浄した。有機相を合せ、Ｈ2Ｏ（30ml）、そして食塩水（30ml）で洗い、減圧蒸発させた。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（CH2Cl2/MeOH溶離液20/1）で精製して所望の生成物を無色鉱油として回収した（収率：2段階で8．42g、すなわち理論収率の76．6％）
（Rf ＝ 0．19（20/1 CH2Cl2/MeOH）
【００５３】
d．（2R）-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ）-2-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノ）ペンタン-1オル
上記で得たジアミノ・ペンタン酸誘導体（5.45g；14.8mmol）の冷却したTHF（60ml）溶液（-15℃）にN-メチルモルホリン（1.654ml；14.8mmol）およびイソブチルクロロ炭酸塩（IBCF）（9.6ml；14.8mmol）を加えた。反応液を-15℃で1分間攪拌してから、10mlの水に溶かした水素化硼素ナトリウム（5.1g；44.6mmol）を添加した。10分間更に撹拌した後、-15℃でＨ2Ｏ（400ml）を混合物に加えては反応を停止した。溶液を酢酸エチルAcOEt（100ml x 2）、その後、蒸留水で洗浄した。有機相を合せ、Ｈ2Ｏ（50ml）については、そして、MgSO4を通じてそれから乾燥しれる食塩水（60ml）については洗った。溶剤を除去し、ケークを酢酸エチル/ヘキサン混合物から再結晶して所望の結晶性生成物（4.94g；収率94.9％）を得た。
融点 ＝ 47.5（48℃）
【００５４】
e．（2R）-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ-2-アミノ−ペンタン-1-オル、
トリフルオロ酢塩
上記で得られた（2R）-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ）-2-(tert-ブチルオキシ−カルボニルアミノ）−ペンタン-1-オル（6.32g；18mmol）のトリフルオロ酢酸（25ml）溶液を室温で2.5時間撹拌した後、溶剤を蒸発させた。ケークをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（MeOH/CH2Cl2溶離液10/1）によって精製してトリフルオロ酢酸塩を鉱油（5,45g；82.7％）として回収した。この酸塩化物は133.0−134.3℃で溶ける（メタノールから再結晶）。
【００５５】
F．（2R）-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ）-2-[(R)-3-ベンジルオキシ−テトラ−デカノイルアミノ]ペンタン-1-オル
（R）-3-ベンジルオキシテトラデカン酸（5.27g；15.8mmol）[Bull. Chem. Soc. Jpn., 60 : (1987), 2197-2204]の-15℃に冷却したTHF（30ml）溶液に、N-メチルモルホリン（1.89ml 15.8mmol）とイソブチルクロロ炭酸塩（15.8mmol、2.21ml）とを添加した。反応液を-15℃で30分間攪拌した後、上記で得られたトリフルオロ酢酸塩（15.25g；14,4mmol）のTHF/Et3N混合物（1.44ml、30ml）溶液を加えた。撹拌は室温で16時間継続した。反応液をＨ2Ｏ（30ml）およびAcOEt（60ml）では希釈した。有機相を除去し、水相は酢酸エチルAcOEt（60ml）、蒸留水で洗浄した。有機相を合わせ、Ｈ2Ｏ（30ml）そして食塩水（30ml）で洗い、溶媒を減圧蒸発させ、MgSO4上で乾燥した。ケークを酢酸エチル/ヘキサン混合物から再結晶して、所望の生成物を結晶状態で得た（5.8g；71.2％）
融点＝117.5-118℃
Rf ＝ 0.32（3/1酢酸エチル）（石油エーテル）
【表５】
2003518086.tif 000078
【００５６】
g．（2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]
ペンタン-1-オル
三つ口フラスコ中で、触媒（20％パラジウム/炭素150mg）に（2R）-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ）-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル（3.0g；5.27mmol）、トリエチルアミンEt3N（6ml）/  HPLC-グレードエタノールEtOH（300ml）の混合物溶液を加えた。空気を減圧して除き、フラスコに水素を導入した。反応液は2時間、室温で水素化した後、触媒を濾過で除去し、濾液を合わせて白い固形物として所望の生成物を下位種した。
Rf ＝ 0.2（5/1/0.5, CH2Cl2/MeOH/Et3N）、
融点＝47-48℃
【表６】
2003518086.tif 000079
1.1.3. 1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシ−テトラ−デカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-10-オル
IIDQ（2-イソブトキシ-1-イソブトキシカルボニル-1、2-ジハイドロキノリン）（364g；1,2 mmol.、1.2当量）を（2RS）-4-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシ−テトラ−デカノイルアミノ]−ブタン酸（850g；1.0mmol；1つの当量）の無水ジクロロメタンCH2Cl2（20ml）溶液に加える。アルゴン下で室温で15分間撹拌した後、（2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル（757；1.0 mmol.1当量）の無水CH2Cl2（10ml）溶液を加え、4時間撹拌した後、溶液を乾燥蒸発させる。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（CH2Cl2/アセトン溶離液5/2）で精製してホスホリレート化ジペプチド様化合物を非晶形固形物として回収する（620mg；53％）。
Rf＝0.49、ジクロロメタン／メタノール／トリエチルアミン（10/1/0.5）
【表７】
2003518086.tif 000080
【００５７】
実施例1.2
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド（＝OM-197-MC）（図2）
1.2.1 
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、β−ベンジルエステル
（R）-3-ドデカノイルオキシテトラデカン酸（3,35g；7.85mmol）の-15℃の無水THF（25ml）の溶液に、アルゴン流下で、メチルモルホリン（0.86ml；7.85mmol；1 当量）とイソブチルクロロ炭酸塩（1.02ml；7.85mmol；1 当量）を加えた。N-メチルモルホリン塩酸塩の沈殿が急速に生成するのが観測された。-15℃で30分間撹拌した後、Ｈ−Ｄ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−ＯＨ溶液（Senn Chemicals社（スイス-Dielsdorf）から市販）（1.75g；7.85mmol、1当量）のEt3N（3.7ml）を含むCH3CN/Ｈ2Ｏ3.5/1混合物（85ml）を加えれた。反応液を一晩、室温で攪拌した。有機溶剤を蒸発させ、水相を0℃まで冷却し、枸櫞酸の10％水溶液でpH ＝ 3まで酸性化し、AcOEt（2x）で抽出した。有機相をMgSO4を蒸発させ、乾燥し、濾過した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（2％の酢酸を含む石油エーテル/AcOEt溶離液2/1）で精製し、トルエンのを共蒸発させてN-[(8）-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸のβ−ベンジルエステル（4.00g；81％）を白い結晶状固形物として回収した。
Rf＝0.42；石油エーテル/2％酢酸を含むEtOAc 1/1)
U.V発色現象試剤＝ホスホモリブデン酸化合物
融点＝ 67−69℃
【００５８】
1.2.2.  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノペンチル｝アミド−ベンジルエステル（ASM-1）
上記で得られたβ-ベンジルエステルの溶液（363mg；0.57mmol）に、（2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシ−テトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル（セクション1.1.2）（250mg；0.57mmol.；1.0当量）の無水CH2Cl2（6ml）溶液を0℃（氷/ウォーターバス）を添加し、アルゴン流下で市販のHOAt（1-ヒドロキシ-7-アザベンジトリアゾル）（94mg、0.69のmmol.、1.2当量）と、市販のN，N‘-ジイソプロピルカルボジイミド（109μl、0.69mmol、1.2当量）とを加える。反応液を1時間、0℃、その後室温で一晩攪拌した。反応液を水、1N−HCl溶液およびNaHCO3飽和溶液、その後、蒸留水で洗浄した。相分離し、有機相はMgSO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（CH2Cl2/アセトン溶離液3/1）で精製して、カップリング反応生成物を白い結晶性固形物として回収した（436mg；72％）
Rf ＝ 0.27（CH2Cl2-アセトン  5/1）
U.V発色現象試剤  ホスホモリブデン酸化合物）
融点＝106-108℃
【表８】
2003518086.tif 000081
【００５９】
1.2.3
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}アミド（＝OM-197-MC）
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸β−ベンジルエステル、α-N-{(4R)-5-）ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノペンチル｝アミド（417mg；0.40mmol）のMeOH/EtOAcの混合物1/1（36ml）溶液を10％ Pd/炭素（20mg）の存在下で3時間、１気圧の水素下で室温で水素化した後、触媒を、濾過し、CH2Cl2/MeOH混合物4/1（50ml）で洗浄し、濾液を乾燥し、吸引真空ポンプで蒸発させて遊離酸を白い結晶性固形物として得る（345mg；100％）
Rf ＝ 0.30  （CH2Cl2/0,5％の酢酸を含むMeOH  9/1）
顕色剤：ホスホモリブデン酸化合物）
融点＝135−137℃
ES/MS：m/z868.7[M+H]+、890.7[M+Na]+、868.7[M+K]+ 912.7[M-H+2Na]+（図3）
【００６０】
1.2.4．N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-L-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-）ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノペンチル｝アミド
上記と同じ反応スキームで、市販のＨ−Ｌ−Ａｓｐ（Ｏｂｎ）−ＯＨ（Fluka、Buchs、スイス）を使用してL-アスパラギン酸系列のエピマー生成物を得た。
【００６１】
実施例1.3
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ジヒドロキシホスホリルオキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル−アミノ]ペンチル｝アミド（＝OM-197-MC-融点）（図2）1.3.1
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ジベンジルオキシホスホリルオキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノペンチル｝アミド  β−ベンジルエステル
上記で得られたN-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミドβ−ベンジルエステル（300mg；0.29mmol）と、1H-テトラゾール（60mg；0.86mmol）の無水THF（12ml）溶液に、室温でアルゴン流下で85％ジベンジル-ジエチルホスホアミダイト（ホスホramidite）（231.μl；0.66mmol）を加えた。反応中、白い結晶の急速な生成が観測された。30分間撹拌した後、反応液を-20℃に冷却し、mCPBA溶液（57−86％；183mg；1.06mmol）のCH2Cl2（8ml）溶液を加えた。結晶が消滅した。室温で45分間撹拌した後、Na2S2O3の飽和溶液を加え、反応液を再び10分間攪拌した。溶液をエーテルで希釈し、有機相を除去し、Na2S2O3（5x）の飽和溶液、NaHCO3（2x）の飽和溶液および1M−HCl（1x）の溶液で洗った。有機相をMgSO4を通して乾燥し、濾過し、蒸発させた。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（CH2Cl2/アセトン溶離液5/1）で精製してトリフルオロエステル（294mg；79％）を白い固形物として回収した。
Rf ＝ 0.27； CH2Cl2-アセトン  5/1
U.V発色現象試剤＝ホスホモリブデン酸化合物
【表９】
2003518086.tif 000082
【００６２】
1.3.2 N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ジヒドロキシホスホリルオキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル]アミノ]ペンチル｝アミド（＝OM-197-MC-融点）
上記で得られたジベンジルホスフエート（249mg；190μmol）のHPLC-グレードのEtOH（12ml）溶液を10％Pd/炭素（30mg）の存在下で4時間１気圧の水素で室温で水素化した。触媒をミリポアフィルタで濾過し、濾液を蒸発させ、ケークを乾燥し、真空ポンプで乾燥して粗遊離ホスフエートを得る（180mg；100％）。
ES/MS：m/z 850.7[M+H-P(O)(OH)3]+ 948.5[M+H]+ 970.5[M+Na]+（図4）
【００６３】
実施例1.1
合成中間体のエピマー化度の決定
アシルアミノ基を有するキラル中心の立体化学を、出発材料のアミノ酸のコンフィグレーションによって決るが、アスパラギン酸やグルタミン酸誘導体と、オルニチンまたはリシンから得られるアミノアルコールとの間でペプチド共役を実行すると、特定の状況ではカップリングに関係する酸の相手のC−αのエピマー化が起こることがある。この種の反応のエピマー化度を調べるためにアスパラギン酸に由来する化合物の場合には以下の方法を用いた。
サンプル（30μg）をミクロガラスビンで蒸発させ、40μlの6M−HClに溶かし、アルゴン空気下、110℃で24時間加水分解した。サンプルを蒸発乾燥した後、100mlの0.1−M四硼酸塩緩衝液（pH 9.2）に再度溶かした。その後、以下の配合のOPA-IBLC（o-フタルジアルデヒド−N-イソブチリルＬ‐システイン）試薬を用いてプレカラム誘導体化を行った：
0.1−M四硼酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ9.2）、5μl、
170mＭOPA、260mM IBLCメタノール溶液、  2μl
被分析溶液、2μl
Hypersil ODSカラム（250×4.6mm、5μｍ、Supelco）でのHPLC分離によって出発材料サンプル中に存在するアスパラギン酸のL-およびＤ形の誘導体の定量ができる(Bruckner et al., 1995, J. Chromatography. A 711, 201-215）。
使用したHPLC操作条件以下の通り：
カラム：Hypersil ODS（250×4.6、5μｍ、Supelco）
移動相：Ａ：23mM酢酸ナトリウム（pH 5.9）
Ｂ：メノール−アセトニトリル（12：）
注入量：5μl
移動比：1ml/分
溶出ステップ：96：4から80：20の勾配2分
検出：UV：338ｎｍ
このクロマトグラフ条件下でL-およびD-アスパラギン酸誘導体の保持時間は16.1および17.2分と観測された。
【００６４】
第2シリーズの実施例
追加的な官能化側鎖スペーサを有すジペプチド様化合物の製造
実施例2.1
3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール−二水素ホスフェート−1-(6，7-ジヒドロキシヘペタノエート）（＝OM-197-FV6）（図5）
2.1.1  1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジル−オキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-10-オル（6-ヘプタノエート）
1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラ−デカノイルアミノ]-10-オル（図1.1）（875mg；0.74mmol）の無水CH2Cl2（25ml）溶液に、6-ヘプテン酸（141μl；1.04mmol、1.4 当量）を加えた。溶液を0℃まで冷却し、EDCl（64mg；0.33mmol、1.4 当量）とDMAP（41mg；0.33mmol、0.14当量）を加える。反応液を30分間0℃で、その後室温で3時間攪拌した。CH2Cl2で希釈後、有機相をＨ2Ｏ、1N−HCl溶液およびＨ2Ｏで順次洗う。有機相をMgSO4で乾燥し、40℃で減圧蒸発させた。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（石油エーテル/AcOEt 1/1溶離液）で精製して1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-10-オル−6-ヘプタノエート（820mg；85％）を白い泡の形で回収した。
Rf ＝ 0.18；（石油エーテル/AcOEt  1/1）
顕色剤：ホスホモリブデン酸化合物）
【表１０】
2003518086.tif 000083
【００６５】
2.1.2  1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシ−テトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-10-オル−（6、7-ジヒドロキシヘプタノエート）
K3Fe(CN)6（373mg；1,13mmol；3当量）と、K2CO3（157mg；1.13mmol、3当量）と、1、4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）（10.7mg；0.095mmol、0.25 当量）とを含むt-ブタノール/水混合液（5ml/5ml）溶液に、上記で得られた化合物（0.38mmol、486mg）を加え、酸化オスミウム（VIII）の2.5％t-ブタノール溶液（48μl；4.75μmol、0.0125 当量）を加え、反応液を16時間室温（27℃）で強く攪拌した。Na2S2O5（60mg）を加え、茶色から緑または青色まで変色するまで撹拌は約1時間継続した。反応液をエーテルで希釈し、有機相を除去した。水相をエーテルで洗浄し、有機相を合わせ、MgSO4で乾燥し、40℃で減圧蒸発させた。所望の粗ジオールが緑のオイルとして得られた。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（CH2Cl2/アセトン5/2）で精製して純粋な1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシ−テトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-10-オール 6、7-ジヒドロキシヘプタノエート（198mg；40％）を非晶形固形物として回収した。
Rf ＝ 0.24；（CH2Cl2/アセトン 5/2）
顕色剤：ホスホモリブデン酸化合物）
【表１１】
2003518086.tif 000084
【００６６】
2.1.3  1（−ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシ−テトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-10-オル（6、7-ジヒドロキシヘプタノエート）
上記で得られたジオール（0.15mmol、198mg）のHPLCグレードのEtOH(20ml）/ AcOEt（1.4ml）混合物の溶液を室温で、10％ Pd（70mg）を含む炭素上のPdの存在下で１気圧の水素で2.5時間水素化した。触媒を濾過で除去し、濾液を乾燥し、ケークを真空ポンプで蒸発乾燥させて粗ジベンジルエート生成物を非晶形固形物として得た（168mg；91％）。
【表１２】
2003518086.tif 000085
2.1.4  3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール-1-二水素−ホスフエート10-(6、7-ジヒドロキシヘプタノエート）（＝OM-197-FV6）
酸化白金PtO2（91mg）のエタノール（1ml）（HPLC-グレード）懸濁液（白金黒を１気圧の水素下で予め10分間予備活性化した）に、上記で得られたトリオールの（168mg；0.14mmol）のHPLC-グレードのEtOH（8ml）/AcOEt混合物（8ml）溶液を加えた。溶液を室温（27℃）で24時間１気圧の水素下で水素化した。触媒を濾過で除去し、濾液を乾燥蒸発し、ケークを吸引真空ポンプで乾燥して、粗ホスフエート生成物を得た（130mg；88％）。HPLC（210ｎｍ）：TR＝23.6分：ES/MS：m/z 1078.9 [M+H]+、1100.8 [M+Na]+、116.8[M+K]+（図6）。
【００６７】
実施例2.2
3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-二水素−ホスフエート10-(6-オキソヘキサノエート）（＝OM-197-FV7）
2.2.1  3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-ジ水素−ホスフエート10-(6-オキソヘキサノエート）（＝OM-197-FV7）（図5）
上記を調製した脱保護したトリオール10mg（9.28μmol、1当量）の（1:1）水/イソプロパノール混合物溶液を、1.86mlの0.1−M NaIO4（39.62mg、20当量）で過沃素酸酸化反応を行った。この反応はＬＣ/UVでモニターし、ジオール官能基のアルデヒドへの変換を2時間後に定量した。過沃素酸酸化段階（図7）後のES/MSスペクトルを観測して1046.8m/zの分子イオンから所望反応が起ることを確認する。このスペクトルで1068.8m/z（[M+Na]+）はナトリウム、948.8m/zはカリウムで、ホスホリル基の減量に対応する断片は1084.8のm/z（[M+K]+）に見える。反応は1〜2滴のエチレングリコールを加えて終了させる。生成物の精製はC18キャリヤのSPEで行い、90％の収率が得られる（ジオールサンプル5mg）
【００６８】
実施例2.3
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラ−デカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド5-O-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート）（＝OM-197-MC-FV5）（図8）
2.3.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラ−デカノイルアミノ]ペンチル｝−アミド-β−ベンジルエステル（5-O-(6-ヘプタノエート）
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシ−テトラデカノイルアミノ]ペンチル｝アミド β−ベンジルエステル（セクション1.2.2）（122mg；0.116mmol）の無水ジクロロメタン（5ml）溶液に、6-ヘプテン酸（22μl；0.160mmol；1.4当量）を加えた。溶液を0℃まで冷却し、EDCI（49.3mg；0.25mmol、2.1当量）とDMAP（5.6mg；0.046mmol、0.4 当量）とを添加し、反応液を0℃で30分間、その後室温で6時間攪拌する。CH2Cl2希釈後、有機相をＨ2Ｏ、1N-HCl（2x）、NaHCO3（2x）およびＨ2Ｏ（2x）で洗う。所望のヘプテン酸エステルが白い固形物として純粋な状態で得られる（119mg；89％）
Rf ＝ 0.62：（5/1 CH2Cl2/アセトン混合液）
顕色剤：ホスホノモリブデン酸
【表１３】
2003518086.tif 000086
【００６９】
2.3.2  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝アミド−β-ベンジルエステル、5-O-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート）
上記で得られたヘプテン酸エステル（60mg；0.052mmol）（5/3ml）のＨ2Ｏ/アセトン混合溶液にN-メチルモルホリンオキサイド（9mg；0.076mmol、1.5当量）を添加した後、OsO4（123μl；0.012mmol、0.23当量）の2.5％ t-ブタノール溶液滴下した。反応液を24時間室温で攪拌し、Na2S2O5（20mg）を加えた後、室温で1〜2時間攪拌する。溶液をエーテルで複数回抽出し、有機相を合わせ、MgSO4で乾燥する。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ処理（5/2 CH2Cl2/アセトン溶離液）で純粋な状態の所望のジオールを白い固形物として回収する（35mg；57％）
Rf ＝0.15；（5/1 CH2Cl2/アセトン混合液）
顕色剤：ホスホノモリブデン酸。
【表１４】
2003518086.tif 000087
【００７０】
2.3.3  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝アミド5-O-(6、7-ジヒドロキシヘプタノエート）（＝ OM-197-MC-FV5）
上記で得られたジオール（35mg；0.029mmol）のHPLC-グレードの MeOH（2ml）/AcOEt（2ml）混合溶液を室温で10％パラジウム（10mg）を含む炭素上のPdの存在下で1気圧水素下で2.5時間水素化する。触媒を濾過して除去し、濾液を乾燥蒸発させ、ケークを真空ポンプで乾燥して白い固形物としての粗生成物ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシ−テトラ−デカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド5-O-(6,7-ジヒドロキシヘプタノエート）（26mg；88％）を得る。
HPLC（210nm）：TR＝26.90分:融点＝94−97℃、[α]D20＝ +11.1（CHCl3/MeOH＝1：0.1）、ES/MS：m/z 1012.7[M+H]+；1034.7[M+Na]+、1050.7[M+K]+（図9）
【００７１】
実施例2.4
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝アミド5-O-(6-オキソヘキサノエート）（＝OM-197-MC-FV7）（図8）
上記（セクション2.3.3）で調製した脱保護トリオールの10mg（9.88μM、1当量）の（1:1）イソプロパノール-水混合液に1.98mlの0.1-M NaIO4（42.25mg、20当量）を加える。溶液を2時間室温で攪拌する。反応を1〜2滴のエチレングリコールを加えることによって停止する。この過沃素酸酸化ステップ後にm/z980.6に観測される [アルデヒド官能基の存在を示す[M+H]+分子イオンがES/MSスペクトル（図10）。ナトリウムに対応するピークは1002.8m/z（[M+Na]+）、カリウムは1018.6m/z（[M+K]+）に見える。C18キャリアでのSPE精製でＯＭ−１９７−ＭＣ−ＦＶ６化合物を90％の収率で回収する。
【００７２】
実施例2.5
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝アミド5-O-(6-ヒドロキシヘキサノエート）（＝OM-197-MC-FV7）（図8）
【００７３】
2.5.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝アミド5-O-(6-ヒドロキシヘキサノエート）（＝OM-197-MC-FV7）
上記で得られた6-オキソヘキサン酸誘導体（0.0043mmol、4.5mg）の90％イソプロパノール（20ml）溶液にに、NaBH4（0.2ml）のメタノール（1mg/ml）溶液を加える。混合物を3分間25℃で攪拌し、過剰酢酸（0.2ml）を加える。C18カラムでHPLCによる精製で生成物OM-197-MC-FV7（51％、2.3mg）をイソプロパノールに90％溶液で回収する。
【００７４】
実施例2.6
（9R、3RS）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラ−デカノイルアミノ]−デカン-10-オル1-二水素−ホスフエート（6-アミノヘキサノエート）（＝OM-287-AC-RS（R））（図11）
2.6.1  1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-ドデカノイルオキシ
−テトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシ−テトラ−デカノイルアミノ]−デカン-10-オル（6-ベンジルオキシカルボニルアミノヘキサノエート）
1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシ−テトラ−デカノイルアミノ]−デカン-10-オル（図1）（230mg；0.20mmol）の無水CH2Cl2（8ml）の溶液に、6-ベンジルオキシカルバノイルアミノヘキサン酸（88mg；0.33mmol、1.65当量）を添加する。溶液を0℃まで冷却し、これにEDCl（200mg、1.04mmol、5.2当量）とDMAP（13mg；0.10mmol、0.5当量）とを添加する。反応液を0℃で30分間、その後4時間室温で攪拌する。CH2Cl2で希釈後、有機相を除去し、Ｈ2Ｏ、1N-HCl、Ｈ2Ｏで洗う。有機相をMgSO4で乾燥し、40℃で減圧蒸発した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（CH2Cl2/Acetone溶離液7/1.2）で精製して純粋なエステルを非晶質固形物として回収する（115mg；41％）。
Rf ＝ 0.77（CH2Cl2/Acetone 5/2）
顕色剤：ホスホモリブデン酸
【表１５】
2003518086.tif 000088
【００７５】
2.6.2.  1-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシ−テトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシ−テトラデカノイルアミノ]−デカン-10-オル10-(6-アミノヘキサノエート）
上記で得られた生成物（115mg；0.81μmol）のHPLC-グレードのEtOH（15ml）/氷酢酸（0.4ml）混合溶液をパラジウム（10％ Pd（炭素））（80mg）の存在下で4時間１気圧の水素で室温で水素化する。触媒を濾過で除去し、濾液を乾燥蒸発し、ケークを真空ポンプで乾燥してから非晶質固形物として脱ベンジル化した生成物（97％、90mg）を得る。
HPLC（210ｎｍ）：TR＝29.185分：ES/MS：m/z  1200.0[M+H]+；952.0 [M+H-(PhO)2OPOH]+
【００７６】
2.6.3  3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-1、10-ジオール−二水素ホスフエート10-(6-アミノヘキサノエート）（＝OM-197-MP-AC）
上記で得らたアミノアルコール（90mg、75μmol）のHPLC-グレードの EtOH（5ml）/1N HCl（0.1ml）混合溶液を、HPLC-グレードのエタノール（1ml）中のを予め活性化した白金黒/酸化白金PtO2（30mg）溶液に10分間1気圧の水素を添加し、24時間1気圧の水素下で溶液を室温で水素化する。触媒を濾過して除去し、濾液を真空ポンプで乾燥し、ケークを蒸発乾燥して所望のアミノホスフエートを得る（79％、60mg）。
HPLC（210ｎｍ）：TR＝28.51分、ES/MS：m/z 1047.5[M+H]+；1069.6（M+Na)+、949.6[M+H-(HO)2OPOH]+（図12）
【００７７】
実施例2.7
（9R、3R）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-1、10-ジオール1-二水素ホスフエート10-(6-アミノヘキサノエート）（OM-197-MP-AC）（図13）
2.7.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(2-テトラヒトロキシピラニル）オキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイル−アミノ]ペンチル｝アミド−ベンジルエステル（ASM-O THP）
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド−ベンジルエステル（1.5g；1.43mmol）の無水CH2Cl2（30ml）の溶液に、室温でアルゴン流下で、4-ジヒドロキシ-2 H-ピラン（DHP）（3.58mmol、327μl）とピリジニウムp-トルエンスルホナート（PPTS）（108mg、429μmol）とを加え、室温で18時間撹拌した後、ららる3,4-ジヒドロ-2 H-ピラン（DHP）（1.43mmol、130μl）を加える。溶液を室温で更に9時間攪拌してから、CH2Cl2で希釈し、5％ NaHCO3溶液とＨ2Ｏで洗う。有機相をMgSO4で乾燥し、濾過し、蒸発乾燥する。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィ（CH2Cl2/アセトン溶離液6/1と7/1）で精製してN-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(2-テトラヒドロキシピラニル）オキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝−アミド−β-ベンジルエステル（1.45g；90％）を白い結晶性固形物として回収する
Rf ＝ 0.57；（CH2Cl2/アセトン5/1）
U.V発色試剤：ホスホモリブデン酸化合物
【００７８】
2.7.2  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(2-テトラヒドロピラニル）オキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイル−アミノ]ペンチル｝アミド
上記で得た化合物（250mg；0.22mmol）のEt3N（0.4ml）を含むEtOH/EtOAc混合物1/1（16ml）の溶液を室温で、10％ Pd（10mg）を含む炭素上のPdの存在下で2時間1気圧の水素で水素化する。触媒を濾過して除去し、濾液を乾燥蒸発し、真空ポンプで乾燥してトリエチルアンモニウム塩（250mg）として酸を回収する。
【００７９】
2.7.3
3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-10-(2-テトラヒドロピラン）オキシ−デカン-1-オル
上記で得られた酸（250mg）のCH2Cl2/無水THF混合物2/1（3ml）溶液に、0℃でアルゴン流下にN-メチルモルホリン（72μl；0.66mmol、3 当量）とイソブチルクロロ炭酸塩（86μl；0.66mmol、3 当量）とを加える。N-メチルモルホリン塩酸塩の沈殿の急速な生成が観測される。反応進行度はTLCでモニターする(Rf＝0.90(CH2Cl2/アセトン2/1))。30分間室温で撹拌した後、反応液を0℃まで冷却し、Ｈ2Ｏ（1ml）中のNaBH4（33mg；0.88mmol、4 当量）を迅速に加える。発泡ガス流が終った時に（5分後）、溶液をＨ2Ｏ（1ml）およびTHF（1ml）で希釈し、5分間室温で攪拌する。相分離し、CH2Cl2およびＨ2Ｏで希釈し、溶液を合わせる。有機相はMgSO4で乾燥し、濾過し、蒸発させる。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（CH2Cl2/アセトン溶離液2/1）での精製でアルコールを白い結晶性固形物として回収す（138mg；2段階で61％）。（Rf＝0.33； CH2Cl2/アセトン3/1、ホスホモリブデン酸化合物、U.V発色剤）
【００８０】
2.7.4  3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-10-(2-テトラヒドロピラニル）オキシ−デカン-1-オルジベンジルホスフエート
上記で調製したアルコール（210mg；0.12mmol）と、1H-テトラゾール（25mg；0.35mmol、3当量）との無水THF（5ml）溶液に、室温でアルゴン流下に85％ジベンジル-ジエチルホスホアミダイト（95μl；0.27mmol、2.3当量）を加える。反応中の白い結晶がの急速に生成するのが見られる。30分間撹拌した後、反応液を-20℃まで冷却し、mCPBA（57-86％；75mg；0.43mmol、3.7当量）のCH2Cl2（3ml）溶液を加える。結晶の消滅が見られる。45分間室温で撹拌した後、飽和Na2S2O3溶液（3ml）を加え、反応液をそれから10分間攪拌する。溶液をエーテルで希釈し、有機相を分離し、Na2S2O3（5x）の飽和溶液およびNaHCO3（2x）の飽和溶液で洗う。有機相をMgSO4を通じて乾燥し、濾過し、蒸発する。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（CH2Cl2/アセトン溶離液4/1と2/1）での精製でジベンジルホスフエート（126mg；84％）が非晶形固形物の形で回収される(Rf ＝ 0.53； CH2Cl2/アセトン3/1、U.V発色剤＝ホスホモリブデン酸化合物）。
【００８１】
2.7.5  3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-
アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-1、10-ジオール1-(ジベンジル・ホスフエート）
0℃で HClの1％メタノール（25ml）溶液を上記で作った化合物（0.54mmol、700mg）のCCH2Cl2（2.5ml）溶液に加える。0℃で45分間撹拌後、反応媒体をCH2Cl2で希釈した5％ NaHCO3溶液で中和し、有機相を分離する。得られた水相をCH2Cl2で抽出し、有機相を貯める。有機相が、MgSO4で乾燥し、濾過し、蒸発させて粗アルコール（640mg；98％）を得る（Rf＝0.50；3/1 CH2Cl2/アセトン、U.V発色現象試剤ホスホモリブデン酸化合物）。
【００８２】
2.7.6  3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-ジベンジルホスフエート10-(6-ベンジルオキシカルボニルアミノヘキサノエート)
上記で用意した化合物（0.53mmol、640mg）および6-(ベンジルオキシカルボニルアミノヘキサン酸（1.60mmol、423mg）の無水CH2Cl2(25 ml)溶液に0℃でアルゴン流下に市販の1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（1.60mmol、306mg）、そして、4-ジメチルアミノピリジン（20mg、160μmol）を加える。反応液は、それから30分間0℃およびその後で、室温で攪拌する。反応媒体を1N HCl水溶液で洗う。上記のHClは相分離に先行する。有機相は、MgSO4を通じて乾燥しれて、濾過されて、蒸発した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（4/1と2/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）の精製し、カップリング反応生成物を回収する（537mg；71％）。
【表１６】
2003518086.tif 000089
【００８３】
2.7.7  3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-110-ジオール1-二水素ホスフエート10-(6-アミノヘキサノエート)（＝ OM-197-融点-AC-R（R））（図13）
上記で調製された化合物（0.35mmol、500mg）の溶液（5/2 CH2Cl2/エタノール混合液（70ml）の酢酸（10ml）を含む）を室温で10％ Pdを含む炭素上のPdの存在下で12〜24時間１気圧の水素で水素化する。触媒を濾過で除去し、濾液を蒸発し、ケークを乾燥して3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラ−デカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-二水素ホスフエート10-(6-アミノヘキサノエート)を得る（368mg、定量的収率、ES/MS：m/z1047.9[M+H]+；1069.8（図14）。
【００８４】
実施例 2.8
（9R、3S）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-1、10-ジオール1-二水素ホスフエート10-(6-ヒドロキシヘキサノエート）（＝OM-197-MP-AC-S、R）
上記と同じ反応スキームでN-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-L-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ−4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}アミド−ベンジルエステルを得る（セクション1.2.4）、最後に実施例2.8の生成物の合成を行う。
【００８５】
実施例 2.9
3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-二水素ホスフエート10-(6-ヒドロキシヘキサノエート）（＝OM-197-FV8）（図15）
2.9.1  （2R）-5-(アミノ）-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンタン-1-オルベンジルオキシジメチルエーテル
（2R）-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル（セクション1.1.2）（2.05g；3.60mmol）の無水CH2Cl2（40ml）の溶液に室温でアルゴン流下にBOMCl（ベンジル・クロロメチル・エーテル）（試薬グレード、1.25ml、60％；5.41mmol；1.5当量）、そして、ジイソプロピルエチルアミン（942μl；5.41mmol、1.5当量）を加える。反応液を一晩中室温で攪拌した後、乾燥蒸発した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（2/1石油エーテル/EtOAc溶離液）で精製して、O-ベンジルオキシメチル誘導体が回収される（2.28g；92％）白い結晶性固形物。（Rf＝0.70（1/3石油エーテル/EtOAc混合物）、ホスホモリブデン酸酸UV顕色剤）、融点＝ 97−100℃。
この生成物のEt3N（4ml）を含むHPLC-グレード EtOH（220ml）の溶液（2.00g；2.90mmol）を炭素（200mg）上のPd(OH)2で3時間１気圧の20％の水素下、室温で水素化する。触媒を濾過で除去し、濾液を蒸発させ、ケークを乾燥し遊離アミンを得る（1.58g；98％、非晶形の固形物、
[ｎ]D＝1度（c ＝1.20；CHCl3）；
【表１７】
2003518086.tif 000090
【００８６】
2.9.2  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-L-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(ベンジルオキシメトオキシ）-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイル−アミノ]−ペンチル)アミド−ベンジルエステル
上記アミンをIIDQの存在下でN-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-L-アスパラギン酸、β−ベンジルエステルとカップリング（1.2.1参照）させる。L-アスパラギン酸、β-ベンジルエステルから調製する1.2.2と同じ条件。シリカゲル上での生成物の精製（2:1 1:1石油エーテル/EtOAc）で65％収率で対応するアミドを得るES/MS：m/z  1169.7（[ M+H]+）。
【００８７】
2.9.3  （9R、3S）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-ジベンジル-ホスフエート
上記を得たカップリング反応生成物（1.05g；0.90mmol。）1/1 EtOH/EtOAcのEt3N（1.5ml）を含んでいる混合物（65ml）の溶液を室温で10％ Pd（50mg）を含んでいる炭素上のPdの存在下で1時間１気圧の水素で水素化する。触媒を濾過で除去し、濾液を乾燥蒸発させ、ケークを1/1 i-PrOH/CH2Cl2混合物（50ml）に溶かし、10分間室温でアンバーライトIR-120（H+）樹脂（3ml）と攪拌する。樹脂を濾過し、濾液を乾燥蒸発して遊離酸を得る（956mg；99％）白い結晶性固形物。
得られた上記の酸（855mg；0.79mmol）の無水THF（5ml）の溶液に0℃でアルゴン流下でN-メチルモルホリン（87μl；0.79mmol、1当量）とイソブチルクロロ炭酸塩（103μl；0.79mmol、1当量）を加える。N-メチルモルホリン塩酸塩の急速な沈殿が観測される。30分間室温で撹拌した後、反応液を0℃まで冷却し、NaBH4（60mg；1.58mmol、2当量）およびＨ２Ｏ（2ml）を速く加える。発泡が終わる（5分）とすぐに溶液をＨ２Ｏ（2ml）およびTHF（2ml）で希釈し、それから5分間室温で攪拌する。CH2Cl2およびＨ２Ｏで希釈し、溶液を集め、1M HClの溶液で中和する。上記のHClは相分離に先行する。有機相をMgSO4を通じて乾燥し、濾過し、蒸発した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（4/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）で精製して還元状態の生成物が回収される（387mg；46％）、白い結晶性固形物。
このアルコール溶液（313mg；0.29mmol）と、1H-テトラゾール（62mg；0.88mmol、3当量）の無水THF（12ml）溶液に室温でアルゴン流下に85％ジベンジル-ジエチルホスホアミダイト（267μl；0.67mmol、2.3当量）を加える。反応媒体に白い結晶の急速な生成が見られる。30分間撹拌のした、反応液を-20℃まで冷却し、mCPBA溶液（57-85％；187mg；1.08mmol、3.7当量）とCH2Cl2（8ml）とを加えると結晶は消滅する。45分間室温で撹拌後、飽和Na2S2O3溶液（5ml）を加え、反応液を10分間攪拌する。溶液をエーテルで希釈し、有機相をれから分離し、Na2S2O3（5x）の飽和溶液、NaHCO3（2x）の飽和溶液および1M HCl溶液（1x）で洗った。有機相をMgSO4を通じて乾燥し、濾過し、蒸発した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（8/1、次いで5/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）での精製でリン酸トリエステルを回収する（361mg；93％）。非晶形固形物。この生成物をTHF-HCl水溶液中でベンジルオキシメチル・アセタールで加水分解反応して（9R、3S）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-ジベンジルホスフェートを得る。
【００８８】
2.9.4  （9R、3S）-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-二水素ホスフエート10-(6、7-ジヒドロキシヘプタノエート)
上記で得られた生成物を0℃で、ジクロロメタンのEDClおよびDMAP（セクション2.3.1を参照）の存在下でヘプト-6-エン酸でO−アシル化して炭素数10にする。このヘプテン酸エステルを触媒としての酸化オスミウム（VIII）およびN-メチルモルホリンオキサイドの存在下でヒドロキシル化する。対応するジオールが生ずる（セクション2.2.2を参照）（6、7-ジヒドロキシヘプタン酸エステル）。この生成物を炭素触媒（セクション2.2.3を参照）上のパラジウム存在下の１気圧の水素でエタノールの水素化分解により脱保護する。
【００８９】
2.9.5  （9R、3S）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-二水素ホスフエート10-(6-オキソヘキサノエート)
上記の脱保護ジオールのイソプロパノール-水混合液（実験的手順はセクション2.2.1）を過沃素酸で酸化する。
【００９０】
2.9.6  （9R、3S）-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−デカン-1、10-ジオール1-二水素ホスフエート10-(6-ヒドロキシヘキサノエート)（＝OM-197-FV8）
上記で得られた6-オキソヘキサン酸誘導体（0.0043mmol、4.5mg）の90％イソプロパノール（20ml）溶液にメタノール（1mg/ml）中のNaBH4（0.2ml）の溶液を加える。混合物を3分間25℃で攪拌し、過剰な酢酸（0.2ml）を加える。C18カラム上でのHPLC精製で90％イソプロパノール中に生成物OM-197-FV8（44％、2mg）を回収する。ES/MS：m/z 1048.5 [M+H；950.5 [M+H-(HO)2OPOH]+（図16）。
【００９１】
実施例 2.10
2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-5-(6-オキソヘキシル）アミノ｝−ペンチル2-((R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-(ジヒドロキシ−ホスホリルオキシ）ブタノエート（＝OM-144-FP9）（図17）
【００９２】
2.10.1  ヘプト-6-エニルトリフルオロメタンスルホナート
無水物トリフィック（Triflic）酸Tf2O（（CF3.SO2）2O；11ml、6.67mmol）を-15℃でヘプト-6-エン-1-オル（515mg；4.51mmol）とEt3N（627μl；4.51mmol）のCH2Cl2（10ml）溶液へ滴下する。アルコールが無くなるまで混合物を30-45分間-15℃で攪拌する。加温後、室温で媒体をCH2Cl2で希釈し、Ｈ２Ｏ、NaHCO3の飽和水溶液、NaCIの飽和水溶液で洗う。得られた有機相をMgSO4を通じて乾燥し、減圧下に取る。ケークを（1/2）酢酸エチル/石油エーテル混合物で取り、シリカゲルで濾過して反応で形成されたトリエチルアミン塩を除去する。濾液の蒸発後、所望のトリフラート化合物が87％の収率で得られる（956mg）。これを次のステップで更なる精製なしで使う。Rf＝0.8(酢酸エチル/石油エーテル1/2)1H-NMR（250MHz、CDCl3）：δppm：5.7、5.0、4.45、2.0、1.8、1.4、13C-NMR（62.89MHz、CDCl3）：δppm：138.21、114.95、77.68、33.40、29.13、28.10、24.53
【００９３】
2.10.2  （2R）-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-5-(ヘプト-6-エニル)アミノ−ペンタン-1-オル
上記で作った新鮮なトリフラート（956mg；3.88mmol）のCH2Cl2（10ml）溶液へ（2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル（セクション1.1.2）（1.69g；3.88mmol）の、CH2Cl2（10ml）溶液をアルゴン流下、室温で4時間で滴下する。CH2Cl2で希釈後、反応媒体をNaHCO3の飽和水溶液、次いでＨ２Ｏで洗浄する。得られた有機相をMgSO4を通じて乾燥し、減圧下に合わせ、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（15/1 CH2Cl2/MeOH溶離液）で精製して所望の第二アミンを回収する（862mg；43％）Rf＝0.3（8/1 CH2Cl2/MeOH）。
ES/MS：m/z 532.0[M+H]+
【表１８】
2003518086.tif 000091
【００９４】
2.10.3  ｛2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-5-(ヘプト-6-エニル）アミノ｝ペンチル2-((R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ)-4-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ)ブタノエート
上で得られた第二アミン（163mg；0.307mmol、1当量）と4-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ)-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]ブタン酸（セクション1.1.1）（278mg；0.368mmol、1.2 当量）のCH2Cl2（25ml）の溶液にN，N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（54μl；1当量）を加える。媒体を0℃まで冷却し、EDCl（71mg；1.2当量）と1-ヒドロキシ-7-アザベンジトリアゾール（HOAt）（41mg；1当量）を加える。反応液を0℃で2時間、その後90時間室温で攪拌する。反応媒体をＨ２Ｏで洗い、有機相をMgSO4上で乾燥し、40℃減圧下で蒸発させ、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィ精製（15/1 CH2Cl2/MeOH溶離液）でO-アシル化された生成物を回収する（126mg；32％）。
【００９５】
2.10.4  ｛2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-5-(6（7-）ジヒドロキシ−ヘプチル）アミノ｝ペンチル2-[(R)-3-ドデカノイルオキシ−テトラデカノイル−アミノ]-4-(ジフェニルオキシホスホリルオキシ)-ブタノエート
新たに調製した2.5％ピリジン（1.1ml；1.9の当量.）のOsO4溶液を25℃で上記で得られたO-アシル化物（0.055mmol、70mg）の無水ピリジン（5ml）溶液に滴下する。混合物を24〜48時間室温で攪拌し、Na2S2O5を添加し、Ｈ２Ｏ、1N HCl水溶液およびＨ２Ｏで洗い、CH2Cl2で最後に希釈する。有機相をMgSO4で乾燥し、濾過し、ケークをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ処理（15/1-10/1 CH2Cl2/MeOH溶離液）で精製して所望のジオールを回収する（27mg；38％）。HPLC（210ｎｍ）：TR＝37.25分、ES/MS：m/z1307.0[M+H]+
【００９６】
2.10.5
｛2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-5-(6,7-ジヒドロキシ−ヘプチル）アミノ｝ペンチル2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-(ジヒドロキシホスホリルオキシ）ブタノエート
a. 脱ベンジル化
上記の得られたジオールの（50mg；0.038mmol）HPLC-グレード MeOH/AcOH混合物（5/0.2ml）の溶液に触媒（10％Pd/C）（10mg）を添加し、反応液を4時間H2下（１気圧）で室温で攪拌する。触媒をミリポアフィルタで濾過し、濾液を更に蒸発し、精製して脱ベンジル化された生成物（46mg；99％）を回収する。HPLC（210nm）：TR＝35.13分、35.51分（2つのジアステレオイソメルが検出された）。ES/MS：m/z  1217.0 [M+H]+
ｂ．  脱フェニル化
触媒（PtO2）（25mg；3.8当量）のHPLC-グレードのEtOH（0.5ml）サスペンションを10分間、H2下で予備活性化する。上記で得られる脱ベンジル化された生成物（0.029mmol、35mg）のHPLC-グレード EtOH（2ml）溶液を触媒サスペンションに加える。反応液を2時間H2下げ室温で攪拌する。触媒をミリポアフィルタに濾過して除去すると濾液の精製なしで所望のリン酸エステルが回収される（26mg；87％）。HPLC（210ｎｍ）：TR＝29.3分と30.9分（2つのジアステレオイソメルが検出された）：
ES/MS：m/z  1064.8 [ M+H]+、1086.8 [ M+Na]+、1108.8 [ M-H+2Na]+（図18）。
【００９７】
2.10.6  2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-5-(6，7-オキソヘキシル）アミノ｝ペンチル2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-(ジヒドロキシホスホリルオキシ）ブタノエート（＝OM-144-FP9）
上記を得られた脱保護生成物10mg（9.39μmol、1当量）のイソプロパノール-水混合液（1:1）に1.87mlの0.1のM NaIO4（40.17mg、20当量）を加える。溶液を2時間室温で攪拌する。反応は1〜2滴のエチレングリコールの添加で停止する。TR＝30.0と31.5分（2つのジアステレオイソメルが検出された）。ES/MS：m/z  1032.8 [ M+H]+、1054.8 [ M+Na]+。
【００９８】
実施例 2.11
（8R、2R）-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-オキソ-4-アザ-8-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ノナン-1、9-ジオール1-O-カルボキシジメチルエーテル9-O-(6-オキソヘキサノエート)（＝OM-112-FV7）（図19）
D-セリンをN-(pメトオキシベンジルオキシカルボニル)誘導体の形で保護する [Reference. Chen. and Wang, Synthesis (1989) : 36-37]。次いで、そのOH官能基をNaH（2当量）の存在下でベンジルブロモ酢酸でアルキル化する。アミン官能基をジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸処理でフリーにし、それからトリエチルアミンの存在下で（R）-3-ドデカノイルオキシテトラデカン酸塩化物処理でアシル化する。得られたセリン誘導体をIIDQの存在下で（2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル・アミン（セクション4.1.1参照）にカップリングすると、（8R、2R）-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-オキソ-4-アザ-8-[(R)-3-ベンジルオキシテトラ−デカノイルアミノ]ノナン-1、9-ジオール1-O-ベンジルオキシカルボニルメチルエーテルが得られる。この生成物をEDClの存在下のヘプト-6-エン酸でO-アシル化する。追加的なエステルの二重結合を酸化オスミウム（VIII）でヒドロキシル化する（触媒量、N-メチルモルホリンN-オキサイドの存在下）。ジオールはエタノール溶液中の炭素上のパラジウムの存在下での水素化分解で脱保護する。イソプロパノール-水混合液の過沃素酸ナトリウムの処理で生成物OM-112-FV-7が得られる。
Ｃ65Ｈ103Ｎ3Ｏ12。
ＭＭ：1010.45
【００９９】
実施例 2.12
（8R、2S）-1-(カルボキシメチル）−チオ-2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシ−テトラデカノイルアミノ]-3-オキソ-4-アザ-8-[(R)-3-ヒドロキシ−テトラデカノイル−アミノ｝−ノナン-9-オル9-O-(7-アミノヘプタノエート)（＝OM-212-AH1）（図20）
D-システインをTHF-水中で炭酸ナトリウムの存在下にp-メトキシベンジルブロモ酢酸でS-アルキル化する。得られたS-ベンジルオキシカルボニルメチルシステインを、（R）-3-テトラデカノイルオキシテトラデカン酸でN-アシル化し、次いで、D-システインのS-アルキル化、N-アシル誘導体をIIDQの存在下で（2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オルアミン（（2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシ−テトラデカノイル−アミノ]ペンタン-1-オルの水素化で得られる、4.1.1参照）にカップリングさせる。得られた生成物をHOBtのエステル誘導体と7-(p-メトオキシベンジルオキシ−カルボニルアミノ)ヘプタン酸とで選択的にO-アシル化する。次いで、2つのp-メトキシベンジル基をトリフルオロ酢酸水溶液でエステル化して除去する。
Ｃ59Ｈ112Ｎ4Ｏ10Ｓ。
ＭＭ  1069.64。
【０１００】
実施例 2.13
（8R、2R）-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-オキソ-4-アザ-8-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ノナン-1、9-ジオール1-O-(2，2-ジカルボキシエチル）エーテル9-O-(6-オキソヘキサノエート)（＝OM-312-FV7）（図21）
N-(p-メトオキシベンジルオキシカルボニル)D-セリン誘導体をNaHの存在下でジベンジル・メチレンマロネートでO-アシル化する。アミン官能基をジクロロメタンのトリフルオロ酢酸処理でフリーし、トリエチルアミンの存在下で（R）-3-ドデカニルオキシテトラデカン酸塩化物の処理でアシル化する。得られたセリン誘導体をIIDQの存在で（2R）-5アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシ−テトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル・アミン（セクション4.1.1参照）に結合して、（8R、2R）-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシ−テトラデカノイルアミノ]-3-オキソ-4-アザ-8-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイル−アミノ]ノナン-1、9-ジオール1-O-[2，2-ビス-(ベンジルオキシカルボニル)エチル]エーテルを得る。この生成物をEDClの存在下でヘプト-6-エン酸ではO-アシル化し、次いで、酸化オスミウム（VIII）を用いてこのヘプテノイルエステルをヒドロキシル化する。ベンジル基はエタノール溶液中で炭素上のパラジウム存在下の水素化分解で除去する。イソプロパノール-水混合液中での過沃素酸ナトリウムで脱ベンジル化すると生成物OM-312-FV-7が得られる。
Ｃ58Ｈ105Ｎ3Ｏ14
ＭＭ：1068.49。
【０１０１】
実施例 2.14
3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-1、10-ジオール-1-二水素10-(6-ブロモアセトアミドヘキサノエート）（＝OM-412-BA7）（図22）
3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-1、10-ジオール-1-二水素10-(6-アミノヘキサノエート)（セクション4.2.3.3を参照）水-DHF中でトリエチルアミンの存在下でブロモ酢酸スクシニルイミジルオキシエステル化合物によってベロモアセチル化する。最終産生物を、HPLCで精製する。
Ｃ57Ｈ108ＢｒＮ4Ｏ13Ｐ
ＭＭ：1168.4。
【０１０２】
実施例2.15
（9R、3R）-3-[(R)-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-デカン-1、10-ジオール−1-二水素ホスフェート10-O-(6-オキソヘキサノエート）（OM-512-FV7）（図23）
2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-ジフェニルオキシ−ホスホリルオキシ−ブタン酸[ベンジルO-(ジフェニルオキシホスホリル)-DL-ホモセリントリフルオロアセチルを（R）-3-ベンジルオキシテトラデカン酸塩化物でのN-アシル化し、そして炭素触媒上のトリエチルアミンおよびパラジウムの存在のエタノールの水素化分解によるベンジルエステルの開裂げ得られる]をIIDQの存在下で（2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル [（2R）-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)-2-アミノ−ペンタン−オルをトリフルロオ酢酸塩でN-アシル化し、（R）-3-ドデカノイルオキシテトラデカン酸塩化物と結合させ、それからエタノール中の炭素触媒上のトリエチルアミンおよびパラジウムの存在下の水素化分解によるC5位置のアミノ基の脱保護で得られる]とカップリングする。形成されたアミドはEDCl存在下で6-ヘプテン酸で遊離OH官能基で対応するエステルをO-アシル化する。追加のエステルの二重結合は酸化オスミウム（VIII）でヒドロキシル化する。ベンジル基は炭素触媒およびリン酸化合物上のパラジウム用いて白金黒の水素化分解による水素化分解によって除去してフリーにする。ジオール官能基は過沃素酸の酸化反応で6-オキソに形成する。ヘキサノイル誘導体OM-512-FV7が得られる。
Ｃ55Ｈ104Ｎ3Ｏ13Ｐ
ＭＭ：1046.42
【０１０３】
実施例 2.16
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-ベンジルオキシカルボニルアミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル−アミノ]ペンチル｝アミド（＝OM-197-MC-AC）（図24）
2.16.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-アミノヘキサノールオキシ）-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイル−アミノ]ペンチル}アミドβ−ベンジルエステル
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイル−アミノ]ペンチル}アミドβ−ベンジルエステル（0.38mmol、400mg）と6（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（0.83mmol、220mg）の無水CH2Cl2（15ml）溶液に0℃で、アルゴン流下に1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（0.85mmol、162mg）と4-ジメチルアミノピリジン（13mg、98μmol）を加える。反応液を30分間0℃で室温で一晩攪拌した後、反応媒体を1N HCl水溶液て洗い、相分離する。有機相をMgSO4を通して乾燥し、濾過し、蒸発する。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（9/1、4/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）で精製してカップリング反応生成物を回収する（395mg；81％）。白い固形物。
【表１９】
2003518086.tif 000092
【０１０４】
2.16.2  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル)アミド
酢酸（2ml）とを含む5/1 CH2Cl2/エタノール混合液（24ml）中に上記化合物（0.26mmol、340mg。）の溶液を作り、室温で炭素上に10％ Pd（40mg）を含むPdの存在下で12〜24時間、大気圧下の水素で水素化する。触媒は濾過で除去する。濾液を乾燥し、ケークに蒸発乾燥してN-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ)-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル}アミドが得られる（238mg、定量的収率、C55H104N4O10：ES/MS：m/z 981.9（[M+H]+）；図25）
【０１０５】
実施例 2.17
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-スクシニルアミドヘクサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシ−テトラデカノイルアミノ]ペンチル)アミド（=OM-197-MC-AC-Succ）（図24）
【０１０６】
例2.16の生成物（50mg；0.051mmol）のピリジン（3ml）溶液（セクション2.16.2）に無水琥珀酸（0.11mmol、11mg）および4-N，Nジメチルアミノピリジン（7mg；0.57mmol）を加える。6時間撹拌後、50℃でArの下にメタノール（2ml）を加え、反応媒体を15分間室温で更に攪拌する。溶剤を蒸発させて、生成物はシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ処理（7:1 5:1 CH2Cl2/MeOH溶離液）によって精製する。白い固形物として生成物を得る（42mg；74％）。
Ｃ59Ｈ108Ｎ4Ｏ13 
ES/MS；m/z  1082（[ M+H ] )+（Rf = 0.1（4:1 CH2Cl2/MeOH））
【０１０７】
実施例 2.18
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ベンジルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシ−テトラデカノイルアミノ]ペンチル｝−アミド（=OM-197-MC-AC-Glyに）（図24）
【０１０８】
2.18.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(ベンジルオキシカルボニルアミノアセトキシ）-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイル−アミノ]ペンチル)アミド−ベンジルエステル
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}−アミド−ベンジルエステル（0.29mmol、300mg）および市販のN-ベンジルオキシカルボニルグリシン（0.49mmol、101mg）の無水CH2Cl2（10ml）の溶液に、0℃でアルゴン流下に1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（0.48mmol、93mg）、4-ジメチルアミノピリジン（6mg、49μmol）を加える。反応液を30分間0℃で室温で一晩攪拌した後、反応媒体を1N HCl水溶液で洗う。相分離し、有機相はMgSO4を通じて乾燥し、濾過し、蒸発した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ（8/1，6/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）の精製でカップリング反応生成物が回収される（313mg；88％）。白い固形物。
【表２０】
2003518086.tif 000093
【０１０９】
2.18.2  N-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(グリシニルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル)アミド（=OM-197-MC-Ｇｌｙ）（図2４）
酢酸（2ml）を含む5/1 CH2Cl2/エタノール混合液（12ml）中に上記化合物（0.22mmol、268mg）の溶液を室温で炭素上に10％ Pd（30mg）を含むPdの存在下で12〜24時間の大気圧水素下で水素化する。触媒は濾過で除去する。濾液を乾燥し、ケークを真空ポンプの吸引乾燥してN-3-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(グリシニル）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミドを得る（200mg、定量的収率）。
Ｃ51Ｈ104Ｎ4Ｏ10：
ES/MS：m/z  925.7（[ M+H]+）（947.8（[ M+Na ]＋））；（図26）
【０１１０】
実施例 2.19
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-スクシニルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシ−テトラデカノイルアミノ]ペンチル｝−アミド（=OM-197-MC-Succ）（図27）
【０１１１】
2.19.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-スクシニルオキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}アミド−ベンジルエステル
Et3N（0.29mmol、40μl）の存在下で、無水CH2Cl2（2ml）の無水琥珀酸（0.25mmol、25mg）溶液に0℃でCH2Cl2（5ml）中にN-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}−アミド−ベンジルエステル（セクション1.2.2）（0.14mmol、150mg）を含む溶液を添加する。反応液を10分間0℃で室温で攪拌した後、CH2Cl2で希釈した後、反応媒体を1N HCl溶液で洗い、溶液を相分離する。有機相をMgSO4を通してて乾燥し、濾過し、蒸発乾燥した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ精製し（2％酢酸を含む9/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）て酸生成物を回収する（148mg；90％）。白い固形物。
【表２１】
2003518086.tif 000094
【０１１２】
2.19.2  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-スクシニルオキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝アミド（=OM-197-MC-Succ）（図27）
上記の化合物（0.11mmol、124mg）の溶液を、酢酸（1ml）を含む熱い（HPLC-grade）EtOH（12ml）に溶かし、炭素上に10％ Pd（15mg）を含むPdの存在下で室温で10時間、大気圧水素下で水素化する。触媒を濾過で除去し、濾液を蒸発乾燥し、ケークを真空ポンプで吸引乾燥し二酸の生成物（97％、102mg）を回収した。
Ｃ53Ｈ97Ｎ3Ｏ12：
ES/MS：m/z  968.6（[ M+H]+）（990.7（[ M+Na ]＋））；（図28）
【０１１３】
実施例 2.20
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシ−テトラデカノイルアミノ]ペンチル｝−アミドβ-N-(3-アミノプロピル）アミド（=OM-197-AP）（図29）
【０１１４】
2.20.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}−アミド
Et3N（4ml）を含む1/1 EtOH/EtOAc混合物（150ml）中で、N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル}アミド-ベンジルlエステル（セクション1.2.2）（2.53g；2.4mmol）の溶液を室温で炭素上に10％ Pd（120mg）を含むPdの存在下で2時間、１気圧水素下で水素化する。触媒は濾過で除去し、濾液は蒸発乾燥し、ケークを真空ポンプで吸引乾燥し、1/1 i-PrOH/CH2Cl2混合物（100ml）中に溶し、10分間室温でアンバーライトIR-120（H+）樹脂（5ml）と一緒に攪拌する。樹脂を濾過し、濾液を蒸発乾燥して、遊離酸を得る（2.25g；97％）。白い結晶質固形物。
Rf=0.45  （CH2Cl2/1％の酢酸を含むMeOH9/1）
U.V発色現象試剤：ホスホモリブデン酸化合物）
m.p.= 115−117℃
2.20.2  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}アミドβ-N-(3-ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル)アミド
IIDQ（2-イソブトキシ-1-イソブトキシカルボニル-1、2-ジヒドロキノリン）（98g；0.32mmol。）の無水CH2Cl2（3ml）溶液に、0℃でアルゴン流下で上記調製された化合物（0.26mmol、250mg。）の無水CH2Cl2（15ml）溶液を加える。反応液を15分間0℃で攪拌し、トリエチルアミン（0.29mmol、40μl）を含む無水CH2Cl2（7ml）中の市販の3-ベンジルオキシカルボニルアミノ-プロピルアミン塩酸塩（0.29mmol、70mg。）の溶液を加える。18時間撹拌後、溶液を蒸発乾燥する。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（20/1 CH2Cl2/MeOH溶離液）でカップリング反応生成物が回収される（217mg；78％）。白い固形物。
2.20.3  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシ−テトラデカノイルアミノ]−ペンチル}アミド-N-(3-アミノプロピル)アミド（=OM-197-AP）
酢酸（1ml）を含む1/1 CH2Cl2/イソプロパノール混合物（8ml）中に上記で作った化合物（44mmol、50mg）の溶液を加え、炭素上に10％ Pd（10mg）を含むPdの存在下で、6〜8時間、大気圧水素下で室温で水素化する。触媒は濾過で除去する。N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル}アミド-N-(3-アミノプロピル)アミド（80％、32mg）を得る。
C52H101N5O8：
ES/MS：m/z  924.8（[ M+H]+）；1848.8（[ 2M+H]+）;(図30）。
【０１１５】
実施例 2.21
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝−アミドβ-N-[(1S)-1-カルボキシ-5-アミノペンチルアミド（=OM-197-Lys）（図31）
【０１１６】
2.21.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝−アミド-N-[(1S)-1-ベンジルオキシカルボニル-5-ベンジルオキシカルボニルアミノペンチル]アミド
IIDQの溶液（2-イソブトキシ-1-イソブトキシカルボニル-1、2-ジヒドロキノリン）（114mg；0.38mmol）の無水CH2Cl2（5ml）溶液を、N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル}アミド（セクション2.20.1）（0.31mmol、300mg）の無水CH2Cl2（20ml溶液に室温でアルゴン流下で加える。反応液を15分間室温で攪拌した後、溶液をて、市販のトリエチルアミン（0.34mmol、48μl）を含む（ε-N-ベンジルオキシカルボニル-L-リシンベンジルエステル塩酸塩（0.31mmol、140mg）の無水CH2Cl2（5ml）溶液に加える。18時間、撹拌後、溶液を蒸発乾燥する。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（30/1、次いで、20/1のCH2Cl2/MeOH溶離液）し、カップリング反応生成物が回収した（317mg；77％）。白い固形物。
【表２２】
2003518086.tif 000095
【０１１７】
2.21.2  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝−アミド-N-[(1S)-1-カルボキシ-5-アミノペンチル]アミド
氷酢酸（0.5ml）を含む1/1 CH2Cl2/エタノール混合液（20ml）中に上記で調製した化合物の溶液（93mg；71μmol）を室温で炭素上に10％ Pd（17mg）を含むパラジウムの存在下で、12〜24時間、大気圧水素下で水素した。触媒は濾過で除去する。濾液を蒸発乾燥し、真空ポンプで吸引乾燥して、N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝−アミド-β−N-[(1S)-1-カルボキシ-5-アミノペンチル]アミドを得る（71mg、化学量論量の収率）。
C55H105N5O10：
ES/MS：m/z  996.9（[ M+H]+）；
1018.9（[ M+Na]+）（図32）。
【０１１８】
実施例 2.22
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミドβ-N-[(1S)-1-カルボキシ-5-アミノペンチルアミド（=
OM-197-Lys-AC）（図31）
【０１１９】
2.22.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-ベンジルオキシカルボニルアミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝−アミド-β−N-[(1S)-1-ベンジルオキシカルボニル-5-ベンジルオキシカルボニルアミノペンチル]−アミド
N-[(R)-3-の溶液に
ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}アミドβ-N-[(1S)-1-ベンジルオキシカルボニル-5-ベンジルオキシカルボニルアミノペンチル]−アミド（セクション2.21.1）（0.48mmol、317mg）と6-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸（0.48mmol、128mg）の無水CH2Cl2（15ml）溶液中に0℃でアルゴン流下に1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（0.48mmol、93mg）と4-ジメチルアミノピリジン（12mg、0.98の.μmol）とを連続して加える。反応液を30分間攪拌した後、0℃で一晩室温で攪拌する。反応媒体を水および1N HCl溶液で洗い、相分離する。有機相はMgSO4に通して乾燥し、濾過、蒸発乾燥する。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ（5/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）で精製してカップリング反応生成物を回収した（226mg；71％）。白い固形物。
【０１２０】
2.22.2
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル｝アミド−β-N-[(1S)-1-カルボキシ-5-アミノペンチル]アミド（=OM-197-Lys-AC）
酢酸（1ml）を含む1/1 CH2Cl2/イソプロパノール混合物（20ml）中の上記で調製した化合物（236mg；151 .μmol）の溶液を炭素上に10％ Pd（100mg）を含むパラジウムの存在下で、室温で12〜24時間、大気圧水素下で水素化した。触媒は濾過で除去した。濾液を蒸発乾燥し、ケークを真空ポンプで吸引乾燥してN-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ)-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル}アミド-β−N-[(1S)-1-カルボキシ-5-アミノペンチル]アミドを得る（83％、140mg）。
C61H116N6O11：
ES/MS：m/z  555.5（[ M+H]+2）；
1110.0（[ M+H]+）（図33）。
【０１２１】
実施例 2.23
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミドβ-N-[(1S)-1,2-ジカルボキシエチル]アミド（=OM-197-Asp）（図34）
【０１２２】
2.23.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}−アミドβ-N-[(1S)-1,2-ビス（ベンジルオキシカルボニル）エチル]アミド
IIDQ（2-イソブトキシ-1-イソブトキシカルボニル-1、2-ジヒドロキノリン）（96g；0.32mmol）の無水CH2Cl2（5ml）溶液にN-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル}アミド（セクション2.20.1）（0.26mmol、252mg）の無水CH2Cl2（20ml）溶液を室温でアルゴン下に加える。反応液を15分間室温で攪拌した後、市販の無水トリエチルアミン（0.29mmol、40μl）を含むCH2Cl2（5ml）中のアスパラギン酸ジベンジル・エステル・パラトルエンスルホナート塩（0.29mmol、141mg）の溶液を加える。18時間撹拌後、溶液を蒸発乾燥する。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（20/1 CH2Cl2/MeOH溶離液）してカップリング反応生成物を回収する（260mg；78％）。
【表２３】
2003518086.tif 000096
【０１２３】
2.23.2
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド−β-N-[(1S)-1,2-ジカルボキシエチル]アミド（=OM-197-Asp）
1/1 CH2Cl2/イソプロパノール混合物（20ml）中に上記で調製した化合物（260mg；207μmol）を含む溶液を炭素上に10％ Pd（50mg）を含むパラジウムの存在下で室温で4時間大気圧水素下に水素化する。触媒を濾過で除去し、濾液を蒸発乾燥し、ケークを真空ポンプで吸引乾燥して二酸（88％、108mg）を得た。
C53H98N4O12：
ES/MS：m/z  983.7（[ M+H]+）；1005.8（[ M+Na]+）;(図35）。
【０１２４】
実施例 2.24
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル−アミノ]−ペンチル｝アミド−β-N-[(1S)-1（2-）ジカルボキシエチル]アミド（=OM-197-Asp-AC）（図34）
【０１２５】
2.24.1  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-ベンジルオキシアミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラ−ドデカノイルアミノ]ペンチル｝アミドβ-N-[(1S)-1,2-ビス（ベンジルオキシカルボニル）エチル]アミド
N-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}アミド−β-N-[(1S)-1,2-ビス（ベンジルオキシカルボニル）エチルアミド（セクション2.23.1）（0.13mmol、158mg）と6-(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸（0.32mmol、84mg）の無水CH2Cl2（6ml）溶液に0℃、アルゴン流下に、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（0.32mmol、61mg）と4-ジメチルアミノピリジン（4mg、33μmol）とを加える。反応液を30分間攪拌した後、0℃で一晩室温で攪拌する。反応媒体を水および1N HCl溶液で洗浄し、相分離する。有機相はMgSO4を通して乾燥し、濾過、蒸発乾燥した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（6/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）してカップリング反応生成物を回収した（83mg；44％）
【表２４】
2003518086.tif 000097
【０１２６】
2.24.2  N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド−β-N-[(1S)-1,2-ジカルボキシエチル]アミド（=OM-197-Asp-AC）
酢酸（1ml）を含む1/4 CH2Cl2/エタノール混合液（10ml）中の上記で調製した化合物（80mg；0.053 mmol）の溶液を炭素上に10％ Pd（50mg）を含むパラジウム存在下で室温で12〜24時間、大気圧水素下に水素化した。触媒は濾過して除去する。濾液は蒸発乾燥し、ケークは真空ポンプで吸引乾燥して二酸（61mg、化学量論量の収率）を得た。
原子分析MS：
計算値C59H109N5O13
実測値：1095.8；
ES/MS：
m/z  1097.0（[ M+H]+）（図36）。
実施例 2.25
N-アセチル-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド（=OM-197-N'C2-AC）（図37）
【０１２７】
2.25.1  N-アセチル-D-アスパラギン酸、β-ベンジルエステル
アセトニトリル（1ml）の無水酢酸（0.90mmol、85の.μl。）溶液にCH3CN.H2O/Et3N（3.5/1.0/0.4ml）混合物中の市販のH-D-Asp(OBn)-OH（Senn Chemicals（CH-Dielsdorf））（0.90mmol、200mg）の溶液を加える。反応液は18時間室温で攪拌する。有機溶剤を蒸発させ、残留した水相を0℃まで冷やし、枸櫞酸の10％水溶液でpH＝3まで酸性化し、EtOAc（2x）で抽出する。有機相は合わせ、MgSO4を通して乾燥し、濾過し、蒸発させる。白い結晶質固形物（81％、192mg）として得られるN-アセチル-Dアスパラギン酸の-ベンジルエステルを次のステップで更なる精製なしで使用した。（Rf =0.45  20/1 CH2Cl2/2％の酢酸を含むMeOH）、U.V発色現象試剤＝ホスホモリブデン酸化合物）
【０１２８】
2.25.2  N−アセチル-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル}アミド−β−ベンジルエステル
IIDQ（2-イソブトキシ-1-イソブトキシカルボニル-1、2-ジヒドロキノリン）（254g；0.84mmol、1.2当量）の無水CH2Cl2（5ml）溶液に室温でアルゴン流下にN-アセチル-Dアスパラギン酸β−ベンジルエステル（0.70mmol、185mg）の無水CH2Cl2（15ml）溶液を加える。反応液は15分間攪拌した後、（2R）-5-アミノ-2-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル（セクション1.1.2）（334mg、0.77mmol.、1当量）の無水CH2Cl2（10ml）溶液を加える。3時間撹拌後、溶液を蒸発乾燥す。残った生成物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（5/3 CH2Cl2/アセトンおよび純粋アセトン溶離液）してカップリング反応生成物（369mg；78％）を回収した。
（Rf =0.22  5/2 CH2Cl2/アセトン）（U.V発色現象試剤＝ホスホモリブデン酸化合物）。
【表２５】
2003518086.tif 000098
MS：計算値C39H59N3O7、 実測値 681.4
m/z 682.5（[ M+H]+）（704.5（[ M+Na]+））
2.25.3  N-アセチル-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド−β−ベンジルエステル
N-アセチル-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル}アミド−β−ベンジルエステル（200mg；0.29mmol）と6-(ベンジルオキシカルバノイルアミノ)ヘキサン酸（156mg；0.59mmol）の無水CH2Cl2（8ml）溶液に0℃、アルゴン流下に市販の1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（0.59mmol、112mg）と4-ジメチルアミノピリジン（7mg、59μmol）を加える。反応液を室温で30分間攪拌した後、0℃で一晩攪拌する。反応媒体を水と1N HCl溶液で洗浄し、相分離する。有機相はMgSO4を通して乾燥し、濾過し、蒸発乾燥した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（6/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）してカップリング反応生成物を回収した（200mg；73％）。白い固形物。
【表２６】
2003518086.tif 000099
【０１２９】
2.25.4  N-アセチル-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド（OM-197-N'C2-AC）
酢酸（2ml）を含む1/1 CH2Cl2/エタノール混合液（16ml）中の上記で得た化合物（200mg；0.22mmol）の溶液を室温で炭素上に10％ Pd（40mg）を含むPdの存在下で、12〜24時間、大気圧水素下に水素化する。触媒を濾過し、濾液を蒸発乾燥し、真空ポンプで吸引乾燥してN-アセチル-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラ−デカノイルアミノ]ペンチル｝アミドを得る（132mg、化学量論量の収率）；MS：計算値 C31H58N4O8、実測値 614.43、m/z 615.5（[M+H]+、629.5（[M+NH4]+）、637.5（[ M+Na]+）（図38）。
【０１３０】
実施例 2.26
N-(2-デカノイルオキソオクタノイル）-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-(6-アミノヘキサノイルオキシ）-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド（=OM-197-N.(C10-2O8C)-AC）（図39）
【０１３１】
2.26.1  ベンジル2-ヒドロキシオクタノン酸
HPLC-グレードのエチルアセタート（30ml）中の市販のラセミ2-ヒドロキシオクタン酸混合物（6.2mmol、1.00g）の溶液に、臭化ベンジル（2.22ml；18.7mmol）、トリエチルアミン（18.7mmol、2.6ml）および沃化化テトラブチルアンモニウム（1.15g；3.12mmol）を加える。溶液を18時間室温で攪拌した後、溶剤を蒸発する。ケークをエーテルで採り、有機相をNaHCO3およびH2O（2x）の飽和溶液で洗浄する。有機相をMgSO4を通して乾燥し、濾過し、蒸発簡素うして粗ベンジル2-ヒドロキシオクタノエートを得る（Rf = 0.57：3/1石油エーテル/EtOAc混合物；ホスホモリブデン酸化合物、U.V発色現象試剤）
【０１３２】
2.26.2  ベンジル2-デカノイルオキシオクタノン酸
上記で得られたエステル（780mg；3.12mmol）の無水CH2Cl2（15ml）溶液中に0℃でピリジン（0.9ml）およびデカノイル塩化物（654mg；3.43mmol）を滴下した。混合物を20時間室温で攪拌した後、反応媒体をNaHCO3（5％）を含む氷水中へ注ぐ。有機相を分離し、1N HCl溶液および水（2x）で洗浄し、有機相はMgSO4を通して乾燥し、濾過し、蒸発乾燥した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（30/1石油エーテル/EtOAc溶離液）して純粋なベンジル2-デカノイルオキシオクタノン酸を回収した。
【０１３３】
2.26.3  2-デカノイルオキシオクタン酸ベンジル
2-ヒドロキシの溶液
HPLC-グレードのEtOH（40ml）中に溶かした上記で得られた2-デカノイルオキシオクタノン酸（515mg；1.27mmol）を室温で10％ Pd（100mg）を含む炭素上のPdの存在下で2時間大気圧下の水素で水素化する。ついで、触媒をミリポアフィルタでろ過除去する。濾液を乾燥、真空ポンプの吸引下に蒸発乾燥させて2-デカノイルオキシオクタン酸を得る（化学量論量の収率）
【０１３４】
2.26.4  N-(2-デカノイルオキシオクタノイル)-D-アスパラギン酸、β−ベンジルエステル
2-デカノイルオキシオクタン酸（317mg；1.01mmol）の-15℃での無水THF（2ml）溶液にアルゴン流下にN-メチルモルフリン（111μl；1.01mmol、1当量）と、イソブチルクロロ炭酸塩（131μl；1.01mmol、1当量）とを加えると、急速にN-メチルモルホリン塩酸塩の沈殿が観測される。-15℃で30分間撹拌後、市販のH-D-Asp(OBn)-OH溶液）(Senn Chemicals AG, Switzerland-Dielsdorf)（225mg；1.01mmol、1当量）のEt3N（0.4ml）を含む3.5/1 CH3CN/H2Oを加える。反応混合物（9ml）を一晩、室温で攪拌する。有機相は蒸発させ、水相は0℃まで冷却し、枸櫞酸の10％水溶液でpH＝3まで酸性化し、EtOAc（2x）で抽出する。有機相はMgSO4を通して乾燥し、濾過し、蒸発乾燥する。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（2％酢酸を含む2/1石油エーテル/EtOAc溶離液）し、トルエン共蒸発させて、N-(2-でそこであることを先行する。デカノイルオキシオクタノイル）-D-アスパラギン酸、β−ベンジルエステルを回収した（140mg；27％）
【０１３５】
2.26.5  N-(2-デカノイルオキシオクタノイル）-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド−β−ベンジルエステル
IIDQ（98mg；0.32mmol、1.2当量）をN-(2-デカノイルオキシオクタノイル)-D-アスパラギン酸、β−ベンジルエステル（140g；0.27mmol）の無水CH2Cl2（15ml）溶液に室温でアルゴン流下で加える。15分間撹拌した後、（2R）-5-アミノ-2-[(R)-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]ペンタン-1-オル（セクション1.1.2）（129mg；0.30mmol、1.1当量）の無水CH2Cl2（5ml）溶液を加える。18時間撹拌後、溶液を蒸発乾燥する。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（5/1 CH2Cl2/アセトンおよび1/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）してカップリング反応生成物を回収した（197mg；78％）
(Rf=0.30；5/1 CH2Cl2/アセトン混合液)
U.V発色剤 ホスホモリブデン酸化合物）
【０１３６】
2.26.6
N-(2-デカノイルオキシオクタノイル）-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-[6-(ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノイルオキシ]-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイル−アミノ]ペンチル｝アミドβ−ベンジルエステル
N-(2-デカノイルオキシオクタノイル）-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-ヒドロキシ-4-[(R)-3-ベンジルオキシテトラデカノイルアミノ]−ペンチル｝アミド−β−ベンジルエステル（97mg；0.21mmol）と6-(ベンジルオキシカルバノイルアミノ）ヘキサン酸（0.42mmol、112mg）の無水CH2Cl2（8ml）の溶液に0℃でアルゴン流下に1-(3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（0.42mmol、81mg）および4-ジメチルアミノピリジン（6mg、42μmol）を連続して加える。反応液を30分間室温で攪拌した後、0℃で一晩攪拌する。反応媒体を水および1N HCl溶液で洗浄し、相分離し、有機相はMgSO4を通して乾燥し、濾過し、蒸発乾燥した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（6/1 CH2Cl2/アセトン溶離液）してカップリング反応生成物を回収した（170mg；68％）。
【０１３７】
2.26.7  N-(2-デカノイルオキシオクタノイル）-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-[6-(アミノヘキサノイルオキシ)-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル]アミド
酢酸（2ml）を含む1/1 CH2Cl2/エタノール混合液（16ml）中の上記で調製された化合物（150mg；0.13mmol）の溶液を室温で炭素上に10％ Pd（40mg）を含むPdの存在下で12〜24時間、大気圧水素下に水素化した。触媒を濾過で除去し、濾液を乾燥し、ケークは真空ポンプで吸引乾燥してN-(2-デカノイルオキシオクタノイル)-D-アスパラギン酸、α-N-{(4R)-5-[6-(アミノヘキサノイルオキシ)-4-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]ペンチル]アミドを得る（110mg、化学量論量の収率）。
MS（原子分析）
計算値：C47H88N4O10
実測値：868.65
m/z  870.0（[ M+H]+）；
884.0（[ M+NH4]+）891.5（[ M+Na ]＋）（図40）。
【０１３８】
実施例 2.27
本発明化合物の精製と分析
合成生成物および追加の官能化側鎖スペーサを有するアシル-ジペプチド様化合物を（1：1v/v）水-イソプロパノール混合物に溶かした。次いで、50mMの濃度が得られるまで2M重炭酸アンモニウムを加えた。
【０１３９】
2.27.1  精製
精製プロセスは下記条件で予備逆相HPLCで実行した：
カラム：Bondapack C18 PrepPak、40x200mm、15-20マイクロメートル、300A、Waters
移動相：
A：（9：1v/v)イソプロパノール-水（50mM重炭酸アンモニウム）
B：（2：8v/v）イソプロパノール-水（50mM重炭酸アンモニウム）
移動比：40ml/分
溶出：カラム上のアイソクラチック
吸着：40％ B（60％A）（10分）
勾配：A：B：40−80％ B10分以内
アイソクラチック溶出：80％B、30分
洗浄ステップ： 100％B、10分、
検出：210ｎｍ、UV
芳香生成物は全く観測されない（不完全な脱保護ステップ）ようにするために、さらに精製ステップを実行する必要がある。この精製プロセスは以下の条件で実行される：
カラム：Kromasil C18、21×250mm、5マイクロメートル、100A、Macherey-Nagel。
移動相：
A：（9：1v/v)イソプロパノール-水(50mM重炭酸アンモニウム)
B：（2：8v/v)イソプロパノール-水（50mM重炭酸アンモニウム）
移動速度：5ml/分
溶出：カラム上のアイソクラチック
吸着：40％ B（60％A）（10分）
アイソクラチック溶出：84％B、30分
洗浄ステップ：10分、100％B
検出：210ｎｍ、UV
システム：WATER2000
アンモニウム塩の形で当該化合物を含む成分を合わせ、C18 Bondapack、15-20マイクロメートル、300A、waterで吸着して濃縮した。反対イオンは水-イソプロパノール混合物（9：1（v/v））中の10グラム/リットル濃度でアルカリ金属塩（例えばNaClまたはKCl）の水溶液で水洗して交換できる。過剰な塩をカラムに（9：1（v/v）水-イソプロパノール混合物流の5容積で除去して純粋なイソプロパノール化合物を溶出した。
【０１４０】
2.27.2
精製プロセスのモニタリング
各ステップ後、各フラクションを以下の条件で分析用逆相HPLCクロマトグラフィで分析した：
カラム：Supelcosil C18、3マイクロメートル、4.6の150mm x、100A、Supelco。
移動相：
A：1：1（v/v）水-アセトニトリル（5mM TBAP）
B：1：9（v/v）水-イソプロパノール(5mM TBAP）
TBAP：テトラブチルアンモニウム・ホスファート
移動速度：1ml/分
溶出ステップ：（75：25〜0：100）37.5分以内にA：B 勾配
検出：UV、210ｎｍおよび254ｎｍ
クロマトグラフィ器械：この分析では異なるHPLCクロマトグラフィ械を使用した。（HP1050 Ti系列、HP1090系列M、LabChromShimadzu）。使用するシステムによって読み込まれる保持時間は各化合物で約1分だけ変化する。
【０１４１】
2.27.3  最終生成物の定量および純度分析
得られた生成物の分析および純度分析は上記のクロマトグラフィ操作条件でのHPLC/UV法で実行した。この分析から生成物の純度は97〜100％であった。UV検出から判断されるように不活性な不純物が存在することを証明するためにLC/ES-MS分析を実行した（electrosprayイオン化、ポジティブモード）。イオン化条件を満たすためにクロマトグラフ分離は以下の条件で実行した：
カラム：Vydac C4、5マイクロメートル、4.6の150mm x、300A
移動相：
A：（1：1（v/v））水-アセトニトリル（0.05％ TFA）
B：（1：9（v/v））水-イソプロパノール（0.05％ TFA）
移動速度：1ml/分
溶出：（80：20-0：100）A/B勾配20分以内
温度：40℃
2.27.4
分光分析
質量分光計
ES/MSスペクトル（正および負のモード）を各質量分析計で記録した（Finnigan LCQ（イオン・トラップ）；Micromass Quattro II（トリプルステージ四極子）；Micromass Z-Bio-Q、トリプルステージ四極子）。MS/MS測定ベースの追加の分析も実行した。
核磁気共鳴
1H-NMRおよび13C-NMRスペクトルはDPX Brukerタイプの器械で250.13および62.89MHzで記録した。
【０１４２】
第３シリーズの実施例
接合体（コンジュゲート）の製造
実施例 3.1
ペプチドFGFGとの接合
図5、8、15、17、19、21および23の合成方法に示すように、近接ジヒドロキシ化反応をオレフィンタイプの追加的な側鎖スペーサを有するジペプチド様化合物で行なって安定なジオール官能基にした。次に、過沃素酸酸化反応によって追加的な側鎖スペーサにアルデヒド官能基を形成した。これに還元性アミノ化反応によって小さいペプチド基、例えばFGFG（フエニルアラニン−グリシン−フエニルアラニン−グリシン、シグマ）がカップルする。溶液中に存在する塩を除去するために、アルデヒド化合物を精製するのが好ましい。このアルデヒド化合物の精製は以下の手順に従ってC18カラムBondapack、15-20μｍ、300A  (Waters)で行うことができる：
−イソプロパノール-水混合液（1:3）へ希釈後にサンプル吸着、
−イソプロパノール-水混合液（1:9）で塩の溶出、
−最少容量のイソプロパノールでアルデヒド化合物を溶出
還元性アミノ化に基づくカップリングはペプチドまたは接合すべき蛋白質にあるアミン官能基とアルデヒド（アシル-ジペプチド様化合物の追加的な側鎖スペーサ）との間の比が化学量論量となるように水溶液で実行する。
FGFGペプチドの場合には、精製された2mgのOM-197-FV7（1.86μmol.、1当量）を、H2O-MeCN（1:1）の1mlに溶かした0.8mgの FGFG（1.86μmol.、1当量）の溶液に加える。この溶液を30分間室温で攪拌してイミンを形成する。次いで、92μlの1−M NaBH3CN（5.77mg、50当量）を加えて還元段階を行って、極めて安定した炭素−窒素結合（図41）を形成する。接合体（コンジュゲート）はまず最初に未反応のペプチドを除去するためにVydac C4カラムで精製し、その後で、Bondapack C18(Waters)で精製してナトリウム塩にする（本発明化合物の精製および分析の項を参照）。次に、接合体を0.01％トリエタノールアミン（TEoA）を含む無菌のH2Oに溶かして生物的活性テストの条件を満たようにする。精製プロセス後、ES/MSマススペクトルを記録する。その結果を示す図43からm/z 1457.4に分子イオン[M+H]+が存在することが示される。これは所望の共役が起こったことの証拠である。また、400および900m/zの間に見えるイオンはMS/MS分析から共役したペプチド分子のピークからくる断片であることが同定された。初期FGFGペプチド（m/z  427.1 [M+H]+、m/z853.0[2M+H]+、図42）に対応するイオンは検出されなかった。
【０１４３】
実施例 3.2
ペプチド（NANP）6P2P30との接合
例えば［図5］に記載の合成方法によって得られるOM-197-FV7化合物は、例えば医薬として重要な下記配列を有する下記ペプチド（NANP)6P2P30[Valmori et al., 1992, J. Imμnol., 149 : 717-721]に連結できる：
（NANP）6QYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
この（NANP）6P2P30ペプチドは4つの潜在的な共役サイト（頂生のアミン＋3つのリシン）を示す。5mgの精製されたOM-197-FV7（4.64.μmol、4当量）を7.49mgの溶液に加えた。（NANP）6P2P30（1.16μmol、1当量）は（1:1）H2O-イソプロパノール混合物の1mlに溶かした。溶液を30分間室温で攪拌した後、230μl の1M NaBH3CN（14.43mg、50当量）を加えて還元ステップを実施した。溶液を2時間室温で攪拌した後、反応液を24時間（3.5kDa透析処理カセット、Slide-A-Lyzer、ピアス）でH2Oに対して透析した。［図44］に示すクロマトグラムで示すように、反応液のLC/ES-MS分析は3つの分子種の存在を示す：
遊離ペプチド（ピークA）に対応する、モノコンジュゲートペプチド（ピークB）およびジコンジュゲートペプチド（ピークC）のピークが明らかに見える。記録されたこれらの各イオンクラウドを図45、46、47に示す。これらはモノコンジュゲートおよびジコジュゲートとしてOM-197-FVの１つまたは２つの分子に対する共有結合性共役がなされたことを証明している。
【０１４４】
図45：ペプチド（NANP)6P2P30（遊離ペプチド）MW：6451.  m/z比1076.2（A6）、1291.2（A5）、1613.7（A4）でのイオン
図46：モノ（単）コンジュゲート：OM-197-FV-(NANP)6P2P30 MW：7481  m/z比1247.8（B6）、1497.4（B5）、1871.2（B4）でのイオン
図47：ビ（ニ）コンジュゲート（OM-197-FV）2-(NANP)6P2P30 MW：8511   m/z比1419.6（C6）、1703.3（C5）、2129.1（C4）でのイオン。
OM-197-FV-(NANP)6P2P30接合体のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析では未反応ペプチド、単共役および二共役に対応する種々の孤立バンドが示された。使用した電気泳動条件下（10％ポリアクリルアミド勾配、トリ-トリシン緩衝液、Bio-Rad、# 161-1108）では、バンド間の差は基準マーカーをベースにして1000原子質量単位と見積もられ、これはペプチドへのOM-197-FVに１分子または２分子の共役が起こったことを示す証拠となる。
【０１４５】
実施例 3.3
ペプチド接合体P2P30
他のペプチドは追加的なアルデヒド基タイプの側鎖スペーサを有する化合物に還元性アミノ化反応によって連結することもできる。OM-197-FVとP2O30ペプチドとの共役の例はを示す。後者は破傷風トキソイドのTエピトープの一部に対応した以下の配列を有する：
KQYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
このP2P30ペプチドは5つの潜在的な共役サイト（末端アミン＋4つのリジン残基）を有し、4200原子質量単位の質量を有する。従ってOM-197-FV7の5当量を使用した。上記で特定した反応条件が観測された。H2O中での透析処理（3.5kDa透析処理カセット、Slide-A-lyzer、ピアス）後、得られた接合体の質量スペクトルをLC/ES-MS技術によって測定し、4200原子質量単位の分子塊を有するペプチドの周囲イオン電荷（図48）を形成する840.9（A5）、1050.9（A4）および1401.0（A3）のm/z比で多価イオンを表す遊離ペプチドP2P30のスペクトルと比較した。OM-197-FV-P2P30のP2P30モノコンジュゲートは872.8（A6）、1047.1（A5）、1308.6（A4）および1744.4（A3）のm/z比で多価イオンを示す（図49）。これらは5230原子質量単位の分子を有する接合体の外周イオン電荷を構成し、還元性アミノ化によるP2P30ペプチド分子上のOM-197-FV分子のグラフトに対応する。
同様に、OM-197-FV)2-P2P30の質量スペクトルから-P2P30がペプチド単位当たり2つのOM-197-FV分子が存在することが確認された。周囲イオン電荷はm/z比1044.5（A6）、1253.1（A5）、1566.3（A4）および2088.4（A3）でイオンによって形成される（図50）。これは変換分析後、予想されたビコンジュゲート分子（6261原子質量単位）が確認された。
【０１４６】
実施例 3.4
ペプチド（NANP）3CS.T3との接合
類似した共役手順を以下の配列を有する（NANP)3CS.T3ペプチド（TNO（MW）：3527原子質量単位）でも実施できる：
NANPNANPNANPDIEKKIAKMEKASSVFNVVNS
H2O透析処理後に単共役および二共役化合物で予想される値に対応する4557および5587原子質量単位の分子量に対応するES/MSスペクトル上にイオンを観測した。
【０１４７】
実施例 3.5
ペプチド接合体MR99B
［図8］に示す反応スキームに従って得られるOM-197-MC-FV6化合物を例えばPyCS 245-253のような医薬として重要なペプチドに連結できる。このペプチドは以下の配列を有するPlasmodium yoelli [Franke, E.D., et al., 1997, J. Imμnol., 159 : 3424-3433]のT-エピトープに対応する：
SYVPSAEQI（PyCS 245-253）
カップリング時にT-エピトープ部分を変化させないためにアミノ酸SERを加えて、以下の配列のMR99Bといわれるペプチドを形成し：
SERSYVPSAEQI（MR99B）
この配列はリシンを含まないので、MR99Bペプチドはユニークな還元性アミノ化共役部位（末端アミン）を有する。従って、2mgの精製されたOM-197-MC-FV6(2.04μmol、1.4 当量）を1mlの1:1 H2O-イソプロパノール混合物に溶かした2mgの MR99B（1.47μmol、1当量）の溶液に加える。溶液を30分間室温で攪拌し、29.4μ.ml（1M）NaBH3CN（2当量、29.4μmol）を加えて還元ステップを実行する。溶液を2時間室温で攪拌する。図52（周囲イオン電荷）および図53（変化後のスペクトル）のスペクトルで示すように、反応液のLC/ES-MS分析から予想された分子量（2330.4原子質量単位（図51））のOM-197-MC-FV-MR99B接合体ができたことが証明された。OM-197-MC-FV-MR99B接合体の精製は以下の条件でC4相上の半−予備的液体クロマトグラフィで実行した：
カラム：Vydac C4、250×10mm、5マイクロメートル、300A（Vydac）
移動相：
A：（9：1（v/v））水−MeCN（0.05％ TFA）
B：（9：1（v/v））イソプロパノール−水（0.05％ TFA）
移動速度：2.5ml/分
溶出：アイソクラチック溶出：20分、65％ B
水洗：10分、100％ B
検出：210nμV
システム：HPLC 1050
ペプチドの抗原性部分が共役によって変わらないことを証明するためにOM-197-MC-FV-MR99Bのトリプシン消化を行う。0.5mgの接合体を1mlのトリス-HCl 50mM緩衝液、2mM CaCl2、Ph 8中の83μgのトリプシン（ロシュ# 109819）（基質-酵素割合（6:1））で24時間培養した。この反応後のLC/ES-MS分析は図54に示してある。図55および図56に示す対応ES-MSスペクトルで2つの断片の存在が確認できた。最初の断片は993.5（[ M+H]+）および1015.6（[ M+Na]+）のm/z比でのイオンを明らかに示し、CSPy 145-253ペプチド（図55）に対応する。第2の断片は678.1（[M+H]+）および1355.0（[M+H]+）のm/zでのイオンを示し、OM-FV-SER基タイプの構造（図56）の存在を示す。第3のピークも見える。このピークはSYVPSおよびEQI断片に対応する（上記クロマトグラフィ溶離条件で共溶離）。この反応はMR99Bが単独で消化された時にも観測される。これらの結果は図51に図式的に示したように、共役によってMR99BペプチドのT-エピトープ部分が変化しないことを証明している。
【０１４８】
実施例 3.6
ペプチドMR99Aとの接合
所定ペプチドへのOM-197-MR-FVの共役割合を増やし、T-エピトープ部分を変えずにアジュバント/抗原比を増加させるために、KGG基型配列をペプチドにグラフトできる。すなわち、例えばKGGKGGK配列をMR99Aペプチドにグラフトして、MR99Bペプチドにすることができる：
KGGKGGKSERSYVVYVPSAEQ  （MR99A）
このペプチドは還元性アミノ化反応用に4つのペプチド共役サイトを有する（3つのリシンと末端アミン）。12mgの精製されたOM-197-MC-FV6（12.2μmol、12当量））を1ml の1:1  H2O-イソプロパノール溶液に溶かした2mgのMR99Aに加える。溶液を30分間室温で攪拌した後、242μlの1M NaBH3CN（244μmol.、242当量）を加えて還元性ステップを実施した。溶液を2時間室温で攪拌する。反応液のLC/ES-MS分析はMR99AペプチドにOM-197-MC-FV分子が種々の共役比率でグラフトしたことに対応する異なるピークを示す。図57（イオンクラウド）および図58（変性後のスペクトル）の質量スペクトルに示すように、OM-197-MC-FV)3-MR99Aに対応するトリコンジュゲート（triconjugate）（4870原子質量単位）がみえる。図59（イオンクラウド）および図60（変性後のスペクト）に示されるスペクトルは（OM-197-MC-FV)4-MR99Aテトラコンジュゲート（5834原子質量単位）が形成されたことを示す。さらにペンタコンジュゲート（pentaconjuguate）の形成に対応するイオンも観測される。これらの結果は一定反応条件（過剰OM-197-MC-FV）下ではリシンは還元性アミノ化反応の反応性アミノ酸ではないことを示している。C4相でのトリおよびテトラコンジュゲート（OM-197-MC-FV)3 4-MR99Aの精製は半−予備的液体クロマトグラフィで以下の条件で実施した：
カラム：Vydac C4、250×10mm、5マイクロメートル、300A（Vydac）
移動相：
A：（9：1（v/v））水−MeCN（0.05％ TFA）
B：（9：1（v/v））イソプロパノール−水（0.05％ TFA）
移動速度：2.5ml/分
溶出：アイソクラチック溶出：
20分、65％ B
水洗：10分、100％ B
検出：210nμV
システム：HPLC 1050
OM-197MC-FV-MR99B単共役の場合には、（OM-197-MC-FV)n-MR99Aポリコンジュゲートをトリプシン消化して抗原部分（CSPy 245-253）が共役で変化したか否かを決定できる。1mgのポリコンジュゲートを1mlの50mMトリスHCl緩衝液、2mM CaCl、pH 8中で166μgのトリプシン（ロシュ（#109819））で24時間、25℃で培養する（基質-酵素割合：6:1）。反応後、LC/ES-MS分析を行って、MR99Aペプチドの各種位置での開裂数が多いか否かを確かめる。生成物の中で、CSPy 245-253のペプチドに対応する993.5（[M+H]+）と1015.6（[M+Na]+）のm/z比での断片に注意する。このペプチドの存在はマルチコンジュゲート反応後でもペプチドのT-エピトープ部分が保全さた証拠である。1621.4（[M+H]+）および1942.8（[M+H]+）のm/z比で3倍のチャージ・イオンによって検出されたる２つの断片は特に重要である。この断片は（OM-197-MC-FV）4-KGGKGGKSERとOM-197-MC-FV)5-KGGKGGKSER）断片に対応する。従って、これが検出されることは、リシン以外のアミノ酸が還元性アミノ化ステップで反応した場合でも、OM-197-MC-FVの異なる分子がCSPy 245-253に加た配列に実際にグラフトしたことを示している。ペプチド上のOM-197-MC-FVのいくつかの立体的分子の存在はトリプシンの場合のようにプロテアーゼ活性に影響を及ぼさない点に留意する必要がある。例えば、活性成分が開裂可能な結合の選択的開裂後に放出されるプロドラッグに共役する場合を考えた時にこの結果は注目に値する。
【０１４９】
実施例 3.7
ペプチドAg85cとの接合
追加的なフルミルバレリル基タイプの側鎖スペーサを有する構造は医薬で重要な多くのペプチドにコンジュゲートできる。例えば、還元性アミノ化反応によって結核菌の抗原たんぱく配列に由来する配列を有する合成ペプチドの末端アミンにOM-197-MC-FV分子をグラフトする例が挙げられる。最初に使用するペプチドは下記である：
ＭR 100  YLQVPSASMGR：            1208.4原子質量単位
ＭR 101  MVQIRPRLVANNTRIWVYC      2176.6  原子質量単位
LR72   PYAASLSGFLNPSEGWWPTLIGLAM  2676.1原子質量単位
OM-197-MC-FVとの反応によって、LC/ES-MS分析で以下の接合体が検出された：例えば2171.0原子質量単位の分子量を有するOM-197-FV-MR100（図61および62）。3140.0原子質量単位のOM-197-MC-FV-MR101および3643.0原子質量単位のOM-197-MC-FV-LR72も得られた。
【０１５０】
実施例 3.8
OM-197型構造を有する二量体
還元性アミノ化方法はOM-197-type構造を有する二量体の合成にも同様に適用できる。例えば、追加的な官能化側鎖スペーサ、例えばOM-197-MC-FVおよびOM-197-MC-ACを有する2つの化合物から二量体を形成できる。すなわち、1mgの精製されたOM-197-MC-FV6（0.98μmol、1当量）を1mgのH2O-イソプロパノール（1:9）に溶かした1mlのOM-197-MC-AC（0.98μmol、1当量）の溶液に加える。溶液を1時間室温で攪拌し、19.6μlの1M NaBH3CN（19.6μmol、20当量）を加えることで還元性ステップを実行する。その後、溶液を12時間室温で攪拌する。反応媒体のLC/ES-MS分析から図63に示すスペクトルによって証明されるように予想された分子量（1945.5原子質量単位）のOM-197-MC-FV-OM-197-MC-AC二量体ができたことが示される。すなわち、この分子はアシル鎖を有する主鎖の末端に2つのカルボキシル酸官能基を有する。
上記合成プロセスをOM-197-MP-FVまたはOM-197-MP-AC基タイプの化合物から初めて行うことによって、図63に示す構造で例えばカルボキシル基の1つをホスホリル基に代えることができる。官能性の側鎖スペーサ（OM-197-MP-FVおよびOM-197-MC-AC）を有する2つの化合物間で上記と同様な還元性アミノ化を実行することによってOM-197-MP-FV-OM-197-MC-AC二量体を得ることができる。図64に示したES/MSスペクトルからこの化合物が予想した分子であることが確認できる（2011.9原子質量単位）。
【０１５１】
実施例 3.9
アミノ型の追加的な側鎖スペーサを有する化合物の共役
アミン基タイプの追加的な側鎖スペーサを有する化合物も還元性アミノ化反応によってペプチド抗原にコンジュゲートできる。例えばコンジュゲートされらるペブチバドのの配列の末端セリンの存在を使用することができる。最初のステップで過沃素酸酸化反応をペプチドに実施して、反応性が非常に高いグリオキシリル基（-CO-CHO）を作る。次に、この基をOM-197基タイプの化合物の追加的な官能化側鎖スペーサで第一アミンと還元性アミノ化反応によって反応させることができる。
例えば、図65の合成方法に示すように合成ペプチドMR99BをOM-197-MC-AC化合物にコンジュゲートできる。そのためには、1mlの水に溶かした1mgのMR99Bペプチド（0.73μmol、1当量）の溶液に147μlの0.1M NaIO4（14.6μmol、20当量）を加える。溶液を2時間室温で攪拌する。形成されたアルデヒド化合物をC18相で精製し、1mlの（1:1）イソプロパノール-水混合液に回収する。次に、0.72mg のOM-197-MC-AC化合物（0.73μ.mol、1当量））および1mlの0.2Mボラート緩衝液（pH 9.2）を加える。30分間の室温で撹拌後、14.6μlの1M NaBH3CN（14.6μmol、20当量）を加えて還元ステップを実行する。溶液を24時間室温で攪拌する。反応液のLC/ES-MS分析から、図66（イオンクラウド）および図67（変性後のスペクトル）のスペクトルから証明されよように、予想された分子（2299.1原子質量単位、図65）のOM-197-MC-AC-MR99B接合体が得られる。アミノタイプの追加的な官能化側鎖スペーサを有する他の化合物も同様にコンジュゲートできる。例えば、OM-197-MC-AP、OM-197-MP-AC、OM-212-AH1、OM-197-MC-glyおよびOM-197-MC-Lys、OM-197-Lys-ACまたはOM-197-Asp-ACを挙げることができる。
【０１５２】
実施例 3.10
オボアルブミンとの接合
蛋白質（例えばオボアルブミン、ovalbumin）は還元性アミノ化共役に特に適している。配列に含まれるリジン残基の数（オボアルブミンでは20リジン残基）は全てアルデヒド官能基を有する追加的な官能化側鎖スペーサを有するジペプチド様化合物の潜在的な共役サイトである。還元性アミノ化反応（アシル-ジペプチド様化合物/蛋白質）の化学量論量比を変えることによって種々のコンジュゲートを行うことができる。
1mgの精製されたOM-197-FV7（0.928μmol、10当量）を5mlのH2Oに溶かした4mgのオボアルブミン（0.09μmol、1当量）の溶液に加える。溶液を30分間室温で攪拌した後、46μlの 1M NaBH3CN（50当量、2.89mg）を加えて還元ステップを行う。溶液を2時間室温で攪拌する。反応液を24時間H2Oに対して透析する（3.5kDa透析カセット、Slide-A-Lyzer、ピアス）。
オボアルブミンは寸法およびそれに固有なヘテロ形質のために分析上多くの問題がある。その結果、マススペクトロメトリによるオボアルブミン接合体のOM-1976FV-のキャラクタリゼーションを行うのは非常に難しい作業になる。
コンジュゲーション反応が実際に起こったことを示すためにSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析をOM-197-FV-オボアルブミンコンジュゲートの異なるバッチで実施した。図68（B）（4−20％ポリアクリルアミドゲル勾配）に示すゲルから明らかなように、オボアルブミンの初期分子量が約3000原子質量単位（レーン2）を上回る分子がOM-1976FV-オボアルブミン接合体（レーン3、4および5）で観測される。この分子量差はOM-197-FVのいくつかの分子がオボアルブミンの各分子に存在することを示唆している。C4相で実施したLC/UV分析でこの結果が確認された。これらの条件では初めに使用したオボアルブミンに対応するピークがＲＴ＝11.3分に明らかに見え、一方、コンジュゲート反応した後では初めに使用したオボアルブミンに対応するピーク見えない。反応が化学量論量だったことを示す事実。しかし、OM-197-FV-オボアルブミン接合体は溶出されない。このクロマトグラフプロフィルも複数の単OM-197-FV分子がオボアルブミンに存在することを示しており、この条件の接合体の溶出を防いでいる。
【０１５３】
実施例 3.11
H1N1血球凝集素との接合
H1N1血球凝集素蛋白質もOM-197基タイプの分子と蛋白質抗原との間の共役を例示する例になる。1mgの精製されたOM-197-FV7（0.928μmol、15当量）を8mlのH2Oに溶かした5mgのH1N1（血球凝集素A/Beijig 262/95、ソルベーDuphar、Weesp、NL）（0.06μmol、1当量）の溶液に加える。溶液を30分間室温で攪拌した後、46μlの1M NaBH3CN（2.89mg、50当量）を加えることによって還元ステップを実行する。溶液を2時間室温で攪拌する。次に、反応液を24時間 H2Oに対して透析する（3.5kDa透析処理カセット）。
OM-197-FV-オボアルブミン接合体（4−20％ポリアクリルアミド勾配）で使用したのと同じ条件でOM-197-FV-H1N1接合体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。始めの蛋白質（レーン6）および透析処理前後で得た接合体（それぞれレーン8、7）の電気泳動プロフィルを図68(C)に示す。H1N1蛋白質は3つのバンドに現れる。その2つは文献（Swiss Biological Computer Science Institute）に報告のHA1およびHA2サブユニットに対応する。OM-197-FV-H1N1接合体の場合には各バンドで分子量差が観測され、H1N1蛋白質とOM-197-FV分子との共役が成し遂げられたことを証明している。
【０１５４】
実施例 3.12
AZTとの接合（図69）
ピリジン（4ml）中のAZT（200mg；0.749mmol）の溶液に連続して無水琥珀酸（150mg；0.5mmol）と4-ジメチルアミノピリジン（50mg；0.41mmol）を加え、12時間50℃に放置後にメタノール（2ml）を加え、反応媒体を更に15分間室温で攪拌する。反応媒体を濃縮し、以下の溶離液を使用してシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィによって生成物を精製する：5/1 CH2Cl2/MeOH。その結果、生成物が白い固形物として得られる（266mg；97％）。C14H17N5O7（M = 367グラム/モル）；Rf = 0.25（4/1 CH2Cl2/MeOH）。
得られた琥珀酸-AZT誘導体（60mg；0.163mmol）の溶液に0℃でTHF（3ml）を加え、アルゴン流下にトリエチルアミン（24μl；0.172mmol）とクロロぎ酸エチル（14μl；0.172mmol）とを加える。直ちにトリエチルアミン塩酸塩が沈殿するのが観測される。40分間撹拌後、トリエチルアミン（24μl；0.172mmol）を含む9/1DMF:水混合物（10ml）中のアミノカプロイル誘導体溶液（Ex. 2.16）（160mg；0.163mmol）を加える。反応液を15℃で攪拌し、0℃およびその後室温で一晩攪拌し、減圧蒸発させる。粗生成物をジクロロメタン（15ml）および水（5ml）に採り、有機相を除去し、水相をジクロロメタン（2x）で抽出し、10％枸櫞酸水溶液で酸化する。有機相を合わせ、MgSO4を通して乾燥し、濾過し、濃縮する。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製によって、AZT-共役化合物（123mg；57％）白い固形物を回収する。溶離液（9/1、次いで7/1 CH2Cl2/MeOH）。Rf=0.2（4/1 CH2Cl2/MeOH）；C69H119N9O16（M = 1329グラム/モル）；実測値：m/z 1330.9（[M+H]+）。
分析HPLC：滞留時間Tr = 24.437分、C18 Supelcosil Column（15cm×4.6mm、3マイクロメートル、100A）；溶剤A = 50％MeCN（5mM TBAP）；溶剤B = 90％2-プロパノール（5mM TBAP）。勾配：25−100％、B 37.5分内、210nmでUV検出。
予備的HPLC：C18 Kromasilカラム（25cm×21mm、、5マイクロメートル、100A、溶剤A =50％ MeCN、5mM TBAP；溶剤B = 90％2-プロパノール（5mM TBAP）。80％ Bで生成物溶出。
最終相： SPE でNa+塩を流す、C18 Bondapack相、90％ 2-プロパノールで溶出。15マイクロメートル
【０１５６】
d4Tとの接合（図69）
ピリジン（4ml）中のd4T（200mg；0.89mmol）の溶液に連続して無水琥珀酸（179mg；0.786mmol）を加え、4-ジメチルアミノピリジン（109mg；0.89mmol）を加える。室温で12時間撹拌後、メタノール（2ml）をえ、反応媒体を室温で15分間攪拌し、最後に蒸発させる。粗生成物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィによって精製する（溶離液：5/1 CH2Cl2/MeOH）。得られた生成物は白い固形物（280mg；97％）。C14H16N2O7（M = 324グラム/モル）；Rf=0.25（4/1 CH2Cl2/MeOH）。
得られた琥珀酸-d4T誘導体（60mg；0.185mmol）の溶液に0℃でTHF（3ml）、そしてアルゴン流下にトリエチルアミン（27μl；194mmol）およびクロロぎ酸エチル（16μl； 0.194mmol）を加える。直ぐにトリエチルアミン塩酸塩が沈殿するのが観測される。40分間撹拌後、9/1 DMF：トリエチルアミン（27μl；0.194mmol）を含むＤＭＦ：水混合液（10ml）を含むアミノカプロイル誘導体（Ex. 2.16）（181mg；0.185mmol）を0℃で加える。反応液を15分間室温で攪拌し、部分減圧下に0℃で蒸発させる。粗生成物をジクロロメタン（15ml）および水（5ml）で採り、有機相は除去し、水相はジクロロメタン（2x）で抽出し、10％枸櫞酸水溶液で酸化する。有機相を合わせ、MgSO4を通して乾燥し、濾過し、濃縮する。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ精製（溶離液：9/1、ついで7/1 CH2Cl2/MeOH）してd4T-共役化合物を回収する（107mg；45％）。白い固形物。Rf=0.2（4/1 CH2Cl2/MeOH）；C69H118N6O16（M = 1329グラム/モル）；実測値：m/z 1288.9（MH+）；1310（Na）。
分析HPLC：滞留時間Tr = 24.455分、C18 Supelcosil Column（15cm×4.6mm 100A、3マイクロメートル）；溶剤A = 50％MeCN（5mM TBAP）；溶剤B = 90％2-プロパノール（5mM TBAP）。勾配：25−100％、B、37.5分以内、210nmでUV検出。
準備のHPLC：C18 Kromasilカラム（25cm×、5マイクロメートル、21mm 100A）50％溶剤A = MeCN（5mM TBAP）；
90％溶剤B = 2-propanol（5mM TBAP）。
80％ B.を有する生成物溶出
最終的な位相：SPE、C18 Bondapack位相、溶出によって90％ 2-propanolによって15マイクロメートルNa+塩を流すこと。
【０１５７】
第4シリーズの実施例
発明化合物の薬理学的研究(インビトロ)
実施例 4.1
エンドトキシン決定検定
エンドトキシンレベルは、時間-経過色Limulus Amoebocyte Lysateテスト（Charles River Endosafe, 1708K、バッチEK2251E）で決定した。このLALテストは本発明化合物に連結する抗原が低いエンドトキシンを有することを証明するために用いた。このテストの生物学的原理は細菌内毒素によるLimulus amoeboycteライゼート（LAL） 中に存在するチモーゲンのプライミングをベーにしたもので、新しく形成された酵素がセリンプロテアーゼ・カスケードを活性化する。無色基質（ｐ−ニトロアニリンに連結するS-2834ペプチド）の存在下での発色団の開裂でｐ−ニトロアニリン（pNA）が生じ、分光光度計で405nmでモニターできる黄色に発色する。
【０１５８】
【化７８】
2003518086.tif 000100
【０１５９】
この時間-経過色テストはエンドトキシン量は0.2の光学濃度（O.D.）に達するのに要する時間の逆数に非理いずれか一項に記載のするという事実に基づく。濃度は0.005-50EU/ml範囲をカバーする標準曲線で決定する。生成物溶液の0.1mg/ml（5-、10-、50-、100-、500-または1000-倍）希釈度でテストする。LAL結果はLPS過負荷の回収を抑制しなくなる最も低い希釈度に対応する。結果は国際的な滴定標準液（EC-6）に対するEU（エンドトキシン単位）で表される。この検定では1EUスタンドは0.08ngの大腸菌O55：B5 LPSを表す。
【０１６０】
【表２７】
2003518086.tif 000101
【０１６１】
テストされた全てのジペプチド様化合物は低いエンドトキシンレベルを示す。多くの生成物の場合、このエンドトキシンは検定センシティビティ未満である。エンドトキシンの定量は、サンプルが過負荷を回収するために希釈しなければならないという事実のために制限される。このLALテストの大部分の活性化合物でも、LPSのエンドトキシンレベル5000倍以下を示す。本発明のジペプチド様化合物はその生物的活性は、エンドトキシンが低い点で重要である。
【０１６２】
【表２８】
2003518086.tif 000102
【０１６３】
オボアルブミンへのOM-197-FV LALのカップリングの結果、実際に検出された活性が増加したものと思われる。この増加はOM-197-FV分子の提示方法で変る。オボアルブミン系の他の生成物も全くおなじLAL活性を有する。LAL結果は非常に変化し、グループ間で3-倍、4倍の相違は有意でない。ピークのLAL活性はカップリング反応生成物の場合の１回の注射（25μg/注射）につき2.4ngのLPS当量に等しく、他のグループではピークのLAL活性は注射当たりLPS当量の0.012ngに等しい。
【０１６４】
【表２９】
2003518086.tif 000103
【０１６５】
H1N1系の生成物は全て同じようなLAL活性を有する。LAL結果は非常に変化し、グループ間で3-倍、4倍の左は有意でない。共役はLAL活性に影響しない。ピークLAL活性は注射（5μg/注射）毎にLPS当量の0.008ngに等しい。
【０１６６】
【表３０】
2003518086.tif 000104
【０１６７】
（NANP）6P2P30系の化合物は全で同様なLAL活性を有する。LAL結果は非常に変化し、グループ間で3-倍、4倍の左は有意でない。共役はLAL活性に影響しない。最大LAL活性は注射（20μg/注射）当たりLPS当量の0.03ngに等しい。
【０１６８】
実施例 4.2
本発明化合物を投与したマウスの骨髄幹細胞の増殖
4.2.1  増殖実験
6週齢の年取った雄のC57/BL6マウスをCO2吸入法で犠牲にする。股関節部、大腿骨、脛骨および後肢骨を除去する。端部分からダルベッコのModified Eagle Medium（DH培地）を注射して骨ルーメンから骨髄を取り出す。幹細胞を水で洗浄し、20％ウシ胎仔血清（FCS）を用いてDH培地に再び懸濁させ、菌体濃度を500000セル/mlにする。20％ FCS、アミノ酸および抗生物質でDH培地に溶かした生成物を直接マイクロタイタープレートに連続的に希釈する。生成物を3回テストする。各マイクロタイタープレートは無地の培地を含む負対照を含む。各ウエルの最終容積は100μlにする。
100μlの細胞懸濁液を生成物の希釈溶液に加え、細胞を8％ CO2および飽和湿度雰囲気下で37℃で7日間培養する。細胞増殖度は生菌のミトコンドリアの色基質XTT（2、3-ビス[2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル]-2H-テトラアゾリウム-5-カルボキシアニリド）の酸化反応を測定して決定する。培養期間の終わりにXTT基質溶液（XTT＋0.008の1mg/ml mg/mlフェナジンメトスルファート）の50μlを各ウエルに加える。8％湿度のCO2下、37℃での8時間培養後、マイクロタイタープレートを分光光度計で492nmで読取、対照サンプルは対して690nmで読ンだ。結果は平均値±標準偏差で表し、線量応答曲線でプロットした。DH培地を含む対照の値（平均±標準偏差）も示した。この線量応答曲線から下記の3つの曲線プロセス変量が計算される：
最大値：曲線最大振幅および対応濃度
EC50：50％極大振幅に対応する濃度
最少値：ブランク±3x標準偏差値に対応する有意な増殖を誘発する最少濃度。
EC50および最少値に対応する濃度値は曲線の差位置の交差線セグメントから決定される。曲線がプラトー期を有せず、テストした最高濃度での傾斜形状を有する場合、記号「>」は最大値およびEC50値の前を示す。曲線がブランク±3x標準偏差値以下に下らない場合、最低濃度をテストした最少値の濃度値「<」とうして示した。
【０１６９】
4.2.2  結果
追加的な官能化側鎖スペーサを有するアシル化ジペプチド様化合物で誘導される骨髄幹細胞の増殖
図70は追加的な官能化側鎖スペーサの活性を示し、マウスの骨髄幹細胞増殖を誘発する能力における各種アシル・ジペプチド様化合物の影響を表している。
ある種のアシル−ジペプチド様化合物は、大腸菌LPSから成るポジティブ対照に比べてより大きな増殖を誘発できる。有意な増殖を誘発できる生成物の最少濃度はポジィティブ対照弟子用した濃度より高い。この生成物の最少濃度は使用した特定の追加的な官能化側鎖スペーサによって大きな影響を受ける。
図71は特定医薬に連結したアシル・ジペプチド様化合物の活性を示す。この活性は化合物がカップリングプロセスしたにもかかわらず、活性を示す証拠を提供する。固有活量と、菌体内エステラーゼによってエステル結合のカップリングをしたものとの活性を区別することできなかった。これら生成物の抗ウィルス活性はエステル結合が少なくとも部分的に開裂することを強く示唆している。いずれの機構にせよ、生物学的活性が保持されるので、抗ウィルス活性と生成物活性とを結合する十分なポテンシャルがある。
【０１７０】
【表３１】
2003518086.tif 000105
【０１７１】
短鎖を有する化合物以外の本発明の全てのアシル-ジペプチド様化合物は、有意な骨髄幹細胞増殖を誘発することができる。
実施例 4.3
本発明化合物で免疫したネズミマクロファージ細胞での一酸化窒素の産生
4.3.1  一酸化窒素産生の実験
6週齢の年取った雄のC57/BL6マウスをCO2吸入法で犠牲にする。股関節部、大腿骨、脛骨および後肢骨を除去する。端部分からダルベッコのModified Eagle Medium（DH培地）を注射して骨ルーメンから骨髄を取り出す。幹細胞を水で洗浄し、ウマの20％血清（SH）および30％ L929セル上澄みを加えたDH培地に再び懸濁させる。L929はネズミの繊維芽細胞系で、その上澄液はマクロファージ細胞（M-CSF）の成長因子を豊富に含む。細胞懸濁液をペトリ皿に分け、飽和湿度雰囲気下のインキュベータで8日間37℃で8％ CO2で培養する。8日後、幹細胞は成熟したマクロファージ細胞に分化する。急速冷却によってマクロファージ細胞をこすり落し、洗浄し、5％ウシ胎仔血清（FCS）、アミノ酸および抗生物質を追加したDH培地に再懸濁させた。細胞密度は700000 細胞/mlにした。
5％ FCS、アミノ酸および抗生物質を追加したDH培地に溶かした上記生成物を直接マイクロタイタープレートで連続的に希釈し、生成物を３回テストした。各マイクロタイタープレートは無地培地を含むネガティブ対照を有する。各ウエルの最終容積は100μlである。100μlの細胞懸濁液を生成物の希釈溶液に加え、8％ CO2および飽和湿度雰囲気下の37℃のインキュベータで22時間培養する。培養期間の終わりに100μlの上澄みを採り、Griess反応で亜硝酸エステル濃度を求めた。2.5％水リン酸中の100μlのグリース試薬（0.5mg/mlスルファニルアミド＋5mg/mlのN-(1-ナフチルエチレンジアミン塩酸塩）を各ウエルに加える。マイクロタイタープレートを分光光度計で562nm波長で測定し、対照サンプルに対しては690nmで読み取る。亜硝酸エステル濃度は形成された一酸化窒素含有量に比例する。亜硝酸エステル含有量は標準曲線を用いて決定する。結果は平均値±標準偏差として与えられ、投与量対応答曲線としてプロットした。この投与量対応答曲線から下記の3つの曲線プロセス変量を計算した：
最大値：曲線最大振幅および対応濃度
EC50：50％極大振幅に対応する濃度
最少値：ブランク±3x標準偏差値に対応する有意な増殖を誘発する最少濃度。
EC50および最少値に対応する濃度値は曲線の差位置の交差線セグメントから決定される。曲線がプラトー期を有せず、テストした最高濃度での傾斜形状を有する場合、記号「>」は最大値およびEC50値の前を示す。曲線がブランク±3x標準偏差値以下に下らない場合、最低濃度をテストした最少値の濃度値「<」として示した。
【０１７２】
4.3.2  結果
追加的な官能化側鎖スペーサを有するアシル化ジペプチド様化合物によって誘導されるネズミマクロファージ細胞による一酸化窒素産生
図72は各種のアシル−ジペプチド様化合物の活性を示し、ネズミの骨髄幹細胞の増殖を誘発する能力での追加的な官能化側鎖スペーサの影響を示す。OM-197-MP-AC（R/S（R））は大腸菌LPSから成るポジティブ対照に比べてより高い増殖応答を誘発できる。有意な増殖を誘発できる生成物の最少濃度はポジティブ対照濃度よりはるかに下である。アシルジペプチド様化合物を抗原投与したネズミのマクロファージ細胞によるNO産生は使用する追加的な官能化側鎖スペーサによって大きく影響される。図73は各医薬に連結したアシルジペプチド様化合物の活性を示す。この活性は共役ステップ後でも化合物が活性のままである証拠とみなされる。固有活量と菌体内エステラーゼによるエステル結合の共役で生じる活性とを区別することはできなかった。これらの生成物の抗ウィルス活性はエステル結合が少なくとも部分的に回裂したことを強く示唆している。基本的機構はともあれ、生物学的活性が保持されることは抗ウィルス活性と産生活性とを合せた医薬のポテンシャルを示している。
【０１７３】
【表３２】
2003518086.tif 000106
【０１７４】
短鎖を有する化合物（OM-197-N’(C10-2OC8)-MC-ACのマイナー産生）以外の本発明の全てのアシル-ジペプチド様化合物はネズミのマクロファージ細胞によって有意に一酸化窒素産生を誘発できる。
【０１７５】
実施例 4.4
樹状細胞の分化テスト
本発明の生成物の前樹状セルを樹状細胞への熟成を誘発する能力を調べた。以下のパラメータを測定した： FITC-Dextran接合体の取込みと、CD83（CD86表面マーカの発現。
4.4.1  実験方法
末梢血液の単核細胞を健康なドナーのバフィーコートから分離した。粘着精製で精製した単核細胞をウシ胎仔血清（FCS）、GM-CSFおよびIL-4（10ng/ml）を10％含むRPMI-1640培地に1×106セル/ml濃度で再懸濁させる。
細胞をペトリ皿に分け（１皿当たり10x 106セル）、6日間培養し、3日後にフレッシュな培地に変えた。得られた細胞を前樹状細胞（DC-6）とよぶ。この前樹状細胞を成熟した樹状細胞へ熟成させるために、生成物またはLPS（ポジティブ対照）の希釈溶液を3日間培養する（下記の生成物セクションを参照）。日9（DC-9）に細胞を収穫し、、樹状細胞の熟成を異なる化学指示薬：CD83アセスメント、CD86界面マーカー発現、FITC-Dextran接合体の取込み能で分析した。これらのパラメータは全てEPICS-XL-MCLモデルFACS（Coulter Immunology、Hialeah、フィンランド）で分析した。表面マーカの発現はLPS-活性化細胞（ポジティブ対照）の平均蛍光％として与えられる；FITC-Dextran接合体取込み割合は基本媒体に維持した細胞の取込み量を基に計算し、％で表した。
【０１７６】
生成物：
OM-197-MC、OM-197-FV6およびOM-197-MP-AC（R/S（R））の原液は0.9％ NaCl/水中に0.5mg/mlの濃度に調製された0.1％トリエタノールアミンを添加して作った。溶液を20分間、37℃で培養し、3分間の強力に撹拌した後、RPMI-1640培地に100マイクログラム/ミリリットルに希釈し、10マイクログラム/ミリリットルから0.03マイクログラム/ミリリットルまでの濃度で希釈して使用した。
参考化合物：
大腸菌リポポリサッカリド（LPS、DIFCO、デトロイト、MI、USA）の5mg/ml PBS原液。中間100マイクログラム/ミリリットル溶液はRPMI 1640培地に調整した。テストする希薄溶液の濃度は1マイクログラム/ミリリットルから0.03マイクログラム/ミリリットルにした。他の実験シリーズでは、全てのアシルジペプチド様化合物を凍結乾燥し、パイロージェン-フリーな水に直接再懸濁させた。。各生成物およびLPS対照は10マイクログラム/ミリリットルの濃度でテストした。結果はデキストラン・ファゴサイトーシスまたはCD86界面マーカー発現に必要な樹状細胞の％と平均蛍光値で示した。これらの結果は使用した生成物に応じて２〜６回の実験の平均値を表す。
【０１７７】
4.4.2  結果の分析
GM-CSFおよびIL-4の結合による単核細胞分化で生じる早熟な樹状細胞（DC-6）はFITC-Dextran接合体を取り入れることができる。成熟中、細胞はFITC-Dextran接合体を取り入れる能力を失う。DC-9 分化ステージに達した時にアッセーを実施した。
結果（図74）はベース媒体に培養した抗原投与してい細胞で観測されたFITC-Dextran接合体の取込み％で表した。LPSまたはOM-197-AC（R/S（R）で処理した細胞はそれぞれ食細胞能の15％および22％だけした保持しない。Dextran取込みを完全に低下させるには少なくとも1マイクログラム/ミリリットルのOM-197-MP-AC（R/S（R））が必要である点に留意する必要がある。食細胞能を22％減少させるには10マイクログラム/ミリリットルのOM-197-MCが必要である。LPSで同じ減少をさせると0.1マイクログラム/ミリリットルになる。さらに、濃度が3マイクログラム/ミリリットル以下ではOM-197-MCはファゴサイトーシスに影響しない。OM-197-FV6は樹状細胞の熟成に作用しないことはあきらかである。
共同刺激表面マーカの発現はDC熟成の他のアセス判定基準になる。CD83、CD86の発現をテストした（図75、図76）。結果はこれらマーカのLPS-起因性発現をベースにした平均蛍光％で表した。これらの結果はファゴサイトーシス研究から得られこものと完全に一致している。OM-197-MP-AC（R/S（R）は0.1マイクログラム/ミリリットル程度の低い表面マーカ濃度で発現の増加を誘発する。一方、OM-197-MCの場合には、CD83およびCD86マーカ―の発現には少なくとも1マイクログラム/ミリリットルが必要である。OM-197-FV6は樹状細胞を代表する表面マーカの発現に全く効果がない。
上記のデータはアシルージペプチド様化合物は選択した追加的な側鎖スペーサに従って大きく異なる行動をすることが示している。OM-197-MP-AC（R/S（R）は0.1マイクログラム/ミリリットルの低い濃度でDC-9細胞のDC-6細胞への分化を誘発する顕著な能力を有するが、OM-197-MCの場合には分化を始めるには1マイクログラム/ミリリットルを超える濃度が必要であり、OM-197-FV6はこの活性を全く欠いている。
【０１７８】
【表３３】
2003518086.tif 000107
【０１７９】
10マイクログラム/ミリリットルの濃度で多くのアシル・ジペプチド様化合物は前樹状細胞の樹状細胞への分化を誘発することができる。追加的な側鎖スペーサによって運ばれる官能基は前樹状細胞を活性化する能力を制御する。意訳に連結したアシル-ジペプチド様化合物OM-197-MC-AC-Succ-AZTは樹状細胞への分化を誘発する有意な能力を有する。アシル-ジペプチド様化合物を配合すに方法は前樹状細胞の樹状細胞への分化を誘発する能力に決定的な影響を及ぼす。所定生成物の活性はこの生成物が0.1％ TEOAの存在下または不存在下で溶けるか否かで大く変化する。
【０１８０】
実施例 4.5
樹状細胞でのMxA蛋白質の誘導分析
本発明化合物の前樹状細胞による抗ウイルス性MxA蛋白質の産生を誘発する能力を調べた。細胞によるMxA産生はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離後にウエスタンブロットで測定した。
4.5.1  実験手順
上記で得られたDC-6 Staged樹状細胞をαIFN（500U/ml）、LPS（1マイクログラム/ミリリットル）、TRANCE（100ng/ml）、CD40L（1マイクログラム/ミリリットル）、OM-197-MP-AC（1マイクログラム/ミリリットル）またはOM-197-FV6（1マイクログラム/ミリリットル）で48時間活性化した。蛋白の抽出および分析は以下のように実施した：細胞を収穫し、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で3回洗浄し、100Mmトリス-HCl緩衝液、150mM NaCl、5mM EDTA、1mM PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオライド）を含む1％ Triton-100および1μ/mlのプロテアーゼインヒビターとしてのペプスタチンでリゼする。溶解は60mMトリス-HCl（pH 6.8）、10％グリセリン、2％ SDS、14.4mM ２‐メルカプトエタノールおよび100μlの0.1％ブロムフェノールを含む（5x）緩衝液で細胞濃度106で実行した。サンプルを密封Eppendorf管で5分間95℃に加熱した。電気泳動は10cm×10cmの12％アクリルアミドミニゲルで同じ数の細胞を有するサンプルで実行した。マイグレーョンは以下の緩衝液で行った：25mMトリス、192mM glycine,0.1％ SDS、pH 8.3。
【０１８１】
ブロッティング：
蛋白をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルからニトロ細胞ロース膜へブロットした（ブロッティング緩衝液：25mMトリス、192mMグリシン、メタノールpH 8.3）
抗体インキュベーション：
ブロッティングはPonceau Redで膜を染色して示した。膜上の非特異的結合部位はTBS（10mMトリス-HCl、150Mm NaCl、pH 7.4）中の5％スキムミルクでブロックし、1時間室温に放置した。膜をTBS-0.1％ Tween 20で３回洗浄ふする。膜をTBS-ミルク中で予め100倍（vol/vol）に希釈した抗MxAモノクローナル抗体溶液（クローン143）で培養した。膜予め100倍（vol/vol）に希釈した第2のパーオキシダーゼ連結抗マウス抗体（HRP（Sigma））で培養した。膜をTBS-Tweenで３回洗浄した。MxAを含むバンドは化学的蛍光試薬（ECL（Amersham Pharmacia））で膜を培養して表示した。この系ではHRPは写真フィルムで検出可能なルミノール媒介化学的ルミネセンス反応を触媒する。
4.5.2  結果
DC-9細胞を0、2時間、4時間、24時間（図77）または48時間（図78）活性化した：
【０１８２】
【表３４】
2003518086.tif 000108
【０１８３】
図77、図78に示すウエスタンブロットは、MxAの時間-経過産生す：IL-197-AC5およびOM-197-FV6生成物によるMxA蛋白の２４時間（図77）後および48時間後（図78）の有意な誘導を示す。MxA産生はLPSポジティブ対照またはαIFNによって誘導されるものに匹敵し、ネガティブ対照によって誘導されるものより高い産生レベルを有し、TRANCE（樹状細胞の熟成を誘発するαTNFのファミリーに属するサイトカイン）またはCD40L（樹状細胞の熟成を促進する他の試剤）によってによって誘導されるものに匹敵する。本発明のOM-197-MP-ACおよびOM-197-FV6に従った化合物はMxA-蛋白産生を誘導するキャパシティによって抗ウイルス特性を示す。
【０１８４】
実施例 4.6
ヒト末梢血液の単核細胞によるαTNF産生の誘発での本発明化合物の能力
4.6.1  手順
末梢血液の単核細胞を6人の健康なドナーのバフィーコートから回収した。このバフィーコート細胞を再懸濁し、単核細胞はフィコール-Paque勾配（Amersham Pharmacia）で遠心分離した。精製された単核細胞は10％ FCS、抗生物質、メルカプトエタノールおよびL-グルタミンを補ったRPMI-1640培地に再懸濁した。菌体濃度は2×106成育可能細胞/mlにした。RPMI 1640培地中に100-、10-または1-倍に希釈した追加的な官能化側鎖スペーサを有するアシル・ジペプチド様化合物の溶液の各100μlをマイクロタイタープレートに入れた。各サンプルを３回テストし、各マイクロタイタープレートには生地培地から成るネガティブ対照を入れた。ポジティブ対照としては大腸菌LPS（1〜0.00001マイクログラム/ミリリットル）を使用した。100μlの細胞懸濁液を生成物希薄溶液または対照を含む各ウエルに加えた。5％ CO2および飽和湿度雰囲気下のインキュベータで生成物を18時間、37℃で細胞培養した。培養期間の終わりにマイクロタイタープレートを遠心分離し、上澄液を合わせ、-80℃でアリコートとしてELISA検定時間まで凍結した。
単核細胞によって分泌されるαTNFの濃度は化学的蛍光ELISA（QuantiGlo #QTA00研究開発キット）で決定した。4倍に希釈した上澄の液を抗-αTNF抗体が結合したマイクロタイタープレートの各ウエルに入れる。マイクロタイタープレートを4時間室温で培養する。洗浄後、パーオキシダーゼ-共役された抗-ヒトαTNF抗体を加える。2時間培養後、完全に水洗し、化学的蛍光基質を加え、20分後に化学的蛍光を読む。上澄液のαTNF含有量は7000〜0.7pg/mlの範囲をカバーする標準曲線で決定する。結果は得られたαTNFのpg/mlで表される。結果はアシル-ジペプチド様化合物活性の代表的実験から得られた。
4.6.2  結果
一般式Iに対応する追加的な官能化側鎖スペーサを有すアシル化ジペプチド様化合物で誘導された末梢血液単核細胞によるαTNFの産生。
【０１８５】
【表３５】
2003518086.tif 000109
【０１８６】
RPMI培地から成るネガティブ対照はベースライン（0.7mg/mlのテスト感度レベル以下）のαTNFの産生を誘発した。
【０１８７】
【表３６】
2003518086.tif 000110
【０１８８】
大腸菌LPSのポジティブ対照はテストした最も低い濃度でもαTNFを高い生産率で産生した。大部分のアシルージペプチド様化合物はポジティブ対照で見られるものより低い産生レベルであるがαTNFを実質的に誘導する。LPSに関しては実質的なαTNFの産生を誘導するためにはより大きい濃度が必要である。OM-197-MCおよびOM-197-MC-MPのような化合物は100マイクログラム/ミリリットルの濃度でも有意な産生レベルを示すことが確認されている。一方、振幅を増やし、実質的な産生を誘導するのに必要な最少生成物濃度を減らした場合のようにアミン官能基はαTNFの産生に特に重要である。短鎖アシル-ジペプチド様化合物OM-197-N'C2-MC-ACおよびOM-197-N’(C10-20C8)-MC-ACは100マイクログラム/ミリリットルの濃度でもαTNFの産生を誘導しない。
【０１８９】
実施例 4.7
大腸菌リポポリサッカリド（LPS）により誘導されるヒト末梢血液単核細胞のαTNF産生の抑制に対する本発明化合物の能力の測定
4.7.1  手順
6人の健康なドナーのバフィーコートから末梢血液の単核細胞を回収した。このバフィーコート細胞を再懸濁し、単核細胞をフィコール-Paque勾配遠心分離（Amersham Pharmacia）で分離した。精製した単核細胞を10％ FCS、抗生物質、メルカプトエタノールおよびL-glutamineを補ったRPMI-1640培地に再懸濁した。菌体濃度は2×106成育可能細胞/mlにした。生成物をこの単核細胞で予備培養し、1時間後にαTFNを産生可能な連続的に希釈したLPSの溶液を加えて、生成物が介在する阻害を決定した。追加的な官能化側鎖スペーサを有する各種アシル・ジペプチド様生成物の抑制濃度は10マイクログラム/ミリリットルであることかわかった。大腸菌LPSは1〜0.00001マイクログラム/ミリリットルの範囲で連続的に希釈した（10倍希釈）。
RPMI 1640培地中の50μlの10マイクログラム/ミリリットル希釈生成物の溶液をマイクロタイタープレートに入れ、各アッセイ（生成物濃度10マイクログラム/ミリリットル＋大腸菌LPS）を３回行った。各マイクロタイタープレートは生地培地から成るネガティブ対照を含む。LPS-誘導αTNFの産生（インヒビターなし）は大腸菌LPS希釈ものをRPMI培地に加えて決定した。100μlの細胞懸濁液を生成物または対照の希釈液を含む各ウエルに加えた。細胞生成物は5％ CO2の飽和湿度雰囲気下のインキュベータで1時間、37℃で培養した。プレインキュベーション期間の終わりに大腸菌LPSの希釈溶液の50μlを連続的に加えた。生成物およびLPSと単核細胞の培養を18時間続けた。細胞活性化期間の終わりにマイクロタイタープレートを遠心分離し、上澄みを集め、ELISAアッセイ時までアリコートで-80℃で凍結した。
単核細胞によって分泌されたαTNF濃度は化学蛍光ELISA（QuantiGlo #QTA00研究開発キット）で決定した。上澄み液の4-倍希釈物を各々にマイクロタイタープレートのウエルに入れ、抗ヒトαTNF抗体を結合した。マイクロタイタープレートを4時間室温で培養し、洗浄し、パーオキシターゼ-共役抗-ヒトαTNF抗体を加える。2時間培し、完全に水洗し、化学蛍光基質を加え、20分後に化学蛍光を読む。上澄液のαTNF含有量は7000〜0.7pg/mlの範囲をカバーしている。共培養中のαTNFの50％産生を誘導する大腸菌LPS濃度で決定される阻害性をRPMIだけを含む対照と比較した標準曲線で特徴づける。この濃度は産生物阻害活性が強くなる程増加する。αTNF産生の阻害値かち、この濃度は100−（生成物およびLPSによるαTNF産生）/（LPSのみによるαTNF産生）*100で計算される。これらの阻害データから約50％阻害を与え２つのLPS希釈の交わる線セグメントに沿って濃度を線形回帰で決定する。LPSに応答する生成物の単核細胞のαTNF産生を抑制する能力は極大阻害によっても特徴づけられる。この最大阻害レベル（阻害> 95％）に対応するLPS濃度も生成物阻害能力を表す。結果は全ての生成物を用た代表実験から計算した。
【０１９０】
4.7.2  結果
【表３７】
2003518086.tif 000111
ベースラインαTNF産生を誘発したRPMI培地から成るネガティブ対照はテスト感度レベル以下の0.7mg/ml
【０１９１】
全てのアシル-ジペプチド様化合物は大腸菌LPSに応答してTNF産生の阻害を誘発することができる。この阻害に必要な生成物濃度は追加的な官能化側鎖スペーサと脂肪酸鎖の長さに依存する。エステル結合を介して意訳に結合したアシルージペプチド様化合物でも上記の阻害を誘発できる。
【０１９２】
実施例 4.8
K562細胞系標的細胞に対するNK細胞細胞毒性活性での本発明化合物の能力の測定
4.8.1  手順
実施例4.6に記載の手順に従ってバフィーコートからPBMCを回収した。簡単にいうと、フィコール勾配遠心と3回の水洗後に、10％ FCSを含む3mlのRPMIに3×106細胞/mlの濃度でPBMCを6-ウエルプレートに分け、単独で培地するか、γIFN（1000U/ml）、LPS（1マイクログラム/ミリリットル）、OM-197-AC5（1マイクログラム/ミリリットル）またはOM-197-FV6（1マイクログラム/ミリリットル）で刺激培養した。この条件で細胞を24時間培養した。K562細胞（ヒト白血病細胞線、ATCC #CCL 243、20110-2209、Manassas、VA、米国）は10％ FCSを含むPMI培地を使用してカルチャーで維持し１週で２世代継続させた。細胞毒性を測定するために、PBMCおよびK562細胞をHBSSで２回正常し、5％ FCSを含むフェノールレッド-free RPMI培地に再懸濁した。PBMCをに丸底96-ウエルに分け、50μl容積でPBMC/ターゲット比を20/1、10/1および5/1にした。5000K562細胞（ターゲット）は50μlのフェノールレッド-free RPMIを使用して各ウエルに加える。最終容積は100μlであった。細胞接触を促進するために遠心分離し、プレート4時間37℃で培養する。
細胞毒性は非放射性CytoTox 96キットを使用してメーカに指示に従って溶菌中に放出されたLDHを測定して分析した（キット#G1780、バッチ# 124100、Promega、マディソン、WI）。細胞毒性の百分比は以下の式に従って計算した：
【０１９３】
【化７９】
2003518086.tif 000112
【０１９４】
4.8.2  結果
【表３８】
2003518086.tif 000113
【０１９５】
実施例 4.9
マウスのリンパ球増殖誘発での本発明化合物の能力
4.9.1  実験方法
一群の4つのCBAマウスから得た脾臓細胞をプールし、OM-197-MP-ACアジュバント（0.1〜10マイクログラム/ミリリットル）の存在したまたは不存在下で４回培養した。1または2日間培養した後、トリチウムチミジン（3H-TdR）テークアップを測定して細胞増殖レスポンスをアッセイした。表に示した値は4つの培養の算術平均＋標準偏差である。
アジュバント：
0.1％トリエタノールアミンを加えたOM-197-MP-AC原液を水中に0.9mg/mlの濃度で含む注射用に調製。
結果
OM-197-MP-AC生成物は脾臓細胞増殖をインビトロで誘発する。この効果は1日の培養後にピーク・レベルでを見られ、1μg/ml濃度でチミジン・テークアップは5倍増加し、10マイクログラム/ミリリットル濃度でチミジン・テークアップは12倍増加する。OM-197-MP-AC生成物は１日の培養で、1マイクログラム/ミリリットル濃度でConcanavalin Aと同じ5マイクログラム/ミリリットルの大きなミトーゲン効果を出す（表1を参照）。
【０１９６】
【表３９】
2003518086.tif 000114
【０１９７】
上記の表に報告したデータは４回の培養の取り込み測定値の平均＋SDである。ポジティブ対照として使用したconcanavaline A（5マイクログラム/ミリリットル）では1日の培養後、37.5±6.2×103cpmのチミジン取り込み量であった。
【０１９８】
実施例 4.10
AZTおよびd4Tに対するプロドラッグとしての本発明化合物の接合体の抗ウィルス活性の測定
4.10.1  手順
白血病の1つの形と関連があるウィルスの、HTLV感染によって持続性細胞株にトランスホームしたT MT-4リンパ球cekk株を用いて本発明ののAZT-およびd4T-共役化合物の抗ウィルス活性（反HIV）をテストした。この細胞の特長は、HIV感染症で生存できないことにある。このテストはこのウイルスの破壊的な効果に対して生成物（AZT等）が示す保護をベースにしている。
各生成物を96-ウエルプレートで希釈溶液で連続的にテストした。マイクロプレートの上部で細胞およびウィルスを各種濃度で培養してテスト（３回）してウイルスの破壊的な効果に対する細胞を保護するための生成物濃度を決定した。生菌数の50％減量が記録された濃度を生成物のIC50とした。生菌数は酵素還元（生菌細胞中のミトコンドリアレベル）で黄色のテトラゾリウム化合物が紫色のホルマザン化合物になるMTTで計測した。生菌を含むウエルは紫色になり、死んだ細胞は黄色のままである。光学密度（O.D.）の測定でこの効果が定量化できる。
同様に、各生成物の細胞毒性をプレートの低部でアセスした。このテストではウィルス-を含まない細胞上で連続的に希釈した生成物を培養し、細胞での生成物の中毒作用を決定した。結果はCC50すなわち50％の細胞が生成物の毒性で死ぬ濃度で与えられる。各生成物の選択性（選択指数（SI））はCC50/IC50比で定義される。効率的な生成物の選択指数は高いので、このパラメータは非常に重要である。
【０１９９】
4.10.2  結果
【表４０】
2003518086.tif 000115
【０２００】
AZTまたはd4T-共役した本発明化合物はMT-4細胞モデルで抗ウィルス活性を表した。この種のプロドラッグの1つの効果は、接合体がウィルス保持者に抗ウイルス医薬を放出し、ターゲット細胞の免疫学的活性を制御する能力によって感染細胞に化合物をターゲット投与できる脂質構造を有する点にある。
【０２０１】
実施例 4.11
樹状細胞にネズミの前樹状細胞の熟成の活性化での本発明化合物の能力
4.11.1  手順
樹状細胞の入手
マウス（C57BI/6、6〜8週齢）の大腿骨および脛骨から骨髄を吸引した。骨髄懸濁液を70マイクロメートル細胞篩でスクリーニングして単一細胞浮遊液を得る。骨髄細胞を10％の不活化ウシ胎仔血清（iFCS）と抗生物質とを補ったIsocoveの修正ダルベッコ培地（IMDM）に再懸濁させた。細胞を6-ウエルマイクロタイタープレートでCO2および飽和湿度雰囲気下で37℃で一晩培養した。次の日（日0）に付着しない細胞を集め、洗浄し、生菌をトリパンブルー色素排除テストで係数した。菌体濃度は20ng/mlのネズミの組換え型GM-CSFおよび20ng/mlのネズミの組換え型IL-4（rmIL-4）を含むIMDM中に2×105細胞/mlに合わせた。プレートを更に培養した。第3日に新たに作成したmGM-CSFおよびrmIL-4を10ng/ml濃度で加えた。第6日に付着しない細胞を集め、
正常し、トリパンブルー染料で数えた。菌体濃度は10ng/mlのrmGM-CSFおよびrmIL-4を含むIMDM中で2×105細胞/mlに合わせた。プレートを更に培養した。第8日に成熟および早熟な樹状細胞（CD-DM）から成る付着細胞を集め、生成物共培養実験で使用した。
本発明化合物を用いた培養：
以下の活性化因子（マイクログラム/ミリリットルの濃度）の存在下で24-ウエルマイクロタイタープレートで5x105細胞/mlの濃度でCD-DMを培養した：ポジティブ対照としてのEsherichia大腸菌株0111：B4 LPS；ネガティブ対照としてのIMDMおよび本発明の2つの化合物：0.1、1およびOM-197-MC-FV5およびOM-197-PM-AC10。48時間培養後、細胞を集め、フローサイトメトリ分析のために保存した。
Flow血球分析
CD-DMを2％ iFCSそして、0.01％アジ化ナトリウムを含むPBS（FACS緩衝液）で洗浄し、細胞を抗CD86抗体、抗CD40抗体、FITC共役抗MCHII抗体およびパーオキシダーゼ共役抗CD80抗体の最適濃度で30分間の氷中で培養した。細胞を３回洗浄した。抗CD86および抗CD40抗体の標識付けはパーオキシダーゼ-共役しロバ抗ラット・イムノグロブリンで30分間、氷上で細胞を培養して行った。培養後、細胞を洗浄し、FACS培地に再懸濁した。蛍光をFACScan（登録商標）フローサイトメトリを用いて測定した。各サンプルで15000パルスのイベントを分析した。ネガティブ対照としては接合体単独で培養した細胞を使用した。
【０２０２】
4.11.2  結果
細胞の発現
【表４１】
2003518086.tif 000116
【０２０３】
本発明生成物は樹状細胞に前樹状細胞の熟成を誘発できる。インビトロで得られたこれらの結果はマウスでのインビボの観測と一致している。すなわち、OM-197-MP-ACを、各ハツカネズミに20μgおよび5μgの濃度でi.v.およびs.c.投与すると脾臓への樹状細胞の熟成および移行、辺縁帯（赤と白のパルプの間に位置）からＴ細胞が見られる白色脾髄への移行が誘導される。本発明生成物で処理した動物の脾臓から取出した組織スランドの免疫染色からLPS処理で見られる成熟樹状細胞および白い皮質のＴ細胞の共局在化が明らかになる。未処置の動物では移行および熟成は観測されない。
【０２０４】
第5シリーズの実施例
本発明化合物の薬理学的研究（インビトロ）
実施例 5.1
ネズミの免疫モデルでの（NANP)6P2P30に結合またはそれと混合した追加的な官能化側鎖スペーサを有するジペプチド様化合物の性質評価
5.1.1  実験手順
抗原：
（NANP）6P2P30ペプチドはPlasmodium falciparumのリカレント（NANP）配列および2つのテタヌストキシンの配列（P2：830−843およびP30：947−967）とから成る。このペプチドはTヘルパーエピトープとして公知で、一般的アジュバントの存在下で強い持続性免疫応答を誘導する能力を有する。この種のペプチドは文献Valmoriほか、1992、J. Imμnol.、149：717−721）に開示の方法に従って合成して得た。抗原原液は0.9％ NaCl /水混合液の0.4mg/ml濃度、pH 8.0に調製した。
アジュバント：
ジペプチド様化合物（OM-197-MP、OM-197-FV6およびOM-197-MC）の原液は0.1％トリエタノールアミンを加えた0.9％ NaCl-水中に1mg/mlの濃度で調製した。ポジティブ対照は0.9％ NaCl/水溶液であり、ネガティブ対照は不完全フロイントアジュバンド（Difco、デトロイト、MI、USAからIFA）から成る。この実験的手順の全体で、抗原およびアジュバントは上記混合物または接合体の形で配合した。2種類の接合体（OM-197-FV）n-(NANP)6P2P30をテストした。この生成物の共役は一つのペプチド分子にOM-197-FVの１、2、3つの分子がみられるように（単共役-、二共役-および三共役体（ = 1 2、3）の混合物）すなわち1つのペプチド分子に1つのOM-197-FV分子が見られる（単共役（n = 1）となるように変えた。
免疫化：
6週齢の雌のBALB/cマウス（１グループ6匹のマウス）に0.1mlを尻尾の反歩から皮下注射で二回免疫化した。投与量は最初の注射で50μgのアジュバントを加えた20μgの抗原および第2の注射で50μgのアジュバントを加えた10μgの抗原である。接合体の場合には、抗原部分は注射量を決定する際に重要である。
実験群のリスト：
【０２０５】
【表４２】
2003518086.tif 000117
【０２０６】
【表４３】
免疫化方法とサンプリング法：
2003518086.tif 000118
採血：
血清準備：
採血は週0及び10μgの5に実施した。血液60分間37℃に維持した後、血清を−80℃で冷凍し、抗体検定時に4℃で一晩放置した。
【０２０７】
5.1.2  抗(NANP)6P2P30免疫グロブリンG抗体価の決定
（NANP)6P2P30抗原に特異的なＩｇＧ抗体の分析はELISAで行った。抗原の結合は96-ウエルマイクロタイタープレート（Maxisorp F96、Nunc、DK）で4℃で湿った室で一晩培養して行った。各ウエルには0.001mg/mlの（NANP)6P2P30抗原を含む0.1mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）を入れた。マイクロタイタープレートのブロッキングは1％のウシ血清アルブミン（BSA、Fluka、スイス）を含むPBSで実行した。プレートは0.05％ Tween 20（シグマ、セントルイス、MO、USA）を含むPBSで洗浄した。5週間に集めた血清サンプルを希釈緩衝液（2.5％のスキムミルク粉末および0.05％のTween 20を含むPBS）で連続的に希釈し、マイクロタイタープレートに送り、1時間間室温（ＲＴ）に放置した。それからプレートをPBSで洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ（シグマ、セントルイス、MO、USA）に連結したハツカネズミポリクローンの抗免疫グロブリンG抗体の希薄溶液を上記プレートに入れ、1時間室温で培養した。プレートをPBSで洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ基質（p-ニトロフェニルリン酸（シグマ、セントルイス、MO、USA）を添加する呈色反応によって特異的抗体を明らかにした。405nmでの吸光指数をマイクロタイタープレート測定器（Dynatech 25000  ELISA測定器、アッシュフォード、ミドルセックス、UK）で読み、各血清サンプルは二回測定した。結果は各グループのマウスに対する405nmでの全吸光指数測定値の平均を表す。
【０２０８】
5.1.3  結果
特異的応答
マウスに1、2、3回投与した免疫注射しは場合のELISAで測定した（NANP)6P2P30抗原に対する特異的ＩｇＧ抗体の産生を視覚的に示した（図79）。抗原＋アジュバント混合物（OM-197-FVまたはOM-197-MC）の2つの注射は、単独で抗原注射した時に比べて大きな血清学的応答を誘導することが観測される。単共役OM-197-FV-（NANP)6P2P30 での免疫化は抗原＋OM-197-FV6混合物で得られるものよりわずかに大きなＩｇＧ応答を誘導する。より高い共役（OM-197-FV）1、2、3-（NANP)6P2P30にしてもこの抗原に対する血清学的応答は改善しない。OM-197-MPアジュバントとOM-197-FV-（NANP)6P2P30単共役とを含む混合物はこの抗原に対して（NANP)6P2P30＋IFAから成るポジティブ対照で得られる値よりかなり高い血清学的応答を示す。同様な結果は抗原としてのNANP)6NAペプチド抗体を使用したELISAでも得られる（図80）。
【０２０９】
実施例 5.2
オボアルブミン免疫化基：1回または2回の皮下注射後にマウスに生じる特異抗体の測定
5.2.1  実験方法
この研究の目的はアジュバント＋抗原混合物（OM-197-MP＋オボアルブミン）と同じ抗原（OM-197-FV-ovalbumin）をベースにした接合体の注射で誘導される結成応答性を比較することにある。そのために30匹のBALB/cマウス（処理初めに8週の雌）を次の3つのグループに分けた：
【０２１０】
【表４４】
2003518086.tif 000119
【０２１１】
溶液：
グループＡ：抗原（オボアルブミン、Fluka社、Buchs、スイス）だけの原液をH2O＋0.01％チオメルサール中に125マイクログラム/ミリリットルの濃度で調整。
グループＢ：抗原＋アジュバント混合物（オボアルブミン＋OM-197-MP）の原液をH2O＋0.01％チオメルサール中に125マイクログラム/ミリリットルの濃度で調整。
グループC： OM-197-FV-オボアルブミン共役原液をH2O＋0.01％チオメルサール中に125マイクログラム/ミリリットルの蛋白濃度で調整。
注射溶液の製造：
各原液を15分間37℃で培養し、各溶液にNaCl（14％）の適切容積を系統的に加えて等浸圧液（0.9％ NaCl）を得る。全部の混合物を3分間攪拌する。
免疫化：
日0および日14に注射する。溶液を皮下投与する（2つの異なる場所に100μl、合計200μl／動物）。日14および。日28に採血（レトロなオービタル穿刺）。
抗オボアルブミン免疫アッセイ：
オボアルブミンに特異的な以下の血清グロブリンをELISAで２回分析した：
IgG1、IgG2aおよびIgG M。簡単にいうと、マイクロタイタープレート（NUNC 免疫プレート、Roskilde、DK）を4℃で重炭酸塩緩衝液、pH 9.6中で100μlオボアルブミン（0.5μg）と共に培養した（一晩コーティング）。0.5％ Tween-20（メルクHohenbrunn（D））で洗浄後、血清を50-、200-および800-倍に希釈した（希釈溶液：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1％＋ウシ血清アルブミン（BSA、Sigma、セントルイス、MO、USA）＋0.02％Tween-20）。100μlの各希釈血清サンプルをウエルに加え、45分、37℃で培養した。
第2回洗浄後、オボアルブミン特異的なIgG1、IgG2aおよびIgG Mを予めPBS/BSA/Tween緩衝液で250-、1000-、500倍に希釈した100μlの抗反IgG1抗体（抗マウス・ラット抗体）-パーオキシダーゼ接合体（Serotec、オックスフォード、UK）、IgG2a-パーオキシダーe接合体（Pharmingen、サンディエゴ、CA、USA）およびIgG M-ビオチン複合体（Pharmingen、サンディエゴ、CA、USA））と一緒に30分間37℃で培養した。IgG Mでは、洗浄後に1：100ストレプトアビジン-パーオキシダーゼ接合体（Dako、Glostrup、DK）の希薄溶液で第3の培養（37℃での30分）が必要だった。
洗浄後、100μlのフェニレン1,2-ジアミン溶液（OPD、メルク、ダルムシュタット、GFR）を加え、パーオキシダーゼ-連結した抗IgG1二次抗体を検出した。IgG2aおよびIgG Mの場合には試薬3‘，3’，5’，5’−テトラメチルベンジディン（TMB、Sigma、セントルイス、MO、USA）を使用した。室温で20分培養後、100μlの2N H2SO4を加えて反応を停止した。吸光指数値はBio-Rad 3550モデルのプレート測定器で490nmで読んだ。
【０２１２】
5.2.2  結果
各490nmでの測定結果はml当たりの任意単位（A.U.）で与えられる。これはグループAから28日に（オボアルブミン単独を注射した動物）に集めたサンプルのプールの各希釈から調製した各サンプルを標準試料と比較して行う。すなわち、50-倍に希釈したサンプルのプールは1000A.U./mlの濃度である。得られた結果を対応する希釈比（50-、200-または800-倍）で訂正し、図81、82および83に示す。中空の丸は14日の平均値に対応し、黒丸は28日の平均値に対応し、楕円はオボアルブミンを表す。この結果はOM-137-FV-オボアルブミン接合体が本モデルの特に効果的な免疫原であることを示す。すなわち、分析した免疫グロブリンサブクラス（IgG1、IgG2aおよびIgG M）にかかわりなく、第2回注射後にマウスのオボアルブミンに対する特異抗体のタイターが増加する。特に、抗オボアルブミンIgG2a（図84）の著しい増加が見られ、TH1免疫反応を示唆している。オボアルブミン＋OM-197-MP非共有結合性混合物は接合体で見られるようてIgG2a応答より低い応答を示す。
【０２１３】
実施例 5.3
H1N1 血液凝固免疫基：1回または2回の皮下注射後にマウスに生じる特異抗体の測定
5.3.1  実験
この研究ではアジュバント＋抗原混合物（OM-197＋H1N1）を注射することによって誘導される血清応答性を同じ抗原（OM-197-FV-H1N1）をベースにした接合体と比較する。そのために、30匹のBALB/cマウス（処理の初めに8週齢の雌を次の３グループに分けた：
【０２１４】
【表４５】
2003518086.tif 000120
【０２１５】
5.3.2  注射溶液の調整
グループＡ：H1N1（A/Beijing 262/95血球凝集素、ソルベーDuphar、Weesp、NL）をH2O中に25マイクログラム/ミリリットルの濃度で調製した原液。
グループＢ：H2O中に25マイクログラム/ミリリットルの濃度のH1N1と500マイクログラム/ミリリットルのOM-197-MPとを含むH1N1＋OM-197-MP原液
は、H1N1の25マイクログラム/ミリリットルおよびむ。
グロープC：H2O中に25マイクログラム/ミリリットルの濃度で含むOM-197-FV-H1N1（OM-197-FVに共有結合したH1N1）の原液
各原液を15分間37℃で培養し2mlの各溶液に135μlのNaCl（14％）を加える。全ての混合物は3分間攪拌した。
【０２１６】
5.3.3  注射と抗H1N1免疫グロブリンアッセイ
注射は日0および日14に行った。溶液は皮下投与（異なる２つの場所に50μl、合計100μl／動物）。採血は日14（レトロなオービタル穿刺）に行う。H1N1に特異なIgG M抗体をELISAで２回アッセイした。簡単にいうと重炭酸塩緩衝液（pH 9.6）中で100μlの H1N1（0.5μg）を入れたマイクロタイタープレート（NUNC Imμnoplate、Roskilde、DK）を4℃で培養する（一晩コーティング）。0.5％ Tween-20（メルクHohenbrunn（D））で洗浄後、血清を50-、200-および800-倍に希釈する（希釈溶液：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1％＋ウシ血清アルブミン（BSA、Sigma、セントルイス、MO、USA）0.02％＋トウィン-20））。100μlの各希釈血清サンプルをウエルに加え、45分、37℃で培養する。
第2回の洗浄後、予めTween緩衝液で希釈した（500倍希釈）100μlの抗IgG M抗体（ラット抗マウス抗体）-ウシ接合体（Pharmingen、サンディエゴ、CA、USAと一緒にH1N1特異的IgG Mを30分間37℃で培養する。さらに洗浄後、1：100ストレプトアビジン-パーオキシダーゼ接合体（Dako、Glostrup、DK）の希薄溶液手第3の培養が必要である（37℃での30分）。洗浄後、100μlの3’，3’，5’，5’−テトラメチルベンジディン溶液（TMB、Sigma、セントルイス、MO、USA）を加えて、パーオキシダーゼ-連結した抗IgG M二次抗体を検出する。室温で20分培養した後、100μlの 2N H2SO4を加えて反応を停止させる。吸光指数値はBio-Rad 3550モズルのプレート測定器をで490nmで読む。
【０２１７】
5.3.4  結果
490nmで測定した各結果１ml当たりの任意単位（A.U.）で与えられる。これは各サンプルをグルロプA（H1N1のみを注射した動物）から28日に集めたサンプル・プールの各希釈物から調製される基準と比較して行う。従って、50-倍のサンプル・プール希釈物は1000A.U./ml濃度であることを意味する。各結果は対応する希釈比（50、200または800-倍）で修正する。図84に示す黒丸は28日の平均値に対応する。OM-197-FV-H1N1接合体で免疫化したマウスは抗H1N1 H1N1抗原のみおよびOM-197-MP＋H1N1混合物から成る対照より大きなIgG M抗体価を示す。
【０２１８】
実施例  5.4
レイシルニア（Leishmania）LmCPb抗原の皮下投与によるハツカネズミ免疫化モデルのOM-294-MP-ACアジュバントの特性評価
5.4.1  実験方法
CBAマウスに尻尾からLeishmania寄生LmCPb抗原（3μg／ハツカネズミ）＋アジュバントを単一皮下注射（100μl）した。各6匹のマウスからなる2つのグループを形成し、以下の投与を行う：抗原だけ（対照群）および抗原＋50μg OM-197-MP-AC。注射後11日に鼠径部および大動脈周囲のリンパ節細胞（2つのグループの各3匹のマウス）を精製LmCPb抗原または寄生（アマスチゴート）の全抽出物の存在下で３回培養した。日4に上澄サンプルを採り、IL-4およびIFNアッセイのために-20℃で保存した。最後に、トリチウムチミジン（3H-TdR）を加えて培養し、増殖反応を測定した。
サイトカインアッセイはサンドイッチELISA検定（OptEIA(キット（γIFNおよびIL-4（BD）PharMingen、バーゼル、スイス）で実行し、増殖応答はチミジン・テークアップ（3H-TdR）の測定で決定した。3H-TdRテークアップは算術平均値＋標準偏差（3匹のマウスで8つのプール）として与えられるcpmで表し、pg/mlで与えられるIL-4濃度は2回の測定（サイトカインアッセイ）の算術平均として3匹のマウスの各プールで個別に表した。
抗原：
LmCPb原液は、PBSの150マイクログラム/ミリリットルの濃度で調製した。
アジュバント：
OM-294-MP-ACの原液は注射用に0.1％トリエタノールアミンを添加した水中に0.9mg/ mlの濃度で調製した。
抗原−アジュバント混合物：
無菌PBS中に適切な最終濃度に合わせらアジュバント調節物（4容積）は注射の直前に抗原原液（1容積）と混合する。
【０２１９】
5.4.2  結果
レイシルニア（Leishmania）LmCPb抗原で免疫化したCBAマウスではOM-197-MP-ACを50μgの投与量で一回投与するだけで、精製抗原（0.6〜15マイクログラム/ミリリットル）またはアマスチゴート・ステージ寄生の全抽出物（2〜50x 10-6/ml）に応答するインビトロで測定したものに対してリンパ節細胞の増殖を増加（２〜6倍）させるのにに十分である。これらの結果は表1に報告した。さらに、マウスをOM-197-MC-ACで処理すると、寄生抗原を投与したリンパ節細胞培養の上澄液中に相当量のIL-4が見られる（表2を参照）。γIFNの産生は検出されない（< 100pg/ml）。
【０２２０】
【表４６】
2003518086.tif 000121
【０２２１】
この表に記載の各値はリンパ節の2つのプールで測定した取り込み量の算術平均＋標準偏差を表す（各プール当たり3匹マウス；各プールを３培養）
【０２２２】
【表４７】
2003518086.tif 000122
【０２２３】
この表に記載の各値はリンパ節細胞の上澄み液の2つのプールで実施した2つのサイトカイン測定値の算術平均＋標準偏差を表す（ａ、b；１プール当たり３匹のマウス）。３回培養。
結論
OM-294-MP-ACアジュバントは、インビトロリンパ球増殖アッセイで示すように、LmCPb（Leishmania寄生アマスチゴートステージ時の多量のプロテアーゼ）で免疫化したCBAマウスのインビトT応答を強化する。さらに、このアジュバントは抗LmCPbリンパ球の開発を促進し、相当量のIL-4を分泌する。
【０２２４】
実施例 5.5
プラスモジウム（Plasmodium yoelii）（PyCS-252-260）からの合成ペプチドに結合または混合した追加的な官能化側鎖スペーサを有するアシル化ジペプチド様化合物のネズミの免疫化モデルでの評価
この実験の目的は、追加的な側鎖スペーサを有するアシル・ジペプチド様化合物がPlasmodium yoelliのcircumsporozoite蛋白からのPyCS 252-260合成ペプチドとグラフトまたは混合した時にこのペプチドに対して液性または細胞免疫応答を誘導する能力を評価することにある。
【０２２５】
5.5.1  実験方法
アジュバントと抗原の調整：
Plasmodium yoelliのcircumsporozoite蛋白のＴ細胞エピトープに対応する合成ペプチドPyCS 252-260は以下の配列SYVPSAEIQ（表1）を有する。ペプチド2のMR99B（SERSYVPSAEIQ）はＮ末端にSERアミノ酸を加えて得られ、ペプチド1のMR99A（KGGKGGKSERSYVPSAEIQ）は上記MR99BペプチドのＮ末端にリシン-グリシン・グリシン・アミノ酸を加えて得られる。これらのペプチドは、固相合成で得られる（Bachem Feinchemikallien（Buddendorf、スイス、Novabiochem、Laufelfingen、スイス）およびFluka、Buchs、スイス）から購入した試薬および溶剤を使用してMerrifieldおよびアサトン合方法（Atherton wt al、Bioorg Chem.、8：350−351、1979）によるF-moc）。ペプチドは逆相HPLCで精製した。
追加的な側鎖スペーサを有するアシル・ジペプチド様化合物との物−およびポリペプチド接合体（OM-197-MC-FV)4ペプチドは実施例3.6に記載の方法[OM-197-MC-FV]および実施例3.5に記載の方法（OM-197-MC-FV-ペプチド 2）で得た。ペプチド接合体の最終無菌液は凍結乾燥した。
ハツカネズミ免疫化：
抗原投与量は20μgのペプチド2をハツカネズミに１回注射する量に対応する（表2）注射前に凍結調合品を0.9％ NaClにいれ、3分間攪拌し、50℃で10分間攪拌する。IFAを入れた配合物は1容積のアジュバントに1容積の抗原（PBS中に14.5μg のペプチドPyCS 252-260＋50μgのP30（ユニバーサルＴ細胞エピトープ）を加えて調製した。4週齢のBALB/cマウス（ハーラン、Zeist、NL）の後尾に1回皮下注射した。公式化は23’を注射し、最終的な容積はゲージ針で50μlを使用した。各動物には第5週に第2の抗原注射をし、第9週に第3の注射をした。
【０２２６】
【表４８】
2003518086.tif 000123
【０２２７】
【表４９】
2003518086.tif 000124
【０２２８】
リンパ器官および採血：
血清サンプリング：
採血は全てのマウスで7週および11週以後実行した。血液6分間37℃に放置し、一晩4℃に保つ。血清は抗体検定時まで-80℃で凍結する。
鼠径部リンパ節および脾臓の回収：
各グループに属する2匹の動物を7週および11週後に犠牲にし、鼠径部リンパ節および脾臓を外科的に取り、細胞をELISPOTによってCTL活性を分析するために培養する。
抗ペプチド1抗体価の測定：
ペプチド1（KGGKGGKSERSYVPSAEQI）に対する特異抗体のアッセーはELISAで実行した。0.001mg/mlのペプチド1を含む0.05mlの PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を入れた96-ウエルマイクロタイタープレート（Maxisorp F96、Nunc、DK）で抗原結合を行う。各ウエルは4℃で湿った室で一晩培養する。プレートをPBS−0.05％ Tween 20（シグマ、St-Louis、MO、米国）（PBS-T）で洗浄し、プレートをPBS-T中で5％スキムミルクで1時間の室温でブロッキングする。週9および週11に各マウスの血清サンプル（A、B、C、D、E、F、G）を希釈緩衝液（2.5％のスキムミルク粉末およびTween 20の0.05％を含むPBS）で連続的に希釈し、マイクロタイタープレートに入れ、1時間間室温（室温）に放置する。それからプレートをPBSで洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ（シグマ、セントルイス、MO、USA）に連結したヤギポリクローン抗マウス・イムノグロブリン抗体を含む希釈溶液をプレートに入れ、室温で1時間培養する。プレートをPBSで洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ基質（p-ニトロフェニルリン酸（シグマ、セントルイス、MO、USA））を加えて抗体を呈色反応で測定する。405nmでの吸光指数をマイクロタイタープレート測定器（Dynatech 25000モデルのELISA測定器、アッシュフォード、ミドルセックス、UK）で読む。各血清サンプルは2回測定する。結果は各グループのマウスの全ての測定値の平均を表す。抗体価最も高い希釈度すなわちバックグラウンドノイズ＋3SDにより大きいODで与えられる。
【０２２９】
γ-インターフェロンELISPOTアッセイ
マウスγ-インターフェロン（O1E703B2）に対する特異的抗体の結合は、ニトロ細胞ロース（ミリポア、Molsheim、フランス）でカバーした丸底ウエルのマイクロタイタープレートに50マイクログラム/ミリリットル濃度の抗体溶液を加えて湿った室中で4℃で一晩培養して行う。ブロッキングステップは、10％のウシ胎仔血清（FCS、Fakola、スイス）を含むDMEM培地（Life Technologies、グランドアイランド、NY、USA）を加え、37℃で2時間放置して行う。リンパ器官（鼠径部リンパ節および脾臓）から得た細胞を200000または400000細胞/ウエルの濃度でマイクロタイタープレートで培養し、100000抗原提示細胞（PyCS 252-260ペプチドで37℃で1時間抗原刺激し、照射（10Krad）し、３回洗浄）と37℃で24時間共培養するか、対照としてのConcanavalin Aの存在下で培養する。培養後、細胞を除去し、洗浄し、第２抗マウスγIFN抗体-ビオチン複合体（ANI、PBS中に2マイクログラム/ミリリットル、1％ BSA）を加え、2時間培養した。1000-倍に希釈したストレプトアビジン-アルカリ性ホスファターゼ共コンジュゲート（Boehringerマンハイム、マンハイム、GFR）を加え、１時間、37℃培養した後、0.05％ Tween 20を含むPBSで３回洗浄し、その後にPBSで３回洗浄した。BCIP/NBT基質（シグマ、セントルイス、MO、USA）を加えることによって抗-γIFN免疫複合体の存在が示される。この反応は水洗で停止される。γIFNにポジなスポットをBiosys社の自動測定器（Karben（ドイツ）でカウントした。特異的スポットのカウントはペプチドで初回抗原刺激を受けた細胞とペプチドが不存在下でカウントしたスポットとの差である。結果は各グループのマウスで記録された測定値の平均で与えられ、培養細胞100万個当たりのスポットの数で表される。
【０２３０】
結果
抗体応答は図85（第2回注射後2週間）および図86（第3回注射後2週間）に示してある。2回の免疫注射後、ポジのレスポンスはグループ５の中の７匹の動物（追加的な側鎖スペーサによるアシル-ジペプチド様化合物を介して連結したペプチド1の4単位で免疫化した動物）から観測された。このグループでは、マウスBおよびDが適度で有意な抗体価を示すので、第3回目の注射後に応答マウスの百分比が増加する。同じアジュバントを混合した同じペプチドで免疫化したグループ3は有意な抗体価を示さない。初期応答はグループ7（フリーのOM-197アジュバントを補った単共役なペプチド２）の３回の免疫化注射後に観測される。短いペプチドまたはペプチドを投与しなかった他のグループではいかなる抗体応答も示さなかった。
結論として、OM-197-ペプチド2の５共役体は全ての免疫化マウスの抗体応答を低いタイターで誘導することができる。細胞活性アッセイはCTL分泌γ−IFNの頻度、特にPyCS 252-260エピトープの分泌頻度をベースにしている。結果は表3に示した。ポジティブ対照はグループ2で表され、ネガティブ対照はアジュバントだけのもの（グループ1と8）で表される。Concanavalin Aをベースにした細胞刺激対照は全てのマウスに対してポジである。グループ5（五共役）およびグループ7（単共役＋アジュバント）はポジティブCTL応答を示す。
結論として、アシル・ジペプチド様化合物（OM-197-ペプチド1）の4つの分子に共役したペプチドは効果があるが、単共役（OM-197-ペプチド 2）はCTL応答を誘導しない。。一方、フリーなOM-197を単共役したものは抗体応答を示さないが、CTLレスポンスを誘導する。これはペプチド2が小再で（12のアミノ酸）であるためであろう。
【０２３１】
【表５０】
2003518086.tif 000125
【０２３２】
実施例 5.6
ウサギモデルでのアシル化ジペプチド様化合物の発熱原性の評価
この実験の目的は、グラフトされた追加的な側鎖スペーサを有するアシル-ジペプチド様化合物を注射ivした時にウサギの発熱を誘発しない最高濃度を決定することにある。
手順：
15匹のニュージーランド白ウサギを以下のグループに分ける：
グループ1：1.0mg/kg 
グループ 2：0.1mg/kg
グループ3：0.01mg/kg 
グループ 4：0.001mg/kg
グループ5：注射水
テスト日にはウサギを箱に入れて拘束し、計量した。温度計を直腸に1時間挿入後、温度を90分間記録し、平均値を計算した。それから各ウサギに（横向き）辺縁の耳鉱脈を介して上記生成物または対照（0.9％ NaCl滅菌水）を注射i.v.した。温度を3時間、30間隔で測定した。注射前の平均値温度と最大温度との差を計算し、報告した。各グループから3匹のウサギと採り、3回の応答での合計が1.15℃を上回らない場合、テストした生成物は発熱原性なしとみなす。また、合計が2.65℃を上回った場合には発熱原性とする。結果がこれらの中間の場合には別の3匹のウサギでテストを繰り返した。
結果
【０２３３】
【表５１】
2003518086.tif 000126
【０２３４】
本発明化合物0.1mg/kg以下の量では発熱原性がない。