【手続補正書】
【提出日】平成23年8月18日(2011.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に導入した場合にＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のｉｎ  ｖｉｖｏ発現、及び細胞増殖を阻害する単離二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、二本鎖分子。
【請求項２】
前記センス鎖が、配列番号１７、配列番号１６及び配列番号１９から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項１に記載の二本鎖分子。
【請求項３】
ヌクレオチド数約１９〜約２５の長さを有する、請求項１又は２に記載の二本鎖分子。
【請求項４】
介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二本鎖分子。
【請求項５】
下記一般式を有する、請求項４に記載の二本鎖分子：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］は配列番号１７、配列番号１６及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の二本鎖分子を発現するベクター。
【請求項７】
ＰＫＩＢ若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２の発現を阻害する少なくとも１つの単離二本鎖分子又は該二本鎖分子をコードするベクターを含む、癌を治療するための組成物であって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、組成物。
【請求項８】
前記センス鎖が配列番号１７、配列番号１６及び配列番号１９から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記二本鎖分子が、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項１０に記載の組成物：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］は配列番号１７、配列番号１６及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項１２】
治療すべき前記癌が前立腺癌、ホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
（ａ）以下：
（ｉ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５に対応する配列を含むｍＲＮＡを検出すること、
（ｉｉ）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、及び
（ｉｉｉ）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出すること、
から成る群から選択される方法のいずれか１つにより被験体由来の生体試料中における遺伝子の発現レベルを決定する工程と、
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した前記発現レベルの増大を、前立腺癌と関連づける工程と、
を含む、前立腺癌のためのマーカーとして、生体試料中におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルを決定する方法。
【請求項１４】
前記前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌又は去勢抗性前立腺癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現レベルが前記正常対照レベルより少なくとも１０％大きい、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のｍＲＮＡとハイブリダイズするプローブを含む、前立腺癌を検出するためのＤＮＡアレイ。
【請求項１７】
配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質と結合する抗体を含む、前立腺癌を検出するための組成物。
【請求項１８】
前記抗体が配列番号３２、配列番号３３又は配列番号３４と結合する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ａ）試験化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）前記ポリペプチドと前記試験化合物との間の結合活性を検出する工程と、
ｃ）前記ポリペプチドと結合する前記試験化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
ａ）試験化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）工程（ａ）の該ポリペプチドの生物活性を検出する工程と、
ｃ）該試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの該生物活性と比較して、該ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のポリヌクレオチドによりコードされる該ポリペプチドの該生物活性を抑制する該試験化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
前記生物活性が細胞増殖の促進又はＰＫＡ−Ｃ核内蓄積活性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）候補化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する細胞と接触させる工程と、
ｂ）前記候補化合物の非存在下で検出される前記発現レベルと比較して、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルを低減する前記候補化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
ａ）候補化合物を、ベクターが導入されている細胞と接触させる工程であって、該ベクターが、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含む、接触させる工程と、
ｂ）前記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程と、
ｃ）対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベル又は活性レベルを低減する候補化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２４】
ａ）試験化合物の存在下で、ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物を、ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程と、
ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
ｃ）前記ポリペプチド間の結合を阻害する前記試験化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２５】
前記ＰＫＩＢポリペプチドの機能的等価物が、配列番号３１から成るポリペプチドを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＫＡ−Ｃポリペプチドの機能的等価物が、ＰＫＩＢ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）試験化合物の存在下で、ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物と、ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と、Ａｋｔとを、リン酸ドナーの存在下で、インキュベートする工程と、
（ｂ）前記Ａｋｔのリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で測定される該Ａｋｔの該リン酸化レベルを対照レベルと比較する工程と、
（ｄ）該対照レベルと比較して該Ａｋｔの該リン酸化レベルを減少させる化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２８】
前記Ａｋｔのリン酸化レベルが、配列番号３５のアミノ酸配列の４７３位のセリン残基において検出される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物と、前記ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と、Ａｋｔとが、細胞において発現され、該細胞又はその可溶化物を試験化合物と接触させることにより試験化合物の存在下でインキュベートされる、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
ＮＡＡＬＡＤＬ２は、新規なＩＩ型膜タンパク質であり、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）ファミリーに属する。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と呼ばれるＧＣＰＩＩの前立腺形態は前立腺癌において発現し、ＰＳＭＡレベルの増大は、ＰＣの進行とＨＲＰＣとに関連する（Rajasekaran AK et al., Am J Physiol Cell Physiol 2005 288: C975-81.及びMurphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.）。そのＰＳＭＡとの相同性と、その類似する発現パターンとを考慮すると、ＮＡＡＬＡＤＬ２は「ＰＳＭＡ２」と呼ぶべきである。ＰＳＭＡはＦＤＡに承認された前立腺癌造影剤である１１１Ｉｎ標識７Ｅ１１モノクローナル抗体（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ、Cytogen、Princeton、NJ）の標的である。ＰＳＭＡは、ＰＳＭＡを発現する細胞への造影剤又は治療薬の特異的送達を目的とする臨床試験にある、Ｊ５９１等のモノクローナル抗体により標的とされる（Murphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.及びHolmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10: 511-9.）。腫瘍マーカーとしてのその特徴に加えて、ＰＳＭＡは、その基質がポリ−γ−グルタミン酸型葉酸を含む、ＧＰＣ活性を有する（Zhou J et al., Nature Review Drug Disc 2005 4: 1015-26.）。ＰＳＭＡの酵素活性はプロドラッグの設計のために利用することができ、該プロドラッグでは薬剤の不活性なグルタミン酸型形態が選択的に切断されることにより、ＰＳＭＡを発現する細胞でのみ活性化される（Denny WA et al., Eur J Med Chem 2001 36: 577-95.）。しかし、ＰＳＭＡが前立腺癌の進行とどのように関連するのかは全く未知であり、ＰＳＭＡの機能又は活性それ自体を標的とする可能性はさらに未知である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明は、患者由来の生体試料中のＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルを決定することにより、被験体における前立腺癌に対する素因を診断又は決定する方法を特徴とする。正常対照レベルと比較した該遺伝子のいずれかの発現レベルの増大は、被験体が前立腺癌を患っているか、又は発症するリスクを有することを示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明は、特定の配列（特に、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９）を含む二本鎖分子が前立腺癌細胞の細胞増殖を阻害するのに有効であるという発見に、少なくとも部分的に基づく。具体的には、ＰＫＩＢ遺伝子及びＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、本発明により提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の別の態様は、本発明の二本鎖分子又はベクターの少なくとも１つを含有する癌を治療する組成物に関する。代替的に、本発明は、前立腺癌を治療又は防止する化合物をスクリーニングする方法であって、ＰＫＩＢタンパク質又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質を発現する細胞と試験化合物を接触させる工程と、続いてＰＫＩＢタンパク質又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質の発現レベルを低減する試験化合物を選択する工程とを含む、方法をさらに提供する。さらに、本発明は、前立腺癌を治療又は防止する化合物をスクリーニングする方法であって、ＰＫＩＢとタンパク質キナーゼＡ触媒サブユニット（ＰＫＡ−Ｃ）との間の結合が検出される、方法を提供する。ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の結合を阻害する化合物は、前立腺癌の症状を低減することが期待される。さらに本発明は、癌を検出する抗体をスクリーニングする方法であって、ＮＡＡＬＡＤＬ２が細胞表面で検出される、方法を提供する。ＮＡＡＬＡＤＬ２を認識した抗体が、前立腺癌を検出するために使用される。
[請求項1001]
細胞に導入した場合にＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ2のｉｎ  ｖｉｖｏ発現、及び細胞増殖を阻害する単離二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、二本鎖分子。
[請求項1002]
前記センス鎖が、配列番号16、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項1001に記載の二本鎖分子。
[請求項1003]
ヌクレオチド数約19〜約25の長さを有する、請求項1002に記載の二本鎖分子。
[請求項1004]
介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項1002に記載の二本鎖分子。
[請求項1005]
下記一般式を有する、請求項1004に記載の二本鎖分子：
5’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−3’
式中、［Ａ］は配列番号16、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
[請求項1006]
請求項1001に記載の二本鎖分子を発現するベクター。
[請求項1007]
前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項1006に記載のベクター：
5’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−3’
式中、［Ａ］は配列番号16、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
[請求項1008]
ＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ2遺伝子を過剰発現する細胞において該遺伝子の発現を阻害する少なくとも1つの単離二本鎖分子を投与する工程を含む、癌を治療する方法であって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、方法。
[請求項1009]
前記センス鎖が配列番号16、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項1008に記載の方法。
[請求項1010]
前記二本鎖分子が、ヌクレオチド数約19〜約25の長さを有する、請求項1009に記載の方法。
[請求項1011]
前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項1008に記載の方法。
[請求項1012]
前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項1011に記載の方法：
5’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−3’
式中、［Ａ］は配列番号16、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
[請求項1013]
前記二本鎖分子がベクターによりコードされる、請求項1008に記載の方法。
[請求項1014]
前記ベクターによりコードされる前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項1013に記載の方法：
5’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−3’
式中、［Ａ］は配列番号16、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
[請求項1015]
治療すべき前記癌が前立腺癌又はホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、請求項1008に記載の方法。
[請求項1016]
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ2の発現を阻害する少なくとも1つの単離二本鎖分子を含む、癌を治療するための組成物であって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、組成物。
[請求項1017]
前記センス鎖が配列番号16、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項1016に記載の組成物。
[請求項1018]
前記二本鎖分子が、約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチドの長さを有する、請求項1017に記載の組成物。
[請求項1019]
前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項1016に記載の組成物。
[請求項1020]
前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項1019に記載の組成物：
5’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−3’
式中、［Ａ］は配列番号16、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択される配列を含むセンス鎖配列であり、［Ｂ］は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
[請求項1021]
前記二本鎖分子が、ベクターによりコードされ、かつ前記組成物中に含有される、請求項1016に記載の組成物。
[請求項1022]
前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項1021に記載の組成物：
5’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−3’
式中、［Ａ］は配列番号16、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
[請求項1023]
治療すべき前記癌が前立腺癌又はホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、請求項1016に記載の組成物。
[請求項1024]
（ａ）以下：
（ｉ）配列番号1、配列番号3又は配列番号5に対応する配列を含むｍＲＮＡを検出すること、
（ｉｉ）配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、及び
（ｉｉｉ）配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出すること、
から成る群から選択される方法のいずれか1つにより被験体由来の生体試料中における遺伝子の発現レベルを決定する工程と、
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した前記発現レベルの増大を、前立腺癌と関連づける工程と、
を含む、前立腺癌を診断する方法。
[請求項1025]
前記前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌又は去勢抗性前立腺癌である、請求項1024に記載の方法。
[請求項1026]
前記発現レベルが前記正常対照レベルより少なくとも10％大きい、請求項1024に記載の方法。
[請求項1027]
前記発現レベルが、前記被験体由来の生体試料の遺伝子転写産物へのプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより決定される、請求項1024に記載の方法。
[請求項1028]
前記ハイブリダイゼーション工程がＤＮＡアレイ上で実施される、請求項1027に記載の方法。
[請求項1029]
前記発現レベルが、前記配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより決定される、請求項1024に記載の方法。
[請求項1030]
前記抗体が、配列番号32、配列番号33又は配列番号34から成るポリペプチドと結合する、請求項1029に記載の方法。
[請求項1031]
前記被験体由来の生体試料が、生検材料、痰、血液又は尿を含む、請求項1024に記載の方法。
[請求項1032]
配列番号33又は配列番号34のアミノ酸配列を含むタンパク質と結合する抗体。
[請求項1033]
配列番号2又は配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質と結合する抗体を含む、前立腺癌を検出するための組成物。
[請求項1034]
前記抗体が配列番号32、配列番号33又は配列番号34と結合する、請求項1033に記載の組成物。
[請求項1035]
ａ）試験化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ2のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）前記ポリペプチドと前記試験化合物との間の結合活性を検出する工程と、
ｃ）前記ポリペプチドと結合する前記試験化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
[請求項1036]
ａ）試験化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ2のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）工程（ａ）の該ポリペプチドの生物活性を検出する工程と、
ｃ）該試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの該生物活性と比較して、該ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ2のポリヌクレオチドによりコードされる該ポリペプチドの該生物活性を抑制する該試験化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
[請求項1037]
前記生物活性が細胞増殖の促進又はＰＫＡ−Ｃ核内蓄積活性である、請求項1036に記載の方法。
[請求項1038]
ａ）候補化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ2を発現する細胞と接触させる工程と、
ｂ）前記試験化合物の非存在下で検出される前記発現レベルと比較して、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ2の発現レベルを低減する前記候補化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
[請求項1039]
ａ）候補化合物を、ベクターが導入されている細胞と接触させる工程であって、該ベクターが、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ2の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含む、接触させる工程と、
ｂ）前記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程と、
ｃ）対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベル又は活性レベルを低減する候補化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
[請求項1040]
ａ）試験化合物の存在下で、ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物を、ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程と、
ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
ｃ）前記ポリペプチド間の結合を阻害する前記試験化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
[請求項1041]
前記ＰＫＩＢポリペプチドの機能的等価物が、配列番号31から成るポリペプチドを含む、請求項1040に記載の方法。
[請求項1042]
前記ＰＫＡ−Ｃポリペプチドの機能的等価物が、ＰＫＩＢ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項1040に記載の方法。
[請求項1043]
（ａ）試験化合物の存在下で、ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物と、ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と、Ａｋｔとを、該ＰＫＩＢポリペプチドによるＡｋｔのリン酸化に適した条件下で、インキュベートする工程と、
（ｂ）前記Ａｋｔのリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で測定される該Ａｋｔの該リン酸化レベルを対照レベルと比較する工程と、
（ｄ）該対照レベルと比較して該Ａｋｔの該リン酸化レベルを減少させる化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
[請求項1044]
前記Ａｋｔのリン酸化レベルが、配列番号35のアミノ酸配列の473位のセリン残基において検出される、請求項1043に記載の方法。
[請求項1045]
前記ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物と、前記ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と、Ａｋｔとが、細胞において発現され、該細胞又はその可溶化物を試験化合物と接触させることにより試験化合物の存在下でインキュベートされる、請求項1043に記載の方法。
[請求項1046]
前記前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、請求項1035、1036、1038、1039、1040及び1043のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
【図１Ａ】半定量ＲＴ−ＰＣＲにより、同様にマイクロダイセクションされた正常な前立腺上皮細胞（ＮＰｍｉｘ）、正常な前立腺の全組織、及び重要な器官（心臓、肺、肝臓及び腎臓）と比較して、ＨＲＰＣ細胞中ではＰＫＩＢの過剰発現が確認された（５／５）が、ＨＳＰＣ細胞では確認されなかったことを示す図である。ＡＣＴＢを、各々のｃＤＮＡ含有量を定量するために使用した。
【図１Ｂ】ＰＫＩＢの発現についての多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロット分析により、ヒト成体の器官のうち、胎盤では約１．５ｋｂのバンドが示されたが、重要な器官（心臓、肺、肝臓及び腎臓）では示されなかったことを示す図である。ＰＫＩＢの発現についてのノーザンブロット分析は、幾つかのＰＣ細胞株（２２Ｒｖ１及びＰＣ−３）がＰＫＩＢを強く発現するのに対して、他の正常な成体の器官はＰＫＩＢを発現しないことを示した。
【図１Ｃ】ＰＣ組織についての免疫組織化学的分析を示す図である。前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）が、ＰＫＩＢについての弱い染色（＋）を示した。
【図１Ｄ】ＰＣ組織についての免疫組織化学的分析を示す図である。Ｇｌｅａｓｏｎグレードが３のＰＣは弱い染色（＋）を示したが、正常な前立腺上皮（Ｎ）は陰性の染色を示した。
【図１Ｅ】ＰＣ組織についての免疫組織化学的分析を示す図である。Ｇｌｅａｓｏｎグレードが５のＰＣは、ＰＫＩＢについての強い陽性の染色（＋＋＋）を示した。
【図１Ｆ】ＰＣ組織についての免疫組織化学的分析を示す図である。ＨＲＰＣも、ＰＫＩＢについての強い陽性の染色（＋＋＋）を示した。
【図２Ａ】半定量ＲＴ−ＰＣＲにより、同様にマイクロダイセクションされた正常な前立腺上皮細胞（ＮＰｍｉｘ）、正常な前立腺の全組織、及び重要な器官（心臓、肺、肝臓及び腎臓）と比較して、ＨＲＰＣ細胞中においてＮＡＡＬＡＤＬ２の過剰発現が確認された（７／１１）ことを示す図である。ＡＣＴＢを、各々のｃＤＮＡ含有量を定量するために使用した。
【図２Ｂ】ＮＡＡＬＡＤＬ２の発現についてのＭＴＮブロット分析により、ヒト成体の器官のうちＰＣ細胞株でのみ約１０ｋｂ、６ｋｂ及び５ｋｂの３本のバンドが示されたが、重要な器官（心臓、肺、肝臓及び腎臓）では示されなかったことを示す図である。
【図３Ａ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＰＫＩＢ−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲにより、２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）において、ｓｉ１及びｓｉ２によるＰＫＩＢ発現に及ぼすノックダウン効果が確認されたが、ｓｉ３及び陰性対照ｓｉＥＧＦＰによっては確認されなかった。ＡＣＴＢを、ＲＮＡを定量するために使用した。
【図３Ｂ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＰＫＩＢ−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。表示したＰＫＩＢに対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ１、ｓｉ２及びｓｉ３）と、陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）とでトランスフェクトした２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）の各々のＭＴＴアッセイ。ジェネテシンと共に２０日間インキュベートした後で、ＳＤ（標準偏差）を示すエラーバーと共に各平均値をプロットする。Ｙ軸のＡＢＳは、マイクロプレートリーダーで６３０ｎｍを基準として測定した、４９０ｎｍでの吸光度を意味する。これらの実験は、三連で実施した。２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）においてｓｉ１及びｓｉ２でトランスフェクトすると、ノックダウン効果が観察されないｓｉ３及びｓｉＥＧＦＰと比較して、生細胞数の劇的な低減がもたらされた（Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【図３Ｃ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＰＫＩＢ−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。表示したＰＫＩＢに対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ１、ｓｉ２及びｓｉ３）と、陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）との各々でトランスフェクトした２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）のコロニー形成アッセイ。ジェネテシンと共に２０日間インキュベートした後で、細胞を、０．１％のクリスタルバイオレットでの染色で可視化した。
【図４Ａ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲにより、２２Ｒｖ１細胞における、ｓｉ＃６９０によるＮＡＡＬＡＤＬ２の発現に及ぼすノックダウン効果が確認されたが、ｓｉ＃９１３、ｓｉ＃１３２８及び陰性対照ｓｉＥＧＦＰによっては確認されなかった。ＡＣＴＢを、ＲＮＡを定量するために使用した。
【図４Ｂ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。表示したＮＡＡＬＡＤＬ２に対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ＃６９０、ｓｉ＃９１３及びｓｉ＃１３２８）と、陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）とでトランスフェクトした２２Ｒｖ１細胞の各々のＭＴＴアッセイ。ジェネテシンと共に２０日間インキュベートした後で、ＳＤ（標準偏差）を示すエラーバーと共に各平均値をプロットする。Ｙ軸は、マイクロプレートリーダーで６３０ｎｍを基準として測定した、４９０ｎｍでの吸光度を意味する。これらの実験は、三連で実施した。２２Ｒｖ１細胞においてｓｉ＃６９０でトランスフェクトすると、ノックダウン効果が観察されない他のｓｉＲＮＡと比較して、生細胞数の劇的な低減がもたらされた（Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【図４Ｃ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。表示したＮＡＡＬＡＤＬ２に対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ＃６９０、ｓｉ＃９１３及びｓｉ＃１３２８）と、陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）との各々でトランスフェクトした２２Ｒｖ１細胞のコロニー形成アッセイ。ジェネテシンと共に２０日間インキュベートした後で、細胞を、０．１％のクリスタルバイオレットでの染色で可視化した。
【図４Ｄ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する別のＣ４−２Ｂ細胞における、ｓｉ＃６９０に対応する合成ＲＮＡ二本鎖によるＮＡＡＬＡＤＬ２発現に及ぼすノックダウン効果が確認された。ＡＣＴＢを、ＲＮＡを定量するために使用した。
【図４Ｅ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。ｓｉ＃６９０に対応する合成ＲＮＡ二本鎖は、対照ＲＮＡ二本鎖ｓｉＥＧＦＰと比較して、Ｃ４−２Ｂ細胞の細胞生存度を抑制した（Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【図５Ａ】ＰＫＩＢタンパク質の細胞内局在を示す図である。抗タグ抗体を使用する免疫細胞化学的分析は、外来性ＰＫＩＢが細胞質に局在し、外来性ＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質が細胞膜に主に局在することを示した。
【図５Ｂ】ＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質の細胞内局在を示す図である。抗タグ抗体を使用する免疫細胞化学的分析は、外来性ＰＫＩＢが細胞質に局在し、外来性ＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質が細胞膜に主に局在することを示した。
【図５Ｃ】ＰＫＩＢ−Ｍｙｃ及びＨＡ−ＰＫＡ−Ｃの発現ベクターを２２Ｒｖ１細胞に同時トランスフェクトし、それらの細胞可溶化物を各々のタグ抗体により免疫沈降した結果を示す図である。ＰＫＩＢ−ＭｙｃはＰＫＡ−Ｃで共免疫沈降を行い、及びその逆も行った。それらの結果は、ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の直接の相互作用を示した。
【図５Ｄ】免疫細胞化学的分析により、対照ｓｉＲＮＡをＰＣ−３細胞にトランスフェクトした場合には、ほとんどのＰＫＡ−Ｃが細胞質中に局在し、ＰＫＡ−Ｃタンパク質の幾つかのシグナルが核内に局在することが観察された（左）。一方、ｓｉＲＮＡがＰＣ−３細胞において内在性ＰＫＩＢをノックダウンした場合には、免疫細胞化学的分析は、核内にＰＫＡ−Ｃのシグナルを全く又はほとんど示さなかった（右）。
【図５Ｅ】ＰＣ細胞中でｓｉＲＮＡ二本鎖を処理した後、核のＰＫＡ−Ｃをより定量的に分析するために、細胞を核画分と細胞質画分とに分画した。タンパク質量３０μｇの分画した細胞可溶化物を、抗ＰＫＡ−Ｃ抗体、及びローディングと核画分の対照のために抗ラミンＢ抗体を使用して、ウェスタンブロットした。核内のＰＫＡ−Ｃの量は、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＲＮＡによるＰＫＩＢノックダウンにおいて明らかに減少したが、細胞質中のＰＫＡ−Ｃの量は、ＰＫＩＢノックダウンにおいて少し増大した。
【図６Ａ】ＲＴ−ＰＣＲにより、ＤＵ１４５由来のクローン（ＰＫＩＢ＃１、＃２及び＃３）におけるＰＫＩＢの構成的発現を確認したことを示す図である。
【図６Ｂ】ウェスタンブロット分析により、ＤＵ１４５由来のクローン（ＰＫＩＢ＃１、＃２及び＃３）におけるＰＫＩＢの構成的発現を確認したことを示す図である。
【図６Ｃ】高レベルの外来性ＰＫＩＢを発現するＤＵ１４５クローン（クローン１〜クローン３）と、モック（ｍｏｃｋ）ベクターをトランスフェクトしたＤＵ１４５（＃１、＃２、＃３の混合物）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖速度を示す図である。Ｘ軸及びＹ軸は、播種後の日数と、対照としての１日目の吸光度の値との比較により直径の吸光度で算出した相対増殖速度とを表す。ＰＫＩＢを過剰発現する細胞はモック細胞より迅速に増殖し、前立腺癌におけるＰＫＩＢの増殖促進効果を示唆した。
【図６Ｄ】２×１０６個の、ＰＫＩＢを安定的に発現したＤＵ１４５細胞（右）、又はモック細胞（左）を、雄のヌードマウスの側腹部に接種した結果を示す図である。接種の１５週後、右側（ＰＫＩＢ＋＋；矢印）にのみ腫瘍が見出されたが、左側（モック）には見出されなかった。
【図６Ｅ】ＰＫＩＢ発現ベクターでのトランスフェクション後におけるＮＩＨ３Ｔ３細胞の浸潤性を実証するマトリゲル浸潤アッセイを示す図である。Ｙ軸は、マトリゲルコーティングしたフィルタを通って移動した細胞数を表す。アッセイを３回実施し、ＳＤ（標準偏差）を示すエラーバーと共に各平均値をプロットする。ＰＫＩＢの過剰発現は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の浸潤性を有意に促進した（Ｐ＝０．００５２）。
【図７Ａ】ＬＮＣａＰ細胞及びＰＣ−３細胞におけるｓｉＲＮＡ二本鎖（ｓｉＰＫＩＢ）によるＰＫＩＢのノックダウンが、Ａｋｔの４７３位のＳｅｒにおけるリン酸化の減少をもたらしたことを示す図である。ｓｉＥＧＦＰ二本鎖のトランスフェクションは、陰性対照として用意された。ＰＫＩＢのノックダウンをＲＴ−ＰＣＲにより確認し、ＡＣＴＢはローディング対照として用意した。
【図７Ｂ】ＰＫＩＢの過剰発現が、ＰＣ−３細胞及び２２Ｒｖ１細胞におけるＡｋｔの４７３位のＳｅｒにおけるリン酸化を増強したことを示す図である。ＰＫＩＢの過剰発現は、ＨＡタグ抗体を使用するウェスタンブロット法により確認された。
【図７Ｃ】ＰＫＡ−Ｃの過剰発現も、ＰＣ−３細胞におけるＡｋｔの４７３位のＳｅｒにおけるリン酸化を増強したことを示す図である。ＰＫＡ−Ｃの過剰発現はＨＡタグ抗体を使用するウェスタンブロット法により確認され、Ａｋｔの総量はローディング対照として用意された。
【図７Ｄ】組換えＰＫＩＢタンパク質及び組換えＰＫＡ−Ｃタンパク質を使用するＡｋｔのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのキナーゼアッセイを示す図である。Ａｋｔの４７３位のＳｅｒのリン酸化は、抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（細胞シグナリング）により検出され、Ａｋｔの総量は抗Ａｋｔ抗体により検出された。ＰＫＡ−ＣキナーゼへのＰＫＩＢの添加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡｋｔの４７３位のＳｅｒのリン酸化を顕著に増大した。
【図８Ａ】ＰＫＩＢの発現が、臨床ＰＣ組織においてＡｋｔのリン酸化と相関したことを示す図である。写真は、ＰＫＩＢについてのＰＣ組織における免疫組織化学的分析を表す。写真は、図８Ｂのリン酸化Ａｋｔのスライドと対面している。
【図８Ｂ】ＰＫＩＢの発現が、臨床ＰＣ組織においてＡｋｔのリン酸化と相関したことを示す図である。写真は、リン酸化したＡｋｔについての、ＰＣ組織における免疫組織化学的分析を表す。写真は、図８ＡのＰＫＩＢのスライドと対面している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
該プロトコルにより、本発明の単離二本鎖分子の標的配列は、以下のように設計された。
ＰＫＩＢ遺伝子に関して配列番号１６及び配列番号１７；及び
ＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子に関して配列番号１９。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力について検査した。したがって、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する：
ＰＫＩＢ遺伝子に対して配列番号１６及び配列番号：配列番号１７；及び
ＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子に対して配列番号１９；。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
任意のヌクレオチド配列から成るループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列との間に位置し得る。したがって、本発明は、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、［Ａ］は標的配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である）を有する二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えば、
ＰＫＩＢに関してヌクレオチド配列番号１６、又は
配列番号１７、及び
ＮＡＡＬＡＤＬ２に関してヌクレオチド配列番号１９、
から成る群から選択され得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
ＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する抗体についてのスクリーニング
ＮＡＡＬＡＤＬ２は、新規なＩＩ型膜タンパク質であり、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）ファミリーに属する。有名な前立腺癌マーカーである前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）も、ＧＣＰＩＩファミリーに属する（Rajasekaran AK et al., Am J Physiol Cell Physiol 2005 288: C975-81.及びMurphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.）。ＮＡＡＬＡＤＬ２はＰＳＭＡと相同性を示し、1つの膜貫通を有し、細胞膜に局在する（図５Ｂ）。ＰＳＭＡは、ＦＤＡに承認された前立腺癌造影剤である１１１Ｉｎ標識７Ｅ１１モノクローナル抗体（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ、Cytogen、Princeton、NJ）の標的であり、ＰＳＭＡは、ＰＳＭＡを発現する細胞への造影剤又は治療薬の特異的送達を目的とする臨床試験にある、Ｊ５９１等のモノクローナル抗体により標的とされる（Murphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.及びHolmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10: 511-9.）。したがって、前立腺癌の診断又は防止に使用され得る抗ＮＡＡＬＡＤＬ２抗体を、細胞表面におけるＮＡＡＬＡＤＬ２の結合能力を指標として使用するスクリーニングを通じて、同定することができる。このスクリーニング方法の実施形態は、
ａ）候補抗体を、ＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する細胞と接触させる工程と、
ｂ）細胞表面上でＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する試験抗体を選択する工程と、
を含む。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により生じさせるのが好ましい。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する共役）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、又はＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ’及びＲは異なるアルキル基である）を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２５】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)のスキャッチャード解析によって求めることができる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）によって増殖させてもよい。この目的に適した培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。また、ハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫瘍として、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させてもよい。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって作り出してもよい（米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照）。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作り出す好ましい手段は、共願の（commonly-owned）同時係属中の出願に開示されている。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６４】
本発明の方法において有用な酵素の例としては、リン酸塩を含有するプロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩を含有するプロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬（フルオロウラシル）に変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチドを含有するプロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なプロテアーゼ、例えばセラチア菌（serratia）プロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、並びにカテプシン（カテプシンＢ及びカテプシンＬ等）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な炭水化物分解酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；並びにアミン窒素がフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を、遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、当該技術分野において「抗体酵素」としても知られる、酵素活性を有する抗体を、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換するために使用することができる（例えば、Massey, Nature 328: 457-458 (1987)を参照）。抗体−抗体酵素複合体は、抗体酵素を腫瘍細胞集団に送達するために、本明細書中に記載されるように調製することができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９０】
実施例１  一般的方法
細胞株
ＣＯＳ７細胞と、ＰＣ細胞株であるＬＮＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５及びＣ４−２Ｂはアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Rockville、MD）から購入し、ＬＮＣａＰ由来のＨＲＰＣ細胞株Ｃ４−２ＢはViroMed Laboratories（Minnetonka、MN）から購入した。３０回より多くの回数継代したＬＮＣａＰをＬＮＣａＰ（ＨＰ）と定義したが、ＬＮＣａＰ（ＨＰ）は継代回数の少ないＬＮＣａＰ細胞と、形態学的に及びその遺伝子発現パターンにおいて、異なっていた。ダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen、Carlsbad、CA）（この培地には、１０％のウシ胎児血清（Gemini Bio-Products、West Sacramento、CA）と、１％の抗生剤／抗真菌剤溶液（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）とを添加した）中でこれらを培養した。細胞を、５％のＣＯ２を有する加湿空気雰囲気中において３７℃で維持した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９２】
このＥＳＴとＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子との間の関連は、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。ＲＴ−ＰＣＲの対数期は、同一の反応から発生したｃＤＮＡ間の半定量比較を可能とするために決定した。各ＰＣＲの計画は、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（PE Applied Biosystems、Foster、CA）により、９８℃で３０秒の初期変性工程と、その後、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で３０秒の２２サイクル（ＡＣＴＢに対して）、２３サイクル（ＰＫＩＢ、ＮＡＡＬＡＤＬ２に対して）とを含むものとした。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０３】
実施例２  ＰＣ細胞におけるＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２の過剰発現
ＨＲＰＣ細胞の全ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイ解析（Tamura K et al., Cancer Res 2007 67: 5117-25.）によりスクリーニングされた数十のトランス活性化した遺伝子のうち、本発明ではＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２に焦点を合わせた。ＰＫＩＢの過剰発現は９つの顕微解剖したＨＲＰＣ細胞集団のうち５つにおいてＲＴ−ＰＣＲにより確認し（図１Ａ）、ＮＡＡＬＡＤＬ２の過剰発現は９つのうち５つにおいてＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図２Ａ）。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２３】
ＮＡＡＬＡＤＬ２は新規なＩＩ型膜タンパク質であり、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）ファミリーに属する。前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）と呼ばれるＧＣＰＩＩの前立腺形態は前立腺癌において発現し、ＰＳＭＡレベルの増大は、ＰＣの進行とＨＲＰＣとに関連する（Rajasekaran AK et al., Am J Physiol Cell Physiol 2005 288: C975-81.及びMurphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.）。そのＰＳＭＡとの相同性と、その類似する発現パターンとを考慮すると、この新規な分子ＮＡＡＬＡＤＬ２は「ＰＳＭＡ２」と呼ぶべきである。ＰＳＭＡはＦＤＡに承認された前立腺癌造影剤である１１１Ｉｎ標識７Ｅ１１モノクローナル抗体（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ、Cytogen、Princeton、NJ）の標的であり、ＰＳＭＡは、ＰＳＭＡを発現する細胞への造影剤又は治療薬の特異的送達を目的とする臨床試験にある、Ｊ５９１等のモノクローナル抗体により標的とされる（Murphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.及びHolmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10: 511-9.）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２４】
腫瘍マーカーとしてのその特徴に加えて、ＰＳＭＡは、その基質がポリ−γ−グルタミン酸型葉酸を含む、ＧＰＣ活性を有する（Zhou J et al., Nature Review Drug Disc 2005 4: 1015-26.）。ＰＳＭＡの酵素活性はプロドラッグの設計のために利用することができ、該プロドラッグでは薬剤の不活性なグルタミン酸型形態が選択的に切断されることにより、ＰＳＭＡを発現する細胞でのみ活性化される（Denny WA et al., Eur J Med Chem 2001 36: 577-95.）。しかし、ＰＳＭＡが前立腺癌の進行とどのように関連するのかは全く未知であり、ＰＳＭＡの機能又は活性それ自体を標的とする可能性も未知である。ＮＡＡＬＡＤＬ２はＨＲＰＣ細胞において強く発現し、正常な成体の器官におけるその発現は、図２Ｂに示したようにきわめて限定されている。腫瘍マーカーとしてのその限定的な発現に加えて、それはＰＣの生存度又は増殖と関与する可能性があり、このことはこのｓｉＲＮＡ実験により支持される。したがって、ＰＳＭＡ２に対する特異的なモノクローナル抗体は、腫瘍マーカーと共に、ＰＳＭＡ２活性を阻害することにより、ＰＣ療法に利用可能だろう。