(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリジンである塩基の存在下、場合により追加の溶媒の存在下で、式Ｉ：
【化１】
0005998198.tif 000016
（式中、Ｒ４およびＲ５は、
一緒になって、式ＩＩ：
【化２】
0005998198.tif 000017
［式中、Ｒ６はそれぞれ個々に、メチル、エチル、プロピル、フェニルであるか、または一緒になってシクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタンまたはシクロオクタン環を形成することができる］の基であり、ならびに、
Ｘがハロゲンである）
のアシル化剤で、ラパマイシンをアシル化することを含む、式ＩＩＩ：
【化３】
0005998198.tif 000018
（式中、Ｒ４およびＲ５は、上記に定義したとおりである）
の化合物の製造方法。
【請求項２】
追加の溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２、クロロホルム、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルアセタート、エチルアセタート、メチルプロピオナート、エチルプロピオナート、ｎ−プロピルアセタート、イソプロピルアセタートまたはこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アシル化剤が、
式：
【化４】
0005998198.tif 000019
（式中、Ｒ６はメチルであり、ならびに、ＸはＣｌである）
である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アシル化を温度−５から２０℃で実施する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
アシル化される化合物の１ｍｏｌ当たり１．０から１０ｍｏｌのアシル化剤を使用する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ピリジンの存在下で、２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボン酸クロリドを用いてラパマイシンの４２位をアシル化する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
９５％を超える純度で結晶性ラパマイシン４２−（２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボキシラート）を生成する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ラパマイシン３１，４２−ビス（２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボキシラート）の含有量が２．０％より低く、ならびにラパマイシンの含有量が０．０５％より低い、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
テムシロリムスを合成する方法であって、ラパマイシン４２−（２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボキシラート）を調製することを含み、前記ラパマイシン４２−（２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボキシラート）を請求項１から８のいずれかに定義された方法によって調製する、方法。
【請求項１０】
テムシロリムスをラパマイシン４２−（２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボキシラート）の酸加水分解によって得る、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラパマイシンのアシル化に関し、特にラパマイシンの位置選択的アシル化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシン（１）は、臓器移植における拒絶反応を防止するために使用される免疫抑制剤であり、以下の式を有するマクロライドである。
【０００３】
【化１】
0005998198.tif 000002
【０００４】
ラパマイシン（１）は、腎細胞癌治療薬であるテムシロリムスの製造のための中間体である。テムシロリムスは以下の式を有する。
【０００５】
【化２】
0005998198.tif 000003
【０００６】
テムシロリムス（２）を調製するには、ラパマイシン（１）の４２位をアシル化しなければならない。
【０００７】
ＷＯ  ９５／２８４０６  Ａ１によれば、ラパマイシンは、アシル化剤、例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で２，４，６−トリクロロ安息香酸混合２，２，５−トリメチル［１，３］ジオキサン−５−カルボン酸無水物でアシル化することが可能であるが、中程度の収率しか得られない。ＷＯ  ２００５／１００３６６  Ａ１によれば、ラパマイシン４２−エステルの位置特異的調製方法には、有効量の微生物リパーゼの存在下でのラパマイシンと活性化エステルとの反応が含まれている。ＵＳ２０１０／０２４９４１５によれば、ラパマイシンはＤＭＡＰの存在下で２，２，５−トリメチル［１，３］ジオキサン−５−カルボン酸無水物を使用してアシル化することができるが、当該文献に記載の通りで「４２−モノアシル化生成物の選択的合成を達成するために、これらの２つの官能基の核（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ）を効果的に区別することは難題となる」。従って、この方法は低転化率（４０％未満）で実施され、良好な選択性を達成するが分解副産物の量は少ない。
【０００８】
ＵＳ−Ａ−４，３１６，８８５によれば、ピリジン中のラパマイシン溶液に無水酢酸を添加することによってラパマイシンのアシル誘導体を調製する。しかしながら、所望の４２−アセチル誘導体の収率は、所望の主生成物ではないビス−アシル誘導体の収率より少ない。
【０００９】
ＵＳ−Ａ−５，１２０，７２７によれば、ジカルボン酸クロリドをトルエン中のラパマイシン溶液に添加する。所望の４２−アシル誘導体の収率および選択性はここでも低い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９５／２８４０６号
【特許文献２】国際公開第２００５／１００３６６号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０２４９４１５号明細書
【特許文献４】米国特許第４，３１６，８８５号明細書
【特許文献５】米国特許第５，１２０，７２７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
公知の方法では、試薬の収率、コストおよび当量に関して十分ではない。
【００１２】
従って、本発明の目的は、試薬の収率、コストおよび／または当量に関し改善した、マクロラクトンポリケチド、特にラパマイシンをアシル化する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、位置選択性を改善した、マクロラクトンポリケチドをアシル化する方法を提供することである。
【００１３】
本明細書における位置選択性は、化学的変化が起こる官能基を２つ以上有する分子の、特定の１つの官能基だけで起こる化学的変化の選択性であると理解されたい。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ピリジンである塩基の存在下、場合により追加の溶媒Ｓの存在下で、式
【００１５】
【化３】
0005998198.tif 000004
のアシル化剤でラパマイシンをアシル化する方法に関し、
式中、Ｒ４およびＲ５が同一または異なって、個々にアセタール、特にテトラヒドロピランの、またはカルボナートの残基またはシリルエーテルの残基であるか、または一緒になって、ボロナート、アセタールまたはケタール、好ましくは式ＩＩ
【００１６】
【化４】
0005998198.tif 000005
［式中、Ｒ６はそれぞれ個々にＨ、メチル、エチル、プロピル、フェニルであるか、または一緒になってシクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタンまたはシクロオクタン環を形成することができる］のケタールの残基となり、ならびに
Ｘがハロゲン、より具体的にはＦ、ＣｌまたはＢｒである。
【００１７】
本発明によれば、ラパマイシンのアシル化に関する転化および選択性を改善することができる。特に、ラパマイシンの４２位のアシル化では、高い選択性とともに転化率が改善されて高くなる。
【００１８】
種々のアシル化条件を評価するために、以下の基準を定義する。
転化は、３ａｒｅａ％／（３ａｒｅａ％＋１ａｒｅａ％）の比率を指す。
選択性は、３ａｒｅａ％／（３ａｒｅａ％＋４ａｒｅａ％）の比率を指す。
【００１９】
太字の数字は本明細書において後段で定義する化合物を指し、
ａｒｅａ％は、クロマトグラムの全ピークの総面積と比較した、特定の１つのピークの面積を指す。
【００２０】
収率は、精製および単離後に存在する純粋化合物の量を指し、画分モル（生成物）：モル（基質）と表示する。
【００２１】
用語、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、反応を観察中の化学種を指し、本明細書では通常、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体を指す。
【００２２】
用語、当量（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）は、基質に対する所与の化合物のモル比を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明に有用なアシル化剤を式Ｉに示す。一実施形態では、式Ｉの置換基は以下の意味：
Ｒ４、Ｒ５は式ＩＩ
【００２４】
【化５】
0005998198.tif 000006
のケタールであり、式ＩＩ中、
Ｒ６はそれぞれ個々にＨ、メチル、エチル、プロピル、フェニルであるか、または一緒になってシクロペンタン環またはシクロヘプタン環を形成することができ、
Ｘはハロゲン、好ましくはＢｒ、Ｆまたは最も好ましくはＣｌである
を有する。
【００２５】
好ましい実施形態では、置換基は以下の意味：
Ｒ４、Ｒ５は式ＩＩ
【００２６】
【化６】
0005998198.tif 000007
のケタールであり、式ＩＩ中、
Ｒ６はメチル、エチルであるか、または一緒になってシクロペンタン環またはシクロヘプタン環を形成し、
Ｘはハロゲン、好ましくはＢｒ、Ｆ、または最も好ましくはＣｌである
を有する。
【００２７】
特定の好ましい一実施形態では、アシル化剤は２，２，５−トリメチル［１，３］ジオキサン−５−カルボン酸クロリド（ＴＭＤＣ−Ｃｌ）である。
【００２８】
使用する塩基はピリジンである。
【００２９】
本方法で使用する塩基の当量は、１から１０当量、より好ましくは３から６当量であることができる。
【００３０】
アシル化は、溶媒、特に非プロトン性極性溶媒と定義される有機溶媒の存在下で実施するのが好ましい。有用な溶媒は、ＣＨ２Ｃｌ２、クロロホルム、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルアセタート、エチルアセタート、メチルプロピオナート、エチルプロピオナート、ｎ−プロピルアセタート、イソプロピルアセタート、またはこれらの混合物である。ピリジンは塩基および溶媒の両方に使用してもよい。
【００３１】
−５から２０℃、特に２から８℃の温度範囲でアシル化を実施してもよい。基質濃度は溶媒１リットル当たり０．０５から０．５モル、特に溶媒１リットル当たり０．１から０．３モルであってもよい。好ましい実施形態では、アシル化剤の１．０から１０当量、特に２．０から３．０当量を使用する。
【００３２】
好ましい一実施形態では、本発明は、最も好ましくは温度−５から２０℃、特に２から８℃で、塩基としてピリジンを用い、２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボン酸クロリドでラパマイシンの４２位をアシル化することに関する。
【００３３】
化合物３の精製
カラムクロマトグラフィーおよび結晶化のような標準的実験技法を使用して、アシル化化合物３の任意の精製を達成することができる。本発明の主題、即ちヘプタンと酢酸エチルとの混合物から得られる生成物の結晶化として、９０％を超える濃度で生成物を得ることができる。さらに、ビス−アシル化副産物の含有量は４．０％より低く、出発物質の含有量は０．０５％より低い。
【００３４】
以下は本発明の代表的な化合物の調製を例証するためのものである。
【００３５】
【化７】
0005998198.tif 000008
【００３６】
上に示す例証は、好ましい実施形態であり、生成物３の濃度は９５％を超えている。特定の好ましい実施形態では、化合物４の含有量は２．０％より低く、化合物１の含有量は０．０５％より低い。
【００３７】
このアシル化工程で得られる化合物の高純度／低不純物レベルは、保護基の除去によって得られる一連の反応生成物の純度にとって極めて重要である。特に、ビス−アシル化生成物の存在により、クロマトグラフィーおよび／または結晶化での除去が困難な不純物が生成物中に生じる。
【００３８】
さらなる実施形態では、化合物３の酸加水分解（脱保護）の反応生成物はテムシロリムス（２）である。
【００３９】
化合物４の加水分解から得られる副産物は、３１−（２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボキシラート）−テムシロリムスとして特徴付けられる化合物である。
【００４０】
化合物２の精製
化合物２の任意の精製は、カラムクロマトグラフィーおよび結晶化のような標準的実験技法を使用して達成することができる。本発明の主題、即ちヘプタンおよび酢酸エチルの混合物から得られる生成物の結晶化として、９０％を超える濃度で生成物を得ることができる。好ましい実施形態では、９５％を超える濃度である。特定の好ましい実施形態では、３１−（２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボキシラート）−テムシロリムスの含有量は、０．１５％より低い。
【００４１】
さらに純度を高めるために、ｐＨＰＬＣ（分取高性能液体クロマトグラフィー）による精製を使用して９８％を超える純度を達成することができる。前記方法によって、発酵に伴う副産物、即ち３６−デスメチル−３６−エチル−テムシロリムスを除去することも可能になる。本発明の好ましい実施形態では、３６−デスメチル−３６−エチル−テムシロリムスの含有量は、最終産物中０．１５ａｒｅａ％より低い。
【００４２】
これらの基準で、以下の実験を使用して種々の条件を調べた。
【実施例】
【００４３】
［実施例１］
２，２，５−トリメチル［１，３］ジオキサン−５−カルボン酸とのラパマイシン４２−エステル（３）
ラパマイシン１．００ｇを２から１０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中で溶解して表１に示した濃度を達成し、以下の表１に示した量の試薬および塩基と混合し、撹拌し、表１に示した温度で保存した。混合物は３日間、または反応制御が完全転化を示すまで撹拌した。アミン塩酸塩の沈殿物を濾過によって除去し、２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２でフィルターを洗浄した。２０ｍｌの水で濾液を洗浄し、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、減圧濃縮して最終産物を得た。
【００４４】
以下のアシル化試薬を使用した。表中、ＴＭＤＣは２，２，５−トリメチル［１，３］ジオキサン−５−カルボン酸を意味する。
【００４５】
【表１】
0005998198.tif 000009
【００４６】
以下の塩基を使用した。
【００４７】
【表２】
0005998198.tif 000010
【００４８】
反応パラメータおよび結果を以下の表１に記入した。
【００４９】
【表３】
0005998198.tif 000011
【００５０】
利点
この反応を成功させるためにはアシル化剤の組合せと塩基の両方が重要であった。例えば、ＴＭＤＣ−Ｃｌの組合せとピリジンがともに重要であることは、他のアシル化剤（表１）に関して得たデータと比較することによって明らかとなる。特に、先行技術で使用されたように、４，４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）および他のアミン塩基、ならびにこれらの組合せを使用すると選択性ははるかに低くなった。さらに温度も影響している。
【００５１】
表１は、転化および選択性に関する最も良好な結果が、本発明によって得られたことを示している。
【００５２】
［実施例２］
ラパマイシン４２−エステルと２，２，５−トリメチル［１，３］ジオキサン−５−カルボン酸（３）
５００ｍＬの３ツ口フラスコにラパマイシン（２５ｇ、２５．９８ｍｍｏｌ）を入れ、７０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を添加した。次いで、この溶液を５℃まで冷却した。別の容器で、ＴＭＤＣ−Ｃｌ（１２．５１ｇ、６４．９５ｍｍｏｌ）を２８ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、次いで、５℃まで冷却した。ピリジン（９．７３ｇ、１２２．１ｍｍｏｌ）を添加し、結果として生じた混合物をラパマイシン溶液に添加した。次いで、結果として生じた混合物を５℃で２４時間撹拌したが、この時ＨＰＬＣによる反応制御は９７％を超える転化を示していた。
【００５３】
（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液の添加により反応混合物をクエンチした。次いで、２００ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、二相混合物を減圧濃縮した。１００ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、２ＭのＨ２ＳＯ４の添加により反応混合物をｐＨ２に調整した。５分間撹拌した後、水層を分離し、廃棄した。次いで、有機層を５０ｍＬのＮａＨＣＯ３溶液および５０ｍＬの塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧濃縮して白色の泡を得た。
【００５４】
ヘプタン／酢酸エチル／１：１を使用して６６０ｇのＳｉＯ２上でカラムクロマトグラフィーにより精製を達成した。生成物を最初の体積の１／３まで濃縮したところで溶液は濁り始めた。種晶を添加し、この後さらに濃縮する。次いで、固形物を濾過し減圧乾燥して９５％を超える濃度で２１ｇ（７５％）の化合物３を得たが、２．０％未満の化合物４が混じっていた。
【００５５】
［実施例３］
テムシロリムス（２）
１８．３ｇの化合物３を１６０ｍＬのＴＨＦ中に溶解した。この溶解している溶液を５℃に冷却した。次いで３２ｍＬ、２ＭのＨ２ＳＯ４を添加し、この混合物を２４時間撹拌した。次いで、飽和ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を中和させ、合計２００ｍＬの酢酸エチルで抽出した。次いで、有機層を半飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮して白色の泡を得た。
【００５６】
ヘプタン／酢酸エチル／１：３を使用して６００ｇのＳｉＯ２上でカラムクロマトグラフィーにより精製を達成した。生成物を最初の体積の１／６まで濃縮し、溶液が濁り始めるまでヘプタンを反応容器に滴下した。種晶を添加し、この後、最初の体積の半分に達するまでヘプタンをさらに添加した。次いで、固形物を濾過し、減圧乾燥して１２．８５ｇ（７３％）の２を得た。
【００５７】
必要に応じて、ヘプタン：酢酸エチル６５：３５で溶解することにより、さらに２の精製を達成することができる。この後、ヘプタン：酢酸エチル６５：３５の混合物を流動相として使用して、順相シリカゲルＹＭＣ  ＳＬ０６Ｓ１１上でｐＨＰＬＣを実施した。ＵＶ検出法により溶出液を分画した後濃縮し、播種し、次いで、ヘプタンを添加して白色固形物として２を生じ、これを濾過によって単離して１０．５４ｇ（８２％）を得ることができる。
【００５８】
本発明はさらに以下の実施形態に関する。
【００５９】
（１）ピリジンである塩基の存在下、場合により追加の溶媒Ｓの存在下で、式
【００６０】
【化８】
0005998198.tif 000012
のアシル化剤でラパマイシンをアシル化する方法であって、
式中、Ｒ４およびＲ５が同一または異なって、個々にアセタール、特にテトラヒドロピランの、またはカルボナートの残基またはシリルエーテルの残基であるか、または一緒になって、ボロナート、アセタールまたはケタール、好ましくは式ＩＩ
【００６１】
【化９】
0005998198.tif 000013
［式ＩＩ中、Ｒ６はそれぞれ個々にＨ、メチル、エチル、プロピル、フェニルであるか、または一緒になってシクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタンまたはシクロオクタン環を形成することができる］のケタールの残基となり、ならびに
Ｘがハロゲン、より具体的にはＦ、ＣｌまたはＢｒである方法。
【００６２】
（２）項目１に記載の方法であって、溶媒ＳがＣＨ２Ｃｌ２、クロロホルム、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルアセタート、エチルアセタート、メチルプロピオナート、エチルプロピオン酸ナート、ｎ−プロピルアセタート、イソプロピルアセタートまたはこれらの混合物からなる群から選択される方法。
【００６３】
（３）項目１または２に記載の方法であって、式Ｉにおいて置換基が以下の意味を有し、
Ｒ４、Ｒ５は式ＩＩ
【００６４】
【化１０】
0005998198.tif 000014
のケタールであり、
Ｒ６はそれぞれ個々にＨ、メチル、エチル、プロピル、フェニルであるか、または一緒になってシクロペンタン環またはシクロヘプタン環を形成することができ、
Ｘがハロゲン、好ましくはＢｒ、Ｃｌ、Ｆまたは最も好ましくはＣｌである方法。
【００６５】
（４）項目１から３のいずれかに記載の方法であって、式Ｉの置換基は以下の意味を有し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はＨであり、
Ｒ４、Ｒ５は一緒になって式ＩＩ
【００６６】
【化１１】
0005998198.tif 000015
の基であり、
式ＩＩ中、Ｒ６がメチルであり、ＸがＣｌである方法。
【００６７】
（７）項目１から６までに記載の少なくとも１つの方法であって、アシル化を温度−５から２０℃、特に＋５℃±３℃で実施する方法。
【００６８】
（８）項目１から７までに記載の少なくとも１つの方法であって、アシル化される化合物の１ｍｏｌ当たり１．０から１０ｍｏｌ、特に２．０から３．０ｍｏｌのアシル化剤を使用する方法。
【００６９】
（９）項目１から８までの少なくとも１つに記載の方法であって、ピリジンの存在下で、２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボン酸クロリドを用いてラパマイシンの４２位をアシル化する方法。
【００７０】
（１０）項目１から９までに記載の少なくとも１つの方法であって、９５％を超える濃度で結晶性４２−ＴＭＤＣ−ＲＡＰＡを生成する方法。
【００７１】
（１１）項目（１０）に記載の方法であって、３１，４２−ＴＭＤＣ−ＲＡＰＡの含有量が２．０％より低く、ラパマイシンの含有量が０．０５％より低い方法。
【００７２】
（１２）項目１から１１までの少なくとも１つに定義されている方法によって得られる４２−ＴＭＤＣ−ＲＡＰＡを使用してテムシロリムスを合成する方法。
【００７３】
（１３）項目１０から１２に記載の少なくとも１つの方法によって得られる、または得られることができるテムシロリムス。
【００７４】
（１４）３１−（２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−カルボキシラート）−テムシロリムスを０．１５ａｒｅａ％未満含有しているテムシロリムス。
【００７５】
（１５）３６−デスメチル−３６−エチル−テムシロリムスを０．１５ａｒｅａ％未満含有しているテムシロリムス。