【手続補正書】
【提出日】平成23年6月28日(2011.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
【図１Ａ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測構造：マウスＣａｒ９遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ０４９０７７）のゲノム構造。
【図１Ｂ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測構造：マウス胃腸管系組織におけるＣａｒ９スプライシング変異体のＲＴ−ＰＣＲ［実施例に用いられるプライマーの配列に関しては下記表２を参照］。
【図１Ｃ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測構造：ＦＬ転写体およびＡＳ転写体の別々の増幅。
【図１Ｄ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測構造：ＦＬアミノ酸配列［配列番号７３］とＡＳアミノ酸配列［配列番号１０７］の比較。
【図１Ｅ】マウスＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測構造：マウスＡＳ ＣＡ ＩＸタンパク質の予測された構造。
【図２Ａ】マウスＡＳ ＣＡ ＩＸの免疫ブロット分析および局在化。マウスＡＳ ｃＤＮＡを含むｐＳＧ５Ｃ−ＡＳプラスミドは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＭＤＣＫ細胞にそれぞれ形質移入された：マウスＣＡ ＩＸに対してポリクローナル血清を用いるＡＳ形質移入細胞の免疫ブロットが、単一のＡＳ関連バンドを示す。
【図２Ｂ】マウスＡＳ ＣＡ ＩＸの免疫ブロット分析および局在化。マウスＡＳ ｃＤＮＡを含むｐＳＧ５Ｃ−ＡＳプラスミドは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＭＤＣＫ細胞にそれぞれ形質移入された：形質移入体の免疫蛍光分析が、マウスＡＳタンパク質の細胞内局在を示す。
【図３Ａ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測された構造：ヒトＣＡ９遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ５４３４９）のゲノム構造の略図。プライマー位置は、矢印により示される[実施例に用いられるプライマーの配列に関しては表２を参照]。選択的スプライシングにより排除されたエクソンは、暗灰色にある。
【図３Ｂ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測された構造：スプライシング変異体間を識別しないｈ１Ｓ−ｈ６Ａプライマー［配列番号９５および９６］を用いたヒト胃腸におけるＣＡ９のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図３Ｃ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測された構造：ｈ６Ｓ−ｈ１１Ａプライマー［配列番号９７および９８］を用いたヒト組織におけるＦＬとＡＳ双方の転写体の増幅。
【図３Ｄ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測された構造：ヒトＦＬおよびＡＳ ＣＡ９  ｃＤＮＡから推測されたアミノ酸配列［配列番号２および１０９］の比較。シグナルペプチド（ＳＰ）はイタリックで書かれ、プロテオグリカン様ドメイン（ＰＧ）は太字であり、炭酸脱水酵素ドメイン（ＣＡ）は実線で囲み、アミノ酸（ａａ）４１５で開始する膜貫通領域（ＴＭ）は破線で囲ってある。点線はＡＳで欠失したアミノ酸残基を表す。触媒亜鉛に結合するヒスチジンおよびＳ−Ｓ結合の形成に関与するシステインは、単独に破線で囲ってある。
【図３Ｅ】ヒトＣＡ ＩＸのスプライシング変異体の同定および予測された構造：ヒトＦＬおよびＡＳ ＣＡ ＩＸタンパク質の予測された構造。
【図４Ａ】スプライシング変異体、すなわちＦＬに関してはｈ７Ｓ−ｈ８Ａ［配列番号９９および１００］およびＡＳに関してはｈ７Ｓ−ｈ１０／７Ａ［配列番号９９および１０１］の個々の増幅のために設計されたプライマーを用いた（図３を参照）ヒトＡＳ ＣＡ９のＲＴ−ＰＣＲ分析による、ヒト腫瘍細胞株およびヒト組織におけるＡＳ ＣＡ ＩＸ変異体の発現。ベータ−アクチンを標品として用いた（図４Ｂおよび４Ｃにおいて同じ）：酸素正常状態（Ｎ）および低酸素状態（Ｈ）に４８時間露出させた細胞からｃＤＮＡを単離した。この結果は、ＡＳ発現が安定しており、低酸素状態に依存しないことを示している。
【図４Ｂ】低密度および高密度で７２時間インキュベートした細胞からｃＤＮＡを単離した。この結果は、ＡＳ発現が安定しており、密度に依存しないことを示している。
【図４Ｃ】正常および腫瘍ヒト組織からｃＤＮＡを単離した。この結果は、ＡＳ発現が安定しており、腫瘍表現型に依存しないことを示している。
【図５Ａ】ヒトＡＳ ＣＡ ＩＸの局在化およびオリゴメリ化を示す図。ＦＬ ＣＡ ＩＸの天然の低酸素状態により誘導された発現を有するＣＡ ＩＸ陰性ＭＤＣＫ細胞およびＨｅＬａ細胞に、ｐＳＧ５Ｃプラスミド内のＡＳＣＡ９ ｃＤＮＡを持続的に形質移入した：ＡＳ形質移入（ＡＳ）、ＦＬ形質移入（ＦＬ）および対照細胞（モック）の免疫蛍光分析を、ＡＳおよびＦＬタンパク質の双方を認識するＭ７５ ｍａｂを用いて実施した。
【図５Ｂ】ヒトＡＳ ＣＡ ＩＸの局在化およびオリゴメリ化を示す図。ＦＬ ＣＡ ＩＸの天然の低酸素状態により誘導された発現を有するＣＡ ＩＸ陰性ＭＤＣＫ細胞およびＨｅＬａ細胞に、ｐＳＧ５Ｃプラスミド内のＡＳＣＡ９ ｃＤＮＡを持続的に形質移入した：ＨｅＬａ−ＡＳ細胞および対照ＨｅＬａ細胞からのタンパク質抽出物および培地の免疫ブロット分析。ＡＳ ＣＡ ＩＸ変異体は、ＡＳ形質細胞の抽出物ならびに培地中のＭ７５ ｍａｂにより検出された。
【図６Ａ】オリゴマーを形成するＦＬおよびＡＳスプライシング変異体の能力：非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭ７５による免疫ブロットにより、ＡＳがオリゴマーを形成できないことを示した。
【図６Ｂ】オリゴマーを形成するＦＬおよびＡＳスプライシング変異体の能力：ＭＡｂＶ／１０（ＡＳは認識しないが、ＦＬを認識する）またはＭ７５（双方の変異体を認識する）で抽出されたＨｅＬａ−ＡＳ抽出物からの免疫沈降によるオリゴマー中のスプライシング変異体の検出。沈降されたオリゴマーの成分は、ペルオキシダーゼ標識Ｍ７５を用いて可視化した。
【図７Ａ】酸性化、阻害剤結合およびスフェロイド形成に対する過剰発現ＡＳ変異体の効果：ＡＳ形質移入ＨｅＬａ細胞および関連するモック形質移入対照を、それぞれ酸素正常状態および低酸素状態で４８時間インキュベートし、細胞外ｐＨを、実験の終了直後に培地中で測定した。データは、低酸素状態の細胞対酸素正常状態の細胞で測定されたｐＨ値間の差異（ΔｐＨ）として表され、標準偏差を含む。結果は、ＡＳの発現が、低酸素状態でＦＬ ＣＡ ＩＸタンパク質により媒介される酸性化を減少させることを示す。
【図７Ｂ】酸性化、阻害剤結合およびスフェロイド形成に対する過剰発現ＡＳ変異体の効果：ヒトＦＬ ＣＡ ＩＸタンパク質を構成的に発現するＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ形質移入細胞を、ＭＤＣＫ−ＡＳ形質移入体からの調整培地を添加した分泌ＡＳ変異体の不在下（対照）または存在下、蛍光ＣＡ阻害剤（ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉ）により４８時間処理した図である。調整培地を、新鮮な培地と混合した。ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉは低酸素状態の細胞にのみ結合し、ＡＳタンパク質の存在下でかなり減少した。
【図７Ｃ】酸性化、阻害剤結合およびスフェロイド形成に対する過剰発現ＡＳ変異体の効果：同じ実験を、ＭＤＣＫ−ＡＳ細胞からの調整培地の半分（１／２ＡＳ）または三分の一（１／３ＡＳ）のいずれかで繰り返し実施した。ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉと対応する蛍光との結合は、シオン（Ｓｃｉｏｎ）画像ソフトウェアを用いて獲得された画像から評価した。データは、ＡＳの不在下、ＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉと共にインキュベートされた低酸素状態のＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞により示された陽性対照のパーセンテージとして表示された。その結果、ＡＳがＣＡ ＩＸに対するＦＩＴＣ−ＣＡ Ｉの結合を減少させることが確認された。
【図７Ｄ】酸性化、阻害剤結合およびスフェロイド形成に対する過剰発現ＡＳ変異体の効果：対照のモック形質移入ＨｅＬａ細胞およびＡＳ形質移入ＨｅＬａ細胞それぞれから増殖させたスフェロイドの顕微鏡画像。対照のＨｅＬａ細胞は、低酸素状態誘導の機能性ＦＬ ＣＡ ＩＸタンパク質を発現し、コンパクトコアを形成するスフェロイドを生じる。低酸素誘導のＦＬ ＣＡ ＩＸおよび構成的に発現したＡＳ双方を含むＨｅＬａ−ＡＳ細胞は、ルースコアを含むが、これは恐らくＦＬの機能がＡＳにより損なわれるため、低酸素コア細胞の生存減少に至ったためと思われる。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｃは、本明細書に記載される、単離されたＭＮ ｃＤＮＡ［配列番号１］クローンのヌクレオチド配列である。また、ｃＤＮＡによりコードされた予測アミノ酸配列［配列番号２］も示している。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｃは、本明細書に記載される、単離されたＭＮ ｃＤＮＡ［配列番号１］クローンのヌクレオチド配列である。また、ｃＤＮＡによりコードされた予測アミノ酸配列［配列番号２］も示している。
【図８Ｃ】図８Ａ〜Ｃは、本明細書に記載される、単離されたＭＮ ｃＤＮＡ［配列番号１］クローンのヌクレオチド配列である。また、ｃＤＮＡによりコードされた予測アミノ酸配列［配列番号２］も示している。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｆは、本明細書に記載される、単離されたＭＮ ｃＤＮＡ［配列番号１］クローンのヌクレオチド配列である。ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｄ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｅ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図９Ｆ】図９Ａ〜Ｆは、ＭＮ［配列番号３］の１０，８９８ｂｐの完全ゲノム配列。塩基数は以下のとおりである：２６５４のＡ；２７３９のＣ；２６４５のＧ；および２８５９のＴ。１１のエクソンは、一般に大文字で示されるが、エクソン１は、ＲＮアーゼ保護アッセイにより測定されたように３５０７位で開始されると考えられている。
【図１０】ヒトＭＮ遺伝子［配列番号２４］の提案されたプロモーターに関するヌクレオチド配列。このヌクレオチドは、ＲＮアーゼ保護アッセイにしたがって転写開始部位から番号が付けられる。調節要素として可能性のあるものを上線で示している。転写開始部位は、星印（ＲＮアーゼ保護）および対応するヌクレオチド上に点（ＲＡＣＥ）で示される。第一のエクソンの配列は、星印のもとで開始する。ＭＮ４プロモーター断片のＦＴＰ分析により、コード鎖および非コード鎖双方で保護された５つの領域（Ｉ〜Ｖ）、および非コード鎖は保護されないが、コード鎖において保護された２つの領域（ＶＩおよびＶＩＩ）が明らかとなった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
ＣＡ ＩＸのマウススプライス変異体の同定、構造および発現
マウス組織におけるＣａｒ９  ｍＲＮＡの発現に関する以前の逆転写（ＲＴ）ＰＣＲデータは、エクソン１〜６の増幅に基づいていた。しかし、エクソン６〜１１にわたる領域を増幅するために、プライマーｍ６Ｓおよびｍ１１Ａを用いたＣａｒ９ ｍＲＮＡのＲＴ ＰＣＲ分析により、２つの増幅産物、すなわち、１つは予想された大きさのＰＣＲ産物、もう１つはそれよりも小さい産物の存在が判明した（図１Ａ、１Ｂ）。この小さいＰＣＲ産物の配列決定により、そのＣａｒ９特異性が証明され、それが、エクソン７および８を欠く、マウスＣａｒ９ ｍＲＮＡの選択的スプライシング（ＡＳ）変異体（配列番号１０６）であることが示された。このマウスＡＳ変異体は、分析した３つの組織、胃、小腸および結腸全てに見られた（図１Ｂ）。対応する一対のプライマー（野性型に対してはｍ８Ｓ〜ｍ１０ＡおよびＡＳに対してはｍ６／９Ｓ〜ｍ１０Ａ）を用いたＣａｒ９の野生型およびＡＳ変異体の個々のＲＴ ＰＣＲ増幅により、分析した組織において、双方の産物が同時に存在することが確認された（図１Ｃ）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
ＡＳ変異体配列のコンピュータ解析により、推定タンパク質（配列番号１０７）は、完全長マウスＣＡ ＩＸより約６ｋＤａだけ小さく、その予測分子量は４８ｋＤａであることが示された。スプライシング変異体は、触媒的（ＣＡ）ドメインのＣ末端部分および膜貫通アンカーの上流の領域を欠く一方、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインは完全のままである、アミノ酸３３５〜３７９を欠失したタンパク質をコードする能力を有する（図１Ｄ、１Ｅ）。