【手続補正書】
【提出日】平成23年5月20日(2011.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のポリペプチドをコードする核酸配列を含む培養された遺伝子改変された生物:
ここで、
(a)該第一のポリペプチドは1500 アミノ酸残基以下であり、配列番号64-69、98-102、116-120、150-229および478-483からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む;または、
(b)該第一のポリペプチドは以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む: 
(i) 配列番号2、配列番号4、配列番号12、および配列番号18; 
(ii) 配列番号2、配列番号4、配列番号12、および配列番号18のホモログ; 
(iii) 配列番号2、配列番号4、配列番号12、および配列番号18の保存的変異体であって、それぞれが以下からなる群から選択される１以上の保存的アミノ酸置換を含むもの：Ala から Cys、Gly、または Ser; Arg から Ile、Lys、Met、または Orn; Asn から Asp、Gln、Glu、または His; Asp から Asn、Gln、または Glu; Cys から Met、Ser、または Thr; Gln から Asn、Asp、または Glu; Glu から Asn、Asp、または Gln; Gly から Acp、Ala、または Pro; His から Asn または Gln; Ile から Leu、Met、または Val; Leu から Ile、Met、または Val; Lys から Arg、Gln、Glu、Ile、Met または Orn; Met から Cys、Ile、Leu、または Val; Phe から His、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または 5-フェニルプロリン; Pro から L-1-チオアゾリジン-4-カルボン酸 または D- または L-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; Ser から Cys、Met、または Thr; Thr から Met、Ser、または Val; Trp から Tyr; Tyr から L-Dopa、His、または Phe;およびVal から Ile、Leu、または Met; および、
(iv)配列番号2、配列番号4、配列番号12、および配列番号18と少なくとも35%の配列同一性を有する配列、
ここで、該培養された組換え生物は脂肪族ケトンまたは炭化水素を生産する。
【請求項２】
核酸配列が以下からなる群から選択される請求項 1の培養された遺伝子改変された生物: 
(a) 配列番号1、配列番号3、配列番号11、および配列番号17;
(b)配列番号1、配列番号3、配列番号11、および配列番号17に対して少なくとも 80%の同一性を有する配列;
(c)配列番号1、配列番号3、配列番号11、および配列番号17に対して少なくとも 90%の同一性を有する配列;および、
(d)配列番号1、配列番号3、配列番号11、および配列番号17に対して少なくとも 95%の同一性を有する配列。
【請求項３】
改変された生物が第二のポリペプチドをコードする核酸をさらに含む請求項 1の培養された遺伝子改変された生物であって、ここで:
(a)該第二のポリペプチドが1500 アミノ酸残基以下であり、配列番号72-74、103-108、121-126、および327-402からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む; または、
(b)該第二のポリペプチドが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する:
(i) 配列番号6、配列番号14、配列番号20、および配列番号88; 
(ii) 配列番号6、配列番号14、配列番号20、および配列番号88のホモログ; 
(iii)配列番号6、配列番号14、配列番号20、および配列番号88の保存的変異体であって、それぞれが以下からなる群から選択される１以上の保存的アミノ酸置換を含むもの：Ala から Cys、Gly、または Ser; Arg から Ile、Lys、Met、または Orn; Asn から Asp、Gln、Glu、または His; Asp から Asn、Gln、または Glu; Cys から Met、Ser、または Thr; Gln から Asn、Asp、または Glu; Glu から Asn、Asp、または Gln; Gly から Acp、Ala、または Pro; His から Asn または Gln; Ile から Leu、Met、または Val; Leu から Ile、Met、または Val; Lys から Arg、Gln、Glu、Ile、Met または Orn; Met から Cys、Ile、Leu、または Val; Phe から His、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または 5-フェニルプロリン; Pro から L-1-チオアゾリジン-4-カルボン酸 または D- または L-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; Ser から Cys、Met、または Thr; Thr から Met、Ser、または Val; Trp から Tyr; Tyr から L-Dopa、His、または Phe;および Val から Ile、Leu、または Met; および、
(iv)配列番号6、配列番号14、配列番号20、および配列番号88と少なくとも35%の配列同一性を有する配列。
【請求項４】
改変された生物がさらに以下から選択される核酸配列を含む請求項 1の培養された遺伝子改変された生物: 
(a) 配列番号5、配列番号13、配列番号19 および配列番号87;
(b)配列番号5、配列番号13、配列番号19 および配列番号87に対して少なくとも 80%の配列同一性を有する配列;
(c)配列番号5、配列番号13、配列番号19 および配列番号87に対して少なくとも 90%の配列同一性を有する配列;および、
(d)配列番号5、配列番号13、配列番号19 および配列番号87に対して少なくとも 95%の配列同一性を有する配列。
【請求項５】
改変された生物が第三のポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項 1 または 3の培養された遺伝子改変された生物であって、ここで:
(a)該第三のポリペプチドが1500 アミノ酸残基以下であり、配列番号70-71、109-115、127-133、142-149および403-487からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む; または 
(b)該第三のポリペプチドが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む: 
(i) 配列番号8、配列番号16、および配列番号22; 
(ii)配列番号8、配列番号16、および配列番号22のホモログ; 
(iii)配列番号8、配列番号16、および配列番号22の保存的変異体であって、それぞれ以下からなる群から選択される１以上の保存的アミノ酸置換を含むもの：Ala から Cys、Gly、または Ser; Arg から Ile、Lys、Met、または Orn; Asn から Asp、Gln、Glu、または His; Asp から Asn、Gln、または Glu; Cys から Met、Ser、または Thr; Gln から Asn、Asp、または Glu; Glu から Asn、Asp、または Gln; Gly から Acp、Ala、または Pro; His から Asn または Gln; Ile から Leu、Met、または Val; Leu から Ile、Met、または Val; Lys から Arg、Gln、Glu、Ile、Met または Orn; Met から Cys、Ile、Leu、または Val; Phe から His、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または 5-フェニルプロリン; Pro から L-1-チオアゾリジン-4-カルボン酸 または D- または L-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; Ser から Cys、Met、または Thr; Thr から Met、Ser、または Val; Trp から Tyr; Tyr から L-Dopa、His、または Phe; およびVal から Ile、Leu、または Met;および、
(iv)配列番号8、配列番号16、および配列番号22と少なくとも35%の配列同一性を有する配列。
【請求項６】
該核酸がさらに以下から選択される核酸配列を含む請求項 2 または 4の培養された遺伝子改変された生物: 
(a) 配列番号7、配列番号15、および配列番号23;
(b) 配列番号7、配列番号15、および配列番号23に対して少なくとも 80%の配列同一性を有する配列;
(c)配列番号7、配列番号15、および配列番号23に対して少なくとも 90%の配列同一性を有する配列;および、
(d)配列番号7、配列番号15、および配列番号23に対して少なくとも 95%の配列同一性を有する配列。
【請求項７】
該核酸がさらに第四のポリペプチドをコードする請求項 1、3 または 5の培養された遺伝子改変された生物であって、ここで: 
(a)該第四のポリペプチドが1500 アミノ酸残基以下であり、配列番号91-97、配列番号135-141、および配列番号230-326からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む; または、
(b)該第四のポリペプチドが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む: 
(i) 配列番号10; 
(ii) 配列番号10のホモログ; 
(iii)配列番号10の保存的変異体であって、それぞれ以下からなる群から選択される１以上の保存的アミノ酸置換を含むもの：Ala から Cys、Gly、または Ser; Arg から Ile、Lys、Met、または Orn; Asn から Asp、Gln、Glu、または His; Asp から Asn、Gln、または Glu; Cys から Met、Ser、または Thr; Gln から Asn、Asp、または Glu; Glu から Asn、Asp、または Gln; Gly から Acp、Ala、または Pro; His から Asn または Gln; Ile から Leu、Met、または Val; Leu から Ile、Met、または Val; Lys から Arg、Gln、Glu、Ile、Met または Orn; Met から Cys、Ile、Leu、または Val; Phe から His、L-Dopa、Leu、Met、Thr、Trp、Tyr、3-フェニルプロリン、4-フェニルプロリン、または 5-フェニルプロリン; Pro から L-1-チオアゾリジン-4-カルボン酸 または D- または L-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸; Ser から Cys、Met、または Thr; Thr から Met、Ser、または Val; Trp から Tyr; Tyr から L-Dopa、His、または Phe; および Val から Ile、Leu、または Met; および、
(iv)配列番号10と少なくとも35%の配列同一性を有する配列。
【請求項８】
改変された生物がさらに以下からなる群から選択される核酸配列を含む請求項2、4、および6のいずれかの培養された遺伝子改変された生物: 
(a) 配列番号9; 
(b) 配列番号9に対して少なくとも80%の配列同一性を有する配列;
(c)配列番号9に対して少なくとも 90 %の配列同一性を有する配列;および、
(d)配列番号9に対して少なくとも 95%の配列同一性を有する配列。
【請求項９】
核酸が、細菌、植物、昆虫、酵母、真菌、藻類、または動物から単離されたものである請求項1-8のいずれかの培養された遺伝子改変された生物。
【請求項１０】
生物が、酵母細胞、真菌細胞、動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、藻類細胞、または 植物細胞である請求項1-9のいずれかの培養された遺伝子改変された生物。
【請求項１１】
生物が:
(a) 以下の属から選択される：Escherichia、Bacillus、Lactobacillus、Rhodococcus、Pseudomonas、Aspergillus、Trichoderma、Neurospora、Fusarium、Humicola、Rhizomucor、Kluyveromyces、Pichia、Mucor、Myceliophtora、Penicillium、Phanerochaete、Pleurotus、Trametes、Chrysosporium、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Stenotrophamonas、Kineococcus、Yarrowia、またはStreptomyce; 
(b)以下からなる群から選択される:Bacillus lentus 細胞、Bacillus brevis 細胞、Bacillus stearothermophilus 細胞、Bacillus licheniformis 細胞、Bacillus alkalophilus 細胞、Bacillus coagulans 細胞、Bacillus circulans 細胞、Bacillus pumilis 細胞、Bacillus thuringiensis 細胞、Bacillus clausii 細胞、Bacillus megaterium 細胞、Bacillus subtilis 細胞、Bacillus amyloliquefaciens 細胞、Trichoderma koningii 細胞、Trichoderma viride 細胞、Trichoderma reesei 細胞、Trichoderma longibrachiatum 細胞、Aspergillus awamori 細胞、Aspergillus fumigates 細胞、Aspergillus foetidus 細胞、Aspergillus nidulans 細胞、Aspergillus niger 細胞、Aspergillus oryzae 細胞、Humicola insolens 細胞、Humicola lanuginose 細胞、Rhizomucor miehei 細胞、またはMucor michei 細胞、Streptomyces lividans 細胞またはStreptomyces murinus 細胞、Actinomycetes 細胞、およびEscherichia coli 細胞; 
(c)以下からなる群から選択される:Stenotrophomonas maltophilia 細胞、Kineococcus radiotolerans 細胞、Bacillus megaterium 細胞、およびSaccharomyces cerevisiae 細胞、Anaeromyxobacter sp. FwI 09-5 細胞、Arthrobacter aurescens 細胞、Arthrobacter chlorophenolicus 細胞、Arthrobacter sp. FB24 細胞、Bdellovibrio bacteriovorus 細胞、Blastopirellula marina 細胞、Brevibacterium linens 細胞、Burkholderia ambifaria 細胞、Burkholderia cenocepacia 細胞、Burkholderia oklahomensis 細胞、Burkholderia pseudomallei 細胞、Burkholderia sp. 383 細胞、Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 細胞、Chloroflexus aggregans 細胞、Chloroflexus aurantiacus 細胞、Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 細胞、Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus 細胞、Clostridium botulinum A 細胞、Clostridium botulinum A3 細胞、Clostridium botulinum B1 細胞、Clostridium botulinum Bf 細胞、Clostridium botulinum F 細胞、Clostridium botulinum 細胞、Colwellia psychrerythraea 細胞、Congregibacter litoralis 細胞、Desulfatibacillum alkenivorans 細胞、Desulfococcus oleovorans 細胞、Desulfotalea psychrophila 細胞、Desulfuromonas acetoxidans 細胞、Flavobacteriales bacterium 細胞、Gemmata obscuriglobus 細胞、Geobacter bemidjiensis 細胞、Geobacter lovleyi 細胞、Geobacter sp. FRC-32 細胞、Geobacter uraniumreducens 細胞、Hahella chejuensis 細胞、Jannaschia sp. CCS1 細胞、Kineococcus radiotolerans 細胞、Lentisphaera araneosa 細胞、Maricaulis maris 細胞、Marinobacter algicola 細胞、Marinobacter aquaeolei 細胞、Micrococcus luteus 細胞、Microscilla marina 細胞、Moritella sp. PE36 細胞、Mycobacterium avium 細胞、Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis 細胞、Mycobacterium marinum 細胞、Mycobacterium sp. GP1 細胞、Mycobacterium tuberculosis 細胞、Mycobacterium vanbaalenii 細胞、Neisseria gonorrhoeae 細胞、Nocardia farcinica 細胞、Opitutaceae bacterium 細胞、Opitutus terrae 細胞、Paenibacillus sp. JDR-2 細胞、Pelobacter propionicus 細胞、Photobacterium profundum 細胞、Photobacterium profundum 細胞、Photorhabdus luminescens subsp. laumondii 細胞、Planctomyces maris 細胞、Plesiocystis pacifica 細胞、Pseudoalteromonas atlantica 細胞、Psychromonas ingrahamii 細胞、Psychromonas sp. CNPT3 細胞、Ralstonia pickettii 細胞、Rhodococcus rhodochrous 細胞、Rhodococcus sp. 細胞、Rhodopirellula baltica 細胞、Roseovarius nubinhibens 細胞、Shewanella amazonensis 細胞、Shewanella baltica 細胞、Shewanella benthica 細胞、Shewanella denitrificans 細胞、Shewanella frigidimarina 細胞、Shewanella halifaxensis 細胞、Shewanella loihica 細胞、Shewanella oneidensis 細胞、Shewanella pealeana 細胞、Shewanella putrefaciens 細胞、Shewanella sediminis 細胞、Shewanella sp. ANA-3 細胞、Shewanella sp. MR-4 細胞、Shewanella sp. MR-7 細胞、Shewanella sp. W3-18-1 細胞、Shewanella woodyi 細胞、Stenotrophomonas maltophilia 細胞、Streptomyces ambofaciens 細胞、Xanthomonas axonopodis 細胞、Xanthomonas campestris 細胞、Xanthomonas oryzae 細胞、およびXylella fastidiosa 細胞、または、
(d)以下からなる群から選択される：CHO 細胞、COS 細胞、VERO 細胞、BHK 細胞、HeLa 細胞、Cv1 細胞、MDCK 細胞、293 細胞、3T3 細胞、およびPC12 細胞、
請求項 10の培養された遺伝子改変された生物。
【請求項１２】
生物が、株 B、株 C、株 K、または 株 WのEscherichia coli 細胞である請求項 11の培養された遺伝子改変された生物。
【請求項１３】
生物が、以下からなる群から選択される脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子における変化を含む、請求項1〜12のいずれかの培養された遺伝子改変された生物: 
(a)アシル-CoA デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失;
(b)アシル-CoA デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における突然変異;
(c)チオエステラーゼをコードする遺伝子における欠失;および、
(d)チオエステラーゼをコードする遺伝子における突然変異。
【請求項１４】
生物が、アシル-CoA シンターゼおよび/またはチオエステラーゼをさらに含む請求項1〜13のいずれかの培養された遺伝子改変された生物。
【請求項１５】
生物が炭化水素を生産し、好ましくは炭化水素がオレフィンであり、該炭化水素が生物によって分泌されてもよい、請求項1〜14のいずれかの培養された遺伝子改変された生物。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれかの遺伝子改変された生物を基質とともに、炭化水素を生産するのに十分な条件下で培養することを含み、基質が、炭素源、脂肪酸、アシル-CoA、アシル-AMP、アシル-ACP、α-アルキル-β-ケト酸、α-アルキル-β-ケトエステル、または脂肪族ケトンである、炭化水素の生産方法。
【請求項１７】
遺伝子改変された生物の生産性が少なくとも3 mg/L/OD600、少なくとも5 mg/L/OD600、少なくとも8 mg/L/OD600、少なくとも15 mg/L/OD600、少なくとも20 mg/L/OD600、または 少なくとも30 mg/L/OD600である請求項 16の方法。
【請求項１８】
遺伝子改変された生物からまたは遺伝子改変された生物が培養されている培地から炭化水素を単離することをさらに含む請求項 16 または 17の方法。
【請求項１９】
炭化水素が飽和のものである請求項16〜18のいずれかの方法。
【請求項２０】
炭化水素がモノ不飽和またはポリ不飽和のものである請求項16〜18のいずれかの方法。
【請求項２１】
炭化水素が10〜40炭素または 17〜34炭素の炭素鎖長を有する請求項16〜20のいずれかの方法。
【請求項２２】
遺伝子改変された生物が脂肪族ケトンを生産する請求項1〜14のいずれかの培養された遺伝子改変された生物。
【請求項２３】
請求項 22の遺伝子改変された生物を基質とともに、脂肪族ケトンを生産するのに十分な条件下で培養することを含む脂肪族ケトンの生産方法。
【請求項２４】
遺伝子改変された生物の生産性が、少なくとも0.1 mg/L/OD600、少なくとも1 mg/L/OD600、少なくとも3 mg/L/OD600、少なくとも6 mg/L/OD600、少なくとも9 mg/L/OD600、少なくとも9 mg/L/OD600、または 少なくとも12 mg/L/OD600である請求項23の方法。
【請求項２５】
遺伝子改変された生物からまたは遺伝子改変された生物が培養されている培地から脂肪族ケトンを単離することをさらに含む請求項 23 または 請求項 24の方法。
【請求項２６】
脂肪族ケトンが、10〜40炭素または 19〜31炭素の炭素鎖長を有する請求項23-25のいずれかの方法。
【請求項２７】
炭化水素を生産するのに十分な条件下で、
(a) 基質を OleAおよび OleC、および所望により OleBとともにインキュベートすること;
(b) 基質をOleAおよびOleD、および所望により OleBとともにインキュベートすること;
(c) 基質をOleA、OleCおよびOleD、および所望によりOleBとともにインキュベートすること; または 
(d)基質をOleA、OleB、OleC、および OleDとともにインキュベートすること、
を含む、オレフィンなどの炭化水素の生産方法。