【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年4月19日(2011.4.19)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】膜タンパク質抽出のためのイオン性液体の使用
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体サンプルからの膜タンパク質抽出のための、イオン性液体、または、少なくとも１種のイオン性液体と少なくとも１種のさらなる溶媒とを含む混合物の使用、膜タンパク質抽出のための方法、これらのタンパク質の抽出用キット、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、特に膜タンパク質の検出または分析は、薬剤において、重要性を増しつつある。医薬研究において調査されるシステムの大部分は、膜タンパク質を含む。膜タンパク質は、数多くの生物学的機能において特に重要である。したがって、多くの膜タンパク質は、病気の進行において重要な役割を果たし、よって、これらの機能の理解は、薬剤の開発において、重要性を増している。したがって、これらのタンパク質の構造特性および機能に関する情報は、メカニズムの理解の基礎となる。
【０００３】
膜タンパク質、特に膜貫通型タンパク質は、疎水性領域を有し、したがって、膜に固定され、そして水において低い溶解性を有する。タンパク質のin-vitro分析を促進するために、膜タンパク質を通常、界面活性剤（Detergentien）の添加により溶解する。しかしながら、界面活性剤による膜タンパク質の遊離は、界面活性剤の影響により、タンパク質の自然構造が変性するという深刻な不利益を有する。一般的な界面活性剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのアニオン性特質、または例えば、Triton-X 100などの非イオン性特質のいずれかである。ＳＤＳの使用は、全てのタンパク質の、したがって膜タンパク質の完全な変性をもたらす、すなわち、膜タンパク質の構造および機能の調査は不可能であるか、または非常に制限された範囲でのみ可能である。Triton-X 100は、効果的に膜タンパク質、特に複数回膜貫通型タンパク質を抽出することが不可能であり、よって望ましい調査を行うことが全くできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、膜タンパク質を生体サンプルから抽出でき、これらをさらに分析できる方法を提供することを目的とする。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
したがって、本発明は、生体サンプルからの膜タンパク質抽出のための、少なくとも１種のイオン性液体、または好ましくは、少なくとも１種のイオン性液体と少なくとも１種のさらなる溶媒とを含む混合物の使用に関する。
【０００６】
好ましい態様において、イオン性液体およびさらなる溶媒を少なくとも含む混合物を抽出のために用いる。
さらなる好ましい態様において、さらなる溶媒は水である。よって、本発明に従って、水溶解性イオン性液体が特に好ましく用いられる。
【０００７】
さらなる好ましい態様において、膜タンパク質は、２または３以上の膜貫通数(transmembrane passage)を有するタンパク質である。
さらなる好ましい態様において、生体サンプルは、組織、細胞、細胞培養物および／または体液、細菌、真菌、ウイルスもしくは植物である。
【０００８】
本発明はまた、好ましくは未変性の、生体サンプルから膜タンパク質を抽出するための方法に関し、これは一般式Ｋ＋Ａ−の少なくとも１種のイオン性液体、または好ましくは一般式Ｋ＋Ａ−の少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物を、任意に機械的作用で、好ましくは未変性の、生体サンプルに添加することを特徴とする。
好ましい態様において、前もって生体サンプルを溶解する。
【０００９】
特に好ましい態様において、生体サンプルの溶解を、界面活性剤、表面活性物質またはポア形成剤の添加によって行う。
好ましい態様において、機械的作用を、振とうまたは攪拌によって達成する。
【００１０】
さらなる好ましい態様において、イオン性液体のアニオンＡ−は、ハロゲン化物、テトラフルオロホウ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、または一般式［Ｎ（Ｒｆ）２］−もしくは一般式［Ｎ（ＸＲｆ）２］−、式中Ｒｆは部分的にまたは完全にフッ素置換された１〜８Ｃ原子を有するアルキルを意味し、ＸはＳＯ２またはＣＯを意味する、のイミドを含む群から選択される。
【００１１】
さらなる好ましい態様において、イオン性液体のカチオンＫ＋は、アンモニウム、ホスホニウム、ウロニウム（uronium）、チオウロニウム（thiouronium）、グアニジニウムカチオンまたは複素環カチオンを含む群から選択される。
さらなる好ましい態様において、複素環カチオンは、モルホリニウムカチオンまたはイミダゾリウムカチオンである。
【００１２】
さらなる好ましい態様において、抽出を４〜３７℃の温度で行う。
さらなる好ましい態様において、少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物におけるイオン性液体の濃度は、０．０２〜５重量％である。
【００１３】
さらなる好ましい態様において、イオン性液体は、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルモルホリニウムビストリフルオロメチスルホニルイミド、４−（２−メトキシエチル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−メチル−４−プロピルモルホリニウム臭化物、４−（２−エトキシエチル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−（３−メトキシプロピル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−ブチル−４−プロピルモルホリニウム臭化物、トリヘキシル（テトラデシル）−ホスホニウムテトラフルオロホウ酸塩、１−デシル−３−メチルイミダゾリウム臭化物、１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、３−メチル−１−オクタデシルイミダゾリウムヘキサフルオロリン酸塩またはこれらの混合物から選択される。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも１種のイオン性液体または好ましくは少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒ならびに、界面活性剤、表面活性物質および／またはポア形成剤の群から選択される少なくとも１種の溶解剤を含む混合物を含む、本発明の方法によって膜タンパク質を抽出するためのキットに関する。
【００１５】
本発明はまた、生体サンプルからの膜タンパク質抽出のための本発明によるキットの使用に関する。
【００１６】
本発明の最も重要な点は、本発明による方法および本発明によるキットが、膜タンパク質、特にマルチパス膜タンパク質を、穏やかに、それらの構造を可能な限り保持して、抽出するために適していることである。膜貫通ドメインが膜の疎水性環境から除去された場合、膜からの抽出の後、タンパク質の３Ｄ構造が不可避的に変わるので、特にマルチパス膜タンパク質の場合、膜からの機能保持抽出物は実質的に不可能であることは当業者に知られている。本発明によるマルチパス膜タンパク質の抽出に関し、用語「未変性（native）」は、したがって、抽出した膜タンパク質は、一般的にそれらの機能を保持して抽出されてはいないが、穏やかに、それらの構造を可能な限り保持して、抽出されることを意味する。例えば、本発明による抽出は、特に、タンパク質の膜貫通ドメインの、質量分光学的および免疫学測定を可能にする。従来の方法、例えば、Triton-X100、Nonidet P40または基準として用いられる他の界面活性剤での抽出を用いて、タンパク質収率および調査されるタンパク質の機能の保持の観点において、同程度の内容は不可能である。
【００１７】
それらの機能または活性とは無関係の部分でのみ膜に固定される膜タンパク質、例えば、ＧＰＩアンカータンパク質の場合、本発明による「未変性」抽出は、タンパク質を、実質的にその構造および活性を保持して、抽出することができることを意味する。例えば、この場合、タンパク質の検出のために、対応する活性測定を行うことができる。
【００１８】
未変性サンプルは、抽出される膜タンパク質が、実質的に依然として未変性配置構造、すなわち、それらの本来の機能に必要な配置構造であるサンプル、または膜タンパク質が依然として活性を示すサンプルである。
【００１９】
本発明による膜タンパク質の抽出は、当業者に既知の全ての生体サンプルから行うことが出来る。生体サンプルは好ましくは、例えば、生検および組織プレパラートなどの組織、細胞、細胞培養物および／または例えば、血液、尿、髄液(liquor）または唾液などの細胞含有体液、ならびに細菌、植物、および真菌などである。 膜含有細胞コンパートメントからの膜タンパク質もまた、本発明にしたがって抽出することができる。組織および細胞培養物からのタンパク質の抽出は、特に、特定のタンパク質の検出、例えば、病気の存在を示すタンパク質の検出を可能にする。本発明による方法は、したがって、病理的に興味深い組織サンプルのために特に有利でもある。
【００２０】
本発明による方法は、特に膜貫通型タンパク質、極めて特にマルチパス膜タンパク質、すなわち、２または３以上の膜貫通数を有するタンパク質、特に例えば、ヘプタヘリカル膜貫通型タンパク質などのマルチヘリカル膜貫通型タンパク質に適している。ヘプタヘリカル膜貫通タンパク質のクラスは、現在、約２５０の既知タンパク質を含む。膜貫通型タンパク質は以下のサブクラスに分けることが出来る：
【００２１】
−Class Aロドプシン、ホルモンタンパク質、(ロドプシン)、オプシン、嗅覚器官、プロスタノイド、ヌクレオチド類似体、カンナビノイド、血小板活性化因子、ゴナドトロピン放出ホルモン、甲状腺刺激放出ホルモンおよび分泌促進剤、メラトニン、ウイルスタンパク質、リゾスフィンゴ脂質&LPA (EDG)、ロイコトリエンB4受容体、Class Aオーファンおよびその他、
【００２２】
−Class B セクレチン、例えば、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、PACAP、セクレチン、血管作動性ポリペプチド、利尿ホルモン、EMR1、ラトロフィリン、脳特異的血管形成阻害物質(BAI)、メトセラ様タンパク質(MTH)、カドヘリンEGF LAG (CELSR)、受容体に結合した非常に大きいG−タンパク質、
【００２３】
−Class C代謝型グルタミン酸／フェロモン、例えば、代謝型グルタミン酸、カルシウム感知様、推定フェロモン受容体、GABA-B、オーファンGPRC5、オーファンGPCR6、bride of sevenless proteins (BOSS)、味覚受容体(T1R)、
【００２４】
−Class D真菌フェロモン、例えば、真菌フェロモンA−因子様(STE2、STE3)、真菌フェロモンB様(BAR、BBR、RCB、PRA)、真菌フェロモンM−およびP−因子、Class E cAMP受容体、縮れた／滑らかな（frizzled/smoothened）ファミリー、縮れた、滑らかな、および以下の非GPCRファミリー：Class Z古細菌／細菌／真菌オプシン。
【００２５】
イオン性液体または液体塩は、有機カチオンおよび一般的には無機アニオンからなるイオン種である。これらは、中性分子を含まず、通常は３７３Ｋより低い融点を有する。
【００２６】
イオン性液体の分野は、潜在用途が多種多様であるので、現在、集中的に研究されている。イオン性液体における総説は、例えば、R. Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399-2407；M.J. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future”, Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398；P. Wasserscheid, W. Keim "Ionische Fluessigkeiten - neue Loesungen fuer die Uebergangsmetallkatalyse" [Ionic Liquids - Novel Solutions for Transition-Metal Catalysis], Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945；T. Welton "Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis”, Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083またはR. Hagiwara, Ya. Ito "Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions”, J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227)である。
【００２７】
本発明に従って用いられるイオン性液体は、特にそれらが本発明の好ましい態様において、少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物において用いられる場合には、好ましくは水混和性である。さらなる溶媒は典型的には水であるか、好ましくは、水性緩衝液系である。これにより、当該溶媒に加えられる１または２以上の水溶解性有機溶媒の量をより少なくすることができる。
【００２８】
本発明は同様に、一般式Ｋ＋Ａ−の少なくとも１種のイオン性液体または、一般式Ｋ＋Ａ−の少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物を、任意に機械的作用で生体サンプルに添加する、生体サンプルからの膜タンパク質の抽出方法に関連する。
【００２９】
本発明の最も単純な態様において、一般式Ｋ＋Ａ−の少なくとも１種のイオン性液体、または一般式Ｋ＋Ａ−の少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物を、生体サンプルに添加する。前記方法は好ましくは、機械的作用、例えば振とうまたは攪拌によって行われる。このように、膜タンパク質の抽出は加速され、抽出タンパク質の収率は改善される。
【００３０】
本発明による方法のさらなる態様において、生体サンプルをまず溶解することができ、すなわち本発明の方法の適用前に細胞基礎構造を崩壊する。この前処理は、当業者に既知の全ての方法において、例えば、手動均質化、機械による振とうによって行うことができる。特に、生体サンプルの溶解は、当業者に既知の、界面活性剤、表面活性物質およびポア形成剤（pore former）の添加により行うこともできる。サンプルの従前の溶解は、得られる膜タンパク質の収率の観点で、抽出の結果をさらに向上させる。したがって、膜タンパク質は膜に残留するが、溶解の間に膜または膜フラグメントは単純な方法において、他の細胞構成物質から分離することができる。溶解は好ましくはジギトニンで行う。
【００３１】
溶解は、抽出と同時に行うこともできるが、より複雑なタンパク質混合物が得られる。
一般的に、当業者に既知の全ての一般式Ｋ＋Ａ−のイオン性液体、特に水に溶解性であるものが、本発明の方法に適している。
【００３２】
イオン性液体のアニオンＡ−は好ましくは、ハロゲン化物、テトラフルオロホウ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、または一般式［Ｎ（Ｒｆ）２］−もしくは一般式［Ｎ（ＸＲｆ）２］−のイミドを含む群から選択され；式中Ｒｆは部分的または完全にフッ素置換された１〜８Ｃ原子を有するアルキルを示し、ＸはＳＯ２またはＣＯを示す。本明細書において、ハロゲン化アニオンは塩化物、臭化物およびヨウ化物アニオン、好ましくは塩化物および臭化物アニオンから選択される。イオン性液体のアニオンＡ−は好ましくはハロゲン化アニオンであり、特に臭化物アニオン、または一般式［Ｎ（ＸＲｆ）２］−のイミド；式中Ｒｆは部分的または完全にフッ素置換された１〜８Ｃ原子を有するアルキルを示し、ＸはＳＯ２を示す。Ｒｆは好ましくは、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ノナルオロブチル、特にトリフルオロメチルである。特に好ましい臭化物または［（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ］−アニオンを含むイオン性液体は、本発明の方法における膜タンパク質の抽出に特に適している。
【００３３】
イオン性液体のカチオンＫ＋の選択に関して、それ自体は何の制限もない。しかしながら好ましくは、有機カチオン、特に好ましくは、アンモニウム、ホスホニウム、ウロニウム、チオウロニウム、グアニジニウムカチオンまたは複素環カチオンである。
【００３４】
アンモニウムカチオンは、例えば、式（１）
［ＮＲ４］＋                        （１）
式中、
Ｒはそれぞれ互いに独立して、
Ｈ、ここで全ての置換基Ｒは同時にＨであることはできず、
ＯＲ’、ＮＲ’２、ただし、式（１）において、最大１つの置換基ＲがＯＲ’、ＮＲ’２であり、
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル、
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであり、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
【００３５】
ここで、１または２以上のＲは、部分的または完全にハロゲン、特に、−Ｆおよび／または−Ｃｌで置換されてもよく、または部分的に、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２で置換されてもよく、ここで、α位にないＲにおける１または２の非隣接炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’は、＝Ｈ、非−、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニルであってもよく、Ｘは＝ハロゲンであってもよい、
で表現することができる。
【００３６】
ホスホニウムカチオンは例えば式（２）
［ＰＲ２４］＋                        （２）
式中、
Ｒ２はそれぞれ互いに独立して、
Ｈ、ＯＲ’またはＮＲ’２
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル、
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであり、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
【００３７】
ここで、１または２以上のＲ２は、部分的または完全にハロゲン、特に、−Ｆおよび／または−Ｃｌで置換されてもよく、または部分的に、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２で置換されてもよく、ここで、α位にないＲ２における１または２の非隣接炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’＝Ｈ、非−、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニル、Ｘ＝ハロゲンである、
で表現することができる。
【００３８】
しかしながら、すべての４または３置換基ＲおよびＲ２が完全にハロゲンで置換されている、式（１）および（２）のカチオン、例えば、トリス（トリフルオロメチル）メチルアンモニウムカチオン、テトラ（トリフルオロメチル）アンモニウムカチオン、またはテトラ（ノナフルオロブチル）アンモニウムカチオンは除かれる。
【００３９】
ウロニウムカチオンは、例えば、式（３）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＯＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋          （３）、
およびチオウロニウムカチオン式（４）
［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋          （４）、
式中、
Ｒ３〜Ｒ７はそれぞれ互いに独立して、
水素、ここで、Ｒ５に関して水素は除外され、
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであり、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
【００４０】
ここで、１または２以上の置換基Ｒ３〜Ｒ７は、部分的または完全にハロゲン、特に、−Ｆおよび／または−Ｃｌで置換されてもよく、または部分的に、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２で置換されてもよく、ここで、α位にないＲ３〜Ｒ７における１または２の非隣接炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ‘−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’＝Ｈ、非−、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニル、Ｘ＝ハロゲンである、
で表現することができる。
【００４１】
グアニジニウムカチオンは式（５）
［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋        （５）
式中、
Ｒ８〜Ｒ１３はそれぞれ互いに独立して、
水素、−ＣＮ、ＮＲ’２、−ＯＲ’
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル、
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであり、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
【００４２】
ここで、１または２以上の置換基Ｒ８〜Ｒ１３は、部分的または完全にハロゲン、特に、−Ｆおよび／または−Ｃｌで置換されてもよく、または部分的に、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２で置換されてもよく、ここで、α位にないＲ８〜Ｒ１３における１または２の非隣接炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’＝Ｈ、非−、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニル、Ｘ＝ハロゲンである、
で表現することができる。
【００４３】
さらに、一般式（６）
［ＨｅｔＮ］＋                        （６）
式中、
ＨｅｔＮ＋は、下記群から選択される複素環カチオンを示す：
【化１】
2010510181.tif 000001
【化２】
2010510181.tif 000002
【００４４】
式中、
置換基Ｒ１’〜Ｒ４’はそれぞれ独立して、
水素、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、
１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の二重結合を有する直鎖または分岐アルケニル、
２〜２０Ｃ原子および１または２以上の三重結合を有する直鎖または分岐アルキニル、
３〜７Ｃ原子を有する、飽和、部分的または完全に不飽和したシクロアルキルであって、これは１〜６Ｃ原子を有するアルキルで置換されてもよく、
飽和、部分的または完全に不飽和したヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルまたはアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルであり、
ここで、置換基Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’は一緒に環を形成していてもよく、
【００４５】
ここで、１または２以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は部分的にまたは完全に、ハロゲン、特に、−Ｆおよび／または−Ｃｌ、もしくは−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２に置換されてもよいが、ここで、Ｒ１’およびＲ４’は同時にハロゲンで完全に置換されることはできず、ここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’において、ヘテロ原子に結合していない１または２以上の非隣接炭素原子は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−の群から選択される、原子および／または原子団によって置き換えられてもよく、ここで、Ｒ’＝Ｈ、非−、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニル、Ｘ＝ハロゲンである、
のカチオンを用いることも可能である。
【００４６】
本発明の目的のためには、完全不飽和置換基は芳香族置換基も意味するように用いられる。
本発明によれば、式（１）〜（５）で表される化合物の好適な置換基ＲおよびＲ２〜Ｒ１３は、水素以外には、好ましくは：Ｃ１〜Ｃ２０、特にＣ１〜Ｃ１４アルキル基、および、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、特にフェニル、により置換されていてもよい飽和または不飽和Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル基（すなわち、芳香族をも含む）である。
【００４７】
式（１）または（２）で表される化合物中の置換基ＲおよびＲ２は、本明細書において、同一であっても、異なっていてもよい。置換基ＲおよびＲ２は、好ましくは異なっている。
置換基ＲおよびＲ２は、特に好ましくは、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシルまたはテトラデシルである。
【００４８】
グアニジウムカチオン［Ｃ（ＮＲ８Ｒ９）（ＮＲ１０Ｒ１１）（ＮＲ１２Ｒ１３）］＋の４個までの置換基はまた、単環式、二環式もしくは多環式カチオンを形成するようにペアを組んで結合していてもよい。
一般性を限定することなく、かかるグアニジウムカチオンの例は：
【００４９】
【化３】
2010510181.tif 000003
【００５０】
式中、置換基Ｒ８〜Ｒ１０およびＲ１３は、上記の意味または上記の特に好ましい意味を有することができる、
である。
所望の場合、上記グアニジウムカチオンの炭素環または複素環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２Ｘ’またはＳＯ３Ｈ、ここでＸおよびＲ’は上記の意味を有し、置換もしくは非置換フェニル、または非置換もしくは置換複素環で置換されてもよい。
【００５１】
ウロニウムカチオン［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）−Ｃ（＝ＯＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋またはチオウロニウムカチオン［（Ｒ３Ｒ４Ｎ）Ｃ（＝ＳＲ５）（ＮＲ６Ｒ７）］＋の４個までの置換基はまた、単環式、二環式もしくは多環式カチオンを形成するようにペアを組んで結合していてもよい。
【００５２】
一般性を限定することなく、かかるカチオンの例は、下記
式中、Ｙ＝ＯまたはＳである：
【００５３】
【化４】
2010510181.tif 000004
【００５４】
式中、置換基Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、上記の意味または上記の特に好ましい意味を有することができる、
で示される。
【００５５】
所望の場合、上記カチオンの炭素環または複素環はまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＲ’２、ＳＯ２ＸまたはＳＯ３Ｈあるいは置換もしくは非置換フェニル、または非置換もしくは置換複素環で置換されてもよく、ここでＸおよびＲ’は上記の意味を有する。
【００５６】
置換基Ｒ３〜Ｒ１３は、それぞれ互いに独立して、好ましくは１〜１０個のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル基である。式（３）〜（５）の化合物における置換基Ｒ３およびＲ４、Ｒ６およびＲ７、Ｒ８およびＲ９、Ｒ１０およびＲ１１、ならびに、Ｒ１２およびＲ１３は、同一であっても、異なっていてもよい。置換基Ｒ３〜Ｒ１３は、特に好ましくは、それぞれ互いに独立して、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フェニルまたはシクロヘキシルであり、極めて特に好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはｎ−ブチルである。
【００５７】
本発明によれば、式（６）の化合物の好適な置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、水素以外には、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ２０、特にＣ１〜Ｃ１２アルキル基、および、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、特にフェニル、により置換されてもよい飽和または不飽和Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル基（すなわち、芳香族をも含む）である。
【００５８】
置換基Ｒ１’およびＲ４’は、それぞれ互いに独立して、特に好ましくはメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。これらは特に極めて好ましくは、メチル、エチル、ｎ−ブチルまたはヘキシルである。ピロリジニウム、ピペリジニウムまたはインドリニウム化合物において、２個の置換基Ｒ１’およびＲ４’は、好ましくは異なっている。
【００５９】
置換基Ｒ２’またはＲ３’は、それぞれ互いに独立して、特に水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロヘキシル、フェニルまたはベンジルである。Ｒ２’は、特に好ましくは水素、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチルまたはｓｅｃ−ブチルである。Ｒ２’およびＲ３’は、極めて特に好ましくは水素である。
【００６０】
Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基は、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、さらにまたペンチル、１−、２−もしくは３−メチルブチル、１，１−、１，２−もしくは２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシルである。任意にジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピルまたはノナフルオロブチルである。
【００６１】
二重結合が複数存在してもよい、Ｃ原子２〜２０個を有する直鎖または分枝アルケニルは、例えば、アリル、２−もしくは３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに４−ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、−Ｃ９Ｈ１７、−Ｃ１０Ｈ１９〜−Ｃ２０Ｈ３９、好ましくはアリル、２−もしくは３−ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、さらに好ましくは４−ペンテニル、イソペンテニルまたはヘキセニルである。
【００６２】
三重結合が複数存在してもよい、Ｃ原子２〜２０個を有する直鎖または分枝アルキニルは、例えば、エチニル、１−もしくは２−プロピニル、２−もしくは３−ブチニル、さらに４−ペンチニル、３−ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、−Ｃ９Ｈ１５、−Ｃ１０Ｈ１７〜−Ｃ２０Ｈ３７、好ましくはエチニル、１−もしくは２−プロピニル、２−もしくは３−ブチニル、４−ペンチニル、３−ペンチニルまたはヘキシニルである。
【００６３】
アリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルは、例えば、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチルまたはフェニルヘキシルを示し、ここでフェニル環およびアルキレン鎖の両方は、上記の通り、ハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌで部分的または完全に、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２で部分的に置換されてもよい。
【００６４】
３〜７個のＣ原子を有する、非置換飽和、または部分的にもしくは完全に不飽和したシクロアルキル基は、したがって、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロペンタ−１，３−ジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサ−１，３−ジエニル、シクロヘキサ−１，４−ジエニル、フェニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタ−１，３−ジエニル、シクロヘプタ−１，４−ジエニルまたはシクロヘプタ−１，５−ジエニルであり、これらはそれぞれ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により置換されていてもよく、ここでシクロアルキル基またはＣ１〜Ｃ６アルキル基により置換されているシクロアルキル基は、また同様に、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ、特にＦもしくはＣｌなどのハロゲン原子、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、−ＮＯ２により置換されていてもよい。
【００６５】
置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３またはＲ１’〜Ｒ４’において、α位においてヘテロ原子に結合していない、１個または２個以上の非隣接炭素原子はまた、群−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−または−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−、ここでＲ’＝非−、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルから選択される原子および／または原子団により置き換えられていてもよい。
【００６６】
一般性を限定することなく、このように修飾された置換基Ｒ、Ｒ２〜Ｒ１３またはＲ１’〜Ｒ４’の例は：
−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ２Ｈ４ＳＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３、−ＳＯ２Ｃ６Ｈ５、−ＳＯ２Ｃ３Ｈ７、−ＳＯ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−Ｏ−Ｃ４Ｈ９、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−Ｃ４Ｆ９、−Ｃ（ＣＦ３）３、−ＣＦ２ＳＯ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ４Ｎ（Ｃ２Ｆ５）Ｃ２Ｆ５、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ２Ｈ３、−Ｃ３ＦＨ６、−ＣＨ２Ｃ３Ｆ７、−Ｃ（ＣＦＨ２）３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５またはＰ（Ｏ）（Ｃ２Ｈ５）２である。
【００６７】
Ｒ’において、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルは、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチルである。
Ｒ’において、置換フェニルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’’２またはＳＯ３Ｈで置換されたフェニルであり、ここで、Ｘ’はＦ、ＣｌまたはＢｒであり、Ｒ’’は、Ｒ’について定義したように、非‐、部分的にまたは完全にフッ素化されたＣ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ３〜Ｃ７シクロアルキルであり、例えばｏ−、ｍ−もしくはｐ−メチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−エチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−プロピルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−イソプロピルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ニトロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ヒドロキシフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−メトキシフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−エトキシフェニル、ｏ−、ｍ−、ｐ−（トリフルオロメチル）フェニル、ｏ−、ｍ−、ｐ−（トリフルオロメトキシ）フェニル、ｏ−、ｍ−、ｐ−（トリフルオロメチルスルホニル）フェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−フルオロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−クロロフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ブロモフェニル、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−ヨードフェニル、
【００６８】
さらに好ましくは、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメチルフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジヒドロキシフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジフルオロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジクロロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジブロモフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジメトキシフェニル、５−フルオロ−２−メチルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニルまたは２，４，５−トリメチルフェニルである。
【００６９】
Ｒ１’〜Ｒ４’において、ヘテロアリールは、５〜１３員環を有する、飽和もしくは不飽和の単−もしくは二環ヘテロ環ラジカルを意味するように用いられ、ここで、１、２もしくは３Ｎおよび／または１もしくは２ＳまたはＯ原子が存在してもよく、ヘテロ環ラジカルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＳＣＦ３、ＳＯ２ＣＦ３、ＣＯＯＨ、ＳＯ２Ｘ’、ＳＯ２ＮＲ’’２またはＳＯ３Ｈにより、単−もしくは多置換されてもよく、ここでＸ’およびＲ’’、は、上記の意味を有する。
【００７０】
ヘテロ環ラジカルは、好ましくは、置換または非置換２−もしくは３−フリル、２−もしくは３−チエニル、１−、２−もしくは３−ピロリル、１−、２−、４−もしくは５−イミダゾリル、３−、４−もしくは５−ピラゾリル、２−、４−もしくは５−オキサゾリル、３−、４−もしくは５−イソオキサゾリル、２−、４−もしくは５−チアゾリル、３−、４−もしくは５−イソチアゾリル、２−、３−もしくは４−ピリジル、２−、４−、５−もしくは６−ピリミジニル、さらに好ましくは、１，２，３−トリアゾール−１−、−４−もしくは−５−イル、１，２，４−トリアゾール−１−、−４−もしくは−５−イル、１−もしくは５−テトラゾリル、１，２，３−オキサジアゾール−４−もしくは−５−イル、１，２，４−オキサジアゾール−３−もしくは−５−イル、１，３，４−チアジアゾール−２−もしくは−５−イル、１，２，４−チアジアゾール−３−もしくは−５−イル、１，２，３−チアジアゾール−４−もしくは−５−イル、２−、３−、４−、５−もしくは６−２Ｈ−チオピラニル、２−、３−もしくは４−４Ｈ−チオピラニル、３−もしくは４−ピリダジニル、
【００７１】
ピラジニル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾフリル、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチエニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−もしくは７−１Ｈ−インドリル、１−、２−、４−もしくは５−ベンゾイミダゾリル、１−、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾピラゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾオキサゾリル、３−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾイソオキサゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾチアゾリル、２−、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾイソチアゾリル、４−、５−、６−もしくは７−ベンゾ−２，１，３−オキサジアゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キノリニル、１−、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−イソキノリニル、１−、２−、３−、４−もしくは９−カルバゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−もしくは９−アクリジニル、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−シンノリニル、２−、４−、５−、６−、７−もしくは８−キナゾリニルまたは１−、２−もしくは３−ピロリジニルである。
【００７２】
ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルは、アリール−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルと類似であり、例えば、ピリジニルメチル、ピリジニルエチル、ピリジニルプロピル、ピリジニルブチル、ピリジニルペンチル、ピリジニルヘキシルを意味するように用いられ、ここで上記のヘテロ環ラジカルは、このようにさらにアルキレン鎖に繋がっていてもよい。
【００７３】
ＨｅｔＮ＋は好ましくは、
【化５】
2010510181.tif 000005
式中、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、それぞれ独立して、上記の意味を有する、
である。
【００７４】
モルホリニウムおよびイミダゾリウムカチオンは本発明において特に好ましく、ここで、前記カチオンにおけるＲ１’〜Ｒ４’は特に、それぞれの場合に互いに独立して、水素、１〜２０Ｃ原子を有する直鎖または分岐アルキル、ここで１または２以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’は、−ＯＨまたは−ＯＲ’で部分的に置換されてもよく、ここでＲ１’＝非−、部分または全フッ素化Ｃ１−〜Ｃ６−アルキル、Ｃ３−〜Ｃ７−シクロアルキル、非置換または置換フェニルであり得る。
【００７５】
本発明によるイオン性液体のカチオンは好ましくは、アンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウムまたはモルホリニウムカチオンである。
好ましいアンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウムまたはモルホリニウムカチオンにおける、極めて特に好ましい置換基Ｒ、Ｒ２、Ｒ１’〜Ｒ４’は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、デシル、ドデシル、オクタデシル、エトキシエチル、メトキシエチル、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル基から選択される。
【００７６】
モルホリニウムトリフルオロメチルスルホニルイミドまたはモルホリニウム臭化物、ホスホニウムテトラフルオロホウ酸塩、イミダゾリウム塩化物、臭化物またはヘキサフルオロリン酸塩は、極めて特に好ましく発明の方法における抽出に用いられ、ここでＮ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルモルホリニウムビストリフルオロメチスルホニルイミド、４−（２−メトキシエチル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−メチル−４−プロピル−モルホリニウム臭化物、４−（２−エトキシエチル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−（３−メトキシプロピル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−ブチル−４−プロピルモルホリニウム臭化物、トリヘキシル（テトラデシル）−ホスホニウムテトラフルオロホウ酸塩、１−デシル−３−メチルイミダゾリウム臭化物、１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、３−メチル−１−オクタデシルイミダゾリウムヘキサフルオロリン酸塩またはこれらの混合物は、本発明の方法において、特に優れた結果を提供する。
【００７７】
本発明の好ましい態様において、少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物を生体サンプルからの膜タンパク質の抽出に用いる。これらの場合、少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物における、イオン性液体の濃度は、混合物に基づいて、典型的に０．０２〜５重量％であり、好ましくは０．１〜１重量％である。適したさらなる溶媒は上述され、好ましくは水または水性緩衝系である。適した緩衝液は、生理的状態を作り出す、すなわちタンパク質を変性しない、緩衝系である。ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液およびトリスベース緩衝液が例示される。
【００７８】
上述の方法において、イオン性液体、または少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物は、追加の添加物および補助剤を含んでもよい。対応する添加剤および補助剤は当業者に既知であり、例えば、界面活性剤、表面活性物質、ポア形成剤ならびに生物学的または生理学的緩衝系、無機塩および阻害剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤）を含む。
【００７９】
本発明の方法は、０℃以上、典型的には０〜９５℃の温度において行うことができる。特に高タンパク質収率が達成され、活性または構造の保持が二次的である場合、抽出は（３７℃より高い）高温において行うことができる。このタイプの抽出は、特にウエスタンブロット分析のために用いることができる。本発明の抽出は、好ましくは０〜３７℃、特に好ましくは０〜８℃、特には０〜４℃で行われる。好ましい温度において、改良された、比較的短時間における抽出およびタンパク質活性保持が認められる。特に比較的敏感な膜タンパク質の、穏やかな抽出のために、この目的のために、より長い抽出時間が必要であることを考慮して、本発明の方法を前記温度範囲内の比較的低温で行うことが望ましい。
【００８０】
典型的な抽出時間は、３０分〜１６時間である。活性タンパク質を抽出する場合、抽出溶液（溶媒およびイオン性液体）のｐＨは、好ましくは約ｐＨ７．４であるべきであり、あるいは２〜１０のｐＨを有する抽出溶液を利用することもできる。
【００８１】
本発明にしたがって抽出したタンパク質は例えば、直接またはゲル電気泳動分離後の質量分光学調査、ウエスタンブロット分析または活性アッセイに利用することができる。一部の適用、例えば、質量分光学判断などに関し、得られたタンパク質抽出物からイオン性液体を前もって除去しなければならない。これは例えば、当業者に既知の方法によるインゲル消化によって行うことができる。
【００８２】
本発明の方法は、サンプルの細胞基礎構造を保持して、すなわち膜タンパク質の構造を可能な限り保って、生体サンプルからの膜タンパク質の抽出に適している。このように、従来方法を用いては単離が困難であるか全く不可能である、膜複合体全体を、単離することが可能である。一般的に、得られた膜タンパク質は、適した抗体を用いて検出することができる。
【００８３】
本発明の方法は、初めて水系において、水溶解性イオン性液体を低刺激な抽出剤として用いて、疎水性膜タンパク質、特にマルチパス膜タンパク質を抽出するの可能性を広げた。このようにして、穏やかな抽出物を非常に単純な方法手順と組み合わせた。水性媒体が既に抽出に用いられているので、非常に広範囲な種類の分析方法において、前もって溶媒を交換することなく、抽出物を直接調査することができる。
【００８４】
本発明の方法を用いて得られた抽出物は、膜タンパク質を含み、同様に本発明の要旨である。これらは、当業者に既知の全タイプのタンパク質分析、例えば、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動、特に二次元ゲル電気泳動）、免疫化学的検出方法（例えば、ウエスタンブロッド分析、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ）、タンパク質配列（例えば、平面およびビーズベースシステム）、質量分析（例えば、Maldi、EsiおよびSeldi）ならびに全てのクロマトグラフ分離方法、特にバイオクロマトグラフ分離方法（ＩＥＸ、ＳＥＣ、ＨＩＣ、アフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー）に対して適している。
【００８５】
本発明は同様に、少なくとも１種のイオン性液体、または少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物を含む、上記の本発明の方法を用いた膜タンパク質抽出のためのキットに関する。本発明のキットは、１または２以上のイオン性液体を含んでも良い。キットが複数のイオン性液体を含む場合、これらは分離していても、混合物の形状で一緒となっていてもよい。好ましくは、上記の特に好ましいイオン性液体がキットに存在する。
【００８６】
本発明のキットは、使用者が、生体サンプルから膜タンパク質を単純な手法で抽出することを可能とする。
本発明は同様に、膜タンパク質、特にマルチ膜貫通型タンパク質を、生体サンプルからの抽出するための本発明によるキットの使用に関する。
さらなる言及なしに、当業者は上記説明をより広い範囲において利用することができると推測される。したがって、好ましい態様および例は単に、決して限定的ではない説明的記載であると解されるべきである。
【実施例】
【００８７】
例：
ヒトMDA MB 468乳がん細胞をRPMI 1640培地（２．０００ｍｇ／ｌのＤ−グルコース、１１０ｍｇ／ｌのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、L−グルタミンなし、Gibco）において、市販のT75細胞培養ボトルにおいて５０％コンフルエントまで、５％のＣＯ２下、３７℃で培養する。細胞スクレーパーを用いて、接着細胞をトリス緩衝塩化ナトリウム溶液（ＴＢＳ）およびプロテアーゼ阻害剤（Calbiochem Protease Inhibitor Cocktail III）中に収穫する。第２抽出段階における、ポア形成剤（抽出緩衝液Ｉ）を用いた細胞質のタンパク質画分の放出後に膜タンパク質を単離する。画分１は、主に細胞質のタンパク質の可溶性タンパク質画分に相当する。
【００８８】
水性緩衝溶液（抽出緩衝液ＩＩ）における、イオン性液体を用いた抽出の後の画分は、膜タンパク質画分である。イオン性液体の２％溶液を穏やかに振とうさせながら、３０分間３７℃でインキュベートする。抽出後、サンプルを１５分間16000 x g、室温において遠心分離する。次いで、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）のための市販のサンプルアプリケーション緩衝液とともに、上清(抽出した膜タンパク質画分)を用いる。サンプルを１０％ＢＩＳ−トリスポリアクリルアミド（PAA）ゲル（Novex, Invitrogen）で分離する。
【００８９】
サンプルをその後、「セミドライウエスタンブロット」法の原理にしたがってＰＶＤＦ膜に移動する。次に、当該膜を以下の第１抗体とともにインキュベートする：
ａ）ダイマー受容体分子の基準として、抗−ＥＧＦＲラビット抗体（Sc03, Santa Cruz１：１００に希釈）、
ｂ）７回膜貫通型透過タンパク質（７−ＴＭ）の基準として、抗Frizzled４抗体（R&D Systems MAB 194、１：５００に希釈）。
ｃ）第２基準タンパク質として、カドヘリンＥＧＦ−ｌａｇ７回膜貫通型透過受容体−３（CELSR3）抗体を用いる(Acris)。
ｄ）検出のために第２抗体として、１：５０００希釈したGeneral Electrics (GE)からの抗ラビット−POD抗体を用いるか、または１：５０００希釈したPierceからの抗ラット−POD抗体を用いる。
【００９０】
化学発光検出をGE (#RPN 2106)から市販のECLウエスタンブロット検出キットを用いて行う。
ウエスタンブロットは、イオン性液体で抽出された膜タンパク質の未変性構造の保持を示す。
【００９１】
TBS：    50 mM Tris
150 mM NaCl
pH 7.4
【００９２】
抽出緩衝液Ｉ：
３００ｍＭ  スクロース
１５ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  Pipes（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
０．０１８７５％のジギトニン
ｐＨ  ７．４
【００９３】
抽出緩衝液ＩＩ：
３００ｍＭ  スクロース
１５ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  Pipes（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
２重量％のＮ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルモルホリニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドまたは１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物
ｐＨ  ７．４
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のイオン性液体、または、少なくとも１種のイオン性液体と少なくとも１種のさらなる溶媒とを含む混合物の、生体サンプルからの膜タンパク質の抽出のための使用。
【請求項２】
イオン性液体およびさらなる溶媒を少なくとも含む混合物を、抽出のために用いることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
さらなる溶媒が水であることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
膜タンパク質が、２または３以上の膜貫通数を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
生体サンプルが、組織、細胞、細胞培養物および／または体液、細菌、真菌、ウイルスもしくは植物であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
生体サンプルからの膜タンパク質抽出のための方法であって、一般式Ｋ＋Ａ−の少なくとも１種のイオン性液体または、一般式Ｋ＋Ａ−の少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物を、任意に機械的作用で、生体サンプルに添加することを特徴とする前記方法。
【請求項７】
生体サンプルを前もって溶解することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生体サンプルの溶解を、界面活性剤、表面活性物質またはポア形成剤の添加によって行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
機械的作用を振とうまたは攪拌によって達成することを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
イオン性液体のアニオンＡ−が、ハロゲン化物、テトラフルオロホウ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、または一般式［Ｎ（Ｒｆ）２］−もしくは一般式［Ｎ（ＸＲｆ）２］−のイミドを含む群から選択され、式中Ｒｆは部分的にまたは完全にフッ素置換された１〜８Ｃ原子を有するアルキルを意味し、ＸはＳＯ２またはＣＯを意味することを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
イオン性液体のカチオンＫ＋が、アンモニウム、ホスホニウム、ウロニウム、チオウロニウム、グアニジニウムカチオンまたは複素環カチオンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
複素環カチオンが、モルホリニウムカチオンまたはイミダゾリウムカチオンであることを特徴とする、請求項１１に記載の発明。
【請求項１３】
抽出を４〜３７℃の温度で行うことを特徴とする、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物におけるイオン性液体の濃度が、０．０２〜５重量％であることを特徴とする、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
イオン性液体が、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−メチルモルホリニウムビストリフルオロメチスルホニルイミド、４−（２−メトキシエチル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−メチル−４−プロピルモルホリニウム臭化物、４−（２−エトキシエチル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−（３−メトキシプロピル）−４−メチルモルホリニウム臭化物、４−ブチル−４−プロピルモルホリニウム臭化物、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムテトラフルオロホウ酸塩、１−デシル−３−メチルイミダゾリウム臭化物、１−ドデシル−３−メチルイミダゾリウム塩化物、３−メチル−１−オクタデシルイミダゾリウムヘキサフルオロリン酸塩またはこれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１種のイオン性液体、または少なくとも１種のイオン性液体および少なくとも１種のさらなる溶媒を含む混合物、ならびに界面活性剤、表面活性物質および／またはポア形成剤の群から選択される少なくとも１種の溶解剤を含む、請求項６〜１５のいずれか一項に記載の方法による膜タンパク質の抽出のためのキット。
【請求項１７】
生体サンプルから膜タンパク質を抽出するための、請求項１６に記載のキットの使用。