【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年4月19日(2011.4.19)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】分岐水溶性ポリマーとその複合物
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は２００３年３月１４日出願の米国仮特許出願番号６０／４５４，９９３、２００３年５月２９日出願の米国仮特許出願番号６０／４７４，０９４及び２００３年１０月７日出願の米国仮特許出願番号６０／５０９，７５２の非暫定的出願であり、それぞれの内容全てをその全目的のためここに文献として取り入れている。
【背景技術】
【０００２】
本発明は分岐水溶性ポリマーとこの分岐ポリマーで形成する複合物に関する。
【０００３】
序文
略号ＰＥＧのポリ（エチレングルコール）は略号ＰＥＯのポリ（エチレンオキサイド）としても知られる様な親水性ポリマーを分子及び表面と複合化する事は生命工学や医学で少なからず利用されている。最も一般的な形ではＰＥＧは各末端が水酸基で終わる線状ポリマーである。
2006523211.tif 000001
ここでnは通常約３から約４０００の範囲である。多くの末端機能化誘導体が文献で知られており商業的に入手可能である。例えばシアーウオーターポリマー社（Shearwater Polymers, Inc.）カタログ "ポリエチレングルコール誘導体 "参照。
【０００４】
２つの末端にそれぞれ異なる基を有するＰＥＧ類は特に有用な化合物である。例えば異二官能性ＰＥＧ類は架橋剤として利用される。更に一つの端末で、例えばメトキシ基の様なアルキル基で "キャップ "したＰＥＧ分子はこの分子の水酸基末端を多数の反応性有機官能基のいずれか一つに変える事ができる。
【０００５】
下記の酸化エチレンと酸化プロピレンとのランダム又はブロック共重合体はＰＥＧとその化学特性が密接に関連しており、多くの応用でＰＥＧの代わりになる。
2006523211.tif 000002
ここで各Ｒは独立に水素かメチル基である。
【０００６】
治療効果のある活性種と水溶性ポリマー間での複合物形成が治療薬の薬物動態学と薬力学改善に有効な戦略である事は分かっている。例えばダン及びオッテンブライト（Dunn and Ottenbrite）、 "ポリマー型薬剤とドラッグデリバリーシステム "（Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems）、アメリカ化学会シンポジウムシリーズ４６９（ACS Symposium Seiries 469）、アメリカ化学会、ワシントンディシー（Washington D.C.）、１９９１年を参照。例えばペプチド薬物治療法誘導化にＰＥＧを用いるとペプチドの免疫原生が減少し且つ循環時のクリアランス時間が延長する事が示された。例えば米国特許４，１７９，３３７（デービス等）（Davis et al.）はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコールと連結した酵素やペプチドホルモンのような非免疫原生ペプチドに関する物である。ペプチド一モル当たりに１０乃至１００モルのポリマーが使用され、生理的活性の少なくとも１５％が維持される。
【０００７】
ＰＥＧ―ペプチド複合物の多数の他例が技術的に知られている。ペプチドのＰＥＧ及びその誘導体との連結の主形式はペブチドアミノ酸残基による非特異的結合である。例えば米国特許４，０８８，５３８では酵素がＰＥＧに共役結合した酵素的活性ポリマーー酵素複合物が開示している。同様に米国特許４，４９６，６８９ではＰＥＧ又はメトキシポリ（エチレングルコール）（ "mPEG "）の様なポリマーとα―１プロテアーゼ阻害剤との共役結合錯体を開示している。アブチョウスキー等（Abuchowski et al.）（ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５２巻、３５７８頁、１９７７年）はｍＰＥＧのウシ血清アルブミンのアミノ基への共役結合を開示している。ＷＯ９３／１５１８９（ベロネーゼ等（Veronese et al.）はタンパク質分解酵素の巨大分子化阻害剤と連結する事によるポリエチレングリコール修飾タンパク質分解酵素活性の維持方法に関する。これら複合物は医療用を意図している。米国特許４，４１４，１４７ではインターフェロンをポリ（無水コハク酸エチレン）の様なジカルボン酸無水物と複合化してインターフェロンの疎水性を減少する方法を開示している。ＰＣＴＷＯ８７／０００５６ではＰＥＧ及びポリ（オキシエチル化）ポリオールとβ―インターフェロン、インターロイキン２及び免疫毒素の様なタンパク質との複合化を開示している。ＥＰ１５４，３１６ではリンフォカインの少なくとも一個の第一級アミノ基と直接結合したＰＥＧ含有インターロイキン２の様な化学修飾リンフォカインを開示し請求している。米国特許４，０５５，６３５では多糖類の様な高分子物質にタンパク質分解酵素を直接共役結合した水溶性錯体の薬剤組成を開示している。
【０００８】
ＰＥＧのペプチドに連結する他の形式はペブチドのグリコシル残基の非特異的酸化による。酸化された糖はＰＥＧ成分のペプチドへの連結場所として利用する。例えばムティムクル（M'Timkulu）（ＷＯ９４／０５３３２）はＰＥＧの糖タンパク質への添加にヒドラジンＰＥＧやアミノＰＥＧの利用を開示している。グリコシル成分を無作為に酸化して対応アルデヒドに変え、続いてアミノＰＥＧと連結する。
【０００９】
上述の各方法ではポリ（エチレングリコール）は無作為に、非特異的にペプチドバックボーンの反応性残基に添加する。しばしばＰＥＧによる誘導化によりペプチド活性を失う結果になるが、これは水溶性ポリマーの複合化に利用する化学が非選択的である事に直接起因する。
【００１０】
水溶性ポリマーと生体分子間の複合物形成に関する他の問題は反応性水溶性ポリマー試薬をこの生体分子の一個以上の個所で標識化できる能力である。複合物一個当たり一個以上の水溶性ポリマーを含むことがしばしば望ましいが、生体分子活性減少の程度は生体分子と結合したポリマー成分数にしばしば比例する。従って一分子当たり二個又はそれ以上の水溶性ポリマー成分含有反応性分岐種を得る事への関心がある。分岐分子を利用により一個以上の水溶性ポリマーを生体分子の一個以上の個所を妨害する必要無しに生体分子と複合化できる。
【００１１】
ポリ（エチレングリコール）に基づく分岐ポリマーは技術的に知られている。例えばグリーンワルド等（Greenwald et al.）（ＷＯ９８／４１５６２）は１，３−ジアミノー２−プロパノールをコアにした分岐ＰＥＧを開示している。モルプルゴ（Morpurgo）と共同研究者はリジンをコアとした分岐ＰＥＧの利用をアプライドバイオケミストリーアンドバイオテクノロジー（Appl. Biochem. Biotechnol）、５６巻、５９−７２頁、１９９６年で検討している。同様のリジンに基づく分岐ＰＥＧをグイオットー等（Guiotto et al.）はバイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Lett.）、１２巻、１７７−１８０頁、２００２年で合成した。ハリス等（Harris et al.）（米国特許５，９３２，４６２）はリジンに基づく分岐ＰＥＧを又合成した。マーティネス等（Martinez et al.）（米国特許５，６４３，５７５）は種々のコア構造を基にした多数の分岐ＰＥＧとこれらの種と生物学的活性材料との複合化を開示している（米国特許６，１１３，９０６）。
【００１２】
ポリ（エチレングリコール）の様なポリマーは一連のポリマー鎖長と分子量からなる不均一分散集団として存在する事が知られている。治療用配合剤を調合するとき、調合間での一貫性と再現性を保証する様に不均一分散が最小のポリマーを利用することが明らかに望ましい。単分散ＰＥＧ試料の作成法は技術的に殆ど知られていない。ルソー等（Loiseau et al.）は特定のＰＥＧ分子の合成を報告した。その方法として実質的に単分散ＰＥＧの多量生産には最適ではない保護／脱保護戦略を用いた。従って分岐ポリ（エチレングリコール）に加えて、単分散ＰＥＧの合成とこの単分散材の分岐ポリマーへの導入する方法は大いに望まれる。
【００１３】
本発明は分岐水溶性ポリマーと単分散ＰＥＧ種の両者の必要性に答え、新規治療用複合物、例えばペプチド複合物への路を開き、且つより安定で治療的に有効な治療薬の必要性に取り組む。治療用生体分子を水溶性ポリマーの様な修飾基で修飾する工業的実施法の必要性が今なおある。特に興味あるのはその複合物が非修飾治療薬に比し物性が改良される方法である。本発明これらとその他の必要性を満たす。
【００１４】
発明の簡単な要約
本発明は多様な構造のコアを基にする分岐水溶性ポリマーを提供する。本発明の分岐ポリマーは二個又はそれ以上の水溶性ポリマー成分を単一連結場所を通して他種と連結する方法を提供する。本発明は分岐ＰＥＧ分子を参考にして説明する。代表的水溶性ポリマーとしてＰＥＧに焦点を合わしているのは説明を明快にするためであり本発明の限界として解すべきではない。熟練者にはここに記載の分岐種は本来いかなる水溶性ポリマーでも生成出来ることは分かる。ＰＥＧ以外に他の典型的水溶性ポリマーとしてはポリ（プロピレングリコール）がある。
【００１５】
第一様態では本発明は下式を有する分岐水溶性ポリマーを提供する。
WSP―Y―Rx
ここでＷＳＰは水溶性ポリマーである。記号Ｙはリンカー、例えば結合又はアミド、カルボン酸エステル、ウレタン、メルカプタン、置換又は非置換アルキル、及び同類を含む成分を表す。典型的リンカーとしては(CH2)n, (CH2)m(C(O)O(CH2)n, (CH2)mC(O)NH(CH2)n, (CH2)mOC(O)NH(CH2)n, (CH2)mO(CH2)n, (CH2)mNH(CH2)n及び(CH2)mS(CH2)n結合があり、ここでｍとnは０から６の独立に選ぶ整数である。Ｒｘは、水溶性ポリマー、水溶性ポリマーと連結の置換又は非置換アルキル基、水溶性ポリマーと連結のアミノ酸又はアミノ酸二量体又は水溶性ポリマーと連結の糖又は糖ヌクレオチドである。ＷＳＰとＲｘの水溶性ポリマー成分は同一水溶性ポリマーであっても異なる水溶性ポリマーであっても良い。
【００１６】
本発明の化合物で用いる典型的水溶性ポリマーとしてはm-PEG,, PEG, m-PPG, PPG、ポリシアリル酸、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、ポリリジン、ポリエチレンイミン、生分解性ポリマー（例えばポリラクチド、ポリグリセリド）及び機能化ＰＥＧ、例えば末端機能化ＰＥＧがある。
【００１７】
2006523211.tif 000003
典型的実施形態ではＹは置換アルキル基であり本発明は下式を有する分岐水溶性ポリマーを提供する。
ここでＸ及びＹはOR1、 NR2R3、SR4、COOR5、CONR6R7、OCONR6R7、置換及び非置換アルキル及び置換及非置換アリールから独立に選ぶメンバーである。Ｚ１はOR1'、 NR2'R3'、SR4'、COOR5'、CONR6'R7'、置換及び非置換アルキル及び置換及非置換アリールから独立に選ぶメンバーである。記号R1、R4、R5は水溶性ポリマーを表す。R2 、R3、R6及びR7は水素原子、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アリール、置換及び非置換ヘテロアリール、置換及び非置換ヘテロシクロアルキル、反応性官能基及びこれらの基が式（Ｉ）の化合物が少なくとも二個の水溶性ポリマー成分を含む様な選択条件を有する水溶性ポリマーから独立に選ぶ。記号R1'、R2'、R3'、R4'、R5'&apos;、R6'及びR7'&apos;は水素原子、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アリール、置換及び非置換ヘテロアリール、置換及び非置換ヘテロシクロアルキル、反応性官能基、担体分子及び水溶性ポリマーから独立に選択した基を表す。
【００１８】
他の典型的実施形態ではＺ１は糖成分からなる。糖成分は活性化糖成分、例えば糖ヌクレオチドを含む事ができる。更にＺ１はペプチドのアミノ酸と直接結合するか又はアミノ酸に連結のグリコシル残基と複合化してペプチドのアミノ酸と間接的に結合する糖成分を含むことができる。
【００１９】
本発明は又アミノ酸やオリゴアミノ酸（例えばジ、トリ、テトラペプチド）に基づいた分岐ポリマーを提供する。典型的アミノ酸ベースの分岐ポリマーは以下から選んだ化学式を有する。
2006523211.tif 000004
2006523211.tif 000005
及び
ここでR11、R11'、R12、R12'、R13'及びR13'&apos;は水素原子、置換又は非置換アルキル及びこれらの基で上記化合物が少なくとも二個の水溶性ポリマー成分を含むような選択条件を持つ水溶性ポリマーから独立に選ぶ。R14は水酸基、反応性官能基、糖成分含有基又は担体分子との連結基から選んだメンバーである。ＡはＮＨ、酸素原子及び硫黄原子から選んだメンバーである。指標 "ｓ "は整数１乃至５を表す。
【００２０】
上式で示した各化合物は他種の物（例えば核酸、ペプチド、糖類など）の化学的ＰＥＧ化に利用する。ＰＥＧ（及びＰＥＧ含有種）間での複合物生成は技術的に一般に知られている。例えばハーマンソン（Hermonson）、生体複合化技法（Bioconjugate Techniques）、アカデミックプレス社（Academic Press）、サンジエゴ、１９９６年及びフィーニー等（Feeney et al.）、タンパク質の修飾（Modification of Proteins） 化学の進歩シリーズ（Advances in Chemistry Series）、１９８巻、アメリカ化学会、ワシントンディシー（Washington D.C.）、１９８２年を参照。
【００２１】
他の典型的実施形態ではＲ１４は糖成分を含む。糖成分は活性化糖成分、例えば糖ヌクレオチドである。更にＲ１４ペプチドのアミノ酸に直接結合するか又はアミノ酸のグリコシル残基との複合化により間接的にペプチドのアミノ酸と結合する糖成分を含む。
【００２２】
更に他の様態では本発明は糖類核を基にした分岐水溶性ポリマー（ "分岐コア "）を提供する。熟練者にはこの糖類核はいかなる構造であっても良いことが分かる。本発明のこの形態に用いる典型的糖類はGlcNA、Gal、Sia、Fun、Glc、GalNAc、GalNH2、GlcNH2及び同類を含む。
【００２３】
本発明の典型的化合物は下式である。
Sugar―O―(L―WSP)2
ここでＬはリンカーでありＷＳＰは水溶性ポリマーである。
【００２４】
他の典型的実施形態では本発明の糖類ベースの分岐水溶性ポリマーは下式を有する。
Nucleotide―Sugar―O―(L―WSP)2
【００２５】
シアル酸中核を基にした本発明のこの様態による更なる典型的実施形態は下式を有し
2006523211.tif 000006
ここでR16 とR16'は水素原子、アセチル基及び
2006523211.tif 000007
ここでR17、R18、R19'及びR13&#38;apos;は水素原子、水酸基、アミノ基、ＮＨＡｃ基及び式（Ｉ）の成分から独立に選んだメンバーである。式ＩでＺ２は酸素原子、硫黄原子、メチレン基及び硫黄原子から選んだメンバーである。Ｒ１１は上述の通りであり指標 "a "は整数０乃至２０を表し、R16、R16'、R17、R18及びR19の少なくとも二個が式Ｉの構造を有する条件を有する。Ｒ１１は又担体分子との連結基又は担体分子との結合であり得る。Ｒ１５は水素原子又は活性化基、例えばリン酸ヌクレオチドから選んだメンバーである。
【００２６】
他の様態では分岐ポリマーはガラクトースか又はＮ−アセチルガラクトースを基にし以下の化学式を有する。
2006523211.tif 000008
ここでR15-R19は上記の通りでありR15-R19の少なくとも二個が式Ｉの成分である。
【００２７】
上記の様な化学式を有する他の典型的糖誘導の構造としてはマンノース及びブドウ糖ベースの分岐水溶性ポリマーである。
【００２８】
更にＲ１５はペプチドのアミノ酸との結合又はペプチドのアミノ酸と直接結合するか又はアミノ酸と連結のグリコシル残基と複合化する事でペプチドのアミノ酸と間接的に結合するグリコシル成分との結合からなる。
【００２９】
本発明は又実質的に単分散集団のポリ（エチレングリコール）合成法を提供する。この方法は明確な分子量を有するＰＥＧ分子、例えばＰＥＧ２００と明確な分子量を有する二官能性活性化ＰＥＧ、例えばＰＥＧ２００の少なくとも２当量と接触させる事からなり、その結果ＰＥＧの単分散試料、例えばＰＥＧ６００を生成する。
2006523211.tif 000009
Ｇはスルホン酸エステルやトリフルオロメタンスルホン酸エステルの様な脱離基である。そこで単分散試料のＰＥＧ６００を二官能性活性化ＰＥＧ２００と接触して単分散ＰＥＧ１００を形成できる。代わりに単分散ＰＥＧ６００を対応二官能性誘導体に変換し、単分散ジヒドロキシＰＥＧ６００の少なくとも２当量と反応して単分散ＰＥＧ１８００を生成できる。本発明のプロセスを所要サイズの単分散ＰＥＧが得られるまで繰り返す。出発材料と生成物間の分子量差を用いていかなる未反応又は一部反応した材料をサイズ排除クロマトグラフィで分離できるようこの合成をデザインする事ができる。
【００３０】
更にポリ（エチレングルコール）の様な修飾水溶性ポリマー生成改良法の必要性に応じて、本発明はポリマーバックボーンの化学的活性化と延長化の方法を提供する。モノ活性化ＰＥＧ分子はＰＥＧを広範囲の種、例えば目標成分、治療用成分、抗ガン剤、細胞毒素、放射性試薬、アミノ酸、糖類及び同類と複合化するのに利用する。
【００３１】
従ってその他の様態では本発明は活性化水溶性ポリマー、特にポリ（エチレングリコール）及びその構造類似体の段階的組み立て法を提供する。この方法は一官能化及び二官能化ＰＥＧ分子への容易なアクセスを提供する。
【００３２】
かくして典型的実施形態では本発明はポリ（エチレングリコール）誘導体合成法を提供する。その方法は以下に概説する。
2006523211.tif 000010
Ｒ−Ｙ／（酸又は塩基）；（ｂ）活性化、例えばトシル化、ハロゲンー脱ヒドロキシ化
例えばＨＸ又はＳＯＸ２とＰＥＧｍとの反応；（ｃ）活性化（R'）、例えばｐーニトロフェニルクロロ蟻酸エステル。
ここで指標ｍとnは整数１乃至１００，０００を独立に表す。
【００３３】
ステップ（a）では出発グリコールを活性化基（Ｒ−Ｙ）と接触してグリコールの水酸基と反応する。Ｙは通常脱離基で、ＲをＰＥＧ分子の水酸基の一つに配置できる。ステップ（ｂ）で生成付加物のフリーの水酸基をスルホン酸エステルの様な基に変換して活性化する。活性化ＰＥＧ種は出発ＰＥＧ（ "ＰＥＧｍ "）と同重合度又は異なる重合度の他のＰＥＧ成分と接触する。他種に連結させることでＲＯ−ＰＥＧn+mを任意にフリーの水酸基を活性化する。
【００３４】
本発明の化合物は治療薬で利用できる一個又はそれ以上の反応残基を直接化学的にＰＥＧ化する事により治療薬、例えばペプチド、脂質、糖脂質の様な基質の水溶性ポリマー複合物形成に利用する。本発明の化合物は又基質の酵素介在の糖ＰＥＧ化に利用できる活性化糖複合物に容易に導入できる。
【００３５】
本発明は本発明の一個又はそれ以上の分岐水溶性ポリマーと複合化した治療薬の薬剤処方を提供する。又治療薬と本発明の分岐水溶性ポリマーとの複合物を投与して改善又は治癒する疾患治療法を提供する。
【００３６】
本発明の追加様態、利点及び対象は以下の詳細記述から明白である。
【発明の開示】
【００３７】
略語
ＰＥＧ，ポリ（エチレングリコール）；ｍ−ＰＥＧ，メトキシポリ（エチレングルコール）；ＰＰＧ，ポリ（プロピレングリコール）；ｍ−ＰＰＧ，メトキシポリ（プロピレングリコール）；Ｆｕｃ，フコシル；Ｇａｌ，ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ，Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ，グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ，Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ，マンノシル；ＭａｎＡｃ，酢酸マンノサミニル；Ｓｉａ，シアル酸；及びＮｅｕＡｃ，Ｎ−アセチルノイラミニル。
【００３８】
定義
別に定義していない限り、ここに用いた全ての技術科学用語は通常本発明が属する技術の通常技術者が一般に理解するのと同義である。通常ここで使用の命名法と細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学とハイブリッド形成での実験室手法は良く知られている物であり技術的に一般に使用されている。標準技法を核酸及びペプチド合成に使用する。その技法と手順は通常種々の文献にある技術的に従来の方法により実施し（ここに文献として含めたサムブルック等（Sambrook）、 分子クローニング、実験マニュアルMolecular Cloning: A Laboratory Manual）、２版、１９８９年、コールドスプリングハーバー出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドすプリングハーバー、ニューヨーク参照）、本文書を通して供与されている。ここに記載の分析化学及び有機合成での使用命名法と実験室的手法はよく知られている物で技術的に通常使用されている。標準技法又はその修正した物を化学合成及び化学分析に用いる。
【００３９】
ここで用いた用語 "糖質複合化 "は修飾糖種とペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基との酵素仲介複合化を意味する。 "糖質複合化 "の亜属である "糖質ＰＥＧ化 "は修飾糖の修飾基がポリ（エチレングリコール）及びそのアルキル誘導体（例えばｍ−ＰＥＧ）又は反応性誘導体（例えばH2N-PEG, HOOC-PEG）である。
【００４０】
用語 "シアル酸 "はカルボン酸化した炭素数９の糖類のいかなるメンバーに関する。シアル酸類の最も一般的メンバーはＮ−アセチルノイラミン酸（２−ケトー５−アセトアミドー３，５−ジデオキシーＤ−グリセローＤ―ガラクトノヌロピラノースー１―オニックアッシド（しばしばＮｅｕ５Ａｃ，ＮｅｕＡｃ又はＮＡＮＡと略称）である。この族の第二のメンバーはＮ―グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕＧｃ）でありＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基が水酸化されている。第三のシアル酸族メンバーは２−ケトー３−デオキシーノヌロソン酸（ＫＤＮ）である。（ナダノ等、（Nadano et al.）ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６１巻、１１５５０−１１５５７頁、１９８６年、金森等（Kanamori et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６５巻、２２１８１１−２１８１９頁、１９９０年）。又９−Ｏ−ラクチルＮｅｕ５Ａｃ又は９−Ｏ−アセチルＮｅｕ５Ａｃの様な９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシルＮｅｕ５Ａｃ、９−デオキシー９−フルオロＮｅｕ５Ａｃ及び９−アジドー９―デオキシＮｅｕ５Ａｃの様な９−置換シアル酸が含まれる。このシアル酸族の総説に関しては例えば、バルキ(Varki)、グリコバイオロジー(Glycobiology)、２巻、２５−４０頁、１９９２年、シアル酸：化学、代謝及び機能（Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function）、アール．シャウア（R. Schauer）編、スプリンガー出版社 （Springer-Verlag）、ニューヨーク、１９９２年を参照。シアル化法でのシアル酸化合物の合成と使用については１９９２年１０月１日発行の国際出願ＷＯ９２／１６４４０に開示されている。
【００４１】
"ペプチド "はモノマーがアミノ酸でアミド結合により一緒に結合したポリマーであり、代わりにポリペプチドとも呼ばれる。更には不自然なアミノ酸、例えばβ―アラニン、フェニルアラニン及びホモアルギニンも又含む。遺伝子コード化されてないアミノ酸も又本発明に使用できる。更に反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療用成分、生体分子及び同類を含む様に修飾したアミノ酸も又本発明に使用できる。本発明で使用の全アミノ酸はＤ−又はＬ―異性体のいずれかである。Ｌ−異性体が通常好ましい。更に他のペプチド模倣体も本発明に有用である。ここで用いた "ペプチド "はグリコシル化及び非グリコシル化ペプチドの両者に関する。又ペプチドを表す系で不完全にグリコシル化したペプチドも又含む。一般的総説に関しては、スパトラ、エイ エフ（Spatola, A. F.）、ビー．ウインスタイン（B. Weistein）編、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の化学と生化学（Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins）、マーセルデッカー社（Marcel Dekker）、１９８３年、２６７頁を参照。
【００４２】
用語 "ペプチド複合物 "はペプチドをここに記載の修飾糖で糖質複合化した本発明種に属する。代表例としてはそのペプチドは野生型ペプチドには存在しないＯ−連結グリコシル化部位を有する突然変異ペプチドである。
【００４３】
用語 "アミノ酸 "は天然に生じるアミノ酸、合成アミノ酸、更にはアミノ酸類似体及び天然に生じるアミノ酸と類似に作用するアミノ酸模倣体が属する。天然に生じるアミノ酸は遺伝暗号でエンコードされたものと同様に後で修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ―カルボキシグルタミン酸塩及びＯ−ホスホセリンがある。アミノ酸類似体は天然に生じるアミノ酸と基本化学構造が同じ化合物、即ちα―炭素が水素原子、カルボキシ基、アミノ基及びＲ基と結合したもの、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキサイド、メチオニンメチルスルホニウムが属する。このような類似体は修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）又は修飾ペプチドバックボーンを有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体はアミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に生じるアミノ酸と同様の作用をする化合物が属する。
【００４４】
ここで用いる用語 "修飾糖 "は本発明の分岐水溶性ポリマーで修飾され、ペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基、脂質、糖脂質及び同類に酵素的添加できる天然に生じるか又は生じない炭水化物が属する。修飾糖としては限定されないが、糖ヌクレオチド（一リン酸、二リン酸及び三リン酸）及び活性化糖（例えばハロゲン化グリコシル、グルコシルメシラート）及び活性化もされずヌクレオチドでもない糖を含む多数の酵素基質から選ぶ。 "修飾糖 "は本発明の分岐ポリマーである "修飾基 "により共有結合で機能化する。修飾基で機能化する場所は "修飾糖 "が酵素的にペプチドや他基質への添加を妨害しない様に選ぶ。
【００４５】
用語 "水溶性 "は水への検出可能程度の溶解度を有する事を意味する。水溶解度の検出法及び／又は定量法は技術的に知られている。典型的水溶性ポリマーとしてはペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）及び同類がある。ペプチドは単一アミノ酸からなる混合配列、例えばポリ（リジン）でも良い。典型的糖類はポリ（シアル酸）である。典型的ポリ（エーテル）はポリ（エチレングリコール）、例えばｍ−ＰＥＧである。ポリ（エチレンイミン）は典型的ポリアミンであり、ポリ（アクリル酸）は代表的ポリ（カルボン酸）である。
【００４６】
用語 "ポリ（エチレングリコール） "、 "ＰＥＧ "、 "ポリ（プロピレングリコール） "及び "ＰＰＧ "は総称的な意味で用いられ、親化合物誘導体、例えばモノアルキル種、例えばｍ−ＰＥＧ、ｍ−ＰＰＧ、反応性種例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド、ｐ−ニトロフェニル炭酸エステル（ｐ−ＮＰ）、ＨＯＢＴ誘導体及びアミン類を含む。これら用語に含まれる物は又二個又はそれ以上の修飾を含む種、例えばｐ−ＮＰ−ＰＥＧ−ＯＭｅ及び同類がある。
【００４７】
ここで使用の用語 "グリコシル連結基 "は試薬（例えば水溶性ポリマー、治療用成分、生体分子）と共有結合するグリコシル残基が属する。本発明法では "グリコシル連結基 "はグリコシル化か非グリコシル化ペプチドと共有結合で連結し、その結果この試薬がペプチドのアミノ酸及び／又はグリコシル残基と連結する。 "グリコシル連結基 "は一般に "修飾糖 "をペプチドのアミノ酸及び／又はグリコシル残基に酵素的に連結し "修飾糖 "を誘導化する。 "無傷グリコシル連結基 "は複合体と連結する各糖モノマーが、例えばナトリウムメタ過沃素酸による、例えば酸化で分解しないグリコシル成分の誘導連結基が属する。本発明の "無傷グリコシル連結基 "は天然に生じるオリゴ糖類に一個又は複数のグリコシル単位を付加するか又は親糖構造から一個又はそれ以上のグリコシル単位を除去して誘導しても良い。
【００４８】
ここに用いた "薬剤的に容認の担体 "としては複合物と組み合わしたとき、複合物の活性を維持し且つ被験者の免疫系と非反応ないかなる材料を含む。例としては限定はされないが、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョンの様なエマルジョン及び種々のタイプの湿潤剤の様な標準薬剤担体がある。他の担体としては減菌溶液、塗布錠剤を含む錠剤及びカプセルがある。通常これら担体は澱粉、ミルク、砂糖、あるタイプのクレー、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、タルク、植物性脂肪又は植物油、ガム、グリコール又は他の既知賦形剤の様な賦形剤を含む。このような担体は又香料及び着色添加剤或いは他成分を含有できる。この様な担体含有組成はよく知られた従来法で配合する。
【００４９】
ここで用いた "投与する "の意味は被験者への経口投与、座薬投与、局所的、静脈、腹腔内、筋肉内、病巣内の様な投与、又は皮下投与、吸入投与又は低速放除器具、例えばミニ浸透圧ポンプの着床である。投与は非経口及び径粘膜的（例えば経口、径鼻、径膣、径直腸又は径皮的に）、特に吸入を含むいずれかの手段で行う。非経口投与としては例えば、静脈、筋肉内、細動脈内、径粘膜的、皮下、腹腔内、脳室内及び頭蓋内がある。更に注射が腫瘍治療、例えばアポトーシス誘導の場合には、投与を腫瘍及び／又は腫瘍周囲組織に直接行っても良い。他のデリバリー形態としては限定はされないが、リポソーム配合、静脈注入、径皮貼付などがある。
【００５０】
用語 "単離の "は材料生成に用いる成分が実質的に或いは本質的に無い材料を意味する。本発明のペプチド複合物については、用語 "単離の "はペプチド複合物生成に用いる混合物中の材料を通常は伴う成分が実質的に或いは本質的に無い事を意味する。 "単離の "と "純粋な "は互換性がある様に用いる。通常本発明の単離ペプチド複合物は好ましくは純度レベルを幅で表す。ペプチド複合物純度幅の下端は約６０％、約７０％或いは約８０％であり純度幅の上端は約７０％、約８０％、約９０％又は約９０％以上である。
【００５１】
ペプチド複合物が約９０％以上純粋であれば、その純度は好ましくは幅で表す。純度幅の下端は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％又は約９８％である。純度幅の上端は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％或いは約１００％純度である。
【００５２】
純度はいかなる技術的に容認された分析法（例えば銀染色ゲルのバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー或いは類似手段）で決定する。
【００５３】
ここで用いた "本質的に集団の各メンバー "によりペプチドへ選択割合で添加の修飾糖をペプチドの複数の同一受容体個所に添加する本発明のペプチド複合物集団の特性を記述する。 "本質的に集団の各メンバー "は修飾糖に複合化したペプチド部位の "均質性 "を物語且つ少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％均一である本発明の複合物を意味する。
【００５４】
"均質性 "は修飾糖類が複合化する受容体成分集団での構造的均一性を意味する。従って各修飾糖成分が他の修飾糖それぞれが複合化する受容体部位と同構造を有する受容体部位と複合化する本発明のペプチド複合物では、そのペプチド複合物は約１００％均質であると云われる。均質性は通常幅で表す。ペプチド複合物の均質性幅の下端は約６０％、約７０％、又は約８０％であり且つ純度幅の上端は約７０％、約８０％、約９０％又は約９０％以上である。
【００５５】
ペプチド複合物が約９０％に等しいかそれ以上に均質であれば、その均質度は好ましくは又幅で表す。均質性の下端は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％又は約９８％である。純度幅の上端は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％又は約１００％均質である。ペプチド複合物純度は通常技術の熟練者には既知の一つ又はそれ以上の方法、例えば液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動法及び同類で決定する。
【００５６】
"実質的に均一な糖形態 "或いは "実質的に均一なグルコシル化形態 "は糖ペプチド種を意味するときには、関心糖転位酵素（例えばフコシル基転位酵素）によりグリコシル化する受容体成分の割合を意味する。例えばα１，２フコシル基転位酵素の場合、実質的に全てのＧａｌβ１，４―ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（以下に定義する）とそれらのシアル酸付加類似体が本発明のペプチド複合物でフコシル化されるならば、実質的に均一なフコシル化形態が存在する。技術の熟知者には出発原料がグルコシル化受容体成分（例えばフコシル化Ｇａｌβ１．４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ成分）を含有しても良い事が分かる。従って計算のグルコシル化パーセントは本発明法によるグリコシル化受容体成分と同時に出発原料で既にグリコシル化された受容体成分も含有する。
【００５７】
"実質的に均一な "という上記定義での用語 "実質的に "は通常特定糖転位酵素用の受容体成分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又はより好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されることを意味する。
【００５８】
用語 "大規模 "及び "工業規模 "は互換性がある様に用いられ、一サイクルの反応の完了で少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも１ｇの糖複合物を生成する反応サイクルを意味する。
【００５９】
2006523211.tif 000011
【００６０】
本発明のある化合物は非溶媒和型と同様に水和型を含む溶媒和型で存在できる。一般に溶媒和型は非溶媒和型と同等であり本発明の範囲内に含まれる。本発明のある化合物は複数の結晶形又は非晶形で存在できる。一般に全ての物理的形態は本発明が意図する使用に関しては同等であり本発明の範囲内を意味する。
【００６１】
本発明のある化合物は不斉炭素原子（光学中心）や二重結合を有する。ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体及び各異性体は本発明の範囲内に含まれる。
【００６２】
本発明の化合物は単一異性体（例えば鏡像異性体、シスートランス、位置、ジアステレオマー）として生成できる。好ましい実施形態では化合物は実質的に単一異性体として生成する。実質的に異性体的に純粋な化合物生成法は技術的に知られている。例えば鏡像異性的にリッチな混合物及び鏡像異性的に純粋な化合物はキラル中心の立体化学を変えずに残すか完全に反転するかのいずれかの反応を組み合わして鏡像異性的に純粋な合成中間体を用いて合成できる。代わりに合成経路での最終生成物又中間体を単一立体異性体に分割できる。特定の立体中心を反転するか又は変えずに残す手法及び立体異性体混合物を分割する手法は技術的に知られており、特定状況に適する方法の選択は十分にこの技術の熟知者の能力範囲内である。一般にはファーニス等（Furniss et al.）、ボーゲル（Vogel）（編）、実用有機化学事典（Encyclopedia of Practical Organic Chemicstry）、ロングマン科学技術社（Longman Scientific and Technical Ltd.）、エッゼクス、１９９１年、８０９−８１６頁及びヘッラー（Heller）、アカントオブケミカルリサーチ（Acc. Chem. Res.）、２３巻、１２８頁、１９９０年参照。
【００６３】
本発明の化合物は又一個又はそれ以上の異常割合の同位元素を化合物構成原子に含有しても良い。例えば化合物は例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素―１２５（１２５Ｉ）又は炭素―１４（１４Ｃ）の様な放射性同位元素で放射標識化できる。本発明の化合物での全同位元素変形物は、放射性でも非放射性でも本発明の範囲内に含まれる事を意味する。
【００６４】
置換基が左から右に書く従来の化学式で明記した場合、これらは構造を右から左に書いた化学的に同一置換基を同様に含み、例えば-CH2O- は又-OCH2-と書けること意味する。
【００６５】
用語 "アルキル "それ自身又は他の置換基の一部として別に記述しない限り、直鎖、分岐鎖又は環状の炭化水素基或いはそれらの組み合わせを意味し、これらは完全に飽和、モノ又はポリ不飽和で且つ指定炭素数を有する（即ちＣ１−Ｃ１０は１乃至１０個の炭素原子を意味する）二価（ "アルキレン "）及び多価基を含む事ができる。飽和炭化水素基の例としては限定はされないが、メチル、エチル、n―プロピル、イソプロピル、n―ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、sec―ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばn―ペンチル、n―ヘキシル、n―ヘプチル、n―オクチル及び同類の同族体及び異性体がある。不飽和アルキル基は一個又はそれ以上の二重結合又は三重結合を有する物である。不飽和アルキル基の例としては限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２―イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル及びその高級同族体及び異性体がある。用語 "アルキル "は別に記述されていなければ "ヘテロアルキル "の様に以下により詳細に定義したアルキル誘導体を含むことを意味する。炭化水素基に限定したアルキル基は用語 "ホモアルキル "と名付ける。
【００６６】
本発明で用いる典型的アルキル基は約１乃至約２５の炭素原子（例えばメチル、エチル及び同類）を含有する。炭素原子８個又はそれ以下を有する直鎖、分岐鎖又は環状炭化水素鎖はここでは "低級アルキル "を呼ぶ。更にここで用いる用語 "アルキル "は炭化水素鎖断片の一個又はそれ以上の炭素原子で一個又はそれ以上置換した物も含む。
【００６７】
用語 "アルコキシ "、 "アルキルアミノ "及び "アルキルチオ "（又はチオアルコキシ）は従来の意味で使用され、且つそれぞれ酸素原子、アミノ基又は硫黄原子により分子残基と結合するアルキル基を意味する。
【００６８】
用語 "ヘテロアルキル "はそれ自身或いは他用語との組み合わせで別に記述しない限り、記載炭素原子数と酸素、窒素、珪素、リン及び硫黄原子からなるグループから選択した少なくとも一個のヘテロ原子からなり、窒素、リン及び硫黄原子が任意に酸化され、且つ窒素ヘテロ原子が任意に四級化されている直鎖、分岐鎖又は環状炭素含有基、又はそれらの基の組む合わせを意味する。一個又は複数のヘテロ原子、酸素、窒素、リン、硫黄及び珪素原子はヘテロアルキル基のいかなる内側位か又はアルキル基の分子残基結合位に位置できる。例としては限定されないが、-CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH-N-OCH3 及びCH=CH-N(CH3)-CH3がある。例えば-CH2-NH-OCH3及び CH2-O-Si(CH3)3の様に二個のヘテロ原子まで連続できる。同様に用語 "ヘテロアルキレン "はそれ自身又は他置換基の一部として限定はされないが、-CH2-CH2-S-CH2-CH2-及び-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-で例示されるヘテロアルキル由来の二価の基を意味する。ヘテロアルキレン基でのヘテロ原子は又鎖末端の片側か両側を占める事ができる（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ及び同類）。更にアルキレン又はヘテロアルキレン連結基において連結基化学式の書いた方向が連結基の方向付けを意味する物ではない。例えば化学式-C(O)2R'- は-C(O)2R'-と -R'C(O)2-の両者を表す。
【００６９】
用語 "環状アルキル "及び "ヘテロ環状アルキル "はそれ自身又は他用語との組み合わせで別に記述してない限り、それぞれ "アルキル "及び "ヘテロアルキル "の環状バージョンを表す。更にヘテロ環状アルキルのヘテロ原子はヘテロ環の分子残基連結位を占めることができる。環状アルキルの例として限定はされないがシクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロへブチル及び同類がある。ヘテロ環状アルキルの例として限定はされないが１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホルニル、３−モルホルニル、２−テトラヒドロフラニル、３−テトラヒドロフラニル、２−テトラヒドロチエニル、３−テトラヒドロチエニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル及び同類がある。
【００７０】
用語 "アリール "は別に記述してなければ単環又は一緒に縮合するか又は共有結合した複数環（好ましくは１乃至３環）の多不飽和芳香族基を意味する。用語 "ヘテロアリール "は窒素、酸素及び硫黄から選んだ１個乃至４個のヘテロ原子を含有し、窒素と硫黄原子が任意に酸化され且つ一個又は複数の窒素原子が任意に四級化された芳香族基（又は環）を意味する。ヘテロアリール基はヘテロ原子により分子残基と連結できる。アリール及びヘテロアリール基の非限定例としてはフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４―ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２―イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニルー４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ[ｂ]フラニル、ベンゾ[ｂ]チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ[１，４]―６−ダイオキシニル、ベンゾ[１，３]―５−ジオキソリル及び６−キノリルがある。上記の各芳香環及び複素環系での置換基は以下に記述の容認された置換基グループから選択する。
【００７１】
用語 "アリール "を略して他用語（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わして用いる時には上に定義したようにアリールとヘテロアリールの両者を含む。従って用語 "アリールアルキル "はアリール基が炭素原子（例えばメチレン基）を例えば酸素原子で置換したアルキル基含有のアルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチル及び同類）と連結した基（例えばフェノキシメチル、２―ピリジロキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル及び同類）を含む事を意味する。
【００７２】
上記用語のそれぞれ（例えば "アルキル "、 "ヘテロアルキル "、 "アリール "及び "ヘテロアリール "）は表示基の置換形と非置換形の両者を含む。各タイプの基に好ましい置換基を以下に供与する。
【００７３】
アルキル基及びヘテロアルキル基（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニル）の置換基は総称的に "アルキル基置換基 "と呼ばれ、限定はされないが種々の基の一個又はそれ以上を以下から選ぶ：数ゼロから（２ｍ'＋１）範囲での-OR', =O,=NR',=N-OR, -NR'R ", -SR', ハロゲン、-SiR'R "R' ", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R ", -O(CO)NR'R ", -NR "C(O)R', NR'-C(O)NR "R' ", -NR "C(O)2R', -NR-C(NR'R "R' ")=NR " ", -NR-C(NR'T ")=NR' ", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R ", -NRSO2R', -CN 及びNO2であり、ここでｍ’は各基の全炭素原子数である。R', R ", R' "及び R " "はそれぞれ好ましくは独立に水素原子、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、例えば１乃至３個のハロゲン置換アリール、置換又は非置換アルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を意味する。例えば本発明の化合物が一個以上のＲ基を含有する時には、各Ｒ基はR', R ", R' "及び R " "基の一個以上が存在する時の各基の様に独立に選ぶ。R' 及びR "が窒素原子と連結している時には、窒素原子と連結して５、６又は７員環を形成する。例えば-NR'R "は限定されないが１−ピロリジニル及び４−モルフホリニルを含むことを意味する。置換基に関する上記の検討から技術の熟知者には用語 "アルキル "はハロアルキル（例えば-CF3 及びCH2CF3）及びアシル（例えばC(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3及び同類）の様な水素基以外の基と結合した炭素原子含有基を含む事を意味する事が分かる。
【００７４】
アルキル基に関して記述の置換基と同様にアリール基及びヘテロアリール基に関する置換基は総称的に "アリール基置換基 "と云われる。その置換基は例えば以下から選ぶ。数ゼロから芳香環系の全開原子価数範囲でのハロゲン、-OR', =O,=NR',=N-OR, -NR'R ", -SR', ハロゲン、-SiR'R "R' ", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R ", -O(CO)NR'R ", -NR "C(O)R', NR'-C(O)NR "R' ", -NR "C(O)2R', -NR-C(NR'R "R' ")=NR " ", -NR-C(NR'R ")=NR' ", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R ", NRSO2R', -CN 及びNO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, フルオロ(C1-C4)アルコキシ及びフルオロ(C1-C4)アルキルであり、ここでR', R ", R' "及び R " "はそれぞれ好ましくは水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール及び置換又は非置換ヘテロアリールから独立に選択する。例えば本発明の化合物が一個以上のＲ基を含有する時には、各Ｒ基はR', R ", R' "及び R " "基の一個以上が存在する時の各基の様に独立に選ぶ。以下のスキームでは記号Ｘは上述の "Ｒ "を表す。
【００７５】
芳香環又は複素環での隣接原子上の二個の置換基は化学式-T-C(O)-(CRR')q-U-置換基で任意に置換でき、ここでＴ及びＵは独立に-NR, -O-, -CRR'-又は一重結合でありｑは０乃至３の整数である。代わりに芳香環又は複素環での隣接原子上の二個の置換基は化学式-A-(CH2)r-B-置換基で任意に置換でき、ここでＡとＢは独立に-CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'-又は単結合であり、ｒは１乃至４の整数である。生成した新規環での一重結合の内の一つは任意に二重結合で置換できる。代わりに芳香環又は複素環での隣接原子上の二個の置換基は化学式-(CRR')s-X-(CR "R' ")d-置換基で任意に置換でき、ここでｓとｄは独立にゼロから３の整数でありＸは-O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-又は-S(O)2NR'-である。置換基R', R ", R' "及び R " "は好ましくは水素原子又は置換又は非置換(C1-C6)アルキルから独立に選ぶ。
【００７６】
ここで用いた用語：ヘテロ原子 "は酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）及び珪素（Ｓｉ）を含む。
【００７７】
用語 "アミノ "又は "アミン基 "は-NR'R " 基(又は-N+RR'R ")を意味し、ここで R、 R'、 R "は水素原子、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール及び置換ヘテロアリールからなる基から独立に選ぶ。置換アミンはR' 又はR "が水素原子以外のアミノ基である。第一級アミノ基ではR' とR "ｍの両者は水素原子であるが、第二級アミノ基ではR' かR "の両者ではなくそのいずれかが水素原子である。更に用語 "アミン "及び "アミノ "は-N+RR'R "基及びその生物学的に適合する陰イオンの対イオンを含むプロトン化及び四級化バージョンの窒素を含む事ができる。
【００７８】
用語 "ハロ "又は "ハロゲン "はそれ自身又は他置換基の一部として別に記述してなければフッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を意味する。更に "ハロアルキル "のような用語はモノハロアルキル及びポリハロアルキルを含む事を意味する。例えば用語 "ハロ(C1-C4)アルキル "は限定されないがトリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル及び同類を含むことを意味する。
【００７９】
ここで用いた用語 "リンカー "又は "Ｌ "は水溶性ポリマー又は分岐水溶性ポリマーを化学反応基の様な他成分或いは生体物質又は非生体物質含有複合物と共有結合する炭素、窒素、酸素、硫黄及びリンからなる基から選んだ１−２０個の非水素原子を有する一重共有結合又は一連の安定共有結合を意味する。典型的連結メンバーとしては-C(O)NH-, -C(O)O-, -NH-, -S-, -O-及び同類含有成分がある。 "開裂可能リンカー "は反応或いは条件により切断できる一個又はそれ以上の切断可能基を有するリンカーである。用語 "開裂可能基 "は複合物の一部、例えば水溶性ポリマーが複合物の残基から放除成分の複合物残基との結合を切断して放除できる成分を意味する。このような切断は事実上化学的に或いは酵素的に仲介される。典型的酵素的開裂可能基としては天然アミノ酸や天然アミノ酸を末端に持つペプチド配列がある。
【００８０】
酵素的開裂可能基のほかに酵素以外の試薬の作用で切断する部位を一個又はそれ以上含む事は本発明の範囲内である。典型的非酵素的開列裂試薬は限定されないが、酸、塩基、光（例えばニトロベンジル誘導体、フェナシル基、ベンゾインエステル）及び熱を含む。多くの開裂可能基が技術的に知られている。例えばユング等、（Junt et al）、バイオケミストリーアンドバイオフィジックアクタ（Biochm. Biophys. Acta）、７６１巻、１５２―１６２頁、１９８３年、ジョッシ等（Joshi et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６５巻、１４５１８−１４５２５頁、１９９０年、ザーリング等（Zarling et al.）ジャーナルオブインミュノロジー（J. Innunol.）、１２４巻、９１３−９２０頁、１９８０年、ブーザー等（Bouizar et al.）、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）、１５５巻、１４１−１４７頁、１９８６年、パーク等（Park et al.）ジャーナルオブバイオケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６１巻、２０５−２１０頁、１９８６年、ブラウニング等（Browning et al.）、ジャーナルオブインミュノロジー（J. Immunol）、１４３巻、１８５９−１８６７頁、１９８９年を参照。更に広範囲の開裂可能な二官能性（ホモ及びヘテロ二官能性）スペーサーアームが商業的に入手できる。
【００８１】
典型的開裂可能基であるエステルは試薬、例えば苛性ソーダで切断可能な開裂可能基であり、カルボン酸塩含有断片と水酸基含有生成物を生ずる。
【００８２】
リンカーは化合物を対象成分（例えば抗体、配位子、非共有結合タンパク質結合基等）、検体、生体分子、薬剤及び同類のような複合物の他成分と連結するのに利用できる。
【００８３】
"非共有結合タンパク質結合基 "は無傷又は変性ポリペプチドと関連で相互作用する成分である。相互作用は生物環境で可逆的か不可逆的かのいずれかでも良い。 "非共有結合タンパク質結合基 "を本発明の蛍光発生性化合物に組み込む事によりポリペブチドと非共有結合的に相互作用できる化合物を提供する。典型的非共有結合相互作用としては疎水性―親水性及び静電的相互作用がある。典型的 "非共有結合タンパク質結合基 "としては陰イオン基、例えばリン酸塩、チオリン酸塩、ホスホン酸塩、カルボン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、スルホン、チオ硫酸塩及びチオスルホン酸塩がある。
【００８４】
ここで用いた "核酸 "はＤＮＡ，ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖或いは高度に凝集したハイブリッド形成モチーフ及びこれらのいかなる化学的修飾物を意味する。修飾物は限定されないが核酸配位子塩基又は核酸配位子全体に追加電荷、分極性、水素結合、静電的相互作用及び流動性を取り入れる化学基を供与する物である。このような修飾物としては限定されないが、ペプチド核酸（ＰＡＮ）、ホスホヂエステル基修飾物（例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート）、２−位糖修飾物、５−位ピリミジン修飾物、８−位プリン修飾物、環外アミンの修飾物、４−チオウリジンの置換体、５−臭素又は５−ヨードウラシルの置換体、バックボーン修飾物、メチル化、イソ塩基、イソシチジン、イソグアニジン及び同類の様なイソ塩基の様な異常塩基対の組み合わせがある。核酸は又例えばニトロインドールの様な非天然塩基も含む。修飾物は又失活剤、フルオロフォア又は他成分でキャップする様な３’及び５位修飾物を含む。
【００８５】
ここで用いた用語 "反応基 "は他の化学基と反応して共有結合を形成できる、即ち適切な反応条件下で共有結合的な反応性がある基を意味し、通常他の物質との連結点を表す。反応基はカルボン酸やスクシニミドエステルの様な他化合物の官能基と化学反応可能で蛍光性又は蛍光発生標識化成分を生成する本発明化合物成分である。反応基は通常求核試薬、求電子試薬及び光活性化基を含む。
【００８６】
典型的反応基としては限定されいが、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキサイド、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアン酸塩、イソシアン酸塩、チオシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジッド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、硫化物、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸塩、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸塩、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物及びニトロソ化合物がある。反応性官能基としては又生体複合物生成に使用する物、例えばＮ−ヒドロキシスクシミドエステル、マレイン酸イミド及び同類がある。これら各官能基作成法は技術的に良く知られておりその特定目的への応用又は修飾はこの技術の熟知者の能力範囲内である。（例えばサンドラー及びカロ(Sandler and Caro)編 、 有機官能基の生成(Organic Functional Group Preparations)、アカデミックプレス社（Academic Press）、サンジエゴ、１９８９年を参照）。
【００８７】
用語 "目標基 "は以下の成分を意味する。（１）連結する構成要素（例えば蛍光発生成分）を対象領域、例えば細胞に能動的に誘導できる成分、又は（２）対象領域に優先的に受動的に吸収されるか同期する成分。目標基は小分子でありえ、非ペプチドとペプチドの両者を含む事を意味する。目標基は限定されないが又巨大分子でも良く、糖類、レクチン、受容体、受容体用の配位子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の様なタンパク質、抗体、ポリ（エーテル）、デンドリマー、ポリ（アミノ酸）などを含む。
【００８８】
ここで用いた "担体分子 "は本発明の化合物と連結するいかなる分子を意味する。代表的担体分子としてはタンパク質（例えば酵素、抗体）、糖タンパク、ペブチド、糖類（例えば単糖、オリゴ糖及び多糖類）、ホルモン、受容体、抗原、基質、代謝物、遷移状態類似体、補助因子、阻害剤、薬剤、染料、栄養素、成長因子など限りなく挙げられる。 "担体分子 "は又 "分子 "の伝統的定義内に入るとは考えられない種、例えば固体サポート（例えば合成サポート、クロマートグラフ用サポート、膜）、ウイルス及び微生物をも意味する。
【００８９】
序文
本発明は分岐水溶性ポリマー及びこの分岐水溶性ポリマーの複合物を提供する。この複合物は本発明の分岐水溶性ポリマーとこの分岐水溶性ポリマーと複合化出来る反応基含有種との間に形成される。本発明水溶性ポリマー用の典型的複合化パートナーとしてはペプチド、糖ペプチド、脂質及び糖脂質がある。典型的複合物は本発明の分岐水溶性ポリマーを有する修飾糖をペプチドのグリコシル化部位に直接又は間接的に（例えば介在グリコシル残基を通じて）連結する物である。又本発明の複合物生成法も供与する。
【００９０】
この複合物と本発明の複合物形成法はここではペプチド及び糖ペプチドを引例として説明する。議論の焦点は説明の明確化にありこの複合物形成に用いるここに開示の分岐水溶性ポリマーの有用性を制限する物と解釈してはならない。この技術の熟知者には本発明の分岐水溶性ポリマーが広範囲の分岐水溶性ポリマー複合物形成に利用される事が分かる。
【００９１】
前節で考察したように共有結合的ＰＥＧ化用の技術的認知の化学的方法はアミノ酸又は炭水化物の反応基による化学的複合化に依存する。複合物と反応条件を念入りに計画して、化学的仲介の複合化戦略を用いて有用な複合物が作成された。ポリマーのタンパク質や糖タンパクとの化学的複合化における主な欠点は活性化ポリマーの選択性の欠如であり、その結果ポリマーがタンパク質か糖タンパクの生物活性に関与する個所としばしば連結する。幾つかの戦略が位置選択的複合化の化学に対処するために展開されたが、種々の組み替えタンパク質に適した一般的方法は一つだけが開発された。
【００９２】
技術的認知の方法とは対照的に本発明は分岐水溶性ポリマーの高度に選択的位置指向のグリコ複合化、例えばグリコＰＥＧ化のための新規な戦略を提供する。本発明の典型的実施形態では分岐水溶性ポリマーの位置指向的連結を体外での特定ペプチド配列の酵素的グルコシル化により達成する。グリコ複合化は分岐水溶性ポリマーーグリコシル種、例えばＰＥＧ―シアル酸をグリコシル化部位に転位できる糖転位酵素を、例えばシアル酸転位酵素を用い酵素的に実施する（ "グリコーＰＥＧ化）。
【００９３】
分岐水溶性ポリマー
第一様態では本発明は下式を有する分岐水溶性ポリマーを提供する。
WSP―Y―Rx
ここでＷＳＰは水溶性ポリマーである。記号Ｙはリンカー、例えば結合又はアミド、カルボン酸エステル、ウレタン、メルカプタン、置換又は非置換アルキル及び同類を表す。典型的連結基としては(CH2)n、(CH2)mC(O)O(CH2)n、(CH2)mC(O)NH(CH2)n、(CH2)mOC(O)NH(CH2)n、(CH2)mO(CH2)n、(CH2)mNH(CH2)n及び(CH2)mS(CH2)nがあり、ここでｍ及びｎは独立に選んだゼロから６の整数である。Ｒｘは水溶性ポリマーと連結の置換又は非置換アルキル基、水溶性ポリマーと連結のアミノ酸又はアミノ酸二量体、又は水溶性ポリマーと連結の糖又は糖ヌクレオチドである。ＷＳＰ及びＲｘの水溶性ポリマー成分は同一水溶性ポリマーでも異なる水溶性ポリマーでも良い。
【００９４】
本発明の化合物に用いる典型的水溶性ポリマーとしてはｍ−ＰＥＧ、ＰＥＧ、ｍ−ＰＰＧ、ＰＰＧ、ポリシアル酸、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリラクチド、ポリグリセリド及び機能化ＰＥＧ、例えば末端機能化ＰＥＧがある。
【００９５】
典型的実施形態でＹは置換アルキルであり本発明は下式を有する分岐水溶性ポリマーを提供する。
2006523211.tif 000012
ここでＸ及びＹはOR1, NR2R3, SR4, COOR5, CONR6R7, OCONR6R7、置換及び非置換アルキル及び置換及非置換アリールから独立に選ぶメンバーである。Ｚ１はOR1', NR2'R3', SR4&apos;, COOR5', CONR6'R7', 置換及び非置換アルキル及び置換及非置換アリールから独立に選ぶメンバーである。記号R1, R4 及びR5は水溶性ポリマーを表す。R2, R3, R6及びR7は水素原子、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アリール、置換及び非置換ヘテロアリール、置換及び非置換ヘテロシクロアルキル、反応性官能基及びこれらの基で式（Ｉ）の化合物が少なくとも二個の水溶性ポリマー成分を含む様な選択条件を有する水溶性ポリマーから独立に選ぶ。記号R1', R2', R3', R4', R5'&apos;, R6'及びR7'&apos;は水素原子、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アリール、置換及び非置換ヘテロアリール、置換及び非置換ヘテロシクロアルキル、反応性官能基、担体分子及び水溶性ポリマーから独立に選択ぶ基を表す。
【００９６】
他の典型的実施形態ではＺ１は糖成分からなる。糖成分は活性化糖成分、例えば糖ヌクレオチドでも良い。更にＺ１はペプチドのアミノ酸に直接結合するか又はアミノ酸と連結のグリコシル残基と複合化してペプチドのアミノ酸と間接的に結合する糖成分からなっても良い。
【００９７】
式Ｉの本発明の典型的化合物は以下に示される。
2006523211.tif 000013
ここでＲ１４は水酸基か反応性官能基である。典型的反応性官能基はC(O)Q'であり、ここでQ' はC(O)Q'が反応性官能基である様に選ぶ。又Q'は担体分子（ "配位子 "）からなる。Q'の典型種としてはハロゲン、NHS、ペンタフルオルフェニル、HOBT、HOAt及びｐ−ニトロフェニルがある。指標 "ｍ "と指標 "ｎ "は１から２０，０００から独立に選んだ整数である。
【００９８】
上に示した化合物及び本発明の追加化合物は以下の出発原料で容易に生成できる。
2006523211.tif 000014
【００９９】
本発明の化合物への典型的手順を以下にしめす。
2006523211.tif 000015
配位子＝ペプチド、糖ヌクレオチド、脂質、糖脂質、糖、ＤＮＡ、ＲＮＡポリマー
【０１００】
本発明の化合物への他の典型的手順を以下に示す。
2006523211.tif 000016
【０１０１】
本発明はアミノ酸かオリゴアミノ酸（例えばジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド）に基づく分岐ポリマーを又供与する。典型的アミノ酸ベースの分岐ポリマーは以下から選ぶ化学式を有する。
2006523211.tif 000017
及び
2006523211.tif 000018
ここでR11, R11', R12, R12', R13',&#38;apos;及びR13'&apos;は水素原子、置換又は非置換アルキル及びこれら基で上記化合物が少なくとも二個の水溶性ポリマー成分を含むような選択条件を持つ水溶性ポリマーから独立に選ぶ。R14は水酸基、反応性官能基、糖成分を含む基又は担体分子と連結した基から選ぶメンバーである。Ａは酸素原子及び硫黄原子から選ぶメンバーである。指標 "ｓ "は整数１乃至５を表す。ＡはＮＨ、酸素原子及び硫黄原子から選ぶメンバーである。
【０１０２】
上の化学式で示した各化合物を他種（例えば核酸、ペプチド、糖類など）の化学的ＰＥＧ化に利用する。ＰＥＧ間での複合物形成法は技術的に通常知られている。例えばハーマンソン（Hermonson）、生体複合物法（Bioconjugate Techniquies）、アカデミックプレス社（Academic Press）、サンジエゴ、１９９６年及びフィーニー等、（Feeney et al.）、タンパク質の修飾（Modification of Proteins）、化学の進歩シリーズ（Advances in Chemistry Series）、１９８巻、アメリカ化学会、ワシントンディシー（Washington D.C.）、１９８２年参照。
【０１０３】
他の典型的実施形態ではＲ１４は糖成分を含む。糖成分は活性化糖成分、例えば糖ヌクレオチドであり得る。更にＲ１４はペプチドのアミノ酸に直接結合するか又はペプチドのアミノ酸をアミノ酸とグリコシル残基と複合化する事で間接的に結合する糖成分を含む。
【０１０４】
本発明の典型的組成物は以下の物を含む。
2006523211.tif 000019
2006523211.tif 000020
であり、ここで "ｍ "、 "n "及び "ｔ "は１から２０，０００から独立に選ぶ整数であり且つＲ１４は上に検討した通りである。
【０１０５】
他の典型例は以下を含む。
2006523211.tif 000021
の様な
2006523211.tif 000022
物である
【０１０６】
アミノ酸構造に基づく追加組成物は以下の表に示される。
2006523211.tif 000023
2006523211.tif 000024
【０１０７】
上表に示した図で記号a及びｂは１乃至１０の間の数を独立に表す。記号ｍ及びoは１乃至１０，０００の間の数を独立に表す。記号Ｘは水酸基、水素原子、Ｑ（活性化基）及びタンパク質、糖、脂質及びヌクレオチドの様な生物成分を表す。
【０１０８】
他の典型的実施形態ではＲ１４は糖成分を含む。糖成分は活性化糖成分、例えば糖ヌクレオチドであり得る。更にＲ１４はペプチドのアミノ酸に直接結合するか又はペプチドのアミノ酸をアミノ酸とグリコシル残基と複合化する事で間接的に結合する糖成分を含む。
【０１０９】
更に他の様態では本発明は糖類核を基にした分岐水溶性ポリマー（ "分岐コア "）を提供する。熟練者にはこの糖類核はいかなる構造であっても良いことが分かる。本発明のこの形態で用いる典型的糖類はGlcNAca, Gal, Sia, Fuc, Glc, GalNAc, GalNH2, GlcNH2及び同類を含む。
【０１１０】
本発明の典型的化合物は下式を有する。
Sugar―O―(L―WSP)2
ここでＬはリンカーでありＷＳＰは水溶性ポリマーである。
【０１１１】
本発明の更なる典型的化合物は下式を有する。
(C6H10O4)―(OC(O)―L―WSP)2
ここでC6H10O4は糖水酸基の２個がOC(O)―リンカーーWSPに変換した糖分岐コアである。
【０１１２】
更に本発明の典型的化合物は下式を有する。
ヌクレオチドー糖―O―(L―WSP)2
【０１１３】
他の典型的実施形態では本発明の糖ベースの分岐水溶性ポリマーは下式を有する。
Nu―O―(C6H9O3)―(OC(O)―L―WSP)2
ここでＮｕはヌクレオチドである。
【０１１４】
シアル酸核を基にした本発明のこの様態による更なる典型的化合物は下式を有する。
2006523211.tif 000025
ここでR16及びR16'は水素原子、アセチル及び下式から選んだメンバーであり、
2006523211.tif 000026
ここでR17, R18, R19'及びR13&#38;apos;は水素原子、水酸基、アミノ基、ＮＨＡｃ基及び式（Ｉ）の成分から独立に選ぶメンバーである。式ＩでＺ２は酸素原子、硫黄原子、メチレン基及び硫黄原子から選ぶメンバーである。Ｒ１１は上述の通りであり、且つ指標 "a "はR16, R16', R17, R18及びR19の少なくとも二個が式Ｉの構造を有する条件を持つ整数０乃至２０を表す。Ｒ１１は又担体分子との連結基又は担体分子との結合である。Ｒ１５は水素原子及び活性化基、例えばリン酸ヌクレオチドから選ぶメンバーである。
【０１１５】
他の典型的実施形態では式Ｉのリンカーは以下の構造を有する。
2006523211.tif 000027
【０１１６】
更に他の典型的実施形態では式Ｉのリンカーは以下の構造を有する。
2006523211.tif 000028
ここでＺ３はＮＨ、酸素原子及び硫黄原子から選んだメンバーである。
【０１１７】
典型的実施形態ではＺ２はＮＨである。
【０１１８】
更なる典型的実施形態であは本発明は以下の構造を有する化合物を提供する。
2006523211.tif 000029
ここでＬは定義にようなリンカーである。
【０１１９】
他の様態では分岐ポリマーはガラクトースかＮ−アセチルガラクトースに基づき以下の構造を有する。
2006523211.tif 000030
ここでR15-R19は上記の通りであり且つR15--R19の少なくとも二個が式Ｉの成分である。
【０１２０】
更にＲ１５はペプチドのアミノ酸との結合か又はペプチドのアミノ酸と直接結合するか又はペプチドのアミノ酸をアミノ酸に連結の糖残基と複合化する事で間接的に結合する糖成分との結合からなる。
【０１２１】
本発明の分岐糖をコアとする水溶性ポリマー生成の典型的スキームを以下に示す。
2006523211.tif 000031
【０１２２】
本発明の糖をコアとする分岐水溶性ポリマー生成の他の典型的スキームを以下に示す。
2006523211.tif 000032
【０１２３】
単分散ポリ（エチレングリコール）
本発明は又単分散高分子量ＰＥＧと本質的に単分散集団のポリ（エチレングリコール）分子の生成法を供与する。この方法は明確な分子量を有するＰＥＧ分子、例えばＰＥＧ２００と明確な分子量を又有する二官能性活性化ＰＥＧ、例えばＰＥＧ２００の少なくとも２当量と接触させ、その結果ＰＥＧの単分散試料、例えばＰＥＧ６００を生成する事からなる。
2006523211.tif 000033
Ｇはスルホン酸エステルやトリフルオロエタンスルホン酸エステルの様な脱離基である。ついで単分散試料のＰＥＧ６００を二官能性活性化ＰＥＧ２００と接触し単分散ＰＥＧ１００を形成できる。代わりに単分散ＰＥＧ６００を対応二官能性誘導体に変換し単分散ジヒドロキシＰＥＧ６００の少なくとも２当量と反応して単分散ＰＥＧ１８００を生成できる。本発明のプロセスを所要サイズの単分散ＰＥＧが得られるまで繰り返す。出発材料と生成物間の分子量差によりいかなる未反応又は一部反応の材料をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離できるようにこの合成を設計できる。
【０１２４】
更にポリ（エチレングルコール）の様な修飾水溶性ポリマー合成改良法の必要性に応じて、本発明はポリマーバックボーンの化学的活性化と延長化法を提供する。モノ活性化ＰＥＧ分子はＰＥＧを広範囲の種、例えば目標成分、治療用成分、抗ガン剤、細胞毒素、放射性試薬、アミノ酸、糖類及び同類と複合化するのに利用する。
【０１２５】
ついでその他の様態では本発明は活性化水溶性ポリマー、特にポリ（エチレングリコール）及びその構造類似体の段階的組み立て法を提供する。この方法は一官能化及び二官能化ＰＥＧ分子への容易なアクセスを提供する。
【０１２６】
ステップaでは出発グリコールはこのグリコールの水酸基と反応する活性化基（Ｒ−Ｙ）と接触する。Ｙは通常脱離基でありＰＥＧ分子の水酸基の一つをＲで置換できる。ステップｂでは生成付加物のフリーの水酸基をスルホン酸エステルの様な基に変換して活性化する。 活性化ＰＥＧを出発ＰＥＧ（ "ＰＥＧｍ "）と同一か異なる重合度の他のＰＥＧ成分と接触する。他種と連結できるようにＲＯ−ＰＥＧ(n+m)成分のフリーの水酸基で任意に活性化する。
【０１２７】
本発明の単分散ＰＥＧは技術的に認知の方法で容易に活性化され活性化誘導体は複合物形成に利用できる。代わりに単分散ＰＥＧを本発明の分岐ＰＥＧに組み込み、複合物形成に利用する。
【０１２８】
水溶性ポリマー
選択ペプチドの親水性をアミン、エステル、水酸及びポリヒドロキシル基含有分子の様な極性分子と共役化した増強する。代表例としては限定されないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びポリエーテル、例えばポリ（エチレングリコール）、ｍ−ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ｍ−ポリ（エチレングルコール）及びその他のＯ−アルキルポリ（アルキレングリコール）成分がある。好ましい水溶性ポリマーは本質的に非蛍光性であるか、又は分析での蛍光標識使用には不適切な最低量の蛍光を発光する。更に天然に存在しない糖ポリマーの使用が通常好ましい。この優先性の例外は他構成要素、（例えばポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、生体分子、治療用成分、診断用成分など）との共有結合で修飾した天然に存在する糖の使用である。他の典型的実施形態では治療用糖成分をリンカーアームと複合化し糖―リンカーアームカセットをついで本発明の方法でペプチドと複合化する。
【０１２９】
水溶性ポリマー及び糖類の活性化法と化学と同様に糖類及びポリマーを種々な種との複合化法は文献に記載されている。一般に使用のポリマー活性化法としては臭化シアン、過沃素酸塩、グルタルアルデヒド、ジエポキシド、エピクロルヒドリン、ジビニールスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルフォニル、トリクロロトリアジンなどによる官能基の活性化がある。（アール．.エフ．テイラー(R. F. Taylor)、タンパク質固定化、基礎と応用（Protein Immobilisation. Fundamentals and Applications）、マーセルデッカー社（Marcel Dekker）、１９９１年、エス．エス．ウオン（S. S. Wong）、タンパク質複合化と架橋の化学（Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking）、シーアールシープレス社（CRC Press）、ボカラトン、１９９２年、ジー．ティー．ハーマンソン等（G. T Hermonson et al.）、固定化アフィニティ配位子法（Immobilized Affinity Ligand Techniquies）、アカデミックプレス社（Academic Press）、ニュウヨーク、１９９３年、ダン、アール．エル．等編（Dunn, R. L. et al.）ポリマードラッグ及びドラッグデリバリーシステム（Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems）、アメリカ化学会シンポジュウムシリーズ（ACS Symposium Series）、４６９巻、アメリカ化学会、ワシントンディー．シー．（Washington D.C.）、１９９１年を参照）。
【０１３０】
多くの水溶性ポリマーがこの技術の熟知者に知られており本発明の実施に利用できる。用語水溶性ポリマーは糖類（例えばデキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）、ポリ（アミノ酸）、核酸、合成ポリマー（例えばポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えばポリ（エチレングリコール）、ペプチド、タンパク質及び同類の様な種を含む。本発明はポリマーが複合物残基との連結点がなければならないという唯一の制限だけでいかなる水溶性ポリマーも使用できる。
【０１３１】
ポリマー活性化法は又ＷＯ９４／１７０３９、米国特許５，３２４，８４４、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許５，２１９，５６４、米国特許５，１２２，６１４、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許５，２８１，６９８及び更にはＷＯ９３／１５１８９に見られ、活性化ポリマーとペプチド間の複合化に関しては、例えば凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許４，４１２，９８９）、ＲＮＡ分解酵素及びスーパーオキシドジスムターゼ（ベロネッセ等（Veronesse et al.）、アプライドバイオケミストリーアンドバイオテクノロジー（App. Biochem. Biotech.）、１１巻、１４１−４５頁、１９８５年）に見られる。
【０１３２】
好ましい水溶性ポリマーはポリマー試料の大部分のポリマー分子がほぼ同一分子量の物であり、このようなポリマーは "単分散 "である。
【０１３３】
本発明は更にポリ（エチレングリコール）又はモノメトキシポリ（エチレングルコール）（ｍ−ＰＥＧ）複合物を例に説明する。ＰＥＧの機能化と複合化に関する幾つかの総説とモノグラフが利用できる。例えばハリス（Harris）、マクロモレキュールケミストリーアンドフィジクス（Macronol. Chem. Phys.）、Ｃ２５卷、３２５−３７３頁、１９８５年、スコーテン（Scouten）、酵素学の方法（Methods in Enzymology）、１３５巻、３０−６５頁、１９８７年、ウオン等（Wong et al.）、エンザイムミクロバイオロジーアンドテクノロジー（Enzyme Microb. Technol.）、１４巻、８６６−８７４頁、１９９２年、デルガード等（Delgado et al.）、クリティカルレビューインセラピウティックドラッグキャリヤーシステム（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems）、９巻、２４９―３０４頁、１９９２年、ザリピスキー（Zalipsky）、バイオコンジュゲートケミストリー（Bioconjugate Chem.）、６巻、１５０−１６５頁、１９９５年及びバルダ等（Bhardra et al.）ファルマジー（Pharmzie）、５７巻、５−２９頁、２００２年を参照。
【０１３４】
本発明の複合物形成に有用なポリ（エチレングルコール）は直鎖か分岐かのいずれかである。いかなる分子量例えば、５Ｋｄ、１０Ｋｄ、２０Ｋｄ及び３０ＫｄのＰＥＧ成分が本発明に利用できる。
【０１３５】
反応性官能基
ＰＥＧ（又は他のリンカー）の反応性誘導体を用いて一個又はそれ以上のペプチド成分をリンカーと結合するのは本発明の範囲内である。本発明は反応性ＰＥＧ類似体の同一性により制限されない。多くのポリ（エチレングリコール）活性化誘導体が商業的にも文献的にも利用できる。適当な活性化ＰＥＧを選び、もし必要なら合成して本発明に有用な基質を合成するのは十分に熟練者の能力範囲内である。アブチョウスキー等(Abuchowski et al.)、キャンサーバイオケミストリーアンドバイオフィジック（Cancer Biochem. Biophys.）、７巻、１７５−１８６頁、１９８４年、アブチョウスキー等(Abuchowski et al.)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５２巻、３５８２−３５８６頁、１９７７年、ジャクソン等（Jackson et al.）、アナリティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.）、１６５巻、１１４−１２７頁、１９８７年、小出等（Koide et al.）、バイオケミストリーバイオフィジックリサーチコミュニケイション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、１１１巻、６５９−６６７頁、１９８３年）、トリフルオロエタンスルホネート (ニルソン等（Nilsson et al ）、メソッドインエンザイモロジー（Methods Enzymol）、１０４巻、５６−６９頁、１９８４年、デルガード等（Delgado et al.）、バイオテクノロジーアンドアプライドバイオケミストリー（Biotechnol. Appl. Biochem.）、１２巻、１１９−１２８頁、１９９０年)、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド誘導化活性エステル（バックマン等（Buckmann et al.）、マクロモレキュールケミストリー（Makromol. Chem.）、１８２巻、１３７９−１３８４頁、１９８１年、ジョピッチ等（Joppich et al.）、マクロモレキュールケミストリー（Makromol. Chem.）、１８０巻、１３８１−１３８４頁、１９７９年、アブチョウスキー等（Abuchowski et al.）、キャンサーバイオケミストリーアンドバイオフィジック（Cancer Biochem. Biophys.）、７巻、１７５−１８６頁、１９８４年、カトレ等（Katre et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、８４巻、１４８７−１４９１頁、１９８７年、北村等（Kitamura et al ）、キャンサーリサーチ（Cancer Res.）、５１巻、４３１０―４３１５頁、１９９１年、ボック等（Boccu et al.）ツアイトシュリフトナツルフォルシュング（Z. Naturforsch.）、３８Ｃ卷、９４−９９頁、１９８３年）、炭酸塩（ザルピスキー等（Zalipsky et al.）、ハリス編（Harris）、 ポリエチレングルコールの化学：バイオ技術的生物医学的応用（Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications）、プレナムプレス社（Plenum Press）、ニュウヨーク、１９９２年、３４７−３７０頁、ザリピンスキー等（Zalipsky et al.）、バイオテクノジーアンドアプライドバイオケミストリー（Biotechnol. Appl. Biochem.）、１５巻、１００−１１４頁、１９９２年、ベロネッセ等（Veronese et al.）、アプライドバイオケミストリーアンドバイオテクノロジー（Appl. Biochem. Biotech.）、１１巻、１４１−１５２頁、１９８５年）、イミダゾリルギ酸エステル（ビーカンプ等（Beauchamp et al.）、アナリティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.）、１３１巻、２５−３３頁、１９８３年、バーガー等（Berger et al.）、ブラッド（Blood）、７１巻、１６４１−１６４７頁、１９８８年）、４−ジチオピ��ジン（ボーギレン等（Woghiren et al.）、バイオコンジュゲートケミストリー（Bioconjugate Chem.）、４巻、３１４−３１８頁、１９９３年）、イソシアネート（ビュン等（Byun et al.）エイエスエイアイオージャーナル（ASAIO Journal）、Ｍ６４９−Ｍ６５３頁、１９９２年）及びエポキシド（ノイシキー等（Noishiki et al.）に交付の米国特許４，８０６，５９５、１９８９年）を参照。他の連結基としてはアミノ基と活性化ＰＥＧ間のウレタン結合がある。ベロネッセ等（Veronese et al.）、アプライドバイオケミストリーアンドバイオテクノロジー（Appl. Biochem. Biotechnol.）、１１巻、１４１−１５２頁、１９８５年参照。
【０１３６】
本発明実施に有用な反応基と反応種は通常生物複合物の化学技術でよく知られた物である。反応性糖成分で利用できる現在の好ましい反応種は比較的温和な条件で行える物である。これらは制限されないが求核置換（例えばアミン及びアルコールとハロゲン化アシル、活性化エステルとの反応）、求電子置換（例えばエナミン反応）及び炭素―炭素及び炭素―ヘテロ原子多重結合への付加（例えばマイケル反応、ディールスーアルダー付加）を含む。これらやその他の有用な反応は例えばマーチ（March）、上級有機化学（Advanced Organic Chemistry）、ジョンワイリーアンドサンズ社（John Wiley & Sons）、ニューヨーク、１９８５年、ハーマンソン（Hermonson）、生物複合化法（Bioconjugate Techniquies）、アカデミックプレス社（Academic Press）、サンジエゴ、１９９６年及びフィーニイ等（Feeney et al.）、タンパク質の修飾（Modification of Proteins）、化学の進歩シリーズ（Advances in Chemistry Series）、１９８巻、アメリカ化学会、ワシントンディシー（Washington D.C.）、１９８２年に検討されている。
【０１３７】
糖核又は修飾基からぶら下がった有用な反応性官能基は限定されないが以下の物を含む。
カルボキシル基及びそれ等の種々の誘導体で限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキルエステル、アルケニルエステル、アルキニルエステル及びアリールエステル、
例えばエステル、エーテル、アルデヒドなどに変換できる水酸基、
ハロゲン化物が後に例えばアミン、カルボン酸アニオン、値オールアニオン、カルバニオン又はアルコキシドの様な求核基で置換でき、その結果新規な基がハロゲン原子の官能基で共有結合するハロアルキル基、
ディールスーアルダー反応に加わる事ができるジエノフィル基、例えばマレイミド基、
例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン又はオキシムの様なカルボニル誘導体形成によるか又はグリニャール付加又はアルキルリチウム付加の様な機構による逐次誘導化が可能なアルデヒド又はケトン基、
アミンと逐次反応して例えばスルホンアミドを形成するハロゲン化スルフォニル、
例えばジスルフィドに変換するか酸ハロゲン化物と反応できるチオール基、
例えばアシル化、アルキル化又は酸化できるアミンかスルホヒドリル基、
例えば付加環化、アシル化、マイケル付加などが起こるアルケン及び
例えばアミン及びヒドロキシル化合物と反応できるエポキシドがある。
【０１３８】
反応性官能基は反応性糖核又は修飾基を組み立てるに必要な反応に加わらないか又は妨げない様に選ぶ。代わりに反応性官能基は保護基の存在により反応への参加を防ぐ事もできる。技術の熟練者には選択反応条件のセットで妨げられない様に特定官能基をいかに保護するかは理解できる。有効な保護基の例は例えばグリーン等（Green et al.）、有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）、ジョンワイリーアンドサンズ社（John Wiley & Sons）、ニューヨーク、１９９１年を参照。
【０１３９】
ペプチド複合物
本発明の化合物の使用を分岐水溶性ポリマーのペプチド複合物形成で例示する。議論の焦点は説明を明快にするためである。熟練者にはこの議論が本発明の分岐水溶性ポリマーを用いた種々の複合物形成に該当する事が分かる。典型的実施形態では化学反応性分岐水溶性ポリマーを技術的に既知の方法或いはその変形でペプチドの補足的反応基と複合化する。
【０１４０】
他の典型的実施形態では分岐水溶性ポリマーは分岐コアとして糖成分を含むか、代わりに分岐水溶性ポリマーが糖と連結する。この糖は糖ベースの分岐水溶性ポリマー（又は糖―分岐水溶性ポリマー複合物）をペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基に転移する酵素用基質である。本技術の熟練者には上に示した方法がペプチドとの実施に限定はされず、他種例えば脂質、糖脂質、糖類及び他の治療用成分にも広く適用できることが分かる。
【０１４１】
本発明の複合物は分岐水溶性ポリマー修飾糖をグリコシル化又は非グリコシル化ペプチドに酵素的連結により形成する。修飾糖はグリコシル化部位に又はグリコシル化部位に直接又は間接的に（例えば一個又はそれ以上のグリコシル残基を通して）連結したグリコシル残基に直接添加する。
【０１４２】
分岐水溶性ポリマー修飾糖をペプチド（又はグリコシル残基）とこの糖の修飾基間に割り込む事により、ここで "グリコシル連結基 "と呼ばれる物になる。グリコシル連詰基は "無傷 "でもあり得るし又分岐水溶性ポリマーを糖に連結するときに、例えば酸化且つ還元的アミノ化で変えられる。糖転位酵素のような優れた酵素の選択性をもちいて、本法により分岐水溶性ポリマーを一個又はそれ以上の特定位に有するペプチドが提供される。かくして本発明により修飾糖がペプチド鎖の選択個所と直接連結するか、又は代わりに修飾糖が糖ペプチドの炭水化物成分に付加する。修飾ペプチドが糖ペプチド炭水化物とペプチドバックボーンのアミノ酸残基に直接結合したペプチドも又本発明の範囲内である。
【０１４３】
既知の化学的酵素的ペプチドの緻密な戦略とは対照的に、本発明は実質的に均質誘導化形態を有するペプチドー複合物及び糖ペプチドー複合物を提供する。本発明に用いる酵素は通常特定アミノ酸残基又はペプチドのアミノ酸残基の組み合わせに選択的である。本発明の複合物は又大規模に使用して合成できる。従って本発明法はあらかじめ選択した均一な誘導化形態を持つ糖ペプチドの大量生産の実際的手段を提供する。この方法は限定されないが、細胞培養細胞（例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞又は原核細胞）、遺伝子組み換え植物又は動物生成時に不完全なグリコシル化糖ペプチドを含む治療用ペプチドの修飾に特に適する。
【０１４４】
ペプチドの分岐水溶性ポリマー複合物は例えばクリアランス速度の減少或いは免疫又は細網内皮系（ＲＥＳ）の取り込み速度の減少による治療半減期の増加という特徴を通常有する。更に本発明の複合物でのペプチド成分に関する抗原決定基は分岐水溶性ポリマーによりマスクされ、ペブチドに対する宿主免疫反応を減ずるか除く。目標試薬を適当な修飾糖を用いてペプチドに選択的に連結する事によりペプチドを特定組織や特定目標試薬に特異的な細胞表面受容体を標的にするのに利用できる。
【０１４５】
治療用糖ペプチドの体内半減期は又ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ）及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む分岐水溶性ポリマーにより増強される。例えばタンパク質の分岐ＰＥＧによる化学修飾（ＰＥＧ化、ｍ−ＰＥＧ化）によりタンパク質との連結ＰＥＧのサイズに依存する分子サイズが増加し表面及び官能基への到達性が減少する。ペプチドの水溶性ポリマーによる修飾は血中濃度半減期やタンパク分解安定性の改良に前途有望な戦略として、免疫原生や肝摂取の減少も通常認められている。（チャフィー等（Chaffee et al.）、ジャーナルオブクリニカルインベスティゲイション（J. Clin. Invest.）、８９巻、１６４３−１６５１頁、１９９２年、ピアタック等（Pyatak et al.）リサーチコミュニケーションオブパソロジーアンドファーマコロジー（Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol.）、２９巻、１１３−１２７頁、１９８０年）。インターロイキンー２のＰＥＧ化は体内での抗ガン効力の増加が報告されており（カトレ等（Katre et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８４巻、１４８７−１４９１頁、１９８７年）且つモノクロナール抗体Ａ７由来のF(ab')2のＰＥＧ化は腫瘍局所化を改良した。（北村等（Kitamura et al.）、バイオケミストリーバイオフィジックオブリサーチコミュニケイション（Biochem. Biophsy. Res. Commun.）、２８巻。１３８７−１３９４頁、１９９０年）。従って他の好ましい実施形態では本発明法による水溶性ポリマーでの誘導化ペプチドの体内半減期は非誘導化ペプチドの体内半減期に関して増加する。
【０１４６】
本発明の複合物でのペプチド体内半減期の増加はその量をパーセント増加範囲で表現するのが一番良い。パーセント増加範囲の下端は約４０％、約６０％、約８０％、約１００％約１５０％又は約２００％である。この範囲の上端は約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％又は約２５０％以上である。
【０１４７】
典型的実施形態ではペプチドと選択成分との連鎖はペブチドと水溶性ポリマー間に割り込む無傷グリコシル基を含む。ここで検討した様に水溶性ポリマーの糖成分（又は糖分岐コアーの使用）との連結によりペプチドにこの修飾糖を付加する適切な転換酵素が認識する "修飾糖 "が提供される。修飾糖の糖成分はペプチドと選択成分間に割り込ますと、 "グリコシル連結基 "、例えば "無傷グリコシル連結基 "となる。グリコシル連結基は水溶性ポリマーによる修飾後、適切な転位酵素用基質であるいずれかのモノー又はオリゴ糖で形成する。
【０１４８】
本発明の複合物は通常以下の一般構造に対応し、
2006523211.tif 000034
ここで記号a、ｂ、ｃ、ｄ及びｓは正のゼロでない整数を表しｔはゼロか正の整数のいずれかである。 "試薬 "は本発明の分岐水溶性ポリマーである。代わりに糖―試薬は糖分岐コアに基づく分岐水溶性ポリマーにより与えられる。リンカーは以下の豊富な連結基のいずれかである。代わりにリンカーは一重結合か "ゼロ次リンカー "でも良い。ペプチドのアイデンティティは無制限である。
【０１４９】
典型的実施形態では水溶性ポリマーはＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ又はｍ−ＰＰＧであり、分岐水溶性ポリマーは無傷のグリコシル連結基によりペプチドと共有結合する。グルコシル連結基はアミノ酸残基かペプチドのグリコシル残基のいずれかに共有結合する。代わりにグルコシル連結基は糖ペプチドの一個又はそれ以上のグリコシル単位と結合する。本発明は又グリコシル連結基（例えばＧａｌＮＡｃ）がアミノ酸残基（例えばスレオニンかセリン）と結合する複合物を提供する。
【０１５０】
本発明は酵素添加の無傷グリコシル連結基により形成した複合物を提供する以外に、その置換傾向が高度に均質な複合物を提供する。本発明法を用いて本質的に本発明複合物集団の修飾糖成分全てを構造的に同一のアミノ酸又はグリコシル残基と連結するペプチド複合物を形成できる。従って第二様態では本発明によりグリコシル連結基、例えば無傷のグリコシル連結基でペプチドと共有結合した分岐水溶性ポリマー成分集団を持つペプチド複合物が提供される。本発明の好ましい複合物では本質的に集団の各メンバーはグルコシル連結基によりペプチドのグリコシル残基と結合し、且つグリコシル連結基が連結したペプチドの各グリコシル残基は同一構造を有する。
【０１５１】
無傷のグリコシル連結基により共有結合した分岐水溶性ポリマー成分集団を持つペプチド複合物も又提供される。好ましい実施形態では本質的に分岐水溶性ポリマー成分集団の各メンバーは無傷グリコシル連結基によりペプチドアミノ酸残基と結合し、且つそれと結合した無傷グリコシル連結基を持つ各アミノ酸残基は同一構造を有する。
【０１５２】
本発明は又ペプチドが更に無傷グルコシル連結基により治療用成分、診断用成分、目標成分、毒素成分又は同類と複合化した上述の物と類似の複合物を提供する。上に列挙の各成分は小分子、天然ポリマー（例えばポリペプチド）又は合成ポリマーであり得る。
【０１５３】
更なる実施形態では本発明は複合物成分としての目標試薬の存在により特定組織に選択的に局在する複合物を提供する。典型的実施形態では目標試薬はタンパク質である。典型的タンパク質としてはトランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ−糖タンパク（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体―特定抗原の組織、血液プール）、凝固因子Ｖ−ＸＩＩ（損傷組織、血餅、癌、血液プール）、血清タンパク質、例えばα―酸性糖タンパク、フェチュイン、α―胎児性タンパク（脳、血液プール）、β２―糖タンパク（肝臓、動脈硬化性プラーク、脳、血液プール）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＥＰＯ（免疫シンミュレーション、癌、血液プール、赤血球細胞産生過剰、神経保護）、アルブミン（半減期増加）、ＩＬ―２及びα―ＩＦＮがある。
【０１５４】
典型的実施形態では複合物は分岐水溶性ポリマーとグリコシル化又は非グリコシル化ペプチド間で形成する。ポリマー、治療用成分又は生体分子は無傷グリコシル連結基によりペプチドと複合化し、ペプチドと修飾基（例えば水溶性ポリマー）間に割り込み且つ両者と共有結合する。その方法としてはペプチドを修飾糖と修飾糖が基質となる糖転位酵素含有混合物と接触する。その反応を修飾糖とペプチド間に共有結合が形成するに十分な条件で行う。修飾糖の糖成分は好ましくは糖ヌクレオチド、活性化糖及びヌクレオチドでもなく活性化もされていない糖から選ぶ。
【０１５５】
受容体ペプチド（グリコシル化又は非グリコシル化）は通常新規に合成するか又は原核細胞（例えば大腸菌の様な細菌性細胞）又は哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞又は植物細胞のような真核細胞で組み替え操作的に発現する。ペプチドは完全長タンパク質か断片かのいずれかである。更にペプチドは野生型か突然変異ペプチドであっても良い。典型的実施形態ではペプチドは一個又はそれ以上の合意のグルコシル化部位をペプチド配列に加えた突然変異を含む。
【０１５６】
本発明法は又組み替え操作で生成の不完全グリコシル化ペプチドの修飾も提供する。多くの組み替え操作生成糖タンパクは不完全にグリコシル化され、好ましくない性質例えば、免疫原生、ＲＥＳによる認識を有する炭水化物残基を露出する。本発明法の修飾糖を用いて、ペプチドを例えば水溶性ポリマー、治療薬又は同類で同時に更にグリコシル化と誘導化ができる。修飾糖の糖成分は完全グリコシル化ペプチドの受容体と適切に複合化する残基であるか又は好ましい性質を有する他の糖成分である。
【０１５７】
本発明の複合物の典型的ペプチド成分を表１に示す。
表１
ホルモン及び成長因子 受容体及びキメラ受容体
顆粒球コロニー刺激因子 ＣＤ４
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体
マクロファージコロニー刺激因子 α―ＣＤ２０
ＴＰＯ モノクローナル抗体−ＣＤ２０
エリスロポリエチン モノクロナール抗体―α―ＣＤ３
エリスロポリエチン変異株 モノクロナール抗体―ＴＮＦ受容体
α―ＴＮＦ モノクロナール抗体―ＣＤ４
レプチン Ｐ―セレクチン糖タンパク配位子−１
酵素及び阻害剤 モノクロナール抗体―Ｐ―セレクチン
糖タンパク配位子−１
組織プラスミノーゲン活性化因子 補体
組織プラスミノーゲン活性化因子変異体 Ｇｌｙ−細胞接着分子又はそのキメラ
ウロキナーゼ Ｎ−細胞接着分子又はそのキメラ
因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ モノクロナール抗体（免疫グロブリン）
ＤＮＡ分解酵素
グルコセレブロシダーゼ モノクロナール抗体―アンチＲＳＶ
ヒルジン モノクロナール抗体―アンチインター
ロイキンー２受容体
α１抗トリプシン
抗トロンビン モノクロナール抗体アンチ癌胎児抗原
サイトカイン及びキメラサイトカイン
インターロイキンー１（ＩＬ−１）、
１Ｂ、２、３、４ モノクロナール抗体―アンチ血小板
ＩＩｂ／ＩＩＩa受容体
α―インターフェロン（ＩＦＮ―α） モノクロナール抗体―アンチ上皮細
ＩＦＮ―α―２ｂ 胞成長因子
ＩＦＮ―β モノクロナール抗体―アンチＨｅｒ−２
受容体
ＩＦＮ−γ
キメラジフテリア毒素ＩＬ−２ 細胞
赤血球細胞
白血球細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、
樹状細胞、マクロファージ、
ナチュラルキラー細胞、好中球、
単球及び同類
幹細胞
【０１５８】
本発明複合物での他の典型的ペプチド成分としては免疫グロブリン類（例えば抗体、主要組織適合複合体分子、Ｔ細胞受容体及び同類）、細胞間受容体（例えばインテグリン、ホルモン又は成長因子用受容体及び同類）、レクチン及びサイトカイン（例えばインターロイキン）がある。追加例としては組織型プラスミノゲン活性因子（ｔ−ＰＡ）、レニン、因子Ｖ―ＸＩＩの様な凝固因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、コロニー刺激因子、ウイルス抗原、補体タンパク質、α１―抗トリプシン、エリスロポエチン、Ｐ―セレクチン糖タンパク配位子―１（ＰＳＧＬ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、抗トロンビンＩＩＩ、インターロイキン、インターフェロン、タンパク質Ａ及びＣ、フィブリノゲン、ハーセプチン、レプチン、グリコシダーゼ、ＨＳ糖タンパク、血清タンパク質（例えばα―酸性糖タンパク、フェチュイン、α―胎児性タンパク）、β２―糖タンパクがとりわけ含まれる。このポリペプチドのリストは代表的なもので限定はされない。複合物のペプチド成分としては又融合タンパク質やキメラタンパク質も含み限定されないが、ＩｇＧの様な免疫グロブリン由来成分或いは免疫グロブリン断片、例えばＦＡｂ（Ｆｃドメイン）を含むキメラタンパク質がある。更に本発明法で修飾できる典型的ペプチドは付属書１に示す。ここに供与の典型的ペプチドは本発明で使用可能な選択ペプチドの提供を意図している。そのこと自体ペプチドは無制限である。熟練者には本発明がいかなる供給源のいかなるペプチドも実質的に使用できる事が分かる。
【０１５９】
本発明複合物のペプチド成分は合成型或いは野生型ペプチドでも良く、又部位指定変異導入法の様な技術的に既知法で生成する突然変異ペプチドでも良い。ペプチドのグルコシル化は通常Ｎ―連結かＯ−連結のいずれかである。典型的Ｎ−連結は修飾糖のアスパラギン残基の側鎖への連結である。Ｘがプロリン以外のいずれかのアミノ酸であるトリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ―スレオニンは炭水化物成分をアスパラギン側鎖と酵素結合するための認識配列である。従ってポリペブチドにこれらトリペプチド配列のいずれかが存在する事によりグリコシル化が可能な部位を創生する。Ｏ―連結グリコシル化は一個の糖（例えばＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、ブドウ糖、フコース又はキシロース）をヒドロキシアミノ酸、ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用できるが、好ましくはセリンかスレオニンの水酸基側鎖に結合する事を意味する。
【０１６０】
更にペプチドに加えて、本発明の分岐水溶性ポリマーと複合化する複合物成分はペプチド以外の生物構造（例えば糖脂質、脂質、スフィンゴ類、セラミド、細胞全体及び同類）でも良い。
【０１６１】
グリコシル化部位をペプチドや他構造に加える事は一個又はそれ以上のグリコシル部位を含有するようにアミノ酸配列を変える事により都合良く達成する。この付加は突然変異やペプチドの全化学合成により行える。ペプチドアミノ酸配列は好ましくはＤＮＡレベルでの変化、特に前もって選んだ塩基のペプチドをコード化するＤＮＡを突然変異しコドンを生成し、望ましいアミノ酸に翻訳される様に変化する。一個又は複数のＤＮＡ変異は好ましくは技術の既知方法を用いて行う。
【０１６２】
典型的実施形態ではグルコシル化部位はポリヌクレオチドの組み替えで加える。候補ペプチドをコード化するポリヌクレオチドはＤＮＡ組み替えプロトコールにより調節できる。ＤＮＡ組み替えは関連遺伝子プールを任意に断片化し続いてポリメラーゼ連鎖反応類似プロセスにより断片を再構築する事により繰り返し組み替えと突然変異を行うプロセスである。例えばステマー（Stemmer）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、９１巻、１０７４７−１０７５１頁、１９９４年、ステマー（Stemmer）、ネーチャー（Nature）、３７０巻、３８９−３９１頁、１９９４年及び米国特許５，６０５，７９３、米国特許５，８３７，４５８、米国特許、５，８３０，７２１及び米国特許５，８１１，２３８を参照。
【０１６３】
本発明の複合物は一個又はそれ以上の選択グリコシル残基を加えるか又は除去し、その後修飾糖がペプチドの選択グリコシル残基の少なくとも一個と複合化したペプチドを含む。本実施形態は例えば修飾糖を選択グルコシル残基がペプチドに存在しないか又は好ましい量でないいずれかの場合で複合化したいときに有益である。従って修飾糖をペプチドと結合する前に、選択グルコシル残基を酵素的又は化学的結合によりペプチドと複合化する。他の実施形態では糖ペプチドのグリコシル化形態を修飾糖の複合化前に糖ペプチドから炭水化物残基を除去して変える。例えばＷＯ９８／３１８２６を参照。
【０１６４】
糖ペプチドにあるいかなる炭水化物成分の添加や除去は化学的か酵素的のいずれかで達成する。化学的脱グルコシル化は好ましくはポリペプチド変異株を化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は同等化合物に暴露して生じる。この処理により連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分又は全ての糖がペプチドを無傷のままで開裂する。化学的脱グルコシル化はハキムディン等（Hakimuddin et al.）、アーカイブバイオケミストリーアンドバイオフィジック（Arch. Biochem. Biophys.）、２５９巻、５２頁、１９８７年及びエッジ等（Edge et al.）、アナリティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.）、１１８巻、１３１頁、１９８１年に記載されている。ペプチド変異株の炭水化物成分の酵素的開裂はトータクラ等（Thotakura et al.）、メソッドインエンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、１３８巻、３５０頁、１９８７年に記載されているように種々のエンドーグルコシダーゼ及びエキソーグルコシダーゼを用いて達成できる。
【０１６５】
グリコシル成分の化学的添加はいずれかの技術認知の方法で行う。糖成分の酵素的添加は好ましくはここに示した方法を改善した物を用いて、本発明に用いた修飾糖の代わりに生来のグルコシル単位を用いる。糖成分の他の添加法は米国特許５，８７６，９８０、米国特許６，０３０，８１５、米国特許５，７２８，５５４及び米国特許５，９２２，５７７に開示されている。
【０１６６】
選択グルコシル残基用の典型的連結点は限定されないが以下の物を含む。（a）Ｎ−及びＯ−グルコシル化用合意部位、（ｂ）糖転位酵素用受容体である末端グルコシル成分、（ｃ）アルギニン、アスパラギン及びヒスチジン、（ｄ）フリーのカルボキシ基、（e）システインのスルフヒドリル基の様なフリーのスルフヒドリル基、（ｆ）セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンの水酸基の様なフリーの水酸基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンの芳香族の様な芳香族残基、又は（ｈ）グルタミンのアミド基。本発明の典型的使用法は１９８７年９月１１日発行のＷＯ８７／０５３３０及びアプリンとウリストン（Aplin and Wriston）、シーアールシークリティカルレビユウオブバイオケミストリー（CRC Crit. Rev. Biochem.）、２５９−３０６頁、１９８１年に記載されている。
【０１６７】
一実施形態では本発明は二個又はそれ以上のペプチドの連結基による連結法を提供する。連結基はいかなる有効な構造を持つ物であり且つ直鎖及び分岐鎖構造から選択できる。好ましくはペプチドが結合するリンカーの各末端は修飾糖（即ち新生無傷グリコシル連結基）を含む。
【０１６８】
本発明の典型的方法では二個のペプチドを分岐水溶性ポリマーリンカー含有リンカー成分により一緒に連結する。その構成物は上記作画に示した一般構造からなる。ここに記述のように本発明構成物は二個の無傷グリコシル連結基（即ちs + t = 1）を含む。二個のグルコシル基含有ＰＥＧリンカーの焦点とするのは明確化の目的のためで本発明実施形態での使用リンカーアームのアイデンティティーを制限するものと解釈てはならない。
【０１６９】
修飾糖
修飾グリコシル供与体種（ "修飾糖と "）しては好ましくは修飾糖ヌクレオチド、活性化修飾糖及びヌクレオチドでも活性化もされていない単純糖類である修飾糖から選ぶ。いかなる望ましい炭水化物構造を本発明の複合物に組み込める。通常その構造は単糖であるが、本発明は修飾単糖類の使用に限定されない。オリゴ糖類や多糖類も同様に有用である。
【０１７０】
修飾基は酵素的手段、化学的手段またはこれらの組み合わせで糖成分と連結しその結果修飾糖を生成する。糖類は糖が修飾糖のペプチド連結に用いる酵素用基質として働く修飾成分と結合できるいかなる位置ででも置換できる。好ましい実施形態ではシアル酸が糖であるときには、そのシアル酸はピルビル側鎖の９位か又はシアル酸では通常アセチル化されたアミン基の５位のいずれかで修飾基置換する。
【０１７１】
本発明のある実施形態では修飾糖ヌクレオチドを修飾糖のペプチドへの添加に用いる。本発明で用いるこれら修飾形の典型的糖ヌクレオチドとしては一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩又はそれらの類似体がある。好ましい実施形態では修飾糖ヌクレオチドはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）配糖体、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）配糖体又はグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）配糖体から選ぶ。更により好ましくは修飾糖ヌクレオチドはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）ガラクトース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）ガラクトサミン、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）ブドウ糖、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グルコサミン、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）マンノース、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）フコース、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）シアル酸又はシチジン一リン酸（ＣＭＰ）ＮｅｕＡｃから選ぶ。糖ヌクレオチドのＮ−アセチルアミン誘導体も又本発明法で有用である。
【０１７２】
本発明は又修飾糖、例えば修飾ガラクトース、修飾フコース、修飾ＧａｌＮＡｃ及び修飾サル酸を用いた修飾ペプチド合成法を提供する。修飾シアル酸を用いた時には、シアル酸転位酵素かトランスーシアリダーゼ（α２，３―連結シアル酸のみ）のいずれかをこの方法で用いる事ができる。
【０１７３】
他の実施形態では修飾糖は活性化糖である。本発明で有用な活性化修飾糖は通常合成的に活性化脱離基を含有する様に変えた配糖体である。ここで用いた用語 "活性化脱離基 "は酵素制御の求核置換反応で容易に置換される成分を意味する。技術的に多くの活性化糖が知られている。例えばボカドロ等（Vocadlo et al.）、エルンスト等（Ernst et al.）編、炭水化物の化学と生物学（In Carbohydrate Chemistry and Biology）、２巻、ワイリーーブイシーエッチ出版社（Wiley-VCH Verlag）、バインハイム（Weinheim）、ドイツ、２０００年 、児玉等（Kodama et al.）、テトラヘドロンレターズ（Tetrahedron Lett.）、３４巻、６４１９頁、１９９３年、ラフィード等（Lougheed et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７４巻、３７７１７頁、１９９９年を参照。
【０１７４】
活性化基（脱離基）の例としてはフルオロ、クロロ、ブロモ、トシレートエステル、メシラートエステル、トリフラート及び同類がある。本発明で用いる好ましい活性化脱離基は配糖体の受容体への酵素転移を立体的に著しくは妨げない物である。従って活性化配糖体誘導体の好ましい実施形態はフッ化グリコシル及びグリコシルメシラートがあり、特にフッ化グリコシルが好ましい。フッ化グリコシルの中でもα―フッ化ガラクトシル、α―フッ化マンノシル、α―フッ化グリコシル、α―フッ化フコシル、α―フッ化キシロシル、α―フッ化シアル酸、α―フッ化Ｎ−アセチルグルコサミニル、α―フッ化Ｎ―アセチルガラクトサミニル、β―フッ化ガラクトシル、β―フッ化マンノシル、β―フッ化グリコシル、β―フッ化フコシル、β―フッ化キシロシル、β―フッ化シアル酸、β―フッ化Ｎ−アセチルグルコサミニル及びβ―フッ化Ｎ―アセチルガラクトサミニルが最も好ましい。
【０１７５】
実例としてフッ化グリコシルをフリーの糖から先ず糖をアセチル化しついでフッ化水素／ピリジンで処理して合成する。これにより保護（アセチル化）フッ化グルコシルの熱力学的に最も安定なアノマー（即ちα―フッ化グリコシル）を生成する。もしより不安定なアノマー（即ちβ―フッ化グリコシル）が望ましいなら、前もってアセチル化した糖を臭化水素／酢酸又は塩化水素で臭化又は塩化アノマーに変換生成して合成できる。この中間体をフッ化銀の様なフッ化塩と反応してフッ化グルコシルを生じる。アセチル化フッ化グリコシルはメタノール中で温和な（触媒的）塩基（例えばナトリウムメトキシド／メタノール）と反応して脱保護できる。更に多くのフッ化グリコシルが商業的に入手できる。
【０１７６】
他の活性化グリコシル誘導体をこの技術の熟知者には既知の従来法を用いて合成できる。例えばグリコシルメシラートは糖の全ベンジル化ヘミアセタール形を塩化メシルで処理し、ついで接触水添によりベンジル基を除去して合成できる。
【０１７７】
更なる典型的実施形態では修飾糖は触角構造を持つオリゴ糖である。好ましい実施形態では一個又はそれ以上の触角末端に修飾成分を有する。一個以上の修飾成分が触角構造を有するオリゴ糖に連結していると、オリゴ糖は修飾成分の "増幅 "に有効である。ペプチドと複合化した各オリゴ糖単位により修飾基の複数コピーがペプチドと結合する。上図で示した本発明の典型的複合物の一般構造は触角構造を利用した本発明の複合物合成で生じる多価種を含む。多くの触角糖構造が技術的に知られており、現方法は制限無しにこれら構造を使用できる。
【０１７８】
通常糖成分と修飾基は通常連結プロセスで新規有機官能基か非反応性種に変換する反応基を用いて一緒に連結する。一個又は複数の糖反応性官能基は糖成分のいかなる位置でも良い。
【０１７９】
以下の議論では本発明実施に利用できる修飾糖の多数の特定例が示される。典型的実施形態ではシアル酸誘導体を修飾基と連結した糖核として利用する。シアル酸誘導体が議論の焦点であるのは説明の明快性のためだけであり、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。技術の熟知者には種々の他糖成分がシアル酸を例として用いて示したのと類似の方法で活性化され且つ誘導化できる事が分かる。例えば数個の糖基質を挙げるとラクトース、ブドウ糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びフコースの修飾に多くの方法が利用でき、技術的に認知の方法で容易に修飾できる。例えばエルハラビ等、（Elhalabi et al.）、カレントメディシナルケミストリー（Curr. Med. Chem ）、６巻、９３頁、１９９９年及びシェーファー等（Schafer et al.）、ジャーナルオブオーガニックケイミストリー（J. Org. Chem.）、６５巻、２４頁、２０００年を参照。
【０１８０】
典型的実施形態では本発明法で修飾するペプチドは原核細胞（例えば大腸菌）、酵母呼び哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞）を含む真核細胞、或いは遺伝子組み換え動物で生成し、従って不完全にシアル酸化したＮ−及び／又はＯ−連結オリゴ糖鎖を含む糖ペプチドである。シアル酸欠如で末端ガラクトース残基含有糖ペプチドのオリゴ糖鎖はグリコＰＥＧ化、グリコＰＰＧ化又は修飾シアル酸で別に修飾できる。
【０１８１】
図式２ではアミノ配糖体１を保護アミノ酸（例えばグリシン）誘導体の活性化エステルで処理し、糖アミノ残基を相当の保護アミノ酸アミド付加物に変換する。この付加物をアルドラーゼで処理しα―ヒドロキシカルボン酸塩２を形成する。化合物２をシチジン一リン酸―シアル産合成酵素（ＣＭＰ―ＳＡ）の作用で対応シチジン一リン酸誘導体に変換し、ついでこのシチジン一リン酸誘導体を接触水添して化合物３を生成する。グリシン付加物形成により導入したアミンはＰＥＧ又はＰＰＧ連結場所として利用し、化合物３を活性化（ｍ−）ＰＥＧ又は（ｍ−）ＰＰＧ誘導体（例えばPEG-C(O)NHS, PPG-C(O)NHS）と反応して、それぞれ４又は５を生成する。
図式２
2006523211.tif 000035
ここでＸ−ＢＷＳＰは本発明の活性化分岐水溶性ポリマーであり、ＢＷＳＰは分岐水溶性ポリマーである。
【０１８２】
表２にＰＥＧ又はＰＰＧ成分で誘導化した糖一リン酸塩の典型例を示す。表２のある化合物は図式４の方法で合成する。他の誘導体は技術的に認知の方法で合成する。例えばケップラー等（Keppler et al.）グリコバイオロジー（Glycobiolog ）、１１巻、１１Ｒ頁、２００１年及びチャーター等（Charter et al.）、グリコバイオロジー（Glycobiology）、１０巻、１０４９頁、２０００年を参照。他のアミン反応性ＰＥＧ及びＰＰＧ類似体は商業的に入手でき、又技術の熟知者が容易に利用できる方法で合成できる。
表２
2006523211.tif 000036
2006523211.tif 000037
ここでＲは本発明の分岐水溶性ポリマーである。
【０１８３】
本発明実施に用いる修飾糖リン酸塩は上に示した物と同様に他の位置で置換できる。シアル酸での現在好ましい置換を以下に示す。
2006523211.tif 000038
ここでＸは好ましくは-O-, -N(H)-, -S, CH2- 及び-NR2から選んだ連詰基であり、各ＲはＲ１−Ｒ５から独立に選ぶメンバーである。記号Ｙ，Ｚ、Ａ及びＢはそれぞれＸのアイデンティティーのために上に示した基から選んだ基を表す。Ｘ，Ｙ、Ｚ、Ａ及びＢはそれぞれ独立に選択され、それ故同一でも異なっても良い。記号Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は水素原子又は分岐水溶性ポリマーである。代わりにこれらの記号は分岐水溶性ポリマーと結合したリンカーを表す。
【０１８４】
架橋基
本発明法で用いる修飾糖の生成は修飾基を糖残基に連結し糖転移酵素用基質である安定付加物を形成する事を含む。糖と修飾基はゼロ次又は高次架橋剤で結合できる。修飾基の炭水化物成分との連結に用いる典型的二官能性化合物としては限定されないが、二官能性ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステル及び同類がある。炭水化物を他分子と結合する一般的やり方は文献で知られている。例えばリー等（Lee et al.）、バイオケミストリー（Biochemistry）、２８巻、１８５６頁、１９８９年、バーティア等（Bhatia et al.）、アナリティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.）、１７８巻、４０８頁、１９８９年、ヤンダ等（Janda et al.）、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ（J. Am. Chem. Soc.）、１１２巻、８８８６頁、１９９０年及びベッドナルスキー等（Bednarski et al.）、ＷＯ９２／１８１３５を参照。以下の議論では反応基は新生修飾糖の糖成分に無害として取り扱う。議論の焦点としては説明の明確化である。この技術の熟知者にはこの議論が修飾基の反応基に同様に該当することが分かる。 
【０１８５】
代表的戦略としてはヘテロ二官能性架橋剤ＳＰＤＰ（n-スクシニミジルー３−）２−ピリジルチオ）プロピオン酸エステル）を用いて保護スルフヒドリル基を糖に組み込み、ついでそのスルフヒドリル基を脱保護して修飾基の他のスルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成する。
【０１８６】
もしＳＰＤＰが修飾糖の糖転移酵素基質として働く能力に有害になれば、２−イミノチオランやＮ−スクシニミジルーＳ−アセチルチオ酢酸エステル（ＳＡＴＡ）の様な多くの他架橋剤の一つを用いてジスルフィド結合を形成する。２−イミノチオランは第一級アミンと反応して直ちに脱保護スルフヒドリル基をアミン含有分子に組み込む。ＳＡＴＡは又第一級アミンと反応するが、保護スルフヒドリル基を組み込み後にヒドロキシルアミンを用いて脱アセチル化してフリーのスルフヒドリル基を生成する。それぞれの場合組み込んだスルフヒドリル基は他のスルフヒドリル基又はＳＰＤＰの様な保護スルフヒドリル基と自由に反応して必要なジスルフィド結合を形成する。
【０１８７】
上記の戦略は本発明で用いるリンカーの代表例であり、限定されない。他架橋剤を利用して修飾基をペプチドと架橋するのに異なる戦略を用いる事ができる。例えばＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）―Ｌ−システインヒドラジッド）及びＴＰＭＰＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカプトプロピオノヒドラジッド）を前もって温和な過ヨウ素酸塩処理で酸化した炭水化物成分と反応して、架橋剤のヒドラジッド部と過ヨウ素酸塩が生成したアルデヒド基の間でヒドラゾン結合を形成する。ＴＰＣＨ及びＴＰＭＰＨは２−ピリジルチオン保護スルフヒドリル基を糖に導入し、ＤＴＴで脱保護しついで成分間でのジスルフィド結合形成の様な複合化に用いる。
【０１８８】
ジスルフィド結合生成が安定修飾糖生成に不適当だと分かると、成分間でより安定な結合が組み込まれる様な他架橋剤を使用できる。ヘテロ二官能性架橋剤のＧＭＢＳ（Ｎ−（γ―マレイミドブチリルオキシ）スクシニミド）及びＳＭＣＣ（スクシニミジルー４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン）は第一級アミンと反応してマレイミド基をその成分に導入する。ついでマレイミド基は前述の架橋剤により導入できる他成分のスルフヒドリル基と反応して、成分間で安定なチオエーテル結合を形成する。もし成分間の立体障害により成分活性或いは糖転移酵素基質として働く修飾糖能力が妨害されるならば、成分間に長いスペーサーアームを導入でき且つ前述の架橋剤（即ちＳＰＤＰ）の幾つかの誘導体を含む架橋剤を用いる事ができる。従って多くの適当な架橋剤があり利用できる。それぞれは最適ペプチド複合物及び修飾糖生成に対するその効果により選ぶ。
【０１８９】
種々の試薬を分子内化学的架橋による修飾糖成分の修飾に利用する。（架橋剤及び架橋法に関する総説は、ウオルド、エフ(Wold F.)、メソッドオブエンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、２５巻、６２３−６５１頁、１９７２年、ウイトール、エッチエッチ及びクーニー、ディエイ（Weetal, H. H. and Cooney, D. A.）、薬物としての酵素（Enzymes as Drugs）（（ホルセンベルグ及びロバート編） (Holcenberg and Robers, eds)）、３９５−４４２頁、ワイリー（Wiley）、ニューヨーク、１９８１年、ジ、ティエッチ（Ji, T. H.）、メソッドオブエンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、９１巻、５８０−６０９頁、１９８３年、マットソン等（Mattson et al.）、モレキュラーバイオロジーレポート（Mol. Bio. Rep.）、１７巻、１６７−１８３頁、１９９３年を参照し、これら全てはここに文献として含まれる。）好ましい架橋剤は種々のゼロ長さのホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋剤に基づく。ゼロ長さ架橋剤としては外因性材の導入無しで二つの内在的化学基の直接複合化がある。ジスルフィド結合形成の触媒試薬はこの部類に属する。他例としてはカルボキシ基とアミノ基の縮合を誘導してアミド結合を形成するカルボジイミド、クロロエチルギ酸エステル、ウッドワード試薬Ｋ（Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３―スルホナート）及びカルボニルジイミダゾールの様な試薬がある。これら化学試薬に加えて酵素のグルタミン転移酵素（グルタミルペプチドーγ―グルタミン転移酵素、ＥＣ２．３．２．１３）もゼロ長さ架橋剤として使用できる。この酵素は通常基質として第一級アミノ基とタンパク質結合グルタミン残基のカルボキサミド基でのアシル転移反応を触媒する。好ましいホモ及びヘテロ二官能性試薬はアミノ基、スルフヒドリル基、グアジニノ基、インドール基又は非特異基と反応する二個の同一又は二個の異なる部位をそれぞれ含有する。
【０１９０】
i．架橋剤の好ましい特異的部位
１．アミノ基との反応基
一つ好ましい実施形態では架橋剤部位はアミノ反応基である。アミノ反応基の有用な無制限な例としてはＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、イソシアネート、酸ハロゲン化物、アリールアジド、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルデヒド及び塩化スルホニルがある。
【０１９１】
ＮＨＳエステルは優先的に修飾糖成分の第一級（芳香族を含む）アミノ基と反応する。ヒスチジンのイミダゾール基が第一級アミンと競争的に反応する事は知られているが、反応生成物は不安定で容易に加水分解する。この反応はＮＨＳエステルの酸カルボキシ基をアミンが求核攻撃してアミドを形成し、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドを遊離する事を含む。従って最初のアミノ基の陽電荷が失われる。
【０１９２】
イミドエステルは修飾糖化合物のアミン基と反応する最も特異的アシル化剤である。ｐＨ７と１０の間でイミドエステルは第一級アミンとのみ反応する。第一級アミンはイミダートを求核的に攻撃し高ｐＨではアミジンに低ｐＨでは新イミダートに分解する中間体を生成する。新イミダートは他の第一級アミンと反応でき、二個のアミノ基を架橋し、推定的一官能性イミダートの場合二官能的に反応する。第一級アミンとの反応の主生成物は最初のアミンより強塩基のアミジンである。最初のアミノ基の陽電荷はそれ故保持される。
【０１９３】
イソシアネート（及びイソチオシアネート）は修飾糖成分の第一級アミンと反応して安定な結合を形成する。スルフヒドリル基、イミダゾール基及びチロシン基との反応では比較的不安定な生成物を与える。
【０１９４】
アシルアジドは又アミノ基への特異的試薬として用いられ、親和成分の求核的アミンが弱いアルカリ条件下で、例えばｐＨ８．５で酸性カルボキシ基を攻撃する。
【０１９５】
１，５−ジフルオロー２，４−ジニトロベンゼンの様な芳香族ハロゲン化物は修飾糖成のアミノ基及びチロシンフェノール基と優先的に反応するが、又スルフヒドリル基及びイミダゾール基とも反応する。
【０１９６】
モノ及びジカルボン酸のｐ−ニトロフェニルエステルは又有用なアミノ反応性基である。その試薬特異性は特別高くはないが、α―及びε―アミノ基は最も速く反応するようである。
【０１９７】
グルタルアルデヒドの様なアルデヒドは修飾糖第一級アミノ基と反応する。アミノ基はアルデヒド化合物のアルデヒドとの反応で不安定なシッフ塩基を形成するが、グルタルアルデヒドは安定な架橋を有する修飾糖に修飾できる。通常の架橋条件ｐＨであるｐＨ６−８で、環状ポリマーは脱水しα、β―不飽和アルデヒドポリマーを形成する。しかしシッフ塩基は他の二重結合と共役していると安定である。両二重結合の共鳴相互作用によりシッフ結合の加水分解を防ぐ。更に局所的濃度の高いアミンはエチレン二重結合を攻撃して安定なマイケル付加物を形成できる。
【０１９８】
芳香族塩化スルホニルは修飾糖成分の種々の部位で反応するが、アミノ基との反応が最も重要で安定なスルホンアミド結合を生じる。
【０１９９】
２．スルフヒドリル基との反応基
他の好ましい実施形態ではその部位はスルフヒドリルとの反応基である。スルフヒドリル基との有効な、制限のない反応基の例としてはマレイミド、ハロゲン化アルキル、ピリジルジスルフィド及びチオフタルイミドがある。
【０２００】
マレイミドは修飾糖成分のスルフヒドリル基と優先的に反応し安定なチオエーテル結合を形成する。マレイミドは又第一級アミノ基及びヒスチジンのイミダゾール基と遙かに遅い速度で反応する。しかしｐＨ７では単純チオールの反応速度は対応アミンのそれに比し１０００倍も大であるため、マレイミド基はスルフヒドリル基への特異基と考えられる。
【０２０１】
ハロゲン化アルキルはスルフヒドリル基、硫化物、イミダゾール及びアミノ基と反応する。しかし中性から弱アルカリｐＨでハロゲン化アルキルはスルフヒドリル基と第一に反応し安定なチオエーテル結合を形成する。高ｐＨではアミノ基との反応を好む。
【０２０２】
ピリジルジスルフィドはジスルフィド交換によりフリーのスルフヒドリルと反応し混合ジスルフィドを生じる。その結果ピリジルジスルフィドは最も特異的なスルフヒドリルとの反応基である。
【０２０３】
チオフタルイミドはフリーのスルフヒドリル基と反応してジスルフィドを形成する。
【０２０４】
３．カルボキシ基への反応残基
他の実施形態では水及び有機溶剤の両者に可溶なカルボジイミドをカルボキシ基への反応試薬として用いる。これら化合物はフリーのカルボキシ基と反応してプソイド尿素を形成し、利用できるアミンと結合してアミド結合を生じ、カルボキシ基をカルボジイミドで如何に修飾するかを教示する。（山田等（Yamada et al.）、バイオケミストリー（Biochemistry）、２０巻、４８３６−４８４２頁、１９８１年）。
【０２０５】
ii架橋剤の好ましい非特異的部位
部位特異的反応性成分の使用に加え本発明は糖を修飾基と連結する非特異的反応基の使用を意図する。
【０２０６】
典型的非特異的架橋剤としては暗所では完全に不活性であるが、妥当なエネルギーのフォトン吸収で反応種に変換する光活性化可能基がある。一つの好ましい実施形態では光活性化可能基としてアジドの熱又は光分解で発生するニトレン前駆体から選ぶ。電子不足ニトレンは非常に反応性に富み且つN-H、O-H、C-H及びC=Cを含む種々の化学結合と反応できる。三つのタイプのアジド（アリール、アルキル及びアシルアジド誘導体）が使用できるが、アリールアジドが現在好ましい。光分解でのアリールアジドの反応性はＣ−Ｈ結合よりＮ−Ｈ及びＯ−Ｈ結合とでより優れている。電子不足アリールニトレンはＣ−Ｈ挿入物を形成するよりはむしろ急速に環拡張してジヒドロアゼピンを形成し、求核試薬と反応しやすい。アリールアジドの反応性は環にニトロ基やヒドロキシル基のような電子求引置換基の存在する事で増加できる。このような置換基はアリールアジドの吸収極大を長波長側に移す。非置換アリールアジドは２６０―２８０nm領域に吸収極大を持つ一方、ヒドロキシ及びニトロアリールアジドは３０５nm以上に主な光吸収を有する。それ故ヒドロキシ及びニトロアリールアジドは非置換アリールアジドに比べ親和成分により害の少ない光分解条件を使用できるので最も好ましい。
【０２０７】
他の実施形態では光活性化可能基をフッ素化アリールアジドから選ぶ。フッ素化アリールアジドの光分解生成物はアリールニトレンで、その全てはＣ−Ｈ結合への挿入を含むこの基の特徴的反応を高効率で起こす。（キーナ等（Keana et al.）、ジャーナルオブオーガニックケミストリー（J. Org. Chem.）、５５巻、３６４０−３６４７頁、１９９０年）。
【０２０８】
他の実施形態では光活性化可能基をベンゾフェノン残基から選ぶ。ベンゾフェノン試薬は通常アリールアジドより高い架橋収率を与える。
【０２０９】
他の実施形態では光活性化可能基を光分解で電子不足カルベンを生成するヂアゾ化合物から選ぶ。これらカルベンはＣ−Ｈ結合への挿入、二重結合への付加（芳香族系を含む）、水素引き抜き及び炭素イオン生成の求核中心への配位を含む種々の反応を起こす。
【０２１０】
更に他の実施形態で光活性化可能基をヂアゾピルビン酸塩から選ぶ。例えばｐ−ニトロフェニルピルビン酸エステルのｐ−ニトロフェニルエステルは脂肪族アミンと反応してヂアゾピルビン酸アミドを生じ、紫外光分解によりアルデヒドを生成する。光分解ヂアゾピルビン酸塩修飾の親和性成分はフォルムアルデヒドやグルタルアルデヒドの様に反応して架橋する。
【０２１１】
iiiホモ二官能性試薬
１．第一級アミンと反応するホモ二官能性架橋剤
アミンと反応する架橋剤の合成、物性及び応用は商業的に文献に記載されている。（架橋法及び試薬の総説に関しては上を参照）。多くの試薬が利用できる。（例えばピーアースケミカルカンパニー（Pierce Chemical Company）、ロックフォード（Rochford）、イリノイ（Ill.）、シグマケミカルカンパニー（Sigma Chemical Company）、セントルイス（St. Louis）、ミズーリ（Mo.）、モレキュラープローブ社（Molecular Probes, Inc.）、ユージン（Eugene）、オレゴン（OR））。
【０２１２】
ホモ二官能性ＮＨＳエステルの好ましい制限のない例としては、グルタール酸ジスクシニミドエステル（ＤＳＧ）、スべリン酸ジスクシニミドエステル（ＤＳＳ）、スべリン酸ビス（スルホスクシニミド）エステル（ＢＳ）、酒石酸ジスクシニミドエステル（ＤＳＴ）、酒石酸ジスルホスクシニミドエステル（sulfo-DST）、ビスー２−（スクシニミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビスー２−（スルホスクシニミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（sulfo-BSOCOES）、エチレングリコールビス（スクシニミドコハク酸エステル）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシニミドコハク酸エステル）（sulfo-EGS）、ジチオビス（スクシニミドプロピオン酸エステル）（ＤＳＰ）及びジチオビス（スルホスクシニミドプロピオン酸エステル）（sulfo-DSP）がある。ホモ二官能性イミドエステルの好ましい制限のない例としては、ジメチルマロン酸イミダート（ＤＭＭ）、ヂメチルコハク酸イミダート（ＤＭＳＣ）、ヂメチルアジピン酸イミダート（ＤＭＡ）、ヂメチルピメリン酸イミダート（ＤＭＰ）、ジメチルスべリン酸イミダート（ＤＭＳ）、ジメチルー３，３−オキシジプロピオン酸イミダート（ＤＯＤＰ）、ジメチルー３，３’−（メチレンジオキシ）ジプロピオン酸イミダート（ＤＭＤＰ）、ジメチルー３，３−（ジメチレンジオキシ）ジプロピオン酸イミダート（ＤＤＤＰ）、ジメチルー３，３’−（テトラメチレンジオキシ）ジプロピオン酸イミダート（ＤＴＤＰ）及びジメチルー３，３−ジチオビスプロピオン酸イミダート（ＤＴＢＰ）がある。
【０２１３】
ホモ二官能性イソチオシアネートの好ましい制限のない例としてはｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）及び４，４−ジイソチオシアノスチルベン−２，２’―スルホン酸（ＤＩＤＳ）がある。
【０２１４】
ホモ二官能性イソシアネートの好ましい制限のない例としては、キシレンジイソシアネート、トルエンー２，４−ジイソシアネート、トルエンー２−イソシアネートー４−イソチアネート、３−メトキシジフェニルメタンー４，４−ジイソシアネート、２，２’−ジカルボキシ−４，４−アゾフェニルジイソシアネート及びヘキサメチレンジイソシアネートがある。
【０２１５】
ホモ二官能性ハロゲン化アリールの好ましい制限のない例としては、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）及び４，４−ジフルオロー３，３’−ジニトロフェニルスルホンがある。
【０２１６】
ホモ二官能性脂肪族アルデヒド試薬の好ましい制限のない例としてはグリオキサール、マロンジアルデヒド及びグルタールアルデヒドがある。
【０２１７】
ホモ二官能性アシル化剤の好ましい制限のない例としてはジカルボン酸のニトロフェニルエステルがある。
【０２１８】
ホモ二官能性芳香族塩化スルホニルの好ましい制限のない例としては、２，４−ジ塩化スルホニルフェノール及び２，４−ジ塩化スルホニル−α―ナフトールがある。
【０２１９】
追加のアミノ基との反応性ホモ二官能性試薬の好ましい制限のない例としてはアミンと反応してビスカルバメートを生じるエリトリトールビス炭酸エステルがある。
【０２２０】
２．フリーのスルフヒドリル基と反応するホモ二官能性架橋剤
この試薬の合成、物性及び応用は文献に記載されている。（架橋法と試薬に関する総説は上を参照）。多くの試薬が商業的に利用できる。（例えばピーアースケミカルカンパニー（Pierce Chemical Company）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ（Ill.）、シグマケミカルカンパニー（Sigma Chemical Company）、セントルイス（St. Louis）、ミズーリ（Mo.）、モレキュラープローブ社（Molecular Probes, Inc.）、ユージン（Eugene）、オレゴン（OR））。
【０２２１】
ホモ二官能性マレイミドの好ましい制限の無い例としては、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、Ｎ，Ｎ−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ，Ｎ−（１，２−フェニレン）ビスマレイミド、アゾフェニルジマレイミド及びビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルがある。
【０２２２】
ホモ二官能性ピリジルジスルフィドの好ましい制限の無い例としては１，４−ジー３―（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミドブタン（ＤＰＤＰＢ）がある。
【０２２３】
ホモ二官能性ハロゲン化アルキルの好ましい制限の無い例としては、２，２―ジカルボキシ−４，４’−ジヨードアセトアミドアゾベンゼン、α、α―ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、α、α’―ジブロモ−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（β―ブロモエチル）ベンジルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ（ブロモアセチル）フェニルヒドラジン及び１，２−ジ（ブロモアセチル）アミノ−３−フェニルプロパンがある。
【０２２４】
３．ホモ二官能性光活性化可能架橋剤
この試薬の合成、物性及び応用は文献に記載されている。（架橋法と試薬に関する総説は上を参照）。多くの試薬が商業的に利用できる。（例えばピーアースケミカルカンパニー（Pierce Chemical Company）、ロックフォード（Rochford）、イリノイ（Ill.）、シグマケミカルカンパニー（Sigma Chemical Company）、セントルイス（St. Louis）、ミズーリ（Mo.）、モレキュラープローブ社（Molecular Probes, Inc.）、ユージン（Eugene）、オレゴン（OR））。
【０２２５】
ホモ二官能性光活性化可能架橋剤の好ましい制限のない例としては、ビス−β―（４−アジドサリシルアミド）エチルジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ジ−Ｎ−（２−ニトロ−４−アジドフェニル）シスタミン−Ｓ，Ｓ−ジオキサイド（ＤＮＣＯ）及び４，４−ジチオビフェニルアジドがある。
【０２２６】
ivヘテロ二官能性試薬
１．ピリジルジスルフィド成分を有するアミノ基との反応性ヘテロ二官能性試薬
この試薬の合成、物性及び応用は文献に記載されている。（架橋法と試薬に関する総説は上を参照）。多くの試薬が商業的に利用できる。（例えばピーアースケミカルカンパニー（Pierce Chemical Company）、ロックフォード（Rochford）、イリノイ（Ill.）、シグマケミカルカンパニー（Sigma Chemical Company）、セントルイス（St. Louis）、ミズーリ（Mo.）、モレキュラープローブ社（Molecular Probes, Inc.）、ユージン（Eugene）、オレゴン（OR））。
【０２２７】
ピリジルジスルフィド成分有するヘテロ二官能性試薬及びアミノ基との反応性ＮＨＳエステルの好ましい制限のない例としては、Ｎ−スクシニミド−３―（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸エステル（ＳＰＤＰ）、スクシニミド−６，３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサン酸エステル（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシニミド−６，３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサン酸エステル（sulfo-ＬＣＳＰＤＰ）、４−スクシニミドオキシカルボニル−α―メチル−α―（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）及びスルホスクシニミド−６−α―メチルーα―（２−ピリジルジチオ）トルアミドヘキサン酸エステル（sulfo―ＬＣ−ＳＭＰＴ）がある。
【０２２８】
２．マレイミド部分を有するアミン反応性ヘテロ2機能性薬品
この試薬の合成、物性及び応用は文献に記載されている。マレイミド成分有するヘテロ二官能性試薬及びアミノ基との反応性ＮＨＳエステルの好ましい制限のない例としては、スクシニミドマレイミド酢酸エステル（ＡＭＡＳ）、スクシニミド−３−マレイミドプロピオン酸エステル（ＢＭＰＳ）、Ｎ−γ―マレイミドブチルオキシスクシニミドエステル（ＧＭＢＳ）、Ｎ−γ―マレイミドブチルオキシスルホスクシニミドエステル（sulfo―ＧＭＢＳ）、スクシニミド−６−マレイミドヘキサン酸エステル（ＥＭＣＳ）、スクシニミド−３−マレイミド安息香酸エステル（ＳＭＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシニミドエステル（sulfo―ＭＢＳ）、スクシニミド−４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸エステル（ＳＭＣＣ）、スルホスクシニミド−４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸エステル（sulfo―ＳＭＣＣ）、スクシニミド−４―（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸エステル（ＳＭＰＢ）及びスルホスクシニミド−４―（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸エステル（sulfo―ＳＭＰＢ）がある。
【０２２９】
３．ハロゲン化アルキル成分を有するアミノ基との反応性ヘテロ二官能性試薬
この試薬の合成、物性及び応用は文献に記載されている。ハロゲン化アルキル成分有するヘテロ二官能性試薬及びアミノ基との反応性ＮＨＳエステルの好ましい制限のない例としては、Ｎ−スクシニミド−（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）、スルホスクシニミド−（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸エステル（sulfo―ＳＩＡＢ）、スクシニミド−６−（ヨードアセチル）アミノヘキサン酸エステル（ＳＩＡＸ）、スクシニミド−６−（６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイルアミノ）ヘキサン酸エステル（ＳＩＡＸＸ）、スクシニミド−６−（４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチルシクロヘキサン−１−カルボニル）アミノヘキサン酸エステル（ＳＩＡＣＸ）、及びスクシニミド−６−（４−（（ヨードアセチル）アミノ）メチルシクロヘキサン−１−カルボン酸エステル（ＳＩＡＣ）がある。
【０２３０】
アミノ基との反応性ＮＨＳエステルを持つヘテロ二官能性試薬とハロゲン化アルキルの好ましい例はＮ−ヒドロキシスクシニミド−２，３−ジブロモプロピオン酸エステル（ＳＤＢＰ）がある。ＳＤＢＰはそのアミノ基を複合化して分子内架橋を親和性化合物に導入する。ジブロモプロピオンニル基の第一級アミンに対する反応性は反応温度で制御する。（マッケンジー等（McKenzie et al.）、プロテインケミストリー（Protein Chem.）、７巻、５８１−５９２頁、１９８８年）。
【０２３１】
ハロゲン化アルキルを有するヘテロ二官能性試薬とアミノ基との反応性ｐ−ニトロフェニルエステル成分の好ましい制限のない例としてはｐ−ニトロフェニルヨード酢酸エステル（ＮＰＩＡ）がある。
【０２３２】
他の架橋剤は技術の熟知者には知られている。例えばポマト等（Pomato et al.）、米国特許５，９６５，１０６を参照。特定の応用に適する架橋剤の選択は技術の熟知者の能力の範囲内である。
【０２３３】
ｖ  開裂可能リンカー基
更なる実施形態でリンカー基は切断により糖残基から修飾基を離脱できる官能基を備えている。多くの開裂可能基が技術的に知られている。例えばユング等（Jung et al.）バイオケイミストリアンドバイオフィジックアクタ（Biochm. Biophys. Acta,）、７６１巻、１５２−１６２頁、１９８３年、ジョッシ等（Joshi et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６５巻、１４５１８−１４５２５頁、１９９０年、  ザーリング等（Zarling et al.）、ジャーナルオブインミュノロジー（J. Immunol.）、１２４巻、９１３−９２０頁、１９８０年、ブーザー等（Bouizar et al.）、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）、１５５巻、１４１−１４７頁、１９８６年、パーク等（Park et al. ）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６１巻、２０５−２１０頁、１９８６年、ブラウニング等（Browning et al.）、ジャーナルオブインミュノロジー（J. Immunol.）、１４３巻、１８５９−１８６７頁、１９８９年を参照。更に広範囲の開裂可能な二官能性（ホモ及びヘテロ二官能性の両者）リンカー基がピアースの様な供給者から商業的に入手できる。
【０２３４】
典型的開裂可能成分は光、熱或いはチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩及び同類を用いて切断できる。更にある好ましい基は体内でエンドサイトーシスに応えて切断する。（例えばシスーアコニチル、シェン等（Shen et al.）、バイオケイミストリアンドバイオフィジックリサーチコミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、１０２巻、１０４８頁、１９９１年参照）。好ましい開裂可能基はジスルフィド、エステル、イミド、炭酸塩、ニトロベンジル、フェナシル及びベンゾイン基からなる基から選んだメンバーの開裂可能成分からなる。
【０２３５】
方法
本発明は又実質的に単分散集団のポリ（エチレングリコール）作成法を提供する。この方法は明確な分子量のＰＥＧ分子、例えばＰＥＧ２００と明確な分子量の二官能活性化ＰＥＧ、例えばＰＥＧ２００の少なくとも２当量と接触させる事からなり、その結果ＰＥＧの単分散試料、例えばＰＥＧ６００を生成する。
2006523211.tif 000039
Ｇはスルホン酸エステルやトリフルオロメタンスルホン酸エステルの様な脱離基である。そこで単分散試料のＰＥＧ６００を二官能活性化ＰＥＧ２００と接触した単分散ＰＥＧ１００を形成できる。代わりに単分散ＰＥＧ６００を対応二官能性誘導体に変換し、単分散ジヒドロキシＰＥＧ６００の少なくとも２当量と反応して単分散ＰＥＧ１８００を生成できる。本発明のプロセスを所要サイズの単分散ＰＥＧが得られるまで繰り返す。出発材料と生成物間の分子量差によりいかなる未反応材や一部反応材をサイズ排除クロマトグラフィで分離できるようにこの合成を設計できる。
【０２３６】
活性化ＰＥＧ誘導体
本発明は又ポリ（エチレングリコール）誘導体作成法を提供する。その方法を図式Ｉに概説する。
2006523211.tif 000040
（a）Ｒ−Ｙ／（酸又は塩基）；（ｂ）活性化、例えばトシル化、ハロゲンー脱ヒドロキシル化、例えばＨＸ又はＳＯＸ２とＰＥＧｍとの反応；（ｃ）活性化（Ｒ‘）、例えばｐ−ニトロフェニルクロロ蟻酸エステル。
ここで指標ｍとnは１乃至１００，０００の整数を独立に表す。Ｒは置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、アルキルアミン、保護アルキルアミン又は活性化基、例えばトリフラート、トシレート及び同類から選ぶメンバーである。
【０２３７】
Ｒ‘は置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル及び置換又は非置換ヘテロアリールから選ぶ。Ｒが結合しているＣＨ２−Ｏ基活性化用脱離基を持っていない場合には、Ｒ’は通常脱離基であるかそれを含む基である。
【０２３８】
典型的実施形態ではＲはメチルの様な低級アルキルである。他の実施形態ではＲ‘はｐ−ニトロフェニルクロロギ酸エステルの様な置換アルキルである。
【０２３９】
ステップ（a）では出発グリコールを活性化基（Ｒ−Ｙ）と接触してグリコールの水酸基と反応する。Ｙは通常脱離基で、ＲをＰＥＧ分子の一個の水酸基に配置できる。ステップ（ｂ）で生成付加物のフリーの水酸基をハロゲン化物、例えばクロロ基或いはスルホン酸エステル、例えばトシレートの様な基で変換して活性化する。活性化ＰＥＧ種は出発ＰＥＧ（“ＰＥＧｍ”）と同重合度又は異なる重合度の他のＰＥＧ成分と接触する。他種に連結させる様にＲＯ−ＰＥＧn+mを任意にフリーの水酸基を活性化する。
【０２４０】
通常Ｒ基は反応性官能基含有種によりＰＥＧ成分に連結する。更に二個のポリ（エチレングリコール）断片を通常連結プロセスで新規有機官能基か非反応性種に変換する反応性官能基を用いて一緒に連結する。一個又は複数の反応性官能基はポリ（エチレングリコール）のどの位置にあっても良いが、好ましくは末端の一つである。
【０２４１】
分岐ポリマー修飾糖のペプチドとの複合化
修飾糖を複合化の仲介に適した酵素を用いてグリコシル化又は非グリコシル化ペプチドと複合化する。好ましくは一個又は複数の修飾供与体糖、一個又は複数の酵素及び一個又は複数のペプチドの濃度を受容体が消費されるまでグルコシル化が進むように選ぶ。シアル酸転移酵素についての本文中に示しているが、以下に検討の考察は一般に他の糖転移酵素反応に適応する。
【０２４２】
糖転移酵素を用いて望ましいオリゴ糖構造を合成する多くの方法が知られおり、通常本発明に応用できる。典型的方法は例えばＷＯ９６／３２４９１、伊藤等（It et al.）ピュアーアプライドケミストリー（Pure Appl. Chem.）、６５巻、７５３頁、１９９３年及び米国特許５，３５２，６７０，米国特許５，３７４，５４１及び米国特許５，５４５，５５３に記載されている。
【０２４３】
本発明は単一糖転移酵素又は組み合わせの糖転移酵素を用いて実施する。例えばシアル酸基転移酵素とガラクトシル基転移酵素の組み合わせを使用できる。一個以上の酵素を用いる実施形態では、酵素と基質は好ましくは最初の反応混合物中で一緒にするか、又は第二酵素反応用の酵素及び試薬を第一酵素反応が完了するかほぼ完了するときに反応媒体に加える。二つの酵素反応を単一容器で連続的に行う事で全収率が中間体種を単離する方法に比べて改善される。更に余分の溶剤及び副生物のクリーンアップと廃棄を減らす。
【０２４４】
好ましい実施形態では第一及び第二酵素のそれぞれは糖転移酵素である。他の好ましい実施形態では一個の酵素はエンドグリコシダーゼである。追加の好ましい実施形態では二個以上の酵素を用いて本発明の修飾糖タンパクを組み立てる。酵素を用いて修飾糖のペプチドへの添加前又は後のいずれかの時点でペプチドの糖構造を変える。
【０２４５】
本発明の複合物中のＯ−結合グリコシル成分は通常ペプチドと連結したＧａｌＮＡｃ成分で始まる。ＧａｌＮＡｃ転移酵素族のいかなるメンバーもＧａｌＮＡｃ成分をペプチドと結合に用いることができる。（ハッサン、エッチ（Hassan H）、ベネット、イーピー(Bennett EP)、マンデル、ユー(Mandel U)、ホリングスウワース、エムエイ(Hollingsworth MA)及びクラウゼン、エッチ(Clasuen H)、２０００年、ムチンーＯ−グルコシル化型の制御：ポリペブチドＧａｌＮＡｃ転移酵素の基質特異性主導によるＯ−グリカン占有率（Control of Mucin-Type O-Clycosylation: O-Glycan Occupancy is Directed by Substrate Specificities of Polypeptide GalNAc-Transferases）、（エルンスト(Ernst)、ハート(Hart)及びサイネイ(Sinay)編）、ワイリーーブイシーエッチ社(WileyVCH)、章、“化学と生物学の炭水化物―包括ハンドブック”（Carbohydrate in Chemistry and Biology-a Comprehension Handbook）、２７３−２９２頁）。ＧａｌＮＡｃ成分自身は無傷グリコシルリンカーであっても良い。代わりに糖残基を一個以上の酵素と一個又はそれ以上の酵素に適切なグリコシル基質を用い建て増し、修飾糖を建て増しグリコシル成分に加える。
【０２４６】
他の実施形態ではこの方法は一個又はそれ以上のエキソ又はエンドグリコシダーゼを用いる。グリコシダーゼは通常突然変異体であり、グリコシル結合を切断するよりむしろ形成する様に操作する。突然変異体グルカナーゼは通常活性部位酸性アミノ酸残基でのアミノ酸残基の置換を含む。例えばエンドグルカナーゼがエンドー水素原子の時には、置換活性部位残基は通常１３０位でＡｓｐ、１３２位でＧｌｕ又はそれらの組み合わせである。アミノ酸は通常セリン、アラニン、アスパラギン又はグルタミンで置換される。
【０２４７】
突然変異体酵素は通常エンドグリカナーゼの加水分解ステップの逆反応と類似の合成ステップでその反応を触媒する。これらの実施形態ではグリコシル供与体分子（例えば望ましいオリゴ又は単糖構造）は脱離基を持ち、且つ反応は供与体分子のタンパク質のＧｌｃＮＡ残基への付加により進む。例えば脱離基はフッ化物の様なハロゲンである。他の実施形態では脱離基はＡｓｎ又はＡｓｎ―ペプチド成分である。更なる実施形態ではグリコシル供与体分子のＧｌｃＮＡｃ残基が修飾される。例えばＧｌｃＮＡｃ残基は１，２−オキサゾリン成分からなる。
【０２４８】
好ましい実施形態では本発明の複合物生成に利用する各酵素は触媒量存在する。特定酵素の触媒量は酵素基質の濃度と同様に温度、時間及びｐＨ値の様な反応条件により変わる。前もって選んだ基質濃度と反応条件下での所定酵素用触媒量の決定手段はこの技術の熟知者には既知である。
【０２４９】
上記プロセスで用いる温度は丁度凍結以上から最も鋭敏な酵素の変性温度までの範囲である。好ましい温度は約０℃から約５５℃、より好ましくは約２０℃から約３０℃である。他の典型的実施形態では本方法の一つ又はそれ以上の成分を好熱性酵素使用の高温で実施する。
【０２５０】
反応混合物は受容体がグリコシル化されるに十分な時間維持し、その結果望ましい複合物を形成する。幾つかの複合物はしばしば数時間後に検出でき、通常回収可能量が２４時間かそれ以下で得られる。この技術の熟知者には反応速度が多くの変動要因（例えば酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒量）に依存し、選択系に最適化する。
【０２５１】
本発明は又修飾糖の工業規模での生産を提供する。ここで用いた工業規模は通常好ましくは一回の反応サイクル後の最終精製複合物、即ち複合物が同一、連続反復合成サイクルの組み合わせ反応生成物ではないものを、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも１グラム生成する事である。
【０２５２】
以下の議論では本発明は修飾シアル酸成分のグルコシル化ペプチドへの複合化を用いて説明する。典型的修飾シアル酸を（ｍ−）ＰＥＧで標識化する。以下の議論の焦点としてＰＥＧ修飾シアル酸とグルコシル化ペプチドを用いるのは説明を明快にするためであり、本発明がこれら二個のパートナーの複合化に限定される事を意図しない。熟練者にはこの議論がシアル酸以外の修飾グリコシル成分の付加に通常適用できる事が分かる。更にこの議論はＰＥＧ以外の他の水溶性ポリマー、治療用成分及び生体分子含有試薬でグリコシル単位の修飾に同様に適用できる。
【０２５３】
酵素的手段は分岐ポリマー修飾炭水化物のペプチド又は糖ペプチドへの選択的導入に使用できる。その方法は分岐水溶性ポリマー含有修飾糖を用い、妥当な糖転移酵素又は糖合成酵素と組み合わす。望ましい炭水化物結合を形成する糖転移酵素を選び且つ修飾糖を供与体基質として用いて、分岐水溶性ポリマーを直接ペプチドバックボーン、糖ペプチドの既存糖残基又はペプチドに前もって加えた糖残基に導入できる。
【０２５４】
シアル酸転移酵素用受容体はペプチド上に存在し、本発明の方法で自然発生構造又は組み替え的、酵素的或いは化学的配置構造に修飾する。適切な受容体としては例えばＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオーズ、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（乳糖）及びこの技術の熟知者には既知のその他の受容体がある。（例えばポールソン等(Paulson et al.)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５３巻、５６１７−５６２４頁、１９７８年を参照）。
【０２５５】
一実施形態ではシアリル酸転移酵素用受容体は糖ペプチド上に存在し、糖ペプチドの体内合成で修飾される。この糖ペプチドは請求の方法を用いて糖ペプチドのグリコシル化形態を修正する事無しにシアル酸化できる。代わりに本発明の方法を用いて適切な受容体を含有しないペプチドをシアリル酸化できる、先ずペプチドをこの技術の熟知者には既知方法で受容体が含有するように修飾する。
【０２５６】
典型的実施形態ではガラクトシル受容体はガラクトース残基をペプチド、例えばＧａｌＮＡｃと連結した適切な受容体に連結して組み立てる。その方法は修飾用ペプチドを適当量のガラクトシル基転移酵素（例えばＧａｌβ１，３又はＧａｌβ１，４）と適当なグリコシル供与体（例えばウリジン二リン酸―ガラクトース）を含む反応混合物と保温する事である。反応を実質的に完了するまで進行するよう放置するか、代わりに前もって選んだ量のガラクトース残基を加えて反応を停止する。選択糖受容体の他の組み立て法はこの技術の熟知者には明白である。
【０２５７】
更に他の実施形態では糖ペプチド連結オリゴ糖を先ず全体か一部を“トリム化”してシアリル酸基転移酵素用受容体か一個又はそれ以上の妥当残基を加えて適当な受容体を得る成分のいずれかを露出する。グルコシル基転移酵素及びエンドグリコシダーゼ（例えば米国特許５，７１６，８１２参照）の様な酵素は連結及びトリミング反応に有用である。
【０２５８】
典型的実施形態では炭水化物残基を修飾糖添加前に“トリム化”する。例えばＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ残基をトリムしてＧａｌＮＡｃに戻す。水溶性ポリマーを有する修飾糖を“トリミング”により露出した一個又はそれ以上の糖残基と複合化する。一例では糖ペプチドを“トリム化”し、水溶性ポリマーを糖成分、例えば水溶性ポリマーに複合化したＳｉａ、Ｇａｌ又はＧａｌＮＡｃ成分により、生成Ｏ−側鎖アミノ酸又は糖ペプチドグリカンに加える。修飾糖成分は“トリム化”糖ペプチドの受容体部位と連結する。代わりに非修飾糖成分、例えばＧａｌをＯ−連結グリカンの末端に加える事もできる。
【０２５９】
他の典型的実施形態では分岐水溶性ポリマーをガラクトース残基含有修飾糖によりＧａｌＮＡｃ残基に加える。代わりに非修飾ＧａｌをＧａｌＮＡｃ残基末端に加えることもできる。
【０２６０】
更なる例では分岐水溶性ポリマーを修飾シアル酸を用いてＧａｌ残基に加える。
【０２６１】
上で議論の典型的実施形態によりここに示した方法の能力の実例が与えられる。本発明の方法を用いて実質的にいかなる所望構造の炭水化物残基を“縮小したり”且つ積み上げたりできる。修飾糖を上に示したように炭水化物末端に加えたり、或いはペプチドコアと炭水化物末端間の中間となり得る。
【０２６２】
典型的実施形態で分岐水溶性ポリマーをポリマー修飾シアル酸を用いてＧａｌ残基末端に添加する。適切なシアル酸基転移酵素を用いて修飾シアル酸を加える。この手段を図式３に要約する。
図式３
2006523211.tif 000041
【０２６３】
更なる方法では図式４に要約する様に、遮蔽反応的官能性がシアル酸上の存在する。遮蔽反応基は好ましくは修飾シアル酸をペプチドに連結する条件下で影響されない。修飾シアル酸をペプチドと共有結合後に、遮蔽基を除きペプチドをＰＥＧ、ＰＰＧ、治療用成分、生体分子又は他試薬の様な試薬と複合化する。この試薬は修飾糖残基の非遮蔽反応基と反応してペプチドと特異的に複合化する。
図式４
2006523211.tif 000042
【０２６４】
いかなる修飾糖も適当な糖転移酵素と使用でき、糖ペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖に依存する（表３）。上に議論した様に分岐水溶性ポリマー構造導入に必要な糖ペプチドの末端糖は発現時に自然に導入できるし、又適当な一個又は複数のグリコシダーゼ、一個又は複数の糖転移酵素又は一個又は複数のグリコシダーゼと一個又は複数の糖転移酵素混合物を用いてポスト発現で生成できる。
表３
2006523211.tif 000043
2006523211.tif 000044
2006523211.tif 000045
X = O, NH, S, CH2, N-(R1-5)2
Y = X; Z-X; A-X; B-X
Q = H2, O, S, NH, N-R
R, R1-4 = H, リンカー-M, M
M = 分岐水溶性ポリマー
【０２６５】
代わりの実施形態ではペプチドバックボーンのＯ−連結グリコシル化部位への糖残基転移で知られる糖転移酵素を用いて修飾糖を直接ペプチドバックボーンに添加する。この典型的実施形態は図式５に示す。本発明実施に有効な典型的糖転移酵素としては限定されないが、ＧａｌＮＡｃ転移酵素（ＧａｌＮＡｃＴ１−２０）、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、フコシル基転移酵素、グルコシル基転移酵素、キシロース基転移酵素、マンノシル基転移酵素及び同類がある。この方法を用いていずれかの炭水化物欠如のペプチドに、又は代わりに既存糖ペプチドに修飾糖を直接添加できる。両者の場合修飾糖の添加は化学的方法を用いるタンパク質のペプチドバックボーン修飾で起こる任意な形ではなく、糖転移酵素の基質特異性により決るペプチドバックボーンの特異的位置で起こる。多くの試薬が適当なアミノ酸配列をポリペプチド鎖に操作する事で糖転移酵素基質ペプチド配列欠如のるタンパク質又は糖ペプチドに導入できる。
図式５
2006523211.tif 000046
【０２６６】
上に示した各典型的実施形態では一個又はそれ以上の追加の化学的又は酵素的修飾手段をペプチドへの修飾糖複合化に続いて利用できる。典型的実施形態では酵素（例えばフコシル基転移酵素）をペプチドと連結の末端修飾糖にグリコシル単位（例えばフコース）を付加するのに用いる。他例では酵素反応を修飾糖が複合化に失敗した部位を“キャップ”（例えばシアル酸化）するのに用いる。代わりに化学反応を複合化修飾糖の構造を変えるのに用いる。例えば複合化修飾糖をこの修飾糖が連結したペプチド成分との結合を安定化又は不安定化する試薬と反応する。他例では修飾糖をペプチドと複合化後脱保護する。熟練者には修飾糖のペプチドとの複合化後段階で本発明法に有用な多数の酵素的及び化学的方法が有ることが分かる。修飾糖―ペプチド複合物の更なる推敲は本発明範囲内である。
【０２６７】
他の典型的実施形態では糖ペプチドは目的試薬、例えばトランスフェリン（ペプチドを血液―脳関門及び赤血球内質に移送するため）、カルニチン（ペプチドを筋細胞に移送するため；例えばルボーン等（LeBrgne et al.）、バイオケミストリーアンドファルマコロジー（Biochem. Pharmacol.）、５９巻、１３５７−６３頁、２０００年参照）及びホスフォン酸塩、例えばビスホスフォネート（ペプチドが骨及び他の含カルシウム組織を標的にするため；例えばモダーンドラッグディスカバリー（Modern Drug Discovery）、２００２年８月、１０頁参照）と複合化する。標的に利用できる他の試薬は本技術の熟練者には明白である。例えばブドウ糖、グルタミン及びインシュリン様成長因子は又筋肉を標的とするのに利用できる。
【０２６８】
標的成分と治療用ペプチドはここで議論のいずれかの方法或いは技術的に別に知られている方法で複合化する。熟知者には上に示したペプチド以外のペプチドをここに示す様に誘導化できる事が分かる。典型的ペプチドは２００１年１０月１０日申請の同時係属公有米国仮特許申請６０／３２８、５２３に貼付の付属書で示される。
【０２６９】
典型的実施形態では標的試薬と治療用ペプチドをリンカー成分で結合する。この実施形態では少なくとも一個の治療用ペプチド又は標的試薬を本発明法の無傷グリコシル連結基によりリンカー成分と結合する。典型的実施形態ではリンカー成分としてポリ（エチレングリコール）の様なポリ（エーテル）がある。他の典型的実施形態ではリンカー成分として体内で分解し、標的試薬から治療用ペプチドを放除し、ついで複合物を体の標的組織又は領域に送達する少なくとも一個の結合がある。
【０２７０】
更に他の典型的実施形態では治療用成分の体内分布を治療用ペプチドと標的成分とを複合化する事無しに治療用成分のグライコフォームを変える事により変化する。例えば治療用ペプチドをグルコシル基の末端ガラクトース成分をシアル酸（又はその誘導体で）で封じる事により細網内皮系での摂取を防ぐ)事ができる。
【０２７１】
i. 酵素
１．糖転移酵素
糖転移酵素はタンパク質、糖ペプチド、脂質或いは糖脂質又は成長オリゴ糖の非還元末端への活性化糖（供与体ＮＤＰ―糖）付加を段階的に触媒する。Ｎ−連結糖ペプチドは転移酵素と脂質結合オリゴ糖供与体Ｄｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ２Ｇｌｃ３Ｍａｎ９の一括転移に続くコアー削除により合成される。この場合“コア”糖の性質は続く連結物とはやや異なる。非常に多数の糖転移酵素が技術的に知られている。
【０２７２】
本発明に用いる糖転移酵素は修飾糖を糖供与体として利用できる限りいかなる物でも良い。このような酵素例としてはガラクトシル基転移酵素、Ｎ―アセチルグルコサミニル基転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン基転移酵素、フコシル基転移酵素、シアル酸基転移酵素、マンノシル基転移酵素、キシロシル基転移酵素、グルクロノシル基転移酵素及び同類の様なルロアール経路糖転移酵素がある。
【０２７３】
糖転移酵素反応を含む酵素糖合成に関する糖転移酵素はクローン化したりいかなる原料から単離できる。多くのクローン化糖転移酵素はそのポリヌクレオチド配列の様に知られている。例えば“ワールドワイドウェブクローン化糖転移酵素案内（The WWW Guide to Cloned Glycosyltransferases”）, (http:/www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm)を参照。糖転移酵素アミノ酸配列及びアミノ酸配列を推論できるヌクレオチド配列コード化糖転移酵素も又ジェンバンク、スイスプロット、ヨーロッパ分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）及びその他を含む種々の公有データベースに見いだされる。
【０２７４】
本発明法で用いる糖転移酵素としては限定されないが、ガラクトシル基転移酵素、フコシル基転移酵素、グルコシル基転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン基転移酵素、Ｎ―アセチルグルコサミン基転移酵素、グルクロノシル基転移酵素、シアル酸基転移酵素、マンノシル基転移酵素、グルクロン酸基転移酵素、ガラクッロン酸基転移酵素呼びオリゴ糖転移酵素がある。適切な糖転移酵素は真核生物と同様に原核生物から得られる物を含む。
【０２７５】
ＤＮＡコード化糖転移酵素は化学合成、適当な細胞又は細胞株培養物の伝令ＲＮＡ逆転写物の選別、適当な細胞のゲノムライブラリーの選別又はこれらの方法を組み合わして得られる。伝令ＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの選別は糖転移酵素遺伝子配列から生じたオリゴヌクオチドプローブを用いて行う。プローブは既知の方法に従い従来のハイブリッド形成分析に用いる蛍光性基、放射性原子又は化学発光性基の様な検出可能基で標識化できる。代わりに糖転移酵素遺伝子配列は糖転移酵素遺伝子配列から生ずるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により得られる。マリス等(Mullis et al.)に対する米国特許４，６９３，１９５及びMullisに対する米国特許４，６８３，２０２参照。
【０２７６】
糖転移酵素は糖転移酵素コード化ＤＮＡ含有ベクターで形質変換した宿主細胞中で合成できる。ベクターを用いて糖転移酵素コード化ＤＮＡの増幅及び／又は糖転移酵素をコード化するＤＮＡの発現のいずれかを行う。発現ベクターは糖転移酵素コード化ＤＭＡ配列を適切な宿主中で糖転移酵素発現に影響する適切な制御配列と実施可能な様に連結した複写可能なＤＮＡ構成物である。この制御配列の必要性は選択宿主及び選択形質変換法により変わる。通常制御配列としては転写プロノーター、転写制御用の任意オペレーター配列、適切な伝令ＲＮＡリボソーム結合部位のコード化配列及び転写及び翻訳終結の制御配列がある。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としない。必要な全ては宿主中での通常複製起源により与えられる複製能力であり、且つ形質転換体認識を促進する選択遺伝子である。
【０２７７】
典型的実施形態では本発明は原核酵素を用いる。このような糖転移酵素としては多くのグラム陰性菌により生成するリポオリゴ糖合成を含む酵素がある。（プレストン等（Preston et al.、クリティカルレビューインマイクロバイオロジー（Critical Reviews in Microbiology）、２３（３）卷、１３９−１８０頁、１９９６年）。このような酵素としては限定されないが、β１，６ガラクトシル基転移酵素及びβ１，３ガラクトシル基転移酵素（例えばヨーロッパ分子生物学研究所アクセス番号Ｍ８０５９９及びＭ８６９３５（大腸菌）、ヨーロッパ分子生物学研究所アクセス番号Ｓ５６３６１（ネズミチフス菌））、グルコシル基転移酵素（スイスプロットアクセス番号Ｐ２５７４０（大腸菌）、β１，２グルコシル基転移酵素（rfaJ）（スイスプロットアクセス番号Ｐ２７１２９（大腸菌）及びスイスプロットアクセス番号Ｐ１９８１７（ネズミチフス菌））及びβ１，２Ｎ−アセチルグルコサミニル基転移酵素（rfaK）（ヨーロッパ分子生物学研究所アクセス番号Ｕ０００３９（大腸菌）を含む大腸菌及びネズミチフス菌の様なrfaオペロン種のタンパク質がある。アミノ酸配列が既知のその他の糖転移酵素としては肺炎桿菌、大腸菌、ネズミチフス菌、腸炎菌、腸炎エルシニア、ライ菌及びの様な生命体に特徴的なrfaBの様なオペロン及び緑濃菌のｒｈｌオペロンでコード化した物がある。
【０２７８】
本発明に用いるのに適した糖転移酵素としては、ラクトーＮ−ネオテトラオース構造含有のＤ−ガラクトシルーβ―１，４−Ｎ−アセチルーＮ−グルコサミニルーβ―１，３−Ｄ−ガラクトシルーβ―１，４−Ｄ―グルコース及び粘膜病原体淋菌及び髄膜炎菌のＬＯＳで同定されたｐｋ血液型三糖類のＤ−ガラクトシルーα―１，４−Ｄ−ガラクトシルーβ―Ｄ−グルコース（ショルテン等（Scholten et al.）、ジャーナルオブメディシナルマイクロバイオロジー（J. Med. Microbiol.）、４１巻、２３６−２４３頁、１９９４年）の生成がある。これら構造の生合成に関与する糖転移酵素のコード化髄膜炎菌及び淋菌の遺伝子は髄膜炎菌免疫型Ｌ３及びＬ１（ジェニングス等（Jennings et al.）、モレキュラーマイクロバイオロジー（Mol. Microbiol.）、１８巻、７２９−７４０頁、１９９５年）及び淋菌突然変異体Ｆ６２（ゴッツリッチ（Gotshlich）、ジャーナルオブエクスペリメンタルメディスン（J. Exp. Med.）、１８０巻、２１８１−２１９０頁、１９９４年）で同定された。髄膜炎菌では三個の遺伝子、ｌｇｔＡ，ｌｇｔＢ及びｌｇＥからなる遺伝子座でラクトーＮ−ネオテトラオース鎖糖での最終の三個に付加するのに必要な糖転移酵素をコード化する。（ワカルチャック等（Wakarchuk et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７１巻、１９１６６−７３頁、１９９６年）。最近ｌｇｔＢ及びｌｇｂＡ遺伝子の酵素活性が示され、提案の糖転移酵素機能にかんして最初の直接的証拠が提供された。（ワカルチャック等（Wakarchuk et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７１（４５）巻、２８２７１−２７６頁、１９９６年）。淋菌ではβ―Ｄ−ＧａｌＮＡｃをラクトーＮ−ネオテトラオース構造の末端ガラクトースの３位に付加するｌｇｔＤと末端α―Ｄ−Ｇａｌを切断ＬＯＳの乳糖要素も付加するｌｇｔＣの二つの追加遺伝子があり、Ｐｋ血液型抗原構造を創生する。（ゴッツリッチ（Gotshlich）、１９９４年、上出）。髄膜炎菌では別の免疫型Ｌ１が又Ｐｋ血液型抗原を発現しｌｇｔＣ遺伝子を持っている事が示された。（ジェンイングス等、１９９５年、上出）。ナイセイラ菌糖転移酵素及び関連遺伝子が又米国特許５，５４５，５５３（ゴッツリッチ（Gotshlich））に記載されている。ピロリ菌でのα１，２―フコシル基転移酵素及びα１，３−フコシル基転移酵素用遺伝子も又特定された。（マーチン等（Martin et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７２巻、２１３４９−２１３５６頁、１９９７年）。カンピロバクタージェジュニの糖転移酵素は本発明に又利用できる。（例えばhttp://afmb.cnrs.mrs.fr/-pedro/CAZY/ftf_42.htmlを参照）。
【０２７９】
（a）フコシル基転移酵素
ある実施形態では本発明法で用いる糖転移酵素はフコシル基転移酵素である。フコシル基転移酵素は技術の熟練書には既知である。典型的フコシル基転移酵素としてはグアニシン二リン酸―フコースのＬ−フコースを受容体糖の水酸基位に転移する酵素がある。非ヌクレオチド糖を受容体に転移するフコシル基転移酵素も又本発明に利用できる。
【０２８０】
ある実施形態では受容体糖は例えばオリゴ糖配糖体のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡＣβ基のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適切なフコシル基転移酵素としては最初人乳で特定されたＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１―α（１→３，４）フコシル基転移酵素（ＦＴＩＩＩＥ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（パルシック等（Palcic et al. ）、カーボハイドレイトリサーチ（Carbohydrate Res.）、１９０巻、１−１１頁、１９８９年、プリールス等（Prieels et al.）、ジャーナルオブバイオケミストリー（J. Biol. Chem. ）、２５６巻、１０４６５−１０４６３頁、１９８１年及びヌーネズ等（Nunez et al.）、カナディアンジャーナルオブケミストリー（Can. J. Chem.）、５９巻、２０８６―２０９５頁、１９８１年）及びヒト血漿で発見されたＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ―αフコシル基転移酵素（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）がある。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）のシアル酸α（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシル基転移酵素も又特定された。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ―α（１→３，４）フコシル基転移酵素の組み替え形も又特定された。（ドゥマス等（Dumas et al.）、バイオオーガニックメディシナルレターズ（Bioorg. Med. Letters）、１巻、４２５−４２８頁、１９９１年及びクコワスカーラターヨ等（Kukowska-Latallo et al.）、ジーンアンドデベロプメント（Genes and Development）、４巻、１２８８―１３０３頁、１９９０年参照）。他の典型的フコシル基転移酵素としては、例えばα１，２フコシル基転移酵素（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）がある。酵素的フコシル化はモリコン等（Mollicone et al.）、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）、１９１巻、１６９−１７６頁、１９９０年又は米国特許５，３７４，６５５記載の方法で実施できる。フコシル基転移酵素生成に用いる細胞は又グアノシン二リン酸―フコース合成用酵素系を含む。
【０２８１】
（ｂ）ガラクトシル基転移酵素
他のグループの実施形態では糖転移酵素はガラクトシル基転移酵素である。典型的ガラクトシル基転移酵素としてはα（１，３）ガラクトシル基転移酵素（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１（例えばダブコブスキー等（Dabkowski et al.）、トランスプラントプロシーディング（Transplant Proc.）、２５巻、２９２１頁、１９９３年及び山本等（Yamamoto et al.）、ネーチャー（Nature）、３４５巻、２２９−２３３頁、１９９０年）、ウシ（ジェンバンクｊ０４９８９、ジョジアッセ等（Joziasse et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６４巻、１４２９０−１４２９７頁、１９８９年）、ネズミ（ジェンバンクｍ２６９２５、ラーセン等(Larsen et al.) 、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８６巻、８２２７−８２３１頁、１９８９年）、ブタ（ジェンバンクＬ３６１５２、ストラーハン等（Strahan et al.）、インミュノジェネティックス（Immunogenetics）、４１巻、１０１−１０５頁、１９９５年）がある。他の適切なα１，３ガラクトシル基転移酵素としては血液型Ｂ抗原合成に関与する物がある。（ＥＣ２．４．１．３７、山本等（Yamamoto et al.）,ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６５巻、１１４６−１１５１頁、１９９０年（ヒト））。更なる典型的ガラクトシル基転移酵素はコアＧａｌ−Ｔ１である。
【０２８２】
本発明法での使用に適するβ（１，４）ガラクトシル基転移酵素としては、例えばＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃ合成酵素）及びＥＣ２．４．１．２２（乳糖合成酵素）（ウシ（ダゴスターロ（D’Agostaro et al.） 、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）、１８３巻、２１１−２１７頁、１９８９年）、ヒト（マスリ等（Masri et al.）、バイオケミストリーアンドバイオフィジックリサーチコミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、１５７巻、６５７−６６３頁、１９８８年）、ネズミ（中沢等（Nakazawa et al.）、ジャーナルオブバイオケミストリー（J. Biochem.）、１０４巻、１６５−１６８頁、１９８８年）、更にはＥ．Ｃ．２．３．１．３８及びセラミドガラクトシル基転移酵素（ＥＣ２．４．１．４５、スタール等（Stahle et al.）、ジャーナルオブニューロサイエンスリサーチ（J. Neuroscie. Res.）、３８巻、２３４−２４２頁、１９９４年）がある。他の適切なガラクトシル基転移酵素は例えばα１，２ガラクトシル基転移酵素（例えば分裂酵母から、チャペル等（Chapell et al. ）、モレキュラーバイオロジーアンドセル（Mol. Biol. Cell）、５巻、５１９−５２８頁、１９９４年）がある。
【０２８３】
（ｃ）シアル酸基転移酵素
シアル酸基転移酵素は本発明の組み替え細胞及び反応混合物に利用できる他のタイプの糖転移酵素である。組み替えシアル酸転移酵素生成細胞は又シアル酸基転移酵素用シアル酸供与体であるシチジン一リン酸―シアル酸を生成する。本発明使用に適したシアル酸基転移酵素の例としてはＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（例えばネズミ又はヒトＳＴ３ＧａｌＩＩＩ）、ＳＴ３ＧａｌＩＶ、ＳＴ３ＧａｌＩ，ＳＴ６ＧａｌＩ，ＳＴ３ＧａｌＶ、ＳＴ６ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、ＳＴ６Ｇａ１ＮＡｃＩＩ及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩ（ここで用いたシリアル酸転移酵素命名法は辻等（Tsuji et al.）、グリコバイオロジー（Glyobiology）、６巻、v−xiv、１９９６年に記載されている）がある。α（２，３）シアリル酸基転移酵素（ＥＣ．２．４．９９．６）とする典型的α（２，３）シアル酸基転移酵素はシアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖体又は配糖体の非還元性末端Ｇａｌに転移する。バンデンアインデン等(Van den Eijnden et al. )ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem）.、２５６巻、３１５９頁、１９８１年、ウィンスタイン等（Weinstein et al. ）ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５７巻、１３８４５頁、１９８２年及びウエン等（Wen et al.）、 ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６７巻、２１０１１頁、１９９２年を参照。他の典型的α２，３−シアル酸基転移酵素（ＥＣ２．４．９９．４）はシアル酸を二糖体又は配糖体の非還元性末端Ｇａｌに転移する。レアリック等（Rearick et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５４巻、４４４４頁、１９７９年及びガレスピー等（Gillespie et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６７巻、２１００４頁、１９９２年を参照。更なる典型的酵素としてはＧａｌ−β―１，４−ＧｌｃＮＡｃα―２，６シアル酸基転移酵素がある。（黒沢等（Kurosawa et al.）、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）、２１９巻、３７５−３８１頁、１９９４年を参照）
【０２８４】
好ましくは糖ペプチド炭水化物のグリコシル化ではシアル酸基転移酵素は完全にシアル酸化した炭水化物構造の末端シアル酸の下にある最も共通の最後から２番目の配列、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮａｃ−配列にシアル酸を転移できる。（表４参照）。
表４  受容体基質としてＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列使用のシアル酸基転移酵素
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ウーチー等（Goochee et al.）、バイオ／テクノロジー （Bio/Technology）、９巻、１３４７−１３５５頁、１９９１年。
山本等（Yamamoto et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biochem. ）、１２０巻、１０４−１１０頁、１９９６年。
ギルバート等（Gilbert et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７１巻、２８２７１−２８２７６頁、１９９６年。
【０２８５】
請求の方法で有効なシアル酸基転移酵素の例はＳＴ３ＧａｌＩＩＩで、α（２，３）シアル酸基移転酵素（ＥＣ２．４．９９．６）とも云われる。この酵素はシアル酸をＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配糖体のＧａｌへの転移を触媒し（例えばウエン等（Wen et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem,）、２６７巻、２１０１１頁、１９９２年、バンデンアインデン等（Van den Eijnden et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５６巻、３１５９頁、１９９１年参照）且つ糖ペプチドのアスパラギン連結オリゴ糖のシアル酸化に関与する。シアル酸はＧａｌと連結して二個の糖間でα―結合を形成する。この糖間結合（連結）はＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位間である。この特定酵素はネズミの肝臓（ウインスタイン等（Weinstein et al. ）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５７巻、１３８４５頁、１９８２年）、ヒト相補ＤＮＡ（佐々木等（Sasaki et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６８巻、２２７８２−２２７８７頁、１９９３年、北川及びポールソン（Kitagawa &  Paulsaon）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６９巻、１３９４−１４０１頁、１９９４年）から単離され、ゲノム（北川等（Kitagawa et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７１巻、９３１−９３８頁、１９９６年）ＤＮＡ配列が知られ、組み替え発現によりこの酵素の生成を促進する。好ましい実施形態では請求のシアル酸化法はネズミＳＴ３ＧａｌＩＩＩを用いる。
【０２８６】
本発明で用いる他の典型的シアル酸基転移酵素としてはそのα（２，３）体を含むカンピロバクタージェジュニから単離した物がある。例えばＷＯ９９／４９０５１参照。
【０２８７】
表５に載せた他のシアル酸基転移酵素も又商業的に重要な糖ペプチドのシアル酸化の経済的効率的大量生産に利用できる。これら他酵素の有用性を見いだす簡単な試験として、種々の量の各酵素（１−１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）をアシアローα１酸性糖タンパク（１−１０ｍｇ／ｍｌで）を反応し、興味のシアル酸基転移酵素のボビンＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ又は両シアル酸基転移酵素のいずれかに比して糖ペプチドシアル酸化の有効性を比較する。変わりに他の糖ペプチド、糖ペプチド又はペプチドバックボーンから酵素的に放除されたＮ−連結オリゴ糖をアシアロα１酸性糖タンパクの代わりにこの評価に使用できる。糖ペプチドのＮ−連結オリゴ糖をＳＴ６ＧａｌＩよりより効果的にシアル酸化できるシアル酸基転移酵素はペプチドシアル酸化の実際的大量プロセス（本開示のＳＴ３ＧａｌＩＩＩに示されている）に使用できる。
【０２８８】
（ｄ）ＧａｌＮＡｃ転移酵素
Ｎ−アセチルガラクトサミニル基転移酵素は本発明の実施に、特にＧａｌＮＡｃ成分をペプチドのＯ−連鎖グリコシル化部位のアミノ酸と結合するのに利用できる。適切なＮ−アセチルガラクトサミニル基転移酵素としては限定はされないがα（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニル基転移酵素、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニル基転移酵素（長田等（Nagata et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６７巻、１２０８２−１２０８９頁、１９９２年及びスミス等（Smith et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６９巻、１５１６２頁、１９９４年）及びポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニル基転移酵素（ホーマ等(Homa et al.)、 ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー （J. Biol. Chem.）、２６８巻、１２６０９頁、１９９３年がある。
【０２８９】
遺伝子工学によるクローン遺伝子からの酵素ＧａｌＮＡｃＴＩ−ＸＸの様なタンパク質生成はよく知られている。例えば米国特許４，７６１，３７１参照。一つの方法は十分な試料を収集し、酵素のアミノ酸配列をＮ−末端配列解読により決定する事を含む。この情報をついで昆虫細胞株Ｓｆ９ｃでの発現で完全活性酵素を合成する完全長（膜結合の）転移酵素をコード化する相補ＤＮＡクローンの単離に用る。酵素の受容体特異性を１６個の異なるタンパク質の既知グリコシル化部位周りのアミノ酸半定量的分析を用いて決定し、ついで合成ペプチドの体内グリコシル化を調べる。本研究によりあるアミノ酸残基はグリコシル化ペプチドセグメントで過剰発現し、グリコシル化セリン及びスレオニン周りの特定位の残基が他のアミノ酸成分より受容体効率により著しく影響する事が明になった。
【０２９０】
２．スルホ基転移酵素
本発明は例えばヘパリン、ヘパラン硫酸塩、カラギーナン及び関連化合物のような硫酸化多糖類を含む硫酸化分子含有ペプチド生成法を提供する。適切なスルホ基転移酵素としては例えばコンドロイチンー６−スルホトランスフェラーゼ（福田等(Fukuda et al.) 、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７０巻、１８５７５−１８５８０頁、１９９５年に記載のトリ相補ＤＮＡ，ジェンバンクアクセス番号Ｄ４９９１５）、グリコサアミノグリカンＮ―アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（ディクソン等(Dixon et al.)、ジェノミックス(Genomics)、２６巻、２３９−２４１頁、１９９５年、ＵＬ１８９１８）及びグリコサアミノグリカンＮ―アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２(オレヤーナ等（Orellana et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６９巻、２２７０−２２７６頁、１９９４年及びエリックソン等（Eriksson et al.）ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６９巻、１０４３８−１０４４３頁、１９９４年記載のネズミ相補ＤＮＡ、ジェンバンク登録アクセスＵ２３０４記載のヒト相補ＤＮＡ)がある。
【０２９１】
３．細胞結合糖転移酵素
他の実施形態では本発明法で使用の酵素は細胞結合糖転移酵素がある。多くの可溶性糖転移酵素が知られているが（例えば米国特許５，０３２，５１９参照）、糖転移酵素は通常細胞に付随しているときには膜結合形である。これまで研究された多くの膜結合酵素は固有タンパク質と考えられる。即ちこれらは超音波処理により膜から遊離せず可溶化には洗浄剤が必要である。既に表面糖転移酵素が脊椎動物及び無脊椎動物細胞表面で同定され、これら表面転移酵素は生理条件下で触媒活性を維持する事が確認された。しかし細胞表面糖転移酵素のより認知された機能は細胞間認識である。（ロース(Roth)、細胞レベル以上の現象への分子的手段（Molecular Approaches to Supracellular Phenomena）、１９９０年）。
【０２９２】
細胞による発現糖転移酵素を変える方法が開発された。例えばラーセン等(Larsen et al.)、はプロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８６巻、８２２７−８２３１頁、１９８９年に細胞表面オリゴ糖構造の発現とその同族糖転移酵素を決定するクローン化相補ＤＮＡ配列を単離する遺伝子的手段を報告している。ウリジン二リン酸―ガラクトース発現で知られるネズミ細胞株から単離の伝令ＲＮＡから生成した相補ＤＮＡライブラリー、β―Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチルーＤ−グルコサミニドα―１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをＣＯＳ−１細胞へ形質移入した。形質移入細胞をついで培養しα１，３糖転移酵素活性度を分析した。
【０２９３】
フランシスコ等(Francisco et al.)はプロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８９巻、２７１３−２７１７頁、１９９２年にβ―ラクタム分解酵素の大腸菌外面への固定法を開示した。（i）外膜タンパク質のシグナル配列、(ii)外膜タンパク質の膜スパン部 及び(iii)完全成熟β―ラクタム分解酵素配列からなる三者間融合が起こり活性表面結合β―ラクタム分解酵素分子を生ずる。しかしフランシコの方法は原核細胞系にのみ限られ、著者も認めているように適切な機能化には完全な三者間融合を必要とする。
【０２９４】
４．融合タンパク質
他の実施形態では本発明法は望ましい糖ペプチド複合物合成に関与する一つ以上の酵素活性を持つ融合タンパク質を用いる。融合ペプチドは例えば補助酵素の触媒活性領域と連結した糖転移酵素の触媒活性領域からなる。補助酵素の触媒領域は例えば糖転移酵素用供与体である糖ヌクレオチド形成段階を触媒できるか又は糖転移酵素サイクル関与の反応を触媒できる。例えば糖転移酵素のコード化ポリヌクレチドをインフレームに糖ヌクレオチド合成関与酵素のコード化ポリヌクレチドと連結できる。生成融合タンパク質はついで糖ヌクレオチド合成だけでなく糖成分の受容体分子への転移を触媒する。この融合タンパク質は二個又はそれ以上のサイクル酵素を連結した一個の発現可能ヌクレチド配列であり得る。他の実施形態では融合タンパク質としては二個又はそれ以上の糖転移酵素の触媒活性領域がある。例えば米国特許５．６４１，６６８参照。本発明の修飾糖ペプチドは適切な融合タンパク質を用いて容易に設計、製造できる、（例えば１９９９年６月２４日のＷＯ９９／３１２２４として公告のＰＣＴ特許申請ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０参照）。
【０２９５】
５．固定化酵素
細胞結合酵素に加えて本発明は又固体及び／又は可溶性サポートに固定した酵素の使用も提供する。典型的実施形態では本発明法の無傷グリコシルリンカーによるＰＥＧとの複合化糖転移酵素を供与する。ＰＥＧ―リンカー−酵素複合物は任意に固体サポートと連結する。本発明法での固体サポート酵素使用により反応混合物の仕上げ及び生成物の精製を簡単にし、又酵素が容易にな回収できる。本発明法に糖転移酵素複合物を利用する。酵素をサポートとの他の組み合わせは技術の熟知者には明白である。
【０２９６】
ペプチド複合物の精製
上述プロセスよる生成物は精製なしで使用できる。しかし通常生成物を回収する事が好ましい。薄層又は厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は膜濾過法の様なグリコシル化糖類の標準の既知回収法が使用できる。回収には以下に議論すし且つここに文献として引用するように膜濾過法の使用、より好ましくは逆浸透膜又は一個又はそれ以上のカラムクロマトグラフィー法を用いるのが好ましい。例えば膜の分子量カットオフが約３０００から約１００００である膜濾過法を糖転移酵素の様なタンパク質除去に用いる事ができる。ナノ濾過法や逆浸透法を塩除去に且つ／又は生成物糖類の精製に使用できる。（例えばＷＯ９８／１５５８１参照）。ナノ濾過膜は使用膜に依存するが、一価塩を透過するが約１００ダルトンより大で２，０００ダルトン迄の多価塩と非荷電溶質を保持する逆浸透膜の一種である。従って通常の応用では本発明法による生成糖は膜内に保持され汚染塩は透過する。
【０２９７】
もし修飾糖タンパクが細胞内で生成する場合、第一段階として宿主細胞か溶解断片のいずれかの微粒子残骸を、例えば遠心分離又は限外濾過により除去する。随意にタンパク質を商業的に利用できるタンパク質濃縮フィルターで濃縮し、ついで免疫アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換カラム分別法（例えばジメチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）又はカルボキシメチル基又はスルホプロピル基含有マトリックス上で）、ブルーセファローズ、ＣＭ―ブルーセファローズ、ＭＯＮＯ―Ｑ，ＭＯＮＯ−Ｓ、レンティルレクチン−セファローズ、ＷＧＡ―セファローズ、ＣｏｎＡセファローズ、エーテルトーヨーパール、ブチルトーヨーパール、フェニルトーヨーパール、ＳＰ―セファローズ又はタンパク質Ａセファローズでのクロトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動クロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、等電点電気泳動逆相高速液体クロマトグラフィー（例えば添加脂肪族基付きシリカゲル）、セファデックス分子篩い又はサイズ排除クロマトグラフィーを用いたゲル濾過、ポリペプチドと選択的に結合したカラムでのクロマトグラフィー及びエタノール又は硫酸アンモニウム沈殿法から選んだ一つ又はそれ以上の方法で他不純物をポリペプチド変性物から分離する。
【０２９８】
培養物による生成修飾糖ペプチドは通常細胞、酵素などから最初に抽出により単離し、ついで一回又はそれ以上の濃縮、塩析、水溶性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィー、例えばＳＰセファローズ処理を行う。更に修飾糖タンパクはアフィニティクロマトグラフィーで精製しても良い。高速液体クロマトグラフィーも又一回又はそれ以上の段階で使用できる。
【０２９９】
タンパク質分解を阻害するために、例えば、フッ化メチルスルフォニル（PMSF）等のプロテアーゼ阻害剤を先行のステップのいずれかに含んでよく、抗生物質も外来性汚染物質の成長を阻むために含んでもよい。
【０３００】
他の実施形態内で本発明の修飾糖ペプチド生成系の上澄みを先ず商業的に利用できるタンパク質濃縮フィルター、例えばアミクロンやミリポアペリコン限外濾過装置を用いて濃縮する。濃縮段階に続いて濃縮物を適切な精製充填材に加える。例えば適切な親和性充填材は適切なサポートと結合したペプチド用配位子、レクチン又は抗体分子からなる。代わりに陰イオン交換樹脂を使用でき、例えばペンダントとしてＤＥＡＥ基を持つ充填材又は基質がある。適切な充填材としてはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に通常使用の他のタイプがある。代わりに陽イオン交換法も使用できる。適切な陽イオン交換剤としてはスルホプロピル基又はカルボキシメチル基を持つ種々の不溶性充填材がある。スルホプロピル基は特に好ましい。
【０３０１】
最後に疎水性逆相高速液体クロマトグラフィー媒体、例えばペンダントとしてメチル又は他の脂肪族基を持つシリカゲルを用いた一個又はそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィーをポリペプチド変性物組成の更なる精製に使用できる。前記の精製法の幾つか或いは全てを種々組み合わして均質修飾糖タンパクを得るのに用いる事ができる。
【０３０２】
大規模発酵で生成の本発明の修飾糖ペプチドはウルダール等（Urdal et al.）、ジャーナルオブクロマトグラフィー（J. Chromatog.）、２９６巻、１７１頁、１９８４年に開示の物と類似の方法で精製できる。この文献では分取高速液体クロマトグラフィーでの組み替えヒトＩＬ−２の精製で二回連続の逆相高速液体クロマトグラフィー法を記載している。代わりにアフィニティクロマトグラフィーの様な技法も修飾糖タンパク精製に利用できる。
【０３０３】
上で議論の複合物に加えて本発明はこれら及び他の複合物生成法を提供する。更に本発明は本発明の複合物を病気を広げる危険のある被験者或いは病気を持つ被験者に投与して、病状を防いだり回復したり或いは改善する方法を提供する。
【０３０４】
薬剤組成
本発明の分岐水溶性ポリマーと複合化した治療用成分は広範囲に薬剤的に適用できる。例えば修飾エリスロポエチン（ＥＰＯ）は全身貧血、再生不良性貧血、化学誘導損傷（骨髄の損傷の様な）、慢性腎不全、腎炎及び地中海貧血症の治療に使用できる。修飾ＥＰＯは又脳／脊椎損傷、多発性硬化症及びアルツハイマー病の様な神経疾患の治療にも使用できる。
【０３０５】
第二の例はα―インターフェロン（ＩＦＮ―α）で、エイズ、Ｂ型又はＣ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＢＶ）、コロナウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）及び水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の様な種々のウイルスで起こるウイルス感染、ヘアリー細胞白血病、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、悪性黒色腫、卵胞非ホジキンリンパ腫、陽性フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）、慢性期骨髄性白血病（ＣＭＬ）、腎臓癌、骨髄腫、慢性骨髄性白血病の様な癌、頭部及び首部癌、骨肉腫の様な癌、更には子宮頸部形成異常及び多発性硬化症の様な中枢神経系障害治療に使用できる。更に本発明法による修飾ＩＦＮ―αはシェーグレン症候群（自己免疫疾患）、ベーチェット病（自己免疫性炎症性疾患）、線維筋痛（筋骨格系疼痛／疲労障害）、アフター性潰瘍（アフター性口内炎）、慢性疲労症候群及び肺線維症の様な他疾患と症状の組み合わせの治療に有効である。
【０３０６】
他例としてはβ―インターフェロンで、多発性硬化症（再発／緩解又は慢性進行性の）、ＡＩＤＳ、Ｂ型又はＣ型肝炎の様な中枢神経系障害、ヒトパピローマウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）及び水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の様な種々のウイルスで起こるウイルス感染、耳鼻感染、筋骨格感染更には乳ガン、頭腫瘍、結腸直腸癌、非小細胞肺ガン、頭部及び首部癌、基底細胞癌、子宮頸部形成異常、黒色腫、皮膚癌及び肝臓癌を含む癌の治療に利用できる。本発明法による修飾ＩＦＮ―βは又移植拒絶反応（例えば骨髄移植）、ハンチントン舞踏病、結腸炎、脳炎、肺線維症、黄斑変性症、肝硬変及び角結膜炎の様な他疾患や症状の治療に用いる。
【０３０７】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は更なる例である。本発明法による修飾Ｇ−ＣＳＦは又癌治療用化学療法の補助剤として使用でき、且つある治療法関連の症状や合併症、例えば化学誘導骨髄障害、白血球減少症（全身）、化学誘導熱性好中球減少症、骨髄移植関連好中球減少症及び重症慢性好中球減少症を防ぐか緩和するのに用いる。修飾Ｇ−ＳＣＳＦは又移植、末梢血液細胞動員、骨髄機能廃絶又は骨髄抑制化学療法を受ける患者の収集末梢血液前駆細胞の動員、好中球減少症、発熱、抗生物質使用、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の誘導／強化治療に続く入院期間の減少に使用できる。修飾Ｇ−ＣＳＦで治療できる他症状又は障害としては喘息及びアレルギー性鼻炎がある。
【０３０８】
更なる一例として本発明法による修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）も小人症、子供及び大人の低身長、悪液質／筋肉疲労、全身筋萎縮症及び性染色体異常症（例えばターナー症候群）の様な成長関連症状の治療に使用できる。修飾ｈＧＨを用いて治療の他症状としては短腸症候群、リポジストロフィ、骨粗鬆症、尿毒症、やけど、女性不妊、骨再生、全身糖尿病、ＩＩ型糖尿病、骨関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び不眠症がある。更に修飾ｈＧＨは又種々なプロセス、例えば全身組織再生、骨再生及び傷治癒の促進や又はワクチン補助剤として使用できる。
【０３０９】
ついで他の様態では本発明は薬剤成分を提供する。薬剤成分は薬剤的に容認の希釈剤及び天然に非存在の水溶性ポリマー、治療用成分又は生体分子とグリコシル化又は非グリコシル化ペプチド間での共有結合複合物を含む。ポリマー、治療用成分又は生体分子はその間に割り込んだ無傷グルコシル連鎖基によりペプチドと複合化しペプチドとポリマー、治療用成分又は生体分子の両者と共有結合する。
【０３１０】
本発明の薬剤成分は種々のドラッグデリバリーシステムでの使用に適する。本発明での使用に適した配合はレミントン(Remington)の薬剤科学（Pharaceutical Sciences）、メース出版社（Mace Publishing Company）、フィラデルフィア、ペンシルバニア（PA）、１７版、１９８５年に見られる。ドラッグデリバリー法の短い総説はランガー（Langer）、サイエンス(Science)、２４９巻１５２７−１５３３頁、１９９０年参照。
【０３１１】
薬剤成分はいずれかの適当な投与法、例えば局所、口径、鼻径、静脈、頭蓋内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与で処方できる。皮下注射の様な非口径投与ではキャリヤーは好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス又は緩衝液からなる。経口投与では上記キャリヤーのいずれかか又はマニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、ブドウ糖、サッカロース及び炭酸マグネシウムの様な固体キャリヤーが使用できる。ミクロスフィア（例えばポリラクチドポリグリコール酸塩）の様な生分解性媒体も又本発明の薬剤成分用キャリヤーとして使用できる。適切な生分解性ミクロスフィアは例えば米国特許４，８９７，２６８及び米国特許５，０７５，１０９に開示されている。
【０３１２】
通常薬剤成分は皮下又は非経口、例えば静脈投与で行う。従って本発明は容認キャリヤー、好ましくは水溶性キャリヤー、例えば水、緩衝用水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及び同類中に溶解又は懸濁した化合物を含む非経口投与成分を供与する。この成分は又トゥイーン２０及びトゥイーン８０の様な洗浄剤、マニトール、ソルビトール、サッカロース及びトレハロースの様な安定剤及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びｍ−クレゾールの様な防腐剤を含有できる。この成分はｐＨ調整及び緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、洗浄剤及び同類の様な適切生理条件に必要な薬剤的に容認の補助剤を含有できる。
【０３１３】
これら成分は従来の殺菌法により殺菌か又は減菌濾過できる。生成水溶液はそのまま使用用に包装するか凍結乾燥し、凍結乾燥調合を投与前に殺菌水溶性キャリヤーと一緒にする。調合液のｐＨは通常３と１１の間、より好ましくは５から９、最も好ましくは７と８の間である。
【０３１４】
ある実施形態では本発明の糖ペプチドは標準小胞形成脂質から形成されるリポソームに組み込める。リポソーム生成には種々の方法が利用でき、例えばスゾカ等（Szoka et al.）、アニュアルレビュウオブバイオフィジックアンドバイオエンジニアリング（Ann. Rev. Biophys. Bioeng.）、９巻、４６７頁、米国特許４，２３５，８７１、米国特許４，５０１，７２８及び米国特許４，８３７，０２８に記載されている。種々の標的試薬（例えば本発明のシアル酸ガラクトシド）を用いてリポソームを標的とする事は技術的に知られている。（例えば米国特許４，９５７，７７３及び米国特許４，６０３，０４４参照）。
【０３１５】
標的試薬とリポソームとの結合には標準的方法を用いる事ができる。これらの方法としては通常標的試薬との連結で活性化されたホスファチジルエタノールアミンの様な脂質化合物のリポソームに組み込むか又は本発明の脂質誘導糖ペプチドのような誘導化親油性化合物がある。
【０３１６】
目標化機構には標的成分が標的、例えば細胞表面受容体と相互作用できる様に標的試薬をリポソーム表面に位置する事が通常必要である。本発明の炭水化物を技術の熟練者には既知の方法を用いてリポソームが形成する前に脂質分子と連結できる。（例えば炭水化物にある水酸基を長鎖ハロゲン化アルキルか又は脂肪酸でそれぞれアルキル化か又はアシル化する）。代わりにリポソームを先ずコネクタ部が膜形成時に膜に組み込まれる様に作る。コネクタ部は膜に強固に埋め込まれ且つ固定した親油性部を保有せねばならない。又リポソームの水溶性表面に化学的に利用できる反応部を持たねばならない。この反応部は後で添加の標的試薬又は炭水化物と安定な化学結合を形成するのに化学的に適する様に選択する。ある場合には標的試薬をコネクタ分子と直接結合できるが、大抵の場合化学的な橋として働く第三の分子を用いるのがより適切で、その結果膜内のコネクタ分子を三次元的に小胞表面から離れるように延びた標的試薬又は炭水化物と結合する。
【０３１７】
本発明法で生成の化合物は又診断用薬としても使用できる。例えば標識化化合物は炎症の疑いがある患者の炎症又は腫瘍転移場所を決めるのに使用できる。この用途には化合物は１２５Ｉ、１４Ｃ又はトリチウムで標識化できる。
【０３１８】
以下の例は本発明の化合物及び方法を説明するために提供しているが、請求の発明を制限する物ではない。
【０３１９】
以下の命名法を実施例１−３で用いる。第一次ＰＥＧサブユニットは四個のエチレングリコール単位からなる。この分子は分子量１９４であるが図では端数を２００に切り上げる。以下の命名法を第一次ＰＥＧサブユニット表現に用いる。
2006523211.tif 000048
【０３２０】
第一次ＰＥＧサブユニットの組み合わせは代わりに以下に示すように官能化末端間を示す端数切り上げ分子量で書くこともできる。
2006523211.tif 000049
【０３２１】
以下の命名法をモノ官能化メトキシＰＥＧサブユニットを表すのに用いる。
2006523211.tif 000050
【実施例１】
【０３２２】
単分散ＰＥＧ及びその活性体の生成
単分散或いは単一分子量ＰＥＧは以下に示すように合成する。生成断片のサイズを調整する事でいかなるサイズのＰＥＧも合成できる。ジオールはついでアルキル化により一端を停止し、タンパク質、糖、脂質又はヌクレオチドの様な生体成分との複合化用に活性化する。
【０３２３】
脱離基を以下に示すように活性化第一次ＰＥＧを創生するため第一次ＰＥＧサブユニットに連結する。この反応でＱは本発明の化学と適合するいかなる脱離基であっても良い。典型的脱離基としてはハロゲン化物、トリフルオロエタンスルホン酸塩、トシレート及びめメシラートがある。
2006523211.tif 000051
【０３２４】
活性化第一次ＰＥＧ創生後化合物を以下に示す第一次ＰＥＧサブユニットと反応する。生成物は第一世代ＰＥＧ拡張である。
2006523211.tif 000052
【０３２５】
第二世代ＰＥＧ拡張は第一世代と同様の方法で創生する。
2006523211.tif 000053
【０３２６】
第三世代ＰＥＧ拡張は以下のように創生する。
2006523211.tif 000054
【０３２７】
第四世代ＰＥＧ拡張は以下のように創生する。
2006523211.tif 000055
【０３２８】
ＰＥＧ拡張プロセスは一官能性成分を二官能性化合物の一つと反応して停止する。この反応では一官能性成分は本発明の化学と整合性あるいかなる基でも良い。典型的停止基としてはアルコキシＰＥＧ及びアルキルがある。
【０３２９】
以下の典型的実施形態では脱離基をメトキシＰＥＧサブユニットに加える。この分子をついで第四世代ＰＥＧ延長と反応する。
2006523211.tif 000056
【０３３０】
他の典型的実施形態ではメチルサブユニットを第四世代ＰＥＧ延長に加える。
2006523211.tif 000057
【０３３１】
一端を停止後ＰＥＧ拡張部の他端を下に示す様に生体複合化のために活性化する。この反応でＸはエステル形成可能ないかなる脱離基でもよい。記号Ｘはイミダゾリール、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、ＮＨＳ及びｐ−ニトロフェニルエステルから独立に選ぶ。
2006523211.tif 000058
【０３３２】
最後にＰＥＧ拡張分子は以下に示すように生体成分と複合化する。
2006523211.tif 000059
タンパク質 糖類 脂質 ヌクレオチド
【実施例２】
【０３３３】
活性化単分散ＰＥＧは反応する拡張分子と同数のＰＥＧサブユニットである必要はない。典型的実施形態では活性化単分散ＰＥＧは反応する拡張分子より多数のＰＥＧサブユニットを有する。以下に示す他の典型的実施形態では活性化単分散ＰＥＧは反応する拡張分子より少数のＰＥＧサブユニットを有する。
2006523211.tif 000060
【０３３４】
これら分子の停止プロセスは実施例１に記載のプロセスと同様である。
2006523211.tif 000061
【実施例３】
【０３３５】
過剰の活性化ＰＥＧサブユニットを加えて下に示すような単分散ＰＥＧを創生できる。
2006523211.tif 000062
ｎは１−１００又は１−２０，０００のいずれかで原料に依存する。
【０３３６】
反応試薬、使用塩基、温度、溶剤及び濃度を変えることにより望ましい主サイズ（ｎ）を生成する様に反応を調整できる。
【０３３７】
この手段によりいかなるサイズの単分散ＰＥＧを生成する簡単、迅速、有効な手段が得られる。この手段により単分散ＰＥＧのサイズ（及びそれ故物理化学的特性）の差のため精製が簡単になる。これによりシリカゲル、逆相セルロース、膜濾過（ナノ濾過及び限外濾過）の様な簡単な標準精製法が使用できる。ついで精製ＰＥＧを望ましいいかなる官能形に誘導化する。
【実施例４】
【０３３８】
アルコキシＰＥＧの生成
以下に示す一般的手段をアルコキシＰＥＧ又は他の単官能化ＰＥＧを生成に用いる。
【０３３９】
第一実施形態では活性化二官能化ＰＥＧ分子を以下に示すように創生する。
2006523211.tif 000063
ここで記号ｎは１と１００，０００の間の数を表す。記号Ｑは本発明の化学と整合するいずれかの脱離基を表す。典型的脱離基としてはハロゲン化物、トリフルオロエタンスルホン酸塩、トシレート及びメシラートがある。記号Ｘはこの脱離基と整合するいずれかの対イオンを表す。
【０３４０】
活性化二官能化ＰＥＧ分子を下に示すようにＰＥＧ分子長さを延長するために用いる。
2006523211.tif 000064
ここで記号ｍは１と１００，０００の間の数を表す。
【０３４１】
第二実施形態では一官能化ＰＥＧを拡張しついで下に示す様に生体成分との複合化に用いる様に活性化する。
【０３４２】
第一段で一官能化ＰＥＧをトシル化する。
2006523211.tif 000065
ここでｎは１と１００，０００の間の数を表す。
【０３４３】
第二段階で一官能化ＰＥＧを拡張する。
2006523211.tif 000066
ここで記号ｍは１と１００，０００の間の数を表す。
【０３４４】
最終段階で拡張一官能化ＰＥＧ化合物を下に示すように生体成分と複合化するよう活性化する。
2006523211.tif 000067
【実施例５】
【０３４５】
二触覚を有するポリマー合成用追加成分と方法
2006523211.tif 000068
本発明の追加の二触角を持つ構造は以下の一般式を有する。
ここで記号Ｘは水酸基、水素原子、Ｑ（活性化基）及びタンパク質、糖、脂質又はヌクレオチドの様な生体分子を表す。記号ｎは１と１０の間の数を表す。用語 "ポリマー "はＰＥＧ、ｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、ＰＰＧ（ポロプロピレングリコール）、ｍＰＰＧ、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、ポリ乳酸塩及びポリシアル酸である。
【０３４６】
典型的実施形態では二触角を持つ構造は下式を有する。
2006523211.tif 000069
ここで記号ｍ及びoは独立に１と１０，０００の間の数を表す。記号Ｘは水酸基、水素原子、Ｑ（活性化基）及びタンパク質、糖、脂質又はヌクレオチドの様な生体分子を表す。
【０３４７】
他の実施形態では二触角を持つ構造は下式を有する。
2006523211.tif 000070
ここで記号a及びｂは独立に１と２４の間の数を表す。記号ｍ及びoは独立に１と１０，０００の間の数を表す。記号Ｘは水酸基、水素原子、Ｑ（活性化基）及びタンパク質、糖、脂質又はヌクレオチドの様な生体分子を表す。
【０３４８】
本発明は特定実施形態を参照して開示したが、本発明のその他実施形態及び変形が本発明の真の精神と範囲を離脱しない限り技術の熟練者により工夫できることは明白である。
【０３４９】
この応用で記載の全特許、特許の応用及び他の出版物は全体に文献として含む。