【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年9月14日(2011.9.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
変性段階と複製段階は必要により数回繰り返される。この場合、ポリメラーゼは各サイクル中に多くの酵素を添加する必要を避けるために熱安定であることが好ましい。反応の終わりに、混合物中に存在するDNA分子はいくつかの種類がある。
効果的に複製されなかった最初の二本鎖鋳型；および、
複製されたいくつかの分子、即ち、これらはもとの鎖と変異オリゴヌクレオチドによって構成される1以上のプライマーから新たに合成された鎖を含有している。
得られた混合物は、DpnI酵素又は2本の鎖上でメチル化されたDNA分子を抑制するとともにメチル化されていないDNA分子又は半メチル化されたDNA分子を維持することを可能にする他の制限酵素による消化に供される。
コンピテント細菌を上記混合物で形質転換し、次にプラスミドが取り込まれた細菌を選択するために選択薬剤を含有する培地上に拡散させる。完全な環状プラスミドの存在が選択培地中の細菌の生存に不可欠であるために、前の段階で切断されたDNA分子は除去される。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
本発明は、特異的変異導入とランダム変異導入との間の中間の手法である。単純な特異的変異導入における例のように、反応の終わりに1つ以上の所望の変異を含む単一産物を得ることを目的とせず、それぞれが1つ以上の所望の変異を含む分子の混合物を得ることを目的とする。本発明は、ランダム変異導入における例のように、任意の置換ではなく一定の位置に特定の予め決められたタイプの置換を導入する方法である。
従って、本方法は、特異的変異導入の利点（与えられた所定の位置に得られる変異の性質を制御する）とランダム変異導入の利点（多くの異なる変異が変異すべきDNA断片の多くの位置に配分されることを達成する）を合わせたものである。本発明は非常に短時間で多くの特異的変異導入を行うことを可能にするものである。
これらの目的は、標的遺伝子の変異導入方法であって、該標的遺伝子の少なくとも1つの領域に実質的に相補的な配列をもつNオリゴヌクレオチドのプールを調製する工程と、前記オリゴヌクレオチドのプールと前記標的遺伝子とを少なくとも1つの変異を保有する該標的遺伝子のコピーを作製することができる条件下で反応させる工程とを含む前記方法による本発明に従って得られる。標的遺伝子は、二本鎖環状プラスミドによって保有されている。各オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の異なる領域に相補的な配列とオリゴヌクレオチド配列の中央に少なくとも1つの変異を有する。Ｎが5より大きいプールの前記Nオリゴヌクレオチドの全体は、前記標的遺伝子の配列の一部又は全部を包含している。次に前記オリゴヌクレオチドのプールとポリメラーゼの存在下に標的遺伝子と反応させて変異遺伝子のライブラリーを作成し、単一オリゴヌクレオチドからのそれぞれの変異が平均してライブラリー中の遺伝子の1/5未満に存在している。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
本発明の変異導入方法は、また、変異遺伝子のライブラリーに適用することができる。そのライブラリーは、標的遺伝子の代わりに鋳型として用いられる。変異標的遺伝子の少なくとも1つの領域に実質的に相補的な配列をもつNオリゴヌクレオチドのプールを調製し、次に前記オリゴヌクレオチドプールと変異標的遺伝子とを少なくとも1つの変異を保有する変異標的遺伝子のコピーを作製することができる条件下で反応させる。変異標的遺伝子は二本鎖環状プラスミドによって保有され、各オリゴヌクレオチドは変異標的遺伝子の異なる領域に相補的な配列とオリゴヌクレオチド配列の中央に少なくとも1つの変異とを有し、Ｎが5より大きいプールの前記Nオリゴヌクレオチドの全体が前記変異標的遺伝子の配列の全部又は一部を包含している。前記オリゴヌクレオチドのプールと変異標的遺伝子とをポリメラーゼの存在下に反応させて変異遺伝子のライブラリーを作成し、単一のオリゴヌクレオチド由来のそれぞれの変異が平均して該ライブラリー中の該遺伝子の1/5未満に存在している。
本発明の方法の他の適用においては、鋳型として用いられる変異標的遺伝子のライブラリーはまず大量変異導入によって得られる。1分子当たりの変異の平均数は、大量変異導入が行われるサイクル数とともに増加する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
本発明の目的は、更に、上で定義した標的遺伝子又は変異標的遺伝子のライブラリーと関係のある変異オリゴヌクレオチドのプールである。
本発明の目的は、更に、上記方法によって得ることができる変異遺伝子のライブラリーであって、それぞれの異なる変異が平均してライブラリー中の遺伝子の1/5未満、好ましくは平均してライブラリー中の遺伝子の約1/Ｎに存在し、Ｎは5より大きい、好ましくは5〜106、更に好ましくは50〜500であることを特徴とする、前記ライブラリーである。このライブラリーは、本発明に従ってＮがより大きい、好ましくは5〜106、更に好ましくは50〜500であるＮオリゴヌクレオチドを用いることにより得られる。
本発明の他の利点や特徴は、下記の非限定的実施例と、添付の図面から明らかであろう。
図1は、CD4分子配列に対する変異オリゴヌクレオチドの分布を示す図である。オリゴヌクレオチドのそれぞれは、中央に位置する矢印の線の中断によって示される、コドンをアラニンに変換するために、最大3つの変異を含んでいる。オリゴヌクレオチドは相互にオーバーラップし、明瞭にするために3つのレベルで示されている。図1の例では、24の変異オリゴヌクレオチドだけが示されている。下記実施例1においては、95個のオリゴヌクレオチドを同時に用いた。この例では、変異を保有するオリゴヌクレオチドすべてが同じ向きである。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  標的遺伝子の少なくとも1つの領域に相補的な配列をもつＮ個のオリゴヌクレオチドのプールを調製すること、前記オリゴヌクレオチドのプールと前記標的遺伝子とを、少なくとも1つの変異を保有する前記標的遺伝子のコピーの生成を可能にする条件下で反応させること、とを含む標的遺伝子への変異導入方法であって、前記標的遺伝子が二本鎖環状プラスミドによって保有され、各オリゴヌクレオチドは前記標的遺伝子の異なる領域に相補的な配列と前記各オリゴヌクレオチド配列の中央に少なくとも1つの変異を有し、前記プールの前記N個（Nは5より大きい）のオリゴヌクレオチドが全体として前記標的遺伝子の配列の全部又は一部を包含し、前記オリゴヌクレオチドのプールと前記標的遺伝子とをポリメラーゼの存在下に反応させて変異遺伝子のライブラリーを作成し、異なるオリゴヌクレオチド由来のそれぞれの変異が平均して前記ライブラリー中の前記遺伝子の1/5未満に存在している、前記方法。
【請求項２】  標的遺伝子の少なくとも1つの領域に実質的に相補的な配列をもつN個のオリゴヌクレオチドのプールを調製することと、前記オリゴヌクレオチドのプールと前記標的遺伝子とを、少なくとも1つの変異を保有する前記標的遺伝子のコピーの生成を可能にする条件下で反応させること、とを含む標的遺伝子のライブラリーへの変異導入方法であって、前記標的遺伝子が二本鎖環状プラスミドによって保有され、各オリゴヌクレオチドは前記標的遺伝子の異なる領域に相補的な配列と前記各オリゴヌクレオチド配列の中央に少なくとも1つの変異をもち、前記プールの前記Ｎ個の（Ｎは5より大きい）オリゴヌクレオチドの全体が前記標的遺伝子の配列の全部又は一部を包含し、前記オリゴヌクレオチドのプールと前記標的遺伝子とをポリメラーゼの存在下に反応させて変異遺伝子のライブラリーを作成し、異なるオリゴヌクレオチド由来のそれぞれの変異が平均して前記ライブラリー中の遺伝子の1/5未満に存在していることを特徴とする、前記方法。
【請求項３】  変異遺伝子のライブラリーが請求項1記載の方法に従って得られる、請求項2記載の方法。
【請求項４】  下記工程を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法:
a) 標的遺伝子又は標的遺伝子のライブラリー、および、抵抗性遺伝子を含むプラスミドとからなる鋳型を調製する工程と、
b) 前記標的遺伝子又は前記標的遺伝子のライブラリーの異なる領域に相補的な配列を有し、中央に少なくとも1つの変異を有するオリゴヌクレオチドの等モルプールを調製する工程であって、前記プール中のオリゴヌクレオチドの組全体が前記標的遺伝子の配列の全部又は一部を包含している前記工程と、
c) 工程(b)で調製されたオリゴヌクレオチドのプールと工程(a)のプラスミドとを、各オリゴヌクレオチドと前記プラスミドとのモル比が0.01〜100であるように混合する工程と、
d) 工程(c)の混合物を加熱により変性して一本鎖の鋳型を得る工程と、
e) 工程(d)の混合物を、前記オリゴヌクレオチドが前記鋳型に対してハイブリダイゼーションできる温度に供する工程と、
f) 少なくとも1つのポリメラーゼと、そのバッファーと、補助因子と、前記オリゴヌクレオチドのいずれかから前記鋳型の鎖を複製することができる十分量の各ヌクレオチド三リン酸とを前記混合物に添加する工程と、
g) 工程(d)、(e)、(f)を繰り返す工程と、
h)工程(f)又は(g)の複製産物を選択する工程と、
i) コンピテント細菌を工程(h)で選択した産物で形質転換し、プラスミドを含んでいる細菌を工程(a)のプラスミドに保持された前記抵抗遺伝子に対応する選択培地上で選択する工程。
【請求項５】  工程(h)が、鋳型からの複製を経た産物を区別するため、メチル化DNAと非メチル化DNAを区別する制限酵素の作用に工程(f)の産物を供することを含むことを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】  標的タンパク質又は標的タンパク質のライブラリーの変異導入方法であって、請求項１〜５のいずれか1項に従って前記タンパク質をコードしている標的遺伝子から変異遺伝子の発現ライブラリーを調製することと、前記変異遺伝子を発現させて変異遺伝子のライブラリーを作製することと、前記変異タンパク質について標的タンパク質に関係した所望の機能をスクリーニングすること、とを含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項７】  非変異タンパク質と比べて改変された活性を示す変異タンパク質、又は前記変異タンパク質に対応する変異遺伝子の選択方法であって、請求項６記載の変異導入方法を含み、変異タンパク質について標的タンパク質に関係した所望の機能をスクリーニングした後、前記所望の機能を示す前記変異タンパク質を選択し、前記変異タンパク質に対応する該変異遺伝子の配列を決定することを特徴とする、前記方法。
【請求項８】  請求項６記載の標的タンパク質又は標的タンパク質のライブラリーの変異導入方法、又は請求項７記載の変異タンパク質又はその対応する遺伝子の選択方法であって、請求項４または５に記載の前記タンパク質をコードしている標的遺伝子から変異遺伝子の発現ライブラリーを調製する工程と、更に下記工程を含む前記方法:
j) 選択培地を適切な温度で個々の細菌コロニーが増殖するのに十分な時間インキュベートする工程と、
k) 工程(j)のコロニーからの細菌の個々の培養物を接種する工程と、
l) 工程(k)の該培養物からプラスミドDNAの調製物を調製する工程と、
m) 工程(l)からのプラスミドDNAの各調製物に関連した生物活性を測定し、結果を非変異プラスミドDNAを用いて得られる結果と比較する工程と、
n) 生物活性の著しい改変を示した前記プラスミドDNA調製物の配列を決定する工程。