【手続補正書】
【提出日】平成23年10月12日(2011.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
開示する実施形態の概要
本発明者らは、製造規模で連鎖球菌属から莢膜多糖（ｃｐ）を生産するための方法を提供することにより、発酵プロトコルの単純化のための必要性を満たした。一部の特定の実施形態において、炭素源の線形添加時のｐＨ平衡化のためのアルゴリズムが排除され、他の実施形態では、培地の不必要な成分が除外された。連鎖球菌属の好ましい種はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅであり、これは、ランスフィールドのＢ群連鎖球菌属またはＧＢＳ、特に、菌株０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、もしくはＭ７８１とも称される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）ｃｐを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備すること、および（ｂ）該菌株を発酵によって培養することを含み、前記培養は、培養培地への炭素源の線形添加を含み、該培養培地のｐＨをモニタリングすることにより該培養を制御するためのアルゴリズムを使用しない、製造規模での莢膜多糖（ｃｐ）の生産のための連鎖球菌属の培養方法。
（項目２）
さらに、莢膜多糖を回収する工程（ｃ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記連鎖球菌属菌株が、さらにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅを含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株が０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、またはＭ７８１である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記播種材料の光学密度（ＯＤ）が約０．６と約１．８の間である、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記培養培地のｐＨが約６．０と約７．５の間である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記ｐＨが約７．３である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記培養培地の温度が約３４℃と約３８℃の間である、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記温度が約３６℃である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記炭素源が、さらにグルコースを含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記培養が、さらに、ＯＤが指定レベルに達したら前記炭素源の線形添加が開始されるように培養培地のＯＤをモニタリングすることを含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記指定レベルが、ｃｐの高容積生産が達成されるように選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記指定レベルが約９．８と約１０．２の間である、項目１１または項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記指定レベルが約１０である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記培養が、さらに、ＯＤが第１および第２の即時添加レベルに達したら、前記炭素源の線形添加の前に酵母抽出物の２回の即時添加が開始されるように培養培地のＯＤをモニタリングすることを含む、項目１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記第１および第２の即時添加レベルが、ｃｐの高容積生産が達成されるように選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第１の即時添加レベルが約２．８と約３．２の間である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の即時添加レベルが約３．０である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第２の即時添加レベルが約４．３と約４．７の間である、項目１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記第２の即時添加レベルが約４．５である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記培養培地が、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む規定培地であり、前記ビタミン源が以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記培養培地が、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む複合培地であり、前記ビタミン源が以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
連鎖球菌属菌株、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、培養培地。
（項目２４）
前記連鎖球菌属がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅである、項目２３に記載の培養培地。
（項目２５）
前記リン酸源が、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、またはＮａＣｌからなる、項目２３または項目２４に記載の培養培地。
（項目２６）
前記炭素源がグルコースである、項目２３〜２５のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目２７）
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの６種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目２８）
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの５種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目２９）
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの４種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３０）
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの３種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３１）
前記ビタミン源がパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３２）
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１９種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３３）
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１８種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３４）
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１７種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
（項目３５）
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１６種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目２３〜３１いずれか１項に記載の培養培地。
（項目３６）
前記アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる、項目２３〜３１いずれか１項に記載の培養培地。
（項目３７）
連鎖球菌属菌株、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、培養培地。
（項目３８）
前記連鎖球菌属がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅである、項目３７に記載の培養培地。
（項目３９）
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、項目３７または項目３８に記載の培養培地。
（項目４０）
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される３種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、項目３７または項目３８に記載の培養培地。
（項目４１）
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される２種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、項目３７または項目３８に記載の培養培地。
（項目４２）
前記ビタミン源がビオチンからなる、項目３７または項目３８に記載の培養培地。
（項目４３）
付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅから莢膜多糖を精製するための方法。
（項目４４）
前記莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、項目４３または項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、項目４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
付着性フィルターを用いた濾過工程の前に、以下の工程：
（ｉ）夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿；ならびに
（ｉｉ）ダイアフィルトレーション
を行なう、項目４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
付着性フィルターを用いた濾過工程の後に、以下の工程：
（ｉｖ）再−Ｎ−アセチル化；
（ｖ）ダイアフィルトレーション
を行なう、項目４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
（ａ）莢膜多糖を含む粗製分離物を準備すること；
（ｂ）該粗製分離物をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出すこと；
（ｃ）莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過すること；および
（ｄ）タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を生成すること
を含む、精製莢膜多糖の生産方法。
（項目５０）
さらに、前記精製莢膜多糖を再−Ｎ−アセチル化する工程（ｅ）を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
さらに、前記精製莢膜多糖を沈殿させる工程（ｆ）を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
さらに、前記莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程（ｇ）を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
工程（ｂ）が、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度までアルコール溶液を添加することを含む、項目４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記アルコール溶液がエタノールを含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記アルコール溶液が、さらにＣａＣｌ２を含む、項目５３または項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記アルコール溶液が約１０％と約５０％の間のエタノール濃度まで添加される、項目５４または項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記アルコール溶液が約３０％のエタノール濃度まで添加される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記タンパク質付着性フィルターが活性炭フィルターである、項目４９〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅから莢膜多糖を精製するための方法であって、該方法は、該莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、方法。
【請求項２】
前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記カーボンフィルターは、マトリックス内に固定化された活性炭を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
付着性フィルターを用いた前記濾過工程の前に、以下の工程：
（ｉ）夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿；ならびに
（ｉｉ）ダイアフィルトレーション
を行なう、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ダイアフィルトレーションが、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２サイクルのタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行われ、最初のダイアフィルトレーションサイクルと２回目のダイアフィルトレーションサイクルとの間に、該最初のダイアフィルトレーションサイクルの保持液が、酢酸／酢酸ナトリウム溶液で処理される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
付着性フィルターを用いた前記濾過工程の後に、以下の工程：
（ｉｖ）再−Ｎ−アセチル化；および
（ｖ）ダイアフィルトレーション
を行なう、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ダイアフィルトレーションが、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
２サイクルのタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行われ、最初のダイアフィルトレーションサイクルと２回目のダイアフィルトレーションサイクルとの間に、該最初のダイアフィルトレーションサイクルの保持液が、酢酸／酢酸ナトリウム溶液で処理される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅは、血清型１ａ、１ｂ、３、４または５から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
付着性フィルターを用いた前記濾過の後に、０．４５／０．２μｍフィルターを用いたさらなる濾過が行なわれる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖が、担体タンパク質にコンジュゲートされている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、またはジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異型である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンジュゲートされたものは、薬学的に許容され得る担体と組み合わせられる、請求項１３または１４に記載の方法。