【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年11月30日(2010.11.30)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新脈管形成を促進するための組成物であって、被験体において新脈管形成を促進するために有効な量の、ポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログを含み、該甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログは、レボサイロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、または３，５−ジヨードサイロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）からなる群より選択され、該ポリマーは、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、アガロース、ポリグリコリド、ポリラクチドおよびこれらの共重合体からなる群より選択され、ここで、該ポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログは、細胞膜レベルで作用し、そして、核の甲状腺ホルモン受容体の影響から独立した新脈管形成促進特性を有する、組成物。
【請求項２】
前記組成物は、非経口投与、経口投与、経直腸投与、局所投与、またはこれらの組み合わせに適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記非経口投与が、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、またはこれらの組み合わせである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログが、２００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログが、カテーテルを介して投与されるのに適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログが、前記カテーテルを介して血管の内側に適用される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログが、増殖因子、血管拡張薬、抗血液凝固薬、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１以上の化合物と共に同時投与されるのに適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記増殖因子が、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、上皮増殖因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、および血管透過性因子からなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記血管拡張薬が、アデノシン、アデノシン誘導体、またはこれらの組み合わせである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗血液凝固薬が、ヘパリン、ヘパリン誘導体、抗第Ｘａ因子、抗トロンビン、アスピリン、クロピドグレル、またはこれらの組み合わせである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログが、前記増殖因子、血管拡張薬、抗血液凝固薬、もしくはこれらの組み合わせを投与する前または後に、ボーラス注入として投与されるのに適している、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
医療用デバイスに沿ってか、または医療用デバイスの周りでの新脈管形成を促進するための組成物であって、ポリマーに結合体化された一定量の甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログを含み、該甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログは、レボサイロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、または３，５−ジヨードサイロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）からなる群より選択され、該ポリマーはポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、アガロース、ポリグリコリド、ポリラクチドおよびこれらの共重合体からなる群より選択され、ここで、該ポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンアナログは、細胞膜レベルで作用し、そして、核の甲状腺ホルモン受容体の影響から独立した新脈管形成促進特性を有し、該組成物は、該デバイスを患者に挿入する前に、該デバイスをコーティングすることを特徴とする、組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、増殖因子、血管拡張薬、抗血液凝固薬、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記医療用デバイスが、ステント、カテーテル、カニューレ、または電極である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
新脈管形成を阻害するための組成物であって、被験体において新脈管形成を阻害するのに有効な量の抗新脈管形成剤を含み、ここで、該抗新脈管形成剤は、テトラヨードサイロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードサイロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）またはこれらの組み合わせであり、かつ、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、アガロース、ポリグリコリド、ポリラクチドおよびこれらの共重合体からなる群より選択されるポリマーに結合体化され、ここで、該抗新脈管形成剤は、細胞膜レベルで作用して新脈管形成促進因子を阻害する、組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、非経口投与、経口投与、経直腸投与、局所投与、またはこれらの組み合わせに適している、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗新脈管形成剤が、１以上の他の抗新脈管形成治療または化学治療剤と共に同時投与されるのに適している、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
共有結合を介してポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたはそのアナログを含む、新脈管形成剤または抗新脈管形成剤であって、該新脈管形成剤または抗新脈管形成剤は、インテグリンαｖβ３上の甲状腺ホルモンの細胞表面受容体に結合し、ここで、該甲状腺ホルモンまたはそのアナログが、レボサイロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、３，５−ジヨードサイロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）、テトラヨードサイロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードサイロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）および図２０の表Ａ−Ｄに列挙される化合物からなる群より選択され、ここで、該ポリマーは、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、アガロース、ポリグリコリド、ポリラクチドまたはこれらの共重合体からなる群より選択され、そして、該新脈管形成剤が細胞膜レベルで作用し、かつ、核の甲状腺ホルモン受容体の影響から独立した新脈管形成促進特性を有するか、または、該抗新脈管形成剤が細胞膜レベルで作用して新脈管形成促進因子を阻害する、新脈管形成剤または抗新脈管形成剤。
【請求項１９】
前記アナログが、テトラヨードサイロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）またはトリヨードサイロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）である、請求項１８に記載の抗新脈管形成剤。
【請求項２０】
前記甲状腺ホルモンまたはそのアナログが、レボサイロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、または３，５−ジヨードサイロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）である、請求項１８に記載の新脈管形成剤。
【請求項２１】
薬学的に受容可能なキャリア中に請求項１８に記載の新脈管形成剤または抗新脈管形成剤を含む、薬学的処方物。
【請求項２２】
１以上の薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項２１に記載の薬学的処方物。
【請求項２３】
前記ポリマーに結合体化された甲状腺ホルモンまたはそのアナログが、２００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項２１に記載の薬学的処方物。
【請求項２４】
前記処方物が、非経口、経口、経直腸、もしくは局所の投与様式、またはこれらの組み合わせを有する、請求項２１に記載の薬学的処方物。
【請求項２５】
前記処方物が、増殖因子、血管拡張薬、抗血液凝固薬、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１以上の化合物と共に、これらを必要としている被験体に同時投与される、請求項２１に記載の薬学的処方物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】甲状腺ホルモンアナログおよび新脈管形成における使用の方法
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ並びに誘導体、及びこれらの重合形態物に関係する。また、当該化合物を使用する方法並びにこれを含有する薬学的組成物を開示する。また、本発明は当該化合物を調製する方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
甲状腺ホルモン、Ｌ−サイロキシン（Ｔ４）並びにＬ−トリヨードサイロニン（Ｔ３）は、脊椎動物の様々な組織にて、多数の、様々な生理学的過程を調節している。甲状腺ホルモンの作用の大部分は、リガンド活性化転写調節因子から成る核受容体スーパーファミリーの一員である甲状腺ホルモン受容体（「ＴＲ」）によって媒介される。ステロイドホルモン並びにレチノイド、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に対する受容体も、このスーパーファミリーに含まれる。これらの受容体は様々な組織において特定の遺伝子の発現を調節することができる転写因子であり、エストロゲン受容体部分拮抗薬であるタモキシフェン等、広く使用されている薬剤の標的となっている。ＴＲα並びにＴＲβという２種類のＴＲをコードする２つの異なる遺伝子がある。これら２つのＴＲはしばしば、別々の組織にて異なる濃度で共発現する。大半の甲状腺ホルモンはこの２つのＴＲを判別せず、同じ親和性で双方に結合する。
【０００３】
マウスの遺伝子ノックアウト実験によって、ＴＲβが聴覚系の発生、及び脳下垂体内のＴ３による甲状腺刺激ホルモンの負のフィードバックにおいて役割を担っており、一方ＴＲαは熱発生及び心臓血管系にて甲状腺ホルモンの効果を調整していることが示されている。ＴＲ拮抗薬の同定は、将来、甲状腺機能低下症の治療において重要な役割を果たすことができると考えられる。当該分子は、受容体レベルで甲状腺ホルモンの効果に直接拮抗することによって迅速に作用し、甲状腺機能低下症を有して、手術を必要とする者、あるいは心臓疾患を有する者、命に係わる甲状腺中毒急性発作症状のリスク状態にある者、に著しい改善がみられると考えられる。
【０００４】
このように、医学的治療のために有用であることが立証されることとなる、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）のイソ型選択的作動薬あるいは拮抗薬として機能することによって甲状腺ホルモンの作用を選択的に調節する化合物の開発は、依然必要とされている。最近の研究開発は、効果が期待される治療薬並びに化学的なプローブとして、甲状腺ホルモン（Ｔ３／Ｔ４）拮抗薬を設計及び合成することに焦点が当てられている。また、天然のホルモンよりも入手しやすく、潜在的に有用な受容体結合特性及び活性化特性を有する甲状腺ホルモン擬似化合物の開発も必要とされている。
【０００５】
アメリカ合衆国では５００万人が慢性安定狭心症であると試算されている。毎年２００，０００人が６５歳未満で「早発性虚血性心臓疾患」と称されるもので死亡している。医学的処置にも係わらず多数の人が心筋梗塞となり、経皮経管冠動脈形成術もしくは冠動脈バイパス手術を用いる血管再生術の必要性が高まる衰弱症状を被っている。心筋虚血を回復する一つの方法は冠動脈の側副循環を高めることであろうと仮説が立てられている。
【０００６】
心筋梗塞急性期における冠動脈内血栓溶解治療時に見られる冠動脈側副血管の解剖学的外観と、クレアチンキナーゼ時間活性曲線並びに梗塞部分の大きさ、動脈瘤形成との間の関連性が確立されている。これらの研究は冠動脈閉塞疾患を有する心臓における側副血管の防御的役割を示し、側副血管が見られなかった患者と比較して、梗塞部の縮小且つ動脈瘤形成の減少、及び心室機能の改善がみられた。心筋細胞が梗塞されると、内皮細胞及び平滑筋細胞のＤＮＡ複製と有糸分裂を伴う増殖によって側副血管が活発に発生する。一旦虚血状態が発生すると、これらの因子が活性化されて受容体を占有できるようになり、外性ヘパリンに曝露すると新脈管形成が始まる場合がある。残念ながら、ほぼ全ての冠動脈疾患の患者において、新脈管形成が発生する「自然の」作用は、虚血状態を回復させるのには不十分である。
【０００７】
虚血状態の間、ＡＴＰの分解を介してアデノシンが放出される。アデノシンは多数の心臓を保護する生物学的現象に関係している。アデノシンは、徐脈並びに血管拡張等の血流動態の変化において役割を担っており、またアデノシンは、プレコンディショニング並びにおそらくは再潅流障害の縮小等、関連性のない現象で役割を担っていることが示唆されている（非特許文献１）。
【０００８】
新脈管形成とは先に存在する血管から新たな血管が発生することである（非特許文献２）。生理学的には、新脈管形成は成熟した生物体の正確な発育の確保、並びに卵子着床に対する子宮の準備、傷が治癒する際の基本的な役割の遂行を行う。胚発生中の血管網の発達、あるいは正常及び病理的な新脈管形成は、成長因子及び細胞外マトリックスとの細胞性相互作用に依存する（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。血管は胚発生の過程で、脈管形成と新脈管形成という二つの経路によって生じる（非特許文献６）。新脈管形成は、新脈管形成促進因子と抗新脈管形成因子とのバランスによって制御される多段階過程である。この過程の後半段階では、内皮細胞（ＥＣ）の増殖と管様構造への組織化とが含まれる。ＦＤＦ２並びにＶＥＧＦ等の成長因子は、内皮細胞の増殖及び分化において主要な役割を持つと考えられている。
【０００９】
新脈管形成の制御は血管成長因子（非特許文献７）及び細胞外マトリックス、接着分子、代謝因子（非特許文献８）の局所的な放出が関係する複雑な過程である。また、血管内部の機械的力にも役割があり得る（非特許文献９）。新たな血管成長に関係する内生成長因子群の主要な部類は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である（非特許文献１０）。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ；ＥＲＫ１／２）シグナル変換カスケードは、ＶＥＧＦ遺伝子の発現と血管内皮細胞の増殖制御の両方に係わっている。
【００１０】
内在性アデノシンは、心筋の酸素要求度の増加に対する冠動脈血流反応を促進する場合があり、冠動脈血流予備量を調節することもできる（非特許文献１１）。生理学的濃度のアデノシンをヒト臍帯静脈内皮細胞培養物に加えると、おそらくは表面受容体を介して、増殖を刺激することが示されている。アデノシンはヒト内皮細胞の増殖及びおそらくは新脈管形成に対する因子である可能性がある。新脈管形成は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）等閉塞性血流を有する患者を防御する模様だが、自然状態での血管成長速度では疾患を転換するのに不十分である。即ち、身体の自然状態の新脈管形成潜在力を増強及び促進する戦略は、ＣＡＤを有する患者に有益であるはずである。
【００１１】
同様に、創傷治癒は多くの発展途上国及び、創傷治癒障害及び慢性炎症疾患を持ち様々なシクロオキシゲナーゼ２（ＣｏＸ２）阻害剤の使用量が増加している糖尿病患者にとって大きな問題である。新たな血管は活力のある細胞を支えるための栄養を提供する、並びに肉芽組織形成を促進する、壊死組織片の除去を助長することから、創傷治癒には新脈管形成が必要である。肉芽組織塊の約６０％が、必要とされる酸素を供給して治癒及び血管成長の促進をも行う血管から構成されている。新脈管形成因子が創傷液内に存在して治癒を促進し、一方抗新脈管形成因子は治癒を阻害することは文書にてよく立証されている。創傷新脈管形成は複雑な多段階過程である。多数の新脈管形成因子について詳しく知られているにも係わらず、これらの因子の源の確定、並びに創傷新脈管形成に関係する制御現象、修復を促進する新脈管形成促進薬剤の臨床使用における進展はほとんどない。さらに、創傷新脈管形成及び修復についての理解を複雑にしているのは、修復に関係する機構及び仲介物質は、恐らく傷の深さ並びに傷の種類（熱傷、外傷等）、部位（筋肉、皮膚、骨等）に応じて変わるという事実である。患者の状態及び年齢（糖尿病性、病原性、ステロイド治療中、老人対乳幼児等）もまた、修復及び新脈管形成因子に対する反応の早さを決定しうる。また、患者の性別及びホルモン状態（閉経前、閉経後等）が修復機構及び修復反応に影響を与える場合もある。創傷治癒障害は特に老人及びアメリカ合衆国内の１４００万人もの糖尿病患者を冒している。これらの患者集団では、新脈管形成の低下が創傷治癒問題に対する原因因子であることが多いため、創傷修復に重要な新脈管形成因子を確定し、創傷治癒障害を予防するあるいは（且つ）矯正するための臨床的使用法を開発することが重要である。
【非特許文献１】ＥｌｙおよびＢｅｍｅ，「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」１９９２年，８５：８９３
【非特許文献２】Ｍｏｕｓａ，Ｓ．Ａ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ：「Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，Ｔｅｘａｓ；２０００年，Ｃｈａｐｔｅｒ  １
【非特許文献３】Ｂｒｅｉｅｒら，「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１９９６年，６：４５４−４５６
【非特許文献４】Ｆｏｌｋｍａｎ，「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」１９９５年，１：２７−３１
【非特許文献５】Ｒｉｓａｕ，「Ｎａｔｕｒｅ」１９９７年，３８６：６７１−６７４
【非特許文献６】Ｂｌｏｏｄら，「Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」１９９０年，１０３２：８９−１１８
【非特許文献７】Ｐ  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，「Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ」２０００年，９０２：２４９−２６０
【非特許文献８】ＲＪ  Ｔｏｍａｎｅｋ，ＧＣ  Ｓｃｈａｔｔｅｍａｎ，「Ａｎａｔ  Ｒｅｃ」２０００年，２６１：１２６−１３５
【非特許文献９】Ｏ  Ｈｕｄｌｉｃｋａ，「Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ」１９９５年，１４７：５７−６８
【非特許文献１０】Ｇ  Ｐａｇｅｓ，「Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ」２０００年，９０２：１８７−２００
【非特許文献１１】Ｅｔｈｉｅｒら，「Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．」１９９３年，Ｈ１３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このように、副作用が最小で、創傷治癒の促進、冠動脈新脈管形成、あるいは他の脈管形成関連疾患に対する基本治療あるいは補助治療として脈管形成因子に関する有効な治療は、依然必要とされている。当該治療は、心筋梗塞あるいは卒中、末梢動脈疾患等の血管疾患を持つ患者に特に有用であり、虚血並びに心筋梗塞の危険性が高まる冠動脈循環不良を持つ患者に予防的に使用することができるとも考えられる。
【００１３】
また、新脈管形成が有害となる他の状況でも発生することに注目することは重要である。この状況には、固形腫瘍の増殖及び転移、関節リウマチ、乾癬、強皮症、３つの一般的な失明の原因である糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障（実際、眼疾患はほとんどの場合に血管新生が伴う。）が含まれる。創傷新脈管形成の過程には実際、腫瘍の新脈管形成と共通する特徴が多数ある。即ち、糖尿病性網膜症あるいは、原発あるいは転移腫瘍の発生等、新脈管形成が有害となる幾つかの状態が存在する。このように、脈管形成因子の影響を阻害するための方法が依然必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は一部、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、並びにこれらの重合形態物が細胞膜レベルで作用し、核の甲状腺ホルモンの影響から独立した新脈管形成促進特性を持つという発見に基づいている。従って、これらの甲状腺ホルモンアナログ及び重合形態物（すなわち脈管形成薬剤）を使用して様々な疾患を治療することができる。同様に本発明は、また甲状腺ホルモンアナログ拮抗物質が当該アナログの脈管形成促進効果を阻害するという発見に基づいており、これも様々な疾患の治療に使用することができる。
【００１５】
従って、一側面において本発明は、新脈管形成を促進するのに効果的な甲状腺ホルモンの重形態物あるいはこれのアナログの量を、それを必要とする被験体に投与することによって新脈管形成を促進することによる治療が効く状態を治療するための方法を特色とする。新脈管形成を促進することによる治療が効く当該状態の例はこの明細書にて提示され、これには閉塞性血管疾患、冠動脈疾患、勃起不全、心筋梗塞、虚血、卒中、末梢動脈血管疾患、並びに創傷を含めることができる。
【００１６】
また、甲状腺ホルモンアナログの例はこの明細書で提示され、これにはトリヨードサイロニン（Ｔ３）、レボサイロキシン（Ｔ４）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロイ（ｈｙｄｒｏｙ）−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）あるいは３，５−ジヨードサイロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）、テトラヨードサイロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、並びにトリヨードサイロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）を含めることができる。さらに別のアナログは図２０の表Ａ〜Ｄである。これらのアナログはポリビニルアルコールあるいはアクリル酸エチレン共重合体、ポリ乳酸、アガロースに結合させることができる。この結合は、使用するポリマーに応じて共有結合あるいは非共有結合を介する。
【００１７】
一実施例では、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、あるいはこれらの重合形態物は、非経口、経口、直腸経由、局所的に、もしくはこれらを組み合わせて投与される。非経口様式の投与には、例えば、皮下、腹膜内、筋肉内、カテーテルによる等の静脈内経由の様式が含まれる。局所的な投与様式には、例えば、バンドエイド法を含めることができる。
【００１８】
別の実施例では、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、あるいはこれらの重合形態物は、微粒子あるいはリポソーム、ポリマー内にカプセル化する、あるいは取り込ませることができる。このポリマーには、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド、あるいはこれらの共重合体を含めることができる。リポソームあるいは微粒子は、約２００ナノメーター未満の大きさであり、一つ以上の非経口経路あるいは他の投与方法を介して投与することができる。別の実施例では、このリポソームあるいは微粒子は、虚血組織を囲む毛細血管床内に留まることができる、あるいはカテーテルを介して血管内部に適用することができる。
【００１９】
また、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、あるいは本発明のこれらの重合形態物は、一つ以上の生物学的活性物質と共投与することができ、この物質には、例えば、成長因子、血管拡張薬、抗凝血薬、抗ウイルス薬、抗細菌薬、抗炎症剤、免疫抑制剤、鎮痛剤、血管新生薬剤、あるいは細胞接着分子、あるいはこれらの組み合わせ物を含めることができる。一実施例では、甲状腺ホルモンアナログあるいは重合形態物は一つ以上の生物学的活性物質を投与する前後に、ボーラス注入として投与される。
【００２０】
成長因子には、例えば、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、並びに形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、塩基性線維芽細胞成長因子、血管内皮増殖因子、上皮増殖因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、血管透過性因子を含めることができる。血管拡張薬には、例えば、アデノシン、アデノシン誘導体、あるいはこれらの組み合わせ物を含めることができる。抗凝血薬にはヘパリン、ヘパリン誘導体、抗Ｘａ因子、抗トロンビン物質、アスピリン、クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｇｒｅｌ）、あるいはこれらの組み合わせ物が含まれるがこれらに限定されない。
【００２１】
本発明の別の一側面では、医療器具を患者に挿入する前に、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、あるいは本発明のこれらの重合形態物でこの医療器具を被覆することによって、医療器具に沿ってあるいは医療器具の周辺で新脈管形成を促進するための方法を提供する。この被覆過程には、さらに医療機器を、これらに限定されないが、成長因子、血管拡張剤、抗凝血薬、あるいはこれらの組み合わせ物等一つ以上の生物学的活性物質で被覆することが含まれ得る。甲状腺ホルモンアナログ、あるいは本発明の重合形態物で被覆することができる医療器具の例には、ステント、あるいはカテーテル、カニューレ、電極が含まれる。
【００２２】
さらなる側面では、本発明は、治療を必要とする被験体に、新脈管形成を阻害するのに有効な抗新脈管形成薬の量を投与して新脈管形成を阻害することによる治療が効く状態を治療するための方法を提供する。
【００２３】
新脈管形成を阻害することによる治療が効く状態の例には、原発あるいは転移腫瘍、糖尿病性網膜症、並びに関連する状態が含まれるがこれらに限定されない。また、新脈管形成を阻害するために使用される抗新脈管形成薬の例は本発明によって提供され、これにはテトラヨードサイロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードサイロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）、モノクローナル抗体ＬＭ６０９、ＸＴ１９９、あるいはこれらの組み合わせ物が含まれるがこれらに限定されない。当該抗新脈管形成薬は細胞表面で作用し、新脈管形成促進因子を抑制することができる。
【００２４】
一実施例において、抗新脈管形成薬は非経口、経口、直腸経由、あるいは局所的に、あるいはこれらを組み合わせて投与される。別の実施例で抗新脈管形成薬は、一つ以上の抗新脈管形成治療薬あるいは化学治療薬剤と共投与することができる。
【００２５】
さらに別の側面で本発明は、ポリマーに結合した甲状腺ホルモン並びに甲状腺ホルモンアナログを包含する組成物（すなわち脈管形成薬剤）を提供する。この結合はそのポリマーに応じて、共有結合あるいは非共有結合を介することができる。共有結合は、例えばエステル結合あるいは無水物結合を介して生じることができる。また、甲状腺ホルモンアナログの例は本発明によって提供され、これにはレボサイロキシン（Ｔ４）、あるいはトリヨードサイロニン（Ｔ３）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロイ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）が含まれる。一実施例においてこのポリマーには、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレン共重合体、ポリ乳酸、またはアガロースを含めることができるがこれらに限定されない。
【００２６】
別の側面において本発明は、薬学的に受容可能な担体内に本発明の脈管形成薬剤を含有する薬学的処方物を提供する。一実施例において、この薬学的処方物には一つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含有することができる。
【００２７】
本発明の薬学的処方物は、リポソームあるいは微粒子、ポリマー内にカプセル化するあるいは取り込むことができる。このリポソームあるいは微粒子は約２００ナノメーター未満の大きさを有する。本発明の任意の薬学的処方物を、非経口、経口、直腸経由、または局所的に、あるいはこれらを組み合わせて投与することができる。別の実施例において、この薬学的処方物は１つ以上の生物学的活性物質と共に、必要とする被験体に投与することができ、この生物学的活性物質には成長因子、血管拡張剤、抗凝血薬、あるいはこれらの組み合わせ物を含めることができるがこれらに限定されない。
【００２８】
本発明の一つ以上の実施様態の詳細は、以下の記述によって示してある。この明細書にて記載されているものと同様あるいは等価の、任意の手法及び物質は、本発明の実践あるいは試験にて使用することができ、好ましい手法及び物質をここに記載する。本発明の他の特性並びに目的、利点は、この記述及び本特許請求の範囲から明らかになる。この明細書及び添付の本特許請求の範囲では、文脈にて明確に他を指示されない限り、単数形には相当する複数物が含まれる。他に定義されない限り、この明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の通常の技術者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。この明細書で引用される全ての特許及び刊行物は、参考のためその全体を援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明の特徴及びその他詳細を、添付する図に対する説明と共に、また本特許請求の範囲によって記されるように、ここでより詳しく記述する。便宜のため、この明細書、実施例、並びに特許請求の範囲で使用される特定の用語をここにまとめる。他に定義されない限り、この明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の通常の技術者が普通に理解するものと同じ意味を有する。
【００３０】
この明細書で使用される用語「脈管形成性薬剤」には、単独でもしくは他の物質と併用して新脈管形成を促進あるいは助長する任意の化合物または物質が含まれる。例には、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３−あるいはＴ４−アガロース、Ｔ３、Ｔ４のアナログ重合体、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロイ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、あるいはＤＩＴＰＡが含まれるがこれらに限定されない。反対に、「抗新脈管形成薬剤」あるいは「抗脈管形成性薬剤」という用語は、単独でもしくは他の物質と併用して新脈管形成を抑制あるいは阻害する任意の化合物あるいは物質を意味する。例には、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、ＸＴ  １９９、並びにｍＡＢ  ＬＭ６０９が含まれるがこれらに限定されない。
【００３１】
この明細書で使用される、「心筋虚血」という語は、心臓の血管の能力が減少したことによって、心筋への血液供給が不十分になった状態と定義される。この明細書で使用される、「冠動脈疾患」という用語は、冠血管が通常の機能のために十分な血流を供給する力と心筋の機能との不均衡が原因の、心臓機能の疾病／障害と定義される。この明細書で記載される組成物並びに手法で治療することのできる冠動脈疾患に関係する特定の冠動脈疾病／障害には、心筋虚血並びに狭心症、冠動脈瘤、冠動脈血栓、冠動脈血管痙攣、冠動脈疾患、冠動脈心臓疾患、冠動脈閉塞、冠動脈狭窄が含まれる。
【００３２】
この明細書で使用される語「閉鎖性末梢血管疾患」（末梢動脈閉塞性疾患としても知られている。）とは、頚動脈もしくは、腸管動脈を含む大腿動脈での閉塞が関係する血管疾患である。大腿動脈での閉塞によって痛み及び運動障害が引き起こされる。閉塞性末梢血管疾患を伴う具体的な疾患には糖尿病患者が患う糖尿病性足病変があり、これはしばしば足の切断となる。
【００３３】
この明細書で使用される語「血管の再生」並びに「新脈管形成」、「血管再生」、「側副枝循環の増加」（あるいはその影響を指す語）は、同義語とみなされる。「薬学的に受容可能な」という語は、天然物質あるいは合成物質を指す場合、毒性効果と比較してその物質の有益な効果がはるかに大きいことを鑑みて、その物質が受容可能な毒性効果を有することを意味する。一方、関連語である「生理学的に受容可能な」とは、その物質が比較的低い毒性を有することを意味する。「共投与」という語は、２つ以上の薬剤を一人の患者にほぼ同時、あるいは近い順序で与え、これらの効果がほぼ同時に、あるいは実質的に重なって現れるようにすることを意味する。この語には薬剤順次投与及び同時投与が含まれる。
【００３４】
「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に受容可能な甲状腺ホルモンアナログ、重合形態物、並びに誘導体の塩を指す。これらの塩は、当分野で周知されている様々な有機並びに無機の対イオンから派生し、これには例として、ナトリウム並びにカリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム等が含まれる。こうした分子が塩基としての機能を有する場合、塩酸塩並びに臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシレート、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩等のような有機酸あるいは無機酸の塩を、薬学的に受容可能な塩として使用することができる。
【００３５】
「被験体」にはヒト、サル、ウシ（ｃｏｗ及びｃａｔｔｌｅ）、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、これらの培養細胞、並びにこれらのトランスジェニック種等の生きた有機体が含まれる。好ましい一実施例において、被験体はヒトである。治療のための本発明の組成物の被験体への投与は、被験体の状態を治療するのに有効な投与量並びに期間、公知の方法を用いて達成することができる。治療効果を達成するために必要な治療化合物の有効量は、年齢、性別、被験体の体重、並びに、被験体体内の外来因子を治療する治療化合物の能力等の要因によって異なる場合がある。投薬レジメンは、最適な治療反応を提供するために調整することができる。例えば、数回に分けた投与量を毎日投与することもでき、あるいは治療状況の緊急性から示されるように、比例的に減らすこともできる。
【００３６】
「投与する」には、本発明の組成物が、例えば新脈管形成の促進を意図する機能を達成することができる投与経路が含まれる。治療する疾患あるいは状態に応じて様々な投与経路が可能であり、これには非経口（例えば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注入）、経口（例えば食事）、局所、鼻腔、直腸、あるいは徐放性マクロキャリア経由が含まれるが必ずしもこれらに限定されない。経口並びに非経口、静脈内投与は、好ましい投与様式である。投与する化合物の処方は選択する投与経路に従って変わることとなる（例えば液体、乳剤、ゲル、エアロゾル、カプセル）。投与する化合物を含む適切な組成物は、必要に応じた補助薬及び保存剤と共に生理学的に受容可能な送達担体（ｖｅｈｉｃｌｅ）あるいは担体（ｃａｒｒｉｅｒ）内に調製することができる。溶液あるいは乳剤に関して、適切な担体には、例えば水溶液あるいはアルコール／水溶液、乳液あるいは懸濁液が含まれ、これには食塩水、緩衝化媒質、滅菌水、クリーム、軟膏、ローション、オイル、ペースト、並びに固体担体が含まれる。非経口送達担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、あるいは不揮発油を含めることができる。静脈内送達担体は、様々な添加剤、保存剤、あるいは液体、栄養剤もしくは電解質補充薬を含有することができる（全般的なことはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｍａｃｋ，Ｅｄ．（１９８０）を参照する。）。
【００３７】
「有効量」には、脈管形成促進性化合物あるいは抗脈管形成性化合物の量が、例えばこの明細書に記載される新脈管形成が関係する疾患において新脈管形成を促進するあるいは抑制する、目的とする機能の達成を可能にする量が含まれる。有効量は多数の要因に依存することなり、この要因には生物学的活性、年齢、体重、性別、全身の健康状態、治療を受ける状態の重症度、及び適切な薬物力学的特性が含まれる。例えば、活性物質の投与量は１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇであることができ、１日あたり約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇであると都合良い。治療的有効量の活性物質は、適切な経路によって一回用量あるいは複数回用量で投与することができる。さらに、活性物質の投与量は、治療状況あるいは予防状況の緊急性から示されるように、比例的に増やすあるいは減らすことができる。
【００３８】
「薬学的に受容可能な担体」には、任意且つ全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、その他化合物の活性に適合し、且つ被験体にとって生理学的に受容可能なものが含まれる。薬学的に受容可能な担体の一例は、生理食塩緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）である。当該媒質並びに薬剤を薬学的に受容可能な物質のために使用することは、当分野にて周知されている。但し、任意の通常の媒質あるいは薬剤がこの治療化合物に不適合である場合以外、薬学的投与に適する組成物においてこれらの使用は熟慮される。
【００３９】
「追加成分」には、一つあるいは複数の以下のものが含まれるがこれらに限定されない。：賦形剤、界面活性剤、分散剤、不活性稀釈剤、造粒剤並びに崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、着色剤、保存剤、ゼラチン等の生理学的に分解可能な組成物、水性送達担体及び水性溶媒、油性送達担体及び油性溶媒、懸濁剤、分散あるいは湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、緩衝液、塩、増粘剤、充填剤、乳化剤、酸化防止剤、抗生剤、抗真菌剤、安定剤、並びに薬学的に受容可能な重合体物質あるいは疎水性物質。本発明の薬学的組成物が含有することができる他の「追加成分」は当分野にて公知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
【００４０】
（組成物）
この明細書で開示するのは、甲状腺ホルモン、これのアナログ、並びにこのホルモン並びにアナログの重合体結合物を含む脈管形成性薬剤である。この開示される組成物は、新脈管形成を促進するために使用して、新脈管形成が有益である疾患を治療することができる。加えて、有害な新脈管形成を伴う疾患を治療するためにこれらの甲状腺ホルモン並びにアナログ、重合体結合物の阻害を用いて新脈管形成を阻害することができる。この明細書で使用されている「脈管形成性薬剤」という語には、単独であるいは他の物質と併用して新脈管形成を促進する、あるいは助長する任意の化合物もしくは物質が含まれる。例には、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３アガロースもしくはＴ４アガロース、Ｔ３、Ｔ４のアナログ重合形態物、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロイ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、あるいはＤＩＴＰＡが含まれるがこれらに限定されない。
【００４１】
重合体結合物は薬剤の生存能を改善するために使用される。新旧多数の治療法が良く許容されているが、多数の化合物は毒性を減らす、あるいは循環時間を増加する、生体内分布を改変するために、高度に進んだ薬剤発見技術を必要とする。薬剤の生存能を改善する方策の一つは、水溶性ポリマーを利用することである。多様な水溶性ポリマーが、生体内分布を改変する、並びに細胞への取り込み様式を改善する、生理学的障壁への透過性を変える、体内から除去される速度を改変する、ことが示されている。標的化効果あるいは持続放出効果を達成するために、末端基として、あるいは骨格部の一部分として、ポリマー鎖上のペンダント基として、薬剤部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。
【００４２】
本発明の代表的な組成物には、ポリマーに結合した甲状腺ホルモンあるいはこれのアナログが含まれる。ポリマーへの結合は、共有結合あるいは非共有結合のいずれかを介し得る。好ましい実施例において、このポリマー結合はエステル結合あるいは無水物結合を介して生じ得る。ポリビニルアルコールを使用するエステル結合が介するポリマー結合の例を、図１７に示している。この調製法では、酸塩化物形態を含む甲状腺ホルモンアナログの酸塩化物で処理して市販のポリビニルアルコール（あるいは関連する共重合体）をエステル化することができる。この塩酸塩にトリエチルアミンを加えて中和してトリエチルアミン塩酸塩を生成させ、このトリエチルアミン塩酸塩は、それぞれのアナログについての甲状腺ホルモンエステル重合体が沈殿する際に、水で洗い流すことができる。このポリマーへのエステル結合は生体内で加水分解され、活性型新脈管形成促進性甲状腺ホルモンアナログを放出することができる。
【００４３】
アクリル酸エチレン共重合体を使用する無水物結合を介したポリマー結合の一例を図１８に示す。これは先のポリマーへの共有結合と似ているが、こちらはアクリル酸共重合体との反応から派生する無水物結合を介している。この無水物結合も、生体内で加水分解に感受性であり、甲状腺ホルモンアナログを放出する。塩酸の中和はトリエチルアミンで処理して達成し、続いて沈殿させたポリ無水物重合体を水で洗浄して、副産物であるトリエチルアミン塩酸塩を除去する。この反応によって甲状腺ホルモンアナログアクリル酸共重合体＋トリエチルアミンが形成されることとなる。生体内で加水分解されると、甲状腺ホルモンアナログ及びアクリル酸エチレン共重合体は時間経過に伴って放出されることとなり、これは調節することができる。
【００４４】
他の典型的な重合体結合物には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合した甲状腺ホルモンあるいはそのアナログが含まれる。様々な薬剤、タンパク質、並びにリポソームにＰＥＧを結合すると、滞留時間を改善し且つ毒性を減少させることが示されている。ＰＥＧは、その鎖の末端にある水酸基を介して、並びに他の化学手段を介して活性薬剤と結合させることができる。しかし、ＰＥＧ自体は１分子当たり２つの活性薬剤に限られる。別の方策では、ＰＥＧとアミノ酸の共重合体が、ＰＥＧの生体適合特性を保持しながら１分子当たりに多数の結合部位を持つという利点が加わり、且つ広範囲の用途に適するよう合成的に設計することが可能な新しい生物材料として探求された。
【００４５】
他の典型的なポリマー結合物には、ポリマーとの非共有結合状態にある甲状腺ホルモンあるいはそのアナログが含まれる。これは詳細を図１９に示す。好ましい非共有結合は、甲状腺ホルモンあるいはこれのアナログの、ポリ乳酸重合体内での捕捉である。ポリ乳酸ポリエステル重合体（ＰＬＡ）は生体内で加水分解されて乳酸単量体となり、この重合体はヒトにおける薬剤送達系のための送達担体として開発されている。甲状腺ホルモンアナログが化学結合によってポリマーと結合する先の二つの共有結合法とは異なり、これは甲状腺ホルモンアナログをＰＬＡポリマービーズ内にカプセル化する非共有結合法となる。この反応によって、含甲状腺ホルモンアナログＰＬＡビーズが水中にて形成されることとなる。ろ過及び洗浄によって含甲状腺ホルモンアナログＰＬＡビーズの形成に帰着し、これは生体内で加水分解されると加水分解によって、調節された量の甲状腺ホルモンと乳酸とが発生することとなる。
【００４６】
さらに、ナノメーター尺度の大きさの有用な物質並びに構造物を作り出すために、ナノテクノロジーを使用することができる。生物性活性物質の大きな欠点は、脆弱なことである。ナノ寸法の物質をこのような生物性活性物質に組み合わせて、生物性活性物質の持続性を劇的に改善し、その物質の局所的な高濃度状態を作り出して損失量を最小にすることで費用を抑えることができる。このように、重合体結合物にはさらに甲状腺ホルモン並びにこれのアナログから成るナノ粒子処方物が含まれる。当該実施例では、甲状腺ホルモン並びにそのアナログを局所的に送達するためのマトリックスとして、ナノポリマー並びにナノ粒子を使用することができる。これは今後まもなく、細胞性標的並びに組織性標的内への送達の調節を助けることとなるであろう。
【００４７】
本発明の組成物には、甲状腺ホルモン、アナログ並びに誘導体の単独もしくはポリマーと共有結合あるいは非共有結合している甲状腺ホルモン、アナログ並びに誘導体の双方が含まれる。典型的なアナログ並びに誘導体の例を図２０の表Ａ〜Ｄに示す。表ＡはＴ２、Ｔ３、Ｔ４、並びに臭素誘導体を示す。表Ｂはアラニル側鎖の改変体を示す。表Ｃは水酸基、ジフェニルエステル結合、及びＤ体を示す。表Ｄはチロシンアナログを示す。
【００４８】
「抗新脈管形成薬剤」または「抗脈管形成性薬剤」という語は、単独もしくは他の物質と併用して新脈管形成を阻害あるいは抑制する任意の化合物もしくは物質を意味する。例にはＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、ＸＴ  １９９、及びｍＡｂ  ＬＭ６０９が含まれるがこれらに限定されない。
【００４９】
（新脈管形成の促進における甲状腺ホルモン、アナログ、並びにポリマー結合体の役割）
甲状腺ホルモンアナログあるいはポリマー形態物の脈管形成促進効果は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の薬理的阻害剤による減衰に対するこのホルモン効果の感応性によって試験されたように、非ゲノム性発動に依存する。こうした結果は甲状腺ホルモンによるＭＡＰＫ活性化の別の結果が新たな血管の成長であることを示唆している。後者は非ゲノム的に開始されるが、もちろん引き続いて複雑な遺伝子転写プログラムを必要とする。甲状腺ホルモンの周囲濃度は比較的安定している。ＣＡＭモデルは、我々が実験した時点で甲状腺欠損状態であり、完全な生物体を再生しない系としてみなすことができる。
【００５０】
新脈管形成のためのニワトリ漿尿膜モデル（ＣＡＭ）アッセイが利用できることによって、新脈管形成の定量、及び甲状腺ホルモンによる新たな血管成長の発動に関係する可能性のある機構を研究するためのモデルが提供される。本出願は、ＣＡＭモデル内のＦＧＦ２の脈管形成促進効果と近似し、且つ最適下量のＦＧＦ２の作用を強化することができるＴ４の脈管形成促進効果を開示する。さらにこのホルモンの脈管形成促進効果が細胞膜レベルで発動し、Ｔ４によるＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化に依存することを明らかにする。上記のとおり、閉塞性末梢血管疾患及び冠動脈疾患、特に冠血管の閉塞、並びに末梢脈管構造且つ（あるいは）冠血管の閉塞に伴う疾患の治療法を開示する。また、それを必要とする患者に新脈管形成を促進し、且つ（あるいは）側副血管を動員するための組成物及び手法を開示する。この組成物には、有効量の甲状腺ホルモンアナログ、重合形態物、並びに誘導体が含まれる。この手法は、有効量の甲状腺ホルモンアナログ、重合形態物、並びに誘導体と他の標準的な新脈管形成促進性成長因子、血管拡張剤、抗凝血薬、血栓溶解薬、あるいは他の血管関連治療薬とを、１週間以上、毎日低量を共投与することを含む。
【００５１】
このＣＡＭアッセイは、新脈管形成を促進すると考えられる様々な成長因子並びに化合物の脈管形成活性を確認するために利用されている。例えば、生理学的濃度のＴ４はこのインビボモデルにて脈管形成促進性であり、分子ベースでＦＧＦ２の活性を有することが示された。ＰＴＵの存在によってＴ４の効果は減少せず、これはこのモデルにおいてＴ３を生じるＴ４の脱ヨウ素が先行条件ではないことを示唆する。様々な甲状腺ホルモンアナログの新脈管形成促進効果を表１にて揚げる。
【００５２】
（表１．ＣＡＭモデルにおける様々な甲状腺ホルモンアナログの新脈管形成促進効果）
【００５３】
【化１】
2007505837.tif 000001
１群につきｎ＝８。
【００５４】
このモデルで新たな血管の成長が現れるのには数日かかり、これによって、甲状腺ホルモンの効果は甲状腺ホルモン対する核受容体（ＴＲ）とホルモンとの相互作用に全面的に依存するものであることが示唆される。ＴＲとこれの天然のリガンドであるＴ３との核内複合体形成を必要とするヨードサイロニン類の作用は本来ゲノム性であり、最終的には遺伝子発現に帰着する。一方、このモデル系のＴ４（ＴＲの天然のリガンドであるＴ３ではなく。）への選択的反応から、新脈管形成がＴ４によって細胞膜にて非ゲノム的に発動され、最終的には遺伝子転写を必要とする効果となるという可能性が高まった。Ｔ４の非ゲノム性作用は幅広く記載されており、通常細胞膜で発動し、シグナル伝達経路によって仲介される可能性がある。これはヨードサイロニンの核内リガンド並びにＴＲを必要としないが、遺伝子転写と調和する、あるいはこれを調節する可能性がある。また、ステロイドの非ゲノム的作用もよく記載されており、ステロイドあるいは他の化合物のゲノム性作用と調和することが公知である。Ｔ４とテトラック、あるいはアガロースＴ４を用いて行われた実験では、Ｔ４の脈管形成促進効果は、細胞膜で発動された可能性が非常に高いことが示唆された。テトラックは細胞膜で発動されるＴ４の効果を阻害したが、テトラック自体はシグナル伝達を活性化しない。つまり、これは甲状腺ホルモンの非ゲノム性作用に対するプローブである。アガロースＴ４は細胞内部には入らないと考えられており、細胞表面で発動する可能性のあるホルモン作用のためのモデルを試験するために使用されている。
【００５５】
一部において、本発明は、それを必要とする被験体にて新脈管形成を促進するための組成物及び手法を提供する。新脈管形成を促進することによる治療が効く状態には、例えば、閉塞性末梢血管疾患並びに冠動脈疾患、特に冠血管閉塞、及び末梢脈管構造及び（あるいは）冠血管の閉塞に伴う疾患、勃起不全、卒中、並びに創傷が含まれる。また、それを必要とする患者の新脈管形成を促進する、及び（あるいは）側副血管を動員するための組成物及び手法を開示する。この組成物には、有効量の甲状腺ホルモンアナログ並びに誘導体の重合形態物、並びに有効量のアデノシン及び（あるいは）一酸化窒素供与体が含まれる。これらの組成物は滅菌された注入可能な薬学的組成物の形態であることができ、これには随意で一つ以上の賦形剤を伴い、生理学的且つ薬学的に受容可能な担体内にある、脈管形成に有効な量の甲状腺ホルモン様物質、並びにアデノシン誘導体が含まれる。
【００５６】
（心筋梗塞）
急性心筋梗塞に続く心不全の主な原因は、新たな血管の形成反応（すなわち、新脈管形成）が適切でないことにある。甲状腺ホルモン並びにそのアナログは心不全に有用であり、冠新脈管形成を刺激する。本発明の方法には、その一部において、心筋に直接注入するか、あるいは間欠的に大動脈を結紮して一時的な等容性収縮を生じさせることにより冠動脈注入を模擬することによって、梗塞時に甲状腺ホルモンアナログの単回処置薬を送達して、新脈管形成及び（あるいは）心室の再構築を達成することが含まれる。
【００５７】
従って、本発明の一側面では、それを必要とする被験体に、新脈管形成の促進に有効なある量の甲状腺ホルモンあるいはそのアナログの重合形態物を投与することによって新脈管形成を促進し、閉塞性血管系疾患、冠動脈疾患、心筋梗塞、虚血、卒中、及び（あるいは）末梢動脈血管系の疾患を治療するための方法を特色とする。
【００５８】
またこの明細書中にて甲状腺ホルモンアナログの重合形態物の例を提供し、これには、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレン共重合体、ポリ乳酸、あるいはアガロースに結合した、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、レボサイロキシン（Ｔ４）、（ＣＧ−１）、あるいは３，５−ジヨードサイロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）が含まれ得る。
【００５９】
またこの方法は、有効量の甲状腺ホルモン様物質と有効量のアデノシン及び（あるいは）ＮＯ供与体とを低量の１日投与量を１週間以上共投与することを含む。一方あるいは双方の成分はカテーテルによって局所的に送達され得る。甲状腺ホルモンアナログ並びに誘導体を適切な大きさにしたリポソームもしくは微粒子内に取り込むことによって、これらの化合物を、生体内で虚血組織を囲む毛細血管床に送達させることができる。甲状腺ホルモンアナログ、重合形態物、並びに誘導体は、適切な抗体に共有結合させることによって虚血組織を標的とすることができる。
【００６０】
この方法は、心筋梗塞後に心臓機能を回復させる治療として利用することもできる。またこの方法は、心筋虚血を患う冠動脈疾患を有する患者における血流、あるいは、例えば閉塞性末梢血管疾患（末梢動脈閉塞性疾患としても公知。）あるいは勃起不全等、心臓以外の部位への血流不全を改善するために利用することもできる。
【００６１】
（創傷治癒）
創傷新脈管形成は、治癒増殖期の重要部分である。最表面以外のあらゆる皮膚の治癒は、新脈管形成なしに生じるはできない。あらゆる損傷を受けた脈管構造は修復される必要があるだけでなく、治癒に必要な局所的な細胞活性の上昇には、血流からの栄養素の供給が増加することが必要である。さらに、血管の内側を形成する内皮細胞は、それ自体が治癒を組織化し、且つ制御するものとして重要である。
【００６２】
つまり、新脈管形成によって創傷治癒を支える新たな微小循環ができる。損傷後４日までに、新たな血管を損傷部内部にて臨床的に目視することができるようになる。血管内皮細胞、線維芽細胞、並びに平滑筋細胞は、損傷肉芽形成を支えるために全てが協調して増殖する。同時に上皮再形成が起こり、上皮の被覆が回復する。創縁あるいは毛嚢深部の表皮細胞は創傷全体に移動し、肉芽組織及び仮のマトリックス全体をそれ自身で確立する。ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）等の成長因子がこの過程を仲介する。いくつかの上皮形成モデル（細胞の滑走対回転）が存在する。
【００６３】
甲状腺ホルモンは代謝速度を調節するため、甲状腺機能低下症のため代謝が低下している時は創傷治癒も低下している。よって、創傷治癒における局所的に投与された甲状腺ホルモンアナログあるいは重合形態物の役割は、糖尿病患者および創傷治癒不全を有する非糖尿病患者にて創傷治癒を加速させる新しい方策となる。局所的な投与はバンドエイドに接着した形態であることができる。さらにナノポリマーおよびナノ粒子を、甲状腺ホルモン並びにこれのアナログを局所的に送達するためのマトリックスとして使用することができる。これは今後、細胞性標的並びに組織性標的内への送達の調節を助けるであろう。
【００６４】
従って、本発明の別の様態は、それを必要とする被験体に、新脈管形成の促進に有効な、ある量の甲状腺ホルモンあるいはこれのアナログの重合形態物を投与して新脈管形成を促進することによって、創傷を治療するための方法を特色とする。詳細は実施例９を参照する。
【００６５】
（新脈管形成阻害における甲状腺ホルモン並びにアナログ、重合体結合物の役割）
本発明はまた、別の一部分にて、それを必要とする被験体にて新脈管形成を抑制するための組成物並びに手法を提供する。新脈管形成を抑制することによる治療が効く状態には、例えば、原発もしくは転移腫瘍、並びに糖尿病性網膜症が含まれる。この組成物には、有効量のＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、あるいはｍＡｂ  ＬＭ６０９を含めることができる。この組成物は滅菌された注入可能な薬学的処方物から成る形態であることができ、この薬学的処方物は、随意で一つ以上の賦形剤と共に、生理学的且つ薬学的に受容可能な担体中に、抗脈管形成に有効な量の抗脈管形成物質を含有する。さらに別の側面では、本発明はそれを必要とする被験体に、新脈管形成を抑制する効果のある抗新脈管形成薬剤の量を投与することによって、新脈管形成を抑制することによる治療が効く状態を治療するための手法を提供する。
【００６６】
また、新脈管形成を抑制するために使用される抗新脈管形成薬剤の例が本発明によって提示され、これにはテトラヨードサイロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードサイロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）、モノクローナル抗体ＬＭ６０９、あるいはこれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。当該抗新脈管形成薬剤は細胞表面で作用して新脈管形成促進因子を阻害することができる。
【００６７】
（癌に関係する新たな血管の成長）
新脈管形成を抑制することによる治療が効く状態の例には、原発あるいは転移腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。当該手法では、甲状腺ホルモンが誘発する脈管形成効果を阻害する化合物を使用して新脈管形成を抑制する。当該手法の詳細は、実施例１２にて説明される。
【００６８】
（糖尿病性網膜症）
新脈管形成を抑制することによる治療が効く状態の例には、糖尿病性網膜症及び関連する状態が含まれるがこれらに限定されない。当該手法では、甲状腺ホルモンが誘発する脈管形成効果を阻害する化合物を使用して新脈管形成を抑制する。当該手法の詳細は、実施例８Ａ及びＢにて説明される。
【００６９】
低酸素症によって誘発される増殖性網膜症（糖尿病ではなく）がαＶ（αＶ）インテグリンの発現に依存するものであることが公知である（Ｅ  Ｃｈａｖａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４５：２６２−２６７，２００２）。この明細書にて、特異的なインテグリン、αＶβ−３（αＶβ３）への甲状腺ホルモンの作用が、糖尿病性網膜症の発症において許容的であることが提唱される。インテグリンαＶβ３は、この明細書にて甲状腺ホルモンに対する細胞表面受容体として同定される。甲状腺ホルモン、並びにこのアナログ、重合体結合物はこの受容体を介して新脈管形成を誘発する。
【００７０】
（治療方法）
甲状腺ホルモンアナログ、重合形態物、並びに誘導体は、それを必要とする患者の新脈管形成を促進するための方法において使用することができる。この方法は、有効量の甲状腺ホルモンアナログ、重合形態物、並びに誘導体を低量の１日投与量で１週間以上の共投与を含む。この方法は心筋梗塞後に心臓機能を回復させるための治療として利用することもできる。またこの方法は、心筋虚血を患う冠動脈疾患を有する患者の血流、あるいは、血流の低下が問題となる、末梢動脈閉塞性疾患等の末梢血管疾患等、心臓以外の部位への血流不全を改善するために利用することもできる。
【００７１】
この化合物は、投与する化合物に適した、任意の医学的に受容可能な手段を介して投与することができ、これには経口、直腸経由、局所的、非経口（皮下、筋肉内、並びに静脈内を含む。）投与が含まれる。例えば、アデノシンの半減期は非常に短い。この理由から、アデノシンは静脈内投与されることが好ましい。しかし、はるかに長い半減期を持つアデノシンＡ．ｓｕｂ．２アナログが開発されており、これは他の手段を通じて投与することができる。甲状腺ホルモンアナログ、重合形態物、並びに誘導体は、例えば、静脈内、経口、局所的、鼻腔内投与することができる。
【００７２】
一部の実施形態において、この甲状腺ホルモンアナログ、重合形態物、並びに誘導体は別の手段を介して投与される。
【００７３】
新脈管形成を促進するのに効果的であるために必要とされる甲状腺ホルモン、そのアナログ、重合形態物、並びに誘導体の量は、当然ながら治療を受ける個人によって異なることとなり、最終的には医師の裁量となる。考慮すべき要因には、治療を受ける患者の状態、使用する特定のアデノシンＡ．ｓｕｂ．２受容体アゴニストの効力、処方物の性質、並びに患者の体重が含まれる。甲状腺ホルモンアナログ、その重合形態物、並びに誘導体の閉塞治療用量は、所望する効果が得られる任意の投与量である。
【００７４】
（処方物）
上記の化合物は、投与様式にとって受容可能な担体と共に、甲状腺ホルモンアナログあるいはその重合形態物、並びに誘導体を含有する処方物にて投与することが好ましい。意図する使用法に適した、当分野の技術者に一般に知られている、活性成分を含有する任意の処方物あるいは薬剤送達系を用いることができる。経口、直腸経由、局所的、あるいは非経口（皮下、腹膜内、並びに静脈内を含む。）投与に適した薬学的に受容可能な担体は、当分野の技術者に知られている。この担体は、処方物の他の成分に適合し且つこれの受容者に有害でないという意味において、薬学的に受容可能なものでなければならない。
【００７５】
非経口投与に適する処方物は、活性化合物の滅菌水性調製物を含有することが都合よく、これは受容者の血液と等張であることが好ましい。即ち当該処方物は、蒸留水、５％デキストロースの蒸留水あるいは生理食塩水溶液を含有することが都合よい。また有用な処方物には、式（Ｉ）の化合物を含有する濃縮液あるいは固体が含まれ、これは適切な溶媒で稀釈されて上記の非経口投与に適した溶液を供与する。
【００７６】
腸内投与については、一化合物を不活性担体内に取り込ませて、カプセル、カシェ剤、錠剤、あるいはロゼンジ等別々の単位物とすることができ、各々は粉末あるいは顆粒、もしくは例えばシロップ、エリキシル、乳剤あるいは頓服水剤の、水性液あるいは非水性液中の懸濁液あるいは溶液として、規定量の活性化合物を含有する。適切な担体は、澱粉あるいは糖類であることができ、滑沢剤、着香剤、結合剤、並びに同じ性質の他の物質を含有することができる。
【００７７】
錠剤は、随意で一つ以上の補助成分と共に、圧縮あるいは成形によって作ることもできる。圧縮錠剤は、粉末あるいは顆粒等の自由流動形態の活性化合物を、例えば結合剤、滑沢剤、不活性稀釈液、界面活性剤あるいは分散剤の補助成分と随意で混合して、適切な機械で圧縮することによって調製することもできる。成形錠剤は、粉末活性化合物と任意の適切な担体との混合物を、適切な機械で成形することによって作製することもできる。
【００７８】
シロップあるいは懸濁液は、活性化合物を、糖（例えばショ糖）の濃縮水性溶液に加えることによって作製することもでき、これにさらに任意の補助成分を加えることもできる。当該補助成分には、着香剤、糖の結晶化を遅らせるための薬剤、あるいは、例えばグリセロールあるいはソルビトールの多価アルコール等のような、任意の他の成分の溶解性を増大させるための薬剤を含めることができる。
【００７９】
直腸経由投与のための処方物は、例えばココアバターあるいはＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｓ５５（ドイツＤｙｎａｍｉｔｅ  Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌの商標。）の一般的な担体と併せて座薬として与えることもできる。
【００８０】
あるいは、この化合物をリポソームあるいはミクロスフェア（あるいは微粒子）として投与することもできる。患者へ投与するためのリポソーム及びミクロスフェアを調製するための方法は、当分野の技術者に周知されている。参考のためその内容をこの明細書に援用してある米国特許第４，７８９，７３４号は、生物性物質をリポソームにカプセル化するための方法を記載している。基本的には、この物質を水性溶液に溶解し、適切なリン脂質及び脂質を加え、さらに必要に応じて界面活性剤を加えて、必要であればその物質を透析あるいは超音波処理する。公知の方法の総説は、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」，Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７〜３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９）によって提供されている。
【００８１】
ポリマーあるいはタンパク質から形成されるミクロスフェアは当分野の技術者に周知されており、消化管を通過して直接血流に輸送されるよう適合させることができる。あるいは、この化合物はミクロスフェアあるいはミクロスフェアから成る複合体内に取り込ませることができ、数日から数か月の期間に渡って緩やかに放出させるために移植することができる。例えば米国特許第４，９０６，４７４号並びに同第４，９２５，６７３号、同第３，６２５，２１４号、及びＪｅｉｎ，ＴＩＰＳ  １９：１５５−１５７（１９９８）を参照する。これらの内容を参考のためこの明細書に援用する。
【００８２】
一実施形態において、この甲状腺ホルモンアナログあるいはその重合形態物及びアデノシン誘導体は、リポソームあるいは微粒子内に処方することができ、これは静脈内投与後に毛細血管床に入り込むのに適した大きさとされる。このリポソームあるいは微粒子を虚血組織周囲の毛細血管床内に入り込ませる場合、薬剤を最も効果が得られ得る部位に局所的に投与することができる。標的とする虚血組織に適切なリポソームは一般に約２００ナノメーター未満であり、また典型的には、単層の送達担体であり、例えばＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒに対する「Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ」と表題された米国特許第５，５９３，６８８号にて開示されるもののようである。この内容を参考のためこの明細書に援用する。
【００８３】
微粒子はポリグリコリド、ポリラクチド、並びにこれらの共重合体等、生分解性ポリマーから調製されたものであることが好ましい。当分野の技術者は、所望する薬剤放出速度並びに所望する投与量等様々な要因に応じて適切な担体系を容易に決定することができる。
【００８４】
一実施形態において、この処方物はカテーテルを介して直接血管内部に投与される。この投与は、例えばカテーテルの孔を通過して行うことができる。活性化合物が比較的長い半減期（およそ１日から１週間あるいはそれを超える）を有するこれらの実施様態では、処方物を、Ｈｕｂｂｅｌらに対する米国特許第５，４１０，０１６号にて開示されるもの等、生分解性ポリマーハイドロゲル内に包含させることができる。これらのポリマーハイドロゲルは組織管腔内部に送達させることができ、活性化合物は時間経過と共にポリマー分解物として放出されることができる。所望する場合、このポリマーハイドロゲルは内部に分散する活性化合物を包含する微粒子あるいはリポソームを含有することができ、これは活性化合物徐放のための別の機構を提供する。
【００８５】
この処方物は便宜のため単位投与量形態として与えることができ、薬学の分野で周知されている任意の手法によって調製することができる。全ての手法には、一つ以上の補助成分から構成される担体に活性化合物を会合させる手順が含まれる。一般にこの処方物は、活性化合物を液体担体あるいは微細に分割された固体担体に均一且つ完全に会合させ、必要であれば、この生成物を所望する単位投与量の形態に成形することによって調製される。
【００８６】
この処方物は、随意で、成長因子（ＴＧＦ−ベータ、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子αおよびβ（ＴＧＦα、並びにβ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子／血管透過因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）を含む）、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、鎮痛剤、脈管形成剤、並びに細胞接着分子等の種々の生物活性物質などの追加の成分を含有することができる。
【００８７】
先述の成分に加えてこの処方物はさらに、例えば、稀釈剤、緩衝液、着香料、結合剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、懸濁剤、保存剤（抗酸化剤を含む。）等、薬学的処方物の分野で利用される一つ以上の随意の補助成分を含有する場合もある。
【００８８】
（材料と方法）
試薬：試薬は全て化学等級のものであり、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から、もしくはＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ）を通じて購入した。コルチゾン酢酸塩、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びゼラチン溶液（２％ウシ皮膚由来のＢ型）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入した。ニワトリ受精卵はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＰＡＦＡＳ  Ａｖｉａｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＆  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｎｏｒｔｈ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＣＴ）から購入した。Ｔ４、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−サイロニン（Ｔ３）、テトラヨードサイロ酢酸（テトラック）、Ｔ４−アガロース、及び６−Ｎ−プロピル−２−チオウラシル（ＰＴＵ）はＳｉｇｍａから入手し、ＰＤ９８０５９はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから、またＣＧＰ４１２５１はＮｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ（スイス、Ｂａｓｅｌ）から入手した。ポリクローナル抗ＦＧＦ２およびモノクローナル抗βアクチンはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手し、ヒト組換えＦＧＦ２はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。リン酸化ＥＲＫ１／２に対するポリクローナル抗体はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから、またヤギ抗ウサギＩｇＧはＤＡＫＯから入手した。
【００８９】
新脈管形成の漿尿膜（ＣＡＭ）モデル：生体内の新生血管形成を、以前に記載した方法によって調べた。９〜１２ケの１０日目ニワトリ胚をＳＰＡＦＡＳ（Ｐｒｅｓｔｏｎ，  ＣＴ）から購入し、相対湿度５５％、３７℃で培養した。皮下注射針を使用して気嚢を覆う殻に小さな孔をあけ、別の孔を、卵の幅の広い側の、検卵によって同定した胚膜の無血管部位の真上に作った。最初の孔で陰圧を掛けることによって、２番目の孔の下に偽気嚢を作出した。これによってＣＡＭは殻から分離する。小型の工作用研摩盤（Ｄｒｅｍｅｌ，ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．）で約１．０ｃｍ２の窓を、分離したＣＡＭを覆う殻に刻み、内部のＣＡＭを直接操作できるようにした。１０日目胚のＣＡＭに新たな血管枝を誘導するため、ＦＧＦ２（１μｇ／ｍＬ）を標準脈管形成促進薬剤として使用した。Ｎｏ．１フィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）滅菌ディスクを３ｍｇ／ｍＬの酢酸コルチゾン及び１ｍｍｏｌ／ＬのＰＴＵで前処理し、滅菌条件下で風乾した。次に甲状腺ホルモン、ホルモンアナログ、ＦＧＦ２、もしくはコントロール溶媒、並びに阻害剤をこのディスクに塗布し、乾燥させた。次にこのディスクをＰＢＳ中で懸濁し、成長中のＣＡＭの上に置いた。３日間のインキュベーションの初日に、Ｔ４あるいはＦＧＦ２で処理したフィルターを置き、記載したように３０分後、ＦＧＦ２に対する抗体を選択した試料に加えた。また２４時間目に、ＭＡＰＫカスケード阻害剤であるＰＤ９８０５９を、このフィルターディスクによって局所的にＣＡＭに与えた。
【００９０】
ＣＡＭ切片の顕微鏡分析：相対湿度５５％、３７℃で３日間インキュベートした後、コントロール及び処理を行ったＣＡＭ試料から、各フィルターディスク直下のＣＡＭ組織を切除した。組織は３回のＰＢＳで洗浄して３５ｍｍのペトリ皿（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）内に置き、ＳＶ６実体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下５０倍で検鏡した。フィルターに曝露したＣＡＭ切片のデジタル画像を、３電荷結合素子カラービデオカメラシステム（Ｔｏｓｈｉｂａ）を使用して集積し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）で解析した。各フィルターディスクと同じ面積の円形区域内にある血管の分岐点の数を計数した。１つの画像を各ＣＡＭ調製物において数え、８から１０個のＣＡＭ調製物から得られた結果を各処理条件（甲状腺ホルモンあるいはアナログ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ２抗体、ＰＤ９８０５９）について分析した。さらに、各実験は３回行った。得られた新脈管形成指数は、各試料組にて新しくできた分岐点の平均値±ＳＥＭである。
【００９１】
ＦＧＦ２分析：ＥＣＶ３０４内皮細胞を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＭ１９９培地で培養した。ＥＣＶ３０４細胞（細胞数１０６）を０．２％ゲルでコーティングした２４ウェルプレートに、完全培地中で一晩プレーティングした。次にこの細胞を、血清を含まない培地で洗浄し、記載したようにＴ４あるいはＴ３で処理した。７２時間後にその上清を回収し、稀釈せずに市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＦＧＦについての分析を行った。
【００９２】
ＭＡＰＫ活性化：ＥＣＶ３０４内皮細胞を、０．２５％のホルモン除去血清１３を加えたＭ１９９培地で２日間培養した。次に細胞をＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）で１５分間から６時間処理した。追加実験にて、細胞をＴ４あるいはＦＧＦ２、もしくはＰＤ９８０５９あるいはＣＧＰ４１２５１存在下にＴ４で処理した。以前に報告した我々の方法によって全試料から核画分を調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってタンパク質を分離し、リン酸化ＥＲＫ１／２に対する抗体を使用する免疫ブロッティングのためにメンブランへ移した。核リン酸化ＥＲＫ１／２が存在することによって、Ｔ４によるこれらＭＡＰＫイソ型体の活性化が示される。
【００９３】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応：１０ｃｍプレート内のコンフルエントＥＣＶ３０４細胞をＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）で６時間から４８時間処理し、イソチオシアン酸グアニジニウム（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（１μｇ）で、Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。全ＲＮＡは４８℃で４５分間ｃＤＮＡに逆転写し、次に９４℃で２分間変性させた。二次ストランドの合成とＰＣＲ増幅は４０サイクル行い、９４℃で３０秒間変性、６０℃で６０秒間アニーリング、６８℃で１２０秒間伸張し、全サイクル終了後に６８℃で７分間、最終伸張を行った。ＦＧＦ２に対するＰＣＲプライマーは次のとおりである。：ＦＧＦ２センス鎖５’−ＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖５’−ＣＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号２）、ＰＣＲ産物の長さは７３４ｂｐ。ＧＡＰＤＨに対するプライマーには、センス鎖５’−ＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧ−３’（配列番号３）、及びアンチセンス鎖５’−ＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡ−３’（配列番号４）が含まれ、ＰＣＲ産物の長さは２１８ｂｐであった。ＲＴ−ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルの電気泳動によって分離し、臭化エチジウムで視覚化した。このゲルの標的とするバンドを、ＬａｂＩｍａｇｅソフトウェア（Ｋａｐｅｌａｎ）を使用して定量し、各時点にて［ＦＧＦ２／ＧＡＰＤＨ］Ｘ１０の値を算出した。
【００９４】
統計分析：試験試料をコントロール試料と比較する一元分散分析によって、統計分析を行った。
【００９５】
マウス体内の、ＦＧＦ２あるいは癌細胞系マトリゲル移植組織におけるインビボ新脈管形成：インビボマウス新脈管形成モデル：以前に記載された方法（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）に従い、また我々の実験室にて行われたように（Ｐｏｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）マウスマトリゲルモデルを実行する。短くまとめると、成長因子を含まないマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）を４℃で一晩溶解し、氷上に置く。マトリゲルの分割物を冷却したポリプロピレン試験管に入れ、ＦＧＦ２もしくは甲状腺ホルモンアナログ、癌細胞（細胞数１Ｘ１０６）をこのマトリゲルに加える。マトリゲルに生理食塩水、もしくはＦＧＦ２、甲状腺ホルモンアナログ、癌細胞を加えたものを、マウスの腹側正中線内に皮下注入する。１４日目にこのマウスを屠殺し、固形化したゲルを切除して新たな血管の存在について分析する。化合物Ａ〜Ｄを異なる投与量で皮下接種する。コントロールゲル移植組織並びに試験ゲル移植組織を、０．５ｍｌの細胞溶解液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むマイクロ遠心チューブに入れ、乳棒で破砕する。次にこのチューブを４℃で一晩インキュベートし、翌日、１，５００Ｘ  ｇで１５分間遠心分離機に掛ける。各試料につき、２００μｌの細胞溶解物部分標本を１．３ｍｌのＤｒａｂｋｉｎの試薬溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓ，ＭＯ）に加える。この溶液を分光光度計にて、５４０ｎｍで分析する。吸光度は試料に含まれるヘモグロビン量に比例する。
【００９６】
腫瘍増殖と転移−ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）腫瘍移植組織モデル：実験手順は以前に記載された通りである（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。短くまとめると、１Ｘ１０７の腫瘍細胞を各ＣＡＭ（７日目胚）の表面に置き、一週間インキュベートする。その結果生じる腫瘍を切除して５０ｍｇの断片に切る。また別の各群につき１０個のＣＡＭに、これらの断片を置き、翌日、ＰＢＳに溶解した化合物（Ａ〜Ｄ）２５μｌを局所的に処理する。７日後、腫瘍をこの卵から切除し、各ＣＡＭについて腫瘍重量を測定する。図８はＣＡＭインビボ腫瘍増殖モデルに含まれる各段階を示す簡略図解である。
【００９７】
癌細胞系の腫瘍増殖速度、腫瘍新脈管形成、及び腫瘍転移に及ぼす、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、並びに甲状腺ホルモン拮抗体の影響を測定することができる。
【００９８】
腫瘍増殖と転移−マウス腫瘍異種移植片モデル：このモデルは、Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｖａｎ  Ｗａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、並びにＡｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１による我々の出版物にて記載されており、各々を参考のためこの明細書にその全体を援用する。様々な投与量で、様々な腫瘍タイプに対する、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、並びに他の甲状腺ホルモン拮抗体の抗癌効果を判定し、比較することができる。
【００９９】
腫瘍増殖と転移−転移の実験モデル：このモデルは、我々の最近の出版物に記載されているものである（Ｍｏｕｓａ，２００２、Ａｍｉｒｋｈｏｓｒａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａと２００３ｂ。各々を参考のため、この明細書にその全体を援用する。）。短くまとめると、Ｂ１６マウス悪性黒色腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）及び他の癌細胞系を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内で培養する。細胞は集密度が７０％となるまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）で回収してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。転移実験のために、細胞を各々２．０Ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度にＰＢＳで再懸濁する。この実験では、体重１８〜２１グラムの動物：Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）を使用する。全ての手順はＩＡＣＵＣ並びに研究所ガイドラインに従う。様々な投与量で、様々な腫瘍タイプに対する、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、並びに他の甲状腺ホルモン拮抗体の抗癌効果を判定し、比較することができる。
【０１００】
（甲状腺ホルモンアナログの新脈管形成に対する影響）
ＣＡＭモデルにおいてＴ４は、新脈管形成指数（基準に対する増加倍数）の著しい増加を誘導した。１μｇのＦＧＦ２によって新脈管形成指数は２〜３倍増加するのと比較して、Ｔ３は０．００１〜１．０μＭで、Ｔ４は０．１〜１．０μＭで、新脈管形成指数の２〜２．５倍増を生じる最大効果に達した（表１並びに図１ａ並びに１ｂ）。Ｔ４の新脈管形成促進効果（新脈管形成指数の２〜２．５倍増加）は、Ｔ４からＴ３への転換を阻害するＰＴＵが存在する場合でも、存在しない場合でも達成された。ＣＡＭモデルにてＴ３自体は、９１〜１００  ｎＭで強力な新脈管形成促進効果を誘発した。Ｔ４アガロースはＴ４と同様の新脈管形成促進効果を生じた。Ｔ４あるいはＴ４アガロースによる脈管形成促進効果は、ＴＥＴＲＡＣあるいはＴＲＩＡＣによって１００％阻害された。
【０１０１】
（最適下濃度のＴ４による、ＦＧＦ２の脈管形成促進効果の増進）
最適下濃度のＴ４及びＦＧＦ２の組み合わせによって新脈管形成指数の相加的増加がみられ、ＦＧＦ２あるいはＴ４の最大新脈管形成促進効果と同程度に達した（図２）。
【０１０２】
（ＣＡＭモデルにおける、Ｔ４並びにＦＧＦ２の脈管形成促進作用に対するＭＡＰＫカスケード阻害剤の影響）
Ｔ４あるいはＦＧＦ２の新脈管形成促進効果は、０．８〜８μｇのＰＤ９８０５９によって完全に阻害された（図３）。
【０１０３】
（ＣＡＭモデルにおける、Ｔ４並びにＦＧＦ２の脈管形成促進作用に対する特異的インテグリンαｖβ３拮抗薬の影響）
Ｔ４あるいはＦＧＦ２の新脈管形成促進効果は、１０μｇの特異的なモノクローナル抗体ＬＭ６０９によって完全に阻害された（図４ａ並びに４ｂ）。
【０１０４】
様々な成長因子及び他の新脈管形成促進剤あるいは抑制剤の脈管形成活性を確認するためにＣＡＭアッセイを用いてきた（２〜９）。これらの研究において、生理学的濃度のＴ４は、ＦＧＦ２の活性に匹敵する脈管形成活性を示した。ＰＴＵが存在してもＴ４の効果が減少せず、これは、このモデルにおいてＴ３を生じるＴ４の脱ヨウ素化が必要条件ではないことを示唆した。このモデルでは新たな血管の成長が現れるのに数日必要なため、甲状腺ホルモンの効果は甲状腺ホルモンに対する核受容体（ＴＲ）との相互作用に全面的に依存すると推測した。ＴＲと自然界でのリガンドであるＴ３との核内複合体形成を必要とするヨードサイロニンの作用は本来ゲノム性であり、最終的には遺伝子発現に繋がる。一方、このモデルの系の、ＴＲの自然界でのリガンドであるＴ３ではなくＴ４に対する選択的反応によって、新脈管形成は非ゲノム的に原形質膜にてＴ４によって発動され、最終的に遺伝子転写を必要とする効果に繋がるという可能性が上昇した。Ｔ４の非ゲノム性作用は広く記載されており、通常原形質膜で発動されてシグナル伝達経路によって仲介される可能性がある。この作用はヨードサイロニンとＴＲとの核内リガンド結合を必要としないが、遺伝子転写を調整するあるいは調節する可能性がある。また、ステロイドの非ゲノム性作用はよく記載されており、ステロイドあるいは他の化合物のゲノム性作用を調整することがわかっている。Ｔ４及びテトラック、あるいはアガロースＴ４を用いて行った実験によって、Ｔ４の脈管形成促進効果は、原形質膜で発動される可能性が極めて高いことが示唆された。我々は、テトラックが膜で発動されるＴ４の効果を阻害するが、それ自体はシグナル伝達を活性化しないことを他で示している。このように、テトラックは甲状腺ホルモンの非ゲノム性作用に対するプローブである。アガロースＴ４は細胞内部に入らないと考えられ、我々並びに他の研究者はホルモンの細胞表面発動性作用の可能性について、モデルを試験するのに使用している。
【０１０５】
これらの結果は甲状腺ホルモンによるＭＡＰＫ活性化がもたらすもう一つの結果が新たな血管の成長であることを示唆している。後者は、非ゲノム的に開始されるが、当然結果として複雑な遺伝子転写プログラムを必要とする。
【０１０６】
甲状腺ホルモンの周囲濃度は比較的安定している。我々が実験を行った時点で、このＣＡＭモデルは甲状腺欠損状態にあり、完全な生物体を再生することのない系とみなすことができる。我々は循環濃度のＴ４が、他の様々な調節因子と共に、ＶＥＧＦ並びにＦＧＦ２等の内生脈管形成性因子に対する血管の感受性を調節する役割のあることを提唱する。
【０１０７】
本発明は以下の限定を設けない実施例において詳細を説明する。
【実施例】
【０１０８】
（実施例１．甲状腺ホルモンの新脈管形成に対する影響）
図１Ａで示し、図１Ｂでまとめたように、ＣＡＭアッセイにてＬ−Ｔ４とＬ−Ｔ３の双方が新脈管形成を増進した。Ｔ４は、培地中に０．１μｍｏｌ／Ｌの生理学的全濃度で、血管分枝の形成を２．５倍（ｐ＜０．００１）増加させた。Ｔ３（１ｎｍｏｌ／Ｌ）もまた新脈管形成を２倍に促進した。細胞性５’−モノデヨージナーゼによってＴ４はＴ３に転換されるため、Ｔ４が効力を有するだけであるという可能性は、デヨージナーゼ阻害剤のＰＴＵが、Ｔ４によって生じる新脈管形成に対する阻害効果を持たないという結果によって除かれた。ＰＴＵはＣＡＭモデルにて使用した全てのフィルターディスクに添加した。このように、Ｔ４並びにＴ３は、成長因子分析のためにこれまでに標準化されているＣＡＭモデルにおいて、新たな血管分枝の形成を促進する。
【０１０９】
（実施例２．Ｔ４−アガロース及びテトラックの影響）
我々は先にＴ４アガロースが、Ｔ４と同じ様式で、原形質膜で開始される細胞性シグナル伝達経路を刺激し、Ｔ４及びＴ４アガロースの作用は、Ｔ４の原形質膜への結合を阻害することがわかっている脱アミノ化ヨードサイロニンアナログであるテトラックによって阻害されることを示した。ＣＡＭモデルにおいて、テトラック（０．１μｍｏｌ／Ｌ）を加えるとＴ４の作用が抑制されるが（図２Ａ）、テトラック単独では新脈管形成への影響は持たなかった（図２Ｃ）。ＣＡＭモデルにおいて、０．１μｍｏｌ／Ｌのホルモン濃度で加えたＴ４−アガロースの作用はＴ４の作用と同程度であり（図２Ｂ）、Ｔ４−アガロースの効果もテトラックの作用によって阻害された（図２Ｂ。２Ｃにまとめてある。）。
【０１１０】
（実施例３．最大下濃度のＴ４による、ＦＧＦ２の脈管形成活性の増強）
新脈管形成は通常、ポリペプチド成長因子の係わりを必要とする複雑な過程である。ＣＡＭアッセイでは、血管の成長を証明するのに少なくとも４８時間を必要とする。即ち、このモデルにおける甲状腺ホルモンの明白な原形質膜効果は、このホルモンに対する複雑な転写反応に帰結する模様である。よって、我々は、ＦＧＦ２がホルモン反応に係わるか否か、またこのホルモンが生理学的濃度を下回る濃度にあるこの成長因子の効果を強化する可能性があるか否かを調べた。Ｔ４（０．０５μｍｏｌ／Ｌ）及びＦＧＦ２（０．５μｇ／Ｌ）は、個々に中程度にまで新脈管形成を促進した（図３）。この最高下濃度ＦＧＦ２の脈管形成性効果は生理学的下濃度のＴ４によって、１．０μｇのＦＧＦ２単独によって引き起こされる程度にまで増強された。このように、最大下濃度のホルモン及び成長因子の効果は相加的である模様である。甲状腺ホルモンの新脈管形成刺激における、さらに正確なＦＧＦ２の役割を確定するため、ＦＧＦ２に対するポリクローナル抗体を、ＦＧＦ２あるいはＴ４で処理したフィルターに加え、７２時間後に新脈管形成を測定した。図４は、外来ＦＧＦ２が存在しない状態で、ＦＧＦ２抗体がＦＧＦ２あるいはＴ４によって刺激された新脈管形成を抑制したことを示しており、これはＣＡＭアッセイにおけるＴ４の影響が、ＦＧＦ２の発現増加によって仲介されていることを示唆している。コントロールＩｇＧ抗体は、このＣＡＭアッセイにおいて促進効果も阻害効果も持たない。
【０１１１】
（実施例４．甲状腺ホルモンによる、内皮細胞のＦＧＦ２放出刺激）
Ｔ４（０．１μｍｏｌ／Ｌ）もしくはＴ３（０．０１μｍｏｌ／Ｌ）で３日間処理したＥＣＶ３０４内皮細胞の培地中のＦＧＦ２濃度を測定した。表２で示したように、Ｔ３は培地中のＦＧＦ２濃度を３．６倍に刺激し、一方Ｔ４は１．４倍の増加をもたらした。この結果は甲状腺ホルモンが、内皮細胞に有用な成長因子濃度を増加させることによって、ＦＧＦ２の脈管形成効果を少なくとも部分的には増強している可能性を示唆する。
【０１１２】
（表２．ＥＣＶ３０４内皮細胞からのＦＧＦ２放出に対するＴ４並びにＴ３の影響）
【０１１３】
【化２】
2007505837.tif 000002
＊Ｐ＜０．００１、Ｔ３処理試料とコントロール試料との分散分析による比較。
†Ｐ＜０．０５、Ｔ４処理試料とコントロール試料との分散分析による比較。
【０１１４】
（実施例５．甲状腺ホルモン並びにＦＧＦ２による新脈管形成促進におけるＥＲＫ１／２シグナル伝達経路の役割）
Ｔ４が細胞に非ゲノム性効果を作用させることによる経路は、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードであり、具体的にはＥＲＫ１／２活性化の経路である。我々は、Ｔ４が上皮成長因子によるＥＲＫ１／２活性化を増進することを知っている。甲状腺ホルモンによるＦＧＦ２発現促進におけるＭＡＰＫ経路の役割を、チロシン−スレオニンリン酸化酵素であるＭＡＰＫキナーゼ１（ＭＥＫ１）及びＭＥＫ２によるＥＲＫ１／２活性化の阻害剤であるＰＤ９８０５９（２から２０μｍｏｌ／Ｌ）を使用することによって試験した。この表にあるデータは、Ｔ４あるいはＴ３で処理したＥＣＶ３０４内皮細胞から放出されるＦＧＦ２の増加を、ＰＤ９８０５９が効果的に遮断したことを示している。同時に、ＣＡＭアッセイにてＥＲＫ１／２阻害の実験を行った。代表的な結果を図５に示す。各々生理学的濃度のＴ３及びＴ４を組み合わせると、血管分枝が２．４倍増加した。この効果は３μｍｏｌ／ＬのＰＤ９８０５９によって完全に阻害された（図５Ａ）。ＦＧＦ２の分枝形成促進（２．２倍）も、このＥＲＫ１／２活性化の阻害剤によって効果的に阻害された（図５Ｂ）。このように、甲状腺ホルモンの脈管形成促進効果は原形質膜で開始され、内皮細胞からのＦＧＦ２の放出を促進するＥＲＫ１／２経路の活性化を伴う。ＥＲＫ１／２活性化は、ＦＧＦ２シグナルを変換するのに再び必要とされ、これによって新たな血管が形成される。
【０１１５】
（実施例６．ＭＡＰＫ活性化に対する甲状腺ホルモン及びＦＧＦ２の作用）
ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫｓのリン酸化並びに核への移行の促進を、Ｔ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）で１５分から６時間処理したＥＣＶ３０４細胞にて調べた。Ｔ４処理の１５分内にリン酸化ＥＲＫ１／２が細胞核内に現れて３０分で最大濃度に達し、６時間目でも依然確認された（図６Ａ）。ＰＤ９８０５９はＭＡＰＫリン酸化酵素によるＥＲＫ１／２のリン酸化を阻害するので予測される結果であるが、このホルモンのこの効果はＰＤ９８０５９によって阻害された（図６Ｂ）。また、別の細胞系のＴ４処理でみられたように、従来のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）−α、ＰＫＣ−β、及びＰＫＣ−γ阻害剤であるＣＧＰ４１２５１もこれらの細胞にて、ＭＡＰＫ活性化に対するこのホルモンの効果を阻害した。甲状腺ホルモンは、インターフェロンγ１３並びに上皮成長因子等、いくつものサイトカイン並びに成長因子の作用を強化した。ＥＣＶ３０４細胞において、Ｔ４は共にインキュベートして１５分でＦＧＦ２によるＭＡＰＫ活性化を強化する（図６Ｃ）。ＥＣＶ３０４細胞での観察結果をＣＡＭモデルに採り入れ、我々はこのホルモンが新脈管形成を誘導する起因となる複雑な機構には、内皮細胞によるＦＧＦ２の放出及び、新脈管形成に対する放出されたＦＧＦ２の自己分泌効果の増大が含まれることを提唱する。
【０１１６】
（実施例７．甲状腺ホルモンで処理したＥＣＶ３０４細胞のＲＴ−ＰＣＲ）
Ｔ４の脈管形成促進作用の機構の研究にて取り組んだ最後の疑問は、このホルモンがＦＧＦ２遺伝子の発現を誘発することができるか否かであった。内皮細胞をＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）で６から４８時間処理し、ＲＴ−ＰＣＲに基づいたＦＧＦ２及びＧＡＰＤＨ  ＲＮＡ（ｃＤＮＡ測定値から推定される。図７）の評価を実施した。ＧＡＰＤＨ量に関して補正したが、６時間のホルモン処理によってＦＧＦ２  ｃＤＮＡ量は明白に増加し、さらに４８時間まで増大した。
【０１１７】
（実施例８Ａ．マウスの網膜新生血管形成モデル（糖尿病性並びに非糖尿病性））
網膜新生血管形成に関して試験物の薬理学的活性を調べるため、乳仔マウスを高酸素環境に７日間曝露して回復させる。これによって網膜上にて新たな血管形成が促進される。網膜新生血管形成が抑制されたか否かを判定するため、試験物を評価する。この網膜をヘマトキシリン−エオシン染色法及び新生血管形成を明らかにする少なくとも一つの染色法（通常はセレクチン染色）で試験した。他の染色法（ＰＣＮＡ、ＰＡＳ、ＧＦＡＰ、新脈管形成のマーカー等）を用いることができる。以下が、このモデルについての概略である。
【０１１８】
（動物モデル）
・乳仔マウス（Ｐ７）及びその雌親を、高酸素付加環境内（７０〜８０％）に７日間置く。
・Ｐ１２において、このマウスを加酸素環境から出し、通常環境内に置く。
・マウスを５〜７日間回復させる。
・次にマウスを屠殺して眼を採集する。
・眼は必要に応じて凍結するかあるいは固定する。
・適切な組織化学染色液で眼を染色する。
・適切な免疫組織化学染色液で眼を染色する。
・血液、血清、もしくは他の組織を採集することができる。
・特に微細血管変化に関して、任意且つ全ての所見について眼を調べる。新生血管の成長は、準定量的に評価されることとなる。また画像分析も利用できる。
【０１１９】
（実施例８Ｂ．甲状腺ホルモンと糖尿病性網膜症）
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発実験的糖尿病及び糖尿病性網膜症を有するラットへのテトラックの投与については、Ｊ  ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８０：４５４−４５９，１９９７にて記載されている実験手順を使用する。エンドポイントは、テトラックによる増殖性網膜症出現（新脈管形成）の抑制である。
【０１２０】
（実施例９．インビトロヒト上皮創傷治癒並びに線維芽細胞創傷治癒）
インビトロ二次元創傷治癒法は、Ｍｏｈａｍｅｄ  Ｓ、Ｎａｄｉｊｃｋａ  Ｄ、Ｈａｎｓｏｎ，ＶによるＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｌｌ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ ２０：９７３−９７５；１９８６に記載されているもので、参考のためその全体をこの明細書に援用する。さらに、既に我々の研究室にて確立されている三次元創傷治癒法をこの実験で利用する（以下を参照。）。データは、甲状腺ホルモンによって創傷治癒が強力に促進されることを示す。
【０１２１】
（ヒト真皮線維芽細胞のインビトロ３Ｄ創傷治癒アッセイ）
手順１：収縮コラーゲンゲルを調製する。
１）２４ウェルプレートを３５０μｌの２％ＢＳＡで、室温で２時間コーティングする。２）集密度８０％のＮＨＤＦ（正常ヒト真皮線維芽細胞、５〜９代目）をトリプシン処理し、増殖培地で中和して遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄する。
３）コラーゲン−細胞混合物を調製する。緩やかに撹拌し、常に氷上で行う。
【０１２２】
【化３】
2007505837.tif 000003
４）２４ウェルプレートから２％ＢＳＡを除き、コラーゲン−細胞混合物を各ウェル当たり３５０μｌ加え、このプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養する。
５）１時間後に、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ培池を各ウェル当たり０．５ｍｌ加える。１０μｌのチップを使用する。各ウェルの端からコラーゲンゲルを剥がし、２日間培養する。線維芽細胞はこのコラーゲンゲルと連絡することとなる。
手順２：３Ｄフィブリン創傷クロットの調整及び創傷コラーゲン包埋培養
１）試験試薬を加えた、もしくは加えないフィブリノーゲン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製する。エッペンドルフチューブ内に各ウェルにつき３５０μｌのフィブリノーゲン溶液。
【０１２３】
【化４】
2007505837.tif 000004
２）中央部分から各収縮コラーゲンゲルをハサミで切断する。このゲルをＰＢＳで洗浄し、ゲルを２４ウェルプレートの各ウェル中央に移す。
３）各試験管に１．５μｌのヒトトロンビン（０．２５Ｕ／μｌ）を加える。よく混合してコラーゲンゲル周囲にその溶液を加える。この溶液は１０分で重合することとなる。
【０１２４】
２０分後、試験試薬を加えたもしくは加えないＤＭＥＭ＋１％（あるいは５％）ＦＢＳを、４５０μｌ／ウェル加え、プレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターで５日目まで培養する。毎日写真を撮る。
【０１２５】
（糖尿病ラットにおけるインビボ創傷治癒）
糖尿病ラットの急性切創モデルを使用して、甲状腺ホルモンアナログ及びその結合形態物の影響を試験した。３〜２１日目、傷口が閉じる速度、破断強度分析、及び組織学検査を定期的に行った。
【０１２６】
（実施例１０．齧歯類の心筋梗塞モデル）
心筋梗塞の冠動脈結紮モデルを使用して、ラットの心臓機能を調べる。ラットは最初にキシラジン及びケタミンで麻酔し、適切な知覚麻痺が得られた後、気管に挿管して陽圧換気を開始する。この動物は、四肢を緩くテープで留めた状態で仰向けに置き、正中胸骨切開を行う。心臓を穏やかに体外に摘出し、冠動脈左前下行枝周囲に６−Ｏ縫合糸を堅固に縛る。心臓を素早く胸部に戻して３−Ｏパースストリング縫合（ｐｕｒｓｅ  ｓｔｒｉｎｇ  ｓｕｔｕｒｅ）で開胸口を閉じ、結節縫合あるいはサージカルクリップで皮膚を閉じる。動物を温度調節した加温パッドに置き、回復の過程を注意深く観察する。必要であれば酸素を追加し、また心肺蘇生術を施す。回復後、このラットを動物飼育設備に戻す。このようなラットの冠動脈結紮によって、大きな前壁心筋梗塞ができる。この手法の４８時間の死亡率は５０％に上る可能性があり、この手法によってできる梗塞の大きさにはばらつきがある。こうした考察及びこれまでの実験に基づくと、次に議論される甲状腺ホルモン送達の２つのモデルを比較できるよう、大きな梗塞を有する１６〜２０のラットを得るために、およそ４００のラットが必要である。
【０１２７】
これらの実験は、無傷動物にて冠動脈結紮の前あるいは後で、甲状腺ホルモンの全身投与が、心エコー検査並びに血流動態測定によって検査される血流動態異常の程度並びに梗塞部大きさの減少を含む、有益な効果をもたらすことを示すように企画される。梗塞後３週間目に転帰の測定が計画される。一部のラットが梗塞を持たない、あるいは小さな梗塞しか生じない場合もあり、これらのラットは正常心エコー検査結果並びに正常血流動態（ＬＶ拡張終期血圧＜８ｍｍ  Ｈｇ）によって同定することができる。
【０１２８】
（甲状腺ホルモンの送達）
２つの送達方法がある。一つ目は、甲状腺ホルモンを直接、梗塞した心筋周辺部分に注入する。急性開胸閉鎖の間、正常心筋と虚血心筋との間の境界は容易に同定できることから、この方法によって、脈管形成効果を検出するのに十分なホルモンの送達が得られる。
【０１２９】
第一のモデルは冠動脈バイパス手術を受ける患者に有用であり、一回の局所的な注入が新脈管形成を誘発するという原則を検証するものであるが、第二のモデルを用いるより広範囲な投与法も利用することができる。第二のモデルでは、心筋梗塞を誘発させる前の麻酔したラットの左心室に、頚動脈を介して逆行性カテーテルを挿入する。あるいは、大動脈弁のすぐ上方で大動脈直接穿刺を行う。冠動脈の始点上方で数秒間大動脈を突然閉塞させることにより、甲状腺ホルモンの冠動脈内への投入が刺激され、これによって等容性収縮が発生する。次に、大動脈が収縮した直後に、甲状腺ホルモンを左心室あるいは大動脈に注入する。結果生じる等容性収縮が、甲状腺ホルモンと共に血液を、心筋全体を灌流する冠血管下方へ推し進める。この手法は効果を得るのに必要な回数行うことができる。注入回数は用いる投与量及び新たな血管の形成状況に応じて異なる。
【０１３０】
（心エコー検査）
麻酔をしていないラットの２−Ｄ及びＭモード心エコー図を得るための方法が開発されている。左心室の大きさ、機能、壁の厚み、並びに壁運動を、再現性よく確実に測定することができる。これらの測定は甲状腺ホルモン投与に関する偏向を除くため、盲検様式で行われる。
【０１３１】
（血行動態）
血行動態測定法を用いて、左心室障害の程度を判定する。ラットをイソフルランで麻酔する。右前頚部にそって切開して右頚動脈及び右頚静脈血管を取り出し、圧変換カテーテル（Ｍｉｌｌｅｒ，ＳＰＲ−６１２，１．２Ｆｒ）を用いてカニューレを挿入する。次に以下の測定を行う。：心拍数、収縮期及び拡張期血圧、平均動脈圧、左心室収縮期圧及び拡張終期圧、並びに＋及び−ｄＰ／ｄｔ。特に有用なのは左心室拡張終期圧の測定であり、これの進行的な上昇は心筋損傷の程度に比例する。
【０１３２】
（梗塞部の大きさ）
ＴＴＣ法を用いた梗塞部分の大きさの測定のため、ラットを屠殺する。
【０１３３】
（形態測定）
梗塞部分内部、梗塞周辺部、及び通常後壁となる梗塞部反対側の残存する心筋内の、微小血管密度（微小血管数／ｍｍ２）を測定する。Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、各ラットの筋細胞横断切片の、７〜１０の顕微鏡高出力視野（Ｘ４００）をデジタルで録画する。盲検調査者が微小血管を計数する。微小循環は、三次細動脈を除く、直径１５０マイクロメーター以下の血管群と定義され、これは細動脈と細静脈との間の組織を持たす。左心室の肥大の差異を補正するため、体重について補正した左心室重量によって微小血管密度を割り出す。擬似手術を行ったラットの心筋をコントロールとして用いる。
【０１３４】
（実施例１１．Ｔ４あるいはＦＧＦ２の新脈管形成促進効果に対する、αＶβ３拮抗体の影響）
ＣＡＭモデルにおいて、αＶβ３の阻害剤であるＬＭ６０９は１０マイクログラムでＦＧＦ２あるいはＴ４が誘発する脈管形成促進効果の双方を完全に阻害した（図１６）。
【０１３５】
（実施例１２．癌が関係する新たな血管成長の抑制）
ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）の移植を受けたＳＣＩＤマウスへのテトラヨードサイロ酢酸（テトラック）の投与には、Ｊ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：２２１１−２２１５，２００２に記載されている実験手順を使用する。マウスモデル内でのこのホルモンアナログの循環濃度が１０−６Ｍになるように、テトラックを飲水中に与える。移植した腫瘍周囲の新脈管形成に対するテトラックの抑制作用がエンドポイントである。
【０１３６】
（その他の実施形態）
具体的な記述に繋げてこの発明を記載してきたが、先の記述は説明を意図するものであって、添付の請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない。他の種類、利点、並びに変法は以下の請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ニワトリＣＡＭアッセイにて定量化した、Ｌ−Ｔ４並びにＬ−Ｔ３の新脈管形成に対する影響。Ａ．コントロール試料はＰＢＳに曝露し、別の試料を１  ｎＭ  のＴ３あるいは０．１μｍｏｌ／ＬのＴ４に３日間曝露した。これらの３回の実験の代表的な画像では、双方のホルモンとも血管分枝の増加を引き起こした。Ｂ．各々９回のＣＡＭアッセイを行った３回の実験の実験期間中に、既存の血管から形成された新たな血管分枝の平均値±ＳＥＭの表。記載した濃度にて、Ｔ３及びＴ４は同様の効果をもたらした（それぞれ１．９倍並びに２．５倍の分枝形成の増加。）。＊＊Ｐ＜０．００１（一元分散分析による、ホルモン処理ＣＡＭ試料とＰＢＳ処理ＣＡＭ試料との比較。）。
【図２】テトラック（Ｔｅｔｒａｃ）はＴ４並びにアガロース結合Ｔ４（Ｔ４−ａｇ）による新脈管形成の促進を抑制する。Ａ．０．１μｍｏｌ／ＬのＴ４に３日間曝露した典型的なＣＡＭ調製物では、血管分枝形成の２．５倍増加が見られる。３回の同様の実験では、２．３倍の増加があった。このホルモンのこの影響は、これまでにＴ４の細胞膜作用を抑制することが示されているＴ４アナログのテトラック（０．１μｍｏｌ／Ｌ）によって抑制される。１３テトラック単独では新脈管形成を促進しない（Ｃ）。Ｂ．Ｔ４−ａｇ（０．１μｍｏｌ／Ｌ）は新脈管形成を２．３倍促進し（３回の実験で２．９倍）、効果はこれもテトラックによって阻害される。Ｃ．ＣＡＭ分析にてテトラック並びにＴ４−ａｇ、Ｔ４の作用を調べる３回の実験の結果をまとめたもの。データ（平均値±ＳＥＭ）は３回の実験ごとの、各実験条件に対し１０の画像から得た。＊＊Ｐ＜０．００１（一元分散分析による、Ｔ４処理した試料並びにＴ４−アガロース処理した試料とＰＢＳ処理したコントロール試料との比較。）。
【図３】ＦＧＦ２及びＴ４の脈管形成促進効果の比較。Ａ．ＣＡＭアッセイにおいて、最高下濃度でのＴ４（０．０５μｍｏｌ／Ｌ）及びＦＧＦ２（０．５μｇ／ｍＬ）のタンデム効果は相加的であり、ＦＧＦ２（Ｔ４がない状態で１μｇ／ｍＬ）で見られた新脈管形成と同程度である。Ｂ．Ａと同様、ＣＡＭアッセイにてＦＧＦ２及びＴ４の作用を調べる３回の実験の結果をまとめたもの（平均値±ＳＥＭ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１（３回の実験において、処理した試料の結果とＰＢＳ処理したコントロール試料の結果との比較。）。
【図４】Ｔ４あるいは外生ＦＧＦ２によって引き起こされる新脈管形成に対する抗ＦＧＦ２の影響。Ａ．３回の実験にて、ＦＧＦ２によってＣＡＭモデルにおける新脈管形成が２倍に増加し、効果はＦＧＦ２に対する抗体（ａｂ）（８μｇ）によって抑制された。また、Ｔ４は新脈管形成を１．５倍に促進し、この効果もＦＧＦ２抗体によって阻害された。ＣＡＭモデルにおいてＴ４並びにＴ３は細胞からのＦＧＦ２の放出を引き起こすため、これはＣＡＭモデルにおける甲状腺ホルモンの作用がＦＧＦ２の自己分泌／パラ分泌効果によって仲介されていることを示唆している（表１）。我々はこれまでに、ＣＡＭアッセイにて非特異的ＩｇＧ抗体は新脈管形成に影響を与えないことを示している。Ｂ．ＦＧＦ２あるいはＴ４存在下でＦＧＦ２−ａｂの作用を調べた３回のＣＡＭ実験の結果をまとめたもの。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１（甲状腺ホルモン並びにＦＧＦ２の新脈管形成に対する影響とＦＧＦ２に対する抗体存在下でのこれらの影響の喪失を調べる３回の実験から、著しい効果が示された。）。
【図５】ＰＤ９８０５９、ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）シグナル伝達カスケード抑制剤の、Ｔ４、Ｔ３並びにＦＧＦ２によって誘発される新脈管形成に対する影響。Ａ．Ｔ４（０．１μｍｏｌ／Ｌ）及びＴ３（１ｎｍｏｌ／Ｌ）双方によって促進された新脈管形成は、ＰＤ９８０５９（３μｍｏｌ／Ｌ）によって完全に阻害される。Ｂ．また、ＦＧＦ２（１μｇ／ｍＬ）によって誘発された新脈管形成もＰＤ９８０５９によって抑制される。これは成長因子の作用もまたＥＲＫ１／２経路の活性化に依存していることを示している。Ｔ４が細胞膜で脈管形成促進効果を発動することを示す、Ｔ４−アガロース（Ｔ４−ａｇ）及びテトラック（図２）が関係する実験状況において、Ａ及びＢで示す結果は甲状腺ホルモンの脈管形成促進作用におけるＭＡＰＫの２つの役割に一致する。ＥＲＫ１／２は、ＦＧＦ２の生成を導くホルモンの初期シグナルを変換し、また続くＦＧＦ２の新脈管形成に対する作用を変換する。Ｃ．Ａ及びＢによって代表される３回の実験結果をまとめたもの。これはＣＡＭモデルにおけるＴ４及びＦＧＦ２の作用に対するＰＤ９８０５９の影響を示す。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１（３回の実験の結果についての分散分析の結果を示す。）。
【図６】Ｔ４及びＦＧＦ２は、ＥＣＶ３０４内皮細胞においてＭＡＰＫを活性化する。０．２５％のホルモン除去血清を加えたＭ１９９培地に細胞を調製し、Ｔ４（０．１μｍｏｌ／Ｌ）で１５分から６時間処理した。細胞を回収し、以前に記載したとおりに核画分を調製した。ゲル電気泳動で分離した核タンパク質を、リン酸化ＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１並びにｐＥＲＫ２、それぞれ４４ｋＤａ並びに４２ｋＤａ）に対する抗体で、次いで蛍光検出系へ繋がる二次抗体で免疫ブロットした。核画分のβアクチンの免疫ブロットを、この図の各部分におけるゲルへの負荷量に対するコントロールとした。各免疫ブロットは３回の実験の典型である。Ａ．Ｔ４はＥＣＶ３０４細胞において、リン酸化の増加とＥＲＫ１／２の核への移行を引き起こす。この効果は６時間以上続くが、３０分で最大となる。Ｂ．ＥＣＶ３０４細胞をＥＲＫ１／２活性化阻害剤ＰＤ９８０５９（ＰＤ；３０μｍｏｌ／Ｌ）あるいはＰＫＣ阻害剤ＣＧＰ４１２５１（ＣＧＰ；１００ｎｍｏｌ／Ｌ）で３０分処理し、記載したようにその後１０−７ＭのＴ４を１５分間細胞試料に加えた。核を回収した。これの典型的な実験は、Ｔ４によってＥＲＫ１／２のリン酸化（活性化）が増加することを示しており（第４レーン）、これは双方の阻害剤で阻害される（第５レーン及び第６レーン）。これは内皮細胞において、Ｔ４によるＭＡＲＫの活性化にＰＫＣ活性が必要であること示唆している。Ｃ．ＥＣＶ３０４細胞をＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）あるいはＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）、もしくは両方の薬剤で１５分間処理した。この図は、ホルモンあるいは成長因子による処理によってｐＥＲＫ１／２が核に蓄積し、さらに両方の薬剤を共に処理すると核のｐＥＲＫ１／２蓄積が増大することを示している。
【図７】ＥＣＶ３０４内皮細胞において、Ｔ４はＦＧＦ２  ｃＤＮＡの蓄積を増加させる。細胞をＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）及び各細胞アリコートから単離したＦＧＦ２  ｃＤＮＡ及びＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡで、６時間から４８時間処理した。上部のブロットで示すＦＧＦ２  ｃＤＮＡ量は、下部ブロットで示すＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡ含量の差に関して補正してあり、ＦＧＦ２濃度の補正は、グラフの下で説明している（平均値±平均値のＳＥ；ｎ＝２回の実験）。全ての時点においてＴ４で処理した細胞から抽出したＦＧＦ２ＲＮＡ転写物量は増加した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（分散分析による、各時点の値のコントロール値に対する比較を示す。）。
【図８】７日目ニワトリ胚腫瘍増殖モデル。腫瘍移植組織から成るニワトリしょう尿膜（ＣＡＭ）モデルの説明。
【図９】Ｔ４は３Ｄ創傷治癒を促進する。この明細書で記載される３Ｄ創傷治癒アッセイに従ってＴ４および対象を曝露したヒト皮膚線維芽細胞の写真。
【図１０】Ｔ４は用量依存的に創傷治癒を上昇させる（３日目）。グラフで示すように、Ｔ４は０．１μＭと１．０μＭの濃度の間で、用量に依存して創傷治癒（外へ出る細胞によって測定する。）を上昇させる。これと同じ上昇は、１．０μＭと３．０μＭの間の濃度のＴ４では見られない。
【図１１】精製インテグリンへのＩ−１２５−Ｔ４結合に対する、非標識Ｔ４並びにＴ３の影響。非標識Ｔ４（１０−４Ｍから１０−１１Ｍ）もしくはＴ３（１０−４Ｍから１０−８Ｍ）を、精製したαＶβ３インテグリン（２μｇ／サンプル）に加え、室温で３０分間インキュベートした。各試料に２マイクロキュリーのＩ−１２５標識Ｔ４を加えた。この試料を室温で２０分間インキュベートし、負荷した色素と混合して、４℃で２４時間、５％ネイティブゲルで、４５ｍÅで泳動した。電気泳動後、このゲルをプラスチックラップで包み、フィルムに露光した。精製したαＶβ３へのＩ−１２５−Ｔ４の結合は、１０−１１Ｍから１０−７Ｍの範囲では非標識Ｔ４に影響されないが、１０−６Ｍの濃度では、非標識Ｔ４によって用量に依存して競合的に排除される。インテグリンに結合する放射性標識したＴ４は、１０−４Ｍの非標識Ｔ４によってほぼ完全に置換される。Ｔ３はαＶβ３に結合するＴ４を競合的に排除する効果が小さく、Ｔ３が１０−６Ｍ並びに１０−５Ｍ、１０−４Ｍの時それぞれ１１％並びに１６％、２８％シグナルを減少させる。
【図１２】テトラック及び含ＲＧＤペプチドは精製したαＶβ３へ結合するＴ４を競合的に排除するが、含ＲＧＥペプチドは競合的に排除しない。Ａ）精製したαＶβ３にテトラックを加えると、投与量に依存してこのインテグリンに結合するＩ−１２５−標識Ｔ４が減少する。１０−８Ｍのテトラックでは、このインテグリンに結合する放射性標識Ｔ４の競合的排除に影響しない。Ｔ４とαＶβ３との会合は、１０−７Ｍのテトラック存在下で３８％減少し、１０−５Ｍのテトラックでは９０％減少した。１０−５Ｍ  のＲＧＤペプチドの添加は、αＶβ３へ結合するＴ４を競合的に排除する。ＲＧＤペプチドに対するコントロールとなるＲＧＥペプチドを１０−５Ｍ並びに１０−４Ｍ加えても、精製したαＶβ３に結合する放射性標識Ｔ４を減らすことはできなかった。Ｂ）図Ａのテトラック及びＲＧＤのデータのグラフ表示。データ箇所は３回の独立した実験に対する平均値±Ｓ．Ｄ．として示してある。
【図１３】αＶβ３に結合するＴ４に対する、モノクローナル抗体ＬＭ６０９の影響。Ａ）記載した濃度でＬＭ６０９をαＶβ３に加えた。一試料当たり１μｇのＬＭ６０９によって、このインテグリンに結合するＩ−１２５−標識Ｔ４が５２％減少する。このインテグリンに結合するＴ４への阻害は、ＬＭ６０９の濃度が１試料当たり２μｇの時に最大に達し、抗体濃度が８μｇまで最大阻害が維持される。抗体特異性に対するコントロールとして、Ｔ４と共にインキュベートする前に、１０μｇ／試料のＣｏｘ−２  ｍＡＢ及び１０μｇ／試料のマウスＩｇＧをαＶβ３に加えた。Ｂ）図Ａのデータのグラフ表示。データ箇所は３回の独立した実験に対する平均値±Ｓ．Ｄ．として示してある。
【図１４】Ｔ４誘発ＭＡＰＫ活性化に対するＲＧＤ並びにＲＧＥ、テトラック、ｍＡｂ  ＬＭ６０９の影響。Ａ）ＣＶ−１細胞（集密度５０〜７０％）を１０−７ＭのＴ４で３０分間処理した（全濃度１０−７Ｍ、遊離濃度１０−１０Ｍ）。Ｔ４を加える前に、選択した試料を記載した濃度の含ＲＧＤペプチドあるいは含ＲＧＥペプチド、テトラック、ＬＭ６０９のいずれかで１６時間処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって核タンパク質を分離し、抗ホスホＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１／２）抗体で免疫ブロットした。１０−６Ｍ以上のＲＧＤペプチドで処理した試料では、ｐＥＲＫ１／２の核への蓄積が減少するが、１０−４ＭのＲＧＥで処理した試料では、有意な変化はない。１０−６Ｍのテトラックで処理したＣＶ１細胞では、ｐＥＲＫ１／２の蓄積が７６％減少し、１０−５Ｍ以上の濃度のテトラックは処理をしないコントロール試料と同程度にｐＥＲＫ１／２の核への蓄積を減少させる。αＶβ３に対するモノクローナル抗体ＬＭ６０９を１μｇ／ｍｌの濃度でＣＶ１培養物に加えると、核内の活性化ＭＡＰＫの蓄積が減少する。Ｂ）図ＡのＲＧＤ及びＲＧＥ、テトラックのデータのグラフ表示。データ箇所は３回の別個の実験に対する平均値±Ｓ．Ｄ．として示してある。
【図１５】Ｔ４誘発ＭＡＰＫ活性化に対する、αＶ及びβ３へのｓｉＲＮＡの影響。ＣＶ１細胞に、αＶ、β３、もしくはαＶ及びβ３の双方へｓｉＲＮＡ（最終濃度１００ｎＭ）を移入した。移入後２日間、細胞を１０−７ＭのＴ４で処理した。Ａ）各ｓｉＲＮＡの特異性及び機能性を確認するため、各移入群から単離したＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｂ）各移入群から核タンパク質を単離して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【図１６−１】ＣＡＭモデルにおけるＴ４誘発新脈管形成に対するαＶβ３  ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の阻害効果。Ａ）試料をＰＢＳ、もしくはＴ４（０．１μＭ）、Ｔ４及び１０ｍｇ／ｍｌのＬＭ６０９に３日間曝露した。Ｔ４によって促進される新脈管形成は、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９を加えることによって実質的に抑制される。Ｂ）実験期間中に既存の血管から形成された新たな分枝の平均値±ＳＥＭを示した表。データは３回の別個の実験から得たもので、各処理群に９つの試料がそれぞれ含まれた。Ｃ、Ｄ）Ｔ４あるいはＦＧＦ２によって促進される新脈管形成も、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９あるいはＸＴ１９９を加えることによって抑制される。
【図１６−２】ＣＡＭモデルにおけるＴ４誘発新脈管形成に対するαＶβ３  ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の阻害効果。Ａ）試料をＰＢＳ、もしくはＴ４（０．１μＭ）、Ｔ４及び１０ｍｇ／ｍｌのＬＭ６０９に３日間曝露した。Ｔ４によって促進される新脈管形成は、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９を加えることによって実質的に抑制される。Ｂ）実験期間中に既存の血管から形成された新たな分枝の平均値±ＳＥＭを示した表。データは３回の別個の実験から得たもので、各処理群に９つの試料がそれぞれ含まれた。Ｃ、Ｄ）Ｔ４あるいはＦＧＦ２によって促進される新脈管形成も、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９あるいはＸＴ１９９を加えることによって抑制される。
【図１６−３】ＣＡＭモデルにおけるＴ４誘発新脈管形成に対するαＶβ３  ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の阻害効果。Ａ）試料をＰＢＳ、もしくはＴ４（０．１μＭ）、Ｔ４及び１０ｍｇ／ｍｌのＬＭ６０９に３日間曝露した。Ｔ４によって促進される新脈管形成は、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９を加えることによって実質的に抑制される。Ｂ）実験期間中に既存の血管から形成された新たな分枝の平均値±ＳＥＭを示した表。データは３回の別個の実験から得たもので、各処理群に９つの試料がそれぞれ含まれた。Ｃ、Ｄ）Ｔ４あるいはＦＧＦ２によって促進される新脈管形成も、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９あるいはＸＴ１９９を加えることによって抑制される。
【図１７】甲状腺ホルモンアナログの重合体組成物−ポリビニルアルコールを使用するエステル結合を介する重合体結合。この調製法では、市販のポリビニルアルコール（もしくは関連する共重合体）を、甲状腺ホルモンアナログの酸塩化物、即ちこれの酸塩化物形態で処理することによってエステル化することができる。この塩酸塩をトリエチルアミンを加えることによって中和してトリエチルアミン塩酸塩を生成させ、このトリエチルアミン塩酸塩は、様々なアナログについての甲状腺ホルモンエステル重合形態物が沈殿する際に、水で洗い流すことができる。この重合体へのエステル結合は生体内で加水分解され、活性型新脈管形成促進甲状腺ホルモンアナログを遊離させることができる。
【図１８】甲状腺ホルモンアナログの重合体組成物−アクリル酸エチレン共重合体を使用する無水物結合を介する重合体結合。これは先の重合体共有結合と似るが、こちらではアクリル酸共重合体の反応に由来する無水物結合が介している。またこの無水物結合も、生体内での加水分解に対して感受性があり甲状腺ホルモンアナログを遊離することができる。塩酸の中和は、トリエチルアミンで処理することで達成され、次いで沈殿したポリ無水物重合体を水で洗浄することで副産物であるトリエチルアミン塩酸塩を除去する。この反応によって甲状腺ホルモンアナログアクリル酸共重合体＋トリエチルアミンが生成することとなる。生体内での加水分解によって、甲状腺ホルモンアナログとアクリル酸エチレン共重合体とが時間と共に遊離することとなり、これは調節することができる。
【図１９】甲状腺ホルモンアナログの重合体組成物−ポリ乳酸重合体内への封入。ポリ乳酸ポリエステル重合体（ＰＬＡ）は、生体内で加水分解されて乳酸単量体となるものであり、これはヒトの薬剤送達系のための送達担体として開発されている。甲状腺ホルモンアナログが化学結合によって重合体に結合する先の２つの共有結合法と異なり、これは、甲状腺ホルモンアナログをＰＬＡポリマービーズ内にカプセル化する非共有結合法と考えられる。この反応によって、水中でＰＬＡビーズを含有する甲状腺ホルモンアナログが形成されることとなる。ろ過及び洗浄によってＰＬＡビーズを含有する甲状腺ホルモンアナログが形成され、生体内での加水分解によって調節された濃度の甲状腺ホルモンと乳酸とが生成されることとなる。
【図２０−１】様々なポリマーと結合可能な甲状腺ホルモンアナログ。Ａ〜Ｄは、結合して本発明の甲状腺ホルモンアナログの重合形態物を形成することができる様々な甲状腺ホルモンアナログを得るために必要な置換基を示す。
【図２０−２】様々なポリマーと結合可能な甲状腺ホルモンアナログ。Ａ〜Ｄは、結合して本発明の甲状腺ホルモンアナログの重合形態物を形成することができる様々な甲状腺ホルモンアナログを得るために必要な置換基を示す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１６−２】
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【図１８】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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