(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１・ｍＨ２Ｏ［式中、ｍは１または１／２である］で表される、結晶性または結晶状形態の、式１によって表される化合物の水和物。
【化１】
0005872539.tif 000024
【請求項２】
吸着水をさらに含み、１・Ｈ２Ｏの重量に基づいて、吸着水の量が約０ｗｔ％から約１０ｗｔ％までの範囲である、請求項１に記載の水和物。
【請求項３】
化合物が結晶性の１水和物である、請求項１記載の水和物。
【請求項４】
ＸＲＰＤ２θ−反射（°）を約１４．８に有する、請求項３に記載の水和物。
【請求項５】
ＸＲＰＤ２θ−反射（°）を約１４．８および１７．６に有するか、または約１４．８、１７．６、および２０．４に有するか、または約８．７、１４．８、１７．６、および２０．４に有するか、または約８．７、１１．１、１３．６、１４．８、１７．６、および２０．４に有する、請求項４に記載の水和物。
【請求項６】
斜方晶結晶である、請求項３記載の水和物。
【請求項７】
以下の単位格子パラメーター：ａ〜１０．９９Å、ｂ〜１３．０９Å、およびｃ〜２０．３６Åを有する、請求項６に記載の斜方晶結晶水和物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の水和物を含む組成物。
【請求項９】
医薬用途に使用するための請求項１〜７のいずれかに記載の水和物。
【請求項１０】
それを必要とする患者におけるＨＣＶを治療するための、請求項１〜７のいずれかに記載の水和物。
【請求項１１】
治療有効量の別の抗ウイルス剤と組み合わせてまたは交替で用いる、請求項１０記載の水和物。
【請求項１２】
他の抗ウイルス剤が、
【化２】
0005872539.tif 000025
テラプレビル、ボセプレビル、ＢＭ−７９００５２、ＩＴＭＮ−１９１、ＡＮＡ−５９８、ＴＭＣ４３５、およびその組み合わせの中から選択される、請求項１１に記載の水和物。
【請求項１３】
式１の化合物を結晶化することを含み、さらに、溶媒または溶媒混合物に溶解するまたは懸濁することを含み、ここで溶媒または溶媒混合物が、アニソール、酢酸エチル、キシレン、トルエン、イソプロパノール、アセトン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、酢酸イソプロピル、ｔ−ブチルメチルエーテル、およびその組み合わせの中から選択されるか、または溶媒混合物が、アニソール／酢酸エチル、ヘプタン／酢酸エチル、キシレン／酢酸エチル／水、アニソール／水、酢酸エチル／キシレン、イソプロパノール／キシレン、アセトン／キシレン、ジクロロメタン／キシレン、ジクロロメタン／ヘキサン、酢酸エチル／トルエン、ジエチルエーテル／キシレン、酢酸イソプロピル／キシレン、酢酸イソプロピル／ヘプタン、酢酸エチル／水、ｔ−ブチルメチルエーテル／水、ｔ−ブチルメチルエーテル／エチルエーテル、およびｔ−ブチルメチルエーテルの中から選択される、請求項１に記載の結晶性化合物を調製する方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物の結晶化度を求める方法であって、ＸＲＰＤまたは単結晶Ｘ線結晶法によって化合物を解析することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１０年３月３１日に出願された米国特許仮出願公開第６１／３１９，５４８号、および２０１０年６月１７日に出願された米国特許仮出願公開第６１／３５５，９４０号の優先権を主張し、その主題は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書において、ヌクレオシドホスホルアミダートおよびウイルス性疾患の治療のための薬剤としてのそれらの使用が開示される。これらの化合物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡのウイルス複製の阻害薬であり、ＨＣＶＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害薬として、ＨＣＶ複製の阻害薬として、および哺乳動物におけるＣ型肝炎感染の治療のために有用である。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界の人口の２〜１５％と推定される相当な数の感染者において、肝硬変および肝細胞癌などの慢性肝疾患をもたらす重大な健康上の問題である。米国疾患管理センターによると米国だけで推定４５０万人の感染者が存在する。世界保健機関によると、世界中に２億人の感染者が存在し、毎年少なくとも３００〜４００万人が感染する。ひとたび感染すると、約２０％の人はウイルスを排除するが、残りは、一生ＨＣＶを潜伏させる恐れがある。慢性的感染者の１０〜２０パーセントが最終的に、肝臓破壊性の肝硬変また癌を発症する。ウイルス性疾患は、汚染した血液および血液製剤、汚染した針によって非経口的に感染したり、または性的に感染したり、感染した母親または保因の母親からその子供へと垂直感染したりする。ＨＣＶ感染のための現行の治療は、組換え型インターフェロン−αを単独で、またはヌクレオシド類似体リバビリンと組み合わせて用いる免疫療法に限定されており、その臨床的有益性に限界がある。その上、ＨＣＶに対する確立したワクチンは存在しない。その結果、慢性ＨＣＶ感染に有効である改良型治療剤に対する緊急の必要性が存在する。
【０００４】
ＨＣＶビリオンは、約３０１０個のアミノ酸のポリタンパク質をコードする約９６００塩基の単一のオリゴリボヌクレオチドゲノム配列を伴う外被プラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶ遺伝子のタンパク質産物は、構造タンパク質Ｃ、Ｅ１およびＥ２、ならびに非構造タンパク質ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ＡおよびＮＳ４ＢとＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂで構成されている。非構造（ＮＳ）タンパク質は、ウイルス複製のための触媒機構を提供すると考えられている。ＮＳ３プロテアーゼは、ポリタンパク質鎖からＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＮＳ５Ｂを放出する。ＨＣＶＮＳ５Ｂポリメラーゼは、ＨＣＶの複製サイクルにおいて鋳型として役立つ１本鎖ウイルスＲＮＡからの２本鎖ＲＮＡの合成のために必要とされる。したがって、ＮＳ５Ｂポリメラーゼは、ＨＣＶ複製複合体における必須の成分とみなされている（Ｋ．Ｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ、Ｈｅｐｔｏｌｏｇｙ、１９９９、２９：１２２７−１２３５；Ｖ．Ｌｏｈｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８、２４９：１０８−１１８）。ＨＣＶＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害は、２本鎖ＨＣＶＲＮＡの形成を妨げ、したがって、ＨＣＶ特異的抗ウイルス療法の開発へ向けた魅力的な手法を構成する。
【０００５】
ＨＣＶは、多くの一般的特徴を共有するはるかに大きいウイルス科に属する。
フラビウイルス科
【０００６】
フラビウイルス科は、少なくとも次の３つの別個の属を含む。すなわち、畜牛および豚の疾患の原因となるペスチウイルス；デング熱および黄熱病などの疾患の主因であるフラビウイルス；およびＨＣＶを唯一の成員とするヘパシウイルスである。フラビウイルス属は、血清学的関連性に基づいて群に分けられる６８超の成員を含む（Ｃａｌｉｓｈｅｒｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、１９９３、７０、３７−４３）。臨床的症候はさまざまであり、発熱、脳炎および出血熱を含む（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．、Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．およびＨｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、１９９６、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１、９３１−９５９）。ヒトの疾患に関係する世界的関心の的であるフラビウイルスには、デング出血熱ウイルス（ＤＨＦ）、黄熱病ウイルス、ショック症候群および日本脳炎ウイルスが含まれる（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９８４、６、２５１−２６４；Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：４７６−４８１、１９８８；Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ、１９８８、３１９、６４  １−６４３）。
【０００７】
ペスチウイルス属には、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、古典的豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ、豚コレラウイルスとも呼ばれる）および羊のボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）が含まれる（Ｍｏｅｎｎｉｇ、Ｖ．ｅｔ  ａｌ、Ａｄｖ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．１９９２、４１、５３−９８）。家畜類（畜牛、豚および羊）のペスチウイルス感染は、世界中で重大な経済的損失の原因となっている。ＢＶＤＶは、畜牛の粘膜疾患をひき起こし、家畜業界にとって著しい経済的重要性をもつ（Ｍｅｙｅｒｓ、Ｇ．およびＴｈｉｅｌ、Ｈ．Ｊ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６、４７、５３−１１８；Ｍｏｅｎｎｉｇ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ、Ａｄｖ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．１９９２、４１、５３−９８）。ヒトペスチウイルスは、動物のペスチウイルスほど広範に特徴づけされていない。しかし、血清学的調査は、ヒトにおける相当なペスチウイルス曝露を示している。
【０００８】
ペスチウイルスおよびヘパシウイルスは、フラビウイルス科内の密接に関連するウイルス群である。この科内のその他の密接に関連するウイルスとしては、ＧＢウイルスＡ、ＧＢウイルスＡ様因子、ＧＢウイルス−ＢおよびＧＢウイルス−Ｃ（Ｇ型肝炎ウイルス、ＨＧＶとも呼ばれる）が含まれる。ヘパシウイルス群（Ｃ型肝炎ウイルス；ＨＣＶ）は、密接に関連するものの遺伝子型によって識別可能である数多くのヒトに感染するウイルスで構成される。少なくとも６つのＨＣＶ遺伝子型および５０を超える亜型が存在する。ペスチウイルスとヘパシウイルスの間に類似性があり、細胞培養においてヘパシウイルスの効率的に成長する能力が低いことによって、ＨＣＶウイルスを研究するための代用として牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）が使用されることが多い。
【０００９】
ペスチウイルスおよびヘパシウイルスの遺伝子構成は、非常に類似している。これらのプラス鎖ＲＮＡウイルスは、ウイルス複製に必要な全てのウイルスタンパク質をコードする単一の大きい読み取り枠（ＯＲＦ）を有する。これらのタンパク質は、成熟ウイルスタンパク質を生成するために細胞およびウイルスでコードされたプロティナーゼの両方により、翻訳と同時および翻訳後に処理されるポリタンパク質として発現される。ウイルスゲノムＲＮＡの複製を担当するウイルスタンパク質は、ほぼカルボキシ末端内に位置する。ＯＲＦの３分の２は、非構造（ＮＳ）タンパク質と称される。ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのためのＯＲＦの非構造タンパク質部分の遺伝子構成およびポリタンパク質処理は、極めて類似している。ペスチウイルスおよびヘパシウイルスの両方について、成熟した非構造（ＮＳ）タンパク質は、非構造タンパク質コーディング領域のアミノ末端からＯＲＦのカルボキシ末端までの順番で、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂで構成されている。
【００１０】
ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳタンパク質は、特異タンパク質の機能に特徴的である配列ドメインを共有する。例えば、両方の群のウイルスのＮＳ３タンパク質は、セリンプロテイナーゼおよびヘリカーゼに特徴的なアミノ酸配列モチーフを有する（Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８、３３３、２２；ＢａｚａｎおよびＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８９、１７１、６３７−６３９；Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９８９、１７、３８８９−３８９７）。同様に、ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳ５Ｂタンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに特徴的なモチーフを有する（Ｋｏｏｎｉｎ、Ｅ．Ｖ．およびＤｏｌｊａ、Ｖ．Ｖ．、Ｃｒｉｒ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１９９３、２８、３７５−４３０）。
【００１１】
ウイルスのライフサイクルにおけるペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳタンパク質の実際の役割および機能は、直接類似している。両方の場合において、ＮＳ３セリンプロテイナーゼが、ＯＲＦのその位置の下流側でのポリタンパク質前駆物質の全てのタンパク質分解処理を担っている（Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｔｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９１、１８４、３４１−３５０；Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、６７、３８３５−３８４４；Ｅｃｋａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９３，１９２、３９９−４０６；Ｇｒａｋｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、６７、２８３２−２８４３；Ｇｒａｋｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９３、９０、１０５８３−１０５８７；Ｈｉｊｉｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、６７、４６６５−４６７５；Ｔｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９３、６７、４０１７−４０２６）。ＮＳ４Ａタンパク質は、両方の場合において、ＮＳ３セリンプロテアーゼとの補因子として作用する（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４、６８、５０４５−５０５５；Ｆａｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４、６８、３７５３−３７６０；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、１９９７、７１：５３  １２−５３２２）。両ウイルスのＮＳ３タンパク質は、ヘリカーゼとしても機能する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９９５、２１５、１６０−１６６；Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９５、３２３、４７−５３；Ｗａｒｒｅｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｔｔ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５、６９，１７２０−１７２６）。最後に、ペスチウイルスおよびヘパシウイルスのＮＳ５Ｂタンパク質は、予測されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する（Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ，  １９９６，  １５，  １２−２２；  Ｌｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  １９９７，  ７１，  ８４１６−８４２８；  Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １９９７，  ２３２，  ２３１−２３５；  Ｈａｇｅｄｏｒｎ，  ＰＣＴ国際公開第９７／１２０３３号；  Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  １９９８，  ７２，  ９３６５−９３６９）。
【００１２】
現在、Ｃ型肝炎ウイルス感染者のための治療の選択肢は限定的である。現行の承認済み治療選択肢は、組換え型インターフェロン−αを単独で、またはヌクレオシド類似体リバビリンと組み合わせて用いる免疫療法を使用することである。この療法は、臨床効果に限界があり、治療された患者の５０％しか療法への応答を示さない。したがって、ＨＣＶ感染が提起する未だ満たされていない医療ニーズに対処するためのより効果的で新規の療法に対する高いニーズが存在する。
【００１３】
ＮＳ２−ＮＳ３オートプロテアーゼ、Ｎ３プロテアーゼ、Ｎ３−ヘリカーゼおよびＮＳ５Ｂポリメラーゼを含むがこれらに限定されない、抗ＨＣＶ治療薬としての直接作用性抗ウイルス薬の薬物開発用にいくつかの潜在的な分子標的が今や特定されている。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、１本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムの複製にとって絶対不可欠であり、この酵素は、医薬品化学者の間に高い関心を引き出してきた。
【００１４】
ＨＣＶ感染に対する潜在的療法としてのＨＣＶＮＳ５Ｂの阻害薬が概説されている：Ｔａｎ，  Ｓ．−Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，  ２００２，  １，  ８６７−８８１；  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｍ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ，  ２００３，  １２，  １２６９−１２８０；  Ｎｉ，  Ｚ−Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ２００４，  ７，  ４４６−４５９；  Ｂｅａｕｌｉｅｕ，  Ｐ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ，  ２００４，  ５，  ８３８−８５０；  Ｗｕ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ−Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  ２００３，  ３，  ２０７−２１９；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  Ｒ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００４，  ３９，  ２２３−２３７；  Ｃａｒｒｏｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ２００６，  ６，  １７−２９．耐性ＨＣＶ株が出現し広範な遺伝子型を網羅する薬剤の特定が必要となる潜在的可能性は、ＨＣＶＮＳ５Ｂ阻害薬としての新規でかつより有効なヌクレオシドを特定するために継続的努力を行なう必要性を裏づけている。
【００１５】
ＮＳ５Ｂポリメラーゼのヌクレオシド阻害薬は、連鎖停止を結果としてもたらす非天然基質として、またはヌクレオチドと競合してポリメラーゼに結合する競合的阻害薬として作用することができる。連鎖停止剤として機能するためには、ヌクレオシド類似体は、細胞により吸収され、ポリメラーゼヌクレオチド結合部位について競合するためにトリホスファートにインビボで変換されなくてはならない。トリホスファートへのこの変換は、一般に細胞キナーゼによって媒介され、そのため潜在的なヌクレオシドポリメラーゼ阻害薬に対して追加の構造的要件が付与される。不幸にして、このことにより、ＨＣＶ複製の阻害薬としてのヌクレオシドの直接的評価は、インサイチュリン酸化が可能な細胞に基づくアッセイに限定される。
【００１６】
いくつかの場合において、ヌクレオシドの生物活性は、それを活性トリホスファート形態に変換するのに必要とされる１種または複数のキナーゼについてのその基質特性の低さにより妨げられている。ヌクレオシドキナーゼによるモノホスファートの形成は、一般に、３つのリン酸化事象の律速段階と考えられている。活性トリホスファート類似体へのヌクレオシドの代謝における初期リン酸化段階に対する必要性を回避するために、安定なホスファートプロドラッグの調製が報告されてきた。ヌクレオシドホスホルアミダートプロドラッグが、活性ヌクレオシドトリホスファートの前駆物質であり、ウイルス感染した全細胞に投与された場合、ウイルス複製を阻害することが示されている（ＭｃＧｕｉｇａｎ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９６，  ３９，  １７４８−１７５３；  Ｖａｌｅｔｔｅ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９６，  ３９，  １９８１−１９９０；  Ｂａｌｚａｒｉｎｉ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９９６，  ９３，  ７２９５−７２９９；  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，  Ａ．  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９９，  ４２，  ４１２２−４１２８；  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｅ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ２００１，  ２０，  １０９１−１０９８；  Ｌｅｅ，  Ｗ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ２００５，  ４９，  １８９８）；米国特許公開第２００６／０２４１０６４号；および国際公開第２００７／０９５２６９号。
【００１７】
実現可能な治療剤としてのヌクレオシドの有用性を限定しているのはまた、時として低い物理化学的特性および薬物動態学の特性である。これらの低い特性は、薬剤の腸内吸収を限定し、標的組織または細胞への摂取を限定する恐れがある。その特性を改善するため、ヌクレオシドのプロドラッグが利用されてきた。ヌクレオシドホスホアミダートの調製が、ヌクレオシドの全身的吸収を改善することが実証されており、さらに、これらの「プロヌクレオチド」のホスホアミダート部分が、中性親油性基でマスクされることで、最適な分配係数を与え、その結果、細胞内への取り込みと輸送が最適化されることで、親ヌクレオシド単独投与に比較して、ヌクレオシドモノフォスフェート類似体の細胞内濃度を劇的に増加することも実証されている。ホスファートエステル部分の酵素媒介加水分解は、ヌクレオシドモノホスファートを生成し、ここで速度を限定する初期リン酸化は不要である。この目的に、国際公開第２００８／１２１６３４号および米国特許公開第２０１０／００１６２５１号に対応する米国特許仮出願第１２／０５３，０１５号は、いくつかのホスホルアミダートヌクレオシドプロドラッグを開示し、その多くがＨＣＶアッセイにおいて活性を示す。米国特許公開第２０１０／００１６２５１号に開示されたいくつかの化合物は、ＦＤＡによる承認を目的として可能性のある臨床候補薬として試験された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本明細書において、結晶性または結晶状形態の、式１によって表される化合物、その水和物または溶媒和物が開示される。
【化１】
0005872539.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】１・Ｈ２Ｏの高分解能ＸＲＤ回折図である。
【図２】１・Ｈ２ＯのＸ線結晶構造である。定義
【００２０】
本明細書中で使用する実体という語句は、１種または複数のその実体、例えば、ある化合物は、１種もしくは複数の化合物、または少なくとも１種の化合物を指す。したがって、ある物、「１種または複数の」および「少なくとも１種の」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００２１】
本明細書において使用される「任意選択の」または「任意選択で」という用語は、後続して記載されている事象または状況が発生してもよいが発生する必要性はないこと、また、この記載が、その事象または状況が発生する場合、およびそれが発生しない場合を含むことを意味する。例えば「任意選択の結合」とは、結合が存在してもしなくてもよいこと、また、この記載には単、二重または三重結合が含まれることを意味する。
【００２２】
「Ｐ＊」（使用される場合）という用語は、リン原子がキラルであり、対応する「Ｒ」または「Ｓ」のカーン・インゴルド・プレローグ順位則に従うことを意味し、文字通りの意味を有する。リンでのキラリティーにより、化合物１は、本明細書において使用される場合、あるときにはＳＰ異性体を指す。そのジアステレオマー類似体は、時にはＲＰ異性体と呼ばれる。ＳＰ異性体およびＲＰ異性体の混合物は、時には１およびＲＰ異性体を含有する混合物と呼ばれる。
【００２３】
本明細書において記載される「精製された」という用語は、所与の化合物の純度を指す。例えば、所与の化合物が組成物の主要成分である場合、その化合物は、「精製され」ており、すなわち少なくとも５０ｗ／ｗ％の純度である。したがって、「精製された」という用語は、少なくとも純度５０ｗ／ｗ％、少なくとも純度６０ｗ／ｗ％、少なくとも純度７０％、少なくとも純度８０％、少なくとも純度８５％、少なくとも純度９０％、少なくとも純度９２％、少なくとも純度９４％、少なくとも純度９６％、少なくとも純度９７％、少なくとも純度９８％、少なくとも純度９９％、少なくとも純度９９．５％、および少なくとも純度９９．９％を包含し、ここで、「実質的に純粋な」は、少なくとも純度９７％、少なくとも純度９８％、少なくとも純度９９％、少なくとも純度９９．５％、少なくとも純度９９．９％を包含する。
【００２４】
「約」という（また〜によって表される）用語は、記述された数値が標準実験誤差内で変動する範囲の一部であることを意味する。
【００２５】
指定されたＸＲＰＤパターン「において実質的に示される」という表現は、ＸＲＰＤパターンにおいて示されるピーク位置が、目視検査または選択されたピークリスト（±０．２°２θ）の手段の内で実質的に同一であることを意味する。当業者は、強度が試料に依存して変動し得ると理解している。
【００２６】
「実質的に無水の」という用語は、最大１０重量％の水、好ましくは最大１重量％の水、より好ましくは最大０．５重量％の水、最も好ましくは最大０．１重量％の水を含むことを意味する。
【００２７】
溶媒または反溶媒（反応、結晶化など、または格子および／もしくは吸着溶媒において使用される）は、Ｃ１〜Ｃ８アルコール、Ｃ２〜Ｃ８エーテル、Ｃ３〜Ｃ７ケトン、Ｃ３〜Ｃ７エステル、Ｃ１〜Ｃ２クロロカーボン、Ｃ２〜Ｃ７ニトリル、雑多な溶媒、Ｃ５〜Ｃ１２飽和炭化水素、およびＣ６〜Ｃ１２芳香族炭化水素の少なくとも１つを含む。
【００２８】
Ｃ１〜Ｃ８アルコールは、そのような数の炭素を有する直鎖／分枝および／または環式／非環式のアルコールを指す。Ｃ１〜Ｃ８アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、イソブタノール、ヘキサノール、およびシクロヘキサノールを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
Ｃ２〜Ｃ８エーテルは、そのような数の炭素を有する直鎖／分枝および／または環式／非環式のエーテルを指す。Ｃ２〜Ｃ８エーテルは、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジｎ−ブチルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、テトラヒドロフラン、およびジオキサンを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
Ｃ３〜Ｃ７ケトンは、そのような数の炭素を有する直鎖／分枝および／または環式／非環式のケトンを指す。Ｃ３〜Ｃ７ケトンは、アセトン、メチルエチルケトン、プロパノン、ブタノン、メチルイソブチルケトン、メチルブチルケトン、およびシクロヘキサノンを含むが、これらに限定されない。
【００３１】
Ｃ３〜Ｃ７エステルは、そのような数の炭素を有する直鎖／分枝および／または環式／非環式のエステルを指す。Ｃ３〜Ｃ７エステルは、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ｉ−プロピル、酢酸ｎ−ブチルなどを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
Ｃ１〜Ｃ２クロロカーボンは、そのような数の炭素を有するクロロカーボンを指す。Ｃ１〜Ｃ２クロロカーボンは、クロロホルム、塩化メチレン（ＤＣＭ）、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、およびテトラクロロエタンを含むが、これらに限定されない。
【００３３】
Ｃ２〜Ｃ７ニトリルは、そのような数の炭素を有するニトリルを指す。Ｃ２〜Ｃ７ニトリルは、アセトニトリル、プロピオニトリルなどを含むが、これらに限定されない。
【００３４】
雑多な溶媒は、有機化学において一般に使用される溶媒を指し、ジエチレングリコール、ダイグライム（ジエチレングリコールジメチルエーテル）、１，２−ジメトキシ−エタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、グリセリン、ヘキサメチルリン酸トリアミド＊ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｐｈｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ、ヘキサメチル亜リン酸トリアミド＊ｔｒｉａｍｅ、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、ニトロメタン、ピリジン、トリエチルアミン、および酢酸を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
Ｃ５〜Ｃ１２飽和炭化水素という用語は、直鎖／分岐、および／または環式／非環式の炭化水素を指す。Ｃ５〜Ｃ１２飽和炭化水素は、ｎ‐ペンタン、石油エーテル（リグロイン）、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、およびシクロヘプタンを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
Ｃ６〜Ｃ１２芳香族という用語は、その骨格としてフェニル基を有する、置換および非置換の炭化水素を指す。好ましい炭化水素は、ベンゼン、キシレン、トルエン、クロロベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、キシレン、およびアニソールを含む。
【００３７】
「共結晶」という用語は、薬学的に許容される塩を包含する塩と組み合わせる１の共結晶を含む。
【００３８】
本明細書において記載される「塩」という用語は、プロトン受容部分のプロトン化および／またはプロトン供与部分の脱プロトン化によって生成し得る、陽イオンおよび陰イオンを含む化合物を指す。プロトン受容部分のプロトン化は、生理学的陰イオンの存在によって電荷が平衡化される陽イオン種の形成を結果としてもたらし、一方、プロトン供与部分の脱プロトン化は、生理学的陽イオンの存在によって電荷が平衡化される陰イオン種の形成を結果としてもたらすという点に留意すべきである。この用語は、薬学的に許容される塩を包含するように意図する。
【００３９】
「薬学的に許容される塩」という語句は、薬学的に許容される塩を意味する。薬学的に許容される塩の例は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸で形成された；またはグリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−二スルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタリンスルホン酸、４−トルエンスルフォン酸、カンファースルホン酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、サリチル酸、ムコン酸、などの有機酸で形成された酸付加塩、または（２）上に列挙された任意の無機酸の共役塩基で形成された塩基付加塩であって、共役塩基は、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、ＮＨｇＲ'''４−ｇ＋［式中、Ｒ'''はＣ１〜３アルキルであり、ｇは、０、１、２、３、または４から選択される数である。］の中から選択される陽イオン成分を含む塩基付加塩を含むが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩に対する言及はすべて、同じ酸付加塩の本明細書に定義される、溶媒付加形態（溶媒和物）または結晶形（多形）を含むことが理解されるはずである。
【００４０】
「調製物」または「剤形」という用語は、活性化合物の固体および液体の両方の製剤を含むように意図されており、当業者は、活性成分が所望の用量および薬物動態パラメーターに応じて異なる調製物中に存在し得るということが理解できよう。
【００４１】
本明細書において使用される「賦形剤」という用語は、医薬品組成物を調製するために使用され、一般に、安全で無毒で、かつ生物学的にもその他の形でも有害でない化合物を指し、家畜への使用ならびにヒトの製薬的使用に許容される賦形剤を含む。
【００４２】
「結晶性の」という用語は、Ｘ線粉末回折または単結晶Ｘ線技法によって決定される場合、１の固体試料が結晶性の特徴を有する状況を指す。
【００４３】
「結晶状の」という用語は、１つの手段によって、例えば、視覚的にまたは光学または偏光顕微鏡によって求められた場合、１の固体試料が結晶性の特徴を有するが、別の手段、例えば、Ｘ線粉末回折によって求められた場合、結晶性の特徴がない状況を指す。視覚によってまたは光学もしくは偏光顕微鏡によって固体試料の結晶化度を視覚的に求める方法は、米国薬局方＜６９５＞および＜７７６＞に開示され、その両方が参照によって組み込まれる。「結晶状」である１の固体試料は、ある条件下では結晶性かもしれないが、他の条件にかけた場合には非晶質であってもよい。
【００４４】
「非晶質の」という用語は、１の固体試料が結晶性でなく、結晶状でもない状況を指す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
第１の実施形態は、結晶性または結晶状形態の、式１によって表される化合物によって表される化合物、その水和物または溶媒和物を対象とする。
【化２】
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【００４６】
結晶性または結晶状の形態の水和物として式１によって表される化合物は、１・ｍＨ２Ｏ［式中、ｍは、整数または非整数値で約０から約５まで変動する。］として示される。結晶性または結晶状の形態の溶媒和物として式１によって表される化合物は、１・ｎＳ［式中、ｎは、整数または非整数値で約０から約３まで変動する。］として示される。式１によって表される化合物、その水和物または溶媒和物は、特定の有利な量の吸着溶媒（Ｓ）または水を有し得る。その場合には、結晶性または結晶状の形態の、式１によって表される化合物またはその水和物の重量に基づいて、Ｓまたは水の量が約０ｗｔ％から約１０ｗｔ％まで変動し得る。
【００４７】
第２の実施形態は、結晶性または結晶状の１を対象とする。
【００４８】
第３の実施形態は、結晶性または結晶状の１・ｍＨ２Ｏ［式中、ｍは、整数または非整数値で約０から約５まで変動する。］を対象とする。
【００４９】
第３の実施形態の第１の態様は、結晶性または結晶状の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５０】
第３の実施形態の第２の態様は、結晶性または結晶状の１・１／２Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５１】
第４の実施形態は、結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５２】
第４の実施形態の第１の態様は、好ましくは以下の単位格子パラメーターａ〜１０．９９Å、ｂ〜１３．０９Å、およびｃ〜２０．３６Åを有する斜方晶系結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５３】
第４の実施形態の第２の態様は、約１４．８にＸＲＰＤ  ２θ−反射（°）を有する結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５４】
第４の実施形態の第３の態様は、約１４．８および１７．６にＸＲＰＤ  ２θ−反射（°）を有する結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５５】
第４の実施形態の第４の態様は、約１４．８、１７．６、および２０．４にＸＲＰＤ  ２θ−反射（°）を有する結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５６】
第４の実施形態の第５の態様は、約８．７、１４．８、１７．６、および２０．４にＸＲＰＤ  ２θ−反射（°）を有する結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５７】
第４の実施形態の第６の態様は、約８．７、１３．６、１４．８、１７．６、および２０．４にＸＲＰＤ  ２θ−反射（°）を有する結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５８】
第４の実施形態の第７の態様は、約８．７、１１．１、１３．６、１４．８、１７．６、および２０．４にＸＲＰＤ  ２θ−反射（°）を有する結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００５９】
第４の実施形態の第８の態様は、図１に示されるもののようなＸＲＰＤ回折パターンを実質的に有する結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００６０】
第５の実施形態は、実質的に純粋な結晶性の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
【００６１】
第６の実施形態は、結晶状の１・Ｈ２Ｏを対象とする。
投薬量、投与、および使用
【００６２】
第７の実施形態は、何らかのウイルス因子の治療および／または予防のための、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳを使用する組成物を対象とする。可能なウイルス因子は、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、日本脳炎ウイルス、またはペスチウイルス、ヘパシウイルス、もしくはフラビウイルスの群に属するウイルスを含むが、これらに限定されない。
【００６３】
この実施形態の態様は、本明細書に開示されるウイルス因子のいずれかの治療のための組成物であって、賦形剤、担体、希釈剤、および同等の媒体、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳのその水和物、溶媒和物、および任意の結晶形を含むように意図される結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏ、または１・ｎＳの中から選択される薬学的に許容される媒体を含む組成物を対象とする。
【００６４】
結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳは、種々様々の経口投与剤形および担体において独立して製剤化されてもよい。経口投与は、錠剤、コーティング錠、硬質および軟質のゼラチンカプセル剤、溶液、乳剤、シロップ剤、または懸濁剤の形態であってもよい。他の投与経路の中でも、坐剤投与によって投与される場合、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳが効果的である。最も都合のよい投与の方式は、一般に、疾患の重症度および抗ウイルス薬に対する患者の反応に従って調節することができる、便利な日々の投薬レジメンを使用する経口法である。
【００６５】
結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳは、１種もしくは複数の従来の賦形剤、担体、または希釈剤と一緒に、医薬品組成物および単位投与量の形態にすることができる。医薬組成物および単位剤形は、追加の活性化合物の有無にかかわらず、従来の比率の従来の成分で構成されていてもよい。また、単位剤形には、用いられる意図した日用投薬量範囲に相応した活性成分の適切な有効量を含んでいてもよい。医薬品組成物は、錠剤もしくは充填したカプセル剤、半固体、粉末、徐放性製剤などの固体、または懸濁剤、乳剤、もしくは充填した経口用カプセルなどの液体として；または直腸および膣内投与の形態で使用されてもよい。典型的な調製物には、約５％〜約９５％（ｗ／ｗ）の活性化合物（複数可）が含まれる。
【００６６】
結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳは、単独で投与することができるが、一般に、意図する投与経路および標準的な医薬品の慣行に関連して選択される、１種もしくは複数の適切な医薬品賦形剤、希釈剤または担体を含む混合物で投与される。
【００６７】
固体形態の調製物としては、例えば粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、坐剤、および分散性顆粒剤が含まれる。固体担体は、希釈剤、芳香剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存料、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料としても作用してよい１種または複数の物質であってよい。粉末中では、一般に担体は、微粉化された活性成分との混合物である微粉化された固体である。錠剤中では、活性成分は一般に、適切な比率で必要な結合能力を有する担体と混合され、所望の形状および寸法に圧密される。適切な担体としては、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオ脂などが含まれるがこれらに限定されない。固体形態調製物は、活性成分に加えて、着色剤、芳香剤、安定剤、緩衝剤、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでいてよい。固体製剤の例は、欧州特許第０５２４５７９号、米国特許出願公開第２００２／０１４２０５０号、米国特許出願公開第２００４／０２２４９１７号、米国特許出願公開第２００５／００４８１１６号、米国特許出願公開第２００５／００５８７１０号、米国特許出願公開第２００６／００３４９３７号、米国特許出願公開第２００６／００５７１９６号、米国特許出願公開第２００６／０１８８５７０号、米国特許出願公開第２００７／００２６０７３号、米国特許出願公開第２００７／００５９３６０号、米国特許出願公開第２００７／００７７２９５号、米国特許出願公開第２００７／００９９９０２号、米国特許出願公開第２００８／００１４２２８号、米国特許第６，２６７，９８５号、米国特許第６，２９４，１９２号、米国特許第６，３８３，４７１号、米国特許第６，３９５，３００号、米国特許第６，５６９，４６３号、米国特許第６，６３５，２７８号、米国特許第６，６４５，５２８号、米国特許第６，９２３，９８８号、米国特許第６，９３２，９８３号、米国特許第７，０６０，２９４号ならびに米国特許第７，４６２，６０８号に例示され、そのそれぞれは参照によって組み込まれる。
【００６８】
液体製剤も、経口投与に適切であり、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、および水性懸濁液を含む液体製剤を含む。これらには、使用直前に液体形態の調製物に変換されるように意図された固体形態調製物が含まれる。液体製剤の例は、米国特許第３，９９４，９７４号、第５，６９５，７８４号、および第６，９７７，２５７号に例示される。乳剤は、溶液中で、例えば、水性プロピレングリコール溶液中で調製されてもよく、またはレシチン、モノオレイン酸ソルビタン、またはアラビアゴムなどの乳化剤を含んでいてもよい。水性懸濁液は、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースなどの粘稠材料、および他の周知の懸濁化剤を含む水中で微粉化された活性成分を分散させることにより調製することができる。
【００６９】
結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳは、坐剤としての投与のために独立して製剤化されてもよい。脂肪酸グリセリドまたはカカオ脂の混合物などの低融点ワックスがまず溶融し、活性成分は、例えば、撹拌によって均一に分散する。次いで、溶融した均一混合物を、都合のよい寸法の型へ注ぎ、冷却し、固化させる。
【００７０】
結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳは、膣投与のために独立して製剤化されてもよい。ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、発泡体またはスプレー剤は、活性成分に加えて、当業界で適していると知られている担体を含有する。これらの製剤のいくつかはまた、殺精剤を含む、または含まないコンドームと組み合わせて使用されてもよい。
【００７１】
適切な製剤は、医薬品担体、希釈剤および賦形剤とともに、参照によってこれによって組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９９５，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａに記載されている。熟練した製剤学者であれば、明細書の教示の範囲内で調合物を修正して、本明細書において企図された化合物を含む組成物を不安定にしたりまたはその治療活性を損なったりすることなく、特定の投与経路向けの数多くの製剤を提供することができる。
【００７２】
さらに、精製した結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳは、独立して、リポソームまたはミセルと組み合わせて製剤化されてもよい。リポソームに関して、精製した化合物は、そのそれぞれが参照によって組み込まれる、米国特許第４，７９７，２８５号、第５，０１３，５５６号、第５，０７７，０５６号、第５，０７７，０５７号、第５，１５４，９３０号、第５，１９２，５４９号、第５，２１３，８０４号、第５，２２５，２１２号、第５，２７７，９１４号、第５，３１６，７７１号、第５，３７６，３８０号、第５，５４９，９１０号、第５，５６７，４３４号、第５，７３６，１５５号、第５，８２７，５３３号、第５，８８２，６７９号、第５，８９１，４６８号、第６，０６０，０８０号、第６，１３２，７６３号、第６，１４３，３２１号、第６，１８０，１３４号、第６，２００，５９８号、第６，２１４，３７５号、第６，２２４，９０３号、第６，２９６，８７０号、第６，６５３，４５５号、第６，６８０，０６８号、第６，７２６，９２５号、第７，０６０，６８９号、および第７，０７０，８０１号に開示されている方式で製剤化できることが企図される。ミセルに関して、精製した化合物は、その両方が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１４５，６８４号および第５，０９１，１８８号に開示される方式で製剤化できることが企図される。
【００７３】
第５の実施形態は、以下のウイルス因子のいずれか１つによる感染症の結果である、何らかの症状の治療用の医薬の製造における結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳの使用を対象とする：Ｃ型肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、デング＊ｄｅｇｕｅウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスおよび日本脳炎ウイルス。
【００７４】
「医薬」という用語は、それを必要とする対象の治療および／または予防方法において使用され、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳを含む組成物、製剤、剤形などを含むが、これらに限定されない物質を意味する。本明細書において開示される抗ウイルス性症状のいずれかを治療するための医薬の製造における、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳは、単独、または本明細書において開示される別の化合物との組み合わせが企図される。医薬には、本明細書において開示される第４の実施形態により企図される組成物のいずれか１つを含むが、これらに限定されない。
【００７５】
第８の実施形態は、それを必要とする対象の治療および／または予防の方法であって、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳの治療有効量を対象に投与することを含む方法を対象とする。
【００７６】
それを必要とする対象とは、Ｃ型肝炎、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、デング＊ｄｅｇｕｅウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、または、日本脳炎ウイルス、フラビウイルス科もしくはペスチウイルスもしくはヘパシウイルスを含むがこれらに限定されない、本明細書において開示されるウイルス因子、または、上に列挙したウイルスのいずれかと同等のまたはそれに匹敵する症候をひき起こすウイルス因子のいずれかによる感染の結果である任意の症状を有する対象であることが意図されている。
【００７７】
「対象」という用語は、畜牛、豚、羊、鶏、七面鳥、水牛、ラマ、ダチョウ、イヌ、ネコおよびヒトを含むがこれらに限定されない哺乳動物を意味し、好ましくは対象はヒトである。第９の態様のその対象の治療方法は、単独または本明細書において開示される別の化合物と組み合わせた、本明細書において企図された化合物のいずれかであり得るということが企図される。
【００７８】
本明細書において使用される「治療有効量」という用語は、個体の疾患の症候を軽減するのに必要とされる量を意味する。用量は、特定の各症例における個々の要件に合わせて調整される。その投薬量は、治療すべき疾患の重症度、患者の年令および全身的健康状態、患者が治療を受けている他の医薬、投与経路および形態ならびに関与する医師の選好および経験などの数多くの要因に応じて、広い限界内で変動し得る。経口投与については、１日あたり０．００１、０．００２５、０．００５、０．００７５、０．０１、０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．１、０．１２５、０．１５０、０．１７５、０．２、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９および９．５などの間の全ての値を含む、約０．００１から約１０ｇの間の１日投薬量が、単剤療法および／または組み合わせ療法において適しているはずである。特定の１日投薬量は、その間の０．０１ｇ（すなわち１０ｍｇ）の全増分値を含む１日あたり約０．０１〜約１ｇの間にあり、好ましい１日投薬量は、それぞれその間の０．０１ｇの全増分値を含む、１日あたり約０．０１〜約０．８ｇ、より好ましくは１日あたり約０．０１〜約０．６ｇ、最も好ましくは１日あたり約０．０１〜約０．２５ｇである。一般に、治療は、ウイルスを素早く低減または除去するため大量の初期「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｏｓｅ）」から開始し、その後、感染の再発を防止するのに充分なレベルまで用量が削減される。当業者は、本明細書において記載される疾患の治療において、過度の実験をせずに知識、経験および本出願の開示に頼って、所与の疾患および患者について本明細書において記載される化合物の治療有効量を確定することができる。
【００７９】
治療薬有効性は、血清タンパク質（例えば、アルブミン、凝固因子、アルカリホスファターゼ、アミノトランスフェラーゼ（例えば、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ）、５'−ヌクレオシダーゼ、γ−グルタミニルペプチド転移酵素、など）、ビリルビン合成、コレステロール合成、および胆汁酸合成；炭水化物代謝、アミノ酸およびアンモニア代謝を含むがこれらに限定されない、肝臓代謝機能などのタンパク質レベルを含むがこれらに限定されない、肝機能の試験から確認することができる。代替として、治療有効性は、ＨＣＶ−ＲＮＡの測定により監視されてもよい。これらの試験の結果により、用量を最適化することができる。
【００８０】
第８の実施形態の第１の態様は、それを必要とする対象における治療および／または予防方法であって、１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳによって表される治療有効量の化合物ならびに治療有効量の別の抗ウイルス剤を対象に投与することを含み、投与が同時または交替である方法を対象とする。交替投与の間の時間は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、および２３時間を含む間のあらゆる下位範囲を含む、１〜２４時間の範囲内であってよいと理解される。
【００８１】
「別の抗ウイルス剤」の例は、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ阻害薬（参照：欧州特許第１８８１００１号、米国特許出願公開第２００３１８７０１８号、米国特許出願公開第２００５２６７０１８号、国際公開第２００３００６４９０号、国際公開第２００３６４４５６号、国際公開第２００４０９４４５２号、国際公開第２００５０２８５０２号、国際公開第２００５０３７２１４号、国際公開第２００５０９５４０３号、国際公開第２００７０１４９２０号、国際公開第２００７０１４９２１号、国際公開第２００７０１４９２２号、国際公開第２００７０１４９２５号、国際公開第２００７０１４９２６号、国際公開第２００７０１５８２４号、国際公開第２００８０１０９２１号、および国際公開第２００８０１０９２１号）；ＨＣＶＮＳ５Ｂ阻害薬（参照：米国特許出願公開第２００４２２９８４０号、米国特許出願公開第２００５１５４０５６号、米国特許出願公開第２００５−９８１２５号、米国特許出願公開第２００６０１９４７４９号、米国特許出願公開第２００６０２４１０６４号、米国特許出願公開第２００６０２９３３０６号、米国特許出願公開第２００６０４０８９０号、米国特許出願公開第２００６０４０９２７号、米国特許出願公開第２００６１６６９６４号、米国特許出願公開第２００７２７５９４７号、米国特許出願公開第６７８４１６６号、米国特許出願公開第２００７２７５９３００号、国際公開第２００２０５７２８７号、国際公開第２００２０５７４２５号、国際公開第２００３０１０１４１号、国際公開第２００３０３７８９５号、国際公開第２００３１０５７７０号、国際公開第２００４０００８５８号、国際公開第２００４００２９４０号、国際公開第２００４００２９４４号、国際公開第２００４００２９７７号、国際公開第２００４００３１３８号、国際公開第２００４０４１２０１号、国際公開第２００４０６５３６７号、国際公開第２００４０９６２１０号、国際公開第２００５０２１５６８号、国際公開第２００５１０３０４５号、国際公開第２００５１２３０８７号、国際公開第２００６０１２０７８号、国際公開第２００６０２００８２号、国際公開第２００６０６５３３５号、国際公開第２００６０６５５９０号、国際公開第２００６０９３８０１号、国際公開第２００７０２６０２号、国際公開第２００７０３９１４２号、国際公開第２００７０３９１４５号、国際公開第２００７０７６０３４号、国際公開第２００７０８８１４８号、国際公開第２００７０９２０００号、および国際公開第２００７０９５２６９号）；ＨＣＶＮＳ４阻害薬（参照：国際公開第２００５０６７９００号および国際公開第２００７０７０５５６号）；ＨＣＶＮＳ５ａ阻害薬（参照：米国特許出願公開第２００６２７６５１１号、国際公開第２００６０３５０６１号、国際公開第２００６１００３１０号、国際公開第２００６１２０２５１号、および国際公開第２００６１２０２５２号）；トール様受容体アゴニスト（参照：国際公開第２００７０９３９０１号）；ならびに他の阻害薬（参照：国際公開第２０００００６５２９号、国際公開第２００３１０１９９３号、国際公開第２００４００９０２０号、国際公開第２００４０１４３１３号、国際公開第２００４０１４８５２号、および国際公開第２００４０３５５７１号）；化合物Ａ（以下に示され、米国特許出願公開第７，４２９，５７２号に開示されている）；化合物Ｂ（米国特許出願公開第２００７／０１９７４６３号に開示されている）；化合物Ｃ（米国特許出願公開第２０１０／００８１６２８号に開示されている。また、化合物Ｃのそれぞれのジアステレオマーである化合物１９ａおよび１９ｂが同出願に開示されている）；化合物Ｄ（米国特許出願公開第２０１０／００１６２５１号に開示されている）；化合物Ｅ（米国特許仮出願第１２／７８３，６８０号に開示され、同出願にＲｐ−４もまた開示されている）；テラプレビル（ＶＸ−９５０としても知られ、米国特許出願公開第２０１０／００１５０９０号に開示されている）；ボセプレビル（米国特許出願公開第２００６／０２７６４０５号に開示されている）；ＢＭＳ−７９００５２（国際公開第２００８／０２１９２７号に開示されている）；ＩＴＭＮ−１９１（米国特許出願公開第２００９／０２６９３０５号の実施例６２−１に開示されている）；ＡＮＡ−５９８（以下に示され、Ｆ．  Ｒｕｅｂａｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  （２００８）  １８：  ３６１６−３６２１において化合物３ｉとして特定された）；ならびにＴＭＣ４３５（以前はＴＭＣ４３５３５０として知られる）の他に、
【化３−１】
0005872539.tif 000004
【化３−２】
0005872539.tif 000005
インターフェロン−α、インターフェロン−β、ペグインターフェロン−α、リバビリン、レボビリン、ビラミジン、別のヌクレオシドＨＣＶポリメラーゼ阻害薬、ＨＣＶ非ヌクレオシドポリメラーゼ阻害薬、ＨＣＶプロテアーゼ阻害薬、ＨＣＶヘリカーゼ阻害薬またはＨＣＶ融合阻害薬を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳが別の抗ウイルス剤と組み合わせて投与される場合、親化合物に比べて活性が増大するかもしれない。治療が組み合わせ療法である場合には、このような投与はヌクレオシド誘導体の投与との関係において同時であっても逐次的であってもよい。したがって、本明細書において使用される「同時投与」は、同時のまたは異なる時点での薬剤の投与を含む。２種以上の薬剤の同時投与は、２種以上の活性成分を含む単一の調合物によってまたは単一の活性薬剤を伴う２種以上の剤形の実質的に同時の投与によって達成可能である。
【００８３】
本明細書における治療への言及は、存在する症状の治療だけでなく予防にまで及ぶことが理解される。さらに、本明細書において使用されるＨＣＶ感染症の「治療」という用語はまた、ＨＣＶ感染症と関連するまたは介在する疾患もしくは症状、またはその臨床症候の治療または予防を含む。
調製
【００８４】
第９の実施形態は、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳを調製する方法であって、１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳを結晶化するステップを含み、ここで、ｍおよびｎは上で定義された通りである方法を対象とする。
【００８５】
第９の実施形態の第１の態様は、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳを調製する方法であって、溶媒または溶媒の混合物中で１を溶解するまたは懸濁するステップをさらに含む方法を対象とする。
【００８６】
第９の実施形態の第２の態様は、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳを調製する方法であって、１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳの種結晶を加えるステップをさらに含む方法を対象とする。
【００８７】
第９の実施形態の第３の態様は、結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳを調製する方法であって、溶媒または溶媒混合物に反溶媒を加えるステップをさらに含む方法を対象とする。
【００８８】
結晶性もしくは結晶状の１・ｍＨ２Ｏまたは１・ｎＳを与える任意の適切な溶媒を使用することができる。企図される特定の溶媒は、アニソール、酢酸エチル、キシレン、トルエン、イソプロパノール、アセトン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、酢酸イソプロピル、ｔ−ブチルメチルエーテル、またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。特定の組み合わせは、アニソール／酢酸エチル、ヘプタン／酢酸エチル、キシレン／酢酸エチル／水、アニソール／水、酢酸エチル／キシレン、イソプロパノール／キシレン、アセトン／キシレン、ジクロロメタン／キシレン、ジクロロメタン／ヘキサン、酢酸エチル／トルエン、ジエチルエーテル／キシレン、酢酸イソプロピル／キシレン、酢酸イソプロピル／ヘプタン、酢酸エチル／水、ｔ−ブチルメチルエーテル／水、ｔ−ブチルメチルエーテル／エチルエーテル、またはｔ−ブチルメチルエーテルを含むが、これらに限定されない。水も含む溶媒の組み合わせに関して、十分な量の水が１・ｍＨ２Ｏ（ｍ≠０である場合）を形成するために必要であり、これは、結晶化に使用される１の量、または１およびそのＲｐ異性体を含有する混合物中に含まれる１の量の見積もりに基づくことが理解される。また、市販の溶媒は、単独で十分なある量の水を含み、結晶性または結晶状の１・ｍＨ２Ｏ（ｍ≠０である場合）の形成に十分な水を与える場合があることが理解される。
【００８９】
第１０の実施形態は、結晶性または結晶状の１・ｍＨ２Ｏの結晶化度を求める方法であって、ＸＲＰＤまたは単結晶Ｘ線結晶法によって１・ｍＨ２Ｏを解析するステップを含む方法を対象とする。
実施例
【００９０】
以下の実施例は、開示された実施形態のよりよい理解を当業者に提供するように意図される。
１の調製
【００９１】
化合物１は、立体選択的または非立体選択的手段によって調製することができる。立体選択的方法は、以下の他に、米国特許仮出願第６１／３１９，５４８号に記載され、これは参照によって組み込まれる。非立体選択的方法はまた、以下の他に、米国特許仮出願第１２／６４５，７６５号に記載され、その主題は参照によって組み込まれる。１およびそのＲｐ異性体を含むジアステレオマー混合物を製造する非立体選択的方法による１の製造は、以下に詳述されるように、１を得るためのジアステレオマー混合物の結晶化、またはＳＭＢクロマトグラフィーによるジアステレオマー混合物のクロマトグラフ分離をさらに含む。
実施例１  １の立体選択的調製
【化４】
0005872539.tif 000006
実施例１−１  （２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−５−（２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メチル）アミノ）−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−４−メチルテトラヒドロフラン−３−オール（３）の合成：
【００９２】
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−２−（ヒドロキシメチル）−４−メチルテトラヒドロフラン−３−オール（２，４ｇ，１２．８ｍｍｏｌ）の０℃で冷却した無水ピリジン（１００ｍＬ）中溶液に、ＤＭＴ−Ｃｌを窒素下に分割して添加した。この褐色の溶液を常温で２４時間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮し、ほとんどの溶媒を除去し、飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）を添加した。混合物を水（１５０ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１２０ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、水（５ｘ１２０ｍＬ）、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒の除去後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中２０％のＥＡからヘキサン中８０％のＥＡ）によって精製し、白色発泡固体として１１．６ｇの生成物３を得た（定量的収率）。１ＨＮＭＲ：（ＤＭＳＯｄ６）δ  ７．９４  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．３９−７．３７  （ｍ，  ３  Ｈ），  ７．２６−７．１４  （ｍ，  １７  Ｈ），  ６．８４−６．８０  （ｍ，  ８  Ｈ），  ５．５８  （ｓ，  １  Ｈ），  ４．０４  （ｂｒ，  １  Ｈ），  ３．７１−３．７０  （ｍ，  １４  Ｈ），  ３．６８  （ｍ，  １  Ｈ），  ３．４８  （ｂｒ，  ２  Ｈ），  ３．２０  （ｄ，  １  Ｈ），  ０．８８  （ｂｒ，  ３  Ｈ）．
実施例１−２  ベンジル（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−５−（２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メチル）アミノ）−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−４−メチルテトラヒドロフラン−３−イルカルボナート（４）の合成：
【００９３】
ヌクレオシド３（２．５２ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（８ｍＬ）中溶液に、ＤＭＡＰ（１．０１ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を氷水浴で０℃に冷却した。Ｃｂｚ−Ｃｌ（０．７７ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を混合物に注射器によって添加し、濁った反応混合物が結果として生じた。この混合物を室温で２４時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）を添加した。混合物をＤＣＭおよび水中で分配した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、白色発泡固体に濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中１０〜６０％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、白色発泡固体として２．７４ｇ（収率、９５％）の生成物４を得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：δ  ７．８７  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．４１−７．１６  （ｍ，  ２４  Ｈ），  ６．７９−６．７５  （ｍ，８  Ｈ），  ６．２８  （ｓ，  １  Ｈ），  ５．６５  （ｂｒ，  １  Ｈ），  ５．１５  （ｓ，  ２  Ｈ），  ４．２８  （ｄ，  １  Ｈ），  ３．７９−３．７１  （ｍ，  １５  Ｈ），  ３．５５−３．５２  （ｍ，  １  Ｈ），  ３．３９−３．３６  （ｍ，  １  Ｈ），  ０．９３  （ｂｒ，  ３  Ｈ）。
実施例１−３  （２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−２−（ヒドロキシメチル）−４−メチルテトラヒドロフラン−３−イルベンジルカルボナート（５）の合成：
【００９４】
１ｖｏｌ％ＴＦＡのＤＣＭ（５０ｍＬ）中溶液を、４（２．６９ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を装填したフラスコに添加した。この混合物を室温で２時間撹拌し、完了した。飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）を添加し、混合物を水およびＤＣＭ中で分配した。有機層を濃縮し、固体残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中０〜５％の２−ＰｒＯＨ）によって精製し、白色発泡固体として１．０１ｇ（収率８８％）の生成物５を得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：δ  ７．８２  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．３９−７．３３  （ｍ，  ５  Ｈ），  ６．０２  （ｄ，  １  Ｈ，  Ｊ  ＝  １９．２  Ｈｚ），  ５．７７  （ｄｄ，  １  Ｈ，  Ｊ  ＝  ２０．８，  ８．８  Ｈｚ），  ５．３２−５．３０  （ｍ，  １  Ｈ），  ５．２０  （ｓ，  ２  Ｈ），  ５．０４  （ｓ，  ２  Ｈ），  ４．３４  （ｄ，  １  Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ），  ４．１５  （ｍ，  １  Ｈ），  ４．０４  （ｓ，  ３  Ｈ），  ３．８５−３．７９  （ｍ，  １  Ｈ），  １．２１  （ｄ，  ３  Ｈ，  Ｊ  ＝  ２２．８  Ｈｚ）．
実施例１−４  （Ｓ）−２−［（４−ニトロ−フェノキシ）−フェノキシ−ホスホリルアミノ］プロピオン酸イソプロピルエステル（ジアステレオマー（Ｓ、ＳＰ）−６および（Ｓ、ＲＰ）−６の混合物）の調製。
【化５】
0005872539.tif 000007
【００９５】
４−ニトロフェニルホスホロジクロリダート＊ｐｈｏｓｈｏｒｏｄｉｃｈｌｏｒｉｄａｔｅ（１２．８ｇ、５０ｍｍｏｌ）の撹拌したジクロロメタン（１００ｍＬ）中溶液に、−７８℃で、フェノールおよびトリエチルアミン（７．７ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）中溶液を２０分の間にわたって添加した。この混合物をこの温度で３０分間撹拌し、次いで、０℃でジクロロメタン（１００ｍＬ）中のＬ−アラニンイソプロピルエステル塩酸塩（８．３８ｇ、５０ｍｍｏｌ）を入れた別の丸底フラスコに移した。混合物に、１５分の間にわたってトリエチルアミン（１４．６ｍＬ、１０５ｍｍｏｌ）の第２のロットを添加した。混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで、溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で研和し、白色固形物を濾別した。濾液を減圧下で濃縮し、薄黄色の油状物を得た。粗の化合物を、０−２０％の酢酸エチル／ヘキサン勾配を使用してクロマトグラフィーで分離し、約１：１の比のジアステレオマーの混合物として生成物（１７ｇ、８３％収率）を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  −２．０５，  −２．１０；  １Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ８．２２  （ｄ，  Ｊ＝９．２Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４１−７．３３（ｍ，  ４Ｈ），  ７．２６−７．１８（ｍ，  ３Ｈ），  ５．０５−４．９６（ｍ，  １Ｈ），  ４．１４−４．０５（ｍ，  １Ｈ），  ３．９３−３．８８（ｍ，  １Ｈ），  １．３８（ｄ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．２２  （ｄｄ，  Ｊ＝６．２  ＆  ３．０Ｈｚ，  ６Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ４０７  （Ｍ−１）＋．
実施例１−５  （Ｓ）−２−［（Ｓ）−（４−ニトロ−フェノキシ）−フェノキシ−ホスホリルアミノ］プロピオン酸イソプロピルエステル（（Ｓ，ＳＰ）−６の結晶化：
【化６】
0005872539.tif 000008
【００９６】
（Ｓ）−２−［（４−ニトロ−フェノキシ）−フェノキシ−ホスホリルアミノ］−プロピオン酸イソプロピルエステル（３．４ｇ）をＩＰＥ（６ｍＬ）に溶解した。溶液が濁るまで手撹拌しながら、上記溶液にヘキサン（１ｍＬ）を添加した。次いで、２、３滴のＩＰＥを混合物に添加し、透明な溶液を得た。この混合物を室温で２０時間穏やかに撹拌した。得られた白色で微細結晶性の固体を濾過し、ＩＰＥ／ヘキサンの１：１混合物で洗浄し、乾燥し、白色のふかふかした固形物（８２０ｍｇ、２４％の収率）ｍｐ５２（収縮）６２〜６６（溶融）を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  −２．０５；  １Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ８．２２  （ｄ，  Ｊ＝９．２Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４１−７．３３（ｍ，  ４Ｈ），  ７．２６−７．１８（ｍ，  ３Ｈ），  ５．０５−４．９６（ｍ，  １Ｈ），  ４．１４−４．０５（ｍ，  １Ｈ），  ３．９３−３．８８（ｍ，  １Ｈ），  １．３８（ｄ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．２２  （ｄｄ，  Ｊ＝６．２  ＆  ３．０Ｈｚ，  ６Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ４０７  （Ｍ−１）＋．（Ｓ，ＳＰ）−６の立体化学は、単結晶Ｘ線結晶法によってＳのＣＩＰ配置を有すると確証された。２０１０年３月３１日出願された米国特許仮出願６１／３１９，５４８を参照のこと。
実施例１−６  ＳＰ−（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）オキシ）−４−フルオロ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（７）の合成：
【００９７】
ヌクレオシド５（１５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ１．５ｍＬ中溶液に、ｔ−ＢｕＭｇＣｌのＴＨＦ中溶液（１．０Ｍ、０．４１ｍＬ）を０℃で添加した。濁った混合物を常温で１時間撹拌し、次いで、ホスホルアミダート試薬（約９５％のキラル純度）（Ｓ）−２−［（Ｓ）−（４−ニトロフェノキシ）フェノキシホスホリルアミノ］プロピオン酸イソプロピルエステル、（Ｓ，ＳＰ）−６、（１６２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１．５ｍＬ中溶液を、注射器によって混合物に滴下添加した。（化合物６は、米国特許出願第１２／６４５，７６５号に略述された手順に従って調製する。）混合物を常温で２０時間撹拌し、出発物質の約２９％は残存した。この反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ（４ｍＬ）の添加によりクエンチし、ＥｔＯＡｃ２０ｍＬを添加した。分離後、有機層を水（３ｘ２５ｍＬ）、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒の除去後、油状残渣を１ＨＮＭＲおよび３１ＰＮＭＲによって点検した。２つの異性体の比は約１２．５：１であった。主要な異性体、１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ７．７３  （ｓ，  １  Ｈ）（完了していない）；３１ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
δ４．０２．
【００９８】
実施例１−７  ＳＰ−（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（１）の合成：
【００９９】
粗のホスホルアミダート７のＭｅＯＨ（２．５ｍＬ）中溶液に、５％Ｐｄチャ−コール（４０ｍｇ）を添加した。フラスコ内の雰囲気を、水素で２度交換した。この混合物を１気圧の水素下で常温で１時間撹拌した。混合物をセライトの短いパッドに通して濾過し、濾液を濃縮した。粗の残渣を１ＨＮＭＲおよび３１ＰＮＭＲによって点検し、２つの異性体の比は約１７：１ＳＰ異性体（１）であり、また薄層クロマトグラフィーによってＳＰ異性体と一致した。３１Ｐ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ４．９１．
【０１００】
代替として、１は、以下に説明されるように２から直接調製することができる。
実施例２  ＳＰ−（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート、１の合成
【０１０１】
乾燥した５０ｍＬフラスコに、ヌクレオシド（２、１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）および無水ＴＨＦ１．５ｍＬを添加した。この懸濁液を氷浴で冷却し、ｔ−ＢｕＭｇＣｌのＴＨＦ中溶液（１．７Ｍ、０．３５ｍＬ、２ｅｑ）を、注射器によってゆっくり添加した。結果として得られた透明溶液を室温で１時間撹拌した。キラルに富むホスホルアミダート試薬（９８：２（Ｓ，ＳＰ）−６／（Ｓ，ＲＰ）−６、１５６ｍｇ、０．３８３ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ１．５ｍＬ中溶液を、室温で注射器によって滴下添加した。４８時間後、ＴＬＣは、出発ヌクレオシドのおよそ３５％が残存することを示した。この反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ（６ｍＬ）の添加によりクエンチした。酢酸エチル（２０ｍＬ）を添加し、有機層を分離した。水層を酢酸エチル（１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、水（２ｘ２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１５ｍＬ）、水（３ｘ２５ｍＬ）、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒の除去後、粗の残渣をＮＭＲによって点検した。３１ＰＮＭＲは、ジアステレオマーの比が７５：１（１の１／ＲＰ異性体）であることを示した。混合物をカラム（シリカゲル、ＤＣＭ中０〜８％のＭｅＯＨ）によって精製し、白色発泡固形物（３５．８ｍｇ、１９％）として生成物を得た。
１の非立体選択的調製
実施例３
（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノアート（１）の合成
【０１０２】
乾燥した２５０ｍＬ丸底フラスコにフェニルジクロロホスファート（２．６６ｇ、１２．６１ｍｍｏｌ）および無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）を装入した。アミノエステル塩（２．６０ｇ、１５．５３ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、混合物を−５℃に冷却した。次いで、Ｎ−メチルイミダゾール（７．７ｍＬ、９７ｍｍｏｌ）を、−５℃で乾燥した注射器によって速やかに添加し、溶液を−５℃で１時間撹拌した。ヌクレオシド（１，３．０４ｇ，９．７ｍｍｏｌ）を、−５℃でバイアルから一度に添加し、固形物を２０分でゆっくり溶解した。反応温度を２時間にわたり常温に上昇させた。１７時間後、反応は完了していなかった。追加の試薬を製造し（上記のようにホスファート（２．６６ｇ）、アミノエステル（２．６０ｇ）、およびＮＭＩ（３．８ｍＬ、４８ｍｍｏｌ）から）、−５℃で反応混合物に添加した。この反応物を室温でさらに２時間撹拌した。反応は、ＴＬＣ結果によって示されたように、ほぼ完了し、ジクロロメタン７０ｍＬで希釈した。ＨＣｌ溶液（１Ｎ、７０ｍＬ）を添加した。水層を分離しジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３、水、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下での溶媒の除去後、粘着性の残渣を、自動カラムクロマトグラフィーに通して２４０ｇのカートリッジおよびジクロロメタン中０〜８％の２−ＰｒＯＨの勾配を使用して精製し、発泡固形物（４．１６ｇ、７．１４ｍｍｏｌ、７３％の収率）として生成物を得た。ＨＰＬＣ純度９７．４％。生成物のＮＭＲスペクトルは、それが１．２：１の比の２つのジアステレオマーの混合物であることを示した。
【０１０３】
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ＝  ７．９８  （１  Ｈ，  ｓ，  一方の異性体の８−Ｈ），  ７．９５  （１  Ｈ，  ｓ，  別の異性体の８−Ｈ），  ７．３７−７．３２  （２  Ｈ，ｍ，  ａｒｏｍ−Ｈ），  ７．２２−７．１５  （３  Ｈ，ｍ，  ａｒｏｍ−Ｈ），  ６．６  （２  Ｈ，  ｓ，  ＮＨ２），  ６．１１  （１  Ｈ，  ｄ，  一方の異性体のＣ１'−Ｈ），  ６．０９  （１  Ｈ，  ｄ，  別の異性体のＣ１'−Ｈ），  ６．０９−５．９８  （１  Ｈ，ｍ，  ａｍｉｄｅ  ＮＨ），  ５．８８  （１  Ｈ，  ｄ，一方の異性体の３'−ＯＨ），  ５．８１  （１  Ｈ，  ｄ，  別の異性体の３'−Ｈ），  ４．８５−４．７５  （１  Ｈ，  ｈｅｐｔａ，  ｉｓｏ−プロピルのメチンＨ），  ４．４６−４．２７  （２  Ｈ，ｍ，  Ｃ４'−Ｈ，  アミノエステルのα−Ｈ），  ４．１５−４．０７  （１  Ｈ，ｍ，  Ｃ３'−Ｈ），  ３．９６  （３  Ｈ，  ｓ，  ＯＣＨ３），  ３．８２−３．７２  （２  Ｈ，ｍ，  Ｃ５'−ＨａおよびＣ５'−Ｈｂ），  １．２３−１．０６  （９  Ｈ，ｍ，  アミノエステルのＣＨ３），  １．０３  （３  Ｈ，  ｄ，  Ｃ２'−ＣＨ３）．
３１ＰＮＭＲ：（ＤＭＳＯｄ６）δ＝４．９１（一方の異性体）、４．７２（別の異性体）。
【０１０４】
代替精製法は、化学的にクロマトグラフ分離を単純化するために、マイナーな３'ホスホルアミダート副生成物を変えることである。粗のホスホルアミダート生成物を無水ピリジン（５ｍＬ／ｇ）に溶解し、常温でｔ−ブチルジメチルシリルクロリドの０．５当量で処理し、３'異性体不純物の遊離の第一級５'ヒドロキシルと選択的に反応させた。反応の進行はＬＣ／ＭＳによって監視することができる。一旦、３'異性体が５'−ｔＢＤＭＳ−３'−ホスホルアミダート誘導体に変換されれば、反応をメタノール（３ｅｑ）でクエンチし、減圧下で濃縮し、酢酸エチルおよび５％のクエン酸の間で分配し、次いで、有機層を濃縮する。次いで、残渣を、ここでは、より高い装填およびより高速の勾配で実施しかつ、高純度を達成することができるクロマトグラフィーにかける。
【０１０５】
非立体選択的方法による１の製造では、１およびＲｐ異性体を含有するジアステレオマー混合物を提供し、それによって、以下に説明するように、混合物の結晶化によって、またはクロマトグラフ分離によって、１をさらに精製することができる。
実施例４  １およびＲｐ異性体を含む混合物からの１の分離
【０１０６】
１およびＲｐ異性体を含むジアステレオマー混合物合計１１．９ｋｇを分離し、ｃＧＭＰプロトコルの下で両異性体（１およびＲｐ異性体）のおよそ８５％の収率を得る。ジアステレオマーの純度の必要条件は、両ジアステレオマーについて＞９８％ｄ．ｅである。
分取クロマトグラフィー条件
【０１０７】
クロマトグラフィーの設備および分離法は以下のとおりである：
【０１０８】
１００グラムのＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＡ（商標）をそれぞれ保持する８カラムで構成される５ｃｍのＳＭＢシステムを、ジアステレオマー混合物の処理に使用した。
移動相は１００％の酢酸エチルであった。
分離および単離
【０１０９】
この物質の溶解度は、移動相中で７５ｇ／ｌであった。物質を撹拌しながら４０℃で移動相に溶解した。
【０１１０】
ＳＭＢからの抽出物流れを、最初は、１／２平方フィート水平薄膜蒸発器（Ｐｒｏｔｈｅｒｍ）を使用して濃縮し、次いで、回転蒸留器で４０℃で乾燥した。抽残物流れの流速はあまりにも低いので、Ｐｒｏｔｈｅｒｍによって扱うことができなかった。抽残物は、回転蒸留器を使用して、直接乾燥した。次いで、生成物を真空オーブンで４０℃で恒量になるまで乾燥した。しかし、酢酸エチルの残留含量は、恒量到達後でも所望の水準（＜０．４ｗｔ％）を上回ることがわかった。真空下で５０℃でさらに乾燥した後も、含量はおよそ１ｗｔ％に留まった。生成物をアセトンに再度溶解し、次いで、回転蒸留器で蒸発乾固させた。このステップは、効果的に０．１ｗｔ％以下に残留酢酸エチル含量を除去した。次いで、生成物を真空オーブンでさらに乾燥して、残留アセトンを所望の含量＜０．４ｗｔ％に減少させた。
結果
【０１１１】
抽出物−１．非晶質１の６，８６４ｇの量は、９９．２％ｄ．ｅのジアステレオマー純度で回収された。
【０１１２】
抽残物−Ｒｐ異性体。３，７０７ｇの量のＲｐ異性体を回収し、そのうち１，８４４ｇは９８．１％ｄ．ｅのジアステレオマー純度を有していた。
実施例５  アニソール／酢酸エチル／水を用いる非晶質固形物１（ＳＭＢクロマトグラフィーから得られた）からの１・Ｈ２Ｏのキロスケール結晶化。
【０１１３】
１０Ｌのロータリーエバポレータフラスコに機械式撹拌機を装備した。常温で、１０００ｇの非晶質固形物（９８．９％のＨＰＬＣ純度、水０．２５当量存在）続いて酢酸エチル（１．００Ｌ）およびアニソール（９９％等級、４．００Ｌ）を添加した。この懸濁液を、すべての固形物が溶解する（１５分）まで高速で撹拌した。撹拌を８８ｒｐｍまで減速した。結晶種（４０ｍｇ）、続いて水（３１ｍＬ、１．０ｅｑ）を添加した。溶液は約３０分後に濁り、３〜４時間後、重い沈殿物が生じ、目に見える水は残存していなかった。この懸濁液を常温で合計２０時間撹拌した。結晶性固体を２５ｃｍブフナー漏斗上で真空濾過によって収集した。ケーキをヘプタンおよびｔ−ブチルメチルエーテル（３ｘ１Ｌ）の５０：５０混合物で洗浄した。ケーキは容易に洗浄され、圧縮を必要としなかった。１５分間の風乾後、固形物を８ｘ１４”乾燥皿に移し、恒量（４時間）になるまで真空（０．２ｍｍＨｇ、５０℃）下で乾燥し、次いで、１７時間常温で真空下に保持し、８４０ｇ（水和の差として約８２％）の微細な砕けた結晶性木舞（ｌａｔｈｓ）および、側面に１５０マイクロメートル未満の針状物を得た。ＨＰＬＣ純度９９．７％。８８℃で収縮が始まり９３〜１００℃で溶融する明白な融点を示した。水和物として、これは、脱水から非晶質固体、および次の相転移温度の組み合わせを意味する。
【０１１４】
結晶化を、比例した方式でさらに９９０ｇについて反復し、同じ純度でさらに８４０ｇ（約８３％）を得た。濾液を合わせ、減圧下で粗の重量４５０ｇの黄色油状物にストリップしたが、なお概算で１５０ｇのアニソールを含んでいた。これに、酢酸エチル（３５０ｍＬ）、追加のアニソール（８５０ｍＬ）、水（９ｇ）および種（２０ｍｇ）を添加した。前と同様に、この溶液を撹拌した。これは４時間後に濁り、常温で２４時間撹拌した。固形物を濾過によって収集し、機械的に塊を壊し黄色味がなくなるまで洗浄しながら、５０：５０ヘプタンおよびｔ−ブチルメチルエーテルですすいだ（４ｘ４５０ｍＬ）。固形物を同様に乾燥し、追加の再結晶化に適切な９８．９％のＨＰＬＣ純度の２００ｇの生成物をさらに得た。母液を１７５ｇの明茶色油状物（８５％のＨＰＬＣ純度）にストリップしたが、なおいくらかのアニソールを含有していた。
実施例６  ヘプタン／酢酸エチルを用いる非晶質１（ＳＭＢクロマトグラフィーから得られた）からの１・Ｈ２Ｏの結晶化。
【０１１５】
１ｇの非晶質１（９８．９％のＨＰＬＣ純度）を、ボルテックスミキサーでの振盪によって酢酸エチル（４ｍＬ）およびヘプタン（２ｍＬ）の混合物に溶解した。この溶液に結晶性物質の少数の種を添加した。この懸濁液を、６時間大気水分に曝したオープン容器内で常温で撹拌した。固形物を濾過によって収集し、エチルエーテルおよびヘキサン（１：１、３×３ｍＬ）の混合物で洗浄し、９１０ｍｇの結晶性固体に乾燥した。ＨＰＬＣ純度９９．５％。
実施例７  キシレン／酢酸エチル／水を用いる非晶質１（ＳＭＢクロマトグラフィーから得られた）からの１・Ｈ２Ｏの結晶化。
【０１１６】
１ｇの非晶質１（９８．９％のＨＰＬＣ純度）を酢酸エチル（１．５ｍＬ）に溶解し、次いでキシレンを濁るまで（３．２ｍＬ）添加した。混合物を４５℃に加熱し、透明な溶液を得、次いで常温に冷却した。水（５０μＬ）を添加し、溶液は磁気撹拌機を用いて撹拌した。種は添加しなかった。７２時間後、結果として得られた沈殿物を濾過によって収集し、キシレン（２．５ｍＬ）中３５％の酢酸エチルで洗浄し、乾燥し（０．２ｍｍＨｇ、常温）、微細な白色の破砕した結晶として９５０ｍｇの生成物を得た。ＨＰＬＣ純度９９．５％。
混合物からの精製に関する検討
【０１１７】
ＳＭＢクロマトグラフィー、および次いで、それを結晶化することによって、１およびその対応するＲｐジアステレオマー対応物を含む混合物から１を分離することに対する実践的な代替法は、混合物から１（または１・Ｈ２Ｏ）を直接結晶化することである。全体の回収は、ＳＭＢ法の経費および時間消費を回避しつつ、ほとんど同じくらい高度である。非常に高いＳＰ／ＲＰ比を含むキラル合成で生成する物質の直接結晶化は、はるかに効率的であると予想される。
実施例８  異性体（ＳＰ／ＲＰ（１．６：１））の混合物の精製した非晶質固体からの１・Ｈ２Ｏの結晶化
【０１１８】
１およびそのジアステレオマー対応物（Ｒｐ異性体）（１．０ｇ）を含む混合物を酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解した。アニソール（４ｍＬ）をゆっくり添加し、高速撹拌しながら透明な溶液を形成した。水（２２ｍｇ、１に基づいて１．０ｅｑ）、続いて結晶性１の種（〜２ｍｇ）を添加した。１０分で固形物が形成し始めた。撹拌を３６時間継続した。白色固形物を濾過によって収集し、エチルエーテル／ヘキサン（１：１、３ｍｌｘ３）の低温混合物で洗浄した。収率＝５２０ｍｇ（９６％  １、Ｐ−ＮＭＲによる）。この４７０ｍｇの物質を、２分にわたって温酢酸エチル（０．７ｍＬ、４５℃）に溶解し、次いで、撹拌しながら、追加の水または種なしでアニソール（２．８ｍＬ）を添加することにより再結晶した。この溶液は５分後濁った。これを常温で４８時間撹拌した。固形物を焼結ガラス漏斗での濾過によって集め、エチルエーテル／ヘキサン（１：１、２ｍｌｘ３）の低温混合物で洗浄し、真空下で、白色固形物４５１ｍｇに乾燥した（Ｐ−ＮＭＲによると純度＞９９％）。理論上出発混合物中に存在する６１５ｍｇの１に基づいた回収率は、７３％であった。
混合物からＳＰ異性体を結晶化する代替溶媒混合物に対する検討
【０１１９】
当量の水を含む酢酸エチル（４ｍＬ／ｇ）に溶解し、続いて約１ｍｌ／ｇに蒸発させた、１およびＲＰ異性体を含有する混合物（１ｇ）から９３％の純粋な物質３９６ｍｇを得た。この３７５ｍｇの試料を、酢酸エチル（２．５ｍＬ）および当量の水から再結晶し、純度９９．１％の物質２７５ｍｇを得た。別の１ｇのジアステレオマー混合物を１当量の水を含む酢酸エチル／ヘプタン２：１（６．５ｍＬ／ｇ）から結晶化し、９５％純度の４３３ｍｇを得た。
【０１２０】
１・Ｈ２Ｏは、１およびＲＰ異性体の粗の混合物の結晶化によって得ることができることが企図される。
【０１２１】
代替として、ＳＰ異性体はまた、クロマトグラフィーなしで、クロロホスファート試薬から形成される粗の生成物からの一水和物の直接結晶化によって単離することができる（上記の非立体選択的法を参照）。アニソール−水は、結晶化を開始し、続いてエチルエーテルで希釈する、適切な溶媒の組み合わせである。精製した１に使用されるような他の溶媒の組み合わせを使用してもよい。
実施例９  粗生成物からの直接結晶化による１の単離
【０１２２】
乾燥した５０ｍＬ丸底フラスコにフェニルジクロロホスファート（２．６８ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）および無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）を装入した。アミノエステル塩（２．５８ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、混合物を−３０℃に冷却した。次いで、Ｎ−メチルイミダゾール（６．３ｇ、７６ｍｍｏｌ）を、−３０℃で乾燥した注射器によって速やかに添加し、溶液を−５℃で２０分間撹拌した。ヌクレオシド（７、２．００ｇ、６．３８ｍｍｏｌ）を、−５℃でバイアルから一度に添加し、固形物を２０分でゆっくり溶解した。反応温度を常温に上昇させ、１時間撹拌した。ＴＬＣは約９５％の完了を示した。反応物をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、１ＮＨＣｌ（２ｘ５０ｍＬ）、飽和重炭酸塩および塩水の１：１混合物で洗浄し、硫酸ナトリウム（５ｇ）で乾燥し、濾過し、減圧下で、次いで高真空下で４．５ｇの粗生成物に濃縮した。Ｐ−ＮＭＲは、ＳＰ／ＲＰ異性体の１．５：１混合物を示した。
【０１２３】
粗の油状物の少量部分（１００ｍｇ）をアニソール（０．３０ｍＬ）に溶解し、この溶液を注射器フィルター（２２ミクロン）に通して濾過した。水（８ｍｇ）、続いて種結晶（約１ｍｇ）を、常温で撹拌した溶液にゆっくり添加した。この溶液は５分で濁った。エチルエーテル（１ｍＬ）をゆっくり滴下し、懸濁液を２時間撹拌し、次いで、沈殿物は濾過によって集め、エチルエーテル−ヘキサン（３ｘ１ｍＬ）の低温１：１混合物で洗浄し、次いで、真空下でＳＰ異性体１７ｍｇに常温で乾燥した。ＮＭＲ純度９８％。これは、出発ヌクレオシドから２１％の収率、および粗の混合物中に形成された１の量の３５％の理論収率を意味する。
固体状態の特性評価の検討。
【０１２４】
塩化メチレン／ヘキサン／大気中の水からの単結晶Ｘ線は、１個の水分子が結晶構造に組み込まれていることを示した。３種の溶媒系（アニソール／酢酸エチル、ヘプタン／酢酸エチル、キシレン／酢酸エチル）からの試料は、ＸＲＰＤによって同じ結晶形をすべて示した。アニソール試料をさらなる検討のために使用した。Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ分析は、一水和物に対応する３．１％の水を示した。ＴＧＡ分析は、８０〜１００℃の間で半分の水和、および１１０〜１７０℃で第２の半分の水和の損失を示した。開放皿で１０℃／分で加熱すると、ＤＳＣは、７５℃で吸熱が始まる、９３．５６℃での開始、および１００．２４℃でのピークを有する脱水を示した。温度可変式ＸＲＰＤは、９０から１００℃の間の結晶化度の損失を示した。ＧＶＳ分析は、９０％ＲＨで可逆的な０．４７％ｗ／ｗの増加を有する一水和物の非常に低い吸湿性、および０％ＲＨで一水和物の安定性を示した。
実施例１０  １・Ｈ２Ｏ（形態１）のＸＲＰＤ
実験
【０１２５】
Ｘ線粉末回折パターンは、Ｃｕ  Ｋａ放射（４０ｋＶ、４０ｍＡ）、θ−２θゴニオメーター、Ｖ４の発散スリットおよび受光スリット、ＧｅモノクロメーターおよびＬｙｎｘｅｙｅ検出器を使用するＢｒｕｋｅｒ  Ｄ８回折計で収集した。装置は、検証されたコランダム標準（ＮＩＳＴ  １９７６）を使用して性能点検した。データ収集用に使用したソフトウェアは、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＸＲＤ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ２．５．０であり、データはＤｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ  １１．０．０．２  ｏｒ  ｖ  １３．０．０．２を使用して、分析し提示した。
【０１２６】
試料は、平板試験片として、入手したままの粉末を使用して周囲条件下で運転した。およそ２０ｍｇの試料を、研磨した、ゼロバックグラウンド（５１０）シリコンウエハーに切削した空洞に穏やかに充填した。試料を、分析の間、それ自体の平面内で回転させた。データ収集の詳細は次のとおりである：
角度範囲：２〜４２°２θ
ステップサイズ：０．０５°２θ
収集時間：０．５秒．ステップ−１
【０１２７】
以下の°２θ／％強度データを与えるＸＲＰＤパターンが得られた：
【表１】
0005872539.tif 000009
図１は、１・Ｈ２ＯのＸＲＰＤスペクトルを含む。
実施例１１  １・Ｈ２ＯのＸ線構造決定
【０１２８】
化合物１・Ｈ２Ｏ、Ｃ２４Ｈ３４Ｎ６ＰＯ９Ｆは、斜方晶空間群Ｐ２１２１２１で結晶化する。（組織の欠如ｈ００：ｈ＝奇数、０ｋ０：ｋ＝奇数、および００ｌ：ｌ＝奇数）ａ＝１０．９９１８（８）Å、ｂ＝１３．０９２５（９）Å、ｃ＝２０．３５７０（１３）Å，Ｖ＝２９２９．６（３）Å３，Ｚ＝４，およびｄｃａｌｃ＝１．３６２ｇ／ｃｍ３。Ｘ線強度データは、１４３（１）Ｋの温度でグラファイト単色化Ｍｏ−Ｋα放射（λ＝０．７１０７３Å）を使用するＢｒｕｋｅｒ  ＡＰＥＸＩＩ  ＣＣＤ面検出器で収集した。予備的指標付けを一連の３６の０．５°回転フレームから３０秒の露光で行った。合計１７９０のフレームを、結晶から検出器までの３７．５２２ｍｍの距離、０．５°の回転幅および３０秒の露光で収集した。
【表２】
0005872539.tif 000010
【０１２９】
ＳＡＩＮＴ  （Ｂｒｕｋｅｒ  （２００９）  ＳＡＩＮＴ．  Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ．）を使用して回転フレームを積分し、平均化されていないＦ２およびσ（Ｆ２）値のリストを作り、次いで、デルペンティウム４コンピューターでのさらなる処理および構造解明のためにＳＨＥＬＸＴＬ  （Ｂｒｕｋｅｒ  （２００９）  ＳＨＥＬＸＴＬ．  Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ．）プログラムパッケージに通した。
合計４７６５４の反射が範囲１．８５≦θ≦２５．０６°，−１３≦ｈ≦１３，−１５≦ｋ≦１５，−２４≦ｌ≦２２にわたって測定し、５１８７の固有の反射（Ｒｉｎｔ＝０．０２６１）が得られた。強度データは、ＳＡＤＡＢＳ  （（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，  Ｇ．Ｍ．  （２００７）  ＳＡＤＡＢＳ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ．）  を使用して、ローレンツおよび分極効果、および吸収について補正した。（最小および最大の伝達０．６７４９、０．７４５２）。
【０１３０】
構造を直接法（ＳＨＥＬＸＳ−９７（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，  Ｇ．Ｍ．  （２００８）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ａ６４，１１２−１２２．））によって解明した。
ＳＨＥＬＸＬ−９７  （Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，  Ｇ．Ｍ．  （２００８）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ａ６４，１１２−１２２．）を使用するＦ２に基づくフルマトリックス最小二乗法によっって精密化した。反射はすべて精密化中に使用した。使用した重み付けスキームは、ｗ＝１／［σ２（Ｆｏ２）＋（０．０４１３Ｐ）２＋０．４９１６Ｐ］（式中、Ｐ＝（Ｆｏ２＋２Ｆｃ２）／３）。非水素原子を異方性的に精密化し、水素原子はライディングモデルを使用して精密化した。精密化は、５０００の観察された反射に対し、Ｒ１＝０．０２４４およびｗＲ２＝０．０６５７に収斂し、５１８７すべての固有の非ゼロ反射および３７７の変数に対して、Ｆ＞４σ（Ｆ）、かつＲ１＝０．０２５９、かつｗＲ２＝０．０６６９、かつＧＯＦ＝１．０５９である（Ｒ１＝Σ｜｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜｜／Σ｜Ｆｏ｜；ｗＲ２＝［Σｗ（Ｆｏ２−Ｆｃ２）２／Σｗ（Ｆｏ２）２］1/2；ＧＯＦ＝［Σｗ（Ｆｏ２−Ｆｃ２）２／（ｎ−ｐ）］1/2；式中、ｎ＝反射の数、ｐ＝精密化するパラメーターの数である。）最小二乗の最終サイクルの最大Δ／σは０．００１であり、最終の差フーリエの２つの最も顕著なピークは＋０．１７０および−０．２４８ｅ／Å３であった。
【０１３１】
表２は、セル情報、データ収集パラメーターおよび精密化データを列挙する。最終の位置およびパラメーターは表３に示される。図２は、３０％の確率で温熱性楕円体が示される１・Ｈ２ＯのＯＲＴＥＰ表現である（結晶構造説明のためのフォートラン温熱性楕円体プロットプログラム“ＯＲＴＥＰ−ＩＩ：  Ａ  Ｆｏｒｔｒａｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ  Ｐｌｏｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｓ．”  Ｃ．Ｋ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ  （１９７６）  ＯＲＮＬ−５１３８．）。
【表３】
0005872539.tif 000011
【０１３２】
以下の実施形態は、様々なホスホルアミダート試薬が、１、そのＲＰ異性体、または１およびそのＲＰ異性体のジアステレオマー混合物を調製するために使用される実施例を提供する。
実施例１２−１  （Ｓ）−２−｛（Ｓ）−［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−プリン−９−イル）−４−（Ｒ）−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロピオン酸イソプロピルエステル一水和物（１）の（Ｓ）−イソプロピル２−（（（Ｓ）−（パーフルオロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（（Ｓ，ＳＰ）−８）による合成ならびにクロマトグラフィーおよび結晶化による単離。
【化８】
0005872539.tif 000012
ａ）（Ｓ）−２−［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−フェノキシ）−フェノキシ−ホスホリルアミノ］プロピオン酸イソプロピルエステル（（（Ｓ，ＳＰ）−８および（Ｓ，ＲＰ）−８））の調製および（Ｓ）−２−［（Ｓ）−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−フェノキシ）−フェノキシ−ホスホリルアミノ］プロピオン酸イソプロピルエステル（（Ｓ，ＳＰ）−８）の単一収穫での結晶化誘起動的光学分割による単離
【０１３３】
低温温度計および機械式撹拌機を取り付けた乾燥した１Ｌ３首フラスコに、フェニルホスホロジクロリダート（２５ｇ、１１８．５ｍｍｏｌ）を装入した。無水ジクロロメタン（１２５ｍＬ）を添加し、溶液を０℃に冷却した。揺動しながら、アラニンエステル塩（オーブン乾燥した）（１９．８６ｇ、１ｅｑ）をＮ２下に速やかに添加した。溶液を、約−５０℃（内部温度）に冷却した（Ｎ２下でアセトン／ドライアイス浴中）。トリエチルアミンのＤＣＭ（１２５ｍＬ）中溶液（２５．２ｇ、２．１ｅｑ）を、−５０℃で０．５時間にわたり添加漏斗経由で滴下添加し、結果として得られた白色スラリーを約−５０℃０．５時間撹拌した。混合物を１．５時間にわたり０℃まで暖め、次いでペンタフルオロフェノール（２１．８２ｇ、１ｅｑ）およびＴＥＡ（１３．２ｇ、１．１ｅｑ）の前もって混合しておいた冷却溶液（ＤＣＭ７５ｍＬ中）（注意：ペンタフルオロフェノールおよびＴＥＡの混合中に熱が放出される）を添加漏斗経由で０℃で０．５時間にわたり添加した。この混合物を０℃でさらに４時間撹拌した。
【０１３４】
この混合物をブフナー漏斗に通して濾過し、収集した固形物のトリエチルアミン塩酸塩をＤＣＭ（３×４０ｍＬ）ですすいだ。濾液を３１ＰＮＭＲによって点検し（約１．１４：１比で低磁場ピークのＳＰジアステレオマーが優勢であった。）、同重量の２つの部分に分けた。その１つを減圧下で濃縮した。白色固形物残渣（３１ｇ）を、ＥｔＯＡｃおよびヘキサン（１５０ｍＬ、２０：８０、ｖ／ｖ）の混合物中で室温で１７時間研和し、その間にそれほど可溶性でないＳＰ異性体の動的分割を可能にした。白色スラリーを濾過し、固形物をヘキサン中２０％のＥｔＯＡｃ（２ｘ２５ｍＬ）ですすいだ。固形分（２２．５８ｇ）を１ＨＮＭＲおよび３１ＰＮＭＲによって点検し、それはトリエチルアミン塩酸塩が混入した一方の異性体としての生成物を含んでいた。固形分を溶解し、ＥｔＯＡｃ３１０ｍＬおよび水１００ｍＬに分配した。有機層の分離後、水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層を、水（３ｘ８０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶液を減圧下で濃縮し、次いで、室温で高真空下で恒量になるまで乾燥し、反応物の半分から白色固形物として１７．３６ｇの生成物が得られた。収率は６４％である。上記からの母液をゴム状残渣（７．８９ｇ）に濃縮し、これは３１ＰＮＭＲに基づいて１：１．２（（Ｓ，ＳＰ）−８／（Ｓ，ＲＰ）−８）の比を有する試薬を含んでいた。
ｂ）（Ｓ，ＳＰ）−８および２からの１の調製
【０１３５】
乾燥した２５０ｍＬ３首丸底フラスコに、プリンヌクレオシド（２）５．０６ｇ（１６．１５ｍｍｏｌ）を添加した。固形物を無水ＴＨＦ４０ｍＬに懸濁し、氷水浴で冷却した。グリニャール試薬（ＴＨＦ中１Ｍ溶液）を注射器によって滴下添加し、透明な溶液が形成された。この混合物を０℃で３０分間撹拌し、（Ｓ，ＳＰ）−８（８．３２ｇ、１８．３５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ４０ｍＬ中溶液を、５０分にわたり添加漏斗経由で添加した。添加終了後に、反応混合物を室温で３時間撹拌した。この反応を０℃で飽和ＮＨ４Ｃｌ２０ｍＬを添加することによりクエンチした。この混合物を酢酸エチル１００ｍＬで希釈した。２層を分離し、水層を酢酸エチル５０ｍＬで抽出した。有機層を合わせ、水（６０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（２×６０ｍＬ）、水（６０ｍＬ）、塩水（４０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、非晶質固形残渣を得た。
【０１３６】
粗の残渣に、酢酸エチル７ｍＬ、続いてアニソール２６ｍＬを添加した。溶液が形成されるまで、この混合物を撹拌した。水（３２０ｍｇ）を添加し、生成物（１）の結晶の種２０ｍｇを添加した。この混合物を−５℃で終夜冷却した。白色固形物が形成され濾過によって収集した。固形分をヘプタンおよびＴＢＭＥ（１：１、３×２ｍＬ）の前もって冷却した混合物ですすぎ、乾燥後、３．３ｇと秤量された。母液を減圧下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５〜７％の２−プロパノール）によって精製した。生成物が白色非晶質固形物（４．５ｇ）として得られた。
【０１３７】
上記からの固形分を合わせて（７．８ｇ）、酢酸エチル７．７ｍＬと混合した。スラリーに、アニソール３１ｍＬを添加し、均一溶液が形成されるまで、混合物が撹拌した。溶液に、水１６０ｍｇ、続いて生成物（１）の結晶種２０ｍｇを添加した。この混合物を室温でゆっくり撹拌し、白色固形物が沈澱した。この混合物を−５℃で２時間維持し、固形物を濾過によって集めた。固形分を、ヘプタンおよびＴＢＭＥ（１：１、４×５ｍＬ）の前もって冷却した混合物ですすぎ、真空内で乾燥した。生成物は６．６９ｇ（６９％の収率）と秤量された。
実施例１２−２  （Ｓ）−２−｛（Ｓ）−［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−プリン−９−イル）−４−（Ｒ）−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロピオン酸イソプロピルエステル一水塩（１）の（Ｓ）−イソプロピル２−（（（Ｓ）−（パーフルオロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（（Ｓ，ＳＰ）−８）による合成および結晶化のみによる単離。
【０１３８】
乾燥した２５０ｍＬ３首丸底フラスコに、ヌクレオシド５ｇ（１５．９６ｍｍｏｌ）および無水ＴＨＦ４０ｍＬを装入した。この懸濁液を氷水浴で冷却し、グリニャール試薬（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、２０ｍｍｏｌ）２０ｍＬを、１０分にわたり注射器によって添加した。透明な反応混合物を０℃で半時間撹拌し、次いで、ＴＨＦ４０ｍＬ中リン試薬（（Ｓ，ＳＰ）−８）の溶液を、２時間で添加漏斗によって添加した。常温までこの反応物をゆっくり暖め、終夜撹拌した。この混合物を０℃に冷却し、１Ｎ希ＨＣｌ５０ｍＬを添加した。ほとんどのＴＨＦを減圧下で除去し、混合物を酢酸エチル２００ｍＬで希釈した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル３０ｍＬで抽出した。合わせた有機層を、水（６０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（２×５０ｍＬ）、５％の炭酸ナトリウム（７０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去し、非晶質固形物残渣を得た。
【０１３９】
粗の残渣を室温でアニソール４１ｍＬに溶解した。溶液に、キシレン２４ｍＬ、続いて水４１０ｍｇを添加した。この混合物を、室温でゆっくり撹拌し、１の結晶種（１０ｍｇ）を添加した。白色固形物が沈澱し、混合物を−５℃で２時間維持した。固形分を濾過によって収集し、ヘプタンおよびＴＢＭＥ（１：１、３×２ｍＬ）の前もって冷却した混合物ですすいだ。固形分は、乾燥後５．８３ｇと秤量された。母液を減圧下で乾固するまで濃縮した。残渣をアニソール７．２ｍＬに溶解し、キシレン１０．７ｍＬを添加した。溶液に水１７８ｍｇを添加し、１の結晶種５ｍｇを添加した。混合物を室温で終夜ゆっくり撹拌した。白色固形物が形成され濾過によって収集した。固形分を、ヘプタンおよびＴＢＭＥの前もって冷却した混合物（１：１。３×１ｍＬ）ですすぎ、１．１７ｇと秤量された。
【０１４０】
上で得られた固形分を合わせて（７．０ｇ）、酢酸エチル７ｍＬを添加した。アニソール２７ｍＬの添加後、透明な溶液が形成された。溶液に水２００ｍｇを添加し、次いで、１の結晶種５ｍｇを添加した。この混合物を常温で撹拌し白色固形物が沈澱した。混合物を−５℃で終夜維持した。結晶性固体を濾過によって収集し、ヘプタンおよびＴＢＭＥ（１：１、３×５ｍＬ）の前もって冷却した混合物ですすいだ。結果として生じた生成物（１）は５．６６ｇと秤量され、ＨＰＬＣによると９８．３％の純度であった。
【０１４１】
上記の固形分を、酢酸エチル５．６ｍＬおよびアニソール２２．６ｍＬの組み合わせからの結晶化によって再び精製した。濾過および乾燥の後、生成物４．４８ｇ（４７％）が得られ、純度はＨＰＬＣによると９９．１８％であった。スペクトル（１Ｈおよび３１ＰＮＭＲ、ＭＳ）および物理的性質（ＨＰＬＣ保持時間、融点および外観）は、基準試料と一致した。
実施例１２−３  （Ｓ）−２−｛（Ｓ）−［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−プリン−９−イル）−４−（Ｒ）−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロピオン酸イソプロピルエステル（１）の（Ｓ）−イソプロピル２−（（（Ｓ）−（２，４−ジニトロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（（Ｓ，ＳＰ）−９）による合成
【化９】
0005872539.tif 000013
ａ）  （２Ｓ）−イソプロピル２−（（（２，４−ジニトロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート  ジアステレオマー混合物（（Ｓ，  ＳＰ）−９および（Ｓ，ＲＰ）−９））の調製ならびに結晶化による単一の異性体（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（Ｓ）−（２，４−ジニトロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（（Ｓ，ＳＰ）−９）の単離
【化１０】
0005872539.tif 000014
＃１  結晶化
【０１４２】
フェニルホスホロジクロリダート（１０．０ｇ、４７．４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ６０ｍＬに溶解し、続いて、−７８℃に冷却した。２，４−ジニトロフェノール（８．７２ｇ、４７．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７．２７ｍＬ、５２．１ｍｍｏｌ）の予備混合したＤＣＭ２０ｍＬ中溶液を、３０分の間にわたり−７８℃でゆっくり添加した。反応物を０℃にし、この温度で２．５時間撹拌し、次に（Ｌ）−アラニンイソプロピルエステル（７．９５ｇ，４７．４ｍｍｏｌ）を１バッチの固形分として添加した。次いで、０℃で４０分間撹拌し、続いて追加のトリエチルアミン（１３．９ｍＬ、９９．５４ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で３時間、またはＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン＝１／３）によって完了と判断されるまで追加撹拌した。続いて反応混合物は減圧下で蒸発させ、残渣をＭＴＢＥ（１００ｍＬ）に再溶解し、固形分を濾別し、濾液を乾固するまで蒸発させ、黄色のシロップが得られた。粗の試料のＮＭＲは、１：１の比の、２つの異性体、（（Ｓ，ＳＰ）−９および（Ｓ，ＲＰ）−９）の混合物であることを示した。ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：１）の混合物（５０ｍｌ）を添加し、１５時間混合物を撹拌した。このようにして形成された白色固形物を濾別し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：１）（２０ｍＬ）ですすぎ、真空下で乾燥して、（Ｓ，ＳＰ）−９の単一の異性体６．０ｇ（２８％）が得られた。
【０１４３】
データ：１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ）  δ：  ８．８２−８．８１  （ｍ，  １  Ｈ），  ８．４３−８．４０  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．８９−７．８６  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．３６−７．３２  （ｍ，  ２  Ｈ），  ７．２３−７．１９  （ｍ，  ３  Ｈ），  ４．９６  （ｈｅｐｔａ，  １  Ｈ），  ４．１９−４．０８  （ｍ，  ２  Ｈ），  １．４２  （ｄ，  ３  Ｈ），  １．２０  （ｄ，  ６  Ｈ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  １６２  ＭＨｚ）  δ：−１．８２．
ｂ）  （Ｓ，  ＳＰ）−９および２からの１の調製
【０１４４】
乾燥した５０ｍＬ丸底フラスコに、２の８０ｍｇ（０．２５５ｍｍｏｌ）および無水ＴＨＦ１ｍＬを添加した。この懸濁液を氷水浴で冷却し、グリニャール試薬０．３３ｍＬを窒素下で注射器によって添加した。透明な溶液が形成され、０℃で半時間撹拌した。（Ｓ，ＳＰ）−９（１３３ｍｇ、０．２９４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１．５ｍＬ中溶液を、注射器経由で添加した。透明なオレンジ色の反応混合物を０℃で２０分でＴＬＣによって点検し、この反応はほぼ完了していた。生成物が、３'，５'−ビスホスホルアミダート副生成物とともに形成された。この反応は、１時間半後、飽和ＮＨ４Ｃｌを添加することによりクエンチした。この混合物を酢酸エチル２０ｍＬで希釈した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、水（５０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（２×４０ｍＬ）、飽和炭酸ナトリウム（４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）、および塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。明黄色の有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。この溶液を減圧下で濃縮し、結果として生じた非晶質固形分残渣を、カラムクロマトグラフィーによって精製した。ビスホスホルアミダート副生成物を、発泡固形分（３２．４ｍｇ）としてＤＣＭ中１％のメタノールで溶出し、１は、ＤＣＭ（７４ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ、４９．６％）中３％のメタノールで溶出された。
実施例１２−４  （Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−プリン−９−イル）−４−（Ｒ）−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロピオン酸イソプロピルエステルジアステレオマー混合物（１およびＲＰ異性体）の（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（２−ニトロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（（（Ｓ，ＳＰ）−１０および（Ｓ，ＲＰ）−１０）による合成
【化１１】
0005872539.tif 000015
ａ）（（Ｓ，ＳＰ）−１０および（Ｓ，ＲＰ）−１０）の調製
【０１４５】
窒素雰囲気下−７０℃のフェニルホスホロジクロリダート（３０ｇ、１４２．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５０ｍＬ）中溶液に、ｏ−ニトロフェノール（１９．７６ｇ、１４２．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１９．８ｍＬ、１４２．２ｍｍｏｌ）の前もって調製した混合物（ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中）を、上記温度で１時間添加漏斗によって滴下添加した。撹拌をさらに２時間継続し、ゆっくり０℃にした。Ｌ−アラニンイソプロピルエステル塩酸塩（２６．２ｇ、１５６．３ｍｍｏｌ）を固体として加え、次いで続いてジクロロメタン（１５０ｍＬ）中のトリエチルアミン（４３．７ｍＬ、３１３．４ｍｍｏｌ）を０℃で２０分間滴下添加し、反応物は、さらに１時間同じ温度で撹拌を継続した。反応混合物を濾過し濃縮し、カラムクロマトグラフィー（２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によってシリカゲルで最終的に精製し、ジアステレオマー混合物（１４．４ｇ、２５％）として（Ｓ、ＳＰ）（−１０および（Ｓ、ＲＰ）−１０）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ）  δ：  ７．９４−７．９０  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．６７−７．６３  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．５７−７．５４  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．３３−７．２６  （ｍ，  ３  Ｈ），  ７．２３−７．１４  （ｍ，  ３  Ｈ），  ５．０４−４．８９  （ｍ，  １  Ｈ），  ４．２１−４．０４  （ｍ，  ２  Ｈ），  １．３８  （ｄ，  ３  Ｈ，異性体Ｉ），  １．３３  （ｄ，  ３  Ｈ，  異性体ＩＩ），  １．２３−１．１７  （ｍ，  ６  Ｈ）．  ３１Ｐ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  １６２  ＭＨｚ）  δ：  −１．５５  （異性体Ｉ），  −１．７６  （異性体ＩＩ）．
ｂ）  １およびそのＲＰ異性体のジアステレオマー混合物の（（Ｓ，ＳＰ）−１０および（Ｓ，ＲＰ）−１０）ならびに２からの調製
【０１４６】
乾燥した５０ｍＬ丸底フラスコに、８０ｍｇ（０．２５５ｍｍｏｌ）の２および無水テトラヒドロフラン１ｍＬを添加した。この懸濁液を氷水浴で冷却し、グリニャール試薬（ＴＨＦ中の１Ｍ、０．３２ｍｍｏｌ）の溶液を、注射器によって添加した。このようにして形成された透明な溶液を、０℃で半時間撹拌し、次いで、リン試薬（１２０ｍｇ、０．２９６ｍｍｏｌ、異性体の混合物）のＴＨＦ１ｍＬ中溶液を、０℃で滴下添加した。この混合物を室温で４４時間撹拌し、１Ｎ希ＨＣｌの添加によってクエンチした。通常通りの水性処理の後、粗の残渣を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中３％のメタノール）によって精製し、２つの異性体の１：１混合物として１およびそのＲＰ異性体３３．９ｍｇ（０．０５８ｍｍｏｌ、２２．８％）を得た。
実施例１２−５  （Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−プリン−９−イル）−４−（Ｒ）−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロピオン酸イソプロピルエステルジアステレオマー混合物（１およびそのＲＰ異性体）の（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（２，４−ジクロロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアートのジアステレオマー混合物（（Ｓ，ＳＰ）−１１および（Ｓ，ＲＰ）−１１）による合成
【化１２】
0005872539.tif 000016
ａ）（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（２，４−ジクロロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（ジアステレオマー混合物（（Ｓ，ＳＰ）−１１および（Ｓ，ＲＰ）−１１））の調製
【化１３】
0005872539.tif 000017
【０１４７】
フェニルホスホロジクロリダート（１０．０ｇ、４７．４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ６０ｍＬに溶解し、続いて、−７８℃に冷却した。２，４−ジクロロフェノール（７．７３ｇ、４７．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７．２７ｍＬ、５２．１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ２０ｍＬ中の、あらかじめ作っておいた混合物をゆっくり添加し、続いて上記温度で３０分間撹拌した。この反応を０℃にし、この温度で２．５時間撹拌し、次に（Ｌ）−アラニンイソプロピルエステル（７．９５ｇ、４７．４ｍｍｏｌ）を１バッチの固形分として添加した。０℃で４０分間撹拌し、続いて追加のトリエチルアミン（１３．９ｍＬ、９９．５４ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で３時間、またはＴＬＣ（酢酸エチル／ヘキサン＝１／３）によって完了と判断されるまで追加撹拌した。続いて、反応混合物を減圧下で蒸発させ、最終的に、シリカゲルでカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中酢酸エチル）にかけ、粘性のある無色油状物として６６％の収率（１３．６ｇ）で生成物（２つの異性体の混合物）を得た。
【０１４８】
データ：１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ４００  ＭＨｚ）  δ：  ７．４７−７．４４  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．４２−７．３９  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．３５−７．３０  （ｍ，  ２  Ｈ），  ７．２４−７．１５  （ｍ，  ３  Ｈ），  ５．０５−４．９４  （ｍ，  １  Ｈ），  ４．１９−４．０８  （ｍ，  １  Ｈ），  ３．９６−３．８９  （ｍ，  １  Ｈ），  １．４１−１．３５  （ｍ，  １  Ｈ），  １．２４−１．１９  （ｍ，  ６  Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１６２ＭＨｚ）δ：−１．５２  （一方の異性体）、−１．５４（他方の異性体）。
ｂ）１およびそのＲＰ異性体のジアステレオマー混合物の（（Ｓ，ＳＰ）−１１および（Ｓ，  ＲＰ）−１１）、ならびに２からの調製
【０１４９】
乾燥した５０ｍＬ丸底フラスコに、１８１ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）の２および無水ＴＨＦ１．５ｍＬを添加した。この懸濁液を氷水浴で冷却した。グリニャール試薬（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、０．７２ｍｍｏｌ）を、０℃で５分にわたり注射器によって滴下添加した。透明溶液を室温で半時間撹拌し、（（Ｓ，ＳＰ）−１１および（Ｓ，ＲＰ）−１１）のＴＨＦ１．５ｍＬ中溶液（２７６ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を１０分にわたって添加した。常温までこの反応物を暖め、２２時間撹拌した。反応は完了せず、出発物質の半分未満が消費された。さらに３日後にこの反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ（５ｍＬ）の添加によりクエンチした。この混合物を酢酸エチル２０ｍＬで希釈した。処理後、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中４％の２−プロパノール）によって精製し、２つのジアステレオマーの混合物として６３．１ｍｇの１（０．１０８ｍｍｏｌ、１９％）およびそのＲＰ異性体を得た。カラムから、出発ヌクレオシド２９．６ｍｇ（０．０９４ｍｍｏｌ）が回収された。
実施例１２−６  （Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−プリン−９−イル）−４−（Ｒ）−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロピオン酸イソプロピルエステルジアステレオマー混合物（１およびＲＰ異性体の（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（２−クロロ−４−ニトロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（（Ｓ，ＳＰ）−１２および（Ｓ，  ＲＰ）−１２）による合成
【化１４】
0005872539.tif 000018
ａ）（（Ｓ，ＳＰ）−１２および（Ｓ，ＲＰ）−１２）の調製、ならびに（Ｓ，ＳＰ）−１２および（Ｓ，ＲＰ）−１２の単離
【化１５】
0005872539.tif 000019
【０１５０】
フェニルホスホロジクロリダート（１０．０ｇ、４７．３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ５０ｍＬに溶解し、続いて、０℃に冷却した。固体の（Ｌ）−アラニンイソプロピルエステルＨＣｌ塩（７．９４ｇ、４７．３ｍｍｏｌ）を添加した後、反応混合物を−７０℃に冷却し、次いで、乾燥ＤＣＭ５０ｍＬに溶解したトリエチルアミン（１３．８ｍＬ、９４．６ｍｍｏｌ）で処理した。結果として得られた混合物をこの温度で３０分間撹拌し、次に０℃に温めた。続いて、乾燥ＤＣＭ２０ｍＬに溶解した２−クロロ−４−ニトロフェノール（８．２ｇ、４７．３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６．６ｍＬ、４７．３ｍｍｏｌ）の前もって作った溶液を、５〜１０分にわたって添加し、さらに２時間継続して撹拌した。この溶液を濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。結果として得られた残渣をＴＢＭＥ５０ｍＬに懸濁させ、室温で１０分間撹拌した。続く濾過で追加のトリエチルアミン塩酸塩を取り除き、濾液が得られ、これを再び減圧下でこの溶媒をストリップした。カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン）によって、固形分として生成物（１２．２ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）が得られた。生成物はＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２：３）を使用して２回再結晶し、（Ｓ，ＲＰ）−１２（５．２ｇ、２５％の収率）を単離し、−５℃まで母液を冷却して、（Ｓ，ＳＰ）−１２が得られた（１．５ｇ、７％の収率）。
【０１５１】
（Ｓ，  ＳＰ）−１２  データ：：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ：８．３３  （ｍ，  １  Ｈ），  ８．１３−８．１０  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．７３−７．７１  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．３６−７．３３  （ｍ，  ２  Ｈ），  ７．２５−７．１８  （ｍ，  ３  Ｈ），  ５．００  （ｈｅｐｔａ，  １  Ｈ），  ４．１９−４．１０  （ｍ，  １  Ｈ），  ４．０２−３．９７  （ｍ，  １  Ｈ），  １．４３  （ｄ，  ３  Ｈ），  １．２３−１．２１  （ｍ，  ６  Ｈ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  １６２  ＭＨｚ）  δ：−１．９７．
（Ｓ，  ＲＰ）−１２データ：：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ：８．３２−８．３１  （ｍ，  １Ｈ），  ８．１３−８．１０  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．７３−７．７１  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．３８−７．３４  （ｍ，  ２  Ｈ），  ７．２８−７．１９  （ｍ，  ３  Ｈ），  ５．０２  （ｈｅｐｔａ，  １  Ｈ），  ４．２１−４．１１  （ｍ，  １  Ｈ），  ４．０１−３．９５  （ｍ，  １  Ｈ），  １．４０  （ｄ，  ３  Ｈ），  １．２５−１．２２  （ｍ，  ６  Ｈ）。
３１Ｐ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  １６２  ＭＨｚ）  δ：−２．０２．
ｂ）  １およびそのＲＰ異性体のジアステレオマー混合物の（（Ｓ，ＳＰ）−１２および（Ｓ，ＲＰ）−１２）ならびに２からの調製  
【０１５２】
乾燥した５０ｍＬ丸底フラスコに、１８１ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）の２および無水ＴＨＦ１．５ｍＬを添加した。この懸濁液を窒素下で氷水浴で冷却した。グリニャール試薬（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、０．７２ｍｍｏｌ）を、注射器によって添加し、透明な溶液が形成された。この混合物を常温で半時間撹拌し、次いで、再び０℃に冷却した。（（Ｓ，ＳＰ）−１２および（Ｓ，ＲＰ）−１２）（２９２ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１．５ｍＬ中溶液を、０℃で１０分にわたって注射器によって添加した。結果として得られたオレンジ色の反応溶液を室温で終夜（１９時間）撹拌し、ＴＬＣによって点検すると、反応はほぼ完了していた。この反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ（５ｍＬ）の添加によってクエンチし、酢酸エチル２０ｍＬおよび水１０ｍＬで希釈した。２層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ２０ｍＬで抽出した。有機層を、水（２０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（２×３０ｍＬ）、５％炭酸ナトリウム（３０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）、および塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、黄色固形物残渣に濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中３％のメタノール）によって精製し、２７９ｍｇの１（０．４８ｍｍｏｌ、８３％）およびそのＲＰ異性体を得た。
【０１５３】
実施例１２−７  （Ｓ）−２−｛（Ｒ）−［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−プリン−９−イル）−４−（Ｒ）−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロピオン酸イソプロピルエステル（１のＲＰ異性体）の（２Ｓ）−イソプロピル２−（（（Ｒ）−（２−クロロ−４−ニトロフェノキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（（Ｓ，ＲＰ）−１２）による合成
【化１６】
0005872539.tif 000020
【０１５４】
乾燥した５０ｍＬ丸底フラスコに、７０ｍｇ（０．２２３ｍｍｏｌ）の２および無水ＴＨＦ１ｍＬを装填した。フラスコを氷水浴で冷却し、グリニャール試薬（ＴＨＦ中１Ｍ溶液、０．３２ｍＬ）を０℃で滴下添加した。０℃で半時間撹拌した後、（Ｓ，ＲＰ−１２）（１２９ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１ｍＬ中溶液を、注射器によって添加した。透明な褐色溶液が形成され、常温まで徐々に暖めた。室温で終夜（１９時間）の後、反応を０℃で１Ｎ希ＨＣｌを添加することによりクエンチした。この混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）で希釈した。２層の分離後、水層をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で抽出した。有機層を、水（１０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（３×１５ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濃縮後、固形物残渣を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中３％のメタノール）によって精製し、白色固形物および単一の異性体として１００ｍｇの生成物（０．１７ｍｍｏｌ、７７％）を得た。
実施例１２−８  （Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−メトキシ−プリン−９−イル）−４−（Ｒ）−フルオロ−３−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イルメトキシ］−フェノキシ−ホスホリルアミノ｝−プロピオン酸イソプロピルエステルジアステレオマー混合物（１および１のＲＰ異性体）のジアステレオマー混合物（２Ｓ）−イソプロピル２−（（フェノキシ（２−チオキソベンゾ［ｄ］チアゾール−３（２Ｈ）−イル）ホスホリル）アミノ）プロパノアート（（Ｓ，ＳＰ）−１３および（Ｓ、ＲＰ）−１３）による合成．
【化１７】
0005872539.tif 000021
ａ）（（Ｓ，ＳＰ）−１３および（Ｓ，ＲＰ）−１３）の調製
【化１８】
0005872539.tif 000022
【０１５５】
フェニルホスホロジクロリダート（６．３７ｇ、３０．１９ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ４０ｍＬに溶解し、続いて、０℃に冷却した。固体（Ｌ）−アラニンイソプロピルエステル（５．０６ｇ、３０．１９ｍｍｏｌ）の添加後、反応混合物を−７８℃に冷却し、次いで、乾燥ＤＣＭ２０ｍＬに溶解したトリエチルアミン（８．８４ｍＬ、６３．３ｍｍｏｌ）で処理した。結果として得られた混合物をこの温度で３０分間撹拌し、次に０℃に温めた。続いて、乾燥ＤＣＭ２０ｍＬに溶解したベンゾ［ｄ］チアゾール−２（３Ｈ）−チオン（５．０５ｇ、３０．１９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．６３ｍＬ、３３．２１ｍｍｏｌ）の前もって作っておいた溶液を５〜１０分にわたって添加し、その後、室温にこの混合物を終夜暖めた。次いで、濁った混合物を、０℃に冷却し戻し、濾過して固体をすべて取り除いた。濾液を減圧下ですべての溶媒をストリップした。結果として得られた残渣をＴＢＭＥ５０ｍＬに懸濁させ、室温で１時間撹拌した。続く濾過で追加のトリエチルアミン塩酸塩を取り除き、濾液が得られ、この溶媒を減圧下で再びストリップした。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ）によって、（（Ｓ，ＳＰ）−１３および（Ｓ，ＲＰ）−１３）（３：１、異性体Ｉ／異性体ＩＩ）が粘性のある油状物として１５％（１．９７ｇ）の収率で得られた。
【０１５６】
データ：１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ３００  ＭＨｚ）  δ：８．６３−８．５９  （ｍ，  １  Ｈ），  ７．３７−７．２７  （ｍ，  ７  Ｈ），  ７．１８−７．１４  （ｍ，  １  Ｈ），  ６．０５−５．９７  （ｍ，  １  Ｈ），  ５．０４  （ｈｅｐｔａ，  １Ｈ，  異性体ＩＩ），  ４．９１  （ｈｅｐｔａ，  １  Ｈ，  異性体Ｉ），  ４．３７−４．２４  （ｍ，  １  Ｈ），  １．４５−１．４２  （ｄ，  ３  Ｈ，異性体Ｉ），  １．４１−１．３９  （ｄ，  ３  Ｈ，異性体ＩＩ），  １．２６−１．２２  （ｍ，  ６  Ｈ），  １．０９−１．０２  （ｍ，  ６  Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２１ＭＨｚ）δ：−０．４３  （異性体Ｉ）、−１．２９（異性体ＩＩ）。
ｂ）１およびそのＲＰ異性体のジアステレオマー混合物の（（Ｓ，ＳＰ）−１３および（Ｓ，ＲＰ）−１３）、ならびに２からの調製
【０１５７】
乾燥した丸底フラスコに、１２０ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ）の２および無水ＴＨＦ１．５ｍＬを添加した。この混合物を０℃に冷却し、グリニャール試薬（０．５ｍｍｏｌ）０．５ｍＬを滴下添加した。透明な溶液を０℃で半時間撹拌した。（（Ｓ，ＳＰ）−１３および（Ｓ，ＲＰ）−１３）（１９７ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ１．５ｍＬ中溶液を、注射器によって添加した。結果として得られた混合物を室温まで暖め、終夜（１９時間）撹拌した。ＴＬＣは反応が完了していないことを示し、生成物がビスホスホルアミダート副生成物とともに見出された。反応を０℃で１Ｎ希ＨＣｌの添加によってクエンチし、混合物を酢酸エチル２０ｍＬで希釈した。上記のように処理した後、油性の残渣が得られた。それをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中３％のメタノール）によって精製して、２つのジアステレオマーの混合物として７８．６ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ、３５％）の１およびそのＲＰ異性体を得た。カラムから、３６．４ｍｇのビスホスホルアミダート副生成物が単離された。
実施例１３。
化合物１の生物学データ
【０１５８】
ＨＣＶレプリコンアッセイ  ＨＣＶレプリコンＲＮＡ含有Ｈｕｈ７細胞（クローンＡ細胞；Ａｐａｔｈ、ＬＬＣ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）を１０％のウシ胎仔血清、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１倍の可欠アミノ酸およびＧ４１８（１０００μｇ／ｍｌ）を含むダルベッコ修正イーグル培地（高グルコース）中で指数関数的成長状態に保った。Ｇ４１８を含まない同じ培地中で、抗ウイルスアッセイを実施した。１ウエルあたり１５００個の細胞の割合で９６ウエル平板内に細胞を播種し、被験化合物を播種直後に添加した。インキュベーション時間は４日。インキュベーションステップの終了時に、全細胞ＲＮＡを単離した（ＲＮｅａｓｙ９６キット；Ｑｉａｇｅｎ）。製造業者が推奨する通りに、単一ステップのマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲプロトコルにおいて、レプリコンＲＮＡと内部対照（ＴａｑＭａｎ  ｒＲＮＡ対照試薬；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を増幅した。ＨＣＶプライマーおよびプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で設計され、高度に保存された５’−未翻訳領域（ＵＴＲ）配列（センス、５’−ＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡ（Ｔ）ＧＡＧＴＧＴ−３’、およびアンチセンス、５’−ＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧ−３’；プローブ、５’−ＦＡＭ−ＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’）を網羅していた。
【０１５９】
化合物の抗ウイルス効果を表現するために、被験化合物の閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルを、無薬物対照の平均閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクル（ΔＣｔＨＣＶ）から減算した。３．３というΔＣｔは、レプリコンＲＮＡレベルにおいて１−ｌｏｇ１０の減少（９０％の有効濃度［ＥＣ９０］に等しい）に等しい。試験化合物の細胞毒性も、ΔＣｔｒＲＮＡ値を計算することにより表現することができよう。次に、ΔΔＣｔ特異性パラメーターを導入することができ（ΔＣｔＨＣＶ−ΔＣｔｒＲＮＡ）、ここではＨＣＶ  ＲＮＡ準位は、ｒＲＮＡ準位について規格化され、無薬物対照に対し較正されている。化合物１は、先のアッセイに基づいたその生物学的な特性に関して試験した。これらの試験の結果は以下に開示される。
【表４】
0005872539.tif 000023
【０１６０】
レプリコンアッセイの結果は、化合物１が化合物Ｃと組み合わせてアッセイされる場合、活性を示す。（米国特許公開第２０１０／００８１６２８号で化合物１９として示された、および同じ出願に開示された各ジアステレオマー（１９ａおよび１９ｂ））；化合物Ｄ（米国２０１０／００１６２５１に開示された）；化合物Ｅ（ＳＰ−４として米国１２／７８３，６８０に開示された。）；ＩＴＭＮ−１９１（実施例６２−１で米国特許公開第２００９／０２６９３０５号に開示された）；およびＡＮＡ−５９８（化合物３ｉとしてＦ．  Ｒｕｅｂａｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  （２００８）  １８：  ３６１６−３６２１  に開示）．驚いたことに、レプリコンアッセイ結果は、化合物１が化合物Ｃ（１９ａまたは１９ｂ）；化合物Ｅ  （ＳＰ−４），  ＩＴＭＮ−１９１；およびＡＮＡ−５９８の任意の１種と組み合わせてアッセイされる場合、相乗作用を示す。
【０１６１】
本出願は、２０１０年３月３１日に出願された米国仮出願第６１／３１９，５１３号；２０１０年３月３１日に出願された米国仮出願第６１／３１９，５４８号；および２０１０年６月１７日に出願された米国仮出願第６１／３５５，９４０号に対する優先権を主張し、その主題全体が参照によって組み込まれる。
【０１６２】
米国特許仮出願第６１／３１９，５４８号および米国特許仮出願第１２／６４５，７６５号、第１２／０５３，０１５号、第１２／７８３，６８０号の内容は、全体として参照によって本明細書に組み込まれる。さらに本明細書中に開示される特許および非特許参考文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。包含されている主題が本出願の本文中で開示されている用語と矛盾する用語を含む場合には、包含されている主題の全体的意味が失われないことを条件として、本出願の中に含まれる用語の意味が支配する。
【図１】
0005872539.tif 000026
【図２】
0005872539.tif 000027