【手続補正書】
【提出日】平成23年10月26日(2011.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族アミノ酸によって修飾されたポリアミンと、RNA干渉に活性のある小さな二本鎖または一本鎖RNAとを含む、トランスフェクション剤として有用な組成物。
【請求項２】
前記ポリアミンは、分枝または線状のポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、デンドリマー，ポリアミノエステル、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンまたはキトサンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリアミンは、線状のポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）、ポリアリルアミン（ＰＡＡ）およびポリリジン（ＰＬＬ）を含む群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリアミンの分子量は４００Ｄａ超である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
ポリアミンは、線状の、２〜２２０ＫＤの線状ポリエチレンイミン、１０〜７０ＫＤのポリアリルアミンおよび１〜３００ＫＤのポリリジンを含む群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ポリアミンを修飾するのに用いられる芳香族アミノ酸は、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンあるいはそれらの誘導体を含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
前記芳香族アミノ酸は、トリプトファンおよび／またはチロシンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
RNAは、通常のものであるか修飾されており、該修飾基は、例えば２’−フルオ、２’−メトキシ、ホスホロチオアート、ＬＮＡまたはモルホリノである、請求項１〜７のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項９】
RNAは、二本鎖または一本鎖アンチセンスsiRNAまたは一本鎖センス／アンチセンスsiRNAの混合物である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１０】
siRNAは、１５〜３０ｍｅｒを有する、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
上記のような芳香族アミノ酸によって修飾されたポリアミンと、二本鎖または一本鎖siRNAとを等張培地、例えば、ＮａＣｌ、グルコース、緩衝液において含む、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
siRNAの濃度は、ピコモルからマイクロモルまで変動する、請求項８〜１１のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１３】
１種以上の添加剤、例えば、ＰＥＧ、ＰＶＡ、単糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質、ビタミン類を更に含む、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１４】
RNAiに活性なRNAを発現するかまたは導入遺伝子をコードするプラスミドDNAを更に含む、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１５】
導入遺伝子は、前記小RNAによって標的化される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記プラスミドは、siRNA、shRNAまたはmicro-RNA適合低分子ヘアピン型RNAを発現し、該各RNAは、芳香族アミノ酸、特に、チロシンおよびその誘導体によって修飾されたポリアミン、特に、チロシンおよびその誘導体を有する線状のポリエリレンイミンを含み、DNAベクターのトランスフェクション剤として有用であり、前記プラスミドは、siRNA、shRNAまたはmicroRNA適合低分子ヘアピン型RNAを発現する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１つに記載の組成物の芳香族アミノ酸によって修飾されたポリアミンを合成する方法であって、該ポリアミンの存在下でジメトキシトリアジン−Ｎ−メチルモルホリウム（ＤＭＴＭＭ）によって活性化された芳香族アミノ酸のスーパーエステルを使用する工程を含む、方法。
【請求項１８】
ポリアミンの合成は、塩基性緩衝液、例えば、ホウ酸塩緩衝液２００ｍＭ（ｐＨ＝７．５〜９）中で、あるいは塩基存在下の水性培地または水／アルコール混合物中で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物中の芳香族アミノ酸によるポリアミンの修飾の割合（百分率）は、０．０１〜１００％、特には１５〜５０％である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１つに記載の組成物の使用を含む、siRNAまたはsiRNAおよびプラスミドDNAをin vitro、ex-vivo転移する方法。
【請求項２１】
siRNAの前記in vitro転移は、懸濁液中の１以上の接着細胞を含む培地で実行される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地が、通常培地または合成培地である、請求項２１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、培養下の真核細胞へ、in vivoまたはex vivoで、細胞中で遺伝子サイレンシングを媒介する核酸、特に低分子干渉RNA（下記説明および特許請求の範囲においてsiRNAという）であって、RNA干渉（RNAi）および場合によってはプラスミドDNAを提供するものを、効果的な合成のポリマー媒介性に送達するめの手段、組成物および方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
哺乳動物細胞におけるRNAiは、si/shRNAまたはmicroRNA適合低分子ヘアピン型RNA（shRNAmir）を発現するsiRNAまたはDNAベクターのいずれかの効果的な細胞内送達に依存する（非特許文献３〜７）。哺乳動物細胞におけるshRNA（short hairpin RNA：低分子ヘアピン型RNA）またはsiRNAの発現は、Pol IIまたはPol III（Ｕ６またはＨ１）プロモータのいずれかからの転写により実現され得る。DNAベクターは、二本鎖低分子ヘアピン型RNA（shRNA）（後に細胞機構によってsiRNAに処理される）を発現するプラスミドおよびウイルスベクター系をベースとする。近年のshRNA系の開発によって、組織特異的で誘導性の遺伝子のノックダウンが可能になっている。RNA干渉用の活性RNAを発現するそういったDNAベクターの細胞内送達は、組換えウイルスまたは非ウイルス送達系を用いて実現され得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
培地は、正常培地または合成培地である。
本発明また、遺伝子による遺伝病（genetic herediary disease）または複雑な遺伝子疾患の原因となるか、またはそれに関与する１種以上の標的タンパク質の発現に対し調節作用を誘導する医薬組成物として使用される組成物を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
1H-NMR(400MHz, CDCl3)による分析:7.2ppm (d, 2H, 芳香族H), 7.1ppm (d, 2H, 芳香族H), 4ppm (m, 1H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH), 3-2.99ppm (dd, 1H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH), 2.84-2.78ppm (dd, 1H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH), 1.48ppm (s, 9H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC), 1.32ppm (s, 9H, BocO-Ar-CH2-CH(NHBOC)-COOH)。
（Ｎ−Ｂｏｃ−トリプトファンの合成）
Ｎ−Ｂｏｃ−トリプトファンの合成は、Ｎ，Ｏ−Ｂｏｃ−チロシンの合成のために用いられたのと同一の手順により実現されたが、トリプトファン２ｇおよびＢｏｃ２Ｏ６．５ｇにより出発し、白色固体２．７９ｇを得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
GL3ルシフェラーゼ（SV40要素制御下のホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ）を安定的に発現するA549（ヒト肺癌、ATCC No.CCL-185）細胞は、pGL3Lucプラスミド（Clontech）の安定なトランスフェクションの後に得られた。A549-GL3Luc細胞をRPMI-1640中で成育させ、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタマックス、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．８μｇ／ｍｌのG418（Promega）を補充した。細胞はすべて５％ＣＯ２湿潤雰囲気中３７℃に維持された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
（トランスフェクション実験）
トランスフェクションの１日前、２．５×１０４個の細胞を、２４ウェル組織培養プレートにおいて１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの新鮮な完全培地中に播いた。トランスフェクションの前に、siRNA／ポリマーの複合体を調製した。所望量のsiRNAを５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６または８）に希釈した。次いで、所望量のポリマー溶液（７．５ｍＭ窒素）をsiRNA溶液に添加した。得られた溶液を１０秒間にわたりボルテックスにより混合し、室温にて１０〜１５分間にわたり放置した。トランスフェクション溶液を細胞に加える前に、完全培地を除去し、１０％のＦＢＳを含む新鮮な完全培地０．５５ｍｌと置き換えた。次いで、複合体溶液５０μｌをウェル毎に加え、プレートを３７℃でインキュベートした。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
（蛍光顕微鏡法）
トランスフェクションの１日前、２．５×１０４個のA549細胞を、２４ウェル組織培養プレートにおいて１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの新鮮な完全培地中に播種した。トランスフェクションの前に、siRNA／ポリマーの複合体を調製した。所望量のsiRNA−ローダミン（Rho）を５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６または８）に希釈した。次いで、所望容積のL-PEI10K-Tyr33%溶液（７．５ｍＭ窒素）をsiRNA溶液に添加した。得られた溶液を１０秒間にわたりボルテックスで混合し、室温にて１０〜１５分間にわたり放置した。細胞にトランスフェクション溶液を加える前に、完全培地を除去し、１０％ＦＢＳを含んだ新鮮な完全培地０．５５ｍｌと置き換えた。次いで、複合体溶液５０μｌをウェル毎に加え、プレートを３７℃で２４または４８時間にわたりインキュベートした。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
（L-PEI-Tyr誘導体による培養細胞へのsiRNA送達）
線状ポリエチレンイミンおよびチロシン修飾線状ポリエチレンイミン（L-PEI10KTyr33%）による培養細胞への比較siRNA送達能力を蛍光siRNA（ローダミン標識siRNA、siRNA-FluoR）を用いて試験した。少量のsiRNA-FluoR（最終濃度２５および５０ｎＭ）を、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２μｌのL-PEI10KまたはL-PEI10KTyr33%（両者とも７．５ｍＭ窒素の保存溶液）と複合体形成させた。得られたトランスフェクション物を、１０％ＦＢＳを含む完全培地で培養されたA549細胞に加えた。細胞を２４ウェル組織培養プレートフォーマットで２４時間にわたりインキュベートした後に、蛍光顕微鏡によって観察した。結果を図２に示す（１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの完全細胞培養培地でインキュベートし、５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２５ｎＭ（Ａ）または５０ｎＭ（Ｂ）のsiRNA−ローダミン（Rho）を２μｌのL-PEI10KまたはL-PEI10KTyr33%（７．５ｍＭ窒素）と複合体形成させた）。観察前、細胞を１ｍｌのPBS-BSA  １％で洗浄し、次いで、蛍光顕微鏡法（ECLIPSE TE2000-S、Nikon）（倍率２００）によって観察した。