【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年12月15日(2010.12.15)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非感染性ウイルス様粒子を製造するための複製欠損型レンチウイルスベクターであって、
（ａ）５’長い末端反復配列（ＬＴＲ）および３’ＬＴＲ；
（ｂ）抗原性エピトープをコードする核酸配列；
（ｃ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）をコードする核酸配列；および
（ｄ）ｒｅｖ配列をコードする核酸
を含む、ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載のベクターであって、レンチウイルスの５’リーダー配列およびｇａｇコード配列中のパッケージング配列をさらに含む、ベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のベクターであって、前記エピトープが、ｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒまたはｅｎｖからのものであるか；ｇａｇ−ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒまたはｅｎｖのスプライシングを受けていないメッセンジャーＲＮＡまたは部分的にスプライシングを受けたメッセンジャーＲＮＡに由来するか；ｔａｔ、ｒｅｖもしくはｎｅｆ；またはｔａｔ、ｒｅｖもしくはｎｅｆの複数スプライシングされたメッセンジャーＲＮＡに由来する、ベクター。
【請求項４】
前記核酸配列（ｂ）が複数抗原構築物をコードする、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
前記複数抗原構築物が、ＣＴＬ、ＣＤ４＋および／またはＢ細胞を刺激し、かつ、ＣＴＬ、ＣＤ４＋および／またはＢ細胞によって認識される、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
前記少なくとも１つの抗原性エピトープが細胞性応答および／または体液性応答を誘導する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
Ψエレメント、ＰＢＳエレメントおよびＰＰＴエレメントから選択される１以上のシス活性エレメントをさらに含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項８】
ｇａｇ−ｐｏｌはＲＴおよびＩＮが欠失しており、ｖｉｆ−ｖｐｒは保存的なエピトープを含み、ｅｎｖはｇｐ１２０とｇｐ４１との間のプロテアーゼ切断部位の欠失を含み、ｔａｔはＴＡＲに関して必要不可欠なＲ−ドメインに欠失を含み、ｎｅｆはＲＲ、Ｍｙｒ、ＮＢＰ−１およびβ−ＣＯＰに欠失を含み、そして、ｒｅｖが、唯一の機能的なウイルスタンパク質である、請求項３に記載のベクター。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ヒトにおいてＨＩＶに対する免疫応答を生成するための、レンチウイルスベクターベースのアプローチ
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、レンチウイルスベースのベクターの技術を用いる、ヒトにおける免疫応答の生成のための複数の新規なアプローチに関する。本発明は、例えば、以前に弱毒化生ワクチン（ＬＡ）  ＨＩＶワクチンに関して実証されたように、患者を疾患のリスクに曝すことなく、ＬＡの効力を模倣する能力を提供する。さらに、本発明は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）の極度の変化可能な性質に起因して以前のワクチンの失敗をもたらしたウイルスエスケープ（ｖｉｒｕｓ  ｅｓｃａｐｅ）を防止する。エスケープに対する制御が、複数の抗原（好ましくは、インビボでの上記抗原の野生型出現例に見出されるかまたはそれに類似する複数の抗原）を提示するための、レンチウイルスベクターベースの技術の使用を介して提供される。複数の抗原の提示により、多様化した免疫応答の生成が提供される。上記レンチウイルスベースのベクターとしては、条件的に複製するベクター、および非感染性ベクター様粒子（ＶＬＰ）を生成するベクターが挙げられる。本発明は、ＨＩＶに関して例示されるが、その戦略は、他のウイルスまたは微生物（細菌を含む）に対する免疫応答の生成に対して容易に適用され得る。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
ＨＩＶは、世界中で４２００万人に感染している。米国（Ｕ．Ｓ．）では、９８０，０００人を超える人々がＨＩＶに感染していると推定されている。ＨＩＶ／ＡＩＤＳによる死亡数は、世界中で年間約３００万人であると推定されており、そして米国では、１５，０００人を超えると推定されている（非特許文献１；非特許文献２）。ＨＩＶに対する処置の選択肢は存在するが、これらは、高価であり、そして以下に示すように、患者の生活の質に対して著しく負の影響力を有する。従って、成功するＨＩＶワクチンについての重大な必要性が存在する。
【０００３】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳの処置についての現在の標準法は、強力な抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）である。この療法は、代表的には、ヌクレオシドリバーストランスクリプターゼインヒビター（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシドリバーストランスクリプターゼインヒビター（ＮＮＲＴＩ）およびプロテアーゼインヒビター（ＰＩ）の３種類の「カクテル」からなる。これらのカクテルは、ウイルス負荷を減少して免疫機能を回復するのに成功しているが、これらは、治癒を示さず、そしてＨＡＡＲＴの長期間の使用に関連する有害な作用に関する懸念がある。具体的には、種々の代謝障害（ＨＩＶ関連リポジストロフィ、腹部の肥満症（ｃｅｎｔｒａｌ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、異脂肪血症、高脂血症、高血糖症、およびインスリン抵抗性が挙げられる）は、ＨＡＡＲＴに起因するものとして報告されている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。これらの反応は、複雑かつ扱いにくい投薬レジメンと組み合され、治療に対する患者−被験体の指示遵守度に対して有害な影響を有し得る（非特許文献６；非特許文献７）。さらに、指示遵守が乏しければ、ＨＩＶ耐性の速度が増大し、薬物に対する感受性が減少したウイルス株が生じる（非特許文献８；非特許文献９）。実際、米国において新規に感染したＨＩＶ感染個体のうちの１８．５％もの多くが、抗レトロウイルス薬物併用療法に対して失敗したかまたは耐性である（非特許文献１０）。これらの患者には、処置選択肢がなく、そして予後が非常に悪い。この数は、増加すると予測されている。なぜなら、１９９５年〜２０００年の間に薬物耐性の著しい増大が実証され、そして薬物耐性が増大し続けるであろうという合理的な予測があるからである。さらに、これらの数は、副作用が原因で薬物療法に不寛容である個体を含まない（非特許文献１１）。
【０００４】
歴史的には、ワクチンは、強度の抗ウイルス中和抗体応答を惹起することにより、ウイルス感染からの防御を提供する。中和抗体は、そのウイルス表面上のタンパク質を認識し、そして健常細胞への結合および感染を防止する。しかし、このアプローチは、ＨＩＶサブタイプの広範な範囲と、十分には多様性でない免疫応答からＨＩＶが免れることを可能にする迅速な変異速度とが原因で、ＨＩＶに対しては有効ではない。中和抗体を惹起するように設計された最も成功したワクチンは、２種の異なるＨＩＶ株に由来する組換えエンベロープタンパク質からなる、２価ワクチンである。ＶａｘＧｅｎは、これらの２価ワクチンに関する分野をリードする。しかし、いくらかの防御的免疫が惹起されるけれども、これらのワクチンに対する免疫応答は、乏しいままである。明白ではないが、このワクチンの乏しい防御に関する理由は、このワクチンが生成する体液性免疫応答（抗体ベースの免疫応答）に加えて、強固で多様な細胞性免疫応答をこのワクチンが刺激しないことであると、考えられている。研究者らはまた、細胞性免疫応答に基づくＨＩＶワクチンを開発している。細胞性免疫は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、すなわちＣＤ８＋Ｔリンパ球（これは、ウイルスに感染した細胞を殺す）と呼ばれる、ある型の白血球に基づく。このアプローチは、体内でのウイルスの増幅を防止し、その結果、疾患は発症せず、そしてこのウイルスは、別の個体へと伝播され得ない。
【０００５】
いくつかのグループが、細胞性免疫に基づくワクチンを試験した。主に、これらの研究は、ＨＩＶタンパク質をペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）として運搬する、疾患を生ぜしめない組換えキャリアウイルスを使用した。このワクチンは、組換えキャリアウイルスが体の中へ送達された場合に、保有されるＨＩＶタンパク質ペイロードを生成して免疫応答を惹起するが、組換えキャリアウイルス自身は複製しないように、設計される。しかし、このアプローチに関しては、いくつかの問題があった。キャリアウイルスを使用する場合、その免疫応答は、ＨＩＶペイロードに加えてこのキャリアウイルスと反応する。これによって、この応答は２つに分岐し、それによって抗ＨＩＶ免疫応答の影響力を減少する。さらに、通常は一種のみのＨＩＶタンパク質が、このキャリアウイルスゲノムの大きさの制限げ原因で、一度に発現され得る。これによって、ＨＩＶがゲノムのその単一の領域において変異を蓄積して、ウイルスの適性に対する著しいコストを伴わずに、その免疫応答から免れることが、より容易になる。Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより試験され、そして科学雑誌のＮａｔｕｒｅ（２００２年１月）に公表された最新のワクチンは、そのワクチン戦略としてこのアプローチを用いた。Ｍｅｒｃｋは、サルにおいてＳＩＶタンパク質ｇａｇを発現する複製不能なアデノウイルスワクチンベクターを用いた。しかし、同じ号の雑誌において報告されているように、免疫が、単一のＨＩＶタンパク質に対して発生するだけであるという事実におそらく起因して、ウイルスは、最終的に変異し、そしてワクチン誘導型抗−ＨＩＶ免疫応答を免れる。ＣＴＬ応答は、より広い範囲のＨＩＶ株に対して防御し得るが、この応答の性質は、この応答が、標的ＨＩＶタンパク質のほんのわずかな領域に対してのみ発生する傾向があるということである。これによって、耐性が起こりやすくなる。なぜなら、ＨＩＶにおける回避的な変異は、ウイルス構造を著しく変化させることなく生じ得るからである。これは、一種のＨＩＶタンパク質のみがワクチン接種において使用される場合に、特に当てはまる。
【０００６】
代替的なワクチンアプローチは、ＨＩＶの弱毒化生（ＬＡ）ワクチン、または、強度の減少したＨＩＶワクチンを使用することである。これは、現在使用されている多くのワクチン（例えば、ポリオワクチン）に関して使用されるアプローチである。ＬＡワクチンは、ヒトにおいて疾患を引き起こさないが、ＬＡワクチンは、複製し得、そして広範な包括的な免疫応答を惹起し得る。この免疫応答は、感染の間に生じたＨＩＶタンパク質に対する、細胞性免疫および中和抗体応答の両方からなる。多様な免疫応答がＨＩＶに対してマウントされることは特に重要である。感染の間のこのウイルスの大きな変異速度によって、このウイルスが免疫系にとってどのように見えるかが変化するので、。ＬＡワクチンは、これらの多様な可変物を免疫系に提示し、これにより、この問題を回避する。しかし、ＨＩＶの類似の動物モデル、サル免疫欠損ウイルス（ＳＩＶ）の感染は、ＬＡ  ＳＩＶワクチンが、若年のサルおよび新生児のサルにおいて、疾患を引き起こし得ることを示した。若年のサルは、これらの動物において病原性になる弱毒化ウイルス（非特許文献１２）を促進する可能性のある未熟な免疫応答を有する。興味深いことに、このワクチンにおける突破ウイルスは、ウイルス復帰変異体から生じるのではなく、むしろ、インビボでより迅速に複製し、さらに欠失したウイルスから生じる。ＬＡ  ＳＩＶワクチンをサルに用いた研究に見られるように、ＬＡアプローチにより、コンプロマイズド・免疫応答（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を有するヒトおよび特に未熟な免疫系を有する小児において、ＬＡ  ＨＩＶワクチンで免疫することがまた、疾患を生起し得るので、このデータは、ヒトにおけるＬＡ  ＨＩＶワクチンでの免疫が、ヒトにおける使用に適切ではないことを示す。
【０００７】
おそらく、より重要なことには、弱毒化ＨＩＶワクチンの使用のリスクは、感染した個体からの血液注入により、ＨＩＶの弱毒化株（Δ−Ｎｅｆ）に不注意に感染した一群の人々のグループにより表される（非特許文献１３；非特許文献１４）。若年性のサルにおけるＬＡ  ＳＩＶの結果に類似して見える結果では、Δ−Ｎｅｆウイルスで感染したものの半分は、後にＣＤ４＋Ｔリンパ球の減少を経験し、このＣＤ４＋Ｔリンパ球の減少がＡＩＤＳの進行の主要な指標である。これらの個体により示されるＬＡ−ＨＩＶワクチンの不幸な現実は、ほとんどのＬＡ−ワクチンとは異なり、ＬＡ−ＨＩＶは、迅速にこの宿主中で潜伏を達成するか、または宿主中のＣＤ４＋Ｔリンパ球のレザバーへの感染を達成し、次いで、将来の任意の時期に疾患を引き起こし得る。
【０００８】
成功したＨＩＶ／ＡＩＤＳワクチンを生成する困難な点が、免疫系の慢性的な過剰活性化につながる強度の抗−ＨＩＶ応答を患者が実際に生み出すという事実により過小評価される。しかし、ＨＩＶのコントロールにつながる代わりに、免疫の活性化は、サイトカインの調節不全をもたらし、そしてＨＩＶが、最終的に後期にリンパ節および胸腺の破壊につながる感染の初期段階の間にリンパ系組織中で高レベルで複製するのを可能にする。
皮肉なことに、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球の活性化（適応免疫の発達の中心となる）は、感染細胞における単にＨＩＶの産生を増強し、その一方で、健康で活性化した細胞は、ウイルスの伝播のためのさらなる燃料（ｆｕｅｌ）を提供する。
【０００９】
インビボでのＨＩＶの制御およびＡＩＤＳの長期の非進行剤（ＬＴＮＰ）は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞傷害性応答に関連しているが、抗体応答には関連していない（非特許文献１５）。リンパ球が、ＨＩＶ媒介性の死、ＨＩＶ関連のアポトーシス、またはＣＴＬ−媒介性のＨＩＶ感染ＣＤ４＋  Ｔリンパ球の殺傷により殺傷されるので、この応答の弱化は、リンパ球としてのＣＤ４＋  Ｔリンパ球の支援の損失の結果であると考えられる。
ＨＩＶ患者のＬＴＮＰの存在は、宿主およびウイルス因子が、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの病因に影響することを示す。特に、ケモカインレセプターＣＣＲ５の欠損するヒトは、ＨＩＶに感染しない。より早期に議論した、天然に獲得した弱毒化ＨＩＶウイルスゲノム（ｎｅｆ欠失）に感染した患者は、ＡＩＤＳの進行の遅延を示した。
【００１０】
この点では、最終的に不十分ではあるが、免疫は、ＨＩＶの複製およびＡＩＤＳの進行に影響する。なぜなら、それぞれＤＮＡおよび抗原発現ベクターを用いた弱毒化ウイルス、不完全なウイルス粒子、またはプライム／ブースト戦略に基づくワクチンは、短期間、疾患の進行を遅延させ得、そしてウイルスの複製を含み得る（非特許文献１６；非特許文献１３、非特許文献１２）。Ａｆｒｉｃａｎ  ＧｒｅｅｎモンキーおよびＳｏｏｔｅｙ  Ｍａｎｇａｂｅｙモンキーは、ＳＩＶに感染した後も、ＡＩＤＳを発達させないし、リンパ節の破壊も胸腺の破壊も示さず、従って、ウイルスと宿主とのバランスが可能であることを示唆する。
【００１１】
今日まで、ＨＩＶ感染速度を防止するか、またはＡＩＤＳの発症を遅延させることに成功したワクチンは存在していない。従来のワクチン戦略（これは、他のウイルス、細菌、および癌に対してさえ、功を奏した）は、ＨＩＶに対しては適用可能ではない。これは、ＨＩＶの、他のレトロウイルスとの比較においてさえ異常に高い変異速度の結果であり、これは、ウイルスそれ自体と同程度に破壊的であり得る神風様の免疫系の性質を可能にする。理想的には、最良のワクチンアプローチは、デノボでＨＩＶ感染を防止するものである。しかし、さらなるアプローチは、ＨＩＶ感染した個体および／またはナイーブな個体に使用され得るワクチンを開発し、インビボでウイルスの複製を抑制してそしてさらなる治療上の処置をせずにＡＩＤＳの発症を防止する防御的なレベルにまで免疫をブーストし、ＨＩＶを「無害」にすることである。この目的を達するため、ワクチン戦略において以前に使用されたものとは別個に、新規の戦略（免疫をブーストし、その一方でＨＩＶの複製を抑制する）が採用され得る。
【００１２】
新規の疾患は、少なくとも１０年間ごとに断続的に出現している（例えば、１９８０年代はＨＩＶ、１９９０年代はＥＢＯＬＡ、そして２０００年代はＳＡＲＳ）。新規の疾患が出現するたびに、各疾患が、防御を達成するために種々の類型のワクチンを必要とするので、相当な量の研究資金が、この疾患の防御的なワクチンを開発するのにあてられる。これは、真実である。なぜなら、いくつかの疾患は体液性の応答により制御され、いくつかの疾患は細胞性の応答により制御され、そしていくつかの疾患は、両方を必要とするからである。各新規の疾患に関し、弱毒化生ワクチンのリスク、および殺傷されたウイルスの効力または組換えタンパク質ワクチンの効力が評価されねばならない。しかし、多様な細胞性免疫および体液性免疫を惹起するワクチン接種のベクターベースのアプローチは、各々の出現の脅威の遺伝的構造に従って再遺伝子操作され得る、すべての疾患に対する単一のワクチンアプローチを可能にする。
【００１３】
上記書類の引用は、前述のいずれもが適切な先行技術である承認として意図されるのではない。日付に関するすべての記載またはこれらの書類の中身に関する説明は、出願人に入手可能な情報に基づいており、これらの書類の日付または内容の正確さに関して承認を構成しない。
【非特許文献１】ＵＮＡＩＤＳ  Ｊｏｉｎｔ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｏｎ  ＨＩＶ／ＡＩＤＳ．ＡＩＤＳ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ．（２００２）
【非特許文献２】Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．ＨＩＶ／ＡＩＤＳ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｒｅｐｏｒｔ．１３（２００１）
【非特許文献３】Ｖｉｇｏｕｒｏｕｘ，Ｃ．ら、Ａｄｖｅｒｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＨＡＡＲＴ）  ｏｆ  ＨＩＶ  ｄｉｓｅａｓｅ．「Ｄｉａｂ．Ｍｅｔａｂ．」（１９９９）２５，３８５〜３９２
【非特許文献４】Ｂｅｈｒｅｎｓ  Ｇ．Ｍ．Ｎ．，Ｓｔｏｌｌ  Ｍ．およびＳｃｈｍｉｄｔ  Ｒ．Ｅ．Ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｉｔ，ｗｈａｔ  ｃａｕｓｅｓ  ｉｔ，ａｎｄ  ｈｏｗ  ｃａｎ  ｉｔ  ｂｅ  ｍａｎａｇｅｄ？  「Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ．」（２０００）２３，５７〜７６
【非特許文献５】Ｐｏｗｄｅｒｌｙ  ＷＧ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｌｉｆｅｌｏｎｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．「Ｊ．Ａｃｑ．Ｉｍｍ．Ｄｅｆ．Ｓｙｎｄ．」（２００２）２９Ｓ，２８〜４０
【非特許文献６】Ｌｕｃａｓ  Ｇ．Ｍ．，Ｃｈａｉｓｓｏｎ  Ｒ．Ｅ．，およびＭｏｏｒｅ  Ｒ．Ｄ．Ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｕｒｂａｎ  ｃｌｉｎｉｃ：ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｎｄ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．「Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．」（１９９９）１３１，８１−８７
【非特許文献７】Ｍａｘ  Ｂ．およびＳｈｅｒｅｒ  Ｒ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ．「Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．」（２０００）３０Ｓ，９６−１１６
【非特許文献８】Ｎｉｊｕｉｓ  Ｍ．，Ｄｅｅｋｓ  Ｓ．およびＢｏｕｃｈｅｒ  Ｃ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｎ  ｖｉｒａｌ  ｆｉｔｎｅｓｓ．「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．」（２００１）１４，２３−２８
【非特許文献９】Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂ．Ｊ．Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．「Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．」（１９９３）１８５Ｓ，１４５−１５１
【非特許文献１０】１１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｆｏｒ  ＨＩＶ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（２００２）Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｐｏｒｔ
【非特許文献１１】Ｌｉｔｔｌｅ  Ｓ．Ｊ．ら、Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｍｏｎｇ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ．「Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．」（２００２）３４７，３８５−３９４．
【非特許文献１２】Ｗｙａｎｄ  Ｓ．，Ｍａｎｓｏｎ  Ｋ．，Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ  Ｄ．Ｃ．，Ｌｉｆｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｐ，およびＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ  Ｒ．Ｃ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」（１９９９）７３，８３５６−８３６３．
【非特許文献１３】Ｄｅａｃｏｎ  Ｎ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｑｕａｓｉ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｆｒｏｍ  ａ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｄｏｎｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．「Ｓｃｉｅｎｃｅ．」（１９９５）２７０，９８８−９９１
【非特許文献１４】Ｌｅａｒｍｏｎｔ  Ｊ．Ｃ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ  ｓｔａｔｕｓ  ａｆｔｅｒ  １４  ｔｏ  １８  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１．Ａ  ｒｅｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｙｄｎｅｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ  Ｃｏｈｏｒｔ．「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」（１９９９）３４０，１７１５−１７２２．
【非特許文献１５】Ｇｅａ−Ｂａｎａｃｌｏｃｈｅ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒｓ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｎｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒｓ．「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２０００）１６５，１０８２−１０９２．
【非特許文献１６】Ａｍａｒａ  Ｒ．Ｒ．ら、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ  ｂｙ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ  ＤＮＡ／ＭＶＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．「Ｓｃｉｅｎｃｅ．」（２００１）２９２，６９−７４．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の開示）
本願は、レンチウイルスベースのベクターの技術を用いた、ヒト中の免疫応答（好ましくは、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）に対する免疫応答）の生成のための、複数の新規のアプローチを提供する。前に弱毒性生（ＬＡ）ワクチンを用いて観察された場合とは異なり、処置した被験体を疾患のリスクに曝さずに、本発明は、ＬＡワクチンの効力に擬似し得るかまたはＬＡワクチンの効力を再生産し得る、組成物または方法を提供する。さらに、本発明は、以前のワクチンの効果からのウイルスの回避をもたらす、高い変異速度という現象に焦点を当てる。
【００１５】
従って、第一の局面では、本発明は、条件的に複製するウイルスをインビボでの抗原提示のために使用するレンチウイルスベクターベースの技術を与える。このベクターベースの技術は、複数の抗原の発現を可能にし、多様化した免疫応答の生成を可能にするが、この応答は、必ずしも本発明により提示されるすべての抗原またはエピトープに対する応答でなければならないことはない。必要とされるのは、本発明の使用により発現される一種以上の抗原に対する応答の生成のみである。好ましくは、この応答は、性質が細胞性および体液性であるが、いずれかの応答の出現が、本発明の実行において生じ得る。よりいっそう好ましいのは、抗原を提示する、抗原または病原体を用いた後のチャレンジに対して防御的である応答である。
【００１６】
ベクターベースのアプローチは、いくつかの長所を提供する。これらとしては、複数の抗原の同時提示；異種のウイルスキャリアと免疫源との間の免疫応答の二分岐がまったくないこと（またはこの二分岐が減少すること）；条件的なベクター複製の背景で、野生型ウイルス複製を模すること；および抗原産生の期間の延長が挙げられる。従って、本発明は、複数（２種以上）の相補的であるが個々では複製欠損型のベクター、または条件的に複製するウイルスベクター（例えば、条件的に複製するＨＩＶベクター（ｃｒＨＩＶ））の系の使用を提供する。この設計は、弱毒化生（ＬＡ）ウイルスよりも安全で、かつ、単一の複製欠損型ベクターよりもなお効力のあるワクチンベクター系を提供する。
【００１７】
非限定的な例として、２種の相補的な、複製欠損型ＨＩＶ−１ベクターは、一種以上のベクターを使用して本発明者らによりなされる知見に基づいて、両ベクターの細胞内の制限された複製および細胞内へのパッケージングを提供し得、これらのベクターの一方が、別のベクターの複製を補完するＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質を発現する。個々のｃｒＨＩＶの複製は、常に最適以下（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）である。なぜなら、この系は、成育可能なウイルス粒子を生み出すために、必要な相補的ベクターを用いた全く同一の細胞の共感染（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を必要とするからである。細胞がこれらのベクターに感染する場合、複数のＨＩＶ抗原が生み出され、強度の体液性免疫応答および細胞性免疫応答を惹起し、これらの体液性免疫応答および細胞性免疫応答は、ＬＡウイルスワクチンを用いたワクチン接種で見られる体液性免疫応答および細胞性免疫応答と類似する。各ベクター単独では、自身では複製し得ず、そして新規の細胞へ伝播し得ない。しかし、必要な相補的ベクターが同一の細胞に存在する場合、相補的ベクターの各々は、細胞が天然に存在するＨＩＶに感染しているかのように、別のベクターの複製およびパッケージングを支持する。子孫のワクチンベクターは、後に他の（隣接）細胞に感染し、従って、この免疫応答を伝播させる。これは、図１に図示される。
【００１８】
これらの相補的なベクターによる複製の間、感染性ウイルス粒子を生み出すための、ＨＩＶの複製およびパッケージングに必要なＨＩＶタンパク質のすべてが発現され、（例えば、誤りがちの逆転写プロセスを介して）発現されたウイルス性抗原に変異が生じていくらかの多様性を提供する機会が生み出される。これは、結果的な免疫応答において上記ベクターに対する寛容を生み出し、従って、上記標的ウイルス因子または標的微生物因子に対する寛容を生み出し、その結果、標的ウイルスまたは微生物の回避に基づく変異は、上記ベクターの投与後（ワクチン接種後）に最小化される。ベクターの変異は、ＬＡウイルス複製に見られる変異を模することが予想され、惹起された免疫応答によりベクター変異物が最終的に排除されるまで、上記ベクターが伝播する間の変異型改変体に対する多様な免疫応答を惹起する。従って、このベクターの、条件的な様式での複製能力および変異能力は、新規の抗原展示（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｐｌａｙ）を常に提供する「活性な」ワクチンを提供し、病原体（例えば、ＨＩＶ）に対して、試験されている現在の代替的ないずれのワクチンよりも十分に防御し得る強度で広範な免疫応答を惹起する。しかし、元になるベクターが、本質的に複製欠損にされ、その結果個々のコード領域のランダムな変異を超えるものが複製能力の再生のために必要であるので、改変体抗原のこの活発な産生は、ビルレンスの潜在能力を増強しないことに留意すべきである。
【００１９】
ベクター間には、必要なウイルスタンパク質の分離に基づいて設計され得る相補的ベクターに複数の構造が存在する。理論上は、任意の必須ウイルスタンパク質がｔｒａｎｓで提供され得、そして複製のために、本発明の意図する（が限定しない）治療上のメカニズムの一部として必須ウイルスタンパク質を必要とするベクターにより利用され得る。相補的ベクター間での組み替えにより生成される、複製能を有するベクター（ＲＣＶ）が存在しないことを確かめるために、分子デザイン（遺伝的抗ウイルス因子）が少なくとも一つのベクター内に、随意には、各ベクター中に含まれ得る。各ベクターにおけるこのような因子の例としては、もう一方のベクターへと指向される、標的化アンチセンス配列、リボザイム、および翻訳後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）が挙げられるがこれらに限定されない。ＰＴＧＳの例としては、以下に記載のように、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）が挙げられる。非限定的な例として、そして共感染した細胞中の相補的ベクターの十分な伝播を確実にするために、このような因子が、この細胞中で示差的に標的化され得る。例えば、一種のベクターは、核内で発現する因子を発現し得、その一方で、第二のベクターにより発現された因子は、細胞質へと往来する。独立した伝播を抑えることなく上記２種のベクター間の組換えを防止する別の非限定的なアプローチは、発現カセットを、二種の相補的ベクターの１種の中に逆方向に設置することである。組換えを通して、元の方向に反転する可能性が極めて低いか、または恐らく不可能であるという理由で、組換えの可能性が回避され、標的化因子は必要とされ得ない。しかし、複製のためにｃｉｓの形態で必要とされるウイルス因子は、パッケージングおよび増殖されやすい、条件的に複製するベクターのすべてに存在する。
【００２０】
条件的に複製するベクターは、任意の適切なエンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質、天然のＨＩＶエンベロープもしくはＨＴＬＶエンベロープ、またはＣＤ４＋  Ｔリンパ球および／もしくはマクロファージもしくは樹状細胞を標的化する任意の分子が挙げられるが、これらに限定されない）で偽型化され得る。偽型粒子は、ベクターすべての複製を補完するのに必要な、少なくとも１コピーの各ベクターを含有し得る。あるいは、この粒子は、ベクターすべての複製を補完する、少なくとも１コピーの各ベクターを含有し得ないが、代わりに、これらのベクターのすべてではないベクターを含有し得る。増殖し得る粒子の使用を介して細胞内へとさらに導入され得る必要なベクターのすべてを提供する粒子の組み合わせは、意図する細胞に感染し、必要な粒子の組み合わせを提供する。２種の相補的なベクターの場合の非限定的な例として、各々は、粒子へと別々にパッケージングされ得、次いで、この粒子は、この粒子に感染した細胞が増殖する条件下で、感染のために標的細胞と接触させられ、その結果、これらの細胞のいくつか、これらの細胞の多くまたはこれらの細胞のすべてが各ベクターの少なくとも１コピーに感染する。
【００２１】
条件的に複製するベクターは、自家細胞移植を利用して、高濃度の標的細胞をエキソビボで形質転換するために使用され得る。あるいは、相補的ベクターは、インビボ（例えば、筋肉内に、皮下に、全身に、またはリンパ系への直接的なドレナージについて標的化された領域）で使用され得る。ブースターは、筋肉内に、または皮下に与えられる、１種以上の条件的に複製するベクターのＤＮＡを用いる単一のＤＮＡワクチン接種から構成され得る。他の遺伝的（ベクター）またはタンパク性のビヒクル（例えば、ワクチン）はまた、ｔｒａｎｓの形態での相補的因子を提供するために使用され得る。非限定的な例として、２種のベクター系が使用される場合（第一のベクターが機能的Ｔａｔタンパク質を提供し、第二のベクターの複製を可能にする）、Ｔａｔタンパク質の送達、またはＴａｔタンパク質を発現し得る他のベクターは、第二のベクターの複製を活性化するために使用され得る。
【００２２】
上記相補的ベクター系はまた、非感染性のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生み出すために修飾され得る。好ましくは、このＶＬＰは、レンチウイルス様粒子であるが、粒子（例えば、ＨＩＶ−１タンパク質（ＨＩＶ−２または他の修飾されたｅｎｖタンパク質もしくは異種ｅｎｖタンパク質の使用を除く）からなる粒子の場合）を構成するウイルスコンポーネントと細胞コンポーネントとのハイブリッドであってもよい。最も単純な修飾は、ｃｉｓの形態に必要なウイルス因子を１種以上のベクターから省略することである。従って、この系のすべてのベクターを含む細胞がウイルス粒子を生み出すのに対し、少なくとも１種のベクターは、粒子へとパッケージングされ得ない。これは、ＶＬＰを産生する能力の、一つの細胞から別の細胞への伝播に対する制御を可能にする。
【００２３】
あるいは、トランスの形態で必要であるが感染の初期には、ウイルス粒子とともに存在する１種以上のウイルス因子のコード配列は、変異されるかまたは省略され得、その結果、１回のみの複製およびパッケージングが生じ得る。ＨＩＶの場合の非限定的な例としては、リバーストランスクリプターゼおよび／またはプロテアーゼの活性の発現を防止するｐｏｌ遺伝子の変異、または欠失が生じ得る。従って、このような変異または欠失を含むベクターは、インビトロでヘルパー／パッケージングベクターとともにパッケージングされ得、これらはトランスの形態でリバーストランスクリプターゼおよび／またはプロテアーゼの活性を提供し、これがまた、必要な相補的ベクターとの影響を受けやすい細胞への導入の後、結果的な粒子へと組み込まれ、１回の複製およびパッケージングを許可する。
【００２４】
第２の局面では、本発明は、２種以上の相補的な、条件的に複製するベクターを使用せずに、非感染性ベクター様粒子（ＶＬＰ）の産生を与える。この局面では、レンチウイルスベクターベースの抗原の産生は、ウイルス因子または微生物因子（例えば、ＨＩＶが挙げられるが、これに限定されない）に対する最大限の細胞性免疫および体液性免疫を同時刺激する。ＨＩＶの非限定的な例としては、このアプローチは、ＨＩＶ抗原スペクトルの提示を最大にするベクターの投与（およびワクチン接種）による、ＨＩＶに対する強度でかつ防御的な免疫を生成し、このベクターの投与（およびワクチン接種）が、ＨＩＶ抗原スペクトルの提示を最大化する。複製欠損型ウイルス様粒子（ＲＤ−ＶＬＰ）をコードするＨＩＶベースのベクターは、体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を生成するように設計される。この（ワクチン）ベクターは、ＨＩＶ抗原の全体（またはほとんど全体）の提示ならびに抗体媒介性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を刺激する能力のために、「Ｔｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶ」と見なされ得る。従って、このベクターにより提供される防御は、伝統的な単一の様式（単一の抗原）のワクチンまたは限定数の抗原を提示するワクチンよりも包括的であると予想される。しかし、本発明は、ＨＩＶまたは任意の他の標的化ウイルスもしくは標的化微生物の、すべてには満たない可能な抗原および抗原性エピトープを提示する「ほぼ全体」のベクターの使用を企図する。
【００２５】
Ｔｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶは、エピトープが細胞によりインビボでプロセシングされるように、各ウイルスタンパク質からのエピトープを発現する用に設計される。好ましくは、Ｔｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶは、レンチウイルスベースのベクターであり、このレンチウイルスベースのベクターは、５’ＬＴＲエレメントおよび３’ＬＴＲエレメントの両方、ならびに宿主細胞または標的細胞への導入後に（ＨＩＶもしくは他のレンチウイルスベクターに対して）異種の構成的に活性な、ＨＩＶコード遺伝子産物の発現を指令するプロモーターを含む。これは、リバーストランスクリプターゼ活性を介した、このベクターのＤＮＡ形態への後の変換であり得る。構成的に活性なプロモーターの選択は、当業者により好まれるものならいずれのプロモーターでもよい（シミアンサイトメガロウイルス（Ｓ−ＣＭＶ−Ｐ）に由来するプロモーターが挙げられるが、これに限定されない）。あるいは、異種の誘導可能なプロモーターは、構成的に活性なプロモーターの代わりに使用され得る。
【００２６】
ＨＩＶおよび他のレンチウイルスおよびいくつかのレトロウイルスの場合、エピトープとしては、ｇａｇ−ｐｏｌ領域、ｖｉｆ領域、ｖｐｒ領域およびｅｎｖ領域からのエピトープ（これらのエピトープは、スプライシングを受けていないメッセンジャーＲＮＡまたは部分的にスプライシングを受けたメッセンジャーＲＮＡに由来する）ならびにｔａｔ領域、ｒｅｖ領域、およびｎｅｆ領域からのエピトープ（これらのエピトープは、複数スプライシングされたｍＲＮＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｍＲＮＡ）に由来する）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターを含む細胞（例えば、ワクチン接種した抗原提示細胞）内でのこれらの抗原のｄｅ  ｎｏｖｏでの合成は、細胞媒介性免疫応答の生成のためにＭＨＣクラスＩの経路に指向される。ＶＬＰの産生のための、このベクターおよび上で議論された相補的なベクターの一つの有益な特徴は、このベクターが、細胞内のＶＬＰの組み立てをもたらす能力が残ったままであるように、ｇａｇ−ｐｏｌ構造遺伝子、およびｅｎｖ構造遺伝子の機能的に重要な領域のいくつかを削除することにより、完全に不完全なＶＬＰを作製する能力である。ベクターを含む細胞から放出されるＶＬＰは、抗体応答を誘導し得る。ＶＬＰの利点は、生成された抗体のいくつかが、ウイルス粒子の表面に見出されそしてウイルス中和に影響するように、ウイルス構造エピトープに指向される（図２を参照のこと）。
【００２７】
不完全なウイルス様粒子ベクター系を構築するために、かなり大きな変異がウイルス遺伝子およびウイルスエレメント（例えば、ｃｉｓ活性化エレメント）の重要な領域に導入され得る。ウイルス配列中の複数の欠失により、このベクターの複製可能なウイルスへの返転（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）の可能性が激的に減少する。非限定的な例として、このシス活性化パッケージングシグナル（ψ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）、および／ならびにポリプリン配列（ＰＰＴ）はすべて、ベクターから除去され、ベクターがパッケージングされ、そして／または逆転写されるのを防止する。さらに、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）および／またはインテグラーゼ（ＩＮ）をｐｏｌ領域中にコードする機能的領域、およびエンベロープ（ｅｎｖ）構造遺伝子は、ベクターの複製欠損を全体的に確実にするために削除され得る。このプロセスにおいて、ＶＬＰ組み立てのためのｇａｇ機能が保存され、上に記載されるような抗体応答の生成のための不完全な粒子の産生を確実にする（図３を参照のこと）。あるいは、これらの部分によりコードされるエピトープに対して指向される免疫応答が望ましい場合、ＲＴ、ＩＮ、および／またはｅｎｖコード配列の一部が保持される。好ましくは、このような部分は、ＲＴ、ＩＮまたはｅｎｖの、ＶＬＰを産生するのに必要な機能を超えた、通常の機能をコードしない。
【００２８】
被験体または患者へのワクチンベクターの送達のための非限定的な方法としては、アジュバンドの存在下で裸のＤＮＡを用いた、筋肉内ルート、皮下ルート、または全身ルート、続いて、培養物中で生成されたＴｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶ  ＤＮＡおよびＶＬＰを用いたブースター注射が挙げられるが、これらに限定されない（図４を参照のこと）。あるいは、このワクチンは、レンチウイルスパッケージング系中にパッケージングされたベクターを用いた、標的細胞（最も好ましくは、リンパ球）および／またはマクロファージもしくは樹状細胞（もしくは他の抗原提示細胞）のエキソビボ導入を介して与えられ、このレンチウイルスパッケージング系は、適切なエンベロープタンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来のＧタンパク質が挙げられるが、これに限定されない）でこのベクターを偽型化する。後者の場合、ＨＩＶ中のシス活性エレメント（例えば、Ψエレメント、ＰＢＳエレメント、およびＰＰＴエレメント）は、このベクター中で保持され得る。
【００２９】
ウイルス遺伝子およびシス活性エレメントの必要不可欠な領域の大規模な欠失を考慮すれば、ＨＩＶの複製可能な形態へのベクターの返転の可能性は、合理的に、存在しないか、またはほぼ存在しなくなる。従って、このワクチンアプローチは、ＬＡ  ＨＩＶウイルスの使用からの質的な改善を提供し、このＬＡ  ＨＩＶウイルスは、サルおよびヒトにおいて病原性であることが示されている。
【００３０】
本発明の第三の局面において、複数抗原発現ベクターが提供される。抗原認識がヒトからヒトへと変化（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）することは、主として主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子のペプチド結合部位に存在する遺伝子多形に由来し、提示された抗原に対する免疫応答の生成および進展をもたらすために、この主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子は、外来抗原を、それぞれＴ細胞およびＢ細胞に提示するために機能する。ＭＨＣ分子のペプチド結合部位のコンフォメーションに依拠して、提示された特定のペプチドは異なる。従って、広範なヒトの人口を超えて適用可能なワクチンは、好ましくは、いくつかのペプチド抗原を使用し、処置される被験体のほとんどまたはすべての間での有効な刺激を確実にする。さらに、ＨＩＶ感染の場合、長期の非進行（ＬＴＮＰ）が、代表的なＨＩＶ患者よりも著しく多様な抗−ＨＩＶ  ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を有し、従って、任意のワクチンアプローチにおいて、多様な免疫応答をＨＩＶ／ＡＩＤＳに対して生成する重要性を強調する。
【００３１】
より発展した宿主の免疫系により認識されるエピトープ（例えば、哺乳動物または霊長類のエピトープ）は、応答（ｒｅｓｐｏｎｄ）する細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ヘルパーＣＤ４＋Ｔリンパ球（ＣＤ４）、およびＢ細胞）に従い、３つの主要なクラスへと分類され得る。Ｂ細胞エピトープは、このエピトープが３次元のネイティブ構造として認識されるか、または変性した直鎖状単位として認識されるかに依存して、構造エピトープおよび直鎖状エピトープへとさらに分類される。多くの免疫優勢エピトープは、経験的に、関連するＭＨＣ遺伝子と併せて定義され、そして本発明のベクターにより、複数抗原提示の一部として容易に発現され得る。
【００３２】
本発明は、本明細書中に開示される、異なるＨＬＡ型を表すエピトープの広範囲のスペクトルを含む任意のベクターを与える。本発明はまた、ＭＨＣ制限の背景で、種々の疾患を引き起こす感染因子（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が挙げられる）のエピトープを機能的に決定するために、使用され得る。現存する合成ペプチドに対するこのアプローチの利点は、ネイティブでかつ、人工的にというよりもむしろ自然にプロセシングを受けたエピトープが選択されていることである。以前のペプチドワクチンの短所が、構造的エピトープ（タンパク質のフォルディングの一部として寄せ集められるアミノ酸残基により形成されるネイティブタンパク質の免疫学的決定基）を模した合成分子を生み出すことが困難であることに対し、本発明のベクターは、よりネイティブな背景で、タンパク質および抗原を生み出すように設計される。次いで、同定された抗原およびエピトープの複数のメンバーは、本発明のベクターにおける発現のために合わされ得る。
【００３３】
このような複数抗原ベクターは、ＣＴＬ、ＣＤ４＋、および／またはＢ細胞の刺激（およびこれらによる認識）のための、多くの保存された優勢なエピトープ（１種以上のポリペプチドとして結合されている）をコードする１種以上の配列を含む。好ましくは、エピトープの間に挿入されているのは、保存されたペプチド抗原プロセシング配列である。このエピトープは、後に生じる免疫応答を免れ得るウイルス変異体の可能性を減少させるように設計された多価ワクチンの開発のための各ウイルスタンパク質を網羅するように設計される。別の言い方では、このエピトープは、好ましくは、多くのウイルス株またはすべてのウイルス株または他の病原体において保存されているエピトープである。種々のエピトープ（例えば、ＣＴＬ応答の増強、ＣＤ４＋応答の増強および／またはＢ細胞応答の増強、特に強度でかつ防御的な応答）の同定または決定が、当業者に公知の任意の方法による同定または決定であり得る。このようなエピトープ、またはその適切に代表的なメンバーは、好ましくは、本発明の実行において使用され、被験体中で、強力で防御的な、細胞性免疫応答および体液性免疫応答を刺激する。
【００３４】
上記の戦略は、別々に使用され得るか、またはお互いに組み合わせて、および／もしくは当業者に公知の他のワクチン戦略と一緒に、これらを必要とする被験体中への投与のために、使用され得る。このような被験体としては、ウイルス因子または微生物因子（例えば、ＨＩＶ）にすでに感染している個体、およびこのような感染のために危険な状態の個体が挙げられる。投与は、当該分野で公知の方法（上記被験体の１以上の細胞を本発明の組成物と接触させる工程が挙げられるが、これに限定されない）による投与であり得る。この開示された戦略は、容易に再度遺伝子操作され、免疫応答を生成し得、そしてワクチンの、多くの他のウイルス感染もしくは細菌感染、または癌に対して、防御的な状態を生成し得る。本発明の実行についての好ましい被験体は、ヒトであるが、本発明は、他の生物、特に哺乳動物および霊長類における使用のために適用され得る。
【００３５】
従って、本発明は、組成物（例えば、上記の核酸構築物およびベクター、これらのウイルス粒子カプセル化形態、それらの使用のための処方物、および免疫応答を引き起こすための方法、ならびに、多くの他のウイルス感染もしくは細菌感染、または癌に対するワクチンの防御的状態）を提供する。さらに、本発明は、本明細書中に開示される方法の実行のための、本発明の構成要素を含有するキットの形態で具体化され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
（本発明を実行するための様式）
本発明は、レンチウイルス由来のベクターの使用に基づく。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスからのＬＴＲを最小限に含み、そして必要に応じて、レンチウイルスの５’リーダー配列およびｇａｇ−コード配列のパッケージング配列を含む。このベクターはまた、Ｒｅｖ依存的な様式で、ベクターＲＮＡの核への輸送を促進するＲＲＥエレメントを必要に応じて含む。
【００３７】
上および本明細書中に記載された本発明の各局面は、その使用により生成される免疫応答が、（１）天然に変異するＨＩＶの間での多様性を模するウイルス抗原に対する多価応答、（２）免疫刺激の広範な寛容、（３）バランスのとれた体液性免疫応答および細胞性免疫応答、の生成により、入来の病原体（例えば、ＨＩＶウイルス）の多様性を含む可能性を最小化するように設計されている。Ｔｏｔｉ  ＶａｃＨＩＶ系において、ウイルスタンパク質のネイティブなコンフォメーションが、成熟したウイルス粒子の背景で保存されているのは注目に値し、これは、中和抗体の産生に利点を提供し得る。
【００３８】
最良の防御的な結果を媒介するために、まったく自然に、本発明のこれらの局面が合わせられる。非限定的な例として、患者は、まず複数抗原ベクターで免疫され、次いで、相補的、条件的に複製するベクターの系で免疫され、この応答の多様化を促進し得る。あるいは、これらのワクチンアプローチは、当業者に公知の前もって試験したワクチン（例えば、ＬＡワクチン、不活化ワクチン、または単一のタンパク質（もしくは他の組換え）ワクチン）と合わせられ得る。具体的には、そして非限定的な例として、患者は、まずＴｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶで免疫され、免疫を感作し、その結果、後に患者は、強力で多様な免疫応答の発展のために、疾患なしで、弱毒化ＨＩＶでワクチン接種され得る。
【００３９】
相補的な、条件的に複製するベクターの系に関して、図１は、２種の相補的な、条件的に複製するベクター、ＶＲＸ−Ｖ２ＡおよびＶＲＸ−Ｖ２Ｂが、誘導と同時に、Ｔ細胞または樹状細胞の刺激により、免疫応答を生成するために使用される、本発明の実施形態を例示する。図１に示されるように、各ベクター単独では、増殖し得ない（一方のベクターは、ｔｒａｎｓの形態で必要とされる構造タンパク質をコードする一方で、もう一方は、ｔｒａｎｓの形態で必要とされる非構造的タンパク質をコードする）が、Ｔリンパ球の共感染の間、両ベクターは、お互いの複製を支援する。
【００４０】
ワクチンベクターで感受性の高い哺乳動物細胞を感染させることで、ＨＩＶタンパク質の発現および後の免疫の刺激が生じる。細胞内のただ１種のベクターによる感染の間、このベクターによりコードされるＨＩＶタンパク質は、さらに発現されるが、生み出されたベクターの子孫は存在しない。ベクターを細胞内へと導入する方法は、当該分野で公知であり、そして本発明の実行において使用され得る。非限定的な例として、この方法は、２０００年８月３１日に出願された、認可済の米国特許出願０９／６５３，０８８に開示される方法を包含し、これは、完全に記載されるように、本明細書中で参考として援用されている。
【００４１】
２種のベクターが、一緒にパッケージングされる場合、アンチセンス遺伝エレメントの、各ベクター中のその存在は、組換えを抑制および／または防止し、複製能力あるＨＩＶベクターを形成する。アンチセンスベースの遺伝エレメントに加えて、本発明は、翻訳後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）のための、リボザイムまたはポリヌクレオチドを生成する配列で実行され得る。遺伝子発現およびウイルス複製を阻害するためのリボザイムの使用が、他の目的で条件的に複製するベクターの使用を介して、米国特許第６，４１０，２５７号に開示される。ＰＴＧＳは、相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の存在により媒介され、これが、標的化ＲＮＡの迅速な崩壊を引き起こす。ＰＴＧＳの一つの形態は、ｄｓＲＮＡの指向された導入により媒介されるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。別の形態は、細胞中でＰＴＧＳを誘導する二本鎖または一本鎖形態の約３０ヌクレオチド未満の小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を介する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の一部であると考えられ、この複合体を切断および分解のために相同ｍＲＮＡ標的にガイドする。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ転写物の遺伝子特異的分解の経路を誘導する。ｓｉＲＮＡは、相補的なＲＮＡ鎖をコードする二重発現カセットの使用を介して発現され得るか、またはヘアピン分子として発現され得る。
【００４２】
図１の工程３および工程４は、ワクチンベクターのさらなる段階の感染および伝播を例示する。ワクチンベクターのさらなる伝播は、免疫媒介性の排除が生じるまで続き、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方により媒介される防御的免疫とつりあう。
【００４３】
当然、本明細書中に開示される相補的ベクターが発現し、従って、非ＨＩＶタンパク質（例えば、他のウイルスまたは微生物に由来するタンパク質）に対する免疫応答を生成する。このような他のウイルスの非限定的な例としては、他のレンチウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＥＩＡＶ、ＶＭＶ、ＣＡＥＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶおよびＳＩＶ）、レトロウイルス、およびエンベロープ糖タンパク質を有する他のウイルス（例えば、トガウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、およびコロナウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。異種のエンベロープタンパク質が、ベクターによりコードされ、そして発現されるはずである場合、このベクターは、好ましくは、このベクターを偽型化し得るベクターである。偽型化のための適切なエンベロープタンパク質の非限定的な例として、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＭＭＬＶエンベロープタンパク質；水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、モコラウイルス、もしくは狂犬病ウイルス由来のＧタンパク質；ＧａＬＶ；アルファウイルスＥ１／２糖タンパク質；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）由来のエンベロープタンパク質；ＲＤ１１４、ネコ内因性ウイルス由来のｅｎｖタンパク質；または他のレンチウイルスもしくはレトロウイルス由来の糖タンパク質（例えば、ウマの感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）由来のｇｐ９０もしくはウシ免疫欠損ウイルス（ＢＩＶ）の表面糖タンパク質）が挙げられる。以下のウイルスファミリーに由来するエンベロープタンパク質をコードする配列もまた、使用され得る：ピコルナウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、パルボウイルス科（Ｐａｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、およびヘルペスウイルス。あるいは、１種より多くのエンベロープタンパク質の一部を含むハイブリッドエンベロープタンパク質が、本発明のベクターにより、コード化され、そして発現され得る。
【００４４】
ウイルスエンベロープタンパク質の発現についてのさらなる方法は、本発明に包含される。一つの意味で、これらの方法は、エンベロープタンパク質置換戦略とみなされ得、そしてウイルス間（特に、ＨＩＶ）でのｅｎｖタンパク質の変異性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）のために、特に魅力的である。ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，６００３  Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９２）は、多くの改変体ｅｎｖ遺伝子の配列を入手可能にしている。ＨＩＶまたはレンチウイルスベクターの系におけるｅｎｖコード配列の、別のＨＩＶ株または分離株からの改変体遺伝子との置換は、より十分に生じたベクターを調節し、免疫応答を生成する。さらに、これらは、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）に関して見られる固有の変異速度に基づく上記ｅｎｖ配列中の変異のための異なる開始点を提供する。これらの代替的なベクターは、世界の特定の部分もしくは特定の集団に蔓延しているＨＩＶ株に対して、または特定のビルレント株に対して、ワクチン接種するために使用され得る。このベクターはまた、特定の感染患者の治療上の処置（例えば、患者に感染した特定のＨＩＶ株の、患者からの単離および同定後の、特定のＨＩＶ株由来のｅｎｖタンパク質をコードする配列の封入による処置）のために調節され得、ＡＩＤＳの兆候の発症を妨害する。これは、ｅｎｖ配列をクローニングし、そして日常的な方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の日常的な方法および他の組換えＤＮＡ技術）により、このｅｎｖ配列をクローン化配列とベクター中で置き換えることにより、容易に達成される。別の実施形態では、異なる多様なＥｎｖタンパク質をコードするベクターの組み合わせが、本発明の実行において使用され得る。改変ｅｎｖコード配列はまた、変異誘発により遺伝子操作され得、そして本発明の実行により使用され得る。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、そして被験体中でのウイルス感染の処置または防止のために、このベクターは、標的ウイルス中に予想されるかまたは見出される天然のエンベロープタンパク質とともに使用され（そしてこれを発現する）。免疫応答が標的ウイルスのエンベロープタンパク質に対して生成されるのを可能にする工程に加え、このアプローチにより、ウイルスの蔓延を促進する異種のエンベロープタンパク質とともに標的化ウイルスがパッケージングされる可能性が低減するか、または最小化する。さらに、本発明のベクターは、標的化ウイルスのコピーとのベクターのウイルス粒子中へのパッケージングを防止する抗ウイルス因子をコードし得るか、またはこれを含み得る。あるいは、本発明のベクターは、本発明のベクターと野生型ウイルスとの組換えの可能性を低減または最小化するエレメントおよび因子を含み得る。このような因子およびエレメントの非限定的な例は、米国特許第６，１６８，９５３号および２０００年９月２２日に出願された認可済の米国特許出願０９／６６７，８９３に提供され、これらの両方は、十分に記載されるように、参考として本明細書中に援用される。
【００４６】
このベクターはまた、他のウイルスタンパク質（他のレンチウイルスまたは他のレトロウイルス由来のカプシドタンパク質が挙げられるが、これに限定されない）をコードし得る。実際に、有用な免疫応答を生成し得る、ウイルスまたは微生物の事実上任意のタンパク質（構造的なタンパク質、非構造的なタンパク質を問わない）は、ベクターの複製および／または遺伝子の発現を防止しない限り、ベクターおよび本発明の方法により発現され得る。これらのタンパク質はまた、ｅｎｖコード配列について上に記載された置換技術に影響を受けやすい。さらに、当業者にとって明白なように、本発明のベクターは、本明細書中に開示されている他のレンチウイルスベクターのゲノムに基づき得る。他のレンチウイルスベースのベクターの使用はまた、異種のタンパク質の発現がベクターの複製および／または遺伝子発現を妨害（別のレンチウイルスゲノムが使用されている場合にこの妨害が減少し得るかまたは存在し得ない）する場合に焦点を当てるために使用され得る。コロナウイルスタンパク質を発現する場合、本発明はまた、ＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を引き起こすウイルスに対して、免疫応答および／または防御的作用を提供するタンパク質の発現を与える。
【００４７】
一つの代表的な例として、ＨＩＶに基づくベクターは、ｇｐ１６０切断部位の変異とともに構築され、この変異は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１へのｇｐ１６０エンベロープ前駆体のプロセシングをブロックする。これは、ＨＩＶベースの粒子の伝播の間のｇｐ１２０抗原の「シェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）」を減少し得る。ｇｐ１６０のｇｐ４１部分は、ｇｐ１２０抗原をよりしっかりと、ｇｐ１６０が挿入される膜に縛られ得る膜貫通ペプチドである。ｇｐ１２０部分の保持の増大は、本発明のべクターの免疫原性部分を改善し、そして膜内の「シェディング」の阻害または保持の増大は、免疫応答を生成するのに有用であり得る。別の代表的な実施形態として、このｅｎｖタンパク質は、キメラ糖タンパク質（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の両方からのエレメントを有するキメラ糖タンパク質、または、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子内の種々の位置にて単離されたＭＮウイルスのＶ３ループに由来する部分（ＵＳＰ５，８６６，１３７号）を有するキメラ糖タンパク質）であり得る。
【００４８】
図２は、ＨＩＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生み出す複製欠損型ベクターが、ＨＩＶタンパク質に対して細胞性応答および／または体液性応答を誘導するために使用される本発明の実施形態を示す。このベクター（例えば、Ｔｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶ）は、安定に宿主細胞のゲノムへと合体し、そして小胞体（ＥＲ）内で内的にプロセシングされ、そして細胞（ＣＤ８すなわち細胞傷害性）免疫応答の刺激のためにＭＨＣクラスＩ経路を介して発現される、ＨＩＶ抗原を生み出す。さらに、タンパク質は、組み込まれたベクターにより生み出され、このベクターを伝播し得ないＶＬＰの形成（例えば、「出芽」を介して）を可能にする。
【００４９】
しかし、ＶＬＰは、細胞（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ））により占められ、そしてこの細胞（免疫応答の生成に寄与する細胞を含む）内の細胞プロセスにより加工される。これの非限定的な例が、図２に示され、ＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩＩ経路を介してＶＬＰからの体液性応答の刺激のための抗原を提示する。
【００５０】
図３は、本発明のＴｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶベクターの可能な実施形態のすべての設計を示す。このベクターは、標的細胞へと（安定に）導入された後、いくつかのＨＩＶエピトープを提示するように設計される（「Ｅ」と表記される）。エピトープは、ＨＩＶに由来するスプライス部位（スプライスドナー、すなわち「ＳＤ」およびスプライスアクセプター、すなわち「ＳＡ」部位）のすぐ近くで切り離される。この示された部位は、「ＳＤ１」、「ＳＤ２」、「ＳＡ１」、および「ＳＡ２」である。ｍＲＮＡは、構成的に発現されるプロモーター、この場合、ＣＭＶプロモーターから転写される。他のプロモーターは、本発明の実行において使用され得る。非限定的な例としては、Ｔｋプロモーター、ＥＦ−αプロモーター、およびＰＧＫプロモーターが挙げられる。
【００５１】
投与後のベクターの伝播を阻害または防止するために、ＲＮＡパッケージングのためのエレメント、核移入のためのエレメント（セントラルポリプリン配列すなわちｃＰＰＴ）、および複製のためのエレメント（プライマー結合部位すなわちＰＢＳ）が除去される。しかし、１）このベクターの伝播を阻害または防止するために、他の欠失または変異（例えば、トランス活性応答性（ＴＡＲ）領域、ｇａｇカルボキシ末端ＣｙｓＨｉｓボックス（すなわち、「ジンクナックル（ｚｉｎｃ  ｋｎｕｃｋｌｅ）」）領域、およびｎｅｆ領域内のポリプリン配列）の欠失）が作製され得ること；２）３種の例示的な変異が、単独で、対で、または他の欠失もしくは変異と組み合わせて使用され、ベクターの増殖を防止し得ること、が当業者には明白である。
【００５２】
このベクターの他の特徴としては、すべてのエピトープペプチドまたは抗原におけるかなり大きな欠失；ＨＩＶウイルスゲノムのネイティブな立体配置に基づくエピトープまたは抗原の発現；ｇａｇ−ｐｏｌ（ＧＰ）エピトープは、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）活性およびインテグラーゼ（ＩＮ）活性の両方が欠失しているが細胞から「出芽」し得るＶＬＰを組み立て得る；ｖｉｆ−ｖｐｒ領域は、保存されたエピトープを保持する；ｔａｔ領域は、トランス活性応答（ＴＡＲ）領域との相互作用のための、必須ではあるが、免疫原性であることが公知ではない、Ｒドメインの欠失を含む；ｅｎｖ領域は、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間に切断部位の欠失を含む；ｎｅｆ領域は、ＲＲ（ダブルのアルギニン）、Ｍｙｒ（ミリスチル化部位）、ＮＢＰ−１（Ｎｅｆ結合タンパク質−１）およびβ−ＣＯＰ（βコートマータンパク質）結合部位に欠失を含む；そしてＲｅｖは、この実施形態における唯一の機能的ウイルスタンパク質である、が挙げられる。上記の変化の多くはまた、複製欠損型ベクターの複製に寄与することに注意されるべきである。他の好ましい実施形態は、ｔａｔ領域、ｖｐｒ領域および／またはｎｅｆ領域の全体または一部に変更（変異および／もしくは欠失）を有し、この変更は、Ｔａｔタンパク質、Ｖｐｒタンパク質および／またはＮｅｆタンパク質の機能を低減させるか、またはこれらの非存在をもたらす。本発明の実施において特に好ましいのは、ｃＰＰＴおよび／またはＰＰＴの全体または一部に不活化欠失を含む実施形態である。本発明のこの局面のいくつかの実施形態は、ＰＢＳの欠損もＲＮＡパッケージング配列も含まない。
【００５３】
当然、本発明の複製欠損型ベクターは、他の配列変更ならびに他のタンパク質、抗原、およびエピトープを発現する能力を含み得る。例えば、他のウイルスまたは病原性微生物因子に由来のタンパク質は、これらをコードする配列により発現され、そして本発明のベクター中へと設置され得る。一つの非限定的な例では、これは、条件的に複製するベクターについて上に記載された置換戦略によるものであり得る。
【００５４】
図３に示される実施形態、および本開示に基づく他の類似のベクターとしては、５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲが挙げられるが、必要に応じてこれらを省略し得る。それにもかかわらず、このようなベクターの各々は、多くのエピトープを同時に提示し得る、完全に複製欠損型のウイルスベクターである。図２に示される場合のように、エピトープ／抗原は、ＭＨＣ  Ｉ（このベクターを含む細胞内の内因性エピトープの発現）を介して、そしてＭＨＣ  ＩＩ（このベクターを含む細胞から放出されたＶＬＰを介して）を介して、提示され得る。このエピトープは、ネイティブな立体配置で、または天然の立体配置に緊密に類似した状態であることが予想される。
【００５５】
本発明の複製欠損型ベクターは、このベクターを用いてトランスフェクションした後、ＶＬＰ産生を支持し得る高感受性の細胞（例えば、インビボまたはエキソビボ（特に、造血由来）での、ＨｅＬａ、ＨｅＬａ−ｔａｔ、ＣＯＳ、２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＥＭｘ１７４、ＳｕｐＴ１、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３、Ｄ１７、酵母、細菌、または霊長類細胞が挙げられるが、これらに限定されない）へと導入され得る。このベクターの導入は、任意の公知の手段によるものであり得、そして一時的または恒久的にＶＬＰの発現をもたらし得る。このＶＬＰは、非限定的な例としては、ペレット化、スクロース勾配精製、またはカラムクロマトグラフィにより、培養物上清から単離され得る。あるいは、このベクターは、エキソビボの条件下で被験体または患者の細胞へと導入され得、その後、この被験体または患者へと戻され得る。この細胞は、戻される前にＶＬＰを産生する能力について確かめられ得るか、または単に戻されて、インビボでＶＬＰを産生し得る。しかし、このベクターが細胞中に存在する場合、たとえこのベクターが複製欠損型であっても、複製欠損型「プロウイルスの」形態とみなされ得る。使用され得る本発明の別の実施形態は、このベクターを含み、そしてＶＬＰを発現する細胞（すなわち、「ＶＬＰ産生者細胞」）では、被験体または患者へと導入され、ＶＬＰＳをインビボで生成する。これは、細胞が必ずしも被験体由来のものまたは患者由来のものである必要はなく、この場合、これらの細胞に対する免疫応答が存在し得るという点でエキソビボのアプローチとは異なる。これは、異種移植片ではなく同種移植片を構成する細胞の使用により幾分軽減され得るが、免疫抑制的な因子の適切な使用は、これらが導入される被験体にとって異種の任意のＶＬＰ産生者細胞の使用とともに、必要とされ得る。
【００５６】
本発明の代替的な実施形態では、上記インビトロの方法またはインビボの方法により産生されるＶＬＰは、治療として、被験体または患者へと導入され、これにより、インビボで存在するベクターの必要性を未然に防ぎ得る。処置されるべき被験体または患者に由来する細胞の使用は、結果として生じたＶＬＰが最小限の排出物（ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の状態で使用され得るという点で、特に有利である。この細胞は、エキソビボで培養物中で維持され、延長された期間、当該分野で公知の技術を介して、ＶＬＰを産生し得る。
【００５７】
図４は、本発明の複製欠損型ベクターの媒介する方法を用いたプロトコールの説明である。この実施形態は、Ｔｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶ  ＤＮＡを用いた免疫に始まる。このＤＮＡが、送達され、そして任意の適切な方法（ＤＮＡが細胞のゲノムへと安定に組み込まれ得る場合、またはエピソーム様に維持され得る場合が挙げられる）により、被験体の細胞に吸収され得る。細胞によるエピトープの発現は、ＭＨＣ  Ｉの背景と組み合わせてエピトープの提示をもたらし、細胞ベースの免疫応答を生成する。この細胞はまた、ＶＬＰ産生に必要なタンパク質を発現し得、続いて、ＶＬＰが組み立てられ、そしてＶＬＰ細胞外環境へと放出されるか、または細胞から細胞への直接的な媒介性移入を介してＶＬＰが放出される。抗原提示細胞によるＶＬＰの取り込みは、ＭＨＣ  ＩＩの背景の中でのＶＬＰの提示をもたらし、体液性ベースの免疫応答を生成する。
【００５８】
十分な時間の後、被験体は、少なくとも一回、Ｔｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶ  ＤＮＡとＶＬＰとの組み合わせ（必要に応じて、上記ＤＮＡにより産生される）によりブーストされる。このブーストは、初期の細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を増強する。細胞性応答または液性応答の誘導または存在は、ＣＴＬ活性についてのクロム放出アッセイおよび中和抗体についてのアッセイ（当業者に公知であるようなアッセイ）に基づく任意の点でアッセイされ得る。
【００５９】
あるいは、図４に例示されていないが、被験体は、個々にブーストされ得るか、またはＴｏｔｉ−ＶａｃＨＩＶと組み合わせて、本明細書中で開示される別のベクターもしくは当業者に公知の別のワクチンと組み合わせて、ブーストされ得る。
【００６０】
本明細書中に開示される任意のベクターは、代替的に使用され、複数の抗原構築物を発現し得、この複数の抗原構築物は、免疫応答の生成のための、特に興味深いエピトープとして同定されたエピトープを含む。この複数抗原構築物は、好ましくは、抗原またはエピトープを含み、この抗原またはエピトープは、好ましくは、優勢な抗原決定基を含み、この優勢な抗原決定基が、細胞性応答および免疫性応答の両方を誘導する。このような抗原およびエピトープは、本発明のベクターの使用により同定され得、本発明のベクターは、免疫応答の生成のために、種々の抗原およびエピトープを、単独でかまたは組み合わせて、種々の型で、動物モデルにおいて提示することに対して適用され得る。強力な細胞性応答および／または体液性応答を惹起するこれらの決定基が、本発明のベクターを介した発現のための複数抗原構築物の調製において、選択され、そして使用され得る。
【００６１】
宿主への導入の前に、本発明のベクターまたは構築物は、治療上および予防上の処置の方法における使用を促進するための、種々の組成物中へと処方され得る。特に、このベクターおよび構築物は、薬学的に受容可能な適切なキャリアまたは希釈剤との組み合わせにより、薬学的組成物へと作製され得、そして、ヒトへの適用または獣医学上の適用に対して適切であるように処方され得る。さらに、遅延型の放出すなわち予定時間を越えた放出のための処方もまた、提供される。
【００６２】
従って、本発明の方法における使用のための組成物は、１種以上の上述のベクターまたは構築物（好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせる）を含有し得る。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知であり、免疫応答の生成のための投与の適切な方法も同様に当業者に周知である。キャリアの選択は、部分的に、特定のベクターまたは構築物により、および組成物を投与するために使用される特定の方法により、決定される。当業者はまた、組成物を投与する工程の種々のルートが利用できること、および投与のための１種以上のルートが使用され得るが、特定のルートが別のルートよりも直接的でかつ効果的な反応を提供し得ることを認識する。従って、本発明の組成物の、広範な種々の適切な処方物が存在する。
【００６３】
本発明のベクターまたは構築物からなる組成物は、単独でかまたは他の抗ウイルス化合物と組み合わせて、被験体への直接的な投与またはエキソビボでの被験体の細胞への投与にとって適切な処方物へと作製され得る。このような処方物としては、水性および非水性、等張（すなわち等浸透性）無菌注射溶液（これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、およびこの処方物と意図されたレシピエントの血液とを等張にする溶質、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存薬を含有し得る、水性および非水性の無菌懸濁液を含有し得る）が挙げられる。この処方物は、単位投薬量封入容器または複数用量封入容器（例えば、アンプルおよびバイアル）にて進呈され得、そして無菌液体キャリア（例えば、水（例えば、使用の直前の、注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵され得る。突発的に注射可能な溶液および懸濁液は、本明細書中に記載されるような、無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤より調製され得る。
【００６４】
上記ベクターは、望ましい場合には、任意の適切な溶液中に貯蔵され得るか、緩衝液中に貯蔵され得るか、または凍結乾燥可能な形態で貯蔵され得る。好ましい貯蔵緩衝液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；トレハロース水溶液（１−５０％）と混合されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（１：１）、好ましくはトレハロース水溶液（１０％）と混合されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（１：１）（その結果、最終濃度は、５％トレハロース）；グルコース水溶液（１−５０％）と混合されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（１：１）、好ましくは、グルコース溶液（１０％）と混合されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（１：１）（その結果、グルコース最終濃度は５％）；トレハロース水溶液（１−５０％）と混合された２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−緩衝化生理食塩水（１：１）、好ましくはトレハロース水溶液（１０％）と混合された２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−緩衝化生理食塩水（１：１）（その結果、最終トレハロース濃度は５％）；または；マンニトロール水溶液（１−５０％）と混合された２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−緩衝化生理食塩水（１：１）、好ましくはマンニトロール水溶液（５％）と混合された２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−緩衝化生理食塩水（１：１）（その結果、最終トレハロース濃度は２．５％）である。
【００６５】
経口投与に適切な処方物は、液体溶液（例えば、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、フルーツジュース）に溶解した有効量の化合物）；カプセル剤、におい袋（ｓａｃｈｅｔ）もしくは錠剤（各々が固形物または顆粒剤として規定量の活性成分を含有する）；ならびに水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョンからなり得る。錠剤の形態は、一種以上のラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモスターチ、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝化剤、湿潤剤、保存剤、矯味矯臭剤、ならびに薬理学的に適合性のキャリアの１種以上を含有し得る。
【００６６】
経口投与が適切な処方物は、風味の活性成分（通常は、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント）を含有し得る口内錠の形態を包含し得る。不活性な基材（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）を含有するトローチ剤（ｐａｓｔｉｌｌｅ）；ならびに適切な液体キャリア中に活性成分を含有するうがい薬；ならびに、活性成分に加えて当該分野で公知であるようなキャリアを含有する、クリーム、エマルジョン、ゲルなどが挙げられ得る。
【００６７】
吸入を介した投与に対して適切なエアロゾル処方物がまた作製され得る。このエアロゾル処方物は、加圧された受容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に設置され得る。
【００６８】
局所的な適用に適した処方物は、クリーム、軟膏、ローション剤の形態であり得る。
【００６９】
動物（本発明の背景では、特にヒト）に投与された用量は、妥当な時間枠にわたって、感染した個体において（防御的）免疫応答を達成するのに十分であるべきである。使用される特定のベクターまたは構築物の潜在能力、疾患状態の重症度、ならびに感染した個体の体重および年齢により決定される。用量の大きさはまた、使用される特定のベクターの使用または構築物の使用に付随する、見出された任意の副作用の存在により決定される。可能な時にはいつでも、副作用を最小限に維持することが、常に望ましい。
【００７０】
上記投薬は、単位投薬形態であり得る。本明細書中で用いられる場合、用語「単位投薬形態」とは、ヒトおよび動物被験体にとっての単位投薬量として適切な、物理的に別々の単位をいい、各単位は、単独でかまたは他の抗ウイルス因子と組み合わせて、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、またはビヒクルと関連して所望の効果を生み出すのに十分な量が計算された規定量のベクターまたは構築物を含有する。本発明の単位投薬形態についての仕様は、使用される特定の化合物または化合物、ならびに達成されるべき効果、ならびに宿主中の各化合物に関連する薬力学に依存する。投与される用量は、「有効量」または個々の患者において「有効レベル」を達成するのに必要な量であるべきである。
【００７１】
「有効レベル」は、投薬のための好ましい終末点として使用されるので、ファーマコキネティクス、薬物の分布、および代謝における個体差に依存して、実際の投薬量およびスケジュールが変動し得る。「有効レベル」は、例えば、本発明に従う１種以上のベクターまたは構築物の濃度に対応する、患者において所望される血液または組織レベルとして定義され得、これが、臨床的な効力に対して予測的なアッセイにおいて、所望のレベルの免疫応答または防御的ワクチン化状態を生み出す。本発明に従う使用についての「有効なレベル」はまた、本発明の組成物が、ジドブジンもしくは他の公知の抗ウイルス性化合物またはこれらの組み合わせと組み合わせて使用される場合に、変動し得る。
【００７２】
当業者は、個々の患者において所望の「有効レベル」を達成するために、使用されている組成物の正確な処方のための適切な投与用量、投与スケジュール、および投与方法を容易に決定し得る。当業者はまた、適切な患者サンプル（例えば、血液および／または組織）のウイルス感染の、直接的なインジケーター（例えば、分析化学的分析）または間接的なインジケーター（例えば、ウイルス感染の代理のインジケーター（例えば、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患の処置のための、ｐ２４またはリバーストランスクリプターゼ））により、本発明の薬剤の「有効レベル」の適切なインジケーターを、容易に決定し、そして使用し得る。
【００７３】
さらに、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患の処置のための、患者における有効レベルを決定する工程に関して、適切な動物モデルが利用可能であり、そしてＨＩＶに対する種々の免疫源のインビボでの効力を評価するために広く実施されている。他のウイルスおよび感染性因子についての類似のモデルもまた、当業者に公知である。このモデルとしては、マウス、サル、およびネコが挙げられる。これらの動物のいくつかは、天然にはＨＩＶ疾患に感受性ではないが、ヒト抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ節、胎児の肝臓／胸腺または他の組織が再形成したキメラマウスモデル（例えば、ＳＣＩＤ、ｂｇ／ｎｕ／ｘｉｄ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ−ｈｕ、免疫応答性ＳＣＩＤ−ｈｕ、骨髄剥離ＢＡＬＢ／ｃ）は、ベクターまたはＨＩＶで感染され得、そしてＨＩＶの病因および遺伝子治療のためのモデルとして使用される。同様に、シミアン免疫欠損ウイルス（ＳＩＶ）／サルのモデルが、使用され得、同様にネコの免疫欠損ウイルス（ＦＩＶ）／ネコのモデルが使用され得る。
【００７４】
さらに、特に、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患の処置についての、患者における有効レベルを決定する工程に関して、適切な動物モデルが、利用可能であり、そして種々の免疫源のＨＩＶに対するインビボでの効力を評価するために実行されている。他のウイルスまたは感染因子についての類似のモデルはまた、当業者に公知である。これらのモデルはまた、臨床試験のために、上記ベクター系の確証の目的で、ベクターの安全性を決定するために使用され得る。重要な適用は、生態分布研究のためのこれらの動物モデルの使用である。形質導入された細胞（好ましくは、ベクターを含むヒトの細胞であるが、これに限定されない）は、非ヒト動物モデルへと注入され、そしてこのベクターの分布の程度は、動物組織におけるベクター遺伝性物質の存在により決定される。ベクター遺伝的物質が動物組織に存在しないことは、そのベクターが自律的に複製せず、そして他の細胞へも伝播せず、従って、本発明に従って使用され得ることを意味する。他の細胞にベクターが存在することは、このベクターが、元の細胞を超えて伝播し得たことを示唆する。しかし、このベクターが自律的に複製する際には、このベクターは、安全性に関する他の基準（例えば、特定の組織における複製の欠如、または動物における複製レベルであるが、これらに限定されない）に従って評価され得る。このベクターの存在または非存在は、ＰＣＲ、またはＦＡＣＳ分析（試験されるベクターがＦＡＣＳにより可視化され得るマーカー遺伝子を発現する場合）により決定され得るが、このような検出方法に限定されない。
【００７５】
一般的に、投与されるベクターまたは構築物が体重の約５μｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、特に、体重の約１０μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇである組織濃度を達成するのに十分なベクターの量が好まれる。用量の数は、送達の手段および投与される特定のベクターに依存して変動する。
【００７６】
いくつかのウイルス感染個体の処置において、「メガ−用量」レジメンを使用することが望ましくあり得、大用量のベクターが投与され、薬剤が作用するための時間が与えられ、次いで、適切な試薬が、活性因子を不活化するために、個体に投与される。本発明の方法においては、処置（すなわち、条件的に複製する構築物、または複製欠損型の構築物の投与）は、必然的に限定される。
【００７７】
薬学的組成物は、本発明に従うベクターまたは構築物と組み合わせた、他の製剤を含有する、治療上ＡＩＤＳを処置するために使用される、医薬の形態であり得る。これらの他の製剤は、従来的な様式（すなわち、疾患を処置するための薬剤として）で使用され得る。特に、アンチレトロウイルス因子（例えば、好ましくは、ジドブジン）が使用されることが企図される。以前に記載されたものに加えて使用され得るこれらのさらなる製剤のさらなる代表的な例としては、ＡＩＤＳを処置するために使用され得る、抗ウイルス性化合物、イムノモジュレーター、免疫賦活薬、抗生物質、および他の薬剤ならびに処置レジメン（代替的な医薬として認識されるものを含む）が挙げられる。抗ウイルス性化合物としては、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ガンシルクロビル（ｇａｎｃｙｌｃｌｏｖｉｒ）、フッ化ジデオキシヌクレオチド、非ヌクレオシドアナログ化合物（例えば、ネビラピン（Ｓｈｉｈら、ＰＮＡＳ，８８，９８７８〜９８８２（１９９１））、ＴＩＢＯ誘導体（例えば、Ｒ８２９１３）（Ｗｈｉｔｅら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，２５７〜２６６（１９９１））、ＢＩ−ＲＪ−７０（Ｓｈｉｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，９０（補遺４Ａ）、８Ｓ−１７Ｓ（１９９１））、および上に記載のように、当業者に公知の試薬およびレジメンが挙げられるが、これらに限定されない。イムノモジュレーターおよび免疫賦活薬としては、種々のインターロイキン、ＣＤ４、サイトカイン、抗体調製、血液の輸血、細胞輸血（ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。抗生物質としては、抗菌因子、抗細菌因子、および抗ニューモシスティスカリニ因子が挙げられる。
【００７８】
他の抗レトロウイルス因子、および特に、公知のＲＴインヒビター（例えば、ｄｄＣ、ジドブリジン、ｄｄＩ、ｄｄＡ、または他のＨＩＶタンパク質に対して作用する他の阻害剤（例えば、抗ＴＡＴ因子）とのウイルス阻害化合物の投与は、一般的に、ウイルスのライフサイクルの複製段階のほとんどまたはすべてを阻害する。ＡＩＤＳ患者またはＡＲＣ患者において使用されるｄｄＣおよびジドブジンの投薬量が公開されている。ｄｄＣのウイルス増殖を抑制する範囲は、一般的には、０．０５μＭと１．０μＭとの間である。約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲は、ほとんどの患者においてウイルス増殖を抑制する。経口投与のための用量範囲は、例えば、２時間、４時間、６時間、８時間、および１２時間の間隔での１回以上の用量で与えられる場合、０．００１〜０．２５ｍｇ／ｋｇより幾分広い。好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重のｄｄＣが８時間ごとに与えられる。併用療法において与えられた場合、もう一方の抗ウイルス化合物は、例えば、本発明に従うベクターと同時に与えられ得るか、または投薬量は所望のように変動（ｓｔａｇｇｅｒ）され得る。このベクターはまた、組成物中で合わされ得る。各用量は、組み合わせて使用される場合、いずれか単独で使用されるより少ない量であり得る。
【００７９】
また、本発明により提供されるのは、コンポーネント（例えば、本明細書中に開示される方法での実行中に使用するための本発明のベクター）を含むキットであり、このようなキットは、容器を含み得、各容器は、この方法で使用される種々の試薬（代表的には、濃縮された形態）を（例えば、必要な場合には緩衝液および試薬を含む）一種以上含む。
本発明の方法におけるキットのコンポーネントを記載するラベルもしくはインジケーター、またはこれらを使用するための一連の取扱説明書はまた、代表的には、取扱説明書が包装挿入物および／またはキットもしくはその構成要素の箱に関連する場所に含まれ得る。
【００８０】
本発明のベクターベースの戦略は、性質が理解しにくい特定の病原体（例えば、ＨＩＶ）に対して、特に有益であり、そしてより効果的であることが予想される。しかし、本発明は、他の感染性疾患に対して、等しい有効性で容易に適用され得る。非限定的な例として、ヒトの集団に対する最近のＳＡＲＳの脅威を考慮し得る。一度ＳＡＲＳウイルスが配列決定され、同定されれば、このウイルスの遺伝的エレメントは、容易に本発明のベクター（例えば、Ｔｏｔｉ−Ｖａｃ，条件的に複製するベクター、複数抗原発現ベクター、またはこれらの組み合わせ）中へと遺伝子操作され得る。本発明により提供される利点は、拡張的な研究も新興の各疾患についての開発も必要とせずに、新興の各疾患により提示される抗原に対して強度の細胞性応答および体液性応答を確実に惹起し得るワクチンの産生である。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例は、当業者に完全な開示および本発明の製造方法および使用方法の記載を提供するために提案され、そして発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定するものではなく、発明者らは、以下の実験が遂行されたすべての実験であり、遂行された実験はこれらだけであることを示すことを意図するものではない。使用された数（例えば、量、温度など）に関して、正確さを保証するための努力がなされているが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されなければ、部分は、重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は、セルシウス温度であり、そして圧力は、大気圧またはその周辺である。
【００８２】
（実施例  細胞培養物におけるワクチンＨＩＶ−ベースのベクターの伝播）
条件的に複製するＨＩＶベースのベクターが、培養物中でお互いに補完し、そして限定された期間に伝播する能力を調査した。第一のベクターは、複製に必要なすべてのタンパク質を含むＨＩＶ−ベースのベクターであるが、エンベロープタンパク質を欠損していた。第二のベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）からのエンベロープタンパク質を発現した。プラスミドを用いて、１５００ｍｍのディッシュ上の１２×１０６個の細胞（２９３Ｆ細胞）を、それぞれ２５μｇおよび２０μｇでコトランスフェクトした。
トランスフェクションの２４時間後、上清を収集し、アリコートし、そして使用するまで−８０℃で貯蔵した。上清を、培地中で５倍、１０倍、５０倍、１００倍、および１０００倍に希釈し、そして６−ウェルプレート中で１×１０６ＨｅＬａ−ｔａｔ細胞に添加した（これを対にした）。希釈を増加した場合の両ベクター構築物の用途を用いて、細胞におけるコインフェクションが、図１に示されるように、他の細胞に感染し得る子孫ベクターの産生をもたらすことを示した。このような子孫ベクターは、インビボでの免疫応答を惹起するのに寄与した。
【００８３】
ウイルスの伝播を、ビリオン産生の測定として、細胞上清についてｐ２４  ＥＬＩＳＡ（ＡＢＩ  Ｌａｂｓ、Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ  ＭＤ）により測定した。ビリオン産生の用量依存的レベルを測定し、そして補完の最終的な減少が生じた（図５）。従って、予想通り、このベクターは、一定期間複製し、その後、２種のベクター構築物のうちの１種を含む細胞に関して、複製周期を終了した。これは、図１に示されており、そして利点が付加されるか、または、本発明に重要な安全特徴を提供する。
【００８４】
ベクターの伝播の終結は、生成される免疫応答のレベルに無関係に、このベクターが、複製を続けないことを示唆する。従って、このベクターは、防御的免疫応答（免疫）の生成または防御的免疫応答の未生成のいずれかの後、このベクターの蔓延は続かない。防御的免疫応答（すなわち、成功したワクチン接種）の生成は、公知のアッセイ（細胞性および抗体についてのインビトロのアッセイ、ならびに疾患の動物モデル（例えば、ＨＩＶに標的化した治療法に対するサル）が挙げられるが、これらに限定されない）により試験され得る。
【００８５】
ベクターの伝播の終結に続いて、そして当業者により必要であると思われる場合、ベクターの増殖は、ベクターの組み合わせの反復使用により再活性化され得る。あるいは、再活性化は、個々のベクターの使用によるものであり得る。必要に応じて、ビリオンの形態で、もともと使用されているベクターのどれか一種を含む細胞に重複感染する。非限定的な例として、そして第一のベクターがすべて必要な成分（第二のベクターにより提供されるウイルスエンベロープタンパク質を除く）を有する場合、第二のベクターは、上記エンベロープタンパク質を発現し得、ウイルス粒子へとパッケージングされ、次いで、２種のベクターの伝播が停止している被験体の細胞へと導入され得る。第二のベクターを含むウイルス粒子による、第一のベクターのみを含む細胞の感染は、上記２種のベクターがさらに免疫応答を誘導またはブーストする。当然、この再活性化は、上で議論され、そして観察されたのと類似の様式で伝播の程度を制限される。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、そしてベクターエレメント（例えば、ビリオン粒子上に見出されるもの）に対して免疫応答が処置された被験体中で生成される状況に立ち向かうために、異なるビリオン粒子の使用が、使用され得る。従って、ベクターの伝播を再活性化するかまたは「ブースト」するために使用される、第二のベクターに関する上記非限定的な例は、第二のベクターが異なる抗原を提示するウイルス粒子へとパッケージングされるように修飾され得る。例えば、第二のベクターが、もともと、抗原Ａ、抗原Ｂおよび抗原Ｃを再活性化のために提示する粒子へのパッケージングを介して使用される場合、同一のベクターが、抗原Ｄ、抗原Ｅ、抗原Ｆを提示する粒子へとパッケージングされ、被験体における免疫応答を回避し得る。
【００８７】
本明細書中に引用されるすべての参考文献（特許、特許出願、および刊行物）は、以前に具体的に援用されていようがされていなかろうが、本明細書中に参考としてその全体が援用される。
【００８８】
本発明を十分に記載したので、同一発明が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、そして過度の実験なしに、等価のパラメーター、濃度、および条件の広汎な範囲内で行われ得ることは、当業者により理解される。
【００８９】
本発明が特定の実施形態と組み合わせて記載される一方、さらなる改変がなされ得る。本願は、一般に、本発明（本発明に関する技術の範囲内の、公知または慣用的な業務の範囲内にある、本開示からのこのような逸脱、および本明細書中に記載される本質的な特徴に応用され得るような、本開示からのこのような逸脱を含む）の原理に従う、本発明の任意のバリエーション、使用、または順応を網羅することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、相補的、複製欠損型ベクターを使用する本発明の戦略の表示としての一つの実施形態の図を示す。工程１：Ｔ細胞へのベクターの静脈送達；細胞内での第一段階の感染。工程２：第一段階のベクターの産生；アンチセンス安全特徴により抑制される共パッケージングベクター。工程３：Ｔ細胞内への第二段階の感染；共感染は、第二段階のベクターの産生をもたらす。工程４：免疫媒介性クリアランスまでの細胞内へのベクター感染の伝播。
【図２】図２は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いた本発明の戦略の戦略として、一つの実施形態の図を示す。
【図３】図３は、ＶＬＰを生み出すための複製欠損型ＨＩＶベクターのゲノムを包含する本発明の一つの実施形態を示す。特徴：復帰変異体を防止するために、すべてのエピトープは、かなり大きな欠失により不完全である。エピトープは、ウイルスゲノムにおけるもともとの配置から発現される。Ｅ  ＧＰは、ＲＴおよびＩＮが欠損しているが、出芽可能なウイルス様粒子を組み立て得る。Ｅ  ｖｉｆ−Ｖｐｒは、保存的なエピトープを含む。Ｅ  ｔａｔは、免疫原性でないＴＡＲに関して必要不可欠なＲ−ドメインを欠失する。Ｅ  ｅｎｖは、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間のプロテアーゼ切断部位を削除する。Ｅ  Ｎｅｆは、ＲＲ、Ｍｙｒ、ＮＢＰ−１、β−ＣＯＰ結合部位に欠失を含む。Ｒｅｖは、この系における唯一の機能的なウイルスタンパク質である。欠失ｃｉｓ−活性座：−ＴＡＲ、−Ψ、−ＰＢＳ、−ｃＰＰＴ、−ＰＰＴ。図３は、完全な複製欠損型ウイルスＤＮＡベクターを記載し、これは、以下の特徴を有する：単一のベクターでの多くのエピトープの提示、ならびにＭＨＣＩを介したＣＴＬに対する抗原（内因性エピトープ発現）の提示、ＭＨＣＩＩを介した抗体に対する抗原（ワクチン化細胞より放出されるウイルス様粒子、エピトープは、ネイティブな高次構造であり得る）の提示。
【図４】図４は、免疫応答を生み出すための複製欠損型ＨＩＶベクターおよびＶＬＰの使用を包含する、本発明の一つの実施形態を示す。
【図５】図５は、相補的な複製欠損型ＨＩＶ−ベースのベクターの系の細胞培養物中での伝播を示す。