【手続補正書】
【提出日】平成23年6月13日(2011.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒトにおける標的核酸から核酸をクローニングする方法であって、
（ａ）標的核酸をＰ２２ＨＴターミナーゼと接触させるステップと、
（ｂ）パッケージングを開始し、それによって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸がパッケージングされるステップと、
（ｃ）前記パッケージングされた核酸を単離するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記標的核酸がゲノム全体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パッケージングされた核酸がカプシド中にパッケージングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
パッケージングが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
パッケージングが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸が染色体ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸がベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｐ２２ＨＴターミナーゼが突然変異体Ｇｐ３タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｐ２２ＨＴターミナーゼがＨＴ１０５／１突然変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｐ２２ＨＴターミナーゼが野生型Ｐ２２ＨＴターミナーゼと比較して低い特異性でＤＮＡを認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｐ２２ＨＴターミナーゼがランダムな位置でＤＮＡに結合して切断する、請求項１０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
第１の核酸はまた、ベクターエレメントを含んでもよい。ベクターエレメントは、ＰＩＳの下流にあってもよく、クローニングされた核酸中に存在してもよい。ベクターエレメントは、低コピー複製開始点および高コピー複製開始点を含むが、これらに限定されない複製開始点であってもよい。ベクターエレメントはまた、高コピー複製開始点および低コピー複製開始点であってもよい。高コピー複製開始点は、複製誘発剤に応答性であってもよい。第１の核酸は、複製誘発剤をコードする核酸を含んでもよい。複製誘発剤は、ＴｒｆＡであってもよい。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
核酸を配列決定する方法であって、
（ａ）核酸を含むカプシドを提供するステップと、
（ｂ）前記核酸を単離するステップと、
（ｃ）前記核酸を配列決定するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記配列決定が、
（ａ）水性マイクロリアクターが、前記核酸の単一コピー、前記核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で前記水性マイクロリアクターの中に前記核酸を送達するステップと、
（ｂ）前記マイクロリアクター中で前記核酸を増幅して前記核酸の増幅コピーを形成し、前記マイクロリアクター中で前記増幅コピーを前記ビーズに結合させるステップと、
（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイに前記ビーズを送達するステップであって、複数の前記反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、
（ｄ）複数の前記反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ビーズが、少なくとも１０，０００個の増幅コピーに結合する、項目２に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって達成される、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記配列決定反応が、ピロリン酸ベースの配列決定反応である、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記配列決定反応が、
（ａ）有効量の配列決定プライマーを前記核酸の前記増幅コピーにアニールし、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて前記配列決定プライマーを伸長させて、配列決定産物、および前記所定のヌクレオチド三リン酸が前記配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合には配列決定反応副産物を得るステップと、
（ｂ）前記配列決定反応副産物を同定し、それによって、反応チャンバー中で前記核酸の配列を決定するステップと
を含む、項目２に記載の方法。
（項目７）
複数の核酸を配列決定する方法であって、
（ａ）それぞれが核酸を含む複数のカプシドを提供するステップと、
（ｂ）前記核酸を単離するステップと、
（ｃ）前記核酸を配列決定するステップと
を含む方法。
（項目８）
前記配列決定が、
（ａ）複数の水性マイクロリアクターが、核酸の単一コピー、前記核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で前記水性マイクロリアクターの中に前記核酸を送達するステップと、
（ｂ）前記マイクロリアクター中で前記核酸を増幅して前記核酸の増幅コピーを形成し、前記マイクロリアクター中で前記増幅コピーを前記ビーズに結合させるステップと、
（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイに前記ビーズを送達するステップであって、複数の前記反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、
（ｄ）複数の前記反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップと
を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ビーズが、少なくとも１０，０００個の増幅コピーに結合する、項目２に記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって達成される、項目２に記載の方法。
（項目１１）
前記配列決定反応が、ピロリン酸ベースの配列決定反応である、項目２に記載の方法。
（項目１２）
前記配列決定反応が、
（ａ）有効量の配列決定プライマーを前記核酸の前記増幅コピーにアニールし、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて前記配列決定プライマーを伸長させて、配列決定産物、および前記所定のヌクレオチド三リン酸が前記配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合には配列決定反応副産物を得るステップと、
（ｂ）前記配列決定反応副産物を同定し、それによって、反応チャンバー中で前記核酸の配列を決定するステップと
を含む、項目２に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｂ）における前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数のコロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、オリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であり、コロニープライマーＸが、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
２つの異なるコロニープライマーＸを、項目１３に記載のステップ（ａ）における前記核酸と混合し、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、前記コロニープライマーＸのうち１
つにハイブリダイズすることができ、前記オリゴヌクレオチドＹが、前記コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じである、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
１つまたは複数の前記核酸コロニーにおける前記核酸を配列決定するステップをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記配列決定するステップが、標識ヌクレオチドの取り込みおよび検出を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸コロニーを視覚化する追加のステップをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記視覚化ステップが、標識核酸プローブまたは非標識核酸プローブの使用を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、前記核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に共有結合で固定するための前記手段が、化学的に修飾された基である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、前記核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記化学的に修飾可能な官能基が、アミノ基である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
少なくとも１つの前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が固定される前記固体支持体が、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンおよびポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、ならびにシリコンウェーハからなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目２５）
前記固体支持体が、ガラスである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記固体支持体上の前記核酸コロニーの密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、項目１３に記載の方法。
（項目２７）
前記固体支持体に付着した前記コロニープライマーＸの密度が、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２である、項目１３に記載の方法。
（項目２８）
前記核酸の密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、項目１３に記載の方法。
（項目２９）
前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、項目１３に記載の方法。
（項目３０）
ステップ（ｂ）における前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数の縮重コロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、核酸鋳型および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目３１）
ステップ（ａ）の前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数のコロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップと
を含む、項目７に記載の方法。
（項目３３）
前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、オリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であり、コロニープライマーＸは、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
２つの異なるコロニープライマーＸを、項目３２に記載のステップ（ａ）における前記核酸と混合し、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、前記コロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズすることができ、前記オリゴヌクレオチドＹが、前記コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じである、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
核酸コロニーにおける前記核酸を配列決定するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記配列決定するステップが、標識ヌクレオチドの取り込みおよび検出を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記核酸コロニーを視覚化する追加のステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記視覚化ステップが、標識核酸プローブまたは非標識核酸プローブの使用を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
１つより多い核酸コロニー中に存在する前記核酸の完全なまたは部分的な配列が同時に決定される、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、項目３２に記載の方法。
（項目４１）
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に共有結合で固定するための前記手段が、化学的に修飾された基である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、前記核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記化学的に修飾可能な官能基が、アミノ基である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
少なくとも１つの前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が固定される前記固体支持体が、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンおよびポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、ならびにシリコンウェーハからなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目４５）
前記固体支持体が、ガラスである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記固体支持体上の前記核酸コロニーの密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、項目３２に記載の方法。
（項目４７）
前記固体支持体に付着した前記コロニープライマーＸの密度が、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２である、項目３２に記載の方法。
（項目４８）
それぞれの核酸の密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、項目３２に記載の方法。
（項目４９）
前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、項目３２に記載の方法。
（項目５０）
ステップ（ｂ）における前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数の縮重コロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライ
マーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で核酸増幅反応を行なうステップと
をさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目５１）
ステップ（ａ）の前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
標的核酸から核酸をクローニングする方法であって、
（ａ）標的核酸の中にパッケージング開始部位を導入するステップであって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸が、前記パッケージング開始部位の下流にあるステップと、
（ｂ）前記パッケージング開始部位でパッケージングを開始し、それによって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸がパッケージされるステップと、
（ｃ）前記パッケージされた核酸を単離するステップと
を含む、方法。
（項目５３）
前記パッケージング開始部位が、λ、Ｐ１、Ｐ７、またはＴ４パッケージング開始部位である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記標的核酸がベクターである、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記標的核酸が染色体ＤＮＡである、項目５２に記載の方法。
（項目５６）
前記標的核酸が全ゲノムである、項目５２に記載の方法。
（項目５７）
前記パッケージング開始部位が、前記核酸の中にランダムに導入される、項目５２に記載の方法。
（項目５８）
前記パッケージング開始部位が、前記標的核酸の中への第１の核酸の転位によって前記標的核酸の中に導入され、前記第１の核酸が、転位性末端および前記パッケージング開始部位を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５９）
前記転位性末端が、Ｔｎ７、Ｔｎ５、Ｔｎ１０、Ｍｕ、およびＭａｒｉｎｅｒからなる群から選択される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記パッケージング開始部位が、第１の核酸および前記標的核酸をライゲーションすることによって、前記標的核酸の中に導入され、前記第１の核酸が、前記パッケージング開始部位を含む、項目５２に記載の方法。
（項目６１）
前記パッケージされた核酸が、カプシド中にパッケージされる、項目５２に記載の方法。
（項目６２）
パッケージングが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生じる、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
パッケージングは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じる、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記第１の核酸が、組み込み部位をさらに含み、前記パッケージされた核酸が、前記組み込み部位を含む、項目５８または６０に記載の方法。
（項目６５）
相補的な組み込み部位でベクターの中に前記パッケージされた核酸を組み込むステップをさらに含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記第１の核酸の前記組み込み部位が、ａｔｔＢであり、前記ベクターの前記組み込み部位が、ａｔｔＰである、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
組み込みは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生じる、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
組み込みは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じる、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記第１の核酸が、複製開始点を含む、項目５８または６０に記載の方法。
（項目７０）
前記複製開始点が、低コピー複製開始点である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記複製開始点が、高コピー複製開始点である、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記第１の核酸が、低コピー複製開始点および高コピー複製開始点を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
前記高コピー複製開始点が、複製誘発剤に条件付きで応答性である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記第１の核酸が、前記複製誘発剤をコードする核酸をさらに含む、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記複製誘発剤が、ＴｒｆＡである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
項目５６に記載の方法に従ってゲノムから複数の核酸をクローニングするステップを含む、ゲノムライブラリーを産生する方法。
（項目７７）
標的核酸から核酸をクローニングする方法であって、
（ａ）標的核酸をＰ２２ＨＴターミナーゼと接触させるステップと、
（ｂ）パッケージングを開始し、それによって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸がパッケージされるステップと、
（ｃ）前記パッケージされた核酸を単離するステップと
を含む方法。
（項目７８）
前記標的核酸が全ゲノムである、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記パッケージされた核酸がカプシド中にパッケージされる、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
パッケージングが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生じる、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
パッケージングが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じる、項目７９に記載の方法。