【手続補正書】
【提出日】平成22年12月1日(2010.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対称的に分裂している神経幹細胞のトランスフェクトされた集団を得てこれを維持する方法であって、
（ａ）選択マーカーＡをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程であって、該選択マーカーＡが、神経幹細胞特異的プロモーターの制御下で発現され得る、工程；
（ｂ）該ＥＳ細胞の神経幹細胞への分化を促進する工程；
（ｃ）該選択マーカーＡを発現する細胞について選択する工程であって、該選択された細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該選択された細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、工程；および
（ｄ）基材に付着した該選択された細胞を、
（ｉ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および
（ii）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記選択マーカーＡが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経幹細胞特異的プロモーターが、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、およびＢＬＢＰからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法の工程が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の順に実施される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）により調製された前記選択された細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）により調製された前記選択された細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターが、ＥＧＦレセプターのアゴニストである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記アゴニストが、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、エピレグリン、ベータセルリン、ニューレグリン１、２、３もしくは４、およびＣｒｉｐｔｏ−１からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターが、ＦＧＦレセプターのアゴニストである、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記アゴニストが、ＦＧＦ−２である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法により得られ得る神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、集団。
【請求項１２】
前記集団中の神経幹細胞が、それらがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、およびＢＬＢＰの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項１１に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１３】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項１２に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１４】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項１２または１３に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１５】
前記集団中の神経幹細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である、請求項１１から１４のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１６】
前記集団中の神経幹細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または前記神経幹細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項１１から１５のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１７】
神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、集団。
【請求項１８】
神経幹細胞を調製する方法であって、
請求項１から１０のいずれかに記載の方法に従って神経幹細胞を培養し、それによって神経幹細胞の培養物を得る工程、および
該培養物から神経幹細胞を単離する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法により得られ得る神経幹細胞。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法により得られ得る神経幹細胞であって、該細胞が、それがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、およびＢＬＢＰの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、神経幹細胞。
【請求項２１】
前記細胞がさらに、それが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項２０に記載の神経幹細胞。
【請求項２２】
前記細胞がさらに、それが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項２０または２１に記載の神経幹細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である、請求項１９から２２のいずれかに記載の神経幹細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または前記細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項１９から２３のいずれかに記載の神経幹細胞。
【請求項２５】
神経幹細胞株を樹立する方法であって、
（ａ）単一の神経幹細胞を得る工程、
（ｂ）請求項１から１０のいずれかに記載の方法の工程（ｄ）に従って該神経幹細胞を培養する工程
を含み、
それによって神経幹細胞の集団を得る、方法。
【請求項２６】
前記神経幹細胞の集団が、クローン集団であり、そして該細胞の全てが、単一の神経幹細胞の子孫である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記単一の神経幹細胞が、請求項１８に記載の方法に従って得られる、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２５から２７のいずれかに記載の方法によって得られ得る細胞株であって、該細胞が、それらがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、Ｓｏｘ−２、およびＢＬＢＰの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、細胞株。
【請求項２９】
前記細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項２８に記載の細胞株。
【請求項３０】
前記細胞がさらに、それらが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項２８または２９に記載の細胞株。
【請求項３１】
前記細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である、請求項２８から３０のいずれかに記載の細胞株。
【請求項３２】
前記細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、請求項２８から３１のいずれかに記載の細胞株。
【請求項３３】
前記細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または前記細胞が、不死化細胞ではない、請求項２８から３２のいずれかに記載の細胞株。
【請求項３４】
神経変性疾患および脳損傷の治療用調製物の製造のための、請求項１１から１７に記載の集団、請求項２８から３３に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項１９から２４に記載の単一の神経幹細胞の使用。
【請求項３５】
神経変性疾患および脳損傷の治療方法であって、請求項１１から１７に記載の集団、請求項２８から３３に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項１９から２４に記載の単一の神経幹細胞の患者への移植を含む、方法。
【請求項３６】
請求項１１から１７に記載の集団、請求項２８から３３に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項１９から２４に記載の単一の神経幹細胞をトランスフェクトする方法であって、
（ａ）選択マーカーＢをコードする構築物で該神経幹細胞をトランスフェクトする工程であって、該選択マーカーＢが、組織特異的プロモーターの制御下で発現され得る、工程；および
（ｂ）該選択マーカーＢを発現する神経幹細胞について選択する工程
を含む、方法。
【請求項３７】
前記選択マーカーＢが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１１から１７に記載の集団、請求項２８から３３に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項１９から２４に記載の単一の神経幹細胞であって、選択マーカーＢをさらに含む、細胞。
【請求項３９】
核再プログラミング方法であって、ドナー核が、請求項１９から２４のいずれかに記載の神経幹細胞または請求項１から１０、１８、もしくは２５から２７のいずれかに記載の方法に従って得られた細胞に由来する、方法。
【請求項４０】
核再プログラミング方法であって、
ドナー細胞の核をレシピエント細胞に移入する工程であって、該ドナー細胞が、（ｉ）請求項１９から２４のいずれかに記載の神経幹細胞、または、（ii）請求項１から１０、１８、もしくは２５から２７のいずれかに記載の方法に従って得られた細胞である、工程；および
該細胞を培養して該ドナー細胞の核を再プログラミングし、それによって再プログラミングされた細胞を得る工程
を含む、方法。
【請求項４１】
必要に応じて前記ドナー細胞の核の移入前におよび必要に応じて該ドナー細胞の核の移入後に、前記レシピエント細胞の核を除去する工程を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ドナー細胞の核を遺伝子操作する工程を含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
疾患原因遺伝子配列または推定疾患原因遺伝子配列を前記ドナー細胞の核に導入する工程を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、
前記再プログラミングされた細胞を培養して該再プログラミングされた細胞に由来する複数の細胞を得る工程；および
アッセイに該複数の細胞を用いる工程
を含む、方法。
【請求項４５】
請求項４０から４４のいずれかに記載の方法であって、
前記再プログラミングされた細胞に由来する組織を含む非ヒト動物を得る工程；および
該組織を用いてアッセイを実施する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
前記レシピエント細胞が非ヒト卵母細胞である、請求項４０から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
細胞を再プログラミングする方法であって、
細胞の混合集団から、請求項１９から２４のいずれかに記載の細胞を単離する工程；および
該単離された細胞の核をレシピエント細胞に移入する工程
を含む、方法。
【請求項４８】
前記単離された細胞を、その核を前記レシピエント細胞に移入する前に遺伝子操作する工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４７または４８に記載の方法であって、
前記単離された細胞を培養して細胞のクローン集団を得る工程；および
該集団中の１つの細胞の核を前記レシピエント細胞に移入する工程
を含む、方法。
【請求項５０】
非ヒト動物をクローン化する方法であって
（ｉ）該非ヒト動物から神経幹細胞を得る工程；
（ii）該非ヒト動物と同じ種の卵母細胞を得る工程；
（iii）該神経幹細胞の核を該卵母細胞に移入する工程；
（iv）（iii）で得られた細胞を該同じ種の雌に移植する工程
を含み、該神経幹細胞が、請求項１９から２４のいずれかに記載の神経幹細胞または請求項１から１０、１８、もしくは２５から２７のいずれかに記載の方法に従って得られた細胞である、方法。
【請求項５１】
ニューロンを得る方法であって、（ａ）ＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下でかつＥＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、神経幹細胞を培養する工程；および（ｂ）その後、ＦＧＦレセプターのアゴニストの不在下でかつＥＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、該細胞を培養する工程を含み、該神経幹細胞が、請求項１から１０、１８、もしくは２５から２７のいずれかに記載の方法に従って得られる、方法。
【請求項５２】
単層培養に細胞を播種する工程を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＥＧＦを含まないがＦＧＦ−２を含む培地にＮＳ細胞を移す工程、および少なくとも２日間それらを培養する工程、および次いで該培地からＦＧＦ−２を除去する工程を含む、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、集団。
【請求項５５】
前記細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項５４に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項５６】
前記細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項５４に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項５７】
細胞が、ＥＧＦファミリーのレセプターのアゴニスト、およびＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下で維持され、該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、細胞株。
【請求項５８】
前記細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項５７に記載の細胞株。
【請求項５９】
前記細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項５７に記載の細胞株。
【請求項６０】
神経幹細胞を含む組成物であって、該神経幹細胞が接着培養中にあり、該組成物中の該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、組成物。
【請求項６１】
前記細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
神経幹細胞を含む組成物であって、該組成物中の該細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、組成物。