【手続補正書】
【提出日】平成23年6月7日(2011.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【図１Ａ】セリン残基のスティック表現（stick representative）を有する野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールを示す。
【図１Ｂ】２次構造構成におけるＦｎ３のアミノ酸配列（配列番号１０３）を示す。ベータ鎖の残基は白丸として示す。側鎖が疎水性コアを形成する残基は太線に含まれる。ループ残基は斜線で示す。矢印はＦｎ３が分離して相補的フラグメントを生じるループの位置を示す。
【図２】修飾に利用可能であると提案したセリン残基（Ｓｅｒ １７−Ｓｅｒ ２１−Ｓｅｒ ４３−Ｓｅｒ ６０−Ｓｅｒ ８９）を有する野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールを示す。
【図３】野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールの３個のストランドシート（鎖Ａ−Ｂ−Ｅ）を示す。シートの下部に候補残基Ｓｅｒ １７およびＳｅｒ ６０が位置する。候補残基Ｓｅｒ ２１は上部に位置する。Ｓｅｒ ５５は結合表面に近いため、除外している。他の潜在的候補残基、すなわちＶａＩ １１、Ｌｅｕ １９およびＴｈｒ ５８が示されている。
【図４】野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールの４個のストランドシートを示す（足場の他の面）Ｔｈｒ ７１はＳｅｒ ８９の近くに位置し、修飾の潜在的候補でもある。
【図５】野生型フィブロネクチン分子の第１０タイプＩＩＩモジュールのＦＧおよびＣＤループを示す。
【図６Ａ】フィブロネクチンベースの結合分子キメラを作成するための野生型フィブロネクチン分子の第７、８、９および１０タイプＩＩＩモジュールのベータ鎖の多様な組合せを示す（ベータ鎖スワッピング）。
【図６Ｂ】フィブロネクチンベースの結合分子キメラを作成するための野生型フィブロネクチン分子の第７、８、９および１０タイプＩＩＩモジュールのベータ鎖の多様な組合せを示す（ベータ鎖スワッピング）。
【図７Ａ】例示的標的に関する情報を提供する。
【図７Ｂ】例示的標的に関する情報を提供する。
【図７Ｃ】例示的標的に関する情報を提供する。
【図８】還元剤なしでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）および野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）＿ｃｙｓ（図８ａ）、ならびに還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）＿３０ｋＤａ  ＰＥＧ（図８ｂ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図９】大腸菌発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）のＰＫ（薬物動態）を示す。
【図１０】大腸菌発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＰＥＧのＰＫ（薬物動態）を示す。
【図１１】WinNonLin ソフトウェアで分析した、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）および野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＰＥＧの計算上の半減期を示す。
【図１２】還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＲＳＡ（図１２ａ）および還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＨＳＡ（図１２ｂ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図１３】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＲＳＡのＰＫを示す。
【図１４】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＨＳＡのＰＫを示す。
【図１５】WinNonLin ソフトウェアで分析した、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）ならびに野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＲＳＡおよびＨＳＡの計算上の半減期を示す。
【図１６】還元剤ありでのＶＥＧＦＲ １０Ｆｎ３バインダー−ＲＳＡ（図１６ａ）および還元剤ありでのＶＥＧＦＲ １０Ｆｎ３バインダー−ＨＳＡ（図１６ｂ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図１７】ＶＥＧＦＲ １０Ｆｎ３バインダー−ＨＳＡおよびＲＳＡによるＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１８】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおけるＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３のＰＫを示す。
【図１９】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおけるＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＲＳＡのＰＫを示す。
【図２０】WinNonLin ソフトウェアで分析した、ＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＨＳＡおよびＶＥＧＦＲ結合Ｆｎ３−ＨＳＡの計算上の半減期を示す。
【図２１】還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−抗ＲＳＡのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２２】大腸菌発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−抗ＲＳＡのＰＫを示す。
【図２３】WinNonLin ソフトウェアで分析した、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）および野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−抗ＨＳＡの計算上の半減期を示す。
【図２４】還元剤ありでの野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）ＦｃのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２５】哺乳類発現系を用いたＬｅｗｉｓラットにおける野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−ＦｃのＰＫを示す。
【図２６】WinNonLinソフトウェアで分析した、野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）および野生型１０Ｆｎ３（ＲＧＤからＲＧＡ）−Ｆｃの計算上の半減期を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
（ｉ）抗ＨＳＡ、抗ＭＳＡまたは抗ＲＳＡ融合分子
抗ＨＳＡバインダー（配列番号１２）または抗ＭＳＡバインダー（配列番号１３）のＤＮＡ配列を、大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｄｓｂＡシグナル配列を有するｐＱＥ−８０Ｌに得られたＤＮＡフラグメントをライゲートした（適切な隣接ＤＮＡ配列を加えた）。ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列（配列番号３および配列番号４）および野生型Ｆｎ３配列（配列番号１および配列番号２）に対応するＤＮＡ配列を、大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。ＴＮＦ結合Ｆｎ３配列（配列番号３および配列番号４）について、プライマー３（配列番号１８）および４（配列番号１９）を用いて、野生型Ｆｎ３配列（配列番号１および配列番号２）について、プライマー３（配列番号１８）および５（配列番号２０）を用いて得られたＤＮＡフラグメントフラグメントを増幅して、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ｐＱＥ−８０Ｌ−ｄｓｂＡ−抗ＨＳＡまたはｐＱＥ−８０Ｌ−ｄｓｂＡ−抗ＭＳＡのＢａｍＨＩ部位にをライゲートした。野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＧＳリンカー−抗ＲＳＡ  Ｈｉｓ（配列番号９２）は、ｐＱＥ−８０Ｌ中の野生型Ｆｎ３（ＲＧＤ→ＲＧＡ）−ＧＳリンカー−抗ＭＳＡ  Ｈｉｓ（配列番号７１）から部位特異的突然変異誘発によって作成した。ＩＫＨＬＫ（配列番号１０４）からＳＳＹＬＮ（配列番号１０５）への第一の突然変異誘発は、プライマー２０（配列番号８０）および２１（配列番号８１）で実施し；ＧＡＳＲ（配列番号１０６）からＲＮＳＰ（配列番号１０７）への第二の突然変異誘発は、プライマー２２（配列番号８２）および２３（配列番号８３）で実施し；そしてＧＡＲＷＰＱ（配列番号１０８）からＴＹＲＶＰＰ（配列番号１０９）への第三の突然変異誘発は、プライマー２４（配列番号８４）および２５（配列番号８５）を用いて実施した。