【手続補正書】
【提出日】平成22年3月19日(2010.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において結腸直腸細胞増殖性疾患を検出および／または分類する方法であって、前記対象から単離した生物学的試料中のセプチン９および／またはＡＬＸ４の発現レベルを決定するステップを含み、低発現および／またはＣｐＧメチル化が前癌性結腸直腸細胞増殖性疾患の存在の表示である、対象において結腸直腸細胞増殖性疾患を検出および／または分類する方法。
【請求項２】
悪性または前悪性細胞増殖性疾患と良性細胞増殖性疾患とを識別する方法であって、低発現および／またはＣｐＧメチル化の存在が悪性または前悪性細胞増殖性疾患の存在を示し、かつそれらが存在しないことが良性細胞増殖性疾患の存在を示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現レベルが、前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在、非存在またはレベルを検出することによって決定される、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記発現レベルが、前記遺伝子またはその配列によってコードされたポリペプチドの存在、非存在またはレベルを検出することによって決定される、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ウエスタンブロット分析、クロマトグラフィー、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、抗体、およびそれらの組合せを含む群から選択された一つ以上の手段によって検出される、請求項４に記載の方法。 
【請求項６】
前記発現が、前記遺伝子内のＣｐＧメチル化の存在または非存在を検出することによって決定され、メチル化の存在によって細胞増殖性疾患の存在が示される、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
対象において細胞増殖性疾患を検出および／または分類する方法であって、
前記対象から得た生物学的試料から単離したゲノムＤＮＡを、少なくとも一種の試薬または一連の試薬であって、前記ゲノムＤＮＡの少なくとも一個の標的領域内で、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドとメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドとを識別する試薬と接触させるステップを含む方法において、
その際、前記標的領域が、それぞれ配列番号１〜配列番号２からなる群から選択された少なくとも一配列の、少なくとも１６個の近接ヌクレオチド配列を含み、またはストリンジェントな条件下でこの配列とハイブリダイズし、
前記近接ヌクレオチドは、少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、
それによって結腸直腸細胞増殖性疾患の検出および／または分類が少なくとも部分的に可能になる方法。
【請求項８】
結腸直腸細胞増殖性疾患を検出かつ／または分類する方法であって、
ａ）該対象から得た生物学的試料からゲノムＤＮＡを抽出し、またはそうでなければ単離するステップ、
ｂ）その５位置のメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシル、またはハイブリダイゼーション特性の点で検出可能にシトシンとは異なる別の塩基に転換する一種以上の試薬で、ａ）の該ゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントを処理するステップ、
ｃ）該処理済みゲノムＤＮＡまたは該処理済みフラグメントを、増幅酵素および配列番号３〜配列番号１０およびその相補鎖からなる群から選択された配列と、相補的であり、またはややストリンジェントもしくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチドの隣接配列を含む少なくとも一個のプライマーと接触させるステップであって、その際、該処理済みゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントが、増幅されて少なくとも一個の増幅物を生成しているか、または増幅されていないステップ、および
ｄ）前記増幅物の存在または非存在または特性に基づき、配列番号１〜配列番号２からなる群から選択された配列の少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態もしくはレベル、または配列番号１〜配列番号２からなる群から選択された配列の複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態もしくはレベルの平均もしくは平均を反映する値を決定し、それによって結腸直腸細胞増殖性疾患の検出および分類の少なくとも一つが、少なくとも部分的に可能になるステップ
を含む方法。
【請求項９】
ｂ）のゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントの処理が、重亜硫酸塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩、およびそれらの組合せを含む群から選択された試薬の使用を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｃ）の接触または増幅ステップが、該増幅酵素として耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用；５'−３'エクソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼの使用；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用；検出可能標識を担持する増幅物核酸分子の発生；を含む群から選択された少なくとも一方法の使用を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該対象から得た該生物学的試料が、細胞系、組織切片、生検試料、パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸流出液、尿、血漿、血清、全血、単離血液細胞、血液から単離した細胞、およびそれらの組合せを含む群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
さらに、ステップｄ）で、いずれの場合にも、配列番号３〜配列番号１０およびその相補鎖からなる群から選択された配列と、相補的であり、またはややストリンジェントもしくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の隣接配列を含む、少なくとも一個の核酸分子もしくはペプチド核酸分子を使用するステップであって、前記核酸分子もしくはペプチド核酸分子が、ハイブリダイズする核酸の増幅を抑制するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｄ）の決定で、いずれの場合にも、配列番号３〜配列番号１０およびその相補鎖からなる群から選択された配列と、相補的であり、またはややストリンジェントもしくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の隣接配列を含む、少なくとも一個の核酸分子もしくはペプチド核酸分子のハイブリダイゼーションが含まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも一個のそのようなハイブリダイズする核酸分子またはペプチド核酸分子が固相に結合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一個のヌクレオチド塩基によって、少なくとも一個のそのようなハイブリダイズする核酸分子を伸展するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ｄ）での決定が、該増幅物のシーケンシングを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ｃ）での接触または増幅ステップが、メチル化特異的プライマーの使用を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
結腸直腸細胞増殖性疾患を検出および／または分類する方法であって、
ａ）該対象から得た生物学的試料からゲノムＤＮＡを抽出し、またはそうでなければ単離するステップ、
ｂ）一種以上のメチル化感受性制限酵素で、ａ）の該ゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントを消化し、ｂ）のＤＮＡ制限酵素消化産物を、増幅酵素、および配列番号１〜３から選択された配列の、少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチドを含む配列の増幅に適切な、少なくとも２個のプライマーと接触させるステップ、および
ｃ）増幅物の存在または非存在に基づき、配列番号１〜配列番号２からなる群から選択された配列の少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを決定し、それによって細胞増殖性疾患の検出および分類の少なくとも一つが、少なくとも部分的に可能になるステップ
を含む方法。
【請求項１９】
増幅物の存在または非存在が、配列番号１〜配列番号２から選択された配列の少なくとも１６塩基長のセグメントと、同一であり、相補的であり、またはストリンジェントもしくは非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも一個の核酸またはペプチド核酸とのハイブリダイゼーションによって決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
当該処理が、そのゲノムＤＮＡ配列の少なくとも一個のメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシルまたはハイブリダイゼーションの点でシトシンとは検出可能に異なる別の塩基に転換するのに適している、ゲノム配列番号１〜配列番号２に由来する処理済み核酸。
【請求項２１】
当該処理が、そのゲノムＤＮＡ配列の少なくとも一個のメチル化されていないシトシン塩基を、ウラシルまたはハイブリダイゼーションの点でシトシンとは検出可能に異なる別の塩基に転換するのに適している、配列番号３〜配列番号１０およびその相補配列からなる群から選択された処理済みゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１６個の近接ヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２２】
配列番号３〜配列番号１０およびその相補配列からなる群から選択されたＤＮＡ配列の少なくとも５０個の近接ヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２３】
診断手段として、配列番号３〜配列番号１０およびその相補配列からなる群から選択された処理済みゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１６個の近接ヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２４】
該近接ヌクレオチド配列が、少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＧ、またはＣｐＡジヌクレオチド配列を含む、請求項２２又は２３のいずれかに記載の核酸。
【請求項２５】
請求項３に記載の方法を実施するのに適切なキットであって、ａ）ストリンジェントまたはややストリンジェントな条件下で、セプチン９および／またはＡＬＸ４遺伝子の転写産物とハイブリダイズすることが可能な複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、（ｂ）該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、および該転写産物を含む患者の生物学的試料を入れるのに適切な容器であって、ストリンジェントまたはややストリンジェントな条件下で、該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、該転写産物とハイブリダイズできる容器、（ｃ）（ｂ）のハイブリダイゼーションを検出する手段、および任意により、（ｄ）使用説明書および該キットの結果の解釈書を含むキット。
【請求項２６】
（ａ）セプチン９および／またはＡＬＸ４ポリペプチドを検出する手段、（ｂ）前記手段および該ポリペプチドを含む患者の該生物学的試料を入れるのに適切な容器であって、該手段によって、該ポリペプチドとの複合体が形成できる容器、（ｃ）  （ｂ）の該複合体を検出する手段、を含む請求項４に記載の方法を実施するのに適切なキット。
【請求項２７】
（ａ）重亜硫酸塩試薬、（ｂ）前記重亜硫酸塩試薬および患者の生物学的試料を入れるのに適切な容器、（ｃ）いずれの場合にも、その配列が、配列番号３〜配列番号１０から選択された配列の９塩基長またはより好ましくは１８塩基長のセグメントと、同一であり、相補的であり、またはストリンジェントもしくは非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２個のオリゴヌクレオチドを含む少なくとも一セットのオリゴヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法を実施するのに適切なキット。
【請求項２８】
（ａ）メチル化感受性制限酵素試薬、（ｂ）前記試薬および患者の生物学的試料を入れるのに適切な容器、（ｃ）配列番号１〜配列番号２から選択された配列の少なくとも９塩基長のセグメントと、同一であり、相補的であり、またはストリンジェントもしくは非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも一セットのオリゴヌクレオチド、一つ以上の核酸もしくはペプチド核酸、および場合によっては（ｄ）使用説明書および該キットの結果の解釈書を含む、請求項７に記載の方法を実施するのに適切なキット。
【請求項２９】
結腸直腸細胞増殖性疾患の診断および／または分類における、請求項１〜１９に記載の方法の使用、請求項２０〜２４に記載の核酸の使用、および／または請求項２５〜２８に記載のキットの使用。