【手続補正書】
【提出日】平成23年3月16日(2011.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
ｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳを含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体の機能解析
一般方法で述べられるようにして、プラスミドｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳをＹ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律性突然変異からのＦＯＡ抵抗性変異体）に形質転換した。形質転換体を上ＭＭプレートで選択した。３０℃で２日間の生育後、形質転換体を拾って新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。ひとたび成長したら、これらの株を個々に３ｍＬの液体ＭＭに３０℃で接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、５つの形質転換体全てにおいて総脂質の約２．２％のＣ２０：２（ＥＤＡ）および１５．３％のＣ１８：２（ＬＡ）が生成したことを示し、これらの５株中でのＣ１８：２からＣ２０：２への変換効率は約１３％と判定された。したがってこの実験データは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ（すなわち配列番号２６および２７に記載されるＥａＤ９ＥＳ）が、能動的にＬＡをＥＤＡに延長することを実証した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．（ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有して、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列と比較すると、アラインメントのブラストＮ法に基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列、
（ｃ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体
を含み、相補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチドを含む、微生物宿主細胞。
２．単離されたポリヌクレオチドが、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードする、上記１に記載の微生物宿主細胞。
３．酵母、藻類、細菌、ユーグレナ類、ストラメノパイル、および真菌からなる群から選択される、上記１に記載の微生物宿主細胞。
４．細胞がクサレケカビ属の真菌である、上記３に記載の微生物宿主細胞。
５．細胞がヤブレツボカビ種およびシゾキトリウム種からなる群から選択されるストラメノパイルである、上記３に記載の微生物宿主細胞。
６．酵母が油性酵母である、上記３に記載の微生物宿主細胞。
７．油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される、上記６に記載の微生物宿主細胞。
８．ａ）（ｉ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）リノール酸源
を含む微生物宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片を発現して、リノール酸をエイコサジエン酸に変換する条件下でステップ（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサジエン酸を回収するステップと
を含む、エイコサジエン酸を生産する方法。
９．ａ）（ｉ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）α−リノレン酸源
を含む微生物宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片を発現して、α−リノレン酸をエイコサトリエン酸に変換する条件下で、ステップ（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサトリエン酸を回収するステップと
を含む、エイコサトリエン酸を生産する方法。
１０．微生物宿主細胞が、配列番号２６に記載のΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子を含むヤロウィア種であり、組み換えヌクレオチド分子がヤロウィア中での発現のために最適化された少なくとも９８個のコドンを含む、上記８または９に記載の方法。
１１．ａ．）組み換え核酸分子が、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を有し、
ｂ．）宿主細胞がヤロウィア・リポリティカである、
上記８または９に記載の方法。
１２．配列番号２６に記載のΔ９エロンガーゼをコードして、少なくとも９８個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有して、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列と比較すると、アラインメントのブラストＮ法に基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列、
（ｃ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードして、配列番号１１、配列番号１２または配列番号２６に記載のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体
を含み、相補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチドを含む、微生物宿主細胞。
【請求項２】
ａ）（ｉ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）リノール酸源
を含む微生物宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片を発現して、リノール酸をエイコサジエン酸に変換する条件下でステップ（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサジエン酸を回収するステップと
を含む、エイコサジエン酸を生産する方法。
【請求項３】
ａ）（ｉ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードして、配列番号１３または配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較すると、アラインメントのクラスタルＶ法に基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する組み換えヌクレオチド分子、および
（ii）α−リノレン酸源
を含む微生物宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸断片を発現して、α−リノレン酸をエイコサトリエン酸に変換する条件下で、ステップ（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサトリエン酸を回収するステップと
を含む、エイコサトリエン酸を生産する方法。
【請求項４】
配列番号２６に記載のΔ９エロンガーゼをコードして、少なくとも９８個のコドンがヤロウィア種中での発現のためにコドン最適化されている、単離された核酸分子。