【手続補正書】
【提出日】平成22年11月1日(2010.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：Ｂ−（Ｊ）ｎ−（Ｚ）ｑ、または（Ｚ）ｑ−（Ｊ）ｎ−Ｂを含む化合物を含む、患者を処置して損傷した軟骨を修復するための組成物であって、
Ｂは、心筋細胞の増殖および／または生存を促進するペプチドであり；
Ｊは、タンパク質新生アミノ酸またはリンカーであり；
Ｚは、ヘパリン結合ペプチドであり；
ｎは、０〜１０の整数であり；そして
ｑは、１〜５の整数であり、
該組成物は、該患者の軟骨損傷の部位に投与されるものであることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
式：Ｂ−（Ｊ）ｎ−（Ｚ）ｑ、または（Ｚ）ｑ−（Ｊ）ｎ−Ｂを含む化合物と、該化合物が軟骨細胞に結合するのを可能にするのに十分な時間および条件下でインキュベートされた軟骨細胞を含む、患者を処置して損傷した軟骨を修復するための組成物であって、
Ｂは、心筋細胞の増殖および／または生存を促進するペプチドであり；
Ｊは、タンパク質新生アミノ酸またはリンカーであり；
Ｚは、ヘパリン結合ペプチドであり；
ｎは、０〜１０の整数であり；そして
ｑは、１〜５の整数であり、
該組成物は、該患者の軟骨損傷の部位への注射または移植によって投与されるものであることを特徴とする、組成物。
【請求項３】
前記化合物は、Ｊがタンパク質新生アミノ酸でありかつＢがインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）もしくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のいずれかである融合タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｚは、以下からなる群：
ＫＫＫＲＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＫＫＹＫＧ（配列番号３）；
ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号４）；
ＰＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶＲ（配列番号５）；
ＫＱＮＣＬＳＳＲＡＳＦＲＧＣＶＲＮＬＲＬＳＲ（配列番号６）；
ＫＤＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号７）；
ＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＡＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫ（配列番号８）；
ＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＴＧＱＹＫＬＧＰＫＴＧＰＧＱＫＡＩＬＦＬＰ（配列番号９）；
ＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶＳＡＮＲＬＦＧＤＫ（配列番号１０）；
ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡＶＹＱ（配列番号１１）；
ＰＬＱＥＲＡＱＡＡＷＱＥＲＬＲＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＲＡＫＬ（配列番号１２）；
ＫＧＫＭＨＫＴＣＹＹ（配列番号１３）；
ＭＧＫＭＨＫＴＣＹＮ（配列番号１４）；
ＰＰＴＩＩＷＫＨＫＧＲＤＶＩＬＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹ（配列番号１５）；
ＫＫＨＥＡＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰ（配列番号１６）；
ＫＧＧＲＧＴＰＧＫＰＧＰＲＧＱＲＧＰＴＧＲＧＥＲＧＰＲＧＩＴＧＫ（配列番号１７）；
ＧＥＦＹＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号１８）；
ＨＲＨＨＰＲＥＭＫＫＲＶＥＤＬ（配列番号１９）；
ＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲ（配列番号２０）；および
ＡＥＡＡＡＲＡＡＡＲＲＡＡＲＲＡＡＡＲ（配列番号２１）
より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記融合タンパク質においてｎ＝０である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記融合タンパク質においてｑ＝１である、請求項４または５に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ヘパリン結合配列に融合した増殖因子を使用して心臓修復を促進する方法
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／８５８，４０６号に対する優先権、およびその利益を請求する。米国仮特許出願第６０／８５８，４０６号の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、細胞の増殖および／または生存を促進するポリペプチドが、ヘパリンに結合するペプチドに融合されているタンパク質に関する。これらタンパク質は、心筋細胞に結合され得、修復の促進を補助するために、損傷した心臓組織に投与され得る。
【背景技術】
【０００２】
インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、心筋細胞の増殖および生存を促進するタンパク質である。ＩＧＦ−１が欠損しているマウスは、心筋梗塞後に増大されたアポトーシスを示す（非特許文献１）のに対して、心筋特異的ＩＧＦ−１過剰発現は、梗塞後の心筋アポトーシスおよび心室拡張から保護する（非特許文献２；非特許文献３）。ＩＧＦ−１過剰発現はまた、心臓幹細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の数および増殖を増大させ、筋細胞ターンオーバーの増大および加齢している心臓における機能をもたらす。梗塞後、ＩＧＦ−１は、心筋へ移植された胚性幹細胞の生着、分化、および機能的改善を促進する（非特許文献４）。さらに、ＩＧＦ−１の血清レベルは、年配の患者のサブセットにおいて先天性心不全の危険性と逆相関する（非特許文献５）。
【０００３】
上記の特徴は、心臓組織に対する損傷を経験した患者（例えば、心筋梗塞を経験した患者）にとって、ＩＧＦ−１を魅力的な治療剤にする。しかし、ＩＧＦ−１は、組織中に迅速に拡散する低分子タンパク質である。結果として、長期間にわたる組織損傷の部位に、高濃度のこの因子を維持することは困難である。高い局所濃度を維持するためにとられてきた１つのアプローチは、ＩＧＦ−１を自己アセンブリする生物学的膜に結合することである（特許文献１を参照のこと）。心筋梗塞のラットモデルを使用して、この膜を新生児心筋細胞に沿って移植する場合、上記移植した細胞の生存および増殖は、非結合ＩＧＦ−１とともに移植した細胞と比較して改善されていることが見いだされた。従って、上記細胞が損傷した心臓にコロニー形成しかつ機能を改善する能力は、増大される。類似のアプローチを使用して、ポジティブな結果がまた、ＰＤＧＦを用いて得られた（特許文献２を参照のこと）。これら結果は見込みがありそうであるものの、膜を構築し移植する必要性を避ける代替の手順が望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００８８５１０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０１４８７０３号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐａｌｍｅｎら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５０：５１６−５２４（２００１）
【非特許文献２】Ｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１９９１−１９９９（１９９７）
【非特許文献３】Ｔｏｒｅｌｌａら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９４：５１４−５２４（２００４）
【非特許文献４】Ｋｏｆｉｄｉｓら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：１２３９−１２４５（２００４）
【非特許文献５】Ｖａｓａｎら，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３９：６４２−６４８（２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、損傷した心臓組織へ移植する前に、ＩＧＦ−１を心筋細胞に結合するための手順の開発に基づく。ＩＧＦ−１をヘパリン結合ペプチド（ＨＢＰ）に結合し、培養細胞の生存に対して有益な効果を維持する融合タンパク質を得ることが可能であることが見いだされた。上記融合タンパク質は、ＩＧＦ−１単独より良好に心筋細胞に（おそらく、細胞表面ヘパリンに）結合する。多くの異なる細胞タイプが、細胞表面ヘパリンを有するので、上記ＩＧＦ−１／ＨＢＰタンパク質を全身に単に注射することが心臓病患者（ｃａｒｄｉａｃ  ｐａｔｉｅｎｔ）に非常に利益があるとは予測されない。しかし、標的化は、移植前に、心筋細胞をＩＧＦ−１／ＨＢＰとともにインキュベートすることによって達成され得る。より少ない程度に、局在性はまた、上記タンパク質を心臓組織へ直接注射することによって達成され得る。同様のアプローチは、（細胞の移植ありまたはなしで）増殖因子に応答する他の状態（例えば、創傷）を処置するにあたって有用であるはずである。
【０００７】
その第１の局面において、本発明は、式：Ｂ−（Ｊ）ｎ−（Ｚ）ｑ、または（Ｚ）ｑ−（Ｊ）ｎ−Ｂを有する化合物に関する。ここでｎは、０〜１０の整数であり；ｑは、１〜５の整数であり；Ｂは、心筋細胞の増殖および／または生存を促進するペプチドであり（例えば、血清を除去させた細胞を用いて測定される場合）、そしてＺは、ヘパリン結合ペプチドである。本明細書に記載されるペプチドのすべてを含む当該分野で公知の任意のヘパリン結合ペプチドが使用され得る。Ｊは、ペプチドを一緒にするために使用され得るタンパク質新生（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）アミノ酸または化合物（例えば、ビオチン／アビジン）のいずれかである。本発明の目的で、すべてのペプチド配列は、Ｎ末端（最も左）からＣ末端（最も右）へ書かれており、別段示されなければ、すべてのペプチドは、「タンパク質新生」アミノ酸（すなわち、それらは、以下のアラニン（Ａ）；アルギニン（Ｒ）；アスパラギン（Ｎ）；アスパラギン酸（Ｄ）；システイン（Ｃ）；グルタミン酸（Ｅ）；グルタミン（Ｑ）；グリシン（Ｇ）；ヒスチジン（Ｈ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；リジン（Ｋ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｆ）；プロリン（Ｐ）；セリン（Ｓ）；スレオニン（Ｔ）；トリプトファン（Ｗ）；チロシン（Ｙ）；またはバリン（Ｖ）のＬ体）から作製されている。
【０００８】
好ましい実施形態において、上記に示される式の化合物は、Ｌがタンパク質新生アミノ酸でありかつＡがインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）または血小板由来増殖因子−１（ＰＤＧＦ）のいずれかである融合タンパク質である。ヒトＩＧＦ−１の全長配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ  ００６１８）は、以下のとおりである：
ＭＧＫＩＳＳＬＰＴＱＬＦＫＣＣＦＣＤＦＬＫＶＫＭＨＴＭＳＳＳＨＬＦＹＬＡＬＣＬＬＴＦＴＳＳＡＴＡＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡＲＳＶＲＡＱＲＨＴＤＭＰＫＴＱＫＥＶＨＬＫＮＡＳＲＧＳＡＧＮＫＮＹＲＭ（配列番号１）。しかし、下線を付した配列は、本明細書に記載される手順によれば、心筋細胞増殖および生存の促進に十分である。従って、本発明の目的のためには、ＩＧＦ−１は、以下のコア配列：ＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣＧＰＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＩＲＲＡＰＱＴＧＩＶＤ  ＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＴＫＳＡ（配列番号２）を有すると定義され、そして必要に応じて、配列番号１の配列の任意のさらなる部分を含み得る。例えば、上記Ｃ末端は、Ｇ、ＡＧ、ＴＡＧなどで始まり得る。同様に、上記配列番号２のＮ末端は、配列番号１に従って拡がり得る。従って、上記ペプチドは、Ｒ、ＲＳ、ＲＳＶなどで終わり得る。ＰＤＧＦの全長アミノ酸配列はまた、当該分野で周知であり（Ｒａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：２３９２−２３９６（１９８６）を参照のこと）、そして特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１１２７として見いだされ得る。上記で示される式において、ｎは、好ましくは０であり、ｑは好ましくは１である。
【０００９】
好ましいヘパリン結合ペプチド（すなわち、式中のＺ）は、以下である：
ＫＫＫＲＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＫＫＹＫＧ（配列番号３）；
ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号４）；
ＰＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶＲ（配列番号５）；
ＫＱＮＣＬＳＳＲＡＳＦＲＧＣＶＲＮＬＲＬＳＲ（配列番号６）；
ＫＤＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号７）；
ＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＡＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫ（配列番号８）；
ＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＴＧＱＹＫＬＧＰＫＴＧＰＧＱＫＡＩＬＦＬＰ（配列番号９）；
ＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶＳＡＮＲＬＦＧＤＫ（配列番号１０）；
ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡＶＹＱ（配列番号１１）；
ＰＬＱＥＲＡＱＡＡＷＱＥＲＬＲＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＲＡＫＬ（配列番号１２）；
ＫＧＫＭＨＫＴＣＹＹ（配列番号１３）；
ＭＧＫＭＨＫＴＣＹＮ（配列番号１４）；
ＰＰＴＩＩＷＫＨＫＧＲＤＶＩＬＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹ（配列番号１５）；
ＫＫＨＥＡＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰ（配列番号１６）；
ＫＧＧＲＧＴＰＧＫＰＧＰＲＧＱＲＧＰＴＧＲＧＥＲＧＰＲＧＩＴＧＫ（配列番号１７）；
ＧＥＦＹＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号１８）；
ＨＲＨＨＰＲＥＭＫＫＲＶＥＤＬ（配列番号１９）；
ＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲ（配列番号２０）；および
ＡＥＡＡＡＲＡＡＡＲＲＡＡＲＲＡＡＡＲ（配列番号２１）。
【００１０】
本発明はまた、上記に記載される融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ分子、これらＤＮＡ分子を含むベクター、および上記ベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。上記宿主細胞は、本明細書に記載される治療方法において使用するための融合タンパク質を生成するために使用され得る。上記ＤＮＡはまた、細胞を形質転換するために使用され得、この細胞は、組織損傷の部位において上記融合タンパク質を分泌する。一旦分泌されると、上記タンパク質は、付近にある他の細胞に結合し、それによって、比較的高い局所濃度が維持されるはずである。
【００１１】
本発明はまた、上記融合タンパク質もしくは化合物のうちの１種以上を使用して、ＩＧＦ−１もしくはＰＤＧＦに応答性の任意の状態に関して患者を処置するための方法を包含する。一実施形態において、上記化合物または融合タンパク質は、それらを内因性細胞の表面に結合させるために、処置部位に直接投与される。より好ましくは、それらは、組織増殖もしくは修復が必要とされかつこのプロセスを補助するために使用され得る利用可能な細胞が存在する状態を処置するにあたって使用される。これらの場合において、上記化合物または融合タンパク質は、移植前にそれらを結合させるために、上記細胞とともに予めインキュベートされる。特に好ましい方法において、患者は、心筋細胞を、上記化合物または融合タンパク質と、一定の期間にわたって、それらを結合させるに十分な条件下でインキュベートすることによって、損傷した心臓組織（例えば、心筋梗塞に起因する）に関して処置される。次いで、上記細胞は、上記患者の心臓組織に注射または移植される。
【００１２】
上記化合物および融合タンパク質はまた、損傷した軟骨を修復するために使用され得る。通常は、ＩＧＦ−１は、軟骨から拡散し、従って、移植した軟骨細胞に対するその効果は、減少されるかまたは喪失される。移植前に、上記軟骨細胞を、ヘパリン結合ＩＧＦ−１とともにインキュベートすることによって、上記増殖因子の局所濃度は増大し、結果として、上記軟骨細胞は、より多くの軟骨を作る。
【００１３】
ヘパリンに結合するように操作された増殖因子（特に、ＩＧＦ−１）はまた、ニューロンを修復および再生するために、例えば、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ）を有する患者において、脳卒中を経験したことがある患者において、または傷害の結果として神経機能を喪失してしまった患者において、移植される細胞に結合され得る。ＩＧＦ−１は、ＡＬＳにおける臨床試験のための候補であり、皮質脊髄運動ニューロンにおける軸索成長を促進することが見いだされた（Oｚｄｉｎｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９：１３７１−１３８１（２００６））。移植前に上記ＩＧＦ−１を上記ニューロンに結合させることによって、インビボでのそれらの増殖は、増強される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
式：Ｂ−（Ｊ）ｎ−（Ｚ）ｑ、または（Ｚ）ｑ−（Ｊ）ｎ−Ｂを有する化合物であって、ここで：
Ｂは、心筋細胞の増殖および／または生存を促進するペプチドであり；
Ｊは、タンパク質新生アミノ酸またはリンカーであり；
Ｚは、ヘパリン結合ペプチドであり；
ｎは、０〜１０の整数であり；そして
ｑは、１〜５の整数である、
化合物。
（項目２）
上記化合物は、Ｊがタンパク質新生アミノ酸でありかつＢがインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）もしくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のいずれかである融合タンパク質である、項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｚは、以下からなる群：
ＫＫＫＲＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＫＫＹＫＧ（配列番号３）；
ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号４）；
ＰＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶＲ（配列番号５）；
ＫＱＮＣＬＳＳＲＡＳＦＲＧＣＶＲＮＬＲＬＳＲ（配列番号６）；
ＫＤＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号７）；
ＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＡＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫ（配列番号８）；
ＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＴＧＱＹＫＬＧＰＫＴＧＰＧＱＫＡＩＬＦＬＰ（配列番号９）；
ＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶＳＡＮＲＬＦＧＤＫ（配列番号１０）；
ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡＶＹＱ（配列番号１１）；
ＰＬＱＥＲＡＱＡＡＷＱＥＲＬＲＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＲＡＫＬ（配列番号１２）；
ＫＧＫＭＨＫＴＣＹＹ（配列番号１３）；
ＭＧＫＭＨＫＴＣＹＮ（配列番号１４）；
ＰＰＴＩＩＷＫＨＫＧＲＤＶＩＬＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹ（配列番号１５）；
ＫＫＨＥＡＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰ（配列番号１６）；
ＫＧＧＲＧＴＰＧＫＰＧＰＲＧＱＲＧＰＴＧＲＧＥＲＧＰＲＧＩＴＧＫ（配列番号１７）；
ＧＥＦＹＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号１８）；
ＨＲＨＨＰＲＥＭＫＫＲＶＥＤＬ（配列番号１９）；
ＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲ（配列番号２０）；および
ＡＥＡＡＡＲＡＡＡＲＲＡＡＲＲＡＡＡＲ（配列番号２１）
より選択される、項目２に記載の融合タンパク質。
（項目４）
ｎ＝０である、項目１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目５）
ｑ＝１である、項目１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目６）
項目２〜５のいずれか１項に記載の融合ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
（項目７）
損傷した心臓組織を有する患者を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）心筋細胞を、項目１に記載の化合物とともに、一定の時間にわたってかつ該化合物が該心筋細胞に結合することを可能にするに十分な条件下でインキュベートする工程；
ｂ）工程ａ）の該インキュベートした心筋細胞を、該患者の該心臓組織に注射または移植する工程、
を包含する、方法。
（項目８）
上記化合物は、Ｊがタンパク質新生アミノ酸でありかつＢがインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）もしくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のいずれかである融合タンパク質である、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記融合タンパク質のＺは、以下からなる群：
ＫＫＫＲＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＫＫＹＫＧ（配列番号３）；
ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号４）；
ＰＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶＲ（配列番号５）；
ＫＱＮＣＬＳＳＲＡＳＦＲＧＣＶＲＮＬＲＬＳＲ（配列番号６）；
ＫＤＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号７）；
ＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＡＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫ（配列番号８）；
ＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＴＧＱＹＫＬＧＰＫＴＧＰＧＱＫＡＩＬＦＬＰ（配列番号９）；
ＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶＳＡＮＲＬＦＧＤＫ（配列番号１０）；
ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡＶＹＱ（配列番号１１）；
ＰＬＱＥＲＡＱＡＡＷＱＥＲＬＲＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＲＡＫＬ（配列番号１２）；
ＫＧＫＭＨＫＴＣＹＹ（配列番号１３）；
ＭＧＫＭＨＫＴＣＹＮ（配列番号１４）；
ＰＰＴＩＩＷＫＨＫＧＲＤＶＩＬＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹ（配列番号１５）；
ＫＫＨＥＡＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰ（配列番号１６）；
ＫＧＧＲＧＴＰＧＫＰＧＰＲＧＱＲＧＰＴＧＲＧＥＲＧＰＲＧＩＴＧＫ（配列番号１７）；
ＧＥＦＹＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号１８）；
ＨＲＨＨＰＲＥＭＫＫＲＶＥＤＬ（配列番号１９）；
ＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲ（配列番号２０）；および
ＡＥＡＡＡＲＡＡＡＲＲＡＡＲＲＡＡＡＲ（配列番号２１）
より選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記融合タンパク質においてｎ＝０である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記融合タンパク質においてｑ＝１である、項目９または１０のいずれか１に記載の方法。
（項目１２）
上記心筋細胞は、胚性幹細胞由来である、項目７に記載の方法。
（項目１３）
上記心臓組織損傷は、心筋梗塞の結果である、項目７に記載の方法。
（項目１４）
損傷した軟骨を修復するために患者を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）軟骨細胞を、項目１に記載の化合物と、一定の期間にわたってかつ該化合物が該軟骨細胞に結合するに十分な条件下でインキュベートする工程；および
ｂ）工程ａ）の該インキュベートした軟骨細胞を、軟骨損傷の部位に注射または移植する工程
を包含する、方法。
（項目１５）
上記化合物は、Ｊがタンパク質新生アミノ酸でありかつＢはインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）もしくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のいずれかである融合タンパク質である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記融合タンパク質におけるＺは、以下からなる群：
ＫＫＫＲＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＫＫＹＫＧ（配列番号３）；
ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号４）；
ＰＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶＲ（配列番号５）；
ＫＱＮＣＬＳＳＲＡＳＦＲＧＣＶＲＮＬＲＬＳＲ（配列番号６）；
ＫＤＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号７）；
ＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＡＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫ（配列番号８）；
ＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＴＧＱＹＫＬＧＰＫＴＧＰＧＱＫＡＩＬＦＬＰ（配列番号９）；
ＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶＳＡＮＲＬＦＧＤＫ（配列番号１０）；
ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡＶＹＱ（配列番号１１）；
ＰＬＱＥＲＡＱＡＡＷＱＥＲＬＲＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＲＡＫＬ（配列番号１２）；
ＫＧＫＭＨＫＴＣＹＹ（配列番号１３）；
ＭＧＫＭＨＫＴＣＹＮ（配列番号１４）；
ＰＰＴＩＩＷＫＨＫＧＲＤＶＩＬＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹ（配列番号１５）；
ＫＫＨＥＡＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰ（配列番号１６）；
ＫＧＧＲＧＴＰＧＫＰＧＰＲＧＱＲＧＰＴＧＲＧＥＲＧＰＲＧＩＴＧＫ（配列番号１７）；
ＧＥＦＹＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号１８）；
ＨＲＨＨＰＲＥＭＫＫＲＶＥＤＬ（配列番号１９）；
ＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲ（配列番号２０）；および
ＡＥＡＡＡＲＡＡＡＲＲＡＡＲＲＡＡＡＲ（配列番号２１）
より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記融合タンパク質においてｎ＝０である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記融合タンパク質においてｑ＝１である、項目１６または１７のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
損傷した神経組織を修復するために患者を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）ニューロンを、項目１に記載の化合物とともに、一定時間にわたってかつ該化合物が該ニューロンに結合することを可能にするに十分な条件下でインキュベートする工程；および
ｂ）工程ａ）の該インキュベートしたニューロンを、神経組織損傷の部位に注射または移植する工程
を包含する、方法。
（項目２０）
上記化合物は、Ｊがタンパク質新生アミノ酸でありかつＢがインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）または血小板由来増殖因子−１（ＰＤＧＦ）のいずれかである融合タンパク質である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記融合タンパク質におけるＺは、以下からなる群：
ＫＫＫＲＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＫＫＹＫＧ（配列番号３）；
ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ（配列番号４）；
ＰＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶＲ（配列番号５）；
ＫＱＮＣＬＳＳＲＡＳＦＲＧＣＶＲＮＬＲＬＳＲ（配列番号６）；
ＫＤＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号７）；
ＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＡＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫ（配列番号８）；
ＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲＴＧＱＹＫＬＧＰＫＴＧＰＧＱＫＡＩＬＦＬＰ（配列番号９）；
ＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶＳＡＮＲＬＦＧＤＫ（配列番号１０）；
ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＤＤＬＱＫＲＬＡＶＹＱ（配列番号１１）；
ＰＬＱＥＲＡＱＡＡＷＱＥＲＬＲＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＲＡＫＬ（配列番号１２）；
ＫＧＫＭＨＫＴＣＹＹ（配列番号１３）；
ＭＧＫＭＨＫＴＣＹＮ（配列番号１４）；
ＰＰＴＩＩＷＫＨＫＧＲＤＶＩＬＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹ（配列番号１５）；
ＫＫＨＥＡＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰ（配列番号１６）；
ＫＧＧＲＧＴＰＧＫＰＧＰＲＧＱＲＧＰＴＧＲＧＥＲＧＰＲＧＩＴＧＫ（配列番号１７）；
ＧＥＦＹＤＬＲＬＫＧＤＫ（配列番号１８）；
ＨＲＨＨＰＲＥＭＫＫＲＶＥＤＬ（配列番号１９）；
ＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲ（配列番号２０）；および
ＡＥＡＡＡＲＡＡＡＲＲＡＡＲＲＡＡＡＲ（配列番号２１）
より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記融合タンパク質においてｎ＝０である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記融合タンパク質においてｑ＝１である、項目２１または２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
上記損傷した神経組織は、神経変性疾患、脳卒中または傷害の結果である、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
上記損傷した神経組織は、ＡＬＳの結果である、項目１９に記載の方法。
（項目２６）
上記ニューロンは、皮質脊髄運動ニューロンである、項目１９に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１もしくはＰＤＧＦ）の高い局所濃度を維持することによって、障害後の組織の回復が促進されるという概念に基づく。当該分野で記載されている実験は、投与部位に治療剤を維持するために、生物学的に適合性の膜を用いてこのアプローチを支援した（ＵＳ２００６００８８５１０およびＵＳ２００６０１４８７０３を参照のこと）。増殖因子は、ヘパリン結合ペプチドに融合されかつ心臓組織にこれらを移植する前に心筋細胞に結合され得ることが今や発見された。上記融合されたタンパク質は、その細胞増殖および生存を促進する能力を維持し、生物学的に適合性の膜を作製および使用する必要性なくして、移植部位において維持される。
【００１５】
（ペプチドの作製）
上記ヘパリン結合ペプチドを上記治療剤に結合する１つの方法は、非ペプチドリンカーの使用を介してである。例えば、分子を連結するためのビオチンおよびアビジンの使用は、当該分野で周知であり、標準的な方法論が、ヘパリン結合ペプチドを増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）に結合させるために使用され得る。上記ビオチン／アビジン群とペプチドとの間の立体障害を予防するために、スペーサーがその２つの間に含められ得る。上記スペーサーは、１〜１５（好ましくは１〜１０）の脂肪酸または１〜１５（好ましくは、１〜１０）アミノ酸の形態をとり得る。このタイプのスペーサーを組み込むための方法論は、当該分野で周知である。
【００１６】
好ましくは、ヘパリン結合ペプチドおよび増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１およびＰＤＧＦ）は、融合タンパク質の形態で一緒に結合される。融合タンパク質は、化学的に合成されるかまたは組換えＤＮＡ技術を用いて作製されるかのいずれかであり得る。化学的方法は、標準的なＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｂｕｔｙｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）（ｔ−Ｂｏｃ）化学を使用する固相ペプチド合成およびｎ−メチルピロリドン化学を使用するサイクルを包含する。一旦ペプチドが合成されたら、ペプチドは、逆相カラム上での高速液体クロマトグラフィーのような手順を使用して精製され得る。精製はまた、ＨＰＬＣによって評価され得、そして正確な組成の存在が、アミノ酸分析によって決定される。
【００１７】
（細胞への結合）
心筋細胞または他の細胞は、標準的な手順を使用して得られ得、次いで、上記融合タンパク質を細胞表面に結合させるに十分な期間にわたって、融合組成物または融合タンパク質とともにインキュベートされ得る。上記インキュベーションは、約１時間から数日間、どんな程度にせよ続き得、そして細胞生存を可能にする条件（例えば、約３７℃で、中性ｐＨ、および細胞生存を保証する培養培地中での）下で実施されるべきである。存在するタンパク質の量は、一般に、上記細胞を被覆するに十分であるべきであるが、正確な量は重要ではない。上記細胞は、シリンジまたはカテーテルによって心臓組織へ投与され得る。使用される細胞の正確な量は重要ではないが、一般に、１×１０５〜１×１０７の間が使用される。
【００１８】
（薬学的組成物および投与量）
融合タンパク質は、キャリア（例えば、生理食塩水、水、リンゲル溶液および他の薬剤）もしくは賦形剤を含む薬学的組成物に組み込まれ得、そして細胞は、生存性を維持するために標準培地中で維持され得る。調製物は、一般に、特に、心臓組織への移植、注入または注射のために設計されるが、局所処置もまた、例えば、創傷の処置において有用である。すべての薬学的組成物は、当該分野で標準的な方法を使用して調製され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ａ．Ｏｓｌｏ．編，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）を参照のこと）。
【００１９】
当業者は、臨床医療において十分確立された方法を使用して、症例毎のベースで投与量を調節することが予測される。最適な投与量は、当該分野で公知の方法によって決定され、患者の年齢、疾患状態、および他の臨床的に関連する要因のような要因によって影響を受ける。
【実施例】
【００２０】
実施例１：心筋細胞の生存
本実施例は、ＩＧＦ−１がＥＳ由来心筋細胞の生存を改善することを実証し、かつ注射された細胞の生存を改善するように操作された新規なヘパリン結合（ＨＢ）−ＩＧＦ−１融合タンパク質の開発を記載する。
【００２１】
（方法および結果）
奇形腫形成を最小にするために、本発明者らは、心筋細胞系統になるように約束されたＥＳ細胞を研究した。α−心筋ミオシン重鎖レセプター駆動性の増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）で安定にトランスフェクトしたマウスＥＳ細胞は、ハンギングドロップ法（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ  ｍｅｔｈｏｄ）によって心筋細胞へと分化し、ＥＧＦＰ陽性細胞を、蛍光セルソーティングによって精製した。これらＥＳ由来心筋細胞において、ＩＧＦ−１は、血清除去により誘導された細胞死を低下させ（１３．６±１．９％  対  コントロールにおいて２５．９±２．５％，ｐ＜０．０５）、血清除去によって誘導されたアポトーシスを減少させた（それぞれ、ＴＵＮＥＬ陽性細胞  ８．０±１．５％〜４．３±０．５％，ｐ＜０．０５）。さらに、ＩＧＦ−１は、ドキソルビシン（１μＭ，２４時間）誘導性またはケレリスチン（ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎ）（３μＭ，１時間）誘導性のアポトーシスを減少させた（ｐ＜０．０１）。ホスホイノシチド−３キナーゼインヒビターである、ＬＹ２９４００２（１０μＭ）は、ドキソルビシン誘導性アポトーシスに対するＩＧＦ−１の保護効果を阻害した（ｐ＜０．０５）。ＩＧＦ−１が注射した部位から迅速に攪拌するので、本発明者らは、次いで、Ｎ末端ＨＢドメインを有する新規な組換えＩＧＦ−１融合タンパク質を設計および発現させた。上記タンパク質を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、次いで、酸化的再折りたたみに供して、生物学的活性を回復させた。細胞表面に結合したＨＢ−ＩＧＦ−１は、ネイティブＩＧＦ−１と同程度に強力に、新生児心筋細胞および３Ｔ３線維芽細胞におけるＩＧＦ−１活性化ＡｔｋおよびＨＢ−ＩＧＦ−１活性化Ａｋｔより劇的に良好であった。
【００２２】
（結論）
ＩＧＦ−１は  ＥＳ由来心筋細胞の生存をインビトロで改善するので、この新たなヘパリン結合ＩＧＦ−１は、注射した細胞の表面に結合することによって、細胞治療を改善するはずである。このことは、局所的に送達された治療的タンパク質を介して細胞性微小環境を変化させる可能性を実証する。
【００２３】
（実施例２：軟骨修復）
この実施例において、本発明者らは、新規なタンパク質ヘパリン結合ＩＧＦ−１（ＨＢ−ＩＧＦ−１）を設計および精製した。このタンパク質は、ネイティブＩＧＦ−１と、ヘパリン結合表皮増殖因子様増殖因子のヘパリン結合ドメインとの融合タンパク質である。ＨＢ−ＩＧＦ−１は、ヘパリンおよび３Ｔ３線維芽細胞、新生児心筋細胞、および分化しつつある胚性幹細胞の細胞表面に選択的に結合した。ＨＢ−ＩＧＦ−１は、同一の反応速度でそしてＩＧＦ−１の用量依存的に、ＩＧＦ−１レセプターおよびＡｋｔを活性化した。このことは、ヘパリン結合ドメインに起因して、生物学的活性の妥協を示さない。軟骨は、プロテオグリカンが豊富な環境でありかつＩＧＦ−１は、軟骨細胞生合成のための公知の刺激であるので、本発明者らは、次いで、軟骨におけるＨＢ−ＩＧＦ−１の有効性を研究した。ＨＢ−ＩＧＦ−１は、軟骨外植片によって選択的に維持され、ＩＧＦ−１と比較して、持続した軟骨細胞プロテオグリカン生合成がもたらされた。これらデータは、局所送達のためにＩＧＦ−１のような「長距離」増殖因子を操作するストラテジーが、組織修復に有用であり得、全身効果を最小化することを示す。
【００２４】
（材料および方法）
（ベクター構築）
ラットＩＧＦ−１  ｃＤＮＡを、プライマー（５’から３’へ）  ＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＧ（順方向，配列番号２２）およびＡＧＣＴＧＡＣＴＴＴ  ＧＴＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣ（逆方向，配列番号２３）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖した。本発明者らは、エキソン３および４をコードする成熟ペプチドＩＧＦ−１（７０アミノ酸）を使用した（Ｈａｍｅｅｄら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４７：２４７−２５４（２００３）；Ｓｈａｖｌａｋａｄｚｅら，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ  ＩＧＦ  Ｒｅｓ  １５：４−１８（２００５）；Ｍｕｓａｒｏら，Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４２：７６−８０（２００７））。この生成物を、ＩＧＦ−１のＣ末端に終止コドン（ＴＡＧ）を付加するｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にサブクローニングして、このようにして、Ｘｐｒｅｓｓタグ化ＩＧＦ−１（Ｘｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１）をコードする。ＨＢ−ＩＧＦ−１をコードするために、ラットＨＢ−ＥＧＦ（ＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧ  ＴＴＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴ  ＴＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡＡＧ  （配列番号２４））のヘパリン結合配列（ＡＡ  ９３−１１３）は、変異誘発を介して、上記Ｘ−ｐｒｅｓｓタグと、ＩＧＦ−１配列との間に挿入した。
【００２５】
増幅を、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，ＴＸ，ＵＳＡ）で行い、テンプレートプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換の前に、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）で消化した。すべての配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００２６】
（タンパク質精製）
Ｘｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１およびＨＢ−ＩＧＦ−１を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞において発現させ、４ｌバッチにおいてＬＢ培地中で増殖させた。タンパク質合成を、４時間にわたって、１ｍＭ  イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドで誘導し、次いで、細胞を遠心分離によって回収し、溶解緩衝液中で溶解し（６Ｍ  塩酸グアニジン、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）、ホモジナイズした。最初の精製工程は、融合タンパク質中のポリヒスチジンタグと、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とによるアフィニティー精製からなった。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を、洗浄緩衝液（８Ｍ  尿素、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ６．２）で洗浄し、結合したタンパク質をｐＨ４で溶出した。次いで、溶出したタンパク質を、酸化的再折りたたみに供して、生物学的活性を回復させた。上記タンパク質を、４℃で一晩、再折りたたみ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１００μＭ  酸化型グルタチオンおよび１００μＭ  還元型グルタチオン，ｐＨ７．８）とともにインキュベートした。再折りたたみ後、上記サンプルを、最終精製工程として、０．１％  トリフルオロ酢酸に調節し、Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラム（Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に載せた。上記カラムを、０．１％  トリフルオロ酢酸中の２５％〜４０％  アセトニトリルの直線勾配に供した。
【００２７】
（細胞培養）
心筋細胞の初代培養物を、新生児Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの心室から調製し、７％  ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し；培地を、２４時間後に、無血清培地と交換した。３Ｔ３線維芽細胞を、１０％  新生児仔牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ中で培養し、その培地を、実験の２４時間前に無血清培地と交換した。マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を、フィーダー細胞なしで、１５％  ＫＮＯＣＫＯＵＴ  ＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および白血病阻害因子（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を補充したグラスゴー最小必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、ゼラチン被覆ディッシュ上で増殖させた。細胞を、３日ごとに継代した。分化を誘導するために、細胞を、最初に酵素的に分離させ、以前に記載されるように（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７：１９１２−１９１６（２００３））、胚様体形成のためにハンギングドロップとして培養した。分化培地（白血病阻害因子を含まない１０％  ＥＳ細胞適性ウシ胎児血清（ＥＳ  ｃｅｌｌ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有）を、添加した。これらＥＳ細胞は、心筋細胞への分化後に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）陽性になった。なぜなら、それらは、α−ミオシン重鎖プロモーター駆動増強ＧＦＰベクターで安定にトランスフェクトされていたからである。胚様体形成後（７日目）、細胞を、ゼラチン被覆ディッシュにプレートした。
【００２８】
（軟骨の回収および培養）
ウシ関節軟骨外移植片（３ｍｍ直径、１ｍｍ厚のディスク）を、１〜２週齡の仔牛の代替の膝外溝（ｆｅｍｏｒｏｐａｔｅｌｌａｒ  ｇｒｏｏｖｅ）から回収し、３７℃で５％  ＣＯ２  雰囲気中、低グルコースＤＭＥＭ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、０．４ｍＭ  Ｌ−プロリン、２０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含有）中で培養した。
【００２９】
（タンパク質分析）
新生児心筋細胞および３Ｔ３線維芽細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、０．２５％  デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４および１：１０００  プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）を含有する）を使用して溶解した。軟骨ディスクを粉砕し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１：１０００  プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）で溶解した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定し、１０μｇタンパク質を、ウェスタンブロット分析のために各ウェル中に載せた。類似のＧＡＧ含有量を、ＤＭＭＢ色素結合によって測定される場合、すべてのサンプル中で観察した。抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ポリクローナルＩＧＦ−１抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、抗ホスホ−ＩＧＦ−１レセプター抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）、抗ホスホ−Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用した。ＩＧＦ−１を、コントロールタンパク質としてＳｉｇｍａから購入した。
【００３０】
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって上記融合タンパク質を検出するために、９６ウェルプレートを、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（１０μｇ／ｍｌ）で一晩被覆した。軟骨抽出物由来のタンパク質の同一の量を、各ウェルに添加した。ポリクローナルＩＧＦ−１抗体を、一次抗体として使用し、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，  ＵＳＡ）を、二次抗体として使用した。ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）の添加後に、プレートを、４０５ｎｍで読み取った。
【００３１】
（結合アッセイ）
ヘパリンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を、３００ｐｍｏｌ  ＨＢ−ＩＧＦ−１またはＸｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１とともに、２時間にわたってインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。ヘパリンアガロースビーズと結合した融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と煮沸させることによって抽出した。３Ｔ３線維芽細胞または新生児ラット心筋細胞を、１００ｎＭ  ＨＢ−ＩＧＦ−１またはコントロールＩＧＦ−１（Ｓｉｇｍａ）とともに、２時間にわたってインキュベートし、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。上記細胞を、溶解緩衝液で溶解し、次いで、抗ＩＧＦ−１抗体を用いてウェスタンブロット分析に供した。胚様体（分化を誘導して１０日間後）を、融合タンパク質とともに２時間にわたってインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体による免疫組織化学の前に、パラホルムアルデヒドで固定した。軟骨ディスクを、無血清ＤＭＥＭ（５００ｎＭ  ＨＢ−ＩＧＦ−１または５００ｎＭ  Ｘｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１のいずれかを補充した）中で培養した。４８時間後（０日目）、ディスクをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＩＧＦ−１なしのＤＭＥＭ中でインキュベートした。ディスクを、０日目、１日目、２日目および４日目に回収した。軟骨抽出物中に残っているタンパク質を、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡによって検出した。
【００３２】
（軟骨生合成アッセイ）
軟骨細胞プロテオグリカン合成を、以前に記載されたように（Ｓａｈら，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．７：６１９−６３６（１９８９））、［３５Ｓ］スルフェート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の組み込みによって測定した。軟骨ディスクを、無血清培地中で１日間にわたって平衡化し、１００ｎＭ  ＨＢ−ＩＧＦ−１、Ｘｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１またはコントロールＩＧＦ−１（Ｓｉｇｍａ）を含む培地中で２日間にわたってインキュベートした。次に、上記ディスクを、ＰＢＳで３回洗浄し、ＩＧＦ−１非含有培地に変更した。培養したディスクを、５μＣｉ／ｍｌ［３５Ｓ］スルフェートで、培養の最後の２４時間にわたって放射性標識した。標識後、各ディスクを、４℃の１．０ｍｌのＰＢＳ（０．８ｍＭ  プロリンおよび１ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４含有）中で３回洗浄して、遊離の放射性標識を除去した。ディスクを、１．０ｍｌのプロテイナーゼＫ（０．１Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５ｍＭ  システイン（ｐＨ６．０）中に、１２５μｇ／ｍｌ）中で消化した。サンプルを、２０μｌの消化物と、１８０μｌのＨｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８（２４）との反応によって、蛍光測定分析によってＤＮＡ含有量について分析した。次いで、上記消化物の［３５Ｓ］スルフェート含有量を、あふれ出し（ｓｐｉｌｌｏｖｅｒ）および消滅について較正したシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で測定した。
【００３３】
（統計分析）
統計分析を、受容レベルα＝０．０５でスチューデントｔ検定によって行った。ｔ検定を、α＝１−（１−α０）１／ｎ（ここでα０＝０．０５およびｎ＝比較総数）を使用してマルチ比較に関して較正した。すべてのデータを、平均±ＳＥとして表した。
【００３４】
（結果）
（ＨＢ−ＩＧＦ−１の精製）
ＩＧＦ−１は、３つのジスルフィド結合を有し、そして７０アミノ酸を含む。上記ＩＧＦ−１融合タンパク質は、タンパク質精製のためのポリヒスチジンタグおよびタンパク質検出のためのＸｐｒｅｓｓタグの両方を含む。ＨＢ−ＩＧＦ−１およびＸｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１の分子量は、それぞれ、１４，０１８Ｄａおよび１１，５４８Ｄａである。ＨＢ−ＩＧＦ−１は、ＩＧＦ−１のＮ末端にＨＢドメインを含む。上記ＨＢドメインは、２１アミノ酸を有し、そして１２個の正に荷電したアミノ酸を含む。折りたたみ後の上記新たな融合タンパク質の最後の精製を、ＲＰ−ＨＰＬＣで行った。正確に折りたたみされたタンパク質の同定を、以前に記載されたように行い（Ｍｉｌｎｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０８（Ｐｔ  ３）：８６５−８７１（１９９５））、生体活性アッセイで確認した。クマシーブルー染色、およびＲＰ−ＨＰＬＣ後の上記再折りたたみされたＩＧＦ−１タンパク質の抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体によるウェスタン分析によって、単一のバンドであることが明らかになった。
【００３５】
（ＨＢ−ＩＧＦ−１はヘパリンおよび細胞表面に結合する）
本発明者らは、ＨＢ−ＩＧＦ−１がヘパリンに選択的に結合するか否かを最初に試験した。ヘパリンアガロースビーズと３００ｐｍｏｌ  ＨＢ−ＩＧＦ−１もしくはＸｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１との２時間のインキュベーションの後に、結合したタンパク質を、煮沸することによりビーズから抽出した。ヘパリンアガロースビーズの結合タンパク質のクマシーブルー染色は、ＨＢ−ＩＧＦ−１が、Ｘｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１と比較して、ヘパリンに選択的に結合することを示した。次に、本発明者らは、３Ｔ３線維芽細胞および新生児ラット心筋細胞を用いて、ＨＢ−ＩＧＦ−１が、ヘパリン硫酸プロテオグリカンを有する細胞表面に結合する能力を試験した。０〜１００ｎＭのＨＢ−ＩＧＦ−１での２時間にわたる前処置の後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。これら実験に関して、市販のＩＧＦ−１をコントロールとして使用した。ＨＢ−ＩＧＦ−１は、１０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で処理した場合に、３Ｔ３線維芽細胞に結合した。新生児心筋細胞に結合するＨＢ−ＩＧＦ−１は、１０ｎＭおよび１００ｎＭのＨＢ−ＩＧＦ−１の明らかな選択的結合および１００ｎＭのＩＧＦ−１に非常に弱いバンドを示した。これら結果は、マイクロモル濃度範囲未満のへパリンに対するこのＨＢドメインの結合と一致する。本発明者らはまた、複数の細胞タイプを含む胚様体において、ＨＢ−ＩＧＦ−１が胚性幹細胞に結合する能力を研究した。ＨＢ−ＩＧＦ−１を、Ｘｐｒｅｓｓエピトープタグに対する免疫蛍光によって、胚様体中の細胞の表面上で容易に検出した。このことは、ＨＢ−ＩＧＦ−１が複数の細胞タイプに結合し得ることを示している。
【００３６】
（ＨＢ−ＩＧＦ−１生体活性）
上記ＨＢドメインが生体活性と干渉するか否かを決定するために、ＩＧＦ−１レセプターリン酸化およびＡｋｔ活性化に対するバイオアッセイを、行った。コントロールＩＧＦ−１、ＨＢ−ＩＧＦ−１およびＸｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１はすべて、用量依存的に新生児心筋細胞のＩＧＦ−１レセプターを活性化し、等しくＡｋｔリン酸化を誘導した。コントロールＩＧＦ−１、ＨＢ−ＩＧＦ−１およびＸｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１はすべて、類似の時間過程内でＡｋｔを活性化した。これらデータは、上記ヘパリン結合ドメインの付加が、ＩＧＦ−１の生体活性を妨げないことを実証する。
【００３７】
（軟骨におけるＨＢ−ＩＧＦ−１輸送）
軟骨は、プロテオグリカンが豊富な組織であり、軟骨細胞は、増大した細胞外マトリクス合成とともに、ＩＧＦ−１に応答する。ＩＧＦ−１シグナル伝達の長期の局所刺激は、従って、軟骨修復にとって有益であり得るので、本発明者らは、ＨＢ−ＩＧＦ−１が軟骨に結合する能力を研究した。等しい大きさにしたウシ関節軟骨ディスクを、１日間、３日間または６日間にわたって、５００ｎＭ  ＨＢ−ＩＧＦ−１またはＸｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１とともにインキュベートしたところ、この期間に軟骨に拡散したＩＧＦ−１タンパク質の量に何ら差異はなかった。ＨＢ−ＩＧＦ−１またはＸｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１とともに４８時間プレインキュベートした後、軟骨ディスクを、０日目にＰＢＳで洗浄し、同様の量のＩＧＦ−１を検出した。しかし、ＩＧＦ−１タンパク質を除去してから１日目、２日目、および４日目に、ＨＢ−ＩＧＦ−１のみが軟骨内に残った。このことは、ＨＢ−ＩＧＦ−１が、上記プロテオグリカンが豊富な細胞外マトリクスに結合したことを示唆する。対照的に、Ｘｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１は、洗浄してから１日目ですら検出不能であった。本発明者らはまた、軟骨抽出物およびＥＬＩＳＡ測定で、この選択的結合実験を行った。これら結果は、ＨＢ−ＩＧＦ−１が軟骨によって選択的に保持される一方で、Ｘｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１は迅速に喪失することを確認した。
【００３８】
（ＨＢ−ＩＧＦ−１は、軟骨細胞生合成を増大させる）
軟骨へのＨＢ−ＩＧＦ−１の選択的保持は、この融合タンパク質が、軟骨細胞生合成に関する持続した刺激を送達し得ることを示唆する。従って、本発明者らは、［３５Ｓ］スルフェートの組み込みによる細胞外マトリクスプロテオグリカンの軟骨細胞生合成を測定した。軟骨ディスクを、１００ｎＭ  ＨＢ−ＩＧＦ−１、コントロールＩＧＦ−１またはＸｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１とともに、２日間インキュベートし、そしてＰＢＳで３回洗浄し、続いて、ＩＧＦ−１を含まない培地中で培養した。［３５Ｓ］スルフェート組み込みを、０日目（洗浄前）、２日目（洗浄直後）、４日目、６日目および８日目に始めて、２４時間にわたって測定した。０日目のＩＧＦ−１構築物とのインキュベーションの間、コントロールＩＧＦ−１、Ｘｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１およびＨＢ−ＩＧＦ−１群はすべて、予測どおり、プロテオグリカン合成を刺激した。しかし、洗浄後、コントロールＩＧＦ−１もＸｐｒｅｓｓ  ＩＧＦ−１も、４日目以降は、プロテオグリカン合成を刺激しなかった。対照的に、ＨＢ−ＩＧＦ−１は、６日間にわたってプロテオグリカン合成の持続した刺激をもたらした。プロテオグリカン合成は、２日目、４日目、および６日目に、Ｘｐｒｅｓｓ−ＩＧＦ−１に対して、ＨＢ−ＩＧＦ−１とともにインキュベートした軟骨において有意に高かった。これらデータは、ＨＢ−ＩＧＦ−１（これは、軟骨中で選択的に保持される）が、より持続した期間にわたって、軟骨細胞生合成を刺激することを実証する。
【００３９】
（考察）
ＩＧＦ−１の局所送達は、組織修復および再生を改善すると同時に、全身の有害な効果を最小にする可能性を有する。この実施例において、本発明者らは、プロテオグリカンが豊富な組織および細胞表面に結合するが、ＩＧＦ−１と同じ生体活性を有する新規なＩＧＦ−１タンパク質であるＨＢ−ＩＧＦ−１を記載する。本発明者らのデータは、ＨＢ−ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１レセプターおよびＡｋｔを活性化し得るので、上記ヘパリン結合ドメインは、ＩＧＦ−１およびそのレセプターの相互作用を妨害しないことを示す。ＩＧＦ−１は、４つのドメインを有する：Ｂドメイン（ＡＡ１−２９）、Ｃドメイン（ＡＡ３０−４１）、Ａドメイン（ＡＡ４２−６２）およびＤドメイン（ＡＡ６３−７０）（上記Ｃドメインは、ＩＧＦ−１レセプターへの結合において最も重要な役割を果たす）。Ｃドメイン全体の置換は、ＩＧＦ−１レセプターに対するアフィニティーにおいて３０分の１への低下を引き起こす。従って、ＩＧＦ−１のＮ末端への上記ヘパリン結合ドメインの付加は、ＩＧＦ−１  Ｃドメインとの相互作用を妨害するとは認められない。
【００４０】
細胞外マトリクスおよび細胞表面はともに、プロテオグリカンが豊富であり、プロテオグリカン結合増殖因子のためのレザバとして働き得る。伝統的な例は、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）系（プロテオグリカンレセプターの低アフィニティー、高収容力プールがその高いアフィニティーレセプターのためのＦＧＦ−２のレザバとして働き得る）である。本発明者らの実験は、ＨＢ−ＩＧＦ−１は細胞表面上に選択的に保持されるので、ＨＢ−ＩＧＦ−１が、類似の様式でいくつかの環境で機能し得ることを示唆する。ＩＧＦ−１はまた、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）を介して細胞外マトリクスと結合し得る；循環中において、ＩＧＦ−１の少なくとも９９％は、ＩＧＦＢＰ（ＩＧＦＢＰ−１からＩＧＦＢＰ−６）に結合される。
【００４１】
ＩＧＦ−１は、軟骨細胞外マトリクスの合成を促進し得、軟骨分解を阻害し得る（Ｂｏｎａｓｓａｒら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７９：５７−６３（２０００））；しかし、軟骨へのＩＧＦ−１送達の実際の様式は、未だ開発されている（Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １４：４０３−４１２（２００６））。ヘパラン流酸プロテオグリカンは、軟骨の細胞周囲マトリクスにおいて、特に、パールカンおよびシンデカン−２上の鎖として優勢であり、ＦＧＦ−２のような他のリガンドを結合することが公知である。本発明者らの実験は、ＨＢ−ＩＧＦ−１タンパク質は、マトリクスと結合し得、軟骨細胞に対して局所的な長期のバイオアベイラビリティーを増大させ得るので、軟骨修復を改善し得ることを示唆している。
【００４２】
軟骨に加えて、ＨＢ−ＩＧＦ−１は、他の組織における使用に関する可能性を有する。例えば、ＩＧＦ−１は、ＰＣ１２細胞および皮質脊髄運動ニューロンの軸索成長を誘導し、よって、ＩＧＦ−１は、運動ニューロン変性疾患に有益であり得る。表皮創傷治癒において、ＩＧＦ−１はまた有効である。なぜなら、ＩＧＦ−１はコラーゲン合成、ならびに線維芽細胞およびケラチノサイトの有糸分裂促進を刺激するからである。ＨＢ−ＩＧＦ−１が細胞の表面に結合する能力は、細胞治療および他の再生ストラテジーを増強し得る。
【００４３】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、十分に参考として援用される。今や十分に本発明を記載したが、本発明が、広くかつ等しい範囲の条件内、パラメーターなどの範囲内で本発明の趣旨および範囲からも本発明のいずれの実施形態からも逸脱することなく実施され得ることは、当業者によって理解される。