(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式１で示される化合物又はその塩。
【化１】
0005872094.tif 000007
【請求項２】
ロンガンの果実と大豆とを納豆菌で発酵させる工程と、
前記工程で得られた発酵物とシクロデキストリンを接触させて、シクロデキストリン複合物を得る工程と、
前記複合物をセルラーゼで酵素処理する工程と、
前記酵素処理物を吸着剤にて吸着回収する工程と、を有する次の化学式１で示される化合物又はその塩の製造方法。
【化１】
0005872094.tif 000008
【請求項３】
次の化学式１で示される化合物及び／又はその塩を有効成分とするメラニン産生抑制剤。
【化１】
0005872094.tif 000009
【請求項４】
次の化学式１で示される化合物及び／又はその塩を有効成分とする筋肉疲労回復剤。
【化１】
0005872094.tif 000010
【請求項５】
ロンガンの果実と大豆を納豆菌で発酵させてメラニン産生抑制剤を調製する方法。
【請求項６】
前記発酵物をシクロデキストリンと接触させて得られた反応物をセルラーゼで酵素処理してメラニン産生抑制剤を調製する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ロンガンの果実と大豆を納豆菌で発酵させて筋肉疲労回復剤を調製する方法。
【請求項８】
前記発酵物をシクロデキストリンと接触させて得られた反応物をセルラーゼ処理して筋肉疲労回復剤を調製する請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメラニン産生抑制剤及び筋肉疲労回復剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロンガンはムクロジ科ムクロジ属に属する植物であって、リュウガンとも称される。この果実の果肉乾燥物は、漢方薬としても利用される。特許文献１には、ロンガン果実と大豆とを納豆菌を用いて発酵した発酵物をシクロデキスリンを用いて処理して得られた発酵物が、チロシナーゼ阻害作用を有することが示されている。また、特許文献２には、ロンガンの種子と大豆とを納豆菌を用いて発酵した発酵物をさらにアルカリ還元処理して得られるソヤセレブロシドＩ誘導体が、チロシナーゼ阻害作用を示すことが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−１３３３３２号公報
【特許文献２】特開２００９−１４３８８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本願発明者らは、特許文献１に記載された発酵物についてさらに研究を進めたところ、当該発酵物中に見いだされた下記の化学式（化１）で示される化合物が、メラニン産生を抑制するとともに、筋肉疲労の回復作用を有することを見いだし、本願発明を完成するに至った。
【化１】
0005872094.tif 000002
【０００５】
すなわち、本発明が解決しようとする課題は、メラニン産生抑制作用及び筋肉疲労の回復作用を示す新規な化合物を提供し、新規なメラニン産生抑制剤及び筋肉疲労回復剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明では、ロンガンの果実及び大豆の混合物に納豆菌を加えて発酵させた発酵物中の活性成分である化学式（化１）で示される化合物、及び／又は当該発酵物をメラニン産生抑制剤又は筋肉疲労回復剤として使用する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、新規なメラニン産生抑制剤及び筋肉疲労回復剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明に係る化合物は次の化学式１（化１）で示される化合物又はその塩である。その塩は薬理学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩であり得る。
【化１】
0005872094.tif 000003
【０００９】
当該化合物は、チミン誘導体であり、分子内にチミンと、プロリンと、リシンと、チロシンと、リボースを有する化合物である。チミン、プロリン、リシン、チロシン、リボースの構成分子比率は１：１：１：１：１であり、アミノ酸はすべてＬ体、リボースはＤ体である。プロリンはリシンのε位のアミノ基と酸アミド結合し、リシンのα位のアミノ基にチロシンが酸アミド結合している。そして、チロシンのα位のアミノ基がチミンの６位の炭素に結合し、リシンのカルボキシル基にリボースの５位の水酸基がエステル結合している。この化合物は下記に述べるように、ロンガンの果実と大豆の納豆菌による発酵物中から見いだされた化合物であるが、チミン、プロリン、リシン、チロシン、リボースを用いた化学合成によっても合成され得る。
【００１０】
発酵物からは例えば次に方法により取得され得る。まず、ロンガンの果実と大豆の混合物に納豆菌を加えて発酵させる。ロンガンは学名をDimocarpus longanと言い、本発明においてはその果実、好ましくはその乾燥物が用いられる。発酵物の調製に際し、ロンガン果実の粉砕物及び大豆の粉砕物が好ましく用いられる。また、それぞれの粉砕物の混合物を発酵させても、ロンガンの果実及び大豆の混合物の粉砕物を発酵させてもよい。ロンガンの果実と大豆の混合比は任意であるが、大豆の使用量はロンガンの使用量に対して１倍以上、好ましくは１〜４倍である。
【００１１】
納豆菌は枯草菌の一種であって、納豆などの食品の加工用に使用される納豆菌と称される菌であれば特に限定されない。発酵条件は納豆菌による発酵が行われる条件であればよく、例えば発酵温度が３４〜５６℃で、発酵時間が数時間から数日間、好ましく２４時間から７２時間の発酵条件が示される。納豆菌の使用量も適宜決められるが、好ましくはロンガン果実と大豆の混合物の１質量部に対して納豆菌０.００１〜０.００５質量部である。発酵に際して、適当量の水が添加され得る。
【００１２】
次に、前記発酵物からシクロデキストリンを用いて発酵生成物を回収する。回収は前記発酵物とシクロデキストリンを接触させて得られたシクロデキストリン複合物を、酵素処理することで行われる。シクロデキストリンはα-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、γ-シクロデキストリンなどの各種シクロデキストリンが用いられ得るが、得られた抽出物の活性や化合物の収率の観点などからα-シクロデキストリンが好適である。シクロデキストリンの添加量も適宜定められ得るが、好ましくは発酵物１質量部に対して０.１〜０.５質量部である。シクロデキストリンとの接触温度は、１℃〜５０℃好ましくは２０〜４０℃である。接触は上記発酵物にシクロデキストリンを添加、攪拌することで行われる。
【００１３】
酵素処理は、発酵物とシクロデキストリンの接触物（シクロデキストリン複合物）とセルラーゼを接触させることで行われる。セルラーゼは、シクロデキストリンを分解できるセルラーゼであればよく、好ましくは食品加工用として使用され得るものが好ましい。酵素処理は、用いられるセルラーゼに適した条件で行われる。また、酵素処理に先立ち、発酵物とシクロデキストリンを接触させた後に、上層に分離した水分を除去することが好ましい。シクロデキストリンに包接されなかった糖類や脂質類を除去し、発酵生成物の回収効率を高めるためである。その後、必要に応じて、得られた酵素処理物を加熱して酵素を失活させる。
【００１４】
得られた酵素処理物について単離精製を行う。単離精製には活性成分を単離する公知の方法が用いられる。当該方法として、例えば分離用担体や吸着用樹脂を用いた方法が示される。分離用担体や吸着用樹脂も公知であって、例えば、多孔性の酸化ケイ素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体などであり得る。具体例として、ダイヤイオン樹脂（商品名：三菱化学社製）が示される。これらに活性成分を吸着させた後、適切な分離用溶媒により化合物を溶出させる。分離用溶媒は、分離用担体や吸着用樹脂に応じて選択され、例えば、メタノール、エタノール、酢酸エチル、エチルエーテルなどの有機溶媒やこれらの有機溶媒と水との混液が例示される。また、複数の分離用溶媒や分離用担体を用いて、単離精製を行うことができる。
【００１５】
こうして得られた化合物は、メラニン産生抑制作用及び筋肉疲労回復作用を有する。メラニン産生抑制作用は紫外線照射時におけるメラニンの産生を抑制する作用であって、紫外線による日焼け防止や美白用として使用され得る。筋肉疲労回復作用は、疲労した筋肉細胞を増殖し、細胞のＡＴＰ産生を促す。これにより、筋肉の疲労回復が図られる。
【００１６】
本発明に係る化合物はメラニン産生抑制剤や筋肉疲労回復剤として単独で使用され得るが、通例、当該化合物を含む組成物として提供される。組成物の形態はヒトなどの動物に適用され得る形態であれば限定されない。組成物は、例えば、経口用組成物であり、外用組成物であり、注射用組成物でもあり得る。また、組成物は医薬組成物であり、化粧用組成物であり、医薬部外用組成物であり、食品組成物でもあり得る。その剤形も限定されることがなく、例えば、錠剤であり、散剤であり、顆粒剤であり、カプセル剤であり、クリーム剤であり、ローション剤であり、液剤であり、硬膏剤であり、流動物であり、ゼリーのような半固形剤でもあり得る。
【００１７】
組成物は、本発明に係る化合物と組成物の製剤化に必要な添加剤を含む。添加剤として、例えば賦形剤のような担体、水や油分などの基剤、乳化剤、安定剤、ｐＨ調整剤、コーティング剤、崩壊剤、結合剤が示される。
【００１８】
組成物中の化合物の含有量は、剤形や適用される対象（例えば、成人や子供の別、体重、使用目的、症状（筋肉疲労度）など）によって適宜決定され得るが、概ね０.００１％〜９９.９％、好ましくは０.００５％〜５０％、さらに好ましくは０.０１％〜２０％である。
【００１９】
また、本発明に係るメラニン産生促進剤又は筋肉疲労回復剤には、前記化合物に替えて、あるいは前記化合物に加えて、ロンガンの果実と大豆の納豆菌による発酵物を用いることもできる。当該発酵物は、前述したロンガンの果実と大豆の納豆菌による発酵物、つまりシクロデキストリンを加える前の発酵物でもあり、これにシクロデキストリンを加えて得られたシクロデキストリン複合物を酵素処理した処理物でもあり、さらには酵素処理した処理物の粗精製物でもあり得る。発酵物は、そのままメラニン産生促進剤又は筋肉疲労回復剤として用いてもよく、化合物を用いて組成物とする場合と同様に発酵物を含む組成物としても使用され得る。組成物中の発酵物の含有量は、剤形や適用される対象（例えば、成人や子供の別、体重、使用目的、症状（筋肉疲労度）など）によって適宜決定され得るが、化合物として概ね０.００１％〜９９.９％、好ましくは０.００５％〜５０％、さらに好ましくは０.０１％〜２０％である。
【００２０】
以下、本発明について下記実施例に基づいて本発明について詳細に説明する。
【実施例１】
【００２１】
（化合物の精製）
ロンガンの果実乾燥物を粉砕機で粉砕した果実粉砕物１ｋｇを発酵用タンクに入れ、水４Ｌを加えた。一方、大豆を３７℃で９０分間加温した後、粉砕した大豆粉砕物１.８ｋｇを前記発酵用タンクに加えた。これに２０ｇの納豆菌（納豆素本舗社製）を添加し、攪拌しながら４３℃で４２時間発酵させた。この発酵物に２Ｌの水を加えた後、珪藻土を用いたろ過器でろ過を行った。得られたろ液にα−シクロデキストリンを添加して３０℃で２時間加温し、シクロデキストリン複合物を分取した。そして、分取した複合物に水を加えてセルラーゼ（セルラーゼＴアマノ４：アマノ製薬社製）によりシクロデキストリンを酵素分解し、９０℃で１時間加温することでセルラーゼを失活させた。この反応物をろ紙でろ過し、酵素処理物とした。
【００２２】
次に酵素処理物１００ｇを５００ｍＬのエタノールに懸濁させ、吸着剤（三菱化学社製、ダイヤイオンＡＭＰ０３）を充填したカラムに通液した後、５v/v％のエタノール含有水１.３Ｌ、１０v/v％のエタノール含有水１.０Ｌ、６０v/v％のエタノール含有水４００ｍＬで順次洗浄した後、８０v/v％エタノール含有水１.０Ｌで溶出して、溶出物を採取した。この溶出物を減圧乾燥機でエタノールと水を除去した後、凍結乾燥機で凍結乾燥して、精製物１９ｇを得た。
【００２３】
この精製物をエタノールに溶解して、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析計）及びＨ1−ＮＭＲ（核磁気共鳴分析装置）により解析を行った。この結果から、分子量が約６６３である次の化学式で示される化合物（Ｃ30Ｈ43Ｏ11Ｎ6）であると結論づけられた。
【化１】
0005872094.tif 000004
【００２４】
（メラニン産生抑制作用）
上記化合物のメラニン産生抑制作用を調べた。ヒト由来メラニン細胞（Melanocell：クラボウ社製）を５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ−１６４０培地（シグマ社製）に播種し、３７℃で培養した。増殖期にある細胞を細胞し、１セル当たり１０4個の細胞を２４穴培養プレートに播種した。これに試験溶液を添加し、紫外線照射装置に入れ、２ｋＷの出力で１時間照射した。試験溶液は、上記乾燥物の水溶液を終濃度が表１に示す濃度となるように添加した。また、対照として生理食塩水を用いた。照射した紫外線領域はＵＶＡとＵＶＢ領域であり、線量は日本の夏の日中１時間に暴露される紫外線量にほぼ等しい量とした。その後、３７℃で４８時間培養し、細胞数を計数した。また、培養後の細胞を超音波破砕して得られた細胞ホモジュネート中のメラニン量を、Nieuwpoortらの方法に従って測定した。その結果を表１に示す。表１に示すように、上記で得られた化合物は対照に比べて有意にメラニン産生抑制効果を示した。
【００２５】
【表１】
0005872094.tif 000005
【００２６】
（筋肉疲労回復作用）
上記化合物の筋肉疲労回復作用を調べた。ヒト由来筋肉細胞（ヒト骨格筋細胞  ＨＳｋＭＣ（Human Skeletal Muscle Cell：東洋紡社製）を５％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地（シグマ社製）に播種し、３７℃で培養した。増殖期にある細胞を細胞し、１セル当たり１０4個の細胞を２４穴培養プレートに播種した。これに筋肉疲労物質として炎症性サイトカイン（ＩＬ−６：フナコシ社製）を各セルに１０μｇを添加した。次いで２４穴培養プレートの各穴に試験溶液を添加し、さらに、５％炭酸ガス下、３７℃で培養インキュベータ中で４８時間培養した。ここに試験溶液を添加して、さらに３７℃で４８時間培養した。試験溶液は、上記乾燥物の水溶液を終濃度が表２に示す濃度となるように添加した。また、対照として生理食塩水を用いた。４８時間培養後の細胞数を計数すると共に、培養後の細胞を超音波破砕して得られた細胞ホモジュネート中のＡＴＰ量を、ＡＴＰ測定キット（東洋インキ社製）を用いて測定した。その結果を表２に示す。表２に示すように、上記で得られた化合物は対照に比べて有意に筋肉細胞数が増加し、ＡＴＰ含有量も増加した。このように、上記化合物は筋肉疲労に対して疲労回復作用を有することが示された。
【００２７】
【表２】
0005872094.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明に係る化合物は、メラニン産生抑制剤及び筋肉疲労回復剤として利用され得る。
【要約】
【課題】  メラニン産生抑制作用及び筋肉疲労の回復作用を示す新規な化合物を提供し、新規なメラニン産生抑制剤及び筋肉疲労回復剤を提供する。
【解決手段】  ロンガンの果実と大豆の混合物を納豆菌で発酵させた後、シクロデキストリンと接触させて生成されたシクロデキストリンとの複合物を取得し、その後セルラーゼで酵素処理を行う。次いで、ダイヤイオン（商品名：三菱化学社製）などの吸着樹脂と接触させた後、６０％エタノール水溶液で溶出して、次の化学式１で示される化合物を得る。当該化合物をメラニン産生抑制剤及び筋肉疲労回復剤として使用する。
【化１】
0005872094.tif 000011
【選択図】なし