【手続補正書】
【提出日】平成23年3月17日(2011.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、迅速に絹フィブロインのゲル化を生じさせる方法：
実質的な絹フィブロインのゲル化が超音波処理後の24時間未満で生じる、
ゲル化を開始させるのに十分な時間の超音波処理を含む処理に絹フィブロインを曝露する段階。
【請求項２】
絹フィブロインのゲル化が、超音波処理後の2時間未満で生じる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
絹フィブロインが、超音波処理後の約5分間〜約2時間までの範囲の時間でゲル化する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記処理が塩溶液をさらに含み、
該塩溶液が、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、銅、亜鉛およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるイオンを任意で含む、
請求項1、2または3記載の方法。
【請求項５】
絹フィブロインが、約pH 4もしくはそれより低いpH、または約pH 7.5もしくはそれより高いpHを有する水溶性溶液の形態である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
塩がカリウムであり、
塩濃度が100 mM未満であり、かつ
塩溶液のpHが約pH 4またはそれより低い、
請求項4記載の方法。
【請求項７】
絹フィブロインが約2時間以内に実質的にゲル化する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法を用いることによって絹フィブロインのゲル化時間を制御する方法。
【請求項８】
超音波処理の振幅および絹フィブロイン溶液の濃度によって、ゲル化時間を制御する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
絹フィブロイン溶液の濃度および塩溶液の濃度によってゲル化時間が制御され、かつ任意で、
絹フィブロインの濃度が4wt%またはそれより低く、該塩溶液がカリウムイオンを含み、かつ該カリウム塩溶液の濃度が20 mM〜100 mMまでの範囲である、
請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
塩溶液の濃度およびpHによってゲル化時間が制御され、かつ任意で
該塩溶液がカリウムイオンを含み、該カリウム塩溶液の濃度が20 mM〜100 mMまでの範囲であり、かつ該溶液のpHがpH 4またはそれより低い、
請求項7記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、少なくとも一つの物質を絹フィブロイン中に封入する方法：
ゲル化を開始させるための時間の超音波処理に絹フィブロイン溶液を接触させる段階；および
絹フィブロイン溶液中で実質的なゲル化が起こる前に、絹フィブロイン溶液に該物質を導入して、絹フィブロイン封入された物質を形成する段階。
【請求項１２】
以下の段階を含む、少なくとも一つの物質を絹フィブロイン中に封入する方法：
絹フィブロイン溶液に該物質を導入する段階；および
ゲル化を開始させるための時間の超音波処理に絹フィブロイン溶液を接触させて、絹フィブロイン封入された物質を形成する段階。
【請求項１３】
前記物質が、治療剤もしくは生物学的材料またはその両者であり、かつ/または
該物質が、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、PNA、アプタマー、抗体、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、抗菌性化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの生物学的材料であり、かつ/または
該細胞が幹細胞であり、かつ/または
細胞増殖培地が、生物学的材料と共に絹フィブロイン中に導入され、かつ/または
該物質が、小分子、薬物およびそれらの組み合わせからなる群より選択される治療剤である、
請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
実質的なゲル化が約2時間以内に起こり、かつ/または
実質的なゲル化が、約5分間〜約2時間までの範囲の時間内に起こり、かつ/または
前記処理が塩溶液をさらに含み、かつ/または
絹フィブロインが、約pH 4もしくはそれより低いpH、または約pH 7.5もしくはそれより高いpHを有する水溶性溶液の形態である、
請求項12または13記載の方法。
【請求項１５】
生体送達装置として使用するための、請求項12および13記載の方法によって得られる絹フィブロイン封入された生物学的材料。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【図１】様々な音波処理条件下での絹フィブロイン（SF）のゲル化を示す。0.5 mlの水溶性溶液を使用し、20%の振幅および5秒〜30秒の幅のある時間で音波処理を行った。値は、各群に関して、N＝3試料の最小値の平均値±標準偏差である。*群の間の有意差を示す（スチューデントt検定、p＜0.01）。
【図２】ゲル化プロセスの間の動的な絹β−シート構造の形成を示す。図2Aは、120分間の音波処理後に、8分毎に取得された波長スキャンを用いて、音波処理された2%（w／v）絹フィブロイン水溶性溶液における円偏光二色性（CD）の測定値を示す。図2Bは、時間に対して記録された、217 nm（β−シート構造のピーク）での楕円率増加の図表を示す。図2Cは、絹ゲル化のメカニズムの模式図である。ゲル化プロセスは、以下の二つの動態段階を含む。（a）短い時間枠内で生じるある鎖間の物理的架橋を伴う、ランダムコイルからβ−シートへの構造変化；（b）β−シート構造の拡張、大量の鎖間β−シート架橋の形成、および比較的長い時間枠にわたってゲル網状組織への分子の組織化。
【図３】絹フィブロインのゲル化に対する、塩およびpHの効果を示す。音波処理に先立ち、様々な濃度の溶液を、20 mM〜200 mMの最終濃度にK＋（図3A）およびCa2+（図3B）を用いて補足した。図3Cは、音波処理前の絹フィブロイン水溶性溶液のpHの調整効果を示す。全ての試料に関して、20%の振幅で15秒間音波処理を行った。値は、各群に関して、N＝3試料の最小値の平均値±標準偏差である。*、◇群の間の有意差（スチューデントt検定、p＜0.05）。
【図４】絹フィブロインハイドロゲルの機械的性質を解析する図表を提示する。図4Aは、30Amp、40Amp、または50Ampの条件下の、様々な濃度である4%、8%および12%（x軸）における絹フィブロインゲルの降伏強さ（kPa）（y軸）を示す。図4Bは、30Amp、40Amp、または50Ampの条件下の、様々な濃度である4%、8%および12%（x軸）における絹フィブロインゲルの弾性率（kPa）（y軸）を示す。図4Cは、様々な濃度である4%、8%および12%（x軸）における絹フィブロインゲルの平衡率（kPa）（y軸）を示す。
【図５】絹フィブロインハイドロゲルの酵素分解を示す。4%、8%および12%（w／v）のハイドロゲルを音波処理によって調製し、かつPBS pH 7.4（対照）またはPBS中のプロテアーゼXIV（5 U／ml）のいずれかに7日間浸漬した。各時点でのゲルプラグの湿重量を元の湿重量と比較することによって、残留質量を決定した。値は、N＝4試料の最小値の平均値±標準偏差である。
【図６】絹フィブロインハイドロゲル中に封入されたhMSCのDNA定量をグラフにより示す。各ゲル群中のDNA含量をPicoGreenアッセイ法を用いて解析し、結果を各ゲルプラグの湿重量によって正規化した。値は、N＝4試料の最小値の平均値±標準偏差である。*群の間の有意差（スチューデントt検定、p＜0.05）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
音波処理に先立ち、絹フィブロインの水溶性溶液を、K＋およびCa2＋を用いて生理学的に妥当な様々な濃度まで補足した。図3Aに示されるように、低いK＋濃度（20 mM〜50 mM）では、K＋濃度の上昇に伴いゲル化時間が有意に減少した（p＜0.05 *試料の間）。しかしながら、高いK＋濃度（100 mM〜200 mM）ではゲル化が阻害された（図3A）。これらの結果は、0.5%〜8%（w／v）の範囲の絹フィブロイン濃度に関して観察された。8%超では、ゲル化が全ての試料において急速に起こったため（2分未満）、いかなる塩効果も観察されなかった。K＋と比較して、同一濃度のCa2＋において、より遅い絹フィブロインのゲル化が誘導された（図3Aおよび3Bを比較のこと）。Ca2＋濃度を20 mMから200 mMまで増加した場合に、絹フィブロインのゲル化時間は有意に増加した（p＜0.05 図3B中の*試料の間）。対照的に、本アプローチにおける観察とは異なる結果であるが、以前の研究においては、K＋はいかなる効果も有しなかったが、Ca2＋は絹フィブロインのゲル化を促進した（Kim et al., 2004）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の方法により生じるハイドロゲルは、良好な機械的性質およびタンパク質分解プロファイルの双方を示す。例えば、4%、8%および12%（w／v）の絹フィブロイン溶液は、音波処理され、その後、hMSCが添加され、0.5時間〜2時間以内にゲル化した。細胞は、21日間にわたって4%ゲル中で成長かつ増殖した。さらに、ゲル化を促進するために、低濃度のK＋および低pHを使用してもよい。
[請求項1001]
以下の段階を含む、迅速に絹フィブロインのゲル化を生じさせる方法：
実質的な絹フィブロインのゲル化が超音波処理後の24時間未満で生じる、
ゲル化を開始させるのに十分な時間の超音波処理を含む処理に絹フィブロインを曝露する段階。
[請求項1002]
絹フィブロインのゲル化が、超音波処理後の2時間未満で生じる、請求項1001記載の方法。
[請求項1003]
絹フィブロインが、超音波処理後の約5分間〜約2時間までの範囲の時間でゲル化する、請求項1001記載の方法。
[請求項1004]
前記処理が塩溶液をさらに含む、請求項1001記載の方法。
[請求項1005]
塩溶液が、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、銅、亜鉛およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるイオンを含む、請求項1004記載の方法。
[請求項1006]
絹フィブロインが、約pH 4もしくはそれより低いpH、または約pH 7.5もしくはそれより高いpHを有する水溶性溶液の形態である、請求項1001記載の方法。
[請求項1007]
塩がカリウムであり、
塩濃度が100 mM未満であり、かつ
塩濃度のpHが約pH 4またはそれより低い、
請求項1005記載の方法。
[請求項1008]
以下の段階によって、絹フィブロインのゲル化時間を制御する方法：
絹フィブロインが約2時間以内に実質的にゲル化する、
ゲル化を開始させるのに十分な時間の超音波処理に絹フィブロイン溶液を接触させる段階。
[請求項1009]
絹フィブロインが、超音波処理後の約5分間〜約2時間までの範囲の時間でゲル化する、請求項1008記載の方法。
[請求項1010]
超音波処理の振幅および絹フィブロイン溶液の濃度によって、ゲル化時間を制御する、請求項1008記載の方法。
[請求項1011]
前記処理が塩溶液をさらに含む、請求項1008記載の方法。
[請求項1012]
絹フィブロイン溶液の濃度および塩溶液の濃度によってゲル化時間を制御する、請求項1011記載の方法。
[請求項1013]
絹フィブロインの濃度が4wt%またはそれより低く、
塩溶液がカリウムイオンを含み、かつ
カリウム塩溶液の濃度が20 mM〜100 mMまでの範囲である、
請求項1012記載の方法。
[請求項1014]
塩溶液の濃度およびpHによってゲル化時間を制御する、請求項1011記載の方法。
[請求項1015]
塩溶液がカリウムイオンを含み、
カリウム塩溶液の濃度が20 mM〜100 mMに及び、かつ
溶液のpHがpH 4またはそれより低い、
請求項1014記載の方法。
[請求項1016]
以下の段階を含む、少なくとも一つの物質を絹フィブロイン中に封入する方法：
ゲル化を開始させるための時間の超音波処理に絹フィブロイン溶液を接触させる段階；および
絹フィブロイン溶液中で実質的なゲル化が起こる前に、絹フィブロイン溶液に該物質を導入して、絹フィブロイン封入された物質を形成する段階。
[請求項1017]
前記物質が、治療剤もしくは生物学的材料またはその両者である、請求項1016記載の方法。
[請求項1018]
前記物質が、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、PNA、アプタマー、抗体、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、抗菌性化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの生物学的材料である、請求項1017記載の方法。
[請求項1019]
前記細胞が幹細胞である、請求項1018記載の方法。
[請求項1020]
細胞増殖培地が、生物学的材料と共に絹フィブロイン中に導入される、請求項1018記載の方法。
[請求項1021]
前記物質が、小分子、薬物およびそれらの組み合わせからなる群より選択される治療剤である、請求項1017記載の方法。
[請求項1022]
絹フィブロイン封入された生物学的材料が、生体送達装置に適切である、請求項1016記載の方法。
[請求項1023]
実質的なゲル化が約2時間以内に起こる、請求項1016記載の方法。
[請求項1024]
実質的なゲル化が、約5分間〜約2時間までの範囲の時間内に起こる、請求項1016記載の方法。
[請求項1025]
前記処理が塩溶液をさらに含む、請求項1016記載の方法。
[請求項1026]
絹フィブロインが、約pH 4もしくはそれより低いpH、または約pH 7.5もしくはそれより高いpHを有する水溶性溶液の形態である、請求項1016記載の方法。
[請求項1027]
以下の段階を含む、少なくとも一つの物質を絹フィブロイン中に封入する方法：
絹フィブロイン溶液に該物質を導入する段階；および
ゲル化を開始させるための時間の超音波処理に絹フィブロイン溶液を接触させて、絹フィブロイン封入された物質を形成する段階。
[請求項1028]
前記物質が、小分子、薬物およびそれらの組み合わせからなる群より選択される治療剤である、請求項1027記載の方法。
[請求項1029]
実質的なゲル化が約2時間以内に起こる、請求項1027記載の方法。
[請求項1030]
実質的なゲル化が約5分間〜約2時間までの範囲の時間内に起こる、請求項1027記載の方法。