【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年12月24日(2010.12.24)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  脂肪を減少する効果を有するヒト単クローン抗体
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は精製ポリペプチド（ＳＡＭ−６．１０）、ならびにこれに通常アジュバントおよび／または担体物質を組み合せて脂肪を減少する効果を有する薬剤を製造するための、および腎臓疾患を治療する薬剤を製造するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内の過剰なコレステロール（高リポタンパク血症）は血管内部の層の硬化（動脈硬化プラーク）を招き、動脈壁を次第に硬化し、しかも厚くする。極端な場合には、血管を閉塞したり、あるいはプラークが破裂した場合には血栓形成を招くおそれがある。動脈硬化症は、その二次疾患（冠動脈疾患，心臓発作，末梢動脈疾患および発作）とともに、西欧諸国においていまだにもっとも多い死因である。医療のために使用可能な財源全体の優に半分以上が、動脈硬化症の影響のために費やされるものと推定されている。動脈硬化症の原因を明確にするために、多くの学説が展開されているが、脂質説が最も重要視されている。
【０００３】
一般的に、血液中のＬＤＬコレステロールのレベルまたは酸化ＬＤＬコレステロールのレベルが高いほど、血管硬化のリスクが高いと言うことができ、これは例えば、心臓発作という結果を伴う。太りすぎや高コレステロール血症は、動脈硬化症を進行させる最も重要なリスク要因である。
【０００４】
定義と用語
コレステロールのような脂肪は水にも、血漿にも溶けない。それにもかかわらず個体の体内領域への脂肪の輸送を可能にするために、その脂肪は血液中に生じるとすぐに特定のアルブミン様物質（タンパク質）と結合する。脂質（脂肪）およびタンパク質を含む、これらの化合物はリポタンパク質と呼ばれる。
【０００５】
血漿の「リポタンパク質」は、脂質（コレステロール，トリグリセリド、およびリン脂質）およびアポリポタンパクを含む、高分子量の水溶性複合体である。コレステロール含有リポタンパクＬＤＬコレステロールは動脈硬化を引き起こし、「悪玉」コレステロールとしても知られ、コレステロールが酸化型である場合は体に対してよりいっそう危険なものである。
【０００６】
「コレステロール」は体内のいたるところで合成され、そして細胞膜およびリポタンパク質の必須成分である。やはり内在的に合成されるトリグリセリドおよびリン脂質とは対照的に、コレステロール分子のステロール環は再度分解されることがなく、コレステロールは肝臓内で胆汁酸に変換するか、変化することなく胆汁とともに消化管中に排出される。
【０００７】
コレステロールは血漿中に、２５乃至４０％が遊離（エステル化しない）コレステロールして、および６０乃至７５％が不飽和脂肪酸でエステル化されて存在する。これら二つの形のコレステロールを合わせて、総コレステロールとして知られている。その低い水溶性のために、コレステロールはアポリポタンパクとの複合体として血漿中に輸送される。血液中において、総コレステロールの約７０パーセントが低比重リポタンパク（ＬＤＬ）を介して輸送される。
【０００８】
「トリグリセリド」は３つの脂肪酸残基を有するグリセリンのエステルである。コレステロールと同様にして、トリグリセリドは溶解性が低いためにアポリポタンパク質と結合して血漿中に輸送される。
【０００９】
「リポタンパク質」は肝臓あるいは消化管内で合成され、コレステロールのような脂溶性物質を血液中に輸送する。
【００１０】
リポタンパク質はその比重に応じて５つの比重クラス、すなわちカイロミクロン、超低比重リポタンパク（ＶＤＬ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）および高比重リポタンパク（ＨＤＬ）とに区分されている。カイロミクロンは、空腹時血清中の生理的濃度が他のリポタンパクと異なって非常に低く、外因性グリセリドを輸送するための媒体である。その他のリポタンパクの生理的分布は、次の通りである：すなわち、ＶＬＤＬ１０％，ＬＤＬ７０％、そしてＨＤＬ２０％である。ＶＬＤＬはＬＤＬの前駆体であり、かつ内在性グリセリドを輸送する媒体である。ＬＤＬはＶＬＤＬの加水分解によって生成される。ＬＤＬおよびＨＤＬはいずれも細胞コレステロールホメオスタシスの制御因子であって、ＨＤＬとともに脂肪分解（トリグリセライドをグリセロールと遊離脂肪酸とに分ける）も調節する。ＬＤＬは約２０ｎｍの直径を有する。ＨＤＬは最も小さく（７−１０ｎｍ）、そして最もタンパク質に富むリポタンパクである。天然のＬＤＬ（ＬＤＬ）に加え、酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）もまた血清中に検出することができる。ｏｘＬＤＬは特定のリガンドを介して内在性血漿タンパク質、特に糖タンパク質と相互作用し、ｏｘＬＤＬ糖タンパク複合体を形成する。
【００１１】
「アポリポタンパク」はリポタンパク質の一成分であり、極性脂質と共に、外殻の一種として、リポタンパク質のコアを取り囲んでいる。アポタンパクＢのみを含有しているＬＤＬを除いて、個々のリポタンパク質クラスは、異なる構造を有する複数のアポリポタンパククラスを有する。
【００１２】
リポタンパク質輸送
コレステロールは主として、２種類のリポタンパク質クラスであるＬＤＬおよびＨＤＬを介して輸送される。ＬＤＬは、ＬＤＬのための特定の受容体を持っている末梢細胞にコレステロールを輸送する役目を主に果たす。ＨＤＬは肝外細胞および血管壁からのコレステロールの除去を可能にし、促進し、そしてそのコレステロールを肝臓へ輸送する。
【００１３】
病理学
脂質代謝障害の病理について考慮するならば、一般的に、ＬＤＬコレステロールの上昇は、ＨＤＬコレステロールの低下と併せて動脈硬化のリスクをもっとも顕著に高めるということができる。したがって病理学では、ＬＤＬ（その粒子は動脈硬化プラークの形成に実質的に寄与する）およびＨＤＬは相反する役割を果たす。総コレステロール／ＨＤＬコレステロールの指数、そして、とくにＬＤＬコレステロール／ＨＤＬコレステロールの指数が、心臓発作のリスクを評価するための決定的要因である。（疫学的研究（フラミンガム研究）もまたＨＤＬコレステロールの防御効果に言及している。）動脈硬化の二次疾患は、冠状動脈性心臓疾患および末梢動脈疾患に加えて、心臓および脳の梗塞（卒中）を含む。
【００１４】
ｏｘＬＤＬは、ＬＤＬと同様に、動脈硬化プラークをもたらすおそれがあり、ｏｘＬＤＬは体に対して最大の危険をもたらす。
【００１５】
しかしｏｘＬＤＬは、その他の疾病においても重要な役割を果たすと思われる。慢性腎臓不全症および糖尿病の患者では、ｏｘＬＤＬ糖タンパク質複合体の濃度が健康な患者たちにおけるよりもはるかに高いのである。
【００１６】
ＬＤＬもまた、肝臓によって、およびマクロファージによって、血液の循環から除かれる。マクロファージは免疫系の細胞で、大きな粒子の貪食をすることができる。
【００１７】
「スカベンジャー経路」は、細胞がいかに粒子を取り込む（食作用）かを説明するための周知のモデルである。食細胞内部への固体粒子（デブリス、異物、バクテリア、あるいはＬＤＬプラーク）の取り込みは、それに引き続く細胞内分解とともに、食作用によって行われる。食細胞は貪食細胞として知られ、そして主として組織マクロファージおよび移動性血中単球からなっている。
【００１８】
食作用において、Ｆｃおよび細胞膜上の補体レセプターに結合することによって粒子が食細胞の細胞膜に付着した後、収縮構造が細胞質内において活性化される。ついで、細胞膜の局所的な反転が、細胞質の空胞中に粒子を封入させる。
【００１９】
いわゆるスカベンジャー食細胞は、髄質を含む線維中の、およびそれに沿ったリンパ節に見出される。
【００２０】
リンパ液がリンパ節の輸入管から輸出管を通過する際、特定の抗原が食細胞によって除去される。
【００２１】
多形核白血球およびマクロファージなどの食細胞への接着は、バクテリア（および他の抗原）の表面に免疫グロブリン（Ｉｇ）が接着することによって増加する。この接着の増加は、免疫グロブリンのＦｃ成分が食細胞のＦｃレセプターに接着することにより影響されると思われる。抗原が抗体の接着（または結合）によって「食欲をそそる」ようにされた後、抗原および抗体の複合体が食細胞によって取り上げられ、食細胞によって速やかに摂取される。免疫グロブリンによる抗体表面の被覆もまたオプソニン媒介性（Ｆｃ）接着として知られ、免疫反応において重要な役割を果たす。
【００２２】
菌体の表面に結合している抗体は細胞外液の特定の成分を固定することができる。一般名では、これらの成分は「補体」と名付けられている。動物実験によって、抗体で被われた細胞の食作用は、補体を欠損した動物では遅滞していることが示されてきた。したがって、オプソニン化は抗体および補体の間に相乗効果をもたらすことが明らかである。
【００２３】
発明の説明
ＬＤＬコレステロールを減少させるための従来技術における薬剤は、コレステロール合成（ＣＳＥ）のための鍵酵素を阻害することによって作用する。例えば、ある種のコレステロール合成阻害剤は商品名「リポベイ（Ｌｉｐｏｂａｙ）として知られるようになった物質である。ＣＳＥ阻害剤の副作用は通常無視できないものであり、とくに、胃腸病、睡眠障害、めまい、視覚障害、アレルギー性反応、および脱毛等が挙げられる。これに対する対策は、専ら試験段階であって、特に、重症の家族性の高コレステロール血症の場合に限って、体細胞の遺伝子治療法がある。この治療法はＬＤＬレセプターの遺伝子を自原性肝臓細胞へ転移することから成っている。
【００２４】
これまでに、脂肪減少剤として働き、副作用がほとんどない物質が市場で手に入ることはなかった。特に、細胞内における大量のリポタンパク質の蓄積を誘導する抗体はこれまでに知られていない。腎臓疾患（腎臓の糸球濾過系統における脂質誘導性の細胞損傷）におけるリポタンパク質の有害な作用は周知であるが、腎臓疾患、とくに糸球体壊死の、抗体を基本とする治療法はこれまでに全く存在しない。
【００２５】
この発明の目的は、梗塞のリスクを減少するという有利な目標とともに、ヒト及び動物のＬＤＬコレステロールまたはｏｘＬＤＬコレステロールを減少させるための薬剤の製造のための新規な物質または新規な物質クラスを生成することにある。
【００２６】
この目的を達成するために、ポリペプチドを提案する。そのアミノ酸配列は配列番号：１および／または配列番号：３のアミノ酸配列と本質的に同一であって、そして、
−低比重リポタンパク（ＬＤＬ）および／または酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）、とくにＬＤＬコレステロールおよび／または酸化ＬＤＬコレステロール（ｏｘＬＤＬコレステロール）に結合する。
【００２７】
この発明の要旨は、その配列がヒト単クローン抗体（ＳＡＭ６．１０）の軽鎖（ＶＬ）または重鎖（ＶＨ）に全体的または部分的に一致する精製ポリペプチドが、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）および／またはｏｘＬＤＬの減少をもたらすという驚くべき観察結果にある。この性質の発見（それは、対応する医薬製剤における脂肪減少剤としての該ポリペプチドの使用を示唆する）は、該ポリペプチドの生化学的特徴付けの過程でなされた。好都合なことに、この発明によるポリペプチドあるいは該ポリペプチドのフラグメントの、ＬＤＬおよび／またはｏｘＬＤＬへの結合ならびにＶＬＤＬ、ＬＤＬの前駆体への結合は、ＨＤＬへの結合よりも強力なのである。この性質の結果として、この発明によるポリペプチドはＬＤＬ／ＨＤＬおよび／またはｏｘＬＤＬ／ＨＤＬのそれぞれの指数について低い値をもたらし、そしてしたがって、梗塞のリスクを最小限にする。
【００２８】
該ポリペプチドと、低比重リポタンパク（ＬＤＬおよび／またはｏｘＬＤＬ）もしくはＬＤＬコレステロールおよび／またはｏｘＬＤＬコレステロールとの特異的な結合は、ＥＬＩＳＡ法によって実験的に証明されている。それと同じ実験で、この発明による物質の高比重リポタンパク（ＨＤＬ）との結合が弱いことを証明することも可能であった。
【００２９】
この発明による抗体は、抗体を記載するための通常の命名法にしたがってＶＬ，ＶＨ，Ｆｖ，Ｆｃ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２と名付けられているグループを含む。前記グループはまた、フラグメントとしても知られている。単一のフラグメントが、この発明によるポリペプチドの脂肪減少効果の要因となることはまったく可能である。この発明による物質のさらなる発展において、その物質はヒト単クローン抗体である。
【００３０】
「機能性フラグメント」という用語は、この発明の趣旨において、完全なポリペプチドによっても示される生物学的活性のうちの少なくとも１つを有するポリペプチドを示す。抗体の場合には、例えば、すべてのＣＤＲ領域が特異的結合に必要なわけではないことが知られている。すなわち、抗体の特異的結合は、ただ１つのＣＤ領域によってもたらされ得るが、全部で３つのＣＤ領域が存在する。該抗体の抗原への特異的結合は、例えば、アポトーシスの誘導、あるいは細胞増殖の抑制をもたらすことができる。機能性フラグメントの生物学的活性は当業者に周知であるさまざまな方法で測定することができる。抗体とＬＤＬとの間、特にＬＤＬコレステロールとの間の相互作用を測定する方法はＥＬＩＳＡ法である。
【００３１】
該ポリペプチド配列の相補性−決定領域（ＣＤＲｓ）は、アミノ酸配列
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（ＣＤＲ１）、
Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＣＤＲ２）および
軽鎖の可変領域（ＶＬ）の配列番号：１のＧｆｎ−Ａｌａ−ＴｒｐＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ｌｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（ＣＤＲ３）と本質的に同一なアミノ酸配列を含む；図２も参照のこと。
【００３２】
該ペプチド配列の相補性−決定領域（ＣＤＲｓ）は、
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ （ＣＤＲ１）、
Ｖａｌ−ｌｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ＣＤＲ２）および軽鎖の可変領域（ＶＨ）の配列番号：３のＡｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＣＤＲ３）と本質的に同一なアミノ酸配列を含む；図４も参照のこと。
【００３３】
ポリペプチドあるいは核酸配列は、参考文献としてまたは核酸配列（配列番号：２および４）として引用されるアミノ酸配列（配列番号：１および３）と少なくとも７５％，８０％，８５％または９０％の［同一性］を有するものであれば、「本質的に同一」と言える。該ポリペプチドまたは核酸配列のさらなる発展において、引用された参考文献と比較して少なくとも９５％，９８％，９９％または１００％の同一性が示され得る。ポリペプチドについては、比較部分が一般的に少なくとも５，１０，１５連続アミノ酸であること、好ましくは、少なくとも２０または２５連続アミノ酸であることが望ましい。
【００３４】
この発明によるポリペプチドは、ハイブリドーマ技術（ケーラー、ミルシュタイン、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、Ｖｏｌ．２５６  ４９５）の名前で知られた方法によって生成することができ、単クローン抗体の分離を可能にする。これは、無制限の生存能力および複製能力を有するミエローマ細胞（例えばＨＡＢ−１）と正常リンパ球との細胞融合によって得られるハイブリッド細胞の試験管内における分離に基づくものである。この方法によって製造されたハイブリドーマ細胞は双方の親細胞の性質を具備する。対応して、これらの細胞は、抗体（例えばＳＡＭ６．１０）を産生するリンパ球の能力および無制限に分裂するミエローマ細胞の能力を備え、それによって多量の抗体を産生する能力を有する。該ハイブリドーマ細胞は複製し、そして所望の特異性の抗体を産生する細胞が選択される。この選択の培養およびその分離は、高い特異的反応性を有する抗体をもたらし、これらの抗体は特定の抗原決定因子とのみ反応する。
【００３５】
血漿中における、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）レベル（またはＬＤＬコレステロールレベル）、またはそれぞれの酸化型の実質的な減少の証拠は、検出可能範囲にＨＤＬレベルが存在しない動物実験によって確認された。これらの本質的な特徴は、抗体の投与中には、動物の生命機能はいかなる影響も及ぼされないことであり、したがって、この発明による物質は、記載された限りにおいて副作用がないと言える。（この発明による抗体のメカニズムは、周知のスカベンジャー径路のメカニズムとの類似性により説明できるかもしれない。）
【００３６】
この発明による薬剤を使用するための他の適応は、腎臓疾患、とくに糸球体壊死（糸球体硬化症）の治療である。
【００３７】
この発明によるポリペプチドが、薬剤の製造のために、好ましくは精製された形態で用いられることは本発明の範囲に含まれ、精製のためには、当業者に周知のすべての方法（たとえば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過）が考慮に入れられる。この発明による物質の適応としては、ＬＤＬまたはＬＤＬ−コレステロールの選択的減少に重きを置いて脂肪減少効果を最も重視する。ＬＤＬおよび／またはｏｘＬＤＬがＨＤＬよりも更に強力に結合するという性質の結果として、この発明によるポリペプチドは、ＬＤＬ／ＨＤＬおよび／またはｏｘＬＤＬ／ＨＤＬの指数について低い値をもたらし、それによって梗塞のリスクを最小限にする。
【００３８】
薬剤を製造するためのアジュバントおよび担体物質は当業者に周知であり、通常の手段を用いて製造することができる。（レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：ザ．サイエンス．アンド．プラクティス．オブ．ファーマシイ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）（第２０版）、発行所エイ．アール．ゲエンナロ．リピンコット．ウィリアムズ．アンド．ウイルキンス社（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２０００年、および製剤技術のエンサイクロペティア（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、著者ジェイ．スワーブリック（Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ）およびジェイ．シー．ボィラン（Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ）、１９９８−１９９９、マーセル デッカー，ニューヨーク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００３９】
材料と方法
リンパ球の不死化および抗体の一次試験
リンパ球は標準プロトコルを用いてヘテロミエロ−マ（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）ＨＡＢ−１と融合し（ファラー（Ｆａｌｌｅｒ）ほか、１９９０）、培養することにより不死化される。要すれば、リンパ球はＰＥＧを用いてＨＡＢ−１細胞と融合される。トリオ−ム（ｔｒｉｏｍｅ）は４枚の２４−ウエルプレートに播種される。平均的な増殖頻度は８０−９０％であり；増殖しているクローンの５０％が免疫グロブリンを分泌する。分泌されたヒト単クローン抗体の一次試験はＥＬＩＳＡによって実施され、アイソタイプが決定された。該ヒト単クローン抗体は、免疫組織化学的、遺伝的、生化学的および分子生物学的技術によって更に分析されることができる。
【００４０】
必要な材料；
・ＲＰＭＩ １６４０（ＰＡＡ社）添加物なし
ＨＡＴ添加ＲＰＭＩ １６４０（ＨＡＴ−添加物、ＰＡＡ社）及び１０％ＦＣＳ，１％グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン
・ＨＡＢ−１（融合パートナー）を添加物なしのＲＰＭＩで２回洗浄する
・毎分１，５００回転で５分間遠心分離する
・凍結したリンパ球（脾臓、リンパ節、または血液から）を解凍し、添加物なしのＲＰＭＩで２回洗浄する；これも遠心分離する
・添加物なしのＲＰＭＩ各１０ｍｌに２つのペレットをそれぞれ懸濁し、ノイバウエル計算盤によって計数する
・Ｈａｂ−１を１：２−１：３の割合でリンパ球に融合する
・二度目の洗浄の後に該細胞ペレットをひとまとめにし、混合し、毎分１，５００回転で８分間遠心分離する
・５０ｍｌ試験管をゆっくりと回転しながら、あらかじめ３７℃に加熱しておいたＰＥＧ（ポリエチレングリコール１５００、ロシュ社より）を該ペレットに注意深く滴下する
・わずかに再懸濁して、３７℃の水浴中で、正確に９０秒、回転させる
・次いで、添加物なしのＲＰＭＩでＰＥＧを洗い流す（２個の１０ｍｌピペット容量いっぱい）
・毎分１，５００回転で５分間遠心分離する
・２４ウェルプレートに、ＨＡＴ添加ＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ＝ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン）を、１ウェルあたり１ｍｌまく。
・ＨＡＴ添加ＲＰＭＩを用いてペレットを懸濁する
・各ケースにつき０．５ｍｌの細胞をピペットで２４ウェルプレートにまく
・恒温器に融合プレートを置く
・１週間に１度ＨＡＴ添加ＲＰＭＩで培地を交換する
【００４１】
ＳＡＭ６．１０抗体の精製
ＦＰＬＣを介した陽イオン交換クロマトグラフィーによる培養上清の精製
【００４２】
この目的のために、ＳＡＭ−６．１０ ＩｇＭ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、特別な無血精培地（ＡＩＭＶ培地，Ｇｉｂｃｏ社）中で培養し、そして比濁法を用いて培養上清中のＩｇＭ含量を測定した。精製のために、培養上清を５．９のｐＨに調節し、その溶液を濾過した。結合のために、特別な陽イオンカラム（Ｈｉｔｒａｐ（商標）ＳＰＦＦカラム，５ｍｌ，アマシャム・バイオサイエンス社）を用いた。精製の開始時に、濾過した緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．９）を用いてカラムを平衡化した。次いで氷上で冷却した培養上清を、１ｍｌ／分の流速でカラムに添加した。上清の添加後、緩衝液Ａを用いて、２ｍｌ／分の流速で２０分間、すべての結合タンパク質が除去されるわけではないような一定のベースラインに達するまで、カラムを洗浄した。その後に、カラムに結合した抗体を混合緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を用いて溶出して、分画して回収した。個々の画分におけるＳＡＭ−６．１０抗体（ＩｇＭ）含量を比濁計で測定し、精製された抗体の精製度および無傷さを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとおよびウェスターンブロット分析によって試験した。
【００４３】
ｏｘＬＤＬの測定
測定は、スウェーデン国、ウプサラ州、メルコディア（Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）からの酸化ＬＤＬ ＥＬＩＳＡテストキットを用いて行った。
試験の原理：酸化ＬＤＬ ＥＬＩＳＡは固相のツーサイト（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）酵素イムノアッセイである。これは直接サンドゥイッチ技術を基本とするもので、この技術において、２種の単クローン抗体が酸化ＬＤＬアポリポタンパクＢ上の特定の抗原に対して指向される。培養の間に、試料中の酸化ＬＤＬが、マイクロタイタープレートのウェルに結合した抗−酸化ＬＤＬ抗体と反応する。洗浄、すなわち試料中の非反応成分が除去された後、ペルオキシダーゼ共役抗−ヒトアポリポタンパクＢ抗体が、固相に結合した酸化ＬＤＬを検出する。結合していない酵素で標識された抗体を除く、二度目のインキュベーションおよび洗浄の後、３，３′，５，５′テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）との反応によって、該共役体が検出される。この反応は酸の添加によって停止されて比色エンドポイントが定められ、該比色エンドポイントはは分光測光器によって４５０ｎｍで読み取られる。
【００４４】
ＳＡＭ−６のｏｘＬＤＬへの結合の測定
ＥＬＩＳＡプレート（ベクトン ディッキンソン ラバレ ユーロップ，フランス国）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂａｒｅ Ｅｕｒｏｐ，Ｆｒａｎｃｅ）を、異なる割合に酸化されたＬＤＬの断片とともに、４℃で一晩にインキュベートした。１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて、１時間、非特異的結合部位をブロッキングした。次いで、このプレートを６０μｇ／ｍｌ ＳＡＭ−６抗体とともに、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後に、ＥＬＩＳＡプレートをＨＲＰ−結合二次抗体とともに、１時間インキュベートした（ウサギ抗ヒト ＩｇＭ，ダコ ハンブルグ，ドイツ国，１：１０００（ＰＢＳ中））。次いで、このプレートを再度ＰＢＳおよびクエン酸緩衝液で洗浄し、ＯＰＤ（ダコ・サイトメーション社，グロストルップ，デンマーク国）（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、そしてＥＬＩＳＡリーダーによって、４９０ｎｍにおける色彩変化を測定した。
【００４５】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ解析）
使用した接着細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡで処理して培養瓶の底から剥離された。反応は１０ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０培地（＋添加物）によって停止され、細胞は１０００×ｇ、５分間でペレット化された。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％アジ化ナトリウム）に懸濁し、そして３０分間氷上に置いて細胞膜を再構成した。次いで、細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度に調節し、細胞懸濁液の２００μｌをＦＡＣＳ反応容器に移した。それによって試験管１本当りの細胞の数は２×１０５となった。細胞を４℃、毎分１４００回転で５分間、ペレット化し、これらのペレットを再懸濁して、氷上において一次抗体とともに１５分間インキュベートした。一次抗体として、ＦＡＣＳ緩衝剤中の１００μｇ／ｍｌ ＳＡＭ−６抗体（総容量２００μｌ）または１００ｍｇ／ｍｌ ＬＤＬを用いた。１００μｇ／ｍｌクロムピュア（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ）ヒトＩｇＭがアイソタイプ対照として作用した。もう一つの方法として、細胞を３０分間ＬＤＬであらかじめインキュベートし、それから１００μｇ／ｍｌ ＳＡＭ−６抗体を１５分添加した。
【００４６】
インキュベート後に、細胞を遠心分離機で分離し；上清を除去して、ペレットを５００μｌの冷却ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。その後、ＦＩＴＣ結合二次抗体（ウサギ抗ヒトＩｇＭ，ＦＩＴＣ結合，ＳＡＭ−６またはクロムピュア（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ）ヒトＩｇＭについて１：５０（ＦＡＣＳ緩衝液中））で１５分間、光を遮断してインキュベートした。再度洗浄後、細胞を２００μｌの冷却ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、測定するまで氷上で、光を遮断して保存した。測定はフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ；ベクトン ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），米国）を用いて行った。
【００４７】
ＳＡＭ６．１０抗体のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）効果を示すための動物実験
【００４８】
実験１：５００μｇ精製ＳＡＭ６．１０抗体をマウスの腹腔内に注入した。血清中のＬＤＬ濃度を２日後に測定した（下記の方法を参照のこと）。
【００４９】
実験２：前記実験と同じ。
【００５０】
実験３：１ｍｇの精製ＳＡＭ６．１０抗体をマウスの腹腔内に注入した。血清中のＬＤＬ濃度を１４日後に測定した。
対照Ａ：通常値の対照マウス
対照Ｂ：通常値の対照マウス
【００５１】
ＳＡＭ６．１０で処理したマウスでは、ＬＤＬの血清濃度が有意に減少した。（図６および７を参照のこと）。
【００５２】
毒性
精製したＳＡＭ６．１０抗体５００μｇおよび１ｍｇを、それぞれマウスの腹腔内に注入した。
・急性毒性なし
・潜伏性の毒性なし（３ヵ月間）。
【００５３】
前記実験１，２および３（上記参照）によって死んだマウスの臓器類を摘出し、調査した。肝臓、肺、心臓、脾臓、小腸、大腸、腎臓、胃および脳はいかなる形態変化も示さなかった。該器官は、何らかの脂質の蓄積について、さらに免疫組織化学的に調査した。ズダンＩＩＩを用いた染色は、どの器官についても脂質の蓄積を示さなかった。
【００５４】
供死したマウスの器官をホルマリン中で固定してパラフィン中に包埋した。ズダンＩＩＩ色素を用いて、以下のプロトコルにしたがって染色を行った。
【００５５】
マクロファージのための／パラフィン切片におけるズダンＩＩＩ染色
脱パラフィン
・キシレン１  ５分
・キシレン２  ５分
・１００％ エタノール１  ５分
・１００％ エタノール２  ５分
・メタノール  ７０ｍｌ
＋Ｈ２Ｏ２５００μｌ  ５分
・９０％ エタノール１  ３分
・９０％ エタノール２  ３分
・８０％ エタノール１  ３分
・８０％ エタノール２  ３分
・７０％ エタノール１  ３分
・７０％ エタノール２  ３分
・ＰＢＳ中に切片を置く
・ズダンＩＩＩとともに、切片を１５分間インキュベートする
・蒸留水で洗浄する
・６０％イソプロパノールに１回浸す
・蒸留水で洗浄する
・ヘマラウン（ｈａｅｍａｌａｕｎ）を用いて、６分間対比染色する
・切片を１０分間浸し、蒸留水で洗浄し、グリセリン・ゼラチン中にマウントする
【００５６】
マクロファージのズダンＩＩＩ染色のために、接着性のマクロファージを目的のスライドガラス上で増殖させ、それから該当する試薬を用いて処理した。染色は次のように行なわれた。すなわち、
・細胞を６０％イソプロパノール中で固定する（６分間）
・ズダンＩＩＩとともに２０分間インキュベートする
・蒸留水で洗浄する
・ヘマラウンを用いて、６分間対比染色する
・切片を１０分間浸し、蒸留水で洗浄し、グリセリン・ゼラチン中にマウントする
【００５７】
血液試料中の脂質の測定
血清中のさまざまな脂質の測定を、ＭＯＤＵＬＡＲ  ＤＰ８００装置（ロシュ社）（Ｒｏｃｈｅ）で自動的に行った。ＬＤＬコレステロール値の測定は、試料を前処理することなく酵素的比色分析（ＣＨＯＤ／ＰＡＰ）で行った。
【００５８】
血清中の脂質濃度を測定するための試験原理：
ＨＤＬ，ＶＬＤＬおよびカイロミクロンは、洗剤１で選択的に加水分解される。これらのリポタンパク質中に遊離されたコレステロールは、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）およびコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）との酵素作用の結果として直ちに反応し、そして過酸化水素が生成する。後者はペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下で、４−アミノアンチピリジンとともに無色の産物を形成する。この過程を通じて、ＬＤＬ粒子は無傷のままである。ＬＤＬコレステロールの反応は洗浄剤２および結合剤Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−ｍ−トルイジン（ＤＳＢｍＴ）の添加によって開始される。二番目の洗浄剤は、ＬＤＬ粒子中のコレステロールを遊離する。酵素の反応によって、結合物質の存在下で色素が形成される。形成された赤色キニーネイミン色素の強度は、ＬＤＬコレステロールの濃度に正比例する。これは５５２ｎｍにおける吸光の増加を測定することによって測定される。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ（ＬＤＬ／ＨＤＬ）
− ＥＬＩＳＡプレートを、ＬＤＬ（ヒト血漿由来の低比重リポタンパク，シグマ社，１０μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中））またはＨＤＬ（ヒトＨＤＬ，ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）社，１０μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中））で前もってコートする→１ウェルあたり５０μｌ
− 容器を覆って、４℃で一晩保存する
− 翌日、プレートをＰＢＳで２回洗浄する
− 各ウェル中に１００ｎｌのＲＰＭＩをピペットで添加し，室温で１時間インキュベートする
− 次いでＰＢＳで２回洗浄する
− それぞれのケースについて、５０μｌの陽性対照を各２ウェルずつピペットで添加する（二重測定）
陽性対照：ヒトに対する単クローン抗体とマウスの免疫グロブリンＧ２ａ、１：１０００（ＰＢＳ中）
− ５０μｌ ＲＰＭＩを陰性対照として一緒に行う（二重測定）
− ５０μｌの試料（上清ＳＡＭ６．１０）を並べてピペットで添加する（二重測定）
− 恒温器において１時間インキュベートする
− ＰＢＳで２回洗浄する
− ＰＢＳ／０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）で２回洗浄する
− ＰＢＳで２回洗浄する
− ５０μｌのそれぞれの二次抗体（ペルオキシダーゼ結合）：すなわちＳＡＭ６．１０について、ウサギ抗ヒトＩｇＭ  １：１０００（ＰＢＳ／０．０５％ツイーン中）；陽性対照ＬＤＬについて、ウサギ抗マウスＩｇＧ類  １：１０００（ＰＢＳツイーンで）を、ピペットで添加する
− 恒温器内で１時間インキュベートする
− ＰＢＳで２回洗浄する
− ＰＢＳ／０．０５％ツイーンで１回洗浄する
− ＰＢＳで２回洗浄する
− クエン酸緩衝液で２回洗浄する
− 評価のため：ＯＰＤ錠剤（ダコ社，ハンブルグ）をクエン酸緩衝液＋Ｈ２Ｏ２（３ｍｌクエン酸緩衝液＋１錠＋５μｌ Ｈ２Ｏ２）に溶解する
− 各ウェルに５０μｌの色素をピペットで添加する
− 陽性の反応（黄色に着色）を示したときは、１０μｌ ３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止する
【００６０】
図面についての説明
配列表
図Ａ（添付せず）は軽鎖の可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【００６１】
図Ｂ（添付せず）は軽鎖の可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号：２）を示す。相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は水平線で示し、これらは配列番号：２のヌクレオチド６７−６９（ＣＤＲ１），１４５−１６５（ＣＤＲ２）および２６２−２８８（ＣＤＲ３）と実質的に同一である。
【００６２】
図Ｃ（添付せず）は重鎖の可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【００６３】
図Ｄ（添付せず）は重鎖の可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号：４）を示す。相補性−決定領域（ＣＤＲｓ）は水平線で示してあり、これらは配列番号：４のヌクレオチド９１−１０５（ＣＤＲ１），１４８−１９８（ＣＤＲ２）および２９５−３３０（ＣＤＲ３）と実質的に同一である。
【００６４】
細胞−生物学的実験
以下に説明する図は、この発明を限定する意図のものではなく、単に発明を説明し、そして実施例への参照とともに発明の実施可能性を立証するためのものである。
【００６５】
図１は硫酸銅溶液によるインキュベーション時間依存的なｏｘＬＤＬの測定を示す。この実験において、ＬＤＬ（シグマ，タウフキルヘン，ドイツ国）（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、２０μＭ ＣｕＳＯ４とともに３時間および１５時間、それぞれインキュベートすることによって酸化した。酸化ＬＤＬの量を、使用法の説明に従って、メルコディア（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）酸化ＬＤＬ ＥＬＩＳＡを用いて測定した。酸化ＬＤＬの量はインキュベーション時間を長くすることによって増加することが、銅イオンで処理されなかった各ＬＤＬ画分がすでに部分的に酸化型で存在することとともに、明らかに観察された。１５時間のインキュベーション後に、酸化ＬＤＬの割合が約２倍になった。
【００６６】
図２はＳＡＭ−６のｏｘＬＤＬとの結合を示す。ＥＬＩＳＡ結合アッセイによってＳＡＭ−６とｏｘＬＤＬとの結合を証明するために、検出の目的に必要な一次抗体ＳＡＭ−６および二次抗体抗−ヒトＩｇＭを添加する前に、ＥＬＩＳＡプレートを、異なる度合に酸化されたＬＤＬの画分であらかじめコートした。その結果は、酸化型で存在するＬＤＬがより多く存在するほど、この発明による抗体ＳＡＭ−６がより強力に結合することを示す。
【００６７】
図３はＦＡＣＳ解析の結果を示す。この目的のために用いた細胞は、マウスマクロファージ細胞株Ｐ３８８Ｄ１（ＩＬ−１）（ＤＳＭＺ受理番号ＡＣＣ２８８）のものである。図３Ａは、ＬＤＬのマクロファージへの結合を示す。図３Ｂは、ヒト単クローン抗体ＳＡＭ−６もまた、マクロファージに結合することを立証する。図３Ｃにおける対照ＩｇＭのマクロファージへの結合の証拠は、マクロファージがμ受容体（ミュー受容体）を保有することを実証する。図３Ｄにおけるシグナルの右寄りのシフトは、ＬＤＬおよびＳＡＭ−６の同時インキュベーションが、ＳＡＭ−６の細胞への多重結合をもたらすことを実証する。
図４および図５は、ズダンＩＩＩ染色の結果を示し、このためにマウスマクロファージ細胞株Ｐ３８８Ｄ１（ＩＬ−１）が用いられた。図４は、ＳＡＭ−６または１種類のＩｇＭ対照抗体のいずれかとともに４８時間インキュベートされ、そして次いでズダンＩＩＩ染色に供された細胞を示す。抗体ＳＡＭ−６とともにインキュベートされた細胞は、その赤色の着色により、中性脂肪の明確な蓄積を示す。対照抗体とともにインキュベートされた細胞は、これに対し変化を示さない。
図５に示された染色のために、マクロファージはＦＣＳ添加ありおよびなしの両方について２４時間培養された。次いで、さらなる２４時間の間、ＬＤＬのみ、またはＳＡＭ−６のみ、またはＬＤＬおよびＳＡＭ−６を一緒に、のいずれかがそれぞれ添加された。その後、ズダンＩＩＩによる染色が行われた。図５Ａ、５Ｃおよび５Ｅで示される図の左カラムは、ＦＣＳの添加なしで培養された細胞を示す。図５Ｂ，５Ｄおよび５Ｆで示される図の右カラムは、ＦＣＳの添加ありで培養された細胞を示す。
図５Ａおよび５Ｂは、ＦＣＳなしで培養されたマクロファージおよびＦＣＳの存在かで増殖したマクロファージの両方が、中性脂肪の基礎的な蓄積を示すことを実証する。図５Ｃは、ＳＡＭ−６がＦＣＳなしで培養されたマクロファージに添加されたときは、脂肪の蓄積が生じないことを実証する。図５Ｄに示されるように、そのいっぽうで、ＦＣＳとともに培養され、その後ＳＡＭ−６が添加されたマクロファージにおいては、強化された脂質の蓄積が観察される。図５Ｅおよび５Ｆは、ＳＡＭ−６およびＬＤＬの共インキュベーションにより、ＦＣＳとともに培養されたマクロファージおよびＦＣＳの添加なしで増殖したマクロファージの両方において、細胞内の脂質の蓄積が実質的に増加することを実証する。
図６は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体ＳＡＭ−６のＬＤＬ値に対する影響を示す。この実験では、１ミリグラムの精製ＳＡＭ−６抗体および、対照実験においては、１ミリグラムのヒトクロムピュアＩｇＭ（アイソタイプ対照）が、マウスの腹腔内に注入された。血液中のＬＤＬ濃度が、２４時間後および４８時間後に測定された。２４時間後および４８時間後に、ＳＡＭ−６で処置されたマウスにおいて、血清ＬＤＬの明確な減少が観察される。血清中のＬＤＬの測定は、ＭＯＤＵＬＡＲ  Ｄ  Ｐ８００装置（ロシュ社）を用いて自動的に行い、プロットされた値は、「ＬＤＬコレステロールダイレクト」診断キット（ロシュ  ダイアグノスティックス社）の結果として得られた。
図７もまた、ＳＡＭ−６．１０のｉｎ  ｖｉｖｏにおける影響を示し、値を計算するためにフリーデヴァルト（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の式にしたがった間接法が用いられている。ここで、ＬＤＬの量は総コレステロール、ＨＤＬおよびトリグリセリドの間の差から計算される。実験を評価するこの方法にしたがえば、ＳＡＭ６．１０処置後の血清中のＬＤＬ濃度の減少は、さらにいっそう大きくなる。しかし、この間接測定法は、図６で用いられた方法と比較して、正確さが劣るものととらえなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は硫酸銅溶液によるインキュベーション時間依存的なｏｘＬＤＬの測定を示す。
【図２】図２はＳＡＭ−６のｏｘＬＤＬとの結合を示す。
【図３】図３はＦＡＣＳ解析の結果を示す。
【図４】図４は、ＳＡＭ−６または１種類のＩｇＭ対照抗体のいずれかとともに４８時間インキュベートされ、そして次いでズダンＩＩＩ染色に供された細胞を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＦＣＳなしで培養されたマクロファージおよびＦＣＳの存在かで増殖したマクロファージの両方が、中性脂肪の基礎的な蓄積を示すことを実証する。図９Ｃは、ＳＡＭ−６がＦＣＳなしで培養されたマクロファージに添加されたときは、脂肪の蓄積が生じないことを実証する。図９Ｄに示されるように、そのいっぽうで、ＦＣＳとともに培養され、そしてその後にＳＡＭ−６が添加されたマクロファージにおいては、強化された脂質の蓄積が観察される。図９Ｅおよび９Ｆは、ＳＡＭ−６およびＬＤＬの共インキュベーションにより、ＦＣＳとともに培養されたマクロファージおよびＦＣＳの添加なしで増殖したマクロファージの両方において、細胞内の脂質の蓄積が実質的に増加することを実証する。
【図６】図６は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体ＳＡＭ−６のＬＤＬ値に対する影響を示す。
【図７】図７もまた、ＳＡＭ−６．１０のｉｎ  ｖｉｖｏにおける影響を示す。