【手続補正書】
【提出日】平成23年1月17日(2011.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞、臍帯血細胞、造血幹細胞または間葉幹細胞のシアリレーションまたはフコシレーションを変更する方法において、
ａ）ＣＭＰ−シアル酸および特異的シアリルトランスフェラーゼ酵素を使用することで前記細胞をシアリル化するステップと、および／または、
ｂ）シアリダーゼ酵素によって前記細胞を脱シアリル化するステップと、および／または、
ｃ）ＧＤＰ−Ｆｕｃおよび特異的フコシルトランスフェラーゼ酵素の使用によって前記細胞をフコシル化するステップと、を具え、
１）ここで、前記酵素が、アミン、チオールまたは酸化グリカンに対して化学的にタグ化され、および、
２）前記酵素が当該酵素の基質結合部位に結合するインヒビタを使用して除去される、方法。
【請求項２】
前記酵素が、
式ＣＯＮＪ、
Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎＴ
による構造を具え、Ｂは前記酵素、Ｇはグリカン（前記酵素がグリカンコンジュゲート体であるとき）、Ｒ１およびＲ２は、化学選択的なライゲーション基、Ｔはタグ、好ましくは、ビオチン；Ｓ１は、選択的なスペーサ基、好ましくは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ｍおよびｎは、独立して、０または１の整数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、抗原、ビオチン、ヒス−タグ、化学タグ、フルオロアルカンまたはビオチン、好ましくは、フルオロアルカンのビオチンからなる群から選択されるタグ化基を酵素表面に共有結合することによってタグ化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素がタグ化グリカンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、Ｎ−アセチルラクトースアミン、ＦＴＩＩＩ、ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ、ＦＴＶＩＩおよびＦＴＩＸ、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＶおよびＳＴ６ＧａｌＩと反応するシアリルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼ、あるいは、ＳＴ３ＧａｌＩまたはＳＴ３ＧａｌＩＩおよびＳＴ３ＧａｌＩＶなど、Ｏ−グリカンコアＩと反応するシアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タグ化酵素は、式：
Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎＴ−Ｌ−（Ｓ２）ｓ−ＳＯＬ
に従って、固相とタグ化酵素の複合体を形成し、
Ｂは前記酵素、ＳＯＬは固相、アフィニティマトリックス、ポリマ、または、前記酵素を除去するのに有用な他のマトリックス、Ｇはグリカン（前記酵素がグリカンコンジュゲート体であるとき）、
Ｒ１およびＲ２が、化学選択的なライゲーション基、Ｔはタグ、好ましくは、ビオチン、Ｌはタグに対して特異的に結合するリガンド；Ｓ１およびＳ２は、選択的スペーサ基、好ましくは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、
ｍ、ｎおよびｓは、独立して、０または１の整数であり、Ｔ−Ｌ間のリンクは、非共有性のアフィニティ結合でもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タグ化修飾酵素は、マトリックスに固定化され、前記マトリックスを前記細胞から分離することによって取り除く、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、前記細胞をＣＭＰ−シアル酸およびシアリルトランスフェラーゼ酵素とともに培養することによって、特異的α３−および／またはα６−リンクシアル酸を用いたシアリレーションステップ、および／または、細胞をＧＤＰ−Ｆｕｃ酸およびフコシルトランスフェラーゼ酵素とともに培養することによって、特異的なα３−および／またはα４−リンクフコースを用いたフコシレーションステップを具える、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素のインヒビタまたは基質とともに細胞を培養するステップを含む、グリコシルトランスフェラーゼまたはシアリダーゼ修飾酵素を修飾細胞から除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記インヒビタは、競合モノサッカライドグリコシドまたはオリゴサッカライドインヒビタである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
単離した臍帯血細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞または胚性幹細胞から調製または取得した細胞集団において、当該細胞集団が、
ａ）ＣＭＰ−シアル酸および特異的シアリルトランスフェラーゼ酵素の使用によって細胞をシアリル化するステップと、および／または、
ｂ）シアリダーゼ酵素によって前記細胞を脱シアリル化するステップと、および／または、
ｃ）ＧＤＰ−Ｆｕｃおよび特異的フコシルトランスフェラーゼ酵素の使用によって、細胞
をフコシル化するステップと；によって得ることが出来るインビトロ酵素的変更シアリレーションおよび／またはフコシレーションを具え、ここで、
１）酵素が、アミン、チオールまたは酸化グリカンに化学的にタグ化され、
２）前記酵素が、当該酵素の基質結合部位に結合するインヒビタを使用することで除去される、細胞集団。
【請求項１２】
前記細胞表面の前記増大したシアリル化および／またはフコシル化構造が、前記細胞を特異的組織にターゲティングするために使用される、請求項１１に記載の細胞集団。
【請求項１３】
請求項１１に記載の修飾細胞上にある構造の存在に関する質量分析において、グリカンの放出、グリカンフラクションの精製、分子質量の測定；選択的に、特異的シアリダーゼ酵素によるグリカンの一部の修飾、および、前記修飾されたグリカンの分析；および、前記特異的な構造へのグリカン分子質量の割当／適合、を具え、
好ましくは、シアリレーションレベル、および、選択的に、ＮｅｕＧｃの有無が、ｍ／ｚ１９４６、ｍ／ｚ２２３７およびｍ／ｚ２２５３でのグリカン名としてのおおよその正確質量数を用いて、指標グリカンシグナル、または、表１および／または表６に挙げられたＮｅｕＧｃ構造に割り当てられた対応するシグナルおよび付加的なシグナルによって分析され、ただし、選択的に、前記質量数が代替構造にも対応するとき、ＮｅｕＧｃの存在は、さらに、他のデータ、好ましくは、質量分析計またはラベリングデータによって確認される、質量分析。
【請求項１４】
臍帯血細胞集団におけるＣＦＵを増大させるために、臍帯血細胞をインビトロで前記細胞のシアリレーションおよび／またはフコシレーションを変更する酵素と接触させるステップを含む方法。
【請求項１５】
前記トランスフェラーゼ又は修飾酵素が、アミンまたはチオール基および／またはタグ化グリカンに共有結合的にタグ化される、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼまたはシアリダーゼ細胞修飾酵素。
【請求項１６】
前記トランスフェラーゼ又は酵素が、
式ＣＯＮＪ
Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎＴ
に従った構造を具え、Ｂは前記トランスフェラーゼ又は酵素であり、Ｇはグリカン（前記トランスフェラーゼ又は酵素がグリカンコンジュゲート体のとき）、Ｒ１およびＲ２は、化学選択的ライゲーション基であり、Ｔはタグ、好ましくは、ビオチン；Ｓ１は、選択的スペーサ基、好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキル、ｍおよびｎは、独立して、０または１の整数である、請求項１５に記載のトランスフェラーゼ又は酵素。
【請求項１７】
単離された初期ヒト細胞から調製または取得した新規細胞集団において、前記細胞集団は、インビトロで酵素的に変更されたシアリレーションを具え、
ａ．Ｎｅｕ５Ａｃによるインビトロでの増大したシアリレーション、および／または、
ｂ．インビトロでの低減したシアリレーション、および／または、
ｃ．ＧＤＰ−Ｆｕｃおよび特異的フコシルトランスフェラーゼ酵素の使用による前記細胞のフコシレーション、
とのいずれかを具える、細胞集団。
【請求項１８】
前記細胞集団が、増大した量のＮｅｕ５Ａｃα３構造のみを具え、さらに、増大した量のα３−および／またはα４−リンクフコースを具える、請求項１７に記載の細胞集団。
【請求項１９】
単離された初期ヒト細胞集団に対して、末端シアル酸グリコシレーションを変更する方法にいて、当該方法が、前記細胞を、インタクト細胞のグリカン構造を変更可能な、グリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素の少なくとも一方と接触させる反応ステップを具える、方法。