【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年3月4日(2011.3.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３２】
（実施例２６：サイズ排除クロマトグラフィーによるＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の結合化学量論の決定）
（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の調製）
ＶＥＧＦ１６５（濃度＝３．６１ｍｇ／ｍｌ）を、ＣＨＯ細胞で一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）（濃度＝０．９ｍｇ／ｍｌ）と３：１（ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））のモル比で混合し、４℃で一晩インキュベートした。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３６】
（実施例２７：オンライン光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによるＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の化学量論の決定）
（複合体調製）
ＶＥＧＦ１６５を、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質と３：１（ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））のモル比で混合し、そして４℃で一晩インキュベートした。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４２】
（実施例２９：改変Ｆｌｔレセプターの薬物動態分析）
（ａ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態分析
Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ＣＨＯで安定的に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＣＨＯで一過性に発現させたＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下注射した。注射後１、２、４、６、２４時間、２日、３日および６日に、マウスを尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するように設計したＥＬＩＳＡでアッセイした。ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦ１６５でコーティングする工程、検出Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を結合させる工程および西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗Ｆｃ抗体でレポートする工程を包含する。この実験の結果を図３７に示す。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）についてのＴmaxは、６時間であったが、一過性Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）および安定的なＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）ならびに一過性ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＴmaxは、２４時間であった。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）についてのＣmaxは、８μｇ／ｍｌであった。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の両方の一過性について、Ｃmaxは、１８μｇ／ｍｌであり、安定的なＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）について、Ｃmaxは、３０μｇ／ｍｌであった。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４３】
（ｂ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態分析
Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下注射した。注射後１、２、５、６、７、８、１２、１５および２０日に、マウスを尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するように設計したＥＬＩＳＡでアッセイした。ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートを１６５でコーティングする工程、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を結合させる工程および西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗Ｆｃ抗体でレポートする工程を包含する。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）は、もはや５日後に血清中で検出され得ないが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、１５日以上検出可能であった。この実験の結果を図３８に示す。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、未改変およびアセチル化されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のＩＥＦゲル分析である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、そのｐＩが９．３より大きいため、ゲルに侵入できない。一方、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、ゲルに侵入し得、そしてｐＩ５．２で平衡化する。
【図２】
図２は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングしたプレートへの、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の結合である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）における細胞外マトリックス成分に広範に結合し、一方、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、結合しない。
【図３】
図３は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける結合である。アセチル化（カラム１３〜１６）、ペグ化（カラム１７〜２０）、およびヘパリン処理したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム２１〜２４）の各々は、コントロール（カラム１〜４）および無関係のタンパク質（カラム５〜８）と比較して、ＶＥＧＦ結合について、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと完全に競合し得る。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム５〜６）は、ＶＥＧＦ結合について、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと部分的にのみ競合するようである。しかし、この結合サンプルの０．５Ｍ  ＮａＣｌでの洗浄（カラム７〜８）は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの改変形態と類似の結合プロフィールを生じ、これは未改変タンパク質が、塩洗浄によって除去され得るチップに対する非特異的結合を示すことを示す。
【図４】
図４は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおけるＶＥＧＦへの結合である。ペグ化およびアセチル化されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の両方は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの親和性に匹敵する親和性を伴ってＶＥＧＦに結合する。
【図５】
図５は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的なプロフィールである。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの未改変、アセチル化、またはペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを皮下注射した。タンパク質注射の１、２、４、６、２４時間、２日、および３日後に、このマウスの尾を出血させ、そして血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を検出するよう設計された標準的なＥＬＩＳＡベースのアッセイでアッセイした。全てのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質  のＴmaxは、６時間と２４時間との間の時点であった。異なるタンパク質のＣmaxは以下のようであった：未改変：０．０６μｇ／ｍｌ〜０．１５μｇ／ｍｌ；アセチル化：１．５μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍｌ；およびペグ化：約５μｇ／ｍｌ。
【図６】
図６Ａ〜６Ｂは、未改変および段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のＩＥＦゲル分析である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、そのｐＩが９．３より大きいために、ゲルに侵入できない。一方、大部分の段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃサンプル（３０〜１００倍過剰のサンプル）は、ゲル中に移動し得、そしてアセチル化の程度に依存して、４．５５と８．４３とのの範囲のｐＩで平衡化する。
【図７】
図７は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングしたプレートへの結合である。無関係のコントロールタンパク質（ｒＴｉｅ２−Ｆｃ）を用いる場合、段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（２０および３０倍過剰のサンプル）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングしたプレートへのいずれの結合も示さないが、一方、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、有意な結合を示す。１０倍過剰のサンプルは、減少した結合を示すが、アセチル化の程度は、細胞外マトリックス成分への結合を完全にブロックするために十分ではない。
【図８】
図８は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける結合である。準化学量論的な比で（０．５μｇ／ｍｌの未改変Ｆｌｔ１（１−３）または段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのいずれか対０．２μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦに完全に結合するためのに十分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（未改変または段階アセチル化のいずれか）は、溶液中には存在しない。１．０μｇ／ｍｌ（これは、約１：１の化学量論比である）において、未改変および段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの両方は、ＶＥＧＦ結合についてより良く競合し得るが、依然として利用可能なＶＥＧＦを完全に飽和するために充分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（未改変または段階アセチル化のいずれか）が存在しない。しかし、５．０μｇ／ｍｌ（これは、１：１の化学量論比よりも数倍高い）において、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の両方は、アセチル化の程度にかかわらず、ＶＥＧＦを飽和し得る。
【図９】
図９は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的なプロフィールである。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの未改変または段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの１０、２０、４０、６０および１００倍過剰なサンプルを皮下注射した（未改変、１０、２０および４０倍過剰のサンプルについて３匹のマウス、ならびに６０および１００倍過剰のサンプルについて２匹のマウス）。注射の１、２、４、６、２４時間、２日および３日後に、このマウスの尾を出血させた。この血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを検出するために設計されたＥＬＩＳＡベースのアッセイでアッセイした。試験したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質についての全てのＴmaxは、６時間の時点であったが、Ｃmaxは以下のようであった：未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ：０．０６μｇ／ｍｌ；１０倍過剰サンプル：−０．７μｇ／ｍｌ、２０倍過剰サンプル−２μｇ／ｍｌ、４０倍過剰サンプル−４μｇ／ｍｌ、６０倍過剰サンプル−２μｇ／ｍｌ、１００倍過剰サンプル−１μｇ／ｍｌ。
【図１０】
図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１１】
図１１は、Ｆｌｔ１の構造の概略図である。
【図１２】
図１２Ａおよび１２Ｂは、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２およびＩｇドメイン３のアミノ酸配列の親水性分析である。
【図１３】
図１３Ａ〜１３Ｄは、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１４】
図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１５】
図１５Ａ〜１５Ｃは、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１６】
図１６Ａ〜１６Ｄは、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R- >N）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１７】
図１７は、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、塩基性領域欠失変異体Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（１−３）R- >N変異体タンパク質の結合である。準化学量論的な比で（０．２５μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的に改変されたサンプルのＦｌｔ（１−３）−Ｆｃ対０１．μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）、Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定化されたＦｌｔ１（１−３）−ＦｃへのＶＥＧＦの結合をブロックするための充分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質が存在しない。０．５μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的に改変されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質において、化学量論比は約１：１であり、そしてＢｉａｃｏｒｅチップへのＶＥＧＦ結合をブロックする増大した能力が存在する。１．０μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的に改変されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（これは、約１０：１の化学量論比である）において、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、ＢｉａｃｏｒｅチップへのＶＥＧＦの結合をブロックし得るが、これらは等価ではない。未改変、アセチル化、およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃは、ＶＥＧＦ結合をブロックする能力において本質的に等しいが、一方で、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R- >N）−Ｆｃは、結合のブロックにおいて幾分効率が低い。
【図１８】
図１８は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングしたプレートへの結合である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、これらのウェルに強く結合し、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃタンパク質は幾分弱く結合し、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃタンパク質はさらにより弱く結合し、そしてＭｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃタンパク質は、最良のプロフィールを示し、他の任意の変異体タンパク質よりもより弱く結合する。Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R- >N）−Ｆｃグリコシル化変異体タンパク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイ上で最低限の利点のみを示す。
【図１９】
図１９は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質の、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおける結合である。試験した濃度において、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質は、同様にＶＥＧＦに結合する。
【図２０】
図２０は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質の薬物動態学的なプロフィールである。これらの試薬についてのＣｍａｘは以下のようであった：未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ  −０．１５μｇ／ｍｌ；４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）Ｆｃ  -１．５μｇ／ｍｌ；およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ  −０．７μｇ／ｍｌ。
【図２１】
図２１Ａ〜２１Ｃは、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）といわれる改変されたＦｌｔ１レセプターのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列である。
【図２２】
図２２Ａ〜２２Ｃは、Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）といわれる改変されたＦｌｔ１レセプターのヌクレオチドおよび推論されたアミノ酸配列である。
【図２３】
図２３は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）アッセイである。このアッセイの結果は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質が、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質と比較して、ＥＣＭに対してかなり粘着性が低いことを実証する。
【図２４】
図２４Ａ〜２４Ｃは、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）といわれる改変されたＦｌｔ１レセプターのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列である。
【図２５】
図２５Ａ〜２５Ｃは、リン酸化アッセイである。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）または一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかの１．５モル過剰において、コントロール培地のチャレンジと比較して、これらの３つの改変されたＦｌｔ１レセプターによるレセプター刺激の完全なブロックが存在する。対照的に、一過性のＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ＶＥＧＦ陽性コントロールのチャレンジと比較して、このモル過剰では有意なブロックを示さなかった。同様の結果が図２５Ｂにおいて見られ、改変されたＦｌｔレセプターはＶＥＧＦ１６５リガンド
の３倍モル過剰である。図２５Ｃにおいて、改変されたＦｌｔ１レセプターは、ＶＥＧＦ１６５リガンドの６倍モル過剰であり、一過性のＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ここで、細胞表面レセプターのＶＥＧＦ１６５誘導刺激を部分的にブロックすることを示し得る。
【図２６】
図２６Ａ〜２６Ｂは、リン酸化アッセイである。ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激によるチロシンリン酸化ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）のウエスタンブロットによる検出は、細胞表面レセプターが、１および２倍モル過剰（図２６Ａ）または３および４倍モル過剰（図２６Ｂ）の、一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、安定なＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、または一過性のＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかでプレインキュベートしたＶＥＧＦ１６５を有するチャレンジサンプルによってリン酸化されないことを示す。試験された全ての改変Ｆｌｔ１レセプター濃度において、プレインキュベーションの間にＶＥＧＦ１６５リガンドの完全な結合があり、これは、コントロール培地チャレンジと比較して、未結合ＶＥＧＦ１６５による細胞表面レセプターの検出可能な刺激を生じない。
【図２７】
図２７は、ＭＧ／Ｒ２細胞増殖アッセイである。以下の改変ＦｌｔレセプターＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ならびに陰性コントロールとしてＴｉｅ２−Ｆｃといわれる無関係のレセプターを、４０ｎＭ〜２０ｐＭから滴定し、そしてこの細胞上で１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、規定培地中のヒト組換えＶＥＧＦ１６５を、１．５６ｎＭの濃度で全てのウェルに添加した。陰性コントロールレセプターＴｉｅ２−Ｆｃは、いずれの濃度でもＶＥＧＦ１６５誘導細胞増殖をブロックしなかったが、一方、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、０．８ｎＭの最大値の半分の用量で１．５６ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５をブロックする。Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃおよびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、約２ｎＭの最大の半分の用量を用いるこのアッセイにおけるＶＥＧＦ１６５のブロックにおいて低効率である。ＶＥＧＦ１６５単独は、１．２の吸光度単位を読み取り、そしてバックグラウンドは０．３８吸光度単位である。
【図２８】
図２８は、結合化学量論のＢｉａｃｏｒｅ分析である。結合化学量論は、１ｎｇ／ｍｌと等価の１０００ＲＵの転換因子を使用して、固定されたＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）に対する結合したＶＥＧＦ１６５のモル比として計算された。この結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たりの１つのＶＥＧＦ１６５ダイマー分子の結合化学量論を示した。
【図２９】
図２９は、サイズ排除クロマトグラフィーの化学量論である。１ｎＭの濃度のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤよりも１０００倍高いと推定した）を、変化する濃度のＶＥＧＦ１６５と混合した。インキュベーションの後、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を測定した。このデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液への１ｎＭのＶＥＧＦ１６５の添加が、ＶＥＧＦ１６５表面へのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全にブロックすることを示す。この結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たりの１つのＶＥＧＦ１６５分子の結合化学量論を示唆した。
【図３０】
図３０は、サイズ排除クロマトグラフィーの化学量論である。１ｎＭの濃度のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤよりも１０００倍高いと推定した）を、変化する濃度のＶＥＧＦ１６５と混合した。インキュベーションの後、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を測定した。このデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液への１ｎＭのＶＥＧＦ１６５の添加が、ＶＥＧＦ１６５表面へのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全にブロックすることを示す。この結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たりの１つのＶＥＧＦ１６５分子の結合化学量論を示唆した。
【図３１】
図３１は、ネイティブ条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ピーク＃１はＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体を表し、そしてピーク＃２は未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。１．１ｍｌと１．２ｍｌとの間の溶出した画分を合わせ、そしてこの複合体を解離させるためにグアニジウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）を添加して、４．５Ｍの最終濃度にした。
【図３２】
図３２は、解離条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。レセプター−リガンド複合体の成分を分離するため、およびそのモル比を決定するために、５０μｌの解離複合体を、６ＭのＧｕＨＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＰＣ  ３．２／３０にロードし、そして溶出した。ピーク＃１はＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を表し、そしてピーク＃２はＶＥＧＦ１６５を表す。
【図３３】
図３３は、オンライン光散乱（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えるサイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。図３３に示すように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク番号１は、レセプター−リガンド複合体を表し、そしてピーク番号２は、未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルから算出した。同じ手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これらの決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７３００（図３３）であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４３９０（図３４）であり、そしてピーク位置でのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３３００である（図３５）。
【図３４】
図３４は、オンライン光散乱（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えるサイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。図３３に示すように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク番号１は、レセプター−リガンド複合体を表し、そしてピーク番号２は、未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルから算出した。同じ手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これらの決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７３００（図３３）であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４３９０（図３４）であり、そしてピーク位置でのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３３００である（図３５）。
【図３５】
図３５は、オンライン光散乱（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えるサイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。図３３に示すように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク番号１は、レセプター−リガンド複合体を表し、そしてピーク番号２は、未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルから算出した。同じ手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これらの決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７３００（図３３）であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４３９０（図３４）であり、そしてピーク位置でのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３３００である（図３５）。
【図３６】
図３６は、ペプチドマッピングおよびグリコシル化分析である。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のジスルフィド構造およびグリコシル化部位を、ペプチドマッピング法により決定した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中に合計１０のシステインが存在する；それらのうちの６つは、Ｆｃ領域に属する。Ｃｙｓ２７はＣｙｓ７６とジスルフィド結合する。Ｃｙｓ１２１は、Ｃｙｓ１８２とジスルフィド結合する。Ｆｃ領域中の始めの２つのシステイン（Ｃｙｓ２１１およびＣｙｓ２１４）は、別のＦｃ鎖中の同じ２つのシステインと分子間ジスルフィド結合を形成する。しかし、ジスルフィド結合が同じシステイン間（例えば、Ｃｙｓ２１１とＣｙｓ２１１）で、またはＣｙｓ２１１とＣｙｓ２１４との間で生じるか否かは、決定され得ない。Ｃｙｓ２１６は、Ｃｙｓ３０６とジスルフィド結合する。Ｃｙｓ３５２は、Ｃｙｓ４１０とジスルフィド結合する。
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中に、５つの可能なＮ結合するグリコシル化部位が存在し、そしてそれらは種々の程度までグリコシル化されることが見出される。完全なグリコシル化は、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ１９３およびＡｓｎ２８２において観察される。部分的なグリコシル化は、Ａｓｎ６５およびＡｓｎ１２０上で観察される。グリコシル化の部位は、図において下線により強調される。
【図３７】
図３７は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ＣＨＯで安定的に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＣＨＯで一過性に発現させたＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下的に注射した。マウスを、注射の１、２、４、６、２４時間、２日、３日、６日後に尾部出血した。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するために設計されたＥＬＩＳＡにおいて、血清をアッセイした。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）のＴｍａｘは６時間であり、一方、一過性および安定なＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）および一過性ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＴｍａｘは２４時間であった。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）についてのＣｍａｘは８μｇ／ｍｌであり、両方の一過性物（Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））について、Ｃｍａｘは、１８μｇ／ｍｌであり、そして安定なＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＣｍａｘは、３０μｇ／ｍｌであった。
【図３８】
図３８は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下的に注射した。マウスを注射の１、２、５、６、７、８、１２、１５および２０日後に尾部出血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するために設計されたＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）は、５日後には、もはや血清中で検出され得ないが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、１５日間以上検出可能であった。
【図３９】
図３９は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のインビボでＨＴ−１０８０線維肉腫腫瘍増殖を阻害する能力である。隔日または１週間に２回のＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）でのＳＣＩＤマウスの処置（２５ｍｇ／Ｋｇ）は、皮下ＨＴ−１０８０線維肉腫腫瘍の増殖を有意に減少した。
【図４０】
図４０は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のインビボでＣ６
神経膠腫腫瘍増殖を阻害する能力である。隔日または１週間に２回のＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）でのＳＣＩＤマウスの処置は、２．５ｍｇ／Ｋｇ程度に低い用量で、皮下Ｃ６神経膠腫腫瘍の増殖を有意に減少した。
【図４１】
図４１は、ＥＶＧＦ誘導性の子宮の透過性亢進である。思春期前の雌ラットにおいて排卵を誘導するために皮下注射されたＰＭＳＧ（５ＩＵ）は、２日後にエストラジオールのサージを生じ、これは、次に子宮においてＶＥＧＦの誘導を引き起こした。この誘導は、子宮の透過性亢進を生じ、そして子宮の濡れを増加した。ＰＭＳＧ注射の１時間後における２５ｍｇ／ｋｇでのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射は、子宮の湿重量の増加の約５０％の阻害を生じた。
【図４２】
図４２Ａ〜４２Ｂは、読み出し情報としてプロゲステロンを使用する黄体新脈管形成の評価である。ＰＭＳＧを皮下注射（５ＩＵ）して、思春期前の雌ラットにおいて排卵を誘導し、これは、移植のために子宮を調製するために血流中にプロゲステロンを分泌する血管の高密度なネットワークを含む、十分に機能する黄体を生じる。黄体中の新脈管形成の誘導は、ＶＥＧＦを必要とする。得られたプロゲステロンのレベルは、約５ｎｇ／ｍｌであり、そしてＰＭＳＧ後には２５〜４０ｎｇ／ｍｌまで誘導され得る。ＰＭＳＧ注射の１時間後における２５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）またはＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射は、４日目におけるプロゲステロン誘導の完全な阻害を生じた。