【手続補正書】
【提出日】平成22年5月31日(2010.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象タンパク質の安定性を改善する方法であって、
対象タンパク質に関連する他のタンパク質の中で高度に保存されていない、該対象タンパク質の表面残基を同定する工程と；
複数の非保存表面残基を、生理学的なｐＨで正に荷電したアミノ酸残基で置換する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
対象タンパク質の安定性を改善する方法であって、
対象タンパク質に関連する他のタンパク質の中で高度に保存されていない、該対象タンパク質の表面残基を同定する工程と；
複数の非保存表面残基を、生理学的なｐＨで負に荷電したアミノ酸残基で置換する工程と、
を含む、方法。
【請求項３】
前記非保存表面残基が疎水性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非保存表面残基が親水性であるか、または負に荷電している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対象タンパク質の安定性を改善する方法であって、
対象タンパク質の表面残基を同定する工程と；
該対象タンパク質に関連する他のタンパク質の中で高度に保存されていない、該対象タンパク質の表面残基を同定する工程と；
該同定した非保存表面残基のそれぞれに疎水性値を割り当てる工程と；
少なくとも１個の表面残基を、生理学的なｐＨで荷電したアミノ酸残基で置換する工程であって、該置換されている残基がすべて同じ型の残基に変異し、該残基の型が正に荷電した残基であるか、または負に荷電した残基のいずれかである、工程と、
を含む、方法。
【請求項６】
前記置換工程が、少なくとも１個の疎水性表面残基を置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記置換工程が、少なくとも１個の親水性表面残基を置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記置換工程が、少なくとも１個の荷電した表面残基を置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記置換工程が、少なくとも１個の表面残基をリジン残基で置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記置換工程が、少なくとも１個の表面残基をアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基で置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記置換工程が、少なくとも２個の表面残基を置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記置換工程が、少なくとも５個の表面残基を置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記置換工程が、少なくとも１０個の表面残基を置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記置換工程が、少なくとも２０個の表面残基を置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記置換工程が、少なくとも３０個の表面残基を置換する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨでより大きな正味電荷を有する修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨでより負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも−５より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも−１０より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも−１５より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも−２０より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨでより正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも＋５より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも＋１０より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも＋１５より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも＋２０より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象タンパク質が凝集しやすいタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象タンパク質が疎水性タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象タンパク質が膜タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象タンパク質が、過剰発現しにくいタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象タンパク質が、精製しにくいタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象タンパク質が受容体である、請求項５に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象タンパク質が転写因子である、請求項５に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象タンパク質が酵素である、請求項５に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象タンパク質が構造タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象タンパク質が蛍光タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象タンパク質が細胞外タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象タンパク質がストレプトアビジンである、請求項５に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項４１】
前記表面残基を同定する工程が、前記タンパク質の三次元構造をコンピュータモデリングする工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項４２】
前記表面残基を同定する工程が、アルゴリズムを使用して、残基がタンパク質の表面に見出されるか否かを予測する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項４３】
前記表面残基を同定する工程が、閾値未満のａｖＮＡＰＳＡ値を有する残基を同定する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項４４】
前記高度に保存されていない表面残基を同定する工程が、前記タンパク質のアミノ酸配列を、同じタンパク質ファミリーに由来する少なくとも１つの他のタンパク質と整列させる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項４５】
前記高度に保存されていない表面残基を同定する工程が、前記タンパク質のアミノ酸配列を、異なる種に由来する該タンパク質の少なくとも１つの他のアミノ酸配列と整列させる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項４６】
前記整列が、少なくとも２つの他のタンパク質配列を使用して行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記整列が、少なくとも３つの他のタンパク質配列を使用して行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記整列が、少なくとも５つの他のタンパク質配列を使用して行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記疎水性値を割り当てる工程が、オクタノール／水のＰ値を使用する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項５０】
前記置換工程が、前記同定した疎水性表面残基を、生理学的なｐＨで荷電した天然アミノ酸残基で置換するように、前記タンパク質配列に突然変異を起こさせる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項５１】
前記天然アミノ酸残基が、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記天然アミノ酸残基が、リジン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記天然アミノ酸残基がリジンである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記天然アミノ酸残基が、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記置換工程が、前記同定した表面残基の部位特異的突然変異誘発を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項５６】
前記置換工程が、前記同定した表面残基のＰＣＲ突然変異誘発を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項５７】
アミノ酸配列：
【化２１】
2009539351.tif 000001
の緑色蛍光タンパク質（＋３６  ＧＦＰ）。
【請求項５８】
請求項５７に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５９】
配列：
【化２２】
2009539351.tif 000002
の請求項５８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６０】
アミノ酸配列：
【化２３】
2009539351.tif 000003
の緑色蛍光タンパク質（＋４９  ＧＦＰ）。
【請求項６１】
請求項６０に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６２】
配列：
【化２４】
2009539351.tif 000004
の請求項６１に記載のポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
対象タンパク質の安定性を改善する方法であって、
対象タンパク質に関連する他のタンパク質の中で高度に保存されていない、該対象タンパク質の表面残基を同定する工程と；
複数の非保存表面残基を、生理学的なｐＨで正に荷電したアミノ酸残基で置換する工程と、
を含む、方法。
（項目２）
対象タンパク質の安定性を改善する方法であって、
対象タンパク質に関連する他のタンパク質の中で高度に保存されていない、該対象タンパク質の表面残基を同定する工程と；
複数の非保存表面残基を、生理学的なｐＨで負に荷電したアミノ酸残基で置換する工程と、
を含む、方法。
（項目３）
前記非保存表面残基が疎水性である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記非保存表面残基が親水性であるか、または負に荷電している、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記非保存表面残基が親水性であるか、または正に荷電している、項目２に記載の方法。
（項目６）
対象タンパク質の安定性を改善する方法であって、
対象タンパク質の表面残基を同定する工程と；
該対象タンパク質に関連する他のタンパク質の中で高度に保存されていない、該対象タンパク質の表面残基を同定する工程と；
該同定した非保存表面残基のそれぞれに疎水性値を割り当てる工程と；
少なくとも１個の表面残基を、生理学的なｐＨで荷電したアミノ酸残基で置換する工程であって、該置換されている残基がすべて同じ型の残基に変異し、該残基の型が正に荷電した残基であるか、または負に荷電した残基のいずれかである、工程と、
を含む、方法。
（項目７）
前記置換工程が、少なくとも１個の疎水性表面残基を置換する工程を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記置換工程が、少なくとも１個の親水性表面残基を置換する工程を含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記置換工程が、少なくとも１個の荷電した表面残基を置換する工程を含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記置換工程が、少なくとも１個の表面残基をリジン残基で置換する工程を含む、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記置換工程が、少なくとも１個の表面残基をアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基で置換する工程を含む、項目６に記載の方法。
（項目１２）
前記置換工程が、少なくとも２個の表面残基を置換する工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目１３）
前記置換工程が、少なくとも５個の表面残基を置換する工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目１４）
前記置換工程が、少なくとも１０個の表面残基を置換する工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目１５）
前記置換工程が、少なくとも２０個の表面残基を置換する工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目１６）
前記置換工程が、少なくとも３０個の表面残基を置換する工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目１７）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨでより大きな正味電荷を有する修飾タンパク質が生成される、項目１、２または６に記載の方法。
（項目１８）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨでより負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目２または６に記載の方法。
（項目１９）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも−５より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目２または６に記載の方法。
（項目２０）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも−１０より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目２または６に記載の方法。
（項目２１）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも−１５より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目２または６に記載の方法。
（項目２２）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも−２０より負に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目２または６に記載の方法。
（項目２３）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨでより正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目１または６に記載の方法。
（項目２４）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも＋５より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目１または６に記載の方法。
（項目２５）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも＋１０より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目１または６に記載の方法。
（項目２６）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも＋１５より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目１または６に記載の方法。
（項目２７）
前記方法によって、対象となる元のタンパク質よりも、生理学的なｐＨで少なくとも＋２０より正に荷電した対象修飾タンパク質が生成される、項目１または６に記載の方法。
（項目２８）
前記対象タンパク質が凝集しやすいタンパク質である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目２９）
前記対象タンパク質が疎水性タンパク質である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３０）
前記対象タンパク質が膜タンパク質である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３１）
前記対象タンパク質が、過剰発現しにくいタンパク質である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３２）
前記対象タンパク質が、精製しにくいタンパク質である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３３）
前記対象タンパク質が受容体である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３４）
前記対象タンパク質が転写因子である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３５）
前記対象タンパク質が酵素である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３６）
前記対象タンパク質が構造タンパク質である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３７）
前記対象タンパク質が蛍光タンパク質である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３８）
前記対象タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目３９）
前記対象タンパク質が細胞外タンパク質である、項目１、２または６に記載の方法。
（項目４０）
前記対象タンパク質がストレプトアビジンである、項目１、２または６に記載の方法。
（項目４１）
前記対象タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである、項目１、２または６に記載の方法。
（項目４２）
前記表面残基を同定する工程が、前記タンパク質の三次元構造をコンピュータモデリングする工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目４３）
前記表面残基を同定する工程が、アルゴリズムを使用して、残基がタンパク質の表面に見出されるか否かを予測する工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目４４）
前記表面残基を同定する工程が、閾値未満のａｖＮＡＰＳＡ値を有する残基を同定する工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目４５）
前記高度に保存されていない表面残基を同定する工程が、前記タンパク質のアミノ酸配列を、同じタンパク質ファミリーに由来する少なくとも１つの他のタンパク質と整列させる工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目４６）
前記高度に保存されていない表面残基を同定する工程が、前記タンパク質のアミノ酸配列を、異なる種に由来する該タンパク質の少なくとも１つの他のアミノ酸配列と整列させる工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目４７）
前記整列が、少なくとも２つの他のタンパク質配列を使用して行われる、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４８）
前記整列が、少なくとも３つの他のタンパク質配列を使用して行われる、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４９）
前記整列が、少なくとも５つの他のタンパク質配列を使用して行われる、項目４５または４６に記載の方法。
（項目５０）
前記疎水性値を割り当てる工程が、オクタノール／水のＰ値を使用する工程を含む、項目６に記載の方法。
（項目５１）
前記置換工程が、前記同定した疎水性表面残基を、生理学的なｐＨで荷電した天然アミノ酸残基で置換するように、前記タンパク質配列に突然変異を起こさせる工程を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目５２）
前記天然アミノ酸残基が、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記天然アミノ酸残基が、リジン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群から選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記天然アミノ酸残基がリジンである、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
前記天然アミノ酸残基が、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記置換工程が、前記同定した表面残基の部位特異的突然変異誘発を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目５７）
前記置換工程が、前記同定した表面残基のＰＣＲ突然変異誘発を含む、項目１、２または６に記載の方法。
（項目５８）
アミノ酸配列：
【化２１】
2009539351.tif 000005
の緑色蛍光タンパク質（＋３６  ＧＦＰ）。
（項目５９）
項目５８に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目６０）
配列：
【化２２】
2009539351.tif 000006
の項目５９に記載のポリヌクレオチド。
（項目６１）
アミノ酸配列：
【化２３】
2009539351.tif 000007
の緑色蛍光タンパク質（＋４９  ＧＦＰ）。
（項目６２）
項目６１に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目６３）
配列：
【化２４】
2009539351.tif 000008
の項目６２に記載のポリヌクレオチド。
（項目６４）
アミノ酸配列：
【化２５】
2009539351.tif 000009
の緑色蛍光タンパク質（−２９  ＧＦＰ）。
（項目６５）
項目６４に記載の緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目６６）
配列：
【化２６】
2009539351.tif 000010
の項目６５に記載のポリヌクレオチド。
（項目６７）
アミノ酸配列：
【化２７】
2009539351.tif 000011
のストレプトアビジン（−４０  ＳＡＶ）。
（項目６８）
項目６７に記載のストレプトアビジンをコードするポリヌクレオチド。
（項目６９）
配列：
【化２８】
2009539351.tif 000012
の項目６８に記載のポリヌクレオチド。
（項目７０）
アミノ酸配列：
【化２９】
2009539351.tif 000013
のストレプトアビジン（＋５２  ＳＡＶ）。
（項目７１）
項目７０に記載のストレプトアビジンをコードするポリヌクレオチド。
（項目７２）
配列：
【化３０】
2009539351.tif 000014
の項目７１に記載のポリヌクレオチド。
（項目７３）
アミノ酸配列：
【化３１】
2009539351.tif 000015
のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（−４０  ＧＳＴ）。
（項目７４）
項目７３に記載のストレプトアビジンをコードするポリヌクレオチド。
（項目７５）
配列：
【化３２】
2009539351.tif 000016
の項目７４に記載のポリヌクレオチド。
（項目７６）
項目１〜５７のいずれか１項に記載の方法により修飾されるタンパク質。
（項目７７）
項目７６に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目７８）
項目１〜５７のいずれか１項に記載の方法を実行するためのキット。
本発明は、タンパク質をより安定させるために修飾するシステムを提供する。本発明は、タンパク質表面の疎水性領域を修飾することにより、タンパク質の超熱力学的特性を改善することができるという認識に基づいている。本発明のシステムは、対象タンパク質の可溶性の改善、タンパク質の凝集に対する抵抗力の改善、および／またはタンパク質の復元能力の改善に特に有用である。これらの特性はすべて、タンパク質の産生、タンパク質の精製、ならびに治療薬および研究ツールとしてのタンパク質の使用に特に有用である。