【手続補正書】
【提出日】平成23年2月15日(2011.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連結された可変領域をコードする配列を含んでなる同族対のライブラリーを生成する方法であって、
ａ）げっ歯類ドナー由来のリンパ球を含んでなる細胞画分を提供すること、
ｂ）前記細胞画分由来の細胞を個々に複数の容器に分配することにより、単離された単一細胞の集団を入手すること、ここに、細胞の少なくとも１つのサブ集団は、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０抗原を発現するものであり、次いで、
ｃ）単離された単一細胞 に由来するテンプレートを使用して、多重分子増幅手順で目的のヌクレオチド配列を増幅し、そして増幅された目的のヌクレオチド配列の連結を行うことによって、単離された単一細胞の前記集団に含有される可変領域をコードする配列の増幅および連結を行うこと
を含んでなる、方法。
【請求項２】
増幅および連結（工程ｃ）を実施する前に、単一細胞の集団における個々の単離された単一細胞が、同遺伝子型細胞の集団に拡大培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リンパ球を含有する細胞画分が、脾細胞、全血液、骨髄、単核細胞、または白血球細胞を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リンパ球を含有する細胞画分が、脾細胞または骨髄 を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
リンパ球を含有する細胞画分が脾細胞を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
リンパ球を含有する細胞画分 が、形質細胞または形質芽細胞について富化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
目的のヌクレオチド配列が、免疫グロブリン可変領域をコードする配列を含んでなり、そして連結が、重鎖可変領域をコードする配列と会合した軽鎖可変領域をコードする配列の同族対を生じるものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
複数の目的の非隣接ヌクレオチド配列を無作為に連結する方法であって、ここに、目的のヌクレオチド配列が可変領域をコードする配列を含んでなり、連結が可変領域をコードする配列の対のコンビナトリアルライブラリーを生じるものであり、
ａ）遺伝的に多様な細胞の集団に由来するテンプレートを使用して、多重分子増幅手順で目的のヌクレオチド配列を増幅すること、ここに、遺伝的に多様な細胞は、げっ歯類ドナー由来のリンパ球を含んでなる細胞画分に由来するものであり、細胞の少なくとも１つのサブ集団は、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０抗原を発現するものであり、次いで、
ｂ）工程ａ）において増幅した目的のヌクレオチド配列の連結を行うこと
を含んでなる、方法。
【請求項９】
多重分子増幅の前に、リンパ球を含んでなる細胞の集団が、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０抗原 を発現する細胞を含んでなることを評価することをさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
多重分子増幅の前に、リンパ球を含んでなる細胞の集団が、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原を発現する細胞を含んでなることを評価することを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
多重分子増幅の前に、前記リンパ球を含んでなる細胞画分を、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０を発現するリンパ球集団について富化することをさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
多重分子増幅の前に、前記リンパ球を含んでなる集団から、ＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０抗原を発現する細胞を単離することをさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
単離された細胞または細胞のサブ集団が、リンパ球を含んでなる細胞画分に関してＣＤ１３８高／ＣＤ４３高またはＣＤ１３８中／ＣＤ４３高である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
富化または単離が、ＭＡＣＳ、ＦＡＣＳまたは別の自動選別手順を含んでなる請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ドナーがマウスである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ドナーがヒトイムノグロブリンを発現するトランスジェニックマウスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記多重分子増幅手順が多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、多重ＰＣＲ増幅の前の個別の逆転写（ＲＴ）工程を含んでなる２工程プロセスであるか、または前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、最初に、逆転写（ＲＴ）および多重ＰＣＲ増幅の両方を実施するのに必要なすべての成分を単一の容器に添加することを含んでなる単一の工程において実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
目的のヌクレオチド配列の前記連結が、多重分子増幅として同じ容器において実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
目的のヌクレオチド配列の前記連結が、多重重複伸長プライマー混合物を利用して、多重ＰＣＲ増幅に関連して行われる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
連結された目的の核酸配列を増幅するために適応されたプライマー混合物を利用して、さらなる分子増幅が実施される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
多重重複伸長プライマー混合物が、
ａ）免疫グロブリン軽鎖領域をコードする配列のセンス鎖に相補的な少なくとも１つのｍＫａｐｐａｒ１またはｈｍＪＫプライマー、
ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列または軽鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖に相補的であり、かつ工程ａ）においてプライマーと共にプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのｍＶＫプライマー、
ｃ）免疫グロブリン重鎖ドメインをコードする配列のセンス鎖に相補的な少なくとも１つのｍＣＨｒｅｖ１、ｍＨＣｒｅｖ１−ｅｘｔ、またはｍＪＨプライマー、
ｄ）免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列または重鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖に相補的であり、かつ工程ｃ）においてプライマーと共にプライマーセットを形成することが可能な少なくとも１つのｍＶＨプライマー
を含んでなる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
連結されたヌクレオチド配列または同族対のライブラリーをベクターに挿入することをさらに含んでなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
連結されたヌクレオチド配列または同族対のライブラリーの個々のメンバーが、軽鎖可変領域をコードする配列と会合した免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列を含んでなり、そして前記配列が、１つもしくはそれ以上の免疫グロブリン定常領域ドメインまたはそれらのフラグメントをコードする配列を既に含有するベクターにインフレームで挿入される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
所望される標的特異性を伴う結合タンパク質をコードする連結された可変領域配列の同族対のサブセットを選択することによってサブライブラリーを作製し、それにより、可変領域をコードする配列の標的特異的同族対のライブラリーを作製することをさらに含んでなる、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記同族対または可変領域をコードする配列の標的特異的同族対のライブラリーを、哺乳動物発現ベクターに移行させることをさらに含んでなる、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物発現ベクターが、ヒト免疫グロブリンクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、κ軽鎖またはλ軽鎖から選択された１つもしくはそれ以上の定常領域ドメインをコードする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
以下の工程、
ａ）連結されたヌクレオチド配列のセグメントをコードするベクターを宿主細胞に導入すること
ｂ）発現のために適応された条件下で、前記宿主細胞を培養すること、
ｃ）前記宿主細胞に挿入されたベクターから発現されるタンパク質産物を入手すること
をさらに含んでなる、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質産物が、重鎖可変領域と会合した軽鎖可変領域の同族対を含んでなる抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ヒト定常領域およびげっ歯類可変領域を伴うキメラ抗体をコードするベクターを作製するための方法であって、
ａ）げっ歯類由来のリンパ球を含んでなる細胞画分を提供すること、
ｂ）前記細胞画分由来の細胞を個々に複数の容器に分配することにより、単離された単一細胞の集団を入手すること、
ｃ）単離された単一細胞または同遺伝子型細胞の集団に由来するテンプレートを使用して、前記核酸を多重分子増幅手順で増幅し、そして免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域をコードする増幅された核酸の連結を行うことによって、単離された単一細胞の前記集団に含有される可変領域をコードする核酸の増幅および連結を行うこと、
ｄ）増幅された可変領域のヒト免疫グロブリン定常領域への連結を行うこと、次いで、
ｅ）得られた核酸をベクターに挿入すること
を含んでなる、方法。
【請求項３１】
該単離された単一細胞の集団における細胞の少なくとも１つのサブ集団がＣＤ４３およびＣＤ１３８抗原またはＭＨＣＩＩおよびＢ２２０抗原を発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記多重分子増幅手順が多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅である、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、多重ＰＣＲ増幅の前の個別の逆転写（ＲＴ）工程を含んでなる２工程プロセスであるか、または前記多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、最初に、逆転写（ＲＴ）および多重ＰＣＲ増幅の両方を実施するのに必要なすべての成分を単一の容器に添加することを含んでなる単一の工程において実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
目的のヌクレオチド配列の前記連結が、多重分子増幅として同じ容器において実施される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
目的のヌクレオチド配列の前記連結が、多重重複伸長プライマー混合物を利用して、多重ＰＣＲ増幅に関連して行われる、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
可変軽鎖への連結を提供することが可能な重複を伴うヒト定常軽鎖またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、マウスＶＨ鎖、リンカー、マウスＶＬ鎖、およびヒト定常軽鎖をこの順序で含んでなる構築物の増幅が可能なプライマーセットと共に、ＰＣＲ混合物に添加されるさらなる増幅工程、および／または
可変重鎖への連結を提供することが可能な重複を伴うヒト定常重鎖またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、ヒト定常重鎖、マウスＶＨ鎖、リンカー、およびマウスＶＬ鎖をこの順序で含んでなる構築物の増幅が可能なプライマーセットと共に、ＰＣＲ混合物に添加されるさらなる増幅工程を含んでなる、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。