(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）の可変領域および（ｂ）の可変領域を含んでなる、酸化低密度リポタンパク質に対し特異的に反応するモノクローナル抗体；
（ａ）Ｎ末端から順に、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）１として配列番号８のアミノ酸配列を、ＣＤＲ２として配列番号９のアミノ酸配列を、ＣＤＲ３として配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域（ＶＨ領域）、
（ｂ）Ｎ末端から順に、ＣＤＲ１として配列番号１３のアミノ酸配列を、ＣＤＲ２として配列番号１４のアミノ酸配列を、ＣＤＲ３として配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域（ＶＬ領域）。
【請求項２】
モノクローナル抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）において、下記（ａ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いと比較して、下記（ｂ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いが小となる、請求項１に記載のモノクローナル抗体；
（ａ）最終濃度０．４９３ｇ／Ｌの正常な低密度リポタンパク質（ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ）に最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で０．５時間反応させて得られる金属酸化低密度リポタンパク質、
（ｂ）最終濃度０．４９３ｇ／Ｌの正常な低密度リポタンパク質（ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ）に最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で２４時間反応させて得られる金属酸化低密度リポタンパク質。
【請求項３】
モノクローナル抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）において、下記（ａ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いと比較して、下記（ｂ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いが小となる、請求項１に記載の脂質異常症患者において酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体；
（ａ）脂質異常症患者から採取した酸化型のレムナントリポタンパク質、
（ｂ）前記脂質異常症患者から採取した正常な低密度リポタンパク質（ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ）。
【請求項４】
前記（ａ）の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列からなる、請求項１から請求項３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記（ｂ）の可変領域が配列番号１２のアミノ酸配列からなる、請求項１から請求項４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−９１６であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−９１６である、請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項１から請求項６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含んでなる、酸化低密度リポタンパク質検出用キット。
【請求項１０】
被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質を検出する方法であって、
請求項１から請求項６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、
前記複合体を検出する工程と
を有する、前記方法。
【請求項１１】
被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質を検出する方法であって、
請求項１から請求項６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を担体に固着する工程と、
担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、
前記複合体を検出する工程と
を有する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質に対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質検出用キットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）の酸化は、生体内における活性酸素の生成と消去とのバランスの崩壊による、活性酸素の過剰すなわち酸化ストレス状態となった場合に生じる。ＬＤＬはアポリポタンパク質Ｂと、コレステロール、リン脂質、中性脂肪などの脂質とが結合した巨大な分子であるが、ＬＤＬの酸化では、まず、構成脂質中の不飽和脂肪酸が活性酸素により酸化される。続いて、次々に連鎖的な酸化反応が起こり、共役ジエンを経て、過酸化脂質やアルデヒドが生成する。この連鎖的な酸化反応あるいは活性酸素による直接的な酸化反応によってアポリポタンパク質Ｂも酸化されて断裂する。これらの酸化反応の結果、ＬＤＬは球形の構造を失い、陰性荷電が増加し、受容体に対する親和性も変化して、正常なＬＤＬ（ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ）とは異なる性質を有する酸化ＬＤＬとなる。【０００３】
酸化ＬＤＬは、動脈硬化病巣に存在することや、健常人と比較して、高脂血症や糖尿病、肝疾患などの患者血清中に高濃度で検出されることなどから、酸化ストレスが関与する種々の疾患に係る重要な物質であると考えられている。そこで、これらの疾患の解明、治療、診断、評価などに利用することを目的として、酸化ＬＤＬを特異的に認識する抗体が開発されている。【０００４】
例えば、動脈硬化病巣から精製した酸化ＬＤＬを免疫原として得た、酸化により切断された脂肪酸を有するリン脂質を抗原として認識する抗酸化リン脂質抗体（非特許文献１）や、血清中のｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬから調製したマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）を免疫原として得た抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体（非特許文献２および非特許文献３）、血清中のｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬからアセチル化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬおよび金属酸化ＬＤＬを調製し、これらをそれぞれ等量含む溶液を免疫原として得た抗体（特許文献１）などを挙げることができる。【０００５】
ＬＤＬは酸化され得る部位を多数有する巨大な粒子であるため、その酸化の程度はさまざまである。一般に、生体において、血液中にはビタミンＣなど多くの抗酸化物質が存在していること、高度に酸化された酸化ＬＤＬ（高度酸化ＬＤＬ）は異物と認識されるために貪食細胞により速やかに除去されることなどから、特に血液中に存在する酸化ＬＤＬとしては軽度に酸化されたＬＤＬ（軽度酸化ＬＤＬ）が多く、血管壁や動脈硬化病巣などに存在する酸化ＬＤＬとしては高度酸化ＬＤＬが多いと考えられている。非特許文献１に記載された抗体が高度酸化ＬＤＬに対する抗体であり、軽度酸化ＬＤＬに対する抗体ではないということは前述の理由によると考えられる。【０００６】
一方、非特許文献２および非特許文献３に記載された抗体は、抗原として認識する部位がＬＤＬ内部に存在するため、サンプルの前処理を行って抗原部位を露出させる必要がある。【０００７】
さらに、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３および特許文献１に記載された抗体は、いずれも血清中に存在する酸化ＬＤＬを免疫原として得られた抗体ではないため、血清サンプルや血漿サンプルに対して用いた場合には、擬陽性反応を生じ、感度が低く、薬剤投与や生活習慣の改善などによる効果を検出することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平９−５３２３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｔａｂｅ Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６９巻、第１５２７４〜１５２７９頁、１９９４年
【非特許文献２】Ｋｏｔａｎｉ Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、第１２１５巻、第１２１〜１２５頁、１９９４年
【非特許文献３】Ｋｏｔａｎｉ Ｋ．ら、臨床病理、第４５巻、第４７〜５４頁、１９９７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、酸化ＬＤＬに係る研究開発において、重要なツールとしての機能を果たし得る、軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体を提供するとともに、そのモノクローナル抗体を用いて軽度に酸化された酸化ＬＤＬを簡便に検出するキットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを簡便に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、肝疾患患者の血清中に出現する軽度酸化ＬＤＬであるトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を免疫原としてハイブリドーマを作製し、選択されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が、軽度酸化ＬＤＬに対して反応の度合いが大きく、かつ高度酸化ＬＤＬに対して反応の度合いが小さいという性質を有することを見出し、下記の各発明を完成した。【００１２】
（１）モノクローナル抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）において、下記（ａ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いと比較して、下記（ｂ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いが小となる、酸化低密度リポタンパク質に対し特異的に反応するモノクローナル抗体；（ａ）最終濃度０．４９３ｇ／Ｌの正常な低密度リポタンパク質（ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ）に最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で０．５時間反応させて得られる金属酸化低密度リポタンパク質、（ｂ）最終濃度０．４９３ｇ／Ｌの正常な低密度リポタンパク質（ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ）に最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で２４時間反応させて得られる金属酸化低密度リポタンパク質。【００１３】
（２）酸化低密度リポタンパク質がトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ）である、（１）に記載のモノクローナル抗体。【００１４】
（３）酸化低密度リポタンパク質がヒトの酸化低密度リポタンパク質である、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体。【００１５】
（４）健常者において酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体。【００１６】
（５）非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）患者においてｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体。【００１７】
（６）脂質異常症患者において酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体。【００１８】
（７）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変領域を含んでなる、（１）から（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。【００１９】
（８）下記（ａ）の可変領域および／または（ｂ）の可変領域を含んでなる、（１）から（７）のいずれかに記載のモノクローナル抗体；（ａ）Ｎ末端から順に、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変領域、（ｂ）Ｎ末端から順に、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変領域。【００２０】
（９）配列番号７のアミノ酸配列からなる可変領域を含んでなる、（１）から（８）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。【００２１】
（１０）配列番号１２のアミノ酸配列からなる可変領域を含んでなる、（１）から（９）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。【００２２】
（１１）受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−９１６であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。【００２３】
（１２）（１）から（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。【００２４】
（１３）受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−９１６である、（１２）に記載のハイブリドーマ。【００２５】
（１４）（１）から（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含んでなる、酸化低密度リポタンパク質検出用キット。【００２６】
（１５）被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質を検出する方法であって、（１）から（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、前記複合体を検出する工程とを有する、前記方法。【００２７】
（１６）被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質を検出する方法であって、（１）から（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を担体に固着する工程と、担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、前記複合体を検出する工程とを有する、前記方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係るモノクローナル抗体、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法によれば、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬをはじめとする酸化ＬＤＬが関与する様々な疾患の解明、治療、診断、評価などを、より効果的かつ簡便に行うことができるとともに、薬効に優れた医薬組成物の開発に寄与し、提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】上下左側の図は、いずれも、健常者（ｎ＝１）または肝疾患患者（ｎ＝１）の血清から超遠心により分離した総リポタンパク質画分について、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った図である。一方、上下右側の図は、いずれも、そのゲル濾過クロマトグラフィーを行って得られた各溶出液における各脂質の濃度を測定した結果を示す図である。図中、ＴＣは総コレステロール、ＰＬはリン脂質、ＦＣは遊離コレステロール、ＴＧは中性脂肪を示す。また、いずれの図も、横軸はフラクションすなわちサイズを示し、横軸のプラス方向（右方向）に位置するほどサイズが小さいことを示す。
【図２】健常者（Ｎ）および肝疾患末期患者（Ｐ）の血清について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図３】Ｇ１１−６抗体の重鎖可変領域（Ｇ１１−６−ＶＨ）のＤＮＡ配列についてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を含む溶液にＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加してＶＨ泳動用溶液とし、電気泳動を行った結果を示す図（左図）、およびＧ１１−６抗体の軽鎖可変領域（Ｇ１１−６−ＶＬ）のｃＤＮＡ配列についてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を含む溶液にＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加してＶＬ泳動用溶液とし、電気泳動を行った結果を示す図（右図）である。
【図４】Ｇ１１−６−ＶＨおよびＧ１１−６−ＶＬのアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列との相同性検索を行った結果、相同性が高かった最上位のものを示す図である。
【図５】Ｇ１１−６−ＶＨの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列うち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２のアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列との相同性検索を行った結果、相同性が高かった最上位のものを示す図である。
【図６】Ｇ１１−６−ＶＨのＣＤＲ３およびＧ１１−６−ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列との相同性検索を行った結果、相同性が高かった最上位のものを示す図である。
【図７】Ｇ１１−６−ＶＬのＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列との相同性検索を行った結果、相同性が高かった最上位のものを示す図である。
【図８】肝疾患患者（ｎ＝１）血清および健常者（ｎ＝１）血清について、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図９】健常者、軽中度肝疾患患者および重度肝疾患患者の血清について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図１０】健常者（ｎ＝１４）、軽中度群（ｎ＝６）および重度群（ｎ＝３）の血清について、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行い測定した吸光度の値を、健常者群、軽中度群および重度群の群別に集計した結果を示す図である。
【図１１】健常者（ｎ＝１）、脂質異常症患者（ｎ＝７）および肝疾患患者（ｎ＝１２）の血清について、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ａ）、ならびに各サンプルの吸光度の測定値を、各サンプルの血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度の値で除した結果を示す図（Ｂ）である。
【図１２】肝疾患患者総リポタンパク質のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ａ）、ならびに健常者総リポタンパク質のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ｂ）である。
【図１３】肝疾患患者（ｎ＝１）血清のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、ＴＧ濃度の測定、ＰＬ濃度の測定、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図１４】ＮＡＳＨ患者（ｎ＝１）血清のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、ＴＧ濃度の測定、ＰＬ濃度の測定、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図１５】脂質異常症患者（ｎ＝２）血清のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、ＴＧ濃度の測定、ＰＬ濃度の測定、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図１６】健常者（ｎ＝２）血清のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、ＴＧ濃度の測定、ＰＬ濃度の測定、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。
【図１７】健常者血清から密度勾配遠心法により得られたＡ画分、Ｂ画分およびＣ画分について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った結果を示す図である。
【図１８】ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを酸化して得られる金属酸化ＬＤＬについて、その酸化時間を変化させて金属酸化ＬＤＬを調製し、その金属酸化ＬＤＬの溶液について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図１９】〈ａ−〉、〈ｂ−〉、〈ｃ−〉および〈ｄ−〉の金属酸化ＬＤＬについて、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度を、横軸はＥＬＩＳＡのサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す。
【図２０】〈ａ−〉の金属酸化ＬＤＬについて、ＴＢＡＲＳ法により過酸化脂質濃度測定を行った結果およびＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ａ；縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度および過酸化脂質濃度を、横軸はＥＬＩＳＡおよびＴＢＡＲＳ法のサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す）、ならびに〈ｃ−〉の金属酸化ＬＤＬについて、ＴＢＡＲＳ法により過酸化脂質濃度測定を行った結果およびＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ｂ；縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度および過酸化脂質濃度を、横軸はＥＬＩＳＡおよびＴＢＡＲＳ法のサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す）である。
【図２１】〈ａ−〉、〈ａ−１〉および〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬについて、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ａ；縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度を、横軸はＥＬＩＳＡのサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す）、ならびに〈ａ−〉、〈ａ−１〉および〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬについて、ＴＢＡＲＳ法により過酸化脂質濃度測定を行った結果を示す図（Ｂ；縦軸は過酸化脂質濃度を、横軸はＴＢＡＲＳ法のサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す）である。
【図２２】〈ａ−〉、〈ａ−１〉、〈ａ＋１〉、〈ａ−１ｗ〉および〈ａ＋１ｗ〉の金属酸化ＬＤＬについて、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度を、横軸はＥＬＩＳＡのサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す。
【図２３】金属酸化ＬＤＬについて、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、ＴＢＡＲＳ法による過酸化脂質濃度測定および共役ジエンの測定を行った結果を示す図である。縦軸はＥＬＩＳＡおよび共役ジエン測定の吸光度と過酸化脂質濃度とを、横軸はサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法について詳細に説明する。本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体は、軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが大であるとともに高度に酸化された酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが小である性質を有するモノクローナル抗体である。
【００３１】
以下、本明細書において、「軽度酸化ＬＤＬ」とは、酸化反応により生じた過酸化脂質やアルデヒド、断裂したアポリポタンパク質Ｂなどの酸化物を比較的少数有し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較して陰性荷電が大きい酸化ＬＤＬ、すなわち軽度に酸化された酸化ＬＤＬのことをいい、「高度酸化ＬＤＬ」とは、酸化反応により生じた過酸化脂質やアルデヒド、断裂したアポリポタンパク質Ｂなどの酸化物を比較的多数有し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較して陰性荷電が顕著に大きい酸化ＬＤＬ、すなわち高度に酸化された酸化ＬＤＬのことをいう。
【００３２】
本発明において軽度酸化ＬＤＬおよび高度酸化ＬＤＬは、いずれも定法に従い調製することができ、例えば、金属を用いて血清中のｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを酸化することにより調製することができる。この場合、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに作用させる金属の濃度または作用させる時間に比例して、得られる酸化ＬＤＬの酸化度は高くなる。例えば、最終濃度が約０．４９３ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに最終濃度が約３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ１時間（０＜Ｈ１＜２４）反応させることにより、最終濃度が約０．４９３ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに最終濃度が約６．５７９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ２時間（０＜Ｈ２＜８）反応させることにより、最終濃度が約０．４７６ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに最終濃度が約２３．８１μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ３時間（０＜Ｈ３＜８）反応させることにより、あるいは最終濃度が約０．４７６ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに最終濃度が約４７．６２μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ４時間（０＜Ｈ４＜８）反応させることにより、軽度酸化ＬＤＬを得ることができ、最終濃度０．４９３ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で少なくとも２４時間反応させることにより、最終濃度が約０．４９３ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに最終濃度が約６．５７９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ５時間（Ｈ５≧８）反応させることにより、最終濃度が約０．４７６ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに最終濃度が約２３．８１μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ６時間（Ｈ６≧８）反応させることにより、あるいは最終濃度が約０．４７６ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに最終濃度が約４７．６２μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ７時間（Ｈ７≧８）反応させることにより、高度酸化ＬＤＬを得ることができる。
【００３３】
本発明において、モノクローナル抗体が、軽度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが大であるとともに高度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが小である性質を有するか否かは、例えば、モノクローナル抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするＥＬＩＳＡにより確認することができる。すなわち、このＥＬＩＳＡにおいて、軽度酸化ＬＤＬをサンプルとした場合の反応の度合いと比較して、高度酸化ＬＤＬをサンプルとした場合の反応の度合いが小となれば、固相化抗体に用いたモノクローナル抗体は、軽度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが大であるとともに高度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが小である性質を有することとなる。
【００３４】
本発明において軽度酸化ＬＤＬは、ヒト、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどの哺乳類や鳥類の軽度酸化ＬＤＬを挙げることができるが、ヒトの軽度酸化ＬＤＬであることが好ましい。また、軽度酸化ＬＤＬはＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬであることが好ましい。
【００３５】
ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、少なくとも肝疾患患者血清中に出現するＬＤＬである。ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは中性脂肪であるトリアシルグリセロール（トリグリセリド、トリ−Ｏ−アシルグリセリン；ＴＧ，ＴＡＧ）の含有量が高いことを特徴とし、この点で、コレステロールの含有量が高い正常なＬＤＬ（ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ）とは異なるリポタンパク質である。肝疾患の進行に伴いＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの血清中濃度は増加し、肝疾患の末期では血清中に存在するリポタンパク質の大部分を占めるのに対し、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬおよび高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の血清中濃度は極端に減少する（Ｎａｇａｓａｋａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ、第１４６巻、第３２９〜３３５頁、２００５年）。
【００３６】
また、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは培養マクロファージを泡沫化する。そして、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬによるマクロファージ泡沫化率と酸化ＬＤＬの一種であるマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）の血清中濃度とが正比例すること（Ｎａｇａｓａｋａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ、第１４６巻、第３２９〜３３５頁、２００５年）、健常者血漿中には過酸化ＴＧがほとんど検出されないのに対し、肝疾患患者血漿中には、過酸化ＴＧの著しい増加が見られること（Ｈｕｉ ＳＰ．ら、Ｌｉｐｉｄｓ、第３８巻、第１２８７〜１２９２頁、２００３年）などから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは酸化ＬＤＬの一種であるとされている。さらに、血清中において、高度酸化ＬＤＬは多量に存在し得ないが、肝疾患患者血清中において、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは多量に存在することから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは軽度酸化ＬＤＬの一種と考えられている。
【００３７】
ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較してＴＧの重量割合が大きいＬＤＬである。また、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、マクロファージを泡沫化するＬＤＬである。このようなＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬには、中間比重リポタンパク質｛Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＩＤＬ（ミッドバンドともいい、分画としてＩＤＬに相当するレムナントリポタンパク質が含まれる）｝の酸化型のもの（すなわち酸化型のレムナントリポタンパク質が含まれる）の他、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄ−ＬＤＬ、変性ＬＤＬ）といわれる、粒子径が２５．５ｎｍ以下であり、比重で分画した場合に１．０４０〜１．０６３のＬＤＬに相当するリポタンパク質の酸化型のものが含まれる。
【００３８】
ここで、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合について測定した結果の典型例を図１および表１に示す。図１の上下左側の図は、それぞれ、健常者（上図）および肝疾患患者（下図）の血清から超遠心法により分離した総リポタンパク質画分について、２８０ｎｍの吸光度を測定しながらゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果を示す図であり、図１の上下右側の図は、それぞれ、健常者（上図）および肝疾患患者（下図）の血清から超遠心法により分離した総リポタンパク質画分についてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、得られた各溶出液について各脂質の濃度を測定した結果を示す図である。一方、表１は、肝疾患患者４名および健常者７名について上記の方法により各脂質の濃度を測定し、平均値と標準偏差を算出した結果を示している。
【００３９】
【表１】
0005854474.tif 000002
【００４０】
図１の上下左側の図に示すように、肝疾患患者においてはＶＬＤＬおよびＨＤＬが消失し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同様の粒子サイズを有するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが高濃度に存在する。その高濃度に存在するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合は、図１右側および表１に示すように、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合と比較して明らかに大きい。しかしながら、表１に示すように、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおける各脂質重量割合の標準偏差の値が大きいことから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合には、ある程度のばらつきがあることがわかる。
【００４１】
また、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの粒子サイズは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などにより測定することにより、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに近似した結果が得られるが、被検者の個体差や疾患の重症度などにより、ある程度異なる場合がある。
【００４２】
ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの電荷については、アガロースゲル電気泳動法などにより測定することにより、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに近似した結果またはｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較してやや負電荷であることを示す結果が得られるが、被検者の個体差や疾患の重症度などにより、ある程度異なる場合がある。
【００４３】
ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬは、肝疾患患者の血清から採取されるが、肝疾患のみならず、種々の疾患、特に、酸化ストレスの関与する疾患の患者やその罹患が疑われる者の血清に存在すると考えられている。そのような疾患としては、例えば、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝線維症、良性反復性肝内胆汁うっ滞症、胆道閉鎖症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）などの肝疾患の他、高コレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高トリグリセリド血症などの脂質異常症、脳梗塞、虚血性心疾患、大動脈瘤、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症などの動脈硬化性疾患、糖尿病、高血圧症などを挙げることができる。
【００４４】
抗体は、一般に、軽鎖（Ｌ鎖；分子量約２５，０００）および重鎖（Ｈ鎖；分子量約５０，０００〜７７，０００）の各２本ずつのポリペプチドが互いにジスルフィド結合で結合したＹ字型のヘテロテトラマーを基本構造としている。Ｙ字型の先端部分を可変領域といい、それ以外の部分を定常領域という。また、軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域という。可変領域は抗原認識部位であり、そのアミノ酸配列は抗体の種類ごとに変化に富む。一方、定常領域のアミノ酸配列は抗体間で比較的変化が少ない。可変領域のうち、直接抗原と接触して抗原に対する結合の中心的役割を担う領域は抗体間におけるアミノ酸配列の変化が特に大きく、この領域を相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）または超可変領域という。また、可変領域のうちのＣＤＲ以外の領域をフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）という。一般に、可変領域には、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）と、３つのＣＤＲを取り囲む４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４が存在することが知られている。
【００４５】
本発明における可変領域（ＶＨ領域およびＶＬ領域）は、本発明に係るモノクローナル抗体が軽度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが大であるとともに高度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが小である性質を有する限り、健常者において酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応する性質を有する限り、ＮＡＳＨ患者においてｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬと特異的に反応する性質を有する限り、または脂質異常症患者において酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応する性質を有する限り、いかなるアミノ酸配列からなるものでもよい。なお、本発明における可変領域（ＶＨ領域およびＶＬ領域）のアミノ酸配列の態様としては、例えば、下記（ｉ）〜（ｖ）を挙げることができる。
【００４６】
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｉｉ）Ｎ末端から順に、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）Ｎ末端から順に、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号１５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列、
（ｖ）配列番号１２のアミノ酸配列。
【００４７】
なお、本発明において、可変領域のアミノ酸配列は、常法に従い確認することができる。そのような方法としては、例えば、まず、後述する本発明に係るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出して、逆転写反応を行ってｃＤＮＡを得る。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、可変領域の増幅に適した既知の配列のプライマーを用いて可変領域のｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅し、必要に応じてクローニングを行った後、シークエンサーを用いてシークエンスを行うことによりＤＮＡ配列を決定する。最後に、決定した可変領域のＤＮＡ配列をトリプレットコドンに従いアミノ酸配列に変換することにより確認することができる。
【００４８】
なお、本発明において、「反応する」は、「相互作用する」、「結合する」、「認識する」と交換可能に用いられる。また、本発明において、抗体が、ある特定の抗原（免疫原）に対し「特異的に反応する」とは、前記特定抗原に対して反応性があることが明らかであればよい。前記特定抗原に対し「特異的に反応する」とは、他の抗原に全く反応しない場合も含むが、他の抗原に対し反応するとともに前記特定抗原に対し顕著に反応する場合も含む。
【００４９】
次に、本発明に係るハイブリドーマは、本発明に係るモノクローナル抗体を産生する。本発明に係るハイブリドーマの作製は、当業者により適宜選択可能な任意の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、第４９５−４９７頁、１９７５年）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻、第７２頁、１９８３年）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、第７７−９６頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５年）などの方法の他、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のステップを有する方法を挙げることができる。
【００５０】
（ｉ）まず、免疫原を調製する。免疫原は、どのような方法により調製してもよいが、本発明においては、血清からＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離した後、限外濾過により濃縮し、続いて透析することにより調製することができる。ここで、血清にＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることを確認する方法としては、当業者により適宜選択可能な方法を挙げることができるが、そのような方法として、アガロースゲル電気泳動法を挙げることができる。本発明においては、被検者血清および健常者血清をアガロースゲル電気泳動に供することにより、被検者血清においてα位のバンドが検出されず、かつ健常者血清と比較して陽極側に移動した位置でβ位のバンドが検出された場合に、その被検者血清にはＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれると判定することができる。
【００５１】
また、血清からＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離する方法としては、当業者により適宜選択可能な方法を挙げることができるが、そのような方法としては、例えば、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４−１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従い、密度勾配遠心法を用いて血清から分離した総リポタンパク質画分をゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離する方法を挙げることができる。
【００５２】
（ｉｉ）次に、分離したＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を免疫原として動物を免疫する。免疫は、適宜常法を用いて行うことができる。また、免疫の対象となる動物は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどを挙げることができる。
【００５３】
（ｉｉｉ）続いて、免疫した動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞などを挙げることができる。さらに、ハイブリドーマを得るため、採取した抗体産生細胞を他の細胞と融合させる。抗体産生細胞を採取する方法および細胞の融合方法は、当業者が適宜選択可能な方法を挙げることができる。また、抗体産生細胞に融合させる細胞としては、増殖能力の強い細胞を用いることが好ましく、例えば、一般に入手可能なミエローマ細胞の細胞株を使用することができる。なお、使用する細胞株は、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
【００５４】
（ｉｖ）次に、作製したハイブリドーマから、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに対しては反応の度合いが小さく、かつ金属酸化ＬＤＬに対しては反応の度合いが大きいモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ法やイムノブロット法などの常法を用いて、当業者が適宜選択可能な手法により行うことができる。ＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングする場合は、例えば、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡをハイブリドーマの培養上清について行い、適当な標識をした抗（免疫動物）抗体によりＥＬＩＳＡの反応を検出し、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに対しては反応の度合いが小さく、かつ金属酸化ＬＤＬに対しては反応の度合いが大きい培養上清を特定することにより、ハイブリドーマを特定することができる。
【００５５】
上記（ｉ）〜（ｉｖ）のステップを有する方法により得られたハイブリドーマを本発明に係るハイブリドーマとすることができるが、クローニングないしスクリーニングをさらに行うことにより細胞を純化し、本発明に係るハイブリドーマとすることができる。そのようなクローニングないしスクリーニング方法としては、例えば、限界希釈法、トリプシン濾紙法、ペニシリンキャップ法などの方法を挙げることができる。
【００５６】
また、このようにして得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を本発明に係るモノクローナル抗体とすることができる他、前記方法のステップ（ｉｉｉ）において採取される抗体産生細胞が産生するモノクローナル抗体を本発明に係るモノクローナル抗体とすることができる。ハイブリドーマまたは抗体産生細胞からモノクローナル抗体を抽出する方法としては、例えば、細胞培養法や腹水形成法などの常法を挙げることができる。抽出したモノクローナル抗体は、例えば、硫安塩析法、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択し、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００５７】
得られたモノクローナル抗体のクラスの判定は、適宜常法に従って行うことができ、例えば、免疫した動物がマウスの場合は、ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社）などを用いて行うことができる。なお、本発明に係るモノクローナル抗体のクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれも用いることができる。
【００５８】
本発明に係るモノクローナル抗体は、必要に応じて、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質、酵素などにより標識して用いることができる。また、必要に応じて、ポリスチレン製プレート、ポリプロピレン製プレート、シリコン製プレート、ポリスチレン製マイクロビーズ、磁気ビーズ、ラテックス粒子などの担体に固着させて用いることができる。
【００５９】
また、本発明に係るモノクローナル抗体は、必要に応じて、ヒト免疫グロブリン産生能を有する動物に免疫することにより、ヒト抗体として得ることができる他、遺伝子工学的手法を用いて、免疫動物由来の可変部とヒト由来の定常部とからなるキメラ抗体として得ることもでき、免疫動物由来の超可変部を有し、それ以外の抗体部分はヒト由来であるヒト化抗体として得ることもできる。
【００６０】
なお、本発明に係るモノクローナル抗体として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１０年３月１７日付で受託されており、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−９１６であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を挙げることができるが、これに限定されるものではない。同様に、本発明に係るハイブリドーマとして、上記の受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−９１６であるハイブリドーマを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００６１】
すなわち、後述する実施例に示されるように、健常者において酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体、ＮＡＳＨ患者においてｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体および脂質異常症患者において酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体も、本発明に係るモノクローナル抗体に包含される。
【００６２】
本発明において、「健常者」とは、障害がなく健康な人（岩波書店  広辞苑  第六版）の他、少なくとも酸化ＬＤＬが関与する疾患に罹患していない人をいう。
【００６３】
次に、本発明は、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットを提供する。本発明に係るキットは、本発明に係るモノクローナル抗体を含んでなるが、二次抗体、標識物質その他の免疫学的検出手段の実施に有用な物質、緩衝液、器具など、その特徴を損なわない限りにおいて、その構成物として含んでもよい。
【００６４】
さらに、本発明は、被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法を提供する。なお、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法には、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬの検出方法を損なわない限り、インキュベート工程や洗浄工程などを含んでいてもよい。
【００６５】
本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法は、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化ＬＤＬを検出する方法であって、
（ｉ）本発明に係るモノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化ＬＤＬに特異的に反応させて複合体を形成させる工程（複合体形成工程）
（ｉｉ）前記複合体を検出する工程（検出工程）
以上（ｉ）および（ｉｉ）の工程を有する。
【００６６】
（ｉ）複合体形成工程において複合体を形成させる方法としては、当業者が適宜選択可能な任意の方法を挙げることができる。そのような方法としては、例えば、本発明に係るモノクローナル抗体を含む溶液と生体試料とを混合させて複合体を形成させる方法の他、生体試料を担体に固着させて本発明に係るモノクローナル抗体を含む溶液と反応させる方法、本発明に係るモノクローナル抗体を担体に固着させて生体試料と反応させる方法などを挙げることができる。
【００６７】
（ｉｉ）検出工程において複合体を検出する方法としては、ＥＬＩＳＡ法、間接抗体法、ラテックス凝集法、比濁法、ＣＬＥＩＡ法などの常法の他、例えば、モノクローナル抗体あるいは生体試料に予め標識をし、この標識を検出する方法を挙げることができる。
【００６８】
次に、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法の異なる態様は、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化ＬＤＬを検出する方法であって、
（ｉ）本発明に係るモノクローナル抗体を担体に固着する工程（固着工程）
（ｉｉ）担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化ＬＤＬに特異的に反応させて複合体を形成させる工程（固着複合体形成工程）
（ｉｉｉ）前記複合体を検出する工程（固着複合体検出工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有する。
【００６９】
（ｉ）固着工程において、本発明に係るモノクローナル抗体を固着する担体は任意のものを用いることができ、そのような担体としては、例えば、上述の担体と同様のものを挙げることができる。また、固着する方法は特に限定されず、用いる担体により適宜設定して行うことができる。
【００７０】
（ｉｉ）固着複合体形成工程および（ｉｉｉ）固着複合体検出工程における、固着複合体を形成させる方法および固着複合体を検出する方法としては、上述の（ｉ）複合体形成工程および（ｉｉ）検出工程と同様の方法を挙げることができる。
【００７１】
本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットおよび軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法は、肝疾患のみならず酸化ＬＤＬが関与する種々の疾患の解明、診断、重症度の評価、治療効果の評価の他、リポタンパク質の酸化度の評価などに用いることが可能である。
【００７２】
以下、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００７３】
＜実施例１＞ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原とするモノクローナル抗体の作製
（１）アガロースゲル電気泳動によるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬの確認
肝疾患末期患者１名および健常者１名から採取した血液を室温で１時間静置した後、３５００ｒｐｍ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行うことにより、肝疾患末期患者血清および健常者血清を得た。得られた血清を１．５μＬずつアガロースゲル（ユニバーサルゲル／８；ヘレナ研究所社）に塗布し、ｐＨ８．６、イオン強度０．０６のバルビタール緩衝液中において、１００Ｖ、１５０Ｗで４５分間電気泳動を行った後、ドライヤーを用いてゲルを乾燥させた。続いて、０．０３％（ｗ／ｖ）のＦａｔ Ｒｅｄ ７Ｂ（ヘレナ研究所社）を含むメタノール２０ｍＬにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２滴加え、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を４ｍＬ加えることにより調製した染色液に、乾燥させたゲルを１０分間浸漬して染色を行った後、７５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液に１０秒間浸漬することにより脱色を行った。【００７４】
図２に示すように、健常者血清（Ｎ）ではＨＤＬに相当するα位およびＬＤＬに相当するβ位にそれぞれバンドが検出された。一方、肝疾患末期患者血清（Ｐ）ではα位のバンドは検出されなかった。また、健常者血清（Ｎ）のβ位のバンドに比して、肝疾患末期患者血清（Ｐ）では陽極側に移動した位置でβ位のバンドが検出された。これらの結果から、この肝疾患末期患者血清にはＨＤＬが含まれず、かつＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることが確認された。【００７５】
（２）免疫原の調製
［２−１］密度勾配遠心法による総リポタンパク質画分の分離
本実施例（１）でＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることが確認された肝疾患末期患者血清について、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４−１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従って密度勾配遠心法を行い、総リポタンパク質画分を得た。具体的には、本実施例（１）の肝疾患末期患者血清に５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ；和光純薬工業社）およびＥＤＴＡ−２Ｎａ（同仁化学研究所社）をそれぞれ０．７ｍｍｏｌ／Ｌおよび２．７ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）となるよう加え、さらに適量の臭化カリウム（関東化学社）を加えることにより比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調整し、サンプル溶液とした。続いて、０．２０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．４）および１ｍｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを含む水溶液（ｄ＝１．００６ｋｇ／Ｌ）に、適量の臭化カリウム（関東化学社）を加えることにより比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調整し、比重液とした。サンプル溶液１２ｍＬを遠心管（４０ＰＡ；日立工機社）に入れ、比重液を満たし、超遠心機ｈｉｍａｃ ＣＰ６０Ｅ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（日立工機社）およびローターＲＰＶ−５０Ｔ ｒｏｔｏｒ（日立工機社）を用いて、４００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で１８時間遠心分離を行って、上層（ｄ＜１．２２５ｋｇ／Ｌ）を総リポタンパク質画分として回収した。回収した総リポタンパク画分約８ｍＬを、アミコン攪拌式セルＭｏｄｅｌ ８０５０（ミリポア社）および限外濾過膜アミコンＸＭ５０（ミリポア社）を用いて、付属の使用書に従い、窒素ガス雰囲気下で２〜３ｍＬに濃縮した。  【００７６】
［２−２］ゲル濾過クロマトグラフィーによるＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分の分離
本実施例（２）［２−１］の総リポタンパク質画分について、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４〜１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従ってゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を得た。具体的には、以下の器具、試薬および条件を用いて、２８０ｎｍの吸光度を計測しながらゲル濾過クロマトグラフィーを行い、溶出液を３ｍＬずつ分取した。【００７７】
サンプル；本実施例（２）［２−１］の総リポタンパク画分２〜３ｍＬ（カラム負荷量）
カラム  ；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（ＧＥヘルスケア社）
緩衝液  ；０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．２７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａ            および３ｍｍｏｌ／ＬのＮａＮ３を含む５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ            緩衝液（ｐＨ７．４）２００ｍＬ
条件    ；クロマトチャンバー  ４℃
流速  ０．１５ｍＬ／分【００７８】
分取した溶出液のうち、吸光度のピークの前後９ｍＬ（３ｍＬ×３画分）ずつ溶出液を集め、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分１８ｍＬ（３ｍＬ×６画分）を得た。【００７９】
［２−３］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分の濃縮および透析
本実施例（２）［２−２］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分１８ｍＬを、アミコン攪拌式セルＭｏｄｅｌ ８０５０（ミリポア社）および限外濾過膜アミコンＸＭ５０（ミリポア社）を用いて、付属の使用書に従い、窒素ガス雰囲気下で２〜３ｍＬに濃縮した。その後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を透析液として、透析膜（セルロースチューブ２０／３２；三光純薬社）を用いて、４℃で一晩透析し、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液２〜３ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。【００８０】
［２−４］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度測定
本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液について、既報に従い、Ｌｏｗｒｙ変法を用いてタンパク質濃度を測定した（Ｍａｒｋｗｅｌｌ ＭＡ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第８７巻、第２０６〜２１０頁、１９７８年）。具体的には、２％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウム、０．４％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム、０．１６％（ｗ／ｖ）の酒石酸塩および１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む水溶液を調製し、この水溶液と４％（ｗ／ｖ）の硫酸銅水溶液とを体積比１００：１に混合した溶液を反応溶液として調製した。また、脱イオン水に等量のフェノール試薬（フォーリン・チオカルト試薬；和光純薬社）を混合してフォーリン・チオカルト試薬液を調製した。また、５００μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を標準溶液として調製した。本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液および標準溶液それぞれ１ｍＬに、調製した反応溶液を３ｍＬずつ加えて室温で３０分間反応させた。続いて、調製したフォーリン・チオカルト試薬液３００μＬを強く撹拌しながら加えた後、室温で４５分間反応させた。その後、６６０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定した。標準溶液の測定値との比較から、本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度を算出した。【００８１】
［２−５］ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度調整
本実施例（２）［２−４］で算出した結果に基づき、本実施例（２）［２−３］のＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度を、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬに調整した後、４℃で保存した。【００８２】
（３）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原としたマウスへの免疫およびハイブリドーマの作製
本実施例（２）［２−５］の０．５〜１ｍｇ／ｍＬのＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液０．１ｍＬを孔径０．４５ｍｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）に通した後、常法に従って、百日咳菌アジュバントを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔内注射することにより免疫を行った。その後、常法に従って、免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、５０％ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマは、常法に従って、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびＨＡＴ溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、コロニーが確認できるまで約１０日間培養した。【００８３】
（４）ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬ、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬおよび金属酸化ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡによるハイブリドーマのスクリーニング
［４−１］ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ画分の調製
本実施例（２）［２−１］、［２−２］、［２−３］、［２−４］および［２−５］に記載の方法に従って、健常者血清からｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液を調製した。【００８４】
［４−２］金属酸化ＬＤＬ画分の調製
本実施例（４）［４−１］のｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液１ｍｇ／ｍＬに、２５μｍｏｌ／Ｌとなるよう硫酸銅を添加し、３７℃で２４時間インキュベートした後、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析を行うことにより、金属酸化ＬＤＬ溶液を調製した。【００８５】
［４−３］ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬおよび金属酸化ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡ
本実施例（４）［４−１］のｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液および本実施例（４）［４−２］の金属酸化ＬＤＬ溶液を、ＰＢＳを用いてそれぞれ２０μｇ／ｍＬに希釈した後、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に５０μＬ／ウェル入れて４℃で一晩反応させることにより、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬおよび金属酸化ＬＤＬをそれぞれプレート上に固着させた。液体を除去して１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェル入れ、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキングを行った後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）を用いて４回洗浄した。続いて、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたウェルおよび金属酸化ＬＤＬを固着させたウェルに本実施例（３）の各コロニーの培養上清を５０μＬ／ウェル入れて、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、ＰＢＳで５００倍に希釈したビオチン標識ラット抗マウスｋ鎖（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェルずつ入れ、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＡＬＰ−ＳＡ；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェル入れて室温で３０分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。次に、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＤｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ溶液を用いて１ｍｇ／ｍＬに調整したＤｉｓｏｄｉｕｍ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社）を１００μＬ／ウェル入れて、室温で３０分間反応させた。続いて、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、主波長４０５ｎｍおよび副波長６００ｎｍで吸光度を測定した。ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたウェルについては吸光度が小さい培養上清を、金属酸化ＬＤＬを固着させたウェルについては吸光度が大きい培養上清をそれぞれ特定することにより、コロニーの選択を行った。【００８６】
［４−４］限界希釈法によるクローニングおよびスクリーニング
本実施例（４）［４−３］で選択したコロニーの細胞を、９６穴プレートに１個／ウェルとなるように播き、ペニシリン−ストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ、Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、ＴｈｙｍｉｄｉｎｅおよびＨｙｂｒｉｄｏｍａ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ−ＨＴ−ＨＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０）を用いて培養を行った。これらの培養上清について、本実施例（４）［４−３］に記載の方法に従い、再度ＥＬＩＳＡを行い、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬを固着させたウェルについては吸光度が小さい培養上清を、かつ金属酸化ＬＤＬを固着させたウェルについては吸光度が大きい培養上清を特定することにより、クローンの選択を行った。その結果、得られたハイブリドーマをＧ１１−６と命名した。【００８７】
（５）Ｇ１１−６抗体の精製
常法に従って、２，６，１０，１４‐テトラメチル‐２‐ペンタデセン酸（プリステン）を注射したマウスの腹腔内に、本実施例（４）のＧ１１−６を接種して培養し、Ｇ１１−６が産生するモノクローナル抗体（Ｇ１１−６抗体）を含む腹水を得た。【００８８】
得られた腹水について、常法に従い飽和硫安（飽和硫酸アンモニウム）沈殿法を行って、粗モノクローナル抗体溶液を得た。具体的には、得られた腹水を氷冷しながら、等量の飽和硫酸アンモニウムをゆっくりと滴下して加えた後、遠心分離を行って上清を除去した。続いて沈殿物に５０％飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて再度遠心して上清を除去することで洗浄を行い、沈殿物をＰＢＳに溶解して粗Ｇ１１−６抗体溶液とした。【００８９】
続いて、粗Ｇ１１−６抗体溶液３００μＬについて、以下の器具・機器、溶離液および条件を用いて常法に従ってＨＰＬＣ法を行い、溶出液を０．５ｍＬずつ分取することにより、８０μｇ／ｍＬ精製Ｇ１１−６抗体溶液を約１．４ｍＬ得た。【００９０】
カラム；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケア社）
溶離液；５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＰＢ溶液（ｐＨ７．２）
システムコントローラ；ＣＢＭ−２０Ａ（島津製作所社）
送液ポンプ：ＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社）
オートサンプラー；ＳＩＬ−２０Ａ（島津製作所社）
カラムオーブン；ＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社）
検出器；ＳＰＤ−２０Ａ（島津製作所社）
条件；流速  ０．５ｍＬ／分
検出波長  ２８０ｎｍ【００９１】
＜実施例２＞Ｇ１１−６抗体のクラス判定
ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、付属の使用書に従い、イムノクロマトグラフィー法により実施例１（５）のＧ１１−６抗体のクラス判定を行った。その結果、Ｇ１１−６抗体のクラスはＩｇＭであることが明らかになった。【００９２】
＜実施例３＞Ｇ１１−６抗体の可変領域の配列確認
（１）ＲＮＡの抽出
実施例１（４）のハイブリドーマＧ１１−６を、１０ｍＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を入れた２５ｃｍ３のフラスコに播種し、５％ＣＯ２雰囲気および３７℃の条件下で７２時間培養した。続いて、常温、８５００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離を行って、上清を除去し、細胞ペレットを回収した。Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて、付属の使用書に従い、回収した細胞のペレットからＲＮＡの抽出を行った。【００９３】
具体的には、まず、４．２μＬのβ−メルカプトエタノールを６００μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに添加し、これを細胞ペレットに加えた。１８Ｇ（外径１．２ｍｍ、内径０．９４ｍｍ）のシリンジでピペッティングを行った後、全量をＰｒｅｆｉｌｔｅｒ Ｓｐｉｎ Ｃｕｐ（Ｃｕｐ１）に収容して、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離を行い、濾液約６００μＬを回収した。ここに６００μＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加えて転倒混和し、約１２００ｍＬのエタノール混和液を得た。このうち、７００μＬをＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｉｎ Ｃｕｐ（Ｃｕｐ２）に移し、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行った後、濾液を除去し、残りのエタノール混和液約５００μＬを加えて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間、再度遠心分離を行った。その後、濾液を除去し、６００μＬのＬｏｗ Ｓａｌｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを加え、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間、さらに遠心分離を行って濾液を除去した。続いて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下でさらに２分間遠心分離を行い、濾液を除去した。ＤＮａｓｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ５０μＬとｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅＩ５μＬとを混合してＣｕｐ２に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。さらにその後、Ｃｕｐ２にＨｉｇｈ−Ｓａｌｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ６００μＬを添加し、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行った後、濾液を除去した。Ｃｕｐ２にＬｏｗ Ｓａｌｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ６００μＬを加えて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行った後、濾液を除去した。さらに、Ｃｕｐ２にＬｏｗ Ｓａｌｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ３００μＬを加えて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で２分間遠心分離を行った後、Ｃｕｐ２を新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。続いて、６０℃に温めたＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ５０μＬをＣｕｐ２に添加して、室温で２分間静置した。その後、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行って濾液を回収し、これをＲＮＡ溶液とした。ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてそのＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度を測定したところ、１２８ｎｇ／μＬであった。そこで、ＲＮＡ溶液にＤＥＰＣ水の適量を添加することで、ＲＮＡ濃度を約１００ｎｇ／μＬに調製した。【００９４】
（２）ｃＤＮＡの調製
本実施例（１）のＲＮＡ溶液を鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社）を用いて、付属の使用書に従い逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。具体的には、まず、下記の組成の反応液Ａおよび反応液Ｂを調製した。【００９５】
反応液Ａ；約１００ｎｇ／μＬ ＲＮＡ溶液  ８μＬ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ  １μＬ、５０ｎｇ／μＬ Ｒａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒｓ  １μＬ
反応液Ｂ；１０×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２  ４μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ  ２μＬ、４０Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ  １μＬ【００９６】
反応液Ａを混和して、６５℃で５分間インキュベートした後、１分間氷中に静置した。続いて、反応液Ａに反応液Ｂを添加して、室温で２分間インキュベートした後、１μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ ＲＴを添加して、室温で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間の順でインキュベートすることにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡ溶液は、４℃で保管した。【００９７】
（３）Ｇ１１−６抗体の重鎖可変領域（Ｇ１１−６−ＶＨ）および軽鎖可変領域（Ｇ１１−６−ＶＬ）のＤＮＡ配列の増幅
本実施例（２）のｃＤＮＡ溶液を鋳型として、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＰＣＲを行い、Ｇ１１−６抗体の重鎖可変領域（Ｇ１１−６−ＶＨ）およびＧ１１−６抗体の軽鎖可変領域（Ｇ１１−６−ＶＬ）のＤＮＡ配列をそれぞれ増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー、ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。【００９８】
ＰＣＲに用いたプライマー｛Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）｝
Ｇ１１−６−ＶＨ（５’プライマー；ＭｕＩｇＶＨ５’−Ｂ）；５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＲＡＡＴＧＳＡＳＣＴＧＧＧＴＹＷＴＹＣＴＣＴＴ−３’（ＲはＡまたはＧ、ＳはＣまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＷはＡまたはＴを表す。；配列番号１）
Ｇ１１−６−ＶＨ（３’プライマー；ＭｕＩｇＭＶＨ３’）；５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＡＡ−３’（配列番号２）
Ｇ１１−６−ＶＬ（５’プライマー；ＭｕＩｇｋＶＬ５’−Ｂ）；５’− ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴ−３’（配列番号３）
Ｇ１１−６−ＶＬ（３’プライマー；ＭｕＩｇｋＶＬ３’）；５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ反応溶液組成；１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋フリー）  ２．５μＬ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２  ０．７５μＬ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ  ２．０μＬ、２５０ｐｍｏｌ／Ｌ ５’プライマー  １．０μＬ、２５０ｐｍｏｌ／Ｌ ３’プライマー  １．０μＬ、ｃＤＮＡ溶液  １．０μＬ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．２５μＬ、ＤＥＰＣ水  １６．５μＬ
ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分の各反応を１サイクルとして４０サイクル行い、その後７２℃で６分の反応を行った。【００９９】
増幅したＧ１１−６−ＶＨのＤＮＡ配列を含む溶液（ＶＨ−ＰＣＲ産物溶液）および増幅したＧ１１−６−ＶＬのＤＮＡ配列を含む溶液（ＶＬ−ＰＣＲ産物溶液）は、４℃で保存した。【０１００】
（４）電気泳動によるＰＣＲ産物の確認
本実施例（３）のＶＨ−ＰＣＲ産物溶液およびＶＨ−ＰＣＲ産物溶液から５μＬずつ分取して、それぞれ２μＬのＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（６×Ｏｒａｎｇｅ ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を添加し、ＶＨ泳動用溶液およびＶＬ泳動用溶液とした。ＶＨ泳動用溶液、ＶＬ泳動用溶液およびＤＮＡラダー（Ｏ’ＧｅｎｅＲｕｌｅｒＴＭ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｌｕｓ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を、０．００７％（ｖ／ｖ）エチジウムブロマイド（ニッポンジーン社）を含む３％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ；ＣＡＭＢＲＥＸ社）にアプライした後、陽極側の泳動用バッファー（１×ＴＡＥ バッファー；ニッポンジーン社）に２μＬのエチジウムブロマイド（ニッポンジーン社）を添加して混和し、１００Ｖで、約４０分間電気泳動を行った。その後、ＵＶ検出器（Ｄｏｌｐｈｉｎ−Ｖｉｅｗ；ＫＵＲＡＢＯ社）を用いて、泳動像の観察を行った。その結果を図３に示す。【０１０１】
図３左図に示すように、ＶＨ泳動用溶液では約４５０ｂｐのバンドが、ＶＬ泳動用溶液では約４００ｂｐのバンドがそれぞれ検出された。この結果から、ＶＨ−ＰＣＲ産物溶液においてＧ１１−６−ＶＨのＤＮＡ配列が、ＶＬ−ＰＣＲ産物溶液においてＧ１１−６−ＶＬのＤＮＡ配列がそれぞれ増幅されていることが確認された。【０１０２】
（５）ＰＣＲ産物の回収およびベクターへの挿入
本実施例（３）のＶＨ−ＰＣＲ産物溶液およびＶＬ−ＰＣＲ産物溶液から１５μＬずつ分取して、実施例（４）に記載の方法により電気泳動を行った。続いて、ＶＨ−ＰＣＲ産物溶液を泳動したアガロースゲルからは約４５０ｂｐのバンドを、ＶＬ−ＰＣＲ産物溶液を泳動したアガロースゲルからは約４００ｂｐのバンドをそれぞれ切り出した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、付属の使用書に従い、ＤＮＡ断片を含む溶液を回収し、Ｇ１１−６−ＶＨ−ＤＮＡ溶液およびＧ１１−６−ＶＬ−ＤＮＡ溶液とした。その後、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、４μＬのＧ１１−６−ＶＨ−ＤＮＡ溶液、１μＬのＳａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび１μＬのＴＯＰＯベクターからなるＶＨライゲーション反応液と、４μＬのＧ１１−６−ＶＬ−ＤＮＡ溶液、１μＬのＳａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび１μＬのＴＯＰＯベクターからなるＶＬライゲーション反応液とを調製し、室温で５分間静置することにより、ＤＮＡ断片のベクターへの挿入を行った。【０１０３】
（６）形質転換（トランスフォーメーション）および大腸菌の培養
本実施例（５）のＶＨライゲーション反応液２μＬおよびＶＬライゲーション反応液２μＬに、それぞれ、ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加して混和した後、氷中で３０分間静置した。続いて、４２℃で３０秒間静置した後、直ちに氷中で冷却し、Ｅ．ｃｏｌｉ増殖用培地であるＳ．Ｏ．Ｃ．ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２５０μＬずつ加えて３７℃で１時間静置することにより、大腸菌の形質転換を行った。ＶＨライゲーション反応液により形質転換した大腸菌を含む溶液をＶＨ大腸菌液とし、ＶＬライゲーション反応液により形質転換した大腸菌を含む溶液をＶＬ大腸菌液とした。【０１０４】
１％（ｖ／ｖ）Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む４％（ｗ／ｖ）ＬＢ Ａｇａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）プレートを６枚用意し、３枚ずつ２群に分けてＶＨプレート群およびＶＬプレート群とした。ＶＨプレート群の各プレートにはＶＨ大腸菌液を、ＶＬプレート群の各プレートにはＶＬ大腸菌液を、それぞれ１０μＬ、５０μＬおよび１００μＬずつ添加して塗布した後、全プレートを３７℃で１５時間インキュベートした。続いて、プレートに出現したコロニーを、ＶＨプレート群から計８個、ＶＬプレート群から計７個、滅菌済みのつまようじで拾い上げ、拾い上げた各コロニーを、１％（ｖ／ｖ）Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む２％（ｗ／ｖ）ＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｂａｓｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５ｍＬに添加した。これを、ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−１５（ＴＡＩＴＥＣ社）を用いて、振盪速度２００ｍｉｎ−１で浸透しながら３７℃で１５時間培養することにより、ＶＨ大腸菌培養液（計８サンプル）およびＶＬ大腸菌培養液（計７サンプル）を得た。【０１０５】
（７）プラスミドＤＮＡの精製
本実施例（６）のＶＨ大腸菌培養液１サンプルおよびＶＬ大腸菌培養液１サンプルについて、常温および３０００ｒｐｍの条件下で１０分間遠心分離を行った後、上清を除去してＶＨ大腸菌ペレットおよびＶＬ大腸菌ペレットを回収した。その後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を用いてプラスミドの精製を行い、ＶＨプラスミド溶液およびＶＬプラスミド溶液を得た。具体的には、ＶＨ大腸菌ペレットおよびＶＬ大腸菌ペレットのそれぞれにＰ１溶液を２５０μＬずつ加えて懸濁し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した後、これにＰ２溶液を２５０μＬずつ加えて転倒混和し、数分静置して大腸菌を溶解させた。続いて、Ｎ３溶液を３５０μＬずつ加えて転倒混和して中和し、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行った後、それぞれ上清を回収して、カラムに添加した。続いて、このカラムを常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行って濾液を除去した後、カラムにＰＥ溶液を７５０μＬずつ加えて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行って濾液を除去することによりカラムを洗浄した。カラムをそれぞれ新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した後、ＥＢ溶液を５０μＬずつ加えて１分間静置した。その後、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で２分間遠心分離を行って濾液を回収し、これをプラスミド溶液とした。ＶＬ大腸菌ペレットから得られたプラスミド溶液をＶＬプラスミド溶液とし、ＶＬ大腸菌ペレットから得られたプラスミド溶液をＶＬプラスミド溶液とした。ＶＨプラスミド溶液およびＶＬプラスミド溶液は４℃で保存した。【０１０６】
（８）シークエンス
本実施例（７）のＶＨプラスミド溶液およびＶＬプラスミド溶液をそれぞれ鋳型ＤＮＡとして、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＴ３プライマー（ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ；配列番号５）を用いてシークエンス反応を行った。シークエンス反応溶液組成およびシークエンス反応条件は以下のとおりである。【０１０７】
シークエンス反応溶液組成；Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ  ２μＬ、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、Ｔ３プライマー  １μＬ、ＤＥＰＣ水  ５μＬ、鋳型ＤＮＡ  １μＬ
シークエンス反応条件；９６℃で１０秒間の反応の後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で３分の各反応を１サイクルとして２５サイクル行い、その後４℃で静置した。【０１０８】
続いて、ＶＨプラスミド溶液を鋳型ＤＮＡとしたシークエンス反応溶液（ＶＨシークエンス反応溶液）およびＶＬプラスミド溶液を鋳型ＤＮＡとしたシークエンス反応溶液（ＶＬシークエンス反応溶液）に、ＳＡＭＴＭ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）４５μＬおよびＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μＬを添加した後、ＭｉｃｒｏＭｉｘｅｒ Ｅ−３６（ＴＡＩＴＥＣ社）を用いて、室温および遮光の条件下で３０分間振盪した。その後、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１０秒間遠心分離を行って上清を回収し、シークエンサー（３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にセットしてＤＮＡ配列を解析した。続いて、ソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ；ＭａｃＶｅｃｔｏｒ社）を用いて、得られたＤＮＡ配列からアミノ酸配列ならびに相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を推定した。その結果を下記に示す。【０１０９】
Ｇ１１−６−ＶＨのＤＮＡ配列
ＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＧＧＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号６）【０１１０】
Ｇ１１−６−ＶＨのアミノ酸配列（下線は順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の領域を示す）
ＶＱＬＱＱＳＧＴＶＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＳＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＫＬＴＡＶＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＮＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＶＹＧＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号７）
ＶＨ領域のＣＤＲ１；ＳＹＷＭＨ（配列番号８）
ＶＨ領域のＣＤＲ２；ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９）
ＶＨ領域のＣＤＲ３；ＶＹＧＲＡＭＤＹ（配列番号１０）【０１１１】
Ｇ１１−６−ＶＬのＤＮＡ配列
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＡＧＴＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＴＧＴＡＴＣＣＡＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＣＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡ（配列番号１１）【０１１２】
Ｇ１１−６−ＶＬのアミノ酸配列（下線は順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の領域を示す）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＹＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨＷＮＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＬＶＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＡＡＴＹＹＣＱＨＩＲＥＬＴＲＳＥＧＧＰＳＷＫ（配列番号１２）
ＶＬ領域のＣＤＲ１；ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨ（配列番号１３）
ＶＬ領域のＣＤＲ２；ＬＶＳＮＬＥＳ（配列番号１４）
ＶＬ領域のＣＤＲ３；ＱＨＩＲＥＬＴ（配列番号１５）【０１１３】
（９）アミノ酸配列の相同性検索
本実施例（８）のＧ１１−６−ＶＨ、Ｇ１１−６−ＶＬ、およびそれらのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の各アミノ酸配列について、ソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ；ＭａｃＶｅｃｔｏｒ社）を用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析およびＢＬＡＳＴ解析を行い、既知のアミノ酸配列との相同性を検索した。相同性検索の結果、相同性が高かった最上位のものを図４〜７に示す。【０１１４】
図４〜７に示すように、Ｇ１１−６−ＶＬのアミノ酸配列と１００％一致する既知のアミノ酸配列は検出されたが、Ｇ１１−６−ＶＨのアミノ酸配列と１００％一致する既知のアミノ酸配列は検出されなかった。また、Ｇ１１−６−ＶＨのＣＤＲ１、Ｇ１１−６−ＶＨのＣＤＲ２、Ｇ１１−６−ＶＬのＣＤＲ１、Ｇ１１−６−ＶＬのＣＤＲ２およびＧ１１−６−ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列とそれぞれ１００％一致する既知のアミノ酸配列は検出されたが、Ｇ１１−６−ＶＨのＣＤＲ３と１００％一致する既知のアミノ酸配列は検出されなかった。これらの結果から、Ｇ１１−６抗体は新規の抗体であることが確認された。【０１１５】
＜実施例３＞肝疾患患者血清に対するＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性
（１）血清サンプルの調製
肝疾患患者１名および健常者１名からそれぞれ血清を採取し、サンプルとした。【０１１６】
（２）Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
［２−１］ビオチン標識抗アポリポタンパク質Ｂ抗体（検出用抗体）の調製
〈２−１−１〉抗アポリポタンパク質Ｂ抗体の精製
抗アポリポタンパク質Ｂポリクローナル抗体を含むヤギ抗血清（ＷａｔＰａ；Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ社）について、実施例１（５）に記載の方法により、常法に従い飽和硫安沈殿法を行って、粗抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液を得た。続いて、粗抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液について、常法に従いアフィニティカラムクロマトグラフィー法を行って、精製抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を得た。具体的には、まず、粗抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液をＰＢＳで１０倍希釈した後、以下の器具・機器および条件を用いてアフィニティカラムに循環して通過させた。【０１１７】
カラム；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）
送液ポンプ；ペリスタルティックポンプ（ＳＪ−１２１５；ＡＴＴＯ社）
条件；４℃、流速約０．２ｍＬ／分【０１１８】
続いて、ＰＢＳを用いてカラム内を洗浄した後、流速約０．２ｍＬ／分で０．１ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を流してカラムに結合した抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を溶出させ、溶出液を０．５ｍＬずつ分取した。【０１１９】
分取した溶出液に速やかに１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和を行った後、各溶出液について波長２８０ｎｍの吸光度を測定して、タンパク質の存在が確認された溶出液を選択した。選択した溶出液を合わせて波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質濃度を算出したところ、４．７ｍｇ／ｍＬの精製抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液約３．５ｍＬが得られたことが確認された。続いて、透析膜（セルロースチューブ２０／３２；三光純薬社）を用い、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析することにより、精製抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液約３．５ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。その後、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬに調整した。【０１２０】
〈２−１−２〉抗アポリポタンパク質Ｂ抗体のビオチン標識
Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（和光純薬社）に、１０ｍｍｏｌ／ＬとなるようＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ ｏｆ ｂｉｏｔｉｎ（ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を溶解することによりビオチン標識液を調製した。本実施例（２）［２−１］〈２−１−１〉の抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液１ｍＬに、調製したビオチン標識液を２７μＬ添加して、室温で４時間、振盪しながら反応させた後、ＰＢＳを透析液として透析を行い、未反応のビオチンを除去することにより、ビオチン標識抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を調製した。その後、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度０．０１ｍｇ／ｍＬに希釈した。【０１２１】
［２−２］Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
実施例１（５）のＧ１１−６抗体について、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度５μｇ／ｍＬに希釈した。これを、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に５０μＬ／ウェル入れて、３７℃で２時間インキュベートすることによりＧ１１−６抗体をプレート上に固着させた。液体を除去して１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェル入れ、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキングを行った後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、ＰＢＳを用いてそれぞれ２０倍に希釈した本実施例（１）の血清サンプルを５０μＬ／ウェル入れて、４℃で一晩反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。次に、本実施例（２）［２−１］〈２−１−２〉のビオチン標識ヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を５０μＬ／ウェル入れ、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで２５０倍に希釈したＡＬＰ−ＳＡ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェル入れて室温で３０分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて４回洗浄した。さらに、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＤｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ溶液を用いて１ｍｇ／ｍＬに調整したＤｉｓｏｄｉｕｍ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社）を１００μＬ／ウェル入れ、室温で６０分間発色反応を行った後、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ；サーモサイエンティフィックフィッシャー社）を用いて、主波長４０５ｎｍおよび副波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。【０１２２】
（３）抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
本実施例（１）の血清サンプルについて、酸化ＬＤＬのＥＬＩＳＡキット（酸化ＬＤＬ測定試薬「ＭＸ」；協和メデックス社）を用いて、付属の使用書に従いＥＬＩＳＡの反応を測定した。具体的には、マウス抗酸化リン脂質モノクローナル抗体が固着されたプレートに反応用緩衝液を１００μＬ／ウェル入れ、付属の検体希釈液を用いて本実施例（１）の血清サンプルを２５０倍に希釈し、それぞれ２０μＬ／ウェル入れて３７℃で２時間インキュベートした後、付属の洗浄液を用いて４回洗浄した。続いて、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトアポリポタンパク質Ｂポリクローナル抗体を１００μＬ／ウェル入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、前記洗浄液を用いて４回洗浄した。次に、３，３’，５，５’，−テトラメチルベンジジン溶液を１００μＬ／ウェル入れて３７℃で３０分間インキュベートし、０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸を５０μＬ／ウェル入れることにより反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ；サーモサイエンティフィックフィッシャー社）を用いて、主波長４５０ｎｍおよび副波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。【０１２３】
（４）抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
本実施例（１）の血清サンプルについて、酸化ＬＤＬのＥＬＩＳＡキット（酸化ＬＤＬエライザ「第一」；積水メディカル社）を用いて、付属の使用書に従いＥＬＩＳＡの反応を測定した。具体的には、付属の洗浄液を用いてマウス抗ＭＤＡ−ＬＤＬモノクローナル抗体が固着されたプレートを３回洗浄した。続いて、検体希釈液（ＨＥＰＥＳ緩衝液）を用いて本実施例（１）の血清サンプルを２０００倍に希釈し、それぞれ１００μＬ／ウェル入れて室温で２時間反応させた後、付属の洗浄液を用いて３回洗浄した。続いて、β−ガラクトシダーゼ標識マウス抗アポリポタンパク質Ｂモノクローナル抗体を１００μＬ／ウェル入れ、室温で１時間反応させた後、付属の洗浄液を用いて３回洗浄した。次に、基質であるｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液を１００μＬ／ウェル入れて、室温で２時間反応させた後、炭酸ナトリウム液を１００μＬ／ウェル入れて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＮＯＶＡＰＡＴＨ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、主波長４１５ｎｍおよび副波長６５５ｎｍで吸光度を測定した。【０１２４】
本実施例（２）、（３）および（４）の結果を図８に示す。図８に示すように、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおいては、肝疾患患者では０．２１２の吸光度が確認されたが、健常者では吸光度がほとんど確認されなかった。これに対し、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおいては、肝疾患患者では０．６０２の吸光度が、健常者では０．０９４の吸光度がそれぞれ確認された。また、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおいては、肝疾患患者では０．１４６の吸光度が、健常者では０．１７９の吸光度がそれぞれ確認された。【０１２５】
これらの結果から、抗酸化リン脂質抗体および抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体が、肝疾患患者血清のみならず健常者血清に対しても少なからず反応するのに対し、Ｇ１１−６抗体は、肝疾患患者血清に反応するが健常者血清にはほとんど反応しないことから、特異性に優れることが示された。【０１２６】
＜実施例４＞肝疾患重症度とＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおける反応性との相関
（１）アガロースゲル電気泳動による肝疾患重症度の判定
肝疾患患者９名、健常者１４名からそれぞれ血清を採取し、実施例１（１）に記載の方法に従ってアガロースゲル電気泳動を行った。健常者血清および肝疾患患者血清の典型的な泳動結果を図９に示す。【０１２７】
図９に示すように、肝疾患患者血清のうち、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が完全に欠失したものと欠失していないものがあった。そこでこの結果に基づき、健常者の泳動パターンに比して、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が完全に欠失した肝疾患患者を重度群と判定し、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が欠失していない肝疾患患者を軽中度群と判定したところ、肝疾患患者９名のうち６名が軽中度群であり、３名が重度群であった。【０１２８】
（２）Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
実施例３（２）［２−２］に記載の方法に従い、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（１）の健常者群１４名、軽中度群６名および重度群３名の血清合計２３サンプルをそれぞれ用いた。吸光度の測定値を健常者群、軽中度群および重度群の群別に集計し、平均値を算出した。その結果を図１０に示す。各群間の比較は、一元配置分散分析およびＳｃｈｅｆｆｅの方法による多重比較検定を行い、 Ｐ＜０．０５である場合に、統計学的に有意であるとした。【０１２９】
図１０に示すように、健常者群の吸光度は０．０５２±０．０２４であったのに対し、軽中度群の吸光度は０．１０５±０．０７４、重度群の吸光度は０．６９９±０．９４２であった。多重比較検定の結果、重度群と健常者群との間はＰ＜０．０５で、有意差が認められた。また、重度群と軽中度群との間はＰ＜０．０５で、有意差が認められた。一方、健常者群と軽中度群との間には有意差が認められなかった。【０１３０】
これらの結果から、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、肝疾患患者において肝疾患の重症度診断に有用であることが確認された。【０１３１】
＜実施例５＞脂質異常症患者血清に対するＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性
（１）血清脂質項目の測定
健常者１名、脂質異常症患者７名（脂質異常症１、脂質異常症２、・・・脂質異常症７とする）および肝疾患患者１２名（肝疾患１、肝疾患２、・・・肝疾患１２とする）から血清合計２０サンプルを採取し、以下の試薬および日立自動分析装置７１７０（日立ハイテクノロジーズ社）を用いて、付属の使用書に従い、血清中脂質濃度を測定した。続いて、測定値を健常者、脂質異常症患者および肝疾患患者の別に集計して、平均値を算出した。その結果を表２に示す。【０１３２】
総コレステロール（ＴＣ）；コレステストＣＨＯ（積水メディカル社）
中性脂肪（ＴＧ）；エクセライザ ＴＧ（積水メディカル社）
リン脂質（ＰＬ）；ピュアオートＳ ＰＬ（積水メディカル社）  
高密度リポタンパク質中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）；コレステストＮ ＨＤＬ（積水メディカル社）
低密度リポタンパク質中のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）；コレステスト ＬＤＬ（積水メディカル社）【０１３３】
【表２】
0005854474.tif 000003
【０１３４】
（２）Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
実施例３（２）［２−２］に記載の方法により、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（１）の健常者１名、脂質異常症患者７名および肝疾患患者１２名の血清合計２０サンプルを用いた。その結果を図１１のＡに示す。また、各サンプルの吸光度の測定値について、以下の式を用いて、本実施例（１）で測定した各サンプルのＬＤＬ−Ｃの血清中濃度で除した。その結果を図１１のＢに示す。【０１３５】
式；吸光度の測定値×１００００／本実施例（１）で測定した血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度【０１３６】
図１１のＡに示すように、健常者の吸光度の測定値はほぼゼロである一方、脂質異常症患者１〜脂質異常症患者７の吸光度の測定値は、概ね健常者の吸光度の測定値と比較して大きい。特に、脂質異常症患者１の吸光度の測定値は、他の脂質異常症患者の吸光度の測定値と比較して大きく、肝疾患患者１〜肝疾患患者１０、肝疾患患者１２の吸光度の測定値と比較しても同程度あるいはそれよりも大きいことが分かる。これに対し、肝疾患患者１〜肝疾患患者１２の吸光度は、健常者の吸光度の測定値と比較して大きく、脂質異常症患者の吸光度の測定値と比較しても、概ね大きいことが分かる。これらの結果から、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、健常者では反応が小さい一方、脂質異常症患者および肝疾患患者では比較的反応が大きいことが確認された。【０１３７】
また、図１１のＢに示すように、各サンプルの吸光度の測定値を各サンプルの血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度で除したところ、肝疾患患者の測定値と健常者および脂質異常症患者の測定値との差が大きくなり、肝疾患患者の測定値が大きい一方、健常者および脂質異常症患者の測定値が小さくなった。この結果から、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度の測定値を血清中ＬＤＬ−Ｃ濃度で除することにより、肝疾患特異的に大きな値となることが確認された。【０１３８】
＜実施例６＞各種疾患患者血清のゲル濾過溶出液に対するＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性
（１）総リポタンパク質画分のゲル濾過溶出液に対する各種ＥＬＩＳＡの反応性
健常者から血清を採取し、既報（Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従って密度勾配遠心法を行い、リポタンパク質を分離した。具体的には、肝疾患患者１名および若年健常者１名から採取したそれぞれの血清２ｍＬを比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調整し、超遠心機ＯｐｔｉｍａＭＡＸ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ベックマン・コールター社）およびローターＭＬＮ−８０（ベックマン・コールター社）を用いて、５００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で２０時間遠心分離を行った後、上層（ｄ＜１．２２５ｋｇ／Ｌ）を総リポタンパク質画分として回収した。続いて、実施例１（５）に記載の方法によりゲル濾過クロマトグラフィーを行って、溶出液を０．５ｍＬずつ分取し、分取した順に溶出番号１、溶出番号２、・・・・溶出番号２８とした。その後、溶出番号５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５および２８の各溶出液についてコレステストＣＨＯ（積水メディカル社）および日立自動分析装置７１７０（日立ハイテクノロジーズ社）を用いて、付属の使用書に従い、ＴＣ濃度を測定した。【０１３９】
続いて、溶出番号５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５および２８の各溶出液をサンプルとして、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、また、付属の検体希釈液を用いて溶出番号５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５および２８の各溶出液を１０倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（３）に記載の方法により抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、さらに、付属の検体希釈液を用いて溶出番号５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５および２８の各溶出液を５００倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（４）に記載の方法により抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、それぞれ行った。【０１４０】
ＴＣ濃度測定および各種のＥＬＩＳＡの、肝疾患患者血清についての結果を図１２のＡに、健常者血清についての結果を図１２のＢにそれぞれ示す。【０１４１】
図１２のＡに示すように、肝疾患患者では溶出番号１３においてＴＣ濃度が最大となった。また、溶出番号１３において、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡのいずれも吸光度が最大となった。【０１４２】
ＴＣ濃度は総リポタンパク質における各リポタンパク質の濃度を示すことから、これらの結果から、Ｇ１１−６抗体は、肝疾患患者に高濃度に存在するＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに特異的に反応することが確認された。また、ＴＣ濃度のピークおよびＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおける反応のピークが、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、すなわち市販の酸化ＬＤＬのＥＬＩＳＡにおける反応のピークと一致したことから、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが酸化ＬＤＬであること、およびＧ１１−６抗体は酸化ＬＤＬに反応することが確認された。【０１４３】
一方、図１２のＢに示すように、若年健常者では溶出番号１３においてＴＣ濃度が最大となったのに対し、溶出番号１４において、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡのいずれも吸光度が最大となった。【０１４４】
これらの結果から、健常者にはｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較して粒子サイズの小さい、酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬが存在すること、Ｇ１１−６抗体はこのような酸化ＬＤＬに対して反応することおよび健常者においては酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応することが確認された。【０１４５】
（２）血清のゲル濾過溶出液に対する各種ＥＬＩＳＡの反応性
肝疾患患者１名、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者１名、脂質異常症患者２名（脂質異常症１、脂質異常症２とする）および健常者２名（健常者１、健常者２とする）から血清合計６サンプルを採取し、実施例１（５）に記載の方法によりゲル濾過クロマトグラフィーを行って、溶出液を０．５ｍＬずつ分取し、分取した順に溶出番号１、溶出番号２、・・・・溶出番号２８とした。その後、溶出番号１〜２８の各溶出液について実施例５（１）に記載の方法によりＴＣ濃度、ＴＧ濃度およびＰＬ濃度を測定した。【０１４６】
続いて、溶出番号１、３、５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２１、２４および２８の各溶出液をサンプルとして、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、付属の検体希釈液を用いて、溶出番号１、３、５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、および２４の各溶出液を５００倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（４）に記載の方法により抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、それぞれ行った。【０１４７】
脂質濃度測定および各種のＥＬＩＳＡの、肝疾患患者（ｎ＝１）血清についての結果を図１３に、ＮＡＳＨ患者（ｎ＝１）血清についての結果を図１４に、脂質異常症患者（ｎ＝２）血清についての結果を図１５に、健常者（ｎ＝２）血清についての結果を図１６にそれぞれ示す。【０１４８】
図１３に示すように、肝疾患患者では、溶出番号１３においてＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＰＬ濃度、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度および抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度がいずれも最大となった。【０１４９】
この結果は本実施例（１）の図１２のＡと同様の結果であり、Ｇ１１−６抗体はＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬに特異的に反応すること、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬが酸化ＬＤＬであることおよびＧ１１−６抗体は酸化ＬＤＬに反応することが確認された。【０１５０】
また、図１４に示すように、ＮＡＳＨ患者では、溶出番号１４においてＴＣ濃度およびＰＬ濃度が、溶出番号５においてＴＧ濃度が、溶出番号１３においてＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、溶出番号１５において抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、それぞれ最大となった。【０１５１】
この結果から、ＮＡＳＨ患者にはｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬが存在すること、Ｇ１１−６抗体はそのような酸化ＬＤＬに対して反応することおよびＮＡＳＨ患者においてはｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬと特異的に反応することが確認された。また、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体がｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較して粒子サイズの小さい酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬに対して反応が大きいのに対し、Ｇ１１−６抗体が酸化型ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬに対して反応が小さいのは、下記の実施例で示すように、ＮＡＳＨ患者における酸化型ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬが高度に酸化されているためと本発明者らは考えている。【０１５２】
また、図１５に示すように、脂質異常症患者では、溶出番号１３においてＴＣ濃度、ＴＧ濃度およびＰＬ濃度が、溶出番号１１においてＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、溶出番号１４または溶出番号１５において抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、それぞれ最大となった。【０１５３】
この結果から、脂質異常症患者にはｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較して粒子サイズの大きい酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のレムナントリポタンパク質が存在すること、Ｇ１１−６抗体はそのような酸化ＬＤＬに対して反応することおよび脂質異常症患者においては酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応することが確認された。一方、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体は、酸化型のレムナントリポタンパク質に対し、あまり反応しないことが確認された。また、ＮＡＳＨ患者血清の場合と同様、脂質異常症患者血清においては、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体がｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較して粒子サイズの小さい酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬに対して反応が大きいのに対し、Ｇ１１−６抗体が酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬに対して反応が小さいのは、下記の実施例で示すように、脂質異常症患者における酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬが高度に酸化されているためと本発明者らは考えている。【０１５４】
また、図１６に示すように、健常者では、溶出番号１３においてＴＣ濃度およびＰＬ濃度が、溶出番号１３または溶出番号５においてＴＧ濃度が、溶出番号１６においてＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、溶出番号１５において抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、それぞれ最大となった。【０１５５】
この結果は本実施例（１）の図１２のＢと同様の結果であり、健常者にはｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと比較して粒子サイズの小さい酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬが存在すること、Ｇ１１−６抗体はそのような酸化ＬＤＬに対して反応することおよび健常者においては酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応することが再度確認された。【０１５６】
また、図１３〜１６の結果から、密度勾配遠心法による総リポタンパク質画分の分離を行わずに血清を直接ゲル濾過クロマトグラフィーに供して得た溶出液に対しても、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、酸化ＬＤＬを特異的に検出するのに十分な感度を有することが確認された。【０１５７】
＜実施例７＞金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性
（１）ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ画分の調製
［１−１］密度勾配遠心法によるリポタンパク質の分離
健常者から血清を採取し、既報（Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７〜７２頁、２００５年）に従って密度勾配遠心法を行い、リポタンパク質を分離した。具体的には、健常者血清２ｍＬを比重ｄがｄ＝１．０１９ｋｇ／Ｌとなるように調製し、超遠心機ＯｐｔｉｍａＭＡＸ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ベックマン・コールター社）およびローターＭＬＮ−８０（ベックマン・コールター社）を用いて、４００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で２０時間遠心分離を行った後、上層（ｄ＜１．０１９ｋｇ／Ｌ）をＡ画分として回収した。続いて、下層を比重ｄがｄ＝１．０６３ｋｇ／Ｌとなるように調製し、上記の超遠心機およびローターを用いて５００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で１８時間遠心分離を行った。ここで得られた上層（１．０１９ｋｇ／Ｌ＜ｄ＜１．０６３ｋｇ／Ｌ）をＢ画分とし、下層をＣ画分としてそれぞれ回収した。【０１５８】
［１−２］ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるリポタンパク質の確認
本実施例（１）［１−１］の健常者血清、Ａ画分、Ｂ画分およびＣ画分について、市販リポタンパク質分析キット（リポフォー；常光社）を用いて、付属の使用書に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った。その結果を図１７に示す。【０１５９】
図１７に示すように、Ｂ画分はＡ画分およびＣ画分と異なり、ＨＤＬを含まないとともにＬＤＬを含むことから、Ｂ画分をｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液とした。【０１６０】
［１−３］ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度測定
本実施例（１）［１−１］のＢ画分すなわちｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液について、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析を行った。その後、実施例１（２）［２−４］に記載の方法によりタンパク質濃度測定を行い、ＰＢＳを用いて０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。【０１６１】
（２）金属酸化ＬＤＬの調製
本実施例（１）［１−３］のｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）１２０μＬに、下記の濃度および量の硫酸銅を添加し、３７℃で０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間インキュベートすることにより、下記の通り様々な酸化度の金属酸化ＬＤＬ溶液を調製した。【０１６２】
〈ａ−〉    ２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ  透析なし  酸化処理終了直後に使用
〈ａ−１〉  ２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ  透析なし  ４℃で２４時間保管
〈ａ−１ｗ〉２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ  透析なし  ４℃で１週間保管
〈ａ＋１〉  ２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ  透析あり  ４℃で一晩透析
〈ａ＋１ｗ〉２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ  透析あり  ４℃で一晩透析の後、４℃で６日間保管
〈ｂ−〉    ５００μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ  透析なし  酸化処理終了直後に使用
〈ｃ−〉    ５００μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅６．０μＬ  透析なし  酸化処理終了直後に使用
〈ｄ−〉  １０００μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅６．０μＬ  透析なし  酸化処理終了直後に使用【０１６３】
上記〈ａ−〉、〈ｂ−〉、〈ｃ−〉および〈ｄ−〉については、各設定時間のインキュベート後、速やかに使用した。上記〈ａ−１〉については各設定時間のインキュベートに続き、４℃で２４時間保管した後に使用した。上記〈ａ−１ｗ〉については各設定時間のインキュベートに続き、４℃で１週間保管した後に使用した。上記〈ａ＋１〉については、各設定時間のインキュベートに続き、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析を行った後に使用した。上記〈ａ＋１ｗ〉については各設定時間のインキュベートに続き、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析を行い、続いて４℃で６日間保管した後に使用した。【０１６４】
（３）金属酸化ＬＤＬの酸化度の確認
本実施例（２）の〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬ溶液について、実施例１（１）に記載の方法により、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図１８に示す。【０１６５】
図１８に示すように、金属酸化ＬＤＬでは、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬに比較して陽極側に移動した位置でバンドが検出された。また、陽極側への移動距離は、硫酸銅添加後のインキュベート時間に比例して大きくなった。この結果から、硫酸銅添加後のインキュベート時間が長さに比例して、ｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬの酸化が進行することが確認された。【０１６６】
（４）金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性（硫酸銅添加量についての比較）
実施例３（２）［２−２］に記載の方法により、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（２）の〈ａ−〉、〈ｂ−〉、〈ｃ−〉および〈ｄ−〉の金属酸化ＬＤＬをそれぞれ用いた。その結果を図１９に示す。【０１６７】
図１９に示すように、〈ａ−〉では、酸化時間２時間まで吸光度が上昇し、酸化時間４時間以上では吸光度が低下し、酸化時間２４時間においてｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同程度の吸光度となった。〈ｂ−〉では、酸化時間１時間まで吸光度が上昇し、酸化時間２時間以上では吸光度が低下し、酸化時間８時間以上においてｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同程度の吸光度となった。〈ｃ−〉および〈ｄ−〉では、酸化時間０．５時間で吸光度が最大となり、酸化時間１時間以上では吸光度が低下し、酸化時間８時間以上においてｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同程度の吸光度となった。【０１６８】
これらの結果から、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、軽度に酸化された酸化ＬＤＬ（軽度酸化ＬＤＬ）に対しては反応が大きく、酸化されていないｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬおよび高度に酸化された酸化ＬＤＬ（高度酸化ＬＤＬ）に対しては反応が小さいことが確認された。【０１６９】
（５）ＴＢＡＲＳ法による金属酸化ＬＤＬの過酸化脂質濃度測定
本実施例（２）の〈ａ−〉および〈ｃ−〉の金属酸化ＬＤＬについて、ＴＢＡＲＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ケイマンケミカル社）を用いて、付属の使用書に従い過酸化脂質濃度測定を行った。具体的には、等量の酢酸と水酸化ナトリウムを混合し、３６．８ｍｍｏｌ／ＬとなるようＴｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄを加えて溶解することにより発色試薬を調製した。本実施例（２）の〈ａ−〉および〈ｃ−〉の金属酸化ＬＤＬ溶液２５μＬずつに対し、１ｍＬの発色試薬および２５μＬのＳＤＳ溶液をそれぞれ加えて混合し、１００℃で１時間インキュベートした後、１分間氷中に置いて反応を停止させた。続いて室温、１２０００ｒｐｍの条件下で１０分間遠心分離を行った後、上清を回収して９６穴マイクロプレート（住友ベークライト社）に１５０μＬ／ウェル入れ、波長５５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ６８０；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて測定した。〈ａ−〉についての結果を、本実施例（４）の〈ａ−〉についての結果と合わせて図２０のＡに、〈ｃ−〉についての結果を、本実施例（４）の〈ｃ−〉についての結果と合わせて図２０のＢに、それぞれ示す。【０１７０】
図２０のＡおよび図２０のＢに示すように、過酸化脂質濃度は〈ａ−〉と〈ｃ−〉とで同様の変化が検出された。すなわち、いずれの場合も酸化時間が２時間を経過するまでは過酸化脂質濃度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると過酸化脂質濃度が緩やかに低下した。一方、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、〈ａ−〉と〈ｃ−〉とで異なる吸光度の変化が検出された。すなわち、〈ａ−〉の場合は酸化時間が２時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると吸光度が急激に低下し、酸化時間が２４時間でｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同程度の吸光度となったのに対し、〈ｃ−〉の場合は酸化時間が０．５時間で吸光度が最大となり、酸化時間が１時間を経過すると吸光度が急激に低下し、酸化時間が８時間でｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同程度の吸光度となった。【０１７１】
これらの結果から、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性が、軽度酸化ＬＤＬに対して大きく、高度酸化ＬＤＬに対して小さいのに対し、チオバルビツール酸の反応性が、軽度酸化ＬＤＬと高度酸化ＬＤＬのいずれに対しても同様であることが確認された。【０１７２】
（６）金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性（金属酸化ＬＤＬの２４時間保管および透析処理の有無についての比較）
実施例３（２）［２−２］に記載の方法により、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（２）の〈ａ−１〉および〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬをそれぞれ用いた。その結果を、本実施例（４）の〈ａ−〉についての結果と合わせて図２１のＡに示す。【０１７３】
また、本実施例（２）の〈ａ−１〉および〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬについて、本実施例（５）に記載の方法により過酸化脂質濃度測定を行った。その結果を、本実施例（５）の〈ａ−〉についての結果と合わせて図２１のＢに示す。【０１７４】
図２１のＡに示すように、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、〈ａ−１〉の場合は、酸化時間が１時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が２時間を経過すると吸光度が低下し、酸化時間が約１６時間でｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同程度の吸光度となった。また、〈ａ＋１〉の場合は、酸化時間が２時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると吸光度が下降し、酸化時間が約１６時間でｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同程度の吸光度となった。【０１７５】
これらの結果から、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡで、〈ａ−〉および〈ａ＋１〉の場合と比較して、〈ａ−１〉の場合は、より短い酸化時間の金属酸化ＬＤＬに対して吸光度が最大となることから、金属酸化ＬＤＬは４℃での保管中に酸化が進むことが確認された。また、〈ａ−〉の場合と比較して、〈ａ＋１〉の場合は、吸光度がほぼ同値か若干小さい値となることから、金属酸化ＬＤＬにおけるＧ１１−６抗体の抗原は、透析により除去される物質ではないことが確認された。また、〈ａ−〉と比較して、〈ａ−１〉および〈ａ＋１〉において酸化時間が２時間を経過した場合では、吸光度が若干小さい値となることから、酸化時間が２時間を経過した金属酸化ＬＤＬは、透析処理の有無にかかわらず、４℃で２４時間保管することによりＧ１１−６抗体に対する反応性が低下することが確認された。【０１７６】
一方、図２１のＢに示すように、〈ａ−１〉の場合、過酸化脂質濃度は酸化時間が４時間を経過するまでは上昇し、酸化時間が８時間を経過すると緩やかに低下した。これに対し、〈ａ＋１〉の場合は、〈ａ−〉および〈ａ−１〉の場合と比較して、酸化時間にかかわらず過酸化脂質濃度が顕著に低下した。【０１７７】
これらの結果から、〈ａ−１〉の場合は過酸化脂質濃度の変化が〈ａ−〉の場合と相似していることから、４℃で保管することにより、チオバルビツール酸への反応性を担う過酸化脂質濃度は変化しないことが確認された。また、金属酸化ＬＤＬにおけるチオバルビツール酸反応性物質は、透析により除去され得る物質であることが確認された。【０１７８】
（７）金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性（金属酸化ＬＤＬの１週間保管および透析処理の有無についての比較）
実施例３（２）［２−２］に記載の方法により、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（２）の〈ａ−１ｗ〉および〈ａ＋１ｗ〉の金属酸化ＬＤＬのうち、硫酸銅添加後のインキュベート時間が０．５時間、１時間、２時間および４時間のものをそれぞれ用いた。その結果を、本実施例（６）のＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの結果と合わせて図２２に示す。【０１７９】
図２２に示すように、〈ａ−１ｗ〉と〈ａ＋１ｗ〉とで同様の吸光度の変化が検出され、いずれの場合も、酸化時間０．５時間で吸光度が最大となり、酸化時間が１時間を経過すると吸光度が低下した。また、〈ａ−〉、〈ａ−１〉および〈ａ＋１〉と比較して、〈ａ−１ｗ〉および〈ａ＋１ｗ〉では、酸化時間が１時間を経過すると吸光度が低下した。【０１８０】
これらの結果から、酸化時間が１時間を経過した金属酸化ＬＤＬは、透析処理の有無にかかわらず、４℃で１週間保管することによってＧ１１−６抗体に対する反応性が低下することが確認された。【０１８１】
＜実施例８＞金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性（各種の抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性との比較）
（１）金属酸化ＬＤＬの調製
実施例７（１）［１−３］のｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）１２０μＬに、３．３３μｍｏｌ／Ｌとなるよう硫酸銅を添加し、３７℃で０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間および２４時間インキュベートすることにより、様々な酸化度の金属酸化ＬＤＬ溶液を調製した。調製した金属酸化ＬＤＬ溶液は速やかにＥＬＩＳＡのサンプルとして使用した。【０１８２】
（２）金属酸化ＬＤＬに対する各種のＥＬＩＳＡ
本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬをサンプルとして、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりＧ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、付属の検体希釈液を用いて、本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬを２５００倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（３）に記載の方法により抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、付属の検体希釈液を用いて、本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬを１０００倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（４）に記載の方法により抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、それぞれ行った。【０１８３】
また、各酸化時間の金属酸化ＬＤＬにおけるアポリポタンパク質Ｂの状態を確認するため、抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。具体的には、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりＥＬＩＳＡを行った。ただし、５μｇ／ｍＬの実施例１（５）のＧ１１−６抗体に代えて、１０μｇ／ｍＬの実施例３（２）〈２−１−２〉のヤギ抗アポリポタンパク質Ｂポリクローナル抗体を用いた。また、２０倍に希釈した実施例３（１）の血清サンプルに代えて、０．１μｇ／ｍＬに希釈した本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬ溶液を用いた。また、２５０倍に希釈したＡＬＰ−ＳＡ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に代えて５００倍に希釈したＡＬＰ−ＳＡ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。【０１８４】
（３）ＴＢＡＲＳ法による金属酸化ＬＤＬの過酸化脂質濃度測定
実施例７（５）に記載の方法によりＴＢＡＲＳ法を行い、本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬの過酸化脂質濃度を測定した。【０１８５】
（４）金属酸化ＬＤＬの共役ジエンの測定
脂質の酸化の指標とするため、各酸化時間の金属酸化ＬＤＬにおける共役ジエンを測定した。具体的には、ＰＢＳを用いて本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬを０．０４ｍｇ／ｍＬに希釈し、分光光度計（Ｖ−５３０；日本分光社）を用いて波長２３４ｎｍの吸光度を測定した。【０１８６】
本実施例（２）、（３）および（４）の結果を図２３に示す。図２３に示すように、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、酸化時間が３時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると吸光度が低下し、酸化時間が８時間でｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同程度の吸光度となり、酸化時間が２４時間では酸化前より吸光度が低くなった。一方、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、酸化時間が８時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間２４時間で吸光度がやや低下した。抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、酸化時間が３時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると吸光度が低下し、酸化時間が２４時間でｎａｔｉｖｅ−ＬＤＬと同程度の吸光度となった。抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を固相化抗体および検出用抗体とするＥＬＩＳＡでは、酸化時間が８時間を経過するまでは吸光度が高く、酸化時間が２４時間で吸光度がやや低下した。ＴＢＡＲＳ法においては、過酸化脂質濃度は、酸化時間が４時間を経過するまでは上昇し、酸化時間が８時間を経過するとやや低下した。共役ジエンの測定では、酸化時間が３時間を経過するまでは吸光度が急激に上昇し、４時間を経過すると酸化時間においても吸光度は徐々に上昇した。【０１８７】
これらの結果から、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、軽度酸化ＬＤＬに反応が大きく、酸化されていないｎａｔｅｖｅ−ＬＤＬおよび高度酸化ＬＤＬに対しては反応が小さいことが確認された。また、Ｇ１１−６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度の変化は、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡの、いずれの吸光度の変化とも異なることから、Ｇ１１−６抗体は酸化ＬＤＬにおいて、抗ＭＤＡ−ＬＤＬ抗体および抗酸化リン脂質抗体とは異なる部位を抗原として認識することが確認された。さらに、Ｇ１１−６抗体が抗原とする部位は、チオバルビツール酸および共役ジエンへの反応性を担う過酸化脂質濃度およびアポリポタンパク質Ｂとも相関するものではないことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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